( PDF ) Estudo dos efeitos de Kalanchoe brasiliensis (Saião) na lifopoese B e T

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

"Estudo dos efeitos de Kalanchoe brasiliensis (Saião)

na linfopoese B e T."

Luciana Souza de Paiva

Tese de Doutorado apresentada

ao Instituto de Microbiologia

Professor Paulo de Góes, visando

a obtenção do grau de Doutor em

Ciências.

INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA

RIO DE JANEIRO

2008

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Estudo dos efeitos de Kalanchoe brasiliensis (Saião) na linfopoiese B e T

Luciana Souza de Paiva

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de

Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Universidade Federal

do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários

à obtenção do título de Doutor em Ciências

(Microbiologia).

Orientador: Dr. Alberto Félix Antônio da Nóbrega

Co-orientadora: Drª Vivian M Rumjanek

Rio de Janeiro

Janeiro de 2008

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Estudo dos efeitos de Kalanchoe brasiliensis (Saião) na linfopoiese B e T

Luciana Souza de Paiva

Orientador: Dr. Alberto Félix Antônio da Nóbrega

Co-orientadora: Drª Vivian M Rumjanek

Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências

(Microbiologia), do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade

Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do

título de Doutor em Ciências (Microbiologia)

Aprovada por:

__________________________________________________________________

Dr. Alberto Félix Antônio da Nóbrega - Prof. Adjunto do IMPPG/UFRJ (orientador)

__________________________________________________________________

Dr. François Germain Noel - Prof. Titular do ICB /UFRJ

__________________________________________________________________

Drª Maria Isabel Dória Rossi – Profª Adjunta do ICB/UFRJ

__________________________________________________________________

Drª Elvira Maria Saraiva – Profª Associada do IMPPG/UFRJ

__________________________________________________________________

Drª Luciana Barros de Arruda Hinds – Profª Adjunta do IMPPG/UFRJ

Rio de Janeiro

Janeiro de 2008

“ Há circunstâncias na vida em que a dignidade humana pode exigir grandes

sacrifícios, isto é, heroísmo. Ninguém tem autoridade moral para exigir de outro

um comportamento heróico. Cada um de nós tem essa obrigação, não porque

os outros lho peçam ou censurem se o não fizer, mas porque as próprias

coisas lho pedem; pede-o sobretudo a dignidade humana.”

(Juan Luis Lorda)

AGRADECIMENTOS

• À Deus - por ter me dado força em todos os momentos que pensei em desistir.

• À meus pais José Maria e Izabel - por todo apoio durante toda a minha vida e por

representarem TUDO de mais importante nela.

• Às minhas irmãs Isabella e Josemery - pelos momentos de compreensão e

amizade e por terem me dado os sobrinhos mais lindos do mundo: Caíque, João

Victor e Luísa.

• À minha avó Alice - que muito contribuiu para que eu chegasse até aqui.

• Ao meu marido e grande amigo Vinicius - que soube compreender minhas

ausências e noites no Fundão. Por ter tido paciência nos momentos em que eu

estava mais estressada. Obrigada pelo amor e carinho!!! E por ter segurado

tantas vezes os animais para mim...

• Ao meu orientador Alberto Nóbrega - que me ensinou a ter paciência, a

perseverar e soube me mostrar o quanto eu era capaz. Por ter contribuído

enormemente para minha formação.

• À Profa Vivian Rumjanek - sempre gentil e solícita, me fez ver que sempre há

uma esperança quando tudo parece perdido e que não devemos desistir nos

momentos de desespero. Há sempre uma nova chance de recomeçar....

• Às colaboradoras Profas Sônia Costa e Vera Koatz (in memorian) – “ninguém

constrói um edifício sozinho”. Estamos aí para nos ajudar...

• À Profa Maria Bellio - por tantas vezes ter contribuído com idéias e por me

“salvar” quando eu precisava de uns animais. Agradeço também pela ajuda em

alguns experimentos.

• Ao Prof. Marcelo Bozza - por ter dado uma força na fase de conclusão dos

artigos.

• Aos amigos de laboratório: Elize, André, Carol, Márcia, Fátima, Gerlinde, Beatriz,

Cris, Raquel e Taiane – mesmo aqueles que já não estão mais no laboratório,

mas são sempre lembrados e aos que ainda estão, por terem me aturado nos

momentos de estresse. Obrigada pela ajuda no laboratório!!!

• Ao Deivid - sempre com tanta boa vontade em segurar os animais para mim,

além de me avisar quando a bolsa já estava na conta...

• À Giany e Michele - por terem realizado a parte química deste trabalho.

• Ao Sr Emílio Faustino - por ser esta pessoa tão prestativa e estar sempre pronto

para ajudar.

• À banca examinadora desta tese, à Profa Luciana Arruda por sua valiosa

contribuição para a revisão deste trabalho e em especial à Profa Thais Souto-

Padrón que esteve sempre disponível nos momentos em que mais precisei.

• À CAPES, que ao me conceder a bolsa permitiu com que eu pudesse levar o

projeto adiante.

FICHA CATALOGRÁFICA

Paiva, Luciana Souza

Estudo dos efeitos de Kalanchoe brasiliensis (Saião) na linfopoese B e T/

Luciana Souza de Paiva. Rio de Janeiro: UFRJ/IMPPG, 2008.

ii.132f.:il; 29,7cm

Orientador: Alberto Felix Antônio da Nóbrega

Tese (doutorado) – UFRJ/Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes/Programa de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), 2008.

Referências bibliográficas: 65-88f.

1.1- Visão geral do desenvolvimento dos linfócitos 1.2- O papel da IL-7 na

diferenciação dos linfócitos B e T 1.3- O papel de outras interleucinas na

diferenciação linfocitária. I. Nóbrega, Alberto Félix. II. Universidade Federal do

Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Programa de Pós-

graduação em Ciências (Microbiologia). III. Estudo dos efeitos de Kalanchoe

brasiliensis (Saião) na linfopoese B e T.

Resumo

Kalanchoe brasiliensis (Kb) é uma planta medicinal da família das Crassuláceas

usada na medicina popular para o tratamento de doenças inflamatórias e infecciosas.

Neste trabalho, nós mostramos que o tratamento de camundongos com Kb leva a uma

forte e seletiva inibição da linfopoese, afetando as linhagens B e T, sem a redução do

desenvolvimento da linhagem mielóide. Essa é a primeira descrição de um produto

natural derivado de planta com estas propriedades. Efeitos semelhantes foram

observados após o tratamento com um composto altamente purificado, o KMC, dimalato

de kalancosina, obtido de Kb. O número de linfócitos maduros nos órgãos linfóides

secundários foi preservado em camundongos tratados com Kb/KMC. O efeito de

Kb/KMC não é dependente de um aumento secundário dos níveis plasmáticos de

corticóide endógeno nem envolve TNF-α, interferon tipo I ou ligantes de TLR2/TLR4, os

quais tem sido descritos como inibidores seletivos da linfopoese. A análise por

citometria de fluxo dos fenótipos dos precursores T e B indicam um bloqueio da

maturação nos estágios proliferativos dependentes de IL-7 in vivo. In vitro, Kb/KMC

inibiu a proliferação dependente de IL-7 das células preB, mas não induziu a apoptose

dos precursores B e T. Esses resultados sugerem que Kb/KMC bloqueia seletivamente

a linfopoese através de um mecanismo que não envolve as substâncias previamente

caracterizadas, possivelmente agindo na via de sinalização da IL-7, abrindo novas

perspectivas para um potencial uso terapêutico de Kb e seus produtos como agentes

imunomoduladores.

Abstract

Kalanchoe brasiliensis (Kb) is a medicinal plant from the Crassulaceae family,

used in folk medicine to treat inflammatory and infectious diseases. In this work, we

show that short-term treatment of naïve mice with Kb led to a strong and selective

inhibition of lymphopoiesis, affecting both B and T cell lineages, without reduction of the

myeloid lineage development. This is the first description of a plant derived natural

product with these properties. Similar effects were observed after treatment with the

highly purified compound KMC, Kalanchosine dimalate, obtained from Kb. Numbers of

mature lymphocytes in secondary lymphoid organs were preserved in Kb/KMC treated

mice. The effect of Kb/KMC was not due to secondary augmentation of plasma levels of

endogenous corticoids neither involves TNF-α, type-I interferon or TLR2/TLR4 ligands,

which have all been described as selective inhibitors of lymphopoiesis. Flow-cytometry

analysis of the phenotypes of T and B cell precursors indicate a blockade of maturation

on IL-7 dependent proliferative stages in vivo. In vitro, Kb/KMC, inhibited the interleukin-

7 dependent proliferation of preB cells and did not induce massive apoptosis of B and T

cell precursors. These results suggest that Kb/KMC is selectively blocking

lymphopoiesis through a mechanism that do not involve the previous characterized

substances, possibly acting on the IL-7 signaling pathway, opening new perspectives for

a potential therapeutic usage of Kb and its derived products as immunomodulatory

agents.

SUMÁRIO

RESUMO................................................................................................................pág.i

ABSTRACT.............................................................................................................pág.ii

1.INTRODUÇÃO.....................................................................................................pág.01

1.1- Visão geral do desenvolvimento dos linfócitos .........................................pág.02

1.1.1- Desenvolvimento de células B......................................................................pág.03

1.1.2- Desenvolvimento de células T .....................................................................pág.06

1.1.3- Ondas de desenvolvimento de células B e timócitos em diferentes

sítios........................................................................................................................pág.09

1.1.4- O ambiente da linfopoese.............................................................................pág.10

1.1.5- Perturbações no ambiente da linfopoese......................................................pág.12

1.1.6- Diferenciação in vitro das linhagens de células B e T..................................pág.14

1.2- O papel da interleucina 7 na diferenciação dos linfócitos B e

T..............................................................................................................................pág.15

1.3- O papel de outras interleucinas na diferenciação linfocitária...................pág.17

2. OBJETIVOS........................................................................................................pág.19

3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................pág.20

Animais....................................................................................................................pág.20

Células....................................................................................................................pág.20

Purificação e cultura de células.............................................................................pág.20

Preparação do sumo de Kb/KMC............................................................................pág.21

Experimentos in vivo com o sumo de Kb/KMC.......................................................pág.21

Marcação das células para análise em citômetro de fluxo......................................pág.22

Diferenciação de células B in vitro..........................................................................pág.22

Medida da proliferação de células B de baço estimuladas com LPS após o tratamento

com sumo de Kb......................................................................................................pág.23

Medida da proliferação de células de medula estimuladas com IL-7 após o tratamento

com sumo de Kb e KMC..........................................................................................pág.23

Medida da proliferação das células da linhagem FDCP-I estimuladas com IL-3 após o

tratamento com Kb e KMC......................................................................................pág.23

Medida da proliferação de células de baço estimuladas com Con A e IL-2 após o

tratamento com KMC...............................................................................................pág.24

Radioimunoensaio...................................................................................................pág.24

Testes estatísticos...................................................................................................pág.24

4.RESULTADOS....................................................................................................pág.25

4.1- Caracterização da fração ativa do sumo de Kalanchoe

brasiliensis............................................................................................................pág.28

4.2- Avaliação das diferentes subpopulações de células B na medula de animais

tratados com o sumo de Kb.................................................................................pág.30

4.3- Efeitos in vivo do sumo de Kb/KMC no timo e em outros

órgãos....................................................................................................................pág.33

4.4-.Dosagem dos níveis plasmáticos de corticosterona.................................pág.39

4.5- Os efeitos de Kb/KMC são independents de TNF-α

αα

α, IFN-β

ββ

β, TLR2 ou

TLR4.......................................................................................................................pág.43

4.6- Efeitos do sumo de Kb na diferenciação de linfócitos B in

vitro........................................................................................................................pág.47

4.7- Interferência do sumo de Kb/KMC na via de sinalização da interleucina 7 (IL-

7).............................................................................................................................pág.50

4.8- Efeitos do Kb/KMC na proliferação celular em resposta a estímulos por IL-2 e

IL-3

..........................................................................................................................pág.52

4.9- Medida da proliferação de linfócitos B de baço estimulados com LPS após

tratamento com o sumo de Kb............................................................................pág.56

5.DISCUSSÃO........................................................................................................pág.58

6.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................pág.65

7. ANEXOS............................................................................................................pág.89

LISTA DE SIGLAS

AMPc monofosfato de adenosina

BCR receptor de célula B

Con A concanavalina A

DMSO dimetilsulfoxi

DN linfócitos T duplo-negativos

DP linfócitos T duplo-positivos

FTOC cultura de órgão fetal tímico

HSA antígeno resistente ao calor

IgD imunoglobulina D

IFN- β interferon beta

IGF-I fator de crescimento insulina-like

IgG imunoglobulina G

IgM imunoglobulina M

Igα cadeia pesada da imunoglobulina A

IL-2 interleucina 2

IL-3 interleucina 3

IL-3R receptor de interleucina 3

IL-4 interleucina 4

IL-7 interleucina 7

IL-7R receptor de interleucina 7

IL-9 interleucina 9

IL-15 interleucina 15

JAK3 kinase janus ativada 3

Kb Kalanchoe brasiliensis

KMC dimalato de kalancosina

LPS lipopolissacarídeo

MHC complexo principal de histocompatibilidade

NK células natural killer

PGE2 prostaglandina E2

RAG genes ativadores de recombinação

SCF fator de célula tronco

SDF-I fator derivado de células estromais 1

SN sobrenadante

SP linfócitos T simples-positivos

STAT fator de transcrição

TCR receptor de célula T

TdT enzima terminal deoxinucleotidil transferase

TLR-2 receptor tipo Toll 2

TLR-4 receptor do tipo Toll 4

TNF-α fator de necrose tumoral

TSLP timopoetina

VLA-4 antígeno de ativação tardia

LISTA DE FIGURAS

Figura 1..........................................................................................................pág. 03

Figura 2 .........................................................................................................pág. 06

Figura 3 .........................................................................................................pág. 26

Tabela 1..........................................................................................................pág.27

Figura 4 .........................................................................................................pág. 28

Figura 5 .........................................................................................................pág. 29

Figura 6 .........................................................................................................pág. 31

Figura 7 .........................................................................................................pág. 32

Figura 8 ........................................................................................................pág. 34

Figura 9 ........................................................................................................pág. 35

Figura 10 ......................................................................................................pág. 36

Figura 11 .......................................................................................................pág. 37

Tabela 2 ........................................................................................................pág. 38

Figura 12 .......................................................................................................pág. 40

Figura 13 .......................................................................................................pág. 41

Figura 14 .......................................................................................................pág. 42

Figura 15 .......................................................................................................pág. 44

Figura 16 .......................................................................................................pág. 45

Tabela 3 ........................................................................................................pág. 46

Figura 17........................................................................................................pág. 48

Figura 18 .......................................................................................................pág. 49

Figura 19 .......................................................................................................pág. 51

Figura 20 .......................................................................................................pág. 53

Figura 21........................................................................................................pág. 54

Figura 22.........................................................................................................pág.55

Figura 23.........................................................................................................pág.57

1- INTRODUÇÃO

Produtos naturais obtidos de plantas constituem uma fonte importante de

novos agentes com valor terapêutico. O uso de plantas na medicina popular tem

estimulado a investigação dos efeitos de extratos de plantas em diferentes processos

inflamatórios. Mais recentemente, algumas classes de novos imunomoduladores

extraídos de plantas vem sendo descritos (Chiba, 2005).

Kalanchoe brasiliensis (Kb) é uma planta medicinal brasileira da família

das Crassulaceae comumente usada na medicina popular para o tratamento de certas

doenças inflamatórias crônicas tais como reumatismo, bem como em casos de

abscessos e gânglios aumentados.

O gênero Kalanchoe é composto por cerca de 100 espécies compostas

por diferentes classes de substâncias, dentre elas, terpenóides (Siddiqui et. al, 1989) e

flavonóides (Liu et. al ,1989) .

Em estudos prévios, o efeito direto do sumo de plantas do mesmo gênero

na ativação de linfócitos humanos in vitro foi investigado na tentativa de mostrar que as

propriedades de cura destas plantas poderiam estar associadas com uma ação no

sistema imunitário (Moraes et. al, 1994; Rossi-Bergmann et. al, 1994). A partir desses

trabalhos foi demonstrado que o sumo liofilizado de plantas do mesmo gênero inibia a

resposta proliferativa de linfócitos a mitógenos in vitro (Rossi-Bergmann et. al., 1994).

Em outros estudos realizados com um modelo de inflamação aguda, o

sumo de Kb demonstrou potente ação anti-inflamatória e imunomoduladora, na medida

em que reduziu o processo inflamatório induzido por zimosan, além de reduzir o número

de células B no linfonodo drenante (Ibrahim et. al, 2002).

Os efeitos imunomodulatórios de Kb já foram descritos e acredita-se

estarem associados à presença de flavonóides, que são substâncias com largo

espectro de atividades biológicas (Middleton Jr & Kandaswami, 1994). Foram também

identificados sete patuletin-glicosídeos purificados do sumo de Kb (Costa et.al, 1994),

sendo três deles potentes inibidores da proliferação linfocitária.

Visto que a administração de Kb reduziu significativamente a população

de células B no linfonodo, acreditamos que haveria um efeito mais amplo do sumo de

Kb nas células do sistema imune, que passamos então a investigar. E, para melhor

compreendermos qual etapa do desenvolvimento e diferenciação linfocitária poderia

estar sendo influenciada por Kb descreveremos a seguir essas etapas.

1.1 – Visão geral do desenvolvimento dos linfócitos

Os linfócitos se desenvolvem nos chamados órgãos linfóides primários

sendo originados de células hematopoéticas pluripotentes a partir das quais todas as

linhagens de células sangüíneas se desenvolvem. Após a etapa de comprometimento

das células tronco hematopoéticas com a diferenciação da linhagem linfóide seguem-se

as etapas de expressão do receptor para antígenos, expansão celular e migração. Além

de todas as etapas de expressão de diferentes moléculas, comum ao processo de

diferenciação de diversos tipos celulares, as células B, assim como os linfócitos T,

apresentam uma etapa particular de seleção de repertório que exige um contato prévio

da célula com um antígeno via receptor. O repertório de células B expressando

imunoglobulinas específicas para auto-antígenos presentes nos órgãos linfóides é

selecionado da seguinte forma: alguns linfócitos cujos anticorpos tem baixa afinidade

por esses auto-antígenos sobrevivem (Schwartz & Stollar, 1994; Melchers et. al., 1995),

mas outros são eliminados em um processo chamado de seleção negativa. A seleção

em linfócitos T é dependente da ligação entre o peptídeo e as moléculas de MHC

presentes nas células do epitélio tímico. Uma pequena fração de células T imaturas

cujo TCR se associa com alta afinidade à peptídeos próprios ligados ao MHC sofre

apoptose, sendo este processo chamado de seleção negativa. Células que expressam

TCR que reconhece peptídeos próprios com afinidade moderada são positivamente

selecionadas. Essa seleção é uma das vias pelas quais o sistema imunitário torna-se

autotolerante. Uma pequena parte dos linfócitos que expressam receptores de

superfície emigram para os órgãos linfóides secundários, constituindo o que chamamos

de células recirculantes (Melchers & Rolink, 1999).

1.1.1 - Desenvolvimento de células B

Figura 1- Marcadores fenotípicos da linhagem B.

Nesta dissertação utilizaremos a nomenclatura de precursores de células

B introduzida por Melchers & Rolink, 1999 para tratar as diferentes etapas da ontogenia

de células B. O desenvolvimento da linhagem B até a fase de células B maduras é

marcado por sucessivos rearranjos nos genes de imunoglobulina e pela expressão de

marcadores intracelulares (Rolink & Melchers, 1991). Os progenitores de células B (pro

B) interagem com células estromais e IL-7, expressam os marcadores B220, CD19 e

CD43, além do receptor para IL-7 (IL-7R) que contribui para a sobrevivência,

proliferação e diferenciação dessas células (Corcoran et. al., 1996 e 1998). Durante a

expansão das células pro B no ambiente de células estromais em presença de IL-7,

ocorre a transição das mesmas para o estágio pre B-I (Rolink, Streb & Melchers, 1991b;

Melchers & Rolink, 1999). As células pre B-I apresentam boa capacidade proliferativa in

vitro na presença de células estromais e IL-7 (Lee et. al, 1989; Sudo et. al, 1989a). Em

camundongos RAG

-/-

deficientes no rearranjo de imunoglobulinas, as células pre B-I

desaparecem (Denis & Witte, 1989; Mombaerts et. al., 1992).

O próximo estágio de desenvolvimento da linhagem B é caracterizado pela

expressão citoplasmática da cadeia µH que define o estágio pre B-II (Arakawa &

Takeda, 1996) Nesse estágio, as células perdem a expressão de c-kit e TdT (Osmond,

1991) e a maioria também não expressa CD43. Por outro lado, as células passam a

expressar CD25 (Rolink et. al.,1994).

O compartimento pre B-II pode ser subdividido em 3 diferentes estágios de

desenvolvimento: 2 são chamados pre B-II grandes onde as células estão ciclando e 1

chamado de pre B-II pequena no qual as células estão em repouso. As células pre B-II

pequenas perdem a capacidade de serem clonadas nas células estromais em presença

de IL-7 e IL-3. As primeiras células do estágio grande expressam em sua superfície o

pre-BCR. Nesse estágio do desenvolvimento da célula B ocorrem dois eventos

importantes envolvendo o pre-BCR: a proliferação das células pre B que expressam o

receptor na superfície e o desligamento do rearranjo VDJ no segundo alelo da cadeia

pesada levando à exclusão alélica evitando que duas cadeias pesadas sejam

expressas na mesma linhagem de célula B (Loffert et. al., 1996). Então, a expressão do

pre-BCR leva a uma seleção positiva das células pre B-II que apresentam rearranjo

VDJ produtivo.

Quando as células pre B-II grandes, as quais não expressam RAG-1 e

RAG-2, tornam-se células pre B-II pequenas os genes RAG-1 e RAG-2 voltam a ser

expressos a nível de RNA e proteína. Nessa etapa, uma grande proporção de células já

rearranjou o locus gênico da cadeia leve (Boekel, Melchers & Rolink, 1995) embora

essas células não expressem imunoglobulinas na superfície. Camundongos IL7

-/-

apresentam um bloqueio no desenvolvimento de células B na transição pre B-I para pre

B-II sugerindo que a IL-7 esteja envolvida na proliferação das células pre B-II que são

positivas para pre-BCR (Freeden-Jeffry et.al., 1995). Essas descobertas foram

reafirmadas por ter sido constatado que camundongos transgênicos para IL-7 tem o

compartimento pro/pre B expandido e que essa população juntamente com as células B

imaturas persistem no baço, linfonodo e sangue do animal adulto transgênico

(Mertsching et. al., 1996; Fisher et. al., 1995).

As células pre B-II pequenas que apresentam rearranjo produtivo da

cadeia leve κ ou λ podem tornar-se células B imaturas expressando IgM na superfície.

Em camundongos normais, as células B expressam uma razão de 10 cadeias κ para

cada cadeia λ (Cohn & Langman, 1990) e a razão entre células pre B-II pequenas e

células B imaturas é aproximadamente 1 (Osmond, 1991; Rolink et.a la., 1994). Então,

a incapacidade para produzir a proteína de cadeia leve tipo κ afeta a transição de

células pre B-II pequenas para células B imaturas. Sugere-se que isso ocorra devido à

ineficiência das cadeias λ em parear com a cadeia pesada µ ou devido à baixa

eficiência dos rearranjos gênicos da cadeia leve λ.

As células B imaturas ainda não podem responder à estimulação

antigênica ou mitogênica através de proliferação e não maturam em células secretoras

de imunoglobulinas (Lang et. al., 1996). Tais células ainda expressam as proteínas

RAG-1 e RAG-2 e podem sofrer um rearranjo secundário de cadeia leve (Rolink et. al.,

1993a; Ghia et. al, 1995). Acredita-se que o rearranjo secundário da cadeia leve possa

ser induzido por autoantígenos presentes nos órgãos linfóides centrais como, por

exemplo, na medula óssea (Radic & Zouali, 1996; Chen, Prak & Weigert, 1997). Sendo

assim, as células B auto-reativas podem perder a especificidade pelo auto-antígeno.

A transição das células imaturas para células B maduras é caracterizada

por uma série de mudanças na expressão de marcadores. Células B maduras

expressam: L-selectina, os receptores de complemento CR1 e CR2 (CD35 e CD21,

respectivamente), CD22, CD23 e CD40 (Hartley et. al., 1993), podendo ser estimuladas

por antígenos T-dependentes e T-independentes para proliferarem e maturarem em

células secretoras de anticorpos. Algumas são células de longa duração apresentando

meia-vida de 6 semanas ou mais. Além disso, alguns estudos têm demonstrado que um

nível constitutivo de sinalização pelo BCR é necessário para a manutenção das células

maduras na periferia (Lam, Kuhn & Rajewsky, 1997).

As células B imaturas entram no baço via artéria central e localizam-se

nas áreas folicular e extrafolicular (MacLennan & Chan, 1993; Chan & MacLennan,

1993). Nesses sítios do baço as células B são ainda imaturas e podem ser distinguidas

das maduras por terem uma meia-vida bem menor (dias ao invés de semanas), além de

terem baixa expressão de B220 e IgD e altos níveis de expressão de heat-stable

antigen (HSA) e IgM (Förster & Rajewsky, 1990; Hardy et. al, 1991).

Somente 5% a 10% das células B imaturas recém formadas se

diferenciam em células B maduras e o motivo dessa pequena proporção de células

selecionadas ainda não é totalmente conhecido (Osmond, 1993; Rajewsky, 1993).

A transferência de células B imaturas da medula para o baço é o primeiro

passo para que ocorra a maturação da célula B (Allman et. al., 1993). Camundongos

que expressam uma forma truncada de Igα apresentam um defeito nessa transferência,

sugerindo que a sinalização dada pela IgM de superfície é necessária para a maturação

(Torres et. al, 1996). Em camundongos CD45

-/-

tem-se observado no baço um aumento

de 3 a 4 vezes no número de células B imaturas (Benaar et. al, 1996), sugerindo que a

CD45 fosfatase pode estar envolvida no aumento da seleção de células B na medula

óssea, no aumento da sobrevivência de células B imaturas no baço ou ainda no

decréscimo da diferenciação em células B maduras.

1.1.2 - Desenvolvimento de células T

Figura 2- Etapas do desenvolvimento dos linfócitos T.

Da mesma forma, o desenvolvimento dos linfócitos T no timo depende da

expressão de vários genes e seus produtos e ocorre em diferentes etapas. Os

progenitores linfóides saem da medula óssea e migram via sangue para o timo, órgão

localizado no mediastino superior. Os progenitores mais precoces de células T não

expressam o receptor TCR, nem os co-receptores CD4 e CD8, sendo chamados de

timócitos duplo-negativos (DN) que correspondem de 1-3% das células no timo adulto.

Os timócitos DN em camundongos podem ser subdivididos em quatro

estágios de diferenciação definidos através da expressão de CD25 (cadeia α do

receptor de IL-2) e de CD44: DN1 (CD44

CD25

), DN2 (CD44

CD25

), DN3 (CD44

CD25

) e DN4 (CD44

CD25

) (Robey, Fowlkes & Pardoll, 1990). Outro marcador usado

nestes estágios é o receptor c-kit, que é co-expresso com CD44. Em humanos,

diferentes marcadores são usados para distinguir estágios correspondentes a estes em

camundongos. O rearranjo do receptor TCR tem um papel central na sobrevivência dos

timócitos. Os timócitos só sobrevivem se os rearranjos das cadeias α, β, γ e δ do TCR

forem bem sucedidos e se associarem posteriormente ao complexo TCR/CD3. As

cadeias β e δ possuem os segmentos gênicos V, D e J para serem rearranjados e as

cadeias α e γ possuem apenas os segmentos gênicos V e J. O rearranjo da cadeia α

automaticamente deleta a cadeia δ. A regulação do rearranjo é essencial para a escolha

entre as linhagens de linfócitos T αβ e γδ.

No estágio DN1, os genes do TCR não estão ainda rearranjados

(Trowbridge et. al., 1985). No estágio DN2, as células passam a expressar CD25,

expandem consideravelmente e iniciam o rearranjo das cadeias β, γ e δ, mas não da

cadeia α (Rodewald et. al., 1993). No próximo estágio, DN3, as células perdem a

expressão de CD44, cessam a proliferação e rearranjam o TCR com a máxima

eficiência (Hoffman et. al., 1996). Neste estágio, se o rearranjo é improdutivo, as

células morrem. O caminho que essas células seguem à partir deste ponto depende do

rearranjo produtivo do TCR que pode ser do tipo αβ ou γδ. As células T γδ sofrem

pequenas modificações nos marcadores de superfície e deixam de expressar CD25.

Células que rearranjaram o TCRβ sofrem um processo seletivo conhecido como

seleção β. Essas células deixam de expressar CD25, passam a expressar CD4 e CD8,

paralizam o rearranjo das cadeias β, γ e δ e iniciam o rearranjo da cadeia α. As células

DN3 então, antes de se tornarem duplo-positivas (DP), passam por um estágio

proliferativo intermediário chamado DN4. A expressão do TCR leva à proliferação

celular durante o estágio DN4 até se tornarem DP, passando a expressar as moléculas

de CD4 e CD8 (Sprent et al, 1988).

Os timócitos DP (αβ TCR

CD4

CD8

), que correspondem a 90% do timo

de indivíduos jovens, interagem com as células epitelais do córtex tímico que

expressam alta densidade de moléculas de MHC classe I e classe II associadas com os

peptídios próprios. A sinalização que resulta na sobrevivência dos timócitos DP é

mediada pelas interações do TCR com os peptídios próprios ligados ao MHC (

Von

Boehmer, Teh & Kisielow, 1989). Uma interação fraca do complexo MHC/peptídio com

o receptor da célula T, resulta em morte celular por negligência e uma interação de alta

afinidade leva à morte por apoptose (seleção negativa). Em contrapartida, níveis

intermediários de interação do TCR com o MHC propicia a maturação efetiva dos

timócitos, por um processo denominado seleção positiva (Kisielow & Von Boehmer,

1995).

A seleção positiva induz o aumento da expressão do TCR (Shortman,

Vremec & Egerton, 1991) e da molécula de CD69 (Bendelac et al, 1992). Então, os

timócitos que estão passando pelo processo de seleção positiva expressam altos níveis

de CD69 na superfície celular. A molécula de CD69 tem sido descrita como um

marcador de ativação celular (Swat et al, 1993), que indica que o sinal do TCR via MHC

foi transmitido aos timócitos. Timócitos que expressam TCR e se associam a peptídios

próprios ligados ao MHC de classe I, perdem a expressão da molécula de CD4 e

tornam-se células T CD8

e aqueles que expressam TCR e se associam a peptídios

próprios ligados ao MHC classe II tornam-se células T CD4

. Essas células simples

positivas (SP) emigram da região medular do timo para os órgãos linfóides periféricos.

Um importante evento que ocorre durante essa diferenciação para o estágio de

timócitos SP é a aquisição de resistência à glicocorticóides, enquanto os timócitos DP

são mais sensíveis aos glicocorticóides (Scollay, Chen & Shortman, 1984).

1.1.3 - Ondas de desenvolvimento de células B e timócitos em diferentes

sítios

Linfócitos B são gerados durante o desenvolvimento embrionário e depois

do nascimento em diferentes sítios no camundongo (Kincade, 1981; Marcos et. al.,

1991). Por volta dos 11 ou 12 dias de gestação, os primeiros progenitores e

precursores da linhagem B podem ser detectados no fígado fetal (Owen, Cooper & Raff,

1974; Rolink et. al., 1993b) onde as linhagens de células B se desenvolvem em ondas

sincrônicas e então no dia 16, as primeiras células expressando IgM são detectadas.

No dia 18, o número de células B que expressam IgM e reagem a mitógenos atingem o

máximo e mais tarde declinam (Rosenberg & Cunningham, 1976; Melchers, 1977).

Precursores podem também ser encontrados no baço até 4 semanas depois do

nascimento (Rolink et. al, 1993b). O desenvolvimento da célula B na medula óssea

inicia-se no nascimento. As ondas de desenvolvimento de célula B do embrião são

abolidas no animal adulto (Clevers & Grosschedl, 1996; Singh, 1996).

As ondas de desenvolvimento de células B no fígado fetal geram

repertórios de cadeia pesada nos quais as junções entre os segmentos V, D, J não

contém inserções de N-nucleotídios porque a enzima terminal deoxinucleotidil

transferase (TdT) não é expressa nessa linhagem de células B (Feeney, 1990; Meek,

1990). As células pro B e pre B derivadas de medula óssea expressam a enzima TdT,

envolvida na geração da diversidade das regiões-N (Gregoire et. al., 1979).

Após 4 semanas do nascimento a medula óssea torna-se o maior sítio de

desenvolvimento de células B. Depois disso, o número de células B, principalmente de

precursores, diminui com a idade e esse processo parece ser regulado pelo tamanho

da população de células B na periferia (Osmond, 1993). A medula óssea vai sendo

preenchida, reduzindo o espaço para hematopoese e linfopoese de células B.

Entretanto, as células tronco hematopoéticas e os precursores da linhagem B não

desaparecem completamente : a medula óssea de camundongos adultos continua a ser

fonte suficiente para a reconstituição das linhagens de células sangüíneas, incluindo a

linhagem de células B na medula óssea e na periferia de camundongos letalmente

irradiados (Rolink et. al., 1993b).

O desenvolvimento dos timócitos é em geral bem semelhante entre timos

de camundongos pós-natais e fetais, mas há algumas diferenças. O estroma tímico fetal

desenvolve-se entre 10 e 12.5 dias de gestação. O epitélio tímico estabelece um

padrão de expressão gênica antes da chegada dos precursores linfóides (Manley,

2000).

Os precursores linfóides proliferam espontaneamente no timo fetal murino

aumentando de 10

células no dia 14.5 para cerca de 5 X 10

células no dia 18. Ao

contrário da cinética do timo pós-natal, no timo fetal as primeiras células Tαβ duplo-

positivas (DP) são geradas por volta do dia 16, as primeiras células T CD4 por volta do

dia 18 e as células CD8 no dia 19. As primeiras células que saem do timo vão para a

periferia 3 dias após o nascimento. No timo pós-natal, o tempo no estágio duplo-

negativo (DN) é de aproximadamente 14 dias, sendo de menos de 3 dias no timo fetal

(Rothenberg, 2005).

Os primeiros precursores que chegam no timo são capazes de gerar

células Tγδ com seu rearranjo VJ pré-determinado. Essas células são os primeiros

timócitos encontrados no camundongo, maturando entre os dias 15.5 e 16.5 do

desenvolvimento fetal e têm propriedades fisiológicas distintas (Dzierzak, Medvinsky &

Bruijn., 1998).

1.1.4 - O ambiente da linfopoese

A geração de células da linhagem B em diferentes sítios especializados

sugere que existe um ambiente especializado de células para precursores e

progenitores da linhagem B nos órgãos que suportam esse desenvolvimento. O

ambiente de células estromais nos órgãos de geração das células B não está ainda

bem definido (Dorshkind, 1990; Jacobsen & Osmond, 1990). Muitas linhagens de

células estromais medeiam somente os estágios proliferativos mais precoces da

linfopoiese das células B e falham em suportar a diferenciação a partir do estágio pré-B

(Hunt et. al., 1987; Deryungina & Muller-Sieburg, 1993) As células estromais S17, por

exemplo, promovem a diferenciação dos progenitores de célula B que respondem a IL-7

(Cumano et. al, 1990, Billips et. al., 1992).

Ainda não se conhece o estágio de diferenciação, regulação da atividade,

estabilidade e especificidade das células estromais que cooperam nos diferentes

estágios de desenvolvimento das células B. É provável que diferentes tipos de células

estromais sejam especializadas para interagir com diferentes tipos de precursores

(Nishikawa et. al, 1988). Essa interação deve ocorrer através de contatos moleculares

entre as células estromais e as células da linhagem B (Kincade, 1991; Law & Clark,

1994). Já foi descrito o papel da molécula de CD28, expressa nas células estromais, no

desenvolvimento de precursores de células B na medula óssea (Parkin et. al, 2002).

Camundongos CD28

-/-

apresentam decréscimo de 20% nos níveis de IgG basal

(Shahinian et. al., 1993). Além disso, estudos de Ferguson e colaboradores (1996)

demonstraram que a habilidade das células B de sofrerem hipermutação somática em

resposta a antígenos T-independentes é comprometida nos animais CD28

-/-

Além

disso, algumas citocinas produzidas pelas células estromais são também importantes

para o desenvolvimento da linhagem B, como a Stromal cell-derived factor -1 (SDF-1),

que age principalmente no fígado fetal, a IL-3 e a IL-7, dentre outras (Marshall et. al.,

1998; Egawa et. al, 2001). Células estromais também previnem a morte por apoptose

de linfócitos normais e transformados (Borghesi & Smithson & Kincade, 1997), além de

prevenir os efeitos negativos dos glicocorticóides na linhagem B (Borghesi, Smithson &

Kincade, 1997).

A geração da linhagem T em camundongos ocorre nos lóbulos tímicos, os

quais estão divididos em zonas distintas com diferentes células estromais que

caracterizam diferentes microambientes (Anderson et. al., 1996). O maior domínio é o

cortex onde se encontram os timócitos DP. Ao redor do córtex há um domínio chamado

medula onde os timócitos encontram-se em um estágio mais avançado, o estágio de

simples-positivos (SP).

As células DP no córtex só seguem para a medula após a seleção

positiva, caso contrário são fagocitadas pelos macrófagos residentes no córtex. A

maturação das células sobreviventes à seleção ocorre na medula do timo por cerca de

2 semanas. As células epiteliais medulares são distintas das células epiteliais do córtex.

Ainda não está claro exatamente como elas influenciam na maturação final das células

T, embora algumas evidências sugiram que elas expressem uma enorme variedade de

antígenos próprios que tem um papel na seleção negativa (Derbinski, 2001).

A compartimentalização das funções no timo provavelmente ajuda a guiar

certas transições durante o desenvolvimento. A responsividade intrínseca das células à

diferentes sinais proliferativos fazem-nas migrar, dependendo de seu estágio, de uma

região rica em um estímulo precoce para outra rica em um estímulo mais tardio

(Gounari et. al., 2001).

1.1.5 - Pertubações no ambiente da linfopoese

A introdução de uma variedade de agentes exógenos no camundongo

pode aumentar ou diminuir a produção de linfócitos B na medula óssea (Osmond et.al.,

1985; Fulop, Pietrangeli & Osmond, 1986). Além disso, a ação de fatores endógenos

também pode ser responsável pela supressão da linfopoese de células B na medula

óssea.

No final do século passado, observou-se que os glicocorticóides induziam

apoptose em casos de leucemias linfocitárias de células B (McConkey et. al., 1991).

Também nesse período foi demonstrado que 45% a 65% das células B220

e IgM

medula óssea murina sofrem apoptose quando expostas a glicocorticóides (Garvy et. al,

1993).

Entretanto, os progenitores resistentes aos glicocorticóides são capazes de

repopular a medula com as células B (Ku & Witte, 1986; Park & Osmond, 1989).

apoptose induzida em timócitos pelos glicocorticóides também já está bem estabelecida

na literatura (Wyllie, 1980; Compton & Cidlowsky, 1986)

sugerindo que a apoptose

pode ter um papel na regulação da linfopoese.

A linfopoese de células B é seletivamente suprimida na medula óssea de

fêmeas grávidas ou de animais tratados com estrogênios (Medina & Kincade, 1994;

Medina, Strasser & Kincade, 2000). Quando os estrogênios são adicionados, os efeitos

supressores no desenvolvimento de células B podem ser observados tanto nos

sistemas in vivo como nos in vitro (Smithson et. al., 1995). Progenitores precoces

(células pro-B e pre-B) parecem ser menos afetados do que os estágios mais tardios de

diferenciação tais como pre-B II e células B imaturas (Medina, Smithson & Kincade,

1993). Os hormônios sexuais estrona, estriol e ß-estradiol medeiam essa supressão por

atuarem no microambiente das células estromais, as quais expressam receptores para

estrogênios (Medina & Kincade, 1994; Smithson et. al., 1995). A progesterona em si

não tem efeito próprio, mas sensibiliza o organismo à ação dos estrogênios. As fêmeas

que possuem uma deleção no gene produtor das gonadotrofinas (HPG/Bm-hpg/hpg)

apresentam uma deficiência secundária na produção de esteróides e tem uma alta

produção de linfócitos B na medula óssea que pode ser revertida com administração de

estrogênio (Smithson et. al., 1994). Então, os hormônios sexuais podem influenciar na

linfopoese de células B em condições normais e enquanto os andrógenos utilizam para

isso apenas um receptor, os estrogênios podem utilizar mais de um (Kincade, Medina &

Smithson, 1994; Smithson et. al, 1998). Além de suprimir a diferenciação, o estrogênio

também atua na proliferação reduzindo a atividade mitótica e a sobrevivência dos

precursores da linhagem B (Medina, Strasser & Kincade, 2000).

Além da supressão da linfopoese mediada pelos glicocorticóides e

estrogênios, as prostaglandinas, especialmente a prostaglandina E (PGE2) tem sido

estudada no que diz respeito à sua atuação no sistema imune. A PGE2 é conhecida por

regular negativamente a produção de interleucina-2 (IL-2) por células Th1 (Betz & Fox,

1991). Em algumas cincunstâncias, a PGE2, produzida pelas células epiteliais no timo

(McCormack et. al., 1991), osteoblastos e macrófagos da medula óssea (Shibata,

1995), pode induzir a apoptose de timócitos (McConkey, Orrenius & Jondal, 1990;

Suzuki &Tadakuma & Kizaki, 1991), assim como suprimir a proliferação de linfomas de

células B imaturas (Phipps et. al., 1989). A apoptose de clones de linfócitos B

dependentes de IL-7 induzida por PGE2, está diretamente relacionada à elevação do

AMPc intracelular, uma vez que os receptores da PGE2 são associados à via da

adenilato ciclase que estimula a formação de AMPc (Fedyk et. al., 1996; Shimozato &

Kincade, 1999), o qual por sua vez, está envolvido na indução de apoptose em

linfócitos B humanos e de camundongo (Lomo et. al., 1995).

Citocinas como o TNF-α e o IFN-tipo I e receptores Toll like como o TLR2

e TLR4 (Kincade, 1994) também já foram descritos como sendo agentes supressores

da linfopoese. Já foi demonstrado que o tratamento com IFN tipo I leva à supressão do

desenvolvimento das linhagens B e T (Lin, Dong & Cooper, 1998; Ueda et. al., 2004). O

TNF-α também vem sendo descrito como um inibidor seletivo da linfopoese, sem afetar

a mielopoese (Ueda et. al., 2004). A inibição seletiva da linfopoese também foi

observada após o engajamento direto dos receptores TLR2 ou TLR4 nos progenitores

hematopoéticos (Nagai et. al., 2006).

1.1.6 - Diferenciação in vitro das linhagens de células B e T

Células pro B e pre B-I de camundongos normais e mutantes tem a

capacidade de proliferar por semanas e meses e serem clonadas in vitro quando

estimuladas por IL-7 ou IL-3 (Rolink et. al., 1991a; Winkler et. al, 1995b).

As células pro B e pre B-I necessitam de contato com as células estromais

para proliferarem por longo tempo em cultura. Células estromais são induzidas a

secretarem citocinas tais como IL-7, SCF- Stem-cell factor, IGF1-insulin-like growth

factor e muitas expressam moléculas de adesão e ligantes para receptores nas

células pre B (Jacobsen et. al., 1992; Landreth, Narayanan & Dorshkind, 1992). O SCF

é produzido na forma solúvel ou associado à membrana sendo uma das mais eficazes

citocinas que suportam a hematopoese de progenitores (Lyman & Jacobsen, 1998).

Dentre as moléculas de adesão envolvidas nesses contatos estão o CD44, o

hialuronato que é um dos ligantes das células estromais que se associa ao CD44, VLA-

4-very late activation antigen 4 e a fibronectina (Bernardi, Patel & Lodish, 1987; Miyake

et. al, 1990a; 1990b e 1991). Células pro B e pre B-I recebem sinais através dos

receptores de citocinas e das moléculas de adesão para proliferarem. Os receptores de

citocinas envolvidos na sinalização são o IL-7R, IL-3R, c-kit - o qual é o receptor para

SCF produzido pelas células estromais, e o receptor para IGF-1.

Anticorpos específicos para c-kit inibem a proliferação das células pro B e

pre B-I in vitro (Rolink et. al., 1991), bem como a hematopoese de muitas linhagens in

vivo. Curiosamente, o mesmo anticorpo que inibe a linfopoese de células B in vitro

aumenta a linfopoese de células B in vivo (Ogawa et. al., 1991). O aumento das células

pre B in vivo mostra que nem todas as células pre B usam o c-kit como um regulador do

crescimento (Kodama et. al, 1992; Takeda, Shimizu & Rodewald, 1997), sugerindo a

presença de uma subpopulação não-responsiva a c-kit.

No que diz respeito à diferenciação in vitro da linhagem T, as culturas de

órgão fetal tímico (FTOC) são capazes de suportar a completa maturação de células T,

comparável a que ocorre in vivo. Durante a cultura, o contato entre o estroma tímico e

os timócitos em desenvolvimento é mantido (Jenkinson & Anderson, 1994). A

arquitetura dos lóbulos tímicos consiste de diferentes tipos de células estromais as

quais incluem células epiteliais, células dendríticas e a linhagem monocítica, que são

essenciais para o desenvolvimento dos linfócitos in vitro (Ceredig et. al., 1982; Kisielow,

Leiserson & Von Bohemer, 1984). A remoção dos precursores de timócitos deste

ambiente estromal organizado impede a proliferação e o desenvolvimento da cultura

(Skinner et. al., 1987). Além disso, a interface dos lóbulos fetais tímicos intactos com o

meio de cultura e a atmosfera é importante para o desenvolvimento dos timócitos, pois

se os lóbulos fetais tímicos são colocados imersos no meio de cultura a proliferação

tímica cessa e os precursores tímicos são perdidos (Kingston, Jenkinson & Owen,

1985).

1.2 - O papel da interleucina 7 (IL-7) na diferenciação dos linfócitos B e T

A IL-7 é uma glicoproteína de 25 kDa produzida pelas células estromais

em muitos tecidos hematopoéticos incluindo a medula, baço, timo e fígado fetal. É

também produzida por queratinócitos, células do epitélio intestinal, células foliculares

dendríticas e células endoteliais (Kroncke et. al., 1996). O receptor de IL-7 consiste de

uma única cadeia α pareada com uma cadeia comum γc que também é encontrada nos

receptores de IL-2, IL-4, IL-9 e IL-15 (Park et. al., 1990; Noguchi et. al., 1993).

Camundongos que perderam a cadeia α tem uma severa deficiência no número de

células T e B na periferia e na linhagem B na medula óssea (Peschon et. al., 1994).

Camundongos com inativação da cadeia γc ou da IL-7 ainda assim possuem células B,

sugerindo a existência de uma citocina alternativa que parece ser a linfopoetina (TSLP),

que também se liga à cadeia α do receptor de IL-7 (Peschon et. al., 1994). Essa

citocina foi primeiramente identificada como fator de crescimento das células pré-B

sendo também produzida por uma linhagem estromal do timo e apresenta os mesmos

efeitos da IL-7 em cultura, embora seja capaz de induzir menos proliferação e mais

diferenciação (Ray et. al, 1996; Levin t. al., 1999). A sinalização através do receptor de

IL-7 requer JAK3 e ativa o fator de transcrição STAT5, enquanto a sinalização através

de TSLP é JAK3 independente, mas também ativa STAT5 (Levin et. al., 1999; Isaksen

et. al., 1999).

Já é conhecido o papel da IL-7 produzida pelas células estromais de

medula na proliferação e diferenciação dos precursores de células B in vitro (Sudo et.

al., 1989b; Corcoran et. al., 1996). A eliminação da IL-7 bloqueia o desenvolvimento de

células B na medula óssea, mas preserva o desenvolvimento fetal sugerindo uma

diferença no papel dessa interleucina nesses 2 compartimentos (Carvalho et. al, 2001)

A IL-7, na realidade, desempenha diferentes papéis dependendo do estágio de

desenvolvimento da célula B (Marshall et. al., 1998; Ray et. al., 1998).

A linfopoiese B diminui em camundongos idosos e isso parece ser

dependente da diminuição da responsividade dos precursores à IL-7 (Stephan, Sanders

& Witte, 1996; Stephan, Lill-Elghanian & Witte, 1997). Além disso, a IL-7 exógena em

doses ótimas pode estimular a linfopoese de células B in vivo, agindo principalmente

nas células do estágio pro B (Morrissey et. al., 1991a; Valenzona et. al., 1998) e

promovendo a regeneração após depleção e transplante de medula óssea (Morrissey

et. al., 1991b; Faltynek et. al.; 1992). Em contrapartida, o tratamento com anticorpos

anti-IL-7 in vivo e in vitro levou, respectivamente, à redução do compartimento

proB/preB e à inibição da proliferação das linhagens IL-7 dependentes (Alpert et. al.,

1993; Merchant, Garvy & Riley, 1996). A IL-7 expressa como um transgene leva à

desregulação do desenvolvimento normal das células B, causando linfoadenopatias de

células B (Valenzona et. al., 1996).

A estimulação dos timócitos por IL-7 parece ser mais restrita às

populações mais imaturas (Takeda, Gillis & Palacios, 1989). Nos estágios DN1-DN2 do

desenvolvimento das células T de animais adultos, a proliferação é dirigida pelos sinais

da IL-7, secretada pelo estroma tímico, com seu receptor (Freeden- Jeffry et. al., 1997).

Vem sendo demonstrado que a IL-7 é um fator de manutenção e sobrevivência para os

timócitos (Murray et. al., 1989). A inativação da cadeia γc, da IL-7 ou da cadeia α do

receptor de IL-7 em camundongos causa um declínio no número de células viáveis nos

estágios DN2 e DN3 (Candeias, Muegge & Durum, 1997; Di Santo & Rodewald, 1998).

Além disso, nos animais que tiveram a IL-7 inativada ocorre um bloqueio intra-tímico

que impede a passagem do estágio DN2 para o estágio DN3 (Moore et. al, 1996). A

neutralização com anticorpos anti-IL7 tem mostrado que essa interleucina tem um papel

importante no desenvolvimento T e B in vivo (Grabstein et. al., 1993; Sudo et. al., 1993).

Alguns trabalhos já mostararam que outras interleucinas estão envolvidas no

desenvolvimento de células T fetais, mostrando que o desenvolvimento dessas células

é diferente dos timócitos de animais adultos (Crompton et. al., 1998). Em culturas onde

se utiliza simultaneamente lóbulos de timo fetal depletados de linfócitos e precursores

do fígado fetal tratados com IL-7 encontra-se um número aumentado de células T

imaturas, sugerindo que a IL-7 pode ser um regulador negativo para as células T fetais

maduras (Plum, Smedt & Leclercq., 1993; DeLuca & Clark, 2002).

1.3 - O papel de outras interleucinas na diferenciação linfócitária

As interleucinas IL-2 e IL-3, também desempenham um papel relevante na

diferenciação de linfócitos B. A interleucina 2 (IL-2), exerce um na ativação de linfócitos

B e T, sendo tal ação dependente do receptor da IL-2 presente nessas células

(Taniguchi et. al., 1986; Smith, 1988). O receptor da IL-2 é constituído de três cadeias

αβγ ou duas cadeias βγ e, ambas as cadeias β e γ são essenciais para a transdução de

sinais intracelulares (Kamino et. al., 1992; Takeshita et. al., 1992), sendo a cadeia γ

partilhada pelo receptor de outras interleucinas como a IL-4, a IL-7, a IL-9 e a IL-15

(Noguchi et. al., 1993a; Russel et. al., 1993). Camundongos com uma mutação

truncada na cadeia γ do receptor da IL-2 mostraram uma redução de células T, B e NK

(Ohbo et. al, 1996) de maneira similar aos camundongos que perderam completamente

a cadeia γ (Cao et. al., 1995; Di santo et. al, 1995). Já foi demonstrado também que a

utilização de anticorpos monoclonais que reconhecem a subunidade γc do receptor de

IL-2 bloqueia o desenvolvimento dos linfócitos T e B (He & Levy & Malek, 1995).

A interleucina 3 (IL-3) é um fator de crescimento hematopoético

multipotencial produzido por células T ativadas, monócitos, macrófagos e células

estromais (Metcalf, 1989; Ogawa, 1994) e exerce sua função através do receptor da IL-

3 (IL-3Rα). A IL-3 estimula a proliferação e diferenciação de células hematopoéticas de

várias linhagens incluindo neutrófilos, eosinófilos, basófilos, megacariócitos e eritrócitos

(Ihle, 1992; Aglietta et. al., 1993). Os efeitos da IL-3 no desenvolvimento das células B

são bastante complexos. A IL-3 é conhecida por suportar a linfopoese de células B em

camundongos jovens, embora tenha um papel menor na linfopoese da medula óssea

adulta (Winkler & Melchers & Rolink, 1995a). Já foi também demonstrado que a IL-3

estimula o crescimento de células pré-B in vitro (Palacios et. al., 1984; Rennick et. al.,

1989), embora já tenha sido demonstrado um papel inibitório desta interleucina em

relação ao desenvolvimento de progenitores linfo-hematopoéticos de camundongos

(Hirayama et. al., 1994).

2 - OBJETIVOS

O objetivo central deste trabalho foi investigar os efeitos do sumo de Kb e

de suas frações in vivo e in vitro no desenvolvimento e diferenciação de linfócitos B e T.

Os objetivos específicos foram:

1) Verificar se o tratamento in vivo de camundongos com o sumo da planta

levaria a uma modificação no número de linfócitos e quais as etapas da

diferenciação estariam sendo afetadas em diferentes órgãos.

2) Após o fracionamento desse sumo, identificar qual a fração ativa do mesmo.

3) Verificar se os efeitos do sumo de Kb eram dependentes da elevação dos

níveis de corticóide, IFN-β, TNFα, TLR2/4 nesses animais, já descritos na

literatura como substâncias inibidoras da linfopoese T e B.

4) Verificar se a diferenciação in vitro dos precursores de medula óssea de

camundongos seria afetada após o tratamento com o sumo de Kb e suas

frações.

5) Verificar se a resposta proliferativa de células B de baço ao LPS seria afetada

pelo sumo de Kb in vitro.

6) Verificar se o Kb possui algum efeito tóxico para as células induzindo a

apoptose de linfócitos B e timócitos in vitro.

7) Investigar uma possível interferência do sumo de Kb e de suas frações nas

vias de sinalização das citocinas IL-2, IL-3 e, principalmente IL-7, já

caracterizada como uma interleucina importante no processo de diferenciação de

linfócitos B e T.

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

Animais: Foram utilizados animais C57BL/10 e C57BL/10ScCr (com idade entre 1,5 e

2 meses), obtidos da Universidade Federal Fluminense. Camundongos geneticamente

modificados TLR2

-/-

(Takeuchi et. al, 2002), TNFR1

-/-

(Rothe et. al., 1993) e C57BL/6

usados como controles das linhagens foram obtidos da FIOCRUZ Minas Gerais e Rio

de Janeiro. Camundongos IFN-R1

-/-

(Muller et. al., 1994) e os controles da linhagem

129xC57BL/6 foram obtidos do Departamento de Imunologia ICB-USP, São Paulo. Os

animais foram mantidos à temperatura controlada e receberam água e comida à

vontade. Os experimentos foram realizados de acordo com o Guia Internacional para

Uso de Animais de Laboratório. O estudo foi aprovado pelo comitê para estudos em

animais do CCS da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Células: Foi utilizada a linhagem celular FDCP-I (Dexter et. al., 1980) gentilmente

cedida pelo Prof. Radovan Borojevic - Departamento de Histologia/UFRJ. As células

foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino,

tampão Hepes 10mM, L-glutamina 2 mM, 100 µg/ml de estreptomicina e 50 UI//ml de

penicilina e mantidas em estufa com 7.5% de CO2 a 37°C. A linhagem FDCP-I foi

cultivada em presença de 10% de IL-3 (obtidas do sobrenadante de cultura de células

da linhagem WEHI, cedidas por Radovan Borojevik, UFRJ, Brasil). Todos os reagentes

utilizados são da marca Gibco.

Purificação e Cultura de células: Células retiradas diretamente da medula foram

centrifugadas e incubadas com anticorpo Anti-IgM ou Anti-B220 Microbeads (Miltenyl

Biotec) por 20 minutos no gelo. Na próxima etapa, as células foram ressuspendidas em

tampão PBS-EDTA 2mM, sendo posteriormente aplicadas em uma coluna magnética

onde foi

feita a seleção das células. A partir de então, as células foram cultivadas em

meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal em placas de 24 orifícios (Nunc),

contendo 2 X 10

células/poço durante 72 horas em estufa com 7,5% de CO

a 37°C.

Em alguns poços, as células foram cultivadas com doses crescentes do sumo de Kb ou

de suas frações: KMC ou o sobrenadante, ou ainda com dexametasona (Sigma). O

antagonista do receptor de glicocorticóides Ru 486 (Sigma) foi utilizado diluído em 1,4

ml de DMSO (Sigma) na concentração de 2 µM. Após 72 horas, as células foram

recolhidas, contadas e marcadas com anticorpos para análise em citômetro de fluxo. Os

anticorpos utilizados foram Anti-IgM FITC e Anti-B220 PE (Pharmingen).

Preparação do sumo de Kb/KMC: Folhas de Kalanchoe brasiliensis foram coletadas

no município de Itaguaí- Rio de Janeiro no mês de julho, época do ano que não

coincide com o período de floração. As folhas foram misturadas e trituradas em um

processador e o sumo filtrado em papel de filtro, foi então liofilizado. Quatro gramas do

sumo resultante do processo de trituração das folhas foi subdividido em duas outras

frações após ser ressuspenso em 108 ml água destilada, fornecendo uma solução

amarelo-acastanhado. Essas frações foram obtidas após precipitação em 108 ml de

etanol (UV/HPLC, Tedia) permanecendo em geladeira a 8˚C por 3 dias, quando então

foi formado um floculado branco. As fases obtidas após a precipitação foram

denominadas como dimalato de kalancosina (KMC) que corresponde ao material

decantado (Costa et. al, 2006) e sobrenadante (SN), que corresponde ao material

líquido. O processo de separação das fases se dá por filtração da mistura em algodão,

ressuspensão do KMC em água destilada, com posterior evaporação do etanol

presente em banho-Maria, seguido de liofilização. As etapas de evaporação do etanol e

liofilização também foram realizadas com o sobrenadante. A proporção encontrada

entre as frações extraídas do sumo de Kb era de 60% de sobrenadante e 30% de

KMC. Em todos os experimentos, o sumo de Kb, SN ou KMC liofilizado foram

dissolvidos em água deionizada estéril e filtrado em membrana Millipore 0.22µm.

Experimentos in vivo com o sumo de Kb/KMC: Nos experimentos in vivo, os animais

foram separados em 4 grupos: controle (animais injetados com água deionizada estéril)

e animais injetados com sumo, KMC ou SN. Os animais foram injetados

intraperitonealmente por 4 dias consecutivos com 480mg/Kg/animal de sumo dissolvido

em um volume de 200 µl de água deionizada estéril/animal. As proporções relativas

das demais frações foram respeitadas no momento da injeção. No 5° dia, os animais

foram sacrificados e as células de medula óssea foram obtidas pela lavagem do

conteúdo medular do fêmur, com o auxílio de uma seringa, contendo meio RPMI 1640.

O mesmo experimento foi realizado para a retirada de outros órgãos como timo, baço e

linfonodos mesentéricos, retirados de animais tratados como descrito acima. As

células do timo, baço e linfonodo foram obtidas após a dissociação dos órgãos e foram

mantidas também em meio RPMI 1640 durante a marcação com anticorpos

monoclonais. As células foram contadas em câmara de Neubauer e as subpopulações

foram identificadas por citometria de fluxo com a utilização de anticorpos monoclonais.

Nos experimentos de cinética da recuperação do tratamento com Kb os animais foram

sacrificados em diferentes tempos após os 4 dias de tratamento.

Marcação das células para análise em citômetro de fluxo: Células frescas obtidas

da medula óssea, baço, linfonodo e timo foram centrifugadas e ressuspendidas em PBS

com azida 0,01% (Sigma) e soro fetal 1% (Gibco). Foram utilizados anticorpos Anti-IgM

FITC (Southern Biotecnology), Anti- IgM alexa 647 (Caltag Laboratories, Burlingame,

CA), Anti-B220 PE, Anti-B220 FITC, Anti CD4-FITC, Anti-CD4 APC, Anti-CD8 PE, Anti-

CD3 FITC, Anti c-kit-PE, Anti-CD25 PE, Anti-CD25 APC, Anti-Mac1 FITC, Anti-Mac1

PE, Anti-TCRγδ FITC, Anti-TCRαβ FITC, Anti-Gr1 PE, Anti-Nk1.1 PE, Anti-CD44biot,

Streptavidina PE alexa 610, anexina V FITC (todos da BD PharMingen, San Diego, CA)

sendo as preparações incubadas em gelo por 20 minutos. As células foram

centrifugadas, ressuspendidas em PBS/azida 0,01% e a aquisição foi feita em citômetro

de fluxo FACSCALIBUR (BD Biosciences, San Jose, CA). As análises foram feitas

utilizando o programa CELLQuest (BD Biosciences).

Diferenciação de células B in vitro: Células retiradas diretamente da medula foram

centrifugadas e incubadas com anticorpo Anti IgM Microbeads (Miltenyl Biotec) por 20

minutos no gelo. Na próxima etapa, as células foram ressuspendidas em tampão PBS-

EDTA 2mM, sendo posteriormente aplicadas em uma coluna magnética onde foi feita a

seleção negativa das células IgM

. A partir de então, as células foram cultivadas em

meio RPMI 1640 em placas de 24 orifícios (Nunc), contendo 2 X 10

células/poço

durante 72 horas em estufa com 7,5% de CO

a 37°C. Em alguns poços, as células

foram cultivadas com concentrações crescentes do sumo de Kb, KMC ou sobrenadante.

O antagonista do receptor de glicocorticóides Ru 486 (Sigma) foi utilizado diluído em

1,4 ml de DMSO (Sigma) na concentração de 2 mM. Após 72 horas, as células foram

recolhidas, contadas e foi realizada a marcação para análise em

citômetro de fluxo com

os anticorpos Anti-IgM FITC e Anti-B220 PE. Para a purificação das células CD19

, as

células IgM

foram marcadas com anti-CD19 Microbeads (Miltenyl Biotec) e reaplicadas

na coluna magnética e sua pureza foi analisada por citometria de fluxo.

Medida da proliferação de células B de baço estimuladas com LPS após

tratamento com sumo de Kb

: As células totais de baço de animal normal foram

estimuladas com LPS 12,5 µg/ml (Sigma - Salmonella thyphimurium) após dissociação

do órgão e cultivadas em placas de 96 poços (Nunc) com concentrações crescentes de

sumo. O número de células foi de 2 X 10

células/poço e o tempo de cultura foi de 72

horas. A timidina 5mCi/mmol foi adicionada na concentração final de 1µCi/poço, 24

horas antes do término da cultura. Ao final da incubação, as células foram recolhidas

com o auxílio de um Cell Harvester (Cambridge Tecnology, INC.), através de lavagem

dos poços com água e etanol, com a retenção do DNA em papel de filtro e a

incorporação de timidina foi medida em cintilador (Packard).

Medida da proliferação de células de medula estimuladas com IL-7 após o

tratamento com sumo de Kb e KMC: As células de medula total após serem

dissociadas foram estimuladas com 10% de IL-7 obtida do sobrenadante de cultura da

linhagem J558 transfectada com o plasmídio de IL-7 (cedidas por Ana Cumano,

Instituto Pasteur, França) e cultivadas em placas de 96 poços com concentrações

crescentes de sumo ou KMC. O número de células foi de 1 X 10

células/poço e o

tempo de cultura foi de 120 horas. A timidina 5mCi/mmol foi adicionada na

concentração final de 1µCi/poço, 24 horas antes do término da cultura. A próxima etapa

foi semelhante à descrita anteriormente.

Medida da proliferação das células da linhagem FDCP-I estimuladas com IL-3

após o tratamento com Kb e KMC: As células da linhagem FDCP-I foram estimuladas

com IL-3 (10%) e cultivadas em placas de 96 poços com concentrações crescentes de

Kb ou KMC. O número de células foi de 10

células/poço e o tempo de cultura foi de 48

horas. A timidina 5mCi/mmol foi adicionada na concentração final de 1µCi/poço, 24

horas antes do término da cultura e as células recolhidas como descrito acima.

Medida da proliferação de células de baço estimuladas com Con A e IL-2 após o

tratamento com KMC: As células de baço total, após serem dissociadas, foram

crescidas por 72 horas com Con A (1µg/ml), lavadas 2 vezes com 30ml de α-metil-

manosídeo (Sigma) 40 mg/ml dissolvido em RPMI 1640 e posteriormente estimuladas

com IL-2 (10%) sendo cultivadas em placas de 96 poços com concentrações

crescentes de KMC. O número de células foi de 2 x 10

células/poço e o tempo de

cultura foi de 48 horas. A timidina [

H] foi adicionada na concentração final de

1µCi/poço, 24 horas antes do término da cultura. As células foram recolhidas como

descrito acima.

Radioimunoensaio: A quantificação da corticosterona foi realizada através da técnica

de radioimunoensaio (RIA, Radio Imune Assay) em kits da ICN Biomedicals

(Costa

Mesa, CA)

. Nesse ensaio foi avaliada a capacidade do hormônio presente nas

amostras de plasma em competir com amostras do hormônio marcado radioativamente

125

)

pela ligação ao anticorpo específico. O produto da reação foi analisado em

comparação com uma curva padrão realizada a cada ensaio. A quantificação foi

realizada em contador gama (ISOMEDIC-ICN 4/600).

Testes estatísticos: A análise estatística dos dados foi obtida através dos testes

estatísticos Mann-Whitney (não paramétrico) e Teste T Student. Os dados foram

considerados significativos quando p< 0.05.

4 - RESULTADOS

Mediante os resultados dos estudos prévios que demonstraram uma ação

imunomoduladora de Kb (Moraes et. al., 1994; Rossi-Bergmann et. al, 1994; Ibrahim

et. al., 2002) na população linfocitária, passamos a investigar os efeitos do sumo de Kb

in vivo e in vitro na diferenciação e proliferação de linfócitos B e T.

Nos primeiros experimentos in vivo os animais foram separados em 2

grupos: o grupo controle, onde os animais foram injetados com água deionizada estéril

e um segundo grupo onde os animais foram injetados com o sumo de Kb. Os estudos

foram realizados utilizando camundongos C57BL/10. A injeção foi ministrada por 4 dias

consecutivos na cavidade peritoneal e no 5° dia os animais foram sacrificados para a

retirada da medula, que foi obtida pela lavagem do conteúdo medular do fêmur. As

células foram então contadas e as subpopulações foram identificadas por citometria de

fluxo após a marcação com anticorpos monoclonais.

A figura 3 mostra o resultado da citometria de fluxo onde foi previamente

delimitada uma área de estudo (gate) abrangendo uma população que inclui

macrófagos, polimorfonucleares e os linfócitos. Embora não haja uma diferença

significativa entre o número total de células dos animais controles e tratados (Tabela

1), o gráfico da Figura 3 mostra uma profunda redução na região linfóide, indicada com

uma seta.

Na Tabela 1 podem ser vistos os resultados de 3 experimentos in vivo de

medula óssea independentes. Nessa tabela são mostradas as contagens do número

absoluto de células da medula óssea em cada animal e as porcentagens de células B

IgM

e IgM

nos mesmos. A redução média dos experimentos é de 80% no número de

células Pre B (B220

IgM

)

e de células B imaturas (B220

IgM

). Essa porcentagem foi

calculada com base na Tabela 1.

Figura 3 - A administração de Kalanchoe brasiliensis reduz a população linfóide

da medula óssea.

Camundongos C57BL/10 receberam diariamente tratamento intraperitoneal com água

(A) ou 480mg/kg de Kb (B) por 4 dias. No 5ْ dia, as células da medula óssea foram

marcadas com anticorpos monoclonais e analisadas por citometria de fluxo. A Figura

mostra um gráfico de tamanho (Forward scatter) e granulosidade (Side scatter) de

células nucleadas da medula óssea (A e B). Células linfóides são indicadas com uma

seta.

Tabela 1 - Animais C57BL/10 receberam tratamento diário intraperitoneal com

480mg/Kg do sumo de Kb por 4 dias. No 5ْ dia, células da medula óssea dos animais

controles injetados somente com água (CTR) ou tratados com 480mg/Kg do sumo de

Kb foram analisados por citometria de fluxo. Células da medula óssea foram marcadas

com anticorpos monoclonais anti-IgM e anti-B220 e as subpopulações pro/preB

(B220

IgM

) e B imaturas (B220

IgM

) foram analisadas. A tabela mostra o resultado

individual de 6 animais em 3 experimentos diferentes. Os dados apresentados acima

mostram uma redução estatisticamente significativa das subpopulações com valor

p<0.05.

4.1 - Caracterização da fração ativa do sumo de Kalanchoe brasiliensis

Por ser o sumo de Kb uma mistura complexa nossa próxima etapa foi

identificar qual a fração ativa do sumo. O fracionamento do sumo de Kb foi realizado

através de uma precipitação em etanol, obtendo-se 2 frações: o sobrenadante (SN) e

uma fração precipitada altamente purificada formada por um complexo sal composto de

kalancosina (ácido 3,6-diamino- 4,5-dihidroxioctanodióico) e ácido málico, na razão 1:2,

recentemente caracterizado (Costa et. al., 2006) e denominado como dimalato de

kalancosina (KMC).

Adaptado de Costa et. al., 2006

Figura 4- Estrutura química da kalancosina.

Para testar o efeito seletivo dessas frações, os animais foram tratados

com 480mg/Kg de Kb, 160 mg/Kg de KMC ou 320mg/Kg de SN para manter a

proporção entre as quantidades de KMC (33%) e SN (67%) encontradas no sumo

original. Como mostrado na Figura 5, a administração do KMC induziu uma profunda

depleção dos precursores de células B na medula óssea, semelhante aos efeitos já

observados no sumo de Kb, enquanto os animais tratados com o SN exibiram um efeito

inibitório parcial nas Pro/PreB.

Figura 5 - Dimalato de kalancosina (KMC) purificado de Kalanchoe brasiliensis é o

principal responsável pela principal atividade inibitória no desenvolvimento das

células B.

Grupos de animais foram diariamente injetados intraperitonealmente com 480 mg/Kg de

Kb, 320mg/Kg de SN e 160mg/kg de KMC como descrito na metodologia. No 5º dia, as

células da medula óssea foram retiradas e marcadas com anticorpos anti-IgM e anti-

B220 e suas subpopulações foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados

mostram a média e o desvio padrão de 3 experimentos diferentes. O (*) indica que

p<0.05.

4.2 - Avaliação das diferentes subpopulações de células B na medula de

animais tratados com o sumo de Kb

Uma vez que o número de células B encontrava-se alterado na medula

óssea após o tratamento com o sumo da planta, resolvemos investigar, ainda no

mesmo experimento mostrado anteriormente, quais as etapas da diferenciação dessas

células poderiam estar sendo afetadas e se o tratamento afetaria também outros tipos

celulares. A Figura 6A mostra as células Pro/PreB, B imaturas e B maduras de um

animal controle dentro das células B totais, enquanto na Figura 6B podemos observar

as células Pro/PreB, B imaturas e B maduras de um animal tratado com o sumo de Kb.

Como demonstrado nessa figura, as células Pro/PreB estão sendo afetadas pelo sumo

da planta, ou seja, podemos notar uma redução significativa dessa população celular

nos animais tratados. A população de células B imaturas também é afetada nos animais

tratados, porém a magnitude do efeito é menor. As células B maduras foram

preservadas nesses animais.

Dentro da população Pro/PreB, as células Pre B-I e Pre B-II também foram

avaliadas. Na Figura 6C, são mostrados o número total de células Pre B-I, Pre B-II e B

imaturas dos animais controles e tratados. Há alterações estatisticamente significativas

no número de células das 3 subpopulações, embora o efeito na subpopulação Pre B-I

seja menor do que o observado nas células Pre B-II, sendo as Pre B-I percentualmente

aumentadas como pode ser visto na Figura 6D.

O número de células Mac1

(quadrante superior à esquerda) e de células

B (quadrante inferior à direita) na medula óssea de um animal controle pode ser visto

na Figura 7A. O animal tratado com o sumo de Kb sofre um aumento percentual no

número de células da linhagem mielóide em função da queda de porcentagem das

células B (Figura 7B), porém o número total de células da linhagem mielóide foi mantido

(Figura 7C).

Figura 6 - Precursores de células B e células B imaturas são preferencialmente

reduzidos em animais tratados com Kb.

Células da medula óssea obtidas como descrito na Figura 1 foram marcadas com

anticorpos anti-IgM e anti-B220 e analisadas por citometria de fluxo. A presença de

diferentes subpopulações de células B foi analisada. No gráfico, a população Pro/PreB

(B220

IgM

) está indicada em I, as células B imaturas (B220

IgM

) estão indicadas em II

e as células B maduras (B220

high

IgM

) em III. Os camundongos foram injetados com

água deionizada estéril (A) ou com Kb (B). Em (C), o número total de células Pro/PreB e

B imaturas/fêmur são mostradas em um gráfico de barras. Em (D), as porcentagens das

células PreBI, PreBII e B imaturas são mostradas em um gráfico de barras. As células B

maduras foram excluídas da análise. O (*) indica que p<0.05. Os dados apresentados

na figura são representativos de 3 experimentos diferentes com 3 animais por grupo.

Figura 7 - Células da linhagem mielóide são preservadas após o tratamento com

Kb.

Células da medula óssea foram marcadas com anticorpos para a identificação das

linhagens B220

e Mac1

nos animais tratados com água (A) e com Kb (B). Células

B220

e Mac1

estão envolvidas por um retângulo e suas porcentagens são indicadas

na Figura. O número total de células Mac1

e B220

por fêmur é mostrado em (C). A

Figura mostra o resultado obtido de 3 experimentos diferentes com 3 animais por grupo.

4.3 - Efeitos in vivo do sumo de Kb/KMC no timo e em outros órgãos

Além da medula óssea, no mesmo experimento in vivo mostrado

anteriormente também foram avaliados outros órgãos como o timo e os órgãos linfóides

secundários, dentre eles o baço e o linfonodo.

Como pode ser visto na Figura 8B, o timo dos animais tratados com o

sumo de Kb sofreu uma redução de 91% na porcentagem de linfócitos T duplo-positivos

(DP), quando comparados com os animais controles (Figura 8A). O número total de

cada população por timo (Figura 8C) e as porcentagens de cada população também

são mostrados (Figura 8D). A Tabela 2 mostra que o número dos linfócitos T totais está

reduzido nos animais tratados com Kb. É importante notar que embora as células

simples-positivas (SP) estejam aumentadas em percentual no timo dos animais tratados

com Kb, o que se deve à diminuição percentual das DP, o número absoluto dessas

células é menor do que nos animais controles (8C e 8D).

Em uma análise mais detalhada dos precursores de células T (Figuras 9A

e 9B), a avaliação da maturação das células T duplo-negativas (DN) mostra um

enriquecimento percentual da subpopulação DN2 (CD25

CD44

) nos animais tratados

com KMC e uma redução simultânea de DN3 (CD25

CD44

), com nenhum efeito nas

DN1 (CD25

CD44

). As porcentagens das populações DN e DP são mostradas na

Figura 9C. A Figura 9D mostra as porcentagens de DN1, DN2, DN3 e DN4 dentro das

DN totais.

O impacto do tratamento com Kb nos órgão linfóides periféricos foi

também investigado. Em contrapartida, não houve redução no número de células T e B

no baço dos animais tratados (Figuras 10A e 10B e Tabela 2). Também não

observamos uma redução significativa no número de células T e B no linfonodo desses

animais (Figuras 11A e 11B e Tabela 2).

Figura 8 - Supressão do desenvolvimento de células T em animais tratados com

Kalanchoe brasiliensis.

Conforme descrito na Figura 1, o timo dos animais tratados foram removidos, os

timócitos marcados com anticorpos anti-CD4 e anti-CD8 e analisados por citometria de

fluxo. Diferentes subpopulações de células T foram analisadas. Os animais foram

tratados com água deionizada estétil (A) ou Kb (B). As porcentagens de diferentes

subpopulações de células T são indicadas em cada quadrante. O número total de

células por fêmur de cada população (C) e as porcentagens de cada população (D) são

mostrados em gráfico de barras. O (*) indica que p<0.05. A Figura mostra o resultado

obtido de 3 experimentos diferentes com 3 animais por grupo.

Figura 9 - Efeito de KMC nos precursores de células T.

Conforme descrito na Figura 1, o timo dos animais tratados foram removidos, os

timócitos marcados com anticorpos anti-CD4, anti-CD8, anti-CD44 e anti-CD25 e

analisados por citometria de fluxo. Diferentes subpopulações de células T foram

analisadas. A Figura mostra a citometria de fluxo das subpopulações DN1 (CD4

CD8

CD44

CD25

), DN2 (CD4

CD8

CD44

CD25

), DN3 (CD4

CD8

CD44

CD25

) and DN4

(CD4

CD8

CD44

CD25

) nos animais controles (A) e nos animais tratados com KMC (B).

As porcentagens das DP CD4

CD8

e das DN CD4

CD8

são mostradas em (C) e as

porcentagens de DN1, DN2, DN3 e DN4 dentro das DN totais são mostradas em (D). O

(*) indica que p<0.05. A Figura é representativa de 2 experimentos diferentes com 5

animais por grupo.

A B

Figura 10 - Efeito de Kb nos linfócitos B e T do baço.

Conforme descrito anteriormente, o baço dos animais tratados com Kb foi removido, as

células marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-B220 e analisadas por citometria de

fluxo. A Figura mostra a citometria de fluxo das subpopulações T (CD3

) e B (B220

)

nos animais controles (A) e nos animais tratados com Kb (B). A Figura é representativa

de 2 experimentos diferentes com 5 animais por grupo.

Figura 11 - Efeito de Kb nos linfócitos B e T do linfonodo mesentérico.

Conforme descrito anteriormente, o linfonodo mesentérico dos animais tratados com Kb

foram removidos, as células marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-B220 e

analisadas por citometria de fluxo. A Figura mostra a citometria de fluxo das

subpopulações T (CD3

) e B (B220

) nos animais controles (A) e nos animais tratados

com Kb (B). A Figura é representativa de 2 experimentos diferentes com 5 animais por

grupo.

Tabela 2 - A administração de Kalanchoe brasiliensis reduz seletivamente os

linfócitos nos órgãos linfóides primários mas não nos secundários.

Animais C57BL/10 receberam diariamente tratamento intraperitoneal com água

deionizada estéril ou 480mg/Kg do sumo de Kb por 4 dias. No 5º dia, células do baço,

linfonodo mesentérico e timo foram obtidas. A Tabela mostra o número total de células

por órgão, com os respectivos valores de média e desvio padrão. Os dados são

representativos de 2 experimentos diferentes com 3 animais por grupo.

4.4 - Dosagem dos níveis plasmáticos de corticosterona

Sendo o efeito do sumo de Kb na medula óssea e timo bastante

semelhante ao dos glicocorticóides no que diz respeito à diminuição de células B e T,

procuramos avaliar se tal efeito era dependente de um aumento dos níveis de corticóide

provocado pela injeção. O experimento in vivo contou com 3 grupos de animais, dentre

eles: um grupo controle (animais não injetados), um grupo em que os animais foram

injetados com água, ou seja, que foram estressados pela picada e um grupo de animais

injetados com o sumo de Kb. Após serem injetados por 4 dias, os animais foram

sacrificados e a dosagem dos níveis plasmáticos de corticosterona foi feita por

radioimunoensaio (vide metodologia). Como mostrado na Figura 12, não houve

diferença significativa dos níveis de corticosterona entre o grupo de animais injetados

com água e aqueles injetados com o sumo, embora o estresse da picada tenha sido

capaz de aumentar significativamente os níveis de corticosterona nesses animais,

quando comparados com os controles não injetados. Sendo assim, isso exclui a

hipótese de um aumento deste hormônio ser a causa dos efeitos observados nos

animais injetados com Kb.

Procuramos também avaliar a cinética de recuperação de animais tratados

com Kb, ou seja, quanto tempo após a interrupção do tratamento com o sumo da planta

o animal levava para se recuperar da imunosupressão. Como podemos observar na

Figura 13, a cinética de recuperação desses animais é bem lenta se comparada à

cinética de recuperação de animais tratados com corticóide conforme já descrito na

literatura, sugerindo, mais uma vez, que o mecanismo de ação do Kb/KMC e dos

glicocorticóides é diferente.

Vem sendo também demonstrado na literatura que a supressão da

linfopoese observada após o tratamento com corticóide é devido a indução de apoptose

nos precursores linfóides, a qual pode ser observada in vitro. Embora o mecanismo de

ação do Kb não pareça ser dependente da elevação dos níveis de corticóide endógeno

nós investigamos se a indução de apoptose pelo Kb estaria ocorrendo in vitro.

Conforme já descrito, o tratamento in vitro das células Pro/PreB com doses crescentes

de dexametasona leva a uma elevada apoptose dos precursores (Figura 14 A-D),

entretanto somente um efeito marginal foi observado na presença de doses crescentes

de Kb. Efeitos semelhantes foram obtidos com os precursores de células T (Figura 14

E-H).

Figura 12 - Bloqueio da linfopoese por Kalanchoe brasiliensis é independente do

aumento dos níveis de corticóide endógeno.

Grupos de 5 animais C57BL/10 foram diariamente tratados intraperitonealmente com

água ou Kb por 4 dias. No 5º dia, os níveis de corticóide sérico dos animais tratados e

dos animais controle (não injetados) foram medidos por radioimunoensaio. As barras

horizontais representam o valor da média por grupo e o (*) indica que os animais

tratados com água ou Kb apresentam diferenças significativas em relação aos valores

obtidos nos animais não manipulados.

Figura 13 - Interrupção do tratamento com KMC resulta na recuperação

progressiva da linfopoese B.

Grupos de 5 animais foram injetados diariamente no peritônio com 160 mg/kg de KMC

por 4 dias consecutivos. O grupo controle foi injetado com água deionizada. Células da

medula óssea foram retiradas e marcadas com anticorpos anti-IgM e anti-B220 nos dias

3, 5, 8 e 12 após o início do tratamento e analisadas para a presença de células

proB/preB (B220

IgM

) e células B imaturas (B220

IgM

) através de citometria de fluxo.

Os dados mostram os resultados de 3 experimentos diferentes com 5 animais por

grupo.

Figura 14. Efeito marginal sobre a apoptose de precursors T e B na presença de

Kb in vitro.

Células B220 purificadas da medula óssea foram cultivadas por 18 hs e a apoptose foi

medida por marcação com anexinaV e iodeto de propídio em citômetro de fluxo. (A)

Controle (B) dexametasona 10

-8

M; (C) Kb 30 µg/ml; (D) Kb 100 µg/ml. Timócitos foram

cultivados por 18 hs e a apoptose foi medida por marcação com anexinaV e iodeto de

propídio em citômetro de fluxo. (E) Controle. (F) dexametasona 10

-8

M; (G) Kb 30 µg/ml;

(H) Kb 100 µg/ml.

4.5 - Os efeitos de Kb/KMC são independentes de TNF-α

αα

α, IFN-β

ββ

β, TLR2 ou TLR4

Vem sendo demonstrado que TNF-α e IFN-β inibem seletivamente a

linfopoese, preservando a mielopoese (Lin & Dong & Cooper, 1998; Ueda et. al., 2004).

Para investigar se o efeito de Kb/KMC poderia estar associado à ação desses

mediadores endógenos já conhecidos por modular a linfopoese, nós tratamos os

animais TNF-R1

-/-

e IFNR

-/-

com Kb/KMC. Os resultados obtidos em ambas as linhagens

mostraram que o tratamento com Kb/KMC leva também a uma profunda e seletiva

redução da linfopoese B e T nesses animais, semelhante àquela encontrada nos

animais controle (Figura 15 A, B e C e Tabela 3).

Recentemente, também tem sido demonstrado que a linfopoese pode ser

inibida pelo engajamento direto dos receptores TLR2 ou TLR4 nos progenitores mais

precoces (Nagai et. al, 2006). Sendo assim, nós também investigamos o papel desses

receptores nos animais tratados com Kb/KMC utilizando animais C57BL/10ScCr (que

consiste em um mutante natural para o receptor Toll 4) e animais TLR2

-/-

e observamos

que os resultados foram semelhantes àqueles observados em animais C57BL/10

selvagens (Figura 16 A e B e Tabela 3). Esses experimentos também foram importantes

para excluir a possível contaminação de origem bacteriana com LPS ou lipoproteínas

que poderiam estar presentes na preparação do Kb/KMC e serem os responsáveis

pelos efeitos observados.

Adicionalmente, a preparação do sumo de Kb foi submetida a uma coluna

de polimixina B para a remoção do LPS presente, confirmado pelo teste de Limulus e

se manteve efetiva em inibir a linfopoese assim como o sumo original (dados não

mostrados).

Figura 15- Kalanchoe brasiliensis suprime o desenvolvimento de células B em

animais TNF-R1

-/-

e IFN-R

-/-

Grupos de animais TNF-R1

-/-

receberam diariamente tratamento i.p. com 480mg/Kg de

Kb (A) ou 160 mg/Kg de KMC (B) e animais β-IFN-R

-/-

receberam diariamente

tratamento i.p. com 160 mg/kg de KMC (C) por 4 dias. No 5º dia, as células da medula

óssea foram retiradas e marcadas com anticorpos anti-IgM e anti-B220 e suas

subpopulações foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados mostram os valores

de média e desvio padrão de 3 experimentos diferentes com p<0.05 *.

Figura 16 - Kalanchoe brasiliensis suprime o desenvolvimento das células B nos

animais C57BL/10ScCr ou TLR2-/-.

Animais C57BL/10ScCr (A) ou TLR2

-/-

(B) receberam diariamente tratamento

intraperitoneal com água deionizada (CTR) ou 480mg/kg de Kb por 4 dias. No 5º dia, as

células da medula óssea foram retiradas e marcadas com anticorpos anti-IgM e anti-

B220 e suas subpopulações foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados

mostram os valores de média e desvio padrão de 3 experimentos diferentes com

p<0.05 *.

Tabela 3. Dimalato de kalancosina suprime o desenvolvimento T e B nos animais

TNF-R1

-/-

, β

ββ

β-IFN-R

-/-

, C57BL/10ScCr ou TLR2 -/-.

Camundongos TNF-RI

-/-

, β-IFN-RI

-/-

, C57BL/10ScCr (mutante natural para TLR4) ou

TLR2

-/-

, receberam diariamente tratamento i.p. com água deionizada ou 160 mg/kg de

KMC por 4 dias. No 5º dia, as células da medula óssea e do timo foram obtidas. A

Tabela mostra o número de células da medula óssea B220

/IgM

e timócitos

CD4

/CD8

. Os valores são expressos em porcentagens em relação ao número de

células obtidas no grupo controle injetado apenas com água deionizada (100%). Os

dados são representativos de 2 experimentos diferentes com 3 animais por grupo.

4.6 - Efeitos do sumo de Kb na diferenciação de linfócitos B in vitro

Tendo sido demonstrado o efeito do sumo de Kb na diferenciação de

linfócitos B in vivo procuramos avaliar se o fenômeno se repetiria em um modelo de

diferenciação de linfócitos B in vitro. Além disso, caso os efeitos in vitro de Kb fossem

semelhantes aos já demonstrados para os corticóides (Garvy et. al., 1993)

levantaríamos a hipótese do Kb estar agindo como um agonista do receptor de

corticosterona.

No experimento in vitro, foram utilizados camundongos normais jovens, os

quais possuem grande número de precursores de células B na medula, de onde foram

depletadas as células B imaturas (IgM

) para que os precursores diferenciassem in vitro

por 3 dias. Decorrido esse tempo, foi feita a contagem das células na câmara de

Neubauer (Figura 17 A e B). O tratamento dessas células com o sumo de Kb é

mostrado na Figura 17 B e o tratamento com Dexametasona é mostrado na Figura 17

A. Além disso, confirmamos a já descrita reversão do efeito da dexametasona nas

células B de medula pelo antagonista do receptor de glicocorticóides, o RU 486 (Figura

17A). Realizamos também a marcação dessas células após as 72hs de cultura e os

resultados demonstram que Kb não inibe a diferenciação de linfócitos B in vitro (Figura

18). E, uma vez que o sumo de Kb não teve efeito in vitro na população de células B da

medula óssea podemos descartar algum efeito agonista desse sumo no receptor de

corticosterona. Os resultados indicam também que o sumo de Kb não tem efeito tóxico

que eleve a mortalidade das células in vitro, mesmo quando mantidas em cultura por

72h.

Figura 17 - Efeitos do tratamento com dexametasona e Kb na diferenciação in

vitro dos precursores de células B

Células da medula óssea depletadas de linfócitos B maduros foram cultivadas por 72h

na presença de dexametasona (concentração expressa em Molar) na ausência ou na

presença de 2 µM RU486, antagonista do receptor de corticosterona (A). Em (B), as

células da medula óssea depletadas de linfócitos B maduros foram cultivadas na

presença de diferentes concentrações de Kb. No final da cultura, o número de células

B220 viáveis foi determinado por contagem em câmara de Neubauer. Os dados

mostrados são representativos de um experimento num total de 3 experimentos

realizados.

Figura 18 - Kalanchoe brasiliensis não inibe a diferenciação dos precursores de

células B in vitro.

Os precursors de células B obtidos através da seleção negativa foram cultivados in vitro

por 72 h, na ausência ou presença de diferentes concentrações do sumo de Kb. No

final da cultura, as células foram marcadas com anticorpos anti-IgM e anti-B220 e

analisadas por citometria de fluxo para a presença de diferentes populações de células

B: proB/preB (B220

IgM

) e células B imaturas (B220

IgM

). No gráfico, as células B

IgM

no dia 0 de cultura são indicadas em (A). Os dados mostram a diferenciação das

células B após 72h de cultura na ausência de Kb (B) e na presença de 100 µg/ml de Kb

(C).

4.7 - Interferência do sumo de Kb/KMC na via de sinalização da interleucina 7

(IL-7)

O papel relevante da interleucina 7 (IL-7) na proliferação dos precursores

de células T e B durante o desenvolvimento já é bem conhecido. Sendo assim, uma

possível interferência na via de sinalização dessa interleucina poderia explicar o efeito

in vivo do sumo de Kb/KMC sobre esses dois tipos celulares. Baseados nessa hipótese,

decidimos averiguar se o sumo seria capaz de inibir total ou parcialmente essa via. Ao

investigarmos a proliferação na presença de IL-7, utilizamos células totais de medula

(Figura 19 A) ou precursores de células B purificados (Figura 19 B), os quais proliferam

bem em resposta a essa interleucina e obtivemos uma severa inibição na proliferação

celular em ambos os casos.

Figura 19 - Kb e KMC inibem a resposta proliferativa dos precursores de células B

à IL-7

(A) Células totais da medula óssea de animais normais foram cultivadas por 5 dias com

IL-7, lavadas e re-cultivadas por mais 72h com IL-7, na ausência ou na presença de

concentrações crescentes de Kb/KMC (µg/ml). A proliferação foi medida por

incorporação de timidina marcada conforme descrito na metodologia. (B) Células

B220

CD19

IgM

foram purificadas e cultivadas por 3 dias com IL-7 na ausência ou na

presença de concentrações crescentes de KMC (µg/ml). A proliferação foi medida por

incorporação de timidina marcada. Os dados são representativos de 3 experimentos

diferentes.

4.8 - Efeitos do do Kb/KMC na proliferação celular em resposta a estímulos por

IL-2 e IL-3

As vias de sinalização das interleucinas IL-2, IL-3 também foram alvo de

nossas investigações. A fim de avaliar se a proliferação celular em resposta ao estímulo

de IL-2 estaria sendo inibida após o tratamento com o KMC, desenvolvemos um modelo

in vitro onde células totais de baço foram primeiramente estimuladas com Con A e

posteriormente crescidas em presença de IL-2. Os resultados nos mostram que KMC foi

capaz de levar a uma inibição de até 43% na resposta à IL-2 (Figura 20). No caso da

IL-3, utilizamos a linhagem celular FDCP-I, que prolifera bem em resposta a essa

interleucina, e pudemos observar uma inibição da proliferação dessas células de até

95% (Figura 21) quando tratadas in vitro com concentrações crescentes de Kb. No caso

do KMC, uma inibição na proliferação celular de apenas 33% pode ser observada na

via da IL-3 (Figura 22).

Figura 20 - Medida da proliferação de células de baço em resposta à IL-2 com

concentrações crescentes de KMC

Células totais do baço de animais normais foram estimuladas com 1 µg/ml de

Concanavalina A por 72h e lavadas com 40mg/ml de α-metil-manosídeo.

Posteriormente, foram estimuladas com 10% de IL-2 e com as concentrações de 10, 30

e 100 µg/ml de KMC. O tempo de cultura foi de 48h. A proliferação basal representada

pela linha tracejada foi de 1257 cpm. Os dados são representativos de 3 experimentos

diferentes.

Figura 21 - Medida da proliferação de células FDC-P1 em resposta à IL-3 com

concentrações crescentes de Kb.

Células da linhagem FDC-P1 foram estimuladas com 10% de IL-3 e cultivadas em

placas de 96 poços com as concentrações de 10, 30 e 100 µg/ml do Kb. O tempo de

cultura foi de 48h. A proliferação basal representada pela linha tracejada foi de 6546

cpm. Os dados são representativos de 3 experimentos diferentes.

Figura 22 - Medida da proliferação de células FDC-P1 em resposta à IL-3 com

concentrações crescentes de KMC.

Células da linhagem FDC-P1 foram estimuladas com 10% de IL-3 e cultivadas

em placas de 96 poços com as concentrações de 10, 30 e 100 µg/ml do KMC. O tempo

de cultura foi de 48h. A proliferação basal representada pela linha tracejada foi de 6546

cpm. Os dados são representativos de 3 experimentos diferentes.

4.9 - Medida da proliferação de linfócitos B de baço estimulados com LPS

após tratamento com o sumo de Kb

Embora o sumo de Kb não tenha mostrado ação in vitro sobre a

diferenciação das células B, tentamos detectar uma inibição na proliferação dessas

células desenvolvendo um modelo de proliferação in vitro. O modelo consistiu de uma

proliferação de células B de baço durante 48 horas estimuladas com o mitógeno LPS. A

medida da proliferação celular foi feita pela contagem da cintilação, que mostrou que o

sumo de Kb inibe marginalmente a proliferação in vitro de linfócitos B em resposta ao

LPS (Figura 23), mostrando que Kb não está agindo como uma substância anti-mitótica

geral e inespecífica.

Figura 23 - Kb inibe marginalmente a resposta proliferativa de células B ao LPS.

Células de baço foram cultivadas por 72h com LPS na ausência ou presença de

concentrações crescentes de Kb (µg/ml). A proliferação foi medida por incorporação

com timidina marcada com trício. Os dados são representativos de 3 experimentos

diferentes.

5 - DISCUSSÃO

Kalanchoe brasiliensis (Kb) é uma planta medicinal brasileira da família

das Crassulaceae comumente usada na medicina popular para o tratamento de certas

doenças inflamatórias crônicas. O efeito direto do sumo de plantas do mesmo gênero

na ativação de linfócitos humanos in vitro foi investigado na tentativa de mostrar que as

propriedades de cura destas plantas poderiam estar associadas a uma ação no sistema

imunitário (Moraes et. al, 1994; Rossi-Bergmann et. al, 1994). A partir desses trabalhos,

foi demonstrado que o sumo liofilizado de plantas do mesmo gênero inibia a resposta

proliferativa de linfócitos a mitógenos in vitro (Rossi-Bergmann et. al., 1994).

Em outros estudos realizados com um modelo de inflamação aguda, o

sumo de Kb demonstrou potente ação anti-inflamatória e imunomoduladora, na medida

em que reduziu o processo inflamatório induzido por zimosan, além de reduzir o número

de células B no linfonodo drenante (Ibrahim et. al, 2002). A partir desses resultados,

nosso principal objetivo foi investigar os efeitos do sumo de Kb nas células do sistema

imune, principalmente os possíveis efeitos na maturação e na diferenciação das células

B eT.

No presente trabalho, após a injeção intraperitoneal de camundongos com

o sumo por 4 dias consecutivos observamos uma redução do número de linfócitos B

imaturos (B220

IgM

) e de seus precursores (B220

IgM

) na medula óssea e da

população duplo-positiva (CD4

CD8

) no timo. Esses resultados sugerem que há um

efeito do sumo de Kb nas populações celulares de transição durante o processo de

diferenciação das células T e B. Os efeitos são somente observados nos órgãos

linfóides primários (medula e timo) e não nos secundários (baço e linfonodo) onde o

número de linfócitos B e T está preservado, levando-nos a acreditar que alguma

interferência esteja ocorrendo na diferenciação celular in vivo.

A preservação dos linfócitos maduros (B220

high

IgM

) observada após o

tratamento com Kb/KMC é condizente com a dinâmica normal de população dos

linfócitos. As células B estão sendo produzidas continuamente na medula óssea adulta

e, apenas 5-10% das células recém formadas são incorporadas no compartimento de

células B maduras (Osmond, 1993; Gaudin et. al., 2004). Essa analogia também se

aplica às células T, embora o número de células T recém formadas no animal adulto

seja menor do que o número de células B, isso é compensado pela intensa proliferação

das células T maduras nos órgãos linfóides periféricos. Portanto, tanto no repertório T

como no B, a porcentagem de linfócitos recém formados não excede 5-10% dos

linfócitos periféricos totais e isso explica porque a linfopoese pode ser dramaticamente

reduzida em poucos dias sem afetar os linfócitos maduros nos órgãos linfóides

secundários (Agenes & Rosado & Freitas, 1997), como observamos neste trabalho.

Vale ressaltar ainda que a redução da população celular parece estar

restrita à população linfóide, visto que o número absoluto de macrófagos na medula

óssea se mantém constante, embora sofra um aumento percentual que é devido à

redução proporcional da população B220

. Isso mostra que os efeitos observados não

são inespecíficos, não ocorrendo em todos os tipos celulares.

Os efeitos inibitórios do sumo de Kb na linfopoese in vivo e in vitro podem

ser reproduzidos pelo dimalato de kalancosina (KMC), um composto purificado obtido

pela precipitação em etanol do sumo. O KMC é composto de um novo metabólito

recentemente descrito, a kalancosina (ácido 3,6-diamino-4,5-dihidroxioctanodióico) e

ácido málico, na razão estequiométrica 1:2 (Costa et. al., 2006). O efeito inibitório

parcial obtido a partir do tratamento das Pro/PreB com o sobrenadante possivelmente

se deve a uma pequena contaminação com resíduos de KMC ainda presentes no

mesmo.

Um efeito semelhante ao do Kb/KMC já havia sido demonstrado em

precusores hematopoéticos, precursores e progenitores de células B de medula óssea

e em timócitos tratados com glicocorticóides como a Dexametasona (Wyllie, 1980). A

exposição ao fármaco levou à indução da apoptose dos precursores de linfócitos B na

medula óssea, que pode ser revertida com o uso do antagonista do receptor de

glicocorticóides, o Ru 486 (Garvy et. al., 1993). Não é somente durante o tratamento

com agentes exógenos como os glicocorticóides que se observa essa redução no

número de células B da medula óssea. Agentes endógenos como os estrogênios

(Medina & Kincade, 1994), citocinas como o TNF-α e o IFN-tipo I e receptores Toll like

como o TLR2 e TLR4 (Kincade, 1994) também já foram descritos como sendo agentes

imunosupressores.

O fato do sumo de Kb ter um efeito bastante semelhante ao dos

glicocorticóides nos linfócitos B e T nos levou a acreditar que a injeção do sumo poderia

estar induzindo o aumento dos níveis de corticóide e que tal aumento seria o

responsável pela redução do número de linfócitos. Embora o aumento nos níveis de

corticóide tenha sido de fato constatado no plasma de animais injetados com o sumo,

esse aumento se deve ao estresse que os animais são submetidos no momento da

picada, e não ao sumo em si, uma vez que os animais que receberam apenas água

apresentaram níveis de corticosterona semelhantes àqueles injetados com sumo. Além

disso, precursores de células B e T cultivados in vitro com Kb/KMC sofrem uma

apoptose marginal, ao contrário daquela observada na presença dos glicocorticóides

(Fig. 11), trazendo mais uma evidência do distinto modo de ação entre Kb/KMC e os

glicocorticóides.

O desenvolvimento das células B é também suprimido por hormônios

estrogênios que inibem a secreção de fatores pelas células estromais, tais como a IL-7

endógena (Medina et. al., 2001; Kincade, 1994), sem induzir a apoptose dos

progenitores de células B. A linfopoese de células B é seletivamente suprimida na

medula óssea de fêmeas grávidas ou de animais tratados com estrogênios (Medina &

Kincade, 1994; Medina, Strasser & Kincade, 2000). Progenitores precoces (células pro-

B e pre-B) parecem ser menos afetados do que os estágios mais tardios de

diferenciação tais como pre-B II e células B imaturas (Medina, Smithson & Kincade,

1993). Entretanto, o tratamento de animais machos e fêmeas com o Kb/KMC nos

mostra que ambos são igualmente suscetíveis à supressão, excluindo a hipótese do

estrogênio ser um mediador do efeito de Kb in vivo.

A produção de IFN tipo I e TNF-α também poderia estar sendo induzida

pela administração de Kb/KMC, o que poderia explicar os efeitos inibitórios de Kb na

linfopoese (Lin & Dong & Cooper, 1998; Ueda et. al., 2004). As funções do TNF-α são

iniciadas pela sua interação com seus receptores que apresentam pesos moleculares

distintos: TNFR1 (TNFp55) e TNFR2 (TNFp75). Os domínios intracitoplasmáticos

desses receptores não apresentam homologia e acredita-se que as vias de sinalização

intracelulares desencadeadas por eles sejam diferentes, sendo que a maioria das

respostas celulares induzidas por TNF-α são atribuídas exclusivamente ao TNFR1

(Engelmann et. al., 1990). A administração de Kb/KMC nos animais TNFR1

-/-

e IFN-R1

-/-

também resultou em uma profunda redução da linfopoese T e B, sugerindo que os

efeitos de Kb/KMC in vivo são independentes dessas citocinas.

Os receptores TLR2 e TLR4, recentemente descritos como supressores

da linfopoese, (Kincade, 1994) foram também abordados neste trabalho. Os receptores

TLR2 reconhecem diversos componentes microbianos distintos, incluindo lipoproteínas

e lipopeptídios de bactérias Gram positivas (Takeuchi et. al., 2002). O receptor TLR4 é

essencial na resposta ao lipopolissacarídeo (LPS). Além do LPS, outras moléculas vem

sendo descritas como ligantes de TLR4. O taxol é um composto derivado de plantas

com propriedades anti-cancerígenas conhecido por mimetizar a ação do LPS em

camundongos (Takeuchi et. al., 2002). No presente trabalho, os experimentos com

animais TLR2

-/-

e C57BL/10ScCr (deficientes no receptor TLR4) também excluíram o

papel da sinalização de TLR2 e TLR4 no bloqueio da linfopoese via Kb/KMC (Tabela 3).

Uma outra hipótese ainda é de que o sumo de Kb estaria inibindo uma ou

várias vias de sinalização celular das interleucinas que participam das etapas de

diferenciação de linfócitos B e T. A manutenção dos precursores comprometidos com a

linhagem linfóide é dependente de uma série de fatores secretados pelo estroma da

medula óssea e do timo, dentre eles a IL-7, cuja presença do receptor composto pelas

cadeias α e γ é responsável pela sobrevivência e proliferação dos precursores mais

precoces (Namen et. al., 1988; Sudo et. al., 1989b), além de ser necessária durante a

transição das fases Pro B/PreB (Corcoran et. al., 1996 e 1998). Já foi demonstrado

inclusive que a IL-7 é suficiente para promover a diferenciação in vitro dos progenitores

da linhagem B, mesmo na ausência de células estromais (Miller et. al., 2002).

Os precursores linfóides perdem a capacidade de responder à IL-7 nos

estágios finais da diferenciação e essa etapa coincide com a expressão dos receptores

BCR e TCR na superfície dos linfócitos imaturos (Hardy et. al., 1991; Zuniga-Pflucker,

2004). Kb/KMC inibiu a proliferação dos precursores de células B em resposta à IL-7 in

vitro, o que poderia explicar a supressão da linfopoese observada in vivo e é coerente

com a redução preferencial das PreBII e B imaturas, sendo a população de células B

ckit

(PreBI) menos afetada com o tratamento com Kb/KMC (Fig. 2C e 2D).

Os resultados obtidos no desenvolvimento das células T também sugerem

que o Kb/KMC também interfere com a sinalização do receptor da IL-7. Animais IL-7KO

e IL-7RKO apresentam um bloqueio no desenvolvimento das células T na transição

entre DN2/DN3, acumulando células no estágio DN2 (Freeden-Jeffry, 1995). Nossos

dados mostraram que animais tratados com Kb/KMC possuem o compartimento DN2

aumentado e o DN3 diminuído, sugerindo que o tratamento com Kb/KMC, ao afetar a

IL-7, bloqueou a transição DN2/DN3 . Além disso, a expressiva redução dos timócitos

CD4

CD8

nos animais tratados com Kb está de acordo com a forte inibição da

proliferação da subpopulação DN4 que lhe origina, a qual depende de IL-7 como um

fator trófico (Di Santo & Rodewald, 1998). O tratamento com Kb/KMC afeta as 2

subpopulações com a maior capacidade mitótica, DN2 e DN4 e ambas dependem de

IL-7, o que leva a uma depleção das progênies imediatas, que são as DN3 e as duplo-

positivas, respectivamente (Penit, Lucas & Vasseur, 1995).

Outras interleucinas como a IL-2 e a IL-3 também foram investigadas. A

IL-2, inicialmente identificada como fator de crescimento das células T, também exerce

um papel no crescimento e ativação de células B (Smith, 1988), sendo sua ação

mediada pelo receptor da IL-2 presente nessas células (Taniguchi et. al.,1986). O

receptor da IL-2 é composto do heterotrímero αβγ ou do heterodímero βγ , sendo as

cadeias β e γ essenciais para a transdução de sinais intracelulares (Kamino et. al.,

1992). A cadeia γ do receptor da IL-2 é partilhada pelo receptor de outras interleucinas,

dentre elas a IL-7 (Noguchi et. al., 1993a e 1993b; Russel et. al., 1993). Embora a

cadeia γ seja indispensável para a sinalização de várias dessas interleucinas tais como

a IL-2, a IL-4, a IL-7, a IL-9 e a IL-15 (Kondo et. al, 1993; Giri et. al., 1994) a disfunção

da IL-7 é a responsável pelos defeitos nas células T e B em camundongos mutantes, já

que ambos os defeitos são encontrados em camundongos IL7

-/-

(Freeden-Jefry et. al.,

1995) ou em casos de administração de anticorpo monoclonal anti-IL-7 (Grabstein et.

al., 1993). Nossos resultados mostram uma diminuição marginal da proliferação celular

em resposta à IL-2 durante o tratamento com o KMC. Uma vez que os receptores de IL-

2 e IL-7 partilham a cadeia γ e alguns membros da família JAK/STAT como JAK1,

JAK3, STAT3 e STAT5 (Noguchi et. al., 1993a e 1993b; Leonard, 2001), estudos mais

detalhados devem ser realizados na tentativa de identificar o alvo molecular de

Kb/KMC.

Em relação à IL-3, importante por estimular o crescimento das células Pre

B in vitro (Palacios et. al., 1984; Rennick et. al., 1989), também pode ser vista uma

inibição nas células da linhagem FDC-P1, que proliferam em resposta à IL-3, pelo sumo

de Kb porém esta inibição é bem mais modesta no tratamento com KMC. Face ao

exposto, sugerimos que o sumo da planta, assim como sua fração ativa, estejam

interferindo nas complexas vias de sinalização dos receptores de citocinas classe I, nos

quais estão inluídas as interleucinas IL-2, IL-3 e IL-7, porém com um efeito bem mais

expressivo na IL-7.

Na tentativa de esclarecer melhor qual etapa da diferenciação celular

estaria sendo bloqueada, utilizamos um modelo de diferenciação de células B in vitro.

Surpreendentemente, os efeitos do sumo da planta não puderam ser observados in

vitro, levando-nos a levantar algumas hipóteses na tentativa de explicar a ausência de

efeito in vitro.

Primeiramente, em nosso modelo de diferenciação in vitro, a grande

maioria das células B, após a depleção das B imaturas, são células que se encontram

no estágio Pre B-II pequena. O estágio Pre B-II é subdividido em Pre B-II grandes e Pre

B-II pequenas, sendo que essas últimas darão origem às células B imaturas durante o

processo de diferenciação celular (Melchers & Rolink, 1999). Sabendo que em nosso

sistema há um predomínio de células Pre B-II pequenas é possível que o sumo de Kb,

assim como o KMC, não tenham ação na etapa de transição Pre B-II pequena/B

imatura, mas talvez possam estar agindo em uma etapa anterior. É possível também

que o sumo de Kb e o KMC possam estar sendo metabolizados in vivo, e que os

produtos de seu metabolismo sejam os responsáveis pelo efeito observado, o que

justificaria a ausência de efeito in vitro, ou ainda, por ser a população PreBII não mais

responsiva a IL-7, isso reafirma que o Kb/KMC estaria bloqueando a resposta

proliferativa dos precursores à IL-7, mas em um estágio mais avançado em que a célula

não mais depende dessa proliferação, a diferenciação dos linfócitos ocorreria

normalmente.

Ao avaliarmos a ação do sumo de Kb in vitro na proliferação de células B

de baço em resposta ao mitógeno LPS, vimos que a proliferação dessas células foi

preservada, sugerindo mais uma vez que a planta está mesmo agindo em alguma

etapa intermediária da diferenciação dos linfócitos B, mas não age na resposta da

célula B madura ao LPS. Isso nos sugere que a via do receptor TLR-4 não foi afetada,

ou seja, o sumo de Kb não foi capaz de interferir na resposta ao LPS.

O LPS é um componente estrutural da parede externa de bactérias Gram-

negativas sendo conhecido como um potente ativador de monócitos e macrófagos,

levando à síntese de inúmeras citocinas como IFNγ, TNF-α e IL-12 as quais podem

interferir no desenvolvimento dos linfócitos. Ao longo deste trabalho, levantamos a

hipótese de uma possível contaminação com LPS nas amostras do sumo de Kb e em

suas frações, que foi então investigada. De fato, detectamos a presença de 0.03% de

LPS em duas amostras de sumo plantadas em diferentes solos. Uma dessas amostras

de sumo foi extraída do caule de Kalanchoe brasiliensis, e não exerceu nenhum efeito

na população de células B (dados não mostrados). A outra amostra, extraída da folha,

exerceu o efeito aqui demonstrado, que foi estudado ao longo de todo nosso trabalho.

Vale destacar ainda, que ambas as amostras de sumo, a que teve efeito sobre as

células B e a que não teve, apresentam níveis de contaminação com LPS semelhantes,

confirmando assim que os efeitos observados ao longo deste trabalho não se devem à

presença do LPS.

Nossos resultados sugerem então que o sumo de Kb e sua fração

purificada KMC bloqueiam a linfopoese através de um novo mecanismo que difere do

modo de ação já descrito para hormônios e citocinas com efeito análogo. Essa é a

primeira descrição de um produto derivado de planta com essas propriedades. Além

disso, a identificação do KMC como sendo a fração ativa do sumo de Kb representa a

descoberta de mais um agente imunosupressor, com efeitos semelhantes aos já

descritos para outros fármacos. Nós então sugerimos que o Kb/KMC está interferindo

na resposta dos progenitores linfóides à IL-7 e, como a IL-7 vem sendo apontada como

importante citocina para o crescimento de linfomas de células T (Yamanaka et. al.,

2006), o Kb/KMC poderia ser apontado como um candidato promissor para o controle

desses tumores.

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO 1

Artigo aceito para publicação no

Journal of Leukocyte Biology

100

101

ANEXO 2

Artigo aceito para publicação no

International Immunopharmacology

102

INHIBITION OF B CELL DEVELOPMENT BY KALANCHOSINE DIMALATE.

Luciana S. de Paiva

, Elize A. Hayashi

, Giany O. De Melo

¶|

, Sonia S. Costa

, Vera Lúcia G. Koatz

Alberto Nobrega

(

) Departamento de Imunologia, Instituto de Microbiologia; (

) Núcleo de Pesquisas de Produtos

Naturais; (||)Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590, Brasil.

Running Title:

Inhibition of B cell development by Kalanchosine dimalate.

Correspondence: Alberto Nobrega, PhD, Departamento de Imunologia, Instituto de Microbiologia,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil, Tel.: 55 21 2562-6747, Fax:

55 21 25612936

Av. Carlos Chagas Filho, 373 –CCS- Bl.I- sala I2-051- Instituto de Microbiologia- Cidade Universitária-

CEP:21941-902- Rio de Janeiro-RJ- Brazil

Email: afnobrega@gmail.com

103

ABSTRACT

Kalanchoe brasiliensis (Kb) is a medicinal plant from the Crassulaceae family, used in folk medicine to

treat inflammatory and infectious diseases. Here we show that short-term treatment of mice with a highly

purified compound named Kalanchosine dimalate (KMC), obtained from Kb, led to a strong and selective

inhibition of B cell development in the bone marrow, without affecting the myeloid lineage development.

Numbers of mature B lymphocytes in bone marrow or peripheral lymphoid organs were preserved in

KMC treated mice. The inhibitory effect of KMC was acute and rapidly reverted with the interruption of

the treatment. In vitro, KMC, inhibited the interleukin-7 dependent proliferation of B cell precursors and

do not induce cell death. Also in vitro, the maturation of B cell precursors was not affected by KMC.

KMC does not inhibit the proliferative response to IL-3 or IL-2. These results suggest that KMC is

selectively affecting B cell lymphopoiesis, possibly acting on the IL-7 signaling pathway, opening new

perspectives for a potential therapeutic usage of Kb derived drugs.

Keywords: Kalanchoe brasiliensis, kalanchosine dimalate, B cell development, interleukin-7.

104

INTRODUCTION

Plants from the genus Kalanchoe are traditionally used in folk medicine to treat inflammatory

diseases. Our group has been investigating the properties of compounds derived from plants of that genus,

aiming at the identification of new substances with potential therapeutical value. Previously we have

shown that the juice prepared from fresh leaves of K. brasiliensis (Kb) possess immunosuppressive

properties in a mouse model of arthritis [1] and that similar preparations derived from K. pinnata

presented immunomodulatory activity in a mouse model of leishmaniasis [2, 3]. More recently, we

showed that a highly purified compound named Kalanchosine dimalate (KMC), a pure complex formed by

the new compound kalanchosine and malic acid in a ratio 1:2, derived from K. brasiliensis [ 4 ], exhibited

a potent anti-inflammatory activity, strongly inhibiting acute inflammation experimentally induced with

zymozan [ 1 ].

Here we show that a short-term treatment of normal mice with KMC promotes a massive

depletion of immature B lymphocytes and B cell precursors in the bone marrow. This ablation is transient

and can be reversed in a few days after discontinuation of the treatment. The effect of KMC in the bone

marrow was found to be selective for the lymphoid lineage, with little effect on the myeloid compartment.

Using an in vitro assay for B cell differentiation, we present evidence to support the notion that depletion

of B cell lineage in the bone marrow by KMC is due to a selective blockade of IL-7 driven expansion of B

cell precursors, without interfering in their maturation process.

105

MATERIAL AND METHODS

Animals.

C57BL/10 (male, 25 g) were obtained from Universidade Federal Fluminense, Rio de Janeiro, Brazil.

Animals were housed in a temperature-controlled room, receiving water and food ad libitum. All the

procedures involving animal experiments were performed in accordance to the International Guidelines

for Animal Use.

Preparation of juice from aerial parts of Kalanchoe brasiliensis (Kb).

The aerial parts of cultivated and not bloomed specimens of K. brasiliensis were collected in the morning

hours at Rio de Janeiro state (Brazil). A voucher specimen 304627 was deposited at Botanical Garden of

Rio de Janeiro, Brazil. The fresh aerial parts of Kb (24 kg) were washed with a solution of sodium

hypochlorite at 100 ppm, rinsed and dried at room temperature. Twenty-four hours later, the fresh plant

material was triturated in an industrial food processor to obtain a green juice (19 L), which was clarified

by decantation at 5 °C for 24 h, resulting in a yellow preparation (17.3 L), named Kb juice, that was

lyophilized for further manipulations.

Preparation of kalanchosine dimalate (KMC) from Kb juice.

Lyophilized Kb juice was dissolved in pyrogen free water plus ethanol (50 % v/v) and the mixture

maintained at 5°C under agitation for 5 days. After this period, the white-flake precipitate was recovered

by paper filtration. The filters were washed with pyrogen free water (1.0 L) and the filtrates obtained were

re-precipitated with ethanol (1.5 L) and filtered again. The collected solid material obtained was partially

dried at 40 °C, dissolved in pyrogen free water, frozen and lyophilized. The

H NMR analysis showed that

the precipitate (0.319% yield w/w from the fresh plant) is a pure complex, formed by the new compound

kalanchosine and malic acid in a ratio 1:2, thereafter named KMC [ 4 ]. The chemical purity KMC

preparations was systematically monitored by using high performance liquid chromatography (HPLC)

106

with the column Asahipak GS-51OH and the Diodearray detector (Shimadzu, Japan), eluted with 20 mM

Tris-HCl buffer pH 8.0 in a flow rate of 0.4 ml/min.

Treatment with K. brasiliensis and fractions.

Just before use lyophilized Kalanchosine dimalate KMC was re-suspended in pyrogen free water and

filtered through a 0.22 µm Millipore filter. Groups of three to five mice were daily treated

intraperitoneally (i.p.) with an injection of 200 µl/mouse containing 160 mg/kg KMC, during the duration

of the experiment. The concentrations of KMC used throughout this study were determined before [1 ].

The preparation of KMC used in all experiments described here were passed through a polymyxin B

column to eliminate possible contaminants of bacterial origin (e.g. LPS and lipoproteins) and were

negative for the Limulus assay (LAL), limit of detection of 0.125 endotoxin U/ml (E-Toxate; Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO). Mock injected animals received pyrogen free water, 200 µl/mouse. At the end of

treatment, mice were sacrificed and bone marrow was used to prepare single cell suspensions.

Cell staining and flow cytometry.

Fresh single cell suspensions from bone marrow was stained with fluorochrome conjugated monoclonal

antibodies and monitored by flow cytometry. The monoclonal antibodies (mAbs) used for staining were as

follow: FITC-goat anti-mouse IgM (Caltag Laboratories, Burlingame, CA), PE-anti-B220, PE-CD11b

(BD PharMingen, San Diego, CA), annexinV-FITC (BD PharMingen, San Diego, CA). Cells were

incubated with the mAbs in FACS buffer (PBS, 1% FCS, 0.05% Na-azide) for 20 min on ice and washed

twice with FACS buffer. Data were acquired on a FACSCalibur

(BD Biosciences, San Jose, CA) and

analyzed using CELLQuest

software (BD Biosciences). Staining with annexinV-FITC were done in

annexin binding buffer, following the protocol indicated by the manufacturer.

Magnetic cell sorting (MACS).

107

For depletion of IgM

B lymphocytes, bone marrow cells were incubated in MACS buffer (PBS

containing 2mM EDTA, 5% FCS) with anti-mouse IgM MicroBeads (Miltenyi Biotec, Germany) for 20

min on ice. Cells were washed and ressuspended in MACS buffer and passed through a nylon mesh and

applied to the magnetic column (Miltenyi Biotec); the effluent was collected, and washed in PBS, 2mM

EDTA, 5% FCS. Viable cells were scored by trypan blue exclusion dye, using a Neubauer

hemacytometer. Collected cells were described as the IgM negative fraction (>99 % purity). For

purification of B220+ cells, IgM-bone marrow cells, prepared as previously described, were incubated in

MACS buffer (PBS containing 2mM EDTA, 5% FCS) with anti-mouse B220 MicroBeads (Miltenyi

Biotec, Germany) for 20 min on ice. Cells were washed and ressuspended in MACS buffer and passed

through a nylon mesh; retained cells were eluted; this process was repeated twice, yielding a population

highly enriched for B220+ cells (> 98%).

Cell cultures.

In vitro B cell maturation: Cells from bone marrow obtained by negative selection using MACS anti-IgM

MicroBeads were cultivated for 72 h in RPMI 1640 supplemented with 10% FCS (GIBCO), 5 x 10

-5

2-ME, streptomycin 100µg/ml penicillin 100U/ml (Life Technologies) in a humidified atmosphere of 7%

at 37°C, in absence or in the presence of different doses of KMC. At the end of culture period, cells

were stained with antibodies anti-IgM FITC and anti-B220 PE and analyzed by flow cytometry.

IL-7 assay: Total bone marrow cells (10

/ml) were cultivated in RPMI 1640 supplemented as above in the

presence of interleukin 7 (IL-7) enriched supernatant produced by a J558 cell line transfected with IL-7

plasmid. After 120 h, cells were recovered, extensively washed to remove IL-7, and re-cultured for 72 h,

in absence or in the presence of IL-7 with different doses of KMC and cell proliferation measured at the

end of the culture period.

IL-2 assay: For the generation of ConA T cell blasts, splenocytes were cultivated for 72 h in vitro in RPMI

supplemented supplemmented as above in 24-well flat-bottom plates in a humidified atmosphere of 5%

at 37°C, in the presence 5µg/ml ConA; after this period, the cells were collected, washed and re-

108

cultured for 48 h in complete medium plus alfa-methyl-mannoside (100 mg/ml) and recombinant IL-2 (20

U/ml), in the presence or absence of KMC.

IL-3 assay: IL-3 dependent FDCP-1 cell line was in cultivated for 72 h in vitro in RPMI supplemented

supplemmented as above, in the absence or in the presence of IL-3 with different doses of KMC.

Proliferation assay.

Bone marrow cells (2 x 10

cells/well) were cultivated in RPMI supplemented as described above, in 96-

well flat-bottom plates in a humidified atmosphere of 5% CO

at 37°C. In the last 18 hr of cell culture,

1µCi of [

H] Thymidine (SIGMA) was added to each culture well. Cells were harvested onto glass

microfiber filter paper 934AH (Whatman, Maidstone, UK) and radioactivity assessed by scintillation

counting. Con A blasts were cultivated in RPMI 1640 supplemented as described above, in 96-well flat-

bottom plates in a humidified atmosphere of 5% CO

at 37°C.for 48 hs (5 x 10

cells/well); cell

proliferation was measured as described. IL-3 dependent FDCP-1 cell line was cultivated in RPMI 1640

supplemented as described above, in 96-well flat-bottom plates in a humidified atmosphere of 5% CO

37°C; cell proliferation was measured as described.

Statistical Analysis.

The data were analyzed by the Student t-test or Mann-Whitney non-parametric test and were considered

statistically significant when p< 0.05.

109

RESULTS

Selective blockade of B cell development in the bone marrow after administration of Kalanchosine

dimalate: The preparation of KMC used in all experiments described here were passed through a

polymyxin B column to eliminate possible contaminants of bacterial origin (e.g. LPS and lipoproteins)

and were negative for the Limulus assay (see Material and Methods). Groups of three to five C57BL/10

mice were injected i.p. daily with 160 mg/kg of Kalanchosine dimalate (KMC), for 4 consecutive days,

and single cell suspensions of bone marrow cells were prepared and analyzed by flow cytometry, twenty-

four hours after the last injection. Control mice were mock-injected with pyrogen free water. Flow

cytometry analysis of bone marrow cell populations for the surface expression of Mac-1 and B220 showed

that B cell lineage was severely diminished in KMC treated mice (fig 1); percentage of Mac1+ cells were

augmented mostly because of the absence of the lymphoid lineage cells, however total numbers of Mac-

1+ myeloid lineage were little or not affected by the treatment (table 1); Mac1-/B220- cells were also

significantly reduced in KMC treated mice (table 1).

Analysis of the B cell lineage populations for the simultaneous expression of B220 and surface

IgM showed that B cell precursors and immature B cell numbers were significantly diminished in

mice treated with KMC (fig2 and table 2), with little effect on bone marrow re-circulating mature

B lymphocytes (fig2). Interestingly, numbers of mature B cells in peripheral lymphoid organs

were not affected by the treatment with KMC (not shown). Kinetic experiments showed that the

administration of KMC from 1 to 7 days led to increasing depletion of B cell lineage populations

in the bone marrow, being already close to maximum on day 5; interruption of the treatment

resulted in the progressive recovering of B cell lymphopoiesis (Fig 3); note that the depletion and

recovering of the immature B cell population shows a lag delay to the pro/preB population of B

cell precursors.

110

Kalanchosine dimalate selectively inhibits IL-7 dependent proliferation of B cell precursors: IL-7 is

a critical factor for the proliferation of adult bone marrow B cell precursors in the mouse; in the absence of

IL-7, B cell development is blocked in the adult animal [5, 6]. Because of the profound effect of in vivo

KMC treatment on the population of B cell precursors, we investigated if KMC would inhibit the in vitro

proliferation to IL-7 of purified B cell precursors. That was indeed the case, as shown in figure 4A. The

effect of KMC on IL-7 proliferative response was found to be specific for that cytokine, as the

proliferative response of T cell blasts to IL-2 was only marginally affected (fig 4B), and the proliferative

response to IL-3, of the IL-3 dependent FDCP-1 cell line, was not inhibited by similar doses of KMC (fig

4C).

Kalanchosine dimalate do not inhibit maturation nor induce death of B cell precursors: The

profound reduction of B cell lineage populations in KMC treated mice, affecting mostly B cell precursors

and immature B cells, is suggestive of a blockade of B cell development. Inhibition of IL-7 dependent

proliferation by KMC could strongly diminish the numbers of maturing precursors without affecting the

maturation process itself; or else, KMC could also interfere with maturation of the precursor. To

investigate in more detail this point, we used an in vitro model of B cell maturation that do not involve IL-

7. As shown in figure 5A, purified B cell precursors, B220+IgM- bone marrow cells, completed their

maturation process after 72 hs of culture in vitro, leading to a massive differentiation of preB cells into

immature B cells expressing surface BCR, IgM. This maturation process was not inhibited by KMC (fig

5B,C). Interestingly, the numbers of viable cells at the end of the culture period was found to be

equivalent in the presence or absence of KMC (fig 6A) showing that this compound also do not promote

death of B cell precursors, neither apoptosis (fig 6C). For comparison, a similar set of cultures was done in

the presence of dexamethasone, which induced massive mortality of B cell precursors (fig. 6B).

111

DISCUSSION

The data presented here show that a short term treatment of mice with the purified compound

Kalanchosine dimalate (KMC), derived from the medicinal plant Kalanchoe brasiliensis, promotes a

profound inhibition of B cell development in the bone marrow, leading to a reduction of B-lineage cells to

less than 20% or their normal numbers. Treatment with KMC did not affected myelopoieisis,

characterizing a selective action of this substance. KMC treated mice also presented a reduction of Mac1-

B220- cells in the bone marrow; as this subset consists of a heterogeneous population of hematopoietic

precursors and several different cell types, including mature T cells, NK cells, plasma cells, it is not

possible to ascertain which populations have been affected by KMC; it would be most relevant to study

the impact of KMC on hematopoietic stem cells. The phenotypic analysis of the different populations of

B-lineage cells in the bone marrow indicates that B cell precursors and immature B cells suffered the

major impact of KMC; numbers of mature B cells in bone marrow and in peripheral lymphoid organs

were preserved. Kinetic experiments showed an acute effect of KMC, affecting B cell lymphopoiesis

already 48 hours after initiation of the treatment (fig 3). The inhibition of B cell development (> 80 % ) is

maximum on day 5; longer treatments do not resulted in more pronounced effects (not shown). It is

important to note that B cell development is not definitively impaired in KMC treated animals, as the

interruption of the treatment allowed these mice to recover B cell lymphopoiesis to normal levels of

production (fig 3).

It is interesting to note that data obtained in the kinetic experiments revealed that numbers of B

cell precursors begin to decline before the reduction of the population of immature B cells; similarly, after

interruption of KMC treatment, numbers of B cell precursors started their recovery before the population

of immature B cells. This result strongly suggest that the original target of KMC is the population of B

cell precursors; it is expected that a reduction of this population would automatically lead to a delayed

reduction of immature B cells [7], as observed (fig 3).As IL-7 is a critical cytokine for B cell development

in adult mice, being responsible for the massive proliferation of B cell precursors during their maturation

112

[8-10], we then investigated if KMC would inhibit the proliferative response of B cell precursors to IL-7,

in vitro; that was indeed the case (fig. 4A). Moreover, the inhibitory effect of KMC was found to be

selective for IL-7; proliferative response to IL-3 and IL-2 was little or not affected (fig 4B and C); also the

proliferative response of mature B cells to LPS was not inhibited by KMC (not shown).

The observation that KMC suppress the response of B cell progenitors to IL-7 in vitro is

suggestive of their mode of action in vivo. However, a toxic effect on B cell precursors, or a blockade of

their maturation process, is also capable to explain the effects of KMC obtained in vivo. We have

investigated these two alternative possibilities using an in vitro model of B cell maturation (fig 5); the

results showed that KMC does not inhibit the maturation of B cell precursors in vitro, neither interferes

with their survival (fig 6). These results reinforce the notion that KMC would be acting through the

inhibition of IL-7 dependent proliferation of B cell precursors. IL-7 signaling pathway involves the

recruitement of Janus kinases JAK1 and JAK3 and the subsequent phosphorylation of the transcription

factors STAT5 [11]. An early action of KMC on IL-7 signaling may result in a reduction of cytoplasmatic

levels of phosphorylated STAT5; that point was not investigated here. It is interesting to note that IL-2

signaling also leads to phosphorylation of STAT5 [12], but IL-2 response was not inhibited (fig 4); it is

possible that KMC may target a late event on the IL-7 signaling pathway.

The data presented here is the first description of a plant derived product, Kalanchosine dimalate,

with a selective effect on B cell lymphopoiesis. Evidence was presented to support the notion the KMC

would be acting through the inhibition of IL-7 signaling, blocking the proliferation of B cell precursors.

To further re-inforce this hypothesis, it is interesting to add that T cell development was also inhibited in

KMC treated mice (manuscript in preparation). Besides its critical role in lymphopoiesis, IL-7 is also

involved in the physiology of mature lymphocytes and plays a role in the growth/survival of T cell

lymphomas and breast cancer [13-17], thus KMC could be a promising candidate as therapeutical agents

in immunoregulation or cancer. Specific studies on the toxicity of KMC to the organism have not yet been

conducted; however KMC is well tolerated by the animals, that kept signs of good health 30 days after

treatment, encouraging further study of this substance.

113

ACKNOWLEDGMENTS: This work was supported by the Brazilian Agencies: FAPERJ,

FINEP, FUJB, CNPq and CAPES. We are grateful to Zenildo B. Morais Filho (NPPN, Universidade

Federal do Rio de Janeiro) for technical support.

114

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117

FIGURE LEGENDS

Figure 1- Effect of KMC is selective for B cell lineage.

C57BL/10 mice received daily i.p. treatment with water or 160 mg/kg KMC for 4 days. On the fifth day,

bone marrow cells were analyzed by flow cytometry. Bone marrow cells were stained with mAbs to

identify the B220+ and Mac1+ cell lineages. Mock injected with water (A) and KMC-treated (B) mice.

Percentages of B220+ and Mac1+ cells are indicated in each quadrant. The figure shows a typical result

obtained from three different experiments with 3 to 5 animals per group.

118

Figure 2-

B cell precursors and immature B cells are preferentially diminished in mice treated with

KMC.

Bone marrow cells were obtained as described in Figure 1, stained with anti-IgM and anti-B220 mAbs and

analyzed by flow cytometry for the presence of different B cell lineage populations: proB and preB cells

(B220+IgM-), immature B cells (B220+IgM+) and mature B cells (B220high IgM+). In the plot, the

location of pro-B and pre-B cells are indicated as gate (1), immature B cells as gate (2) and mature B cells

as gate (3). Mice were mock injected with water (A) or with KMC (B). The data presented in the figure is

representative of three different experiments with 3 to 5 animals per group.

119

Figure 3- Interruption of the treament with KMC resulted in the progressive recovering of B cell

lymphopoiesis.

Groups of mice were injected i.p. daily with 160 mg/kg KMC for 4 consecutive days. Control group were

mock-injected with pyrogen free water. Single cell suspensions of bone marrow cells were prepared and

stained with anti-IgM and anti-B220 mAbs in days 3, 5

, 8

and 12

and analyzed for the presence of B cell

precursors (B220+IgM-) and immature B cells (B220+IgM+) by flow cytometry. The data show the

results from 3 different experiments with 3 to 5 mice per group.

120

Figure 4- KMC promotes the selective inhibition of IL-7 dependent proliferation.

(A): B220+IgM- bone marrow cells from naïve mice were cultured for 5 days with IL-7, washed and re-

cultivated for additional 72 h with IL-7, in absence or in the presence of increasing concentrations of

KMC (µg/ml); proliferation was measured by tritiaded-thymidine uptake; with IL-7, filled symbols;

without IL-7, open symbols; KMC alone has no effect (B): T cell blasts obtained from splenocytes

stimulated with Concanavalin-A for 72 h, were cultured for additional 2 days in complete medium

supplemented with alfa-methyl-mannoside (100 mg/ml) and recombinant IL-2 (20 U/ml), in absence or in

the presence of increasing concentrations of KMC (µg/ml); proliferation was measured by tritiaded-

thymidine uptake; with IL-2, filled symbols; without IL-2, open symbols; KMC alone has no effect (C):

Il-3 dependent FDCP-1 cell line was cultured for 72 hs in medium with 10% IL-3, in the presence of

increasing concentrations of KMC (µg/ml); proliferation was measured by tritiaded-thymidine uptake;

with IL-3, filled symbols; without IL-3, open symbols; KMC alone has no effect.

121

Figure 5- KMC does not inhibit in vitro maturation of B cell precursors.

B220+IgM-B cell precursors were cultured in vitro for 72 h, in the presence or absence of differents doses

of KMC. At the end of the culture, cells were stained with anti-IgM and anti-B220 mAbs and analyzed by

flow cytometry for the presence of different B cell lineage populations: proB and preB cells (B220+IgM-)

and immature B cells (B220+IgM+). In the plots, the location of IgM positive B cell is indicated with a

box. In (A), the plot shows the flow-cytometric profile of purified B220+IgM- bone marrow cells in the

beginning of the culture, day 0. Differentiation of B cell precursors at the end of the culture, 72 h, in the

absence of KMC (B) or in the presence of 100 µg/ml KMC (C).

122

Figure 6- KMC does not promotes death of B cells and B cell precursors.

B220+IgM-B cell precursors were cultured in vitro for 72 h, in the presence or absence of variable doses

of KMC. At the end of the culture the numbers of viable B220+ cells were counted by tryan blue

exclusion (A). Similar set of cultures was done in the presence of dexamethasone, which induced massive

mortality of B cell precursors (B); dexamethasone doses are expressed in molar, [M]; data shown are

representative from a total of three different experiments. In (C), the apoptosis of B cell precursors,

cultured in vitro for 24hs, was evaluated by flow-cytometry, measuring binding Annexin V to

phosphatidyl-serine.

123

TABLE 1

Total numbers of Mac-1+ myeloid lineage were little or not affected by the treatment with KMC.

C57BL/10 mice received daily i.p. treatment with 160mg/Kg of KMC for 4 days. On the fifth day, bone

marrow cells from KMC treated mice, or control animals mock injected with water only (CTR), were

analysed by flow cytometry. Bone marrow cells were stained with anti-Mac1 and anti-B220 mAbs. The

table shows the absolute numbers, million of cells/femur, of individual mice. Data is representative of four

different experiments, with three to five mice per group.

124

TABLE 2

Administration of KMC results in suppression of B cell lymphopoiesis.

C57BL/10 mice received daily i.p. treatment with 160mg/Kg KMC for 4 days. On the fifth day, bone

marrow cells from KMC treated mice or control animals mock injected with water only (CTR), were

analysed by flow cytometry. Bone marrow cells were stained with anti-IgM and anti-B220 mAbs and

analysed for the presence of different B cell lineage populations: proB and preB cells (B220+, IgM-) and

immature B cells (B220+, IgM+). The table shows the results of individual mice in three different

experiments, with three animals per group.

125

FIGURE 1

126

FIGURE 2

127

FIGURE 3

128

FIGURE 4

129

FIGURE 5

130

FIGURE 6

131

TABLE 1

132

TABLE 2

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