( PDF ) Estudo da regulação da secreção de tireotrofina murina pelo endocanabinóide endógeno, anandamida

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MARCO AURÉLIO LIBERATO COSTA DA VEIGA

ESTUDO DA REGULAÇÃO DA SECREÇÃO DE

TIREOTROFINA MURINA PELO

ENDOCANABINÓIDE ENDÓGENO, ANANDAMIDA

Rio de Janeiro

2008

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MARCO AURÉLIO LIBERATO COSTA DA VEIGA

ESTUDO DA REGULAÇÃO DA SECREÇÃO DE

TIREOTROFINA MURINA PELO

ENDOCANABINÓIDE ENDÓGENO, ANANDAMIDA.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de

Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do

Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.

Orientação: Dra. Carmen Cabanelas Pazos de Moura.

Rio de Janeiro

2008

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FOLHA DE APROVAÇÃO

ESTUDO DA REGULAÇÃO DA SECREÇÃO DE

TIREOTROFINA MURINA PELO ENDOCANABINÓIDE

ENDÓGENO, ANANDAMIDA

MARCO AURÉLIO LIBERATO COSTA DA VEIGA

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como

parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em

Ciências.

Aprovada por:

Dra. Carmen Cabanelas Pazos de Moura – IBCCF/UFRJ

Dra. Doris Rosenthal – IBCCF/UFRJ

Dr. Luis Carlos Reis – UFRRJ

Dra. Patrícia Cristina Lisboa da Silva – UERJ

Dra. Vânia Maria Correa da Costa – IBCCF/UFRJ

Rio de Janeiro

2008

FICHA CATALOGRÁFICA

Rio de Janeiro

2008

VEIGA, MARCO AURÉLIO LIBERATO COSTA

ESTUDO DA REGULAÇÃO DA SECREÇÃO DE TIREOTROFINA

MURINA PELO ENDOCANABINÓIDE ENDÓGENO,

ANANDAMIDA

87f

Tese (Doutor em Ciências) UFRJ.

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.

Orientação: Dra. Carmen Cabanelas Pazos de

Moura

1. Anandamida 2. Tireotrofina 3. Hipotireoidismo 4. Hipertireoidismo

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro (2008)

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Endocrinologia

Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ, sob a

orientação da professora Carmen Cabanelas Pazos de Moura, com

apoio financeiro concedido pelo CNPq – Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico e FAPERJ - Fundação Carlos

Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro.

DEDICATÓRIA

Aos meus maiores amores, minha

esposa Priscila, nossa filha e

nossa Biluca.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por conhecer e suprir todas as necessidades para a

realização deste trabalho.

A minha orientadora, Carmen Cabanelas P. Moura que, com seu

profissionalismo e inteligência, tornou-se um exemplo e estímulo de

profissional e pessoa a ser alcançada.

À minha esposa, Priscila Fialho Pesarini, por todo

companheirismo e amor.

Aos meus pais, Lauro e Silvia, e aos meus sogros, Angelo e

Carla, por me darem todas as condições e ferramentas para

realização deste trabalho.

À Karen de Jesus Oliveira, por toda paciência, amizade e alegria

que tornaram este trabalho possível e mais prazeroso (tudo, ainda

será pouco para agradecer-te!).

A todos do LEM, indistintamente, sem a mínima ajuda de cada um

tudo seria menos valoroso. Obrigado.

A todos componentes dos laboratórios da Dra. Denise Pires de

Carvalho e da Dra. Doris Rosenthal, por quem tenho sincera

admiração.

À profa. Dra. Cássia Thaïs B. V. Zaia, por ter me apresentado o

interessante mundo da pesquisa científica sendo a minha primeira

referência e exemplo profissional.

À Tatiana Valério pela hospitalidade que facilitou a conclusão do

trabalho e a todos amigos e familiares que compartilharam os

melhores e piores momentos durante este período.

E por fim, a quem com essencial amizade, encorajamento e

hospitalidade permitiu o início de tudo, Adriana Bechara .

Obrigado!

RESUMO

VEIGA, Marco Aurélio Liberato Costa. Estudo da regulação da secreção de

tireotrofina murina pelo endocananbinóide endógeno, anandamida. Rio de Janeiro,

2008. Tese – Doutorado em Ciências – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Endocanabinóides estão envolvidos com a modulação de vários sistemas

biológicos, entre os quais os sistemas neuroendócrinos. Entretanto, não há informação

disponível a respeito da regulação do eixo tireotrofo-tireóide. Neste trabalho examinou-

se o efeito do canabinóide endógeno, anandamida, assim como do antagonista

sintético do receptor canabinóide, AM251, sobre a secreção de tireotrofina (TSH) e

dos hormônios tireoideanos. Ratos machos eutireoideos mostraram redução de 42%

(P<0,05) na concentração sérica de TSH duas horas após injeção única subcutânea

de anandamida (0,02mg/Kg PC) acompanhada pela redução de 28% (P<0,01) na

concentração sérica de tiroxina (T4), sem alterações significativas na concentração de

triiodotironina (T3). Nos tempos de 0,5 e 1 hora os hormônios citados não mostraram

qualquer alteração sérica. Nos experimentos com modelos animais hipo- e

hipertireoideos, ratos hipotireoideos mostraram redução de 35% (P<0,01) no TSH

sérico duas horas após administração de anandamida, que, por sua vez, não teve

qualquer efeito no TSH de ratos hipertireoideos. Ambos os grupos, hipo- e

hipertireoideos, não apresentaram alteração na concentração sérica dos hormônios

tireoideanos induzida pela anandamida. Explantes de adenohipófises de animais

eutireoideos apresentaram redução de 65% na liberação de TSH para o meio de

incubação na presença de anandamida (10

-7

M). Entretanto, na concentração de 10

M, a anandamida estimulou (61%) a liberação de TSH neste sistema in vitro. O

antagonista do receptor canabinóide, AM251, estimulou (4,3 vezes - P<0,0001) a

secreção sérica de TSH, sem alteração nos hormônios tireoideanos, 1,5 hora após sua

administração sistêmica. Em conclusão, a anandamida é capaz de inibir agudamente a

liberação de TSH em ratos eu- e hipotireoideos, agindo, ao menos em parte, na

adenohipófise. Uma vez que o antagonista do receptor endocanabinóide, AM251,

provocou aumento na liberação de TSH, é possível sugerir que o sistema

endocanabinóide exerça in vivo, papel de regulador negativo sobre a secreção de

TSH.

ABSTRACT

VEIGA, Marco Aurélio Liberato Costa. Estudo da regulação da secreção de

tireotrofina murina pelo endocananbinóide endógeno, anandamida. Rio de Janeiro,

2008. Tese – Doutorado em Ciências – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Endocannabinoids have been implicated in modulation of several biological

systems, among those the neuroendocrine system. However, no information is

available regarding the regulation of the thyrotroph-thyroid axis. Here we examined the

effect of the endogenous cannabinoid, anandamide, as well as those of the synthetic

cannabinoid receptor antagonist, AM251, on thyrotropin (TSH) and thyroid hormone

secretion. Euthyroid male rats showed a 42% decrease (P<0.05) in serum TSH, two

hours after a single subcutaneous injection of anandamide (0.02mg/kg BW)

accompanied by a 28% reduction (P<0.01) in serum thyroxine (T4), but no alteration in

serum T3. At earlier times (0.5 and 1 h) these serum hormones remained unchanged.

Hypothyroid rats also showed a 35% reduction in serum TSH, 2 hours after

anandamide injection, that had no effect on hyperthyroid rats. Both hypo- and

hyperthyroid rats had no modification of serum thyroid hormones induced by

anandamide. Anterior pituitaries explants from euthyroid rats had a 65% reduction in

TSH release in the presence of 10

-7

M anandamide in the incubation medium.

However, at 10

-11

M anandamide was able to stimulate TSH release (61%) in this in

vitro system. The cannabinoid receptor antagonist, AM251, was able to importantly

stimulate TSH secretion (4.3-fold increase in serum TSH), without changes in the

serum thyroid hormones, 1.5h after its systemic administration. In conclusion,

anandamide, an endogenous cannabinoid, has the ability to acutely inhibit TSH release

in eu- and hypohyroid rats, acting at least in part at the pituitary. Since the cannabinoid

receptor antagonist, AM251, increased TSH release, it is suggested that the

endocannabinoid system may exerts an in vivo role as negative regulator of TSH

secretion.

LISTA DE ABREVIATURAS

2-AG – 2-aracdonoilglicerol

ACTH – Hormônio adenocorticotrófico

AM251 – [N-(piperidina-1-il)-5-(4-iodofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-lH-

AMPc – Adenosina monofosfato cíclico

CART – Transcrito regulado por cocaína e anfetamina

CB1 – Receptor canabinóde tipo 1

CB2 – Receptor canabinóde tipo 2

cDNA – Ácido desoxirribonucléico do tipo complementar

CRH – Hormônio liberador de corticotrofina

D1 – Desiodase tipo 1

D2 – Desiodase tipo 2

D3 – Desiodase tipo 3

DMSO – Dimetil sulfóxido

ERK - Cinase regulada por sinal extracelular

EPM – Erro padrão da média

FAAH - Hidrolase de amida de ácido graxo

FAK – Cinase de adesão focal

FSH – Hormônio folículo estimulante

GH – Hormônio do crescimento

GIRK - Canais de influxo retificador de potássio acoplados a proteína G

GnRH - Hormônio liberador de gonadotrofina

ip – Intraperitoneal

IgG – Imunoglobulina G

KDa – Quilodalton

LH – Hormônio luteinizante

MAGL – Lípase de monoacilglicerida

MAPK – Proteína cinase ativada por mitógeno

µm - Micrômetro

MMI – Metimazol

NAPE – N-aracdonoil-fosfatidiletanolamida

NAT – N-aciltransferase

NMDA – N-metil-D-Aspartato

NPY – Neuropeptídeo Y

PKA – Proteína cinase A

PKC – Proteína cinase C

PLC – Fosfolipase C

PLD – Fosfolipase D

PVN – Núcleo paraventricular hipotalâmico

RNAm – Acido ribonucléico mensageiro

SREBP-1c – Proteína 1c regulador de esteróide

T3 – 3, 5, 3’ triiodotironina

T4 – 3, 5, 3’, 5 tetraiodotironina, tiroxina

TBG – Globulina ligadora de tiroxina

THC – delta-9-tetrahidrocanabiol

TNF – Fator de necrose tumoral

TR – Receptor para hormônio tireoideano

TRE – Elemento responsivo a hormônio tireoideano

TRH – Hormônio liberador de TSH

TRHR – Receptor do hormônio liberador de TSH

VR1 – Receptor vanilóide tipo 1

TSH – Hormônio estimulador da tireóide

TSHR – Receptor para TSH

TTR – Transtiretina

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Esquema de regulação do eixo tireoideano...................... 5

Figura 2 – Estrutura química da molécula delta-9-tetrahidrocanabiol

(THC)................................................................................................... 16

Figura 3 – Estrutura química da molécula de anandamida e 2-

aracdonoilglicerol................................................................................. 17

Figura 4 – Via de síntese de anandamida.......................................... 19

Figura 5 – Moléculas com efeito inibitório sobre o transportador de

anandamida......................................................................................... 20

Figura 6 – Esquema de inativação da anandamida ........................... 21

Figura 7 – Esquema das principais vias sinalizadoras

desencadeadas pelo receptor CB1 ..................................................... 25

Figura 8 – Principais antagonistas dos receptores

endocanabinóides................................................................................ 27

Figura 9 – Esquema experimental com animais eutireoideos in vivo. 38

Figura 10 – Esquema experimental com animais hipertireoideos in

vivo ...................................................................................................... 39

Figura 11 – Esquema experimental com animais hipotireoideos in

vivo ...................................................................................................... 40

Figura 12 – Esquema ilustrando o procedimento para o experimento

in vitro com hemi-adenohipófises de animais eutireoideos................. 42

Figura 13 – Concentração sérica de TSH em animais eutireoideos .. 45

Figura 14 – Concentração sérica de T4 total em animais

eutireoideos ......................................................................................... 46

Figura 15 – Concentração sérica de T3 total em animais

eutireoideos ......................................................................................... 47

Figura 16 – Concentração sérica de TSH em animais

hipertireoideos..................................................................................... 48

Figura 17 – Concentração sérica de T4 total em animais

hipertireoideos..................................................................................... 49

Figura 18 – Concentração sérica de T3 total em animais

hipertireoideos..................................................................................... 50

Figura 19 – Concentração sérica de TSH em animais hipotireoideos 51

Figura 20 – Concentração sérica de T4 total em animais

hipotireoideos ...................................................................................... 52

Figura 21 – Concentração sérica de T3 total em animais

hipotireoideos ...................................................................................... 53

Figura 22 – Concentração sérica de TSH em animais eutireoideos

após AM251......................................................................................... 54

Figura 23 – Concentração sérica de T4 total em animais

eutireoideos após AM251.................................................................... 55

Figura 24 – Concentração sérica de T3 total em animais

eutireoideos após AM251.................................................................... 56

Figura 25 – Secreção basal de TSH a partir de hemi-adenohipófises

de animais eutireoideos....................................................................... 58

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Secreção de TSH a partir de hemi-adenohipófises de

animais eutireoideos............................................................................ 57

SUMÁRIO

1 – INTRODUÇÃO .............................................................................. 1

1.1 – Hormônio estimulador da tireóide (TSH).................................... 2

1.1.1 – Aspectos históricos.................................................................. 2

1.1.2 – Características gerais.............................................................. 3

1.2 – Eixo hipotálamo-hipófise-tireóide ............................................... 5

1.2.1 – Hormônio liberador de tireotrofina (TRH)................................ 6

1.2.2 – Hormônios tireoideanos........................................................... 7

1.3 – Regulação da secreção de TSH................................................. 10

1.3.1 – Alterações da concentração sérica de TSH............................ 10

1.3.2 – Outros reguladores da secreção de TSH................................ 11

1.4 – Anandamida................................................................................ 15

1.4.1 – Aspectos gerais e históricos.................................................... 15

1.4.2 – Síntese de anandamida........................................................... 18

1.4.3 – Inativação e liberação de anandamida.................................... 20

1.4.4 – Receptores e transdução de sinal........................................... 22

1.4.5 – Antagonismo sobre a ação do receptor endocanabinóide...... 26

1.4.6 – Ações no sitema nervoso ........................................................ 28

1.4.7 – Efeitos já descritos dos canabinóides no sitema endócrino e

metabólico ........................................................................................... 29

1.5 – Canabinóides e eixo tireoideano ................................................ 33

2 – OBJETIVO..................................................................................... 35

3 – MATERIAL E MÉTODOS.............................................................. 36

3.1 – Animais....................................................................................... 36

3.2 – Modelo hipertireoideo................................................................. 36

3.3 – Modelo hipotireoideo .................................................................. 36

3.4 – Experimentos in vivo................................................................... 37

3.4.1 – Administração de anadamida.................................................. 37

3.4.2 – Curso temporal do efeito de administração aguda de

anandamida em ratos eutireoideos ..................................................... 38

3.4.3 – Efeito da adminsitração aguda de anandamida em ratos

hiper- e hipotireoideos......................................................................... 39

3.4.4 – Administração do antagonista de anandamida – AM251........ 40

3.5 – Experimentos in vitro.................................................................. 41

3.6 – Radioimunoensaio para TSH ..................................................... 42

3.7 – Dosagem de T4 e T3 totais ........................................................ 43

3.8 – Análise estatística....................................................................... 44

4 – RESULTADOS OBTIDOS............................................................. 45

5 – DISCUSSÃO ................................................................................. 59

5.1 – Experimentos in vivo................................................................... 59

5.2 – Experimentos in vitro.................................................................. 65

6 – CONCLUSÃO................................................................................ 68

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................. 69

1 – INTRODUÇÃO

Os hormônios secretados pela glândula tireóide são importantes

para o crescimento e desenvolvimento normal dos mamíferos. Quando

adultos, os hormônios tireoideanos, tiroxina (T4) e triiodotironina (T3),

mantêm os níveis metabólicos estáveis através da regulação dos gastos

celulares de oxigênio, do peso corpóreo e do metabolismo intermediário.

A secreção tireoideana é estimulada pelo eixo hipotálamo-hipófise,

através do hormônio liberador de tireotrofina (TRH) e da tireotrofina

(TSH), respectivamente. Agindo em conjunto com o sistema nervoso

simpático, a atividade do eixo neuroendócrino hipotálamo-hipófise-

tireóide desempenha um papel central na regulação do metabolismo

corpóreo (revisão em Pinkney et al., 1998). Os endocanabinóides,

também têm um importante papel no controle do balanço energético e

controle do peso corpóreo (Di Marzo & Matias, 2005) e as interações

entre o eixo hipotálamo-hipófise-tireóide e os endocanabinóides são o

objeto do presente estudo.

Efeitos dos canabinóides sobre a função tireoideana foram

primeiramente descritos em 1965, quando experimentos com extrato de

Marijuana mostraram uma diminuição na captação e liberação de iodeto

marcado radioativamente em tireóide de ratos (Brown & Dobs, 2002).

Posteriormente, verificou-se que poderiam ser revertidos pela

administração exógena do hormônio estimulador da tireóide, sugerindo

existir um sítio de ação hipotalâmico/hipofisário para o principal agente

ativo da Marijuana denominado delta-9-tetrahidrocanabiol (THC) (revisão

em Brown & Dobs, 2002). A caracterização (Devane et al., 1988) e a

clonagem molecular (Matsuda et al., 1990) do receptor canabinóde tipo

1, denominado CB1, no sistema nervoso central de mamíferos

corroboraram a possibilidade de uma ação da THC sobre o eixo

tireoideano via hipotálamo.

Em 1992, Devane e colaboradores, mostraram a existência de uma

molécula de aracdoniletanolamida, denominada anandamida, sintetizada

endogenamente com afinidade pelos receptores CB1. Finalmente,

Gonzalez e colaboradores (2000) demonstraram a expressão do RNAm

para CB1 na hipófise anterior de ratos, tornando possível a hipótese de

ação da anandamida sobre o eixo tireoideano, via hipófise anterior.

Portanto, nós nos propomos neste trabalho, a investigar a ação

sistêmica da anandamida sobre a secreção de TSH em animais eu-,

hipo- e hipertireoideos, assim como sua ação local, a partir da incubação

de suas adenohipófises com anandamida.

1.1 – Hormônio estimulador da tireóide (TSH)

O hormônio estimulador da tireóide, ou tireotrofina, é o

principal regulador da secreção dos hormônios tireoideanos. É

sintetizado na adenohipófise e pertence a uma família composta por

outros hormônios glicoprotéicos, como o hormônio folículo-estimulante

(FSH) e o hormônio luteinizante (LH) (Larsen et al., 2007).

1.1.1 – Aspectos históricos

A história do TSH é extremamente antiga e tem início com as

observações feitas por Niépece, em 1851, de um controle exercido pela

glândula hipófise sobre a tireóide (citado em Morley, 1981).

Aron e colaboradores foram os primeiros a postular um controle

por retro-alimentação entre a hipófise e a tireóide. A terminologia

utilizada atualmente foi estabelecida por Hoskins em 1949. Até então, o

TSH era denominado como “substância estimuladora da tireóide” (citado

em Morley, 1981).

Por volta da metade da década de 1960 o TSH foi purificado e, no

início da década seguinte, foi determinada a seqüência primária de

aminoácidos das subunidades do TSH (revisão em Grossmann et al.,

1997). Somente no final da década de 1980 foi atingida a clonagem dos

genes codificadores das subunidades α e β do TSH, assim como do seu

receptor, possibilitando um enorme avanço nos estudos sobre a

estrutura, regulação e ação do TSH (revisão em Weintraub et al., 2001).

1.1.2 – Características gerais

Com peso molecular de 28 a 30kDa, o TSH é uma glicoproteína

sintetizada e secretada a partir de células basófilas denominadas

tireotrofos, localizadas na adenohipófise. Os tireotrofos perfazem cerca

de 5% do total de células da adenohipófise e encontram-se

predominantemente na região ântero-medial da glândula (Morley, 1981).

O TSH é composto por duas subunidades distintas, glicosiladas,

ligadas não-covalentemente e denominadas alfa e beta. Quando livres,

ambas as subunidades não apresentam atividade. A subunidade alfa do

TSH apresenta a mesma seqüência da subunidade alfa das

gonadotrofinas (FSH e LH) com 92 aminoácidos e peso molecular de

aproximadamente 14kDa. A subunidade beta, por sua vez, com 118

aminoácidos e peso molecular aproximado de 15KDa, é estruturalmente

singular e responsável pela especificidade biológica e imunológica do

hormônio (Grossmann et al., 1997).

A molécula de TSH contém carboidratos ligados à seqüência

peptídica, nos resíduos de asparagina, que perfazem aproximadamente

15 a 22% de seu peso molecular (revisão em Morley, 1981). Estas

cadeias glicídicas são importantes para determinar a meia-vida do

hormônio até sua distribuição e os mecanismos de depuração que

modulam seus níveis na circulação (Weintraub et al., 2001).

O gene para o receptor de TSH (TSHR) foi clonado em 1989 e

codifica um peptídeo de 744 aminoácidos com peso molecular de

aproximadamente 100kDa. Pertencente à família dos receptores

acoplados à proteína G estimulatória, sua ligação com o TSH ativa a

enzima adenilato-ciclase, que, por sua vez, aumenta a concentração

intracelular de AMPc (adenosina monofosfatada cíclica) que é capaz de

ativar o sistema da via sinalizadora da Proteína Cinase A (PKA). Além

disso, a ligação do TSH com seu receptor pode ativar a via da

Fosfolipase C (PLC) (Nagayama & Nagataki, 1994).

As ações do TSH ocorrem sobre o funcionamento e crescimento

da glândula tireóide. Entretanto, a presença de receptores para TSH em

outros tecidos e tipos celulares sugere uma atividade extra-tireoideana

para este hormônio, porém, ainda está pouco esclarecida (revisão em

Weintraub et al., 2001).

As principais ações do TSH sobre a atividade tireoideana são:

promover a captação e organificação do íon iodeto, estimular a produção

de tireoglobulina e a secreção dos hormônios tireoideanos. Sobre o

crescimento glandular, o TSH promove hipertrofia e hiperplasia dos

tireócitos (Weintraub et al., 2001).

Jordan e colaboradores (1980) demonstraram que a secreção de

TSH, em ratos, apresenta uma variação circadiana ao longo de 24 horas.

Esta variação é caracterizada por um pico máximo de secreção no final

da manhã (entre 11 e 12 horas), enquanto o nadir ocorre no início da

noite, aproximadamente por volta das 20 horas. A amplitude desta

variação é de aproximadamente 34% ao longo de um dia.

Em seres humanos, a secreção de TSH apresenta um padrão

circadiano com seu zênite e nadir caracterizados por um pico máximo no

início da madrugada e um mínimo de secreção ao fim da tarde,

respectivamente. Além disso, a secreção de TSH obedece a um padrão

pulsátil com 2 a 6 horas de intervalo entre os picos que, durante a noite,

aumentam de freqüência e amplitude (revisão em Weintraub, et al.,

2001).

1.2 – Eixo hipotálamo-hipófise-tireóide

A regulação da atividade sintética e secretora da glândula tireóide

é exercida principalmente através do TSH e da disponibilidade de iodeto

no organismo que, por sua vez, é controlada basicamente através da

ingestão de iodo. Já a secreção e a síntese do TSH são reguladas

principalmente pelo estímulo do hormônio liberador de tireotrofina (TRH)

e pela inibição produzida pelos hormônios tireoideanos (Fig. 1). Há ainda

a regulação local (parácrina/autócrina) apresentada adiante (revisão em

Scalon, 2001).

Fig. 1 – Esquema de regulação do eixo tireoidenao. SNC (Sistema Nervoso Central);

TRH (Hormônio Liberador de Tireotrofina); TSH (Tireotrofina); EGF (Fator de

Crescimento Epidermal); SP (Substância P); NB (Neuromedina B); NT (Neurotensina);

IL-1 (Interleucina –1) (adaptado de Pazos-Moura et al., 2003).

1.2.1 – Hormônio liberador de tireotrofina (TRH)

Embora a existência do TRH tenha sido primeiramente sugerida no

início da década de 1950, somente 15 anos mais tarde foi observado que

extrato hipotalâmico porcino apresentava capacidade de estimular a

secreção de TSH (revisão em Scalon, 2001).

O TRH é um tripeptídeo (piroglutamil-histidil-prolinamida) que,

como outros peptídeos mais complexos, é o resultado de clivagem pós-

traducional de uma molécula precursora maior. Tanto o TRH como sua

molécula precursora, denominada pró-TRH, são encontrados no corpo

celular de neurônios do núcleo paraventricular – PVN (revisão em

Scalon, 2001).

A ação direta dose-dependente do TRH sobre a síntese e liberação

de TSH pelos tireotrofos é bem conhecida em estudos in vivo e in vitro. A

via de acesso do TRH para atingir os tireotrofos na adenohipófise se dá

através de sua liberação na circulação porta-hipofisária localizado na

eminência média.

O receptor de TRH (TRHR) pertence à família de receptores

acoplados à proteína G. Neste sistema, a ligação do TRH ao seu

receptor promove a ativação da fosfolipase C (PLC) que, via

diacilglicerol, ativa a proteína cinase C (PKC), enquanto através do

inositol 1,4,5-trifosfato, ocorre rápido aumento de cálcio (Ca

)

intracelular, o qual também ativa a PKC (revisão em Scalon, 2001).

A atividade dos neurônios que sintetizam TRH é influenciada ao

menos por dois fatores principais: aferências nervosas e pela

concentração dos hormônios tireoideanos. Enquanto vias aferentes

noradrenérgicas têm efeito estimulatório sobre a secreção de TRH, vias

mediadas por opiáceos endógenos têm efeito inibitório (Larsen et al.,

2007). Os hormônios tireoideanos, por sua vez regulam negativamente a

transcrição do gene codificador para TRH, assim como a secreção do

hormônio maduro (Hollenberg et al., 1995).

1.2.2 – Hormônios tireoideanos

Em seres humanos, a glândula tireóide secreta aproximadamente

vinte vezes mais T4 do que T3. Entretanto, uma quantidade substancial

de T4 é convertida a T3 em outros tecidos dando origem ao T3 sérico.

Esta conversão é catalisada pelas enzimas desiodase tipo I (D1) e/ou

tipo II (D2). A enzima desiodase do tipo III (D3) é responsável pela

desiodação no anel interno das iodotironinas originando rT3 a partir de

T4 e 3-3’T2 a partir de T3. A distribuição das desiodases é bastante

ampla e podem ser citados como exemplos de tecidos que expressam

D1: o fígado, o rim e a tireóide. A isoforma D2 ocorre em abundância na

hipófise, no tecido adiposo marrom e no cérebro (revisão em Bianco &

Kim, 2006).

Aproximadamente 99,98% do T4 e 99,7% do T3 circulam ligados a

proteínas plasmáticas que incluem a globulina ligadora de tiroxina (TBG),

a transtiretina (TTR) e a albumina, enquanto uma pequena fração

encontra-se ligada à lipoproteínas (Larsen et al., 2007). Desta forma, em

seres humanos, concentrações da ordem de 21 picomoles de T4 e 6

picomoles de T3 encontram-se livres e, portanto, com capacidade de

ligar-se aos seus receptores (revisão em Stockigt, 2001).

Pela característica lipofílica dos hormônios tireoideanos, admitia-se

que sua entrada no meio intracelular ocorresse por difusão, entretanto,

atualmente sabe-se que existem transportadores específicos para T3 e

T4 com relevante importância fisiológica. Entre os mais importantes

encontra-se o MCT8, que é um transportador aminoácido do tipo T,

pertencente à família de transportadores monocarboxilados e facilita o

transporte de T4, rT3 e T3. Há ainda, o transportador denominado

OATP1C1, específico para T4 e petencente à família de polipetídeos

transportadores de ânion orgânico (Larsen et al., 2007). A maioria dos

efeitos fisiológicos dos hormônios tireoideanos é mediada via receptores

nucleares de alta afinidade denominados de receptor de hormônio

tireoideano (TR). Existem dois genes descritos que codificam os

receptores para hormônios tireoideanos denominados de TRα e TRβ

(revisão em Jameson, 2001). O T3 apresenta atividade biológica

consideravelmente maior do que o T4 e sua ligação com o receptor

nuclear de hormônio tireoideano tem afinidade de 10 a 15 vezes maior do

que a afinidade pelo T4 (revisão em Jameson, 2001).

Os receptores de hormônios tireoideanos, α e β, são codificados

por genes distintos localizados, em seres humanos, nos cromossomos

17 e 3, respectivamente. Em mamíferos, o rearranjo alternativo do

transcrito primário para o gene TRα resulta em, ao menos, dois produtos

protéicos distintos denominados TRα1 e TRα2. Em contraste, o rearranjo

alternativo do transcrito primário para o gene TRβ produz três formas

variantes, denominadas TRβ1, TRβ2 e TRβ3 (Cheng, 2005).

Estes receptores nucleares agem em genes específicos através de

seqüências nucleotídicas denominadas Elementos Responsivos ao

Hormônio Tireoideano (TRE). Um grande número de proteínas

adicionais, denominadas fatores de transcrição, participa na ação dos

receptores de hormônios tireoideanos, estimulando a transcrição gênica

de diferentes genes (denominadas coativadores) ou reprimindo a

atividade transcricional de diferentes genes (denominadas co-

repressores), ainda que no mesmo tecido (Cheng, 2005).

Em geral, as isoformas α e β dos receptores dos hormônios

tireoideanos são amplamente distribuídas, porém com padrões de

expressão distintos. A isoforma α1é predominantemente expressa no

coração, tecido ósseo e no cérebro, enquanto a isoforma β1 é mais

abundante no fígado, rim e tireóide. A expressão da isoforma β2 é

expressa na hipófise, hipotálamo, retina e ouvido interno, enquanto a

expressão da isoforma β3 ocorre principalmenteno coração e no rim

(Cheng, 2005).

Os hormônios tireoideanos exercem efeitos em virtualmente todos

os tecidos e suas ações fisiológicas podem ser divididas em três

categorias: efeitos sobre o desenvolvimento celular, sobre a

diferenciação celular e efeitos sobre as vias metabólicas.

Alguns dos mais importantes efeitos dos hormônios tireoideanos

ocorrem durante o desenvolvimento fetal e durante a primeira infância.

Muitos destes efeitos não podem ser revertidos por um tratamento

posterior a períodos denominados “janelas do desenvolvimento”,

indicando que estes efeitos dependem da combinação com outros

fatores de diferenciação que podem não estar disponíveis em estágios

posteriores (revisão em Jameson, 2001).

Em adultos, os efeitos dos hormônios tireoideanos são

manifestados por ações que envolvem não apenas consumo de oxigênio,

mas também o metabolismo de proteínas, carboidratos, lipídios e

vitaminas. Os hormônios tireoideanos também podem alterar as taxas de

síntese e degradação de outros hormônios e fatores de crescimento,

podendo, assim, influenciar outras vias endócrinas (revisão em Jameson,

2001).

A principal regulação da síntese e secreção de TSH ocorre através

de retroalimentação negativa pelos hormônios tireoideanos na

adenohipófise. Além de diminuir o número de receptores para TRH nos

tireotrofos (DeLean et al., 1977), a expressão do RNAm codificador das

subunidades alfa e beta do TSH pode ser inibida, quase que

completamente, pelos hormônios tireoideanos, mesmo frente ao efeito

estimulatório do TRH (Gurr & Kourides, 1985). Este efeito inibitório é

exercido em grande parte pelo T3 formado a partir do T4 pela enzima

desiodase tipo 2 presente na adenohipófise (Larsen et al.,1981).

Além da adenohipófise, o próprio hipotálamo é um dos locais sobre

o qual os hormônios tireoideanos têm efeito inibidor. Assim, nos

neurônios do PVN, responsáveis pela síntese e secreção de TRH, os

hormônios tireoideanos inibem a expressão de RNAm codificador de pró-

TRH (Segerson et al., 1987).

1.3 – Regulação da síntese e secreção de TSH

1.3.1 – Alterações da concentração sérica de TSH

A concentração sérica de TSH pode apresentar-se anormalmente

alterada em situações de hipo- ou hipertireoidismo.

A diminuição da concentração de TSH pode ser causada

basicamente por aumento da concentração circulante de hormônios

tireoideanos, denominado hipertireoidismo primário, ou sem o

envolvimento dos hormônios tireoideanaos, denominado hipotireoidismo

central. Enquanto o aumento da secreção de hormônios tireoideanos

pode ser mais facilmente diagnosticado, o hipotireoidismo central pode

ser etiologicamente subdividido em hipotireoidismo central secundário,

quando há deficiência de TSH de origem hipofisária, ou hipotireoidismo

central terciário, quando ocorre deficiência na secreção de TRH

hipotalâmico (revisão em Weintraub et al., 2001).

A situação oposta é o aumento na concentração de TSH que pode

ser causada, basicamente, pela diminuição ou ausência da inibição

causada pelos hormônios tireoideanos na hipófise e no hipotálamo, ou

devido ao aumento da atividade do próprio tireotrofo. A causa mais

comum de aumento de TSH é o hipotireoidismo primário devido à lesão

tireoideana. Tumores hipofisários que secretam TSH (adenoma

hipofisário secretor de TSH) são responsáveis por apenas 1% de todos

tumores encontrados na hipófise e são a causa mais comum de

hipertireoidismo secundário (revisão em Weintraub et al., 2001).

1.3.2 – Outros reguladores da secreção de TSH

Associada inicialmente à inibição do hormônio do crescimento, o

tetrapeptídeo somatostatina mostrou-se também capaz de inibir a

liberação de TSH in vivo e in vitro, através do aumento da proteína G

inibitória. Tal efeito encontrou confirmação no aumento da concentração

sérica de TSH quando a somatostatina endógena foi imunobloqueada. A

transcrição da subunidade β de TSH também é inibida pela dopamina e

pelo seu agonista, bromocriptina, via inibição da adenilatociclase. Tanto a

dopamina como a bromocriptina também inibem os picos noturnos e

diminuem sua amplitude de secreção. De maneira semelhante à

somatostatina, estes efeitos encontraram confirmação quando os

receptores de dopamina foram bloqueados pela metoclopramida (revisão

em Larsen et al., 2007).

Resultados obtidos com experimentos que investigaram a

influência das vias alfa-adrenérgicas sobre a atividade do eixo

tireoideano evidenciaram um efeito tônico e estimulatório destas vias

sobre a secreção de TSH. Em situações características de ativação alfa-

adrenérgica, como o frio ou a hipovolemia, o aumento da secreção de

TSH seria mediado por neurônios responsivos às terminações alfa2-

adrenérgicas localizados em neurônios secretores de TRH no PVN

(Moura & Moura, 2004).

As informações acerca dos efeitos dos hormônios sexuais sobre a

secreção de TSH são conflitantes. Apesar disto, aguardando a

publicação de mais trabalhos esclarecedores, o que se sabe é que a

administração de estrogênio em mulheres pós-menopausa causa o

aumento da secreção de TSH. Em ratas ovariectomizadas, o estrogênio

aumenta o conteúdo hipofisário de TSH e a intensidade da resposta ao

estímulo causado pelo TRH quando administrado em doses fisiológicas,

mas não quando em doses farmacológicas. Neste último caso, o que

observa-se é exatamente o contrário (Santos, 1995). Nenhum efeito foi

observado após a administração de progesterona em ratas castradas

(Moreira et al., 2000). Em relação ao efeito da testosterona, após sua

administração em ratos castrados, observa-se aumento na secreção de

TSH (Borges et al.,1998)

É conhecida a influência do estresse agudo sobre o eixo

tireoideano suprimindo o TSH sérico, apesar da concomitante diminuição

de triiodotironina sérica. O cortisol é o principal hormônio relacionado ao

estresse e inibe agudamente a secreção de TSH (Azukizawa et al.,

1979).

A leptina é um hormônio secretado principalmente pelos adipócitos

que aumenta o gasto energético e diminui a ingestão de alimentos

(Ahima et al., 2000). Durante o jejum, a supressão de TSH e da liberação

de TRH, apesar da diminuição dos hormônios tireoideanos, associa-se à

diminuição da leptina sistêmica, cuja administração pode reverter esta

supressão da função tireoideana. Tanto em ratos alimentados

eutireoideos, como em hipertireoideos, a administração aguda sistêmica

de leptina aumenta a secreção de TSH (Ortiga-Carvalho et al., 2002;

Veiga et al., 2004). Como a leptina é produzida na adenohipófise

(Morash et al., 1999), propôs-se somar à regulação exercida pela leptina

sistêmica um papel regulador parácrino/autócrino sobre a secreção de

TSH. Interessantemente, a incubação de hemi-adenohipófises dos

mesmos modelos animais na presença de leptina provoca uma

inesperada diminuição da secreção de TSH, resultado que é confirmado

pelo aumento na secreção de TSH durante a incubação de hemi-

adenohipófises dos mesmos modelos com antisoro anti-leptina (Ortiga-

Carvalho et al., 2002; Veiga et al., 2004).

Além de estimular fortemente o apetite, o neuropeptídeo Y (NPY)

inibe a secreção de TSH in vivo e este efeito, aparentemente, dá-se

através da modulação hipotalâmica sobre o TRH, uma vez que inúmeras

fibras secretoras de neuropeptídeo Y originadas no núcleo arqueado

projetam-se para neurônios secretores de TRH no núcleo paraventricular

(Chowdhury et al., 2004).

Finalmente, em relação a moduladores associados à situação

nutricional, há estudos que relatam que o Transcrito Regulado por

Anfetamina e Cocaína (CART) diminui a secreção de TSH em cultura de

células hipofisárias (Baranowska et al., 2003). Já a orexina B,

diferentemente da orexina A, estimula a secreção de TSH quando

injetada no terceiro ventrículo (Jones et al., 2001).

Apesar de, em seres humanos, os efeitos da interleucinas sobre a

função tireoideana não estarem totalmente claros, em ratos, há

evidências de que tanto a interleucina-1, quanto a interleucina-6 e o Fator

de Necrose Tumoral (TNF) inibem a secreção de TSH (revisão em

Larsen et al, 2007).

Substâncias sintetizadas localmente na hipófise e, possivelmente

no hipotálamo, assim como seus receptores, têm sido associados a

estudos realizados com a glândula isolada e os resultados obtidos, por

sua vez, sugerem um possível e relevante papel sobre a regulação local

de TSH. Entre tais substâncias encontram-se a leptina, a substancia P, o

neuropeptídeo Y, galanina, opióides endógenos, fatores de crescimento,

citocinas, peptídeos bombesina-símiles, entre outros (revisão em Pazos-

Moura et al, 2003).

Como regulador local da secreção de TSH destaca-se a

neuromedina B. Encontrada em grande concentração na hipófise, que

expressa seus receptores e onde ocorre sua síntese, em ratos, só foi

detectada nos tireotrofos. Há uma relação direta entre a concentração

sérica de hormônios tireoideanos e de neuromedina B hipofisária; e uma

relação inversa entre neuromedina B e análogos da somatostatina que

inibem o TSH, como por exemplo, o octeotride. Situações experimentais

como o jejum e o diabetes mellitus, que se associam à redução da

liberação de TSH, apresentam elevação na concentração de

neuromedina B hipofisária, enquanto o frio e a administração de TRH

inibem sua expressão hipofisária. Todas estas modificações que

evidenciam uma relação inversa entre as concentrações de neuromedina

B e de TSH, confirmam uma estreita relação entre estas duas

substâncias. A imunoneutralização da neuromedina B endógena

aumenta a secreção de TSH por hipófises isoladas, comprovando o seu

efeito fisiológico. Este efeito é bem maior nas hipófises de animais

hipertireoideos, do que nas dos eutireoideos e está ausente nas hipófises

de animais hipotireoideos, mostrando que o aumento da neuromedina B,

que ocorre no hipertireoidismo, pode ter um papel na inibição do TSH,

nesta situação (revisão em Pazos-Moura et al, 2003). Em camundongos

knockout para receptores de neuromedina B, o TSH sérico basal

encontra-se ligeiramente elevado, mas a resposta do TSH ao TRH é

muito maior que nos animais selvagens (Oliveira et al., 2006).

1.4 – Anandamida

1.4.1 – Aspectos gerais e históricos

Preparações a partir de Cannabis sativa foram amplamente

utilizadas por seres humanos tanto para propósitos terapêuticos como

ritualísticos na antiguidade. Na China, local onde encontram-se os mais

antigos registros arqueológicos da relação entre seres humanos e a

planta de Cannabis sativa, há uma lenda, segundo a qual, o imperador

chinês Sheng Nung há 3000 anos A.C, tinha um abdômen transparente

que o permitia “ver” o efeito das plantas, e dentre estas, três plantas

medicinais eram consideradas as mais importantes para a cultura

daquela época, a éfedra, o ginseng e a Cannabis sativa (revisão em

Lambert & Fowler, 2005).

Denominada de “ma” ou “ta ma” em chinês, com significado de

“grande fibra” Cannabis sp. é descrita na farmacopéia chinesa desde 200

anos D.C., sendo utilizada por diferentes civilizações em uma variedade

de aplicações médicas, como por exemplo, a dor, estimulação do apetite,

náusea, febre, infecções e desordens ginecológicas. A primeira evidência

para o uso de Cannabis foi a descoberta de cinzas fossilizadas da planta,

junto ao corpo de uma mulher grávida em uma tumba próximo de

Jerusalém, no mesmo local moedas foram encontradas com datação de

315-392 anos D.C. (revisão em Lambert & Fowler, 2005).

Apesar do uso da Cannabis como agente terapêutico durante o

século XIX, sendo um dos seus proponentes o próprio médico particular

da rainha Victoria, Sir John Russel Reynolds, somente em 1964 ocorreu

a caracterização estrutural do principal princípio ativo responsável pelos

seus efeitos psicoativos da Cannabis. Gaoni & Mechoulam (1964)

identificaram o delta-9-tetrahidrocanabiol ou delta-1-tetrahidrocanabiol

(Fig. 2), dois nomes para a mesma molécula, dependendo do sistema de

numeração usado, cuja denominação química é (6αR,10αR)-6α,7,8,10α-

tetrahidro-6,6,9-trimetil-3-pentil-6H-dibenzo[b,d]piran-1-ol (revisão em

Lambert & Fowler, 2005).

Fig. 2 – Estrutura química da molécula delta-9-tetrahidrocanabiol (THC) (Lambert &

Fowler, 2005).

Até a década de 1980, o termo “canabinóide” representava um

grupo típico de diterpenos (C21) presentes na Cannabis sativa, assim

como seus ácidos carboxílicos, análogos e metabólitos. Apesar da

identificação do delta-9-tetrahidrocanabiol e de sua alta lipofilicidade, ou

seja, a possibilidade de atingir o meio intracelular de um grande número

de células, seu alvo celular não foi identificado por mais de 25 anos

(revisão em Lambert & Fowler, 2005).

Antes da identificação dos receptores canabinóides, vários ensaios

foram realizados em animais, sendo a maioria comportamental. Entre

alguns dos clássicos resultados, encontram-se a diminuição da

temperatura retal (hipotermia), a diminuição da locomoção causada pela

redução do campo de visão, a catalepsia no teste do “anel” ou da “barra”

e analgesia no teste da cauda (Martin, 1986).

Em 1988 estudos realizados por Devane e colaboradores

identificaram a presença de um receptor canabinóide no cérebro e, em

1990, foi divulgada a clonagem do receptor canabinóide (em rato) que

atua como um inibidor da adenilato-ciclase por acoplar-se a um membro

dos receptores acoplados à proteína G inibitória (Matsuda et al., 1990) e,

três anos mais tarde, um segundo receptor foi identificado com

homologia parcial, restrito às células do sistema imunológico (Munro et

al., 1993).

A nomenclatura atual destes dois receptores é CB1 e CB2,

respectivamente (Howlett et al., 2002). Com a identificação destes dois

receptores, deu-se inicio à busca por possíveis ligantes endógenos. Com

base no conceito de que o ligante endógeno apresentasse

liposolubilidade, dois metabólitos lipídicos foram isolados: o

aracdoniletanolamida, em extratos de cérebro de porco e batizado de

anandamida referindo-se aos termos “ananda” de origem sânscrita

significando felicidade e amida pela natureza química do composto e o 2-

aracdonoilglicerol (2-AG) (Fig. 3) (Devane et al.,1992).

Fig. 3 – Estrutura química da molécula de anandamida e 2-aracdonoilglicerol (adaptado

de Lambert & Fowler, 2005)

Além da anandamida e do 2-aracdonoilglicerol, vários outros

compostos endógenos têm sido isolados e compartilham a capacidade

de se ligar e ativar ao menos um dos dois receptores descritos. Estas

moléculas têm sido denominadas como endocanabinóides (Di Marzo et

al., 1999)

1.4.2 – Síntese de anandamida

Diferentemente dos transmissores clássicos como as monoaminas

e acetilcolina, os endocanabinóides não são armazenados, mas

sintetizados instantes antes de sua liberação, ou seja, sob demanda

(Fonseca et al., 2005).

A anandamida é formada pela clivagem de um precursor

fosfolipídico, o N-aracdonoil-fosfatidiletanolamida (NAPE). Este

precursor, por sua vez, é sintetizado pela enzima N-aciltransferase

(NAT), que catalisa a transferência do acido aracdônico a partir da

fosfatidilcolina para o grupamento fosfatidiletanolamina, requer a

presença de Ca

e é regulada por AMPc, que aumenta a atividade da

NAT pela fosforilização da proteína cinase A (Cadas et al., 1996;

Piomelli, 2003). A liberação da anandamida a partir da molécula de N-

aracdonoil-fosfatidiletanolamida é catalisada por uma fosfolipase

especifica denominada Fosfolipase D (PLD), recentemente clonada (Fig.

4) (Okamoto et al., 2004).

Fig. 4 – Via de síntese de anandamida (adaptado de Piomelli et al., 2003)

Esta enzima (PLD), não tem homologia com as fosfolipases D

conhecidas e é classificada como um membro da família da

metalohidrolase de zinco. Sua presença é abundante no cérebro, rins e

testículos. A atividade da fosfolipase D específica para síntese de

anandamida é regulada pela despolarização de membranas neuronais ou

pela ativação dos receptores ionotrópicos glutamato N-metil-D-Aspartato

(NMDA), pelos receptores nicotínicos α7 neuronais (Stella & Piomelli,

2001; Piomelli, 2003) ou pelos receptores metabotrópicos dos principais

neurotransmissores, incluindo a dopamina, o glutamato e a acetilcolina

(Giuffrida et al.,1999; Varma et al., 2001; Kim et al., 2002).

1.4.3 – Inativação e liberação de anandamida

A sinalização dos endocanabinóides é interrompida por um

processo que pode ser composto por dois passos que incluem o

transporte para o interior celular seguido pela hidrólise por dois sistemas

enzimáticos específicos, ou independentemente do transporte para o

meio intracelular. Ambos os passos exercem uma regulação fina dos

níveis de endocanabinóides nos tecidos, permitindo a rápida eliminação

da sinalização desencadeada por estas moléculas (Fonseca et al., 2005).

A captação de anandamida é mediada por um transportador que é

amplamente distribuído através de todo cérebro e funciona similarmente

a outros transportadores de lipídios facilitando a captação de

anandamida passivamente (Beltramo et al., 1997; Giuffrida et al., 2001);

apresenta especificidade e é saturável, podendo ainda ser

especificamente bloqueado por drogas como AM404, UCM707 e

AM1172 (Fig. 5) (Fonseca et al., 2005).

Fig. 5 – Moléculas com efeito inibitório sobre o transportador de anandamida ( Fonseca

et al., 2004.

A degradação enzimática composta por duas enzimas específicas

incluí a Hidrolase de Amida de Ácidos Graxos (FAAH) e a Lípase de

Monoacilglicerida (MAGL). A FAAH pertence à família das hidrolases de

serinas e é uma enzima amplamente distribuída através do corpo com

altas concentrações no cérebro e no fígado. A FAAH pode degradar

muitas amidas de ácidos graxos, incluindo aciletanolaminas como a

anandamida. Embora a FAAH possa degradar o 2-aracdonoilglicerol, a

principal enzima responsável pela degradação desta molécula de

monoglicerídeo é a MAGL (Fig. 6) (Cravatt et al., 1996; Dinh et al., 2002).

Fig. 6 – Esquema de inativação da anandamida (Piomelli et al., 2003).

Ainda não há um consenso estabelecido sobre o processo de

liberação de anandamida (Lambert & Fowler, 2005). Estudos mostram

que a anandamida é encontrada em meio de incubação com neurônios e

no fluído intersticial cerebral, corroborando sua difusão facilitada através

das membranas (Di Marzo et al., 1994; Giuffrida et al., 1999; Walker et

al., 1999). Estudos fisiológicos trazem a interessante constatação de que

a anandamida é capaz de ativar receptores CB1 presentes nas

adjacências de axônios pós-sinápticos, podendo difundir-se até 20 µm a

partir de sua célula de origem antes de ser degradada (Wilson & Nicol,

2001).

O fato de que a membrana plasmática contenha moléculas

precursoras da síntese de anandamida indica que esta possa deixar a

célula em que é sintetizada assim que é formada. Proteínas

extracelulares ligadoras de lipídios, como por exemplo, lipocalinas que

são altamente expressas no cérebro, podem facilitar a saída imediata da

anandamida recém sintetizada e auxiliar sua chegada às células-alvo.

Embora este cenário aguarde confirmação, ele pode ser um reflexo do

que ocorre na corrente sanguínea, onde o transporte da anandamida

seria feito, possivelmente, pela sua ligação reversível com a albumina

sérica (Beuckmann et al., 2000; Bojensen & Hansen, 2003).

1.4.4 – Receptores e transdução de sinal.

A existência de um receptor para canabinóide no cérebro,

denominado CB1, foi primeiramente demonstrado em 1988 (Devane et

al., 1988). Matsuda e colaboradores (1990) isolaram e clonaram o gene

codificante para o receptor CB1 no córtex cerebral de rato.

Subseqüentemente, Gerard e colaboradores (1991) clonaram o receptor

CB1 em seres humanos e observaram que sua seqüência apresentava

alta similaridade com o receptor CB1 identificado em rato.

Em 2000, Gonzalez et al., demonstraram a expressão do RNAm

para CB1 na hipófise anterior de ratos, tornando possível postular uma

ação da anandamida sobre a função tireoideana. Além da localização no

sistema nervoso central, nos neurônios periféricos e em células gliais, o

RNAm para o receptor CB1 foi também descrito em diversos outros

tecidos de seres humanos, felinos, ratos, camundongos, aves, anfíbios e

peixes (Pertwee, 2001), sendo a homologia bastante preservada ao

longo do processo evolucionário com identidade de aproximadamente 97

– 99% dos aminoácidos entre receptores CB1 de rato, camundongo e

seres humanos (Howlett et al., 1990). Entretanto, o nível de CB1 em

tecidos periféricos de seres humanos, é muito menor do que no sistema

nervoso central.

Logo após a descoberta do receptor CB1, um outro receptor

canabinóide, expresso perifericamente e denominado CB2, foi descrito

em um banco de cDNA proveniente de uma linhagem celular derivada de

leucemia humana promielocítica (Munro et al., 1993).

A forma CB2 do receptor canabinóide, também conhecido como

receptor canabinóide periférico, é expressa em macrófagos/monócitos da

zona marginal do baço, no córtex de linfonodos e na corona nodular das

placas de Peyer. A expressão dos níveis de RNAm para o receptor CB2

em células e tecido imunológicos é 10 a 100 vezes maior do que a

expressão do receptor CB1 nas mesmas células ou tecidos (Lynn &

Herkenham, 1994).

Uma particularidade em relação à anandamida é que seus efeitos

podem se dar através da mediação de outros sistemas, especialmente os

mediados pelos Receptores Vanilóides tipo 1 (VR1), tanto por

mecanismos diretos como pela ação dos metabólitos derivados da

lipoxigenase (Zygmunt et al., 1999). Baseado em sua homologia, estes

receptores podem ser agrupados com canais para cálcio, que permitem o

influxo transiente em função do potencial de ação, em terminais nervosos

sensoriais (Howlett & Mukhopadhyay, 2000).

A relação entre os receptores vanilóides e os canabinóides foi

primeiramente demonstrada em 1999 por Zygmunt e colaboradores,

quando reportaram a capacidade da anandamida de ativar os canais

VR1 expressos em células HEK293, podendo ser esta ativação

bloqueada pela capsazepina, antagonista de VR1.

O receptor CB1 é o mais abundante receptor acoplado à proteína

G inibitória, com densidades entre 10–50 vezes maior do que clássicos

neurotransmissores, como por exemplo, a dopamina ou receptores

opióides (Howlett et al., 1990).

Endocanabinóides exibem distintas propriedades de ligação e

atividade sobre os receptores CB1 e CB2. A anandamida comporta-se

como agonista parcial tanto do receptor CB1 como do CB2, mas com

afinidade muito maior pelo receptor do tipo CB1 (Hillard et al., 1999;

Howlett et al., 2002). A afinidade da anandamida aos receptores CB1 é

de 4 a 30 vezes maior do que nos receptores CB2. Por outro lado, o 2-

aracdonoilglicerol é agonista tanto do receptor CB1 como do CB2 e tem

menos afinidade do que a anandamida por ambos os receptores (Stella

et al., 1997; Howlett et al., 2002).

Ambos receptores canabinóides desencadeiam sistemas de

transdução de sinal similares. A ativação do receptor canabinóide foi

inicialmente descrita como inibidora da formação de AMPc, através de

seu acoplamento com proteína G inibitória (Devane et al., 1998). Como

em outros receptores acoplados à proteína G inibitória, a ativação do

receptor CB1 diminui a condutância ao Ca

e aumenta a condutância ao

. Há ainda resultados que descrevem a possibilidade de que o

acoplamento tanto de receptores CB1, como de receptores CB2, poderia

desencadear a ativação de cascatas sinalizadoras como a da Proteína

Cinase Ativada por Mitógeno (MAPK), a da Fosfatidilinositol 3-Cinase, a

Quinase de Adesão Focal (FAK), a sinalização via ceramida e a

produção de óxido nítrico. A ativação da ERK e da FAK pode ser

simulada por inibidores de cinases dependentes de AMPc e é perdida

quando exposta a seus análogos (Fig. 7) (Derkinderen et al., 2003;

Hoffman et al., 2003).

Devem existir importantes diferenças entre os efetores que

medeiam a sinalização entre os receptores CB1 e CB2, uma vez que a

transfecção do receptor CB2 em células CHO não apresenta efeito sobre

as correntes iônicas de cálcio e potássio, apesar de se manter a

capacidade de inibir a adenilato-ciclase (Felder et al., 1995).

Outros estudos revelam que, sob certas condições, os receptores

CB1 podem estimular a formação de AMPc ao acoplar-se com proteína

G estimulatória (revisão em Reggio, 2002). Tais observações ilustram o

conceito básico de que receptores acoplados à proteína G podem agir

através de vários efetores distintos, e cada sistema efetor pode estar

designado para propósitos específicos (Howlett, 2004).

Fig. 7 – Esquema das principais vias sinalizadoras desencadeadas pelo receptor CB1.

∆9-THC (delta-9-tetrahidrocanbinol); AC (Adenilato Ciclase); Gi (Proteína G Inibitória);

Gs (Proteína G estimulatória); ATP (Adenosina Trifosfato); cAMP (Adenosina

Monofosfato Cíclica) (Axelrod & Felder, 1998).

1.4.5 – Antagonismo sobre ação do receptor endocanabinóide.

Os estudos que vêm caracterizando as propriedades dos

receptores endocanabinóides também propiciaram a descoberta de

diversas moléculas que antagonizam o seu efeito ou agem como

“agonistas inversos” (Pertewee, 2005). Este conceito pode ser

compreendido como a capacidade do ligante desencadear o efeito

inverso ao do agonista quando ligado ao receptor. Alguns exemplos das

várias moléculas já descritas como antagonistas dos receptores

endocanabinóides são apresentadas na figura abaixo (Fig. 8)

Fig. 8 – Principais antagonistas dos receptores endocanabinóides (Lambert & Fowler,

2005).

O antagonista denominado [N-(piperidina-1-il)-5-(4-iodofenil)-1-

(2,4-diclorofenil)-4-metil-lH-pirazol-3-carboxamida], ou simplesmente

AM251 é um agonista inverso que age preferencialmente via receptor

CB1 (Gatley et al., 1996).

Alguns resultados, obtidos com efeitos do antagonista AM251 via

receptor CB1, também reforçam o envolvimento deste receptor com o

metabolismo energético e com o sistema nervoso central. A

administração de AM251 suprime a ingestão de alimentos em ratos

(McLaughlin et al., 2003).

Outro antagonista CB1, o SR141716A, também conhecido como

rimonabant, foi recentemente introduzido na terapêutica para tratamento

de síndrome metabólica, portanto, é relevante conhecer os efeitos

crônicos destes antagonistas CB1 sobre a função tireoideana.

1.4.6 – Ações no sistema nervoso

Após a descoberta da anandamida e de suas propriedades

canabimiméticas, os primeiros passos para se estabelecer possíveis

ações no sistema nervoso central foram dados no sentido de descobrir

os mecanismos de sua biossíntese e degradação. Estudos realizados

com ratos mostraram que a síntese e liberação de anandamida em níveis

basais no cérebro eram baixas se comparados à maioria dos

neurotransmissores. Apesar disso, como outros clássicos

neurotransmissores, a anandamida é liberada após despolarização da

membrana neuronal e influxo do cátion cálcio. Sua inativação ocorre

através de sua captação seguida por mecanismos de degradação

enzimática (Di Marzo et al., 1998).

Desde que descrita a expressão de CB1 no sistema nervoso

central de rato, vários estudos in vivo e in vitro têm reforçado o conceito

de que as principais funções dos endocanabinóides, ou do sistema

endocanabinóide, ocorram pelo controle sobre a atividade neural, em

geral diminuindo-a. Soma-se o fato de que muitos dos efeitos exercidos

por exo- e endocanabinóides têm encontrado explicação graças à

presença de seus receptores em circuitos neuronais específicos (Pazos

et al., 2005). A distribuição do receptor CB1 no cérebro de rato é, sem

dúvida, a melhor conhecida entre todas as espécies animais estudadas,

graças a resultados auto-radiográficos, imunohistoquímicos e de

hibridização in situ (Herkenham et al., 1991; Tsou et al., 1998a; Mailleux

& Vanderhaeghen, 1992). Uma notável característica destes receptores é

sua atípica localização pré-sináptica durante diferentes estágios de

desenvolvimento de regiões e circuitos nervosos específicos no sistema

nervoso central, como por exemplo, na formação de córtex, hipocampo,

núcleos da base e cerebelo, o que sugere que o sistema

endocanabinóide possa desempenhar um importante papel na

transmissão sináptica (Berrendero et al., 1998; Herkenham et al., 1991).

Além da grande expressão dos receptores canabinóides no

sistema nervoso central, há também a ampla distribuição de uma das

principais enzimas envolvidas na degradação da anandamida e do 2-

aracdonoilglicerol, a hidrolase de amida de ácido graxo (FAAH). Sua

expressão já foi demonstrada em neurônios piramidais corticais e

hipocampais, além de células de Purkinje (Tsou et al., 1998b). É

importante notar que a localizaçã da FAAH, diferentemente da dos

receptores CB1, é pós-sináptica em diferentes circuitos neuronais,

revelando um papel complementar distinto do padrão de distribuição dos

receptores CB1 (Egertova et al., 1998). Como ocorre com outros neuro-

moduladores endógenos, a anandamida pode ter um sistema especifico

de inativação, estando a FAAH envolvida com o seu processo de

remoção da fenda sináptica para sofrer hidrólise intra-celular (Pazos et

al., 2005).

1.4.7 – Efeitos já descritos dos canabinóides no sistema endócrino e

no metabolismo

Na década de 1960, o aumento dramático do uso casual de

Marijuana levantou questionamentos acerca dos potenciais efeitos

adversos sobre a saúde dos seres humanos. Em 1972, Harmon e

Aliapoulios realizaram o primeiro estudo clínico sobre o impacto do uso

de Marijuana no sistema endócrino, associando-o inicialmente à

ginecomastia. Investigações posteriores demonstraram que a Marijuana

através de seu componente bioativo o delta-9-tetrahidrocanabiol e a

própria anandamida exerciam diversos efeitos em modelos experimentais

de vários sistemas hormonais, incluindo gônadas, prolactina, hormônio

do crescimento e tireóide, além de interagir com o controle do balanço

energético (Brown & Dobs, 2002).

Os receptores CB1, presentes em núcleos hipotalâmicos

envolvidos com a regulação do apetite, são ativados após uma breve

restrição alimentar, o que sugere uma possível ação da anandamida

sobre a regulação dos níveis de mediadores orexígenos e anorexígenos

(Di Marzo et al., 2001). De fato, o nível do Hormônio Liberador de

Corticotrofina (CRH), que também exerce efeito anorexígeno através de

sua ação no núcleo hipotalâmico paraventricular, está elevado em

camundongos knock-out para o receptor CB1, o que sugere uma ação

inibitória da anandamida sobre a expressão de CRH (Cota et al., 2003).

Em outros estudos, a anandamida mostrou uma ação inibitória via

CB1 sobre a secreção do CART em várias regiões do hipotálamo

envolvidas com a ingestão alimentar (Osei-Hyiaman et al., 2005; Verty et

al., 2006). Com base em resultados em que os endocanabinóides

estimulam a liberação de neuropeptídeo Y (NPY) no hipotálamo, sugere-

se que o seu efeito orexígeno também possa ser parcialmente exercido

através deste mediador (Verty et al., 2006; Gamber et al., 2005), muito

embora, receptores CB1 não estejam co-localizados com neurônios

secretores de NPY (Cota et al., 2003). Tal constatação indica que

mecanismos multi-sinápticos são requeridos para que a ativação de

receptores CB1 estimule a liberação de NPY (Matias & Di Marzo, 2006).

Em relação ainda aos efeitos metabólicos dos canabinóides,

receptores tipo CB1 encontram-se presentes em tecidos periféricos

envolvidos com o controle da homeostase energética. Tais tecidos

incluem: o intestino, o fígado, o tecido adiposo branco, a musculatura

esquelética e o pâncreas (revisão em Matias & Di Marzo, 2006). Em

relação ao tecido adiposo branco, camundongos normais wild type têm

maior quantidade de massa adiposa e menor quantidade de massa

“magra” em comparação com animais knock-out para o receptor CB1. A

presença do receptor CB1 descrita no tecido adiposo branco está

acoplada à estimulação da atividade da enzima lipoproteína lípase. Tais

informações sugerem que o sistema endocanabinóide contribua para a

acumulação de gordura, agindo diretamente no tecido adiposo (Cota et

al., 2003).

No fígado, o receptor CB1 é expresso nos hepatócitos e estimula a

expressão de um importante fator de transcrição denominado Elemento

Ligante de Proteína 1c Reguladora de Esteróide (SREBP-1c), cujos os

alvos são a Acetil-Carboxilase 1 e a Ácido Graxo Sintase (Osei-Hyiaman

et al., 2005).

Recentemente, os endocanabinóides mostraram-se envolvidos na

regulação dos níveis de insulina, assim como na captação e utilização de

glicose pelos tecidos. Em ilhotas de Langerhans isoladas foi demostrado

que a estimulação de receptores CB2 reduz a liberação de insulina,

enquanto a ativação sistêmica de receptores do tipo CB1 causa

intolerância à glicose in vivo (Juan-Pico et al., 2005).

A administração aguda de canabinóides interfeririu com o processo

normal de espermatogênese e diminuiu a concentração de testosterona

em ratos. Entretanto, em seres humanos, os resultados não são

consistentes (Brown & Dobs, 2002).

A administração aguda de delta-9-tetrahidrocanabiol em roedores

produziu significativa diminuição tanto das concentrações séricas de

testosterona como de gonadotrofinas devido à inibição dos pulsos

geradores de liberação de GnRH (Hormônio liberador de gonadotrofina)

(Murphy et al., 1998). Efeitos similares foram demonstrados em primatas.

Em macacos Rhesus, a administração de delta-9-tetrahidrocanabiol

causou redução de aproximadamente 65% nas concentrações séricas de

testosterona dentro de 1 hora (Smith et al., 1976). Já os efeitos crônicos

da administração de canabinóides são menos claros. Embora uma

diminuição dose-dependente do Hormônio Luteinizante (LH) seja

observada com a administração crônica de delta-9-tetrahidrocanabiol

(Collu et al., 1975), tal efeito mostra-se menos dramático do que o

observado com administração aguda (Symons et al., 1976) podendo

estar relacionado com o desenvolvimento de tolerância (Rosenkrantz &

Esber, 1980).

Os canabinóides, incluindo componentes da marijuana modulam a

atividade dos neurônios dopaminérgicos (Fernandez-Ruiz et al., 1992),

portanto alterando a secreção de prolactina. Estudos com modelos

animais demonstraram redução aguda nos níveis de prolactina após a

administração de delta-9-tetrahidrocanabiol, tanto em roedores como em

primatas, e mostraram uma redução na concentração sérica de

prolactina de 84% em macacas ovariectomizadas e de 74% em

macacos, 30 a 90 minutos após uma única injeção de delta-9-

tetrahidrocanabiol (Smith et al., 1979; Bromley & Zimmerman, 1976)

Os canabinóides alteram o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal

através da modulação exercida sobre a liberação de CRH tanto

diretamente, através de receptores CB1 presentes em neurônios

produtores de CRH no núcleo hipotalâmico paraventricular (Herkenham

et al., 1991), quanto indiretamente, por outras vias (Murphy et al., 1998).

Em vários estudos animais, a administração aguda de canabinóides

provocou aumento tanto do Hormônio Adrenocorticotrófico (ACTH), como

nos níveis de glicocorticóides, respeitando um padrão dose-dependente;

aparentemente, trata-se de um efeito mediado pelo aumento da secreção

de CRH (Puder et al., 1982; Jackson & Murphy, 1997; Rodriguez de

Fonseca et al., 1992). Roedores submetidos à administração de um

agonista do receptor CB1 denominado HU-210 apresentam significativa

ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, porém, em altas doses

observa-se diminuição de ACTH e aumento de glicorticóides, sugerindo

uma rápida resposta de retroalimentação negativa desempenhada pelos

glicocorticóides (Martin-Calderon et al., 1998). Entretanto, rapidamente

desenvolve-se tolerância a estes efeitos durante administração crônica

(Rodriguez de Fonseca et al., 1992).

Estudos com seres humanos mostram diferentes efeitos da

marijuana e dos componentes canabinóides sobre eixo hipotálamo-

hipófise-adrenal. Similarmente aos efeitos em animais, observa-se

aumento de cortisol sérico após a administração de marijuana (Cone et

al., 1986). Entretanto, em contraste com estes resultados, nenhuma

alteração foi observada no ritmo de secreção de cortisol durante

administração crônica de delta-9-tetrahidrocanabiol através do fumo de

marijuana (Dax et al., 1989).

Um efeito inibitório dos canabinóides sobre a secreção de

Hormônio do Crescimento (GH), mediado pela estimulação de liberação

de somatostatina, foi observado (Rettori et al., 1988). Diminuições

agudas nas concentrações séricas de GH têm sido observadas com a

administração de agonistas de receptores canabinóides CB1 (HU-210 ou

THC68) em ratos (Martin-Calderon et al., 1998). Há poucos estudos

investigando o efeito da marijuana e de outros canabinóides sobre a

secreção de GH em seres humanos. Benowitz e colaboradores (1976)

relataram que a administração oral de delta-9-tetrahidrocanabiol bloqueia

a resposta secretória de GH induzida por hipoglicemia provocada por

insulina. Efeitos sobre a dinâmica secretora de GH pelo uso crônico de

marijuana são desconhecidos (Brown & Dobs, 2002).

1.5 – Canabinóides e eixo hipotálamo-hipófise-tireóide

O efeito dos canabinóides sobre a função tireoideana foi

primeiramente descrito em 1965, quando experimentos in vivo com

administração de extrato de Marijuana em ratos mostraram diminuição

liberação de produtos tireoideanos radiomarcados (Miras, 1965).

A administração aguda de delta-9-tetrahidrocanabiol em roedores

reduziu significativamente as concentrações séricas de T3, T4 e TSH por

mais de 6 horas (Hillard et al., 1984; Nazar et al., 1981). As

concentrações séricas de T3 e de T4 podem ser normalizadas pela

administração exógena de TSH, sugerindo que, através de um sítio de

ação hipotalâmico/hipofisário para delta-9-tetrahidrocanabiol, a

diminuição do TSH circulante pudesse ser a causa primária da redução

no T3 e T4 séricos (Nazar et al., 1981; Lomax, 1970).

Entretanto, com a administração crônica de delta-9-

tetrahidrocanabiol, o efeito supressivo dos canabinóides observado

agudamente desaparece, o que sugere o desenvolvimento de tolerância

(Hillard et al., 1984). Não há dados acerca de efeitos dos canabinóides

sobre a função tireoideana em humanos.

Em relação ao efeito exercido pela administração exógena de TRH

sobre a secreção de TSH, a administração de delta-9-tetrahidrocanabiol

não produziu qualquer efeito (Hillard et al., 1984). Em 1998, Buckley e

colaboradores descreveram a presença de altos níveis de RNAm

codificador do receptor canabinóide CB1 nos estágios embriológicos

mais tardios do desenvolvimento da tireóide em ratos. Recentemente,

Porcella e colaboradores (2002) relataram a expressão do receptor CB1

em tireóide de ratos.

Assim, apesar de haver alguns estudos que investigaram o

envolvimento do delta-9-tetrahidrocanabiol através do receptor CB1

sobre a atividade tireoideana, nada se tem publicado acerca da ação da

anandamida, que é um ligante endógeno do receptor CB1 presente no

hipotálamo, na hipófise anterior e na própria tireóide.

Portanto, este trabalho propõe-se a contribuir para o entendimento

da ação do sistema endocanabinóide sobre a atividade do eixo hipófise-

tireóide, com foco sobre a secreção de TSH, T4 e T3.

2 – OBJETIVO

Geral:

Este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito in vivo e in vitro da

anandamida modulando a secreção de TSH no eu- hipo- e

hipertireoidismo.

Específicos:

Avaliar o efeito sistêmico agudo da anandamida sobre a

concentração sérica de TSH, T4 e T3 em animais eu- hipo- e

hipertireoideos.

Avaliar o efeito in vivo do antagonista de receptor canabinóide

AM251, sobre a secreção de TSH, T4 e T3 em animais eutireoideos.

Avaliar o efeito in vitro da anandamida sobre a responsividade de

explantes adenohipofisários de animais eutireoideos na secreção de

TSH.

3 – MATERIAL E MÉTODOS

Todos os protocolos experimentais foram previamente submetidos

e aprovados pelo Comissão de Avaliação da Utilização de Animais em

Pesquisa (CAUAP) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

3.1 – Animais

Foram utilizados ratos machos Wistar com, aproximadamente, 3

meses de idade e peso corpóreo entre 270 e 300g. Os animais foram

mantidos em ambiente controlado com ciclo claro/escuro de 12 horas

cada, temperatura em torno de 24

C e acesso à água e ao alimento ad

libitum.

3.2 – Modelo hipertireoideo

O modelo hipertireoideo foi obtido através da administração diária

de solução de tiroxina (T4 – L-Thyroxine, Sigma – USA) na dose de 10µg

para cada 100g de peso corpóreo, injetado subcutaneamente no volume

de 0,3mL, durante 6 dias. O T4 foi previamente solubilizado em solução

NaOH 0,05M e posteriormente diluído em solução salina obtendo-se uma

concentração final de NaOH de 0,004M.

3.3 – Modelo hipotireoideo

Para obtenção do modelo hipotireoideo, os animais foram tratados

com metimazol (MMI – Methimazole, Sigma – USA) que inibe a síntese

de hormônios tireoideanos, na concentração de 0,03% na água de beber

durante 21 dias.

3.4 – Experimentos in vivo

A primeira etapa consistiu em determinar o curso temporal do

efeito do endocanabinóide endógeno anandamida sobre a concentração

sérica de TSH em animais normais. Após esta etapa, os experimentos in

vivo direcionaram-se para os efeitos da anandamida sobre a

concentração sérica de TSH em animais hiper- ou hipotireoideos.

Finalmente, investigamos o efeito da administração do antagonista

seletivo de anandamida (AM251) sobre a concentração sérica de TSH

em animais normais.

3.4.1 – Administração de anandamida

Utilizou-se nos experimentos in vivo anandamida - (N-(2-

Hidroxietil)-5z,8z,11z,14z-eicosatetraenamida, (C22H37NO2),

proveniente da empresa Tocris Cookson Inc. (Missouri, USA), com peso

molecular de 347,54, fornecida pré-dissolvida em etanol anidro na

concentração de 5mg/mL. Minutos antes da administração, diluiu-se esta

solução na proporção de 1:150 em veículo composto por salina

(0,9%):propileno glicol:etanol na proporção de 2:1:1, respectivamente, de

modo que a concentração de anandamida injetada intraperitonealmente

foi de 0,02mg/Kg de peso corporal em 0,2mL.

Levando-se em consideração um volume sangüíneo de

aproximadamente 30mL para um rato de 300g, estimamos que esta dose

seja equivalente a uma molaridade circulante inicial de aproximadamente

9,7x10

-7

3.4.2 – Curso temporal do efeito de administração aguda de

anandamida em ratos eutireoideos

Para determinar o curso temporal do efeito da anandamida sobre a

concentração sérica de TSH em ratos eutireoideos, quatro grupos foram

utilizados.

Um grupo denominado controle (C) recebeu uma injeção de dose

de 0,2mL de veículo - salina (0,9%):propileno glicol:etanol na proporção

de 1:2:1, respectivamente, intraperitonealmente, enquanto três grupos

receberam uma injeção de 0,2mL de anandamida na dose 0,02mg/Kg de

peso corporal, por via intraperitoneal.

Os grupos que receberam anandamida foram sacrificados por

decapitação 0,5; 1 e 2 horas após a administração de anandamida, seu

sangue foi coletado a partir do tronco e imediatamente resfriado para

posterior centrifugação e armazenamento do soro a -20

O grupo que recebeu veículo teve seus animais reagrupados em

três subgrupos de mesmo n. Então, cada subgrupo com 1/3 dos animais

que receberam veículo, foi sacrificado por decapitação, imediatamente

após o sacrifício dos grupos que receberam anandamida nos diferentes

tempos (Fig. 9). Seu sangue foi coletado da mesma forma e recebeu o

mesmo tratamento que os grupos que receberam anandamida.

Fig. 9 – Esquema experimental com animais eutireoideos in vivo.

3.4.3 – Efeito da administração aguda de anandamida em ratos

hiper- e hipotireoideos

A dose, volume, solubilização e via de administração do veículo

para o grupo controle e da solução de anandamida para os grupos

experimentais hiper- ou hipotireoideos foram as mesmas previamente

descritas para os experimentos com os animais eutireoideos. Os

experimentos com animais hiper- ou hipotireoideos foram realizados em

datas distintas.

Após a indução do hiper- ou hipotireoidismo, conforme

previamente descrito, os animais submetidos a um dos dois tratamentos

(hiper- ou hipotireoidismo) foram divididos em dois subgrupos que

receberam veículo (grupo controle - C) ou anandamida (grupos

experimentais – Hiper ou Hipo).

O tempo de sacrifício foi determinado em 2 horas após a

administração do veículo (grupo controle - C) ou anandamida (Hiper ou

Hipo), de acordo com os resultados obtidos com os experimentos

realizados previamente com os grupos eutireoideos para determinação

do curso temporal.

Para o experimento com animais hipertireoideos a dose de veículo

ou de anandamida foi administrada no sétimo dia após o início do

tratamento com tiroxina (6 dias de tratamento com tiroxina) (Fig. 10).

Fig. 10 – Esquema experimental com animais hipertireoideos in vivo.

Para o experimento com os grupos hipotireoideos a dose de

veículo ou de anandamida foi administrada no vigésimo segundo dia

após o início do tratamento com metimazol (21 dias de tratamento com

metimazol) (Fig. 11).

Fig. 11 – Esquema experimental com animais hipotireoideos in vivo.

3.4.4 – Administração do antagonista de anandamida – AM251

O antagonista do receptor CB1 denominado N-(piperidina-1-yl)-5-

(4-iodofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-1H-pirazole-3-caboxamida,

(C22H21Cl2IN4O), ou apenas AM251, com peso molecular de 555,24 foi

adquirido da empresa Tocris Cookson Inc. (Missouri, USA). Fornecido na

forma liofilizada, o mesmo foi ressuspendido em solução composta de

etanol:DMSO:salina na proporção 1:14:5, respectivamente, de modo que

a concentração de AM251 injetada intraperitonealmente foi de 1,7mg/Kg

de peso corporal, com molaridade circulante inicial teórica para um rato

de 300g estimada em 3x10

-5

M, em 0,2mL.

Os animais que receberam AM251 foram sacrificados 90 minutos

após a dose administrada. O grupo controle (C), cuja dose administrada

não conteve AM251, apenas a solução de etanol, DMSO e salina; teve

seus animais sacrificados imediatamente após o grupo que recebeu

anandamida. Com o objetivo de minimizar os efeitos das variações

circadianas, bem estabelecidas pela literatura, sobre a secreção de TSH,

os experimentos foram realizados de modo que os animais não fossem

sacrificados após as 12:00 horas.

3.5 – Experimentos in vitro

Nestes experimentos foi avaliada a resposta secretora de TSH a

partir de hemi-adenohipófises de animais eutireoideos incubadas na

ausência ou presença de anandamida em três diferentes molaridades.

Da mesma maneira que nos experimentos in vivo, os animais

foram sacrificados por decapitação. Seu sangue foi coletado a partir do

tronco, processado para obtenção do soro que foi armazenado a -20

para posterior dosagem de TSH.

As hipófises foram dissecadas descartando-se a neurohipófise e

separando cada hemi-adenohipófise para incubação em 1 mL de meio

Krebs-Ringer bicarbonato pH 7,4, contendo bacitracina – 0,1% (Sigma,

EUA). O meio de incubação foi mantido a temperatura de 37

C, em

atmosfera carbogênica (95% de O

e 5% de CO

) em banho-maria do

tipo Dubnoff.

Após 30 minutos de pré-incubação, o meio de incubação foi

trocado por meio fresco com o mesmo volume, contendo ou não

anandamida. Utilizou-se, nos experimentos in vitro, anandamida (N-(2-

Hidroxietil)-5z,8z,11z,14z-eicosatetraenamida, (C

), proveniente

da empresa Tocris Cookson Inc. (Missouri, USA), com peso molecular de

347,54kD, fornecida na concentração de 10mg/mL em Tocrisolve™

(Tocris Cookson Inc. – Missouri, USA). Minutos antes da administração,

diluiu-se esta solução em e meio de incubação Krebs-Ringer na

proporção de 1:300.000 para obtermos a primeira molaridade (10

-7

M) a

partir da qual foram feitas as diluições (10

-9

M e 10

-11

M).

As adenohipófises provenientes de animais eutireoideos foram

divididas em quatro grupos: incubadas na ausência (Controle +

Tocrisolve™) ou presença de anandamida nas concentrações de 10

-11

-9

M e 10

-7

M, com volume de incubação de 1mL.

Após 2 horas de incubação, uma alíquota de 100µL foi retirada

para avaliação do TSH basal, conforme mostra a figura a seguir (Fig. 12).

Fig. 12 – Esquema ilustrando o procedimento para o experimento in vitro com hemi-

adenohipófises de animais eutireoideos.

3.6 – Radioimunoensaio para TSH

As concentrações de TSH séricas e do meio de incubação foram

determinadas através de radioimunoensaio para TSH murino (método do

duplo anticorpo) como previamente descrito (Ortiga, 1992).

Os padrões de referência para construção de uma curva padrão, o

anticorpo anti-TSH murino obtido a partir de coelho (primeiro anticorpo) e

o TSH purificado para iodação foram gentilmente fornecidos pelo

National Hormone Pituitary Program – NHPP (Bethesda, USA).

O TSH foi marcado com iodo radioativo (

125

I) pelo método da

cloramina T (Chard, 1987). Após a ligação do radioisótopo, separou-se o

TSH das moléculas não marcadas e do radioisótopo livre pelo método da

cromatografia de filtração em gel de poliacrilamida (Bio-Gel P-60, Bio-

Rad, USA).

A curva padrão foi construída com valores conhecidos de TSH e

variaram entre 0,18 a 11,64 ng/mL.

O ensaio consiste em incubar as amostras ou os padrões durante

2 horas em tampão PBS/BSA pH 7,6 com o primeiro anticorpo (diluição

final por tubo de ensaio de 1 : 1.500.000). Após esta primeira etapa,

adiciona-se o volume equivalente a 10.000 cpm/tubo de TSH ligado ao

radioisótopo e mantém-se a reação em temperatura ambiente pelas

próximas 24 horas, quando então, precipita-se os complexos antígeno-

anticorpo pela adição do segundo anticorpo (IgG de cabra contra IgG de

coelho) junto com 5% de polietilenoglicol (Polietilenoglicol 6.000, Isofar) e

posterior centrifugação (1900xg a 4

C durante 30 minutos).

Após desprezar o sobrenadante, a radioatividade no tubo foi

determinada em um cintilador de fase sólida (Compugama LKB, 1282 -

Wallac) com especificidade centrada em torno da energia do

125

O limite mínimo de detecção de TSH para todos os ensaios foi de

0,18 ng/mL. O coeficiente de variação intra-ensaio dos experimentos foi

de 8,8%.

3.7 – Dosagem de T4 e T3 totais

A determinação da concentração sérica de T4 e T3 totais foi

realizada com kit comercial (T4 ou T3 MAb da ICN Pharmaceuticals –

Costa Mesa, CA – USA) baseado no princípio de radioimunoensaio de

fase sólida com anticorpo específico aderido à parede do tubo. O limite

mínimo de sensibilidade informado pelo fabricante é de 0,76 µg/dL para

T4 e 25 ng/dL para T3.

Todas as amostras comparadas foram dosadas dentro de um

mesmo ensaio. O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 3,1% para

T4 e 4,4% para T3.

3.8 – Análise estatística

Todos os valores são expressos como média ± erro padrão da

média (EPM) em ng/mL.

O TSH sérico dos animais eutireoideos empregados no

experimento denominado “curso temporal”, foi analisado com o emprego

do teste Kruskal-Wallis, seguido pelo pós-teste de comparação múltipla

de Dunn, enquanto o T4 e o T3 foram analizados por Análise de

Variância (ANOVA) univariado bicaudal seguido do teste de comparação

múltipla de Dunnett.

Análise de Variância (ANOVA) univariado bicaudal seguido do

teste de comparação múltipla de Dunnett também foram aplicados para

determinar a significância do TSH secretado para o meio de incubação

proveniente dos resultados dos experimentos in vitro.

Teste Mann-Whitney foi empregado para os resultados de TSH,

enquanto teste “t” não-pareado foi utilizado para análise de T4 e T3

obtidos a partir dos experimentos in vivo com animais hiper- ou

hipotireoideos que receberam anandamida e a partir do experimento in

vivo com animais eutireoideos que receberam AM251.

Ambos os testes foram efetuados através do programa GraphPad

versão 3.02 da Prism Software. A hipótese nula foi descartada quando

p<0,05.

4 – RESULTADOS OBTIDOS

Conforme mostra a figura abaixo (Fig. 13) a administração de

anandamida (0,02mg/Kg peso corporal) causou significativa (p<0,05)

diminuição (42%) na concentração de TSH sérico de ratos eutireoideos,

2 horas (1,2±0,12 ng/mL) após sua administração, em comparação com

o grupo controle (2±0,25 ng/mL). Entretanto, nenhuma alteração

significativa na concentração sérica de TSH foi observada nos grupos

sacrificados 0,5 hora (1,6±0,2 ng/mL) ou 1 hora (1,6±0,23 ng/mL) após

administração de anandamida.

TSH sérico em animais eutireoideos após

administração aguda de anandamida

C 0.5 1 2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Tempo (h) após administração de anandamida

TSH (ng/mL)

Fig. 13 – Concentração sérica de TSH em animais eutireoideos; 0,5 (n=10); 1 (n=9) e 2

horas (n=11) após administração aguda (ip) de anandamida na concentração de

0,02mg/kg peso corporal ou veículo (solução salina - 0,9%:propileno glicol:etanol) na

proporção de 1:2:1, respectivamente, no grupo controle – C (n=11). Valores expressos

como média ± EPM. *p<0,05 x C.

A concentração sérica de T4 total dos animais eutireoideos que

receberam anandamida (0,02mg/Kg peso corporal) esteve

significativamente (p<0,01) diminuída (28%) no grupo sacrificado após 2

horas (3,2±0,43 µg/dL) em comparação com o grupo controle (C)

(4,5±0,1 µg/dL). Entretanto, nenhuma alteração significativa na

concentração sérica de T4 total foi observada nos grupos sacrificados 0,5

hora (4,1±0,33 µg/dL) ou 1 hora (4,1±0,17 µg/dL) após administração de

anandamida, conforme mostra a figura a seguir (Fig. 14).

T4 sérico dos animais eutireoideos após

administração aguda de anandamida

C 0.5 1 2

Tempo (h) após administração de anandamida

T4 (

g/dL)

Fig. 14 – Concentração sérica de T4 total em animais eutireoideos 0,5 (n=7); 1 (n=7) e

2 horas (n=9) após administração aguda (ip) de anandamida na concentração de

0,02mg/kg peso corporal ou veículo (solução salina - 0,9%:propileno glicol:etanol) na

proporção de 1:2:1, respectivamente, no grupo controle – C (n=11). Valores expressos

como média ± EPM. *p<0,01 x C.

A concentração sérica de T3 total dos animais eutireoideos que

receberam anandamida (0,02mg/Kg peso corporal), não apresentou

alteração significativa em nenhum dos distintos tempos de sacrifício (0,5h

– 54,9±5,93; 1h – 62,4±3,61 e 2h – 55,1±4,67 ng/dL) quando

comparados com o grupo controle (C) (70,3±4,54 ng/dL), conforme

mostra a figura a seguir (Fig. 15).

T3 sérico dos animais eutireoideos após

administração aguda de anandamida

Controle 0,5 1 2

Tempo (h) após administração de anandamida

T3 (ng/dL)

Fig. 15 – Concentração sérica de T3 total em animais eutireoideos 0,5 (n=6); 1 (n=7) e

2 horas (n=6) após administração aguda (ip) de anandamida na concentração de

0,02mg/kg peso corporal ou veículo (solução salina - 0,9%:propileno glicol:etanol) na

proporção de 1:2:1, respectivamente, no grupo controle – C (n=11). Valores expressos

como média ± EPM.

Conforme mostra a figura abaixo (Fig. 16), a administração de

anandamida (0,02mg/Kg peso corporal) não causou qualquer alteração

na concentração de TSH sérico de ratos hipertireoideos 2 horas

(0,3±0,06 ng/mL) após sua administração, em comparação com o grupo

controle hipertireoideo que recebeu veículo (0,4±0,13 ng/mL). O gráfico

representa apenas os valores detectáveis, uma vez que 5 amostras do

controle e 4 amostras do grupo que recebeu anandamida encontravam-

se abaixo do limite mínimo de detecção (0,18 ng/mL).

TSH sérico dos animais hipertireoideos após

administração aguda de anandamida

Controle Anandamida

0.00

0.18

0.2

0.4

0.6

0.8

TSH (ng/mL)

Fig. 16 – Concentração sérica de TSH em animais hipertireoideos (n=7) 2 horas após

administração aguda (ip) de anandamida na concentração de 0,02mg/kg peso corporal

ou veículo (solução salina - 0,9%:propileno glicol:etanol) na proporção de 1:2:1,

respectivamente, no grupo controle – C (n=9). Valores expressos como média ± EPM.

A concentração sérica de T4 total dos animais hipertireoideos que

receberam anandamida (0,02mg/Kg peso corporal) não apresentou

alteração 2 horas após sua administração (8,1±0,4 µg/dL) quando

comparados com o grupo controle hipertireoideo que recebeu veículo

(7,9±0,44 µg/dL), conforme mostra a figura que segue (Fig 17).

T4 sérico dos animais hipertireoideos após

administração aguda de anandamida

Controle Anandamida

0.0

1.5

3.0

4.5

6.0

7.5

9.0

T4 (

g/dL)

Fig. 17 – Concentração sérica de T4 total em animais hipertireoideos (n=10) 2 horas

após administração aguda (ip) de anandamida na concentração de 0,02mg/kg peso

corporal ou veículo (solução salina - 0,9%:propileno glicol:etanol) na proporção de

1:2:1, respectivamente, no grupo controle – C (n=9). Valores expressos como média ±

EPM.

A concentração sérica de T3 total dos animais hipertireoideos que

receberam anandamida (0,02mg/Kg peso corporal) não apresentou

alteração 2 horas após sua administração (154,8±9,96 ng/dL) quando

comparados com o grupo controle hipertireoideo que recebeu veículo

(132,2±9,13 ng/dL), conforme mostra a figura abaixo (Fig. 18).

T3 sérico dos animais hipertireoideos após

administração aguda de anandamida

Controle Anandamida

100

120

140

160

180

T3 (ng/dL)

Fig. 18 – Concentração sérica de T3 total em animais hipertireoideos (n=9) 2 horas

após administração aguda (ip) de anandamida na concentração de 0,02mg/kg peso

corporal ou veículo (solução salina - 0,9%:propileno glicol:etanol) na proporção de

1:2:1, respectivamente, no grupo controle – C (n=6). Valores expressos como média ±

EPM.

Conforme mostra a figura que segue (Fig. 19), a concentração

sérica de TSH esteve significativamente (p<0,01) diminuída (35% de

redução) no grupo hipotireoideo (27,5±2,1 ng/mL) sacrificado 2 horas

após administração de anandamida (0,02mg/Kg peso corporal) em

comparação com o grupo controle hipotireoideo que recebeu veículo

(42±3,39 ng/mL).

TSH sérico dos animais hipotireoideos após

administração aguda de anandamida

Controle Anandamida

TSH (ng/mL)

Fig. 19 – Concentração sérica de TSH em animais hipotireoideos (n=8) 2 horas após

administração aguda (ip) de anandamida na concentração de 0,02mg/kg peso corporal

ou veículo (solução salina - 0,9%:propileno glicol:etanol) na proporção de 1:2:1,

respectivamente, no grupo controle – C (n=9). Valores expressos como média ± EPM.

*p<0,01 x C.

A concentração sérica de T4 total dos animais hipotireoideos que

receberam anandamida (0,02mg/Kg peso corporal) não apresentou

alteração 2 horas após sua administração (2,6±0,14 µg/dL) quando

comparados com o grupo controle hipotireoideo que veículo (2,6±0,15

µg/dL), conforme mostra a figura a seguir (Fig. 20).

T4 sérico dos animais hipotireoideos após

administração aguda de anandamida

Controle Anandamida

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

T4 (

g/dL)

Fig. 20 – Concentração sérica de T4 total em animais hipotireoideos (n=10) 2 horas

após administração aguda (ip) de anandamida na concentração de 0,02mg/kg peso

corporal ou veículo (solução salina - 0,9%:propileno glicol:etanol) na proporção de

1:2:1, respectivamente, no grupo controle – C (n=8). Valores expressos como média ±

EPM.

A concentração sérica de T3 total dos animais hipotireoideos que

receberam anandamida (0,02mg/Kg peso corporal) não apresentou

alteração 2 horas após sua administração (27,2±1,46 ng/dL) quando

comparados com o grupo controle hipotireoideo que veículo (25,2±0,26

ng/dL), conforme mostra a figura abaixo (Fig. 21).

T3 sérico dos animais hipotireoideos após

administração aguda de anandamida

Controle Anandamida

T3 (ng/dL)

Fig. 21 – Concentração sérica de T3 total em animais hipotireoideos (n=10) 2 horas

após administração aguda (ip) de anandamida na concentração de 0,02mg/kg peso

corporal ou veículo (solução salina - 0,9%:propileno glicol:etanol) na proporção de

1:2:1, respectivamente, no grupo controle – C (n=9). Valores expressos como média ±

EPM.

Conforme mostra a figura que segue (Fig. 22) a administração do

antagonista de receptor CB1, AM251 (1,7mg/Kg peso corporal) causou

significativo (p<0,0001) aumento (4,3 vezes) na concentração de TSH

sérico de ratos eutireoideos, 1,5 hora (6,6±1,25 ng/mL) após sua

administração, em comparação com o grupo controle eutireoideo que

recebeu veículo (1,5±0,21 ng/mL).

TSH sérico em animais eutireoideos 1,5h após

administração de AM251

C AM251

0.0

1.5

3.0

4.5

6.0

7.5

9.0

TSH (ng/mL)

Fig. 22 – Concentração sérica de TSH em animais eutireoideos após AM251; (n=10)

1,5 hora após administração (ip) de AM251 na concentração de 1,7mg/kg peso corporal

ou veículo (solução etanol:DMSO:salina na proporção 1:14:5, respectivamente), no

grupo controle – C (n=9). Valores expressos como média ± EPM. *p<0,0001 x C.

A concentração sérica de T4 total dos animais eutireoideos que

receberam AM251 (1,7mg/Kg peso corporal) não apresentou alteração

1,5 hora após sua administração (4,9±0,17 µg/dL) quando comparados

com o grupo controle eutireoideo que recebeu veículo (4,8±0,08 µg/dL),

conforme mostra a figura que segue (Fig 23).

T4 sérico dos animais eutireoideos após

administração aguda de AM251

Controle AM251

T4 (

g/dL)

Fig. 23 – Concentração sérica de T4 total em animais eutireoideos (n=10) 1,5 hora

após administração aguda (ip) de AM251 na concentração de 1,7mg/kg peso corporal

ou veículo (solução etanol:DMSO:salina na proporção 1:14:5, respectivamente), no

grupo controle – C (n=9). Valores expressos como média ± EPM.

A concentração sérica de T3 total dos animais eutireoideos que

receberam AM251 (1,7mg/Kg peso corporal) não apresentou alteração

1,5 hora após sua administração (71,5±7,05 ng/dL) quando comparados

com o grupo controle eutireoideo que recebeu veículo (72,4±5,57 ng/dL),

conforme mostra a figura abaixo (Fig. 24).

T3 sérico dos animais eutireoideos após

administração aguda de AM251

Controle AM251

T3 (ng/dL)

Fig. 24 – Concentração sérica de T3 total em animais eutireoideos (n=8) 1,5 hora após

administração aguda (ip) de AM251 na concentração de 1,7mg/kg peso corporal ou

veículo (solução etanol:DMSO:salina na proporção 1:14:5, respectivamente), no grupo

controle – C (n=9). Valores expressos como média ± EPM.

Os valores de TSH secretados no meio de incubação com hemi-

adenohipófises de animais eutireoideos foram significativamente (p<0,05)

alterados pela anandamida adicionada ao meio de incubação nas

concentrações de 10

-11

M (aumento de 61%) e 10

-7

M (diminuição de

65%), em comparação ao Controle incubado na presença de meio puro.

Nenhuma alteração foi observada em relação ao grupo cuja

concentração de anandamida presente no meio foi de 10

-9

M, conforme

mostra a figura a seguir (Fig. 25). Os valores de todos os grupos estão

expressos na Tabela 1.

Tabela 1 – Secreção de TSH a partir de hemi-adenohipófises de animais

eutireoideos incubadas sem anandamida (Controle n=14) ou com anandamida

(10

-11

M n=12; 10

-9

M n=12 e 10

-7

M n=12) por duas horas. Os valores são

expressos como média ± EPM.

Grupo

(Molaridade)

Controle 10

-11

-9

-7

TSH

(ng/mL)

170,5±19,18 274,5±40,48

214,7±36,94

59±6,92

Efeito da anandamida sobre a secreção basal de TSH

de hemi-adenohipófises de animais eutireoideos

C -11 -9 -7

120

180

240

300

360

Molaridade da solução de anandamida (10

)

TSH (ng/mL)

Fig. 25 – Secreção basal de TSH a partir de hemi-adenohipófises de animais

eutireoideos incubadas sem anandamida (Controle n=14) ou com anandamida (10

-11

n=12; 10

-9

M n=12 e 10

-7

M n=12) por duas horas. Os valores são expressos como

média ± EPM. *p<0,05 x C.

5 – DISCUSSÃO

5.1 – Experimentos in vivo

Após a descrição do efeito do delta-9-tetrahidrocanabiol como

inibidor do eixo tireoideano, reduzindo a concentração de TSH,

somaram-se as descobertas da presença do receptor CB1, ativado pelo

delta-9-tetrahidrocanabiol, na hipófise e a descoberta de um análogo

endógeno, capaz de ativar o mesmo receptor, que é a anandamida.

Com nenhum dado na literatura acerca do efeito da anandamida

sobre a concentração de TSH sérico, partimos em busca de qual tempo

seria razoável para observarmos alguma alteração, caso essa existisse.

Portanto, desenhamos um curso temporal com base em dados obtidos

em nosso laboratório com outras drogas testadas previamente e

aproximando-nos das informações obtidas com as investigações de

Scorticati e colaboradores (2004) e Wenger e colaboradores (1997), que

acompanharam a ação da anandamida durante 150 e 180 minutos após

sua administração no hipotálamo e intraperitoneal, respectivamente, e o

trabalho de Porcela e colaboradores (2002) que investigaram o efeito de

um agonista preferencial do receptor CB2 (WIN55,212-2) 4 horas após

sua administração. Wenger e colaboradores (1997), por utilizarem

anandamida via intraperitoneal e com tempos de sacrifício de 45, 90 e

180 minutos para os seus grupos, foi o que mais se aproximou dos

nossos objetivos e nos auxiliou na escolha dos tempos de sacrifício no

presente trabalho.

Com relação à concentração da dose administrada

intraperitonealmente, usamos a metodologia aplicada por Wenger e

colaboradores (1997) para investigar o efeito, também sistêmico da

anandamida, porém sobre o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal com foco

na secreção de ACTH. Com esta dose (0,02mg/Kg peso corporal) os

autores observaram aumento na concentração sérica de ACTH dentro de

45 e 90 minutos com retorno à concentração basal em 180 minutos.

Em paralelo, no mesmo estudo de Wenger e colaboradores (1997),

o mesmo curso temporal foi observado para a imunoreatividade de FOS,

um marcador de atividade transcricional nuclear, nos neurônios

parvocelulares do PVN. Os resultados mostraram imunoreatividade para

FOS no PVN, indicando a ativação de FOS, após 45 minutos com pico

após 90 minutos da admistração de anandamida. Os autores sugeriram

que a anandamida injetada por via sistêmica poderia estar atuando via

CRH, ou seja, ativando o eixo adrenal com a participação hipotalâmica.

Os resultados apresentados no nosso trabalho demonstram que a

anandamida é capaz de diminuir a concentração sérica de TSH em ratos

normais 2 horas após a sua administração sistêmica. Resultado este,

claramente apoiado pelos efeitos já descritos por Hillard e colaboradores

(1984) para a ação do delta-9-tetrahidrocanabiol que em doses de

3mg/Kg de peso corporal ou maiores causaram a supressão dose-

dependente da concentração sérica de TSH. Os mesmos autores

também investigaram o curso temporal da ação da dose de 10mg/Kg de

peso corporal de delta-9-tetrahidrocanabiol e observaram efeito inibitório

a partir de 15 minutos que se mostrou estatisticamente significativo até 3

horas após a administração. A mesma dose também causou redução das

concentrações séricas dos hormônios tireoideanos, observada com

significância estatística 3 e 6 horas após a administração de delta-9-

tetrahidrocanabiol para T3 e apenas 6 horas após a administração para

T4.

O efeito da anandamida sobre o TSH independe do efeito

supressor que o T4 exerce sobre o TSH, uma vez que o próprio T4

encontra-se diminuído nos mesmos grupos experimentais sacrificados

após 2 horas da administração de anandamida. Em um estudo prévio

realizado por Porcella e colaboradores (2002) foi observado que a

administração do agonista CB1 e CB2, WIN55,212-2, causou a

diminuição da concentração sérica de T3 e T4 livres 4 horas após sua

administração. O mesmo estudo mostrou a presença de receptores CB1

na tireóide e sugere o seu envolvimento na mediação do efeito inibitório

causado pelo agonista WIN55,212-2 sobre a secreção dos hormônios

tireoideanos. Portanto, estes autores sugeriram que o agonista atuaria

diretamente sobre a tireóide, mesmo porque não encontraram alterações

na concentração sérica de TSH no tempo estudado (4h). Entretanto, não

nos passa desapercebido, o fato da droga WIN55,212-2 ser um agonista

preferencial CB2 e, apesar de administrado em concentração distinta

(superior) em relação ao presente trabalho, possui propriedades de

distribuição e degradação distintas da anandamida. Nosso estudo, no

entanto, sugere que a ação primária seria no hipotálamo/hipófise, já que

encontramos concomitantemente TSH e T4 diminuídos. É possível que a

redução de T4 que se sucede à diminuição de TSH leve à normalização

do TSH, que foi observada no tempo de 4 horas no trabalho acima

citado.

Entretanto, aguardamos novos resultados para o esclarecimento

se o efeito sistêmico aqui observado deve-se à ação da anandamida

sobre a hipófise ou sobre o hipotálamo.

Além de verificar o efeito da anandamida em animais normais, os

resultados obtidos trazem informação acerca do efeito da anandamida

em animais com o estado tireoideano alterado. Em animais

hipertireoideos, a administração sistêmica de anandamida 2 horas antes

do sacrifício não foi capaz de alterar a concentração sérica de TSH. Por

outro lado, em animais com hipotireoidismo, a anandamida administrada

sistemicamente, 2 horas antes do sacrifício, causou diminuição

significativa da concentração sérica de TSH.

Como é sabido, os hormônios tireoideanos causam tanto a

diminuição da síntese e da secreção de TRH, assim como a diminuição

da síntese e da secreção de TSH. No hipertireoidismo, o excesso de

hormônio tireoideano intensifica o efeito inibitório sobre a síntese e

secreção de TRH, assim como sobre a síntese e secreção de TSH. Essa

inibição hipotalâmica e hipofisária exercida pelos hormônios tireoideanos

pode explicar a ausência do efeito inibidor da anandamida sobre a

concentração de TSH sérico observada no hipertireoidismo.

Já durante o hipotireoidismo, os resultados comprovam que o

aumento de TSH sérico, devido à ausência do efeito supressor dos

hormônios tireoideanos, pode ser inibido significativamente pela

administração sistêmica de anandamida 2 horas antes do sacrifício.

Assim como com os animais eutireoideos, verificou-se a

concentração de hormônios tireoideanos (T4 e T3 totais) não apenas

para o acompanhamento do resultado do tratamento em si (hiper- ou

hipotireoidismo), mas também para verificar se a supressão de TSH

sérico induzida pela anandamida, observada no hipotireoidismo poderia

coincidir com alguma alteração de hormônio tireoideano. Porém,

nenhuma alteração de T3 ou T4 totais foi observada, quer seja no

hipertireoidismo ou no hipotireoidismo. No hipertireoidismo, portanto, a

anandamida não é capaz de agir aditivamente ao T4, que é o mais

potente inibidor da secreção de TSH.

O efeito inibitório da secreção de TSH pela anandamida na

situação de hipotireoidismo é extremamente relevante. Primeiro, porque

revela a potência do efeito da anandamida, já que o efeito inibitório pode

ser exercido na deficiência de hormônios tireoideanos, que é o fator mais

relevante para aumentar a secreção de TSH. Além disto, esta

constatação corrobora a hipótese de que o sítio de ação da anandamida

nos animais hipotireoideos dê-se, de fato, na adenohipófise/hipotálamo,

já que a droga anti-tireoideana utilizada para induzir o hipotireoidismo

bloqueia a biossíntese hormonal tireoideana.

O mecanismo pelo qual os canabinóides endógenos podem

modificar a secreção de TSH não podem ser totalmente esclarecidos

pelo presente estudo. Outros trabalhos (Scorticati et al., 2003; Scorticati

et al., 2004; De Miguel et al., 1998) mostraram que vários

neurotransmissores atuantes no hipotálamo são alterados em resposta à

administração de canabinóides. A concentração de dopamina no

hipotálamo médio-basal e na hipófise anterior aumenta dentro de 90

minutos após injeção intracerebroventricular única de anandamida,

associada à inibição na liberação de prolactina (Scorticati et al., 2003). À

medida que a dopamina age como um inibidor tanto de prolactina como

de TSH (Weintraub et al., 2001), é possível propor um mecanismo

indireto pelo qual a anandamida possa inibir tanto a liberação de

prolactina como de TSH promovendo o aumento da secreção de

dopamina.

Podemos ainda, aventar a hipótese de que o próprio TRH diminua

em função da ação direta, ou não, da anandamida e que esta diminuição

de TRH seja responsável pela diminuição da concentração sérica de

TSH observada no eu- e no hipotireoidismo. Corroborando esta hipótese,

podemos citar os resultados obtidos por Wenger e colaboradores (1997),

que mostram a depleção do conteúdo de CRH em neurônios da

eminência média após a administração intraperitoneal da mesma dose

de anandamida e com efeito temporal similar ao observado no presente

estudo.

Em nosso último experimento in vivo, testamos um possível efeito

sistêmico que o antagonista preferencialmente da forma CB1 do receptor

endocanabinóide, denominado AM251, exerceria sobre a concentração

de TSH sérico. A quase inexistência de dados previamente publicados

nos obrigou, novamente, à escolha de um tempo de sacrifício após a

administração de AM251 baseado nos resultados obtidos com os

experimentos realizados com a anandamida. No trabalho de Gatley e

colaboradores (1996) observa-se que após a administração intravenosa

de AM251 marcado radioativamente, a radioatividade devido à captação

cerebral atinge nível máximo dentro de 1 hora e só retorna ao valor basal

8 horas após a administração. Além disso, como os resultados com a

anandamida foram observados com os grupos sacrificados 2 horas após

a sua administração, o tempo escolhido para o sacrifício após a

administração de AM251 foi de 1,5 hora. Em relação à concentração de

AM251 a ser administrada, calculamos a molaridade circulante inicial

teórica para um rato de aproximadamente 300g em 3x10

-5

O resultado comprovou que, diante da inibição sistêmica da ação

desencadeada pelo receptor CB1 de endocanabinóide, causada pelo

AM251, houve aumento significativo da concentração de TSH sérico. Tal

observação tem relevante interesse, já que pode ser uma evidência para

o papel fisiológico do endocanabinóide, no sentido de exercer inibição

tônica sobre a secreção de TSH.

A concentração de hormônios tireoideanos (T4 e T3 totais) foi

dosada para verificar se a supressão de TSH sérico observada no

experimento com o antagonista AM251 poderia coincidir com alguma

alteração de hormônio tireoideano, porém, nenhuma alteração de T3 ou

T4 totais foi observada. Portanto, a ação do antagonista parece também

ocorrer via eixo hipotálamo-hipofisário.

O AM251 não é apenas um antagonista neutro, mas um agonista

inverso, ou seja, é capaz de desencadear o efeito inverso ao do agonista

quando ligado ao receptor. Esta constatação também pode explicar o

efeito causado pelo AM251 sobre a concentração sérica de TSH, efeito

este, inclusive de maior magnitude se comparado à resposta

desencadeada pela anandamida. O estudo realizado por Scorticati e

colaboradores (2004) também mostrou que enquanto a anandamida

diminui a concentração sérica de LH dentro de 30 e 90 minutos, a

administração de AM251 esteve associada a um aumento de LH sérico

após 90 minutos, muito mais expressivo do que o efeito inibitório da

própria anandamida.

Além disso, tanto a anandamida como AM251 agem

preferencialmente via receptor endocanabinóide CB1. Portanto, o efeito

estimulatório sobre a secreção de TSH observado com o AM251

corrobora a hipótese de que o efeito da anandamida também ocorra via

CB1.

Consideramos ainda, a possibilidade de que o Iodo presente na

estrutura química da molécula de AM251 pudesse ter algum

envolvimento na síntese/secreção de T3 e T4. Entretanto, os resultados

das dosagens séricas dos hormônios tireoideanos no experimento com

AM251 não mostraram qualquer alteração, nos permitindo supor que não

houve liberação de Iodo da molécula de AM251 que pudesse alterar per

se a secreção de hormônios tireoideanos.

Conscientes de que o efeito inibidor da anandamida e estimulador

do AM251, administrado sistemicamente, sobre a concentração sérica de

TSH possam ocorrer indiretamente, acreditamos na possibilidade de que

tais ações dêem-se, pelo menos em parte, diretamente na adenohipófise,

baseados nos resultados obtidos in vitro, que serão discutidos a seguir.

5.2 – Experimentos in vitro

Com o objetivo de investigar o efeito local da anandamida sobre a

adenohipófise de ratos, regulando a liberação de TSH, experimentamos

a incubação de hemi-adenohipófises com distintas concentrações de

anandamida. Com base nos resultados de dois trabalhos publicados

investigando o efeito in vitro de anandamida (Scorticati et al., 2003 e

Scorticati et al., 2004), ainda que não tenha sido utilizado tecido

hipofisário, mas sim hipotalâmico, direcionamos nossos experimentos

para concentrações coincidentes com os dados publicados e

experimentos já realizados em nosso laboratório. Entretanto, em relação

ao tempo de incubação, enquanto os trabalhos publicados optaram por

30 e 60 minutos de incubação, nossa experimentação optou por 120

minutos de incubação com anandamida.

Interessantemente, nossos resultados mostraram que a incubação

de hemi-adenohipófise com anandamida na concentração de 10

-7

M foi

capaz de inibir significativamente a secreção de TSH. Tal resultado,

corrobora a possibilidade de que o efeito inibitório da anandamida,

administrada sistemicamente, possa dever-se ao seu efeito direto na

adenohipófise, uma vez que, a estimativa da concentração de

anandamida empregada sistemicamente levando-se em conta o volume

sanguíneo dos animais, foi semelhante à empregada no experimento in

vitro. Não podemos, entretanto, precisar o quanto e em quanto tempo a

degradação da anandamida influencia a sua distribuição nos tecidos,

nem tão pouco, quais efeitos seus metabólitos são capazes de

desencadear.

Ainda que a ação inibitória possa envolver outras células

adenohipófisárias e outros mediadores locais que ajam no sentido de

provocar a inibição de TSH observada por nós tanto in vivo como in vitro,

a presença de receptores CB1 na hipófise (Gonzales et al., 2000) permite

a sugestão de que a própria anandamida possa agir sobre os tireotrofos,

o que espera futura comprovação. No trabalho realizado por Scorticati e

colaboradores (2004), seus resultados foram observados com

concentrações de anandamida no meio de incubação que variaram de

-11

a 10

-5

M e o efeito inibitório da anandamida sobre a secreção de

LHRH ocorreu apenas na concentração de 10

-9

M, corroborando nossa

visão de que o efeito obtido em nossos experimentos não se deve a

citotoxicidade. Portanto, é possível que o efeito in vivo da anandamida

seja realizado, pelo menos em parte, por atuação hipofisária. Entretanto,

não há como descartar com o presente trabalho que ocorra também

efeitos hipotalâmicos, que deverão ser alvo de futuros estudos.

Observa-se ainda, que na concentração de 10

-11

M de anandamida

no meio de incubação, houve um aumento na concentração de TSH

secretado. Esta observação pode ser uma evidência que a anandamida

tenha, a exemplo de outros sinalizadores extracelulares, efeito sinoidal,

que se caracteriza por padrão de resposta dose-dependente não

diretamente proporcional, podendo variar com aumento ou diminuição da

resposta, alternadamente, ainda que apenas se aumente a concentração

do estímulo. O mesmo efeito, também bimodal, foi observado

recentemente por Genn e colaboradores (2004) com a ação da

anandamida sobre a ansiedade e mostra que em doses baixas a

anandamida exibe efeito ansiolítico e em doses altas efeito ansiogênico.

6 – CONCLUSÃO

O endocanabinóide endógeno, anandamida, administrado por via

sistêmica, tem efeito agudo inibidor sobre a secreção de TSH em animais

eutireoideos.

Na ausência do efeito repressor dos hormônios tireoideanos sobre

a secreção de TSH, o efeito da anandamida persiste, mas não é

detectado quando o TSH foi suprimido pelo excesso de hormônios

tireoideanos.

O agonista inverso de receptores endocanabinóides do tipo 1,

AM251, administrado por via sistêmica, tem efeito agudo estimulador

sobre a secreção de TSH em animais eutireoideos, o que sugere a

participação do sistema endocanabinóide endógeno no controle da

secreção de TSH, provavelmente via receptor CB1.

O mecanismo parece envolver, pelo menos em parte, atuação

direta na adenohipófise, já que esta responde à incubação com

anandamida, em concentrações similares às empregadas in vivo com

diminuição da secreção de TSH.

Entretanto, ainda resta por esclarecer se há participação

hipotalâmica no efeito in vivo e qual o significado do efeito estimulador da

secreção de TSH observado em glândulas incubadas com concentrações

menores de anandamida.

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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