( PDF ) Análise da expressão das enzimas desubiquitinadoras 5, 14 e 16 durante o ciclo de vida do Schistosoma mansoni

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DAS ENZIMAS

DESUBIQUITINADORAS 5, 14 E 16 DURANTE O CICLO

DE VIDA DO Schistosoma mansoni.

AUTORA: HELAINE GRAZIELE SANTOS VIEIRA

ORIENTADORA: PROFª. DRª. RENATA GUERRA DE SÁ

CO-ORIENTADOR: PROF. DR. ÉLIO HIDEO BABÁ

Dissertação submetida ao programa de Pós-Graduação do

Departamento de Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos

requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências

Biológicas, área de concentração: Biologia Molecular.

Ouro Preto, maio de 2007.

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“Determinação, coragem e autoconfiança são fatores decisivos para o

sucesso. Não importa quais sejam os obstáculos e as dificuldades. Se

estamos possuídos de uma inabalável determinação, conseguiremos

superá-los. Independentemente das circunstâncias, devemos ser

sempre humildes, recatados e despidos de orgulho”.

- Dalai-Lama -

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Dedico este trabalho aos meus pais, ao meu

irmão Denilson, às minhas queridas irmãs

Raquel e Isabella, e ao meu amado

sobrinho, por terem sempre me incentivado e

apoiado incondicionalmente durante esta

longa caminha de estudos em Ouro Preto.

Agradecimentos

Agradeço a Deus, pela minha vida e por me dar dia após dia fé e perseverança

pra conseguir enfrentar as grandes tempestades.

Ao Prof. Dr. Élio Hideo Babá pela acolhida no LBBM, pela co-orientação neste

trabalho, por todos estes anos de boa convivência e pelos grandes ensinamentos que

levarei comigo pra sempre.

À Prof. Dra. Renata Guerra de Sá, pela orientação e pelo apoio constante

durante a realização deste trabalho.

Aos meus pais, Liberticina e Oliver, aos meus irmãos e demais familiares que

mesmo longe sempre me apoiaram, e através de suas orações para que meus

experimentos dessem certo, contribuíram para a concretização deste trabalho.

Aos meus pais de bancada e queridos amigos Carmem Regina Nery e Silva e

Wander Jeremias de Jesus.

Ao mestrando e grande amigo Matheus Gomes de Souza, pessoa de um

coração enorme, que teve grande participação neste trabalho auxiliando na parte

experimental, sempre me incentivando e procurando soluções para os problemas que

surgiam, faltam me palavras pra lhe agradecer.

Aos professores do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular (LBBM),

Profª Dra. Maria Lúcia Pedrosa sempre atenciosa e cativante, Prof. Dr. Elísio Alberto

Evangelista, pela alegria, pelo apoio e incentivo.

Aos colegas e amigos do LBBM: Cássio, Nilza, Maísa, Robertinha, Letícia,

Nayara, Natália, Leonardo, Roberta, Roenick, Tiago, Eneida. Aos ex-LBBM e aqueles

que deixaram sua marca registrada por aqui Ângelo, Gustavo, Rafaela, Militão, Carla,

Guilherme, Amanda, Ângela, Cláudia, Nancy, Juliana, Júlio, Keila, Levindo, Olavo,

Hiroko, Fabiana; todos vocês contribuíram muito para a minha formação científica, seja

ajudando no dia a dia de bancada seja oferecendo apoio e carinho.

Ao Ezequiel, técnico de nosso laboratório e por quem tenho enorme carinho,

agradeço pela boa convivência durante estes anos, por sua alegria e pela amizade

sincera.

À Julia (esposa do chefe), sempre presente em nossas festas de confraternização

do LBBM nos presenteando com suas deliciosas especiarias, agradeço o carinho e a

atenção.

Ao Dr. Omar dos Santos Carvalho, do Laboratório de Malacologia e ao Dr.

Rodrigo Correia Oliveira do Laboratório de Imunologia do CPqRR/Fiocruz-BH, por

gentilmente fornecerem os materiais biológicos (cercárias e vermes adultos) utilizados

neste trabalho. A Dra. Liana, Delza, Dílci e Sueleny, responsáveis pela manutenção do

ciclo do S. mansoni, agradeço pela atenção, pelo carinho, presteza e pelos ensinamentos.

Ao Prof. Dr. Luís Carlos Crocco e a Profª Dra. Simone pelo acesso ao

Laboratório de Imuno Parasitologia, contribuindo muito para a realização deste

trabalho. E a todos os colegas do LIP especialmente Eduardo, Leandro, Djalma,

Roberta, Liz, Tiago, Marcos, Rafaela e Jamile.

Aos professores do NUPEB, pelo conhecimento fornecido e pela receptividade

em seus laboratórios permitindo a realização deste trabalho.

A todos os colegas da pós-graduação Geórgia, Nilza, Cássio, Maísa, Fernanda,

Thiago, Alessandra, Ana Maria, Juliana, Joelma, Anderson, Emerson, Rafaela, Gil,

Helen, Analina, Alex e àqueles não listados aqui.

Aos colegas dos Laboratórios do NUPEB, pela solidariedade mútua e amistosa

convivência. Um especial agradecimento a Zezé, Maristela e aos colegas do Laboratório

de Patologia Clínica.

À Maria Aparecida (Cida) secretária do NUPEB, por sua alegria e

prestatividade.

Aos inúmeros amigos conquistados durante estes quase sete anos morando, ou

melhor vivendo Ouro Preto, pessoas com quem morei, vizinhos, amigos das repúblicas

ouropretanas, colegas de sala de aula, colegas da capoeira, do yoga, da escalada, em

especial Tiago Godoy e Fábio Pavesi, se eu fosse listar todos aqui daria outra

dissertação; todos contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.

E finalmente, agradeço a Universidade Pública e Federal de Ouro Preto e à Ouro Preto,

cidade que me acolheu e que me encanta com sua beleza natural, arte, cultura e magia,

onde cresci e amadureci, jamais te esquecerei.

Sumário

Lista de Tabelas

Lista de Figuras

Lista de Abreviaturas

xii

Abreviação dos Aminoácidos

xiv

Resumo

Abstract

xvi

1 – Introdução

1.1 - Esquistossomose humana

1.2 - Ciclo biológico do parasito 03

1.3 - Patologia e controle da esquistossomose

1.4 - Genoma e transcriptoma de S. mansoni

1.5 - Modificação pós-traducional dependente de ubiquitina

1.6 – Desubiquitinação

1.7 - Modificação pós-traducional dependente de ubiquitina em S. mansoni

2 – Objetivos

2.1 – Objetivos Específicos

3 – Materiais e Métodos

3.1 - Obtenção das formas evolutivas do S. mansoni (vermes adultos, cercárias

e ovos)

3.2 - Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos in vitro

3.3 - Extração de DNA genômico

3.4 - Extração de RNA total

3.5 - Oligonucleotídeos iniciadores específicos para os genes DUB5, DUB14

e DUB16 (deubiquitinating enzyme)

3.6 - RT-PCR (Reverse- Transcription Polimerase Chain Reaction)

3.7 - Purificação e clonagem dos produtos das PCR’s 29

3.8 - Obtenção de células competentes para transformação

3.9 - Transformação de bactérias E. coli DH5 α

3.10 - Mini-preparação dos plasmídios recombinantes

3.11 – Sequenciamento

3.12 - Análise computacional das seqüências

3.13 - Análise da expressão de DUB 5, DUB 14 e DUB 16 durante as fases de

S. mansoni

4 – Resultados

4.1 - Análise computacional das seqüências de cDNA codificadoras para as

enzimas desubiquitinadoras

4.1.1 - Enzima desubiquitinadora 5

4.1.2 - Enzima desubiquitinadora 14 42

4.1.3 - Enzima desubiquitinadora 16 45

4.2 - Análise semi-quantitativa do padrão de expressão gênica das enzimas

desubiquitinadoras durante o ciclo evolutivo do S. mansoni

4.2.1 - DUB5

4.2.2 - DUB14 50

4.2.3 - DUB16 52

4.2.4 - Padrão de expressão das DUB’s durante o desenvolvimento de S.

mansoni

4.3 - Padrão de expressão gênica das subunidades RPN9 e COP9S3 do

proteassoma 26S durante o ciclo evolutivo do S. mansoni

5 – Discussão

6 – Conclusões

7 – Referências Bibliográficas

Apêndice

Lista de tabelas

Tabela 1 - Composição do meio 169 24

Tabela 2 - Oligonucleotídeos iniciadores gerados de DUB5, DUB14 e DUB16 28

Tabela 3 - Oligonucleotídeos utilizados como controle neste trabalho 35

Tabela 4 - Seqüências de organismos que apresentam gene ortólogo a SmDUB5 40

Tabela 5 - Seqüências de organismos que apresentam gene ortólogo a SmDUB14 43

Tabela 6 - Seqüências de organismos que apresentam gene ortólogo a SmDUB16 46

Lista de Figuras

Figura 1 - Ciclo de vida do S. mansoni apresentado em diagrama esquemático 05

Figura 2 - Estágios de desenvolvimento de S. mansoni 06

Figura 3 – Algumas das várias funções das modificações dependentes de ubiquitina 10

Figura 4 – Esquema representativo do proteassoma associado aos seus reguladores 12

Figura 5 – Funções das enzimas desubiquitinadoras 14

Figura 6 - DNA genômico de cercária de S. mansoni 25

Figura 7 – Extração de RNA total das fases evolutivas de S. mansoni 27

Figura 8 – PCR das colônias 32

Figura 9 – Mini-preparação 33

Figura 10 – Seqüência da ORF predita pelo programa ORF finder de SmDUB5 38

Figura 11 - Representação esquemática da localização dos domínios conservados em

SmDUB5

Figura 12 – Alinhamento da seqüência SmDUB5 com seqüências ortólogas de USP5 41

Figura 13 – Seqüência da ORF predita pelo programa ORF finder de SmDUB14 42

Figura 14 – Representação esquemática da localização dos domínios conservados em

SmDUB14

Figura 15 – Alinhamento da seqüência SmDUB14 com seqüências ortólogas de

USP14

Figura 16 – Seqüência da ORF predita pelo programa ORF finder de SmDUB16 45

Figura 17 - Representação esquemática da localização dos domínios conservados em

SmDUB16

Figura 18 – Alinhamento da seqüência SmDUB16 com seqüências ortólogas de

USP16

Figura 19 – Amplificação do cDNA correspondente ao gene SmDUB5 na fase de

verme adulto de S. mansoni

Figura 20 – Padrão de expressão do gene SmDUB5 49

Figura 21 – Amplificação do cDNA correspondente ao gene SmDUB14 na fase de

verme adulto de S. mansoni

Figura 22 – Padrão de expressão do gene SmDUB14 51

Figura 23 – Amplificação do cDNA correspondente ao gene SmDUB16 na fase de

verme adulto de S. mansoni

Figura 24 – Padrão de expressão do gene SmDUB16 53

Figura 25 – Gráfico comparativa da expressão das DUB’s nas fases Ce (cercárias),

V.A (vermes adultos) e Ovos

Figura 26 - Gráfico comparativo da expressão das DUB’s durante o estágio larval 54

Figura 27 – Padrão de expressão das subunidades COP9S3 e RPN9 do proteassoma

26S

Lista de Abreviaturas

µg Microgramas

µg/mL Microgramas por mililitros

µL Microlitros

µM Micromolar

ATP Adenosina trifosfato

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

cDNA DNA complementar

Centímetros quadrados

COP9S3 Constitutive photomorphogenic 9 subunidade 3

D.O Densidade óptica

DNA Ácido desoxiribonucléico

dNTP Deoxinucleosídeo trifosfato (N = A, C, G, ou T)

DTT Ditiotreitol

DUB Deubiquitin enzyme

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

g Gramas

HEPES 2-4-(2-Hidroxietil)-piperazinil-(1) ácido etanosulfônico

IPTG

Isopropil β-D-galactosídeo

Kb Kilobases

kDa KiloDaltons

M Molar

Mb Megabases

mg Miligramas

mg/mL Miligramas por mililitros

Magnésio

mL Mililitros

mM Milimolar

MOPS [Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico]

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

NCBI National Center for Biotechnology Information

ng Nanogramas

nm Nanômetros

ºC Grau celsius ou centígrados

pb Pares de bases

PCR Reação em cadeia da polimerase

pH Potencial hidrogeniônico

PM Peso molecular

pmol Picomoles

RNA Ácido ribonucléico

RNAi RNA interference

RNAse Ribonuclease

RPN9 Non-ATPase regulatory subunit 9 of proteassoma 26S

SDS Dodecil sulfato de sódio

SmDUB Enzima desubiquitinadora de Shistosoma mansoni

Taq Thermus aquaticus

Tris Tris-hidroximetilaminometano

Ub Ubiquitina

Volts Voltagem

WHO World Health Organization

Abreviaturas dos aminoácidos

Aminoácidos Abreviação de

três letras

Abreviação de uma

letra

Alanina

Ala A

Arginina

Arg R

Asparagina

Asn N

Ácido aspártico

Asp D

Ácido glutâmico

Glu E

Cisteína

Cys C

Glicina

Gly G

Glutamina

Gln Q

Histidina

His H

Isoleucina

Ile I

Leucina

Leu L

Lisina

Lys K

Metionina

Met M

Fenilanina

Phe F

Prolina

Pro P

Serina

Ser S

Tirosina

Tyr Y

Treonina

Thr T

Triptofano

Trp W

Valina

Val V

Resumo

O Schistosoma mansoni apresenta um ciclo biológico bastante peculiar, no qual

diversas alterações bioquímicas e morfológicas ocorrem no verme. Estas mudanças são

adaptações evolutivas encontradas pelo parasito para sobreviver nos distintos

ambientes. Acredita-se que estas adaptações são promovidas por um conjunto de genes

expressos coordenadamente nos seis estágios de vida do parasito, sendo de extrema

importância a identificação destes genes para elabor vacinas e novas drogas. Neste

contexto, as vias de modificações pós-traducional de proteínas como a ubiquitina

devem ser atuantes em vários processos celulares no parasito. A ubiquitina se liga

covalentemente a proteína alvo, através de uma ligação isopeptídica entre o resíduo de

glicina (Gly 76) da ubiquitina, localizado na região C-terminal e o resíduo de lisina

(Lys) do grupo amino da proteína a ser ubiquitinada. Esse processo é reversível, sendo

regulado pelas enzimas chamadas desubiquitinadoras (DUBs). As DUBs são cisteíno

proteases que clivam a ligação isopeptídica existente entre as ubiquitinas que formam a

cadeia poliubiquitinada, mantendo o pool de Ub intracelular livre e processam a pré-

proteína dando origem a forma madura da Ub. No presente trabalho, objetivamos

validar as análises in silico das DUB’s 5, 14 e 16 em S. mansoni e avaliar o padrão de

expressão destas enzimas em cercárias, esquistossômulos obtidos in vitro nos tempos

de 3 horas, 18,5 horas; 24 horas, 3 dias, em verme adulto e ovos. A expressão

comparada das DUB’s 5, 14 e 16 mostra que elas são mais expressas nas fases cercária,

verme adulto e ovo, do que nos diferentes estágios de esquistossômulos estudados,

confirmando resultados encontrados anteriormente em que foi verificada a atividade

DUB total nas fases de esquistossômulos menor comparada às demais fases. Este

padrão de expressão também corrobora com os resultados obtido por nosso grupo de

pesquisa onde foi observada a presença de conjugados ubiquitinados em todas as fases

de S. mansoni, com uma abundância predominante durante as diferentes culturas de

esquistossômulos (3h, 4h, 8h, 18h, 24h, 3 dias, 5 dias, 8 dias e 10 dias). Estes dados

juntamente com os resultados obtidos sugerem que a ocorrência de ciclos de

ubiquitinação/desubiquitinação podem estar envolvidos em processos celulares críticos

durante um ciclo biológico completo do S. mansoni.

Abstract

Schistosoma mansoni presents a peculiar life cycle, in which several

morphologic and biochemical alterations occur in different phases of development.

These changes are evolutive adaptations found by the parasite to survive in distinct

environments. These adaptations are promoted by a set of genes expressed coordinately

in the six life periods of the parasite, being a target to elaboration of vaccines and new

drugs. In this context, the post-transductional modifications of proteins, as

ubiquitination, must be operating in some crucial cellular processes in the parasite.

Ubiquitin (Ub) binds to target protein covalently, through an isopeptide linkage

between the C-terminal glicina residue (Gly 76) of Ub and the amino group of Lysine

(Lys). The reversible process of ubiquitination is the deubiquitination. DUBs

(deubiquitin enzymes) are cystein proteases that specifically cleave off Ub from Ub-

protein conjugates, Ub precursors and Ub adducts. In the present work, our objective

was to validate the in silico analyses of DUB's 5, 14 and 16 in S. mansoni and evaluate

the expression patterns of these enzymes in cercariae, in vitro schistosomulum obtained

by times of 3 hours, 18,5 hours; 24 hours, 3 days, in adult worms and eggs. The

comparative expression patterns of DUB' s 5, 14 and 16 shown that they are more

expressed in cercariae, adult worm and egg phases, and in basal level in different

periods of in vitro cultivate schistosomulum. Our results corroborate the low total DUB

activity in phases of schistosomulum when compared with the other phases. This

expression pattern also corroborates with the results obtained by our group, where the

presence of ubiquitin conjugates was observed in all the phases of S. mansoni, with a

relative abundance during the different culture times of schistosomulum (3h, 4h, 8h,

18h, 24h, 3 days, 5 days, 8 days and 10 days). These data suggest that the occurrence

of ubiquitinating/deubiquitinating cycles can be involved in critical cellular processes

during the full biological S. mansoni life cycle.

1 Introdução

1.1) Esquistossomose humana

A esquistossomose é uma importante doença parasitária humana que afeta mais

de 200 milhões de indivíduos distribuídos em 76 países tropicais e subtropicais em

desenvolvimento. É a segunda moléstia tropical de maior prevalência, causadora de

severa morbidade e mortalidade tornando-se assim um problema de saúde pública.

Estima-se que 500 a 650 milhões de pessoas estão em risco de infecção pela

esquistossomose (WHO, 2006).

De acordo com os primeiros relatos sobre a doença, a esquistossomose teve sua

provável origem nas bacias de dois importantes rios, o Nilo na África e o Yangtze na

Ásia. Tudo indica que sua história é bastante antiga já que existem relatos de ovos de

Schistosoma sp em vísceras de múmias egípcias de 3.500 a.C. Dos vários tipos de

esquistossomoses conhecidas, aquela que mais se disseminou, atingindo inclusive o

continente americano, foi a mansônica (Kloos, H. & David, R., 2002).

Três espécies contribuem para a maioria das esquistossomoses em humanos:

Schistosoma mansoni, que vive principalmente nas vênulas que drenam o intestino

grosso; S. japonicum, que é encontrado principalmente nas vênulas do intestino delgado

e S. haematobium que vive nas vênulas da bexiga urinária. Outras espécies como S.

intercalatum, S. mekongi e S. malayensis também podem infectar humanos (Hickman,

C.P.J. et al., 2004).

A distinção entre as diferentes espécies de Schistosoma pode ser feita através da

observação do formato dos ovos, do número de lobos testiculares dos vermes adultos

machos, do comprimento relativo do útero e dos vitelógenos nas fêmeas.

O agente etiológico da esquistossomose no Brasil é o S. mansoni, localmente

conhecida como barriga d’água ou bilharziose em diversos países do mundo. O termo

bilharziose foi uma homenagem ao patologista Theodor Bilharz, que em 1852 ao

realizar uma autópsia observou a presença destes parasitos no sistema venoso porta

intra-hepático.

O S. mansoni é um trematódeo digenético (Trematoda, Digenea) pertencente à

família Schistosomatidae, parasitando não somente o homem mas também alguns

mamíferos e marsupiais. Ele apresenta ainda claro dimorfismo sexual entre os seus

vermes na fase adulta.

1.2) Ciclo biológico do parasito

Os ovos de S. mansoni são excretados nas fezes de portadores da

esquistossomose, sendo que cada ovo contém uma larva ciliada chamada miracídio. Em

contato com a água os ovos eclodem, através de estímulos como luz intensa,

temperatura e oxigenação, liberando assim os miracídios. Estes procuram pelo

hospedeiro intermediário do parasito, o molusco de água doce do gênero Biomphalaria.

As larvas, que têm sexo definido, penetram ativamente a hemocele do caramujo,

multiplicam-se assexuadamente tornando-se esporocistos mães e posteriormente, surge

uma segunda geração denominada esporocistos filhos. O hepatopâncreas do caramujo

fica repleto de esporocistos filhos que se diferenciam por expansão clonal dando

origem à terceira geração, as larvas agora denominadas cercárias (Cunha, A.S., 1970).

Através de estímulos como luz e calor, as cercárias deixam o caramujo entre a

quarta e sexta semana após a infecção, permanecendo no meio aquático até

encontrarem seu hospedeiro definitivo. Respondendo a sinais químicos, as cercárias

penetram ativamente na pele humana através de ações mecânica e enzimática, perdendo

suas caudas bifurcadas durante este processo. Após os primeiros 15 minutos de

infecção no hospedeiro definitivo, já podem ser observadas alterações fisiológicas nas

cercárias, que a partir deste momento são denominadas esquistossômulos. A passagem

das cercárias pela epiderme e derme do hospedeiro pode durar de 24 a 72 horas

aproximadamente (Cunha, A.S., 1970).

Após este período os esquistossômulos iniciam a migração através do sistema

sanguíneo ou linfático e por volta do quarto dia eles chegam aos pulmões. Nos pulmões

o número de esquistossômulos atigem o pico máximo entre os dias 7 e 9 após infecção.

Durante o processo de migração, os esquistossômulos sofrem apenas um elongamento

aumentando assim seu volume corporal, não havendo sinais de divisão celular durante

esta fase (Clegg, J.A., 1965).

A migração dos esquistossômulos continua de forma assincrônica, passando

pelo coração até chegar ao fígado onde o seu desenvolvimento se completa. A partir do

oitavo dia já são encontrados esquistossômulos na veia porta-hepática, nesta fase

também se inicia a alimentação por sangue hospedeiro e a divisão celular (Clegg, J.A.,

1965 & Cunha, A.S., 1970). Os esquistossômulos se acumulam lentamente nos vasos

hepáticos onde, evidenciando o assincronismo, indivíduos jovens são encontrados ao

lado de indivíduos adultos durante vários dias. A partir da terceira semana inicia-se a

migração dos esquistossômulos para as veias mesentéricas, onde os parasitos já na fase

adulta atigem a maturidade. Macho e fêmea se acasalam e as fêmeas realizam a postura

de seus ovos completando assim o ciclo evolutivo (Cunha, A.S., 1970). A Figura 1

ilustra o ciclo biológico completo do parasito e a Figura 2 a passagem entre as fases

cercária/verme adulto dividida em estágios.

A fêmea de S. mansoni permanece alojada no canal ginecóforo do macho. O

casal pode viver por muitos anos pareado no sistema porta intra-hepático de seu

hospedeiro vertebrado. Este pareamento desencadeia uma cascata de eventos que

promovem um bom desenvolvimento do ovário e das glândulas vitelogênicas nas

fêmeas, de forma a garantir a manutenção do ciclo de vida do parasito (Cunha, A.S.,

1970 and Shaw, M.K., 1987).

A longevidade de um Schistosoma adulto é em torno de 3 a 5 anos podendo se

estender por mais de 30 anos. Os casais de vermes adultos podem produzir cerca de 300

a 1.000 ovos por dia. O potencial teórico de reprodução por casal de parasitos é acima

de 600 bilhões de Schistosomas (Gryseels, B. et al., 2006).

Ocorre uma divisão de trabalho entre o casal, onde a fêmea de S. mansoni

concentra toda sua energia metabólica em torno da reprodução, formando e propagando

seus ovos com eficiência. O macho em contato com a fêmea promove o

desenvolvimento do ovário e das glândulas vitelogênicas, ele fornece à fêmea proteção,

alimento e esperma para a fertilização dos oócitos, além de outros fatores químicos

envolvidos na maturação do sistema reprodutor feminino (Fitzpatrick, J.M. et al.,

2006).

Em casos de infecções unissexuais de fêmeas, estas apresentam redução no

tamanho, retração da maturação sexual e o não desenvolvimento dos ovos (Kunz, W.

2001). O mecanismo exato pelo qual o macho influencia a maturação sexual da fêmea

ainda não é bem conhecido, porém vários dados experimentais sugerem que processos

como transporte de biomoléculas, indução de sinalização e regulação transcricional

sexo específica devem ser fundamentais (Fitzpatrick, J.M. et al., 2006).

Figura 1 - Ciclo de vida do S. mansoni apresentado em diagrama esquemático - O parasito coexiste

em três ambientes distintos: o interior do hospedeiro vertebrado, o ambiente aquático e o interior do

hospedeiro invertebrado (moluscos do gênero Biomphalaria). No homem formas larvais

(esquistossômulos B) dão origem a parasitos sexualmente maduros (verme adulto A), os quais se

acasalam e produzem ovos (C) que são liberados no ambiente aquático. Os ovos eclodem (D)

liberando os miracídios infectantes (E) que penetram no caramujo dando origem a numerosos

esporocistos (F). Os esporocistos geram cercárias (G) que saem do caramujo e nadam ativamente

na água a procura do hospedeiro vertebrado. Adaptado de : Introdução à Parasitologia. Wilson, R.

A, 1980. pp13.

1.3) Patologia e controle da esquistossomose

Os sintomas da esquistossomose em sua fase aguda se manifestam através de

pequenas urticárias na região de penetração das cercárias, onde linfócitos e macrófagos

são reunidos como resposta imune primária à invasão do parasito. Dependendo do

número de parasitos e da sensibilidade do hospedeiro vertebrado, este pode desenvolver

a forma toxêmica da doença, que é um processo de hipersensibilidade sistêmica contra

a migração dos esquistossômulos, caracterizada por febre, fadiga, mialgia,

linfadenopatia, tosse não produtiva, eosinofilia entre outros sintomas, que podem

desaparecer em poucas semanas (Gryseels et al., 2006).

Dias

Comprimento em mm

igura 2

- Estágios de desenvolvimento de S. mansoni. O esquema ilustra o desenvolvimento do parasito em

camundongos dividido em 7 estágios. O estágio 0 é caracterizado pela penetração da cercária no hospedeiro,

que ao perder a cauda passa a ser chamada de esquistossômulos. Este processo pode durar cerca de 3 dias e no

quarto dia os esquistossômulos migram em direção aos pulmões. Com 7 dias de infecção, estágio 1, já pode

ser encontrada a forma pulmonar dos esquistossômulos que sofrem durante este estágio um elongamento. No

estágio 2 (15 dias) os esquistossômulos podem ser encontrados na veia porta-hepática, apresentando um

aumento em volume do intestino. O estágio 3 é caracterizado pela organogênese, os machos iniciam o

desenvolvimento das extensões laterais do corpo e das testes. Um estreito útero pode ser visto nas fêmeas

nesta fase. A gametogênese inicia-se no estágio 4, os machos desenvolvem 8 testes e inicia a produção de

espermatozóides. As fêmeas apresentam um pequeno ovário e neste estágio ocorre o acasalamento. No quinto

estágio as proteínas da casca do ovo são sintetizadas e no sexto estágio os vermes adultos migram para as

veias mesentéricas onde ocorre a ovoposição. Figura adaptada de Clegg, J.A., 1965.

Cercária

Formação do

intestino

Forma pulmonar

Casca do ovo

Ovoposição

Organogênese

Gametogênese

As principais lesões na infecção crônica não são devidas aos vermes adultos e

sim aos seus ovos. Somente cerca de 50% dos ovos liberados pela fêmea são

eliminados nas fezes, os demais permanecem retidos nas paredes do intestino e no

parênquima hepático do hospedeiro (Warren, K.S. et al., 1967). Os ovos secretam

enzimas proteolíticas que provocam reações inflamatórias eosinófilicas e

granulomatosas. Na fase crônica pode ocorrer perda de peso, diarréia, dipnéia, dores

abdominais difusa, hipertensão portal e hepatoesplenomegalia. A severidade dos

sintomas está relacionada com a intensidade da infecção, o estado nutricional, a idade, a

carga parasitária, a linhagem do parasito, e com a resposta imune do indivíduo

(Gryseels et al., 2006).

O tratamento da doença é realizado com praziquantel, um fármaco muito

utilizado no combate a esquistossomose que, embora seja seguro e efetivo, não oferece

proteção contra reinfecções em áreas endêmicas (Ismail M et al., 2002). Muitas cepas

de S. mansoni apresentam resistência ao tratamento com este fármaco, porém os

mecanismos utilizados pelo parasito neste processo ainda não estão bem esclarecidos

(Ismail M. e cols., 1999).

Várias medidas de saúde pública têm sido adotadas no controle de doenças

parasitárias tais como: melhoramento de moradias, higiene sanitária e controle dos

vetores. Entretanto, estas abordagens para o controle da esquistossomose têm se

mostrado em muitos casos insuficientes ou pouco efetivas, sendo assim de grande

importância o desenvolvimento de vacinas e novos quimioterápicos.

1.4) Genoma e transcriptoma de S. mansoni

Atualmente o genoma de S.mansoni está estimado em aproximadamente 300

Mb, organizado em oito pares de cromossomos sendo sete pares autossômicos e um par

de cromossomos sexuais. Os machos são homogaméticos (ZZ) e a fêmea

heterogamética (ZW). Uma característica do genoma do parasito é o elevado conteúdo

de DNA repetitivo (40 a 60%), elementos gênicos móveis, microsatélites e

minisatélites, SNPs (Single nucleotide polymorphisms) e íntrons que podem variar em

tamanho de 30 pb a 10 kb. (Tanaka, K., 1995 e Simpsom, A.J.G. et al., 1982).

Em 1994 teve início o Projeto Genoma do Schistosoma, criado através de um

consórcio internacional, tendo como alvo as espécies S. mansoni e S. japonicum, que

foram analisadas separadamente. A iniciativa para a criação deste projeto partiu da

Organização Mundial de Saúde (WHO) juntamente com outras agências de fomento,

com o intuito de promover o desenvolvimento de novas drogas e quimioterápicos (Lo

Verde, P.T. et al., 2004).

Os resultados deste trabalho propiciaram o desenvolvimento de bibliotecas de

cDNA, construção de bibliotecas de cromossomos artificiais de bactérias e leveduras,

mapas físicos parciais dos cromossomos, e a geração de ESTs (Expressed Sequence

Tags) de Schistosoma. As primeiras ESTs foram depositadas por Franco et al 1995,

sendo sequenciadas 607 ESTs de uma biblioteca de cDNA de vermes adultos, onde

foram identificados 154 novos genes, dando início a era de descoberta de genes do

parasito (Lo Verde, P.T. et al., 2004).

Paralelamente ao sequenciamento de ESTs em larga escala, diversos trabalhos

foram publicados descrevendo genes importantes para a biologia do parasito, porém um

grande avanço foi alcançado com a liberação do resultado do projeto Transcriptoma do

S. mansoni realizado no Brasil. Este projeto contou com a participação de um consórcio

de laboratórios conhecido como a rede ONSA (Organization of Nucleotide Sequence

and Analysis), que foi financiado pela FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do

Estado de SãoPaulo).

Cerca de 163.586 ESTs de S. mansoni foram seqüenciadas, cobrindo 92% do

transcriptoma, destas 151.684 foram originadas de minibibliotecas ORESTES (Open

reading frames ESTs) e 11.902 seqüências de bibliotecas normalizadas de vermes

adultos. O número de genes preditos foi de aproximadamente 14.000 genes, sendo 50%

expressos na fase de verme adulto e 1.000 genes com um padrão de expressão estágio-

específica (Verjovski-Almeida, S. et al., 2003). Atualmente, estima-se a existência de

~17.500 genes no genoma do S. mansoni, muitos destes apresentando modulação de

função através de trans-splincing ou splincing alternativo (Brindley, P.J., 2005 e

Wilson, R.A. et al., 2006).

O outro projeto, o Transcriptoma do S. japonicum, foi realizado na China e teve

como resultado cerca de 43.707 ESTs geradas de verme adulto (macho e fêmea) e ovos

de S. japonicum. Esse conjunto de EST’s foi agrupado em 13.131 contigs, sendo que

cada contig é um provável representante gênico do parasito (Hu, W. et al., 2004).

A análise do transcriptoma de S. mansoni e S. japonicum, através da

classificação funcional dos transcritos pelo Gene Ontology (GO), confirma e sugere a

presença de genes associados a eucariotos e processos específicos dos metazoários,

como diferenciação eixo anterior-posterior, dorsoventralidade, epitélio, processo neural,

motilidade, diferenciação sexual e maturação, longevidade, parasitismo, evasão imune e

resposta a stress (Verjovski-Almeida, S. et al., 2003).

Hoje, na era pós genômica, novas ferramentas são utilizadas para validar a

presença e quantificar a abundância dos transcritos sequenciados das diferentes fases do

S. mansoni, possibilitando assim a aplicação do genoma funcional. Experimentos tais

como expressão gênica diferencial por "microarrray”, manipulação do genoma

silenciando genes utilizando RNAi e estudo do proteoma através da separação de

proteínas por eletroforese bidimensional, vêm sendo realizados. Estas inovações

possibilitaram a identificação e caracterização dos genes estágios específicos, bem

como a constatação do envolvimento das vias de modificação pós-traducional durante

um ciclo de vida completo do parasito (Dillon, G.P. et al., 2006).

1.5) Modificação pós-traducional dependente de ubiquitina

Muitos processos biológicos são controlados pelas modificações pós-

traducionais dependentes de ubiquitina e proteínas similares a ubiquitina, dentre eles:

proteólise intracelular, controle do ciclo celular, desenvolvimento embrionário, resposta

a estresse, reparo do DNA, resposta imune, transdução de sinal, biogênese de organelas,

regulação transcricional, endocitose e endereçamento de proteínas (Quesada, V., 2004).

A ubiquitina é uma proteína de 76 resíduos de aminoácidos, presente no citosol,

núcleo e em diversos compartimentos da célula, sendo bastante conservada entre os

organismos eucariotos. Ela se conjuga covalentemente a proteína alvo, através de uma

ligação isopeptídica entre o resíduo de glicina (Gly 76) da ubiquitina, localizado na

região C-terminal e o resíduo de lisina (Lys) do grupo amino da proteína a ser

ubiquitinada (Kim, J.H. et al., 2003). Os sinais para a ubiquitinação nas proteínas alvo

podem ser geneticamente programados, regra do N-terminal, onde as proteínas têm

seqüências de aminoácidos na região N-terminal necessárias para direcionar a sua

ubiquitinação. Uma outra forma de sinalização ocorre por meio da fosforilação

regulando a ubiquitinação das proteínas alvo (Wilkinson, K.D., 2000).

O processo de ubiquitinação de proteínas é catalizado por três enzimas: enzima

ativadora de ubiquitina (E1), enzima conjugadora de ubiquitina (E2) e enzima ligase

(E3). A ubiquitina é ativada pela E1, por uma ligação ATP dependente, formando um

intermediário tio-éster, sendo em seguida transferida ao grupo tio-éster de uma E2

conjugada. Essas E2 transferem a ubiquitina a uma enzima ligase (E3) que se liga a E2 e

ao substrato, como ilustrado na Figura 3 (Pickart, C.M., 2001).

Citosol

Núcleo

Ativação

Transcricional

Lisossomo Peptídeos

Proteas-

soma

26S

Enzimas

Desubiquiti-

nadora

Proteína

alvo

Fusão de

Membrana

Endosso-

precose

Proteína X

Figura 3

– Algumas das várias funções das modificações dependentes de ubiquitina:

(a)

Uma molécula de

ubiquitina livre é ativada pela enzima ativadora de ubiquitina E1 por um mecanismo ATP dependente – passo

(1). Em seguida a ubiquitina é transferida para uma enzima de conjugação E2 - passo (2). O conjugado E2-

Ubiquitina e a proteína substrato associam-se especificamente a uma enzima de ligação E3 e a ubiquitina é então

transferida para a proteína substrato passo (3). Sucessivas conjugações de moléculas de ubiquitina na proteína

alvo geram uma cadeia poliubiquitinada que funciona como sinal para a proteína ser degradada no proteassoma

26S – passo (4). O substrato é degradado em pequenos peptídeos - passo (5) e monômeros de ubiquitina livre são

gerados pela atividade das enzimas desubiquitinadoras (DUB) – passo (6). (b) Proteínas de membrana marcadas

por diubiquitinação para a degradação no lisossomo. (c) Monoubiquitinação ou uma simples modificação por

uma ubiquitina pode marcar proteínas para diferentes destinações subcelulares. (d) A geração de uma cadeia de

poliubiquitina pode ativar a regulação transcricional direta ou indiretamente. CM - corpo muiltivesicular; Pi –

fosfato inorgânico; PPi - pirofosfato inorgânico; Ub - ubiquitina. Figura adaptada de Ciechanover, A., 2005

Núcleo

Proteína Y

As reações de ligação entre as enzimas e a ubiquitina envolvem a glicina do grupo

carboxil terminal da ubiquitina e o resíduo de cisteína das enzimas envolvidas neste

processo.

Um substrato alvo pode ser modificado pela adição de uma, duas ou mais

ubiquitinas. Substratos com quatro ou mais moléculas de ubiquitina ligados no resíduo

de lisina 29 ou lisina 48 são direcionados para a proteólise dependente do proteassoma

26S. A mono e poliubiquitinação no resíduo de lisina 63 está envolvida no processo de

degradação lisossomal, endocitose, reparo de DNA, ativação de quinases e herança

mitocondrial (Kim, J.H. et al., 2003). Numerosas permeases, transportadores,

receptores, histonas e fatores de transcrição são regulados pela monoubiquitinação via

Lys 63 (Kim, J.H. et al., 2003).

O proteassoma 26S é um complexo proteolítico de 2.000 a 3.000 kDa,

constituído por múltiplas proteases diferentes que se associam formando um cilindro

contendo um poro central por onde as proteínas passam para serem degradadas (Figura

4). Ele consiste de uma porção proteolítica central de coeficiente de sedimentação 20S,

e em suas terminações está associada uma ou duas partículas regulatórias 19S

(Ciechanover, A., 2005).

A estrutura cilíndrica central é formada por quatro anéis heptaméricos, dois

anéis periféricos compostos por sete subunidades alfa, e dois aneis centrais compostos

por sete subunidades beta. O proteassoma é o sistema de proteólise mais importante em

eucariotos sendo responsável pela remoção de diversas proteínas regulatórias

envolvidas em funções celulares essenciais (Ciechanover, A., 2005; Jackson, P. et al.,

2000; Tanaka, K. et al., 1998).

As diferentes montagens do proteassoma 20S associado aos reguladores PA28

(Proteassome activator 28), PA700 ou ao PA200 permitem a degradação de

importantes polipeptídeos. PA700 ou 19S é o único ativador que estimula a degradação

de proteínas poliubiquitinadas e este mecanismo é dependente de ATP. O complexo

regulatório 19S é constituído de 17 subunidades ATPásicas e não ATPásicas que se

dividem em dois sub-complexo chamado de tampa e base.

O regulador PA28 também denominado 11S, não reconhece proteínas

ubiquitinadas e não necessita de ATP em seu processo de ativação do proteassoma.

PA28 é um complexo homo ou heterodimérico de aproximadamente 28 kDa contendo

sete subunidades. Ahn, J.Y. et al. (1995) verificaram que PA28 é induzido por

interferon (IFN)γ, sugerindo que este regulador tem importante papel no sistema imune

de vertebrados. A Figura 4 ilustra o proteassoma associado aos reguladores 19S e 11S.

PA200 é constituído de uma cadeia simples de proteínas com aproximadamente

200kDa, ele é o mais recente ativador descoberto, suas propriedades biológicas indicam

seu envolvimento no processo de reparo de DNA (Rechsteiner, M. & Hill, C.P., 2005).

Outro regulador multifuncional do proteassoma é o COP9 signalossoma (CSN),

um complexo constituído por oito subunidades protéicas que são conservadas entre os

organismos. A função bioquímica do COP9 signalossoma não está clara, mas alguns

dados apontam para uma cooperação entre este complexo e a proteólise mediada pelo

proteassoma 26S, implicando na sua participação em processo de desenvolvimento

(Bech-Otschir, D. et al., 2002). Somando-se a estas evidências, Freilich, S. et al., (1999)

demonstraram que o COP9 é essencial para o desenvolvimento de D. melanogaster.

Figura 4

– Esquema representativo do proteassoma associado aos seus reguladores. As possíveis

montagens do centro catalítico 20S com o regulador 19S estão ilustradas em (g) e (h), nas figuras

(i) e (j) estão representados os imunoproteassomas.

1.6) Desubiquitinação

A ubiquitinação de proteínas é um processo reversível, sendo as enzimas

desubiquitinadoras responsáveis pela remoção de ubiquitina dos conjugados

ubiquitinados, em um mecanismo denominado desubiquitinação. Assim como fosforilar

e defosforilar, a ubiquitinação e a desubiquitinação são de extrema importância na

regulação das vias dependentes de ubiquitina, que está relacionada a numerosos

processos celulares.

No princípio da década de oitenta foi caracterizada a primeira atividade

desubiquitinadora, quando pôde ser verificado que a enzima denominada isopeptidase

era capaz de clivar as ligações isopeptídicas de ubiquitina de histona H2A (Matsui, S. et

al., 1982). Desde então um vasto número de DUB’s vêem sendo identificadas, porém

muito pouco é conhecido sobre o mecanismo de ação destas enzimas.

As enzimas desubiquitinadoras (DUBs) estão envolvidas no processamento de

ubiquitina, reconhecendo a ligação peptídica entre os resíduos de glicina e metionina da

cadeia de poliubiquitina. A molécula de ubiquitina é codificada como um transcrito

policistrônico (poliubiquitina) ou em fusão com subunidades ribossomais L40 e S27a.

Estes mRNAs são traduzidos e processados gerando a ubiquitina livre (Hershko, A. &

Ciechanover, A., 1998).

As DUBs regulam de forma negativa a degradação de proteínas

poliubiquitinadas, evitando a proteólise via proteassoma ou vacuolar, aumentando assim

a meia-vida destas proteínas. Elas são responsáveis também pela retirada das cadeias de

ubiquitina ancoradas ao proteassoma 26S, que podem competir com substratos

ubiquitinados pelos sítios de ligação à ubiquitina, além de estarem envolvidas na

remoção de ubiquitina de proteínas que regulam o ciclo celular durante a mitose (Kim,

J.H. et al., 2003; Amerik A.Y. and Hoshstrasser M., 2004). As funções catalíticas das

enzimas desubiquitinadoras estão ilustradas na Figura 5.

Figura 5 – Funções das enzimas desubiquitinadoras: (1) Processamento dos precursores de

Ub. (2) Edição ou recuperação de conjugados ubiquitinados. (3) Reciclagem da Ub ou

oligômeros de Ub dos conjugados proteína/substrato para a degradação. (4) Separação dos

oligômeros de ubiquitina em monômeros. Figura adaptada de Wilkinson, K.D., 2000.

As enzimas desubiquitinadoras são organizadas em 5 grupos de cisteíno-

proteases: UCH (ubiquitin C-terminal hydrolase), USP (ubiquitin-specific protease),

OTU (Ovarian Tumor), MJD (Machado-Joseph diseases protease), o quinto grupo

envolve as metaloproteases JAMM (JAB1/MPN/Mov34, metaloenzima) (Nijman,

S.M.B. et al., 2005).

As proteases específicas de ubiquitina (USP), também denominadas proteases

processadoras de ubiquitina (UBP) ou ubiquitinas carboxil terminal hidrolases 2,

apresentam tamanhos variados e grande complexidade estrutural. Cerca de 90 proteases

constituem este grupo, sendo proteínas de alto peso molecular, 50-300 kDa, que contém

várias regiões conservadas em suas seqüências de aminoácidos, incluindo aquelas em

torno dos resíduos Cys, His e Asp que formam a tríade catalítica característica de USP

(Wing, S.S., 2003 e Hu, M. et al., 2002).

As USPs exibem extensões N-terminal e C-terminal que parecem ter importante

papel na determinação da localização celular e na especificidade/reconhecimento dessas

enzimas pelo substrato. Estas proteases atuam em múltiplos níveis na via da ubiquitina,

sendo responsáveis pela geração de ubiquitina livre através da hidrólise das cadeias não

ancoradas de poliubiquitina e de proteínas precursores de ubiquitina. As UBPs também

Ribossomo

estão correlacionadas com a estabilidade de fatores transcricionais entre outras funções

(Kim, J.H. et al., 2003 e Quesada, V. et al., 2004).

Ubiquitina carboxil-terminal hidrolase (UCH) é o segundo grupo de cisteíno-

proteases composto de proteínas relativamente pequenas, entre 20 a 30 kDa, com

algumas exceções. UCHs têm um domínio catalítico de aproximadamente 230

aminoácidos, que é estruturalmente caracterizado pela presença de uma tríade catalítica

apresentando os resíduos conservados Cys, His e Asp (Kim, J.H. et al., 2003).

As UCHs atuam principalmente na reciclagem de ubiquitina quando esta é

inapropriadamente conjugada (como exemplo, glutationa, poliaminas). Elas também

estão envolvidas no processamento da síntese de ubiquitina, que é traduzida ou como

precursor de poliubiquitina ou fundida ao precursor de proteína ribossomal.

Alguns estudos sugerem um papel para as UCHs em processos específicos

regulados por ubiquitina. Mutações em UCH-L1 (UCH expressa especificamente em

neurônios), foram descritas em dois irmãos com doença de Parkinson (PD). UCH-L1

mutada tem sua atividade DUB reduzida e um polimorfismo neste gene tem sido

relacionado à redução no risco de PD. Nem todos os estudos têm encontrado uma

relação estrita entre a atividade UCH-L1 e PD (Nijman, S.M.B. et al., 2005).

A ataxin-3, uma proteína com domínio MJD (Doença Machado-Joseph),

representa o terceiro grupo de cisteíno-proteases. Instabilidade de um nucleotídeo nas

repetições CAG no gene da ataxin-3 leva a uma condição neurológica hereditária

conhecida como ataxia espinocerebelar tipo 3 ou doença de Machado Joseph. A ataxin-

3 se associa ao proteassoma, participando da via ubiquitina-proteassoma, e apresenta

propriedades típicas das DUBs (Nijman, S.M.B. et al., 2005 e Amerik, A.Y. &

Hochstrasser, M., 2004). Alguns experimentos indicam que a função normal da ataxin-3

está envolvida na regulação transcricional, mas se a atividade desta DUB tem um papel

neste processo não se sabe ao certo.

As proteases OTU (ovarian tumor) compreendem um grupo pontual de cisteíno-

proteases que são homólogas ao gene do tumor ovariano de Drosophila. Otubain-1 e

otubain-2 foram as duas primeiras proteínas OTU onde a atividade DUB foi verificada

in vitro. Cézanne, outra proteína contendo o domínio OTU, regula negativamente o NF-

kB clivando cadeias de poliubiquitina in vitro (Balakirev, M.Y., et al., 2003 e Evans,

P.C., et al., 2003).

O grupo das metaloproteases JAMM/MNP+ pode ser representado por um

constituinte da tampa do proteassoma 26S, a subunidade Rpn11, que é de extrema

importância para a degradação de substratos poliubiquitinados. Outra proteína com

motivo JAMM/MPN+ foi recentemente encontrada, a AMSH (molécula associada com

o domínio SH3 de STAM), que também tem atividade desubiquitinadora (Amerik, A.Y.

& Hochstrasser, M., 2004).

1.7) Modificação pós-traducional dependente de ubiquitina em S. mansoni

Em 2000 foi realizada a primeira caracterização de cDNA codificando para

poliubiquitina em S. mansoni, e foi verificada a expressão do gene SmUbi (Schistosoma

mansoni poliubiquitina) em todas as formas de desenvolvimento do parasito (Guerra-Sá,

R., 2000). Além disso, Castro-Borges, W. (2005), utilizando a técnica de Westen Blot

em gel de proteína bi-dimensional com extratos totais de cercárias, esquistossômulos de

3horas, 3 dias e vermes adultos, confirmou a presença de conjugados ubiquitinados em

todas as fases analisadas. Nas fases larvais, a quantidade de conjugados ubiquitinados

detectados foi consideravelmente superior em relação a fase adulta, sugerindo que a via

de degradação dependente de ubiquitina e proteassoma exercem papel importante nos

processos de remodelagem do S. mansoni.

Tendo como bases as evidências anteriores foi constatada a atividade proteolítica

endógena dependente de ubiquitina e do proteassoma 26S em vermes adultos de S.

mansoni. Experimentos realizados na presença do MG132, inibidor da atividade

peptidásica do proteassoma, mostraram 90% de inibição da proteólise exógena e 80%

da endógena (Guerra-Sá, R. et al., 2005).

Infecção experimental de camundongos Balb-C com cercárias previamente

incubadas com MG132, mostrou uma redução significativa no número dos

esquistossômulos, na carga parasitária e no número de ovos presente nas fezes desses

animais. Sugerindo assim que a inibição transitória do proteassoma de cercárias

compromete o desenvolvimento do parasito no hospedeiro vertebrado. O uso deste

inibidor em parasitos adultos mantidos in vitro também mostrou uma alteração no

pareamento dos vermes (Guerra-Sá, R., 2000).

Analisando os resultados de atividade proteolítica endógena e exógena

dependente do proteassoma 20S e 26S de vermes adultos e cercárias, pôde ser

observado que a taxa de proteólise é aproximadamente 50% menor em cercária quando

comparado a vermes adultos (Guerra-Sá, R., et al., 2005).

Com relação a atividade desubiquitinadora em S. mansoni, Andreolli, A.B.P.

(2005), através de análises in silico, identificou cerca de 32 enzimas desubiquitinadoras,

destas 25 pertencem a família USP e 7 à família UCH. Para a realização desta análise

foram utilizados dados gerados no projeto de sequenciamento do Transcriptoma de S.

mansoni.

Considerando a presença de conjugados ubiquitinados em todas as fases de S.

mansoni, a quantidade relevante destes conjugados durante a fase de esquistossômulos e

também o grande número de DUB’s existentes em diversos organismos, é de

fundamental importância o estudo destas enzimas neste parasito. As DUB’s podem estar

envolvidas em vários processos celulares essenciais para os diferentes estágios de

desenvolvimento do parasito.

2 Objetivos

Objetivos

Analisar a expressão das enzimas desubiquitinadoras 5, -14 e -16 durante o ciclo

do parasito S. mansoni enfatizando o estágio de transformação de cercária em verme

adulto.

2.1 - Objetivos específicos

1) Obter cercária, esquistossômulos de 3 horas, 18,5 horas, 24 horas, 3 dias de cultivo

in vitro, verme adulto e ovos.

2) Obter in silico o cDNA completo para as enzimas desubiquitinadoras 5, 14 e 16 de

verme adulto e sequenciar estes genes.

3) Análisar os níveis de expressão das enzimas DUB5, DUB14 e DUB16 por RT-PCR

semi-quantitativa em cercária, esquistossômulos de 3 horas, 18,5 horas, 24 horas, 3

dias, verme adulto e ovos.

Materiais e Métodos

3 Materiais e Métodos

3.1) Obtenção das formas evolutivas do S. mansoni (vermes adultos, cercárias e

ovos)

O ciclo biológico do S. mansoni, cepa LE é rotineiramente mantido no

Moluscário "Lobato Paraense" do Centro de Pesquisa René Rachou, Fundação

Oswaldo Cruz (Fiocruz) em Belo Horizonte/MG.

Os vermes adultos foram perfundidos do sistema porta-hepático de

camundongos da linhagem Swiss Webster após 50 dias de infecção com

aproximadamente 100 cercárias inoculadas na via subcutânea, conforme descrito por

Smithers S.R. & Terry R.J., (1965).

Os ovos do S. mansoni presentes nos fígados de 30 camundongos infectados

foram obtidos após perfusão dos vermes adultos. Os fígados foram picados e colocados

em um béquer contendo solução salina 1,7% e deixados a 4ºC por 24 horas. Em seguida

o material foi incubado a 37ºC em banho-maria por 2 horas e homogeneizado, com o

auxílio de um liquidificador na rotação máxima por 5 minutos. A velocidade do

liquidificador foi reduzida para a rotação média e nova homogeneização foi realizada

por mais 3 minutos. O homogenato foi lavado através da emissão de jatos de salina

1,7% sob a amostra, utilizando para isto um borrifador. Após a lavagem a mistura foi

passada em duas peneiras próprias para separar os ovos do “macerado” de fígado.

Depois desta etapa a amostra foi acondicionada em 3 cálices de vidro de 500 mL, e

incubada novamente a 4ºC por uma hora para a sedimentação dos ovos. Passada a etapa

de sedimentação, as fibras foram removidas por aspiração, os ovos ressuspendidos em

salina 1,7% e distribuídos em tubos Falcon de 50 mL. Vários processos de lavagens dos

ovos com salina 1,7% foram realizados, seguidos de centrifugação a 4ºC a 1200 x g por

3 minutos e posterior aspiração do sobrenadante.

Os ovos maduros foram separados dos ovos imaturos e dos hepatócitos através

de um gradientes descontínuos de Percoll

(Amersham Biosciences) preparado de

acordo com o seguinte procedimento: 6 mL de Percoll e 4 mL de RPMI, a amostra

contendo os ovos foi cuidadosamente distribuída no gradiente de Percoll. A separação

dos ovos maduros ocorreu devido à diferença de densidade entre ovos maduros (mais

densos), ovos imaturos e restos celulares de fígado (menos denso). Foi realizada uma

centrifugação do gradiente a 1200 x g durante 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi

descartado e os ovos maduros submetidos a sucessivas lavagens com meio RPMI 1640

(INVITROGEN) seguido de centrifugações por 30 segundos a 1200 x g até completa

remoção do Percoll. Os ovos purificados foram estocados a -70°C até o momento do

uso.

As cercárias foram obtidas de caramujos B. glabrata infectados através de um

processo de eliminação induzido artificialmente. Em um béquer com 200 mL de água

declorada aquecida a 28ºC foram colocados 50 caramujos e estes expostos à luz branca

fria em uma estufa a 25ºC. Depois de duas horas de exposição dos moluscos a luz, as

cercárias eliminadas foram recolhidas. Após centrifugação por 10 minutos a 12.000 x g,

uma alíquota das cercárias foi armazenada a -70ºC até o momento de uso.

3.2) Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos in vitro

Aproximadamente 100.000 a 150.000 cercárias foram obtidas segundo o

procedimento anteriormente descrito. Processos de lavagens com água declorada foram

realizados para a limpeza dos resíduos dos caramujos. As cercárias foram transferidas

juntamente com a água declorada para um béquer previamente gelado e após duas horas

de incubação em banho de gelo obteve-se um sedimento. O sobrenadante foi removido

e descartado com o auxílio de uma pipeta e o sedimento de cercárias transferido para 4

tubos do tipo Falcon de 50 mL. Em cada tubo foi adicionado 25 mL de água declorada

e o material foi novamente sedimentado por 15 minutos em banho de gelo. O

sobrenadante foi retirado com o auxílio de uma pipeta e o procedimento repetido por

mais duas vezes ou até o sedimento de cercárias ficar completamente sem resíduos. Na

última lavagem foi adicionado meio de cultura RPMI 1640 (INVITROGEN). Os

sedimentos de cercárias contidos nos tubos tipo Falcon de 50 mL foram concentrados

em um único tubo e o sobrenadante retirado deixando apenas um volume final de 5 mL.

O processo de transformação de cercárias em esquistossômulo foi realizado

utilizando o método descrito por Ramalho-Pinto F.J. et al., (1974). As cercárias,

100.000 a 150.000, contidas em 5 mL de meio RPMI tiveram as caudas quebradas

mecanicamente pela homogeneização com auxílio de um vortex em velocidade máxima

por 3 minutos. A separação dos corpos cercarianos das caudas foi realizada mediante

três lavagens seguidas por sedimentação. Os corpos cercarianos, agora chamados

esquistossômulos, concentraram-se ao fundo do tubo tipo Falcon e as caudas suspensas

no sobrenadante foram descartadas.

Os esquistossômulos foram transferidos para um frasco de cultura de 75 cm

e a

ele acrescentado 30 mL de meio de cultura RPMI suplementado com 100 U/mL de

penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina. Em seguida a cultura foi incubada em estufa

de CO

a 5% a 37°C por 3 horas, tempo necessário para completar a transformação.

Após esse período, 28 mL de RPMI contendo caudas cercarianas foram retirados e

descartados. Os outros 2 mL foram transferidos para dois tubos de poliestireno estéreis

(tipo eppendorf). Os esquistossômulos foram submetidos a sucessivas lavagens (10 a

12) com meio RPMI, seguidas por sedimentação com intervalos de 4 minutos e

remoção das caudas remanescentes suspensas no sobrenadante. Posteriormente todo o

sobrenadante foi removido e o pellet contendo os corpos cercarianos (neste momento os

parasitos foram considerados larvas de 3 horas), sem as caudas, foi estocado em tubo de

poliestireno estéril (tipo eppendorf) e armazenado a -70°C até o momento do uso.

O cultivo dos esquistossômulos durante os tempos 18,5 horas, 24 horas e 3 dias

foi realizado em placas de 6 poços contendo 8 mL do meio rico M169 (Tabela 1) e 10%

de soro fetal bovino. A coleta das larvas após cada período de cultivo consistiu primeiro

na avaliação da esterilidade da preparação (detecção de contaminação por fungos ou

bactérias) com auxílio de microscópio, seguido de aspiração dos esquistossômulos

utilizando pipeta de vidro estéril de 25 mL para tubos Falcon de 50 mL. Os parasitos

foram centrifugados durante 10 minutos a 10.000 x g/4ºC. O resíduo celular contendo

as larvas foi transferido para tubo de poliestireno estéril (tipo eppendorf) de 1.5 mL e

armazenados a -70ºC até o momento de uso.

Tabela 1- Composição do meio 169

Componentes Concentração

Meio líquido BME (Eagle) __

Hidrolisado de lactoalbumina 0,1%

Glicose 0,1%

Hipoxantina 5 X 10

-7

Serotonina 1 X 10

-6

Hidrocortisona 1 X 10

-6

Triiodotironina (T3) 210

-7

Meio Mínimo Vitamina 0,5%

Meio Schneider 5%

3.3) Extração de DNA genômico

Para a extração do DNA genômico de S. mansoni foram utilizadas cerca de

100.000 cercárias. O protocolo adotado foi descrito por Costa P.I. (Tese de doutorado,

1997), apresentando neste trabalho algumas modificações.

As cercárias armazenadas previamente a -70ºC foram ressuspensas em 500 µL

de tampão de extração (Tris 50 mM , EDTA 1 mM, pH 7,5 e 1% de N-Laurilsarcosina).

A amostra foi incubada a 37ºC por 16 horas contendo 50 µL de proteinase K 20

mg/mL. Posteriormente foram adicionados 250 µL de NaCl 5M à amostra e outra

incubação a 65ºC foi realizada por 10 minutos. Para a desproteinização da amostra foi

adicionado 100 µL de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB)/NaCl 10%, após 20

minutos de incubação a 65ºC as proteínas foram extraídas com igual volume de

clorofórmio e separadas por centrifugação a 12.000 x g por 5 minutos. O sobrenadante

foi transferido para outro tubo de poliestireno estéril (tipo eppendorf) e o DNA

precipitado com igual volume de isopropanol, seguido de incubado por 30 minutos à

temperatura ambiente. Depois de centrifugar a amostra por 15 minutos, na temperatura

ambiente a 12.000 x g, o pellet foi lavado uma vez com etanol 70%, foi secado e a ele

adicionado 60 µL de água milli-Q estéril. O DNA genômico foi incubado durante uma

noite a 37° C e na manhã seguinte uma alíquota de 5 µL, analisada em gel de agarose

0,5% em eletroforese a 90 volts. A Figura 6 mostra uma preparação típica de DNA

genômico obtido utilizando o protocolo descrito acima.

A quantificação da amostra foi obtida por espectrofotometria com leitura em

densidade ótica de 260 e 280 nm. A pureza da preparação de DNA genômico foi

estimada utilizando a relação A

260

280

nm.

3.4) Extração de RNA total

Após a obtenção do material biológico (vermes adultos, cercárias, ovos e

esquistossômulos de 3 horas, 18,5 horas, 24 horas e 3 dias) o RNA total foi extraído,

utilizando Trizol (Invitrogen), como descrito abaixo.

Aproximadamente 100 mg de vermes adultos foram homogeneizados em

vortex, na rotação máxima, contendo 1,0 mL de Trizol LS (Invitrogen) e incubados a

temperatura ambiente por 60 minutos. A cada 15 minutos novas homogeneizações em

vortex foram realizadas até a completa solubilização dos vermes. Para que a amostra

não apresentasse contaminação com DNA genômico, a mistura foi passada 10 vezes em

uma seringa descartável (10 mL/25 x 8) com agulha, para fragmentar o DNA,

facilitando assim sua separação do RNA durante os procedimentos de extração. Em

seguida, foram adicionados 200 µL de clorofórmio à amostra e realizada uma agitação

moderada com o auxílio de vortex durante 1 minuto. Posteriormente, uma incubação

Figura 6

- DNA genômico de cercária de S. mansoni

analisado em gel de agarose 0,5% corado com

brometo de etídio. Foram aplicados no gel 5 µl da

amostra de DNA contendo aproximadamente 1,7 µg.

por 20 minutos a temperatura ambiente foi realizada e a amostra foi centrifugada a

12.000 x g durante 10 minutos.

Após centrifugação três fases foram observadas, a fase aquosa foi transferida

para um tubo de poliestireno estéril (tipo eppendorf) e a ela adicionados 500 µL de

isopropanol para a precipitação do RNA total. O tubo foi invertido por três vezes

cuidadosamente, incubado a temperatura ambiente por 30 minutos e centrifugado a

12.000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado

com etanol 70% gelado seguido de nova centrifugação por 10 minutos a 12.000 x g.

Novamente o sobrenadante foi descartado e o RNA foi seco a temperatura ambiente em

fluxo laminar por 15 minutos. O RNA total foi ressuspenso em 30 µL de água tratada

com dietilpirocarbonato (DEPC) e incubado por 10 minutos a 56° C.

Para a extração de RNA total das fases larvais do ciclo do S. mansoni, foram

utilizadas cerca de 150.000 cercárias, 100.000 esquistossômulos e 5.000 ovos. Na

extração de RNA total de esquistossômulos utilizamos glicogênio a 40 µg/mL para co-

precipitar o RNA das amostras juntamente com o isopropanol. E na extração de RNA

total de ovos após a adição do Trizol a mistura foi congelada em nitrogênio líquido e

levada ao vortex por três vezes para romper as cascas dos ovos e garantir uma boa

extração do RNA.

A qualidade do RNA total foi avaliada em gel de agarose-formaldeído 1%. Para

a preparação do gel, inicialmente 600 mg de agarose foram dissolvidos em 40,0 mL de

água DEPC autoclavada. Em outro recipiente, foram adicionados: 12,8 mL de água

DEPC, 6,0 mL de MOPS 10X concentrado (MOPS, acetato de sódio diidratado, EDTA

tetrassódico, água DEPC completando para um volume final de 500 mL), 1,2 mL de

formaldeído e 0,5 µL de brometo de etídio. A solução foi misturada à agarose e deixada

em repouso até completa solidificação. As amostras foram previamente desnaturadas

em tampão (formamida, formaldeído, MOPS 1X, azul de bromofenol, água DEPC e

brometo de etídio), incubadas por 15 minutos a 65°C, deixadas em banho de gelo

durante 3 minutos e aplicadas no gel. As condições de realização da eletroforese foram:

80 volts em tampão de corrida (MOPS 1X) por aproximadamente 75 minutos. A Figura

7 mostra uma preparação típica de RNA total, obtido como descrito acima.

A quantificação das amostras também foi realizada por espectrofotometria, com

leitura em densidade ótica de 260 e 280 nm e a pureza dos RNAs totais foi estimada

utilizando a relação A

260

280

nm.

3.5) Oligonucleotídeos iniciadores específicos para os genes DUB5, DUB14 e

DUB16 (deubiquitinating enzyme)

Os oligonucleotídeos iniciadores específicos para os genes DUB5, DUB14 e

DUB16 (deubiquitinating enzyme), foram idealizados no programa GenneRunning. As

seqüências utilizadas são originadas do banco de dados da FAPESP (Fundação de

Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo), que foi criado através do consórcio de

sequenciamento do transcriptoma de S. mansoni.

Durante a análise das seqüências optamos por desenhar iniciadores, cujos

produtos, cobrissem a maior parte das seqüências das enzimas desubiquitinadoras em

estudo. Na Tabela 2 estão listados os iniciadores gerados pelo programa Genne

Running e seus respectivos número de acesso (Contig).

Tabela 2 - Oligonucleotídeos iniciadores gerados de DUB5, DUB14 e DUB16

Enzima Contig

F (direto)

R (Reverso)

Produto

Esperado

(nt)

DUB 5

607508.1

(F) 5'ACAAGCACACAAGAGCAG3'

(R) 5'ATCTTCCACTGATGCTGG3'

550

DUB 14

609068.1

(F) 5'GCTTATTCCACGGAAGAC3’

(R) 5'GTTGCAATTCAGGCGTAC3'

844

DUB 16

608180.1

(F) 5'GGCTGTTTAGATCAGTGC3'

(R) 5'GGGAACAGAACAGAAAGG3'

882

Figura 7

– Extração de RNA

total das fases evolutivas de S.

mansoni. Gel de

agarose/formaldeído 1%

contendo em cada canaleta

aproximadamente 5 µg de RNA

total. (E) abreviatura de

esquistossômulos e (h) horas.

Cercária

E 3h

E 18,5h

E 24h

E 3Dias

Verme adulto

Ovos

Para validar os iniciadores gerados, PCR’s (Polimerase Chain Reaction) foram

realizadas para amplificar os possíveis genes das enzimas desubiquitinadoras 5, 14 e

16. O DNA genômico de cercária foi utilizado como DNA molde para a reação.

Cada reação de amplificação foi realizada em tubo ependorff de 200µl,

contendo aproximadamente 350 ng de DNA genômico, 10 mM de cada dNTP’s (dATP,

dCTP, dTTP, e dGTP - Promega), 50 mM de MgCl

, 5 picomoles de cada

oligonucleotídeo (direto e reverso), 2,5 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e

1X do tampão PCR 10X concentrado sem Mg

; completando o volume da reação com

água milli-Q para 50 µl.

Depois de vários testes as temperaturas de anelamento das DUB’s foram

padronizadas em 49ºC para DUB 5 e DUB 16, e 47ºC para DUB 14. A seguinte

ciclagem foi utilizada nas reações de amplificação: após uma desnaturação inicial de 2

minutos a 95ºC um programa de 35 ciclos foi estabelecido, com desnaturação a 95ºC

por 1 minuto, anelamento a 49ºC (DUB 5 e 16) ou 47ºC (DUB 14) por 1 minuto,

extensão por 90 segundos a 72ºC e uma elongação final de 6 minutos a 72ºC.

Os produtos das PCR’s foram aplicados em gel de agarose 1,2% (90 volts – 75

minutos), a temperatura ambiente, juntamente com o padrão de peso molecular 100pb

DNA Ladder (Invitrogen). O gel foi corado com brometo de etídio, observado ao

transiluminador (Vilber Lourmat) e fotografado.

3.6) RT-PCR (Reverse- Transcription Polimerase Chain Reaction)

Para a confirmação dos genes preditos DUB 5, DUB 14 e DUB 16, através do

sequenciamento, foi obtido o cDNA a partir de mRNA do verme adulto de S. mansoni.

As técnicas utilizadas para a obtenção deste cDNA estão detalhadas a seguir.

A partir do RNA total obtido de verme adulto foi sintetizada uma fita simples de

cDNA pela atividade da enzima transcriptase reversa (Thermoscript RT- PCR System -

Invitrogen), seguindo as recomendações dadas pelo fabricante. Inicialmente foram

utilizados aproximadamente 5 µg de RNA total, 50 pmol de oligodT, 10 mM de dNTPs

e água livre de RNAse para um volume final de 10 µL. A desnaturação do RNA foi

realizada através da incubação da mistura a 65°C em termociclador (ThermoHybaid)

durante 5 minutos, seguida de banho de gelo por 1 minuto. Em seguida, foi adicionado

o tampão da enzima, 0,1 M de DTT (ditiltreitol) e 15 unidades da enzima transcriptase

reversa. Posteriormente, essa mistura foi incubada em termociclador a 37°C durante 60

minutos, seguida de outra incubação a 85°C por 5 minutos. Finalizando a reação foi

acrescentado 1,0 µL de RNAse H e a amostra incubada por 20 minutos a 37ºC para a

digestão do RNA utilizado como molde. A amostra foi estocada a -20°C até o momento

do uso.

No intuito de obter o cDNA fita dupla, amplificações foram realizadas

utilizando 2µL do cDNA de verme adulto de S. mansoni, combinados com os

oligonucleotídeos específicos para a amplificação dos genes DUB 5, DUB14 e DUB

16. Nestas reações de amplificações foram utilizados os parâmetros previamente

estabelecidos para os genes de DUB, como descrito no item 3.5.

3.7) Purificação e clonagem dos produtos das PCR’s

Os produtos das PCR’s gene específicas foram purificados através da adição de

1/10 de acetato de sódio 3M pH 7.0 por tubo e dois volumes de etanol absoluto, sendo

em seguida incubados a -20ºC por 30 minutos. Após centrifugação a temperatura

ambiente por 10 minutos a 12.000 g, o sobrenadante foi descartado e o pellet lavado

com 500µl de etanol 70%. Depois de centrifugado nas mesmas condições que a etapa

anterior, o etanol 70% foi descartado e o pellet ressuspendido em 50 µl de água milli-Q

estéril.

As reações de ligação dos produtos de PCR purificados DUB5, DUB14 e

DUB16 ao vetor pGEMT Easy (Promega) foram realizadas conforme orientações do

fabricante. Foram utilizados 3 µL do produto de PCR (150 ng/µL) por reação de

ligação que foi incubada por 16 horas a 4°C.

3.8) Obtenção de células competentes para transformação

As bactérias E.coli – DH5 α utilizadas em experimentos de transformação

foram tornadas competentes de acordo com o método Pipes (Hanahan, D., 1985).

Bactérias E.coli – DH5 α não competentes, armazenadas a -70°C foram

descongeladas em banho de gelo e 50 µl foram expandidos em 5 mL de meio não

seletivo (sem antibióticos) Luria-Bertani caldo (10 g de NaCl; 5 g de extrato de

levedura; 10 g de tryptona). Este meio foi suplementado com 50 µL de MgSO

1 M, 50

µL de MgCl

1 M e incubado a 37°C por 16 horas sobre agitação orbital de 200 x g

(agitador - B. Braum Biotech International). Uma alíquota de 250 µL desta cultura foi

expandida em um tubo tipo Falcon contendo 50 mL de meio SOB (20 g triptona, 5 g

extrato de levedura, 0,58 g NaCl, 0,2 g KCl pH 7,5, com KOH para 1 litro), onde foi

adicionado 250 µL de MgSO

1 M e 250 µL de MgCl

1 M. A cultura de bactérias foi

incubada a 37°C sob agitação orbital de 270 x g, por 2 horas, ou até atingir uma leitura

em densidade ótica de 600 nanômetros (espectrofotômetro Metrolab 1700 U.V. visível).

Ao atingir DO 600 entre 0,4 e 0,6 nm a cultura foi incubada em banho de gelo por 30

minutos e centrifugada a 4°C 3.000 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado

e o precipitado celular ressuspendido em 10 mL de tampão Pipes (CaCl

60 mM, 100

mL de água destilada, 10 mM Pipes, 15% de Glicerol pH 7.0) gelado. A suspensão de

células foi novamente centrifugada a 4°C 2.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante

descartado, esta etapa foi repetida por mais duas vezes. As células foram

ressuspendidas em mais uma vez em tampão Pipes e incubadas em banho de gelo por

30 minutos, após este intervalo outra centrifugação a 4°C 2.000 x g por 10 minutos foi

realizada. O precipitado bacteriano foi resuspendido com 1,2 mL de tampão Pipes,

alíquotas de 200µl foram colocadas em tubo de poliestireno estéril (tipo eppendorf) e

mantidas no gelo para proceder à transformação.

3.9) Transformação de bactérias E. coli DH5 α

αα

Os plasmídios recombinantes foram introduzidos em bactérias competentes da

linhagem DH5α como descrito a seguir.

Aos tubos de poliestireno estéril (tipo eppendorf) contendo as células E.coli

DH5 α competentes foram colocados, em cada tubo, aproximado de 5 µL da construção

plasmidial pGEMT-Easy/DUB5, pGEMT-Easy/DUB14 e pGEMT-Easy/DUB16 e

levados a banho de gelo por 30 minutos seguido por um choque térmico de 42°C por

exatamente 90 segundos e novamente incubados no gelo por 2 minutos. Foi adicionado

1 mL de Luria-Bertani caldo (LB caldo) por tubo e as amostras incubadas por 90

minutos a 37°C sob agitação orbital de 270 x g. Após a incubação 100µl da cultura foi

plaqueado em Agar Luria – Bertani (LB) contendo 100 µg/mL de ampicilina, IPTG 200

mg/mL e 40 mg/mL de Xgal (LB-XIA), de acordo com Maniatis. As placas foram

incubadas a 37°C durante a noite e os clones recombinantes foram identificados pela

seleção azul/branca.

Controles negativos com o plasmídio sem o inserto foram preparados em

paralelo para descartar a possibilidade de contaminação e um controle positivo que

atesta a eficiência das células competentes foi realizado utilizando o plasmídio PUC 18.

As colônias brancas que cresceram foram coletadas isoladamente e inoculadas

em 1 mL de LB caldo contendo 100 µg/mL de ampicilina em tubos de poliestireno

estéreis (tipo eppendorf) e incubados a 37°C sob agitação orbital de 220 x g durante a

noite. Em seguida, após adição de 30% do volume de glicerol, foram armazenadas a -

70°C.

Para verificar a presença dos insertos nos transformantes, PCR das colônias

foram realizadas utilizando como DNA molde cerca de 2 µl da cultura de cada clone

obtido. Os produtos das PCR’s foram aplicados em gel de agarose 1,2% corado com

brometo de etídio que está representado na Figura 8.

3.10) Mini-preparação dos plasmídios recombinantes

Cerca de 50 µL de cultura de cada clone recombinante obtidos como descrito

anteriormente foram crescidos em 5 mL de LB/ampicilina, durante a noite sob agitação

orbital a 37°C. Aproximadamente 3 mL foram retirados da cultura bacteriana de cada

clone, transferidos para tubos de poliestireno e centrifugados a 14000 x g a temperatura

ambiente por 3 minutos. Os precipitados foram homogeneizados em 300 µL de

GTE/RNAse (500 mM TRIS-HCl; 10 mM EDTA; 100 µg de RNAse A; pH 8,0) e

DUB 5 DUB 14 DUB 16

Figura 8

– PCR das colônias. Nas

canaletas de 1 a 5 foram aplicadas

alíquotas dos produtos de PCR de 5

transformantes contendo o gene DUB 5.

Nas canaletas 6 a 10 pode ser verificada a

presença do gene DUB 14 nos

transformantes e de 11 a 15 também há

amplificações para o gene DUB 16. PM –

100pb (Invitrogen)

1 2 3 4 5 PM 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

incubados durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente foram

adicionados em cada tubo 300 µL de NaOH/SDS (200 mM NaOH e SDS 1%) e nova

incubação, agora em banho de gelo, foi realizada durante 5 minutos. Em seguida, foram

adicionados 300 µL KOAc (acetato de potássio 3 M em pH 5,5) à mistura que foi

incubada novamente em banho de gelo por 5 minutos e centrifugada a 4°C durante 10

minutos a 14000 x g. Os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos onde foram

adicionados 500 µL de isopropanol para a precipitação dos DNAs plasmidiais. As

amostras foram incubadas a temperatura ambiente por 20 minutos e centrifugadas

novamente a 14000 x g por 15 minutos. Após o descarte dos sobrenadantes os pellets

foram lavados com etanol 70% e centrifugados durante 5 minutos a 14000 x g. Os

sobrenadantes foram descartados, os precipitados secos a temperatura ambiente e

ressuspensos em 50 µL de água milli-Q. Uma alíquota de 5 µL de DNA plasmidial

obtido para cada clone foi aplicada em gel de agarose 0,8%. A Figura 9 mostra uma

preparação típica, utilizando o protocolo descrito acima.

3.11) Sequenciamento

Para determinar a seqüência de nucleotídeos de DUB5, DUB 14 e DUB 16

inseridas nos plasmídios recombinantes pGEMT Easy, foram realizadas reações de

sequenciamento segundo os procedimentos descritos no manual de instrução do

fabricante do Kit BIG-DYE Terminator 3.0 (Applied Biosystems), que segue o método

de Sanger (1977).

Os oligonucleotídeos iniciadores M13, direto (GTAAAACGACGGCCAGT) e

reverso (CAGGAAACAGCTATGAC) foram utilizados para a amplificação em

termociclador por 40 ciclos, nas seguintes condições: 95ºC por 5 segundos, anelamento

do iniciador a 50ºC por 20 segundos e extensão a 65ºC por 4 minutos.

Figura 9

– Mini-preparação analisada

em gel de agarose 0,8% corado com

brometo de etídio.

As amostras foram precipitadas para remover os ddNTPs não incorporados.

Inicialmente, em cada amostra, foram adicionados 100 µL de isopropanol 75%, seguido

de uma incubação de 15 minutos a temperatura ambiente. Decorrido este tempo, elas

foram centrifugadas por 50 minutos a 4.000 x g 4ºC. Posteriormente, o sobrenadante foi

descartado e ao precipitado foram adicionados 150 µL de etanol 70%, outra

centrifugação de 10 minutos foi realizada nas mesmas condições descritas acima. O

sobrenadante foi descartado e os dois passos anteriores repetidos. As amostras foram

secas por 30 minutos a 37°C, ressuspensas em 10 µL de formamida, desnaturadas a

96°C e analisadas no seqüenciador automático de DNA ABI-3100 (Applied

Biosystems).

3.12) Análise computacional das seqüências

As seqüências obtidas no sequenciamento foram submetidas à busca de

homologia em relação a nucleotídeos e aminoácidos utilizando os algoritmos BLASTn

e BLASTp respectivamente, que estão disponíveis no site (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Também foi utilizado o algoritmo BLAST do banco de dados S. mansoni GeneDB

(www.genedb.org) e do MEROPS (www.merops.sanger.ac.uk) que é um banco de

dados contendo somente seqüências de peptidases. Para a identificação dos domínios de

aminoácidos conservados foi utilizado o banco de dados pfam disponível no site

www.sanger.ac.uk/cgi-bin/Pfam e Interpro (www.ebi.ac.uk/interpro/). O alinhamento

das seqüências de DNA e proteínas preditas em relação aos outros organismos foi

realizado utilizando o algoritmo ClustalW, disponível no site (www.ebi.ac.uk/clustalw).

3.13) Análise da expressão de DUB 5, DUB 14 e DUB 16 durante as fases de S.

mansoni

Os cDNAs de cada fase do S. mansoni codificantes para as proteínas DUB5,

DUB14 e DUB16 foram obtidos e a análise semi-quantitativa destes genes realizada

pela técnica de RT-PCR.

A partir dos RNAs totais obtidos foram sintetizadas uma fita simples de cDNA

para cada uma das fases (verme adulto, cercária, ovo e esquistossômulo de 3 horas,

18,5 horas, 24 horas e 3 dias) como descrito no item 3.6.

Para obter os cDNAs fita dupla, amplificações foram realizadas utilizando 2µL

do cDNA de cada fase de S. mansoni, combinados com os oligonucleotídeos

específicos para a amplificação dos genes DUB 5, DUB 14, DUB 16 (Tabela 2) e

também oligonucleotídeos dos genes do proteassoma COP9S3, RPN9 e alfa 5,

utilizados para comparação, cujas seqüências, contigs, temperatura de anelamento e o

produto esperado estão indicados na Tabela 3.

Tabela 3 - Oligonucleotídeos utilizados como controle neste trabalho. Os clusters

foram recuperados do banco de dados da FAPESP do projeto ONSA:

Gene Contig

F (direto)

R (Reverso)

Temperatura

de anelamento

ºC

Produto

Esperado

(nt)

Alfa 5

607745

(F) 5’CTCACCAGCTTCATCATG3’

(R) 5’CCAACCATCATAGATCCC3’

50 582

COP9

608930

(F) 5’AGTCCTCAGGATTGTTAGATCG3’

(R) 5’GCGATATCTGTCTAATGGTGTC3’

839

RPN9

604757

(F) 5’TTAAATCTGCTTGTTCCG3’

(R) 5’CAAATCGAAGTATGATGG3’

45 409

As condições em que estas amplificações foram realizadas, concentrações dos

reagentes (Taq, dNTP’s, tampão) e ciclagem, são as mesmas descritas no item 3.6. Os

produtos das PCR’s foram analisados em géis de agarose 1,2% corado com brometo de

etídio. Posteriormente, os géis de agarose foram analisados através do programa

Quantity One, que avalia a intensidade das bandas no gel e desta forma quantifica em

valores numéricos a expressão dos mRNAs.

4 Resultados

4.1) Análise computacional das seqüências de cDNA codificadoras para as enzimas

desubiquitinadoras

4.1.1) Enzima desubiquitinadora 5

A seqüência de DUB5 gerada pelo sequenciamento foi submetida a análises

computacionais em vários bancos de dados como descrito a seguir.

Com o intuito de aumentar o código aberto de leitura, ORF (open reading frame)

da proteína predita analisada, a seqüência foi estendida em seu início 5’ e no final 3’.

Para isto, foi realizado um BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) da seqüência,

utilizando o banco de dados de Schistosoma mansoni disponível no GeneDB (Sanger &

Welcome Trust). Esta ferramenta busca entre as seqüências previamente depositadas no

banco de dados, aquelas que têm identidade/similaridade significativa com a seqüência

submetida à análise. A seqüência do GeneDB que apresentou 100% de identidade com o

produto do sequenciamento, o contig Smp_069960, foi utilizado para promover a

extensão da seqüência de DUB5. A partir deste momento a seqüência estendida foi

chamada de SmDUB5 e utilizada nas análises subseqüentes (Apêndice item 1.1).

O contig Smp_069960 é derivado de seqüência genômica, assim sendo

investigamos também a existência de regiões não codificadoras em SmDUB5, utilizando

para isso o próprio banco cuja seqüência está deposita no GeneDB. Como resultado,

observamos que a seqüência genômica é constituída de 11 éxons e 10 íntrons. O

tamanho dos íntrons varia entre 680 a 5700pb, o desenho da seqüência contendo os

íntrons e éxons está apresentado no Apêndice item 3.1.1.

As análises seguintes foram realizadas utilizando o NCBI (National Center of

Biotechnology Information), utilizando o programa ORF finder que permitiu verificar

que a seqüência estudada apresenta janela de leitura codificando para a proteína DUB5.

A Figura 10 mostra a seqüência de nucleotídeos e aminoácidos da ORF da proteína

predita SmDUB5.

A localização dos domínios conservados na seqüência predita para a enzima

desubiquitinadora 5 foi realizada utilizando o programa Pfam Domain, que compara as

seqüências de aminoácidos e denomina os motivos conservados. Também foi utilizado

o programa InterPro, de forma a aumentar a confiabilidade de nossos resultados. O

InterPro é uma ferramenta que integra vários bancos de dados dentre eles o Pfam

1441 cgttttggtgtggaagaacgcctacaatgtggtttgacaaataag

R F G V E E R L Q C G L T N K

1486 gtctcgtacaaaactgatcatgaatggattctttcagttccagtt

V S Y K T D H E W I L S V P V

1531 ccaatggaagcggtaacgaatcaaaaagcattagacaattatgag

P M E A V T N Q K A L D N Y E

1576 aaacgacgtgctgacgctgagttaaatggtatacatttatcacct

K R R A D A E L N G I H L S P

1621 gaagaggttgtacgaccaattattcctatggaagcttgcctgtcg

E E V V R P I I P M E A C L S

1666 gcttgggctcaaacagaacgaattactgattttaaaacaccagca

A W A Q T E R I T D F K T P A

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856 ggtattgatgtaatgcttatgcaaaaaaccgataaaacaatggcc

G I D V M L M Q K T D K T M A

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1081 gcctatcaattaccagtttggtgtgaggaagcattggatcaattc

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1216 tggctagttccaaataattttagtcatactactacaggtggccct

W L V P N N F S H T T T G G P

1261 gtgcctattctcccgggtatacgtccaattttgtttcgtcgatta

V P I L P G I R P I L F R R L

1306 atgggtgctcataactccacatttgccacaagacagcaacaagat

M G A H N S T F A T R Q Q Q D

1351 gcttgcgaatttttaatatatctattagatttattagaacaaaaa

A C E F L I Y L L D L L E Q K

1396 gccaataaacaggaacacggaaaagtacatccaagtaatgtgatg

A N K Q E H G K V H P S N V M

Figura 10

– Seqüência da ORF predita pelo programa ORF finder de SmDUB5, janela+1 contendo 916 resíduos de

aminoácidos. A seqüência de nucleotídeos inicia no nucleotídeo 1 e termina no nucleotídeo 2751, ela está

representada em letra minúscula, a seqüência de aminoácidos está representada em letra maiúscula.

Domain, SMART, UniProt, Prosite, TIGR, PANTHER, ProDom, Gene 3D, dentre

outros.

Para a proteína predita SmDUB5 foi verificada a presença dos quatro domínios

ligados a ubiquitina de isopeptidase T ou USP5. São os domínios zf-UBP, que tem

início no aminoácido 205 e término no aminoácido 280, o domínio UCH, que inicia no

resíduo de aminoácido 329 e termina no resíduo 906, e dois domínios associados à

ubiquitina (UBA), um iniciando no aminoácido 670 e terminando no 710 e outro

iniciando no 745 e terminando no aminoácido 784. Os quatro domínios encontrados em

SmDUB5 têm homologia com o domínio UBP14 de S. cerevisiae, dados estes

condizentes com a literatura onde Amerik, A.Y. et al., (1997) verificou que USP5 de

humano é homóloga a Ubp14 de S. cerevisiae (Figura 11 e Apêndice item 2.1).

A seqüência foi submetida à busca de similaridade com outras seqüências de

aminoácidos depositadas do GeneBank (NCBI), utilizando o algoritmo BLASTp, os

resultados mais significativos foram selecionados e apresentados resumidamente na

Tabela 4.

A seqüência de SmDUB5 apresentou aproximadamente 40% de identidade em

relação às seqüências dos demais organismos e todas mostraram similaridade com

USP5. Em relação à S. japonicum SmDUB5 apresentou 90% de identidade indicando

uma alta similaridade entre as USP5 das duas espécies de Schistosoma.

Figura 11 - Representação esquemática da localização dos domínios conservados em SmDUB5. O domínio zf-

UBP está destacado em azul, o domínio UCH (Peptidase C19B) em vermelho.e de verde está representado a

localização do domínio UBP14.

Tabela 4 - Seqüências de organismos que apresentam gene ortólogo a SmDUB5

Número de acesso Organismo E Value

Score

(Bits)

Identidade (%)

AAP36190.1 Homo sapiens

0.0 657 40

XP001063371.1

Rattus norvegicus

0.0 655 40

NP038728.1

Mus musculus

0.0 652 40

XP001163218.1

Pan troglodytes

0.0 643 39

NP647773.1

Drosophila melanogaster

-170

602 38

AAX28515.2

Schistosoma japonicum

-123

447 90

NP491765.2

Caenorhabditis elegans

-96

357 29

NP596085.1

Schizosaccharomyces pombe

-80

303 27

Também foi realizado BLAST utilizando o banco de dados específico de

peptidases, o MEROPS. Este programa identifica, alinha a seqüência a ser analisada

com aquelas previamente depositadas e classifica a seqüência protéica em Clan, família

e subfamília. Do resultado do BLAST, foram selecionadas as entradas no banco de

dados de alguns organismos e suas seqüências de aminoácidos foram recuperadas. As

seqüências foram alinhadas no programa ClustalW com a seqüência da enzima

desubiquitinadora em questão pesquisada. Após o alinhamento, através do programa

Boxshade foi possível analisar a identidade da proteína de estudo em relação às

proteínas de outras espécies. Na Figura 12 está apresentado o alinhamento entre

SmDUB5 e USP5 de outras espécies.

O alinhamento através do MEROPS apresentou em torno de 40% de identidade

entre a proteína DUB5 de S. mansoni e USP5 de outras espécies, uma delas foi a

espécie Leishmania major que é um parasito intracelular obrigatório de humano.

Através do BOXSHADE é possível observar que vários resíduos de aminoácidos

permaneceram conservados nestas proteínas ao longo da evolução. O alinhamento entre

USP5 de mamíferos mostrou identidade próximo de 90%.

Através do BLAST

é possível identificar seqüências de amin

oácidos de diversos organismos ortólogas a

seqüência de SmDUB5. A similaridade entre estas seqüências é medida pela porcentagem de identidade que

indica os aminoácidos idênticos na região de alinhamento das seqüências analisadas pelo programa. Na tabela

estão apresentados os resultados do BLASTp de alguns organismos.

4.1.2) Enzima desubiquitinadora 14

Para DUB14 a seqüência obtida com o sequenciamento foi submetida às

mesmas análises descritas no item 4.1.1. A seqüência nucleotídica de DUB14 foi

Figura 12

– Alinhamento da seqüência SmDUB5 com seqüências ortólogas de USP5. O programa BOXSHADE

indica a similaridade (cinza claro) e identidade (cinza escuro) entre os aminoácidos das seqüências analisadas.

Número de acesso: MER48703 Leishmania major, MER05430 Schizosaccharomyces pombe, MER05446

Caenorhabditis elegans, MER02066 Homo sapiens, MER56266 Pan troglodytes, MER05459 Mus musculus,

MER61937 Rattus norvegicus, MER11185 Drosophila melanogaster.

estendida, utilizando a entrada Sm00289 do GeneDB que apresentou 100% de

identidade, o resultado, a seqüência SmDUB14 obtida, pode ser verificado no apêndice

item 1.2. Não foi possível fazer inferência sobre a presença ou não de regiões não

codificadoras para DUB14 em S. mansoni. Em nossas análises não foi encontrada a

seqüência genômica que cobrisse a proteína aqui estudada.

A ORF predita para a proteína SmDUB14 e os domínios conservados foram

identificados como descrito anteriormente e apresentados nas Figuras 13 e 14

respectivamente. A análise realizada no Pfam Domain mostrou a presença do domínio

conservado UCH localizado nos 382 aminoácidos iniciais da seqüência. O mesmo

resultado pode ser verificado no InterPro que também caracterizou a seqüência

apresentando o domínio UCH-2 (E-value 2

e-398

), tendo similaridade com seqüência

depositada no banco de dados Prosite (Apêndice item 2.2).

Figura 14 – Representação esquemática da localização dos domínios conservados em SmDUB14. O domínio

UCH (peptidase C19A) está destacado em vermelho.

668 cttattagtcggcttccagcttacctatgtattcattttgttcgt

L I S R L P A Y L C I H F V R

713 ttcttctacaaggaagataaacagataaatgctaagattttaaag

F F Y K E D K Q I N A K I L K

758 gatgtaaaatttccactaacattggatatgcacgaattttgtacg

D V K F P L T L D M H E F C T

803 cctgaattgcaacagaaattactacccatgcgtgaaaaacagcgc

P E L Q Q K L L P M R E K Q R

848 cttaaagaagatgaggtggccaatccctcaagccaaacaaatact

L K E D E V A N P S S Q T N T

893 ttcaaaagtaaaccagattctgtacaacctgacccattccaaaat

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938 cctgacttgtacgagcctaactttttcgctgatgatcccggttcg

P D L Y E P N F F A D D P G S

983 aataactctgggtactacgaacttcaaggtgttttgagccaccaa

N N S G Y Y E L Q G V L S H Q

1028 ggtagaacaagtaccagtgggcattatgttgcttgggtgaaaaaa

G R T S T S G H Y V A W V K K

1073 caaggaatgtggtttaaatttgatgacgatcgtgtcagccaggtt

Q G M W F K F D D D R V S Q V

1118 acctcagaagatattttgcgcttatctggaggtggtgattggcat

T S E D I L R L S G G G D W H

1163 tgtgcatacatactgttatatggacctcacttcataaggaagaat

C A Y I L L Y G P H F I R K N

1208 gcatgcaacgatccttctggaagtaccgtatga 1240

A C N D P S G S T V *

38 atgaacgctgctgtccaattgcttttctcaattccagaattgcgt

M N A A V Q L L F S I P E L R

83 atagctttgcagatatgccgttttccccaaacttcaccggattct

I A L Q I C R F P Q T S P D S

128 ccgaatcttggttccttatgtgaaagtttgaagtttttgttcaat

P N L G S L C E S L K F L F N

173 tccctaagcaaaactgaaaaaccggttactcctctgctcttcttg

S L S K T E K P V T P L L F L

218 acttgcttgcacagtgtttgtccgcagttcgccgcacgtgcatcg

T C L H S V C P Q F A A R A S

263 tcttctgatgcaagtaaatccgctccaggtgctctatctatgatt

S S D A S K S A P G A L S M I

308 tcccgtggcttcgaacaacaagatgctagtgaatgttggacagag

S R G F E Q Q D A S E C W T E

353 ctaatcagagcactacaaagtagcaagattgattctcaagtttat

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398 gcgtcaacagtgagtttgcctccaagttttcttacaacttctcaa

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W N P V D R F L T G Q L S C K

488 cttagatgtactgaatcagatgaacccgaaacagatagtctagaa

L R C T E S D E P E T D S L E

533 acatttactcaactttcttgcttcatgcatcaagatgtaaagtat

T F T Q L S C F M H Q D V K Y

578 ttgattactggtattcgaaatggattgacgggaaatctaactaag

L I T G I R N G L T G N L T K

623 cattcatctttgctggatcggaatgcagtatataaacgcgagtct

H S S L L D R N A V Y K R E S

Figura 13

–

Seqüência da ORF p

redita pelo programa ORF finder

DUB

14,

janela

conten

do 400

aminoácidos. A seqüência de nucleotídeos inicia no nucleotídeo 38 e termina no nucleotídeo 1240 e está

representada em letra minúscula, a seqüência de aminoácidos está representada em letra maiúscula.

Como resultado do BLASTp (NCBI) realizado para SmDUB14, foi possível

observar aproximadamente 45% de identidade desta seqüência em relação às seqüências

dos demais organismos ortólogos a USP14. Foi verificado também 86% de identidade

entre S. japonicum e SmDUB14 indicando alta similaridade entre as USP14 das duas

espécies. Na Tabela 5 estão apresentados resumidamente os resultados mais

significativos do BLASTp de SmDUB14.

Tabela 5 - Seqüências de organismos que apresentam gene ortólogo a SmDUB14

Número de acesso Organismo E Value

Score

(Bits)

Identidade (%)

EAX01735.1

Homo sapiens

-88

329 47

NP001038961.1

Pan troglodytes

-88

329 47

NP001008302.1

Rattus norvegicus

-87

326 46

NP001033678.1

Mus musculus

-86

323 45

NP609377.1 Drosophila melanogaster

-79

297 43

NP497006.1

Caenorhabditis elegans

-58

228 34

NP594117.1

Schizosaccharomyces pombe

-58

227 37

AAX27253.2

Schistosoma japonicum

-47

192 86

XP844529.1

Trypanosoma cruzi

-40

169 32

Como descrito anteriormente, foi realizado um BLAST da seqüência SmDUB14

no banco de dado MEROPS. A análise realizada no MEROPS apresentou resultado

semelhante ao encontrado no banco de dados do NCBI, cerca de 45% de identidade

entre a proteína DUB14 de S. mansoni e USP14 de outras espécies. Posteriormente

realizou-se o alinhamento da mesma no programa ClustalW com seqüências de

aminoácidos de USP14 de outros organismos e utilizando o programa BOXSHADE a

Figura 15 foi gerada.

Através do BLASTp é possível identificar seqüências de aminoácidos de diversos organismos ortólogas a

seqüência de SmDUB14. A similaridade entre estas seqüências é medida pela porcentagem de identidade que

indica os aminoácidos idênticos na região de alinhamento das seqüências analisadas pelo programa. Na tabela

estão apresentados os resultados do BLASTp de alguns organismos.

4.1.3) Enzima desubiquitinadora 16

A ORF da seqüência de DUB16 obtida no sequenciamento também foi

ampliada, sendo utilizado o contig Smp_162200.2 do Gene DB, que apresentou 100%

de identidade com a seqüência de estudo. A seqüência de nucleotídeos estendida,

SmDUB16, está representada no Apêndice item 1.3.

Figura 15

– Alinhamento da seqüência SmDUB14 com seqüências ortólogas de USP14. O programa

BOXSHADE indica a similaridade (cinza claro) e identidade (cinza escuro) entre os aminoácidos das

seqüências analisadas. Número de acesso: MER02667 Homo sapiens, MER36673 Pan troglodytes,

MER12099 Mus musculus, MER55892 Rattus norvegicus, MER13539 Drosophila melanogaster,

MER02892 Caenorhabditis elegans, MER04316 Schizosaccharomyces pombe, MER50568 Leishmania

major, MER53085 Trypanosoma brucei.

Em seguida, depois de realizada a busca no programa ORF finder, foi

identificada a ORF predita para SmDUB16 que está ilustrada na Figura 16.

O contig Smp_162200.2 é originado de seqüência genômica, através das

análises realizadas no Gene DB podemos observar a existência de 11 regiões não

codificadoras e 12 regiões codificadoras em SmDUB16. O tamanho dos íntrons varia

entre 33 a 11.900pb, o desenho da seqüência contendo os íntrons e éxons está

apresentado no Apêndice item 3.2.1.

A busca pelos domínios conservados presentes na seqüência foi realizado nos

programas Pfam Domain e Interpro e como resultado foi encontrado o domínio

conservado UCH, que tem início no aminoácido 32 e término no aminoácido 745 da

1126 aaccaaggttcttgtgatgaagtagcatcatcggacgggaattgt

N Q G S C D E V A S S D G N C

1171 gcagacgttgaaggtagtgatcgatatgacagtgttgcatcactg

A D V E G S D R Y D S V A S L

1216 caagtcattccaaatggctgtgatgaaaatgtaaaacagtcagag

Q V I P N G C D E N V K Q S E

1261 ataaatcatatcaacacagcattggaaaagttatctttggacaca

I N H I N T A L E K L S L D T

1306 gttgtatcgtcacagttgttttcatgtgattcagatgaattaaat

V V S S Q L F S C D S D E L N

1351 caagctattcattatgcacgagttccacttggtcagaataaaagt

Q A I H Y A R V P L G Q N K S

1396 aacaattcaacagaagaaggagttacttctatttatgaatgtctt

N N S T E E G V T S I Y E C L

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1531 agtaatttggatagtaaatcaatggataagcagacgcctaacaac

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1576 aacaagccagacattttacaagatactatcaaacgtgatttaatc

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1711 ccaatctacttggatattactcctttctgttctgttctcgctgtg

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1981 catcatcagctgttgttatcatcgaataatttcacatcttcttct

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2026 attcgaaatgacaccaattcacttgtgtgtaataataataataat

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2161 tattgttccgatagtcatgtaacacgtgtatcccagtcaactgta

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2206 ttgaattgtcaggcttatgttttattttatgaacgtattgaatga

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1 atgggaaagaaaaacaaaattagaagagaactatgtcagacgtcg

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91 aatgtacctgtcaaaggtcttcataatttaggcaacacatgttat

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181 aatctgttagttgtcgatgaatccagagaatctgctctaactaaa

N L L V V D E S R E S A L T K

226 cctaatggggactcattatgcacattatgtgtttccctaccactg

P N G D S L C T L C V S L P L

271 atgaagtgcccactaacaacccagtttaaggaacttatttctgtt

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316 ttaaagcctggtgaactgtcaaataccaaaatgagctcttccaac

L K P G E L S N T K M S S S N

361 acaattagtcctgggatgtttcgaaatgtgtttattgaacgttgt

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406 cctcgattcagtggatttaggcaacatgatagccatgagttaatt

P R F S G F R Q H D S H E L I

451 cgtgctctattggactgcttaaaacaagaagaactttcacgctgg

R A L L D C L K Q E E L S R W

496 aagaagggcattttgctcaaactcaatgttaacccaaaagatgtt

K K G I L L K L N V N P K D V

541 cgtgatgatgagaaagagtctattcgcagttggggaaaagcagct

R D D E K E S I R S W G K A A

586 tcgatagccacgattgtagatcgacttttcggtgggattcttgtc

S I A T I V D R L F G G I L V

631 agtacaatacagtgttgttgttgtggtactgttcgtcctaaattt

S T I Q C C C C G T V R P K F

676 gaaccatttctggacctttcactgtctgtttctgaaacgaatgtt

E P F L D L S L S V S E T N V

721 tcaaaacgcaatataaatgaatctgtgtctaaacagcattctaaa

S K R N I N E S V S K Q H S K

766 ggtgcctccagttccaaacaacttcggaaaagggaacgtaaacgt

G A S S S K Q L R K R E R K R

811 aaagctccaaaacaacgaaaacgtcaaaatttcatacatgattat

K A P K Q R K R Q N F I H D Y

856 caatcagatcagggctgtttagatcagtgcagttcagattcagat

Q S D Q G C L D Q C S S D S D

901 agtcagaaaacaaaacataataaccaccaaccattggactcattt

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946 attgcaaaatgtgctgatgtaactgatccaaatgtagacagtaag

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991 cgtgtcgagaacgtggatgggaatcttggcgtaaatgagcatcaa

R V E N V D G N L G V N E H Q

1036 catgaagataataatagcaacgatgatgtaaataagaatgaggtg

H E D N N S N D D V N K N E V

1081 aatttgttcaattcgaatgaatgcgagctttcaagcgaaacaata

N L F N S N E C E L S S E T I

Figura 16

– Seqüência da ORF predita pelo programa ORF finder de SmDUB16, janela +1 contendo 749

resíduos de aminoácidos. A seqüência de nucleotídeos inicia no nucleotídeo 1 e termina no nucleotídeo 2250 e

está representada em letra minúscula, a seqüência de aminoácidos está representada em letra maiúscula

proteína predita SmDUB16 (Figura 17). A análise no Interpro caracterizou também a

seqüência apresentando o domínio UCH-2 característico de enzimas UBP, o resultado

encontra-se apresentado no Apêndice item 2.3.

A identidade de SmDUB16 em relação às seqüências de USP16 dos demais

organismos é de aproximadamente 30% e 60% com a seqüência predita para USP16 em

S. japonicum.

Tabela 6 - Seqüências de organismos que apresentam gene ortólogo a SmDUB16

Número de acesso Organismo E Value

Score

(Bits)

Identidade (%)

AAX25082.2

Schistosoma japonicum

-78

297 58

AAH30777.1

Homo sapiens

-57

225 28

XP001160045.1

Pan troglodytes

-56

223 27

NP077220.1

Mus musculus

-55

219 28

XP213676.3

Rattus norvegicus

-54

218 28

NP572220.1

Drosophila melanogaster

-47

194 23

Os resultados de identidade/similaridade obtidos para DUB16 estão

apresentados na Tabela 6 e na Figura 18.

Através do Blastp é possível identificar seqüências de aminoácidos de diversos organismos ortólogas a seqüência

de SmDUB16. A similaridade entre estas seqüências é medida pela porcentagem de identidade que indica os

aminoácidos idênticos na região de alinhamento das seqüências analisadas pelo programa. Na tabela estão

apresentados os resultados do Blastp de alguns organismos.

Figura 17 - Representação esquemática da localização dos domínios conservados em SmDUB16. O

domínio UCH está entre os aminoácidos 32 e 745. As regiões características de peptidase C19E e peptidase

C19K estão representadas em vermelho.

Figura 18

– Alinhamento da seqüência SmDUB16 com seqüências ortólogas de USP16. O programa

BOXSHADE indica a similaridade (cinza claro) e identidade (cinza escuro) entre os aminoácidos das

seqüências analisadas. Número de acesso: MER14273 Mus musculus, MER61936 Rattus norvegicus,

MER05493 Homo sapiens MER24829 Drosophila melanogaster, MER11125 Schizosaccharomyces pombe.

4.2) Análise semi-quantitativa do padrão de expressão gênica das enzimas

desubiquitinadoras durante o ciclo evolutivo do S. mansoni

4.2.1) DUB5

Como descritos em Materiais e Métodos, os oligonucleotídeos iniciadores

específicos para a DUB5 foram utilizados na PCR para amplificar o cDNA de

verme adulto, a Figura 19 mostra o produto amplificado.

O produto gênico obtido para SmDUB5 tem tamanho de 550pb. Este produto de

PCR foi purificado, em seguida clonado no vetor pGEMT EASY (Promega) e

seqüenciado para a confirmação da especificidade do primer.

Para realizar a análise da expressão de DUB5 nas demais fases do ciclo de vida

de S. mansoni, foi extraído RNA total de cada fase e obtidas as primeira fitas do DNA

conforme descrito em Materiais e Métodos. Após a realização da PCR utilizando

primers específicos de DUB5 para cada uma das fases, os produtos das reações foram

analisados em gel de agarose 1,2% corados com brometo de etídio. Utilizamos o gene

referente a uma das subunidades do proteassoma, o alfa 5, para a validação dos cDNAs

Figura 19 – Amplificação do cDNA correspondente ao

gene SmDUB5 na fase de verme adulto de S. mansoni

analisado por RT-PCR. Foram aplicados 10µL do

produto de PCR em gel de agarose 1,2% corado com

brometo de etídio. (PM) peso molecular de 100 pares

de base (1) SmDUB5 de verme adulto e (2) controle

negativo contendo todos os reagentes da PCR menos o

cDNA.

PM 1 2

550pb

500pb

obtidos. Na Figura 20 estão apresentados os géis de agarose mostrando a expressão de

SmDUB5 e alfa 5.

A expressão de SmDUB5 foi verificada em todas as fases do ciclo do parasito

estudadas neste trabalho, sendo encontrado um amplificado com tamanho de 550pb. Em

nossos resultados, foi encontrado maior expressão de SmDUB5 nas fases de cercária,

verme adulto e ovos quando comparadas aos esquistossômulos cultivados nos diferentes

tempos. Os níveis de mRNA expressos foram avaliados através da densitometria que

analisa a intensidade das bandas nos géis de agarose Figura 20 (c) e (d)}.

4.2.2) DUB14

E3h

E18,5

E24h

E3Dias

Ovos

(a) (b)

Figura 20 – Padrão de expressão do gene SmDUB5. (a) Expressão de SmDUB5 visualizada em gel de agarose

1,2% corado com brometo de etídio. Em cada canaleta foram aplicados 10µL do produto de PCR. (b)

Expressão do gene alfa 5 utilizado neste trabalho como controle. O gráfico (c) mostra a expressão de SmDUB5

durante as fases de S. mansoni e o gráfico (d) a expressão de SmDUB5 em relação ao controle alfa 5. As fases

do ciclo do parasito analisadas estão representadas nos géis e no gráfico da seguinte maneira: cercárias (Ce),

esquistossômulos de 3 horas (E3h), esquistossômulos de 18,5 horas (E18,5h), esquistossômulos de 24 horas

(E24h), esquistossômulos de 3 dias (E3Dias), vermes adultos (V.A) e ovos. (PM) peso molecular de 100 pares

de base e (CN) controle negativo contendo todos os reagentes da PCR menos o cDNA.

500pb

550pb

500pb

582pb

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Sm DUB5

0 1 2 3 4 5 6

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Fases de S. mansoni

Níveis de mRNA (%)

DUB5/Alfa5

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Fases de S. mansoni

Níveis de mRNA (%)

Níveis de mRNA para SmDUB5

Razão em unidades arbitrárias

A Figura 21 mostra o produto gênico para SmDUB14 obtido a partir de cDNA

de verme adulto utilizando oligonucleotídeos específicos que geraram um produto com

tamanho de 844pb. O produto da PCR de SmDUB14 foi purificado, clonado e

posteriormente seqüenciado como descrito em Materiais e Métodos.

Utilizando a técnica de RT-PCR, foi realizada a análise da expressão de

SmDUB14 durante as fases cercária, esquistossômulos verme adulto e ovos de S.

mansoni. Os produtos das reações foram aplicados em géis de agarose (Figura 22).

Figura 21 – Amplificação do cDNA correspondente ao

gene SmDUB14 na fase de verme adulto de S. mansoni

analisado por RT-PCR. Foram aplicados 10µL do

produto de PCR em gel de agarose 1,2% corado com

brometo de etídio. (PM) peso molecular de 100 pares

de base (1) SmDUB14 de verme adulto e (2) controle

negativo contendo todos os reagentes da PCR menos o

cDNA.

PM 1 2

500pb

844pb

Para SmDUB14 foi verificado um padrão de expressão semelhante ao

encontrado em SmDUB5, maior expressão nas fases de cercária, verme adulto e ovos

quando comparadas aos esquistossômulos cultivados, sendo que para esquistossômulos

de 24 horas a expressão foi muito baixa, quase não detectada no gel de agarose.

4.2.3) DUB16

(a)

(b) (c)

Figura 22 – Padrão de expressão do gene SmDUB14. Em (a) estão representados os padrões de expressão de

SmDUB14 e do controle alfa 5, que foram visualizados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de

etídio. Em cada canaleta foram aplicados 10µL do produto de PCR. O gráfico (b) mostra a expressão de

SmDUB14 durante as fases de S. mansoni e o gráfico (c) a expressão de SmDUB14 em relação ao controle

alfa 5. As fases do ciclo do parasito analisadas estão representadas nos géis e no gráfico da seguinte maneira:

cercárias (Ce), esquistossômulos de 3 horas (E3h), esquistossômulos de 18,5 horas (E18,5h),

esquistossômulos de 24 horas (E24h), esquistossômulos de 3 dias (E3Dias), vermes adultos (V.A) e ovos.

(PM) peso molecular de 100 pares de base e (CN) controle negativo contendo todos os reagentes da PCR

menos o cDNA.

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

582pb

500pb

Alfa 5

SmDUB14

844pb

500pb

DUB14

0 1 2 3 4 5 6 7

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Fases de S. mansoni

Níveis de mRNA (%)

DUB14/Alfa5

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Fases de S. mansoni

Níveis de mRNA (%)

Níveis de mRNA para SmDUB14

Razão em unidades arbitrárias

O produto gênico encontrado para a DUB 16 foi de 882pb (Figura 23). O

mesmo procedimento aplicado para as demais enzimas desubiquitinadoras foi realizado

para SmDUB16, o produto da PCR foi purificado, clonado e seqüenciado de acordo

com a metodologia detalhada no capítulo 3.

O padrão de expressão de SmDUB16 nas demais fases de S. mansoni foi

avaliado através da técnica de RT-PCR descrita em Materiais e Métodos. Utilizando

oligonucleotídeos específicos de DUB16, foram realizadas PCR’s para cada uma das

fases, e os produtos das reações analisados em gel de agarose 1,2% corados com

brometo de etídio (Figura 24).

Figura 23 – Amplificação do cDNA correspondente ao

gene SmDUB16 na fase de verme adulto de S. mansoni

analisado por RT-PCR. Foram aplicados 10µL do produto

de PCR em gel de agarose 1,2% corado com brometo de

etídio. (PM) peso molecular de 100 pares de base (1)

SmDUB16 de verme adulto e (2) controle negativo contendo

todos os reagentes da PCR menos o cDNA.

PM 1 2

882pb

500pb

A expressão de SmDUB16 pode ser observada em quase todas as fases estudadas

do ciclo de vida do parasito, não foi detectada a expressão em esquistossômulos

cultivados por 3 dias.

(a)

(b) (c)

Figura 24 – Padrão de expressão do gene SmDUB16. Em (a) estão representados os padrões de

expressão de SmDUB16 e do controle alfa 5, que foram visualizados em gel de agarose 1,2% corado

com brometo de etídio. Em cada canaleta foram aplicados 10µL do produto de PCR. O gráfico (b)

mostra a expressão de SmDUB16 durante as fases de S. mansoni e o gráfico (c) a expressão de

SmDUB16 em relação ao controle alfa 5. As fases do ciclo do parasito analisadas estão

representadas nos géis e no gráfico da seguinte maneira: cercárias (Ce), esquistossômulos de 3 horas

(E3h), esquistossômulos de 18,5 horas (E18,5h), esquistossômulos de 24 horas (E24h),

esquistossômulos de 3 dias (E3Dias), vermes adultos (V.A) e ovos. (PM) peso molecular de 100

pares de base e (CN) controle negativo contendo todos os reagentes da PCR menos o cDNA.

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

882pb

500pb

582pb

500pb

Alfa 5

SmDUB16

Sm DUB16

0 1 2 3 4 5 6 7 8

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Fases de S. mansoni

Níveis de mRNA (%)

DUB16/Alfa5

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Fases de S. mansoni

Níveis de mRNA (%)

Razão em unidades arbitrárias Níveis de mRNA para SmDUB16

4.2.4) Padrão de expressão das DUB’s durante o desenvolvimento de S. mansoni

Nas Figuras 25 e 26 estão apresentadas em forma de gráfico os padrões de

expressão das enzimas desubiquitinadoras 5, 14 e 16 comparados entre si durante as

fases cercária, verme adulto e ovos, e durante o estágio larval, com esquistossômulos

cultivados nos diferentes tempos.

Padrão de Expressão das DUB's em

S. mansoni

0 2 4 6 8

V.A

Ovos

Fases

Níveis de mRNA (%)

SmDUB16

SmDUB14

SmDUB5

Padrão de Expressão das DUB's durante o

Estágio Larval

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

Cultura de

esquistossômulos

Níveis de mRNA (%)

SmDUB16

SmDUB14

SmDUB5

4.3) Padrão de expressão gênica das subunidades RPN9 e COP9S3 do proteassoma

26S durante o ciclo evolutivo do S. mansoni

Figura 25

– Gráfico comparativa da expressão das DUB’s nas fases Ce (cercárias), V.A

(vermes adultos) e Ovos.

Figura 26

- Gráfico comparativo da expressão das DUB’s durante o estágio larval.

Foram analisadas as culturas de esquistossômulos de 3 horas (E3h), esquistossômulos

de 18,5 horas (E18,5h), esquistossômulos de 24 horas (E24h) e esquistossômulos de

3dias (E3Dias).

A expressão dos genes referente às subunidades dos reguladores do proteassoma,

COP9 e RPN9, durante o ciclo de S. mansoni, também foram avaliadas no presente

trabalho. Esta análise foi realizada no intuito de correlacionar a expressão das enzimas

desubiquitinadoras com o proteassoma 26S. Na Figura 27 estão apresentados os padrões

de expressão das subunidades do proteassoma.

Para a subunidade RPN9 foi verificada expressão somente nas fases de

esquistossômulos de 3 dias, verme adulto e ovos. A subunidade COP9S3 é expressa em

todas as fases estudadas do ciclo de vida de S. mansoni.

E3h

E18,5

E24h

E3Dias

Ovos

(b) COP9S3

E3h

E18,5

E24h

E3Dias

Ovos

(a) RPN9

Figura 27

– Padrão de expressão das subunidades COP9S3 e RPN9 do proteassoma 26S.

(a)

(b)

Resultado da expressão das subunidades RPN9 e COP9S3 respectivamente, analisadas durante as fases

cercárias (Ce), esquistossômulos de 3 horas (E3h), esquistossômulos de 18,5 horas (E18,5h),

esquistossômulos de 24 horas (E24h), esquistossômulos de 3 dias (E3Dias), vermes adultos (V.A) e ovos de

S. mansoni. Foram aplicados 10µL do produto de PCR em gel de agarose 1,2% corado com brometo de

etídio. (PM) peso molecular de 1kb em (a) e 100pb em (b). Em (c) está o gráfico comparativo da expressão

de RPN9 em relação a COP9S3. (d) Gráfico da expressão da subunidade COP9S3.

RPN9/COP9S3

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Fases de S. mansoni

Níveis de mRNA

(c)

COP9S3

0 1 2 3 4 5 6 7 8

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Fases de S. mansoni

Níveis de mRNA (%)

(d)

839pb

409pb

Razão em unidades arbitrárias

5 Discussão

O S. mansoni apresenta um ciclo biológico bastante peculiar, no qual diversas

alterações bioquímicas e morfológicas ocorrem no verme. Estas mudanças são

adaptações evolutivas encontradas pelo parasito para sobreviver nos distintos

ambientes, água e interior dos hospedeiros, por ele habitado. Acredita-se que estas

adaptações sejam promovidas por um conjunto de genes que devem ser expressos

coordenadamente nos seis estágios de vida do parasito. Desta forma, é de extrema

importância a identificação destes genes para melhor entendimento da biologia

molecular do Schistosoma, e assim tornar possível a elaboração de vacinas que confiram

imunidade e também de novas drogas.

A identificação do gene SmUbi, a detecção de conjugados ubiquitinados tanto na

fase larval como em verme adulto e a constatação da atividade proteolítica endógena

dependente de ubiquitina em S. mansoni sugerem que modificações pós-traducionais

como ubiquitinação e desubiquitinação devem ser atuantes em vários processos

celulares no parasito (Guerra-Sá, R., 2000 e Castro-Borges, W., 2005).

Dentre os vários sistemas envolvidos na marcação de proteínas com moléculas

de mesma natureza, o sistema de ubiquitinação é o melhor caracterizado devido a sua

participação na regulação do ciclo celular (Richter-Ruoff, B. & Wolf, D.H., 1993),

diferenciação e desenvolvimento (Hernebring, M. et al., 2006), resposta ao estresse,

reparo de DNA e transcrição gênica (Glickman, M.N. & Ciechanover, A. 2002).

Nos últimos 5 anos o nosso grupo de pesquisa tem concentrado esforços no

sentido de caracterizar os vários mecanismos envolvidos no processo de ubiquitinação,

investigando inicialmente o envolvimento da ubiquitinação como marcação de proteínas

para serem degradadas pelo proteassoma 26S, e estabelecendo a relação desta via

bioquímica durante o desenvolvimento do S. mansoni.

Uma outra via estudada por nosso grupo em S. mansoni é a desubiquitinação,

mecanismo inverso à ubiquitinação, que tem grande importância nas vias dependentes

de ubiquitina e na regulação de múltiplos processos celulares. Análises in silico

identificaram a existência de pelo menos 30 enzimas desubiquitinadoras em S. mansoni.

(Andreolli, A.B.P., 2005). O número de DUB’s identificadas em S. mansoni é bastante

expressivo quando comparado ao total de genes preditos do parasito, estimado em

17.000, sendo que 8% do trascriptoma de S. mansoni não foram elucidados ainda,

podendo ser encontradas novas DUB’s. Somente duas enzimas desubiquitinadoras

foram caracterizadas até o momento em S. mansoni, a SmDUB7 e SmDUB12

(Andreolli, A.B.P., 2005). SmDUB7 é constitutiva em S. mansoni e ortóloga a Hausp

humana. A enzima desubiquitinadora Hausp está envolvida na via p53-Mdm2

estabilizando a proteína supressora de turmor p53, um fator transcricional nuclear,

ocasionando a inibição da proliferação celular e ativando a apoptose em resposta aos

vários tipos de estresses. A Hausp atua na estabilização endógena de Mdm-2, uma E3

ligase que ubiquitina p53. Mdm-2 também se autoubiquitina e não havendo sua ligação

a p53 esta enzima é degradada in vivo (Li et al., 2004 e Hu et al., 2002).

No presente trabalho foi realizada a análise da expressão das enzimas

desubiquitinadoras 5, 14 e 16 em S. mansoni. A seqüência obtida para SmDUB5

codifica uma ORF de 916 aminoácidos. A proteína predita SmDUB5 pertence à família

das proteases específicas de ubiquitina (USP), também denominada ubiquitina carboxil

hidrolase tipo 2 (UCH2) ou família peptidase C19B. A seqüência apresenta os domínios

conservados UCH2, dois domínios UBA e o domínio Zn-UBP (Zinc-Finger UBP)

(Apêndice 2.1). A presença destes domínios em SmDUB5 corrobora os dados da

literatura onde USP5 de humano também apresenta os domínios UBP/UCH2 (contendo

as regiões cys e his box características da tríade catalítica), dois domínios UBA e um

Zinc-Finger UBP (Reys-Turcu, F.E. et al., 2006). SmDUB5 é ortóloga a USP5/UBP5 ou

Isopeptidase T de humano, com alta similaridade a esta seqüência, cerca de 40%, com

USP5 de outros organismos (Tabela 3 e Figura 12).

A enzima desubiquitinadora Isopeptidase T (USP5) em humano e sua ortóloga

em S. cerevisiae Ubp14, têm como função principal desassociar cadeias de

poliubiquitinas livres em monômeros de ubiquitina, e também clivar cadeias

poliubiquitinadas ligadas ao resíduo de lisina 29 da proteína-alvo. A poliubiquitinação

neste resíduo de lisina destina a proteína alvo à degradação, assim sendo a atividade

USP5 atua de forma a aumentar a meia vida destas proteínas. Ubp14 é a DUB com

maior capacidade de clivar cadeias poliubiquitinadas no resíduo de lisina 29 em S.

cerevisiae. (Russel, N.S. & Wilkinson, K.D., 2004).

Em nossos resultados não foram identificados na seqüência SmDUB5 analisada

os domínios Cys e His característicos da tríade catalítica de USP, entretanto a ausência

destes domínios não devem modificar a atividade da enzima. Ensaios foram realizados

por Rao-Nail, C. et al., (2000) onde uma proteína quimera USP de Arabidopsis

thaliana, foi construída consistindo da seqüência Cys box de AtUBP5 e os demais

resíduos de aminoácidos de outra proteína denominada AtUBP3. A proteína quimera

gerada apresentou atividade e exibiu especificidade característica de AtUBP3. Este

resultado indica que a modulação natural, e a especificidade das enzimas USPs pelos

seus sítio de clivagem não são determinadas pelo domínio Cys box.

Para as demais DUB’s estudadas neste trabalho também não foram encontrados

os resíduos característicos da tríade catalítica. As USPs são cisteíno proteases que

contêm seqüências altamente divergentes exibindo forte identidade, principalmente nas

duas regiões em torno dos resíduos catalíticos Cys, His e Asp. Dada a alta divergência

das seqüências e escassa informação estrutural, não está muito claro se a arquitetura

destes três domínios é geralmente conservada entre outras USPs (Hu, M. et al., 2005).

SmDUB14 possui uma ORF que codifica 400 aminoácidos, contendo o domínio

característico da família peptidase C19A. O resultado do BLAST mostrou que

SmDUB14 apresenta identidade com USP14/UBP14, sendo encontrada uma alta

similaridade, 45%, com USP14 dos demais organismos (Tabela 4 e Figura 15). A

seqüência apresenta ainda o domínio conservado UCH2 que categorizada a enzima

como membro da família das proteases USP/UBP (Apêndice 2.2).

Apesar de ser relatado que USP14 e seus homólogos possuem um domínio

ubiquitina-símile tipo II (UbII) na região N-terminal, em nossas análises este domínio

não foi encontrado. Em ensaios com deleção do domínio UbII da enzima Ubp6 de

Schizosaccharomyces pombe, homóloga a USP14 de mamíferos, foi observado que a

enzima apresentou o mesmo fenótipo, sugerindo assim que o domínio UbII não é

necessário para o processamento in vitro de ubiquitinas de fusão. O domínio UbII pode

ser necessário para ligar USP14/Ubp6 ao seu substrato alvo e não para a atividade de

catálise em si (Borodovsky, A. et al., 2001). Assim, a ausência de UbII em SmDUB14

sugere que outras regiões da enzima são responsáveis pela especificidade de ligação ao

substrato alvo e a atividade de catálise desta DUB.

Para SmDUB16 foi encontrada uma ORF que codifica 749 aminoácidos, nela

está contido o domínio característico de USP16 homólogo ao domínio UCH2

característico da família das USPs (Apêndice 2.2). A SmDUB16 possui identidade com

USP16/UBP16, sendo encontrado cerca de 30% de similaridade entre as seqüências

(Tabela 5 e Figura 18). Muito pouco é conhecido sobre a função e mecanismo de ação

de USP16.

Realizamos a verificação in silico da existência ou não de íntrons nas seqüências

das DUB’s estudadas, onde foram encontradas 10 regiões não codificadoras para

SmDUB5 e 11 regiões não codificadoras para SmDUB16. Não foi encontrado nos

bancos de dados analisados seqüência genômica de DUB14 que permitisse a

investigação de íntrons. Está documentado na literatura que enzimas desubiquitinadoras

apresentam em suas seqüências regiões não codificadoras, sendo o processamento

destes íntrons realizado por splicing alternativo gerando isoformas distintas. Em

humanos são encontradas isoformas a e b para cada uma das DUB’s 5, 14 e 16. Em

nosso trabalho este tipo de processamento não foi detectado.

Considerando o grande número de íntrons identificados in silico nas seqüências

genômicas referentes às proteínas preditas SmDUB5 e SmDUB16, o elevado conteúdo

de seqüências repetitivas no genoma de S. mansoni e ainda a grande diversidade de

DUB’s existentes, podemos sugerir que estas enzimas sofrem algum tipo de splicing, de

forma a garantir sua diversidade. Porém, as seqüências geradas neste trabalho através do

sequenciamento dos fragmentos das DUB’s não apresentou íntrons. Apesar de

realizamos o sequenciamento apenas do cDNA de verme adulto, os resultados das RT-

PCR obtidas a partir dos cDNAs de todas as fases de S. mansoni gerou produtos únicos,

visualizados em gel de agarose 1,2%, com tamanho condizente ao esperado, 550pb e

882pb, para DUB5 e DUB16 respectivamente, desta forma podemos sugerir que a

região das enzimas por nós estudada não é provida de íntrons.

Nas seqüências analisadas de DUB5 e DUB16 todas as regiões não

codificadoras encontradas seguem a regra GT/AG e apresentam tamanhos bem

distintos, com íntrons variando de 33pb a 11900pb (Apêndice 3). Resultado semelhante

pode ser verificado para seqüência genômica de S. mansoni que contém a mensagem

codificadora do receptor TGF-β tipo II, onde o menor íntron tem tamanho de 33pb e o

maior 4,82Kb. A ocorrência de splicing alternativo origina dois transcritos para TGF- β

um de 2,4Kb e o outro de 3,9Kb que codificam as proteínas de aproximadamente 62kDa

e 92kDa respectivamente (Osman A. et al., 2006).

Através da técnica de RT-PCR verificamos a expressão das DUB’s 5, 14 e 16

durante as fases de cercária, esquistossômulo de 3h, 18,5h, 24h e 3 dias; verme adulto e

ovo de S. mansoni. Os tempos de cultivo de esquistossômulos utilizados neste trabalho

foram estabelecidos visando mimetizar in vitro a passagem do parasito pela pele do

hospedeiro vertebrado e sua migração para o pulmão. Durante a penetração da cercária

na pele de seu hospedeiro vertebrado, são observadas adaptações bioquímicas e

morfológicas que preparam o parasito para conseguir sobreviver no novo ambiente, que

apresenta temperatura e osmolaridade elevadas quando comparado ao habitat anterior, a

água. Além disso, duas horas após a penetração a estrutura trilaminada do tegumento do

parasito é convertida em dupla membrana heptalaminada, a maior parte do glicocálice é

perdida e o metabolismo deixa de ser aeróbio passando a ser anaeróbio, nesta etapa o

parasito tem intolerância a água fresca. Ensaios realizados verificaram não haver

ocorrência de divisão celular em esquistossômulos até o oitavo dia de infecção e

experimentos utilizando metionina marcada comprovaram também a ausência de síntese

protéica durante este mesmo estágio. Esta etapa de transição entre

cercária/esquistossômulo de sete dias é muito pouco estudada. (Clegg, J.A. 1965; Brink,

L.H., et al., 1977; Miller, P. & Wilson, A., 1980; Curwen, R.S., & Wilson, A., 2003 e

Castro-Borges, W. 2005).

A SmDUB5 foi expressa em todas as fases estudadas neste trabalho

apresentando o mesmo tamanho para o fragmento analisado, um produto de 550pb

(Figura 19). SmDUB5 apresentou também um padrão de expressão decrescente durante

as fases de cercária, verme adulto e ovos, sugerindo uma diminuição pela metade dos

níveis de mRNA em ovos (Figura 25). Já na fase larval, o padrão de expressão da

enzima manteve-se constante em quase todos os estágios de esquistossômulos, havendo

um considerável aumento da expressão somente em esquistossômulos de 18,5 horas

(Figura 26). Para podermos confirmar esta expressão diferenciada de DUB5 nas fases

de S. mansoni de forma a modular as vias de degradação dependente de ubiquitina,

outras experimentações, como PCR em tempo real, são necessárias.

Em nosso trabalho não foi analisada a interação de SmDUB5 com seu substrato,

porém considerando a similaridade encontrada entre os domínios identificados in silico

para S. mansoni e humano podemos sugerir um modo de ação para a enzima de estudo.

O mecanismo de ação sugerido para USP5 em humano é baseado na especificidade da

ligação desta DUB ao seu substrato alvo devido a presença do domínio Zn-UBP, ele é

necessário para a ligação à ubiquitina, formando um arcabouço em torno da cauda C-

terminal livre da cadeia de ubiquitina. É improvável que os domínios UBA sejam

responsáveis pela ativação de USP5, vários estudos estruturais mostram

conclusivamente que o domínio UBA liga-se a I44 numa pequena região hidrofóbica na

ubiquitina e não na região C-terminal. Os domínios UBA (ubiquitin - pathway

associated) devem trabalhar em conjunto com o ZnF-UBP na atividade da Isopeptidase

T (Reys-Turcu, F.E. et al., 2006).

Com relação à segunda enzima de estudo SmDUB14, também foi verificada

expressão em todas as fases com produtos amplificados de 844pb (Figura 22). O padrão

de expressão de SmDUB14 foi constante tanto na fase larval, quanto nas fases de

cercária, verme adulto e ovo, sendo que nos estágios de esquistossômulos os níveis de

mRNA encontram-se três vezes menor quando comparado às demais fases (Figuras 25 e

26).

Dados encontrados na literatura mostram que USP14 de mamíferos é uma

proteína acessória ao proteassoma que se liga a partícula reguladora 19S, tendo como

função principal ajudar na remoção de ubiquitina ou poliubiquitinas ligadas a proteínas

alvo destinadas a degradação dependente de ubiquitina. Entretanto, as atividades do

proteassoma e das DUB’s podem ser interdependentes. Ensaios realizados por

Borodovsky, A. et al. (2001) verificaram que a inibição da proteólise via proteassoma

resulta no acúmulo de conjugados ubiquitinados e no aumento da atividade de USP14.

O mecanismo proposto para a união funcional entre as atividades do proteassoma e de

USP14 ligada a este complexo protéico, é que a ativação de USP14 ocorre devido a

mudanças conformacionais propagadas através do complexo inteiro do proteassoma 26S

sob inibição. Por outro lado a atividade de USP14 pode ser regulada também pelos

níveis de substratos poliubiquitinados, que estão aumentados com o proteassoma inibido

(Borodovsky, A. et al., 2001 e Hu, M. et al., 2005).

Várias DUB’s são associadas ao proteassoma 26S sendo esta associação

necessária para a completa atividade da enzima, como exemplo UCH37, UBP14/Upb6 e

Rpn11/POH. A enzima desubiquitinadora Rpn11/POH pertence a classe MPN+/JAMM,

e constitui uma subunidade integrada ao complexo regulatório do proteassoma 19S, e

sua atividade DUB requer a interação com outras subunidades do complexo 19S. Ubp6

liga-se a subunidade Rpn 1 do complexo 19S e interage fortemente estimulando a

atividade de Ubp6. Assim a atividade de ambas Rpn11 e Ubp6 são delimitadas aos seus

sítios de ação, o proteassoma. Mutações que eliminam a atividade DUB de Rpn11 ou de

Ubp6 são letais em fungos, e leva também a um acúmulo de substratos ubiquitinados.

As DUB’s que não estão associadas ao proteassoma são reguladas de maneira diferente,

pois elas apresentam uma alta especificidade por seus substratos (Hu, M. et al., 2005 e

Amerik, A. et al., 2006).

Wilson, S.M. et al., (2002) verificou que a atividade desubiquitinadora de

USP14 associada à atividade proteassomal depende de ubiquitina são essências em

alguns processos celulares. Ratos com mutações em USP14 resultam em uma

transmissão sináptica anormal, doença conhecida como ataxia. USP14 neste processo

tem como função manter os níveis celulares de monômeros de ubiquitina, alterações

nestes níveis podem contribuir para a ocorrência de doenças neurológicas (Hu, M. et al.,

2005).

Para SmDUB16 foram obtidos amplificados com tamanhos de 882pb (Figura

23). A expressão de SmDUB16 na fase de cercária é menor comparado aos níveis de

mRNA de verme adulto e ovos (Figura 25). Na fase larval (Figura 26), o padrão de

expressão encontrado é maior em esquistossômulos de 3 horas, e inexistente ou

apresentando níveis muito baixo de mRNA em esquistossômulos de 3 dias. O terceiro

dia de infecção é considerado um ponto crítico no desenvolvimento de S. mansoni,

também denominado o ponto de não retorno, quando várias mudanças bruscas foram

detectadas na via de ubiquitinação e na degradação dependente de ubiquitina, um

exemplo é a detecção após este estágio de um pico de proteólise 20X maior (Guerra-Sá,

R., 2000 e Castro-Borges, W. 2005).

Apesar dessa enzima ser muito pouco conhecida, duas funções celulares distintas

são sugeridas para USP16, a primeira é que ela estaria envolvida em processos de

desubiquitinação de histonas H2A e H2B. A USP16 também conhecida como Ubp-M, é

uma protease processadora de ubiquitina com relevante importância durante a divisão

celular em mamíferos. Ubp-M é fosforilada no começo da mitose e defosforilada

durante a transição metáfase/anáfase. Células trasfectadas com plasmídios contendo

Ubp-M mutada pararam a divisão celular e eventualmente sofreram apoptose. Esta

enzima deve desubiquitinar uma ou mais proteínas críticas que estão envolvidas na

condensação de cromossomos mitóticos, possivelmente atuando seletivamente nas

histonas H2A e H2B, as maiores proteínas ubiquitinadas da cromatina. Por mais de duas

décadas tem sido evidenciado que histonas H2A e H2B são monoubiquitinadas, porém

esta modificação pós-traducional não leva a um aumento na degradação proteolítica

(Ying, S., 1998). Ensaios são necessários para verificar com precisão o envolvimento de

USP16 regulando a ubiquitinação/desubiquitinação de histonas durante o processo de

desenvolvimento de S. mansoni, principalmente durante a fase de transição

cercária/verme adulto, onde até o sétimo dia após a infecção não é encontrada divisão

celular.

A segunda função sugerida para USP16 relaciona-se com a sua presença

associada a membrana atuando em processos de sinalização. USP16 foi encontrada na

membrana mitocondrial de S. cerevisiae por Kinner, A. (2003) através de experimentos

com imunofluorescência e fracionamento celular. Esta enzima apresentou um domínio

N-terminal hidrofóbico que é similar a seqüências de outras proteínas da membrana

mitocondrial de fungos. A presença desta seqüência sinal e os demais resultados

encontrados sugerem que USP16 é uma proteína integral da membrana externa da

mitocôndria com uma orientação N interna-C externa (Kinner, A. & Kölling, R., 2003).

Caracterização fenotípica e expressão de USP16 mutantes sugerem que esta

enzima provavelmente não é importante para as funções gerais da mitocôndria, mas sim

para funções mais especializadas. Perda da atividade de USP16 não mostrou um efeito

discernível no modelo de proteínas ubiquitinadas de extratos células, sugerindo que

USP16 não contribui muito para a atividade desubiquitinadora geral na célula. Esses

resultados sugerem que USP16 tem papel principal na homeostase de ubiquitina ou na

manutenção do pool de ubiquitina livre sobre condições normais. Ela parece realizar

uma função mais especializada, atuando por exemplo na rede de sinalização celular.

Muitas vias de sinalização convergem na mitocôndria, provavelmente o sistema

ubiquitina e consequentemente a USP16 devem atuar nesses processos de sinalização

regulando o turnover ou a atividade de proteínas na membrana externa da mitocôndria

(Kinner, A. & Kölling, R., 2003).

Como a ubiquitinação também participa na modulação negativa de proteínas de

membrana, incluindo muitas proteínas, receptores e transportadores, consequentemente

o processo inverso, a desubiquitinação também pode ser atuante. No caso de

ubiquitinação, as proteínas alvo são modificadas ou por uma única ubiquitina ou curtos

oligômeros de ubiquitina ligados ao resíduo de Lys63 (Amerik, A. et al., 2006).

A expressão comparada das DUB’s 5, 14 e 16 (Figura 25 e 26) mostra que elas

são mais expressas nas fases de cercária, verme adulto e ovo, do que nos diferentes

estágios de esquistossômulos estudado, confirmando resultados encontrados por Guerra-

Sá (2003) que verificou a atividade DUB total nas fases de esquistossômulos menor

comparada às demais fases. Este padrão de expressão também corroboram com os

resultados obtido por Castro-Borges, W., (2005), que observou a presença de

conjugados ubiquitinados em todas as fases de S. mansoni, com uma abundância

predominante durante as diferentes culturas de esquistossômulos (3h, 4h, 8h, 18h, 24h,

3 dias, 5 dias, 8 dias e 10 dias. Estes dados juntamente com os resultados obtidos neste

trabalho sugerem que a ocorrência de ciclos de ubiquitinação/desubiquitinação podem

estar envolvidos em processos celulares críticos durante um ciclo biológico completo do

S. mansoni. Considerando o fato de não haver uma síntese protéica real durante os

diferentes estágios de esquistossômulos aqui estudados e a variação dos níveis de

expressão entre as fases ser pequena, é possível sugerir também que os mRNA de

DUB’s encontrados são pré-existentes. Ensaios futuros de Westen blot serão realizados

para confirmar o padrão de expressão das DUB’s encontrado neste trabalho.

A expressão do gene referente a subunidade do proteassoma alfa 5 durante o

ciclo de S. mansoni foi analisada com o intuito de validar os cDNAs obtidos nas

diferentes fases e correlacioná-la com a expressão das DUB’s. O padrão encontrado

para a expressão de alfa 5 foi semelhante àquele verificado para as DUB’s, com níveis

de expressão de mRNA menores durante os diferentes estágios de esquistossômulos

(Apêndice 4). Apesar desse gene ser detectado nas fases cercária, esquistossômulo,

verme adulto e ovos sua expressão não é simétrica, apresentando nível de mRNA muito

baixa no estágio de esquistossômulos de 3 dias. De um modo geral a expressão das

DUB’s durante as fases do ciclo do parasito foi menor quando comparada a expressão

de alfa 5, porém a expressão de SmDUB14 nas fases cercária e esquistossômulos de 3

dia foi quase duas vezes maior que a de alfa 5 (Figura 22). A DUB14 é a única entre as

enzimas neste trabalho analisada que está associada ao proteassoma 26S. Borodovsky,

A. et al., (2001) verificou em seus experimentos que células de mamíferos tratadas com

inibidor de proteassoma teve a atividade USP14 aumentada.

Também analisamos o padrão de expressão da subunidade RPN9, componente

da tampa do complexo regulador do proteassoma 19S, e a expressão da subunidade 3

constituinte do regulador COP9 signalossoma. Em nossas análises foram verificados

níveis significativos de mRNA de RPN9 apenas no terceiro dia de cultura de

esquistossômulos, em vermes adultos e em ovos. A subunidade 3 foi bastante expressa

em todas as fases de S. mansoni analisadas.

Algumas evidências experimentais, indicam que o CSN interage diretamente

com o proteassoma 26S e compete com o complexo 19S, e em excesso molar de CSN

ocorre a substituição da tampa do 19S pelo CSN, o que influência diretamente a

atividade peptidásica do proteassoma in vitro (Huang, X. et al., 2005 & Peng, Z. et al.,

2003). Atualmente já está bem documentado na literatura a modulação positiva dos

proteassomas devido à interação do 20S aos seus ligantes naturais, o PA700, PA28 e

PA200.

Recentemente resultados de estudos realizados em S. mansoni indicam uma

regulação transcricional dos componentes dos complexos tampa e base do 19S do

proteassoma, e também de algumas subunidades do COP9 signalossoma (CSN), durante

o desenvolvimento do parasito (Janku-Cabral, F., 2006). Em nossos resultados foi

verificada maior expressão de RPN9 nas fases esquistossômulos de 3 dias, verme adulto

e ovos e baixa expressão nas fases cercária, esquistossômulos 3 horas, 18,5 horas e 24

horas, prevalecendo nesta fase a expressão de COP9S3. Sugerindo assim que o

complexo 19S do proteassoma está sub-regulado nestes estágios de vida do parasito. O

CSN pode funcionar como uma tampa alternativa do proteassoma 26S modulando assim

a atividade proteassomal nos estágios intermediários do parasito, e atuando como um

regulador do desenvolvimento por controlar a expressão de diversos genes de S.

mansoni (Janku-Cabral, F. et al., 2006).

Considerando as montagens alternativas do proteassoma e seu impacto na

proteólise total, não podemos descartar a interação de SmDUB14 com este complexo.

Para confirmar esta hipótese serão necessários ensaios de co-imunoprecipitação seguido

de espectrometria de massa para comprovar a associação direta de SmDUB14 com o

proteassoma 26S.

6 Conclusões

lxviii

 Não foram encontrados em nosso trabalho os resíduos característicos da

tríade catalítica das enzimas desubiquitinadoras 5, -14 e -16.

 A expressão comparada das DUB’s 5, 14 e 16 mostra que elas são mais

expressas nas fases de cercária, verme adulto e ovo, do que nos diferentes estágios de

esquistossômulos estudados.

 Uma sub-regulação de RPN9 foi verificada nos estágios, cercária,

E3horas, E18,5horas e E24horas prevalencendo uma alta expressão de COP9S3 nestes

estágios de vida do parasito.

lxix

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lxxxii

Apêndice

lxxxiii

1) Seqüências das DUB’s 5, 14 e 16 estendidas no GeneDB

Smp_069960 ||29278.t000033, 29278.m000590|ubiquitin specific

protease 5/ubp14, putative|Schistosoma mansoni|chr unknown01|||Auto

ATGTCCGAATCTATTTTTGAGGACTTATCTGCTCAAGTCAGGATTCCTGGTGACGGGGAAAAGGTATTCAAGGATGA

ATGTCCGTTTTCGTTTGAGACACCTGAGACAGAAAAAGGAATATACATATGCATGCGACACTTCGTTGCGATCGGCT

CTAAAACACTTAGGCTTTATTATGAGAAAACTGGCTGTCGTGCTTTCCTAAGATACAAGATCGAAAAGCAATTCAAA

GATAAGGGTACTAGTGCTCAAGAACGCCCGACAAAACTCGCCGTTGGAGTTTCTGGAGGTTTTGACTTTCCCCAAGA

TATGTATACAGTCACTGAACATTGGTCGCTAGTACGTCTTCCGCAAGGCGACTCATTTGATATCCCGAATCCAGAAC

CCGGACAAGGACAATCTGATATATCTCACTTAGAGATTTTGGAACTCCCTAAACGCCTGGCTACTTCGATCGCATTA

ATTCAACGTGCTGAGTCAGTATTACTAGCAGAAGAACGAGCTAACTCACTTAAAGCTTGGGAAGATGATAATATTTG

TTTTATTTCCTCGTATGCCATGAATTTAGCACAAATAAATAATTCTGTTCGGATTCCTCCGTCTGGATGGAAATGTG

CCAAATGTGATTTGAGAGATAATCTGTGGATGAATCTTACTGATGGAACCATACTTTGTGGCCGAAAATTTTGGGAT

GGGTCTGGAGGGAATAATCACGCTCTGGAGCATTATGAGAAGACCAAGTATCCACTAGCTGTCAAACTTGGAACTAT

AACTCCGAAGGGTGGAGAAGTGTTTTCATATCCTGAAGATTCAATGGTAACCGACCCAAAATTAGCAGAACATCTTG

CTCACTTCGGTATTGATGTAATGCTTATGCAAAAAACCGATAAAACAATGGCCGAGTTAGAAGTGGATGCAAATGAA

AGACTTGGAGAATGGCTAACATTGCAGGAATCCAACCATACACTTGAAGCACGTTATGGTCCAGGTATGACTGGACT

TAGAAATCTCGGTAATACTTGTTACATGAATGCTGTGTTACAGGTTCTGTTTTCAATTTCACAATTTCGTTCGTACT

ATGCCTATCAATTACCAGTTTGGTGTGAGGAAGCATTGGATCAATTCACTTCTGAAAATCATCCACTTCTACCAGTA

GATCATATTGGTCTACAATTTTCGAAATTAGGACATGGTCTTTGTTCAGGCGCTCATTCATGGCTAGTTCCAAATAA

TTTTAGTCATACTACTACAGGTGGCCCTGTGCCTATTCTCCCGGGTATACGTCCAATTTTGTTTCGTCGATTAATGG

GTGCTCATAACTCCACATTTGCCACAAGACAGCAACAAGATGCTTGCGAATTTTTAATATATCTATTAGATTTATTA

GAACAAAAAGCCAATAAACAGGAACACGGAAAAGTACATCCAAGTAATGTGATGCGTTTTGGTGTGGAAGAACGCCT

ACAATGTGGTTTGACAAATAAGGTCTCGTACAAAACTGATCATGAATGGATTCTTTCAGTTCCAGTTCCAATGGAAG

CGGTAACGAATCAAAAAGCATTAGACAATTATGAGAAACGACGTGCTGACGCTGAGTTAAATGGTATACATTTATCA

CCTGAAGAGGTTGTACGACCAATTATTCCTATGGAAGCTTGCCTGTCGGCTTGGGCTCAAACAGAACGAATTACTGA

TTTTAAAACACCAGCAAGTCAACCTCCAGGTGCCAAAACATTCGCTTTACGTTCTAATCGTTTAACAAATTTTCCAA

ATTATTTATGTATACAAGTTGGACGATTTACTGTTGGTACAGATTGGCTTCCGAAAAAATTGGATGTGGACATCGAG

TTGAAATCATCTGTTGGAAATCATGGTAATACAGAATGGTTTATTGATTTAAATAATTTACGTGCACCAAATGGTAG

TAGACCGTTGCCTGGTGAACAATTGATGCCAACTGGAGATGAAATAAAATCTGAACAAATGAAAATTGATGATGATG

TACAGTCAGATGTAACAATTATCAATGATCTGTTAGTTATGGGTTTCACTTTAGAAGCAGCACAGAAAGCTTGTAAA

TTTACACAAAATAGTAGTGTAGAAAATGCTACCAACTGGTTAATGGAACATTTAGATGATCCAGATTTAAATGATCC

GTTGCCGCCGCCTAGTGATTATCAACAACAAAATAAACAGAAACAATCAGTGGTTGGATCGGTCACTTCTACAGATA

TTGACGAAAACGCAGTTGAAATGATGTTGGCTATGGGATTCAGTAGACAACAGTCAATCGTCGCATTACAACATAAA

AATGGTAATTTGGAACAAGCTGCTGACTGGGCATTGAGTAGTCCAGATGAATTAGAAACTTTATTACTTCAGTCTGA

AATAAATATGACTAATAAATCTTCCGCTGATGCTGGGAATAATTCAAGTCAGACATCATCATCTTCATCAGGTCCAT

TGCTATCAGATGGTAGTTCAAAGTATGAATTATTCGCTTTTATTAGTCATATGGGAAAGTCGACCAATGATGGTCAT

TACGTAGCTCATATTAAACGATCATTTCTAGCTAAATGTATTCCTCATGAACCGCCAGTATATCATGTTGGCTCACC

AATTTGTGGCGGTTCCGATCAAGAATGGATTATATTCAATGATGAGAAAGTAGCAAAAAGTGAATGCCCTCCACATC

GTCATGCTTATTTATATTTCTTTCGAAGATTAGATGCTACTGATCAGTCTGACTAA

1.1 – BLASTn realizado no Schistosoma mansoni

GeneDB

. A seqüência de DUB5 obtida

pelo sequenciamento (sombreada na figura) teve seu início estendido, tendo como

parâmetro o contig Smp_069960. Esta seqüência foi denominada SmDUB5.

Sm00289 |||putative

Ubiquitin carboxyl

terminal hydrolase

14|Schistosoma mansoni|chr unknown002||Partial|Auto

GCACGAGGGCCTCGTAAATCTTGGCAACACTTGTTATATGAACGCTGCTGTCCAATTGCTTTTCTCAATTCCAGAA

TTGCGTATAGCTTTGCAGATATGCCGTTTTCCCCAAACTTCACCGGATTCTCCGAATCTTGGTTCCTTATGTGAAA

GTTTGAAGTTTTTGTTCAATTCCCTAAGCAAAACTGAAAAACCGGTTACTCCTCTGCTCTTCTTGACTTGCTTGCA

CAGTGTTTGTCCGCAGTTCGCCGCACGTGCATCGTCTTCTGATGCAAGTAAATCCGCTCCAGGTGCTCTATCTATG

ATTTCCCGTGGCTTCGAACAACAAGATGCTAGTGAATGTTGGACAGAGCTAATCAGAGCACTACAAAGTAGCAAGA

TTGATTCTCAAGTTTATGCGTCAACAGTGAGTTTGCCTCCAAGTTTTCTTACAACTTCTCAATGGAATCCTGTAGA

TAGATTTCTCACTGGTCAGTTATCCTGCAAACTTAGATGTACTGAATCAGATGAACCCGAAACAGATAGTCTAGAA

ACATTTACTCAACTTTCTTGCTTCATGCATCAAGATGTAAAGTATTTGATTACTGGTATTCGAAATGGATTGACGG

GAAATCTAACTAAGCATTCATCTTTGCTGGATCGGAATGCAGTATATAAACGCGAGTCTCTTATTAGTCGGCTTCC

AGCTTACCTATGTATTCATTTTGTTCGTTTCTTCTACAAGGAAGATAAACAGATAAATGCTAAGATTTTAAAGGAT

GTAAAATTTCCACTAACATTGGATATGCACGAATTTTGTACGCCTGAATTGCAACAGAAATTACTACCCATGCGTG

AAAAACAGCGCCTTAAAGAAGATGAGGTGGCCAATCCCTCAAGCCAAACAAATACTTTCAAAAGTAAACCAGATTC

TGTACAACCTGACCCATTCCAAAATCCTGACTTGTACGAGCCTAACTTTTTCGCTGATGATCCCGGTTCGAATAAC

TCTGGGTACTACGAACTTCAAGGTGTTTTGAGCCACCAAGGTAGAACAAGTACCAGTGGGCATTATGTTGCTTGGG

TGAAAAAACAAGGAATGTGGTTTAAATTTGATGACGATCGTGTCAGCCAGGTTACCTCAGAAGATATTTTGCGCTT

ATCTGGAGGTGGTGATTGGCATTGTGCATACATACTGTTATATGGACCTCACTTCATAAGGAAGAATGCATGCAAC

GATCCTTCTGGAAGTACCGTATGAAGTTCATAAATGCAAAACAG

1.2 – BLASTn realizado no Schistosoma mansoni

GeneDB

. A seqüência de DUB14 obtida pelo

sequenciamento (sombreada na figura) teve seu final estendido utilizando o contig Sm00289. Esta

seqüência foi denominada SmDUB14.

lxxxiv

1.3 – BLASTn realizado no Schistosoma mansoni

GeneDB

. A seqüência de DUB16 obtida pelo

sequenciamento (sombreada na figura) teve o início e o final estendido pelo contig Smp_162200.2.

Esta seqüência foi denominada SmDUB16.

Smp_162200.2 ||29297.t000011, 29297.m000652|ubiquitin

specific

protease 16-related|Schistosoma mansoni|chr unknown01|||Auto

ATGGGAAAGAAAAACAAAATTAGAAGAGAACTATGTCAGACGTCGGATAATGCTAGAGACAAGGTGAACTTTCGTAACA

ATGTGAAAGAAAATGTACCTGTCAAAGGTCTTCATAATTTAGGCAACACATGTTATCTTAATGCTGCCCTTCAATGTCT

TGCAAAAAGTCCATGGCTTTTGAATCTGTTAGTTGTCGATGAATCCAGAGAATCTGCTCTAACTAAACCTAATGGGGAC

TCATTATGCACATTATGTGTTTCCCTACCACTGATGAAGTGCCCACTAACAACCCAGTTTAAGGAACTTATTTCTGTTT

TAAAGCCTGGTGAACTGTCAAATACCAAAATGAGCTCTTCCAACACAATTAGTCCTGGGATGTTTCGAAATGTGTTTAT

TGAACGTTGTCCTCGATTCAGTGGATTTAGGCAACATGATAGCCATGAGTTAATTCGTGCTCTATTGGACTGCTTAAAA

CAAGAAGAACTTTCACGCTGGAAGAAGGGCATTTTGCTCAAACTCAATGTTAACCCAAAAGATGTTCGTGATGATGAGA

AAGAGTCTATTCGCAGTTGGGGAAAAGCAGCTTCGATAGCCACGATTGTAGATCGACTTTTCGGTGGGATTCTTGTCAG

TACAATACAGTGTTGTTGTTGTGGTACTGTTCGTCCTAAATTTGAACCATTTCTGGACCTTTCACTGTCTGTTTCTGAA

ACGAATGTTTCAAAACGCAATATAAATGAATCTGTGTCTAAACAGCATTCTAAAGGTGCCTCCAGTTCCAAACAACTTC

GGAAAAGGGAACGTAAACGTAAAGCTCCAAAACAACGAAAACGTCAAAATTTCATACATGATTATCAATCAGATCAGGG

CTGTTTAGATCAGTGCAGTTCAGATTCAGATAGTCAGAAAACAAAACATAATAACCACCAACCATTGGACTCATTTATT

GCAAAATGTGCTGATGTAACTGATCCAAATGTAGACAGTAAGCGTGTCGAGAACGTGGATGGGAATCTTGGCGTAAATG

AGCATCAACATGAAGATAATAATAGCAACGATGATGTAAATAAGAATGAGGTGAATTTGTTCAATTCGAATGAATGCGA

GCTTTCAAGCGAAACAATAAACCAAGGTTCTTGTGATGAAGTAGCATCATCGGACGGGAATTGTGCAGACGTTGAAGGT

AGTGATCGATATGACAGTGTTGCATCACTGCAAGTCATTCCAAATGGCTGTGATGAAAATGTAAAACAGTCAGAGATAA

ATCATATCAACACAGCATTGGAAAAGTTATCTTTGGACACAGTTGTATCGTCACAGTTGTTTTCATGTGATTCAGATGA

ATTAAATCAAGCTATTCATTATGCACGAGTTCCACTTGGTCAGAATAAAAGTAACAATTCAACAGAAGAAGGAGTTACT

TCTATTTATGAATGTCTTTCAAAATATACTTCTGCTGAATTATTAACAGGATCTAATCGTTTAATTTGTGATGTATGCA

CAAAACAAAAATCATTAGATGAGTTGGATAGTAATTTGGATAGTAAATCAATGGATAAGCAGACGCCTAACAACAACAA

GCCAGACATTTTACAAGATACTATCAAACGTGATTTAATCTATAAACCTCCACCGATTCTGACAATACATTTAAAGCGA

TTTCAACAGGTCGGTTTTCAATTACGAAAATCTCAGAAACGTATTCACTTCCCAATCTACTTGGATATTACTCCTTTCT

GTTCTGTTCTCGCTGTGACCCGTTCCAATCAGATACGTTATCGTCTTTACGGTGTAATTGAGCATACTGGACATTTAAC

TTCTGGTCATTATGTAGCTTATGTAAGTGTGCCAAAATCATACACTAATTGTAATGATAATAAATCAGATCTCATGGAG

AATCAATTCATTGGCCCTTTGAATCGTTCACCTAAATGGCCTTTATCTGTGAATGATTTAATTCAACGTCTTCGTCAAT

GTGATCATCATCAGCTGTTGTTATCATCGAATAATTTCACATCTTCTTCTATTCGAAATGACACCAATTCACTTGTGTG

TAATAATAATAATAATAATAATGGTAACAATACCATCAATCATTCAACAAATCATAACAATGAAGTGGTTGATGATTAT

GATCATGATGATTCACGTCAATGGTTCTATTGTTCCGATAGTCATGTAACACGTGTATCCCAGTCAACTGTATTGAATT

GTCAGGCTTATGTTTTATTTTATGAACGTATTGAATGA

lxxxv

2) Análise dos domínios conservados no InterPro

2.1) SmDUB5

SEQUENCE: SmDUB5_1_ORF1 LENGTH: 916 aa

Ubiquitin-associated/Translation elongation factor EF1B, N-terminal

Banco de Dados Nº de Acesso Domínio E-value

PFAM PF00627

UBA

2.9e-06 [670-710]T 5.5e-09 [745-784]T

SMART SM00165

UBA

0.19 [671-709]T 7.7e-07 [746-783]T

PROFILE PS50030

UBA

10.475 [663-710]T 14.764 [744-784]T

SEQUENCE: SmDUB5_1_ORF1 LENGTH: 916 aa

Peptidase C19, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2

Banco de Dados Nº de Acesso Domínio E-value

PFAM PF00443

UCH

3e-42 [329-906]T

PROFILE PS50235

UCH_2_3

26.277 [332-910]T

PROSITE PS00972

UCH_2_1

8e-5 [333-348]T

PROSITE PS00973

UCH_2_2

8e-5 [830-848]T

Molecular Function: ubiquitin thiolesterase activity (GO:0004221)

Biological Process: ubiquitin-dependent protein catabolic process (GO:0006511)

SEQUENCE: SmDUB5_1_ORF1 LENGTH: 916 aa

Zinc finger, UBP-type

Banco de Dados Nº de Acesso Domínio E-value

PFAM PF02148

zf-UBP

7.4e-32 [205-280]T

SMART SM00290

ZnF_UBP

7.8e-21 [204-259]T

PROFILE PS50271

ZF_UBP

17.394 [203-275]T

SEQUENCE: SmDUB5_1_ORF1 LENGTH: 916 aa

unintegrated

Banco de Dados Nº de Acesso Domínio E-value

GENE3D G3DSA:1.10.8.30

no description

2.5e-18 [700-790]T

PANTHER PTHR10420

UBIQUITIN SPECIFIC

PROTEASE FAMILY C19-

1e-171 [24-405]T 1e-171

[426-512]T 1e-171 [544-

641]T 1e-171 [825-836]T

PANTHER PTHR10420:SF36

UBIQUITIN SPECIFIC

PROTEASE 5/UBP14(YEAST)

1e-171 [24-405]T 1e-171

[426-512]T 1e-171 [544-

641]T 1e-171 [825-836]T

lxxxvi

2.2) SmDUB14

SEQUENCE: SmDUB14_2_ORF1 LENGTH: 400 aa

Peptidase C19, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2

Banco de Dados Nº de Acesso Domínio E-value

PFAM PF00443

UCH

2.9e-62 [3-394]T

PROFILE PS50235

UCH_2_3

21.377 [1-386]T

PROSITE PS00973

UCH_2_2

8e-5 [321-339]T

Molecular Function: ubiquitin thiolesterase activity (GO:0004221)

Biological Process: ubiquitin-dependent protein catabolic process (GO:0006511)

SEQUENCE: SmDUB14_2_ORF1 LENGTH: 400 aa

unintegrated

Banco de

Dados

Nº de Acesso Domínio E-value

PANTHER PTHR10420

UBIQUITIN SPECIFIC PROTEASE

FAMILY C19-RELATED

8e-89 [3-83]T 8e-89 [105-

269]T 8e-89 [328-339]T

PANTHER PTHR10420:SF39

UBIQUITIN SPECIFIC PROTEASE

14/UBP6(YEAST)

8e-89 [3-83]T 8e-89 [105-

269]T 8e-89 [328-339]T

2.3) SmDUB16

SEQUENCE: SmDUB16_1_ORF1 LENGTH: 749 aa

Peptidase C19, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2

Banco de Dados Nº de Acesso Domínio E-value

PFAM PF00443

UCH

3.2e-51 [32-745]T

PROFILE PS50235

UCH_2_3

26.612 [35-749]T

PROSITE PS00972

UCH_2_1

8e-5 [36-51]T

PROSITE PS00973

UCH_2_2

8e-5 [593-610]T

Molecular Function: ubiquitin thiolesterase activity (GO:0004221)

Biological Process: ubiquitin-dependent protein catabolic process (GO:0006511)

SEQUENCE: SmDUB16_1_ORF1 LENGTH: 749 aa

unintegrated

Banco de

Dados

Nº de Acesso Domínio E-value

PANTHER PTHR10420

UBIQUITIN SPECIFIC

PROTEASE FAMILY C19-

1.8e-77 [34-67]T 1.8e-77 [84-

237]T 1.8e-77 [470-502]T 1.8e-

77 [531-599]T

PANTHER PTHR10420:SF52

UBIQUITIN-SPECIFIC

PROTEASE 16-RELATED

1.8e-77 [34-67]T 1.8e-77 [84-

237]T 1.8e-77 [470-502]T 1.8e-

77 [531-599]T

lxxxvii

3) Análises das regiões codificadoras e não codificadoras em DUB5 e DUB16

3.1) Seqüência genômica de DUB5

A seqüência CDS: Smp_069960 é derivada do supercontig Smp_scaff000236 e

está localizada entre os nucleotídeos 676290 e 698592. O tamanho da seqüência

contendo regiões codificadoras e não codificadoras é de 22303pb, a mesma seqüência

contendo somente regiões codificantes tem o tamanho de 2751pb.

A localização dos éxons está representada na figura pelas barras azuis e listada a

seguir: éxons (676290..676527, 678174..678537, 679322..679499, 680498..680761,

682226..682457, 685193..685401, 688034..688201, 689566..689887, 691391..691701,

697447..697692, 698374..698592).

3.2) Seqüência genômica de DUB16

A seqüência CDS: Smp_162200.2 é derivada do supercontig Smp_scaff000255

e está localizada entre os nucleotídeos 208705 e 239160. O tamanho da seqüência

contendo regiões codificadoras e não codificadoras é de 30456pb, a mesma seqüência

contendo somente regiões codificantes tem o tamanho de 2250pb.

A localização dos éxons está representada na figura pelas barras azuis e listada a

seguir: éxons (208705..209199, 214359..214445, 217368..217873, 220862..220909,

223576..223888, 235884..235918, 236576..236807, 238496..238654, 238693..238833,

238866..238994, 239023..239072, 239106..239160).

3.1.1 – Figura esquemática da seqüência genômica Smp_069960. As linhas traçadas entre as barras azuis

representam as regiões não codificadoras que estão enumeradas. Os tamanhos dos íntrons são (1) 1646pb, (2)

784pb, (3) 998pb, (4) 1464pb, (5) 2735pb, (6) 2632pb, (7) 1364pb, (8) 1503pb, (9) 5745pb e (10) 681pb. A linha

verde ilustra a região na seqüência genômica onde está localizada a proteína SmDUB5.

lxxxviii

4) Expressão da subunidade do proteassoma alfa 5

Alfa 5

0 1 2 3 4 5 6

E3h

E18,5h

E24h

E3Dias

V.A

Ovos

Fases de S. mansoni

Níveis de mRNA (%)

3.2.1 – Figura esquemática da seqüência genômica Smp_162200.2. As linhas traçadas entre as barras azuis

representam as regiões não codificadoras que estão enumeradas. Os tamanhos dos íntrons são (1) 5159pb, (2)

2922pb, (3) 2988pb, (4) 2666pb, (5) 11.995pb, (6) 657pb, (7) 1688pb, (8) 38pb, (9) 37pb, (10) 28pb e (11) 33pb. A

linha verde ilustra a região na seqüência genômica onde está localizada a proteína SmDUB16.

4.1 - Gráfico da expressão da subunidade alfa 5 do proteassoma durante as fases de S.

mansoni. Foram analisadas as fases cercárias (Ce), esquistossômulos de 3 horas (E3h),

esquistossômulos de 18,5 horas (E18,5h), esquistossômulos de 24 horas (E24h),

esquistossômulos de 3 dias (E3Dias), vermes adultos (V.A) e ovos.

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