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1
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Centro de Biotecnologia
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
ASPECTOS BIOLÓGICOS E ESTRUTURAIS DAS UREASES DE
Canavalia ensiformis.
Rafael Real Guerra
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação
em Biologia Celular e Molecular da UFRGS como
requisito parcial para a obtenção do título de Mestre
em Ciências
Orientadora: Dra. Célia Regina R. S. Carlini
Porto Alegre – RS
Abril - 2007
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2
Membros da Banca Examinadora
Prof
a
. Dra. Leila Maria Beltramini
Depto. de Física e informática, Instituto de Física de São Carlos – USP São Carlos
Prof
a
. Dra. Maria Lucia Bianconi
Depto. de Bioquímica Médica, Instituto de Ciências Biomédicas – UFRJ
Dr. Daniel Macedo Lorenzini (revisor)
Depto. Biotecnologia, Instituto de Biociências – UFRGS
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3
Agradecimentos
À minha família pelo apoio incondicional que me permitiu chegar até aqui.
Ao Dr. João Alexandre R. G. Barbosa, por todos os ensinamentos sobre
cristalografia de raios X, e por sempre conseguir encaixar meu nome em algum
horário em que a linha estivesse disponível.
À Dra. Leila Beltramini, pela disponibilidade e atenção com o que me
recebeu em seu laboratório durante o período em que estive na USP São Carlos.
Aos amigos do Laboratório de Proteínas Tóxicas, não só pela ajuda
experimental, como pelas festas e boas risadas na cozinha.
À minha namorada Fernanda, por me ajudar sempre, tornando tudo mais
fácil mesmo à distância.
À minha orientadora Célia Carlini, pelos ensinamentos, pelas oportunidades
e principalmente por me dar a chance de começar.
Às agencias financiadoras CNPq, Capes, FINEP, FAPERGS.
4
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO 6
1.1 Ureases 6
1.2 Aspectos estruturais da urease de Canavalia ensiformes 7
1.3 Função das ureases em plantas 12
1.4 A Canatoxina 14
1.5 Modificação química de proteínas 16
2. OBJETIVOS 20
3. METODOLOGIA 22
Determinação do conteúdo de proteína 22
Medida da atividade ureásica 22
Purificação da canatoxina e urease de C. ensiformis 22
Atividade inseticida 24
Modificação química de grupos carboxilicos 24
Modificação de resíduos de lisina 24
Hidrólise in vitro de JBU 26
Western-blot 27
Medidas de dicroísmo circular 27
Medidas de afinidade por ressonância plasmônica de superfície 28
5
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 29
4.1 Parte I: modificação química de aminoácidos 29
4.1.1 Modificação de grupos carboxilicos 30
4.1.2 Modificação química de resíduos de lisina 32
4.1.3 Atividade enzimática 33
4.1.4 Atividade inseticida 35
4.1.5 Hidrólise in vitro da JBU com enzimas de D. peruvianus 37
4.2 Parte II:Caracterização estrutural de JBU e Canatoxina e
afinidade diferencial por gangliosídeos 41
4.2.1 Dicroísmo circular 43
4.2.2 Afinidade por gangliosídeos 49
6. CONCLUSÕES 61
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63
8. ANEXO 68
6
1. INTRODUÇÃO
1.1 Ureases
Ureases (uréia aminohidrolase; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel
dependentes (Dixon et al., 1975), que catalisam a hidrólise da uréia a amônia e
carbamato, o qual espontaneamente se decompõe para formar dióxido de carbono
e uma segunda molécula de amônia, como mostrado na representação do ciclo
catalítico (figura 1).
Figura 1: Reação de hidrólise da uréia, catalisada pela urease (adaptado de
Bennett & Wren, 1977).
Summer (1931) foi o primeiro a demonstrar a formação do carbamato entre
os produtos da hidrólise da uréia catalisada pela urease
(Summer, 1953), e vários
trabalhos posteriores estabeleceram que este é o primeiro intermediário livre na
reação de hidrólise da uréia (Wang et al., 1955; Jenks, 1963; Blakeley, 1969).
N
O
N
O
N
H
2
2
H
Urea-urease
Urease
H
2
Urease
NH
3
CO
2
NH
3
+
H
2
O
7
1.2 Aspectos estruturais da urease de Canavalia ensiformis
Passados 81 anos desde seu isolamento e cristalização, e mesmo após seu
completo sequenciamento, muitas questões permanecem em aberto a respeito da
estrutura da urease de Canavalia ensiformis. Ainda se especula sobre a forma
nativa da enzima em solução e a relação da forma oligomérica da proteína com a
atividade ureolítica. No entanto não há um consenso sobre esse tema, e em
grande parte, isso é devido à existência de uma série de isoenzimas com
diferentes comportamentos catalíticos, cuja origem não se sabe ser genética,
conformacional ou polimérica.
Em um estudo recente do grupo foi utilizado Dynamic Light Scatterinng
(DLS) e Static Light Scattering (SLS) para investigar a influência da concentração
de proteína, tampões, e agentes redutores sobre o comportamento da urease
majoritária de Canavalia ensiformis em solução (Follmer, et al., 2004 a). Nesse
estudo, observou-se que a proteína pode assumir diferentes estados poliméricos
de acordo com sua concentração e a composição do meio em que se encontra.
Esses dados representam bem a complexidade dessa molécula, além de
apresentar uma possível explicação para a grande discordância encontrada na
literatura sobre a forma da proteína em solução (Sumner & Eriksson-Quensel,
1938; Gorin et al., 1967; Baileiy & Boulter, 1969; Reithel, 1971; Dixon et al., 1980;
Takishima et al., 1988).
De fato, as informações mais consistentes sobre a forma molecular da
urease surgiram após a obtenção da seqüência de aminoácidos desta enzima,
tanto por sequenciamento direto (Mamiya et al., 1985), como por dedução a partir
do cDNA (Figura 2; Riddles et al., 1991). Com base nessas informações, foi
possível mostrar que a unidade básica desta enzima é uma cadeia polipeptídica
8
única com 840 resíduos de aminoácidos e massa molecular de 90.770 Da. A
forma mínima dessa enzima expressando atividade enzimática é de um trímero de
270 kDa, e a conformação mais amplamente aceita na comunidade científica para
sua forma nativa é de um hexâmero de 540 kDa (Zerner, 1991). A urease de
Canavalia ensiformis apresenta em seu sítio ativo dois íons Ni
2+
, sendo cada um
deles coordenado por dois resíduos de histidinas, e mais uma lisina carbamilada,
compartilhada por ambos. Há também um importante resíduo de cisteína nas
proximidades do sítio ativo, cuja participação na reação de hidrólise da uréia é
discutível (Zerner, 1991; Jabri et al. 1995).
Ureases estão amplamente distribuídas entre fungos, bactérias e plantas. O
motivo estrutural envolvido no mecanismo de catálise destas enzimas parece ser
bem conservado, principalmente no que diz respeito às histidinas que complexam
o níquel, que é crítico para a atividade enzimática.
Até hoje apenas três ureases tiveram suas estruturas tridimensionais
elucidadas, todas de origem bacteriana. São elas as ureases de Klebsiella
aerogenes, Bacillus pasteurii e Helicobacter pylori (figura 3). O fato da não
existência de estruturas resolvidas, por técnicas experimentais (cristalografia de
raios X, Ressonância magnética nuclear, etc), para as ureases vegetais, deve-se,
em grande parte, a indisponibilidade de grandes quantidades dessas proteínas
com um bom grau de pureza, o que, em contrapartida foi obtido para essas
ureases microbianas pela expressão heteróloga por técnicas de DNA
recombinante.
9
00
1
MKLSPREVEK LGLHNAGYLA QKRLARGVRL NYTEAVALIA SQIMEYARD
G
051 EKTVAQLMCL GQHLLGRRQV LPAVPHLLNA VQVEATFPDG TKLVTVHDPI
101 SRENGELQEA LFGSLLPVPS LDKFAETKED NRIPGEILCE DECLTLNIGR
151 KAVILKVTSK GDRPIQVGSH YHFIEVNPYL TFDRRKAYGM RLNIAAGTAV
201 RFEPGDCKSV TLVSIEGNKV IRGGNAIADG PVNETNLEAA MHAVRSKGFG
251 HEEEKDASEG FTKEDPNCPF NTFIHRKEYA NKYGPTTGDK IRLGDTNLLA
301 EIEKDYALYG DECVFGGGKV IRDGMGQSCG HPPAISLDTV ITNAVIIDYT
351 GIIKADIGIK DGLIASIGKA GNPDIMNGVF SNMIIGANTE VIAGEGLIVT
401 AGAIDCHVHY ICPQLVYEAI SSGITTLVGG GTGPAAGTRA TTCTPSPTQM
451 RLMLQSTDYL PLNFGFTGKG SSSKPDELHE IIKAGAMGLK LHEDWGSTPA
501 AIDNCLTIAE HHDIQINIHT DTLNEAGFVE HSIAAFKGRT IHTYHSEGAG
Ni-Ni
551 GGHAPDIIKV CGIKNVLPSS TNPTRPLTSN TIDEHLDMLM VCHHLDREIP
601 EDLAFAHSRI RKKTIAAEDV LNDIGAISII SSDSQAMGRV GEVISRTWQT
651 ADPMKAQTGP LKCDSSDNDN FRIRRYIAKY TINPAIANGF SQYVGSVEVG
701 KLADLVMWKP SFFGTKPEMV IKGGMVAWAD IGDPNASIPT PEPVKMRPMY
751 GTLGKAGGAL SIAFVSKAAL DQRVNVLYGL NKRVEAVSNV RKLTKLDMKL
801 NDALPEITVD PESYTVKADE KLLCVSEATT VPLSRDYFLP
Figura 2. Seqüência de aminoácidos da urease da Canavalia ensiformis (deduzida
a partir do cDNA, gdb: M65260). Os resíduos de histidinas (assinalados em
vermelho), ácido aspártico e a lisina carbamilada (ambos apresentados em azul),
complexam os dois átomos de níquel (em verde) do sítio catalítico. O resíduo de
cisteína 592, cuja participação na reação de clivagem da uréia é discutível, está
indicado por um asterisco.
*
10
Em um estudo comparativo da estrutura secundária das ureases
microbianas de Klebsiella aerogenes, Bacillus pasteurii e Helicobacter pylori,
observa-se um alto grau de conservação, tanto em termos de número de estados
de estrutura secundária (número de α-hélices e folhas β) como na quantidade de
Figura 3. Estrutura de ureases
microbianas determinadas po
r
cristalografia de difração de raios X.
A. Estrutura da urease de Klebsiella
aerogenes, formada por três
cadeias distintas: cadeia A,
cadeia B e a cadeia C. Acesso
PDB: 1FWJ.
B. Estrutura da urease de
Helicobacter pylori, formada po
r
duas cadeias, cadeia A e cadeia
B. Acesso PDB: 1E9Z.
C. Estrutura da urease de Bacillus
pasteurii, formada por três
cadeias distintas: cadeia A,
cadeia B e cadeia C. Acesso
PDB: 2UBP.
Cadeia A
Cadeia B
Cadeia C
Cadeia B
Cadeia C
Cadeia A
C
Cadeia B
B
A
Cadeia A
11
resíduos envolvidos nestes estados (percentagem de α-hélices e folhas β). Apesar
da grande semelhança entre a urease de Canavalia ensiformis e as ureases
microbianas até então conhecidas (que apresentam cerca de 50% de identidade
de seqüência quando comparadas à urease de Canavalia ensiformis, figura 4),
uma importante diferença estrutural está no fato da urease de Canavalia
ensiformis ser constituída de apenas uma cadeia, enquanto as urease microbianas
são formadas por duas ou três cadeias.
Figura 4: Comparação esquemática das subunidades estruturais das ureases de
diferentes organismos. O número de aminoácidos que compõe cada cadeia está
indicado (dentro das barras). Os valores percentuais representam a identidade de
seqüência das cadeias com suas regiões correspondentes na seqüência da
urease de C. ensiformis (retirada de Olivera-Severo et al., 2006).
12
1.3 Função das ureases em plantas
A existência de ureases em tecidos vegetais é bastante comum, sendo as
leguminosas particularmente ricas nessas proteínas (Polacco & Holland, 1993),
entre as quais se destaca a soja (Glycine max). As ureases também são
abundantes entre as bactérias, no entanto, nesses organismos, parecem exercer
uma função diferente das ureases vegetais. Entre as funções atribuídas às
ureases bacterianas estão a contribuição para o metabolismo de compostos
nitrogenados, sendo também, importantes na patogenicidade causada por alguns
destes organismos, principalmente por permitir sua sobrevivência em ambientes
de pH desfavorável (Olivera-Severo et al., 2006).
Com relação às ureases vegetais, apesar de sua ampla distribuição entre
as plantas, pouco se conhece sobre sua função fisiológica. Postula-se que em
plantas superiores a urease esteja envolvida no aproveitamento de nitrogênio a
partir da uréia proveniente de algumas rotas metabólicas (ureídeos, purinas e
arginina), e que isto seja possível apenas pela ação de ureases. Em plantas,
desprovidas de urease, seja induzidas geneticamente (Meyer-Bothiling et al.,
1989; Polacco et al., 1989), com o uso de inibidores de urease, ou por remoção do
níquel do meio (Polacco & Holland, 1993), observa-se um acúmulo de uréia em
folhas e raízes e/ou um comprometimento do emprego de uréia como fonte de
nitrogênio por parte da planta.
O que desperta muita curiosidade em relação ao estudo da função das
ureases nas plantas é o fato da uréia não ser um metabólito majoritário nos
vegetais onde esta enzima é abundantemente encontrada (Polacco & Holland,
1993). Porém, é importante ressaltar que uréia não é o único substrato para as
ureases (Bennett & Wren, 1977).
13
A descoberta de duas isoformas de urease em soja (Glycine max) levantou
uma série de ponderações a cerca da função destas enzimas em plantas. Uma
dessas isoformas, denominada urease embrião-específica, é sintetizada somente
durante o desenvolvimento do embrião na semente em formação, acumulando-se
na semente madura (Torisky & Polacco, 1990). Já a outra isoforma, denominada
urease ubíqua, está presente em todos os tecidos da planta, como folhas,
embriões, raízes e sementes (Polacco & Winkler, 1984). A urease embrião-
específica é cerca de 1000 vezes mais abundante na semente de soja do que a
urease ubíqua (Torisky & Polacco, 1990).
Estudos demonstraram que a urease ubíqua possui um papel na reciclagem
de derivados de uréia, uma vez que mutantes com silenciamento do gene dessa
urease apresentam anormalidades características do acúmulo de uréia, como
necroses nas extremidades das folhas e raízes, acúmulo de uréia nas folhas e
sementes, e retardo na germinação (Polacco & Holland, 1993). Por outro lado, o
mesmo estudo realizado para a urease embrião-específica não constatou qualquer
mudança no fenótipo da planta, ou aumento dos níveis de uréia nas sementes,
quando comparada à espécie selvagem.
Em culturas de cotilédones de ervilha e de soja mostrou-se que as
ureases desempenham pouca ou nenhuma função na nutrição do embrião, visto
que a uréia comporta-se como uma fonte extremamente pobre de nitrogênio
(Polacco & Holland, 1993). Neste contexto, uma questão pertinente pode ser feita:
por que o embrião de soja “investiria” energia em uma enzima cuja atividade não é
importante para a planta naquele tecido? Estes dados sugerem que esta urease
esteja envolvida em algum outro tipo de função, possivelmente na defesa da
planta (Polacco & Holland, 1993). A descoberta de que a Canatoxina, uma
14
proteína presente na semente de Canavalia ensiformis, que apresenta atividade
tóxica para mamíferos e insetos, é uma isoforma de urease (Follmer et al., 2001),
reforçou a hipótese de que as ureases estariam envolvidas no sistema de defesa
das plantas.
1.4 A Canatoxina
A semente de Canavalia ensiformis é fonte de várias proteínas de
interesse bioquímico e biotecnológico, como a urease, a lectina concanavalina A,
inibidores de tripsina e a canatoxina (Carlini & Guimarães, 1981).
A canatoxina, primeiramente descoberta como uma proteína tóxica de C.
ensiformis distinta da lectina concanavalina A (Carlini & Guimarães, 1981), foi
mais tarde identificada como uma isoforma de urease (Follmer et al. 2001). Vários
peptídeos internos da canatoxina já foram seqüenciados sendo que todos eles
revelaram um alto grau de similaridade e identidade com a seqüência primária da
urease de Canavalia ensiformis. Também a composição percentual de
aminoácidos é indicativa de uma grande semelhança das duas proteínas (Follmer
et al., 2001). Estruturalmente sabe-se que a principal forma ativa da canatoxina
apresenta um peso molecular de 184 kDa quando analisada em gel-filtração em
pH 7,5. Em SDS-PAGE, em meio redutor ou não, seu peso molecular é de ca. 95
kDa, sugerindo que a forma nativa da canatoxina é provavelmente um dímero,
contrastando com a urease que é um hexâmero. A canatoxina é uma metalo-
proteína contendo zinco e níquel (Barcellos, 1992; Follmer et al., 2001; 2002).
15
Quando injetada por via intraperitoneal, é letal, com uma DL
50
de 2mg/kg,
sendo inócua (em doses até 10 vezes maiores do que a LD
50
) quando
administrada via oral nesses animais (Carlini et al., 1984; Carlini & Guimarães,
1991). Nesses animais, a morte induzida pela canatoxina é caracteristicamente
acompanhada por convulsões, e o sistema nervoso central foi identificado como
um dos órgãos alvo da toxina. Essa proteína também possui a característica de
interagir com outros tipos celulares como plaquetas, ilhotas pancreáticas,
neutrófilos, mastócitos, etc (Carlini et al., 1985; Barja-Fidalgo et al., 1991a
e1991b).
A Canatoxina também apresenta potente atividade inseticida (Carlini et
al.,1997; Ferreira-da Silva et al.,2000; Carlini & Grossi-de-Sá, 2002), que está
relacionada com a clivagem da proteína por enzimas digestivas dos insetos,
gerando um peptídeo de 10 kDa que é o agente responsável por essa atividade.
Isso agrega a essa proteína, uma grande potencialidade para o desenvolvimento
de biopesticidas, ou plantas transgênicas resistentes a insetos que são pragas
agrícolas, através da expressão dessa proteína ou do próprio peptídeo.
Recentemente um peptídeo recombinante equivalente a esse foi expresso em
Escherichia coli acoplado a um epitopo v5 e cauda de histidina, peptídeo este
denominado Jaburetox-2Ec (Mulinari, 2004). Proteínas tóxicas, supostamente
homólogas à canatoxina já foram encontradas em várias outras leguminosas,
dentre as quais, a soja (Glycine max) (Carlini et al., 1988; Vasconcelos et al.,
1994).
Apesar desse conhecimento, a forma de interação da canatoxina com as
células alvo ainda precisa ser esclarecida. Um fator importante a ser considerado
é o fato de a canatoxina comportar-se como uma lectina monovalente, ou
16
hemilectina. Diferentemente de outras hemilectinas de origem vegetal, como ricina
e abrina, que ligam hexoses simples (com a D-galactose), a canatoxina interage
com glicoconjugados mais complexos, como sialoproteínas e gangliosídeos
(Follmer et al., 2001), e nesse aspecto acaba se assemelhando mais a
neurotoxinas bacterianas como é o caso das toxinas tetânica e botulínicas. Essa
característica de hemilectina provavelmente “direciona” a proteína para a
superfície de células enriquecidas neste tipo de glicolipídeo, explicando sua
especificidade por tecidos nervosos.
A canatoxina e a urease de C. ensiformis compartilham algumas atividades
biológicas além da atividade enzimática. Sabe-se que tanto as atividades
características da canatoxina (toxicidade intraperitoneal em ratos e
camundongos), bem como outras atividades compartilhadas pela canatoxina e
pela urease de C. ensiformis (caráter de hemilectina, capacidade de promover
agregação em plaquetas, e atividade inseticida) são completamente
independentes da atividade enzimática (Follmer et al., 2001; Follmer et al., 2004b).
Isso indica a existência de domínios protéicos independentes responsáveis por
diferentes atividades dessas moléculas.
1.5 Modificação química de proteínas
O advento de técnicas como a mutagênese sítio-dirigida e outras técnicas
de biologia molecular tem sido de grande valor para estudos de química de
proteínas. Apesar desses grandes avanços na tecnologia, a modificação química
de proteínas continua a ser de enorme utilidade no estudo de proteínas. A
modificação química é um recurso amplamente utilizado em enzimologia, que
17
pode fornecer informações importantes a respeito da estrutura e funcionamento
das enzimas. Derivados quimicamente alterados de proteínas são utilizados na
determinação de seqüência de aminoácidos, para comprovar propriedades
conformacionais de proteínas em solução, e identificação de resíduos de
aminoácidos envolvidos nas reações catalíticas de enzimas. Métodos para
modificação química específica de diferentes aminoácidos estão disponíveis
(Glazer, 1976; Lundblad, 2005) e novos procedimentos continuam a ser
desenvolvidos e aplicados a diversas proteínas.
Alguns trabalhos de modificação química de aminoácidos específicos já
foram realizados para ureases a fim de identificar resíduos importantes para o sítio
ativo dessas enzimas. Os reagentes p-hidroximercuribenzoato (p-OHMB) (Riddles
et al., 1983), e 1,4– benzoquinona (p-BQ) (Zaborska et al.; 2002) inibem
totalmente a atividade enzimática da urease de C. ensiformis, ao ligar-se a uma
cisteína nas proximidades de seu sítio ativo (impedindo assim o acesso da uréia
ao sítio de substrato), abolindo também a atividade ureásica da canatoxina. Foi
através dessas modificações que se descobriu que as demais atividades
biológicas da canatoxina e da urease de C. ensiformis são independentes da
atividade enzimática (Follmer et al., 2001, 2004b).
Como já foi mencionado anteriormente, a estrutura das ureases é bastante
conservada, principalmente no que se refere aos aminoácidos que compõe o sítio
ativo da enzima (figuras 5 e 6). A grande homologia entre as ureases nos permite
utilizar as estruturas 3D já determinadas para três ureases microbianas, como
modelos para as de outros organismos.
18
Figura 5: Alinhamento da seqüência de aminoácidos das regiões que participam
diretamente do sítio catalítico, ou estão próximas a este, nas ureases de C.
ensiformis, de Glycine max e ureases bacterianas. Em vermelho estão
assinalados os resíduos críticos para a formação do sítio ativo. A região em azul
está próxima do sítio catalítico da enzima, mas não participa da reação de
catálise.
Figura 6: Representação espacial do sítio catalítico da urease de Klebsiella
aerogenes (adaptado de Jabri et al.,1995).
DCH
407
VHYI...GLK
490
IH...NIH
519
TD...TYH
545
SE...MVCHHLDR ... TID
633
SQ
Canavalia ensiformis
DCH
405
VHYI...GLK
488
LH...NIH
517
TD...TYH
543
SE...MVCHHLDR...SSD
331
SQ
Glycine max
DAH
136
I H FI...GLK
219
LH...AIH
248
TD...TYH
274
TE... MVCHHLDR ... SSD
362
SQ
Bacillus sp
.
DCH
136
VHYI...GLK
219
LH...AIH
248
SD...SFH
274
VE... MVCHHLKR ... TID
362
AL Bacillus pasteurii
DTH
137
I H FI... GLK
220
LH...AIH
249
TD...TYH
275
IE... MVCHHLDR ... SSD
363
SQ Bacillus subtilis
DTH
134
I H FI... GLK
217
IH...AIH
246
SD... VFH
272
TE... MVCHHLDR ... SSD
360
SQ Proteus vulgaris
DTH
136
I H FI... GFK
219
IH...AIH
248
TD... TFH
274
TE... MVCHHLDR ... SSD
362
SQ Helicobacter pylori
DCH
141
VHLI...GFK
224
LH...ALH
253
SD...AYH
279
TE... MVCHHLNR ... GSD
367
SQ Mycobacterium tuberculosis
DTH
133
I HWI...GLK
216
IH... ALH
245
SD...TFH
271
TE... MVCHHLDR ... SSD
359
SQ
Klebsiella aerogenes
19
Grupos carboxílicos são importantes para a atividade de inúmeras enzimas,
como por exemplo, as aspártico-proteases. Nas ureases de Canavalia ensiformis,
a modificação desses grupos é de particular interesse devido à existência de dois
resíduos ácidos que compõe o sítio ativo, Asp 633 (que participa diretamente do
sítio catalítico) e Asp 596 (que se encontra nas proximidades do sítio). Ainda
existe o fato de que um resíduo com características ácidas, que se supõe
participar da reação de hidrólise da uréia, ainda não foi identificado (Mobley &
Hausinger, 1989).
Sabe-se ainda que resíduos de lisinas são muito importantes para a
atividade de diversas toxinas protéicas, como é o caso das toxinas de escorpião
dos tipos α e β de diferentes espécies, em que a atividade biológica diminui
drasticamente após a modificação química destes resíduos (Sampieri &
Habersetzer-Rochat, 1978; Darbon et al., 1983; Hassani et al., 1999). Estudos
anteriores do grupo mostraram que a modificação química de resíduos de lisina da
urease de C. ensiformes exerce um efeito protetor da atividade enzimática,
possivelmente por impedir que a enzima forme agregados a partir da interação da
proteína com alguns íons metálicos, como é o caso do Cu
2+
(Follmer & Carlini,
2005).
20
2. Objetivos
As ureases de origem vegetal são proteínas extremamente complexas que
apresentam diversas atividades não relacionadas entre si, entre as quais destaca-
se a atividade inseticida. A ausência de estrutura tridimensional para ureases
vegetais torna difícil a compreensão dos fatores determinantes que governam
cada uma dessas atividades.
A crescente busca por inseticidas naturais que causem baixo dano ao meio
ambiente e à saúde humana torna de grande interesse os estudos das ureases
vegetais, em especial as duas isoformas de urease de C. ensiformis. A
compreensão dos fatores estruturais determinantes da atividade inseticida são de
extrema importância para a concretização do uso destas moléculas ou seus
fragmentos como ferramentas biotecnológicas. Essas proteínas apresentam
outras atividades também pouco caracterizadas do ponto de vista estrutural, como
o caráter de hemilectina, por exemplo, e cuja compreensão pode contribuir para o
entendimento das propriedades biológicas e papel fisiológico das proteínas em
diferentes organismos.
Neste contexto, este trabalho teve como objetivos principais:
1. Verificar o efeito da modificação química de aminoácidos específicos
(lisinas, ácidos aspártico e glutâmico) sobre as atividades ureolítica e
inseticida da urease de C. ensiformis.
21
2. Caracterização estrutural comparativa das duas isoformas de urease de C.
ensiformis através da técnica de dicroísmo circular.
3. Realizar estudos do caráter de hemilectina, tanto para urease como para
canatoxina, em relação à afinidade por glicoconjugados complexos.
22
3. METODOLOGIA:
3.1 Procedimento experimental
Determinação do conteúdo de proteína
O conteúdo protéico das amostras foi determinado pela absorbância em
280 nm (1,0 A280 = 1mg de proteína) e, alternativamente, pelo método de
Coomassie Blue (Spector, 1978).
Medida de atividade ureásica
A atividade ureásica foi estimada pela medida colorimétrica da amônia
liberada, utilizando o método do fenol-nitroprussiato-hipoclorito, e uma curva
padrão com sulfato de amônio (Weatherburn, 1967). Uma unidade de atividade
ureásica foi definida como a massa de enzima capaz de liberar 1 µmol de amônia
por segundo, a 37 °C, em pH 7,5. Os parâmetros cinéticos foram calculados
segundo Cleland (1979).
Purificação da canatoxina e urease de C. ensiformis (JBU- jack bean urease)
O método de purificação é o mesmo descrito por Blakeley et al. (1969), com
as modificações introduzidas por Follmer et al. (2004 b). Resumidamente, após a
moagem, a farinha das sementes de C. ensiformis foi delipidada com acetona e
clorofórmio, e submetida à extração com tampão A (fosfato de sódio 20 mM, pH
7,5, EDTA 1 mM e 2-mercaptoetanol 2 mM) por 1h a 4°C. O resíduo de farinha foi
23
removido por centrifugação (30.000g, 20 min, 4°C), e 28% (v/v) de acetona (-20°C)
foi adicionada ao sobrenadante. Após aproximadamente 10 h a 4°C, o material foi
centrifugado, e o novo sobrenadante recolhido. A concentração de acetona nesse
sobrenadante foi aumentada para 31,6% (v/v). Após remoção e descarte do
precipitado formado, o sobrenadante foi dialisado contra o tampão B (Fosfato de
sódio 20 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM e 2-mercaptoetanol 5 mM). A amostra foi então
submetida a uma cromatografia de troca iônica utilizando a resina Q-Sepharose
(Amersham-Biotech) equilibrada em tampão B. A cromatografia foi realizada em
duas etapas, a primeira pela adição de 100mM de NaCl ao tampão B, e a
segunda, contendo a fração enriquecida em urease, pela adição de 300mM de
NaCl ao tampão B. A segunda fração foi concentrada com cartuchos CentriPrep
(cut-off de 50.000 kDa , Millipore) e aplicada em coluna de gel-filtração Superose 6
HR 10/30 (Amersham-Biotech) equilibrada com tampão B, em sistema FPLC. O
pico contendo atividade ureásica foi dialisado contra fosfato de sódio 20 mM, pH
7,0, 0,5 M NaCl (tampão C). A separação das isoformas de urease foi realizada
como descrito por Follmer et al., 2004 b. Após a gel-filtração, o pool de frações
com atividade ureásica foi submetido à cromatografia de afinidade por metal, em
resina IDA-Sepharose (Amersham-Biotech) carregada com o íon Co
2+
quelado e
equilibrada com tampão C. A fração não retida na resina contém a isoforma
majoritária conhecida como urease de C. ensiformis (ou JBU) e o material retido,
eluído com NH
4
Cl 2M, corresponde à canatoxina, a outra isoforma de urease
dessa semente. Ambas frações foram dialisadas contra tampão B e suas
atividades ureásicas medidas conforme descrito. As soluções de proteína foram
estocadas a 4 °C, em presença do tampão B.
24
Atividade Inseticida
A atividade inseticida de JBU, bem como de seus derivados modificados foi
avaliada em bioensaios usando o percevejo manchador do algodão Dysdercus
peruvianus (Hemiptera) conforme descrito por Stanisçuaski et al. (2005). A
solução de JBU foi adicionada à farinha de cotilédones de semente de algodão
(concentração final de 0,05 e 0,1% m/m), a mistura foi liofilizada e utilizada para
preencher as cápsulas de gelatina oferecidas aos insetos. A toxicidade foi
expressa como taxa de sobrevivência num período de 20 dias. A análise
estatística foi realizada utilizando–se ANOVA e o teste t de Student. Valores p
<0,05 foram considerados significantes.
Modificação química dos grupos carboxílicos
Para a modificação de grupamentos ácidos, optamos por um método que
utiliza uma carbodiimida como ativador do grupo carboxílico, e amina como
reagente modificante. A reação genérica de modificação intermediada por
carbodiimidas é apresentada na figura 7.
Figura 7: Reação genérica para a modificação onde HX representa o nucleófilo
utilizado, no nosso caso etilenodiamina (Hoare & Koshland, 1966).
25
O procedimento experimental empregado para a modificação da urease foi
adaptado de outros trabalhos (Pho et al., 1977; Yamada et al., 1981; Woodhead
and Malcolms, 1981; Lundblad, 2005) utilizando-se a razão molar 1:500:750
(conteúdo de resíduos ácidos, EDC, etilenodiamina, respectivamente). Uma
solução de JBU em água foi misturada a etilenodiamina, e o pH ajustado em 7,0
com ácido clorídrico. EDC (1-etil-3[3-(dimetilamino) propil] carbodiimida) foi então
adicionado à solução sob agitação a 4°C para promover o início da reação. O pH
foi mantido em 7,0 pela adição de HCl durante a reação. Após a estabilização do
pH da reação (18 – 20 h), a solução foi exaustivamente dialisada contra tampão B
a 4°C, e analisada por cromatografia de troca iônica em coluna Mono Q HR 5/5
(Pharmacia) equilibrada em tampão B, pH 7,0, em um sistema de FPLC. A eluição
foi realizada com um gradiente de 0 a 1 M de NaCl.
Modificação de resíduos de lisina
A acetilação de JBU foi realizada pela adição de anidrido acético à
solução de proteína e o pH ajustado para 8,0. A razão molar usada foi 1:50 em
relação ao conteúdo de lisina da proteína (Diaz-Oreiro et al., 1997). A reação
permaneceu em constante agitação durante 18 - 20h, 4°C, e então foi
exaustivamente dialisada contra o tampão B. O resultado da modificação foi
avaliado através da mudança de migração da proteína por PAGE em pH 4.8 (Smit,
1994), corado com nitrato de prata (Blum et al., 1987). Um esquema da reação de
modificação é apresentado na figura 8:
26
Figura 8: Reação de modificação de resíduos de lisina com anidrido acético
(Lundblad 2005).
Hidrólise in vitro de JBU
Os homogeneizados de intestino de D. peruvianus foram preparados como
descrito por Stanisçuaski et al., 2005. Resumidamente: intestinos de ninfas de
quarto estádio foram dissecados, homogeneizados, centrifugados a 4°C a 4.000 g
(2x, 10 min cada), e novamente a 12.000 g por 5 min. O sobrenadante final foi
mantido a –20°C até o uso. Para determinar a atividade enzimática, os
homogeneizados foram incubados com azocaseína em pH 5,6 a 37°C. Uma
unidade enzimática foi definida como a quantidade de enzima capaz de gerar 0,1
A
420
por hora a 37°C, pH 5,6 (Ferreira-daSilva et al., 2000).
A hidrólise de JBU foi realizada usando a razão de 0,5mU de
homogeneizado para cada micrograma de urease, incubada em formiato de
amônio 5 mM, pH 5,6, at 37°C, sob agitação contínua (Ferreira-daSilva et al.,
2000). O homogeneizado foi adicionado à solução de urease em duas etapas (0 e
12h). A reação foi parada após 24 h pelo congelamento e liofilização das
amostras.
27
Western-blot
A hidrólise in vitro de JBU foi analisada por SDS-PAGE e Western blot
(Towbin et al., 1979). As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de
gradiente de poliacrilamida (10-20%) contendo SDS 0,1% (Weber et al., 1969).
Após transferência para membranas de PVDF 0,2 mm (Sigma), e bloqueio com
leite desnatado 3%, as membranas foram incubadas por 2 h com anticorpo anti-
Jaburetox-2Ec (1: 25.000), lavadas e incubadas por 2 h com anti-IgG de coelho
acoplado a fosfatase alcalina (1:30.000). A reação colorimétrica foi desenvolvida
usando NBT (nitro-blue tetrazolium, 330µg/ml) e BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl
phosphate, 82,5 µg/ml) em tampão pH 9,6 contendo MgCl
2
(2,5 mM).
Medidas de Dicroísmo Circular (CD – circular dichroism)
Os espectros de CD foram obtidos usando um espectropolarímetro Jasco J-
715, com comprimentos de onda na faixa de 195 – 250 nm. As condições foram as
seguintes para todas as proteínas analisadas: tempo constante 2 s; varreduras 0,5
nm.s
-1
; temperatura de 25°C, percurso ótico de 0,1 cm em cubetas de quartzo. As
concentrações de proteínas utilizadas foram de 0,2 mg/ml para JBU e canatoxina,
e os espectros foram tipicamente obtidos como a média de 16 varreduras. Nos
estudos de estabilidade das proteínas em diferentes pHs, utilizou-se um tampão
de três componentes, acetato de sódio 20 mM, borato de sódio 20mM e fosfato de
sódio 20mM, com pH variando de 2,0 – 12,0. A mudança do pH foi realizada pela
diluição de uma solução de proteína concentrada (~2mg/ml) na solução com o pH
de interesse, até atingir a diluição desejada (0,2 mg/ml). Os espectros obtidos
foram convertidos para elipsidade molar (Cantor et al., 1980) antes da análise de
28
estrutura secundária. As análises dos espectros em termos de conteúdo de
estrutura secundária foram realizadas utilizando o método CONTINLL (Provencher
and Glockner 1981; van Stokkum et al. 1990). As medidas foram realizadas no
Departamento de Física e Informática, Instituto de Física da USP-São Carlos, SP,
Brasil.
Medidas de afinidade por ressonância plasmônica de superfície
JBU e canatoxina, a partir de uma solução concentrada (~2mg/ml) foram
diluídas cerca de 10 vezes em tampão acetato de sódio 50mM, pH 4,5, na hora do
ensaio. As proteínas foram imobilizadas em sensor chips CM-5 até atingir o valor
de 2000 unidades de ressonância (RU - resonance units) e posteriorrmente
fixadas utilizando uma mistura de EDC (400 mM) e NHS (N-hidroxisuccinimida,
100 mM), essa mistura também é responsável pelo bloqueio do chip impedindo
que novas proteínas se liguem a ele. As análises foram então realizadas utilizando
um sistema BIAcore (Amersham). Várias concentrações dos gangliosídeos GM1,
Gd1b e GT1b (Sigma) foram injetadas (em duplicatas) em ordem aleatória com um
fluxo de 30 µL/min sobre as duas células de fluxo. Após uma fase de dissociação
de 1 min, 1 M NaCl foi injetado por 2 min no fluxo de 30 µL/min para remover
qualquer gangliosídeo remanescente, deixando a superfície “pronta” para um novo
ciclo. Os sensorgramas resultantes foram analisados pelo software BiaEvaluation
e ajustados com um modelo 1:1 (Langmuir). As medidas foram realizadas no
Departamento de Física e Informática, Instituto de Física da USP-São Carlos, SP,
Brasil.
29
4. Resultados e Discussão
4.1. Parte I
Modificação química de aminoácidos
30
4.1.1. Modificação de grupos carboxílicos
A modificação específica de grupos carboxila em proteínas é algo bastante
difícil de conseguir. A maior parte dos trabalhos utiliza carbodiimidas solúveis em
água para a obtenção deste tipo de modificação, no entanto a grande instabilidade
das carbodiimidas, quando em contato com o meio reacional, torna a utilização
deste tipo de modificação um grande desafio (Lundblad, 2005).
A reação de modificação de resíduos de ácido aspártico e glutâmico
intermediada por EDC ocorre a partir da interação do EDC com o grupo carboxila
em seu estado protonado, gerando um intermediário ativado que então reage com
um nucleófilo, por exemplo uma amina (no nosso caso, etilenodiamina). Devido a
essa característica de reação com o grupamento carboxila protonado, essa reação
ocorre de maneira mais eficiente em pHs ácidos (geralmente em pH 4,75, em que
os grupamentos carboxila da proteína encontrar-se-iam ~50% em seu estado
protonado). No entanto, isso acarreta algumas limitações, como a impossibilidade
de aplicação a proteínas sensíveis à pHs ácidos, bem como uma degradação mais
rápida da carbodiimida. Essa reação pode ser realizada em pHs entre 6 e 7,
ocorrendo, no entanto, de maneira muito menos eficiente.
Sendo a urease de Canavalia ensiformis uma proteína com ponto isolétrico
em 4,5 - 4,8 e instável em pHs mais ácidos (Follmer et al., 2001), a reação de
modificação com etilenodiamina, intermediada por EDC, foi realizada a pH 7,0 e
4°C (Woodhead and Malcolms, 1981; Yamada et al., 1981). Após 18 – 20 h horas
de reação, cerca de 70 % de JBU foi recuperada como um derivado solúvel. O
sucesso da reação foi monitorado pela variação no pH do meio reacional, mantido
em 7,0 pela adição de HCl. Após o cessar da variação do pH, a reação foi
considerada terminada. O padrão cromatográfico da proteína derivatizada em
31
cromatografia de troca iônica em pH 7,0 em resina mono Q (Pharmacia) é
mostrado na figura 9, bem como o perfil cromatográfico da proteína nativa. A JBU
nativa e sua forma quimicamente modificada foram eluídas em concentrações de
NaCl diferentes, cerca de 213mM e 188mM, respectivamente. Esse dado
claramente indica uma redução na quantidade de cargas negativas na molécula
em decorrência da modificação de resíduos de ácido aspártico e glutâmico.
5101520
0,00
0,05
0,10
0,15
Cromatografia de troca iônica
Volume (mL)
A280/ml
JBU acido modificada
JBU nativa
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
[NaCl] (M)
[NaCl]
Figura 9: Cromatografia de troca-Iônica (Mono Q). Perfil cromatográfico de JBU
nativa (vermelho) e JBU modificada para resíduos ácidos (preto). A cromatografia
foi realizada a pH 7,0 e a eluição feita com um gradiente de 0 – 1 M de NaCl
(azul).
A JBU é uma proteína composta por 840 aminoácidos, dos quais 100
correspondem a ácidos aspártico ou glutâmico (50 Asp e 50 Glu). Grande parte
desses resíduos negativamente carregados provavelmente estão envolvidos na
32
manutenção da estrutura terciária e quaternária da proteína, não estando,
portanto, susceptíveis à reação de modificação sem a ocorrência de uma
desnaturação (ao menos parcial) da proteína, tendo em vista o grande volume
molecular do principal responsável pela reação de modificação que é o EDC.
4.1.2. Modificação química de resíduos de lisina
A reação de acetilação de grupamentos amina com anidrido acético foi uma
das primeiras modificações químicas desenvolvidas para proteínas (Fraenkel-
Conrat, 1957) e ainda hoje, uma das mais usadas. Esse tipo de modificação é
extremamente dependente do ambiente químico no qual se encontram as lisinas
na proteína. Para que a reação de modificação ocorra, há a necessidade de que o
grupamento amino da cadeia lateral da lisina esteja desprotonado, podendo assim
atuar como um bom nucleófilo, razão dessa reação geralmente exigir pHs
alcalinos. Embora seja possível a obtenção de modificações em pHs mais baixos
(Smit, 1994), esse tipo de modificação é normalmente realizado em pH 8,0 (Atassi
& Habeeb, 1972; Smit, 1994), conveniente no caso da modificação de JBU, que é
bastante estável na faixa de pH de 6,5 a 8,5 (faixa de pH ótimo).
Dessa forma, a reação de acetilação dos resíduos de lisina foi realizada
pela adição de anidrido acético à solução de proteína, sendo o pH mantido em 8,0
pela adição de NaOH à mistura. O meio reacional permaneceu sob constante
agitação, 4°C, por um período de 18 – 20 h. Após a reação de modificação, cerca
de 90% de JBU foi recuperada na forma solúvel. Para verificar a eficiência da
reação de modificação, observamos a diferença na mobilidade eletroforética em
gel de poliacrilamida na ausência de SDS, ou seja, em condições não
33
desnaturantes (Smit, 1994). O gel é apresentado na figura 10, em que se observa
um aumento na migração da proteína após a reação de modificação, indicando,
portanto, um considerável decréscimo no número de resíduos positivamente
carregados em JBU.
Figura 10. Gel de eletroforese não desnaturante. JBU modificada para lisinas foi
analisada em PAGE não desnaturante (8%) em pH 4,8. Canaletas (1) JBU nativa;
(2) JBU modificada para lisinas. Corado com nitrato de prata.
4.1.3. Atividade enzimática
Os parâmetros cinéticos da atividade ureolítica medidos para JBU, bem
como seus derivados quimicamente modificados, são apresentados na tabela 1.
J
B
U
n
at
i
va
J
B
U
Li
s
in
a
m
od
ifi
cada
2
1
34
Nenhuma alteração significativa na atividade enzimática da JBU pode ser
observada após modificações, ao contrario do que se esperava (pelo menos no
caso da modificação de resíduos ácidos).
Tabela 1: Medida dos parâmetros cinéticos da urease de C. ensiformis e seus
derivados quimicamente modificados
JBU native JBU Lys-modif JBU Ac-modif
K
m
(mM)
a
5,2 + 1,5 4,1 + 0,7 3,7 + 0,5
V
max
(U.mg
-1
)
a
24,5 + 5,3
29,4 + 3,2 20,3 + 6,4
K
cat
(s
-1
)
a
12,2
x
10
5
+ 1,8
x
10
4
14,7
x
10
5
+ 0,3
x
10
4
10,3
x
10
5
+ 0,37
x
10
4
a
Média de três medidas independentes ± erro padrão. Todas as medidas foram realizadas em pH
7,5.
Um resíduo de lisina carbamilada e um resíduo de ácido aspártico estão
presentes no sítio ativo das ureases e são essenciais para a manutenção da
estabilidade desse sítio (Jabri et al., 1995; Mobley & Hausinger, 1989). No caso da
modificação de resíduos de lisina, esse resultado era até certo ponto esperado,
uma vez que o resíduo de lisina que está presente no sítio ativo das ureases é um
resíduo naturalmente modificado. Esse resíduo recebe uma acetilação pós-
traducional pela incorporação de bicarbonato catalizada por uma proteína
acessória, responsável pela ativação da urease em bactérias e plantas (Jabri et
al., 1995; Bacanamwo et al., 2002). Essa modificação é essencial para a atividade
ureolítica da proteína. A não alteração da atividade enzimática da JBU modificada
35
nos dá fortes indícios de que a conformação global da proteína não sofreu
grandes alterações em decorrência da modificação de resíduos de lisina, pelo
menos não o suficiente para interferir em sua atividade enzimática. Isso nos torna
mais confiantes em atribuir qualquer possível alteração em outras atividades
biológicas de JBU, exclusivamente à modificação dos resíduos.
A persistência da atividade enzimática após a modificação dos resíduos de
ácido aspártico e glutâmico indica que o resíduo D633, que faz parte do sítio ativo,
ou outros na proximidade, não são facilmente acessíveis para aos reagentes de
modificação. Isso provavelmente ocorre devido ao grande volume molecular do
EDC (quando comparado à uréia), não permitindo assim, que este tenha acesso
ao interior da cavidade do sítio catalítico. Da mesma forma observada para a
modificação de resíduos de lisinas, a não alteração da atividade enzimática da
JBU após a modificação de resíduos de ácido aspártico e glutâmico revela indícios
de que a estrutura global da proteína não sofreu grandes alterações após esse
procedimento.
4.1.4. Atividade inseticida
Como descrito em trabalhos anteriores (Follmer et al., 2004b), a JBU é
altamente tóxica para o inseto manchador do algodão Dysdercus peruvianus, com
uma DL
50
de aproximadamente 0,017 % (m/m) de proteína adicionada na
alimentação do inseto. O efeito tóxico de JBU é dependente do tempo, atingindo
seu máximo de letalidade em torno de 15 ou 20 dias. Para verificar o efeito das
modificações da JBU na atividade inseticida, a proteína nativa e os derivados
quimicamente modificados foram ensaiados em D. peruvianus (figura 11).
36
Efeito das Modificações Químicas na Atividade
Entomotóxica de JBU
Tempo (dias)
0369121518
Sobrevivencia (%)
0
20
40
60
80
100
JBU 0,1%
JBU Asp-Glu 0,1%
JBU Lys 0,1%
Controle
a
b
c
Figura 11. Atividade inseticida de JBU e seus derivados quimicamente
modificados. A JBU nativa e seus derivados foram ensaiados quanto a toxicidade
contra o hemíptera Dysdercus peruvianus (ninfas de terceiro estádio). As
proteínas foram adicionadas à farinha de sementes de algodão na concentração
de 0,1% (m/m). A mortalidade foi acompanhada por 17 dias. Os resultados são
médias de pelo menos dois testes independentes, em triplicata (15 insetos em
cada).
a
Estatisticamente diferente do controle (ANOVA p<0,05).
b, c
Estatisticamente diferente de JBU (ANOVA p<0,05).
Contrastando com a JBU nativa, ambas as modificações afetaram a
atividade entomotóxica pela redução do efeito em cerca de 60% e 50% para a
37
modificação de resíduos ácidos e de resíduos de lisina, respectivamente. O efeito
entomotóxico apresentado pelas ureases vegetais é devido a um fragmento de
aproximadamente 10 kDa que é liberado após a digestão da proteína pelas
enzimas digestivas dos insetos (Ferreira-daSilva et al., 2000; Stanisçuaski et al.,
2005). Dessa maneira, os dados apresentados na figura 11, mostram que
resíduos de ácidos aspártico ou glutâmico, bem como resíduos de lisina, têm
relevante participação na atividade entomotóxica da urease. Essa redução da
atividade inseticida da JBU modificada pode ter duas razões:
(1) as modificações alteraram os sítios de clivagem da proteína pelas enzimas
digestivas dos insetos, impedindo que o peptídeo tóxico seja liberado;
(2) essas modificações alteram o próprio peptídeo entomotóxico, de forma que
apesar da sua liberação pelas enzimas digestivas do inseto, seu efeito inseticida
fica comprometido.
4.1.5. Hidrólise in vitro da JBU com enzimas de D. peruvianus
A hidrólise in vitro da JBU (nativa e derivados quimicamente modificados)
com enzimas digestivas do homogeneizado de trato digestório de D. peruvianus
mostrou que a modificação dos grupamentos carboxílicos tornou a JBU resistente
à hidrólise, abolindo a liberação do peptídeo entomotóxico (figura 12A). Para a
JBU modificada em resíduos de lisina, no entanto, nenhuma alteração no padrão
de fragmentação da proteína por enzimas digestivas do inseto foi observado,
havendo a formação de um peptídeo imunoreativo com o tamanho esperado
(figura 12B).
38
Figura 12. Hidrólise in vitro de JBU com enzimas digestivas de D.peruvianus.
A JBU nativa e seus derivados quimicamente modificados foram submetidos à
hidrólise proteolítica com homogeneizado do trato digestório de D.peruvianus. A
hidrólise foi conduzida usando 0,5 mU de homogeneizado por µg de urease,
durante 24 h à 37°C, pH 5,6. (A) Análise por Western blot da hidrólise de JBU
modificada para resíduos ácidos. Canaletas (1): JBU nativa; (2): JBU nativa +
homogeneizado; (3): JBU modificada para resíduos ácidos; (4): JBU modificada
para resíduos ácidos + homogeneizado. (B) Análise da hidrólise por gel de
eletroforese, de JBU modificada para resíduos de lisina. Canaletas (1): Padrão de
massa molecular; (2): Homogeneizado de Dysdercus peruvianus; (3): JBU nativa;
(4): JBU nativa após 24h de incubação a 37°C (na ausência do homogeneizado);
(5): JBU nativa + homogeneizado; (6): JBU modificada para lisinas; (7): JBU
modificada para lisinas após 24h de incubação a 37°C (na ausência do
homogeneizado); (8): JBU modificada para lisinas + homogeneizado; (9): peptídeo
entomotóxico Jaburetox 2Ec; (10): Padrão de massa molecular. As setas indicam
a subunidade de 90 kDa da JBU.
Como mostrou a figura 11, a atividade inseticida foi afetada tanto pela
modificação de resíduos de lisina, como pela modificação de resíduos de ácido
Jaburetox 2E
c
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
kDa
B
50
25
30
90
Jaburetox 2E
c
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
kDa
B
50
25
30
90
--90
10--
90--
kDa
3 41 2
A
39
aspártico e glutâmico. A hidrólise in vitro com enzimas digestivas de D. peruvianus
foi utilizada para investigar a causa da menor atividade entomotóxica da JBU
modificada, mostrando claramente que a modificação de resíduos ácidos afetou a
etapa de liberação do peptídeo entomotóxico a partir da urease. Recentemente,
Salvadori (2006) isolou proteinases ácidas tipo catepsina B e D do trato digestório
de ninfas de D. peruvianus, mas até o momento, a(s) enzima(s) proteolítica(s)
desse inseto envolvida(s) na ativação proteolítica da JBU ainda não foi(ram)
identificada(s). Observando as seqüências de aminoácidos que flanqueiam o
peptídeo tóxico gerado a partir da canatoxina/JBU por enzimas do caruncho
Callosobruchus maculatus (Gombarovits, 1999; figura 13), verifica-se a existência
de dois resíduos de ácido aspártico, um do lado N-terminal e outro do lado C-
terminal. A modificação desses resíduos ácidos poderia causar algum tipo de
impedimento estérico, impedindo o acesso das enzimas digestivas do inseto aos
seus sítios de clivagem na molécula da JBU, impedindo a geração do peptídeo
tóxico e explicando, assim, a redução da atividade inseticida.
225 NAIADGPVNETNLEAAMHAVRSKGFGHEEEKDASEGFTKEDPNCPFNTFIH
RKEYANKYGPTTGDKIRLGDTNLLAEIEKDYALYGDECVFGGGKVIRDGM
325
Figura 13: A seqüência do peptídeo entomotóxico (em verde) é apresentada em
dentro da seqüência de JBU (GenBank M65260). Os resíduos de ácido aspártico
flanqueando o N- e o C-terminal do peptídeo são apresentados em vermelho.
Contrastando com os resultados de bloqueio da liberação do peptídeo
entomotóxico a partir JBU modificada em resíduos ácidos, a modificação de lisinas
40
aparentemente não mostrou qualquer interferência na liberação desse fragmento
como pode ser observado na figura 12B pela presença de peptídeos na região de
ocorrência do fragmento tóxico. Esse dado sugere que a modificação de resíduos
de lisina afetaria o próprio peptídeo, alterando sua atividade inseticida. Como
mostra a figura 13, o peptídeo entomotóxico apresenta 8 resíduos de lisina
passíveis de serem modificados. Estudos de modelagem molecular mostraram
que o fragmento entomotóxico liberado a partir da urease apresentaria parte da
estrutura tridimensional formando um beta-hairpin (dados não publicados), um
motivo estrutural presente em toxinas peptídicas de escorpião e aranhas. Apesar
do mecanismo de ação do peptídeo entomotóxico da urease ainda não ser
conhecido, essa modelagem molecular sugere um possível motivo de ligação a
canais iônicos, que coincide com alguns sintomas de neurotoxicidade observados
nos insetos tratados com JBU ou com o peptídeo entomotóxico. Hassani et al
(1999) mostrou que para a toxina VII do escorpião Tityus serrulatus, resíduos de
lisina são extremamente importantes para a atividade tóxica sobre canais iônicos.
Assim, a modificação química, por acetilação, desses resíduos na toxina VII
resultaram em redução de sua capacidade de ligar-se a canais de sódio e redução
da toxicidade em insetos. A modificação de lisinas afeta, de maneira similar,
diversas outras toxinas tipo α de escorpião (Sampieri & Habersetzer-Rochat, 1978;
Darbon et al., 1983). Os dados aqui mostrados sugerem que os resíduos de lisina
podem ser importantes na interação do peptídeo entomotóxico com seu sítio alvo
nos insetos.
41
4.2. Parte II
Caracterização estrutural de JBU e Canatoxina e
afinidade diferencial por gangliosídeos
42
Até hoje nenhuma urease de origem vegetal teve sua estrutura
tridimensional elucidada, pois apesar da facilidade em formar cristais, esses não
difratam raios X. Tendo em vista as múltiplas propriedades biológicas
independentes relatadas para as ureases, com algumas isoformas apresentando
atividades específicas, como a toxicidade intraperitoneal em camundongos, até o
momento exclusiva da canatoxina, ou a atividade inseticida, característica das
enzimas vegetais mas ausente nas bacterianas, o desconhecimento da estrutura
3D dessas proteínas torna difícil a compreensão das particularidades de cada
molécula. Essa lacuna de conhecimento constitui também uma barreira para o
desenvolvimento de aplicações biotecnológicas baseadas nessas proteínas.
A canatoxina e JBU são duas isoformas de urease provenientes da mesma
fonte, as sementes de Canavalia ensiformis. Em termos de atividades biológicas, a
maior diferença entre as duas consiste da toxicidade da canatoxina em roedores
por via intraperitonial, sendo que a JBU é inócua quando administrada por essa
via. Além disso, as duas isoformas apresentam diferenças com relação à potência
de suas outras atividades. No caso da atividade enzimática, observou-se que a
canatoxina tem cerca de 50% da atividade ureolítica da JBU, apresentando K
M
semelhante, mas V
max
menor, provavelmente associado ao fato dessa isoforma
conter 1 átomo de Zn e 1 de Ni por subunidade, ao invés dos 2 átomos de Ni
presentes na JBU (Follmer et al., 2001; Follmer et al., 2002).
Com o objetivo de avançar o entendimento das diferenças entre essas
ureases, realizamos estudos comparativos com as duas isoformas quanto ao
conteúdo de estrutura secundária em diferentes pHs por dicroísmo circular e a
especificidade de interação com diferentes tipos de gangliosídeos, através de
ressonância plasmônica de superfície.
43
4.2.1. Dicroísmo circular
Dicroísmo circular é uma excelente ferramenta para determinação do
conteúdo estrutural de proteínas. Na espectroscopia de dicroísmo circular mede-
se a absorção diferencial da luz circularmente polarizada para a direita e para a
esquerda, que acontece devido a assimetrias nas moléculas. A estrutura
secundária de uma proteína pode ser medida por esta técnica em comprimentos
de onda na região do ultravioleta distante (190 – 250 nm). Devido a quiralidade do
carbono alfa da maior parte dos aminoácidos, a ligação peptídica torna-se o
principal cromóforo, sendo que a absorção diferencial da luz circularmente
polarizada pelo esqueleto polipeptídico da proteína também é afetado pelos
ângulos Φ e Ψ. Dessa maneira, as três principais estruturas secundárias
apresentadas por proteínas (α-hélices, folhas β, e estrutura desordenada) são
caracterizáveis por espectros de CD distintos. No entanto, como qualquer método
espectroscópico, os sinais observados refletem a média da população total da
molécula, e por essa razão, o método permite determinar a porcentagem de cada
estrutura, mas não localizá-la na molécula (Miles et al., 1980; Kallenbach, 1996).
Tendo em vista a grande homologia entre as ureases, medidas de
dicroísmo circular foram utilizadas para investigar as similaridades e diferenças
entre as duas isoformas de urease de Canavalia ensiformis. A figura 14 apresenta
os espectros de CD - UV distante de JBU e canatoxina. As análises dos espectros
mostraram para a JBU um mínimo local em 220,6 nm, intersecção em zero em
203 nm e um máximo em 198,4 nm. Já para canatoxina, os dois mínimos locais
observados não são bem distinguíveis e ocorrem entre 220 nm e 215,4 nm,
intersecção em zero em 202,4 nm e máximo em 197,2 nm. As análises do
conteúdo de estrutura secundária das duas proteínas, realizadas com os
44
programas CONTINLL, SELCON3 e CDSSTR (Provencher & Glockner 1981; van
Stokkum et al. 1990; Sreerama & Woody, 2000) são apresentadas na tabela 2,
mostrando que as isoformas apresentam diferenças com relação ao conteúdo de
estrutura secundária. Os dados mostram um menor conteúdo de α-hélices e maior
percentagem de folhas β para canatoxina, em relação a JBU.
Figura 14: A) Espectro de dicroísmo circular da JBU (preto) e canatoxina
(vermelho). Os espectros foram obtidos para uma solução 0,2 mg/mL de proteína
em tampão B pH 7,5 através de uma varredura de 195 – 250 nm em uma cubeta
de 0,1 cm de percurso ótico, como uma média de 16 varreduras a 25°C. B e C)
traçados originais da Canatoxina e JBU, respectivamente.
200 210 220 230 240 250
-15
-10
-5
0
5
10
15
200 210 220 230 240 250
-15
-10
-5
0
5
10
15
[θ] (deg cm
2
dmol
-1
)10
-3
λ (nm)
JBU
canatoxina
A
B
C
45
Tabela 2: Conteúdo de estrutura secundária das ureases de C. ensiformis.
Estrutura* JBU Canatoxina
α-hélices 39% 27%
folhas β 13% 22%
Turns 22% 19%
Desordenado 26% 32%
* referente aos dados de dicroísmo circular apresentados na Figura 14 analisados
pelo programa CONTINLL. RMSD abaixo de 0,1 para todas as medidas.
As diferenças estruturais em nível de estrutura secundária e terciária
provavelmente resultam, ou pelo menos contribuem para a estrutura quaternária
diferenciada das isoformas canatoxina e JBU. Assim, a forma nativa da canatoxina
em solução é a de um dímero com 184 kDa (Follmer et al., 2001), enquanto JBU
apresenta-se majoritariamente como um hexâmero. As variações nas atividades
biológicas das duas isoformas de urease são provavelmente reflexos das
diferenças estruturais entre elas.
O conteúdo de estrutura secundária obtidos para as duas isoformas de
urease de C. ensiformis podem ser comparados aos dados referentes às três
ureases de origem bacteriana que já tiveram suas estruturas cristalográficas
elucidadas: Klebsiella aerogenes (acesso PDB 1FWJ), Bacillus pasteurii (acesso
PDB 2UBP) e Helicobacter pylori (acesso PDB 1E9Z). O conteúdo de estrutura
secundária destas ureases é apresentado na figura 15. Ainda que seja necessário
considerar que as ureases de origem bacteriana são formadas por duas, ou três
subunidades enquanto as ureases de origem vegetal são proteínas de cadeia
46
única. Com base nesta comparação observa-se que canatoxina aproxima-se mais
das ureases bacterianas no conteúdo de estrutura secundária, do que a JBU.
Figura 15: Conteúdo de estrutura secundária em ureases bacterianas. As
estruturas secundárias são indicadas para cada bactéria (H = alfa-hélices, S =
folhas beta). Dados obtidos a partir do PDB.
Tendo em vista as diferenças estruturais encontradas entre JBU e
canatoxina, foi realizada uma investigação do comportamento dessas isoformas
em diferentes pHs com o objetivo de verificar se as diferenças nas estruturas
poderiam resultar em maior ou menor instabilidade das proteínas. Para isso foram
feitas medidas de dicroísmo circular em soluções com pH variando de 2,0 até
12,0, incubando-se as proteínas durante 24 h a 4
o
C nas diferentes soluções antes
de realizados os ensaios. Os espectros são apresentados nas figura 16 e 17 para
JBU e canatoxina respectivamente.
47
200 210 220 230 240 250
-15
-10
-5
0
5
10
15
200 210 220 230 240 250
-15
-10
-5
0
5
10
15
λ (nm)
[θ] (deg cm
2
dmol
-1
)10
-3
pH 2,0
pH 3,0
pH 4,0
pH 4,5
pH 5,0
pH 6,0
pH 7,0
A
200 210 220 230 240 250
-15
-10
-5
0
5
10
15
200 210 220 230 240 250
-15
-10
-5
0
5
10
15
[θ] (deg cm
2
dmol
-1
)10
-3
λ (nm)
pH 7,0
pH 8,0
pH 9,0
pH 10,0
pH 11,0
pH 12,0
B
Figura 16: Espectro de dicroísmo circular de JBU em diferentes pHs. Os
espectros de soluções 0,2 mg/mL de JBU nos diferentes pH foram obtidos através
de uma varredura de 195 – 250 nm em cubeta de 0,1cm de percurso ótico, como
uma média de 16 scans a 25°C. (A) JBU em pHs ácidos (B) JBU em pH alcalinos.
48
200 210 220 230 240 250
-10
-5
0
5
10
15
200 210 220 230 240 250
-10
-5
0
5
10
15
λ (nm)
[θ] (deg cm
2
dmol
-1
)10
-3
pH 2,0
pH 3,0
pH 4,0
pH 5,0
pH 6,0
pH 7,0
A
200 210 220 230 240 250
-10
-5
0
5
10
15
200 210 220 230 240 250
-10
-5
0
5
10
15
λ (nm)
[θ] (deg cm
2
dmol
-1
)10
-3
pH 7,0
pH 8,0
pH 9,0
pH 10,0
pH 11,0
pH 12,0
B
Figura 17: Espectro de dicroísmo circular de canatoxina em diferentes pHs. Os
espectros de soluções 0,2 mg/mL de canatoxina nos diferentes pH foram obtidos
através de uma varredura de 195 – 250 nm em cubeta de 0,1 cm de percurso
ótico, como uma média de 16 varreduras a 25°C. (A) Canatoxina em pHs ácidos;
(B) canatoxina em pHs alcalinos.
49
Os resultados nas figuras 16 e 17 mostram que as duas isoformas de
urease apresentam o mesmo comportamento frente aos diferentes pHs, mantendo
praticamente inalteradas suas estruturas secundárias quando submetidas à pHs
alcalinos ou levemente ácidos até pH 4,5 ou 5,0. Ambas as proteínas apresentam
pontos isoelétricos em pH próximo a 4,5 (Follmer et al., 2001). Qualquer
diminuição no pH da solução abaixo do PI faz com que as proteínas comecem a
apresentar sinais de mudanças conformacionais. As duas isoformas apresentam-
se parcialmente insolúveis entre os pHs 4,0 e 3,0 (recuperação de cerca de 70 %
da proteína após centrifugação), situação em que apresentam um conteúdo
aumentado de folhas β na sua estrutura. Ambas as isoformas tornam-se
novamente solúveis em pHs mais ácidos, no entanto já com uma conformação
majoritariamente desordenada. As amostras submetidas aos pHs ácidos foram
depois exaustivamente dialisadas contra tampão A pH 7,5 (ver purificação de JBU
em materiais e métodos) com o objetivo de verificar a ocorrência de “refolding” das
proteínas, mas a desnaturação observada foi completamente irreversível.
4.2.2. Afinidade por gangliosídeos
Follmer et al., 2001, mostraram que a canatoxina e a JBU comportavam-se
como uma lectina monovalente (hemilectina), ligando-se a glicoconjugados
complexos (gangliosídeos) e sialoproteínas (fetuína), mas não interagem com
pequenos açúcares como glicose, manose, galactose, entre vários outros
testados. Dados preliminares (Carlini et al., 1989) sugeriam ainda que a
canatoxina apresentaria preferência por polisialogangliosídeos, ligando-se mais
extensivamente no triasialogangliosídeo GT1b, do que no mono- ou di-
50
sialogangliospídeo da mesma série, mas essa informação, contudo, não estava
disponível para a JBU. Em sendo a canatoxina uma proteína neurotóxica (Carlini
et al., 1984; Barja-Fidalgo et al., 1991), a propriedade de interagir com
polisialogangliosídeos é extremamente interessante. Neurotoxinas protéicas de
origem bacteriana como as toxinas botulínicas e toxina tetânica também possuem
afinidade por polisialogangliosídeos, abundantes em tecidos nervosos, que
funcionam como aceptores, dirigindo as toxinas para seus sítios de ação na
membrana neuronal (Alouf & Freer, 1999).
Como já mencionado, uma diferença importante entre as propriedades
biológicas de JBU e a canatoxina é toxicidade para ratos e camundongos por via
intraperitoneal apresentada pela última. Seria a capacidade de ligação a
glicolipídeos, tão abundantes em células nervosas, a característica determinante
que faz com que a canatoxina apresente toxicidade em roedores enquanto JBU
parece ser inócua? Visando responder a essa questão foram realizadas medidas
de afinidade das duas proteínas com diferentes gangliosídeos através das
técnicas de ressonância plasmônica de superfície (SPR – surface plasmon
resonance).
SPR é um método relativamente novo e que vem sendo muito empregado
na investigação de interações entre moléculas. SPR é um fenômeno ótico que é
usado para medir mudanças na concentração de moléculas em solução. Neste
método, uma onda eletromagnética é propagada paralelamente ao longo de uma
superfície metálica (geralmente ouro), a qual está acoplado a um ligante de
interesse (proteína, DNA e outros). A propagação da onda é dependente do índice
de refração do meio em contato com a superfície, que é alterado por qualquer
molécula adicionada a este. Desta forma, quando uma solução contendo o analito
51
de interesse é injetada sobre a superfície, a interação do analito com a molécula
acoplada a essa superfície metálica promove alterações na propagação da onda
eletromagnética (por mudança no índice de refração da solução), e essas
alterações são quantificadas resultando em uma medida em tempo real da cinética
de interação entre as moléculas (Boozer et al., 2006).
Foram determinados os parâmetros de interação entre a canatoxina e a
JBU com monosialo- (GM1), disialo- (GD1b) e trisialogangliosídeo (GT1b) da série
b. As estruturas dos gangliosídeos são apresentadas na figura 18. Para a medida
dessas interações, injeções de diversas concentrações dos gangliosídeos foram
realizadas em um fluxo de 30 µl/min sobre um sensor contendo canatoxina ou JBU
imobilizadas. A figura 19 mostra os sensorgramas obtidos para a canatoxina
nesses estudos.
52
53
54
Os dados de afinidade obtidos foram ajustados para um modelo 1:1
(Langmuir) utilizando o softweare BIAEvaluation 4.1. Os resultados indicam que a
canatoxina liga aos gangliosídeos com afinidades diferenciadas (GT1b > GD1b
>>GM1), o que está em concordância com os dados previamente obtidos (Carlini
et al., 1989). As constantes cinéticas associadas aos gangliosídeos são
apresentadas na tabela 3. Os valores de χ
2
associados ao experimento variaram
de 0,47- 1,23% do R
max
,
sendo tipicamente considerados aceitáveis valores de χ
2
até 2% do R
max
(Yowler & Schengrund, 2004; Boozer et al., 2006).
Tabela 3: Constantes obtidas com um ajuste modelo 1:1 a partir dos
sensorgramas de cinco concentrações dos gangliosídeos expostos à canatoxina
imobilizada em um sensor CM5 (GE).
K
A
(M
-1
) K
D
(M)
R
max
(RU)
χ
2
GM1 4,16
x
10
3
2,41
x
10
-4
99,4 0,464
GD1b 2,04
x
10
4
4,90
x
10
-5
39,2 0,481
GT1b 2,44
x
10
4
4,10
x
10
-5
41,7 0,761
K
A
– constante de associação; K
D
– constante de dissociação; R
max
– sinal máximo.
Até então a capacidade de ligação a gangliosídeos tinha sido somente
caracterizada para a canatoxina, de forma que não havia nenhuma informação se
essa afinidade é compartilhada também por sua isoforma, a JBU. Visando
esclarecer essa questão, assim como realizado para a canatoxina, JBU foi
imobilizada em um sensor CM5 (GE) e submetida à interação com diversas
concentrações dos mesmos três gangliosídeos. Os sensorgramas resultantes são
apresentados nas figuras 20.
55
56
Os parâmetros de afinidade associados à ligação dos gangliosídeos a JBU
são apresentados na tabela 4. Os valores de χ
2
Associados às medidas variam de
0,38 - 1,1% do R
max
, sendo que os dados tipicamente aceitáveis apresentam
valores de χ
2
abaixo de 2% do R
max
(Yowler & Schengrund, 2004; Boozer et al.,
2006)
.
Tabela 4: Constantes obtidas com um ajuste modelo 1:1 a partir dos
sensorgramas de cinco concentrações dos gangliosídeos expostos à JBU
imobilizada em um sensor CM 5 (GE).
K
A
(M
-1
) K
D
(M) R
max
(RU)
χ
2
GM1 2,83
x
10
3
3,53
x
10
-4
120 0,457
GD1b 3,08
x
10
3
3,25
x
10
-4
513 2,28
GT1b 9,0
x
10
3
1,1
x
10
-4
89,3 1,0
K
A
– constante de associação; K
D
– constante de dissociação; R
max
– sinal máximo.
Como resultado desse estudo, observamos que a JBU também apresenta
afinidade (K
D
~10
-4
M) por gangliosídeos, ainda que menor do que aquela medida
para a canatoxina (K
D
~10
-5
M). A JBU parece compartilhar a mesma preferência
da canatoxina por polisialogangliosídeos, na ordem GT1b > GD1b >
GM1.
Diversas neurotoxinas protéicas de origem bacterianas também
apresentam afinidade por polisialogangliosídeos. Yowler & Schengrund, 2004,
através da técnica de SPR, mostraram que a toxina botulinica A apresenta a
mesma ordem de preferência por polisialogangliosídeos observada aqui para a
canatoxina e a JBU, no entanto, com constantes de afinidade cerca de 100 vezes
57
maiores. Resultados similares foram obtidos para a toxina tetânica, que também
interage preferencialmente com o gangliosídeo GT1b com estequiometria 1:1,
conforme estudos de microcalorimetria de Krell et al., 2003. A afinidade da toxina
tetânica por polisialogangliosídeos é de 2 a 3 ordens de grandeza maior do que a
observada para a canatoxina, o que poderia explicar em parte, a menor
neurotoxicidade dessa, com valores de DL50 para camundongo por via i.p. na
faixa de µg e mg por Kg de peso para essas proteínas, respectivamente.
Em outros organismos patogênicos produtores de urease, como é o caso
do Helicobacter pylori (bactéria causador da ulcera péptica), a urease é
considerada um importante fator de colonização garantindo condições de pH
favoráveis ao crescimento bacteriano no estômago do hospedeiro. No entanto o
mecanismo de colonização, intermediado pela urease, ainda não está
completamente esclarecido. Numerosas propriedades adesivas da bactéria foram
descritas, inclusive ligação a glicoproteínas da matriz extracelular e a
oligossacarídeos como Neu5Ac-α3-Gal-β4-GlcNAc (revisto em Olivera-Severo et
al., 2006). Icatlo et al., 2000, demonstraram que a urease purificada de H. pylori
se liga à mucina gástrica, heparina, e glicolipídeos da membrana celular em pH
5,0 e que essa propriedade é independente da atividade ureolítica que requer pH
neutro-alcalino.
Devido ao grande número de relatos sobre a resistência de isolados clínicos
de H.pylori a antibióticos, outras classes de drogas, em particular carboidratos
inibidores, são tidos hoje como potenciais candidatos para uma terapia anti-
adesão, que possa interferir no processo de colonização da mucosa gástrica por
essa bactéria (Olivera-Severo et al., 2006)
58
Adicionalmente, estão em andamento ensaios de fluorescência e
microcalorimetria visando a caracterização da interação de gangliosídeos com
JBU e canatoxina. Dados preliminares obtidos a partir dessas técnicas estão de
acordo com os resultados obtidos por SPR indicando uma alta afinidade de ambas
as ureases por gangliosídios polisialilados, no entanto há indícios da existência de
um segundo sítio de ligação de baixa afinidade. Resultados similares a esse
também foram observados para toxina botulinica A (Yowler & Schengrund, 2004) e
toxina colérica (Turnbull et al., 2004).
Proteínas tóxicas vegetais e bacterianas que apresentam propriedades de
ligação a carboidratos em geral exercem seus efeitos intracelularmente, atuando
como complexos Haptomero–Efetômero (Carlini & Guimarães, 1991). Este
modelo, apresentado na figura 25, propõe que a proteína é composta por dois
domínios com propriedades biológicas distintas, um domínio B responsável pelo
reconhecimento da célula alvo através da interação com carboidratos existentes
na superfície celular, e um domínio A, que é o agente tóxico propriamente dito.
59
Figura 21: Representação esquemática do mecanismo de ação intracelular de
proteínas tóxicas que atuam como complexos haptômero-efetômero (hemilectinas
tóxicas). O haptômero liga-se ao “receptor” na superfície da célula seguido pela
internalização da proteína por exocitose. Uma vez dentro do compartimento
endocítico, a proteína é processada levando à liberação do efetômero
enzimaticamente ativo. A figura mostra de forma genérica os principais passos do
mecanismo de ação de hemilectinas tóxicas, sendo que cada toxina pode
apresentar requerimentos específicos nas diferentes etapas do processo.
Adaptado de Carlini & Guimarães 1991.
Sendo a canatoxina (e provavelmente outras ureases) capaz de se ligar a
gangliosídeos, essa propriedade certamente é relevante para a expressão de seus
efeitos biológicos. Em estudos anteriores, Campos et al., 1991 mostraram que a
canatoxina é internalizada por várias linhagens de células em cultura ao final de
40 minutos. No entanto, esse processo é lento se comparado com outros efeitos
60
da canatoxina, como agregação plaquetária (máximo em 2 minutos; Barja-Fidalgo
et al., 1991b) ou secreção de neurotransmissores em sinaptosomas (máximo em
10 minutos, Barja-Fidalgo et al., 1988). Assim, postulamos que esses efeitos
provavelmente requerem a ligação da canatoxina com “receptores” celulares,
entre os quais estariam os gangliosídeos, acionando uma cascata de mensageiros
ou interferindo com canais iônicos, como revisto por Olivera-Severo et al., 2006,
que levariam à expressão dos efeitos acima mencionados, sem necessidade de
internalização da proteína.
Mas por que então JBU também capaz de se ligar a gangliosídeos e com a
mesma especificidade aparente de sua isoforma, não apresenta toxicidade
intraperitoneal ? Além de uma diferença na afinidade por gangliosídeos, o fato de
a canatoxina apresentar-se em sua forma nativa como um dímero enquanto a JBU
é um hexâmero, provavelmente torna mais difícil a absorção parenteral da JBU,
explicando a sua falta de efeito por essa via de administração.
61
6. Conclusões
• As modificações de resíduos de lisina (com anidrido acético), e resíduos
ácidos (com EDC e etilenodiamina) da molécula de JBU não foram capazes
de promover alterações em sua atividade enzimática, mas causaram
significativas alterações na atividade inseticida da urease.
• No caso da modificação de resíduos ácidos, a diminuição da atividade
entomotóxica parece ser devido a um bloqueio dos sítios de clivagem na
molécula por enzimas digestivas dos insetos, que são as responsáveis pela
liberação do peptídeo inseticida.
• No caso da modificação de resíduos de lisinas, nenhuma alteração na
formação do peptídeo inseticida foi observada, sugerindo que o decréscimo
na atividade inseticida dar-se-ia por alterações no próprio peptídeo, o que
reduziria sua atividade.
• Apesar das grandes semelhanças entre as duas isoformas de urease de C.
ensiformis, os resultados de dicroísmo circular revelaram significativas
diferenças estruturais entre elas. No entanto, as isoenzimas não se
diferenciam em relação à sensibilidade ao efeito desnaturante frente a
diferentes pH.
62
• Tanto JBU como canatoxina interagem com gangliosídeos, mostrando uma
clara preferência por polisialogangliosídeos, sendo a afinidade da
canatoxina por esses glicoconjugados cerca de 10 vezes maior do que a
observada para a JBU. A maior afinidade por gangliosídeos e a forma
dimérica poderiam explicar a neurotoxicidade apresentada pela canatoxina
quando injetada via i.p., contrastando com a JBU, não tóxica pela mesma
via, que apresenta menor afinidade e forma hexamérica.
63
7. Referências Bibliográficas
Alouf, J. E. & Freer, J. H., The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. 2
nd
ed.
Academic Press. London. 1999.
Atassi, M. Z. & Habeeb, A. F., Reaction of protein with citraconic anhydride. Methods in
Enzymology 25, 546.1972.
Bacanamwo, M., Witte, C. P., Lubbers, M. W. & Polacco, J. C., Activation of the urease of
Schizosaccharomyces pombe by the UreF accessory protein from soybean. Molecular Genetics
and Genomics. 268, 525 – 34. 2002.
Barcellos, G. B., Canatoxina: análise estrutural e estudos comparativos com a lectina
concanavalina A em sementes de Canavalia ensiformis. Tese de Mestrado, UFRJ, Brasil. 1992.
Barja-Fidalgo, C., Carlini, C. R. & Guimarães, J. A.,The secretory effect of canatoxin on rat brain
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68
ANEXO
69
70
71
72
73
74
75
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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