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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Alterações de Parâmetros Cardiovasculares e
Envolvimento dos Receptores AT
2
na CVLM sobre a
Pressão Arterial, induzidas por Atividade Física de
Baixa Intensidade em Ratos com Hipertensão
Renovascular
Míriam Carmo Rodrigues
Ouro Preto - MG
2007
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2
Míriam Carmo Rodrigues
Alterações de Parâmetros Cardiovasculares e
Envolvimento dos Receptores AT
2
na CVLM sobre a
Pressão Arterial, induzidas por Atividade Física de
Baixa Intensidade em Ratos com Hipertensão
Renovascular
Orientadora: Andréia Carvalho Alzamora
Co-orientadora: Raquel do Pilar Machado
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação de Ciências Biológicas do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos
requisitos para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Biológicas, área de concentração Bioquímica
Estrutural e Fisiológica.
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Trabalho desenvolvido no Laboratório de Hipertensão,
Laboratório de Nutrição Experimental e Laboratório de
Imunopatologia da Universidade Federal de Ouro
Preto com auxílio financeiro da CAPES, PROPP-
UFOP, PRONEX-CNPq-FAPEMIG.
4
Dedico este trabalho à minha família e a Deus,
fontes inesgotáveis de Vida e Amor.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que colaboraram para a realização deste trabalho, em especial:
À Profª. Drª. Andréia Carvalho Alzamora pela oportunidade, orientação e pelo voto
de confiança em meu trabalho. Na correria do dia-a-dia muitas coisas se perdem e ficam
mesmo por dizer, por isso quero registrar minha gratidão sincera pelo estímulo, bem a seu
modo, que muitas vezes para mim era compreendido muito mais como exigências, mas que
foram cruciais para levarmos adiante este trabalho que pelas dificuldades e adversidades
da vida pensei muitas vezes em interromper, abandonar ou mesmo ser incapaz de concluir.
À Profª. Drª. Raquel do Pilar Machado, pelos exemplos de perseverança, luta pela
vida e extrema dedicação à educação e ao ensino público.
À Profª. Drª. Maria José Campagnole-Santos, ao Prof. Dr. Robson Santos e a todos
do Laboratório de Fisiologia e Biofísica da Universidade Federal de Minas Gerais, agradeço
sinceramente o carinho e respeito com os quais sempre fui recebida e aos valiosos
ensinamentos compartilhados.
Á Profª. Drª. Claúdia Martins Carneiro, à Técnica Maria e a todos do Laboratório de
Imunopatologia, agradeço a dedicação e paciência com os quais conseguiram transmitir
conhecimentos tão valiosos e aos mesmo tempo de extrema importância para a conclusão
deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Marcelo Estáquio Silva, Ao Técnico Jair e ao Bolsista Fabrício bem
como todos do Laboratório de Nutrição Experimental, agradeço sinceramente à dedicação
e zelo com os quais sempre receberam a mim e a todos deste laboratório.
Às Professoras Drª. Patrícia Ferreira, Drª. Sordaini Maria Caligiorne e Drª. Cristiane
Rocha Fagundes Moura, pelo apoio e incentivo na realização deste trabalho.
A Todos os Professores do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, agradeço
a oportunidade de aprendizado, o respeito, diálogo e o convívio cordial e alegre seja nos
corredores ou mesmo, nas muitas vezes, que precisei recorrer aos laboratórios, seja para
esclarecimentos técnicos ou mesmo para buscar auxílio na execução de alguma atividade
experimental.
6
Aos financiadores deste trabalho: CNPq-PRONEX-FAPEMIG, CAPES, PROPP-
NUPEB-UFOP.
À Universidade Federal de Ouro Preto e ao Ensino Público, sem os quais nunca
teria concluído este trabalho.
A todos os colegas do Laboratório de Hipertensão: Amanda, Carolina, Elton, Enyara,
Karina, Uberdan, Edivaldo, Vinícius (in memorian), Giselle, Luiza Michelle, Janete, Gilberto,
Everton e a todos que mesmo por um curto tempo estiveram conosco auxiliando de alguma
forma para a concretização deste trabalho. Gostaria de agradecer de modo especial à
minha querida amiga e colega de mestrado Analina, pelo carinho e pelo convívio agradável
durante estes anos de trabalho. Gostaria de agradecer também aos queridos colegas José
Luiz e Sara que com dedicação, desprendimento e busca extremada pelo saber tornaram
este trabalho possível.
Agradeço profundamente à minha família. Aos meus queridos pais e irmãos,
exemplos de persistência, perseverança e fontes de alegria e amor. Às queridas Luiza e
Yasminn, pela doçura e carinho.
Agradeço também de forma especial e carinhosa à Ines♀☾ ível República Quarto
Crescente, suas moradoras e ex-alunas, pela amizade sincera e pelo apoio incondicional.
Às amigas de sempre Boka e Lesa, pela convivência e amizade.
Ao Lu e ao Timóteo, por me mostrarem que o verdadeiro amor vem logo após o
olhar, passa pelo coração e muitas vezes perde tempo na cabeça procurando respostas e
conjeturando o que vai além de qualquer paradigma... daí, se agita e muda tudo na gente,
mas só encontra conforto e abrigo lá longe, além, bem perto do fundo da alma...
Gostaria de agradecer, em fim, a todas as pessoas infinitamente bondosas e
especiais que Deus cuidadosamente colocou no meu caminho até aqui e que seria
impossível colocar o nome de todas elas. Vocês estarão para sempre no meu coração, na
minha lembrança e nas minhas orações.
Finalmente, agradeço aos animais experimentais que com inocência sacrificam suas
vidas pela ciência.
7
RESUMO
A atividade física de baixa intensidade tem sido utilizada como tratamento
coadjuvante e não farmacológico da hipertensão arterial. O bulbo ventrolateral caudal
(CVLM) atua promovendo inibição sobre a área ventrolateral rostral (RVLM). Na
hipertensão parece haver uma inabilidade dos neurônios da CVLM em contrabalancear o
aumento da atividade pressora intrínseca dos neurônios da RVLM. O modelo experimental
de hipertensão renovascular 2R1C caracteriza-se por apresentar altos níveis de renina e
angiotenisna II (Ang II). Neste estudo avaliamos o envolvimento do sistema renina
angiotensina (SRA) no controle da pressão arterial (PA), na sensibilidade da bradicardia
reflexa e a reatividade dos neurônios da CVLM para Ang II (100 nL de uma solução 380
µM) e para o antagonista específico de receptor de Ang II, AT
2
, PD123319 (100 nL de uma
solução 678 µM) em ratos sedentários ou ativos normotensos e com hipertensão
renovascular (2R1C).
Ratos Fisher (150 a 200 g) foram anestesiados com cetamina (50 mg/ kg. ip) e
xilazina (5 mg/ kg, ip) para produção da hipertensão 2R1C ou fictícia (Sham) e foram
separados em dois grupos, sedentários e submetidos à atividade física aeróbica de baixa
intensidade (natação) por quatro semanas com 1 hora de duração, 5 dias na semana. A PA
foi mensurada durante as quatro semanas de treino tanto nos animais ativos como nos
sedentários através do método de pletismografia de cauda. 30 dias após as cirurgias, os
animais 2R1C e Sham (sedentários e ativos) foram anestesiados com uretana (1,2 g/ kg,
ip), posicionados em aparelho estereotáxico para exposição do bulbo e instrumentados
para registro da pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC). A sensibilidade
da bradicardia reflexa foi avaliada através da injeção (i.v.) de fenilefrina. Ao final dos
experimentos os animais eram sacrificados por decaptação e coletados cérebro, rins,
coração e músculos. Uma parte destes órgãos era pesada (peso seco corrigido pela massa
corpórea do animal) e outra parte era enviada para análise histológica.
Os valores de PA avaliados por pletismografia de cauda mostraram que a PA dos
ratos 2R1C sedentários (105 ± 2 mmHg, n=11) e 2R1C ativos (118 ± 4 mmHg, n=17) foram
significativamente superiores aos dos animais Sham sedentários (93 ± 3 mmHg, n=12) já
na primeira semana após a realização das cirurgias (2R1C e Sham) e também durante a
segunda e terceira semanas seguintes. Na quarta semana após a realização das cirurgias
os valores de PA dos animais hipertensos sedentários (153 ± 6 mmHg, n=11) e ativos (129
± 4 mmHg, n=17) foram superiores aos apresentados pelos animais Sham sedentários (103
± 3 mmHg, n=12). Porém, no grupo 2R1C ocorreu uma redução significativa entre os
valores de PA no grupo ativo quando comparados aos animais hipertensos sedentários.
8
O percentual de redução do rim clipado foi semelhante entre os ratos 2R1C
sedentários (-27 ± 7 %, n=5) e os ratos 2R1C ativos (-39 ± 9 %, n=8) e maiores em relação
aos animais Sham. A análise histológica das estruturas renais do rim esquerdo (clipado)
mostra que as alterações patológicas como esclerose glomerular e inflamação presentes no
grupo Sham sedentário foram reduzidas no grupo Sham ativo. Já os ratos 2R1C ativos
apresentaram congestão, degeneração tubular focal, fibrose, inflamação e dilatação tubular,
reduzidos em relação ao grupo 2R1C sedentários. Com relação à análise histológica do rim
direito (não-clipado), no grupo Sham ativo, foi observada redução da congestão, esclerose
glomerular e inflamação e um aumento da degeneração tubular focal e dilatação tubular
quando comparado com os animais do grupo Sham sedentário. De forma semelhante, no
grupo 2R1C ativo houve aumento da degeneração tubular focal, esclerose glomerular e
inflamação e redução na congestão e fibrose quando comparamos com os animais do
grupo 2R1C sedentários.
O peso seco do coração dos animais dos grupos 2R1C (sedentário e ativo) e Sham
ativo foram estatisticamente similares e maiores do que o peso seco do coração dos
animais Sham sedentários. Porém, foi observado um aumento significativo do peso seco
dos ventrículos nos animais 2R1C sedentários e ativos que não ocorreu nos ratos Sham
ativos. A análise histológica das estruturas cardíacas mostrou uma redução na
degeneração dos cardiomiócitos e um espessamento excêntrico da parede ventricular nos
ratos Sham ativos quando comparados com os animais Sham sedentários. No grupo 2R1C
ativo foi observada uma redução no espessamento da parede ventricular e vascular e uma
redução na fibrose e um aumento na degeneração e inflamação ventricular focal em
comparação aos ratos 2R1C sedentários.
Os ratos 2R1C sedentários apresentaram ingestão aumentada de água até a quarta
semanas após a cirurgia, sendo que atividade física reduziu esta ingestão na quarta
semana da cirurgia (2R1C ativos). Já, os animais do grupo Sham ativo apresentaram
ingestão aumentada de água somente durante a primeira e segunda semanas de natação.
Os níveis séricos de uréia foram significativamente maiores nos animais ativos (Sham e
2R1C).
A PAM basal dos ratos 2R1C sedentários (161 ± 13,5 mmHg; n=5) foi
significativamente maior que a PAM basal dos ratos Sham sedentários (105 ± 4,3 mmHg;
n=6). O exercício físico reduziu significativamente a PAM no grupo 2R1C ativo (127 ± 6
mmHg; n=7) sendo que estes valores foram estatisticamente diferentes da PAM basal dos
ratos 2R1C sedentários e Sham (sedentários e ativos). Os valores basais de FC não foram
significativamente diferentes no grupo Sham ativo em comparação aos ratos Sham
sedentários (400 ± 13 bpm; n=6). Contudo, no grupo 2R1C ativo, a FC basal (375 ± 8 bpm;
9
n=7) foi significativamente menor que a FC basal no grupo 2R1C sedentário (407 ± 12 bpm;
n=5).
A bradicardia reflexa nos ratos 2R1C sedentários foi significativamente menor em
comparação aos ratos Sham sedentários (0,36 ± 0,07 ms/ mmHg, n=6). Não houve
diferença significativa na bradicardia reflexa nos ratos Sham (ativos ou sedentários). Ao
contrário, no grupo 2R1C ativo houve um aumento significativo na bradicardia reflexa (0,2 ±
0,03 ms/ mmHg, n=7) em comparação aos ratos 2R1C sedentários (0,09 ± 0,03 ms/ mmHg;
n=5). A sensibilidade barorreflexa no grupo 2R1C ativo foi similar ao grupo Sham ativo
(0,33 ± 0,03 ms/ mmHg, n=7).
A Ang II microinjetada na CVLM induziu uma diminuição significativa da PAM nos
grupos 2R1C similar à observada no grupo Sham (-13 ± 1 mmHg, n=6; ratos sedentários e -
13 ± 2 mmHg, n=7; ratos ativos). Surpreendentemente, o antagonista de receptores AT
2
para Ang II, PD123319, na CVLM produziu efeito hipotensor nos ratos 2R1C sedentários (-
10 ± 1 mmHg) significativamente diferentes em comparação a microinjeçãos de salina (-5 ±
1 mmHg, n=5). De forma diferente, em ratos 2R1C ativos o efeito depressor do PD123319
na CVLM foi similar ao observado após microinjeção de salina. No grupo Sham (sedentário
e ativo) o efeito hipotensor produzido pelo PD123319 na CVLM foi similar ao efeito
produzido pela salina. O efeito hipotensor da Ang II na CVLM foi bloqueado pela
microinjeção do PD123319 na CVLM em todos os grupos.
Os resultados de nosso estudo mostram que a atividade física aeróbica de baixa
intensidade provoca uma diminuição na PAM basal, restaura a bradicardia barorreflexa e
não altera a responsividade à Ang II na CVLM em ratos com hipertensão 2R1C. Nossos
dados, por outro lado, mostram alterações na responsividade do receptor AT
2
na CVLM que
parecem estar envolvidas nos efeitos cardiovasculares da atividade física de baixa
intensidade e importantes vias do SRA que podem participar na homeostase cardiovascular
e na adaptação do exercício físico sobre a hipertensão renovascular.
10
ABSTRACT
Low intensity physical activity has been used as a non-pharmacological treatment for
hypertension. The caudal vetrolateral medulla (CVLM) represents the major tonic inhibitory
afferece to the rostral ventrolateral medulla (RVLM). Regarding hypertensive states, CVLM
neurons seem to be inefficient in counteracting the increased intrinsic pressor activity of the
RVLM neurons. The 2K1C renovascular hypertensive experimental model exhibit high
plasmatic levels of renin and angiotensin II (Ang II). The present study aimed and evaluated
the involvement of the renin-angiotensin system (RAS) in the blood pressure (BP) control
mechanisms, in the sensitivity of the baroreflex bradycardia and in the reactivity of the
CVLM neurons to Ang II (40 ng) and to the selective AT
2
receptor antagonist PD123319 (50
ng) in sedentary or trained normotensive or hypertensive (2K1C).
Fisher rats (weighting 150 to 200 g) were anesthetized by a mixture of Ketamine (50
mg/ Kg, i.p.) and xylazine (5 mg/ Kg, i.p.) for the placement of the silver clip around the left
renal artery or for Sham surgery and were separated in two groups: sedentary or low
intensity trained (swimming) one hour per day, five days per week, during four weeks. The
BP was measured in trained and sedentary animals every training day throught tail cuff
method. 30 days after the surgeries, the 2K1C and Sham animals (sedentary and trained)
were anesthetized with urethane (1.2 g/ Kg, i.p.), placed onto a stereotaxic apparatus, had
the medulla exposed and were intrumented for mean arterial pressure (MAP) and heart rate
(HR) measurements. The baroreflex bradycardia sensitivity was assessed trough i.v. bolus
injection of phenylephrine. At the end of the experiments the animals underwent
decapitation and had the brain, kidneys and hearts collected. Some of these organs were
weightened (dry organ weight/ body weight) and another part was sent for histological
analisys.
The tail cuff method showed that the 2K1C sedentary (105 ± 2 mmHg, n=11) and
2K1C trained group (118 ± 4 mmHg, n=17) presented higher BP levels when compared to
the sedentary Sham group (93 ± 3 mmHg, n=12) after the first week after surgery and on the
second and third weeks as well. On the fourth week after surgeries the BP levels of the
sedentary hypertensive (153 ± 6 mmHg, n=11) and trained groups (129 ± 4 mmHg, n=17)
were higher in comparison to the Sham sedentary group (103 ± 3 mmHg, n=12). However,
in the 2K1C group we observed a significative reduction in the BP levels of the trained group
in comparison to the trained hypertensive group. The percentage of mass reduction in the
clipped kidney were similar among 2K1C sedentary (-27 ± 7 %, n=5) and 2K1C trained (-39
± 9 %, n=8) groups and increased when compared to Sham groups. The histological
analisys showed that the pathological changes (such as glomerual sclerosis and
inflammation) of the clipped (left) kidney of Sham sedentary animals appear to be reduced
11
in the Sham trained group. Meanwhile, the 2K1C trained rats presented congestion, tubular
focal degeneration, fibrosis, inflammation and tubular dilation reduced in comparison to the
sedentaries 2K1C rats. Regarding the histological analisys of the non-clipped kidney (right),
we observed reduced congestion, glomeruar sclerosis and inflamation and increased focal
tubular degeneration and tubular dilation in the Sham trained group in comparison to the
Sham sedentary group.
The dry heart weight from 2K1C animals (sedentary and trained) were statisticaly
similar and higher than the dry heart weight from sham sedentary animals. However, it was
observed an increased ventricular mass of the hearts of 2K1C sedentary and trained
animals that has not occurred to the ventricles of Sham trained animals. The histological
analisys of the cardiac structures showed a reduction in the cardiac muscle cells
degeneration and excentric ventricular wall thickening in sham trained in comparison to
sham sedentary animals. It was also observed that in the 2K1C trained group a reduction in
the ventricular and vascular wall thickening, a reduction in the fibrosis and increased focal
ventricular degeneration and inflammation when compared to 2K1C sedentary group.
Regarding water consumption, 2K1C sedentary animals presented an increased
ingestion until the fourth week after surgery; while the 2K1C trained animals reduced the
water ingestion in the fourth week after surgery. The Sham trained animals presented an
increased ingestion of water increased only during the first and second weeks of swimming.
The urea serum levels were significantly higher in trained animals (Sham and 2K1C).
The basal MAP levels of 2K1C sedentary group was significantly higher compared to
Sham sedentary group (161 ± 13.5 mmHg; n=5 vs 105 ± 4.3 mmHg; n=6, respectively). The
physical training significantly reduced the MAP levels of the 2K1C trained group (127 ± 6
mmHg; n=7) and these values were statisticaly different from 2K1C sedentary and Sham
(trained and sedentary) groups. The basal HR values of the Sham trained group (375 ± 8
bpm; n=7) were not significantly different from the sham sedentary group (400 ± 13 bpm;
n=6). Nevertheless, the basal HR of the 2K1C trained group were significantly reduced
when compared to 2K1C sedentary group (407 ± 12 bpm; n=5).
The baroreflex bradycardia was significantly reduced in the 2K1C sedentary group in
comparison to the Sham sedentary group (0.36 ± 0.07 ms/ mmHg, n=6). There were no
significative differences in the baroreflex bradycardia among Sham (sedentary and trained)
groups. On the other hand, 2K1C trained group presented an increased baroreflex
bradycardia in comparison to 2K1C sedentary animals (0.2 ± 0.03 ms/ mmHg, n=7 vs 0.09 ±
0.03 ms/ mmHg; n=5, respectively). The baroreflex sensitivity measured in the 2K1C trained
group was similar to that observed in the 2K1C sedentary rats.
The microinjection of Ang II into the CVLM was able to reduce the MAP of 2K1C
groups to the levels observed in the Sham groups (-13 ± 1 mmHg, n=6; sedentary and -13 ±
12
2 mmHg, n=7; trained). Surprisingly, the microinjection of the selective AT
2
receptor
antagonist, PD123319, into the CVLM produced a hypotensive effect in the 2K1C sedentary
group (-10 ± 1 mmHg), that was significantly different from the vehicle microinjections into
the same site (-5 ± 1 mmHg, n=5). In a different fashion, 2K1C trained rats presented a
hypotensive effect in response to the PD123319 microinjection into the CVLM that was
similar to that observed after the saline microinjection. The hypotensive effect in response to
microinjection of Ang II into the CVLM was blunted by the prior PD123319 microinjection
into the CVLM in all groups tested.
The results of the present study showed that low-intensity physical activity, that is
effective in reducing high BP and in restoring the sensitivity of the baroreflex bradycardia,
does not induce changes in the responsiveness to Ang II at CVLM of normotensive or
hypertensive, 2K1C rats. Concerning the later results, on the order hand, changes in the
responsiveness to AT
2
related stimuli at the CVLM appears to be involved in the
cardiovascular effect of low-intensity physical activity and add new and significant insights
into RAS mechanisms involved in cardiovascular homeostasis and in its adaptation to
exercise in renovascular hypertension.
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Figura ilustrativa da cirurgia para produção da hipertensão 2R1C ................... 25
Figura 2 – Protocolo de atividade física utilizado ................................................................ 26
Figura 3 – Foto ilustrativa do sistema de pletismografia de cauda ..................................... 27
Figura 4 – Esquema utilizado para a obtenção do Índice de Sensibilidade do
Barorreflexo.......................................................................................................................... 30
Figura 5 – Demonstração do local de realização das microinjeções na CVLM .................. 31
Figura 6 – Fotos ilustrativas dos músculos sóleo e bíceps ................................................. 32
Figura 7 – Protocolo experimental para a avaliação da bradicardia reflexa ....................... 36
Figura 8 – Protocolo experimental para a avaliação dos efeitos cardiovasculares
produzidos pela microinjeção de Ang II e PD123319 na CVLM .......................................... 37
Figura 9 - PA mensurada através de pletismografia de cauda em ratos acordados (Sham e
2R1C, sedentários e ativos) na 1
a
, 2
a
, 3
a
e 4
a
semana após as cirurgias (Sham e
2R1C)................................................................................................................................... 40
Figura 10 - Ingestão hídrica (ml) em ratos (Sham e 2R1C, sedentários e ativos) na 1
a
, 2
a
, 3
a
e 4
a
semana após as cirurgias (Sham e 2R1C) .................................................................. 42
Figura 11 - Peso corporal (g) de ratos (Sham e 2R1C, sedentários e ativos) na 1
a
, 2
a
, 3
a
e
4
a
semana após as cirurgias (Sham e 2R1C) ..................................................................... 44
Figura 12 - Fotos ilustrativas dos rins de ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos, 30 dias
após as cirurgias (Sham e 2R1C) ........................................................................................ 47
Figura 13 - Alterações do peso seco dos rins direito (não-clipado) e rins esquerdo (clipado)
(g/ 100g de peso corporal) em ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos .......................... 48
Figura 14 - % de redução do peso seco do rim esquerdo (clipado) (g/ 100g de peso
corporal) de ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ....................................................... 49
Figura 15 - Histologia do rim esquerdo (clipado) e do rim direito (não-clipado) de ratos
Sham e 2R1C, sedentários e ativos .................................................................................... 50
Figura 16 - Fotomicrografias da região medular do rim esquerdo (clipado) de ratos
pertencentes aos grupos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ............................................ 51
Figura 17 – Fotomicrografias da região cortical do rim direito (não-clipado) de ratos
pertencentes aos grupos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ............................................ 52
Figura 18 - Alterações no peso seco do coração, ventrículos e átrios (g/ 100g de peso
corporal) de ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ....................................................... 54
Figura 19 - Histologia do coração de ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ............... 55
14
Figura 20 - Fotografias do coração de ratos pertencentes aos grupos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos ............................................................................................................. 56
Figura 21 - Fotomicrografias do miocárdio de ratos pertencentes aos grupos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos ............................................................................................................. 57
Figura 22 - Fotomicrografias do miocárdio de ratos pertencentes aos grupos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos ............................................................................................................. 58
Figura 23 - Valores de PA na quarta semana após a cirurgia (Sham e 2R1C, sedentários e
ativos) medida de forma indireta pela pletismografia, no início e ao término do
experimento.......................................................................................................................... 61
Figura 24 - Registro típico de PAM, PAP e FC basais de um rato Sham e 2R1C, sedentário
e ativo .................................................................................................................................. 62
Figura 25 – Valores basais de PAM e FC, basais, de ratos Sham e 2R1C, sedentários e
ativos ................................................................................................................................... 63
Figura 26 - Alterações na PAM produzidas por injeções intravenosas de Ang II, PD123319
e salina em ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ........................................................ 65
Figura 27 - Alterações no índice de sensibilidade da bradicardia barorreflexa em ratos
Sham e 2R1C, sedentários e ativos .................................................................................... 68
Figura 28 - Alterações reflexas na FC em ratos Sham e 2R1C, sedentários e
ativos.................................................................................................................................... 68
Figura 29 - Registros típicos das alterações de PAP, PAM e FC produzidas pelas
microinjeções de Ang II, PD123319 e Salina, na CVLM de um rato 2R1C e Sham,
sedentário e ativo ................................................................................................................ 70
Figura 30 - Alterações na PAM e FC produzidas por microinjeções de salina, Ang II e
PD123319 na CVLM em ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ................................... 71
Figura 31 - Alterações na PAM produzidas por microinjeções na CVLM de Ang II antes e 5,
15 e 30 min após microinjeções de PD123319 em ratos Sham e 2R1C, sedentários e
ativos.................................................................................................................................... 74
Figura 32 - Alterações na FC produzidas por microinjeções na CVLM de Ang II antes e 5,
15 e 30 min após microinjeções de PD123319 em ratos Sham e 2R1C, sedentários e
ativos.................................................................................................................................... 75
Figura 33 - Fotografia e diagrama da superfície ventral do bulbo ilustrando a localização do
centro das as microinjeções ................................................................................................ 76
15
LISTA DE TABELAS
Tabela I: Valores da pressão arterial (mmHg) mensurada através da pletismografia de
cauda em ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos .......................................................... 40
Tabela II: Valores da ingestão hídrica (ml) avaliados por quatro semanas após cirurgias em
ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ........................................................................... 42
Tabela III: Valores do peso corporal (g) avaliados por quatro semanas após cirurgias em
ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ........................................................................... 44
Tabela IV: Valores do peso dos rins (g/ 100g do peso corporal) em ratos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos ............................................................................................................. 48
Tabela V: Valores da % de redução do peso seco do rim esquerdo (clipado) em relação ao
rim direito (não-clipado) em ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos .............................. 49
Tabela VI: Valores do peso dos corações, ventrículos e átrios (g/ 100g do peso corporal)
em ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos ..................................................................... 55
Tabela VII: Concentração sérica de creatinina (µmol/L) e uréia (mmol/L) em ratos Sham e
2R1C, sedentários e ativos .................................................................................................. 59
Tabela VIII: Valores da pressão arterial (mmHg) em animais acordados (pletismografia) e
após anestesia - 20 minutos e duas horas, em ratos Sham e 2R1C, sedentários e
ativos.................................................................................................................................... 61
Tabela IX: Valores basais de Pressão Arterial Média (mmHg) em ratos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos ............................................................................................................. 66
Tabela X: Valores basais de Freqüência Cardíaca (bpm) em ratos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos ............................................................................................................. 66
Tabela XI: Valores basais de PAM e FC, índice de correlação da regressão linear e
sensibilidade da bradicardia reflexa em ratos Sham e 2R1C, sedentários e
ativos.................................................................................................................................... 67
Tabela XII: Valores Basais de Pressão Arterial Média (mmHg) em ratos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos ............................................................................................................. 72
Tabela XIII: Valores Basais de Frequência Cardíaca (bpm) produzidas por microinjeções de
salina, Ang II e PD123319 na CVLM em ratos Sham e 2R1C, sedentários e
ativos.................................................................................................................................... 72
Tabela XIV: Valores basais de Pressão Arterial Média (mmHg) em ratos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos ............................................................................................................. 74
Tabela XV: Valores basais de Freqüência Cardíaca (bpm) em ratos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos ............................................................................................................. 75
16
LISTA DE ABREVIATURAS
µg micrograma
µL microlitro
µm micrômetro
2R1C hipertensão renal do tipo dois-rins, um clip de Goldblatt
Ang II angiotensina II
ANOVA análise de variância
AT
1
receptors angiotensinérgicos do tipo 1
AT
1A
receptors angiotensinérgicos do tipo 1, subtipo A
AT
1B
receptors angiotensinérgicos do tipo 1, subtipo B
AT
2
receptors angiotensinérgicos do tipo 2
bpm batimentos por minuto
CVLM bulbo ventrolateral caudal
DC débito cardíaco
dL decilitro
ECA enzima conversora de angiotensina
EF exercício físico
EPM erro padrão da média
FC freqüência cardíaca
FCb freqüência cardíaca basal
FCp freqüência cardíaca pulsátil
i.p. intraperitonial
i.v. intravenosa
mmHg milímetros de mercúrio
NA núcleo ambíguo
PA pressão arterial
PD123319 antagonista de receptor AT
2
para Ang II
PAM pressão arterial média
PAP pressão arterial pulsátil
RVP resistência vascular periférica
RVLM bulbo ventrolateral rostral
Sham grupo submetido à cirurgia fictícia, grupo normotenso, controle
SHR rato espontaneamente hipertenso
SNA sistema nervoso autônomo
SNS sistema nervoso simpático
SRA sistema renia angiotensina
UI unidades internacionais
Δ delta, variação
ΔIP variação de intervalos de pulsos
ΔPAM variação da pressão arterial média
17
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................................. 07
ABSTRACT .......................................................................................................................... 10
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ 13
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ 15
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................ 16
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 19
Revisão da literatura .......................................................................................................... 21
3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................. 40
3.1. Animais ....................................................................................................................... 41
3.2. Cirurgia para o Desenvolvimento da Hipertensão Renovascular................................. 41
3.3. Treinamento Físico...................................................................................................... 42
3.4. Avaliação Indireta da PA Através de Pletismografia de Cauda.................................... 43
3.5. Avaliação do Peso Corporal........................................................................................ 44
3.6. Avaliação da Ingestão Hídrica..................................................................................... 44
3.7. Confecção de Cânulas Vasculares.............................................................................. 44
3.8. Procedimentos Cirúrgicos ........................................................................................... 44
3.9. Registro Direto da PAM e FC...................................................................................... 45
3.10. Avaliação da Sensibilidade da Bradicardia Baroreflexa............................................. 46
3.11. Procedimentos de Microinjeções na Superfície Ventrolateral Caudal........................ 47
3.12. Injeções Intravenosas de Drogas em Ratos Anestesiados........................................ 47
3.13. Coleta de Órgãos e Amostras de Tecidos................................................................. 48
3.14. Coleta de Plasma...................................................................................................... 49
3.15. Dosagens de Creatinina............................................................................................ 49
3.16. Dosagens de Uréia.................................................................................................... 49
3.17. Drogas Utlilizadas ..................................................................................................... 50
3.18. Preparo de Soluções................................................................................................. 50
3.19. Verificação Histológica.............................................................................................. 51
3.20. Análise Estatística..................................................................................................... 52
3.21. Protocolos Experimentais.......................................................................................... 52
3.21.1. Avaliação da Sensibilidade da Bradicardia Reflexa ........................................ 52
3.21.2. Avaliação dos Efeitos Cardiovasculares Produzidos pela Microinjeção de Ang II
e PD123319 no Bulbo Ventrolateral Caudal ............................................................... 53
18
4. RESULTADOS .............................................................................................................. 54
4.1 AVALIAÇÃO DE DIFERENTES PARÂMETROS DA HIPERTENSÃO
RENOVASCULAR.......................................................................................................... 55
4.1.1. Evolução da PA após Cirurgia para Produção da Hipertensão 2R1C............... 55
4.2. Avaliação da Ingestão Hídrica................................................................................. 57
4.3. Avaliação do Peso Corporal dos Animais após as Cirurgias (Sham ou 2R1C)........ 59
4.4. Avaliação Histológica e do Peso Seco dos Rins...................................................... 61
4.5. Avaliação Histológica e do Peso Seco do Coração ................................................. 69
4.6. Avaliação dos Níveis Séricos de Creatinina e Uréia ................................................ 75
4.7. AVALIAÇÃO DIRETA DOS PARÂMETROS CARDIOVASCULARES ..................... 76
4.7.1. Níveis de Basais de PAM e FC......................................................................... 76
4.8. Administração Intravenosa de Ang II e PD123319................................................... 80
4.9. Efeitos Cardiovasculares Produzidos por Microinjeções de Ang II e PD123319 na
CVLM............................................................................................................................. 85
4.10. Efeito de Microinjeções de Ang II na CVLM após o Bloqueio do Receptor AT
2
pelo
Antagonista PD123319................................................................................................... 89
4.11. Avaliação histológica da CVLM ............................................................................. 92
5. DISCUSSÃO.................................................................................................................. 93
5.1. AVALIAÇÃO DE DIFERENTES PARÂMETROS DA HIPERTENSÃO
RENOVASCULAR.......................................................................................................... 95
5.1.1. Pletismografia de Cauda:.................................................................................. 95
5.1.2. Ingestão Hídrica:............................................................................................... 97
5.1.3. Avaliação do peso Corporal:............................................................................. 99
5.1.4. Avaliação do Peso dos Rins:...........................................................................100
5.1.5. Avaliação do Peso do Coração:.......................................................................102
5.1.6. Avaliação da Creatinina Plasmática:................................................................104
5.1.7. Avaliação da Uréia Plasmática: .......................................................................104
5.2. AVALIAÇÃO DIRETA DOS PARÂMETROS CARDIOVASCULARES ....................105
5.2.1. Avaliação da PAM e FC...................................................................................105
5.2.2. Administração Intravenosa de Ang II iv............................................................107
5.2.3. Bradicardia Reflexa .........................................................................................108
5.2.4. Bulbo Ventrolateral Caudal..............................................................................109
6. SUMÁRIO E CONCLUSÕES........................................................................................111
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................114
8. ANEXOS ..................................................................................................................... 129
19
INTRODUÇÃO
20
1. INTRODUÇÃO
A hipertensão arterial acomete milhares de pessoas no mundo todo e tem sido
explicada como sendo resultado da disfunção do controle da pressão arterial (PA). Está
bem estabelecido na literatura que o exercício físico (EF) de baixa à moderada intensidade
produz bradicardia de repouso e diminuição da pressão arterial média (PAM) em ratos e
humanos hipertensos (ROMAN e cols., 1981; HAGBERG e cols., 1990; TIPTON e cols.,
1991; ARAKAWA, 1993; VÉRAS-SILVA e cols., 1997; NEGRÃO e cols., 1999). Estes
estudos mostram que estas alterações cardiovasculares estão relacionadas à alteração do
tônus autonômico induzido pelo EF, principalmente diminuição da atividade simpática.
Da mesma forma que o sistema renina-angiotensina (SRA) atua modulando
respostas cardiovasculares e o equilíbrio hidroeletrolítico, sua participação durante o
exercício é relevante, uma vez que durante uma sessão de exercício ou até mesmo após o
treinamento físico, são observadas varias alterações do sistema cardiovascular e da
homeostasia corporal. Na maioria dos modelos de hipertensão, entre os quais estão
incluídas a hipertensão gênica ou a hipertensão renovascular 2R1C, apresentam aumento
da atividade do SRA (JUDY e cols., 1976; LUNDIN, e cols., 1984). O bulbo ventrolateral
(VLM) influencia a atividade intrínseca do nervo simpático pré-motor espinhal e tem um
papel crítico no controle da PA (BLESSING e cols., 1982; MURATANI e cols., 1993 e
DAMPNEY, 1994). As áreas rostral (RVLM) e caudal (CVLM) do VLM, possuem ações
pressoras e depressoras, respectivamente. Na hipertensão parece haver um desequilíbrio
entre a RVLM e a CVLM, ou seja, uma inabilidade dos neurônios da CVLM em
contrabalancear o aparente aumento da atividade pressora intrínseca dos neurônios da
RVLM em animais hipertensos (MURATANI e cols., 1993).
No presente estudo, investigamos o efeito da atividade física aeróbica de baixa
intensidade, natação, sobre parâmetros cardiovasculares em ratos com hipertensão
renovascular 2R1C. Foi avaliada a pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC),
ingestão hídrica, o peso corporal dos animais, o peso seco, o percentual de redução e as
alterações histológicas nos rins e do coração dos animais experimentais. Avaliamos ainda a
bradicardia reflexa, os níveis séricos de uréia e creatinina e o efeito da administração
venosa e da microinjeção na CVLM de Ang II, PD123319 e salina nos animais com
hipertensão renovascular e normotensos.
21
REVISÃO DA LITERATURA
O sistema cardiovascular integra o corpo como uma unidade e proporciona aos
músculos ativos uma corrente contínua de nutrientes e de oxigênio, de modo que pode ser
mantido um alto rendimento energético. Por outro lado, os produtos do metabolismo são
removidos rapidamente pela circulação do local de maior gasto de energia.
O sistema cardiovascular é um sistema contínuo que consiste em uma bomba, um
circuito de distribuição de alta pressão, canais de permuta e um circuito de coleta e de
retorno de baixa pressão. A pressão sanguínea no sistema arterial, ou pressão arterial (PA)
é gerada e mantida pela integração entre a força propulsora cardíaca, a capacidade de
dilatação elástica da aorta e a resistência ao fluxo do sangue exercida, predominantemente,
pelas arteríolas e artérias de calibre inferior a 200 µm de diâmetro.
Assim, a relação direta entre o volume de sangue ejetado por minutos pelo coração,
débito cardíaco (DC) e a resistência vascular periférica (RVP) permite que esse sistema
dotado de uma bomba intermitente gere pressões supra-atmosféricas permanentemente
que oscilam entre um nível máximo e um nível mínimo, sendo, portanto, de natureza pulsátil
(ASHTON, 2007).
A regulação da PA é uma das funções fisiológicas mais complexas, que depende de
ações integradas dos sistemas cardiovascular, renal, neural e endócrino. A hipertensão
arterial é uma desordem do nível médio em que a PA é regulada. Embora tenha enorme
importância clínica, uma vez que, cronicamente a pressão elevada acarreta danos ao
coração, vasos sanguíneos e rins, pelo menos, nos estágios iniciais da hipertensão, não
causa alterações evidentes na função cardiovascular. A maioria das alterações
cardiovasculares provocadas pela hipertensão é desencadeada por mecanismos
compensatórios provocados diretamente pela pressão alta, como a hipertrofia ventricular e
vascular, ou indiretamente, devido ao dano vascular causado como a aterosclerose e
nefroesclerose. A investigação da fisiopatologia da hipertensão arterial, portanto, significa
entender os mecanismos de controle da PA normal e procurar as alterações sutis que
precedem ao aumento da pressão para níveis de hipertensão. Esses conhecimentos são o
substrato essencial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficientes,
visando a um controle mais homogêneo da PA em períodos de 24 horas. A regulação
efetiva da PAM é o resultado da atividade de sistemas de retroalimentação que operam em
curto e em longo prazo. O principal mecanismo de controle em curto prazo é
desempenhado pelos reflexos que são originados nos pressorreceptores arteriais e nos
receptores de estiramento da região cardiopulmonar. Assim, com o diagnóstico e
tratamento da hipertensão arterial focados no nível basal da pressão sanguínea ocorre
grande redução da morbidade mortalidade da população. Por outro lado, a variabilidade da
22
PA, momento a momento, cujo controle é função do barorreflexo, é também de importante
significado clínico (CAMPAGNOLE-SANTOS e HAIBARA, 2001).
O tônus simpático basal e o barorreflexo são modulados primeiramente pelos
neurônios do bulbo. O bulbo ventrolateral (VLM) influencia a atividade intrínseca dos
neurônios pré-ganglionares simpáticos e tem um papel crítico no controle da PA
(BLESSING e cols., 1982; MURATANI e cols., 1993 e DAMPNEY, 1994). As áreas rostral e
caudal do VLM, RVLM e CVLM, respectivamente, possuem, papéis importantes no controle
central da PAM. A RVLM tem sido caracterizada como uma região pressora e contém
neurônios excitatórios que se projetam diretamente à região preganglionar simpática
motora na medula espinhal, enquanto a CVLM tem sido caracterizada como uma região
depressora (GUERTZENSTEIN e SILVER, 1974; LOEWY e cols., 1981, ROSS e
cols.,1984a,b; GUYENET, 1990). Outros núcleos importantes no bulbo são os núcleos
ambíguo (NA) e motor do vago, que contêm corpos celulares das fibras parassimpáticas
vagais, desempenhando papel fundamental no controle da FC (NOSAKA e cols., 1972;
HOPKINS e ARMOUR, 1982).
As informações periféricas são processadas e integradas no núcleo do trato solitário
(NTS) com sinais que chegam de outras regiões regulatórias como a medula, ponte,
diencéfalo e telencéfalo (FELDMAN e ELLEMBERGER, 1988). Vários estudos (GORDON,
1987, SMITH e BARRON, 1990 e AGARWAL e CALARESU, 1990 e 1991) mostraram a
existência de projeção excitatória do NTS para a região CVLM, a qual promove uma
inibição sobre a região simpato-excitatória, RVLM, através de uma via neuronal
ascendente. Existe uma conexão entre a CVLM e o NA e motor do vago, permitindo que
essa área atue sobre a FC (NOSAKA e cols., 1972; HOPKINS e ARMOUR, 1982, HESPEL
e cols, 1988; CRAVO e cols., 1991 e SCHREIHOFER e cols, 2003).
A maioria dos modelos de hipertensão, entre os quais estão incluídas a hipertensão
gênica ou a hipertensão renovascular, apresentam aumento da atividade do sistema
nervoso simpático (SNS) (JUDY e cols., 1976; LUNDIN, e cols., 1984). Na hipertensão
parece haver um desequilíbrio entre a RVLM e a CVLM, ou seja, uma inabilidade dos
neurônios da CVLM em contrabalancear o aparente aumento da atividade pressora
intrínseca dos neurônios da RVLM em animais hipertensos (CARVALHO e cols., 2003).
McCUBBIN e colaboradores, 1956, foram pioneiros mostrando que os
barorreceptores se adaptam a um novo “set point” e exercem sua função em níveis
mantidos de PA alta ou baixa. A seguir diversos trabalhos têm mostrado o processo de
deslocamento ou adaptação da faixa de funcionamento dos pressorreceptores para níveis
mais elevados de pressão nos hipertensos, em várias espécies e em diferentes formas de
hipertensão (BRITTO e cols., 1997; NEGRÃO e cols. 2001). Entretanto, não significa que
os barorrecptores atuem do mesmo modo que na normotensão. BRISTOW e
23
colaboradores, 1969, mostraram que o controle barorreflexo da FC estava diminuído em
indivíduos hipertensos. Ainda se discute se a diminuição da sensibilidade barorreflexa é
causa ou conseqüência da hipertensão. A redução da sensibilidade barorreflexa pode
produzir aumento da labilidade da PA diante de diferentes atividades diárias interferindo na
função cardiovascular normal e podendo comprometer o funcionamento de diversos órgãos
em situações especiais.
Um aumento na sensibilidade do barorreflexo após o treinamento físico foi
observado em hipertensos (KRIEGER e cols., 1999). Em ratos espontaneamente
hipertensos (SHR), no período posterior ao exercício, foi observado aumento da bradicardia
barorreflexa enquanto que as respostas taquicárdicas permaneceram inalteradas
(KRIEGER e cols., 1999). Foi observado também, um aumento na integridade vascular em
seres humanos após o exercício (KRIEGER e cols., 1999), sugerindo que o “shear stress”
aumentado durante o exercício físico também aumenta a liberação dos fatores endoteliais
(KRIEGER e cols., 1999). Todos estes mecanismos podem aumentar a sensibilidade das
aferências arteriais dos barorreceptores, aumentando, assim a sensibildade do
barorreflexo. MEDEIROS e cols., 2004, em um estudo com ratos Wistar treinados através
de natação, por 8 semanas, com uma carga de 5% do peso corporal, mostraram que o
aumento nas respostas bradicárdicas nestes animais estavam associadas a um efeito
cardíaco vagal aumentado, sem alterações no efeito simpático.
Além das rápidas respostas neurais (segundos), os pressorreceptores controlam
também a liberação de hormônios que participam na manutenção dos valores basais da
PA. Esses sistemas hormonais prolongam por minutos ou até mesmo horas as respostas
cardiovasculares comandadas pelos pressorreceptores. Entre estes sistemas o mais
amplamente estudado é o sistema renina angiotensina (SRA). Na regulação da PA pelo
SRA, diversos mecanismos controlam a liberação de renina pelo rim, sendo três deles
considerados mais importantes.
O primeiro é o mecanismo barorreceptor renal que é desencadeado quando ocorre
modificação na pressão da artéria renal. Uma redução na pressão de perfusão renal
aumenta a liberação de renina, enquanto um aumento na pressão de perfusão renal diminui
a liberação de renina. Acredita-se que o gradiente de pressão transmural é o mais
importante determinante da liberação de renina por este mecanismo. O segundo
mecanismo é desencadeado pelo SNS renal que estimula a liberação de renina quando
ocorre diminuição da PA renal e sistêmica. Os nervos renais parecem controlar a liberação
de renina por ação direta sobre as células justaglomerulares, mediada pelos receptores
beta-adrenérgicos. O terceiro mecanismo de controle da liberação da renina é o humoral
em que várias substâncias estão envolvidas incluindo vasopressina, prostaglandinas, Ang
II, dentre outras (DZAU, 1986).
24
Um aumento da Ang II plasmática pode levar à diminuição da liberação de renina
através da estimulação da liberação de aldosterona e vasopressina e do aumento da PA
sistêmica, mecanismo chamado de retroalimentação negativa. A liberação de renina é
dependente da concentração de sódio no plasma. Uma redução na concentração
intracelular de sódio, ao nível da mácula densa, estimula a liberação de renina na
circulação sistêmica. Várias técnicas têm sido utilizadas na tentativa de analisar o papel
individual e a interação dos mecanismos envolvidos na liberação de renina (DZAU, 1986).
Dessa forma, tem sido proposto que o rim contém um SRA intrarenal que regula a
hemodinâmica intrarenal, o balanço tubuloglomerular e a homeostasia de sal (DZAU, 1988).
Vários modelos de hipertensão renal têm sido utilizados para elucidar a importância
do SRA, na patogenia da hipertensão arterial. A hipertensão renal é produzida
experimentalmente através da estenose da artéria renal, perinefrite, compressão renal ou
coarctação da aorta nos animais com um ou dois rins. Nesses modelos de hipertensão, o
aumento da PA é associado, ao menos inicialmente, com o aumento nos níveis plasmáticos
de renina e Ang II (BRODY e cols., 1991).
O modelo de hipertensão renal descrito inicialmente por GOLDBLATT e
colaboradores, 1934, pode ser produzido pela constrição de uma artéria renal enquanto o
rim contra lateral é mantido intacto (hipertensão renal 2 rins e 1 clipe de Goldblatt – 2R1C).
Com a constrição da artéria renal começa a ocorrer uma diminuição do fluxo sanguíneo
para este órgão, deste modo, o rim em constrição retém água e sal. O SRA é o responsável
pela fase inicial nesse tipo de hipertensão (UNGER e cols., 1998; BRODY e cols., 1991). A
renina é fator dominante na manutenção da hipertensão 2R1C denominada renina-
dependente. Neste modelo de hipertensão o aumento dos níveis de renina produzida pelo
rim isquêmico também determina, no rim direito (não-clipado), retenção de água e sal
(NAVAR e cols., 1998).
No rato com hipertensão de Goldblatt 2R1C, a atividade de renina plasmática um
mês após a constrição da artéria renal está aumentada, embora a renina plasmática, nesse
modelo de hipertensão, tenha uma ampla faixa de distribuição, podendo ser normal em
alguns ratos. Na hipertensão de Goldblatt 2R1C, a concentração de renina no rim, cuja
artéria está parcialmente ocluída, é 3 a 4 vezes maior que o normal dentro de uma semana,
enquanto no rim contralateral (não ocluído) os níveis de renina são quase indetectáveis. A
redução da pressão de perfusão e do fluxo sanguíneo renal imposto pela constrição da
artéria renal é, certamente, o estímulo para o aumento da produção de renina no rim
isquêmico. O desenvolvimento da hipertensão, com conseqüente aumento da pressão de
perfusão e do fluxo sanguíneo renal, bem como o aumento de renina circulante, explica a
depleção de renina do rim normal (NAVAR e cols, 1998). A remoção do rim normal na
hipertensão de Goldblatt 2R1C leva a uma redução dos níveis de renina do rim
25
parcialmente ocluído. Embora a razão para esse fato não seja totalmente compreendida,
talvez a remoção do rim normal reduza a excreção de sódio e a eliminação de água na
urina, levando a um aumento no volume do fluido extracelular, o que poderia influenciar os
níveis de renina do rim isquêmico (NAVAR e cols, 1998).
A reversão da hipertensão de Goldblatt 2R1C pode ser obtida pela remoção da
constrição arterial ou pela retirada do rim com clipe. Quando o clipe ou o rim é removido em
ratos com hipertensão crônica (mais de 2 meses de duração), geralmente a PA não se
reduz, pelo menos não até os níveis de normalidade. Entretanto, a remoção do rim
contralateral no animal hipertenso crônico 2R1C normaliza a PA, indicando que o rim
contralateral deva ser responsável pela manutenção da hipertensão (FAZAN e cols., 2001).
A idéia de que a hipertensão de Goldblatt 2R1C em ratos evolui de uma maneira
tríplice foi sugerida inicialmente por BROWN e colaboradores em 1979. A fase I é
caracterizada por aumento na PA, na atividade da renina plasmática e nos níveis
circulantes de Ang II imediatamente após a constrição da artéria renal. A retirada do clipe
renal ou a administração de um inibidor da ECA durante esta fase resulta em queda
imediata da concentração de Ang II plasmática e da PA. Em 2 a 4 semanas, a atividade da
renina plasmática e os níveis de Ang II tendem a cair para níveis semelhantes ao normal,
ao passo que a PA permanece elevada e continua a aumentar (MORTON e cols., 1983).
Este cenário é característico da fase II. Apesar dos níveis plasmáticos normais de renina e
Ang II, a hipertensão nesta fase ainda é angiotensina dependente, já que a PA pode ser
completamente normalizada pelos inibidores da ECA (WALLACE e cols., 1984). Se a fase II
não for tratada por vários meses existe uma progressão gradual para a fase III, na qual a
inibição do eixo renina angiotensina não é mais capaz de reverter completamente a PA.
A dissociação aparente entre a Ang II circulante e a PA na fase II em face da
contínua dependência de angiotensina representa um interessante paradoxo, uma vez que
os inibidores da ECA são efetivos no tratamento da hipertensão. Diversas teorias têm
tentado responder esta questão. Uma idéia é que os efeitos antihipertensivos dos inibidores
da ECA devem-se a ações farmacológicas dessas drogas que não estão relacionados com
a inibição da formação de Ang II. Durante a inibição da ECA os níveis tissulares de
bradicinina aumentam, causando vasodilatação e subseqüente queda da PA. Esta idéia
tem sido testada repetidas vezes porém com resultados inconsistentes (BAO e cols., 1992).
Tem sido também sugerido que os inibidores da ECA reduzem a PA por aumentar a
produção de prostanóides (prostaglandinas) vasodilatadores (SCHRÖR, 1992), através do
aumento da ação do NO (GOLDSCHMIDT e cols., 1991) e por bloquear o influxo de cálcio
na células da musculatura lisa vascular (ZHU e cols., 1993).
Outra possibilidade é que a fase II da hipertensão 2R1C seja a manifestação do
aumento das ações pressoras da Ang II circulantes. Está bem documentado que a Ang II
26
plasmática pode aumentar a PA através de 2 mecanismos distintos. Doses maiores desses
peptídeos (>29 pmol/ kg/ min) aumentam a PA agudamente em segundos a minutos. Esse
é o efeito pressor direto, ou rápido, da Ang II. Esse efeito é causado principalmente pelas
ações vasocontritoras desse peptídeo. O outro mecanismo pelo qual a Ang II aumenta a PA
é o efeito pressor lento, que foi cacacterizado por DICKINSON e LAWRENCE em 1963,
esse fenômeno pelo qual a infusão de baixas doses de Ang II que não causam efeitos
pressores agudos, quando mantida ao longo de horas ou dias, produz hipertensão
sustentada. O efeito pressor lento foi extensivamente mostrado por BROWN e
colaboradores, 1979, no qual ficou evidente que níveis de Ang II plasmática quase
indetectáveis podem induzir a hipertensão crônica em ratos normais. É possível que na
hipertensão 2R1C, um ou ambos desses efeitos pressores podem estar aumentados e
portanto mantendo a PA elevada. Apesar da ocorrência de alterações na estrutura vascular
dos ratos 2R1C causando aumento na reatividade dos vasos de resistência in vitro, estudos
anteriores (BROWN e cols., 1979) têm demonstrado que o efeito pressor rápido da Ang II
não está aumentado na hipertensão 2R1C. Todavia, a contribuição do efeito pressor lento
nesse modelo hipertensivo ainda não foi adequadamente estudado. Outros investigadores
(WALLACE e cols., 1984; SKULAN e cols., 1974; TEN BERG e cols., 1980) sugerem um
aumento na sensibilidade do mecanismo pressor lento da Ang II em hipertensão 2R1C.
Adicionalmente, MELARAGNO e cols., 1995 mostraram que a estenose da artéria renal
promoveu aumento da responsividade do efeito pressor lento da Ang II em ratos. Estes
resultados sugerem que esta responsividade aumentada explique a aparente dissociação
entre a concentração plasmática de Ang II e PA observadas na fase II da hipertensão 2R1C
em ratos, quando níveis plasmáticos normais desse peptídeo são capazes de manter a
hipertensão. Estudos adicionais são necessários para confirmar estes dados.
Em sua definição clássica, o SRA atua sobre a PA por meio da angiotensina II (Ang
II), gerada na circulação em uma cascata enzimática iniciada pela renina, que é secretada
pelas células justaglomerulares do rim constituído por células mioepiteliais diferenciadas
localizadas na mácula densa, região distal da arteríola aferente, próxima à porção inicial do
túbulo distal (DZAU, 1986). A renina cliva o angiotensinogênio produzido no fígado,
gerando o decapeptídeo inativo Ang I, que dá origem à Ang II pela ação da enzima
conversora de angiotensina (ECA) (IRIGOYEN e cols, 2001, NICKENIG e HARRISON,
2002a,b). Atualmente, considera-se que os efeitos biológicos do SRA são decorrentes não
só da principal angiotensina desse sistema, a Ang II, como também de outros fragmentos
ativos de angiotensina I e Ang II, que possuem propriedades biológicas mais seletivas
(KHOSLA e cols, 1974; DZAU, 1988; SANTOS e cols, 1988; FERRARIO e cols, 1990a,b;
SANTOS e CAMPAGNOLE-SANTOS, 1994).
27
Em uma visão mais atual, considera-se que as ações do SRA dependem em grande
parte dos produtos ativos carboxi-terminal da Ang II, angiotensina III (Ang III), angiotensina
IV (Ang IV) e amino-terminal, angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] (SANTOS e cols, 1988;
FERRARIO e cols, 1990a,b; SANTOS e CAMPAGNOLE-SANTOS, 1994). As angiotensinas
destacam-se por terem um importante papel no controle da PAM e na homeostasia dos
fluidos e eletrólitos. A Ang II, como já dito, é considerada a principal angiotensina desse
sistema por interagir com múltiplos tecidos, incluindo o córtex adrenal, o miocárdio, o
músculo liso vascular, o rim e o cérebro, e suas ações mais importantes estão relacionadas
com a modulação da frequência e contratilidade cardíaca, tônus vascular, liberação de
aldosterona, filtração e reabsorção de sódio glomerular e secreção de vasopressina, dentre
outras. Essas funções podem estar alteradas nas doenças vasculares como na hipertensão
e aterosclerose. Além disso, a Ang II promove o crescimento e a hipertrofia do músculo
cardíaco e músculo liso vascular.
THOMAS e QIAM, 2003, observaram que a Ang II, que tem seus níveis aumentados
na hipertensão, é capaz de estimular o crescimento de células da musculatura lisa vascular,
cardiomiócitos e células renais e contribuir para a hipertrofia patológica observada nos
vasos sanguíneos, coração e rins em associação com doenças cardiovasculares.
Já está estabelecido na literatura que a hipertensão por si só e também os níveis
elevados de Ang II circulante, característico da hipertensão 2R1C, são capazes de provocar
diversas alterações patológicas, dentre as quais destacamos a degeneração, a inflamação,
a esclerose glomerular e a fibrose.
A degeneração é um processo patológico regressivo da célula, no qual o citoplasma
apresenta-se mais acentuadamente lesado do que o núcleo. Em conseqüência da lesão, há
redução ou perda da função celular. As degenerações também são designadas distrofias.
As lesões degenerativas às vezes são produzidas por fatores pouco agressivos e, por isso,
denominadas subletais, sendo de gravidade reduzida e, consequentemente, reversíveis
(AGUAS e NICKERSON, 1991).
A lesão mais complexa que envolve todos os componentes do tecido é a inflamação,
que se caracteriza por modificações locais da microcirculação e pela saída de células do
leito vascular, acompanhadas por lesões celulares e do interstício provocadas
principalmente por ação das células fagocitárias e das lesões vasculares que acompanham
o processo. É uma reação secundária que acompanha a maioria das lesões iniciais
produzidas por diferentes agentes lesivos (HILGERS e cols., 2001).
A esclerose caracteriza-se por um aumento de tecido fibroso em vários órgãos e
tecidos, adquirindo especial relevância as alterações vasculares. Os rins são acometidos
em cerca de 40% dos casos. Na esclerose glomerular, os túbulos renais encontram-se
hipotróficos ou em necrose. No interstício, existem edema, infiltrado inflamatório
28
mononuclear focal e, posteriormente, fibrose. A etiopatogênese das lesões renais é pouco
conhecida, sendo sugerido como causas a agressão ao endotélio, aumento da
permeabilidade vascular e coagulação intravascular, não estando bem definido qual seria o
primeiro evento a ocorrer. A participação de imunocomplexos é admitida pela presença de
imunoglobulinas e complemento nas paredes vasculares (HILGERS e cols., 2001).
As fibroses são condições caracterizadas por aumento do estroma conjuntivo de um
órgão decorrente de cicatrização normal ou exagerada ou de um processo reacional em
que a produção de matriz extracelular não está relacionada com processo reparativo. Em
conseqüência das modificações na arquitetura do órgão e das alterações na função das
células parenquimatosas pela fibrose, podem surgir transtornos funcionais importantes nos
locais acometidos. Nas hipertrofias decorrentes da hipertensão arterial, a fribrose reacional
é intensa e desproporcional à hipertrofia. O aumento da quantidade de fibras colágenas no
estroma é maior do que a hipertrofia celular, de modo que a relação entre a massa de
estroma e massa dos cardiomiócitos aumenta (HILGERS e cols., 2001).
A Ang II exerce funções em órgãos-alvo distantes do local de sua produção. Esse
conceito clássico do SRA como um sistema exclusivamente circulante foi alterado.
Utilizando-se técnicas de biologia molecular, foi detectado e quantificado RNAm para renina
e angiotensinogênio em vários tecidos além do rim e do fígado, que são os locais clássicos
da expressão gênica dessas substâncias (IRIGOYEN e cols., 2001). O SRA sistêmico pode
afetar a produção de Ang II local por afetar a liberação de renina, ECA e angiotensinogênio
do plasma circulante para os tecidos (JOHNSTON, 1990), pois estes componentes podem,
sofrer endocitose e serem usados para síntese local da Ang II. Em muitos tecidos é difícil
determinar a relativa contribuição do SRA local e sistêmico para produção de Ang II.
Entretanto, o SRA cerebral tem sido considerado como tendo sua regulação independente
do SRA sistêmico (PHILLIPS, 1987, UNGER e cols., 1988).
A existência de SRA tecidual tem sido evidenciada pela determinação de atividade
de renina e de seus substratos, e pela presença da ECA, angiotensinas e receptores de
angiotensinas em múltiplos tecidos, principalmente naqueles que estão envolvidos com a
homeostasia cardiorrenal e da PA, ou seja, rim, adrenal, cérebro, coração e vasos
sanguíneos. Além disso, como já mencionado, as técnicas de biologia molecular têm
claramente demonstrado que tanto a renina quanto o angiotensinogênio estão presentes
em múltiplos órgãos (CAMPBELL, 1987; DZAU, 1988; ALLEN e cols., 1998).
O SRA periférico e central parecem estar envolvidos no desenvolvimento e
manutenção de várias formas de hipertensão tais como: hipertensão essencial, hipertensão
renal, hipertensão neurogênica e hipertensão por mineralocorticóides e sal (FERRARIO e
cols., 1990a, b; BRODY e cols., 1991).
29
Na hipertensão renovascular o SRA tecidual está ativado e os produtos desta
ativação agem de forma parácrina, sendo muitas vezes não detectáveis no plasma
(KAGIYAMA e cols., 2001; SADJADI e cols., 2005). KAGIYAMA e colaboradores, 2001
mostraram que na hipertensão 2R1C até 6 a 10 meses após a implantação do clipe, a PA
mantinha-se elevada e que apesar dos níveis de Ang II no plasma estarem reduzidos a
hipertensão era sustentada pelo SRA central. Esses mesmos autores relataram, em ratos
transgênicos, que havia uma inibição permanente da síntese cérebro-específica de
angiotensinogênio (AGT) e que ocorria uma redução da hipertensão induzida pela
administração de baixas doses de Ang II. Além disso, relataram também um significativo
aumento nos níveis de Ang II no hipotálamo, no núcleo paraventricular (PVN) e na área
postrema em ratos com hipertensão renovascuular. KOPP e colaboradores, 1989,
mostraram que há evidências para sugerir que os mecanismos neurogênicos centrais e
periféricos interagem no desenvolvimento e na manutenção da hipertensão 2R1C. A
hipertensão 2R1C pode ser mediada por mecanismos neurogênicos centrais e
angiotensina-dependentes que são influenciados pelo nervo renal aferente (MURATANI e
cols., 1993).
Os neurônios da VLM são modulados por peptídeos do SRA. Estudos prévios
(BLESSING e cols., 1982; DAMPNEY, 1994; AVERILL e cols., 2000; BECKER e cols.,
2005; ALZAMORA e cols., 2002 e 2006) mostraram que há uma interação importante entre
os neurônios de VLM e a Ang II. A Ang II microinjetada na RVLM e na CVLM age como um
agente excitatório, tanto em animais anestesiados (AVERILL e cols., 2000; MURATANI e
cols, 1993; SESOKO e cols., 1995; ALZAMORA e cols., 2002 e 2006) quanto em animais
acordados (FONTES e cols.1997, BECKER e cols., 2005).
Sesoko e colaboradores, 1995, mostraram que a Ang II endógena na CVLM modula
o barorreflexo em ratos anestesiados normotensos Sprague-Dawley (SD). Neste estudo foi
observado a atividade simpática do nervo renal (RSNA) em resposta às alterações
transitórias da PA induzidas por infusões (i.v.) de fenilefrina (aumentos) e nitroglicerina
(diminuições), antes e depois de microinjeções bilaterais de Sar
1
,Thr
8
-Ang II, (antagonista
não seletivo de receptor de angiotensina) na CVLM. O antagonista de angiotensina
aumentou a PAM e RSNA e também aumentou a sensibilidade do barorreflexo durante
infusões de nitroglicerina. Ao contrário, a sensibilidade do barorreflexo examinada após
infusão com fenilefrina não foi alterada após pré-tratamento com o antagonista de
angiotensina. Dessa forma, estes resultados sugerem que a Ang II endógena da região
CVLM exerce um papel modulatório no controle barorrreflexo da RSNA.
ALZAMORA e colaboradores, 2002, mostraram que o efeito hipotensor produzido
por microinjeções de Ang II na CVLM depende principalmente de mudanças no tônus
vascular adrenérgico, enquanto o efeito hipotensor de Ang-(1-7) pode envolver um diferente
30
mecanismo através de uma via nitroxidérgica. Recentemente mostramos (ALZAMORA e
cols, 2006) que a microinjeção desses peptídeos na CVLM produziu hipotensão, que
também não foi acompanhada por alterações significativas de FC e do DC, e induziu
alterações distintas sobre a modulação do controle reflexo da FC. Enquanto a Ang-(1-7) na
CVLM atenuou a bradicardia e facilitou a taquicardia barorreflexa a microinjeção de Ang II
na CVLM produziu efeitos contrários, ou seja, atenuou a taquicardia e melhorou a
bradicardia reflexas.
Vários trabalhos (FERRARIO e cols, 1970; GUO e ABBOUD, 1984 e MATSUMURA
e cols, 1989) mostraram que a Ang II diminui a sensibilidade do controle pressorreceptor.
Adicionalmente, estudos com ratos SHR jovens, mostraram que agentes anti-hipertensivos
podem atenuar o desenvolvimanto da hipertensão arterial por promover uma restauração
da sensibilidade do reflexo pressorreceptor (KUMAGAI e cols., 1990 e 1996).
A Ang II vem sendo estudada como um dos fatores determinantes não só no
desenvolvimento como na manutenção de diferentes tipos de hipertensão. Além de sua
ação direta sobre o músculo liso vascular (funcional e estrutural) e sobre a regulação do
volume sanguíneo por meio da aldosterona, suas ações central e periférica no controle da
atividade simpática contribuem decisivamente para o processo hipertensivo (IRIGOYEN e
cols., 2001). Uma série de estudos sugere a participação da Ang II cerebral no aumento da
atividade eferente vasoconstrictora observada em animais hipertensos (FALCON e cols,
1978; PHILLIPS e KIMURA, 1986; UNGER e cols., 1988; GYURKO e cols., 1993; WIELBO
e cols., 1995). A Ang II age através de seus receptores do tipo I e tipo II, sendo
respectivamente denominados receptores AT
1
e AT
2
. Os receptores AT
1
são sensíveis ao
derivado imidazólico losartan (DUP 753) e os receptores AT
2
, insensíveis ao losartan,
porém sensíveis a CGP42112A, PD123177 e PD123319 (WITEBREAD e cols, 1989,
SPETH e KIM, 1990, BUMPUS e cols, 1991). Particularmente na RVLM, onde os neurônios
apresentam excitabilidade aumentada nos SHR (CHAN e cols, 1991), ocorre um aumento
da expressão de receptores AT
1
(GUTKIND e cols., 1988).
Embora a Ang II ligue-se aos subtipos de receptor tipo AT
1
e tipo AT
2
, é o receptor
AT
1
que media a maioria dos seus efeitos cardiovasculares que podem levar à hipertensão,
incluindo o estresse oxidativo, a liberação de norepinefrina, a vasoconstrição, a secreção
de aldosterona, a reabsorção de sódio renal, a estimulação simpática, a liberação de
vasopressina, a hipertrofia celular vascular e cardíaca e a proliferação celular (NICKENIG e
HARRISON, 2002).
O receptor AT
1
é expresso em células musculares lisas, miocárdio, pulmões,
cérebro, rins, fígado e glândulas adrenais. Embora o receptor AT
2
seja amplamente
expresso no período embrionário, sua expressão em adultos é baixa e ocorre em certos
tecidos como no cérebro, medula das adrenais, rins, útero e ovários. Evidências indicam
31
que o receptor AT
2
participa de múltiplas funções fisiológicas, incluindo natriurese (LO e
cols., 1995), efeitos sobre a PA (TONY e PORTER, 1993 e HU e cols., 2002),
autorregulação do fluxo sanguíneo cerebral (STROMBERG e cols., 1993) e apoptose.
Estudos mostraram elevação da PAM em camundongos deficientes de receptores AT
2
,
sugerindo um papel direto ou indireto dos receptores AT
2
no controle cardiovascular e/ ou
na homeostasia dos fluidos corporais (JOHREN e cols., 2004).
Existem duas espécies de receptores AT
1
, os AT
1A
e AT
1B
. Os receptores de AT
1A
têm um papel essencial no controle da PA, sendo, portanto, essenciais para o
desenvolvimento da hipertensão 2R1C (CERVENKA e cols., 2002). Existem evidências de
que ocorre um aumento na atividade da óxido nítrico sintase (NOS) em modelos de
hipertensão dependentes de Ang II. O óxido nítrico (NO) promove um efeito vasodilatador
importante que neutraliza as respostas pressoras da Ang II, sendo que a hipótese mais
aceita é a de que exista um caráter compensatório no aumento na atividade da NOS que
neutraliza parcialmente a influência vasoconstritora da Ang II na hipertensão renovascular
de Goldblatt (dois rins e 1 clip, 2R1C). O aumento na atividade da NOS também poderia ser
atribuído aos altos níveis de PA que causa um “shear stress” endotelial aumentado, que é
um estímulo para a liberação de NO. Outra possibilidade seria um estímulo ao aumento na
produção de NO causado pela própria Ang II. Contudo, as vias que promovem a liberação
de NO pela Ang II agindo em seus receptores angiotensinérgicos específicos, AT
1A
e AT
2
,
ainda são foco de diversos estudos.
Estudos anteriores (BLUNE e cols., 2001; CERVENKA e cols., 2002) sugerem que,
no modelo de hipertensão renal 2R1C, o aumento na produção de NO é dependente da
ativação do receptor AT
2
. Esses trabalhos rmostraram que a administração de agonista do
receptor AT
2
potencializou as ações antihipertensivas provocadas pelo bloqueio do receptor
AT
1
em SHR e diminuiu a PA em ratos normotensos. Além disso, o bloqueio do receptor
AT
2
alterou o curso da hipertensão renal e os ratos “knockout” para o receptor AT
2
apresentaram a PA basal ligeiramente mais elevada e uma maior sensibilidade à Ang II, na
medida em que apresentavam respostas pressoras mais elevadas. Por outro lado, há
também estudos que demonstraram que os receptores AT
2
não têm um papel importante
como mediadores de ações vasodilatoras. Foi relatado que o bloqueio crônico dos
receptores AT
2
não foi capaz de mudar o curso da hipertensão em ratos infundidos com
Ang II (CERVENKA e cols., 2002). Porém, em animais “knockout” para o receptor AT
1A
a
infusão de PD123319, pelo contrário, causou um significante aumento na PA dos animais,
mostrando que em situações específicas o receptor AT
2
pode participar da regulação aguda
da PA (CERVENKA e cols., 2002).
32
Como já mencionado anteriormente, a manutenção da PA é essencial para
assegurar uma boa perfusão e o bom funcionamento dos órgãos e tecidos. Entre os vários
mecanismos de controle que atuam no sistema cardiovascular a fim de manter constante a
PA há os que atuam em longo prazo e os que atuam em curto prazo, envolvendo vários
sistemas fisiológicos: cardiovascular, renal, neural e endócrino (SHEPHERD, 1982;
DAMPNEY, 1994). Sem correção, a hipertensão pode resultar em insuficiência cardíaca,
infarto do miocárdio ou apoplexia (acidente vascular cerebral).
As doenças cardiovasculares como, a hipertensão arterial, têm sido a causa de
milhares de óbitos de pessoas no mundo todo e por esta razão vários estudos têm sido
desenvolvidos para tentar compreender melhor esta patologia.
Uma em cada três a quatro pessoas terá uma PA anormalmente alta em algum
momento no transcorrer de suas vidas, essa doença é prevalente entre os americanos
negros. Estima-se que um bilhão de pessoas sejam hipertensas em todo mundo. Nos EUA,
esta doença acomete cerca de 50 milhões de indivíduos, isto é, 30% da população (The
JNCV Report, 1993). Estudos no Brasil mostram taxas de 16,1% a 35,1% de prevalência
dependendo dos grupos étnicos e sociais estudados e dos parâmetros propostos para os
limites definidos de hipertensão (FREITAS e cols., 2001). A HAS (hipertensão arterial
sistêmica) possui alto custo social sendo responsável por 40% dos casos de aposentadoria
precoce e de absenteísmo do trabalho em nosso meio (SABRY e cols., 2001).
Atualmente, os valores de referência para a classificação da HAS foram alterados,
indivíduos que apresentam PAS de 120 a 139 mmHg e/ou PAD de 80 a 89 mmHg são
considerados como pré-hipertensos e já passam a requerer modificações de estilo de vida
para prevenir o surgimento das doenças cardiovasculares (DCV) (The JNC VII Report,
2003). Porém, este tipo de classificação, por apenas níveis tencionais, é insuficiente para
se definir a hipertensão e para se obter um diagnóstico confiável, sendo necessária uma
análise global do paciente.
Sem dúvida, a HAS é um importante fator de risco independente para DCV. As DCV
(s) são descritas como uma entidade clínica multifatorial e consideradas uma síndrome
caracterizada por níveis tensionais elevados associados a alterações metabólicas e
hormonais, já que a regulação da pressão sanguínea é um processo altamente complexo,
influenciado por diversos sistemas fisiológicos (NEUTEL e SMITH, 1999).
Uma redução de apenas 2 mmHg na PAS pode reduzir as mortes por apoplexia em
6% e a enfermidade cardíaca em 4%. A PAM deve ser checada a intervalos periódicos,
pois a hipertensão pode passar despercebida por vários anos. Entretanto, pode ser tratada
efetivamente com modificações no estilo de vida e por medicações que reduzem o volume
líquido extracelular ou a resistência periférica ao fluxo sanguíneo. Certas modificações
benéficas no estilo de vida, tais como uma dieta prudente, o controle de peso e o exercício
33
moderado realizado regularmente, são mais desejáveis que a abordagem farmacológica
para o tratamento da hipertensão leve. Isso por causa dos possíveis efeitos colaterais
deletérios da terapia medicamentosa sobre outros fatores de risco para coronariopatia
(KAPLAN, 1990).
As pressões sistólica e diastólica podem ser reduzidas em aproximadamente 6 a 10
mmHg com o exercício aeróbico regular para muitos homens e mulheres até então
sedentários, independente da idade. Esses resultados foram observados com indivíduo
normotensos e hipertensos, tanto em repouso quanto durante a realização de um exercício
(BAGLIVO e cols., 1990; URATA e cols., 1987). A prática de exercícios físicos regulares
contribui, com o passar do tempo, no controle da tendência de aumento da PA nos
indivíduos com risco de hipertensão (PAFFENBARGER e cols., 1991). Esse papel de
prevenção é importante, pois até mesmo quando a PA elevada é normalizada, o risco em
relação a essa doença continua sendo mais alto do que poderia ser se a pessoa nunca se
houvesse se tornado hipertensa.
Os efeitos do treinamento físico sobre a PA são mais efetivos na maioria dos
pacientes com hipertensão moderada ou “limítrofe” (HAGBERG e cols., 1989). CLAUSEN e
colaboradores, 1969, mostraram em um estudo realizado com homens de meia-idade com
coronariopatia, que a pressão sistólica média em repouso caiu em 6 mmHg após 4 a 6
semanas de treinamento. Com níveis submáximos semelhantes de exercício, a PAS caiu
18 mmHg, enquanto a PAD foi reduzida também em 13 mmHg. Consequentemente, o
exercício reduziu a PA em aproximadamente 14% após o treinamento. Achados
semelhantes foram observados para um grupo de hipertensos aparentemente sadios,
porém limítrofes, de 37 homens de meia-idade após seis meses de exercício (CHOQUETT
e cols., 1973). Para um grupo de homens e mulheres de 60 a 70 anos de idade vítimas de
hipertensão, um programa de nove meses de exercício aeróbicos de baixa intensidade
conseguiu reduzir a PAS em 20 mmHg e a PAD em 12 mmHg (HAGBERG e cols., 1989).
Até mesmo quando o exercício se revela ineficaz no sentido de normalizar a PA, o
treinamento aeróbico confere benefícios de saúde independentes do efeito sobre a PA.
BLAIR e colaboradores, 1989, em estudos com indivíduos com hipertensão e
aerobicamente aptos, apresentaram taxa de mortalidade 60% mais baixa que indivíduos
normotensos inaptos aerobicamente. A maior mortalidade associada com a PA elevada era
superada completamente pelo nível de aptidão mais alto do indivíduo. Para as elevações
mais intensas e resistentes na PA, poderá ser necessária uma combinação de dieta, perda
de peso, maior quantidade de exercício e terapias farmacológicas.
O exercício físico (EF) que produz um aumento de tensão, especialmente durante a
fase concêntrica (de encurtamento) da contração muscular, comprime mecanicamente o
sistema arterial periférico. Isso acarreta uma redução persistente na perfusão muscular
34
(aumento drástico na RVP) que é diretamente proporcional ao percentual da capacidade de
força máxima exercida. Consequentemente, a atividade do SNS, o DC e a PAM aumentam
drasticamente na tentativa de restaurar o fluxo sanguíneo muscular (GAFFNEY e cols.,
1990). A magnitude da resposta está relacionada diretamente à intensidade do esforço e ao
tamanho da massa muscular envolvida (FRIEDMAN e cols., 1992).
É conhecido que os efeitos benéficos do EF dependem de mecanismos
hemodinâmicos, autonômicos ou reflexos que regulam o sistema cardiovascular. Também
já está estabelecido que o EF de baixa intensidade produz bradicardia de repouso e
diminuição da PAM em ratos e humanos hipertensos (ROMAN e cols., 1981; HAGBERG e
cols., 1990; TIPTON e cols., 1991; ARAKAWA, 1993; VÉRAS-SILVA e cols., 1997;
NEGRÃO e cols., 1999).
Os efeitos fisiológicos do EF podem ser classificados em agudos imediatos, agudos
tardios e crônicos. Os efeitos agudos imediatos são os que ocorrem nos períodos peri e
pós-imediato do EF, com elevação da FC, da PA, do volume sistólico, da ventilação
pulmonar, sudorese e diminuição da RPV. Já os efeitos tardios acontecem no longo das
primeiras 24 ou 48 horas após o EF. Podem ser identificados por uma discreta redução dos
níveis tensionais, especialmente nos hipertensos, e aumento da sensibilidade insulínica na
musculatura esquelética, além de expansão do volume plasmático e melhora da função
endotelial. Por fim, os efeitos crônicos, ou seja, as adaptações resultam da exposição
freqüente e regular ao EF. Têm-se como efeito crônico do EF a bradicardia relativa de
repouso, o aumento do volume sangüíneo, a hipertrofia muscular, a hipertrofia excêntrica
ventricular esquerda fisiológica e o aumento do consumo máximo de O
2
(O’SULLIVAN e
BELL, 2000).
Estudos deixam poucas dúvidas com relação ao efeito benéfico do exercício físico
crônico na hipertensão arterial. Porém, estes benefícios dependem do tipo de EF, da
intensidade e da duração do mesmo, em animais e em humanos. Em geral, exercícios
isométricos produzem maiores aumentos de FC e de PA quando comparados aos
exercícios dinâmicos (LAUGHIN, 1999).
Com relação à duração do EF, estudos realizados por OVERTON e colaboradores,
1988, em ratos SHR revelaram que treinamentos de 20 a 40 min foram capazes de
provocar queda pressórica. Já em humanos a queda pressórica foi melhor observada em
treinos de 25 minutos de duração do que em treinamentos com duração igual ou superior a
45 minutos. A relevância clínica destes estudos se baseia no fato de que os níveis
pressóricos permaneciam abaixo dos níveis pressóricos de um dia controle por 24 horas
(efeito agudo do exercício). Outra relevância clínica é a aplicabilidade deste método
também em humanos, uma vez que os resultados não são observados somente
experimentalmente.
35
Com relação à intensidade, exercícios de baixa intesidade (50% do consumo de O
2
de pico) provocaram diminuição significativa na PAS, PAD e média em SHR, entretanto os
Ativos com alta intensidade (85% de consumo de O
2
de pico) não tiveram o quadro de
hipertensão modificado. Geralmente, exercícios de baixa a moderada intensidade e com
longa duração produzem maiores efeitos sobre a PAM de repouso (KRIEGER e cols.,
1999).
Um outro ponto de dúvida entre os pesquisadores era se durante o exercício
ocorreria bradicardia reflexa, uma vez que era observado, na verdade, uma intensa
taquicardia o que poderia levantar a hipótese de desativação dos pressoreceptores arteriais
durante o EF. Porém, estudos com infusão endovenosa de fenilefrina provocaram
diminuição na FC, mostrando que mesmo durante o EF há funcionamento dos
pressorrecptores arteriais e que o treinamento melhorava a sensibilidade barorreflexa em
SHR (NEGRÃO e cols., 2001).
No entanto, existem controvérsias a respeito do EF sobre os componentes do
barorreflexo. SILVA e colaboradores, 1997, mostraram, em ratos submetidos á atividade
física que o EF produziu aumento da sensibilidade para os dois componentes do
barorreflexo, para a bradicardia e taquicardia, retornando-os para valores próximos dos
normais. Por outro lado, BRUM e colaboradores, 2000, observaram apenas um aumento da
taquicardia barorreflexa sem alterar a bradicardia após o EF em ratos normotensos.
NEGRÃO e colaboradores, 1993 sugerem que essas alterações diferenciadas na
sensibilidade barorreflexa possam ser explicadas por alterações no controle intrínseco da
freqüência cardíaca, como modificações no padrão de descarga do nodo sino-atrial.
Os mecanismos que podem estar envolvidos no ganho na sensibilidade barorreceptora
nos animais hipertensos após o EF são um aumento da complacência vascular aórtica
(KIRCHHEIM, 1976) ou ainda mudanças endoteliais produzidas pelo “shear estress”
durante o exercício, que poderiam aumentar a liberação de fatores endoteliais (CAMERON
e DART, 1994). Além disso, NEGRÃO e cols, 2001, demonstraram que em ratos SHR, o EF
melhora o controle barorreflexo, o que é decorrente de uma maior sensibilidade do nervo
depressor aórtico.
A redução da PAM em animais e humanos hipertensos após o EF, pode estar
relacionada a uma queda da RVP e/ ou a decréscimo do DC decorrente da bradicardia de
repouso após o EF. Observações prévias (JENNINGS e cols., 1986; NEGRÃO e cols.,
1992; KRIEGER e cols., 1999) demonstram que animais hipertensos submetidos a
condicionamento físico com atividade física leve apresentam uma redução da PA
acompanhada de queda do inotropismo com repercussão sobre o DC. Percebeu-se ainda
que o treinamento de alta intensidade não alterava o DC.
36
Durante o exercício físico aeróbico, o aporte de sangue para a musculatura aumenta
para garantir o fornecimento de oxigênio e nutrientes para a contração muscular (SALTIN e
cols., 1998). Para suprir essa necessidade o sistema cardiovascular sofre alterações
importantes e imediatas. Esses ajustes cardiovasculares são mediados pela ação imediata
do comando central, que diminui a atividade parassimpática para o coração (ROWELL e
cols., 1990) e pela contração muscular que ativa os mecanorreceptores e quimiorreceptores
musculares e articulares, aumentando a atividade nervosa simpática para o coração
(O’SULLIVAN e cols., 2000). Em conjunto, esses mecanismos levam ao aumento da PAS,
da FC e do volume sistólico aumentando consequentemente o DC (ROWELL e cols., 1990).
Simultaneamente a produção de metabólitos e fatores dilatadores na musculatura
provocam dilatação dos vasos esqueléticos (SALTIN e cols., 1998 e O`SULLIVAN e cols.,
2000) reduzindo sobremaneira, a resistência vascular na musculatura para garantir o aporte
de sangue adequado para o músculo ativo. No entanto, essa intensa vasodilatação é
compensada pela intensificação nervosa simpática em regiões inativas e mesmo pelo
aumento dessa atividade na região ativa, restringindo a vasodilatação excessiva e evitando
queda demasiada da PA diastólica (SALTIN e cols., 1998 e ROWELL e cols., 1990).
Porém, as alteraçãoes neurais, metabólicas e cardiovasculares mensionadas dependem da
intensidade do exercício aeróbio (SALTIN e cols., 1998 e ROWELL e cols., 1990).
Durante uma sessão de exercício há um aumento da concentração plasmática de
Ang ll, a qual contribui para o efeito pressor do exercício através de uma facilitação da
liberação de norepinefrina pelos neurônios pós-ganglionares simpáticos (WARREN e cols.,
2001). Em adição, BRAITH e colaboradores, 1999, observaram que após treinamento físico
as concentrações plasmáticas de Ang II, aldosterona, vasopressina e hormônio natriurético
atrial (ANP) diminuem durante o repouso em pacientes com insuficiência cardíaca. No
entanto no pico do exercício não foi observada diminuição dos níveis plasmáticos desses
neuro-hormônios. Estes dados indicam que o EF altera apenas a hiperatividade
neuroendócrina associada à insuficiência cardíaca, sem alterar as respostas hormonais
durante a fase intensa do exercício. Também em pacientes hipertensos o EF produz
diminuição da atividade nervosa muscular (WINDER e cols, 1982).
McARDLE e colaboradores, 1998, demonstraram que as adaptações
cardiovasculares produzidas pelo EF podem estar relacionadas à alteração da atividade
autonômica periférica, uma vez que ocorre uma diminuição do tônus simpático e um
aumento do tônus vagal após o treinamento. Além disso, esta redução do tônus simpático,
na verdade, normaliza este parâmetro em ratos hipertensos, permanecendo assim com
níveis de atividade simpática semelhantes ao dos animais normotensos. Sendo assim, o EF
no rato hipertenso se presta a normalizar o tônus simpático no coração e, em conseqüência
normalizar a FC de repouso, enquanto que no rato normotenso, em que ocorre a verdadeira
37
bradicardia de repouso, o EF altera o funcionamento do marcapasso cardíaco (NEGRÃO e
cols, 2001). Também foi demonstrado que a diminuição do tônus simpático sobre o coração
ocorre sem modificação do tônus vagal ou da FC intrínseca (NEGRÃO e cols.,1992). Com
isso nota-se que os estudos realizados em várias espécies mostram-se contraditórios em
relação ao aumento da atividade vagal após o EF. De qualquer forma, oberva-se, em
humanos e ratos hipertensos, que o EF produz diminuição dos níveis circulantes de
norepinefrina (DUCAM e cols., 1985; GRASSI e cols., 1994).
Diante das considerações de que em animais e humanos hipertensos os
mecanismos de controle da PAM apresentam-se alterados e que o exercício físico é
eficiente em reduzir os altos níveis de PA, sobretudo na hipertensão leve ou limítrofe, por
interferir na sensibilidade do barorreflexo e modular os efeitos pressores produzidos pelo
SRA. Considerando ainda que o modelo de hipertensão renovascular de Goldblatt é
caracterizado por apresentar níveis elevados de Ang II circulante que pode estar
relacionado a uma ação central de Ang II sobre o SNS. Atentando também pra o fato de
não existirem dados na literatura referentes ao efeito da atividade física sobre a reatividade
neuronal da CVLM na hipertensão renovascular 2R1C. Considendo sobretudo estudos de
Becker e cols, 2005, que mostraram que o EF é capaz de alterar a responsividade dos
neurônios da RVLM, hipotetizamos que as alterações na atividade simpática induzidas pelo
EF podem estar relacionadas também a uma alteração da responsividade dos neurônios da
CVLM à Ang II. Para testar esta hipótese, no presente estudo, nós avaliamos a participação
do SRA no controle da PA, na sensibilidade da bradicardia barorreflexa e na reatividade da
CVLM à Ang II e ao antagonista do receptor AT
2
em ratos com hipertensão renovascular
sedentários ou ativos, uma vez que dados não publicados de nosso laboratório revelaram
que não há alteração na reatividade da CVLM ao antagonista de receptor AT
1
.
38
OBJETIVOS
39
OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar o efeito da atividade física sobre os diferentes parâmetros cardiovasculares
em ratos com hipertensão renovascular (2R1C, modelo de Goldblatt, 30 dias).
2.2 Objetivos específicos
Avaliar o efeito da natação sobre a PA e FC, em ratos Fischer normotensos e com
hipertensão renal 2R1C sedentários e submetidos à atividade física.
Avaliar a sensibilidade da bradicardia reflexa em ratos Fischer normotensos e com
hipertensão renal 2R1C sedentários e ativos.
Avaliar as alterações no peso do coração e rins e perfil plasmático de uréia e
creatinina em ratos normotensos e com hipertensão 2R1C sedentários e ativos.
Avaliar o efeito da natação sobre o ganho de peso e a ingestão hídrica em ratos
normotensos e com hipertensão 2R1C sedentários e ativos.
Avaliar através de análises histológicas alterações na morfologia cardíaca e renal
em ratos normotensos e com hipertensão renal, sedentários e ativos.
Avaliar o efeito da administração intravenosa e de microinjeções de de Ang II e de
seu antagonista de receptor AT
2
, PD 123319 na CVLM em ratos Fischer
normotensos e com hipertensão renal 2R1C sedentários e ativos.
Avaliar o efeito do bloqueio de receptores AT
2
na CVLM pelo PA123319 após
microinjeções sucessivas de Ang II na CVLM.
40
MATERIAIS E MÉTODOS
41
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados neste estudo ratos Fischer machos, pesando entre 150 e 200g,
provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental da Escola de Nutrição da
Universidade Federal de Ouro Preto.
3.2. Cirurgia para o Desenvolvimento da Hipertensão Renovascular
Para produção da hipertensão arterial foi utilizado o método descrito por GOLDBLATT
e cols., 1934, denominado 2 rins 1 clip, (2R1C). Os ratos (150 – 200g) foram submetidos a
jejum de 24 horas, com livre acesso à água. No dia da cirurgia, sob anestesia produzida
pela solução de cetamina e xilazina (50 mg/ kg e 5 mg/ kg, ip, respectivamente) os animais
foram colocados em decúbito dorsal em uma prancha cirúrgica, e submetidos a tricotomia e
assepsia da região abdominal. Em seguida foi feita uma incisão mediana de 4 a 6 cm
abaixo do processo xifóide. Foram colocados retratores bilateralmente na incisão cirúrgica e
as alças intestinais foram deslocadas, em seguida a artéria renal esquerda foi isolada com
o auxílio de pinças e cotonetes. Um clip de prata 950 (que contém 5% de liga de cobre e
apresenta ótimo grau de dureza) apresentando 8 mm de comprimento e 2 mm de largura,
em forma de U, cuja abertura havia sido previamente fixada através do uso de um
calibrador, era colocado ao redor da artéria renal. O grau de constricção do clip escolhido
era de 0,20 mm de diâmetro interno, de acordo com BRITTO e cols., 1997, que mostraram
que este grau de constricção proporcionava maior índice de obtenção de PA > 130 mmHg
(nível de pressão escolhida para selecionar ao animais hipertensos). A Figura 1, abaixo,
ilustra o momento da implantação do clip.
Figura 1 – Figura ilustrativa da cirurgia para produção da hipertensão 2R1C.
Renina
Renina
Ang
Ang
II
II
Pressão
Intrarenal
Reabs. Na
+
Exc. Na
+
Rim sem estenose
Rim com estenose
Renina
Ang
Ang
II
II
ECA
Reabs. Na
+
Exc. Na
+
Renina
Renina
Ang
Ang
II
II
Aldosterona
Resistência Vascular
Periférica
Tônus Simpático
Pressão Arterial
Adaptado de Navar e cols., 1998.
42
Outro grupo de animais foi submetido à cirurgia fictícia (Sham), que consistia na
realização de todos os procedimentos acima, exceto a colocação do clip de prata em torno
da artéria renal. Estes animais, Sham, foram utilizados como controle (normotensos).
Em todos os animais o abdômen foi suturado com pontos contínuos, envolvendo a
camada muscular e a pele. Ao final dos procedimentos cirúrgicos, em todos os animais era
administrado antibiótico (0,01 ml/ 100 g do peso corporal) (pentabiótico veterinário/ FORT
DODGE).
3.3. Exercício Físico
Após 4 dias da cirurgia, os ratos 2R1C e Sham, com livre acesso à água e comida,
foram separados em dois grupos experimentais, sedentários e submetidos à atividade física
aeróbica de baixa intensidade (natação livre sem carga). A tividade era realizada 5 vezes
por semana durante quatro semanas. No primeiro dia a duração da sessão era de 20
minutos, no segundo dia 40 minutos, e a partir do terceiro dia os animais nadavam 60
minutos até completarem 20 sessões de exercícios. A Figura 2, abaixo, ilustra o protocolo
de atividade física utilizada.
Animais Utilizados
A B C D E F G H I J L M N
1 20
1 2 40 20
1 2 3 60 40 20
1 2 3 4 60 60 40 20
1 2 3 4 5 60 60 60 40 20
1 2 3 4 5 6 60 60 60 60 40 20
1 2 3 4 5 6 7 60 60 60 60 60 40 20
1 2 3 4 5 6 7 8 60 60 60 60 60 60 40 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 60 60 60 60 60 60 60 40 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 60 60 60 60 60 60 60 60 40 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 60 60 60 60 60 60 60 60 60 40 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 40 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 40 20
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 40
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
12 13 14 15 16 17 18 19 20 60 60 60 60 60 60 60 60 60
13 14 15 16 17 18 19 20 60 60 60 60 60 60 60 60
14 15 16 17 18 19 20 60 60 60 60 60 60 60
15 16 17 18 19 20 60 60 60 60 60 60
16 17 18 19 20 60 60 60 60 60
17 18 19 20 60 60 60 60
18 19 20 60 60 60
19 20 60 60
20 60
Dias de Treino Tempo de treino (min.)
Figura 2 – Figura ilustrativa do protocolo de atividade física utilizada: as letras
indicam os animais utilizados. Note que cada animal se exercitava inicialmente por
20 min., no segundo dia por 40 min. e do terceiro ao vigésimo dia por 60 min.
43
O exercício era realizado em tanques coletivos de 38 por 60 cm de largura e 50 cm
de profundidade, a temperatura da água era mantida em 30 ± 2°C, através do uso de um
termostato. Os exercícios foram realizados simultaneamente em dois tanques com
capacidade para cinco ratos cada um.
3.4. Avaliação Indireta da PA Através de Pletismografia de Cauda
A avaliação da PA por pletismografia de cauda iniciou-se a partir da primeira
semana após a cirurgia, tanto nos ratos sedentários quanto nos ratos ativos. Estas medidas
foram realizadas por quatro semanas.
O método utilizado para verificar a PA indireta dos animais foi proposto por WILLIAN
e cols. (1939) e modificado por MAGALDI (1944). O método utilizado consiste em um
sistema fechado contendo água, que sob pressão é ajustado a um manguito de borracha
que envolve toda a porção distal da cauda do animal. Outro manguito de borracha
conectado a uma coluna de mercúrio, envolve a porção proximal da cauda, e é responsável
pela oclusão da artéria caudal. A Figura 3 ilustra a foto de um pletismógrafo.
Figura 3 – Foto ilustrativa do sistema de pletismografia de cauda utilizado.
Os animais permaneciam, aproximadamente, por cerca de dois a três minutos em
uma caixa de madeira contendo uma lâmpada de 150 watts para promover uma dilatação
da artéria da cauda e facilitar a medida da PA. A seguir, os animais eram colocados em um
sistema de contensão para proceder a medida. Neste sistema de contenção somente a
cauda do animal era mantida exteriorizada, comprimia-se a cauda com o manguito de
Coluna de mercúrio
Coluna de água
Manguito de
b
orracha
que comprime a
cauda do animal
Sistema de seringas para
controle da pressão da
coluna de água
44
borracha e insuflava-se o manguito da coluna de mercúrio. Em seguida, a pressão na
coluna líquida era reduzida e o nível do líquido na coluna mantido a aproximadamente 10
cm de altura da cauda do animal. Posteriormente, a pressão no manômetro de mercúrio era
reduzida lentamente ao mesmo tempo em que se observava alteração no nível do líquido
na coluna do pletismógrafo, o que ocorria em função do aumento do volume de sangue na
cauda. Neste mesmo instante era realizada a leitura da pressão na coluna de mercúrio que
correspondia à PAM do animal.
3.5. Avaliação do Peso Corporal
O peso corporal dos animais foi verificado semanalmente, no mesmo dia em que era
mensurada a PA por pletismografia de cauda.
3.6. Avaliação da Ingestão Hídrica
A ingestão hídrica de 24 horas era verificada anotando-se o volume de água
presente no recipiente para fornecimento de água (bebedouro) colocada em cada gaiola
contendo os animais e, subtraindo deste volume, o restante, vinte e quatro horas depois.
Como geralmente ficavam de quatro a cinco animais em cada gaiola foi feita uma média de
ingestão hídrica entre os animais. A ingestão hídrica foi medida 2 vezes por semana.
3.7. Confecção de Cânulas Vasculares
Cânulas foram confeccionadas a partir de 4 cm (arterial) ou 2 cm (venosa) de tubos
de polietileno PE 10, polimerizados por aquecimento a 17 cm de tubos de polietileno PE 50.
O interior das cânulas era preenchido com uma solução salina (NaCl, 0,9%) e a
extremidade livre de PE 50 era fechada com um oclusor metálico.
3.8. Procedimentos Cirúrgicos
3.8.1. Anestesia:
Após 30 dias da cirurgia, os animais 2R1C e Sham (sedentários e ativos) eram
anestesiados com uretana (1,2 g/ kg, ip). Todos os procedimentos cirúrgicos e avaliações
cardiovasculares diretas foram realizados com os ratos anestesiados.
45
3.8.2. Traqueostomia:
Os animais foram colocados em uma mesa cirúrgica em decúbito dorsal e
submetidos a uma incisão mediana na região cervical anterior. A musculatura era
divisionada e a traquéia exposta. Em seguida uma cânula de polietileno (PE 90) era
introduzida na traquéia com a finalidade de manter as vias aéreas patentes.
3.8.3. Canulação e Isolamento de Artéria e Veia Femorais:
Para registro dos parâmetros cardiovasculares realizava-se uma pequena incisão na
pele, separando a musculatura para localização do feixe vásculo-nervoso femoral. As
cânulas foram introduzidas na aorta abdominal, via artéria femoral e na veia cava inferior
através da veia femoral, para administração de drogas. A seguir, as mesmas eram
amarradas junto ao feixe com fio cirúrgico.
3.8.4. Exposição do Bulbo para Realização de Microinjeções na CVLM:
Após a realização dos procedimentos cirúrgicos relacionados acima, os animais
eram colocados em decúbito ventral em um aparelho estereotáxico (David Kopf modelo DKI
900). A cabeça do animal era fixada com uma inclinação de aproximadamente 45° (-11
mm) com o auxílio das barras auriculares e peça bucal do aparelho. Era realizada uma
incisão mediana na região cervical posterior, separando-se a musculatura. A seguir,
procedia-se uma craniotomia occipital, seccionando-se a membrana atlanto-occipital e as
meninges (dura-máter e aracnóidea) para exposição da superfície dorsal do tronco
cerebral.
3.9. Registro Direto da PAM e FC
A avaliação dos diferentes parâmetros cardiovasculares (PAM, FC e sensibilidade
do barorreflexo) foi realizada através do registro direto da PA nos animais anestesiados
com uretana (1,2 g/ kg, iv) acoplados ao sistema computadorizado de aquisição de dados
(Powerlab).
A pressão arterial era monitorada por um transdutor de pressão modelo Gould conectado
a um amplificador (PM-1000, CWE). O sinal de pressão arterial pulsátil era derivado para
um cardiotacômetro (PM-1000,CWE) para se obter a FC. A pressão arterial pulsátil e FC
eram continuamente amostradas por um sistema de conversão analógico/ digital de 12 bits
(Powerlab 4/ 20) a uma freqüência de 800 Hz e armazenados em disco rígido (PC).
Posteriormente, o sinal era processado por um software (Powerlab 4/ 20) para se obter a
PAM, as características temporais e as alterações máximas dos parâmetros desejados.
46
Simultaneamente, a PAM e FC eram calculados a partir de pulsos de PA. Essas variáveis
eram apresentadas simultaneamente em canais diferentes do monitor e armazenadas em
disco rígido do computador.
3.10. Avaliação da Sensibilidade da Bradicardia Baroreflexa
A sensibilidade da bradicardia reflexa foi avaliada relacionando-se as alterações reflexas
de FC induzidas por alterações transitórias da PAM. Para produzir alterações da PAM, os
animais eram submetidos a injeções (em bolus) endovenosas (0,1 ml) de doses crescentes
de fenilefrina que variavam de 0,5 a 40,0 g, de maneira a se obter respectivamente
respostas pressoras de aproximadamente 10, 20, 30, 40 mmHg. Um intervalo mínimo de
um minuto era mantido entre as injeções, para permitir que a PAM e FC retornassem aos
valores basais.
O pico das mudanças na FC ocorriam durante os primeiros 5-10 segundos e
correspondiam à máxima alteração na PAM produzidas pela fenilefrina. A FC foi convertida
em intervalo de pulso (IP, ms) através da fórmula: 60.000/ FC (Figura 4). O melhor ajuste
da regressão linear foi extraído da média ± EPM para alterações de PAM e FC para cada
dose de fenilefrina para cada animal. A curva de regressão linear foi usada como um índice
de sensibilidade barorreflexa (ganho barorreflexo).
Figura 4 – Descrição das fórmulas utilizadas para a obtenção do Índice de
Sensibilidade do Barorreflexo.
Teste Barorreflexo
PAM
PAM
(mmHg)
(mmHg)
FC
FC
(beats/min)
(beats/min)
Fenilefrina
Fenilefrina
(1
(1
-
-
20
20
g/ kg)
g/ kg)
FC convertida em Intervalo de Pulso
(ms)
IP
=
-
FC
p
60 000
FC
b
60 000
(ms)
IP
=
-
FC
p
60 000
FC
p
60 000
FC
b
60 000
FC
b
60 000
Índice
da
Sensibilidade do
Barorreflexo
Í
ndice
(ms/ mmHg)
PAM
=
IP
47
3.11. Procedimentos de Microinjeções na Superfície Ventrolateral Caudal
As microinjeções eram feitas através de micropipeta de vidro, devidamente fixada ao
micromanipulador do estereotáxico. As microinjeções foram realizadas pela pressão de ar
exercida por uma seringa de plástico conectada a extremidade distal da micropipeta. Para
controlar os efeitos de volume e/ ou pressão exercida pela microinjeção de peptídeos, o
mesmo volume de veículo (NaCl 0,9%) era injetado no local da microinjeção.
Microinjeções unilaterais de Ang II (100 nL de uma solução 380 µM), PD123319 (100 nL de
uma solução 678 µM) e salina (100 nl) foram efetuadas na área caudal na CVLM, tendo o
óbex como ponto de referência ântero-posterior e lateral. Os parâmetros utilizados para se
localizar a CVLM foram 0,7 mm rostral e 1,8 mm lateral ao óbex; a profundidade foi
determinada no momento em que a micropipeta tocou a superfície ventral do bulbo, sob a
pia máter. A Figura 5 indica o local onde foram realizadas as microinjeções, sendo: A =
microinjeção de Ang II; B = microinjeção de PD123319 e C = microinjeção de salina.
Figura 5 – Demonstração do local de realização das microinjeções na CVLM.
3.12. Injeções Intravenosas de Drogas em Ratos Anestesiados
Realizados os procedimentos de microinjeções na CVLM procedia-se a
administração intravenosa de Ang II (0,05 ml de uma solução 240 µM) antes e após a
injeção do antagonista de receptor AT
2
, PD123319, (0,05 ml de uma solução 570 µM) a fim
de avaliar o efeito periférico das mesmas sobre o sistema cardiovascular. Como o volume
A
B
C
A
B
C
48
da injeção de Ang II e PD123319 era muito pequeno e fatalmente esses peptídeos iriam
atingir somente a cânula e não a corrente sanguínea do animal, imediatamente injetávamos
0,05 ml de salina (NaCl 0,9%) para garantirmos que esses peptídeos teriam acesso à
circulação.
3.13 Coleta de Órgãos e Amostras de Tecidos
Ao término dos experimentos os animais eram sacrificados por decaptação,
submetidos a uma laparotomia mediana para ressecção dos tecidos. Foram coletados rins,
coração, músculo sóleo, parte do músculo bíceps e cérebro. Durante o primeiro ano de
trabalho os órgãos eram retirados, pesados (peso úmido) e colocados na estufa para que
fosse avaliado o peso seco dos mesmos. Já no segundo ano de trabalho, os órgãos eram
retirados, colocados em formol a 10% e conservados em recipientes protegidos da luz.
Este material era utilizado para análise histológica. A Figura 6 mostra fotos do músculo
sóleo (Painel B) e do músculo bíceps (Painel D) respectivamente, no momento da retidada;
pata traseira (Painel A) e pata dianteira (Painel C).
Figura 6 – Fotos ilustrativas do momento da retirada dos músculos sóleo e bíceps.
(A) Pata Traseira
(B) Músculo Sóleo
(D) Músculo Bíceps
(C) Pata Dianteira
49
3.14. Coleta de Plasma
Em outro grupos de animais 2R1C e Sham, sedentários e ativos, após 4 semanas
das cirurgias (2R1C ou Sham) os animais foram decaptados, sem anestesia e amostras de
sangue foram coletadas em tubos de polietileno (eppendorf) contendo heparina sódica
(25.000 UI/ 5 mL - Roche) para dosagem de uréia e creatinina. Os eppendorfs eram
mantidos em gelo e o sangue era imediatamente centrifugado a 4°C/ 2.500 rpm/ 20 min e o
plasma rapidamente separado e estocado a -20°C até o processamento das amostras.
3.15. Dosagens de Creatinina
Com a intenção de avaliarmos a função renal e também as alterações bioquímicas
provocadas pelo exercício físico foram realizadas dosagens de creatinina.
A creatinina e outros componentes do soro reagem com a solução de picrato em
meio alcalino, formando um complexo de cor vermelha que é medido fotometricamente.
A adição de acidificante abaixa o pH para 5,0, promovendo a decomposição do
picrato de creatinina, permanecendo inalterada a cor derivada dos cromogêneos, que
também é medida fotometricamente. A diferença entre as duas leituras fornece o valor da
creatinina verdadeira (TONKS, 1972).
Para a dosagem utilizou-se 125 µl de plasma. Após homogeneização do plasma e
dos reagentes, fez-se a incubação destes em banho-maria a 37°C por 10 minutos. A leitura
foi realizada em espectofotômetro a 510 nm determinando-se a absorbância A
1
.
Adicionou-se 50µl de acidificante e após 5 minutos em temperatura ambiente, determinou-
se a absorbância A
2
em espectofotômetro a 510nm.
Para a obtenção da concentração, subtraiu-se da absorbância A
2
da A
1
utilizando-se
um padrão de creatinina de 4mg/dl. (TONKS, 1972).
3.16. Dosagens de Uréia
Na intenção de usar a uréia como marcador biológico de intensidade de treinamento
físico, foi realizada a dosagem de uréia plasmática de ratos hipertensos e normotensos,
sedentários e ativos. A uréia é hidrolisada pela urease a íons de amônia e CO
2
. Em meio
alcalino, os íons amônia reagem a salicitato e hipoclorito de sódio, sob a ação catalisadora
do nitroprussiato de sódio, para formar o azul de indofenol. A absorbância do complexo azul
formado, medida em 600nm, é diretamente proporcional à concentração de uréia na
amostra. (TONKS, 1972).
50
Foram retirados 10 µl de plasma que foram adicionados a 1000 µl de urease
tamponada e homogeneizados. Esta mistura era levada ao banho-maria a 37°C por 5
minutos. A leitura era realizada em espectofotômetro a 600 nm. Para se obter a
concentração da amostra, utilizou-se um padrão de 70mg/ dl (TONKS, 1972).
3.17. Drogas Utlilizadas
3.17.1.Anestésicos:
Quetamina - Syntec do Brasil Ltda
Xilazina - Divisão Vetbrands Saúde Animal
Uretana - Sigma Chemical Co, St, Louis, USA
3.17.2.Demais drogas:
Angiotensina II – Bachem (Torance, USA) ou Península Laboratórios (Belmont,
USA)
PD123319 – Bachem (Torance, USA) ou Península Laboratórios (Belmont, USA)
Phenilefrina Hidroxycloride - Sigma Chemical Co, St, Louis, USA
3.18 Preparo de Soluções
O agonista adrenérgico, L-Fenilefrina (sal cloridrato), foi preparado em soluções de
sete concentrações diferentes (0,5 g/ ml; 1,0 g/ ml; 2,5 g/ ml; 5,0 g/ ml; 10 g/ ml, 20
g/ ml e 50 g/ ml). Estas soluções foram aliquotadas em tubos de polietileno Eppendorf e
permaneceram congeladas até o momento do uso.
Os peptídeos, Ang II e PD 123319 eram dissolvidos em solução salina (NaCl 0,9%)
na concentração de 2 mg/ ml e 3,2 mg/ ml, respectivamente, e aliquotadas em 10 µl em
tubos eppendorf e mantidos a - 20°C (solução estoque). No dia do experimento a solução
final de uso era preparada a partir da solução estoque pela adição de 40 µl de salina estéril.
A dose dos pepitídeos e antagonistas utilizados nesse estudo foi escolhida com base em
estudos anteriores (SILVA e cols., 1993; FONTES e cols., 1994; SANTOS e cols., 1994;
ALZAMORA e cols., 2002 e 2006).
51
3.19. Verificação Histológica
Ao final de cada experimento, os animais eram sacrificados por decaptação e o
cérebro era removido e acondicionado em recipiente protegido da luz contendo solução de
formol a 10%.
Em seguida foram feitos cortes seriados de 50 m de espessura do bulbo utilizando-
se um criostato (Leica CM 1850). As fatias eram dispostas em lâminas de vidro previamente
gelatinadas. Após secagem (24 h) as lâminas eram coradas através da técnica de
coloração pelo vermelho neutro. A localização do sítio das microinjeções nos cortes
histológicos era realizada com auxílio de microscópio e tinha como referência os diagramas
do Atlas de PAXINOS e WATSON, 1986. Posteriormente, os cortes mais representativos de
cada grupo eram visualizados em uma lupa (Leica MZ6) e em seguida fotografados.
A colheita de outros tecidos (coração, rins, músculo sóleo e bíceps) para análise
histológica também era realizada ao final dos experimentos. Neste caso os tecidos também
eram acondicionados em recipiente protegido da luz contendo solução de formol a 10%.
Em seguida, o material era processado em processador histológico (OMA Metalúrgica)
através de banhos sucessivos com duração de 60 minutos de álcool (70%, 80% e 90%),
álcool absoluto, xilol e parafina, respectivamente. Posteriormente este material era fixado
em blocos de parafina, cortados na espessura de 4 m, dispostos em lâminas e corados
com hematoxilina e eosina. Todo o processo de coloração e montagem de lâminas era
realizado em capela (GP Científica).
Para a realização da análise histológica foram observadas algumas alterações
patológicas características de animais hipertensos previamente descritas na literatura
(WANG e cols., 2001 e EVANGELISTA e cols., 2003), são elas:
Rins: Congestão, Degeneração tubular focal, Esclerose glomerular, Fibrose,
Dilatação tubular, Inflamação e Deposição protéica.
Coração: Espessamento da parede do ventrículo, Espessamento da parede
do vaso, Degeneração, Fibrose, Inflamação ventricular focal.
A análise histológica foi realizada de forma qualitativa e subjetivamente.
Estabelecemos como padrão de normalidade a ausência de qualquer alteração, para
alterações discretas foi estabelecido que o órgão deveria apresentar 1/3 das alterações,
para moderada 2/3 e para acentuado 100% das alterações deveriam estar presentes.
Para cada grupo experimental foi estabelecido um número de amostra de 3 animais. A
quantificação das alterações foi feita através da classificação por cruzes, sendo que cada
cruz possuía um valor de 11%.
52
3.20. Análise Estatística
Todos os resultados foram expressos com médias ± EPM. Para observações entre
animais diferentes foi utilizado o teste “t” de Student não pareado. Comparações entre
diferentes grupos foram avaliadas por one-way ou two-way ANOVA seguido de teste de
Bonferroni ou Dunnet quando apropriado. Estas análises foram realizadas no software
Graphpad Prism (versão 4.00). Foram consideradas diferenças significativas para p < 0.05.
3.21. Protocolos Experimentais
3.21.1. Avaliação da Sensibilidade da Bradicardia Reflexa
Os animais eram anestesiados, submetidos aos procedimentos cirúrgicos e
posicionados no aparelho extereotáxico. A seguir, iniciava-se o registro da pressão arterial.
Após um período de 15 minutos a micropipeta de vidro era posicionada na área do bulbo
correspondente à CVLM. Observava-se as alterações típicas transitórias de PAM e FC, que
auxiliavam para determinar a localização correta da pipeta. Após um período de 20 minutos
era iniciado o teste do barorreflexo. A sensibilidade do reflexo pressorreceptor foi avaliada
relacionando-se as alterações reflexas de FC induzidas por alterações transitórias da PAM.
Para produzir alterações da PAM, os animais foram submetidos a injeções intravenosas
(em bolus) de doses (0,1ml) com concentrações crescentes (0,5 a 50,0g/mL) de fenilefrina
a fim de se obter respostas pressoras. Um intervalo mínimo de um minuto ou mais foi
mantido entre as injeções, para permitir que a PAM e a FC retornassem aos valores basais.
A Figura 7 sumariza o protocolo utilizado.
Figura 7 – Protocolo experimental para a avaliação da bradicardia reflexa.
Cirurgia para
produção da
Hipertensão
Renovascular
(2R1C) e SHAM
4 dias
repouso
Controle de PA por Pletismografia de
Cauda - 28 dias
Grupo Ativo: 20 sessões de natação
com 1 hora de duração, 5 vezes por
semana, durante 4 semanas
2R1C <
SHAM <
Sedentários
Ativos
Sedentários
Ativos
2R1C <
SHAM <
Sedentários
Ativos
Sedentários
Ativos
Sedentários
Ativos
Sedentários
Ativos
Procedimentos cirúrgicos:
•Canulação
•Traqueostomia
•Exposição do bulbo e
microinjeção na CVLM
Pipeta
na
CVLM
Teste do
Barorreflexo
PA e FC Basais
Injeções intravenosas
de fenilefrina
53
3.21.2. Avaliação dos Efeitos Cardiovasculares Produzidos pela Microinjeção
de Ang II e PD123319 no Bulbo Ventrolateral Caudal
Os animais eram anestesiados, submetidos aos procedimentos cirúrgicos e
posicionados no aparelho extereotáxico. A seguir, iniciava-se o registro da pressão arterial.
Após um período de 15 minutos a micropipeta de vidro era posicionada na área do bulbo
correspondente à CVLM. Observava-se as alterações típicas transitórias de PAM e FC, que
auxiliavam para determinar a localização correta da pipeta. Microinjeção dos peptídeos em
áreas adjacentes aos locais estudados não produziam alterações significantes de PAM.
Após um período de 20 minutos e realizado o teste do barorreflexo, procedia-se a
microinjeção de Ang II (380 µM) e PD 123319 (678 µM) ou salina (100 nL). Um intervalo de
20 minutos era mantido entre as microinjeções e a ordem das mesmas era alternada no
mesmo grupo experimental. Apenas o lado esquerdo do bulbo era estudado em cada
animal. Ao final dos experimentos o cérebro dos animais era removido para posterior
análise histológica. A Figura 8 sumariza o protocolo utilizado:
Figura 8 – protocolo experimental para a avaliação dos efeitos cardiovasculares produzidos pela
microinjeção de Ang II e PD123319 na CVLM.
Cirurgia para
produção da
Hipertensão
Renovascular
(2R1C) e SHAM
4 dias
repouso
2R1C <
SHAM <
Sedentários
Ativos
Sedentários
Ativos
2R1C <
SHAM <
Sedentários
Ativos
Sedentários
Ativos
Sedentários
Ativos
Sedentários
Ativos
CVLM
Procedimentos cirúrgicos:
•Canulação
•Traqueostomia
•Exposição do bulbo e
microinjeção na CVLM
Pipeta
na
CVLM
Ang
II
Salina
PD123319
AngII após
PD 123319
Controle de PA por Pletismografia de
Cauda - 28 dias
Grupo Ativo: 20 sessões de natação
com 1 hora de duração, 5 vezes por
semana, durante 4 semanas
5’ 15’ 30’
54
RESULTADOS
55
4. RESULTADOS
4.1 AVALIAÇÃO DE DIFERENTES PARÂMETROS DA HIPERTENSÃO
RENOVASCULAR
4.1.1. Evolução da PA após Cirurgia para Produção da Hipertensão
Renovascular 2R1C
Os valores de PA apresentados na Figura 9 e Tabela I foram avaliados por
pletismografia de cauda durante 4 semanas em ratos sedentários e ativos, normotensos
(Sham) e com hipertensão renovascular (2R1C).
Como mostrado na Figura 9 e Tabela I, os valores de PA dos ratos 2R1C
sedentários (105 ± 2 mmHg, n=11) e 2R1C ativos (118 ± 4 mmHg, n=17) foram
significativamente superiores aos dos animais Sham sedentários (93 ± 3 mmHg, n=12) já
na primeira semana após a realização da cirurgia 2R1C. Da mesma forma que observado
na primeira semana, na segunda semana após as cirurgias (Sham ou 2R1C) os valores de
PA dos ratos 2R1C sedentários (107 ± 3 mmHg, n=11) e 2R1C ativos (126 ± 3 mmHg,
n=17) foram superiores aos dos animais Sham sedentários (94 ± 3 mmHg, n=12). Assim, na
primeira e segunda semana após as cirurgias (Sham e 2R1C) os animais 2R1C ativos
apresentaram níveis de PA significativamente maiores que os animais 2R1C sedentários.
Na terceira semana após as cirurgias (Sham ou 2R1C), os valores de PA dos
animais 2R1C sedentários (142 ± 5 mmHg, n=11; p<0,05) e 2R1C ativos (133 ± 3 mmHg,
n=17; p<0,05) foram similares entre si e superiores aos dos animais Sham sedentários (98
± 2 mmHg, n=12).
Na quarta semana após a realização das cirurgias (Sham e 2R1C) os valores de PA
dos animais hipertensos sedentários (153 ± 6 mmHg, n=11; p<0,05) e ativos (129 ± 4
mmHg, n=17; p<0,05) foram superiores aos apresentados pelos animais Sham sedentários
(103 ± 3 mmHg, n=12). Porém, no grupo 2R1C observamos uma redução significativa entre
os valores de PA no grupo ativo quando comparados aos animais hipertensos sedentários,
mostrando que o exercício físico reduz os valores de PA em animais hipertensos. Em todas
as semanas em que foram avaliadas a PA, não foi observada diferença significativa entre
os animais Sham sedentários e ativos (Figura 9 e Tabela I).
56
PRESSÃO ARTERIAL MENSURADA ATRAVÉS DA PLETISMOGRAFIA DE CAUDA
Figura 9 - Pressão arterial (PA, mmHg) mensurada através de pletismografia de cauda
em ratos acordados (Sham sedentários, n=12; Sham ativos, n=13; 2R1C sedentários, n=11
e 2R1C ativos, n=17) na 1
a
, 2
a
, 3
a
e 4
a
semana após as cirurgias. *p<0,05 em comparação
aos ratos Sham sedentários. #p<0,05 em comparação aos ratos 2R1C sedentários (teste “t”
de Student para observações não pareadas).
Tabela I: Valores da pressão arterial (PA, mmHg) mensurada através da pletismografia de
cauda
1ª Semana 2ª Semana 3ª Semana 4ª Semana
SHAM Sedentário
(n=12)
93 3
94 3
98 2
103 3
SHAM Ativo
(n=13)
102 2
96 2
100 2
102 1
2R1C Sedentário
(n=11)
105 2*
107 3*
142 5*
153 6*
2R1C Ativo
(n=17)
118 4*
#
126 3*
#
133 3*
129 4*
#
Valores expressos em média ± erro padrão da média. * p<0.05 em comparação aos ratos
Sham sedentários. #p<0,05 em comparação aos ratos 2R1C sedentários (teste “t” de
Student para observações não pareadas).
1
a
semana
2
a
semana 3
a
semana 4
a
semana
PA, mmHg
0
50
100
150
200
*
*
*
*
*
*
*
*
#
#
#
Após cirurgia (Sham e 2R1C)
2R1C
ativos
2R1C
sedent
á
rios
Sham
ativos
Sham
sedent
á
rios
57
4.2. Avaliação da Ingestão Hídrica
Para avaliar o efeito do exercício físico sobre a ingestão hídrica em animais
normotensos e hipertensos submetidos à atividade física através da natação, foi realizada
semanalmente, durante 4 semanas, o controle da ingestão de água dos animais (Figura 10
e Tabela II). As medidas eram realizadas duas vezes na semana. Como cada grupo era
dividido em duas gaiolas contendo de 4 a 5 animais , para avaliar a ingestão hídrica do
grupo era feita uma média de ingestão hídrica entre os animais. Sendo assim, o EPM
observado é de quatro medidas.
Como mostrado na Figura 10, na primeira semana após as cirurgias (Sham e 2R1C)
a ingestão hídrica dos animais do grupo 2R1C (52,5 ± 0,5 ml, n=10; ratos sedentários e
54,7 ± 2,3 ml, n=10; ratos ativos; p<0,05) e os ratos Sham ativos (36,9 ± 0,3 ml; n=10;
p<0,05) foi maior do que a ingestão hídrica dos ratos Sham sedentários (29,5 ± 0,5 ml;
n=10). Da mesma forma observada na primeira semana, na segunda semana a ingestão
hídrica dos animais do grupo 2R1C (41 ± 1 ml; n=10; ratos sedentários e 44,9 ± 4,5 ml;
n=10; ratos ativos; p<0,05) e os ratos Sham ativos (35,1 ± 0,5 ml; n=10; p<0,05) foi maior
do que a observada nos ratos Sham sedentários (30,1 ± 0,1 ml; n=10).
Porém, na terceira semana após as cirurgias, somente os animais do grupo 2R1C
apresentaram uma ingestão hídrica (47 ± 1 ml, n=10; ratos sedentários e 41,7 ± 1,7 ml,
n=10; ratos ativos; p<0,05) maior do que a dos ratos Sham sedentários (30,5 ± 0,5 ml;
n=10). Os animais do grupo Sham, sedentários e ativos (33,9 ± 1,5 ml; n=10),
apresentaram valores semelhantes de ingestão hídrica neste período.
Na quarta semana do protocolo experimental, somente os animais 2R1C
sedentários (48,5 ± 0,5 ml; n=10; p<0,05) apresentaram uma ingestão hídrica superior a
dos animais Sham sedentários (30,5 ± 0,5 ml; n=10).
58
INGESTÃO HÍDRICA
Figura 10 - Avaliação da Ingestão hídrica (ml) em animais Sham sedentários, (n=10); Sham
ativos, (n=10); 2R1C sedentários, (n=10) e 2R1C ativos, (n=10) na 1
a
, 2
a
, 3
a
e 4
a
semana
após as cirurgias (Sham ou 2R1C). *p<0,05 em comparação aos ratos Sham sedentários
(teste “t” de Student para observações não pareadas).
Tabela II: Valores da ingestão hídrica (ml) avaliados por quatro semanas após cirurgias
1ª Semana 2ª Semana 3ª Semana 4ª Semana
SHAM Sedentário
(n=10)
29,5 0,5
30,1 0,1
30,5 0,5
30,5 0,5
SHAM Ativo
(n=10)
36,9 0,3*
35,1 0,5*
33,9 1,5
34,7 1,5
2R1C Sedentário
(n=10)
52,5 0,5*
41,0 1,0*
47,0 1,0*
48,5 0,5*
2R1C Ativo
(n=10)
54,7 2,3*
44,9 4,5*
41,7 1,7*
34,3 2,3
Valores expressos em média ± erro padrão da média. * p<0.05 em comparação aos ratos
SHAM sedentários (teste “t” de Student para observações não pareadas).
Ingestão
h
í
drica
, ml
1
a
semana 2
a
semana
3
a
semana
4
a
semana
0
50
*
*
*
*
*
*
*
*
*
25
75
Após cirurgia (Sham e 2R1C)
2R1C
ativos
2R1C
sedent
á
rios
Sham
ativos
Sham
sedent
á
rios
59
4.3 Avaliação do Peso Corporal dos Animais após as Cirurgias (Sham ou
2R1C)
Para avaliar o efeito do exercício físico sobre o peso corporal em animais
normotensos e hipertensos durante o treinamento físico com natação, os animais
hipertensos (2R1C) e normotensos (Sham) foram pesados semanalmente, a contar da data
da realização das cirurgias 2R1C ou fictícia. A Figura 11 e a Tabela III apresentam os
valores do peso corporal dos ratos após as cirurgias para produção da hipertensão
renovascular 2R1C e Sham.
Como mostrado na A Figura 11 e na Tabela III os ratos 2R1C sedentários
apresentam valores menores de peso tanto na primeira (188 ± 8 g, n=11; p<0,05) quanto na
segunda semana (213 ± 9 g, n=11; p<0,05) após a cirurgia quando comparados aos
animais Sham sedentários na primeira (217 ± 7 g, n=12) e segunda semana (237 ± 6 g,
n=12) após a cirurgia. A partir da terceira semana os ratos 2R1C sedentários (251 ± 8 g,
n=11) apresentaram pesos semelhantes aos ratos Sham sedentários (257 ± 8 g, n=12).
Não foram observadas diferenças de peso nos demais grupos de animais quando
comparados aos animais Sham sedentários.
A análise histológica qualitativa dos músculos bíceps e sóleo não apresentaram
alterações significativas nos grupos submetidos á atividade física (2R1C e Sham) em
relação aos animais sedentários (2R1C e Sham).
60
AVALIAÇÃO DO PESO CORPORAL
Figura 11 - Peso corporal (g) de ratos (Sham sedentários, n=12; Sham ativos, n=13; 2R1C
sedentários, n=11 e 2R1C ativos, n=17) na 1
a
, 2
a
, 3
a
e 4
a
semana após as cirurgias).
*p<0,05 em comparação aos ratos Sham sedentários (teste “t” de Student para
observações não pareadas).
Tabela III: Valores do peso corporal (g) avaliados por quatro semanas após cirurgias
1ª Semana 2ª Semana 3ª Semana 4ª Semana
SHAM Sedentário
(n=12)
217 7
237 6
257 8
268 12
SHAM Ativo
(n=13)
238 11
256,1 10
255 11
282 9
2R1C Sedentário
(n=11)
188 8*
213 9*
251 8
284 8
2R1C Ativo
(n=17)
214 7
236 8
249 9
262 7
Valores expressos em média ± erro padrão da média. * p<0.05 em comparação aos ratos
SHAM sedentários (teste “t” de Student para observações não pareadas).
1
a
semana
2
a
semana 3
a
semana 4
a
semana
Peso corporal, g
100
200
300
*
*
0
Após cirurgia (Sham e 2R1C)
2R1C
ativos
2R1C
sedent
á
rios
Sham
ativos
Sham
sedent
á
rios
61
4.4. Avaliação Histológica e do Peso Seco dos Rins
Com a intenção de confirmar se a estenose da artéria renal (rim clipado) poderia ser
um parâmetro para avaliar a hipertensão renovascular, foi avaliado o peso seco dos rins
dos animais Sham e dos animais submetidos a cirurgia 2R1C.
A Figura 12 ilustra os rins dos ratos 30 dias após às cirurgias fictícia (Sham)
(sedentário, painel A e Ativo, painel B), e para produção da hipertensão renovascular
(2R1C) (sedentário, painel C e ativo, painel D).
A Figura 13 e Tabela IV mostra que o peso seco relativo dos rins esquerdo (clipado)
dos animais 2R1C sedentários (0.06 ± 0,007 g/ 100g; n=7; p<0,05) e dos animais 2R1C
ativos (0.05 ± 0,004 g/ 100g; n=10; p<0,05) foram menores do que o peso relativo dos rins
esquerdo dos ratos Sham sedentários (0.07 ± 0,002 g/ 100g; n=9) e dos ratos Sham ativos
(0.08 ± 0,004 g/ 100g; n=9).
Por outro lado, o peso seco relativo do rim direito (contralateral) dos ratos com
hipertensão renovascular 2R1C sedentários (0.1 ± 0,004 g/ 100g; n=7; p<0,05) e 2R1C
ativos (0.09 ± 0,004 g/ 100g; n=10; p<0,05) foi maior do que o peso seco relativo do rim
direito dos ratos Sham sedentários (0.07 ± 0,002 g/ 100g; n=9) e Sham ativos (0.08 ± 0,004
g/ 100g; n=9).
Com o objetivo de verificarnos o grau de constrição da artéria renal nos ratos
clipados (2R1C) sedentários e ativos, avaliamos o percentual de redução do rim esquerdo
(clipado) em relação aos rim direito (não-clipado). Como mostram as Figuras 14 e a Tabela
V, os ratos 2R1C sedentários (27 ± 7 %, n=5) apresentaram o percentual de redução do rim
clipado semelhante aos ratos 2R1C ativos (39 ± 9 %, n=8), sendo que estas reduções
foram significativamente maiores em relação ao percentual de redução dos rins dos animais
Sham. Não houve diferença entre o percentual de redução do rim esquerdo nos ratos Sham
sedentários (1 ± 2%; n=6) e os ratos Sham ativos (2 ± 2%; n=6).
A análise histológica das estruturas renais do rim esquerdo (não clipado) nos mostra
que as alterações patológicas como esclerose glomerular (11%; n=3) e inflamação (11%;
n=3) presentes no grupo Sham sedentário foram reduzidas no grupo Sham ativo, ou seja,
este grupo apresentou ausência destas manifestações patológicas (0%; n=3; esclerose
glomerular e 0%; n=3; inflamação). Foi observado um aumento da dilatação tubular nos
ratos Sham ativos (44%; n=3). Não foi observada alteração aparente da congestão
presente no grupo Sham ativo em relação ao grupo Sham sedentário (Figura 15, Painel A).
Já no grupo hipertenso, os ratos 2R1C ativos mostraram através da análise
histológica que os parâmetros avaliados como congestão (22%; n=3), degeneração tubular
focal (11%; n=3), fibrose (11%; n=3), inflamação (33%; n=3) e dilatação tubular (33%; n=3)
apresentaram-se reduzidos em relação ao grupo 2R1C sedentários (44%, n=3; congestão;
33%, n=3; degeneração tubular focal; 33%, n=3; fibrose; 88%, n=3; inflamação e 55%, n=3;
62
dilatação tubular). Foi observado um aumento na presença de esclerose glomerular no
grupo 2R1C sedentário em relação ao grupo Sham sedentário, porém não houve diferença
na presença de esclerose glomerular no grupo 2R1C sedentário em relação ao grupo 2R1C
ativo. Com relação à presença de depósitos protéicos, apenas o grupo hipertenso
sedentário teve essa alteração manifestada, sendo que esta foi observada tanto no rim
esquerdo quanto no direito (Figura 15, Painel A). A Figura 16 ilustra cortes histológicos dos
rins esquerdos de ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos.
Com relação à análise histológica do rim direito (não-clipado), no grupo Sham ativo,
foi observada redução da congestão (0%; n=3), esclerose glomerular (11%; n=3) e
inflamação (11%; n=3) quando comparado com os animais do grupo Sham sedentário (11%
n=3, congestão; 22%, n=3; esclerose glomerular e 22%, n=3; inflamação). No grupo Sham
ativo em relação à degeneração tubular focal (33%; n=3) e dilatação tubular (44%; n=3) foi
observado aumento desses parâmetros em relação aos Sham sedentários (11%, n=3;
degeneração tubular focal e 33%, n=3; dilatação tubular). De forma semelhante, no grupo
2R1C ativo houve aumento na manifestação de alguns parâmetros (33%, n=3;
degeneração tubular focal; 44%, n=3; esclerose glomerular e 33%, n=3; inflamação) e
redução na manifestação de outros, como congestão (0%; n=3) e fibrose (0%; n=3) quando
comparamos os animais do grupo 2R1C sedentários (11%, n=3; congestão e 22%, n=3;
fibrose). Com relação à dilatação tubular não houve alteração com relação a este
parâmetro neste grupo de animais (Figura 15, Painel B). A Figura 17 ilustra cortes
histológicos dos rins direitos de ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos.
63
RINS DE RATOS 30 DIAS APÓS ÀS CIRURGIAS FICTÍCIA (SHAM) E PARA
PRODUÇÃO DA HIPERTENSÃO RENOVASCULAR (2R1C)
Figura 12 - Fotos ilustrando os rins (a fresco) dos ratos 30 dias após às cirurgias fictícia
(Sham) (sedentário, painel A; e ativo, painel B) e 30 dias após a cirurgia para produção da
hipertensão renovascular (2R1C) (sedentário, painel C; e ativo, painel D).
(A) Sedentário
D
E
(B) Ativo
D
E
(D) Ativo
D
E
D
E
(C) Sedentário
RATOS SHAM
RATOS 2R1C
64
AVALIAÇÃO DO PESO SECO DOS RINS
Figura 13 - Alterações do peso seco dos rins direito (não-clipado) e rins esquerdo (clipado)
(g/ 100g de peso corporal) em ratos Sham sedentários (n=9) e ativos (n=9) e 2R1C
sedentários (n=7) e ativos (n=10). *p<0,05 em comparação aos rins não clipados. #p<0,05
em comparação aos rins direito dos ratos Sham (teste “t” de Student para observações não
pareadas).
Tabela IV: Valores do peso dos rins (g/ 100g do peso corporal)
SHAM
Sedentário
SHAM Ativo
2R1C
Sedentário
2R1C Ativo
Rim Direito
0,07 0,002
(n=9)
0,08 0,004
(n=9)
0,1 0,004
#
(n=7)
0,09 0,004
#
(n=7)
Rim Esquerdo
0,07 0,002
(n=9)
0,08 0,004
(n=9)
0,060,007*
#
(n=10)
0,05 0,004*
#
(n=10)
Valores expressos em média ± erro padrão da média. *p<0,05 em comparação aos rins não
clipados. #p<0,05 em comparação aos rins direito dos ratos Sham (teste “t” de Student para
observações não pareadas).
2R1CSham
Peso seco rim/ peso corporal, g/ 100 g
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
*
*
#
#
#
#
Rim
Esquerdo
Rim
Direito
Rim
Esquerdo
Rim
Direito
Sedentários
Ativos
65
% DE REDUÇÃO DO RIM CLIPADO
Figura 14 - Avaliação da % de redução do peso seco do rim esquerdo (clipado) [g/ 100g de
peso corporal) (rim esquerdo/ rim direito x 100] de ratos Sham sedentários (n=5) ou ativos
(n=8) ou 2R1C sedentários (n=6) ou ativos (n=6). *p<0,05 em comparação com ratos do
grupo sham (teste “t” de Student para observações não pareadas). (ANOVA seguido de
Bonferroni ou Dunnet quando apropriado).
Tabela V: Valores da % de redução do peso seco do rim esquerdo (clipado) [g/ 100g de
peso corporal) (rim esquerdo/ rim direito x 100]
SHAM
2R1C
Sedentários
1 2
(n=6)
27 7*
(n=5)
Ativos
2 2
(n=6)
39 9*
(n=8)
Valores expressos em média ± erro padrão da média. *p<0,05 em comparação com ratos
do grupo sham (teste “t” de Student para observações não pareadas). (ANOVA seguido de
Bonferroni ou Dunnet quando apropriado).
2R1C
% de Reduç
ão
rim esquerdo/ rim direito
Sham
*
*
% de Reduç
ão
rim esquerdo/ rim direito
50
40
30
20
10
0
Sedentários
Ativos
66
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DOS RINS
RIM ESQUERDO
RIM DIREITO
Figura 15 - Avaliação histológica do rim esquerdo (clipado) (Painel: A) e do rim direito (não-
clipado) (Painel: B) de ratos Sham sedentários (n=3) ou ativos (n=3) ou 2R1C sedentários
(n=3) ou ativos (n=3).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Congestão
Esclerose
Glomerular
Inflamação
Dilatação
Tubular
Deposição
Protéica
Degeneração
Tubular Focal
Fibrose
Sham sedentário
Sham treinado
2R1C sedentário
2R1C treinado
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Congestão
Esclerose
Glomerular
Inflamação
Dilatação
Tubular
Deposição
Protéica
Degeneração
Tubular Focal
Fibrose
Sham sedentário
Sham treinado
2R1C sedentário
2R1C treinado
(A)
(B)
% de alterações histológicas
% de alterações histológicas
67
*
A
B
DC
Figura 16 - Fotomicrografias da região medular do rim esquerdo (clipado) de ratos
pertencentes aos grupos Sham e 2R1C, sedentários e ativos. Observa-se aspecto
histológico compatível com quadro de normalidade no grupo Sham (A), dilatação e
vacuolização tubular no grupo Sham ativo (B), processo inflamatório intenso (setas),
degeneração tubular focal (*) no grupo 2R1C (C) e redução dessas alterações no grupo
2R1C ativo que mostrou raras células inflamatórias (D). Hematoxilina Eosina, X 600.
68
A
B
D
C
*
Figura 17 - Fotomicrografias da região cortical do rim direito (não-clipado) de ratos
pertencentes aos grupos Sham e 2R1C, sedentários e ativos. Observam-se degeneração e
dilatação tubular discretas no grupo Sham (A), moderadas no grupo Sham ativo (B); Fibrose
e inflamação (seta) são observadas no grupo 2R1C (C) e degeneração (*) acompanhada de
inflamação (seta) e esclerose glomerular (cabeça de seta) no grupo 2R1C ativo (D).
Hematoxilina Eosina, X 600.
69
4.5. Avaliação Histológica e do Peso Seco do Coração
A Tabela VI mostra que os valores de peso seco do coração dos animais dos grupos
2R1C sedentário (0,07 ± 0,005 g/ 100g; n=7), 2R1C ativo (0,07 ± 0,003 g/ 100g, n=10) e
Sham ativo (0,07 ± 0,002 g/ 100g; n=9) foram similares e significativamente maiores do que
o peso seco do coração dos animais Sham sedentários (0,06 ± 0,002 g/ 100g, n=9).
Em relação ao peso seco dos ventrículos houve um aumento nos animais 2R1C
sedentários (0,068 ± 0,005 g/ 100g; n=7; p<0,05) e 2R1C ativos (0,063 ± 0,003 g/ 100g;
n=10; p<0,05) quando comparados ao peso seco dos ventrículos dos animais Sham
sedentários (0,06 ± 0,002 g/ 100g, n=9) (Figura 18). Não houve diferença entre o peso dos
ventrículos dos animais Sham sedentários e Sham ativos.
Nos animais do grupo Sham ativo (0,007 ± 0,001 g/ 100g; n=9; p<0,05) houve um
aumento do peso relativo dos átrios quando comparados aos ratos Sham sedentários
(0,005 ± 0,001 g/ 100g, n=9). Ao contrário, no grupo 2R1C não houve diferença do peso
relativo dos átrios nos ratos 2R1C sedentários (0,006 ± 0,001 g/ 100g; n=7) e nos ratos
2R1C ativos (0,006 ± 0,003 g/ 100g; n=10) (Figura 18).
A análise histológica das estruturas cardíacas (Figura 19) nos permite observar uma
redução na degeneração dos cardiomiócitos nos ratos Sham ativos (0%; n=3) quando
comparados com os animais Sham sedentários (11%; n=3). Não foi observada alteração da
inflamação ventricular focal no grupo Sham ativo e sedentário. Foi observado um
espessamento excêntrico da parede ventricular (33%; n=3), aumentando a luz do órgão, no
grupo Sham ativo em relação aos sedentários. Já no grupo hipertenso, a análise histológica
nos permitiu observar que no grupo 2R1C ativo foi observada uma redução no
espessamento da parede ventricular (22%; n=3) e vascular (22%; n=3) em comparação aos
ratos 2R1C sedentários (33%, n=3; espessamento da parede ventricular e 33%, n=3;
vascular) que apresentaram espessamento concêntrico da parede ventricular. Também no
grupo hipertenso ativo foi observada uma redução na fibrose (0%; n=3) e um aumento na
degeneração (55%; n=3) e inflamação ventricular focal (22%; n=3) em comparação aos
animais 2R1C sedentários (22%, n=3; fibrose, 22%, n=3; degeneração e 11%; n=3,
inflamação ventricular focal). As Figuras 20, 21 e 22 ilustram cortes histológicos das
estruturas cardíacas nos ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos.
70
PESO SECO DO CORAÇÃO
A)
PESO SECO DOS VENTRÍCULOS
B)
PESO SECO DOS ÁTRIOS
C)
Figura 18 - Alterações no peso seco do coração, ventrículos e átrios (g/ 100g de peso
corporal) de ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos. *p<0,05 em comparação aos ratos
sham (teste “t” de Student para observações não pareadas).
Sham
2K1C
Peso seco coração/ peso corporal, g
/ 100 g
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
*
*
*
2K1C
0.000
0.025
0.050
0.075
*
*
Peso seco ventrículos/ peso corporal, g
/ 100 g
Sham
2K1C
Peso seco átrios/ peso corporal, g
/ 100 g
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
*
Sham
Seden
tários
Ativos
2R1
C
2R1C
2R1C
71
Tabela VI: Valores do peso dos corações, ventrículos e dos átrios (g/ 100g do peso
corporal)
SHAM
Sedentário
(n=9)
SHAM Ativo
(n=9)
2R1C
Sedentário
(n=7)
2R1C Ativo
(n=10)
Peso seco do coração
0,06 0,002 0,07 0,002* 0,07 0,05* 0,07 0,001*
Peso seco dos
ventrículos
0,06 0,002 0,06 0,002 0,0680,005*
0,063 0,003*
Peso seco dos átrios
0,004 0,005
0,007 0,001*
0,006 0,001
0,006 0,006
Valores expressos em média ± erro padrão da média. *p<0,05 em comparação aos rins não
clipados. #p<0,05 em comparação aos ratos SHAM (teste “t” de Student para observações
não pareadas).
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO CORAÇÃO
Figura 19 - Avaliação histológica do coração de ratos Sham sedentários (n=3) ou ativos
(n=3) ou 2R1C sedentários (n=3) ou ativos (n=3).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Sham sedentário
Sham treinado
2R1C sedentário
2R1C treinado
Espessamento
Parede Ventrícuo
Espessamento
Parede Vaso
Degeneração
Fibrose
Inflamação
Ventricular Focal
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Sham sedentário
Sham treinado
2R1C sedentário
2R1C treinado
Espessamento
Parede Ventrícuo
Espessamento
Parede Vaso
Degeneração
Fibrose
Inflamação
Ventricular Focal
% de alterações histológicas
72
A
B
D
C
Figura 20 - Fotografias do coração de ratos pertencentes aos grupos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos. Observa-se aspecto histológico compatível com quadro de normalidade
nos grupos Sham representados pela figura A. Nos animais do grupo ativo, Sham (B) e
2R1C (D), observa-se hipertrofia cardíaca excêntrica (aumento na luz do órgão), enquanto
no grupo 2R1C sedentário (C), observa-se hipertrofia concêntrica (redução na luz do órgão).
Hematoxilina Eosina.
73
A
B
DC
Figura 21 - Fotomicrografias do miocárdio de ratos pertencentes aos grupos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos. Observa-se aspecto histológico compatível com quadro de normalidade
nos grupos Sham representados pela figura A. No miocárdio dos animais do grupo 2R1C (B)
observa-se fibrose (cabeças de seta) enquanto no grupo 2R1C ativo, a presença de foco
inflamatório ativo (C - setas) e degeneração acentuada (D - setas). Hematoxilina Eosina, X
600.
74
A
C
B
Figura 22 - Fotomicrografias do miocárdio de
ratos pertencentes aos grupos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos. Observa-se aspecto
histológico compatível com quadro de
normalidade nos grupos Sham representados
na figura A. No miocárdio dos animais do
grupo 2R1C (B) observa-se espessamento da
parede de vaso enquanto no ativo a presença
de foco inflamatório perivascular (seta) e
espessura semelhante ao normal (C).
Hematoxilina Eosina, X 600.
75
4.6. Avaliação dos Níveis Séricos de Creatinina e Uréia
A Tabela VII mostra os níveis séricos de uréia e creatinina de ratos normotensos e
hipertensos, sedentário e ativos.
Os níveis séricos de creatinina nos animais Sham sedentários (124,15 ± 15,18,
n=10) e Sham ativos (133,47 ± 21,37, n=10) foram similares ao observado nos animais
2R1C sedentários (132,99 ± 20,41, n=10) e 2R1C ativos (126,24 ± 21,97, n=10).
Já em relação à dosagem sérica de uréia houve interação entre os animais 2R1C
sedentários (6,75 ± 0,81, n=10) e Sham sedentários (7,2 ± 0,81, n=10) e o efeito da cirurgia
2R1C ou fictícia (Sham) e o efeito do treinamento físico nos 2R1C ativos (8,51 ± 0,71,
n=10) e Sham ativos (7,41 ± 1, 09, n=10). Estas diferenças foram significativas tanto devido
ao treinamento quanto devido à hipertensão renovascular, porém nossos dados são
insuficientes para sugerir alguma alteração com relação ao metabolismo protéico ou com
relação à filtração glomerular.
Tabela VII - Concentração sérica de creatinina (µmol/L) e uréia (mmol/L)
Grupos
Creatinina
(µmol/L)
Uréia
(mmol/L)
SHAM Sedentário
(n=10)
124,15 ± 15,18
7,2 ± 0,81
a
SHAM Ativo
(n=10)
133,47 ± 21,37
7,41 ± 1,09
a, b
2R1C Sedentário
(n=10)
132,99 ± 20,41
6,75 ± 0,81
a
2R1C Ativo
(n=10)
126,24 ± 21,97
8,51 ± 0,71
b
Valor de P
Treinamento
NS <0,05
Hipertensão
NS <0,05
Interação
NS <0,05
76
O resultado indicado é a média ± desvio padrão. Duas 2 Letras diferentes indicam
diferenças significativas na mesma coluna (p≤ 0,05). Two-way ANOVA seguido de pós teste
de Tunkey.
4.7 AVALIAÇÃO DIRETA DOS PARÂMETROS CARDIOVASCULARES
4.7.1. Níveis de Basais de PAM e FC
Com a intenção de verificarmos a correlação entre a medida indireta (Pletismografia
de cauda) que submete o animal a estresse como o manuseio, constrição e calor e a
medida direta da PAM (Powerlab) e se poderia haver algum efeito do anestésico uretana
utilizado para os estudos cardiovasculares, avaliou-se a pressão arterial na quarta semana
após a cirurgia (2R1C e Sham) medida de forma indireta por pletismografia de cauda (na
ausência da anestesia), e a pressão arterial no início do experimento, assim que o animal
foi conectado ao transdutor (em torno de 20 minutos após a anestesia) e ao término do
experimento (em torno de duas horas após a anestesia). Nossos dados mostram que nos
animais do grupo Sham, sedentários e ativos, não houve alteração nos valores de PAM no
início do experimento (105 ± 3 mmHg, n=15; Sham sedentários e 106 ± 3 mmHg, n=13;
Sham ativos) e ao término do experimento (97 ± 5 mmHg, n=12; Sham sedentários e 96 ± 9
mmHg, n=13; Sham ativos) quando comparados com os valores de PAM obtidos de forma
indireta pela pletismografia (103 ± 3 mmHg, n=12; Sham sedentários e 102 ± 1 mmHg,
n=13; Sham ativos). Já nos animais do grupo 2R1C não houve alteração nos valores de
PAM no início do experimento (152 ± 8 mmHg, n=14; 2R1C sedentários e 119 ± 4 mmHg,
n=20; 2R1C Ativos) quando comparados com os valores de PAM obtidos de forma indireta
pela pletismografia (153 ± 6 mmHg, n=11; 2R1C sedentários e 129 ± 4 mmHg, n=17; 2R1C
ativos). Porém, neste mesmo grupo de animais hipertensos houve significativa alteração
nos valores de PAM no final do experimento (114 ± 11 mmHg, n=12; 2R1C sedentários e
87 ± 8 mmHg, n=17; 2R1C ativos) quando comparados com os valores de PAM obtidos de
forma indireta pela pletismografia (Figura 23 e Tabela VIII).
A Figura 24 ilustra o registro típico de PAM, pressão arterial pulsátil (PAP) e FC de
um rato normotenso (Sham) e hipertenso (2R1C). A PAM basal dos ratos 2R1C sedentários
(161 ± 13,5 mmHg; n=5; p<0,05) foi maior que a PAM basal dos ratos Sham sedentários
(105 ± 4,3 mmHg; n=6). O exercício físico reduziu a PAM no grupo 2R1C ativo (127 ± 6
mmHg; n=7) sendo que estes valores foram significativamente diferentes da PAM basal dos
ratos 2R1C sedentários e Sham (sedentários e ativos). A PAM dos ratos 2R1C ativos foi
maior que a PAM basal dos ratos Sham ativos (105 ± 4 mmHg; n=7; p<0,05) (Figura 25).
Os valores basais de FC não foram diferentes no grupo Sham ativo (373 ± 9,8 bpm;
n=7) em comparação aos ratos Sham sedentários (400 ± 13 bpm; n=6). Contudo, no grupo
77
2R1C ativo a FC basal (375 ± 8 bpm; n=7) foi significativamente menor que a FC basal no
grupo 2R1C sedentário (407 ± 12 bpm; n=5) (Figura 25). Nossos dados sugerem que o
exercício foi eficiente em promover uma redução nos níveis basais de PA e FC nos animais
2R1C ativos.
AVALIAÇÃO DA PAM ANTES E APÓS ANESTESIA
0
40
80
120
160
200
Antes do anestésico
20 min após o anestésico
2 horas após o anestésico
*
*
SHAM
Sedentário
SHAM
Ativo
2R1C
Sedentário
2R1C
Ativo
PAM, mmHg
Figura 23 - Valores de pressão arterial, na quarta semana após a cirurgia (sham
sedentários, n=12-15; sham ativos, n=13; 2R1C sedentários, n=11-14 e 2R1C ativos, n=17-
20) medida de forma indireta pela pletismografia, no início do experimento (em torno de 20
minutos após a anestesia) e ao término do experimento (em torno de duas horas após a
anestesia). *p<0,05 comparado com a PAM antes da anestesia (medida pela
pletismografia) (teste “t” de Student para observações não pareadas).
Tabela VIII: Valores da pressão arterial (PA, mmHg) em ratos acordados (pletismografia) e
após anestesia - 20 minutos e duas horas
SHAM
Sedentário
SHAM
Ativo
2R1C
Sedentário
2R1C
Ativo
Ratos acordados
(pletismografia)
103 3
(n=12)
102 1
(n=13)
153 6*
(n=11)
129 4*
(n=17)
Ratos anestesiados (20
minutos)
105 3
(n=15)
106 3
(n=13)
152 8*
(n=14)
119 4
(n=20)
Ratos anestesiados (2
horas)
97 5
(n=12)
96 9
(n=13)
114 11*
(n=12)
87 8*
(n=17)
78
Valores expressos em média ± erro padrão da média. *p<0,05 comparado com a PAM
antes da anestesia (medida pela pletismografia) (teste “t” de Student para observações não
pareadas).
REGISTROS TÍPICOS DE PAP, PAM E FC BASAL
Figura 24 - Registros de pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média
(PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC, bpm) basal de ratos anestesiados com
uretana.
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
200
300
400
500
(A) Sham Sedentário
50
100
150
200
250
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
0
50
100
150
200
250
200
300
400
500
50
100
150
200
250
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
0
50
100
150
200
250
200
300
400
500
(B) 2R1C Sedentário
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
200
300
400
500
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
200
300
400
500
(C) Sham Ativo
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
200
300
400
500
(D) 2R1C Ativo
79
PAM BASAL
FC BASAL
Figura 25 - Pressão arterial média basal (PAM, mmHg) e frequência cardíaca (batimentos/
min) de ratos Sham sedentários ou ativos e 2R1C sedentários ou ativos. *p<0,05 em
comparação com ratos do grupo Sham (teste “t” de Student para observações não
pareadas). (ANOVA seguido de Bonferroni ou Dunnet quando apropriado ). #p<0,05 em
comparação aos ratos do grupo 2R1C (teste “t” de Student para observações não
pareadas).
0
25
50
75
100
125
150
175
*
*
Sham 2R1C
#
PAM (mmHg)
0
25
50
75
100
125
150
175
*
*
Sham 2R1C
#
PAM (mmHg)
200
250
300
350
400
450
Sham 2R1C
#
FC (bpm. / min)
200
250
300
350
400
450
Sham 2R1C
#
FC (bpm. / min)
Sedentários
Ativos
80
4.8 Administração Intravenosa de Ang II e PD123319
Na intenção de verificarmos se a atividade física poderia alterar o efeito provocado
pela injeção intravenosa Ang II e PD 123319, nós avaliamos as alterações nos valores
basais de PAM e FC produzidas por injeções intravenosas de Ang II (240 µM), PD123319
(570 µM) e salina (0,05 ml; NaCl 0,9%) em ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos.
No grupo Sham sedentário, como mostrado na Figura 26 e na Tabela IX, a injeção
intravenosa de Ang II (43 5 mmHg, n=5; p<0,05) produziu efeito hipertensor superior à
injeção de salina (16 5 mmHg, n=5). A injeção intravenosa de PD 123319 (5 3 mmHg,
n=5) produziu efeito na PAM similar ao da salina e não foi capaz de abolir o efeito
hipertensor da Ang II (56 10mmHg, n=5; p<0,05).
No grupo Sham ativo o efeito hipertensor produzido pela injeção intravenosa de Ang
II (44 9 mmHg, n=6; p<0,05) foi superior à injeção de salina (12 4mmHg, n=6). A injeção
intravenosa de PD123319 (6 2 mmHg, n=6) produziu efeito similar ao da salina, porém
inibiu o efeito hipertensor induzido pela injeção de Ang II (26 9 mmHg, n=6; em
comparação a 44 9 mmHg, n=6; Ang II antes do PD) (Figura 26 e Tabela IX).
De modo semelhante ao grupo Sham sedentário, no grupo 2R1C sedentário a
injeção intravenosa de Ang II (59 19mmHg, n=6; p<0,05) produziu efeito hipertensor que
foi superior à injeção de salina (12 5mmHg, n=6). A injeção intravenosa de PD 123319 (7
5mmHg, n=6) foi similar ao efeito da salina e não aboliu o efeito hipertensor produzido
pela injeção de Ang II (50 15mmHg, n=6; p<0,05 em comparação a 59 19 mmHg, n=6;
p<0,05 Ang II antes do PD) (Figura 26 e Tabela IX).
No grupo 2R1C ativo a injeção intravenosa de Ang II (39 14 mmHg, n=6; p<0,05)
foi diferente da injeção de salina (5 3 mmHg, n=6). A injeção intravenosa de PD 123319
(0,5 3 mmHg, n=6) produziu efeito similar ao da salina, porém da mesma forma que
observado no grupo Sham ativo, o PD perifericamente, inibiu o efeito hipertensor induzido
pela injeção de Ang II (18 16 mmHg; n=6 em comparação a 39 14 mmHg, n=6; Ang II
antes do PD) (Figura 26 e Tabela IX).
Não foram observadas alterações significativas na FC dos animais após a injeção
intravenosa de Ang II e PD123319 (Tabela X).
81
ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE ANG II, PD123319 E SALINA
Figura 26 - Alterações na pressão arterial média (PAM, mmHg) produzidas por injeções
intravenosas de Ang II (13 µg), PD123319 (21 µg) e salina (0,05 ml; NaCl 0,9%) em ratos
Sham sedentários (n=5) e ativos (n=6) e ratos 2R1C sedentários (n=6) e ativos (n=6).
*p<0,05 em comparação a injeções de salina (teste “t” de Student para observações não
pareadas).
SHAM sedentário
0
20
40
60
80
*
*
PAM, mmHg
SHAM ativo
0
20
40
60
80
*
PAM, mmHg
2R1C sedentário
0
20
40
60
80
*
*
PAM, mmHg
2R1C ativo
0
20
40
60
80
*
PAM, mmHg
Salina
Ang II
PD123319
82
Tabela IX: Valores basais de Pressão Arterial Média em ratos Sham e 2R1C, sedentários e
ativos.
SHAM Sedentário
n=5
SHAM Ativo
n=6
2R1C Sedentário
n=6
2R1C Ativo
n=6
Salina
103 6 103 2 129 9 90 5
Ang II
113 6 97 7 116 19 87 17
Salina
117 9 94 7 127 12 87 11
PD
129 10 100 8 128 11 86 13
Salina
99 5 88 7 110 18 72 10
Ang II
101 7 104 11 114 18 84 17
Valores em média ± erro padrão da média. *p<0,05 em comparação com ratos do grupo
Sham sedentário (teste “t” de Student para observações não pareadas).
Tabela X: Valores basais de Freqüência Cardíaca em ratos Sham e 2R1C, sedentários e
ativos.
SHAM Sedentário
n=5
SHAM Ativo
n=6
2R1C Sedentário
n=6
2R1C Ativo
n=6
Salina
331 38 380 18 388 19 314 19
Ang II
293
37
341
25
300 22 299 14
Salina
292 34
327 9
298 24 293 6
PD
287 30
315
8
298 25 285 10
Salina
300
38
341
15
310 26 299 15
Ang II
301 3
333 13
307 27 288 23
Valores em média ± erro padrão da média. *p<0,05 em comparação com ratos do grupo
sham sedentário (teste “t” de Student para observações não pareadas).
83
4.6.2. Avaliação da Bradicardia Reflexa
Como esperado e mostrado na Figura 27 e Tabela XI a bradicardia barorreflexa nos
ratos 2R1C sedentários (0,09 ± 0,03 ms/mmHg; n=5; p<0,05) foi menor em comparação
aos ratos Sham sedentários (0,36 ± 0,07 ms/ mmHg; n=6). Não houve diferença na
bradicardia barorreflexa nos ratos ativos ou sedentários do grupo Sham. Ao contrário, no
grupo 2R1C ativo houve um aumento na bradicardia barorreflexa (0,2 ± 0,03 ms/ mmHg;
n=7; p<0,05) em comparação aos ratos 2R1C sedentários (0,09 ± 0,03 ms/ mmHg; n=5). A
sensibilidade barorreflexa no grupo 2R1C ativo não foi diferente da encontrada no grupo
Sham ativo (0,33 ± 0,03 ms/ mmHg; n=7).
Os valores do índice de sensibilidade da bradicardia refelxa (ISBR) estão
apresentados na Tabela XI. O índice de correlação linear foi de r ² = 0,9185 para ratos
2R1C sedentários, r² = 0,9516 para ratos 2R1C Ativos, r² = 0,9088 para ratos Sham
sedentários e r² = 0,9791 para ratos Sham ativos, como mostrado na Figura 28.
Tabela XI: Valores basais de PAM e FC, índice de correlação da regressão linear e
sensibilidade da bradicardia reflexa.
Valores Basais
PAM
(mmHg)
FC
(bpm)
Índice de Correlação
da Regressão Linear
(r²)
Sensibilidade da Bradicardia
Reflexa
(ΔIP/ ΔPAM, ms/ mmHg)
SHAM
Sedentário
(n=6)
105 4,3
400 13
0,9088
0,36 0,07
SHAM
Ativo
(n=7)
105 4
3739,8
0,9791
0,33 0,03
2R1C
Sedentário
(n=5)
161 13,5*
40712
0,9185
0,09 0,03*
†
2R1C
Ativo
(n=7)
127 6*
#
375 8
#
0,9516
0,2 0,03*
#
Valores em média ± erro padrão da média. *p<0,05 em comparação com ratos do grupo
sham sedentário (teste “t” de Student para observações não pareadas). (ANOVA seguido
de Bonferroni ou Dunnet quando apropriado). † p<0,05, em comparação ao grupo sham
ativos (teste “t” de Student para observações não pareadas). (ANOVA seguido de
Bonferroni ou Dunnet quando apropriado). #p<0,05 em comparação aos ratos do grupo
2R1C sedentário (teste “t” de Student para observações não pareadas).
84
ÍNDICE DE SENSIBLIDADE DA BRADICARDIA BARORREFLEXA
Figura 27 - Alterações no índice de sensibilidade da bradicardia barorreflexa (IP / PAM,
ms / mmHg) induzida por aumentos na PAM produzidos pela fenilefrina (iv) em ratos Sham
(sedentários ou ativos) e 2R1C (sdentários ou Ativos). *p<0,05 em comparação com ratos
do grupo sham sedentário (teste “t” de Student para observações não pareadas). (ANOVA
seguido de Bonferroni ou Dunnet quando apropriado). † p<0,05 em comparação ao grupo
Sham ativo (teste “t” de Student para observações não pareadas). (ANOVA seguido de
Bonferroni ou Dunnet quando apropriado). #p<0,05 em comparação aos ratos do grupo
2R1C sedentário (teste “t” de Student para observações não pareadas).
Figura 28 - Alterações reflexas na FC (expressas em IP, ms) em resposta a variações na
PAM produzidas por doses crescentes de fenilefrina (0,25 a 5µg, iv) nos grupos Sham e
2R1C sedentários (n=5-6) e ativos (n=7-7). As linhas representam a reta de melhor ajuste
obtida por regressão linear.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Sham 2R1C
*
*
#
†
ms/ mmHg
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Sham sedentários
Sham ativos
2R1C sedentários
2R1C ativos
Variações na PAM, mmHg
Variações em Intevalos de Pulso (msec)
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Sham sedentários
Sham ativos
2R1C sedentários
2R1C ativos
Variações na PAM, mmHg
Variações em Intevalos de Pulso (msec)
Sedentários
Ativos
85
4.9. Efeitos Cardiovasculares Produzidos por Microinjeções de Ang II e PD123319 na
CVLM
Na intenção de verificarmos se alterações induzidas pela atividade física poderiam
estar relacionadas à reatividade da CVLM para Ang II, nós avaliamos a microinjeção de
Ang II em ratos normotensos (Sham) e com hipertensão renovascular (2R1C) submetidos à
atividade física de baixa intensidade.
A Figura 29 apresenta registros típicos das alterações de PAP, PAM e FC
produzidas pelas microinjeções de Ang II, PD123319 e Salina, na CVLM de ratos 2R1C e
Sham, sedentários e ativos.
A AngII microinjetada na CVLM produziu significativas diminuições na PAM nos
grupos 2R1C (-12 ± 0,97 mmHg; n=5, nos ratos sedentários e -13 ± 3,5 mmHg; n=7 nos
ratos ativos) similares às observadas no grupo Sham (-13± 1,3 mmHg; n=6 no ratos
sedentários e -13 ± 1,95 mmHg; n=7 nos ratos ativos) (Figura 30 e Tabela XII).
Todos estes efeitos hipotensivos foram significativamente diferentes daqueles
produzidos por microinjeções de salina (Tabela XII). A microinjeção de Ang II não provocou
alterações significativas na FC dos animais (Figura 30 e Tabela XIII).
O antagonista de receptores AT
2
para Ang II, PD 123319, microinjetado na CVLM
produziu efeito hipotensor nos ratos 2R1C sedentários (-9,7 ± 0,89 mmHg, n=5; p<0,05)
diferentes em comparação a microinjeçãos de salina (-5 ± 1,3 mmHg, n=5). De forma
diferente, em ratos 2R1C ativos o efeito depressor do PD123319 na CVLM (-6,4 ± 1,7
mmHg, n=7) foi similar ao observado após microinjeção de salina (-4,6 ± 1,2 mmHg, n=7)
(Figura 30 e Tabela XII).
No grupo Sham o efeito hipotensor produzido pelo PD123319 na CVLM não foi
diferente em relação ao efeito produzido pela salina tanto nos animais Sham sedentários (-
6 ± 1,8 mmHg em comparação à -6 ± 1,7 mmHg, n=6, no grupo salina) quanto nos animais
Sham ativos (-6 ± 0,86 mmHg em comparação à -5,5 ± 0,97 mmHg, n=6, no grupo salina)
(Figura 30 e Tabela XII).
86
REGISTROS TÍPICOS DE PAP, PAM E FC DOS EFEITOS PRODUZIDOS PELAS
MICROINJEÇÕES DE SALINA, ANG II E PD123319 NA CVLM
Figura 29 - Registros de pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média (PAM,
mmHg) e freqüência cardíaca (FC, bpm) ilustrando o efeito da microinjeção de salina, Ang II e
PD 123319, na CVLM de ratos anestesiados com uretana. A linha vertical indica o momento da
microinjeção.
(A) Sham Sedentário
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
Ang II, 40 ngSalina, 100 nl
PD, 40 ng
20
40
60
80
100
120
140
20
40
60
80
100
120
140
300
350
400
450
500
550
40
60
80
100
120
140
20
40
60
80
100
120
140
160
20
40
60
80
100
120
140
160
20
40
60
80
100
120
140
160
300
350
400
450
500
550
300
350
400
450
500
550
(B) 2R1C Sedentário
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
Ang II, 40 ng
Salina, 100 nl
PD, 40 ng
40
60
80
100
120
140
20
40
60
80
100
120
140
160
40
60
80
100
120
140
20
40
60
80
100
120
140
20
40
60
80
100
120
140
160
20
40
60
80
100
120
140
160
300
350
400
450
500
550
300
350
400
450
500
550
300
350
400
450
500
550
(C) Sham Ativo
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
Ang II, 40 ngSalina, 100 nl
PD, 40 ng
40
60
80
100
120
140
40
60
80
100
120
140
40
60
80
100
120
140
40
60
80
100
120
140
160
40
60
80
100
120
140
160
40
60
80
100
120
140
160
300
350
400
450
500
550
300
350
400
450
500
550
300
350
400
450
500
550
(D) 2R1C Ativo
PAP,
mmHg
PAM,
mmHg
FC,
bpm
Ang II, 40 ng
Salina, 100 nl
PD, 40 ng
40
60
80
100
120
140
40
60
80
100
120
140
40
60
80
100
120
140
20
40
60
80
100
120
140
160
20
40
60
80
100
120
140
160
20
40
60
80
100
120
140
160
300
350
400
450
500
550
300
350
400
450
500
550
300
350
400
450
500
550
87
EFEITOS CARDIOVASCULARES PRODUZIDOS PELA MICROINJEÇÃO DO
ANTAGONISTA DE RECEPTOR AT
2
NA CVLM
Figura 30 - Alterações da pressão arterial média (MAP, mmHg) e frequência cardíaca (FC,
batimentos por min., bpm) produzidas por microinjeções de salina (100 nl, n=5-7), Ang II (40
pmoles, n=5-7) ou PD123319 (40 pmoles, n=5-7) na CVLM em ratos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos. * p< 0.05, em comparação a salina (ANOVA seguido por Bonferroni ou
Dunnet quando apropriado). Teste “t” de Student para observações não pareadas.
AngII
PD 123319
Salina
-30
-20
-10
0
FC, bpm
-30
-20
-10
0
FC, bpm
-20
-10
0
Sham
Sedentários
Sham
Ativos
2R1C
Sedentários
2R1C
Ativos
*
*
*
*
*
PAM, mmHg
-5
-15
Sham
Sedentários
Sham
Ativos
2R1C
Sedentários
2R1C
Ativos
88
Tabela XII: Valores Basais de Pressão Arterial Média (PAM, mmHg) em ratos Sham e
2R1C, sedentários e ativos.
Sham 2R1C
Sedentários
(n=6)
Ativos
(n=7)
Sedentários
(n=5)
Ativos
(n=7)
Início do Experimento
(20 min após uretana)
105 ± 4 105 ± 3 161 ± 13 127 ± 6*
Salina (100 nl))
100 ± 5 94 ± 9 117 ± 11* 91 ± 7
Ang II (40 ng)
101 ± 5 91 ± 10 114 ± 12* 93 ± 6
PD12319 (40 ng)
103 ± 5 94 ± 9 105 ± 13* 93 ± 8
Valores expostos em média ± EPM. * p<0.05 em comparação aos ratos Sham sedentários.
(Test “t” de Student não pareado).
Tabela XIII: Valores Basais de Frequência Cardíaca (FC, bpm) produzidas por
microinjeções de salina, Ang II e PD123319 na CVLM em ratos Sham e 2R1C, sedentários
e ativos.
Sham 2R1C
Sedentários
(n=6)
Ativos
(n=7)
Sedentários
(n=5)
Ativos
(n=7)
Início do Experimento
(20 min após uretana)
400 ± 13 373 ± 9 407 ± 12 375 ± 8*
Salina (100 nl))
293 ± 28 295 ± 14 366 ± 47* 292 ± 25
Ang II (40 ng)
327 ± 32 323 ± 15 369 ± 39* 288 ± 30
PD12319 (40 ng)
298 ± 31 285 ± 15 333 ± 45* 294 ± 23
Valores expostos em média ± EPM. * p<0.05 em comparação aos ratos Sham sedentários.
(Test “t” de Student não pareado).
89
4.10. Efeito de Microinjeções de Ang II na CVLM após o Bloqueio do Receptor
AT
2
pelo Antagonista PD123319.
Na intenção de verificarmos se a atividade física poderia alterar o tempo de inibição
provocado pela micronjeção de PD123319 à resposta produzida pela Ang II na CVLM, nós
avaliamos o efeito da Ang II microinjetada na CVLM 5, 15 e 30 minutos após a microinjeção
de PD123319 na CVLM em ratos normotensos (Sham) e com hipertensão renovascular
(2R1C) sedentários e submetidos à atividade física.
Como mostrado na Figura 31 e na Tabela XIV, a microinjeção de PD123319 na
CVLM aboliu o efeito da Ang II durante 5 minutos nos grupos Sham sedentários (-2 ± 1
mmHg, n=6; em comparação -13 ± 1 mmHg, n=6; Ang II antes do PD) e ativos (-2 ± 1
mmHg, n=6; em comparação a -13 ± 2 mmHg, n=7; Ang II antes do PD) e também no grupo
2R1C sedentário (-0,5 ± 1 mmHg, n=56; em comparação a -12 ± 1 mmHg, n=5; Ang II antes
do PD) e ativo (-2 ± 2 mmHg, n=76; em comparação a -14 ± 3 mmHg, n=8; Ang II antes do
PD) .
A microinjeção de PD123319 na CVLM aboliu o efeito da Ang II durante 15 minutos
somente nos grupos Sham sedentários (-5 ± 1 mmHg, n=6; em comparação -13 ± 1 mmHg,
n=6; Ang II antes do PD) e ativos (-2 ± 1 mmHg, n=7; em comparação a -13 ± 2 mmHg,
n=7; Ang II antes do PD) e no grupo 2R1C ativo (-6 ± 2 mmHg, n=8; em comparação a -
14 ± 3 mmHg, n=8; Ang II antes do PD). No entanto, no grupo 2R1C sedentário o
PD123319 microinjetado na CVLM não aboliu o efeito da Ang II (-6 ± 3 mmHg, n=5; em
comparação a -12 ± 1 mmHg, n=5; Ang II antes do PD) após 15 minutos da sua
microinjeção (Figura 31 e na Tabela XIV).
A microinjeção de Ang II 30 minutos após o PD na CVLM não aboliu o efeito da Ang
II nos grupos Sham sedentários (-9 ± 2 mmHg, n=6) e ativos (-10 ± 3 mmHg, n=7) e
também no grupo 2R1C sedentário (-13 ± 2 mmHg, n=5) e ativo (-13 ± 4mmHg, n=7) em
relação à microinjeção de Ang II antes do PD123319 (Figura 31 e na Tabela XIV).
A microinjeção de Ang II não provocou alterações significativas na FC nestes
animais (Figura 32 e Tabela XV).
90
EFEITO DA ANG II NA CVLM APÓS INIBIÇÃO POR PD123319
-20
-15
-10
-5
0
Sedentário
Sedentário
Ativo
Ativo
*
*
*
*
*
*
*
2R1C
SHAM
PAM, mmHg
Figura 31 - Alterações na pressão arterial média (PAM, mmhg) produzidas por
microinjeções na CVLM de Ang II (380 µM, n=5-8) antes e 5, 15 e 30 min após
microinjeções de PD123319 (678 µM, n=5-8) na CVLM em ratos Sham e 2R1C sedentários
(n=5-6) ou ativos (n=7-7). *p<0,05 em comparação a microinjeções de Ang II antes do PD
na CVLM (teste “t” de Student para observações não pareadas). (ANOVA seguido de
Bonferroni ou Dunnet quando apropriado).
Tabela XIV: Valores basais de Pressão Arterial Média (PAM, mmHg) em ratos Sham e
2R1C, sedentários e Ativos.
SHAM
Sedentário
n=6
SHAM
Ativo
n=7
2R1C
Sedentário
n=5
2R1C
Ativo
n=8
Ang II antes PD
101 5
91 10
114 12
93 6
Ang II 5 min após PD
101 6
95 8
108 12
91 8
Ang II 15 min após
PD
102 6
95 10
100 16
85 10
Ang II 30 min após
PD
97 5
80 12
104 12
83 11
Valores em média ± erro padrão da média. *p<0,05 em comparação a Ang II antes do PD
(teste “t” de Student para observações não pareadas).
30 min
ap
ó
s
PD
15 min
ap
ó
s
PD
5 min
ap
ó
s
PD
Antes
da
Microinje
ç
ão
de PD
91
EFEITO DA ANG II NA CVLM APÓS INIBIÇÃO POR PD123319
Figura 32 - Alterações na freqüência cardíaca (FC, bpm) produzidas por microinjeções na
CVLM de Ang II (380 µM, n=5-8) antes e 5, 15 e 30 min após microinjeções de PD123319
(678 µM, n=5-8) na CVLM em ratos Sham e 2R1C sedentários (n=5-6) e ativos (n=7-7).
*p<0,05 em comparação a microinjeções de Ang II antes do PD na CVLM (teste “t” de
Student para observações não pareadas). (ANOVA seguido de Bonferroni ou Dunnet
quando apropriado).
Tabela XV: Valores basais de Freqüência Cardíaca (FC, bpm) em ratos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos.
SHAM
Sedentário
(n=6)
SHAM
Ativo
(n=7)
2R1C
Sedentário
(n=5)
2R1C
Ativo
(n=8)
Ang II antes
PD 123319
327 33
323 15
369 39
303 24
Ang II 5 min após
PD123319
317 32
284 17
325 40
291 22
Ang II 15 min após
PD123319
324 32
291 18
321 41
288 30
Ang II 30 min após
PD123319
325 32
299 13
333 40
294 23
Valores em média ± erro padrão da média. *p<0,05 em comparação a microinjeções de Ang
II antes do PD na CVLM (teste “t” de Student para observações não pareadas).
FC, bpm
-50
-40
-30
-20
-10
0
30 min após PD
15 min após PD
5 min após PD
Antes da Microinjeção de PD
Sham
Sedentários
Sham
Ativos
2R1C
Sedentários
2R1C
Ativos
92
4.11. Avaliação histológica da CVLM
A Figura 33 apresenta uma fotografia e um esquema da superfície ventral do bulbo
(painel A) ilustrando o posicionamento típico (ântero-posterior e latero-lateral) das
microinjeções na CVLM. O painel B mostra uma fotografia de um corte histológico típico da
CVLM ilustrando a localização do centro das microinjeções na CVLM e a lesão provocada
pela micropipeta de vidro e um diagrama de corte frontal do bulbo do atlas de PAXINOS e
WATSON, 1986.
A análise dos cortes histológicos dos animais desse estudo mostra que as
microinjeções de Ang II, salina e PD123319 estavam confinadas à porção ventral dos
núcleos reticular lateral, a uma distância de 0,7 mm rostral e 1,8 mm lateral ao óbex,
respectivamente os esquemas 71 a 73 do Atlas de Paxinos e Watison, 1986.
B
Figura 33 - Painel A- Fotografia da superfície ventral do bulbo ilustrando o
posicionamento típico (seta vermelha) das microinjeções na CVLM. À direita da foto,
diagrama da superfície ventral do bulbo ilustrando a localização das diferentes áreas de
controle cardiovascular. Painel B- Fotografia de um corte frontal do bulbo ilustrando o
centro da microinjeção em um animal. À direita da foto, diagrama de corte frontal do bulbo
extraído do Atlas de PAXINOS e WATSON (1986), mostrando a localização do centro de
todas as microinjeções do presente estudo (círculos cinza). Amb= núcleo ambíguo; IO=
núcleo olivar inferior; NTS= núcleo do trato solitário; nXII= núcleo do hipoglosso; Py= trato
piramidal.
RVLM
CPA
CVLM
A
RVLM
CPA
CVLM
RVLM
CPA
CVLM
A
-
13.68 mm posterior
ao
bregma
Amb
nXII
py
IO
NTS
Amb
nXII
py
IO
NTS
93
DISCUSSÃO
94
5. DISCUSSÃO
Os resultados obtidos no presente estudo, em síntese, mostram que o exercício
físico de baixa intensidade provoca uma melhora significante dos parâmetros
cardiovasculares em ratos com hipertensão renovascular, acompanhada por uma alteração
na responsividade dos receptores AT
2
nos neurônios da CVLM em ratos com hipertensão
2R1C. Além disso, os animais hipertensos, sedentários e ativos e Sham ativos
apresentaram maior ingestão hídrica, hipertrofia cardíaca, níveis séricos elevados de uréia.
Porém, os animais submetidos à atividade física de baixa intensidade apresentaram
adaptações desses parâmetros em decorrência da atividade física.
Alguns aspectos metodológicos devem ser considerados na interpretação de nossos
resultados. Uma limitação encontrada para a interpretação dos nossos dados refere-se ao
fato de que nossos experimentos foram realizados em animais anestesiados, um estado
que sabidamente pode interferir com os diferentes parâmetros cardiovasculares avaliados.
Além disso, as respostas cardiovasculares provocadas por angiotensinas centralmente ou a
reatividade das diferentes vias eferentes podem ser modificadas pelo anestésico. O
anestésico escolhido, a uretana é muito utilizada em experimentos com animais,
principalmente por causa de sua ação anestésica de longa duração e propriedades
relaxantes da musculatura esquelética (STROBEL e WOLLMAN, 1969). Além disso, a
uretana produz uma condição de anestesia cirúrgica que é caracterizada por apenas uma
pequena diminuição da atividade do sistema nervoso autônomo, o que torna este
anestésico um dos mais apropriados para o estudo da função cardiovascular (MAGGI e
MELI, 1986). A uretana produz depressão tanto das respostas pressoras como depressoras
decorrentes da estimulação do SNC. Assim, o efeito depressor da uretana não é seletivo,
isto é, tanto as respostas pressoras como as depressoras são afetadas de maneira
semelhante, ao passo que outros anestésico (que atuam mais mimetizando ou aumentando
os efeitos do GABA no SNC) abolem seletivamente as respostas depressoras e as
convertem, frequentemente em episódios pressores (LALLEY, 1980). Por outro lado, os
estudos de microinjeção no SNC em animais não anestesiados envolvem a implantação
crônica de cânulas metálicas (MICHELINI e BONAGAMBA, 1990; LACERDA, 1996;
FONTES e cols., 1997) que determinam uma lesão mecânica mais extensa no tecido a ser
estudado. As micropipetas de vidro usadas em nossos experimentos possuem um diâmetro
que variavam entre 100 a 150 m, produzindo um dano mínimo às áreas circunvizinhas à
microinjeção.
95
Uma outra questão que sempre é levantada em estudos de microinjeção central é a
possibilidade de que parte do efeito observado seja devido a um extravazamento do
peptídeo para a periferia. Na periferia, a Ang II produz aumento da pressão arterial
decorrente de uma potente vasoconstrição, através da ativação de subtipo de receptores
AT
1
de angiotensina (OSEI e cols., 1993; PORSTI e cols., 1994 ; BROSNIHAN e cols.,
1996). Desta forma, a possibilidade de que os efeitos produzidos pela Ang II e seu
antagonista de receptor AT
2
, PD123319, na VLM possam ser devido a um extravasamento
deste peptídeo para a periferia é muito pequena, principalmente devido à ação hipotensora
da Ang II na CVLM (ALZAMORA e cols., 2002 e 2006).
5.1 AVALIAÇÃO DE DIFERENTES PARÂMETROS DA HIPERTENSÃO
RENOVASCULAR
5.1.1 Pletismografia de Cauda
Os resultados do presente estudo mostram, em relação ao desenvolvimento da
hipertensão mensurada pela avaliação da PA através da pletismografia de cauda, realizada
semanalmente após a realização das cirurgias (2R1C e Sham) que houve um aumento
significativo da PA já na primeira semana após a cirurgia nos grupos 2R1C, sedentário e
ativo em relação ao grupo Sham. Observou-se também que o grupo 2R1C ativo apresentou
durante as duas primeiras semanas valores de PA mais elevados que o grupo 2R1C
sedentário, sendo que esta diferença deixou de existir na terceira semana e retornou a
aparecer na quarta semana, porém em sentido contrário, ou seja, ocorreu uma redução de
PA dos ratos 2R1C ativos em relação aos ratos 2R1C sedentários.
Nossos dados corroboram com trabalhos anteriores, uma vez que a partir da terceira
semana após as cirurgias e da atividade física, os ratos dos grupos 2R1C sedentário e
ativo, apresentaram valores de PA semelhantes e na quarta semana após as cirurgias e
atividade física, os ratos 2R1C ativos apresentaram valores de PA inferiores aos
observados nos animais hipertensos sedentários. Esses dados sugerem um processo de
adaptação ocorrido nos animais hipertensos submetidos ao exercício físico e mostram
também que a atividade física de baixa intensidade foi efetiva em reduzir os níveis de
hipertensão. Também em nosso estudo, os valores de PA elevados a partir da primeira
semana após a cirurgia, observado nos animais submetidos à cirurgia 2R1C (sedentários e
Ativos) sugerem um aumento nos níveis de Ang II circulantes.
Está estabelecido que SRA possui um importante papel na regulação da PA
durante o desenvolvimento da hipertensão renovascular (DeFORREST e cols.1982). No
96
modelo de hipertensão renovascular unilateral (2R1C de Goldblatt) a estenose da artéria
renal estimula o SRA. A contribuição do SRA neste modelo varia dependendo do tempo
decorrido após a constrição da artéria renal (MARTINEZ-MALDONADO, 1991). Na fase
aguda da hipertensão 2R1C, a atividade da renina plasmática está elevada e o aumento da
PA é dependente do SRA. PLOTH, 1983 e MITCHELL e colaboradores, 1995 mostraram
que os efeitos diretos e indiretos do aumento das concentrações de Ang II circulante
conjuntamente aos aumentos dos níveis circulantes de aldosterona e da atividade aferente
simpática, dependentes da ação da Ang II, contribuem para a incapacidade excretória do
rim não-clipado. Estas interações contribuem para o desenvolvimento dos estágios iniciais
da hipertensão Goldblatt 2R1C, quando a atividade plasmática da renina e as
concentrações circulantes de angiotensina estão elevadas. No entanto, as concentrações
dos níveis plasmáticos da atividade da renina e Ang II normalizam na fase crônica na
hipertensão 2R1C apesar da manutenção dos elevados níveis de PA (OKAMURA e cols.
1986 e NISHIMURA e cols. 1992).
Embora a Ang II ligue-se aos subtipos de receptor tipo I (AT
1
) e tipo II (AT
2
), é o
receptor AT
1
que media a maioria dos seus efeitos cardiovasculares que podem levar à
hipertensão, incluindo o estresse oxidativo, a liberação de norepinefrina, a vasoconstrição,
a secreção de aldosterona, a reabsorção renal de sódio, a estimulação simpática, a
liberação de vasopressina, a hipertrofia celular vascular e cardíaca e a proliferação celular
dentre outros (NICKENIG e HARRISON, 2002a, b).
WARREN e colaboradores, 2001, mostraram que o exercício físico induz um
aumento nos níveis de Ang II circulantes bem como a liberação de noradrenalina pelos
neurônios simpáticos pós-ganglionares. Este aumento nos níveis circulantes de Ang II e da
atividade simpática durante o exercício contribui para as respostas pressoras observadas
durante a atividade física. Desta forma, os níveis de PA significativamente elevados nos
ratos 2R1C Ativos em relação aos ratos 2R1C sedentários, talvez se deva ao aumento dos
níveis de Ang II e da atividade simpática ocorrida na fase inicial da atividade física (1ª e 2ª
semanas de treinamento) em adição ao aumento de Ang II circulante em decorrência da
estenose renal (cirurgia 2R1C).
HAYASHI e colaboradores, 2000, mostraram que o treinamento físico diminui
significativamente a atividade e a concentração plasmática da renina. As alterações da
atividade da renina plasmática durante o treinamento físico estão relacionadas com o
ganho da capacidade física, uma vez que maior a capacidade física menor é o nível da
atividade da renina plasmática (HESPEL e cols., 1988). BRAITH e colaboradores, 1999,
observaram que após o treinamento físico as concentrações plasmáticas de Ang II,
aldosterona, vasopressina e hormônio natriurético atrial (ANH) diminuem durante o repouso
e em exercício nos pacientes com insuficiência cardíaca.
97
5.1.2 Ingestão Hídrica
Com relação à Ingestão hídrica, que foi avaliada semanalmente, observamos uma
ingestão de água aumentada nos grupos 2R1C, sedentário e ativo e também no grupo
Sham ativo. Durante a primeira e segunda semanas após as cirurgias (2R1C e Sham) e da
atividade física, o aumento da ingestão hídrica observado nos grupos Sham ativo, 2R1C
sedentário e ativo, se deve, muito provavelmente, ao aumento dos níveis de Ang II
circulante, em decorrência da atividade física e da hipertensão renovascular.
Na terceira semana após a realização das cirurgias (2R1C e Sham), foi observado
que os ratos Sham têm sua ingestão hídrica significativamente similar aos ratos Sham
sedentários, indicando que para este grupo de animais a adaptação à atividade físico
ocorre na terceira semana após a cirurgia fictícia (Sham). Entretanto, no grupo 2R1C,
sedentário e ativo, na terceira semana após a cirurgia, ainda há uma ingestão hídrica
elevada em relação ao grupo Sham.
Porém, na quarta semana após a realização da cirurgia 2R1C, observamos uma
redução na ingestão hídrica do grupo 2R1C ativo, que passa a apresentar uma ingestão
semelhante a dos animais do grupo Sham, sedentários e ativos. Os ratos 2R1C
sedentários, no entanto, na quarta semana após a cirurgia mantêm valores elevados de
ingestão hídrica. De forma diferente, os ratos 2R1C ativos diminuíram a ingestão hídrica,
após quatro semanas de atividade física, provavelmente devido à redução dos níveis
circulantes das substâncias do SRA como Ang II, renina e aldosterona em decorrência de
uma adaptação à atividade física (HESPEL e cols., 1988; BRAITH e cols., 1999 e HAYASHI
e cols., 2000).
Os mecanismos que mantêm a homeostase hidroeletrolítica ainda não são bem
entendidos. A normalidade hidroeletrolítica e suas conseqüências fisiológicas têm
constituído o foco de muitos estudos. A ingestão hídrica, muitas vezes tem sido vista como
um dos muitos mecanismos regulatórios do volume e da osmolaridade corporal (JORDAN e
cols, 200).
Diversos peptídeos vasoativos, dentre eles a Ang II, que circulam no plasma e são
produzidos em diversos tecidos inclusive o cérebro (STANDAERT e cols., 1988) também
atuam no SNC alterando a ingestão hídrica (SAMSON e cols., 1991). Existem diversas vias
centrais peptidérgicas que são capazes de modular a ingestão hídrica e podem exercer um
papel sobre a PA e regulação osmótica. Esses diversos sistemas peptidérgicos podem
modular a ingestão hídrica através de alterações na função barorreceptora e da regulação
da osmolaridade do fluido extracelular (MURPHY e cols., 1995).
A restrição ao fluxo sanguíneo renal que ocorre na hipertensão renovascular (1R1C
ou 2R1C) aumenta imediatamente os níveis plasmáticos de renina e Ang II que causa
alteração na ingestão de água e sódio correlacionado a vários estágios dessa hipertensão.
98
No modelo 2R1C em que a isquemia de um dos rins não afeta todo o tecido renal (ver
adiante nossa discussão sobre a histologia renal), os níveis circulantes de renina e Ang II
permanecem elevados por muito tempo para depois diminuírem, ocorre inicialmente maior
retenção de água e sódio sem que ocorra aumento do volume sanguíneo (FAZAN e cols.,
2001). Porém, a retenção de sódio nem sempre tem sido observada (FITZSIMONS e
TURKISH, 1989). Dentro de poucas horas e por até duas ou três semanas após a cirurgia
para a realização da clipagem do rim, ocorre aumento da ingestão de água sendo que a
ingestão de sódio se matém inalterada. A remoção do clip ou altas doses de captropil,
substância que impede a formação de Ang II, após sete ou 14 dias da contrição renal
restaura a PA e a excessiva ingestão de água. A Ang II estimula o aumento da ingestão de
água por agir diretamente em estruturas no cérebro ou indiretamente através de seus
efeitos sobre o balanço hidroeletrolítico. Em adição, trabalhos que mostram aumentos da
ingestão de sódio sugerem um efeito direto da Ang II ou indireto através da estimulação da
aldosterona (FAZAN e cols., 2001). Em estágios crônicos (acima de quatro semanas) da
hipertensão renovascular ocorre persistente elevação da ingestão de sódio e relativa
aversão ao sódio (FORMAN e FALK, 1979). Nossos dados estão de acordo com estes
autores e mostram que ratos com hipertensão 2R1C, na primeira, segunda, terceira e
quarta semanas após a cirurgia ocorre um aumento da ingestão de água nos ratos
sedentários, sendo que atividade física reduz esta ingestão somente na quarta semana da
cirurgia. Porém, em nosso estudo, não avaliamos a ingestão de sódio.
KRAEMER e cols., 1999, em um estudo realizado com homens adultos, mostraram
que o exercício físico afeta dramaticamente a secreção hormonal e a regulação dos fluidos
corporais, uma vez que aumenta os níveis plasmáticos de noradrenalina, dopamina,
peptídeo atrial e ácido lático. Em adição, durante a atividade física, ocorre também aumento
do metabolismo corporal que pode aumentar a osmolaridade plasmática e estimular a
ingestão hídrica.
Em nosso estudo, no entanto, acreditamos que o aumento da ingestão de água se
deve em parte a um possível aumento da osmolaridade em decorrência do aumento do
metabolismo e do aumento dos níveis plasmáticos de uréia (ver adiante na discussão), bem
com a hiperatividade do SRA nos animais submetidos à atividade física e nos animais com
hipertensão renal.
Há duas importantes alterações ocorridas durante a atividade física que atuam
sobre o volume de líquidos corporal. A primeira se refere ao aumento da osmolaridade
plasmática e a segunda ao aumento da acidose plasmática. Esses parâmetros estão
aumentados principalmente devido ao aumento de células vermelhas no sangue durante a
atividade física em alta intensidade e estão moderadamente alterados em atividade física
de baixa e média intensidade. Durante a atividade física de alta intensidade a osmolaridade
99
plasmática pode aumentar cerca de até 40 mosmol/ Kg H
2
O. A causa do aumento da
osmolaridade não é devido ao aumento da concentração de eletrólitos tais como Na
+
, K+ ou
Cl
-
. Os movimentos dos íons são acompanhados por movimentos da água, uma vez que
existe uma grande permeabilidade para a água nas células musculares (SEJERSTED e
cols. 1982). Assim, como os íons são seguidos pela água, a osmolaridade permanece
inalterada, apesar dos volumes dos compartimentos internos poderem estar alterados. A
causa para o aumento da osmolaridade é devido ao aumento da produção de metabólitos
dentro das células musculares. Parte dos metabólicos (lactato e produtos da quebra de
fosfocreatina) acumula-se dentro das células, aumentando o transporte de água do espaço
intersticial e do sangue para dentro das células (BÖNING e cols., 1984) e
consequentemente, aumentando a osmolaridade plasmática.
5.1.3 Avaliação do peso Corporal
Com relação ao peso corporal dos animais experimentais, que foi avaliado
semanalmente, nossos resultados mostram que o exercício físico de baixa intensidade ao
qual os ratos Sham e 2R1C foram submetidos, não promoveu alterações de peso em
relação aos animais do grupo Sham sedentários.
Embora exista uma relação clássica entre exercício físico e ganho de massa
muscular ou ganho de peso, dados da literatura (MEDEIROS e cols., 2004 e
EVANGELISTA e cols., 2003) em camundongos e ratos Wistar jovens utilizando protocolo
de treinamento com carga de 2 a 5% do peso corporal não observaram aumento de peso
corporal dos animais em relação aos animais sedentários. Em nossos estudos, utilizando
protocolo de atividade física de baixa intensidade, em que não foi utilizado sobrecarga de
peso, também não foi observado ganho de peso nos animais. Corroborando com esses
dados, a análise histológica qualitativa que foi realizada nesses animais não nos permitiu
observar alterações significativas com relação à hipertrofia muscular, aumento de fibras ou
mesmo células musculares.
No entanto, os animais 2R1C sedentários na primeira e segunda semana após a
cirurgia 2R1C apresentaram redução do peso corporal, provavelmente devido ao estresse
produzido pela cirurgia 2R1C, porém os animais 2R1C ativos não apresentaram redução de
peso, talvez porque a atividade física tenha melhorado as condições físicas desses animais
no período pós-operatório.
Esta redução no peso dos ratos 2R1C sedentários na 1ª e 2ª semanas após a
cirurgia, sugere que os níveis elevados de Ang II, que caracterizam esse modelo de
hipertensão, possam interferir no processo de cicatrização da cirurgia abdominal pelas
ações pró-inflamatórias da mesma. A Ang II possui um significante papel na iniciação e
manutenção dos processos inflamatórios. A inibição das ações da Ang II por inibidores da
100
ECA e por antagonistas de Ang II bloqueia os efeitos anti-hipertensivos e antinflamatórios
da Ang II (FERRARIO e STRAWN, 2006).
Em relação aos ratos 2R1C ativos, alguns dados na literatura nos induzem a pensar
que a atividade física tenha melhorado as condições físicas desses animais no período pós-
operatório. A concentração de cortisol aumenta muito em exercícios de longa duração e em
menor quantidade em exercícios de curta duração (60 minutos) (CHRISTENSEN e cols.,
1983). Não há dúvidas que a atividade física altera a concentração de células
imunocompetentes e influencia a função imunológica (CANNON e KLUGER, 1984; ILBACK
e cols., 1991). Estes efeitos são mediados por diversos fatores incluindo a indução da
liberação de citocinas e os clássicos hormônios estimulados por estresse (catecolaminas,
hormônio do crescimento, cortisol, glutamina e outros). Em geral, exercícios de grande
intensidade e longa duração induz imunossupressão e aumenta a susceptibilidade à
doenças infecciosas, enquanto exercício de baixa ou moderada intensidade parece
aumentar a resistência à infecções (CANNON & KLUGER, 1984; ILBACK e cols., 1991).
5.1.4 Avaliação do Peso dos Rins
O peso seco relativo do rim esquerdo (clipado) dos ratos 2R1C foi menor que o peso
seco relativo do rim direito (não clipado). O rim direito, contralateral, dos ratos 2R1C,
sedentários e ativos, foi maior quando comparado com rim direito de ratos Sham, sugerindo
uma hiperfunção compensatória. Nos animais do grupo Sham não houve diferença entre o
peso seco relativo dos rins direito e esquerdo destes animais.
Em adição, a porcentagem de redução do peso seco relativo do rim esquerdo
(clipado) sobre rim direito (não-clipado) no grupo 2R1C, sedentário e ativo foi similar.
Nossos dados mostram que embora o percentual de redução do rim clipado em relação ao
não clipado, seja semelhante entre os ratos do grupo 2R1C (sedentários e ativos), os
animais hipertensos ativos apresentam valores de PA reduzidos em relação aos ratos
2R1C sedentários, sugerindo que a cirurgia para produção da hipertensão 2R1C foi
eficiente tanto nos ratos 2R1C sedentários como nos 2R1C ativos e a redução da PA se
deve realmente à atividade física de baixa intensidade. Como era de se esperar, não foi
observada diferença na porcentagem de redução entre os pesos secos relativos dos rins
direito e esquerdo dos ratos Sham.
LUPU e colaboradores, 1972, mostraram que reduções muito intensas no fluxo renal
unilateral (maior que 50%) podem levar a estados hipertensivos mais prolongados, sendo a
severidade da hipertensão proporcional ao grau de obstrução da artéria renal. Em nosso
estudo, no entanto, não analisamos o fluxo sanguíneo renal, porém, percebemos, através
da análise histológica, que animais que apresentaram um percentual de redução do peso
101
seco relativo do rim esquerdo em relação ao direito, superior a 40% apresentavam
comprometimento da estrutura renal, com intensa degeneração, inflamação, pigmentação,
calcificação e fibrose. Os animais do nosso estudo que apresentaram comprometimento
estrutural do órgão, ou seja, pontos visíveis de isquemia, foram excluídos. Uma intensa
constrição da artéria renal pode levar a um comprometimento funcional do rim e não
caracteriza o modelo 2R1C.
A análise histológica das estruturas renais do rim esquerdo (não clipado) nos
permite observar que as raras alterações patológicas (esclerose glomerular e inflamação)
presentes no grupo Sham sedentário apresentaram-se diminuídas ou ausentes no grupo
Sham ativo. Foi observado um aumento da dilatação tubular nos ratos Sham ativos.
Acreditamos que este aumento na dilatação tubular esteja relacionado a um aumento no
fluxo sanguíneo neste órgão, efeito proveniente do exercício físico e que não
necessariamente está relacionado com comprometimento no funcionamento do órgão.
Já no grupo hipertenso, a análise histológica do rim esquerdo (clipado) mostrou que
praticamente todos os parâmetros avaliados (congestão, degeneração tubular focal, fibrose,
inflamação e dilatação tubular) apresentaram-se elevados nos ratos 2R1C sedentários em
relação aos ratos Sham sedentários, no entanto, esses parâmetros foram reduzidos no
grupo 2R1C ativo, mostrando que o exercício físico foi eficiente em reduzir os efeitos
deletérios impostos ao rim clipado no modelo de hipertensão 2R1C. Foi observado um
aumento da esclerose glomerular ns ratos 2R1C sedentários em relação aos ratos Sham.
Com relação à presença de depósitos protéicos apenas o grupo hipertenso sedentário teve
essa alteração manifestada tanto no rim esquerdo quanto no direito.
A análise histológica do rim direito (não-clipado), no grupo Sham ativo, foi observada
redução da congestão, esclerose glomerular e inflamação quando comparado com os
animais do grupo Sham sedentário. Já com relação à degeneração tubular focal e dilatação
tubular, foi observado aumento desses parâmetros no grupo Sham ativo em relação aos
Sham sedentários. Acreditamos que este aumento da dilatação tubular esteja relacionado a
um aumento no fluxo sanguíneo neste órgão, efeito proveniente do exercício físico e que
não necessariamente está relacionado com comprometimento no funcionamento do órgão.
Em relação à degeneração tubular focal, vale lembrar que este processo nem sempre
culmina em morte celular, com fibrose e comprometimento na capacidade funcional do
órgão. O processo degenerativo geralmente é uma reação celular a algum agente externo
que de alguma forma possa estar dificultando o seu funcionamento, diante desta dificuldade
que lhe está sendo imposta a célula tem como se adaptar e voltar a funcionar normalmente
ou então, perdendo totalmente sua função.
De forma semelhante ao observado no grupo Sham ativo, no grupo hipertenso
houve aumento na manifestação de alguns parâmetros (degeneração tubular focal,
102
esclerose glomerular e inflamação) e redução na manifestação de outros (congestão e
fibrose) quando comparamos os animais do grupo 2R1C ativo com os 2R1C sedentários.
Neste caso, o exercício parece estar de alguma forma retardando um processo patológico,
pois embora no grupo ativo tenha mais degeneração tubular focal e mais inflamação, a
quantidade de células fibrosadas diminui no grupo 2R1C ativo em relação aos sedentários.
Estudos posteriores se fazem necessários a fim de verificar se mantendo-se o treinamento
físico por mais algumas semanas estas células teriam uma tendência de recuperação ou se
o exercício, na verdade implicaria, em um fator de agravamento de processos patológicos
renais preexistentes. Com relação à dilatação tubular não houve alteração com relação a
este parâmetro neste grupo de animais.
Uma avaliação histológica geral do rim esquerdo (clipado) em relação ao rim direito
(não clipado) mostra maior comprometimento patológico do rim clipado em relação ao rim
não clipado e fazendo uma correlação com nossos dados em que o rim contra-lateral (não
clipado) apresentou aumento do peso seco, podemos sugerir uma hiperfunção
compensatória. Esses dados (menor comprometimento patológico e aumento do peso seco
do rim não clipado) talvez possam estar relacionados a dados da literatura que sugerem
que o rim não clipado seja o responsável pela manutenção da hipertensão no modelo 2R1C
(NAVAR e cols., 1998)
5.1.5 Avaliação do Peso do Coração
Ainda em se tratando de peso de órgãos, nossos resultados mostram que houve
hipertrofia cardíaca, ou seja, aumento no peso seco do coração nos grupos Sham ativo,
2R1C sedentário e 2R1C ativo.
Em nosso estudo, a hipertrofia cardíaca nos ratos 2R1C, sedentários e ativos, foi
devido a um aumento no peso seco dos ventrículos em relação ao grupo Sham. No
entanto, no grupo Sham ativo, a hipertrofia cardíaca ocorreu devido a um aumento no peso
seco dos átrios. Resultado semelhante foi observado por EVANGELISTA e colaboradores,
2003, em estudos realizados com camundongos e utilizando sobrecarga de peso de 2 a 4%
do peso corporal submetidos a natação duas vezes ao dia por 60 minutos e por 6 semanas.
Apesar dessa diferença encontrada por nós, em relação ao peso dos átrios em ratos
normotensos ativos, devemos considerar a grande dificuldade metodológica em separar os
átrios devido sua estrutura anatômica.
A análise histológica das estruturas cardíacas mostra uma redução na degeneração
cardíaca nos ratos Sham ativos quando comparados com os animais Sham sedentários,
mostrando a eficiência do exercício físico em reduzir eventuais alterações patológicas em
103
animais normotensos. Não foi observada alteração na inflamação ventricular focal no grupo
Sham ativo em relação ao grupo Sham sedentário, porém foi observado um espessamento
excêntrico da parede ventricular, aumento a luz do órgão, no grupo Sham ativo em relação
aos ratos sedentários (Sham e 2R1C). Este achado é importante porque embora não
tenhamos observado bradicardia de repouso no grupo normotenso ativo esta alteração na
morfologia cardíaca é também um indicador de adaptação crônica ao exercício físico.
Já no grupo hipertenso, a análise histológica mostra que no grupo 2R1C ativo foi
observada uma redução no espessamento da parede ventricular e vascular em
comparação aos ratos 2R1C sedentários. Este achado também lança nova luz sobre
nossos resultados, mostrando que a hipertrofia concêntrica, que reduz sobremaneira a luz
do coração, dificultando o trabalho cardíaco se encontra reduzida no grupo 2R1C ativo.
Também no grupo hipertenso ativo foi observada uma redução na fibrose e um
aumento na degeneração e inflamação ventricular focal em comparação aos animais 2R1C
sedentários. Neste caso, mais uma vez, de forma semelhante aos processos patológicos e
degenerativos observados nos rins, o exercício parece estar de alguma forma retardando
um processo patológico, pois embora o grupo ativo apresente mais degeneração cardíaca e
mais inflamação, a quantidade de células fibrosadas diminui no grupo 2R1C ativo em
relação aos sedentários. Contudo, estudos posteriores se fazem necessários a fim de
verificar se mantendo-se o treinamento físico por mais algumas semanas estas células
teriam uma tendência de recuperação ou se o exercício, na verdade, implicaria em um fator
de risco e agravamento de processos patológicos cardíacos preexistentes.
Nossos resultados corrobram com trabalhos anteriores que mostram que a
hipertrofia cardíaca pode acontecer como uma resposta adaptativa fisiológica (atividade
física) ou patológica (doenças valvulares, hipertensão ou obesidade) ao aumento do
trabalho cardíaco (HUNTER e cols., 1999 e SCHEUER e cols., 1982). Durante a atividade
física o aumento metabólico induz um aumento do débito cardíaco levando, em curto prazo,
ao incremento da PA, FC, contratilidade do miocárdio e aumento da resistência periférica
total. Em logo prazo, o exercício físico melhora a função cardíaca por alterar o fenótipo
celular e molecular dos miócitos cardíacos, incluindo alterações adaptativas no tamanho da
célula, função contrátil, transporte de cálcio e resistência para alterações metabólicas. Em
ratos saudáveis ocorre um aumento tempo dependente na massa cardíaca e do tamanho
das células durante o treinamento físico. O aparente crescimento longitudinal dos
cardiomiócitos por acréscimos de sarcômeros em série são evidentes em estudos sobre o
efeito do treinamento físico sobre a massa de miocárdio (WISLOFF e cols., 2001). Este
mecanismo celular induz uma hipertrofia ventricular excêntrica que ocorre em humanos e
animais submetidos a programas de treinamento físico. Estudos de SCHAIBLE e
SCHEUER, 1981, demonstraram que em ratos o treinamento físico com natação pode
104
promover um aumento na relação peso coração sobre o peso corporal em valores que
variam de 12 a 31%. Os cardiomiócitos constituem cerca de 75% do volume total do
miocárdio, mas corresponde somente a um terço de todas as células (BRAUNWALD,
1997). O tamanho da célula varia consideravelmente no mesmo coração e depende se
trata-se de um coração normal, submetido à atividade física ou doente.
EVANGELISTA e cols., 2003, mostraram que a natação é bem reconhecida por ser
efetiva em induzir a hipertrofia do miocárdio do ventrículo esquerdo e aumentar o volume
diastólico final em ratos (GEENEN e cols., 1988). A natação se mostra mais efetiva na
produção da bradicardia de repouso do que a corrida (SCHAIBLE e SCHEUER, 1979).
Contudo, os mecanismos envolvidos na bradicardia produzida pela natação ainda não são
totalmente compreendidos.
5.1.6 Avaliação da Creatinina Plasmática
Neste estudo a dosagem de creatinina plasmática foi utilizada como um indicador de
treinamento e ganho de massa muscular, uma vez que existe uma correlação entre
concentração de creatinina e índice de massa corporal (IMC) em atletas de elite oriundos
de diferentes esportes caracterizados por diferentes treinamentos, em intensidades
variadas e envolvendo tanto o metabolismo aeróbico como anaeróbico (BANFI e cols.,
2006).
Em nosso estudo, os níveis séricos de creatinina nos ratos 2R1C (sedentários e
ativos) foram similares aos níveis de creatinina nos animais Sham (sedentários e ativos)
mostrando que nem a hipertensão 2R1C, nem a atividade física de baixa intensidade
alteraram os níveis séricos de creatinina.
5.1.7 Avaliação da Uréia Plasmática
Em nosso estudo, a dosagem sérica de uréia foi significativamente diferente entre
os grupos de animais, tanto comparando o efeito da hipertensão renovascular (Sham
sedentários e 2R1C sedentários) como o efeito do treinamento (Sham ativos e 2R1C
ativos). Estas diferenças foram significativas em relação à hipertensão 2R1C e ao
treinamento. FAZAN e colaboradores, 2001, mostraram que a função renal, em termos de
uréia e creatinina sanguíneas bem como o “clearance” de inulina ou p-aminopurato é
normal na hipertensão de Goldblatt, tanto 2R1C como 1R1C, nossos dados estão de
105
acordo com FAZAN e colaboradores em relação à creatinina, porém contrários em relação
à uréia.
Muitos estudos têm indicado que o exercício aumenta a concentração sérica de
uréia, a excreção urinária e as perdas através do suor. Além disso, tem-se mostrado que a
ureagênese aumenta durante o exercício (WASSERMAN e cols, 1991). A captação de
aminoácidos pelo fígado aumenta durante o exercício em cães, sugerindo que estes
aminoácidos sejam usados para aumentar a gliconeogênese durante o exercício
(WASSERMAN e cols. 1991). De acordo com esses dados, foi reportado que a glicose
administrada com aminoácidos antes ou durante o exercício reduz a ureagênese hepática
devido a redução na gliconeogênese hepática, em comparação com a administração
isolada de aminoácidos (HAMADA e cols, 1998). Além do aumento na gliconeogênese a
formação de uréia também precisa ser aumentada para processar a amônia liberada pelo
músculo em atividade (FERREIRA e cols. 1998).
5.2 AVALIAÇÃO DIRETA DOS PARÂMETROS CARDIOVASCULARES
Em síntese, os resultados obtidos no presente estudo demonstram que o exercício
físico de baixa intensidade é efetivo em reduzir a PA, a FC e em restaurar a sensibilidade
da bradicardia barorreflexa em ratos com hipertensão renovascular. Além disso, a Ang II
microinjetada na CVLM produz um efeito hipotensivo similar em ratos Sham e 2R1C,
sedentários e ativos. Este efeito hipotensivo foi significativamente bloqueado pelo
antagonista, PD123319, em ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos. Em adição, o
antagonista de receptor AT
2
para Ang II, PD123319, induziu uma redução na PA, após sua
microinjeção na CVLM de ratos 2R1C sedentários, sendo que este efeito hipotensivo foi
atenuado nos ratos 2R1C submetidos à atividade física de baixa intensidade.
5.2.1 Avaliação da PAM e FC
Em nosso estudo foi observada uma significativa redução da PAM e FC somente
nos animais 2R1C submetidos à atividade física e não foram observadas diferenças
significativas na PA e FC no grupo Sham, sedentários ou ativos. Apesar da diminuição da
FC cardíaca ser considerada um marcador de atividade física, a anestesia, em nosso
estudo, pode ter impedido a dimiuição da FC no grupo Sham ativo, conforme já discutimos
em considerações metodológicas. O fato da FC basal não ter sido alterada no grupo Sham
ativo está de acordo com estudos prévios, realizados também com ratos anestesiados
(BECKER e cols., 2005 e CARVALHO e cols., 2003).
106
O endotélio possui uma importante participação na regulação do fluxo sanguíneo e
da PA. O tônus vascular está sobre o controle de fatores locais e sistêmicos, e é o
resultado entre o balaço de substâncias vasodilatadoras e vasoconstritoras. Localmente, a
autorregulação do tônus vascular ocorre especialmente em resposta a estímulos
mecânicos. Dados da literatura (HILTON, 1959) em vasos da coronária epicárdica sugerem
que o exercício físico induz aumento do “shear stress” no endotélio que é proporcional à
vasodilatação. O mecanismo pelo qual o estímulo mecânico estimula o aumento do fluxo
sanguíneo devido ao aumento da vasodilatação não está ainda bem entendido, mas parece
que a deformação do citolesqueleto provocada pelo “shear stress” induz a liberação de
substâncias vasodilatadoras tais como, óxido nítrico, prostaciclina (PGI2), bradicinina, etc e
por outro lado, diminui substâncias vasoconstritoras tais como, endotelina, fatores de
ativação plaquetárias dentre outras (CINES e cols., 1998).
Está bem estabelecido o papel do treinamento físico como modulador da PA,
enfatizando a importância do esporte como um mecanismo terapêutico. Investigações
(LAUGHLIN e McALLISTER, 1992) mostram a parede vascular como alvo de ação do
exercício físico e das várias adaptações benéficas ao exercício físico crônico. Apesar do
efeito agudo aumentando o fluxo sanguíneo, evidências sugerem que aumentos crônicos
do fluxo sanguíneo induzidos por atividade física regular, exercem um efeito benéfico sobre
a reatividade vascular. Esta adaptação tem sido sugerida no sentido de aumentar as
respostas vasodilatadoras e atenuar a vasoconstrição por agentes vasoativos (LAUGHLIN
e McALLISTER, 1992).
Estudos em SHR têm mostrado que o exercício físico de baixa intensidade é efetivo
na redução da FC e do DC, atenuando, consequentemente, a hipertensão em SHR
(VÉRAS-SILVA e cols., 1997 e TIPTON, 1999). Nossos dados, no grupo 2R1C ativo, estão
de acordo com esses autores, pois a atividade física de baixa intensidade foi efetiva em
reduzir a PAM e FC, melhorando a função cardiovascular em ratos com hipertensão
renovascular.
Para elucidar os mecanismos através dos quais o exercício físico de baixa
intensidade causa a bradicardia, uma variedade de estudos (GAVA e cols., 1995 e
KRIEGER e cols., 1999) tem mostrado uma atenuação no tônus simpático, mas não no
tônus vagal, que se mantêm inalterado, em ratos SHR. Acredita-se que o exercício físico de
baixa intensidade é capaz de trazer o tônus simpático para níveis normais. Um aumento na
bradicardia de repouso após o exercício tem sido observado em estudos com hipertensos
(PAGANI e cols., 1988 e KRIEGER e cols., 1999).
A avaliação da PA antes (medida indireta – pletismografia) e após a anestesia
mostrou que nos animais 2R1C (sedentários e ativos) após duas horas da anestesia
apresentaram diminuição significativa da PAM, sendo que nos animais dos grupos Sham
107
(sedentários e ativos) não apresentaram alteração da PAM após duas horas sob anestesia,
sugerindo que somente os ratos com hipertensão renovascular sofram interferência do
anestésico. Essa interferência do anestésico sobre a PAM dos ratos 2R1C provavelmente
deva acontecer sobre a hiperatividade simpática que acontece nesse modelo de
hipertensão. MINAMI e colaboradoes, 2003 mostraram em SHR um maior nível de PAM e
FC mensurados indiretamente através da plestimografia de cauda em relação à medida
direta (trandutor de pressão) em ratos acordados e sugeriram que durante a medida
indireta ocorra um aumento da atividade simpática devido ao estresse da metodologia
como restrição, calor e manuseio.
5.2.2 Administração Intravenosa de Ang II iv
Com o objetivo de verificar se a atividade física poderia alterar o efeito provocado
pela injeção intravenosa Ang II e PD123319, nós avaliamos as alterações nos valores
basais de PAM e FC produzidas por injeções intravenosas de Ang II, pelo antagonista de
receptor AT
2
, PD123319, em ratos Sham e 2R1C, sedentários e ativos.
Em nossos estudos o antagonista de receptor AT
2
, PD123319, perifericamente não
alterou os níveis basais de PAM tanto nos grupos Sham como nos 2R1C, sedentários ou
ativos. No grupo Sham sedentário, a injeção intravenosa de Ang II produziu efeito
hipertensor que não foi abolido pela injeção intravenosa de PD123319, mostrando que o
antagonista de receptor AT
2
é incapaz de abolir o efeito pressor da Ang II perifericamente.
Já no grupo Sham ativo, porém, o PD123319, administrado perifericamente, reduziu a
resposta pressora induzida pela Ang II.
De modo semelhante ao grupo Sham sedentário, no grupo 2R1C a injeção
intravenosa de PD123319 não foi capaz de abolir o efeito pressor da Ang II perifericamente.
Também da mesma maneira observada no grupo Sham ativo, no grupo 2R1C ativo, a
injeção intravenosa de PD123319 aboliu o efeito hipertensor da Ang II perifericamente.
Nossos dados sugerem que atividade a física de baixa intensidade altera a responsividade
do receptor AT
2
perifericamente e de importantes vias do SRA que podem estar envolvidas
nas adaptações cardiovasculares da atividade física de baixa intensidade sobre a PA.
A eficiência da Ang II como substância vasoconstritora já está bem estabelecida na
literatura, 1µg pode aumentar a PA do ser humano em 10 a 20 mmHg em algumas
condições. Além disso, a Ang II é um peptídeo hormonal com importantes ações
cardiovasculares, endócrinas e metabólicas, incluindo constrição de vasos sanguíneos,
neuromodulação, apetite pelo sal, estimulação simpática, equilíbrio hidroeletrolítico e
manutenção da homeostase através da liberação de aldosterona, além de efeitos diretos
nos rins e fígado, como aumento da reabsorção de sódio, gliconeogênese e glicogenólise,
108
respectivamente. Estas ações são mediadas principalmente pelo receptor do tipo AT
1
cuja
expressão em humanos é determinada por um único gene, mas que em roedores se
manifesta sob a forma de dois subtipos específicos, AT
1A
e AT
1B
(THOMAS e QIAN, 2003).
Q. LI e colaboradores, 1996, examinaram os mecanismos que mediam a
hipertensão em ratos acordados durante a infusão aguda e crônica de Ang II (50, 100 e 200
ng/ kg/ min) e verificaram que a Ang II age primeiramente no músculo liso vascular durante
a infusão aguda, aumentando a resistência vascular periférica, e posteriormente, através de
vias neurais, durante o tratamento crônico.
Na tentativa de elucidar os mecanismos vasculares envolvidos nas respostas de
cada subtipo de receptor para Ang II, JÖHREN e colaboradores., 2004, verificaram que a
Ang II em baixas concentrações inibe a produção de NO, sendo, neste caso, a
vasodilatação mediada via receptor AT
1
e produção de superóxido. Em altas concentrações,
estes efeitos são antagonizados por efeitos vasodilatadores via ativação de receptor AT
2.
Sendo assim, a Ang II pode exercer efeitos opostos via receptor AT
1
e AT
2
que podem estar
envolvidos na via das cininas e do NO.
De acordo com nossos dados, o antagonista de receptor AT
2
, PD123319,
perifericamente, não alterou os níveis basais de PAM tanto nos grupos Sham como nos
2R1C, sedentários ou ativos. Estudos usando antagonistas farmacológicos de receptor AT
2
concluíram que este receptor não está envolvido na regulação da PA em animais
normotensos e hipertensos (TONEY e PORTER, 1993). Porém, CERVENKA e
colaboradores, 2002, mostraram a importância do receptor AT
1A
para o surgimento e
manutenção da hipertensão 2R1C. Neste mesmo estudo, a infusão aguda de PD123319
(50 µg/kg de peso corporal/ min) não alterou significativamente a PA em camundongos que
possuíam o receptor AT
1A
. Já nos animais “knockout” para o receptor AT
1A
a infusão de
PD123319, pelo contrário, causou um significante aumento na PA dos animais, mostrando
que em situações específicas o receptor AT
2
pode participar da regulação aguda da PA.
Em relação ao efeito da inibição da ação da Ang II pelo PD123319 em ratos
hipertensos, observada nos animais submetidos à atividade física, não existem dados na
literatura e mais estudos são necessários para melhor compreensão de nossos resultados.
5.2.3 Bradicardia Reflexa
Em nosso estudo a bradicardia reflexa dos animais 2R1C sedentários foi
signficativamente menor em comparação aos ratos SHAM sedentários, como
extensivamente mostrado em estudos prévios da literatura (MOREIRA e cols., 1988;
MATSUMURA e cols., 1989; KUMAGAI e cols., 1990; BRITO e cols., 1997 e KRIEGER e
cols., 1999). A redução do reflexo barorreceptor em hipertensos está associado ao aumento
da atividade simpática. É interessante observar que as áreas do SNC desprovidas de
109
barreira hemato-encefálica, estão suscetíveis à modulação pelas angiotensinas circulantes,
cujos níveis estão aumentados em ratos com hipertensão 2R1C. Várias áreas “fora da
barreira hemato-encefálica” participam da modulação do barorreflexo, como a área
postrema que possui conexões com outras áreas bulbares relacionadas com a regulação
cardiovascular (BARNES e cols., 1984). Portanto, os nossos resultados sugerem que as
angiotensinas circulantes exerçam influência sobre a modulação central do barorreflexo, ou
a funcionalidade do SRA cerebral esteja também alterado ou ambos os fatores ocorrendo
no sentido de diminuir a sensibilidade barorreflexa neste modelo de hipertensão.
No entanto, o exercício físico de baixa intensidade foi efetivo em reduzir a elevada
PA e restaurar a sensibilidade da bradicardia barorreflexa em ratos com hipertensão
renovascular. Estes achados estão de acordo com prévios estudos (TIPTON, 1999 e
VÉRAS-SILVA e cols., 1997) que mostram que o exercício físico pode provocar importantes
alterações no sistema cardiovascular em animais e humanos com hipertensão.
Em SHR, no período pós-exercício, observou-se que a resposta bradicárdica
apresenta-se aumentada, enquanto a resposta taquicárdica mantem-se reduzida (SILVA e
cols., 1997 e KRIEGER e cols., 1999). Em adição, um aumento na complacência vascular
também foi observada em humanos após o exercício (KRIEGER e cols., 1999). Um
aumento no “shear stress” durante o exercício pode aumentar a liberação de fatores
endoteliais (KRIEGER e cols., 1999). Todos estes mecanismos podem aumentar a
sensibilidade dos barorreceptores arteriais aferentes, aumentando assim, a sensibilidade da
bradicardia barorreflexa.
5.2.4 Bulbo Ventrolateral Caudal
Nossos resultados mostram que a microinjeção de Ang II na CVLM produz uma
significante redução na PAM no grupo 2R1C similar ao observado no grupo Sham,
sugerindo que não exista uma significante alteração na CVLM para Ang II exógena.
Diversos estudos (ISHIDE e cols., 2005 e ALLY e cols., 2006) têm avaliado o papel
de áreas da VLM sobre a contração muscular estática, contudo, poucos estudos têm
relacionado a interação entre o SRA e a VLM em animais submetidos à atividade física.
BECKER e colaboradores, 2005, mostraram que o exercício físico induz alterações na
resposividade à AngII na RVLM em ratos normotensos. Ao contrário, no presente estudo,
nós observamos que a atividade física de baixa intensidade não modifica o efeito
hipotensivo da Ang II microinjetada na CVLM de animais Sham e 2R1C.
O receptor AT
2
é moderadamente expresso em certos núcleos envolvidos na
regulação cardiovascular como o lócus coeruleus, o núcleo para gigantocelular, o núcleo
reticular medular, núcleo reticular lateral, o NTS e o núcleo ambíguo (LENKEI e cols., 1997
e VEERASINGHAM e cols., 2003) contudo, a contribuição do receptor AT
2
nestas áreas no
110
controle da PA ainda não está esclarecida. No presente estudo nós mostramos que o
antagonista de receptor AT
2
para Ang II, PD123319, atenua significativamente o efeito da
AngII na CVLM por 5 minutos em ratos Sham e 2R1C, sedentários e Ativos, e por 15
minutos apenas nos ratos do grupos Sham, sedentários e ativos e 2R1C ativo, sendo que
nos ratos 2R1C sedentários este antagonista não aboliu o efeito hipotensor da Ang II na
CVLM após 15 minutos. Após 30 minutos de sua microinjeção o PD123319 não foi capaz
de bloquear significativamente o efeito da Ang II tanto no grupo 2R1C como no grupo Sham
(sedentários e ativos).
Nossos dados sugerem, portanto, que o receptor AT
2
pode estar mediando, em
parte, a ação hipotensiva à Ang II exógena na CVLM. AMBUHL e colaboradores, 1992
mostraram que a Ang II microinjetada no núcleo olivar inferior (NOI) tem um efeito
excitatório e que este efeito é mediado por receptores AT
2
. Apesar do PD123319 ter inibido
o efeito hipotensor da Ang II microinjetada na CVLM tanto nos animais Sham como nos
2R1C não podemos descartar completamente a posssiblilidade de que em nosso estudo a
Ang II também possa estar agindo nos neurônios do NOI.
Nossos achados também revelam que a microinjeção de PD123319 na CVLM
produziu um efeito depressor em ratos 2R1C sedentários que foi atenuado em ratos 2R1C
ativos. Não foram observadas mudanças na PAM após a microinjeção de PD123319 na
CVLM de ratos Sham, sedentários ou ativos. HU e colaboradores, 2002, mostraram um
aumento na expressão de receptores AT
1
na RVLM de ratos hipertensos, talvez possa
ocorrer, da mesma forma que ocorre na RVLM, um aumento na expressão de AT
1
na
CVLM. Assim, o bloqueio do receptor AT
2
pelo PD123319 poderia aumentar a ligação de
Ang II endógena ao receptor AT
1
na CVLM, resultando em um aumento no efeito
hipotensivo.
Contudo, estudos anteriores realizados em nosso laboratório não suportam esta
hipótese, uma vez que a microinjeção do antagonista de receptor AT1, losartan, na CVLM,
não alterou a PAM de animais com hipertensão renovascular. Considerando que em muitas
circunstâncias o PD123319 pode interferir na resposta de outros peptídeos ou mesmo
apresentar um efeito agonista, estudos posteriores fazem-se necessários para que
possamos esclarecer melhor estes achados.
Sumarizando nossos resultados, mostramos que a atividade física aeróbica de baixa
intensidade provoca uma diminuição na PAM basal, restaura a bradicardia barorreflexa e
não altera a responsividade à Ang II na CVLM em ratos com hipertensão 2R1C. Nossos
dados, por outro lado, mostram alterações na responsividade do receptor AT
2
na CVLM que
parecem estar envolvidas nos efeitos cardiovasculares da atividade física de baixa
intensidade e importantes vias do SRA que podem participar na homeostase cardiovascular
e na adaptação do exercício físico sobre a hipertensão renovascular.
111
SUMÁRIO E CONCLUSÕES
De tudo ficaram três coisas:
a certeza de que estava sempre começando,
a certeza de que era preciso continuar
e a certeza de que seria interrompido antes de terminar.
Fazer da interrupção um caminho novo,
fazer da queda, um passo de dança,
do medo, uma escada,
do sonho, uma ponte,
da procura, um encontro.
(Fernando Sabino)
112
6. SUMÁRIO E CONCLUSÕES
Em síntese, os resultados do presente estudo mostram:
• Os ratos 2R1C (sedentários e ativos) apresentaram aumento significativo da PA
avaliada por pletismografia na 1ª semana após a cirurgia, em relação ao grupo
Sham. Na 4ª semana ocorreu redução da PA dos ratos 2R1C ativos em relação aos
ratos 2R1C sedentários.
• Os ratos Sham ativos apresentaram ingestão aumentada de água durante a 1ª e 2ª
semanas de natação. De forma diferente, nos ratos 2R1C sedentários houve
aumento da ingestão de água até a 4ª semana, enquanto que nos ratos 2R1C
submetidos à atividade física houve redução a ingestão hídrica na 4ª semana.
• A porcentagem de redução do peso seco relativo dos rins foi similar entre os ratos
2R1C sedentários e ativos.
• Os ratos Sham ativos e 2R1C (sedentários e ativos) apresentaram hipertrofia
cardíaca.
• Os níveis séricos de uréia foram significativamente aumentados nos ratos
submetidos à atividade física (Sham e 2R1C).
• A atividade física somente reduziu a PAM e FC nos ratos 2R1C.
• A uretana alterou a PAM (após 2 horas) somente nos ratos 2R1C (sedentários e
ativos).
• A bradicardia reflexa dos ratos 2R1C sedentários foi significativamente menor em
relação aos ratos Sham sedentários. No entanto, o exercício físico de baixa
intensidade foi efetivo em restaurar a sensibilidade da bradicardia reflexa nos ratos
com hipertensão renovascular.
• A microinjeção de Ang II na CVLM produz uma significante redução na PAM nos
ratos 2R1C (sedentários e ativos) similar aos ratos Sham (sedentários e ativos).
113
• O antagonista de receptor AT
2
, PD123319, inibiu o efeito da Ang II na CVLM por até
15 minutos nos ratos Sham (sedentários e ativos) e 2R1C ativos. Porém, este
antagonista, nos ratos 2R1C sedentários, foi eficaz apenas por 5 minutos.
• Surpreendentemente, a microinjeção de PD123319 na CVLM produziu um efeito
depressor em ratos 2R1C sedentários que foi atenuado nos ratos 2R1C ativos. Não
foram observadas mudanças significativas na PAM após a microinjeção de
PD123319 na CVLM de ratos Sham, sedentários ou ativos.
Os resultados obtidos no presente estudo, mostram que o exercício físico de baixa
intensidade provoca uma significante melhora dos parâmetros cardiovasculares,
acompanhada por uma alteração na responsividade dos receptores AT
2
nos neurônios da
CVLM em ratos com hipertensão 2R1C. Além disso, os animais ativos com hipertensão
2R1C ou Sham apresentaram adaptações sobre a ingestão hídrica, hipertrofia cardíaca e
níveis séricos de uréia, em decorrência da atividade física .
114
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
115
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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129
ANEXOS
130
8. ANEXOS
PRODUÇÃO CIENTÍFICA ASSOCIADA A ESTA DISSERTAÇÃO
Artigo publicado:
RODRIGUES, MC, Campagnole-Santos MJ, Machado RP, Silva ME, Rocha JLM,
Ferreira PM, Santos RAS, Alzamora AC, Evidence for a role of AT2 receptors at the CVLM
in the cardiovascular changes induced by low-intensity physical activity in renovascular
hypertensive rats. Peptides, doi:10.1016, 2007.
Resumos apresentados em eventos internacionais:
RODRIGUES, M.C., Machado, R.P., Silva, M.E., Rocha, J.L.M., Ferreira, P. M.,
Cardoso, V.R., Santos, R.A.S., Campagnole-Santos, M.J, Alzamora, A.C.; Evaluation of
Baroreflex Bradycardia en Renovascular Hypertensive Rats Submitted to Physical
Activity, XLI Congress of the Brazilian Physiological Society & Joint Meeting with The
Physiological Society, Ribeirão Preto, 2006.
RODRIGUES, M. C., Machado, R.P., Silva, M.E., Rocha, J.L.M., Ferreira, P. M.,
Cardoso, V.R., Santos, R.A.S., Campagnole-Santos, M.J, Alzamora, A.C; Cardiovascular
effects induced by physical activity in renovascular hypertensive rats, VI Internacional
Symposium Vasoactive Peptides, Ouro Preto, 2006.
Resumos apresentados em eventos nacionais:
RODRIGUES, M. C., Campagnole-Santos, M.J, Machado, R.P., Silva, M.E., Rocha, J.L.M.,
FERREIRA, P., Santos, R.A.S., Alzamora, A.C.; Atividade física de baixa intensidade restaura a
sensibilidade da bradicardia reflexa em ratos com hipertensão renovascular, XXII Reunião
Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, Águas de Lindóia, 2007.
RODRIGUES, M.C., Machado, R.P., Silva, M.E., Rocha, J.L.M., Ferreira, P. M.,
Cardoso, V.R., Santos, R.A.S., Campagnole-Santos, M.J, Alzamora, A.C.; Avaliação
cardiovascular em ratos com hipertensão renal submetidos a natação, XI Simpósio
Brasileiro de Fisiologia Cardiovascular, São Paulo, 2007.
ROCHA, J.L.M., Machado, R.P., Silva, M.E., Rodrigues, M.C., Santos, R.A.S.,
Campagnole-Santos, M.J, Alzamora, A.C.; Avaliação da atividade física aeróbica de
baixa intensidade sobre a pressão arterial em ratos com hipertensão 2R1C, XIV
Seminário de Iniciação Científica, Ouro Preto, 2006.
RODRIGUES, M.C., Machado, R.P., Silva, M.E., Rocha, J.L.M., Santos, R.A.S.,
Campagnole-Santos, M.J, Alzamora, A.C.; Efeito da atividade física aeróbica de baixa
intensidade sobre diferentes parâmentros cardiovasculares em ratos com
hipertensão renovascular, III Congresso Mineiro de Nutrição Clínica, II Congresso Mineiro
de Nutrição Esportiva e I Congresso Mineiro de Obesidade, Belo Horizonte, 2006.
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