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SILVANA MARIA ALBAN
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS
ISOLADAS DE HANSENOMAS
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção de grau de Mestre em
Processos Biotecnológicos, Curso de Pós-
Graduação em Processos Biotecnológicos,
Setor de Tecnologia, Universidade Federal do
Paraná.
Área de Concentração: Saúde Humana e
Animal.
Orientador: Profª. Drª. Vanete Thomaz Soccol
Co-Orientador: Prof. Dr. Marcelo Távora Mira
CURITIBA
2006
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ii
AGRADECIMENTOS
A Deus pela vida, pelas oportunidades, por ter-me permitido chegar até aqui
e pela certeza de Sua presença ao longo desta caminhada.
A meus pais, Selvino Alban e Neiva Fedatto Alban e a minha irmã Sandra
Maria Alban, pelo amor, compreensão e por compartilhar momentos de cansaço e
preocupações, sempre me incentivando a prosseguir.
À professora Drª. Vanete Thomaz Soccol, primeiramente, por ter-me aceito
como orientada, e ao longo deste tempo, espero ter merecido sua confiança.
Agradeço pelos ensinamentos, atenção, infinita paciência, dedicação e incentivo a
não esmorecer.
Ao professor Dr. Marcelo Távora Mira, pela atenção dedicada desde que
fomos-nos apresentados. Agradeço pela receptividade, dicas e contribuições
certamente importantes.
À Sandra R. B. R. Sella, pela oportunidade de conhecê-la, pela confiança em
mim depositada na realização do estágio curricular no CPPI e por conduzir-me no
caminho da pesquisa. Agradeço pelos conhecimentos transmitidos, pela
generosidade, amizade e por sempre estar disposta a ajudar.
Ao Sr. Rubens L. F. Gusso, diretor do CPPI, pela oportunidade do estágio
curricular, pela disponibilização dos laboratórios, materiais, insumos e equipamentos
imprescindíveis na realização deste trabalho.
À Regina E. F. Dlugokenski, Wilma R. Guerra, Neide F. B. Binder, Regiane
A. Szargiki, João Carlos Minozzo, Júlia S. Camillo, Isolete P. da Silva e Rosana Z.
Guimarães, pela atenção, colaboração e ensinamentos. À Elza R. Mendes, Neuza
de Araújo, Sonilda S. dos Santos, Shirley M. dos Santos, Eva Braz, Milena S. G. da
Silva, Rosangela P. de Lara, Rosângela S. de L. Paula e Margarete P. Machado pela
disposição em ajudar-me. À Adalgisa L. Braga, Maria Inês de P. Corrêa, Nadir
Laidane Filho, Rubemyr M. S. Chaiben, Rubens G. de Souza, Isabel C. da Silva,
Maria José Passos, Dóris do C. Baungart, Lilian C. Dornelles, Paulo da R. L.
Pacheco, João A. da Cruz, Antonio Silvério Oliveira e Jacques B. da Silva por
auxiliar-me em questões administrativas e rotineiras. Enfim, agradeço a todos do
CPPI, inclusive àqueles que não citei, pela satisfação em conhecê-los, pela amizade
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iii
e pela convivência ao longo destes anos. Espero, sinceramente, poder estarmos
juntos por mais tempo.
À Fundação Pró-Hansen, especialmente professor Dr. Ruy N. Miranda,
exemplo de dedicação, à Ivone T. Dechamdt e Arnoldo Tod, pela participação em
introduzir-me no caminho da pesquisa e pela disponibilidade em ajudar com
amostras e informações.
Ao Hospital de Dermatologia Sanitária do Paraná, especialmente aos
médicos Dr. Hamilton L. Rebeiro e Dr. José M. Lanzoni, as enfermeiras Jussara de
Carvalho, Maria Bernadete G. de Lima e Cristina M. Umezawa, à Anadir M. Daris,
auxiliar de enfermagem, e ao farmacêutico bioquímico Rene A. Penno pela
prontidão, receptividade e pela colaboração com amostras e informações.
À Nivera N. Stremel, coordenadora estadual do programa de Eliminação de
Hanseníase da Secretária Estadual de Saúde, pela atenção, contribuições e pelos
convites às oficinas. Aos profissionais das regionais de saúde do Paraná e dos
centros de referência dos demais estados do Brasil, não citarei nomes, pois, são
muitos, pela atenção em atender-me, pelas informações e pelo auxílio quando
possível.
Aos professores do programa de pós-graduação em Processos
Biotecnológicos, com o coordenador professor Dr. Carlos R. Soccol e vice-
coordenadora professora Drª. Luciana P. de Souza Vandenberghe, pelos
conhecimentos transmitidos.
Às professoras do Departamento de Patologia Básica, do laboratório
de Parasitologia Molecular, Drª. Edilene A. de Castro e Drª. Rosângela C.
Paulino pela cooperação.
À Giovanna B. M. Lucas, Andréa Boçois e Thiago O. Agostino da
Biblioteca de Ciências e Tecnologia pelos serviços bibliotecários.
Aos colegas de pós-graduação e de laboratório, especialmente
Michele R. Spier, Katherine A. T de Carvalho, Nelson L. M. Fernandes,
Samira C. Ehlers, Cristina S. Sotomaior, Paôla W. Meireles, Ellen de S.
Marquez, Silvia C. Osaki, Yanê de Carvalho, Marcelo Malaghini, Soraia R.
Gilber, Luciane M. Henning, Juliana T. Pereira, Viviane Milczewsk, Tatiana
iv
Gazda e Diego Canloffski, seja pelo auxílio ou seja pelo companheirismo e
amizade.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pelo apoio financeiro.
Enfim, sou grata a todos aqueles, que gentilmente contribuíram de
alguma forma para a execução deste trabalho.
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ...............................................................................................viii
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................x
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................xiii
LISTA DE SÍMBOLOS..............................................................................................xv
RESUMO.................................................................................................................xvii
ABSTRACT............................................................................................................xviii
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
2 OBJETIVOS.............................................................................................................3
2.1 GERAL ..................................................................................................................3
2.2 ESPECÍFICOS ......................................................................................................3
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................4
3.1 MICOBACTÉRIAS................................................................................................4
3.1.1 Características Gerais.......................................................................................4
3.1.2 Classificação das Micobactérias .......................................................................5
3.1.3 Biossegurança...................................................................................................7
3.1.4 Colheita e Processamento de Amostras ...........................................................7
3.1.5 Digestão e Descontaminação das Amostras.....................................................7
3.1.5.1 Agentes para digestão e descontaminação....................................................8
3.1.6 Concentração ....................................................................................................9
3.1.7 Coloração para Bacilos Ácido-Resistentes......................................................10
3.1.7.1 Exame e interpretação dos esfregaços ........................................................12
3.1.8 Meios de Cultura e Métodos de Isolamento ....................................................14
3.1.8.1 Meios a base de ovos...................................................................................15
3.1.8.2 Meios a base de ágar...................................................................................16
3.1.8.3 Meio líquido ..................................................................................................17
3.1.8.3.1 Sistema BACTEC AFB..............................................................................17
3.1.8.3.2 Sistema MB/BacT......................................................................................18
3.1.8.3.3 Sistema ESP MYCO..................................................................................19
3.1.8.3.4 Sistema Septi-Chek AFB...........................................................................19
3.1.8.3.5 Sistema tubo indicador de crescimento de micobactéria (MGIT) ..............20
3.1.8.4 Outros meios de cultura para recuperação de micobactérias ......................20
3.1.8.5 Sistema de lise-centrifugação ......................................................................20
3.1.9 Identificação ....................................................................................................21
3.1.9.1 Método tradicional ........................................................................................22
3.1.9.1.1 Morfologia de colônias...............................................................................22
3.1.9.1.2 Velocidade de crescimento e temperatura ................................................24
3.1.9.1.3 Pigmentação e fotorreatividade.................................................................25
3.1.9.1.4 Identificação bioquímica............................................................................25
3.1.9.2 Cromatografia...............................................................................................30
3.1.9.3 Análise do perfil plasmidial...........................................................................31
3.1.9.4 Sondas de DNA............................................................................................31
3.1.9.5 Detecção direta de M. tuberculosis ..............................................................33
3.1.9.6 PCR-seqüenciamento ..................................................................................33
3.1.9.7 PCR-RFLP ...................................................................................................44
3.1.9.8 Microarranjo de DNA....................................................................................52
3.1.9.9 PCR-hibridização..........................................................................................53
vi
3.1.10 Significado Clínico.........................................................................................55
3.2 HANSENÍASE ....................................................................................................62
3.2.1 História ............................................................................................................62
3.2.2 Etiologia...........................................................................................................68
3.2.3 Epidemiologia..................................................................................................71
3.2.3.1 Distribuição geográfica.................................................................................71
3.2.3.2 Transmissão.................................................................................................74
3.2.4 Genética da Suscetibilidade do Hospedeiro à Hanseníase.............................75
3.2.5 Reação de Mitsuda .........................................................................................78
3.2.6 Sinais e Sintomas............................................................................................80
3.2.7 Classificação ...................................................................................................81
3.2.8 Manifestações Clínicas e Reações .................................................................83
3.2.8.1 Manifestações clínicas ..................................................................................83
3.2.8.1.1 Hanseníase indeterminada........................................................................83
3.2.8.1.2 Hanseníase tuberculóide...........................................................................84
3.2.8.1.3 Hanseníase virchowiana ...........................................................................85
3.2.8.1.4 Hanseníase dimorfa ..................................................................................88
3.2.8.2 Reações hansênicas .....................................................................................90
3.2.8.2.1 Reação tipo reversa ..................................................................................91
3.2.8.2.2 Reação tipo 2 ............................................................................................92
3.2.9 Diagnóstico......................................................................................................93
3.2.9.1 Um caso de hanseníase...............................................................................93
3.2.9.2 Diagnóstico da doença.................................................................................93
3.2.10 Identificação Molecular de M. leprae.............................................................95
3.2.11 Tratamento ..................................................................................................102
3.2.11.1 Tratamento poliquimioterápico ..................................................................102
3.2.11.2 Acompanhamento do caso.......................................................................103
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................107
4.1 BIOSSEGURANÇA ..........................................................................................107
4.2 MICRORGANISMOS........................................................................................107
4.2.1 Cepas Referência..........................................................................................107
4.2.2 Amostras Clínicas .........................................................................................108
4.3 CULTIVO DE MICRORGANISMOS .................................................................109
4.4 RECUPERAÇÃO DE BIOMASSA BACTERIANA ............................................110
4.5 PROCESSAMENTO DAS BIÓPSIAS PARA REMOÇÃO DE MICOBACTÉRIAS..
................................................................................................................................110
4.6 EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIAS DE BIÓPSIAS E CULTURAS ...113
4.6.1 Extração de DNA das Culturas de Micobactérias..........................................113
4.6.2 Extração de DNA das Amostras Clínicas ......................................................115
4.6.3 Quantificação e Determinação da Pureza do DNA Genômico ......................115
4.6.4 Eletroforese ...................................................................................................116
4.7 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR): SELEÇÃO DE SEQÜÊNCIAS-
ALVO E CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO ...........................................................116
4.7.1 Amplificação do Fragmento do Gene hsp65 .................................................117
4.7.2 Amplificação do Fragmento do Gene rpoB....................................................118
4.8 POLIMORFISMO DE TAMANHO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO (RFLP) ..
................................................................................................................................120
4.9 ANÁLISE DE DADOS.......................................................................................121
5 RESULTADOS....................................................................................................122
vii
5.1 EFICIÊNCIA DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO ...........122
5.2 PROCESSAMENTO DAS BIÓPSIAS ..............................................................124
5.2.1 Pesquisa de Bacilos Ácido-Resistentes ........................................................125
5.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ............................................127
5.3.1 Amplificação do Fragmento do Gene hsp65 .................................................127
5.3.2 Amplificação do Fragmento do Gene rpoB....................................................130
5.4 POLIMORFISMO DE TAMANHO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO (RFLP) ..
................................................................................................................................132
5.4.1 RFLP dos Fragmentos do Gene hsp65.........................................................132
5.4.2 RFLP dos Fragmentos do Gene rpoB ...........................................................138
6 DISCUSSÃO........................................................................................................159
7 CONCLUSÕES....................................................................................................170
REFERÊNCIAS.......................................................................................................171
ANEXOS .................................................................................................................185
viii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - ESQUEMA DE CLASSIFICAÇÃO DE RUNYON PARA
MICOBACTÉRIAS NÃO TUBERCULOSAS (NTM)................
6
TABELA 2 - MÉTODO DE INFORME DO NÚMERO DE BACILOS
ÁCIDO-RESISTENTES OBSERVADOS EM ESFREGAÇOS
CORADOS..............................................................................
13
TABELA 3 - ESQUEMA DE TRATAMENTO PARA MICOBACTÉRIAS.... 22
TABELA 4 - CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE ALGUMAS
ESPÉCIES DE MICOBACTÉRIAS.........................................
23
TABELA 5 - TESTES BIOQUÍMICOS CHAVES PARA AUXILIAR NA
DISTINÇÃO DE MICOBACTÉRIAS PERTENCENTES AO
MESMO GRUPO....................................................................
25
TABELA 6 - GENÔMICA COMPARATIVA DE M. leprae e M.
tuberculosis.............................................................................
70
TABELA 7 - PAÍSES QUE AINDA NÃO ATINGIRAM A META DE
ELIMINAÇÃO..........................................................................
72
TABELA 8 - TAXAS DE PREVALECIA E DETECÇÃO DA HANSENÍASE
NO BRASIL EM 2005 POR REGIÃO.....................................
73
TABELA 9 - TENDÊNCIAS NA DETECÇÃO DE NOVOS CASOs
ENTRE 2001-2005, POR REGIÃO.........................................
74
TABELA 10
- FORMAS CLÍNICAS DA HANSENÍASE RELACIONADAS
COM BACILOSCOPIA E REAÇÃO DE MITSUDA,
SEGUNDO A CLASSIFICAÇÃO DE MADRI..........................
81
TABELA 11
- CORRELAÇÃO ENTRE AS CLASSIFICAÇÕES DE MADRI
(1953), DE RIDLEY E JOPLING (1966) E DA OMS (1982)
ADOTADAS PARA A HANSENÍASE......................................
83
TABELA 12
- CEPAS REFERÊNCIA E RESPECTIVOS CÓDIGOS........... 107
TABELA 13
- INFORMAÇÕES REFERENTES AOS PACIENTES
SUBMETIDOS Á BIÓPSIA.....................................................
109
TABELA 14
- VOLUME E CONCENTRAÇÃO DE REAGENTES USADOS
PARA PREPARAR 60 µl DA MISTURA DE PCR DO GENE
hsp65......................................................................................
118
TABELA 15
- PROGRAMAÇÃO PARA AMPLIFICAÇÃO SEM
TOUCHDOWN DO GENE hsp65...........................................
118
TABELA 16
- PROGRAMA PARA AMPLIFICAÇÃO COM TOUCHDOWN
DO GENE hsp65....................................................................
118
TABELA 17
- VOLUME E CONCENTRAÇÃO DE REAGENTES USADOS
PARA PREPARAR 60 µl DA MISTURA DE PCR DO GENE
rpoB........................................................................................
119
TABELA 18
- PROGRAMAÇÃO PARA AMPLIFICAÇÃO SEM
TOUCHDOWN DO GENE rpoB.............................................
119
TABELA 19
- PROGRAMAÇÃO PARA AMPLIFICAÇÃO COM
TOUCHDOWN DO GENE rpoB.............................................
120
TABELA 20
- VOLUMES DOS REAGENTES USADOS PARA
PREPARAR A MISTURA DE DIGESTÃO..............................
120
TABELA 21
- SEQÜÊNCIAS DE RECONHECIMENTO PARA AS
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO HaeIII, BstEII E BstU I...............
121
ix
TABELA 22
-
PUREZA E CONCENTRAÇÃO DO DNA EM µ
g/ml
DETERMINADOS POR ESPECTROFOTOMETRIA
REFERENTES AS CEPAS M. kansasii E M. phlei.................
122
TABELA 23
-
PUREZA E CONCENTRAÇÃO DO DNA EM µ
g/ml
DETERMINADOS POR ESPECTROFOTOMETRIA
REFERENTES AS MICOBACTÉRIAS CULTIVÁVEIS...........
123
TABELA 24
- PESQUISA DE BACILOS ÁCIDO-RESISTENTES NAS
FRAÇÕES SOBRENADANTE E SEDIMENTO DAS
AMOSTRAS PROVENIENTES DE TECIDOS.......................
126
TABELA 25
- AMOSTRAS, FRAÇÕES AMPLIFICADAS E CONDIÇÕES
DE AMPLIFICAÇÃO DO FRAGMENTO DO GENE hsp65....
129
TABELA 26
- AMOSTRAS, FRAÇÕES AMPLIFICADAS E CONDIÇÕES
DE AMPLIFICAÇÃO DO FRAGMENTO DO GENE rpoB......
132
TABELA 27
- FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO PRODUTO DE PCR
DE 439 pb DO GENE hsp65 PARA AS CEPAS DE
REFERÊNCIA.........................................................................
135
TABELA 28
- FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO PRODUTO DE PCR
DE 439 pb DO GENE hsp65 PARA AS AMOSTRAS
CLÍNICAS...............................................................................
138
TABELA 29
- FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO PRODUTO DE PCR
DE 342 pb DO GENE rpoB PARA AS CEPAS DE
REFERÊNCIA.........................................................................
141
TABELA 30
- FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO PRODUTO DE PCR
DE 342 pb DO GENE rpoB PARA AS AMOSTRAS
CLÍNICAS...............................................................................
145
TABELA 31
- RESUMO DOS DADOS DOS PACIENTES DOADORES DE
HANSENOMA NO QUE SE REFERE AO TRATAMENTO,
BACILOSCOPIA, PCR E RFLP..............................................
146
TABELA 32
- TEMPERATURAS DE INCUBAÇÃO DAS ENZIMAS DE
RESTRIÇÃO UTILIZADAS.....................................................
197
TABELA 33
- VOLUME DE REAGENTES USADOS PARA O PREPARO
DE GEL DE POLIACRILAMIDA.............................................
199
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - COLORAÇÃO POR ZIEHL-NEELSEN DE Mycobacterium
tuberculosis...............................................................................
12
FIGURA 2 - APARÊNCIA TÍPICA DE MICOBACTÉRIAS EM MEIO
SÓLIDO....................................................................................
24
FIGURA 3 - MODELO ESQUEMÁTICO DA PAREDE CELULAR DO M.
leprae........................................................................................
69
FIGURA 4 - TAXA DE PREVALÊNCIA NO FINAL DE 2005........................
72
FIGURA 5 - ESPECTRO CLÍNICO DA HANSENÍASE................................ 79
FIGURA 6 - HANSENOMAS........................................................................ 86
FIGURA 7 - FLUXOGRAMA DE PROCESSAMENTO DAS BIÓPSIAS...... 112
FIGURA 8 - ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 0,8% DO DNA
GENÔMICO EXTRAÍDO DAS CEPAS M. kansasii E M. phlei
122
FIGURA 9 - ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 0,8% DO DNA
GENÔMICO EXTRAÍDO DE MICOBACTÉRIAS
CULTIVÁVEIS...........................................................................
124
FIGURA 10
- HANSENOMA HUMANO OBTIDO POR BIÓPSIA...................
124
FIGURA 11
- BACILOS ÁCIDO-RESISTENTES DA FRAÇÃO
SOBRENADANTE CORADOS PELA TÉCNICA ZIEHL-
GABBET OBSERVADOS NO AUMENTO DE 1000X..............
127
FIGURA 12
- BACILOS ÁCIDO-RESISTENTES DA FRAÇÃO
SEDIMENTO CORADOS PELA TÉCNICA ZIEHL-GABBET
OBSERVADOS NO AUMENTO DE 1000X..............................
127
FIGURA 13
- PRODUTOS DE PCR DO FRAGMENTO DO GENE hsp65
EM GEL DE AGAROSE A 1,6% DAS CEPAS DE
MICOBACTÉRIAS CULTIVÁVEIS............................................
128
FIGURA 14
- PRODUTOS DE PCR DO FRAGMENTO DO GENE hsp65
VISUALIZADOS EM GEL DE AGAROSE A 1,6% DAS
AMOSTRAS PROVENIENTES DE TECIDOS..........................
129
FIGURA 15
- PRODUTOS DE PCR DO FRAGMENTO DO GENE rpoB EM
GEL DE AGAROSE A 1,6% DAS CEPAS DE
MICOBACTÉRIAS CULTIVÁVEIS............................................
130
FIGURA 16
- PRODUTOS DE PCR DO FRAGMENTO DO GENE rpoB
VISUALIZADOS EM GEL DE AGAROSE A 1,6% DAS
AMOSTRAS PROVENIENTES DE TECIDOS..........................
131
FIGURA 17
- PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III
PARA AS CEPAS DE REFERÊNCIA VISUALIZADO EM GEL
DE POLIACRILAMIDA A 10%..................................................
133
FIGURA 18
- PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII
PARA AS CEPAS DE REFERÊNCIA VISUALIZADO EM GEL
DE POLIACRILAMIDA A 10%..................................................
134
FIGURA 19
- PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III
PARA AS AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADO EM GEL
DE POLIACRILAMIDA A 10%..................................................
136
xi
FIGURA 20
- PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII
PARA AS AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADO EM GEL
DE POLIACRILAMIDA A 10%..................................................
137
FIGURA 21
- PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Hae III
PARA AS CEPAS DE REFERÊNCIA VISUALIZADO EM GEL
DE POLIACRILAMIDA A 8%....................................................
139
FIGURA 22
- PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Bst UI PARA
AS CEPAS DE REFERÊNCIA VISUALIZADO EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 8%..........................................................
140
FIGURA 23
- PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Hae III
PARA AS AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADOS EM GEL
DE POLIACRILAMIDA A 8%....................................................
142
FIGURA 24
- PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Bst UI PARA
AS AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADOS EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 8%..........................................................
143
FIGURA 25
- PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Hae III E Bst
UI PARA AS AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADOS EM
GEL DE POLIACRILAMIDA A 8% APÓS PURIFICAÇÃO DO
PRODUTO DE PCR.................................................................
144
FIFURA 26 - DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A
ENZIMA DE RESTRIÇÃO Bst EII, AOS FRAGMENTOS DE
DNA RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES
PARA O GENE hsp65, DAS AMOSTRAS CLÍNICAS..............
148
FIGURA 27
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A
ENZIMA DE RESTRIÇÃO Bst EII, AOS FRAGMENTOS DE
DNA RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES
PARA O GENE hsp65, DAS CEPAS REFERÊNCIAS.............
149
FIGURA 28
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A
ENZIMA DE RESTRIÇÃO Hae III, AOS FRAGMENTOS DE
DNA RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES
PARA O GENE hsp65, DAS AMOSTRAS CLÍNICAS..............
150
FIGURA 29
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A
ENZIMA DE RESTRIÇÃO Hae III, AOS FRAGMENTOS DE
DNA RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES
PARA O GENE hsp65, DAS CEPAS REFERÊNCIAS.............
151
FIGURA 30
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A
ENZIMA DE RESTRIÇÃO Bst UI, AOS FRAGMENTOS DE
DNA RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES
xii
PARA O GENE rpoB, DAS AMOSTRAS CLÍNICAS................
152
FIGURA 31
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A
ENZIMA DE RESTRIÇÃO Bst UI, AOS FRAGMENTOS DE
DNA RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES
PARA O GENE rpoB, DAS CEPAS REFERÊNCIAS...............
153
FIGURA 32
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A
ENZIMA DE RESTRIÇÃO Hae III, AOS FRAGMENTOS DE
DNA RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES
PARA O GENE rpoB, DAS AMOSTRAS CLÍNICAS................
154
FIGURA 33
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A
ENZIMA DE RESTRIÇÃO Hae III, AOS FRAGMENTOS DE
DNA RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES
PARA O GENE rpoB, DAS CEPAS REFERÊNCIAS...............
155
FIGURA 34
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM TRÊS
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (Hae III, Bst UI, Bst EII), AOS
FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR COM OS
INICIADORES PARA OS GENES rpoB E hsp65, DAS
AMOSTRAS CLÍNICAS............................................................
156
FIGURA 35
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM TRÊS
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (Hae III, Bst UI, Bst EII), AOS
FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR COM OS
INICIADORES PARA OS GENES rpoB E hsp65 PARA
CEPAS REFERÊNCIAS...........................................................
157
FIGURA 36
- DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM TRÊS
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (Hae III, Bst UI, Bst EII), AOS
FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR COM OS
INICIADORES PARA OS GENES rpoB E hsp65 PARA
AMOSTRAS CLÍNICAS E CEPAS REFERÊNCIAS.................
158
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
a.C. - Antes de Cristo
AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adiquirida
ATCC - American Type Culture Collection
B - Borderline
BB - Bordreline-Borderline
BL - Borderline-Lepromatoso
Borstel - National Research Institute for Mycobacteria, Borstel
BT - Borderline-Tuberculóide
CIPT - Collection Instituut Pasteur de Paris-Tuberculose
CPPI - Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos
D - Dimorfo
d.C. - Depois de Cristo
DD - Dimorfo-Dimorfo
DL - Dimorfo-Lepromatoso
DNA - Ácido Desoxirribonucléico
DNAr - DNA ribossômico
DSM - Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismem
DT - Dimorfo-Tuberculóide
DV - Dimorfo-Virchoviano
E-MTD - Enhanced M. tuberculosis Direct Test
ENH - Eritema Nodoso da Hanseníase
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Pressão
I - Indeterminado
IP - Institut Pasteur
ITS - Seqüência Intergência 16S-23S DNAr
L - Lepromatoso
LCR - Líquido Cefalorraquidiano
LJ - Löwenstein-Jensen
LL - Lepromatoso-Lepromatoso
xiv
MAC - Complexo M. avium, formado por M. avium e M. intracellulare
MAIS - Complexo M. avium/intracelullare/srofulaceum
BCG - Bacilo Calmette-Guérin
NCTC - National Collection of Type Culture
NTM - Micobactérias não Tuberculosas
OCF - Italian Reference Laboratory for Mycobacteria
OMS - Organização Mundial de Saúde
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
PGL - Glicolipídio Fenólico
PQT - Poliquimioterapia
RFLP - Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição
RIDOM - Ribossomal Differentiation of Medical Microorganismos
RNA - Ácido Ribonucléico
RNAr - RNA ribossômico
T - Tuberculóide
TAE - Tris-Acetato-EDTA
TBE - Tris-Borato-EDTA
TD PCR - Touchdown PCR
TE - Tris-EDTA
TT - Tuberculóide-Tuberculóide
V - Virchowiano
xv
LISTA DE SÍMBOLOS
% - Por cento
ºC - Graus Celsius
> - Maior que
< - Menor que
X - Vezes
A
260
/A
280
- Razão entre as absorbância a 260 nm e a 280
nm
Bis - N,N’-metilenobisacrilamida
C - Citosina
Célula T CD4 - Células T com o co-receptor CD4
cm - Centímetros
CO
2
- Dióxido de carbono
dNTP - Deoxinucleosídio trifosfato
e
-
- Elétron
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético
32
P - Fósforo radioativo
G - Guanina
g - Grama ou força centrífuga relativa
H - Hidrogênio
H
2
O - Água
HCl - Ácido clorídrico
Kb - Kilobases
KCl - Cloreto de potássio
KDa - Kilodalton
M - Molar
M. sp - Amostra de cultura proveniente de lesão de
paciente hanseniano
Mb - Megabase
MFO, MGI, MKA, TEM, OCM - Isolados clínicos de Mycobacteriology
Laboratory of Verena Hospital
xvi
mg - Miligramas
MgCl
2
- Cloreto de magnésio
min - Minuto
ml - Mililitros
ML1 - Amostra de M. leprae cedida pela FIOCRUZ
mm - Milímetros
mM - Milimolar
mm
3
- Milímetros cúbicos
NaCl - Cloreto de sódio
ng - Nanograma
nm - Nanômetro
pb - Pares de base
pH - Potencial dos íons hidrogênio
pmol - Picomol
s - Segundo
SDS - Dodecil sulfato de sódio
TEMED - N,N,N’,N’-tetrametil etileno diamina
Tris - Tris(hidroximetil)aminometano
U - Unidade ezimática
V - Volts
µg
- Micrograma
µl
- Microlitro
µm
- Micrômetro
µM
- Micromolar
xvii
RESUMO
A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, causada pelo Mycobacterium
leprae, que acomete principalmente a pele e o sistema nervoso periférico. Para a
classificação da doença e avaliação da resposta imune do indivíduo ao M. leprae,
usa-se o teste de Mitsuda. Este teste consiste na injeção intradérmica da mitsudina
integral ou antígeno de Mitsuda, que provoca uma reação tardia denominada reação
de Mitsuda, cuja leitura é realizada quatro semanas após a aplicação. A mitsudina é
uma suspensão de M. leprae mortos pelo calor, os quais são obtidos de
hansenomas de pacientes com hanseníase virchowiana ou de tecidos de tatu
infectados com M. leprae, isso porque o agente causador da doença não é cultivável
in vitro. Para investigar a presença de M. leprae e/ou outras micobactérias nas
lesões de pacientes com hanseníase, que por sua vez são utilizadas como matéria-
prima para a produção de mitsudina, um pequeno fragmento dos hansenomas foi
removido para a identificação molecular de micobactérias. Os métodos PCR-RFLP
para o genes hsp65 e rpoB permitiram a diferenciação das espécies de
micobactérias estudadas, com exceção dos membros do complexo M. tuberculosis.
Dos 23 hansenomas, apenas 12 (52,17%) continham numerosos bacilos e
amplificaram para micobactérias. Além de M. leprae, encontrou-se M. szulgai, em
um dos hansenomas. Na cultura de micobactérias obtida de lesão cutânea profunda
de paciente com hanseníase virchowiana identificou-se M. kansasii. Os dados
obtidos com esta pesquisa contribuirão para melhorar a qualidade da mitsudina até
então produzida, através da aplicação da metodologia aqui padronizada para a
seleção de amostras adequadas, assim como, os dados servirão de suporte para
futuro desenvolvimento de antígeno para intradermorreação em substituição a
mitsudina.
Palavras-chaves: Hanseníase, Mycobacterium leprae, hansenomas, micobactérias,
identificação molecular.
xviii
ABSTRACT
Leprosy is a chronic infection disease caused by Mycobacterium leprae which affects
mainly the skin and the peripheral nervous system. The Mitsuda reaction has been
classically used for disease classification and evaluation of individual immune
response against M. leprae. This test consists of an intradermic injection of integral
lepromin, also known as Mitsuda antigen, that provokes a late reaction called
Mitsuda reaction. This reaction is read four weeks after injection. Because M. leprae
is not cultivable in vitro, lepromin has to be prepared from a suspension of heat-killed
M. leprae obtained either from lepromas of patients with lepromatous leprosy or from
tissue of armadillo infected with M. leprae. In order to investigate the presence of M.
leprae and/or other mycobacteria in lesions from patients with leprosy, as used as
raw material for lepromin production, a small fragment of the lepromas was removed
and submitted to molecular techniques for mycobacteria identification. PCR-RFLP
methods for hsp65 and rpoB gene markers allowed the differentiation of several
species of mycobacteria, the exception being the M. tuberculosis complex members.
From 23 lepromas, only 12 (52.17%) revealed large numbers of bacilli that amplified
for mycobacteria. In addition to M. leprae, M. szulgai was detected in one of the
lepromas. A mycobacteria isolate cultivated from a deep cutaneous lesion of one
pacient with lepromatous leprosy was identified as M. kansasii. Our data will
contribute to improve the quality of lepromin production by using the methodology
here standardized for selecting appropriate samples. In addition, this data will provide
support for future antigen development for intradermoreaction in substitution of
lepromin.
Key words: Leprosy, Mycobacterium leprae, lepromas, mycobacteria, molecular
identification.
1
1 INTRODUÇÃO
A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, causada pelo
Mycobacterium leprae (M. leprae), que acomete a pele, os nervos periféricos e,
ocasionalmente, outros órgãos. Apesar da redução na taxa de prevalência nas
últimas duas décadas, a taxa de detecção de novos casos não declinou
substancialmente. A hanseníase permanece um problema de saúde pública em seis
países no mundo, incluindo o Brasil. Uma vez infectado, o indivíduo pode manifestar
a doença em um espectro de formas clínicas que pode variar da forma tuberculóide
à forma virchowiana.
O diagnóstico da hanseníase é baseado em alguns sinais, como a presença
de anestesia em lesões cutâneas, o espessamento de nervos periféricos e a
demonstração de M. leprae nos esfregaços de linfa e cortes histológicos de tecidos.
Para a classificação da doença e avaliação da resposta imune do indivíduo
ao M. leprae, usa-se o teste de Mitsuda. Este teste consiste na injeção intradérmica
da mitsudina ou antígeno de Mitsuda, que provoca uma reação tardia denominada
de reação de Mitsuda, cuja leitura é realizada quatro semanas após a aplicação. A
mitsudina é uma suspensão de M. leprae inativados pelo calor, os quais são
extraídos de hansenomas de pacientes com hanseníase virchowiana ou de tecidos
de tatu infectados com M. leprae, isso por que o agente causador da doença não é
cultivável in vitro.
O único fornecedor de mitsudina para o Ministério da Saúde é o Centro de
Produção e Pesquisa de Imunobiológicos (CPPI), localizado em Piraquara, região
metropolitana de Curitiba, Paraná, que produz a mitsudina desde 1990, a partir de
hansenomas provenientes dos serviços públicos de Saúde do Estado do Paraná e
de outros estados do país. Os problemas encontrados na produção deste antígeno
são a dificuldade de obtenção dos hansenomas e os riscos associados à
manipulação de amostras contaminadas com M. leprae. Estes problemas são por si
só suficientes para a pesquisa de novos antígenos para intradermorreação.
Para a seleção dos hansenomas e conseqüentemente de M. leprae na
confecção do antígeno é necessário conhecer se a biópsia contém ou não
micobactérias. Além disso, a observação em microscópio óptico, método utilizado na
2
produção da mitsudina, possui a desvantagem de não permitir a identificação do
agente presente. Portanto, a presença de outras micobactérias nos hansenomas e
conseqüente inclusão das mesmas na mitsudina, vem reforçar a necessidade de
antígenos alternativos ao antígeno de Mitsuda.
Quanto à variabilidade genética entre cepas de M. leprae, alguns estudos
demostram que não há diferenças entre isolados, enquanto outros mostram variação
genética entre cepas. Na produção da mitsudina utilizam-se principalmente amostras
provenientes do Paraná e o produto é distribuído para todo o Brasil, portanto, a
questão é se as cepas de M. leprae encontradas no Paraná são as mesmas
encontradas nos demais estados ou são diferentes, neste último caso, o produto
deveria ser um pool de todas as cepas encontradas no Brasil.
Para a seleção adequada de antígenos, é necessária a padronização de
metodologias que sejam rápidas e precisas capazes de identificar micobactérias em
nível de espécie. Os métodos moleculares permitem a identificação de espécies
diretamente em amostras clínicas o que vem auxiliar e melhorar a triagem de
amostras para a produção do antígeno de Mitsuda, diminuindo, assim, reações
cruzadas ou falso-positivos.
Os métodos de identificação baseados em características de cultura e em
testes bioquímicos apresentam a desvantagem de requerem amostras frescas, são
demorados, podem fornecer resultados incorretos e necessitam de técnicos
altamente treinados.
Por esta razão, o presente trabalho visa padronizar método de PCR-RFLP
para identificar diferentes espécies de micobactérias quer seja em culturas, quer
seja em tecidos infectados.
3
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Testar e implementar protocolo de identificação molecular de micobactérias
a ser aplicado na avaliação pré-processamento de hansenomas humanos utilizados
na produção de mitsudina.
2.2 ESPECÍFICOS
Avaliar diferentes protocolos de extração de DNA de micobactérias;
Padronização de protocolo de identificação de micobactérias por PCR-RFLP;
Aplicar as técnicas desenvolvidas na identificação molecular de micobactérias
isoladas de pacientes hansenianos;
Verificar polimorfismo entre as cepas isoladas.
4
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 MICOBACTÉRIAS
O gênero Mycobacterium compreende 125 espécies (EUZÉBY, 2006), sendo
que Mycobacterium tuberculosis, agente causador da tuberculose, e M. leprae,
responsável pela hanseníase são as espécies mais conhecidas (VOSSLER, 2000).
Este gênero inclui, além de microrganismos patogênicos, microrganismos saprófitas
(HALL; HOWARD, 1994). Os organismos patogênicos produzem doença em
humanos e animais (VOSSLER, 2000).
3.1.1 Características Gerais
As micobactérias são bacilos delgados, levemente curvados ou retos, com
tamanho de 0,2 a 0,4 x 2 a 10 µm. São microrganismos aeróbicos, imóveis e não
formadores de esporos (VOSSLER, 2000).
A parede celular das micobactérias contém um glicopeptídeo unido a um
polissacarídeo de cadeia ramificada denominado arabinogalactana, por meio de
ligações fosfodiéster. As terminações distais da arabinogalactana estão esterificadas
com o ácido micólico. Os ácidos micólicos são ácidos graxos complexos, β-
hidroxilados e α-substituídos, que ocorrem como ésteres. O complexo glicopeptídeo-
ácido micólico-arabinogalactana forma o esqueleto da parede celular
micobacteriana. As cadeias de carbono dos ácidos micólicos estão intercaladas com
as de numerosos lipídios e glicolipídios associados à parede. Os lipídios são
responsáveis por 60% do peso seco da parede celular das micobactérias
(KONEMAN et al., 2001).
Devido à parede celular desses microrganismos possuir alto conteúdo de
lipídios, as células micobacterianas são difíceis de corar com corantes de anilina
básicos como aqueles usados no método de Gram (FORBES; SAHM; WEISSFELD,
1998). A aparência de micobactérias coradas por Gram pode ser variável. As
micobactérias podem ser gram invisíveis, podendo aparecer como imagens coradas
5
negativamente ou como “fantasmas”, ou podem aparecer como bacilos gram-
positivos em contas (NOLTE; METCHOCK, 1995).
Procedimentos de coloração especiais são usados para promover a
incorporação de corantes. Uma vez coradas, as micobactérias resistem à
descoloração com álcool acidificado. Está resistência à descoloração por álcool-
ácido é chamada ácido-resistência (NOLTE; METCHOCK, 1995). A ácido-resistência
está associada às moléculas de ácido micólico-arabinogalactana, externas à
camada glicopeptídica e que constituem a maior parte dos materiais da parede
celular (KONEMAN et al., 2001).
Outra importante característica é que as micobactérias crescem mais
lentamente que a maioria das bactérias patogênicas em humanos, devido a sua
superfície celular hidrofóbica. Esta hidrofobicidade faz com que os microrganismos
se agrupem e assim os nutrientes não são facilmente acessíveis a célula. O
crescimento é lento, com colônias tornando-se visíveis em dois a 60 dias em
temperatura ótima (FORBES; SAHM; WEISSFELD, 1998).
3.1.2 Classificação das Micobactérias
O gênero Mycobacterium pertence à família Mycobacteriaceae (o único
gênero desta família), ordem Actinomycetales e classe Actinomycetes.
As micobactérias podem ser divididas em dois grandes grupos baseado em
diferenças na epidemiologia e associação com doenças, estes dois grupos são:
complexo M. tuberculosis e micobactérias não tuberculosas (NTM).
O termo micobactérias não tuberculosas inclui todas as outras espécies de
micobactérias que não pertencem ao complexo M. tuberculosis. Outros nomes são
usados para designar micobactérias não tuberculosas, como: anônimas, atípicas,
não classificadas, desconhecidas, tuberculóides, ambientais, oportunistas,
micobactérias outras que o bacilo tubérculo (MOTT) (FORBES; SAHM;
WEISSFELD, 1998). O termo micobactérias não tuberculosas (NTM) parece ser o
mais aceito para HALL e HOWARD (1994). Como afirmado indiretamente acima,
para FORBES, SAHM e WEISSFELD (1998) o M. leprae é uma micobactéria não
tuberculosa, enquanto para outros, como KOH, KWON e LEE (2002) o termo
6
micobactérias não tuberculosas se refere as micobactérias exceto o complexo M.
tuberculosis e M. leprae.
RUNYON (1959) classificou as NTM em quatro grupos, I, II, III e IV, baseado
principalmente na velocidade de crescimento e pigmentação das colônias (tabela 1).
Os grupos I a III de Runyon se referem aos microrganismos de crescimento lento e
grupo IV de Runyon se refere aos microrganismos de crescimento rápido. As NTM
de crescimento lento podem ainda ser divididas em três grupos, que são chamados
fotocromogênicas, escotocromogênicas e não-fotocromogênicas (FORBES; SAHM;
WEISSFELD, 1998).
TABELA 1 – ESQUEMA DE CLASSIFICAÇÃO DE RUNYON PARA
MICOBACTÉRIAS NÃO TUBERCULOSAS (NTM)
NÚMERO DO
GRUPO
NOME DO GRUPO DESCRIÇÃO
I Fotocromogênicas Colônias que desenvolvem pigmentos após
exposição à luz e levam mais de sete dias
para tornarem-se visíveis em meio sólido
II Escotocromogênicas Colônias que desenvolvem pigmentos na
presença ou ausência de luz e levam mais de
sete dias para tornarem-se visíveis em meio
sólido
III Não-fotocromogênicas Colônias que não produzem pigmentos e
levam mais de sete dias para tornarem-se
visíveis em meio sólido
IV Crescimento rápido Colônias que tornam-se visíveis em meio
sólido em sete dias ou menos
FONTE: Adaptado de FOBES, B. A.; SAHM, D. F.; WEISSFELD, A. S. BAILEY & SCOTT’S:
diagnostic microbiology. 10th ed. St. Louis: Mosby. 1998. p. 719.
Deve ser notado, como em muitos esquemas de classificação, a
classificação de Runyon nem sempre se mantem verdadeira, por exemplo, algumas
NTM podem ser ou fotocromogênicas ou não-fotocromogênicas
Devido a dificuldade em determinar o significado clínico do isolado de uma
amostra clínica, vários esquemas de classificação para NTM foram propostos. Por
exemplo, um dos esquemas classifica as NTM recuperadas de humanos em quatro
grupos (pulmonar, linfadenite, cutânea, disseminada) baseado na doença clínica que
elas causam. Outra classificação é baseada no potencial patogênico dos
microrganismos (FORBES; SAHM; WEISSFELD, 1998).
7
3.1.3 Biossegurança
Práticas de biossegurança nível dois e equipamentos de retenção para
preparar esfregaços para ácido-resistência e culturas são recomendados.
Procedimentos que geram aerossóis devem ser realizados em cabine de segurança
biológica classe II A ou B ou III. Se M. tuberculosis é cultivado e então propagado e
manipulado, práticas de biossegurança nível três são recomendadas (FORBES;
SAHM; WEISSFELD, 1998).
3.1.4 Colheita e Processamento de Amostras
As micobactérias podem ser recuperadas de uma variedade de amostras
biológicas, incluindo as provenientes do trato respiratório (escarro obtido por
expectoração ou por nebulização, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares,
biópsias brônquicas e outras), urina, fezes, sangue, líquido cefalorraquidiano (LCR),
biópsias de tecidos e aspirados profundos virtualmente de qualquer órgão ou tecido
(VOSSLER, 2000; KONEMAN et al., 2001).
O sucesso do isolamento da micobactérias de amostras biológicas depende
da coleta e manipulação dessas amostras. Os procedimentos para coletas e
processamento das diferentes amostras encontram-se descritos em literatura
específica, a saber, HALL e HOWARD (1994), NOLTE e METCHOCK (1995),
FORBES, SAHM e WEISSFELD (1998), VOSSLER (2000) e KONEMAN et al.
(2001).
3.1.5 Digestão e Descontaminação das Amostras
Para assegurar uma recuperação ótima de micobactérias de amostras
biológicas, muitas amostras devem ser processadas antes da inoculação em meios
de cultura. Amostras de locais estéreis do corpo devem ser simplesmente
concentradas (se em grande volume) e inoculadas. Porém, amostras que podem
conter bactérias comensais devem ser descontaminadas e concentradas
(VOSSLER, 2000).
8
A elevada concentração de lipídios na parede celular da maioria da
micobactérias torna esses microrganismos mais resistentes à ação letal de soluções
ácidas ou alcalinas fortes do que outras bactérias que possam estar presentes na
amostra. Em conseqüência, as amostras que podem conter microbiota bacteriana
mista são tratadas com um agente descontaminante. Após o tratamento com agente
descontaminante durante um período cuidadosamente controlado, o ácido ou o álcali
utilizado é neutralizado e a mistura centrifugada em alta rotação, para concentrar as
micobactérias (KONEMAN et al., 2001).
A maioria das amostras biológicas, como escarro, contém mucina ou debris
orgânicos que envolvem a bactéria dentro da amostra. Uma abundância de
microrganismos não micobacterianos, bem como possíveis micobactérias, compõem
a microflora dessas amostras. Quando em meio de culturas, os abundantes
microrganismos não micobacterianos podem rapidamente crescer mais que as
micobactérias. O propósito do processo de digestão-descontaminação é: liquefazer
(liberar o organismo da mucina ou células) a amostra através da digestão do
material proteináceo e permitir que o agente descontaminante entre em contato e
exerça sua ação bactericida sobre os microrganismos não micobacterianos.
Amostra que contêm muco e requerem tanto digestão e descontaminação
são escarro, lavado gástrico, lavado broncoalveolar, lavado brônquico e aspirado
transtraqueal. Urina, tecido de autópsia, fluido abdominal e qualquer fluido
conhecido ser contaminado requer descontaminação. Amostras de locais
normalmente estéreis, como sangue, LCR, fluido sinovial e tecidos de biópsia de
órgãos profundos, não requerem descontaminação. A esterilidade deve ser mantida
na coleta e transporte da amostra. Descontaminação de fezes é especialmente difícil
e requer repetidas tentativas de descontaminação (VOSSLER, 2000).
3.1.5.1 Agentes para digestão e descontaminação
Cada laboratório deve manter um balanço adequado entre taxa de
recuperação de micobactérias e a supressão do crescimento de contaminantes.
Falhas no isolamento de micobactérias de pacientes com sinais e sintomas de
doença micobacteriana clássica pode indicar que o processo de descontaminação é
9
muito severo. Por outro lado, se mais de 5% de todas as amostras cultivadas são
contaminadas, o processo de descontaminção pode estar inadequado. A ação
bactericida de um agente descontaminante é influenciada pela concentração do
agente, tempo de exposição e temperatura, logo, alterações em qualquer um dos
fatores podem aumentar ou diminuir o efeito bactericida. Em geral, uma faixa que é
considerada aceitável nesse delicado balanço é entre 2% e 5% de culturas
micobacterianas contaminadas.
O processo de descontaminação ótimo requer um agente suave que permita
crescimento de micobactérias e controle o crescimento de contaminantes. O uso de
meios seletivos ou tratados com antibióticos pode diminuir a necessidade de
processos de descontaminação severos (VOSSLER, 2000).
Os agentes descontaminantes mais utilizados são: N-acetil-L-cisteína
(NALC) mais 2% de hidróxido de sódio, ditiotreitol mais 2% de hidróxido de sódio,
fosfato trissódico a 13% mais cloreto de benzalcônio (Zephiran; Winthrop
Laboratories, Nova York, N.Y.), hidróxido de sódio a 4%, fosfato trissódico a 13%,
ácido oxálico a 5% e cloreto de cetilpiridino a 1% mais 2% de cloreto de sódio
(KONEMAN et al., 2001).
Não há um método de digestão e descontaminação ideal para todas as
amostras clínicas, para todos os laboratórios e para todas as circunstâncias
(NOLTE; METCHOCK, 1995). Cada micobacteriologista deve selecionar os agentes
conforme a quantidade e o tipo de amostras recebidas, assim como o tempo e
pessoal técnico disponíveis para processar as amostras (NOLTE, METCHOCK,
1995; KONEMAN et al., 2001).
Os procedimentos de digestão e descontaminação encontram-se descritos
em literatura específica como HALL e HOWARD (1994), NOLTE e METCHOCK
(1995), FORBES, SAHM e WEISSFELD (1998), VOSSLER (2000) e KONEMAN et
al. (2001).
3.1.6 Concentração
O peso específico do bacilo varia de 1,07 a 0,79. Devido ao baixo peso
específico do bacilo ácido-resistente, uma baixa força centrífuga tem um efeito
10
flutuante em vez de um efeito de sedimentação. O excesso de muco aumenta este
efeito. O tratamento com agentes mucolíticos separa mucoproteínas, permitindo
maior sedimentação. KENT E KUBICA
1
, citados por VOSSLER (2000), sugerem que
uma eficiência de sedimentação de 95% deve ser o objetivo para recuperação.
Portanto, a velocidade de centrifugação deve ser ao menos de 3.000 g para
maximizar a recuperação. Velocidades de centrifugação menores necessitam de
tempos maiores. As conseqüências de tempos de centrifugação mais longos são:
exposição prolongada aos efeitos tóxicos do agente de digestão-descontaminação
usado em temperaturas mais altas geradas por centrífugas não refrigeradas. O
agente de digestão-descontaminação usado, sua concentração, tempo de exposição
e velocidade de centrifugação afetam a recuperação de micobactérias (VOSSLER,
2000).
3.1.7 Coloração para Bacilos Ácido-Resistentes
A natureza ácido-resistente de um organismo pode ser determinada por dois
tipos de coloração:
1) Coloração com carbolfucsina: uma mistura de fucsina com fenol
a) Ziehl-Neelsen
b) Kinyoun
2) Coloração com fluorocromo: auramina O, com ou sem um segundo
fluorocromo, rodamina.
Os ácidos micólicos existentes na parede celular cérea, rica em lipídios, das
micobactérias têm a capacidade de se ligarem aos corantes fucsina e auramina O,
resistido à descoloração com álcool-ácido. Um corante de contraste é empregado
para destacar o organismo corado e facilitar assim o reconhecimento ao
microscópio.
A coloração de Ziehl-Neelsen é conhecida como “coloração quente” porque
é utilizado calor para facilitar a penetração do corante fucsina através da parede
celular. A coloração de Kinyoun é conhecida como “coloraração fria” porque alta
1
KENT, P. T.; KUBICA, G. P. Public health mycobacteriology: a guide for the level III
laboratory. Alanta: Centers for Disease Control, 1985.
11
concentração de fenol presente no reagente serve para “dissolver” o material lipídico
da parede celular, permitindo a penetração do corante fucsina sem a utilização de
calor. Uma vez corada, a parede celular mantém o corante “resistente”, o que lhe
confere a característica coloração vermelha contra um fundo azul se o corante de
contraste usado for o azul-de-metileno ou um fundo verde se o verde-brilhante for o
corante de constraste empregado (KONEMAN et al., 2001).
As bactérias coradas com fluorocromo aparecem em amarelo brilhante
(auramina) ou laranja-avermelhado (rodamina) contra um fundo escuro, permitindo
que a preparação possa ser observada com menor aumento sem perda da
sensibilidade. As modificações da coloração com fluorocromo-auramina incluem
adição de rodamina, que confere um aspecto dourado às células, ou o uso de
laranja de acridina como corante de contraste, que produz fundo vermelho a laranja
(KONEMAN et al., 2001).
Os esfregaços corados com o método de carbolfucsina devem ser
observados com objetiva de imersão (HALL, HOWARD, 1994; NOLTE, METCHOCK,
1995; FORBES, SAHM, WEISSFELD, 1998; DELLA-LATTA, WEITZMAN, 1998;
VOSSLER, 2000; KONEMAN et al., 2001). Em contraste, os esfregaços corados
com fluorocromo podem ser observados com microscópio de fluorescência em
objetiva de 25x a 40x (FORBES, SAHM, WEISSFELD, 1998; DELLA-LATTA,
WEITZMAN, 1998; VOSSLER, 2000; KONEMAN et al., 2001). Variações quanto ao
aumento empregado para exame dos esfregaços corados com fluorocromo são
encontradas em HALL e HOWARD (1994) e em NOLTE e METCHOCK (1995).
Visto que é possível ler uma superfície de esfregaço significativamente maior
por unidade de tempo com a coloração fluorocrômica do que o método de
carbolfucsina, a coloração fluorocrômica oferece como vantagem maior
sensibilidade. Alguns laboratoristas utilizam o método de fluorocromo com
propósitos de triagem e depois confirmam os achados, reexaminando a preparação
após descoloração e recoloração com o método de carbolfucsina (KONEMAN et al.,
2001).
Geralmente as micobactérias aparecem em forma de bacilos, que podem se
apresentar levemente curvados, curtos ou longos, mas, podem aparecer
filamentosos ou cocóides. Os bacilos podem conter áreas muito coradas chamadas
12
contas e muitas vezes têm áreas claras e coradas alternadas, fazendo-os aparecem
em faixa (figura 1) (HALL; HOWARD, 1994).
FIGURA 1 – COLORAÇÃO POR ZIEHL-NEELSEN DE Mycobacterium tuberculosis
FONTE: HOWARD, B. J. et al. Clinical and pathogenic microbiology. 2nd. ed. St. Louis: Mosby,
1994. p. C18-A.
A ácido-resistência pode ser em parte ou completamente perdida em algum
estágio do crescimento por alguma proporção de células de algumas espécies.
Micobactérias de crescimento rápido podem não ser coradas com a coloração por
fluorocromo (NOLTE; METCHOCK, 1995). Segundo FORBES, SAHM e
WEISSFELD (1998), a ácido-resistência pode ser afetada, além do estágio do
crescimento, pelo meio de cultura e luz ultravioleta.
Os procedimentos de coloração encontam-se descritos em FORBES, SAHM
e WEISSFELD (1998), DELLA-LATTA e WEITZMAN (1998), VOSSLER (2000) e
KONEMAN et al. (2001).
3.1.7.1 Exame e interpretação dos esfregaços
Os esfregaços corados pelo método de carbolfucsina devem ser examinados
por no mínimo 300 campos antes de serem relatados como esfregaços negativos.
Enquanto, esfregaços corados com fluorocromo devem ser examinados por no
mínimo 30 campos (VOSSLER, 2000).
Quando microrganismos ácido-resistentes são observados em um
esfregaço, o resultado deve ser quantificado para ser significativo. Devido esta
13
quantificação estimar o número de bacilos excretados, a extensão da infecção do
paciente pode ser avaliada para propósitos clínicos e epidemiológicos. As
recomendações para interpretação e comunicação de micobactérias observadas em
esfregaços corados para detecção de bacilos ácido-resistentes estão incluídas no
tabela 2.
TABELA 2 – MÉTODO DE INFORME DO NÚMERO DE BACILOS ÁCIDO-
RESISTENTES OBSERVADOS EM ESFREGAÇOS CORADOS
NÚMERO DE BACILOS ÁCIDO-RESISTENTES VISTOS
Coloração com
Carbolfucsina
Coloração com Fluorocromo
1000x 250x 450x
MÉTODO DE
INFORME
0 0 0
Ausência de bacilos
ácido-resistentes
1-2/300 campos 1-2/30 campos 1-2/70 campos Duvidoso; repetir
1-9/100 campos 1-9/10 campos 2-18/50 campos 1+
1-9/10 campos 1-9/campo 4-36/10 campos 2+
1-9/campo 10-90/campo 4-36/campo 3+
>9/campo >90/campo >36/campo 4+
FONTE: NOLTE, F. S.; METCHOCK, B. Mycobacterium. In: MURRAY, P. R. Manual of clinical
microbiology. Washington: ASM Press, 1995. p. 413.
A contaminação cruzada de bacilos ácido-resistentes de um esfregaço para
outro durante o processo de coloração e uso de água contaminada com
micobactérias saprófitas pode conduzir a resultados falso-positivos. Jarras de
coloração não devem ser empregadas; bacilos ácido-resistentes podem também ser
transferidos de uma lâmina para outra via imersão em óleo (NOLTE, METCHOCK,
1995; FOBES, SAHM, WEISSFELD, 1998). A incidência de esfregaços falso-
positivos é muito baixa quando um bom controle de qualidade é mantido (FORBES;
SAHM; WEISSFELD, 1998).
Na interpretação de esfregaços como positivo para ácido-resistência, os
profissionais de laboratório devem estar atentos que outros microrganismos podem
ser corados, como Nocardia, Legionella micdadei e Rhodococcus (FORBES, SAHM,
WEISSFELD, 1998; VOSSLER, 2000). Além destes microrganismos, FORBES,
SAHM e WEISSFELD (1998), incluem oocistos de Cryptosporidium e Isospora.
DELLA-LATTA e WEITZMAN (1998) incluem, também, cistos de Cyclospora.
14
A sensibilidade em geral de esfregaços ácido-resistentes varia de 20% a
80% (VOSSLER, 2000). Fatores como tipo de amostra, método de coloração,
método de cultivo podem influenciar a sensibilidade (FORBES; SAHM; WEISSFELD,
1998). Um mínimo de 5 x 10
3
a 5 x 10
4
de bacilos por mililitro de escarro é requerido
para a detecção por esfregaço, enquanto a cultura detecta tão pouco quanto 10 a
100 organismos viáveis.
Embora a sensibilidade do exame do esfregaço para ácido-resitência direto
para o diagnóstico de infecção micobacteriana é baixo comparado com aquele de
métodos de cultura, a coloração tem um importante papel para o diagnóstico
precoce de doença, pois, longo tempo é requerido para detecção de micobactérias
por cultura. É importante detectar a presença de doença micobacteriana tão rápido
quanto possível para implementação de cuidados ao paciente e medidas de saúde
pública apropriados. A coloração serve também para confirmar a natureza ácido-
resistente de organismos recuperados de cultura e monitorar a eficiência da terapia
antimicobacteriana. A quantificação de um esfregaço positivo é também usada como
um apoio na determinação da diluição apropriada da amostra para teste de
suscetibilidade (NOLTE; METCHOCK, 1995).
3.1.8 Meios de Cultura e Métodos de Isolamento
A velocidade de crescimento das micobactérias é lenta, com tempo de
geração variando com a espécie e estendendo-se de 2 a maior que 20 horas.
Colônias facilmente visíveis podem ser produzidas após 2 dias a 8 semanas de
incubação sob condições ótimas, dependendo na espécie, o isolamento de M.
ulcerans pode levar até 12 semanas. A temperatura ótima de crescimento varia
entre as espécies, estendendo-se de 25º a 45ºC. Uma atmosfera de 5 a 10% de CO
2
no ar estimula o crescimento de todas as micobactérias cultivadas em tubos ou
placas (NOLTE; METCHOCK, 1995). Para o meio de crescimento as micobactérias
requerem um pH entre 6,5 a 6,8 e crescem melhor em umidade mais alta. Uma da
micobactérias patogênicas para humanos, M. leprae, não é cultivável in vitro
(VOSSLER, 2000).
15
Embora a maioria das micobactérias cresça em meios sintéticos simples
uma vez adaptadas em crescimento in vitro, meios complexos devem ser usados
para o isolamento primário (HALL, HOWARD, 1994; NOLTE, METCHOCK, 1995).
Os diferentes meios disponíveis para a recuperação de micobactérias de
amostras biológicas são variações de três tipos principais: meio a base de ovos,
meio com ágar e meio líquido. Dentro de cada tipo principal, existem meios não-
seletivos e meios seletivos, sendo que estes possuem agentes antimicrobianos para
prevenir o sobrecrescimento de contaminantes. Devido alguns isolados não
crescerem em um meio particular e cada tipo de meio de cultura oferecer certas
vantagens, a combinação de meios de cultura é geralmente recomendada para o
isolamento primário. O uso de um meio sólido (meio a base de ovos ou meio com
ágar) em combinação com um meio líquido é recomendado para o cultivo de
amostras biológicas para a recuperação de bacilos ácido-resistentes (VOSSLER,
2000).
3.1.8.1 Meios a base de ovos
Os ingredientes básicos desses meios, como Löwenstein-Jensen (LJ),
Petragnani e meio da American Thoracic Society são ovos inteiros frescos, gemas
de ovos, farinha de batata e glicerol com variações mínimas em sais definidos, leite
e batata. Cada um contém verde de malaquita para suprimir o crescimento de
bactérias gram-positivas. O meio LJ é o mais usado em laboratórios clínicos
(VOSSLER, 2000). O meio Petragnani contém maior concentração de verde de
malaquita que o meio LJ, o que o faz adequado para amostras muito contaminadas.
O meio da American Thoracic Society contém baixa concentração de verde de
malaquita e por isso é mais adequado para amostras menos contaminadas (HALL;
HOWARD, 1994).
Meios seletivos que contêm antibióticos, como meio Gruft (modificação de
LJ) e Mycobactosel (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.), são
algumas vezes usados em combinação com meios não seletivos para aumentar o
isoalmento de micobactérias de amostras contaminadas (VOSSLER, 2000). O meio
Gruft contém penicilina e ácido nalidíxico e o meio Mycobactosel contém
16
cicloheximida, lincomicina e ácido nalidíxico (HALL, HOWARD, 1994; NOLTE,
METCHOCK, 1995).
3.1.8.2 Meios a base de ágar
Estes meios, tais como ágar Middlebrook 7H10 e ágar Middlebrook 7H11,
são preparados de um meio basal de sais definidos, vitaminas, cofatores, glicerol,
verde de malaquita e ágar combinado com um suplemento, que consiste de ácido
oléico, albumina bovina, glicose e catalase (meio de enriquecimento Middlebrook
OADC). O ágar Middlebrook 7H11 também contém 0,1% de hidrolisado de caseína,
o qual melhora a recuperação de cepas de M. tuberculosis resistentes a isoniazida.
A adição de agentes antimicrobianos torna os meios mais seletivos por suprimir o
crescimento de bactérias contaminantes. O meio Mitchison, meio Middlebrook 7H11
seletivo, contém polimixina B, anfotericina B, carbenicilina e lactato de trimetoprima
(VOSSLER, 2000).
Suplementos adicionais podem ser úteis para a recuperação de
micobactérias e em certas situações, por exemplo, a adição de 0,2% de ácido
pirúvico é recomendado se M. bovis é suspeitado e 0,25% de L-asparginina ou 0,1%
de aspartato de potássio deve ser adicionado ao ágar 7H10 para maximizar a
produção de niacina (NOLTE; METCHOCK, 1995).
Embora os meios seletivos 7H10 e 7H11 são muito efetivos, eles devem ser
usados em combinação com meios não seletivos (HALL; HOWARD, 1994).
Em contraste aos meios opacos a base de ovos, os meios à base de ágar
são transparentes e podem ser examinados usando um estereomicroscópio para
detecção precoce de crescimento e morfologia das colônias. Testes de
susceptibilidade à drogas podem ser realizados em meio a base de ágar sem a
alteração da concentração de drogas que ocorre com os meios a base de ovos.
(VOSSLER, 2000). Segundo NOLTE e METCHOCK (1995), colônias podem ser
observadas em 10 a 12 dias, em contraste a 18 a 24 dias com meio a base de ovos.
Certas precauções devem ser seguidas na preparação, estocagem e
incubação de meio Middlebrook. Excesso de calor e exposição a luz pode resultar
17
na liberação de formaldeído, o qual é tóxico para as micobactérias (HALL,
HOWARD, 1994; NOLTE, METCHOCK, 1995; VOSSLER, 2000).
3.1.8.3 Meio líquido
Os meios líquidos são usados para subcultivo de cepas estoque, preparo de
inóculo para procedimentos de identificação e para isolamento primário de
micobactérias de amostras fluidas. Os meios líquidos geralmente usados são o
caldo Middlebrook 7H9 e caldo Dubos Tween albumina (HALL, HOWARD, 1994;
NOLTE, METCHOCK, 1995; VOSSLER, 2000).
Existem vários sistemas de meio líquido para cultivo e detecção de
crescimento de micobactérias. Estes sistemas são: sistema BACTEC AFB (Becton
Dickinson Diagnostic Systems Instruments, Sparks, MD), sistema MB/BacT
(Organon Teknika Durhan, NC), sistema ESP MYCO (Difco Laboratories, Detroit,
Michigan), sistema Septi-CheK AFB (BBL) e sistema MGIT (Becton Dickinson
Diagnostic, Cockeysville, MD). Os três primeiros são sistemas automatizados,
enquanto, os dois últimos são manuais. O índice de recuperação e o tempo
necessário para a positividade de micobactérias provenientes de materiais
biológicos melhoram com o emprego de meios de cultura líquidos e por isso, o uso
destes meios líquidos é amplamente recomendado (KONEMAN et al., 20001).
3.1.8.3.1 Sistema BACTEC AFB
O sistema BACTEC é um sistema de cultura radiométrico para a detecção
do crescimento de micobactérias. O sistema BACTEC contém um substrato (ácido
palmítico) marcado com
14
C que é metabolizado pelas micobactérias, liberando
dióxido de carbono radioativo (
14
CO
2
) para o espaço superior do frasco. A
quantidade de
14
CO
2
é detectada pelo instrumento BACTEC 460 e interpretado como
um índice de crescimento. É assumido que a liberação de CO
2
indica crescimento do
microrganismo. Antibióticos fornecidos pelo fabricante – polimixina B, anfotericina B,
ácido nalidíxico, trimetoprina e azlocilina (PANTA) reconstituído em estearato de
18
polioxietileno, um agente de aumento de crescimento – são adicionados a cada
frasco no momento da inoculação.
Estudos mostram que o método de isolamento BACTEC melhora
significativamente a taxa de isolamento de micobactérias e reduz o tempo de
recuperação comparado com meios de isolamento convencionais. Com o método
BACTEC, micobactérias podem ser detectadas em amostras biológicas em menos
de duas semanas (VOSSLER, 2000).
As desvantagens do sistema incluem o custo do instrumento, a
impossibilidade de observar a morfologia das colônias e detectar cultivos mistos, o
sobrecrescimento de contaminantes, a necessidade de descartar materiais
radioativos e o uso extensivo de agulhas (KONEMAN et al., 20001).
O sistema BACTEC pode não ser bom na recuperação de todas as espécies
de Mycobacterium, especialmente M. fortuitum e complexo M. avium. Resultados
falso-positivos de contaminação cruzadas foram relatados (VOSSLER, 2000).
O sistema BACTEC pode ser usado para teste de sucetibilidade
antimicrobiana de M. tuberculosis. Geralmente, não é recomendado para testes de
sensibilidade de micobactérias não tuberculosas (VOSSLER, 2000).
3.1.8.3.2 Sistema MB/BacT
É um sistema não-radiométrico para detecção de micobactérias. Os frascos
MB/BacT contêm caldo Middlebrook 7H9 em atmosfera de CO
2
, nitrogênio e
oxigênio sob vácuo. Antes da inoculação, deve ser adicionado em cada frasco o
suplemento antibiótico reconstituído para micobactérias (MAS), que contém
anfotericina B, azlocilina, ácido nalidíxico, polimixina B, trimetoprima e fatores de
crescimento, para estimular o desenvolvimento de micobactérias e reduzir o de
bactérias contaminantes que podem sobreviver ao procedimento de
descontaminação e concentração. O fundo de cada frasco está equipado com um
sensor permeável ao gás e que muda de verde-escuro para amarelo-claro quando
CO
2
é produzido no caldo pelo metabolismo das micobactérias. Os frascos são
colocados em orifícios individuais na câmara incubadora, e a monitoração contínua
de produção de CO
2
pelas bactérias é realizada utilizando-se luz refletida. A
19
detecção colorimétrica, não-radiométrica, do crescimento micobacteriano,
eliminando a necessidade de manipulação e descarte de radioisótopos é uma nítida
vantagem (KONEMAN et al., 20001).
3.1.8.3.3 Sistema ESP MYCO
Cada frasco de cultivo é unido a um sensor e monitorado continuamente
para detecção de qualquer alteração na pressão de gás devida à atividade
metabólica dos microrganismos. Mudanças de pressão significativas podem ser
assinaladas precocemente a partir do consumo de oxigênio, ou mais tarde, com a
produção de gases do metabolismo dos microrganismos.
Cada frasco contém meio de Middlebrook 7H9 modificado, casitone, glicerol
e esponjas de celulose. As esponjas proporcionam uma plataforma de crescimento
para as micobactérias, simulando alvéolos pulmonares. Antes da inoculação da
amostra, o meio em cada frasco é suplementado com a mistura antibiótica (PVNA)
que contém polimixina B, vancomicina, ácido nalidíxico e anfotericina B. O método
de detecção não-radiométrico utilizado, também, elimina a necessidade de
manipular e descartar materiais radioativos (KONEMAN et al., 20001).
3.1.8.3.4 Sistema Septi-Chek AFB
É um sistema de cultura bifásico composto de um frasco com caldo
Middlebrook 7H9 modificado e uma placa em forma de remo contendo ágar
chocolate, meio Löwenstein-Jensen e ágar Middlebrook 7H11. Antes da inoculação
da amostra, adiciona-se um suplemento reconstituído, composto de glicose, glicina,
ácido oléico, piridoxina, trimetoprima, polimixina B e anfotericina B. O frasco é
invertido regularmente para inocular os meios sólidos. O crescimento é detectado
pela observação da superfície dos meios de ágar e caldo (KONEMAN et al., 20001).
20
3.1.8.3.5 Sistema tubo indicador de crescimento de micobactéria (MGIT)
O sistema consiste de um tubo contendo caldo basal 7H11 modificado, ao
qual são adicionados OADC como enriquecimento (ácido oléico, albumina bovina,
dextrose e catalase) e uma mistura antibiótica PANTA (polimixina B, anfotericina B,
ácido nalidíxico, trimetoprima, azlocilina). No fundo do tubo encontra-se um
composto fluorescente embebido em silicone. Este composto é sensível ao oxigênio
dissolvido no caldo, isto é, a presença do oxigênio no meio não-inoculado serve para
extinguir a emissão de luz fluorescente. Como o crescimento bacteriano ativo
consome o oxigênio dissolvido, a fluorescência é revelada e pode ser detectada por
exame do tubo sob luz ultravioleta. O crescimento pode ser detectado mediante
observação de turvação heterogênea ou de pequenos grânulos ou flocos no meio de
cultura (KONEMAN et al., 20001).
3.1.8.4 Outros meios de cultura para recuperação de micobactérias
M. haemophilum crescerá em meios a base de ovos ou ágar se o meio
estiver suplementado com hemina, hemoglobina ou citrato de amônio férrico.
Portanto, amostras de lesões de pele, articulações ou ossos, devem ser inoculadas
em ágar chocolate; ágar Middlebrook 7H10 com hemolisado de eritrócitos de
carneiro, hemina ou um disco de fator-X; ou meio de Löwenstein-Jensen contendo
1% de citrato de amônio férrico para aumentar a recuperação deste organismo. Meio
BACTEC deverá ser semelhantemente suplementado (NOLTE; METCHOCK, 1995)
3.1.8.5 Sistema de lise-centrifugação
O sistema Isolator (Wampole Laboratorios, Cranbury, N.J.) é um sistema de
coleta que contém saponina para liberar microorganismos intracelulares. Após o
tratamento coma saponina, a amostra de sangue é inoculada em meios para
micobactérias. O sistema permite aumento no rendimento e redução do tempo de
recuperação de micobactérias. O sistema oferece a vantagem de produzir colônias
isoladas e a capacidade de quantificar micobacteremia, a qual pode ser útil no
21
monitoramento da efetividade da terapia na infecção disseminada pelo complexo M.
avium (VOSSLER, 2000).
3.1.9 Identificação
As micobactérias devem ser identificadas ao nível de espécie sempre que
possível. De acordo com métodos tradicionais, as micobactérias são geralmente
identificadas pela velocidade de crescimento, morfologia das colônias, pigmentação
e para propósitos diferenciais, perfis bioquímicos. A identificação deve ser baseada
em tantas observações quantas possíveis, mas, é prudente selecionar apenas testes
bioquímicos chaves que pareçam ser úteis para a espécie suspeitada. Os métodos
tradicionais são bem estabelecidos, padronizados, relativamente baratos, mas lentos
em fornecer informações relevantes clinicamente (NOLTE; METCHOCK, 1995).
Segundo TAKEWAKI et al. (1994) micobactérias podem levar de três a oito semanas
para crescer e outras duas a quatro semanas são necessárias para a identificação
final por testes bioquímicos. E nem sempre a identificação baseada em
características de cultura e testes bioquímicos fornece resultados corretos (LEE et
al., 2000; WONG et al., 2001). Com o recente aumento de infecções causadas por
M. tuberculosis e micobactérias não tuberculosas, há uma demanda aumentada
para métodos de diagnóstico mais específicos, sensíveis e rápidos para sua
detecção e identificação (KIM et al. 2004). A identificação de micobactérias é
importante para estabelecer o tratamento adequado e para estudos epidemiológicos
(KIM et al. 2001). A tabela 3 mostra o esquema de tratamento para uma espécie e
um complexo de micobactérias.
22
TABELA 3 – ESQUEMA DE TRATAMENTO PARA MICOBACTÉRIAS
ESPÉCIE TRATAMENTO DURAÇÃO
Complexo M. avium
Claritromicina
Azitromicina
Etambutol
Rifabutina
Estreptomicina
Amicacina
ou
+
+
±
Ou
Até cultura negativa por 12 meses
Rifampina
Etambutol
Isoniazida
+
+
M. kansasii
(para doença severa:
estreptomocina ou claritromicina)
EUA: 18 meses, cultura negativa ao
menos por 12 meses
Reino Unido: 9 a 12 meses
FONTE: WAGNER, D.; YOUNG, L. S. Nontuberculous mycobacterial infections: a clinical review.
Infection, v. 31, n. 5, p. 262, 2003.
O M. leprae não cresce em meios artificiais, portanto, o diagnóstico
laboratorial deste organismo difere de outras micobactérias.
A microscopia é o primeiro passo na identificação. A coloração para ácido-
resistência é usada para confirmar se o isolado é micobactéria e determinar se a
cultura está contaminada com outras bactérias. Embora certas características
morfológicas são associadas com certas espécies, as características morfológicas
microscópicas não devem ser a base para a identificação final da espécie (NOLTE;
METCHOCK, 1995).
3.1.9.1 Método tradicional
3.1.9.1.1 Morfologia de colônias
A morfologia das colônias pode ser observada em colônias individuais com
lente de mão (3X – 10X) ou um estereomicroscópio (10X – 50X). Se o crescimento é
confluente, um subcultivo deve ser feito para obter colônias isoladas. O
micobacteriologista deve observar várias características coloniais como textura,
forma e pigmentos (HALL; HOWARD, 1994). As características coloniais de algumas
micobactérias estão reunidas na tabela 4 e sua aparência em meio sólido na figura
2.
23
TABELA 4 – CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE ALGUMAS ESPÉCIES DE
MICOBACTÉRIAS
MICRORGANISMO
MORFOLOGIA DE COLÔNIAS EM
MEIO LÖWENSTEIN-JENSEN (LJ)
MORFOLOGIA DE COLÔNIAS EM
ÁGAR 7H10
M. avium-intracellulare As colônias são geralmente lisas,
em forma de cúpula e amarelas;
colônias rugosas são algumas
vezes vistas; na mesma culturas
podem aparecer mais de um tipo de
colônia
As colônias são geralmente lisas,
circulares, finas transparentes e em
forma de pirâmide ou hemisféricas;
como no meio LJ, colônias rugosas
podem ser vistas e mais de um tipo
de colônia pode aparecer na cultura
M. fortuitum As colônias são macias, parecidas
com manteiga, hemisféricas e
multilobulares ou são rugosas com
centro amontoado; apesar de não
pigmentadas podem aparecer
verdes devido a absorção do verde
de malaquita
As colônias de um a dois dias
mostram filamentos ramificados, o
que não ocorre em colônias mais
velhas, em ágar cornmeal
filamentos ramificados são visíveis
em colônias jovens e velhas
M. kansasii As colônias são lisas ou rugosas,
apesar de não pigmentada quando
cultivadas na ausência de luz,
tornam-se amarelo-limão quando
expostas a luz por uma hora; em
exposição contínua a luz, aparecem
cristais vermelho-alaranjado
O centro da colônia aparece
elevado e espesso; quando
observadas microscopicamente
porções periféricas mais finas
mostram filamentos de bacilos; as
colônias variam na aspereza e são
muitas vezes intermediárias entre
completamente lisas e
completamente rugosas, mas
podem ser completamente rugosas,
ou raramente completamente lisas;
a pigmentação é semelhante a
aquela observada em meio LJ
FONTE: Adaptado de HALL, G.S.; HOWARD, B. J. Mycobacteria. In: HOWARD, B. J. Clinical and
pathogenic microbiology. 2nd ed. St. Louis: Mosby, 1994. p. 512.
As características das colônias podem fornecer uma identificação presuntiva
do organismo e por isso podem ser usadas para sugerir quais testes bioquímicos ou
sondas de ácidos nucléicos usar para a identificação definitiva (NOLTE;
METCHOCK, 1995).
24
FIGURA 2 – APARÊNCIA TÍPICA DE MICOBACTÉRIAS EM MEIO SÓLIDO
A, complexo M. avium, B, M. kansasii, C, M. fortuitum.
FONTE: FORBES, B. A.; SAHM, D. F.; WEISSFELD, A. S. Bailey & Scott’s: diagnostic microbiology.
3th. ed. St. Louis: Mosby, 1998. p. 732.
3.1.9.1.2 Velocidade de crescimento e temperatura
A velocidade de crescimento é o tempo requerido para colônias tornarem-se
visíveis sem aumento em meio sólido. Micobactérias que formam colônias dentro de
sete dias são chamadas de micobactérias de crescimento rápido, enquanto aquelas
que requerem maiores períodos são chamadas de micobactérias de crescimento
lento.
Algumas micobactérias de crescimento rápido podem levar mais de sete
dias para crescer em meios de isolamento primário e de modo inverso, excesso de
inóculo pode fazer que uma micobactéria de crescimento lento pareça ser uma
micobactéria de crescimento rápido. Portanto, a velocidade de crescimento deve ser
confirmada por subcultivo (NOLTE; METCHOCK, 1995). O procedimento para
determinação da velocidade de crescimento encontra-se descrito em NOLTE e
METCHOCK (1995) e em FORBES, SAHM e WEISSFELD (1998).
O crescimento em relação a temperatura pode ser determinado pela
observação da cultura primária ou subcultivo em 37º e 30ºC. Quando identificação
mais definitiva é necessária, os isolados devem ser incubados a 24º, 30º, 35º a 37º e
42ºC (HALL, HOWARD, 1994; NOLTE, METCHOCK, 1995).
B
C
A
25
3.1.9.1.3 Pigmentação e fotorreatividade
Algumas micobactérias produzem pigmentos carotenóides sem luz,
enquanto, outras requerem luz (fotoativação) para produção de pigmentos. As
micobactérias são classificadas em três grupos baseado na produção de pigmentos:
fotocromogênicas, escotocromogênicas e não-fotocromogênicas (NOLTE;
METCHOCK, 1995).
O procedimento para determinação da fotorreatividade de micobactérias
encontra-se em HALL e HOWARD (1994); NOLTE e METCHOCK (1995); FORBES,
SAHM e WEISSFELD (1998) e em KONEMAN et al. (2001).
3.1.9.1.4 Identificação bioquímica
A avaliação da morfologia das colônias, determinação da velocidade de
crescimento e fotorreatividade permitem a classificação do isolado em um subgrupo
e para cada subgrupo existem testes bioquímicos chaves úteis para a identificação
(tabela 5) (NOLTE; METCHOCK, 1995).
TABELA 5 – TESTES BIOQUÍMICOS CHAVES PARA AUXILIAR NA DISTINÇÃO
DE MICOBACTÉRIAS PERTENCENTES AO MESMO GRUPO
GRUPO TESTES BIOQUÍMICOS CHAVES
Complexo M. tuberculosis Niacina, redução de nitrato, catalase a 68ºC
Não-fotocromogênicas Redução de nitrato, redução de telurito, catalase a
68ºC, catalase semiquantitativa, hidrólise do Tween 80
Escotocromogênicas Redução de nitrato, hidrólise do Tween 80, urease,
crescimento em NaCl a 5%
Fotocromogênicas Redução de nitrato, hidrólise do Tween 80, catalase
semiquantitativa, uréase
Micobactérias de crescimento rápido Arilsulfatase, redução de nitrato, incorporação de ferro,
crescimento em ágar MacConkey
FONTE: NOLTE, F. S.; METCHOCK, B. Mycobacterium. In: MURRAY, P. R. Manual of clinical
microbiology. Washington: ASM Press, 1995. p. 422.
Um painel de testes bioquímicos pode identificar a maioria das micobactérias
isoladas, mas devido ao seu crescimento lento, a conclusão destes testes pode levar
várias semanas. Os testes bioquímicos são baseados nas enzimas que o organismo
possui e a inibição do seu crescimento em exposição a compostos selecionados.
26
Cepas de controles de qualidade devem ser incluídas para cada teste bioquímico
(VOSSLER, 2000). Os princípios destes testes são descritos abaixo. A descrição
dos métodos e controles podem ser encontrados em HALL e HOWARD (1994);
DELLA-LATTA e WEITZMAN (1998) e em KONEMAN et al. (2001).
• Acúmulo de niacina
Todas as espécies de micobactérias produzem niacina ribonucleotídeo;
entretanto, virtualmente todas as cepas de M. tuberculosis, M. simiae e algumas de
M. chelonae carecem de enzimas necessárias para a conversão posterior da niacina
em nicotinamida-adenina-dinucleotídeo (NAD). Assim, a niacina acumula-se no meio
de cultura, do qual pode ser extraída com água ou solução fisiológica esterilizadas.
O extrato é transferido para um pequeno tubo, no qual é colocada uma tira de papel
de filtro impregnada de regente para niacina (KONEMAN et al., 2001).
• Redução de nitrato
As micobactérias produtoras de nitrorredutase são capazes de catalisar a
redução de nitratos a nitritos. Na reação, o oxigênio é retirado do nitrato segundo a
fórmula:
NO
3
-
+ 2e
-
+ 2H NO
2
+ H
2
O
Nitrato Nitrito
A presença de nitritos é detectada por adição de α-naftilamina e ácido
sulfanílico, com formação de um corante de diazônio vermelho, o p-sulfobenzeno-
azo-α-naftilamina (KONEMAN et al., 2001).
• Catalase
A catalase é uma enzima capaz de degradar o peróxido de hidrogênio em
água e oxigênio. A presença desta enzima é detectada pela adição de peróxido de
hidrogênio a cultura teste e observação da formação de borbulhas. As espécies
produtoras de catalase podem ser distinguidas por diferenças quantitativas na
27
atividade da catalase demonstrada na prova da catalase semiquantitativa e por
diferenças na estabilidade ao aquecimento pela prova de catalase a 68ºC.
− Prova da catalase semiquantitativa
Este teste divide as micobactérias em dois grupos: aquelas que produzem
uma coluna de borbulhas < 45 mm (low catalase) e aquelas que produzem uma
coluna de borbulhas > 45 mm (high catalase).
− Prova da catalase termoestável (68ºC)
Algumas micobactérias perdem a atividade de catalase quando suspendidas
em tampão pH 7,0 e aquecidas a 68ºC por 20 minutos.
− Método da Catalase
A atividade da catalase pode ser avaliada rapidamente colocando-se
algumas gotas de peróxido de hidrogênio sobre colônias e observando-se a rápida
efervescência das borbulhas (NOLTE; METCHOCK, 1995).
• Hidrólise do Tween-80
Tween-80 é o nome comercial do detergente monoleato polioxietileno
sorbitol. Algumas espécies de Mycobacterium possuem uma enzima que libera ácido
oléico a partir do Tween-80. A mudança de cor, de laranja para rosa, é devida a
hidrólise do Tween-80, que altera a rotação óptica da luz que atravessa o substrato
(KONEMAN et al., 2001).
Este teste é usado para separar micobactérias de crescimento lento
escotocromogênicas e não-fotocromogências potencialmente patogênicas
(negativas) das micobactérias geralmente saprófitas (positivas) (NOLTE;
METCHOCK, 1995).
• Incorporação de ferro
O teste é usado para detectar micobactérias capazes de converter citrato de
amônio férrico a óxido de ferro. O óxido de ferro é visível como uma coloração de
ferrugem castanho avermelhada nas colônias. O meio mostra uma descoloração
castanho amarelado. O teste é útil para distinguir M. chelonae, geralmente negativa,
28
de M. fortuitum e da maioria das outras micobactérias de crescimento rápido, que
são positivas (NOLTE; METCHOCK, 1995).
• Arilsulfatase
A arilsulfatase é uma enzima que cinde fenolftaleína livre a partir do sal
tripotássico de dissulfito de fenolftaleína. A prova para identificação de espécies de
Mycobacterium é realizada em tubo contendo substrato de fenolftaleína em ágar
ácido oléico (Wayne). Após 3 (ou 14) dias de incubação de um subcultivo da espécie
desconhecida, o desenvolvimento de cor vermelha após adição de carbonato de
sódio indica reação positiva (KONEMAN et al., 2001).
• Pirazinamidase
A enzima pirazinamidase hidrolisa a pirazinamida a ácido pirazinóico. Este
ácido é detectado pela adição de sulfato de amônio ferroso no meio de cultura. A
formação de um complexo ácido pirazinóico-ferroso rosa indica um teste positivo.
Este teste é útil na separação de M. marinum de M. kansasii e M. bovis de M.
tuberculosis. M. bovis é negativa mesmo em sete dias, enquanto M. tuberculosis é
positiva dentro de quatro dias (NOLTE; METCHOCK, 1995).
• Urease
A urease é uma enzima presente em muitas espécies de Mycobacterium,
que podem hidrolisar uréia para formar amônia e dióxido de carbono. A amônia
reage em solução, formando carbonato de amônio e produzindo alcalinização e
aumento do pH do meio (KONEMAN et al., 2001).
O teste é útil na identificação de micobactérias escotocromogênicas e não-
fotocromogênicas. M. scrofalaceum é urease positiva, enquanto membros do
complexo M. avium são urease negativos (NOLTE; METCHOCK, 1995).
29
• Inibição do crescimento por hidrazida do ácido tiofeno-2-carboxílico
A hidrazida do ácido tiofeno-2-carboxílico (T
2
H) inibe o crescimento de M.
bovis, mas não o de outras espécies de micobactérias, característica útil para
diferenciar M. bovis de M. tuberculosis (KONEMAN et al., 2001).
• Crescimento em cloreto de sódio a 5%
M. triviale é a única micobactéria de crescimento lento que cresce em meios
com 5% de NaCl. Espécies de crescimento rápido patogênicas, exceto M.
mucogenicum e a maioria dos isolados de M. chelonae, crescem em meios com 5%
de NaCl (NOLTE; METCHOCK, 1995).
• Prova NAP (p-nitro-α-acetilamino-β-hidroxipropiofenona); (BACTEC)
Os membros do complexo Mycobacterium tuberculosis não crescem em
presença de p-nitro-α-acetilamino-β-hidroxipropiofenona (NAP). Cada frasco de
BACTEC contém 5 µg de NAP. Quando nesse frasco é adicionado 1 ml do cultivo de
um membro do complexo M. tuberculosis, em crescimento ativo em meio 12B, seu
desenvolvimento é inibido. As micobactérias não-tuberculosas não sofrem
significativa inibição de crescimento. A ocorrência de crescimento é indicada pelo
detector de radioatividade do instrumento por monitoração da produção de
14
CO
2
,
cuja ausência (falta de aumento no índice de crescimento) é compatível com o
complexo M. tuberculosis (KONEMAN et al., 2001).
• Crescimento em ágar MacConkey
A capacidade de crescimento em ágar MacConkey especial, formulado sem
cristal violeta, diferencia M. fortuitum e M. chelonae, que podem desenvolver-se em
cinco dias, de outras micobactérias de crescimento rápido, que apresentam apenas
um leve crescimento em 11 dias (KONEMAN et al., 2001).
30
• Redução de telurito
A redução de telurito de potássio incolor a telúrio metálico preto em três a
quatro dias é uma característica do complexo M. avium e, portanto, é útil para
distinguir o complexo M. avium de outras espécies não-cromogênicas. Além disso,
todas as espécies de crescimento rápido são capazes de reduzir telurito em três dias
(FORBES, SAHM, WEISSFELD, 1998; VOSSLER, 2000).
3.1.9.2 Cromatografia
A parede celular das micobactérias contém ácidos graxos de cadeia longa
chamados ácidos micólicos que podem ser detectados cromatograficamente
(VOSSLER, 2000). Em micobactérias os ácidos micólicos contêm 60 ou mais
carbonos (DUFFEY; GUTHERTZ; EVANS, 1996). Evidências mostram que os ácidos
micólicos em micobactérias são espécie-específicos (BUTLER; JOST; KILBURN,
1991). A identificação cromatográfica de micobactérias tem sido objeto de interesse
há muito tempo e os métodos são alterados conforme a tecnologia evolui. Métodos
empregados no início, como cromatografia em coluna e cromatografia em camada
delgada, foram substituídas pela cromatografia líquido-gasosa e cromatografia
líquida de alta pressão (HPLC). Os métodos correntes permitem fácil extração de
suficiente quantidade de ácidos micólicos a partir de pequenas quantidades de
bactérias (VOSSLER, 2000). A identificação de espécies de micobactétias por HPLC
tem mostrado concordância com a identificação bioquímica e por sondas. Em um
estudo, THIBERT e LAPIERRE (1993) mostraram que a HPLC identificou 96,1% de
1103 isolados, enquanto os testes bioquímicos e/ou sondas de DNA identificaram
98,3% dos isolados. Em um outro estudo, GUTHERTZ et al. (1993) demostraram
uma concordância de 97,2% em 502 culturas de micobactérias e comparando os
padrões cromatográficos com sondas de DNA para 111 culturas demostraram
concordância de 98,2%.
Fazendo uma comparação entre HPLC e os métodos moleculares, o
processamento da amostras em HPLC é rápido e fácil, mas, para reprodutibilidade
dos padrões cromatográficos, condições padronizadas de crescimento devem ser
31
usadas. A HPLC necessita de mais biomassa celular que os métodos moleculares.
Os métodos moleculares possuem sensibilidade de detecção maior que a HPLC.
Ambos os métodos, HPLC e seqüenciamento automatizado requerem
instrumentação sofisticada e custosa. Em HPLC uma úncia amostra pode ser
processada em duas horas, enquanto o seqüenciamento automatizado requer mais
de oito horas (BUTLER; GUTHERTZ. 2001).
3.1.9.3 Análise do perfil plasmidial
Uma das primeiras ferramentas moleculares usadas para auxiliar a
diferenciação de micobactérias de crescimento rápido foi a análise do perfil
plasmidial. Sondas de DNA com uma sonda associada a plasmídio têm sido um guia
útil para a comparação de cepas. A variabilidade genética de plasmídios pode ser
estudada por RFLP (Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição) de
plasmídios ou hibridização com seqüências definidas ou repetitivas. Porém, estes
métodos por se concentrarem no DNA extracromossômico, não fornecem evidências
conclusivas que cepas são relacionadas. Isolados com perfil plasmidial semelhante
podem pertencer a diferentes grupos biovariantes e vice-versa. Portanto, o uso do
perfil plasmidial para a identificação de espécies é de valor limitado, visto que alguns
isolados de micobactérias de crescimento rápido não contêm plasmídios
detectáveis, o perfil de plasmídios pode mudar com o tempo e plasmídios
completamente diferentes podem ser do mesmo tamanho. Geralmente, outros
métodos que se focam no DNA cromossômico substituiram esta análise (BROWN-
ELLIOTT; WALLACE, 2002).
3.1.9.4 Sondas de DNA
Sondas de DNA comerciais (AccuProbe; Gen-Probe, Inc, San Diego,
Califórnia, USA) são disponíveis para a identificação de algumas espécies de
micobactérias importantes clinicamente, incluindo complexo M. tuberculosis, M.
avium, M. intracellulare, complexo M. avium, M. kansasii e M. gordonae. Os testes
são baseados em sondas de DNA espécie-específicas que hibridizam com o RNA
32
ribossômico liberado da bactéria. As sondas são marcadas com éster de acridina e
os resultados são medidos com um luminômetero. Para as amostras de cultura
positiva, o tempo de análise é de aproximadamente duas horas (CHEMLAL;
PORTAELS, 2003).
A sensibilidade de reconhecimento é cerca de 10
4
microrganismos por
mililitro. É estimado que 10
5
a 10
7
microrganismos por mililitro são requeridos para a
detecção por Gen-Probe. De acordo com o fabricante, 3 a 6 x 10
8
microrganismos
por mililitro são requeridos. Quando uma sonda é usada em uma amostra
contaminada ou houver falhas na etapa de lise das micobactérias, podem ocorrer
resultados falso-negativos (NOLTE, METCHOCK, 1995; VOSSLER, 2000).
As sondas não permitem a diferenciação dos membros do complexo M.
tuberculosis. Relatos indicaram que alguns isolados de M. terrae e complexo M.
celatum produziram reações falso-positivas com as sondas do complexo M.
tuberculosis (NOLTE; METCHOCK, 1995).
A identificação por hibridização do DNA pode ser aplicada em cultivo em
ágar convencional, meio líquido ou em sistema radiométrico como BACTEC. A
combinação da detecção radiométrica e identificação por hibridização de DNA
usando sondas permite rápida recuperação e identificação (VOSSLER, 2000).
Outro kit disponível é INNO-LIPA Mycobacteria (Innogenetics, Ghent,
Belgium). A análise é baseada na hibridização reversa, na qual a região intergência
16S-23S RNAr (RNA ribossômico) é amplificada pela reação em cadeia da
polimerase (PCR) e os produtos de PCR são subseqüentemente hibridizados com
várias sondas para várias espécies de micobactérias (CHEMLAL; PORTAELS,
2003). A versão 1 inclui sondas para a identificação do complexo M. tuberculosis, M.
kansasii (grupo I, II e III), M. xenopi, M. gordonae, M. chelonae (grupo I, II e III) e
MAC (designado complexo MAIS por incluir M. scrofulaceum) com sondas espécie-
específicas para M. avium, M. intracellulare e M. scrofulaceum. A versão 2 possui
sondas para M. celatum, M. genavense, M. simiae, M. marinum-M. ulcerans, M.
malmoense, M. haemophilum, M. smegmatis e a sonda MIN-2 específica para M.
intracellulare sequevar Mac-A (LEBRUN et al., 2005).
33
3.1.9.5 Detecção direta de M. tuberculosis
A entidade americana Food and Drug Administration (FDA) aprovou duas
técnicas moleculares para a detecção direta de M. tuberculosis em amostras
clínicas: Amplicor M. tuberculosis test (Amplicor; Roche Diagnostic Systems, Inc.,
Branchburg, NJ) e Enhanced M. tuberculosis Direct Test (E-MTD; Gen-Probe, San
Diego, CA).
A técncia Amplicor test detecta a presença do gene 16S RNAr por PCR
seguido por uma reação de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). O tempo
de análise é de 6.5 horas e uma versão automatizada chamada de Cobas Amplicor
é disponível. A técnica é aprovada apenas para amostras respiratórias com
esfregaço positivo para bacilos ácido-resistentes. Apresenta especificidade de 99%
e sensibilidante de 80 a 92%.
A técnica E-MDT é baseada na amplificação mediada por transcrição (TMA).
O RNAr micobacteriano é liberado das células por sonicação e amplificado por TMA.
O tempo de análise é de 3.5 horas. Seu uso é aprovado para amostras respiratórias
com esfregaço negativo ou positivo para bacilos ácido-resistentes. A comparação
entre E-MTD e Amplicor mostrou desempenho semelhante na detecção de M.
tuberculosis (HAZBÓN, 2004).
3.1.9.6 PCR-seqüenciamento
O seqüenciamento de fragmentos baseado na PCR tornou-se o método
“padrão ouro” para a identificação de micobactérias. O método consiste na
amplificação por PCR do DNA micobacteriano com primers específicos ao gênero
seguido do seqüenciamento dos produtos de PCR. O organismo é identificado por
comparação da seqüência de nucleotídios com seqüências de referência
(CHEMLAL; PORTAELS, 2003).
O alvo mais usado é o gene que codifica a subunidade 16S do RNA
ribossômico (16S DNAr) (SOINI, VILJANEN, 1997; CHEMLAL, PORTAELS, 2003;
LEE et al., 2003).
34
O gene 16S RNAr é altamente conservado mas, contém variações de
seqüência gênero ou espécie-específica em certas posições. A análise da seqüência
tornou-se uma ferramenta útil para a identificação e análise filogenética de bactérias
e pode conduzir a descoberta de organismos não cultiváveis e espécies previamente
não caracterizadas (HOLBERG-PETERSEN et al., 1999).
KIRSCHNER et al. (1993) realizaram a identificação de micobactérias
isoladas de amostras clínicas pela determinação da seqüência das regiões
hipervariáveis A e B do gene 16S RNAr amplificadas por PCR. Os membros do
complexo M. tuberculosis produziram idênticas seqüências. M. kansasii e M. gastri
não foram diferenciadas e o mesmo aconteceu com M. ulcerans e M. marinum. Mas,
diferenças na seqüência que ocorrem além destas duas regiões permitiriam a
diferenciação entre M. ulcerans e M. marinum. Entre as micobactérias de
crescimento rápido, M. chelonae subsp. chelonae e M. chelonae subsp. abscessus
não foram distinguidas dentro das regiões A e B, mas, diferem em outras posições
do gene 16S RNAr. M. gordonae mostrou variabilidade intraespécie. A seqüência do
gene 16S RNAr de M. leprae também é descrita, sendo que a mesma foi obtida da
publicação de TESKE, WOLTERS e BÖTTGER (1991).
Segundo ROTH et al. (1998) o número de sítios polimórficos no gene 16S
DNAr no gênero Mycobacterium é pequeno, visto que algumas espécies possuem a
mesma seqüência (M. kansasii e M. gastri ou M. senegalense e M. farcinogenes) e
outras possuem alto grau de similaridade de seqüência (M. malmoense e M. szulgai
ou M. marinum e M. ulcerans).
HOLBERG-PETERSEN et al. (1999) identificaram cepas de referência e
isolados clínicos por análise da seqüência das regiões A e B do gene 16S RNAr
amplificadas por PCR. Dois clínicos isolados produziram seqüências incompatíveis
com as seqüências publicadas. De 323 isolados identificados como micobactérias de
crescimento lento por técnicas convencionais (características de cultura, testes
bioquímicos, sondas de DNA comerciais e perfil lipídico), 318 (98,5%) foram
identificados a mesma espécie ou grupo por análise da seqüência do gene 16S
DNAr. Dois isolados identificados como MAC (complexo M. avium, formado por M.
avium e M. intracellulare) por métodos convencionais foram identificados como M.
terrae por análise da seqüência. O complexo M. avium e M. terrae são distinguidos
35
por testes bioquímicos e a análise retrospectiva revelou que os dois isolados
deveriam ter sido identificados como M. terrae. Um isolado identificado
convencionalmente como M. scrofulaceum revelou uma seqüência 16S DNAr
semelhante a M. novocastrense. Estes dois organismos são facilmente identificados
pela velocidade de crescimento, perfil lipídico e testes bioquímicos. Análise
retrospectiva revelou que a discrepância foi provavelmente devido a interpretação
bioquímica errada. Dois isolados de crescimento rápido não foram identificados por
testes convencionais. O complexo M. tuberculosis exibiu idêntica seqüência 16S
DNAr. As espécies do complexo podem ser distinguidas por características
fenotípicas. Do mesmo modo, M. gastri e M. kansasii mostraram idêntica seqüência,
mas, são diferenciadas pelo perfil lipídico, fotocromogenicidade, atividade de
catalase e redução de nitrato. Membros do MAC são bioquimicamente
indistinguíveis, mas, podem ser diferenciados por métodos moleculares. Membros
de MAIS (complexo M. avium/intracelullare/srofulaceum) não são diferenciados por
perfil lipídico, mas, M. scrofulaceum é escotocromogênica e MAC é não-
fotocromogênica. A análise da seqüência 16S DNAr combinada com algumas
características de cultura como, velocidade de crescimento, pigmentação, testes de
suscetibilidade, oferece uma rápida, reproduzível e geralmente, identificação
definitiva de isolados de micobactérias.
Conforme KIM et al., (1999) resultados ambíguos devido a presença de dois
genes 16S RNAr diferentes em um organismo pode limitar o uso do seqüenciamento
deste alvo na identificação de espécies.
PATEL et al. (2000) avaliaram o sistema comercial MicroSeq 500 (PE
Applied Biosystems) para a identificação de micobactérias. Este sistema de
identificação bacteriano é universal, pois os primers usados são genéricos para
todas as bactérias. O sistema se baseia na amplificação por PCR de um fragmento
de 500 pb (pares de base) da extremidade 5’ do gene 16S RNAr a partir de culturas
puras seguido do seqüenciamento. O organismo é identificado por comparação da
seqüência 16S DNAr com o banco de dados MicroSeq, que consiste de seqüências
de referência. No estudo, 82% (93/113) dos isolados apresentaram resultados
concordantes com a identificação por sondas de DNA, testes bioquímicos ou
cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e 16% (18/113) dos isolados
36
apresentaram resultados discordantes com a identificação original. MicroSeq 500
subdividiu os isolados do complexo M. avium-intracellulare em duas espécies. Todos
os isolados previamente agrupados no complexo M.terrae-triviale foram identificados
como M. nonchromogenicum. Outros estudos relataram que a maioria dos isolados
informados como complexo M. terrae-triviale são verdadeiramente M.
nonchromogenicum. Um isolado originalmente relatado como M. fortuitum foi
identificado como M. peregrinum, a qual foi previamente classificada como uma
subespécie de M. fortuitum. O sistema não diferenciou as espécies do complexo M.
tuberculosis. Do mesmo modo, o sistema foi insuficiente para distinguir entre M.
chelonae e M. abscessus, entre M. genavensae e M. simiae e entre M. kansasii e M.
gastri. A seqüência inteira 16S DNAr é idêntica para M. genavensae e M. simiae,
assim como para M. kansasii e M. gastri. Existem diferenças na seqüência 16S
DNAr entre M. chelonae e M. abscessus, mas, ocorrem na região 5’ do gene.
Os 18 isolados com resultados discrepantes foram agrupados em duas
categorias: (1) espécies freqüentemente encontradas, que foram erroneamente
identificadas pela identificação fenotípica ou por sondas e (2) espécies raramente
isoladas, que são difíceis de identificar por métodos fenotípicos. Dois isolados não
foram identificados por características fenotípicas, mas, o sistema MicroSeq foi
capaz de identificar um desses isolados. A identificação fenotípica incorreta
provavelmente resultou da variação fenotípica dentro de uma espécie e da falta de
experiência entre técnicos que realizaramm e leram os testes bioquímicos.
Segundo TURENNE et al. (2001) métodos de identificação baseados no
seqüenciamento do DNA ribossomal (DNAr) 16S são mais rápidos e mais corretos
que os métodos convencionais. Além da identificação, a técnica é empregada para a
caracterização de novas espécies. Apesar dos problemas associados, muitas
pessoas confiam em bancos de dados públicos para a comparação de seqüências.
Porém, bancos de dados de qualidade controlada como fornecido por RIDOM
(Ribossomal Differentiation of Medical Microorganismos), que por sua vez é
disponível livremente na internet, é essencial para a identificação correta de
espécies e detecção de variações de seqüência conduzindo a descoberta de novas
espécies.
37
HAN et al. (2002) desenvolveram um método de identificação por
amplificação e seqüenciamento de um fragmento de 650 pb que compreende as
regiões hipervariáveis A e B do gene 16S DNAr. Houve 87% de concordância com
sondas de ácidos nucléicos e testes bioquímicos e 13% de identificações
discordantes. As identificações discordantes foram encontradas ser espécies
recentemente propostas e estreitamente relacionadas. Ocasionalmente, correlação
com algumas características de cultura podem ser necessárias para diferenciar
espécies com seqüência 16S DNAr idênticas, como M. kansasii e M. gastri, M.
chelonae subsp. chelonae e M. chelonae subsp. abscessus, que não foram
diferenciadas, mas, podem ser identificadas por testes bioquímicos ou PCR e
seqüenciamento de aproximadamente 500 pb downstream usando primers
universais.
Conforme RINGUET et al. (1999) o gene 16S RNAr possui valor para a
identificação de micobactérias de crescimento lento, pois há pouca variabilidade
dentro dessa seqüência em micobactérias de crescimento rápido. O gene hsp65, o
qual está presente em todas as micobactérias, é mais variável que a seqüência do
gene 16S RNAr e portanto, potencialmente útil para a identificação de espécies
geneticamente relacionadas. A variação na seqüência do gene hsp65 pode ser
explorada para a identificação de micobactérias de crescimento lento e rápido.
O potencial do seqüenciamento de 441 pb do gene hsp65 para a
identificação de micobactérias de crescimento rápido foi avaliado. Dez cepas de
referência foram investigadas, entre elas quatro principais espécies responsáveis
por infecções em humanos, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum e M.
peregrinum, e cada espécie apresentou uma seqüência de nucleotídeos, que
permitiu a diferenciação. No estudo, foi observado algum grau de diversidade alélica
intraespécie, o que foi coerente com os resultados de estudos prévios. Esta
diversidade é mais baixa que a divergência interespécie e não afetou a identificação
das espécies. O efeito da diversidade alélica na seqüência de aminoácidos foi
também estudado. A maioria das substituições de nucleotídeos conduziu a
mudanças que foram conservativas ou codificaram aminoácidos semelhantes
funcionalmente. Esta observação suporta a teoria que a proteína Hsp65 é altamente
conservada entre as micobactérias.
38
KIM et al. (2005) analisaram uma seqüência de 604 pb do gene hsp65 de 56
espécies de micobactérias de referência e de 105 isolados clínicos após a
amplificação de um fragmento de 644 pb. Mais de 83,1% de similaridade foi
observado entre as seqüências. M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti e
M. tuberculosis apresentaram seqüências idênticas. A seqüência de M. simiae ATCC
25275 e M. genavense ATCC 51233 também foi idêntica. A similaridade entre cepas
de cada espécie foi maior que 98,2%. Entre as cepas de referência estava a cepa M.
leprae Thai-53 e entre os 105 isolados clínicos havia 16 amostras de biópsias
obtidas de lesões de pacientes com hanseníase. Os 16 isolados de M. leprae
apresentaram seqüências idênticas. Quando o protocolo foi aplicado a 70 isolados
clínicos, com análise de apenas 422 pb do fragmento de 644 pb, todos os isolados
foram identificados. Comparando com a análise de seqüência do gene 16S RNAr, a
análise do gene hsp65 permitiu a separação entre M. abscessus e M. chelonae,
entre M. szulgai e M. malmoense e entre M. kansasii e M. gastri, o que não é
alcançado com a análise do gene 16S RNAr. Além disso, PCR-RFLP usando Xho I
promoveu a diferenciação do complexo M. tuberculosis de espécies de
micobactérias não tuberculosas e a separação das micobactérias não tuberculosas
em cinco grupos.
Além do gene 16S DNAr e hsp65, outros genes foram caracterizados para a
identificação de micobactérias, pelo método PCR-seqüenciamento, como gene que
codifica uma proteína de 32 KDa, gene gyrA, gene gyrB, gene rpoB, ITS, gene recA,
gene dnaJ e gene secA1.
O gene que codifica uma proteína de 32 KDa é específico para
micobactérias e existem variações na sua seqüência entre as espécies de
micobactérias. SOINI, BÖTTGER e VILJANEN (1994) determinaram a seqüência de
um fragmento de 423 pb do gene que codifica a proteína de 32 KDa por PCR-
seqüenciamento. Um total de dez espécies foi estudado. Os membros do complexo
M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG e M. microti) não foram
distinguidos. Estas espécies são diferenciadas por métodos bioquímicos. A
seqüência de M. avium-intracellulare foi diferente uma da outra. M. kansasii, M.
gastri, M. gordonae e M. malmoense apresentaram uma seqüência espécie-
específica única.
39
Em um estudo posterior SOINI e VILJANEN (1997) utilizaram a mesma
metodologia para 18 outras espécies, incluindo M. gordonae. Em dez casos, todos
os isolados da mesma espécie apresentaram seqüências idênticas e variabilidade
intraespécie foi encontrada em seis casos (M. asiaticum, M. smegmatis, M.
flavescens, M. vaccae, M. triviale e M. celatum).
De acordo com a análise da seqüência do DNA ribossomal 16S, M. celatum
pode ser dividido em dois grupos. A seqüência do gene da proteína de 32 KDa de M.
celatum tipo I e tipo II foram também encontradas ser levemente diferentes uma da
outra. Portanto, os dados suportam a presença de dois tipos de M. celatum. M.
branderi e M. celatum apresentaram diferentes seqüências, porém suas seqüências
são semelhantes, sugerindo que as espécies são relacionadas.
A análise da seqüência de nucleotídeos da região conservada na
subunidade A da DNA girase por GUILLEMIN, CAMBAU e JARLIER (1995) resultou
na diferenciação de nove espécies de micobactérias, incluindo M. leprae, a qual foi
obtida de tecido de camundongo.
A DNA girase é uma topoisomerase tipo II e é a enzima essencial para o
superenrolamento do DNA, a qual é requerida para a replicação e transcrição do
DNA. Duas subunidades A e duas subunidades B codificadas pelo gene gyrA e
gyrB, respectivamente, formam a enzima tetramérica ativa. A estrutura primária da
subunidade A e B da DNA girase são conservadas entre procariotos, provavelmente
devido a função essencial da enzima. Além disso, um domínio N-terminal da
subunidade A é altamente conservado entre procariotos e entre procariotos e
eucariotos. Este domínio contém o sítio catalítico da enzima e a região determinante
de resistência a quinolonas (QRDR), o qual é suposto ser o sítio de interação entre a
subunidade A da DNA girase e quinolonas. As quinolonas são ativas no tratamento
da tuberculose e hanseníase, mas recidivas devido a seleção de mutantes
resistentes podem ocorrer durante o tratamento com quinolonas. Em M.
tuberculosis, M. avium e M. smegmatis, mutações afetando a subunidade A da DNA
girase (especialmente códons 83 e 87) e mutações associadas com resistência
adquirida a quinolonas foram descritas.
40
No estudo realizado, observou-se alto grau de conservação na seqüência de
nucleotídeos da QRDRs das nove espécies de micobactérias, mas a análise das
diferenças entre as espécies permitiu a diferenciação das mesmas.
M. tuberculosis e M. bovis BCG apresentaram uma homologia de seqüência
de 98,3%, mas como algumas cepas de M. tuberculosis foram relatadas possuir
seqüência idêntica a aquela de M. bovis BCG, a diferença encontrada entre as duas
espécies (um G por um C na posição 284) é provavelmente devido ao polimorfismo
natural descrito previamente em M. tuberculosis e não pode ser usado para
distinguir M. tuberculosis de M. bovis BCG (GUILLEMIN; CAMBAU; JARLIER, 1995).
DAUENDORFFER et al. (2003) avaliaram o seqüenciamento do produto de
PCR das QRDRs dos genes gyrA e gyrB para a diferenciação de 21 espécies de
micobactérias, incluindo isolados clínicos de M. leprae.
As seqüências de nucleotídeos da QRDR do gene gyrA (120 pb) e da QRDR
do gene gyrB (117 pb) foram altamente conservados entre as cepas testadas, os
valores de similaridade variaram entre 75 e 100% para QRDR do gene gyrA e 79 a
100% para QRDR do gene gyrB. As seqüências de nucleotídeos de gyrA e gyrB
foram comparadas para todas as espécies e para todas as cepas dentro de cada
espécie.
A comparação interespécie mostrou que as seqüências de QRDR do gene
gyrA (120 pb) e do gene gyrB foram espécie-específicas. Espécies que são
estreitamente relacionadas por suas características fenotípicas e bioquímicas ou
seqüência ribossomal apresentaram diferenças na seqüência da QRDR do gene
gyrA (120 pb) e do gene gyrB. Por exemplo, M. kansasii e M. gastri, M. szulgai e M.
malmoense, M. avium e M. intracellulare, M. gordonae, M. szulgai e M. aurum foram
diferenciadas. O grupo M. chelonae (M. chelonae e M. abscessus) e o grupo M.
fortuitum (M. fortuitum e M. peregrinum) foram distinguidos, assim como as duas
espécies dentro cada grupo. As espécies que pertencem ao complexo M.
tuberculosis (M. tuberculosis, M. africanum e M. bovis) não foram diferenciadas. M.
marinum e M. ulcerans também não foram diferenciadas. Os maiores valores de
similaridade apresentados por M. leprae foram 86,7% com M. intracellulare para a
seqüência da QRDR do gene gyrA e 83,8% com M. marinum para a seqüência da
QRDR do gene gyrB.
41
A similaridade intraespécie variou de 97,5 a 100%. Diferenças na seqüência
foram raramente observadas entre as cepas da mesma espécie, com exceção de
mutantes resistentes a fluoroquinolonas. A diferença intraespécie foi considerada um
polimorfismo natural de seqüência.
KIM et al. (1999) realizaram a identificação de 44 cepas de referência,
incluindo M. leprae, pela análise da seqüência de um fragmento de 342 pb do gene
rpoB. Este gene codifica a subunidade β da RNA polimerase. Foram observados 85
a 100% de similaridade entre as espécies micobacterianas. Os membros do
complexo M. tuberculosis apresentaram seqüências idênticas. M. kansasii foi
diferenciada de M. gastri. M. haemophilum foi a espécie mais semelhante a M.
leprae. M. szulgai foi separada de M. malmoense, assim como, M. intracellulare foi
distinguida de M. avium. Quando a técnica foi aplicada aos 113 isolados clínicos
observarm-se variações na seqüência de nucleotídeos entre as cepas de cada
espécie (99 a 100% de similaridade). Variantes de M. tuberculosis foram
encontrados apenas entre cepas resistentes a rifampicina. Seis isolados de M.
leprae obtidos de biópsia de pele foram corretamente identificados e todos
apresentaram 100% de similaridade. Segundo os autores, a análise da seqüência do
gene rpoB pode ser usada eficientemente para a identificação de isolados clínicos e
micobactérias em paralelo com métodos de cultura tradicionais e como um
complemento da análise do gene 16S DNAr.
ADÉKAMBI, COLSON e DRANCOURT (2003) realizaram a análise da
seqüência do gene rpoB inteiro para 20 cepas de micobactérias de crescimento
rápido de referência a fim de melhorar a identificação baseada na seqüência desse
grupo de patógenos emergentes. Foram observadas cinco regiões variáveis
flanqueadas por regiões conservadas: região I, II, III, IV e V. A região III inclui a
região de identificação descrita por KIM et al. (1999) e a região V apresentou maior
variabilidade.
A seqüência completa do gene rpoB foi mais variável que a seqüência do
gene 16S RNAr. As seqüências rpoB variaram de 84,3 a 96,6% (excluindo “M.
houstonense”), enquanto, para o gene 16S RNAr a variação foi de 95,7 a 99,7%.
Este achado sugere que o rpoB pode aumentar a discriminação molecular de
micobactérias de crescimento rápido. Além disso, a porcentagem de homologia
42
interespécie e intraespécie para o gene rpoB inteiro foi de 84,3 a 96,6% e 98,2 a
99,9%, respectivamente e aquelas para o gene rpoB parcial (723 pb), seqüência
incluída na região V, foi de 83,9 a 97% e 98,3 a 100%, respectivamente. Isto sugere
que a região de 723 pb do gene rpoB é uma boa escolha para uso na identificação.
O método foi utilizado para a identificação de 63 isolados clínicos
previamente identificados por características fenotípicas e análise da seqüência do
gene 16S RNAr. Dos 63 isolados 59 (94%) foram corretamente identificados. M.
abscessus e M. mucogenicum foram distinguidos de M. chelonae; M. magaritense foi
diferenciada de “M. houstonense”. Quatro isolados não foram identificados e foram
suspeitados ser três novas espécies, pois cada um possuía consistentes seqüência
genética e padrão bioquímico.
Os genes codificantes para o RNAr estão arranjados na ordem 5’-16S-23S-
5S-3’ e são separados por duas regiões espaçadoras. A seqüência intergência
(ITS)16S-23S DNAr é sugerida como um alvo potencial dentro do genoma
bacteriano para encontrar sítios para sondas e das quais obter informações
filogenéticas adicionais (ROTH et al., 1998).
ROTH et al. (1998) investigaram a utilidade do ITS para a identificação de
micobactérias. A seqüência de 13 espécies foi determinada.
Observou-se alto grau de variabilidade em toda a seqüência e como
resultado desta variabilidade, verificou-se polimorfismo de seqüência intraespécie
em quatro de 11 espécies para as quais múltiplas cepas dentro de uma espécie
foram analisadas, estas espécies são: M. gastri, M. avium, M. simiae e M. xenopi. M.
triplex e M. genavense foram as duas espécies que apresentaram mais alto grau de
similaridade de seqüência (96%). M. marinum e M. ulcerans apresentaram a mesma
seqüência ITS, assim como os membros do complexo M. tuberculosis.
Baixos níveis de similaridade foram obtidos com a seqüência ITS do que
com a seqüência 16S DNAr. M. kansasii e M. gastri apresentaram 92 a 93% de
similaridade e M. malmoense e M. szulgai apresentaram 88% de similaridade,
enquanto, a similaridade encontrada com a seqüência 16S DNAr para estas
espécies foi maior que 99%.
O estudo demonstrou que a região ITS do gênero Mycobacterium exibiu
variações e mostrou um razoável número de substituições e inserções ou sítios de
43
deleções. Este alto grau de variações é de valor para a discriminação de espécies
estreitamente relacionadas como M. gastri e M. kansasii.
Os resultados mostraram que o seqüenciamento da região ITS representa
um complemento para a análise da seqüência do gene 16S RNAr e a variação
apresentada na seqüência ITS tem potencial para ser usado no desenvolvimento de
sondas como um acesso rápido para a identificação de micobactérias.
BLACKWOOD et al. (2000) utilizaram o gene recA como um alvo para
identificação de micobactérias. O gene recA existe em todas as bactérias devido sua
importante função na recombinação de DNA homólogo, reparo de danos no DNA e
indução da resposta SOS. Os genes recA de 31 espécies de micobactérias foram
estudadas, incluindo M. leprae, cuja seqüência foi obtida do GenBank.
O seqüenciamento do gene recA mostrou menor grau de similaridade
interespécie do que a análise da seqüência do gene 16S RNAr (94,3-100%),
variando de 96,2% entre M. gastri e M. kansasii a 75,7% entre M. aurum e M. leprae.
Exceção disso foram os membros do complexo M. tuberculosis que apresentaram
seqüências idênticas. Duas cepas de cada 27 espécies foram testadas e a
similaridade intraespécie variou de 98,7 a 100%. Porém a comparação de duas
cepas de M. peregrinum resultou em 96,2% de similaridade. A seqüência de gene
16S RNAr destas duas espécies foram determinadas e indicaram 100% de
similaridade. Os autores acreditam que o seqüenciamento do gene recA possa se
usado em combinação com a análise da seqüência do gene 16S RNAr para a
correta identificação de micobactérias.
TAKEWAKI et al. (1994) determinaram a seqüência de nucleotídeos do
segmento do gene dnaJ de 19 espécies obtidos por PCR. Os autores observaram
que existiam diferenças na seqüência entre as espécies e essas diferenças
poderiam ser úteis na distinção das mesmas. As espécies do complexo M.
tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e M. microti)
apresentaram seqüências idênticas. Diferenças na seqüência neste complexo
possibilitaram a distinção entre o complexo M. tuberculosis e micobactérais não
tuberculosas. M. avium e M. intracellulare mostraram uma grande similaridade de
seqüência (94%). M. avium e M. paratuberculosis foram quase idênticas (99%). M.
kansasii e M. gordonae apresentaram o mais baixo grau de similaridade (62%).
44
ZELAZNY et al. (2005) demonstraram que o fragmento de 700 pb do gene
secA1 pode ser usado para a identificação de micobactérias. Este gene codifica uma
proteína essencial SecA1, componente chave na secreção de proteínas através da
membrana plasmática. O fragmento do gene secA1 foi amplificado e seqüenciado
para 30 espécies de micobactérias, incluindo M. leprae, cuja seqüência do gene foi
obtida do GenBank. A variabilidade na seqüência permitiu a diferenciação de todas
as espécies, exceto os membros do complexo M. tuberculosis, que apresentaram
seqüências idênticas. Espécies estreitamente relacionadas como M. gastri e M.
kansasii, M. chelonae e M. abscessus e M. marinum e M. ulcerans foram
diferenciadas. A similaridade interespécie variou de 83,3 a 100%. Embora os primers
usados no estudo também amplificaram o gene secA1 de duas espécies de
Nocardia testadas, o seqüenciamento permitiu a diferenciação entre estas espécies
e todas as espécies de micobactérias testadas. A divergência intraespécie foi menor
que 1,0% (>99% de similaridade), exceto em três casos. Duas cepas de referência
de M. celatum (ATCC 51131 e ATCC 51130) mostraram 95,7 % de similaridade. A
análise da seqüência de três cepas de referência de M. triviale mostrou que duas
cepas (ATCC 23290 e ATCC 23291) foram quase idênticas (99,9% de similaridade),
mas, foram divergentes daquela da type strain (91,9 e 91,7% de similaridade,
respectivamente). A porcentagem de similaridade entre três cepas de referência de
M. flavescens foi baixa, duas cepas (ATCC 23008 e ATCC 23033) pareceram mais
relacionadas uma a outra (96,3% de similaridade) do que com a type strain (91,0 a
90,4% de similaridade). As cepas M. flavescens (ATCC 23008) e ATCC 23033)
pareceram mais relacionadas com M. smegmatis type strain. As seqüências de
isolados clínicos pertencentes a nove espécies revelaram uma similaridade
intraespécie de 96 a 100% e todas foram corretamente identificadas. A maior
variabilidade intraespécie foi observada com M. kansasii e M. gordonae.
3.1.9.7 PCR-RFLP
Neste método, um gene ou um segmento do gene é amplificado por PCR, o
produto é clivado com endonucleases de restrição e os fragmentos são analisados
45
em gel de agarose ou de poliacrilamida ou por eletroforese capilar (HERNANDEZ et
al., 1999).
As técnicas de PCR-RFLP foram desenvolvidas para vários genes
micobacterinaos como hsp65, região intergência 16S-23S DNAr (ITS) e rpoB. Destes
o mais investigado e validado é o gene hsp65 (WONG et al., 2001). Além destes
genes, outros foram usados como gene gyrB, gene para 16S RNAr, região
promotora do gene 16S RNAr e gene dnaJ.
TELENTI et al. (1993) desenvolveram um método de identificação baseado
na amplificação por PCR de um fragmento de 439 pb do gene hsp65 seguido da
digestão do produto de PCR com as enzimas de restrição Bst EII e Hae III. Foram
investigadas 31 espécies de referência para a construção de um algoritmo. Os
membros do complexo M. tuberculosis não foram diferenciados. O complexo M.
avium-intracellulare foi discriminado em M. avium e M. intracellulare. M. avium-
intracellulare ATCC 35770 sorotipo 18 revelou um padrão RFLP de M. intracellulare.
O complexo M. fortuitum foi separado em subespécies. M. kansasii e M. gastri
exibiram distintos perfis. M. gordonae foi separada em cinco padrões e M.
flavescens produziu dois diferentes padrões.
TAYLOR et al. (1997) inicialmente, aplicaram o método desenvolvido por
TELENTI et al. (1993) para a identificação de 28 espécies de micobactérias de
referência e, posteriormente, para a identificação de isolados clínicos obtidos de
meio líquido. Os testes demonstraram que os padrões de restrição foram facilmente
interpretados e concordavam com aqueles obtidos previamente, porém, exceções
foram observadas. Estas envolviam variações pequenas no tamanho de vários
fragmentos de restrição, observação de fragmentos antes não relatados e a
inabilidade de observar o fragmento de 115 pb de M. haemophilum ATCC 29548.
Além disso, M. nonchromogenicum e M. simiae apresentaram dois subtipos (I e II),
um novo padrão para M. gordonae foi nomeado VI para diferenciação dos cinco
padrões descritos previamente, padrões de restrição para M. chelonae presumtive e
para M. neoarum foram relatados. Baseado nas observações, um novo algoritmo foi
construído. Um produto de 439 pb foi obtido de dois isolados, Streptomyces albus e
Rhodococcus equi, e a análise do perfil de restrição demonstrou que ambos os
46
padrões foram distinguíveis daqueles dos fragmentos produzidos pelas
micobactérias.
DEVALLOIS, GOH e RASTOGI (1997) aplicaram o método proposto por
TELENTI et al. (1993) para diferenciar espécies de micobactérias que não haviam
sido estudadas previamente, com ênfase especial na diferenciação de M. chelonae,
M. abscessus, M. fortuitum e M. peregrinum. Estas quatro espécies foram
previamente referidas como complexo M. fortuitum (composto de M. fortuitum var.
fortuitum, M. fortuitum var. peregrinum, M. chelonae subsp. chelonae e M. chelonae
subsp. abscessus). Um algoritmo mais complexo foi proposto por incorporação de
novos perfis – três subgrupos de M. kansasii (II, IV e V), dois subgrupos de M.
peregrinum (II e III), um subgrupo de M. abscessus (II) e também espécies não
analisadas previamente como M. ulcerans, “M. engbackii”, M. porcinum, M. phlei e
M. senegalense. Os membros de complexo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M.
africanum, M. bovis, M. bovis BCG) produziram idênticos perfis. M. avium e M.
intracellulare foram diferenciadas, M. paratuberculosis apresentou o mesmo perfil de
M. avium.
RASTOGI, GOH e BERCHEL (1999) utilizaram a mesma metodologia para
caracterizar M. leprae. O bacilo foi obtido de diferentes órgãos de tatu e
camundongo nude infectados experimentalmente. Um total de 15 amostras foi
analisado. Todos os isolados produziram padrões de restrição idênticos e o limite de
detecção estabelecido foi de 8 a 13 bacilos.
BRUNELLO et al. (2001) empregaram a técnica PCR-RFLP do gene hsp65
proposto por TELENTI et al. (1999) para a identificação de micobactérias usando
também o gel de poliacrilamida para a separação de fragmentos de restrição. Foram
avaliadas 32 espécies já descritas e 22 espécies adicionais e um algoritmo foi
derivado para estas 54 espécies.
A análise baseada na eletroforese em gel de poliacrilamida forneceu uma
estimativa mais precisa que aquela baseada na eletroforese em gel de agarose do
tamanho real dos fragmentos de restrição, como deduzido da análise da seqüência,
e permitiu identificação de micobactérias cujo perfil de digestão foi claramente
identificado por fragmentos mais curtos que 60 pb.
47
HERNANDEZ et al. (1999) desenvolveram uma análise baseada na
amplificação por PCR de regiões polimórficas com primers fluorescentes seguido por
restrição e análise por eletroforese capilar de fluorescência (FCE). Vinte e duas
espécies de micobactérias foram identificadas por análise dos fragmentos de
restrição de um segmento de 439 pb do gene hsp65 usando Hae III e Bst EII e de
uma região hipervariável de 475 pb do gene 16S RNAr usando Hae III e Cfo I.
As amostras foram analisadas em um instrumento de eletroforese capilar de
fluorescência e o tamanho dos fragmentos gerados foi comparado com o tamanho
de fragmentos determinados por seqüenciamento dos produtos de PCR dos genes
usados como alvo. Quatro fragmentos de restrição fluorescentes para cada gene
foram gerados (dois fragmentos para cada enzima de restrição, exceto para os
casos no quais os produtos de PCR não foram clivados devido a ausência de sítios
de restrição).
Entre as 22 cepas, cinco padrões foram observados quando o fragmento do
gene hsp65 foi digerido com Bst EII. Nenhum fragmento foi obtido com Bst EII para
M. szulgai. A digestão do fragmento do gene hsp65 com Hae III produziu oito
padrões. Um padrão foi comum para o complexo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M.
bovis, M. bovis BCG e M. africanum), mas não com M. microti. Embora M. microti é
incluída no complexo, seu padrão com Hae III foi compartilhado com M. avium e M.
intracellulare. O fragmento do gene 16S RNAr digerido com Cfo I produziu seis
padrões. Nenhum fragmento foi observado para M. gordonae. Seis padrões
resultantes da digestão do gene 16S RNAr com Hae III foi observado entre as 22
espécies. Um único padrão foi observado para o complexo M. tuberculosis, exceto
para M. microti. Portanto, M. microti foi diferenciada dos outros membros do
complexo M. tuberculosis.
Quando o tamanho dos fragmentos obtidos por análise de FCE foi
comparado com aqueles determinados por análise da seqüência de DNA, foi
encontrado que a diferença variou de um a quatro pares de bases (exceto para um
fragmento com Hae III para M. fortuitum e M. peregrinum). Embora seis e nove
espécies pudessem ser identificadas após digestão do produto de PCR do
fragmento do gene hsp65 e 16S RNAr, respectivamente, por uma única enzima, a
identificação de todas as espécies requer a análise de todos os oito fragmentos.
48
De 22 espécies, foram obtidos distintos padrões RFLP para 19 espécies.
Três membros do complexo M. tuberculosis apresentaram um padrão RFLP comum.
GOH et al. (2001) fazem referência a inclusão de M. canetti como membro
do complexo M. tuberculosis. Os autores investigaram os organismos do complexo
M. turculosis por PCR-RFLP de um fragmento de 441 pb do gene hsp65 e
mostraram que M. canetti pode ser diferenciada dos demais membros do complexo.
O perfil de digestão obtido com a enzima Hha I permitiu esta distinção.
HÄFNER et al. (2004) utilizaram a técnica PCR-RFLP de um fragmento de
441 pb do gene hsp65 com as enzimas Bst EII e Hae III para relatar padrões de
cinco espécies raramente isoladas e quatro subsespécies ou variantes, para as
quais padrões não haviam sido publicados.
WONG et al. (2001) desenvolveram uma análise baseada em PCR-RFLP de
um fragmento de 294 pb do gene hsp65 usando as enzimas Sau 96I e Cfo I. Um
algoritmo foi produzido para 43 espécies e subespécies.
Os padrões de restrição para o complexo M. tuberculosis e para o complexo
M. avium foram distintos. Ocorreu diferenciação entre M. avium, M. intracellulare e
M. scrofulaceum. Para o complexo M. terrae o perfil RFLP foi muito heterogêneo.
A análise foi proposta para que os mais freqüentes isolados, em particular M.
tuberculosis e M. avium, pudessem ser identificados com facilidade.
AVANISS-AGAJANI et al. (1996) desenvolveram um método de PCR-RFLP
usando uma região de 480 pb do gene 16S DNAr para a identificação de 13
espécies de micobactérias. A seqüência-alvo compreende uma região 5’ e central do
gene 16S RNAr. O primer 5’ foi marcado com fluorescência na sua extremidade 5’,
portanto, as moléculas de DNA amplificadas têm uma marcação fluorescente na
extremidade 5’. O produto de PCR foi digerido com enzimas de restrição (Dpn II,
Hae III, Hha I, Msp I e Rsa I) e um seqüenciador de DNA automatizado foi
empregado para determinar o tamanho dos fragmentos de restrição marcados.
Desde que o produto de PCR é marcado apenas na extremidade 5’, a análise
identifica apenas o fragmento próximo da extremidade 5’. Cada espécie tem um
único fragmento de restrição 5’ para cada endonuclease. Um conjunto de enzimas
de restrição produz um conjunto único de fragmentos para cada espécie, permitindo
assim a identificação.
49
O tamanho do fragmento observado foi comparado com o tamanho
calculado e observou-se que mais da metade dos tamanhos dos fragmentos
observados e calculados eram idênticos ou diferiam no máximo por três pares de
bases. Para um par de espécies (M. avium e M. intracellulare) o padrão de
fragmentos de restrição marcado foi muito semelhante e a identificação dessas
espécies pode não ser possível. O método permite a identificação de mais de um
organismo na mesma amostra.
DOBNER et al. (1996) propuseram o método PCR-RFLP usando como alvo
uma região de 0,3 a 0,4 Kb (kilobases) não codificante, hipervariável e anterior a
região codificante para 16S RNAr. A região promotora é mais polimórfica que a
região 16S DNAr inteira ou ao fragmento de 0,36 Kb do gene hsp65. Oito espécies
de micobactérias foram estudadas, incluindo M. leprae, a qual foi obtida de tecido de
camundongo infectado.
O padrão de RFLP de M. bovis foi idêntico a aquele de M. tuberculosis.
Padrões RFLP distintos foram observados para M. gordonae, M. xenopi, M. leprae,
M. avium, M. intracellulare e M. smegmatis.
KASAI, EZAKI e HARAYAMA (2000) determinaram a seqüência do gene
gyrB de 15 espécies de micobactérias e observaram que mais substituições foram
encontradas na seqüência do gene gyrB do que nas seqüências 16S DNAr e ITS. A
análise da seqüência gyrB permitiu a determinação de primers para a amplificação
específica de espécies do complexo M. tuberculosis. A digestão dos produtos de
PCR com Rsa I e Taq I possibilitou a diferenciação de quatro espécies do complexo
(M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum e M. microti).
Conforme CHIMARA, FERRAZOLI e LEÃO (2004) o complexo M.
tuberculosis é formado por M. tuberculosis, M. bovis subsp. bovis, M. bovis subsp.
caprae, M. bovis BCG, M. africanum (subtipos I e II), M. microti, “M.canetti” e M.
pinnipedii.
Cepas de referência incluindo M. tuberculosis, M. bovis subp. bovis, M. bovis
BCG, “M. canetti”, M. africanum e M. pinnipedii foram analisadas por PCR-RFLP
conforme descrito por KASAI, EZAKI e HARAYAMA (2000), em que um fragmento
de 1020 pb do gene gyrB foi amplificado e digerido com as enzimas Rsa I, Taq I e
Sac II. Baseado nos resultados obtidos e em informações de seqüência gyrB
50
publicadas, um algoritmo foi elaborado. M. tuberculosis, M. africanum II e “M. canetti”
não foram diferenciadas. O mesmo ocorreu entre as espécies M. africanum I e M.
pinnipedii e entre M. bovis subp. bovis e M. bovis BCG. M. microti e M. bovis subp.
caprae produziram padrões de RFLP distintos.
LEE et al. (2000) desenvolveram uma técnica de PCR-RFLP usando com
alvo uma região do gene rpoB para a identificação de micobactérias. Foram
utilizadas 44 espécies de micobactérias e três espécies relacionadas para a
amplificação de uma região de 360 pb do gene. O DNA amplificado foi digerido com
as enzimas de restrição Msp I e Hae III e após a determinação do tamanho dos
fragmentos gerados, um algoritmo foi construído.
Os resultados mostraram que o gene rpoB presente em todas as
micobactérias e em algumas outras bactérias como Nocardia e Rhodococcus foi
amplificado. Ocorreu a diferenciação entre M. kansasii e M. gastri e entre M.
abscessus e M. chelonae. Além disso, para algumas espécies como M. fortuitum, M.
celatum, M. gordonae e M. kansasii foram observadas subsespécies.
Algumas cepas que não foram diferenciadas com as enzimas Msp I e Hae III
poderiam ser separadas com uma terceira enzima. Por exemplo, os membros do
complexo M. tuberculosis não foram distinguidos usando Msp I e Hae III, mas a
enzima Sau 3AI poderia ser usada para diferenciar M. africanum dos demais
membros do complexo. A enzima Hinc II poderia ser usada para diferenciar M.
gordonae I de M. celatum I e M. abscessus e M. chelonae poderiam ser separadas
por Bst EII.
KIM et al. (2001) utilizaram a mesma região de 342 pb do gene rpoB, usada
previamente para a identificação de micobactérias por análise de seqüência, como
alvo do método PCR-RFLP. A digestão do produto de PCR com as quatro enzimas
de restrição (Hae III, Hind II, Mva I e Acc II) gerou perfis de restrição distintos. Um
algoritmo com 49 cepas de referência foi construído, incluindo a cepa M. leprae Thai
53. Os tamanhos exatos dos fragmentos de restrição no algoritmo foram
determinados da seqüência de nucleotídeos.
Micobactérias de crescimento rápido e lento puderam ser diferenciadas pela
digestão do DNA amplificado com a enzima Hae III. A digestão com Hind II distinguiu
o complexo M. tuberculosis de outras micobactérias. Espécies estreitamente
51
relacionadas como M. avium-M. paratuberculosis-M. intracellulare, M.celatum I- M.
celatum II e M. marinum-M.ulcerans foram distinguidas. Seis subsespécies (I a VI)
de M. kansasii puderam ser distinguidas de M. gastri. O método não apenas
diferenciou os isolados obtidos de culturas, mas também permitiu a detecção e
identificação de micobactérias diretamente em amostras clínicas.
KIM et al. (2004) desenvolveram um método de PCR duplex (DPCR) para a
diferenciação do complexo M. tuberculosis de micobactérias não tuberculosas. O
alvo utilizado foi o gene rpoB e dois conjuntos de primers amplificaram um fragmento
de 235 pb e 136 pb do complexo M. tuberculosis e micobactérias não tuberculosas,
respectivamente. Quando o método foi aplicado a não micobactérias, cepas de
Tuskamurella, Rhodococcus e Nocardia produziram um fragmento de 136 pb. O
produto de PCR de micobactérias não tuberculosas pode ser analisado por RFLP ou
seqüenciamento para a diferenciação de espécies. Um algoritmo de DPCR-RFLP
com Msp I e Hae III foi proposto.
O gene dnaJ codifica uma proteína de estresse é altamente conservado
entre o gênero bacteriano. TAKEWAKI et al. (1994) demonstraram que a
combinação de PCR para o gene dnaJ como RFLP pode diferenciar micobactérias.
O par de primer 1 amplificou um fragmento de 236 pb do gene dnaJ de 18
espécies de micobactérias. M. chelonae produziu uma fragmento de 225 pb do gene
danJ usando o par de primer 2. As 19 espécies puderam ser diferenciadas em dez
grupos com as enzimas Sma I, Nae I, Hinf I e Fok I. O complexo M. tuberculosis (M.
tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e M. microti) foram diferenciadas
das micobactérias não tuberculosas; M. avium foi distinguida de M. intracellulare; M.
kansasii, M. gastri e M. marinum não foram diferenciadas. M. avium e M.
paratuberculosis, que são conhecidas como espécies próximas geneticamente, não
foram discriminadas. M. xenopi, M. fortuitum e M. chelonae não apresentaram sítios
de restrição para as quatro enzimas usadas. Mas a diferenciação poderia ser
possível quando enzimas diferentes foram usadas, por exemplo, M. kansasii, M.
marinum e M. gastri podem ser separadas com Hae I; M. xenopi com Dra III; M.
fortuitum com Hae II e M. chelonae com Sac I.
ROTH et al. (2000) estabeleceram um método de PCR-RFLP usando como
alvo a região intergênica 16S-23S DNAr para a identificação de micobactérias.
52
Foram investigadas 48 espécies de micobactérias e espécies de outros gêneros.
Entre as espécies não micobacterianas, apenas Gordonia terrae foi amplificada. O
tamanho dos produtos de PCR variou de 200 pb a 330 pb. A maior parte das
espécies puderam ser identificadas com as enzimas Hae III e Cfo I e as demais
espécies foram separadas usando enzimas adicionais como Taq I, Msp I, Dde I, Hinf
I e Ava II. O método não distinguiu as espécies M. marinum e M. ulcerans.
Variabilidade intraespécie foi observada em M. fortuitum, M. flavenscens, M.
parafortuitum, M. kansasii, complexo M. terrae, M. intracellulare, M. chelonae, M.
peregrinum, M. phlei e M. scrofulaceum. Baseado no perfil de restrição, um algoritmo
foi proposto.
3.1.9.8 Microarranjo de DNA
O microarranjo de DNA oferece a possibilidade de exame rápido de grande
quantidade de DNA com uma única etapa de hibridização. Este método é aplicado
para a identificação de espécies e detecção de mutações que conferem resistência a
rifampicina em micobactérias (SOINI; MUSSER, 2001).
O microarranjo de DNA ou DNA chip geralmente consiste de uma superfície
de vidro na quais múltiplas sondas de DNA com identidades conhecidas são fixadas
para a hibridização molecular com amostras de DNA, a qual permite o exame da
expressão genética ou genotipagem. Este método permite a análise simultânea de
milhares de genes em um curto tempo de análise e é útil para a análise filogenética.
Para a identificação de bactérias, este método pode envolver a marcação de RNA
transcrito in vitro de um gene alvo da bactéria, subseqüente hibridização do RNA
transcrito in vitro marcado com sondas espécie-específicas em um microarray e
detecção da marcação geralmente por fluorescência (FUKUSHIMA et al., 2003).
GINGERAS et al. (1998) utilizaram o microarranjo de DNA com sondas
complementares a seqüência do gene rpoB de M. tuberculosis de 705 pb. O método
permitiu a detecção de mutações que conferem resistência a rifampicina em isolados
de M. tuberculosis e a identificação de dez espécies de micobactérias.
TROESCH et al. (1999) realizaram o microarranjo baseado no gene 16S
RNAr para a identificação de 27 espécies de micobactérias e no gene rpoB para a
53
detecção de cepas de M. tuberculosis resistentes a rifampicina. No estudo, M. avium
e M. paratuberculosis, M. kansasii e M. gastri, M. marinum e M. ulcerans, M. bovis e
M. tuberculosis e M. chelonae e M. abscessus não foram individualmente
identificadas. Todas as cepas de M. tuberculosis resistentes a rifampicina foram
corretamente detectadas.
FUKUSHIMA et al. (2003) desenvolveram um microarranjo baseado na
seqüência do gene gyrB para a identificação de 14 espécies de micobactérias. A
maioria das espécies não podia ser identificada com uma única sonda, então, um
conjunto de 28 sondas foi usado para a identificação. O estudo mostrou que a
tecnologia pode identificar espécies e pode distinguir aquelas estreitamente
relacionadas, como M. bovis e M. tuberculosis; M. avium e M. intracellulare. O
método foi também capaz de identificar dois tipos de bactérias em casos de infecção
dupla e detectar diretamente micobactérias de amostras clínicas.
3.1.9.9 PCR-hibridização
BÖDDINGHAUS et al. (1990) descreveram seqüências de nucleotídeos
específicas ao gênero, grupo ou espécie de micobactérias por comparação de
seqüências de 16S RNAr. No estudo, os autores desenvolveram sondas de DNA
espécie-específicas para o grupo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis e M.
africanum), grupo M. avium (M. avium, M. paratuberculosis) e M. intracellulare.
Seqüências de nucleotídeos também foram investigadas para detectar micobactérias
por hibridização e PCR.
A sensibilidade de procedimento de amplificação foi avaliada com M.
tuberculosis, como um sistema modelo. Através do uso da diluição em série de ácido
nucléico purificado, 10 pg de ácido nucléico adicionado à mistura de reação poderia
ser amplificado suficientemente para produzir um fragmento detectável em gel de
agarose. Quando a presença de DNA micobacteriano amplificado foi identificada por
hibridização com oligonucleotídeos marcado com
32
P pela análise slot blot, a
sensibilidade foi melhorada para aproximadamente 100 vezes. Quando a transcrição
reversa de extrato de ácido nucléico em cDNA (DNA complementar) foi realizada
antes da PCR, a sensibilidade foi aumentada 1000 vezes.
54
Como um outro teste para determinar a sensibilidade do procedimento de
amplificação, soluções de ácido nucléico de diluições em série de uma suspensão
contendo um número conhecido de células de M. tuberculosis foram adicionadas à
mistura de reação. Quando alíquotas da mistura de amplificação foram aplicadas em
gel de agarose 0,8%, um fragmento discreto de aproximadamente 1.0 kilobase (Kb)
foi visível em amostras contendo 500 micobactérias. Porém, quando o RNAr foi
transcrito em cDNA antes da PCR, resultou em um fragmento definido de tamanho
adequado em amostras contendo aproximadamente 30 micobactérias. A
combinação dos procedimentos de amplificação e hibridização resultou em um limite
de detecção de três micobactérias na amostra.
TAKEWAKI et al. (1993) demonstraram que a amplificação por PCR do gene
dnaJ usando primers específicos para micobactérias e subseqüente análise dot blot
com sondas espécie-específicas permitiu a amplificação do complexo M.
tuberculosis, M. avium, M. inatracellulare e M. kansasii.
ZOLG e PHILIPPI-SCHULZ (1994) empregaram o gene que codifica a
enzima superóxido dismutase (SOD) como alvo na identificação de micobactérias.
Foram desenvolvidos primers específicos ao gênero que permitiram a amplificação
de todas as 28 espécies de micobactérias testadas. Um pool de sondas gênero
específicas reconheceu 23 das 28 espécies. Também, foram identificadas sondas
espécie-específicas para M. avium, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M.
kansasii, M. scrofulaceum, M. simiae, complexo M. tuberculosis e M. xenopi.
BEENHOUWER et al. (1997) desenvolveram um método que combina PCR
e OSCPH (oligonucleotide-specific capture plate hibridization) para a detecção e
identificação de micobactérias. O alvo utilizado foi um segmento do gene 16S DNAr.
Durante a PCR, um marcador (dUTP-11-digoxigenina) foi incorporado no produto de
PCR. Após a amplificação, o amplicon é hibridizado em placas de microtitulação
revestidas com estreptavidina preparadas com oligonucleotídeo espécie-específico
biotinilado. Um oligonucleotídeo específico ao gênero e sete oligonucleotídeos
espécie-específicos (complexo M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M.
scrofulaceum, M. xenopi, M. genavense e M.chelonae-M.abscessus) foram
designados como sondas de captura. Após a hibridização específica, o emprego da
técnica de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) revelou especificamente o
55
complexo ligado, permitindo a identificação da espécie. O teste de sensibilidade
revelou que o método pode detectar aproximadamente três micobactérias, enquanto
a PCR, aproximadamente 300 micobactérias.
LEE et al. (2003) analisaram a seqüência de uma região de 360 pb do gene
rpoB de 26 espécies de micobactérias. A análise da seqüência desta região mostrou
que as espécies estudadas poderiam ser distinguidas. Por exemplo, houve
diferenciação entre M. kansasii e M. gastri, entre M. abscessus e M. chelonae e
entre M. fortuitum e M. peregrinum. Subsespécies de M. kansasii, M. fortuitum e M.
gordonae também foram diferenciadas. Porém, não foram observadas diferenças na
seqüência entre as espécies do complexo M. tuberculosis, incluindo, M. tuberculosis,
M. bovis, M. microti e M. africanum. Baseado na análise da seqüência, os autores
desenvolveram sondas que mostraram serem úteis para a identificação de
micobactérias por técnica de hibridização por dot blot.
3.1.10 Significado Clínico
A maioria das espécies de micobactérias é distribuída da natureza, mas,
outras como o complexo M. tuberculosis e M. leprae são encontradas em tecidos
humanos ou de animais.
É uma observação comum que micobactérias não tuberculosas causam
doenças em indivíduos com o sistema imune alterado. Doença pulmonar obstrutiva
crônica, enfisema, bronquiectasia, fibrose cística, gastrectomia, alcoolismo crônico,
procedimentos cirúrgicos e AIDS (síndrome de imunodeficiência adiquirida) são
algumas das condições predisponentes de doença devido a estas micobactérias. O
mecanismo de patogênese dessas micobactérias não é claro (KATOCH, 2004).
A seguinte seção contém a descrição de doenças associadas com algumas
espécies clinicamente importantes de micobactérias. Segundo KATOCH (2004)
quando 95 espécies eram caracterizadas, aproximadamente 30 espécies eram
associadas a doenças em humanos. A espécie, M. leprae, será discutida no item
3.2.
56
• Complexo Mycobacterium tuberculosis
Os membros do complexo M. tuberculosis são os agentes causadores da
tuberculose em humanos e em animais. Apesar da estreita relação genética, as
espécies do complexo diferem na epidemiologia, patogenicidade, âmbito geográfico
e preferência de hospedeiro (CHIMARA; FERRAZOLI; LEÃO, 2004).
O complexo M. tuberculosis não ocorre na natureza e depende da
transmissão do hospedeiro para a sua sobrevida. O M. tuberculosis é a principal
causa de doença humana (TOOSSI; ELLNER, 1999). M. bovis causa tuberculose
em bovinos, humanos e outros primatas, carnívoros, incluindo cães e gatos, suínos,
papagaios, e algumas aves de rapina. A doença produzida em humanos é
virtualmente indistinguível daquela causada por M. tuberculosis e é tratada
semelhantemente (NOLTE; METCHOCK, 1995). A linhagem de M. bovis, conhecida
como BCG (bacilo Calmette-Guérin) é usada como vacina contra a tuberculose
(KONEMAN et al. 2001). M. africanum causa tuberculose em humanos na África
tropical. M. microti causa tuberculose em rato silvestre e produz lesões locais em
cobaias, coelhos e bezerros (NOLTE; METCHOCK, 1995). Segundo KASAI, EZAKI
e HARAYMA (2000), M. microti também acomete humanos.
Certos subgrupos da população possuem risco elevado de adquirir
tuberculose, seja por maior probabilidade de exposição e infecção ou por serem
mais propensos a progredir para doença ativa. Em alguns casos, ambos os fatores
podem ser importantes. A infecção com HIV (vírus da imunodeficiência humana) é o
maior fator de risco conhecido para a ativação da infecção tuberculosa latente em
doença clínica (NOLTE; METCHOCK, 1995). Numerosos estudos mostraram a
contribuição de fatores genéticos no controle da suscetibilidade a tuberculose. Por
exemplo, evidência positiva para o envolvimento no controle da susceptibilidade do
hospedeiro à tuberculose já foi obtida para genes HLA, NRAMP1, VDR, IL-1Ra e IL-
1b (MARQUET; SCHURR, 2001).
O M. tuberculosis é carregado em partículas transportadas pelo ar que são
geradas quando o paciente com tuberculose pulmonar tosse, espirra ou fala. Estas
partículas têm de 1 a 5 µm de tamanho e são mantidas suspensas no ar por
correntes de ar. A infecção ocorre quando uma pessoa suscetível inala as partículas
57
contendo o M. tuberculosis. As partículas infectadas alcançam as vias respiratórias
terminais no pulmão e no alvéolo, onde os microrganismos são engolfados pelos
macrófagos alveolares. Normalmente, a resposta imune mediada por células do
hospedeiro limita a multiplicação e a propagação do M. tuberculosis; porém, algum
bacilo pode permanecer viável, mas dormente por muitos anos após a infecção
inicial.
A tuberculose pulmonar em adultos é um processo inflamatório lentamente
progressivo caracterizado por inflamação crônica intensa, necrose e caseação. As
cavidades que se formam nos pulmões podem romper dentro de brônquios,
permitindo que grande número de organismos se espalhe para outras áreas do
pulmão e sejam aerossolizadas pela tosse, e, portanto, infectando outras pessoas.
As características clínicas comuns de tuberculose pulmonar incluem tosse, perda de
peso, febre baixa, dispnéia e dor torácica. A tuberculose em pacientes com AIDS
progride muito mais rapidamente e, muitas vezes, se dissemina (NOLTE;
METCHOCK, 1995).
Além da tuberculose pulmonar, a tuberculose pode ser extrapulmonar. Os
locais mais comuns de tuberculose extrapulmonar são linfonodos, a pleura, o trato
gastrointestinal, ossos e articulações, meninges e peritônio, mas praticamente
qualquer sistema orgânico pode ser acometido (RAVIGLIONE; O’BRIEN, 1998).
• Complexo M. avium
O complexo M. avium inclui M. avium e M. intracellulare (VOSSLER, 2000).
M. avium possui três subespécies, que são: M. avium subsp. avium, M. avium subsp.
paratuberculosis e M. avium subsp. silvaticum (FORBES, SAHM, WEISSFELD,
1998; RIDOM, 2006).
Os organismos do complexo que causam doença em humanos são M.
avium, M. intracellulare e M. paratuberculosis. Embora M. avium e M. intracellulare
sejam organismos distintos, estes organismos são muito semelhantes e a distinção
entre eles não pode ser feita por determinações laboratoriais de rotina ou em bases
clínicas. Como resultado, algumas vezes esses organismos são referidos como M.
avium-intracellulare. Além disso, devido o isolamento de M. paratuberculosis em
58
laboratórios de rotina ser raro, o termo complexo M. avium é geralmente usado para
relatar os isolados de M. avium-intracellulare (FORBES; SAHM; WEISSFELD, 1998).
Organismos do complexo M. avium estão difundidos na natureza e foram
isolados da água, solo, plantas, poeira doméstica e de outras fontes ambientais. M.
avium causa doença em aves domésticas e suínos. As águas naturais parecem ser
o reservatório para infecções em humanos (VOSSLER, 2000). Infecções humanas
por M. avium-intracellulare podem ser adquiridas por ingestão de águas ou
alimentos contaminados ou por inalação de microrganismos em aerossóis aquosos
(KONEMAN et al., 2001).
O complexo M. avium emergiu como um importante patógeno em
imunocomprometidos e imunocompetentes. Aproximadamente 90% das infecções
micobacterianas em pacientes com AIDS envolve o complexo M. avium ou M.
tuberculosis, e os outros 10% de infecções são causadas por outras espécies não
tuberculosas (FORBES; SAHM; WEISSFELD, 1998).
O complexo causa doença pulmonar, linfadenite e doença disseminada.
Pacientes com AIDS podem apresentar infecção focal ou disseminada. A infecção
focal geralmente envolve pulmões, trato gastrointestinal e ocasionalmente linfadenite
periférica. A infecção disseminada ocorre, normalmente, após um ano ou mais do
diagnóstico de AIDS, quando a contagem de CD4 é menor que 100 células por mm
3
(NOLTE; METCHOCK, 1995).
Existem evidências de uma associação entre a doença de Crohn e M.
paratuberculosis. A doença de Crohn é uma doença inflamatória de intestino que
ocorre em humanos. Esta doença é semelhante a doença de Johne, causada por M.
paratuberculosis, que ocorre em bovinos, ovinos e caprinos (NOLTE; METCHOCK,
1995). O envolvimento de M. paratuberculosis na doença de Crohn ainda não foi
elucidado (KATOCH, 2004).
• M. kansasii
Cepas de M. kansasii foram isoladas de água (VOSSLER, 2000). Acredita-
se que a água de torneira é o maior reservatório associado com doença em
humanos (RIDOM, 2006). A manifestação mais comum é doença pulmonar crônica.
59
Infecções extrapulmonares incluem linfadenite, infecção de pele e de tecidos moles
e infecção em articulações. Doença disseminada raramente ocorre em pacientes
imunocompetentes, mas, é relatada em pacientes severamente
imunocomprometidos, particularmente aqueles com AIDS (VOSSLER, 2000).
• M. scrofulaceum
M. scrofulaceum é freqüentemente associada com linfadenite cervical em
crianças. Infecções extranodais incomuns incluem doença pulmonar, doença
disseminada, conjuntivite, osteomielite, meningite e hepatite granulomatosa (NOLTE;
METCHOCK, 1995). Organismos com características de M. scrofulaceum e do
complexo M. avium são referidos como M. avium-intracellulare-scrofulaceum ou
grupo MAIS (VOSSLER, 2000).
• M. xenopi
O organismo é recuperado de água potável, incluindo água estocada em
tanques em hospitais e em aves. Doença pulmonar é a manifestação mais comum
da infecção, normalmente ocorre em pacientes com doença pulmonar subjacente ou
com outras condições predisponentes (malignidade de pulmões, alcoolismo ou
diabetes). Infecções disseminadas e extrapulmonar são descritas em indivíduos
imunocomprometidos, incluindo receptores de transplante renal, pacientes de diálise
peritoneal e pacientes com AIDS (NOLTE; METCHOCK, 1995).
• Grupo M. fortuitum
O grupo M. fortuitum é formado por M. fortuitum (antigamente M. fortuitum
biovar. fortuitum), M. peregrinum (antigamente M. fortuitum biovar. peregrinum) e
complexo M. fortuitum terceiro biovariante (BROWN-ELLIOTT; WALLACE JUNIOR,
2002).
Comum no ambiente, M. fortuitum é isolado da água, solo e poeira (NOLTE;
METCHOCK, 1995). O grupo é implicado em infecções de ferida pós-traumática
60
localizada, infecções de cateter e infecções de ferida cirúrgica (BROWN-ELLIOTT;
WALLACE JUNIOR, 2002). Os organismos do complexo também causam
osteomielite, celulite, otite média, úlcera corneal e doença pulmonar crônica
(NOLTE; METCHOCK, 1995).
• M. chelonae
Este organismo causa infecções de ferida pós-traumática localizada,
infecções corneal pós-cirúrgica ou pós-traumática e infecções de cateter. Em
pacientes que recebem corticosteróides e recptores de órgãos causa infecção de
pele disseminada e infecção de cateter (BROWN-ELLIOTT; WALLACE JUNIOR,
2002). O organismo foi isolado do solo (RIDOM, 2006).
• M. szulgai
Das infecções relatadas com M. szulgai, a manifestação mais comum é
doença pulmonar (VOSSLER, 2000). As infecções extrapulmonares incluem
linfadenite, bursite, adenite cervical, tenossinovite, infecção cutânea e osteomielite
(NOLTE; METCHOCK, 1995).
• M. malmoense
O organismo é associado à doença pulmonar crônica e adenite cervical
(VOSSLER, 2000). Raramente causa doença extrapulmonar e doença disseminada.
Seu reservatório ambiental é o solo e a água (RIDOM, 2006).
• M. simiae
O organismo foi isolado de água de torneira. São infreqüentes os casos de
infecção humana por M. simiae e mais freqüentemente causa doença pulmonar em
pacientes com preexistente dano em pulmões (VOSSLER, 2000). É relatado,
também, que M. simiae causa osteomielite e doença disseminada (RIDOM, 2006).
61
• M. marinum
M. marinum é implicado em doenças de peixe e é isolado de aquários. A
infecção cutânea em humanos ocorre quando pele traumatizada entra em contato
com água doce inadequadamente clorada ou água salgada. Tipicamente, as lesões
aparecem como nódulos moles, subcutâneos, vermelhos ou vermelhos-azulados,
em geral envolvendo cotovelos, joelho e dedos da mão ou de pés (“granuloma de
piscina”). Em alguns casos, um abscesso se desenvolve no sítio primário de
inoculação, com disseminação ao longo dos linfáticos (VOSSLER, 2000). Infecções
profundas incluindo tenossinovite, artrite, bursite e osteomielite são também
relatadas (NOLTE; METCHOCK, 1995).
• M. ulcerans
M. ulcerans causa uma infecção ulcerosa que geralmente envolve membros
inferiores. Na África, a doença é conhecida como úlcera de Buruli e na Austrália, é
chamada de úlcera de Bairnsdale. Tipicamente, a doença aparece como um nódulo
subcutâneo indolor no local do traumatismo prévio. Após poucas semanas, uma
úlcera pouco profunda se desenvolve no lugar do nódulo. As lesões podem tornar-se
necróticas e se estenderem para o tecido subcutâneo. Também podem aparecer
nódulos satélites que podem ulcerar (NOLTE; METCHOCK, 1995).
• M. haemophilum
As raras infecções associadas com M. haemophilum ocorrem principalmente
me paciente imunocomprometidos. Foram relatados casos em pacientes com
doença de Hodgkin e AIDS. Linfadenite submandibular, nódulos subcutâneos,
edema dolorosos e úlceras que podem progredir para abscessos e fístulas são
freqüentemente as manifestações clínicas (VOSSLER, 2000).
62
• M. abscessus
Este organismo causa doença pulmonar crônica, infecções de ferida pós-
traumática localizada, infecção de ferida cirúrgica, infecção de cateter e otite média
crônica. Em pacientes imunossupremidos causa infecção de pele disseminada e
infecções de cateter (BROWN-ELLIOTT; WALLACE JUNIOR, 2002). É encontrado
em água de torneira e freqüentemente isoado de pacientes com fibrose cística
(RIDOM, 2006).
3.2 HANSENÍASE
3.2.1 História
Conforme OPROMOLLA (2000), muito já se escreveu sobre a origem e
existência da hanseníase em várias regiões da antigüidade. Observa-se, contudo,
que muitos desses escritos são citações de fontes descrevendo a moléstia sem seus
aspectos mais característicos que são as deformidades provocadas e sinais de
comprometimento neurológico ou dermato-neurológico como manchas ou áreas
cutâneas com distúrbios de sensibilidade, e vários deles são traduções errôneas de
termos designando diferentes moléstias.
Apesar disso, há referências com relação à hanseníase em livros muito
antigos. Ao que parece, essa doença já era conhecida na Índia em 1500 a.C. (antes
de Cristo), e no Regveda Samhita (um dos primeiros Vedas que eram os livros
sagrados da Índia), a hanseníase é denominada Kushta apresentando dois tipos de
manifestações, um que era a anestesia local e deformações nas extremidades e
outro caracterizado por ulcerações, queda de dedos e desabamento da pirâmide
nasal. Em 600 a.C., em uma recompilação denominada Sushruta Samhita, esses
dois tipos são referidos como vatratka e vat-somhita, respectivamente.
Há a possibilidade da hanseníase ter se originado na Índia e de lá ter
seguido para o leste, gerando focos no Sudeste asiático, China e Japão. Há,
contudo, na China, referências muito antigas sobre essa doença, como aquela feita
em um dos tratados médicos chineses mais antigos, o Nei Ching Su Wen, atribuído
63
ao imperador Huang Ti. Esse tratado é uma recompilação de antigos textos
realizada em 600 a.C., e nele é usado o termo “li-feng” para designar paralisia grave,
e descrito um estado mórbido “ta-feng” que provoca queda de sobrancelhas,
nódulos, ulceração, dormência, mudança de cor de pele e desabamento do nariz.
Diz-se também que a hanseníase existiu em épocas remotas no Egito, e
que, no “Papiro de Ebers” (18ª Dinastia 1300-1800 a.C.) era citada. Contudo o que
foi traduzido como lepra no referido documento em uma “queixa de caráter externo
para o qual era prescrito um ungüento”. Muitas outras afirmativas da existência da
hanseníase no Egito, naquele tempo, têm como fonte o Papiro de Ebers.
Na Bíblia, o termo “tsraath” (ou saraath), no hebraico, significava uma
condição anormal da pele dos indivíduos, das roupas, ou das casas, que
necessitava purificação. Aqueles que apresentassem o “tsraath” deveriam ser
isolados até que os sinais desta condição desaparecessem.
Segundo o Livro Sagrado, o “tsraath” na pele dos judeus seriam “manchas
brancas deprimidas em que os pêlos também se tornavam brancos”. Na tradução
grega do texto hebraico, a palavra “tsraath” foi traduzida como lepra e “lepros”, em
grego, significa “algo que descama”. A palavra lepra também foi usada pelos gregos
para designar doenças escamosas do tipo da psoríases, e a hanseníase era
chamada de elefantíase.
Autores admitem a possibilidade da hanseníase ter chegado à Ásia Menor e
Grécia através do Império Persa pelo seu contato com o foco da Índia. Heródoto
refere a presença da enfermidade na Pérsia em 500 a.C.
A hanseníase não era conhecida na Europa na época de Hipócrates (467
a.C.). Nos trabalhos do “Pai da Medicina”, não há referência a qualquer condição
que se assemelhasse àquela doença.
Admite-se que foram as tropas de Alexandre, o Grande, quando voltavam à
Europa, que trouxeram soldados contaminados com a doença nas campanhas
realizadas na Índia (300 a.C.). Depois as conquistas romanas se encarregaram de
disseminar a doença para outras regiões européias.
A hanseníase era bem conhecida por volta do ano 150 d.C. (depois de
Cristo), quando se encontram referências sobre ela, feitas por Areteo da Capadocia
e por Galeno. O primeiro autor, no seu trabalho “Terapeuta de Afecções Crônicas”,
64
designa a hanseníase como Elephas ou Elefantíase. Foi ele quem denominou, pela
primeira vez, de “face leonina”, a face infiltrada do paciente com hanseníase
virchoviana.
Na obra chinesa intitulada “Remédios Secretos Completos” o autor Hua To,
nascido em 190 d.C., descreve uma doença que provoca perda de sensibilidade, na
qual aparecem manchas vermelhas que incham e depois se ulceram ocorrendo em
seguida queda de sobrancelhas, cegueira, deformidades dos lábios, rouquidão,
ulceração nas plantas dos pés, achatamento do nariz e deslocamento de
articulações. Também na China, Ko Hung escreve que os primeiros sintomas do “lai
ping” são dormência da pele e sensação de vermes andando.
A hanseníase continuou sua disseminação pela Europa depois da queda do
Império Romano e o início da Idade Média. Atingiu o seu máximo, naquele
continente, entre os anos 1000 e 1300 que coincide com o período das Cruzadas.
Foram oito as Cruzadas e a última foi conduzida por São Luís, rei da França, em
1270, que culminou com a expulsão dos cristãos do Oriente Médio e do norte da
África, e que deu origem ao retorno para o continente europeu de muitos soldados,
aventureiros, comerciantes e entre eles doentes de hanseníase.
A hanseníase era designada como lepra, como também assim eram
denominadas todas as doenças que se supunham ser idênticas ou ter alguma
relação com ela. Outras condições como a miséria tinham a mesma conotação. O
termo lepra absorveu, então, outras designações da doença como a elefantíase,
assim como incorporou a designação de outras doenças.
A elefantíase dos gregos, por exemplo, se tratava hoje de hanseníase e os
árabes empregavam a denominação “dal fil” (doença do elefante) para a doença que
hoje se conhece como elefantíase (filariose). Então, duas entidades nosológicas
diferentes ficaram com o mesmo nome: elefantíase dos árabes e elefantíase dos
gregos.
Os árabes, por outro lado, conheciam a elefantíase dos gregos e a
denominavam com os nomes de “judam”, “juzam”, “alzuzam”, e “dsjuddam”. Esses
termos foram traduzidos pelos autores europeus como lepra, que era empregado
pelos médicos gregos, para designar muitas afecções escamosas que não tinham
relação com a elefantíase dos gregos ou com elefantíase dos árabes. Foi assim que
65
os termos elefantíase grega e lepra árabe se tornavam sinônimos. Também se
tornaram sinônimos de lepra, a “leuke” (vitiligo), a morféia e a pelagra.
Os médicos antigos não tinham uma idéia exata das doenças cutâneas.
Alguns colocavam na mesma categoria o líquem, a psora (psoríase) e a lepra, ou a
gale (sarna), o impetigo e a lepra, de maneira que eles viam cada uma dessas
afecções como graus sucessivamente mais altos de uma mesma entidade mórbida.
Chegavam a considerar a elefantíase como grau mais alto de lepra.
Além disso, o diagnóstico da doença era feito de maneira imprópria. A lei de
Strasbourg, por exemplo, exigia que quatro pessoas fossem designadas para
examinar e diagnosticar um portador de lepra. No fim do século XV, exigia-se que
entre as quatro pessoas houvesse um médico, um cirurgião e dois barbeiros. Eles
tinham que realizar os testes de urina e do sangue nos pacientes.
Durante os anos 1100 e mesmo depois houve um grande surto de simpatia e
piedade pelos “leprosos”, encorajado pela Igreja. Esta ensinava que essas pessoas
infelizes eram os pobres de Cristo. Datam desse período San Martin e Isabel da
Hungria (1207-1231). Ela era casada com o Landgrave Luis de Turingia e fundou
numerosos edifícios para isolamento desses pacientes que eram administrados por
ordens religiosas e, foi canonizada em 1235 como santa padroeira dos doentes de
lepra.
Como resultado dessa devoção, os lazaretos foram fundados em todos os
lugares, destinados aos doentes de lepra, entre os quais existiam tanto doentes de
hanseníase, como aqueles portadores de outras doenças cutâneas e mesmos
indivíduos sãos, como mendigos.
O número de doentes na Europa diminui a partir do século XVI. Uma das
causas poderia ter sido a melhoria das condições de vida, e outra é que o
“complexo” lepra foi se esvaziando porque as doenças cutâneas foram sendo melhor
estudadas e foram recebendo os seus nomes definitivos.
Nas Américas, a hanseníase deve ter chegado com os colonizadores entre
os séculos XVI e XVII. Nos Estados Unidos, foram os franceses, que deram origem
ao estado de Louisiana, os que provavelmente trouxeram a hanseníase; na América
do Sul, a doença teria sido trazida pelos colonos espanhóis e portugueses.
66
No Brasil, os primeiros documentos que atestavam a existência da
hanseníase datam do fim do século XVII, tanto que, em 1696, o governador Artur de
Sá e Menezes procurava dar assistência no Rio de Janeiro, aos “míseros leprosos”,
já então em número apreciável.
De acordo com ANDRADE (1996), no ano de 1741, dois médicos na côrte
redigiram a primeiro regulamento para combater a lepra no Brasil. A hanseníase foi
considerada uma doença contagiosa e, como medida de controle, se estabeleceu o
isolamento dos doentes. Esse isolamento deveria ser efetuado em asilos especiais
segundo o sexo e as condições sociais. A partir da instituição desse regulamento,
inicia-se a construção de asilos para lázaros. No período Colonial fundaram-se
hospitais no Rio de Janeiro (1741), em São Paulo (1799) e na Bahia (1784). O
primeiro hospital asilo foi edificado no Maranhão em 1833, na cidade de São Luís,
durante o império. As principais recomendações do primeiro Congresso
Internacional de Lepra, realizado em 1897 na cidade de Berlim, foram o isolamento
compulsório, a notificação obrigatória dos casos e a vigilância dos contatos. Em
1912, propõe-se que o isolamento fosse feito em asilos-colônias.
Segundo OPROMOLLA (2000), em 1952, a Organização Mundial de Saúde
(OMS) havia enviado ao Brasil uma Comissão que recomendou, em benefício da
doença, que colocasse fim aos isolamento compulsório como outros países haviam
feito. Nesse ano, foi realizada a IIIª Reunião dos Leprólogos Brasileiros na cidade de
Três Corações, em Minas Gerais, onde se reconheceu a importância da sulfona
como uma arma profilática tendo como conseqüência o fato do doente tratado com
esse medicamento deixar de ser transmissor da doença, podendo, portanto,
conviver normalmente em sociedade. Em 1956, por ocasião da IV Reunião dos
Leprólogos Brasileiros, foi recomendado o fim do isolamento compulsório, e que o
isolamento do doente se restringisse a casos de caráter médico-social ou se
houvesse conveniência profilática. Nesse mesmo ano, houve em Belo Horizonte um
Seminário de Leprologia promovido pela Organização Pan-Americana da Saúde e
pelo Ministério da Saúde cujas conclusões foram que o isolacionismo se
apresentava como “inútil para a profilaxia, injusto para o doente, desintegrador de
lares, estigmatizante, auxiliar de preconceitos, mantenedor de superstições, e, tudo
isso, “as custas de elevadas despesas que poderiam ser aplicadas em técnicas mais
67
racionais e eficazes”. No ano seguinte, na Vª Reunião dos Leprólogos Brasileiros, na
cidade de Cambuquira em Minas Gerais, Orestes Diniz provou que o ônus financeiro
do modelo isolacionista o tornava inexeqüível para o país e que, do ponto de vista
epidemiológico, havia se demonstrado ineficiente, visto a impossibilidade real de
internamento de todos os doentes contagiosos e a impossibilidade de controle de
todos os comunicantes (pessoas que convivem com os doentes).
Em 1955, o Serviço Nacional de Lepra implantou no Rio de Janeiro um
projeto piloto visando observar os resultados do tratamento domiciliar de todos os
doentes, a vigilância dos comunicantes, e não mais o isolamento compulsório. Com
os resultados obtidos desse projeto, as recomendações do Congresso de Madri em
1953, e o apoio do Governo que estava se instalando, teve início a chamada
“Moderna Campanha Nacional contra a Lepra” com a finalidade de estender para
todo o país um programa baseado no projeto do Rio de Janeiro.
A lei federal número 610 que instituiu o isolamento, contudo, continuava
vigente e o Serviço Nacional de Lepra procurou meios para tentar revoga-la. Em
1962, o então Primeiro Ministro Tancredo Neves instituiu o Decreto Federal nº 968
de 07/05/1962, que apesar de não revogar a lei 610, liberava o doente e acabava
com o isolamento.
No VIIº Congresso Internacional de Leprologia realizado no Rio de Janeiro
em 1963, foram apresentados muitos trabalhos atestando os resultados ineficazes
da política isolacionista e os bons resultados do tratamento ambulatorial dos
pacientes.
Em 1970, o Professor Abrão Rotberg conseguiu modificar oficialmente, no
Brasil, a designação da doença substituindo o termo “lepra” por “hanseníase”, com o
intuito de auxiliar no processo de sua desestigmatização (OPROMOLLA, 2000). Em
1975, o Ministério da Saúde adotou o termo “hanseníase” pelo Decreto nº 76.078, de
04/08/1975 do Governo Geisel. Em 29 de março de 1995, por intermédio de Lei
Federal nº 9.010, tornou-se obrigatório o uso da terminologia hanseníase em
substituição ao “termo” lepra (OPROMOLLA; MARTELLI, 2005).
Hoje, com o auxílio de medidas terapêuticas eficazes, no Brasil está
realizando um trabalho coordenado e intenso para controlar a hanseníase em seu
território, fazendo com que o Brasil irmanado a outras nações e sob amparo da
68
Organização Mundial da Saúde consiga atingir a meta de eliminar a doença como
um problema de saúde pública, ou seja, um doente por 10.000 habitantes
(OPROMOLLA, 2000).
3.2.2 Etiologia
O agente etiológico da hanseníase – o Mycobacterium leprae – foi
descoberto pelo médico norueguês Gerhard Armauer Hansen, em 1873 (HANSEN,
1955).
Morfologia celular: o M. leprae é um bastonete imóvel, não formador de
esporos, microaerófilo, ácido-resistente, reto ou levemente curvado (SCOLLARD et
al, 2006). Estudos concluíram que sua parede celular é um complexo
covalentemente ligado de peptidioglicana-arabinogalactana-ácido micólico
semelhante na composição a parede celular de todas as micobactérias (figura 3).
A parede celular contém peptidioglicano, composto de cadeias alternantes
de N-acetilglucosamina e N-glicolilmuramato ligadas por pontes peptídicas, o qual é
ligado a camada galactana pela arabinogalactana. Três cadeias ramificadas de
arabinose estão por sua vez ligadas a galactana, formando, junto com a camada de
peptidioglicano, uma zona eletro-densa. Os ácidos micólicos estão ligados aos
terminais das cadeias de arabinose para formar o folheto interno da bicamada
pseudolipídica. O folheto externo é composto de ácidos micólicos intercalantes de
monomicolatos de trealose e ácidos micoserosóico de dimicocerosatos de ftiocerol
assim como glicolipídios fenólico (PGLs), formando a zona eletro-transparente
(VISSA; BRENNAN, 2001). Supõe-se que muitas dessas moléculas junto com
manosídeos de fosfatidilinositol e fosfolipídios são liberados da parede celular após
a síntese, formando uma cápsula. O lipídio dominante na parede celular, que
confere ao M. leprae especificidade imunológica é o glicolipídio fenólico 1 (PGL-1)
(SCOLLARD et al., 2006).
69
FIGURA 3 – MODELO ESQUEMÁTICO DA PAREDE CELULAR DO M. leprae
FONTE: Adaptado de VISSA, V. D; BRENNAN, P. J. The genome of Mycobacterium leprae: a minimal
mycobacterial gene set. Genome Biology, v. 2, n. 8, p. 1023.2, aug. 2001.
NOTA: A membrana plasmática é envolvida pela parede celular formada de peptidioglicano
covalentemente ligado a arabinogalactana. Três cadeias ramificadas da arabinana são
ligadas a galactana. Os ácidos micólicos são ligados aos terminais das cadeias arabinana
para formar o folheto interno de uma bicamada pseudolipídica. O folheto externo é formado
por formado pelos ácidos micólicos monomicolato de trealose (TMM) e ácidos micocerosóico
de dimicocerosatos de ftiocerol (PDIMs) e glicolípidios fenólicos (PGLs). A cápsula
presumivelmente composta de PGLs e outras moléculas como PDIMs, monosídeos de
fosfatidilinositol e fosfolipídios envolve a bactéria. Lipoglicanas como monosídeos de
fosfatidilinositol, lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) ancorados na membrana
plasmática, são também encontrados na camada capsular.
Cultivo: M. leprae não é cultivado em meios de cultura artificiais, mas, pode
ser mantido em culturas axênicas, que conferem um estado metabólico estável por
poucas semanas (SCOLLARD et al., 2006). A temperatura ótima de crescimento do
bacilo é de 30ºC (VAN BEERS; WIT; KLATSER, 1996).
Várias espécies de animais já foram inoculadas como M. leprae, entre eles
camundongos e tatus (MADEIRA; ROSA, 2000). SHEPARD (1960) conseguiu
multiplicação muito lenta do M. leprae, inoculado-o no coxim da pata do
camundongo. Em camundongo, o bacilo se divide em 12 a 14 dias (VAN BEERS;
70
WIT; KLATSER, 1996). Grande progresso relativo à transmissão experimental do M.
leprae foi a obtenção de infecção disseminada, descrita por KIRCHHEIMER e
STORRS (1971), com a inoculação de tatus de nove bandas (Dasypus
novemcinctus).
No entanto, a propagação de M. leprae é restrita a modelos animais,
incluindo tatu, e camundongos normais, atímicos ou nocaute. Estes sistemas têm
fornecido recursos básicos para estudos genéticos, metabólicos e antigênicos do
bacilo. O crescimento de M. leprae em coxim plantar de camundongo também
fornece ferramentas para avaliar a viabilidade da bactéria e testar a suscetibilidade a
drogas de isolados clínicos (SCOLLARD et al., 2006).
Genoma: A comparação do genoma de M. leprae com o genoma de M.
tuberculosis sugere que M. leprae sofreu um caso extremo de evolução redutiva. Isto
é refletido pelo menor genoma (3.3 Mb para M. leprae versus 4.4 Mb para M.
tuberculosis) e uma maior redução no conteúdo G + C (57,8% para M. leprae versus
65,6% para M. tuberculosis) (tabela 6). 49,5% do genoma de M. leprae corresponde
a genes codificantes para proteínas, enquanto, 27% são formados por pseudogenes
reconhecíveis. Os restantes 23,5% do genoma parece não ser codificante e pode
corresponder a seqüências regulatórias ou genes residuais mutados a ponto de se
tornarem irreconhecíveis (COLE et al., 2001).
TABELA 6 – GENÔMICA COMPARATIVA DE M. leprae e M. tuberculosis
PARÂMETRO M. leprae M. tuberculosis
Tamanho do genoma (pb) 3.268.203 4.411.532
Nº de genes codificantes para proteínas 1.604 3.959
Nº de pseudogenes 1.116 6
Genes codificantes para proteínas (%) 49,5 90,8
Conteúdo G + C (%) 57,79 65,61
FONTE: COLE, S. T. et al. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature, v. 409, p. 1007, feb.
2001.
A distribuição dos 1.116 pseudogenes é essencialmente aleatória em todo o
genoma. Dos 1.604 genes potencialmente ativos, 1.439 são comuns a ambos os
patógenos. Entre os 165 genes com nenhum ortólogo em M. tuberculosis, para 29
podem ser atribuídas funções. As 136 seqüências codificantes restantes em M.
71
leprae, os quais não mostram nenhuma similarilade com genes conhecidos, podem
representar pseudogenes (COLE et al., 2001).
Na classificação de proteínas em famílias, os maiores grupos funcionais
estão envolvidos no metabolismo e modificação de ácidos graxos e policetídeos,
transporte de metabólitos, síntese do envelope celular e regulação gênica. A
evolução redutiva, decaimento de genes e redução do genoma eliminaram vias
metabólicas junto com seus circuitos regulatórios e funções acessórias,
particularmente aquelas envolvidas no catabolismo (EIGLMEIER et al., 2001).
Estas observações ímpares do genoma de M. leprae podem ajudar a
explicar características marcantes do bacilo, tais como o fato de ser um parasita
intracelular obrigatório, seu longo tempo de duplicação e sua incapacidade de cultivo
in vito (COLE et al., 2001).
3.2.3 Epidemiologia
3.2.3.1 Distribuição geográfica
A hanseníase é um problema de saúde pública, ou seja, sua taxa de
prevalência é maior que 1 em 10.000 habitantes, em quatro países da África, um
país do Sudeste Asiático e um país da América Latina. Estes países são: Repúpblica
Democrática do Congo, Madagascar, Moçambique, Tanzânia, Nepal e Brasil (OMS,
2006). Ver figura 4 e tabela 7.
72
FIGURA 4 – TAXA DE PREVALÊNCIA NO FINAL DE 2005
FONTE: OMS. Leprosy: prevalence rates at end 2005. Disponível em:
http://who.int.lep/situation/PrateEnd2005v2-WM2.pdf Acesso em: 01 nov. 2006.
TABELA 7 – PAÍSES QUE AINDA NÃO ATINGIRAM A META DE ELIMINAÇÃO
PREVALÊNCIA REGISTRADA Nº DE NOVOS CASOS DETECTADOS
PAÍS
Início de
2004
Início de
2005
Início de
2006
Durante
2003
Durante
2004
Durante
2005
Brasil 79.908
(4.6)
30.693
(1.7)
27.313
(1.5)
49.206
(28.6)
49.384
(26.9)
38.410
(20.6)
Repúplica
Democrática
do Congo
6.891
(1.3)
10.530
(1.9)
9.785
(1.7)
7.165
(13.5)
11.781
(21.1)
10.737
(18.7)
Madagascar 5.514
(3.4)
4.610
(2.5)
2.094
(1.1)
5.104
(31.1)
3.710
(20.5)
2.709
(14.6)
Moçambique 6.810
(3.4)
4.692
(2.4)
4.889
(2.5)
5.907
(29.4)
4.266
(22.0)
5.371
(27.1)
Nepal 7.549
(3.1)
4.699
(1.8)
4.921
(1.8)
8.046
(32.9)
6.958
(26.2)
6.150
(22.7)
Tanzânia 5.420
(1.6)
4.777
(1.3)
4.190
(1.1)
5.279
(15.4)
5.190
(13.8)
4.237
(11.1)
Total 112.092
60.001
53.192
80.707
81.289
67.614
FONTE: WHO. Global leprosy situation, 2006. Weekly Epidemiological Record, Geneva, v. 81. n.
32, p. 313, aug. 2006.
NOTAS: Taxa de prevalência é mostrada entre parênteses (número de casos em 10.000 habitantes).
Taxa de detecção é mostrada entre parênteses (numero de casos em 100.000 habitantes).
73
Em 2005, além destes seis países, a haneníase era um problema de saúde
pública, em Angola, Repúplica Centro Africana e Índia (OMS, 2005).
A redução significante relatada na prevalência registrada no Brasil de 2004 a
2005 é resultado da atualização do registro de pacientes e padronização de
definições de caso (OMS, 2005).
A tabela 8 mostra as taxas de prevalência e detecção por região no Brasil no
ano de 2005. As regiões com maiores taxas são Norte, Nordeste e Centro-Oeste.
TABELA 8 – TAXAS DE PREVALECIA E DETECÇÃO DA HANSENÍASE NO
BRASIL EM 2005 POR REGIÃO
REGIÃO
TAXA DE
PREVALÊNCIA
PARÂMETRO
TAXA DE
DETECÇÃO
PARÂMETRO
Norte 4,02
Médio
5,63
Hiperendêmico
Nordeste 2,14
Médio
3,07
Muito alto
Sudeste 0,60
Baixo
0,88
Médio
Sul 0,53
Baixo
0,69
Médio
Centro-Oeste 3,30
Médio
4,41
Hiperendêmico
Brasil 1,48
Médio
2,09
Muito alto
FONTE: MINISTÉRIO DA SAÚDE. Plano nacional de eliminação da hanseníase em nível
municipal 2006-2010. Brasília: Programa Nacional de Eliminação da Hanseníase, 2006.
A prevalência global registrada no início de 2006 foi de 219.826 casos e o
número de novos casos relatados durante 2005 foi de 296.499. A detecção global de
novos casos continua mostrar um declínio acentuado: o número de novos casos
relatados diminuiu mais que 110.000 casos (27%) durante 2005 comparado com o
número de novos casos durante 2004 (OMS, 2006) (tabela 9).
74
TABELA 9 – TENDÊNCIAS NA DETECÇÃO DE NOVOS CASOS ENTRE 2001-
2005, POR REGIÃO
Nº DE NOVOS CASOS DETECTADOS DURANTE O ANO
REGIÃO
2001 2002 2003 2004 2005
África 39.612
48.248
47.006
46.918
42.814
América 42.830
39.939
52.435
52.662
41.780
Sudeste da
Ásia
668.658
520.632
405.147
298.603
201.635
Mediterrâneo
Ocidental
4.758
4.665
3.940
3.392
3.133
Pacífico
Ocidental
7.404
7.154
6.190
6.216
7.137
TOTAL 763.262
620.638
514.718
407.791
296.499
FONTE: WHO. Global leprosy situation, 2006. Weekly Epidemiological Record, Geneva, v. 81. n.
32, p. 313, aug. 2006.
A modelagem matemática do declínio potencial na incidência e prevalência
da hanseníase sugere que a doença permanecerá um grande problema de saúde
pública por várias décadas (SCOLLARD et al., 2006).
3.2.3.2 Transmissão
O mecanismo preciso da transmissão do M. leprae é desconhecido
(SCOLLARD et al., 20006). A principal via de eliminação do bacilo pelo doente de
hanseníase e a provável via de entrada do bacilo no organismo é a via respiratória
(particularmente o nariz). A pele é também uma possível porta de entrada e saída do
bacilo. Os pacientes com hanseníase lepromatosa não tratados podem eliminar
grande número de bactérias de suas úlceras ou pele injuriada. Porém, é possível
que a pele seja uma porta de entrada apenas em inoculações acidentais e não há
evidências que M. leprae pode penetrar em pele íntegra (VAN BEERS; WIT;
KLATSER, 1996). Há outra possibilidade, como a transmissão através de insetos.
Indivíduos que estão em contato direto com paciente de hanseníase têm grande
chance de adquirir a doença. Geralmente, o contato direto está relacionado à dose
de infecção que por sua vez está relacionada à ocorrência da doença. Das várias
situações que promovem contato entre indivíduos doentes e sadios o domiciliar é o
mais facilmente identificado (OMS, 2006).
75
Os únicos reservatórios naturais conhecidos do bacilo são o homem e o tatu,
apesar do relato de animais selvagens naturalmente infectados como o chimpanzé
(DONHAM; LEININGER, 1977) e macaco sooty mangabey (MEYERS; GORMUS;
WALSH, 1992).
Os pacientes multibacilares, que abrigam um grande número de bacilos, são
a principal fonte de infecção da doença. A hanseníase pode atingir pessoas de todas
as idades e de ambos os sexos. O período de incubação para o desenvolvimento de
hanseníase, apesar de sugerido por diversos autores, é desconhecido, e pode variar
de meses a 30 anos (GODAL, 1978; VAN BEERS, WIT, KLATSER, 1996; BRITTON,
LOCKWOOD, 2004). Fatores ambientais e associados ao hospedeiro são envolvidos
no desenvolvimento da hanseníase, como contatos domiciliares, fatores genéticos
(ver 3.2.4), fatores socioeconômicos e vacinação BCG (VAN BEERS; WIT;
KLATSER, 1996). Evidências indicam que imunosupressão terapêutica extensa
confere aos indivíduos alta suscetibilidade a infecção com M. leprae, mas que em
indivíduos HIV positivos há resposta do hospedeiro ao M. leprae comparável àquela
de indivíduos não HIV infectados, mesmo quando a infecção com HIV progride e o
número de células CD4
+
circulantes diminui. A experiência com terapia antiretroviral
altamente ativa sugere que em áreas endêmicas de hanseníase, a infecção
subclínica e infecção clínica inicial com M. leprae pode ser mais predominante entre
indivíduos HIV positivos do que geralmente é reconhecido. Além disso, parece que a
restauração da função imune após terapia antiretroviral altamente ativa pode ser
associada com o desenvolvimento de reações tipo 1 (SCOLLARD et al., 2006).
3.2.4 Genética da Suscetibilidade do Hospedeiro à Hanseníase
Na maioria das doenças infecciosas apenas uma proporção dos indivíduos
expostos a um patógeno tornam-se infectados e desenvolvem clinicamente doença.
Ao menos em parte, esta variabilidade interindividual é determinada pelo efeito
combinado de proteínas do hospedeiro codificadas por uma série de genes que
controlam a quantidade e qualidade da interação parasira-hospedeiro e a
conseqüente resposta imune. A identificação dos mais importantes genes de
suscetibilidade/resistência do hospedeiro permitirá um melhor entendimento da
76
patogênese das doenças infecciosas e provavelmente facilitarão o desenvolvimento
de novas estratégias terapêuticas.
Várias estratégias podem ser usadas para mapear e identificar genes de
suscetibilidade a doenças infecciosas do hospedeiro. Três dos mais usados são:
modelos experimentais animais, estudo de genes candidatos e varreduras
genômicas (MARQUET; SCHURR, 2001).
Entre os genes ou regiões cromossômicas implicadas na modulação da
suscetibilidade do hospedeiro à hanseníase estão:
HLA (Human Leukocyte Antigen): VAN EDEN et al. (1980) observaram
uma herança preferencial significante de variantes HLA-DR2 entre irmãos afetados
com hanseníase tuberculóide, mas não entre irmãos saudáveis ou afetados com
hanseníase lepromatosa. Outros autores como IZUMI et al. (1982) associaram
variantes HLA-DR2 com hanseníase tuberculóide e lepromatosa. KIM et al. (1987)
detectaram os antígenos HLA-DR1, DR2, DRw9 e DQw1 em freqüência maior nos
pacientes de hanseníase lepromatosa e tuberculóide que no grupo controle. TODD,
WEST e McDONALD (1990) encontraram que os antígenos HLA-DR2 e DQwI
estavam associados com ambas as formas lepromatosa e tuberculóide da
hanseníase. VAN EDEN et al. (1985) observaram que HDL-DR3 foi herdado
preferencialmente por crianças com hanseníase tuberculóide em vez de hanseníase
lepromatosa e que a suscetibilidade a hanseníase per se é provavelmente não
controlada por genes ligados ao HLA.
TAP (Transporter Associated with Antigen Processing): RAJALINGAM,
SINGAL e MEHRA (1997) associaram alelos do gene do TAP2-B com a hanseníase
tuberculóide em um estudo aplicado a uma população do norte da Índia.
TNF (Tumor Necrosis Factor): ROY et al. (1997) relataram uma alta
frequência do alelo TNF2 em pacientes com hanseníase lepromatosa na Índia.
NRAMP1 (Natural Resistance Associated Macrophage Protein 1): ABEL
et al. (1998) realizaram um estudo em 168 pacientes de 20 famílias do Sudoeste
Asiático e verificaram significante ligação entre a hanseníase per se e haplótipos de
marcadores intragênicos ao gene NRAMP1.
VDR (Vitamin D Receptor): A análise de polimorfismo TaqI na região 3’ do
gene VDR mostrou que a distribuição dos genótipos entre os grupos controle,
77
lepromatoso e tuberculóide foram diferentes. Na hanseníase tuberculóide o genótipo
tt foi encontrado em freqüência significativamente mais alta que no grupo controle.
Em contraste, o genótipo TT foi encontrado em freqüência maior no grupo com
hanseníase lepromatosa comparado com o grupo controle. Os heterozigotos do
genótipo Tt foram encontrados em menor frequência em ambos os tipos de
hanseníase do que no grupo controle (ROY et al., 1999).
Cromossomo 10p13: SIDDIQUI et al. (2001) identificaram uma região em
ligação com suscetibilidade à hanseníase no cromossomo 10 em uma população do
sul da Índia. Segundo SCOLLARD et al. (2006) a maioria dos pacientes nestas
famílias tinha hanseníase tuberculóide (paucibacilar) e não está claro se o lócus que
foi identificado está associado à hanseníase per se ou apenas à hanseníase
tuberculóide. Neste contexto, MIRA et al. (2003), estudanto uma população
vietnamita, confirmaram que o lócus no cromossomo 10p13 está envolvido apenas
na hanseníase paucibacilar.
Cromossomo 20p12: TOSH et al. (2002) identificaram uma região de
ligação no cromossomo 20 (20p12) como um lócus de suscetibilidade em uma
população recrutada em Tamil Nadu, região do Sul da Índia. Porém, esta região do
cromossomo não pareceu ser ligada entre as famílias de Andhra Pradish, outra
região do Sul da Índia.
Cromossomo 6q25: MIRA et al. (2003) identificaram forte evidência de
ligação entre hanseníase per se (hanseníase independente de apresentações
clínicas específicas) e a região cromossômica 6q25-q27 em um painel de 86 famílias
afetadas com hanseníase do Vietnam do Sul.
PARK2/PACRG: Utilizando análise de ligação baseada em famílias, MIRA et
al. (2004) investigaram mais além a região do cromossomo 6q25-26, previamente
ligada a suscetibilidade à hanseníase (MIRA et al., 2003) e indentificaram variações
dos genes PACRG e PARK2 associadas com um risco maior de hanseníase.
Inicialmente a análise foi aplicada a 197 famíias vietnamitas independentes; em
seguida, os resultados foram replicados em uma segunda amostra caso-controle de
975 indivíduos do Brasil (587 pacientes com hanseníase e 388 controles).
78
3.2.5 Reação de Mitsuda
A mitsudina, nome adotado no Brasil para a lepromina, é uma suspensão
esterilizada de M. leprae mortos pelo calor, extraídos mecanicamente de
hansenomas de pacientes virchowianos ou de tecidos de tatu infectados por M.
leprae. Quando a mitsudina é obtida de hansenomas, ela é denomidada mitsudina
H, para indicar a origem humana. No caso de ser extraída de tecidos de tatu, ela é
denomidada mitsudina A. A denominação mitsudina foi adotada no Brasil para
homenagear Kensuke Mitsuda, o primeiro a relatar, na III Conferência Internacional
de Hanseníase, realizada em 1923, em Estrasburgo, os resultados das experiências
em larga escala como a suspensão de M. leprae, que ele vinha fazendo.
Atulamente, a preparação da mitsudina obedece às normas de padronização
e segurança recomendadas pela OMS para a escolha e processamento de tecidos
utilizados para a extração dos bacilos, testes de esterilidades, inocuidade,
reatividade cutânea, conteúdo total de proteína, conteúdo total de fenol e contagem
de bacilos cuja concentração deve variar entre 40 a 160 milhões por mililitro
(BEIGUELMAN, 2002).
A injeção intradérmica na face anteior do antebraço de mitsudina pode
provocar uma reação precoce, que é lida entre 24 a 72 horas após a inoculação
desta supensão, conhecida como reação de Fernandez, e uma reação tardia,
realizada entre 21º e 28º dias após a inoculação, que é denomidada reação de
Mitsuda. Esta reação é expressa em milímetros, tomando-se a média das medidas
longitudinal e transversal da induração, e é considerada positiva quando ultrapassa
5 mm (TOMIMORI-YAMASHITA et al., 1996.)
A reação de Mitsuda não é útil para o diagnóstico da hanseníase, pois 90%
das pessoas adultas sadias são Mitsuda-positivo (SCHNITZLER, 1991). A reação de
Mitsuda é utilizada para a classificação da hanseníase e avaliação da resposta
imune ao M. leprae (OPAS, 1983). A reação de Mitsuda positiva está associada à
forma tuberculóide, e a reação negativa, à forma lepromatosa da doença.
(OPRAMOLLA, 2000). Na forma tuberculóide (TT) há uma vigorosa resposta celular,
enquanto a forma lepromatosa (LL) está associada a uma potente resposta humoral.
Nos pacientes borderline, borderline-tuberculóide (BT), borderline-borderline (BB) e
79
borderline-lepromatoso (BL), a progressiva redução da resposta imune mediada por
células é acompanhada por aumento da carga bacilar e dos níveis de anticorpos
(figura 5) (GOULART; PENNA; CUNHA, 2002).
FIGURA 5 – ESPECTRO CLÍNICO DA HANSENÍASE
FONTE: Adaptado de GOULART, I. M. B.; PENNA, G. O.; CUNHA, G. Imunopatologia da hanseníase:
a complexidade dos mecanismos da resposta imune do hospedeiro ao Mycobacterium
leprae. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 35, n. 4, p. 367, jul./ago.
2002.
NOTAS: A imunidade celular (IC) medida pelo teste de Mitsuda é inversamente proporcional à carga
bacilar, medida pelo índice baciloscópico (IB).
TT: forma tuberculóide; LL: forma lepromatosa; BT, BB, BL: grupo borderline.
As células T que produzem interleucina 2 (IL-2) e interferon γ (IFN-γ) são
chamadas Th1 e aumentam a imunidade mediada por células. IFN-γ ativa
macrófagos e IL-2 estimula o crescimento de células T antígeno-específicas,
resultando em uma doença mais localizada, que pode evoluir para a cura (pólo
tuberculóide). Células T que produzem IL-4, IL-5 e IL-10 são chamadas Th2, e
aumentam a resposta humoral. IL-4 estimula a produção de IgE e ambas, IL-4 e IL-
10 estimulam células B e inibem a ativação de macrófagos resultanto em infecção
progressiva (pólo lepromatoso).
Análise de clones de células T derivadas de lesões de pacientes com
hanseníase tem revelado que diferentes padrões de citocinas encontradas em
lesões cutâneas são produzidas por subclasses de CD4
+
e CD8
+
predominantes
nestas lesões. Clones CD4
+
de pacientes TT produzem altos níveis de IFN-γ, IL-2 e
níveis indetectáveis de IL-4. Esses clones, que também são deficientes na atividade
80
helper para a formação de anticorpo, foram designados como células T CD4
+
tipo 1,
favorecedores da imunidade mediada por células. Clones de CD8
+
derivadas de
lesões LL, produzem altos níveis de IL-4 in vitro e baixos níveis de IFN-γ.
Considerando o padrão de secreção de citocinas dessas células T-supressoras,
particularmente de IL-4 estes clones de células foram designados como células T
CD8
+
tipo 2, contribuindo para o aumento da produção de anticorpos (GOULART;
PENNA; CUNHA, 2002).
3.2.6 Sinais e Sintomas
A hanseníase manifesta-se através de sinais e sintomas
dermatoneurológicos que podem levar à suspeição e ao diagnóstico clínico da
doença. A doença, geralmente, manifesta-se através de lesões de pele com
diminuição ou ausência de sensibilidade. As lesões mais comuns são: manchas
esbranquiçadas ou avermelhadas, pápulas, infiltrações, tubérculos e nódulos.
A alteração da sensibilidade é causada pelo acometimento de ramos
sensitivos cutâneos. A sensibilidade nas lesões pode ser diminuída (hipoestesia), ou
ausente (anestesia). Na fase inicial da lesão, porém, pode haver um aumento da
sensibilidade (hiperestesia) acompanhada de uma sensação de formigamento.
A hanseníase manifesta-se, não apenas através de lesões de pele, mas,
principalmente, através de lesões nos troncos nervosos periféricos. Essas lesões
são decorrentes de processos inflamatórios dos nervos periféricos (neurites),
causados tanto pela ação direta do bacilo nos nervos, como pela reação do
organismo ao bacilo (reações hansênicas). Elas se manifestam através de dor e/ou
espessamento dos nervos periféricos; diminuição e/ou perda de sensibilidade nas
áreas inervadas por esses nervos, principalmente nos olhos, mãos e pés; diminuição
e/ou perda de força nos músculos inervados por esses nervos, principalmente
pálpebras e nos membros superiores e inferiores.
Em alguns casos de neurite, ocorre espessamento de nervos periféricos,
alteração de sensibilidade e alterações motoras sem sintomas agudos de dor.
A ação do bacilo nos nervos periféricos causa incapacidades, tais como
mãos e pés insensíveis, que possibilitam a ocorrência de queimaduras, ferimentos,
81
úlceras, fissuras, etc., predispondo à infecções que podem destruir as estruturas da
pele, dos músculos, dos ossos e provocar deformidades (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2004).
3.2.7 Classificação
A classificação de Madri (1953) dividide a hanseníase em: tuberculóide (T),
lepromatosa (L), indeterminada (I) e em borderline ou dimorfa (B). Os quatro critérios
que definem a classificação da doença, nesta ordem, são:
1. Clínico: compreende a morfologia das lesões de pele e manifestações
neurológicas.
2. Bacterilógicos: envolve o exame de esfregaços de lesões de pele e
mucosa nasal.
3. Imunológico: reação à lepromina.
4. Histopatológico: aspectos histopatológicos das lesões
(INTERNATIONAL CONGRESS LEPROLOGY, 6., 1953).
As formas clínicas da hanseníase, na classificação de Madri (1953),
considerando-se aspectos bacteriológicos e resposta à intradermorreação de
Mitsuda, estão relacionados na tabela 10.
TABELA 10 - FORMAS CLÍNICAS DA HANSENÍASE RELACIONADAS COM
BACILOSCOPIA E REAÇÃO DE MITSUDA, SEGUNDO A
CLASSIFICAÇÃO DE MADRI
Indeterminada
(I)
Tuberculóide
(T)
Bordeline
(B)
Lepromatosa
(L)
Reação de Mitsuda
Positiva ou
negativa
Fortemente
positiva
Negativa a
positiva fraca
Negativa
Baciloscopia Negativa Negativa
Positiva a raros
bacilos
Positiva
FONTE: Adaptado de SOUZA, C. S. Hanseníase: formas clínicas e diagnóstico diferencial. Medicina,
Ribeirão Preto, v. 30, p. 326, jul./set. 1997.
RIDLEY e JOPING (1966) propuseram uma classificação para formas
clínicas da hanseníase, segundo rígidos critérios clínicos, histopatológicos,
imunológicos e bacteriológicos. Segundo estes autores, a hanseníase pode ser
82
classificada em cinco grupos: tuberculóide-tuberculóide (TT), lepromatosa-
lepromatosa (LL), borderline-tuberculóide (BT), borderline-borderline (BB),
borderline-lepromatosa (BL). Pacientes que não se enquadram em nenhum dos
cinco grupos acima são definidos com portadores de hanseníase indeterminada.
Em 1982, o Grupo de Estudos da Organização Mundial da Saúde (OMS)
para quimioterapia em programas de controle recomendou uma classificação para
hanseníase baseada na classificação de Ridley-Jopling e na carga bacteriana em
esfregaços de linfa. Nesta classificação, criada essencialmente para fins
terapêuticos, os pacientes TT e BT com índice bacteriológico (BI) ≤ 2+ foram
classificados como doença paucibacilar e BB, BL e LL com BI > 2+ foram
classificados como doença multibacilar. O IB reflete o número de bacilos ácido-
resistesntes por média dos campos microscópicos imersos em óleo e é expresso em
uma escala semilogarítmica de 0 a 6+.
Em 1988, o Comitê Técnico em Hanseníase da OMS recomendou que
qualquer paciente com esfregaço positivo fosse classificado como doença
multibacilar. Em 1998, este Comitê declarou que os esfregaços não eram essenciais
para dirigir o tratamento e que o número de lesões presentes deveria ser a base
para a classificação. As normas para diagnóstico clínico recomendadas foram:
pacientes que não sofrem de reações e possuem menos de cinco lesões são
classificados como doença paucibacilar (PB) e aqueles com mais de cinco lesões
são classificados como multibacilar (MB) (MOSCHELLA, 2004).
As classificações adotadas para as formas clínicas da hanseníase, a de
Madri, a de Ridley e Jopling e da OMS, podem ser correlacionadas, como mostrado
na tabela 11.
No Brasil, usa-se o termo “virchowiana” para referir-se a hanseníase
lepromatosa ou a hanseníse lepromatosa-lepromatosa, uma homenagem a Virchow,
que descreveu as células espumosas encontrada na hanseníase.
83
TABELA 11 – CORRELAÇÃO ENTRE AS CLASSIFICAÇÕES DE MADRI (1953),
DE RIDLEY E JOPLING (1966) E DA OMS (1982) ADOTADAS
PARA A HANSENÍASE
Madri
Indeterminada
(I)
Tuberculóide
(T)
Borderline
(B)
Lepromatosa
(L)
Ridley e Jopling I TT BT BB
BL LL
OMS Paucibacilares Multibacilares
FONTE: Adaptado de SOUZA, C. S. Hanseníase: formas clínicas e diagnóstico diferencial. Medicina,
Ribeirão Preto, v. 30, p. 326, jul./set. 1997.
NOTA: TT: tubercuóide-tuberculóide; BT: borderline-tuberculóide; BB borderline-bordeline; BL:
borderline-lepromatoso e LL: lepromatoso-lepromatoso.
3.2.8 Manifestações Clínicas e Reações
3.2.8.1 Manifestações clínicas
3.2.8.1.1 Hanseníase indeterminada
Essa forma clínica se caracteriza por áreas circunscritas da pele ou máculas
com distúrbios de sensibilidade e anidrose ou hipoidrose. Pode ocorrer queda de
pêlos no local. Não há comprometimento de troncos nervosos e, por isso, não
ocorrem alterações motoras ou sensitivas que possam causar incapacidades.
As máculas são hipocrômicas ou eritêmato-hipocrômicas e, nestas últimas,
com freqüência, o eritema se localiza apenas na sua periferia (máculas eritêmato
hipocrômicas com eritema marginal).
O seu tamanho varia, havendo lesões minúsculas, de 1 ou 2 cm, e outras
maiores de 4 cm ou mais, e se localizam mais freqüentemente na face, superfície de
extensão dos membros, tronco e nádegas. O número também é variável, havendo
casos com uma única lesão, outros com duas ou três e alguns com um múmero
relativamente grande delas.
A baciloscopia de rotina nesses casos é negativa e o teste de Mitsuda pode
ser positivo ou negativo (OPROMOLLA, 2000).
Do ponto de vista histopatológico, as lesões apresentam alterações de
processo inflamatório crônico inespecífico, constituídas por pequenos infiltrados
linfo-histiocitários perivasculares, perifoliculares, periglandulares e perineurais, com
84
bacilos ausentes ou presentes em pequeno número nos filetes nervosos
(SCHNITZLER, 1991).
Quanto a sua evolução, as manifestações clínicas podem desaparecer
espontaneamente ou evoluir para as outras formas da doença, de acordo com as
características imunológicas do paciente (OPROMOLLA, 2000).
3.2.8.1.2 Hanseníase tuberculóide
As lesões tuberculóides podem ser planas, mas apresentando certa
consistência, ou elevadas formando placas bem individualizadas. As primeiras
caracterizam a variedade macular da hanseníase tuberculóide.
As placas tuberculóides podem ser cheias, isto é, toda a lesão está elevada,
ou apresentam apenas a periferia infiltrada formando um bordo de largura variável.
Esse bordo não é liso, mas constituído por pequenas pápulas que se agrupam e lhe
dão aspecto granitado. O limite das lesões tuberculóides, com a pele normal, é bem
nítido.
Essas lesões apresentam uma cor castanha ou castanho-violácea e, quando
ela é eritêmato-pardacenta, com predomínio do tom eritematoso, provavelmente as
lesões estão sofrendo uma reação tipo 1. Quando existe um área central plana, ela
quase é hipocrômica, mas às vezes parece normal.
As placas tuberculóides podem apresentar formas variáveis. Na maioria das
vezes, são circulares ou anulares, mas podem apresentar aspecto irregular, dito
geográfico. Quando há um número maior de lesões, elas podem confluir formando
lesões circinadas. As placas são de tamanhos diversos e podem ter a dimensão de
uma cabeça de alfinete como acontece na hanseníase nodular da infância, ou serem
numulares, ou aprestarem quatro ou mais centímetros de diâmetro. Há, raramente,
lesões extensas que comprometem parte do tronco ou de segmentos de membros.
As alterações sensitivas são, em geral, bastante pronunciadas nas lesões
tuberculóides, havendo quase sempre anidrose e perda de pêlos. Não é infreqüente
se observar um ramo nervoso emergindo de uma placa tuberculóide caracterizando
as lesões “em raquete de tênis”.
85
Freqüentemente, somente um único nervo está lesado, mas dependendo de
qual está acometido, como o ulnar, por exemplo, ele pode dar origem a
incapacidades graves.
Além das lesões “em raquete”, um outro comprometimento característico do
tipo tuberculóide é chamado “abscesso de nervo”.
A baciloscopia nos casos tuberculóides crônicos é sempre negativa e a
reação de Mitsuda é fortemente positiva com ulceração ou não.
Histopatologicamente esses casos se caracterizam pela formação de granulomas
tuberculóides.
Há uma variedade de casos tuberculóides chamada hanseníase nodular da
infância. Nesta variedade, as lesões ocorrem em crianças na faixa etária de uma a
quatro anos, podendo ocorrer pouco mais tarde. As lesões em geral são pápulas ou
nódulos, pequenas, únicas ou em pequeno número ocorrendo na face e outras
localizações. Elas regridem espontaneamente, ao redor de cinco a seis meses e
deixam no local uma pequena área atrófica. Essas lesões não apresentam bacilos
ou eles são evidenciados em pequeno número. Não há comprometimento de troncos
nervosos e não se consegue evidenciar alterações da sensibilidade ao nível das
lesões. Do ponto de vista imunológico, a reação de Mitsuda é positiva e o subtrato
histopatológico também é constituído por granulomas epitelióides. Essas lesões
nodulares são observadas em crianças filhas de pais com hanseníase virchowiana e
são consideradas raras, talvez pelo fato de não se examinar com freqüência,
crianças nessa faixa etária (OPROMOLLA, 2000).
3.2.8.1.3 Hanseníase virchowiana
As primeiras manifestações do tipo virchowiano são máculas clinicamente
indeterminadas, que progressivamente se tornam lesões virchovianas fracas.
Nas formas indeterminadas que irão evoluir para esse pólo anérgico da
doença, há sempre um número grande de máculas hipocrômicas que confluem
atingindo grandes extensões do tegumento, passando o indivíduo doente a
apresentar uma hipocromia difusa. Antes de confluírem ou de aumentar muito o seu
número, as máculas já passaram por um estágio em que eram clinicamente
86
indeterminadas, mas já apresentavam do ponto de vista histopatológico discretos
infiltrados histiocitários na derme com bacilos que acabam sendo detectados em
esfregaços de rotina. Posteriormente, sobrevem eritema difuso sobre essa
hipocromia e, a seguir, provavelmente pelo aumento do número de bacilos, ocorre o
aparecimento de uma pigmentação que dá à pele um tom ferruginoso.
As lesões, então, se infiltram difusamente e nos locais em que essa
infiltração for mais acentuada podem se formar pápulas, tubérculos, nódulos e
placas que são denominados genericamente de hansenomas (figura 5). Elas
aparecem, em geral, em pequeno número de cada vez, e lentamente podem
aumentar de tamanho.
FIGURA 6 – HANSENOMAS
FONTE: A e B, SCHNITZLER, R. Hanseníase. In: AMARO NETO, V.; BALDY, J. L. da. S. 3. ed. rev.
e amp. Doenças transmissíveis. São Paulo: Sarvier, 1991. p. 460. C, OPROMOLLA, D. V.
A. Noções de hansenologia. Bauru: Centro de Estudos Dr. Reynaldo Quagliato, 2000.
p.124.
Devido à infiltração de áreas pilosas, como supercílios, cílios, região da
barba e outras áreas do tegumento, há queda total ou parcial dos pêlos. A queda de
sobrancelhas e a de cílios é denominada madarose. Os cabelos, na maioria das
vezes, estão aparentemente conservados, mas em várias ocasiões notam-se áreas
semi-alopécicas “em clareira”. O fato dos cabelos permaneceram não significa que o
couro cabeludo não esteja infiltrado pela doença. Pacientes, com a pele da face
muito infiltrada e conservação dos cabelos, diz-se que possuem fácies leonina.
A
B
C
87
Na hanseníase virchowiana não há resistência à disseminação bacilar. Da
mesma forma que a doença se dissemina na pele, o faz também para as mucosas,
ossos, vasos sanguíneos, nervos e algumas vísceras.
A mucosa nasal é comprometida e o indivíduo doente apresenta infiltrações
ao nível do septo cartilaginosos e, às vezes, a presença de hansenomas que tornam
a mucosa congesta dificultando a respiração do paciente e causando epistaxis. Pode
haver perfuração do septo nasal com a deformidade conseqüente.
Há também lesões amigdalianas da mucosa bucal, e o palato mole, palato
duro, pilares e língua podem apresentar infiltrações e hansenomas. As gengivas,
aparentemente, são pouco comprometidas, mas há lesões periodontais. A infiltração
pode se estender à laringe e o paciente apresenta ronquidão e dispinéia nos casos
avançados.
Os ossos e articulações são atingidos com freqüência e costumam ocorrer
osteítes, lesões líticas e comprometimento de sinóvias. Na face, além da destruição
da espinha nasal, pode haver a erosão de outros ossos como o processo alveolar do
maxilar que leva à queda dos incisivos superiores. Em geral, observam-se, do ponto
de vista histológico, bacilos dentro do endotélio dos capilares da derme, mas
também ocorre o comprometimento das grandes veias cutâneas superficiais dos
antebraços e pernas, causando a obstrução desses vasos. Há uma panflebite
virchoviana, com envolvimento de todas as camadas das veias e isto se apresenta
macroscopicamente como cordões endurecidos palpáveis e até visíveis.
O comprometimento neural é discreto, nos casos iniciais, mas, à medida que
a doença vai se agravando, as lesões se tornam mais acentuadas e evidentes.
Os nervos envolvidos no processo são mais freqüentemente o ulnar,
mediano, o fibular e o tibial posterior. Diferente de outras formas clínicas, esse
comprometimento, além de extenso, é pouco intenso.
As vísceras mais freqüentemente atingidas são o fígado, baço, suprarrenais
e testículos. As lesões testiculares causam o aparecimento de ginecomastia e perda
da potência sexual. O globo ocular é outro órgão comumente comprometido,
podendo apresentar lesões na córnea, íris e corpo ciliar. Diminuição da acuidade
visual e, mesmo a cegueira, são conseqüências desse comprometimento,
principalmente quando ocorrem reações no órgão.
88
Os virchowianos são os casos contagiantes e suas lesões albergam grande
quantidade de bacilos. A ausência de uma imunidade específica contra a invasão do
M. leprae é demonstrada pela reação de Mitsuda que é negativa. Histologicamente,
as lesões virchowianas se traduzem por um infiltrado histiocitário rico em bacilos e
pequena quantidade de linfócitos.
Duas variedades de hanseníase virchowiana são referidas mais
particularmente que são a hanseníase históide e a hanseníase de Lúcio.
A variedade históide se manifesta com hansenomas de aspecto queloidiano
e aparecem em casos em que está havendo uma recidiva da moléstia. As lesões
são intensamente bacilíferas e há um grande predomínio de bacilos típicos que
seriam resistentes à terapêutica.
A hanseníase de Lúcio é uma variedade de hanseníase virchowiana que foi
descrita no México e seria característica desse país. Suas lesões são constituídas
por um infiltrado difuso que não altera as feições do paciente, por madarose total
superciliar e ciliar, podendo haver desabamento da pirâmede nasal. Há casos de
hanseníase de Lúcio que se iniciam com infiltração difusa sem passar pela forma
indeterminada (forma primária) e casos que se iniciam passando por essa forma
(forma secundária). Nessa variedade, há comprometimento visceral importante, uma
grande quantidade de bacilos é detectada em suas lesões, e uma característica
marcante desses casos é o aparecimento de um tipo especial de reação aguda
antes do início de qualquer tratamento, denominado de fenômeno de Lúcio. A
hanseníase de Lúcio, com manifestações reacionais é também designada como
“hanseníase manchada de Lúcio”.
3.2.8.1.4 Hanseníase dimorfa
Adotando a nomenclatura dada por Ridley e Jopling, o grupo dimorfo (D) ou
bordeline (B) inclui: BT (ou DT), BL (ou DL ou DV) e BB (ou DD).
Os DT seriam aqueles casos semelhantes aos tuberculóides. Neles as
lesões são maiores, em maior número e, às vezes, podem apresentar algumas das
placas com limites pouco nítidos em toda a lesão ou em parte dela. Alguns autores
consideram como uma característica das lesões DT as lesões satélites que
89
aparecem junto a algumas placas. Alguns autores acham que os tuberculóides
dificilmente comprometem troncos nervosos e acham que só os DT o fazem, e vários
nervos poderiam ser lesados e de maneira assimétrica. Os abscessos de nervo e as
lesões “em raquete” seriam características desse grupo de casos.
Nos DT, os bacilos podem ser detectados, às vezes, nos esfregaços de
rotina, mas em pequeno número, e a reação de Mitsuda é positiva, mas é menos
intensa do que nos tuberculóides. Na histopatologia predominam os granulomas
tuberculóides.
Evolutivamente, esses casos têm tendência a cura espontânea, mas muitas
vezes com seqüelas neurológicas devido às reações. Há, na evolução, a partir do
grupo indeterminado, uma fase “pré-DT” com lesões clinicamente indeterminadas e
estrutura tuberculóide.
Os DD são casos que apresentam placas cheias, anulares ou contornos
irregulares, com limites pouco precisos. Têm tonalidade ferruginosa quando não
estão em reação e aqueles que têm um bordo ferruginoso o centro é plano, liso e
hipocrômico, nunca cicatricial. Lesões características desse grupo são aquelas com
áreas central circular, hipocrômica, plana, bem delimitada, e com a periferia infiltrada
formando um bordo espesso que se difunde gradativamente para a pele
aparentemente sã circunvizinha. Essas lesões “foveolares”, “esburacadas” também
são conhecidas como lesões em “queijo suíço”.
Tem-se a impressão que essas lesões seriam lesões iniciais indeterminadas
que passaram para a forma dimorfa DD como lesões pré-DD (clinicamente
indeterminada e com infiltrado dérmico incipiente DD) e que, uma vez
transformadas, começaram a aumentar de tamanho. Quando essas lesões, e as
anulares, confluem, dão um aspecto reticulado ao tegumento que concorrem para
dar o caráter bizarro que caracterizam essa forma clínica. Os nervos são
comprometidos de maneira extensa e intensa principalmente quando esses casos
sofrem uma reação tipo 1. A baciloscopia nesse grupo é sempre positiva, a
estrutura histológica ainda esboça alguns aspectos tuberculóides e a reação de
Mitsuda é negativa.
Os DV englobam todos aqueles casos muito semelhantes aos virchowianos,
mas que possuem aspectos que não se enquadram com os desses últimos. Assim,
90
as lesões são numerosas, com tendência à simetria, a pele em torno delas também
está infiltrada, e tem um tom ferruginoso que em algumas lesões se acentua devido
a uma maior infiltração adquirindo uma tonalidade mais acastanhada. Às vezes são
pápulas, tubérculos e nódulos como verdadeiros hansenomas e se notam lesões
com aspecto anular ou figurado. Há casos em que a maioria das lesões é constiuída
por placas de mais ou menos o mesmo tamanho, assumindo um aspecto
monomorfo. Os pacientes virchovianos, nos quais se nota alguma lesão com
aspecto dimorfo, são considerados por alguns autores como virchowianos sub-
polares.
Parece que os DV sofrem menos reações tipo 1 e há aqueles que
apresentam eritema nodoso. Alguns têm poucas lesões neurológicas e outros em
que elas são múltiplas e com tendência a simetria. Há envolvimento visceral nesses
pacientes. Em todos os casos a baciloscopia é intensamente positiva e a reação de
Mitsuda é negativa. Os DV podem ser distinguidos dos virchowianos
histologicamente (OPROMOLLA, 2000).
3.2.8.2 Reações hansênicas
As reações hansênicas são fenômenos inflamatórios agudos que ocorrem
durante a evolução da hanseníase e, elas podem ocorrer em todas as formas
clínicas com exceção do grupo indeterminado (OPROMOLLA, 2000).
Acredita-se que as reações sejam mediadas imunologicamente, mas os
mecanismos responsáveis para cada tipo de reação permanecem pouco entendidos
(SCOLLARD et al., 2006).
Os tipos de reação mais importantes são a reação reversa ou reação tipo 1 e
a reação tipo 2 ou eritema nodoso da hanseníase (ENH) (ARAÚJO, 2003).
Os estados reacionais são a principal causa de lesões dos nervos e de
incapacidades provocadas pela hanseníase (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
Podem ocorrer antes, durante ou depois do tratamento (JACOBSON;
KRAHENBUHL, 1999).
91
3.2.8.2.1 Reação tipo reversa
Evidências indicam que a reação tipo 1 é o resultado do aumento
espontâneo da imunidade mediada por células e da hipersensibilidade tardia aos
antígenos de M. lepae, mas as causas e mecanismos deste aumento permanecem
pouco entendidos (SCOLLARD et al., 2006).
Este tipo de reação ocorre em pacientes bordeline (DV, DD e DT)
(SCOLLARD et al., 2006). Quando há melhora da imunidade celular a reação é
chamada de reação ascendente ou up-grading e quando há piora da imunidade
celular a reação é chamada de reação descendente ou down-grading
(MARGARIDO-MARCHESE; TEDESCO-MARCHESE; RIVITTI, 2004).
Na reação reversa, as lesões preexistentes tornam-se eritematovioláceas,
sensíveis, intumescidas, elevadas, e máculas tornam-se placas. Ocorre, também,
elevação e melhor definição dos limites das lesões. Evoluem com descamação e,
por vezes, sobrevém ulceração. Novas lesões tendem a surgir, em áreas
adjacentes, assemelhando-se à lesões preexistentes, e podem ser numerosas,
pequenas e esparsas. Nos pacientes DV, edema acrofacial pode estar presente,
assim como sintomas sistêmicos, como febre e mal-estar, que não são usuais.
O comprometimento neural é comum, por vezes, acentuado e grave,
resultando, ocasionalmente, em marcante perda de função e paralisia súbita. Nervos
comprometidos tornam-se intumescidos, com graus variáveis de dor, e exacerbação
da sensibilidade, local e/ou territorial (SOUZA, 1997). O tronco neural mais
comumente acometido é o nervo ulnar na região do cotovelo. A manifestação mais
acentuada é o pé caído, que ocorre quando o nervo fibular é acometido (GELBER,
2002).
Segundo OPRAMOLLA (2000) um surto reacional tem uma duração de
quatro a seis meses, com ou sem tratamento, se for considerado desde o seu início,
período de estado e desaparecimento das lesões.
92
3.2.8.2.2 Reação tipo 2
A reação ocorre em pacientes com imunidade celular deficiente ao M.
leprae, abundantes bacilos em lesões nervosas periféricas ou cutâneas e uma
resposta a anticorpo policlonal forte com altos níveis de imunoglobulinas circulantes.
Autores propuseram que a reação tipo 2 representa um fenômeno mediado por
imunocomplexos, mas essa teoria não foi provada nem desaprovada (SCOLLAR et
al., 2006).
A reação ocorre em pacientes multibacilares (V e DV) (SCOLLARD et al.,
2006). As reações se caracterizam, na pele, pelo aparecimento súbito de nódulos,
pápulas e placas eritematosas, dolorosas, em todo o tegumento. Têm como
localizações preferenciais, as orelhas, a superfície de extensão dos membros e
região lombares, mas podem acometer outros locais. As lesões agudas podem
ulceram, algumas ou todas elas, é o chamado eritema nodose necrotizante.
O ENH é um fenômeno sistêmico, não se restringindo somente à pele. Ele
ocorre mais freqüentemente na hanseníase vichoviana que acomete vários órgãos,
e todos os lugares onde houver infiltrado específico pode fazer parte do quadro
reacional, e mesmo onde não há esse infiltrado.
Em um surto complexo o cortejo sintomático se caracteriza por
manifestações prodrômicas, como febre, mal estar, inapetência, artralgias, seguidos
por aumento doloroso de linfonodos, aparecimento das lesões cutâneas, irites,
iridociclites, neurites, artrites, orquites e orquiepididimites, e aumento doloroso
fígado e do baço, caracterizando as hepatoesplenomegalia reacionais.
Um surto reacional tem uma duração de 15 a 20 dias e eles podem ocorrer
de maneira irregular ou periodicamente ou ser subintrantes (OPRAMOLLA, 2000).
93
3.2.9 Diagnóstico
3.2.9.1 Um caso de hanseníase
Na sétima reunião do Comitê Técnico em Hanseníase da OMS em 1997, um
caso de hanseníase foi definido como um indivíduo que não completou o tratamento
e possui um ou mais dos três sinais:
• Lesões de pele hipopigmentadas ou avermelhadas com perda de
sensibilidade;
• Envolvimento dos nervos periféricos como demostrado por seu
espessamento e associada perda de sensibilidade;
• Baciloscopia positiva para bacilos ácido-resistentes (MOSCHELLA,
2004).
3.2.9.2 Diagnóstico da doença
O diagnóstico da hanseníase baseia-se nos sinais clínicos e nos sintomas
característicos da doença, ou seja, as lesões ou áreas da pele com alteração de
sensibilidade e comprometimento dos nervos periféricos.
O processo de diagnóstico da hanseníase deve ser realizado através do
exame clínico e quando disponível o exame baciloscópio deve ser realizado.
O exame clínico tem como propósito fazer a avaliação dermatoneurológica
do paciente, buscando identificar os sinais e sintomas característicos da doença,
bem como outras intercorrências clínicas. A avaliação dermatológica busca
identificar as lesões de pele e pesquisar a sensibilidade dessas lesões, e a avaliação
neurológica busca identificar neurites, o comprometimento ou lesões de nervos
periféricos e as incapacidades físicas e deformidades, provocadas por essas lesões.
Através do exame clínico do paciente são identificados, também os estados
reacionais ou reações hansênicas, quando há uma exacerbação dos sinais e
sintomas da hanseníase, e é feito o diagnóstico diferencial como outras doenças
dermatológicas e neurológicas com sinais e sintomas semelhantes aos da
hanseníase.
94
O exame baciloscópio, ou baciloscopia, é um exame laboratorial que fornece
informações sobre a presença do bacilo nas lesões suspeitas. Quando disponível,
deve ser utilizado como apoio ao diagnóstico e a classificação da doença. É
importante salientar, porém, que quando existe evidência clínica da hanseníase o
resultado da baciloscopia não afasta o diagnóstico de hanseníase. Em alguns
lugares do corpo do paciente é mais comum a presença de bacilos da hanseníase,
devendo estes, serem eleitos como sítios de coleta. Os sítios de coleta padronizados
são: as lesões dermatológicas ou áreas anestésicas, se houver; lóbulos auriculares
e cotovelos.
O teste de histamina pode ser utilizado como um apoio ao diagnnóstico
precoce da hanseníase em casos onde a pesquisa de sensibilidade é difícil ou
duvidosa. Este teste é útil para os exames bacilocópio e histopatológico, quando
indicados. O teste fornece informações sobre a integridade das ramificações
nervosas periféricas.
Quando concluído o processo de diagnóstico o doente deve ser classificado,
operacionalmente, para fins de tratamento, em paucibacilar ou multibacilar. A
classificação é feita através do exame clínico para a identificação do número de
lesões dermatológicas. O doente é classificado como paucibacilar quando apresenta
até cinco lesões de pele e o doente com mais de cinco lesões de pele é classificado
como multibacilar. A baciloscopia, se disponível, deve ser usada como método para
a classificação. O doente que apresenta baciloscopia positiva é classificado como
multibacilar e quando a baciloscopia é negativa o paciente é classificado como
paucibacilar (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
O diagnóstico e classificação da hanseníase, em campo, são baseados no
exame clínico e na baciloscopia. Testes de diagnóstico como exame histopatológico,
inoculação em camundongos, testes sorológicos, testes cutâneos e PCR são
limitados a países onde tais técnicas são disponíveis e em centros acadêmicos ou
de pesquisa (MOSCHELLA, 2004).
95
3.2.10 Identificação Molecular de M. leprae
A identificação definitiva de M. leprae é, algumas vezes, problemática, pois,
o organismo não é cultivável. Análises moleculares rápidas foram desenvolvidas
para a detecção de M. leprae diretamente em amostras clínicas usando dados
genéticos disponíveis.
As análises são baseadas, principalmente, na amplificação de seqüências
específicas do M. leprae usando PCR e identificação do fragmento de DNA do
organismo (SCOLLARD et al., 2006). Diferentes alvos são utilizados no
desenvolvimento de análise por PCR para a detecção de M. leprae em amostras
clínicas como, gene que codifica a proteína de 18 KDa, gene que codifica o antígeno
de 36 KDa, gene groE-L, gene para 16S rRNA, seqüência repetitiva (RLEP), gene
LSR/A15, região intergênica 85 A-C (fbpA-fbpC), região do gene Ag 85 B (fbpB) e
também, RNA ribossômico.
WOODS e COLE (1989) desenvolveram um método baseado na PCR para
detectar M. leprae em amostras de biópsia. Dois pares de primers foram
empregados, um par amplificou o fragmento de 714 pb do gene groE-L que codifica
o antígeno de 65 KDa e o outro par amplificou um fragmento de 372 pb de uma
seqüência repetitiva. Os produtos de PCR foram visualizados por coloração em
brometo de etídio após eletroforese em gel e agarose ou por Southern blotting. A
seqüência repetitiva está presente cerca de 23 vezes no cromossomo, enquanto o
gene groE-L está presente em cópia única, portanto, o uso da seqüência repetitiva
como seqüência-alvo permitiu aumentar a sensibilidade da PCR.
SANTOS (1992) empregou a técnica de PCR baseada na seqüência
repetitiva descrita por WOODE e COLE (1989) para detecção de M. leprae em
diferentes amostras clínicas como, sangue, linfa, biópsia e pêlo de pacientes
multibacilares e paucibacilares não tratados. Para eliminar resultados falso-positivos
devido a amplificação não específica, o material amplificado foi submetido à
hibridização. Estabeleceu-se um limite de detecção visual, com DNA alvo purificado,
posteriormente confirmado por hibridização, de 100 ag. Após hibridização dos
produtos de PCR com seqüência específica, 25 dos 27 pacientes analisados
forneceram resultados positivos para M. leprae em ao menos uma das amostras.
96
YOON et al. (1993) avaliaram parâmetros da técnica de PCR, que amplifica
um fragmento de 372 pb da seqüência repetitiva de M. leprae, em biópsias de
pacientes com hanseníase antes do tratamento. Os resultados de PCR foram
comparados com o índice bacteriológico (IB) de biópsias e de esfregaços de pele.
Uma amostra com apenas um único organismo forneceu resultado positivo por PCR.
A PCR foi positiva para 11 (73,3%) das 15 biópsias com IB igual a zero determinado
a partir de biópsias. A PCR também forneceu resultados positivos para 84 (86,6%)
das 87 amostras com IB positivo. Embora não houve diferença estatisticamente
significativa entre PCR e microscopia, a PCR parece ter vantagem sobre a
microscopia na detecção de M. leprae em biópsias negativas para bacilos ácido-
resistentes.
JAMIL et al. (1994) desenvolveram um método de PCR nested de tubo
único, usando como alvo a seqüência repetitiva (RLEP) para o diagnóstico de
pacientes com hanseníase paucibacilar. A detecção dos produtos de PCR foi
simplificada utilizando um método colorimétrico. O teste foi específico para M. leprae
e a sensibilidade foi de 1 fg de DNA genômico purificado de M. leprae. Os resultados
da PCR utilizando biópsias de pele de pacientes não tratados mostraram que a
análise poderia detectar 100% das amostras multibacilares (IB ≥ 2), 69% e 70% das
amostras com IBs de um e zero, respectivamente. Também se utilizou a técnica para
avaliar a efetividade da poliquimioterapia.
CHEMOUILLI et al. (1996) descreveram um método para a detecção de M.
leprae por PCR em biópsias de nervo secionadas com criostato e tratadas com
proteinase K. A seqüência-alvo utilizada na PCR foi a seqüência repetitiva RLEP,
que produziu um fragmento de 447 pb. Todas as amostras examinadas de pacientes
com hanseníase lepromatosa foram PCR positiva, enquanto apenas 50% das
amostras examinada de nervos, nas quais nenhum bacilo foi visível, produziram
resultados positivos.
ALMEIDA et al. (2004) investigaram se o DNA de M. leprae poderia ser
detectado em amostras de sangue e de secreção nasal de contatos domiciliares por
PCR usando a seqüência repetitiva como alvo. Todas as amostras foram
submetidas á hibridização para excluir qualquer resultado falso positivo ou negativo.
97
Duas amostras de sangue de um total de 119 (1,7%) e 2 amostras de secreção
nasal de um total de 120 analisadas (1,7%) apresentaram PCR positiva.
PLIKAYTIS, GELBER e SHINNICK (1990) desenvolveram um método de
PCR nested baseado na amplificação de um fragmento de 347 pb do gene groE-L
(também chamado gene do antígeno de 65 KDa) para a detecção de M. leprae.
Nenhum produto de amplificação foi produzido com DNAs de 19 outras espécies de
micobactérias, 19 espécies não micobacterianas, células de camundongo e células
humanas. Produtos de amplificação foram observados para “M. lufu”, M. simiae e M.
smegmatis. Estes produtos foram distinguidos do produto de M. leprae pelo tamanho
e pelo padrão de restrição. O método poderia amplificar amostras com 3 fg de DNA
genômico de M. leprae (quantidade de um bacilo). A técnica, também, foi utilizada
para a detecção de M. leprae em amostras de biópsia e o limite de detecção nestas
amostras foi de 20 células.
HARTSKEERL, WIT e KLATSER (1989) desenvolveram uma PCR baseada
na amplificação de um fragmento de 530 pb do gene que codifica o antígeno de 36
KDa para a detecção de M. leprae. Os primers usados foram capazes de detectar
especificamente bacilos de M. leprae purificados, como também, M. leprae em tecido
de tatu. O limite de detecção do método foi de aproximadamente um bacilo.
WIT et al. (1991) empregaram a PCR baseada na amplificação de um
fragmento de 530 pb do gene que codifica o antígeno rico em prolina de M. leprae
(chamado também de gene que codifica o antígeno de 36 KDa) em amostras de
biópsia congelada ou fixadas provenientes de pacientes com hanseníase não
tratados. Quando a PCR foi aplicada em amostras congeladas, a amplificação foi
positiva em amostras positivas para bacilos ácido-resistentes e em 56% das
amostras de pacientes negativos para bacilos ácido-resistentes. Com as biópsias
fixadas em formalina neutra, a amplificação foi positiva em 92% das amostras de
pacientes positivos para bacilos ácido-resistentes e em 61% das amostras de
pacientes negativos para bacilos ácido-resistentes. As biópsias expostas a fixadores
contendo formaldeído não tamponado ou cloreto mercúrico não foram adequadas
para amplificação por PCR.
WIT et al. (1993) aplicaram a PCR baseada na amplificação de um
fragmento de 531 pb do gene que codifica o antígeno rico em prolina de M. leprae
98
em amostras de secreção nasal de pacientes com hanseníase tratados e não
tratados, contatos ocupacionais e em controles endêmicos e não endêmicos.
Produtos de amplificação foram encontrados em 55% dos pacientes não tratados,
em 19% dos contados ocupacionais, em 12% dos controles endêmicos e em
nenhuma das amostras de pacientes com hanseníase sob tratamento, como
também, nos controles não endêmicos.
RAFI, DONOGHUE e STANFORD (1995) empregaram a PCR baseada na
amplificação de um fragmento de 530 pb do gene que codifica o antígeno de 36 KDa
para a detecção de M. leprae em amostras de escarro e linfa de pacientes
aparentemente curados pela monoterapia com dapsona. Os resultados da PCR
foram comparados com os da baciloscopia. De 44 amostras de escarro, 2 foram
positivas por PCR (4,5%) e de 44 amostras de linfa dos mesmos pacientes, 10 foram
positivas por PCR (22,7%). Nenhum resultado positivo foi encontrado por
baciloscopia.
TORRES et al. (2003) utilizaram a PCR que amplifica um fragmento de 531
pb do gene que codifica o antígeno de 36 KDa para detecção de M. leprae em
diferentes amostras clínicas de 60 pacientes com hanseníase. Os pacientes foram
divididos em três grupos: (1) 20 pacientes multibacilares com IB positivo e em
tratamento; (2) 30 pacientes multibacilares com IB negativo com tratamento, de no
mínimo dois anos, completo; (3) 10 pacientes paucibacilares com tratamento de seis
meses realizado há oito anos. Nos pacientes multibacilares com IB positivo, o exame
histopatológico de lesão detectou bacilos ácido-resistentes em 95% dos casos, no
esfregaço de linfa de lesão foi detectado bacilos ácido-resistentes em 75% dos
casos, em swab de lóbulo de orelha foi detectado bacilos ácido-resistentes em 55%
dos casos e em swab nasal foi detectado bacilos ácido-resistentes em 40% dos
casos. A PCR detectou M. leprae em 100% das amostras de biópsia, em 80% de
swab de linfa de lesão, em 65% de swab de linfa de lóbulo da orelha e em 100% de
swab pós-biópsia. No grupo de pacientes multibacilares com IB negativo os exames
de esfregaço de linfa de lesão e histopatológico detectaram um caso de recidiva em
um paciente que havia completado o tratamento há três anos. Todos os demais
pacientes apresentaram resultados negativos para bacilo ácido-resistentes em todos
os sítios, enquanto o PCR detectou M. leprae em uma amostra de swab de linfa de
99
lesão, em três amostras de biópsia e em seis amostras de swab pós-biópsia. No
grupo paucibacilar, nenhum bacilo ácido-resistente foi detectado por método
convencionais ou por PCR.
PARKASH et al. (2004) empregaram a PCR baseada no gene que codifica o
antígeno de 36 KDa para a detecção de M. leprae em amostras de urina de 16
pacientes hansenianos, 11 com hanseníase lepromatosa e 5 com hanseníase
tuberculóide, e de 8 indivíduos saudáveis. O número de amostras positivas por PCR
foram 36,4% (4/11) em pacientes com hanseníase lepromatosa e em 40% (2/5) em
pacientes com hanseníase tuberculóide. Nenhuma das amostras de indivíduos
saudáveis foi positiva. Outro achado foi que 66,6% (4/6) dos pacientes tratados
apresentaram PCR positiva, enquanto, 20% (2/10) dos pacientes não tratados
apresentaram PCR positiva.
WILLIAMS et al. (1990) desenvolveram um método de PCR acoplado a
hibridização para a detecção de M. leprae obtido de tecido humano e de
camundongo. O segmento de DNA alvo para a amplificação foi uma região de 360
pb do genoma de M. leprae que codifica aproximadamente 80% do gene para a
proteína de 18 KDa. A PCR foi específica para M. leprae e o limite de detecção em
biópsia de pele humana foi de 100 bacilos.
SUNG et al. (1993) utilizaram a PCR baseada na amplificação de um
fragmento de 360 pb do gene que codifica uma proteína de 18 KD para detecção de
M. leprae em biópsias fixadas em formalina e mantidas em parafina de cinco
pacientes com hanseníase multibacilar não tratados e de três pacientes com
hanseníase paucibacilar não tratados. Os produtos de PCR foram analisados por
Southern Blot. Todas as oito amostras apresentaram PCR positiva para M. leprae e
o limite de detecção da análise foi de um bacilo.
SCOLLARD, GILLIS e WILLIAMS (1998) examinaram amostras de biópsia
por PCR usando primers para amplificar um fragmento de 360 pb para uma proteína
de 18 KD de M. leprae. Os produtos PCR foram detectados por eletroforese em gel
de agarose por coloração em brometo de etídio e foram confirmados por
hibridização slot blot. A PCR foi positiva para 10 das 20 amostras diagnosticadas
como hanseníase por exame histopatológico e em nenhuma de 17 amostras não
100
diagnosticadas como hanseníase. A especificidade foi de 100% e a sensibilidade
variou de 50% a 83%.
DONOGHUE, HOLTON e SPIGELMAN (2001) desenvolveram dois
conjuntos de primers nested específicos para M. leprae. Os primers para o gene que
codifica para o antígeno de 18 KDa forneceu um produto externo de 136 pb e em
produto interno de 110 pb. Os primers baseados na seqüência repetitiva RLEP
produziram um produto externo de 120 pb e um produto interno de 99 pb.
Comparando com os primers do gene para o antígeno de 36 KDa, os primers
externos do gene para o antígeno de 18 KDa foram 100 vezes mais sensíveis e os
primers externos para RLEP foram 1000 vezes mais sensíveis. Os dois pares de
primers nested foram usados para amplificar três amostras de linfa de pacientes com
hanseníase tratados com IB de zero e três de seis amostras arqueológicas datadas
dos séculos X-XI. As amostras arqueológicas foram positivas com primers para o
gene do antígeno de 18 KDa, como também, com primers para o gene de RLEP. As
três amostras de linfa apresentaram PCR nested positiva para o gene de RLEP,
enquanto, apenas uma das amostras de linfa apresentou resultado positivo para o
gene do antígeno de 18 KDa.
GUERRERO et al. (2002) padronizaram uma técnica de PCR para amplificar
um fragmento de 321 pb utilizando primers complementares a um segmento do gene
LSR/A15 que codifica uma proteína de 15 KDa. O limite de detecção da técnica foi
de 100 fg de DNA (correspondente a 10-100 bacilos). Com a técnica, foi detectado a
presença de M. leprae em amostras de secreção nasal de 9 (12,8%) dos 70 contatos
domiciliares.
PATTYN et al. (1992) avaliaram a sensibilidade da PCR usando como alvo
um fragmento de 405 pb do DNA que codifica o fragmento espécie-específico da
subunidade 16S do RNAr de M. leprae. As amostras examinadas foram tecido de
camundongo e biópsias de pele humana. A sensibilidade da técnica variou entre 1 e
3 x 10
4
organismos.
KURABACHEW, WONDIMU e RYON (1998) desenvolveram uma técnica de
PCR de transcrição reversa (RT-PCR) utilizando com alvo o 16S RNAr de M. leprae
para a detecção do organismo em amostras clínicas. Após eletroforese em gel de
agarose os produtos de PCR foram visualizados por Southern blotting. Um
101
fragmento de 171 pb foi amplificado quando RNA de M. leprae foi utilizado como
molde, mas não quando um painel de RNAs de 28 espécies de micobactérias, 7
gêneros relacionados ao gênero Mycobacterium e 3 organismos normalmente
encontrados entre a flora da pele ou nariz foram testados. Quando a técnica foi
aplicada em amostras clínicas, M. leprae foi detectado em 82% das biópsias de pele
obtidas de pacientes com hanseníase não tratados, enquanto, biópsias de pele de
voluntários saudáveis e de pacientes com outras doenças dermatológicas foram
negativas. A técnica foi capaz de detectar 10 bacilos em tecido de camundongo
infectado e 23 bacilos em tecido humano A sensibilidade da PCR-RT foi maior que
aquela de esfregaços de linfa corados para bacilos ácido-resistentes ou de amostras
de biópsia coradas para bacilos ácido-resistentes, uma vez que 53% das biópsias
negativas para bacilos ácido-resistentes foram PCR-RT positivas. Desde que o 16S
RNAr é rapidamente degradado em células mortas, a análise pode detectar apenas
organismos viáveis e pode ser útil para avaliar a resposta a poliquimioterapia.
HAILE e RYON (2004) desenvolveram um ensaio de hibridização em placa
de microtitulação colorimétrico para detecção de M. leprae em amostras clínicas.
Este sistema detecta produtos amplificados por RT-PCR utilizando como alvo uma
seqüência espécie-específica do 16S RNAr. O limite de detecção da análise variou
entre 10 a 100 bacilos isolados de tecido de camundongo ou de biópsia de pele
humana. A sensibilidade para o diagnóstico em amostras clínicas foi avaliada para
58 biópsias de pele de pacientes hansenianos não tratados. A análise detectou
produtos de PCR-RT de M. leprae em 100% das biópsias de pacientes
multibacilares e em 80% das biópsias de pacientes paucibacilares. A análise
colorimétrica é rápida, mais sensível e simplifica a detecção de produtos PCR-RT
comparado com a análise Southern blot.
MARTÍNEZ (2005) realizou um estudo comparativo entre a PCR
convencional e a tecnologia da PCR em tempo real (SYBR Green e LUX) para a
detecção de M. leprae em amostras de biópsia de pele e nervo. Dos quatro sistemas
padronizados três (PCR convencional, SYBR e LUX) tiveram como alvo a região
intergênica 85 A-C (fbpA-fbpC) e, um sistema em tempo real (LUX) teve como alvo a
região do gene Ag 85 B (fbpB). Em 67 biópsias de nervo processadas com Trizol, 34
(59,6%) amostras foram diagnosticadas como forma neural pura (PNL). Os dados
102
demonstraram que a associação entre a PCR convencional e o sistema LUX 85 B foi
capaz de detectar 11 novos casos que foram negativos para todos os outros critérios
laboratoriais, o que representou um incremento de 32,3% (11/34) na taxa de
detecção. O percentual de positividade para a PCR foi de 76,5% (26/34) entre os
indivíduos que tiveram definido o diagnóstico de PNL quando os sistemas
(convencional 85 A-C e LUX B) foram conjugados.
3.2.11 Tratamento
O tratamento integral do doente de hanseníase é efetuado através da
poliquimioterapia (tratamento PQT) e do acompanhamento do caso, visando
diagnosticar e tratar intercorrências (estados reacionais, efeitos colaterais de
medicamentos e recidivas) que podem ocorrer durante ou após o tratamento PQT,
bem como prevenir e/ou tratar incapacidades e deformiddes físicas provocadas pela
doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
3.2.11.1 Tratamento poliquimioterápico
O tratamento quimioterápido de hanseníase consiste na utilização de um
conjunto de medicamentos associados, que são: a rifampicina (droga bactericida), a
dapsona e a clofazimina (drogas bacteriostáticas), padronizadas pela OMS e
recomendado pelo Ministério da Saúde conhecido como poliquimioterapia padrão
OMS (PQT/OMS) ou tratamento PQT.
Nos casos paucibacilares é utilizada a associação de dois medicamentos
(rifampicina e dapsona) e nos casos multibacilares é utilizada a associação dos três
medicamentos (rifampicina, dapsona e clofazimina). Para os pacientes com contra-
indicação formal ou intolerância a algum medicamento desses esquemas são
adotados esquemas alternativos. Os medicamentos que podem ser utilizados, além
daqueles do esquema-padrão, são ofloxacina e minociclina.
O tratamento PQT previne a evolução da doença, bem como as
incapacidades físicas e as deformidades provocadas pela hanseníase; logo no início
do tratamento a transmissão da doença é interrompida, pois os medicamentos
103
destroem o bacilo, que se torna inviável para infectar outras pessoas. O tratamento
completo, com a administração correta dos medicamentos, garante a cura da
doença.
O tratamento é ambulatorial e deve ser realizado nas unidades básicas de
saúde, da rede de serviços do Sistema Único de Saúde.
O paciente deverá ter uma consulta mensal (de 28 em 28 dias) na unidade
de saúde para o acompanhamento do seu caso e para receber os medicamentos do
tratamento PQT: a dose supervisionada que lhe será administrada durante a
consulta e os medicamentos daquele mês que ele deverá tomar em cada,
diariamente (doses diárias auto-administradas pelo paciente).
A duração dos esquemas de tratamento PQT deve obedecer aos prazos
estabelecidos: de seis a nove meses para os casos paucibacilares e de 12 a 18
meses para os casos multibacilares. Em alguns casos multibacilares poderão
necessitar de 12 doses adicionais de PQT (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
3.2.11.2 Acompanhamento do caso
Durante o tratamento deve ser feito o acompanhamento do caso, visando o
controle do tratamento PQT, o atendimento à possíveis intercorrências que podem
acontecer durante, em em alguns casos, após o tratamento PQT e a prevenção e o
tratamento de incapacidades e deformidades físicas.
Quando o paciente necessitar de atenção de maior complexidade, não
existente na unidade de saúde, deve ser encaminhado a unidades de referência. A
internação do paciente somente é indicada no caso de intercorrências graves, assim
como efeitos colaterais graves dos medicamentos, estados reacionais graves, ou a
necessidade de correção cirúrgica de deformidades físicas. Quando necessário, a
internação deve ser feita em hospitais gerais e, após a alta hospitalar, o paciente
deve ser reencaminhado à sua unidade de origem para dar continuidade ao seu
tratamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). Para o tratamento da reação tipo 1 são
tipicamente empregados antiinflamatórios corticosteróides. Na reação tipo 2 podem
ser utilizados clofazimina, talidmida e pentoxfilina (BRITTON; LOCKWOOD, 2004).
104
Alguns pacientes após a alta podem apresentar intercorrências como
reações hansênicas e recidivas. O paciente em estado reacional deve, somente,
receber o tratamento para a reação e o paciente com recidiva deve reiniciar o
tratamento PQT de acordo com a classificação do paciente em paucibacilar ou
multibacilar.
É considerado um caso de recidiva, o paciente, que após ter recebido alta do
tratamento PQT da hanseníase, desenvolve novos sinais e sintomas da doença,
afastada a possibilidade de estados reacionais (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
A freqüência de recidiva relatada varia muito, dependendo de vários fatores
operacionais e da duração do acompanhamento. Devido ao crescimento lento de M.
leprae, o acompanhamento de ao menos dez anos é necessário para obter uma
avaliação razoável da recidiva. Além desta dificuldade, o fato de que durante os
últimos 20 anos de recomendações a cerca da duração do tratamento e
combinações de drogas terem se alterado várias vezes, dificulta mais a avaliação
(SCOLLARD et al., 2006).
DASANANJALI (1996) avaliou a recidiva na hanseníase após
poliquimioterapia entre pacientes tratados de 1984 a 1994. Vinte pacientes
paucibacilares e 24 pacientes multibacilares recidivaram entre 5298 pacientes
originalmente classificados como paucibacilares e pacientes multibaclares ocorreram
em 2624 pacientes originalmente classificados como multibacilares. O intervalo de
tempo para a recidiva médio foi de 3-4 anos. A taxa de recidiva entre dez anos após
suspensão do tratamento foi de 0,83% em paucibacilares e 0,19% em multibacilares.
A taxa de recidiva estimada por 1000 pessoa/anos foi de 1,55 para paucibacilares e
0,41 para multibacilares.
DASANANJALU, SCHEUDER e PIRAVAVARAPORN (1997) examinaram
188 pacientes de hanseníase (130 pacucibacilares e 58 multibacilares) de abril de
1984 a março de 1985. O estudo continuou até maio de 1996. Os resultados
mostraram que 182 pacientes completaram o tratamento; 167 pacientes (122 PB e
45 MB) foram liberados do acompanhamento; 82 pacientes paucibacilares foram
disponíveis para acompanhamento até o final de 1994 e 31 pacientes paucibacilares
até maio de 1996. Dois pacientes paucibacilares foram diagnosticados com recidiva,
105
mostrando uma taxa de recidiva de 0,2 por 100 pessoa/anos em risco. Após uma
média de oito anos de acompanhamento, nenhum multibacilar recidivou.
LI et al., (1997) avaliaram 8307 pacientes de hanseníase após tratamento
entre 1986 e 1995. A taxa de recidiva média para pacientes multibacilares foi de
0,15/1000 pessoa/anos e para pacientes paucibacilares 0,55/1000 pessoa/anos. Nos
pacientes multibacilares, as cinco recidivas ocorreram entre quatro a sete anos e em
pacientes paucibacilares, cinco recidivas ocorreram entre quatro a cinco anos após o
tratamento.
CHEN et al., (1999) avaliaram 47276 pacientes curados ou liberados da
poliquimioterapia em um perído de seis anos. A taxa de recidiva total foi de
0,73/1000 paciente/anos. Houve uma diferança significativa estatisticamente nas
taxas de recidiva de pacientes multibacilares (0,61/1000 paciente/anos) e
paucibacilares (1,04/1000 paciente/anos).
HALDAR et al., (2003) relataram uma taxa de recidiva de 1,71/1000
pessoa/anos para pacientes paucibacilares originais e 0,76/1000 pessoa/anos para
pacientes multibacilares originais. Os pacientes foram acompanhados após o
tratamento por um período de dois anos para paucibacilares e cinco anos para
multibacilares. O estudo também mostrou que a história de contato com pacientes
de hanseníase ativos e tratamento irregular conduziu mais pacientes paucibacilares
a recidiva que os pacientes controles.
NORMAN, JOSEPH e RICHARD (2004) relataram um estudo em que 173
pacientes multibacilares foram acompanhados por 20 anos após terem iniciado o
tratamento. A duração média de acompanhamento foi de 16,4 ± 1,83 anos. Dois
pacientes recidivaram 14 a 15 anos depois de terem completado o tratamento,
sendo taxa de recidiva de 0,07 por 100 pessoa/anos de acompanhamento.
GELBER, BALAGON e CELLONA (2004) relataram que a recidiva está
confinada aos pacientes com BL e LL com alto índice bacteriológico e ocorre muito
tempo depois do término do tratamento.
ALI et al., (2005) realizaram um estudo que incluiu 3248 pacientes (2892 PB
e 356 MB. Um total de 58 casos de recidiva foram relatados, o que forneceu uma
taxa acumulativa bruta de recidiva de 1,78% para o período de 16 anos de
acompanhamento; as taxas para PB e MB foram de 1,9% e 0,84%, respectivamente.
106
Com respeito aos paucibacilares, 68% das recidivas foram relatadas nos primeiros
três anos após o tratamento. O número de lesões de pele e envolvimento de nervos
foram os principais fatores de risco para a recidiva.
107
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 BIOSSEGURANÇA
No presente trabalho os procedimentos realizados para manipular os
microrganismos seguiram recomendações estabelecidas por VESLEY e LAUER
(1995), U.S. DEPARTAMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES et al. (1995),
KEUHNE et al. (1995), GILCHRIST (1995), FLEMING (1995) e OMS (2003), assim
com as recomendações determinadas pelas Boas Práticas de Laboratório. Para
descontaminação de vidraria, materiais e bancadas foram empregados germicidas
selecionados conforme BEST et al. (1990), COLE et al. (1990), RUTALA et al.
(1991) e RUSSELL (1996).
4.3 MICRORGANISMOS
4.2.1 Cepas Referência
As cepas referência (tabela 12) foram obtidas do Instituto Nacional de
Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)
com exceção de M. bovis, que foi adquirida da Seção de Coleção de Culturas da
Divisão de Biologia Médica do Instituto Adolfo Lutz.
TABELA 12 – CEPAS REFERÊNCIA E RESPECTIVOS CÓDIGOS
ESPÉCIE CÓDIGO
M. kansasii ATCC 12478
M. avium ATCC 25291
M. fortuitum subsp. fortuitum ATCC 6841
M. szulgai ATCC 35799
M. gordonae ATCC 14470
M. terrae ATCC 15755
M. phlei ATCC 11758
M. smegmatis ATCC 607
M. bovis BCG-MORAEU
Para M. leprae referência foi trabalhado apenas com DNA, que foi
gentilmente cedido por Dr. David Scollard, do Laboratory Research Branch, National
108
Hansen’s Disease Programs, Louisiana State University-SVM, Baton Rouge,
Louisiana 70803, EUA. Também foi obtido DNA de uma cepa de paciente com
hanseníase virchowiana gentilmente cedida por Dr. Milton Osório Moraes, do
Laboratório de Hanseníase, Departamento de Medicina Tropical da FIOCRUZ, Rio
de Janeiro, RJ, Brasil. A cepa de M. tuberculosis foi obtida junto ao Laboratório
Central do Estado do Paraná (LACEN) e identificada por MALAGHINI et al.
(comunicação pessoal).
4.2.2 Amostras Clínicas
Para pesquisa das micobactérias, em esfregaço ou por reação em cadeia da
polimerase (PCR), foram coletados 23 hansenomas, uma amostra de fígado de tatu
infectado por M. leprae, e uma cultura de micobactéria obtida de paciente
hanseniano virchowiano.
Os hansenomas foram colhidos de pacientes com diagnóstico confirmado
anteriormente. A coleta foi feita no serviço médico de diferentes regiões do estado
do Paraná e do país e encaminhada ao Centro de Produção e Pesquisa de
Imunobiológicos (CPPI). Ao chegar à instituição o material foi autoclavado a 121ºC
por 20 minutos e após o resfriamento foi congelado em freezer a -20ºC até seu uso.
No total foram obtidas 23 biópsias de humanos com hanseníase
virchowiana, sendo 20 procedentes de 7 municípios do Estado do Paraná, 2 de São
Paulo e 1 de Minas Gerais. Onze pacientes estavam em tratamento por período de 4
dias a 24 meses. A tabela 13 contém informações referentes aos pacientes
submetidos à biópsia, dados de origem, forma clínica, uso de medicamentos,
período de tratamento até a coleta do hansenoma e alta médica.
A amostra de fígado de tatu infectado com M. leprae foi cedida gentilmente
por Drª. Maria Esther Salles Nogueira e Drª. Patrícia Sammarco Rosa do Instituto
Lauro de Souza Lima, Bauru, São Paulo.
A micobactéria isolada era procedente de lesão de paciente hanseniano
virchowiano diagnosticado na Fundação Pró-Hansen, que estava mantida em meio
de Löwenstein-Jensen e em meio líquido constituído por caldo extrato de carne
acrescido de plasma humano na proporção de 2:1 (MIRANDA et al.,1989).
109
TABELA 13 – INFORMAÇÕES REFERENTES AOS PACIENTES SUBMETIDOS À
BIÓPSIA
PACIENTE ORIGEM
FORMA
CLÍNICA
TRATAMENTO
PERÍODO DE
TRATAMENTO
ALTA
CPPI 1 Curitiba/PR V Não N.A. N.A.
CPPI 2 Guarapuava/PR V Sim 4 meses
(clofazimina)
Alta
CPPI 3 Guarapuava/PR V Sim 5 meses
(clofazimina)
Alta
CPPI 4 Guarapuava/PR V Não N.A. Alta
CPPI 5 Curitiba/PR V Não N.A. N.A.
CPPI 6 Jacarezinho/PR V Não N.A N.A.
CPPI 7 Foz do Iguaçu/PR V Não N.A. N.A.
CPPI 8 Cascavel/PR V Sim 4 dias
(PQT/MB)
N.A.
CPPI 9 Cascavel/PR V Sim 1 mês
(PQT/MB)
N.A.
CPPI 10 Foz do Iguaçu/PR V Não N.A. N.A.
CPPI 11 Guarapuava/PR V Não N.A. Alta
CPPI 12 Curitiba/PR V Sim 9 meses
(PQT/MB)
N.A.
CPPI 13 Curitiba/PR V Sim 4 meses
(PQT/MB)
N.A.
CPPI 14 Piraquara/PR V Sim 1 mês
(PQT/MB)
N.A.
CPPI 15 Curitiba V Sim 2 meses
(PQT/MB)
N.A.
CPPI 16 Curitiba V Não N.A. N.A.
CPPI 17 Piraquara V Sim 24 meses
(Esquema
alternativo há 3
meses)
N.A
CPPI 18 Ribeirão Preto/SP V Não N.A. N.A.
CPPI 19 Piraquara/PR V Sim
(1)
11 meses N.A.
CPPI 20 Uberlândia/MG V Não N.A. N.A.
CPPI 21 Maringá V Sim 1 mês
(PQT/MB)
N.A.
CPPI 22 Guarapuava/PR V Não N.A. Alta
CPPI 23 Bauru/SP V Não N.A N.A.
NOTAS: V = hanseníase virchowiana.
N.A. = não aplicável.
PQT/MB = poliquimioterapia esquema multibacilar.
(1) Paciente teve diagnóstico de hanseníase indeterminada com baciloscopia negativa, tratou por seis
meses com PQT/PB (poliquimioterapia esquema paucibacilar). Dois meses depois, teve
diagnóstico de hanseníase virchowiana, com baciloscopia positiva e recebeu PQT/MB. O período
de tratamento até a coleta foi de cinco meses.
4.3 CULTIVO DE MICRORGANISMOS
Após o recebimento das cepas referências, as mesmas foram hidratadas
com solução de glicerol 10% e a suspensão obtida foi usada para semear quatro
110
tubos de meio Löwenstein-Jensen. Para M. smegmatis usou-se quatro tubos de ágar
Brain Heart Infusion (BHI) e quatro tubos de caldo BHI. Todas as cepas foram
criopreservadas e armazenadas a -70ºC (anexo 1).
Para o cultivo, os tubos semeados foram incubados em estufa a 37ºC até o
desenvolvimento de colônias. Após crescimento, os tubos com os microrganismos
foram armazenados em refrigerador a 4ºC. A cada seis meses, as culturas foram
repicadas.
4.4 RECUPERAÇÃO DE BIOMASSA BACTERIANA
As células micobacterianas, em meio Löwenstein-Jensen, foram removidas
por raspagem da superfície do meio em solução de cloreto de sódio a 0,9%. A
suspensão de células obtida foi recolhida em tubo de centrífuga de 15 ml. As células
que se desenvolveram em meio líquido, tiveram o conteúdo dos tubos de cultivo
transferidos para tubos de centrífuga de 50 ml. A suspensão de células contida em
tubos foi inativada pelo calor e, em seguida, submetida à centrifugação a 2.500 g por
15 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em
solução tampão de Tris-EDTA (TE). Novamente, a suspensão de células foi
centrifugada a 2.500 g por 15 minutos. O sobrenadante obtido foi descartado e o
sedimento transferido para microtubos de 2 ml e armazenados a -20ºC até sua
utilização para a extração do DNA (ver item 4.6.1). O procedimento de recuperação
da biomassa está descrito no anexo 2.
4.5 PROCESSAMENTO DAS BIÓPSIAS PARA REMOÇÃO DE MICOBACTÉRIAS
Os fragmentos de hansenoma foram processados da seguinte forma:
1. Cortar com bisturi um fragmento e transferir o mesmo para gral;
2. Adicionar 10 ml de solução tampão (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM e
EDTA 10 mM, pH 7,4) em tubos cônicos previamente identificados;
3. Adicionar, com auxílio de pipeta pasteur, 1 ml de tampão no gral para
triturar o fragmento de tecido;
4. Triturar o material com auxílio de pistilo;
111
5. Transferir o macerado para o tubo de células;
6. Adicionar, com o auxílio de pipeta pasteur, 2 ml de solução tampão no gral
e transferir o conteúdo para o tubo de células. O processo deverá ser repetido até
que todo resíduo de tecido seja removido do gral;
7. Homogeneizar os tubos com células em agitador tipo vortex;
8. Centrifugar os tubos contendo as células a 300 g por 1 minuto;
9. Transferir o sobrenadante, com auxílio de pipeta pasteur, para o
respectivo tubo identificado com o número da amostra e sobrenadante (tubo de 100
ml);
10. Ao tubo com o sedimento, adicionar, 10 ml de solução tampão;
11. Homogeneizar os tubos com células em agitador tipo vortex;
12. Centrifugar os tubos nas mesmas condições do item 8;
13. Em seguida, transferir o sobrenadante, com auxílio de pipeta pasteur,
para o mesmo tubo destinado para a coleta do sobrenadante;
14. Repetir os passos 10 ao 13 por mais uma vez;
15. Centrifugar os tubos contendo o sobrenadante a 2.500 g por 15 minutos;
16. Descartar o sobrenadante para recipiente de coleta;
17. Transferir, com auxílio de pipeta pasteur, o sedimento obtido do
sobrenadante para tubo cônico de 15 ml identificado para tal;
18. Com auxílio da mesma pipeta pasteur usada no item 17, remover
resíduos do sedimento no tubo através de lavagens do mesmo com solução tampão
e transferir o lavado para o tubo cônico de 15 ml (sobrenadante);
19. Centrifugar os tubos contendo o sedimento do sobrenadante em 2.500 g
por 15 minutos;
20. Durante a centrifugação, preparar lâmina, para pesquisa de bacilos
ácido-resistentes (ver anexo 3) do sedimento resultante do item 14 e distribuir o
mesmo, cerca de 100 a 200 µl, com auxílio de micropipeta e ponteira com
extremidade cortada, para microtubos identificados com amostra e com sedimento;
21. Após a centrifugação, transferir, com auxílio de pipeta pasteur, o
sobrenadante para o mesmo recipiente de coleta do sobrenadante (descarte);
22. Preparar uma lâmina, para pesquisa de bacilos ácido-resistentes, no
sedimento obtido do sobrenadante;
112
23. Distribuir, cerca de 100 a 200 µl, com auxílio de micropipeta e ponteira
com extremidade cortada, o sedimento do sobrenadante para microtubos
identificados com amostra e com sobrenadante;
24. Submeter um microtubo com sedimento e um microtubo com
sobrenadante ao choque térmico (5 minutos a 95ºC e -70ºC até congelar por três
vezes consecutivas);
25. Adicionar aos microtubos solução tampão para um volume final de 400
µl;
26. Armazenar os microtubos a -20ºC para posterior extração de DNA.
A figura 7 mostra um fluxograma que esquematiza o procedimento de
processamento das biópsias.
FIGURA 7 – FLUXOGRAMA DE PROCESSAMENTO DAS BIÓPSIAS
Hansenoma
Trituração em solução tampão
(Tris-HCl 100 mM, NaCl 150
mM e EDTA 10 mM, pH 7,4)
Centrifugação (300g 1’)
Recuperação do
sobrenadante
3 X
Obtenção do sedimento
Centrifugação
(2.500g 15’)
Armazenamento
-20ºC
Coloração de
Ziehl-Gabbet
Obtenção do sobrenadante
(sedimento da centrifugação)
Descarte do
sobrenadante
Armazenamento
-20ºC
Adição tampão
3 X
Coloração de
Ziehl-Gabbet
Extração de DNA
Extração de DNA
113
4.6 EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIAS DE BIÓPSIAS E CULTURAS
4.6.1 Extração de DNA das Culturas de Micobactérias
O propósito da extração de DNA é separar o DNA de todos os componentes
da célula, como por exemplo, aminoácidos, carboidratos, lipídios e proteínas,
resultando em uma solução que representa toda a informação genética contida
dentro da célula. Não há dificuldade em separar o DNA de moléculas pequenas visto
que o peso molecular do DNA é elevado. Conseqüentemente, os principais
componentes celulares que devem ser removidos durante a purificação do DNA são
proteínas e RNA (SURZYCKI, 2000).
Os métodos de extração de DNA envolvem quatro passos:
• Lise celular;
• Remoção de proteínas e RNA;
• Concentração de DNA;
• Determinação da pureza e concentração de DNA.
Em vista das características da parede celular das micobactérias, foram
avaliados dois protocolos para a extração de DNA, um segundo SAMBROOK,
FRITSCH e MANIATIS (1989) e outro segundo BELISLE e SONNENBERG (1998).
Estes protocolos serão aqui denominados: protocolo um e dois, respectivamente.
Para testá-los foram usadas duas amostras de células obtidas de micobactérias
cultiváveis. O detalhamento dos protocolos está descrito no anexo 4.
No protocolo um, o rompimento celular se deu pela ação do detergente
aniônico SDS (dodecil sulfato de sódio), enquanto, no protocolo dois, a lise celular
ocorreu pela ação da lisozima e posteriormente pela ação do SDS.
No protocolo dois, antes do tratamento com lisozima, as células
micobacterianas foram colocadas em contato com uma mistura de clorofórmio e
metanol na proporção de dois para um. A solução possui a função de remover os
lipídios da parede celular expondo o peptidioglicano e assim deixando a célula mais
sensível a clivagem pela lisozima. Segundo BELISLE e SONNENBERG (1998), esta
extração também inativa o bacilo. A suspensão celular, depois de ter seu pH
ajustado, recebeu a lisozima. Após o período de incubação, as soluções de SDS e
114
proteinase K foram adicionadas. O SDS atua como auxiliar na lise celular e na
remoção de proteínas. A proteinase K, requerida para aumentar a eficiência da
remoção de proteínas por solventes orgânicos, foi utilizada numa concentração
reduzida pela metade em relação ao protocolo um. O tempo de ação do SDS e
proteinase K no protocolo um foi de quatro horas e duas horas, respectivamente e
no protocolo dois foi para ambos de três horas.
Após digestão, pela proteinase K, solventes orgânicos foram utilizados para
a remoção de proteínas. Os métodos de desproteinização que usam solventes
orgânicos foram associados para permitir eficiente remoção de proteínas. No
protocolo um, usou-se a extração com fenol saturado e com a mistura
fenol/clorofórmio/álcoolisoámilico (25:24:1). A extração subseqüente com clorofórmio
visava a remoção de traços de fenol da solução de ácidos nucléicos. No protocolo
dois, combinou-se a extração de proteínas com a mistura fenol/clorofórmio/álcool
isoamílico (25:24:1) e com a mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). A extração,
com a última mistura, possui também a função de remover fenol residual. Os tempos
de centrifugação usados no protocolo um, durante a remoção de proteínas, foram de
5 minutos, enquanto no protocolo dois os tempos foram de 30 minutos, para a
mesma velocidade de rotação. Observou-se que com 30 minutos a camada protéica
formada na interface orgânica-aquosa era mais compactada o que facilitou a coleta
da fase aquosa. O tempo de homogeneização entre a fase orgânica formada pela
mistura fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e a fase aquosa no protocolo um
foi de 10 minutos e no protocolo dois foi de 30 minutos. Tempo maior de
homogeneização sugere melhor eficiência na remoção de proteínas da solução de
DNA, mas, também mais danos podem ser introduzidos na estrutura do DNA.
Apenas no protocolo um usou-se RNase para remoção de RNA.
Após a remoção de proteínas e RNA ou apenas proteínas, realizou-se a
precipitação do DNA com etanol na presença de acetato de sódio 3M. No protocolo
um, a precipitação ocorreu a -20ºC por no mínimo quatro horas, enquanto, no
protocolo dois, ocorreu a 4ºC por uma hora.
Após precipitação do DNA, o mesmo foi lavado com etanol 70%. No
protocolo um, por duas vezes e no protocolo dois, por uma vez. O etanol 70% é
usado para eliminar solutos inorgânicos e moléculas orgânicas pequenas. Em
115
seguida o pélete de DNA foi seco a 37ºC por 10 minutos e depois dissolvido em
água ultrapura.
4.6.2 Extração de DNA das Amostras Clínicas
Para cada amostra usou-se o sedimento e o sobrenadante para extração de
DNA. O detalhamento do protocolo de extração está descrito no anexo 5.
A biópsia foi triturada em gral e os bacilos liberados foram separados do
material restante, que ainda contém bacilos.
A solução tampão usada, além de Tris e EDTA, que por sua vez estão em
maior concentração que na solução tampão de TE, continha NaCl.
O rompimento das células (tecido e microrganismo) ocorreu por três ciclos
de congelamento a -70ºC por cinco minutos e descongelamento a 95ºC por cinco
minutos. Neste processo, há formação intracelular de grandes cristais de gelo que
podem perfurar a célula e provocar sua lise. O aquecimento da suspensão celular
também resultou no rompimento das células, como a incubação do material a 60ºC
por 12 horas.
A remoção de proteínas ocorreu pela ação da proteinase K e por métodos
que utilizam solventes orgânicos. Usou-se além da mistura fenol/clorofórmio/álcool
isoamílico (25:24:1), fenol saturado.
Para a precipitação do DNA foi usado etanol absoluto. A precipitação foi
realizada a -20ºC e a centrifugações a 4ºC. Após lavagem de pélete com álcool 70%
por duas vezes, o DNA foi seco em estufa a 37ºC por 10 minutos e posteriormente
dissolvido em água ultrapura.
4.6.3 Quantificação e Determinação da Pureza do DNA Genômico
A determinação da concentração e pureza do DNA foi realizada em
GeneQuant II (Pharmacia Biotech). O detalhamento do procedimento de
quantificação do material genético está descrito no anexo 6. Para as amostras
provenientes de cultura, preparou-se a partir das concentrações obtidas uma
solução de DNA de trabalho de 20 ng/µl.
116
Das amostras provenientes de tecido não foi dosado os DNA(s), pois, a
distinção entre o DNA do microrganismo e do hospedeiro não é possível.
4.6.4 Eletroforese
No presente trabalho, realizou-se a eletroforese em gel de agarose para
DNA genômico e dos produtos de PCR. A concentração de agarose utilizada para o
DNA genômico e produtos de PCR foram de 0,8% e 1,6%, respectivamente. O
tampão de eletroforese empregado foi TAE (Tris-Acetato-EDTA). A voltagem
aplicada foi de 60 V, para uma cuba com 18,0 cm de distância entre os eletrodos. O
tampão de amostra utilizado era composto por 0,25% de azul de bromofenol e 40%
de sacarose em água. O procedimento de eletroforese em gel de agarose está
descrito no anexo 7.
4.7 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR): SELEÇÃO DE SEQÜÊNCIAS-
ALVO E CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO
Frente às várias seqüências-alvo existentes foram selecionadas duas, a
saber, o fragmento de 439 pares de bases do gene que codifica uma proteína de
choque térmico de 65 KDa (hsp65) e o fragmento de 342 pares de bases (pb) do
gene que codifica a subunidade β da RNA polimerase (rpoB).
As reações de amplificação foram realizadas em 60 µl de volume final (ver
itens 4.7.1 e 4.7.2).
A quantidade de DNA a ser usada na reação foi diferente se o material era
procedente de cultivo ou de biópsia de tecido. Para as amostras provenientes de
cultura, utilizou-se 5 µl e 7,5 µl da solução de DNA a 20 ng/µl para a amplificação do
fragmento do gene hsp65 e do fragmento do gene rpoB, respectivamente.
Para as amostras provenientes de tecidos utilizou-se de 1,5 µl a 30 µl da
solução de DNA para um volume de reação de 60 µl. Inicialmente, realizou-se uma
PCR com menores quantidades de solução de DNA, se não houvesse amplificação
o produto desta PCR foi usado para uma segunda PCR. Quando não se observava
117
o produto da reação, fez-se uma nova PCR com maiores quantidades de solução de
DNA e se não ocorresse a amplificação, o produto desta PCR foi usado para uma
segunda PCR.
A fração de escolha para a amplificação do DNA de micobactérias para cada
amostra de tecido foi o material extraído do sobrenadante, mas quando não houve
amplificação com esta fração, foi usado o sedimento correspondente da amostra.
Quando todas as condições foram testadas e não havendo amplificação do
fragmento de DNA esperado, empregou-se o procedimento touchdown PCR.
O touchdown PCR foi empregado em combinação com hot start. Para isto,
realizaram-se os seguintes passos: preparar a mistura de PCR com todos os
componentes, exceto a Taq DNA polimerase; cobrir o conteúdo de cada tubo de
reação com 30 µl de óleo mineral; incubar os tubos em um termociclador a 94ºC por
2 minutos; manter a reação a 94ºC e adicionar Taq DNA polimerase em cada um
dos tubos, certificando-se de adicionar a enzima abaixo da camada de óleo;
continuar com os ciclos de desnaturação, anelamento e extensão.
4.7.1 Amplificação do Fragmento do Gene hsp65
O protocolo usado foi proposto por TELENTI et al. (1993). A reação de PCR
realizada para 60 µl possui a seguinte composição: 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH
8,4), 1,5 mM MgCl
2
, 30 pmoles de cada primer, 1,5 U de Taq DNA polimerase, 10%
glicerol e 200 µM de cada deoxinucleosídio trifosfato (ver tabela 14).
Os primers (iniciadores) utilizados foram:
• Tb11 5’ ACCAACGATGGTGTGTCCAT 3’
• Tb12 5’ CTTGTCGAACCGCATACCCT 3’
A condição de amplificação utilizada para a reação de PCR está descrita na
tabela 15 e para touchdown PCR, na tabela 16.
118
TABELA 14 – VOLUME E CONCENTRAÇÃO DE REAGENTES USADOS PARA
PREPARAR 60 µl DA MISTURA DE PCR DO GENE hsp65
COMPONENTE CONCENTRAÇÃO
VOLUME PARA UM TUBO DE 60 µL
Água ultra pura -
(1)
q.s.p. 60 µl
Glicerol -
6,0 µl
Tampão 10X
6,0 µl
MgCl
2
50 mM
1,8 µl
dNTPS 2,5 mM
4,8 µl
Primer Tb11
20 pmol/µl
1,5 µl
Primer Tb12
20 pmol/µl
1,5 µl
Taq DNA polimerase
5U/µl
0,3 µl
(1) q.s.p. = quantidade suficiente para.
TABELA 15 – PROGRAMAÇÃO PARA AMPLIFICAÇÃO SEM TOUCHDOWN DO
GENE hsp65
PASSO
TEMPO
(min)
TEMPERATURA (ºC) Nº CICLOS
1 5
94
1
2 1
94
45
1
60
1
72
3 10
72
1
TABELA 16 – PROGRAMA PARA AMPLIFICAÇÃO COM TOUCHDOWN DO GENE
hsp65
PASSO
TEMPO
(min)
TEMPERATURA
(ºC)
Nº CICLOS
1 5
94
1
2 1
94
2
1
65
1
72
3 1
94
10
1
(a cada ciclo diminuição de 1ºC) 65
1
72
4 1
94
33
1
55
1
72
5 10
72
1
4.7.2 Amplificação do Fragmento do Gene rpoB
O protocolo para amplificar o gene rpoB foi proposto por KIM et al. (2001). A
reação de PCR realizada para 60 µl possui a seguinte composição: 50 mM KCl, 20
119
mM Tris-HCl (pH 8,4), 1,5 mM MgCl
2
, 60 pmoles de cada primer, 3 U de Taq DNA
polimerase e 250 µM de cada deoxinucleosídio trifosfato (ver tabelas 17).
Os iniciadores utilizados foram:
• MF 5’ CGACCACTTCGGCAACCG 3’
• MR 5’ TCGATCGGGCACATCCGG 3’
A condição de amplificação utilizada para a reação de PCR está descrita na
tabela 18 e para touchdown PCR, na tabela 19.
TABELA 17 – VOLUME E CONCENTRAÇÃO DE REAGENTES USADOS PARA
PREPARAR 60 µl DA MISTURA DE PCR DO GENE rpoB
COMPONENTE CONCENTRAÇÃO VOLUME PARA 1 TUBO DE 60 µL
Água ultra pura -
(1)
q.s.p. 60 µl
Tampão 10X
6,0 µl
MgCl
2
50 mM
1,8 µl
dNTPS 2,5 mM
6,0 µl
Primer MF 20 pmol/µl
3,0 µl
Primer MR 20 pmol/µl
3,0 µl
Taq DNA polimerase 5U/µl
0,6 µl
(1) q.s.p. = quantidade suficiente para.
TABELA 18 – PROGRAMAÇÃO PARA AMPLIFICAÇÃO SEM TOUCHDOWN DO
GENE rpoB
PASSO TEMPO
TEMPERATURA
(ºC)
Nº CICLOS
1 5 min
94
1
2 30 s
95
30
30 s
60
45 s
72
3 5 min
72
1
120
TABELA 19 – PROGRAMAÇÃO PARA AMPLIFICAÇÃO COM TOUCHDOWN DO
GENE rpoB
PASSO TEMPO
TEMPERATURA
(ºC)
Nº CICLOS
1 5 min
94
1
2 30 s
95
2
30 s
63
45 s
72
3 30 s
95
8
30 s
(a cada ciclo diminuição de 1ºC) 63
45 s
72
4 30 s
95
20
30 s
55
45 s
72
5 5 min
72
1
4.8 POLIMORFISMO DE TAMANHO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO (RFLP)
Os produtos de PCR foram digeridos com as enzimas de restrição Hae III e
Bst EII para o fragmento do gene hsp65 e com as enzimas Hae III e Bst UI para o
fragmento do gene rpoB. Os componentes para uma reação de 15 µl estão
dispostos na tabela 20. A digestão foi realizada em estufa na temperatura indicada
pelo fabricante por 12 a 24 horas.
TABELA 20 – VOLUMES DOS REAGENTES USADOS PARA PREPARAR A
MISTURA DE DIGESTÃO
COMPONENTE CONCENTRAÇÃO
VOLUME PARA UMA REAÇÃO DE 15 µL
Água ultrapura -
3,0 µl
Tampão 10X
1,5 µl
Enzima de restrição
10 U/µl
0,5 µl
Produto da PCR -
10,0 µl
A enzima Hae III é isolada de Haemophilus aegyptius, enquanto as enzimas
Bst EII e Bst UI são isoladas do Bacillus stearothermophilus. Os sítios de
reconhecimento estão descritos na tabela 21.
121
TABELA 21 – SEQÜÊNCIAS DE RECONHECIMENTO PARA AS ENZIMAS DE
RESTRIÇÃO Hae III, Bst EII E Bst UI
ENZIMA DE RESTRIÇÃO SEQÜÊNCIA DE RECONHECIMENTO
Hae III 5’-G G C C-3’
3’-C C G G-5’
Bst EII 5’-GG T N A C C-3’
3’-C C A N T GG-5’
Bst UI 5’-C G C G-3’
3’-G C G C-5’
NOTAS: As setas indicam sítios de clivagem.
N indica qualquer base.
Após o período de digestão, o produto foi submetido a eletroforese em gel
de poliacrilamida. A concentração do gel empregada para o fragmento do gene
hsp65 foi de 10% e para o fragmento do gene rpoB foi de 8%. O tampão de
eletroforese utilizado foi TBE (Tris-Borato-EDTA). O tampão de amostra era
composto de 0,25% de azul de bromofenol e 40% de sacarose em água sacarose. A
corrida eletroforética foi realizada em 60 V. O procedimento de digestão e
eletroforese estão descritos no anexo 8 e 9 respectivamente. As amostras que
apresentaram arraste em eletroforese em gel de poliacrilamida tiveram o produto de
PCR purificado usando o kit PureLink
TM
Quick Gel Extraction (Invitrogen) e
submetidas novamente ao RFLP.
4.9 ANÁLISE DE DADOS
Para avaliar o peso molecular dos fragmentos gerados por RFLP foi usado o
programa Gelpro Analyser. Os fragmentos de restrição menores que 50 pb não
foram considerados.
122
5 RESULTADOS
5.1 EFICIÊNCIA DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO
Os dois protocolos usados para extração do DNA foram analisados quanto a
sua eficiência, em espectrofotometria para avaliar a pureza e concentração do DNA,
e em eletroforese em gel de agarose, para avaliar a qualidade do DNA (tabela 22 e
figura 8). A relação A
260
/A
280
variou de 1,431 a 1,679.
TABELA 22 – PUREZA E CONCENTRAÇÃO DO DNA EM µ
g/ml
DETERMINADOS POR ESPECTROFOTOMETRIA
REFERENTES AS CEPAS M. kansasii E M. phlei
AMOSTRA PROTOCOLO A
260
/A
280
CONCENTRAÇÃO
(µg/ml)
M. kansasii 1
1,591
27,2
M. phlei 1
1,670
38,4
M. kansasii 2
1,431
43,5
M. phlei 2
1,679
71,1
FIGURA 8 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 0,8% DO DNA GENÔMICO
EXTRAÍDO DAS CEPAS M. kansasii E M. phlei
4 3 2 1
As linhas 1 e 2 referem-se ao DNA obtido das cepas M. kansasii e M. phlei, respectivamente,
segundo o protocolo 1. As linhas 3 e 4 referem-se ao DNA obtido das cepas M. kansasii e M. phlei,
respectivamente, segundo o protocolo 2.
123
Quando se avaliou a concentração do DNA, verificou-se que maiores
concentrações foram obtidas com o protocolo dois. Porém, quanto à pureza do DNA,
verificou-se que o protocolo um foi mais eficiente.
A escolha de um protocolo de extração de DNA é baseada na quantidade de
DNA e na pureza, necessárias para o propósito que se deseja. A reação de PCR
requer pequenas quantidades de DNA, cerca de 50 a 500 ng, e pode tolerar a
presença de proteínas contaminantes (SURZYCKI, 2000). Portanto, ambos os
protocolos atenderam as necessidades para a reação de PCR. Porém, ao avaliar as
duas variáveis optou-se por trabalhar com o protocolo um para as micobactérias
cultiváveis, pois, o processo de extração foi mais rápido que o do protocolo dois.
Numa tentativa de aumentar a concentração de DNA, as amostras foram incubadas
por 12 horas a 55ºC ao invés de apenas 2 horas (tabela 23 e figura 9). Das dez
cepas, cujo DNA foi extraído, a relação A
260
/A
280
variou de 1,426 a 1,684 e a
concentração variou de 31,2 a 352,3 µg/ml. As cepas M. smegmatis e M. szulgai
apresentaram maior concentração de DNA, pois, a biomassa de partida foi maior
que as demais, devido a motivos técnicos.
TABELA 23 – PUREZA E CONCENTRAÇÃO DO DNA EM µ
g/ml
DETERMINADOS POR ESPECTROFOTOMETRIA
REFERENTES AS MICOBACTÉRIAS CULTIVÁVEIS
AMOSTRA A
260
/A
280
CONCENTRAÇÃO
(µg/ml)
M. kansasii 1,533
44,9
M. phlei 1,472
57,7
M. gordonae 1,546
49,5
M. fortuitum 1,498
87,4
M. bovis 1,684
46,0
M. smegmatis 1,552
352,3
M. szulgai 1,426
120,6
M. terrae 1,434
31,2
M. avium 1,488
35,0
M. sp
(1)
1,474
45,1
(1) Amostra de cultura proveniente de lesão de paciente hanseniano.
124
FIGURA 9 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 0,8% DO DNA GENÔMICO
EXTRAÍDO DE MICOBACTÉRIAS CULTIVÁVEIS
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Linhas 1: M. avium; 2: M. bovis; 3: M. fortuitum subsp. fortuitum; 4: M. gordonae; 5: M. kansasii; 6:
M. phlei; 7: M. smegmatis; 8: M. sp; 9: M. szulgai; 10: M. terrae.
5.2 PROCESSAMENTO DAS BIÓPSIAS
A figura 10 mostra um hansenoma humano obtido por biópsia da pele.
FIGURA 10 – HANSENOMA HUMANO OBTIDO POR BIÓPSIA
125
5.2.1 Pesquisa de Bacilos Ácido-Resistentes
As frações sobrenadante e sedimento, de todas as biópsias, foram
submetidas à pesquisa de bacilos ácido-resistentes. Os resultados obtidos são
apresentados na tabela 24.
Na fração sobrenadante foram encontrados bacilos ácido-resistentes em 12
hansenomas (52,17%), enquanto, que no sedimento foram encontrados bacilos em
16 (69,56%) amostras.
Das 24 amostras, incluindo a amostra de tatu, apenas em 13 foram
detectados bacilos ácido-resistentes, tanto na fração sobrenadante quanto na fração
sedimento. Em quatro amostras observaram-se raros bacilos, que somente foram
visualizados no sedimento presos as células do tecido.
126
TABELA 24 – PESQUISA DE BACILOS ÁCIDO-RESISTENTES NAS FRAÇÕES
SOBRENADANTE E SEDIMENTO DAS AMOSTRAS
PROVENIENTES DE TECIDOS
AMOSTRA FRAÇÃO: SOBRENADANTE FRAÇÃO: SEDIMENTO
CPPI 1 + +
CPPI 2 - -
CPPI 3 - -
CPPI 4 - -
CPPI 5 + +
CPPI 6 + +
CPPI 7 + +
CPPI 8 + +
CPPI 9 + +
CPPI 10 + +
CPPI 11 - -
CPPI 12 - -
CPPI 13 - -
CPPI 14 + +
CPPI 15 - +
CPPI 16 - +
CPPI 17 - +
CPPI 18 + +
CPPI 19 - +
CPPI 20 + +
CPPI 21 + +
CPPI 22 - -
CPPI 23 + +
Tatu + +
NOTAS: + = presença de bacilos.
- = ausência de bacilos.
Nas figuras 11 e 12 são mostrados bacilos no material obtido do
sobrenadante e sedimento. Maior quantidade de detritos celulares foram observadas
na fração sedimento em relação a fração sobrenadante.
127
FIGURA 11 – BACILOS ÁCIDO-RESISTENTES DA FRAÇÃO SOBRENADANTE
CORADOS PELA TÉCNICA ZIEHL-GABBET OBSERVADOS NO
AUMENTO DE 1000X
FIGURA 12 – BACILOS ÁCIDO-RESISTENTES DA FRAÇÃO SEDIMENTO
CORADOS PELA TÉCNICA ZIEHL-GABBET OBSERVADOS NO
AUMENTO DE 1000X
5.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
5.3.1 Amplificação do Fragmento do Gene hsp65
As cepas de micobactérias cultiváveis e amostras provenientes de tecido
foram submetidas à amplificação do fragmento de 439 pb do gene hsp65 (figuras 13
e 14). As figuras exemplificam apenas algumas amostras.
128
Das várias tentativas de amplificação e usando os diferentes programas
descritos em Material e Métodos, amplificou-se o fragmento alvo para as seguintes
amostras: CPPI 1, CPPI 5, CPPI 6, CPPI 7, CPPI 8, CPPI 9, CPPI 10, CPPI 14,
CPPI 18, CPPI 20, CPPI 21 e CPPI 23, a amostra proveniente de tatu e a cultura de
paciente hanseniano. A tabela 25 aponta a fração da amostra cujo DNA foi
amplificado.
FIGURA 13 – PRODUTOS DE PCR DO FRAGMENTO DO GENE hsp65 EM GEL
DE AGAROSE A 1,6% DAS CEPAS DE MICOBACTÉRIAS
CULTIVÁVEIS
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Linhas 1: marcador de peso molecular de 50 pb; 2: M. smegmatis; 3: M. phlei; 4: M.fortuitum subsp.
fortuitum; 5: M. szulgai; 6: M. kansasii; 7: M. avium; 8: M. terrae; 9: M. bovis; 10: M. gordonae; 11: M.
sp.
129
FIGURA 14 – PRODUTOS DE PCR DO FRAGMENTO DO GENE hsp65
VISUALIZADOS EM GEL DE AGAROSE A 1,6% DAS
AMOSTRAS PROVENIENTES DE TECIDOS.
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Linhas 1: marcador de peso molecular 50 de pb; 2: CPPI 1; 3: CPPI 5: 4: CPPI 6; 5: CPPI 8; 6: CPPI
10; 7: CPPI 18; 8: CPPI 20; 9: CPPI 21; 10: CPPI 23; 11:Tatu.
TABELA 25 – AMOSTRAS, FRAÇÕES AMPLIFICADAS E CONDIÇÕES DE
AMPLIFICAÇÃO DO FRAGMENTO DO GENE hsp65
AMOSTRA
FRAÇÃO
AMPLIFICADA
CONDIÇÕES DE
AMPLIFICAÇÃO
CPPI 1 Sedimento TD PCR de TD PCR
CPPI 5 Sedimento PCR
CPPI 6 Sobrenadante PCR
CPPI 7 Sobrenadante TD PCR de TD PCR
CPPI 8 Sedimento PCR
CPPI 9 Sedimento TD PCR de TD PCR
CPPI 10 Sobrenadante PCR
CPPI 14 Sobrenadante PCR de PCR
CPPI 18 Sobrenadante PCR
CPPI 20 Sobrenadante PCR
CPPI 21 Sobrenadante PCR
CPPI 23 Sobrenadante PCR
Tatu Sobrenadante TD PCR de TD PCR
NOTA: TD PCR = Touchdown PCR.
130
5.3.2 Amplificação do Fragmento do Gene rpoB
As cepas de micobactérias cultiváveis e amostras provenientes de tecido
foram submetidas à amplificação do fragmento de 342 pb do gene rpoB. As figuras
15 e 16 apontam algumas das amostras amplificadas.
FIGURA 15 – PRODUTOS DE PCR DO FRAGMENTO DO GENE rpoB EM GEL DE
AGAROSE A 1,6% DAS CEPAS DE MICOBACTÉRIAS
CULTIVÁVEIS
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Linhas 1: marcador de peso molecular de 50 pb; 2: M. fortuitum subsp. fortuitum; 3: M. phlei; 4: M.
smegmatis; 5: M. avium; 6: M. gordonae; 7: M. szulgai; 8: M. terrae; 9: M. bovis; 10: M. tuberculosis.
131
FIGURA 16 – PRODUTOS DE PCR DO FRAGMENTO DO GENE rpoB
VISUALIZADOS EM GEL DE AGAROSE A 1,6% DAS
AMOSTRAS PROVENIENTES DE TECIDOS
14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Linhas 1: marcador de peso molecular de 50 pb; 2: CPPI 1; 3: CPPI 5; 4: CPPI 6; 5: CPPI 8; 6: CPPI
9; 7: CPPI 14; 8: CPPI 18; 9: CPPI 20; 10: CPPI 21; 11: CPPI 23; 12: Tatu; 13: M. sp; 14: CPPI 7.
Todas as amostras de referência foram amplificadas enquanto, as amostras
clínicas que apresentaram amplificação do segmento alvo foram: CPPI 1, CPPI 5,
CPPI 6, CPPI 7, CPPI 8, CPPI 9, CPPI 10, CPPI 14, CPPI 18, CPPI 20, CPPI 21 e
CPPI 23, como também, a amostra de tecido de tatu e a amostra de cultura
proveniente de paciente hanseniano. A tabela 26 evidencia a amostra e a
correspondente fração cujo DNA foi amplificado.
132
TABELA 26 – AMOSTRAS, FRAÇÕES AMPLIFICADAS E CONDIÇÕES DE
AMPLIFICAÇÃO DO FRAGMENTO DO GENE rpoB
AMOSTRA
FRAÇÃO
AMPLIFICADA
CONDIÇÕES DE
AMPLIFICAÇÃO
CPPI 1 Sobrenadante TD PCR + hot start
CPPI 5 Sedimento TD PCR + hot start
CPPI 6 Sobrenadante TD PCR + hot start
CPPI 7 Sedimento TD PCR de TD PCR + hot start
CPPI 8 Sedimento TD PCR + hot start
CPPI 9 Sobrenadante TD PCR de TD PCR + hot start
CPPI 10 Sobrenadante TD PCR + hot start
CPPI 14 Sobrenadante TD PCR de TD PCR + hot start
CPPI 18 Sobrenadante TD PCR + hot start
CPPI 20 Sobrenadante TD PCR + hot start
CPPI 21 Sobrenadante TD PCR + hot start
CPPI 23 Sobrenadante TD PCR + hot start
Tatu Sedimento TD PCR de TD PCR + hot start
NOTA: TD PCR = Touchdown PCR.
5.4 POLIMORFISMO DE TAMANHO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO (RFLP)
5.4.1 RFLP do Fragmento do Gene hsp65
Para o fragmento de 439 pb do gene hsp65 submetido à digestão com a
enzima Hae III, verificou-se o corte do produto de PCR em dois, três e quatro
fragmentos e a combinação entre eles deu origem a dez genótipos para as cepas de
referência (figura 17). Cada genótipo reuniu amostras que apresentaram os mesmos
fragmentos de restrição e os fragmentos foram considerados idênticos quando se
encontravam na mesma linha, independente do peso molecular.
133
FIGURA 17 – PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III PARA AS
CEPAS DE REFERÊNCIA VISUALIZADO EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 10%
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Linhas 1: marcador de peso molecular de 50 pb; 2: M. tuberculosis; 3: M. bovis; linha 4: M. terrae;
linha 5: M. szulgai; linha 6: M. leprae; linha 7: M. kansasii; linha 8: M. gordonae; linha 9: M. avium;
linha 10: M. smegmatis; linha 11: M. phlei; linha 12: M. fortuitum subsp. fortuitum; linha 13: marcador
de peso molecular de 10 pb.
A digestão do produto da PCR de 439 pb do gene hsp65 com a enzima de
restrição Bst EII produziu dois ou três fragmentos para as cepas de referência
exceto para a cepa M. szulgai, em que não se observou a digestão. O número de
genótipos gerados foram seis (figura 18).
134
FIGURA 18 – PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII PARA AS
CEPAS DE REFERÊNCIA VISUALIZADO EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 10%
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Linhas 1: marcador de peso molecular de 50 pb; 2: M. tuberculosis; 3: M. bovis; 4: M. terrae; 5: M.
szulgai; 6: M. leprae; 7: M. kansasii; 8: M. gordonae; 9: M. avium; 10: M. smegmatis; 11: M. pheli; 12:
M. fortuitum subsp. fortuitum; 13: marcador de peso molecular de 10 pb.
A tabela 27 apresenta o tamanho dos fragmentos dos produtos de PCR do
gene hsp65 após restrição com as enzimas Hae III e Bst EII para as cepas de
referência.
135
TABELA 27 – FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO PRODUTO DE PCR DE 439 pb
DO GENE hsp65 PARA AS CEPAS DE REFERÊNCIA
TAMANHO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO EM pb
CEPA DE REFERÊNCIA
Hae III Bst EII
M. fortuitum subsp. fortuitum 135, 116, 59, 52 230, 112, 87
M. phlei 129, 80, 59, 51 230, 192
M. smegmatis 131, 114, 58 230, 125, 87
M. avium 119, 99 224, 190
M. gordonae 147, 107, 59 242, 113, 88
M. kansasii 119, 99, 78 230, 192
M. leprae Thai-53 274, 121 338, 126
M. leprae ML1 284, 120 344, 127
M. szulgai 120, 99, 70 Não digeriu
M. terrae 160, 119 332, 111
M. bovis 140, 120, 70 230, 112, 87
M. tuberculosis 142, 121, 70 230, 114, 88
A partir do perfil de digestão obtido com as cepas de referência, comparou-
se este padrão de fragmentos com o perfil de digestão gerado com as amostras
clínicas para identificação de micobactérias (figuras 19 e 20). Estas figuras
evidenciam a maioria das amostras.
136
FIGURA 19 – PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III PARA AS
AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADO EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 10%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Linhas 1: marcador de peso molecular de 10 pb; 2: CPPI 1; 3: CPPI 5; 4: CPPI 6; 5: CPPI 8; 6:
CPPI 9; 7: CPPI 10; 8: CPPI 18; 9: CPPI 20; 1 0: CPPI 21; 11: CPPI 23; 12: M. sp; 13: ML1; 14:
Tatu; 15: marcador de peso molecular de 50 pb, ML1 = amostra cedida pela FIOCRUZ.
137
FIGURA 20 – PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII PARA AS
AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADO EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 10%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Linhas 1: ML1; 2: padrão de peso molecular de 50 pb; 3: CPPI 1; 4: CPPI 5; 5: CPPI 6; 6: CPPI 8; 7:
CPPI 9; 8: CPPI 10; 9: CPPI 18; 10: CPPI 20; 11: CPPI 21; 12: CPPI 23; 13: M. sp; 14: Tatu; 15:
padrão de peso molecular de 50 pb; ML1 = amostra cedida pela FIOCRUZ.
A tabela 28 apresenta o tamanho dos fragmentos dos produtos de PCR do
gene hsp65 após restrição com as enzimas Hae III e Bst EII para as amostras
clínicas.
138
TABELA 28 – FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO PRODUTO DE PCR DE 439 pb
DO GENE hsp65 PARA AS AMOSTRAS CLÍNICAS
TAMANHO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO EM pb
AMOSTRA
Hae III Bst EII
CPPI 1 118, 97, 68 Não digeriu
CPPI 5 265, 119 344, 127
CPPI 6 274, 119 350, 127
CPPI 7 274, 119 344, 127
CPPI 8 265, 119 344, 127
CPPI 9 274, 119 362, 127
CPPI 10 265, 119 344, 127
CPPI 14 265, 119 344, 127
CPPI 18 265, 120 344, 127
CPPI 20 265, 119 344, 127
CPPI 21 274, 120 350, 127
CPPI 23 284, 120 356, 128
M. sp 119, 98, 77 236, 193
Tatu 284, 121 350, 130
Analisando os resultados do RFLP para o fragmento do gene hsp65,
verificou-se que para as amostras CPPI 5, CPPI 6, CPPI 7, CPPI 8, CPPI 9, CPPI
10, CPPI 14, CPPI 18, CPPI 20, CPPI 21 e CPPI 23 e para a amostra de tatu foi
identificado M. leprae. Para a amostra CPPI 1, detectou-se M. szulgai e para a
amostra de cultura isolada de paciente hanseniano observou-se M. kansasii.
5.4.2 RFLP do Fragmento do Gene rpoB
Para o fragmento de 342 pb do gene rpoB submetido a digestão com a
enzima Hae III, verificou-se o corte do produto de PCR em dois e três fragmentos e
formação de seis genótipos para as cepas de referência (figura 21).
139
FIGURA 21 – PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Hae III PARA AS
CEPAS DE REFERÊNCIA VISUALIZADO EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 8%
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Linhas 1: marcador de peso molecular de 50 pb ; 2: M. tuberculosis; 3: M. bovis, 4: M. terrae; 5: M.
szulgai; 6: M. leprae; 7: M. gordonae; 8: M. avium; 9: M. smegmatis; 10: M. phlei; 11: M. fortuitum
subsp. fortuitum; 12: M. kansasii; 13: marcador de peso molecular de 10 pb.
A digestão do produto da PCR de 342 pb do gene rpoB com a enzima de
restrição Bst UI produziu dois ou três fragmentos para as cepas de referência,
exceto para a cepa M. kansasii, em que não se observou a digestão. O número de
genótipos gerados foram nove (figura 22, tabela 29).
140
FIGURA 22 – PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Bst UI PARA AS
CEPAS DE REFERÊNCIA VISUALIZADO EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 8%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Linhas 1: marcador de peso molecular de 10 pb; 2: M. fortuitum subsp. fortuitum; 3: M. gordonae; 4:
M. szulgai; 5: M. terrae; 6: M. bovis; 7: marcador de peso molecular de 50 pb; 8: M. tuberculosis; 9: M.
avium; 10: M. smegmatis; 11: M. phlei; 12: marcador de peso molecular de 50 pb; 13: M. kansasii; 14:
M. leprae; 15: marcador de peso molecular de 50 bp.
A tabela 29 apresenta o tamanho dos fragmentos dos produtos de PCR do
gene rpoB após restrição com as enzimas Hae III e Bst UI para as cepas de
referência.
141
TABELA 29 – FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO PRODUTO DE PCR DE 342 pb
DO GENE rpoB PARA AS CEPAS DE REFERÊNCIA
TAMANHO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO EM pb
CEPA DE REFERÊNCIA
Hae III Bst UI
M. fortuitum subsp. fortuitum 192, 71 193, 87
M. phlei 189, 71 189, 78
M. smegmatis 189, 71 229, 67
M. avium 141, 121 199, 87
M. gordonae 119, 112, 70 176, 87, 78
M. kansasii 227, 69 Não digeriu
M. leprae Thai-53 227, 71 191, 78, 72
M. leprae ML1 238, 69 198, 77, 72
M. szulgai 145, 113 173, 88, 79
M. terrae 139, 119 174, 94, 79
M. bovis 146, 114, 70 139, 95, 78
M. tuberculosis 145, 114, 70 139, 94, 78
O perfil de digestão obtido com as cepas de referência foi comparado com o
perfil de digestão gerado com as amostras clínicas para identificação de
micobactérias (figuras 23 e 24). Estas figuras mostram a maioria das amostras.
142
FIGURA 23 – PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Hae III PARA AS
AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADOS EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 8%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Linhas 1: marcador de peso molecular de 50 pb; 2: CPPI 1; 3: CPPI 5; 4: CPPI 6; 5: CPPI 7; 6: CPPI
8; 7: CPPI 9; 8: CPPI 14; 9: CPPI 18; 10: CPPI 20; 11: CPPI 21; 12: CPPI 23; 13: M. sp; 14: Tatu;
15: marcador de peso molecular de 50 pb; ML1 = amostra cedida pela FIOCRUZ.
143
FIGURA 24 – PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Bst UI PARA AS
AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADOS EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 8%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Linhas 1: marcador de peso molecular de 50 pb; 2: CPPI 1; 3: CPPI 5; 4: CPPI 6; 5: CPPI 7; 6: CPPI
8; 7: CPPI 9; 8: CPPI 14; 9: CPPI 18; 10: CPPI 20; 11: CPPI 21; 12: CPPI 23; 13: M. sp; 14: Tatu; 15:
marcador de peso molecular de 50 pb; ML1 = amostra cedida pela FIOCRUZ; T = tatu.
Os produtos da PCR das amostras CPPI 7, CPPI 9, CPPI 14, CPPI 23 , tatu
e ML1 foram purificados, pois, o RFLP destas amostras apresentou um arraste.
Após a purificação, o RFLP foi repetido e os resultados são mostrados na figura 25.
144
FIGURA 25 – PERFIL DA DIGESTÃO DO PRODUTO DE PCR PARA O
FRAGMENTO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Hae III E Bst UI
PARA AS AMOSTRAS CLÍNICAS VISUALIZADOS EM GEL DE
POLIACRILAMIDA A 8% APÓS PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE
PCR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Linhas 1 a 5: produtos de PCR digerido com Bst UI: 1: ML1; 2: Tatu; 3: CPPI 23; 4: CPPI 14; 5: CPPI
7; linha 6: padrão de peso molecular de 50 pb; linhas 7 a 11: produtos de PCR digeridos com Hae III:
7: ML1; 8: Tatu; 9: CPPI 23; 10: CPPI 14; 11: CPPI 7; ML1 = amostra cedida pela FIOCRUZ.
A tabela 30 apresenta o tamanho dos fragmentos dos produtos de PCR do
gene hsp65 após restrição com as enzimas Hae III e Bst UI para as amostras
clínicas.
145
TABELA 30 – FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO PRODUTO DE PCR DE 342 pb
DO GENE rpoB PARA AS AMOSTRAS CLÍNICAS
TAMANHO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO EM pb
AMOSTRA
Hae III Bst UI
CPPI 1 236, 148, 111, 69 198, 176, 85, 76, 71
CPPI 5 232, 69 198, 76, 71
CPPI 6 236, 68 198, 77, 72
CPPI 7 236, 68 198, 77, 72
CPPI 8 236, 69 205, 78, 73
CPPI 9 241, 68 198, 77, 73
CPPI 10 241, 68 198, 78, 72
CPPI 14 227, 68 198, 78, 72
CPPI 18 241, 69 200, 78, 73
CPPI 20 232, 69 198, 78, 73
CPPI 21 241, 69 205, 78, 73
CPPI 23 232, 69 198, 78, 73
M. sp 236, 69 Não digeriu
Tatu 241, 69 215, 78, 72
Analisando os resultados do RFLP para o fragmento do gene rpoB verificou-
se que para as amostras CPPI 5, CPPI 6, CPPI 7, CPPI 8, CPPI 9, CPPI 10, CPPI
14, CPPI 18, CPPI 20, CPPI 21 e CPPI 23 e para a amostra de tatu foi identificado
M. leprae. Para a amostra CPPI 1, além de M. leprae, detectou-se M. szulgai e para
a amostra de cultura isolada de paciente hanseniano observou-se M. kansasii.
A tabela 31 resume os dados de tratamento, baciloscopia, PCR e RFLP dos
dois alvos moleculares para cada doador de hansenoma.
146
TABELA 31 – RESUMO DOS DADOS DOS PACIENTES DOADORES DE HANSENOMA NO QUE REFERE AO
TRATAMENTO, BACILOSCOPIA, PCR E RFLP
continua
BACILOSCOPIA
PACIENTE TRATAMENTO
PERÍODO
TRATAMENTO
ALTA
Sobrenadante Sedimento
PCR
hsp65
PCR
rpoB
RFLP
hsp65
RFLP
rpoB
CPPI 1 Não N.A. N.A. + + Positiva Positiva M. szulgai M. szulgai
M. leprae
CPPI 2 Sim 4 meses
(clofazimina)
Alta - - Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 3 Sim 5 meses
(clofazimina)
Alta - - Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 4 Não N.A. Alta - - Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 5 Não N.A. N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 6 Não N.A. N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 7 Não N.A. N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 8 Sim 4 dias (PQT/MB) N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 9 Sim 1 mês (PQT/MB) N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 10 Não N.A. N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 11 Não N.A. Alta - - Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 12 Sim 9 meses
(PQT/MB)
N.A. - - Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 13 Sim 4 meses
(PQT/MB)
N.A. - - Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 14 Sim 1 mês (PQT/MB) N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 15 Sim 2 meses
(PQT/MB)
N.A. - + Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 16 Não N.A. Alta - + Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 17 Sim 24 meses
(Esquema
Alternativo há 3
meses)
N.A. - + Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 18 Não N.A. N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 19 Sim
(1)
11 meses N.A - + Negativa Negativa N.A. N.A.
147
TABELA 31 – RESUMO DOS DADOS DOS PACIENTES DOADORES DE HANSENOMA NO QUE REFERE AO
TRATAMENTO, BACILOSCOPIA, PCR E RFLP
conclusão
BACILOSCOPIA
PACIENTE TRATAMENTO
PERÍODO
TRATAMENTO
ALTA
Sobrenadante Sedimento
PCR
hsp65
PCR
rpoB
RFLP
hsp65
RFLP
rpoB
CPPI 20 Não N.A. N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 21 Sim 1 mês (PQT/MB) N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
CPPI 22 Não N.A Alta - - Negativa Negativa N.A. N.A.
CPPI 23 Não N.A. N.A. + + Positiva Positiva M. leprae M. leprae
NOTAS: N.A. = não aplicável.
+ = presença de bacilos ácido-resistentes.
- = ausência de bacilos ácido-resistentes.
PQT/MB = poliquimioterapia esquema multibacilar.
(1) Paciente teve diagnóstico de hanseníase indeterminada com baciloscopia negativa, tratou por seis meses com PQT/PB (poliquimioterapia esquema
paucibacilar). Dois meses depois, teve diagnóstico de hanseníase virchowiana, com baciloscopia positiva e recebeu PQT/MB. O período de
tratamento até a coleta foi de cinco meses.
148
Os produtos de RFLP cortados pelas diferentes enzimas de restrição foram
avaliados pela análise fenética, usando o índice de Jaccard e a técnica aglomerativa
UPGMA (Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Means). Para o gene
hsp65 cortado com a enzima Bst EII verificou-se que as amostras clínicas formaram
três grupos com distância de 100% de dissimilaridade. O primeiro agrupou a cepa
CPPI 1, o segundo separou a cepa M. sp e o terceiro grupo reuniu 12 amostras
clínicas (figura 26). No dendrograma construído com os dados das cepas referência
observou-se que M. fortuitum subsp. fortuitum, M. gordonae, M. bovis e M.
tuberculosis formaram um único cluster e M. phlei, M. avium e M. kansasii também
apresentam 100% de similaridade (figura 27).
FIGURA 26 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Bst EII, AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR
COM OS INICIADORES PARA O GENE hsp65, DAS AMOSTRAS
CLÍNICAS
149
FIGURA 27 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Bst EII, AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR
COM OS INICIADORES PARA O GENE hsp65, DAS CEPAS
REFERÊNCIAS
O corte com a enzima de restrição Hae III do produto de PCR das amostras
clínicas formou dois clusters, sendo que 12 amostras se reúnem num único cluster e
as amostras CPPI 1 e M. sp se agruparam com cerca de 50% de similaridade (figura
28). Para as cepas referências esta enzima permite a separação de todas as
espécies, com exceção de M. tuberculosis e M. bovis (figura 29).
150
FIGURA 28 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Hae III, AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR
COM OS INICIADORES PARA O GENE hsp65, DAS AMOSTRAS
CLÍNICAS
151
FIGURA 29 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Hae III, AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR
COM OS INICIADORES PARA O GENE hsp65, DAS CEPAS
REFERÊNCIAS
Para o gene rpoB as amostras clínicas se dividem em três grupos ao ser
cortado pela enzima Bst UI, sendo que 13 amostras se reúnem num único cluster e a
amostra CPPI 1 apresenta 80% de similaridade e M. sp se isola completamente.
Para as cepas referências M. tuberculosis e M. bovis apresentam 100% de
similaridade, assim como M. gordonae e M. szulgai (figuras 30 e 31).
152
FIGURA 30 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Bst UI, AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR
COM OS INICIADORES PARA O GENE rpoB, DAS AMOSTRAS
CLÍNICAS
153
FIGURA 31 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Bst UI, AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR
COM OS INICIADORES PARA O GENE rpoB, DAS CEPAS
REFERÊNCIAS
O dendrograma construído com os dados de RFLP com a enzima de
restrição Hae III mostra 100% de similaridade entre todas as amostras clínicas com
exceção do isolado CPPI 1 (figura 32). Dentre as cepas referências M. fortuitum
subsp. fortuitum, M. phlei e M. smegmatis apresentaram 100% de similaridade, o
que foi também observado para M. kansasii/M. leprae, M. bovis/M. tuberculosis e M.
avium/M.terrae (figura 33).
154
FIGURA 32 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Hae III, AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR
COM OS INICIADORES PARA O GENE rpoB, DAS AMOSTRAS
CLÍNICAS
155
FIGURA 33 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM A ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Hae III, AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR
COM OS INICIADORES PARA O GENE rpoB, DAS CEPAS
REFERÊNCIAS
156
O dendrograma construído para as amostras clínicas, levando em
consideração os dados obtidos para os dois genes e enzimas de restrição, mostra a
formação de quatro grupos. Um grupo reuniu 12 isolados, a cepa CPPI1a foi
separada em um grupo, assim como a cepa CPPI1 e a cepa M. sp (figura 34). Para
as cepas referências, graças a somatória dos dois genes e das três enzimas de
restrição foi possível verificar a individualização de todas as espécies de
Mycobacterium, com exceção de M. bovis e M. tuberculosis (figura 35).
Quando os dados das amostras clínicas são comparados às cepas
referência verifica-se que o isolado M. sp se agrupa ao cluster de M. kansasii, a
amostra clínica CPPI 1 se agrupa ao cluster de M. szulgai e as demais amostras se
agrupam à M. leprae (figura 36).
FIGURA 34 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM TRÊS ENZIMAS DE
RESTRIÇÃO (Hae III, Bst UI, Bst EII), AOS FRAGMENTOS DE DNA
RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES PARA OS
GENES rpoB E hsp65, DAS AMOSTRAS CLÍNICAS
157
FIGURA 35 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM TRÊS ENZIMAS DE
RESTRIÇÃO (Hae III, Bst UI, Bst EII), AOS FRAGMENTOS DE DNA
RESULTANTES DA PCR COM OS INICIADORES PARA OS
GENES rpoB E hsp65 PARA CEPAS REFERÊNCIAS
158
FIGURA 36 – DENDROGRAMA CONSTRUÍDO COM OS DADOS OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM
TRÊS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (Hae III, Bst UI, Bst EII), AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA
PCR COM OS INICIADORES PARA OS GENES rpoB E hsp65 PARA AMOSTRAS CLÍNICAS E CEPAS
REFERÊNCIA
159
6 DISCUSSÃO
Para a classificação da hanseníase e avaliação da resposta imunológica do
paciente ao M. leprae usa-se a mitsudina ou o antígeno de Mitsuda. No Brasil, o
Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos (CPPI), é o único fornecedor
deste antígeno para o Ministério da Saúde, e sua produção é realizada a partir de
hansenomas de pacientes com hanseníase virchowiana.
Utilizando intradermicamente o antígeno de Mitsuda, pode-se observar in
vivo dois tipos de hipersensibilidade tardia, conhecidas como reação de Fernandez e
reação de Mitsuda. A reação de Mitsuda depende da concentração bacilar e da
integridade dos bacilos que compõem a mitsudina (ARRUDA et al., 1985).
Ao realizar a contagem bacilar, através da observação em microscópio, de
uma suspensão corada, não é possível identificar o M. leprae, pois, outras
micobactérias, se presentes, também irão se corar.
Para verificar se os hansenomas, a matéria-prima para a produção da
mitsudina, continham apenas M. leprae, realizou-se a identificação micobactérias,
extraídas dos tecidos, por biologia molecular.
Escolheram-se dois métodos para a identificação de micobactérias, o PCR-
RFLP de fragmento do gene hsp65 e PCR-RFLP de fragmento do gene rpoB. A
seleção das seqüências-alvo foi baseada no número de espécies já identificadas
com estes métodos em estudos prévios, incluindo M. leprae. Muitas seqüências-alvo
estudadas não incluem M. leprae, pois os estudos foram baseados em
micobactérias isoladas de meios de cultura. O alvo mais usado é o gene codificante
para 16S RNAr, mas, algumas espécies não podem ser distinguidas e os resultados
podem ser ambíguos devido a presença de dois genes 16S RNAr diferentes em um
organismo. Além disso, o gene hsp65 para uso em PCR-RFLP é o alvo mais
investigado e validado. Optou-se por dois métodos ao invés de apenas um, pois,
segundo HÄFNER et al. (2004), a identificação correta de organismos necessita da
combinação de dois ou mais métodos. Conforme os autores, resultados
discordantes podem ser obtidos com diferentes métodos.
No estudo realizado, identificou-se M. szulgai, em um dos 23 hansenomas, e
M. kansasii, na cultura obtida a partir de lesão profunda de paciente com hanseníase
virchowiana, o que correspondeu a 8% das amostras estudadas.
160
A presença de micobactérias na pele de pacientes com hanseníase foi
investigada por SALEM et al. (1989). O estudo envolveu, além de pacientes
hansenianos, indivíduos saudáveis. As amostras analisadas para pacientes com
hanseníase foi biópsia de pele e para indivíduos saudáveis foi o lavado de antebraço
e mãos. Após o processamento das amostras, as mesmas foram inoculadas em
meio Löwenstein-Jensen (LJ), LJ acrescido de piruvato e LJ acrescido de citrato
férrico amoniacal e a identificação dos isolados foi baseada na velocidade de
crescimento, produção de pigmentos, temperatura de crescimento, testes
bioquímicos e no perfil de ácidos micólicos. As espécies, M. avium-intracellulare, M.
terrae, M. simiae, M. gordonae, M. scrofulaceum, M. szulgai, M. flavescens e M.
fortuitum, além de isolados não identificados, foram encontradas em 37,5% das
amostras nos indivíduos saudáveis. Nos pacientes com hanseníase apenas
observou-se M. avium-intracellulare, que corresponderam a 11,1% das amostras.
Um outro estudo, com o objetivo de avaliar a flora micobacteriana em
pacientes hansenianos, foi realizado por FANDINHO et al. (1991). As formas clínicas
incluídas no estudo foram tuberculóide-tuberculóide, borderline-tuberculóide,
borderline-borderline, lepromatosa-lepromatosa e indeterminada, sendo todos os
pacientes não tratados. As amostras selecionadas foram linfa de dedos das mãos e
lavado de mãos. O material coletado foi inoculado em meio LJ, LJ acrescido de
piruvato e LJ acrescido de citrato férrico amoniacal e os isolados foram identificados
por métodos convencionais. Em 13 de 89 pacientes foram identificadas
micobactérias, incluindo dois casos em pacientes com a forma indeterminada, um
caso com a forma tuberculóide-tuberculóide, dois casos com a forma borderline-
borderline e oito casos com a forma lepromatosa-lepromatosa. Na linfa foram
encontradas micobactérias em três amostras, que corresponderam as formas
indeterminada, tuberculóide-tuberculóide e borderline-borderline. As micobactérias
identificadas foram M. gordonae, micobactéria escotocromogênica de crescimento
lento e micobactéria de crescimento rápido. No lavado de mãos foram encontradas
micobactérias nas formas indeterminada, borderline-borderline e lepromatosa-
lepromatosa, que foram M. fortuitum, M. avium e M. scrofulaceum.
SHARMA et al. (1995) isolaram e caracterizaram micobactérias cultiváveis
de pele de pacientes com hanseníase. O estudo envolveu pacientes hansenianos
com as formas borderline-borderline (BB), borderline-lepromatosa (BL), lepromatosa-
161
lepromatosa (LL), tuberculóide-tuberculóide (TT), borderline-tuberculóide (BT), e
indeterminada (I), assim como pessoas sãs. As amostras utilizadas foram biópsia e
linfa de lesões no caso de hansenianos e biópsia e linfa de pele normal nos
controles. O método de identificação foi baseado em testes bioquímicos. De 129
amostras foram isolados 17 micobactérias em pacientes com hanseníase e dois em
50 indivíduos saudáveis. Os isolados foram: quatro isolados de M. scrofulaceum
(todos de casos LL); três de M. avium (dois de casos LL e um em indivíduo
saudável); um do complexo M. avium-intracellulare (um caso LL); dois de M.
gordonae (um de BB e um de BT); M. flavescens (de BL); um de M. fortuitum (de
BL); um de M. chelonae (de um caso de recidiva de BT); dois de M. smegmatis (em
BL) e quatro de M. phlei (um BT, um BL, um LL e um em indivíduo saudável).
Portanto, trabalhos anteriores demonstravam a presença de micobactérias,
principalmente M. avium e M. scrofulaceum, na pele de pacientes com hanseníase
virchowiana. Os métodos de identificação utilizados nestes trabalhos, baseados no
isolamento de microrganismos em meios de cultura, não permitiam detectar M.
leprae, se presente, visto que, este organismo não é cultivável in vitro.
A metodologia padronizada no presente trabalho para a identificação de
micobactérias usou num primeiro tempo cepas de referência e foi avaliando
comparativamente os resultados aqui obtidos com aqueles de outros autores, que
também utilizaram o método PCR-RFLP para o gene hsp65 ou o método PCR-RFLP
para o gene rpoB e verificaram-se variações.
Para o gene hsp65, o tamanho dos fragmentos de restrição gerados mostrou
uma variação de tamanho comparado com aqueles anteriormente publicados (ver
anexos 10 a 19).
Nos trabalhos realizados por TELENTI et al. (1993), TAYLOR et al. (1997) e
DEVALLOIS, GOH e RASTOGI (1997), fragmentos menores que 60 pb foram
desconsiderados da análise. No presente trabalho o uso do gel de poliacrilamida
como substrato para eletroforese permitiu a detecção de fragmentos inferiores a 60
pb e conseqüentemente permitiu melhor distinção entre espécies que não poderiam
ser separadas como, por exemplo, M. fortuitum (fragmentos observados: 135, 116,
59 e 52) e M. smegmatis (fragmentos observados: 131, 114, 58).
BRUNELLO et al. (2001) descreveram para o PCR-RFLP do gene hsp65
com a enzima Hae III três fragmentos para M. fortuitum e para M. avium, enquanto,
162
as espécies estudadas nesse trabalho apresentaram quatro e dois fragmentos,
respectivamente (ver anexo 17).
Também, para o gene rpoB, o tamanho dos fragmentos gerados para as
cepas de referência mostrou uma variação em relação àqueles anteriormente
publicados (ver anexos 20 e 21).
O algoritmo construído a partir do RFLP do gene rpoB por KIM et al. (2001)
foi baseado na seqüência de nucleotídeos e não na análise dos fragmentos
visualizados em gel de agarose ou poliacrilamida. Conforme HÄFNER et al. (2004) o
perfil de restrição baseado na seqüência não necessariamente reflete o perfil
observado no gel, o que de fato se observou.
Para algumas espécies como M. fortuitum, M. phlei, M. smegmatis, M.
szulgai e M. terrae o terceiro fragmento descrito por KIM et al. (2001) com a enzima
Hae III não foi detectado no presente estudo. A cepa M. fortuitum ATCC 6841, usada
no presente trabalho, apresentou um perfil de restrição com a enzima Bst UI mais
próximo àquele apresentado pela cepa M. fortuitum ATCC 49403. A cepa M.
fortuitum ATCC 6841 apresentou o perfil de digestão 193, 87, enquanto o perfil
descrito para a cepa M. fortuitum ATCC 6841 era 207, 55 e para a cepa M. fortuitum
ATCC 4903 era de 207, 79.
Ocasionalmente, fragmentos de menor intensidade e que não possuíam
correspondentes nos algoritmos propostos previamente foram observados e nestes
casos, foram desconsiderados. Admite-se que esses fragmentos sejam resultado de
amplificação inespecífica.
Uma das limitações do método PCR-RFLP é a falta de padronização, o que
faz os padrões de digestão, até agora, descritos difíceis de comparar (HÄFNER et
al., 2004).
Alguns dos fatores principais que podem alterar a reprodutibilidade da
técnica são: o tempo de corrida, concentração do gel e do tampão, concentração de
DNA-alvo ou enzima, temperatura e tempo de digestão (ARIAS; INFANTE-
MALACHIAS, 2001). Segundo BARTLETT (2003) embora a mobilidade eletroforética
da fita dupla de DNA é inversamente proporcional ao logaritmo do tamanho do
fragmento, esta relação pode ser alterada pelo conteúdo GC e seqüência.
Outras limitações do método são a descrição de novos padrões para novas
espécies e o alto polimorfismo apresentado por algumas espécies como M. kansasii
163
e M. gordonae, o que faz o padrão de digestão difícil de interpretar (HÄFNER et al.,
2004).
Frente a estas limitações, HÄFNER et al. (2004) sugerem a construção de
coleções de cepas e bancos de dados próprios quando se emprega PCR-RFLP,
proposta que renovamos aqui.
Os dois métodos empregados não permitem a diferenciação dos membros
do complexo M. tuberculosis, porém a distinção entre M. tuberculosis e M. bovis é
realizada com PCR-RFLP do gene gyrB como descrito por KASAI, EZAKI e
HARAYAMA (2000) e CHIMARA, FERRAZOLI e LEÃO (2004).
Quando se analisa o perfil de restrição produzido pelas amostras clínicas,
verifica-se a presença de fragmentos de baixa intensidade assim como fragmentos
em intensidade significativa e diferente daqueles que caracterizam M. leprae, M.
szulgai ou M. kansasii. Estes fragmentos produziram perfis que não correspondem a
nenhum dos perfis apresentados em trabalhos prévios, embora sendo difícil essa
comparação, por motivos já citados, provavelmente estes fragmentos sejam
resultado de amplificações inespecíficas. Informações citadas a seguir em trabalhos
prévios reforçam esta hipótese.
TAYLOR et al. (1997) afirmam a amplificação do fragmento do gene hsp65
para Nocardia braziliensis, Streptomyces albus e Rhodococcus equi e
provavelmente com outros gêneros de actinomicetos. DEVALLOIS, GOH e
RASTOGI (1997) relatam que o gene hsp65 está presente em todas as
micobactérias e algumas outras espécies como Nocardia spp.
LEE et al. (2000) verificaram a amplificação de um fragmentos de 360 pb do
gene rpoB em todas as micobactérias estudadas e em algumas outras bactérias
como Nocardia e Rhodococcus. KIM et al. (2004) demonstraram a amplificação de
um fragmento de 136 pb do gene rpoB em micobactérias assim como em cepas de
Tuskamurella, Rhodococcus e Nocardia.
Estas amplificações com espécies diferentes de micobactérias ocorreram
por que os gêneros Corynebacterium, Propionibacterium, Tsukamurella e
Actinomyces são relacionados filogeneticamente a micobactérias. Os membros do
gênero Mycobacterium formam uma sublinhagem dos actinomycetos e outros
gêneros incluídos são: Rhodococcus, Nocardia e Streptomyces. Porém, a
identificação de espécies outras que micobactérias não limita a aplicação do método
164
por PCR-RFLP, pois, os padrões de restrição de espécies não micobacterianas
podem ser distinguidos daqueles de micobactérias (TAYLOR et al., 1997). Portanto,
a inclusão de espécies relacionadas ao gênero Micobacterium nos métodos PCR-
RFLP permite a correta identificação de espécies.
A amostra CPPI 1 com o método PCR-RFLP hsp65 apresentou o perfil de
restrição compatível com M. szulgai e enquanto com o método PCR-RFLP rpoB
apresentou perfil de restrição de M. leprae e M. szulgai. A princípio, esta diferença
poderia ser devido a frações diferentes utilizadas na amplificação. Para o gene
hsp65 usou-se a fração sedimento e para o gene rpoB a fração sobrenadante. Mas,
os resultados com a fração sedimento para o gene rpoB mostrou os mesmos
resultados que a fração sobrenadante (dados não mostrados). Portanto, a diferença
entre os resultados dos métodos não se deve ao uso de frações diferentes de
amostras. Também, realizou-se, para algumas amostras, a identificação de
micobactérias na fração sobrenadante e sedimento e verificou-se M. leprae em
ambas as frações. Como referido anteriormente, resultados conflitantes podem ser
obtidos entre métodos e por isso, a importância de usar dois ou mais métodos de
identificação.
No dendrograma da figura 34 a amostra CPPIa (perfil correspondente ao M.
leprae) ficou separada das demais amostras que também correspondiam ao M.
leprae, pois, M. leprae foi identificado apenas com PCR-RFLP rpoB, enquanto, nas
demais amostras, em ambos os genes o mesmo organismo foi identificado.
Ao analisar o perfil de restrição obtido com as amostras clínicas, cuja
identificação forneceu M. leprae, não se observou polimorfismo, como também não
se observou polimorfismo entre as cepas de M. leprae das amostras clínicas e as
cepas de M. leprae de referência, indicando que todas as cepas de M. leprae
estudadas são idênticas.
WILLIAMS, GILLIS e PORTAELS (1990) aplicaram a análise de RFLP em
dez isolados de M. leprae, incluindo seis isolados humanos de quatro regiões
distintas e um isolado e macaco Mangabey e três isolados de tatus, para avaliar a
relação genética entre os isolados. A digestão do DNA cromossômico por
endonucleases de restrição (Eco RI, Bst EII, Pst I e Pvu I) foi analisado usando
sondas de DNA que codificam para as proteínas 12KD, 18KD, 28KD, 65KD e 70KD
assim como sondas contendo seqüências repetidas específicas ao M. leprae. A
165
comparação das autoradiografias mostrou que os padrões RFLP foram todos
idênticos, indicando que estes isolados não contêm polimorfismo com respeito aos
sítios de restrição analisados. Além disso, o padrão RFLP de dois isolados humanos
de M. leprae permaneceram inalterados após três ciclos de infecção experimental
em tatu. Os resultados indicaram que os isolados de M. leprae foram indistinguíveis
e sugerem homogeneidade entre os membros desta espécie.
Segundo SHIN et al. (2000) outros trabalhos, em que a análise RFLP
usando várias sondas foi empregada, não mostraram diferenças entre os isolados
de M. leprae. Padrões de polimorfismo de conformação de fita simples e seqüências
de DNA da região entre 16S RNAr (RNA ribossômico) e 23S RNAr também foram
idênticas em M. leprae de diferentes pacientes hansenianos multibacilares. O relato
de uma classe de seqüências repetidas específica ao M. leprae, RLEP, sugeriu
outras possibilidades de diferenciação entre isolados de M. leprae, pois, a
amplificação por PCR destas seqüências mostrou diferentes intensidades e a
ausência de seqüências RLEP no gene pol(A) de certos isolados de M. leprae.
MATSUOKA et al. (2000) estudaram a diversidade genética e a distribuição
global de 51 isolados de M. leprae. Os isolados foram obtidos de pacientes de 12
regiões geográficas diferentes do mundo e dois foram obtidos de duas fontes não
humanas. A análise se iniciou pela amplificação por PCR do gene rpoT seguido do
seqüenciamento. Os isolados foram classificados em dois grupos baseados no
número de cópias de seqüências repetidas em série. Os isolados do Japão (exceto
Okinawa) e Coréia pertenceram a um grupo (quatro seqüências repetidas), enquanto
aqueles do sudeste Asiático, Brasil, Haiti e Okinawa no Japão pertenceram ao
segundo grupo (três seqüências repetidas). M. leprae obtido de tatu e macaco
Mangabey revelou o segundo genótipo.
SHIN et al. (2000) identificaram seqüências repetidas TTC no genoma de M.
leprae. O conjunto de primers designados para amplificar a região flanqueando as
seqüências repetidas TTC revelou produtos de PCR de tamanhos diferentes,
indicando que o número de cópias de seqüências repetidas em cada lócus pode ser
variável entre as cepas de M. leprae de pacientes hansenianos multibacilares. A
análise da seqüência da região de seqüências repetidas TTC em cada cepa de M.
leprae mostrou uma variação de 10 a 37 cópias.
166
MATSUOKA et al. (2004) encontraram isolados de M. leprae com diferentes
números de cópias de seqüência repetidas TTC entre residentes do mesmo
domicílio em povoados onde a hanseníase é endêmica e que alguns contatos
abrigavam bacilos com um genótipo diferente daquele abrigado pelo paciente. O
número de cópias de seqüências repetidas variou de 7 a 29 entre os isolados de M.
leprae.
GROATHOUSE et al. (2004) identificaram nove seqüências repetidas em
quatro isolados de M. leprae propagados em tatus e demonstraram que a
amplificação destas seqüências combinada com métodos automatizados para
eletroforese e para determinação de tamanho permitiu a discriminação entre
isolados de M. leprae.
TRUMAN et al. (2004) avaliaram o número de cópias de cinco diferentes
seqüências repetidas em série, incluindo seqüência repetida TTC estudada
previamente, em 12 isolados de M. leprae derivados de pacientes de regiões
diferentes assim como de tatus e macaco Mangabey e, também, examinaram a
estabilidade do número de cópias destas seqüências com a passagem de cepas em
camundongos nude e tatus. Foi encontrado diversidade em quatro seqüências
repetidas no genoma de M. leprae. Relativamente pequena variação foi observada
com a transferência interespécie de bacilos ou com a passagem a curto prazo de
cepas em camundongos nude ou tatu. A variação genotípica foi mais comum após
propagação a longo prazo em tatus. A maioria dos genótipos permaneceram estável
em passagens, mas, a cepa M. leprae Thai-53 mostrou notável variabilidade em oito
anos de passagem em camundongos nude. A cepa M. leprae Thai-53 foi isolada por
M. Matsuoka (National Infections Disease Institute, Tokyo, Japão) em 1982 de
leproma de um paciente tailandês e vem sendo mantida em passagens contínuas
em camundongo nude, ou seja, há mais de 20 anos.
Segundo HAILE e RYON (2004) são necessários 10
4
organismos por grama
de tecido para detecção por microscopia, portanto, a sensibilidade de exames
microscópicos é baixa. A técnica de PCR é caracterizada pela sua alta sensibilidade,
uma vez que a técnica, teoricamente, é sensível para detectar DNA de um único
organismo em condições otimizadas. E estudos desde os anos 90 demonstram que
a PCR é muito mais sensível que o exame microscópico para a detecção de M.
leprae, visto que amostras com IB (índice bacteriológico) igual a zero apresentaram
167
com freqüência PCR positiva. Alguns trabalhos sugeriram que a técnica poderia
detectar um único bacilo, determinado por microscopia, mas, é possível que o
número de microrganismos seja maior que aquele determinado por microscopia.
Neste estudo, amostras em que não foram detectados bacilos ácido-
resistentes ou que apresentavam raros bacilos na microscopia, os DNAs também
não foram amplificados. Nas amostras em que não foram observados bacilos, pode-
se admitir que de fato nenhum bacilo estaria presente ou poderiam estar em número
muito pequeno, o que não permitiu sua amplificação. Alternativamente, a não
amplificação das amostras com nenhum ou poucos bacilos poderia ser devido a
outros fatores tais como: a amostra coletada poderia não ser representativa da lesão
ou de bacilos e a área da lesão escolhida para PCR poderia não conter bacilos
devido a uma distribuição irregular de M. leprae em lesões. Depois de coletada, as
amostras são colocadas em frascos contendo salina fenolada 0,5% e não se sabe
quais são os efeitos desta solução sobre o DNA do bacilo. Para diminuir o risco de
contaminação do manipulador foi realizada autoclavação por 120ºC/20 minutos. Este
processo poderia inviabilizar o DNA, ou liberar o material genético na solução e
consequentemente ao ser descartada ter-se-ia perdido o DNA da amostra, pois,
alguns protocolos de extração de DNA de micobactérias utilizam temperaturas não
superiores a 100ºC por 10 minutos para liberar o DNA. Depois da esterilização as
amostras são armazenadas a -20ºC em meio da mesma solução fisiológica fenolada
até o momento do uso, podendo ter aí permanecido por meses a anos. Segundo
SCOLLARD et al. (2006) as amostras adequadas para PCR são: amostras frescas e
processadas imediatamente, congeladas a -80ºC, fixadas em fixadores adequados
por tempo determinado e/ou mantidas em parafina. Portanto, as condições e período
de armazenamento dos hansenomas poderiam não ser ideais para preservação do
DNA. Além disso, segundo SCOLLARD et al. (2006) biópsias de pacientes tratados
não são amostras adequadas para PCR. Observou-se no presente trabalho que
amostras provenientes de pacientes sem tratamento ou em tratamento iniciado há
um mês foram positivas para PCR. As amostras de pacientes que já haviam
completado o tratamento ou amostras de pacientes em tratamento por dois ou mais
meses não foram positivas para PCR. Dados de WILLIAMS et al. (1992) corroboram
nossos resultados, pois demonstraram que o sinal da PCR foi diminuído ou ausente
em pacientes hansenianos após dois meses de tratamento. Conforme SCOLLARD,
168
GILLIS e WILLIAMS (1998) o tratamento com antimicobacterianos como rifampicina
rapidamente mata o patógeno e conduz a degradação do DNA entre dois a três
meses. Em adição, WIT et al. (1991) relataram que a resposta imune do hospedeiro
poderia degradar o DNA de M. leprae e YOON et al. (1993) sugerem a presença de
inibidores de PCR em tecidos de pele.
Portanto, acredita-se que a combinação destes vários fatores poderia
responder o porquê da técnica de PCR foi negativa para as amostras com poucos
bacilos.
Ressalva-se que os métodos de PCR-RFLP para o gene hsp65 e rpoB são
viáveis para uso na seleção de hansenomas para produção de mitsudina. Pois, a
PCR foi positiva para as amostras com muitos bacilos e é isso que se procura nos
hansenomas, além daqueles que contenham apenas M. leprae.
Portanto, a metodologia aqui padronizada poderá ser aplicada para a
seleção de amostras adequadas para a produção do antígeno de Mitsuda, ou seja,
amostras com numerosos bacilos, pois amostras com nenhum ou poucos bacilos
estariam diluindo o preparado, e amostras contendo apenas M. leprae, pois a
presença de outras micobactérias irão fornecer reação cruzada e respostas falso-
positiva.
Além disso, a metodologia poderá ser utilizada como auxiliar no diagnóstico
da hanseníase. Segundo SCOLLARD et al. (2006) a PCR é útil quando bacilos são
vistos, mesmo se eles não são numerosos e, nesta situação não é garantia que a
PCR será positiva, mas pode auxiliar. Deve ser levado em consideração para o
diagnóstico as condições de colheita e armazenamento que preservem o DNA do
organismo. O tempo de tratamento do paciente também deve ser levado em
consideração ao pedir um diagnóstico de hanseníase por PCR. Para evitar erros na
amostragem poderão ser realizados estudos de padronização do tamanho da
biópsia ou quando PCR negativa, repetir testes com nova amostra, estudos estes
que não puderam ser realizados neste trabalho devido a indisponibilidade de
amostra. Além disso, poderão ser testados métodos de concentração de bacilos
para aumentar a capacidade de detecção. Também, outros métodos de detecção de
fragmentos amplificados, como a hibridização, poderiam ser examinados para
aumentar a sensibilidade dos métodos.
169
Embora a mitsudina esteja entrando em desuso na prática clínica, por outro
lado, a mitsudina provavelmente é o único antígeno de teste cutâneo que reflete a
capacidade de um indivíduo de gerar uma resposta granulomatosa a antígenos
micobacterianos. Neste contexto, a reação de Mitsuda se torna uma ferramente
valiosa de pesquisa em áreas de enorme impacto sobre a saúde humana, tais como
a imunologia e a genética.
Quanto à identificação de micobactérias, a maioria dos trabalhos já
publicados não inclui M. leprae, por ser um organismo não cultivável. Neste estudo,
buscou-se identificar especialmente M. leprae. Um dos genes alvos usados foi o
gene hsp65, que é um dos alvos aplicados para a identificação de micobactérias em
geral e para identificar especificamente M. leprae. Por outro lado, o gene rpoB não é
tido na literatura como específico para a identificação de M. leprae; nosso estudo
sugere que este gene também possa ser de importância como alvo específico para a
identificação do bacilo de Hansen.
Este trabalho pode vir a contribuir com o aumento da qualidade da mitsudina
até então produzida, já que apenas amostras contendo apenas M. leprae podem ser
selecionadas e incluídas no preparo do antígeno de Mitsuda. A detecção de outras
espécies de micobactérias contaminantes das amostras biológicas utilizadas como
fonte primária de mitsudina reforça a necessidade de desenvolvimento de antígenos
alternativos, mais específicos em comparação com o antígeno de Mitsuda.
170
7 CONCLUSÕES
a) Ambos os protocolos avaliados para a extração de DNA de micobactérias
cultiváveis fornecerem DNA em boa quantidade e qualidade para uso na reação
em cadeia da polimerase (PCR);
b) Quanto se optar pelo emprego de PCR-RFLP cepas de referência devem ser
utilizadas para compor o perfil padrão a ser usado para a identificação de
isolados clínicos;
c) A utilização de mais de um método de análise molecular é recomendada, uma
vez que os resultados podem ser complementares.
d) Os métodos PCR-RFLP do gene hsp65 e do gene rpoB permitiram a
identificação das espécies de micobactérias estudadas, com a exceção de M.
bovis e M. tuberculosis;
e) Em 12 dos 23 hansenomas (52,17%) foram encontrados bacilos ácido-
resistentes quando avaliados por microscopia, na fração sobrenadante, fração
esta usada na produção de mitsudina.
f) A PCR foi positiva para micobactérias em 12 dos 23 hansenomas (52,17%), tanto
para o fragmento de 439 pares de base (pb) do gene hsp65 e para o fragmento
de 342 pb do gene rpoB;
g) Em um hansenoma identificou-se M. szulgai por PCR-RFLP do gene hsp65 e, M.
szulgai e M. leprae para PCR-RFLP do gene rpoB. Nos demais hansenomas
identificou-se M. leprae;
h) Não se observou polimorfismo entre os isolados de M. leprae estudados;
i) Na cultura de micobactérias obtida de lesão cutânea profunda de paciente com
hanseníase virchoviana identificou-se M. kansasii;
j) A metodologia padronizada poderá ser utilizada para a triagem de hansenomas
para o preparo de mitsudina com o objetivo de selecionar aquelas com
numerosos bacilos e contendo apenas M. leprae.
k) A metodologia poderá vir a ser utilizada, também, como auxiliar no diagnóstico
da hanseníase, desde que sejam observadas as condições adequadas de
amostras para PCR.
171
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185
ANEXOS
ANEXO 1 - PROTOCOLO PARA RECUPERAÇÃO E
CONGELAMENTO DE CEPAS DE Mycobacterium................
187
ANEXO 2 - PROTOCOLO PARA RECUPERAÇÃO DE BIOMASSA.........
188
ANEXO 3 - PROTOCOLO PARA COLORAÇÃO DAS LÂMINAS PELO
MÉTODO DE ZIEHL-GABBET................................................
189
ANEXO 4 - PROTOCOLO PARA EXTRAÇÃO DE DNA............................
190
ANEXO 5 - PROTOCOLO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE BIÓPSIAS
DE PELE ADAPTADO DE MARTÍNEZ (2005)........................
193
ANEXO 6 - PROTOCOLO PARA QUANTIFICAÇÃO E
DETERMINAÇÃO DA PUREZA DO DNA...............................
194
ANEXO 7 - PROTOCOLO PARA ELETROFORESE EM GEL DE
AGAROSE...............................................................................
195
ANEXO 8 - DIGESTÃO COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO........................ 197
ANEXO 9 - PROTOCOLO PARA ELETROFORESE EM GEL DE
POLIACRILAMIDA SEGUNDO SAMBROOK e RUSSELL
(2001), BARKER (2002) e BARTLETT (2003).........................
198
ANEXO 10
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII ENTRE O PRESENTE
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR TELENTI et
al. (1993)..................................................................................
201
ANEXO 11
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III ENTRE O PRESENTE
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR TELENTI et
al. (1993)..................................................................................
202
ANEXO 12
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII ENTRE O PRESENTE
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR TAYLOR et
al. (1997)..................................................................................
203
ANEXO 13
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III ENTRE O PRESENTE
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR TAYLOR et
al. (1997)..................................................................................
204
ANEXO 14
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII ENTRE O PRESENTE
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR
DEVALLOIS, GOH e RASTOGI et al. (1997)..........................
205
ANEXO 15
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III ENTRE O PRESENTE
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR
DEVALLOIS, GOH e RASTOGI et al. (1997)..........................
206
ANEXO 16
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII ENTRE O PRESENTE
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR BRUNELLO
et al. (2001)..............................................................................
207
ANEXO 17
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III ENTRE O PRESENTE
186
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR BRUNELLO
et al. (2001)..............................................................................
208
ANEXO 18
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII DE M. leprae ENTRE
O PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS
POR RASTOGI, GOH e BERCHEL (1999).............................
209
ANEXO 19
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III M. leprae ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR
RASTOGI, GOH e BERCHEL (1999)......................................
210
ANEXO 20
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE rpoB COM A ENZIMA Bst UI ENTRE O PRESENTE
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR KIM et al.
(2001).......................................................................................
211
ANEXO 21
- TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO
GENE rpoB COM A ENZIMA Hae III ENTRE O PRESENTE
TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR KIM et al.
(2001).......................................................................................
212
ANEXO 22
- MATRIZ DISJUNTIVA CONSTRUÍDA COM OS DADOS
OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM
TRÊS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (Hae III, Bst UI, Bst EII),
AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA PCR
COM OS INICIADORES PARA OS GENES rpoB E hsp65
PARA AMOSTRAS CLÍNICAS E CEPAS REFERÊNCIA........
213
187
ANEXO 1 – PROTOCOLO PARA RECUPERAÇÃO E CONGELAMENTO DE
CEPAS DE Mycobacterium
1. Serrar a base da parte superior da ampola com lixa;
2. Quebrar a ampola no lugar serrado, protegendo com gaze embebida em álcool
70%;
3. Verter cerca de 5 ml da solução de glicerol a 10% em tubo cônico de 50 ml.
Transferir com pipeta pasteur estéril, lentamente, um pouco da solução de glicerol a
10% para a ampola e homogeneizar para ressuspensão do liófolo. Adicionar mais
um pouco de solução de glicerol e transferir o conteúdo para tubo cônico de 15 ml
com o auxílio de pipeta pasteur. Enxaguar a ampola com solução de glicerol para
remoção de microrganismos aderidos a superfície interna da ampola e transferir o
conteúdo para o tubo através da pipeta pasteur;
4. Homogeneizar a suspensão através da agitação em vortex;
5. Transferir, com auxílio de alça esterilizada, a suspensão para seus respectivos
tubos de meio Löwenstein-Jensen (LJ) (quatro tubos para cada espécie). Esterilizar
a alça no final do processo da semeadura de cada espécie ou sempre que
necessário. Para a espécie Mycobacterium smegmatis o meio de recuperação foi o
ágar Brain Heart Infusion BHI (quatro tubos) e caldo BHI (quatro tubos). Transferir
três alçadas da suspensão de células em glicerol para cada um dos tubos;
6. Transferir, com auxílio de pipeta pasteur, aproximadamente 1 ml da suspensão
restante para flaconetes de criopreservação;
7. Identificar os tubos semeados e os flaconetes com o nome da espécie e data;
8. Colocar os flaconetes a -70ºC para conservação de microrganismos;
9. Incubar os tubos inoculados em estufa a 37ºC até o desenvolvimento de colônias.
188
ANEXO 2 – PROTOCOLO PARA RECUPERAÇÃO DE BIOMASSA
1. Transferir cerca de 8 ml de solução de cloreto de sódio 0,9% para tubo cônico
graduado de 15 ml;
2. Com auxílio de pipeta pasteur, transferir a solução salina para o tubo LJ que
contém a micobactéria em questão e raspar a superfície do meio com alça
esterilizada. Esterilizar a alça sempre que necessário;
3. Transferir o conteúdo do tubo LJ para tubo cônico de 15 ml destinado para coleta
de células;
4. Repetir os itens dois e três até remoção das células da superfície do tubo LJ;
5. Para a espécie M. smegmatis cultivada em caldo BHI, distribuir o conteúdo dos
tubos de cultivo para tubos cônicos de 50 ml;
6. Inativar a suspensão de micobactérias em banho-maria a 80ºC por 10 minutos
(TELENTI et al, 1993);
7. Centrifugar os tubos por 15 minutos a 2.500 g (BELISE; SONNENBERG, 1998);
8. Com auxílio de pipeta pasteur, remover sobrenadante do tubo centrifugado para
um tubo cônico de 50 ml de descarte;
9. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, cerca de 8 ml de tampão TE (10 mM
Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) para tubo cônico graduado de 15 ml
destinados para tal;
10. Com auxílio de pipeta pasteur, transferir uma pequena quantidade de tampão TE
para o tubo com o pélete para ressuspendê-lo. Adicionar mais tampão até completar
8 ml;
11. Centrifugar os tubos a 2.500 g por 15 minutos;
12. Com auxílio de pipeta pasteur, remover o sobrenadante do tubo centrifugado
para um tubo cônico de 50 ml de descarte;
13. Ressuspender o sedimento e, se necessário, adicionar um pouco de tampão TE
apenas para permitir a aspiração e pipetar 50 µl do sedimento para microtubos;
14. Identificar os microtubos com etiquetas contendo o nome da espécie e data;
15. Congelar os microtubos em freezer a -20ºC.
189
ANEXO 3 – PROTOCOLO PARA COLORAÇÃO DAS LÂMINAS PELO MÉTODO DE
ZIEHL-GABBET
1. Preparar formol-leite como segue: 0,15 ml de formol a 40%, 1 ml de leite
desnatado 0% de gordura e 10 ml de água destilada;
2. Adicionar 10 µl da solução formol-leite em área delimitada de uma lâmina de
cerca de 1 cm de diâmetro;
3. Agitar a suspensão contida em microtubo;
4. Adicionar 10 µl da suspensão de células, homogeneizando o material através de
movimentos de sucção e ejeção da micropipeta e espalhando o conteúdo em toda a
área do círculo;
5. Colocar o material em estufa a 37ºC até secar;
6. Após a secagem, proceder a fixação do material em vapores de formol, em
câmara saturada fechada (jarra de Coplin, contendo 3 ml de formol a 40%) por 3
minutos;
7. Retirar a lâmina da câmara saturada e colocá-la sobre vapores provenientes de
banho-maria, feito como um copo de béquer com água fervente sob tela de amianto
e sobre béquer parte de placa de Petri voltada para baixo encaixando na boca do
copo de béquer, e sobre placa de Petri, a lâmina escavada, por 2 minutos;
8. Repetir fixação em vapores de formol a 40% por 3 vezes;
9. Após a fixação, proceder a coloração do esfregaço pelo método de Ziehl-Gabbet,
sendo:
Cobrir a lâmina com fucsina de Ziehl por 25 minutos;
Lavar a lâmina com água destilada;
Cobrir a lâmina com azul de Gabbet por 2 minutos;
Lavar a lâmina com água destilada;
Com auxílio de papel absorvente, limpar e secar a lâmina em estufa a
37ºC.
10. Visualizar o material em microscópio óptico com objetiva de imersão 100X.
190
ANEXO 4 – PROTOCOLO PARA EXTRAÇÃO DE DNA
Protocolo 1 segundo SAMBROOK, FRITSCH e MANIATIS (1989)
1. À um volume de 50 mg a 100 mg de células adicionar 400 µl de tampão TE.
Adicionar SDS a 1% (0,5% mínimo) em volume final. Incubar 2 horas a 37ºC em
presença de 200 µg/ml final de RNAse. Adicionar proteinase K (solução a 20 mg/ml),
para atingir uma concentração final de 200 µg/ml e incubar de 2 horas a uma noite a
55ºC;
2. Adicionar a solução fenol saturado (fase inferior) volume/volume, agitar
levemente. Centrifugar 5 minutos, 12.000 g a 20ºC, recuperar a fase superior para
outro tubo usando ponteira com diâmetro de 3 a 4 mm. Repetir se necessário;
3. Adicionar a mistura fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) volume/volume,
agitar gentilmente, centrifugar 5 minutos, 12.000 g a 20ºC. Recuperar a fase superior
para outro tubo usando ponteira com diâmetro de 3 a 4 mm. Repetir se necessário;
4. Adicionar clorofórmio volume/volume, agitar gentilmente, centrifugar 5 minutos,
12.000 g a 20ºC. Recuperar a fase superior para outro tubo usando ponteira com
diâmetro de 3 a 4 mm. Repetir se necessário;
5. Se o volume obtido é inferior a 700 µl, extrair com dois volumes de etanol; se o
volume é superior a 700 µl, extrair com um volume de isopropanol. Adicionar acetato
de sódio 3 M para obter 10% no volume final, adicionar 2,5 volumes de etanol (ou
um volume de isopropanol), agitar levemente, colocar de 4 horas a uma noite a -
20ºC (etanol ou isopropanol) ou 1 hora no mínimo a -80ºC (somente etanol).
Centrifugar 30 minutos, 12.000 g a 4ºC, remover o sobrenadante, fazer 2 lavagens
do sedimento com etanol a 70% (300 µl por tubo). Ressuspender o sedimento em
centrifuga por 15 minutos, 12.000 g a 4ºC. Remover o etanol e secar;
6. Ressuspender o DNA em 100 µl de água ultrapura e deixar hidratar por no mínimo
uma noite.
191
Protocolo 2 segundo BELISLE e SONNENBERG (1998)
1. Ressuspender as células em 500 µl de TE;
2. Adicionar igual volume de clorofórmio/metanol (2:1) e agitar em homogeneizador
por 5 minutos;
3. Centrifugar a suspensão a 2.500 g por 15 minutos. A bactéria forma uma banda
compacta na interface orgânica-aquosa. Remover ambas as camadas, orgânica e
aquosa, tendo cuidado para deixar a banda bacteriana fortemente compactada no
tubo;
4. Colocar o tubo destampado contendo as células deslipídicas a 55ºC por 10-15
minutos para remover traços de solvente orgânicos que podem interferir com a
atividade lisosomal;
5. Adicionar 500 µl de TE e suspender as células em agitador vortex vigorosamente;
6. Adicionar 0,1 volume de 1M Tris-HCl, pH 9 para aumentar o pH da suspensão
celular;
7. Adicionar lisozima para uma concentração final de 100 µg/ml e incubar a 37ºC por
12-16 horas. Não usar vortex para misturar;
8. Adicionar 0,1 volume de SDS 10% e 0,01 volume de solução de proteinase K (10
mg/ml) para lise celular. Misturar por inversão várias vezes e incubar a 55ºC por 3
horas. Se nesse ponto a suspensão não é homogênea ou viscosa aumentar a
concentração de SDS para 2% e 0,01 volume de proteinase K, misturar e incubar
por mais uma hora;
9. Adicionar igual volume de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e
gentilmente agitar no homogeneizador por 30 minutos seguido de centrifugação a
12.000 g por 30 minutos;
10. Cuidadosamente transferir a camada aquosa (fase superior) para tubo com a
ponteira com diâmetro de 3 a 4 mm;
11. Adicionar a fase aquosa igual volume de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e
agitar gentilmente por 5 minutos. Centrifugar a 12.000 g por 30 minutos. Transferir a
fase superior, com ponteira de diâmetro de 3 a 4 mm, para novo tubo;
12. Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 2 volumes de etanol
(etanol a -20ºC). Inverter o tubo lentamente para misturar e colocar a 4ºC por 1 hora;
192
13. Centrifugar a solução a 12.000 g por 30 minutos. Remover o sobrenadante e
lavar o DNA com etanol 70% frio (-20ºC);
14. Novamente, centrifugar o DNA (12.000 g por 30 minutos a 4ºC), removendo
etanol e permitir o pélete secar ao ar;
15. Dissolver o DNA em 100 µl TE ou água ultrapura.
193
ANEXO 5 – PROTOCOLO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE BIÓPSIAS DE PELE
ADAPTADO DE MARTÍNEZ (2005)
1. Descongelar as amostras;
2. Digerir com 300 µg/ml de proteinase K por 12 horas a 60ºC;
3. Inativar a proteinase K pelo calor a 95ºC por 10 minutos;
4. Adicionar fenol saturado volume a volume, homogenizar o conteúdo por 10
minutos a velocidade lenta e centrifugar a 12.000 g por 5 minutos;
5. Transferir a fase aquosa, com ponteira de diâmetro de 3 a 4 mm, para novo
microtubo. Repetir os itens 4 e 5 se necessário;
6. Adicionar fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) volume a volume,
homogenizar o conteúdo por 10 minutos a velocidade lenta e, centrifugar a 12.000 g
por 5 minutos;
7. Transferir a fase aquosa, com ponteira de diâmetro de 3 a 4 mm, para novo
microtubo. Repetir os itens 6 e 7 se necessário;
8. Adicionar dois volumes de etanol absoluto a -20ºC e homogeneizar gentilmente
por inversão;
9. Deixar precipitar overnight em freezer a -20ºC;
10. Centrifugar a 12.000 g por 30 minutos a 4ºC;
11. Descartar o etanol;
12. Adicionar 300 µl etanol 70% gelado;
13. Centrifugar a 12.000 g por 15 minutos a 4ºC;
14. Desprezar o etanol 70%. Repetir a lavagem com etanol 70% por mais uma vez;
15. Secar o precipitado;
16. Ressuspender em 100 µl de água ultrapura.
194
ANEXO 6 – PROTOCOLO PARA QUANTIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA
PUREZA DO DNA
1. Preparar uma diluição do DNA com água ultrapura. Geralmente, uma diluição 1:50
ou 1:100 é adequada. O branco é a água ultrapura;
2. Colocar a amostra em cubeta de quartzo;
3. Realizar a leitura em espectrofotômetro nas absorbâncias de 260 e 280 nm. A
concentração de DNA e a razão A
260
/A
280
são fornecidos automaticamente pelo
aparelho.
195
ANEXO 7 – PROTOCOLO PARA ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
Montagem do aparato de eletroforese:
1. Em bancada, colocar a cuba de eletroforese contendo suporte para verter o gel,
pentes e dispositivo delimitador de suporte, fonte de energia e fios de corrente;
2. Conectar os fios de corrente a fonte;
3. Colocar os dispositivos delimitadores da bandeja;
4. Colocar o pente.
Preparo do gel de agarose:
1. Para detecção de DNA genômico utilizar agarose a 0,8% e para detecção de
produtos de PCR utilizar agarose a 1,6%. A cuba para eletroforese empregada
comporta um volume de 30 ml de solução e para preparar um gel de 0,8%, deve-se
pesar 0,24 g de agarose e para preparar um gel 1,6 %, deve-se pesar 0,48 g de
agarose;
2. Medir em proveta 30 ml de TAE 1X;
3. Transferir a agarose para erlenmeyer e verter o conteúdo da proveta para o
erlenmeyer;
4. Agitar a mistura e dissolver em microondas até fusão da agarose.
Preparo da cuba de eletroforese com o gel de agarose e corrida:
1. Deixar esfriar a solução de agarose até 55ºC;
2. Deixar a solução solidificar;
3. Colocar o tampão de eletroforese apenas o suficiente para cobrir o gel;
4. Remover o pente;
5. Sobre um pedaço de parafilme, misturar as amostras como 0,2 volumes de
tampão de amostra;
6. Aplicar a mistura para dentro da canaleta;
7. Após aplicação das amostras, fechar a tampa da cuba e conectar a ela os fios de
corrente;
196
8. Ligar a fonte na voltagem desejada, neste caso 60 V. O DNA irá migrar para o
pólo positivo (ânodo), indicado pela cor vermelha.
Coloração de DNA em gel de agarose:
1. Colocar o gel em recipiente contendo brometo de etídio a 0,5 µg/ml em suficiente
quantidade para cobrir o gel por 20 minutos em temperatura ambiente;
2. Transferir o gel para recipiente contendo água destilada por aproximadamente 2
minutos;
3. Visualizar o gel sob luz ultravioleta;
4. Fotografar o gel.
197
ANEXO 8 – DIGESTÃO COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
1. Preparar a mistura de reação (ver item 4.8);
2. Adicionar 10 µl do produto de PCR ao tubo contendo o mix;
3. Agitar para homogeneizar;
4. Incubar todos os tubos, em estufa, na temperatura recomendada pelo fabricante
(ver tabela 32);
5. Deixar em estufa por 12 a 24 horas;
6. Após a digestão armazenar os tubos a 4ºC até o momento da eletroforese.
TABELA 32 – TEMPERATURAS DE INCUBAÇÃO DAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
UTILIZADAS
ENZIMA DE RESTRIÇÃO TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO
Hae III (Invitrogen) 37ºC
Bst EII (Fermentas) 37ºC
Bst UI (New England BioLabs) 60ºC
198
ANEXO 9 – PROTOCOLO PARA ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
SEGUNDO SAMBROOK e RUSSELL (2001), BARKER (2002) e
BARTLETT (2003)
Montagem do aparato e preparo do gel:
1. Lavar as placas de vidro e espaçadores com água morna e detergente, usando
uma escova macia ou um pano que não arranhe o vidro. Enxaguar bem em água de
torneira, após enxaguar com álcool e por último em água destilada. Segurar as
placas pela margem ou usar luvas, para não depositar gordura das mãos na
superfície das placas. Secar em estufa ou com papel-toalha e remover qualquer
vestígio de umidade com lenços de papel fino;
2. Montagem das placas de vidro com espaçadores:
Colocar a placa maior (não chanfrada) sobre uma folha de papel-toalha, a qual
está sobre a bancada;
Aplicar silicone nas margens laterais e do fundo, o suficiente para manter fixos os
espaçadores;
Colocar os espaçadores em cada lado paralelos as margens e no fundo;
Colocar a placa menor (chanfrada) sobre a placa maior, apoiando-a sobre os
espaçadores;
Prender as placas com grampos. Vedar as laterais e o fundo do conjunto com
perfil de silicone. Existem muitos tipos de aparelhos para eletroforese disponíveis
comercialmente, e o arranjo das placas e espaçadores difere de fabricante para
fabricante. Seja qual for o modelo, o objetivo é ter uma vedação entre as placas e os
espaçadores de modo que a solução de gel não polimerizada não vaze.
3. Considerar o tamanho das placas de vidro e espessura dos espaçadores para
calcular o volume de gel a ser preparado. Foram preparados 20 ml de géis a 8% e
10% de poliacrilamida e os volumes utilizados dos componentes do gel estão na
tabela 33.
199
TABELA 33 – VOLUME DE REAGENTES USADOS PARA O PREPARO DE GEL
DE POLIACRILAMIDA
GEL DE
POLIACRILAMIDA
(%)
ACRILAMIDA:BIS
40 %
(ml)
ÁGUA
ULTRAPURA (ml)
TBE 5X
(ml)
PERSULFATO
DE AMÔNIO 10%
(µl)
8 4
12
4
100
10 5
11
4
100
Moldagem do gel:
1. Misturar os componentes na ordem: acrilamida:bis, água, tampão e persulfato de
amônio;
2. Adicionar 50 µl de TEMED para cada 100 ml de solução de acrilamida:bis.
Misturar gentilmente e despejar o gel, rapidamente, no espaço entre as duas placas,
cuidando para não formar bolhas. Se bolhas são formadas, interromper a adição da
solução, inclinar levemente o conjunto das duas placas e voltar o mesmo para a
posição normal;
3. Inserir o pente, cuidando para não formarem bolhas embaixo dos dentes. Se
necessário, adicionar mais solução do gel para preencher completamente o espaço
entre as duas placas;
4. Deixar a solução acrilamida:bis polimerizar por 30 a 60 minutos em temperatura
ambiente, adicionando mais solução do gel se o mesmo retrair;
5. Após a polimerização, remover o pente com auxílio de uma espátula;
6. Lavor os poços com TBE 1X com auxílio de seringa e agulha;
7. Remover o perfil de silicone e o espaçador do fundo.
Carregamento do gel e corrida:
1. Fixar o conjunto no suporte da cuba, usando grampos. A placa chanfrada deve
ser voltada para dentro da cuba;
2. Preencher os reservatórios da cuba com TBE 1X;
3. Remover bolhas no topo e no fundo do gel com auxílio de seringa e agulha;
4. Adicionar a cada microtubo com amostra 5 µl de tampão de amostra, misturar e
carregar o gel usando uma micropipeta equipada com ponteira alongada. Para
200
preparar o padrão de peso molecular, misturar 1 µg de DNA, 4 µl de água ultrapura e
5 µl do tampão de amostra e aplicar a mistura no gel;
5. Conectar os fios de corrente a fonte, ligar a fonte e iniciar a corrida com voltagem
em 60 V (1-8 V/cm);
6. Correr o gel até o marcador de azul de bromofenol ter percorrido a distância
desejada. Desligar a fonte, desconectar os fios de corrente e descartar o tampão de
eletroforese dos reservatórios;
7. Desunir as placas de vidro, com auxílio de espátula e jatos de água destilada
aplicados entre as mesmas. Remover a placa superior, com cuidado, retirar os
espaçadores e destacar o gel preso à outra placa usando jatos de água.
Coloração de DNA em gel de poliacrilamida:
1. Colocar o gel, com muito cuidado, em recipiente contendo brometo de etídio a 0,5
a 1 µg/ml em suficiente quantidade para cobrir o gel por aproximadamente 5 minutos
em temperatura ambiente;
2. Transferir o gel, com muito cuidado, para recipiente contendo água destilada por
aproximadamente 2 minutos;
3. Visualizar o gel sob luz ultravioleta;
4. Fotografar o gel.
201
ANEXO 10 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR TELENTI et al. (1993)
OBSERVADO TELENTI et al. (1993)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de agarose 3%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
60 pb
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
230, 112, 87
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
245, 125, 80
M. phlei (ATCC 11758) 230, 192 - -
M. smegmatis (ATCC 607) 230, 125, 87 M. smegmatis (IP 14133.0001) 245, 140, 85
M. avium (ATCC 25291) 224, 190 M. avium (Borstel) 245, 220
M. gordonae (ATCC 14470) 242, 113, 88
M. gordonae (IP 14034.0001, ATCC
14470)
245, 125, 80 (M. gordonae I, II)
M. kansasii (ATCC 12478) 230, 192
M. kansasii (NCTC 10268, IP
14011.0001, DSM 43224)
245, 220
M. leprae (Thai-53) 338, 126 - -
M. szulgai (ATCC 35799) Não digeriu M. szulgai (Borstel, IP 14024.0001) Não digeriu
M. terrae (ATCC 15755) 332, 111 M. terrae (DSM 10111.68) 325, 125
M. bovis (BCG-MORAEU) 230, 112, 87 M. bovis (IP 14002.0001)
245, 125, 80 (complexo M.
tuberculosis)
M. tuberculosis (isolado clínico) 230, 114, 88 M. tuberculosis (IP 14001.0001)
245, 125, 80 (complexo M.
tuberculosis)
202
ANEXO 11 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR TELENTI et al. (1993)
OBSERVADO TELENTI et al. (1993)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de agarose 3%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
60 pb
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
135, 116, 59, 52
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
155, 135
M. phlei (ATCC 11758) 129, 80, 59, 51 - -
M. smegmatis (ATCC 607) 131, 114, 58 M. smegmatis (IP 14133.0001) 160, 130
M. avium (ATCC 25291) 119, 99 M. avium (Borstel) 140, 105
M. gordonae (ATCC 14470) 147, 107, 59
M. gordonae (IP 14034.0001, ATCC
14470)
170, 115 (M. gordonae I)
M. kansasii (ATCC 12478) 119, 99, 78
M. kansasii (NCTC 10268, IP
14011.0001, DSM 43224)
140, 105, 70
M. leprae (Thai-53) 274, 121 - -
M. szulgai (ATCC 35799) 120, 99, 70 M. szulgai (Borstel, IP 14024.0001) 140, 105
M. terrae (ATCC 15755) 160, 119 M. terrae (DSM 10111.68) 190, 140
M. bovis (BCG-MORAEU) 140, 120, 70 M. bovis (IP 14002.0001)
160, 140, 70 (complexo M.
tuberculosis)
M. tuberculosis (isolado clínico) 142, 121, 70 M. tuberculosis (IP 14001.0001)
160, 140, 70 (complexo M.
tuberculosis)
203
ANEXO 12 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR TAYLOR et al. (1997)
OBSERVADO TAYLOR et al. (1997)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de agarose 3%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
60 pb
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
230, 112, 87 M. fortuitum (urina) 245, 115, 80
M. phlei (ATCC 11758) 230, 192 - -
M. smegmatis (ATCC 607) 230, 125, 87 M. smegmatis (ATCC 607) 245, 140, 80
M. avium (ATCC 25291) 224, 190 M. avium-intracellulare (CAP E7-93) 245, 220 (M. avium)
M. gordonae (ATCC 14470) 242, 113, 88 M. gordonae I (CAP E7-92, E-93) 245, 115, 80
M. kansasii (ATCC 12478) 230, 192 M. kansasii (CAP E10-92, E1-93) 245, 220
M. leprae (Thai-53) 338, 126 - -
M. szulgai (ATCC 35799) Não digeriu M. szulgai (CAP E9-92, E2-93) Não digeriu
M. terrae (ATCC 15755) 332, 111 M. terrae (ATCC1 15755) 325, 115
M. bovis (BCG-MORAEU) 230, 112, 87 - -
M. tuberculosis (isolado clínico) 230, 114, 88
M. tuberculosis (CAP E5-93, E8-93,
E11-93)
245, 115, 80 (complexo M.
tuberculosis)
204
ANEXO 13 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR TAYLOR et al. (1997)
OBSERVADO TAYLOR et al. (1997)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de agarose 3%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
60 pb
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
135, 116, 59, 52 M. fortuitum (urina) 155, 135
M. phlei (ATCC 11758) 129, 80, 59, 51 - -
M. smegmatis (ATCC 607) 131, 114, 58 M. smegmatis (ATCC 607) 160, 135, 60
M. avium (ATCC 25291) 119, 99 M. avium-intracellulare (CAP E7-93) 140, 105 (M. avium)
M. gordonae (ATCC 14470) 147, 107, 59 M. gordonae I (CAP E7-92, E-93) 170, 115, 60
M. kansasii (ATCC 12478) 119, 99, 78 M. kansasii (CAP E10-92, E1-93) 140, 105, 80
M. leprae (Thai-53) 274, 121 - -
M. szulgai (ATCC 35799) 120, 99, 70 M. szulgai (CAP E9-92, E2-93) 140, 105, 70
M. terrae (ATCC 15755) 160, 119 M. terrae (ATCC1 15755) 190, 140
M. bovis (BCG-MORAEU) 140, 120, 70 - -
M. tuberculosis (isolado clínico) 142, 121, 70
M. tuberculosis (CAP E5-93, E8-93,
E11-93)
160, 140, 70 (complexo M.
tuberculosis)
205
ANEXO 14 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR DEVALLOIS, GOH e RASTOGI
et al. (1997)
OBSERVADO DEVALLOIS, GOH e RASTOGI (1997)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de agarose 3%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
60 pb
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
230, 112, 87 M. fortuitum (ATCC 6841) 245, 120, 80 (M. fortuitum I, II)
M. phlei (ATCC 11758) 230, 192 M. phlei (ATCC 11758) 245, 220
M. smegmatis (ATCC 607) 230, 125, 87 M. smegmatis (ATCC 19420) 245, 140, 80
M. avium (ATCC 25291) 224, 190 M. avium (ATCC 25291) 245, 220
M. gordonae (ATCC 14470) 242, 113, 88 M. gordonae (ATCC 14470) 245, 120, 80 (M. gordonae I, II)
M. kansasii (ATCC 12478) 230, 192 M. kansasii (ATCC 12478) 245, 220 (M. kansasii I)
M. leprae (Thau-53) 338, 126 - -
M. szulgai (ATCC 35799) Não digeriu M. szulgai (NCTC 1081) Não digeriu
M. terrae (ATCC 15755) 332, 111 M. terrae (ATCC 15755) 325, 120
M. bovis (BCG-MORAEU) 230, 112, 87 M. bovis BCG (CIPT 140040001)
245, 120, 80 (complexo M.
tuberculosis)
M. tuberculosis (isolado clínico) 230, 114, 88
M. tuberculosis (ATCC 27294,
ATCC 25177, CIPT 140010059)
245, 120, 80 (complexo M.
tuberculosis)
206
ANEXO 15 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR DEVALLOIS, GOH e RASTOGI
et al. (1997)
OBSERVADO DEVALLOIS, GOH e RASTOGI (1997)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de agarose 3%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
60 pb
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
135, 116, 59, 52 M. fortuitum (ATCC 6841) 155, 135 (M. fortuitum I)
M. phlei (ATCC 11758) 129, 80, 59, 51 M. phlei (ATCC 11758) 150, 80
M. smegmatis (ATCC 607) 131, 114, 58 M. smegmatis (ATCC 19420) 160, 135, 60
M. avium (ATCC 25291) 119, 99 M. avium (ATCC 25291) 140, 105
M. gordonae (ATCC 14470) 147, 107, 59 M. gordonae (ATCC 14470) 170, 115, 60 (M. gordonae I)
M. kansasii (ATCC 12478) 119, 99, 78 M. kansasii (ATCC 12478) 140, 105, 80 (M. kansasii I)
M. leprae (Thai-53) 274, 121 - -
M. szulgai (ATCC 35799) 120, 99, 70 M. szulgai (NCTC 1081) 140, 105, 70
M. terrae (ATCC 15755) 160, 119 M. terrae (ATCC 15755) 190, 140
M. bovis (BCG-MORAEU) 140, 120, 70 M. bovis BCG (CIPT 140040001)
160, 140, 70 (complexo M.
tuberculosis)
M. tuberculosis (isolado clínico) 142, 121, 70
M. tuberculosis (ATCC 27294,
ATCC 25177, CIPT 140010059)
160, 140, 70 (complexo M.
tuberculosis)
207
ANEXO 16 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR BRUNELLO
et al. (2001)
OBSERVADO BRUNELLO et al. (2001)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa Tamanho dos fragmentos (pb)
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
230, 112, 87
M. fortuitum (ATCC 19542, MFO1,
MFO2, MFO3, MFO4)
234± 3, 131± 5, 85± 3 (M. fortuitum
subp. fortuitum)
M. phlei (ATCC 11758) 230, 192 M. phlei (OCF878)
234± 3, 211± 4
M. smegmatis (ATCC 607) 230, 125, 87 M. smegmatis (ATCC 19420)
234± 3, 131± 5, 85± 3
M. avium (ATCC 25291) 224, 190 M. avium (ATCC 15769)
234± 3, 211± 4 (M. avium-parat.)
M. gordonae (ATCC 14470) 242, 113, 88
M. gordonae I (MGI1, MGI2, MGI3,
MGI4, MGI5)
234± 3, 117± 2, 84± 5 (M. gordonae
I, II)
M. kansasii (ATCC 12478) 230, 192
M. kansasii (MKA1, MKA2, MKA3,
OCF921)
234± 3, 211± 4 (M. kansasii I)
M. leprae (Thai-53) 338, 126 - -
M. szulgai (ATCC 35799) Não digeriu M. szulgai (OCF 891) Não digeriu
M. terrae (ATCC 15755) 332, 111
M. terrae (ATCC 15755, MTE1,
OCF895)
313± 10, 117± 3
M. bovis (BCG-MORAEU) 230, 112, 87 M. bovis BCG (ATCC 27291)
234± 3, 117± 2, 84± 5 (complexo M.
tuberculosis)
M. tuberculosis (isolado clínico) 230, 114, 88
Complexo M. tuberculosis (OCM1,
OCM2, OCM3)
234± 3, 117± 2, 84± 5 (complexo M.
tuberculosis)
208
ANEXO 17 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR BRUNELLO
et al. (2001)
OBSERVADO BRUNELLO et al. (2001)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa Tamanho dos fragmentos (pb)
M. fortuitum subsp. fortuitum (ATCC
6841)
135, 116, 59, 52
M. fortuitum (ATCC 19542, MFO1,
MFO2, MFO3, MFO4)
137, 117, 58 ou 133, 104, 73 (M.
fortuitum subp. fortuitum)
M. phlei (ATCC 11758) 129, 80, 59, 51 M. phlei (OCF878) 141, 85, 51
M. smegmatis (ATCC 607) 131, 114, 58 M. smegmatis (ATCC 19420) 154, 129, 63
M. avium (ATCC 25291) 119, 99 M. avium (ATCC 15769) 127, 104, 51 (M. avium-parat.)
M. gordonae (ATCC 14470) 147, 107, 59 M. gordonae I (MGI1 a MGI5) 158, 111, 54 (M. gordonae I)
M. kansasii (ATCC 12478) 119, 99, 78
M. kansasii (MKA1, MKA2, MKA3,
OCF921)
128, 105, 82 (M. kansasii I)
M. leprae (Thai-53) 274, 121 - -
M. szulgai (ATCC 35799) 120, 99, 70 M. szulgai (OC 891) 131, 106, 75
M. terrae (ATCC 15755) 160, 119
M. terrae (ATCC 15755, MTE1,
OCF895)
187, 132
M. bovis (BCG-MORAEU) 140, 120, 70 M. bovis BCG (ATCC 27291)
157, 131, 71 (complexo M.
tuberculosis)
M. tuberculosis (isolado clínico) 142, 121, 70
Complexo M. tuberculosis
(OCM1, OCM2, OCM3)
157, 131, 71 (complexo M.
tuberculosis)
209
ANEXO 18 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Bst EII DE M. leprae
ENTRE O PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR RASTOGI, GOH e BERCHEL (1999)
OBSERVADO RASTOGI, GOH e BERCHEL (1999)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de agarose 3%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
60 pb
M. leprae (Thai-53) 338, 126 M. leprae (tatu e camundongo nude) 315, 135
210
ANEXO 19 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE hsp65 COM A ENZIMA Hae III M. leprae
ENTRE O PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR RASTOGI, GOH e BERCHEL (1999)
OBSERVADO RASTOGI, GOH e BERCHEL (1999)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% Substrato da eletroforese: gel de agarose 3%
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
60 pb
M. leprae (Thai-53) 274, 121 M. leprae (tatu e camundongo nude) 265, 130
211
ANEXO 20 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Bst UI ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR KIM
et al. (2001)
OBSERVADO KIM et al. (2001)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% O tamanho dos fragmentos foi determinado da seqüência
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa Tamanho dos fragmentos (pb)
M. fortuitum subsp. fortuitum
(ATCC 6841)
193, 87 M. fortuitum (ATCC 6841) 207, 55
M. phlei (ATCC 11758) 189, 78 M. phlei (ATCC 11758) 198, 68
M. smegmatis (ATCC 607) 229, 67 M. smegmatis (ATCC 19420) 231, 55
M. avium (ATCC 25291) 199, 87 M. avium (ATCC 25291) 216, 79
M. gordonae (ATCC 14470) 176, 87, 78 M. gordonae (ATCC 14470) 180, 79, 74
M. kansasii (ATCC 12478) Não digeriu M. kansasii I (ATCC 12478) 342
M. leprae (Thai-53) 191, 78, 72 M. leprae (Thai-53) 210, 68, 64
M. szulgai (ATCC 35799) 173, 88, 79 M. szulgai (ATCC 35799) 180, 79, 74
M. terrae (ATCC 15755) 174, 94, 79 M. terrae (ATCC 15755) 180, 88, 74
M. bovis (BCG-MORAEU) 139, 95, 78 M. bovis (ATCC 19210) 142, 94, 68
M. tuberculosis (isolado clínico) 139, 94, 78 M. tuberculosis (ATCC 27294) 142, 94, 68
212
ANEXO 21 – TABELA COMPARATIVA DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DO GENE rpoB COM A ENZIMA Hae III ENTRE O
PRESENTE TRABALHO E OS DADOS PUBLICADOS POR KIM
et al. (2001)
OBSERVADO KIM et al. (2001)
Substrato da eletroforese: gel de poliacrilamida 10% O tamanho dos fragmentos foi determinado da seqüência
Cepa
Tamanho dos fragmentos (pb) – até
50 pb
Cepa Tamanho dos fragmentos (pb)
M. fortuitum subsp. fortuitum
(ATCC 6841)
192, 71 M. fortuitum (ATCC 6841) 201, 61, 50
M. phlei (ATCC 11758) 189, 71 M. phlei (ATCC 11758) 201, 61, 50
M. smegmatis (ATCC 607) 189, 71 M. smegmatis (ATCC 19420) 201, 61, 50
M. avium (ATCC 25291) 141, 121 M. avium (ATCC 25291) 146, 117, 54
M. gordonae (ATCC 14470) 119, 112, 70 M. gordonae (ATCC 14470) 117, 114, 79
M. kansasii (ATCC 12478) 227, 69 M. kansasii I (ATCC 12478) 229, 79
M. leprae (Thai-53) 227, 71 M. leprae (Thai-53) 229, 80
M. szulgai (ATCC 35799) 145, 113 M. szulgai (ATCC 35799) 149, 114, 54
M. terrae (ATCC 15755) 139, 119 M. terrae (ATCC 15755) 145, 117, 80
M. bovis (BCG-MORAEU) 146, 114, 70 M. bovis (ATCC 19210) 149, 114, 79
M. tuberculosis (isolado clínico) 145, 114, 70 M. tuberculosis (ATCC 27294) 149, 114, 79
213
M. fortuitum 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1
M. phlei 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1
M.smegmatis 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0
M.avium 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
M. gordonae 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0
M. kansasii 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0
M. leprae 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
M. szulgai 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0
M. terrae 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0
M. bovis 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0
M.tuberculosis 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0
CPPI 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0
CPPI a 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 5 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 6 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 7 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 8 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 9 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 10 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 14 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 18 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 20 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 21 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
CPPI 23 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
M. sp
0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0
Tatu 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
ANEXO 22 – MATRIZ DISJUNTIVA CONSTRUÍDA COM OS DADOS OBTIDOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA RFLP, COM
TRÊS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (Hae III, Bst UI, Bst EII), AOS FRAGMENTOS DE DNA RESULTANTES DA
PCR COM OS INICIADORES PARA OS GENES rpoB E hsp65 PARA AMOSTRAS CLÍNICAS E CEPAS
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