( PDF ) Estudos sobre atividades biológicas de Symphyopappus casarettoi Robinson (Asteraceae) : evidências preliminares quanto à presença de efeitos antitumoral, antimalárico e antioxidante

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

ESTUDOS SOBRE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE SYMPHYOPAPPUS

CASARETTOI ROBINSON (ASTERACEAE):

EVIDÊNCIAS PRELIMINARES QUANTO À PRESENÇA DE EFEITOS ANTITUMORAL,

ANTIMALÁRICO E ANTIOXIDANTE

MARA REGINA NETTO BENETTI

Orientador: Prof. Dr. Gilberto Schwartsmann

Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Bioquímica, como

requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Bioquímica.

Porto Alegre, janeiro de 2007.

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Há duas maneiras de viver sua vida: uma, como se nada fosse um milagre; outra, como se

tudo fosse um milagre.

Albert Einstein.

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À minha família.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Gilberto Schwartsmann, por ter sido meu orientador e oportunizado

participar de seu grupo de pesquisa. Também pelo exemplo de competência.

Às minhas colegas de laboratório e amigas, Andréa, Kátia, Luciana e Sandra que

muito me ajudaram não só com os experimentos, mas também com companheirismo e

disposição para conversar nos momentos difíceis.

Aos demais colegas do Centro de Pesquisas Clínicas (Ulbra), pela ajuda e

ensinamentos compartilhados.

Ao Prof. Sérgio Bordignon, por sua disposição e seu indispensável conhecimento

botânico.

Aos professores e funcionários da pós-graduação do Departamento de Bioquímica

da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pelos ensinamentos e pela formação

científica proporcionados.

Ao Prof. José Cláudio Fonseca Moreira, por sua amizade e conselhos, fundamentais

ao longo do desenvolvimento dessa tese e também pela oportunidade de realizar

experimentos em seu laboratório.

Ao Marcos e ao Alfeu, pela ajuda nos experimentos e em especial à Martina, pela

paciência, dedicação e por compartilhar ensinamentos.

À Prof. Adriana Coitinho, pelo incentivo e auxílio indispensáveis no último ano do

trabalho.

Ao Prof. Rafael Linden e demais equipe da Feevale, pela oportunidade e ajuda na

realização de experimentos.

Aos pesquisadores Dra. Antoniana Krettli, Dra. Tereza Santos e Dr. Paulo Bus, e

demais equipe da Fiocruz, pelo trabalho em colaboração científica.

Ao Prof. Afonso Barth e ao Serviço de Microbiologia do Hospital de Clínicas de

Porto Alegre, pela ajuda inestimável.

Ao Dr. Rein Bos, pela gentileza de doar a eupatoriopicrina, e pelo exemplo de

cooperação científica.

Ao CNPq, pelo apoio financeiro através da Bolsa de Doutorado.

Aos meus amigos, pela força e amizade que sempre precisei e a todas as pessoas

que de uma maneira ou de outra contribuíram para que eu pudesse realizar essa tese.

À minha sogra, meus cunhados e sobrinhas pela força e confiança e ao meu sogro,

que, por seu exemplo de luta, me estimulou na pesquisa de descoberta de novas drogas.

A toda a minha família, pelo apoio e pela compreensão da minha ausência nas

várias horas dedicadas ao estudo.

Ao meu pai, pelo apoio, interesse e orgulho demonstrados enquanto ainda pertencia

a esse mundo.

À minha mãe, por nunca ter medido esforços para que eu pudesse realizar todos os

meus sonhos e ser fonte de afeto, sabedoria e força. Também pelo apoio e paciência.

Ao meu marido André, com quem conversei, ri, chorei, compartilhei bons e maus

momentos ao longo dessa tese e sem o qual talvez não conseguisse chegar ao final.

Obrigada pelo carinho, compreensão e amor.

Ao grande presente que chegou durante esse caminho: meu filho João Pedro, pelo

sorriso, olhar e companhia que me proporcionam momentos felizes e inesquecíveis e à

minha filha Isabela que vivenciou comigo esses momentos finais e que já me traz inúmeras

alegrias mesmo ainda não tendo chegado a esse mundo.

Ao Criador, por todas as oportunidades recebidas e infinito Amor.

SUMÁRIO

RESUMO ........................................................................................................................... 08

ABSTRACT ....................................................................................................................... 09

APRESENTAÇÃO ............................................................................................................ 10

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 11

1.1. Biodiversidade ................................................................................................ 11

1.2. Fontes naturais de novos fármacos ............................................................... 11

1.2.1. Vegetais ............................................................................................. 14

1.2.1.1. Metabolismo secundário ................................................... 14

1.2.2. Desenvolvimento de fármacos ........................................................ 16

1.2.2.1. Aquisição de compostos pela etnofarmacologia ............. 18

1.2.2.2. Aquisição de compostos através da quimiossistemática..18

1.2.2.3. Aquisição de compostos através da pesquisa de avaliação

ecológica/racional ............................................................... 19

1.2.2.4. Principais etapas no desenvolvimento de novos fármacos

.............................................................................................. 20

1.2.2.4.1. Fármacos anticâncer ........................................ 22

1.2.2.4.2. Fármacos antimicrobianos e antiparasitários 24

1.2.2.4.3. Fármacos antioxidantes ................................... 26

1.3.Asteraceae (Compositae) ................................................................................ 27

1.3.1. Distribuição e características ....................................................... 27

1.3.2. Espécies e utilização ...................................................................... 28

1.3.3. Symphyopappus casarettoi ............................................................... 29

2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 31

3. ARTIGO 1 ................................................................................................................. 32

4. ARTIGO 2 ................................................................................................................. 55

5. ARTIGO 3 ................................................................................................................. 69

6. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 78

7. CONCLUSÕES E COMENTÁRIOS FINAIS ...................................................... 89

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 92

9. ANEXOS ................................................................................................................. 106

9.1. Lista de Figuras ............................................................................................... 106

9.2. Lista de Tabelas ............................................................................................... 107

RESUMO

Plantas da família Asteraceae de diversos gêneros têm demonstrado relevantes

propriedades biológicas. O gênero Eupatorium tem sido estudado em todo o mundo e

muitos compostos biologicamente ativos já foram isolados de espécies desse gênero. Entre

as atividades biológicas descritas para extratos ou compostos desse gênero, merecem

destaque as relacionadas à proliferação celular: citotóxica, citostática, antitumoral e

antileucêmica. Destacam-se também a atividade antibacteriana, antifúngica, antimalárica e

antioxidante. Esse trabalho teve por objetivo verificar a presença de atividade biológica em

extratos brutos e semi-purificados de Symphyopappus casarettoi Robinson (sin.

Eupatorium casarettoi (B.L. Rob) Steyerm), uma planta nativa do Sul do Brasil e cujas

propriedades biológicas e compostos químicos nunca haviam sido pesquisados. O extrato

etanólico de inflorescências de S. casarettoi demonstrou atividade antiproliferativa

significativa em cinco linhagens celulares derivadas de tumores humanos. O fracionamento

com solventes de polaridade crescente sugeriu que tal atividade antiproliferativa ocorreu

devido a compostos presentes na fração clorofórmica. Desta forma, preparou-se uma fração

enriquecida de lactonas sesquiterpênicas, a qual demonstrou atividade antiproliferativa com

doses mais baixas. Três de quatro manchas cromatográficas obtidas a partir dessa fração

foram consideradas ativas, com valores de IC

entre 24.33±3.65 to 1.87±0.32 µg/ml nas

cinco linhagens tumorais e em fibroblastos humanos normais. Adicionalmente, não foi

observada atividade antiproliferativa em linfócitos humanos. A análise por citometria de

fluxo da mancha de cromatografia C2, sugeriu um mecanismo de ação diferente entre os

tipos celulares testados. Não foram observadas atividades antibacteriana e antifúngica nos

testes com o extrato etanólico de S. casarettoi. Atividade antimalárica foi observada in vitro

contra Plasmodium falciparum e in vivo, com a dose de 250 mg/kg em camundongos

infectados com P. berghei. A fração clorofórmica foi a que demonstrou melhor atividade e

a hexânica demonstrou uma fraca atividade. Adicionalmente, a fração metanólica de S.

casarettoi demonstrou um potencial antioxidante maior, quando comparado às outras

frações em ensaios in vitro. Já nos testes ex vivo, tanto a fração metanólica, quanto o extrato

etanólico atenuaram a morte celular e protegeram contra dano lipídico induzido por ferro.

Embora haja a necessidade de estudos adicionais com o intuito de isolar e identificar os

compostos bioativos, podemos sugerir que substâncias pertencentes ao grupo das lactonas

sesquiterpênicas sejam responsáveis pelas atividades antiproliferativa e antimalárica, e que

compostos fenólicos respondam pelas atividades antioxidantes observadas, como descrito

previamente para outras espécies do gênero Eupatorium.

ABSTRACT

Species of the Asteraceae family of many genera have demonstrated a wide array of

biological properties. The Eupatorium genus has been studied worldwide and a

considerable number of bioactive natural products have been isolated from species of this

genus. Among the biological activities reported, special attention was given to the

inhibition of cell proliferation, including cytotoxicity, cytostasis and antitumor effects. In

addition, antibacterial, antifungal, antimalarial and antioxidant activities have also been

described. The aim of this work is to study for the first time the biological properties of

crude and partially purified extracts of Symphyopappus casarettoi Robinson (syn.

Eupatorium casarettoi (B.L. Rob) Steyerm), a plant native to South Brazil. Notably, the

inflorescence ethanolic extract of S. casarettoi showed significant inhibitory activity

against five cell lines derived from human tumors. Fractionation with solvents in increasing

polarity demonstrated that the antiproliferative activity was due compounds found in

chloroformic fraction. This last fraction was separated to get the enriched sesquiterpene

lactones fraction, which inhibited cell proliferation with lower dosage. Three of four

chromatographic spots from sesquiterpene enriched fraction were considered active with

values ranging from 24.33±3.65 to 1.87±0.32 µg/ml in five human cancer cell lines

tested and normal human fibroblasts. Additionally, no cytotoxic activity was found in

human lymphocytes. The flow cytometry analysis of C2 chromatographic spot suggested a

different mechanism of action of the active compound. We did not observe antibacterial

and antifungal activities in the ethanolic extract of S. casarettoi. Antimalarial activity was

observed in vitro against Plasmodium falciparum and in vivo, at 250 mg/kg in mice

infected with P. berghei. The chloroformic fraction again was the most active one and the

hexanic fraction had a weak activity. In addition, methanolic fraction showed a higher

antioxidant potential compared to the other fractions in the in vitro assays. In the ex vivo

tests, the ethanolic extract and the methanolic fraction attenuated cell death and effectively

protected against lipid damage induced by iron. Despite the needs of additional studies to

isolate and identify the bioactive compounds, we suggest that substances of the lactone

sesquiterpenic class are probably responsible for the antiproliferative and antimalarial

activities, while phenolic compounds are responding for the antioxidant activities. These

biological properties should be further evaluated.

APRESENTAÇÃO

Esta tese está organizada da seguinte maneira: Introdução, Objetivos, Artigos

Científicos publicados, submetidos ou a submeter, Discussão, Conclusões, e Referências

Bibliográficas. Na Introdução está o embasamento teórico desse trabalho. Os Materiais e

Métodos e Resultados, assim como as Referências Bibliográficas específicas, encontram-se

em cada artigo. A Discussão contém uma interpretação geral dos resultados obtidos nos

diferentes trabalhos. A seção Conclusões aborda as conclusões gerais da tese. A seção

Referências Bibliográficas lista as referências citadas na Introdução e Discussão da tese.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Biodiversidade

Os ambientes mais ricos em termos de quantidades de espécies parecem ser as

florestas tropicais, os recifes de corais, os grandes lagos tropicais e as profundezas do mar

(Primack e Rodrigues, 2001; Schwartsmann et al., 2001).

A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão, tal a sua

complexidade, estimando-se a existência de mais de dois milhões de espécies distintas de

plantas, animais e microorganismos. Atualmente, aproximadamente 248.500 espécies de

plantas foram descritas, mas muitas certamente ainda aguardam a descoberta científica. O

Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com mais de 55

000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350 000 e 550 000. As oportunidades

para a identificação de produtos com possível utilização médica aumentam com a

diversidade das espécies (Nodari e Guerra, 1999, Mans et al., 2000).

A biodiversidade inclui diversidade genética, crucial para a resposta evolutiva,

sendo de fundamental importância entre e dentro das espécies (Ricklefs, 2003).

Conseqüência da diversidade genética é a diversidade de moléculas presentes nos

organismos. Muitas vezes, mesmas espécies ocorrendo em localizações geográficas

distintas podem apresentar substâncias diferentes. Determinadas classes de compostos

apresentam grande variação entre espécies de um mesmo gênero.

1.2. Fontes naturais de novos fármacos

Ao longo dos anos, a humanidade recorreu à natureza para satisfazer necessidades

tais como alimentação, vestuário, utensílios, transportes, fertilizantes, sabores e fragrâncias

e remédios. Plantas são utilizadas há centenas de anos por diversas culturas nos cuidados

com a saúde (da Rocha et al., 2001; Schwartsmann G, 2001; Ferraz et al., 2005).

Os produtos naturais têm provado consistentemente seu valor como fonte de

diversidade química para o desenvolvimento de novos fármacos (Cragg et al., 1997;

Harvey et al., 1998; Dolle e Nelson, 1999; Jones et al., 2006). Essa mudança no rumo da

aquisição de fármacos é devida à compreensão de que a natureza, quando comparada com

as técnicas de química combinatória, fornece compostos candidatos que têm propriedades

melhores (em termos de absorção e metabolismo) e maior diversidade química (levando a

estudos de estrutura-atividade) (Harvey, 1999). Quando identificados, esses compostos

podem ser otimizados pela química combinatória ou, em países economicamente menos

privilegiados, pela química clínica tradicional.

Atualmente, os produtos naturais desempenham um papel altamente significativo

nos processos de descoberta e desenvolvimento de novos fármacos. Isso é particularmente

evidente nas áreas de câncer e doenças infecciosas, onde mais de 60% e 75% desses

fármacos, respectivamente, são de origem natural (Schwartsmann e Workman, 1992;

Schwartsmann et al., 2002; Newman et al., 2003). Segundo Newman et al., 2003, de 1981 a

2002 tem aumentado a utilidade de produtos naturais como fontes de novas estruturas, mas

não necessariamente da droga final. Das 868 novas entidades químicas aprovadas por

agências reguladoras (como por exemplo, a Food and Drug Administration) durante esse

período, 471 são proteínas ou peptídeos grandes isolados de organismos ou linhagens

celulares, produtos naturais, derivados de produtos naturais com modificação semi-

sintética, sintéticas com farmacóforo derivado de um produto natural ou produtos naturais

mimetizados.

Reconhecidamente, as estratégias de desenvolvimento baseadas em compostos

candidatos derivados da natureza, podem apresentar um número considerável de obstáculos

que não acontecem pela síntese racional. Tais problemas podem ser: inacessibilidade aos

locais de coleta, lento desenvolvimento e alto custo para chegar aos componentes ativos

devido às dificuldades no isolamento e produção do ingrediente farmacologicamente ativo

e disputas sérias entre governos no que diz respeito à propriedade intelectual. Mesmo

assim, o “screening” de produtos naturais parece ter maior probabilidade de sucesso se

comparado ao “screening” de compostos racionalmente escolhidos.

É preciso expandir o estudo da natureza como fonte de agentes ativos novos que

podem servir como modelos ou “esqueletos” para elaborar fármacos eficazes, muito

necessárias nos dias atuais, para uma variedade de doenças (Newman et al., 2000). O

Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da maior floresta

equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua vocação para os produtos

naturais (Pinto et al., 2002). Desde o início de sua colonização essa importância já fora

percebida, quando médicos portugueses voltaram-se para os remédios indígenas, devido à

escassez, na colônia, de remédios empregados na Europa. A partir de 1808, começaram a

chegar ao país as primeiras expedições científicas, cujo principal objetivo era dar

conhecimento aos europeus da exuberância da nossa fauna e flora. De lá para cá, muito se

avançou na pesquisa de produtos naturais brasileiros, mas diante da grande biodiversidade

de nosso país, pode-se dizer que estamos ainda no início.

1.2.1. Vegetais

A partir de agora a ênfase será dada aos vegetais como candidatos à descoberta de

novos fármacos, uma vez que o alvo dessa pesquisa foi uma espécie vegetal e, dentre os

diversos reinos da natureza, o vegetal é o que tem contribuído de forma mais significativa

para o fornecimento de moléculas orgânicas (Pinto et al., 2002).

A percepção da natureza como uma coleção de animais que se movem em um fundo

verde de plantas é uma má interpretação da complexidade e da dinâmica da vegetação. As

plantas realizam todas as funções vitais que um leigo pode, superficialmente, atribuir só a

animais, incluindo comunicação e defesa (da Rocha et al., 2001; Ferraz et al., 2005). Com

esse objetivo, fazem uso de mecanismos sinalizadores sofisticados, tais como ferormônios e

um arsenal químico composto por diversas substâncias.

1.2.1.1. Metabolismo secundário

Os produtos químicos produzidos pelos vegetais podem ser divididos em dois

grandes grupos. Os primeiros, essenciais a todos os seres vivos, são os metabólitos

primários ou macromoléculas, tais como carboidratos, lipídios, proteínas, clorofila e ácidos

nucléicos. Os produtos do metabolismo primário, através de rotas biossintéticas diversas e

freqüentemente desconhecidas, originam o segundo grupo de compostos químicos – os

metabólitos secundários ou micromoléculas, que ao contrário daqueles do metabolismo

primário, são encontrados em concentrações relativamente baixas e em determinados

grupos de plantas (von Poser e Mentz, 1999).

No passado, alguns autores lançaram a hipótese de que os metabólitos secundários

nada mais eram do que subprodutos do metabolismo primário. Entretanto, o fato de o

vegetal utilizar rotas biossintéticas elaboradas, com elevados gastos de energia, conduz à

hipótese mais aceita atualmente de que os vegetais consomem essa energia para sintetizar

compostos necessários para a sua sobrevivência e preservação. Pesquisas têm demonstrado

o papel essencial desses metabólitos na ecofiosiologia das plantas, atuando na defesa contra

herbívoros e ataques de patógenos, na competição entre as plantas e como atrativo para

organismos benéficos como polinizadores ou simbiontes. Também agem como protetores

de estresses abióticos, como alterações na temperatura, quantidade de água, níveis de luz,

exposição à UV e nutrientes minerais. Além disso, estudos recentes indicaram papéis

potenciais em nível celular, como reguladores de crescimento, moduladores da expressão

gênica e transdução de sinal (Kaufman et al., 1999).

É provável que essa variedade de funções dos produtos secundários nas plantas

possa ter uma relação com os efeitos medicinais em humanos, devido à similaridade de

seus alvos potenciais. Por exemplo, produtos secundários envolvidos na defesa da planta

por citotoxicidade contra patógenos, poderiam ser úteis como antibióticos ou antitumorais

para humanos, se não forem muito tóxicos; ou produtos envolvidos na defesa contra

herbívoros por atividade neurotóxica, poderiam ser utilizados por humanos como

antidepressivos, sedativos, relaxantes musculares ou anestésicos (ação no sistema nervoso

central) (Briskin, 2000).

As combinações de produtos secundários nas plantas são distintas. Determinados

grupos de metabólitos são encontrados caracteristicamente em certas famílias de plantas,

conseqüentemente, seus efeitos medicinais também. Há também uma enorme variação no

esqueleto, estereoquímica, grupos funcionais e isomerismo posicional nas moléculas de um

mesmo grupo de compostos encontrado em espécies diferentes. Assim, a procura por novos

modelos de moléculas a partir de plantas constitui um amplo campo na descoberta de

fármacos para o tratamento de muitas doenças humanas.

1.2.2. Desenvolvimento de fármacos

Dos tempos antigos aos modernos, as plantas têm sido utilizadas como agentes

medicinais, primeiramente com base no conhecimento popular e posteriormente com base

científica (Lee, 2004). Atualmente, em torno de 80% da população mundial residente nos

países do terceiro mundo utiliza produtos de plantas no cuidado primário de sua saúde. Os

20% restantes, residentes do primeiro mundo, usam, em mais de 25% dos casos, produtos

farmacêuticos diretamente derivados de plantas (Farnsworth, 1984; Cox, 1994). Até o

século XIX, os recursos terapêuticos eram constituídos predominantemente por plantas e

extratos vegetais, o que pode ser ilustrado pelas Farmacopéias da época. Muitas das

espécies já citadas nos tempos antigos resistiram à ação do tempo e da crítica científica,

estando presentes em farmacopéias mais recentes (Schenkel et al., 1999). No início do

século passado, os recursos terapêuticos vegetais começaram a ser cientificamente

estudados e começaram os isolamentos de compostos ativos. As descobertas das

substâncias ativas presentes nas plantas medicinais alavancaram, junto com o início da

síntese orgânica, uma revolução científica e tecnológica, alterando muito rapidamente o

arsenal terapêutico. Por exemplo, em 1897 Kolbe sintetiza o ácido acetilsalisílico, inspirado

na salicina, tida como substância ativa de Salix alba L. Destaca-se também a importância

do desenvolvimento da farmacologia como ferramenta para desvendar mecanismos

fisiológicos. Em muitas situações, a descoberta da atividade de determinadas substâncias

não representou apenas o surgimento de um grupo novo de substâncias, mas originou a

identificação de uma nova possibilidade de intervenção terapêutica.

Após a década de 60 ocorreu um desinteresse em se continuar essa linha de

pesquisa. As razões desse desinteresse são muito mais comerciais do que científicas.

Atualmente, para a descoberta de novos fármacos, deseja-se uma filtragem rápida,

identificação acertada e desenvolvimento dirigido à identificação de compostos ativos, os

quais gerarão compostos-base, ou seja, os denominados em idioma inglês “lead

compounds”. Assim, programas de pesquisa tradicionais, baseados em testagem de

extratos, isolamento guiado por efeitos biológicos, elucidação estrutural e subseqüente

produção, ficam em desvantagem quando comparados a projetos que utilizam livrarias

químicas sintéticas definidas (Koehn e Carter, 2005).

Entretanto, o interesse foi renovado, pois, como já foi mencionado, as florestas

tropicais continuam oferecendo ótimas possibilidades para o descobrimento de novos

fármacos promissores e continuam sendo uma fonte de alta diversidade química,

especificidade bioquímica e outras propriedades moleculares que as colocam em vantagem

como moldes de estrutura para a descoberta de novos fármacos (Koehn e Carter, 2005).

Muitas instituições governamentais de pesquisa que atuam em grande escala e

laboratórios farmacêuticos industriais nos países mais desenvolvidos, freqüentemente

aplicam a aquisição ao acaso e testagem de vários extratos. Essas estratégias requerem a

avaliação de aproximadamente 20 000 compostos candidatos para obter uma droga

clinicamente útil (Cragg et al., 1997). Em nosso laboratório, utiliza-se a estratégia da

aquisição determinada de espécies de plantas pré-selecionadas. Assim, faz-se uso de

informações etnofarmacológicas, quimiossistemáticas e ecológicas (Schwartsmann et al.,

1988; Schwartsmann e Workman, 1992; Mans et al., 2000).

1.2.2.1. Aquisição de compostos pela etnofarmacologia

Freqüentemente argumenta-se que a cultura popular identifica sintomas, mas não

caracteriza ou entende as doenças como nós as caracterizamos e conclui-se, por isso, que

tais informações não servem de base para ajudar a desenvolver novos medicamentos. A

ausência de educação e cultura formais não é sinônimo de ausência de conhecimento; de

fato, somos todos ignorantes quanto a culturas que não conhecemos (Elisabetsky, 1999). Os

dados etnofarmacológicos são obtidos consultando curandeiros tradicionais e pelo acúmulo

de informações no uso de plantas da medicina popular, mas também da literatura na

medicina popular.

A vasta gama de informações sobre o uso de centenas de plantas como “remédios”

em todos os lugares do mundo, leva à necessidade de se desenvolver métodos que facilitem

a enorme tarefa de avaliar cientificamente o valor terapêutico de espécies vegetais

(Heinrich e Bremmer, 2006). Como a maior parte da flora ainda é desconhecida do ponto

de vista químico, a aquisição de compostos baseada nesse critério, muito provavelmente,

levará ao descobrimento de fármacos novos. A perda da biodiversidade e o acelerado

processo de mudança cultural acrescentam um senso de urgência em garantir o registro

desse saber, inclusive para uso científico (Elisabetsky, 1999).

1.2.2.2. Aquisição de compostos através da quimiossistemática

A quimiossistemática envolve o uso do conhecimento sobre a composição

fitoquímica de certas espécies, gêneros ou famílias, como indícios para avaliar espécies

relacionadas para a presença de substâncias estruturalmente comparáveis com um índice

terapêutico aperfeiçoado. Uma visão abrangente da quimiodiversidade da natureza vem de

encontro à expectativa de descobrimento de novas moléculas. Assim, um levantamento

bibliográfico sobre espécies para as quais fora atribuído algum uso medicinal em alguma

parte do mundo, pode direcionar os pesquisadores para o estudo de espécies relacionadas.

Mais uma vez o Brasil leva vantagem em termos de biodiversidade, uma vez que vários

vegetais são nativos e exclusivos de nosso país.

1.2.2.3. Aquisição de compostos através da pesquisa de avaliação ecológica/racional

Através dessa estratégia de aquisição, presume-se descobrir tanto novos compostos,

quanto análogos e é melhor explicada com um exemplo prático. A presença de uma única

espécie de planta livre de fungo, em uma grande área de vegetação densa, quase

completamente coberta de fungos significa que tal espécie pode produzir uma substância

fungicida, valendo à pena testar seu potencial frente a outras atividades biológicas. Assim,

essa proposta de aquisição de compostos utiliza a diversidade.

Uma das principais limitações até agora relacionadas com a questão das plantas

como fonte de novos fármacos é a alegada complexidade do processo de avaliação, pela

presença de misturas biológicas, de difícil caracterização. Entretanto, técnicas inovadoras e

novos processos de engenharia vêm superando rapidamente essas limitações (Nisbet e

Moore, 1997). No que diz respeito aos benefícios oriundos da pesquisa com plantas

medicinais, os novos fármacos podem melhorar a qualidade de vida em doenças crônicas

ou a própria sobrevivência do paciente. Socialmente, a descoberta de fontes naturais e

locais pode contribuir para a economia do país que usualmente importa compostos

químicos ou remédios, além de proporcionar autonomia para o gerenciamento das políticas

de saúde. O valor econômico do produto (não apenas o seu valor de mercado) pode estar

associado à geração de empregos e novas atividades econômicas, bem como à conservação

e preservação de plantas e ecossistemas. Além disso, tem-se o valor comercial, que pode

movimentar importantes volumes de capital.

1.2.2.4. Principais etapas no desenvolvimento de um novo fármaco

Na descoberta de fármacos, o produto desejado é um composto com propriedades

farmacológicas específicas (Tulp e Bohlin, 2002). Por isso, é crucial para qualquer

investigação com extratos de plantas para uma determinada atividade biológica, escolher

um sistema de testes que seja simples, rápido, reproduzível, sensível e não muito caro.

Quando decidido qual teste realizar, é necessário escolher organismos adequados, tais como

microorganismos, sistemas subcelulares isolados, cultura de células, órgãos isolados de

vertebrados ou animais inteiros (Hostettmann et al., 1997).

A descoberta de uma nova droga, guiada por processos biológicos, é um processo

interativo. Uma vez escolhido um vegetal candidato e delineado o experimento, a atividade

biológica desejada é testada. A seguir, é dado início ao processo de isolamento e

identificação do composto responsável por essa atividade. A cada progresso no isolamento,

um novo teste para a atividade biológica é realizado (fracionamento bioguiado). Seguindo a

fase pré-clínica, são realizados estudos toxicológicos in vivo, preparação de uma fórmula

com o composto para uso clínico, envolvendo testes de estabilidade da molécula bioativa e

a determinação de uma dose inicial segura para humanos.

Posteriormente, inicia-se a pesquisa clínica, dividida em quatro fases. Na fase I,

avalia-se a toxicidade, a dose-limite para a toxicidade, a dose máxima tolerada,

farmacocinética e a atividade biológica desejada. Na fase II, os principais focos de estudo

são o espectro e freqüência dos efeitos tóxicos, determinação objetiva da atividade

biológica, ajustes da droga e são obtidas informações adicionais do agente. Já na fase III, o

novo composto é comparado com a terapia usual e também é feita a observação de

toxicidade tardia. Finalmente, na fase IV é estabelecido o papel do novo composto para o

tratamento dos pacientes e a integração desse composto como primeiro tratamento para a

doença, além do estudo de toxicidades decorrentes de tratamento prolongado

(Schwartsmann et al., 1988).

Paralelamente, estudos ajudam a refinar a estrutura ativa inicial: relação estrutura-

atividade, mecanismos de ação (interações com os receptores e inibição de enzimas

específicas), metabolismo (identificação de metabólitos bioativos e bloqueio de inativação

metabólica), modelação molecular e química combinatória (Lee, 1999).

É evidente que o desenvolvimento de uma nova droga requer um grande

investimento de capital e recursos humano e tecnológico. Assim, uma nova droga é

desenvolvida em resposta à necessidade da humanidade, na medida em que os recursos

financeiros e tecnológicos permitam (Dickson e Gagnon, 2004). Do início ao final, esse

processo pode demorar de 12 a 24 anos (Lombardino e Lowe, 2004) e pode ser

interrompido em qualquer uma das fases, se a droga não preencher os objetivos propostos

do estudo. Dessa forma, o desenvolvimento de uma nova droga envolve muitos riscos e,

estima-se que a taxa de sucesso final é de 21,5% (DiMasi, 2003). Entretanto, é um processo

extremamente necessário, já que para muitas doenças crônicas e degenerativas ainda não

existe tratamento eficaz e para as agudas há a necessidade de renovação dos medicamentos.

1.2.2.4.1.Fármacos anticâncer

O câncer é um problema público em crescimento, cuja incidência de novos casos no

mundo é, aproximadamente, seis milhões de casos por ano (Srivastava et al., 2005),

constituindo a segunda maior causa de mortes em homens e mulheres, matando mais de

seis milhões de pessoas a cada ano no mundo (Kimura, 2005). Depois de cinco décadas de

desenvolvimento de novos fármacos e, de obter-se nesse período um número considerável

de fármacos quimioterápicos, ainda necessita-se agentes antineoplásicos mais efetivos. Os

tumores humanos adultos mais comuns são resistentes às fármacos antineoplásicos

disponíveis (Yarbro, 1992) e, a maioria desses agentes tem atividade limitada contra

tumores sólidos (Yarbro, 1992; Chabner, 1991) e pouco impacto nas taxas de sobrevida,

além de efeitos colaterais significativos (Nature Review, 2004).

Embora as plantas tenham sido usadas por mais de 3 500 anos no tratamento de

“câncer”, foi somente na década de 50 que se iniciou o estudo de extratos de plantas para

seu potencial antiproliferativo. Desde então, foram testados mais de 120 000 extratos de

mais de 6 000 gêneros de plantas, resultando no desenvolvimento de produtos naturais com

grande diversidade química como candidatos a agentes anticâncer. Dentre os compostos

anticâncer desenvolvidos a partir de plantas, podemos citar:

- Alcalóides da vinca

(vincristina e vinblastina)

Representam uma das mais antigas classes de agentes citotóxicos identificados e são

usados no tratamento de grande variedade de cânceres em humanos. Isolados no final da

década de 50 da planta Catharanthus roseus (Apocynaceae), possuem como mecanismo de

ação a inibição da polimerização de tubulina. Análogos desses alcalóides foram preparados

com o objetivo de aumentar a eficiência terapêutica e alguns deles, como vindesina e

vinorelbina são clinicamente utilizados (Budman, 1997).

- Podofilotoxinas

(etoposide e teniposide)

Possuem atividade terapêutica significativa contra vários neoplasmas humanos.

Foram isolados de Podophyllum peltatum e P. emodi (Berberidaceae) no início da década

de 50 e atuam inibindo a enzima topoisomerase II.

- Taxanos

(paclitaxel e docetaxel)

Os taxanos são uma classe importante de agentes anticâncer que exercem seus

efeitos por um mecanismo de ação único: promovem a estabilização da tubulina. Em 1963,

um extrato bruto de Taxus brevifolia (Taxaceae) foi avaliado para atividade citotóxica. O

paclitaxel foi identificado como o constituinte ativo em 1971 (Rowinsky e Donehower,

1995). Como a pouca abundância na planta do paclitaxel foi um dos problemas enfrentados

no desenvolvimento dessa droga, vários estudos foram feitos até ser descoberto outro

composto parecido e mais abundante (a 10-acetil-bacatina III), que foi utilizado como

matéria-prima para a síntese do paclitaxel. Através da mesma rota sintética foi obtido o

docetaxel.

- Camptotecina (irinotecan, topotecan, 9-aminocamptotecina, 9-

nitrocamptotecina)

As camptotecinas são uma classe de agentes antineoplásicos que têm como alvo a

enzima topoisomerase I. O primeiro composto dessa classe (camptotecina) foi isolado em

1966 de Camptotheca acuminata (Nyssaceae). Devido à forte toxicidade, foram

desenvolvidos inúmeros análogos dessa substância. Irinotecan e topotecan são os agentes

mais utilizados no tratamento do câncer humano.

Outros agentes derivados de plantas que estão em fase experimental, em aprovação

ou já sendo utilizados clinicamente são flavopiridol, homoharringtonina, 4-ipomeanol,

elliptinium, dentre outros (Mans et al., 2000; Lee, 2004).

1.2.2.4.2. Fármacos antimicrobianos e antiparasitários

Fungos, bactérias e outros microorganismos causam importantes doenças humanas,

especialmente em regiões tropicais e em pacientes com o sistema imune comprometido ou

deficiente. Embora existam fármacos potentes contra os microorganismos, linhagens

resistentes ou multi-resistentes estão continuamente surgindo, impondo a necessidade de

continuamente pesquisar e desenvolver novos fármacos (Silver e Bostian, 1993).

Recentemente, novas classes de fármacos antimicrobianos foram colocadas na prática

clínica. Entretanto, a experiência até então vivida do surgimento e expansão rápidos da

resistência aos novos antibióticos, indicam que essas novas classes terão um curto período

de vida (Coates et al., 2002).

A medicina tradicional está aumentando sua receptividade para o uso de fármacos

derivados de plantas, sejam antimicrobianas ou com outras atividades biológicas, uma vez

que os antibióticos tradicionais (produtos de microorganismos ou seus derivados sintéticos)

tornam-se ineficientes e algumas doenças continuam sem tratamento (Cowan, 1999). Outro

fator que renovou o interesse em antimicrobianos de plantas nos últimos 20 anos, foi a alta

taxa de extinção, pois inúmeras estruturas fitoquímicas potencialmente utilizáveis e que

poderiam ser quimicamente sintetizadas, podem ser irreversivelmente perdidas (Lewis et

al., 1995).

Durante os últimos anos, houve um acréscimo na incidência de infecções por fungos

devido ao crescimento do número de pacientes imunocomprometidos, tais como receptores

de órgãos transplantados, portadores de câncer ou HIV/AIDS (García et al., 2003).

Também ocorre a resistência a antibióticos e a toxicidade durante o tratamento prolongado,

além de haver poucos compostos em uso clínico para o tratamento desse tipo de infecção.

Desde o final da década de 70, muitos trabalhos foram feitos, mas os problemas continuam

devido à grande especificidade no sistema de transporte de peptídeos desses organismos.

Atualmente, os principais grupos de compostos antimicrobianos isolados de plantas

são fenóis e polifenóis (quinonas, flavonas, flavonóides, flavonóis, taninos e cumarinas),

terpenóides, incluindo óleos essenciais, alcalóides, lectinas e polipetídeos, poliaminas,

isotiocianatos, tiosulfinatos e glicosídeos (Cowan, 1999).

Os protozoários causam inúmeras doenças no ser humano. A malária, causada pelo

Plasmodium, é uma das mais importantes infecções parasitárias devido à alta morbidade e

mortalidade (Andrade-Neto et al., 2004a), afetando mais de 500 milhões de pessoas por ano

e matando 2,7 milhões delas (Go, 2003), predominantemente nos países tropicais. Os

fármacos usados atualmente para tratar a malária são derivados de quinolina, modelados a

partir da molécula quinina encontrada nas espécies do gênero Cinchona (Rubiaceae). A

cloroquina (também inspirada na quinina) aproximou-se de ser a droga ideal para tratar

malária durante décadas, devido a sua grande eficiência, baixo custo, alta tolerância e baixa

toxicidade. Ainda hoje é utilizada em áreas onde os parasitas não adquiriram resistência

(Krettli et al., 2001). Entre os compostos antimaláricos modernos isolados de plantas,

podem ser citados alcalóides, xantonas e chalconas (precursores dos flavonóides). Merece

atenção especial a artemisinina (lactona sesquiterpênica), isolada de Artemisia annua L

(Asteraceae) primeiramente em 1972, que proporciona bons efeitos terapêuticos e melhora

ou cura todos os pacientes, além de não ter efeitos colaterais óbvios (Modzelewska et al.,

2005).

1.2.2.4.3. Fármacos antioxidantes

A literatura relata abundantemente estudos sugerindo que radicais livres e outras

espécies reativas estão envolvidas em diversas doenças humanas. Participam em mais de

100 enfermidades, variando desde artrite reumatóide e choque hemorrágico, passando por

cardiomiopatias e fibrose cística, até isquemia gastrintestinal, diabetes, AIDS, câncer e

também outras doenças que envolvem processo inflamatório. Isso se deve ao fato de que

danos aos tecidos corporais levam a estresse oxidativo (Halliwel e Gutteridge, 1999).

Algumas doenças podem ser causadas por estresse oxidativo. Entretanto, na maioria delas,

esse estresse é uma conseqüência e não uma causa do processo primário da doença. Apesar

disso, desempenha um papel importante nas doenças humanas. A grande descoberta do

futuro é desenvolver antioxidantes terapêuticos efetivos, demonstrar seus benefícios para

pacientes e provar que estão agindo por um mecanismo antioxidante (Halliwel e

Gutteridge, 1999).

Atualmente, o papel dos antioxidantes é considerado mais preventivo do que

terapêutico, através da ingestão principalmente de vegetais pela dieta. Mas vem crescendo o

interesse na utilização dessas substâncias com o intuito de tratar doenças. Isso pode

envolver o uso de antioxidantes que ocorrem naturalmente (com ou sem adaptações

estruturais), ou moléculas completamente sintéticas. Além disso, há evidências que alguns

fármacos já utilizados clinicamente podem exercer parte ou todo o seu efeito por

mecanismos antioxidantes, tais como penicilamina, aminosaliciatos, apomorfina,

tetraciclinas, omeprazol, cetoconazol entre outras (Van Zyl et al., 1993).

1.3. Asteraceae

1.3.1. Distribuição e características

Família natural e cosmopolita, muito grande, formada por cerca de 1 100 gêneros e

mais de 24 000 espécies, dos quais 191 gêneros foram identificados no Brasil (Barroso et

al., 1991). Aproximadamente 600 espécies são encontradas no Rio Grande do Sul

(comunicação pessoal, C. Mondin, 2001). Encontram-se representantes em todas as zonas

do globo, podendo ser encontradas em todas as formações (lugares úmidos, secos,

sombreados, ensolarados, em selvas, montes e campos, em solos normais, arenosos,

salitrosos ou humíferos). A maioria das espécies é composta por ervas anuais ou perenes;

somente nas zonas tropicais e subtropicais chegam a formar arbustos e até árvores e, mais

raramente, trepadeiras (Burkart et al., 1974).

Relativo à filogenia e paleobotânica, por razões de morfologia comparada, os

pesquisadores têm chego quase unanimemente à conclusão de que a família das Asteraceae

é altamente evoluída e representa um desenvolvimento máximo, um clímax evolutivo até

hoje não superado das Dicotiledôneas metaclamídeas. Sua homogeneidade fundamental faz

supor uma origem monofilética e recente, de desenvolvimento explosivo. No registro fóssil

essa família quase não está representada. É certo que a identificação fóssil, geralmente a

base de rochas, é difícil porque as plantas dessa família, de certo modo, repetem a variação

foliar de outras famílias de latifoliadas. De qualquer modo, a falta ou escassez de

fossilizações atribuíveis a asteráceas, pode ser interpretada como prova do caráter recente,

ou seja, a juventude dessa família, sempre considerada em termos de idades geológicas.

Segundo os conhecimentos atuais, a evolução dessas plantas se produziu no curso da era

Terciária e na atual, é dizer, em menos de 50 milhões de anos. Sua evolução parece ter sido

rápida e sua difusão notavelmente de êxitos. Possui gêneros com elevada capacidade de

adaptação para colonizar altas montanhas, regiões áridas ou terras desmatadas pelo cultivo.

Parece que segue evoluindo na atualidade pela facilidade com que se observam mutações,

hibridizações, trocas cromossômicas, etc (Burkart et al., 1974).

1.3.2. Espécies e utilização

No que diz respeito à importância econômica pode-se levar em conta o número de

espécies úteis e também as daninhas (invasoras, tóxicas ou espinhosas). Plantas da família

Asteraceae são comumente utilizadas na medicina popular em todo o mundo, com mais de

1000 espécies registradas em databases etnomedicinais (Monks et al., 2002). O girassol

(Helianthus annuus L.) e o falso-açafrão (Carthamus tinctorius L.) são oleaginosos de

grande cultivo. Muitas Asteraceae são hortaliças apreciadas, como a alface (Lactuca sativa

L.), a chicória (Cichorium intybus L.), a salsa (Tragopogon porrifolius L.), a alcachofra

(Cynara scolymus L.), etc. As espécies medicinais, inseticidas e aromáticas são numerosas,

como a camomila (Matricaria chamomilla L.), o piretro (Chrysanthemum cinerariaefolium

Vis.), o absinto (Artemisia absinthium L.), a marcela (Achyrocline satureioides), etc. Por

outro lado, há muitas Asteraceae prejudiciais por invasão. São conhecidos os cardos

(Carduus, Cynara, Cirsium, Centaurea, Silybum div. Espécies), o abrolho (Xanthium

cavanillesii Schouv.), que invadem os campos e deslocam os pastos úteis, competindo com

as plantas cultivadas (Burkart et al., 1974).

1.3.3. Symphyopappus casarettoi (syn. Eupatorium casarettoi)

Essa planta constitui-se de um arbusto de 1-2 metros de altura, ramoso, e tem por

nomes vulgares eupatório-de-casaretto, vassoura-do-campo, vassoura bichada (Cabrera e

Klein, 1989). É característico e exclusivo do litoral do Sul do Brasil, estendendo-se desde

Paranaguá (PR), através de Santa Catarina até o Rio Grande do Sul, pela “Porta de Torres”,

chegando até Osório, onde possivelmente se encontra seu limite austral (Cabrera e Klein,

1989). É uma espécie heliófita e seletiva xerófita, muito abundante na vegetação litorânea,

situada sobre solos arenosos enxutos, onde, por vezes, forma extensos e densos

agrupamentos quase puros. Ocorre também de permeio à vegetação arbustiva da restinga

em campos litorâneos. Como espécie rara e estranha é encontrada em capoeiras de encostas

(Cabrera e Klein, 1989). O nome do gênero, descrito por Turczaninow (1848) é em

referência ao papus que é fortemente fundido ao calo e cai como uma unidade com o

último, na maioria das espécies. Sua inflorescência é formada por cinco flores, que podem

variar entre as tonalidades branca, rosa ou lilás. Floresce desde setembro até março sendo

janeiro e fevereiro o período predominante (Matzembacher, 1979).

Há controvérsia a respeito do gênero ao qual essa planta pertence: se Eupatorium,

ou se Symphyopappus. O gênero tem sido mantido como distinto durante a maioria dos 130

anos desde sua descrição. Foi reconhecido por Bentham and Hooker (1873) e B. Robinson

incluiu novas espécies. Na chave de B. Robinson para gêneros (1913), Symphyopappus é

distinguido pelo pappus com pelos ásperos, unidos em um anel espesso na base e pelas

folhas serem coriáceas. O gênero foi reduzido como sinônimo de Eupatorium por

Steyermark em 1953, e foi tratado como parte desse gênero por Cabrera e Vittet (1963). No

retrospecto, B. Robinson estava correto em manter o gênero, mas reconhecidamente, as

características dadas por ele não foram inteiramente fidedignas, e não há caminho para

separar adequadamente Symphyopappus de Eupatorium conforme ele exprimiu (King e

Robinson, 1987). O gênero Symphyopappus parece ser restrito ao Brasil, e tem 11 espécies

reconhecidas. Além de S. casarettoi, também podem ser encontradas no Rio Grande do Sul

S. reticulatus (= Eupatorium reitzii), S. lymansmithii (= E. lymansmithii) e S. compressum

(= E. compressum = S. polystachyus) (Matzembacher, 1979; King e Robinson, 1987).

Essa planta foi escolhida para estudo nessa tese com base em informações

quimiossistemáticas sobre espécies do gênero Eupatorium e da família Asteraceae, de um

modo geral. Também foram testados extratos orgânicos e aquosos de outras partes de S.

casarettoi (folhas e galhos), mas foi escolhido o extrato orgânico de inflorescências devido

ao seu melhor desempenho em testes realizados no Instituto do Câncer dos Estados Unidos.

2. OBJETIVOS

Objetivo Geral

Verificar a ocorrência de atividades biológicas em extratos de inflorescência de

Symphyopappus casarettoi (sin. Eupatorium casarettoi) (Asteraceae).

Objetivos Específicos

1- Investigar atividade citotóxica em modelo in vitro de linhagens tumorais.

2- Investigar atividades antibacteriana e antifúngica em modelos in vitro de cepas

de bactéria e fungo.

3- Investigar atividade antimalárica em modelos in vitro e in vivo.

4- Investigar atividade antioxidante em modelos in vitro e ex vivo.

ARTIGO 1

In vitro antiproliferative activity of extracts from Symphyopappus casarettoi

Robinson (Asteraceae).

(Submetido à Phytomedicine).

In vitro antiproliferative activity of extracts from Symphyopappus

casarettoi Robinson (Asteraceae).

Mara Regina Netto Benetti

, Kátia Regina Bica Machado

, Luciana Sperb Tonding

, Aline

Fossá

, Ivana Grivicich

, Sérgio Augusto Loreto Bordignon

, Rafael Linden

and Gilberto

Schwartsmann

a,c

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.

Universidade Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brazil.

South-American Office for Anticancer Drug Development (SOAD), Hospital de Clínicas

de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil.

Centro Universitário Feevale, Novo Hamburgo, RS, Brazil.

*Corresponding author:

Mara Regina Netto Benetti

South American Office for Anti-Cancer Drug Development (SOAD)

Hospital de Clínicas de Porto Alegre, sala 399

R. Ramiro Barcelos, 2350

Porto Alegre, RS, Brazil

90035-007

Telephone/Fax: 55-51-2101-8012

E-mail: marare@ig.com.br and f[email protected]frgs.br

Summary

In the present study we have investigated the in vitro antiproliferative activity of

crude and partially purified extracts from Symphyopappus casarettoi Robinson (syn:

Eupatorium casarettoi (B.L. Rob) Steyerm) (Asteraceae) native from South Brazil against

five human tumor cell lines, lymphocytes and fibroblasts. The ethanolic extract showed

significant inhibitory activity. Fractionation with solvents in increasing polarity

demonstrated antiproliferative activity in chloroformic fraction. Three of four TLC spots

from sesquiterpene enriched fraction were considered active with IC

values ranging from

24.33±3.65 to 1.87±0.32 µg/ml on five human cancer cell lines tested and normal human

fibroblasts. No cytotoxic activity was found on lymphocytes. The flow cytometry analysis

suggested a different mechanism of action of the active compound among the cell lines

tested. Further studies to characterize the active components of these extracts and to better

define its therapeutic potential in tumor models are warranted.

Keywords: Symphyopappus; Eupatorium; anticancer; natural products, extracts.

1. Introduction

Throughout history, a variety of plants or plant-derived materials have been used for

the prevention and treatment of several diseases in virtually all cultures (Matthews et al.,

1999). Plants have also formed the basis of sophisticated traditional medicine systems

(Cragg et al., 1999; Schwartsmann et al., 2002). Over the last five decades, a systematic

approach to drug discovery and development has led to the identification of a significant

number of active agents for the management of human cancer, which were derived from

terrestrial and marine natural sources (Jessup et al., 1996; Schwartsmann et al., 2001; da

Rocha et al., 2001). As the need for more effective antineoplastic agents remains, nature

continues to be a very rich source of anticancer compounds (Mans et al., 2000).

Asteraceae is a large family comprising millions species. The genus

Symphyopappus belongs to the Eupatorieae and over ten species are listed, all appearing to

be restricted in Brazil (King and Robinson, 1987). Symphyopappus casarettoi is synonym

of Eupatorium casarettoi, and it is native to South Brazil. The two genera are very similar

and there is controversy about which genus this plant belongs on the basis of morphological

and anatomical data. A molecular study to clarify this matter is warranted.

Various species of the Asteraceae have been used in folk medicine in different parts

of the world. Eupatorium spp are used against several diseases and are know to contain a

considerable number of bioactive natural products. This genus seems to be a promising

bioresource for lead to new drugs and value-added products (Sharma et al., 1998). Species

that belong to this genus have shown to posses cytotoxicity and antitumor (Herz et al.,

1981; Woerdenbag et al.,1987; Woerdenbag,1989; Rucker et al., 2001; Yang et al., 2004),

antibacterial (Habtemariam and Macpherson, 2000; El-Seedi et al., 2002), antifungal

(Gupta et al., 2002.) antiinflammatory and antioxidant (de las Heras et al., 1998), ant-

repellent (Okunade and Wiemer, 1985), antiplasmodial (Lang et al., 2002) activities.

The purpose of this study was to evaluate the antiproliferative activity of crude and

partially purified extracts of Symphyopappus casarettoi Robinson (syn: Eupatorium

casarettoi (B.L. Rob) (Steyerm) against a series of human tumor cell lines, fibroblasts and

lymphocytes.

2. Materials and Methods

2.1.Plant material

Symphyopappus casarettoi was collected in the Estrada do Mar, Arroio do Sal – RS,

Brazil. A voucher specimens (Bordignon et al., 2396) was identified by Dr. S. Bordignon,

Universidade Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brazil and has been deposited in the

Herbarium of the same university.

2.2. Extract preparation

The air dried and powdered inflorescence material was extracted with ethanol

(EtOH) 10x the weight in volume (yield:12.07%) by maceration. These organic extracts

were concentrated by rotary evaporation in a Quimis 219 equipment and stored at –20°C

until testing.

Subsequently, the crude extract was dissolved successively with hexane (C

)

(yield:19.60%), chloroform (CHCl

) (yield:43.40%) and methanol (MeOH)

(yield:32.60%). These fractions were also evaporated to dryness under reduced pressure at

45°C.

CHCl

fraction was partitioned with 25ml EtOH and 25ml lead acetate 10% to form

the enriched sesquiterpene lactones fraction (ESL) which was re-solubilizated with CHCl

and submitted to preparative TLC over silica gel 60 PF

254

(Merck). The plate was eluted

using the system hexane:CHCl

:MeOH (20:79:01). Chromatograms were visualized in UV

(254 and 365nm) and revelated Vanillin-sulphuric acid spray. Resulting spots were coded

as C

, C

and C

2.3. Phytochemical analysis

Phytochemical analysis was performed with dry and powdered inflorescences of S.

casarettoi as described previously (Costa, 2002).

2.4. HPLC analysis

Ten mg of ESL fraction was dilluted in 10 ml metanol and taken to perform HPLC

analysis. The HPLC system (Shimadzu) consisted of a pump (LC-10ATVP), a degasificator

(DGU-14A), a column oven (CTO-10ASVP), an autosampler (SIL10AF), a diode array

detector (SPDM10AVP) and a SCL-10AVP control module. Column was a Shim-Pack

C18, 15 x 4.6 mm, 5 µm particle size. Mobile phase used for isocratic elution was

acetonitrile: phosphate buffer pH 2.3 (63:37 v/v). Injection volume was 10µl at flow-rate of

1ml/min and 225 nm monitoring (sweeping 196 to 380 nm). The sample was analysed for

the presence of eupatoriopicrin and quercetin.

2.5. Cell line maintenance

The crude extracts as well as (partially) purified samples prepared from them were

evaluated for their cell growth-inhibiting potential at 100 µg/ml concentration, against two

cell lines: HT29 human colon carcinoma and NCI-H460 non-small cell lung carcinoma.

Subsequently, extracts were evaluated in the five human cell line panel, at five

concentrations (50, 25, 10, 5, 1 µg/ml) and the IC

value (concentration that inhibits 50%

of cell growth when compared to untreated controls) was determinate. The cell lines were:

HT29 human colon carcinoma, NCI-H460 non-small cell lung carcinoma, MCF-7 human

breast carcinoma, OVCAR-3 human ovarian carcinoma were obtained from the American

Type Culture Collection (Rockville; Maryland, USA) and RXF393 human kidney

carcinoma, was kindly supplied by Dr. G. Cragg from the National Cancer Institute (USA).

Further, spots resulted from TLC were evaluated in fibroblasts and lymphocytes

obtained from healthy donors. Fibroblasts were centrifuged from amniotic fluid and

lymphocytes were obtained by Ficoll-Hypaque centrifugation from anticoagulated venous

blood.

Cells were maintained in RPMI 1640 cell culture medium containing 10% (v/v)

fetal calf serum and 2% (w/v) L-glutamine, at a temperature of 37°C and in a humidified

atmosphere of 5% CO

in air. Fibroblasts were maintained in Amniomax (Gibco) medium

at the same conditions.

2.6. Cell growth inhibition studies

Thus, cancer cell were inoculated into the wells of microtiter plates and incubated

for 72 h in the presence of extract. Extracts were dissolved in dimethilsulfoxide (DMSO)

and further diluted with cell culture medium (final DMSO concentration of 0.25%, v/v)

before inoculation. At the end of the incubation period, cells were fixed in situ with

trichloroacetic acid (TCA) 50%, stained with sulforhodamine B (SRB) and assessed by

means of a colorimeter (ELISA microplate reader, 515 nm) for their cell growth-inhibiting

capacity (Monks et al., 2002).

Compounds were considered to have potent growth inhibitory activity when the

reduction in SRB absorbance was lower than 25% when compared to untreated cells, or the

value was ≤50µg/ml. The DMSO present in the samples (0.25%,v/v) was shown not to

affect the experiments performed.

2.7. Flow cytometric analysis of cell cycle phase distribution.

MCF-7 human cell line and human normal fibroblasts were treated with the IC

value of C

TLC spot for 72h. After treatment, cells were harvested by trypsinization and

washed twice in ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) (3,000 rpm centrifuged).

Samples (floating and adherent cells) were then fixed in 70% EtOH at 4°C overnight. The

3,000 rpm centrifuged cells pellet was again washed and resuspended in ice-cold PBS. Into

0.5 ml cell sample was added 0.5 ml hypotonic fluorochrome solution (RNAse A 250

µl/ml, 100µg/ml propidium iodide in 0.1% sodium citrate plus 0.1% Triton X-100).

Samples were than incubated in the dark at room temperature for 30 min, and kept

at 4°C until measured. Cells (15,000) were assessed using a flow cytometer (FACS

Calibur). The DNA content was analyzed using ModFit 2.0 software. The number of cells

having a subdiploid DNA content was taken as a measure of the number of apoptotic cells

(Nicoletti et al., 1991).

2.8. Statistical analysis

The statistical analysis (ANOVA) was performed using the SPSS 10.0 software.

3. Results and Discussion

The ethanolic extract showed a potent growth inhibitory effect (< 25% of control

SRB absorbance) at 100 µg/ml in the HT-29 and H-460 human cell lines (Figure 1). The

presence of antiproliferative activity is in accordance with previous observations with

species of the Eupatorium genus, which were shown to have cytotoxic activity in various

preclinical models (Woerdenbag et al., 1989; Habtemariam and Macpherson, 2000;

Mongelli et al., 2000).

Subsequently, the ethanolic extract was submitted to fractionation with solvents of

increasing polarity and re-assayed in five concentrations (50, 25, 10, 5, 1 µg/ml) against a

panel of five human tumor cell lines (Table 1). Testing the hexane, chloroform and

methanol fractions, we observed a typical concentration-dependent antiproliferative effect

of the CHCl

fraction against five cancer cell lines. HT29 was the most resistant cell line,

showing an IC

value 3.1-fold higher than RXF393 (less resistant cell line) (Table 1). The

chloroform fraction was the most active one, with IC

values ranging from 20.01±0.92 to

6.42±0.73 µg/ml. Considering that the antiproliferative effect in Eupatorium genus has

been attributed to sesquiterpene lactones, a large and diverse group of biologically active

plant constituents (Robles et al., 1995) whose cytotoxic activity was previously

demonstrated (Sharma et al., 1998), we decide to elute the chloroformic fraction with lead

acetate to form a enriched sesquiterpene lactones fraction (ESL). Results of the

phytochemical analysis are summarized in Table 3. HPLC analysis of this fraction

suggested the presence of eupatoriopicrin, a characteristic sesquiterpene lactone from

Eupatorium genus. The ESL fraction showed the lowest IC

values against the five human

tumor cell lines (p<0.05) ranging from 6.45±2.37 to 3.42±0.44 µg/ml. Notably, the IC

values were more than 2-fold lower in all cell lines (p<0.05), when compared to the

chloroformic fraction, suggesting that growth inhibitory effect was related, at least in part,

to sesquiterpene lactones.

In order to continue the bioassay-guided purification, we submitted the ESL fraction

to TLC. The resulting spots C

, C

and C

were tested against the five tumor cell lines,

fibroblasts and lymphocytes. No antiproliferative activity was observed in C

. However, the

, C

and C

fractions showed a dose-dependent cytotoxic effect in highly proliferative

cells (tumor cell lines and fibroblasts) inhibiting cell growth at doses ranging from

24.33±3.65 to1.87±0.32 µg/ml, but were inactive against lymphocytes, which present a

very low proliferation rate (Table 2). The results suggest that this effect is dependent on the

presence of cells in exponential growing. Cells were more resistant to C

while IC

values

were similar between C

and C

The activity found in three of four fractions, could be attributed to more than one

type of sesquiterpene lactones, considering that several of them have been isolated from

Eupatorium species (Woerdenbag, 1988; Sharma et al., 1998; Yang et al., 2004). These

bioactive compounds are known to posses a variety of skeletons, stereochemical variations,

functional groups and positional isomerism. Variations in the molecular structure of the

sesquiterpene lactones may enhance or diminish the cytotoxic properties (Woerdenbag,

1988).

The observed antiproliferative effects could also be related to the presence of

flavonoids (Dobberstein et al., 1977; Herz et al., 1981; Stevens et al., 1995; Sharma et al.,

1998; Colossi et al.,1999; Oliveira et al., 2001) others than quercetin, absent in ESL

fraction as suggested by HPLC analysis. However, as shown in table 3, sesquiterpene

lactones are present in much higher concentration in the SLE fraction and the cytotoxic

effect of flavonoids have been demonstrated in a least extent (Woerdenbag, 1988).

Flow cytometry analysis was performed with the MCF-7 breast cancer cells and

normal human fibroblasts. The fraction utilized in this assay was C

, which showed the

lowest IC

value (5.47±0.61 µg/ml) in MCF-7 cell line (p<0.001).

As shown in Figure 2, the antiproliferative effect of the C

fraction could be

associated to alterations in the cell cycle phase distribution. MCF-7 cells were arrested in

the S-phase of the cell cycle (2.3-fold increase in treated cells) (p=0.005), while fibroblasts

were arrested in S and G2-M phases of the cell cycle (p<0.001). In addition, there was only

a small amount of cells in G0-G1 phases, when compared to control.

The induction of cell death was evaluated using flow cytometry in cells stained with

propidium iodide. Despite the similar C

values in both, MCF-7 cell line and

fibroblasts, results of flow cytometry analysis indicate that the mechanisms of action of the

antiproliferative effect seems to differ in tested cells. By contrast to the induction of sub-G1

population in fibroblasts, C

TLC spot did not promote increase in sub-G1 cell fraction in

MCF-7 cells, suggesting that in this cell line this fraction decreases the survival of cells by

a nonapoptotic mechanism. Indeed, some sesquiterpene lactones are know to have both

cytostatic and cytotoxic effects against human tumor cell lines (Woerdenbag, 1988),

causing DNA damage in tumour cells (Woerdenbag et al., 1989).

In summary, our preliminary results demonstrated the antiproliferative activity of

extracts from S. casarettoi, confirming previous observations of this effect of compounds

derived from Eupatorium genus. Considering that the extracts proved to be active at

relatively low concentrations, further studies are warranted to complete the isolation and

characterization of its active components and to better define its therapeutic potential.

Acknowledgements

Financial support of the CNPq/Brasil and SOAD. We thank staff of Screening and

Extraction Laboratories, Lutheran University of Brazil, for assistance and Dr. R. Bos for

kindly supply the eupatoriopricrin.

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Table 1. IC

values (µg/ml; means ± SD; n=9) in five cell lines after treatment for 72h with

hexane, chloroform, methanol and sesquiterpene enriched fractions of S. casarettoi.

Table 2. IC

values (µg/ml; means ± SD; n=9) in five cell lines, fibroblasts and

lymphocytes after treatment for 72h with C

, C

and C

TLC spots from sesquiterpene

lactones enriched fraction of S. casarettoi (syn: E. casarettoi).

Table 3. Phytochemical analysis of inflorescences of S. casarettoi (syn: E. casarettoi).

Figure1. Percentage of cell growth (means ± SD, n=9) in H-460 non-small cell lung

carcinoma and HT-29 colorectal carcinoma by 72h S. casarettoi ethanolic extract treatment.

Figure 2. Cell cycle phase distribution (% of cells; means ± SD, n ≥ 9) in MCF-7 breast

carcinoma and human normal fibroblasts, upon treatment for 72h with C

TLC spot from

chloroformic fraction of S. casarettoi.

Table 1.

Hexane Chloroform Methanol SL

HT-29 OR

20.01±0.92

6.45±2.37

NCI-H460 OR

11.36±3.07

5.48±1.87

RXF393 OR

6.42±0.73 47.00±3.37 3.42±0.44

MCF-7 OR

14.13±4.08

5.84±1.28

OVCAR-3 OR

11.81±4.21

4.38±0.90

SL: Sesquiterpene lactones enriched fraction

OR: Overage (IC

>50µg/ml)

Table 2.

HT29 OR

24.33±3.65 7.88±0.49 8.64±0.64

NCI-H460 OR

18.05±0.27 3.28±0.70 3.50±0.08

RXF393 OR

6.93±0.48 2.46±0.23 1.87±0.32

MCF-7 OR

14.69±4.42 5.47±0.61 6.65±0.48

OVCAR-3 OR

9.26±0.44 4.48±0.64 4.48±0.85

FIBROBLASTS OR

18.92±2.96 4.52±0.27 3.73±0.07

LYMPHOCYTES

OR OR OR OR

OR: overage (IC

>50µg/ml)

Table 3.

Compounds Results

Phenolic compouds Positive

Flavonoids Weakly positive

Lactones Strongly positive

Coumarins

Negative

Tanins Negative

Cardiotonic heterosides Negative

Alkaloids Negative

Saponins Negative

Antraquinones Negative

Figure 1.

*Different of control

Figure 2.

*Different of control

C: Control

T: Treated

List of abbreviations

DMSO: dimethilsulfoxide

DNA: deoxyribonucleic acid

ESL: enriched sesquiterpene lactones fraction

PBS: phosphate-buffered saline

RNAse: ribonuclease

rpm: rotations per minute

SRB: sulforhodamine B

TCA: trichloroacetic acid

TLC: thin layer chromatography

UV: ultraviolet

ARTIGO 2

Antimalarial activity of Symphyopappus casarettoi Robinson (Asteraceae) extracts.

(A ser submetido à Phytotherapy Research).

Antimalarial activity of Symphyopappus casarettoi Robinson (Asteraceae)

extracts.

Mara Regina Netto Benetti

, Rodrigo Soares

, Isabel Freitas

, Adriana Coitinho

, Gilberto

Schwartsmann

1,4

and Antoniana Ursine Krettli

Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

RS, Brazil.

Laboratory of Malaria, Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ, Belo Horizonte,

MG, Brazil.

Universitary Center Feevale, Novo Hamburgo, RS, Brazil.

South-American Office for Anticancer Drug Development (SOAD), Hospital de Clínicas

de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil.

Short title: Antimalarial activity of S. casarettoi.

Keywords: Symphyopappus, Eupatorium, Asteraceae, antimalarial activity.

Correspondence to:

Mara R. N. Benetti

Address: South-American Office for Anticancer Drug Development (SOAD), Hospital de

Clínicas de Porto Alegre, 3 Leste, Rua Ramiro Barcelos, 2350, Porto Alegre, RS, Brazil.

CEP: 90035-007.

E-mail: marare1@hotmail.com

Telephone/Fax: 55-51-2101-8012

SUMMARY

The antibacterial, antifungal and antimalarial activities of extracts of

Symphyopappus casarettoi (syn. Eupatorium casarettoi) were investigated. The extracts

showed no antibacterial and antifungal activities. Antimalarial activity was observed in

vitro against Plasmodium falciparum and in vivo, at 250 mg/kg in mice infected with P.

berghei. The chloroformic fraction was the most active one, while methanolic fraction did

not demonstrate any activity and the hexanic fraction had a weak activity. Further studies to

confirm its antimalarial properties and the identification of the chemical structure of the

active(s) compound(s) are planned.

INTRODUCTION

Fungus, bacterias and other microorganisms cause important human diseases,

especially in tropical regions and in immunocompromised patients. Althought there are

many potent drugs against microorganisms, resistant or multi-resistant lines are continually

appearing, carry on the need of new drugs research and development (Silver and Bostian,

1993). Malaria (caused by Plasmodium spp) is one of the most important parasitic

infections of humans due to its high morbidity and mortality (Andrade-Neto et al., 2004b),

affecting more then 500 million people a year, and killing about 2,7 million of them (Go,

2003).

Eupatorium spp were reported to have activity against several diseases and are

know to have a considerable number of bioactive natural products. Among its biological

activities are antimicrobial (Gupta et al., 2002) and anti-plasmodial (Lang et al., 2002). In

this paper, we presented the results of the antibacterial, antifungic and antimalarial

evaluation of Symphyopappus casarettoi Robinson (syn. Eupatorium casarettoi (B.L. Rob)

Steyerm) (Asteraceae) extracts.

MATERIAL AND METHODS

Plant material and extract preparation. Symphyopappus casarettoi Robinson

(Asteraceae) was collected in the Estrada do Mar, Arroio do Sal – RS, Brazil. A voucher

specimens (Bordignon et al., 2396) was identified by Dr. S. Bordignon, Universidade

Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brazil and has been deposited in the Herbarium of the

same university.

The air dried and powdered inflorescence material was extracted with ethanol

(EtOH) PA 10x the weight in volume (yield:12.07%) by maceration. These organic extracts

were concentrated by rotary evaporation in a Quimis 219 equipment and stored at –20°C

until testing. Subsequently, the crude extract was eluted successively with hexane (C

)

(yield:19.60%), chloroform (CHCl

) (yield:43.40%) and methanol (MeOH)

(yield:32.60%). These fractions were also evaporated to dryness under reduced pressure at

45°C.

Antibacterial and antifungal assays. Antibacterial and antifungal activities were

tested using the modified broth microdilution MIC testing (Hindler J, 1997) with

Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus

aureus (ATCC 25923), Enterococcus faecalis (ATCC 29212) and Candida parapsilosis

(ATCC 22019). Briefly, 90 µl of sterile Mueller-Hinton or Saboraud 2% broths, 100 µl of

corresponding dosis of the extract (700, 300, 100, 50, 20, 5 µl/ml) and 10 µl of bacterial or

fungal suspension (0,5 Mc Farland) were inoculated in microdilution wells and icubated in

ambient-air incubator at 35°C overnight. Standard antibiotics were ceftazidime and

chloramphenicol for bacterias and anfotericin for fungus. The MIC (minimal inhibitory

concentration) was determined by observing the lowest concentration of extract that

inhibited visible growth of the organisms. Experiments were performed in triplicates.

Antimalarial assays. Plasmodium falciparum (clones W2 and BHz) parasites were

cultured with human erythrocytes (blood group O

) at 5% hematocrit in RPMI 1640

supplemented with 10% human plasma as previously described (Trager & Jensen, 1976).

Antimalarial activity was tested as descbribed previously (Desjardins et al., 1979). Briefly,

in vitro [

H]-hypoxanthine incorporation assay was performed with trophozoite stages in

sorbitol-synchronized blood cultured at 2% parasitaemia and 2.5% haematocrit. P.

falciparum were incubated in 96 wells plates with the plant extracts at different

concentrations, at a temperature of 37°C, 5% CO

in air, for 24h. After, 25 µl of a [

H]-

hypoxanthine solution were added, following 18h incubation. Then, erythrocytes were

lysed, harvested and readed in a Betaphase or Microbeta apparatus (Wallac-Perkin Elmer)

to count [

H]-hypoxanthine incorporation. The half-maximal inhibitory response (IC

)

compared with parasite growth in the drug-free controls was estimated by curve fitting

using a software program (Microcal, Origin Software, Inc., Northampton, MA, USA).

Chloroquine was the standard antimalarial drug.

In vivo antimalarial suppressive test described by Peters (1985) and modified by

Carvalho et al., (1991) was performed in mice infected with P. berghei, strain NK-65,

originally received from New York Medical School. Parasites were maintained by weekly

blood passage in BALB/c mice by intraperitoneal route, 10

infected red blood cells per

mice. Animals were randomly separated into groups of five (two control groups: treated

with chloroquine and not treated, and tested groups). Treatment was carried out by oral

route, daily, for 4 consecutive days, in dosis of 250 and 500 mg/kg of the extracts of S.

casarettoi, diluted in 70% ethanol and further solubilized in water (0.2 ml volume per

animal). Antimalarial activity was evaluated by counting parasitaemia in blood smears

taken at days 5 and 7 after parasite inoculation, by microscopy, after methanol fixation and

staining with Giemsa. Inhibition of parasite growth was calculated in relation to the control

(non-treated) group. Results were expressed as a percentage of parasitaemia reduction and

extracts that reduced parasite growth by ≥30% were considered active (Carvalho et al.,

1991). All assays were performed in triplicate.

Animal use and ethical approval. BALB/c adult mice, weighing 18-20g, were

used for the antimalarial tests. The animals received water and food ad libitum. Their use

was approved by the Ethical Committee for Using Animals (CEUA-P0094-01) at Fundação

Oswaldo Cruz (FIOCRUZ).

RESULTS AND DISCUSSION

Over the past years, some researchers have demonstrated the antibacterial and

antifungal properties of Eupatorium species (Urzua et al., 1998; Habtemariam and

Macpherson, 2000; El-Seedi et al., 2002; García et al., 2003). We did not observed such

activities testing inflorescence ethanolic extract of S. casarettoi. That might be due to the

low concentration of flavonoids found in phytochemical screening (data not showed). Since

some of these compounds are known to be synthesized by plants in response to microbial

infection, it should not be surprising that they have been found in vitro to be effective

antimicrobial substances against a wide array of microorganisms (Cowan, 1999).

This work shows for the first time the antimalarial activities of S. casarettoi (syn. E.

casarettoi) extract and fractions. Ethanolic extract showed parasite growth inhibition in

vitro against P. falciparum in a dose dependent manner (Figure 1). In vivo experiments

suggested important antimalarial activity against P. berghei, reducing parasitaemia by 42%

at day 5 and 63% at day 7 in animals treated with 250 mg/Kg of extract and 73% at day 5

and 65% at day 7 with 500 mg/Kg of extract (Table 1). These data confirmed the presence

of a clear antimalarial activity. These results are in agreement with previous studies that

suggested antiplasmodium and antimalarial activities of Eupatorium species (Carvalho et

al., 1991; Blair et al., 2002; Lang et al., 2002).

In order to begin the bioassay-guided purification, the ethanolic extract was

submitted to fractionation with solvents of increasing polarity and re-assayed in vitro. Both

clones (W2 and BHz) of the human malaria parasite P. falciparum displays similar in vitro

antimalarial susceptibility to S. casarettoi fractions (hexane, chloroform and methanol). As

shown in Table 2, methanol fraction displays no activity (IC

≥ 50 µg/ml) and hexane

fraction displays a weak activity (IC

43.03 and 39.38 µg/ml, respectively). However, the

chloroform fraction was the most active one, with IC

values 4.97-fold and 4.42-fold

lower than hexane fraction, in clones W2 and BHz respectively. Considering that in a

phytochemical analysis (data not showed), S. casarettoi demonstrate to have a high

concentration of sesquiterpene lactones, we speculate that the better anitmalarial effect of

chloroformic fraction is due to this class of compounds. Artemisinin is an example of a

sesquiterpene lactone used in treatment of malaria.

These results are important in the sense that these strains are chloroquine-resistant

and chloroquine is still widely used to treat malaria, but only in areas where notable drug

resistance has not yet appeared (Krettli, 2001). The observed anti-malarial activity of S.

casarettoi inflorescence extracts in vitro and in vivo were encouraging and have stimulated

us to initiate additional experiments to isolate and identify the active compound (s)

responsible for the above mentioned biological activity.

ACKNOWLEDGEMENTS

Financial support of CNPq/Brazil and SOAD; Dr. S. Bordignon for identification of plant

material; Dr. A. Bart for assistance with the antibacterial and antifungal assays.

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Figure 1. In vitro growth inhibition of P. falciparum (strain W2) incubated with ethanolic

extract of S. casarettoi and the inhibitory concentration dose (IC

) in one representative

experiment.

Table 1. In vivo antimalarial activity of S. casarettoi ethanolic extract in mice infected with

P. berghei. Results are representative of experiments performed in triplicata.

Table 2. In vitro growth inhibition (%) of P. falciparum (strains W2 e BHZ) incubated with

chloroformic, methanolic and hexanic fractions of S. casarettoi.

Figure 1.

Table 1.

Parasitaemia reduction Ethanolic extract

Day 5 Day 7

250 mg/kg 42% 63%

500 mg/kg 73% 65%

Table 2.

Parasite inhibition growth

Strain W2 Strain BHz

Concentration Hexane

Chloroform

Methanol Hexane

Chloroform

Methanol

50 µg/ml

62% 80% 7% 60% 82% 14%

25 µg/ml

18% 77% 0% 31% 79% 11%

12.5 µg/ml

10% 62% 0% 19% 62% 14%

6.25 µg/ml

0% 35% 0% 5% 34% 7%

3.12 µg/ml

0% 18% 0% 0% 16% 0%

1.56 µg/ml

0% 6% 0% 0% 0% 0%

43.03

µg/ml

8.71 µg/ml ≥ 50

µg/ml

39.38

µg/ml

8.90 µg/ml ≥ 50

µg/ml

ARTIGO 3

Evaluation of the antioxidant effect of extracts of Symphyopappus casarettoi

Robinson.

(Aceito para publicação na Fitoterapia).

Evaluation of antioxidant effect of extracts of Symphyopappus casarettoi

Robinson.

Mara Regina Netto Benetti

a,c

*, Martina Rudnicki

a,b

, Alfeu Zanotto

, Marcos Roberto de

Oliveira

, Andréa Gisiane Kurek

, Adriana Coitinho

, Gilberto Schwartsmann

a,c

and José

Cláudio Fonseca Moreira

a,b

Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Bioquímica, Instituto de Ciências

Básicas de Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rua Ramiro Barcelos, 2600

(anexo), Porto Alegre, RS, Brazil. CEP: 90035-003.

Centro de Estudos em Estresse Oxidativo, Departamento de Bioquímica, Instituto de

Ciências Básicas de Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rua Ramiro

Barcelos, 2600 (anexo), Porto Alegre, RS, Brazil. CEP: 90035-003.

South-American Office for Anticancer Drug Development (SOAD), Hospital de Clínicas

de Porto Alegre, Rua Ramiro Barcelos, 2350, Porto Alegre, RS, Brazil. CEP: 90035-007.

Centro Universitário Feevale, RS 239, 2755, Novo Hamburgo, RS, Brazil. CEP: 93352-

000.

*Correspondence to:

E-mail: marare1@hotmail.com

Telephone/Fax: 55-51-2101-8012

Abstract

The ethanolic extract of Symphyopappus casarettoi (syn. Eupatorium casarettoi)

was partitioned in three fractions (hexanic, chloroformic and methanolic). Extract and

fractions were tested for their antioxidant activity in vitro and ex vivo assays. The

methanolic fraction showed a higher total reactive antioxidant potential compared to the

other fractions, which was correlated with its total phenol content. In addition, the ethanolic

extract and the methanolic fraction attenuated ex vivo iron-induced cell death, quantified by

lactate dehydrogenase leakage, and effectively protected against lipid damage induced by

iron. These findings suggest that the ethanolic extract of Symphyopappus casarettoi

inflorescence and its methanolic fraction have potent in vitro and ex vivo antioxidant

properties and might be considered as possible new sources of natural antioxidants.

Keywords: Symphyopappus, Eupatorium, antioxidant activity.

Plant. Symphyopappus casarettoi Robinson (= Eupatorium casarettoi (B.L. Rob) Steyerm)

was collected in Arroio do Sal, Rio Grande do Sul, Brazil, in January 2002. A voucher

specimens (Bordignon et al., 2396) were identified by Dr. S. Bordignon, Universidade

Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brazil and are on deposited at the Herbarium of the same

university.

Uses in traditional medicine. Eupatorium species have a wide range of activities such as

cardiac stimulant, laxative, anticoagulants [1], against spleen, liver and biliary diseases,

diarrhoea, ulcers, fever, bronchial infections, malaria, cancer, rheumatism. Also are used as

a diuretic, immunostimulant and antiseptic, among others [2].

Previously isolated classes of constituents. Eupatorium species contain predominantly

sesquiterpene lactones. Flavonoids and alkaloids have been also reported [3]. In a minor

extent other classes of compounds such as coumarins [3], diterpenes [4], benzofuranes [5]

and sesquiterpenes [2] were found in this genus.

Tested material. Ethanol extract (yield:12,07%), that was partitioned successively with

hexane (yield:19,60%), chloroform (yield:43,40%) and methanol (yield:32,60%) resulting

three fractions. Phytochemical screening gave positive tests for lactones and phenolic

compounds.

Studied activity. Total phenolic content of the extracts was determined using the Folin-

Ciocalteau method [6] employing tannic acid as standard. The in vitro antioxidant activity

was estimated by the TRAP assay [7] while the ex vivo cytoprotective potential was

verified by the LDH leakage [Kit LDH Liquiform

, Brazil] and antilipoperoxidative

activity by TBARS measurement [8].

Results. Results of the in vitro experiments are reported in Table 1 and data of the ex vivo

assays are presented in Table 2. Hexanic fraction was excluded due low total polyphenol

content.

Conclusions. The ethanolic inflorescence extract, the methanolic and the chloroformic

fractions of S. casarettoi demonstrated a dose-dependent antioxidant capacity. However,

the methanolic fraction showed a higher total reactive antioxidant potential compared to the

other fractions. Total phenolic content and antioxidant capacity were correlated (r = 0.976)

only in methanolic fraction suggesting that phenolic compounds accounted for the

antioxidant capacity in this fraction. In addition, LDH leakage was significantly decreased

with the presence of methanolic fraction in both concentrations tested suggesting a

cytoprotective role. Methanolic fraction also prevented lipid peroxidation in a dose

dependent manner, being the best antioxidant among those tested. Ethanolic extract

prevented lipoperoxidation only in the concentration of 0.5µg/ml, maybe due to the

increase of the concentration of other compounds (for example, sesquiterpene lactones) in

the 5 µg/ml that might be acting as pro-oxidant molecules. Further studies are in progress to

identify the active components.

Acknowledgments

We thank Dr. S. Bordignon for identification of the plant material.

References

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Pizzol F, Schapoval EE, Bassani VL, Moreira JCF. Life Sci 2004;23: 2815.

[8] Draper HH, Hadley M. Methods Enzymol 1990;186:421.

Table 1. Total polyphenol content of ethanolic extract and methanolic and chloroformic

fractions of S. casarettoi and their antioxidant properties (TRAP). Results of total

poliphenol content were expressed as mg/g of extract and data of TRAP were expressed as

trolox equivalent capacity (TEAC). Experiments were performed in triplicata.

Table 2. The effect of ethanolic extract and methanolic fraction of S. casarettoi on iron

induced lipoperoxidation (TBARS) and on LDH leakage. Results of TBARS were

expressed as MDA equivalents (nmol/mg protein) ± SD and in LDH leakage are expressed

as U LDH/µg protein ± SD. The chosen doses of the extract and the fraction were the

lowest concentration that showed an antioxidant capacity in the TRAP assay. Data are

representative of three independent experiments performed in triplicate.

Table 1.

Ehanolic extract Metanolic fraction Chloroformic fraction

TRAP (TEAC) 3.02 0.41 0.1

Total polyphenolic content (mg/g

extract)

2.16 4.104 1.403

Correlation between TEAC and

total phenolic content

0,919 0,976* 0,81

*Pearson coeficient; p < 0.05

Table 2.

TBARS (nmol/mg protein ± SD) LDH

(U LDH/µg protein ± SD)

Ethanolic Methanolic Ethanolic Methanolic

Control

0.133±0.012 0.203±0.012 2.830±0.075 1.059±0.151

Control+Iron

0.425±0.065* 0.350±0.15* 3.937±0.105* 1.877±0.221*

Extract

0.141±0.018 0.162±0.018 2.500±0.200 1.334±0.066

Extract + Iron

0.2971±0.017** 0.241±0.013** 3.221±0.045 1.014±0.012**

Extract 10x + Iron

0.465±0.035* 0.103±0.006*** 2.671±0.120** 1.170±0.102**

*Different of control.

**Different of control + iron (FeSO

80µM).

*** Different of control, different of control + iron (FeSO

80µM) and different of extract + iron (FeSO

80µM)

ANOVA; Tukey and SNK tests; p < 0.05

6. DISCUSSÃO

Desde os tempos mais remotos, em todos os povos, extratos de plantas são

comumente utilizados para tratar doenças. Isso sugere que o apelo de “drogas

maravilhosas” que resolvem problemas médicos complexos é universal e parte da natureza

humana (Schwartsmann, 2001). O redescobrimento da conexão entre plantas e saúde é

responsável pelo lançamento de uma nova geração de tratamentos envolvendo vegetais, que

incluem medicamentos derivados de plantas, fármacos “multicomponentes”, suplementos

dietéticos e proteínas recombinantes produzidas a partir de plantas (Devasagayam et al.,

2004). Medicamentos derivados de plantas precederam os progressos da medicina ao longo

de nossa existência (Schwartsmann, 2000). Os compostos, isolados das plantas, podem ser

usados como tais, mas também como moléculas que servem de base para a preparação de

compostos semi-sintéticos ou ainda servir como modelo para sintetizar outros compostos

(Woerdenbag, 1988).

O gênero Eupatorium tem sido pesquisado em várias partes do mundo e muitas

propriedades biológicas são atribuídas a extratos e compostos bioativos presentes nas

plantas pertencentes a espécies desse gênero. O principal grupo de atividades biológicas

relacionadas a esse gênero refere-se ao câncer: citotóxica, citostática, antitumor e

antileucêmica (Woerdenbag, 1988; Sharma et al., 1998; Mongelli et al., 2000; Rucker et al.,

2001; Monks et al., 2002; Yang et al., 2004; Shen et al., 2005). Destacam-se também as

atividades antimicrobianas: antibactérias, antifungos e antivírus (Abad et al., 1999;

Hnatyszyn et al., 1999; Habtemariam e Macpherson, 2000; El-Seedi et al., 2002; García et

al., 2003, Muschietti et al., 2005; Sasikumar et al., 2005). Citam-se ainda propriedades

antimaláricas (Blair et al., 2002; Lang et al., 2002), antioxidantes (de las Heras et al., 1998)

e antiinflamatórias (de las Heras et al., 1998; Habtemariam, 2001; Muschietti et al., 2001),

entre inúmeras outras.

Dentre os compostos presentes em plantas desse gênero, merecem atenção as

lactonas sesquiterpênicas, que serão discutidas mais adiante juntamente com as

propriedades biológicas de S. casarettoi. Também foram descritos polifenóis, alcalóides e

inúmeros outros grupos de substâncias. De acordo com o screening fitoquímico realizado

com S. casarettoi, as lactonas são os metabólitos secundários majoritários. Compostos

fenólicos estão presentes nessa planta, sendo baixa a concentração de flavonóides. Não

detectamos a presença de cumarinas, taninos, saponinas, antraquinonas, heterosídeos

cardiotônicos ou alcalóides. Pela análise de HPLC, observamos a presença de

eupatoriopicrina, a lactona mais freqüentemente encontrada nas espécies de Eupatorium,

segundo revisão bibliográfica. Essa análise também sugeriu ausência de quercetina,

flavonóide observado em espécies vegetais de vários gêneros, incluindo Eupatorium (Nair

Ramachandran et al., 1995).

Apesar dos avanços na compreensão dos processos biológicos que levam ao

desenvolvimento de câncer, ainda há a necessidade de agentes novos e efetivos, para

auxiliar no controle dessa doença. Uma das mais antigas e mais efetivas estratégias para

desenvolver novos quimioterápicos é o isolamento de moléculas de origem natural. A

importância dos produtos naturais para a descoberta de fármacos é impressionante: basta

olhar para o número de fármacos clinicamente ativos utilizados na terapia do câncer, para

ver quantas delas são produtos naturais ou baseadas em produtos naturais (Modzelewska et

al., 2005). Para satisfazer a demanda de novos agentes anticâncer, os cientistas estão

percorrendo o mundo em busca de organismos que possuam compostos com propriedades

antiproliferativas (Monks et al., 2002).

Levando em consideração que um agente anticâncer pode ter suas propriedades

farmacodinâmicas e/ou farmacocinéticas melhoradas devido a variações moleculares e que

os compostos oriundos do metabolismo secundário variam de espécie para espécie, muitos

pesquisadores baseiam-se na literatura existente para eleger suas plantas-alvo de estudo.

Docetaxel é um exemplo de um composto anticâncer desenvolvido a partir de uma

molécula isolada de uma planta do mesmo gênero (Taxus) com propriedades melhoradas,

se comparada ao composto original (paclitaxel). Assim, Symphyopappus casarettoi foi

selecionada com base em informações quimiossistemáticas de espécies do gênero

Eupatorium.

A presença de atividade antiproliferativa in vitro no extrato etanólico de S.

casarettoi confirmou as observações prévias para plantas do gênero Eupatorium. Como no

campo da descoberta de novos fármacos a partir de produtos naturais, um método que

aumenta o sucesso é o fracionamento bioguiado (Park e Pezzuto, 2002), o extrato etanólico

foi fracionado em hexano, clorofórmio e metanol e novamente testado. Visto que o efeito

antiproliferativo nesse gênero é atribuído principalmente às lactonas sesquiterpênicas,

nossos resultados também sugeriram ser provável que esse mesmo grupo seja o responsável

por essa atividade, uma vez que obtivemos um IC

menor para a fração clorofórmica

(obtida a partir do extrato etanólico) e ainda menor para a fração enriquecida de lactonas

sesquiterpênicas (obtida a partir da fração clorofórmica). A fração hexânica não

demonstrou efeito antiproliferativo em nenhum dos tipos celulares testados e a metanólica

apresentou somente na linhagem tumoral RXF 393.

Sesquiterpenos são uma classe de moléculas que têm demonstrado potencial

terapêutico (Modzelewska et al., 2005). As frações C

, C

e C

(separadas a partir da fração

enriquecida de lactonas sesquiterpênicas) demonstraram efeito antiproliferativo, sendo que

no tratamento com C

houve uma maior resistência celular, se comparado ao tratamento

com C

e C

que demonstrou valores menores de IC

. As lactonas sesquiterpênicas são

conhecidas também por possuírem uma ampla variedade de esqueletos, variações

estereoquímicas, grupos funcionais e isomerismo de posição. Essas variações estruturais

podem aumentar ou diminuir a atividade citotóxica (Woerdenbag, 1988). Por esse motivo,

sugerimos que o efeito antiproliferativo encontrado em C

, C

e C

, possa ser atribuído a

mais de um tipo de lactonas sesquiterpênicas, considerando que muitas delas já foram

isoladas de espécies do gênero Eupatorium (Woerdenbag, 1988; Sharma et al., 1998; Yang

et al., 2004).

Segundo Woerdenbag (1988), a ação de algumas lactonas sesquiterpênicas isoladas

de E. canabinnum não é específica, resultando em pouca discriminação de toxicidade entre

células de tecido tumoral e células de tecidos normais. Apesar de diminuir a sobrevivência

de fibroblastos e células tumorais de forma semelhante (valores de IC

próximos), as

frações C

, C

e C

de S. casarettoi não causaram decréscimo de sobrevivência em

leucócitos, sugerindo que o efeito antiproliferativo dos compostos é observado somente em

células em crescimento exponencial. Diversos fármacos em uso clínico no tratamento de

câncer, também afetam todas as células em crescimento exponencial, causando os efeitos

colaterais mais freqüentemente observados em pacientes utilizando quimioterápicos:

alopecia e mielossupressão.

Na tentativa de indicar um mecanismo de ação para a fração C

, e de observar se

esse mecanismo assemelhava-se em células normais e tumorais, foi realizada a citometria

de fluxo. Observou-se que o efeito antiproliferativo da fração C

pode ser associado a

alterações na distribuição das fases do ciclo celular, uma vez que a linhagem MCF-7 teve

seu ciclo celular interrompido na fase S, enquanto os fibroblastos tiveram seu ciclo celular

interrompido nas fases S e G2-M, além de uma quantidade pequena de células nas fases

G0-G1, se comparadas ao controle. A interrupção do ciclo celular na fase S, provavelmente

ocorreu devido à inibição da síntese de enzimas envolvidas na replicação do DNA, uma vez

que as lactonas sesquiterpênicas exibem interação com enzimas que possuem grupo

sulfidrila (Woerdenbag, 1988; Zhang et al., 2005), dentre as quais podem ser citadas a

DNA polimerase e a timidilato sintetase. Algumas lactonas também demonstraram efeito de

supressão da síntese de RNA e redução de fosforilação de histonas, sendo que esses efeitos

também ocorreram pela inibição de enzimas com grupo tiol (Hall et al., 1980; Zhang et al.,

2005). Já a parada no ciclo na fase G2-M em fibroblastos, pode ter ocorrido por vários

motivos, uma vez que nessa fase, a célula faz uma checagem de possíveis erros

(checkpoint) e inúmeros mecanismos celulares estão envolvidos. Estudos prévios

demonstraram que algumas lactonas sesquiterpênicas causam dano ao DNA, fato que pode

ter ocorrido nesse caso. Outra possibilidade para a interrupção do ciclo celular na fase G2-

M é que a replicação do DNA pode não ter sido completada.

Segundo esses dados, percebeu-se que as células normais (fibroblastos) foram mais

sensíveis à ação da fração C

, pois o tratamento com essa fração causou mais alterações no

ciclo celular, quando comparadas com as células não tratadas. Pode-se especular que essa

diferença seja devida a mutações na linhagem MCF-7, que possam tê-la tornado menos

suscetível a determinados danos.

No que se refere à indução de morte celular, também observamos que em contraste

à indução de população sub-G1 em fibroblastos, a fração C

não causou aumento em sub-

G1 na linhagem MCF-7, sugerindo que o decréscimo de sobrevivência das células acontece

por um mecanismo não apoptótico. Woerdenbag (1988) demonstrou as atividades

citotóxica e citostática da lactona sesquiterpênica eupatoriopicrina, isolada de E.

cannabinum.

A atividade citotóxica das lactonas sesquiterpênicas acontece pela interação do

motivo ativo com enzimas pertencentes ao grupo sulfidrila, resultando em uma inibição de

atividades e metabolismos enzimáticos celulares, levando a dano ao DNA (Woerdenbag,

1988; Zhang et al., 2005) e possivelmente à apoptose. Sabendo-se que o tratamento de

células de mamíferos com doses adequadas de fármacos citostáticos causa a morte celular,

Woerdenbag (1988) sugeriu que a atividade citostática da eupatoriopicrina (e talvez de

outras lactonas sesquiterpênicas) aumenta, in vitro e in vivo, com a inibição da síntese de

glutationa (envolvida em reparo de dano celular e detoxificação). Também sugeriu que

provavelmente essa ação citostática possa estar relacionada com reações de radicais livres,

uma vez que a eupatoriopicrina causa lipoperoxidação in vitro e um excesso desse tipo de

reação pode ocorrer se os níveis celulares de seqüestradores de radicais livres (como a

glutationa) forem insuficientes. Além do mais, os radicais livres também causam dano ao

DNA.

As doenças infecciosas representam um problema crítico para a saúde e são umas

das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo (García et al., 2003). Sendo

que as plantas têm uma capacidade quase ilimitada de sintetizar substâncias aromáticas, a

maioria delas sendo metabólitos secundários, várias categorias de compostos fitoquímicos

com capacidade antimicrobiana já foram identificadas (Conan et al., 1999).

Alguns pesquisadores demonstraram atividades antibacterianas e antifúngicas de

espécies do gênero Eupatorium (Urzua et al., 1998; Habtemariam and Macpherson, 2000;

El-Seedi et al., 2002; García et al., 2003). Em nossos estudos, não observamos atividade

nos testes com o extrato etanólico de inflorescência de S. casarettoi, talvez devido à baixa

concentração de flavonóides nesse extrato, demonstrada pela análise fitoquímica. Os

flavonóides são apontados como os principais compostos derivados de plantas,

responsáveis por tais atividades. Uma vez que esses compostos são sintetizados pelas

plantas em resposta a infecção por micróbios, não surpreende o fato de pesquisas

demonstrarem sua eficiência antibiótica in vitro, contra uma grande variedade de

microorganismos. Sua atividade é, provavelmente, devida à habilidade de formar

complexos com proteínas extracelulares e solúveis e também de se ligar com a parede

celular de bactérias (Cowan, 1999). Algumas lactonas sesquiterpênicas isoladas de plantas

do gênero Eupatorium demonstraram propriedades antibacteriana e antifúngica (Sharma et

al., 1998), mas nosso estudo sugere que embora estejam presentes em grande quantidade

em S. casarettoi, as lactonas dessa espécie não possuem tais atividades biológicas.

Grandes esforços têm sido feitos no sentido de encontrar novos agentes

antiplasmodiais com maior potência e seletividade, devido à morbidade e mortalidade

associadas à malária. Espera-se que a triagem de extratos e moléculas de plantas

selecionadas constitua uma estratégia promissora e menos dispendiosa que os

medicamentos sintéticos, nessa procura por novos antimaláricos. Nas últimas décadas

muitos fármacos alcançaram estágios avançados de screening e um número menor chegou a

entrar em estudos clínicos (Carvalho et al., 1991). Modelos para compostos continuam

sendo obtidos de fontes naturais (plantas e microorganismos) e síntese química. O grande

desafio no tratamento da malária é descobrir agentes seguros e seletivos, cujos efeitos não

sejam comprometidos pela resistência adquirida pelo Plasmodium (Go, 2003), que é

altamente adaptativo por mutação (Andrade-Neto et al., 2004a). A resistência à cloroquina

(droga mais comumente usada no tratamento da malária) é o principal problema que afeta o

controle da doença (Andrade-Neto et al., 2004b). A artemisinina (isolada de Artemisia

annua L.) e seus derivativos, surgiram como uma promessa de uma nova classe de

fármacos antimaláricos, particularmente para o tratamento da malária severa (Carvalho et

al., 1991).

Outra estratégia que tem sido utilizada na busca de novos antimaláricos é o

screening de databases comerciais ou especializadas. Como os agentes antiplasmodiais são

basicamente agentes citotóxicos, no caso da malária atuando seletivamente contra o

parasita, um número crescente de estudos tem mostrado atividade desses compostos in vitro

e in vivo (Go, 2003). Há uma grande diversidade estrutural nos compostos com boa

atividade antimalárica (≤ micromolar), refletindo a variedade de possíveis alvos existentes

no Plasmodium, um organismo de complexidade considerável. Os mecanismos de ação da

maioria desses fármacos permanecem desconhecidos.

Em nosso estudo, verificamos atividade antimalárica importante do extrato

etanólico de S. casarettoi in vitro contra P. falciparum e in vivo contra P. berghei. No

ensaio in vitro, a inibição do crescimento do parasita ocorreu de maneira dose-dependente.

Já nos experimentos in vivo, a parasitemia foi reduzida 42% no quinto dia de tratamento e

63% no sétimo dia do tratamento com uma dose de 250 mg/kg do extrato e 73% no quinto

dia e 65% no sétimo dia em animais tratados com uma dose de 500 mg/kg do extrato. Os

dados dos experimentos in vitro e in vivo foram concordantes entre si, sugerindo que o(s)

composto(s) responsável (eis) continua (m) ativo (s) em hospedeiros e que a atividade

antimalárica demonstrada provavelmente não é dependente de transformação metabólica

pelo hospedeiro.

Dando início ao processo de purificação guiado por atividades biológicas, o extrato

etanólico foi fracionado com solventes de polaridade crescente (hexano, clorofórmio e

metanol) e novamente testado in vitro contra os clones W2 e BHz do parasita causador de

malária em humanos P. falciparum. Ambos os clones demonstraram suscetibilidade similar

às frações de S. casarettoi, sendo que no tratamento com a fração metanólica, não houve

inibição de crescimento do parasita. Houve uma fraca inibição no tratamento com a fração

hexânica e uma ótima inibição no tratamento com a fração clorofórmica. Esses resultados

são importantes, uma vez que os clones utilizados nos experimentos são resistentes à

cloroquina. Experimentos que descreveram previamente atividades antimaláricas e

antiplasmodiais para espécies de Eupatorium, sugeriram que lactonas sesquiterpênicas são

responsáveis por essa atividade (Blair et al., 2002; Lang et al., 2002). De acordo com os

dados do nosso estudo, especulamos que esses compostos respondem pela atividade

antimalárica, visto que a análise fitoquímica revelou uma alta concentração de lactonas em

S. casarettoi.

Os radicais livres podem estar envolvidos na etiologia de várias doenças humanas e

do processo de envelhecimento (stress oxidativo). Todas as moléculas biológicas presentes

em nosso corpo correm risco de ser atacadas por radicais livres. Os antioxidantes são

substâncias que neutralizam os radicais livres ou suas ações, sendo que atualmente, várias

pesquisas têm revelado as aplicações em potencial das manipulações de

antioxidantes/radicais livres na prevenção ou controle de doenças. Adicionalmente, há

estudos epidemiológicos que demonstraram correlação inversa entre os níveis de

antioxidantes presentes em amostras de tecidos/sangue e a ocorrência de doença

cardiovascular, câncer ou mortalidade devido a essas doenças (Devasagayam et al., 2004).

Entre os antioxidantes não-enzimáticos encontrados em vegetais, podemos citar

além das vitaminas E e C, os carotenóides, flavonóides e polifenóis relacionados

(Devasagayam et al., 2004), que atuam principalmente em nível de interceptação de

radicais livres, geralmente por seqüestramento de radicais. Dentre estes, as pesquisas

envolvendo polifenóis vêm recebendo atenção crescente, devido às suas propriedades

biológicas.

Os polifenóis incluem um grande grupo de componentes de plantas, principalmente

associados com a parede celular. Os dados de pesquisas sugerem que os polifenóis podem

agir na prevenção do câncer, como antiinfecciosos, antioxidantes, atuarem em nível

hormonal, na indução de enzimas em nossa defesa química, na coagulação sangüínea e no

sistema vascular, entre inúmeras outras propriedades (Dragsted, 2003).

Ao testarmos a capacidade de seqüestramento de radicais, observamos atividade

antioxidante da fração metanólica, extrato etanólico e fração clorofórmica (em ordem

decrescente de atividade) de S. casarettoi. A fração hexânica não foi testada devido à sua

baixa concentração de polifenóis. A fração metanólica teve a mais alta concentração de

polifenóis e também foi a fração com melhor capacidade antioxidante, demonstrando

correlação entre esses dois grupos de dados, sugerindo que os polifenóis são os

responsáveis pela atividade antioxidante nessa fração. Já no extrato etanólico, podemos

sugerir que os polifenóis são parcialmente responsáveis pela atividade antioxidante (não

houve correlação). Adicionalmente, nesse extrato há uma mistura maior de substâncias,

podendo conter compostos que estejam atuando como pró-oxidantes, tais como as lactonas

sesquiterpênicas. A fração clorofórmica demonstrou uma baixa capacidade antioxidante e

foi excluída dos testes subseqüentes.

Os lipídeos das membranas celulares e das organelas subcelulares são altamente

suscetíveis ao dano provocado por radicais livres. Quando os lipídeos reagem com radicais

livres, podem sofrer peroxidação, uma reação em cadeia grandemente prejudicial para o

funcionamento da célula, que provoca efeitos diretos e indiretos. Com essa reação, muitos

subprodutos são gerados, acarretando efeitos em áreas longe daquelas onde surgiram,

atuando como mensageiros secundários (Devasagayam et al., 2004). Muitas pesquisas têm

demonstrado que o ferro é um iniciador de oxidações envolvendo radicais livres, como a

lipoperoxidação (Qian & Buettner, 1999). Nós também constatamos um aumento na

geração de TBARS (espécies reativas de ácido tiobarbitúrico), na presença de ferro.

Entretanto, a fração metanólica de S. casarettoi preveniu a lipoperoxidação, demonstrando

atividade antioxidante de maneira dose dependente e confirmando a melhor capacidade

antioxidante entre os extratos testados. O extrato etanólico preveniu o dano causado pelo

ferro somente em uma concentração baixa. Provavelmente não tenhamos observado o efeito

antioxidante em concentração maior, novamente devido ao aumento da concentração de

outros compostos que possam ter agido como pró-oxidantes.

O vazamento extracelular de LDH foi utilizado para quantificar dano celular em

fatias de fígado de camundongos. A fração metanólica de S. casarettoi diminuiu

significativamente o extravasamento dessa enzima, sugerindo uma propriedade

citoprotetora. Esse efeito pode ter ocorrido devido à ação estabilizadora dos polifenóis na

membrana celular, pois tais compostos podem interagir com essas membranas aumentando

sua fluidez e protegendo-as da peroxidação dos lipídeos e da oxidação de proteínas (Saija et

al., 1995; Arora et al., 2000). O extrato etanólico demonstrou efeito citoprotetor em alta

concentração. É possível que esse extrato não seja citoprotetor nesse modelo de

experimento e que os resultados sejam devidos à deficiência na medida da atividade

enzimática, a qual pode ser inibida por lactonas sesquiterpênicas, bem como o são outras

enzimas que possuem grupamento tiol (Hall et al., 1980).

7. CONCLUSÕES

Conclusão geral

Foram descritas atividades antitumoral, antimalárica e antioxidante para o extrato

bruto e frações de inflorescência de S. casarettoi Robinson.

Conclusões específicas

1. O extrato etanólico e as frações clorofórmica, enriquecida de lactonas

sesquiterpênicas e as manchas de cromatogragia C

, C

e C

, demonstraram atividade

antiproliferativa em linhagens tumorais e fibroblastos.

2. O extrato etanólico não demonstrou atividades antibacteriana e antifúngica nos

ensaios utilizados.

3. O extrato etanólico e a fração clorofórmica demonstraram atividade antimalárica

significativa in vitro e in vivo.

4. O extrato etanólico e a fração metanólica demonstraram atividade antioxidante

nos modelos testados.

Comentários Finais

Desde os tempos mais remotos, a natureza tem desempenhado um papel crítico na

sobrevivência do homem no planeta. As plantas, desde a antigüidade, têm sido utilizadas na

prevenção e tratamento de doenças, bem como para solucionar problemas de diversas

naturezas, por exemplo, no combate à infertilidade, para afugentar animais, em rituais

religiosos etc. Nos dias atuais as plantas continuam sendo fundamentais para a

sobrevivência humana. Além de outros auxílios, já forneceram várias moléculas, ou

modelos de moléculas, utilizadas no tratamento de uma ampla variedade de doenças. A

maioria dessas moléculas é metabólitos secundários, dos quais, no mínimo 12 000 foram

isolados, um número que se estima ser menos de 10% do total (Cowan, 1999).

Nesse sentido, investigamos a espécie S. casarettoi, nativa do Rio Grande do Sul, e

cujas propriedades biológicas nunca tinham sido estudadas. Em resumo, sugerimos que o

extrato etanólico e as frações clorofórmica, enriquecida de lactonas sesquiterpênicas e as

manchas de cromatografia C

, C

e C

, de inflorescência de S. casarettoi, demonstraram

atividade antiproliferativa in vitro. Considerando que o extrato e as frações foram ativos em

concentrações relativamente baixas, estudos adicionais são necessários para completar o

isolamento e a caracterização dos componentes ativos e definir melhor seu potencial

terapêutico.

Apesar de espécies do gênero Eupatorium terem demonstrado atividade contra

microorganismos, o extrato etanólico de inflorescência de S. casarettoi não demonstrou

atividades antibacteriana e antifúngica in vitro. O extrato etanólico e a fração clorofórmica

e em menor intensidade, a fração hexânica, demonstraram atividade antimalárica in vitro e

in vivo. Também nesse caso, a atividade foi verificada com concentrações dos extratos

relativamente baixas, inclusive nos experimentos in vivo. A continuidade do isolamento

bioguiado é necessária para a identificação do (s) composto (s) responsáveis pela atividade

antimalárica.

Ainda outra propriedade biológica foi verificada: o extrato etanólico e a fração

metanólica de inflorescência de S. casarettoi demonstraram capacidade antioxidante in

vitro e ex vivo. A fração metanólica, que não demonstrou atividade relacionada com morte

celular (nos experimentos antiproliferativos e antimaláricos), teve o melhor efeito

antioxidante entre o extrato e as frações testadas, sugerindo um efeito preventivo de dano

celular e citoprotetor.

Embora preliminares, os resultados descritos nessa tese podem ter relevância para o

desenvolvimento de novos fármacos com diferentes aplicações terapêuticas. Nesse sentido,

estudos estão sendo elaborados com o intuito de elucidar as estruturas dos compostos

responsáveis pelas atividades descritas.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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106

9. ANEXOS

9.1. Lista de Figuras

Artigo 1

Figura 1 – Porcentagem de crescimento celular (médias ± DP, n=9) na H-460 carcinoma de

pulmão de células não pequenas e HT-29 carcinoma coloretal, após tratamento de 72h com

extrato etanólico de S. casarettoi.

Figura 2 – Distribuição das fases do ciclo celular (% de células; médias ± DP, n ≥ 9) na

MCF-7 carcinoma de mama e em fibroblastos humanos normais, após tratamento por 72h

com a mancha de cromatografia C

da fração enriquecida de lactonas sesquiterpênicas de S.

casarettoi.

Artigo 2

Figura 1 – Inibição do crescimento de P. falciparum (strain W2) in vitro, incubado com

extrato etanólico de S. casarettoi e dose da concentração inibitória (IC

) em um

experimento representativo.

107

9.2. Lista de Tabelas

Artigo 1

Tabela 1 – Valores de IC

(µg/ml; médias ± DP; n=9) em cinco linhagens celulares após

tratamento por 72h com as frações hexânica, clorofórmica, metanólica e enriquecida de

lactonas sesquiterpênicas de S. casarettoi.

Tabela 2 – Valores de IC

(µg/ml; médias ± DP; n=9) em cinco linhagens celulares,

fibroblastos e linfócitos, após tratamento por 72h com as manchas de cromatografia C

, C

e C

da fração enriquecida de lactonas sesquiterpênicas de S. casarettoi.

Tabela 3 – Análise fitoquímica de inflorescências de S. casarettoi.

Artigo 2

Tabela 1 – Atividade antimalárica in vivo do extrato etanólico de S. casarettoi em

camundongos infectados com P. berghei. Os resultados são representativos de

experimentos feitos em triplicata.

Tabela 2 – Inibição do crescimento (%) in vitro de P. falciparum (linhagens W2 e BHZ)

incubadas com as frações hexânica, clorofórmica e metanólica de S. casarettoi.

108

Artigo 3

Tabela 1 – Conteúdo total de polifenóis do extrato etanólico e das frações metanólica e

clorofórmica de S. casarettoi e suas propriedades antioxidantes (TRAP). Os resultados do

conteúdo total de polifenóis foram expressos como mg/g do extrato e os dados do TRAP

foram expressos como capacidade equivalente de trolox (TEAC). Os experimentos foram

feitos em triplicata.

Tabela 2 – Efeito do extrato etanólico e da fração metanólica de S. casarettoi na

lipoperoxidação induzida por ferro (TBARS) e no extravasamento de LDH. Os resultados

de TBARS foram expressos como equivalentes de MDA (nmol/mg proteína) ± DP e em

extravasamento de LDH foram expressos como U LDH/µg proteína ± DP. As doses para o

extrato e a fração foram a menor concentração com atividade antioxidante no experimento

TRAP. Os dados são representativos de três experimentos independentes, feitos em

triplicata.

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