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JULIANA TRACZ PEREIRA
MÉTODOS DE DESINFECÇÃO EM ÁGUA CONTENDO
Cryptosporidium parvum (APICOMPLEXA: CRYPTOSPORIDIIDAE)
E SUA DETECÇÃO POR TÉCNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dissertação apresentada como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia, Parasitologia e
Patologia – Área de Concentração Parasitologia, dos
Setores de Ciências Biológicas e da Saúde da
Universidade Federal do Paraná.
Orientadora: Profª. Drª. Vanete Thomaz Soccol
Co-orientadora: Profª. Drª. Adriana Oliveira Costa
CURITIBA
2007
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JULIANA TRACZ PEREIRA
MÉTODOS DE DESINFECÇÃO EM ÁGUA CONTENDO
Cryptosporidium parvum (APICOMPLEXA: CRYPTOSPORIDIIDAE)
E SUA DETECÇÃO POR TÉCNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dissertação apresentada como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia, Parasitologia e
Patologia – Área de Concentração Parasitologia, dos
Setores de Ciências Biológicas e da Saúde da
Universidade Federal do Paraná.
Orientadora: Profª. Drª. Vanete Thomaz Soccol
Co-orientadora: Profª. Drª. Adriana Oliveira Costa
CURITIBA
2007
ii
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais pelo incentivo e apoio dados durante todos os momentos.
À Universidade Federal do Paraná, por viabilizar minha formação profissional
e intelectual.
Ao Departamento de Patologia Básica, por proporcionar a realização deste
curso.
À Professora Dra. Vanete Thomaz Soccol, pela orientação, oportunidade e
ensinamentos.
À Professora Dra. Adriana Oliveira Costa pela co-orientação.
Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia,
Parasitologia e Patologia da Universidade Federal do Paraná.
Às Professoras Dras. Rosângela Clara Paulino e Edilene Alcântara de Castro,
pela valiosa ajuda na execução do trabalho, além do apoio e amizade.
Ao Wellington Cesar Gallice, pela paciência e ajuda tão importantes.
À bióloga e técnica do Laboratório de Parasitologia Molecular, Luciane Mara
Hennig, pela amizade e auxílio.
À colega e amiga Paôla Wolski Meireles, pelo apoio em muitos momentos.
Ao médico veterinário Nelson Luis Mello Fernandes, pela amizade, auxílio e
conselhos.
À FUNASA - FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, pelo auxílio financeiro do
presente projeto.
Ao Srs. Cleverson Vitorio Andreoli, Wagner Schuchardt, Wandir Roche,
Carlos Hartmann e Carlos Eduardo Ferreira da Silva (SANEPAR), ao Sr. Vicente
Martinazzo (EKA) e ao Sr. Joel Rodrigues (Diagtech) pelo auxílio prestado durante
os experimentos.
Ao Laboratório de Parasitologia do Hospital de Clínicas (UFPR).
A todas as pessoas que de maneira direta ou indireta contribuíram para a
conclusão desta etapa em minha vida.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................ vi
LISTA DE TABELAS ........................................................................................ vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.......................................................... ix
RESUMO.......................................................................................................... xi
ABSTRACT...................................................................................................... xii
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................... 1
2 OBJETIVOS.......................................................................................... 5
2.1 Objetivo Geral........................................................................................ 5
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 5
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................ 6
3.1 Cryptosporidium ................................................................................... 6
3.1.1 Histórico................................................................................................. 6
3.1.2 Taxonomia e Classificação.................................................................... 7
3.1.3 Morfologia.............................................................................................. 8
3.1.4 Biologia.................................................................................................. 8
3.1.5 Patogenia .............................................................................................. 10
3.1.6 Criptosporidiose no homem................................................................... 10
3.1.7 Criptosporidiose em animais de produção............................................. 11
3.1.8 Criptosporidiose em animais de companhia .......................................... 11
3.1.9 Epidemiologia ........................................................................................ 12
3.2 Métodos de detecção de Cryptosporidium spp. em água ..................... 16
3.2.1 Métodos diretos ..................................................................................... 16
3.2.2 Métodos indiretos .................................................................................. 19
3.3 Tratamento da água com objetivo de remoção ou inativação de
Cryptosporidium spp.............................................................................. 21
3.4 Avaliação da viabilidade de oocistos de Cryptosporidium parvum ........ 25
4 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 27
4.1 Obtenção e purificação de oocistos de Cryptosporidium parvum ......... 27
4.2 Detecção molecular de Cryptosporidium parvum em água ................... 28
4.2.1 Extração de ácido desoxirribonucléico (DNA) ....................................... 28
4.2.2 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) ............................................. 29
4.2.3 Eletroforese em gel de agarose............................................................. 31
4.2.4 Determinação da sensibilidade da PCR ................................................ 31
iv
4.3 Metodologia de desencistamento para determinação da
viabilidade de oocistos de Cryptosporidium parvum.............................. 32
4.4 Métodos químicos para inativação de Cryptosporidium parvum
em água................................................................................................. 33
4.4.1 Desinfecção por ácido hipocloroso........................................................ 33
4.4.2 Desinfecção por dióxido de cloro........................................................... 34
4.4.3 Desinfecção por ozônio ......................................................................... 35
4.5 Concentração dos oocistos de Cryptosporidium parvum após os
métodos de desinfecção química .......................................................... 35
4.6 Medidas de segurança para organismos patogênicos .......................... 36
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES.......................................................... 37
5.1 Obtenção e purificação de oocistos de Cryptosporidium parvum.......... 37
5.2 Padronização da detecção molecular de Cryptosporidium parvum
em água................................................................................................. 39
5.2.1 Extração de DNA................................................................................... 39
5.2.2 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) ............................................. 42
5.3 Metodologia de desencistamento para determinação da
viabilidade de oocistos de Cryptosporidium parvum.............................. 46
5.4 Métodos químicos para inativação de Cryptosporidium parvum
em água................................................................................................. 48
5.4.1 Efeito do ácido hipocloroso sobre a viabilidade de oocistos
de C. parvum......................................................................................... 48
5.4.2 Efeito do dióxido de cloro sobre a viabilidade de oocistos
de C. parvum......................................................................................... 51
5.4.3 Efeito do ozônio sobre a viabilidade de oocistos de C. parvum ............ 57
5.5 Medidas importantes para garantir a qualidade da água....................... 62
6 CONCLUSÕES ..................................................................................... 64
REFERÊNCIAS ............................................................................................... 65
ANEXOS.......................................................................................................... 89
v
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- CICLO BIOLÓGICO DE Cryptosporidium spp ................................................. 9
FIGURA 2 - APARELHO USADO PARA FILTRAÇÃO DE AMOSTRAS DE ÁGUA
PARA CONCENTRAÇÃO DOS OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum..... 36
FIGURA 3 - ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE (1,6%) MOSTRANDO OS
PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DE FRAGMENTO GÊNICO DE
Cryptosporidium parvum. COLUNA 1, PM-PADRÃO DE PESO
MOLECULAR 100BP; COLUNAS 2 A 4, PRIMER AWA (GÊNERO-
ESPECÍFICO): 2, (10
3
OOCISTOS); 3, (10
2
OOCISTOS); 4, (10
5
OOCISTOS); COLUNAS 5 A 8, PRIMER LAX (ESPÉCIE-ESPECÍFICO):
5, (10
2
OOCISTOS); 6, (10
3
OOCISTOS); 7, (10
4
OOCISTOS) E 8, (10
5
OOCISTOS) .......................................................... .......................................... 42
FIGURA 4- ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE (1,6%) MOSTRANDO OS
PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DE FRAGMENTO GÊNICO
ESPECÍFICO DE Cryptosporidium parvum EM AMOSTRAS DE ÁGUA
CONTAMINADAS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE OOCISTOS.
CN, CONTROLE NEGATIVO (SEM DNA); PM, PADRÃO DE PESO
MOLECULAR; CP, CONTROLE POSITIVO. O PAR DE INICIADORES
USADO PARA AMPLIFICAÇÃO DO DNA FOI CRY15F/CRY9R.................... 43
FIGURA 5 - ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE (1,6%) MOSTRANDO OS
PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DE FRAGMENTO GÊNICO A PARTIR
DE NESTED-PCR COM OS PRIMERS XIAOF/XIAOR E
AWA995F/AWA1206R COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE
OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum. PM, PADRÃO DE PESO
MOLECULAR 100 BP; CN, CONTROLE NEGATIVO ..................................... 44
FIGURA 6 - TESTE DE VIABILIDADE IN VITRO PARA Cryptosporidium parvum
VISTO EM MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE. A-B:
OOCISTOS INTACTOS, C-E: OOCISTOS PARCIALMENTE
DESENCISTADOS, F-G: OOCISTOS DESENCISTADOS (APENAS A
MEMBRANA DO OOCISTO), H: OOCISTOS INTACTOS, COM
DESTRUIÇÃO DAS ESTRUTURAS INTERNAS POR EXPOSIÇÃO AO
OZÔNIO............................................................................................................ 47
FIGURA 7 - REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO TRATAMENTO
COM ÁCIDO HIPOCLOROSO (2 PPM, pH 7,5) NA INATIVAÇÃO DE
OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum ....................................................... 49
FIGURA 8 - REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO TRATAMENTO
COM DIÓXIDO DE CLORO (1 PPM, 2 PPM E 5 PPM) NA INATIVAÇÃO
DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum ................................................. 52
FIGURA 9 - REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO pH (7,0 E 8,0 A
19ºC) NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum
COM DIÓXIDO DE CLORO (2PPM) ............................................................... 53
FIGURA 10 - REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO TRATAMENTO
COM OZÔNIO NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium
parvum (SISTEMA ABERTO) .......................................................................... 57
FIGURA 11 - REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO TRATAMENTO
COM OZÔNIO NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium
parvum (SISTEMA FECHADO) ....................................................................... 59
vi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - ESPÉCIES DE Cryptosporidium E PRINCIPAIS HOSPEDEIROS ................. 7
TABELA 2 - CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE Cryptosporidium spp. QUE
FACILITAM A TRANSMISSÃO POR VIA HÍDRICA E ALIMENTAR ............... 16
TABELA 3- LISTA DE ALVOS MOLECULARES, TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO E
PRINCIPAL APLICAÇÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE Cryptosporidium
spp. . ................................................................................................................. 21
TABELA 4 - LISTA DE PRIMERS (INICIADORES) TESTADOS NAS REAÇÕES DE
PCR PARA IDENTIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE Cryptosporidium spp.
E C. parvum..................................................................................................... 30
TABELA 5 - COMPONENTES DA REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DO DNA E
RESPECTIVAS CONCENTRAÇÕES UTILIZADAS EM UMA REAÇÃO
DE PCR ........................................................................................................... 30
TABELA 6 - CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO PARA OS DIFERENTES
INICIADORES PARA Cryptosporidium spp. E C. parvum .............................. 31
TABELA 7 - DOSAGEM POR ESPECTROFOTOMETRIA DE DNA EXTRAÍDO DE
OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum, EMPREGANDO ULTRA-SOM
E ENZIMAS....................................................................................................... 40
TABELA 8 - DOSAGEM POR ESPECTROFOTOMETRIA DE DNA EXTRAÍDO DE
OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum, EMPREGANDO SOMENTE
ENZIMAS.......................................................................................................... 40
TABELA 9 - DOSAGEM POR ESPECTROFOTOMETRIA DE DNA EXTRAÍDO DE
OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum, EMPREGANDO
CONGELAMENTO/DESCONGELAMENTO.................................................... 41
TABELA 10 - DADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO
TRATAMENTO COM ÁCIDO HIPOCLOROSO (2 PPM, pH 7,5) NA
INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum .......................... 49
TABELA 11 - PARÂMETROS ANALISADOS DURANTE O MÉTODO DE INATIVAÇÃO
COM ÁCIDO HIPOCLOROSO (2PPM) EM ÁGUA ULTRAPURA (pH 7,5)
CONTENDO OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum .................................. 50
TABELA 12 - DADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO
TRATAMENTO COM DIÓXIDO DE CLORO (1 PPM, 2 PPM E 5 PPM)
NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum .................... 52
TABELA 13 - DADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO pH
(7,0 E 8,0 A 19ºC) NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium
parvum COM DIÓXIDO DE CLORO (2PPM) .................................................. 53
TABELA 14 - EFICIÊNCIA DO DIÓXIDO DE CLORO NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS
DE Cryptosporidium parvum (10
4
/mL) EM ÁGUA ULTRAPURA (pH 7,0 A
19°C) ................................................................................................................ 54
TABELA 15 - RESUMO DE DADOS DE INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE
Cryptosporidium parvum USANDO DIÓXIDO DE CLORO E
COMPARAÇÃO COM OS RESULTADOS DO PRESENTE ESTUDO
(ADAPTADO DE CHAURET ET AL.,
2001)................................................................. ............................................... 56
vii
TABELA 16 - DADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO
TRATAMENTO COM OZÔNIO NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE
Cryptosporidium parvum (SISTEMA ABERTO) .............................................. 57
TABELA 17 - EFICIÊNCIA DO OZÔNIO NA REDUÇÃO DA VIABILIDADE DE
OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum UTILIZANDO SISTEMA
ABERTO........................................................................................................... 58
TABELA 18 - DADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO
TRATAMENTO COM OZÔNIO NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE
Cryptosporidium parvum (SISTEMA FECHADO) ............................................ 59
TABELA 19 - EFICIÊNCIA DO OZÔNIO NA REDUÇÃO DA VIABILIDADE DE
OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum UTILIZANDO SISTEMA
FECHADO................................................................................................. ...... 60
TABELA 20 - VALORES DE CT PARA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE
Cryptosporidium parvum EMPREGANDO OZÔNIO COMO
DESINFETANTE...................................................................................... ....... 61
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A - Adenina
APHA - American Public Health Association
ASTM - American Society for Testing and Materials
AWWA - American Water Works Association
C - Citosina
COWP - Cryptosporidium oocyst wall protein
CT - Concentração do desinfetante (mg/L ou ppm) x Tempo de contato
(minutos)
DAPI - 4,6-Diamino-2-phenylindole
DNA - Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid)
dNTP - Deoxinucleotídeos trifosfato
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético
FDA - Diacetato de fluoresceína
G - Guanina
g - Grama
x g - Gravidade
GP60 - Glicoproteína 60
HCl - Ácido clorídrico
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana
Hsp70 - Heat shock protein 70
ICR - Information Collection Rule
IF - Imunofluorescência
IMS - Separação imunomagnética
KCl - Cloreto de potássio
L - Litro
log - Logaritmo
mg - Miligrama
Mg
2+
- Íon magnésio – cátion divalente
MgCl
2
- Cloreto de magnésio
mL - Mililitro
ix
NaCl - Cloreto de sódio
NaHCO
3
- Bicarbonato de sódio
Nested-PCR - PCR de seqüências internas
N/No - Razão entre o número de oocistos de C. parvum viáveis e o número
total de oocistos no início do experimento de desinfecção
PBS - Solução salina tamponada (phosphate buffer saline)
PCR - Polimerase Chain Reaction (Reação da Polimerase em Cadeia)
pH - Potencial de hidrogênio
PI - Iodeto de propídio
ppm - Parte por milhão
RFLP - Restriction fragment length polymorphism
RNA - Ácido ribonucléico (Ribonucleic Acid)
RT-PCR - PCR por transcriptase reversa
SIDA - Síndrome da imunodeficiência adquirida
SSU-rDNA -Small subunit ribosomic DNA – menor subunidade do DNA
ribossômico
THM - Trihalometano
UFPR - Universidade Federal do Paraná
µg - Micrograma
µL - Microlitro
UHT - Ultra High Temperature
USEPA - United States Environment Protection Agency
UTN - Unidade de turbidez nefelométrica
< - Menor que
> - Maior que
≤ - Menor ou igual a
WEF - Water Environment Federation
x
RESUMO
Cryptosporidium é um protozoário de reconhecida importância como patógeno de
veiculação hídrica. Sua transmissão ocorre por meio da ingestão de oocistos, forma
de resistência capaz de sobreviver no ambiente externo. Em indivíduos jovens (0 a
15 anos) e imunocomprometidos, a infecção pode se tornar grave, com diarréia,
síndrome de má absorção e atraso no crescimento, chegando a ser fatal em alguns
casos. Criptosporidiose é considerada parasitose emergente e está incluída na lista
de doenças negligenciadas da Organização Mundial da Saúde. A prevenção se faz
necessária para evitar grandes epidemias, como as registradas em países
desenvolvidos. O presente trabalho teve como objetivos avaliar a eficiência ou não
dos diferentes métodos de desinfecção com produtos químicos usados no
tratamento convencional de água de abastecimento público, empregando o método
de desencistamento in vitro para avaliação da viabilidade, e ainda determinar a
sensibilidade analítica por meio de técnica de biologia molecular (PCR) na detecção
de oocistos de Cryptosporidium parvum. Nos métodos de desinfecção avaliados
observou-se que o ácido hipocloroso a 2 ppm inativou 49% dos oocistos de C.
parvum após 120 minutos de contato. Para o dióxido de cloro, foram necessários 5
ppm e tempo de contato de 90 minutos para inativar 90% dos oocistos de C. parvum
presentes. O ozônio na concentração de 0,18 mg/L inativou 98,87% dos oocistos de
C. parvum e para 100% de inativação, a concentração necessária foi de 0,24 mg/L.
A técnica molecular (PCR) mostrou-se sensível para 10
2
oocistos de C. parvum.
Neste trabalho, foi confirmada a resistência de C. parvum aos processos usuais de
desinfecção, indicando a necessidade de tratamentos mais efetivos para melhorar a
qualidade da água consumida no Brasil.
Palavras-chave: ácido hipocloroso, Cryptosporidium parvum, desencistamento in
vitro, dióxido de cloro, ozônio, PCR
xi
ABSTRACT
Cryptosporidium is a protozoan that has its importance widely recognized in
waterborne diseases. It is transmitted by the ingestion of oocysts, a form which is
able to survive in outer environments. In young (zero to 15 years old) and
immunocompromised individuals, the infection can become serious, with diarrhea,
mal-absorption syndrome, and growth delay, and in some cases it can even be fatal.
Cryptosporidiosis is considered an emerging parasitosis, which is included in the list
of neglected illnesses published by the WHO-World Health Organization. Its
prevention proves to be necessary in order to avoid widespread epidemics, as those
reported in developed countries. The present work aims at evaluating the efficacy –
or lack of efficacy – of the different disinfection methods involving chemical products
used in conventional water supply treatment, employing the in vitro excystation
method to evaluate the oocysts viability, and moreover to evaluate the analytical
sensitivity through molecular biology method (PCR) in detection of Cryptosporidium
parvum. In the disinfection methods evaluated, it was possible to observe that
hypochlorous acid at 2 ppm inactivated 49% of C. parvum oocysts after a 120 min
contact. For chlorine dioxide, 5 ppm and a 90 min contact were necessary to
inactivate 90% of the C. parvum oocysts present. A 0.18 mg/L ozone concentration
inactivated 98.87% of the C. parvum oocysts; and for 100% inactivation, the
necessary concentration proved to be 0.24 mg/L. The molecular method (PCR)
showed sensitivity of 10
2
C. parvum oocysts. In the present work, the resistance of
C. parvum to the usual disinfection processes was confirmed, indicating the need for
more effective treatments in order to improve the quality of potable water consumed
in Brazil.
Keywords: chlorine dioxide, Cryptosporidium parvum, hypochlorous acid, in vitro
excystation, ozone, PCR
xii
1
1. INTRODUÇÃO
Na atualidade, dificilmente se encontra uma fonte de água doce que não tenha
suas características alteradas pelo homem. A eliminação de resíduos provenientes
da atividade humana é um dos fatores relevantes na contaminação dos corpos
d'água, constituindo um dos grandes problemas de saúde pública em diversas partes
do mundo (AMARAL et al., 1994). Há muito tempo a qualidade da água vem sendo
deteriorada, apresentando assim, um risco potencial de comprometimento à saúde e
ao bem-estar do homem (WORLD DEVELOPMENT REPORT, 1992). A
industrialização e o aumento populacional dos centros urbanos têm intensificado a
contaminação dos mananciais tornando necessário o tratamento da água para o
consumo humano (DI BERNARDO e DANTAS, 2005). Desta forma, quanto mais
conservado um manancial mais simples será o tratamento da água.
A infra-estrutura de saneamento na maioria dos países em desenvolvimento é
caracterizada por provisão pequena e desigual. Aproximadamente duas em cada dez
pessoas não tiveram acesso à água limpa em 2000, cinco em cada dez pessoas não
tiveram condições adequadas de saneamento e nove entre dez pessoas não tiveram
água tratada, especialmente em áreas rurais (WORLD DEVELOPMENT REPORT,
2006). Apenas 69% da população da América Latina e do Caribe têm acesso a
serviços de saneamento básico de esgoto e somente 10% do esgoto coletado é
tratado. O acesso a suprimento adequado de água limpa e saneamento básico é
fator crítico para a garantia da saúde (OPAS, 1998). Quando estes serviços não são
disponibilizados em determinadas áreas, um dos reflexos é o registro de altos níveis
de morbidade e mortalidade provenientes de doenças diarréicas.
No Brasil, em 2003, a população residente era de 173.966.052 habitantes,
com 84,3% residindo em áreas urbanas. A quinta causa de morte no país, com taxa
de 5,5%, foram as doenças infecciosas e parasitárias (OPAS,2005). Em 2004,
doenças infecciosas e parasitárias foram responsáveis por 8,38% das internações
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005). A existência de um sistema de tratamento eficiente
de águas e esgoto é de fundamental importância para que não se tenha
contaminação ambiental e se reduza a morbidade e mortalidade por doenças infecto-
parasitárias.
2
Dentre os agentes causadores de doenças parasitárias, veiculados pela água,
merece destaque Cryptosporidium spp., protozoário que infecta o homem e animais
domésticos, outros mamíferos silvestres, aves e répteis. Causa quadros clínicos
severos, tanto em humanos como em animais domésticos. A doença pode se
manifestar com diarréia, má absorção com déficits nutricionais e graves perdas de
peso. A criptosporidiose em crianças pequenas está associada a episódios de
diarréia prolongada pós-infecção, levando à má absorção e diminuição do
crescimento (AGNEW et al., 1998). Segundo alguns estudos, a criptosporidiose é
endêmica na maioria das regiões tropicais, sendo Cryptosporidium spp. um dos três
principais agentes causadores de diarréia infecciosa. No Brasil, o protozoário
representa causa de morbidade e mortalidade em crianças de zero a cinco anos de
idade e pacientes portadores de HIV (OSHIRO et al., 2000, GATEI et al., 2003).
Hospedeiros infectados podem excretar entre 10
9
e 10
10
oocistos de Cryptosporidium
spp. por grama de fezes, o que faz tanto animais domésticos quanto selvagens
serem considerados reservatórios de infecção humana (SMITH e ROSE, 1998). A
patologia em animais silvestres ainda é pouco conhecida e por isso discute-se o
papel destes animais como reservatórios deste microrganismo (APELBEE et al.,
2005).
Vários são os surtos de criptosporidiose citados na literatura recente,
especialmente nos Estados Unidos e Reino Unido (LECLERC et al., 2002, SMITH et
al., 2006). Deflagração de criptosporidiose de origem hídrica tem sido assinalada em
associação com contaminação de poço artesiano (NIME et al., 1976), água filtrada
de rede de abastecimento público (SMITH, 1998, SMITH et al., 2006) e água
superficial não tratada (ORLANDI e LAMPEL, 2000). Cryptosporidium spp.
representa um desafio à infraestrutura de saneamento das cidades. Pelo fato da
água ser o veículo mais importante na transmissão de oocistos de Cryptosporidium
spp. muitos estudos têm sido feitos sobre a ocorrência do parasito em esgotos,
águas superficiais, subterrâneas e tratadas em vários países (SMITH e ROSE,
1998). Na Inglaterra, GOH et al. (2004) mostraram que consumo de água de
abastecimento público, é um importante fator de risco para criptosporidiose
esporádica em humanos. Nos Estados Unidos, estudo sobre fatores de risco para
criptosporidiose esporádica em pessoas imunocompetentes mostrou que a maior
proporção de casos foi atribuída ao contato com bovinos, seguido do contato com
3
crianças com quadro diarréico, hábito de nadar em piscinas, lagos e viagens
internacionais (ROY et al., 2004). Águas de recreação, tais como piscinas públicas e
parques aquáticos, freqüentemente usadas por um grande número de pessoas, têm
sido relacionadas a epidemias de criptosporidiose nos últimos anos (CARPENTER et
al., 1999). MATHIEU et al. (2004) demonstraram numa investigação epidemiológica
no ano de 2000 em Ohio, EUA, que o principal fator de risco para surtos de
criptosporidiose foi o uso de piscinas recreacionais.
Este parasito apresenta, no curso do seu ciclo biológico, oocistos como
formas de resistência, que são eliminadas junto com fezes no ambiente. O homem
muitas vezes facilita a dispersão destas formas no solo e na água, quando os
contamina com suas próprias fezes ou as de animais. Isso ocorre por falta de
saneamento básico ou ainda por realizar a coleta de esgoto, proceder a tratamento
primário e lançá-los no ambiente, com organismos ainda viáveis. A reciclagem de
corpos d’água favorece a infecção por Cryptosporidium spp., por estarem sujeitos a
lançamentos de esgotos e pela capacidade dos oocistos em sobreviver por longos
períodos em variadas condições ambientais.
Face aos constantes relatos da ocorrência desta protozoose, esforços
importantes têm sido feitos para melhorar métodos de detecção e controle do
parasito a partir de uma possível fonte de infecção: a água. O tamanho micrométrico
(2-6 µm em compressão) deste organismo dificulta a sua detecção, necessitando-se
de técnicas de concentração de grande volume de água, seguido de identificação
microscópica das formas parasitárias. Estes procedimentos demandam estratégias
complexas e experiência considerável do pesquisador, além de apresentarem custo
elevado. Métodos moleculares como PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) têm
se mostrado promissores como alternativa para a detecção destes parasitos,
podendo ser futuramente empregados para avaliar a qualidade de processos de
tratamento da água. Ressalta-se, entretanto, que diferentemente de bactérias, a
detecção dos protozoários em água, por si só não é suficiente para a avaliação do
risco de infecção para humanos. É imprescindível avaliar de forma adequada a
viabilidade dos oocistos, já que somente aqueles viáveis possibilitam a ocorrência de
infecção.
Apesar dos processos de tratamento de água (associação de coagulação,
floculação, sedimentação e filtração) reduzirem em até 3 a 4 logs (99,9 e 99,99%,
4
respectivamente) de Cryptosporidium spp. da água de superfície, os oocistos deste
microrganismo são capazes de passar na etapa de filtração e resistir ao tratamento
por cloração (SMITH et al., 2006). O cloro é o desinfetante utilizado nos processos
convencionais de tratamento de água. Contudo, nas concentrações usuais, ele não
apresenta taxas efetivas de inativação dos oocistos de Cryptosporidium spp. (FAYER
et al., 1995, FINCH et al., 1997). Para que o cloro seja eficiente, são necessárias
altas concentrações do produto e longo período de contato, o que tornaria o
processo não aplicável. A busca por produtos desinfetantes que sejam eficientes na
inativação dos oocistos de Cryptosporidium spp. é alvo de muitas pesquisas. Neste
contexto, o dióxido de cloro e o ozônio são alternativas a serem consideradas para
aprimorar os sistemas convencionais de tratamento de água. Deve haver o
desenvolvimento e avaliação de métodos continuamente, buscando confirmar os
parâmetros de qualidade. Estas informações, além de contribuir para identificação e
avaliação de risco de surtos de origem hídrica, poderão ser úteis às instituições
governamentais como base para a definição, estruturação e implementação de
políticas públicas de saneamento e de saúde.
5
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Comprovar a eficiência ou não dos diferentes produtos químicos
empregados na desinfecção da água contendo Cryptosporidium parvum, bem como
determinar a sensibilidade analítica da técnica de biologia molecular na detecção
deste protozoário.
2.2 Objetivos Específicos
1. Determinar a sensibilidade analítica da técnica molecular (PCR) na
detecção de Cryptosporidium parvum em água, em escala laboratorial.
2. Determinar a viabilidade do protozoário pelo método de
desencistamento in vitro;
3. Testar a eficiência do ácido hipocloroso sobre o protozoário presente na
água;
4. Testar a eficiência do dióxido de cloro, em diferentes concentrações,
sobre o protozoário presente na água;
5. Testar a eficiência do ozônio, em diferentes concentrações, sobre o
protozoário presente na água.
6
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Cryptosporidium
3.1.1 Histórico
Este parasito foi observado pela primeira vez em 1907, no tubo digestivo de
um camundongo de laboratório, aparentemente sadio (TIZZER, 1907, 1910). Mas
sua presença só foi relacionada à doença em 1955 em perus (SLAVIN, 1955) e em
1971 em bezerros (PANCIERA et al., 1971). O primeiro caso de infecção humana foi
relatado em 1976, em uma criança de três anos de idade residente da zona rural
(NIME et al., 1976). Todavia, a criptosporidiose só passou a ter importância no início
dos anos 80 com o aparecimento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA)
e a seguir com as epidemias de veiculação hídrica (CRAUN et al., 1998, SMITH e
ROSE, 1998). Várias epidemias de criptosporidiose foram registradas nos Estados
Unidos, no Texas em 1985 e Geórgia em 1987 (D’ANTONIO et al., 1985, HAYES et
al., 1989). Devido a estas epidemias a agência de proteção ambiental inclui o
parasito na lista de organismos a serem pesquisados em água potável (SAVIOLI et
al., 2006). A maior epidemia ocorreu em Milwaukee, EUA, em 1993, onde 403.000
pessoas foram contaminadas pela ingestão de água potável contendo oocistos do
protozoário (MACKENZIE et al., 1994). Atualmente a criptosporidiose é considerada
uma doença emergente e a Organização Mundial da Saúde (OMS) a coloca na lista
das doenças negligenciadas (SAVIOLI et al., 2006). A exposição humana ao parasito
aumenta com a concentração de crianças em creches, popularização de piscinas
públicas, aumento do número de indivíduos imunocomprometidos e certas
peculiaridades do parasito. Por se tratar de uma séria questão de saúde pública,
vários são os estudos para detecção e inativação de Cryptosporidium spp.
7
3.1.2 Taxonomia e classificação
Phylum Apicomplexa
Classe Sporozoasida
Subclasse Coccidiasina
Ordem Eucoccidiida
Subordem Eimeriina
Família Cryptosporidiidae
Gênero Cryptosporidium (LEVINE, 1980).
Cryptosporidium é o único coccídeo pertencente à família Cryptosporidiidae e
muitas espécies têm sido encontradas parasitando numerosos vertebrados como
mamíferos (bovino, ovino, cães, homem), aves, répteis e peixes (O’DONOGHUE,
1995). Apresenta potencial zoonótico como assinalado na Austrália, África, América
(Costa Rica, Haiti, EUA e Brasil) (Tabela 1).
TABELA 1 - ESPÉCIES DE Cryptosporidium E PRINCIPAIS HOSPEDEIROS
Espécies de Cryptosporidium Principais hospedeiros
C. hominis
Humanos, macacos
C. parvum
Bovinos, outros ruminantes, humanos
C. bovis
Bovinos
C. muris
Roedores
C. suis
Suínos
C. canis
Cães
C. felis
Gatos
C. meleagridis
Perus, humanos
C. andersoni
Bovinos, camelos
C. wrairi
Porquinho da Índia
C. baileyi
Aves
C. galli
Aves
C. serpentis
Serpentes
C. saurophilum
Lagartos
C. molnari
Peixes
C. nasorum *
Peixes
FONTE: Cacciò et al., 2005 (revisão, tabela baseada no artigo de Xiao et al., 2004) e Appelbee et al.,
2005. *Appelbee et al., 2005 citam esta espécie como parasita de peixes e não citam C. molnari.
8
Sete espécies foram descritas parasitando humanos (C. hominis, C. parvum,
C. meleagridis, C. felis, C. canis, C. suis, C. muris) (SMITH et al., 2006). Estudos
recentes, usando como ferramentas a biologia molecular, têm demonstrado a grande
variabilidade genética intra-específica. A análise de mais de 3000 amostras permitiu
identificar que Cryptosporidium parvum e C. hominis são as espécies mais
freqüentemente assinaladas (MORGAN-RYAN et al., 2002). Mas suas prevalências
variam em diferentes partes do mundo. C. hominis é mais freqüente na América do
Norte, América do Sul, Austrália e África, enquanto que C. parvum seria mais
prevalente na Europa.
3.1.3 Morfologia
O parasito possui diversas formas dependendo da fase no ciclo biológico. Os
oocistos têm forma esférica ou elíptica, chegando medir de 2 a 6 µm de diâmetro,
quando comprimido. No interior dos oocistos possuem quatro esporozoítos (sem
esporocistos) e um corpo residual. A parede é lisa e dupla. Existem dois tipos de
oocistos: os de parede espessa (80%) e parede delgada (20%). As demais formas
são encontradas nas células intestinais dos hospedeiros, constituindo de meronte
contendo merozoítos e os gametócitos masculinos e femininos (AKIYOSHI et al.,
2003).
3.1.4 Biologia
A infecção com Cryptosporidium spp. ocorre por ingestão dos oocistos viáveis
presentes na água ou alimentos. O desencistamento ocorre pela exposição a
temperaturas corporais, ácido gástrico, tripsina e sais biliares. Os esporozoítos
liberados penetram nas microvilosidades intestinais, geralmente do jejuno ou íleo, ou
trato respiratório. Forma-se então um vacúolo parasitóforo intracelular, porém extra-
citoplasmático. Neste local os esporozoítos transformam-se em trofozoítos e sofrem
divisão múltipla, formando o meronte, onde são gerados merozoítos de tipo I ou de
tipo II, por meio de reprodução assexuada.
Os merozoítos de tipo I são capazes de infectar outras células e repetir a
reprodução assexuada. Os merozoítos de tipo II iniciam o ciclo sexuado
9
(gametogonia), gerando gametas masculinos (microgametócitos) e femininos
(macrogametócitos). Cada microgameta fertiliza um macrogameta, produzindo o
zigoto, dentro de um oocisto, o qual sofre meiose e dá origem ao oocisto esporulado.
Os oocistos são liberados na luz intestinal e excretados nas fezes (Figura 1).
FIGURA 1 - CICLO BIOLÓGICO DE Cr
NTE: lpsi.barc.usda.gov/awpl/cryptosporidium
O ciclo biológico se completa de 12 a 14 horas e o período entre a ingestão de
ocistos e a excreção destes nas fezes pode variar de acordo com o hospedeiro e a
spécie de Cryptosporidium (FAYER, 1997).
O oocisto esporulado é a única forma exógena e já é infectante ao ser
liminado. Tal característica, aliada à auto-infecção, explica a baixa dose infectante
luntários humanos indicaram doses
fectantes mínimas de nove oocistos (OKHUYSEN et al., 1999).
yp
tos
p
oridium s
pp
.
FO
o
e
e
para o homem. Estudos realizados com vo
in
10
3.1.5 Patogenia
O mecanismo de ação patogênica do parasito ainda não está completamente
ostram que a invasão celular por Cryptosporidium spp., por
eio do complexo apical, é dependente de cálcio intracelular e de alterações do
eriza-se por diarréia, dor abdominal, febre baixa,
fadiga, perda de apetite e de peso, náusea e vômito. Outras manifestações clínicas
incluem
nal e exposição prévia, uma vez que
pesso
.1.6 Criptosporidiose no homem.
doença no homem pode evoluir de quatro formas: assintomática, aguda,
crônic
S, 1998). A forma crônica geralmente
ocorre
10 vezes ao dia,
sem s
caracterizada por uma diarréia líquida com eliminação de fezes de 10 a 20 vezes ao
dia podendo levar a perda de 10 litros de água por dia. A progressão ocorre com
perda importante de peso, hipovolemia e caquexia, levando à morte. Quando há
elucidado. Estudos m
m
citoesqueleto do parasito (CHEN et al., 2004).
A criptosporidiose caract
colecistite, hepatite, pancreatite e problemas respiratórios.
A susceptibilidade e a severidade da doença variam entre os indivíduos e
dependem do estado imunológico e nutricio
as que residem em áreas endêmicas apresentam infecção leve ou
assintomática (CURRENT, 1994). O período entre a ingestão de oocistos e o
aparecimento dos sintomas é de sete a dez dias, podendo variar de cinco a 28 dias.
3
A
a ou fulgurante (intensa e rápida). A taxa de indivíduos excretando oocistos
sem diarréia é baixa. HAYES et al. (1989) relatam que 13% de pessoas excretando
oocistos não eram portadoras de diarréia. A forma aguda é observada em crianças
com menos de cinco anos de idade (GRIFFTH
em indivíduos mal nutridos ou em pacientes imunodeprimidos.
Em indivíduos imunocompetentes que desenvolvem casos de gastrenterite
observa-se uma síndrome diarréica, com eliminação de fezes 3 a
angue e contendo muco. Os principais sintomas são dores abdominais, febre,
náuseas e vômitos. A doença normalmente é autolimitada. Em indivíduos
imunocomprometidos, como pacientes HIV-positivos com linfócitos CD4
+
abaixo de
200 céls./mm
3
, a infecção pode ser crônica e fatal (POZIO et al., 1997). Pode
apresentar-se na forma digestiva (93%) ou pulmonar (33%). A forma digestiva é
11
infecçã
Desta
s outros agentes patogênicos.
m aves a infecção pode se manifestar por síndrome digestiva ou pulmonar
(SRET
atos a espécie em causa é C. felis. Animais com infecção aguda também
aprese
o maciça pode haver invasão pulmonar por contigüidade e pneumopatias
intersticiais são descritas (MACKENZIE et al., 1994).
Torna-se importante destacar que não existe terapia curativa para
criptosporidiose humana. Em indivíduos HIV-positivos é feita terapia antiretroviral, o
que tem diminuído o risco de morte por diarréia. Nitazoxanide diminui a eliminação
de oocistos e tem sido utilizado em crianças HIV-negativas (SAVIOLI et al., 2006).
forma, a prevenção deve ser considerada o ponto principal para controle da
doença.
3.1.7 Criptosporidiose em animais de produção
O sinal comumente observado é diarréia líquida e profusa, possui coloração
amarelada e odor fétido. Acompanhando a diarréia surge desidratação, febre e
anorexia.
Em bovinos a doença afeta animais na faixa etária de quatro a 30 dias, com
maior prevalência para duas semanas de idade. A excreção de oocistos pode durar
sete dias. Quando ocorre uma epidemia até 85% dos animais podem ser afetados
(TZIPORI et al., 1980).
Em caprinos quando o desmame ocorre em 24 a 48 horas pode haver uma
diarréia profusa e mortalidade dos animais geralmente é observada em uma a duas
semanas (VIEIRA et al., 1997).
Em suínos a doença apresenta-se de forma sazonal e 26% dos animais
infectados apresentaram diarréia (SANFORD, 1987). Nos animais com diarréia foram
observado
E
ER e VARGA, 2000).
3.1.8 Criptosporidiose em animais de companhia
Em g
ntam diarréia. São conhecidos dois casos de infecção causada por C. felis em
pacientes HIV-positivos, nos Estados Unidos (MORGAN et al., 2000).
12
LALLO e BONDAN (2006) demonstraram prevalência de C. parvum de 9,5%
na população canina de São Paulo entre 2003 e 2004.
997).
baixa dose infectante, oocistos esporulados infectando
imediatamente após sua eliminação com as fezes, pode ser transmitido de pessoa
para p mbiente e se dispersam por
via hídrica, alimentos ou ainda pelo ar. A transmissão direta (contato com pessoas
infecta
onais também
repres
pregados nestas águas,
espec
e aerossóis ou contaminar águas superficiais
e subterrâneas. A ingestão de água contaminada é a principal via de contaminação
human 00). Dezenove epidemias foram registradas nos últimos
anos por consumo de água contaminada (SMITH e ROSE, 1998).
Nos animais em geral a infecção pode se manter em estado subclínico e
condições de stress ou outra condição de imunodepressão poderia reativar a
excreção de oocistos (FAYER, 1
3.1.9 Epidemiologia
Vários são os fatores que influenciam a epidemiologia desta protozoose:
pequeno tamanho do oocisto,
essoa, os oocistos são altamente resistentes no a
das ou animais infectados) ou indireta (ingestão de água contaminada,
ingestão de alimentos contaminados, inalação dos oocistos) é favorecida por altas
densidades populacionais (CACCIÒ et al., 2005). Águas recreaci
entam grande problema de saúde pública, devido à alta resistência de
Cryptosporidium parvum aos desinfetantes em
ialmente o cloro, e ao grande número de banhistas (CARPENTER et al., 1999).
A utilização de fezes de animais como adubo orgânico em culturas vegetais pode
levar à infecção direta pela formação d
a (FAYER et al., 20
O parasito tem uma distribuição mundial e pode ser encontrado tanto em
países desenvolvidos como em países em desenvolvimento (SLIFKO et al., 2000; DI
GIORGIO et al., 2002; HIGGINS et al., 2003; MONIS e THOMPSON, 2003). SMITH
e ROSE (1998) relataram que ocorrem anualmente de 250 a 500 milhões de
infecções causadas por Cryptosporidium spp. na Ásia, África e América Latina.
Nos Estados Unidos, surto de criptosporidiose que ocorreu na Geórgia (EUA)
resultou da contaminação de água da rede pública de abastecimento, embora o
sistema de tratamento da água fosse filtração em areia e cloração e cumprisse o
exigido pelas normas oficiais americanas (HAYES et al., 1989). De acordo com
13
CORSO et al. (2003) pelo menos dez surtos de criptosporidiose foram associados
com água potável nos Estados Unidos entre 1990 e 2000. O maior surto registrado
neste país foi o que ocorreu em Milwaukee, no qual 403 mil pessoas foram afetadas,
apesar de terem ingerido água filtrada e clorada (MACKENZIE et al.,1994). Relatos
recentes demonstram que o parasito está presente em 80 a 97% de águas
superficiais e em 26 a 54% de águas tratadas (SIMMONS et al., 2001, LUNA et al.,
2002). Alguns estudos demonstraram que a criptosporidiose apresenta variação
sazon
iose
ocorre
etectada em várias provícias foi entre 1,36 e
13,3%
tivos no norte da Índia, 10,8% foram positivos
també
al, sendo mais freqüente nos meses quentes e úmidos (UNGAR, 1990). Um
estudo dos casos de infecção por parasitas intestinais no ano de 2000 nos Estados
Unidos, mostrou uma prevalência de Cryptosporidium spp. de 13%, sendo que o pico
ocorreu na primavera (AMIN, 2002).
Em 2003, surto com 25 casos humanos confirmados de criptosporid
u em Surrey, Canadá, dos quais 15 haviam nadado em piscina recreativa, na
qual foram detectados oocistos de Cryptosporidium spp. Em nove casos tratava-se
de C. parvum (LOUIE et al., 2004).
Na Europa, LEMARCHAND e LEBARON (2003) detectaram a presença de
Cryptosporidium spp. em 78% de amostras de água residual não tratada e 52% em
efluentes de sistema de tratamento de esgoto por lodos ativados. Na Finlândia, o
primeiro registro de Cryptosporidium em águas superficiais ocorreu em 2002 e
estima-se 15 casos de criptosporidiose por ano nesse país (RIMHANEN-FINNE et
al., 2002). Na Noruega o número de casos de criptosporidiose é baixo. Entre 1992 e
2003 (exceto 1999) houve 67 casos suspeitos da infecção, onde apenas dois foram
comprovados como positivos, ambos em 2000 (ROBERTSON et al., 2006). Em
2005, 62 casos de infecção por C. parvum foram confirmados em Pertshire, Escócia,
relacionados à visita em um centro de animais selvagens (McGUIGAN, 2005).
Segundo WANG et al. (2002) a taxa de infecção por C. parvum na Província
Anhui, China, é de 1,33%. A taxa d
. Um estudo em Jeollanam-do, Coréia, demonstrou que apenas 1% dos
pacientes imunocompetentes com diarréia foi positivo para C. parvum (LEE et al.,
2005).
Em pacientes HIV - soroposi
m para C. parvum (MOHANDAS et al., 2002). No Iran, pesquisa com
14
indivíduos HIV - positivos apresentou prevalência de 1,5% para C. parvum (ZALI et
al., 2004).
Estudo com crianças africanas da Uganda, que apresentavam diarréia
persistente, detectou prevalência de Cryptosporidium spp. de 31,3%. Entre as
crianças com HIV, a taxa foi de 73,6% (TUMWINE et al., 2005). Em Gana, um estudo
mostra prevalência de Cryptosporidium spp. de 27,8 e 15,6% em crianças com e
sem diarréia,respectivamente (ADJEI et al., 2004).
Segundo UNGAR et al. (1988) a prevalência de criptosporidiose em crianças
de paí
Bolívia. Na Venezuela, em dois vilarejos ameríndios no oeste do país, um
estudo
baixa renda. No México, estudo com três comunidades de Chihuahua, foi
encon
ACH et al., 2004).
ses latino americanos varia de 2 a 31%. Um estudo na Jamaica demonstrou
uma prevalência de Cryptosporidium spp. em torno de 4%, especialmente em
crianças (LINDO et al., 1998). ESTEBAN et al. (1998) registraram prevalência de
Cryptosporidium spp. de 31,6% em crianças da comunidade Aymara, no altiplano
norte da
determinou prevalência global de Cryptosporidium spp. de 8,8% (CHACÍN-
BONILLA e SÁNCHEZ-CHÁVEZ, 2000). No Peru, XIAO et al. (2001) demonstraram
uma prevalência de Cryptosporidium spp. de 21% em crianças de uma comunidade
urbana de
trada taxa global de 70,4% de Cryptosporidium spp. (REDLINGER et al.,
2002). Nestas comunidades não havia serviço municipal de saneamento e a maioria
da população não tinha água encanada em suas casas. Na Guatemala, pesquisa
feita com crianças de duas comunidades ao redor do Lago Atitlan mostrou uma
prevalência de 32% de Cryptosporidium spp. (LAUB
No Brasil, segundo o Ministério da Saúde, de 1980 a 1999 foram notificados
4.691 casos de criptosporidiose em portadores de imunodeficiência. A presença do
parasito tem sido assinalada desde os anos 80 quer seja em pacientes
imunodeprimidos ou em crianças que representam grupos de risco (MOURA et al.,
1989). Os estudos sobre Cryptosporidium spp. e criptosporidiose geralmente estão
relacionados a levantamentos epidemiológicos em algumas regiões do país.
MASCARINI e DONALÍSIO (2006) demonstraram prevalência de 15,5% (2002) e
3,7% (2003) de Cryptosporidium sp. em crianças de creches municipais de Botucatu,
São Paulo.
Com relação à presença de oocistos de Cryptosporidium spp. no ambiente,
registram-se vários trabalhos científicos no Brasil. GAMBA et al. (2000) mostram a
15
contaminação de águas superficiais em oito de dez pontos examinados no município
de Itaquaquecetuba. FRANCO et al. (2001), em pesquisa de oocistos em águas
superficiais do rio Atibaia, assinalam a presença de oocistos durante três semanas
consecutivas. No município de Campinas, o protozoário também foi observado tanto
em ág
te na água. No ambiente, os oocistos de Cryptosporidium spp. podem
sobrev
utras características destes protozoários são: a resistência
aos de
uas superficiais como em água mineral (FRANCO e CANTUSIO, 2002).
HELLER et al. (2004) relatam a presença de Cryptosporidium spp. em água de
mananciais, em concentrações elevadas com 510 oocistos de Cryptosporidium spp.
por litro. A taxa média ficou entre seis a 20 oocistos por litro. Em efluentes de ETA(s)
os autores detectaram quantidades de oocistos de Cryptosporidium spp. superiores
às citadas na Europa.
Os protozoários de veiculação hídrica têm como característica comum a
presença de formas capazes de resistir por meses no ambiente externo,
especialmen
iver por até um ano a 4ºC (TAMBURRINI e POZIO, 1999). Na água, os
oocistos podem permanecer viáveis por até 176 dias, incluindo 35 dias na água do
mar, suportam ampla variação de temperatura e não são alterados pela luz do sol
(CHAURET et al., 1995).
Também pode haver contaminação de plantações de hortaliças, por meio de
água contaminada utilizada para irrigação. Estas, se não devidamente higienizadas e
consumidas cruas, podem se transformar em importantes vias de transmissão. O
primeiro relato de infecção por consumo de alimentos contaminados com oocistos de
Cryptosporidium spp. ocorreu em Maine, EUA, em 1994 após a ingestão de suco de
maçã fresco, onde 213 pessoas foram infectadas (MILLARD et al., 1994). No Brasil,
não há registro de surtos diretamente associados à contaminação alimentar por
Cryptosporidium spp. O
sinfetantes, seu tamanho reduzido, as baixas doses infectantes e serem os
reservatórios de infecção o homem ou os animais (Tabela 2).
16
TABELA 2 – CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE Cryptosporidium spp. QUE
FACILITAM A TRANSMISSÃO POR VIA HÍDRICA E ALIMENTAR
Característica Cryptosporidium spp.
Grande número de oocistos eliminados
pelos hospedeiros infectados.
Oocistos são infectantes quando eliminados nas
fezes. Aproximadamente 10
10
oocistos são
excretados durante infecção sintomática. 10
7
oocistos
por grama de fezes em bovinos infectados.
Especificidade multi-hospedeiro aumenta o
potencial de disseminação e contaminação
ambiental.
Sete espécies descritas de Cryptosporidium e duas
não descritas (cervo e macaco) infectam o homem.
Grande resistência de oocistos aumenta a
sobrevivência em ambientes favoráveis
antes da ingestão por hospedeiros
potenciais.
A sobrevivência de oocistos é intensificada em
ambientes frios e úmidos (regiões temperadas). Seis
meses suspensos em água.
Sobrevivência dos oocistos a alguns
processos de tratamento de água.
Surtos por veiculação hídrica indicam que oocistos
podem sobreviver a tratamentos físicos e
desinfecção. Oocistos são resistentes a desinfetantes
comumente utilizados no tratamento da água.
O pequ o tamanho de oocistos ajuda na
passagem pelos filtros de areia.
Os oocistos de todas as espécies que infectam o
homem têm 4,5 - 6,0 µm, com exceção de C. muris,
que tem 8,4 X 6,3 µm (comprimento X largura).
en
Dose infectante baixa significa que poucos
oocistos viáveis precisam ser ingeridos
cção
hospedeiros suscep
A dose infectante para C. parvum é 9 -1042 oocistos;
dez oocistos podem causar infecção em primatas
ju .
para a infe se estabelecer em
tíveis.
não-humanos venis
A excreção de oocistos nas fezes facilita a
disseminação para a água.
Oocistos viáveis hospedeiros
paratênicos (transporte passivo) como os gansos do
excretados por
Canadá.
A excreção de oocistos em cursos de água
facilita a contaminação de moluscos
filtradores marinhos e de água doce.
Acima de 5 X 10
3
oocistos de C. parvum. Oocistos de
C. parvum, C. hominis e C. meleagridis podem ser
detectados em vários mariscos.
FONTE: Smith et al., 2006 (Adaptado de Sm
i
m água
quantidade de oocistos freqüenteme ais é
et al., 2004). Os métodos
th et al., 1995).
3.2 Métodos de detecção de Cryptosporidium spp. e
3.2.1 Métodos diretos
No que diz respeito à detecção deste parasito deve-se lembrar que a
nte encontrada em amostras ambient
pequena, demandando a concentraç
recuperação (100L ou menor escala d
ão de grandes volumes de água para sua
e 10-20L) (CAREY
mais comuns para detecção e quantificação, inicialmente desenvolvidos para Giardia
17
spp. e posteriormente empregados p
SPENCER, 1997).
ara concentrar as amostras de água, as técnicas envolvem geralmente a
filtraçã et al., 1987)
ou membranas filtrantes (ONGERTH e STIBBS, 1987). Após a passagem da
amostra, as partículas de tamanho maior que a porosidade nominal (a partir de 1 μm)
são recuperadas com eluentes. Taxas de recuperação por este tipo de filtração são
variad
ecuperação acima de 70% para Cryptosporidium spp., tanto em
água d
desenvolveram um método indireto com anticorpos policlonais específicos para
ara Cryptosporidium spp., constam de etapas
como a concentração das formas parasitária
mesmas e a coloração por im
s na amostra de água, a purificação das
unofluorescência (VESEY et al., 1993b,
LECHEVALLIER et al., 1995, JAKUBOWSKI et al., 1996, BORCHARDT e
P
o empregando filtros do tipo cartucho de polipropileno (MUSIAL
as, sendo reportados valores de 11,2% para filtros tipo cartucho por
SHEPHERD e WYN-JONES (1996). Nas membranas filtrantes de acetato-celulose,
cuja recuperação dos parasitos pode se dar por dissolução das mesmas por
acetona, foram relatadas taxas de recuperação de 70,5% (ALDOM e CHAGLA,
1995), com a vantagem de não haver alteração das formas em etapas posteriores de
coloração com anticorpo monoclonal (GRACZYK et al., 1997). Outra opção de
concentração é a floculação química com carbonato de cálcio, com posterior
dissolução dos flocos em ácido e redução do volume a um mililitro para análise
(VESEY et al., 1993b). Utilizando este método, SHEPHERD e WYN-JONES (1996)
obtiveram taxas de r
estilada como em água de rio.
Na etapa de purificação, os parasitos podem ser separados de outros
sedimentos, o que geralmente é realizado por técnicas de flutuação em gradiente de
Percoll ou sacarose. Com isso, o material de interesse passa por uma separação
adicional de outras partículas que dificultam a identificação dos parasitos.
Na quantificação/identificação de Cryptosporidium spp. do material, a
metodologia mais freqüentemente empregada é a imunofluorescência (IF), utilizada
também para detecção em exame parasitológico de fezes (RUSNAK et al., 1989). A
imunofluorescência emprega anticorpos monoclonais ou policlonais específicos,
marcados com isotiocianato de fluoresceína, capazes de se ligarem à superfície do
parasito (IF direta) ou do anticorpo primário (IF indireta). Isso permite visualizar os
parasitos por emissão de fluorescência e morfologia. ONGERTH e STIBBS (1987),
18
Cryptosporidium de amostra ambiental, previamente purificado. Os anticorpos
monoclonais podem diminuir a reação cruzada com outros organismos e forma
complexos parasita-anticorpo mais estáveis.
O método americano ASTM (American Society for Testing and Materials) foi
um d
aprovou o
métod
e se liga à parede do oocisto e o torna
fluores
estruturas de densidade e aspecto similar às
formas
os primeiros que utilizou o procedimento filtração/flutuação/detecção por
imunofluorescência para identificar e quantificar Cryptosporidium spp. em água
(ASTM, 1991). Entretanto, baixos índices de recuperação (25,3%) foram descritos
para este método (LECHEVALIER et al., 1991). Posteriormente, a USEPA
o ICR Protozoan Method, como parte de uma regra de monitoramento
conhecida como “Information Colletion Rule” (USEPA, 1996). O método ICR
apresenta princípios similares ao ASTM, porém limitações como a baixa eficiência de
recuperação de oocistos demandava modificações para melhorar a detecção
(LECHEVALIER e NORTON, 1995).
No Reino Unido e Austrália, a citometria de fluxo baseada na distribuição
celular é outro método de detecção bastante utilizado para detecção de
Cryptosporidium spp. em amostras ambientais (VESEY et al., 1993a). O princípio
deste método é a detecção de células eletricamente carregadas em função de um
sinal fluorescente. Amostras concentradas de água são incubadas com anticorpo
monoclonal conjugado a um fluorocromo, qu
cente. Uma suspensão é aplicada no citômetro, o qual analisa as células,
diferenciando-as pelo tamanho, conteúdo interno e fluorescência. O material livre de
debris é então coletado em lâmina e observado ao microscópio. Estudos mostram
que esta técnica é bem mais sensível que a IF, além de demandar menos tempo que
o método ASTM (COMPAGNON et al., 1997). A desvantagem deste método é o alto
custo do aparelho e a necessidade de experiência do operador do mesmo.
Uma das importantes inovações tecnológicas aplicadas aos métodos para
detecção de parasitos foi a separação imunomagnética (IMS). A IMS substitui a
purificação por flutuação, a qual pode determinar a ocorrência de falsos positivos na
imunofluorescência, devido ao fato de
parasitárias sofrerem ligações inespecíficas aos anticorpos utilizados para os
parasitos. Isto ocorre especialmente em Cryptosporidium spp., cujo tamanho
reduzido dificulta a sua identificação. A IMS utiliza partículas ou pérolas magnéticas
adsorvidas com anticorpos capazes de capturar os oocistos em meio aos
19
sedimentos concentrados. Aplica-se então um forte campo magnético que captura
os complexos pérolas/parasitos, os quais são removidos e posteriormente
separados, resultando em uma suspensão purificada (CAREY et al., 2004). A
separação imunomagnética é utilizada no método 1623 da EPA (USEPA, 2001),
para detecção de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. e no protocolo padrão de
operação para monitoramento de Cryptosporidium spp. ou SOP (QUINTERO-
BETANCOURT et al., 2002). Ambos utilizam, após a separação imunomagnética, a
imunofluorescência para detecção. Incluem também a microscopia de contraste por
interfe
tem se mostrado promissora e permite o
estudo
rência e uso de corante vital (DAPI – 4,6-diamino-2-phenylindole e PI – iodeto
de propídio) para confirmação morfológica. Entretanto, a eficiência da IMS diminui
com amostras de água com alta turbidez.
Conforme observado, as técnicas disponíveis para detecção de
Cryptosporidium spp. em água envolvem procedimentos complexos e demorados.
Discute-se também que a variação entre lotes dos kits de identificação por
imunofluorescência e a reatividade cruzada dos anticorpos com algas e outros
elementos possa levar a erros de interpretação (QUINTERO-BITENCOURT et al.,
2002). Embora bem padronizadas por pesquisadores e técnicos americanos, o custo
destas metodologias é um fator limitante considerando a realidade brasileira. Outra
desvantagem é que estas metodologias permitem apenas a identificação do gênero
do parasito em questão, não permitindo determinar a fonte de contaminação e se
representa ou não risco para o homem. Neste contexto, alternativas para a etapa de
detecção dos parasitos devem ser consideradas.
3.2.2 Métodos indiretos
Entre as novas propostas de metodologia a detecção molecular específica por
PCR (Reação da Polimerase em Cadeia)
da genotipagem para melhor compreensão da epidemiologia e conhecimento
das fontes de infecção.
Na Tabela 3 estão relacionadas seqüências alvos e métodos moleculares
utilizados para identificação de Cryptosporidium spp.
Como metodologia molecular, a PCR tem a vantagem sobre métodos
microscópicos, que têm como limitações o tamanho e o número reduzido dos
20
parasitos em amostras ambientais e a necessidade de experiência por parte do
pesquisador para reconhecer a morfologia. A especificidade e sensibilidade da PCR
têm levado à sua utilização para detectar Cryptosporidium spp. em amostras clínicas
e ambientais (MONIS et al., 2002; KAUCNER e STINEAR, 1998).
A técnica é capaz de amplificar milhares de vezes regiões específicas do
DNA, através de uma reação que usa os elementos básicos do processo de
replica ula. Os componentes essenciais para que a reação
ocorra são: DNA polimerase termoestável (Taq polimerase), oligonucleotídeos
(prime
pós a abertura da fita de DNA que permite o pareamento
entre
estudado, que é separado
poster
stos em água de
superf
01) e STURBAUM et al. (2001) têm mostrado que a
PCR é
ção natural desta moléc
rs ou iniciadores) para iniciar a síntese de DNA, deoxinucleotídeos trifosfato
(dNTPs), cátion divalente (Mg
2+
), tampão para manter o pH, cátions monovalentes
(KCl), DNA molde (template).
A reação ocorre a
os iniciadores e o DNA alvo e nova síntese. Como resultado obtém-se um
fragmento amplificado, específico do organismo
iormente por eletroforese.
LOWERY et al. (2001) utilizaram a PCR em amostras de água de consumo na
Irlanda do Norte, para detectar Cryptosporidium spp. após separação
imunomagnética. Os autores destacam a sensibilidade e especificidade da técnica,
além da capacidade de fornecer a genotipagem dos parasitos de forma rápida.
RIMHANEN-FINNE et al. (2002), detectaram de 50 a 100 ooci
ície e constataram que alta turbidez exige purificação extra antes da PCR.
Um dos problemas da técnica de PCR é a presença de inibidores, que são
freqüentes em amostras ambientais. Para minimizar este problema, os
pesquisadores utilizam técnicas mais aprimoradas para extração do DNA das
amostras, como o uso de resinas especiais (HALLIER-SOULIER e GUILLOT, 1999;
GUY et al., 2003). No que se refere à sensibilidade, trabalhos como de CHUNG et
al. (1999), MONIS e SAINT (20
sensível para detectar de um a 10 oocistos de Cryptosporidium spp. Nestes
trabalhos os autores utilizaram a estratégia da Nested-PCR, na qual o material já
submetido a uma primeira amplificação é re-amplificado, aumentando a
sensibilidade.
SMITH et al. (2006) referem-se à PCR como uma técnica viável para
monitorar Cryptosporidium spp. em amostras ambientais, pois alguns problemas de
21
inibição da Taq polimerase, sensibilidade e avaliação da viabilidade podem ser
superados.
TABELA 3 – LISTA DE ALVOS MOLECULARES, TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO E PRINCI
PAL
Alvos mole
APLICAÇÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE Cryptosporidium spp.
culares Técnicas de amplificação Principal aplicação
18SSU rDNA PCR, nested PCR, PCR-RFLP
sequenciamento, PCR tempo real,
microarranjo.
Identificação de espécies e
genótipos
Hsp 70 PCR, nested PCR, sequenciamento,
PCR tempo real, microarranjo.
Identificação de espécies e
genótipos
COWP PCR, nested PCR, PCR-RFLP
sequenciamento, PCR tempo real,
microarranjo.
Identificação de espécies e
genótipos
Actina PCR, nested PCR, sequenciamento. Identificação de espécies e
genótipos
ß-Tubulina PCR, nested PCR, PCR-RFLP, Identificação de espécies e
GP60
sequenciamento. genótipos
PCR, nested PCR, sequenciamento. Identificação de subgenótipos
Microsa
heteroduplex.
telites PCR, nested PCR, sequenciamento. Identificação de subgenótipos
Minisatelites PCR, nested PCR Identificação de subgenótipos
RNA
extracromossomal
RT-PCR, sequenciamento, Identificação de subgenótipos
FONTE: Cacciò et al., 2005 e Smith et al., 2006. Abreviações: 18SSU-rDNA - Small subunit ribosomic
NA; Hsp70 - Heat shock protein 70; COWP – Cryptosporidium oocist wall protein; GP60 -
licoproteína 60; RFLP - restriction fragment lehgth polymorphism; RT-PCR - Reverse Transcription-
3.3 Tratam ou inativação de
Em virtude
esforços têm sido empreendidos pelas empresas de saneamento para monitorar e
nsum
gência
em f águ e de
nto, vi emoção ou inativaçã p. de
4,5 logs ( l de
D
g
PCR .
ento da água com objetivo de remoção
Cryptosporidium spp.
do aumento de surtos de criptosporidiose de origem hídrica,
reduzir a presença deste patógeno na água de co o.
A A de Proteção Ambiental Americana (USEPA) estabeleceu, em 1999,
uma das primeiras regulamentações para controle de Cryptosporidium spp. Estas
normas exig iltração e desinfecção de toda a de superfície e de red
abastecime sando redução (r o) de Cryptosporidium sp
3 a 99,9 a 99,997%, respectivamente), dependendo do níve
22
contaminação da PA, 1999). No Reino Unido, a regulamentação da
Como resultado da implementação destas normas a porcentagem de água
atada contendo oocistos de Cryptosporidium spp. caiu de 8% registrados em 1999
para 1% em 2003 (SAVIOLI et al., 2006).
estabelece parâmetros para tratamento da água de abastecimento (BRASIL.
MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). O Cap. IV
e
Giardia
As tecnologias
mais comuns de tratamento de água incl
que não ficaram retidos nos processos
anteriores são expostos a processos químico
m parvum (CAMPBELL, 1982, KORICH et al., 1990,
FAYER et al., 1995, FINCH et al., 1997, VENCZEL et al., 1997). FAYER et al. (1995),
água (USE
Agência de Água estipula um número máximo permitido de 10 oocistos por 100 L de
água tratada por processo de filtração (FAIRLEY et al., 1999).
tr
No Brasil, o Ministério da Saúde, publicou a Portaria MS n
o
518, onde
, Art. 11, § 8º, trata do padrão de
potabilidade exigindo ausência de Escherichia coli ou Coliformes termotolerantes em
100 mL. Com vistas a assegurar a eficiência para remoção de enterovírus, cistos d
spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. é recomendado para filtração rápida
valores de turbidez inferiores a 0,5 UT em 95% dos dados mensais, e nunca
superiores a 5,0 UT. Todavia, para cumprir tais normas torna-se necessário o
desenvolvimento de técnicas sensíveis e específicas para o monitoramento destes
protozoários.
Processos convencionais de tratamento de água de efluentes contribuem para
reduzir os microrganismos presentes na água, embora sua eficiência não seja a
mesma para todos os protozoários (BETANCOURT e ROSE, 2004).
uem processos ou etapas como a
coagulação/floculação, sedimentação, filtração e desinfecção.
Na etapa de desinfecção, organismos
s ou físicos que têm o objetivo de torná-
los inviáveis ou não infectantes. Destaca-se que, embora a desinfecção possa ser
levada a ponto de esterilização, nem sempre se atinge a destruição completa dos
microorganismos (MEYER, 1994).
Dos processos químicos, a substância desinfetante utilizada é o cloro. No
início, o cloro era empregado na desinfecção de águas somente quando ocorriam
epidemias. A partir de 1900 a cloração começou a ser empregada de maneira
contínua (MEYER, 1994). Nas concentrações comumente utilizadas nos tratamentos
convencionais de água, o cloro não apresenta taxas efetivas de inativação para
oocistos de Cryptosporidiu
23
demon
ondições usualmente
encon
es. A reatividade do cloro geralmente é menor em
pH m
straram em modelo animal, que oocistos ainda permaneciam infectivos após
exposição a 5,25% de cloro. As concentrações efetivas são altas e requerem longo
período de exposição, tornando o processo de desinfecção caro e tóxico (FAYER,
1997). CARPENTER et al. (1999), examinaram os efeitos do cloro sobre a
viabilidade dos oocistos de C. parvum, simulando as c
tradas em piscinas e águas recreacionais. Os valores de CT (Concentração x
Tempo) são altos para obtenção de inativação e há resultados variáveis. Além disso,
o CT tem seus valores alterados na presença de material fecal. Tal observação
reforça o fato de que os oocistos se aderem às partículas orgânicas e ficam então
protegidos da ação dos desinfetant
ais alto e temperatura mais baixa (MEYER, 1994, MACEDO, 2004). Nas
estações de tratamento de água, a cloração pode ser realizada utilizando os
derivados clorados inorgânicos (como hipoclorito de sódio, gás cloro e dióxido de
cloro) ou orgânicos (cloraminas, especialmente monocloraminas) (MEYER, 1994,
ANDRADE e MACEDO, 1996). As cloraminas também não apresentam taxas muito
efetivas de inativação de oocistos de C. parvum. Da mesma maneira que o cloro,
não alcançam mais que 1 log (90%) de inativação (KORICH et al., 1990, FINCH et
al., 1997). KORICH et al. (1990), encontraram CT de 7.200 para o cloro e para a
monocloramina. Contudo, em águas com teor de cloro residual, as cloraminas
funcionam como uma fonte de cloro frente a qualquer substância oxidável que surgir
na rede de abastecimento, como no caso de recontaminação. Isso se deve à
instabilidade química das cloraminas, que reagem primeiro (MEYER, 1994). Outros
estudos também mostram que a pré-cloração pode melhorar a inativação secundária
das monocloraminas (FINCH et al., 1997, RENNECKER et al., 2000). Uma vantagem
das cloraminas é que os subprodutos (ácido tricloroisocianúrico e dicloroisocianurato
de sódio) da sua decomposição na água, apresentam toxicidade menor que o próprio
princípio ativo. E não formam trihalometanos (THMs) em níveis considerados
significativos (MACÊDO, 1997). Os THMs são formados pela reação do ácido
hipocloroso com material orgânico natural (ROOK, 1979). Estas substâncias estão
relacionadas a diversos tipos de câncer e por isso não podem estar presentes na
água em concentração maior que 100µg/L, segundo a Portaria MS n
o
518, Cap. IV,
Art. 14. Pesquisa feita por FIGUEIREDO et al. (1999) mostrou que o cloro pode
apresentar taxa de produção de THMs de 3,69 µg/L/h, sendo 4,7 vezes maior que a
24
taxa para cloraminas. Para controlar a formação de THMs, pesquisadores sugerem o
uso de desinfetantes alternativos ao cloro, como dióxido de cloro e ozônio
(PASCHOALATO et al., 2003). De qualquer modo, para se alcançar altos níveis de
inativação de oocistos de C. parvum, também ocorrerá aumento dos riscos
toxicológicos.
A taxa de inativação de oocistos de C. parvum com dióxido de cloro tem sido
alvo de diversas pesquisas e apresenta resultados melhores que os do cloro
(PEETERS et al., 1989, KORICH et al., 1990, FINCH et al., 1997, LIYANAGE et al.,
1997, LI et al., 1998). KORICH et al. (1990), obtiveram CT de inativação de 78 (1,3
ppm por 60 minutos). RUFFELL et al. (2000), propõem valores mínimos de CT para
1 log (90%) de inativação de 71,2. Os valores de CT são dependentes da
temperatura e do pH . Uma desvantagem do dióxido de cloro é a produção de
cloritos e cloratos, além de outras espécies aniônicas. Estas substâncias ainda não
têm seu efeito sobre a saúde completamente elucidado (MEYER, 1994).
O ozônio apresenta os melhores resultados de inativação de C. parvum em
relação ao dióxido de cloro, cloro e cloraminas (KORICH et al., 1990, FINCH et al.,
1997). Para inativação de 2 log (99%), PEETERS et al. (1989) obtiveram CT de 4,1 a
4,6 mg. min/L, PERRINE et al. (1990) obtiveram CT de 2,6 mg. min/L e KORICH et
al. (1990) apresentaram um CT de 5 mg. min/L. FINCH et al. (1993), observaram
inativação de 2 log (99%) com CT na faixa de 2 a 8 mg. min/L a 22°C e CT de 5 a 10
mg. min/L a 7°C, enquanto ROCHELLE et al. (2002) obtiveram 2,2 log (>99%) de
inativação de oocistos de C. parvum expostos ao ozônio utilizando CT de 16 mg.
min/L
s níveis de
resistê
de ozônio e KEEGAN et al. (2003) obtiveram 2,19 log (>99%) com CT de 20
mg. min/L. Estudos feitos por RENNECKER et al. (2000) mostram que o pré-
tratamento feito com ozônio diminui o valor de CT necessário para inativação
secundária com cloro livre. O mesmo ocorre para a utilização de monocloramina
como desinfetante secundário. Da mesma forma que aconteceu em outros estudos
(RENNECKER et al., 1999, RUFFELL et al., 2000), a temperatura exerceu
importante efeito sobre a cinética de inativação de oocistos de C. parvum. Porém,
efeitos sinérgicos de desinfecção seqüencial foram observados em temperaturas
mais baixas. Diferentes preparações de oocistos apresentam diferente
ncia ao ozônio. Isso se deve a variações nas cepas, técnicas de purificação ou
ambos (RENNECKER et al., 1999). Estudos indicam que o aumento da temperatura
25
e tempo de armazenamento tem impacto significativo no número de oocistos viáveis.
Entretanto, alguns oocistos de C. parvum permanecem infectantes por meses
(WARE e SCHAEFER, 2005). Pesquisas têm mostrado que tratamento de pré-
oxidação com ozônio leva a baixos níveis de THMs com demanda de cloro inalterada
(GALLARD e VON GUNTEN, 2002). Segundo estudos de VON GUNTEN (2003),
uma dose de 2,5 mg/L de ozônio reduziu em 70% a formação de THM. Isso ocorre
porque o ozônio reage com o material orgânico natural e leva a uma remoção parcial
dos precursores de THM. O problema do tratamento da água com ozônio é que
ocorre produção de bromato, o qual representa risco à saúde devido ao seu
potencial carcinogênico. Para minimizar a formação de bromatos medidas adicionais
no tratamento da água têm sido investigadas, como pré-cloração e adição de amônia
antes da aplicação do ozônio (BUFFLE et al., 2004).
3.4 Avaliação da viabilidade de oocistos de Cryptosporidium parvum
A viabilidade de Cryptosporidium parvum pode ser avaliada por ensaios de
desencistamento in vitro, coloração vital (DAPI/PI), infecção experimental em
camundongos ou cultivo celular. Embora haja alguns autores que dizem que o
desencistamento in vitro e a coloração vital superestimam a viabilidade dos oocistos
de C. parvum (KORICH et al., 1990, FINCH et al., 1993, BLACK et al., 1996,
BUKHARI et al., 2000), outros mostram que o desencistamento in vitro é uma
alternativa adequada para avaliar os métodos de desinfecção. RENNECKER et al.
(1999), mostraram que resultados de inativação com ozônio, obtidos pelo método de
desencistamento in vitro, foram consistentes com os de infectividade animal
observados em estudos anteriores. RUFFELL et al. (2000), obtiveram resultados de
desencistamento in vitro condizentes com os resultados obtidos com infecção
experimental por LIYANAGE et al. (1997) e LI et al. (1998) para avaliação da
inativação de oocistos de C. parvum por dióxido de cloro. O mesmo foi observado
por RENNECKER et al. (2000). JENKINS et al. (2002), observaram boa correlação
entre inoculação em animal e cultivo celular, em múltiplos ensaios de viabilidade.
ROCH dois
métodos. Apesar do cultivo celular representar uma alternativa para comprovar a
eficácia de processos de desinfecção, apresenta desvantagens como o custo mais
ELLE et al. (2002), também encontraram resultados equivalentes entre os
26
elevado, maior demanda de trabalho para sua execução e o tempo mais longo para
se obter a resposta do teste.
Levando-se em conta as vantagens e desvantagens de cada método, foi
escolhido o método de desencistamento in vitro na aferição da viabilidade dos
parasitos neste trabalho.
27
4. MATERIAL E MÉTODOS
.1 Obtenção e purificação de oocistos de Cryptosporidium parvum
oram realizados 250 exames de pacientes HIV-positivos e suspeita clínica de
criptosporidiose, usando-se o método de coloração por fucsina ácida. Também foi
realizada busca do parasito em bezerros neonatos. Foram examinadas 420
amostras de gado de corte procedentes da região de Guarapuava, Paraná. Os
oocistos de C. parvum foram obtidos de fezes de bezerros neonatos infectados por
via oral com uma solução aquosa de 10
6
oocistos, na UFMT (Dra. Márcia Benedita –
Universidade Federal do Triângulo Mineiro). Os animais foram alimentados durante
todo o período com leite de vaca desnatado (UHT). As fezes destes animais foram
examinadas diariamente para a pesquisa de oocistos de C. parvum. Aquelas
contendo oocistos foram diluídas em água, peneiradas (peneiras com malhas de
0,150; 0,053 e 0,037 mm), adicionadas de solução de dicromato de potássio
(K
2
Cr
2 7
) a 2,5% e estocadas a 4
o
C até o momento do uso. A purificação dos
oocistos foi realizada utilizando protocolos descritos por ORTEGA-MORA et al.
(1992) com modificações segundo SILVA et al. (2000). Abaixo são descritas as
etapas
• Eliminar o K
2
Cr
2
0
7
mediante lavagem com PBS pH 7,2 - Tween 80 (PBS-T)
• Retirar a porção lipídica por suspensão em PBS-T/éter etílico 7:1 e
4
F
0
principais:
a 2% (1.500 g por 10 minutos);
centrifugação a 1.500 g por 10 minutos;
• Eliminar os resíduos de éter etílico por lavagens (três vezes) com PBS-T;
• Purificar os oocistos em gradiente descontínuo de sacarose, com soluções
de densidade 1,05 g/mL e 1,15 g/mL e centrifugação a 1.500 g por 20
minutos à temperatura ambiente;
• Separar a banda rica em oocistos e eliminar dos restos de sacarose
mediante lavagens (três vezes) com PBS pH 7,2 (1.500 g por 10 minutos);
• As bactérias remanescentes eram eliminadas por suspensão dos oocistos
em solução de hipoclorito de sódio a 1% e descanso por 10 minutos em
banho de gelo;
28
• Lavar os oocistos (três vezes) com PBS (1.500 g por 10 minutos);
• Quantificar os oocistos em câmara de Neubauer utilizando como corante de
contraste solução aquosa de verde malaquita a 0,17%.
• Estocar os oocistos em PBS com antibióticos, penicilina (500 UI/mL) e
4 ium parvum em água
desoxirr
cadeia (PCR) e determinação de sua sensibilidade para detecção de
Cryp
Três métodos foram testados: método clássico, segundo SAMBROOK (1989),
méto os acima
citad c
A passos básicos: lise
celul
Lise celular
estreptomicina (0,024 mg/mL) e 0,01% de Tween 20 a 4ºC.
.2 Detecção molecular de Cryptosporid
Nesta etapa do trabalho são descritos a metodologia de extração de ácido
ibonucléico (DNA), a padronização da técnica de reação da polimerase em
tosporidium parvum em água.
4.2.1 Extração de Ácido desoxirribonucléico (DNA)
do proposto por WEISS (1993) e modificado, e associação dos métod
os om aplicação de ultra-som.
extração de DNA para a execução da PCR teve quatro
ar, desproteinização, concentração e quantificação do DNA extraído.
– Para a lise da parede dos oocistos de Cryptosporidium parvum
foram testados três protocolos. No primeiro foram realizados três ciclos de
conge elamento a
37ºC por 5 minutos. No segundo protocolo a ruptura celular foi feita com tampão de
lise co
-som com cinco ciclos de 30 segundos a 50 Hz
(Anexo 1), seguido de digestão com lisozima (100 mg/mL), RNAse (10 mg/mL) e
protein
lamento em nitrogênio líquido a -196ºC por 5 minutos e descong
ntendo β-mercaptoetanol [100 µL de 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 100 µL 50
mM EDTA (pH 8,0) + 50 µL SDS a 10% + 3,5 µL 70 mM β-mercaptoetanol] e
enzimas (lisozima, proteinase K e RNAse). No terceiro protocolo foi acrescentada
uma fase de ruptura celular por ultra
ase K (20 mg/mL).
29
Desproteinização – Os ácidos nucléicos são moléculas predominantemente
hidrofí
resíduos foi empregada uma solução de
fenol/c
oncentração
licas e facilmente solúveis em água. As proteínas, no entanto, contém
diversos resíduos hidrofóbicos que são parcialmente solúveis em ácidos orgânicos.
Para a completa remoção destes
lorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) (Anexo1).
C – O DNA é uma molécula de alto peso molecular, para
promover sua concentração, foram usadas soluções de acetato de sódio (3 M) e
etanol puro. Nas lavagens subseqüentes usou-se etanol a 70%. O DNA foi eluído
com 100 µL de tampão TEN (Tris-EDTA-NaCl).
Dosagem do DNA – A última etapa da purificação do DNA foi a verificação do
rendimento e pureza. As ferramentas usadas foram: quantificação em gel de agarose
a 0,8% e espectrometria (GeneQuant®). O DNA tem uma absorbância máxima em
260 nm e mínima em 234 nm. Proteínas têm absorção máxima em 280 nm devido à
presença de resíduos de tirosina e triptofano. Para determinar a concentração de
proteína contaminante no DNA foi feito uma leitura a 280 nm. A avaliação da relação
A
260
/A foi feita para determinar o grau de pureza do DNA extraído. O DNA extraído
foi ma
la 4) previamente descritos
(LAXER et al., 1991, AWAD-EL-KARIEM et al., 1994, SPANO et al., 1998, XIAO et
al., 1
loreto de magnésio e temperatura de
anelamento foram avaliados para padronização da PCR.
280
ntido a temperatura de 4°C até sua utilização.
4.2.2 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)
Cinco pares de primers ou iniciadores (Tabe
999) foram avaliados para amplificação de Cryptosporidium spp.
(AWA995F/AWA1206R, CRY15F/CRY9R, XIAOF/XIAOR e
XIAO2ªPCR/XIAO2ªPCR1) e C. parvum (LAX469F/LAX869R). Parâmetros como
concentração de DNA molde, concentração de c
Visando aumentar a sensibilidade da técnica foi feito PCR de PCR usando
como DNA molde 5 µL da primeira PCR. Nas duas etapas de PCR foram usados os
mesmos pares de iniciadores. Para melhorar ainda mais a sensibilidade passou-se a
trabalhar com a técnica de Nested-PCR. Esta técnica se baseia na amplificação
30
primária de um fragmento de DNA com um determinado par de iniciadores. Em
seguida, faz-se uma amplificação secundária de um fragmento interno ao que foi
amplificado na primeira PCR, usando um par de iniciadores diferente do primeiro. O
segundo par de iniciadores sempre amplifica uma seqüência menor que o primeiro
par. No presente trabalho, utilizou-se na primeira PCR o par de iniciadores
XIAOF s AWA995F/AWA1206R para
identificação do gênero e LAX469/LAX869 ou CRY15F/CRY9R para a identificação
da esp
/XIAOR, e na segunda os iniciadores interno
écie C. parvum.
As condições de amplificação do DNA são dadas nas Tabelas 5 e 6.
TABELA 4 – LISTA DE PRIMERS (INICIADORES) TESTADOS NAS REAÇÕES DE PCR
PARA IDENTIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE Cryptosporidium spp. E C. parvum
Iniciador
(primer)
Localização
gênica
Seqüência 5’-3’ No. Bases
Fragmento
amplificado
CRY15F COWP GTAGATAATGGAAGAGATTGTG 22 550 bp
CRY9R COWP GGACTGAAATACAGGCATTATCTTG 25 550 bp
AWA995F
18SSU-rDNA
TAGAGATTGGAGGTTGTTCCT 21 211 bp
AWA1206R
18SSU-rDNA
CTCCACCAACTAAGAACGGCC 21 211 bp
LAX469F
18SSU-rDNA
CCGAGTTTGATCCAAAAAGTTACGAA 26 451 bp
LAX869R
18SSU-rDNA
TAGCTCCTCATATGCCTTATTGAGTA 26 451 bp
XIAOF
18SSU-rDNA
TTCTAGAGCTAATACATGCG 20 1325 bp
XIAOR
18SSU-rDNA
CCCATTTCCTTCGAAACAGGA 21 1325 bp
XIAO 2ªPCR
18SSU-rDNA
GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG 26 826-864 bp
XIAO 2ªPCR1
18SSU-rDNA
AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA 22 826-864 bp
TABELA 5 – COMPONENTES DA REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DO DNA E
RESPECTIVAS CONCENTRAÇÕES UTILIZADAS EM UMA REAÇÃO
DE PCR
Componentes
Concentração
estoque
Volume na reação
(µL)
Controle negativo da
reação
Tampão 10X 2,5 2,5
d
Primer1 5
Primer2 5 ng/µl 0,5 0,5
Taq polimerase
A se 0
ltrapura q.s.p. q.s.p.
l --- 5
NTP MIX 2,5 mM 1 1
ng/µl 0,5 0,5
MgCl
2
X mM A ser determinada A ser determinada
5 U/µL 0,5 0,5
DNA
Água u
---
---
r determinada
Tota 25 2
31
TA RENTES IN
Cr spp. E
p
CRY
ra/Tempo
R
peratura
IAOF/X
BELA 6 – CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO PARA OS DIFE ICIADORES PARA
yptosporidium
eratura/Tempo
C. parvum
Temperatura/Tempo Temperatu
Número Tem
de
ciclos
15F/CRY9R AWA995F/ LAX469F/LAX869
AWA1206R
Tem /Tempo
X IAOR
1 ciclo 94 4ºC / 3ºC / 3 min. 95ºC / 5 min. 95ºC / 7 min. 9 min.
94 / 1 min. 4ºC / 4
65 1 min. 5ºC / 4
72 2 min. 2ºC / 1
2 2ºC/
ºC / 1 min. 94ºC / 1 min. 94ºC 9 5 seg.
ºC / 1 min.
ºC / 1 min.
54ºC / 1 min. 52ºC /
72ºC / 2 min. 72ºC /
5
7
5 seg.
min.
35ciclos
1 ciclo 7 ºC/ 10 min. 72ºC/ 7 min. 72ºC/ 10 min. 7 10 min.
Após a fase de extensão final o termociclador (ThermoHybaid®) foi programado
para mp foi
armazenado a 4ºC até a eletroforese em gel de agarose.
letrofor em gel de ose
etermi quantida aproximada de DNA, após o processo de
extraç i usada a na conc %. P s produtos
amplificados após a PCR, a concentração de agarose foi de 1,6%. Os produtos de
ampli a ados no gel 15 µL), acresc 2 µL de bromofenol,
e sub os a corre elétrica (60 uenos e 110 a 120 V para os
géis grandes – fonte de eletroforese BIO-RAD) numa cuba de eletroforese
(HORIZON®
s
c traçã se no g anho da c inutos a 4 horas).
Apó a sep produt por ele DNA
brometo de o a 1/2 mpão T etato-E m
concentração final de 0,5 µg/mL. Os géis eram visualizados em fonte ultravioleta a
365 n
a 10
6
oocistos foram submetidas ao
processo de extração de DNA e depois, à PCR específica para avaliação da
sensib
manter a te eratura a 4ºC por uma a 10 horas. O produto da amplificação
4.2.3 E ese agar
Para d nar a de
ão fo garose entração de 0,8 ara avaliação do
ficação eram plic (10 ou ido de
metid nte V para os géis peq
58 ou HORIZON® 20•25).
O
oncen
t aempo de corrid eletr araoforética p eparação das banda a s dependia d
o de agaro el e do tam uba (30 m
s aração dos os de PCR troforese o foi corado com
etídio diluíd 0.000 em Ta AE (Tris-Ac DTA) 1X, co
m (Life Technologies™) e fotodocumentados (Polaroid Gel Cam®).
4.2.4 Determinação da sensibilidade da PCR
Amostras nas concentrações de um
ilidade.
32
A determinação das amostras de 10
6
a 10
2
oocistos foi realizada por
contagem em câmara de Neubauer e diluição sucessiva, após filtração do material.
As amostras contendo 10 formas parasitárias foram obtidas da seguinte maneira:
Gotas de 4 a 10 μL de suspensão com 10
2
oocistos/mL foram distribuídas com
espaçamento mínimo de 1,5 cm em placa de Petri. A placa foi levada ao microscópio
invertid
e 10 μL de
PBS-T, para lavagem por aspiração, de 3 a 5 vezes, novamente transferindo-se o
conteú
s microtubos contendo as quantidades determinadas de oocistos foram
centrif
rtou-se o sobrenadante, deixando-se
cerca d
mento foi suspenso em 100 a 200 μL de
solução
o para visualização das gotas e aquelas contendo 10 oocistos de
Cryptosporidium parvum foram selecionadas.
O mesmo procedimento foi repetido para obtenção de uma única forma
parasitária, utilizando suspensão original com concentração < 50 oocistos/mL. Cada
gota contendo o número de formas parasitárias desejado foi individualmente
aspirada e transferida para um microtubo de 2,0 mL. No local aplicou-s
do para o mesmo microtubo.
O
ugados duas vezes com água ultrapura esterilizada e o sedimento submetido à
técnica de extração de DNA.
4.3 Metodologia de desencistamento para determinação da viabilidade de
oocistos de Cryptosporidium parvum
As amostras contendo oocistos de C. parvum foram submetidas ao método de
desencistamento proposto por HOU et al. (2004). Amostras contendo
aproximadamente 10
5
oocistos foram colocadas em microtubos de 1,5 mL e
centrifugadas 11.000 g por 10 minutos. Desca
e 100 µL de sedimento. Esse material foi incubado com 1,0 mL de PBS pH
3,8 a 37ºC por 30 minutos. Centrifugou-se então por 10 minutos a 11.000 g, retirou-
se o sobrenadante e acrescentou-se a solução de desencistamento, composta por
200 μL de solução de Hanks, 400 μL de bile bovina a 1% e 50 μL de solução de
NaHCO
3
a 0,44%. O material ficou a 37ºC “overnight”. Centrifugou-se novamente,
descartando-se o sobrenadante. O sedi
de desencistamento, homogeneizado por agitação e examinado entre lâmina
e lamínula, em microscópio (Olympus BX41) com iluminação de contraste de fase.
33
Foi realizada a contagem de 200 a 300 formas parasitárias, aplicando-se a seguinte
fórmula
OD + PD
para cálculo de viabilidade, expressa posteriormente em percentagem:
em
gua
4.4.1 Desinfecção por ácido hipocloro
tado o efeito da concentração de 2 ppm de cloro livre sobre a
viabilid Esta concentração foi utilizada por
ser a ento de água, pois é
suficie MS nº
518 (Cap. IV , Art. 13).
ões de pH, turbidez, alcalinidade
e temperatura.
T
Onde:
OD - número de oocistos desencistados;
PD - número de oocistos parcialmente desencistados;
T - soma de todas as formas, incluindo OD, PD e os oocistos intactos.
A eficiência dos métodos de desinfecção foi avaliada pelos valores de CT e
regressão linear do número de oocistos viáveis em função dos valores de CT. O
cálculo do CT foi realizado através da multiplicação do tempo necessário de contato
do desinfetante com os oocistos e da concentração do desinfetante. A regressão
linear foi feita utilizando-se o programa Origin 7.0.
4.4 Métodos químicos para inativação de Cryptosporidium parvum
á
so
Foi tes
ade de oocistos de C. parvum em água.
mesma usada em uma estação convencional de tratam
nte para garantir o residual mínimo de 0,2 ppm exigido pela Portaria
A solução de cloro foi preparada a partir de solução de ácido hipocloroso,
adicionada ao tampão fosfato (concentração final 0,01 M, pH 7,5), preparado com
água ultrapura. O cloro livre foi aferido por método colorimétrico usando-se NNN-
dietilphenilenodiamina (DPD Reagente para cloro livre, Permachem Reagentes)
(APHA, 1999). Foram também realizadas as mediç
34
O ensaio de desinfecção de água contendo oocistos de C. parvum, por ácido
hipocloroso, foi realizado em balão volumétrico de 2 L, contendo solução tamponada
(pH 7,5) preparada em água ultrapura. Foi então adicionado 1 mL de suspensão de
oocisto o final de 2 x 10
4
oocistos/mL).
os tempos 0, 15, 30, 45, 60 e 120 minutos, 200 mL da suspensão foram
retirad
s ao nível de 2 ppm (concentração inicial).
faixa citada na literatura (DI BERNARDO e DANTAS, 2005). As
soluçõ
rico
usand
pós 5, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos, foram retirados do frasco 100 mL da
soluçã o do pH e depois para aferição da
concentração de dióxido de cloro. Aos 70 mL restantes adicionou-se solução de
tiossul
s contendo 4 x 10
7
parasitos (concentraçã
N
os e transferidos para um béquer, onde foram acrescentados 4 mL de
tiossulfato de sódio a 1% (proporção de 5 a 10 ppm de tiossulfato de sódio para cada
1ppm de cloro), para suspender a ação do cloro. Nestes tempos determinados, foi
realizada a dosagem do cloro livre para correção da demanda de cloro de modo a
restituir as concentraçõe
4.4.2 Desinfecção por dióxido de cloro
Foi testado o efeito das concentrações de 1, 2 e 5 ppm de dióxido de cloro na
água sobre a viabilidade de oocistos de C. parvum. As concentrações trabalhadas
estão dentro da
es de dióxido de cloro foram preparadas a partir de solução concentrada do
produto (1.300 a 1.500 ppm) (gentilmente cedida por EKA Chemicals do Brasil S.A.),
diluída em tampão fosfato, concentração final 0,01 M, preparada em água ultrapura,
com pH 7,0. A concentração de dióxido de cloro foi aferida por método colorimét
o-se NNN-dietilphenilenodiamina (DPD Reagente para cloro livre, Permachem
Reagentes) (APHA, 1999).
Cada ensaio de desinfecção de água contendo oocistos de C. parvum por
dióxido de cloro foi realizado separadamente, em volume de 1 L em balão
volumétrico. A concentração do parasito foi de 2 x 10
4
oocistos/mL, similares à
concentração listada na literatura (CHAURET et al., 2001).
A
o, separando-se 30 mL para mediçã
fato de sódio a 1% (proporção de 5 a 10 ppm de tiossulfato de sódio para cada
1ppm de cloro), para suspender a ação do cloro.
35
4.4.3 Desinfecção por ozônio
O ozônio foi gerado a partir de oxigênio puro utilizando-se um gerador de
ozônio (modelo OKTEC
®
) cedido gentilmente pela empresa Diagtech. Foi aplicado
na amostra, por meio de um difusor de bolhas, nas concentrações de 0,1; 0,45 e 0,7
mg/L
L
oocistos de C. parvum.
trações de ozônio foram ajustadas
para 0,18; 0,24; 0,36; 0,48 e 1,44 mg/L. A concentração de ozônio foi medida em
cada experimento pelo método azul de trissulfonato (CHIOU et al., 1995).
.5 Concentração dos oocistos de Cryptosporidium parvum após
cada amostra foi imediatamente filtrada em aparelho da Millipore™ (Millipore
Filter H
recupe
viabilidade
obtida como 100%.
Os ensaios de desinfecção por ozônio foram realizados, primeiramente, em
provetas de 1 L (sistema aberto). Os experimentos foram realizados em triplicata. O
volume de água ultrapura foi de 800 mL contendo 2 x 10
4
/m
Posteriormente, para controlar a entrada de ozônio e evitar efeitos de
flutuação na concentração do mesmo, o experimento foi realizado em balão
volumétrico pirex de 1 L (sistema fechado) e com agitação no interior do reator. O
volume de água ultrapura foi de 500 mL contendo 2 x 10
4
oocistos/mL de C. parvum,
em experimento realizado em triplicata. As concen
4
os métodos de desinfecção química
Após o ensaio de desinfecção com ácido hipocloroso, dióxido de cloro e
ozônio,
older part # 4), contendo membrana filtrante de acetato celulose de diâmetro
47 mm e porosidade 0,8 µm, sob pressão negativa de 10 a 15 cmHg (Figura 2). A
membrana foi retirada e depositada em embalagem plástica com PBS-T para
ração dos oocistos por fricção. As amostras foram centrifugadas a 1.000 g por
15 minutos e o sedimento submetido ao desencistamento segundo o protocolo de
HOU et al. (2004).
O decréscimo da viabilidade foi avaliado com base em amostras controle
mantidas na solução tamponada, com adição de tiossulfato de sódio a 1%, porém
sem a aplicação dos desinfetantes. As amostras controle foram submetidas a todas
as etapas de concentração que as amostras testes. Considerou-se a
36
FIGURA 2 – APARELHO USADO PARA FILTRAÇÃO DE AMOSTRAS DE ÁGUA
PARA CONCENTRAÇÃO DOS OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum
.6 Medidas de segurança para organismos patogênicos
Com
subme do ao comitê de
da criptosporidiose bovina na região do Triângulo Mineiro – MG” que foi aprovado
pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro (UFTM) em 21/03/2005, Protocolo CEUA UFTM nº 011.
ara coleta de fezes proveniente de humanos o projeto foi aprovado no
comitê de ética junto ao Comitê de Ética do Hospital de Clínicas da UFPR, Protocolo
CEH HC nº 128.
ntes de ser descartada, a água contaminada experimentalmente que sobrou
dos testes de desinfecção foi submetida à esterilização em autoclave, a temperatura
de 121ºC por 30 minutos. Toda vidraria e aparatos usados durante os experimentos
foram submetidos à esterilização por calor ou química.
4
o as infecções experimentais foram realizadas em bezerros neonatos, foi
ética animal o projeto “Freqüência e caracterização genéticati
P
A
37
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
bezerros neonatos
proced
entais em bezerros neonatos para chegar às concentrações
neces
Nos últimos anos muitos são os trabalhos demonstrando prevalência deste
protozoário em diferentes regiões do país. Um dos primeiros é realizado em Belém,
Pará, onde LOUREIRO et al. (1990) estudando a ocorrência de criptosporidiose em
crianças, encontraram prevalência de 5,2%. NEWMAN et al. (1994) estudaram a
epidemiologia da criptosporidiose em uma comunidade de Fortaleza e verificaram
que 94% das pessoas estudadas apresentavam anticorpos (IgG e IgM) para
Cryptosporidium spp. Em Campinas, São Paulo, FRANCO e CORDEIRO (1996)
observaram prevalência de 6,4% de C. parvum em crianças de creches. Em
Uberlândia, Minas Gerais, em estudo realizado com crianças de 0 a 12 anos,
observou-se prevalência de criptosporidiose de 4,26% e que as infecções
apresentaram variação sazonal (GENNARI CARDOSO et al., 1996). MOITINHO et
al. (1997) observaram a ocorrência de Cryptosporidium spp. em 6,6% de amostras
de fezes de crianças de Maringá, no Paraná. Segundo OSHIRO et al. (2000), a
prevalência de C. parvum em crianças menores de cinco anos, na zona urbana de
Campo Grande, Mato Grosso do Sul, é de 1,1%. Num estudo com crianças
portadoras de gastroenterite aguda em Ribeirão Preto, São Paulo, observou-se
prevalência de Cryptosporidium spp. de 1,8% (MEDEIROS et al., 2001). Em um
estudo com crianças em uma escola de educação infantil de São Paulo, em 2001,
20,3% foram positivas para Cryptosporidium spp. (CARVALHO-ALMEIDA et al.,
5.1 Obtenção e purificação de oocistos de Cryptosporidium parvum
Os resultados dos exames realizados em amostras de pacientes humanos
HIV-positivos e suspeita clínica de criptosporidiose e dos
entes da região de Guarapuava, foram todos negativos. Para avaliar o efeito
dos desinfetantes sobre oocistos de C. parvum, os mesmos foram obtidos a partir de
infecções experim
sárias para os diferentes experimentos. A infecção experimental foi realizada
na Universidade Federal do Triângulo Mineiro (Comissão de Ética no Uso de Animais
da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM) em 21/03/2005. Protocolo
CEUA UFTM nº. 011).
38
2006). 12,9% de crianças infectadas com
Cryptosporidium spp. num surto diarréico em creche de São Paulo, ocorrido em
2001. em
crianças abaixo de 10 anos, hospitalizadas por diarréia em Goiânia, Goiás. Além
disso,
m de 9,5% na população canina de São Paulo entre 2003 e
2004.
genótipos isolados não são encontrados normalmente em humanos (RYAN et al.,
GONÇALVES et al. (2006) detectaram
PEREIRA et al. (2002) detectaram prevalência de C. parvum de 18,7%
também demonstraram que fatores intra e extra-familiar têm relevância na
infecção.
No presente estudo, todas as amostras de humanos examinadas foram
negativas. Seria esperado que pacientes HIV-positivos com suspeita de
criptosporidiose, confirmassem esta suspeita nos exames, através do achado de
oocistos. A negatividade das amostras pode ser explicada pelo tratamento com
antiretrovirais e nitazoxanide, que diminuem a eliminação dos oocistos.
Quanto à criptosporidiose animal, LALLO e BONDAN (2006) demonstraram
prevalência de C. parvu
GARCIA e LIMA (1993), detectaram 27,87% de positividade para
Cryptosporidium sp. em amostras de fezes diarréica e não diarréica, de bezerros em
Minas Gerais. O parasito foi encontrado em 74% das propriedades estudadas,
evidenciando ampla distribuição do mesmo. MAIA et al. (1995), encontraram 27,1%
de bezerros positivos para C. muris e 6,6% de vacas positivas para C. parvum, em
propriedades de gado leiteiro e de corte em Montes Claros, Minas Gerais.
QUADROS (2002), estimou média de 17% dos bovinos analisados como positivos
para Cryptosporidium spp., em propriedades de Lages, Santa Catarina. A presença
de oocistos variou de 10,16 a 23,84%. FEITOSA et al. (2004), encontraram valores
positivos de 10,26% pelo ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) e 12,4%
pelo teste de Sheather, para amostras fecais de bezerros em propriedades leiteiras
na região de Araçatuba, São Paulo. EDERLI et al. (2004), encontraram 43,6% de
positividade para Cryptosporidium em bezerros na microrregião de Campos dos
Goytacazes, Rio de Janeiro. Também evidenciaram a ampla distribuição do parasito,
onde em 96,3% das propriedades visitadas foram encontradas amostras de bezerros
com a presença de oocistos de Cryptosporidium. No Canadá, McALLISTER et al.
(2005) detectaram prevalência global de Cryptosporidium spp. de 13% em bovinos.
Análises de amostras fecais por meio de PCR mostraram prevalência de 26% de
Cryptosporidium spp. Apenas um isolado se tratava de C. hominis e a maioria dos
39
2005). Em um estudo na Malásia, FARIZAWATI et al. (2005), encontraram 98% de
positividade para Cryptosporidium spp. em amostras de esgoto oriundo de bovinos,
com concentrações entre 20 a 3,1x10
3
oocistos/mL. Esta alta prevalência do
protozoário entre bovinos e a detecção de oocistos em amostras de água de rio
mostram a possibilidade de bovinos serem fonte de contaminação de rios com
oocistos de Cryptosporidium, o que representa risco à saúde humana, uma vez que
pesso
eio.
as podem fazer uso de água desses rios contaminados.
Ainda se faz necessário que sejam implementadas pesquisas, em todos os
estados brasileiros, usando a mesma metodologia, a mesma faixa etária para
determinar a taxa de prevalência em humanos, animais domésticos, silvestres e
aquáticos e conhecer o verdadeiro risco da criptosporidiose em nosso m
5.2 Padronização da detecção molecular de Cryptosporidium parvum em
água
5.2.1 Extração de DNA
O método de extração de DNA usando ultra-som e enzimas para a lise da
membrana celular e digestão de proteínas e RNA apresentou maior concentração de
DNA e melhor razão na relação A
260
/A
280
entre os três métodos empregados
(Tabelas 8, 9 e 10), produzindo portanto, DNA de melhor qualidade. Para a dosagem
de DNA, foram realizadas três repetições de cada concentração de oocistos para os
três métodos de extração testados. A variação nas concentrações de DNA
apresentadas se deve à oscilação do próprio espectrofotômetro (GeneQuant®) e ao
lote de oocistos utilizado.
Uma das etapas principais da técnica de PCR é a obtenção de DNA de boa
qualidade. Duas foram as dificuldades encontradas para trabalhar com oocistos de
Cryptosporidium spp. Primeira, a parede dos oocistos de Cryptosporidium spp. tem
dupla membrana com espessura de 40 nm (HARRY e PETRY, 1999), o que os torna
resistentes ao rompimento e liberação do DNA. Segunda dificuldade é que oocistos
são formas encontradas em fezes, solo ou água o que dificulta o processo de
isolamento e purificação de DNA, limitando a sensibilidade do método de PCR.
Muitos são os contaminantes inibidores da técnica de PCR entre eles são citados
40
carboidratos e produtos químicos (HIGGINS et al., 2001). Nas amostras de água
com alta turbidez há a necessidade de purificação extra antes da PCR (RIMHANEN-
FINNE et al., 2002).
ABELA 7 – DOSAGEM POR ESPECTROFOTOMETRIA DE DNA EXTRAÍDO DE OOCISTOS DE
Cryptosporidium parvum, EMPREGANDO ULTRA-SOM E ENZIMAS
Quantidade de Absorbância a
Razão A /A
C
T
onc. de DNA
oocistos 260 nm
260 280
(µg/mL)
1 0,013 1,929 6,90
10 0,030 2,378 18,00
100 0,070 2,100 7,50
1000 0,060 2,891 3,90
0,050 2,475 17,50
000 0,070 1,483 12,50
10000 0,030 1,440 3,60
100000
1000
T
ABELA 8 – DOSAGEM POR ESPECTROFOTOMETRIA DE DNA EXTRAÍDO DE OOCISTOS DE
Cryptosporidium parvum, EMPREGANDO SOMENTE ENZIMAS
Quantidade de
oocistos
Absorbância a
260 nm
Razão A
260
/A
280
Conc. de DNA
(µg/mL)
1 0,013 2,308 6,90
10 0,050 3,583 2,20
100 0,010 0,791 0,70
1000
0,010 2,504 10,90
10000 0,030 3,636 10,70
100000 0,070 0,750 1,60
1000000 0,080 3,356 4,80
41
T
260 nm (µg/mL)
ABELA 9 – DOSAGEM POR ESPECTROFOTOMETRIA DE DNA EXTRAÍDO DE OOCISTOS DE
Cryptosporidium parvum, EMPREGANDO CONGELAMENTO/DESCONGELAMENTO
Quantidade de
oocistos
Absorbância a
Razão A
260
/A
280
Conc. de DNA
1 0,020 1,635 0,18
10 0,070 0,864 0,60
1000 0,020
1000 3,127
100000 0,060 3,424 0,80
1000000 0,070 2,956 0,90
100 0,050 1,838 0,80
2,670
0,50
0 0,050 0,90
extraç ntroles positi ) foram
acomp s microscopic e a cada e a extração e verificou-se que o
simples congelamento e d gelamento ou poucos ciclos de ultra-som não
rompem a parede cística. São necessários primeiramente pelo menos cinco ciclos de
ultra-som para romper oocistos de C. parvum, seguidos de dois ciclos de três
congelamentos a -196ºC e descongelamentos a 37ºC. O primeiro ciclo deve ser
realizado antes da incubação em tampão de lise TEM (10 mM Tris-HCl, 10 mM
Proteinase K e RNAse.
a vasta literatura é ntrada prop
de DNA para Cryptosporidiu . Os princípios dos métodos são: 1) químicos,
usando digestão alcalina e fenol/clorofórmio (XIAO et al., 2002, JIANG e XIAO, 2003,
ALVES et al., 2003), hipoclorito de sódio e Chelex-100; 2) métodos físicos
usando
pérolas de zircônia com sílica ativada ou pérolas de vidro c
(McLAUCHLIN et al., 1999); ou por choque térmico congelament ongelamento
(BLEAR l., 2002) 3) as ão de princ ísicos e quím ENEMARK et
al., 2002). A maioria dos protocolos usa omo QIAmp tissue purification
(MORGAN et al., 1998, WARD et al., 2002), GeneClean Bio101 (SPANO et al.,
1998), kit de separação imunomagnética Dynabeads (WU et al., 2000), High Pure
Template preparation kit (TANRIVERDI et al., 2002). JINAG et al. (2004), avaliaram
seis kits diagnósticos para extração de DNA de Cryptosporidium spp. e relataram
que o uso de kit para extração de DNA aumenta a sensibilidade das técnicas
Para avaliar a melhor técnica de ão, co vos (spiking
anhado ament tapa d
escon
EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0) e o segundo após a digestão com lisozima, SDS,
Um enco ondo diferentes protocolos de extração
m spp
om sílica ativada
o/desc
S et a sociaç ípios f icos (
kits c
42
moleculares. Além do uso do kit, muitos pesquisadores ainda associam outros
compon ro ina ( dimetilsulfó (ZHOU et
al., 2003, JELLISON et al., e
DNA purificado para o uso em métodos moleculares.
s gênero-e ico AWA995F A1206R, que
amplificou um fragmento de 211 bp, foram observadas bandas amplificadas de DNA
quando se utilizaram amostras com 10
3
e 10
5
oocistos de C. parvu
ara o par de iniciadores espécie-específico LAX469F/LAX869R, que
amplif
SE EM GEL DE AGAROSE (1,6%) MOSTRANDO OS PRODUTOS DE
O DE FRAGMENTO GÊNICO DE Cryptosporidium parvum. COLUNA1,
entes como so albumina bov
2004), testemunho da dificuldade que é a obtenção d
BSA) e xido (DMSO)
5.2.2 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)
Para o par de iniciadore specíf /AW
m.
P
icou um fragmento de 451 bp, foram observadas bandas amplificadas de DNA
quando se utilizou amostra com 10
5
oocistos de C. parvum. Na figura 3 são
demonstradas as amplificações para os iniciadores AWA995F/AWA1206R e
LAX469F/LAX869R.
Para o par de iniciadores CRY15F/CRY9R, que amplificou um fragmento de
550 bp, foram observadas bandas amplificadas de DNA quando se utilizou amostra
com 10
5
e 10
6
oocistos de C. parvum (Figura 4).
FIGURA 3 – ELETROFORE
AMPLIFICAÇÃ
PM-PADRÃO DE PESO MOLECULAR 100 BP; COLUNAS 2 A 4, PRIMER AWA
(GÊNERO-ESPECÍFICO): 2, (10
3
OOCISTOS); 3, (10
2
OOCISTOS); 4, (10
5
OOCISTOS); COLUNAS 5 A 8, PRIMER LAX (ESPÉCIE-ESPECÍFICO): 5, (10
2
OOCISTOS); 6, (10
3
OOCISTOS); 7, (10
4
OOCISTOS) E 8, (10
5
OOCISTOS)
1 2 3 4 5 6 7 8
2072
1500
600
100
43
FIGURA
R DE INICIADORES USADO PARA
A téc
aneira passou-s
iniciador, na primeira PCR
par de iniciadores AWA995F/AWA1206R. A Nested-PCR permitiu melhora na
sensibilidade sendo possível detectar até 10
2
oocistos de C. parvum (Figura 5).
4 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE (1,6%) MOSTRANDO OS PRODUTOS DE
AMPLIFICAÇÃO DE FRAGMENTO GÊNICO ESPECÍFICO DE Cryptosporidium parvum
EM AMOSTRAS DE ÁGUA CONTAMINADAS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE
OOCISTOS. CN, CONTROLE NEGATIVO (SEM DNA); PM, PADRÃO DE PESO
MOLECULAR; CP, CONTROLE POSITIVO. O PA
AMPLIFICAÇÃO DO DNA FOI CRY15F/CRY9R
nica PCR de PCR não melhorou a sensibilidade da PCR simples. Desta
10
6
10
5
10
4
10
3
10
2
10 CN CP PM
3000
2000
1000
500
750
m e a trabalhar com a técnica de Nested-PCR usando como
o par de iniciadores XIAOF/XIAOR e na segunda PCR, o
44
FIGURA 5 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE (1,6%) MOSTRANDO OS PRODUTOS
sensibilidade das técnicas moleculares é na atualidade a grande
preocupação dos pesquisadores, pois somente com técnicas altamente sensíveis e
ida execução é que se poderá ter melhor controle da água que bebemos.
ode-se aumentar a sensibilidade se aumentarmos o número de amostragens ou de
coleta
s na
Taq polimerase ou separação imunomagnética (IMS), que aumenta o número de
oocistos recuperados e os concentra em um tampão livre de inibidores da Taq
polimerase. Porém para Cryptosporidium spp. não existe disponível comercialmente
um de IMS espécie-específico para detecção de anticorpos que reconheçam os
epítopos de todos os oocistos de C. parvum e C. hominis que parasitam humanos.
Número baixo de oocistos presentes nas amostras requer o uso de métodos como o
Nested-PCR ou PCR em tempo real. Água e alimentos contêm muitos outros
DE AMPLIFICAÇÃO DE FRAGMENTO GÊNICO A PARTIR DE NESTED-PCR
COM OS PRIMERS XIAOF/XIAOR E AWA995F/AWA1206R COM DIFERENTES
CONCENTRAÇÕES DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum. PM, PADRÃO
DE PESO MOLECULAR 100 BP; CN, CONTROLE NEGATIVO
PM 10 10 10 10 10 1 CN
5 4 3 2
2072
1500
600
100
A
de ráp
P
(SAVIOLI et al., 2006). Usar métodos específicos como os imunológicos ou os
moleculares isoladamente ou de forma complementar pode melhorar a qualidade do
diagnóstico do parasito em água ou solo. Vários são os critérios citados na literatura
para obter melhoria na sensibilidade e especificidade. Entre estes, estão o uso de
métodos que maximizem a extração de DNA e minimizem os efeitos inibidore
kit
45
org e
escolha de inic
descartada a po
estes iniciadores. Alguns iniciadores de Cryptosporidium amplificam DNA genômico
de Eim ria acervu sm orm E. acervulina
com DNA de Giardia duodenalis. Quando possível, os alvos moleculares para uso
em PCR m er escolhidos entre aqueles que já foram utilizados com sucesso
em estudos epidemiológicos ou taxonômicos e cujas seqüências tenham sido
validadas por vários centros de pesquisa (Tabelas 3 e 4). Comparações de métodos
publicados são difíceis porque existem métodos não padronizados para extração de
DNA e outros que não levam em conta os efeitos inibitórios para Taq polimerase. A
inclusão de controles positivos aumenta o nível de confiança obtido quando os
resultados são negativos. O uso de iniciadores espécie-específicos (particularmente
daqueles de espécies e genótipos conhecidos que infectam humanos) e iniciadores
para subgenotipagem, melhora a sensibilidade. Nesse contexto, o uso de
microarranjo para determinar todas as espécies, genótipos presentes em ambientes
individuais e amostras fecais vem como nova tecnologia (WEISS, 1993, LABERGE
et al.,
anismos qu normalmente não são encontrados nas fezes. Apesar de criteriosa
iadores e a minimização dos efeitos inibitórios, não pode ser
ssibilidade de haver contaminantes que podem ser amplificados por
lina, da me a f a que hibridizam amplicons de
deve
e
s
1996, CAMPBELL e SMITH, 1997, KAUCNER e STINNEAR, 1998, NICHOLS
et al., 2000, STRAUB et al., 2002, NICHOLS e SMITH, 2003, OURA et al., 2004,
JIANG et al., 2005, CACCIÒ et al., 2005, SMITH et al., 2006).
A sensibilidade da técnica de PCR para detecção de DNA de Cryptosporidium
spp. vem sendo discutida por diferentes autores. ROCHELLE et al. (1997)
analisaram os iniciadores LAX469F/869R e AWA995F/1206R e foram capazes de
detectar sinais de amplificação (bandas) quando usados 500 e 5.000 oocistos em
amostras contaminadas experimentalmente, independente do par de iniciadores
empregado. Para melhorar a sensibilidade da técnica os autores propuseram a
técnica de slot blot. WARD e WANG (2001), ao avaliarem a sensibilidade da técnica,
demonstram que ela está relacionada com o método de extração de DNA e que
necessita de 10
4
oocistos para ter sinais de amplificação em amostras cujo DNA seja
extraído com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Quando usa spin collumns ou glass
milk a metodologia é capaz de detectar 100 oocistos. HANNINEN (2006) usando o
par de primers CRY15F/CRY9R associando a prova de hibridização foram capazes
de detectar 125 oocistos em amostras de água.
46
Os diferentes trabalhos com técnicas moleculares apresentam sensibilidades
variáveis dependendo dos iniciadores usados ou da técnica de extração de DNA.
SCORZA et al. (2003), só obtiveram 100% de sensibilidade em amostras com 10
4
oocistos. Já HIGGINS et al. (2001) relatam sensibilidade para detecção de 200
oocistos e KUHN et al. (2002) referem-se à sensibilidade de 10 oocistos.
A metodologia molecular de detecção de DNA de C. parvum padronizada no
presente trabalho, pode ser usada para controle de água de superfície e em água
tratada, pois o método tem capacidade de detectar 10
2
oocistos. Segundo a literatura
consultada a sensibilidade das técnicas de determinação deste protozoário é
bastante variável. Nos métodos parasitológicos tradicionais para detectar
Cryptosporidium spp. são necessários 50.000 a 500.000 oocistos por grama de fezes
pela técnica de Ziehl-Neelsen acid fast e 1.000 oocistos por grama de fezes na
técnica de flutuação em ZnSO
4
(VILLENEUVE, 2004). Quanto à imunofluorescência,
a sensibilidade é variável sendo que a IF direta tem sensibilidade para detectar
100.000 oocistos/grama de fezes e o método indireto são necessários de 50.000 a
500.000 oocistos por grama de fezes (WEBER et al., 1991). A identificação por
imunofluorescência tem a desvantagem de apresentar reatividade cruzada dos
anticorpos com algas e outros elementos e pode levar a erros de interpretação
(QUINTERO-BETANCOURT et al., 2002).
5.3 Metodologia de desencistamento para determinação da viabilidade de
oocistos de Cryptosporidium parvum
Para verificar a eficiência ou não dos produtos químicos foi necessário utilizar
uma metodologia para determinar a viabilidade dos oocistos de C. parvum. A técnica
para desencistamento usada no presente trabalho foi baseada no protocolo proposto
por HOU et al. (2004). Foi possível identificar claramente os oocistos intactos e
desencistados (Figura 6).
47
FIGURA
o-se valores de 69 a 95% nos
infecção foi utilizado um
controle individual. Tal variação pode estar relacionada a fatores como maturidade
dos oocistos e mesmo diferenças biológi
resultando em graus distintos de desencista es foram
relatadas anteriormente por outros autores (RENNECKER et al., 1999, WARE e
in vitro constituem uma das alternativas para
avaliar a viabilidade de protozoários. Algumas publicações têm demonstrado que
esta técnica é superior àquelas baseadas no uso de corantes vitais como diacetato
de fluoresceína (FDA), DAPI e iodeto de propídio (PI) (SMITH e SMITH, 1989,
CAMPBELL et al., 1992, BUKHARI et al., 2000).
6 – TESTE DE VIABILIDADE IN VITRO PARA Cryptosporidium parvum VISTO EM
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE.
a-b: OOCISTOS INTACTOS, c-e:
OOCISTOS PARCIALMENTE DESENCISTADOS,
f-g: OOCISTOS
DESENCISTADOS (APENAS A MEMBRANA DO OOCISTO),
h: OOCISTOS
INTACTOS (COM DESTRUIÇÃO DAS ESTRUTURAS INTERNAS POR
EXPOSIÇÃO AO OZÔNIO)
Adicionalmente, observou-se que ocorre variabilidade considerável na
viabilidade de diferentes amostras de oocistos, obtend
controles. Por este motivo, para cada experimento de des
cas individuais entre as amostras,
mento. Observações semelhant
SCHAEFER, 2005). Por este motivo, a utilização de mistura de oocistos ou
repetições dos experimentos com diferentes amostras pode reproduzir melhor a
realidade encontrada nas contaminações naturais, onde oocistos de diferentes
hospedeiros podem estar presentes.
As técnicas de desencistamento
48
Outro método de avaliação de viabilidade que tem sido comparado ao
to é a infecção experimental de animais, com vários autores
este teste o mais adequado para este fim (LABATIUK et al.,1991,
desencistamen
relatando ser
FINCH et al., 1993b, HAYES et al., 2003). Por outro lado, há trabalhos que
demonstram haver correspondência entre os dois métodos (RENNECKER et al.,
1999; HIRATA et al., 2001). RENNECKER et al. (2000), também encontraram
resultados semelhantes de inativação pelos métodos de desencistamento in vitro e
infecção animal. Algumas discrepâncias podem ocorrer devido à variabilidade
analítica.
infecção experimental em animais de
laboratório para teste de viabilidade. Entre eles, devem ser levantadas as questões
éticas (por exemplo, em relação ao uso de elevado número de animais) e a
dificuldade para as companhias de saneamento manter um biotério para testes em
série. Desta maneira, uma alternativa para avaliação da viabilidade e eficiência dos
desinfetantes sobre oocistos de C. parvum é o cultivo celular. JENKINS et al. (2002)
e ROCHELLE et al. (2002) descreveram boa correlação entre infecção experimental
e ensaios
experimental e c
sobre a viabilidade de oocistos de C. parvum
pm do ácido hipocloroso em água,
Existem vários problemas com o uso
de cultivo celular. Segundo ROCHELLE et al. (2002), infecção
ultivo celular são equivalentes para mostrar curva dose-resposta,
sensibilidade e escala de dose infectante.
Na escolha da metodologia de avaliação de viabilidade, devem ser levados
em consideração aspectos como a facilidade e rapidez de execução e capacidade de
dar resposta que possa representar melhor a realidade, buscando equilibrar as
vantagens e desvantagens de cada método.
5.4 Métodos químicos para inativação de Cryptosporidium parvum em
água
5.4.1 Efeito do ácido hipocloroso
Os resultados de inativação dos oocistos de C. parvum são mostrados na
Figura 7 e Tabela 10. Os dados são apresentados como redução da viabilidade
(N/No) em função da concentração do desinfetante e o tempo de contato deste com
os oocistos do parasito (CT). A utilização de 2 p
49
aos 15 minutos, apresentou uma redução de 6,71% da viabilidade dos oocistos em
relação ao experimento controle. Nos tempos de 30 a 60 minutos a redução foi em
média de 37% e aos 120 minutos, de 49%. Para a inativação de 49% dos oocistos
obteve-se CT de 240 (Tabela 11). Observou-se baixa eficiência do ácido hipocloroso
na inativação de oocistos de C. parvum. Os parâmetros temperatura, turbidez e pH
também estão descritos na Tabela 11.
FIGURA
0 50 100 150 200 250
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
N/N
0
CT (mg.min/L)
7 - REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO
TRATAMENTO COM ÁCIDO HIPOCLOROSO (2 PPM, pH 7,5)
NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum
NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum
TABELA 10 - DADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO
TRATAMENTO COM ÁCIDO HIPOCLOROSO (2 PPM, pH 7,5)
Equação da reta: Y = A + B.X
Parâmetros Valor Erro
A 0,86489 0,07133
B -0,00176 6,00687E-4
Coeficiente R Desvio padrão (SD) Coeficiente de
determinação (R
2
)
-0,82538 0,11397 0,84179
50
Sabe-se que C. parvum é bastante resistente ao cloro e diversos trabalhos
têm relatado este fato (KORICH et al.,1990; FAYER et al.,1994). Em experimento
para avaliação de derivados clorados, KORICH et al. (1990) relataram que foram
necessárias concentrações de 80 ppm de cloro livre por 90 minutos para promover a
inativação de oocistos de C. parvum a 25ºC em pH 7,0. O valor de CT para eliminar
1 log foi de 7.200. Nos trabalhos de FAYER et al. (1994), oocistos submetidos à
solução de hipoclorito de sódio a 5,25% por um período de 2 horas, ainda foram
apazes de infectar animais de laboratório, o que confirma a resistência do parasito
o cloro. KEEGAN e sando
cloro a 10 mg/L por uma hora. Com concent ncubação
por 24 horas também não houve inativação significativa.
TABELA 11 – PARÂMETROS ANALISADOS DURANTE O MÉTODO DE INATIVAÇÃO COM
ÁCIDO HIPOCLOROSO (2PPM) EM ÁGUA ULTRAPURA (pH 7,5) CONTENDO
OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum
Tempo
Temperatura
(
o
C)
Turbidez
(UTN)
Cloro*
(ppm)
Cor
aparente**
pH CT
Redução de
viabilidade (%)
c
a t al. (2003), obtiveram menos de 0,1 log de inativação u
ração de cloro de 5 mg/L e i
0 20,6 0,11 2,08 B 7,57 0
15 20,1 0,11 2,06 B 7,55 6,71
30 20,0 0,11 2,03 B 7,55 38,81
45 19,9 0,11 1,96 B 7,54 36,72
60 19,9 0,11 1,83 B 7,54 37,92
120 19,9 0,11 1,83 B 7,54 240*** 49,04
*Concentração de cloro restituída a 2 ppm com adição de ácido hipocloroso após cada aferição nos
tempos determinados. ** Cor aparente: Boa (B).
*** Indicado o CT para o maior índice de inativação
(49,04%)
studos com águas recreativas contaminadas com material fecal mostram
que para inativação de oocistos de C. parvum, são necessários, pelo menos,
expos ão bém
observ ram que a des ndo os
valores de CT (CARPENTER et al., 1999).
m estaçõe de tratamento de ág ilização de conc s mais
elevad s de oso é inviá dada pe de
formação de subprodutos tóxicos como tr etanos (THM l.,
1974, OOK e EVANS, 1979). Além disso, o tempo de retenção numa estação
convencional é de 60 a 120 minutos (SANEPAR, informação pessoal).
E
iç a 2 ppm de cloro por 48 horas ou a 10 ppm de cloro por 6 horas. Tam
infecção é prejudicada pelo material fecal, aumentaa
E s ua, a ut entraçõe
a ácido hipoclor vel e não recomen la possibilidade
s) (BELLAR et aihalom
R
51
Nos experimentos, utilizou-se a concentração de cloro de 2 ppm por ser este
o teor máximo de cloro residual livre recomendado pela Portaria MS nº 518 (Cap. IV,
Art. 16, § 2º). A observação que a cloração da água possui baixa eficiência para
eliminar protozoários que possuem parede cística como Cryptosporidium, já é
clássica na literatura mundial (CAMPBELL et al., 1982; SUNDERMANN et al., 1987;
SMITH et al., 1988, KORICH et al., 1990, RANSOME et al., 1993, FAYER et al.,
1995, FINCH et al., 1997, VENCZEL et al., 1997).
A ineficiência deste produto na inativação de Cryptosporidium demanda,
portanto, o uso de outras substâncias que possam auxiliar ou agir sinergicamente na
desinfecção da água.
5.4.2 Efeito do dióxido de cloro sobre a viabilidade de oocistos de C. parvum
Avalia concentrações de 0,2 ppm e 0,5
p d o o v obt se
redução da viabilidade de apenas 3 pós 60 inuto cont to. Por este otivo,
foram realizados experimentos usando concent ões , 2 e ppm de o de
clo além d exper o p mpar o efe o pH na inati dos
oocistos. Os dados são apresentados como redução da viabilidade (N/No) em função
14 .
ndo-se preliminarmente o efeito das
pm de ióxi e cldo d ro sobre ocistos de C. par um, eve- percentual de
0% a m s de a m
raç de 1 5 dióxid
ro, e um iment ara co ar ito d vação
da concentração do desinfetante e o tempo de contato deste com os oocistos do
parasito (CT). Os resultados são apresentados nas Figuras 8 e 9 e Tabelas 12, 13 e
52
FIGURA 8 - REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO TRATAMENTO
COM DIÓXIDO DE CLORO (1 PPM, 2 PPM E 5 PPM, pH 7,0 A 19ºC)
NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum
0 100 200 300 400 500 600 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1 ppm
2 ppm
5 ppm
N/N
0
CT (mg. min/L)
TABELA 12 - DADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO
TRATAMENTO COM DIÓXIDO DE CLORO (1 PPM, 2 PPM E 5 PPM,
pH 7,0 A 19ºC) NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium
parvum
Equação da reta: Y = A + B.X
Parâmetros Valor Erro
A 0,81872 0,06354
B -0,00444 0,00105
Coeficiente R Desvio padrão (SD) Coeficiente de
determinação (R
2
)
-0,86526 0,118 0,75708
53
0 50 100 150 200 250
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
N/N
0
CT (mg.min/L)
2 ppm pH 7
2 ppm pH 8
E
FIGURA
CO
TABELA 13 - D
(7
Cr um parvum COM DIÓXIDO DE CLORO (2 PPM)
9 - REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO pH (7,0 E 8,0 A
19ºC) NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum
M DIÓXIDO DE CLORO (2 PPM)
ADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO pH
,0 E 8,0 A 19ºC) NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE
yptosporidi
quação da reta: Y = A + B.X
P Varâmetros alor Erro
A 0 0,11926 ,54544
B -0 9,85736E-4
C D C
de
,00217
oeficiente R esvio padrão (SD) oeficiente de
terminação (R
2
)
-0,66779 0,22149 0,93026
54
* Indicado o CT para o maior índice de inativação (90,56%)
No presente trabalho a maior eficiência do dióxido de cloro foi alcançada
trabalhando-se com 5 ppm por 90 minutos, em pH 7,0 a 19ºC. Assim, o CT obtido foi
de 450. Porém se comparados os valores percentuais de redução de viabilidade,
pode-se perceber que não há diferenças significativas entre os resultados com 2
ppm e com 5 ppm. De tal maneira que o dióxido de cloro a 2 ppm pode ser
empregado na desinfecção da água com bons resultados e sem alcançar níveis
tóxicos uve
diferen a nos resul ido
que as diferenças nos valores de CT dependem de aspectos como pH, temperatura
e a linhagem do microrganismo. CHAURET et al. (2001), em experimento para
determinar a inativação de oocistos de m com dióxido H 7,0;
21ºC), mostraram as variações dos resultados de acordo com a origem das cepas. A
avaliação da e foi feita por cultiv e desencistamen . Foram
usadas três cepas diferentes e houve variação nos resultados de CT entre os
métodos e dentro de um mesmo método. Pelo método de cultivo celular a variação
entre as cepas foi de aproximadamente 300 CT, resultado semelhante ao método de
desencistamento in vitro. Porém os valores de CT deste último foram um pouco
maiores para a inativação da mesma cepa. Para C. parvum, a cinética de inativação
Dióxido de cloro (ppm) Redução de viabilidade (%)
TABEL
Crypt
A 14 - EFICIÊNCIA DO DIÓXIDO DE CLORO NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE
osporidium parvum (10
4
/mL) EM ÁGUA ULTRAPURA (pH 7,0 A 19°C)
Tempo
1 2 5 1 2 5
CT
0 1,10 2,01 5,02 0 0 0
5 1,05 1,96 4,95 25,97 66,40 67,76
15 0,99 1,90 4,78 37,42 66,60 65,63
30 0,96 1,85 4,62 39,83 66,12 72,83
45 0,93 1,93 4,76 28,04 73,28 74,09
60 0,90 1,78 4,68 52,55 79,98 83,30
90 0,87 1,74 4,52 49,32 82,15 90,56
120 0,85 1,66 4,46 73,97 87,25 89,78
450*
. O experimento para avaliar a influência do pH mostrou que não ho
tados de inativação utilizando-se pH 7,0 ou 8,0. É reconhecç
C. parvu de cloro (p
viabilidad o celular to in vitro
55
não se mostrou linear para experimentos realizados em pH 7,0 e temperatura de
21ºC.
Os trab al. lor CT de 78
ndo co 1,3 p por 6 minuto , em pH 7,0 a 25°C. RANSOME et al.
93), avaliar efei dióx e cl C e mostraram
a eficiência torn 90% LIY E ( mo ue o efeito do
ido de clo epe te d e te tura sua eficiênc é maior a
C e pH 11, gan inat log ) de os arv m com um
po de contato de 70 minutos FE l. (2 rop alo s mínimos
CT para 1 e in ção 1,2 pa ivação de oocistos de C.
vum com o d ro. bém bse va em o da
eratura. P ada dim os per C ento num fator
8,0 não apresentou diferenças na
taxa de inativação, mas em pH 10,0 a inativação foi mais rápida, necessitando de
CT 20
alhos de KORICH et (1990) mostraram um va
trabalha m pm 0 s
(19 am o to do ido d oro em oocistos de . parvum
um em o de . Já ANAG 1998), strou q
dióx ro é d nden e pH mpera e que ia
25° 0 che do a ivar 1 (90% oocist de C. p u
tem . RUF LL et a 000), p õem v re
de log d ativa de 7 a 20°C ra inat
par dióxid e clo Tam foi o rvada riação funçã
temp ara c 10°C inuíd na tem atura, o T aum u
de aproximadamente 3,4. O pH na faixa de 6,0 a
a 30% menor que em pH 6,0 a 8,0. CHAURET et al. (2001), obtiveram CT de
1.000 para inativação de oocistos de C. parvum trabalhando com pH 8,0 a 21ºC.
Os diferentes trabalhos que citam a grande interferência de pH e temperatura
são mostrados na Tabela 15.
56
DE ypt spo idiu pa vum USANDO DIÓXI O DE C OR E
ESTUDO (ADAPTADO DE CHAURET ET AL., 2001)
dência da cepa de C. parvum.
CIS OS
OS DO PRESENTE
roce
TABELA 15 – RESUMO DE DADOS DE INATIVAÇÃO DE OO T Cr o r m r D L O
COMPARAÇÃO COM OS RESULTAD
a
ddH2O, água deionizada e destilada, PHF, Pleasant Hill Farm - p
b
O valor de CT é o máximo teórico
e exposição. Notar que Liyanage et al., 1997 fornece dados p
mentos de inativação de oocistos de C. parvum, e, em todos os caso
arênteses foram recalculados por Finch et al., 1999.
CT,
calculado pela multiplicação da dose inicial de desinfetante pelo t ara
valores iniciais e finais residuais de dióxido de cloro para os experi s, o
valor residual final foi 60% ou menos que o valor inicial.
c
Valores os
selecionados de cada referência foram a
d
Somente dad
empo d
em p
p
resentados.
e
Valor a
p
roximado.
57
5.4.3 Efeito do ozônio sobre a viabilidade de oocistos de C. parvum
Para avaliar a eficiência do ozônio na inativação dos oocistos rvum
am realizados dois experimentos. O primeiro foi realizado em sistema aberto e
aram-se aplicações de 0,1; 0,45 e 0,7 mg/L. Os dados são apresentados como
ção da viabilidade (N/No) em função da concentração do desinfetante (mg/L)
ra 10 e Tabela 16). O percentual de redução da viabilidade é mostrado na
la 17.
de C. pa
for
avali
redu
(Figu
Tabe
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
N/No
Conc. (mg/L)
FIGURA 10 – REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO TRA
COM OZÔNIO NA INATIVAÇÃO DE OOCIS
Cryptosporidium parvum (SISTEMA ABERTO)
TABELA 16 – DADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O E
TRATAMENTO COM OZÔNIO NA INATIVAÇÃO DE OOC
Cryptosporidium parvum (SISTEMA ABERTO)
TAMENTO
TOS DE
FEITO DO
ISTOS DE
Equação da reta: Y = A + B.X
Parâmetros Valor Erro
A 0,69136 0,24782
B -1,09699 0,59135
Coeficiente R Desvio padrão (SD) Coefic
determi
iente de
nação (R
2
)
-0,79526 0,33024 0,98613
58
Concentração de ozônio
(mg/L)
Redução de
viabilidade (%)
Ne e
97,48% após a aplic ção de C. parvum por
ozônio vem sendo investigada por muitos autores em diferentes países (PEETERS
et al., 1989; PERRINE et al., 1990; KORICH et al., 1989, 1990, FINCH et al., 1993a;
LIYANAGE et al., 1998, RENNECKER et al., 1999; CORONA-VASQUEZ et al.,
2003). PEETERS et al. (1989), conseguiram inativação de 2 log (99%) com CT de
4,1 a 4,6 mg. min/L. PERRINE et al. (1990), obtiveram inativação de 2 log com CT de
2,6 mg. min/L. No entanto, a utilização de um sistema de ozonização contínuo
subestimou a dose de ozônio. O mesmo ocorreu para os resultados apresentados
por KORICH et al. (1990), que apresentaram um CT de 5 mg. min/L para 2 log de
inativação. FINCH et al. (1993), observaram inativação de 2 log com CT na faixa de
2 a 8 mg. min/L a 22°C e CT de 5 a 10 mg. min/L a 7°C. Para inativação de 3 log
(99,9%) o CT foi entre 3 e 15 mg. min/L a 22°C e CT entre 8 e 16 mg. min/L a 7°C.
ROCHELLE et al. (2002), obtiveram inativação de 2,2 log (99,4%) pelo método de
cultura celular e 2,5 log (99,7%) pelo método de infecção experimental, utilizando CT
de 16 g log
(99,35%) de inativa ostos ao ozônio na
concentração de 2,0 mg/L durante 10 minutos.
Considerando a baixa eficiência ivação obtida no ento do
presente trabalh em relação aos d literatura, procu repetir o
experimento em sistema fechado, simulando um reator. Nesta condição foram
avaliadas as es de 0,18; 0,24 ,48 e 1,44 mg/L dos são
apresentados como redução da viabilidade (N/No) em função da concentração do
ste tipo de sistema, o maior percentual de redução da viabilidade foi d
ação de 0,7 mg/L. A cinética de inativa
m . min/L de ozônio, enquanto KEEGAN et al. (2003), obtiveram 2,19
ção de oocistos de C. parvum exp
de inat experim
o, ados da rou-se
aplicaçõ ; 0,36; 0 . Os da
0,10 74,25
0,45 88,85
0,70 97,48
TABELA 17 - EFICIÊNCIA DO OZÔNIO NA REDUÇÃO DA VIABILIDADE DE
OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum UTILIZANDO SISTEMA
ABERTO
59
desinfetante (mg/L) (Figura 11 e Tabela 18). O percentual de redução da viabilidade
é mos atr do na Tabela 19.
FIGURA 11 - REG NDO O EFEITO DO TRATAMENTO
COM OZÔNIO NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium
parvu STEMA FECHADO)
RESSÃO LINEAR MOSTRA
m (SI
0,2
0,4
0,6
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
0,0
0,8
1,0
N/N
0
Concentração (mg/L)
Equação da reta: Y = A + B.X
TABELA 18 - DADOS DA REGRESSÃO LINEAR MOSTRANDO O EFEITO DO
TRATAMENTO COM OZÔNIO NA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE
Cryptosporidium parvum (SISTEMA FECHADO)
Parâmetros Valor Erro
A 0,32434 0,23252
B -0,34621 0,35852
Coeficiente R Desvio padrão (SD) Coeficiente de
2
determinação (R )
-0,4348 0,41013 0,99999
60
A inativação foi de 100% a partir da concentração de 0,24 mg/L. A relação CT
é diferente de um trabalho para outro e muitas variáveis podem interferir neste valor.
Entre elas podem ser citadas a temperatura (Tabela 20), o pH, a concentração de
matéria orgânica encontrada na água in natura do manancial onde ela é captada e
adicionalmente, as linhagens do parasito. Estudos sobre inativação de oocistos de C.
parvum com 1 mg/L de ozônio em pH 8,0 mostram valores < 1 log na época do
inverno e 2 log no período do verão (USEPA, 2003). RENNECKER et al. (1999),
obtiveram inativação de 5 log com 1 mg/L de ozônio, no período do verão. Com
doses de 0,5 mg/L de ozônio, obtiveram inativação ≤ 1 log no período do verão e não
obtiveram inativação na época chuvosa ou de inverno. Segundo os autores, a
diferença sazonal se deve à alta energia de ativação para inativar o C. parvum. O
método de desencistamento in vitro pode apresentar resultados discrepantes, uma
vez q dos
oocisto intactos, so foi verificado por
RENNECKER et al. (1999). Também foi observado que oocistos intactos, quando
expos n rdem sua refratabi
classificado erroneamente como desencistado e superestimando o resultado de
desencistamento. Uma alternativa para minimizar esse erro seria avaliar a viabilidade
por meio da contagem de esporozoítos tados e utilizar equações para
corrigir o número de esporozoítos presentes na amostra antes do processo de
desinfecção (denominada “branco”) e para normalizar o controle. Outra observação
verificada por diversos autores é que pode haver aumento do desencistamento a
uma exposição relativamente baixa a agentes oxidantes (REDUKER e SPEER,
1985, RENNECKER et al., 1999, RUFFELL et al., 2000). Esse artefato da técnica de
Concentração de ozônio Redução de
ue pode haver dificuldade na diferenciação de formas desencistadas
após o processo de ozonização. Iss
tos a a trações de ozôltas concen io, pe lidade, sendo
desencis
(mg/L) viabilidade (%)
0,18 98,87
0,24 100
0,36 100
0,48 100
1,44 100
TABELA 19 - EFICIÊNCIA DO OZÔNIO NA REDUÇÃO DA VIABILIDADE DE
OOCIS
FECHA
TOS DE Cryptosporidium parvum UTILIZANDO SISTEMA
DO
61
desen st fetantes
aprese tem maior tax
a última década, Cryptosporidium spp. passou a representar um importante
proble a para causado veiculação
hídrica, com o maior número de casos notificados principalmente em países
desenvolvidos (MACKENZIE et al.,1994, BETANCOURT e ROSE, 2004, SAVIOLI et
al., 2006; SMITH et al., 2006). Em Surrey, no Canadá, piscinas que eram tratadas
com sistema de filtração com areia, ozonização e cloração foram responsáveis por
um surto de criptosporidiose (LOUIE et al., 2004).
ci amento faz com que as amostras submetidas aos desin
a de desencistamento que o controle. n
N
m saúde pública por ter grandes epidemias de
Mesmo estabelecidos os processos de tratamento adequados e uma correta
operacionalização sabe-se que há passagem de oocistos de Cryptosporidium spp.
na água de beber (SMITH et al., 2006). Processos de desinfecção de água utilizando
o dióxido de cloro e o ozônio têm sido foco de vários estudos. O ozônio tem a
vantagem de ser bastante eficaz para vários microrganismos sob doses menores,
mas é considerado mais dispendioso que o cloro (BETANCOURT e ROSE, 2004).
Outro fator a ser considerado é que o ozônio não produz residual para o sistema de
distribuição (MEYER, 1994).
TABELA 20 – VALORES DE CT PARA INATIVAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum
EMPREGANDO OZÔNIO COMO DESINFETANTE
Inativação CT (mg.min/L)
[-log10(N/No)]
0,5ºC 5ºC 10ºC 15ºC 20ºC 25ºC 30ºC
0,5 20.1 11.3 6.08 3.34 1.87 1.07 0.62
1,0 32.7 18.4 9.88 5.43 3.05 1.74 1.01
1,5 45.3 25.4 13.7 7.52 4.22 2.41 1.40
2,0 57.9 32.5 17.5 9.60 5.39 3.08 1.79
2,5 70.4 39.5 21.3 11.7 6.56 3.75 2.18
3,0 83.0 46.6 25.1 13.8 7.73 4.42 2.57
3,5 95.6 53.7 28.9 15.9 8.90 5.09 2.96
4,0 108.0 60.7 32.7 18.0 10.1 5.76 3.35
4,5 121.0 67.8 36.5 20.0 11.2 6.43 3.74
5,0 133.0 74.8 40.3 22.1 12.4 7.10 4.13
5,5 146.0 81.9 44.0 24.2 13.6 7.77 452
6,0 158.0 88.9 47.8 26.3 14.8 8.44 4,91
FONTE: Adaptado de Rennecker et al. (1999).
62
Apesar do custo, o ozônio vem sendo usado como desinfetante em muitas
estações de tratamento de água em diferentes partes do mundo. Ele mostrou-se
uma e
sinfetante secundário com tempo
suficie
trabalho, percebe-se que existem alternativas capazes
de melhorar as taxas de inativação de oocistos de Cryptosporidium parvum
p
Como ferentes regiões do Brasil,
uma questão que pode ser levantada é se existe variabilidade genética intra-
específica para Cr efletir no
comportamento das linhagens frente aos desinfetantes.
d ro m m q a e cia
sofre g e interf ia das terís quím e fí da á Por no
caso do Brasil, é ssária aval nas diferentes regiões, pois sendo um
país de dimensão continental, riável. Se a variação
ocorre tro de u smo e o, oc a outro, o
que dif a o con as va is ac e
água existentes no país.
istos de C vum os c ozô em
sistema fechado, são os melhores result três desinfetantes
testados. O ozônio também tem sua eficiência afetada por fatores como pH e
xcelente alternativa como desinfetante no pré ou pós-tratamento de água por
ser altamente eficiente e por agir em doses baixas (MEUNIER et al., 2006).
Pesquisas recentes têm mostrado que a aplicação seqüencial de diferentes
desinfetantes é mais eficiente que o efeito de cada um individualmente, pois efeitos
sinérgicos aumentam a eficiência da desinfecção (DIBERNARDO e DANTAS, 2005,
RENNECKER et al., 1999). RENNECKER et al. (2000), sugerem que a utilização do
ozônio como desinfetante primário e um outro de
nte de contato podem prover bons resultados na inativação de oocistos de C.
parvum. Além disso, o pré-tratamento com ozônio diminui o CT para o desinfetante
secundário.
5.5 Medidas importantes para garantir a qualidade da água
No Brasil, pouco se sabe a respeito da real eficiência de outros desinfetantes,
além do cloro. Pelo presente
resentes na água, tornando os sistemas de tratamento de água mais eficientes.
Cryptosporidium spp. vem sendo encontrado em di
yptosporidium spp. e se este fato poderia se r
Os resultados de inativação com dióxido e clo ostra ue su ficiên
rand erênc carac ticas icas sicas gua. isto,
nece uma iação
possui água com qualidade va
den m me stad orre ainda mais de um estado par
icult trole d riáve ima referidas nas estações de tratamento d
Os valores de inativação de ooc . par obtid om o nio,
ados em relação aos
63
tempe
s oocistos de C. parvum são capazes de passar filtros convencionais,
fazem-se necessárias barreiras eficientes para este protozoário. Se forem utilizadas
barreir enor demanda
dos desinfetantes.
ratura, mas é a alternativa mais promissora para o tratamento da água. O fato
de ser possível a associação dos desinfetantes, melhora ainda mais as perspectivas.
Nesse contexto, o ozônio se mostra como uma ótima opção de desinfetante no pré
ou pós-tratamento de água.
Para se garantir a eficiência dos desinfetantes alternativos reforça-se a
condição de adaptação constante dos valores de CT. Como o país apresenta regiões
com características peculiares de solo e clima, ocorre grande variação na qualidade
da água, pois esta é influenciada pelo solo e pela sazonalidade. Desta maneira, as
estações de tratamento de água devem fazer avaliações periódicas das
características da água a ser tratada a fim de garantir um CT ótimo para cada local.
Sabendo-se que apesar da implementação e padronização dos processos de
tratamento, o
as que evitem ao máximo a passagem de oocistos, haverá m
Como o método de desinfecção utilizado no Brasil ainda é somente o cloro e
sua eficiência na inativação de oocistos de C. parvum é sabidamente baixa, o país
não tem estrutura para enfrentar uma eventual epidemia de criptosporidiose.
Programas de saneamento básico e educação sanitária continuam sendo de
fundamental importância para evitar a contaminação ambiental e da população.
Sabendo-se do potencial risco de contaminação por animais, devem ser tomadas
medidas para que estes não eliminem seus excrementos próximos às áreas de
mananciais.
Se o ambiente estiver livre de contaminação, não haverá necessidade da
utilização de produtos químicos em altas doses. A água deve estar livre de
microrganismos patogênicos, mas também de produtos e subprodutos químicos em
concentrações capazes de levar a outras doenças por sua toxicidade. A principal
barreira deve ser feita nos mananciais para que sua preservação seja assegurada.
64
6. CONCLUSÕES
A técnica molecular (PCR) para Cryptosporidium parvum, mostrou-se
sensível para 10
2
oocistos. Foi possível melhorar a sensibilidade por meio da técnica
de Ne
diferen
detectados e permaneceram viáveis. O ácido hipocloroso a 2
ppm in
ação x
tempo
do. Em sistema aberto, a redução da viabilidade foi de 97,48% após a
aplicaç
sted-PCR. Os melhores resultados de extração de DNA foram obtidos
utilizando-se o método que emprega ultra-som e enzimas. Ainda são necessários
ajustes visando o aumento da sensibilidade da técnica para uso em amostras
ambientais.
O método de desencistamento in vitro mostrou-se como boa alternativa para
avaliação da viabilidade de oocistos de C. parvum. Este método possibilitou a
ciação de oocistos desencistados e intactos, além de apresentar as
vantagens de fácil reprodutibilidade, custo acessível e dispensa do manuseio de
animais.
O tratamento convencional de água utilizando cloração mostra que oocistos
de C. parvum foram
ativou apenas 49% dos oocistos de C. parvum, após tempo de contato de 120
minutos.
O tratamento com dióxido de cloro apresentou valores de CT (concentr
de contato do desinfetante) de 450, considerados altos. Na concentração de 5
ppm por 90 minutos, inativou 90% dos oocistos de C. parvum.
O tratamento com ozônio promoveu 98,87% de inativação na concentração
de 0,18 mg/L e 100% de inativação ocorreu quando usado 0,24 mg/L do produto, em
sistema fecha
ão de 0,7 mg/L de ozônio. O ozônio representa uma excelente opção de
desinfetante.
65
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89
ANEXOS
ANEXO 1 - PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO PARA
Cryptosporidium parvum UTILIZANDO ULTRA-SOM E ENZIMAS
Descongelar os oocistos purificados em banho-maria a 65ºC por 5 minutos;
Colocar 200 µL da suspensão (contagem conhecida) em um tubo de 2,0 mL,
acrescentar 1.000 µL de solução fisiológica 0,85% e homogeneizar;
Centrifugar a 12.000 g por 5 minutos, em temperatura ambiente;
Descartar o sobrenadante;
Ressuspender o sedimento em 1.000 µL de solução fisiológica 0,85% (repetir
duas ou três vezes, até que o sobrenadante fique claro);
Ressuspender o sedimento em tampão de lise (500 µL) contendo β-
mercaptoetanol [50 µL de 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 50 µL 50 mM EDTA
(pH 8,0) + 50 µL SDS 10% + 3,5 µL 70 mM β-mercaptoetanol + 346,5 µL de
água ultrapura];
Congelar (-196ºC) e descongelar (37ºC) 3 vezes;
Aplicar cinco ciclos de ultra-som (30 segundos a 50 Hz) conservando em
banho de gelo;
Incubar em banho-maria a 65ºC por 1 hora e 30 minutos;
Adicionar lisozima (5 µL de uma solução recente a 100 mg/mL);
Incubar em banho-maria a 37ºC por 60 minutos;
Digerir com RNAse (10 mg/mL) em banho-maria a 37ºC por 60 minutos;
Acrescentar 20 µL de proteinase K (20 mg/mL) e incubar novamente em
banho-maria a 55ºC por 2 h e 30 minutos ou over night ;
Parar a reação a 95ºC por 10 minutos e deixar em temperatura ambiente por
15 minutos;
Acrescentar 500 µL da solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1)
e centrifugar a 12.000 g por 15 minutos;
Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e acrescentar 500 µL de
clorofórmio puro e centrifugar a 12.000 g por 15 minutos;
90
sobrenadante para um outro tubo limpo e acrescentar 30 µL de
acetato de sódio 3 M, e 1.000 µL de etanol puro gelado e centrifugar a 12.000
Transferir o
g por 30 minutos;
Desca o) e
centrifugar a 12.000 g por 15 minutos;
rtar o sobrenadante e acrescentar 500 µL de etanol 70ºC (gelad
Descartar o sobrenadante, secar o tubo a vácuo por 15 minutos;
Eluir o DNA com 100 µL do tampão TE (Tris-EDTA) e armazernar a 4ºC.
91
ANEXO 2 – PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA ASSOCIANDO
CONGELAMENTO/DESCONGELAMENTO E ENZIMAS
(PROTOCOLO DESCRITO POR WEISS,1993 E MODIFICADO)
Ao sedimento de oocistos adicionar 500 μL de tampão TEN (Tris-HCl 10 mM,
EDTA 10 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0) esterilizado e suspendê-lo usando
agitador mecânico;
Congelar a suspensão obtida em nitrogênio líquido a -196°C por 5 minutos e
descongelá-la, em banho-maria, a 37°C por 5 minutos;
Adicionar 5 μL de solução de lisozima fresca, preparada em tampão TEN e na
oncentração de 100 mg/mL. Incubar a mistura a 37°C, em banho-maria com
gitação, por 1 hora;
c
a
Adicionar 50 μL de solução de SDS a 5% (preparada em tampão TEN) e
isturar; m
Adicionar 2,5 μL de solução de proteinase K (preparada em água e na
oncentração de 20 mg/mL) e homogeneizar; c
cubar a 55°C, em banho-maria com agitação, por 30 minutos; In
ongelar e descongelar o material duas vezes de modo idêntico ao descrito
o item 2;
C
n
quecer o material a no mínimo 95°C, em banho-maria, por 10 minutos, para
ativação da protease;
A
in
entrifugar a mistura a 1.000 g por 5 minutos. Transferir o líquido
obrenadante para um tubo novo esterilizado;
C
s
Adicionar 10 μL de RNase (10 mg/mL). Incubar a mistura a 37°C, em banho-
aria com agitação, por 30 minutos; m
azer extração de restos celulares e proteínas com solução saturada de
nol, depois com a mistura fenol/clorofórmio/álcool isoamílico nas proporções
e 25:24:1, respectivamente, e finalmente com clorofórmio puro:
o Verificar o volume de líquido presente no tubo que contém a amostra e
adicionar, com micropipeta apropriada, quantidade igual de solução de
fenol saturada;
o Misturar, delicadamente, invertendo o tubo 10 vezes;
F
fe
d
92
o Centrifugar a 12.000 g, a 20°C, por 5 minutos. Após a centrifugação,
r, cuidadosamente, o tubo da centrífuga e observar se há duas retira
camadas;
rior esteja límpido;
e modo idêntico ao
crito para a solução de fenol;
o Coletar o líquido da camada superior e transferi-lo para um tubo novo.
Repetir o procedimento de extração com fenol até que o líquido da
camada supe
o Fazer a extração novamente, mas com a mistura de
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), d
descrito para a solução de fenol;
o Repetir o processo de extração, mas com clorofórmio puro, de modo
idêntico ao des
Terminada a extração com solventes orgânicos, verificar o volume de líquido
presente no tubo e adicionar 10% de solução de acetato de sódio 3 M, pH
6,0;
ente no tubo e adicionar etanol
A. Inverter o
Novamente verificar o volume de líquido pres
absoluto gelado, em dobro, para provocar a precipitação do DN
tubo, delicadamente, para homogeneização;
0°C por 4 a 12 horas; Manter a -2
Centrifugar a 12.000 g, a 4°C, por 30 minutos. Descartar o líquido
sobrenadante;
Lavar o sedimento de DNA adicionando 300 μL de solução de etanol a 70% e
suspendê-lo por agitação leve do tubo;
Centrifugar a 12.000 g, a 4°C, por 5 minutos. Após, descartar a solução de
etanol. Repetir esta lavagem com etanol 70%;
Secar o sedimento de DNA em estufa, a 37°C, por 15 minutos mantendo o
tubo aberto e em posição horizontal;
Apó s
agitand
s eco o DNA, adicionar 100 μL de tampão TE (Tris-EDTA) e suspendê-lo
o levemente o tubo com a mão;
Estoca por 12 horas, para que ocorra a solubilização do DNA.
De ubmetido à PCR
ou então armazená-lo a -20°C para uso posterior.
r o tubo a 4°C,
corrido este tempo, o DNA estará pronto para ser logo s
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