ads:
Melani Ribeiro Custódio
Avaliação do efeito isolado do fósforo e do paratormônio sobre o
tecido cardíaco de ratos urêmicos paratireoidectomizados
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor em Ciências
Área de concentração: Nefrologia
Orientadora: Prof. Dra. Vanda Jorgetti
São Paulo
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
“Bom mesmo é ir à luta com determinação, abraçar a vida e
viver com paixão, perder com classe e viver com ousadia.
Pois o triunfo pertence a quem se atreve, e a vida é muito
bela para ser insignificante”.
Charles Chaplin
ads:
Agradecimentos
Dra. Vanda Jorgetti
Minha orientadora, um modelo de Mulher: pesquisadora brilhante, médica
admirável, incansável na sua luta, sensível e feminina, dona de um coração
imenso, que abriga o mundo. Com você tenho aprendido muito,
crescido...graças à sua compreensão, incentivo, paciência e carinho.
Sinto tanto orgulho de às vezes poder ser sua “cover”...
A sua amizade continua sendo a minha maior conquista.
Sem ar de “despedida”... esta sessão vai ser leve, simples e alegre:
Meu filhos Luciano, Rafael e Flávio
Sinto-me orgulhosa em perceber que, freqüentemente, vocês é que têm sido
meus modelos de perseverança, ousadia e determinação. É um privilégio.
O amor por vocês é imenso, incondicional e eterno.
Minhas queridas “meninas” Daniela, Vanessa, Thaís e Mariana
Muito além do sentimento de responsabilidade, o do amor que compartilha,
principalmente coisas da alma feminina. Maravilhoso, é uma benção ter
vocês!!!
Roberto
Meu amigo, companheiro de muitos momentos importantes, sempre me
apoiando, incentivando, dividindo as alegrias e dificuldades do caminho.
Jair e Cristina
Meus amigos irmãos, presentes toda uma vida no meu dia a dia, incansáveis
em ouvir, partilhar. Me dão a certeza de que não estou só.
...
Dra. Viktoria Woronik
São muitos anos de convivência, de uma amizade profunda, compartilhando
tantos momentos e experiências importantes de nossas vidas.
Minha amiga Vick, não sei como te agradecer o apoio que sempre torna
mais fácil meus momentos “dark”. Mas, da próxima vez (?), vai para a
sessão família.
Dra. Rosa M. A. Moysés
Fico feliz quando olho para trás e vejo o início de uma carreira que progrediu
brilhantemente e tão rápido! E hoje, Rosinha, você distribui com carinho, a
Glória e a Fama para todos que estão ao seu redor (inclusive eu). Você é
demais!!!
Dr. Roberto Zatz
A minha admiração por você é imensa. Não sei o que brilha mais: se o
pesquisador ou o ser humano simples, carinhoso, sempre próximo quando
precisamos. É um privilégio conviver com você e escutar as histórias de
“minerin”
Dr. Joel Heimann
Mais do que os ensinamentos de hipertensão, obrigada pelo carinho e
brincadeiras em cada encontro no lab.
Aproveito para estender meu carinho e gratidão a Dra. Clarice, Dra. Denise
Malheiros, Dra. Regina, Dr. Praxedes, Dr. Luis Yu, Dr. Hugo, Dr. João Egídio
e à toda equipe da Nefrologia: residentes, enfermeiros, secretárias
(especialmente Denise, Neide, Eliana, Célia) e todos os funcionários (Janice
e Walter).
Obrigada por todos estes anos de ensinamento, colaboração e amizade.
Dra. Irene Noronha
Através do mundo das imunohistoquímicas, ganhei conhecimento e uma
amiga.
Dr. Rui Toledo Barros
Cheguei até aqui porque o senhor me abriu as portas deste brilhante serviço
de nefrologia, me incentivou e, aprendi que ser cobrada, também faz parte.
Sou eternamente grata.
Dr. Carlos A. Pasqualucci
Pelo apoio nas análises histológicas, pela colaboração técnica do seu
laboratório. Foi de grande importância para meu trabalho.
Minha família Ósseo Metabólica:
Fabi - Nosso modelo de elegância! Tenho acompanhado com o maior
orgulho seu crescimento... Guiachellinha, sei que implica comigo, mas no
fundo me ama.
Dani - minha amiga querida, parceira na organização do lab. Conviver com
você é bem leve, acho que é reflexo da Disney...
Carol - aquele tempo juntas, é inesquecível. Sinto muita sua falta, e agora, a
do Pedrinho também.
Kátia - nossa “Magaldinha”, brilhante! Viabilizou nossos projetos, sem
palavras...Será que é o sol de Salvador?
Andréa - minha partner de tese, projetos, é muito bom compartilhar de sua
alegria, bom humor e ainda aprender tantos apelidos.
Lulú
O seu agradecimento é especial porque você e o Marc trouxeram uma
alegria tão grande para nós: este serzinho amado que é o Lucas, o mais
novo membro de nossa família, está nos dando a oportunidade de trocar
fraldas, dar colo. Não é um sucesso?
Wagner
Você faz tantas contas, tabelas e confusão na minha cabeça, que não cabe
junto com ninguém. De novo, o que seria de nós todas sem você?
Obrigada também pelo companheirismo das noites passadas no lab, dos
cinemas, vinhos, do caminho de volta para casa...
Aluízio
Conviver e aprender com você é um prazer...
São tantas lembranças gostosas, alegres...
Cris e Cilene - agregadas especiais, amigas e companheiras...
Cris Karohl - amiga carinhosa, diretamente do sul, Secretment poderosa!
Mariana - com a tarefa inglória de nos emagrecer e, tão especial, que
merece mesmo um armador.
Rozi - encontramos pouco, como sol e lua, mas, o carinho é o mesmo.
Meire - obrigada pelo carinho. Sua amizade é importante para mim.
Rita - Com seu jeitinho tímido, especial, sempre pronta para colaborar.
Rodrigo - Será que é karma ter que agüentar nós todas? E sempre gentil
Ludmila, Bia, Juliana, Cris, Luciene, Patrícia, Flávia, Verônica e Verônica
(iniciação) - muito gostoso conviver com vocês, espero que ainda tenhamos
muito tempo pela frente.
Wagner, Rafa - a tese de vocês podia ser: Emagreça com pouco esforço!!!
Patrícia e Valéria - muito gracinhas, fazendo parte do nosso ambula.
Fábio Montenegro - uma história muito longa de parceria, amizade e troca de
experiências. Um amigo muito querido.
Philippe - meu primeiro “iniciante científico”. Sua participação foi valiosa para
o meu trabalho. Fiquei encantada com sua responsabilidade e capacidade
de aprendizado.
Ivone - amiga querida, o que seria de nós sem seus conhecimentos, sua
colaboração e paciência ?
Tatiana e Fátima (LIM51) - obrigada pela ajuda imunohistoquímica.
A todo LIM 16
Estou aqui há um longo tempo, convivendo com vocês, em diferentes
tempos e profundidade. São muitas as alegrias, trabalhos, comemorações,
angústias e dificuldades partilhados. Obrigada pelo carinho e paciência de
todos vocês.
Márcia Koike - Sem sua colaboração este trabalho não teria sido completo.
Obrigada pela paciência, pelos ensinamentos que foram além da morfologia
miocárdica.
Dr. Clóvis De Carvalho Frimm
Obrigada por ter me aberto as portas do LIM 51, pela colaboração valiosa ao
meu projeto.
Ao Instituto do Rim de Uberlândia
Dr. Hélio Teixeira e Dr. Paulo César de Oliveira - Há muitos anos vocês vêm
colaborando com um sonho que agora é uma conquista. Sem a
compreensão e amizade de vocês isto não seria possível. Obrigada!!
Heloísa e Deusdélia- muito mais que colaboradoras, minhas amigas sempre
presentes, principalmente nos momentos difíceis. Vocês fazem diferença,
me dão aquela sensação de que sou importante, necessária e querida!
A toda equipe de enfermagem, Dra. Carina, colaboradores, funcionários e
pacientes: espero ser importante para vocês como são para mim.
Minhas filhas adotivas Chiquinha e Silemar: muito queridas e especiais
A todos, obrigada pelo carinho de cada volta.
A Universidade Federal de Uberlândia, especialmente à Nefrologia:
Agradeço a colaboração da direção do Hospital das Clínicas, de todos os
meus amigos e colegas que deram suporte à minha ausência.
Aos outros amigos
Reúno aqui as pessoas queridas que convivem comigo...são muitos nomes
e rostos. Podem ter certeza de que não esqueci de ninguém.
Obrigada por aquela palavrinha, aquele abraço, aquela força.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, pelo
apoio financeiro.
Aos Ratinhos que participaram deste projeto...
Obrigada por serem instrumentos de nosso aprendizado.
Sem vocês, a história dos Homens não seria a mesma. Espero que sempre
os resultados sejam revertidos em benefícios de muitos.
Ao Universo
Que compactuou para que hoje fosse Hoje.
Que abriga meus entes queridos e os deixa mais próximos.
Uma energia de amor que envolve a gente.
Que esta força continue sempre viva dentro de mim,
Impulsionando e fazendo a diferença no meu Caminho.
OBRIGADA!!!
Sumário
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Summary
1. Introdução ............................................................................................ 1
1.1 - Fatores de risco para DCV........................................................... 2
1.1.1 - Fatores de risco tradicionais ................................................ 2
1.1.2 - Fatores de risco relacionados à terapia dialítica ................. 2
1.1.3 - Fatores de risco relacionados à uremia ............................... 3
1.2 - Remodelação cardíaca ou HVE ................................................... 7
1.2.1 - Estrutura do coração............................................................ 7
1.2.2 - Definição e fisiopatologia da remodelação cardíaca............ 8
1.3 - Interrelação da DRC e RC.......................................................... 14
2. Objetivos............................................................................................. 16
3. Material e Métodos............................................................................. 17
3.1 - Seleção dos animais .................................................................. 17
3.2 - Paratireoidectomia (PTX) ........................................................... 17
3.3 - Nefrectomia 5/6 (Nx) e implante de mini-bomba osmótica......... 18
3.4 - Dietas ......................................................................................... 19
3.5 - Grupos experimentais ................................................................ 19
3.6 - Medida da pressão arterial caudal (PAC)................................... 21
3.7 - Coleta de sangue e obtenção de fragmentos cardíacos ............ 21
3.8 - Avaliação bioquímica.................................................................. 21
3.9 - Histologia do tecido cardíaco ..................................................... 22
3.9.1 - Preparo do tecido cardíaco ................................................ 22
3.9.2 - Parafinização do tecido cardíaco ....................................... 22
3.9.3 - Desparafinização e colorações histológicas ...................... 23
3.9.4 - Avaliação da histologia miocárdica .................................... 25
3.9.5 - Avaliação histológica das artérias coronarianas ................ 26
3.9.6 - Imuno-histoquímica............................................................ 27
3.10 - Avaliação da imuno-histoquímica............................................. 32
3.11 - Análise estatística .................................................................... 32
4. Resultados.......................................................................................... 34
4.1 - Características gerais e bioquímicas.......................................... 34
4.2 - Hipertrofia miocárdica................................................................. 37
4.3 - Fibrose miocárdica ..................................................................... 37
4.4 - Imuno-histoquímica .................................................................... 38
4.5 - Análise dos vasos coronarianos................................................. 41
4.6 - Análise de correlação univariada ............................................... 45
4.7 - Análise de regressão linear múltipla........................................... 46
5. Discussão........................................................................................... 48
6. Conclusão........................................................................................... 58
7. Referências Bibliográficas................................................................ 59
Lista de Figuras
Figura 1. Patogênese da doença cardíaca na
insuficiência renal crônica ..............................................................10
Figura 2. Esquema dos grupos experimentais ..............................................20
Figura 3. Diâmetros dos miócitos nos diferentes grupos,
expressos em μm ..........................................................................37
Figura 4. Fração de volume de colágeno na região subendocárdica,
nos diversos grupos ...................................................................... 38
Figura 5. Fotomicrografias de tecido miocárdico com expressão
de TGF-b em vaso (A) e fibras miocárdicas (B).............................38
Figura 6. Quantificação da expressão de TGF-β no miocárdio,
expressa em % ..............................................................................39
Figura 7. Fotomicrografias de tecido miocárdico com expressão
de angio II em vaso (A) e fibras miocárdicas (B) ...........................39
Figura 8. Quantificação da expressão de angio II no miocárdio,
expressa em % ..............................................................................40
Figura 9. Fotomicrografias de tecido miocárdico mostrando
vasos com diferentes escores de lesão: escore 0 (A),
escore 1 (B), escore 2 (C) e escore 3 (D) ......................................42
Figura 10. Escore médio de lesão dos vasos coronarianos
avaliados nos diferentes grupos.....................................................43
Figura 11. Fotomicrografias de tecido miocárdico com expressão de
α-actina em vaso normal (A) e vaso calcificado (B)...................... 43
Figura 12. Quantificação da expressão da α-actina nos
vasos coronarianos ........................................................................44
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Dados gerais dos animais do estudo .............................................35
Tabela 2 - Análise bioquímica e do hematócrito dos animais .........................36
Tabela 3 - Análise da espessura da camada média
dos vasos coronarianos .................................................................41
Tabela 4 - Correlação univariada de parâmetros morfológicos.......................45
Tabela 5 - Regressão múltipla dos parâmetros morfológicos .........................46
Tabela 6 - Regressão múltipla dos parâmetros avaliados
por imuno-histoquímica..................................................................47
Resumo
Custódio MR. Avaliação do efeito isolado do fósforo e do paratormônio sobre
o tecido cardíaco de ratos urêmicos paratireoidectomizados [tese]. São
Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2007. 70p.
A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de mortalidade nos
pacientes com doença renal crônica (DRC) e a hipertrofia de ventrículo
esquerdo (HVE), a alteração mais freqüente. A remodelação cardíaca (RC)
patológica ocorre em resposta a agressões como sobrecarga de volume ou
de pressão e é influenciada por ativação neurohormonal, fatores locais,
inflamação, isquemia, necrose e apoptose celular. Os miócitos são as
principais células envolvidas na RC. Avaliamos o papel da hiperfosfatemia e
do paratormônio (PTH) em animais urêmicos. Trinta e dois ratos Wistar
machos foram submetidos à paratireoidectomia (PTX) e nefrectomia (Nx),
com reposição contínua de PTH em concentração fisiológica (PTHf= 0,022
μg/100g/h) ou elevada (PTHe=0,11μg/100g/h). Os animais sham (N=16)
foram operados e recebiam infusão de veículo. Apenas o conteúdo de
fósforo nas dietas era diferente, ou seja: pobre=0,2% (pP) ou rica em
fósforo=1,2% (rP). Dividimos os animais em 6 grupos: Sham: Sham-pP (G1),
Sham-rP (G2); PTX+Nx: PTHf-pP (G3), PTHf-rP (G4), PTHe-pP (G5), PTHe-
rP (G6). Semanalmente determinamos o peso e a pressão arterial caudal.
Creatinina, fósforo, cálcio PTH e hematócrito foram analisados. Após 8
semanas os animais foram sacrificados. A hipertrofia e fibrose miocárdicas
foram analisadas com o sistema digital Leica. O peso do coração corrigido
por 100g peso corporal foi maior nos grupos G5 e G6 e apresentou uma
correlação positiva com hipertrofia e fibrose miocárdica. A hipertrofia e
fibrose foram menores no G3, quando comparado aos grupos Nx. A
hipertrofia miocárdica foi maior no G6, evidenciando o papel do P neste
processo. A fibrose mocárdica ocorreu principalmente em subendocárdio e
foi mais intensa no G6. Analisamos a expressão do fator transformador de
crescimento (TGF-β) e angiotensina II que foram mais intensas nos grupos
G5 e G6. As lesões das artérias coronarianas foram avaliadas de forma
semi-quantitativa e os animais G5 e G6 mostraram calcificações de camada
média. A expressão da α-actina se correlacionou negativamente com as
lesões coronarianas. Nossos resultados demonstraram a importância do
fósforo e PTH na fisiopatologia da DCV, sendo necessário um melhor
controle destes elementos para prevenção de mortalidade nos pacientes
com DRC.
Descritores: doença cardiovascular, hiperfosfatemia, paratormônio,
hipertrofia de ventrículo esquerdo, remodelação cardíaca, fibrose,
angiotensina II, calcificação vascular.
Summary
Custódio MR. Evaluation of the isolated effect of phosphorus and parathyroid
hormone on the cardiac tissue of parathyroidectomized uremic rats [thesis].
São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2007. 70p.
Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of mortality in patients
with chronic kidney disease (CKD), and left ventricular hypertrophy (LVH) is
the most common alteration. Pathologic cardiac remodeling (CR) occurs in
response to injuries such as volume or pressure overload, and it is influenced
by neurohormonal activation, local factors, inflammation, ischemia, necrosis
and cellular apoptosis. Myocytes are the principal cells involved in CR. We
evaluated the role of hyperphosphatemia and parathyroid hormone (PTH) in
uremic animals. Thirty-two male Wistar rats were submitted to
parathyroidectomy (PTX) and nephrectomy (Nx), with PTH continuous
replacement in physiologic concentration (PTHf=0.022μg/100g/h) or elevated
(PTHe=0.11μg/100g/h). The sham animals (N=16) were operated and
received vehicle infusion. Only the phosphorus content in diets was different,
that is: poor = 0.2% (pP) or rich in phosphorus = 1.2% (rP). We divided the
animals into 6 groups: Sham: Sham-pP (G1), Sham-rP (G2); PTX+Nx: PTHf-
pP (G3), PTHf-rP (G4), PTHe-pP (G5), PTHe-rP (G6). We determined the
weight and caudal blood pressure weekly. Creatinine, phosphorus, PTH
calcium and hematocrit were analyzed. After 8 weeks, the animals were
sacrificed. Myocardial hypertrophy and fibrosis were analyzed using Leica
digital system. The weight of the heart corrected for 100g body weight was
greater in groups G5 and G6 and presented a positive correlation with
myocardial hypertrophy and fibrosis. Hypertrophy and fibrosis were lower in
G3, when compared to Nx groups. Myocardial hypertrophy was higher in G6,
determining the role of P in this process. Myocardial fibrosis occurred mainly
in subendocardium and was more intense in G6. We analyzed the
expression of transforming growth factor (TGF-β) and angiotensin II, which
were more intense in groups G5 and G6. Coronary artery lesions were
evaluated semiquantitatively and G5 and G6 animals showed middle layer
calcifications. Expression of α-actin correlated negatively with coronary
lesions. Our results demonstrated the importance of phosphorus and PTH in
the pathophysiology of CVD; therefore, a better control of these elements is
required in order to prevent mortality in patients with CKD.
Keywords: cardiovascular disease, hyperphosphatemia, parathyroid
hormone, left ventricular hypertrophy, cardiac remodeling, fibrosis,
angiotensin II, vascular calcification.
1
1. Introdução
Os estudos que avaliam a sobrevida dos pacientes portadores de
doença renal crônica (DRC) vêm despertando grande interesse nas últimas
décadas.
Lindner e cols em 1974 descreveram elevada incidência de doença
coronariana e morte por acometimento cardíaco nesses pacientes [1]. Ainda
nos dias atuais, a doença cardiovascular (DCV) responde por
aproximadamente 50% dos óbitos e um terço das hospitalizações de
pacientes com DRC [2]. A DCV acomete pacientes de todas as idades e
diferentes tempos em diálise, como demonstraram Goodman e cols
estudando calcificação coronariana em adultos jovens [3].
De acordo com a American Heart Association, a presença de
albuminúria e elevação da creatinina na população geral são consideradas
fatores de risco independentes para DCV e acometem aproximadamente 20
milhões de americanos, caracterizando uma verdadeira epidemia desse
século [4]. A prevalência da hipertrofia ventricular esquerda (HVE) e doença
obstrutiva coronariana (DOC) é de 75% e 40% respectivamente nos
pacientes com DRC [5,6].
Um fato relevante é que a maioria dos pacientes em diálise não morre
de infarto agudo do miocárdio (IAM), mas, de morte súbita, provavelmente
devido a mecanismos não coronarianos, que afetam a função cardíaca [7].
Nesses pacientes são observadas lesões secundárias a remodelação das
2
artérias, arteríolas e capilares miocárdicos, além das lesões decorrentes da
hipertensão arterial (HA), e parecem estar dissociadas entre si. Estas lesões
estariam contribuindo para a reduzida tolerância à isquemia,
desenvolvimento de insuficiência cardíaca e arritmias [8].
1.1 - Fatores de risco para DCV
Diversos fatores de risco, relacionados à uremia e terapia dialítica,
contribuem para aumentar a morbidade e mortalidade por DCV nos
pacientes com DRC, além dos fatores tradicionais presentes na população
geral. São eles:
1.1.1 - Fatores de risco tradicionais
Idade avançada, sexo masculino, história familiar, hipertensão arterial,
dislipidemia, tabagismo, diabete melito, menopausa e sedentarismo [4,9]
1.1.2 - Fatores de risco relacionados à terapia dialítica
A terapia dialítica, especialmente a hemodiálise (HD), promove
alterações inflamatórias decorrentes da exposição de células mononucleares
circulantes à membrana do dialisador, favorecendo o desenvolvimento da
DCV. Além disto, alterações hemodinâmicas, próprias da HD, contribuem
para isquemia miocárdica principalmente quando associadas à anemia. Por
outro lado, na população de pacientes em diálise peritoneal, a elevação da
proteína C reativa (PCR) tem sido atribuída à bioincompatibilidade das
3
soluções de diálise peritoneal ou ainda aos componentes plásticos das
bolsas que acondicionam o dialisato
[10].
1.1.3 - Fatores de risco relacionados à uremia
Dentre os principais fatores [4,11,12,13,14,15] destacamos:
a) O estresse oxidativo, ou seja, substâncias resultantes do desequilíbrio
entre produção de compostos oxidantes e antioxidantes, levam ao dano
celular
e aumentam o risco de DCV [5,16,17].
Na uremia, há uma ativação
crônica e inadequada deste processo, que, além disso, favorece inflamação.
Essa inter-relação é complexa, podendo o estresse oxidativo atuar tanto
como causa como conseqüência da inflamação;
b) A aterosclerose atualmente é considerada uma inflamação crônica,
resultante da disfunção endotelial, com produção de citocinas, tromboxane e
fatores de crescimento, além do acúmulo de macrófagos e linfócitos T nas
placas ateroscleróticas. Na DRC, a inflamação associada a uma
aterosclerose acelerada contribui para a elevada mortalidade observada
nessa população [18]. Desta forma, na aterosclerose vários processos estão
interrrelacionados: estresse oxidativo, disfunção endotelial, calcificação
vascular e inflamação [19].
c) Os distúrbios do metabolismo mineral: Alterações no metabolismo do
cálcio (Ca), fósforo (P), paratormônio (PTH) e do calcitriol contribuem para o
desenvolvimento de DCV [20,21,22,23,24]. A hipocalcemia, a
hiperfosfatemia, e a deficiência de calcitriol, decorrentes da perda de função
renal, desencadeiam e perpetuam o hiperparatireoidismo secundário (HPT2)
4
que acomete cerca de 50% dos pacientes com DRC [24,25]. Esses
distúrbios, e medidas terapêuticas (uso de quelantes de fósforo a base de
cálcio e de calcitriol em doses farmacológicas) empregadas para corrigi-los,
favorecem o desenvolvimento de calcificações extra-ósseas [25,26].
Recentemente, constatou-se que o FGF23 (da família das fosfatoninas)
participa da fisiopatologia da DCV aumentando a excreção de fósforo e
diminuindo a síntese de 1, 25(OH)VD [27].
Cerca de 60% dos pacientes em diálise apresentam calcificação
cardíaca (achados de autópsia). Os depósitos de cálcio são encontrados no
sistema de condução, nas válvulas cardíacas, em arteríolas e artérias
coronárias, levando a anomalia na condução, estenose e/ou refluxo valvular,
insuficiência cardíaca congestiva (ICC) e óbito [28].
Tanto o PTH quanto o calcitriol aumentam a quantidade de Ca nos
cardiomiócitos e células musculares lisas de vasos, alterando o metabolismo
oxidativo, afetando a pressão e a contratilidade cardíaca. Estes eventos
deixam o coração criticamente dependente de oxigênio e, portanto, mais
susceptível à isquemia [29].
O coração apresenta receptores de PTH e in vitro, foi demonstrado que
esse hormônio induz hipertrofia dos cardiomiócitos [30]. Estudos clínicos
mostram a participação do PTH na HVE, fibrose e calcificação da camada
média das artérias independentemente da pressão arterial, favorecendo a
disfunção diastólica e arritmias [31,32].
Na DRC, para manter uma remodelação óssea adequada, preconiza-se
que os valores de PTH sejam mantidos entre 2 a 3 vezes o maior valor da
5
normalidade [33]. Entretanto, para o sistema cardiovascular, esses valores
deveriam ser menores, ou seja, em torno de 60 pg/ml, uma vez que, como já
descrevemos, o excesso de PTH contribui para o desenvolvimento da DCV
[31].
Recentemente, Block e cols demonstraram que valores de PTH acima
de 600 pg/mL se correlacionaram positivamente com maior mortalidade e
freqüência de hospitalizações [34].
Aproximadamente 70% dos pacientes com DRC apresentam
hiperfosfatemia (P>1,6mmol/l), decorrente da excreção insuficiente do P
absorvido da dieta e da falta de excreção renal. Sabe-se que o tratamento
dialítico corrige parcialmente o P sérico, pois apenas 0,02% desse elemento
encontra-se no plasma, portanto, acessível a depuração [35].
Classicamente, a importância do controle do P, na DRC, era atribuída
ao seu papel na patogênese do HPT2 [36], mas, atualmente sabe-se que a
hiperfosfatemia (fósforo sérico> 5,5 mg/dl) aumenta a mortalidade
decorrente de complicações cardiovasculares, O mesmo efeito foi detectado
em relação ao Ca, ao produto cálcio X fósforo (Ca X P) e ao PTH [34].
O mecanismo exato, através do qual, a hiperfosfatemia aumenta a
mortalidade não é bem conhecido, porém, cada vez mais se reconhece sua
participação no desenvolvimento da calcificação vascular. O excesso de P é
capaz de induzir a transformação fenotípica de células musculares lisas de
vasos em osteoblastos. Essas células modificadas passam, então, a
sintetizar e a mineralizar proteínas nas paredes vasculares [37]. Estudo de
Jono e cols demonstraram, in vitro, que esta mudança fenotípica promovida
6
pelo P associava-se a um aumento na atividade do co-transportador sódio
fósforo (Pit-1), favorecendo sua entrada nas células e levando a formação de
cristais de apatita em células que normalmente não mineralizam [38,39].
Descreveu-se também a indução, estimulada pelo P, do Cbfa-1 (Core biding
factor-1), fator determinante da diferenciação osteoblástica, na célula
muscular lisa de vasos
[37].
Uma outra via (indireta), pela qual o excesso de P induziria a
calcificação vascular, seria aumentando a secreção de PTH que, por sua
vez, aumenta a remodelação óssea (doença óssea de alto remanejamento),
liberando cálcio e fósforo para a circulação e favorecendo a calcificação.
Entretanto, a calcificação vascular também é observada na doença óssea de
baixa remodelação, sendo que nesta situação, seria devido ao menor
tamponamento ósseo do cálcio e fósforo que permanecendo no plasma,
poderiam se depositar nos vasos e/ou partes moles [40,41].
Nos indivíduos normais, mesmo com concentrações fisiológicas de
cálcio e fósforo, poderiam ocorrer calcificações vasculares, o que não
acontece pela presença de inibidores desse processo como, por exemplo: a
MGP (Matrix GLA protein), OPG (osteoprotegerina), fetuína-A e os
pirofosfatos. Nos pacientes com DRC, alguns desses inibidores estão
diminuídos, facilitando o aparecimento de calcificação [40].
A deficiência de calcitriol é um fator importante no desenvolvimento do
HPT2 que ocorre desde as fases iniciais da DRC. Entretanto, sabe-se
também que doses elevadas de calcitriol (usado para tratamento do HPT2),
7
promovendo maior absorção intestinal de cálcio e fósforo, favorecem o
processo de calcificação, aumentando o risco CV [42].
A vitamina D (VD), além de atuar no metabolismo cálcio-fósforo e no
tecido ósseo, apresenta outras ações. O receptor de VD é encontrado em
inúmeros tecidos, inclusive coração, parede dos vasos, rins e células
imunológicas e, como ligante de fator de ativação transcripcional, regula
vários genes envolvidos em outros processos fisiológicos [43]. Levin e cols
demonstraram em pacientes com HVE, uma associação entre diminuição de
mortalidade e tratamento com calcitriol ou análogos. Potencialmente, seriam
três os mecanismos que explicariam este efeito cardioprotetor da VD: a
regulação da inflamação, a ação na hipertrofia e proliferação celular e no
sistema renina-angiotensina [44,45,46,47].
Outros estudos mostraram que a VD exerce um papel na contração,
proliferação, maturação e expressão de proteínas da célula cardíaca, entre
elas, o colágeno. Assim, sugere-se que a VD seja importante na
manutenção do tônus vascular e débito cardíaco [48].
Diante do exposto, o alto risco para DCV na DRC resulta de múltiplos
fatores, como alterações hemodinâmicas, do metabolismo mineral e
endócrino, que isoladamente ou em associação, desencadeiam a hipertrofia
ou remodelação cardíaca e, posteriormente, insuficiência cardíaca (IC).
1.2 - Remodelação cardíaca ou HVE
1.2.1 - Estrutura do coração
Os principais componentes do músculo cardíaco são:
8
Miócitos - São células alongadas e ramificadas ligadas por junções
intercelulares complexas. A estrutura e função das proteínas contráteis
presentes nos miócitos são praticamente as mesmas das células do músculo
esquelético [49].
Fibroblastos - Constituem cerca de dois terços das células cardíacas e são
responsáveis principalmente pela síntese de colágeno e metaloproteinases.
Os fibroblastos, em condições patológicas, se transdiferenciam em
miofibroblastos aumentando a síntese de colágeno, enquanto sua
degradação pelas metaloproteinases da matriz, encontra-se inalterada ou
até diminuída [50].
Células musculares lisas e células endoteliais - Revestem internamente
os vasos sangüíneos e estão unidas entre si por meio de zonas de oclusão,
Matriz extracelular - É formada por uma rede de colágeno fibrilar,
proteoglicanas, glicosaminoglicanas e moléculas de sinalização, Possui
também colágenos do tipo I, III, IV, V e VI, assim como elastina.
A matriz extracelular possui função mecânica, suportando e mantendo a
arquitetura do tecido, mas também regula funções celulares como migração,
sobrevivência, proliferação e diferenciação [49,50].
1.2.2 - Definição e fisiopatologia da remodelação cardíaca
A remodelação cardíaca é uma resposta adaptativa do coração a uma
agressão, levando a alterações funcionais, celulares e moleculares,
Macroscopicamente, o coração apresenta modificações no seu tamanho e
forma.
9
Algumas das causas de remodelação são: IAM, sobrecarga de pressão
(estenose de aorta, hipertensão), doença inflamatória do miocárdio
(miocardite), cardiomiopatia dilatada idiopática ou sobrecarga de volume
[50].
A essência da hipertrofia cardíaca é um aumento do número de
unidades geradoras de força (sarcômeros) no miócito bem como do tecido
conectivo, dos capilares e terminações nervosas.
Em nível celular, a hipertrofia do cardiomiócito se caracteriza por
aumento do seu tamanho devido a um incremento da síntese protéica.
Analisando molecularmente, ocorre uma alteração gênica, levando a maior
expressão fenotípica dos genes de beta-miosina de cadeia pesada e da α-
actina esquelética. Há uma alteração das relações beta/alfa miosina e da α-
actina esquelética/cardíaca, levando a anormalidades na contração cardíaca
[51].
O processo de hipertrofia cardíaca também é caracterizado por um
acúmulo exagerado de colágeno no interstício e ao redor das artérias e
arteríolas coronarianas. O excesso de colágeno ventricular é resultado do
aumento da sua síntese pelo fibroblasto e miofibroblasto e da diminuição da
sua degradação pelas metaloproteinases da matriz. Os miofibroblastos
diferem dos fibroblastos (não estimulados) por expressarem α-actina de
músculo liso e produzirem maiores quantidades de colágeno [51].
Fatores hemodinâmicos e não hemodinâmicos estão envolvidos neste
desequilíbrio de síntese/degradação do colágeno e, portanto, da
remodelação cardíaca.
10
a) Fatores hemodinâmicos:
A figura 1 resume os principais fatores envolvidos na remodelação
cardíaca
↑ pressão arterial
↑
volume plasmático
sexo
idade
Hipertrofia do
ventrículo esquerdo
SRAA
Fatores de crescimento
locais / inibidores
catecolaminas
Insuficiência
cardíaca
inflamação
Aterosclerose
isquemia
Stress
oxidativo
apoptose
Figura 1. Patogênese da doença cardíaca na insuficiência renal crônica.
(Adaptado de G.M. London)
(Clinical Epidemiology of Cardiovascular Diseases in Chronic Kidney Disease, vol 16 (2) 85-94, 2003)
A sobrecarga de pressão e/ou volume são estímulos que levam ao
estiramento dos miócitos e aumento do estresse de parede no ventrículo,
favorecendo a produção e liberação local de angiotensina II, norepinefrina e
endotelina, que promovem a expressão de proteínas e hipertrofia dos
miócitos. O aumento do estresse de parede é compensado por um aumento
paralelo das unidades contráteis de cardiomiócitos, como citado
anteriormente. Há um espessamento do VE e a progressão da hipertrofia
favorece o desenvolvimento da IC. A deterioração do trabalho cardíaco
11
aumenta a ativação neurohormonal, elevando a produção de aldosterona e
citocinas que estimulam mais ainda a síntese de colágeno [13].
Desta forma, ocorre um aumento desproporcional da matriz
extracelular, mantendo a eficiência mecânica da contração cardíaca, as
custas de enchimento diastólico prejudicado.
A disfunção diastólica é a principal anormalidade observada nos
pacientes com IC, muitas vezes com função sistólica preservada.
O mesmo ocorre em modelo animal, onde foi observado que a
inflamação também tem uma importante participação na remodelação
cardíaca. A sobrecarga de pressão provoca um processo inflamatório
perivascular, com transmigração precoce de macrófagos, produção de
citocinas, fator transformador de crescimento (TGF-β), que induzindo a
síntese de colágeno do tipo I e III, inicia o processo de fibrose, se
estendendo posteriormente, para o interstício [52].
b) Fatores não hemodinâmicos:
Dois diferentes achados sugerem que fatores não hemodinâmicos
também contribuem para a fibrose ventricular nos pacientes hipertensos. Em
primeiro lugar, a fibrose tem sido identificada não só no VE, como também
no VD, septo interventricular e átrio esquerdo. O segundo achado se refere à
capacidade de algumas drogas, como os inibidores da enzima de conversão
(ECA) e antagonistas de receptor tipo I da angiotensina, diminuirem a
fibrose. Esse efeito é independente da ação anti-hipertensiva [53, 54].
12
Assim, a fibrose pode ser conseqüência da perda de regulação que
normalmente existe entre moléculas profibróticas e antifibróticas e, a
participação do sistema renina-angiotensina-aldosterona é particularmente
importante.
O aumento da angiotensina II é decorrente da produção sistêmica e
local e exerce múltiplos efeitos profibróticos no tecido cardíaco, induzindo
hiperplasia do fibroblasto, sua diferenciação em miofibroblasto, ativação das
vias de síntese de colágeno e inibição das vias de degradação. Além disto, a
fibrose parece ser uma resposta à inflamação e ao estresse oxidativo
induzidos pela angiotensina II, através de sua interação com receptor tipo I
nas células do endotélio vascular [55].
A angiotensina II estimula a secreção de aldosterona e como o coração
possui receptores para mineralocorticóides, esse hormônio também contribui
para a indução do estresse oxidativo e fenótipos pro-
inflamatórios/fibrogênicos. Deve-se destacar a presença freqüente de
hiperaldosteronismo secundário na IC e que o uso da espironolactona
(compete com receptor da aldosterona) favorece a redução da fibrose
miocárdica [56,57].
A remodelação cardíaca é influenciada pela liberação de
neurotransmissores, hormônios e substâncias vasoativas. Dependendo do
fator desencadeante, outros processos podem ocorrer no miocárdio
interagindo com a remodelação, tais como isquemia, necrose celular e
apoptose [49].
13
A apoptose é uma forma programada de morte celular, caracterizada
por fragmentação do DNA, condensação da cromatina, levando a formação
de núcleos picnóticos e corpos apoptóticos. A mitocôndria induz a morte
celular, liberando proteínas pró-apoptóticas no citoplasma, entre elas as
caspases. Quando há uma agressão miocárdica, a apoptose pode favorecer
a hipertrofia miocárdica e disfunção do VE. Os mecanismos que levam a
apoptose incluem algumas citocinas, estresse oxidativo e lesão mitocondrial
[50,58,59].
A necrose é uma forma abrupta de morte celular iniciada por um
determinado estímulo, levando a edema de organelas intracelulares, ruptura
da membrana plasmática, desintegração do citoplasma, resultando em
rápida interrupção da homeostase da célula [59]
Outros fatores que estão envolvidos na remodelação cardíaca são:
a) Endotelinas: São peptídeos vasoconstrictores potentes que geralmente
estão elevados na IC [50].
b) Citocinas: O TNF-α (fator α de necrose tumoral) e algumas citocinas
estão aumentados na IC, e esse aumento é proporcional a severidade da
doença. A viabilidade celular depende de uma complexa interação entre
indutores e inibidores de apoptose, os quais são susceptíveis a modulação
das citocinas, como TNF-α, que indiretamente aumentam a apoptose e
diretamente a necrose (efeito citotóxico) [50].
c) Estresse Oxidativo: A produção excessiva de espécies reativas de
oxigênio (ROS) ocorre no miocárdio, aorta, rins e musculatura esquelética. A
IC está relacionada com o estresse oxidativo, que tem um efeito deletério na
14
integridade estrutural do miocárdio e na sua função de contração. A
mitocôndria é a principal fonte da produção de ROS e ocorre em resposta a
ação de citocinas, como fator de necrose tumoral (TNF) e óxido nítrico (NO),
modificando a função de transporte elétrico e gerando O2. Desta forma,
existe uma correlação fisiopatológica entre disfunção mitocondrial e estresse
oxidativo (semelhante ao que ocorre na idade e nas doenças degenerativas).
A angiotensina II tem um papel importante na estimulação de outros
sistemas enzimáticos, como o NADPH (células endoteliais vasculares e
musculares), que também são fontes produtoras de ROS. Assim, o estresse
oxidativo tem um papel importante no desenvolvimento e progressão da
remodelação e falência cardíaca [60].
d) Metaloproteinase da matriz (MMP): contribui para a remodelação
cardíaca e sua atividade está aumentada na HVE e IC, especialmente em
resposta ao estresse oxidativo e a angiotensina II. Apesar da complexidade
do mecanismo, a ação aumentada desta enzima leva a degradação
progressiva da matriz extracelular, explicando em parte, a dilatação que
ocorre no VE, apesar do mecanismo de fibrose [61].
1.3 - Interrelação da DRC e RC
Existem fatores comuns na fisiopatologia e/ou progressão da DRC e
RC e, muitas vezes, é difícil avaliar isoladamente esses fatores. A
hiperfosfatemia, por exemplo, cursa freqüentemente com elevação dos
níveis de PTH, e as intervenções terapêuticas podem promover calcificação
vascular ou mesmo piorar a função renal.
15
Recentemente um modelo experimental de uremia, desenvolvido por
Neves e cols, possibilitou avaliar o efeito isolado do P no tecido
cardiovascular, onde se variou a concentração de P na dieta, fixando-se os
níveis de PTH [22]. Neste estudo, alguns animais desenvolveram
hiperfosfastemia marcante, aumento do coração e calcificações vasculares,
independentes da uremia e da hipertensão arterial.
Esses resultados nos levaram a supor que o P poderia participar da
ativação da célula miocárdica, uma vez que Meleti e cols demonstraram, em
osteoblastos, que o aumento de fósforo intracelular poderia alterar o
potencial de membrana mitocondrial, provocando morte celular [62].
Até o momento, sabe-se que a hiperfosfatemia é um fator de risco em
pacientes com DCV, provavelmente por favorecer a calcificação vascular.
Entretanto, pouco se sabe sobre sua ação (direta ou indireta) no músculo
cardíaco, principalmente no processo da remodelação cardíaca [63]. Embora
tenhamos demonstrado que a hiperfosfatemia isolada favorece a HV [22], os
mecanismos que levaram a esta alteração não foram elucidados:
a) Qual o papel do P e do PTH nos processos de hipertrofia, fibrose
miocárdica e lesão dos vasos? É possível isolar a ação do P?
b) Através de quais mecanismos o P e o PTH participariam da RC? Síntese
de proteínas? Inflamação? Calcificação?
16
2. Objetivos
Avaliar o efeito isolado do fósforo e do PTH na remodelação cardíaca,
analisando especialmente a hipertrofia, a fibrose miocárdica e calcificação
vascular em animais urêmicos.
17
3. Material e Métodos
Este estudo foi realizado de acordo com as normas estabelecidas pela
Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa - CAPPESQ nº
293/01 do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo.
3.1 - Seleção dos animais
Utilizamos ratos Wistar machos adultos com peso entre 280 a 320 g
aclimatados durante uma semana no biotério. Os animais foram alojados em
gaiolas, com livre acesso a água e dieta controle (Harlan-Teklad, Madison-
WI/USA) contendo 0,7% de fósforo, 0,7% de cálcio e 25% de proteína. O
ciclo sono-vigília foi respeitado com períodos iguais de iluminação (12h
escuro, 12h claro), temperatura (25°C) e umidade (25%).
3.2 - Paratireoidectomia (PTX)
Os animais foram anestesiados com pentobarbital (50 mg/kg de peso)
por via intra peritoneal (ip), para realização da PTX. Foi feita uma incisão
cervical anterior com exposição da traquéia e tireóide. As paratireóides
foram cauterizadas com bisturi elétrico, preservando-se a tireóide. A incisão
foi fechada com fio de algodão 4-0 e aplicada uma dose de penicilina
benzatina (100,000 UI/kg intramuscular). Os animais controles foram
submetidos à anestesia com exposição da traquéia e tireóide e receberam a
18
mesma dose de antibiótico. A eficácia da paratireoidectomia foi confirmada
pela dosagem de cálcio iônico, ou seja, foram considerados
paratireoidectomizados os animais cujos níveis de cálcio sérico eram ≤ 0,9
mmo/L.
3.3 - Nefrectomia 5/6 (Nx) e implante de mini-bomba osmótica
Os animais se recuperavam durante uma semana, recebendo dieta
controle (15 a 20 g/dia) adotando-se o protocolo de pair-feeding, onde a
quantidade de ração oferecida, ao par de animais, era determinada pelo
animal do par que ingeria menos ração.
Para realização da nefrectomia 5/6 (Nx) os animais foram anestesiados
com pentobarbital (50 mg/kg) ip, a seguir realizamos tricotomia na face
anterior do abdômen seguida de laparotomia com exposição do rim
esquerdo e ligadura de dois a três ramos da artéria renal esquerda. A seguir,
foi realizada nefrectomia total do rim direito. A incisão foi fechada por planos
(muscular e peritônio parietal) com fio categute cromado 4-0 e a pele com fio
algodão 4-0. Simultaneamente à Nx, a atividade do PTH era restaurada
através do implante de uma minibomba osmótica (Alzet modelo: 2mL
4
, Alza
Corp, Palo Alto, CA, USA) colocada na região subcutânea interescapular.
Essa minibomba liberava o hormônio de forma constante e de acordo com a
concentração escolhida, ou seja: PTH normal (1-34 rat PTH na dose de
0,022/100g/h) ou alto (1-34 rat PTH na dose de 0,11/100g/h) (Sigma-Aldrich,
St, Louis, MO, USA). No 28
o
dia, a mini-bomba foi substituída por uma nova,
com o animal anestesiado com éter, mantendo-se as mesmas
19
concentrações de infusão referidas anteriormente. A troca foi necessária,
pois a vida útil de cada mini bomba era de 28 dias. Essa incisão foi fechada
com fio de algodão 4-0. Foi aplicada uma dose de penicilina benzatina
(100.000 Ui/kg i.m.). Os animais controles foram submetidos à laparotomia,
com manipulação do hilo renal e implante de mini-bomba osmótica contendo
veículo (cisteína a 2% em solução salina 0,9%. Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA).
3.4 - Dietas
Após a recuperação cirúrgica da Nx, os animais receberam dietas com
distintas concentrações de fósforo: dieta rica em fósforo [1,2%], dieta pobre
em fósforo [0,2%], de acordo com o grupo estudado. O protocolo pair
feeding foi mantido até o final do experimento.
3.5 - Grupos experimentais
Grupo 1 (Sham-pP)
Ratos controles com infusão contínua de veículo e dieta pobre em fósforo.
Grupo 2 (Sham-rP)
Ratos controles com infusão contínua de veículo e dieta rica em fósforo.
Grupo 3 (Nx PTHf-pP)
Ratos nefrectomizados, paratireoidectomizados, com infusão contínua de
PTH na dose de 0,022μg/100g/h (para manter níveis séricos de PTH dentro
da faixa fisiológica) e dieta pobre em fósforo.
20
Grupo 4 (Nx PTHf-rP)
Ratos nefrectomizados, paratireoidectomizados, com infusão contínua de
PTH na dose de de 0,022μg/100g/h e dieta rica em fósforo.
Grupo 5 (Nx PTHe-pP)
Ratos nefrectomizados, paratireoidectomizados, com infusão contínua de
PTH na dose de 0,11μg/100g/h (para manter os níveis séricos de PTH em 5
vezes acima da faixa fisiológica) e dieta pobre em fósforo.
Grupo 6 (Nx PTHe-rP)
Ratos nefrectomizados, paratireoidectomizados, com infusão contínua de
PTH na dose de 0,11μg/100g/h e dieta rica em fósforo.
Figura 2. Esquema dos grupos experimentais.
Nx
PTHf-pP
Nx
PTHf-rP
PTH fisiológico
Sham
PTH elevado
Sham-pP Sham-rP
Nx Nx
PTHe-pP PTHe-rP
G1 G2 G3 G4 G5 G6
21
3.6 - Medida da pressão arterial caudal (PAC)
As medidas de pressão arterial caudal foram realizadas nos animais
acordados utilizando o método oscilométrico (Harvard Indirect Rat Tail Blood
Pressure Monitor – Harvard Apparatus Ltd, Edenbridge, Kent, England). O
equipamento estava conectado a um computador para o armazenamento e
análise dos dados (CODAS-DATAQ Instruments). Os animais eram
previamente treinados para adaptação a medida, ou seja, eram aquecidos
em gaiola especial durante 30 minutos. A medida da PAC foi registrada 1
vez por semana.
3.7 - Coleta de sangue e obtenção de fragmentos cardíacos
Findo as 8 semanas, os animais foram sacrificados sendo anestesiados
com pentobarbital (50mg/Kg ip) e submetidos à coleta de sangue através de
punção aórtica, além de se proceder à retirada do coração para análise
histológica e imuno-histoquímica.
3.8 - Avaliação bioquímica
Nas amostras de sangue determinamos o hematócrito (Htc), Ca iônico
(analisador de eletrólitos AVL-9140), P (método colorimétrico Labtest- Lagoa
Santa, MG/BR), PTH (rat PTH IRMA kit – Immutopics San Clemente,
CA/USA) e a creatinina (método colorimétrico Heinegard-Tiderstrom
modificado). A creatinina foi corrigida por 100g de peso do animal (Cr/100g).
22
3.9 - Histologia do tecido cardíaco
3.9.1 - Preparo do tecido cardíaco
Após a extração, o coração foi cortado transversalmente em
fragmentos de aproximadamente 3 mm e fixados em solução de Duboscq-
Brazil. Em seguida, estes fragmentos permaneceram em solução de formol a
10% acrescido de tampão fosfato por 2 horas, e posteriormente foram
incluídos em parafina.
3.9.2 - Parafinização do tecido cardíaco
Após a fixação, os fragmentos de corações foram colocados em caixetas
perfuradas e identificadas. Estas caixetas foram colocadas no processador
automático de tecido (Jung-Histokinette 2000 Leica, Nussloch, Alemanha).
Esse procedimento durou cerca de 14 horas e os fragmentos foram
desidratados em soluções com concentrações progressivas de álcool 50%,
70%, 96% (2 banhos), álcool absoluto (2 banhos), seguida de diafanização
(álcool absoluto + xilol (v/v), xilol (3 banhos) sendo então imersos
seqüencialmente, em parafina fundida a 60 °C. Após solidificação, os blocos
de parafina com os fragmentos permaneceram em temperatura ambiente.
Antes de serem seccionados, os blocos permaneceram 30 minutos a -
20°C sendo então cortados em micrótomo (Reichert Yung Supercut 2065
Leica, Nussloch, Alemanha) na espessura de 5 μm. Os cortes foram
colocados em lâminas previamente revestidas com gelatina 2% (Sigma
Chemical Co, St Louis, EUA). Essas lâminas permaneceram na estufa
23
(Fabbe-Primar, São Paulo, Brasil) a 60 ºC por 2 horas e em seguida foram
armazenadas a 4 ºC.
3.9.3 - Desparafinização e colorações histológicas
Antes das colorações histológicas, as lâminas foram desparafinizadas
em xilol durante 9 minutos, por 3 vezes. A seguir, desidratadas em álcool
absoluto (2 vezes), álcool 96% e álcool 70%. Finalizado este processo, as
lâminas foram hidratadas e processadas para as diferentes colorações
histológicas. Para a avaliação da fibrose e da hipertrofia miocárdica foi
usado um sistema de imagem digital (Leica Imaging Systems Itd.
Cambridge, U).
a) Ácido periódico de Schiff (PAS)
Após terem passado pelo processo de desparafinização, diafanização e
hidratação, as lâminas foram lavadas em água destilada e permaneceram no
ácido periódico 1% durante 10 minutos, sendo lavadas em seguida em água
destilada. As lâminas foram coradas pelo reativo de Schiff durante 45
minutos em ambiente escuro e lavadas em água corrente durante 10 a 15
minutos. A contra-coloração foi realizada com a hematoxilina de Harris
(preparada no laboratório) por 5 minutos, lavadas em água corrente e
montadas com lamínulas com o meio permanente, Permount (Fischer
Chemical, New Jersey, EUA).
Para o preparo do reagente de Schiff, foi adicionado 1 g de fucsina
diamante (Merck, Darmstadt, Alemanha) em 200 ml de água destilada
fervente. Quando a temperatura atingiu 50 °C, esta solução foi filtrada em
24
papel de filtro fino adicionando-se então 30 ml de ácido clorídrico (Merck,
Darmstadt, Alemanha). Após atingir a temperatura ambiente, acrescentamos
9g de metabissulfito de sódio anidro (Merck, Darmstadt, Alemanha) e esta
solução foi colocada em ambiente escuro durante 48 h. Após este período, a
solução adquiriu coloração amarelo-palha. Foi então adicionado 1g de
carvão ativo de Norita (Merck, Darmstadt, Alemanha), sendo filtrado com
bomba a vácuo, adquirindo uma cor transparente.
A hematoxilina de Harris foi preparada dissolvendo-se em 1000 ml de
água destilada fervente, 100g de alumínio e amônio sulfato dodecahidrato
(alúmen) (Merck, Darmstadt, Alemanha). Em paralelo, dissolvemos 5g de
hematoxilina (Sigma, Chemical Co, St Louis, EUA) em álcool aquecido. Em
seguida, estas 2 soluções foram misturadas e fervidas rapidamente
adicionando-se 2,5g de óxido de mercúrio vermelho (Merck, Darmstadt,
Alemanha) até atingir a cor púrpura-escuro. O corante foi então filtrado.
b) Picrossírius
O método de picrossírius é específico para detecção de colágeno. Os
cortes histológicos, corados por este método, podem ser estudados tanto na
luz habitual do microscópio como sob luz polarizada. A luz polarizada
permite a distinção entre o colágeno tipo I e III. O colágeno tipo I aparece
formado por fibras grossas coradas em vermelho ou amarelo, em fundo
escuro e o colágeno tipo III adquire cor verde birrefringente (Junqueira et al.,
1986).
Não usamos luz polarizada para o estudo do colágeno.
25
c) Von Kossa
Esta coloração é específica para cálcio e melanina. As lâminas são
cobertas com nitrato de prata a 5% e expostas à luz intensa (luz do sol ou
lâmpada incandescente de 100W) e depois de tratadas com hipossulfito de
sódio 5%, são contracoradas em cromalumen de Mayer.
d) Hematoxilina-eosina (HE)
Esta coloração utiliza a hematoxilina de Harris, eosina e álcool etílico
95%, acidificado com ácido clorídrico 1%. A hematoxilina cora em azul ou
violeta o núcleo das células e outras estruturas ácidas (como porções do
citoplasma ricas em RNA e a matriz da cartilagem hialina). A eosina por
outro lado, cora o citoplasma e o colágeno em cor de rosa.
3.9.4 - Avaliação da histologia miocárdica
a) Diâmetro dos miócitos: Os cortes histológicos foram corados com PAS
e analisados com aumento de 400 vezes. O diâmetro dos miócitos foi
mensurado apenas naqueles com disposição longitudinal, núcleos ovalados
e centralizados. Analisamos, em média, 10 miócitos por corte, cujos valores
foram expressos em micrômetros (μm).
b) Fibrose: Na quantificação da fibrose empregamos cortes histológicos
corados com picrossirius red e aumento de 200 vezes. A fração de volume
do colágeno (FVC) foi calculada pela razão percentual da área do tecido
miocárdico marcadas positivamente para as fibras colágenas (quantidade
26
absoluta de colágeno, excluindo áreas perivasculares) no ventrículo
esquerdo (quantidade absoluta de colágeno e miócitos), campo a campo.
Em cada corte, 30 campos foram examinados, sendo 10 para cada uma das
seguintes regiões: subendocárdica, septo e parede livre do ventrículo
esquerdo.
3.9.5 - Avaliação histológica das artérias coronarianas
a) Densidade celular da camada média: Para quantificação da densidade
celular da camada média selecionamos artérias de 50-200 μm de diâmetro e
relação diâmetro menor/maior superior a 0,5 μm, em cortes corados com
HE. As artérias foram fotografadas em aumento de 580x e analisadas no
software IMAGE J (National Institutes of Health, USA). A densidade celular
da camada média foi expressa em número de células musculares lisas por
área (células/mm
2
).
b) Espessura da camada média: Para avaliar a espessura da camada
média, selecionamos artérias de 50-200 μm e de 200-400 μm de diâmetro,
considerando a relação diâmetro menor/maior superior a 0,5 μm, em cortes
corados com HE, fotografadas com aumento de 580x e analisadas no
programa IMAGE J (National Institutes of Health, USA). Quatro medidas,
duas no menor diâmetro e duas no maior diâmetro foram realizadas (μm).
c) Avaliação da parede das artérias: Avaliamos diferentes camadas das
artérias coronarianas de forma semiquantitativa, atribuindo os seguintes
escores:
27
(0) normal - túnica íntima e lâmina elástica íntegras, camada média
organizada e ausência de calcificações.
(1) lesão leve - descontinuidade parcial ou total da túnica íntima e/ou lâmina
elástica, camada média organizada e ausência de calcificações.
(2) lesão moderada - descontinuidade parcial ou total da túnica íntima e/ou
lâmina elástica, camada média desorganizada e ausência de calcificações.
(3) lesão severa - descontinuidade parcial ou total da túnica íntima e/ou
lâmina elástica, camada média desorganizada e presença de calcificações.
Em média, analisamos de 3 a 5 artérias em cada corte, sendo que cada
artéria recebeu um escore. As comparações foram realizadas com a média
de escores das artérias de cada animal.
d) Avaliação da calcificação: Para a avaliação da calcificação
empregamos cortes histológicos submetidos à coloração de Von Kossa e
aumento de 200x. A calcificação da camada média, identificada pela cor
preta, foi estimada pelo cálculo da razão percentual entre a área corada
positivamente em preto e a área total da camada média.
3.9.6 - Imuno-histoquímica
a) Silanização de lâminas para imuno-histoquímica
Inicialmente as lâminas foram lavadas com detergente neutro por 24 hs
(Extran 10%) (Merck, Darmstadt, Alemanha). No dia seguinte foram
novamente lavadas durante uma hora em água corrente seguido por 10
minutos em água destilada. A seguir, foram mergulhadas em solução de
28
álcool absoluto e éter (1:1) por 15 minutos (2 vezes) e, posteriormente,
lavadas com água destilada. Permaneceram em estufa a 60 °C, até a
secagem.
No preparo do organosilano utilizamos uma solução de organosilano a
2% (Sigma Chemical Co, St Louis, EUA) diluído em 500 ml de acetona
(Merck, Darmstadt, Alemanha). Nessa solução as lâminas foram
mergulhadas por 3 minutos.
b) Métodos de imuno-histoquímica
Utilizamos anticorpos específicos para identificação da expressão de
angiotensina II (Ang II) de α-actina de músculo liso (α-actina) e de TGF-β. O
controle negativo do método foi realizado em todos os experimentos
omitindo-se o anticorpo primário específico. A seguir, a descrição da
metodologia.
c) Desparafinização e exposição antigênica
Inicialmente as lâminas foram desparafinizadas. Esse procedimento
consiste em, permanecer 30 minutos em estufa a 60°C, quando então as
lâminas foram imersas em xilol durante 9 minutos, 3 vezes.
Em seguida, mergulhamos as lâminas em álcool absoluto por 5 minutos
(2 vezes) e álcool 96%, por 3 minutos (2 vezes).
Finalizado este processo, as lâminas foram hidratadas em solução
salina tris-tamponada (TBS) pH=7,6. A solução TBS foi preparada
misturando-se Tris HCl a 0,5M (Serva, Heidelberg, Alemanha) pH=7,6
29
acrescida de cloreto de sódio (NaCl) a 0,15M (Merck, Darmstadt, Alemanha),
na proporção de 1:10.
O forno de micro-ondas foi utilizado para aumentar a exposição
antigênica, uma vez que a parafinização pode diminuir a expressão dos
antígenos no tecido dificultando sua detecção. Para tanto, as lâminas foram
imersas em tampão citrato (2,1g de ácido cítrico mono hidratado dissolvido
em 1000ml de água destilada, ajustando pH=6,0 com NaOH) e levadas ao
micro-ondas (Sanyo, São Paulo, Brasil) com potência de 2400 watts. Este
procedimento foi realizado uma vez durante 15 minutos (Torben e cols,
1994; Leong e cols, 1990).
d) Reações de imuno-histoquímica para angio II, α-actina e TGF-β
As reações de imuno-histoquímica, para identificação da expressão de
angio II e α-actina foram realizadas pela técnica estreptavidina-
biotina/fosfatase alcalina (Fujihara e cols, 1998). Para avaliação da
expressão do TGF-ß foi utilizada a técnica da avidina-biotina/peroxidase.
Angio II: Após exposição antigênica em tampão citrato, realizamos o
bloqueio da avidina e da biotina endógena 15 minutos cada um, seguido de
bloqueio inespecífico com soro não-imune de cavalo (Vector, Burlingame,
EUA) na diluição de 1:70, durante 30 minutos. Os cortes foram então
incubados com o anticorpo primário policlonal de coelho anti-angio II
(Península, Belmont, EUA) na diluição de 1:400 durante a noite, a uma
temperatura de 4 °C, em câmara úmida. A etapa seguinte foi uma incubação
30
com imunoglobulina biotinilada de cabra anti-coelho (Vector, Burlingame,
EUA) na diluição de 1:1000, durante 45 minutos e em seguida com o
complexo estreptavidina-biotina/fosfatase alcalina (Vector, Burlingame,
EUA), durante 30 minutos. O tempo de revelação com o substrato
cromogênico foi de 10 minutos e a contra-coloração realizada com
hemalumbre de Mayer. As células que expressavam a angio II
apresentavam cor vermelha.
α-actina: inicialmente realizamos o bloqueio da avidina e da biotina
endógenas 15 minutos cada uma, seguida do bloqueio inespecífico com soro
não-imune de cavalo (Vector, Burlingame, EUA) na diluição de 1:70, durante
30 minutos. Em seguida os cortes foram incubados com o anticorpo primário
monoclonal de camundongo anti-α-actina de músculo liso (Sigma Chemical
Co, St Louis, EUA) na diluição de 1:800. Essa etapa durou uma noite, a 4°C,
em câmara úmida. A seguir os cortes, foram incubados com imunoglobulina
biotinilada anti-camundongo adsorvida em rato (Vector, Burlingame, EUA) na
diluição de 1:200 durante 45 minutos, seguida de nova incubação com o
complexo estreptavidina-biotina/fosfatase alcalina (Vector, Burlingame,
EUA), durante 30 minutos. O tempo de revelação com o substrato
cromogênico foi de 10 minutos e a contra-coloração foi feita com
hemalumbre de Mayer. As células que expressavam α-actina apresentavam
cor vermelha.
TGF-β: Realizamos o bloqueio de peroxidase endógena durante 30 minutos,
com uma solução de peróxido de hidrogênio 10% em álcool metílico, com
uma concentração final de 3%. Em seguida, as lâminas foram lavadas em
31
PBS durante 5 minutos. Seguiu-se o bloqueio da avidina endógena, por 15
minutos, e o bloqueio inespecífico com soro não imune de cavalo durante 30
minutos. O anticorpo primário foi o anticorpo policlonal de coelho anti-TGF-β
(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA), na diluição de 1:10 seguido
de incubação foi durante toda a noite a uma temperatura de 4 °C, em
câmara úmida.
Antes da incubação com o anticorpo secundário, as lâminas
permaneceram durante 60 minutos em câmara seca. Em seguida foram
lavadas e incubadas com uma imunoglobulina biotinilada anticoelho (Vector,
Burlingame, EUA) na diluição de 1:1000, durante 45 minutos. Como último
passo, as lâminas foram incubadas com o complexo avidina-
biotina/peroxidase (ABC Kit, Vector, Burlingame, EUA) durante 30 minutos.
A solução de revelação foi feita na hora com 10 mg amino-etil-carbazol
(AEC) (Sigma Chemical Co, St Louis, EUA) dissolvido em 2,5 ml de
dimetilformamida. A esta solução foram acrescidos 47,5 ml de tampão de
acetato a 0,05M pH=5,0 e 250 μl de uma solução de peróxido de hidrogênio
a 3 % (Merck, Darmstadt, Alemanha). O tampão acetato é composto de 3,7
ml de ácido acético a 0,2M e 8,8 ml acetato de sódio a 0,2M, diluído em
água destilada para 50 ml.
A contra-coloração das lâminas foi realizada utilizando-se o corante
hemalumbre de Mayer. As lamínulas foram colocadas com gelatina
glicerinada Kaiser (Merck, Darmstadt, Alemanha) previamente aquecida. As
células que expressavam o TGF-ß apresentavam cor marrom.
32
3.10 - Avaliação da imuno-histoquímica
Quantificação da expressão de angiotensina II e TGF-β
Na avaliação da expressão de angiotensina II e de TGF-β, utilizamos
a técnica de contagem de pontos, ou seja, empregamos um microscópio,
com uma ocular com retículo de 100 pontos, acoplado a um monitor de
vídeo. Contamos os pontos que correspondiam à presença de células que
expressavam angio II ou TGF-β. Analisamos 25 campos consecutivos sob
um aumento de 200 X (Jepsen & Mortensen, 1979). Os resultados foram
expressos em porcentagem em relação à área total.
Quantificação da expressão da α-actina
A positividade para α-actina nos vasos cardíacos foi estimada
semiquantitativamente, empregando-se o seguinte escore:
(1) marcação fraca ou ausente, restrita a poucas áreas da camada média;
(2) marcação moderada, irregular e dispersa na camada média;
(3) marcação intensa e uniformemente distribuída na camada média.
3.11 - Análise estatística
Os resultados estão expressos em média±erro padrão. Quando as
variâncias entre os grupos diferiam, foi feita a transformação logarítmica dos
dados para normalização dos mesmos, e posteriormente, realizada a
comparação entre os grupos por ANOVA (pós-teste de Newman-Keuls).
33
Caso as variâncias ainda diferissem, foi aplicado o teste de Kruskal-Wallis
com pós-teste de Dunn. Foi considerado significativo o valor de p<0,05.
Análise de correlação univariada foi realizada pelo coeficiente de
correlação de Pearson para seleção das variáveis a introduzir na regressão
múltipla. Utilizamos o software Prism versão 4.0 (GraphPad Software, Inc,
San Diego, CA, EUA). Foi considerado significativo o valor de p<0,05.
Análise de regressão linear múltipla stepwise foi feita para determinar
quais variáveis independentes influenciaram significativamente a variável
dependente (diâmetro do miócito, percentual de fibrose subendocárdica ou
escore de lesão vascular). Nesta etapa utilizamos o software SYSTAT
versão 10. Para manutenção das variáveis no modelo de regressão foi
adotado p<0,150 (coeficiente com intervalo de confiança de 95%).
34
4. Resultados
4.1 - Características gerais e bioquímicas
As características gerais dos animais estão resumidas na tabela 1.
Com relação ao peso inicial dos animais, não notamos diferenças
entre os grupos,
O peso final dos animais foi maior nos grupos controles e no Nx G3,
que recebeu infusão fisiológica de PTH e dieta pobre em P (p<0,05).
A ingestão de dieta foi maior nos grupos controles (G1 e G2) e nos
grupos Nx com PTH fisiológico (G3 e G4), independente da concentração de
P (p<0,001).
O peso do coração, corrigido para 100g de peso do animal, foi maior
nos grupos Nx com PTH elevado (G5 e G6) do que nos grupos controles e
no G3 (p<0,05),
A pressão arterial caudal dos grupos Nx G5 e G6 foi maior do que nos
grupos controles (p<0,05).
35
Tabela 1 - Dados gerais dos animais do estudo
Média±erro padrão
Peso inicial
(g)
Peso final
(g)
Ingestão
(g/dia)
Peso do
coração (g)/
100 g de peso
corpóreo
PAC
(mmHg)
G1 – Sham-pP (n=8)
310,25±10,53
432,25±13,02
a
17,59±0,47
b
0,28±0,01 114,87±1,19
G2 – Sham-rP (n=8)
311,13±13,18
397,88±8,82
a
17,53±0,40
b
0,29±0,01 109,59±1,12
G3 – Nx PTHf-pP (n=8)
307,88±11,77
416,88±12,29
a
17,19±0,53
b
0,31±0,01 141,64±2,11
G4 – Nx PTHf-rP (n=8)
322,00±9,93 352,25±16,82
15,77±0,38
b
0,36±0,01 137,49±1,31
G5 – Nx PTHe-pP (n=9)
307,44±6,18 305,89±7,26 12,28±0,29
0,42±0,02
c
149,55±2,58
d
G6 – Nx PTHe-rP (n=7)
336,43±8,46 340,14±20,77 11,89±0,86
0,41±0,03
c
143,49±4,69
d
a p<0,05 vs G4,G5,G6
b p<0,001 vs G5,G6
c p<0,05 vs G1,G2,G3
d p<0,05 vs G1,G2
Os resultados da análise bioquímica e do hematócrito estão descritos
na tabela 2. As principais observações foram:
Creatinina - Os grupos Nx apresentaram a creatinina mais elevada do que a
dos grupos controles, com exceção do G3, que recebeu infusão fisiológica
de PTH e dieta pobre em P (p<0,05).
Cálcio - Os grupos controles (G1 e G2) e os Nx submetidos a dieta pobre
em P (G3 e G5), tiveram os valores maiores de cálcio sérico, se destacando
o G5, que também foi superior ao G2 e G3 (p<0,01).
Fósforo - Os grupos Nx que receberam dieta com concentração elevada de
fósforo (G4 e G6), concordantemente, apresentaram maiores valores de P
36
sérico quando comparados aos grupos controles e aos animais que
receberam dieta com baixa concentração de P, G3 e G5 (p<0,001).
PTH - Os grupos Nx G5 e G6 apresentaram valores maiores do que os
controles e que os grupos Nx G3 e G4 (p<0,05).
Hematócrito - Houve diferença entre os grupos controles e G3 e o grupo G6
(p<0,05).
O produto Ca x P (dado não demonstrado) foi maior nos grupos Nx G4, G5
e G6 com relação aos controles (p<0,05).
Tabela 2 - Análise bioquímica e do hematócrito dos animais
Média±erro padrão
Cr
(mg/dL)
iCa
(mmol/L)
P
(mg/dL)
iPTH
(pg/mL)
Ht
(%)
G1 – Sham-pP (n=8)
0,31±0,01
1,21±0,05
b
4,43±0,39 10,52±2,88
42,88±0,46
f
G2 – Sham-rP (n=8)
0,46±0,03
1,17±0,03
b
4,95±0,33 111,90±18,29
43,50±0,51
f
G3 – Nx PTHf-pP (n=8)
0,56±0,04
1,19±0,05
b
5,59±0,48 114,95±30,12
42,94±1,09
f
G4 – Nx PTHf-rP (n=8)
1,09±0,14
a
0,61±0,05
14,70±2,44
d
86,76±20,31 39,08±1,30
G5 – Nx PTHe-pP (n=9)
1,02±0,10
a
1,44±0,07
c
5,04±0,51
249,64±45,25
e
39,39±1,63
G6 – Nx PTHe-rP (n=7)
0,95±0,15
a
0,65±0,09
12,99±1,47
d
379,97±66,68
e
36,69±0,88
a p<0,05 vs G1,G2
b p<0,001 vs G4,G6
c p<0,01 vs G2,G3,G4,G6
d p<0,001 vs G1,G2,G3,G5
e p<0,05 vs G1,G2,G3,G4
f p<0,05 vs G6
37
4.2 - Hipertrofia miocárdica
A avaliação da hipertrofia miocárdica, através da medida dos
miócitos, mostrou que os grupos Nx apresentaram valores maiores que os
controles (p<0,05). Dentre os animais Nx, o G3 (PTH fisiológico e dieta
pobre em P) apresentou os menores valores, enquanto no G6 (PTH elevado
e dieta rica em P) o diâmetro dos miócitos foi maior do que no G3 e G5
(p<0,001) (Figura 3).
G1 G2 G3 G4 G5 G6
0
5
10
15
diâmetro dos miócitos (μm)
º p<0,05 vs G1,G2
g p<0,05 vs G3
§ p<0,001 vs G3,G5
º
ºg
ºg
ºg
§
Figura 3. Diâmetros dos miócitos nos diferentes grupos, expressos em μm.
4.3 - Fibrose miocárdica
A análise da porcentagem do volume de colágeno, na região do
subendocárdio, mostrou maiores valores no grupo G6 quando comparado
aos controles e ao G3 (p<0,05) (Figura 4). Nas demais regiões analisadas
não encontramos diferenças entre os grupos.
38
G1 G2 G3 G4 G5 G6
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Fração de volume do colágeno
subendocárdio (%)
º
º
p
<0,05 vs G1,G2,G3
Figura 4. Fração de volume de colágeno na região subendocárdica, nos
diversos grupos.
4.4 - Imuno-histoquímica
TGF-β - A Figura 5 mostra a expressão de TGF-β em vasos e fibras
miocárdicas.
Figura 5. Fotomicrografias de tecido miocárdico com expressão de TGF-β
em vaso (A) e fibras miocárdicas (B). Aumento de 400x
A
B
39
A análise da expressão do TGF-β no miocárdio mostrou diferença entre os
grupos com PTH alto (G5 e G6) e o controle G2 (p<0,05) (Figura 6).
G1 G2 G3 G4 G5 G6
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
º º
º
expressão de TGFβ (%)
p
<0,05 vs G2
Figura 6. Quantificação da expressão de TGF-β no miocárdio, expressa
em %
Angiotensina II - A Figura 7 mostra a expressão de angio II em vasos e
fibras miocárdicas.
A
B
Figura 7. Fotomicrografias de tecido miocárdico com expressão de angio II
em vaso (A) e fibras miocárdicas (B). Aumento de 400x
40
A expressão de angio II no tecido miocárdico mostrou uma intensidade
maior nos grupos com PTH alto (G5 e G6) quando comparado aos demais
grupos (p<0,05) (Figura 8).
G1 G2 G3 G4 G5 G6
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
expressão de angiotensina II (%)
º
º
º
p
<0,05 vs G1,G2,G3,G4
Figura 8. Quantificação da expressão de angio II no miocárdio, expressa
em %.
41
4.5 - Análise dos vasos coronarianos
A diferença entre as medidas de densidade celular da camada média
relativa a todos os grupos não foi significativa (dados não mostrados).
A medida da espessura da camada média não foi diferente entre os
grupos estudados, mesmo quando os vasos foram agrupados em diâmetros
de 50-200 μm e de 200-400 μm. Os dados são apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 – Análise da espessura da camada média dos vasos coronarianos.
G1 G2 G3 G 4 G5 G6
(n=6) (n=5) (n=6) (n=6) (n=8) (n=7)
Espessura
da camada
média
(vasos de
50-200 μm)
23±3 18±4 27±1 27±4 25±4 27±6
- (n=2) (n=3) (n=5) (n=6) (n=7)
Espessura
da camada
média
(vasos de
200-400 μm)
--- 30±4 35±4 38±3 41±6 44±6
Média±erro padrão
A Figura 9 demonstra as diferentes lesões vasculares que foram
classificadas por escores variando de 0 a 3.
42
B
A
D C
Figura 9. Fotomicrografias de tecido miocárdico mostrando vasos com
diferentes escores de lesão: escore 0 (A), escore 1 (B), escore 2
(C) e escore 3 (D). Aumento de 580x.
O escore de lesão dos vasos foi maior nos grupos com infusão
elevada de PTH (G5 e G6) quando comparados aos controles e aos Nx G3 e
G4 (p<0,01) (Figura 10).
43
G1 G2 G3 G4 G5 G6
0
1
2
3
º
escore médio de
lesão dos vasos
p
<0,05 vs G1,G2,G3,G4
º
º
Figura 10. Escore médio de lesão dos vasos coronarianos avaliados nos
diferentes grupos.
α-actina - A Figura 11 mostra a expressão de α-actina em vasos com
estrutura normal e vasos calcificados.
A
B
Figura 11. Fotomicrografias de tecido miocárdico com expressão de α-
actina em vaso normal (A) e vaso calcificado (B). Aumento de
580x.
44
O escore de expressão da α-actina mostrou-se significativamente
menor nos animais dos grupos com infusão elevada de PTH (G5 e G6)
quando comparados aos controles e aos Nx G3 e G4 (p<0,05) (Figura 12).
.
Figura 12. Quantificação da expressão da α-actina nos vasos coronarianos.
G1 G2 G3 G4 G5 G6
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
p
Escore de expressão da α-actin
º
a (%)
<0,05 vs G1,G2,G3,G4
º
º
45
4.6 - Análise de correlação univariada
A tabela 4 mostra os resultados da análise univariada, revelando que o
diâmetro de miócitos correlacionou-se positivamente com a PAC, Cr, P,
produto CaxP, iPTH, expressão de TGF-β e de angio II e negativamente com
Ht, iCa e expressão de α-actina. No tecido cardíaco, a fibrose
subendocárdica também apresentou correlação positiva com PAC, Cr, P,
iPTH e expressão de TGF-β e negativamente com Ht, iCa, e expressão de
α-actina. O escore de lesão dos vasos correlacionou-se positivamente com
PAC, Cr, iPTH, expressão de TGF-β e angio II e negativamente com Ht e
expressão de α-actina.
Tabela 4 – Correlação univariada de parâmetros morfológicos.
PAC Ht Cr P iCa CaxP iPTH
TGF-β
α-
actina
Angio
II
Diâmetro
miócitos
0,71
<0,0001
-0,64
<0,0001
0,71
<0,0001
0,60
<0,0001
-0,52
0,0007
0,56
0,0002
0,50
0,002
0,41
0,01
-
0,42
0,02
Fibrose
0,38
0,01
-0,50
0,0005
0,45
0,002
0,45
0,002
-0,35
0,02
0,26
ns
0,37
0,02
0,37
0,02
-
0,34
ns
Escore
de lesão
vascular
0,60
0,0001
-0,35
0,03
0,36
0,03
0,12
ns
-0,15
ns
0,18
ns
0,64
<0,0001
0,45
0,007
-0,81
<0,0001
0,76
<0,0001
46
4.7 - Análise de regressão linear múltipla
A tabela 5 mostra os resultados da regressão linear. O diâmetro dos
miócitos foi dependente principalmente da PAC e do PTH, enquanto o Ht
contribuiu para diminuição do mesmo. Com relação à fibrose miocárdica,
pode-se notar que foi dependente do PTH, sendo influenciada
negativamente pelo iCa. O outro resultado observado foi que o escore de
lesão vascular foi dependente do PTH e se relacionou negativamente com a
expressão da α-actina.
Tabela 5 - Regressão múltipla dos parâmetros morfológicos
Coeficiente de
regressão
Intervalo de confiança
(95%)
p
Diâmetro de miócitos
PTH
0,004 (0,002 ; 0,006) 0,01
PAC
0,059 (0,032 ; 0,086) 0,002
Hematócrito
-0,135 (-0,249 ; -0,021) 0,059
Fibrose miocárdica
Cálcio
-3,120 (-6,206; -0,034) 0,100
PTH
0,012 (0,005; 0,019) 0,007
Escore de lesão vascular
PTH
0,002 (0,0003; 0,0037) 0,020
α-actina
-0,804 (-1,093; -0,515) <0,0001
47
Tabela 6 – Regressão múltipla dos parâmetros avaliados por imuno-
histoquímica
Coeficiente de
regressão
Intervalo de confiança
(95%)
p
TGF-β
PAC
0,039 (0,011; 0,067) 0,026
Angiotensina II
PAC
0,024 (0,007; 0,041) 0,023
PTH
0,002 (0,005; 0,019) 0,052
α-actina
PAC
-0,019 (-0,031; -0,007) 0,020
PTH
-0,001 (-0,003; 0,000) 0,105
A tabela 6 apresenta os resultados da regressão múltipla das
diferentes citocinas avaliadas. Podemos observar que a PAC foi a que mais
influenciou a expressão do TGF-β. Com relação à expressão da angio II e
da α-actina, observamos a participação da PAC e do PTH sérico.
48
5. Discussão
São inúmeros os estudos sobre a incidência, fisiopatologia e
prevenção da DCV na DRC, considerando sua importância na mortalidade
destes pacientes. Entretanto, muitos questionamentos persistem e o
conhecimento de novos mecanismos fisiopatológicos permitiria ampliar o
tratamento, além de melhor prevenir essa comorbidade.
Nosso estudo avaliou o papel do P e do PTH na remodelação
cardíaca de animais urêmicos. Analisar isoladamente a ação da sobrecarga
de P e/ou do excesso de PTH, na uremia, é difícil uma vez que suas ações
estão interligadas. Anteriormente, nosso laboratório demonstrou em animais
urêmicos que a ingestão excessiva de P favorecia a hipertrofia miocárdica,
analisando o peso do coração [22]. No estudo atual avaliamos, através de
análise morfométrica e de técnicas de imuno-histoquímica, os processos que
participam não só da hipertrofia miocárdica como das lesões das artérias
coronarianas.
Uma das principais complicações da uremia é a hipertensão arterial.
Nossos resultados revelaram que elevadas concentrações de PTH agravam
essa comorbidade. Além de seu papel determinante na homeostase do Ca e
P, o PTH atua em vários outros tecidos, dentre eles, o sistema
cardiovascular. Tanto fragmentos de PTH (amino terminal) como a molécula
intacta se ligam ao receptor PTH/PTHrP e agudamente agem como potentes
vasodilatadores, aumentando os níveis intracelulares de AMP cíclico, que
49
por sua vez, inibem os canais de Ca dessas células, diminuindo o influxo de
Ca e conseqüentemente as concentrações de Ca intracelular [64]. Rashid e
col mostraram ainda ação do PTH em células endoteliais, aumentando a
síntese e liberação de óxido nítrico (NO), também com potente efeito vaso
dilatador [65].
Nos pacientes com HPT1 e HPT2 a secreção cronicamente elevada
de PTH mantém o Ca intracelular aumentado, alterando a função de
vasodilatação e a produção de substâncias vasoativas, especialmente a
síntese de NO, pelas células endoteliais, favorecendo a hipertensão arterial.
Além disso, o PTH aumenta a síntese de substâncias vasoconstritoras que
impedem a vasodilatação, via canais de K das células musculares lisas,
contribuindo ainda mais para a elevação da pressão arterial É importante
lembrar que o PTH age não só na função dos vasos, mas também na
estrutura das paredes, promovendo um espessamento que favorece a HA
[66]. Azar e cols mostraram uma correlação direta entre níveis séricos de
PTH e severidade da HA em pacientes submetidos à hemodiálise [67].
Ainda em relação a análise da HA, é interessante ressaltar que
quando comparamos os pares de animais entre si, os animais do G5 eram
mais hipertensos do que os do G6, assim como os do G3 mais que os do
G4, embora sem diferença estatística. Vale lembrar que esses animais eram
também os mais hipercalcêmicos (provavelmente como conseqüência da
diminuição da oferta oral de fósforo). Esse fato sugere que a hipercalcemia,
assim como o PTH, é capaz de promover uma ativação endotelial,
contribuindo para a HA [68].
50
Com relação ao peso do coração maior nos animais com PTH
elevado, sabe-se que o PTH favorece a HVE por efeito direto nos
cardiomiócitos, independente do Ca sérico e da PA [30,70f]. Estudos
anteriores revelaram uma associação entre HVE e níveis de PTH na
população geral [30], entre HVE e pacientes portadores de HPT1 [69], assim
como redução de HVE após PTX em pacientes portadores de HPT2 [70].
Nos animais que receberam infusão elevada de PTH não pudemos
observar o papel isolado da sobrecarga de P no processo de HVE. Nesse
caso, a elevada concentração de PTH foi o determinante da hipertrofia
cardíaca, provavelmente encobrindo a participação do P. Um fato importante
é que a sobrecarga de P foi avaliada pela fosfatemia, uma vez que não
dosamos o P tecidual, e como se sabe, a fosfatemia per si não é um bom
marcador da sobrecarga de P intracelular.
Quando analisamos os animais que receberam PTH em
concentrações fisiológicas e dieta pobre em P, vimos que, mesmo urêmicos,
apresentavam alterações de HVE e fibrose miocárdica discretas, se
assemelhando mais aos animais controles do que dos outros animais Nx.
Esses achados foram semelhantes aos observados por Ritz e cols [7],
demonstrando que a baixa ingestão de P foi benéfica para o tecido cardíaco.
Entretanto, no modelo dele não era possível distinguir qual efeito se devia ao
P ou ao PTH, o que foi possível no nosso, especialmente nos animais que
receberam concentração fisiológica de PTH. E ainda evidenciamos o oposto,
em que os animais submetidos a sobrecarga de P apresentaram resultados
de HVE e fibrose miocárdica próximos as dos grupos com PTH elevado,
51
exceto com relação às lesões vasculares [7,22,23] . Desta forma, quando
comparamos os dois grupos que receberam PTH fisiológico, observamos a
influência isolada do P na HVE assim como na fibrose do miocárdio.
Este é o primeiro estudo que analisou a influência do PTH e P nos
processos de hipertrofia e fibrose, através da medida do diâmetro de
miócitos e quantificação do volume do colágeno.
A hipertrofia miocárdica foi mais acentuada no G6 em relação aos G3
e G5 (infusões de PTH distintas e a mesma dieta pobre em P). Esses
resultados revelam que além do PTH, a hiperfosfatemia também contribuiu
para o desenvolvimento da HVE justificando o fato do G6 não ser diferente
do G4. Estudos clínicos mostram a associação de hiperfosfatemia e HVE,
inclusive obtendo redução da hipertrofia com melhor controle da
hiperfosfatemia [62,71]. Outros fatores também influenciaram a HVE, sendo
de forma positiva a pressão arterial e negativa, o hematócrito.
Quando analisamos a fibrose miocárdica, vimos que a mesma ocorria
principalmente na região do subendocárdio, quando comparada ao septo e
parede livre (dados não mostrados), e era mais intensa nos animais que
receberam PTH elevado e sobrecarga de P. Estes resultados são
concordantes com outros em que, independentemente da agressão
cardíaca, a região subendocárdica é a mais lesada. Isto ocorre
principalmente em situações onde se observa uma diferença no gradiente de
pressão, com diminuição da pressão arterial sistêmica e aumento da
pressão diastólica final do VE, prejudicando a perfusão coronariana e que
afeta principalmente o subendocárdio [72,73]. Não podemos afirmar, em
52
nosso estudo, que este mecanismo contribui para uma maior lesão em
subendocárdio, pois não avaliamos estas medidas hemodinâmicas. Nossos
animais, com hipertensão arterial severa, desenvolveram hipertrofia do
miocárdio, com participação importante do processo de fibrose, resultado do
aumento da síntese de colágeno e provável diminuição de sua degradação
[51]. Sabe-se que, além da sobrecarga de pressão, outros fatores
contribuem para a fibrose, principalmente a angiotensina II e a aldosterona.
Nossos resultados mostraram a influência da creatinina sérica, ou seja, a
uremia per si contribuiu para seu desenvolvimento. Além disto, confirmamos
a participação do PTHl no desenvolvimento da fibrose. Este hormônio age
como ativador dos fibroblastos e regulador de fatores pró-fibróticos como a
aldosterona [74,75]. Assim, novamente podemos constatar, no nosso
modelo, a participação do P, indicando que além do PTH e da PAC, a
hiperfosfatemia contribuiu para o processo de fibrose, especialmente no G6
onde o volume de colágeno foi maior. Estes achados coincidem com os de
Ritz e cols que mostraram o papel indireto da hiperfosfatemia na fibrose
intersticial, promovendo hipocalcemia, aumentando a síntese de PTH e o
processo de fibrose [7].
Nos animais com função renal preservada, a sobrecarga de P na dieta
não teve efeitos deletérios no miocárdio e vasos. Essa sobrecarga elevou os
níveis de PTH, e provavelmente da fosfatonina FGF23 que, por sua vez,
promoveu fosfatúria, normalizando os níveis de P [27].
Por outro lado, se questionava os efeitos de concentrações elevadas
de PTH na ausência de uremia, se promoveria alterações em artérias e
53
interstício do miocárdio [7]. Recentemente, estudo desenvolvido em nosso
laboratório mostrou calcificações em artérias de animais controles e
nefrectomizados, ambos submetidos a concentrações elevadas de PTH [32].
A expressão do TGF-β, considerada molécula chave nos processos
de fibrose tecidual, produzido pelos fibroblastos e mediador da ação
inflamatória da angiotensina II, foi determinante nos processos de hipertrofia,
fibrose e lesão dos vasos. E a quantificação da expressão do TGF-β se
mostrou mais intensa nos animais mais hipertensos que receberam
concentrações elevadas de PTH. Kai e cols mostraram que a hipertensão
arterial promove alterações inflamatórias na parede das artérias
coronarianas. Com a infiltração de macrófagos, há produção de citocinas e
TGF-β, ativando a cascata da fibrose miocárdica [52]. Nossos achados são
concordantes, e agrupando os resultados, observamos que a diferença entre
G5 e G6 (PTH alto e hipertensos) foi a fibrose, reafirmando o papel da
hiperfosfatemia.
Quanto à expressão da angiotensina II, a mesma foi significativa na
hipertrofia mocárdica e na lesão dos vasos. Com relação à fibrose, a angio II
não foi uma determinante. Achamos que este resultado se deve ao fato de
que a angiotensina II atua principalmente em fases mais precoces da
inflamação e, na fase de fibrose, sua expressão já estaria diminuída. A PAC
e o PTH foram os fatores que mais influenciaram a expressão da
angiotensina II e isto justificou sua intensidade nos grupos G5 e G6 com
relação aos demais grupos. Novamente chamamos atenção para a ação
permissiva do PTH em relação a esta proteína. Dentre os vários estudos
54
apontando a angiotensina II como um dos principais mediadores da lesão
CV, destacamos o de Tokuda e cols que mostraram a sua importância,
induzindo a inflamação e fibrose [55].
Na morfometria dos vasos coronarianos, avaliamos a espessura e
densidade celular da camada média para analisar a hipertrofia e, apesar de
observar um aumento nos grupos que receberam infusão elevada de PTH,
não conseguimos demonstrar diferença estatística entre os grupos. Uma
hipótese para justificar nossos resultados seria o pequeno número de
animais estudados, lembrando ainda que nas situações de agressão, o
contingente de vasos no miocárdio está diminuído [7]. São vários os fatores
que contribuem para o espessamento da parede vascular, mas,
considerando a uremia e a hipertensão dos animais NX, destacamos apenas
o papel do fósforo e PTH. Como já descrevemos, as células musculares
lisas dos vasos tem receptores para PTH/PTHrP e, principalmente na
uremia, o PTH é um fator facilitador do espessamento da parede das artérias
e do desenvolvimento de fibrose miocárdica [75]. Quando avaliamos
particularmente os animais com PTH elevado, além do reduzido número de
artérias, muitas delas apresentavam calcificações, prejudicando a
quantificação da camada média.
As lesões das artérias coronarianas, que variaram desde uma
descontinuidade da lâmina elástica até a calcificação da camada média,
foram analisadas por método semiquantitativo e vimos que o PTH foi o maior
determinante dessas lesões. Acredita-se que as alterações nas paredes dos
vasos, produzidas pelo PTH e já citadas anteriormente, precedem a
55
aterosclerose. Realmente, os grupos que apresentaram escores maiores
foram os que receberam PTH elevado, inclusive mostrando artérias muito
calcificadas em ambos os grupos, independente da concentração de P da
dieta. Os animais que receberam PTH em concentração fisiológica e dieta
rica em P não apresentaram calcificações vasculares. Os mesmos
resultados foram encontrados em outro estudo, destacando a importância do
PTH [32]. Entretanto, vale lembrar que a sobrecarga de P favorece a
calcificação alterando a expressão fenotípica da célula muscular lisa e sendo
um fator de risco independente para CV [21,23,37,39].
Sabe-se que fisiopatologia das lesões arteriais é complexa e envolve
muitos fatores, dentre eles: hipertensão arterial, uremia, PTH, inflamação e
fibrose.
Com relação à expressão da α-actina nas artérias, esta se relacionou
negativamente com os processos de hipertrofia e fibrose miocárdicas e
principalmente com a lesão dos vasos. À medida que a célula muscular lisa
dos vasos sofre uma mudança fenotípica, como ocorre nas situações de
hiperfosfatemia, vai expressando menos a α-actina [37]. Desta forma, a α-
actina apresentou uma expressão significativamente menor nos grupos G5 e
G6, mas não se mostrou diferente com relação à sobrecarga de P, como era
de se esperar. Talvez a razão seja que, sob concentrações elevadas de
PTH, o papel do P fica menos evidente e difícil de ser avaliado.
Recentemente, demonstrou-se que a dieta pobre em fósforo não protegeu
os vasos de calcificações em vigência de concentrações elevadas de PTH
[32].
56
Neste estudo nós não avaliamos a apoptose das células miocárdicas,
mas, sabemos que a disfunção cardíaca se deve, em parte, a morte celular.
Por outro lado, é conhecido o fato de que o aumento do P intracelular
desencadeia perda do potencial de membrana da mitocôndria, o que pode
ativar a morte celular. Estudos em cultura de células “osteoblasto-like”
mostraram que o P induz apoptose [58,62]. Poderíamos então conjeturar
que este seria um outro mecanismo pelo qual a hiperfosfatemia estaria
contribuindo para a hipertrofia miocárdica.
Um ponto a ser ressaltado é que no nosso estudo, infelizmente não
dosamos os metabólitos de vitamina D. Recentemente, tem se demonstrado
que a vitamina D exerce um efeito protetor na HVE [47,48].
Outros estudos mostrando a importância do estresse oxidativo nestes
processos de hipertrofia e fibrose miocárdica, assim como em lesões
coronarianas, são necessários e vão ser realizados posteriormente.
Este estudo nos chama atenção para aspectos importantes e práticos
com relação a P e PTH, inclusive levando a reflexões de mudanças na
conduta clínica.
O conceito de sobrecarga de fósforo na dieta, por exemplo, talvez
deva ser revisto, uma vez que a associação fósforo-mortalidade tem sido
mostrada até em pacientes com função renal normal. Vários estudos têm
sido publicados evidenciando a relação entre P e lesões coronarianas [76,
77}. Atualmente, cada vez mais os alimentos têm uma concentração maior
de P em função de aditivos, e, na maioria das vezes, avaliamos nosso
paciente com uma dosagem de P sérico, que não reflete esta sobrecarga ao
57
longo dos anos. Sugerimos que dentro do conceito de uma dieta saudável,
um dos objetivos seja diminuir a ingestão de P, prevenindo a DCV.
Com relação ao PTH, questionamos a recomendação do guia de
práticas clínicas para prevenção e tratamento dos distúrbios do metabolismo
mineral e ósseo (Kidney Disease Outcomes Quality Initiative - K/DOQI)
sugerir valores de PTH-intacto entre 150-300 pg/mL. Este nível de PTH
seria ideal para a manutenção da remodelação óssea normal; entretanto é
deletério para o tecido cardiovascular.
58
6. Conclusão
Em resumo, nossos dados confirmam que, além dos fatores clássicos
já descritos na uremia, os distúrbios do metabolismo mineral, ou seja,
sobrecarga de fósforo e hiperparatireoidismo desempenham papel
fundamental nos processos de hipertrofia, fibrose miocárdica e lesão dos
vasos. Portanto, o controle destas variáveis pode contribuir para a
diminuição da elevada morbi-mortalidade encontrada nos pacientes com
doença renal crônica.
59
7. Referências Bibliográficas
1- Lindner A, Charra B, Sherrard DJ, Scribner BH. Accelerated
atherosclerosis in prolonged maintenance hemodialysis. N Engl J Med.
1974 Mar 28;290(13):697-701.
2- Tonelli M, Wiebe N, Culleton B, House A, Rabbat C, Fok M, McAlister F,
Garg AX. Chronic kidney disease and mortality risk: a systematic
review. J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 2034-2047.
3- Goodman WG, Goldin J, Kuizon BD, Yoon C, Gales B, Sider D, Wang
Y, Chung J, Emerick A, Greaser L, Elashoff RM, Salusky IB. Coronary-
artery calcification in young adults with end-stage renal disease who are
undergoing dialysis. N Engl J Med.2000 May 18;342(20):1478-83.
4 - Zoccali C. Cardiorenal risk as a new frontier of nephrology: research
needs and areas for intervention. Nephrol Dial Transplant. 2002 ;17
[Suppl11]:50-54.
5- Bongartz LG, Cramer MJ, Doevendans PA, Joles JA, Braam B. The
severe cardiorenal syndrome: “Guyton revisited”. European Heart
Journal. 2005; 26: 11-27.
6- Foley RN, Parfrey PS, Sarnak MJ. The clinical epidemiology of
cardiovascular disease in chronic renal disease. Am J Kidney Dis. 1998;
32 (3 Suppl): S112-S119.
60
7- Amann K, Törnig J, Kugel B, Gross M-L, Tyralla K, El-Shakmak A,
Szaro A, and Ritz E. Hyperphosphatemia aggravates cardiac fibrosis
and microvascular disease in experimental uremia. Kidney Int. 2003; 63:
1296-1301.
8- Amann K, Ritz E. Microvascular disease- the Cinderella of uraemic
heart disease. Nephrol Dial Transplant. 2000; 15:1493-1503.
9- Yao Q, Pecoits-Filho R, Lindholm B, Stenvinkel P. Traditional and non-
traditional risk factors as contributors to atherosclerotic cardiovascular
disease in end-stage renal disease. Scand J Urol Nephrol. 2004; 38:
405-416.
10- Libetta C, De Nicola L, Rampino T, De Simone W, Memoli B:
Inflammatory effects of peritoneal dialysis: Evidence of systemic
monocyte activation. Kidney Int. 1996; 49: 506-511.
11- Foley R N, Parfrey P S, Harnett J D, Kent G M, Murray D C, Barre P E:
The impact of anemia on cardiomiopathy, morbidity and mortality in
end-stage renal disease. Am J Kidney Dis. 1996; 28: 53-61.
12- Pecoits-Filho R, Heimbürger O, Bárány P, Suliman M, Fehrman-Ekholm
I, Lindholm B, Stenvinkel P. Associations between circulating
inflammatory markers and residual renal function in CRF patients Am J
Kidney Dis. 2003 Jun;41(6):1212-8
13- London GM. Cardiovascular disease in chronic renal failure:
pathophysiologic aspects. Seminars in Dialysis. 2003; 16(2): 85-94.
61
14- Martola L, Barany P, Stenvinkel. Why do dialysis patients develop a
heart of stone and bone of china? Blood Purif. 2005;23: 203-210.
15- Locatelli F, Canaud B, Eckardt K-U, Stenvinkel P, Wanner C, Zoccali C.
Oxidative stress in end-stage renal disease: an emerging threat to
patient outcome. Nephrol Dial Transplant. 2003; 18:1272-1280.
16- Handelman GJ. Evaluation of oxidant stress in dialysis patients. Blood
Purif. 2000; 18:343-349.
17. Yilmaz MI, Saglam M, Caglar K, Cakir E, Sonmez A, Ozgurtas T, Aydin
A, Eyileten T, Ozcan O, Acikel C, Tasar M, Genctoy G, Erbil K, Vural A,
Zoccali C. The determinants of endothelial dysfunction in CKD:
oxidative stress and asymmetric dimethylarginine. Am J Kidney Dis.
2006; 47(5):924-5.
18- Stenvinkel P, Ketteler M, Johnson RJ, Lindholm B, Pecoits-Filho R,
Riella M, Heimburger O, Cederholm T, Girndt M. IL-10, IL-6, and TNF-
alpha: central factors in the altered cytokine network of uremia--the
good, the bad, and the ugly. Kidney Int. 2005 Apr;67(4):1216-33.
19- Schiffrin EL, Lipman ML, Mann JFE. Chronic kidney disease: effects on
the cardiovascular system. Circulation. 2007;116: 85-97.
20- Block GA, Friedrich K. Re-evaluation of risks associated with
hyperphosphatemia and hyperparthyroidism in dialysis patients:
Recommendations for a change in management. Am J Kidney Dis
2000; 35:1226-1237.
62
21- Reslerova M, Moe SM. Vascular Calcification in Dialysis Patients:
Pathogenesis and Consequences. Am J Kidney Dis 2003; 41(S1):S96-
99.
22- Neves KR, Graciolli FG, dos Reis LM, Pasqualucci CA, Moyses RM,
Jorgetti V. Adverse effects of hyperphosphatemia on myocardial
hypertrophy, renal function, and bone in rats with renal failure. Kidney
Int. 2004 Dec;66(6):2237-44.
23- Nishizawa Y, Jono S, Ishimura E, Shioi A. Hyperphosphatemia and
vascular calcification in end-stage renal disease. Journal of Renal
Nutrition, 2005; 1:178-182.
24- Naveh-Many T, Rahamimov R, Livini N, Silver J: Parathyroid cell
proliferation in normal and chronic renal failure rats: The effects of
calcium, phosphate and vitamin D. J Clin Invest 1995; 96: 1786-1793.
25- Kuzela DC, Huffer WE, Conger J D, Winter SW, Hammond WS. Soft
tissue calcification in chronic dialysis patients. Am J Pathol. 1977;
86:403-424.
26- Ribeiro S, Ramos A, Brandão A, Rebelo JR, Guerra A, Resina C et al.
Cardiac valve calcification in haemodialysis patients: role of Ca
phosphate metabolism. Nephrol Dial Transplant. 1998; 13: 2037-2040.
27- Fukagawa M, Kasama JJ. With or without the kidney: the role of FGF23
in CKD. Nephrol Dial Transplant. 2005; 20: 1295-1298
63
28- Braun J, Oldendorf M, Moshage W, Heidler R, Zeitler E, Luft F C.
Electron beam computed tomography in the evaluation of cardiac
calcification in chronic dialysis patients. Am J Kidney Dis. 1996; 27:394-
401.
29- Tyralla K, Amann K. Morphology of the heart and arteries in renal
failure. Kidney Int. 2003; 63(suppl 84): S80-S83.
30- Saleh FN, Schirmer H, Sundsfjord J, Jorde R. Parathyroid hormone and
left ventricular hypertrophy. European Heart Journal. 2003;24:2054-
2060.
31- McCarty M F. Nutritional modulation of parathyroid hormone secretion
may influence risk for ventricular hypertrophy. Medical Hypotheses.
2005; 64: 1015-1021.
32- Neves KR, Graciolli FG, dos Reis LM, Graciolli RG, Neves CL,
Magalhães AO, Custódio MR, Batista DG, V Jorgetti, Moyses RM.
Vascular calcification: Contribution of parathyroid hormone in renal
failure. Kidney Int. 2007; Jun;71(12):1262-70.
33- K/DOQI Clinical Practice Guidelines for Bone Metabolism and Disease
for Chronic Kidney Disease. Am J Kidney Dis. 2003; 42 (3 Suppl) S1-
S170.
34- Block G A, Klassen P S, Lazarus J M, Ofsthun N, Lowrie E G, Chertow
G M. Mineral metabolism, mortalily, and morbidity in maintenance
hemodialysis. J Am Soc Nephrol. 2004; 15(8): 2208-2018.
64
35- Delmez JA, Slatopolsky E: Hyperphosphatemia: Its consequences and
treatment in patients with chronic renal disease. Am J Kidney Dis. 1992;
19:303-317.
36- Slatopolsky E, Brown A, Dusso A: Pathogenesis of secondary
hyperparathyroidism. Kidney Int. 1999; 56 (73Suppl):S14-S19.
37- Giachelli CM, Speer M Y, Li X, Rajachar RM, Yang H. Regulation of
vascular calcifications. Roles of phosphate and osteopontin. Circ Res.
2005; 96:717-722.
38- Jono S, McKee M, Shioi A, Nishizawa Y, Mori K, Morii H et al.
Phosphate regulation of vascular smooth muscle cell calcification. Circ
Res. 2000; 87: e10-e17.
39- Li X, Yang HY, Giachelli CM. Role of the sodium-dependent phosphate
cotransporter, Pit-1, in vascular smooth muscle cell calcification. Circ
Res. 2006; 14;98 (7): 905-912.
40- Ketteler M, Gross M-L, Ritz E. Calcifications and cardiovascular
problems in renal failure. Kidney Int. 2005; 67, Suppl 94: S120-S127.
41- Goodman WG, London G, Block GA, Giachelli C, Hruska k, Ketteler M,
Levin A, Massy Z, McCarron DA, Raggi P, Shanahan CM and Yorioka
N. Vascular Calcification in Chronic Kidney Disease. Am J Kidney Dis,
2004; vol 43, 3: 572-579.
42- Moe SM. Vascular calcification and renal osteodystrophy relationship in
chronic kidney disease. European Journal of Clinical Investigation.
2006;36 (Suppl.2): 51-62.
65
43- Haussler MR, Whitfield GK, Haussler CA, et al. The nuclear vitamin D
receptor: Biological and molecular regulatory properties revealed. J
Bone Miner Res. 1998; 13: 325-349.
44- Levin A, Li YC. Vitamin D and its analogues: Do they protect against
cardiovascular Disease in patients with kidney disease?. Kidney Int.
2005; 68: 1973-1981.
45- Li YC. Vitamin D regulation of the rennin-angiotensin system. J Cell
Biochem. 2003; 88: 327-331.
46- Li YC, Kong J, Wei M, Chen Z-F, Liu SQ, Cao LP.1,25-Dihydroxyvitamin
D3 is a Negative endocrine regulator of the renin-angiotensin system. J
Clin Invest . 2002;110:229–238.
47- Achinger SG, Ayus JC. The role of vitamin D in left ventricular
hypertrophy and cardiac function. Kidney Int. 2005; 67, Suppl 95: S37-
S42.
48- Weishaar, Kim SN, Saunders D, Simpson RU. Involvement of vitamin
D3 with cardiovascular function III. Effects on physical and
morphological properties. Am J Physiol 1990; 258:E134-E 142.
49- Cohn JN. Cardiac remodeling: basic aspects. Up To Date. [on-line]
2007 [citado 18 set 2007]. Disponível em:
http://www.uptodateonline.com/utd/content/topic.do?topicKey=hrt_fail/1
8875&selectedTitle=2~59&source=search_result.
66
50- Cohn JN, Ferrari R, Sharpe N. Cardiac remodeling - Concepts and
clinical implications: A consensus paper from an International Forum on
cardiac remodeling. J Am Coll Cardiol. 2000; 35: 569-582.
51- Díez J, Gonzalez A, Lopez B, Querejeta R. Mechanisms of disease:
Pathologic structural remodeling is more than adaptive hypertrophy in
hypertensive heart disease. Nature. 2005; 2(4): 209-216.
52- Kai H, Kuwahara F, Tokuda K, Imaizume T. Diastolic Dysfunction in
hypertensive hearts: Roles of perivascular inflammation and reactive
myocardial fibrosis. Hypertens Res. 2005; 28(6): 483-490.
53- Brilla CG, Funck RC, Rupp H. Lisinopril-mediated regression of
myocardial fibrosis in patients with hypertensive heart disease.
Circulation. 2000; 102: 1388-1393.
54- Diez J, Querejeta R, Lopez B, Gonzalez A, Larman M, Martinez Ubago
JL. Losartan-dependent regression of myocardial fibrosis is associated
with reduction of left ventricular chamber stiffness in hypertensive
patients. Circulation. 2002; 105: 2512-2517.
55- Tokuda K, Kai H, Kuwahara F, Yasukawa H, Tahara N, Kudo H,
Takemiya K, Koga M, Yamamoto T, Imaizumi T. Pressure-independent
effects of angiotensin II on hypertensive myocardial fibrosis.
Hypertension. 2004; 43: 499-503.
56- Sun Y, Zhang J, Lu l, Chen SS, Quinn MT, Weber KT. Aldosterone-
induced inflammation in the rat heart. Role of oxidative stress. American
Journal of Pathology.2002; 161, 5: 1773-1781.
67
57- Brilla CG, Weber KT. Mineralocorticoid excess, dietary sodium and
myocardial fibrosis. J Lab Clin Med. 1992; 120: 893-901.
58- Van Empel VPM, Bertrand ATA, Hofstra L, Crijns HJ, Doevendans PA,
De Windt LJ. Myocyte apoptosis in heart failure. Cardiovascular
Research. 2005; 67: 21-29.
59- Bras M, Queenan B, Susin SA. Programmed cell death via
mitochondria: different modes of dying. Biochemistry (Moscow). 2005;
70: 231-239
60- Tsutsui H. Novel pathophysiological insight and treatment strategies for
heart failure - Lessons from mice and patients. Circ J. 2004; 68: 1095-
1103.
61- Ahmed SH, Clark LL, Pennington WR, Webb CS, Bonnema DD,
Leonardi AH, McClure CD, Spinale FG, Zile MR. Matrix
Metalloproteinases/ Tissue inhibitors of metalloproteinases:
Relationship between changes in proteolytic determinants of matrix
composition and structural, functional, and clinical manifestations of
hypertensive heart disease. Circulation. 2006;113:2089-2096.
62- Meleti Z, Shapiro M, Adams CS. Inorganic phosphate induces apoptosis
of osteoblast-like cells in culture. Bone,2000; 27(3):359-366.
63- Achinger SG, Ayus JC. Left ventricular hypertrophy: Is
hyperphosphatemia among dialysis patients a risk factor? J Am Soc
Nephrol. 2006; 17: S255-S261.
68
64- Schleiffer R, Bergmann C, Pernot F et al. Parathyroid hormone acute
vascular effect is mediated by decreased Ca uptake and enhanced
cAMP level.1989. Mol Cell Endocrinol; 67:63-71.
65- Rashid G, Bernheim J, Green J, Benchetrit S. Parathyroid hormone
stimulates the endothelial nitric oxide synthase through protein kinase A
and C pathways. Nephrol Dial Transplant. 2007. 22(10):2831-2837.
[Epub ahead of print].
66- Jolma P, Kööbi P, Kalliovama J, Saha H, Fan M, Jokihaara J, Moilanen
E, Tikkanen I, Pörsti I. Treatment of secondary hyperparathyroidism by
high calcium diet is associated with enhanced resistance artery relation
in experimental renal failure. Nephrol Dial Transplant. 2003; 18: 2560-
2569.
67- Azar B, Hamid N. Correlation of Serum Parathormone with
Hypertension in Chronic Renal Failure Patients Treated with
Hemodialysis. Saudi J Kidney Dis Transplant. 2005; 16(3):288-292
68- Fallo F, Cella G, Casonato A, Ermani M, Vettor R, Zanella S, Lumachi
F. Biochemical Markers of Endothelial activation in Primary
Hyperparathyroidism. Horm Metab Res. 2006; 38: 125-129.
69- Anderson P, Rydberg E, Willenheimer. Primary hyperparathyroidism
and heart disease- a review. European Heart Journal. 2004; 25:1776-
1787.
69
70- Sato S, Ohta M, Kawaguchi Y, Okada H, Ono M, Saito H. Effects of
parathyroidectomy on left ventricular mass in patients with
hyperparathyroidism. Mine Electrolyte Metab. 1995; 21: 67-71.
71- Ritz E, Gross M-L, Dikow R. Role of calcium-phosphorous disorders in
the progression of renal failure. Kidney Int. 2005; 68, S 99: S66-S70.
72- Toyota E, Ogasawara Y, Hiramatsu O. et a. Dynamics of flow velocities
in endocardial and epicardial coronary arterioles. Am J Physiol Heart
Circ Physiol. 2005; H1598-H1603.
73- Koike MK, Frimm CC, Curi M. Low coronary driving pressure early in
the course of myocardial infarction is associated with subendocardial
remodeling and left ventricular dysfunction. Int J Exp Path. 2007;
88(4):279-290.
74- Amann K, Ritz E, Wiest G, Klaus G, Mall G. A role of parathyroid
hormone for the activation of cardiac fibroblasts in uremia. J Am Soc
Nephrol. 1994 ;4(10):1814-9.
75- Amann K, Torning J, Flechtenmacher Ch, Nabokov A, Mall G, Ritz E.
Blood-pressure-independent wall thickening of intramyocardial arterioles
in experimental uraemia: evidence for a permissive action of PTH.
Nephrol Dial Transp. 1995; 10:2043-2048.
76- Narang r, Ridout D, Nonis C, Kooner J S. Serum calcium, phosphorus
and albumin levels in relation to the angiographic severity of coronary
artery disease. International Journal of Cardiology. 1997; 60:73-79.
70
77- Tonelli M, Sacks F, Pfeffer M, Gao Z, Curhan G. Relation Between
Serum Phosphate Level and Cardiovascular Event Rate in People With
Coronary Disease. Circulation. 2005;112:2627-2633.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
