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FERNANDA BELLO COSTA DE SOUZA
ESTUDO DA COLONIZAÇÃO E VARIABILIDADE GENÉTICA DE LEVEDURAS
DO GÊNERO Candida ISOLADAS DA CAVIDADE BUCAL DE CRIANÇAS COM
SÍNDROME DE DOWN
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre, Curso de Pós-
Graduação em Microbiologia, Parasitologia e
Patologia – Área de Concentração: Microbiologia -
Departamento de Patologia Básica, Setor de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Paraná
Orientadora: Prof.
a
Dr.
a
Vânia Aparecida Vicente
Co-orientador: Prof. Dr. Fabian Calixto Fraiz
CURITIBA
2007
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i
Universidade Federal do Paraná
Sistema de Bibliotecas
Souza, Fernanda Bello Costa
Estudo da colonização e variabilidade genética de leveduras do gênero
Candida isoladas da cavidade bucal de crianças com Síndrome de Down.
ix; 91f. : il. ; 30cm.
Orientadora: Vânia Aparecida Vicente
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências
Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
(Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica).
1. Candida 2. Síndrome de Down I. Título II. Vicente, Vânia Aparecida III.
Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia
Básica).
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i
DEDICATÓRIA
Em primeiro lugar dedico este trabalho e toda a minha vida a DEUS,
que esteve comigo ao longo desta jornada, me fortalecendo a cada
momento, me carregando no colo nos momentos difíceis e derramando
bênçãos no meu caminho e na vida da minha família.
Aos meus pais, Juraci e Terezinha, por mais uma vez terem
demonstrado que são os melhores pais do mundo, sempre me
incentivando, me apoiando e torcendo por mim através dos seus gestos e
orações. Essa vitória é nossa!
Ao meu marido Marcos... Você foi a pessoa que primeiro plantou
esse desejo no meu coração, quando eu ainda não imaginava os caminhos
a seguir. Obrigada pelo carinho, amor, apoio e incentivo nestes dois anos.
Obrigada por existir e estar ao meu lado. Eu te amo!
A minha irmã Flávia, por sempre estar ao meu lado, por tornar minha
vida mais feliz.
A minha vózinha, que sempre vibrou com cada conquista. Mesmo
longe, sei que a senhora hoje vibra por mais esta! Saudades...
ii
AGRADECIMENTOS
A Prof.
a
Dr.
a
Vanete Soccol, pela coragem e determinação com que
coordena o Programa de Mestrado. Sua dedicação incansável torna
possível o nosso crescimento pessoal e profissional. Muito obrigada.
A Prof.
a
Dr.
a
Vânia Vicente, minha orientadora, pelo incentivo, apoio,
e dedicação destinadas a este projeto. Seus ensinamentos e esforços ao
longo do trajeto muito contribuíram para meu aperfeiçoamento e realização
deste trabalho. Obrigada pela amizade, carinho, orientação e empenho.
Muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Fabian Calixto Fraiz, pela confiança depositada em mim,
por aceitar me guiar em mais um projeto. Pelos ensinamentos, apoio e
palavras de incentivo. Obrigada.
A Cirurgiã-Dentista Vera Carneiro. O carinho com que você trata as
crianças “especiais” inspira todos ao seu redor... Obrigada pelo seu
exemplo de vida, apoio, compreensão e amizade.
A todos os funcionários do Ambulatório da Síndrome de Down, pelo
apoio e carinho com que me acolheram durante suas rotinas de trabalho.
Muito obrigada.
A Cirurgiã-Dentista Francisca Berenice Dias Gil e a todos os
funcionários do Ambulatório de Pediatria Preventiva, pelo acolhimento e
ajuda prestados durante o trabalho.
A Rosângela e a Marissol, pela supervisão na prática laboratorial,
pelo apoio incondicional e pela amizade. Vocês são pessoas especiais.
A Nanci, Emília, Lili, Cida e Adriana, da equipe do Laboratório de
Micologia, obrigada pelo acolhimento carinho, amizade e ensinamentos.
Obrigada por fazerem meus dias de trabalho mais felizes.
A Dicler, sua calma e seu jeito meigo me fizeram perceber que seria
possível atingir meus objetivos. Obrigada pelo apoio desde o inicio desta
trajetória.
A colega de curso e profissão, Mônica, pela paciência, pelas dicas e
ensinamentos. Obrigada pela amizade e incentivo.
iii
Ao Prof. Dr. Arnaldo Colombo, pela gentileza em ceder as linhagens
referências usadas na pesquisa.
Ao Prof. Walter Boerger e sua equipe de estagiários, pela
acolhida no Laboratório de Ecologia Molecular, empréstimo de
equipamentos e ajuda oferecida.
Aos professores do Programa de mestrado, pelos valiosos
ensinamentos e exemplos de profissionalismo, ética e competência.
Aos colegas e amigos do curso de mestrado, pelo apoio e incentivo
durante todo o período, em especial Josiane e Ana Cristina pela amizade.
Aos estagiários do Laboratório de Microbiologia, Eduardo, Isadora,
Paulo, pela constante colaboração.
A todas as crianças que participaram do estudo, vocês são todas
especiais!
A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a
realização deste trabalho.
iv
Vá até onde puder ver. Quando lá
chegar, poderá ver ainda mais longe.
Johann Wolfgang Von Goethe
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .................................................................................................................. vii
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................. viii
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................................... ix
RESUMO.................................................................................................................................... xi
ABSTRACT ................................................................................................................................ xii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 4
3. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................... 5
3.1 SÍNDROME DE DOWN................................................................................................... 5
3.2 Candida spp. ................................................................................................................... 11
3.2.1 Identificação das Espécies do Gênero Candida ............................................................. 12
3.2.2 Colonização por Candida spp. ........................................................................................ 15
3.2.3 Candidoses, fatores de virulência e aspectos imunológicos do hospedeiro................... 19
3.2.3.1 Aspectos Clínicos das Candidoses Bucais.................................................................... 20
3.3 SÍNDROME DE DOWN X Candida spp.......................................................................... 22
3.4 MARCADORES MOLECULARES .................................................................................. 24
3.4.1 Marcadores RAPD........................................................................................................... 25
4. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................... 29
4.1 MEIOS DE CULTURA..................................................................................................... 29
4.1.1 Ágar Saboraud Dextrose................................................................................................. 29
4.1.2 Ágar Batata Dextrose – BDA........................................................................................... 29
4.1.3 Ágar Hicrome Candida (Himedia ®)................................................................................ 29
4.1.4 Ágar Fubá com Tween 80 ............................................................................................... 30
4.1.5 Meio para Assimilação de Carboidratos.......................................................................... 30
4.1.6 Meio para Assimilação de Nitrato.................................................................................... 30
4.2 SOLUÇÕES REAGENTES ............................................................................................. 30
4.2.1 Solução Salina................................................................................................................. 30
4.2.2 DNA polimerase .............................................................................................................. 30
4.2.3 dNTP................................................................................................................................ 31
4.2.4 Gel de Agarose (0,8%) .................................................................................................... 31
4.2.5 Gel de Agarose (1,4%).................................................................................................... 31
4.2.6 Oligonucleotídios iniciadores (Primers)........................................................................... 31
4.2.7 Tampão da amostra ........................................................................................................ 31
4.2.8 Tampão CTAB................................................................................................................. 32
4.2.9 Tampão de corrida para gel de agarose (TEB 10X) - pH 8,0 ......................................... 32
4.2.10 Solução de Brometo de Etídio......................................................................................... 32
4.3 ESTERILIZAÇÃO ............................................................................................................ 32
4.4 LINHAGENS UTILIZADAS.............................................................................................. 33
4.5 CASUÍSTICA ................................................................................................................... 33
4.6 EXAME CLÍNICO ............................................................................................................ 33
4.7 COLETAS SALIVARES................................................................................................... 34
4.8 ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA NA SALIVA........................ 34
4.9 IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA ....................................... 34
4.9.1 Formação do Tubo Germinativo...................................................................................... 35
4.9.2 Ágar Hicrome Candida
®
(Himedia).................................................................................. 36
4.9.3 Sistema API 20 C AUX
®
(BioMérieux) ............................................................................ 36
4.9.4 Microcultivo de Leveduras............................................................................................... 37
4.9.5 Assimilação de Carboidratos (Auxonograma) e Nitrogênio ............................................ 38
4.10 ANÁLISE ESTATÍTICA DOS RESULTADOS ENCONTRADOS.................................... 40
4.11 EXTRAÇÃO DO DNA...................................................................................................... 40
4.12 SEQUENCIAMENTO ...................................................................................................... 40
4.12.1 PCR................................................................................................................................. 41
4.12.2 Reação de Seqüenciamento........................................................................................... 42
vi
4.12.3 Precipitação do DNA a ser seqüenciado ........................................................................ 42
4.12.4 Seqüenciamento e análise das seqüências.................................................................... 42
4.13 VARIABILIDADE GENÉTICA............................................................................................. 43
4.13.1 Amplificação do DNA por RAPD ..................................................................................... 43
4.13.2 Eletroforese ..................................................................................................................... 44
4.13.3 Análise da Variabilidade Genética .................................................................................. 44
5. RESULTADOS E DISCUSSÂO ...................................................................................... 45
5. 1 IDENTIFICAÇÃO E PREVALÊNCIA DAS LEVEDURAS ISOLADAS ............................ 45
5.2 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA.................................................................... 61
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 69
REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 70
APÊNDICES............................................................................................................................... 78
APÊNDICE 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO............................. 79
APÊNDICE 2 - APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA............................................................. 81
APÊNDICE 3 - FICHA DE ANAMNESE E EXAME CLÍNICO.................................................... 83
APÊNDICE 4 - SEQÜÊNCIA CONSENSO - ISOLADO PC32 .................................................. 85
APÊNDICE 5 - SEQÜÊNCIA CONSENSO - ISOLADO SD44 .................................................. 87
APÊNDICE 6 - SEQÜÊNCIA CONSENSO - ISOLADO SD3
1 ...............................................................................
89
ANEXO 1 - ARTIGO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO "BRAZILIAN
JOURNAL OF MICROBIOLOGY" ...................................................................... 91
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS PELAS LEVEDURAS ISOLADAS
(AUXONOGRAMA)
............................................................................ 39
TABELA 2 – PRIMERS UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE RAPD ................................. 43
TABELA 3 – ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS PELAS LEVEDURAS ISOLADAS
(API 20 C AUX
®
) ............................................................................... 48
TABELA 4 – DISTRIBUIÇÃO DOS ISOLADOS DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida .. 51
TABELA 5 – OCORRÊNCIA DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida NOS GRUPOS
ESTUDADOS
................................................................................... 52
TABELA 6 – SUBGRUPOS FORMADOS DE ACORDO COM A FAIXA ETÁRIA .............. 55
TABELA 7 – OCORRÊNCIA DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida NOS
SUBGRUPOS AVALIADOS
................................................................. 57
TABELA 8 – FREQÜÊNCIA DE ESPÉCIES DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida
NOS SUBGRUPOS AVALIADOS ...................................................................... 57
TABELA 9 – OCORRÊNCIA DE LEVEDURA DO GÊNERO Candida X SEXO DOS
PARTICIPANTES DO ESTUDO
........................................................... 60
TABELA 10 – LINHAGENS UTILIZADAS NO ESTUDO DE VARIABILIDADE GENETICA
DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida, POR MARCADORES RAPD
........ 61
viii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS COLÔNIAS DE LEVEDURAS
DO GÊNERO Candida ...................................................................................... 35
FIGURA 2 – CARACTERÍSTICAS DO CRESCIMENTO DAS COLÔNIAS EM MEIO
CROMOGÊNICO................................................................................................ 36
FIGURA 3 – CARACTERÍSTICAS MICROMORFOLOGICAS DE LEVEDURAS DO
GÊNERO Candida.............................................................................................. 38
FIGURA 4 – ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS E NITROGÊNIO PELAS LEVEDURAS
ISOLADAS ......................................................................................................... 39
FIGURA 5 – OCORRÊNCIA DE LEVEDURAS DO GENERO Candida NOS GRUPOS
AVALIADOS ....................................................................................................... 45
FIGURA 6 – CARACTERÍSTICAS MACRO E MICROFORMOLÓGICAS DE LEVEDURAS
DO GENÊRO Candida....................................................................................... 47
FIGURA 7 – CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E DE CRESCIMENTO DE
LEVEDURAS DO GÊNERO Candida................................................................ 49
FIGURA 8 – FREQÜÊNCIA DE LEVEDURAS ISOLADAS NOS SUBGRUPOS................... 56
FIGURA 9 – PERFIL DE AMPLIFICAÇÃO DE RAPD DAS AMOSTRAS DE LEVEDURAS
ISOLADAS UTILIZANDO O PRIMER OPX 14 .................................................. 62
FIGURA 10 – DENDOGRAMA GERADO A PARTIR DE SIMILARIDADE GENETICA
OBTIDA POR MARCADORES RAPD DAS LINHAGENS DESCRITAS NA
TABELA 12 UTILIZANDO COEFICIENTE DE JACCARD E MÉTODO DE
AGRUPAMENTO UPGMA ................................................................................. 63
FIGURA 11 – ANÁLISE DA SIMILARIDADE ENTRE AS LEVEDURAS ISOLADAS –
GRÁFICO BIDIMENSIONAL.............................................................................. 65
FIGURA 12 – ANÁLISE DA SIMILARIDADE ENTRE AS LEVEDURAS ISOLADAS –
GRÁFICO TRIDIMENSIONAL .......................................................................... 66
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
% id – Porcentagem de identificação
µl - Microlitro
µm – Micrômetro
AP-PCR - Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
ATCC - American Type Culture Collection
Atm - Atmosfera
BDA – Ágar Batata Dextrose
CIA - Clorofórmio-álcool isoamílico
CTAB - Brometo de cetiltrimetilamônico (Cationic hexadecyl trimethyl ammonium)
DNA - Ácido desoxirribonucléico
dNTP - Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
EDTA - Ácido etileno diamino tetracético (Ethylenediaminetetracetate)
EPM – Escola Paulista de Medicina
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Vírus)
IgA – Imunoglobulina classe A
IgG – Imunoglobulina classe G
kb: Quilo base
LEMI – Laboratório Especial de Micologia
M.O. – microscopia óptica
min - minutos
ml - mililitro
mm - milímetro
mM – milimolar
NaCl – cloreto de sódio
NK – células natural killers
NTSYS - Numerical Taxonomy System of Multivariate Programs
pb - Pares de bases
PFGE – Eletroforese de Campo Pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis)
PCR - Polymerase Chain Reaction
pH - Potencial hidrogeniônico
x
RAPD - Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (Random Amplified
Polymorphic DNA)
REA - Análise de enzima de restrição
rpm - Rotações por minuto
SD - Síndrome de Down
SDA – Saboraud Dextrose Agar
TCD
4
– linfócitos T
TCR/CD3 – Receptor CD3 de célula T
TE - TRIS-EDTA
TEB -TRIS-EDTA-ácido bórico
Th1/ Th2 – linfócitos T auxiliares
TRIS - Tris-(hidroximetil)-aminometano
UFC - Unidade formadora de colônia
UFPR – Universidade Federal do Paraná
UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo
UPGMA - Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Average
UTI – Unidade de Tratamento Intensivo
UV - Radiação ultravioleta
xi
RESUMO
Crianças com Síndrome de Down apresentam um comprometimento do sistema
imunológico, o que as torna mais predispostas à colonização por leveduras do
gênero Candida, em especial C. albicans. Este estudo buscou determinar a
ocorrência de leveduras do gênero Candida na saliva de crianças com Síndrome
de Down (grupo 1), comparando com crianças sem a síndrome (grupo 2). Os
isolados foram submetidos á analise da variabilidade genética por meio de
marcadores RAPD. Foram coletadas amostras salivares da cavidade bucal de 51
crianças com Síndrome de Down e de 50 crianças sem a síndrome, todas com
idades entre 0 e 6 anos. As amostras coletadas foram diluídas, semeadas em
Agar Sabouraud Dextrose e incubadas a 30ºC por 48 horas. Para a identificação
das leveduras isoladas foram usados métodos distintos: Formação do Tubo
Germinativo, Ágar Hicrome Candida
®
(Himedia), Sistema API 20 C AUX
®
(BioMèrieux), Microcultivo de leveduras, provas de Assimilação de Carboidratos e
Assimilação de Nitrogênio. Foram isoladas leveduras do Gênero Candida em 51%
dos pacientes com Síndrome de Down, sendo que 81,5% dos isolados eram de C.
albicans. Apenas 5 crianças (10%) sem síndrome tinham a cavidade bucal
colonizadas por leveduras do gênero Candida, com a espécie C. albicans a mais
prevalente (40%). Também foram investigadas as prevalências em relação à
idade dos pacientes, sendo que a mesma foi mais alta na faixa etária dos 24 a 47
meses (subgrupo B), com 80% no grupo 1 e 12% no grupo 2. O subgrupo C,
formado por crianças entre 48 e 72 meses, apresentou a segunda maior
prevalência nos grupos 1 e 2, com 63,6 e 11,1%, respectivamente. A menor
prevalência foi encontrada no subgrupo A (0 a 23 meses), com 28% para o grupo
1 e 8% para o grupo 2. Quando comparados os subgrupos do grupo de crianças
com Síndrome de Down, foi encontrada diferença significativa entre os subgrupos
A e B (p=0,011), diferença limítrofe entre A x C (p=0,051) e não houve diferença
estatisticamente significante entre os grupo B x C. Para a verificação da
variabilidade genética dos isolados, foi feita a extração do DNA total das
leveduras isoladas com o uso de CTAB e ultra-som associados. Para o RAPD
foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores OPA 10, OPX 11, OPX 12, OPX
14, OPX 17 e OPX 19 e as bandas foram analisadas com o coeficiente de
Jaccard e o método UPGMA foi utilizado para a construção dos dendrogramas. A
consistência dos agrupamentos foi verificada por Bootstrap. Os resultados
permitem concluir que crianças com Síndrome de Down apresentam uma alta
freqüência de colonização da cavidade bucal por leveduras do gênero Candida,
sendo representada principalmente pela espécie C. albicans e com ocorrência
maior na faixa etária de 24 a 72 meses. A análise feita por meio dos marcadores
RAPD mostrou a alta variabilidade genética existente entre as espécies de
Candida e dentro de uma mesma espécie.
Palavras-Chave: Síndrome de Down; Candida; Candida albicans; RAPD.
xii
ABSTRACT
Children with Down’s syndrome (DS) are more predisposed to have Candida
yeasts, especially C. albicans, in theirs oral cavity, probably due to an
immunologic deficit. The aim of this study was to verify the presence of Candida
yeasts in the saliva of children with Down’s syndrome and also verify theirs genetic
variability, using the RAPD technique. Fifty –one children with Down’s syndrome
and 50 children without the syndrome were included in the study. They were all
aged between 0 and six years and samples were taken using a sterile cotton
swab. The saliva samples were diluted, applied to Sabouraud´s dextrose agar and
incubated for 48 hours at 30°C. Candida yeasts were identified using the gem-tube
test, the yeast identification system API 20 C AUX
®
(BioMèrieux), microscopical
characteristics and substrate assimilation tests. The proportion of subjects
colonized with Candida yeasts in the oral cavity was significantly higher in the DS
group (51%), than in the control group (10%). C. albicans was the most frequently
species isolated in both groups (80% and 40%). The subjects were subdivided into
three age groups (in months): 0 – 23 (A), 24-47 (B) and 48-72 (C). For the group
A, the frequency of candidal carriage was low (28% for the DS children and 8% for
the control group), while for the group B, the frequency was higher (80 and 12%).
In the group C, the frequency was decreased (63,6, and 11,1%). Statistical
analysis showed a significantly higher frequency of candidal isolation from DS
infants of group B and C compared to group A. The Total DNA extraction was
carried out using the CTAB buffer and associated sonication. RAPD reactions
used the OPA 10, OPX 11, OPX 12, OPX 14, OPX 17 and OPX 19 oligonucleotide
primers. The software NTSYS was used for polymorphism analysis using the
Jaccard coefficient and the UPGMA method was used for the construction of
dendrograms. The consistency of different groupings was evaluated by bootstrap.
The results of the present study showed a higher prevalence of oral candidal
carriage in children with DS and C. albicans was the most isolated yeast, with
higher frequency in children between 24 and 72 months. The RAPD markers
showed a higher degree of variability between the species and within the same
species.
Key Words: Down’s Syndrome, Candida, Candida albicans, RAPD.
1
1 INTRODUÇÃO
A Síndrome de Down foi descrita pela primeira vez, em 1866, por
Langdon Down e sabe-se hoje que é a alteração cromossômica mais comum em
humanos, resultado de uma trissomia do cromossomo 21. Os pacientes
portadores da Síndrome de Down apresentam alterações fenotípicas clássicas e
também algumas desordens sistêmicas importantes, dentre as quais, alterações
no sistema imunológico (MUSTACCHI e RAZONE, 1990; SCHAWRTZMAN, 1999;
PILCHER, 2001).
O sistema imune em pacientes com Síndrome de Down apresenta
diferentes anormalidades, como menor capacidade de quimiotaxia e fagocitose
dos neutrófilos, deficiência na ativação das células T, deficiência de anticorpos,
baixa contagem de linfócitos T CD4
+
, funções de células NK reduzidas,
diminuição na expansão dos linfócitos T e B e alterações no timo (de tamanho
menor e com variações histológicas), que podem alterar o processo de maturação
dos linfócitos T (LAROCA et al., 1990; TRINCADO et al., 1988; SCOTESSE et al.,
1998; RIBEIRO et al., 2003; ZALDIVAR-CHIAPA et al., 2005; de HINGH et al.,
2005).
O sistema estomatognático nos portadores da síndrome também
apresenta anormalidades em diferentes aspectos. São exemplos destas
anormalidades: alterações no complexo crânio – facial, com desenvolvimento
menor em alguns ossos, mau posicionamento da língua e maior prevalência de
alterações como língua fissurada e geográfica e hipotonicidade dos músculos
orbiculares, deixando os lábios entreabertos e sujeitos a fissuras, especialmente
nas comissuras labiais (REY e BIRMAN, 1990; SCHWARTZMAN, 1999;
PILCHER, 2001; SCULLY et al. 2002). Além disso, o fluxo e a composição da
saliva podem estar alterados nos pacientes com Síndrome de Down (JARA et al.
1991; COGULU et al. 2006; YARAT et al. 1999; SIQUEIRA et al. 2005). As
anomalias dentárias também são freqüentes, com atraso na erupção dos dentes,
alterações na seqüência de erupção e na morfologia dos elementos dentários
2
(REY e BIRMAN, 1990; SCHWARTZMAN, 1999; PILCHER, 2001). Algumas
alterações na microbiota bucal destes pacientes também podem ser verificadas.
As crianças portadoras da Síndrome apresentam uma maior colonização pelas
bactérias causadoras da doença periodontal, como Actinobacillus
actinomycetemcomitans (STABHOLZ, 1991). Já o S. mutans, bactéria etiológica
da cárie, apresenta menor freqüência de colonização em pacientes com SD
(SREEDEVI e MUNSHI, 1998). Além destes dois microrganismos, diferentes
estudos mostraram que leveduras do gênero Candida, em especial C. albicans,
são encontradas com maior freqüência na cavidade bucal destes pacientes
(CARLSTEDT et al., 1996; SCULLY et al., 2002; RIBEIRO et al., 2005; VIEIRA et
al., 2005).
As leveduras do gênero Candida são consideradas microrganismos
comensais, participando da microbiota normal de diferentes sítios do organismo
humano: cavidade bucal, tubo digestivo, intestino, orofaringe, ânus, vagina e pele
(ODDS, 1988). A prevalência de leveduras do gênero Candida na cavidade bucal
de crianças e adultos jovens saudáveis pode variar de 5 a 70%, sendo que cerca
de 80% dos isolados são de C.albicans, seguidos das espécies de C.
parapsilosis, C. krusei, C. kefyr, C. famata e C. tropicalis (DARWAZEH e AL-
BASHIR, 1995; AKDENIZ et al., 2002; KADIR et al).
Quando há desequilíbrio entre o binômio parasito/hospedeiro as
leveduras têm seu potencial de proliferação aumentado, passando da forma
comensal para a forma parasitária, podendo causar danos ao hospedeiro (ODDS,
1984; FOTOS e HELLSTEIN, 1992; SIDRIN e MOREIRA, 1999). Uma gama de
fatores locais e/ou sistêmicos podem facilitar este desequilíbrio e favorecer a
instalação dos processos infecciosos causados pelas leveduras do gênero
Candida, entre eles destacam-se os quadros de imunodeficiências, deficiências
nutricionais, presença de tumores malignos, xerostomia, mucosites, uso de
próteses, dieta, alterações endócrinas e uso de determinados medicamentos
(ODDS, 1984; FOTOS e HELLSTEIN, 1992).
Diferenças entre as características morfológicas e bioquímicas entre as
leveduras do gênero Candida sempre foram usados na identificação das espécies
isoladas. Contudo a metodologia tradicional apresenta algumas limitações, como
3
o tempo de trabalho longo e o poder de discriminação dos métodos utilizados. O
aumento do número de pacientes imunocomprometidos devido ao vírus HIV, à
terapia contra o câncer e o aumento no sucesso nos transplantes fez com que
houvesse um aumento na incidência de candidoses muco - cutâneas e sistêmicas
causadas por diferentes espécies de Candida. Sendo assim tornou-se necessário
técnicas de identificação mais precisas e rápidas (OTERO et al., 1995; RESENDE
et al., 2004).
Com o advento da PCR (reação em cadeia da polimerase) em biologia
molecular, diversos estudos começaram e ser feitos no intuito de verificar as
características genotípicas e a variabilidade genética existente entre as espécies
e dentro de uma mesma espécie de Candida. Atualmente técnicas como RAPD,
que utilizam o princípio da PCR, têm sido usadas na identificação de leveduras e
em estudos epidemiológicos sobre diversidade genética (LEHMANN, LIN e
LASKER, 1992; ROBERT et al., 1995; CLEMONS et al., 1997; WALTIMO et al.,
2001; ANSARI et al., 2003; BAUTISTA et al., 2003; PINTO et al., 2004).
Dentro deste contexto, o presente estudo se propôs a comparar a
ocorrência e a variabilidade genética, por meio de marcadores RAPD, de
leveduras do gênero Candida isoladas da cavidade bucal de crianças com
Síndrome de Down, comparando com crianças sem a síndrome.
4
2 OBJETIVOS
1. Isolar e identificar amostras de leveduras do gênero Candida da cavidade
bucal de crianças com e sem Síndrome de Down e comparar a ocorrência
entre os grupos;
2. Verificar a freqüência das espécies de leveduras do gênero Candida em
crianças com Síndrome de Down, comparando com crianças sem a
síndrome;
3. Estudar o perfil da variabilidade genética, por meio de marcadores RAPD,
nas leveduras isoladas.
5
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 SÍNDROME DE DOWN
A Síndrome de Down (SD) pode ser definida como uma cromossopatia,
ou seja, uma doença cujo quadro clínico é explicado pela presença de um
cromossomo 21 extra, caracterizando assim uma trissomia. Tal fato ocorre
freqüentemente por erro durante a divisão celular, denominado não-disjunção,
associado à meiose materna ou paterna. Em cerca de 95% dos casos de SD, a
trissomia do 21 é simples, com o cariótipo mostrando três cromossomos livres.
Em 1,5 a 3% dos afetados, um dos três cromossomos 21 está ligado a outro
cromossomo, como resultado de uma fusão denominada de translocação
cromossômica. Há ainda cerca de 2% a 3% de casos em que ocorrem duas
linhagens celulares em um mesmo cariótipo: uma normal e outra trissômica,
condição esta chamada de mosaicismo (MUSTACCHI e RAZONE, 1990;
SCHAWRTZMAN, 1999).
A incidência da Síndrome em recém-nascidos vivos está em torno de
1:600 a 1:800 nascimentos, sendo a idade materna avançada o principal fator de
risco. (MUSTACCHI e RAZONE, 1990; SCHAWRTZMAN, 1999).
Os pacientes portadores da trissomia do 21 apresentam alterações
fenotípicas clássicas ao nascimento, que quando consideradas em conjunto, são
sinais patognomônicos desta desordem. São alguns destes sinais: face achatada,
fendas palpebrais oblíquas, excesso de pele no pescoço, ponte nasal achatada,
orelhas de implantação baixa, prega transversal palmar única, sulco entre o hálux
e o segundo artelho, micrognatia, hiperelasticidade articular e hipotonia muscular
generalizada, entre outros. (MUSTACCHI e RAZONE, 1990; SCHAWRTZMAN,
1999; PILCHER, 2001).
Além das alterações fenotípicas os portadores da síndrome podem
apresentar diferentes alterações sistêmicas, sendo a deficiência mental uma
delas. Os pacientes apresentam ainda deficiências de crescimento e excesso de
peso em relação à altura. As alterações endocrinológicas, em especial a
disfunção da tireóide e o hipogonadismo, são comuns nos portadores desta
6
trissomia. Associadas freqüentemente à SD estão as cardiopatias congênitas,
sendo a incidência de cerca de 40%. Há ainda maior incidência de Prolapso da
Válvula Mitral, acometendo cerca de 50% dos pacientes. São achados comuns
entre os pacientes com SD os problemas oftalmológicos de refração (miopia,
hipermetropia e astigmatismo), o estrabismo e também o aparecimento de
pequenas manchas de coloração pálida na íris (manchas de Brushfield), sendo
estas alterações benignas. A perda auditiva pode ser observada freqüentemente
nestes indivíduos e podem ser uma das causas das dificuldades de linguagem
nas crianças com a síndrome. As malformações gastrintestinais congênitas são
bastante freqüentes na SD, sendo a atresia duodenal e a doença de Hirscprung
as mais importantes (PILCHER, 2001; SCHAWRTZMAN, 1999; MUSTACCHI e
RAZONE, 1990).
Portadores da Síndrome apresentam maior susceptibilidade a infecções,
principalmente no trato gastrintestinal e respiratório. A incidência de leucemias
neste grupo de paciente é cerca de 20 vezes maior que em crianças sem a
patologia (PILCHER, 2001; SCHAWRTZMAN, 1999; MUSTACCHI e RAZONE,
1990). CARLSEDT et al. (1996) analisaram os históricos médicos de 110 crianças
e jovens, com idades entre 0 e 21 anos, sendo que 55 eram portadoras da SD. O
estudo foi feito através de entrevista com os responsáveis e os autores
verificaram que nove dentre as crianças com SD apresentavam mais de dez
infecções a cada ano, contra nenhuma do grupo controle, diferença esta
significativa. As infecções acometiam principalmente o trato respiratório superior.
Estudos realizados mostraram diferentes anormalidades no sistema imunológico
destes pacientes.
TRINCADO et al. (1988) avaliaram grupos de pacientes com diagnóstico
clínico e citogenético de SD. Todos eles apresentavam histórias de infecções
recorrentes, principalmente no trato respiratório, além de infecções
gastrintestinais, urinárias e lesões de candidose mucocutâneas. As funções dos
neutrófilos polimorfonucleares nestes pacientes também foram avaliadas através
de diferentes experimentos in vitro e os resultados mostraram que a capacidade
de adesão e motilidade destas células eram diminuídas. Já a capacidade de
fagocitose frente a leveduras de C.albicans não mostrou diferenças significativas
7
em relação ao grupo controle. SCOTESSE et al (1998) estudaram um grupo de
40 pacientes, com idades entre 4 e 16 anos, sendo 20 pacientes portadores da
SD e 20 pacientes sem a síndrome. Foram realizados diferentes experimentos in
vitro e os resultados mostraram que a ativação das células T nos portadores da
SD apresenta deficiências devido a transdução parcial de sinais ao complexo
TCR/CD3, receptor desta célula. RIBEIRO et al. (2003) avaliaram aspectos
epidemiológicos, clínicos e laboratoriais em um grupo com 49 pacientes com
Síndrome de Down, com idades entre um e 12 anos, que apresentavam infecções
graves e/ou recorrentes. O estudo foi feito a partir de uma revisão dos prontuários
médicos de pacientes que freqüentaram o Ambulatório de Alergia e Imunologia do
Departamento de Pediatria da FMUSP–SP entre janeiro de 1990 e julho de 1999.
Trinta e um dos 49 participantes do estudo estavam dentro do critério adotado
para infecções repetidas, que incluía: 3 ou mais episódios de pneumonia, 4 ou
mais episódios de oitite, 5 infecções de tonsilas, 12 ou mais episódios de
rinofaringite dentro do período de 1 ano, além de 4 ou mais episódios de sinusite
em 6 meses. A avaliação imunológica mostrou dois casos de deficiência do
anticorpo IgG2, dois casos de baixa contagem de linfócitos CD4+ e cinco casos
em que as funções das células NK estavam reduzidas.
ZALDIVAR-CHIAPA et al. (2005) realizaram um estudo com o objetivo de
avaliar as respostas frente ao tratamento cirúrgico e não cirúrgico de periodontites
moderadas a severas em pacientes com SD. Além disso, os autores também
avaliaram a função de células polimorfonucleares nestes pacientes. Catorze
pacientes com SD, com idades entre 17 e 30 anos, tiveram dois quadrantes da
cavidade bucal tratados através de raspagem e alisamento (procedimento não-
cirúrgico) e os outros dois quadrantes tratados cirurgicamente. Também foram
realizados testes imunológicos com o objetivo de avaliar a capacidade de
quimiotaxia e fagocitose dos neutrófilos destes pacientes frente a um grupo
controle formado por nove indivíduos sem SD, com idade entre 24 e 28 anos. Os
resultados mostraram melhoras significativas em ambos os tipos de tratamento,
com diminuição do índice de placa bacteriana e profundidade das bolsas
periodontais. Os pacientes com SD apresentaram atividades de quimiotaxia e
8
fagocitose dos neutrófilos diminuídas em comparação ao grupo controle,
diferenças estas estatisticamente significativas.
DE HINGH et al. (2005) avaliaram 96 crianças com SD, com idade entre
1 e 20 anos com o objetivo de comparar a população de linfócitos entre estes
pacientes e pacientes da mesma faixa etária sem SD. Os resultados mostraram
que 88% das crianças com SD apresentavam população de linfócitos abaixo do
décimo percentil de normalidade e 61% apresentavam valor abaixo do quinto
percentil. Além disso, os autores verificaram diminuição na expansão dos
linfócitos T e B nas crianças com SD nos primeiros anos de vida. O grupo de
pacientes com SD, com idade entre 9 e 15 meses apresentou média na contagem
de linfócitos que está abaixo da média em crianças sem a SD nos primeiros dias
de vida. Os resultados encontrados sugerem alterações intrínsecas na resposta
humoral nos pacientes portadores da síndrome, que podem ser explicadas pelas
alterações de timo descritas nestes pacientes: timo freqüentemente menor e com
variações histológicas nas porções medulares e corticais, podendo prejudicar a
maturação dos linfócitos T (LAROCA et al., 1990).
A cavidade bucal dos pacientes com SD também apresenta certos
desvios quanto ao desenvolvimento dos ossos do crânio, da dentição, oclusão
dental, doença periodontal e cárie (REY e BIRMAN, 1990; SCHWARTZMAN,
1999; PILCHER, 2001).
Os portadores da SD apresentam menor crescimento dos ossos do
crânio, sendo estes mais delgados e com fechamento tardio das fontanelas. O
terço médio da face está diminuído devido ao menor crescimento da maxila,
deixando a face achatada. O palato apresenta altura normal, mas é mais estreito
e curto. A mandíbula apresenta crescimento normal, conferindo ao paciente uma
relação de prognatismo maxilo-mandibular, mal-oclusão freqüente nos pacientes
com a síndrome. A maioria dos pacientes apresenta má postura da língua, sendo
esta projetada para fora devido a um conjunto de fatores, como a hipotonicidade
dos músculos orbiculares, dimensões diminutas da cavidade bucal,
hiperelasticidade ou ausência do freio lingual e obstruções nasais, alteração
comum na SD. Este mau posicionamento da língua pode representar dificuldade
adicional às funções respiratórias, da fala e mastigação. Além disso, pode ser
9
observada a presença de língua fissurada, língua geográfica e hipertrofia papilar.
(REY e BIRMAN, 1990; SCHWARTZMAN, 1999; PILCHER, 2001).
Os lábios geralmente estão entreabertos e sujeitos a ação da saliva
devido a protrusão da língua e respiração bucal, causando irritações e fissuras
nos cantos destes, proporcionando maior facilidade para a instalação de
processos infecciosos. Assim a queilite angular pode ser detectada com certa
freqüência nessa população, podendo estar associada a C.albicans (REY e
BIRMAN, 1990; SCHWARTZMAN, 1999; PILCHER, 2001).
SCULLY et al. (2002) examinaram 77 pacientes portadores da SD e
verificaram a presença de queilite angular e fissuras labiais em 52% dos
indivíduos, sendo que 77% das lesões foram positivas para o isolamento de
C.albicans. Os pacientes com SD podem também apresentar diminuição do fluxo
salivar devido ao hábito da respiração bucal, contudo estudos realizados mostram
resultados conflitantes. JARA et al. (1991) e COGULU et al. (2006) não acharam
diferenças significativas no fluxo salivar quando compararam pacientes com e
sem SD. YARAT et al. (1999) e SIQUEIRA et al. (2005) verificaram uma
diminuição do fluxo salivar em pacientes com SD, quando comparado com
pacientes sem a patologia.
As anomalias dentárias são freqüentes, e os portadores da SD
apresentam em geral hipodontia ou oligodontia, afetando principalmente os
incisivos laterais permanentes. Alterações morfológicas, como fusões e
geminações também são mais comuns nos indivíduos com SD. Os portadores da
SD apresentam ainda atraso significativo na erupção dos dentes decíduos e
permanentes, além da seqüência de erupção ser alterada. (REY e BIRMAN,
1990; SCHWARTZMAN, 1999; PILCHER, 2001). GARCIA e AVILA (2003)
estudaram a erupção dental em crianças de 1 a 12 anos com SD comparando
com grupo controle. Os autores verificaram que antes do primeiro ano de vida, as
crianças com SD não apresentavam nenhum dente na cavidade bucal e que a
dentição decídua só se tornava completa entre os três e quatro anos nestas
crianças.
Uma menor incidência de lesões de cáries tem sido verificada nos
portadores da SD. Tal fato pode ser explicado pelo atraso na erupção dos dentes,
10
pela maior distância entre os dentes devido a microdontia ou agenesia de alguns
elementos dentários (PILCHER, 2001) e características salivares (REY e
BIRMAN, 1990).
STABHOLZ (1991) verificaram uma menor prevalência de cárie em
pacientes com SD quando comparados com pacientes sem a síndrome e
pacientes com retardo mental. A contagem de colônias de S.mutans isoladas da
saliva também foi menor no grupo com SD. MORINUSHI, LOPATIN e TANAKA
(1995) verificaram baixos índices de cáries e altos níveis do anticorpo IgM em
crianças e adolescentes com SD. LEE et al. (2004) e COGULO et al. (2006)
verificaram menor prevalência de lesões de cárie e maiores níveis salivares de
IgA, o anticorpo específico para S.mutans, nos pacientes portadores de SD.
YARAT et al. (1999) não encontraram diferenças significativas na atividade de
cárie em um grupo de pacientes com SD quando comparados com um grupo
controle de crianças sem a síndrome.
A composição salivar dos indivíduos com SD tem sido bastante estudada,
porém os resultados têm se mostrado conflitantes. SIQUEIRA et al. (2005)
verificaram que a capacidade tampão da saliva é maior nos pacientes com SD,
prevenindo assim as quedas de pH e seus efeitos na cavidade bucal. COGULU
(2006), YARAT (1999) e JARA et al. (1991) não encontraram diferenças quanto
ao pH e capacidade tampão salivar em pacientes com e sem SD. Ainda de acordo
com YARAT (1999), as concentrações salivares de proteínas e ácido siálico estão
aumentadas nos portadores da SD, enquanto JARA et al. (1991) afirmam que
concentrações de cloreto, bicarbonato e sódio não apresentam alterações,
enquanto que a concentração de potássio está diminuída nestes indivíduos.
Outro aspecto de interesse odontológico na SD é a alta prevalência de
doença periodontal. Nestes indivíduos a doença ocorre precocemente, tem
progressão rápida e características de periodontite severa, com perdas ósseas
generalizadas. Alterações freqüentes na anatomia dentária, maloclusões,
alterações histológicas no tecido periodontal, alterações no sistema imune são
algumas das várias causas que podem explicar esta maior prevalência
(REULAND-BOSMA e VAN DIJK, 1986).
11
BARR–AGHOLME et al. e AMANO et al. (2000) verificaram que crianças
com SD têm a cavidade bucal mais precocemente colonizada por bactérias
envolvidas na patogênese da doença periodontal e estes patógenos são isolados
com maior freqüência do sulco gengival de pacientes com SD quando
comparados com indivíduos sem a síndrome. IZUMI et al. (1989) verificaram
menor capacidade de quimiotaxia dos neutrófilos de pacientes com SD quando
comparados a pacientes sem SD. Além disso, os autores verificaram uma relação
positiva entre o menor índice de quimiotaxia dos neutrófilos e maior perda óssea
na cavidade bucal dos pacientes com SD.
SREEDEVI e MUNSHI (1998) investigaram a relação existente entre o
status da saúde periodontal, a freqüência de isolamento de Actinobacillus
actinomycetemcomitans (bactéria considerada como principal patógeno da
doença periodontal) e atividade de quimiotaxia dos neutrófilos de 35 pacientes
com SD, com idades entre 6 e 14 anos. Os resultados mostraram altos índices de
inflamação gengival nos pacientes com SD. Além disso, em 54,3% dos pacientes
com SD ocorreu o isolamento de A. actinomycetemcomitans, contra 5% do grupo
controle. A atividade de quimiotaxia dos neutrófilos foi significativamente menor
no grupo de indivíduos com SD.
3.2 Candida spp.
As leveduras são fungos unicelulares, geralmente arredondados que se
reproduzem por brotamentos e originam blastósporos. Nos meios de cultura são
caracterizadas como colônias de aspecto glabroso, mucóide e com variação de
tonalidades. Em especial as colônias do gênero Candida variam da tonalidade
bege ao branco e são denominadas de hialinas. Ao microscópico as leveduras
são caracterizadas por numerosas estruturas redondas ou ovaladas, unicelulares,
com algumas apresentando brotamentos (SIDRIN e MOREIRA, 1999).
As leveduras mais comuns na cavidade bucal são as leveduras do gênero
Candida, formado por mais de 150 espécies. As leveduras do gênero Candida
são consideradas fungos imperfeitos, pois apesar de serem encontradas
predominantemente na forma assexuada, apresentam poucas formas sexuadas
12
de reprodução. Sendo assim estão incluídas na divisão Deuteromycota, Classe
Blastomycetes, família Cryptococcacea do reino Fungi (LACAZ et al., 2002). Ao
microscópio óptico as leveduras do gênero Candida se apresentam como células
globosas, ovaladas, alongadas ou com filamentos denominados de pseudo-hifas,
todas Gram-positivas. Existem ainda algumas espécies que apresentam a
capacidade de formar hifas verdadeiras (FOTOS e HELLSTEIN, 1999).
3.2.1 Identificação das Espécies do Gênero Candida
A identificação clássica das leveduras do gênero Candida compreende
diferentes etapas: isolamento, prova do tubo germinativo, microcultivo e provas
bioquímicas de assimilação e fermentação de carboidratos e assimilação de
nitrogênio (ODDS, 1988; SANDVÉN, 1990; SIDRIN e MOREIRA, 1999). Ainda é
possível fazer a identificação das leveduras através do uso de meios
cromogênicos, métodos comerciais e análise de DNA (ODDS e BERNAERTS,
1994; PFALLER, HOUSTON e COFFMANN, 1996; SIDRIN E MOREIRA, 1999;
GÜNDES, GULENC e BINGOL, 2001; SILVA e CANDIDO, 2005; LEHMANN, LIN
e LASKER, 1992; STEFFAN et al., 1997; MELO et al., 1998; BAUTISTA-MUÑOZ
et al., 2003). O isolamento das leveduras do gênero Candida é feito em Ágar
Saboraud Dextrose e o seu crescimento é favorecido em temperaturas variando
entre 20° C e 38°C e com pH entre 2,5 e 7,5. As colônias de Candida são
caracterizadas pelo formato esférico, coloração branco-fosca, aspecto de
porcelana (brilhante) e cremosas, apresentando diâmetro entre um e oito mm e
odor característico (BARBIERI, 2005).
A primeira prova realizada para a identificação das leveduras do gênero
Candida é a verificação da formação ou não do tubo germinativo. O tubo
germinativo é definido como uma extensão filamentosa da célula levedurifome
com metade da largura e comprimento de três a quatro vezes o diâmetro da
célula mãe (KONEMAN et al., 2001). Pode ser considerado excelente teste para a
identificação presuntiva de C.albicans, isto porque o índice de positividade desta
espécie para tal teste é de cerca de 94 a 97%. As outras espécies de Candida
não produzem tubo germinativo, podendo apresentar prolongamentos que são
13
pseudo-hifas, como por exemplo, a C. tropicalis. (ODDS, 1988; SIDRIN E
MOREIRA, 1999).
O microcultivo da levedura em Ágar fubá com Tween 80 visa diferenciar
as distintas estruturas de reprodução assexuada formadas durante o crescimento
do fungo. Quando incubadas em baixa tensão de oxigênio, as leveduras do
gênero Candida podem produzir filamentos, que são as pseudo-hifas e/ou hifas
verdadeiras. A presença ou não destes filamentos podem auxiliar na identificação
das espécies.
Além da morfologia são também utilizadas provas de assimilação de
carboidratos, as quais se baseiam na capacidade que as leveduras apresentam
de utilizar certos carboidratos como fonte de carbono. Alem disso, a capacidade
das leveduras de fermentarem determinados açúcares, produzindo gás carbônico,
são parâmetros importantes para a diferenciação das espécies (ODDS, 1988;
SIDRIN E MOREIRA, 1999).
Os métodos laboratoriais tradicionais para a identificação das diferentes
espécies de leveduras são bastante laboriosos e leva-se muito tempo para chegar
a um resultado final. A fim de facilitar este processo existem hoje no mercado
diferentes métodos para se realizar o processo de identificação. Os mais
utilizados na rotina de laboratório são os métodos comerciais, que podem ser
manuais ou automatizados e os meios cromogênicos. Estes métodos são de fácil
realização e interpretação, além de oferecer os resultados em menor tempo
(SIDRIN E MOREIRA, 1999; GÜNDES, GULENC e BINGOL, 2001; SILVA e
CANDIDO, 2005). Os meios cromogênicos são utilizados para o isolamento
primário de leveduras, que desde seu crescimento inicial demonstram diferentes
colorações de colônias, dependendo da espécie (SIDRIN E MOREIRA, 1999).
São exemplos de meios cromogênicos: o Albicans ID
®
(BioMériuex), o
CHROMagar Candida
®
(CHROMagar Company) e o Hicrome Candida
®
(HIMEDIA). Os meios cromogênicos têm como vantagens a identificação
presuntiva das leveduras de forma rápida e a facilidade em detectar culturas
mistas, com diferentes espécies de Candida (ODDS e BERNAERT, 1994;
PFALLER, HOUSTON E COFFMANN, 1996). Já os métodos comercializados têm
como principio básico a assimilação de diferentes carboidratos por meio das
14
diferentes espécies de leveduras. A leitura é feita por turvação do meio, reação
colorimétrica ou mudança do indicador de pH.
São exemplos de métodos comerciais manuais conhecidos no mercado:
API 20 C AUX
®
(BioMérieux), ID 32C
®
(BioMérieux), Fungichrom I
®
(International
Microbio)
,
Candifast
®
(International Microbio), entre outros (SIDRIN E MOREIRA,
1999; GÜNDES, GULENC e BINGOL, 2001). Alguns trabalhos existentes na
literatura avaliaram e/ou compararam a desempenho de diferentes métodos.
SHEPPARD et al. (1998) compararam dois sistemas de identificação de
leveduras: API 20 C AUX
®
e o Auxacolor
®
(Sanofi Diagnostics Pasteur) e os
resultados mostraram que um número maior de isolados foi corretamente
identificada pelo Auxacolor
®
em comparação ao API 20 C AUX
®
. Os autores
também afirmam que a leitura do primeiro seria mais fácil para o observador.
SMITH et al. (1999) compararam a desempenho do API 20 C AUX
®
com o RapID
Yeast Plus System
®
(InnovativeDiagnostic Systems) e os resultados mostraram
que a porcentagem de identificações corretas pelo primeiro foi de 99, 1% e do
segundo de 97, 2%, mostrando que ambos os métodos são seguros.
GÜNDES, GULENC e BINGOL (2001) compararam três sistemas
comerciais pra a identificação de leveduras, API 20 C AUX
®
(BioMérieux),
Fungichrom I
®
(International Microbio) e Candifast
®
(International Microbio). Os
resultados mostraram que o melhor índice de acerto foi do sistema Fungichrom I
®
, com 95,6%. Em segundo, o API 20 C AUX
®
, com um índice de 82, 7% e em
terceiro ficou o Candifast
®
com 82,7%. Estaticamente não houve diferenças
significativas entre os dois primeiros métodos. SILVA e CANDIDO (2005)
avaliaram o sistema API 20 C AUX
®
para a identificação de 50 leveduras
previamente identificadas pela metodologia clássica. O sistema identificou
corretamente 46 (92%) das 50 leveduras analisadas, sendo que 76% (38) não
precisaram de testes adicionais e em 16% (8) houve a necessidade dos mesmos.
Apesar de suas limitações o sistema API 20 C AUX
®
é amplamente utilizado nas
rotinas laboratoriais e vários trabalhos da literatura usam o mesmo sistema para a
identificação de leveduras (CARLSTEDT et al., 1996; SCULLY et al., 2002; JIN et
al., 2004; KADIR et al., 2005).
15
3.2.2 Colonização por Candida spp.
As leveduras do gênero Candida são microrganismos comensais que
participam da microbiota normal de diferentes sítios do organismo humano.
Diversas são as espécies de Candida que têm sido isoladas de sítios anatômicos
distintos: cavidade bucal, tubo digestivo, intestino, orofaringe, ânus, vagina e pele
(ODDS, 1988). Na cavidade bucal as leveduras são encontradas principalmente
no dorso da língua, onde características anatômicas como a presença de papilas
filiformes, forame cego e fissura mediana atuam como sítios que favorecem o
desenvolvimento do microrganismo (ARENDORF e WALKER, 1980). Podem ser
encontradas também no palato, mucosa jugal e mucosa vestibular da cavidade
bucal (CARLSTEDT et al., 1996; RIBEIRO et al., 2002; VIEIRA et al., 2005).
C.albicans é a espécie mais comumente isolada na cavidade bucal, mas
outras espécies também já foram isoladas, sendo as mais freqüentes: C.
tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. kefyr, C. guilliermondii, C. glabrata, entre
outras (FOTOS e HELLSTEIN, 1992; KADIR et al., 2005).
A ocorrência de leveduras do gênero Candida na cavidade bucal de
crianças e adultos jovens saudáveis pode variar de 5 a 70% (DARWAZEH e AL-
BASHIR, 1995; AKDENIZ et al., 2002; KADIR et al., 2005). Diferentes estudos
mostram diferentes resultados que podem ser explicados pela variação dos
métodos de coleta, origem das amostras, meios de cultura, subgrupos estudados
e métodos de análise (FOTOS e HELLSTEIN, 1992). Cerca de 80% dos isolados
de leveduras do gênero Candida da cavidade bucal são de C. albicans, seguidos
das espécies de C. parapsilosis, C. krusei, C. kefyr, C. famata e C. tropicalis
(DARWAZEH e AL-BASHIR, 1995; AKDENIZ et al., 2002; KADIR et al., 2005).
As espécies de Candida são consideradas microrganismos comensais,
habitando normalmente a cavidade bucal. Quando há um desequilíbrio entre o
binômio parasito/hospedeiro as leveduras podem então adquirir caráter
patogênico e causar danos ao hospedeiro (ODDS, 1988; FOTOS e HELLSTEIN,
1992; SIDRIN e MOREIRA, 1999). Existem diferentes fatores locais e sistêmicos
que predispõem a ruptura deste equilíbrio e favorecem a instalação dos
processos infecciosos causados pelas leveduras do gênero Candida, entre eles
16
destacam-se os quadros de imunodeficiências, deficiências nutricionais, presença
de tumores malignos, xerostomia, mucosites, uso de próteses, dieta, alterações
endócrinas e uso de determinados medicamentos (antibióticos, esteróides, drogas
citotóxicas e psicotrópicas) (ODDS, 1988; FOTOS e HELLSTEIN, 1992).
O uso de antibióticos, principalmente os de amplo espectro, causa
eliminação de bactérias que fazem parte da microbiota normal do hospedeiro e
competem com as leveduras pelos sítios de colonização e nutrientes, o que
facilita a multiplicação e colonização destas (ODDS, 1988; FOTOS e HELLSTEIN,
1992).
A composição da dieta também pode favorecer a colonização por
leveduras do gênero Candida. JIN et al. (2004) verificaram que a presença da
sacarose facilita a adesão de C.albicans ao biofilme existente na cavidade bucal.
KADIR et al. (2005) verificaram que crianças, entre zero e dois anos, que faziam
uso exclusivo de aleitamento materno não eram colonizadas por leveduras do
gênero Candida, enquanto que 18,5% das crianças que usavam mamadeiras
eram colonizadas por leveduras do mesmo gênero. FRAIZ (1999) afirma que a
mamadeira é um veículo facilitador para a inclusão de açúcar na dieta das
crianças de menor idade. Os resultados encontrados nos estudos corroboram
com a hipótese de que o açúcar presente na dieta facilita a colonização por
Candida spp. Tal fato pode ser explicado por duas hipóteses: os carboidratos da
dieta são metabolizados por bactérias presentes na cavidade bucal, formando
ácidos que diminuem o pH e assim favorecem o crescimento das espécies de
Candida (KADIR et al., 2005) e a presença de carboidratos na dieta faz com que
as leveduras tenham uma maior capacidade de adesão e formação do biofilme,
por meio de mecanismos ainda não elucidados (JIN et al., 2004).
Fatores mecânicos, como uso de próteses, chupetas e presença de
lesões de cáries cavitadas facilitam a colonização por leveduras do gênero
Candida, pois alteram o ambiente bucal criando novos sítios de retenção de
biofilme. DARWAZEH e AL-BASHIR (1995) mostraram em seu estudo maior
freqüência de isolamento de leveduras do gênero Candida em crianças que
faziam uso de chupetas.
17
AKDENIZ et al. (2002) não acharam diferenças significativas no
isolamento de C. albicans em relação aos hábitos de dieta, uso de chupeta e
mamadeiras e pH salivar. Já a presença de lesões de cárie foi um fator importante
no isolamento das leveduras. Entre as crianças que apresentavam mais de quatro
dentes cariados 69,2% tinham suas cavidades bucais colonizadas por C. albicans.
Apenas 5% dos pacientes sem cárie eram colonizados pelo microrganismo. Os
autores ainda verificaram que o microrganismo estava presente em 16 dos 20
canais radiculares analisados, mostrando um novo sítio de colonização da C.
albicans.
Outro fator que deve ser considerado é a idade. No período neonatal há
susceptibilidade aumentada à colonização por leveduras do gênero Candida e à
candidose devido à imaturidade do sistema imune e à falta de microbiota bucal
balanceada (ODDS, 1988; SCHERMA et al, 2004). DARWAZEH e AL-BASHIR
(1995) realizaram um estudo com o objetivo de verificar a ocorrência de leveduras
do gênero Candida na cavidade bucal de 206 crianças, com idades entre 2 e 11
meses e sua relação com o tipo de aleitamento (materno, artificial ou misto). A
freqüência de isolamento nos grupo variou de 40 a 46,8%, não representando
diferença estatisticamente significante.
ZÖLLNER e JORGE (2003) coletaram amostras salivares de um grupo de
lactentes, com idades até 5 meses, sendo que 55 faziam aleitamento natural (não
faziam uso de chupetas e mamadeiras) e 30 utilizavam aleitamento artificial. Os
resultados mostraram que no primeiro grupo foram isoladas leveduras do gênero
Candida em 19 (34.55%) das amostras coletadas. No segundo grupo foram
isoladas 20 (66,67%) amostras de leveduras do gênero Candida, diferença
estatisticamente significativa. Nos dois grupos a espécie mais freqüente foi a C.
albicans (57,89 e 46,1%, respectivamente), seguida de C. parapsilosis, C.
tropicalis, C. guilliermondii e C. krusei.
SCHERMA et al. (2004) investigaram amostras da cavidade bucal de 100
recém-nascidos nas suas primeiras 24 horas de vida e verificaram o isolamento
de leveduras do gênero Candida em apenas 3 (3%) amostras coletadas. Trinta
crianças foram acompanhadas durante quatro meses e mensalmente se faziam
coletas de amostras salivares. Com 30 dias de vida, 13 (20,3%) bêbes tinham sua
18
cavidade bucal colonizadas por leveduras do gênero Candida, aos 60 dias,
29,7%, aos noventa dias 32,8% e aos 120 dias, 17,2%. De todas as amostras
isoladas, 44.6% eram de C. albicans, seguida por C. tropicalis (33.8%).
A ocorrência de Candida spp. na cavidade bucal de 300 crianças, com
idades entre 0 e 12 anos foi estudada por KADIR et al. (2005). Neste estudo
também foi investigada a relação entre o aleitamento materno ou uso de
mamadeira como fator local para colonização pelas leveduras. Os resultados
mostraram que 26,3% das crianças eram colonizadas por alguma espécie de
Candida, sendo que 22,3% (80% dos isolados) apresentavam C. albicans,
enquanto 3,9 % eram colonizadas por outras espécies (C. parapsilosis, C. Krusei,
C, Kefyr, C. famata e C. tropicalis). Dividindo - se em grupos foi possível verificar
que nas crianças entre zero e 5 anos (grupo A) a freqüência de isolamento de
Candida spp. foi de 17%. O grupo B era formado por crianças com idades entre 6
e 8 anos e mostrou uma freqüência de Candida spp. de 50,8%. O terceiro grupo
(grupo C), formado por crianças entre 9 e 12 anos, mostrou uma prevalência de
27,9%. Houve diferença estatisticamente significante quando comparado o grupo
B com os grupos A e C. As crianças do grupo B apresentam uma fase de
transição na dentição, com a esfoliação dos dentes decíduos e erupção dos
permanentes, o que pode facilitar a colonização por leveduras do gênero
Candida. As crianças com idades entre zero e dois anos foram divididas em dois
grupos: aquelas que faziam aleitamento materno exclusivo (grupo 1) e as que
faziam aleitamento materno e também usavam mamadeiras com outros leites
e/ou líquidos (grupo 2). Dezoito por cento das crianças do grupo 2 eram
colonizadas por leveduras do gênero Candida, enquanto que no grupo 1 nenhuma
criança apresentou colonização pelo microrganismo. Pelos resultados
encontrados, alguns autores afirmam que o aleitamento materno pode conferir ao
lactente proteção contra a colonização por Candida, já que o mesmo contém
fatores de resistência, como a lactoferrina, lisozima, leucócitos e imunoglobulinas,
em especial IgA, que inibem a adesão e conseqüente desenvolvimento destes
microrganismos (FOTOS e HELLSTEIN, 1992; ZÖLLNER e JORGE, 2003;
SCHERMA et al., 2004; KADIR et al, 2005).
19
3.2.3 Candidoses, fatores de virulência e aspectos imunológicos do hospedeiro
A candidose é a infecção fúngica oportunista mais freqüente, tendo um
espectro bastante extenso, indo desde manifestações locais em mucosas, como a
mucosa bucal, até quadros sistêmicos com a invasão de diferentes órgãos
(SIDRIM, 1999). Na cavidade bucal a simples presença de leveduras não é
sinônimo da doença, mas a doença em si é invariavelmente precedida pela
colonização (SCHARDOSIMI e CHERUBINI, 2004). Com o desequilíbrio no
sistema de defesa do hospedeiro e presença de fatores predisponentes (redução
do fluxo salivar, uso de prótese, entre outros) as leveduras têm seu potencial de
proliferação aumentado, passando de sua forma comensal para a forma
parasitária. As leveduras são geralmente encontradas em mucosa na forma de
células ovais apresentando brotamento. A forma invasiva do fungo consiste na
formação do pseudomicélio, ou seja, a presença de hifas septadas com
blastoconídios nas constrições das mesmas (GOMPERTZ e CEBALLOS, 1991).
A virulência da Candida está relacionada a diferentes fatores, sendo o
principal a sua capacidade de adesão às células epiteliais, que ocorre
principalmente pela presença de hifas e tubos germinativos, no caso da espécie
C.albicans. Sabe-se que o poder de adesão dos tubos germinativos é maior, o
que provavelmente explique a prevalência de colonização por C.albicans e seu
maior potencial patogênico. As leveduras desta espécie podem ainda se aderir às
bactérias da cavidade bucal, dispostas principalmente na forma de placa
bacteriana sobre os elementos dentários (ODDS, 1988).
BARBIERI (2005) analisou a aderência entre C. albicans e S. mutans in
vitro e verificou que houve aumento considerável no desenvolvimento dos dois
microrganismos quando estes eram cultivados juntos, porém a C. albicans
sozinha também apresentou capacidade de aderência à estrutura dentária,
mesmo com ausência de biofilme bacteriano.
As hifas e pseudo-hifas, próprias de algumas espécies de Candida,
podem ter comprimento maior que 200µm, o que dificulta a fagocitose, principal
meio de defesa do organismo contra este tipo de infecção (SIDRIM, 1999).
Algumas espécies de Candida, incluindo a C.albicans, são produtoras de enzimas
20
hidrolíticas, como as proteinases ácidas e as fosfolipases, que facilitam sua
penetração no tecido subjacente. Também produzem ácidos, em especial o
piruvato e o lactato, que baixam o pH do meio e ativam as enzimas ácidas
(ODDS, 1988).
Em indivíduos imunologicamente saudáveis, os mecanismos de defesa do
hospedeiro são suficientes para prevenir infecções pela Candida. Apesar da
realização de diversos estudos, há poucas respostas elucidativas sobre os
mecanismos específicos usados pelo sistema imune contra a Candida
(REPENTIGNY, LEWANDOWSKI e JOLICOEUR, 2004). Sabe-se que para a
manutenção da saúde bucal contra as candidoses, as respostas imunes (celular e
humoral) estão envolvidas. Na resposta imune celular, considerada a mais
importante, os antígenos (Candida) são apresentados às células T pelas células
apresentadoras de antígenos (macrófagos, células de Langerhans, queratinócitos
e células dendríticas). As células T CD4
+
auxiliares (Th1 e Th2) passam então a
produzir citosinas (interleucinas, interferons e fatores de necrose tumoral) que
ajudam a eliminar o agente agressor através da estimulação de outras células, da
fagocitose e da quimiotaxia (CANTORNA e BALISH, 1991; NEWMAN e HOLLY,
2001; FARAH et al., 2002). A resposta imune humoral ocorre pela produção de
anticorpos IgA, que estão presentes na saliva e se ligam às superfícies das
leveduras do gênero Candida, impedindo assim sua adesão as células epiteliais
da mucosa (COOGAN, SWEET e CHALLACOMBE; 1994). A saliva ainda
apresenta em sua composição outros fatores microbianos como lisozima,
lactoperoxidases, polipeptídios ricos em histidina, calprotectinas, lactoferrina,
histatinas, mucinas, células fagocitárias e outras glicoproteínas, que mantém o
equilíbrio ecológico oral, sendo considerada o primeiro agente de defesa na
cavidade bucal (COOGAN, SWEET e CHALLACOMBE; 1994; EDDGERTON,
1998; ROSS e HERZBERG, 2001).
3.2.3.1 Aspectos Clínicos das Candidoses Bucais
As candidoses bucais apresentam-se sob aspectos clínicos variados, e
quando avaliadas pela sua evolução, podem apresentar-se sob duas formas:
aguda ou crônica. As formas agudas subdividem-se em pseudomembranosas ou
21
eritematosas, e as crônicas em pseudomembranosas, hiperplásicas, eritematosa,
queilite angular e candidose mucocutânea crônica (SIDRIM, 1999; LACAZ et al,
2002; AZUL e TRANCOSO, 2006) Destacam-se os tipos pseudomembranoso e
eritematoso, conhecidos pela sua maior freqüência em crianças.
A candidose pseudomembranosa é a manifestação clássica e mais
comum em crianças. Geralmente aguda, pode, quando não tratada, evoluir para
um quadro crônico. As lesões se caracterizam por placas esbranquiçadas,
semelhantes a “leite coalhado”, localizadas em qualquer região da cavidade
bucal, especialmente na língua e no palato. Tais placas são constituídas, em
grande parte, de pseudomicélio e epitélio descamado, com erosão mínima da
mucosa. As placas são facilmente removidas por raspagem, deixando abaixo um
tecido eritematoso e sensível. Na maioria dos casos as lesões se limitam a
cavidade bucal, mas outras vezes se propagam a orofaringe, esôfago e
estômago. (ODDS, 1988; SIDRIM, 1999; e LACAZ, 2002).
A candidose eritematosa caracteriza-se pela presença de zonas difusas,
vermelhas e cujos limites são, normalmente mal definidos. Localiza-se
preferencialmente na superfície dorsal da língua, podendo também ser
encontrada no palato. Tal como a candidose pseudomembranosa, existe na forma
aguda ou crônica, sendo acompanhada, algumas vezes, por sensação de
queimadura.
Diferentes estudos verificaram a prevalência de alterações bucais em
crianças, entre elas a candidose. BALDANI, LOPES e SCHEIDT (2001)
examinaram a cavidade bucal de 200 crianças entre zero e 24 meses e os
resultados mostraram que 2,5% das crianças estudadas apresentavam candidose
e esta foi encontrada com maior freqüência em crianças de zero a três meses.
BEZERRA e COSTA (2000) analisaram 1042 fichas clínicas de pacientes de zero
a cinco anos que haviam sido atendidos em uma clínica pública, na cidade de
Natal. Os resultados mostraram que 2,3% das crianças continham em suas fichas
anotações sobre a presença de lesões bucais em dias de consulta, sendo que 6%
das lesões eram de candidose. As lesões foram observadas em crianças de zero
a três meses e estavam localizadas no dorso da língua. YARED et al. (2001)
avaliaram 730 bebês na faixa etária de zero a 300 dias e encontraram uma
22
prevalência de 12,9% de crianças acometidas por candidose da forma
pseudomembranosa aguda. A maioria destas crianças tinham entre 0 e 90 dias.
DECONINCK et al. (2003) acompanharam a rotina de consultório de 35
odontólogos por um período de seis meses. Foram atendidos ao total 354
pacientes, com idades entre zero e seis anos. As lesões bucais encontradas com
maior freqüência foram as aftas ulceradas, em 27% dos pacientes, seguida pela
candidose oral, que afetou 15% dos pacientes. 47% dos pacientes com candidose
tinham entre zero e quatro anos.
3.3 SÍNDROME DE DOWN X Candida spp.
São poucos os trabalhos da literatura que buscaram investigar a relação
entre a SD e a colonização da cavidade bucal por leveduras do gênero Candida.
Os trabalhos existentes mostram resultados semelhantes, com pacientes com SD
apresentando uma colonização destes microrganismos significativamente maior
que em pacientes sem a Síndrome. As alterações anátomo-fisiológicas existentes
na cavidade bucal dos portadores da SD, a dificuldade motora, infecções
respiratórias recorrentes, alterações na resposta imunológica, maior prevalência
de doença periodontal, estão entre as possíveis causas citadas por diferentes
autores (CARLSTEDT et al., 1996; SCULLY et al., 2002; LINOSSIER et al., 2002;
RIBEIRO et al., 2005; VIEIRA et al., 2005).
CARLSTEDT et al. (1996) avaliaram a ocorrência de diferentes espécies
de Candida na cavidade bucal de um grupo de 55 crianças e adolescentes com
SD (34 meninos e 21 meninas), com idade entre 0 e 21 anos. O grupo controle
era formando por 55 crianças e adolescentes sem SD, com idade semelhante,
sendo 34 meninos e 21 meninas. Os participantes da pesquisa foram submetidos
ao exame clínico e coleta de saliva, por meio de swabs, de quatro regiões
distintas da cavidade bucal (mucosa vestibular direita e esquerda, palato e dorso
posterior da língua). Os resultados mostraram que 69% dos pacientes com SD
eram colonizados por C.albicans e 40% apresentavam lesões de candidose
(pseudomembranosa ou eritematosa). Dezenove crianças (35%) do grupo
controle eram colonizadas por C.albicans, sendo que só uma apresentava lesões
23
de candidose. Três pacientes com SD apresentaram colonização por outras
espécies de Candida (C. parapsilosis, C. guilliermondii e C. tropicalis) e um
paciente controle apresentou colonização por C. tropicalis. A distribuição das
leveduras na cavidade bucal e o número de colônias isoladas também variaram
entre os grupos. Nos pacientes com SD a distribuição das colônias foi similar
entre o palato, a língua, mucosa vestibular e o número de colônias isoladas foi
significativamente maior. Os pacientes do grupo controle apresentaram uma
maior distribuição de células na língua e mucosa vestibular.
SCULLY et al. (2002) examinaram 77 pacientes portadores da SD, sendo
40 do sexo masculino e 37 do sexo feminino. O grupo compreendia pacientes
ingleses e espanhóis, de todas as idades, com diferentes tipos de trissomia do
cromossomo 21, sendo que alguns viviam em instituições e outros em casa.
Realizou-se a avaliação clínica a fim de se verificar a presença de fissuras labiais
ou queilite angular. A seguir coletaram-se amostras de saliva, por meio de swabs,
de 50 pacientes estudados. As amostras eram coletadas de diferentes regiões da
cavidade bucal (palato duro, dorso de língua e lesões labiais, quando presentes).
Os resultados mostraram que 27% dos indivíduos estudados apresentavam
fissuras labiais e 25%, queilite angular. Foram isoladas leveduras de C. albicans
da cavidade bucal de 28 pacientes (56%) sendo que a maioria dos isolados
(77,3%) era de pacientes que apresentam fissuras labiais ou queilite angular.
LINOSSIER et al (2002) realizaram um estudo com a intenção de
estabelecer a relação quantitativa existente entre o nível de Streptococcus mutans
e C. albicans em crianças com SD, comparando com pacientes com retardo
mental e pacientes controle. Participaram do estudo um total de 166 crianças e
adolescentes, com idades entre 5 e 19 anos, sendo que 49 destes eram
portadores da SD, 60 apresentavam retardo mental e 57 formavam o grupo
controle. Fez-se a estimulação do fluxo salivar com uma solução de ácido cítrico a
1% e a coleta de cerca de 0,5 ml de secreção salivar em tubos de vidro. As
amostras isoladas foram submetidas a um experimento de agregação para se
observar a aderência do S. mutans à levedura de C. albicans. Os resultados
demonstraram que existe um aumento diretamente proporcional entre a
quantidade de leveduras e bactérias isoladas nos três grupos. Os pacientes dos
24
grupos SD e com retardo mental apresentaram uma maior expressão geométrica
de C. albicans em comparação ao grupo controle.
RIBEIRO et al. (2005) realizaram um estudo com o objetivo de verificar a
ocorrência de leveduras do tipo C. albicans produtoras de fosfolipase na saliva de
crianças com SD. A fosfolipase é uma enzima extracelular produzida pelas
leveduras de C. albicans e pode estar relacionada à virulência deste
microrganismo. Participaram do estudo 60 crianças, com idade entre zero e 10
anos, sendo que 30 eram portadoras da SD. As crianças foram submetidas ao
exame clínico odontológico quando se fez a coleta da secreção salivar da mucosa
jugal por meio de swabs esterilizados. Foram isoladas leveduras de C. albicans
da saliva de 83,3% das crianças portadoras de SD e destas 88% eram produtoras
de fosfolipase. Das crianças sem SD foram isoladas cinco amostras de C.
albicans (16,7%), sendo que quatro (80%) eram produtoras de fosfolipase.
VIEIRA et al. (2005) realizaram uma pesquisa com o objetivo de verificar a
ocorrência de C. albicans isoladas da cavidade bucal de crianças com SD.
Participaram do estudo 70 crianças com idades entre 0 e 10 anos, sendo 35
portadoras da SD e as demais crianças desprovidas desta síndrome. As amostras
foram coletadas com swabs esterilizados da mucosa jugal das crianças
participantes do estudo. Os resultados mostraram que 85,7% das crianças com
SD eram colonizadas por C. albicans enquanto que apenas 17,1% das crianças
sem a síndrome apresentaram colonização por C. albicans, diferença esta
estatisticamente significativa.
3.4 MARCADORES MOLECULARES
A variabilidade genética entre microrganismos pode ser verificada através
de análises de suas características fenotípicas ou pela análise do genótipo, ou
seja, seu material genético. As análises fenotípicas tradicionais se baseiam em
um certo número de características expressas pelos microrganismos e é realizada
por meio de caracterizações morfológicas e provas bioquímicas, o que muitas
vezes pode ser insuficiente para uma identificação precisa, devido à limitação dos
métodos. Atualmente, a análise do genótipo de microrganismos vem sendo
25
amplamente utilizada, seja na identificação direta de espécies isoladas, seja para
verificar a variabilidade genética entre espécies distintas ou dentro de uma
mesma espécie.
As técnicas de biologia molecular eram limitadas até meados da década
de 1980, quando surgiu uma nova metodologia para clonagem e detecção do
material genético. Denominada de reação em cadeia da polimerase (PCR), esta
nova metodologia é baseada em uma reação de replicação in vitro, na qual se
obtém o enriquecimento de um fragmento específico de DNA por meio de sua
duplicação em modo exponencial (SILVA - PEREIRA, 2003).
O processo de amplificação envolve repetidos ciclos de desnaturação
térmica do DNA molde (92°a 95°C), anelamento dos iniciadores às suas
seqüências complementares (35°a 60°C) e extensão dos oligonucleotídios
anelados por uma enzima DNA polimerase (72°C). A principio a escolha de uma
enzima polimerase que resistisse às altas temperaturas necessárias para a
desnaturação da fita molde representou uma limitação da técnica. Nesse sentido
o isolamento de uma enzima polimerase (Taq polimerase) de uma bactéria
(Thermus aquacticus) resistente às altas temperaturas promoveu o grande
impacto da técnica (SILVA - PEREIRA, 2003).
Uma vez que os produtos recém-sintetizados também são
complementares e capazes de se ligar aos iniciadores (primers), após
desnaturação térmica, cada ciclo sucessivo essencialmente dobra a quantidade
de DNA sintetizada no ciclo anterior. O resultado é o acumulo exponencial do
fragmento específico de DNA aproximadamente a 2
n
, onde n é o numero de ciclos
realizados (POWER, 1996; SILVA - PEREIRA, 2003).
Atualmente, uma variedade de técnicas em biologia molecular explora o
princípio da PCR, entre elas a técnica de RAPD (Random Amplified Polymorfic
DNA).
3.4.1 Marcadores RAPD
Nesta técnica um único primer, com aproximadamente 10pb, é usado
para amplificar o DNA a ser estudado, por uma reação de PCR. A grande
26
vantagem da técnica é a não necessidade do conhecimento prévio do DNA a ser
analisado. A seleção do primer é arbitrária e a sua ligação é feita em sítios não
específicos (POWER, 1996; PINTO et. al., 2004). Além disso, a técnica tem alta
capacidade de discriminação e é considerada fácil de ser realizada (PINTO et al.,
2004).
A técnica vem sendo questionada quanto a sua dificuldade de
reprodução, problemas técnicos durante os passos e a dificuldade de se analisar
os resultados. Neste sentido, diferentes pesquisas vêm trabalhando para
aperfeiçoar a metodologia e diminuir os riscos de possíveis falhas (HOLMBERG e
FEROZE, 1996; SANSFORIANO, 2001).
CLEMONS et al. (1997) avaliaram a variabilidade genética de isolados de
C. albicans de três localidades diferentes por meio de três técnicas distintas de
biologia molecular: Análise de Enzima de Restrição (REA), RAPD e Eletroforese
em campo pulsado (PFGE). Os resultados mostraram que as técnicas de RAPD e
REA têm melhor poder de discriminação que PFGE, além da técnica de RAPD ser
mais rápida e precisar de menores quantidades de DNA extraído. Os 102 isolados
de C. albicans apresentaram alta variabilidade genética, com 58 perfis genéticos
diferentes (RAPD). Os isolados da Europa e Estados Unidos foram agrupados,
enquanto que os de Singapura ficaram em grupo distinto. Resultados
semelhantes foram encontrados por BOSTOCK et al. (1993), DIAZ-GUERRA et
al. (1997), RIBOT et al. (2000), mostrando que isolados de C. albicans
apresentam grande variabilidade genética, que pode ser observada por meio de
marcadores RAPD. Os resultados encontrados reforçam o uso desta técnica para
estudos de variabilidade genética destes microrganismos.
A variabilidade genética entre isolados de leveduras do gênero Candida
vem sendo alvo de diversos estudos. ROBERT et al. (1995) avaliaram a
variabilidade genética entre 84 amostras de C. albicans, isoladas de pacientes de
uma Unidade de Terapia Intensiva (UTI), por meio de marcadores RAPD,
comparando com amostras isoladas de outros pacientes internados em outras
áreas do mesmo hospital. Os resultados mostraram que entre os 84 isolados de
pacientes da UTI (18), havia apenas 7 perfis genéticos diferentes, enquanto que
27
as outras amostras mostraram 22. Os resultados encontrados mostraram que a
RAPD é de grande valor para estudos epidemiológicos.
WALTIMO et al. (2001) isolaram 37 amostras de C. albicans de canais
radiculares de 37 pacientes com periodontite apical. As amostras foram avaliadas
quanto ao fenótipo por meio de perfil enzimático, assimilação de açúcar e
resistência ao ácido bórico. O primeiro teste mostrou quatro fenótipos diferentes,
o segundo nove e o terceiro dois, resistente ou sensível. Uma combinação dos
resultados mostrou que as amostras apresentavam 14 fenótipos distintos. Os
marcadores RAPD mostraram 31 genótipos diferentes, mostrando o alto
polimorfismo genético da espécie.
Outros trabalhos buscaram verificar, através dos marcadores RAPD, se
leveduras do tipo C. albicans isoladas de sítios anatômicos diferentes apresentam
o mesmo perfil genético. ANSARI et al. (2003) isolaram leveduras do gênero
Candida da cavidade bucal e das fezes de 108 crianças, divididas em dois
grupos: grupo controle, formado por crianças sem cárie e grupo de estudo
formado por crianças com lesões cariosas. Leveduras do gênero Candida foram
isoladas das amostras salivares, em 2% das crianças do primeiro grupo e em
67% do segundo grupo, mostrando que lesões de cárie representam um nicho
ecológico para o desenvolvimento de leveduras. Também foi encontrada maior
prevalência de leveduras nas fezes das crianças com cárie (59%), contra 2% do
grupo controle. Um total de 55 amostras de pacientes co-infectados (33) foram
submetidas à análise gênica, por RAPD. Trinta e três amostras apresentavam
perfis genéticos idênticos entre amostras isoladas da cavidade bucal e fezes.
CERIKÇIOGLU et al. (2004) isolaram leveduras do gênero Candida de
diferentes sítios anatômicos (orofaringe, axilas, umbigo, reto e sangue) de 134
recém-nascidos prematuros com baixo peso internados em uma UTI entre 1999 e
2002. Foram avaliadas a atividade das enzimas proteinase e fosfolipase das
leveduras isoladas. Os resultados mostraram que 48,5% (65) dos bebês eram
colonizados por leveduras do gênero Candida, sendo a espécie C. albicans a
mais prevalente (80%). Quatro dos 65 recém-nascidos colonizados por leveduras
desenvolveram candidemia, ou seja, infecção do sangue pelas leveduras. A
análise da variabilidade genética, realizada por meio de marcadores RAPD, entre
28
os isolados do sangue e os isolados de outros sítios anatômicos mostrou que em
um mesmo paciente os isolados eram idênticos. Foi verificada também uma alta
atividade das enzimas hidrolíticas (proteinase e fosfolipase) nos isolados das
crianças com candidemia.
Atualmente diferentes estudos avaliam o uso da RAPD para a identificação
direta de leveduras do gênero Candida. RESENDE et al. (2004) isolaram e
identificaram fenotipicamente 242 amostras de leveduras do gênero Candida, sendo
que as amostras (37) das espécies mais freqüentes (C. albicans, C. tropicalis e C.
parapsilosis), 15 amostras que foram de difícil identificação pelo fenótipo e linhagens
ATCC foram submetidas à análise do polimorfismo genético e à identificação, por
meio de RAPD. Os resultados mostraram 100% de compatibilidade entre a primeira
identificação (fenótipo) e os agrupamentos do RAPD, mostrando que este método
pode ser usado para a identificação direta de Candida spp.
GIAMMANCO et al. (2005) avaliaram 28 amostras de C. albicans isoladas
da cavidade bucal de 18 pacientes com HIV e verificaram, através da análise do
fenótipo, que todas as amostras apresentavam o mesmo padrão de assimilação
de açúcar. A análise de resultados da RAPD mostrou que quase todos os
pacientes apresentavam perfis genéticos diferentes, mostrando mais uma vez o
polimorfismo genético da espécie. LEHMANN, LIN e LASKER (1992), STEFFAN
et al. (1997), MELO et al. (1998), e BAUTISTA-MUÑOZ et al. (2003) afirmam que
os marcadores RAPD podem ser usados como marcadores para descrições
taxonômicas e identificação direta de Candida spp. em investigações
epidemiológicas.
29
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MEIOS DE CULTURA
4.1.1 Ágar Saboraud Dextrose - SDA
Peptona 10g
Dextrose 40g
Agar 15g
Água destilada 1000ml
O pH final foi ajustado para 5,6
4.1.2 Ágar Batata Dextrose – BDA
Infusão de Batatas 200ml
Dextrose 20g
Ágar 15g
Água destilada 1000ml
O pH final foi ajustado para 5,6.
4.1.3 Ágar Hicrome Candida (Himedia ®)
Digestão péptica do tecido animal 15g
Fosfato dipotássico de hidrogênio 1g
Mistura cromogênica 11,22g
Clorafenicol 0,5g
Agar 15g
Água destilada 1000ml
O pH final foi ajustado para 7,2.
30
4.1.4 Ágar Fubá com Tween 80 (SIDRIM e MOREIRA, 1999)
Fubá de milho 40g
Ágar bacteriológico 20g
Tween 80 12ml
Água destilada 1000ml
4.1.5 Meio para Assimilação de Carboidratos (SIDRIM e MOREIRA, 1999)
Yeast Nitrogen Base (Difco
®
) 6,7g
Ágar bacteriológico 20g
Água destilada 1000ml
4.1.6 Meio para Assimilação de Nitrato (SIDRIM e MOREIRA, 1999)
Yeast Carbon Base (Difco
®
) 6,7g
Ágar bacteriológico 20g
Água destilada 1000ml
4.2 SOLUÇÕES REAGENTES
4.2.1 Solução Salina
NaCl 8,5g
Água destilada 1000ml
4.2.2 DNA polimerase
A Taq DNA polimerase utilizada nas reações de amplificação foi a da
marca Invitrogen, na concentração de 5U/µL.
31
4.2.3 dNTP
Os quatro desoxirribonucleotídeos (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) estoques
(100mM), foram diluídos em água ultrapura a 2,5mM (solução de uso). Nas
reações de amplificação, a concentração final utilizada foi de 0,2mM de cada
dNTP.
4.2.4 Gel de Agarose (0,8%)
Agarose 0,8g
Tampão TEB 1X 100ml
4.2.5 Gel de Agarose (1,4%)
Agarose 1,4g
Tampão TEB 1X 100ml
4.2.6 Oligonucleotídios iniciadores (Primers)
Os primers foram diluídos em água ultrapura autoclavada usando o peso
molecular do primer individual dado pelo fornecedor. Os primers diluídos foram
mantidos a -20ºC.
4.2.7 Tampão da amostra
Sacarose 40g
Azul de bromofenol 0,25g
Água destilada 100ml
Os ingredientes foram solubilizados e mantidos a 4ºC.
32
4.2.8 Tampão CTAB
Tris-base 2,42g
Cloreto de sódio 8,2g
Na-EDTA 0,74g
CTAB 2g
Água destilada 80ml
pH:7,5
A solução foi aquecida para que o Na-EDTA e o CTAB fossem dissolvidos
e o volume completado para 100mL com água destilada autoclavada.
4.2.9 Tampão de corrida para gel de agarose (TEB 10X) - pH 8,0
Tris-base 54g
Ácido bórico 27,5g
EDTA 0,5M 20ml
Água destilada 500ml
4.2.10 Solução de Brometo de Etídio
Foram dissolvidos 1,0% (p/v) de brometo de etídio em água destilada,
agitando-se por várias horas. A solução foi estocada à temperatura ambiente.
Para revelação, foram diluídos em 3 µL de água destilada.
4.3 ESTERILIZAÇÃO
Os meios de cultura e soluções foram esterilizados em autoclave, com
pressão atmosférica de 1 atm por 20 min. Vidrarias foram autoclavadas por 40
min. Frascos, ponteiras e tubos tipo eppendorf foram autoclavados à pressão de 1
atmosfera, por 15 min e os procedimentos diferenciados foram especificados em
cada item. Todo material contaminado foi esterilizado antes do descarte.
33
4.4 LINHAGENS UTILIZADAS
Foram utilizadas linhagens de leveduras do Gênero Candida, isoladas da
saliva de crianças atendidas nos Ambulatório de Síndrome de Down e de
Pediatria Preventiva do Hospital de Clínicas da UFPR, além de crianças atendidas
em uma Unidade Básica de Saúde da Região Metropolitana de Curitiba (Colombo
– PR). Também foram usadas as linhagens ATCC 750 de C. tropicalis, 6258 de C.
krusei e 22019 de C. parapsilosis, gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Arnaldo
Colombo do Laboratório Especial de Micologia - LEMI da EPM/UNIFESP. A
linhagem ATCC 10231 de C. albicans utilizada foi gentilmente cedida pela bióloga
Rosângela Lameira Pinheiro, Setor de Micologia do Hospital de Clinicas da UFPR.
4.5 CASUÍSTICA
Fizeram parte do estudo 101 crianças com idades entre zero e 6 anos. O
estudo realizado foi um estudo de caso-controle, constituído de dois grupos. O
primeiro (grupo 1) foi formado por 51 crianças portadoras da Síndrome de Down
que freqüentavam o ambulatório de Síndrome de Down do Hospital de Clínicas da
UFPR e selecionadas primeiramente de acordo com as características do serviço.
O grupo 2 foi formado por 50 crianças sem SD que eram atendidas no
Ambulatório de Pediatria Preventiva do Hospital de Clínicas da UFPR e em uma
Unidade Básica de Saúde da região metropolitana de Curitiba, Colombo – PR.
Buscou-se a semelhança deste grupo em relação à idade do grupo 1. Os critérios
de inclusão adotados foram: não utilização de antibióticos no dia da coleta,
condições gerais de saúde normais, ausência de lesões na mucosa bucal e
permissão dos responsáveis através do termo de consentimento informado
(Apêndice 1). O estudo foi aprovado pelo comitê de Ética em Pesquisa em Seres
Humanos do Hospital de Clínicas da UFPR (Apêndice 2).
4.6 EXAME CLÍNICO
Primeiramente foi realizado o preenchimento de uma ficha clínica
(Apêndice 3) que continha dados de identificação do paciente, condições gerais
34
de saúde e uso de medicamentos. As crianças foram avaliadas por um único
observador, que verificou a ausência de lesões na mucosa bucal.
4.7 COLETAS SALIVARES
Foram realizadas coletas salivares com auxílio de swabs de algodão
esterilizados (Fabrimed
®
). Este foi o método mais indicado devido a pouca idade
das crianças participantes do estudo (DARWAZEH e AL-BASHIR, 1995;
CARLSTEDT et al., 1996; RIBEIRO et al., 2002; SCULLY et al, 2002;
SCHARDOSIMI e CHERUBINI, 2004; KADIR et al., 2005; VIEIRA et al., 2005). A
coleta foi feita passando-se o swab por diferentes regiões da cavidade bucal
(dorso de língua, palato, mucosa vestibular e mucosa jugal). Os swabs com
amostras de saliva eram então depositados em tubos contendo cinco ml de
solução salina esterilizada. Os tubos foram mantidos em recipientes térmicos com
gelo e as amostras foram processadas em até duas horas após a coleta.
4.8 ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida NA SALIVA
As amostras foram processadas no laboratório de Micologia do Hospital
de Clínicas da UFPR. Os tubos contendo os swabs eram colocados no agitador
magnético (Vortex QL-901/Biomixer) para homogeneização da solução. O
conteúdo era então diluído a 10
-1
em novo tubo contendo solução salina
esterilizada e novamente homogeneizado em agitador magnético. A partir desta
diluição, 0,1 ml de cada amostra foram semeadas (em estrias) em placa de Petri
contendo o meio Ágar Saboraud Dextrose. As placas foram incubadas a 30°C por
um período de 48 horas até sete dias.
4.9 IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida
Após o período de incubação era verificado se houve o desenvolvimento
de colônias de leveduras. A primeira análise era realizada pelas características
macroscópicas das colônias que apresentaram crescimento. As colônias de
35
Candida spp. têm como características serem esféricas, de coloração branco-
fosca, com aspecto de porcelana, aspecto cremoso, diâmetro entre 1 a 8 mm e
odor característico (Figura 1a). As colônias que apresentavam tais características
eram submetidas à Coloração de Gram e observadas em microscópico óptico
(Nikon/YS2-T) (Figura 1b). Confirmada a presença de leveduras, uma colônia de
cada placa era repicada para um tubo contendo BDA e outro tubo contendo SDA.
Todos os isolados foram mantidos em Ágar Saboraud Dextrose e repicados, em
média, uma vez por mês. Para a identificação das leveduras isoladas foram
usados métodos distintos: Formação do Tubo Germinativo, Ágar Hicrome
Candida
®
(Himedia), Sistema API 20 C AUX
®
(BioMèrieux), Microcultivo de
leveduras, provas de Assimilação de Carboidratos e Assimilação de Nitrogênio.
FIGURA 1 - CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS COLÔNIAS DE LEVEDURAS DO
GÊNERO Candida
FONTE: O autor
a – Macromorfologia das leveduras do gênero Candida - esféricas, coloração branco-fosca,
aspecto cremoso
b – Micromorfologia de leveduras do gênero Candida (C. albicans) em 1000X em M.O.
c – Formação do tubo germinativo em 400X em M.O.
4.9.1 Formação do Tubo Germinativo
Para a realização deste teste foram utilizadas colônias novas (24 horas)
repicadas em BDA. Utilizou-se 0,5 ml de plasma humano depositado em tubo
esterilizado, acrescido de traços de dextrose e uma alçada da amostra a ser
analisada. O tubo foi então incubado em estufa a 37°C por três horas. Para a
a
b
c
36
visualização, uma gota da cultura em suspensão foi colocada entre lâmina e
lamínula e observada em microscópico óptico (Nikon/YS2-T) (Figura 1c).
4.9.2 Ágar Hicrome Candida
®
(Himedia)
Todas as leveduras isoladas foram também repicadas em meio
cromogênico. Colônias novas (24-48horas) repicadas em SDA foram repicadas,
em estrias, em placas de Petri contendo o meio com a mistura cromogênica. Os
resultados eram observados pelo crescimento das colônias, com 24 a 48 horas,
em cores distintas (Figura 2). Segundo as instruções do produto as leveduras de
C. albicans ficam da cor verde clara, as colônias de C. tropicalis ficam da cor azul
clara. A C. krusei tem aspecto branco cremoso e a C. glabrata cresce com a
coloração icor rosa.
FIGURA 2 - CARACTERÍSTICAS DO CRESCIMENTO DAS COLÔNIAS EM MEIO
CROMOGÊNICO
FONTE: O autor
a – Crescimento de C. albicans em meio cromogênico (verde clara)
b – Crescimento de C. krusei em meio cromogênico (branca cremosa)
c – Crescimento de C. tropicalis em meio cromogênico (azul clara)
4.9.3 Sistema API 20 C AUX
®
(BioMérieux)
Para a realização deste teste foram utilizadas colônias novas (24 horas)
repicadas em SDA. Primeiramente era feita a transferência de uma pequena
quantidade da colônia para um tubo contendo cerca de um ml de solução
fisiológica esterilizada (API NaCl 0,85%) e então a diluição era ajustada a uma
ab c
37
turbidez equivalente ao tubo 2 da escala de McFarland. Em seguida 100 μL desta
suspensão eram adicionadas ao meio basal do sistema API 20C Aux (API C
Medium) e homogeneizado (Vortex QL-901/Biomixer). A seguir gotas desta
suspensão eram usadas para preencher os 20 poços do painel de identificação,
que eram formados por 19 carboidratos diferentes (D-glucose, glicerol, cálcio-2-
ceto-gluconato, L-arabinose, D-xilose, adonitol, xilitol, D-galactose, inositol, D-
sorbitol, Metil-α-D-glucopiranosido, N-acetil-glucosamina, D-celobiose, D-lactose,
D-maltose, D-sacarose, D-trealose, D-melezitose e D-rafinose) e um controle
negativo. O painel era então incubado em câmara úmida previamente preparada
por 72 horas, quando se fazia a leitura. Era considerado como resultado positivo a
presença de opacidade (turvação) nos poços, enquanto os resultados negativos
eram mostrados pela ausência de opacidade. Obteve-se assim um código de
quatro dígitos, cuja interpretação foi realizada com o auxilio do programa de
identificação apiweb
TM
. Foram considerados os resultados que apresentaram
identificações consideradas como excelente ou muito boa (%id entre 100 e 97%)
(SILVA e CANDIDO, 2005).
4.9.4 Microcultivo de Leveduras
As amostras que obtiveram valor de identificação menor que o valor
estabelecido no sistema API 20 C AUX
®
ou aquelas que geraram dúvidas, foram
submetidas à prova de microcultivo. Para a realização desta prova foram usadas
colônias de 24 horas repicadas em SDA. Foram preparadas duas lâminas para
cada amostra. Em cada uma das lâminas era distribuído o meio Ágar fubá com
Tween 80, previamente aquecido. Esperava-se o meio solidificar e com auxilio de
uma alça de platina contendo uma pequena quantidade da amostra a ser
analisada, fez-se duas estrias sobre cada lâmina. Por sobre a lâmina, depositou-
se uma lamínula e ambas foram incubadas dentro de uma placa de Petri de 150 X
20 mm de diâmetro, em estufa a 30°C por 48 horas (SIDRIM e MOREIRA, 1999).
Para a leitura, levou-se a lâmina ao microscópico óptico (Nikon/YS2-T), para
verificação das estruturas formadas (Figura 3).
38
FIGURA 3 – CARACTERÍSTICAS MICROMORFOLÓGICAS DE LEVEDURAS DO GÊNERO
Candida
FONTE: O autor
a – Micromorfologia de levedura C. krusei em aumento de 1000 X em M.O.
b – Micromorfologia de levedura C. albicans em aumento de 1000 X em M.O.
c – Micromorfologia de levedura C. parapsilosis em aumento de 1000 X em M.O.
4.9.5 Assimilação de Carboidratos (Auxonograma) e Nitrogênio
Para a realização das provas foram usadas colônias novas (24 horas)
repicadas em SDA. Primeiramente foi feita uma diluição da amostra em água
esterilizada. Em uma placa de Petri de 150 X 20 mm de diâmetro, foram vertidos
cerca de dois ml da diluição da amostra e cerca de 40 ml dos meios de cultura. Fez
– se movimentos circulares com as placas a fim de homogeneizar o inoculo. Foram
preparadas quatro placas para cada amostra, sendo que três eram para o teste de
assimilação de carboidratos e uma para o teste de assimilação do nitrogênio. Após
a solidificação dos meios foram adicionados quatro carboidratos, na forma de
discos de papel já impregnados com o açúcar ou o açúcar in natura, em cada canto
das três placas destinadas para o teste de assimilação de carboidratos. Os
açúcares utilizados foram: dextrose (Laborclin
®
), lactose (Laborclin
®
), sacarose
(Laborclin
®
), maltose (Laborclin
®
), galactose (Laborclin
®
), inositol (Laborclin
®
),
celobiose (Enterofar II
®
), melobiose (Enterofar II
®
), xilose (Enterofar II
®
), trealose
(Laborclin
®
), rafinose (Merck’s Praparete
®
) e dulcitol (Laborclin
®
). Na placa para o
teste de assimilação do nitrogênio colocou-se nos extremos opostos da placa uma
pequena quantidade de nitrato de potássio e peptona (controle positivo) (SIDRIM e
MOREIRA, 1999). Os resultados eram observados pela formação de um halo ao
redor dos carboidratos e da fonte de nitrogênio, indicando sua assimilação ou não
a
b
c
39
(Figura 4) e o padrão de comportamento era verificado de acordo com KONEMAN
e ROBERTS (1985) (Tabela 1).
FIGURA 4 – ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS E NITROGÊNIO PELAS LEVEDURAS
ISOLADAS
FONTE: O autor
a e b – Assimilação de carboidratos por levedura isolada (C.albicans)
c- Teste de assimilação de nitrogênio
TABELA 1 – ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS PELAS LEVEDURAS ISOLADAS
(AUXONOGRAMA
)
Assimilação
Dextrose
Maltose
Sacarose
Lactose
Galactose
Melobiose
Celobiose
Inositol
Xylose
Rafinose
Trealose
Dulcitol
KNO
3
C. albicans
+ + + - + - - - + - + - -
C. glabrata
+ - - - - - - - - - + - -
C. parapsilosis
+ + + - + - - - + - + - -
C. tropicalis
+ + + - + - +* - + - + - -
C. pseudotropicalis
+ - + + + - + - +* + - - -
C. krusei
+ - - - - - - - - - - - -
C. guilliermondii
+ + + - + + + - + + + + -
C. rugosa
+ - - - - + - - + - - - -
C. famata
+ + + +* + +* + - + + + +* -
* Variação da espécie
FONTE:
KONEMAN e ROBERTS (Modificado)
a
bc
40
4.10 ANÁLISE ESTATÍTICA DOS RESULTADOS ENCONTRADOS
Para a comparação dos dados foram utilizados os testes não-
paramétricos “Mann-Whitney”, “Comparação entre duas Proporções” (através do
software “Primer of Biostatistics”), “Qui-Quadrado” e “Exato de Fisher” (pelo Epi-
Info). O nível de significância (probabilidade de significância) adotado foi menor
que 5% (p<0,05). Recorreu-se à análise descritiva dos dados através de Tabelas
e gráficos.
4.11 EXTRAÇÃO DO DNA
A extração de DNA foi realizada de acordo com VICENTE (2000)
modificado por MOREIRA (2006). As amostras foram previamente repicadas para
Ágar Batata Dextrose e incubadas por 48h a 30ºC. Após este período, de três a
cinco alçadas das culturas foram transferidas a um tubo contendo uma mistura de
sílica em pó (sílica gel Merck) e celite 2:1, em 600 μL de CTAB. Em seguida foram
aplicados dois pulsos (de 30 seg) de ultra-som (potência 70), com intervalos de 30
seg entre cada pulso, sob banho de gelo, utilizando desruptor de célula
ultrassônico (marca Unique).
Foram, então, adicionados 400 μL de CTAB e as amostras foram
incubadas em banho-maria a 65ºC por 10 minutos. Após atingir temperatura
ambiente, foram adicionados 1000 μL de clorofórmio e os tubos centrifugados a
12000 rpm por sete minutos. O sobrenadante foi transferido a outro tubo, ao qual
foram adicionados mais 1000 μL de CIA e a centrifugação repetida. Cerca de
2000 μL de álcool 96% gelado foram adicionados ao sobrenadante e os tubos
incubados a - 20ºC por 24 horas para precipitação dos ácidos nucléicos. Após
este período foram centrifugados a 12000 rpm por sete minutos. O sobrenadante
foi desprezado e o precipitado lavado com álcool 70% gelado e repetida a
centrifugação a 12000 rpm por mais sete minutos. O álcool foi retirado e os tubos
vertidos em fluxo laminar até a secagem completa do precipitado (cerca de 15
minutos). Posteriormente, foram adicionados 50 μL de água ultrapura para
ressuspender o DNA. Os tubos foram deixados à temperatura ambiente por 24h e
41
armazenados a - 4ºC. A integridade foi verificada mediante eletroforese em gel de
agarose 0,8%, e visualizada com brometo de etídio em luz UV.
4.12 SEQÜENCIAMENTO
Três isolados foram ainda submetidos à reação de seqüenciamento para
a confirmação dos resultados obtidos por meio dos diferentes métodos de
identificação previamente utilizados. O processo de seqüenciamento envolve
diferentes etapas que serão descritas a seguir:
4.12.1 PCR
O DNA das amostras previamente extraído foi amplificado com os pares
de primers V9G (5’TTACGTCCCTGCCCTTTGTA3’) e LS266 (5’
GCATTCCCAAACAACTCGACTC 3’). Para a reação de PCR foi utilizado um
volume de 50µl contendo 12ng do DNA extraído, 1 U de Taq DNA polimerase
(Invitrogen, Brasil), 0,2 mM para um mix de dNTP, 3 mM de MgCl
2
, 0,8 µM de
cada primer, 10 mM de tampão da enzima. A reação de amplificação consistiu de
30 ciclos (30 segundos de desnaturação a 94ºC, 1 min de anelamento a 56ºC, 1
min de síntese a 72ºC), utilizando 2 min para desnaturação inicial e 3 min de
extensão final (Termociclador Mastercycler gradient)
Os produtos foram aplicados em gel de agarose 1,6% (utilizando 5 µl da
amostra e 3 µl do corante) para visualização. O marcador de peso molecular
utilizado foi o Ladder de 200pb.
Posteriormente foi realizada a purificação dos produtos de PCR. Foi
adicionado 50 µL de polietilenoglicol (PEG) aos 50 µl de reação de PCR. Em
seguida o material foi transferido para um tubo tipo eppendorf de 0,5 ml e
incubado a 37°C por 30 min. O material foi centrifugado por 20min a 11337 x g e o
sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 125 µl de etanol 80% gelado e o
material foi novamente centrifugado por 2 min a 11337 x g. O sobrenadante foi
descartado. Em seguida foram adicionados 125 µl de Etanol 96% (gelado) pela
parede do tubo e retirado em seguida. O sobrenadante foi descartado e o etanol
42
96% evaporado em bomba a vácuo (Univapo 100 ECH) por 10min a 70ºC. O
material foi ressuspendido em 15 µl de água ultrapura e mantido em temperatura
ambiente por pelo menos 2 horas.
4.12.2 Reação de Seqüenciamento
Para a reação de seqüenciamento, foram utilizados os primers ITS4
(5´TCCTCCGCTTATTGATATGC3´) e ITS5 (5´GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
3´). Para cada reação foi utilizado foi utilizado 0,5 µl do bigdie terminador (ABI PRISM
BigDye Terminators v 3.0 da Applied Biosystems), 1 a 3 µl do produto de PCR
purificado (aproximadamente 10 ng, item 4.12.1), 0,5 µl do primer, 0,5 µl do tampão e
água ultrapura a completar 10 µl. O programa de amplificação (Termociclador
Mastercycler personal) constituiu de 35 ciclos de 10 segundos a 96°C, 5 segundos a
50°C e 4 min a 60°C. Após 25 ciclos foi realizada a refrigeração a 8°C.
4.12.3 Precipitação do DNA a ser seqüenciado
Os 10 µl do DNA amplificado de acordo com o item 4.12.2 foram
transferidos para tubos tipo eppendorfs de volume de 0,5 mL e 40 µL de
isopropanolol 75% foi adicionado, homogeneizado e deixado à temperatura
ambiente por 20 min. Em seguida o material foi centrifugado por 25 min a 13000
rpm. O isopropanol foi removido e adicionado 200 μL etanol 70% não gelado.
Nova centrifugação por 5 min a 7558 g foi realizada. O etanol foi cuidadosamente
removido visando a preservação do precipitado. Posteriormente as amostras
foram secas em bomba a vácuo (Univapo 100 ECH) por 45 min. a 60°C, e
mantidas na ausência de luz.
4.12.4 Seqüenciamento e análise das seqüências
Após a secagem completa do DNA precipitado (item 4.12.3), o mesmo foi
ressuspendido em 10 a 20 µL de formamida Hi-Di (Applied Biosystems), solução
indicada para o seqüenciador utilizado. Depois da dissolução, as soluções de
DNA foram transferidas para a placa de seqüenciamento e mantidas em
termociclador (Mastercycler personal) por 2 minutos a 95°C para desnaturação. A
43
reação de seqüenciamento foi realizada no seqüenciador modelo 3130 da Applied
Biosystems. A análise da qualidade das seqüências obtidas, a construção das
seqüências consenso e o alinhamento das seqüências foram realizados usando o
programa Bioedit versão 7.0.2 (TIPPMANN, 2004). A comparação com as
seqüências existentes no GenBank foi feita utilizando-se o programa BLAST do
NCBI como alinhador. A identificação da espécie analisada foi baseada na
seqüência com o maior índice de similaridade.
4.13 VARIABILIDADE GENÉTICA
4.13.1 Amplificação do DNA por RAPD
Para a amplificação do DNA, foram utilizadas as condições descritas por
VICENTE (2000), modificado, utilizando uma mistura contendo, além da amostra de
DNA, os seguintes elementos: 1,5 unidades de Taq DNA polimerase, 0,4 mM para
cada dNTP, 4,0 mM de cloreto de magnésio (MgCl
2
), 0,4 mM de primer, 10 mM de
tampão da enzima 1X e 12 ng de DNA para 11 µL de reação. A reação de
amplificação consistiu de 40 ciclos com as seguintes condições: 1 min a 92ºC; 1,5
min a 37ºC e 2 min a 72ºC, utilizando 4 min a 92ºC para desnaturação inicial e 3 min
a 72ºC de extensão final. Os oligonucleotídios utilizados foram da linha Operon
Technologies
®
e suas respectivas seqüências podem ser visualizadas na Tabela 2.
TABELA 2 - PRIMERS UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE RAPD
Oligonucleotídio Seqüência 5’ – 3’
OPA 10 5’ GTGATCGCAG 3’
OPX 11 5’ GGAGCCTCAG 3’
OPX 12 5’ TCGCCAGCCA 3’
OPX 14 5’ ACAGGTGCTG 3’
OPX 17 5’ GACACGGACC 3’
OPX 19 5’ TGGCAAGGCA 3’
FONTE:
Operon Technologies
®
44
4.13.2 Eletroforese
Os produtos resultantes da amplificação por RAPD foram analisados por
eletroforese em gel de agarose 1,4%, submetidos à corrida eletroforética
realizada sob voltagem constante de 3V/cm. O padrão de peso molecular utilizado
foi o de 100 pb (DNA Ladder 100 pb, Invitrogen). O gel foi corado com brometo de
etídio 0,5 µg/mL (15 min) e as bandas observadas com auxílio de um
transluminador de luz ultravioleta.
4.13.3 Análise da Variabilidade Genética
Para a análise do polimorfismo gerado pelos marcadores RAPD, foi
utilizado o software NTSYS (Numerical Taxonomy System of Multivariate
Programs). As bandas resultantes da amplificação foram analisadas com base em
variáveis binárias, onde 0 indica ausência de banda e 1 presença. Utilizando o
software NTSYS, a partir da matriz binária obtida, foi construída uma matriz de
similaridade utilizando o coeficiente de Jaccard (J). Este coeficiente permite
calcular similaridades com base em variáveis binárias. As bandas foram
consideradas como variáveis enquanto as linhagens como unidades. O
coeficiente foi calculado segundo a fórmula J=M/P, onde M é o número de
concordâncias positivas, e P o número total de variáveis, menos as concordâncias
negativas. A partir da matriz de similaridade, as unidades foram agrupadas
através do método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical
Average), para a construção dos dendogramas. A confiabilidade dos grupamentos
foi verificada pela análise bootstrap com 10000 reamostragens. (MOREIRA, 2006)
Para o estudo foram utilizadas 31 amostras isoladas e as quatro linhagens
referência ATCC; totalizando 35 amostras.
45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5. 1 IDENTIFICAÇÃO E PREVALÊNCIA DAS LEVEDURAS ISOLADAS
Participaram do presente estudo 101 crianças com idades entre zero e 6
anos, classificados em dois grupos: grupo 1, formado por crianças portadoras da
SD (n = 51), e grupo 2, formado por crianças sem SD (n= 50). A análise dos
dados referentes aos grupos mostrou que os dois eram similares, sem diferenças
estatísticas entre as variantes idade (p=0,794) (Mann-Whitney) e sexo (p=0,136)
(Qui-Quadrado) dos participantes.
Existem poucas pesquisas na literatura sobre a ocorrência de leveduras
do gênero Candida na cavidade bucal de crianças com SD, sendo que os
mesmos variam quanto à metodologia e as características dos grupos estudados
(CARLSTEDT et al., 1996; SCULLY et al., 2002; RIBEIRO et al., 2005; VIEIRA et
al., 2005). Os resultados encontrados no presente trabalho mostraram que em
51% (26) das crianças com SD foi possível isolar leveduras do Gênero Candida
das amostras coletadas, enquanto que no grupo 2 foram isoladas leveduras em
apenas 5 crianças (10%), diferença esta estatisticamente significativa (p<0,0001)
pelo teste do Qui-Quadrado (Figura 5).
FIGURA 5 – OCORRÊNCIA DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida NOS GRUPOS AVALIADOS
49,0
90,0
51,0
10,0
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
PERCENTUAL
Ausência Presença
Grupo 1 Grupo 2
p < 0,0001
FONTE: O autor
46
Ao total foram isoladas e identificadas 32 amostras de leveduras, sendo
27 isolados de crianças com SD (uma criança deste grupo apresentou
colonização por duas espécies diferentes) e 5 de crianças sem SD.
As amostras salivares eram semeadas em SDA e as colônias que
apresentavam crescimento e desenvolvimento característico de leveduras do
gênero Candida (Figura 6a, 6b) eram coradas pela técnica de Gram (Figura 6d,
6e, 6f). Após esta primeira confirmação do isolamento, as colônias
presuntivamente identificadas como Candida spp. eram submetidas a testes
complementares de identificação. Inicialmente era realizada a prova da formação
do tubo germinativo (Figura 6c). As espécies que formavam o tubo germinativo
eram identificadas presuntivamente como C. albicans, enquanto as outras eram
consideradas Candida não albicans.
A avaliação do crescimento em Ágar contendo mistura cromogênica (Ágar
Hicrome Candida
®
) revelou presuntivamente as espécies C. albicans, C. krusei e
C. tropicalis (Figura 6g, 6h, 6i). Este teste apresentou algumas limitações, tais
como a identificação de apenas quatro espécies e a semelhança das cores
dificultava sua interpretação, indicando assim a necessidade do uso de métodos
mais precisos.
Todos os isolados foram submetidas ao Sistema API 20 C AUX
®
(BioMèrieux), teste bioquímico que avalia a assimilação de diferentes carboidratos
pelas leveduras. Os resultados das leituras realizadas, com a assimilação ou não
dos carboidratos pelas leveduras e o resultado do teste, com sua porcentagem de
identificação, estão na Tabela 3.
Um isolado não foi identificado (SD3
1
), outras obtiveram valores de
porcentagem de identificação menores que o estabelecido (entre 97 e 100%) e
algumas geraram dúvidas durante a leitura (Tabela 3). Então se fez necessário a
utilização de métodos adicionais de identificação. Os isolados SD3
1
, SD3
2
, SD24,
SD22, PC2, PC11, PC32 e PC38 foram submetidas ao microcultivo, visando as
suas identificações pela observação das estruturas morfológicas formadas
durante o crescimento do fungo (Figura 7a, 7b, 7c).
47
Dois isolados (PC2 e PC 38) foram ainda submetidas ao teste de
assimilação de carboidratos tradicional (auxonograma) e ao teste de assimilação
do nitrogênio, para a confirmação da espécie (Figura 7a, 7b, 7c).
FIGURA 6 – CARACTERÍSTICAS MACRO E MICROFORMOLÓGICAS DE LEVEDURAS DO
GENÊRO Candida
FONTE: O autor
a – Macromorfologia de colônias de leveduras C. albicans
b – Macromorfologia de colônias de leveduras C. krusei
c – Formação do tubo germinativo em aumento de 400 X em M.O.
d – Coloração de Gram em leveduras C. guilliermondii (1000 X em M. O.)
e – Coloração de Gram em leveduras C. krusei (1000 X em M. O.)
f – Coloração de Gram em leveduras C. albicans (1000 X em M. O.)
g, h, i – Aspectos das colônias de leveduras do gênero Candida em ágar cromogênico (g - C.
albicans, h - C. krusei e i - C. tropicalis)
a
b
c
d
ef
g
h
i
48
TABELA 3 – ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS PELAS LEVEDURAS ISOLADAS (API 20 C AUX
®
)
Nomenclatura
dos isolados*
D-glucose
Glicerol
Cálcio-2-
Cetogluconato
L-arabinose
D-xilose
Adonitol
Xilitol
D-galactose
Inositol
D-sorbitol
Metil-α-D-
glucopiranosid
N-acetil-
glucosamina
D-celobiose
D-lactose
D-maltose
D-sacarose
D-trealose
D-melezitose
D-rafinose
Tubo
germinativo
Identificação
Porcentagem
SD3(1) + + + - - - - + - + - + - - + + - + - - ----------- ** ----**
SD3(2) + + + + + + + + - + + + + - + + + + + +
C. guillermondi
99,7%
SD5 + + + - + + - + - + + + + + + + + + + -
C. famata
99,6%
SD6 + - + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
97,4%
SD11 + - + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
97,4%
SD15 + + + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
98,2%
SD17 + + + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C.albicans
98,2%
SD18 + + + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
98,2%
SD21 + + + - - + + + - + + + - - + + + + - +
C. albicans
98,7%
SD22 + + + + - + + + - + + + + - + + + + + -
C. guillermondi
99,1%
SD24 + - + - + + + + - + - + - - + + + - - +
C. albicans
93,9%
SD26 + + + - + + + + - + + + - - + + - - - +
C. albicans
99,4%
SD28 + + + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
98,2%
SD33 + - + - + + + + - + + + - - + + + - - -
C. albicans
97,2%
SD35 + + + - + + + + - + + - - - + + + - - +
C. albicans
98,1%
SD36 + + + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
98,2%
SD38 + + + + + + + + - + + + + - + + + + + -
C. guillermondi
99%
SD40 + + + - + - - + - - - + - - + + - - - +
C. albicans
97,2%
SD42 + + + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
98,2%
SD43 + - + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
97,4%
SD44 + + + - + + + + + + + + - - + + + - - +
C. albicans
98,2%
SD45 + - + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
97,4%
SD46 + + + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
98,2%
SD48 + + + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
98,2%
SD49 + - + - + - - + - - - + - - + + - - - +
C. albicans
99,6%
SD51 + - + - + + + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
97,4%
SD52 + - + - + + - + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
99,3%
PC2 + - + - + - - + - + - + - - + + + - - +
C. tropicalis
79,2%
PC11 + + + + + + - + - + - + - - + + - + - -
C. parapsilosis
98,9%
PC32 + + + - - + + + - + - + - - + + - - - -
C. dubiliniensis
99,9%
PC36 + - + - + - + + - + + + - - + + + - - +
C. albicans
99,2%
PC38 + - + - + + - + - + + + - - + + + - - +
C. tropicalis
95,7%
* SD – levedura isolada de paciente com SD, PC – levedura isolada de paciente sem SD
** levedura não identificada pelo método
49
FIGURA 7 – CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E DE CRESCIMENTO DE LEVEDURAS DO
GÊNERO Candida
FONTE: O autor
a, b, c – Micromorfologia de leveduras do gênero Candida (a - C. albicans, b - C. krusei e c – C.
parapsilosis) (400 X em M.O.)
d – Halo indicando a assimilação da maltose
e – Halo indicando a assimilação da sacarose
f – Halo indicando a assimilação da peptona
Três isolados foram submetidos à reação de seqüenciamento para
verificação da identidade obtida (SD3
1
, SD44
e PC32). O isolado SD3
1
não foi
identificado pelo sistema API 20 C AUX
®
(BioMèrieux), necessitando então de uma
confirmação precisa dos achados do microcultivo, que sugeriam a identificação do
isolado como C. krusei. O isolado PC32 foi identificado como C. dubliniensis (99%)
pela utilização do sistema API 20 C AUX
®
(BioMèrieux). Porém, a baixa freqüência
de isolamento desta espécie da cavidade bucal de indivíduos saudáveis (SULLIVAN
et al., 2004; MIRHENDI et al., 2005) além da sua semelhança morfológica e
fenotípica com a espécie C. albicans (SULLIVAN et al., 1995; KHAN et al., 2004;
MOSCA et al., 2005), sugeria outros métodos de confirmação para a identificação.
Sendo assim seqüências da região ITS dos isolados SD3
1
, SD44
e PC32 foram
utilizadas como suporte para esta identificação. As seqüências obtidas foram
comparadas a seqüências depositadas no GenBank pelo programa BLAST e os
resultados mostraram 100% de analogia entre a seqüência do isolado PC32 com
seqüência de C. dubliniensis depositada no GenBank (Apêndice 4), 99% de analogia
a
b
c
d
ef
50
entre a amostra SD44 e seqüência de C. albicans (Apêndice 5) e 99% de analogia
entre a amostra SD3
1
e seqüência de Issatchenkia orientalis, forma telomórfica de
C. Krusei (Apêndice 6).
A espécie C. dubliniensis foi identificada e descrita pela primeira vez por
SULLIVAN et al. em 1995, sendo inicialmente recuperada da cavidade bucal de
pacientes infectados pelo vírus HIV.
C. dubliniensis é considerada como patógeno emergente, associada
principalmente à colonização e à infecção da cavidade bucal de pacientes infectados
pelo vírus HIV (SULLIVAN et al., 1995; VARGAS e JOLY, 2002; KHAN et al., 2004;
MOSCA et al., 2005), porém já foi recuperada com menor freqüência de outros sítios
anatômicos, de indivíduos saudáveis e em casos de infecção sistêmica (SILVA et al.,
2003; MOSCA et al., 2005; CHAVASCO et al., 2006).
Existem semelhanças morfológicas e fenotípicas entre as espécies C.
dubliniensis e C. albicans, sendo que as duas formam tubo germinativo e produzem
clamidósporos. Sendo assim a identificação precisa destas duas espécies é
importante do ponto de vista epidemiológico e no tratamento de pacientes infectados
(SULLIVAN et al., 1999; MARTINEZ et al., 2002; KHAN et al., 2004; MOSCA et al.,
2005).
Baseado nas características das leveduras isoladas e pelos resultados
obtidos por meio dos diferentes métodos de identificação utilizados, foi possível
identificar todas as 32 amostras isoladas. A distribuição das espécies encontradas
em cada grupo (crianças com e sem SD) está representada na Tabela 4.
51
TABELA 4 – DISTRIBUIÇÃO DOS ISOLADOS DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida
Crianças com SD Crianças sem SD
Pacientes
Nomenclatura
dos Isolados
*
Identificação dos
isolados
Pacientes
Nomenclaturas
dos Isolados
**
Identificação dos isolados
1 SC 1 SC
2 2 PC 2
C.albicans
3 SD 3
1
SD 3
2
C. Krusei + C.
guilliermondii
3 SC
4 SC 4 SC
5 SD 5
C. famata
5 SC
6 SD 6
C.albicans
6 SC
7 7 SC
9 9 SC
10 10 SC
11 SD 11
C.albicans
11 PC 11
C. parapsilosis
12 SC 12 SC
13 SC 13 SC
14 SC 14 SC
15 SD 15
C.albicans
15 SC
16 SC 16 SC
17 SD 17
C.albicans
17 SC
18 SD 18
C.albicans
18 SC
19 SC 19 SC
20 SC 20 SC
21 SD 21
C.albicans
21 SC
22 SD 22
C.guilliermondii
22 SC
23 SC 23 SC
24 SD 24
C.albicans
24 SC
25 SC 25 SC
26 SD 26
C.albicans
26 SC
27 SC 27 SC
28 SD 28
C.albicans
28 SC
29 SC 29 SC
30 SC 30 SC
31 SC 31 SC
32 SC 32 PC 32
C. dubliniensis
33 SD 33
C.albicans
33 SC
34 SC 34 SC
35 SD 35
C.albicans
35 SC
36 SD 36
C.albicans
36 PC 36
C.albicans
37 SC 37 SC
38 SD 38
C.guilliermondii
38 PC 38
C.tropicalis
39 SC 39 SC
40 SD 40
C.albicans
40 SC
41 SC 41 SC
42 SD 42
C.albicans
42 SC
43 SD 43
C.albicans
43 SC
44 SD 44
C.albicans
44 SC
45 SD 45
C.albicans
45 SC
46 SD 46
C.albicans
46 SC
47 SC 47 SC
48 SD 48
C.albicans
48 SC
49 SD 49
C.albicans
49 SC
50 SC 50 SC
51 SD 51
C.albicans
51 SC
52 SD 52
C.albicans
* amostras de leveduras isoladas de pacientes com Síndrome de Down (SD); **amostras de
leveduras isoladas de pacientes sem Síndrome de Down (PC); SC: sem crescimento de
leveduras.
52
Entre as 27 amostras de leveduras isoladas no grupo de crianças com SD,
22 (81,5%) eram da espécie C. albicans. Comparando as diferentes freqüências
entre a C. albicans e as outras espécies isoladas do grupo 1 , foi verificada uma
diferença estatisticamente significativa (p=0,011). Além disso, foram isoladas neste
grupo leveduras de C. guilliermondii (11,11%), C. famata e C. krusei. No grupo 2,
verificou-se as leveduras: C. albicans (40%), C. parapsilosis, C. tropicalis e C.
dubliniensis. (Tabela 5).
TABELA 5 – OCORRÊNCIA DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida NOS GRUPOS ESTUDADOS
Crianças
com SD
Crianças
sem SD
TOTAL
Candida spp.
N° % N° % N° %
Ausência 25 49,0 45 90,0 70 69,3
Presença 26 51,0 05 10,0 31 30,7
• C. albicans
22 81,5 02 40,0 24 75
• C. dubliniensis
- - 01 20,0 01 3,12
• C. famata
01 3,7 - - 01 3,12
• C. guiliermondii
03 11,11 - - 03 9,37
• C. parapsilosis
- - 01 20,0 01 3,12
• C. tropicalis
- - 01 20,0 01 3,12
• C. krusei
01 3,7 - - 01 3,12
TOTAL 51 100,0 50 100,0 101 100,0
Total (independente do grupo) → p < 0,0001 (Proporções).
Crianças com SD 1 x Crianças sem SD (ausência x presença) → p < 0,0001 (Qui-
Quadrado).
Espécie (C.albicans x Outra espécie) → p = 0,011 (Fisher).
Os resultados aqui encontrados assemelham-se aos obtidos em outros
estudos, mostrando sempre uma diferença significativa na ocorrência de Candida spp.
entre crianças com e sem SD. CARLSTEDT et al. (1995), SCULLY (2002), RIBEIRO et
al (2002) e VIEIRA et al (2005) apresentaram resultados semelhantes com a freqüência
de isolamento de leveduras do gênero Candida variando entre 69% a 84,6% nas
crianças com SD e 6% a 35% nos grupos controles, sendo C. albicans a espécie mais
comumente isolada (cerca de 80%). CARLSTEDT et al. (1995) também verificaram que
a densidade de colônias isoladas (UFC) também era significativamente maior no grupo
com SD (p < 0.001). No presente estudo não foi quantificado o número de Unidades
Formadoras de Colônias (UFC), pois a mesma é feita multiplicando-se o número de
colônias isoladas pelo fator de diluição. O uso de swabs impossibilita padronizar a
quantidade de saliva a ser diluída, sendo assim não foi possível analisar este aspecto.
53
A freqüência de isolamento de leveduras no grupo de crianças sem SD foi
de 10% estando de acordo com os resultados encontrados por DARWAZEH e AL-
BASHIR (1995), AKDENIZ et al (2002) e KADIR (2004), com 5 a 48%. A espécie
mais freqüente no grupo de crianças sem SD também foi a C. albicans, com 40%.
Outros estudos realizados com crianças sem SD também apontam a C. albicans
como a espécie mais freqüentemente isolada, com porcentagens de isolamento
variando entre 44 e 67% (DARWAZEH e AL-BASHIR, 1995; ZÖLLNER e JORGE,
2003; SCHERMA et al., 2004; KADIR et al., 2005). A prevalência da espécie C.
albicans pode ser explicada pelo fato do tubo germinativo, característico desta
espécie, ter maior poder de adesão às células epiteliais e aos elementos da placa
bacteriana (ODDS, 1988; SIDRIM, 1999). Estas características da espécie sugerem
vantagem no momento de colonização do sitio anatômico.
Além da espécie C. albicans, outras espécies também foram isoladas nos dois
grupos avaliados (Tabela 5). Nas crianças com SD a segunda maior ocorrência foi de
leveduras da espécie C. guilliermondii, com três amostras isoladas. Foram ainda
encontradas C. krusei e C. famata, que somadas representaram 18,5% dos isolados.
CARLSTEDT et al. (1996) também verificou o isolamento de espécies diferentes de C.
albicans em crianças com SD, encontrando isolados de C. parapsilosis, C. guilliermondii
e C. tropicalis, sendo que as mesmas somavam 7,3% dos isolados.
Nas crianças sem SD foram encontradas no presente trabalho, além da C.
albicans, leveduras das espécies C. parapsilosis, C. tropicalis e C. dubliniensis, com
uma amostra isolada de cada uma. DARWAZEH e AL-BASHIR (1995), ZÖLLNER e
JORGE (2003), SCHERMA et al. (2004) e KADIR et al. (2005) encontraram em crianças
sem SD, isolados de C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, C. tropicalis, C. guilliermondii,
C. krusei, C. glabrata, C. famata, C. lusitaniae, C. cerevisae, sendo que a soma destas
amostras representavam entre 33 e 56%. Estes resultados mostram que apesar da C.
albicans ser a espécie mais prevalente na cavidade bucal, outras espécies deste
gênero também são colonizadoras deste sítio anatômico.
A maior freqüência de colonização da cavidade bucal por leveduras do
gênero Candida em pacientes com SD pode ser explicada por diferentes hipóteses.
A primeira seria de que as alterações do sistema estomatognático causados pela
cromossopatia facilitam a colonização por estes microrganismos. A má postura de
língua e maior ocorrência de língua fissurada e geográfica podem representar sítios
54
de colonização mais propícios para a levedura, visto que características anatômicas
normalmente encontradas dorso da língua (papilas filiformes, forame cego e fissura
mediana) já atuam como sítios que favorecem o desenvolvimento do microrganismo
(ARENDORF e WALKER, 1980). Os lábios geralmente entreabertos e sujeitos a
ação da saliva devido a protrusão da língua e respiração bucal predispõem a
ocorrência de lesões e fissuras labiais, o que por sua vez facilita a instalação de
processos infecciosos associada às leveduras do gênero Candida (REY e BIRMAN,
1990; SCHWARTZMAN, 1999; PILCHER, 2001; SCULLY et al., 2002).Os pacientes
com SD podem também apresentar uma diminuição do fluxo salivar devido ao hábito
da respiração bucal (YARAT et al., 1999; SIQUEIRA et al., 2005). Além disso, a
composição salivar pode estar alterada (SIQUEIRA et al., 2005; YARAT, 1999; JARA
et al., 1991). Sabe-se que a saliva é considerada o primeiro agente de defesa na
cavidade bucal por ter em sua composição diferentes fatores antimicrobianos, como
anticorpos (IgA) e enzimas (CHALLACOMBE, 1994; EDDGERTON, 1998; ROSS e
HERZBERG, 2001). No caso de colonização da cavidade bucal a saliva atua
impedindo a aderência da levedura ao epitélio, tanto por sua ação mecânica, como
pela produção de IgA, que se liga a superfície do microrganismo, impedindo sua
adesão (COOGAN, SWEET e CHALLACOMBE; 1994).
Apesar dos fatores locais citados acima poderem influenciar, a explicação mais
aceita para justificar a maior colonização por Candida da cavidade bucal de crianças
com SD reside no fato das mesmas serem imunocomprometidas (CARLSTEDT et al,
1995; RIBEIRO et al., 2002; VIEIRA et al, 2005). Diferentes estudos realizados mostram
anormalidades no sistema imune destes pacientes. De um modo geral, as crianças com
SD apresentam infecções recorrentes, principalmente do trato respiratório superior
(TRINCADO et al., 1988; CARLSEDT et al. 1996; RIBEIRO et al., 2003). Alguns
estudos avaliaram a capacidade de adesão, quimiotaxia e fagocitose dos neutrófilos em
pacientes com SD e os resultados mostraram que estas funções estão diminuídas nos
pacientes com SD (TRINCADO et al., 1988; IZUMI et al. 1989; SREEDEVI e
MUNSHI,1998; ZALDIVAR-CHIAPA et al., 2005). Funções reduzidas das células NK,
deficiências de anticorpos, baixa contagem de linfócitos T e B e deficiências na ativação
das células T também foram relatadas nestes pacientes (SCOTESSE et al., 1998;
RIBEIRO et al., 2003; HINGH et al., 2005).
55
Em indivíduos imunocompetentes a resposta imune celular e humoral são
suficientes para controlara a colonização e prevenir infecções pela Candida. Apesar de
não se saber exatamente os mecanismos específicos usados pelo sistema imune
contra a Candida (REPENTIGNY, LEWANDOWSKI e JOLICOEUR, 2004) alguns
estudos desvendaram algumas estratégias. Os antígenos (Candida) são apresentados
às células T pelas células apresentadoras de antígenos (macrófagos, células de
Langerhans, queratinócitos e células dendríticas). As células T CD4 + auxiliares (Th1 e
Th2) passam então a produzir citosinas (interleucinas, interferons e fatores de necrose
tumoral) que ajudam a eliminar o agente agressor através da estimulação de outras
células, da fagocitose e da quimiotaxia (CANTORNA e BALISH, 1991; NEWMAN e
HOLLY, 2001; FARAH et al., 2002). Sendo assim, um baixo número de células de
defesa ou falhas na ativação das mesmas pode facilitar a colonização por leveduras do
gênero Candida, como acontece em pacientes com SD (CARLSTEDT et al., 1995;
SCULLY, 2002; RIBEIRO et al., 2002; VIEIRA et al., 2005).
A ocorrência de leveduras isoladas também foi avaliada nas diferentes faixas
etárias dos participantes e para isso os dois grupos (1 e 2) foram divididos em
subgrupos. O primeiro (subgrupo A) era formado por crianças com idades entre dois
meses e 23 meses. O subgrupo B era formado por crianças com idades entre 24 e 47
meses e subgrupo C, por crianças com idades entre 48 e 72 meses. A distribuição entre
os subgrupos foi homogênea, sem diferença significativa (Tabela 6).
TABELA 6 – SUBGRUPOS FORMADOS DE ACORDO COM A FAIXA ETÁRIA
Crianças
com SD
Crianças
sem SD
TOTAL
FAIXA ETÁRIA (meses)
N° % N° % N° %
Até 23 (A) 25 49,0 25 50,0 50 49,5
24 a 47 (B) 15 29,4 16 32,0 31 30,7
48 a 72 (C) 11 21,6 09 18,0 20 19,8
TOTAL 51 100,0 50 100,0 101 100,0
P = 0,895 (Qui-Quadrado).
A análise estatística mostrou diferença significativa na prevalência de
isolamento de leveduras do gênero Candida entre os grupos 1 e 2 nas faixas etárias
de 24 a 47 meses (p=0,002) e de 48 a 72 meses (p= 0,025). Na faixa etária de até
23 meses, embora no grupo 1 a prevalência de leveduras isoladas tenha sido de
56
28% e no grupo 2 de apenas 8%, a diferença não apresentou significância
estatística (Figura 8).
FIGURA 8 – FREQÜÊNCIA DE LEVEDURAS ISOLADAS NOS SUBGRUPOS
FONTE: O Autor
Também foi comparada a prevalência de isolamento de leveduras do gênero
Candida entre os subgrupos (A, B e C) de cada grupo (1 e 2) separadamente. Foi
constatado que no Grupo 2 o comportamento entre as faixas etárias foi semelhante,
sem diferenças significativas. No grupo 1 houve diferença estatisticamente
significantes entre os subgrupos A e B (28% e 80%) (p=0,011). Quando comparados
os subgrupos A e C (28 e 63,6%) houve uma diferença significante (p=0,050), com a
probabilidade considerada limítrofe. Entre os subgrupos B e C (80 e 63,6%) não
houve diferença estatisticamente significante (p=0,457) (Tabela 7).
28,0
8,0
80
12,5
63,6
11,1
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
PERCENTUAL
A
té 23 24 a 47 48 a 72
Grupo 1 Grupo 2
p = 0,069 p = 0,002 p = 0,025
57
TABELA 7 – OCORRÊNCIA DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida NOS SUBGRUPOS
AVALIADOS
GRUPO 1 GRUPO 2 TOTAL
FAIXA ETÁRIA / Candida spp.
N° % N° % N° %
VALOR DE p
Até 23 meses (subgrupo A) 25 49,0 25 50,0 50 49,5 0,069
(1)
• Ausência
18 72,0 23 92,0 41 82,0
• Presença
07 28,0 02 8,0 09 18,0
24 a 47 meses (subgrupo 2) 15 29,4 16 32,0 31 30,7 0,002
(2)
• Ausência
03 20 14 87,5 17 54,8
• Presença
12 80 02 12,5 14 45,2
48 a 72 meses (subgrupo 3) 11 21,6 09 18,0 20 19,8 0,025
(1)
• Ausência
04 36,4 08 88,9 12 60,0
• Presença
07 63,6 01 11,1 08 40,0
TOTAL 51 100,0 50 100,0 101 100,0
(1) Fisher; (2) Qui-Quadrado.
Grupo 1 → Até 23 x 24 a 47 (p=0,011); Até 23 x 48 e mais (p=0,050); 24 a 47 x 48 e mais (p=0,457);
Grupo 2 → Até 23 x 24 a 47 (p=0,512); Até 23 x 48 e mais (p=0,616); 24 a 47 x 48 e mais (p=0,713) (Fisher e Qui-Quadrado).
No Grupo 1, onde foi observado diferença significativa em relação à faixa
etária, a espécie predominante no subgrupo B foi a C. albicans (Tabela 8). Em razão
das sub-amostras, não foi possível realizar a análise estatística destes dados
(subgrupos X espécies isoladas).
TABELA 8 – FREQÜÊNCIA DE ESPÉCIES DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida NOS
SUBGRUPOS AVALIADOS
GRUPO 1 GRUPO 2 TOTAL
FAIXA ETÁRIA / ESPÉCIE DE Candida
N° % N° % N° %
Até 23 meses 07 26,9 02 40,0 09 30,0
• C. albicans
04 57,1 01 50,0 05 55,6
• C. famata
01 14,3 - - 01 11,1
• C. guilliermondii
01 14,3 - - 01 11,1
• C. parapsilosis
- - 01 50,0 01 11,1
• C. krusei + C.guilliermondii
01 14,3 01 11,1
24 a 47 meses 12 46,15 02 40,0 14 43,3
• C. albicans
12 100,0 - - 12 85,7
• C. dublinense
- - 01 50,0 01 7,14
• C. tropicalis
- - 01 50,0 01 7,14
48 a 72 meses 07 26,9 01 20,0 08 26,7
• C. albicans
06 85,7 01 20,0 07 87,5
• C. guilliermondii
01 14,3 - - 01 12,5
• C. tropicalis
- - - - - -
TOTAL 26 100,0 05 100,0 31 100,0
58
O subgrupo A apresentou a menor freqüência no isolamento de leveduras do
gênero Candida (28 e 8%), sem diferença estatisticamente significativa entre os grupos
1 e 2. As crianças que compunham este grupo tinham idades até 23 meses, ou seja,
período de vida em que é comum fazer uso do aleitamento materno. Na literatura os
estudos que comparavam crianças sem SD que faziam uso exclusivo de aleitamento
materno e crianças que faziam aleitamento do tipo misto ou usavam mamadeiras
apresentaram resultados que mostraram uma maior ocorrência no segundo grupo, com
diferenças estatisticamente significativas, sendo a C. albicans a espécie mais freqüente
(KADIR et al., 2005; ZÖLLNER e JORGE, 2003). FOTOS e HELLSTEIN (1992),
ZÖLLNER e JORGE (2003), SCHERMA et al. (2004) e KADIR et al. (2005) acreditam
que o leite materno é um fator de proteção contras as leveduras do gênero Candida,
pois o mesmo contem fatores de resistência, como a lactoferrina, lisozima, leucócitos e
imunoglobulinas, em especial IgA, que inibem a adesão e conseqüente
desenvolvimento destes microrganismos. Porém outros estudos, como o de
DARWAZEH e AL-BASHIR (1995) mostraram ocorrência semelhante entre os dois
grupos (40 a 46,8%), não representando diferença estatisticamente significante.
O menor número de dentes na cavidade bucal das crianças desta faixa
etária (0 a 23 meses) pode dificultar a colonização por leveduras do gênero Candida,
já que possíveis nichos de adesão destes microrganismos estão diminuídos.
Crianças com SD apresentam um atraso na erupção dos dentes quando
comparadas às crianças sem a síndrome. GARCIA e AVILA (2003) mostraram que
crianças com SD não apresentam elementos dentários antes de um ano de idade,
enquanto que a erupção dos dentes decíduos em crianças sem SD tem início perto
dos seis meses de idade. Mesmo com o atraso na erupção dentária e a possível
diminuição dos nichos de adesão das leveduras, as crianças com SD desta faixa
etária apresentaram maior colonização por leveduras do gênero Candida quando
comparadas às crianças sem SD sugerindo que outros fatores influenciam a
colonização bucal destas crianças por Candida spp.
O subgrupo B, formado por crianças com idades entre 24 e 47 meses
apresentou a maior freqüência de isolamento de leveduras do gênero Candida, com 80 e
12,5%, respectivamente, mostrando diferenças estatisticamente significantes entre os
grupos 1 e 2 e quando comparados os subgrupos A e B do grupo 1. Fatores de transição
podem ser a causa desta maior ocorrência. Em crianças com Síndrome de Down a
59
dentição decídua se completa entre os três e quatro anos de idade, com a erupção dos
segundos molares decíduos (GARCIA e AVILA, 2003), o que representa novos nichos de
colonização pelos microrganismos bucais, incluindo as leveduras (ODDS, 1988).
Esta também é uma fase de transição na dieta das crianças. FRAIZ (1999)
afirma que nesta fase de acomodação à dieta familiar, as crianças começam também a
experimentar outros produtos, normalmente produtos doces, que culturalmente
apresentam significado de afeto. É nesta faixa etária também que as crianças passam a
escolher os alimentos e a ingestão de guloseimas e doces aumentam (FRAIZ, 1999).
JIN et al. (2004) verificaram que a presença da sacarose facilita a adesão de C.
albicans ao biofilme existente na cavidade bucal. KADIR et al. (2005) acreditam que o
que o açúcar presente na dieta facilita a colonização por Candida, pois são
metabolizados por bactérias presentes na cavidade bucal, formando ácidos que
diminuem o pH e assim favorecem o crescimento das espécies de Candida.
Fatores mecânicos, como o uso de chupetas e presença de lesões de cáries
cavitadas, facilitam a colonização por leveduras do gênero Candida, pois alteram o
ambiente bucal criando novos sítios de retenção de biofilme. DARWAZEH e AL-
BASHIR (1995) mostraram em seu estudo uma maior freqüência de isolamento de
leveduras do gênero Candida em crianças que faziam uso de chupetas.
AKDENIZ et al. (2002) não acharam diferenças significativas no isolamento
de C. albicans em relação aos hábitos de dieta, uso de chupeta e mamadeiras e pH
salivar. Já a presença de lesões de cárie foi fator importante no isolamento das
leveduras. 69,2% das crianças que apresentavam mais de quatro dentes cariados
tinham suas cavidades bucais colonizadas por C. albicans. Apenas 5% dos
pacientes sem cárie eram colonizados pelo microrganismo.
O subgrupo C, formado por crianças com idades entre 48 e 72 meses
apresentaram a segunda maior freqüência (63,3 e 11,1%). A diferença foi
estatisticamente significante entre os grupos 1 e 2, provavelmente pelas causas já
discutidas. Comparando-se os subgrupos A e C do grupo 1 houve diferenças
significativas, mas quando comparados os subgrupos B e C as diferenças não foram
estatisticamente significativas. Tal fato pode ser explicado pelo fato de que entre
estas faixas etárias não há mudanças significativas na cavidade bucal de crianças
com SD, já que o inicio da dentição mista apresenta atrasos nestes pacientes
60
(GARCIA e AVILA, 2003). Além disso, os hábitos de dieta e higiene bucal instalados
em idades precoces tendem a serem mantidos (FRAIZ, 1999).
Os resultados mostraram que a ocorrência de isolamento de leveduras foi
diferente nas diferentes faixas etárias entre as crianças com SD, permitindo concluir
que a variante idade tem influência na colonização de leveduras do gênero Candida
na cavidade bucal destas crianças. Já as crianças sem SD apresentaram
comportamento semelhante nas diferentes faixas etárias (0 a 6 anos). KADIR et al.
(2005) avaliaram a ocorrência de Candida spp. na cavidade bucal de 300 crianças
sem SD com idades entre 0 e 12 anos e formou 3 subgrupos para melhor avaliação
dos resultados. O subgrupo 1 era formado por crianças entre 0 e 6 anos, o subgrupo
B era formado por crianças entre 6 e 8 anos e o C , por crianças entre 9 e 12 anos. A
maior freqüência de isolamento de leveduras foi encontrada no subgrupo B (50,8%),
seguida pelo subgrupo C (27,9%). O subgrupo A apresentou a menor freqüência,
com 17%. Os resultados encontrados pelo presente estudo e por KADIR et al. (2005)
permitem concluir que em crianças sem SD a faixa etária de 0 a 6 anos apresenta
baixa colonização da cavidade bucal por leveduras do gênero Candida. Alterações
na cavidade bucal após os 6 anos, com a transição das fases de dentição mista e
dentição permanente são as prováveis causas do aumento da colonização.
A freqüência de isolamento das leveduras também foi investigada em
relação a variante sexo dos participantes do estudo, mas nenhuma diferença
significativa foi encontrada, ou seja, a prevalência de leveduras do gênero Candida
independe desta variante (Tabela 9).
TABELA 9 - OCORRÊNCIA DE LEVEDURA DO GÊNERO Candida X SEXO DOS PARTICIPANTES
DO ESTUDO
MASCULINO FEMININO TOTAL
Candida spp.
N° % N° % N° %
Ausência 38 66,7 33 75,0 71 70,3
Presença 19 33,3 11 25,0 30 29,7
• C. albicans
14 73,7 08 72,7 22 73,4
• C. dubliniensis
- - 01 9,1 01 3,3
• C. famata
01 5,3 - - 01 3,3
• C. guilliermondii
03 15,7 - - 03 10,0
• C. parapsilosis
01 5,3 - - 01 3,3
• C. tropicalis
- - 02 18,2 02 6,7
TOTAL 57 100,0 44 100,0 101 100,0
p = 0,491 (Qui-Quadrado).
61
5.2 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA
Para análise da variabilidade genética dos isolados de leveduras do gênero
Candida por meio de marcadores RAPD, foram utilizadas um total de 31 amostras
de leveduras isoladas da cavidade bucal de crianças com e sem SD. Uma das
amostras de leveduras isoladas (SD 17) estava contaminada com bactérias e,
portanto foi excluída da análise. Como referência foram utilizadas quatro linhagens:
C. albicans ATCC 10231, C. tropicalis ATCC 750, C. krusei ATCC 6258 e C.
parapsilosis ATCC 22019, num total de 35 amostras (Tabela 10).
TABELA 10 – LINHAGENS UTILIZADAS NO ESTUDO DE VARIABILIDADE GENETICA DE
LEVEDURAS DO GÊNERO Candida, POR MARCADORES RAPD
Número Isolado Nomenclatura no
Estudo*
Origem** Idade
1
C. krusei
CK - 1 SD 3 14 meses
2
C. guilliermondii
CG - 2 SD 3 14 meses
3
C. famata
CF - 1 SD 5 21 meses
4
C. albicans
CA - 4 SD 6 33 meses
5
C. albicans
CA - 5 SD 11 6 meses
6
C. albicans
CA - 6 SD 15 28 meses
7
C. albicans
CA - 7 SD 18 52 meses
8
C. albicans
CA - 8 SD 21 65 meses
9
C. guilliermondii
CG - 9 SD 22 48 meses
10
C. albicans
CA - 10 SD 24 24 meses
11
C. albicans
CA - 11 SD 26 36 meses
12
C. albicans
CA - 12 SD 28 20 meses
13
C. albicans
CA - 13 SD 33 61 meses
14
C. albicans
CA - 14 SD 35 47 meses
15
C. albicans
CA - 15 SD 36 30 meses
16
C. guilliermondii
CG - 16 SD 38 13 meses
17
C. albicans
CA - 17 SD 40 28 meses
18
C. albicans
CA - 18 SD 42 23 meses
19
C. albicans
CA - 19 SD 43 2 meses
20
C. albicans
CA - 20 SD 44 55 meses
21
C. albicans
CA - 21 SD 45 47 meses
22
C. albicans
CA - 22 SD 46 29 meses
23
C. albicans
CA - 23 SD 48 33 meses
24
C. albicans
CA - 24 SD 49 57 meses
25
C. albicans
CA - 25 SD 51 29 meses
26
C. albicans
CA - 26 SD 52 33 meses
27
C.albicans
CA - 27 PC 2 64 meses
28
C. parapsilosis
CP - 28 PC 11 4 meses
29
C. dubliniensis
CD - 29 PC 32 36 meses
30
C. albicans
CA - 30 PC 36 15 meses
31
C. tropicalis
CT - 31 PC 38 32 meses
*Ck – C. krusei, CG – C. guilliermondii, CF – C. famata, CA – C. albicans, CP – C. parapsilosis,
CD – C. dubliniensis, CT – C. tropicalis
** SD – Criança com SD, PC – Criança sem SD (paciente controle)
62
Para a realização deste estudo, foram utilizados seis primers (Tabela 2),
resultando em um total de 115 marcadores, com pesos variáveis entre 0,3 e 2 kb. Os perfis
de amplificação com os primers OPX 14, 17 e 19 podem ser verificados na Figura 9.
FIGURA 9 – PERFIL DE AMPLIFICAÇÃO DE RAPD DAS AMOSTRAS DE LEVEDURAS ISOLADAS
UTILIZANDO OS PRIMERS OPX 14, OPX 17 e OPX 19
FONTE: O Autor
a – Perfil de amplificação das amostras com o primer OPX 14
b – Perfil de amplificação das amostras com o primer OPX 17
c – Perfil de amplificação das amostras com o primer OPX 19
a b
c
a
63
No dendrograma apresentado na Figura 10 pode se observar a análise dos
dados realizada através do programa NTSYSpc 2.1, utilizando o coeficiente de
Jaccard e o método de agrupamento UPGMA.
FIGURA 10 – DENDOGRAMA GERADO A PARTIR DE SIMILARIDADE GENETICA OBTIDA POR
MARCADORES RAPD DAS LINHAGENS DESCRITAS NA TABELA 12, UTILIZANDO
COEFICIENTE DE JACCARD E MÉTODO DE AGRUPAMENTO UPGMA
Legenda: I – agrupamento entre as linhagens de C. krusei, C. guilliermondii e C. famata, II –
agrupamento entre as linhagens de C. albicans, III – agrupamento entre as linhagens
de C. dubliniensis, C. tropicalis e C. parapsilosis
De acordo com o dendrograma, verificaram-se três agrupamentos,
separando as diferentes espécies do gênero Candida, já anteriormente identificadas
II
III
I
p = 1.0000
r = 0,92555
64
pelas características morfológicas (macro e micromorfologia) (Figuras 6 e 7) e
bioquímicas (Tabelas 1 e 3).
O agrupamento (I) reuniu as espécies C. krusei, C. guilliermondii e a amostra
de C. famata apresentando três subgrupos. No primeiro subgrupo ficaram a amostra
do isolado de C. krusei (CK-1) e a linhagem ATCC da mesma espécie, com
similaridade de 65% e valor de bootstrap de 65,52. Os três isolados identificados
como C. guilliermondii formavam o segundo subgrupo, onde os isolados CG-9 e CG-
16 apresentavam similaridade de 50% entre si, enquanto a linhagem CG-2
apresentava similaridade de 35% em relação a estas. No terceiro subgrupo estava a
amostra de levedura da espécie C. famata (CF-3) com baixa similaridade em relação
aos outros isolados deste grupo.
No agrupamento II observou-se a reunião da maioria dos isolados
previamente identificados como C. albicans, apresentando diferentes índices de
similaridade, variando entre 25 e 75%. A maior parte destas amostras foram isoladas
da saliva de pacientes com SD. Nos pacientes controles foram isoladas duas
leveduras identificadas como C. albicans (CA-27 e CA-30), sendo que estas
apresentaram baixos índices de similaridade em relação ao restante das amostras.
No gráfico bidimensional (Figura 11) pode-se visualizar melhor a separação
observada. Devido ao baixo número de recuperação de C. albicans em crianças sem
SD, não se pode afirmar que estas leveduras são geneticamente mais distantes em
relação aos isolados de pacientes com SD, porém na análise apresentada nas
Figuras 10 e 11 pode-se visualizar agrupamentos definidos entre os isolados dos
grupos 1e 2, sugerindo grupos geneticamente separados.
Ainda na Figura 11 foi possível observar a separação das amostras CA-4,
CA-10, CA-11, CA-14 e CA-15 de C. albicans (sinalizadas em violeta), as quais
apresentaram-se agrupadas quanto à sua origem, verificando-se que estas foram
isoladas de crianças com SD na faixa etária entre 24 a 47 meses, onde foi
observada a maior prevalência de isolamento.
65
FIGURA 11 – ANÁLISE DA SIMILARIDADE ENTRE AS LEVEDURAS ISOLADAS – GRÁFICO
BIDIMENSIONAL
Legenda: Agrupamento sinalizado em verde – isolados de C.albicans de crianças sem SD,
agrupamento sinalizado em violeta – isolados de C.albicans de crianças com SD na faixa
etária entre 24 e 47 meses
As linhagens de C. parapsilosis (CP-ATCC 33 e CP-28) foram agrupadas no
grupo III e mostraram similaridade de cerca de 50% entre si, com valor de bootstrap
de 96,90, mostrando a confiabilidade deste agrupamento.
Ainda no grupo III foram encontradas as amostras de C. tropicalis (CT-ATCC
34 e CT-31) com similaridade pequena entre as amostras. Agrupada a estas estava
a amostra CD-29 de C. dubliniensis, com baixo índice de similaridade (25%).
Na Figura 12 pode-se observar o gráfico tridimensional obtido com os
resultados encontrados, sua análise permite visualizar os agrupamentos formados,
identificando melhor os diferentes grupos de isolados.
66
FIGURA 12 – ANÁLISE DA SIMILARIDADE ENTRE AS LEVEDURAS ISOLADAS – GRÁFICO
TRIDIMENSIONAL
Legenda: Agrupamento sinalizado em azul – isolados de C. albicans de crianças com SD, amostras
sinalizadas em verde – isolados de C. albicans de crianças sem SD, agrupamento em
vermelho – isolados de C. guilliermondii e em laranja – isolados de C. tropicalis.
De acordo com a Figura 12, a maioria dos isolados de C.albicans foram
reunidos em um grupo (sinalizado em azul), enquanto as amostras CA-27 e CA-30
aparecem distantes deste agrupamento, indicando assim a maior similaridade entre
os isolados provenientes de crianças com SD.
As linhagens de C. parapsilosis estão agrupadas entre si, porém com baixo
valor de similaridade (15%) e distantes das amostras de C. albicans, o que foi
identificado no dendograma (Figura 10).
As amostras de C. guilliermondii também ficaram agrupadas (CG-2, CG-9 e
CG16) entre si, distantes das amostras de C. tropicalis, C. albicans e C. parapsilosis,
confirmando os achados antes visualizados no dendograma. Da mesma forma para
as amostras de C. krusei, que se apresentaram agrupadas no dendograma com
baixo valor de similaridade, não foi observado um agrupamento definido no gráfico
tridimensional.
De um modo geral, pôde-se avaliar pelos dados obtidos que entre as
67
espécies de Candida há uma grande diversidade genética, estando de acordo
com os resultados apresentados na literatura (BOSTOCK et al., 1993; DIAZ-
GUERRA et al., 1997 e LÓPEZ-RIBOT et al., 2000).
O alto grau de polimorfismo genético da espécie C. albicans isoladas
da cavidade bucal também foi demonstrada em outros trabalhos utilizando
marcadores RAPD. WALTIMO et al. (2001) avaliaram um total de 37 amostras
de C. albicans isoladas de canais radiculares por meio de testes bioquímicos
e verificaram que as amostras apresentavam 14 fenótipos distintos, enquanto
que a análise por meio de marcadores RAPD revelou 31 padrões de
amplificação diferentes, mostrando o polimorfismo entre isolados da cavidade
bucal desta espécie.
GIAMMANCO et al. (2005) ao avaliarem por meio de testes bioquímicos 28
amostras de C. albicans isoladas da cavidade bucal de 18 pacientes com HIV
(pacientes imunossuprimidos) verificaram que todas as amostras apresentavam o
mesmo padrão de assimilação de açúcar, porém a análise por meio de marcadores
RAPD mostrou que quase todos os pacientes apresentavam leveduras de perfis
genéticos diferentes, mostrando mais uma vez o polimorfismo genético da espécie,
associado a um padrão de colonização do hospedeiro.
A imunossupressão inata observada nos pacientes SD pode ser um dos
fatores que favorecem a diversidade de colonização e conseqüentemente a
variabilidade genética dos isolados. Tais padrões de colonização podem ser
justificados por inúmeros fatores, tais como: menor capacidade de quimiotaxia e
fagocitose de neutrófilos, deficiência de anticorpos e baixa contagem de linfócitos
(TRINCADO et al., 1988; SCOTESSE et al., 1998; RIBEIRO et al., 2003; ZALDIVAR-
CHIAPA et al., 2005; de HINGH et al., 2005).
Alterações anatômicas do complexo buco-crânio-facial, como o menor
crescimento da maxila, prognatismo mandibular, lábios entreabertos, mau
posicionamento da língua, alta prevalência de língua fissurada, geográfica e lesões
labiais e atraso na erupção dentaria, com alteração na seqüência de erupção (REY e
BIRMAN, 1990; SCHWARTZMAN, 1999; PILCHER, 2001; SCULLY et al. 2002)
também podem sugerir a causa desta maior colonização e conseqüente
variabilidade genética entre as leveduras isoladas da cavidade bucal, porém mais
68
estudos devem ser realizados para o melhor entendimento entre a prevalência e o
alto polimorfismo genético das leveduras C. albicans em pacientes com SD.
Sendo assim, de acordo com estes resultados e em conjunto com os dados
relatados na literatura pode-se concluir que a colonização da cavidade bucal por
leveduras do gênero Candida é alta em pacientes com SD, sendo a espécie C.
albicans a mais prevalente. Além disso, a variabilidade genética entre as espécies
isoladas destes indivíduos também é grande, com a espécie C. albicans
apresentando o maior grau de polimorfismo genético. A maior prevalência e a maior
variabilidade genética das leveduras neste grupo de indivíduos podem ser
explicadas pelo fato dos portadores da SD serem imunossuprimidos e apresentarem
diferentes alterações na cavidade bucal, justificando a susceptibilidade de
colonização por estas leveduras. No entanto, mais estudos devem ser realizados
com um maior número de amostragem para a elucidação desta relação.
69
6 CONCLUSÕES
De acordo com a metodologia empregada e baseada nos resultados obtidos,
conclui-se que:
1. Crianças com SD apresentam uma maior colonização da cavidade bucal por
leveduras do gênero Candida quando comparadas às crianças sem SD, sendo
que a prevalência é maior nas crianças na faixa etária de 24 a 72 meses,
independente do sexo, e a espécie mais isolada é a C. albicans.
2. Além da C. albicans, foram isoladas e identificadas leveduras de C.
guilliermondii, C. krusei e C. famata entre crianças com SD e C. parapsilosis, C.
tropicalis e C. dubliniensis entre crianças sem SD, mostrando que outras
espécies deste gênero também são colonizadoras da cavidade bucal.
3. A análise feita por marcadores RAPD mostrou uma grande variabilidade
genética entre os isolados da mesma espécie e espécies diferentes, sendo a C.
albicans a levedura mais isolada e que apresenta maior variabilidade.
70
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78
APÊNDICES
79
APÊNDICE 1
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
80
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Estamos realizando uma pesquisa em pacientes cadastrados no Ambulatório de
Síndrome de Down, do Hospital de Clínicas, da Universidade Federal do Paraná. O objetivo
do trabalho é verificar a ocorrência de leveduras do gênero Candida na microbiota bucal das
crianças na faixa etária de 0 a 6 anos.
Não existe nenhum risco ao paciente que irá participar da pesquisa. O trabalho
consiste na coleta de uma pequena quantidade de saliva do paciente, em entrevista com os
responsáveis e por um exame clínico da cavidade oral do paciente. A coleta de saliva será
realizada com auxilio de swabs esterilizados.
O profissional responsável pela pesquisa, a dentista Fernanda Bello Costa de Souza,
poderá ser encontrada nos telefones (41) 3323-2389 ou (41) 91212041. Caso seja mais
conveniente o professor Fabian C. Fraiz, como pesquisador, está autorizado a prestar
maiores esclarecimentos e pode ser encontrado no Curso de Odontologia da Universidade
Federal do Paraná todas as 2as. e 3as. feiras das 13:30 ás 17:30.
Estão garantidas todas as informações desejadas ao longo do estudo.
A sua participação é voluntária, sendo possível negar a participação ou retirar o
consentimento a qualquer momento. O atendimento no ambulatório de Síndrome de Down
do HC não está vinculado à sua participação neste estudo.
Os pacientes, assim como seus responsáveis, que participarem da pesquisa não
terão suas identidades reveladas. Os resultados divulgados em relatórios, eventos e/ou
publicações científicas serão feitos sob forma codificada, assegurando a confidencialidade
dos participantes.
Nenhuma despesa necessária para a realização da pesquisa será de sua
responsabilidade.
Nenhuma gratificação sob a forma de dinheiro será recebida pelos participantes
deste trabalho.
Eu, __________________________________________ li o texto acima e
compreendi a natureza e objetivo da pesquisa da qual fui convidado (a) a participar. A
explicação que me foi feita compreende as características, benefícios e riscos do estudo.
Entendi que posso deixar de participar do trabalho a qualquer momento sem ter que
justificar minha decisão. Concordo voluntariamente a participar do estudo.
__________________________________________ Data: __/__/__
Assinatura do Responsável
__________________________________________ Data: __/__/__
Fernanda Bello Costa de Souza
81
APÊNDICE 2
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
82
83
APÊNDICE 3
FICHA DE ANAMNESE E EXAME CLÍNICO
84
Questionário de Anamnese
1. Identificação
Nome da criança: _________________________________________________________
No. do prontuário: _________________________________________________________
Data de nascimento: __________________ data do exame: ________________________
Nome da mãe ou responsável: _______________________________________________
Telefone para contato: ______________________________________________________
Endereço: _______________________________________________________________
2. Saúde geral
Como esta a saúde de seu filho no dia de hoje? __________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Seu filho está fazendo uso de algum medicamento no dia de hoje?__________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Seu filho já teve “sapinho”? ( ) sim ( ) não Quantas vezes? _____ Idade: ___________
3. Observações:
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
85
APÊNDICE 4
SEQÜÊNCIA CONSENSO - ISOLADO PC32
86
Candida dubliniensis 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal
Transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2,
complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Length=4621
Score = 1134 bits (614), Expect = 0.0, Identities = 614/614 (100%), Gaps = 0/614
(0%) Strand=Plus/Plus
GATCATTACTGATTTGCTTAATTGCACCACATGTGTTTTGTTCTGGACAAACTTGCTTTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GATCATTACTGATTTGCTTAATTGCACCACATGTGTTTTGTTCTGGACAAACTTGCTTTG
GCGGTGGGCCCCTGCCTGCCGCCAGAGGACATAAACTTACAACCAAATTTTTTATAAACT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCGGTGGGCCCCTGCCTGCCGCCAGAGGACATAAACTTACAACCAAATTTTTTATAAACT
TGTCACGAGATTATTTTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGTCACGAGATTATTTTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT
CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTC
GTTTCTCCCTCAAACCCCTAGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTTGCTTGAAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTTTCTCCCTCAAACCCCTAGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTTGCTTGAAA
GATGATAGTGGTATAAGGCGGAGATGCTTGACAATGGCTTAGGTGTAACCAAAAACATTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GATGATAGTGGTATAAGGCGGAGATGCTTGACAATGGCTTAGGTGTAACCAAAAACATTG
CTAAGGCGGTCTCTGGCGTCGCCCATTTTATTCTTCAAACTTTGACCTCAAATCAGGTAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
87
APÊNDICE 5
SEQÜÊNCIA CONSENSO - ISOLADO SD44
88
Candida albicans internal transcribed spacer 1 (ITS1); 5.8S ribosomal RNA; internal
transcribed spacer 2 (ITS2) Length=4025
Score = 1061 bits (574), Expect = 0.0, Identities = 584/588 (99%), Gaps = 4/588
(0%) Strand=Plus/Plus
GATCATTACTGATTTGCTTAATTGCACCACATGTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GATCATTACTGATTTGCTTAATTGCACCACATGTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTT
GGCGGTGGGCCCAGCCTGCCGCCAGAGGTCTAAACTTACAACCAATTTTTTATCAACTTG
|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GGCGGTGGGCCCAG-CTGCCGCCAGAGGTCTAAACTTACAACCAATTTTTTATCAACTTG
TCACACCAGATTATTACTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TCACACCAGATTATTACTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT
CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||
GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGA-GGCATGCCTGTTTGAGCGTC
GTTTCTCCCTCAAACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTTGCTTGAAA-
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTTTCTCCCTCAAACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTTGCTTGAAAA
GACGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCTAACCAAAAACATTGC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
G-CGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCTAACCAAAAACATTGC
89
APÊNDICE 6
SEQÜÊNCIA CONSENS0 - ISOLADO SD3
1
90
Issatchenkia orientalis isolate wb589 small subunit ribosomal RNA gene, partial
sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene and internal
transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene,
partial sequence Length=488
Score = 835 bits (452), Expect = 0.0, Identities = 455/456 (99%), Gaps = 1/456 (0%)
Strand=Plus/Plus
GATCATTACTGTGATTTACTACTACACTGCGTGAGCGGAACGAAAACAACAACACCTAAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GATCATTACTGTGATTTACTACTACACTGCGTGAGCGGAACGAAAACAACAACACCTAAA
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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A
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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AGCGGACGACGTGTAAAGAGCGTCGGAGCTGCGACTCGCCTGAAAGGGAGCGAAGCTGGC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
91
ANEXO 1
92
ARTIGO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO “BRAZILIAN JOURNAL OF
MICROBIOLOGY”
93
GENETIC DIVERSITY AMONG Candida spp. ISOLATES FROM THE ORAL CAVITY OF
CHILDREN WITH DOWN’S SYNDROME
Fernanda Bello Costa de Souza
1
Fabian Calixto Fraiz
2
Rosângela Lameira Pinheiro
3
Mônica Moreira
1
Vânia Aparecida Vicente
1*
1
Curso de pós – graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia do
Departamento de
Patologia Básica da Universidade Federal do Paraná,
2
Departamento de Estomatologia da
Universidade Federal do Paraná,
3
Laboratório de Micologia do Hospital de Clínicas da Universidade
Federal do Paraná.
Corresponding author: Programa de Mestrado em Microbiologia, Parasitologia e Patologia,
Departamento de Patologia Básica, Setor de Ciências Biológicas; Centro Politécnico, Universidade
Federal do Paraná UFPR; Jardim das Américas, CEP 81531-990, Curitiba, Paraná Brasil. e-mail:
[email protected], fone: 0051-2141-33611704, fax: 0051-02141-32662042
ABSTRACT
Children with Down’s syndrome are more predisposed to have Candida yeasts, especially C. albicans,
in theirs oral cavity, probably due to anatomic changes and an immunologic deficit. The aim of this
study was to verify the presence of Candida yeasts in the saliva of children with and without Down’s
syndrome and theirs genetic variability, using the RAPD technique. Fifty –one children with Down’s
syndrome and 50 children without the syndrome, all aged between 0 and six years, were included in
the study. The saliva samples were applied to Sabouraud´s dextrose agar and incubated for 48 hours at
30°C. Candida yeasts were identified using the gem-tube test and carbohydrates assimilation test (API
94
20 C AUX). A total of 31 isolates of genus Candida were identified, with C. albicans being the most
frequently. Total DNA extraction was carried out using the CTAB buffer and associated sonication.
RAPD reactions used the OPA 10, OPX 11, OPX 12, OPX 14, OPX 17 and OPX 19 primers. The
Jaccard similarity index was used to construct a pairwise similarity matrix, which was used to perform
hierarchical cluster analyses based upon the unweighted pairgroup method with arithmetic mean
(UPGMA) using NTSYS software. The results of the present study showed a high prevalence of oral
candidal carriage in children with DS and C. albicans was the most isolated yeast. The RAPD markers
showed a higher degree of variability between the species, especially within the species C. albicans.
KEY WORDS
Down’s syndrome, Candida, Candida albicans, RAPD.
VARIABILIDADE GENÉTICA DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida ISOLADAS DA
CAVIDADE BUCAL DE CRIANÇAS COM SÍNDROME DE DOWN
RESUMO
Crianças com Síndrome de Down apresentam alterações anatômicas e comprometimento da
imunidade, tornado-as mais predispostas à colonização por leveduras do gênero Candida. Este estudo
buscou verificar a ocorrência e a variabilidade genética, por meio de marcadores RAPD, de leveduras
do gênero Candida na cavidade bucal de crianças com e sem Síndrome de Down. Foram coletadas
amostras salivares da cavidade bucal de 51 crianças com Síndrome de Down e de 50 crianças sem a
síndrome, com idades entre 0 e 6 anos. As amostras foram semeadas em Ágar Sabouraud Dextrose e
incubadas a 30ºC por 48 horas. Para a identificação das leveduras foram usados as provas de formação
do tubo germinativo e o método comercial API 20 C AUX (BioMèrieux). Ao total foram isoladas e
identificadas 31 amostras de leveduras do gênero Candida, sendo a maioria de C. albicans. A extração
do DNA das leveduras foi realizada com o uso de CTAB e ultra-som associados. Para o RAPD foram
95
utilizados os primers OPA 10, OPX 11, 12, 14,17 e 19. As bandas foram analisadas com o coeficiente
de Jaccard e o método UPGMA foi utilizado para a construção dos dendrogramas pelo programa
NTSYS. Os resultados demonstraram que houve isolamento de leveduras do gênero Candida em 51%
das crianças com Síndrome de Down e em 10% das crianças sem a síndrome. Tais achados permitiram
concluir que crianças com Síndrome de Down apresentam uma alta freqüência de colonização por
Candida spp. quando comparadas com crianças sem a síndrome. A análise feita por meio dos
marcadores RAPD mostrou uma alta variabilidade genética existente entre as espécies de Candida,
sendo que o maior grau de polimorfismo genético foi encontrado entre as amostras de C. albicans.
PALAVRAS – CHAVE
Síndrome de Down; Candida; Candida albicans; RAPD.
INTRODUÇÃO
Leveduras do gênero Candida têm sido isoladas com maior freqüência da cavidade bucal de
crianças com Síndrome de Down (SD) quando comparadas a crianças sem a Síndrome. Alterações
anátomo-fisiológicas existentes na cavidade bucal dos portadores da SD, dificuldade motora, infecções
respiratórias recorrentes, alterações na resposta imunológica e maior prevalência de doença
periodontal estão entre as possíveis causa citadas por diferentes autores. (CARLSTEDT et al., 1996;
SCULLY et al., 2002; RIBEIRO et al., 2002; VIEIRA et al., 2005).
O sistema imune em pacientes com Síndrome de Down apresenta diferentes anormalidades,
como menor capacidade de quimiotaxia e fagocitose dos neutrófilos, deficiência na ativação das
células T, deficiência de anticorpos, baixa contagem de linfócitos T CD4
+
, funções de células NK
reduzidas, diminuição na expansão dos linfócitos T e B e alterações no timo (de tamanho menor e com
variações histológicas), que podem alterar o processo de maturação dos linfócitos T (‘TRINCADO et
al., 1988; SCOTESSE et al., 1998; RIBEIRO et al., 2003; ZALDIVAR-CHIAPA et al., 2005; de
HINGH et al., 2005).
96
O sistema estomatognático nos portadores da síndrome também apresenta anormalidades em
diferentes aspectos. As anormalidades envolvem alterações no complexo crânio – facial, com
desenvolvimento menor em alguns ossos, mau posicionamento da língua e maior prevalência de
alterações como língua fissurada e geográfica e hipotonicidade dos músculos orbiculares, deixando os
lábios entreabertos e sujeitos a fissuras, especialmente nas comissuras labiais (REY e BIRMAN, 1990;
SCHWARTZMAN, 1999; PILCHER, 2001; SCULLY et al. 2002). Além disso, o fluxo e a
composição da saliva podem estar alterados (JARA et al. 1991; COGULU et al. 2006; YARAT et al.
1999; SIQUEIRA et al. 2005). As anomalias dentárias também são freqüentes, com atraso na erupção
dos dentes, alterações na seqüência de erupção e na morfologia dos elementos dentários (REY e
BIRMAN, 1990; SCHWARTZMAN, 1999; PILCHER, 2001). Algumas alterações na microbiota
bucal são verificadas. As crianças portadoras da Síndrome apresentam uma maior colonização por
bactérias potencialmente causadoras da doença periodontal, como Actinobacillus
actinomycetemcomitans (STABHOLZ, 1991). Porém, é relatado para estes hospedeiros uma menor
freqüência de colonização por S. mutans, principal agente etiológico da cárie (SREEDEVI e
MUNSHI, 1998).
As leveduras do gênero Candida são consideradas microrganismos comensais, participando
da microbiota normal de diferentes sítios incluindo cavidade bucal, tubo digestório, intestino,
orofaringe, trato urogenital e pele (ODDS, 1994). A prevalência de leveduras do gênero Candida na
cavidade bucal de crianças e adultos jovens saudáveis pode variar de 5 a 70%, sendo que cerca de 80%
dos isolados são de C. albicans. (DARWAZEH e AL-BASHIR, 1995; AKDENIZ et al., 2002;
KADIR et al, 2005). Quando há desequilíbrio entre o binômio parasito/hospedeiro as leveduras têm
seu potencial de proliferação aumentado, passando da forma comensal para a forma parasitária,
podendo causar danos ao hospedeiro (FOTOS e HELLSTEIN, 1992; SIDRIN e MOREIRA, 1999).
Uma gama de fatores locais e/ou sistêmicos podem facilitar este desequilíbrio e favorecer a instalação
dos processos infecciosos causados pelas leveduras do gênero Candida, entre eles destacam-se os
quadros de imunodeficiências, deficiências nutricionais, presença de tumores malignos, xerostomia,
97
mucosites, uso de próteses, dieta, alterações endócrinas e uso de determinados medicamentos (ODDS,
1994; FOTOS e HELLSTEIN, 1992).
Marcadores morfológicos e bioquímicos são frequentemente utilizados na identificação das
espécies do gênero Candida. Tais marcadores porém, apresentam algumas limitações na discriminação
entre espécies e variedades (OTERO et al., 1995; RESENDE et al., 2004). Os marcadores moleculares
representam ferramentas adicionais possibilitando uma taxonomia mais efetiva além de fornecer dados
precisos para estudos epidemiológicos e diversidade genética (LEHMANN, LIN e LASKER, 1992;
ROBERT et al., 1995; WALTIMO et al., 2001; ANSARI et al., 2003; BAUTISTA-MUÑOZ et al.,
2003; PINTO et al., 2004).
O presente estudo visou investigar a ocorrência de leveduras do gênero Candida isoladas da
cavidade bucal de crianças com Síndrome de Down em relação a crianças sem a síndrome e comparar
variabilidade genética dos isolados por meio de marcadores RAPD.
MATERIAIS E MÉTODOS
Isolamento das leveduras do gênero Candida – participaram do estudo 101 crianças, com
idades entre zero e 6 anos, sendo 51 portadoras de SD e 50 crianças sem síndrome. Os dois grupos não
apresentavam diferença estatisticamente significativa quanto à composição (idade e sexo dos
participantes). As amostras salivares coletadas foram diluídas em solução salina esterilizada, semeadas
em Ágar Saboraud Dextrose e incubadas a 30° C por um período de 72 horas.
Identificação dos isolados – os isolados foram identificados por meio da morfologia,
avaliando a formação de tubo germinativo. A avaliação fisiológica foi realizada por meio da
assimilação de carboidratos (Sistema API 20 C AUX – BioMériuex). Os isolados não identificados
pelos critérios citados anteriormente foram comparados por meio de seqüências da região ITS do gene
DNA ribossomal.
Extração DNA – a extração de DNA foi realizada de acordo com Vicente (2000) modificado
por Moreira (2006). As amostras foram diluídas em CTAB e submetidas a dois pulsos de ultra-som.
98
Em seguida, foram adicionados clorofórmio, álcool 96 e álcool 70. O DNA extraído foi ressuspenso
em água ultrapura e mantido a - 4°C.
Ribotipagem e reação de seqüenciamento - O DNA dos isolados foi amplificado com os
pares de primers V9G (5’TTACGTCCCTGCCCTTTGTA3’) e LS266 (5’
GCATTCCCAAACAACTCGACTC 3’). Para a reação de PCR foi utilizado um volume de 50µl
contendo 12ng do DNA extraído, 1 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen, Brasil), 0,2 mM para um
mix de dNTP, 3 mM de MgCl
2
, 0,8 µM de cada primer, 10 mM de tampão da enzima. A reação de
amplificação consistiu de 30 ciclos (30 segundos de desnaturação a 94ºC, 1 min de anelamento a
56ºC, 1 min de síntese a 72ºC), utilizando 2 min para desnaturação inicial e 3 min de extensão final
(Termociclador Mastercycler gradient). Posteriormente foi realizada a purificação dos produtos de
PCR., adicionando-se 50 µL de polietilenoglicol (PEG) aos 50 µl de reação de PCR. Em seguida o
material foi transferido para um tubo tipo eppendorf de 0,5 ml e incubado a 37°C por 30 min. O
material foi centrifugado por 20min a 13000 rpm e o sobrenadante foi descartado. Foram
adicionados 125 µl de etanol 80% gelado e o material foi novamente centrifugado por 2 min a 13000
rpm. O sobrenadante foi descartado. Em seguida foram adicionados 125 µl de Etanol 96% (gelado)
pela parede do tubo e retirado em seguida. O sobrenadante foi descartado e o etanol 96% evaporado
em bomba a vácuo (Univapo 100 ECH) por 10min a 70ºC. O material foi ressuspenso em 15 µl de
água ultrapura e mantido em temperatura ambiente por pelo menos 2 horas.
Na PCR realizada para o seqüenciamento, foram utilizados os primers ITS4
(5´TCCTCCGCTTATTGATATGC3´) e ITS5 (5´GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3´). Para
cada reação foi utilizado foi utilizado 0,5 µl do bigdie terminador (ABI PRISM BigDye Terminators v
3.0 da Applied Biosystems), 1 a 3 µl do produto de PCR purificado, 0,5 µl do primer, 0,5 µl do
tampão e água ultrapura a completar 10 µl. O programa de amplificação (Termociclador Mastercycler
personal) constituiu de 35 ciclos de 10 segundos a 96°C, 5 segundos a 50°C e 4 min a 60°C. Após 25
ciclos foi realizada a refrigeração a 8°C. A precipitação do DNA a ser seqüenciado foi realizado
usando isopropanolol 75% e etanol 70%.Após a secagem completa do DNA precipitado, o mesmo foi
ressuspenso em 10 a 20 µl de formamida Hi-Di (Applied Biosystems) indicada para o seqüenciador
99
utilizado. Depois da dissolução, as soluções de DNA foram transferidas para a placa de
seqüenciamento e mantidas em termociclador (Mastercycler personal) por 2 minutos a 95°C para
desnaturação. A reação de seqüenciamento foi realizada no seqüenciador modelo 3130 da Applied
Biosystems. A análise da qualidade das seqüências obtidas, a construção das seqüências consenso e o
alinhamento das seqüências foram realizadas usando o programa Bioedit versão 7.0.2. A comparação
com as seqüências existentes no GenBank foi feita utilizando-se o programa BLAST do NCBI como
alinhador. A identificação da espécie analisada foi baseada na seqüência com o maior índice de
similaridade.
Amplificação do DNA por RAPD – Foram utilizados os 31 isolados obtidos além das 4
linhagens utilizadas como referência: C. albicans ATCC 10231, C. tropicalis ATCC 750, C. krusei
ATCC 6258 e C. parapsilosis ATCC 22019, totalizando 35 mostras Os oligonucleotídios utilizados
foram: OPA 10, OPX 11, OPX 12, OPX 14, OPX 17 e OPX 19 (Operon Technologies
®
). .
Para a amplificação do DNA foi utilizada uma mistura contendo, além da amostra de DNA, os
seguintes elementos: 1,5 unidades de Taq DNA polimerase, 0,4 mM para cada dNTP, 4,0 mM de
cloreto de magnésio (MgCl
2
), 0,4 mM de primer, 10 mM de tampão da enzima 1X e 12 ng de DNA
para 11 µL de reação. A reação de amplificação consistiu de 40 ciclos com as seguintes condições: 1
min a 92ºC; 1,5 min a 37ºC e 2 min a 72ºC, utilizando 4 min a 92ºC para desnaturação inicial e 3 min
a 72ºC de extensão final.
Os produtos resultantes da amplificação por RAPD foram analisados por eletroforese em gel
de agarose 1,4% corados com brometo de etídio.
O índice de similaridade de Jaccard foi utilizado para a construção da matriz binária de
similaridade. A partir desta matriz as unidades foram agrupadas através do método
UPGMA.(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Average) do software NTSYS versão
2.1. A confiabilidade dos grupamentos foi verificada pela análise bootstrap com 10000 reamostragens.
100
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em 51% (26) das crianças com SD foi possível isolar leveduras do gênero Candida das
amostras salivares coletadas, enquanto que nas crianças sem SD foram isoladas leveduras em 10% (5)
das crianças, sendo a diferença estatisticamente significativa (p<0,0001) (Qui – Quadrado). Os
resultados encontrados assemelham-se aos obtidos em outros estudos, mostrando uma diferença
significativa na ocorrência de Candida spp. entre crianças com e sem SD (CARLSTEDT et al., 1996;
SCULLY et al., 2002; RIBEIRO et al., 2005; VIEIRA et al., 2005).
A identificação dos isolados foi realizada utilizando-se diferentes marcadores morfológicos e
fisológicos (teste do tubo germinativo e assimilação de carboidratos através do teste bioquímico API
20 C AUX – BioMerieux, além do seqüenciamento de três isolados. O resultado dos diferentes
métodos forneceu a identificação dos 31 isolados e a distribuição das espécies encontradas em cada
grupo está representada na Tabela 1.
Entre as 27 amostras de leveduras isoladas entre as crianças com SD, 81,5% eram da espécie
C. albicans, 11,11% de C. guilliermondii, 3,7% de C. famata e 3,7% de C. krusei. Entre as crianças
sem SD foram encontrados 2 isolados de C. albicans e um isolado de cada uma das seguintes espécies:
C. parapsilosis, C. tropicalis e C. dubliniensis.
A espécie C. albicans é citada pela literatura como a espécie mais freqüentemente isolada da
cavidade bucal de crianças (DARWAZEH e AL-BASHIR, 1995; CARLSTEDT et al., 1996; SCULLY
et al., 2002; ZÖLLNER e JORGE, 2003; SCHERMA et al., 2004; RIBEIRO et al., 2005; VIEIRA et
al., 2005; KADIR et al., 2005), porém outras espécies também são colonizadoras da mucosa bucal,
dados confirmados pelos resultados encontrados no presente estudo e em outros citados na literatura
(DARWAZEH e AL-BASHIR, 1995; CARLSTEDT et al., 1996; ZÖLLNER e JORGE, 2003;
SCHERMA et al., 2004; KADIR et al.,
2005). A baixa freqüência de isolamento C. dubliniensis da
cavidade bucal de indivíduos saudáveis (SULLIVAN et al., 2004; MIRHENDI et al., 2005) além da
sua semelhança morfológica e fenotípica com a espécie C. albicans (SULLIVAN et al., 1995; KHAN
et al., 2004; MOSCA et al., 2005), sugeria outros métodos de confirmação para a identificação. Sendo
assim, seqüências da região ITS deste isolado foram utilizadas como suporte para esta identificação.
101
Além deste, foram seqüenciadas também a região ITS dos isolados SD3
1
, não identificado pelo
sistema API 20 C AUX (BioMerieux) e o isolado de C. albicans SD44
As seqüências obtidas destes três isolados foram comparadas a seqüências depositadas no
GenBank pelo programa BLAST e os resultados mostraram 100% de analogia entre a seqüência do
isolado PC32 com seqüência de C. dubliniensis depositada no GenBank, 99% de analogia entre a
amostra SD44 e seqüência de C. albicans e 99% de analogia entre a amostra SD3
1
e seqüência de
Issatchenkia orientalis, forma telomórfica de C. Krusei , confirmando assim a identificação dos
isolados.
A análise da variabilidade genética dos isolados por meio de marcadores RAPD diferentes
padrões de amplificação entre os 31 isolados utilizados no estudo.
O dendograma gerado a partir da similaridade genética entre os isolados por meio dos
marcadores RAPD pode ser visualizado na Figura 1.
O maior agrupamento (agrupamento I) formado foi entre os isolados de C. albicans, com
índices de similaridade variando entre 25 e 75%, mostrando o alto índice de variabilidade genética
desta espécie. O alto grau de polimorfismo genético da espécie C. albicans isoladas da cavidade bucal
também foi demonstrada em outros trabalhos utilizando marcadores RAPD (WALTIMO et al., 2001;
GIAMMANCO et al., 2005). Como em outros relatos da literatura o estudo mostrou padrões
fenotípicos semelhantes entre os isolados, como o mesmo padrão de assimilação de açucares, porém a
análise por meio de marcadores RAPD revelou padrões de amplificações diferentes, mostrando o
polimorfismo genético da espécie, associado a um padrão de colonização do hospedeiro.
O agrupamento II reuniu as espécies C. krusei, C. guilliermondii e o isolado de C. famata
apresentando três subgrupos. No primeiro subgrupo ficaram o isolado de C. krusei (CK-1) e a
linhagem ATCC da mesma espécie, com similaridade de 65% e valor de bootstrap de 65,52. Os três
isolados identificados como C. guilliermondii formavam o segundo subgrupo, onde os isolados CG-9
e CG-16 apresentavam similaridade de 50% entre si, enquanto a linhagem CG-2 apresentava
similaridade de 35% em relação a estas. No terceiro subgrupo estava a amostra de levedura da espécie
C. famata (CF-3) com baixa similaridade em relação aos outros isolados deste grupo.
102
As linhagens de C. parapsilosis (CP-ATCC 33 e CP-28) foram agrupadas no grupo III e
mostraram similaridade de cerca de 50% entre si, com valor de bootstrap de 96,90, mostrando a
confiabilidade deste agrupamento.
Ainda no grupo III foram encontradas as amostras de C. tropicalis (CT-ATCC 34 e CT-31)
com similaridade pequena entre as amostras. Agrupada a estas estava a amostra CD-29 de C.
dubliniensis, com baixo índice de similaridade (25%).
O gráfico tridimensional gerado pelo programa NTSYS (Figura 2) mostra o agrupamento entre
as espécies de C. albicans, sendo que duas amostras estão distantes deste agrupamento, sendo as
mesmas provenientes de amostras salivares de crianças sem SD. O agrupamento maior é formado
pelos isolados de crianças com SD. Características anatômicas da cavidade bucal, características
salivares e aspectos imunológicos podem sugerir a causa desta maior colonização, variabilidade
genética e explicar o distanciamento genético entre os isolados da saliva de crianças com e sem SD,
porém, mais estudos com um maior número de amostragem devem ser realizados para o melhor
entendimento entre a prevalência e o alto polimorfismo genético das leveduras C. albicans em
pacientes com SD.
CONCLUSÕES
Sendo assim, de acordo com estes resultados e em conjunto com os dados relatados na
literatura pode-se concluir que a colonização da cavidade bucal por leveduras do gênero Candida é
alta em pacientes com SD, sendo a espécie C. albicans a mais prevalente. Além disso, a variabilidade
genética entre as espécies isoladas destes indivíduos também é grande, com a espécie C. albicans
apresentando o maior grau de polimorfismo genético. A maior prevalência e a maior variabilidade
genética das leveduras neste grupo de indivíduos podem ser explicadas pelo fato dos portadores da SD
serem imunossuprimidos e apresentarem diferentes alterações na cavidade bucal, justificando a
susceptibilidade de colonização por estas leveduras. No entanto, mais estudos devem ser realizados
com um maior número de amostragem para a elucidação desta relação.
103
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106
TABELA 1 – DISTRIBUIÇÃO DOS ISOLADOS DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida
Crianças com SD Crianças sem SD
Pacientes
Nomenclatura
dos Isolados
*
Identificação dos
isolados
Pacientes
Nomenclaturas
dos Isolados
**
Identificação dos
isolados
1 SC 1 SC
2 2 PC 2
C.albicans
3 SD 3
1
SD 3
2
C. Krusei + C.
guilliermondii
3 SC
4 SC 4 SC
5 SD 5
C. famata
5 SC
6 SD 6
C.albicans
6 SC
7 7 SC
9 9 SC
10 10 SC
11 SD 11
C.albicans
11 PC 11
C. parapsilosis
12 SC 12 SC
13 SC 13 SC
14 SC 14 SC
15 SD 15
C.albicans
15 SC
16 SC 16 SC
17 SD 17
C.albicans
17 SC
18 SD 18
C.albicans
18 SC
19 SC 19 SC
20 SC 20 SC
21 SD 21
C.albicans
21 SC
22 SD 22
C.guilliermondii
22 SC
23 SC 23 SC
24 SD 24
C.albicans
24 SC
25 SC 25 SC
26 SD 26
C.albicans
26 SC
27 SC 27 SC
28 SD 28
C.albicans
28 SC
29 SC 29 SC
30 SC 30 SC
31 SC 31 SC
32 SC 32 PC 32
C. dubliniensis
33 SD 33
C.albicans
33 SC
34 SC 34 SC
35 SD 35
C.albicans
35 SC
36 SD 36
C.albicans
36 PC 36
C.albicans
37 SC 37 SC
38 SD 38
C.guilliermondii
38 PC 38
C.tropicalis
39 SC 39 SC
40 SD 40
C.albicans
40 SC
41 SC 41 SC
42 SD 42
C.albicans
42 SC
43 SD 43
C.albicans
43 SC
44 SD 44
C.albicans
44 SC
45 SD 45
C.albicans
45 SC
46 SD 46
C.albicans
46 SC
47 SC 47 SC
48 SD 48
C.albicans
48 SC
49 SD 49
C.albicans
49 SC
50 SC 50 SC
51 SD 51
C.albicans
51 SC
52 SD 52
C.albicans
* amostras de leveduras isoladas de pacientes com Síndrome de Down (SD); **amostras de
leveduras isoladas de pacientes sem Síndrome de Down (PC); SC: sem crescimento de
leveduras.
107
Figura 1 – Dendograma gerado a partir de similaridade genetica obtida por marcadores
rapd das linhagens descritas na Tabela 1, utilizando coeficiente de jaccard e
método de agrupamento UPGMA
Legenda: I - agrupamento entre as linhagens de C. albicans, II – agrupamento entre as linhagens
de C. krusei, C. guilliermondii e C. famata, III – agrupamento entre as linhagens de C.
dubliniensis, C. tropicalis e C. parapsilosis
I
II
III
108
Figura 2 - Análise da similaridade entre as leveduras isoladas – gráfico tridimensional
Legenda: Agrupamento sinalizado em cinza – isolados de C. albicans de
crianças com SD, amostras sinalizadas em tracejado – isolados de
C. albicans de crianças sem SD
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