( PDF ) Caracterização molecular de um luteoviridae associado à doença azul do algodoeiro identificação de fatores de patogenicidade na família viral envolvidos com a supressão de silenciamento por RNA

Download PDF

ads:

Universidade Federal do Rio de Janeiro

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM

LUTEOVIRIDAE ASSOCIADO À DOENÇA AZUL DO

ALGODOEIRO E IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE

PATOGENICIDADE NA FAMÍLIA VIRAL ENVOLVIDOS

COM A SUPRESSÃO DE SILENCIAMENTO POR RNA

Régis Lopes Corrêa

2008

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM LUTEOVIRIDAE ASSOCIADO À

DOENÇA AZUL DO ALGODOEIRO E IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE

PATOGENICIDADE NA FAMÍLIA VIRAL ENVOLVIDOS COM A SUPRESSÃO

DE SILENCIAMENTO POR RNA

Régis Lopes Corrêa

Rio de Janeiro

Fevereiro de 2008

Tese de Doutorado apresentada ao Programa

de Pós-graduação em Ciências

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia

Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal

do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de Doutor em

Ciências (Microbiologia).

Orientadora

Dra. Maité Vaslin de Freitas Silva

Co-orientador

Dr. Peter Waterhouse

ads:

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM LUTEOVIRIDAE ASSOCIADO À

DOENÇA AZUL DO ALGODOEIRO E IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE

PATOGENICIDADE NA FAMÍLIA VIRAL ENVOLVIDOS COM A SUPRESSÃO

DE SILENCIAMENTO POR RNA

Régis Lopes Corrêa

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal

do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em

Ciências (Microbiologia).

Aprovada por:

_______________________________

Presidente, Prof. Maité Vaslin de Freitas Silva

_______________________________

Prof. Davis Ferreira

_______________________________

Prof. Francisco Murilo Zerbini

_______________________________

Prof. Luciana Jesus da Costa

_______________________________

Prof. Renato de Oliveira Resende

_______________________________

Prof. Marcelo Bozza

_______________________________

Prof. Paulo Cavalcanti Gomes Ferreira

Rio de Janeiro

Fevereiro de 2008

iii

Corrêa, Régis Lopes.

Caracterização Molecular de um Luteoviridae associado com a doença

azul do algodoeiro e identificação de fatores de patogenicidade na família

viral envolvidos com a supressão de silenciamento por RNA/ Régis Lopes

Corrêa.- Rio de Janeiro: UFRJ/ IMPPG, 2008.

xi, 166f.: il.; 31 cm.

Orientador: Maité Vaslin de Freitas Silva

Tese (doutorado) – UFRJ/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes/Programa de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), 2008.

Referências Bibliográficas: f. 140-161.

1. Doença azul do algodoeiro. 2. Cotton leafroll dwarf virus. 3.

Luteoviridae. 4. Polerovirus. 5. Luteovirus. 6. Enamovirus. 7. Silenciamento

gênico. 8. Supressão viral de silenciamento. 9. RNAi. 10. Potato leafroll

virus. 11. Pea enation mosaic virus-1. 12. Argonautes. 13. Arabidopsis

thaliana. I. Vaslin, Maité Freitas Silva. II. Universidade Federal do Rio de

Janeiro,

Microbiologia Prof. Paulo de Góes/Programa de Pós-graduação em Ciências

(Microbiologia). I

II. Título.

RESUMO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM LUTEOVIRIDAE ASSOCIADO À

DOENÇA AZUL DO ALGODOEIRO E IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE

PATOGENICIDADE NA FAMÍLIA VIRAL ENVOLVIDOS COM A SUPRESSÃO DE

SILENCIAMENTO POR RNA

A família viral Luteoviridae é dividida nos gêneros Luteovirus, Polerovirus e

Enamovirus, todos apresentando genoma de RNA fita simples positiva. Nesse trabalho,

oligonucleotídeos degenerados foram desenhados com o intuito de identificar membros

desse grupo viral associados com a doença azul do algodoeiro. A doença azul é transmitida

pelo afídeo Aphis gossypii e causa danos à agricultura em diversas partes do mundo.

Reações de RT-PCR foram capazes de amplificar um fragmento em plantas doentes

utilizando-se oligos específicos para o gênero Polerovirus. A análise das seqüências obtidas

indica que o vírus, denominado Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), deve ser considerado

um membro definitivo do gênero Polerovirus. Para melhor entender a biologia dessa

família viral, uma busca por genes supressores de silenciamento por RNA foi realizada.

Silenciamento gênico é um mecanismo de controle da expressão gênica conservado em

diversos reinos biológicos e, em plantas, está associado com a defesa antiviral. Nenhuma

supressora foi encontrada no gênero Luteovirus. No entanto, a P0 do Enamovirus apresenta

atividade supressora, assim como já tinha sido observado para membros do gênero

Polerovirus. A expressão dessa proteína em Arabidopsis causa alterações no

desenvolvimento da planta que estão associados com redução nos níveis de pequenos

RNAs endógenos e aumento na concentração de seus alvos. Foi observado também que a

P0 interage com SKIP2 e que sua atuação depende de um domínio tipo F-Box. Dados

indicam que a proteína suprime a resposta antiviral através da indução da degradação de

genes importantes no processo, tais como Argonaute e Dicer.

Palavras-chave: doença azul do algodoeiro; Luteoviridae; RNAi; ubiqüitinação.

Rio de Janeiro

Fevereiro de 2008

ABSTRACT

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF A LUTEOVIRIDAE ASSOCIATED WITH

COTTON BLUE DISEASE AND IDENTIFICATION OF FACTORS IN THE FAMILY

INVOLVED WITH SUPPRESSION OF RNA SILENCING

The family Luteoviridae is grouped in three genera: Luteovirus, Polerovirus and

Enamovirus and all members have positive single-stranded RNA genomes. In this work

degenerated primers were designed to identify members of this family associated with

cotton blue disease. Blue disease is transmitted by the aphid Aphis gossypii and causes

economically important losses in cotton crops around the world. Polerovirus-specific

primers were able to amplify part of the genome of a virus associated with this disease.

Sequence analysis indicates that the named Cotton leafroll dwarf virus (CLDV) should be

considered as a permanent member of the genus Polerovirus. To help understanding the

biology of this group of virus, a search for suppressors of RNA silencing in the family was

also done. Gene silencing is a conserved mechanism for controlling gene expression and in

plants is associated with viral defense. No suppressor was found in the genus Luteovirus.

However, the P0 from the Enamovirus proved to be a strong suppressor of silencing, as

already stated for P0s of the genus Polerovirus. Expression of the suppressor in

Arabidopsis induced several developmental problems that were associated with a reduction

in the levels of endogenous small RNAs and an increase in the level of their targets. It was

also observed that the action of P0 depends on the interaction with the SKIP2 through an F-

Box-like domain. It is proposed that the P0 protein from the Enamovirus group is able to

suppress gene silencing by targeting Argonaute and Dicers proteins for degradation.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Valdira e Walkyrio, por toda educação, apoio incondicional e

suporte para completar mais essa etapa acadêmica.

Aos meus irmãos, Marcelo e Milena, pela amizade, apoio e alegrias que trazem para

a minha vida.

À minha orientadora, Maité Vaslin, por ter-me “criado” desde os primórdios da

iniciação científica. Por todas as etapas e momentos vividos. Por todo conhecimento

transmitido, tanto profissional, quanto pessoal. Pela confiança em meu trabalho. Pela

oportunidade de trabalhar nesse belo projeto de tese. Pelo exemplo de determinação

profissional e de vida.

À Márcia Vidal pelo suporte teórico, técnico e financeiro nas fases iniciais do

projeto.

I would like to thank my supervisor Dr. Peter Waterhouse for the opportunity to join

his group at CSIRO. I am deeply indebted for all scientific, laboratorial and personal

support he gave me in Australia. His expertise and passion for science have influenced me

greatly.

Aos demais professores do LGMV Gilberto Sachetto, Márcia Margis, Márcio

Ferreira e Rogério Margis pelo suporte material e teórico, discussões e pelo constante

exemplo de amor e dedicação à ciência.

Ao Dr. Jean Araújo por disponibilizar o seqüenciador automático de DNA.

Aos doutores Jean Belot, Nelson Suassuna, Paulo Barroso e Pierre Silvie pela

colaboração e envio de plantas para o início do projeto da doença azul.

Aos grandes amigos que passaram na “família LGMV” ao longo desses quatro anos,

em especial para Alexandre, Adriana Arongaus (Adrianinha), Adriana Menezes

(Adrianinhaninha), Aline, Anna Cristina, Danilo, Elisson Romanel, Emília Pires, Érica

Duarte, Fabiano Salgueiro, Fátima, Felipe Karan, Fernanda Cruz (@hotmail.com), Graça,

Isabel, Itamar, Kelly, Lina, Luis, Mariana, Roberto, Tati, Vanessa Cardeal, Vinícius e

Yamá.

Aos técnicos do LGMV Fátima, Itamar e Luis por todo o imprescindível auxílio

laboratorial.

À Kelly por sua competência na administração do laboratório.

vii

À Tatiane Franca pela excelente companhia profissional e pessoal ao longo dos

quatro anos. Pelas conversas, minipreps, PCRs, clonagens etc. Pela continuação do estudo

da doença azul no Brasil. Por não levar a sério nenhuma das milhares de brincadeiras que

falava quase que diariamente. E, claro, pela oportunidade única de visitar o

internacionalmente conhecido “Palácio do 400”.

Ao grande companheiro Felipe Karam pela eterna disponibilidade em discutir

detalhadamente cada micro resultado da tese. Por todas as sugestões que contribuíram

significativamente para o aumento da qualidade do trabalho. Pela ajuda na busca da

resposta para a pergunta mais primordial de todo cientista brasileiro: “existe vida após o

doutorado?”.

Ao camarada Elisson Romanel pela amizade e por todas as discussões sobre

trabalho, ciência e filosofia.

I am deeply thankful to all members of CSIRO Plant Industry for availability to help

anytime I needed. The friendly and supportive atmosphere inherent to the whole Plant

Industry group contributed greatly to my personal and professional progress. My special

thanks go to Adriana Fusaro, Adriane Machado, Andrew Eamens, Carl Davis, Chris

Helliwell, Craig Wood, Donna Bond, Geoff Ellacott, Janice Norman, Judith Gaudron, Jean

Finnegan, John Watson, José Maria Barrero, Limin Wu, Liz Dennis, Louisa Matthew,

Mark Talbot, Masumi Robertson, Ming-Bo Wang, Niel Smith, Narayana Upadhyaya, Peter

Waterhouse and Rosemary White.

À Adriana Fusaro tenho profunda e eterna gratidão por toda ajuda que me deu para

concretizar o sonho de ir à Austrália. Pela força na adaptação ao novo país e ao novo

laboratório. Pelos momentos de alegria. Pelo consolo nos momentos de tristeza. Por me

ensinar grande parte das técnicas que aprendi na Austrália, incluindo “o grande mundo dos

pequenos RNAs”. Por acreditar e abraçar o projeto da P0. Pelos de experimentos de

northern blot, western blot, agro-infiltração, PCR em tempo real e imunoprecipitação que

realizou para a tese e para o artigo que será submetido. Pelo exemplo de ser humano e de

vida.

I am particularly grateful to Dr. Masumi Robertson for helping me with the yeast

two hybrid experiments; Shaun Curtin for providing protocols, plasmids, clones and

knowlodgment during all my stay in Australia; Dr. Craig Wood for providing protocols and

viii

tips for FLAG immunoprecipitation; Dr. Rosemary White and Dr. Mark Talbot for

excellent microscope support; Kerrie Ramm for teaching me how to bombard onion cells

with GFP and Geoff Ellacott for support with Arabidopsis work.

A los nuevos amigos aussie-hablantes que conocí en Austrália. Estoy muy

agradecido a Agustín Zsogon, José Maria Barrero, Juan Pablo, Lucía Yañez, Luciana

Porfírio, Marga Garcia, Maria Alonso, Hernano Alonso (Nano) y Salva Herrero por todos

los momentos mágicos que tuvimos juntos alli. Gracias por todas las conversaciones,

apoyo, viajes, fiestas, wine tastings, cafés, cenas, bailes, acrobacias, buen humor, la lengua

española y gallega, películas, cines, woolis, helados, pubs, canciones, salsa, cultura, Tato,

campings, patatas (o papas) de limón, abrazos, besos, palabras, en fin por todos los

capítulos compartidos en el gran libro de la vida. Amigos para siempre!

Aos amigos da vida, de todas as épocas: Alvim, Caroço, Claire, Guerra, Kátia,

Leco, Léo, Levedo, Patrícia, Roberta Rodrigues (Robertinha) e Rodrigo Barros. Obrigado

por todo apoio incondicional.

Aos amigos de caminhadas, por todas as conversas, por todos os desafios vencidos e

a serem vencidos. Em especial para Allyson, Ana Diório, Clara, Fernanda Mandarini,

Henrique Castelletti, João, José Luis, Luis Cristo, Paulo, Wanderley e Zélia.

SUMÁRIO

Resumo iv

Abstract v

Lista de Abreviaturas 001

Lista de Figuras 002

Lista de Tabelas 004

Capítulo I 005

I.1 Introdução 006

I.1.1 Cultura do algodão 006

I.1.2 Doença azul 007

I.1.3 Família Luteoviridae 009

I.2 Objetivos 016

I.3 Material e Métodos 018

I.3.1 Propagação viral em casa de vegetação 018

I.3.2 Desenho de oligonucleotídeos 018

I.3.3 Amplificação do genoma viral por PCR 020

I.3.4 Clonagem dos fragmentos amplificados em vetores

pGEMT-Easy 020

I.3.5 Seqüenciamento de nucleotídeos 021

I.3.6 Análise das seqüências de nucleotídeos 021

I.3.7 Southern blot 022

I.3.8 Northern blot 023

I.4 Resultados 025

I.4.1 Reprodução dos sintomas da doença azul em

casa de vegetação 025

I.4.2 Identificação do Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), um

Polerovirus associado à doença azul do algodoeiro 027

I.4.3 Seqüências da proteína do movimento, polimerase e

região intergênica 035

I.4.4 Proteína de transmissão 036

I.4.5 Diagnóstico molecular da doença azul 038

I.4.6 Detecção por northern blot 041

I.5 Discussão e Perspectivas 044

I.6 Conclusões 050

Capítulo II 050

II.1 Introdução 052

II.1.1 Silenciamento gênico por RNA em animais 053

II.1.1.1 Via dos siRNAs em animais 054

II.1.1.2 Via dos microRNAs em animais 056

II.1.2 Silenciamento gênico em plantas 060

II.1.2.1 Silenciamento gênico pós-transcricional 062

II.1.2.1.1 Descoberta e indução 062

II.1.2.1.2 Manutenção da degradação 065

II.1.2.1.3 Amplificação e transitividade 067

II.1.2.2 Silenciamento gênico transcricional 068

II.1.2.3 Via de microRNAs 069

II.1.2.4 Via de tasiRNAs 072

II.1.2.5 Via de disseminação da RNAi 075

II.1.3 Supressão de silenciamento gênico 077

II.1.3.1 Identificação de supressores 078

II.1.3.2 Supressores de silenciamento bem caracterizados 079

II.1.3.2.1 HC-Pro 080

II.1.3.2.2 P19 081

II.1.3.2.3 2b 081

II.1.3.3 Supressores de silenciamento na família Luteoviridae 082

II.2 Objetivos 086

II.3 Material e Métodos 088

II.3.1 Obtenção das construções plasmidiais: clonagens

GATEWAY 088

II.3.2 Mutagênese via PCR 092

II.3.3 Agro-Infiltração em Nicotiana benthamiana 095

II.3.4 Transformação de Arabidopsis thaliana 095

II.3.5 Northern blot 096

II.3.6 Detecção de pequenos RNAs 096

II.3.7 Co-Imunoprecipitação 098

II.3.8 Western blot 099

II.3.9 PCR em tempo real 100

II.3.10 Duplo híbrido em leveduras 102

II.3.11 Bombardeamento em célula de cebola 103

II.3.12 Microscopia ótica 104

II.3.13 Microscopia eletrônica de varredura 104

II.4 Resultados 106

II.4.1 Procura de novas proteínas supressoras de

silenciamento na família Luteoviridae 106

II.4.2 PEP0 atua como uma proteína F-Box 109

II.4.3 Expressão das supressoras PLP0 e PEP0 em

Arabidopsis thaliana 114

II.4.4 Supressoras PLP0 e PEP0 alteram acúmulo e

função dos pequenos RNAs 120

II.4.5 PLP0 e PEP0 desestabilizam AGO1 126

II.4.6 PEP0 interage com DCL1, AGO4, AGO6 e DRB5 128

II.4.7 PLP0 e PEP0 apresentam localização nuclear 130

II.5 Discussão e Perspectivas 133

II.6 Conclusões 142

Referências bibliográficas 144

LISTA DE ABREVIATURAS

A – adenina

b - base

C – citosina

cDNA – DNA complementar

Da - dalton

DNA – Ácido desoxirribonucléico

dNTP – desoxirribonucleotídeos trifosfato

EDTA – ácido etilenodianimotetracético

g – grama

G – guanina

k – quilo

L – litro

m - mili

M – molar

n – nano

N – qualquer nucleotídeo

nt – nucleotídeo

ºC – graus Celsius

p – pico

pb – par de base

PCR – reação da polimerase em cadeia

pH – potencial hidrogenionte

RNA – ácido ribonucléico

RPM – rotações por minuto

SDS – dodecil sulfato de sódio

T – timina

U – uracila

UV – ultravioleta

µ − micro

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1: Esquema do genoma dos gêneros Luteovirus, Polerovirus

e Enamovirus 012

Figura 2: Sintomas da doença azul do algodoeiro reproduzidos em casa

de vegetação via inoculação com o inseto transmissor

Aphis gossypii 026

Figura 3: Representação esquemática do genoma dos Polerovirus 028

Figura 4: Amplificação parcial do genoma do CLRDV 028

Figura 5: Alinhamento da seqüência de aminoácidos da CP do CLRDV com

CPs de outros Luteoviridae 032

Figura 6: Análise filogenética do CLRDV e outros membros da família

Luteoviridae 034

Figura 7: Filogenia com parte da proteína de transmissão (ORF5) do

CLRDV e demais membros da família Luteoviridae 037

Figura 8: Desenho de oligos específicos para o diagnóstico molecular

do CLRDV 039

Figura 9: Eficiência do diagnóstico molecular para a doença azul 040

Figura 10: Detecção do RNA genômico do CLRDV por Northern blot

em plantas apresentando sintomas da doença azul 042

Figura 11: Principais vias de silenciamento por RNA em plantas 061

Figura 12: Vetores de destino GATEWAY 091

Figura 13: Estratégia para a introdução de mutações pontuais na P0 do

Pea enation mosaic virus-1. 094

Figura 14: Identificação de possíveis proteínas supressoras de silenciamento

no gênero Luteovirus. 107

Figura 15: P0 do Pea enation mosaic virus-1 é uma supressora de

silenciamento gênico e atua através de um domínio tipo F-Box 108

Figura 16: Mutações pontuais no domínio F-Box da P0 do

Pea enation mosaic virus-1. 110

Figura 17: Infiltração de P0 do Pea enation mosaic virus-1 em

N. benthamiana 16c elimina siRNAs. 112

Figura 18: P0 do Pea enation mosiac virus-1 interage com SKIP2 de

Arabidopsis 113

Figura 19:

Alteração no desenvolvimento vegetal de plantas de Arabidopsis

thaliana transformadas com o gene P0 do Potato leafroll virus

116

Figura 20: Alteração no desenvolvimento vegetal de plantas de Arabidopsis

thaliana transformadas com o gene P0 do

Pea enation mosaic virus-1. 119

Figura 21: Acúmulo de pequenos RNAs em plantas de Arabidosis thaliana

expressando as supressoras P0 do Potato leafroll virus e P0 do

Pea enation mosaic virus-1 123

Figura 22: Acúmulo dos alvos dos pequenos RNAs em plantas de

Arabidopsis thaliana expressando as supressoras P0 do

Potato leafroll virus e P0 do Pea enation mosaic virus-1 124

Figura 23: Detecção do acúmulo de mRNA do gene AGO1 em plantas

transgênicas de Arabidopsis thaliana expressando P0 do

Potato leafroll virus ou P0 do Pea enation mosaic virus-1. 125

Figura 24: Avaliação da expressão das supressoras P0 do

Potato leafroll virus e P0 do Pea enation mosaic virus-1

no acúmulo de AGO1 127

Figura 25: Duplo híbrido em leveduras mostrando a interação de P0 do

Pea enation mosaic virus-1 com proteínas da via de silenciamento

por RNA 129

Figura 26: Bombardeamento de células de cebola com os genes

PLP0, PEP0 e PEP0∆LPP fusionados com a sequência

codificadora da GFP 131

Figura 27: Modelo proposto por Baumberger et al., 2007 para a

restrição dos Polerovirus ao floema 138

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Oligonucleotídeos desenhados para amplificar o genoma do vírus associado

com a doença azul do algodoeiro baseado no alinhameto completo de

membros da família viral Luteoviridae 019

Tabela 2: Identidade entre seqüências de aminoácidos do capsídeo (CP),

proteína do movimento (MP) e polimerase (RdRp) do CLRDV

e regiões correspondentes em outros luteovirus 031

Capítulo I

_________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO

I.1 – Introdução

I.1.1 – Cultura do algodão

O algodão (Gossypium hirsutum L.) é uma planta dicotiledônea da família

Malvaceae de porte arbóreo ou herbáceo. Há indícios de que sua domesticação para

fabricação de tecidos se iniciou na índia, cerca de 3.500 anos atrás. Atualmente, a China, os

Estados Unidos e Índia são os maiores produtores, respondendo por mais de 60% da

produção mundial, segundo dados do departamento de agricultura Norte Americano. O

Brasil é o quinto maior produtor, logo após o Paquistão. O país também se encontra entre

os cinco maiores exportadores da fibra, atrás dos Estados Unidos, Uzbequistão, Índia e

Austrália.

A cotonicultura nacional iniciou-se no Nordeste e em seguida migrou para regiões

do Sudeste, especialmente no estado de São Paulo (Buainain & Batalha, 2007). Nos últimos

17 anos, no entanto, houve uma migração da atividade para áreas do cerrado, especialmente

no Centro-Oeste. Houve também, nas últimas décadas, uma grande mudança no perfil de

produção. O cultivo do algodão deixou de ser baseado na pequena propriedade e no regime

familiar, passando a ser realizado em grandes plantações, com áreas que se estendem de

100 a 3.000 hectares (Buainain & Batalha, 2007). Além disso, uma alta mecanização foi

introduzida, contando com o emprego de adubação, herbicidas, fungicidas, inseticidas e

reguladores de crescimento.

O cultivo do algodão no Brasil tem hoje um importante impacto sócio-econômico.

Estima-se, por exemplo, que na safra 2006/2007, o cultivo da planta represente 2.7% do

Produto Interno Bruto (PIB) do agronegócio nacional e irá gerar mais de 430 mil empregos

(Corrêa, 2007). Segundo estimativas da Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), a

safra 2006/2007 deverá ser 40% maior do que a obtida no ano anterior e representará um

recorde para a produção brasileira, com exportações atingindo 470 mil toneladas de pluma.

Os estados de Mato Grosso, Bahia e Goiás são atualmente os maiores produtores

nacionais, somando sozinhos cerca de 90% de todo o algodão processado. Por ser

produzido prioritariamente em zonas de cerrado, diversas variedades de algodão adaptadas

a esse tipo de ambiente já foram desenvolvidas. Entre elas, a ITA-90 é uma das mais

cultivadas (Freire, 1998). Esta variedade apresenta alta produtividade e fornece uma fibra

que atende padrões nacionais e internacionais de consumo. No entanto, a variedade

apresenta alta susceptibilidade a viroses e outros agentes infecciosos.

I.1.2 - Doença azul

Existem seis patógenos economicamente importantes nas plantações de algodão ao

redor do mundo, sendo quatro deles de origem viral (Cia & Salgado, 1997). As doenças do

algodoeiro reduzem sensivelmente a produtividade e geram de moderadas a graves perdas

econômicas. No Brasil, quatro doenças já foram relacionadas com viroses: o mosaico

comum, causado pelo Abutilon mosaic virus (AbMV), um Geminivirus transmitido por

mosca branca (Bemisia tabaci); o mosaico tardio, causado pelo Tobacco streak virus

(TSV), um Bromovirus; o vermelhão, causado pelo Cotton anthocyanosis virus (CAV) e o

mosaico das nervuras ou doença azul, cujo vírus responsável ainda não havia sido

identificado até o início deste trabalho.

A doença azul é transmitida pelo pulgão Aphis gossypii e os sintomas caracterizam-

se pela redução do porte devido ao encurtamento dos entrenós, presença de mosaico/

amarelecimento nas nervuras, folhas rugosas e com curvatura nos bordos, enrolamento das

folhas em sua superfície inferior, associados a uma coloração verde-escura com tonalidade

azulada. A folha adquire uma consistência quebradiça ao toque e os órgãos florais e

frutíferos se reduzem em tamanho e número, podendo, em alguns casos, serem abortados

ou a planta apresentar esterilidade total (Cauquil & Vaissayre, 1971; Takimoto, 2003). A

gravidade dos sintomas depende em grande parte da idade de infecção e também do estado

fisiológico da planta (Takimoto, 2003; Michelotto & Busoli, 2006). Em casos extremos de

infecções precoces e intensas as plantas podem reduzir seu porte normal e tornarem-se

rasteiras (Cia & Salgado 1997).

A doença azul foi pela primeira vez descrita em campos de cultivo na República

Centro-Africana, em 1949 (Cauquil & Vaissayre 1971). Vinte anos mais tarde houve

relatos de severas perdas em várias regiões da África. Sintomas semelhantes aos

encontrados na África foram relatados também nas Filipinas em 1963, na Tailândia e no

Paraguai em 1977 (Halliwell e Cauquil, 1981), na Argentina, em diversas regiões da África

(Tchad, Camarões, Zaire, Benin) e na antiga União Soviética (Azerbaijão, Turquistão,

Armênia) (Cauquil, 1977). Ainda não se sabe ao certo, no entanto, quando a doença foi

detectada pela primeira vez no Brasil. Em 1937, uma doença do algodoeiro chamada de

mosaico das nervuras foi identificada (Costa & Foster, 1938). Posteriormente, em 1962, foi

detectada uma outra doença que apresentava sintomas parecidos com o mosaico das

nervuras, porém muito mais severos (Costa & Carvalho, 1962). Essa doença foi chamada

de mosaico das nervuras - Ribeirão Bonito, nome da cidade onde foi observada pela

primeira vez. Acreditava-se que a variante Ribeirão Bonito era uma forma mais virulenta da

mesma doença observada em 1937. Mais ou menos ao mesmo tempo, na década de 60,

sintomas semelhantes foram observados em outros países da América do Sul, onde

receberam o nome de “enfermedad azul” ou “mal de misiones”. No entanto, essas doenças

observadas na América apresentavam sintomas muito semelhantes aos descritos para a

doença azul no resto do mundo. Além disso, a transmissão ocorria através do mesmo vetor,

o pulgão Aphis Gossypii. Esses dados evidenciaram que as doenças observadas no

continente americano eram, na realidade, a mesma doença e que estavam fortemente

relacionadas com a doença azul identificada em campos africanos desde 1949.

A doença azul é um problema fitopatológico importante no Brasil, especialmente

pela utilização de variedades de algodão susceptíveis à virose, como as CNPA ITA-90 e

Deltapine Acala 90. Perdas severas decorrentes da doença já foram relatadas no território

brasileiro e no Paraguai (Freire, 1998). Por exemplo, na safra 1997/1998 registrou-se uma

perda de 34 mil toneladas de pluma em função da doença. Reduções de até 90% na

produção por planta também já foram observadas em algumas safras (Freire, 1998). A

forma de controle mais comumente adotada pelos agricultores é a redução das populações

de pulgões. Recomenda-se nunca permitir que a população dos insetos passe de 10% de

plantas infestadas nos primeiros 100 dias após a germinação das plantas. Em seguida,

recomenda-se manter as populações em torno de 30% de plantas infestadas, até o fim da

colheita. Dessa forma, mesmo não havendo surto da doença em determinadas safras, o

controle dos pulgões ocasionam um aumento no custo de produção. Outra estratégia

adotada é o uso de variedades de algodão com resistência natural à doença azul. Cultivares

nacionais e importadas resistentes à virose, tais como CEDRO, DeltaOpal e CD404, já

estão disponíveis no mercado. Além disso, recomenda-se o controle de plantas daninhas e a

rotação de culturas.

Os sintomas descritos para a doença azul são muito semelhantes aos sintomas

observados para viroses causadas por membros da família Luteoviridae. De fato, testes

sorológicos em plantas doentes apresentaram reação positiva para o Barley yellow dwarf

virus RPV (BYDV-RPV), Barley yellow dwarf virus PAV (BYDV-PAV) (Lenardon, 1994)

e para o Beet western yellows virus (BWYV) (Takimoto, 2003), três membros bem

caracterizados da família Luteoviridae.

I.1.3 – Família Luteoviridae

A família Luteoviridae é composta por vírus transmitidos por afídeos, todos

apresentando genoma de RNA fita simples com polaridade positiva, sem a presença de

cauda poli(A), encapsulados em uma partícula icosaédrica não envelopada e divididos em

três gêneros: Luteovirus, Polerovirus e Enamovirus (Mayo & Ziegler-Graff, 1996). Os

primeiros sintomas atribuídos a membros desse grupo foram relatados em plantas de batata

na Europa em 1790 (Harrison, 1999). Esses primeiros sintomas reportados possivelmente

foram causados pelo Potato leafroll virus (PLRV), o vírus tipo do gênero Polerovirus e um

dos mais bem caracterizados da família.

Uma das características mais peculiares desse grupo de vírus é a sua restrição ao

floema (Esau et al., 1967). As partículas acumulam-se principalmente no citoplasma das

células companheiras do vaso condutor e por esse motivo apresentam baixa concentração

na planta, tornando a purificação mais complexa. Assim, o desenvolvimento de anticorpos

para a detecção de membros da família ocorreu mais tarde do que para a maioria dos outros

grupos vegetais. Dados de sorologia, no entanto, permitiram um maior entendimento da

biologia desse grupo de vírus. O primeiro desafio enfrentado foi a diferenciação dos

isolados envolvidos na doença do amarelecimento da cevada. Acreditava-se que a doença

era causada por um único vírus, que foi denominado de Barley yellow dwarf virus (BYDV).

Ficou claro mais tarde, no entanto, que o amarelecimento da cevada era causado por cinco

vírus diferentes, todos distinguíveis por sorologia. Os isolados receberam o nome RPV,

RMV, MAV, SGV e PAV (Miller & Rasochová, 1997). Em função da grande diferença

entre os isolados, o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV) decidiu trocar o

nome dos isolados RPV e RMV para Cereal yellow dwarf virus (CYDV) (Miller &

Rasochová, 1997). Hoje em dia os vírus BYDV-MAV, BYDV-SGV e BYDV-PAV são

classificados dentro do gênero Luteovirus e os vírus CYDV-RPV e CYDV-RMV estão

classificados no gênero Polerovirus.

No entanto, somente após a obtenção dos primeiros genomas completos, a

taxonomia e a biologia dos membros da família passaram a ficar mais claros. O primeiro

vírus da família a ter seu genoma todo seqüenciado foi o BYDV-PAV (Miller et al., 1988).

O vírus apresenta um genoma com cerca de seis mil bases, possuindo cinco grandes fases

abertas de leitura, que foram denominadas com números de 1 a 5, comumente

representadas como ORF1 a ORF5 (ou P1 a P5, em se tratando das proteínas codificadas).

Ficou claro que o genoma é dividido em duas partes distintas, separadas por uma região

intergênica. A região 5’ apresenta genes que codificam as proteínas não estruturais e a 3’

contém os genes codificantes de proteínas estruturais (Figura 1). A região 5’ contém as

ORFs sobreopstas 1 e 2 e apresenta alta similaridade com genes envolvidos na replicação

em membros do gênero Carmovirus, da família Tombusviridae, fornecendo a primeira

evidência de que a família teria surgido de um evento de recombinação (Miller et al.,

1988). Em seguida, a obtenção dos genomas do BWYV (Veidt et al., 1988) e do PLRV

(van der Wilk et al., 1989), contribuiu ainda mais para o entendimento taxonômico e

evolutivo da família. Em linhas gerais, os dois novos genomas obtidos apresentavam uma

organização muito parecida com a do BYDV-PAV (Figura 1). No entanto, algumas

diferenças foram observadas. Os dois vírus apresentam um gene extra na porção 5’ do

genoma e este foi denominado de ORF0 (ou P0). Observou-se que a ORF0 apresenta alta

sobreposição de seqüência com a ORF1 e, assim como ocorre com o BYDV-PAV, a ORF1

dos novos genomas também está sobreposta com a ORF2. No entanto, o bloco 5’ do

genoma dos dois novos vírus apresenta similaridade com genes de replicação dos

Sobemovirus e não com os Carlavirus, como observado para o vírus da cevada. Assim,

ficou evidente que os três vírus eram muito semelhantes na região 3’ do genoma, mas que

apresentavam diferenças evolutivas importantes na porção 5’. Em seguida, o

seqüenciamento completo do genoma do RNA1 do Pea enation mosaic virus (PEMV-1)

mostrou que o mesmo tem uma organização muito semelhante à observada para o BWYV e

para o PLRV, apresentando uma ORF0 e possuindo genes de replicação semelhantes aos

Sobemovirus (Demler & Zoeten, 1991). A principal diferença estrutural observada foi a

ausência da ORF4, presente no genoma dos três vírus seqüenciados até aquele momento

(Figura 1). O PEMV-1, no entanto, apresenta características biológicas fundamentais que o

diferencia dos demais vírus. A principal delas é o fato do vírus conseguir sair do floema

durante a infecção viral. Além disso, o vírus é capaz de ser transmitido mecanicamente e

está sempre associado com um outro RNA, comumente denominado de PEMV-2. Análise

do genoma do RNA2 do PEMV mostrou que este apresenta similaridade com membros do

gênero Umbravirus (Demler et al., 1993). Foi observado ainda que os dois RNAs são

replicados de forma independente, mas que o encapsulamento do RNA2 depende de

produtos gênicos do RNA1 e que os dois RNAs são necessários para a evasão do floema e

para a transmissão mecânica (Demler et al., 1993). Acredita-se, portanto, que os RNAs1 e 2

do PEMV apresentem uma relação de simbiose durante a infecção viral.

Apesar de todas as diferenças genômicas e biológicas observadas nesses vírus, todos

eram agrupados em um único táxon denominado Luteovirus. Em 1997, no entanto, o ICTV

decidiu criar a família Luteoviridae e a dividiu nos atuais gêneros Luteovirus (tendo o

BYDV-PAV como vírus tipo), Polerovirus (tendo o PLRV como vírus tipo) e Enamovirus

(apresentando apenas o PEMV-1 como membro) (D’Arcy & Mayo, 1997). Já foram

observados também alguns vírus que são recombinantes entre os gêneros Luteovirus e

Polerovirus (Rathjen et al., 1994; Maia et al., 2000; Moonan et al., 2000; Domier et al.,

2002; Siepen et al., 2005). Nesses casos, recomendou-se usar os genes de replicação (ORF1

e ORF2) como critério para classificação. Vírus que apresentassem genes semelhantes ao

Carmovirus seriam considerados como Luteovirus e os que apresentassem genes de

replicação semelhante aos Sobemovirus seriam considerados como Polerovirus.

Figura 1: Esquema do genoma dos gêneros Luteovirus, Polerovirus e

Enamovirus. ORF0 – Supressora de silenciamento gênico; ORF 1 e ORF2 – Polimerase;

ORF3 – Proteína do capsídeo; ORF4 – Proteína de movimento; ORF3 e ORF5 – Proteína

de transmissão. Adaptado de http://www.scri.sari.ac.uk/TiPP/documents/luteo.pdf (último

acesso em março de 2006).

- Genoma com P0

- RNA com VPg

- Polimerase é tipo Sobemovirus

- Região intergênica com 200 nts

- P1 e P2 com muita sobreposição

- Genoma sem P0

- RNA sem VPg

- Polimerase é tipo Carmovirus

- Região intergênica com 100 nts

- P1 e P2 com pouca sobreposição

- Genoma como Polerovirus, mas:

- Sem P4

- Dependente de Umbravirus

Estudos funcionais dos genes presentes na família Luteoviridae evidenciaram

fascinantes mecanismos de regulação gênica. Trabalhos recentes mostraram que a proteína

PO dos Polerovirus é uma forte supressora de silenciamento gênico, um mecanismo

genético de defesa anti-viral (Pfeffer et al., 2002). A ORF1 codifica uma proteína com

função de helicase e a proteína P2 apresenta domínios típicos das polimerases de RNA

dependente de RNA. Na região de interseção entre os genes, no entanto, existe uma

seqüência rica em uracila que promove uma mudança de fase de leitura dos códons do

RNA (Prüfer et al., 1992). Assim, a síntese protéica inicia-se na ORF1, troca de fase na

região de interseção e passa a sintetizar a ORF2, criando uma proteína de fusão envolvida

na replicação viral (Brault & Miller, 1992; Reutenauer et al., 1993). Logo após a ORF2

existe uma região intergênica que apresenta cerca de 100 nucleotídeos em Luteovirus e 200

nucleotídeos em Polerovirus e Enamovirus. Essa região apresenta seqüências regulatórias

que iniciam a síntese de um RNA subgenômico contendo as ORFs 3, 4, 5, todas

codificantes de proteínas estruturais (Tacke et al., 1990; Dinesh-Kumar et al., 1992). A

ORF3 codifica a proteína do capsídeo viral, a única envolvida na morfogênese viral

(Reutenauer et al., 1993). Dentro do gene do capsídeo existe uma outra fase aberta de

leitura denominada de ORF4. Esse gene é traduzido em taxas muito mais elevadas do que a

própria CP (Tacke et al., 1990; Dinesh-Kumar et al., 1992) e acredita-se que a proteína

resultante esteja envolvida no movimento viral célula a célula ou que seja parte da estrutura

VPg observada na região 5’ do RNA dos Polerovirus e Enamovirus (van der Wilk et al.,

1989; Tacke et al. 1991). Observou-se também que algumas vezes o códon de término do

gene do capsídeo não é lido, gerando uma proteína de fusão com a ORF5 geralmente

denominada de RTD (“Readthrough Domain”) que está envolvida na transmissão do vírus

por afídeos (Brault et al., 2000; Brault et al., 2002).

Uma outra característica que distingue os membros da família Luteoviridae das

demais famílias de vírus vegetais é a alta especificidade pelo vetor de transmissão e a

restrita gama de hospedeiros. Quando adquiridos pelo inseto, os Luteoviridae circulam, mas

não replicam no vetor. Por esse motivo a transmissão é dita circulativa e não propagativa.

Inicialmente os vírus são sugados e transportados para o lúmen do trato digestivo do inseto,

atravessam as células do tubo digestivo com a ajuda de proteínas bacterianas chamadas

GroEl, se acumulam nas glândulas salivares e em seguida são injetados no floema vegetal

(Gray & Gildow, 2003). Estima-se que 30 minutos após da aquisição viral em uma planta

infectada, os insetos já estejam aptos a transmití-los para outras plantas. A especificidade

da transmissão ocorre em duas etapas: primeiro no reconhecimento da proteína GroEl e em

seguida no acesso do vírus às células das glândulas salivares. Especula-se que

possivelmente a RTD viral possa interagir de forma específica com genes presentes na

membrana das células salivares. Um trabalho recente comparando insetos transmissores e

não transmissores de um isolado de BYDV-PAV indicou que possivelmente apenas um

gene do inseto pode estar envolvido nessa interação (Burrows et al., 2007).

Assim como observado para os membros da família, a transmissão da doença azul

do algodoeiro ocorre de forma circulativa não-propagativa. O vetor da doença, Aphis

gossypii, é transmissor de outras luteoviroses, como as causadas pelo Cucurbit aphid-borne

yellows virus (CABYV), um Polerovirus. Além disso, os sintomas de enrolamento de folha

são muito parecidos com os desenvolvidos pelo PLRV em barata e o amarelecimento de

nervuras semelhante ao provocado pelo BWYV em diversas plantas. As semelhanças

biológicas entre as doenças, aliadas aos resultados preliminares de sorologia indicam

fortemente, portanto, que a doença azul esteja associada com um vírus da família

Luteoviridae.

Capítulo I

_________________________________________________________________________

OBJETIVOS

I.2 – Objetivos

A primeira parte deste trabalho de tese teve como objetivo geral identificar e

caracterizar molecularmente o vírus responsável pela doença azul do algodoeiro. Os

objetivos específicos foram:

• Propagar a doença azul do algodoeiro em casa de vegetação;

• Desenhar oligonucleotídeos degenerados para a amplificação de regiões

conservadas no genoma dos membros dos gêneros Luteovirus e Polerovirus;

• Amplificar, clonar e seqüênciar parte do genoma viral, compreendendo parte dos

genes coficadores da polimerase e da proteína de transmissão, toda a região

codificadora do capsídeo viral e proteína do movimento e toda a região intergênica;

• Determinar a relação filogenética com demais membros da família Luteoviridae;

• Analisar filogenia com seqüências amplificadas;

• Desenvolver kit diagnóstico através de RT-PCR e hibridação com sonda molecular;

Capítulo I

_________________________________________________________________________

MATERIAL

MÉTODOS

I.3 – Material e Métodos

I.3.1 – Propagação viral em casa de vegetação

Plantas de algodão (Gossypium hirsutum L) cultivar CNPA ITA 90 da safra

2003/2004 apresentando sintomas típicos da doença azul foram coletadas em campo no

município de Primavera do Leste, Mato Grosso, e enviadas pelo pesquisador Paulo

Augusto Vianna Barroso (CNPA – Embrapa Algodão – Campina Grande – PB). Pulgões

(Aphis gossypii) coletados em plantas apresentando sintoma característico da doença azul

foram utilizados como fonte para a transmissão do vírus para plantas jovens de algodão da

mesma cultivar, crescidas e mantidas em casa de vegetação. Estas plantas foram

acompanhadas diariamente para a observação do aparecimento de sintomas e evolução da

doença. A casa de vegetação utilizada é fechada por vidros e totalmente vedada, tendo a

temperatura ajustada a 28 ± 2

C e mantida constante por compressores.

Para a propagação da doença, plantas doentes foram infestadas por pulgões não

infectados durante dois dias para a aquisição viral. Cerca de dez pulgões infectados foram

transferidos para cada planta jovem da variedade CNPA ITA 90. Os insetos foram mantidos

nestas plantas por dois dias e em seguida eliminados através da pulverização do inseticida

Orthene. Plantas infectadas foram mantidas em isolamento dentro de caixas de madeira,

vidro e telado de voil.

I.3.2 – Desenho de oligonucleotídeos

Com o objetivo de verificar a existência de luteovirus e/ou polerovirus associados à

doença azul, genomas de membros da família Luteoviridae foram obtidos no GeneBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e suas seqüências alinhadas através do programa ClustalW.

Os genomas utilizados nos alinhamentos para membros do gênero Luteovirus foram:

Soybean dwarf virus (SbDV), NC 003056; Bean leafroll virus (BLRV), NC 003369; Barley

yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV), NC 004750; Barley yellow dwarf virus-PAS

(BYDV-PAS), NC 002160; Barley yellow dwarf virus-GAV (BYDV-GAV), NC 004666;

Barley yellow dwarf virus-MAV (BYDV-MAV), NC 003680; Os genomas utilizados nos

alinhamentos para membros do gênero Polerovirus foram: Turnip yellows virus (TYV), NC

003743; Beet mild yellowing virus (BMYV), NC 003491; Beet chlorosis virus (BChV), NC

002766; Beet western yellows virus (BWYV), NC 004756; Cucurbit aphid-borne yellows

virus (CAbYV), NC 003688; Potato leafroll virus (PLRV), NC 001747; Cereal yellow

dwarf virus-RPV (CYDV-RPV),NC 004751; Cereal yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS),

NC 002198. Os alinhamentos foram analisados e as seqüências com maiores níveis de

conservação foram selecionadas para o desenho de iniciadores degenerados. As seqüências

de todos os oligos desenhados para amplificar o genoma viral estão listadas na Tabela 1.

Tabela 1: Oligonucleotídeos desenhados para amplificar o genoma do vírus associado

com a doença azul do algodoeiro baseado no alinhameto completo de membros da

família viral Luteoviridae.

Oligo Seqüência Degeneração Região do genoma

LUTF TTTTTAGAGGGGCTCTGYDCCGMCTCYGGTT

24x Polimerase

LUTR TGTTGGTCRAAKCKRCTVGCATC 48x Polimerase

PLF ACDGAYTGYTCYGGTTTYGACTGG 48x Polimerase

PLR TCTGAWARASWCGGCCCGAASGTGA 32x CP

PL2F AACAATTAGGTTTTAAAGTCGAGG 0x Polimerase

PL2R TTCTACCCACGACCGTATTCAT 0x CP

PL4F TGCGACAAATAGTTAATGAATACGGT 0x CP

o3R GTCTACCTATTTBGGRTTNTGGAA 24x CP

P1-2F GGCTTCGGSTGGCCCMAGTTCGG 4x Polimerase

PL3R ACDCTCCAGTCRAAACCRGAGCA 12x Polimerase

CPstF TTTAGGGTCACAATTCGGTGCCA 0x CP

o5R CCRTAHGARACRGCRTARTTRTA 192x RTD

Bases degeneradas estão representadas pelas letras R (A ou G), Y (C ou T), M (A ou C), K

(G ou T), S (G ou C), W (A ou T), H (A, C ou T), H (A, C ou T), B (G, T ou C), V (G, C

ou A), D (G, A ou T) e N (A, T, C ou G). A última letra no nome do oligo indica sua

orientação: F são os oligos anelando em regiões 5’ e R indica o oligonucleotídeos reverso,

que anela na região 3’ do DNA. O grau de degeneração de cada oligo é dado.

I.3.3 – Amplificação do genoma viral por PCR

Folhas de plantas infectadas na casa de vegetação apresentando sintomas da doença

azul foram maceradas na presença de nitrogênio líquido e em seguida o RNA total foi

extraído através do kit de purificação RNeasy (Qiagen Co.), seguindo as recomendações do

fabricante. O RNA extraído foi quantificado através de leitura da densidade ótica (D.O.) em

espectrofotômetro e gel de agarose. O cálculo da concentração de RNA foi feito utilizando-

se um valor padrão onde 1 D.O. equivale a 40 µg de RNA.

Para a síntese de cDNA, cerca de 3 µg de RNA total foram misturados com 5 µM de

oligonucleotídeo reverso, 1µL de dNTP 10 mM e água até atingir o volume de 10 µL. A

mistura foi aquecida a 70 ºC por 10 minutos, colocada diretamente no gelo e em seguida

foram adicionados 200U de transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen), 20 mM de

DTT, 1X de tampão da primeira fita, em um volume final de 20 µL. A reação foi realizada

por 2 horas a 45 ºC e em seguida a enzima foi desnaturada a 70ºC por 15 minutos. A reação

de PCR foi realizada com 2 µL do cDNA sintetizado, 1X de tampão da Taq polimerase,

2,5U de Taq polimerase, 2 µM de cada oligonucleotídeo, 1,5 mM de MgCl

e 0,2 mM de

dNTP, em um volume final de 50 µL. O programa utilizado para a ciclagem foi: 95 ºC por

5 minutos, 95 ºC por 1 minuto, temperatura de anelamento dos oligonucleotídeos por 1

minuto, 72 ºC por 2 minutos, repetir ciclagem por 40 vezes e finalmente uma polimerização

por 10 minutos a 72 ºC.

I.3.4 – Clonagem dos fragmentos amplificados em vetores pGEMT-Easy

As seqüências amplificadas foram ligadas em vetores pGemT-Easy (Promega). Para

isso, 5 µL da reação de PCR foram misturados com 5 ng de vetor, 1X de tampão de ligação

e 3U de T4 DNA ligase, em um volume final de 30 µL. A ligação foi realizada por oito

horas a 16 °C e em seguida precipitada por 3 horas à -80 ºC com 20 ng de glicogênio, 0,2X

de NaCl 5 M e 2,5X de etanol absoluto. O precipitado foi centrifugado por 30 minutos a

12000 rpm, lavado duas vezes com etanol 70% e ressuspenso em 10 µL de água estéril.

O DNA ligado foi transformado em células competentes de Escherichia coli XL1

através de eletroporação (25 µF, 200 Ω e 1,80 kV, Biorad) e em seguida as bactérias foram

plaqueadas em meio LB sólido (bactotriptona 10 g/l, extrato de levedo 5 g/l, NaCl 10 g/l,

pH 7,2, agarose 0,8%) contendo ampicilina (50 mg/ml), 20 µl de IPTG (1M) , 100 µl de

X-gal 20 mg/mL e 80 µl de LB líquido. Bactérias eletro competentes da cepa XL1 foram

preparadas de acordo com o descrito em Maniatis et al. (1989). A mini-preparação

plasmidial seguiu os procedimentos descritos por Feliciello & Chinali (1993). O DNA

plasmidial precipitado foi ressuspenso em cerca de 100 µL de água e quantificado em gel

de agarose. A confirmação da clonagem foi feita pela digestão dos vetores extraídos com a

enzima EcoRI (Invitrogen).

I.3.5 – Seqüenciamento de nucleotídeos

Cerca de 200 ng de DNA plasmidial foram utilizados para o seqüenciamento através

do método de terminação por di-deoxi nucleotídeos. O DNA foi misturado com 0,5 µM de

iniciador específico, 3,5 µL de tampão de seqüenciamento e 1 µL de “BigDye” (mistura

contendo dNTPs livres, dNTPs marcados com fluorescência e Taq polimerase), em um

volume final de 10 µL. A reação foi ciclada nas seguintes condições: 95 °C por 2 minutos;

25 repetições de 95°C por 45 segundos, 50 °C por 30 segundos e 60 °C por 4 minutos. Em

seguida foram adicionados 10 µL de água, 2 µL de NaCl 5M e 50 µL de etanol absoluto. A

reação foi precipitada por 8 horas a -20 °C, centrifugada a 4 °C por 45 minutos a 4000 rpm,

lavada com etanol 70% e ressuspensa em 10 µL de água.

Para garantir fidelidade de seqüência, de três a seis clones de cada fragmento,

oriundos de diferentes reações de PCR, foram seqüenciados em ambas as direções, através

dos oligonucleotídeos T7 e M13 que anelam no vetor. A reação foi processada pelo

pesquisador Jean Luiz Araújo (Embrapa Agrobiologia – Seropédica – RJ) através de um

seqüenciador automático MegaBACE.

I.3.6 – Análise das seqüências de nucleotídeos

As seqüências das regiões amplificadas por RT-PCR foram inicialmente

comparadas com todas as seqüências depositadas no GeneBank, EMBL e DDBJ usando o

programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Em seguida, seqüências

correspondentes à região amplificada de diferentes membros da família Luteoviridae foram

alinhadas através do programa ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw) e em

posteriormente analisadas no programa MEGA2 (http://www.megasoftware.net) para a

reconstrução filogenética. Os vírus analisados foram: Chickpea stunt disease associated

virus (CpSDaV), Y11530; Groundnut rosette assistor virus (GRAV), AF195828; Tobacco

vein distorting virus, AM411003; Pea enation mosaic virus-1, NC_003629 e todos os

demais citados no ítem I.3.2. Árvores filogenéticas foram feitas através do método de

“Neighbor-joining” com 3000 mil réplicas, usando-se a opção “p-distance” como matriz e

“pairwise deletion” para a eliminação de “gaps” no alinhamento. As deduções das

seqüências de aminoácido foram feitas pelo pacote de ferramentas de bioinformática do

BCM (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/seq-util.html). A estimativa dos pesos

moleculares das proteínas foi feita pelas ferramentas disponibilizadas pelo Instituto Suíço

de Bioinformática (SIB), através do site: http://br.expasy.org/tools/pi_tool.html. O cálculo

das identidades entre as seqüências foi realizado através do programa GeneDoc

(http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html).

I.3.7 – Southern blot

O DNA amplificado total foi eletroforeticamente separado em gel de agarose 0,8%,

com tampão de corrida TAE 0,5X e posteriormente fotografado no transiluminador e a

posição do marcador molecular foi anotada. Em seguida este foi transferido para um

recipiente de plástico e agitado, suavemente, em 2-3 volumes (50 – 100 ml) de solução de

depurinação (0,25 M de HCl) por 7 minutos. A solução foi decantada, o gel foi lavado em

água destilada e agitado novamente com uma solução de desnaturação (0,5 M de NaOH,

1,5 M de NaCl) por 30 minutos, trocando a solução duas vezes. Após decantação da

solução e lavagem do gel em água destilada, uma última agitação foi feita em uma solução

de neutralização (3 M de NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4) por 30 minutos, trocando a

solução duas vezes.

A solução e o gel foram novamente decantados e lavados, respectivamente, e o

aparato de transferência foi montado, utilizando-se filtro de nylon (Hybond N/ Amersham),

3-6 folhas de papel 3 MM e papel toalha ou jornal até atingir uma altura de 8 cm. O tampão

SSC 20X (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio, pH 7,0) foi utilizado como carreador, por

cerca de 16 horas. O aparato foi em seguida desmontado, o filtro foi lavado em 3X SSC e

depois o DNA foi fixado à membrana por exposição à UV (GS Gene Linker UV

Chamber).

As pré-hibridações foram feitas a 65 ºC por 2 horas, utilizando-se uma solução de

hibridação contendo tampão fosfato 0,5 M, SDS 7% e EDTA 1 mM. Seguiu-se uma

hibridização de 20 horas a 65º C com sondas correspondentes a CP ou a polimerase viral

marcadas radioativamente através de “random primer” (PerkinElmer) com αdCTP

previamente purificada em coluna de Sephadex G50 (Sigma) e desnaturada a 95º C por 10

minutos. As lavagens foram realizadas com 3X SSC, 1% SDS; 1X SSC, 1% SDS e 0,1X

SSC, 1% SDS. As membranas foram expostas a filmes Kodak X AR (Kodak) por tempo

variado em freezer a – 80º C.

I.3.8 – Northern blot

O diagnóstico viral foi realizado com experimentos de northern blot. Cerca de 30

µg de RNA total foram misturados com 2,5 µL de MOPS 10X, 5 µL de formaldeído 37%,

12,5 µL de formamida e 1 µg de brometo, atingindo um volume final de 26 µL. Em seguida

as amostras foram aquecidas por 15 minutos a 55 ºC e aplicadas em um gel de agarose 1,2

%, contendo 1X MOPS e 3% de formaldeído. A migração do RNA em gel foi feita por 4

horas a 80 V, em tampão de corrida MOPS 1X.

Após o término da eletroforese, o gel foi colocado em uma ponte de transferência

com SSC 20X e um filtro de náilon (Hybond N/Amersham) sobre ele. Sobre o filtro

colocou-se 3-6 folhas de papel 3 MM e, por cima, várias camadas de papel toalha ou jornal

até atingir uma altura de 8 cm. Colocou-se por cima de tudo uma placa de vidro com um

peso e deixou-se transferindo por aproximadamente 16 horas. O aparato foi desmontado, o

filtro foi lavado em 3X SSC e depois o RNA foi fixado à membrana por exposição ao UV

(GS Gene Linker UV Chamber). A pré-hibridação, a hibridação e as lavagens seguiram o

mesmo protocolo descrito nos experimentos de Southern blot do item III.7.

Capítulo I

_________________________________________________________________________

RESULTADOS

I.4 – Resultados

I.4.1 – Reprodução dos sintomas da doença azul em casa de vegetação

Pulgões coletados em plantas de algodão com sintomas da doença azul de fazendas

de cultivo do município de Primavera do Leste (Mato Grosso) foram transferidos para

plantas saudáveis CNPA ITA 90 em casa de vegetação; e, em seguida, eliminados através

do inseticida orthene. Durante a primeira passagem foi possível observar sintomas típicos

da doença, tais como encurtamento dos entrenós, folhas rugosas e com curvatura nos

bordos, enrolamento das folhas em sua superfície inferior, associados a uma coloração

verde-escura com tonalidade azulada (Figura 2). Os primeiros sintomas da doença foram

observados aproximadamente 15 dias após a inoculação viral, caracterizando-se

principalmente pelo enrolamento das folhas (Figura 2B). As folhas jovens já cresciam com

fenótipo de enrolamento e, com o tempo, passavam a apresentam sintomas de

amarelecimento das nervuras, muito comum em infecções associadas com membros da

família Luteoviridade (Figura 2D). As fases mais tardias da infecção, cerca de 15 dias após

o inóculo, caracterizaram-se por escurecimento das folhas e uma drástica redução no porte

das plantas (Figura 2E).

Figura 2: Sintomas da doença azul do algodoeiro reproduzidos em casa de vegetação

via inoculação com o inseto transmissor Aphis gossypii. A – Folha expandida de uma

planta sadia; B – Sintomas de enrolamento de folha em planta infectada; C – Folha jovem

sadia; D – Folha jovem apresentando sintoma de amarelecimento das nervuras; E –

Sintoma de nanismo em fases tardias de infecção, aproximadamente 30 dias após a

inoculação viral (plantas 1, 2, 3), ao lado de uma planta sadia (planta 4).

1 2 3 4

I.4.2 – Identificação do Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), um Polerovirus

associado à doença azul do algodoeiro

Com o objetivo de verificar a existência de luteovirus e/ou polerovirus associados à

doença azul, os genomas completos dos membros já sequenciados da família Luteoviridae

foram obtidos no GeneBank e suas seqüências nucleotídicas alinhadas através do programa

ClustalW. O alinhamento dos membros do gênero Luteovirus, realizado com os vírus

SbDV, BLRV, BYDV-PAV, BYDV-PAS, BYDV-GAV, BYDV-MAV, mostrou duas

regiões conservadas, ambas na polimerase (ORF2). Assim, foram desenhados dois

iniciadores nessa região, chamados de LUTF, com 31 bases e degeneração de 24 vezes e

LUTR, com 23 bases e degeneração de 48 vezes (Tabela 1). O par amplificaria um

fragmento de aproximadamente 700 pares de base do gene da polimerase viral. No entanto,

os testes realizados em RNA total de plantas doentes não apresentaram resultados positivos,

indicando a ausência de membros desse gênero associados à doença (dados não mostrados).

Os genomas completos de oito membros do gênero Polerovirus foram alinhados:

TYV, BMYV, BWYV, BChV, CABYV, PLRV, CYDV-RPV, CYDV-RPS. A análise do

alinhamento indicou a existência de regiões conservadas e, com isso, oligonucleotídeos

específicos para esse gênero (PLF e PLR), foram desenhados (Tabela 1; Figura 3). O oligo

PLF anela no início do gene da polimerase (OFR2) e o oligo PLR em uma região

conservada na região central do gene da proteína capsidial (Figura 3). Dessa forma, o

fragmento amplificado pelo par PLF/PLR teria cerca de 1100 bases, compreendendo parte

do gene da polimerase, toda a região intergênica e parte do gene da CP. A análise do

produto de amplificação em gel de agarose mostrou a existência de bandas com o tamanho

esperado em três plantas infectadas quando amplificadas com os oligonucleotídeos

específicos para Polerovirus (Figura 4A, painel superior). Algumas bandas de baixa

intensidade de tamanhos não esperados foram observadas na planta não infectada utilizada

como controle. No entanto, experimentos de Southern blot usando uma sonda específica

para o gene do capsídeo viral mostraram que essas bandas eram amplificações

inespecíficas, possivelmente resultado da degeneração dos oligos (Figura 4A, painel

inferior).

Figura 3: Representação esquemática do genoma dos Polerovirus. As posições de

anelamento dos oligos desenhados para amplificar segmentos do genoma do vírus

associado à doença azul do algodoeiro estão indicadas por setas. ORF 1 e ORF2 –

Polimerase; ORF3 – Proteína do capsídeo; ORF4 – Proteína de movimento; ORF3 e ORF5

– Proteína de transmissão.

Figura 4: Amplificação parcial do genoma do CLRDV. A – Produto de amplificação

obtido pelo par de oligos PLF/PLR. O fragmento amplificado contém parte dos genes

codificadores da polimerase e do capsídeo viral e toda a região intergênica. Painel superior:

gel de agarose corado com brometo de etídio; Painel inferior: Southern blot hibridado com

sonda específica para a CP viral. B – Amplificação da seqüência completa do gene

codificador da CP viral com os oligos PL4F e o3R. Painel superior: gel de agarose corado

com brometo de etídio; Painel inferior: Southern blot hibridado com sonda específica para a

CP viral. Inoc – Plantas inoculadas com o vírus; Ni – Planta não inoculada.

Os fragmentos amplificados foram clonados em pGEMT-Easy e três a seis clones

de cada amplicon foram seqüenciados. Após os primeiros resultados de seqüenciamento,

que gerou seqüências correspondentes às extremidades do fragmento amplificado, oligos

internos PL2F e PL2R, com seqüências específicas do vírus, foram desenhados para o

seqüenciamento completo do fragmento (Tabela 1; Figura 3). Como esperado, a análise das

seqüências mostraram que os amplicons apresentam alta similaridade com membros do

gênero Polerovirus. Dos 1.058 nucleotídeos obtidos, 612 tinham identidade com o gene da

polimerase viral, 187 com a região intergênica e 259 bases com o gene da capa protéica. As

seqüências foram depositadas no GeneBank sob os números de acesso AY758560 e

AY758561.

Com o intuito de melhor analisar o vírus identificado, os oligonucleotídeos PL4F

(não degenerado) e o3R (degenerado) foram desenhados para a amplificação de todo o gene

da capa protéica (ORF3) (Tabela 1; Figura 3). Um fragmento de 606 bases foi amplificado,

clonado e seqüenciado (Figura 4B, painel superior). Experimentos de Southern blot

utilizando o gene da proteína capsidial marcado radioativamente mostraram que a banda

amplificada no experimento de PCR realmente corresponde a parte do genoma viral.

A dedução da seqüência de aminoácidos indicou que a proteína da CP, com 201

aminoácidos, tem um peso molecular de aproximadamente 22.3 kDa. A análise de

seqüência indicou que a mesma apresenta 92% de identidade com a CP do Chickpea stunt

disease associated virus (CpSDaV), um membro ainda não classificado da família

Luteoviridae (Tabela 2). O CpSDaV é um vírus endêmico da Índia que infecta leguminosas

(Reddy & Kumar, 2004). Análise do alinhamento mostrou que os vírus apresentam apenas

nove substituições de aminoácido. No entanto, somente parte da seqüência do gene do

capsídeo do CpSDaV está disponibilizada no banco de dados do NCBI. Dessa forma, ainda

não é possível precisar corretamente o grau de parentesco entre esses dois vírus.

Identidades significativas foram obtidas com outros membros do gênero Polerovirus, tais

como TYV (79%), BMYV (78%), BChV (78%) e BWYV (78%) (Tabela 2). Os critérios de

taxonomia da família Luteoviridae dizem que se dois vírus apresentam similaridade de

seqüência na CP inferior a 90%, estes já podem ser considerados como membros de

espécies diferentes (Van Regenmortel et al., 1997). O vírus associado com a doença azul

apresenta identidade abaixo de 90% com todos os membros definitivos da família e,

portanto, deve constituir-se de uma nova espécie.

Em função dos sintomas observados em campo o vírus foi denominado Cotton

leafroll dwarf virus (CLRDV). Um alinhamento da seqüência de aminoácido de membros

da família mostrou que os resíduos expostos na superfície da CP do PLRV (Terradot et al.,

2001) e do BWYV (Brault et al., 2003) também estão conservados na capa protéica do

CLRDV, indicando que são potencialmente imunogênicos (Figura 5).

A análise filogenética do CLRDV mostrou que o vírus se encontra, junto com o

CpSDaV, em um clado fortemente suportado que contém todos os vírus de beterraba e

também o TYV (Figura 6A). O vírus se encontra claramente, portanto, no ramo específico

dos Polerovirus.

Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), Y11530; Turnip yellows virus (TYV),

NC 003743; Beet mild yellowing virus (BMYV), NC 003491; Beet chlorosis virus (BChV),

NC 002766; Beet western yellows virus (BWYV), NC 004756; Groundnut rosette assistor

virus (GRAV), AF195828; Cucurbit aphid-borne yellows virus (CAbYV), NC 003688;

Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV),NC 004751; Cereal yellow dwarf virus-RPS

(CYDV-RPS), NC 002198; Potato leafroll virus (PLRV), NC 001747; Soybean dwarf virus

(SbDV), NC 003056; Tobacco vein distorting virus, AM411003; Bean leafroll virus

(BLRV), NC 003369; Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV), NC 004750; Barley

yellow dwarf virus-PAS (BYDV-PAS), NC 002160; Barley yellow dwarf virus-GAV

(BYDV-GAV), NC 004666; Barley yellow dwarf virus-MAV (BYDV-MAV), NC 003680;

Pea enation mosaic virus-1, NC_003629

Figura 5: Alinhamento da seqüência de aminoácidos da CP do CLRDV com CPs de

outros Luteoviridae. Regiões em preto significam resíduos que estão presentes em todos os

vírus do alinhamento. Colunas no alinhamento com menos de 100% de conservação e com

mais de 60% estão representadas em cinza. Os resíduos E109, E170, D173, E176 e D177,

presentes na superfície da CP, estão destacados. Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV),

AY758560; Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), Y11530; Turnip yellows

virus (TYV), NC 003743; Beet western yellows virus (BWYV), NC 004756; Beet mild

yellowing virus (BMYV), NC 003491; Beet chlorosis virus (BChV), NC 002766; Potato

leafroll virus (PLRV), NC 001747; Cereal yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS), NC

002198; Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV), NC 004751; Cucurbit aphid-borne

yellows virus (CAbYV), NC 003688; Groundnut rosette assistor virus (GRAV),

AF195828; Sugarcane yellows virus (ScYV), NC 000874; Tobacco vein distorting virus,

AM411003; Bean leafroll virus (BLRV), NC 003369; Soybean dwarf virus (SbDV), NC

003056; Barley yellow dwarf virus-GAV (BYDV-GAV), NC 004666; Barley yellow dwarf

virus-MAV (BYDV-MAV), NC 003680; Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV),

NC 004750; Barley yellow dwarf virus-PAS (BYDV-PAS), NC 002160; Pea enation

mosaic virus-1, NC_003629

Figura 6: Análise filogenética do CLRDV e outros membros da família Luteoviridae. A

– Filogenia com a CP do CLRDV e outros Luteoviridae. B – Filogenia da parte C-terminal

da polimerase do CLRDV e outros Luteoviridae. As filogenias foram realizadas através de

Neighbor joinning, distância p, com 1000 replicatas. Chickpea stunt disease associated

virus (CpSDaV), Y11530; Turnip yellows virus (TYV), NC 003743; Beet western yellows

virus (BWYV), NC 004756; Beet mild yellowing virus (BMYV), NC 003491; Beet

chlorosis virus (BChV), NC 002766; Potato leafroll virus (PLRV), NC 001747; Cereal

yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS), NC 002198; Cereal yellow dwarf virus-RPV

(CYDV-RPV), NC 004751; Cucurbit aphid-borne yellows virus (CAbYV), NC 003688;

Groundnut rosette assistor virus (GRAV), AF195828; Sugarcane yellows virus (ScYV),

NC 000874; Tobacco vein distorting virus, AM411003; Bean leafroll virus (BLRV), NC

003369; Soybean dwarf virus (SbDV), NC 003056; Barley yellow dwarf virus-GAV

(BYDV-GAV), NC 004666; Barley yellow dwarf virus-MAV (BYDV-MAV), NC 003680;

Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV), NC 004750; Barley yellow dwarf virus-PAS

(BYDV-PAS), NC 002160; Pea enation mosaic virus-1, NC_003629

I.4.3 – Seqüências da proteína do movimento, polimerase e região intergênica

A seqüência da ORF4 (ou MP, de “Movement Protein”) do CLRDV, região

possivelmente codificadora de uma proteína responsável pelo movimento viral de célula a

célula, também foi obtida. Essa proteína é expressa através de uma fase aberta de leitura

existente dentro da seqüência da CP (Figura 1). No CLRDV a seqüência traduzida

apresenta 174 aminoácidos e um peso molecular estimado de 19,8 kDa. Em geral, a MP dos

Luteovirus e Polerovirus apresentam peso estimado de 17 kDa e 19 kDa, respectivamente.

Dessa forma, o peso estimado para a MP do CLRDV está em acordo com o observado para

os membros do gênero Polerovirus. Além disso, a análise da seqüência mostrou que, assim

como na região da CP, a MP do CLRDV também apresenta identidades mais altas com

membros do gênero Polerovirus, tais como TYV, BMYV, BChV e BWYV (Tabela 2).

Os 612 nucleotídeos obtidos da ORF2 viral codificam 203 aminoácidos da região

C-terminal da polimerase (RdRp). A análise das identidades indica que ORF2 do CLRDV

está mais relacionada com membros do gênero Polerovirus do que com membros do gênero

Luteovirus (Tabela 2). Na filogenia, a seqüência agrupa com o TYV, um membro do

gênero Polerovirus, confirmando, dessa forma, os dados de identidade (Figura 6B). No

entanto, não foi possível determinar o grau de parentesco dessa região do CLRDV com o

CpSDaV, pois somente parte da seqüência da CP está depositada no Genebank para esse

vírus. Com o intuito de melhor analisar a região da polimerase viral, os oligos P1-2F e

PL3R foram desenhados para clonar e seqüênciar regiões acima do fragmento inicialmente

obtido pelo par de oligos PLF/PLR (Tabela 1; Figura 3). O oligo P1-2F apresenta

degeneração de quatro vezes e foi desenhado alinhando-se apenas os vírus mais

relacionados com o CLRDV na região da polimerase: TYV, BMYV, BWYV e CABYV

(Tabela 1; Figura 3; Figura 6B). O oligo PL3R foi feito baseando-se apenas na seqüência

do próprio CLRDV. No entanto, uma degeneração de 12 vezes foi introduzida nesse oligo

para cobrir a diversidade de nucleotídeos observada dentro dos clones obtidos para o vírus.

Vale ressaltar, no entanto, que as mudanças de nucleotídeos observadas em diferentes

clones do CLRDV não promoveram alteração na seqüência de aminoácidos nessa região

(dados não mostrados). Assim, foi possível seqüênciar mais 714 nucleotídeos do gene da

polimerase viral, obtendo-se toda a região da ORF2 não sobreposta com a ORF1 e mais 40

bases da região de sobreposição entre as ORF1 e ORF2. As análises de identidade e

filogenia com o novo fragmento corroboraram os dados obtidos para o fragmento C-

terminal da polimerase (dados não mostrados).

A região intergênica entre a ORF2 e a ORF3 também foi obtida. Membros do

gênero Luteovirus, em geral, apresentam uma região intergênica de 100 nucleotídeos e

membros do gênero Polerovirus de aproximadamente 200 nucleotídeos. No CLRDV essa

seqüência apresenta 187 nucleotídeos e, dessa forma, corrobora os dados obtidos para a CP,

MP e RdRp, indicando que o vírus é um membro típico do gênero Polerovirus.

I.4.4 – Proteína de transmissão

Uma região de 620 nucleotídeos do gene da proteína de transmissão viral (ORF5)

foi obtida com os oligos CPstF e o5R (Tabela 1; Figura 3). A análise da seqüência no

programa BLAST mostrou que a ORF5 do CABYV, um vírus também transmitido pelo

Aphis gossypii, é a mais próxima da ORF5 obtida para o CLRDV (dados não mostrados).

Esse resultado poderia indicar que as proteínas codificadas por esses genes estariam sob

pressão seletiva para permitir a sua transmissão pelo pulgão. A análise da filogenia dessa

região mostrou, como esperado, que o CLRDV agrupa com o CABYV e ambos estão em

um clado muito bem suportado que inclui também os vírus Sugarcane yellow leaf virus

(ScYLV) e Chickpea chlorotic stunt virus (CpChSV) (Figura 7). Esse clado, no entanto,

está fora do grupo contendo os demais membros do gênero Polerovirus. Esse resultado

indica, portanto, que as proteínas de transmissão dos vírus ScYLV, CpChSV, CABYV e

CLRDV são muito semelhantes entre si e estatisticamente diferentes dos demais membros

do gênero. No entanto, não há evidências de que ScYLV e CpChSV sejam transmitidos

pelo Aphis gossypii.

Figura 7: Filogenia com parte da proteína de transmissão (ORF5) do CLRDV e

demais membros da família Luteoviridae. A filogenia foi realizada através de Neighbor

joinning, distância p, com 1000 replicatas. Turnip yellows virus (TYV), NC 003743; Beet

western yellows virus (BWYV), NC 004756; Beet mild yellowing virus (BMYV), NC

003491; Beet chlorosis virus (BChV), NC 002766; Potato leafroll virus (PLRV), NC

001747; Cereal yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS), NC 002198; Cereal yellow dwarf

virus-RPV (CYDV-RPV), NC 004751; Cucurbit aphid-borne yellows virus (CAbYV), NC

003688; Sugarcane yellows virus (ScYV), NC 000874; Soybean dwarf virus (SbDV), NC

003056; Barley yellow dwarf virus-GAV (BYDV-GAV), NC 004666; Barley yellow dwarf

virus-MAV (BYDV-MAV), NC 003680; Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV),

NC 004750; Barley yellow dwarf virus-PAS (BYDV-PAS), NC 002160; Carrot red leaf

virus (CRLV), NC 006265; Chickpea chlorotic stunt virus (CpChSV), NC_008249.

TYV

BW YV

BMYV

BChV

CYDV RPS

CYDV RPV

SbDV

PLRV

CRLV

BYDV GAV

BYDV MAV

BYDV PAS

BYDV PAV

ScYLV

CpChSV

CLRDV

CAbYV

100

0.05

I.4.5 – Diagnóstico molecular da doença azul

A análise do alinhamento das seqüências do capsídeo obtidas dos diversos clones

do CLRDV permitiu a elaboração de um par de oligos específico para esse vírus. As

regiões utilizadas para o desenho dos oligos CPF e CPR estão destacadas na figura 8. As

seqüências selecionadas para os oligos não estão conservadas nos demais membros da

família. Buscas com o programa BLAST confirmaram a especificidade dos oligos

desenhados, pois não foram encontradas identidades significativas com outros membros da

família Luteoviridae e nem com seqüências do genoma de algodão (dados não mostrados).

Para testar a eficiência da detecção, RNAs totais de plantas doentes provenientes de

Cascavel (Paraná) foram extraídos e amplificados. Os vírus existentes nessas plantas

tinham sido trazidos de Primavera do Leste (MT) e estavam sendo propagados há mais de

dois anos na estação experimental da Coodetec, uma cooperativa central de pesquisa

agrícola criada pela Organização de Cooperativas do Estado do Paraná. As reações de RT-

PCR foram capazes de amplificar o vírus de forma eficiente e específica (Figura 9). Os

fragmentos amplificados foram clonados e seqüenciados. As análises confirmaram que os

amplicons tratavam-se do mesmo vírus amplificado em plantas oriundas de Primavera do

Leste (dados não mostrados).

Figura 8: Desenho de oligos específicos para o diagnóstico molecular do CLRDV. Os

genes da CP dos Luteoviridae foram alinhados com a CP do CLRDV. Regiões em cinza

representam resíduos com conservação entre 60% e 100% entre membros. Alinhamento foi

realizado com o programa Multalign e analisado no GeneDoc. As regiões usadas para

desenhar os oligos de ida e volta específicos para o CLRDV estão marcados em azul e

vermelho, respectivamente.

Figura 9: Eficiência do diagnóstico molecular para a doença azul. Amplificação por

RT-PCR da CP viral a partir de RNA total extraído de plantas inoculadas a partir de

material apresentando sintomas típicos da doença azul coletado em Primavera do Leste e

mantidas em casa de vegetação em Cascavel, PR. 1- Lambda DNA digerido com PstI; 2 a

7- Plantas sintomáticas para doença azul do algodoeiro; 8- Controle negativo (planta sadia).

I.4.6 – Detecção por northern blot

Experimentos de northern blot foram realizados em plantas sadias e em plantas com

30 dias após a infecção. Duas bandas foram observadas nos RNAs totais extraídos de

plantas infectadas, possivelmente correspondendo aos RNAs genômicos e sub-genômicos

(Figura 10). Nenhuma banda foi observada nos RNAs extraídos de plantas não infectadas.

Figura 10: Detecção do RNA genômico do CLRDV por Northern blot em plantas

apresentando sintomas da doença azul. Inoc – plantas doentes, 30 dias após a inoculação.

Ni – plantas sadias. 30 µg de RNA total foram aplicados em cada pista e hibridados com

um fragmento correspondendo a CP viral.

Capítulo I

_________________________________________________________________________

DISCUSSÃO

PERSPECTIVAS

I.5 – Discussão e Perspectivas

Nesse trabalho foi realizada a caracterização molecular de um vírus associado com a

doença azul do algodoeiro, uma doença economicamente importante no Brasil e em

diversas regiões produtoras do mundo. Os sintomas apresentados pelas plantas em campo e

testes sorológicos prévios (Takimoto, 2003) indicavam que o vírus poderia pertencer à

família Luteoviridae. Membros dessa família são classificados em três gêneros: Luteovirus,

Polerovirus e Enamovirus. Vírus pertencentes ao primeiro grupo infectam apenas plantas

monocotiledôneas e apenas um único vírus é encontrado no gênero Enamovirus,

apresentando este uma biologia significativamente diferente dos demais membros.

Membros do gênero Polerovirus são os mais abundantemente encontrados em plantas

cultivadas e podem infectar tanto monocotiledôneas, quanto dicotiledôneas. Portanto, vírus

desse gênero eram os principais candidatos a estarem envolvidos com a doença azul. Em

acordo com essa hipótese, oligonucleotídeos degenerados específicos para Polerovirus

foram capazes de amplificar um vírus em plantas de algodão doentes. O vírus identificado

foi denominado de Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) e as análises das seqüências do

gene da capa protéica e parte da polimerase indicam que ambas apresentam identidade com

membros do gênero Polerovirus. Esses dados, portanto, excluem a possibilidade de ser um

vírus recombinante entre os gêneros Luteovirus e Polerovirus, como já observado para

outros membros da família (Rathjen et al., 1994; Maia et al., 2000; Moonan et al., 2000;

Domier et al., 2002; Siepen et al., 2005). Dessa forma, o CLRDV deve ser considerado

como um membro definitivo do gênero Polerovirus.

Trabalhos anteriores já tinham tentado, sem sucesso, identificar membros da família

Luteoviridae em plantas apresentando sintomas da doença azul (Takimoto, 2003; Takimoto

et al., 2003). Esses testes iniciais foram realizados com oligonucleotídeos desenvolvidos no

início da década de 90 por Robertson et al. (1991). Na época em que foram desenvolvidos,

existiam poucos membros da família seqüenciados e, dessa forma, as degenerações

introduzidas nos oligos não seriam suficientes para cobrir grande parte da diversidade

observada hoje na família. Assim, os oligos desenvolvidos por Robertson et al., 1991

dificilmente conseguiriam amplificar o CLRDV. De fato, a divergência entre os membros

dos três gêneros observada hoje é tão alta que o desenho de um par de oligos capaz de

amplificar qualquer membro da família se torna praticamente inviável. Por essa razão, no

presente trabalho optou-se em desenhar iniciadores específicos para cada um dos gêneros.

A seqüência da CP do CLRDV apresentou identidade de 92% com a seqüência

parcial da CP do Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV) depositada no

Genebank, indicando que ambos poderiam ser considerados como isolados do mesmo

vírus. Os critérios de demarcação de espécies na família Luteoviridae são baseados em

grande parte nas identidades da CP e da polimerase (Van Regenmortel et al., 1997). Vírus

com identidade maior do que 90% na CP são considerados como a mesma espécie. No

entanto, existem casos de vírus que apresentam alta identidade em uma região do genoma e

baixa em outra. É o observado, por exemplo, para os vírus Beet western yellows virus

(BWYV) e Beet mild yellows virus (BMYV). Ambos apresentam alta identidade na

seqüência da CP e em demais regiões da parte 3’ do genoma e por esse motivo foram

considerados por muito tempo como membros da mesma espécie. Com o seqüenciamento

completo dos dois genomas observou-se, no entanto, que a porção 5’ dos mesmos são

muito divergentes, indicando que poderiam ter sido originados de eventos de recombinação

entre membros do gênero Polerovirus (Guilley et al., 1995). Em função das divergências

observadas, os dois vírus foram considerados como membros de espécies diferentes. A

seqüência parcial do gene da CP do CpSDaV foi obtida em plantas de grão de bico

apresentando nanismo na Índia, mas, até o momento, a seqüência do gene da polimerase

para esse vírus ainda não foi depositada em bancos de dados genéticos. Portanto, com os

atuais dados, ainda não é possível saber se o CLRDV e o CpSDaV são vírus diferentes ou

isolados da mesma espécie. O seqüenciamento total do genoma dos dois vírus será de

grande importância para resolver essa questão taxonômica. Os 2.739 nucleotídeos obtidos

nesse trabalho estão servindo de base para o projeto de mestrado da aluna Yamá Castilho

que tem como objetivo o seqüenciamento e a análise de todo o genoma do CLRDV.

A análise da ORF5 do CLRDV, codificadora da proteína responsável pela

transmissão por afídeos, apresentou alta identidade com o Curcubit aphid-borne yellows

virus (CABYV) (Figura 7). Ambos os vírus são transmitidos pelo pulgão Aphis gossypii e

sabe-se que os membros da família Luteoviridae apresentam uma alta especificidade por

seus insetos transmissores (Gray & Gildow, 2003). Dessa forma, a semelhança observada

entre as duas proteínas pode ser atribuída a uma adaptação para que consigam interagir com

proteínas do Aphis gossypii. Esses dados indicam, portanto, que o desenho de

oligonucleotídeos degenerados na região da ORF5 poderia ser uma interessante estratégia

para determinar a existência de membros da família Luteoviridae associados com doenças

que são transmitidas por insetos comumente associados a esse grupo de vírus.

Em um trabalho anterior, anti-soros desenvolvidos contra três membros da família

Potyviridae, um membro do gênero Carlavirus e quatro da família Luteoviridae (BWYV,

PLRV, ScYLV e BYDV-PAV) foram utilizados em extratos de plantas de algodão

apresentando sintomas típicos da doença azul (Takimoto, 2003). Os experimentos de

ELISA apresentaram resultados negativos para todos os vírus, exceto por um fraco sinal

positivo para BWYV. Os oligos PLF/PLR usados no presente trabalho apresentam

diversidade suficiente para amplificarem qualquer membro do gênero Polerovirus. No

entanto, durante o processo de identificação do agente causal da doença azul, apenas um

vírus foi encontrado. Somados, esses resultados indicariam que a doença azul deve estar

associada com apenas um vírus, o CLRDV. No entanto, a análise mais extensiva realizada

em nosso laboratório evidenciou que três dos cerca de 50 isolados do CLRDV encontrados

até agora apresentam diversidade suficiente para serem considerados como outra espécie

(Silva, 2008). Esses isolados foram identificados em plantações de algodão em Presidente

Olegário (MG), Primavera dos Leste (MT) e Campo Verde (MT) na safra 2006/2007. Os

isolados apresentam a seqüência da CP muito similares ao isolado do CLRDV identificado

originalmente em Primavera do Leste. No entanto, a identidade da polimerase desses novos

isolados com o CLRDV é de apenas 70%. Em geral, vírus da mesma espécie na família

Luteoviridae apresentam identidade na região da polimerase maiores que 85%. Dessa

forma, as diferenças estruturais entre esses vírus se assemelham muito às observadas entre

os vírus BWYV e BMYV: conservação das proteínas estruturais e divergência nas

proteínas não estruturais. Os resultados indicam fortemente que os novos isolados surgiram

de um evento de recombinação do CLRDV com algum outro membro ainda não

identificado do gênero Polerovirus e, portanto, devem ser considerados como uma segunda

espécie associada à doença azul do algodoeiro. No entanto, como a maior parte das plantas

analisadas não apresenta esse isolado recombinante e ainda assim desenvolvem sintomas da

doença, possivelmente o segundo vírus não é fundamental para a patogenicidade.

Atualmente, o diagnóstico da doença azul é realizado somente através da

sintomatologia. Como os sintomas não são claros no início da doença, os produtores, em

geral, não são capazes de eliminar plantas infectadas nesse estágio, podendo resultar em

grandes perdas. Portanto, métodos de diagnósticos que sejam capazes de detectar o vírus

com alta sensibilidade, como RT-PCR, teriam uma grande importância para o controle da

doença azul. Além disso, o teste poderia ser utilizado para a detecção de plantas que servem

como reservatório para o vírus nos períodos entre as safras. Uma vez detectadas, essas

plantas poderiam ser eliminadas, evitando assim, a transmissão para culturas de algodão. A

obtenção da seqüência parcial do CLRDV possibilitou o desenho de oligos específicos

(CPF e CPR) que podem ser utilizados para o diagnóstico molecular do vírus. Além disso,

experimentos de northern blot também foram capazes de identificar o vírus de forma

eficiente. Foi concluído recentemente por nosso grupo um projeto com o objetivo de

caracterizar a diversidade do CLRDV em diferentes áreas produtoras do Brasil (Silva,

2008). Os oligos CPF e CPR já foram capazes de amplificar cerca de 50 isolados virais,

provenientes dos estados de Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais, São Paulo e do Distrito

Federal, confirmando, dessa forma, a reprodutibilidade e a sensibilidade do ensaio de

diagnóstico desenvolvido. Além disso, um método de diagnóstico economicamente mais

viável, baseado em ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), também está sendo

desenvolvido pelo grupo (Correa et al., 2007). Os experimentos foram iniciados nessa tese

de doutorado (dados não mostrados) e estão sendo conduzidos atualmente pelo aluno de

mestrado Alexandre Alberto Queiroz de Oliveira. A proteína do capsídeo viral foi clonada

pela tecnologia Gateway e em seguida transferida para vetores de expressão em bactérias e

plantas. As proteínas serão purificadas em seguida utilizadas para a produção de anticorpos

contra o vírus.

Até a década de 70, a doença azul do algodoeiro não era considerada como um fator

limitante na produção, pois grande parte dos agricultores usava cultivares nacionais

resistentes a esse patógeno. No entanto, a virose passou a ser um problema

economicamente importante após a introdução de variedades dos Estados Unidos e da

Austrália, ambas sensíveis à doença (Freire, 1999). Recentemente, os agricultores deixaram

de usar variedades sensíveis, como a ITA-90, e passaram a usar outras apresentando

resistência ou tolerância à doença azul, tais como Cedro, Delta Opal, CD406 e CD408. Nas

safras de 2005/2006 e 2006/2007, no entanto, sintomas típicos da doença azul foram

observados em campos de plantas teoricamente resistentes à virose. Essas plantas, muito

frequentemente estavam rodeadas por plantas apresentando sintomas atípicos da doença,

tais como folhas murchas e avermelhadas. Este mesmo padrão sintomático foi registrado

também em variedades sensíveis, como a FM966. Testes moleculares foram capazes de

identificar o CLRDV associado com as variedades Delta Opal, Cedro, CD406 e ST474 em

duas cidades do estado de Goiás (Silva, 2008). A análise de seqüência mostrou que o vírus

apresenta as seqüências dos genes da CP e da polimerase muito semelhantes às obtidas no

isolado original do CLRDV, sendo, portanto, da mesma espécie. Duas hipóteses foram

elaboradas para explicar a possível quebra de resistência. Como algumas plantas também

apresentaram sintomas de folhas avermelhadas, uma possível explicação seria a co-infecção

com outro vírus. Experimentos em casa de vegetação e em campo já mostraram que em

muitos casos a infecção mista pode potencializar a patogenicidade dos vírus. Por exemplo,

a co-infecção de plantas de tabaco com Potato virus X (PVX, Potexvirus) e membros do

gênero Potyvirus causa um sinergismo caracterizado pelo aumento expressivo dos sintomas

e elevação da concentração do PVX de 3 a 10 vezes em folhas sistêmicas (Pruss et al.,

1997). Estudos recentes apontam que as proteínas supressoras de silenciamento gênico, um

mecanismo envolvido na defesa anti-viral, possuem papel fundamental nesse processo

(Voinnet, 2005a). Assim, a co-infecção do CLRDV com um outro grupo de vírus capaz de

suprimir o sistema de defesa de forma mais eficiente poderia promover uma quebra da

resistência no algodoeiro. Nos Polerovirus, a proteína P0 é uma supressora de

silenciamento gênico (Pfeffer et al., 2002). Assim, uma outra hipótese para explicar a

quebra de resistência poderia ser uma modificação nessa proteína, permitindo um escape

mais eficiente do sistema de degradação vegetal. Dessa forma, o estudo da ação de

proteínas supressoras de silenciamento gênico em membros da família Luteoviridae seria

de grande importância para o melhor entendimento da relação vírus-hospedeiro.

Capítulo I

_________________________________________________________________________

CONCLUSÕES

I.6 – Conclusões

A cultura do algodão é uma das mais antigas da humanidade e está entre os

negócios que mais geram empregos ao redor do planeta. A doença azul do algodoeiro foi

inicialmente observada na República Centro-Africana, em 1949, e em seguida encontrada

também em diversos outros países da África, Ásia e América. A doença é transmitida pelo

afídeo Aphis gossypii e representa um problema econômico para as plantações de algodão

no cerrado brasileiro. No capítulo I dessa tese foi realizada a caracterização molecular do

agente causal da doença. As principais conclusões obtidas foram:

1) Sintomas observados em campo podem ser reproduzidos de forma efetiva em

experimentos em casa de vegetação através da infecção com pulgões Aphis gossypii

virulíferos.

2) A doença está associada a um novo vírus que foi denominado de Cotton leafroll

dwarf virus.

3) O novo vírus identificado apresenta as regiões 5’ e 3’ do genoma semelhantes a

membros do gênero Polerovirus, família Luteoviridae e, dessa forma, deve ser

classificado como um membro definitivo desse gênero.

4) O diagnóstico viral pode ser realizado de forma efetiva com oligos específicos para

o capsídeo viral.

5) Sondas moleculares específica para o gene da CP são capazes de detectar o vírus

associado com a doença.

Capítulo II

_________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO

II.1 – Introdução

Silenciamento gênico por RNA é um termo genérico aplicado a diversos

mecanismos celulares que estão envolvidos na regulação da expressão gênica através da

degradação específica de RNA mensageiros (mRNAs). O mecanismo foi inicialmente

identificado em plantas, entretanto, alguns anos mais tarde, foi encontrado e

extensivamente estudado em diferentes organismos, incluindo mamíferos, nematóides,

insetos, protozoários, fungos e leveduras (Chapman & Carrington, 2007). Em plantas, o

mecanismo foi inicialmente denominado de co-supressão ou silenciamento gênico pós-

transcricional (“post-transcriptional gene silencing” – PTGS), em fungos de “quelling” e

em animais de interferência por RNA (RNAi). Estudos genéticos e bioquímicos mostraram

que a via de degradação é altamente conservada entre os diferentes reinos biológicos,

evidenciando sua importância evolutiva.

A principal molécula envolvida na via do silenciamento por RNA é a fita dupla de

RNA (dsRNA). A demonstração de que essa molécula é a responsável por disparar o

processo de degradação em nematóide (Fire et al., 1998) e em plantas (Waterhouse et al.,

1998) forneceu fortes evidências de que se tratava de um mecanismo de regulação

conservado entre os eucariotos. De fato, a importância da descoberta rendeu o prêmio

Nobel de Medicina de 2006 para os americanos Andrew Fire e Craig Mello, pelos trabalhos

realizados em Caenorhabditis elegans. Em seguida, a descoberta da existência de pequenos

RNAs interferentes ou siRNAs (“short interfering RNAs”) de 21 a 26 nucleotídeos em

sistema vegetal (Hamilton & Baulcombe, 1999) e animal (Hammond et al., 2000)

demonstrou ainda mais a conexão entre os dois sistemas de degradação. A caracterização

posterior de diversos genes conservados permitiu a elaboração de um modelo simplificado

para o silenciamento gênico. Tornou-se claro que o mecanismo atua de forma seqüencial.

Inicialmente uma dsRNA é reconhecida por uma endonuclease celular chamada Dicer que,

com o auxílio de proteínas ligantes de dsRNA DRB (“dsRNA Binding”), promove sua

degradação em intervalos de 21 a 26 nucleotídeos, gerando os siRNAs (Hamilton &

Baulcombe, 1999; Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000). Os siRNAs são então

incorporados em um complexo enzimático denominado “RNA-induced silencing complex”,

ou RISC (Hammond et al., 2000; Tang, 2005). No complexo RISC existem enzimas

denominadas Argonautes (AGO) que têm a função de degradar mRNAs que possuem

similaridade de seqüência com o siRNA que está incorporado ao complexo (Fagard et al.,

2000; Liu et al., 2004; Baumberger & Baulcombe, 2005).

Cada grupo de organismo apresenta um diferente número de enzimas atuantes na

via de silenciamento. Esse variado repertório permitiu uma grande diversificação funcional

ao longo da evolução. A origem e a estrutura do dsRNA determinam, em geral, que via de

silenciamento será disparada na célula. Existem, por exemplo, genes endógenos nos

organismos que geram transcritos de RNA apresentando estruturas imperfeitas de fita

dupla, comumente conhecidas como RNAs em forma grampo. Esses RNAs são

processados por enzimas da via de silenciamento, gerando pequenos RNAs de 21 a 24

nucleotídeos conhecidos como microRNAs (Bartel, 2004). Os microRNAs, ao entrarem na

RISC, promovem a regulação de genes importantes para o desenvolvimento. O

silenciamento gênico pode funcionar também como um mecanismo de defesa contra vírus

(Voinnet, 2005a). Em uma infecção, os vírus produzem intermediários replicativos ou de

estrutura que apresentam estruturas perfeitas de fita dupla de RNA. Esse dsRNA, assim

como o gerado por genes endógenos, é reconhecido e degradado pela maquinaria celular de

silenciamento, controlando a infecção viral. Na mosca Drosophila melanogaster, por

exemplo, existem duas Dicers. Uma está envolvida no reconhecimento e processamento de

microRNAs e a outra atua em estruturas de dsRNA perfeitas, como as geradas por vírus ou

elementos transponíveis (Kavi et al., 2005). Em Arabidopsis thaliana, uma planta modelo,

existem quatro Dicers, cinco DRBs e dez AGOs, indicando a existência de uma complexa

rede de degradação mediada por RNA (Brodersen & Voinnet, 2006).

II.1.1 – Silenciamento gênico por RNA em animais

Em animais já foram descritas quatro vias de silenciamento gênico por RNA, sendo

as mais estudadas as vias de siRNAs (comumente chamada de RNAi) e a via dos

microRNAs. Existe também uma via de pequenos RNAs oriundos de seqüências repetitivas

que estão associados com o remodelamento de cromatina (Matzke & Birchler, 2005). Mais

recentemente descobriu-se uma nova classe de pequenos RNAs que se associam a um tipo

de Argonaute exclusiva de animais chamada de PIWI. Esses RNAs, denominados piRNAs

(“PIWI-interacting RNAs”), são ligeiramente maiores que os siRNAs e estão envolvidos na

manutenção e no desenvolvimento de células tronco e na repressão da atividade de

transposons (Klattenhoff & Theurkauf, 2008).

II.1.1.1 – Via dos siRNAs em animais

Muito do que se sabe hoje sobre a bioquímica do silenciamento é proveniente de

estudos realizados em modelos animais, especialmente na mosca Drosophila. Logo após a

descoberta dos siRNAs em extratos de células S2 de Drosophila, um grande esforço foi

feito para melhor entender a estrutura dessas pequenas moléculas. Observou-se que a

degradação da dsRNA ocorre em intervalos de 21-23 nucleotídeos e que os siRNAs

produzidos apresentam uma estrutura de dupla fita, com um fosfato na região 5` e dois

nucleotídeos não pareados na região 3` (Elbashir et al., 2001).

As características dos primeiros siRNAs estudados indicavam que eles estavam

sendo gerados pela ação de uma RNase do tipo III. Como esperado, ao mesmo tempo em

que os siRNAs estavam sendo caracterizados, o grupo liderado por Gregory Hannon

conseguiu isolar uma RNaseIII de classe III em extratos de células S2 que tinham ação de

degradação de dsRNA (Bernstein et al., 2001). Essas proteínas caracterizam-se por

apresentarem domínios de ligação a dsRNA (dsDRB) e os domínios do tipo PAZ (Piwi,

Argonaute, Zwille) e helicase, também encontrados nas proteínas Argonautes. Em função

de sua ação no processo de silenciamento, os autores a chamaram de Dicer e denominaram

o primeiro alelo encontrado em Drosophila de Dicer-1 (ou DCR-1). Hoje se sabe que a

clivagem pela Dicer necessita da ação conjunta de proteínas ligantes de dsRNA (DRBs).

Em Drosophila, a DRB atuante recebe o nome de R2D2 (Liu et al., 2003). Em humanos, as

DRBs participantes recebem o nome de TRBP (“Human immunodeficiency virus

transactivating response RNA-binding protein”) (Chendrimada et al., 2005) e PACT (Lee

et al., 2006b).

Aproximadamente ao mesmo tempo em que a enzima Dicer foi descoberta, o

mesmo grupo conseguiu isolar um complexo enzimático associado aos siRNAs que

apresentava atividade de nuclease em extratos de células S2 de Drosophila (Hammond et

al., 2000). No entanto, até hoje não existe um consenso de quais são as proteínas

componentes do complexo induzido por RNA, que foi denominado RISC. Desde sua

descoberta, complexos variando de 140 a 550 kDa, contendo diferentes grupos de

proteínas, já foram isolados. No entanto, a única molécula encontrada em todos os

complexos já purificados até hoje é a Argonaute e, por esse motivo, é considerada um

marco da formação da RISC. De fato, a importância dessa molécula no complexo foi

confirmada com a descoberta de que a Argonaute é a única nuclease responsável pela

degradação dos mRNAs via siRNAs, tanto em Drosophila quanto em humanos (Liu et al.,

2004).

Inicialmente acreditava-se que o processo de produção dos siRNAs, via Dicer, era

totalmente independente da montagem e da ação da RISC. No entanto, a observação de que

a introdução de siRNAs artificiais, feitos em laboratório, em culturas de células só

funcionavam na presença de Dicer, indicou fortemente que os dois processos poderiam

estar acoplados (Doi et al., 2003). Além disso, observou-se a interação de Dicers com

Argonautes em diferentes organismos (Hammond et al., 2001; Tabara et al., 2002; Tahbaz

et al., 2004) e também que a entrada dos siRNAs na RISC necessitava das DRBs, proteínas

que sabidamente interagem com as Dicers (Tabara et al., 2002; Liu et al., 2003). Assim,

atualmente, acredita-se que a formação da RISC ocorre de forma seqüencial e integrada

com a ação da Dicer.

A fita do siRNA que será ativa, ou seja, a que promoverá a degradação dos mRNAs,

recebe o nome de “fita guia” e a outra, que será degradada, recebe o nome de “fita de

passagem”. A escolha de qual fita será a guia e de qual será degradada depende em grande

parte da estabilidade termodinâmica do siRNA (Khvorava et al., 2003; Schwarz et al.,

2003; Preall et al., 2006). A fita que possuir uma região 5’ menos estável será a fita

selecionada como guia. Produtos de degradação da fita de passagem, contendo nove bases,

já foram identificados em extratos de Drosophila (Matranga et al., 2005). Observou-se

também que a degradação da fita de passagem depende da presença da fita guia e que a

degradação é mediada pela Ago2 de Drosophila. Além disso, foi mostrado que o processo

de clivagem da fita de passagem pela Ago2 é por si só, um fenômeno importante para a

montagem da RISC (Matranga et al., 2005; Kim et al., 2007).

Os conhecimentos obtidos sobre os siRNAs nos últimos anos possibilitaram o

surgimento de diversas aplicações tecnológicas, especialmente na área de genômica

funcional (revisado em Hannon & Rossi, 2004). Como a RNAi mostrou-se um potente

processo de regulação da expressão, sua primeira aplicação foi no estudo da função gênica.

A repressão específica da expressão de um gene poderia produzir um fenótipo semelhante

ao obtido com mutantes defectivos. A grande vantagem no uso da RNAi seria a ausência

dos demorados tratamentos para a obtenção de mutantes. No entanto, a tecnologia já foi

utilizada experimentalmente também para descobrimento de drogas, tratamento contra

vírus, como o HIV (Jacque et al., 2002), HBV (McCaffrey et al., 2003) e HCV (Randall et

al., 2003) e estima-se, inclusive, que pode ser uma ferramenta contra o câncer e outras

doenças genéticas (Hannon & Rossi, 2004).

II.1.1.2 – Via dos microRNAs em animais

A descoberta da existência de microRNAs foi feita pelo grupo do americano Victor

Ambros no nematóide C. elegans (Lee et al., 1993). O grupo observou que um gene do

verme chamado lin-4, mesmo não codificando proteínas, estava envolvido na regulação da

expressão do gene lin-14. Análises mais detalhadas da expressão de lin-4 mostraram que o

gene acumulava na célula em duas formas: um RNA pequeno, em torno de 22 nucleotídeos

e um outro, um pouco maior, de 61 bases. Observaram ainda que o RNA maior apresentava

uma estrutura em forma de grampo e que possivelmente era o precursor do RNA menor.

Como lin-4 promovia uma redução nos níveis protéicos de lin-14, mas não afetava o

acúmulo de seu RNA, especulou-se que o mecanismo de repressão estava baseado no

pareamento de RNA entre os dois genes, inibindo a tradução.

Os dados observados para o sistema lin-4 / lin-14 foram considerados por muito

tempo como um mecanismo de regulação raro na natureza. No entanto, com a descoberta

dos siRNAs anos mais tarde (Hamilton & Baulcombe, 1999; Hammond et al., 2000),

diversos laboratórios iniciaram projetos para a clonagem e identificação de pequenos RNAs

em diferentes organismos. Esforços iniciais de seqüenciamento de pequenos RNAs

conseguiram identificar centenas de novos pequenos RNAs semelhantes aos observados

originalmente pelo grupo de Victor Ambros (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001;

Lee & Ambros, 2001). Dessa forma, ficou evidente que essas pequenas moléculas

reguladoras oriundas de estruturas em forma de grampo eram mais comuns do que se

pensava. Para diferenciá-las dos siRNAs já caracterizados, a nova classe de RNA foi

chamada de microRNA (miRNA).

Alguns miRNAs identificados encontram-se dentro de íntrons de outros genes

(Lagos-Quintana et al., 2003; Aravin et al., 2003). No entanto, muitos miRNAs já foram

observados em regiões do genoma com baixa concentração de genes e, portanto,

apresentam seus próprios elementos regulatórios (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al.,

2001). E, em alguns casos, existem regiões com conjuntos de microRNAs relacionados

lado a lado, atuando como uma unidade policistrônica (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et

al., 2001; Aravin et al., 2003; Wienholds et al., 2005; Bentwich et al., 2005). O maior

conjunto de microRNA já identificado até o momento localiza-se no cromossomo 9 do

genoma humano e apresenta 54 genes, todos envolvidos na formação da placenta.

A análise de outros microRNAs seqüenciados revelou que muitos deles são

conservados mesmo entre espécies distantemente relacionadas (Lagos-Quintana et al.,

2003). A conservação de seqüência foi utilizada, então, para a elaboração de diversos

algoritmos computacionais para a identificação de novos genes. A estratégia in silico

permite a identificação de microRNAs pouco expressos, sendo portanto uma

complementação dos esforços de clonagem.

Diversos grupos iniciaram também pesquisas para elucidar o processo de

transcrição e regulação dos microRNAs. As observações iniciais logo mostraram que os

genes são regulados ao longo do desenvolvimento e que apresentam também uma alta

especificidade por determinados tecidos (Lagos-Quintana et al., 2002; Wienholds et al.,

2005). Esses dados indicavam que os microRNAs são regulados por seqüências

promotoras. O transcrito primário produzido foi denominado de pri-microRNA e, em geral,

apresenta cerca de mil pares de base (Lee et al., 2002). A observação de que os pri-

microRNAs apresentam estruturas cap, cauda poli(A) e que sua produção é reprimida pela

ação de inibidores de polimerase II forneceram fortes evidências de que esses genes

estavam sendo regulados de maneira muito semelhante aos RNAs mensageiros celulares

(Lee et al., 2004; Cai et al., 2004). No entanto, trabalhos posteriores mostraram que

microRNAs localizados próximo a RNAs transportadores (tRNAs) ou seqüências

repetitivas tipo Alu ou tipo MWIR (“mammalian-wide interspersed repeat”) são transcritos

pela polimerase III e não pela polimerase II (Borchert et al., 2006). O pri-microRNA

produzido é, em seguida, clivado por uma RNaseIII de classe II chamada Drosha, gerando

uma estrutura com cerca de 70 nucleotídeos conhecida como pré-microRNA (Lee et al.,

2003). O pré-microRNA é transportando para o citoplasma por um gene denominado

exportin-5 (Yi et al., 2003) e em seguida reconhecido pela enzima Dicer (Grishok et al.,

2001; Hutvágner et al., 2001; Ketting et al., 2001; Knight & Bass, 2001).

A clivagem inicial pela enzima Drosha é feita no núcleo e tem a participação de

proteínas ligantes de dupla fita de RNA (Han et al., 2004; Landthaler et al., 2004). O

processamento define uma extremidade do miRNA, liberando um pré-microRNA que

apresenta uma região 5’ com monofosfato e uma 3’ com 2 nucleotídeos não pareados,

assim como observado nos siRNAs (Lee et al., 2003). Essa estrutura é reconhecida pela

enzima Dicer que cliva e libera um microRNA maduro, apresentando duas fitas de RNA,

ambas com 5’ fosfato e 3’ com dois nucleotídeos não pareados (Lee et al., 2003). Assim

como ocorre na clivagem pela Drosha, a Dicer também atua na presença de DRBs

(Chendrimada et al., 2005; Förstemann et al., 2005; Saito et al., 2005; Lee et al., 2006b).

De cada transcrito de microRNA produzido pela célula, somente um microRNA maduro é

produzido. A dupla fita de microRNA gerada é comumente descrita como

miRNA:miRNA*, sendo a primeira a fita ativa, que entrará no complexo RISC e a segunda,

a fita estrela, que será descartada e degradada. Alguns trabalhos de clonagem e

seqüenciamento de microRNAs já conseguiram identificar as fitas miRNA*, no entanto,

sempre em níveis muito mais baixos do que os observados para as fitas ativas (Lagos-

Quintana et al., 2002; Aravin et al., 2003). A escolha de qual fita entrará na RISC segue os

mesmos princípios para a entrada dos siRNAs, ou seja, a fita que apresentar a região 5’ com

menor estabilidade termodinâmica será selecionada para a entrada no complexo. A outra

será degradada via Ago2 (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003; Matranga et al.,

2005).

A regulação da expressão de genes mediada por miRNAs pode ocorrer de duas

maneiras: inibição da tradução, como observado originalmente por Lee e colaboradores

(1993) ou então por degradação do RNA mensageiro. O nível de pareamento entre o

microRNA e o mRNA alvo é o maior determinante de qual o processo de regulação irá

ocorrer, assim como observado também na regulação via siRNAs (Hutvágner & Zamore,

2002; Zeng et al., 2002; Zeng & Cullen, 2003; Doench et al., 2003). O processo de

clivagem ocorre entre os nucleotídeos 10 e 11 do microRNA e, após efetuado, o miRNA

continua ativo para interagir com outros mensageiros (Hutvágner & Zamore, 2002). Em

humanos, a clivagem ocorre através de Ago2, assim como ocorre na via de siRNAs. Em

Drosophila, no entanto, a degradação mediada por microRNAs é realizada por Ago1,

contrastando com o observado na via de siRNA (Miyoshi et al., 2005). No entanto, dos

microRNAs de animais analisados até hoje, a maior parte atua via inibição da tradução

(Hutvagner & Zamore, 2002). Observou-se também que os nucleotídeos 2 a 8 são

fundamentais para o reconhecimento do RNA mensageiro alvo. De fato, os resíduos de 2 a

8 são os mais conservados dentro dos miRNAs homólogos nos metazoários (Lewis et al.,

2003; Lim et al., 2003). No entanto, as regiões não conservadas da região 3’ dos miRNAs

também são importantes para a degradação dos alvos (Leaman et al., 2005). Alguns grupos

utilizaram essas características de pareamento para o desenvolvimento de algoritmos para a

identificação dos alvos dos microRNAs (Enright et al., 2003; Lewis et al., 2003; Stark et

al., 2003). Com isso, centenas de alvos de microRNAs já foram caracterizados em animais,

evidenciando o papel desses genes em diversos fenômenos biológicos, tais como: tempo do

desenvolvimento, morte celular, proliferação celular, hematopoiese, desenvolvimento

neural, segmentação e inclusive na defesa anti-viral (Ambros, 2004; Leaman et al., 2005;

Simon-Mateo & Garcia, 2006; Triboulet et al., 2007).

Assim, embora os microRNAs maduros apresentem a mesma constituição química

dos siRNAs, existe uma grande diferença na forma como são produzidos e processados. Os

microRNAs são originados de genes endógenos com estruturas de dupla fita em forma de

grampo. Em geral, existem pareamentos imperfeitos nessa estrutura, mesmo dentro da

região onde está localizado o miRNA. Após o processamento do grampo, apenas um

microRNA é gerado e este atua in trans, ou seja, regula expressão de genes não

relacionados com a molécula geradora. Os siRNAs são originados de dsRNA perfeitos, de

origem viral ou endógena (transposons, por exemplo). Vários siRNAs são originados de

uma mesma molécula degradada. A atuação dos siRNAs ocorre in cis, ou seja, degrada

moléculas relacionadas ao seu precursor. Se, por exemplo, um siRNA se originou a partir

de um intermediário de replicação viral, então o pequeno RNA gerado vai atuar

preferencialmente em RNAs virais, reduzindo sua concentração na célula.

II.1.2 – Silenciamento gênico em plantas

Em Arabidopsis thaliana, planta modelo para estudos em genética vegetal, existem

quatro genes relacionados à enzima Dicer de Drosophila (chamadas de Dicer-Like1 a

Dicer-Like4, ou DCLs), seis genes relacionados com RNAs polimerase dependentes de

RNA (RDR1 a RDR6) e dez Argonautes (AGO1 a AGO10). Essa ampla gama de genes

permitiu uma diversificação das vias de silenciamento gênico ao longo do processo

evolutivo em plantas. Atualmente já foram identificadas pelo menos seis vias distintas,

sendo as mais estudadas: silenciamento gênicos pós-transcricional (PTGS ou co-supressão),

silenciamento gênico transcricional (TGS), microRNAs, tasiRNAs (“trans-acting small

interfering RNAs”) e a via envolvida na disseminação do silenciamento. Existe também

uma via mediada por siRNAs endógenos chamados de nat-siRNAs (“natural antisense

small interfering RNAs”) que está envolvida na resposta a fatores abióticos, como a

tolerância ao sal (Borsani et al., 2005). As vias de microRNA, tasiRNA, TGS e PTGS estão

esquematicamente representadas na Figura 11. Muitos genes ainda não foram plenamente

caracterizados em plantas e outras vias ainda podem ser descobertas.

Figura 11: Principais vias de silenciamento por RNA em plantas. A- microRNAs ao serem

transcritos geram transcritos que apresentam estrutura em forma de grampo. Essas estruturas são

degradadas pela enzima DCL1, contando com a participação da DRB1 e da HEN1. O duplex de

microRNA formado pode ser usado para a degradação de mRNAs ou genes TAS, ambos os

processos mediados por AGO1. B - Os genes TAS ao serem degradados são convertidos em

dsRNAs por RDR6 e em seguida degradados por DCL4, com a participação dos genes DRB4 e

HEN1, gerando tasiRNAs. A degradação dos alvos dos tasiRNAs pode ser feita tanto por AGO1,

quanto por AGO7. C - Seqüências repetitivas no genoma são reconhecidas e degradadas por DCL3,

gerando siRNAs que promovem a metilação da cromatina através de AGO4, DRM1/2 e DRD1 e

PolIVb. D - Genomas virais ao replicarem geram dsRNAs que são preferencialmente reconhecidas

por DCL4 e DCL2. Os siRNAs gerados, chamados de primários, atuam diretamente na degradação

de RNA mensageiros virais. No entanto, a degradação dos RNAs virais pelo complexo RISC

contendo AGO1, os siRNAs primários podem ser recrutados por uma RDR6 para servirem como

iniciadores da síntese de novas dsRNA. Essas moléculas são degradadas novamente pelas Dicers e

geram os siRNAs secundários, amplificando o sinal de silenciamento.

A B

II.1.2.1 – Silenciamento gênico pós-transcricional

II.1.2.1.1 – Descoberta e indução

O silenciamento gênico pós-transcricional em plantas foi a primeira forma de

degradação mediada por RNA observada pela ciência (Lindbo & Dougherty, 2005).

Evidências diretas do mecanismo foram descritas no clássico trabalho publicado por

americanos e holandeses em 1990 (Napoli et al., 1990). Na tentativa de alterar a cor das

flores de petúnia, os pesquisadores introduziram por transgenia cópias adicionais do gene

que codifica a enzima chalcona sintase, uma participante chave na pigmentação em plantas.

O intuito era aumentar a coloração púrpura das flores, no entanto, os autores observaram

plantas com níveis variados de pigmentação, incluindo plantas em que as flores eram

totalmente brancas, sem a presença de pigmentos. Ficou claro que o transgene introduzido

tinha sofrido um processo de repressão e este processo, de alguma forma, passou a afetar

também o gene endógeno correlato. Por essa razão, o mecanismo recebeu o nome de co-

supressão. Experimentos posteriores mostraram que na co-supressão existe uma alta

transcrição do transgene no núcleo, mas o mRNA não é acumulado no citoplasma. Foi

sugerido, então, que um mecanismo de regulação pós-transcricional poderia estar envolvido

nesses processos. Essa regulação seria dependente de seqüência e somente o gene alvo e

possíveis homólogos dentro da célula entrariam na rota de degradação (Dougherty & Parks,

1995).

A primeira hipótese elaborada para tentar explicar o fenômeno especulou que a

planta poderia, de alguma forma, detectar níveis anormais de mRNA no citoplasma. Dessa

forma, se a quantidade do transcrito ultrapassasse os limites de tolerância, um processo de

degradação a nível pós-transcricional seria desencadeado (Dougherty & Parks, 1995;

Elmayan & Vaucheret, 1996). Esse modelo recebeu o nome de quantitativo ou do limiar,

pois leva em consideração o nível de RNA mensageiro no citoplasma.

Um outro modelo para explicar o PTGS foi elaborado e recebeu o nome de modelo

qualitativo ou do RNA aberrante. Neste, a degradação dos RNAs citoplasmáticos seria

iniciada não por ter sido atingida uma quantidade limite dos transcritos, mas por esses

apresentarem alguma anormalidade, sendo considerados aberrantes (Sijen et al., 1996).

Grande parte dos casos de PTGS existente em plantas ocorre quando os transgenes são,

propositadamente ou não, inseridos no genoma da planta em cópias repetidas ou invertidas

(Dougherty & Parks, 1995). Alguns autores alegam, portanto, que essas anormalidades na

estrutura do transgene estariam ocasionando a formação dos RNAs aberrantes (Sijen et al.,

1996). A hipótese qualitativa encontrou grande suporte quando mais tarde foi observado

que tanto em plantas quanto em animais o silenciamento é disparado por dsRNA

(Waterhouse et al., 1998; Fire et al., 1998). Experimentos mostraram que plantas contendo

transgenes em repetições invertidas ou expressando mutuamente, em uma mesma planta,

transgenes senso e anti-senso disparam o silenciamento de forma muito mais eficiente do

que transgenes senso ou anti-senso isoladamente (Waterhouse et al., 1998). Em seguida, o

mesmo grupo mostrou que a introdução de estruturas de dupla fita de RNA em forma de

grampo chamadas de hpRNAs (“hairpin RNAs”) permite uma alta indução de RNAi em

células vegetais (Smith et al., 2000). Esses experimentos evidenciaram que possivelmente a

dupla fita de RNA poderia ser um tipo de RNA aberrante e que esta seria a responsável

pelo disparo de silenciamento em grande parte dos experimentos de transgenia obtidos na

década de 90. No entanto, análises recentes dos componentes da via de RNAi indicam que

o mecanismo também pode ser iniciado por uma via dependente de concentração de RNAs

(Axtell et al., 2006).

A descoberta de que estruturas em forma de grampo disparam RNAi de forma

eficiente levou ao desenvolvimento de diversos vetores que tem como finalidade a

repressão específica da expressão de genes nas plantas (Wesley et al. 2001; Helliwell &

Waterhouse, 2005; Watson et al., 2005). Estima-se que mais de três mil laboratórios em

todo mundo já tenham utilizado essa tecnologia para estudos de função gênica (Peter

Waterhouse, comunicação pessoal).

Uma questão que permanecia em aberto, no entanto, era como o silenciamento

poderia ser disparado em sistemas transgênicos em que uma seqüência senso a um gene

endógeno era introduzida no genoma, como no famoso trabalho com petúnias (Napoli et

al., 1990). Especulava-se que nesses casos haveria a ação de uma RNA polimerase

dependente de RNA (RDR) que teria como função sintetizar a dupla fita de RNA a partir de

um molde de fita simples. Em 1998, o gene dessa enzima foi isolado e caracterizado em

plantas de tomate, entretanto sua função até então não tinha sido correlacionada com o

silenciamento (Schiebel et al., 1998). Posteriormente, diversos grupos encontraram

mutantes defectivos em PTGS cujos genes relacionados apresentavam homologia com a

RDR de tomate (Dalmay et al., 2000; Mourrain et al., 2000). Existem seis RDRs em

Arabidopsis e parece existir uma especialização na função dessa classe de proteínas. Por

exemplo, plantas mutantes para RDR6 apresentam alta sensibilidade ao vírus Cucumber

mosaic virus (CMV), mas não aos vírus Tobacco rattle virus (TRV) e Tobacco mosaic

virus (TMV) (Dalmay et al., 2001). A mesma enzima mostrou-se importante para o

combate viral em regiões meristemáticas (Schwach et al., 2005). Em contrapartida,

mutantes de tabaco na RDR1 apresentam susceptibilidade aumentada ao TMV (Xie et al.,

2001). As RDRs podem atuar na presença ou na ausência de iniciadores (Schiebel et al.,

1993). Acredita-se que a atividade independente de iniciador possa estar envolvida na

produção de dsRNA a partir de transgenes tipo senso e também de RNAs virais durante a

infecção. Essas enzimas seriam dispensáveis, no entanto, nos casos em que o silenciamento

fosse induzido diretamente por uma dsRNA, como nos vetores utilizados para genômica

funcional expressando hpRNAs. Em acordo com essa hipótese, foi demonstrado que o

funcionamento da RNAi em plantas expressando hpRNAs não é afetado em mutantes RDR

(Béclin et al., 2002). Nesse caso, o transgene por si já produz o dsRNA indutor e o papel de

síntese de dsRNA das RDRs teria um papel limitado.

Dessa forma, especulou-se que os vírus vegetais poderiam ser reconhecidos como

estruturas aberrantes e com isso seriam alvo de polimerização pelas RDRs, induzindo uma

resposta de silenciamento na planta. Além disso, o próprio processo replicativo do vírus

poderia produzir dsRNA e, com isso, disparar silenciamento gênico mesmo sem a

participação de RDRs. A indução de silenciamento pela replicação viral foi denominada de

VIGS (“virus-induced gene silencing”) e essa propriedade também já foi bastante explorada

na área de genômica funcional (Watson et al., 2005). No entanto, recentemente foi

mostrado que a estrutura secundária em forma de grampo dos RNAs de fita simples dos

vírus são mais fortes indutores de silenciamento do que os próprios intermediários de

replicação (Molnár et al., 2005). Vírus de DNA também podem desencadear uma resposta

de silenciamento em plantas (Akbergenov et al., 2006; Moissiard & Voinnet, 2006). Nesse

caso, a dsRNA poderia ser produzida tanto por estruturas secundárias do RNA viral

expresso, quanto pelos RNAs transcritos de regiões sobrepostas do genoma circular

(Moissiard & Voinnet, 2006; Blevins et al., 2006).

II.1.2.1.2 – Manutenção da degradação

A descoberta de que em animais os siRNAs são produzimos por uma RNAseIII

levou diversos grupos a buscarem um similar da Dicer de Drosophila em plantas. A

primeira Dicer de plantas foi identificada em um estudo que visava buscar genes maternais

envolvidos na embriogênese em Arabidopsis (Golden et al., 2002). O gene encontrado,

chamado inicialmente de SIN1 (“short integuments1”) apresenta similaridade com outros

dois mutantes previamente encontrados: SUS1 (“suspensor1”) e CAF1 (“carpel factory1”).

O grupo observou, no entanto, que o gene também apresenta homologia com a recém

descoberta Dicer de Drosophila (Golden et al., 2002) e, em função disso, passou a ser

chamado de Dicer-Like1 (ou DCL1) (Schauer et al., 2002).

Uma análise mais detalhada de Dcl-1, no entanto, mostrou que a mesma não está

envolvida na via de siRNAs (Finnegan et al., 2003). Além disso, observou-se que no

genoma de Arabidopsis existem mais três Dicers (Finnegan et al., 2003). As novas Dicers

identificadas foram nomeadas de Dicer-Like2 a Dicer-Like4 (ou DCL2 a DCL4). Mais

tarde, observou-se que os genomas de populus e de arroz apresentam cinco e seis genes

Dicer-like, respectivamente (Margis et al., 2006), evidenciando uma alta diversidade desses

genes em plantas.

Com uma grande quantidade de Dicers existentes, ficou evidente que as plantas

deveriam ter várias vias de silenciamento e que as Dicers atuariam de forma especializada.

A primeira tentativa de classificar as quatro Dicers de Arabidopsis nas vias de

silenciamento conhecidas até então indicou que DCL2 seria a principal Dicer envolvida na

resposta contra o Turnip crinkle virus (TCV) (Xie et al., 2004). Experimentos posteriores

mostram que DCL4 é a responsável por clivar dsRNA gerados a partir de transgenes em

forma de grampo (Dunoyer et al., 2005). No entanto, a disponibilidade de mutantes

simples, duplos, triplos e quádruplos das Dicers de Arabidopsis evidenciaram que o sistema

de regulação é bem mais complexo e, em muitos casos, atua de forma hierárquica (Gasciolli

et al., 2005; Akbergenov et al., 2006; Bouché et al., 2006; Blevins et al., 2006; Deleris et

al., 2006; Fusaro et al., 2006; Henderson et al., 2006; Moissiard & Voinnet, 2006; Dunoyer

et al., 2007). Experimentos com mutantes múltiplos mostraram que, na realidade, a via de

degradação de transgenes em forma de grampo regulados por fortes promotores é a mesma

via de combate antiviral (Bouché et al., 2006; Deleris et al., 2006; Fusaro et al., 2006).

Tanto vírus, quanto hpRNAs são preferencialmente degradados pela DCL4, gerando

siRNAs de 21 nucleotídeos. Na ausência de DCL4, a DCL2 atua, gerando siRNAs de 22

nucleotídeos. Na ausência de DCL4 e DCL2, os vírus e hpRNAs são processados pela

DCL3, gerando siRNAs de 24 nucleotídeos. Existem evidências de que a DCL1 também

poderia ter uma pequena participação na degradação viral e de transgenes na ausência das

demais Dicers (Bouché et al., 2006; Blevins et al., 2006). As vias de degradação de

hpRNAs e vírus são diferentes, no entanto, quando os transgenes são expressos por

promotores endógenos, mais fracos do que o 35S do Cauliflower mosaic virus (CaMV),

usualmente utilizado em experimentos de transgenia. Transgenes fracamente expressos são

degradados preferencialmente pela DCL4. No entanto, na ausência de DCL4, a DCL3 é a

principal atuante e não a DCL2, como observado para vírus e transgenes regulados pelo

promotor 35S (Dunoyer et al., 2007). Observou-se ainda que os siRNAs gerados pelas

DCLs 1, 2 e 3 são funcionais no RISC apenas quando estão presentes em altas

concentrações, como usualmente ocorre em transgenes com fortes promotores ou em

infecções virais (Dunoyer et al., 2007). Evidências recentes indicam também que DCL1

possivelmente atua na RNAi como se fosse uma Drosha animal (Dunoyer et al., 2007). A

enzima faz uma clivagem inicial, facilitando depois o acesso para as demais Dicers.

Mostrou-se também que a proteína do capsídeo do TCV possui uma atividade inibitória de

DCL4. Para esse vírus, portanto, DCL2 é a principal Dicer atuante, o que poderia explicar

os resultados iniciais observados por Xie e colaboradores (2004) (Bouché et al., 2006;

Deleris et al., 2006). Outro fato interessante é que as Dicers de plantas apresentam

localização nuclear (Xie et al., 2004). A replicação de vírus vegetais no citoplasma celular

indica um possível redirecionamento das Dicers durante o processo infeccioso (Waterhouse

& Fusaro, 2006).

Ao contrário do que ocorre em animais, pouco se sabe sobre a composição de

RISCs em plantas. Arabidopsis possui dez genes relacionados com Argounautes, no

entanto, mutações no gene Ago1 geram plantas com deficiência nas vias de silenciamento

citoplasmático (resposta antiviral e transgenia) e na via nuclear de microRNAs (Morel et

al., 2002; Vaucheret et al., 2004). Esses resultados indicam que, apesar do grande número

de genes, a AGO1 deve ser a única participante nessas duas vias de silenciamento. A

descoberta de que AGO1 é capaz de clivar mRNAs via siRNAs confirmou sua importância

na atividade do complexo RISC vegetal (Baumberger et al., 2005; Qi et al., 2005).

II.1.2.1.3 – Amplificação e transitividade

Em plantas e em nematóides existe um mecanismo de amplificação do

silenciamento dependente de RDR. Nesse mecanismo, os siRNAs primários produzidos

pelas degradação direta da dsRNA pelas Dicers podem servir de iniciadores para que as

RDRs sintetizem mais dsRNA a partir de moldes de RNA fita simples. As novas dsRNAs

sintetizadas são em seguida degradadas, gerando mais siRNAs, sendo esses chamados de

secundários. Dessa forma, uma molécula de siRNA teria o potencial de produzir diversos

dsRNAs, fazendo com que um número ainda maior de mRNAs sejam alvo de degradação.

Durante uma infecção viral existe uma alta concentração de RNAs em função do rápido

processo replicativo. Dessa forma, acredita-se que o mecanismo de amplificação seja de

grande importância na defesa antiviral.

A amplificação do silenciamento em plantas e nematóides gera uma conseqüência

conhecida como transitividade. O fenômeno foi observado em experimentos de indução de

silenciamento por transgenia (Voinnet et al., 1998; Vaistij et al., 2002). A indução de

silenciamento utilizando-se apenas parte de um gene alvo, muitas vezes gera siRNAs

secundários que são complementares a regiões do alvo que não estão presentes na molécula

indutora. Por exemplo, ao silenciar um genes que apresente os domínios A, B e C com

siRNAs direcionados apenas para o domínio B, muitas vezes os siRNAs secundários

também apresentavam complementaridade aos domínios A e C. Nesse caso, as RDRs de

plantas estariam utilizando os siRNAs primários como iniciadores e sintetizando dsRNAs,

tanto no sentido 5’, quanto no sentido 3’ do gene alvo. A transitividade, no entanto, nunca

foi observada em genes endógenos. Uma explicação possível seria uma preferência das

RDRs por RNAs aberrates, ou seja, sem cap e poli(A) e esses poderiam ser mais facilmente

gerados em sistemas de transgenia do que no processo transcricional com reguladores

endógenos (Wassenegger & Krczal, 2006; Axtell et al., 2006).

II.1.2.2 – Silenciamento gênico transcricional

O silenciamento gênico transcricional (TGS) consiste em uma repressão na

atividade gênica através da inibição de promotores. Hoje, sabe-se que o processo ocorre

através da metilação de DNA e histonas por pequenos RNAs e que está envolvido no

controle de transposons e no remodelamento de cromatina. Por essa razão, também é

conhecido pelo nome de RdDM (“RNA-directed DNA Methylation”) (Huettel et al., 2007).

Experimentos recentes de seqüenciamento já identificaram centenas de milhares de

pequenos RNAs diferentes em plantas e cerca da metade deles estão associados com

seqüências repetitivas e transposons (Henderson et al., 2006; Lu et al., 2006; Rajagopalan

et al., 2006; Zhang et al., 2006; Kasschau et al., 2007; Vaughn et al., 2007). Esses

experimentos evidenciam, portanto, a importância desse tipo de regulação na célula.

Plantas mutantes na via RdDM revelaram a participação de diferentes tipos de genes

neste processo, em especial metiltransferases, enzimas modificadoras de histonas, proteínas

remodeladoras de cromatina e algumas proteínas envolvidas na via de RNAi (

Ziberman et

al., 2003; Chan et al., 2004; Zheng et al., 2006). Foi descoberta recentemente em plantas

uma quarta DNA polimerase que também está envolvida no processo de metilação no DNA

mediado por RNA (

Herr et al., 2005; Kanno et al., 2005; Onodera et al., 2005; Pontier et

al., 2005)

. Observou-se que ela é codificada por três genes em Arabidopsis e forma dois

complexos distintos: DNA polimerase IVa (ou PolIVa) e DNA polimerase IVb (ou

PolIVb). Até hoje, no entanto, pouco se sabe sobre sua função na RdDM.

Assim, após o isolamento e a caracterização de diversos genes envolvidos no

processo de metilação, um modelo começou a ser elaborado (Matzke & Birchler, 2005;

Huettel et al., 2007). O processo poderia ser dividido em duas grandes partes: indução,

mediada por siRNA e manutenção, independente de siRNA. Assim como ocorre em

qualquer uma das vias de RNAi, o processo é induzido por uma dsRNA. Nesse caso, a

molécula pode ser gerada a partir de repetições invertidas no genoma ou de transposons,

possivelmente com a participação da PolIVa. A enzima transcreveria RNAs dos loci alvos e

estes, em seguida, seriam convertidos em dupla fita de RNA por RDR2, uma RNA

polimerase dependente de RNA. DCL3 reconheceria o dsRNA e com ajuda de uma

proteína ligante de dsRNA ainda não identificada, levaria a degradação em siRNAs de 24

bases. Esses siRNAs entrariam em complexos RISC contendo AGO4 ou AGO6 que

recrutariam metiltranferases, remodeladores de cromatina e enzimas modificadoras de

histona para o DNA alvo. Em seguida a metilação seria mantida por MET1, DDM1, HDA6

e reforçado por metilação em histonas.

II.1.2.3 – Via de microRNAs

Em geral, os microRNAs de plantas são muito parecidos com os microRNAs de

animais. No entanto, existem algumas diferenças importantes, especialmente na biogênese

e no modo de ação (Jones-Rhoades et al., 2006).

Os primeiros microRNAs de plantas foram descobertos como a maioria dos

microRNAs de animais: através de projetos de clonagem e seqüenciamento de pequenos

RNAs (Llave et al., 2002; Mette et al., 2002). Após a clonagem dos primeiros miRNAs,

observou-se que estes apresentam um precursor primário maior e mais complexo do que o

observado nos miRNAs de animais (Bonnet et al., 2004). Programas que incluíam as

peculiaridades de estrutura dos microRNAs de plantas foram desenvolvidos e com isso um

número ainda maior de genes foram identificados, especialmente em Arabidopsis e arroz

(Bonnet et al., 2004; Jones-Rhoades & Bartel, 2004; Wang et al., 2004; Adai et al., 2005;

Sunkar & Zhu, 2004; Lu et al., 2005b).

Os primeiros dados genômicos evidenciaram que os miRNAs de plantas, ao

contrário do observado para os de animais, estão em sua grande maioria localizados em

regiões intergênicas e, com isso, apresentando seus próprios elementos regulatórios. A

biogênese segue os mesmos princípios básicos observados para animais, mas apresentam

algumas diferenças. Por exemplo, o processamento do pri-microRNA e do pré-microRNA é

realizado pela mesma enzima. Em plantas, a enzima Dicer-Like1 (DCL1) atua somente no

núcleo e possui a atividades equivalentes as da Drosha nuclear e da Dicer citoplasmática de

animais (Park et al., 2002; Kurihara & Watanabe, 2004). O processo de clivagem do pré-

microRNA, assim como acontece em animais, é realizado com a participação de uma

enzima ligante de dsRNA. Em plantas, a enzima é chamada de HYL1 (“hyponastic

leaves1”) e mutações no gene produzem os mesmos defeitos no desenvolvimento que são

também observados em mutantes para o gene Dcl1 (Han et al., 2004b; Vazquez et al.,

2004a; Kurihara et al., 2006). A clivagem é realizada também com a participação do gene

Serrate, mas sua função exata no processo ainda não foi descoberta (Yang et al., 2006).

Após a clivagem, um complexo miRNA:miRNA* é formado e em seguida metilado pela

proteína HEN1, aumentando sua estabilidade (Park et al., 2002; Boutet et al., 2003; Yu et

al., 2005). O processo ocorre em corpos especializados do núcleo (Fang & Spector, 2007;

Song et al., 2007). Esses locais, no entanto, diferem dos corpos de Cajal, local onde ocorre

o processamento de microRNAs em animais. Por serem induzidos pela DCL1, esses corpos

foram batizados de corpos-D (“D-bodies, onde ‘D’ significa Dicer) (Fang & Spector,

2007). O transporte para o citoplasma é realizado pela proteína HST (“hasty”), um

homólogo da Exportin-5 de animais (Park et al., 2005).

Depois de produzidos e processados, os miRNAs entram em um complexo RISC

contendo AGO1 (Vaucheret et al., 2004; Baumberger & Baulcombe, 2005; Qi et al., 2005).

Pouco se sabe sobre o mecanismo de entrada dos miRNAs no RISC, no entanto, acredita-se

que siga os mesmos mecanismos observados para a entrada de siRNAs e miRNAs no RISC

de animais. Ao contrário do observado em animais, os miRNAs de planta, em geral, atuam

preferencialmente por degradação de mRNAs e não por inibição da tradução. Observou-se

que a degradação ocorre entre as bases 10 e 11 do miRNA e que o processo é mais eficiente

quando existe um pareamento perfeito nas primeiras oito bases do miRNA com o alvo

(Mallory et al., 2004; Parizotto et al., 2004; Vaucheret et al., 2004). Em muitos casos, a

região 5’ do RNA alvo degradado é rapidamente usada como molde por uma polimerase

dependente de RNA para a síntese de dsRNA e em seguida é degrada em siRNAs

(Ronemus et al., 2006). A região 3’ também é degradada, no entanto, tem uma meia vida

alta o suficiente para que seja detectável por técnicas como northern blot e RACE-PCR

(“Rapid Amplification of cDNA Ends – PCR”).

Em função do alto pareamento, a identificação dos alvos dos miRNAs de plantas foi

realizada de forma muito mais eficiente e rápida do que em animais (Rhoades et al., 2002).

A maior parte dos alvos encontrados são fatores de transcrição, muitos envolvidos no

desenvolvimento e na identidade de órgãos (Kidner & Martienssen, 2005). No entanto,

alvos não relacionados com fatores de transcrição também foram encontrados. Entre eles,

pode-se destacar proteínas do tipo F-box (Jones-Rhoades & Bartel, 2004) e até genes da

própria via de microRNA, tais como DCL1, regulada pelos miRNAs 162 (Xie et al., 2003)

e 838 (Rajagopalan et al., 2006) e AGO1, regulada pelo miRNA168 (Vaucheret et al.,

2004). Projetos de identificação de microRNAs em diversos grupos vegetais evidenciaram

que muitos estavam presentes antes do surgimento das plantas terrestres (Floyd &

Bowman, 2004; Arazi et al., 2005; Axtell & Bartel, 2005; Talmor-Neiman et al., 2006;

Axtell et al., 2007; Barakat et al., 2007). Recentemente identificou-se microRNAs na alga

unicelular Chlamydomonas reinhardtii (Molnar et al., 2007; Zhao et al., 2007). Os genes

encontrados apresentam precursores e forma de atuação muito parecidos com os miRNAs

de plantas. No entanto, possuem pouca conservação de seqüência. Especulou-se, dessa

forma, que os microRNAs surgiram antes dos primeiros organismos multicelulares (Molnar

et al., 2007; Zhao et al., 2007). Além disso, descoberta de microRNAs conservados entre

plantas e animais evidenciou que um tipo de regulação via microRNA possivelmente já

existia nos ancestrais dos eucariotos (Arteaga-Vazquez et al., 2006). No entanto, alguns

miRNAs não conservados entre plantas com flores também já foram identificados (Lu et

al., 2005b; Fahlgren et al., 2007). Dessa forma, acredita-se que novos genes de microRNAs

possam ter surgido mesmo após a separação dos grandes grupos de plantas. Um modelo

hipotético para o surgimento e evolução de novos miRNAs foi proposto (Allen et al.,

2004). Nessa hipótese, os microRNAs seriam formados a partir da duplicação de segmentos

de seus genes alvos. Inicialmente um gene ou parte de um gene codificador de proteínas

sofre uma duplicação, formando uma estrutura de grampo com pareamento quase perfeito.

Essa estrutura passa então a produzir siRNAs. Mutações na região do grampo fariam com

que a estrutura passasse a produzir siRNAs especiais, com pouca similaridade aos seus

alvos. siRNAs desse tipo já foram identificados em Arabidopsis, como o siRNA

ASRP1729. Novos eventos de mutação fariam com que o grampo fosse mais

eficientemente reconhecido pela DCL1 do que pelas demais DCLs, passando a gerar, dessa

forma, um tipo de microRNA primitivo. Esses miRNAs, por serem mais recentes, seriam

muito mais parecidos aos seus alvos na região do grampo do que os miRNAs mais antigos.

Muitos microRNAs não conservados entre os grandes grupos de plantas, como o

miRNA161 e o miRNA163, apresentam essa característica. Ao longo do processo

evolutivo, no entanto, novas mutações seriam introduzidas até que praticamente só a região

do miRNA maduro teria similaridade com os alvos, como geralmente é observado nos

miRNAs conservados nas plantas. Duplicações dessas seqüências dariam origem às

diversas famílias de miRNAs frequentemente observadas nos genomas.

As características dos microRNAs de plantas já foram utilizadas também no

desenvolvimento de ferramentas para genética funcional. Foram desenvolvidos sistemas

onde um segmento de 21 nucleotídeos é inserido em um vetor que, quando expresso,

formará um RNA com estrutura similar a um pré-microRNA (Alvarez et al., 2006; Schwab

et al., 2006). Este RNA será processado pela DCL1 e a seqüência de 21 nucleotídeos

introduzida funcionará como um microRNA, sendo, portanto, uma excelente ferramenta

para silenciar genes em plantas. A grande vantagem dos chamados microRNAs sintéticos

ou artificiais é a alta especificidade de degradação. Nos modelos antigos, um longo dsRNA

é clivada em diferentes tipos de siRNAs. Alguns desses, no entanto, podiam silenciar genes

parecidos com os alvos. Clivagens inespecíficas são problemáticas especialmente quando o

gene alvo faz parte de uma família multigênica. No sistema de microRNAs, no entanto,

apenas um tipo de pequeno RNA é produzido e, com isso, pode-se escolher uma região de

21 nucleotídeos que não seja conservada em genes similares ao alvo.

II.1.2.4 – Via de tasiRNAs

Os pequenos RNAs conhecidos como “trans-acting siRNAs” (ou tasiRNAs) são

encontrados apenas em plantas (Peragine et al., 2004; Vazquez et al., 2004b), algas (Zhao

et al., 2007) e nematóides (Lee et al., 2006a). Os tasiRNAs apresentam características

únicas e pode-se dizer que são híbridos funcionais entre siRNAs e microRNAs. Sua

geração ocorre pela degradação de dsRNAs perfeitos por DCL4, assemelhando-se,

portanto, com os siRNAs. No entanto, os tasiRNAs atuam in trans, ou seja, degradando

seqüências que são diferentes das que deram origem ao pequeno RNA (Peragine et al.,

2004).

A biogênese dos tasiRNAs apresenta peculiaridades que os distinguem dos demais

pequenos RNAs. Sua formação pode iniciar pela transcrição de genes nucleares chamados

TAS. Esses genes são expressos, mas não apresentam nenhuma fase aberta de leitura.

Transcritos com essas características foram descobertos há tempos em projetos de

seqüenciamento de ESTs (“Expressed Sequence Tags”) e eram considerados como pseudo-

genes, ou seja, um DNA que é transcrito, mas que não tem informação para a síntese de

proteínas. Descobriu-se, no entanto, que os genes TAS possuem sítios de clivagens para

microRNAs (Allen et al., 2005;

Yoshikawa et al., 2005). Uma vez clivados, os transcritos

são convertidos em um longo dsRNA pela enzima RDR6 (Peragine et al., 2004). Esse

dsRNA com pareamento perfeito é então clivado por DCL4 em pequenos RNAs de 21

nucleotídeos, gerando os tasiRNAs (Dunoyer et al., 2005; Gasciolli et al., 2005; Xie et al.,

2005). Nesse processo há também a participação da proteína ligante de dsRNA DRB4

(Nakazawa et al., 2007). Ao contrário do que ocorre com os siRNAs normais, DCL4 cliva

o dsRNA do gene TAS somente em uma fase. Ou seja, a DCL4 inicia a clivagem do

dsRNA sempre no mesmo ponto e, com isso, os tasiRNAs produzidos a partir de um tipo

de dsRNA apresentam todos a mesma fase (Allen et al., 2005; Yoshikawa et al., 2005).

Durante algum tempo não se sabia ao certo o que determinava a clivagem seqüencial e em

fase do dsRNA. Hoje se sabe, no entanto, que a clivagem do microRNA determina um

registro de leitura e processamento do dsRNA. DCL4 inicia sempre o processamento a

partir da região onde ocorreu a clivagem pelos microRNAs (Allen et al., 2005; Yoshikawa

et al., 2005

). Uma vez produzidos, esses tasiRNAs em fita dupla de 21 bases são metilados

por HEN1 (Li et al., 2005) e em seguida introduzidos no complexo RISC contendo AGO7

(Adenot et al., 2006; Fahlgren et al., 2006).

O panorama de geração desses pequenos RNAs tornou-se mais complexo, no

entanto, com a descoberta de que genes codificadores de proteínas, quando clivados por

microRNAs, também poderiam entrar na via de tasiRNAs (Howell et al., 2007). Dessa

forma, a degradação de um mRNA por um microRNA, em alguns casos poderia levar a

formação de pequenos RNAs em fase que iriam degradar outros mRNAs através de AGO7.

Em outros casos, no entanto, mRNAs alvos de miRNAs não entrariam nessa via de

pequenos RNAs em fase (Lu et al., 2005a). Além disso, a via de geração de tasiRNAs

através de RDR6 também pode ser acionada pelos próprios tasiRNAs, ao clivarem seus

alvos (Howell et al., 2007). Ficou claro, dessa forma, que existe uma complexa e

interligada rede de geração de pequenos RNAs atuantes in trans, envolvendo a participação

de microRNAs, genes TAS, mRNAs e também os próprios tasiRNAs. Um grupo mostrou

que o número de sítios de clivagens de microRNAs ou de um tasiRNAs em um alvo,

codificador de proteínas ou não, é o principal determinante de qual via será acionada

(Axtell et al., 2006). Por exemplo, se existe apenas um sítio de clivagem de microRNA em

um gene TAS ou em um mRNA, esses alvos não serão geradores de tasiRNAs. No entanto,

se existirem dois sítios de clivagem nos alvos, para um mesmo microRNA ou para dois

microRNAs independentes, a via de geração de pequenos RNAs em fase é acionada. Foi

mostrado ainda que a clivagem em um ponto do alvo e o recrutamento do complexo RISC

em outro, mesmo não havendo clivagem no segundo, já é suficiente para dar início à

formação dos tasiRNAs (Axtell et al., 2006). Os autores especularam ainda que mutações

aleatórias em RNAs que retirassem a proteção cap no 5’ ou a cauda poli(A) poderiam

contribuir para a entrada dessas seqüências na via de pequenos RNAs. Esses eventos raros e

aleatórios de clivagem dupla de RNAs aumentariam de freqüência com o aumento da taxa

de transcrição. Dessa forma, especulou-se que genes altamente expressos, ou transgenes

sob fortes promotores ou ainda RNAs oriundos de infecções virais estariam mais sujeitos a

entrarem na via de tasiRNAs do que RNAs com taxas normais de transcrição (Axtell et al.,

2006). Assim, a ativação da via de pequenos RNAs induzida por dupla clivagem de

mensageiros, mediada por eventos estocásticos ou por microRNAs ou tasiRNAs, daria um

suporte genéticos à antiga hipótese quantitativa do silenciamento, que prediz que o

mecanismo é disparado pelo acúmulo excessivo de RNAs no citoplasma vegetal

(Dougherty & Parks, 1995; Elmayan & Vaucheret, 1996). Assim, as hipóteses quantitativa

e qualitativa para disparo do silenciamento que foram inicialmente elaboradas seriam

complementares e não contrastantes. O excesso de transcrito aumentaria a chance de

formação de RNAs com dois sítios de clivagem, fazendo com que RDR6 produzisse um

dsRNA que iria disparar todo o processo. No entanto, nos casos em que os transgenes eram

introduzidos de uma maneira em que seu RNA transcrito já apresentava uma forma de

dsRNA, o processo seria disparado mesmo que os mesmos não apresentassem alta taxa de

transcrição.

Assim como ocorre com os microRNAs, os tasiRNAs têm como alvos preferenciais

genes envolvidos no desenvolvimento, muitos deles fatores de transcrição (Peragine et al.,

2004; Vazquez et al., 2004b; Allen et al., 2005). tasiRNAs originados do gene TAS3, por

exemplo, degradam os genes ARF3 e ARF4, envolvidos na transição da fase vegetativa

para a fase reprodutiva e também no estabelecimento de polaridade na folha (Adenot et al.,

2006; Fahlgren et al., 2006; Garcia et al., 2006; Hunter et al., 2006). Muitos dos tasiRNAs

identificados até hoje são conservados nas plantas com flores (Allen et al., 2005) e alguns

já foram identificados em musgos (Axtell et al., 2006; Talmor-Neiman et al., 2006a) e

algas (Zhao et al., 2007), evidenciando que sua função reguladora do desenvolvimento tem

um papel tão importante quanto a desempenhada pelos microRNAs.

II.1.2.5 – Via de disseminação da RNAi

Uma das características mais peculiares do silenciamento gênicos em plantas é a sua

capacidade de se disseminar para outros tecidos. O espalhamento pode ocorrer tanto

sistemicamente, seguindo o fluxo do floema e atingindo regiões meristemáticas, quanto em

curta distância, envolvendo a passagem de célula a célula (Mlotshwa et al., 2002; Voinnet,

2005b).

A disseminação a longa distância do silenciamento é dependente de RDR6

(Schwach et al., 2005). No entanto, essa molécula não está envolvida na movimentação

célula a célula, indicando que os dois processos seguem vias genéticas distintas (Himber et

al., 2003). Análises de plantas de Nicotiana benthamiana indicaram que RDR6 atua como

uma receptora do sinal sistêmico de silenciamento em regiões meristemáticas. O modelo

proposto indica que um sinal sistêmico é produzido em regiões indutoras de uma forma

independente de RDR6 e este seria recepcionado e amplificado em células do meristema

através de RDR6 (Schwach et al., 2005). Pouco se sabe, até hoje, sobre quais seriam os

outros componentes genéticos do processo e qual ou quais seriam as moléculas

sinalizadoras. Adredita-se que os sinalizadores sistêmicos podem ser longas moléculas de

dupla fita de RNA ou então pequenos RNAs gerados de uma forma independente de Dicer

(Brosnan et al., 2007; David Baulcombe, comunicação pessoal).

Grande progresso tem sido feito recentemente, no entanto, para o entendimento do

processo de disseminação a curta distância. Os resultados obtidos indicam que as plantas

têm uma via de silenciamento distinta que está envolvida na produção e no transporte de

moléculas sinalizadoras de silenciamento célula a célula. Inicialmente observou-se que

siRNAs de 21 nucleotídeos produzidos por DCL4 são as moléculas responsáveis pela

disseminação (Dunoyer et al., 2005). Estudo posteriores com mutantes defectivos em

diferentes etapas das vias de silenciamento evidenciaram que genes atuantes nas vias de

hpRNAs (DCL2, DCL3, DCL4, DRB4), microRNAs (DCL1, HEN1) e metilação (RDR2,

NRPD1a, NRPD2a) estavam trabalhando em conjunto para a produção e transporte dos

siRNAs sinalizadores (Dunoyer et al., 2007; Smith et al., 2007). No modelo proposto,

DCL1 atuaria como se fosse uma Drosha, promovendo uma clivagem inicial do dsRNA

indutor e facilitando seu acesso às demais Dicers. O dsRNA pré-processado por DCL1 seria

então degradado preferencialmente por DCL4, gerando siRNAs de 21 bases. Essa clivagem

seria facilitada por DRB4, uma ligante de dsRNA. Na ausência de DCL4 ou DBR4, haveria

um acesso hierárquico pelas Dicers 3, 2 e, em pequena escala, por DCL1. No entanto, as

Dicers 3, 2 e 1 atuariam somente na presença de um forte indutor, produtor de dsRNA em

altas concentrações. Os pequenos RNAs gerados seriam metilados por HEN1 e em seguida

parte seria transportada para um complexo RISC contendo AGO1 e outra parte seria

transportada via plasmodesmas para células vizinhas através de RDR2 e NRPDa1. Ao

chegar às células vizinhas, uma parte entraria novamente no complexo RISC e outra seria

transportada para outra célula, promovendo assim, uma diluição dos siRNAs ao se

movimentarem entre as células. Essa diluição poderia explicar o fato do movimento célula

a célula ser observado apenas em 13 a 15 células de distancia da célula que recebeu o

indutor primário (Dunoyer et al., 2005).

A disseminação do silenciamento tem um impacto muito forte em infecções virais.

Uma vez dentro da célula, a maquinaria de silenciamento promove a degradação viral

preferencialmente por DCL4. Os siRNAs produzidos promovem a redução da concentração

viral na célula infectada, através da degradação dos RNAs virais de fita simples via RISC-

AGO1, e também migram para células vizinhas, tentando conter os vírus apenas em locais

próximos às células inicialmente infectadas. Ao mesmo tempo, um sinal sistêmico ainda

desconhecido é gerado e diretamente transportado via floema para as células

meristemáticas, onde é recepcionado e amplificado pela ação de RDR6. Dessa forma, as

novas folhas produzidas após o início da infecção ficam livres de partículas virais. O

sistema hierárquico das Dicers dependente de concentração também tem um papel

importante nesse processo. Hoje é sabido que os vírus apresentam proteínas capazes de

suprimir diferentes etapas da via de silenciamento (Ding & Voinnet, 2007). A maior parte

das supressoras estudadas até hoje, ou inibem diretamente a DCL4 ou então evitam que os

siRNAs por ela gerados atuem no RISC (Bouché et al., 2006; Deleris et al., 2006; Lakatos

et al., 2006). Dessa forma, DCL2 e DCL3 poderiam ter acesso para produzir siRNAs de 22

e 23 nucleotídeos que, por estarem em alta concentração em função do elevado número de

cópias virais, estariam aptos a entrarem na RISC e promoverem a degradação viral. Nessa

situação, as plantas conseguiriam sobrepujar a infecção apenas se o sinal sistêmico de

silenciamento conseguisse chegar às células meristemáticas antes da infecção viral.

II.1.3 – Supressão de silenciamento gênico

Desde os primeiros experimentos evidenciando a existência de silenciamento em

plantas, muitos pesquisadores especularam que este mecanismo poderia ter surgido como

sistema natural de defesa contra infecções virais (revisado por Lindbo & Dougherty, 2005).

A posterior descoberta de que o dsRNA é o desencadeador da via forneceu ainda mais

evidências para essa hipótese. Cerca de 90% dos vírus que infectam plantas apresentam seu

genoma constituído de RNA (Mayo, 1999) e, portanto, seriam produtores em potencial

desse tipo de estrutura durante o processo replicativo. No entanto, mesmo com esse potente

mecanismo antiviral, as plantas continuam acometidas por infecções virais, muitas vezes

severas. Dessa forma, especulava-se que os vírus possivelmente deveriam ter desenvolvido

mecanismos de contra defesa. Não foi de grande surpresa para a comunidade científica,

portanto, quando começaram a ser descobertos vírus que apresentavam proteínas

supressoras de silenciamento (Voinnet, 2005a).

A primeira evidência da existência de proteínas virais supressoras de PTGS surgiu

da observação de interações sinérgicas entre o vírus Potato virus Y (PVY), um Potyvirus, e

outros vírus não relacionados (Pruss et al., 1997). Os experimentos mostraram que o PVY

possue um determinante de patogenicidade que permite o aumento do acúmulo de outros

vírus, como o Potato virus X (PVX). Mais tarde, a natureza desse determinante de

patogenicidade foi determinada por três grupos independentes (Anandalakshmi et al., 1998;

Brigneti et al., 1998; Kasschau & Carrington, 1998). Observou-se que a proteína

multifuncional HC-Pro (“Helper-Component-Proteinase”) dos membros do gênero

Potyvirus é uma forte supressora de silenciamento, atuando tanto em silenciamento

induzido por transgenes, quanto por vírus (VIGS). Após essas descobertas iniciais,

inúmeras outras proteínas supressoras foram encontradas em vírus de plantas. As proteínas

identificadas, no entanto, não são evolutivamente e nem funcionalmente relacionadas,

indicando que o mecanismo de supressão viral surgiu diversas vezes na natureza.

II.1.3.1 – Identificação de supressores

Entre as estratégias utilizadas para identificar proteínas supressoras, as mais comuns

envolvem experimentos de expressão transiente, ensaios de reversão de silenciamento e

ensaios com transgenes estáveis.

O sistema de expressão transiente (agro-infiltração) foi o mais utilizado até hoje, em

especial em plantas de Nicotiana benthamiana 16C (Ruiz et al., 1998). Essa linhagem

expressa o gene marcador GFP (“Green Fluorescent Protein”) sob controle do forte

promotor 35S e, portanto, apresenta coloração fluorescente quando iluminada com lâmpada

ultravioleta. No entanto, a infiltração de mais transcritos de GFP (mGFP) ou de um

transcrito de GFP em forma de grampo (hpGFP) através da bactéria Agrobacterium

tumefaciens leva a um disparo de silenciamento contra os genes GFP. As agrobactérias são

patógenos naturais de plantas e por apresentarem a capacidade de introdução de um

fragmento de DNA, o T-DNA, no genoma vegetal, são muito frequentemente utilizadas

para produção de plantas transgênicas e também para expressar genes de forma transiente,

como no caso dos experimentos com GFP na planta 16C. A infiltração de agrobactéria em

plantas aciona o sistema de silenciamento contra os genes deste patógeno, como uma

resposta de defesa (Dunoyer et al., 2006). Dessa forma, a infiltração de agrobactéria

carreando o gene da GFP na linhagem 16C, dispara silenciamento dessa seqüência na

região inoculada e, com isso, os transcritos de GFP da bactéria e do transgene são

degradados, gerando uma região avermelhada sob iluminação ultravioleta. O mecanismo de

degradação é inibido, no entanto, através da co-infiltração de mGFP ou hpGFP com um

gene codificante de uma proteína supressora de silenciamento. Nesse caso, observa-se uma

forte região fluorescente no tecido infiltrado, resultado da expressão do transgene da planta

e também da GFP extra que foi introduzida pela bactéria. O mesmo tipo de ensaio pode ser

feito, no entanto, em plantas selvagens de Nicotiana benthamiana.

O método de reversão de silenciamento consiste em infectar vírus em plantas

transgênicas que estejam silenciadas para um gene marcador qualquer. A própria planta

16C já foi utilizada para essa finalidade (Ruiz et al., 1998). Nesse caso, plantas 16C com

até três semanas de idade são infiltradas com mGFP ou hpGFP através de agrobactéria. O

silenciamento local dos transcritos de GFP se espalha para outros tecidos e cerca de uma

semana após a infiltração ocorre um silenciamento sistêmico, em toda a planta, não sendo

mais possível detectar fluorescência sob luz ultravioleta. Após a indução sistêmica do

silenciamento as plantas são inoculadas com vírus e, caso estes apresentem uma proteína

supressora, os tecidos infectados voltam a expressar GFP. Infecção das plantas com formas

mutantes do vírus poderia indicar qual ou quais as proteínas envolvidas na supressão (Ruiz

et al., 1998). O sistema de identificação por expressão estável de transgenes, em geral, é

utilizado para confirmar a ação de uma proteína supressora. Plantas transgênicas

expressando as supressoras candidatas são cruzadas com plantas transgênicas silenciadas

para genes marcadores, como GFP ou GUS (β-glucuronidase). A progênie é então

analisada para verificar se o silenciamento foi suprimido nas plantas apresentando os dois

transgenes (Anandalakshmi et al., 1998; Brigneti et al., 1998; Kasschau & Carrington,

1998).

II.1.3.2 – Supressores de silenciamento bem caracterizados

Grande parte das proteínas virais supressoras de silenciamento identificadas até hoje

são consideradas como determinantes de patogenicidade ou determinantes de gama de

hospedeiros (Brigneti et al., 1998; Voinnet et al., 1999). A grande diversidade de estruturas

e modo de ação, no entanto, são as características mais interessantes destas proteínas.

Atividade de supressão já foi encontrada em proteínas estruturais e não estruturais e

diversas estratégias de supressão já foram identificadas: inibição da síntese de siRNAs

(Bouché et al., 2006; Deleris et al., 2006), inibição da entrada dos siRNAs na RISC

(Lakatos et al., 2006; Mérai et al., 2006), inibição dos sinais locais ou sistêmicos de

silenciamento (Voinnet et al., 2000; Guo & Ding, 2002; Hamilton et al., 2002) e, mais

recentemente, mecanismos de degradação de proteínas da via através de ubiqüitinação

(Pazhouhandeh et al., 2006; Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007) e inativação

da síntese de dsRNA (Glick et al., 2008). Alguns vírus apresentam mais de uma supressora,

cada uma atuando em uma etapa diferente da via de silenciamento. Por exemplo, o Citrus

tristeza virus, um Closterovirus, apresenta três tipos de supressores diferentes (Lu et al.,

2004). As proteínas mais bem caracterizadas até hoje são a HC-Pro dos Potyvirus, a P19

dos Tombusvirus, a 2b dos Cucumovirus e a P0 dos Polerovirus.

II.1.3.2.1 – HC-Pro

A proteína HC-Pro foi a primeira supressora identificada e umas das primeiras a

serem caracterizadas. No entanto, até recentemente havia pouco consenso de como é a ação

da proteína na via de silenciamento. A análise da atividade de HC-Pro em diferentes

modelos experimentais já levou a formulação de diversas hipóteses. Uma delas previa que

HC-Pro seria capaz de atuar em tecidos com silenciamento previamente estabelecido

(Anandalakshmi et al, 1998; Brigneti et al, 1998; Voinnet et al, 1999; Llave et al, 2000).

Outro modelo indicou que HC-Pro poderia estar suprimindo silenciamento através da

ligação com uma proteína relacionada com calmodulina (Anandalakshmi et al, 2000). Já foi

sugerido também que HC-Pro poderia estar inibindo a ação de Dicer (Mallory et al, 2001;

Dunoyer et al, 2004) ou do complexo RISC (Chapman et al., 2004).

Recentemente, no entanto, foi demonstrado que HC-Pro tem atividade de ligação a

pequenos RNAs dupla fita de 21 nucleotídeos, mas não de 19 ou 24 nucleotídeos (Lakatos

et al., 2006; Mérai et al., 2006). Dessa forma, especulou-se que, na realidade, HC-Pro se

liga aos siRNAs gerados a partir do genoma viral impedindo que os mesmos entrem no

complexo RISC. Por serem quimicamente indistinguíveis, a proteína também é capaz de se

ligar ao duplex de microRNA:microRNA*. No entanto, é pouco provável que os

microRNAs tenham uma atividade antiviral relevante em plantas. Dessa forma, acredita-se

que a inibição da via de microRNAs seja um efeito secundário da atividade supressora.

Esse efeito poderia explicar as anormalidades no desenvolvimento observadas em plantas

de Arabidopsis expressando HC-Pro (Kasschau et al., 2003; Dunoyer et al., 2004).

Explicaria também o excessivo acúmulo de microRNA* nessas plantas. Assim, hoje se

acredita que parte dos sintomas observados em infecções virais naturais podem estar

associados com uma desregulação acidental de outras vias de pequenos RNAs existentes

em plantas (Silhavy & Burgyán, 2004). A atuação das supressoras nas vias endógenas de

pequenos RNAs poderia explicar, portanto, o motivo pelo qual essas proteínas estão

frequentemente associadas com a severidade das infecções virais, sendo muito

frequentemente denominadas de determinantes de patogenicidade.

II.1.3.2.2 – P19

A proteína supressora P19 dos Tombusvirus também é uma das mais bem estudadas

e caracterizadas. Assim como observado para HC-Pro, a atuação de P19 parece estar

associada com o seqüestro de siRNAs, impedindo que os mesmos sejam incorporados no

complexo RISC (Silhavy et al., 2002; Vargason et al., 2003; Chapman et al., 2004;

Dunoyer et al., 2004; Lakatos et al., 2004). De fato, recentemente observou-se que o

seqüestro e a inativação de siRNAs é uma estratégia de supressão adotada por diferentes

grupos virais (Lakatos et al., 2006; Mérai et al., 2006).

A estrutura de cristalografia da P19 ligada a siRNAs foi obtida e revelou que a

proteína interage preferencialmente com siRNAs de 21 nucleotídeos, mas também é capaz

de ligar-se com pequenos RNAs um pouco maiores ou menores (Vargason et al., 2003; Ye

et al., 2003). No entanto, ao contrário de HC-Pro, P19 se liga a pequenos RNAs mesmo que

estes não apresentem uma estrutura típica de siRNAs, ou seja, com um fosfato 5’ e dois

nucleotídeos não pareados na região 3’. Plantas transgênicas expressando P19 também

apresentam defeitos severos no desenvolvimento e acumulam microRNA*, indicando que,

assim como HC-Pro, a proteína também interfere acidentalmente em outras vias endógenas

de pequenos RNAs endógenas (Chapman et al., 2004; Dunoyer et al., 2004).

II.1.3.2.3 – 2b

A proteína 2b dos Cucumovirus foi a segunda supressora viral identificada (Brigneti

et al., 1998) e as evidências experimentais iniciais indicavam que a proteína estava

bloqueando a produção do sinal de espalhamento do silenciamento (Guo & Ding, 2002). A

expressão de 2b em plantas, no entanto, permitiu um maior entendimento de sua ação na

via. Observou-se que plantas expressando o supressor apresentavam defeitos no

desenvolvimento (Zhang et al., 2006a). Esses defeitos correlacionam-se com o acúmulo das

fitas guia e de passagem dos microRNAs e também dos alvos dos microRNAs. Dessa

forma, 2b não interfere na produção dos microRNAs, mas sim com a sua função.

Especulou-se, portanto, que a supressora poderia estar inibindo a ação de AGO1, proteína

responsável pela atividade de degradação no RISC das vias de siRNAs virais e de

microRNAs. Essa hipótese foi comprovada por experimentos de imunoprecipitação,

observando-se a interação de 2b com o domínio PAZ de AGO1 (Zhang et al., 2006a).

Observou-se também uma redução no acúmulo de tasiRNAs nas plantas expressando 2b,

possivelmente pela inibição da clivagem dos genes TAS pelos microRNAs.

Assim, 2b estaria suprimindo o silenciamento pela inibição da principal proteína

envolvida na RISC de plantas, AGO1. Experimentos iniciais realizados com 2b indicaram

que o supressor está envolvido na repressão do sinal de disseminação do silenciamento,

tanto de célula a célula, quanto a nível sistêmico (Guo & Ding, 2002). Recentemente, no

entanto, observou-se que as proteínas Argonautes não estão envolvidas na geração do sinal

de disseminação de célula a célula (Baumberger et al., 2007). Sendo assim, possivelmente a

2b deve atuar também em outras vias de silenciamento. Dados recentes indicam que a 2b do

Tomato aspermy virus, um vírus do gênero Cucumovirus, é capaz de se ligar aos siRNAs e

também a longos dsRNAs (dados não publicados discutidos em Diaz-Pendon et al., 2007).

Assim, uma ação dupla de 2b permitiria que o vírus replicasse eficientemente nas células

infectadas pela inibição de AGO1 e, além disso, evitaria a disseminação do silenciamento

através da ligação com pequenos RNAs.

II.1.3.3 – Supressores de silenciamento na família Luteoviridae

A família Luteoviridae apresenta três gêneros distintos: Luteovirus, Polerovirus e

Enamovirus. Atividade supressora de silenciamento já foi observada na proteína codificada

pela ORF0 (ou P0) de três membros do gênero Polerovirus: Beet western yellows virus

(BWYV), Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) e Potato leafroll virus (PLRV)

(Pfeffer et al., 2002). Nunca foi reportado na literatura, no entanto, atividade supressora em

membros dos outros dois gêneros da família.

Experimentos com a P0 do BWYV (BWP0) em Nicotiana benthamiana 16C

mostraram que essa proteína é uma forte supressora de silenciamento local, mas não

interfere na produção do sinal de disseminação sistêmico (Pfeffer et al., 2002). Mostrou-se

também que a atividade supressora elimina siRNAs quando plantas 16C são co-infiltradas

com transcritos de GFP (sGFP) (Pfeffer et al., 2002), mas não quando o indutor é uma

dupla fita de GFP (hpGFP) (Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007).

O papel de P0 na supressão do silenciamento ficou mais claro quando se mostrou

que a proteína atua na via de ubiqüitinação como se fosse uma F-box, levando a proteólise

de alvos (Pazhouhandeh et al., 2006). Estudos com duplo híbrido em leveduras mostraram

que a BWP0 e a P0 do CABYV (CAP0) interagem in vivo e in vitro com a proteína

codificada pelo gene SKIP2 (AT5g42190) de Arabidopsis thaliana. O gene SKIP2 é um

homólogo do gene SKIP1 de leveduras e codifica uma proteína que está envolvida na via

de ubiqüitinação através do complexo SCF (SKIP1_Cullin1_F-box_RBX1). A proteína

SKIP1 se liga a CULLIN1 e a uma proteína com domínio F-box. As proteínas F-box, por

sua vez, se ligam a proteínas alvos que são então ubiqüitinadas por uma enzima conjugante

de ubiqüitina E2 e em seguida degradadas no proteasoma 26S (Petroski & Deshaies, 2005).

O sistema de degradação é muito conservado e, de fato, foi observado que CAP0 é capaz de

interagir tanto com a SKIP2 de plantas, quanto com a SKIP1 de leveduras (Pazhouhandeh

et al., 2006). Proteínas P0 que apresentam mutações pontuais em sítios conservados do

domínio F-box, no entanto, não interagem com SKIP2.

O único membro do gênero Enamovirus, o Pea enation mosiac virus 1 (PEMV-1),

também apresenta uma proteína P0. Essa proteína, no entanto, é cerca de 200 nucleotídeos

maior e possui identidade de seqüência de apenas 5 a 10% com a P0 dos membros do

gênero Polerovirus. Esse vírus, em associação simbiótica com o RNA de um Umbravirus

(PEMV-2), é capaz de sair do floema e ser transmitido mecanicamente. Membros do

gênero Luteovirus não apresentam P0 e são biologicamente indistinguíveis dos Polerovirus,

exceto pelo fato de infectarem apenas monocotiledôneas. Dessa forma, a identificação e a

caracterização de proteínas supressoras de silenciamento por RNA nesses dois grupos de

vírus seriam de grande importância para o melhor entendimento da biologia da família viral

Luteoviridae.

Capítulo II

_________________________________________________________________________

OBJETIVOS

II.2 – Objetivos

A segunda parte desta tese teve como objetivo geral identificar e caracterizar novas

proteínas supressoras de silenciamento gênico na família Luteoviridae. Os objetivos

específicos foram:

• Clonar todos os genes do Barley yellow dwarf virus – PAV (BYDV-PAV) em

vetor de expressão de plantas e testar a atividade de supressão de silenciamento

de cada uma das proteínas codificadas pelo vírus.

• Clonar a ORF0 do Pea enation mosaic virus-1 (PEMV-1) e verificar se a

proteína codificada apresenta ação de supressão;

• Determinar se a P0 do PEMV-1 atua como uma proteína F-Box;

• Determinar possíveis alvos de ação das proteínas P0 de Polerovirus, usando o

modelo PLRV, e de Enamovírus, usando o PEMV-1;

Capítulo II

_________________________________________________________________________

MATERIAL

MÉTODOS

II.3 – Material e Métodos

II.3.1 – Obtenção das construções plasmidiais: clonagens GATEWAY

As clonagens dos genes para expressão em plantas ou em leveduras foram

realizadas através da tecnologia de GATEWAY (invitrogen).Como clones de entrada para

foram utilizados os plasmídios pDONR-201 ou o plasmídio p-ENTR-D-TOPO, ambos da

Invitrogen. Para a clonagem via pDONR-201, dois pares de oligos foram desenhados para

cada construção. O primeiro par de oligo contém cerca de 20 bases específicas do gene e

mais parte do sítio de recombinação do fago lambda, necessário para a recombinação. O

segundo par de oligos possui toda a seqüência do sítio de recombinação do fago lambda. As

reações de PCR com oligos gene específicos foram feitas com 2,5 unidades de Pfu

(Promega), tampão de reação 1X, 0,5 µM de cada oligo, 0,2 mM de dNTPs e 2 µL de

cDNA ou 100 ng de DNA plasmidial. O DNA foi desnaturado a 95 °C por 5 minutos e em

seguida foram realizadas 33 ciclagens de 94 °C por 45 segundos, temperatura de

anelamento (TM) dos oligos por 45 segundos e 72 °C de um a dois minutos. A

amplificação foi finalizada com uma extensão de 5 minutos a 72 °C. A visualização do

produto de amplificação foi feita através de eletroforese em gel de agarose 1,2% em TAE

0,5X (0,02 M Tris-acetato, 0,5 mM EDTA). O fragmento correspondente ao gene foi

cortado do gel e purificado com o “QIAquick Gel Extraction Kit” (Invitrogen Co.),

seguindo recomendações do fabricante. O fragmento sacado foi utilizado para uma segunda

reação de PCR. Essa etapa é realizada com oligos correspondentes a toda região de

recombinação do fago Lambda e tem como objetivo introduzir toda a seqüência AttB1 e

AttB2 nas bordas 5´ e 3` do fragmento amplificado, respectivamente. Para tanto, 10 µL do

fragmento sacado foram misturados com 2,5 unidades da polimerase Pfu (Promega),

tampão de reação 1X, 1 µM de cada oligo, 0,2 mM de dNTPs. O DNA foi desnaturado a 95

°C por 1 minuto e em seguida foram realizadas 5 ciclos de 94 °C por 15 segundos, 40 °C

por 30 segundos e 72 °C por um minuto. Uma novo ciclo com 20 etapas foi realizada com

94 °C por 15 segundos, 55 °C por 30 segundos e 72 °C de um a dois minutos, dependendo

do tamanho do fragmento. A amplificação foi finalizada com uma extensão de 5 minutos a

72 °C. Novamente a visualização do produto de amplificação foi feita através de

eletroforese em gel de agarose 1,2% em TAE 0,5X e o fragmento correspondente ao

amplicon foi cortado do gel e purificado com o “QIAquick Gel Extraction Kit”, seguindo

recomendações do fabricante. Em seguida os fragmentos amplificados foram recombinados

para o plasmídeo de doação (pDONR 201 – Invitrogen). As reações BP foram realizadas

com 40 ng de PCR purificado, 75 ng de pDONR 201, 1X do tampão de reação e 1 µL da

recombinase BP (Invitrogen), em um volume final de 5 µL. A reação foi incubada por 3

horas a 25 °C e em seguida foi misturada por mais 10 minutos com 1 µL de proteinase K a

37 °C. Cerca de 2 µL das reações foram transformadas em E. coli XL1 Blue ou DH5α por

eletroporação e em seguida espalhadas em meio LB sólido contendo 25 µg/mL de

canamicina.

Para a clonagem via pENTR-D-TOPO, a seqüência “CACC” foi adicionada na

frente de todos os oligos de descida (forward). As reações de PCR foram realizadas com 2

µL de DNA plasmidial (100 ng) ou cDNA, 2,5 unidades da polimerase Pfu (Promega), 1X

de tampão da Pfu polimerase, 0,5 µM de cada oligo e 0,2 mM de dNTPs, em um volume

final de 50 µL. O programa utilizado para a ciclagem foi: 95 ºC por 5 minutos, ciclagem de

40 vezes a 95 ºC por 1 minuto, temperatura de anelamento dos oligonucleotídeos por um

minuto, 72 ºC por um ou dois minutos (dependendo do tamanho do fragmento) e uma

polimerização final por 10 minutos a 72 ºC. A visualização do produto de amplificação foi

feita através de eletroforese em gel de agarose 1,2% em TAE 0,5X (0,02 M Tris-acetato,

0,5 mM EDTA). O fragmento correspondente ao gene foi cortado do gel e purificado com o

“QIAquick Gel Extraction Kit” (Invitrogen), seguindo recomendações do fabricante. A

reação TOPO foi realizada por 15 minutos a temperatura ambiente com 1 µL de PCR

purificado (5 – 10 ng), 0,5 µL de solução salina contendo 1,2 M de NaCl e 0,06 M de

MgCl

, 0,5 µL de vetor, em um volume final de 3 µL. Toda a reação foi misturada com

cerca de 30 µL de bactéria TOP10 (Invitrogen) termo competente. A reação foi

inicialmente mantida por 30 minutos em gelo, depois por 30 segundos a 42 ºC e transferida

para o gelo novamente. Em seguida foram adicionados 125 µL de meio SOC (2% triptona,

0,5% extrato de levedura, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl

, 10 mM MgSO

, 20

mM glicose), as bactérias foram agitadas a 220 rpm por uma hora a 37 ºC e em seguida

espalhadas em meio LB sólido contendo 25 µg/mL de canamicina.

As reações LR foram realizadas com 100 ng de plasmídeo de destino (Figura 11),

50 ng de plasmídeo de entrada (pDONR-201 ou pENTR-D-TOPO), 1X do tampão de

reação e 1 µL da recombinase LR (Invitrogen), em um volume final de 5 µL. As reações

foram incubadas por 2 horas a 25 °C e em seguida misturadas por mais 10 minutos com 1

µL de proteinase K a 37 °C. Cerca de 2 µL de cada reação foram usados para transfomar E.

coli XL1 Blue ou DH5α por eletroporação; após o que as bactérias foram selecionadas em

meio LB sólido contendo antibiótico apropriado. Os protocolos para produção de células

competentes, transformação e mini-preparação plasmidial estão descritos na parte I.3.4

desta tese.

Os genes do BYDV-PAV e do PLRV foram amplificados a partir de plasmídios

contendo clones totais ou parciais dos vírus, gentilmente cedidos pelo Dr. Peter

Waterhouse. Os genes de Arabidopsis DCL1, DCL2, DCL3 e DCL4 foram clonados por

restrição no p-ENTR-D-TOPO pelo técnico Niel Smith do CSIRO, Canberra, Austrália.

Esses clones de entrada foram utilizados para a recombinação com os plasmídios de

destino. Os demais genes de Arabidopsis (DRB1, DRB2, DRB3, DRB4, DRB5, AGO1,

AGO2, AGO4, AGO6, AGO7, SKIP2, SGS3) foram amplificados a partir de cDNAs. As

reações de síntese de cDNAs foram feitas através do mesmo protocolo descrito na parte

I.3.3. Os genes do BYDV-PAV (PAV P1-P2, PAV P3, PAV P4, PAV P3-P5) foram

transferidos com o códon de término para o vetor pBART::FLAG, gerando os vetores

pBART-PAVP1-P2, pBART-PAVP3, pBART-PAVP4, pBART-PAVP3-P5. Os genes,

portanto, não apresentam fusão com o FLAG. A P0 do PLRV foi transferida para os vetores

pBART::FLAG, pArt27::HA, pArt::GFP e pAS2-1, gerando os vetores pBART-PLP0,

pHA-PLP0, pGFP-PLP0, pBD-PLP0, respectivamente. Os genes de Arabidopsis SKIP2,

DRB1, DRB2, DRB3, DRB4, DRB5, AGO1, AGO2, AGO4, AGO6, AGO7, SGS3 foram

transferidos para o vetor pBART::FLAG, gerando os vetores pBART-SKIP2, pBART-

DRB1, pBART-DRB2, pBART-DRB3, pBART-DRB4, pBART-DRB5, pBART-AGO1,

pBART-AGO2, pBART-AGO4, pBART-AGO6, pBART-AGO7 e pBART-SGS3. Os

genes de Arabidopsis DCL1, DCL2, DCL3, DCL4, DRB1, DRB2, DRB3, DRB4, DRB5,

AGO1, AGO2, AGO4, AGO6, AGO7, SGS3 foram transferidos para o vetor pACT2,

gerando os vetores finais pAD-DCL1, pAD-DCL2, pAD-DCL3, pAD-DCL4, pAD-DRB1,

pAD-DRB2, pAD-DRB3, pAD-DRB4, pAD-DRB5, pAD-AGO1, pAD-AGO2, pAD-

AGO4, pAD-AGO6, pAD-AGO7, pAD-SGS3. Os mapas de todos os vetores de destino

utilizados nesta parte da tese estão esquematicamente representados na figura 11. Os

vetores pBART::FLAG, pArt27::HA e pArt::GFP foram construídos pelo aluno de

doutorado do CSIRO Shaun Curtin. Os vetores Clontech pAS2-1 e pACT2 foram

adaptados para a tecnologia GATEWAY pela pesquisadora do CSIRO Masumi Robertson

(Robertson, 2004). Os vetores contendo o gene marcador GFP sob controle do promotor

35S (35S-GFP) ou fusionado com o vírus Potato virus X (PVX-GFP) foram gentilmente

fornecidos pelos doutores Peter Waterhouse e Olivier Voinnet, respectivamente.

Figura 12: Vetores de destino GATEWAY. A – vetor para expressão em plantas

pBART::FLAG. Utilizado em experimentos de transformação de plantas, expressão

transiente e co-imunoprecipitação. B – vetor para expressão em plantas pART27::HA.

Utilizado para expressão transiente e co-imunoprecipitação. C – vetor não binário

pART::GFP para fusão com GFP. Utilizado para experimentos de localização sub-celular

das supressoras em células de cebola. D – vetor para duplo híbrido em leveduras pAS2-1

(Clontech). Utilizado para a fusão das supressoras com o domínio de ligação ao DNA da

GAL4 (GAL4 BD). E - vetor para duplo híbrido em leveduras pACT2 (Clontech Co.).

Utilizado para a fusão de genes vegetais com o domínio de ativação da GAL4 (GAL4 AD).

II.3.2 – Mutagênese via PCR

Mutações pontuais foram introduzidas na P0 do Pea enation mosaic virus-1 (PEP0),

com o intuito de verificar se sua atividade está envolvida com a presença de um domíneo

tipo F-Box íntegro. As versões mutantes da PEP0 (PEP0∆P, PEP0∆LP, PEP0∆LPP) foram

geradas por PCR, através de oligos sobrepostos (Figura 12). Para a geração do mutante

PEP0∆P, a seqüência da PEP0 selvagem foi amplificada com os oligos PEP0TPF (5’

CACCATGCACGGAATTGAGCAG 3’) e PEP0LPR (5’

AGAAGGTGAGCAAGTCCAATT 3’) e em seguida com os oligos PEP0AF

(5’ATGGACATGGCCCAATTGGACTTGCTCACCTTCTCAATGCCAATTGCTAATA

CA 3’) e PEP0R (5’ CTAGAAGAAGTTATCAAGATC 3’). Os produtos amplificados

foram purificados, misturados em um mesmo tubo e usados como molde para a

amplificação com os oligos PEP0TPF e PEP0R. Para a geração do mutante PEP0∆LP, a

seqüência da PEP0 selvagem foi amplificada com os oligos PEP0TPF e PEP0AAR (5’

GTCCAATTGGGCCATGTCCATCCAGATGTTGTTAGGAAGTGCCCAGTATGA 3’) e

em seguida com os oligos PEP0PF (5’ AACAACATCTGGATGGACATG 3’) e PEP0R.

Os produtos amplificados foram purificados, misturados em um mesmo tubo e usados

como molde para a amplificação com os oligos PEP0TPF e PEP0R. Para a geração do

mutante PEP0∆LPP, a seqüência da PEP0 selvagem foi amplificada com os oligos

PEP0TPF e PEP0AAR e em seguida com os oligos PEP0AF e PEP0R. Os produtos

amplificados foram purificados, misturados em um mesmo tubo e usados como molde para

a amplificação com os oligos PEP0TPF e PEP0R. As reações de PCR foram realizadas com

a enzima Pfu (Promega) e a seguiram o mesmo protocolo descrito no item II.3.1. Em

seguida os fragmentos amplificados foram clonados em vetores pENTR-D-TOPO, como

descrito no item II.3.1. As mutações foram confirmadas através de seqüenciamento, como

descrito em I.3.5.

Figura 13: Estratégia para a introdução de mutações pontuais na P0 do Pea enation

mosaic virus-1. As setas representam o local e o sentido de polimerização dos oligos

desenhados. As bases modificadas introduzidas nas seqüências dos oligos estão realçadas

em vermelho. Os resíduos de aminoácidos conservados do domínio F-box da P0 estão

destacados em amarelo. Mutantes PEP0∆P foram obtidos pela amplificação da PEP0

selvagem através dos oligos PEP0TPF e PEP0LPR e em seguida com os oligos PEP0AF e

PEP0R. Os produtos amplificados foram usados como molde para a amplificação com os

oligos PEP0TPF e PEP0R. Mutantes PEP0∆LP foram obtidos pela amplificação da PEP0

selvagem com os oligos PEP0TPF e PEP0AAR e em seguida com os oligos PEP0PF e

PEP0R. Os produtos amplificados foram usados como molde para a amplificação com os

oligos PEP0TPF e PEP0R. Mutantes PEP0∆LPP foram obtidos pela amplificação da PEP0

selvagem com os oligos PEP0TPF e PEP0AAR e em seguida com os oligos PEP0AF e

PEP0R.

II.3.3 – Agro-Infiltração em Nicotiana benthamiana

Infiltrações via Agrobactéria em Nicotiana bethamiana foram realizadas com o

intuito de verificar a atividade supressora de proteínas virais e também para a realização de

experimentos de co-imunoprecipitação. As construções de interesse foram transformadas

através de eletroporação (25 µF, 200 Ω e 1,80 kV, Biorad) em Agrobacterium tumefaciens

cepa GV3101. Após dois dias de crescimento a 28 °C, uma colônia isolada foi retirada com

o auxilio de um palito estéril e transferida para um pré-inóculo contendo 5 ml de LB e os

antibióticos Rifampicina (100 µg/mL), Gentamicina (40 µg/mL) e as resistências dos

plasmídios introduzidos. O pré-inóculo foi agitado a 220 rpm por 20 horas a 28 °C, em

seguida diluído em 50 mL de LB contendo os mesmos antibióticos, MES (10 mM) e

acetosiringona (20 µM) e então agitado a 28

C por mais 20 horas. As bactérias foram

sedimentadas e ressuspensas em uma solução contendo MES (10 mM), cloreto de magnésio

(10 mM) e acetosiringona (100 µM) até atingirem a densidade ótica de 1. As bactérias

foram deixadas por pelo menos duas horas a temperatura ambiente e em seguida infiltradas

na parte de baixo das folhas de Nicotiana benthamiana linhagem 16c, gentilmente cedidas

pelo Dr. Olivier Voinnet, com o auxílio de uma seringa de 3 mL sem agulha. As plantas

foram mantidas a 24 °C em casa de vegetação.

II.3.4 – Transformação de Arabidopsis thaliana

Plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia foram transformadas com a s

supressoras através da técnica de “Floral Dip”. As plantas foram germinadas em potes de

terra até atingirem a fase de florescimento. Os primeiros ramos florais foram cortados para

a estimulação de novos botões florais secundários. Cepas de Agrobacterium tumefaciens

GV3101 foram transformadas com genes de interesse em vetor binário através de

eletroporação (25 µF, 200 Ω e 1,80 kV, Biorad). Colônias isoladas foram crescidas em 100

mL de LB líquido contendo antibióticos apropriados por dois dias em seguida sedimentadas

através de centrifugação por 15 minutos a 6000 RPM. As bactérias foram ressuspensas em

solução contendo 5% de sacarose e 0,05% de Vac-In-Stuff Silwet L-77 (OSi Specialties

Inc). As flores de Arabidopsis foram gentilmente mergulhadas e agitadas por cerca de 5

segundos na solução de Agrobactéria e cobertas com plástico por um ou dois dias. Uma

semana depois, as plantas foram novamente mergulhadas em solução de agrobactéria, para

garantir máxima eficiência de transformação. As plantas foram mantidas em casa de

vegetação e as sementes foram coletadas cerca de um mês após a infiltração, quando se

iniciou a secagem das mesmas. Para a descontaminação, as sementes foram mantidas por 4

horas em ambiente fechado na presença de uma solução contendo 100 mL de água sanitária

e 3 mL de ácido clorídrico concentrado (~10 M). Foram em seguida distribuídas em placas

com meio MS (sacarose 30 g/L; mio-inositol 100 mg/L; glicina 2 mg/L; ácido nicotínico

0,5 mg/L; piridoxina-HCl 0,5 mg/L; tiamina-HCl 0,1 mg/L; Na

EDTA.2H

O 37,3 mg/L;

FeSO

.7H

O 27,8 mg/L; Bacto Agar 0,7%; pH 5,8) contendo 200 µg/mL de timentina e

antibiótico apropriado para a seleção das plantas transformadas.

II.3.5 – Northern blot

Ensaios com sondas moleculares foram realizados com o objetivo de detectar o

acúmulo dos RNAs alvos de pequenos RNAs endógenos. RNAs totais de Arabidopsis

thaliana e Nicotiana benthamiana foram extraídos através de Trizol (Invitrogen Co.),

seguindo especificações do fabricantes. Os géis de northern blot para a detecção de RNAs

de alto peso molecular foram feitos seguindo o protocolo descrito em I.3.8.

II.3.6 – Detecção de pequenos RNAs

Os géis de detecção de pequenos RNAs foram feitos através da corrida de RNA

total de Arabidopsis thaliana ou Nicotiana benthamiana em poliacrilamida. Os RNAs

foram extraídos com Trizol (Invitrogen Co.), seguindo as recomendações do fabricante,

exceto pelo fato da precipitação com isopropanol ter sido feita por 8 horas na temperatura

de – 20 °C. Os RNAs foram inicialmente quantificados em espectrofotômetro e em seguida

analisados em géis de agarose. As bandas dos pequenos RNAs foram visualmente

analisadas e as correções para que estivessem em quantidades homogêneas foram feitas.

Os géis foram preparados misturando-se 8,25 mL de acrilamida 40% (Biorad Co.),

2,2 mL de 10X TBE (890 mM tris-base; 890 mM ácido bórico; 20 mM EDTA), 4,95 mL de

água destilada e 9,6 g de uréia. A solução foi resfriada a 4 °C e em seguida polimerizada

pela adição de 132 µL de persulfato de amônia 10% e 11 µL de TEMED (Invitrogen).

Cerca de 40 µg de RNA total foram concentrados para 6 µL e em seguida adicionou-se 18

µL de tampão de formamida (10 mL de formamida, 1 mg de azul de bromo fenol e 1 mg de

xileno). A amostra foi aquecida por dois minutos a 95 °C e aplicada no gel. A corrida foi

realizada a 60 V por cerca de 15 horas em aparato “Protean II” (Biorad Co.) contendo 1X

TBE (8,9 mM tris-base; 8,9 mM ácido bórico; 2 mM EDTA). Após a corrida o gel foi

retirado, lavado com TBE 0,5X e usado para montar o aparato de transferência, que

consistiu de: espuma protetora, duas folhas de papel 3 MM ou uma folha “Trans-Blot

15X20” (Biorad), gel, membrana Hybond-N (Amersham), duas folhas de papel 3 MM ou

uma folha “Trans-Blot 15X20” (Biorad) e espuma protetora. A transferência ocorreu a 60 V

por uma hora em TBE 0,5X a 4 °C. Após transferência o aparato foi desmontado e a

membrana foi fixada em aparelho “Crosslinker” (Biorad).

As pré-hibridações foram feitas a 38 ºC por 4 horas, utilizando-se uma solução de

hibridação contendo tampão fosfato 125 mM, SDS 7%, NaCl 250 mM e formamida 50%.

Seguiu-se uma hibridização de 16 horas a 38º C com sondas radioativamente marcadas.

Duas lavagens de 45 minutos foram realizadas a 38 ºC com a solução 2X SSC, 0,1% SDS.

As membranas ainda úmidas foram colocadas em sacos plásticos selados, expostas por

cerca de cinco dias e reveladas através do aparelho Phosphoimager FLA-5000 (Fujifilm).

As sondas para a detecção de siRNAs nas infiltrações em Nicotiana benthamiana

foram preparadas através de “random primer” (PerkinElmer) ou por transcrição in vitro.

Para random priming, o fragmento da GFP foi sacado do vetor pGEMT-Easy por restrição

e 50 ng em 12 µL foram aquecidos a 95 ºC por 5 minutos. Adicionou-se 6 µL do “random

primer buffer”, 6 µL de dDTP (dNTP sem dCTP), 5 µL de α-dCTP

e 1 µL de Klenow. A

reação foi realizada por uma hora a 37 ºC, o volume final foi elevado para 50 µL, em

seguida o material foi purificado em colunas de Sephadex G-50 (Amersham) e desnaturado

a 95 ºC por 5 minutos antes de ser adicionado na solução de hibridação.

As reações de transcrição in vitro foram feitas com as enzimas T7 ou SP6 na

presença de UTP marcado radioativamente. A transcrição ocorreu com 200 ng de DNA

plasmidial linearizado na presença de tampão de transcrição 1X, 10 mM de DTT, 40 U de

inibidor de RNase “RNase Block II” (Stratagene), 2.5 mM dos ribonucleotídeos ATP, GTP

e CTP, 1 mM de ribonucleotídeo UTP, 40 µCi de α-dUTP

e 20 U de T7 polimerase ou

SP6 polimerase (Fermentas), em um volume total de 20 µL. A reação foi realizada por uma

hora a 37 ºC, adicionou-se 40U de inibidor de RNase “RNase Block II” (Stratagene) e após

mais uma hora de incubação a 37 ºC foi realizada uma precipitação com 10 µL de acetato

de amônia 7,5M e 75 µL de etanol. A mistura foi mantida por 10 minutos em gelo e em

seguida centrifugada a 14000 RPM por 15 minutos. Uma segunda precipitação foi realizada

adicionando-se ao sedimentado 100 µL de TE, 50 µL de acetato de amônia e 375 µL de

etanol. Após 10 minutos no gelo a mistura foi centrifugada e ressuspensa em 20 µL de água

ou TE. Após a precipitação, foram adicionados 300 µL de solução de carbonato (NaHCO

80 mM; Na

120 mM) e a mistura foi incubada a 60 ºC pelo tempo necessário para a

redução da sonda para um tamanho médio de 50 nucleotídeos. O tempo necessário foi

calculado através da fórmula t = (Li – Lf)/(Li.Lf.0,11), onde t é tempo em minutos, Li é o

tamanho inicial do fragmento, Lf é o tamanho final (50 bases) e 0,11 a taxa de clivagem em

mil bases por minuto. Após a clivagem por carbonação, foram adicionados 20 µL de

NaOAc 3M (pH 5) e em seguida todo o volume foi adicionado na solução de hibridação.

As sondas para detecção de microRNAs e tasiRNAs foram preparadas através da

transferência de fósforo radioativamente marcados para oligonucleotídeos através da

polinucleotídeo quinase (PNK) do fago T4. Para tanto, 3 pmoles de oligo foram misturados

com 1X de tampão da PNK, 10 µL de γ-ATP

(10 µCi/µL), 10 U de T4 PNK, em um

volume final de 20 µL. A reação foi incubada por uma hora a 37 ºC e em seguida

precipitada através da adição de 40 µL de água, 240 µL de acetato de amônia 5M e 750 µL

de etanol gelado. A mistura foi mantida por 30 minutos em gelo e o precipitado foi

sedimentado através de centrifugação a 14000 RPM por 20 minutos a 4 ºC. O sedimentado

foi lavado uma vez com etanol 70% e ressuspenso em 100 µL de TE (Tris-EDTA).

II.3.7 – Co-Imunoprecipitação

Experimentos de co-imunoprecipitação foram realizados com o intuito de verificar a

interação das supressoras com SKIP2 e possíveis outras proteínas-alvo de Arabidopsis

thaliana. Após infiltradas em Nicotiana bethamiana como descrito no item II.3.3, cerca de

1 g de folha foram maceradas em nitrogênio líquido em seguida foram adicionados 5 mL de

tampão de lise (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; Triton X100 1% e

50 µL de inibidor de protease Sigma, P9599). Após sonicar 4 vezes por 15 segundos a 100

W, o material foi sedimentado por centrifugação a 20.500 g por 40 minutos a 4 ºC. O

sobrenadante foi retirado e adicionou-se mais 50 µL de inibidor de protease. Uma alíquota

de 1 mL do sobrenadante foi incubada com 20 µL de resina anti-FLAG lavada (Ezview

anti-FLAG M2 agarose, Sigma) por 2 horas a 4 ºC com leve agitação. A resina foi

sedimentada por centrifugação a 8200 g por 30 segundos a 4 ºC e lavada com 1 mL de

tampão de lise e, em seguida, lavada por duas vezes de 5 minutos com tampão LNDET

(LiCl 0,25 M; NP40 1%; ácido deoxicólico 1%, EDTA 1 mM; Tris-HCl 10 mM, pH 8) a 4

ºC. A resina foi incubada a 95 ºC por 5 minutos em 50 µL de tampão de corrida SDS-

PAGE (Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%; mercaptoetanol 2%; 0,002%

azul de bromo fenol). Entre 10 e 15 µL foram aplicados em géis de SDS-PAGE.

II.3.8 – Western blot

O acúmulo de proteínas foi analisado através de SDS-PAGE seguido da hibridação

com anticorpos. Os géis de SDS-PAGE foram polimerizados em duas partes: o gel de

separação na parte inferior e o gel de aplicação na superior. Os géis de separação foram

polimerizados com 2,5 mL de Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8; 50 µL de SDS 20%; 50 µL de

persulfato de amônia 10%, 10 µL de TEMED e quantidades variáveis de água e acrilamida

40% (Biorad) para obter concentrações variando de 7% a 15%. O gel de aplicação foi feito

com 1,25 mL de Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8; 25 µL de SDS 20%; 25 µL de persulfato de

amônia e 10 µL de TEMED e quantidades varáveis de água e acrilamida 40% (Biorad) para

obter concentrações variando de 3% a 5%. O tecido vegetal (0,01 g) foi misturado com 100

µL de tampão de corrida (Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%;

mercaptoetanol 2%; 0,002% azul de bromo fenol), aquecido a 90 ºC por 10 minutos,

resfriado em gelo por 1 minuto, agitado brevemente em vortex e depois centrifugado a

14000 RPM por 5 minutos a temperatura ambiente. Cerca de 20 µL de amostra foram

aplicadas e a migração correu em cubas “mini-protean” (Biorad) a 150 V por cerca de 2

horas em tampão contendo 3 g/L de Tris, 14,4 g/L de glicina e 1 g/L de SDS. Foi utilizado

o “Prestained Bench Marker Molecular Weight” (Invitrogen Co.) como marcador de peso

100

molecular. Em seguida os géis ou foram corados com azul de coomassie ou transferidos

para membrana PVDF. A coração com azul de coomassie ocorreu por cerca de 2 horas e as

lavagens foram feitas com solução contendo 50% de metanol e 10% de ácido acético, por

tempo variado.

Para a transferência, a membrana foi ativada por 5 minutos em metanol e em

seguida utilizada para montar o aparato de transferência, que consistiu de: espuma

protetora, duas folhas de papel 3 MM ou uma folha “Trans-Blot” (Biorad), gel, membrana

PVDF (Millipore), duas folhas de papel 3 MM ou uma folha “Trans-Blot” (Biorad) e

espuma protetora. A transferência ocorreu a 100 V por uma hora em tampão de

transferência (Tris-HCl 25 mM; glicina 192 mM; metanol 20%) a 4 °C. Após transferência

o aparato foi desmontado e a membrana foi diretamente bloqueada por cerca de 10 horas

em solução contendo 5% de leite em pó em TBS 1X (Tris-HCl 10 mM pH 7,4; NaCl 150

mM) a 4 °C. Em seguida a membrana foi lavada duas vezes com TBS 1X e o anticorpo

primário, anti-FLAG (Sigma) ou anti-HA (Sigma), foi adicionado em solução contento

0,1% de leite em pó em TBS 1X, em uma diluição de 10000 vezes. A solução foi agitada

por cerca de 2 horas a temperatura ambiente e em seguida lavada por quatro vezes de 5

minutos com TBS 1X, com leve agitação. Finalmente o anticorpo secundário anti-Mouse

(Promega) contendo uma peroxidase foi adicionado 5000 vezes diluído em uma solução

contendo 0,1% de leite em pó em TBS 1X. A reação foi realizada por uma hora a

temperatura ambiente em seguida lavada por quatro vezes de 5 minutos com TBS 1X, com

leve agitação. A membrana foi revelada com o kit “Western Lighting with Enhanced

Luminol” (PerkinElmer).

II.3.9 – PCR em tempo real

Experimentos de PCR em tempo real foram realizados para detectar o acúmulo de

genes alvos de microRNAs em plantas de Arabidopsis thaliana expressando ou não as

proteínas supressoras. Antes de iniciar a síntese de cDNA para as reações de PCR em

tempo real, os RNAs totais extraídos de folhas de Arabidopsis thaliana foram tratados com

DNase. Para tanto, 50 µg de RNA total foram misturados com 50 U de DNase RQ1

(Promega), 400 U de inibidor de RNase “RNasin” (Promega) e tampão RQ 1X, em um

101

volume final de 400 µL. Em seguida a reação foi lavada através da coluna do kit Rneasy

(Qiagen). Para tanto, a reação foi separada em dois tubos de 200 µL e adicionou-se em cada

um 700 µL de tampão RLT, 7 µL de mercaptoetanol e 500 µL de etanol. A mistura foi

aplicada em dois lotes em duas colunas “RNeasy Mini Spin Column” (coluna rosa)

diferentes e centrifugadas a 15 segundos a 10000 RPM. Adicionou-se 500 µL de tampão

RPE, centrifugou-se por 15 segundos e logo em seguida por mais 2 minutos. Os RNAs

foram liberados das colunas pela aplicação de 30 µL de água no centro das mesmas, sendo

coletados em tubos de microcentrífuga por centrifugação de um minuto a 10000 RPM. Uma

segunda alíquota de 30 µL foi aplicada em cada coluna. No final, os RNAs eluídos de cada

uma das colunas foram juntados, resultando em um volume final de 120 µL para cada

amostra de RNA total inicialmente tratada com DNase. Os RNAs tratados foram

quantificados por espectrofotômetro e 5 µg utilizados para a síntese de cDNA, seguindo o

mesmo protocolo descrito no item I.3.3. As amostras de cDNA foram diluídas 25 vezes e 5

µL foram misturados com 10 µL de “SYBR Green JumpStart Taq Ready Mix” (Sigma Co.)

e 0,2 µM de cada oligo, em um volume final de 20 µL. Foram realizadas três reações

independentes para cada par de oligos na máquina Rotor-Gene 3000 (Corbett

Robotics). As

configurações usadas foram: 72 “well rotor”, “normal speed”, “channel FAM/SYBR”. As

ciclagens foram: 95 °C por 5 minutos, 45 vezes a 95 °C por 15 segundos, 60 °C por 15

segundos, 72 °C por 30 segundos, uma polimerização final de um minuto a 72 °C. Em

seguida a temperatura foi reduzida a 55 °C por 5 minutos e então elevada para 99 °C,

esperando 5 segundos a cada grau de elevação. Os dados foram analisados pelo programa

existente no Rotor-Gene 3000, usando a opção de comparação quantitativa.

Os oligos utilizados para a amplificação dos genes Dcl1, Arf6, Arf8, Cuc1, Myb33,

Ago1, Phavoluta e Arf3 foram: DCL1F (5’ GCAGAGGTATTATCGATGTCTATGG 3’),

DCL1R (5’ TGGAGGGTTCAACATCAACA 3’), ARF6F (5’

AGCTCAAGGCCTCTTTTTCC 3’), ARF6R (5’ TCGAAGGCCAATTAGAAGACC 3’),

ARF8F (5’ TGCTATCGAAGGGTTGTTGG 3’), ARF8R (5’

ACGTCCTTCTCCATGATCTCC 3’), CUC1F (5’ CCTCCGCTAAGGATGAATGG 3’),

CUC1R (5’ AATGTATGAAAGCTCGCATCG 3’), MYB33F (5’

CCAGATAGCCATACCCCTACG 3’), MYB33R (5’ CAGAGTGTGGAGGAGATGACG

3’), AGO1F (5’ CCTTTACCAGGCCTCATTGG 3’), AGO1R (5’

102

GGAGGTGGACCTTCTTCTGG 3’), PHAVOLUTAF (5’

GATTTCAGCGACCTTCATGG 3’), PHAVOLUTAR (5’

TTCCTTTGCAAGGCTACAGG 3’), ARF3F (5’ TGCAAGACCTTATGGAAACCA 3’),

ARF3R (5’ TCCCTGTCTCTGAGGGGATT 3’). Todos os oligos foram desenhados entre

os sítios de clivagem dos seus respectivos pequenos RNAs, portanto, amplificando somente

os transcritos que não foram alvo de clivagem pela via de silenciamento.

II.3.10 – Duplo híbrido em leveduras

Os experimentos de duplo híbrido foram realizados através de co-transformação dos

vetores contendo genes fusionados com o domínio de ligação ao DNA ou com o domínio

de ativação da GAL4 (item II.3.1; Figura 11) na cepa AH109 de levedura. A cepa AH109

apresenta quatro genes marcadores sob regulação de promotores ativados por GAL4:

ADE2, HIS3, MEL1 e LacZ. Os dois primeiros permitem o crescimento das leveduras em

meios de cultura sem a presença dos aminoácidos adenina e histidina, respectivamente.

MEL1 e LacZ codificam os genes α-galactodidase e β-galactosidase, respectivamente e

permitem uma detecção visual dos clones positivos.

A co-transformação foi realizada segundo o descrito no manual do kit BD

Matchmaker (Clontech Co.). Uma colônia de AH109 com menos de quatro semanas e

apresentando de 2 a 3 mm de tamanho foi lançada em 3 mL de meio YPDA (peptona 20

g/L; extrato de levedura 10 g/L; adenina hemisulfato 0,03 mg/L; glicose 0,2%; pH 6,5) em

tubos de 15 mL. A célula foi agitada vigorosamente em vortex em seguida incubada a 220

RPM por 8 horas a 30 °C. A pré-cultura lançada foi diluída aplicando-se 5 µL de células

em 50 mL de YPDA em um frasco de 250 mL. A cultura foi mantida sob agitação de 250

RPM a 30 °C até atingir a densidade ótica entre 0,15 e 0,3 (cerca de 20 horas de

crescimento). As células foram centrifugadas por 5 minutos a 700 x g a temperatura

ambiente, ressuspensas em 100 mL de YPDA e mantidas sem agitação a 30 °C por 3 a 5

horas, até atingir a densidade ótica entre 0,4 e 0,5. Uma nova centrifugação a 700 x g foi

realizada por 5 minutos a temperatura ambiente, seguindo-se de uma lavagem do sedimento

com 60 mL de água deionizada. Após centrifugação a 700 x g por 5 minutos a temperatura

ambiente, as células foram ressuspensas em 3 mL de 1.1X TE/LiAc (Tris-EDTA 1.1X; 110

103

mM LiAc), separadas em dois tubos de microcentrífuga e centrifugadas por 15 segundos a

14000 RPM. Cada um dos sedimentos foi ressuspenso com 600 µL de 1.1X TE/LiAc. Para

a transformação, 50 µL de células foram misturadas com 250 ng de cada um dos DNAs, 50

µg de DNA de esperma de salmão desnaturado e 500 µL de solução PEG/LiAc (PEG 3350

40%; Tris-HCl 1X; LiAc 100 mM). A mistura foi agitada em vortex e incubada a 30 °C por

30 minutos, com agitação por vortex cada 15 minutos. Foi adicionado 20 µL de DMSO e

incubou-se por 20 minutos a 42 °C, agitando em vortex a cada 5 minutos. As células foram

centrifugadas a 14000 RPM por 15 segundos, ressuspensas em 1 mL de YPDA e incubadas

a 30 °C por 90 minutos, com agitação a cada 15 minutos. Foram mais uma vez

centrifugadas por 15 segundos a 14000 RPM, ressuspensas em 1 mL de água e 200 µL

foram espalhados em placas contendo meio SD (mistura de bases nitrogenadas sem

aminoácidos da Difco, glicose e mistura de aminoácidos requerida) sem leucina e sem

triptofano para a seleção dos dois plasmídeos introduzidos. Três colônias de cada

transformante foram lançadas em meio SD líquido sem leucina e triptofano, crescidas sob

agitação por 1 dia a 30 °C, misturadas com quantidades iguais com solução de glicerol 65%

e mantidas em -80 °C. Para o teste de interação, os estoques em glicerol foram distribuídos

em placas contendo meio SD sem leucina, triptofano, histidina e adenina e crescidos por 4 a

8 dias a 30 °C ou 21 °C.

II.3.11 – Bombardeamento em célula de cebola

Com o intuito de verificar a localização sub-celular das supressoras, células de

cebola foram bombardeadas com as construções pGFP-PLP0, pGFP-PEP0 e pGFP-∆LPP.

As partículas de ouro usadas para bombardeamento (1,04 mg de partículas de 5 µm e 1,04

mg de partículas de 1,5 – 3 µm para cada construção) foram inicialmente lavadas duas

vezes com 200 µL de etanol absoluto e em seguida com 200 µL de água em tubos de

microcentrífuga previamente revestidos com silicone e em seguida . Em cada lavagem, as

partículas foram agitadas em vortex e centrifugadas a 6000 RPM por 15 segundos. O

sedimento foi ressuspenso em 25 µL de água, adicionou-se 2,5 µg de plasmídeo, 17 mM de

espermidina, 1 M de cloreto de cálcio e centrifugou-se por 10 segundos. O sedimento foi

lavado com 100 µL de etanol absoluto e em seguida ressuspenso em 30 µL de etanol. Os

104

bombardeamentos foram realizados a 900 psi em aparelho Biolystic Gun (Biorad), modelo

PDS-1000. As cebolas bombardeadas foram mantidas no escuro por 24 horas e em seguida

analisadas sob microscópio confocal Leica SP2.

II.3.12 – Microscopia ótica

Os cotes histológicos para microscopia ótica foram feitos através do aparelho

Vibratome Series 1000 (The Vibratome Company). Para tanto, folhas de Arabidopsis

thaliana foram embebidas em agarose 5% e seccionados a 100 µm de espessura. Em

seguida os tecidos foram clareados em etanol 100% por tempo variado e corados em

solução de azul de toluidina 0,05%.

II.3.13 – Microscopia eletrônica de varredura

As amostras de folhas de Arabidopsis thaliana usadas na microscopia eletrônica de

varredura foram fixadas por 3 horas em formaldeído 4% preparado com 50 mM de PIPES.

Após lavagem por 3 vezes de 10 minutos com PIPES 50 mM, as amostras foram

desidratadas em uma série de passagens em etanol diluído em água, iniciando em 10% e

aumentando a concentração de 10 em 10% até chegar a etanol 100%, permanecendo 30

minutos em cada solução. Os tecidos foram então secos através de CO2 líquido, cobertos

com partículas de ouro (20 nm) e visualizados a 15 kV no microscópio eletrônico de

varredura JEOL 6400.

Capítulo II

_________________________________________________________________________

RESULTADOS

106

II.4 – Resultados

II.4.1 – Procura de novas proteínas supressoras de silenciamento na família

Luteoviridae

Para a identificação de novas supressoras de silenciamento gênico na família viral

Luteoviridae, todas as fases abertas de leitura do BYDV-PAV, vírus tipo do gênero

Luteovirus e a ORF0 do PEMV-1, vírus tipo do gênero Enamovirus, foram clonadas em

vetores de expressão de plantas.

Os genes do BYDV-PAV foram co-infiltrados com o gene que codifica a proteína

marcadora GFP (mGFP) em plantas transgênicas de Nicotiana benthamiana expressando

GFP (linhagem 16c). Os resultados de infiltração, no entanto, mostraram que o produto de

fusão da polimerase (P1-P2), o capsídeo viral (P3) e as proteínas de movimento (P4) e

transmissão (P3-P5) não apresentam atividade de supressão nas condições analisadas

(Figura 14).

A atividade supressora da P0 do PEMV-1 (PEP0) foi inicialmente testada em

experimentos de co-infiltração com um vetor expressando o genoma do Potato virus X

fusionado com GFP (PVX-GFP) em plantas de N. benthamiana selvagens. Especulou-se

que se a PEP0 fosse capaz de suprimir o PTGS, o vírus poderia replicar mais, resultando

em um maior acúmulo de GFP visível. A co-infiltração do PVX-GFP com a PEP0 resultou

em um aumento significativo dos níveis de GFP quando comparados com a infiltração do

mesmo com o vetor vazio (Figura 15D). O aumento de intensidade de GFP foi observado

também na co-infiltração do PVX-GFP com a P19 do Tomato bushy stunt virus (Figura

15B) e a P0 do PLRV (Figura 15C), usados como controles. Esse resultado indicou

fortemente, portanto, que a P0 dos Enamovirus é uma supressora de silenciamento gênico,

assim como a P0 dos Polerovirus.

107

Figura 14: Identificação de possíveis proteínas supressoras de silenciamento no gênero

Luteovirus. O gene GFP foi co-infiltrado em plantas N. benthamiana 16c com diferentes

construções. A - vetor vazio (pBART:FLAG), como controle negativo; B - P19 do Tomato

bushy stunt virus, como controle positivo; C – Polimerase (ORF1 e ORF2) do BYDV-

PAV; D – Capsídeo (ORF3) do BYDV-PAV; E - Proteína de movimento (ORF4) do

BYDV-PAV; F – Proteína de transmissão (ORF3 e ORF5) do BYDV-PAV. Fotos foram

tiradas sob luz ultravioleta 5 dias após a infiltração.

108

Figura 15: P0 do Pea enation mosaic virus-1 é uma supressora de silenciamento gênico

e atua através de um domínio tipo F-Box. Plantas de N. benthamiana foram co-infiltradas

com plasmídeos contendo a seqüência codificadora do PVX fusionado com a seqüência da

proteína marcadora “Green flourescent Protein” (PVX-GFP) e diferentes construções. A –

vetor vazio (pBART:FLAG), como controle negativo; B - P19 do Tomato bushy stunt

virus; C - P0 do PLRV; D - P0 do PEMV-1; E - PEP0∆P; F - PEP0∆LP; G - PEP0∆LPP.

Fotos tiradas 5 dias após a infiltração. H – Detecção dos níveis de GFP por northern blot

nos tecidos infiltrados com PVX-GFP e vetor (Vec), P19, PLP0 (PL), PEP0 (PE), PEP0∆P

(∆P), PEP0∆LP (∆LP) e PEP0∆LPP (∆LPP). As bandas observadas representam os RNAs

genômicos e sub-genômicos do PVX. A sonda molecular foi feita a partir da seqüência do

gene da GFP através da marcação com P

109

II.4.2 – PEP0 atua como uma proteína F-Box

Apesar de estar na mesma posição do genoma, a ORF0 dos Enamovirus é cerca de

200 nucleotídeos maior do que a ORF0 dos Polerovirus e as identidades entre elas variam

apenas entre 5 a 10% (dados não mostrados). No entanto, das seqüências de aminoácidos

revelou que a PEP0 apresenta um domínio do tipo F-Box conservado, indicando que apesar

das diferenças observadas, ambas possivelmente atuam através do mesmo mecanismo

(Figura 16). O domínio tipo F-Box observado nos Luteoviridae consiste em

LPXX(L/I)(X)

10-13

P, onde L é leucina, P é prolina, I é isoleucina e X qualquer aminoácido.

Para determinar a importância desse domínio para a atividade de supressão da PEP0, três

tipos de mutações pontuais foram introduzidas (Figura 16). Na primeira mutação, chamada

de PEP0∆P, a prolina no final do domínio foi trocada por uma alanina. Na mutação

PEP0∆LP, os dois primeiros resíduos de leucina e prolina do domínio foram substituídos

por duas alaninas. No mutante PEP0∆LPP, todos os três aminoácidos mais conservados

foram mudados para alaninas. As construções mutadas foram introduzidas em vetores de

expressão de plantas e em seguida utilizadas em testes de supressão de silenciamento.

Inicialmente os genes foram co-infiltrados com PVX-GFP em N. benthamiana selvagem.

Os resultados mostraram que as mutações simples e duplas introduzidas na PEP0 não

afetam a capacidade supressora da proteína (Figuras 15E e 15F). No triplo mutante

PEP0∆LPP, todavia, a proteína não foi mais capaz de suprimir (Figura 15G). Os RNAs

totais dos tecidos infiltrados foram extraídos, amplificados por RT-PCR, clonados em

pGEMT-Easy e seqüenciados. A análise das seqüências obtidas confirmou a presença das

mutações introduzidas na PEP0 (dados não mostrados). Os dados de fluorescência foram

confirmados molecularmente através de northern blot para detecção do acúmulo de mRNA

da GFP (Figura 15H).

110

Figura 16: Mutações pontuais no domínio F-Box da P0 do Pea enation mosaic virus-1.

Três versões mutantes da PEP0 foram geradas. Na PEP0∆LP os resíduos de leucina e

prolina no início do domínio foram trocados para alanina. Na PEP0∆P, o resíduo de prolina

no final do domínio foi convertido em alanina. Na PEP0∆LPP os três aminoácidos mais

conservados foram trocados para alanina. Wt – Tipo selvagem.

111

Com o objetivo de confirmar os resultados obtidos nas infiltrações com o PVX-

GFP, as construções selvagens e mutadas da PEP0 foram transientemente expressas em

plantas N. benthamiana da linhagem 16c (Figura 17). Essas plantas expressam GFP e

disparam silenciamento da mesma quando infiltradas com mais transcritos de GFP (mGFP)

ou com dupla fita de RNA da GFP (hpGFP). A co-infiltração de mGFP com PEP0, no

entanto, impediu o disparo da degradação e, dessa forma, confirmou a atividade supressora

desta proteína. Além disso, os ensaios com as versões alteradas da PEP0 indicaram mais

uma vez que o domínio F-Box é importante para sua atividade. Géis para detectar RNAs de

alto e baixo peso molecular foram feitos e mostraram que na presença de PEP0, assim

como ocorre para os Polerovirus, há uma redução drástica no acúmulo dos siRNAs no

tecido infiltrado (Figura 17H).

Os experimentos indicam, portanto, que a PEP0 é uma supressora de silenciamento

que depende de um domínio tipo F-Box intacto para que exerça sua função. Proteínas do

tipo F-Box em geral interagem com uma proteína do complexo de ubiqüitinação que, em

leveduras, é denominada de SKIP1. Com o objetivo de verificar se a PEP0 interage com a

proteína SKIP2, o homólogo de SKIP1 presente em Arabidopsis, experimentos de co-

imunoprecipitação foram realizados. Para tanto, SKIP2 fusionado com o peptídeo FLAG

(SKIP2-FLAG) foi co-expresso com a supressora PEP0 fusionada com o peptídeo de

hemaglutinação do vírus influenza (PEP0-HA) em plantas de N. benthamiana selvagens.

Os resultados mostraram que a proteína PEP0-HA co-purificou com a proteína SKIP2-

FLAG, mas não com a proteína FLOWERING LOCUS C (FLC-FLAG), usada como

controle (Figura 18). Dessa forma, os dados indicam que existe uma ligação específica da

supressora dos Enamovirus com SKIP2.

112

Figura 17: Infiltração de P0 do Pea enation mosaic virus-1 em N. benthamiana 16c

elimina siRNAs. Plantas foram co-infiltradas com gene da GFP e diferentes construções. A

- vetor vazio (pBART:FLAG); B - P19; C - P0 do PLRV; D - P0 do PEMV-1; E - PEP0∆P;

F - PEP0∆LP; G - PEP0∆LPP. Fotos foram tiradas sob lâmpada de ultravioleta 5 dias após

a infiltração. H – Northern blot para detecção de RNAs de alto (mRNA) e baixo (siRNA)

da GFP nos tecidos infiltrados. A sonda molecular foi feita a partir da seqüência do gene da

GFP através da marcação com P

. rRNA – RNA total dos tecidos infiltrados corado com

brometo de etídeo. Foi utilizado como controle uma sonda contra o gene constitutivo em

plantas U6.

113

Figura 18: P0 do Pea enation mosiac virus-1 interage com SKIP2 de Arabidopsis.

Plantas de Nicotiana benthamiana selvagens foram infiltradas com PEP0 fusionado com o

peptídeo de hemaglutinação do vírus influenza (PEP0-HA) e com SKIP2 ou FLC

fusionados com o peptídeo FLAG (Sigma). Extratos das plantas infiltradas com as

construções indicadas no painel por “X” foram imunoprecipitados com resinas anti-FLAG

e analisados em experimentos de western blot com anticorpos secundários contra os

peptídeos HA (gel superior) e FLAG (gel inferior).

114

II.4.3 – Expressão das supressoras PLP0 e PEP0 em Arabidopsis thaliana

Em plantas existem diversas vias de silenciamento gênico e, dessa forma, alguns

dos genes envolvidos no processo podem atuar em mais de uma rota de degradação.

Portanto, a desestabilização de um gene ou um subproduto de alguma etapa de uma via

pode ter como efeito secundário a interferência em outra via relacionada. A expressão de

supressoras de silenciamento em plantas pode, assim, indicar se a proteína atua em alguma

etapa do silenciamento que é compartilhada com outra via. De fato, já foi observado que a

expressão de diversas supressoras virais em plantas leva ao desenvolvimento de fenótipos

muito parecidos aos observados nos sintomas da infecção. Em geral, supressoras que

causam problemas no desenvolvimento vegetal têm como alvo componentes da via de

silenciamento que também atuam nas vias de microRNAs e/ou tasiRNAs. Com o intuito de

melhor entender a ação das supressoras da família Luteoviridae, plantas de Arabidopsis

thaliana foram transformadas com os genes PLP0 e PEP0 sob controle do promotor 35S do

CaMV.

Diversos tipos de fenótipos foram observados em plantas expressando a P0 do

PLRV. Em função da gravidade das alterações observadas, os fenótipos foram divididos em

quatro tipos (Figura 19). Plantas do fenótipo tipo 1, o mais brando, apresentam folhas

normais e são férteis (Figura 19B, 19C, 19I). No entanto, essas plantas apresentam graves

alterações nas ramificações dos eixos florais. Em muitos casos os eixos se fundem (Figura

19B, 19C, 19K) e, às vezes, crescem de forma espiralada (Figura 19C). Cortes histológicos

evidenciam uma distribuição irregular dos feixes vasculares nos eixos florais dessas

plantas, quando comparado com plantas do tipo selvagem (Figura 19J, 19K). Plantas do

tipo 2 apresentam eixos florais, flores e sementes normais. No entanto, desenvolvem folhas

alongadas e retorcidas (Figura 19D). Plantas com o fenótipo 3, o mais frequentemente

observado, apresentam um aspecto geral extremamente alterado (Figura 19E). As flores

dessas plantas, em sua grande maioria, são estéreis e apresentam deformidades variadas

(Figura 19I). As folhas em geral são enroladas e serradas e algumas apresentam fusão

parcial das laterais, formando um tubo que se abre no topo (Figura 19G). Plantas do tipo 4

apresentam graves alterações no desenvolvimento. Possuem porte reduzido, não

desenvolvem flores e apresentam folhas enroladas e serradas (Figura 19F, 19H, 19I).

115

Experimento de northern blot indicou que a severidade dos fenótipos observados está

correlacionada com o nível de acúmulo do transgene no citoplasma, indicando que quanto

mais expressa, maiores são os defeitos causados pela PLP0 no desenvolvimento.

116

117

Figura 19: Alteração no desenvolvimento vegetal de plantas de Arabidopsis thaliana

transformadas com o gene P0 do Potato leafroll virus. A – Planta do tipo selvagem (wt).

B e C – Plantas apresentando o fenótipo 1. Plantas apresentam graves alterações nas

ramificações dos eixos florais. Em muitos casos os eixos se fundem e, às vezes, crescem de

forma espiralada. D – Planta apresentando o fenótipo 2, com folhas alongadas. E – Planta

apresentado o fenótipo 3, com folhas enroladas e serradas e algumas apresentam fusão

parcial das laterais, formando um tubo que se abre no topo. F – Planta apresentando o

fenótipo 4, com porte reduzido, sem flores e folhas enroladas e serradas. G – Folha de uma

planta selvagem (primeira da esquerda para a direita) ao lado de diferentes tipos de folhas

observadas nas plantas PLP0 tipo 3. H - Folha de uma planta selvagem (primeira da

esquerda para a direita) ao lado de diferentes tipos de folhas observadas nas plantas PLP0

tipo 4. I – Flores observadas nos diferentes tipos de fenótipos obtidos. J – Corte histológico

de um eixo floral selvagem. K – Corte histológico no eixo floral de uma planta

apresentando fenótipo do tipo I. L – Northern blot para detectar os níveis de expressão dos

transgenes nas plantas obtidas. Sondas correspondentes ao gene PLP0 foram feitas com

CTP marcado com P

A expressão da P0 do PEMV-1 também acarretou na geração de plantas com

defeitos drásticos no desenvolvimento. No entanto, os fenótipos não se parecem com

nenhum dos quatro observados para as plantas expressando a PLP0. No início do

desenvolvimento, as folhas cotiledonares das plântulas expressando PEP0 apresentam uma

curvatura para cima bastante peculiar (Figura 20O). Em plantas do tipo selvagem essa

curvatura é, em geral, para baixo (Figura 20P). Conforme crescem, as plantas adquirem

folhas enroladas e dobradas sobre si mesmas (Figura 20B). Quando atingem a idade de

cinco a seis semanas, as folhas passam a apresentar pronunciadas protuberâncias ou

enações, comumente observadas em plantas hospedeiras infectadas pelo vírus PEMV-1

(Figura 20D). Análises das plantas com microscópio eletrônico de varredura mostraram que

as protuberâncias apresentam células com tamanhos normais no topo (Figura 20G), porém,

atipicamente longas na base (Figuras 20F, 20G, 20H). As plantas permanecem sempre no

estágio vegetativo de desenvolvimento, não desenvolvendo flores.

118

Plantas de Arabidopsis thaliana também foram transformadas com as versões

mutadas da PEP0. Plantas expressando PEP0∆P apresentam fenótipos muito parecidos com

os obtidos para a PEP0. No entanto, três tipos de fenótipos foram observados nas plantas

expressando a PEP0∆LP. Uma das plantas obtidas, denominada como tipo 1, apresenta

morfologia muito parecida com plantas do tipo selvagem (Figura 20J). A ausência de

alterações no desenvolvimento, no entanto, pode estar correlacionada com o pouco

acúmulo do transcrito no citoplasma, indicando que o transgene está silenciado nessa planta

(Figura 20R). Plantas classificadas como tipo 2 apresentam fenótipos mais brandos quando

comparados com plantas expressando a PEP0 (Figura 20K). As folhas apresentam uma

concavidade para cima, mas não foram observados os fenótipos de enrolamento e

dobramento (Figura 20M). As plantas apresentam flores normais, no entanto, desenvolvem

siliquas pequenas, com deformidades e com poucas sementes (Figura 20N). Plantas

PEP0∆LP do tipo 3 apresentam os mesmos fenótipos observados na expressão da

supressora sem as mutações. Finalmente, todas as linhagens transgênicas obtidas com a

PEP0∆LPP apresentam fenótipos semelhantes às plantas de Arabidopsis do tipo selvagem,

apesar dos altos níveis de transcrição do transgene (Figura 20Q, 20R). Esse resultado indica

mais uma vez, portanto, que a alteração no domínio F-Box dessa proteína afeta sua

capacidade de interferência nas vias de pequenos RNAs (Figura 20Q).

119

120

Figura 20: Alteração no desenvolvimento vegetal de plantas de Arabidopsis thaliana

transformadas com o gene P0 do Pea enation mosaic virus-1. A – Planta do tipo

selvagem. B-H - plantas transgênicas PEPO, B – Fenótipo observado em plantas com até 4

semanas. C – Fenótipo observado em plantas com mais de 4 semanas. D – Detalhe da

folhas de uma planta com seis semanas mostrando a existência de diversas protuberâncias.

E, F, G, H – Microscopia eletrônica de varredura. E – Folha de uma planta do tipo

selvagem. F – Detalhe de uma protuberância na folha de uma planta expressando PEP0. G

– Análise em detalhe da protuberância indicada pela seta em F. H – Base da folha

expressando PEP0. I – Planta expressando PEP0∆P. J – Planta do tipo 1 expressando

PEP0∆LP. K - Planta do tipo 2 expressando PEP0∆LP. L - Planta do tipo 3 expressando

PEP0∆LP. M - Folhas de plantas PEP0∆LP tipos 2 e 3 comparadas com uma folha da

planta selvagem. N – Siliquas observadas em plantas PEP0∆LP tipo 2. O – Fenótipo tipo 3

comumente observados em plântulas expressando PEP0, PEP0∆P ou PEP0∆LP. P –

Plântula do tipo selvagem. Q – Planta expressando PEP0∆LPP. R – Detecção dos níveis

dos transcritos nas diferentes plantas transformadas com P0 do PEMV-1. T1 – Plantas com

fenótipo 1. T2 – Plantas com fenótipo 2. T3 – Plantas com fenótipo 3. T4 – Plantas com

fenótipo 4. Sondas correspondentes ao gene PEP0 foram feitas com CTP marcado com P

II.4.4 – Supressoras PLP0 e PEP0 alteram acúmulo e função dos pequenos

RNAs

Muitos dos pequenos RNAs endógenos, tais como microRNAs e tasiRNAs estão

envolvidos na regulação de genes importantes para o desenvolvimento. Dessa forma, os

fenótipos observados nas plantas expressando as supressoras PEP0 e PLP0 sugerem que

essas proteínas poderiam estar interferindo na geração e/ou função desses reguladores do

desenvolvimento. Para testar essa hipótese, o acúmulo de diferentes pequenos RNAs foi

analisado em experimentos de northern blot realizados com plantas transgênicas PLP0

apresentando os quatro tipos de fenótipo, e com a P0 do PEMV integra, PEP0, e

apresentando as deleções do domínio F-Box (Figura 21). As plantas foram analisadas com

5 semanas após a germinação e os dados mostram que os microRNAs 159 e 168

apresentam uma leve redução no seu acúmulo nas plantas transgênicas, quando comparados

121

com os níveis dos mesmos nas plantas selvagens do ecotipo Columbia. Além disso, a

redução está negativamente correlacionada com a severidade dos fenótipos. Por exemplo, o

miR159 acumula mais nas plantas PLP0 com fenótipos brandos (tipos 1 e 2) do que nas

plantas severamente afetadas (tipos 3 e 4). No entanto, mesmo nas plantas apresentando

poucos defeitos no desenvolvimento, o miR159 acumula menos do que em plantas do tipo

selvagem. Esse tipo de correlação foi observado também nas plantas PLP0 para o miR166.

O mesmo não pode ser dito, entretanto, para o acúmulo desse microRNA nas plantas PEP0,

onde verificou-se que somente quando a proteína supressora está em sua forma não mutada

pode se observar uma alteração mais acentuada nos níveis do microRNA166.

O acúmulo de um tasiRNA (siR2141) e um siRNA originado de um retroelemento

(Copia1) também foi analisado. Em geral, esses dois pequenos RNAs pouco alteraram sua

concentração nas plantas transgênicas. No entanto, uma leve redução no acúmulo é

observada nas plantas com fenótipos mais severos (PLP0 tipo 4 e PEP0).

Para determinar se as supressoras estariam interferindo com a função dos pequenos

RNAs, os níveis de alguns alvos dessas moléculas foram analisados por PCR em tempo real

(Figura 22). Pouca ou nenhuma variação foi observada no acúmulo dos genes MYB33 e

DCL1, alvos dos microRNAs 159 e 162, respectivamente. No entanto, um aumento no

acúmulo de transcritos nas plantas transgênicas foi observado para os genes CUC1,

PHAVOLUTA, ARF8, AGO1 e ARF3, alvos dos microRNAs 164, 166, 167, 168 e do

tasiR2141, respectivamente. O retrotransposon Copia1 apresenta aumento de concentração

em plantas expressando PEP0, mas está em níveis normais em plantas expressando a PLP0.

Com o objetivo de confirmar os dados de PCR em tempo real, um experimento de

northern blot foi realizado para detectar o acúmulo de mRNA do gene AGO1. Os dados

confirmaram o aumento de acúmulo de AGO1 nas plantas expressando as supressoras

(Figura 23). Foi observado também um aumento no acúmulo desse mensageiro nas plantas

expressando PEP0∆P e PEP0∆LP tipos 2 e 3. Em contrapartida, os níveis de transcritos

AGO1 estão semelhantes ao do tipo selvagem em plantas expressando a proteína não

funcional PEP0∆LPP, indicando que o acúmulo desse gene está correlacionado com a

severidade dos fenótipos observados (Figura 23). Em conjunto, esses dados sugerem,

portanto, que pelo menos parte dos fenótipos observados nas plantas transgênicas

122

expressando as supressoras PLP0 e PEP0 podem ser atribuídos a uma desregulação das vias

endógenas de pequenos RNAs.

123

Figura 21: Acúmulo de pequenos RNAs em plantas de Arabidopsis thaliana

expressando as supressoras P0 do Potato leafroll virus e P0 do Pea enation mosaic

virus-1. Acúmulo dos microRNAs 168, 166 e 159, do tasiRNA2141 e de siRNAs oriundos

de um retroelemento (Copia1) foram detectados através de sondas radioativas. Foi utilizado

como controle uma sonda contra o gene constitutivo em plantas U6.

124

Figura 22: Acúmulo dos alvos dos pequenos RNAs em plantas de Arabidopsis thaliana

expressando as supressoras P0 do Potato leafroll virus ou P0 do Pea enation mosaic

virus-1. Os alvos de seis microRNAs (Myb33, Dcl1, Cuc1, Phavoluta, Arf8 e Ago1), um

tasiRNA (Arf3) e um retroelemento (Copia1) foram analisados em experimentos de PCR

em tempo real. Barras verticais representam os desvios padrão entre três réplicas

experimentais. Nos eixos “Y” estão plotadas as concentrações relativas dos RNAs em cada

uma das plantas plotadas no eixo dos “X”.

125

Figura 23: Detecção do acúmulo de mRNA do gene AGO1 em plantas transgênicas de

Arabidopsis thaliana expressando P0 do Potato leafroll virus ou P0 do Pea enation

mosaic virus-1. RNA total de plantas transgênicas foram extraídos, separados em géis

desnaturante de agarose, transferidos para membranas de nailon e hibridados com sonda

específica para o gene AGO1 marcada com P

(painel superior). O RNA ribosomal corado

com brometo de etídio foi utilizado como controle (painel inferior). PLP0T1 – Planta

transformada com P0 do Potato leafroll virus apresentando fenótipo do tipo 1. PLP0T2 –

Planta transformada com P0 do Potato leafroll virus apresentando fenótipo do tipo 2.

PLP0T3 – Planta transformada com P0 do Potato leafroll virus apresentando fenótipo do

tipo 3. PLP0T4 – Planta transformada com P0 do Potato leafroll virus apresentando

fenótipo do tipo 4. PEP0 – Planta expressando P0 do Pea enation mosaic virus-1. ∆P -

Planta expressando P0 do Pea enation mosaic virus-1 com mutação simples no domínio

tipo F-Box. ∆LPT1 - Planta expressando P0 do Pea enation mosaic virus-1 com mutação

dupla no domínio tipo F-Box e apresentando fenótipo do tipo 1. ∆LPT2 - Planta

expressando P0 do Pea enation mosaic virus-1 com mutação dupla no domínio tipo F-Box

e apresentando fenótipo do tipo 2. ∆LPT3 - Planta expressando P0 do Pea enation mosaic

virus-1 com mutação dupla no domínio tipo F-Box e apresentando fenótipo do tipo 3. ∆LPP

- Planta expressando P0 do Pea enation mosaic virus-1 com mutação tripla no domínio tipo

F-Box.

126

II.4.5 – PLP0 e PEP0 desestabilizam AGO1

Os dados obtidos nos experimentos de PCR em tempo real e northern blot

mostraram que os pequenos RNAs endógenos de Arabidopsis podem não estar funcionando

corretamente quando as supressoras PLP0 e PEP0 estão presentes nas células, sugerindo

uma possível não funcionalidade do complexo RISC. Com o objetivo de verificar esta

hipótese foram realizados experimentos para testar se as supressoras poderiam estar

degradando na proteína AGO1, a principal nuclease da RISC envolvida nas vias de

microRNA e siRNA viral.

Experimentos de co-infiltração em Nicotiana benthamiana mostraram que a

presença de PLP0 fusionada com o peptídeo de hemaglutinação do vírus influenza (PLP0-

HA) é capaz de eliminar a expressão de AGO1 fusionada com o peptídeo FLAG (AGO1-

FLAG) (Figura 24A). Esse dado sugere, portanto, que a PLP0 pode estar promovendo a

degradação de AGO1. Ensaios de co-infiltração mostraram também que a AGO1-FLAG

continua sendo degradada pela PLP0-HA mesmo na presença de um inibidor de

proteasoma, evidenciando, assim, que o mecanismo deve atuar por outra via. O mesmo tipo

de experimento foi realizado também com a supressora PEP0 fusionada com peptídeo HA

(PEP0-HA) (Figura 24B). No entanto, foi observada apenas uma redução nos níveis de

AGO1-FLAG na presença de PEP0-HA e não uma eliminação como acontece com a

supressora dos Polerovirus. Além disso, os dados de co-infiltração mostraram que a

redução nos níveis de AGO1-FLAG mediada pela PEP0 é dependente de proteasoma,

contrastando mais uma vez com a atividade da PLP0.

127

Figura 24: Avaliação da expressão das supressoras P0 do Potato leafroll virus e P0 do

Pea enation mosaic virus-1 no acúmulo de AGO1. AGO1 fusionada com peptídeo FLAG

(AGO1-FLAG) e P19 foram co-infiltrados em plantas de Nicotiana benthamiana com as

supressoras fusionadas com peptídeo HA. A – Experimentos com a P0 do Potato leafroll

virus. B – Experimentos com a P0 do Pea enation mosaic virus-1. Os ensaios foram feitos

na presença ou ausência do inibidor de proteasoma MG132 ou de DMSO, usado como

controle negativo. A supressora P19 foi usada para aumentar o nível de expressão das

proteínas infiltradas.

128

II.4.6 – PEP0 interage com DCL1, AGO4, AGO6 e DRB5

Ensaios de co-infiltração sugerem que AGO1 é um alvo de degradação das

proteínas PLP0 e PEP0. No entanto, se AGO1 fosse a única proteína alvo das supressoras,

esperar-se-ia que as plantas transgênicas obtidas nesse trabalho apresentassem fenótipos

semelhantes aos observados em mutantes para o gene AGO1. No entanto, as plantas

expressando PLP0 ou PEP0 apresentam fenótipos que variam significativamente dos

descritos para esse mutante (dados não mostrados). De fato, as plantas expressando as

supressoras não apresentam fenótipos semelhantes a nenhum mutante simples de genes já

caracterizados nas vias de silenciamento por RNA (dados não mostrados), indicando que

possivelmente existem múltiplos alvos.

Com o intuito de detectar outros alvos em potencial das supressoras, experimentos

de duplo híbrido em leveduras foram realizados. Para tanto, as supressoras PLP0, PEP0 e

PEP0∆LPP foram fusionadas com a seqüência codificadora do domínio de ligação ao DNA

do gene GAL4 e os genes da via de silenciamento por RNA AGO1, AGO2, AGO4, AGO6,

AGO7, DCL1, DCL2, DCL3, DCL4, DRB1, DRB2, DRB3, DRB4, DRB5 e SGS3 foram

fusionados com a seqüência codificadora do domínio de ativação da GAL4. A análise do

crescimento das leveduras a 21 °C em placas contendo quatro tipos de marcadores mostrou

que a supressora PEP0 interage com DCL1, AGO4, DRB5 e, mais fracamente, com AGO6

(Figura 25). As interações com AGO6, DCL1 e DRB5 foram perdidas, no entanto, no

mutante PEP0∆LPP. A versão não funcional da PEP0 também apresentou uma redução

drástica na interação com AGO4. Todas as interações observadas com PEP0 e PEP0∆LPP

foram perdidas, no entanto, quando as leveduras foram cultivadas a temperatura de 30 °C

(dados não mostrados).

129

Figura 25: Duplo híbrido em leveduras mostrando a interação de P0 do Pea enation

mosaic virus-1 com proteínas da via de silenciamento por RNA. Leveduras foram

cultivadas a 21 °C em meios contendo seleção para os plasmídeos (sem triptofano e

leucina) (A) e em meios contendo seleção para os plasmídeos e para possíveis interações

(meio sem triptofano, leucina, histidina e adenina) (B). Como controle, os vetores vazios

contendo as seqüências codificadoras dos domínios de ligação ao DNA (BD) ou o de

ativação (AD) da GAL4 foram co-transformados com os genes testados da via de

silenciamento por RNA.

130

II.4.7 – PLP0 e PEP0 apresentam localização nuclear

Três das quatro proteínas que interagem com PEP0 (DCL1, AGO4, AGO6)

apresentam localização nuclear na célula. Dessa forma, para poder interagir com essas

proteínas, a PEP0 deveria ter o mesmo tipo de localização subcelular. Para testar essa

hipótese, os genes PLP0, PEP0 e PEP0∆LPP foram fusionados com a seqüência

codificadora da proteína marcadora GFP, gerando as construções PLP0-GFP, PEP0-GFP e

∆LPP-GFP. Os plasmídeos gerados foram transformados através de bombardeamento em

células de cebola e em seguida analisados em microscópio confocal. As imagens obtidas

indicam que as três construções codificam proteínas que se acumulam preferencialmente no

núcleo celular (Figura 26). A mesma localização foi observada também para as versões

mutantes PEP0∆P e PEP0∆LP (dados não mostrados). Esses dados indicam, portanto, que

as supressoras possuem como alvos proteínas da via de silenciamento por RNA que

apresentam localização nuclear.

131

Figura 26: Bombardeamento de células de cebola com os genes PLP0, PEP0 e

PEP0∆

∆∆

∆LPP fusionados com a sequência codificadora da GFP. A – Células de cebola

bombardeadas com GFP livre. B – Células bombardeadas com a P0 do Potato leafroll virus

fusionada com GFP. C – Células bombardeadas com a P0 do Pea enation mosaic virus-1

fusionada com GFP. D – Células bombardeadas com o triplo mutante não funcional da P0

do Pea enation mosaic virus -1 fusionada com GFP.

Capítulo II

_________________________________________________________________________

DISCUSSÃO

PERSPECTIVAS

133

II.5 – Discussão e Perspectivas

Neste trabalho, supressores de silenciamento na família viral Luteoviridae foram

identificados e caracterizados. Para tanto, todas as fases abertas de leitura do Barley yellow

dwarf virus-PAV (BYDV-PAV), membro tipo do gênero Luteovirus e a ORF0 do Pea

enation mosaic virus-1 (PeMV-1), único membro do gênero Enamovirus, foram clonadas e

analisadas. Nenhuma supressora foi encontrada no BYDV-PAV (Figura 14), no entanto,

observou-se que a P0 do PeMV-1 (PEP0) apresenta forte atividade de supressão de

silenciamento por RNA (Figura 15; Figura 17).

Membros do gênero Luteovirus apresentam biologia muito parecida com os

membros do gênero Polerovirus, exceto pelo fato dos primeiros infectarem apenas plantas

monocotiledôneas e os segundos infectarem também dicotiledôneas. Ambos os vírus são

restritos ao floema e transmitidos especificamente por afídeos (Mayo & Ziegler-Graff,

1996). Sabe-se que a P0 dos Polerovirus apresenta uma atividade de supressão de

silenciamento por RNA (Pfeffer et al., 2002) e acredita-se que a mesma seja fundamental

para o escape da defesa antiviral promovida pelo hospedeiro (Baumberger et al., 2007).

Membros do gênero Luteovirus não apresentam a P0 e, portanto, devem apresentar uma

estratégia alternativa para escaparem do sistema de degradação por silenciamento em

tecidos floemáticos. No entanto, as proteínas da polimerase, capsídeo, de movimento e de

transmissão não apresentam atividade supressora quando testados em plantas de Nicotiana

benthamiana (Figura 14). Três hipóteses poderiam explicar os resultados negativos obtidos

para os genes do BYDV-PAV. Já foi observado na literatura que alguns vírus necessitam de

mais de uma proteína para suprimirem a defesa vegetal. Por exemplo, o Citrus tristeza virus

apresenta três genes envolvidos na supressão de silenciamento (Lu et al., 2004). A HC-Pro,

uma das supressoras virais mais estudadas, apresenta maior capacidade de supressão

quando atua em conjunto com a proteína auxiliar P1 existente na região 5’ dos Potyvirus

(Pruss et al., 1997). Experimentos de co-infiltração com diferentes combinações de genes

poderiam determinar, dessa forma, se o BYDV-PAV necessitaria de mais de uma proteína

para sua atividade de supressão. Outra possibilidade interessante seria a existência de uma

supressora de silenciamento específica de monocotiledôneas. Apesar do silenciamento por

RNA ser um mecanismo conservado em diversos reinos biológicos, algumas diferenças

134

entre plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas já foram observadas. Por exemplo, em

arroz, um modelo de estudo em monocotiledôneas, foram identificadas duas Dicers a mais

do que em Arabidopsis, sendo uma delas específica do grupo das monocotiledôneas

(Margis et al., 2006). Como os Luteovirus infectam apenas monocotiledôneas, sua possível

supressora poderia atuar em um gene específico desses hospedeiros. A existência de uma

supressora específica de monocotiledôneas poderia explicar, inclusive, a restrição dos

Luteovirus a plantas desse grupo. Para testar essa hipótese seria necessário, portanto, o

desenvolvimento de um sistema de detecção de atividade supressora em uma planta

monocotiledônea. Alternativamente, membros do gênero Luteovirus poderiam escapar do

sistema de degradação vegetal mesmo sem apresentarem uma proteína que atue

especificamente na supressão de silenciamento por RNA. Já foi observado, por exemplo,

que os Adenovirus suprimem silenciamento através da transcrição de RNAs subgenômicos

que apresentam estruturas secundárias semelhantes a microRNAs (Andersson et al., 2005).

Membros desse grupo sintetizam RNAs subgenômicos em uma quantidade alta o suficiente

para saturar o sistema de degradação celular e, com isso, diminuem a degradação do RNA

viral genômico. A expressão do RNA subgenômico de Luteovirus em sistema vegetal

poderia elucidar se esse tipo de estratégia também se aplica aos vírus desse grupo.

A P0 do PeMV-1, em contrapartida, apresenta forte atividade supressora em sistema

de agro-infiltração em plantas de Nicotiana benthamiana (Figura 15; Figura 17). Observou-

se que a mutação dos três resíduos mais conservados do domínio F-Box gera uma proteína

sem capacidade de supressão (Figura 15G). A troca de um ou dois desses aminoácidos, no

entanto, não provoca alteração detectável na atividade da proteína (Figura 15E; Figura

15F). Esses dados contrastam com os previamente obtidos para membros do gênero

Polerovirus, onde foi observado que a troca dos dois aminoácidos iniciais LP por alaninas

já é suficiente para abolir a atividade dessas supressoras (Pazhouhandeh et al., 2006). Além

disso, experimentos de co-imunoprecipitação mostraram que a P0 dos Enamovirus, assim

como dados obtidos para os Polerovirus (Pazhouhandeh et al., 2006), também se liga com

SKIP2 de Arabidopsis, um homólogo de SKIP1 de leveduras envolvido na via de proteólise

(Figura 18). Dessa forma, as supressoras devem atuar através do direcionamento de

proteínas da via de silenciamento para a degradação via ubiqüitinação.

135

Plantas transgênicas expressando as diferentes formas de PEP0 e também a P0 do

Potato leafroll virus (PLRV), membro tipo do gênero Polerovirus, apresentam drásticos

defeitos no desenvolvimento. Outros pesquisadores já tinham observado que a expressão da

P0 do PLRV (PLP0) em batata gera defeitos no desenvolvimento muito semelhantes aos

observados em infecções naturais do vírus (Van der Wilk et al., 1997). Apesar das

proteínas PLP0 e PEP0 terem produzido fenótipos muito diferentes quando expressas em

plantas, os dados indicam que as duas supressoras estariam interferindo com proteínas

importantes para a regulação do desenvolvimento. Plantas de Arabidopsis com mutações

em genes das vias de microRNAs e/ou tasiRNAs também apresentam graves defeitos no

desenvolvimento (Telfer & Poethig, 1998; Lu & Fedoroff, 2000; Chen et al., 2002; Morel

et al., 2002). Em contrapartida, plantas com mutações em genes que atuam exclusivamente

nas vias de siRNAs raramente apresentam esses tipos de defeitos (Dalmay et al., 2000;

Mourrain et al., 2000; Zilberman et al., 2003; Xie et al., 2004). Dessa forma, genes que

atuam nas vias de repressão viral e nas vias de microRNA ou tasiRNA, tais como DCL1,

DCL4, Argonautes e DRBs seriam os principais candidatos a serem alvos das supressoras.

A análise do perfil molecular mostrou que os níveis de microRNAs, tasiRNAs, siRNAs

endógenos e os alvos desses pequenos RNAs estão afetados nas plantas expressando ambas

as supressoras (Figura 21; Figura 22; Figura 23). Existe nessas plantas uma tendência para

a redução nos níveis dos pequenos RNAs e um aumento no acúmulo do mRNA dos alvos,

quando comparados com uma planta do tipo selvagem.

Assim como observado nas plantas expressando PLP0 ou PEP0, mutantes AGO1 de

Arabidopsis apresentam níveis de microRNAs iguais ou levemente menores do que plantas

selvagens. Além disso, alguns dos alvos dos pequenos RNAs também acumulam mais

nesses mutantes (Vaucheret et al., 2004). Observou-se ainda que quanto mais severamente

afetada a AGO1, maior o efeito na acumulação dos alvos (Vaucheret et al., 2004). Por

exemplo, o gene MYB65, alvo do miRNA159, acumula 31.7 vezes mais no mutante nulo

ago1-3 do que em plantas do tipo selvagem. O mesmo gene, no entanto, acumula apenas

1.3 e 1.7 vezes mais do que no selvagem em mutantes hipomórficos ago1-27 e ago1-26,

respectivamente. Além disso, é sabido que a AGO1 atua tanto na via de resposta antiviral

(Morel et al., 2002; Zhang et al., 2006), quanto na via de microRNAs (Vaucheret et al.,

2004). Dessa forma, essa proteína seria a principal candidata a ser o alvo das supressoras

136

durante o processo de infecção. De fato, experimentos de co-infiltração em N. benthamiana

mostraram que as supressoras PLP0 e PEP0 desestabilizam a expressão de AGO1 (Figura

24). A PLP0 abole completamente a expressão da proteína e a repressão atua mesmo na

presença de um inibidor de proteasoma (Figura 24A). A PEP0, em contrapartida, apenas

reduz o acúmulo de AGO1 e essa ação parece ser dependente de proteasoma (Figura 24b).

Além disso, experimentos de co-imunoprecipitação conduzidos por Adriana Fusaro, no

CSIRO, Austrália mostraram que ambas as supressoras se ligam com AGO1 (comunicação

pessoal). Esses resultados sugerem, portanto, que as proteínas PLP0 e PEP0 interagem com

AGO1 e a direcionam para um complexo de degradação. Indicam ainda que a supressora

dos Polerovirus apresenta uma maior afinidade por essa proteína do que a dos Enamovirus.

Resultados similares foram recentemente publicados com outros vírus do grupo dos

Polerovirus (Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007). Observou-se que a P0 do

Beet western yellows virus (BWYV) também se liga (Bortolamiol et al., 2007) e degrada a

AGO1 (Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007) e que essa ação ocorre de forma

independente de proteasoma (Baumberger et al., 2007). Plantas expressando a P0 do

BWYV (BWP0), assim como observado para a expressão das supressoras PLP0 e PEP0,

apresentam fortes defeitos no desenvolvimento, redução nos níveis de microRNAs,

tasiRNAs e aumento no acúmulo em alguns dos alvos desses pequenos RNAs (Bortolamiol

et al., 2007).

Os dados de duplo híbrido em leveduras mostraram que a PEP0 possivelmente

também interage com as proteínas DCL1, AGO4, AGO6 e DRB5. Experimentos de co-

imunoprecipitação estão sendo realizados no CSIRO para confirmar a interação dessas

proteínas com a supressora. Nenhuma interação foi observada, no entanto, para a PLP0. A

ausência de resultados positivos para essa proteína pode estar relacionada com a fraca

interação entre os genes. Trabalhos anteriores já tentaram identificar os alvos das

supressoras de Polerovirus por duplo híbrido e também não obtiveram sucesso

(Pazhouhandeh et al., 2006; Bortolamiol et al., 2007). Além disso, os dados observados

com a PEP0 só foram obtidos quando as leveduras foram crescidas a 21 °C, corroborando a

hipótese de que a interação entre as proteínas ocorre fracamente em células de leveduras,

até mesmo com a supressora do PeMV-1. Essa fraca interação poderia explicar também

porque foram obtidos resultados negativos para a interação da PEP0 com AGO1 por duplo

137

híbrido, apesar de a supressora estar desestabilizando a expressão dessa proteína (Figura

24) e ter interagido com AGO1 em experimentos de co-imunoprecipitação (Adriana Fusaro,

comunicação pessoal).

Dentre as proteínas identificadas por duplo híbrido, a DRB5 foi a que apresentou

interação mais forte com a supressora do PeMV-1. A DRB5 é uma das cinco proteínas

ligantes de dsRNA existente em Arabidopsis. Sabe-se que a DRB1 de Arabidopsis, também

conhecida como HYL1, atua em conjunto com a DCL1 para a geração dos microRNAs

(Han et al., 2004; Vazquez et al., 2004a). Sabe-se também que a DRB4 atua junto com a

DCL4 para a geração de tasiRNAs (Nakazawa et al., 2007). Acredita-se, portanto, que as

outras DRBs também atuem na produção de pequenos RNAs juntamente com Dicers, no

entanto, nenhuma atividade específica foi atribuída ainda para as DRB2, DRB3 e DRB5.

Observou-se também interação com as AGO4 e AGO6, ambas envolvidas na via de

metilaçao (Zilberman et al., 2003; Zheng et al., 2006).

A recente observação de que a P0 do BWYV, um Polerovirus, desestabiliza

diferentes tipos de Argonautes (AGO1, AGO2, AGO4, AGO5, AGO6 e AGO9) levou a

proposição de um modelo para explicar a restrição desse grupo de vírus ao floema vegetal

(Baumberger et al., 2007; Figura 27). Ao serem injetados pelos insetos no floema vegetal,

haveria produção de siRNAs primários originados dos Polerovirus, que, no entanto, não

seriam efetivos, pois a RISC estaria inativa devido à degradação de proteínas Argonautes

mediada pela supressora. Em conseqüência, a via de geração de pequenos RNAs

secundários dependente de RDR6 não seria acionada, pois esta depende da ação da AGO1

(Beclin et al., 2002; Figura 11). A inibição da síntese de siRNAs secundários explicaria

porque a supressão pela P0 dos Polerovirus não elimina siRNAs em experimentos de agro-

infiltração quando o indutor é uma dsRNA (Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al.,

2007), mas elimina quando o indutor é um mRNA (Figura 17H; Pfeffer et al., 2002). No

primeiro caso, os siRNAs que se acumulam são siRNAs primários, originados diretamente

da degradação da dsRNA introduzida via DCL4, sem a participação de Argonautes. No

segundo caso, no entanto, há a necessidade de ativação da via de geração de siRNAs

secundários, processo dependente de RDR6 e AGO1.

138

Figura 27: Modelo proposto por Baumberger et al., 2007 para a restrição dos

Polerovirus ao floema. Vírus são inoculados no floema vegetal e em seguida as dsRNAs

produzidas são reconhecidas por enzimas Dicers da planta, gerando os siRNAs primários.

Esses, no entanto, não conseguem atuar, pois o complexo RISC está inibido pela

degradação de proteínas Argonautes mediada pela supressora P0, uma das primeiras

proteínas a serem traduzidas a partir do genoma viral. No entanto, os siRNAs primários

podem migrar para células vizinhas antes que o vírus seja capaz de codificar a sua

supressora. Com isso, há a ampliação do sinal de silenciamento pela produção de siRNAs

secundários via RDR6 e AGO1 nessas células, restringindo o vírus às células inicialmente

infectadas.

139

Assim, os Polerovirus seriam capazes de suprimir silenciamento localmente no

tecido infectado, pois impediriam a ação de clivagem da AGO1, principal proteína

envolvida no processo de silenciamento induzido por vírus (Morel et al., 2002; Zhang et

al., 2006a). No entanto, como as Argonautes não estão envolvidas na produção do sinal de

disseminação de silenciamento célula a célula (Baumberger et al., 2007), este continuaria

sendo produzido e, com isso, restringindo os vírus nos tecidos inicialmente infectados.

O Enamovirus PeMV-1, no entanto, consegue sair das células floemáticas em

infecções simbiônticas com o Pea enation mosaic virus-2 (PeMV-2), um Umbravirus.

Fatores encontrados nos dois vírus são importantes para a infecção sistêmica em plantas

hospedeiras (Demler et al., 1993). Dessa forma, o complexo infeccioso PeMV-1/PeMV-2

deve apresentar mecanismos que evitam a degradação dos dois vírus fora dos tecidos

floemáticos. Foi observado que a P0 do Polerovirus BWYV degrada preferencialmente os

motivos PAZ e N-terminal da proteína AGO1 (Baumberger et al., 2007). Esse domínio

também está presente em proteínas Dicers (Margis et al., 2006). Sabe-se também que a

DCL4 está envolvida na geração do sinal de silenciamento a curta distância (Dunoyer et al.,

2005) que, segundo o modelo proposto por Baulcombe e colaboradores (Baumberger et al.,

2007), é o principal mediador da restrição dos Polerovirus ao floema. Dessa forma, a saída

do PeMV-1 de células floemáticas poderia ser explicada por um redirecionamento da

atividade de sua supressora para a degradação de proteínas Dicers e não somente

Argonautes, como ocorreria nos Polerovirus. Uma preferência por degradação de Dicers

poderia explicar, por exemplo, o motivo da PEP0 ter apenas diminuído os níveis de AGO1

em experimentos de co-infiltração, contrastando com a eliminação dessa proteína mediada

pela P0 de Polerovirus (Figura 24; Baumberger et al., 2007). A interação da PEP0 com

DCL1 em experimentos de duplo híbrido poderia ser um outro indicativo desse

redirecionamento de atividade, embora uma ação em DCL4 explicaria melhor o modelo de

evasão do floema proposto. Além disso, uma ação conjunta em Argonautes e Dicers

poderia explicar os fenótipos mais drásticos observados em plantas expressando PEP0,

quando comparados com os observados em plantas expressando PLP0 (Figura 19; Figura

20). Uma forma direta de testar essa hipótese seria a verificação da interferência da PEP0

no acúmulo de siRNAs primários, pois esses são gerados diretamente por DCL4.

Experimentos em plantas 16C mostraram que a PEP0 reduz os níveis de siRNAs quando o

140

silenciamento é induzido pela seqüência senso de GFP (Figura 17). Nesse caso, no entanto,

a maior parte dos siRNAs gerados são siRNAs secundários, originados pelo processo de

amplificação do silenciamento mediado por RDR6 e AGO1 (Figura 11). Uma ação de

PEP0 em AGO1 seria suficiente, portanto, para explicar os dados observados.

Experimentos de agro-infiltração estão sendo conduzidos por Adriana Fusaro no CSIRO

para verificar o efeito de PEP0 no acúmulo de siRNAs primários originados em

experimentos de indução de silenciamento em plantas 16C por uma dupla fita de GFP. Já

foi observado que a P0 do BWYV não interfere no acúmulo desses siRNAs primários

(Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007). No entanto, os níveis desses pequenos

RNAs deveriam reduzir na presença da PEP0, caso a proteína tenha uma ação nas Dicers,

em especial na DCL4, principal atuante em silenciamento induzido por dsRNA (Fusaro et

al., 2006).

Capítulo II

_________________________________________________________________________

CONCLUSÕES

142

II.6 – Conclusões

Silenciamento gênico é um mecanismo de controle da expressão gênica existente

em diversos reinos biológicos e, em plantas, está associado com a defesa antiviral. Vírus

apresentam proteínas com capacidade de supressão do sistema de defesa vegetal. No

capítulo II dessa tese foram realizadas a busca e a caracterização de proteínas supressoras

de silenciamento gênico em vírus pertencentes à família Luteoviridae. As principais

conclusões obtidas foram:

1) As proteínas da polimerase, capsídeo, movimento e transmissão do Barley yellow

dwarf virus-PAV (BYDV-PAV), membro tipo do gênero Luteovirus, não

apresentam capacidade de supressão local em plantas de Nicotiana benthamiana.

2) A ORF0 do Pea enation mosaic virus-1 (PEMV-1), único membro do gênero

Enamovirus, codifica uma proteína capaz de suprimir silenciamento induzido por

genes na orientação senso em plantas de Nicotiana benthamiana.

3) A P0 do PEMV-1 (PEP0) se liga com SKIP2 de Arabidopsis thaliana e depende de

um domínio F-Box intacto para exercer sua atividade supressora.

4) A atividade de supressão da PEP0 elimina os pequenos RNAs interferentes

secundários.

5) A expressão da PEP0 ou da P0 do Potato leafroll virus (PLRV), membro tipo do

gênero Polerovirus, em Arabidopsis thaliana acarreta graves defeitos no

desenvolvimento que estão associados com uma redução nos níveis de pequenos

RNAs endógenos e com um aumento nos níveis dos alvos dos mesmos.

6) Tanto a PEP0 quanto a P0 do PLRV (PLP0) desestabilizam a expressão de proteína

ARGONAUTE1 (AGO1) de Arabidopsis thaliana. Ao contrário do observado para

PLP0, a ação da PEP0 é dependente de proteasoma.

7) A PEP0 apresenta interação com as proteínas DCL1, AGO4, AGO6 e DRB5 em

experimentos de duplo híbrido.

8) PLP0 e PEP0 apresentam localização nuclear em células de cebola.

REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

144

Referências bibliográficas

Adai, A.; Johnson, C.; Mlotshwa, S.; Archer-Evans, S. & Manocha, V. (2005).

Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana. Genome Research 15: 78–

91.

Adenot, X.; Elmayan, T.; Lauressergues, D.; Boutet, S.; Bouche, N.; Gasciolli, V. &

Vaucheret, H. (2006). DRB4-dependent TAS3 transacting siRNAs control leaf

morphology through AGO7. Current Biology 16: 927–932.

Akbergenov, R.; Si-Ammour, A.; Blevins, T.; Amin, I.; Kutter, C.; Vanderschuren,

H.; Zhang, P.; Gruissem, W.; Meins, F.; Hohn, T. & Pooggin, M.M. (2006).

Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.

Nucleic Acids Research 34: 462–471.

Allen, E.; Xie, Z.; Gustafson, A.M. & Carrington, J.C. (2005). microRNA-directed

phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121: 207–221.

Allen, E.; Xie, Z.; Gustafson, A.M.; Sung, G.H.; Spatafora, J.W. & Carrington, J.C.

(2004). Evolution of microRNA genes by inverted duplication of target gene sequences in

Arabidopsis thaliana. Nature Genetics 36: 1282–1290.

Alvarez, J.P.; Pekker, I.; Goldshmidt, A.; Blum, E.; Amsellem, Z. & Eshed Y. (2006).

Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized

regulation of multiple targets in diverse species. The Plant Cell 18: 1134-1151.

Ambros, V. (2004). The functions of animal microRNAs. Nature 431: 350-355.

Anandalakshmi, R.; Marathe, R.; Xin, G.; Herr, J.M.; Jr., Mau, C.; Mallory, A.C.;

Pruss, G.; Bowman, L. & Vance, V.B. (2000). A calmodulin-related protein suppresses

post-transcriptional gene silencing in plants. Science 290: 142 – 144.

Anandalakshmi, R.; Pruss, G.J.; Xin, G.; Marathe, R.; Mallory, A.C.; Smith, T.H. &

Vance,V.B. (1998). A viral suppressor of gene silencing in plants. Proceedings of the

National Academy of Sciences 95: 13079-13084.

Andersson, M.G.; Haasnoot, P.C.; Xu, N.; Berenjian, S.; Berkhout, B. & Akusjärvi G.

(2005). Suppression of RNA interference by adenovirus virus-associated RNA. Journal

of Virology 79: 9556-9565.

Aravin, A.A.; Lagos-Quintana, M.; Yalcin, A.; Zavolan, M.; Marks, D.; Snyder, B.;

Gaasterland, T.; Meyer, J. & Tuschl, T. (2003). The small RNA profile during

Drosophila melanogaster development. Development Cell 5: 337–350.

Arazi, T.; Talmor-Neiman, M.; Stav, R.; Riese, M.; Huijser, P. & Baulcombe, D.C.

(2005). Cloning and characterization of micro-RNAs from moss. The Plant Journal 43:

837–848.

145

Arteaga-Vázquez, M.; Caballero-Pérez, J. & Vielle-Calzada, J.P. (2006). A family of

microRNAs present in plants and animals. The Plant Cell 18: 3355-3369.

Axtell, M,J.; Snyder, J.A. & Bartel, D.P. (2007). Common functions for diverse small

RNAs of land plants. The Plant Cell 19: 1750-1769.

Axtell, M.J. & Bartel, D.P. (2005). Antiquity of microRNAs and their targets in land

plants. The Plant Cell 17: 1658-1673.

Axtell, M.J.; Jan, C.; Rajagopalan, R. & Bartel, D.P. (2006). A two-hit trigger for

siRNA biogenesis in plants. Cell 127, 565 -5 77.

Barakat, A.; Wall, K.; Leebens-Mack, J.; Wang, Y.J.; Carlson, J.E. & Depamphilis

CW. (2007). Large-scale identification of microRNAs from a basal eudicot (Eschscholzia

californica) and conservation in flowering plants. The Plant Journal 51: 991-1003.

Bartel, D.P. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell

116, 281 – 297.

Baumberger, N. & Baulcombe, D.C. (2005). Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA

Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs.

Proceedings of the National Academy of Sciences 102: 11928-11933.

Baumberger, N.; Tsai, C.H.; Lie, M.; Havecker, E. & Baulcombe, D.C. (2007). The

Polerovirus Silencing Suppressor P0 Targets ARGONAUTE Proteins for Degradation.

Current Biology 17: 1609 – 1614.

Béclin, C.; Boutet, S.; Waterhouse, P. & Vaucheret, H. (2002). A branched pathway for

transgene-induced RNA silencing in plants. Current Biology 12: 684–688.

Bentwich, I.; Avniel, A.; Karov, Y.; Aharonov, R.; Gilad, S.; Barad, O.; Barzilai, A.;

Einat, P.; Einav, U.; Meiri, E.; Sharon, E.; Spector, Y. & Bentwich, Z. (2005).

Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nature

Genetics 37: 766-770.

Bernstein, E.; Caudy, A.A.; Hammond, S.M. & Hannon, G.J. (2001). Role for a

bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409: 363 – 366.

Blevins, T.; Rajeswaran, R.; Shivaprasad, P.V.; Beknazariants, D.; Si-Ammour, A.;

Park, H.S.; Vazquez, F.; Robertson, D.; Meins, F.; Hohn, T. & Pooggin, M.M.

(2006). Four plant Dicers mediate viral small RNA biogenesis and DNA virus induced

silencing. Nucleic Acids Research 34: 6233-6246.

Bonnet, E.; Wuyts, J.; Rouze, P. & Van de Peer, Y. (2004). Detection of 91 potential

conserved plant microRNAs in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa identifies

important target genes. Proceedings of the National Academy of Sciences 101: 11511–

11516.

146

Borchert, G.M.; Lanier, W. & Davidson, B.L. (2006). RNA polymerase III transcribes

human microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology 13: 1097-1101.

Borsani, O.; Zhu, J.; Verslues, P.E.; Sunkar, R. & Zhu, J.K. (2005). Endogenous

siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in

Arabidopsis. Cell 123: 1279-12791.

Bortolamiol, D.; Pazhouhandeh, M.; Marrocco, K.; Genschik, P. & Ziegler-Graff, V.

(2007). The Polerovirus F Box Protein P0 Targets ARGONAUTE1 to Suppress RNA

Silencing. Current Biology 17: 1615 – 1621.

Bouche, N.; Lauressergues, D.; Gasciolli, V. & Vaucheret, H. (2006). An antagonistic

function for Arabidopsis DCL2 in development and a new function for DCL4 in

generating viral siRNAs. The EMBO Journal 25: 3347–3356.

Boutet, S,; Vazquez, F.; Liu, J.; Beclin, C. & Fagard, M. (2003). Arabidopsis HEN1: a

genetic link between endogenous miRNA controlling development and siRNA

controlling transgene silencing and virus resistance. Current Biology 13: 843–848.

Brault, V. & Miller, W.A. (1992). Translational frameshifting mediated by a viral

sequence in plant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 89: 2262-2266.

Brault, V.; Bergdoll, L.M.; Mutterer, J.; Prasad, V.; Pfeffer, S.; Erdinger, M.;

Richards, K.E. & Ziegler-Graff, V. (2003). Effects of point mutations in the major

capsid protein of Beet western yellows virus on capsid formation, virus accumulation, and

aphid transmission. Journal of Virology 77: 3247–3256.

Brault, V.; Mutterer, J.; Scheidecker, D.; Simonis, M.T.; Herrbach, E.; Richards, K.

& Ziegler-Graff, V. (2000). Effects of point mutations in the readthrough domain of the

Beet western yellows virus minor capsid protein on virus accumulation in planta and on

transmission by aphids. Journal of Virology 74: 1140–1148.

Brault, V.; Pfeffer, S.; Erdinger, M.; Mutterer, J. & Ziegler-Graff V. (2002). Virus-

induced gene silencing in transgenic plants expressing the minor capsid protein of Beet

western yellows virus. Molecular Plant-Microbe Interactions 15: 799–807.

Brigneti, G.; Voinnet, O.; Li, W.-X.; Ji, L.-H.; Ding, S.-W. & Baulcombe, D.C. (1998).

Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana

benthamiana. The EMBO Journal 17: 6739 – 6746.

Brodersen, P. & Voinnet, O. (2006). The diversity of RNA silencing pathways in plants.

Trends in Genetics 22, 268-280.

Brosnan, C.A.; Mitter, N.; Christie, M.; Smith, N.A.; Waterhouse, P.M. & Carroll,

B.J. (2007). Nuclear gene silencing directs reception of long-distance mRNA silencing in

Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences 104: 14741-1476.

147

Buainain, A.M. & Batalha, M.O. (2007). Cadeia produtiva do algodão. Secretaria de

Política Agrícola, Brasília, 108 pp.

Burrows, M.E.; Caillaud, M.C.; Smith, D.M. & Gray, S.M. (2007). Biometrical genetic

analysis of luteovirus transmission in the aphid Schizaphis graminum.

Heredity 98:106-113.

Cai, X.; Hagedorn, C.H. & Cullen, B.R. (2004). Human microRNAs are processed from

capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA 10: 1957–

1966.

Cauquil, F. (1977). Etudes sur une maladie d’ origine virale du cotonnier: La maladie

bleue. Coton et Fibres Tropicales 32: 259-278.

Cauquil, J. & Vaissayre, M. (1971). La "Maladie bleue" du cotonnier en Afrique:

transmission de cotonnier à cotonnier par Aphis Gossypii Glover. Coton et Fibres

Tropicales: 463 – 466.

Chan, S.W.; Zilberman, D.; Xie, Z.; Johansen, L.K.; Carrington, J.C.; & Jacobsen

S.E. (2004). RNA silencing genes control de novo DNA methylation. Science 303: 1336.

Chapman, E.J.; Prokhnevsky, A.I.; Gopinath, K.; Dolja, V.V. & Carrington, J.C.

(2004). Viral RNA silencing suppressors inhibit the microRNA pathway at an

intermediate step. Genes & Development 18: 1179–1186.

Chapman, E.J. & Carrington, J.C. (2007). Specialization and evolution of endogenous

small RNA pathways. Nature Reviews in Genetics 8: 884-896.

Chen, X.; Liu, J.; Cheng, Y. & Jia, D. (2002). HEN1 functions pleiotropically in

Arabidopsis development and acts in C function in the flower. Development 129: 1085–

94.

Chendrimada, T.P.; Gregory, R.I.; Kumaraswamy, E.; Norman, J.; Cooch, N.;

Nishikura, K. & Shiekhattar, R. (2005). TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for

microRNA processing and gene silencing. Nature 436: 740-744.

Chendrimada, T.P.; Finn, K.J.; Ji, X.; Baillat, D.; Gregory, R.I.; Liebhaber, S.A.;

Pasquinelli, A.E. & Shiekhattar, R. (2007). MicroRNA silencing through RISC

recruitment of eIF6. Nature 447: 823-828.

Cia, E. & Salgado, C.L. (1997). Doenças do Algodoeiro (Gossypium Spp.). In Manual de

Fitopatologia 2: Doenças de Plantas Cultivadas.

Correa, R.L.; Oliveira, A.A.Q. & Vaslin, M.F.S. (2007). Expressão da proteína da capa

protéica íntegra e deletada do Cotton Leafroll Dwarf Vírus em bactérias e planta. Anais

do VI Congresso Brasileiro do Algodão 6: 80 – 80.

Corrêa, S. (2007). Anuário Brasileiro do Algodão 2007. Ed. Gazeta Santa Cruz. 144p.

148

Costa, A,S. & Carvalho, A.M.B. (1962). Moléstias de vírus do algodoeiro. Bragantia 21:

50–51.

Costa, A.S. & Forster, R. (1938). Nota preliminar sobre uma nova moléstia de vírus do

algodoeiro – mosaico das nervuras. Boletim Técnico do Instituto Agronômico de

Campinas 51: 11.

Dalmay, T.; Hamilton, A.; Rudd, S.; Angell, S. & Baulcombe, D.C. (2000). An

RNAdependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional

gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell 101: 543–553.

Dalmay, T.; Horsefield, T.H.B. & Baulcombe, D.C. (2001). SDE-3 encodes an RNA

helicase required for post-transcriptional gene silencing in Arabidopsis. The EMBO

Journal 20 (8), 2069 – 2077.

D'Arcy, C.J. & Mayo, M. (1997). Proposals for changes in luteovirus taxonomy and

nomenclature. Archives of Virology 142:1285-1287.

Deleris, A.; Gallego-Bartolome, J.; Bao, J.; Kasschau, K.D.; Carrington, J.C. &

Voinnet, O. (2006). Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in

antiviral defense. Science 313: 68-71.

Demler, S.A. & Zoeten, G.A. (1991). The nucleotide sequence and luteovirus-like nature

of RNA 1 of an aphid non-transmissible strain of Pea enation mosaic virus. Journal of

General Virology 72: 1819-1834.

Demler, S.A.; Rucker, D.G. & Zoeten, G.A. (1993). The chimeric nature of the genome

of Pea enation mosaic virus: the independent replication of RNA 2. Journal of General

Virology 74: 1-14.

Diaz-Pendon, J.A.; Li, F.; Li, W.X. & Ding, S.W. (2007). Suppression of antiviral

silencing by cucumber mosaic virus 2b protein in Arabidopsis is associated with

drastically reduced accumulation of three classes of viral small interfering RNAs.

The Plant Cell 19: 2053-2063.

Dinesh-Kumar, S.P.; Brault, V. & Miller, W.A. (1992). Precise mapping and in vitro

translation of a trifunctional subgenomic RNA of Barley yellow dwarf virus. Virology

187: 711-722.

Ding, S.W. & Voinnet, O. (2007). Antiviral immunity directed by small RNAs. Cell 130:

413-426.

Doench, J.G.; Peterson, C.P. & Sharp, P.A. (2003). siRNAs can function as miRNAs.

Genes & Development 17: 438–442.

149

Doi, N.; Zenno, S.; Ueda, R.; Ohki-Hamazaki, H.; Ui-Tei, K. & Saigo K. (2003). Short-

interfering-RNA-mediated gene silencing in mammalian cells requires Dicer and eIF2C

translation initiation factors. Current Biology 13: 41–46.

Domier, L.L.; McCoppin, N.K.; Larsen, R.C. & D’Arcy, C.J. (2002). Nucleotide

sequence shows that Bean leafroll virus has a Luteovirus-like genome organization.

Journal of General Virology 83: 1791–1798.

Dougherty, W.G. & Parks, T.D. (1995). Transgenes and gene suppression: telling us

something new? Current Opinion in Cell Biology 7: 399 – 405.

Dunoyer, P.; Himber, C. & Voinnet, O. (2005). DICER-LIKE 4 is required for RNA

interference and produces the 21-nucleotide small interfering RNA component of the

plant cell-to-cell silencing signal. Nature Genetics 37:1356-1360.

Dunoyer, P.; Himber, C. & Voinnet, O. (2006). Induction, suppression and requirement

of RNA silencing pathways in virulent Agrobacterium tumefaciens infections. Nature

Genetics 38: 258-263.

Dunoyer, P.; Himber, C.; Ruiz-Ferrer, V.; Alioua, A. & Voinnet O. (2007). Intra- and

intercellular RNA interference in Arabidopsis thaliana requires components of the

microRNA and heterochromatic silencing pathways. Nature Genetics 39: 848-856.

Dunoyer, P.; Lecellier, C.H.; Parizotto, E.A.; Himber, C. & Voinnet, O. (2004).

Probing the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded

suppressors of RNA silencing. The Plant Cell 16: 1235–1250.

Elbashir, S. M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W. & Tuschl, T. (2001).

Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster

embryo lysate. The EMBO Journal 20, 6877–6888.

Elmayan, T. & Vaucheret H. (1996) Expression of single copies of a strongly expressed

35S transgene can be silenced post-transcriptionally. The Plant Journal 9: 787-797.

Enright, A.J.; John, B.; Gaul, U.; Tuschl, T.; Sander, C., & Marks, D.S. (2003).

MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biology 5: R1.

Esau, K.; Cronshaw, J.; & Hoefert, L.L. (1967). Relation of Beet yellows virus to the

phloem and to movement in the sieve tube. Journal of Cell Biology 3: 71-87.

Fagard, M.; Boutet, S.; Morel, J-B.; Bellini, C. & Vaucheret, H. (2000). AGO1, QDE-

2, and RDE-1 are related proteins required for post-transcriptional gene silencing in

plants, quelling in fungi, and RNA interference in animals. Proceedings of the National

Academy of Sciences 97, 11650-11654.

Fahlgren, N.; Howell, M.D.; Kasschau, K.D.; Chapman, E.J.; Sullivan, C.M.; Cumbie,

J.S.; Givan, S.A.; Law, T.F.; Grant, S.R.; Dangl, J.L. & Carrington, J.C. (2007).

150

High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs: evidence for frequent birth and

death of MIRNA genes. PLoS ONE 2: e219.

Fahlgren, N.; Montgomery, T.A.; Howell, M.D.; Allen, E.; Dvorak, S.K.; Alexander,

A.L. & Carrington, J.C. (2006). Regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR3 by

TAS3 ta-siRNA affects developmental timing and patterning in Arabidopsis. Current

Biology 16: 939–944.

Fang, Y. & Spector, D.L. (2007). Identification of nuclear dicing bodies containing

proteins for microRNA biogenesis in living Arabidopsis plants. Current Biology 17: 818-

823.

Feliciello, I. & Chinali, G. (1993). A modified alkaline lysis method for the preparation of

highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anals of Biochemistry 212: 394-401.

Finnegan, J.; Margis, R. & Waterhouse, P.M. (2003). Posttranscriptional Gene Silencing

Is Not Compromised in the Arabidopsis CARPEL FACTORY (DICER-LIKE1) Mutant,

a Homolog of Dicer-1 from Drosophila. Current Biology 13: 236-40.

Fire, A.; Xu, S.; Montgomery, M.K.; Kostas, S.A.; Driver, S.E. & Mello, C.C. (1998).

Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis

elegans. Nature 391: 806-811.

Floyd, S.K. & Bowman, J.L. (2004). Gene regulation: ancient microRNA target

sequences in plants. Nature 428: 485–486.

Förstemann, K.; Tomari, Y.; Du, T.; Vagin, V.V.; Denli, A.M.; Bratu, D.P.;

Klattenhoff, C.; Theurkauf, W.E. & Zamore, P.D. (2005). Normal microRNA

maturation and germ-line stem cell maintenance requires Loquacious, a double-stranded

RNA-binding domain protein. PLoS Biology 3: e236.

Freire, E. C. (1998). Doença Azul do Algodoeiro. Fibras e Óleos 28: 4.

Freire, E.C. (1999). Doença azul tem solução. Cultivar 1: 64-65.

Fusaro, A.F.; Matthew, L.; Smith, N.A.; Curtin, S.J.; Dedic-Hagan, J.; Ellacott, G.A.;

Watson, J.M.; Wang, M.B.; Brosnan, C.; Carroll, B.J. & Waterhouse, P.M. (2006).

RNA interference-inducing hairpin RNAs in plants act through the viral defence pathway.

EMBO Reports 7: 1168-1175.

Garcia, D.; Collier, S.A.; Byrne, M.E. & Martienssen, R.A. (2006). Specification of leaf

polarity in Arabidopsis via the trans-acting siRNA pathway. Current Biology 16: 933–

938.

Gasciolli, V.; Mallory, A.C.; Bartel, D.P. & Vaucheret, H. (2005). Partially redundant

functions of Arabidopsis DICER-like enzymes and a role for DCL4 in producing trans-

acting siRNAs. Current Biology 15: 1494-1500.

151

Glick, E.; Zrachya, A.; Levy, Y.; Mett, A.; Gidoni, D.; Belausov, E.; Citovsky, V. &

Gafni, Y. (2008). Interaction with host SGS3 is required for suppression of RNA

silencing by tomato yellow leaf curl virus V2 protein. Proceedings of the National

Academy of Sciences 105: 157-161.

Golden, T.A.; Schauer, S.E.; Lang, J.D.; Pien, S.; Mushegian, A.R.; Grossniklaus, U.;

Meinke, D.W. & Ray, A. (2002). SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1/CARPEL

FACTORY, a Dicer homolog, is a maternal effect gene required for embryo development

in Arabidopsis. Plant Physiology 130: 808–822.

Gray, S. & Gildow, F.E. (2003). Luteovirus-aphid interactions. Annual Review of

Phytopathology 41: 539–566.

Grishok, A.; Pasquinelli, A.E.; Conte, D.; Li, N.; Parrish, S.; Há, I.; Baillie, D.L.; Fire,

A.; Ruvkun, G. & Mello, C.C. (2001). Genes and mechanisms related to RNA

interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans

developmental timing. Cell 106, 23 – 34.

Guilley, H.; Richards, K.E. & Jonard, G. (1995). Nucleotide sequence of beet mild

yellowing virus RNA. Archives of Virology 140: 1109–1118.

Guo, H. & Ding, S.W. (2002). A viral protein inhibits the long range signaling activity of

the gene silencing signal. The EMBO Journal 21: 398–407.

Halliwell, R.S. & Cauquil J. (1981). Virus and mycoplasma like organisms. In: Watkins,

G.M., (Ed). Compendium of Cotton Diseases. Minnesota: American Phytopathology

Society: 56 - 59.

Hamilton, A. J. & Baulcombe, D.C. (1999). A Species of small antisense RNA in

posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286, 950 – 952.

Hamilton, A.; Voinnet, O.; Chappell, L.; & Baulcombe, D. (2002). Two classes of short

interfering RNA in RNA silencing. The Embo Journal 21(17): 4671- 4679.

Hammond, S.M.; Bernstein, E.; Beach, D. & Hannon, G.J. (2000). An RNA-directed nuclease

mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.

Nature 404, 293 – 296.

Hammond, S.M.; Boettcher, S.; Caudy, A.A.; Kobayashi, R. & Hannon, G.J. (2001).

Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293:

1146–1150.

Han, J.; Lee, Y.; Yeom, K.H.; Kim, Y.K.; Jin, H. & Kim, V.N. (2004a). The Drosha–

DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes & Development 18: 3016–

3027.

Han, M.H.; Goud, S.; Song, L. & Fedoroff N. (2004b). The Arabidopsis double-stranded

RNAbinding protein HYL1 plays a role in microRNA-mediated gene regulation.

Proceedings of the National Academy of Sciences 101:1093–1098.

152

Hannon, G.J. & Rossi, J.J. (2004). Unlocking the potential of the human genome with

RNA interference. Nature 431: 371-378.

Harisson, B.D. (1999). Steps in the development of Luteovirology. In: The Luteoviridae

(Smith, H. & Backer, H., eds.). CABI Publishing, Wallingford, Oxon, England, pp. 1-14.

Helliwell, C,A. & Waterhouse, P.M. (2005). Constructs and methods for hairpin RNA-

mediated gene silencing in plants. Methods in Enzymology 392: 24-35.

Henderson, I.R.; Zhang, X.; Lu, C.; Johnson, L.; Meyers, B.C.; Green. P.J. &

Jacobsen, S.E. (2006). Dissecting Arabidopsis thaliana DICER function in small RNA

processing, gene silencing and DNA methylation patterning. Nature 6: 721-725.

Henz, S.R.; Cumbie, J.S.; Kasschau, K.D.; Lohmann, J.U.; Carrington, J.C.; Weigel,

D. & Schmid, M. (2007). Distinct expression patterns of natural antisense transcripts in

Arabidopsis. Plant Physiology 144: 1247-1255.

Herr, A.J.; Jensen, M.B.; Dalmay, T.; & Baulcombe, D.C. (2005). RNA polymerase IV

directs silencing of endogenous DNA. Science 308: 118–120.

Himber, C.; Dunoyer, P.; Moissiard, G.; Ritzenthaler, C. & Voinnet O. (2003).

Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing. The

EMBO Journal 22: 4523-4533.

Howell, M.D.; Fahlgren, N.; Chapman, E.J.; Cumbie, J.S.; Sullivan, C.M.; Givan,

S.A.; Kasschau, K.D. & Carrington, J. C. (2007). Genome-Wide Analysis of the RNA-

DEPENDENT RNA POLYMERASE6/DICER-LIKE4 Pathway in Arabidopsis Reveals

Dependency on miRNA- and tasiRNA-Directed Targeting. The Plant Cell 19: 926-942.

Huettel, B.; Kanno, T.; Daxinger, L.; Bucher, E.; van der Winden, J.; Matzke, A.J. &

Matzke M. (2007). RNA-directed DNA methylation mediated by DRD1 and Pol IVb: a

versatile pathway for transcriptional gene silencing in plants. Biochemical and

Biophysical Acta 1769: 358-374.

Hunter, C.; Willmann, M.R.; Wu, G.; Yoshikawa, M.; de la LuzGutierrez-Nava, M. &

Poethig, S.R. (2006). Trans-acting siRNA-mediated repression of ETTIN and ARF4

regulates heteroblasty in Arabidopsis. Development 133: 2973–2981.

Hutvágner, G. & Zamore, P.D. (2002). A microRNA in a multiple turnover RNAi

enzyme complex. Science 297: 2056–2060.

Hutvágner, G.; McLachlan, J.; Pasquinelli, A.E.; Balint, E.; Tuschl, T. & Zamore,

P.D. (2001). A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation

of the let-7 small temporal RNA. Science 293: 834 – 838.

Jacque, J.M.; Triques, K. & Stevenson, M. (2002). Modulation of HIV-1 replication by

RNA interference. Nature 418: 435–438.

153

Jones-Rhoades, M.W. & Bartel, D.P. (2004). Computational identification of plant

micro-RNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Molecular Cell 14:

787–799.

Jones-Rhoades, M.W.; Bartel, D.P. & Bartel, B. (2006). MicroRNAs and their

regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology 57: 19–53.

Kanno, T.; Huettel, B.; Mette, M.F.; Aufsatz, W.; Jaligot, E.; Daxinger, L.; Kreil,

D.P.; Matzke, M. & Matzke, A.J. (2005). Atypical RNA polymerase subunits required

for RNA-directed DNA methylation. Nature Genetics 37: 761–765.

Kasschau, K.D., & Carrington, J.C. (1998). A counterdefensive strategy of plant viruses:

Suppression of posttranscriptional gene silencing. Cell 95: 461 – 470.

Kasschau, K.D.; Fahlgren, N.; Chapman, E.J.; Sullivan, C.M.; Cumbie, J.S.; Givan,

S.A. & Carrington, J.C. (2007). Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis

siRNAs. PLoS Biology 5: e57.

Kasschau, K.D.; Xie, Z.; Allen, E.; Llave, C.; Chapman, E.J. & Carrington, J. (2003).

P1/HC-Pro, a viral suppressor of RNA silencing, interferes with Arabidopsis

development and miRNA function. Development Cell 4: 205–217.

Kavi, H.H.; Fernandez, H.R.; Xie, W. & Birchler, J.A. (2005). RNA silencing in

Drosophila. FEBS Letters 579, 5940 – 5949.

Ketting, R.F.; Fischer, S.E.; Bernstein, E.; Sijen, T.; Hannon, G.J. & Plasterk, R.H.

(2001). Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in

developmental timing in C. elegans. Genes Development 15, 2654 – 2659.

Khvorova, A.; Reynolds, A. & Jayasena, S.D. (2003). Functional siRNAs and miRNAs

exhibit strand bias. Cell 115: 209–216.

Kidner, C.A. & Martienssen, R.A. (2005). The developmental role of microRNA in

plants. Current Opinion in Plant Biology 8: 38-44.

Kim, K.; Lee, Y.S. & Carthew, R.W. (2007). Conversion of pre-RISC to holo-RISC by

Ago2 during assembly of RNAi complexes. RNA 13: 22-29.

Klattenhoff, C. & Theurkauf, W. (2008). Biogenesis and germline functions of piRNAs.

Development 35: 3-9.

Knight, S.W. & Bass, B.L. (2001). A role for the RNase III enzyme DCR-1 in RNA

interference and germ line development in Caenorhabditis elegans. Science 293, 2269 –

2271.

Kurihara, Y. & Watanabe, Y. (2004). Arabidopsis micro-RNA biogenesis through Dicer-

like 1 protein functions. Proceedings of the National Academy of Sciences 101: 12753–

12758.

154

Kurihara, Y.; Takashi, Y. & Watanabe, Y. (2006). The interaction between DCL1 and

HYL1 is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant microRNA

biogenesis. RNA 12: 206-212.

Lagos-Quintana, M.; Rauhut, R.; Lendeckel, W. & Tuschl, T. (2001). Identification of

novel genes coding for small expressed RNAs. Science 294: 853–858.

Lagos-Quintana, M.; Rauhut, R.; Meyer, J.; Borkhardt, A. & Tuschl, T. (2003). New

microRNAs from mouse and human. RNA 9: 175–179.

Lagos-Quintana, M.; Rauhut, R.; Yalcin, A.; Meyer, J.; Lendeckel, W & Tuschl, T.

(2002). Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Current Biology 12:

735–739.

Lakatos, L.; Szittya, G.; Silhavy, D. & Burgyán, J. (2004). Molecular mechanism of

RNA silencing suppression mediated by p19 protein of tombusviruses. The EMBO

Journal 23: 876-884.

Lakatos, L.; Csorba, T.; Pantaleo, V.; Chapman, E.J.; Carrington, J.C.; Liu, Y.P.;

Dolja, V.V.; Calvino, L.F.; Lopez-Moya, J.J. & Burgyan, J. (2006). Small RNA

binding is a common strategy to suppress RNA silencing by several viral suppressors.

The EMBO Journal 25: 2768-2780.

Landthaler, M.; Yalcin, A. & Tuschl, T. (2004). The human DiGeorge syndrome critical

region gene 8 and its D. melanogaster homolog are required for miRNA biogenesis.

Current Biology 14: 2162–2167.

Lau, N.C.; Lim, L.P.; Weinstein, E.G. & Bartel, D.P. (2001). An abundant class of tiny

RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294: 858–862.

Leaman, D.; Chen, P.Y.; Fak, J.; Yalcin, A.; Pearce, M.; Unnerstall, U.; Marks, D.S.;

Sander, C.; Tuschl, T. & Gaul, U. (2005). Antisense-mediated depletion reveals

essential and specific functions of microRNAs in Drosophila development.

Cell 121: 1097-1108.

Lee, R.C. & Ambros, V. (2001). An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis

elegans. Science 294: 862–864.

Lee, R.C.; Feinbaum, R.L. & Ambros, V. (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-

4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75: 843–854.

Lee, R.C.; Hammell, C.M. & Ambros, V. (2006a). Interacting endogenous and

exogenous RNAi pathways in Caenorhabditis elegans. RNA 12: 589–597

Lee, Y.; Ahn, C.; Han, J.; Choi, H.; Kim, J.; Yim, J.; Lee, J.; Provost, P.; Radmark,

O.; Kim, S. & Kim, V.N. (2003). The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA

processing. Nature 425: 415–419.

155

Lee, Y.; Hur, I. Park, S-Y.; Kim, Y-K.; Suh, M.R. & Kim, V.N. (2006b). The role of

PACT in the RNA silencing pathway. EMBO Journal 25: 522–532.

Lee, Y.; Jeon, K.; Lee, J.T.; Kim, S. & Kim, V.N. (2002). MicroRNA maturation:

stepwise processing and subcellular localization. EMBO Journal 21: 4663–4670.

Lee, Y.; Kim, M.; Han, J.; Yeom, K.H.; Lee, S.; Baek, S.H. & Kim, V.N. (2004).

MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO Journal 23: 4051–4060.

Lenardon, S. (1994). Caracterizacíon del agente causal de la enfermedad azul del algodón

en el area centro chaqueña. Informe del PIC 320.536.-IFFIVE (CICA) del INTA.

Lewis, B.P.; Shih, I.; Jones-Rhoades, M.W.; Bartel, D.P. & Burge, C.B. (2003).

Prediction of mammalian microRNA targets. Cell 115: 787–798.

Li, J.; Yang, Z.; Yu, B.; Liu, J. & Chen X. (2005). Methylation protects miRNAs and

siRNAs from a 3'-end uridylation activity in Arabidopsis. Current Biology 15: 1501-

1507.

Lim, L.P.; Lau, N.C.; Weinstein, E.G.; Abdelhakim, A.; Yekta, S.; Rhoades, M.W.;

Burge, C.B. & Bartel, D.P. (2003). The microRNAs of Caenorhabditis elegans. Genes

Development 17: 991–1008.

Lindbo, J.A. & Dougherty, W.G. (2005). Plant pathology and RNAi: a brief history.

Annual Review of Phytopathology 43: 191-204.

Liu, J.; Carmell, M.A.; Rivas, F.V.; Marsden, C.G.; Thomson, J.M.; Song, J.J.;

Hammond, S.M.; Joshua-Tor, L. & Hannon, G.J. (2004). Argonaute2 is the catalytic

engine of mammalian RNAi. Science 305: 1437–1441.

Liu, Q.; Rand, T.A.; Kalidas, S.; Du, F.; Kim, H.E.; Smith, D.P. & Wang, X. (2003).

R2D2, a bridge between the initiation and effector steps of the Drosophila RNAi

pathway. Science 301: 1921–1925.

Llave, C.; Kasschau, K.D. & Carrington, J.C. (2000). Virus-encoded suppressor of

posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway.

Proceedings of the National Academy of Sciences 97: 13401 – 13406.

Llave, C.; Kasschau, K.D.; Rector, M.A. & Carrington, J.C. (2002). Endogenous and

silencing associated small RNAs in plants. The Plant Cell 14: 1605–1619.

Lu, C. & Fedoroff, N. (2000). A mutation in the Arabidopsis HYL1 gene encoding a

dsRNA binding protein affects responses to abscisic acid, auxin, and cytokinin. The Plant

Cell 12: 2351–2366.

Lu, C.; Kulkarni, K.; Souret, F.F.; MuthuValliappan, R.; Tej, S.S.; Poething, S.;

Henderson, I.R.; Jacobsen, S.E.; Wang, W.; Green, P. & Meyers, B.C. (2006).

156

MicroRNAs and other small RNAs enriched in the Arabidopsis RNA-dependent RNA

polymerase-2 mutant. Genome Research 16: 1276–1288.

Lu, C.; Tej, S.S.; Luo, S.; Haudenschild, C.D.; Meyers, B.C. & Green,P.J. (2005a).

Elucidation of the small RNA component of the transcriptome. Science 309: 1567–1569.

Lu, R.; Folimonov, A.; Shintaku, M.; Li, W.X.; Falk, B.W.; Dawson, W.O. & Ding,

S.W. (2004). Three distinct suppressors of RNA silencing encoded by a 20-kb viral RNA

genome. Proceedings of the National Academy of Sciences 101: 15742-15747.

Lu, S.; Sun, Y.H.; Shi, R.; Clark, C.; Li, L. & Chiang, V.L. (2005b). Novel and

mechanical stressresponsive microRNAs in Populus trichocarpa that are absent from

Arabidopsis. The Plant Cell 17: 2186–21203.

Maia, I.G.; Gonçalves, M.C.; Arruda, P. & Vega, J. (2000). Molecular evidence that

Sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) is a member of the Luteoviridae family. Archives of

Virology 145: 1009–1019.

Mallory, A.C.; Dugas, D.V.; Bartel, D.P.; Bartel, B. (2004). MicroRNA regulation of

NACdomain targets is required for proper formation and separation of adjacent

embryonic, vegetative, and floral organs. Current Biology 14: 1035–1046.

Mallory, A.C.; Ely, L.; Smith, T.H.; Marathe, R.; Anandalakshmi, R.; Fagard, M.;

Vaucheret, H.; Pruss, G.; Bowman, L. & Vance, V.B. (2001). HC-Pro suppression of

transgene silencing eliminates the small RNAs but not transgene methylation or the

mobile signal. The Plant Cell 13: 571 – 583.

Maniatis, T.; Frisch, E.F. & Sambrook, J. (1989). Molecular cloning: a laboratory

Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Margis, R.; Fusaro, A.F.; Smith, N.A.; Curtin, S.J.; Watson, J.M.; Finnegan, E.J. &

Waterhouse, P.M. (2006). The evolution and diversification of Dicers in plants.

FEBS Letters 580: 2442-2450.

Matranga, C.; Tomari, Y.; Shin, C.; Bartel, D.P. & Zamore, P.D. (2005). Passenger-

strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme

complexes. Cell 123: 607-620.

Matzke, M.A. & Birchler, J.A. (2005). RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nature

Reviews in Genetics. 6, 24 - 35.

Mayo, M.A. & Ziegler-Graff, V. (1996). Molecular biology of luteoviroses. Advances in

Virus Research 46: 413-460.

Mayo, M.A. (1999). Developments in plant virus taxonomy since the publication of the 6th

ICTV report. Archives of Virology 144: 1659–1666.

157

McCaffrey, A.P; Nakai, H.; Pandey, K.; Huang, Z.; Salazar, F.H.; Xu, H.; Wieland,

S.F.; Marion, P.L. & Kay, M.A. (2003). Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA

interference. Nature Biotechnology 6: 639–644.

Mérai, Z.; Kerenyi, Z.; Kertesz, S.; Magna, M.; Lakatos, L. & Silhavy, D. (2006).

Double-stranded RNA binding may be a general plant RNA viral strategy to suppress

RNA silencing. Journal of Virology 80: 5747-5756.

Mette, M.F.; van der Winden, J.; Matzke, M. & Matzke, A.J. (2002). Short RNAs can

identify new candidate transposable element families in Arabidopsis. Plant Physiology

130: 6–9.

Michelotto, M.D. & Busoli, A.C. (2006). Efeito da época de inoculação do vírus do

mosaico das nervuras por Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) no

desenvolvimento e na produção do algodoeiro. Neotropical Entomology 35.

Miller, W.A. & Rasochová, L. (1997). Barley yellow dwarf viruses. Annual Review of

Phytopathology 35:167–190.

Miller, W.A.; Waterhouse, P.M. & Gerlach, W.L. (1988). Sequence and organization of

barley yellow dwarf virus genomic RNA. Nucleic Acids Research 16: 6097-6111.

Miyoshi, K.; Tsukumo, H.; Nagami, T.; Siomi, H. & Siomi, M.C. (2005). Slicer function

of Drosophila Argonautes and its involvement in RISC formation. Genes Development

19: 2837-2848.

Mlotshwa, S.; Voinnet, O.; Mette, M.F.; Matzke, M.; Vaucheret, H.; Ding, S.W.;

Pruss, G. & Vance, V.B. (2002). RNA Silencing and the Mobile Silencing Signal. The

Plant Cell S289 – S301.

Moissiard, G. & Voinnet, O. (2006). RNA silencing of host transcripts by cauliflower

mosaic virus requires coordinated action of the four Arabidopsis Dicer-like proteins.

Proceeding of the National Academy of Sciences 103: 19593-19598.

Molnár, A.; Csorba, T.; Lakatos, L.; Várallyay, E.; Lacomme, C. & Burgyán, J.

(2005). Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly from highly

structured single-stranded viral RNAs. Journal of Virology 79: 7812-7818.

Molnar, A.; Schwach, S.; Studholme, D.J.; Thuenemann, E.C. & Baulcombe, D.C.

(2007). miRNAs control gene expression in the single-cell alga Chlamydomonas

reinhardtii. Nature 447: 1126 – 1130.

Moonan, F.; Molina, J. & Mirkov, T.E. (2000). Sugarcane yellow leaf virus: an emerging

virus that has evolved by recombination between luteoviral and poleroviral ancestors.

Virology 269: 156-171.

158

Morel, J.B.; Godon, C.; Mourrain, P.; Beclin, C.; Boutet, S. & Vaucheret, H. (2002).

Fertile hypomorphic ARGONAUTE (ago1) mutants impaired in post-transcriptional gene

silencing and virus resistance. The Plant Cell 14: 629–639.

Mourrain, P.; Béclin, C.; Elmayan, T.; Feuerbach, F.; Godon, C.; Morel, J-B; David;

Jouette, D.; Lacombe, A-M.; Nikic, S.; Picault, N.; Rémoué, K.; Sanial, M.; Vo, T-A.

& Vaucheret, H. (2000). Arabidopsis SGS2 and SGS3 Genes Are Required for

Posttranscriptional Gene Silencing and Natural Virus Resistance. Cell 101: 533 – 542.

Nakazawa, Y.; Hiraguri, A.; Moriyama, H. & Fukuhara, T. (2007). The dsRNA-

binding protein DRB4 interacts with the Dicer-like protein DCL4 in vivo and functions in

the trans-acting siRNA pathway. Plant Molecular Biology 63: 777-785.

Napoli, C.; Lemieux, C. & Jorgensen, R. (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone

Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes

in trans. Plant Cell 2: 279–289.

Onodera, Y.; Haag, J.R.; Ream, T.; Nunes, P.C.; Pontes, O. & Pikaard, O.S. (2005).

Plant nuclear RNA polymerase IV mediates siRNA and DNA methylation-dependent

heterochromatin formation. Cell 120: 613–622.

Parizotto, E.A.; Dunoyer, P.; Rahm, N.; Himber, C. & Voinnet, O. (2004). In vivo

investigation of the transcription, processing, endonucleolytic activity, and functional

relevance of the spatial distribution of a plant miRNA. Genes & Development 18: 2237-

2242.

Park, M.Y.; Wu, G.; Gonzalez-Sulser, A.; Vaucheret, H. & Poethig, R.S. (2005).

Nuclear processing and export of microRNAs in Arabidopsis. Proceedings of the

National Academy of Sciences 102: 3691–3696.

Park, W.; Li, J.; Song, R.; Messing, J. & Chen, X. (2002). CARPEL FACTORY, a Dicer

homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis

thaliana. Current Biology 12: 1484–1495.

Pazhouhandeh, M.; Dieterle, M.; Marrocco, K.; Lechner, E.; Berry, B.; Brault, V.;

Hemmer, O.; Kretsch, T.; Richards, K.E.; Genschik, P. & Ziegler-Graff, V. (2006).

F-box-like domain in the polerovirus protein P0 is required for silencing suppressor

function. Proceedings of the National Academy of Sciences 103: 1994-1999.

Peragine, A.; Yoshikawa, M.; Wu, G.; Albrecht, H.L. & Poethig, R.S. (2004). SGS3

and SGS2/SDE1/RDR6 are required for juvenile development and the production of

transacting siRNAs in Arabidopsis. Genes & Development 18: 2368–2379

Petersen, B.O. & Albrechtsen, M. (2005). Evidence implying only unprimed RdRP

activity during transitive gene silencing in plants. Plant Molecular Biology 58: 575–583.

Petroski, M.D. & Deshaies, R.J. (2005). Function and regulation of cullin-RING ubiquitin

ligases. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology 6: 9-20.

159

Pfeffer, S.; Dunoyer, P.; Heim, F.; Richards, K.E.; Jonard, G. & Ziegler-Graff, V.

(2002). P0 of Beet western yellow virus is a suppressor of posttranscriptional gene

silencing. Journal of Virology 13: 6815-24.

Pontier, D.; Yahubyan, G,; Vega, D.; Bulski, A.; Saez-Vasquez, J.; Hakimi, M.A.;

Lerbs-Mache, A.; Colot, V. & Lagrange, T. (2005). Reinforcement of silencing at

transposons and highly repeated sequences requires the concerted action of two distinct

RNA polymerases IV in Arabidopsis. Genes & Development 19: 2030–2040.

Preall, J.B.; He, Z.; Gorra, J.M. & Sontheimer, E.J. (2006). Short interfering RNA

strand selection is independent of dsRNA processing polarity during RNAi in Drosophila.

Current Biology 16: 530-535.

Prüfer, D.; Tacke, E.; Schmitz, J.; Kull, B.; Kaufmann, A. & Rohde, W. (1992).

Ribosomal frameshifting in plants: a novel signal directs the -1 frameshift in the synthesis

of the putative viral replicase of potato leafroll luteovirus. The EMBO Journal 11:1111-

1117.

Pruss, G.; Ge, X.; Shi, X.M.; Carrington, J.C. & Vance, V.B. (1997). Plant viral

synergism: the potyviral genome encodes a broad-range pathogenicity enhancer that

transactivates replication of heterologous viruses. The Plant Cell 9: 859-868.

Qi, Y.; Denli, A.M. & Hannon GJ. (2005). Biochemical specialization within Arabidopsis

RNA silencing pathways. Molecular Cell 19: 421-428.

Rajagopalan, R.; Vaucheret, H.; Trejo, J. & Bartel, D.P. (2006). A diverse and

evolutionarily fluid set of microRNAs in Arabidopsis thaliana. Genes & Development 20:

3407–3425.

Randall, G.; Grakoui, A. & Rice, C.M. (2003). Clearance of replicating hepatitis C virus

replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. Proceedings of the National

Academy of Sciences 100: 235–240.

Rathjen, J.P.; Karageorgos, L.E.; Habili, N.; Waterhouse, P.M.; Symons, R.H. (1994).

Soybean dwarf luteovirus contains the third variant genome type in the luteovirus group.

Virology 198: 671-679.

Reddy, S.V. & Kumar, P.L. (2004). Transmission and properties of a new luteovirus

associated with chickpea stunt disease in India. Current Science 86: 1157–1161.

Reutenauer, A.; Ziegler-Graff, V.; Lot, H.; Scheidecker, D.; Guilley, H.; Richards, K.

& Jonard, G. (1993). Identification of Beet western yellows luteovirus genes implicated

in viral replication and particle morphogenesis. Virology 195: 692-699.

Rhoades, M.W.; Reinhart, B.J.; Lim, L.P.; Burge, C.B.; Bartel, B. & Bartel DP.

(2002). Prediction of plant microRNA targets. Cell 110: 513–520.

160

Robertson, M. (2004). Two Transcription Factors Are Negative Regulators of Gibberellin

Response in the HvSPY-Signaling Pathway in Barley Aleurone. Plant Physiology 136:

2747–2761.

Robertson, N.L.; French, R. & Gray, S.M. (1991). Use of group-specific primers and the

polymerase chain reaction for the detection and identification of luteoviruses.

Journal of General Virology 72: 1473-1477.

Ronemus, M.; Vaughn, M.W.; Martienssen, R.A. (2006). MicroRNA-targeted and small

interfering RNA-mediated mRNA degradation is regulated by argonaute, dicer, and

RNA-dependent RNA polymerase in Arabidopsis. The Plant Cell 18: 1559-1574.

Ruiz, M.T; Voinnet, O. & Baulcombe D. (1998). Initiation and maintenance of virus-

induced gene silencing. The Plant Cell 10: 937–946.

Saito, K.; Ishizuka, A.; Siomi, H. & Siomi, M.C. (2005). Processing of pre-microRNAs

by the Dicer-1-Loquacious complex in Drosophila cells. PLoS Biology 3: e235.

Schauer, S.E.; Jacobsen, S.E.; Meinke, D.W. & Ray, A. (2002). DICER-LIKE1: blind

men and elephants in Arabidopsis development. Trends in Plant Science 7: 487-491.

Schiebel, W.; Haas, B.; Marinkovic, S.; Klanner, A. & Sanger, H.L. (1993). RNA-

directed RNA polymerase from tomato leaves. II. Catalytic in vitro properties. Journal of

Biological Chemistry 268: 11858–11867.

Schiebel, W.; Pélissier, T.; Riedel, L. Thalmeir, S.; Schiebel, R.; Kempe, D.;

Lottspeich, F.; Saenger, H.L. & Wassenegger, M. (1998). Isolation of an RNA-

directed RNA polymerase-specific cDNA clone from tomato. The Plant Cell 10: 1-16.

Schwab, R.; Ossowski, S.; Riester, M.; Warthmann, N. & Weigel, D. (2006). Highly

specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell 18: 1121-

1133.

Schwach, F.; Vaistij, F.E.; Jones, L. & Baulcombe DC. (2005). An RNA-dependent

RNA polymerase prevents meristem invasion by potato virus X and is required for the

activity but not the production of a systemic silencing signal Plant Physiology 138: 1842-

1852.

Schwarz, D.S.; Hutvágner, G.; Du, T.; Xu, Z.; Aronin, N. & Zamore, P.D. (2003).

Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115: 199–208.

Siepen, M.; Pohl, J.O.; Koo, B.J.; Wege, C.; Jeske, H. (2005). Poinsettia latent virus is

not a cryptic virus, but a natural polerovirus–sobemovirus hybrid. Virology 336: 240 –

250.

161

Sijen, T.; Wellink, J.; Hiriart, J-B. & Van Kammen, A. (1996). RNA-mediated virus

resistance: role of repeated transgenes and delineation of targeted regions. The Plant Cell

8: 2277 - 2294.

Silhavy, D.; Molnár, A.; Lucioli, A.; Szittya, G.; Hornyik, C.; Tavazza, M. &

Burgyán, J. (2002). A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-

generated, 21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs. The EMBO Journal 21: 3070-

3080.

Silhavy, D. & Burgyán, J. (2004). Effects and side-effects of viral RNA silencing

suppressors on short RNAs. Trends in Plant Science 9: 76-83.

Silva, T.F. (2008). Mapeamento da doença azul do algodoeiro no território brasileiro:

análise da diversidade do Cotton leafroll dwarf virus. Dissertação de Mestrado, Instituto

de Biologia, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil,

100 pp.

Simon-Mateo, C.; & Garcia, J.A. (2006). MicroRNA-guided processing impairs Plum

pox virus replication, but the virus readily evolves to escape this silencing mechanism.

Journal of Virology 80: 2429-2436.

Smith, L.M.; Pontes, O.; Searle, I.; Yelina, N.; Yousafzai, F.K. Herr, A.J.; Pikaard,

C.S. & Baulcombe, D.C. (2007). An SNF2 protein associated with nuclear RNA

silencing and the spread of a silencing signal between cells in Arabidopsis.

The Plant Cell 19:1507-1521.

Smith, N.A.; Singh, S.P.; Wang, M-B; Stoutjesdijk, P.A.; Green, A.G. & Waterhouse, P.M.

(2000). Gene expression: Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.

Nature

407: 319 – 320.

Song, L.; Han, M.H.; Lesicka, J. & Fedoroff, N. (2007). Arabidopsis primary microRNA

processing proteins HYL1 and DCL1 define a nuclear body distinct from the Cajal body.

Proceedings of the National Academy of Sciences 104: 5437-5442.

Stark, A.; Brennecke, J.; Russell, R.B. & Cohen, S.M. (2003). Identification of

Drosophila microRNA targets. PLOS Biology 1: E60.

Sunkar, R. & Zhu, J.K. (2004). Novel and stress-regulated microRNAs and other small

RNAs from Arabidopsis. The Plant Cell 16: 2001–2019.

Tabara, H.; Yigit, E.; Siomi, H. & Mello, C.C. (2002). The dsRNA binding protein RDE-

4 interacts with RDE-1, DCR-1, and a DExH-box helicase to direct RNAi in C. elegans.

Cell 109: 861–871.

Tacke, E.; Prufer, D.; Salamini, F. & Rohde, W. (1990). Characterization of a Potato

leafroll luteovirus subgenomic RNA: differential expression by internal translation

initiation and UAG suppression. Journal of General Virology 71: 2265-2272.

162

Tacke, E.; Prufer, D.; Schmitz, J. & Rohde, W. (1991). The Potato leafroll luteovirus

17K protein is a single-stranded nucleic acid-binding protein. Journal of General

Virology 72: 2035-2038.

Tahbaz, N.; Kolb, F.A.; Zhang, H.; Jaronczyk, K.; Filipowicz, W. & Hobman, T.C.

(2004). Characterization of the interactions between mammalian PAZ PIWI domain

proteins and Dicer. EMBO Reports 5: 189–194.

Takimoto, J.K. (2003). Estudo da relação vetor-patógeno-hospedeiro para a doença azul

do algodoeiro. Dissertação de Mestrado, Instituto Agronômico de Campinas, São Paulo,

Brasil, 97 pp.

Takimoto, J.K.; Sawasaki, H.; Souza-Dias, J.A.C. & Cia, E. (2003). Doença azul do

algodoeiro: possível não Luteovirus. Anais do XXXVI Congresso Brasileiro de

Fitopatologia 28: 254-254.

Talmor-Neiman, M.; Stav, R.; Frank, W.; Voss, B. & Arazi, T. (2006). Novel micro-

RNAs and intermediates of micro-RNA biogenesis from moss. The Plant Journal 47: 25-

37.

Talmor-Neiman, M.; Stav, R.; Klipcan, L.; Buxdorf, K.; Baulcombe, D.C. & Arazi, T.

(2006a). Identification of trans-acting siRNAs in moss and an RNA-dependent RNA

polymerase required for their biogenesis. The Plant Journal 48: 511-521.

Tang, G. (2005). siRNA and miRNA: an insight into RISCs. Trends in Biochemistry

Science 30:106-114.

Telfer, A. & Poethig, R.S. (1998). HASTY: a gene that regulates the timing of shoot

maturation in Arabidopsis thaliana. Development 125: 1889–1898.

Terradot, L.; Souchet, M.; Tran, V. & Ducray-bourdin, D.G. (2001). Analysis of a

threedimensional structure of Potato leafroll virus coat protein obtained by homology

modeling. Virology 286: 72–82.

Triboulet, R.; Mari, B.; Lin,Y-L.; Chable-Bessia, C.; Bennasser,Y.; Lebrigand, K.;

Cardinaud, B.; Maurin, T.; Barbry, P.; Baillat,V.; Reynes, J.; Corbeau, P.; Jeang,

K-T. & Benkirane, M. (2007). Suppression of MicroRNA-Silencing Pathway by HIV-1

During Virus Replication. Science 315: 1579-1582.

Vaistij, F.E.; Jones, L.& Baulcombe, D.C. (2002). Spreading of RNA targeting and DNA

methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative

RNA-dependent RNA polymerase. Plant Cell 14, 857 - 867.

Vargason, J.M.; Szittya, G.; Burgyán, J.; Tanaka Hall, T.M. (2003). Size selective

recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor. Cell 115: 799-811.

163

van der Wilk, F.; Huisman, M.J.; Cornelissen, B.J.; Huttinga, H. & Goldbach, R.

(1989). Nucleotide sequence and organization of potato leafroll virus genomic RNA.

FEBS Letters 245: 51-56.

van der Wilk, F.; Houterman, P.; Molthoff, J.; Hans, F.; Dekker, D.; van den Heuvel,

J.; Huttinga, H. & Goldbach, R. (1997). Expression of the Potato Leafroll Virus ORF0

Induces Viral-Disease-like Symptoms in Transgenic Potato Plants. Molecular Plant

Microbe Interactions 10: 153–159.

Van Regenmortel, M.H.; Bishop, D.H.; Fauquet, C.M.; Mayo, M.A.; Maniloff, J. &

Calisher, C.H. (1997). Guidelines to the demarcation of virus species. Archives of

Virology 142: 1505-1518.

Vaucheret, H,; Vazquez, F.; Crete, P. & Bartel DP. (2004). The action of

ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are

crucial for plant development. Genes & Development 18:1187–1197.

Vaughn, M.W.; Tanurd, I.M; Lippman, Z.; Jiang, H.; Carrasquillo, R.; Rabinowicz,

P.D.; Dedhia, N.; McCombie, W.R.; Agier, N.; Bulski, A.; Colot, V.; Doerge, R.W. &

Martienssen, R.A. (2007). Epigenetic Natural Variation in Arabidopsis thaliana.

PLoS Biology 5: e174.

Vazquez, F.; Gasciolli, V.; Crete, P. & Vaucheret, H. (2004a). The nuclear dsRNA

binding protein HYL1 is required for microRNA accumulation and plant development,

but not posttranscriptional transgene silencing. Current Biology 14: 346–351.

Vazquez, F.; Vaucheret, H.; Rajagopalan, R.; Lepers, C.; Gasciolli, V., Mallory, A.;

Bartel D. & Crete, P. (2004b). Endogenous trans-acting siRNAs regulate the

accumulation of Arabidopsis mRNAs. Molecular Cell 16: 69–79.

Veidt, I.; Lot, H.; Leiser, M.; Scheidecker, D.; Guilley, H.; Richards, K. & Jonard, G.

(1988). Nucleotide sequence of beet western yellows virus RNA. Nucleic Acids Research

16: 9917-9932.

Voinnet, O. & Baulcombe, D.C. (1997). Systemic signalling in gene silencing. Nature

389: 553.

Voinnet, O. (2005a). Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral

infections. Nature Reviews in Genetics 6, 206 – 220.

Voinnet, O. (2005b). Non-cell autonomous RNA silencing. FEBS Letters 579: 5858-5871.

Voinnet, O., Vain, P., Angell, S. & Baulcombe, D.C. (1998). Systemic Spread of

Sequence-Specific Transgene RNA Degradation in Plants Is Initiated by Localized

Introduction of Ectopic Promoterless DNA. Cell 95: 177 - 187.

164

Voinnet, O.; Pinto, Y.M. & Baulcombe, D.C. (1999). Suppression of gene silencing: a

general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proceedings of the

National Academy of Sciences 96: 14147-14152.

Voinnet, O.; Vain, P.; Angell, S. & Baulcombe, D.C. (1998). Systemic spread of

sequence-specific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized

introduction of ectopic promoter-less DNA. Cell 95, 177 – 187.

Voinnet, O.; Lederer, C. & Baulcombe, D.C. (2000). A viral movement protein prevents

spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell 103: 157-167.

Wang, X.J.; Reyes, J.L.; Chua, N.H. & Gaasterland, T. (2004). Prediction and

identification of Arabidopsis thaliana microRNAs and their mRNA targets. Genome

Biology 5:R65

Wassenegger, M. & Krczal, G. (2006). Nomenclature and functions of RNA-directed

RNA polymerases. Trends in Plant Science 11: 142 – 151

Waterhouse, P.M. & Fusaro, A.F. (2006). Plant science. Viruses face a double defense by

plant small RNAs. Science 313: 68-71.

Waterhouse, P.M.; Graham, M.W. & Wang, M.B. (1998). Virus resistance and gene

silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense

RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 95, 13959

‾

13964.

Watson, J.M.; Fusaro, A.F.; Wang, M.B. & Waterhouse, P.M. (2005). RNA silencing

platforms in plants. FEBS Letters 579: 5982–5987.

Wesley, S.V.; Helliwell, C.A.; Smith, N.A.; Wang, M.; Rouse, D.T.; Liu, Q;.Gooding,

P.S.; Singh, S.P.; Abbott, D.; Stoutjesdijk, P.A.; Robinson, S.P; Gleave, A.P; Green,

A.G & Waterhouse, P.M. (2001). Construct design for efficient, effective and high-

throughput gene silencing in plants. The Plant Journal 27: 581 - 590.

Wienholds, E.; Kloosterman, W.P.; Miska, E.; Alvarez-Saavedra, E.; Berezikov, E.;

de Bruijn, E.; Horvitz, H.R.; Kauppinen, S. & Plasterk, R.H. (2005). MicroRNA

expression in zebrafish embryonic development. Science 309: 310-311.

Xie, Z.; Allen, E.; Wilken, A. & Carrington, J.C. (2005). DICER-LIKE 4 functions in

transacting small interfering RNA biogenesis and vegetative phase change in Arabidopsis

thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences 102: 12984–12989.

Xie, Z.; Fan, B.; Chen, C. & Chen, Z. (2001). An important role of an inducible RNA-

dependent RNA polymerase in plant antiviral defense. Proceedings of the National

Academy of Sciences 98: 6516-6521.

Xie, Z.; Johansen, L.K.; Gustafson, A.M.; Kasschau, K.D.; Lellis, A.D.; Zilberman,

D.; Jacobsen, S.E. & Carrington, J.C. (2004). Genetic and functional diversification of

small RNA pathways in plants. PLoS Biology 2:E104.

165

Xie, Z.; Kasschau, K.D. & Carrington, J.C. (2003). Negative feedback regulation of

Dicer-Like1 in Arabidopsis by microRNA-guided mRNA degradation. Current Biology

13: 784–89.

Yang, L.; Liu, Z.; Lu, F.; Dong, A. & Huang, H. (2006). SERRATE is a novel nuclear

regulator in primary microRNA processing in Arabidopsis. The Plant Journal 47: 841-

850.

Ye, K.; Malinina, L. & Patel, D.J. (2003). Recognition of small interfering RNA by a

viral suppressor of RNA silencing. Nature 426: 874-878.

Yi, R.; Qin, Y.; Macara, I.G. & Cullen, B.R. (2003). Exportin-5 mediates the nuclear

export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Development 17: 3011–3016.

Yoshikawa, M.; Peragine, A.; Park, M.Y. & Poethig RS. (2005). A pathway for the

biogenesis of trans-acting siRNAs in Arabidopsis. Genes & Development 19: 2164–2175.

Yu, B.; Yang, Z.; Li, J.; Minakhina, S. & Yang, M. (2005). Methylation as a crucial step

in plant microRNA biogenesis. Science 307: 932–935.

Zamore, P.D.; Tuschl, T.; Sharp, P.A. & Bartel, D.P. (2000). RNAi: Double-Stranded

RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals.

Cell 101, 25 – 33.

Zeng, Y. & Cullen, B.R. (2003). Sequence requirements for microRNA processing and

function in human cells. RNA 9: 112–123.

Zeng, Y.; Wagner, E.J. & Cullen, B.R. (2002). Both natural and designed micro RNAs

can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells. Molecular

Cell 9: 1327–1333.

Zhang, X.; Yazaki, J.; Sundaresan, A.; Cokus, S.; Chan, S.W.; Chen, H.; Henderson,

I.R.; Shinn, P.; Pellegrini, M.; Jacobsen, S.E. & Ecker, J.R. (2006). Genome-wide

high-resolution mapping and functional analysis of DNA methylation in arabidopsis. Cell

126: 1189-201.

Zhang, X.; Yuan, Y.R.; Pei, Y.; Lin, S.S.; Tuschl, T.; Patel, D.J. & Chua, N.H.

(2006a). Cucumber mosaic virus-encoded 2b suppressor inhibits Arabidopsis Argonaute1

cleavage activity to counter plant defense. Genes & Development 20: 3255-3268.

Zhao, T.; Li, G.; Mi, S.; Li, S.; Hannon, G.J.; Wang, X.J. & Qi, Y. (2007). A complex

system of small RNAs in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii.

Genes & Development 21: 1190-1203.

Zheng, J.; Zhu, A.; Kapoor, S. & Zhu, J-K. (2006). Role of Arabidopsis AGO6 in

siRNA accumulation, DNA methylation and trasncriptional gene silencing. The EMBO

Journal 26: 1691–1701.

166

Zilberman, D.; Cao, X. & Jacobsen, S.E. (2003). ARGONAUTE4 control of locus

specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science 299: 716–719.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 