( PDF ) Ação do bezafibrato, um agonista de PPAR-alfa, sobre a hipercolesterolemia induzida por dieta e excesso de ferro, em hamsteres

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

Ação do Bezafibrato, um Agonista de PPAR-α, sobre a

Hipercolesterolemia Induzida por Dieta e Excesso de Ferro, em

Hamsteres

AUTOR: Marcos Rodrigo de Oliveira

ORIENTADORA: Profª Drª Maria Lúcia Pedrosa

CO-ORIENTADOR: Prof Dr Marcelo Eustáquio Silva

Ouro Preto, 2007.

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

OLIVEIRA,MR Apoio Financeiro

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

Ação do Bezafibrato, um Agonista de PPAR-α, sobre a

Hipercolesterolemia Induzida por Dieta e Excesso de Ferro, em

Hamsteres

AUTOR: Marcos Rodrigo de Oliveira

ORIENTADORA: Profª Drª Maria Lúcia Pedrosa

CO-ORIENTADOR: Prof Dr Marcelo Eustáquio Silva

Dissertação apresentada ao programa de Pós-

Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto,

como parte integrante dos requisitos para a obtenção

do título de Mestre, em Ciências Biológicas, área de

concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.

Ouro Preto, 2007.

ads:

OLIVEIRA,MR Apoio Financeiro

III

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular e no

Laboratório de Nutrição Experimental do Núcleo de Pesquisa em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, com o auxílio da CAPES,

FAPEMIG* e UFOP.

* Projeto financiado:

"Efeito do tratamento com fibrato na hipercolesterolemia provocada por dieta e excesso

de ferro e ação do ferro na expressão do PPAR-alfa em hamsteres"

FAPEMIG CDS-670/05

OLIVEIRA,MR Dedicatória

Dedicatória

Aos Meus pais, Ana Maria e José Batista, que

sempre me apoiaram e me incentivaram em

minhas infindáveis viagens

OLIVEIRA,MR

Agradecimento Especial

Aos professores Maria Lúcia Pedrosa e

Marcelo Eustáquio Silva, mais que orientadores

pessoas de lealdade e sinceridade, sempre e incondicional.

Obrigado pela paciência e atenção, continuem com esse belo exemplo

OLIVEIRA,MR Agradecimentos

Agradecimentos

Ao meu irmão, Marcelo, pelo apoio e incentivo.

A todos os colegas do Laboratório de Nutrição Experimental, em especial, ao Alan,

Aleçandra, Bruno, Emerson, Fabiano, Flávia, Fabrício, Glauciene, Heberth,

Jamily, Joamyr, Juliana, Kamylla, Larissa, Maísa, Wanda, pelo companheirismo,

carinho e ajuda.

Ao Jair incansável colaborador.

À Cida, pela dedicação e resolução de nossos grandes problemas.

À República Vira Saia

, meu grande aprendizado.

A todos os Virassaianos, verdadeiros amigos.

Ao Maestro Raumsol.

OLIVEIRA,MR Resumo

VII

Resumo

O ferro é essencial para o metabolismo celular e respiração aeróbica por atuar

como cofator de diversas proteínas. Entretanto, em concentração elevada pode levar à

toxicidade celular e lesão oxidativa dos componentes celulares devido ao seu

envolvimento na formação de radicais livres. O presente estudo foi delineado para

avaliar os efeitos do bezafibrato sobre a homeostase de lipídios séricos e enzimas

relacionadas às defesas antioxidantes e à função hepática em hamsteres

hipercolesterolêmicos e com excesso de ferro. Quarenta e cinco Hamsteres Golden

Syrian machos, foram divididos em cinco grupos com nove animais cada (de acordo

com a dieta recebida, bezafibrato e injeções de ferro dextran intraperitoniais): grupo C

recebeu dieta controle; grupo H recebeu dieta hipercolesterolemiante; grupo HFE

recebeu dieta hipercolesterolemiante e injeções de ferro dextran (25 mg via

intraperitoneal divididas em cinco doses); grupo HFI recebeu dieta

hipercolesterolemiante mais bezafibrato na dieta (0,5%); grupo HFEFI recebeu dieta

hipercolesterolemiante mais ferro dextran e bezafibrato na dieta. As injeções de ferro

dextran foram administradas diariamente a partir do 28

dia de experimento, contendo

5mg de ferro na forma de dextran durante 5 dias. Os animais dos grupos HFI e HFEFI

receberam o bezafibrato a partir do 42

dia de experimento. Após 60 dias de

experimento os animais foram anestesiados e sacrificados, os parâmetros bioquímicos e

estresse oxidativo foram determinados. Os resultados foram analisados pela ANOVA,

análise univariada, complementada pelo teste de Tukey ao nível de 5% de

probabilidade. Observou-se que o ferro potencializou o efeito hipercolesterolêmico da

dieta, uma vez que os animais dos grupos que receberam excesso de ferro apresentaram

valores de colesterol 43% superiores aos demais grupos. O ferro interferiu no

metabolismo do colesterol, elevando principalmente na fração HDL (em cerca de 217%

do grupo H comparado ao grupo HFE) e o bezafibrato reverteu parcialmente os efeitos

provocados pelo ferro. O bezafibrato provocou o aumento de cerca de 7 vezes na

atividade da aspartato aminotransferase (AST) e na presença de ferro esse efeito foi

reduzido. O excesso de ferro reduziu a atividade de paraoxonase (PON), quando o

paraoxon foi utilizado como substrato (371 ± 54 e 310 ± 27 U/L para os grupos H e

HFE, respectivamente). O bezafibrato reduziu a atividade da PON, quando tanto o

OLIVEIRA,MR Resumo

VIII

paraoxon quanto o fenilacetato foram usados como substratos e estes efeitos foram

parcialmente revertidos pelo ferro. Os resultados do presente trabalho mostraram que,

em hamsteres, o ferro interfere no metabolismo do colesterol, principalmente na fração

HDL e essa interferência pode envolver, direta ou indiretamente, a via de sinalização de

receptores ativados de proliferação dos peroxisomos α (PPAR-α), posto que o

bezafibrato reverteu parcialmente os efeitos provocados pelo ferro.

OLIVEIRA,MR

Abstract

Abstract:

Iron is essencial for cell metabolism and aerobic respiration because of its function as

cofactor many proteins. However, in high concentration, it play a role in cell toxicity

and oxidative damage of cells components, because of its involvement in the formation

of the free radicals. The present study was designed to evaluate the effects of

bezafibrate on serum lipids homeostasis and enzymes related to the antioxidant defenses

and to the hepatic function in hypercholesterolemics hamsters and with iron overdose

excess. 45 Golden Syrian male hamsters were divided into five groups with 9 animals

each , according to diet, bezafibrate and intraperitoneal iron dextran injection; Group C

was fed a control diet; group H received hypercholesterolemic diet; Group HFE was fed

hypercholesterolemic diet and iron dextran injections (25 mg intraperitoneal, divided in

5 doses); Group HFI was fed hypercolesterolemic diet, iron dextran and bezafibrate

diet. The iron dextran injections were administrated daily from 28

with 5mg of dextran

iron for 5 days. The HFI and HFEFI groups received the bezafibrate from 42

day of

expetimentation. After 60 experimental days, the animals were anesthetized and

sacrificed, and the biochemistry and oxidative stress parameters were determinated.

Data were tested by one-way ANOVA. When interactions were significant, Tukey’s test

was applyed to determine the specific differences between means at 5% significance.

Our results demonstrated that iron potentializes the hypercholesterolemic effect of the

diet, since the animals of HFE and HFEFI groups presented higher cholesterol values

when compared to the other groups without iron overdose (about 23% increase). Those

data suggest that iron interferes in lipid metabolism. Iron interferes in cholesterol

metabolism, mainly on the HDL fraction (69,74 ± 7,89 and 151,57 ± 46,67mg/dL for

the H and HFE groups, respectively) and the bezafibrate revertes partially the effects

caused by iron. The bezafibrate increased about 7 times the activity of the AST and in

the presence of iron this effect was reduced. The iron excess reduced the PON activity

when paraoxon was used as substrate (371 ± 54 and 310 ± 27 U/L for H and HFE

groups, respectively). The bezafibrate reduced PON activity when the paraoxon and the

fenilacetate were used as substrate, and those effects were partially reverted through the

iron overdose. The results of the present work show that, in hamsters, iron by on

cholesterol metabolism, mainly by increase HDL fraction. This interference can

OLIVEIRA,MR

Abstract

involve, directly or indirectly, the sinalization way of PPAR-α, since the bezafibrate

reverts partially the effects caused by iron.

OLIVEIRA,MR Sumário

SUMÁRIO

APOIO FINANCEIRO .............................................................................................................III

DEDICATÓRIA ........................................................................................................ ..............IV

AGRADECIMENTO ESPECIAL ............................................................................................V

AGRADECIMENTOS............................................................................... ..............................VI

RESUMO................................................................................................................................ VII

ABSTRACT..............................................................................................................................IX

LISTA DE QUADROS E TABELAS ......................................................................... .........XIV

LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................XV

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................................ XVII

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................................1

2 REVISÃO DA LITERATURA ...............................................................................................5

2.1 Captação e Transporte de Ferro............................................................................................5

2.2 Regulação do Metabolismo do Ferro....................................................................................8

2.3 Situações em que Ocorre Excesso de Ferro..........................................................................9

2.4 Estresse Oxidativo e Ferro..................................................................................................10

2.5 Efeito do Estresse Oxidativo no Metabolismo do Ferro.....................................................11

2.6 Colesterol, Estresse Oxidativo e Aterosclerose ..................................................................12

2.6 Paraoxonase ........................................................................................................................14

2.7 Fibratos e Hipercolesterolemia ...........................................................................................15

3 OBJETIVOS ..........................................................................................................................18

3.1 Objetivo Geral.....................................................................................................................18

3.2 Objetivos Específicos .........................................................................................................18

4 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................................19

4.1 Animais...............................................................................................................................19

4.2 Dietas ..................................................................................................................................19

4.3 Delineamento Experimental ...............................................................................................20

4.4 Dosagem de Parâmetros Séricos.........................................................................................20

4.4.1 Colesterol Total................................................................................................................21

4.4.2 Colesterol HDL................................................................................................................21

4.4.3 Colesterol Não HDL ........................................................................................................21

4.4.4 Triacilgliceróis.................................................................................................................21

4.4.5 Ferro Sérico......................................................................................................................22

OLIVEIRA,MR Sumário

XII

4.4.6 Capacidade de Ligação de Ferro......................................................................................22

4.4.7 Proteínas Totais................................................................................................................23

4.4.8 Aspartato Aminotransferase (AST) .................................................................................23

4.4.9 Alanina Aminotransferase (ALT)....................................................................................23

4.4.10 Glicose ...........................................................................................................................24

4.4.11 Albumina .......................................................................................................................24

4.4.12 Uréia...............................................................................................................................24

4.4.13 Determinação de Radicais Sulfidrilas............................................................................25

4.4.14 Paraoxonase – Atividade Arilesterase ...........................................................................25

4.4.15 Paraoxonase - Atividade Paraoxonase...........................................................................26

4.4.16 Catalase..........................................................................................................................26

4.4.17 Digestão e Dosagem de Ferro no Fígado.......................................................................27

4.5 Análise Estatística...............................................................................................................28

5 RESULTADOS .....................................................................................................................29

5.1 Ensaio 1- Efeito da Dieta Hipercolesterolemiante (H) Sobre Enzimas, Metabólitos

Séricos, Pesos Corporal e de Órgãos em Hamsteres Alimentados Com Dietas Controle

1 Hipercolesterolemiante ..........................................................................................................29

5.1.1 Capacidades Total e Latente de Ligação ao Ferro, Ferro Sérico e Índice de

Saturação da Transferrina e Ferro Hepático .............................................................................29

5.1.2 Perfil Lipídico..................................................................................................................30

5.1.3 Defesas Antioxidantes .....................................................................................................31

5.1.4 Atividade das Aminotransferases ....................................................................................31

5.1.5 Albumina, Proteínas Totais, Glicose, Bilirrubinas e Uréia..............................................32

5.1.6 Pesos relativos dos Órgãos e Peso Corporal....................................................................32

5.2 Ensaio 2: Avaliação do Efeito do Bezafibrato no Perfil Lipídico, Parâmetros

Bioquímicos e Estresse Oxidativo em Hamsteres Hipercolesterolêmicos Induzidos por

Dieta e Excesso de Ferro ..........................................................................................................33

5.2.1 Concentração de Ferro, Capacidade Latente de Ligação ao Ferro (CLLF),

Capacidade Total de Ligação ao Ferro (CTLF), Índice de Saturação da Transferrina

(%IST) ......................................................................................................................................33

5.2.2 Defesas Antioxidantes .....................................................................................................35

5.2.2.1 Atividade da Paraoxonase para Fenilacetato ................................................................35

5.2.2.2 Atividade da Paraoxonase para Paraoxon.....................................................................35

5.2.2.3 Atividade da Catalase ...................................................................................................36

5.2.3 Valores do Perfil Lipídico................................................................................................37

5.2.4 Atividades da Aspartato e Alanina Aminotransferase....................................................40

5.2.5 Pesos Relativos dos Órgãos e Peso Corporal...................................................................41

6 DISCUSSÃO .........................................................................................................................43

6.1 Ferro....................................................................................................................................43

6.2 Lipídios ...............................................................................................................................46

6.3 Defesas Antioxidantes ........................................................................................................49

6.4 Aminotransferases ..............................................................................................................51

6.5 Peso dos Órgãos..................................................................................................................52

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................53

OLIVEIRA,MR Sumário

XIII

8 CONCLUSÕES .....................................................................................................................55

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................56

OLIVEIRA,MR

Lista de Tabelas

XIV

Lista de quadros e tabelas

Quadro I

Composição das dietas controle e hipercolesterolemiante em gramas para

cada 1000g de dieta

Tabela 1. Capacidade Total de Ligação ao Ferro (CTLF), Ferro, Capacidade Latente de

Ligação ao Ferro (CLLF) e Índice de Saturação da Transferrina (IST), de hamsteres

alimentados com dieta controle (C) e hipercolesterolemiante (H).

Tabela 2. Colesterol, Triacilgliceróis, Lipoproteína de Alta Densidade (HDL) e

Colesterol não HDL em hamsteres alimentados com dieta controle (C) e

hipercolesterolemiante (H).

Tabela 3. Atividade da Paraoxonase (PON-fenilacetato), Paraoxonase- (PON -

Paraoxon), Catalase de hamsteres alimentados com dieta controle (C) e

hipercolesterolemiante (H).

Tabela 4. Sulfidrilas Totais, Sulfidrilas Livres e Sulfidrilas Ligadas à Fração Protéica

de hamsteres alimentados com dieta controle (C) e hipercolesterolemiante (H).

Tabela 5. Atividades séricas das aminotransferases AST e ALT de hamsteres

alimentados com dieta controle (C) e hipercolesterolemiante (H).

Tabela 6. Albumina, Proteínas Totais, Glicose, Bilirrubinas e Uréia de hamsteres

alimentados com dieta controle (C) e hipercolesterolemiante (H).

Tabela 7. Pesos Relativos do Fígado, Rins, Coração e Peso Corporal de hamsteres

alimentados com dieta controle (C) e hipercolesterolemiante (H) .

Tabela 8. Ferro sérico, Capacidade Latente de Ligação ao Ferro (CLLF) e Capacidade

Total de Ligação ao Ferro (CTLF), em hamsteres alimentados com dieta

hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos

(HFEFI).

Tabela 9. Transferrina sérica, Índice de Saturação da Transferrina (IST) e Ferro

Hepático em hamsteres alimentados com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com

ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI).

Tabela 10. Concentrações de Sulfidrilas Totais, Livres, e Protéica em hamsteres

alimentados com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com

bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI)

Tabela 11. Porcentagem dos pesos dos órgãos em relação ao peso final dos hamsteres

alimentados com dieta hipercolesterolemiante, com ou sem ferro dextran e bezafibrato.

FE(ferro), FI (Bezafibrato) no final do experimento.

OLIVEIRA,MR Lista de Figuras e Gráficos

Lista de figuras

Figura I - Mecanismo de transporte gastrintestinal do ferro.

Figura II - Mecanismo de transporte do ferro dentro dos hepatócitos

Figura III - Esquema sumarizado da ativação do PPAR. AR - ácido retinóico

Figura 1. Ferro no fígado de hamsteres alimentados com dieta controle (C) e

hipercolesterolemiante (H).

Figura 2. Ferro no fígado em hamsteres alimentados com dieta hipercolesterolemiante

(H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI)

Figura 3. Atividade sérica da Paraoxonase fenilacetato em hamsteres alimentados com

dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou

ambos (HFEFI)

Figura 4. Atividade sérica da Paraoxonase paraoxon em hamsteres alimentados com

dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou

ambos (HFEFI)

Figura 5. Atividade sérica da Catalase em hamsteres alimentados com dieta

hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos

(HFEFI)

Figura 6. Concentração sérica do Colesterol Total em hamsteres alimentados com dieta

hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos

(HFEFI)

Figura 7. Concentração sérica de Triacilgliceróis em hamsteres alimentados com dieta

hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos

(HFEFI)

Figura 8. Concentração sérica da fração HDL-Colesterol em hamsteres alimentados

com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI)

ou ambos (HFEFI)

Figura 9. Concentração sérica da fração não HDL-Colesterol em hamsteres alimentados

com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI)

ou ambos (HFEFI)

Figura 10. Atividades séricas da AST (aspartato aminotransferase) em hamsteres

alimentados com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com

bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI).

OLIVEIRA,MR Lista de Figuras e Gráficos

XVI

Figura 11. Atividades séricas da ALT (alanina aminotransferase) em hamsteres

alimentados com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com

bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI)

OLIVEIRA,MR Abreviaturas

XVII

Abreviaturas

ALT - Alanina aminotransferase

AST - Aspartato aminotransferase

CETP - Proteína de transferência de éster de colesterol

DAC - Doenças arteriais coronarianas

DCV - Doenças cardiovasculares

DMT1 - Transportador de metal divalente 1

ERO - Espécies reativas do oxigênio

HDL - Lipoproteína de alta densidade

HMG CoA - 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A

IRE - Elementos responsivos ao ferro

IRP - Proteínas reguladoras do ferro

LCAT - Lecitina colesterol acil transferase

LDL - Lipoproteína de baixa densidade

LPL - Lipoproteína lipase

NO - Óxido nítrico

PON - Paraoxonase

PPAR - Receptores ativados da proliferação dos peroxisomos

PPRE - Elementos responsivos de proliferação dos peroxisomos

RXR - Receptor retinóide X ativado

VLDL - Lipoproteína de muito baixa densidade

OLIVEIRA,MR In

trodução

1- Introdução

Há um número crescente de evidências indicando que a diminuição nas defesas

antioxidantes e aumento de espécies reativas do oxigênio promovem danos às

macromoléculas tais como proteínas, lipídios e DNA e estes danos estão relacionados

ao desenvolvimento de diversas doenças. Mecanismos endógenos de defesas

antioxidantes, enzimáticos e não enzimáticos, têm importante papel em transformar

espécies reativas em espécies inertes (Bunker, 1992), mas componentes da dieta podem

também modificar o status redox aumentando ou diminuindo a capacidade redox do

organismo. O ferro está entre os nutrientes que afetam tal capacidade.

O ferro é essencial para o metabolismo celular e respiração aeróbica por atuar

como cofator de diversas proteínas. Entretanto, em concentração elevada pode levar à

toxicidade celular e lesão oxidativa dos componentes celulares devido ao seu

envolvimento na formação de radicais livres (Leonarduzzi et al, 1997). O papel dos

metais na formação in vitro das espécies reativas do oxigênio (ERO) é justificado pelas

reações de Fenton e de Haber- Weiss (Dunford , 1987).

A toxicidade do ânion superóxido (O

) e peróxido de hidrogênio (H

)

aparecem pelas conversões dependentes de ferro ao radical hidroxil (OH°) que é muito

reativo e causa danos graves as membranas, proteínas e DNA (Halliwell e Gutteridge,

1984). O peróxido de hidrogênio (H

) tem vida longa, é capaz de atravessar camadas

lipídicas, pode reagir com a membrana eritrocitária e com proteínas ligadas ao Fe

(Scott et al.,1991). Assim, é altamente tóxico para as células; esta toxicidade pode ser

aumentada em até dez mil vezes quando em presença de ferro (Eaton, 1991).

Doenças arteriais coronarianas (DAC), uma das principais causas de morbidade

e mortalidade em sociedades ocidentais, estão associadas a diversos fatores de risco,

dentre eles o tabagismo, hipertensão arterial, Diabetes Mellitus, sedentarismo e

+ Fe

 O

+ Fe

+ H

 Fe

OH° + OH

 O

+ OH° + OH

OLIVEIRA,MR In

trodução

dislipidemias. Mais recentemente tem sido proposta a hipótese oxidativa, segundo a

qual o aumento da formação de radicais livres por espécies reativas de oxigênio e

diminuição das defesas antioxidantes são responsáveis pela aterosclerose (Navab et al.,

2004). Experimentalmente, a modificação da LDL que pode ser obtida pela sua

oxidação por espécies reativas de oxigênio, na presença de metais de transição (Halliwel

et al ,1992) tem sido considerada um importante fator de risco para aterosclerose.

Em 1981, Sullivan propôs a “hipótese do ferro” segundo a qual a deficiência de

ferro poderia proteger contra distúrbios cardiovasculares, como uma possível explicação

para a diferença de risco para doenças cardiovasculares entre homens e mulheres. Essa

hipótese sugere que o desenvolvimento de doenças cardiovasculares poderia estar

relacionado a estoques de ferro elevados. Evidências no suporte dessa hipótese

surgiram em 1992, quando resultados publicados pela “ Finnish Kuopio Ischemic Heart

Disease Risk Factor Study” mostraram a relação linear entre o risco de ataque cardíaco

em homens e níveis de ferritina e reportaram que homens com ferritina sérica ≥ 200

µg/L tinham duas vezes mais risco de apresentar problemas cardiovasculares, quando

comparados com aqueles que tinham baixos níveis de ferritina (Salonen et al, 1982).

Ao lado do provável papel do ferro na etiologia da aterosclerose, tem sido

proposto seu papel na etiologia de outras doenças crônicas incluindo diabetes tipo II

(Jiang et al 2004), síndrome de resistência à insulina e esteato-hepatite não alcoólica

(Mendles et al., 1999). Estudos crossecionais têm encontrado que níveis elevados de

ferritina estão associados à obesidade central (Gillum, 2001) e dislipidemia (Willians et

al., 2002).

A deficiência de ferro é um problema nutricional mais comum, mas

recentemente alguns pesquisadores têm sugerido que a população está consumindo

excesso de ferro devido à utilização de alimentos fortificados e suplementos

alimentares. Há no organismo dos mamíferos um sofisticado e complexo mecanismo

regulatório do metabolismo de ferro, evitando seu acúmulo, pois uma vez absorvido, o

ferro não é ativamente excretado. De forma simplificada, a absorção de ferro é regulada

por feedback, ou seja, a absorção de ferro depende das necessidades metabólicas,

aumentando quando os estoques estão baixos e vice-versa (Beard, 2002). Apesar disso,

tem-se demonstrado que existem situações em que esta regulação parece não ocorrer

perfeitamente e o excesso de ferro pode ocorrer. Ele acontece, por exemplo, em

OLIVEIRA,MR In

trodução

indivíduos com doenças hereditárias como a hemocromatose, doença comum em

indivíduos de descendência Européia e nas populações do sub-Sahara (Sheth & Brand,

2000), em que ocorre intenso depósito de ferro em diversos órgãos ou tecidos,

principalmente no fígado, devido ao aumento da absorção de ferro no intestino. Existem

situações menos drásticas em que o excesso de ferro pode também ocorrer, como

observada na Suécia, onde a suplementação dos alimentos com ferro foi obrigatória por

50 anos e 5% dos homens tiveram níveis aumentados de ferro e 2% níveis iguais aos

encontrados em estágios iniciais de hemacromatose (Olsson et al., 1978; 1995). A alta

ingestão de ferro por idosos, através do consumo de grandes quantidades de carne, ou a

ingestão de suplementos nutricionais também são consideradas causas potenciais de

excesso de ferro (Fleming et al. 2002); um estudo conduzido na Austrália (Whitfield et

al., 2001) mostrou que o consumo de álcool mesmo em baixas doses, 8 a 14 drinks por

semana – aumenta a ferritina sérica e por inferência os estoques de ferro. Assim estes

trabalhos sugerem que a absorção de ferro da dieta não é tão firmemente controlada,

como se pensava, principalmente em idosos. Isto mostra a relevância de estudos que

relacionem ferro e desenvolvimento de doenças.

Tentando contribuir para o esclarecimento da interação entre excesso de ferro e

os fatores de risco para a aterosclerose e doenças cardiovasculares, foi verificado em

nosso laboratório que, em ratos hipercolesterolêmicos, que receberam 10% decolesterol

na dieta, o excesso de ferro diminui níveis de colesterol total e aumenta HDL (Turbino-

Ribeiro et al., 2003). A partir desses achados foi utilizado o hamster como modelo

experimental, pois apesar do rato ser uma espécie muito usada para a detecção e agentes

que afetam o metabolismo, há diferenças na distribuição de lipídios e lipoproteínas entre

ratos e humanos. O metabolismo do colesterol do hamster é mais parecido com o do

homem, e esta espécie tem sido usada para estudar metabolismo de lipídios hepático e

de lipoproteínas (Nistor et al, 1987; Fernandez et al., 1999).

Ao se utilizar hamsteres como modelo experimental, Silva et al. (2005)

verificaram que a sobrecarga de ferro aumentava a concentração do colesterol total,

indicando que o excesso de ferro pode influenciar o metabolismo de lipídios e

lipoproteínas desencadeando dislipidemia metabólica e dessa forma corroborando a

hipótese de que o ferro pudesse aumentar o risco para aterosclerose.

OLIVEIRA,MR In

trodução

O presente estudo foi delineado para avaliar os efeitos do bezafibrato sobre a

homeostase de lipídios séricos, outros metabólitos séricos e enzimas relacionadas às

defesas antioxidantes em hamsteres hipercolesterolêmicos e com excesso de ferro.

Os fibratos, são compostos derivados do ácido fíbrico e têm sido usados no

tratamento de hiperlipidemias. O bezafibrato, fenofibrato e gemfibrozil são amplamente

prescritos para tratar pacientes com hipertrigliceridemia e baixo nível de HDL (Staels

et al 1998). A ação dos fibratos sobre o metabolismo de lipídios é mediada

principalmente pelos receptores ativadores da proliferação peroxisomal alfa (PPAR)α,

levando à expressão de genes envolvidos no metabolismo de lipídios e lipoproteínas

(Chinetti-Gbaguidi et al., 2005; Kota et al., 2005; Perrone et al., 2005). A expressão do

PPARα ocorre principalmente no fígado, coração e rim. PPARα se heterodimeriza com

o receptor X retinóide (RXR) para se ligar ao elemento responsivo ao PPAR (PPER)

em regiões promotoras de genes envolvidos na homeostase metabólica. PPARα regula

genes alvos que codificam para o metabolismo de ácidos graxos (β oxidação), enzimas

transportadoras de ácidos graxos, homeostase do colesterol e metabolismo de

lipoproteínas (Schoonjans et al., 1996; Motojima et al., 1998 e Dreyer et al., 1992).

Dentre eles, o gene responsável pela enzima colesterol 7-α hidroxilase (CYP7-α), é

considerada como enzima limitante da velocidade síntese dos ácidos biliares (Cheema

& Agellon, 2000).

Considerando que a conversão de colesterol a ácidos biliares no fígado

representa uma rota importante pela qual o colesterol é eliminado do corpo, como

Marcil et al (2006) sugeriram que o estresse oxidativo diminui a expressão de PPAR e

uma vez que, experimentos anteriores em hamsteres mostraram que o ferro

potencializava a hipercolesterolemia induzida pela dieta, resolvemos avaliar se o efeito

do excesso de ferro sobre a concentração de colesterol pode ser revertido pela

bezafibrato e se existem outros efeitos quando estes agentes são utilizados em

hamsteres.

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

2- Revisão da Literatura

2.1 Captação e Transporte de Ferro

O ferro é o metal de transição mais abundante no corpo. É um elemento

essencial para o transporte e a utilização do oxigênio, bem como componente de

numerosas oxidases e oxigenases. Em adultos normais que ingerem uma dieta livre de

suplementos de ferro, o corpo contém de 3-4 gramas de ferro e é suficientemente

balanceado entre os componentes funcionais, complexos estocados, transportes

quelados, ingestão e excreção.

A absorção do ferro é um importante processo no controle dos níveis de ferro

corporal, porque não existe uma via específica para excreção do ferro do organismo.

Sua eliminação pode ocorrer somente por renovação de tecidos que não são reutilizados

(por exemplo, células de epiderme e mucosa gastrintestinal), menstruação e outras

perdas sangüíneas (Devlin, 2002).

Na dieta, o ferro é encontrado na forma hemínica e iônica (não-hemínica) e sua

absorção ocorre no duodeno. O ferro não-hemínico existe principalmente na forma

oxidada (Fe

) que não é biodisponível e deve ser reduzido a Fe

para ser transportado

através do epitélio intestinal (figura 1). A redução do íon férrico para ferroso ocorre no

enterócito principalmente pela ferri-redutase (Dcytb), presente na borda em escova do

duodeno. O transporte do ferro ferroso através da membrana apical do enterócito ocorre

pelo transportador de metal divalente 1 (DMT1). O ferro absorvido pode ser estocado

intracelularmente como ferritina ou liberado para a circulação pela ferroportina, um

transportador basolateral, e é então oxidado pela hefaestina, uma cobre-oxidase, e então

ligado à transferrina (Fleming et al., 2005). O ferro hemínico é absorvido no enterócito

por um receptor específico, uma vez internalizado é liberado do heme por uma heme-

oxigenase e então estocado ou transportado do enterócito por mecanismo similar ao do

ferro iônico (Siah et al., 2005)

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

Figura I - Mecanismo de transporte gastrintestinal do ferro. DMT1 (transportador de

metal divalente 1); Dcytb (ferri-redutase); Trf1 (receptor de transferrina 1). Trf2

(receptor de trasferrina 2)

Adaptado de : Siah et al., (2005).

Ferroportina é também a mediadora de transporte do ferro para fora do

hepatócito (Abboud et al., 2000) o qual é oxidado pela ceruloplasmina e liga-se à

transferrina (Randell et al., 1994) (figura 2).

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

Figura II - Mecanismo de transporte do ferro dentro dos hepatócitos

Adaptado de: Siah et al (2005).

O ferro é transportado e estocado por proteínas específicas (transferrina,

lactoferrina, ferritina e hemoproteínas) (Ferrali et al., 1992). Transferrina sérica, uma

glicoproteína monomérica de 80 kDa, é a transportadora do ferro no sangue e se liga no

ferro na forma férrica (Fe

) com alta afinidade (Ponka et al., 1998). Através de estudos

cinéticos e por termodinâmica, sabe-se que a transferrina pode estar presente no plasma

sob quatro formas: apotransferrina livre do ferro, transferrina diférrica totalmente

saturada e transferrina monomérica contendo ferro ligado ao terminal N ou terminal C

(Ponka et al, 1998). Em condições fisiológicas, somente 30% da transferrina está

saturada com ferro (Pantopoulos & Hentze, 2000).

A captação celular de ferro ocorre através dos receptores da transferrina na

superfície da célula. Íon férrico é reduzido para a forma ferrosa e liberada por um

endossomo no citosol. A fração de ferro liberada permanece ligada em quelatos de

baixo peso molecular, como citrato, ATP, pirofosfatos e ácido ascórbico e determinam a

quantidade de ferro da célula, conhecido como “pool lábil de ferro” (Pantopoulos &

Hentze, 2000). Excesso de ferro é seqüestrado pela ferritina, a principal proteína

intracelular de estocagem do ferro, a qual é composta de 24 subunidades de cadeias H e

L (21 e 19kDa, respectivamente) e podem estocar até 4500 átomos de ferro por

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

molécula (Ponka et al., 1998). A ferritina desempenha um papel chave na prevenção da

toxicidade porque ela tem a habilidade de seqüestrar milhares de átomos de ferro em

sua cavidade central, na forma solúvel, não tóxica e biodisponível (Lobreàux et

al.,1993). A incorporação do ferro na ferritina requer a atividade ferroxidase associada

com as subunidades H e o centro de nucleação associada com as subunidades L.

2.2 Regulação do Metabolismo do Ferro

No citosol existem duas proteínas que respondem a alterações na concentração

de ferro chamadas proteínas reguladoras do ferro (IRPs), que se ligam em mRNA

conhecidos como elementos responsivos ao ferro (IREs). Quando os níveis

intracelulares de ferro estão baixos, as IRPs ligam-se aos IREs presentes na região

flanqueadora 5’ do mRNA da ferritina e na região flanqueadora 3’ do mRNA do

receptor de transferrina, bloqueando a tradução do mRNA da ferritina e estabilizando o

do receptor de transferrina, prevenindo sua clivagem por uma endonuclease,

favorecendo sua tradução (Ponka,1999; Kaur & Andersen, 2004). A presença de

elementos responsivos ao ferro em regiões que codificam os mRNA da DMT-1 e

ferroportina sugere que a expressão dessas proteínas pode ser susceptível à regulação

pós-transcricional pelos elementos responsivos ao ferro (Gunshin et al., 2001).

Hepatócitos servem como estocagem e reservatórios de ferro, captando ferro da

dieta via circulação porta e quando há aumento na demanda do ferro, libera este na

circulação pela via ferroportina. A liberação do ferro mediada pela ferroportina, pelos

enterócitos, hepatócitos e macrófagos é reconhecida como determinante importante na

homeostase do ferro. A descoberta da hepcidina revelou um importante papel do

hepatócito na sensibilidade do status do ferro corpóreo e a modulação da liberação

celular do ferro mediada pela ferroportina.

Hepcidina é um polipetídeo com 25 resíduos de aminoácidos, produzida pelos

hepatócitos, e apresenta papel chave no metabolismo do ferro (Ganz , 2003). A

hepcidina regula dois passos chave no metabolismo do ferro, reciclando este nos

macrófagos (Deicher & Hörl , 2004). Estoques de ferro, atividade eritropoiética,

hemoglobina, disponibilidade de oxigênio e inflamação, regulam a absorção intestinal

do ferro e também regulam a expressão da hepcidina pelo fígado. Quando cada um

desses fatores sofre mudança, a absorção intestinal varia inversamente com a expressão

da hepcidina hepática. A hepcidina diminui a atividade funcional da ferroportina pela

ligação direta, levando à sua internalização pela superfície celular e sua posterior

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

degradação (Nemeth et al., 2004). No enterócito essa ação levará à diminuição da

transferência do ferro basolateral e sua absorção na dieta. No macrófago do

reticuloendotelial e no hepatócito a hepcidina leva à diminuição da exportação do ferro

e o aumento no seu estoque. Anormalidades na regulação da hepcidina têm sido

relacionadas com duas condições clínicas importantes: hemocromatose hereditária e

anemia da inflamação. As anormalidades da homeostasia do ferro observadas na

hemocromatose hereditária são opostas daquela observada na anemia da inflamação.

Hepcidina é inapropriadamente baixa em pacientes com hemocromatose hereditária,

enquanto há um aumento em pacientes com condições inflamatórias. Na

hemocromatose hereditária, há um aumento na absorção dietética do ferro, com

relativamente baixo ferro nos macrófagos do reticuloendotelial e um aumento na

saturação pelo ferro da transferrina circulante. Hepatócitos tornam-se liberadores de

ferro nesse cenário, presumivelmente porque a captação do ferro através da circulação

excede sua exportação mediada pela ferroportina. De modo oposto, na anemia da

inflamação, a retenção de ferro pelos enterócitos e macrófagos do reticuloendotelial

leva marcadamente à baixa saturação da transferrina, restrição da eritropoiese e

moderada anemia. Dessa forma a hepcidina oferece uma explicação unificada para as

anormalidades no metabolismo do ferro nessas duas condições clínicas comuns.

2.3 Situações em que Ocorre Excesso de Ferro

Apesar do sofisticado e complexo mecanismo regulatório do metabolismo de

ferro de forma a atender as demandas das células e ao mesmo tempo evitar seu

acúmulo, há algumas situações em que o excesso de ferro pode ocorrer. Excesso de

ferro ocorre principalmente em indivíduos com doenças hereditárias como

hemacromatose, caracterizada por uma sobrecarga de ferro maciça, causada pelo

aumento da absorção de ferro no duodeno com conseqüente acúmulo de ferro nos

tecidos acarretando danos irreversíveis aos órgãos. Em outras doenças hereditárias,

como na atransferrinemia onde se tem escassa transferrina circulante, e durante o

tratamento da talassemia. Talassemias são doenças genéticas em que a taxa de síntese

de uma ou mais cadeias da hemoglobina está diminuída. Pacientes não tratados morrem

de anemia na infância, mas podem ser mantidos com vida, com regulares transfusões

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

sangüíneas. Uma vez que cada unidade de sangue contém em torno de 0,2g de ferro,

pacientes tornam-se sobrecarregados com ferro e o pool lábil de ferro é drasticamente

aumentado. Isso é consistente com as seguintes observações sobre o excesso de ferro no

plasma: o pool de ferro lábil é detectado através de ensaio de bleomicina, a produção de

OH é estimulada, a proliferação de lipossomas de fosfolipídios é estimulada, a

transferrina é completamente saturada, e além disso, a apotransferrina é completamente

protegida (Fontecave & Pierre, 1993).

Existem situações menos drásticas onde o excesso de ferro pode ocorrer como

no caso da Suécia onde o governo obrigou a suplementação de ferro por 50 anos e 5%

dos homens tiveram níveis aumentados de ferro e 2% níveis iguais aos encontrados em

estágios iniciais de hemacromatose (Olsson et al., 1978; 1995). A alta ingestão de ferro

através do consumo de grandes quantidades de carne ou a ingestão de suplementos

nutricionais também é considerada causa potencial de excesso de ferro (Fleming et al.,

2002).

2.4 Estresse Oxidativo e Ferro

O metabolismo oxidativo é o principal suporte da vida aeróbica. Nutrientes

servem para produção de energia pela fosforilação oxidativa e formação de

intermediários no metabolismo, incluindo a incorporação de átomos de oxigênio através

do oxigênio molecular nas biomoléculas. A utilização do oxigênio em sistemas

biológicos inclui a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO), as quais podem

causar danos às moléculas biológicas. Dessa maneira, processos biológicos levam a

geração de produtos oxidantes, um foco interessante particular está na oxidação do

DNA, proteínas e lipídeos. Por outro lado, há uma estratégia de defesa contra danos

oxidativos incluindo antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos bem como resposta

adaptativa (Sies, 1993). No balanço entre oxidantes e antioxidantes em favor dos

primeiros potencialmente levará a degenerações e é chamado de estresse oxidativo

(Sies, 2000). O termo descreve a condição metabólica de células, órgãos, ou o

organismo inteiro caracterizando a oxidação generalizada.

Em baixos níveis, ERO medeiam as funções celulares via sinalização

intracelular, ativadas pelo estímulo que influenciam o estado redox celular. Mudanças

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

no estado de tióis intracelulares, especialmente a glutationa, desempenham um papel

chave na regulação da transcrição gênica (Wu et al., 2004). Dependendo da via de

geração ou a maior quantidade de ERO formadas, o fenômeno do estresse oxidativo

pode ser estresse metabólico oxidativo, estresse fotooxidante (Sies & Stahl, 2004),

estresse oxidativo dependente de medicamento ou estresse nitroativo (Sies, 2000). O

aumento no estresse oxidativo tem sido associado com doenças como diabetes, fibrose

cística, catarata ou infecções (Willcox et al., 2004).

Acredita-se que o excesso de ferro possa gerar estresse oxidativo, uma vez que

ele promove o aumento na concentração das ERO e nitrogênio. A toxicidade do ânion

superóxido (O

) e peróxido de hidrogênio (H

) aparecem pelas conversões

dependentes de ferro do radical hidroxil (

OH) que causam graves danos nas

membranas, proteínas e DNA (Halliwell & Gutteridge, 1984).

2.5 Efeito do Estresse Oxidativo no Metabolismo do Ferro

Estudos em lisados de fígados de ratos têm mostrado que H

ou O

sozinhos

têm fraca reatividade na proteína responsiva ao ferro-1 (IRP-1), mas a ação combinada

das duas espécies induz a inativação reversível da IRP-1 (Cairo et al., 1996). A

inativação da IRP-1 tem sido subseqüentemente observada em fibroblastos murinos

expostos em menadiona (Gehring et al., 1999), dioxina (Smith et al., 1998), forane

(Cairo et al.,1995) e ratos sujeitos à isquemia de reperfusão (Tacchini et al., 1997).

Assim, tem sido conclusivo que a regulação aumentada da atividade da IRP pode ser

uma resposta comum ao aumento da formação de H

e O

, levando uma diminuição

dos níveis dos receptores de transferrina enquanto há também o aumento dos níveis da

transferrina. Do mesmo modo a resposta poderá eventualmente reduzir o pool de ferro

lábil antes da conversão de H

e O

OH. O ponto fraco para essa hipótese é que

o O

pode ser responsável pela liberação do ferro da ferritina (Puntarulo & Cederbaum,

1996). Esse efeito pode expandir o pool de ferro lábil e agir na redução induzida pela

inativação da IRP-1/ síntese de ferritina. Esse efeito totalmente oposto pode ser

reconciliado através da suposição que a taxa de liberação de ferro incorporado na

apoferritina (recentemente sintetizada) excede a taxa de liberação do ferro pela ferritina

pré-existente (Cairo et al., 2002). O peróxido de hidrogênio não ativa a IRP-1 ligando

diretamente (Brazzalotto et al., 1999), mas ele induz a rápida ativação dos elementos

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

responsivos ao ferro ligando com habilidade em células intactas, assim os ampliam

extracelularmente (Pantopoulos et al., 1997). A ativação da IRP-1 pela H

acompanhada pela inibição da síntese da ferritina e pela estabilização do RNAm do

receptor da transferrina. Recentemente, foi proposto que a H

exógena atua através de

transdução de sinal na membrana (Muller et al., 2001).

IRP-2 é um alvo adicional para a produção de radicais de oxigênio sob

condições de estresse oxidativo. IRP-2 é facilmente degradada em fígados de ratos

expostos a depleção de glutationa ou isquemia de reperfusão (Tacchini et al., 1997) e

em células expostas em menadiona (Gehring et al., 1999). No entanto, IRP-2 não foi

afetada em células por pulsos exógenos de H

(Pantopoulos et al., 1995).

Correntemente há poucas evidências conclusivas que ambos IRP-1 e IRP-2 sejam alvos

em condições do aumento da formação de radicais livres na célula, promovendo nela

uma regulação que diminui redução do pool lábil de ferro e prevenindo a amplificação

do dano oxidativo.

2.6 Colesterol, Estresse Oxidativo e Aterosclerose

LDL oxidadas e os produtos gerados por esta oxidação estão associados com o

estresse oxidativo e podem acumular-se nas paredes arteriais e acelerar o processo de

aterosclerose. Em 1979, Chilsolm et al. reportaram que a oxidação da LDL provocava

danos nas células da parede arterial, sugerindo que a oxidação da LDL poderia ser

importante na aterogênese. Eles demonstraram também que a HDL inibia a citotoxidade

induzida pela LDL. Depois de duas décadas, esse grupo elucidou a base dessas

observações e estabeleceu a importância do papel dos produtos de oxidação do

colesterol, especialmente, os hidroperóxidos de colesterol (Colles et al., 2001). Em

1988 e 1999, trabalhos foram publicados indicando que LDL oxidadas estavam

presentes nas paredes arteriais de animais com aterosclerose (Haberland et al., 1988;

Palinski et al., 1989; Yla-Herttuala, 1989). Napoli et al.(1997) demonstraram que o

acúmulo de LDL oxidadas precedia a entrada dos monócitos nas paredes arteriais. Em

estudo em fetos humanos foi encontrado que as LDL estavam presentes e foram

oxidadas antes da entrada dos monócitos . HDL e seu principal componente estrutural,

apolipoproteína A1, podem prevenir a oxidação das LDL (Navab et al., 2004). Um

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

número de mecanismos moleculares pode aparecer depois da transferência de

hidroperóxidos de éster de colesterol (CEOOH) da LDL para HDL, num processo

parcialmente determinado pela atividade enzimática da proteína de transferência de

éster de colesterol (CETP) (Serdyuk & Morton, 1999). No entanto, o papel da CETP é

potencialmente aterogênico e inibidores de CETP (JTT-705 e torcetrapib) têm

mostrado como protetor em várias triagens clínicas (Brousseau et al, 2004). Porém deve

ser lembrado que o mecanismo de transferência do colesterol pela HDL da

apolipoproteína B (num processo que leva a troca de triacilgliceróis) opera em ambas as

vias e depende da concentração das lipoproteínas ricas em triacilgliceróis (Serdyuk &

Morton, 1999). A renovação da HDL especialmente é mais importante que sua alta

concentração na proteção vascular. Em particular, a ação da CETP na HDL facilita a

esterificação pela lecitina colesterol acil transferase (LCAT) e assim o efluxo do

colesterol. A ação combinada CETP e lipase hepática na HDL madura (HDL

) gera

frações de HDL que contêm baixas concentrações de lipídios e são melhores aceptoras

de colesterol (Brousseau et al., 2004).

O mecanismo de formação da LDL oxidada compreende no mínimo três passos.

O primeiro consiste nas partículas de LDL com ácido araquidônico e hidroperóxidos de

ésteres de colesterol (CEOOH) (Navab et al, 2000). O segundo passo, a LDL atravessa

o espaço subendotelial, onde há um acúmulo adicional de espécies reativas de oxigênio.

O terceiro passo envolve a oxidação de fosfolipídeos das LDL através da reação com as

altas concentrações de espécies reativas de oxigênio. A atividade da paraoxonase

presumivelmente interfere no primeiro desses passos.

Numerosos estudos clínicos e epidemiológicos têm relacionado fortemente a

diminuição da concentração plasmática da lipoproteína de alta densidade (HDL) com o

desenvolvimento de doença arterial coronariana (DAC) (Young et a.l,2004). Baixa

concentração de HDL circulante é um fator de risco independente para DAC (Assmann

& Nofer, 2003). Esse efeito também é observado na síndrome metabólica (Brinton,

2003), que inclui resistência à insulina (Rashid et al., 2003), intolerância à glicose

(Borggreve et al., 2003) e hipertensão arterial (Schillaci et al., 2001). Além disso, o

aumento das concentrações plasmáticas das lipoproteínas aterogênicas, incluindo a

VLDL e a LDL, está freqüentemente associado à diminuição da concentração da HDL.

O efeito antiaterogênico da HDL se dá, sobretudo, devido à sua propriedade de

transportar lipídios, principalmente ésteres de colesterol, dos tecidos periféricos para o

fígado, o que é conhecido como transporte reverso do colesterol (TRC). Contudo, outras

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

ações protetoras importantes da HDL, além do TRC, têm sido descritas em diversos

modelos experimentais e estudos epidemiológicos. Essas ações incluem: proteção

antioxidante, mediação do efluxo de colesterol, inibição da expressão de moléculas de

adesão celular, ativação de leucócitos, indução da produção de óxido nítrico (NO),

regulação da coagulação sangüínea e da atividade plaquetária.

2.6 Paraoxonase

A paraoxonase/arilesterease humana (PON-1) (EC3.1.1.2) é uma glicoproteína

cálcio dependente que está presente ligada às partículas de HDL. Investigações têm

demonstrado que a paraoxonase sérica diminui o risco de doença arterial coronariana

através da destruição de moléculas proinflamatórias envolvidas no início da progressão

das lesões ateroscleróticas (Kujiraoka et al., 2000). O potencial antiaterogênico da

paraoxonase vem de sua capacidade de hidrolisar lipídeos oxidados, fosfolípides, e

hidroperóxidos de éster de colesterol (CEOOH), prevenindo assim que eles se

acumulem nas partículas de LDL. Além da inibição da oxidação da LDL, há evidências

em animais e modelos in vitro que a paraoxonase pode proteger a HDL contra sua auto-

oxidação e assim manter sua integridade (Oda et al., 2002). Devido a HDL ter funções

atero-protetoras, a qual remove o excesso de colesterol dos tecidos (transporte reverso

do colesterol) e pode inibir o processo inflamatório, a preservação da partícula de HDL

pode ser o papel benéfico da paraoxonase.

No sangue, a paraoxonase pode hidrolisar homocisteína tiolactona, um

metabólito da homocisteína (Jakubowski, 2000). Homocisteína tiolactona pode ter

efeitos adversos na síntese de proteínas e pode levar à disfunção endotelial e dano

vascular (Jakubowski, 2005). A detoxicação da homocisteína tiolactona pode ser a

função cardioprotetora da paraoxonase.

Resultados em modelos animais demonstram a proteção antiaterogênica da

PON. Camundongos deficientes em PON não protegiam suas LDL do processo de

oxidação (Shih et al., 1998), enquanto camundongos transgênicos com HDL isoladas de

humanos (tinham de duas a quatro vezes aumento de PON no plasma) eram mais

protegidos contra a oxidação das LDL de maneira dose dependente (Tward et al., 2002).

Outra forte evidência no papel da PON, é que camundongos deficientes de PON são

mais propensos a desenvolver a aterosclerose que o tipo selvagem, quando alimentados

com uma dieta rica em gordura e colesterol.

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

2.7 Fibratos e hipercolesterolemia

Os fármacos para o tratamento da hipercolesterolemia podem agir de duas

formas: inibindo a síntese de colesterol ou afetando a absorção gastrintestinal do

mesmo. As vastatinas podem inibir a síntese de colesterol pela da inibição da enzima

chave da síntese do colesterol, a 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A (HMG CoA)

redutase. Esta classe de fármacos vem sendo empregada com grande sucesso desde o

seu surgimento e já demonstrou efeitos benéficos na redução da morbimortalidade

cardiovascular (Gould et al., 1998). Apesar deste formidável avanço, as pesquisas ainda

prosseguem e novas vastatinas estão sendo avaliadas.

Outra classe de fármacos promissora é a das 2- azetidinonas, potentes inibidores

da absorção intestinal do colesterol dietético e biliar. Seu mecanismo de ação ainda não

se encontra plenamente esclarecido, porém têm demonstrado ser bem tolerados e

eficazes em doses baixas. Parecem inibir o transportador responsável pela captação do

colesterol nas células intestinais. Um representante desta classe, já comercializado no

Brasil é o ezetimibe. Pode ser usado isoladamente ou em associação com as vastatinas e,

diferentemente de outros agentes de ação sistêmica, não interferem na absorção das

vitaminas lipossolúveis (Salen et al., 2004)

Fibratos e seus derivados (Bezafibrato, fenofibrato, clofibrato, gemfibrozil) são

ligantes sintéticos dos PPAR-α. PPARs ativados heterodimerizam com o receptor

retinóide X ativado (RXR) e se ligam especificamente aos Elementos Responsivos de

Proliferação dos Peroxisomos (PPREs), os quais estão localizados no promotor de genes

alvos. PPREs são constituídos de repetições diretas (DR) de seqüências hexaméricas as

quais são separadas por um ou dois nucleotídeos (DR1 e DR2). Enquanto a geometria

do PPRE assegura a especificidade do heterodímero PPAR/RXR, PPREs RD1 e RD2

são também reconhecidos por homodímeros RXR ou heterodímeros de receptores de

ácido retinóico (RAR)/RXR, sugerindo que a ligação de RARs e RXRs podem

influenciar no controle metabólico (Ijpenberg et al., 2004). A ligação dos PPARs nos

PPREs induz a expressão de genes alvos (figura III).

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

Figura III - Esquema sumarizado da ativação do PPAR. AR - ácido retinóico; PPAR -

receptor ativado da proliferação peroxisomal; RXR - receptor X retinóide; PPRE -

elementos responsivos da proliferação peroxisomal; Adaptado de Schoonjans et al.,

(1996)

Quando esses elementos de ativação se ligam a um receptor do PPAR-α, situado

no gene que regula o metabolismo do HDL-colesterol, ocorre aumento da transcrição

dos genes da apo A-I (apoproteína A-I), apo A-II (apoproteína A-II), LPL (lipoproteína

lipase) e SR-B1 (receptores scavenger B1) , além de aumento da produção, maturação e

catabolismo do HDL-colesterol. A estimulação do SR-B1 favorece ainda a saída de

colesterol dos macrófagos (Tontonoz & Nagy, 1999) .Ácidos graxos de cadeia longa

saturados e insaturados e seus derivados eicosanóides também são ativadores naturais

dessa subclasse de receptores.

Dados pré-clínicos sugerem que o PPARα tem papel no controle de peso

corporal, apoiando o uso de agonistas de PPARα no tratamento da obesidade (Fu et

al., 2003). Camundongos deficientes de PPARα exibem uma resposta prejudicada ao

estímulo inflamatório (Devchand et al.,1996). Várias triagens clínicas demonstram a

eficiência dos fibratos na diminuição de marcadores inflamatórios e reduzindo a

progressão das lesões ateroscleróticas das coronárias. A habilidade do PPARα de

melhorar os sintomas da síndrome metabólica (obesidade visceral, resistência à insulina,

dislipidemia, aterosclerose e inflamação) sugere que os PPARα podem ser benéficos na

prevenção ou tratamento do diabetes mellitus tipo 2 e complicações associadas.

Triagens clínicas bem como dados in vitro fornecem evidências convincentes que os

PPARα atuam como fatores antiaterogênicos por meio de interferências em múltiplos

estágios do processo da aterosclerose. Resultados de modelos animais têm rendido

OLIVEIRA,MR Revisão da Literatura

resultados conflitantes, os quais podem ser devido às diferenças naturais em modelos, e

espécies diferentes encontradas em metabolismos de roedores e humanos (Tordjman et

al., 2001), (Duez et al., 2002) e (Li et al., 2004). Na ausência de estímulo inflamatório,

PPARα podem promover resposta pró-aterogênica. A expressão no nível de proteínas

quimiotáticas de monócitos 1 (MCP-1) e interleucina 8 (IL-8) em células endoteliais

sofrem upregulation pela ativação do PPARα (Lee et al., 2000). Além disso ligantes de

PPARα exercem efeito gerando espécies reativas de oxigênio (ERO) em macrófagos

não ativados (Teissier et al., 2004). Além disso fibratos aumentam Cu-Zn superóxido

dismutase e aumentam NADPH oxidase em células endoteliais, aumentando

potencialmente a oxidação das LDL (Inoue et al., 2001). PPARα tem papel crítico no

controle do ciclo do colesterol em macrófagos. A expressão de ABCAl é estimulada

pelo PPARα em células espumosas no receptor X hepático de maneira dependente,

promovendo o efluxo do colesterol mediado pela Apo Al. SR-Bl, o qual tem papel em

ambos, captação de HDL-CE pelo fígado e efluxo de colesterol pelos macrófagos,

sofrem upregulation pelos ligantes de PPARα em macrófagos (Chinetti et al., 2000)

favorecendo a remoção do colesterol.

OLIVEIRA,MR Objetivos

3- Objetivos

3.1- Objetivo geral

Avaliar o efeito do bezafibrato e ferro sobre o perfil sérico de lipídios, defesas

antioxidantes e atividades das aminotransferases em hamsteres hipercolesterolêmicos.

3.2 – Objetivos específicos

1. Avaliar o efeito da dieta hipercolesterolemiante sobre a atividade das

aminotransferases e concentração de metabólitos séricos, peso corporal e de órgãos em

hamsteres.

2. Nos animais submetidos ao tratamento com bezafibrato, ferro dextran ou

ambos, avaliar:

• Os níveis de ferro no soro e fígado;

• O perfil de lipídios no soro;

• Defesas antioxidantes: atividade da catalase, paraoxonase e concentração

de sulfidrilas;

• A função hepática pela determinação das atividades das

aminotransferases e outros metabólitos séricos.

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

4. Materiais de Métodos

4.1 Animais

Foram utilizados 45 hamsteres, Golden Syrian, albinos, machos, com cerca de

60 dias e 100g, provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental do Departamento

de Alimentos, Escola de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto. Durante o

experimento, os animais foram mantidos de acordo com as normas descritas em

Canadian Council on Animal Care (1984)

4.2 Dietas

Segundo as recomendações AOAC, 1980, foi preparada a dieta controle. A

quantidade de óleo de soja, colesterol e fibra da dieta hipercolesterolemiante foram

diferentes da dieta controle. As dietas foram isocalóricas, para isso, uma maior

quantidade de fibras foi adicionada na dieta hipercolesterolemiante. As dietas foram

preparadas no Laboratório de Nutrição Experimental do Departamento de Alimentos,

Escola de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto e foram acondicionadas em

vasilhas plásticas e armazenadas a 20

C negativos. O excesso de ferro foi obtido com

injeções de ferro dextran. As dietas, durante o experimento foram oferecidas ad libitum.

Quadro 1

Composição das dietas controle e hipercolesterolemiantes em gramas para

cada 1000g de dieta

Controle Hiper Hiper

+Bezafibrato

Caseína 120 120 120

Mistura de sais

50 50 50

Mistura de

Vitaminas

10 10 10

Óleo de soja 80 170 170

Colesterol - 5 5

Colina 0,4 0,4 0,4

Celulose 10 120 120

Amido 729,6 524,6 524,1

Bezafibrato - - 5

Calorias 4.118,4 4.153,4 4.151,4

Mistura de Sais (expresso por g/Kg da mistura): NaCl – 139,3/ MgSO

.7H

O – 57,3/ CaCO

– 381,4/

MnSO

O/ - 4,01/ FeSO

.7H

O – 27,0/ ZnSO

.7H

O – 0,548/ CuSO

.5H

O – 0,477/ CoCl

.6H

O –

0,023/ KH

. – 389,0. Mistura de Vitaminas (expresso em g/Kg da mistura): acetato de retinol –

2.000.000 UI/ colecalciferol – 200.000 UI/ ácido p-amino benzóico – 10,00/ I- inositol – 10,00/ niacina –

4,00/ pantotenato de cálcio – 4,00/ riboflavina – 0,80/ tiamina HCl – 0,50/ piridoxina HCl – 0,50/ ácido

fólico – 0,20/ biotina – 0,40/ vitamina B

– 0,003/ α - tocoferol – 10.000 UI sacarose qsp – 1000.

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

4.3 - Delineamento Experimental

45 Hamsteres Golden Syrian machos, foram divididos em cinco grupos com

nove animais cada de acordo com a dieta recebida, bezafibrato e injeções de ferro

dextran intraperitoniais: grupo C recebeu dieta controle; grupo H recebeu dieta

hipercolesterolemiante; grupo HFE recebeu dieta hipercolesterolemiante e injeções de

ferro dextran (25 mg via intraperitoneal divididas em cinco doses); grupo HFI recebeu

dieta hipercolesterolemiante mais bezafibrato na dieta (0,5%); grupo HFEFI recebeu

dieta hipercolesterolemiante mais ferro dextran e bezafibrato na dieta. As injeções de

ferro dextran foram administradas diariamente a partir do 28

dia de experimento,em 5

doses de 5mg, totalizando 25mg de ferro. Nos grupos que não receberam ferro, foram

administradas injeções de salina. Os animais dos grupos HFI e HFEFI receberam o

bezafibrato a partir do 42

dia de experimento. Após 60 dias de experimento os animais

foram anestesiados e sacrificados, os parâmetros bioquímicos e stress oxidativo foram

determinados. Os animais do grupo C, foram utilizados para certificar o efeito da dieta

hipercolesterolemiante, garantindo assim que a hipercolesterolemia estivesse presente

nos hamsteres

4.4 - Dosagem de Parâmetros Séricos

Depois de 12 horas de jejum, os animais foram anestesiados com éter, o sangue

foi coletado através de plexo axilar e centrifugado por 15 minutos a 3000g. Após a

centrifugação o soro foi removido e diversas dosagens foram feitas em até 3 dias. As

dosagens de ferro sérico, capacidade de ligação de ferro, triacilgliceróis, colesterol total,

colesterol HDL, proteínas totais, albumina, alanina aminotransferase (ALT), aspartato

aminotransferase (AST), glicose e uréia foram feitas utilizando-se kits comerciais da

Labtest, MS10009010021, Lagoa Santa, MG, Brasil, seguindo seus respectivos

protocolos. As atividades de paraoxonase (arilesterase), paraoxonase (paraoxon) foram

determinadas como descrito por Beltowski et al., em 2002 e a atividade da catalase foi

determinada seguindo protocolos descritos por Beutler et al., (1975) e as concentrações

de sulfidrilas livres e sulfidrilas totais foram feitas seguindo a técnica utilizada por

Sedlak et al. (1968).

O fígado, coração e os rins foram retirados e pesados.

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

4.4.1 - Colesterol total

O colesterol total foi dosado pelo método enzimático – trinder.

Os ésteres de colesterol são hidrolisados, pela colesterol esterase, a colesterol

livre e ácido graxo. A colesterol oxidase promove a oxidação de colesterol livre para a

colest-4-en-ona e peróxido de hidrogênio. O fenol e a 4 aminoantipirina, contidos no

reagente, na presença de peroxidase e peróxido de hidrogênio formam a

antipirilquinoneimina, que tem absorbância máxima em 500nm. Além do reagente de

cor, o Kit fornece tampão e padrão de colesterol com concentração de 200mg/dL.

4.4.2 - Colesterol HDL

O colesterol ligado à lipoproteína de alta densidade (HDL) é determinado após

centrifugação no sobrenadante de uma reação onde as lipoproteínas de densidade muito

baixas (VLDL) e as lipoproteínas de densidade baixa (LDL) são precipitadas com ácido

fosfotúngstico e cloreto de magnésio, que estão contidos no precipitante do Kit.

Posteriormente o colesterol HDL é dosado como no método para colesterol total.

Foram misturados 125 µL de soro a 125 µL de precipitante e misturado por 30

segundos vigorosamente, depois foi centrifugado por 15 minutos a 3000 g para se obter

o sobrenadante límpido. O sobrenadante foi utilizado para se dosar o colesterol como no

método para colesterol total. O padrão fornecido pelo Kit tinha concentração de

20mg/dL.

4.4.3 - Colesterol não HDL

Foi calculado subtraindo o colesterol HDL do colesterol total.

4.4.4 - Triacilgliceróis

Por meio da lipase lipoprotéica, o glicerol é liberado dos triacilgliceróis e

convertido em glicerol - 3- fosfato pela gliceroquinase. O glicerol – 3- fosfato na

presença da glicerolfosfato oxidase é oxidado a diidroxicetona e peróxido de

hidrogênio. Este peróxido de hidrogênio sofre uma reação de acoplamento com a 4-

aminoantipirina e 4-clorofenol catalisada pela peroxidase, produzindo a

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

antipirilquinoneimina que tem máximo de absorbância em 500nm. Um padrão de

glicerol correspondente a 200mg/dL de triacilgliceróis foi fornecido.

4.4.5 - Ferro Sérico

Em pH ácido os íons férricos são dissociados da transferrina e reduzidos a íons

ferrosos por ação da hidroxilamina. A intensidade da cor magenta brilhante formada

após a adição de Ferrozine tem absorbância máxima em 560 nm e é proporcional à

quantidade de ferro na amostra. Um padrão de ferro correspondente a 500µg/dL foi

fornecido.

4.4.6 - Capacidade de ligação de ferro

Uma alíquota de ferro com concentração conhecida (500µg/dL) foi incubada

com o soro em um tampão de pH 8,3. Ocorre então a saturação dos sítios disponíveis

para o ferro na proteína transportadora (transferrina). O ferro livre forma um complexo

magenta brilhante com a adição de Ferrozine. Através dos cálculos, encontra-se a

capacidade latente de ligação de ferro (CLLF), que são os sítios disponíveis para ligação

de ferro na transferrina. O procedimento adotado foi o seguinte: 500 µL de tampão

foram adicionados aos tubos de teste e branco, 170 µL de padrão foram adicionados aos

tubos de teste e padrão, foram adicionados 340 µL de água destilada no branco, 120 µL

nos tubos de teste e 1670µL no tubo padrão e 50µL de soro nos tubos de amostra .

Foram misturados e incubados à 37

C em banho-maria por 10 minutos. O aparelho foi

zerado com o branco e a 560 nm foi obtida a absorbância A1. Logo após foram

adicionados 20 µL de ferrozine. Foram misturados e incubados a 37

C em banho-maria

por 10 minutos. E determinadas as absorbâncias (A2) do teste e do padrão a 560 nm.

Para se calcular a capacidade latente de ligação do ferro foi adotada a seguinte fórmula:

Após calcula-se a capacidade de ligação total de ferro (CTLF), a insaturação de

transferrina (IST%) e transferrina.

CLLF = 500 – [(A2-A1) x 500.] / Abs. Padrão

CTLF = Ferro sérico + CLLF

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

4.4.7 - Proteínas Totais

As proteínas do soro reagem com o reagente biureto, os íons de cobre contidos

nele reagem com as ligações peptídicas das proteínas séricas, assim a quantidade de

proteínas da amostra é proporcional à cor formada, a qual tem absorbância máxima em

545 nm. O Kit fornece um padrão com concentração 4,0 g/dL.

4.4.8 - Aspartato aminotransferase (AST)

Sua atividade é determinada pelo método cinético de tempo fixo e medição de

ponto final – Reitman e Frankel. Ela promove a transferência de grupamentos amina de

alfa aminoácidos para acetoácidos, que são contidos no substrato fornecido pelo Kit.

L- Aspartato + α-cetoglutarato AST Glutamato + oxalacetato.

O oxalacetato reage com a 2,4 difenilhidrazina contida no reagente de cor e

produz hidrazona que possui cor intensa em meio alcalino, que é conseguido quando

adiciona-se o NaOH. A solução tem absorbância máxima em 505 nm.

O kit também contém um padrão com concentração de 2mmol/L , com o qual foi

construída uma curva para obtenção das atividades enzimáticas.

A curva de calibração foi realizada seguido a metodologia do fabricante Labtest.

4.4.9 - Alanina aminotransferase (ALT)

Semelhante ao procedimento seguido em AST (descrito anteriormente), há

somente a mudança no substrato, onde o aspartato é substituído pela alanina e segue-se

a seguinte reação.

Alanina + Cetoglutarato ALT Glutamato + piruvato.

IST% = Ferro sérico x 100 /CTLF

Transferrina = CTLF x 0,70

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

O piruvato formado reage com a 2,4 difenihidrazina , contida no reagente,

produzindo a hidrazona. Com a adição de hidróxido de sódio obtém coloração máxima,

medida em 505 nm. O Kit também fornece um padrão possui concentração de 2mmol/L.

4.4.10 - Glicose

Usa-se um método cinético ou de ponto final – trinder.

Glicose + O

+ H

O glicose oxidase ácido glicônico + H

A glicose é oxidada pela glicose oxidase (GOD) formando ácido glicônico e

peróxido de hidrogênio. Este reage com 4- aminoantipirina e fenol e pela ação da

peroxidase (POD) produz, através de uma reação oxidativa de acoplamento, a

antipirilquinoneimina vermelha cuja cor, medida em 505 nm, é proporcional à

concentração de glicose na amostra. O Kit também fornece um padrão com

concentração de 100mg/dL.

2 H

+ 4 aminoantipirina + fenol POD antipirilquinoneimina + 4

4.4.11 - Albumina

O procedimento utiliza o método de ponto final Verde de Bromocresol.

A albumina tem a propriedade de se ligar a uma grande variedade de ânions e

moléculas complexas de corante. Esse sistema baseia-se no desvio do pico de

absortividade máxima do verde de bromocresol, contido no reagente de cor, quando se

liga à albumina. A cor formada é proporcional à concentração de albumina na amostra e

é medida em 630 nm. O kit fornece um padrão de 3,8g/dL.

4.4.12 - Uréia

A uréia é hidrolisada pela urease, fornecida no Kit, a íons amônio e CO

. Os

íons amônio reagem, em pH alcalino, com salicilato e hipoclorito de sódio sob a ação

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

catalisadora do nitroprussiato de sódio, para formar azul de indofenol, a intensidade da

cor formada é proporcional à quantidade de uréia na amostra e tem absortividade

máxima em 600 nm.

4.4.13 - Determinação de radicais sulfidrilas

A concentração de grupos sulfidrilas (SH), os grupos sulfidrilas ligados a

proteína e os grupos sulfidrilas ligados a compostos de baixo peso molecular e

chamados de sulfidrilas livres, foram determinados usando ácido 5,5’-Ditio-bis(2-

nitrobenzoico) - DTNB (reagente de Ellman) segundo Sedlak et al , (1968). Os grupos

tióis reagem com o DTNB formando um composto que tem absorbância máxima em

412nm. Para se determinar a concentração dos grupos sulfidrilas livres, as proteínas são

precipitadas usando ácido tricloroacético (TCA) 10% p/v, e é usado o sobrenadante para

a dosagem.

Para se determinar o SH total foram misturados 40 µL de soro, 150 µL de

Tris.HCl 30mM pH 8,2, 50 µL de DTNB (Sigma) e 800 µL de metanol. Centrifugou-se

a 3000g por 5 minutos e foi feita a leitura em 412 nm no espectrofotômetro Fenton 600.

Para se determinar o SH livre foram utilizados 200 µL de amostra, 200 µL de

ácido tricloroacético (TCA), centrifugado por 15 minutos a 13.000 rpm, Após esse

procedimento foram colocados 150 µL do sobrenadante em um tudo de ensaio,

adicionou-se 600 µL de TrisHCl pH 8.9, 60 µL de DTNB, e foi feita a leitura a 412 nm

no espectrofotômetro.

Foi feita uma curva padrão para o SH livre e para o SH total usando glutationa

estoque (20mM) que foi diluída em Trietanolamina-HCl (TEA), preparada com 1,33

mL de TEA em 500 mL de água destilada. Para se obter a quantidade de SH ligado às

proteínas foi subtraída o SH total do SH livre. As concentrações são obtidas em µmol/L.

4.4.14 - Paraoxonase – atividade arilesterase

A atividade arilesterase da paraoxonase foi determinada como previamente

descrito por Beltowski J et al, (2002), tendo como base a velocidade de hidrólise do

fenilacetato.

Para o procedimento do teste, foi preparada uma solução contendo 1µL de

fenilacetato e 1500 µL de Tris HCl 9mM pH 8, dessa solução foi retirado 0,5mL e

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

misturados com 2mL de Tris HCl 9mM pH 8, contendo CaCl

0,9mM. Foram

colocados 5 µL de soro e a absorbância foi monitorada a 270nm e obtida em 3 minutos

exatamente. O branco foi feito como descrito acima, porém sem amostra e foi subtraído

das absorbâncias obtidas. Foi usado o coeficiente de extinção molar, do fenilacetato,

1.310 (M

-1

) e os resultados foram expressos em U/mL, onde uma U hidrolisa 1

µmol de fenilacetato por minuto.

C = A/ε

C = Concentração

A = Absorbância

ε = Coeficiente de extinção molar

4.4.15 - Paraoxonase - atividade paraoxonase

A atividade paraoxon da paraoxonase foi determinada como previamente

descrito por Beltowski J et al, (2002), tendo como base a velocidade de hidrólise do

paraoxon.

Inicialmente preparou-se uma solução contendo: 4,8mL de tampão

glicina/NaOH pH 10,6, CaCl

0,9 mM, 1,06 mL de paraoxon. Para cada amostra

utilizou-se 780 µL dessa solução e adicionou-se 20 µL de plasma heparinizado,

homogeneizou-se a solução, colocou-se no espectrofotômetro em 412 nm e fez-se três

leituras, a cada minuto, obtendo-se a liberação do para-nitrofenol por minuto. O branco

foi feito como descrito acima, porém sem amostra e foi subtraído das absorbâncias

obtidas. Foi usado o coeficiente de extinção molar do paraoxon, 18290 M

–1

. Os

resultados foram expressos em U/mL; 1 U da enzima hidrolisa 1 µmol de paraoxon por

minuto.

4.4.16 - Catalase

A atividade da catalase foi determinada baseado na sua capacidade de

hidrolisar o peróxido de hidrogênio (H

) em água e oxigênio molecular.

Em um tubo de ensaio colocou-se 900 µL de H

10 mM, 50 µL de tampão

fosfato pH 7,2, 40 µL de H

O destilada e 10 µL do soro. Homogeneizou-se a solução,

zerou-se o espectrofotômetro a 240 nm e determinou-se as absorbâncias a cada minuto,

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

durante cinco minutos. Foi usado o coeficiente de extinção molar do H

, 39,4 M

–1

. Os resultados foram expressos em µkat; 1 µkat da enzima hidrolisa 1 mol de H

por minuto.

4.4.17 - Digestão e dosagem de ferro no fígado

Usando o método de orto-fenantrolina, de acordo com a AOAC (1980), foi

dosado o ferro nos tecidos.

Cerca de 100mg de tecido foram colocados em tubos de ensaio, juntamente com

0,5 mL de ácido nítrico concentrado. Em seguida, os tubos foram colocados no digestor

Kieldahl a 110ºC de modo que ocorresse a digestão dos tecidos e a evaporação total do

ácido. Posteriormente o resíduo foi ressuspendido com 2 mL de ácido clorídrico

concentrado, esse material foi transferido para um balão volumétrico, com capacidade

para 10 mL e o volume foi completado com água deionizada.

A 0,5 mL da solução obtida foram adicionados 200µL de solução de

hidroxilamina 10%, 4,1 mL de tampão acetato 4M pH 3,5 e 200µL de orto-fenantrolina

0,1%. Foi feito um branco para leitura no espectrofotômetro contendo 0,5 mL de água

deionizada, 200µL de hidroxilamina, 4,1 mL de tampão acetato pH 3,5 e 200µL de orto-

fenantrolina. A leitura foi feita a 510 nm. Os valores obtidos em unidades convencionais

(µg/dL) foram transformados em unidades internacionais (µmol/L), pela multiplicação

por 0,179.

OLIVEIRA,MR Materiais e Métodos

4.5- Análise Estatística

Os resultados foram expressos com média ± desvio padrão. Para a comparação

entre os grupos controle e hiper, foi utilizado o teste t de student com nível de

significância de 95% (p<0,05). Os resultados dos grupos H, HFE, HFI e HFEFI foram

analisados pela ANOVA, análise univariada. Quando as alterações foram significativas,

o teste de Tukey foi feito para se determinar as diferenças específicas entre as médias. A

diferença de p<0,05 foi considerada significativa.

OLIVEIRA,MR Resultados

5. Resultados

5. 1 Ensaio - 1. Efeito da dieta hipercolesterolemiante (H) sobre enzimas,

metabólitos séricos, pesos corporal e de órgãos em hamsteres alimentados

com dietas controle e hipercolesterolemiante

5.1.1 Capacidades Total e Latente de Ligação ao Ferro, Ferro Sérico e Índice de

Saturação da Transferrina e ferro hepático.

Os hamsteres que receberam diferentes dietas sofreram modificações em vários

parâmetros envolvidos no metabolismo do ferro (Tabela 1). Com relação à Capacidade

Total de Ligação ao Ferro (CTLF), os animais que receberam a dieta hiper (grupo H)

tiveram uma redução de cerca de 34%, quando comparados aos animais que receberam

a dieta controle (grupo C). Já os níveis de ferro sérico foram maiores no grupo H,

aumento de cerca de 31%. A Capacidade Latente de Ligação ao Ferro (CLLF) foi

reduzida em torno de 44 % com a dieta hiper e o Índice de Saturação da Transferrina

(IST) foi duas vezes maior nos animais do grupo H.

Tabela 1. Capacidade Total de Ligação ao Ferro (CTLF), Ferro Sérico, Capacidade

Latente de Ligação ao Ferro (CLLF) e Índice de Saturação da Transferrina (IST), de

hamsteres alimentados com dieta controle (C) e hipercolesterolemiante (H)

1,2

Ferro µg/dL CLLF µg/dL CTLF µg/dL

IST (%)

169,41 ± 17,35

1006,86 ± 65,41

1182,18 ± 65,84

14,59 ± 1,34

208,04 ± 74,97

621,49 ± 193,84

829,53 ± 189,14

26,12 ± 11,52

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

A dieta hipercolesterolemiante reduziu os estoque de ferro hepático (Figura 1)

onde os animais que receberam a dieta controle tiveram 2,7 vezes mais ferro no fígado

quando comparados com aqueles que receberam a dieta hiper.

OLIVEIRA,MR Resultados

C H

g/100 mg de tecido

Figura 1. Ferro no fígado de hamsteres alimentados com dieta controle (C) e

hipercolesterolemiante (H). Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05);

n = 9.

5.1.2 - Perfil lipídico.

A dieta hipercolesterolemiante provocou o aumento de cerca de 94%do

colesterol total no nosso modelo animal (Tabela 2). Tanto a fração HDL-colesterol,

quanto a não HDL-colesterol foram maiores nos grupos H, quando comparadas ao

grupo C. Nos Triacilgliceróis, a dieta não influenciou significativamente os resultados.

Tabela 2. Concentração de Colesterol Total, Triacilgliceróis , Lipoproteína de Alta

Densidade (HDL) e Colesterol não HDL em de hamsteres alimentados com dieta

controle (C) e hipercolesterolemiante (H)

1,2

Triacilgliceróis

(mg/dL)

Colesterol Total

(mg/dL)

HDL (mg/dL) Não HDL (mg/dL)

151,33 ± 55,55

132,7 ± 26,62

45,34 ± 23,45

87,36 ± 31,52

112,99 ± 20,93

257,06 ± 64,75

69,74 ± 7,89

187,32 ± 68,58

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

OLIVEIRA,MR Resultados

5.1.3 - Defesas antioxidantes

Os hamsteres que receberam dietas controle (C) e hipercolesterolemiante (H)

não apresentaram diferenças significativas em relação aos parâmetros PON

(fenilacetato) e catalase (Tabela 3). Os hamsteres do grupo H apresentaram redução

significativa (p<0,05) na atividade da PON (paraoxon) em cerca de 36%.

Tabela 3. Atividade da Paraoxonase (PON-fenilacetato), Paraoxonase- (PON -

Paraoxon), Catalase de hamsteres alimentados com dieta controle (C) e

hipercolesterolemiante (H)

1,2

PON fenilacetato (U/mL) PON paraoxon (U/mL) Catalase (U/mL)

934,29 ± 269,45

70,62 ± 11,38

19,87 ± 4,39

988,02 ± 110,32

45,46 ± 6,75

24,75 ± 5,27

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

Com relação às sulfidrilas totais, a dieta Hiper também teve efeito e nesse

parâmetro, a redução causada pela dieta foi em torno de 27% (Tabela 4). O mesmo

ocorreu para as sulfidrilas ligadas à fração protéica, onde a redução foi de 52%. Já para

as sulfidrilas livres a dieta não teve efeito.

Tabela 4. Concentração de sulfidrilas totais, sulfidrilas livres e sulfidrilas ligadas à

fração protéica em hamsteres alimentados com dieta controle (C) e

hipercolesterolemiante (H)

1,2

Sulfidrilas Totais

(µmol/L)

Sulfidrilas livres

(µmol/L)

Sulfidrilas Fração

Protéica(µmol/L)

251,41 ± 57,51

50,55 ± 3,86

200,86 ± 55,9

183,11 ± 15,39

50,42 ± 3,66

132,13 ± 17,42

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

5.1.4 – Atividade das aminotransferases

A dieta hipercolesterolemiante não alterou os valores da atividade da AST

(aspartato aminotransferase) e da ALT (alanina aminotransferase) (Tabela 5).

OLIVEIRA,MR Resultados

Tabela 5. Atividades séricas das aminotransferases AST e ALT de hamsteres

alimentados com dieta controle (C) e hipercolesterolemiante (H)

1,2

AST (aspartato aminotransferase) U/L ALT (alanina aminotransferase) U/L

19,65 ± 4,11 21,04 ± 5,05

17,27 ± 3,61 24,51 ± 4,75

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; n = 9; 2. não foram encontradas

diferenças significativas (p>0,05).

5.1.5 – Albumina, proteínas totais, glicose, bilirrubinas e uréia

A glicemia dos hamsteres do grupo H apresentou um aumento significativo

(cerca de 29%) em relação ao grupo C (Tabela 6). Para os valores de Albumina,

Proteínas Totais, Bilirrubinas, não foram encontradas diferenças significativas entre os

grupos.

Tabela 6. Concentração de Albumina, Proteínas Totais, Glicose, Bilirrubinas e Uréia

de hamsteres alimentados com dieta controle (C) e hipercolesterolemiante (H)

1,2

Albumina

(g/L)

Proteínas Totais

(g/L)

Bilirrubinas

(mg/dL)

Glicose (mg/dL) Uréia (mg/dL)

23,9 ± 0,7

62,0 ± 3,0 0,22 ± 0,05

93,66 ± 14,09

44,91 ± 4,81

24,8 ± 1,9

61,3 ± 4,0 0,26 ± 0,12

120,66 ± 21,81

46,35 ± 4,8

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

5.1.6 – Pesos relativos dos órgãos e peso corporal

Na Tabela 7 estão apresentados os valores dos pesos relativos dos órgãos e peso

corporal. Fígado e peso corporal não tiveram diferenças significativas ao fim do

experimento. Os pesos relativos dos fígados foram cerca de 60% maiores nos animais

que receberam a dieta hipercolesterolemiante. O mesmo aconteceu para os pesos

relativos dos rins, os hamsteres do grupo H apresentaram aumento de cerca de 7%.

OLIVEIRA,MR Resultados

Tabela 7. Pesos relativos do Fígado, Rins, Coração e valor do Peso Corporal de

hamsteres alimentados com dieta controle (C) e hipercolesterolemiante (H)

1,2

Fígado (%p/p) Rins (%p/p) Coração (%p/p) Peso Corporal (g)

3,00 ± 0,16

0,72 ± 0,03

0,35 ± 0,02 102,86 ± 5,12

4,79 ± 0,24

0,77 ± 0,05

0,34 ± 0,03 94,64 ± 9,71

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

5.2 - Ensaio 2- Avaliação do efeito do bezafibrato no perfil lipídico,

parâmetros bioquímicos e estresse oxidativo em hamsteres

hipercolesterolêmicos induzidos por dieta e excesso de ferro.

5.2.1 – Concentração de Ferro, Capacidade Latente de Ligação ao Ferro (CLLF),

Capacidade Total de Ligação ao Ferro (CTLF), Índice de Saturação da Transferrina

(%IST).

As injeções de ferro dextran tiveram efeito nos níveis de ferro sérico (Tabela 8) ,

sendo que os grupos HFE e HFEFI tiveram maiores concentrações médias de ferro

sérico e os menores níveis de ferro sérico foram encontrados nos grupos H e HFI . O

ferro dextran influenciou na capacidade latente de ligação ao ferro (CLLF), onde as

médias dos grupos HFE e HFEFI, foram cerca de 29% superiores aos grupos H e HFI,

porém essa diferença não foi significativa. O ferro dextran também aumentou a

capacidade total de ligação ao ferro (CTLF) em cerca 42% nos grupos HFE e HFEFI,

quando comparados com os grupos H e HFI.

Tabela 8. Ferro sérico, Capacidade Latente de Ligação ao Ferro (CLLF) e Capacidade

Total de Ligação ao Ferro (CTLF), em hamsteres alimentados com dieta

hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos

(HFEFI)

1,2

Ferro sérico µg/dL CLLF µg/dL CTLF µg/dL

208,04 ± 74,97

621,49 ± 193,84

829,53 ± 189,14

HFE

485,77 ± 84,45

776,95 ± 184,7

1262,72 ± 149,54

HFI

281,98 ± 54,53

642,59 ± 249,92

924,57 ± 238,82

HFEFI

417,34 ± 76,12

852,12 ± 74,41

1269,46 ± 106,63

OLIVEIRA,MR Resultados

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

Para o índice de saturação de transferrina (IST%) não houve efeito do ferro e

nem do bezafibrato (Tabela 9). Os valores de transferrina dos animais que receberam

ferro dextran foram maiores quando comparados aos que não receberam. No grupo HFE

em relação ao grupo H, houve um aumento de 52% enquanto que os animais do grupo

HFI e HFEFI o aumento foi de 37%.

Tabela 9. Transferrina sérica, Índice de Saturação da Transferrina (IST) e Ferro

Hepático em hamsteres alimentados com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com

ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI)

1,2

Transferrina µg/dL

IST (%)

580,67 ± 132,4

26,12 ± 11,52

HFE

883,9 ± 104,68

39,18 ± 9,33

HFI

647,2 ± 167,18

32,65 ± 12,07

HFEFI

888,62 ± 74,64

32,75 ± 4,36

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

Em relação ao ferro depositado no fígado (Figura 2), os animais dos grupos HFE

e HFEFI apresentaram maiores valores que os grupos que não receberam o ferro, H e

HFI, cerca de 13 e 12 vezes maiores, respectivamente.

Ferro no fígado

H HFE HFI HFEFI

g/ 100mg de tecido

OLIVEIRA,MR Resultados

Figura 2. Ferro no fígado em hamsteres alimentados com dieta hipercolesterolemiante

(H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI)

. Letras

diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05); n = 9.

5.2.2 – Defesas antioxidantes

5.2.2.1 - Atividade da Paraoxonase para fenilacetato

Na paraoxonase fenilacetato (Figura 3), os grupos H e HFE tiveram as maiores

atividades enzimáticas que os grupos HFI e HFEFI, o bezafibrato reduziu em 33% na

atividade. Além disso, o grupo que recebeu somente o bezafibrato, teve o menor valor

de atividade da PON.

PON fenilacetato

a,b

200

400

600

800

1000

1200

H HFE HFI HFEFI

(U/mL)

Figura 3. Atividade sérica da paraoxonase fenilacetato em hamsteres alimentados com

dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou

ambos (HFEFI)

.Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05); n = 9.

5.2.2.2 - Atividade da Paraoxonase para paraoxon

Em relação às atividades da paraoxonase paraoxon (Figura 4), o grupo H teve as

maiores atividades, seguido dos grupos HFE e HFEFI, sendo que as menores atividades

foram encontradas no grupo que só recebeu bezafibrato na dieta, HFI.

OLIVEIRA,MR Resultados

PON Paraoxon

H HFE HFI HFEFI

(U/mL)

Figura 4. Atividade sérica da Paraoxonase paraoxon em hamsteres alimentados com

dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou

ambos (HFEFI)

. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05); n = 9.

5.2.2.3 - Atividade da Catalase

A atividade da Catalase foi maior no grupo H. O ferro provocou uma redução

em cerca de 48% na atividade enzimática quando comparado com o grupo H. O

bezafibrato reduziu a atividade da catalase em relação ao grupo H, embora em menor

intensidade que o ferro (redução de cerca 30%). E juntos bezafibrato e ferro também

reduziram a atividade catalase (Figura 5).

Catalase

H HFE HFI HFEFI

kat

Figura 5. Atividade sérica da Catalase em hamsteres alimentados com dieta

hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos

(HFEFI)

. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05); n = 9.

OLIVEIRA,MR Resultados

Nenhum grupo apresentou diferença significativa nas dosagens das Sulfidrilas

Totais e na Fração Protéica (Tabela 10). No entanto, os animais do grupo HFE

apresentaram os maiores valores para as sulfidrilas livres e os hamsteres dos grupos H,

HFI e HFEFI não tiveram diferenças significativas.

Tabela 10. Concentrações de Sulfidrilas Totais, Livres, e Protéica em hamsteres

alimentados com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com

bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI)

1,2

Sulfidrilas Totais

(µmol/L)

Sulfidrilas livres

(µmol/L)

Sulfidrilas Fração

Protéica(µmol/L)

183,11 ± 15,39 51,14 ± 4,06

132,13 ± 17,42

HFE

196,81 ± 25,7 58,31 ± 7,2

144,56 ± 31,67

HFI

196,81 ± 20,72 45,21 ± 5,1

153,11 ± 20,24

HFEFI

194,84 ± 17,06 50,68 ± 4,34

144,16 ± 15,64

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

5.2.3 – Valores do perfil lipídico

Para os níveis de colesterol total, os animais do grupo H e HFI apresentaram os

menores valores (Figura 6). Os hamsteres que receberam injeções de ferro dextran

(HFE) apresentaram aumento significativo em cerca de 43% em relação ao grupo H. E

também em relação ao grupo H, os hamsteres que receberam o ambos bezafibrato e

ferro dextran isoladamente aumento de cerca de 22%. Ambos bezafibrato e ferro

(HFEFI) reduziram parcialmente a hipercolesterolemia potencializada pelo ferro.

OLIVEIRA,MR Resultados

Colesterol Total sérico

100

150

200

250

300

350

400

450

H HFE HFI HFEFI

mg/dL

Figura 6. Concentração sérica do Colesterol Total em hamsteres alimentados com dieta

hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos

(HFEFI)

. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05); n = 9.

Os níveis de Triacilgliceróis não apresentaram valores significativamente

diferentes entre os grupos estudados (Figura 7).

Triglicerídeos séricos

100

150

200

250

H HFE HFI HFEFI

mg/dL

Figura 7. Concentração sérica Triacilgliceróis em hamsteres alimentados com dieta

hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI) ou ambos

(HFEFI)

. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05); n = 9.

Para a fração HDL- Colesterol (Figura 8), os animais grupo HFE apresentaram

os maiores valores . Os demais grupos (H, HFI e HFEFI) não apresentaram diferenças

significativas

OLIVEIRA,MR Resultados

Colesterol HDL sérico

100

150

200

250

H HFE HFI HFEFI

mg/dL

Figura 8. Concentração sérica da fração HDL-Colesterol em hamsteres alimentados

com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI)

ou ambos (HFEFI)

. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05); n = 9.

Os hamsteres do grupo HFI apresentaram os menores valores para o colesterol

não HDL (figura 9), comparados ao grupo H, a redução foi de cerca de 15 %. Os

hamsteres que receberam ambos, o bezafibrato e ferro (HFEFI) apresentaram os maiores

valores de colesterol não HDL, cerca de 22%, quando comparados com o grupo H. E os

animais que isoladamente receberam o ferro (HFE) também apresentaram aumento,

cerca de 15%, em relação ao grupo H.

OLIVEIRA,MR Resultados

Colesterol Não HDL sérico

a,b

100

150

200

250

300

350

H HFE HFI HFEFI

mg/dL

Figura 9. Concentração sérica da fração não HDL-Colesterol em hamsteres alimentados

com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com bezafibrato (HFI)

ou ambos (HFEFI); n = 9

5.2.4 – Atividades da Aspartato e Alanina Aminotransferase

A Figura 10 mostra as atividades séricas da aspartato aminotransferase. Os

grupos H e HFE apresentaram as menores atividades, o grupo HFEFI apresentou

valores intermediários. E as maiores atividades séricas foram encontradas no grupo HFI.

Quando comparados com o grupo H, os animais do grupo HFI apresentaram atividades

enzimáticas 7 vezes maiores.

AST (aspartato aminotransferase)

100

120

140

160

180

200

H HFE HFI HFEFI

U/L

Figura 10. Atividades séricas da AST (aspartato aminotransferase) em hamsteres

alimentados com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com

bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI). Letras diferentes indicam diferenças

significativas (p<0,05); n = 9

OLIVEIRA,MR Resultados

As atividades séricas da ALT (alanina aminotransferase) não sofreram influência nem

do ferro nem do bezafibrato (Figura 11). Apesar dos hamsteres do grupo HFI terem

apresentado os maiores valores de atividade, sem diferença significativa.

ALT (alanina aminotransferase)

H HFE HFI HFEFI

U/L

Figura 11. Atividades séricas da ALT (alanina aminotransferase) em hamsteres

alimentados com dieta hipercolesterolemiante (H), tratados com ferro (HFE), com

bezafibrato (HFI) ou ambos (HFEFI); n = 9

5.2.5 – Pesos relativos dos órgãos e peso corporal

O peso relativo do fígado dos animais que receberam ferro e bezafibrato

(HFEFI) foram maiores, seguidos do grupo HFE e HFI, sendo que os menores pesos

relativos apresentaram os hamsteres do grupo H (Tabela 11). Os hamsteres que

receberam ferro (grupos HFE e HFEFI) tiveram os pesos relativos de seus fígados em

27%. Com relação ao peso relativo dos rins, os hamsteres que receberam o bezafibrato

HFI e HFEFI foram maiores que os grupos que não receberam H e HFE, aumento de

32%. Não houve diferença significativa nos pesos dos corações dos animais estudados.

Nem bezafibrato nem as injeções de ferro dextran influenciaram nos pesos corpóreos

finais dos animais no final do experimento.

OLIVEIRA,MR Resultados

Tabela 11. Porcentagem dos pesos dos órgãos em relação ao peso final dos hamsteres

alimentados com dieta hipercolesterolemiante, com ou sem ferro dextran e bezafibrato.

FE(ferro), FI (Bezafibrato) no final do experimento

1,2

Fígado (%p/p) Rins (%p/p) Coração (%p/p) Peso Total (g)

4,79 ± 0,24

0,77 ± 0,05

0,33 ± 0,02 94,64 ± 9,71

HFE

6,39 ± 0,73

0,75 ± 0,09

0,33 ± 0,04 92,89 ± 9,02

HFI

5,81 ± 0,36

0,99 ± 0,07

0,36 ± 0,02 93,43 ± 13,12

HFEFI

7,06 ± 0,48

1,02 ± 0,05

0,37 ± 0,02 85,03 ± 7,08

1 . Os resultados são indicados como a média

desvio padrão; 2 letras diferentes indicam diferenças

significativas na mesma coluna (p<0,05); n = 9.

OLIVEIRA,MR Discussão

6- Discussão

6.1 FERRO

A associação sinérgica entre os aumentos da ferritina e LDL-colesterol séricos

com o risco do infarto agudo do miocárdio sustenta a teoria de que o aumento do ferro

pode aumentar o risco do infarto agudo do miocárdio através da promoção da oxidação

do LDL colesterol. Acúmulo de LDL oxidadas leva ao desenvolvimento de células

espumosas, resultando na formação de placas nas paredes arteriais. Por outro lado, tem-

se questionado que em indivíduos saudáveis o ferro livre não foi realmente mensurado,

pois o ferro pode estar ligado à transferrina ou estocado como ferritina (Meyers, 2000),

assim o organismo estaria protegido contra seus efeitos deletérios. No entanto, o radical

superóxido é capaz de liberar o ferro da ferritina (Biemond et al., 1984). Essa liberação

forma Fe

que inicia a formação de radicais livres do oxigênio, via reações de Haber-

Weiss, e conseqüentemente leva à peroxidação de lipídios.

Ao lado do possível papel do ferro na oxidação de LDL, o ferro pode alterar a

concentração de colesterol sérico e distribuição de suas frações o que também tem

importância na determinação da aterogênese. Colesterol na fração LDL é considerado

aterogênico, enquanto a fração HDL está associada a mecanismo de proteção contra

lesões ateroscleróticas. A homeostase intracelular do metabolismo do colesterol é,

portanto, importante para a prevenção de doenças cardiovasculares e diversos artigos

mostram os efeitos benéficos dos inibidores de HMG-CoA redutase e fibratos sobre

hipercolesterolemia e aterosclerose. O excesso de ferro pode afetar o metabolismo de

colesterol e suas frações, uma vez que o fígado é o principal órgão tanto de

armazenamento de ferro e como também um importante órgão na manutenção da

homeostasia do colesterol e lipoproteínas plasmáticas. Indicação da relação entre ferro e

metabolismo de colesterol foi feita pela observação que microssomos de células

hepáticas submetidos à peroxidação catalisada por ferro-ascorbato apresentavam

redução da atividade da HMG-CoA- redutase, ACAT e CYP7-alfa, três enzimas

chaves na regulação do metabolismo do colesterol (Brunet et al., 2000). Além disso,

macrófagos humanos submetidos ao excesso de ferro apresentam expressão diminuída

de PPAR-α, receptor nuclear, que tem importante papel no controle da expressão gênica

de enzimas relacionadas ao metabolismo de lipídios (Marcil et al., 2006)

OLIVEIRA,MR Discussão

Neste trabalho nós utilizamos hamsteres para avaliar o efeito do tratamento com

ferro dextran e sua combinação com fibrato, um agonista da PPAR-α, sobre o perfil

lipídico e defesas antioxidantes. Embora já se tenha avaliado o efeito de fibratos em

hamsteres (Rizvi et al., 2003 e Guo et al. 2002) e o efeito do excesso de ferro em outros

modelos animais (Araújo et al., 1995 e Dabbagh et al., 1994), não há na literatura

trabalhos que relacionem o efeito do ferro e fibrato em hamsteres.

A necessidade de um modelo experimental que se aproxime dos humanos é

muito importante, uma vez que espécies diferentes podem se comportar de maneiras

distintas frente ao transporte do colesterol. Várias espécies têm sido usadas como:

macaco, cobaia, porco, rato, coelho e hamster (Scanu et al., 1988). Dentre os roedores,

o hamster apresenta algumas vantagens – como humanos, possui LDL como principal

lipoproteína carreadora do colesterol (Spady & Dietschy, 1983). Nesses animais, há a

presença da apoproteína (apo) B-48 de origem exclusivamente intestinal e a apo-B-100

de origem exclusivamente hepática, da mesma forma que em humanos, o que não é

observado em ratos e camundongos (Arbeeny et al., 1992) e também desenvolvem

placas ateroscleróticas (Sima et al., 2001). O hamster tem sido utilizado em nosso

laboratório em experimentos com hipercolesterolemia, induzida por uma dieta contendo

0,5% de colesterol (Silva et al., 2005), com uma resposta satisfatória. No presente

trabalho, os animais do grupo hiper (H) desenvolveram a hipercolesterolemia, e como

padrão de comparação, os animais do grupo controle (C) apresentaram aumento de

94%.

Para aumentar os estoques de ferro, em hamsteres, utilizamos injeções

intraperitoniais de ferro dextran. Com isso tentamos evitar que os mecanismos indiretos

de regulação dificultassem a absorção do nutriente dificultando o aumento dos estoques.

Na literatura não há relatos sobre o metabolismo do ferro dextran em hamsteres. Em

camundongos, o ferro ligado a esse polímero de glicose é rapidamente removido da

circulação pelas células do sistema retículo endotelial. Existem dois períodos

importantes que se seguem à administração do ferro: nas primeiras 6 horas o conteúdo

de ferro sérico se encontra elevado, depois de 24 horas da injeção há diminuição do

ferro no soro e aumento nas células do sistema retículo endotelial do fígado e baço; o

ferro ligado ao dextran é processado pelas células do sistema retículo endotelial antes de

ser liberado para o pool de transferrina, sendo distribuído aos demais tecidos (Holbein,

1980). No presente trabalho, os animais que receberam as injeções de ferro dextran,

OLIVEIRA,MR Discussão

grupos HFE e HFEFI, apresentaram níveis de ferro plasmático maiores do que aqueles

que não receberam, grupos H e HFI, e o mesmo perfil foi observado para a capacidade

total de ligação ao ferro (CTLF). O excesso de ferro fez com que o hamster aumentasse

sua capacidade de transporte do metal na corrente sangüínea, uma vez que sua CTLF

ficou aumentada nos grupos com excesso de ferro. Essa capacidade aumentada pode ser

entendida pelo aumento da concentração da transferrina, o mais importante carreador de

ferro na circulação. No hamster, entendemos que esse excesso de ferro circulante pode

deixar o animal mais exposto ao excesso de ferro livre, e conseqüentemente levar à

maior formação de ERO. Turbino-Ribeiro et al. (2003) verificaram que ratos que

receberam dieta hipercolesterolemiante e ferro dextran apresentam concentração de

ferro sérico semelhante aos ratos hipercolesterolêmicos, sugerindo que o rato parece

eliminar o metal mais rapidamente da circulação, enquanto que em nosso modelo

experimental, o ferro permanece na circulação por um período de tempo maior. Dessa

forma, o hamster pode estar mais exposto à formação de radicais livres induzidos pelo

ferro, enquanto o rato mais protegido. Assim o hamster pode ser um modelo mais

sensível para se estudar as alterações provocadas pelo ferro, quando comparado ao rato.

Com relação à saturação da transferrina, não observamos diferenças estatísticas

ao final do experimento, ainda que os animais do grupo H tenham apresentado menor

valor de saturação e o grupo HFE ter o maior grau, as diferenças não foram

significativas (26,12 ± 11,52 e 39,18 ± 9,33 %, respectivamente). Normalmente, no

plasma, a transferrina está saturada em média 30% com o ferro. Por meio de estudos

cinéticos e por termodinâmica, sabe-se que a transferrina pode estar presente no plasma

sob quatro formas: apotransferrina livre do ferro, transferrina diférrica totalmente

saturada e transferrina monomérica contendo ferro ligado ao N- terminal ou C-terminal

(Ponka et al, 1998). Os hamsteres que receberam ferro tiveram os maiores valores de

transferrina, o que pode proteger o organismo, desde que transferrina mais saturada

poderia levar a uma liberação maior de ferro no plasma, favorecendo então a formação

das espécies reativas de oxigênio. Em hamsteres, Silva et al (2005) utilizando o ferro

dextran na mesma dose utilizada neste trabalho, observaram aumento de ferro sérico de

2,3 vezes, resultado compatível ao deste trabalho, e no baço de 7,8 vezes. Os fígados

dos animais de nosso experimento que receberam as injeções de ferro (HFE) tiveram

valores 13 vezes superiores daqueles que não receberam (H), mostrando que esse órgão

comporta-se como depósito desse metal, armazenando o ferro após o processamento do

OLIVEIRA,MR Discussão

ferro dextran nos macrófagos. Esse valor está abaixo do nível considerado tóxico (> 22

vezes de aumento) onde foi observada injúria hepática (Park et al., 1987).

6.2 Lipídios

A hipercolesterolemia foi aumentada nos grupos de animais que receberam

excesso de ferro, dados que corroboram com os dados obtidos por Silva et al. (2005).

Por outro lado, em ratos, o excesso de ferro não potencializou a hipercolesterolemia

induzida pela dieta, pelo contrário houve uma redução do colesterol total (Turbino-

Ribeiro et al., 2003), dados também encontrados por Dabbagh et al. (1994) em coelhos.

Sustentamos então, que o ferro em espécies diferentes pode modificar o metabolismo do

colesterol de maneiras distintas. Por outro lado não podemos descartar a hipótese que

estas diferenças sejam derivadas dos diferentes níveis de ferro nos fígados nos diversos

modelos animais. Turbino-Ribeiro et al. (2003) encontraram para ratos

hipercolesterolêmicos tratados com ferro dextran um aumento de cerca 5 vezes no

conteúdo de ferro hepático, conteúdo portanto inferior ao obtido no presente trabalho.

De qualquer forma, isoladamente, o ferro potencializou a hipercolesterolemia

induzida pela dieta. O excesso de ferro pode diminuir a atividade da enzima 7-α-

hidroxilase (Brunet et al., 2000). O ferro também leva à diminuição da atividade da

acilcolesterol aciltransferase (ACAT) e da 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG

CoA) redutase (Brunet et al., 2000). A diminuição da atividade da ACAT está

relacionada com o aumento do colesterol sérico, enquanto a inibição da HMG CoA

redutase o contrário. Interessante mencionar que Brunet et al. (2000) observaram que

mecanismos diferentes justificam as inibições das enzimas expostas ao excesso de ferro,

uma vez que ao usarem o tocoferol como antioxidante, a inibição da ACAT era

revertida, enquanto o mesmo não acontecia com a 7-α-hidroxilase, mostrando que a

peroxidação lipídica era fundamental para a diminuição da atividade enzimática da

ACAT, mas o mesmo não acontecia com a 7-α-hidroxilase e uma possibilidade sugerida

pelos autores foi que nesta última haveria uma ligação direta do ferro à enzima,

inativando-a. Nesse sentido, podemos supor que o efeito predominante que justifica o

aumento de colesterol, seja a inibição da ACAT e 7-α-hidroxilase e em menor

intensidade a inibição da HMG-CoA redutase, desde que, quando há excesso de

colesterol na dieta espera-se uma redução da atividade da HMG-CoA-redutase, assim

OLIVEIRA,MR Discussão

uma diminuição da esterificação do colesterol pela ACAT e uma diminuição da

formação de sais biliares pela redução da 7-α-hidroxilase levaria ao aumento da

concentração de colesterol intracelular levando ao aumento da concentração do

colesterol circulante.

Os animais que receberam o bezafibrato apresentaram valores menores no

colesterol total (cerca de 9%). Guo et al. (2001) observaram que a administração de

fenofibrato em hamsteres levou à redução da concentração de colesterol e redução das

atividades das enzimas HMG-CoA redutase e HMG-CoA-sintase. Por outro lado, com

relação ao bezafibrato, Cheema et al., (2000) demonstraram que agonistas PPAR-α

diminuem a atividade da enzima chave na síntese dos ácidos biliares, 7-α-hidroxilase.

A síntese dos ácidos biliares é a principal rota de excreção do colesterol, porém

ao sintetizar menos ácidos biliares, a quantidade de colesterol absorvida da dieta pode

ser prejudicada, como no modelo utilizado no presente estudo, onde a

hipercolesterolemia foi induzida pela adição de colesterol à dieta. Esse fato pode

explicar, até certo ponto, a discreta redução do colesterol induzida pelo bezafibrato no

presente trabalho.

No grupo HFEFI, o efeito do ferro parece ter predominado sobre o bezafibrato,

embora os valores do grupo HFEFI fossem menores que os hamsteres do grupo HFE.

Esses resultados sugerem que as inibições da ACAT e 7-α-hidroxilase devem ter sido

mais importantes levando ao aumento do colesterol. Contudo, os dados também

sugerem algum efeito do bezafibrato sobre a concentração do colesterol quando

associado ao ferro. Marcil et al., (2006) utilizando macrófagos humanos observaram

que o excesso de ferro pode diminuir a expressão para o mRNA de PPAR-α ο que pode

explicar também o aumento do colesterol. Na presença de um agonista de PPAR-α este

efeito seria atenuado, explicando dessa forma porque o bezafibrato conseguiu reverter

parcialmente a hipercolesterolemia induzida pelo ferro.

Em nosso modelo, os hamsteres que receberam o ferro dextran, (HFE)

apresentaram aumento na concentração do HDL colesterol em 2,2 vezes em relação ao

grupo H. Os animais que receberam somente o bezafibrato (HFI) apresentaram valores

comparados com o grupo H. Porém, ambos bezafibrato e excesso de ferro apresentaram

valores comparáveis com o grupo H e não com o grupo HFE. Quando consideramos os

efeitos do excesso de ferro sobre os níveis de HDL, há consenso na literatura de que o

excesso de ferro aumenta HDL colesterol, como foi observado por Dabbagh et al.,

OLIVEIRA,MR Discussão

(1994) , Brunet el al., (2000), Turbino-Ribeiro et al., (2003) e Silva et al. (2005). O

perfil do colesterol neste trabalho mostrou que o ferro dextran aumentou o colesterol

total em 42% e a fração HDL em 217%, bezafibrato reduziu o colesterol total em cerca

de 9%, portanto as alterações nas concentrações de HDL observadas neste trabalho não

refletem as alterações do colesterol total. Apesar de não observarmos efeito do

bezafibrato isoladamente, a redução da fração colesterol-HDL no grupo HFEFI sugere

que o ferro pode interferir no metabolismo de HDL e este efeito pode ser revertido

diretamente ou indiretamente, via PPAR. Agonistas de PPAR-α impactam a

concentração de HDL-C de várias maneiras - eles aumentam a síntese de Apo AI e Apo

AII, principais apoproteínas da partícula da lipoproteína de alta densidade (HDL)

(Staels et al., 1998) e (Fruchart, 2001) e também aumentam a expressão para o gene que

codifica o transportador ABCAl (ATP- binding cassete transporter Al) (Chinetti et al.,

2001). Todos esses efeitos contribuem para a elevação da concentração de HDL. A

ativação de PPAR-α por fibrato aumenta a síntese de SR-BI. Isto aumenta a captação

hepática de ésteres de colesterol de HDL e portanto tende a reduzir o nível de HDL. A

influência de fibratos sobre HDL –C é, portanto, o efeito líquido de vários fatores.

Assim é provável que o ferro comprometa a expressão e ou a função de SR-B1

contribuindo para um aumento da fração HDL, efeito este revertido pelo bezafibrato.

Agonistas PPARα têm seu grande emprego na hipertrigliceridemia, pois

aumentam a expressão da lipoproteína lípase (LPL) e reduzem a expressão do gene que

codifica a Apoproteína CIII (Apo CIII), a qual inibe a LPL (Staels et al., 1998). Porém,

nosso modelo não desenvolveu a hipertrigliceridemia, portanto não ocorrendo

diferenças estatísticas entre os quatro grupos (H, HFE, HFI e HFEFI). Além disso, Guo

et al. (2001) observaram redução de lipídios séricos pela administração de fenofibrato,

de forma dose-dependente, assim pode ser que a dose de bezafibrato no presente estudo

não tenha sido suficiente para que seus efeitos fossem observados isoladamente, mas

quando associado ao ferro.

Em relação ao colesterol não HDL (onde a fração predominante relaciona-se ao

LDL), os animais do grupo HFI apresentaram os menores valores médios. Podemos

notar o efeito do bezafibrato, provavelmente nas inibições da HMG-CoA redutase e 7-

α-hidroxilase. Os hamsteres do grupo HFEFI não apresentaram diferença significativa

em relação ao grupo HFE sugerindo que o aumento do colesterol total é devido

principalmente à fração HDL.

OLIVEIRA,MR Discussão

6.3 DEFESAS ANTIOXIDANTES

Como descrito anteriormente, o potencial antiaterogênico das HDL colesterol

tem sido atribuído à paraoxonase (PON), uma glicoproteína cálcio dependente. Esse

potencial vem de sua capacidade de hidrolisar lipídeos oxidados, fosfolípides, e

hidroperóxidos (CEOOH), impedindo assim que eles se acumulem nas partículas de

LDL (Oda et al., 2002). Em nosso experimento, o bezafibrato promoveu diminuição da

atividade da PON arilesterase nos hamsteres. O ferro não interferiu na atividade

enzimática isoladamente, apesar do grupo HFE ter tido valores menores que o H, essa

diferença não foi significativa. No entanto, quando os animais receberam, ao mesmo

tempo, o ferro e o bezafibrato, a atividade enzimática não sofreu tal redução. Utilizando

fenofibrato, Beltowski et al., (2002) observaram a diminuição da atividade enzimática

da PON arilesterase em plasma de ratos, corroborando nosso estudo com hamsteres,

enquanto Gouédard et al., (2003) utilizando células de hepatomas humanos

demonstraram um aumento na atividade da PON arilesterase utilizando tanto

fenofibrato como bezafibrato, porém o mesmo não ocorreu quando utilizaram o

gemfibrozil, outro agonista PPARα. Dessa maneira, podemos salientar que o nosso

modelo experimental não corroborou o estudo em células humanas em relação à

atividade enzimática arilesterase da PON, demonstrando assim que em espécies

diferentes podem ser encontradas respostas distintas nas ações dos agonistas PPARα.

Quando se determinou a atividade da PON utilizando-se como substrato o

paraoxon (atividade paraoxonase), o bezafibrato novamente atuou diminuindo a

atividade enzimática. O ferro isoladamente também reduziu, em menor intensidade, a

atividade enzimática da PON. O ferro através da catálise da peroxidação lipídica pode

diretamente modular a atividade enzimática pelo ataque aos ácidos graxos

poliinsaturados, resultando em mudanças nas propriedades físicas e na fluidez da

membrana, a qual a PON é ancorada (Getz e Reardon, 2004). Além disso a catálise pelo

ferro da peroxidação lipídica pode afetar a proteína PON desestabilizando sua estrutura

terciária e acelerando sua degradação (Levyl et al., 2005). E quando ao mesmo tempo

foram administrados nos hamsteres o ferro e o bezafibrato, o ferro reverteu

parcialmente o efeito do bezafibrato, novamente os resultados mostram que o ferro

interfere na sinalização do PPAR-α. O aumento da HDL com redução da atividade

OLIVEIRA,MR Discussão

PON sugere que o ferro converte a HDL de novo numa forma mais pró-aterogênica,

desde que há menor capacidade antioxidante e supostamente um transporte reverso

prejudicado. Dessa maneira, no hamster o ferro parece desestabilizar a estrutura da

paraoxonase mais em relação à sua atividade paraoxonase que em sua atividade

arilesterase.

A superexpressão da catalase (enzima que degrada a H

) inibe a adesão

leucocitária mediada por LDL oxidadas (Shi et al., 2004), agindo portanto como uma

das defesas antioxidantes do organismo e suporta ainda a hipótese de que a H

desempenha um papel na patogênese da aterosclerose. Os hamsteres que receberam

ferro, bezafibrato, ambos ou isoladamente (grupos HFE, HFI e HFEFI) tiveram

menores valores de catalase, dessa maneira podemos supor que tanto ferro quanto

bezafibrato atuaram em nosso modelo como nocivos a essa defesa antioxidante do

animal. O ferro ao promover danos à membrana celular, proteínas e DNA (Halliwell &

Gutteridge, 1984), poderia atuar na deterioração da enzima catalase, como demonstrado

na diminuição de sua atividade.

Tióis de baixo peso molecular e dissulfetos, incluindo homocisteína, cisteína e

glutationa, são componentes celulares críticos e desempenham importantes papéis no

metabolismo e homeostase do organismo. Glutationa, cisteína e cisteinilglicina

compõem a maioria dos aminotióis do plasma humano (Kleinman et al., 2000). Em

nosso experimento não houve diferenças significativas com relação as sulfidrilas totais e

nem nas sulfidrilas relacionadas à fração protéica. Porém, com relação as sulfidrilas

livres, os hamsteres que receberam ferro (HFE) tiveram um aumento de 14% em relação

àqueles que não receberam (H) e os animais dos grupos que receberam o bezafibrato,

com ou sem ferro (HFEFI e HFI, respectivamente) não foram estatisticamente

diferentes do grupo H. Enquanto os esforços têm direcionado para a homocisteína como

importante indicador de doenças cardiovasculares e cerebrovasculares, pouca atenção

tem sido dada à cisteína, um dos mais abundantes tióis no plasma, metabólica e

estruturalmente relacionada com a homocisteína. Outras investigações têm apontado

altos níveis de diferentes formas de cisteínas em pacientes com doenças vasculares

periféricas e cerebral (Araki et al., 1989) e (Andersson et al,. 1995). Ambos,

homocisteína total e cisteína são compostos que interagem e que promovem trocas de

pontes dissulfeto. Cisteína, homocisteína e glutationa compreendem o maior sistema

redox. Alteração em algum desses tióis pode afetar outros (Ueland, 1995). Eles também

OLIVEIRA,MR Discussão

exibem propriedades autooxidantes na presença de íons metálicos, resultando na

geração de radicais livres e peróxido de hidrogênio (Saez et al., 1982). O ferro, ao

influenciar o aumento das sulfidrilas livres, as quais em sua maioria homocisteína,

cisteína e cisteinilglicina, poderia via sistema redox tióis em hamsteres aumentar o

estresse oxidativo. Isso pode suportar a modificação superóxido-mediada da LDL,

facilitando assim a formação de células espumosas (Heinecke et al.,1987). Jacob et al.,

(1999) mostraram uma associação entre cisteinemia e doença cardiovascular. Um dos

leves efeitos da hiperhomocisteinemia é o deslocamento da cisteína da albumina, o que

presumivelmente libera cisteína no plasma. Nesse seguimento, se a transição das

reações de oxidação dependente íon metálico, desempenham um papel na propensão

aterogênica da hiperhomocisteinemia, então a cisteína plasmática poderá levar a mais

efeitos deletérios que protetores (Ueland et al., 1996).

6.4 AMINOTRANSFERASES

A aspartato aminotransferase (AST) está distribuída nos tecidos orgânicos,

incluindo o fígado, o coração e os músculos, enquanto que a alanina aminotransferase

(ALT) é principalmente encontrada no fígado, embora quantidades significativas

possam ser encontradas nos rins. Parece que aproximadamente 80% as AST dos

hepatócitos está localizada na mitocôndria, enquanto acredita-se que a ALT seja

predominante extra-mitocondrial. Foi postulado que na lesão hepatocelular leve, quando

a membrana plasmática do hepatócito é lesada e a membrana mitocondrial permanece

íntegra, a ALT e a AST citoplasmáticas são liberadas no soro. Nas lesões

hepatocelulares mais graves, a lesão celular pode resultar na liberação da AST

mitocondrial, elevando a proporção AST/ALT (Henry, 1999).

Os valores para a ALT dos hamsteres que receberam excesso de ferro (HFE e

HFEFI) não foram diferentes dos demais (H e HFI). O mesmo não ocorreu com a AST,

onde o os animais que receberam bezafibrato (HFI) tiveram aumento de cerca de 7

vezes na atividade dessa enzima, quando comparado com os que não receberam o

bezafibrato (H). Interessantemente, os hamsteres do grupo HFE não foram

estatisticamente diferentes do grupo H, no entanto quando os animais receberam tanto

bezafibrato como o ferro (HFEFI) houve um aumento na atividade em relação ao grupo

H, porém em menor intensidade (4,6 vezes), quando comparada com o grupo HFI.

OLIVEIRA,MR Discussão

Cornwell et al., (2004) ao avaliar o perfil de genes expressos em ratos com o uso de seis

análogos do ácido fibrico observaram que essas substâncias induziam a hepatomegalia e

esta foi correlacionada com: a proliferação dos peroxisomos e hipertrofia hepatocelular

e um dos compostos na maior dosagem aumentou a atividade de ALT e AST. Essa

observação foi justificada principalmente devido à maior expressão dos genes de

muitos citocromos P450 (Cyp4A3, Cyp4A10, Cyp11B2, Cyp2C22, Cyp2J3, Cyp 2J4,

Cyp17α e citocromo P-450e). No presente trabalho, os hamsteres do grupo HFI

apresentaram aumento de cerca de 21% no peso do fígado quando comparado ao grupo

H, demonstrado que o bezafibrato pode ter modificado a expressão gênica nesse

sentido. Podemos salientar que o ferro pode ter interferido na ação do bezafibrato,

fazendo com que a expressão gênica apresentasse menor intensidade e causasse assim a

menor hepatomegalia, representada no hamster por menor aumento da AST no grupo

HFEFI quando comparado ao grupo HFI. Embora os animais do grupo HFEFI tenham

apresentado as menores atividades de AST, eles apresentaram os maiores valores para o

peso hepático. Se por um lado o ferro poderia interferir na via PPAR-α, por outro, o

fígado atua como o depósito desse metal e essas alterações poderiam estar relacionadas

com o acúmulo de ferro no tecido hepático e outros mecanismos independentes de

PPAR-α.

6.5 PESO DOS ÓRGÃOS

Ao final do experimento não foi constatada diferença significativa no peso

corpóreo dos animais, dessa forma, verificamos que a dieta, o ferro ou o bezafibrato

interferiram no desenvolvimento dos animais. Todavia, os fígados dos animais que

receberam a dieta hipercolesterolemiante foram maiores que os animais do grupo

controle, órgão este responsável pelo processamento dos lipídios e ferro. A

concentração da uréia dos hamsteres dos grupos HFI e HFEFI foram maiores (49,91 e

56,54 mg/dL) do que aqueles que não consumiram o bezafibrato, grupos H e HFE

(46,36 e 41 mg/dL, respectivamente). Alguns relatos mencionam que os fibratos podem

alterar a função renal (Hirai et al., 1996). Moléculas também excretadas pelos rins,

como a cistatina C e homocisteína sofreram aumentos após terapia com fibratos

(Dierkes et al., 1999). Isso sugere que esses fibratos reduzem a taxa de filtração

glomerular. Fibratos prejudicam a geração de prostaglandinas vasodilatadoras in vitro e

OLIVEIRA,MR Discussão

in vivo, processo pelo qual obviamente pode contribuir para a disfunção renal (Wilson

et al., 1995) e (Ledwith et al., 1997). O gemfibrozil, em contraste com fenofibrato, para

o bezafibrato e ciprofibrato, não tem sido demonstrada causa de disfunção renal. Uma

das hipóteses da ausência desse efeito nefrotóxico pela molécula de gemfibrozil, em

contraste com os outros fibratos, é que ele falha ao se ligar PPAR (Krey et al., 1999).

De fato, esses receptores nucleares uma vez ligados aos fibratos, diminuem a expressão

gênica para a indução da enzima COX-2 (Wilson et al., 1995) e (Ledwith et al., 1997), a

qual tem papel crítico na manutenção das prostaglandinas vasodilatadoras no rins.

Como suporte para essa hipótese, clofibrato e ciprofibrato, mas não gemfibrozil,

inibiram a produção de prostaglandinas vasodilatadoras (Ledwith et al., 1997) e

(Yoshinari et al., 1998). Dessa maneira, assim como em humanos, em nosso modelo

experimental, o bezafibrato pode ter induzido uma disfunção renal, demonstrado pela

elevação da uréia e aumento do peso dos rins nos animais alimentados com o

bezafibrato. Na ausência do bezafibrato, os animais que somente receberam as injeções

de ferro dextran (HFE) tiveram menores valores de uréia quando comparados àqueles

que não receberam nem o bezafibrato e nem o ferro. Todavia os animais que receberam

ambos ferro dextran e bezafibrato, tiveram os maiores valores para uréia sugerindo

efeitos independentes do ferro e bezafibrato sobre a função renal.

7 - CONSIDERAÇÕES FINAIS.

Nossos resultados confirmaram que o ferro potencializa o efeito

hipercolesterolêmico da dieta, uma vez que os animais dos grupos que receberam

excesso de ferro tiveram maiores valores de colesterol, quando comparados aos que não

receberam. Esses dados sugerem que o ferro interfere no metabolismo lipídico, no

entanto até o momento, na literatura não há dados que expliquem esses resultados. A via

de sinalização de PPAR-α parece ser uma possibilidade marcante a ser explorada.

A presença do bezafibrato (agonista PPAR-α) interferiu no metabolismo do

colesterol no hamster e sua interação com o excesso de ferro pode estar envolvida com

as enzimas chaves no metabolismo do colesterol (7-α-hidroxilase, HMG CoA redutase

e ACAT) e HDL (Apo AI, Apo AII e ABCAl). Como houve um efeito antagônico

quando ferro e bezafibrato atuaram no hamster, os resultados sugerem que a atuação do

ferro no metabolismo dos lipídeos pode ocorrer por meio da sinalização via PPAR-α,

OLIVEIRA,MR Discussão

uma vez que esse metal interferiu na resposta produzida pelo agonista PPARα. Esta

suposição é apoiada pelos resultados de Marcil (2006) que mostraram que o estresse

oxidativo induzido por ferro ascorbato diminui a expressão de PPAR-a e o efluxo de

colesterol de macrófagos.

Embora o bezafibrato possa ter seu uso principal na hipertrigliceridemia em

humanos e em roedores causar proliferação peroxisomal, mais estudos devem ser

realizados com relação ao estresse oxidativo, uma vez que nos hamsteres a diminuição

da atividade da catalase é um indício de depleção de uma das defesas antioxidantes. Da

mesma maneira a redução da paraoxonase, enzima que tem sido relacionada como

principal fator de proteção da HDL colesterol também foi reduzida nos hamsteres que

receberam o bezafibrato.

De grande importância é o entendimento do metabolismo do ferro e seus efeitos

no organismo quando em excesso. Uma vez que a suplementação indiscriminada desse

metal tão importante ao organismo poderá aumentar o estresse oxidativo,

conseqüentemente reduziu as defesas antioxidantes, representadas em nosso modelo

pela PON (paraoxon) e catalase.

OLIVEIRA,MR Conclusão

8- Conclusões

 O ferro interfere no metabolismo do colesterol, principalmente na fração

HDL, e essa interferência pode envolver, direta ou indiretamente, a via de

sinalização de PPAR-α, posto que o bezafibrato reverte parcialmente os

efeitos provocados pelo ferro

 O bezafibrato provocou o aumento da AST e na presença de ferro esse

efeito foi reduzido, sugerindo mais uma vez que o ferro interfere na resposta

do hamster ao bezafibrato.

 O excesso de ferro reduziu a atividade de PON, quando o paraoxon foi

utilizado como substrato.

 O bezafibrato reduziu a atividade da PON, quando tanto o paraoxon quanto

o fenilacetato foram usados como substratos e estes efeitos foram

parcialmente revertidos pelo ferro.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

8 - Referências Bibliográficas

Abboud S. & Haile D.J. (2000) A novel mammalian protein involved in intracellular

iron etabolism. J Biol Chem, 275: 19906– 199912.

Araki A.; Sako Y.; Fukushima Y.; Matsumoto M.; Asada T. & Kita T.( 1989).

Plasma sulfhydryl-containing amino acids in patients with cerebral infarction and in

hypertensive subjects. Atherosclerosis,79:139–46.

Araujo J.A.; Romano E.L.; Brito B.E.; Parthé V.; Romano M.; Bracho M.; Montaño

R.F. & Cardier J. (1995) Iron overload augments the development of atherosclerotic

lesions in rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 15: 1172-

1180

Arbeeny, C.M.; Meyers, D.S.; Bergquist, K.E., & Gregg, R.E. (1992). Inhibition of

fatty acid synthesis decreses very low density lipoprotein secretion in the hamster. J.

Lipid Res. 33: 843-851.

Andersson A.; Lindgren A. & Hultberg B. (1995). Effect of thiol oxidation and thiol

export from erythrocytes on determination of redox status of homocysteine and

other thiols in plasma from healthy subjects and patients with cerebral infarction.

Clin Chem,41:361–6.

Assmann, G & Nofer, J. R. (2003). Atheroprotective effects of highdensity

lipoproteins. Annu Rev Med. 54: 321-341.

Association of Official Analytical Chemists (1980). Official Methods of Analysis.

AOAC, Washington, DC.

Beard, J. (2002). Dietary iron intakes and elevated iron stores in the elderly: is it

time to abandon the set-point hypothesis of regulation of iron absorption? Am JClin

Nutr 76, 1189-1190.

Beltowski J.; Wojcicka G. & Jamroz A. (2002). Differential effect of 3-hydroxy-3-

methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors on plasma paraoxonase 1 activity in

the rat. Polish Journal Pharmacology 54(6): 661-671

Biemond, P., van Eijk, H. G., Swaak, A. J. & Koster, J. F. (1984) Iron mobilization

from ferritin by superoxide derived from stimulated polymorphonuclear leukocytes.

Possible mechanism in inflammation diseases. J. Clin. Investig. 73: 1576–1579.

Bishop, R.W. (1992). Structure of the hamster low density lipoprotein receptor

gene. Department of Molecular Genetics, University of Texas Southwestern

Medical Center, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75235.

Beutler, E.; Ho.brand; A.V. & Cook J.D., (2003). Iron deficiency and overload.

Hematology 1: 40–61.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

Borggreve, S. E., De Vries R. & Dullaart R.P., (2003). Alterations in high-density

lipoprotein metabolism and reverse cholesterol transport in insulin resistance and

type 2 diabetes mellitus: role of lipolytic nzymes, lecithin, cholesterol

acyltransferase and lipid transfer proteins. Eur J Clin Invest, 33(12): 1051-1069.

Brinton, E. A. (2003). Lipid abnormalities in the metabolic syndrome. Curr Diab

Rep. 3: 65-72.

Brazzalotto; X.; Gaillard Z.; Pantopoulos, K.; Hentze, M.W. & Moulis, J.M.,

(1999). Human cytoplasmic aconitase (iron regulatory protein 1) is converted into

its [3Fe–4S] form by hydrogen peroxide in vitro but is not activated for iron-

responsive element binding. J. Biol. Chem. 274: 21625–21630.

Brousseau M.E.; Schaefer E.J.; Wolfe M.L.; Bloedon L.T.; Digenio A.G. & Clrk

R.W. et al. (2004). Effects of an inhibitor of cholesterol ester transfer protein on

HDL cholesterol. N Engl J Med. 350:1505-1515.

Brunet, S.; Thibault, L.; Lepage, G.; Seidman, E.G.; Dube, N. & Levy E. (2000).

Modulation of endoplasmic reticulum-bound cholesterol regulatory enzymes by

iron/ascorbate-mediated lipid peroxidation. Free Radic Biol Med. 28(1):46-54

Bunker. V.W. (1992). Free radicals, antioxidants and ageing. Med Lab Sci.

49(4):299-312

Cairo G.; Tacchini L.; Pogliaghi G.; Anzon E.; Tomasi A. & Bernelli-Zazzera, A.,

(1995). Induction of ferritin synthesis by oxidative stress. Transcriptional and post-

transcriptional regulation by expansion of the ‘‘free’’ iron pool. J. Biol. Chem. 270:

700–703.

Cairo G.; Castrusini E.; Minotti E. & Bernelli-Zazzera A. (1996). Superoxide and

hydrogen peroxidedependent inhibition of iron regulatory protein activity: a

protective stratagem against oxidative injury. FASEB J. 10: 1326–1335.

Cairo G.; Recalcati S.; Pietrangelo, A. & Minotti G. (2002). The iron regulatory

protein: targets and modulators of free radical reactions and oxidative damage. Free

Radical Biol. Med. 32, 1237–1243.

Cheema S.K. & Agellon L. B. (2000). The murine and human cholesterol 7a-

hydroxylase gene promoters are differentially responsive to regulation by fatty acids

mediated via peroxisome proliferator-activated receptor α.

J Biol Chem .275(17):

12530–12536.

Chinetti G.; Lestavel S.; Bocher V.; Remaley A.T.; Neve B. & Torra I.P. et al.

(2001). PPAR-alpha and PPAR-gamma activators induce cholesterol removal from

human macrophage foam cells through stimulation of the ABCA1 pathway. Nat

Med 7:53–58.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

Chinetti G. Gbaguidi FG, Griglio S, Mallat Z, Antonucci M, Poulain P, Chapman J,

Fruchart JC, Tedgui A, Najib-Fruchart J, & Staels B. (2000). CLA-1/SR-BI is

expressed in atherosclerotic lesion macrophages and regulated by activators of

peroxisome proliferator-activated receptors. Circulation. 101:2411–2417.

Chinetti-Gbaguidi, Rigamonti E, Helin L, Mutka AL, Lepore M, Fruchart JC,

Clavey V, Ikonen E, Lestavel S, & Staels B. . (2005). Peroxisome proliferator-

activated receptor controls cellular cholesterol trafficking in macrophages. J. Lipid

Res. 46:2717–2725.

Colles S. M.; Maxson J. M.; Carlson S. G. & Chisolm G. M. (2001). Oxidized

LDL-induced injury and apoptosis in atherosclerosis. Potential roles for oxysterols.

Trends Cardiovasc Med. 11(3-4):131-138.

Cornwell P.D. & Souza A.T. Ulrich R.G., (2004). Profiling of hepatic gene

expression in rats treated with fibric acid analogs. Mutat Res 549: 131–145

Dabbagh, A.J.; Mannion, T., Lynch, S.M. & Frei, B. (1994). The effect of iron

overload on rat plasma and liver oxidant status in vivo. The Biochemic J, 300: 799-

803.

Danesh, J. & Appleby, P. (1999) Coronary heart disease and iron status: meta-

analyses of prospective studies. Circulation 99: 852–854.

Deicher, R. & Hörl, W.H. (2004). Hepcidin: a molecular link between inflammation

and anaemia. Nephrol Dial Transplant 19: 521-4.

Devchand, P.R., Keller H, Peters J.M., Vazquez M., Gonzalez F.J. & Wahli W.

(1996). The PPARα-leukotriene B-4 pathway to inflammation control. Nature.

384:39–43.

Devlin T.M. (2002) Metabolismo do heme e do ferro. In: Manual de Bioquímica e

Correlações Clínicas. Eds. Awaed, W.M.. pp, 934-937.

Dierkes, J.; Westphal, S. & Luley. C. (1999). Serum homocysteine increases after

therapy with fenofibrate or bezafibrate. Lancet 354: 219–220

Dreyer, C.; Krey, G.; Keller, H.; Givel. F.; Helftenbein, G. & Wahli W. (1992)

Control of the peroxisomal beta-oxidation pathway by a novel family of nuclear

hormone receptors. Cell 68: 879 –887.

Duez, H., Chao Y.S., Hernandez M., Torpier G., Poulain P., Mundt S., Mallat Z.,

Teissier E., Burton C.A., Tedgui A., Fruchart J.C., Fiévet C., Wright S.D., Staels B.

(2002). Reduction of atherosclerosis by the peroxisome proliferator-activated

receptor α agonist fenofibrate in mice. J. Biol. Chem. 277:48051–48057.

Dunford, H.B.(1987). Free radicals in iron-containing systems. Free Radic Biol Med

3: 405-421.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

Eaton, J.W. (1991). Catalases and peroxidases and glutathione and hydrogen

peroxide: mysteries of the bestiary (editorial; comment). J Lab Clin Med 118: 3-4.

Fernandez, M.L.; Wilson, T.A.; Conde, K.; Vergara-Jimenez, M. & Nicolosi, R.J.

(1999). Hamsters and guinea pigs differ in their plasma lipoprotein cholesterol

distribution when fed diets varying in animal protein, soluble fiber, or cholesterol

content. J Nutr. 129(7):1323-1332.

Ferrali, M.; Signorini, C.; Ciccoli, L. & Comporti, M. (1992). Iron release and

membrane damage in erythrocytes exposed to oxidizing agents, phenylhydrazine,

divicine and souramil. Biochem. J. 285, 295–301.

Fleming, D.J.; Tucker, K.L.; Jacques, P.F.; Dallal, G.E.; Wilson P.W. & Wood R.J.

(2002) Dietary factors associated with the risk of high iron stores in the elderly

Framingham Heart Study cohort. A J Clin Nutr 6: 1375-84.

Fleming, R.E. & Bacon, B.R.(2005). Orchestration of Iron Homeostasis.

N Engl J Med

N Engl J Med. 352(17): 1741-1744.

Fontecave, M. & Pierre, J.L. (1993). Iron: metabolism, toxicity and therapy.

Biochimie 75: 767–773.

Fruchart, J.C. (2001). Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha activation

and high-density lipoprotein metabolism. Am J Cardiol. 88: 24-29.

Fu, J. Gaetani S., Oveisi F., Lo Verme J., Serrano A., Rodríguez De Fonseca F.,

Rosengarth A., Luecke H., Di Giacomo B., Tarzia G. & Piomelli D., (2003).

Oleylethanolamide regulates feeding and body weight through activation of the

nuclear receptor PPARα. Nature. 425:90–93.

Getz, G.S. & Reardon, C.A. (2004). Paraoxonase, a cardioprotective enzyme:

continuing issues. Curr Opin Lipidol, 15:261-267.

Ganz T. (2003). Hepcidin, a key regulator of iron metabolism and mediator of

anemia of inflammation. Blood 102: 783-788.

Gehring, N.H.; Hentze, M.W. & Pantopoulos, K. (1999). Inactivation of both RNA

binding and aconitase activities of iron regulatory protein-1 by quinone-induced

oxidative stress. J. Biol. Chem. 274: 6219–6225.

Gillum, R.F. (2001). Association of serum ferritin and indices of body fat

distribution and obesity in Mexican American men--the Third National Health and

Nutrition Examination Survey.Int J Obes Relat Metab Disord 25: 639-645

Gouédard C.; Koum-Besson N.; Barouki R.; & Morelopposite Y.(2003). Regulation

of the human paraoxonase-1 gene pon-1 by fenofibrate and statins. Mol Pharmacol

63:945–956.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

Gould, A.L.; Rossow, J.E.; Santanello, N.C.; Heyse, J.F. & Furberg ,C.D. (1998)

Cholesterol reduction yields clinical benefit: impact of statin trials. Circulation.

97(10):946-52.

Gunshin, H.; Allerson, C.R.; Polycarpou-Schwarz M.; Rofts A., Rogers J.T. & Kishi

F. et al. (2001) Iron-dependent regulation of the divalent metal ion transporter. Fed

Eur Biochem Soc Lett. 509(2):309-316

Guo, Q; Wang, P.R.; Milot, D.P.; Ippolito, M.C.; Hernandez, M.; Burton, C.A.;

Wright, S.D.e Chao, Y. (2001). Regulation of lipid metabolism and gene expression

by fenofibrate in hamsters. Biochim Biophys Acta. 1533(3):220-3.

Haberland, M. E.; Fong, D. & Cheng, L. (1988). Malondialdehyde altered protein

occurs in atheroma of WHHL rabbits. Science. 241: 215–218.

Halliwell, B. & Gutteridge, J.M.C. (1984). Oxygen toxicity, oxygen radicals,

transition metals and disease. Biochem. J. 219: 1–14.

Halliwell, B. & Gutteridge J.M.C. (1986). Oxygen free radicals and iron in relation

to biology and medicine: some problems and concepts. Arch Biochem Biophys,

246: 501-514.

Halliwell, B.; Gutteridge J.M.C & Cross, C.E. (1992). Free radicals, antioxidants,

and human disease: Where are we now? J. Lab. Clin. Med., 119:568-620.

Heinecke, J.W.; Rosen, H. Suzuki, L.A. & Chait A. (1987).The role of sulfur-

containing amino acids in superoxide production and modification of low density

lipoprotein by arterial smooth muscle cells. J Biol Chem . 262:10098–100103.

Henry, J.B. (1999) Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 19ª

ed. Saunders Company.

Hirai, M.; Tatuso. E.; Sakurai, M.; Ichikawa, M.; Matsuya, F. & Saito, Y. (1996).

Elevated blood concentrations of cyclosporine and kidney failure after bezafibrate in

renal graft recipient. Ann Pharmacother. 30: 883–884

Holbein, B.E. (1980). Iron-controlled infection with Neisseria meningitidis in mice.

Infect Immun 29(3): 886-91.

Inoue, I. Goto S, Matsunaga T.; Nakajima T.; Awata T.;, Hokari S.;, Komoda T. &

Katayama S. (2001). The ligands/activators for peroxisome proliferator-activated

receptor α (PPARα) and PPARγ increase Cu

,Zn

- superoxide dismutase and

decrease p22phox message expressions in primary endothelial cells. Metabolism.

50:3–1.

Ijpenberg, A. Tan N.S.; Gelman L.; Kersten S.; Seydoux J.; Xu J.; Metzger D.;

Canaple L.; Chambon P.; Wahli W. & Desvergne B. (2004). In vivo activation of

PPAR target genes by RXR homodimers. EMBO J. 23:2083–2091.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

Jacob, N.; Bruckert, E.; Giral, P.; Foglietti; M.J. & Turpin G. (1999). Cysteine is a

cardiovascular risk factor in hyperlipidemic patients. Atherosclerosis, 146(1):53–59.

Jakubowski, H. (2000). Calcium-dependent human serum homocysteine thiolactone

hydrolase. A protective mechanism against protein N-homocysteinylation. J Biol

Chem 275:3957–3962.

Jakubowski, H. (2005). Anti-N-homocysteinylated protein autoantibodies and

cardiovascular disease. Clin Chem Lab Med, 43(10):1011-1014

Jiang, R.; Manson, J.E.; Meigs, J.B.; Ma, J.; Rifai, N. & Hu, F.B. (2004). Body iron

stores in relation to risk of type 2 diabetes in apparently healthy women. JAMA.

291(6):711-717

Kaur, D. e Anderson J. (2004). Does cellular iron dysregulation play a causative role

in Parkinson’s disease? Ageing Research Reviews 3: 327-343.

Kleinman, W.A. & Richie, J.P.(2000). Status of glutathione and other thiols and

disulfides in human plasma. Biochem Pharmacol. 60:19–29.

Kota, B.P.; Huang, T.H.E. & Roufogalis, B.D. (2005) An overview on biological

mechanisms of PPARs. Pharmacological Research 51(2). 85-94.

Krey, G.; Braissant, O. & L'Horset, F. (1999). Fatty acids, eicosanoids, and

hypolipidemic agents identified as ligands of peroxisome proliferators by

coactivator-dependent receptor ligand assay. Mol Endocrinol, 11: 779–791.

Kujiraoka, T.; Oka, T. & Ishihara, M. (2000). A sandwich enzyme-linked

immunosorbent assay for human serum paraoxonase concentration. J Lipid Res.

41(8):1358-63

Ledwith, B.J.; Pauley, C.J.; Wagner, L.K.; Rokos, C.L.; Alberts, D.W. & Manam, S.

(1997). Induction of cyclooxygenase-2 expression by peroxisome proliferators and

non-tetradecanoylphorbol 12, 13- myristate-type tumor promoters in immortalized

mouse liver cells. J Biol Chem, 272: 3707–3714.

Lee, H. et al. (2000). Role for peroxisome proliferator- activated receptor 〈 in

oxidized phospholipids induced synthesis of monocyte chemotactic protein- 1 and

interleukin-8 by endothelial cells. Circ. Res. 87:516–521.

Leonarduzzi, G.; Scavazza, A.; Biasi F.; Chiarpotto E.; Camandola S.; Vogel S.;

Dargel R. & Poli G. (1997). The lipid peroxidation end product 4-hydroxy-2, 3-

nonenal up regulates transforming growth factor beta1 expression in the

macrophage lineage: a link between oxidative injury and fibrosclerosis. FASEB J.

11:851–857.

Levy1, E.; Trudel, K.; Sinnett, D.; James, R.W.; Delvin, E. A. & Seidman E.

(2005). iron–ascorbic acid-induced oxidant stress and its quenching by paraoxonase

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

1 in hdl and the liver: comparison between humans and rats. J Cell Biochem.

96:404–411.

Li, A.C. Binder, C.J.; Gutierrez, A.; Brown, K.K.; Plotkin, C.R.; Pattison, J.W.;

Valledor, A.F.; Davis, R.A.; Willson, T.M.; Witztum, J.L.; Palinski, W. & Glass,

C.K. (2004). Differential inhibition of macrophage foam-cell formation and

atherosclerosis in mice by PPARα, β/δ, and γ. J. Clin. Invest. 114:1564–1576.

Lobreàux, S.; Hardy, T. & Briat, J.F. (1993). Abscisic acid is involved in the iron-

induced synthesis of maize ferritin. EMBO J. 12, 651–657.

Marcil, V.; Delvin, E.; Sané A.T.; Tremblay, A. & Levy, E. (2006). Oxidative

stress influences cholesterol efflux in THP-1 macrophages: Role of ATP-binding

cassette A1 and nuclear factors. Cardiovasc Res 72: 473–482

Mendler, M.H.; Turlin, B.; Moirand, R.; Jouanolle, A.M.; Sapey, T.; Guyader, D.;

Le Gall, J.Y.; Brissot, P.; David, V. & Deugnier, Y. (1999). Insulin resistance-

associated hepatic iron overload. Gastroenterology. 117(5):1155-63.

Meyers, D. G. (2000). The iron hypothesis: does iron play a role in atherosclerosis?

Transfusion 40: 1023–1029.

Motojima, K.; Passilly, P.; Peters, J.M.; Gonzalez, F.J. & Latruffe N. (1998).

Expression of putative fatty acid transporter genes are regulated by peroxisome

proliferator-activated receptor alpha and gamma activators in a tissue- and inducer-

specific manner J. Biol. Chem, 273: 16710 –16714.

Mueller, S.; Pantopoulos, K.; Hubner, C.A.; Stremmel, W. & Hentze, M.W. (2001).

IRP1 activation by extracellular oxidative stress in the perfused rat liver. J. Biol.

Chem. 276, 23192–23196.

Napoli, C.; P. F. D’Armiento, F. P. Mancini, A.; Postiglione, J. L.; Witztum, G,

Palumbo, & Palinski, W. (1997). Fatty streak formation occurs in human fetal aortas

and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia: intimal accumulation of

low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early

atherosclerotic lesions. J. Clin. Invest. 100: 2680–2690.

Navab, M.; Hama, S.Y.; Cooke, C.J.; Ananthramaiah, G.M.; Chadda, M. & Jin, L.

et al. (2000). Normal high density lipoprotein inhibits three steps in the formation of

midly oxidized low density lipoprotein: step 1. J Lipid Res., 41: 1481-94.

Navab, M.; Ananthramaiah, G.M.; Reddy, S.T.; van Lesten, B.J.; Ansell, B.J. &

Fararow, G.C. Vahabzadeh, K.; Hama, S.; Hough, G.; Kamranpour, N.; Berliner,

J.A.; Lusis, A.J. & Fogelman, A.M. (2004) Te oxidation hypotesis of

atherosclerosis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45:993-

1007.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

Nemeth, E.; Tuttle, M.S. & Powelson, J. et al. (2004) Hepcidin regulates cellular

iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science,

306:2090-2093

Nistor, A.N.; Bulla, A.; Filip, D.A. & Radu, A (1987) The hyperlipidemic hamster

as a model of experimental atherosclerosis. Atherosclerosis 68:159–173

Oda, M.N.; Bielicki, J.K.; Ho, T.T.; Berger, T.; Rubin, E.M. & Forte, T.M. (2002).

Paraoxonase overexpression in mice and its effect on high-density lipoproteins.

Biochem Biophys Res Commun, 290:92 -97.

Olsson K.S.;Heedman, P.A. & Staugard F. (1978) Preclinical hemochromatosis in a

population on a high-iron-fortified diet. JAMA 239(19): 1999-2000.

Olsson, K.S.; Marsell, R.; Ritter, B.; Olander, B.; Akerblom, A.; Ostergard, H. &

Larsson, O. (1995). Iron deficiency and iron overload in Swedish male adolescents.

J Intern Med. 237(2): 187-194.

Palinski, W.; Rosenfeld M. E.; Yla-Herttuala,S.; Gurtner, G. C.; Socher, S. S. ;

Butler, S. W.; Parthasarathy, S. Carew, T. E.; Steinberg, D. & Witztum, J. L. (1989).

LDL undergoes oxidative modification in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:

1372–1376.

Pantopoulos, K.; Gray, N. & Hentze, M.W. (1995). Diferential regulation of two

related RNA-binding proteins, iron regulatory protein (IRP) and IRPB. RNA 1:

155–163.

Pantopoulos, K.; Mueller, S.; Atzberger, A.; Ansorge, W.; Stremmel, W. & Hentze,

M.W., (1997). Diferences in the regulation of iron regulatory protein 1 (IRP1) by

extra- and intracellular oxidative stress. J. Biol. Chem. 272: 9802–9808.

Pantopoulos, K. & Hentze, M.W., (2000). Nitric oxide, oxygen radicals, and iron

metabolism. Nitric Oxide 19: 293–313.

Park, C. H.; Bacon, B.R.; Brittenham, G.M. & Tavill A.S. (1987) Pathology of

dietary carbonyl iron overload in rats. Lab Invest 57: 555-563.

Perrone, M.G.; Santandrea, E.; Dell'uomo, N.; Giannessi, F.; Milazzo, F.M.,

Sciarroni, A.F.; Scilimati, A. & Tortorella, V. (2005) Synthesis and biological

evaluation of new clofibrate analogues

as potential PPARα agonists. Eur J Med

Chem 40: 143–154.

Ponka, P.; Beaumont, C. & Richardson D.R. (1998). Function and regulation of

transferrin and ferritin. Semin Hematol 35 (1):35-54.

Ponka, P. (1999), Cellular iron metabolism. Kidney Int Suppl 69, 2-11.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

Puntarulo, S. & Cederbaum, A.I. (1996). Role of cytochrome P-450 in the

stimulation of microsomal production of reactive oxygen species by ferritin.

Biochim. Biophys. Acta. 1289: 238–246.

Rashid, S. Watanabe, T.; Sakaue, T. & Lewis, G.F. (2003). Mechanisms of HDL

lowering in insulin resistant, hypertriglyceridemic states: the combined effect of

HDL triglyceride enrichment and elevated hepatic lipase activity. Clin Biochem,

36(6): 421-429.

Randell, E.W.; Parkes, J.G.; Olivieri, N.F. & Templeton, D.M. (1994). Uptake of

non-transferrin bound iron by both reductive and nonreductive processes is

modulated by intracellular iron. J Biol Chem, 269: 16046 - 16053.

Rizvi, F., Puri A., Bhatia G., Khanna, A.K., Wulff, E.M., Rastogi, A.K., & Chander,

R. (2003) Antidyslipidemic action of fenofibrate in dyslipidemic-diabetic hamster

model Biochem. Bioph. Res Comm, 305: 215-222

Saez, G.; Thornalley, P.J.; Hill, H.A.O.; Hems, R. & Bannister, J.V. (1982). The

production of free radicals during the autooxidation of cysteine and their effect on

isolated rat hepatocytes. Biochem Biophys Acta, 719:24–31.

Salen, G.; von Bergmann, K.; Lutjohann, D.; Kwiterovich, P.; Kane, J. & Patel, S.B.

et al. (2004). Ezetimibe effectively reduces plasma plant sterols in patients with

sitosterolemia. Circulation, 109(8): 966-971.

Salonen, J. T.; Nyyssonen, K.; Korpela, H.; Tuomilehto, J.; Seppanen, R. &

Salonen, R. (1992). High stored iron levels are associated with excess risk of

myocardial infarction in eastern Finnish men. Circulation 86: 803–811.

Scanu, A. M.; A. Khalil, L.; Neven, M.; Tidore, G.; Dawson, D.; Pfaffinger, E.;

Jackson, K. D.; Carey, H. C.; McGill, & Fless, G. M. (1988). Genetically

determined hypercholesterolemia in a rhesus monkey family due to a deficiency of

the LDL receptor. J. Lipid Res. 29: 1671-1681.

Sheth, S. & Britthenham, G.M. (2000). Genetic disorders affecting proteins of iron

metabolism: clinical implications. Annu Rev Med, 51: 443-464.

Schillaci, G. et al. (2001). High-density lipoprotein cholesterol and left ventricular

hypertrophy in essential hypertension. J Hypertens. 19: 12, 2265-2270.

Schoonjans, K.; Staels, B. & Auwerx, J. (1996). Role of the peroxisome

proliferators activated receptor (PPAR) in mediating the effects of fibrates and fatty

acids on gene expression. J Lipid Res 37:907- 925.

Scott, M.D.; Lubin, B.H.; Zuo, L. & Kuypers, F.A. (1991). Erythrocyte defense

against hydrogen peroxide: preeminent importance of catalase. J Lab Clin Med ,

118: 7-16.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

Sedlak J. & Lindsay R.H. (1968) Estimation of total, protein-bound, and nonprotein

sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent. Analytical Biochemistry 25: 192-

205.

Serdyuk, A.P. & Morton, R.E. (1999). Lipid transfer inhibitor protein defines

theparticipation of lipoproteins in lipid transfer reactions: CETP has no preference

for cholesterol ester in HDL versus LDL. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19:718-

26.

Shih, D.M.; Gu, L.; Xia, Y.R.; Navab, M.; Li, W.F.; Hama, S.; Castellani, L.W.;

Furlong, C.E.; Costa, L.G.; Fogelman, A.M. & Lusis, A.J. (1998). Mice lacking

serum paraoxonase are susceptible to organophosphate toxicity and atherosclerosis.

Nature, 394:284-287.

Shi, M.J.; Yang, H.; Motley, E.D. & Guo, Z.M. (2004). Overexpression of Cu/Zn

superoxide dismutase and/or catalase in mice inhibits aorta smooth muscle cell

proliferation. Am J Hypertens. 17: 450–456.

Siah, C.W.; Trinder, D. & Olynyk J.K. (2005) Iron overload. Clin Chim Acta, 358:

24-36.

Sies, H. (1993). Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem. 215: 213–219.

Sies, H. (2000). Oxidative stress. In: Encyclopedia of Stress (Fink, G., ed.), Vol. 3,

pp. 102–105. Academic Press, San Diego, CA.

Sies, H. e Stahl, W. (2004). Nutritional protection against skin damage from

sunlight. Annu. Rev. Nutr. 24: 173–200.

Silva, J.C.A. (2005). Efeito do excesso de ferro e dieta hipercolesterolemiante sobre

o perfil de lipídios séricos e estresse oxidativo em hamsters. Dissertação ( Mestrado

em Ciências Biológicas). Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas

Gerais.

Smith, A.G.; Clothier, B.; Robinson, S.; Scullion, M.J.; Carthew, P.; Edwards, R.;

Luo, J.; Lim, C.K. & Toledano, M. (1998). Interaction between iron metabolism and

2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in mice with variants of the Ahr gene: a hepatic

oxidative mechanism. Mol. Pharmacol, 53: 52–61.

Sima, A., Stancu, C., Constanticescu, E., Olegeanu, L. & Simionescu, M. J. The

hyperlipemic hamster - model for testing he anti-atherogenic effect of amlodipine

(2001) Cell Mol. Med, 5: 153-162

Spady, D.I.C. & Dietschy, J. M. (1983). Sterol synthesis in vivo in 18 tissues of the

squirrel monkey, guinea pig, rabbit, hamster, and rat. Lipid Res. 2: 303-315.

Staels, B.; Dallongeville, J.; Auwerx, J.; Schoonjans, K.; Leitersdorf, E. & Fruchart

J.C. (1998) Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism.

Circulation, 98: 2088-2093.

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

Sullivan, J. L. (1981). Iron and the sex difference in heart disease risk. Lancet 1:

1293–1294.

Sung, B.; Park, S.; Yu, B.P. & Chung, H.Y. (2004) Modulation of PPAR in aging,

inflammation, and calorie restriction. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 59: 997-1006.

Tacchini, L.; Recalcati, S.; Bernelli-Zazzera, A. & Cairo, G., (1997). Induction of

ferritin synthesis in ischemic-reperfused rat liver: analysis of the molecular

mechanisms. Gastroenterology, 113: 946–953.

Teissier, E.; Nohara, A.; Chinetti, G.; Paumelle, R.; Cariou, B.; Fruchart, J.C.;

Brandes, R.P.; Shah, A. & Staels, B. (2004). Peroxisome proliferators activated

receptor α induces NADPH oxidase activity in macrophages, leading to the

generation of LDL with PPAR-α activation properties. Circ. Res. 95: 1174–1182.

Tontonoz, P.; Nagy, L. (1999). Regulation of macrophage gene expression by

peroxisome-proliferator-activated receptor A: implications for cardiovascular

disease. Curr Opin Lipidol 10: 485-90.

Tordjman, K.; Bernal-Mizrachi, C.; Zemany, L.; Weng, S.; Feng, C.; Zhang, F.;

Leone, T.C.; Coleman, T.; Kelly, D.P. & Semenkovich, C.F. (2001).

PPARαdeficiency reduces insulin resistance and atherosclerosis in ApoE-null mice.

J. Clin. Invest. 107: 1025–1034.

Turbino-Ribeiro, S.M.L.; Silva, M.E.; Chianca, J.R.D.A.; Paula, H.; Cardoso, L.M.;

Colombari, E. & Pedrosa, M.L. (2003). Iron overload in hypercholesterolemic rats

affects iron homeostasis and serum lipids but not blood pressure. J Nutr 133: 15-20.

Tward, A.; Xia, Y.R.; Wang, X.P.; Shi, Y.S.; Park, C.; Castellani, L.W.; Lusis, A.J.

& Shih, D.M. (2002). Decreased atherosclerotic lesion formation in human serum

paraoxonase transgenic mice. Circulation 106: 484-90.

Ueland, P.M.(1995). Homocysteine species as components of plasma redox thiol

status. Clin Chem, 41(3): 340–2.

Ueland, P.M.; Mansoor, M.A.; Guttormsen, A.B.; Müller, F.; Aukrust, P.; Refsum,

H. & Svardal, A.M. (1996). Reduced, oxidized and protein-bound forms of

homocysteine and other aminothiols in plasma comprise the redox thiols status—a

possible element of the extracellular antioxidant defence system. J Nutr, 126: 1281–

1284.

Whitfield, J.B.; Zhu, G.; Heath, A.C.; Powell, L.W. & Martin, N.G.(2001). Effects

of alcohol consumption on indices of iron stores and of iron stores on alcohol intake

markers. Alcohol Clin Exp Res, 25:1037-45.

Wilson, M.W.; Lay, L.T.; Chow, C.K.; Tai, H.; Robertson, L.W. & Glauert, H.P.

(1995). Altered hepatic eicosanoid concentrations in rats treated with the

OLIVEIRA,MR

Referências Bibliográficas

peroxisome proliferators ciprofibrate and perfluorodecanoic acid. Arch Toxicol, 69:

491–497

Willcox, J. K.; Ash, S. L. & Catignani, G. L. (2004). Antioxidants and prevention of

chronic disease. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 44: 275–295.

Wu, G.; Fang, Y. Z.; Yang, S.; Lupton, J. R. & Turner, N. D. (2004). Glutathione

metabolism and its implications for health. J. Nutr. 134: 489–492.

Yla-Herttuala, S.; Palinski, W.; Rosenfeld, S.; Parthasarathy, S. Carew, T. E. Butler,

S.; Witztum, J. L. & D. Steinberg. (1989). Evidence for the presence of oxidatively

modified low density lipoprotein in atherosclerotic lesions of rabbit and man. J.

Clin. Invest. 84: 1086–1095.

Young, C.E.; Karas, R.H. & Kuvin JT. (2004). High-density lipoprotein cholesterol

and coronary heart disease. Cardiol Rev. 12: 107-119.

Yoshinari, M.; Asano, T.; Kaori, S. Shi, A.H.; Wakisaka, M.; Iwase, M.&

Fujishima, M. (1998). Effect of gemfibrozil on serum levels of prostacyclin and

precursor fatty acids in hyperlipidemic patients with type 2 diabetes. Diabetes Res

Clin Pract. 42: 149–154.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 