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Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Medicina de Botucatu
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES STEAP1 E
STEAP2 EM ADENOCARCINOMAS DE PRÓSTATA POR
RT-PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL
SHADIA MUHAMMAD IHLASEH
Botucatu - SP
2008
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Patologia da
Faculdade de Medicina de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista –
UNESP, para obtenção do título de
Mestre em Patologia
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Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Medicina de Botucatu
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES STEAP1 E STEAP2 EM
ADENOCARCINOMAS DE PRÓSTATA POR RT-PCR
QUANTITATIVA EM TEMPO REAL
Mestranda: Shadia Muhammad Ihlaseh
Orientador:Prof. Dr. João Lauro Viana de Camargo
Co-orientadora: Prof. Dra. Silvia Regina Rogatto
Botucatu - SP
2008
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Patologia da
Faculdade de Medicina de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista –
UNESP, para obtenção do título de
Mestre em Patologia
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Ihlaseh, Shadia Muhammmad.
Análise da expressão dos genes STEAP1 e STEAP2 em adenocarcinomas de
próstata por RT-PCR quantitativa em tempo real / Shadia Muhammad Ihlaseh.
– Botucatu : [s.n.], 2008
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina de Botucatu, 2008.
Orientador: João Lauro Viana de Camargo
Co-orientadora: Silvia Regina Rogatto
Assunto CAPES: 40105008
1. Câncer - Próstata - Aspectos genéticos 2. Patologia
CDD 616.994
Palavras-chave: Adenocarcinoma de próstata; Correlação clínica; Gene
STEAP1; Gene STEAP2; RT-PCR quantitativa em tempo real
Dedico este trabalho ao meu pai Muhammad e minha mãe Zilda (in memoria) pelo amor
incondicional e pelo exemplo de perseverança, respeito e fé...
“O tempo não pára! Só a saudade é que faz as coisas pararem no tempo...”
(Mario Quintana)
Agradecimentos Especiais
Ao meu orientador, Dr. João Lauro Viana de Camargo, pelos ensinamentos que nos faz
ver mais claro e pelo exemplo diário de dedicação e honestidade à pesquisa.
À minha co-orientadora, Dra. Silvia Regina Rogatto, pela sua capacidade de instigar em
mim o senso crítico de fazer ciência.
“Eu aprendi que para crescer como pessoa é preciso me
cercar de gente mais inteligente do que eu.”
(William Shakespeare)
Agradecimentos
A Deus, que só pode estar em primeiro lugar na minha vida, por tudo... Obrigada!
Ao meu namorado Caio, pelo amor, cumplicidade e compreensão... essa conquista
também é sua...
Àos meus avós, Faustino e Ana, e toda minha famíla, pelas orações e incentivo.
Aos meus amigos: Ivana, Carol, Diego, Rebeca, Renato, Mariana, Juliana, Cibele pela
alegria que vocês me passam, tornando o dia seguinte sempre mais leve.
Aos amigos do laboratório Toxicam: Carla, Marize, Meire, Alexandre, Merielen, Tony,
Paula, João, João Paulo, Bianca, Mitscheli, Ana Paula, Gabrielli, Cristina, Paulo, Mara,
Viviane e Luciana pelo companheirismo e amizade.
Ao Dr. José Carlos de Souza Trindade Filho, à Dra. Maria Domingues e ao Dr.
Fernando Soares por colaborarem com meu amadurecimento como pós-graduanda.
Aos funcionários do departamento de Patologia: Zé Carlos, Ronaldo, Du, Milena, Ivana,
Cris, Marquinhos, Chico, Claudinei, Luciano, Cícera, Lúcia e Denise pela colaboração
de alguma forma nesse trabalho.
Ao pessoal do NeoGene laboratório pelo apoio e amizade, em especial, Sandra, Fabíola,
Rodrigo, Greicy, Carlos, Flávia, André e Fernanda que me ajudaram mais diretamente
na execução do projeto.
Aos pacientes, que aceitaram participar desse estudo.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pelo suporte
financeiro.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa – CNPq, pela bolsa de estudos concedida.
Índice
Revisão de Literatura
1. Epidemiologia do adenocarcinoma de próstata (CaP).................................................01
2. Apectos clínicos e histopatológicos do CaP................................................................02
3. Alterações genéticas e CaP..........................................................................................04
4. Genes STEAP1 e STEAP2...........................................................................................06
5. RT-PCR quantitativa em tempo real...........................................................................07
Referências Bibliográficas............................................................................................09
Manuscrito.....................................................................................................................14
Resumo............................................................................................................................15
Abstract............................................................................................................................16
Introdução........................................................................................................................17
Material e Métodos..........................................................................................................19
Resultados........................................................................................................................22
Discussão.........................................................................................................................23
Conclusão........................................................................................................................25
Tabela I e Figuras............................................................................................................26
Referências Bibliográficas...............................................................................................29
Apêndice
Tabela II ..........................................................................................................................32
Anexos
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa.........................................................................34
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido................................................................35
Ihlaseh, SM Revisão de Literatura
1
Revisão da Literatura
1. Epidemiologia do adenocarcinoma de próstata
O câncer de próstata (CaP) é considerado um sério problema de saúde pública
devido suas altas taxas de incidência e mortalidade. É a segunda causa de óbitos por
câncer em homens, superado apenas pelo câncer de pulmão e representa cerca de 10%
do total de câncer no mundo. No Brasil, estima-se a ocorrência de 49.530 novos casos
em 2008, contra 47.280 casos em 2006 (Instituto Nacional do Câncer - INCA, 2008). O
aumento observado nas taxas de incidência verificado nos últimos anos pode ser
parcialmente justificado pelo progressivo aumento da eficácia investigativa dos métodos
diagnósticos, pela melhoria na qualidade dos programas de rastreamento e sistemas de
informação do país e pelo aumento na expectativa de vida do brasileiro.
Os principais fatores de risco para o câncer de próstata são idade avançada, etnia
e predisposição familial. O envelhecimento é considerado o fator de risco mais
significante. Estudos realizados principalmente em autópsias estimam que aos 80 anos,
aproximadamente 70% dos homens devam possuir células neoplásicas na próstata (Soos
et al., 2005). A incidência do CaP difere substancialmente entre os grupos étnicos. Os
afro-americanos têm incidência de 10 a 40 vezes maiores que os asiáticos (Hsing et al.,
2000). A magnitude estimada do risco relativo em parentes de primeiro grau de afetados
não parece diferir significativamente entre os grupos raciais (africanos, caucasianos e
asiáticos) embora, ocorram grandes diferenças na incidência da doença entre estes
grupos. Parentes de primeiro grau de pacientes com CaP apresentam risco aumentado de
2 a 3 vezes, quando comparado a homens na população geral (Carter et al., 1990;
Goldgar et al., 1994). Entre outros fatores de risco encontram-se a alimentação
Ihlaseh, SM Revisão de Literatura
2
altamente calórica e desequilíbrio nos níveis de hormônios masculinos (Epstein et al.,
2005a).
2. Apectos clínicos e histopatológicos do CaP
A próstata é uma glândula exócrina do sistema reprodutor masculino localizada
na base da bexiga e envolvendo completamente um segmento da uretra. Apresenta
estrutura compacta e nela podem ser consideradas quatro regiões anatômicas distintas:
zona periférica, de transição, central e estroma fibromuscular anterior (Sampson et al.,
2007). Aproximadamente 70% das neoplasias epiteliais prostáticas têm origem na zona
periférica (McNeal, 1986; Che & Grignon, 2002), enquanto que a hiperplasia nodular da
próstata (HNP) ocorre preferencialmente na zona de transição da glândula.
Em geral, o adenocarcinoma da próstata apresenta crescimento lento e sem
manifestações clínicas, levando aproximadamente 15 anos para atingir 1 cm³, o que
favorece a presença da doença local ampliada ao diagnóstico. Em vista disso, os estudos
se voltaram para o diagnóstico precoce da doença. A implementação na rotina da
determinação dos níveis séricos do PSA (antígeno específico da próstata) aumentou
consideravelmente as taxas de detecção precoce do adenocarcinoma de próstata. Este
antígeno é produzido pelas células epiteliais superficiais dos ácinos prostáticos e é
secretado diretamente para o sistema de ductos da glândula; sua transcrição é regulada
por andrógenos e, em geral, os seus níveis aumentam conforme o volume e extensão da
neoplasia. Algumas críticas a esse exame referem-se à sua baixa sensibilidade para
distinguir o câncer de doenças benignas, como hiperplasia nodular da próstata e
prostatites, e detectar o CaP em indivíduos com valores baixos de PSA, como é o caso
de pacientes com histórico familial de adenocarcinoma prostático (De Marzo et al.,
2007). Variações do PSA são utilizadas para aumentar sua especificidade diagnóstica,
Ihlaseh, SM Revisão de Literatura
3
como é o caso da velocidade de duplicação do PSA, ou ainda monitorar a recorrência do
CaP após prostatectomia radical, pelo tempo livre da doença ou de recidiva bioquímica
pós-cirúrgicos, i.e., valores de PSA iguais ou maiores que 0,4ng/mL indicam recorrência
tumoral (Lang et al., 1989; Stephenson et al., 2006). Porém, esse valor de referência é
controverso, pois em recente consenso europeu foi considerada a possibilidade de
tratamento quando os valores de PSA são iguais ou maiores que 0,2 ng/mL, seguidos
por elevação subseqüente (Boccon-Gibod et al., 2004).
Quando diagnosticados, os adenocarcinomas de próstata são classificados pelo
sistema TNM (T:tamanho do tumor, N: linfonodos comprometidos, M: metástase) para
definição do seu estádio (tamanho e disseminação do tumor) (Epstein et al., 2004) e
pelo sistema de Gleason, para sua graduação (diferenciação histológica da neoplasia)
(Epstein et al., 2005b). Este sistema considera cinco padrões histológico do tumor, que
apresentam indiferenciação crescente (padrões 1 a 5 de Gleason). O escore da
graduação histológica é baseado na soma dos padrões mais prevalentes, de modo que a
graduação varia de 2 (1+1), quando há um só padrão, bem diferenciado, até 10 (5+5),
quando todo o tumor é praticamente indiferenciado. Em termos de prognóstico, os
escores 2-4 são classificados como bem diferenciados; 5, 6 e 7 (3+4) como
moderadamente diferenciado, e 7(4+3), 8, 10 como pouco diferenciados. O
estadiamento inicialmente é feito pela extensão da doença ao exame anatomopatológico.
Os tumores pT1 são do tipo incidental, encontrados em produtos de ressecção de
hiperplasia nodular da próstata ou em necropsias. Quanto à capacidade invasiva do
tumor pode-se considerar os tumores pT2 (confinados na glândula), subdivididos em
pT2a (apresentam 50% ou menos de envolvimento de um lobo), pT2b (envolvem mais
de 50% de um lobo) e pT2c (envolvem ambos os lobos), e os tumores pT3, que são
subdivididos em pT3a (com extensão extra-prostática) e pT3b (invasão das vesículas
Ihlaseh, SM Revisão de Literatura
4
seminais). Os fatores prognósticos essenciais no CaP são estadiamento, grau
histológico e níveis séricos de PSA. A combinação destas três variáveis permite uma
uma melhor avaliação do prognóstico do que a análise de qualquer uma delas
isoladamente (Partin et al., 1997). Outra característica com importância prognóstica é a
capacidade do tumor invadir vasos sanguíneos e linfáticos, não contemplada pelo
sistema TNM (Epstein et al., 2005a; Antunes et al., 2006).
Segundo Nelson et al. (2004), baseando-se no modelo de progressão clínica
altamente variável dos cânceres, o CaP é uma entidade que representa, na verdade,
múltiplas doenças. O presente estudo procurou abranger apenas os fatores prognósticos
mais utilizados na prática clínica, para serem correlacionados ao perfil de expressão de
genes candidatos a marcadores moleculares do CaP.
Os CaPs são heterogêneos em seus aspectos clínico, morfológico e biomolecular.
Apesar dos parâmetros clínicos e histológicos serem úteis para a classificação dos
cânceres prostáticos, estes não são capazes de diferenciar adenocarcinomas prostáticos
indolentes dos invasivos. Em geral, os marcadores utilizados ao diagnóstico e na
avaliação da progressão da doença não correspondem de forma satisfatória à evolução
dos pacientes e, portanto, há necessidade da identificação de novos marcadores.
3. Alterações genéticas e CaP
O CaP possui natureza multifocal dentro da glândula e se desenvolve devido ao
acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas (Shand e Gelmann, 2006). Vários
estudos identificaram alterações genômicas não-randômicas, isto é, regiões
cromossômicas aparentemente envolvidas de modo não-casual com o início e
progressão da neoplasia. Perdas cromossômicas em 1p, 5q, 6q, 8p, 8q, 10p, 10q, 13q,
Ihlaseh, SM Revisão de Literatura
5
16q, 17p, 18q e Y e ganhos em 1q, 2p, 7, 8q, 17p, 17q, 18q e Xq foram registradas pela
técnica de hibridação genômica comparativa (CGH) (Zhang et al., 2003; Fromont et al.,
2005). Ganho genômico do cromossomo 7 foi associado com comportamento agressivo
do CaP (Das et al., 2005). Igualmente, vários genes foram relacionados com o CaP,
como o ERBB1, PAI, RAF e o EZH2, mapeados no cromossomo 7 (Vogel et al., 2001);
o gene RB (Maddison et al., 2004); o APC (Brewster et al., 1994; Gerstein et al., 2002);
o TP53 associado a CaP avançado ou metástase (Yang et al., 1996; Lin et al., 2005); o
BRCA1 (Langston et al., 1996; Horsburgh et al., 2005); o TP16 (Jarrard et al., 2002); o
AR (Visakorpi et al., 1995; Terry et al., 2006); os genes relacionados à atividade da
telomerase (Zhang et al., 1998); os genes reguladores de apoptose, como o BCL2
(McDonnell et al., 1997; Chi 2005); o gene GST, associado à biotransformação de
drogas; o NKX3.1, localizado em 8p21 (Ju et al., 2006); o PTEN, localizado no
cromossomo 10 e associado à regulação da fosfatidilinositol (Wang et al., 2006) e o
gene da E-caderina (Bonilla et al., 2006). Esses dados mostram a existência de grande
heterogeneidade no perfil de alterações genéticas no adenocarcinoma de próstata.
Em trabalho anterior desenvolvido no NeoGene Laboratório, coordenado pela
Dra. Silvia Regina Rogatto nesta Faculdade de Medicina, foram identificados, pela
metodologia de CGH-array, regiões contendo alto nível de ganho e perda genômica em
adenocarcinomas prostáticos. Os genes STEAP1 e STEAP2 (Six-transmembrane
epithelial antigen of prostate1 e 2, respectivamente) estão mapeados em 7q21.13, uma
das regiões que apresentaram alto nível de amplificação nesse estudo (Santos, 2007).
Por esta razão estes genes foram selecionados como alvos potenciais de pesquisa para a
compreensão de seu papel no desenvolvimento do adenocarcinoma de próstata.
Ihlaseh, SM Revisão de Literatura
6
4. Genes STEAP1 e STEAP2
Os genes STEAP1 (sinônimos: MGC19484, PRSS24, STEAP) e STEAP2
(sinônimos: IPCA1, PCANAP1, PUMPCn, STAMP1, STMP) (Six-transmembrane
epithelial antigen of prostate 1 e 2, respectivamente) estão localizados no cromossomo
7q21.13 e pertencem a uma família gênica ainda pouco estudada, composta por esses
dois genes e mais os genes STEAP3 e STEAP4 (Ohgami et al., 2006; National Center for
Biotechnology Information – NCBI, 2007).
O gene STEAP1 é predominantemente expresso em próstata humana normal,
mas possui expressão aumentada em várias linhagens celulares de cânceres, como de
próstata, bexiga, ovário, cólon, sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma e melanoma
(Hubert et al., 1999; Rodeberg et al., 2005). Estudos clínico e experimental também
demonstraram a expressão aumentada de STEAP1 em metástases ósseas e linfonodais do
CaP (Yang et al., 2001; Challita-Eid et al., 2007). Na próstata, seus produtos gênicos
foram identificados nas junções celulares do epitélio acinar. A proteína contem seis
domínios transmembrânicos e terminações intracelulares amino e carboxil, o que sugere
se tratar de canais iônicos envolvidos com a comunicação celular (Hubert et al., 1999;
Ohgami et al., 2006; Challita-Eid et al., 2007). Sanches-Pulido et al. (2004)
relacionaram as proteínas STEAP1 e STEAP2 com o crescimento tumoral, ao
demonstrar em suas estruturas a presença do domínio ACRATA (Apoptosis, Cancer e
Redox Associated Transmembrane domain), homólogo ao encontrado na estrutura de
bactérias NADPH-oxidase (Nox), envolvidas na produção de espécies reativas de
oxigênio. As proteínas STEAP1 e STEAP2 reúnem características de antígenos
tumorais: expressão aumentada em diversos tipos de cânceres, expressão reduzida em
tecidos normais (exceto próstata) e localização na superfície celular. Nesse sentido,
Ihlaseh, SM Revisão de Literatura
7
estudos in vitro e in vivo estão sendo realizados para identificar peptídeos dessas
proteínas capazes de provocar resposta imune antitumoral, mediada por linfócitos T
(Rodeberg et al., 2005; Alves et al., 2006; Garcia-Hernandez et al., 2007).
Aparentemente, andrógenos sintéticos não alteram a expressão dos genes STEAP1 e
STEAP2 (Hubert et al., 1999; Porkka et al., 2002).
O produto de STEAP2 também está predominantemente expresso em próstata
normal e secundariamente em ovário, pâncreas, duodeno, cérebro e fígado fetal
(Korkmaz et al., 2002; Ohgami et al., 2006). Porkka et al. (2002) identificaram aumento
da expressão gênica de STEAP2 em tumores primários de CaP em relação à hiperplasia
nodular de próstata. A proteína STEAP2 foi localizada por imunofluorescência no
complexo de Golgi e em estruturas vesículo-tubulares citoplasmáticas, sugerindo estar
envolvida em sistemas secretores/endocíticos (Korkmaz et al., 2002). Considerando sua
estrutura protéica e localização celular, testes in vitro demonstraram o envolvimento do
produto gênico de STEAP2 em reações de oxidorredução, sugerindo uma provável
função de metalorredutase (Ohgami et al., 2006; Knutson, 2007).
5. RT-PCR quantitativa em tempo real
A técnica de RT-PCR quantitativa em tempo real é um método cinético que usa
moléculas marcadas com fluorocromos específicos para quantificar seqüências de
cDNA à medida que são amplificadas (Seuánez et al., 2004). Esta metodologia tem sido
usada como ferramenta na análise do perfil de expressão gênica em tumores humanos,
incluindo o CaP, e permitido a identificação de candidatos a marcadores tumorais.. Ji et
al. (2005) observaram redução da expressão do gene receptor de estrógeno β (ESR2),
sugerindo que esse receptor possa mediar sinais supressores, de modo que sua ausência
Ihlaseh, SM Revisão de Literatura
8
promova proliferação celular nos tumores de próstata. Utilizando a mesma técnica,
pesquisadores japoneses identificaram expressão aumentada do gene PCA-1 (prostate
cancer antigen-1) no CaP, mas não na hiperplasia nodular prostática e em tecido normal
adjacente ao tumor (Konishi et al., 2005). Para o nosso conhecimento, ainda não há
dados sobre o papel dos genes STEAP1 e STEAP2 no desenvolvimento e progressão do
câncer da próstata, a não ser que encontram-se amplificados (Hubert et al., 1999; Yang
et al., 2001; Ohgami et al., 2006). Faltam informações sobre a correlação entre os
achados moleculares com os aspectos anatomopatológicos dos tumores e com as
características clínicas dos pacientes.
Ihlaseh, SM Referências Bibliográficas
9
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14
Expressão aumentada do gene STEAP1 como marcador prognóstico em
adenocarcinomas de próstata
Ihlaseh SM
1
, Gambarini GHR
2
, Trindade Filho JCS
3
, João Lauro Viana de Camargo
4
Silvia Regina Rogatto
5
.
1
Mestranda, Laboratório TOXICAM, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina,
UNESP, Botucatu, 18618-000, SP, Brasil.
2
Doutoranda, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, 18618-
000, SP, Brasil.
3
Professor
Assistente Doutor, Departamento de Urologia, Faculdade de Medicina, UNESP,
Botucatu, 18618-000, SP, Brasil.
4
Professor Titular de Patologia, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina, UNESP,
Botucatu, 18618-000, SP, Brasil.
5
Professora Adjunta Doutora, NeoGene Laboratório, Departamento de Urologia, Faculdade de
Medicina, UNESP, Botucatu, 18618-000, SP, Brasil.
Trabalho desenvolvido nos Departamentos de Patologia e de Urologia, Faculdade
de Medicina, UNESP, SP, Brasil.
Correspondência: Dr. João Lauro Viana de Camargo
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina, UNESP
Distrito de Rubião Júnior, s/n. Botucatu – SP. Brasil.
Cep: 18.618-000
e-mail: decam@fmb.unesp.br
Auxílios: Auxílio FAPESP (Processo 2006/58091-8); CNPq (Bolsa PQ - Processo
302361/2003); Núcleo de Avaliação do Impacto Ambiental sobre a Saúde Humana
(TOXICAM); NeoGene Laboratório.
Manuscrito segundo as normas do Periódico Prostate (ISSN: 0270-4137) – fator de
impacto 3.7.
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
15
RESUMO
O câncer de próstata (CaP) é um problema de saúde pública devido suas altas taxas de
incidência e de mortalidade. Atualmente, os marcadores disponíveis para o diagnóstico e
prognóstico não são capazes de diferenciar os CaPs indolentes dos que progridem mais
agressivamente. Estudos moleculares usando análises em larga escala, como hibridação
genômica comparativa baseada em arrays (aCGH), permitem a identificação de vários genes
candidatos a marcadores. Estudos prévios de nosso grupo usando hibridação aCGH em CaP
demonstraram amplificação em 7q21.13, onde estão mapeados os genes STEAP1 e STEAP2 (six-
transmembrane epithelial antigen of prostate 1 e 2). Esses genes apresentam expressão
aumentada em diversas linhagens de células neoplásicas, incluindo as de próstata. No entanto,
seu papel no desenvolvimento e progressão do CaP permanece desconhecido.Há evidências de
que eles codificam antígenos tumorais com potencial para serem utilizados como marcadores
prognósticos. O presente trabalho visou determinar o perfil de expressão dos genes STEAP1 e
STEAP2 por RT-PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) em adenocarcinomas primários de
próstata, em amostras de tecido não-neoplásico adjacente aos tumores e em hiperplasias
nodulares da próstata (HNP). Amostras de próstatas avaliadas histologicamente como normais
foram obtidas de necropsias e usadas como controles. Os pacientes foram agrupados em três
classes segundo o risco de recorrência do tumor (baixo, moderado e alto) de acordo com o PSA
(antígeno prostático sérico), a graduação histológica e o estadiamento dos tumores. Foi
observado aumento de expressão dos genes STEAP1 e STEAP2 em 28% e 38% das amostras,
respectivamente; em três pacientes com alto risco de recorrência houve aumento simultâneo da
expressão dos dois genes. A expressão do gene STEAP2 mostrou correlação positiva com a
expressão do gene STEAP1 no CaP (Spearman r=0,63; p<0,0001) e no tecido não neoplásico
adjacente ao tumor (Spearman r=0,78; p=0,0002). Houve aumento significativo (p < 0,05) da
expressão do gene STEAP1 nas amostras de CaP com escore de Gleason ≥ 7(4+3) em relação ao
tecido não-neoplásico adjacente ao tumor e também nos casos que apresentavam invasão
angiolinfática. Esses dados sugerem que a expressão do gene STEAP1 está associada a
parâmetros anatomo-clínicos de pacientes com CaP e pode ser considerado um marcador de
pior prognóstico.
Palavras-chave: STEAP1, STEAP2, adenocarcinoma de próstata, RT-PCR quantitativa em
tempo real, correlação clínica
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
16
ABSTRACT
Prostate cancer (PCa) is a public health problem due to the high incidence and mortality
rates. Available prognostic markers as serum PSA levels, Gleason differentiation scores and
tumor staging have not been able to discriminate indolent from aggressive tumors. Increased
expressions of STEAP1 and STEAP2 genes (six-transmembrane epithelial antigen of prostate 1
e 2) have been shown in neoplastic cell lineages from prostate, urinary bladder, ovary and other
tumors. Previously, using comparative genomic hybridization based in arrays in prostate
adenocarcinomas and their metastasis, we described genomic gains at the 7q21.13. In this region
are mapped the STEAP1 and STEAP2 genes. The involvement of these genes in PCa
development and progression remains to be clarified. These genes possibly express tumoral
antigens and are putative molecular markers.The objective of the present study was to determine
the gene expression profiles of the STEAP1 e STEAP2 genes by real time quantitative PCR in
primary prostate adenocarcinomas, surrounding non-neoplastic tissues, and in nodular
hyperplasia of the prostate. The results were associate with tumor pathologic characteristics and
patients clinical features. Samples from histologically confirmed normal prostates obtained from
necropsies were used as normal controls. According to potential risk for tumor recurrence (low,
moderate and high risk) patients were classified in three groups depending on the serum PSA
levels, Gleason scores, and tumor stages. Increased expression of STEAP1 e STEAP2 genes were
registered in 28% and 38% of samples, respectively; both genes presented simultaneously
increased expression level in three high-risk cases. Similar pattern of expression were detected
in the majority of CaP (Spearman r=0,63; p<0,0001) and non-neoplastic surrounding tissue
(Spearman r=0,78; p=0,0002) samples. Compared to the non-neoplastic surrounding tissues
there was significant increase of STEAP1 gene expression in PCa samples with Gleason scores ≥
7(4+3) and also in the cases with vascular invasion (p < 0,05). Besides, there was a trend for
increased STEAP1 expression in the high risk when compared to the moderate risk group. The
present data suggest that increased STEAP1 gene expression is related to clinical and
pathological parameters of PCa patients and may be considered a poor prognostic marker.
Key- words: STEAP1, STEAP2, prostate adenocarcinoma, real time quantitative RT-PCR,
clinical correlation.
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
17
INTRODUÇÃO
O câncer de próstata (CaP) é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo e o
mais prevalente em homens, representando cerca de 10% de todos os cânceres
(1)
. As
taxas de incidência deste tipo de câncer são aproximadamente seis vezes maiores nos
países desenvolvidos comparados aos países em desenvolvimento
(1)
. Os CaPs são
heterogêneos em seus aspectos clínico, morfológico e biomolecular. Os fatores
primários para o prognóstico do CaP são estadiamento, grau histológico e PSA
(2)
.
Quando diagnosticados, os adenocarcinomas de próstata são classificados pelo sistema
TNM para definição do seu estádio (tamanho e disseminação do tumor)
(3)
e pelo sistema
de Gleason, para sua graduação (diferenciação histológica da neoplasia)
(4)
. A
determinação dos níveis séricos do PSA (antígeno específico da próstata) é considerada
normal até 4,0ng/mL. Algumas críticas à eficácia desse exame referem-se à sua baixa
sensibilidade para distinguir o câncer de doenças benignas, como hiperplasia nodular da
próstata e prostatites, e à existência de casos de CaP com valores baixos de PSA, como é
o caso de pacientes com histórico familial para esta neoplasia e tumores hormônio-
independentes
(5)
. Em pacientes com CaP submetidos à prostatectomia radical, valores de
PSA acima de 0,4ng/mL após a cirurgia indicam pior prognóstico
(6)
. Um método para
melhorar a sensibilidade do PSA em predizer o risco do paciente é pelo cálculo do PSA
doubling-time (PSADT), i.e., um cálculo usando regressão linar logarítmica que estima
o tempo de duplicação do PSA em meses após a cirurgia; quanto menor o PSADT maior
a chance de recorrência tumoral
(7)
. O risco de recorrência do tumor pode ser estimado
pela combinação destas três variáveis; sendo mais fidedigno do que a análise de
qualquer uma delas isoladamente
(8)
. Outra característica com importância prognóstica é
a capacidade do tumor invadir as estruturas angiolinfáticas, não contemplada pelo
sistema TNM
(9,10)
. Apesar de os parâmetros clínicos e histológicos serem úteis para a
classificação dos cânceres prostáticos, estes não são capazes de diferenciar
adenocarcinomas prostáticos indolentes dos invasivos. Em geral, os marcadores
utilizados ao diagnóstico e no monitoramento da progressão da doença não
correspondem de forma satisfatória à evolução dos pacientes e, portanto, há a
necessidade da identificação de novos marcadores.
Os genes STEAP1 e STEAP2 (six-transmembrane epithelial antigen of prostate 1
e 2) são, predominantemente, expressos na próstata normal e apresentam expressão
aumentada em diversas linhagens de células neoplásicas, como de próstata, bexiga,
ovário, e outros
(11,12)
. A expressão aumentada de STEAP1 foi descrita em metástases
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
18
ósseas e linfonodais do CaP
(13,14)
. Na próstata, os produtos gênicos de STEAP1 e
STEAP2 foram identificados nas junções celulares do epitélio acinar e no complexo de
Golgi, respectivamente
(11,12)
. Eles contêm um domínio hexa-transmembrana e
terminações intracelulares amino e carboxil, o que sugere se tratar de canais iônicos
envolvidos com a comunicação celular
(14,15,16,)
. Sanches-Pulido et al. (2004)
(17)
relacionaram as proteínas STEAP1 e STEAP2 com o crescimento tumoral, ao
demonstrar em suas estruturas o domínio ACRATA (apoptosis, cancer and redox
associated transmembrane domain), homólogo ao encontrado na estrutura das bactérias
NADPH-oxidase (Nox), envolvidas na produção de espécies reativas de oxigênio.
Alterações no número de cópias do DNA têm sido extensivamente caracterizadas
em cânceres de próstata e incluem regiões recorrentes de perdas, indicando a localização
de genes conhecidos ou candidatos a supressores tumorais no CaP como em 13q (RB1),
10q (PTEN), 16q (CDH1) assim como regiões recorrentes de ganhos como em 8q
(MYC) e 7, entre outros, como candidatos a oncogenes
(18,19)
. Em estudo prévio,
utilizamos CGH-array para avaliar o número de cópias do DNA em tumores primários
de CaP e suas metástases. Análise hierárquica supervisionada revelou que os genes
STEAP1 e STEAP2, mapeados em 7q21.13, eram classificadores quanto ao risco de
progressão para metástase. Para avaliar essa hipótese, o presente estudo foi delineado
para validar os achados preliminares usando análise de expressão gênica quantitativa em
tempo real para os dois genes. Os produtos desses genes reúnem características que os
tornam possíveis antígenos tumorais: expressão aumentada em diversos tipos de
cânceres, expressão reduzida em tecidos normais (exceto próstata) e, no caso do
STEAP1, localização na superfície celular
(20)
. Nesse sentido, estudos in vitro e in vivo
estão sendo realizados com o objetivo de identificar os peptídeos capazes de provocar
resposta imune antitumoral, mediada por linfócitos T
(20,21, 22)
. Aparentemente, a
expressão dos genes STEAP1 e STEAP2 não é alterada por andrógenos sintéticos
(11,12)
.
O papel dos genes STEAP1 e STEAP2 no desenvolvimento e progressão do
câncer da próstata não está bem estabelecido. Para o nosso conhecimento, a única
informação disponível em literatura é o fato de estarem amplificados no CaP
(11,13,16)
. O
presente trabalho visou determinar o padrão de expressão dos genes STEAP1 e STEAP2
em CaP, no tecido não-neoplásico adjacente ao tumor e na hiperplasia nodular da
próstata (HNP) particularmente no sentido identificar potencial associação entre o perfil
clínico dos pacientes, os aspectos anatomo-patológicos dos tumores e de validar os
achados preliminares de ganhos em 7q21.13.
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
19
MATERIAL E MÉTODOS
1. Caracterização das amostras
Neste estudo estão incluídos fragmentos a fresco de 33 casos de
adenocarcinomas de próstata, 17 amostras de tecido não-neoplásico adjacente ao tumor
e cinco amostras de hiperplasia nodular (HNP) Essas 55 amostras foram obtidas de
produtos de prostatectomias radicais de pacientes com CaP. Duas amostras de próstatas
normais provenientes de necropsias de pacientes que foram a óbitos por outras causas
foram usadas como controle. Todos os pacientes e/ou familiares foram informados da
pesquisa e assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Este projeto foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu
(Protocolo CEP nº 446/2005).
Os pacientes não receberam qualquer tratamento hormonal ou radioterápico
precedendo este estudo. Imediatamente após a cirurgia, amostras das regiões das
próstatas referidas nos laudos das biópsias prévias como sítio de neoplasias foram
confirmadas histologicamente em cortes de congelação por um único patologista
(JLVC). Os tumores foram macrodissecados de modo a evitar contaminação pelo tecido
normal adjacente e os fragmentos obtidos foram estocados a -80
o
C até o momento do
uso.
A graduação histológica dos tumores seguiu o sistema de Gleason
(4)
e o
estadiamento foi dado pelo sistema TNM
(3)
. A caracterização clínica e as informações
sobre o seguimento dos pacientes foram obtidos dos prontuários hospitalares. A idade
média dos casos foi de 64 anos (variação de 48 a 75anos) e a idade dos dois casos
controles foi de 49 anos. O tempo de seguimento médio dos pacientes foi de 12,6
meses(variação de 1 à 46 meses). Os pacientes com CaP foram agrupadas segundo o
PSA pré-cirúrgico, a graduação histológica e o estádio dos tumores em três grupos
quanto ao risco de recorrência do tumor (baixo, moderado e alto) (Tabela I).
Naturalmente, as amostras de tecido não-neoplásico adjacente ao tumor e as HNP não
podem ser classificadas quanto ao escore de Gleason e consequentemente, o risco de
recorrência para esses casos foi realizado segundo as características anatomopatológicas
presentes nos laudos das prostatectomias radicais.
Os resultados da expressão dos genes STEAP1 e STEAP2 obtidos por RT-PCR
quantitativa em tempo real nos diferentes tecidos analisados foram comparados entre si
nos três grupos de pacientes em relação aos parâmetros clínico-laboratoriais (história
familial, idade e PSA pós-cirúrgico) e anatomopatológicos (escore de Gleason,
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
20
estadiamento, invasão angiolinfática, comprometimento de margem cirúrgica e extensão
extra-prostática) isolados. Para a análise do escore de Gleason isolado, as amostras de
CaP com escore ≤ 7(3+4) foram classificadas como de baixo grau e as amostras de CaP
com escore ≥ 7(4+3) como de alto grau
(23)
. O PSADT foi obtido somente em quatro
casos que possuíam todas as informações necessárias para o cálculo on line
(24)
.
2. Extração do RNA e obtenção do cDNA
O RNA total foi extraído de tecido tumoral congelado e pulverizado utilizando o
Rneasy mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), de acordo com as recomendações
do fabricante. As amostras de RNA foram estocadas em água destilada livre de RNAse,
a -70ºC. A qualidade das amostras de RNA foi confirmada por eletroforese em gel de
agarose 2% corado com brometo de etídio e as bandas de RNA, 18S e 28S, foram
visualizadas em luz ultravioleta. Para evitar contaminação com DNA, as amostras foram
digeridas com 1 unidade de Dnase I Amplification Grade (Life Technologies, Rockville,
MD, U.S.A.) em 10X Dnase I Reaction Buffer e 25 mM de EDTA pH 8.0. As reações
foram realizadas em um termociclador PTC-100 (Peltier - Effect Cycling - MJ
Research, Inc., USA) por 15 min em temperatura ambiente e a enzima foi inativada pelo
aquecimento das reações a 70ºC por 10 min. O RNA foi transcrito em um volume final
de 20µl contendo 5x First-Strand Buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15
mM MgCl
2
), 10 mM de cada dNTP, 0.5µg/µl de Oligo (dT)
18
, 0.1 M ditiotreitol e 200
unidades da transcriptase reversa SuperScript
TM
II (Invitrogen Life Technologies, Inc.,
Carlsbad, CA). A transcrição reversa foi realizada a 42ºC por 60 min e a reação foi
subseqüentemente inativada por 15 min a 70ºC. Na análise qualitativa, os controles
negativos consistiram de reações com os mesmos reagentes, exceto a ausência da
enzima de transcriptase reversa. O cDNA foi estocado a -70ºC.
3. RT-PRC quantitativa em tempo real (q-RT-PCR)
Foram avaliadas 55 amostras para os genes STEAP1 e STEAP2. As etapas da
PCR foram realizadas em termociclador automático (ABI Prism 7000 Sequence
Detection System) e processadas pelo sistema de detecção após número variável de
ciclos em fase exponencial. Os valores de cada amostra foram normalizados pela razão
entre os valores obtidos para o gene de interesse e para o gene referência, GAPDH
(gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase). Este gene é comumente adotado em estudos de
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
21
quantificação de DNA e RNAm em diferentes tipos tumorais
(25)
, incluindo o carcinoma
de próstata. Os ensaios dos primers e da sonda para os genes STEAP1
(Hs00185180_m
1
), STEAP2 (Hs00537784_m
1
) e GAPDH (4326317E) foram delineados
pela Applied Biosystems (Protocolo Assay on Demand - Applied Biosystems). Os
fragmentos amplificados para os genes STEAP 1, STEAP 2 e GAPDH foram de 78pb,
70pb e 122pb, respectivamente. Para a amplificação foi utilizado o TaqMan Universal
PCR Master Mix (Applied Biosystems), que contém todos os reagentes necessários para
a reação. O experimento foi realizado com volume final de reação de 10µL. A condição
de ciclagem para os genes foi de 50°C-2min; 95°C-10min; 95°C-15s e 40 ciclos de
60°C-1min. Para garantir a ausência de contaminação, em cada reação de amplificação
foi utilizado um controle negativo (ausência de cDNA) contendo os iniciadores do gene
amplificado. Como controle foram utilizadas amostras de prostátas de necropsias,
comprovadas histologicamente como normais.
Para determinar a eficiência de amplificação dos iniciadores foram construídas
curvas-padrão com diluições em série de um pool de RNA de amostras tumorais e
normais adjacentes de próstata. Para esta etapa foi utilizado 1µg de RNA diluído em
água DEPC nas seguintes concentrações: 100, 20, 4, 0.8 e 0.16ng/µl. A eficiência de
amplificação foi calculada pela fórmula: E=10
-1/slope
– 1.
A quantificação do RNA obtido utilizou os valores de Ct (Cycle Threshold) pela
fórmula 2
(-∆∆Ct)
. Para cada amostra, o valor de ∆Ct foi determinado subtraindo a média
das duplicatas dos valores de Ct do gene de interesse da média das duplicatas dos
valores de Ct do gene referência (GAPDH). Posteriormente, para determinar o ∆∆Ct, o
valor de ∆Ct de cada amostra foi subtraído do valor da média de ∆Ct das amostras
normais. Este último valor foi adicionado à fórmula 2
(-∆∆Ct)
. Para cada amostra foi
determinada a quantidade relativa de transcrito (QR) (n vezes maior ou menor que o
normal).
4. Análise dos dados
Os genes foram considerados como tendo aumento da expressão nas amostras de
CaP, no tecido não neoplásico adjacente ou nas HNP quando apresentavam QR ≥ 2,0 ou
diminuição da expressão quando o valor de QR ≤ 0,5, em relação às amostras de
próstatas normais. As comparações dos valores de expressão (QR) com as variáveis
clínicas e histopatológicas foram realizadas pelo teste não-paramétrico de Mann-
Whitney quando duas categorias foram avaliadas, e pelo teste de Kruskal-Wallis quando
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
22
três categorias foram comparadas. As análises de correlação utilizaram o teste não-
paramétrico de Sperman (r). Os resultados foram considerados significativos quando
p<0,05. Para a análise foi utilizado o software Gradhpad Prism versão 3.0.
RESULTADOS
Os dados de expressão gênica foram comparados com os parâmetros clínicos e
anatomo-patológicos para os genes alvo (Tabela 2- Apêndice). A variação do QR das
amostras normais de pacientes sem câncer de próstata foi de 0,97 a 1,26 para o gene
STEAP1 e de 0,86 a 1,20 para o gene STEAP2. Nove CaP (16,1%) para o gene STEAP1
e 12 CaP ( 21,4%) para o gene STEAP2 apresentaram aumento de expressão. Duas
amostras de tecido adjacente ao tumor (casos 172 e 214), e três amostras de CaP de um
mesmo paciente (caso 222) apresentaram aumento de expressão dos dois genes. Esses
pacientes estão incluídos no grupo de alto risco de recorrência, com escore de Gleason ≥
7, estádio ≥ pT3 e presença de invasão angiolinfática. Os casos 172 e 222 tinham PSA
pré-cirúrgico de 29,0 ng/mL. O caso 172, que está em seguimento clínico há 21 meses
apresentou recidiva bioquímica inferior a seis meses, i.e., PSA pós-cirúrgico ≥0,4
ng/mL, e foi submetido a terapia adjuvante no décimo primeiro mês pós-cirúrgico. Os
valores do PSA pós-cirúrgico dos casos 214 e 222 estão abaixos dos níveis detectáveis,
porém esses casos estão em seguimento há somente 4 e 2 meses, respectivamente. Os
genes STEAP1 e STEAP2 apresentaram diminuição de expressão em nove e 12
amostras, respectivamente, sendo que em cinco delas ocorreu diminuição da expressão
de ambos os genes. Todos esses casos apresentavam escore de Gleason ≤ 7(3+4), ou
seja, eram tumores mais diferenciados (Tabela II- Apêndice).
O gene STEAP1 apresentou aumento significativo da expressão em CaP de alto
grau, com escores de Gleason
≥ 7 (4+3) em relação ao tecido adjacente ao tumor
(p<0,05). As amostras de HNP apresentaram expressão do gene STEAP1 dentro da faixa
de normalidade, exceto um caso em que houve diminuição de sua expressão (Figura 1).
As expressões dos genes STEAP1 e STEAP2 mostraram correlação positiva nas
amostras de CaP (Spearman r=0,63; p<0,0001) e nas amostras de tecido adjacente
(Spearman r=0,78; p=0,0002), ou seja, para a maioria das amostras a expressão do gene
STEAP2 acompanhou a expressão do gene STEAP1 e vice-versa.
Em relação aos parâmetros individuais, a expressão do gene STEAP1 apresentou
aumento significativo nos casos com invasão angiolinfática (p= 0,02) (Figura 2A). A
expressão dos genes STEAP1 e STEAP2 apresentaram aumento significativo em
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
23
amostras com margem cirúrgica comprometida (p= 0,0003 e p = 0,02, respectivamente).
Não foi observada diferença significativa na comparação entre a expressão dos genes
STEAP1 e STEAP2 e o risco de recorrência. Embora estatisticamente não significativa, a
expressão do gene STEAP1 apresentou mediana aumentada nos casos com PSA pós-
cirúrgico acima de 0,4ng/mL, considerando o último exame realizado em pacientes com
mais de quatro meses de seguimento clínico (Figura 2B). Além disso, tumores com
escore de Gleason elevado, assim como tumores com alto risco de recorrência, estavam
associados com expressão aumentada do STEAP1 (Figuras 2C e 2D, respectivamente).
Em apenas quatro casos pudemos calcular o PSADT (casos 88, 184, 188, 193),
porém em nenhum desses houve aumento da expressão dos genes STEAP1 e STEAP2.
Um caso (188) apresentou diminuição de expressão para os dois genes; seu primeiro
PSA pós-cirúrgico elevado provavelmente dependeu de comprometimento de margem.
O tempo de seguimento para esses casos variou de 16 a 46 meses.
DISCUSSÃO
Os resultados desse trabalho demonstraram aumento significativo da expressão
do gene STEAP1 em amostras de CaP quando foram considerados três fatores
reconhecidamente relacionados a pior prognóstico: escore de Gleason ≥ 7(4+3) em
relação ao tecido não-neoplásico adjacente ao tumor, nos casos com invasão
angiolinfática e em amostras de pacientes com margem cirúrgica comprometida
(9,10,23)
.
Este último parâmetro estava também relacionado a aumento significativo da expressão
do gene STEAP2.
Hubert et al. (1999)
(11)
foram os primeiros a relatar um aumento da expressão da
proteína STEAP1 por imunoistoquímica em tumores primários de próstata e sua relação
com altos escores de Gleason. Recentemente, Challita-Eid et al. (2007)
(14)
demonstraram
expressão aumentada de STEAP1 em metástases ósseas e linfonodais de CaP e em
linhagem de câncer de bexiga e de pulmão. Utilizando um modelo de ratos trangênicos
que receberam células neoplásicas de camundongo denominados TRAMP (transgenic
adenocarcinoma mouse prostate), Yang et al. (2001)
(13)
identificaram aumento da
expressão do gene STEAP1 em tumores primários de próstata e em metástases em
linfonodos, fígado e vísceras por RT-PCR. O gene STEAP1 humano tem homologia de
seqüência em 80% com o gene de camundongos
(13)
.
Os dados do presente estudo também mostram aumento da expressão de STEAP1
no CaP primário em relação ao tecido não-neoplásico adjacente. Essa diferença parece
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
24
se restringir para CaPs com escores de Gleason elevados, quando comparados aos
tumores mais bem diferenciados (escores de Gleason ≤ 6). Um achado interessante, é
que nenhum dos 12 casos de CaPs com escores de Gleason ≥ 7(4+3) mostraram
diminuição da expressão do gene STEAP1. Considerando o número limitado de casos
analisados, esse achado precisa ser comprovado.
A invasão angiolinfática pela neoplasia é referida em laudos patológicos de
prostatectomia radical desde 1994
(26)
, e tem sido considerada um fator prognóstico
independente na seleção de pacientes para receber terapia adjuvante após a cirurgia,
além de ter se mostrado fortemente relacionada ao tempo de recidiva bioquímica
(10)
. O
gene STEAP1 apresentou aumento significativo de sua expressão nos casos com invasão
angiolinfática (p= 0,02) (Figura 2A). Dos oito pacientes deste estudo que apresentavam
invasão angiolinfática, seis eram do grupo de alto risco de recorrência tumoral,
apresentavam extensão extra-prostática da neoplasia e ainda, dois deles apresentaram
recidiva bioquímica. Este achado sugere que estes pacientes devem ser acompanhados
cuidadosamente, considerando que o tempo de seguimento até o presente é inferior a
quatro meses.
Os genes STEAP1 e STEAP2 apresentaram aumento significativo de suas
expressões em amostras com margens cirúrgicas comprometidas. O comprometimento
de margens cirúrgicas é considerado um fator de pior prognóstico, pois provavelmente
representa tumor residual no paciente. Ocorre principalmente em situações em que o
cirurgião quer preservar o paciente em algumas de suas funções e em tumores
volumosos, mais difíceis de ressecar
(9)
. Esses dados sugerem que os tumores com
aumento da expressão desses genes são mais agressivos e podem comprometer regiões
de feixes nervosos e de maior vascularização. Infelizmente, as informações disponíveis
nos laudos anatomo-patológicos, não permitiram esclarecer o volume do tumor na
glândula com precisão e quais regiões anatômicas das próstatas apresentavam as
margens cirúrgicas comprometidas pelo tumor.
Também, ocorreu tendência de aumento da expressão do gene STEAP1 em
pacientes com tempo de seguimento superior a quatro meses, com PSA pós-cirúrgico ≥
0,4ng/mL (considerando o último exame após a prostatectomia radical) antes de
qualquer tratamento adjuvante (radioterapia, quimioteraria ou hormonioterapia). A
expressão dos gene STEAP1 e STEAP2 não foi estatisticamente significativa quanto ao
risco de recorrência tumoral. Mesmo assim, houve tendência de aumento de expressão
do gene STEAP1 nas amostras de CaP de pacientes com alto risco de recorrência em
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
25
relação aos pacientes com risco moderado de recorrência. Esta casuística não possuia
amostras de CaP de pacientes com baixo risco de recorrência. O caso 213, pertencente
ao grupo de alto risco que apresentou menor expressão, tinha quatro meses de
seguimento clínico, escore de Gleason 6(3+3) e PSA pós-cirúrgico = 0 e, o caso que
apresentou expressão mais elevada pertencente ao grupo de baixo risco foi o caso 187,
com seguimento de 21 meses, Gleason 7(3+4), PSA pós-cirúrgico de 1,08ng/mL,
indicação de radioterapia, e no mesmo lobo prostático do fragmento estudado
apresentou Gleason 7(4+3) em biópsia anterior (Figura 2D).
Os genes STEAP1 e STEAP2 estão localizados na região cromossômica 7q21.13,
distando aproximadamente 50kb um do outro
(27)
. No presente trabalho, foi identificada
correlação positiva significativa entre a expressão dos transcritos de STEAP1 e STEAP2,
tanto em tecido neoplásico como no tecido adjacente ao tumor, sugerindo a formação de
um amplicon. Em alguns casos, a amplificação e consequentemente o aumento da
expressão gênica fornecem vantagens adaptativas à célula neoplásica. Desse modo, a
amplificação geralmente se associa a comportamento agressivo e estádio avançado
(28)
.
Nesse sentido, nove casos apresentaram aumento de expressão para o gene
STEAP1 e 12 casos para o gene STEAP2, sendo que nos casos 172, 214 de tecido
adjacente ao tumor e no caso 222 de CaP houve aumento de expressão em ambos os
genes. Os pacientes que mostraram aumento de expressão para os genes STEAP1 e
STEAP2 pertencem ao grupo de alto risco de recorrência, com escore de Gleason ≥ 7,
estádio ≥ pT3 e presença de invasão angiolinfática. Esses dados sugerem que os casos
com aumento de expressão de STEAP1 e STEAP2 estão relacionados a características de
pior prognóstico.
CONCLUSÃO
O presente estudo demonstrou relação direta da expressão do gene STEAP1 com
presença de invasão angiolinfática e tendência de aumento da expressão deste gene em
pacientes com alto risco de recorrência tumoral. A expressão do gene STEAP1 foi mais
específica aos parâmetros clínicos analisados do que o gene STEAP2. Aumento da
casuística de pacientes e análise protéica por imunoistoquímica em casos com
informações clínicas detalhadas, assim como longo tempo de seguimento clínico,
poderão confirmar o potencial destes genes a marcadores de agressividade no câncer de
próstata.
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
26
Tabela I: Risco de recorrência de adenocarcinoma de próstata em pacientes submetidos
a prostatectomia radical, segundo o estadiamento pelo sistema TNM, graduação de
Gleason e valor de PSA pré-cirúrgico.
Risco de
recorrência
Características clínicas e morfológicas
Baixo risco
pT1-pT2a e escore de Gleason 2 – 6 e PSA < 10 ng/mL
Risco moderado
pT2b-pT2c ou escore de Gleason 7 ou PSA = 10-20 ng/mL
Alto risco
pT3a ou pTxN1 ou pTxNxM1 ou Score de Gleason 8-10 ou PSA
> 20 ng/mL
Adaptado de NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology™: Prostate
Cancer,Version 2. 2007.
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
27
Figura 1: Quantificação relativa (QR) do gene STEAP1 em amostras de CaP de baixo e
alto grau, tecido adjacente ao tumor e HNP em relação à expressão em próstatas
normais. As barras em cada grupo indicam as medianas de QR; As barras pontilhadas
indicam os limites de QR=0,5 e QR=2,0.
CaP baixo grau CaP alto grau HPB Tec Adj
0.01
0.1
1
10
QR STEAP1
Cap baixo grau CaP alto grau HNP Tec. adjacente
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
28
Figura 2: Quantificação relativa (QR) do gene STEAP1 em amostras de CaP de acordo
com (A) presença de invasão angiolinfática referida em laudo anatomopatológico
(p=0,02); (B) níveis séricos de PSA pós-cirúrgico (< 0,4 ng/mL e ≥ 0,4 ng/mL) em
amostras de pacientes com seguimento acima de quatro meses; (C) escore de Gleason
baixo (≤ 7(3+4) e alto (≥ 7(4+3) e (D) risco de recorrência tumoral; (E)
comprometimento de margem cirúrgica (p=0,0003). (F) Quantificação relativa (QR) do
gene STEAP2 de acordo com comprometimento de margem cirúrgica (p=0,02).
Ausente Presente
0.1
1
10
QR STEAP1
A
n=24 n=9
B
PSA > 0,4 PSA < 0,4
0.01
0.1
1
10
QR STEAP1
n=4
n=28
Gleason baixo Gleason alto
0.1
1
10
CaP
QR STEAP1
C
n=20
n=13
Moderado Alto
0.1
1
10
QR STEAP1
213
187
D
n=13
n=20
Comprometida Livre
0.01
0.1
1
10
QR STEAP1
E
n=23
n=30
Comprometida Livre
0.1
1
10
QR STEAP2
F
n=23 n=30
Ihlaseh SM, et al. Manuscrito
29
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32
Tabela II: Expressão relativa dos genes STEAP1 e STEAP2 e parâmetros clínico-histoptológicos de amostras de CaP, tecido não-neoplásico adjacente ao tumor
e HNP.
Caso Tecido
QR
STEAP1
QR
STEAP2 Idade
PSA pré
(ng/mL)
Score Gleson pTNM
Risco de
recorrência
Invasão
angiolinfática
Extensão
extra-
prostática
Margem
Cirúrgica
PSA pos
(ng/mL)
Seguimento
(meses)
Tempo
livre da
doença
(meses)
PSADT
88 CaP
0,6 0,7
65 5,82 7(4+3) pT3a alto + + - 0 46 1* 5,7
Tec adj.
0,6 1,4
7(4+3) pT3a alto + + -
205 CaP
0,3 0,8
67 5,96 7(3+4) pT2c moderado - - - 0 8 8
Tec adj.
0,8 1,6
7(3+4) pT2c moderado - - -
208 HNP
0,2 0,4
72 8,56 5(2+3) pT2c moderado - - - 2,1 3 3*
Tec adj.
1,3 2,8
5(2+3) pT2c moderado - - -
211 HNP
0,6 2,7
67 7,8 6(3+3) pT2c moderado - - - 0 8 8
Tec adj.
0,2 0,2
6(3+3) pT2c moderado - - -
213 CaP
0,2 0,3
65 7 6(3+3) pT3a alto - + - 0 3 4
HNP
0,5 0,4
6(3+3)+ areas 5 pT3a alto - + -
214 HNP
0,6 0,8
68 8 7(3+4) pT3a alto - + + 0 4 4
Tec adj.
3,2 17,5
7(3+4) pT3a alto - + +
217 CaP
0,5 0,3
62 6,95 6(3+3) pT3a alto - + - s.i. s.i. si
Tec adj.
1,1 0,7
6(3+3) pT3a alto - + -
218 CaP
1,5 2,5
74 4,84 6(3+3) pT2c moderado - - + s.i. 1 si
HNP
1,9 3,2
6(3+3) *7(3+4) pT2c moderado - - +
222F1 CaP
3,5 1,08
57 29 6(3+3) ppT4 alto + + + 0,01 2 1
222F3a CaP
5,4 6,30
10(5+5) ppT4 alto + + +
222F4 CaP
10,7 6,70
7(3+4) ppT4 alto + + +
222Fb CaP
6,1 5,76
8(3+5) ppT4 alto + + +
162 CaP
0,6 1,2
58 >4,0 7(3+4) pT3a alto - + - 0,06 34 si
168 CaP
0,5 0,5
70 4,45 8(5+3) pT3a alto + + - 0 30 28
170 CaP
1,3 2,2
70 4,98 8(5+3) pT2c alto - - - 0,1 6 6
174 CaP
0,6 0,5
60 8,09 6(3+3) pT2c moderado - - - 0 23 23
176 CaP
1,5 1
62 37,21 7(4+3) pT3a alto + + + 0,2 15 15
181 CaP
0,7 0,9
71 9,5 7(3+4) pT2c moderado - - - 0,02 9 2
182 CaP
0,6 1
65 5,38 6(3+3) pT2c moderado - - - 0 19 19
184 CaP
1,2 1,3
64 7,39 8(5+3) pT3a alto - + + 0,8 24 3* 8,72
33
Caso Tecido
QR
STEAP1
QR
STEAP2
Idade
PSA pré
(ng/mL) Score Gleson pTNM
Risco de
recorrência
Invasão
angiolinfática
Extensão
extra-
prostática
Margem
Cirúrgica
PSA pos
(ng/mL)
Seguimento
(meses)
Tempo
livre da
doença
(meses) PSADT
186 CaP
0,7 0,8
53 11,36 8(3+5) pT3a alto - + + 0 18 18
187 CaP
4,7 0,5
63 5,48 7(3+4) pT2c moderado - - + 1,08 21 1*
188 CaP
0,3 0,4
65 7,22 7(3+4) pT2c moderado - - + 1,3 16 1* 6,14
189 CaP
0,4 0,6
70 6,87 7(3+4) pT3a alto - + + 0 19 19
190 CaP
0,5 0,4
71 3,1 6(3+3) pT2c moderado + - - 0 20 20
195 CaP
0,9 1,3
59 21,4 7(3+4) pT2c alto - - + 0,04 7 7
198 CaP
1 0,8
49 4,1 7(3+4) pT2c moderado - - - 0 11 11
199 CaP
0,5 1,3
65 7,3 6(3+3) pT2c moderado - - - 0 10 10
200 CaP
0,7 0,5
60 11,67 7(3+4) pT3a alto - + + 0 4 4
201 CaP
2,5 1,3
64 37,95 7(4+3) pT3b alto + + + 0,14 3 3
202 CaP
1,8 3,2
71 13,75 7(3+4) pT2c moderado - - + 0 7 7
203 CaP
0,7 0,5
69 >4,0 8(3+5) pT3a alto + + - 0 4 4
207 CaP
0,8 0,5
56 8,5 7(3+4) pT2c moderado - - - 0,1 10 10
209 CaP
2,1 1,5
52 4,5 6(3+3) pT3a alto - + + 0 7 7
220 CaP
1,25 0,3
48 4 8(3+5) pT2a alto - - - 0 1 1
223 CaP
0,78 0,3
50 4 6(3+3) pT2c moderado - - - 0,1 1 1
70 Tec adj.
0,4 1,2
71 9,94 7(4+3) pT2c moderado - - - 0,03
30 (obito- efisema
pulmonar) 30
172 Tec adj.
5,2 9,8
67 28,64 8(3+5) pT3c alto - + + 0,8 21 1*
173 Tec adj.
0,4 0,4
71 17,68 7(3+4) pT3b alto + + + 0,1 26 2*
179 Tec adj.
0,5 1
64 5,63 7(3+4)+ áreas 5 pT3a alto - + + 0 21 21
193 Tec adj.
1,2 0,9
69 19,36 7(3+4)+ áreas 5 pT2c moderado - - + 0,1 18 18 1,52
204 Tec adj.
0,5 0,3
63 6,97 6(3+3) pT2c moderado - - - 0 3 3
206 Tec adj.
0,5 1,1
61 7,77 7(3+4) pT2a moderado + - - 0 10 10
210 Tec adj.
0,7 1,5
68 11,08 6(3+3) pT2b moderado - - - 0 10 10
212 Tec adj.
0,3 0,6
52 - 6(3+3) pT2a baixo - - - 0,29 2 1
215 Tec adj.
0,5 1,3
52 3,97 6(3+3) pT2a baixo - - - 0 4 4
216 Tec adj.
1,5 3,8
75 9,44 6(3+3) pT2c moderado - - - 0 1 1
QR: quantificação relativa dos genes alvo; CaP: adenocarcinoma de próstata; HNP: hiperplasia nodular da próstata; Tec. Adj: tecido não-neoplásico
adjacente ao tumor; s.i.: sem informação; (+) presença; (-) ausência. Os casos nº 88 ao nº 222 possuem mais de um fragmento analisado. O caso Nº 218
possui em outro fragmento tumoral não estudado graduação de Gleason 7(3+4). Os escores de Gleason nos fragmentos de HNP e tecido adjacente
correspondem ao escore dado ao tumor no laudo anatomopatológico. *pacientes com primeiro PSA pós-cirúrgico acima de 0,4ng/mL.
34
35
HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA UNESP – BOTUCATU
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo admitido neste hospital para exames ou cirurgia de próstata. Como parte do tratamento,
você será submetido a uma biópsia ou cirurgia, sendo prática rotineira a remoção de fragmentos que
serão utilizados em exames clínicos laboratoriais necessários para um diagnóstico definitivo.
Para obter um maior conhecimento clínico e científico das neoplasias, o corpo clínico deste hospital
(médicos e pesquisadores) desenvolve pesquisa clínica e científica. Através desta pesquisa é possível
conhecer melhor os mecanismos da doença e, portanto, oferecer novas possibilidades de diagnóstico e
tratamento. Ainda mais, este trabalho envolve a busca, em neoplasias, de novos genes ou lesões
genéticas em genes já existentes.
Muitas destas pesquisas exigem material proveniente de neoplasias a fresco no lugar de células
neoplásicas cultivadas em laboratório, pois estas não estão sob as mesmas influências que aquelas no
corpo humano (hormônios, fatores de crescimento, outros). Assim, a obtenção de material proveniente
de neoplasias humanas é desejável e fundamental, bem como pequena amostra de sangue.
Após a cirurgia ou biópsia, o seu médico irá remover um fragmento de seu tecido prostático, que não
seria usado para diagnóstico. O material biológico (sangue e fragmento de tecido coletado) será
congelado e posteriormente utilizado para pesquisa científica. A obtenção deste fragmento e da amostra
de sangue não implicará em riscos adicionais na sua cirurgia e não implicará em aumento no tempo da
operação, do exame, ou na extensão da cirurgia. O estudo proposto abrange vários projetos relacionados,
que foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do hospital (protocolos CEP342/2004;
CEP446/2005).
Este fragmento de tecido será identificado no laboratório NeoGene por códigos formados por números e
letras e portanto sua privacidade e identidade serão preservadas. O tecido será preservado no laboratório
por até cinco anos e poderá, sob nova autorização, ser utilizado em eventuais pesquisas futuras; caso isso
ocorra, seus familiares serão avisados. A eventual inclusão dos resultados em publicação científica será
feita de modo a manter o anonimato do paciente.
Concordando com a retirada e uso deste fragmento, do modo descrito, é necessário esclarecer que você
não terá quaisquer benefícios ou direitos financeiros sobre os eventuais resultados decorrentes da
pesquisa. Se você não concordar em doar o fragmento da peça para pesquisa, sua decisão não
influenciará, de modo algum, o seu tratamento.
______________________________________________________________________________
Nome do paciente ou responsável legal
Data
Médico responsável
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