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CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA LECTINA
DE FOLHAS DE MANDIOCA
(Manihot esculenta Crantz)
MARIA CRISTINA SILVA
2008
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MARIA CRISTINA SILVA
CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA LECTINA DE FOLHAS DE
MANDIOCA (Manihot esculenta Crantz).
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Lavras como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Agroquímica,
para a obtenção do título de “Mestre”.
Orientadora
Profa. Dra. Angelita Duarte Corrêa
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2008
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Silva, Maria Cristina.
Caracterização parcial da lectina de folhas de mandioca (Manihot esculenta
Crantz / Maria Cristina Silva. -- Lavras : UFLA, 2008.
52 p. : il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2008.
Orientador: Angelita Duarte Corrêa.
Bibliografia.
1. Lectina. 2. Atividade hemaglutinante. 3. Atividade fungicida.
I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD – 574.19245
MARIA CRISTINA SILVA
CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA LECTINA DE FOLHAS DE
MANDIOCA (Manihot esculenta Crantz).
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Lavras como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Agroquímica,
para a obtenção do título de “Mestre”.
APROVADA em 20 de fevereiro de 2008
Profa. Dra. Adelir Aparecida Saczk UFLA
Prof. Dr. Luiz Carlos de Oliveira Lima UFLA
Profa. Dra. Angelita Duarte Corrêa
UFLA
(Orientadora)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
A Deus,
por ser meu refúgio e me amparar
durante os momentos mais difíceis.
Aos meus pais, Geraldo e Aparecida,
pelo exemplo de determinação e por
toda dedicação e carinho.
As minhas irmãs, Janaína e Talita e
à pequena Sarah, por nossa amizade,
e união.
À minha avó, Dona Neguinha,
e minhas tias, Rita e Lurdinha,
por me acolherem com tanto
carinho.
E aos meus amigos Luciana, Chrystian e Simone, pelos
conselhos, ajuda, carinho e grande amizade.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me dar força e iluminar o meu caminho.
Aos meus pais, pelo apoio e carinho fundamentais na realização deste
trabalho.
À professora Angelita Duarte Corrêa, pela orientação, dedicação e
amizade, por acreditar em mim e me ajudar a crescer profissionalmente.
Ao professor Custódio Donizete dos Santos, pela co-orientação e
disponibilidade.
Ao professor José Donizeti Alves, pela gentileza em colocar à
disposição o Laboratório de Biologia Molecular (Setor de Fisiologia Vegetal-
DBI/UFLA) para a realização da cromatografia.
Ao professor Luiz Carlos de Oliveira Lima, por fornecer a resina
utilizada na cromatografia e pela disponibilidade.
Ao Dr. Marcelo Murad Magalhães, pela receptividade, atenção,
ensinamentos, presteza e auxílio na realização de parte fundamental deste
trabalho.
Ao professor Luciano Vilela Paiva, pelo espaço cedido no Laboratório
de Biologia Molecular para a realização de parte deste trabalho e pelos
ensinamentos.
Ao professor Paulo Estevão, que disponibilizou a Clínica Fitossanitária
do Departamento de Fitopatologia para a realização dos ensaios biológicos.
A todos os professores do Departamento de Química, pela receptividade.
Ao professor Ruy Carvalho, chefe do Departamento de Química e à
professora Celeste Maria Patto de Abreu, coordenadora da pós-graduação, por
disponibilizarem recursos para o desenvolvimento do projeto.
Aos funcionários do Departamento de Química, em especial à Miriam e
à Xulita, pela atenção e ajuda.
À Flávia, bolsista de iniciação científica, por sua ajuda e contribuição na
realização desse trabalho.
Aos funcionários do Laboratório Central de Biologia Molecular, em
especial ao Anderson, pela atenção e disponibilidade.
Ao Dartagnan, funcionário do Departamento de Fisiologia Vegetal, pelo
apoio e ajuda em qualquer hora.
À Eliane, funcionária do Departamento de Fitopatologia, pela ajuda com
os ensaios biológicos.
A todos os amigos da pós-graduação, em especial a Luciana, Chrystian,
Abel, Simone, Annete, José Renato, Marcele e Rafaela, pela amizade, apoio e
disposição em ajudar.
Ao Departamento de Química e à UFLA, pela oportunidade concedida.
À Capes pelo apoio financeiro.
E a todos que, de alguma forma, participaram e contribuíram para a
conclusão deste trabalho.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE SIGLAS...............................................................................................i
LISTA DE TABELAS..........................................................................................ii
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................iii
RESUMO.............................................................................................................iv
ABSTRACT .........................................................................................................v
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................1
2 REFERENCIAL TEÓRICO..............................................................................4
2.1 Folhas de mandioca: subproduto agrícola x suplemento alimentar ................4
2.2 Lectinas...........................................................................................................6
2.2.1 Considerações gerais....................................................................................6
2.2.2 Distribuição e função das lectinas nas plantas.............................................8
2.2.3 Classificação das lectinas vegetais...............................................................9
2.2.4 Atividade antinutricional ...........................................................................11
2.2.5 Aplicações biotecnológicas das lectinas vegetais......................................12
2.3 Fungos fitopatogênicos.................................................................................14
2.3.1 Atividade fungicida das lectinas de plantas...............................................15
2.3.2 Fusarium oxysporum .................................................................................16
3 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................18
3.1 Material biológico e reagentes......................................................................18
3.2 Colheita, secagem das folhas de mandioca e preparo da farinha de folhas de
mandioca ........................................................................................................18
3.3 Métodos de extração das proteínas ...............................................................19
3.4 Dosagem de proteínas...................................................................................20
3.5 Atividade hemaglutinante.............................................................................20
3.6 Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante ..............................21
3.7 Efeito de cátions divalentes (Ca
2+
e Mn
2+
) na atividade hemaglutinante......21
3.8 Precipitação das proteínas e diálise...............................................................22
3.9 Purificação parcial das proteínas ..................................................................23
3.10 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS........................24
3.11 Avaliação da atividade fungicida................................................................25
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................27
4.1 Métodos de extração das proteínas ...............................................................27
4.2 Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante ..............................30
4.3 Efeito de cátions divalentes (Ca
2+
e Mn
2+
) na atividade hemaglutinante......31
4.4 Precipitação das proteínas e diálise...............................................................33
4.5 Purificação parcial das proteínas ..................................................................34
4.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS..........................36
4.7 Avaliação da atividade fungicida..................................................................38
5 CONCLUSÕES ...............................................................................................40
6 PERSPECTIVAS.............................................................................................41
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................42
ANEXO ..............................................................................................................51
i
LISTA DE SIGLAS
AH
Atividade hemaglutinante
BDA
Batata, dextrose, agar
BOD
Incubadora com “biological oxygen demand”
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
EGTA
Ácido etilenoglicoltetracético
FFM
Farinha de folhas de mandioca
Gal
Galactose
GalNAc
N-acetilgalactosamina
kDa
Kilodalton
nm
Nanômetros
PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida
SDS
Dodecil sulfato de sódio
TEMED
Tetrametilenodiamina
Tris
Trihidroximetilaminometano
UH
Unidades hemaglutinantes
ii
LISTA DE TABELAS
Página
TABELA 1 Composição centesimal (g 100 g
-1
) e fatores
antinutricionais (g 100g matéria seca
-1
) da farinha de
folhas de mandioca (Manihot esculenta Crantz cv.
Cacao)...............................................................................
6
TABELA 2 Rendimentos médios de proteínas (g/100g) da farinha de
folhas de mandioca...........................................................
28
TABELA 3 Atividade hemaglutinante com dois extratores e vários
tempos de extração............................................................
29
TABELA 4 Aglutinação de hemácias incubadas com soluções
salinas contendo diferentes concentrações de Ca
2+
e
Mn
2+
e da mistura de ambos os íons.................................
32
TABELA 5 Proteína total e atividade hemaglutinante no extrato
protéico e no precipitado com sulfato de amônio a
80%...................................................................................
33
iii
LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1 Curvas e equações de regressão representativas dos valores
de rendimento protéico de dois extratores, em função do
tempo de extração..................................................................
28
FIGURA 2 Efeito da temperatura na atividade hemaglutinante da
lectina da farinha de folhas de mandioca..............................
30
FIGURA 3 Perfil cromatográfico do precipitado protéico da farinha de
folhas de mandioca................................................................
35
FIGURA 4 Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%), com SDS
das frações de purificação da lectina da farinha de folhas de
mandioca................................................................................
37
FIGURA 5 Bioensaio realizado com o extrato protéico da FFM
precipitado com sulfato de amônio a 80%, sobre o
crescimento micelial do fungo Fusarium
oxysporum........................................................................
38
FIGURA 6 Efeito do extrato protéico da FFM precipitado com sulfato
de amônio a 80%, sobre o crescimento micelial do fungo
Fusarium oxysporum...........................................................
39
iv
RESUMO
SILVA, Maria Cristina. Caracterização parcial da lectina de folhas de
mandioca (Manihot esculenta Crantz). 2008. 52p. Dissertação (Mestrado em
Agroquímica) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
∗
Lectinas são proteínas (ou glicoproteínas) ligantes de carboidratos e, em
função dessa propriedade, são capazes de provocar a aglutinação de células,
principalmente hemácias (fenômeno conhecido como hemaglutinação). São
amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em muitos organismos,
desde vírus e bactérias, até animais e plantas. Algumas dessas proteínas são
tóxicas e ou antinutritivas, e, quando ingeridas, provocam efeitos fisiológicos
adversos no organismo. No entanto, as lectinas despertam interesse científico,
desde que representam importantes ferramentas em pesquisas nas áreas
biológicas e médicas. A farinha de folhas de mandioca (FFM), um subproduto
agrícola, vem sendo utilizada como suplemento alimentar para populações
carentes. Dessa forma, o estudo da lectina da FFM é de extrema importância
tanto pela sua ação antinutricional, como por suas possíveis aplicações
biotecnológicas, agregando valores a esse subproduto. O objetivo da realização
deste trabalho foi extrair, purificar e caracterizar a lectina de FFM quanto às
propriedades químicas e biológicas. Para a extração das proteínas da FFM,
foram testados vários métodos de extração, em que se utilizaram dois extratores,
água destilada e solução salina tamponada (NaCl 0,15mol L
-1
, tampão fosfato
pH 7,4) e quatro tempos de extração, 15, 60, 120 e 180 minutos. O método de
extração que proporcionou maior atividade hemaglutinante (AH) foi obtido
quando se utilizou água como extrator, em um tempo de 15 minutos (proporção
1:20 m/v). A lectina da FFM apresentou estabilidade térmica numa faixa de
temperatura de 40º a 70ºC e não é dependente de íons Ca
2+
e Mn
2+
para exercer
sua AH. O extrato protéico foi precipitado com sulfato de amônio a 80% de
saturação e o precipitado foi submetido à cromatografia em coluna de
bioafinidade Sepharose CL-4B. A cromatografia mostrou um pico que
apresentou AH e, quando levado à eletroforese em gel de poliacrilamida em
presença de SDS revelaram-se três bandas protéicas de 64, 61 e 58 kDa. O
extrato protéico de FFM precipitado com sulfato de amônio a 80% de saturação
não apresentou efeito inibitório sobre o crescimento micelial do fungo Fusarium
oxysporum, na concentração de até 100µg mL
-1
.
∗
Comitê Orientador: Dra. Angelita Duarte Corrêa (Orientadora), Dr. Custódio Donizete
dos Santos, Dra. Celeste Maria Patto de Abreu (Co-orientadores) – DQI/UFLA.
v
ABSTRACT
SILVA, Maria Cristina. Partial characterization of lectin of cassava leaves
(Manihot esculenta Crantz).2008. 52p. Dissertation (Master in Agrochemistry)
– Federal University of Lavras, Lavras, MG.
∗
Lectins are carbohydrates binding proteins (or glycoproteins) and owing
to this property are capable of provoking agglutination of cells, mainly red blood
cells (phenomenon known as hemagglutination). Are widely distributes in
nature, found it in a number of organisms, since viruses and bacteria till animals
and plants. Some of these proteins are toxic and or antinutritive and when
ingested they incite adverse physiologic effects in the organism. Nevertheless,
lectins awake the scientific interest, since they stand for important tools in
research in the biologic and medical areas. Cassava leaf flour (FFM), a sub
product of agricultural has been utilized as a food supplement for low income
populations. Thus, the study of FFM lectin is extremely important both for its
anti nutritional action and for its possible biotechnological applications, adding
values to the sub products. The objective of this work was extracting, purifying
and characterizing FFM lectin both its chemical and biological properties. For
the extraction of FFM proteins, several extraction methods have been tested, in
which two extractors were employed: distilled water and buffered saline solution
(0.15mol L
-1
NaCl, phosphate buffer pH 7.4) and four extraction times, 15, 60,
120 and 180 minutes. The extraction method which provided highest
hemagglutinating activity (AH) was obtained when water was utilized as an
extractor, in a time of 15 minutes (ratio 1:20 m/v). The FFM lectin file a thermal
stability in a temperature range of 40 to 70º C and it is not dependent on Ca
2+
and Mn
2+
ions to exercise its AH. The protein extract was precipitated with
ammonium sulfate at 80% of saturation and the precipitate was submitted to
Sepharose CL-4B bio affinity column
chromatography. Chromatography
showed a peak which presented AH and when taken to polyacrylamide gel
electrophoresis in the presence of SDS revealed three protein bands of 64, 61
and 58 kDa. The FFM’s protein extract that precipitated with ammonium sulfate
at 80% of saturation don’t presented inhibitory effect don mycelial growth of the
fungus Fusarium oxysporum, at the concentration of up to 100µg mL
-1
.
∗
Guidance Committee: Dr. Angelita Duarte Corrêa (Adviser), Dr. Custódio Donizete
dos Santos, Dr. Celeste Maria Patto de Abreu, (Co-advisers) – DQI/UFLA.
1
1 INTRODUÇÃO
Dos diferentes tipos de exposição humana a agentes químicos, nenhuma
é tão complexa como a que ocorre com o uso dos alimentos. Esta complexidade
pode ser atribuída à quantidade e à diversidade de compostos químicos
eventualmente presentes ou constituintes do próprio alimento.
Muitos alimentos da dieta humana, além da porção nutritiva, podem
conter fatores antinutricionais, que são substâncias capazes de bloquear o
aproveitamento de outras substâncias ou que reúnem propriedades tóxicas,
provocando efeitos fisiológicos adversos no organismo.
A maioria das substâncias que compõem os alimentos consumidos pelo
homem, exceto os nutrientes, não está, ainda quimicamente, muito bem
caracterizada e, como conseqüência, seus eventuais efeitos nocivos são ainda
desconhecidos, seja isoladamente ou resultante de interações.
A desnutrição energético-protéica constitui um dos principais problemas
nutricionais no Brasil, com elevada prevalência na população de baixa renda. Os
indivíduos mais vulneráveis, por suas exigências nutricionais, são as crianças,
cujo desenvolvimento físico e mental está condicionado ao estado de nutrição
dos primeiros anos de vida.
Com o intuito de diminuir o índice de desnutrição no Brasil, várias
organizações governamentais e não governamentais, como a Pastoral da
Criança, vêm incentivando o uso da “multimistura” como suplemento alimentar
para populações carentes. A formulação da “multimistura” varia de acordo com
a disponibilidade local dos ingredientes, mas basicamente é composta de
alimentos não convencionais na dieta habitual, entre eles os farelos, o pó de
casca de ovo, as folhas verde-escuras (folhas de mandioca, por exemplo) e as
sementes. No entanto, a biodisponibilidade de seus nutrientes e a presença de
2
fatores antinutricionais têm gerado polêmica e oferecido restrições ao seu
emprego como tal (Vizeu, Feijó & Campos, 2005).
A farinha de folhas de mandioca (FFM), um dos constituintes da
“multimistura”, possui alto teor em proteínas, vitaminas e minerais, entretanto,
apesar do seu potencial nutritivo, a FFM possui algumas substâncias
antinutritivas e ou tóxicas, como cianeto, polifenóis (taninos), nitrato, ácido
oxálico, saponinas, inibidores de tripsina e uma classe de proteínas denominada
lectinas, as quais serão enfatizadas neste trabalho.
A purificação e a caracterização das lectinas são de extrema
importância, não só no que diz respeito à sua ação antinutricional, mas também
devido ao seu uso potencial em pesquisas nas áreas biológicas e médicas.
A lectina purificada de folhas de mandioca poderia encontrar inúmeras
aplicações biotecnológicas, como, por exemplo, a sua utilização como material
de afinidade em cromatografia de coluna, como agente fungicida, bactericida e
inseticida entre outras. Além disso, o estudo detalhado da lectina da folha de
mandioca poderá trazer subsídios para o consumo seguro da farinha de folhas.
A busca de produtos naturais, que possam apresentar aplicações
biotecnólogicas, como as citadas acima, é extremamente relevante. No caso da
folha de mandioca, a agregação de valor ao que antes era considerado um
subproduto agrícola, além de gerar benefícios econômicos, contribui para o meio
ambiente, uma vez que milhares de toneladas desse resíduo deixariam de ser
descartadas, para serem utilizadas nas mais diversas áreas biológicas e médicas.
Portanto, o objetivo geral deste trabalho foi extrair, isolar e purificar
parcialmente a lectina da FFM, caracterizando-a quanto às propriedades
químicas e biológicas. Os objetivos específicos foram: (1) determinar o método
de extração das proteínas da FFM, (2) realizar a precipitação dessas proteínas,
(3) purificar a lectina de folhas de mandioca em coluna cromatográfica, (4)
avaliar a lectina de folhas de mandioca quanto à sua estabilidade térmica,
3
influência dos íons Ca
2+
e Mn
2+
na atividade hemaglutinante e a massa
molecular aparente e (5) avaliar a ação fungicida do extrato protéico obtido da
FFM sobre o fungo Fusarium oxysporum.
4
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Folhas de mandioca: subproduto agrícola x suplemento alimentar
A mandioca, Manihot esculenta Crantz, é uma planta perene, arbustiva,
pertencente à família das Euforbiáceas. Do ponto de vista econômico, a parte
mais importante da planta é a raiz, rica em fécula (amido), utilizada na
alimentação humana e animal ou como matéria-prima para diversas indústrias
(Fraife Filho & Bahia, 2006).
Originária da América do Sul, a mandioca constitui um dos principais
alimentos energéticos para cerca de 500 milhões de pessoas, sobretudo nos
países em desenvolvimento. Ela pode ser cultivada em pequenas áreas com
pouca tecnologia, pois apresenta características que facilitam sua difusão, como,
por exemplo, fácil adaptação a solos pobres, resistência à seca, além de
conseguir sobreviver junto a ervas daninhas e pragas, tendo como resultado uma
alta resistência biológica (Penteado & Flores, 2007).
Atualmente, o Brasil é o maior produtor mundial, com uma produção,
em 2007, de 27,3 milhões de toneladas e estimativa semelhante para 2008
(IBGE, 2008).
Segundo Jesus et al. (1987), a utilização de plantas de maneira
especializada provoca o desperdício de componentes nutricionais, no momento
do descarte dos restos da cultura. Esses resíduos agrícolas podem apresentar uma
fonte adicional de recursos alimentares. A necessidade de se dar uma utilização
adequada à parte aérea da mandioca, ou seja, de não considerá-la apenas um
subproduto agrícola, baseia-se no grande desperdício deste material que, além de
sua alta produtividade, nutricionalmente, apresenta grande potencial para o
consumo humano.
5
Segundo Cereda et al. (2001), por tonelada de raiz são produzidas 2,5 t
ha
-1
de folhas de mandioca. No Brasil, cerca de 178 mil toneladas de folhas de
mandioca são desperdiçadas a cada ano.
Em regiões de solo arenoso e alimento escasso, como o Norte de Minas
Gerais e o Nordeste do país, a folha da mandioca é usada no combate à
desnutrição, uma vez que este subproduto (parte do alimento normalmente
descartada) é um dos constituintes da chamada multimistura. Além da
participação nessa mistura, a farinha feita a partir da folha é fornecida na
merenda escolar e incluída em cestas básicas para famílias carentes.
Em alguns países da África, as folhas de mandioca são consumidas
como vegetal, fazendo parte da dieta regular (Awoyinga et.al., 1995; Gidamis
et.al., 1993; Lutaladio, 1984; Lyimo, 1991).
Melo et al. (2007) avaliaram a composição química da farinha de folhas
de mandioca (Manihot esculenta Crantz cv. Cacao). Os dados obtidos por este
autor para composição centesimal e para alguns fatores antinutricionais
encontram-se na Tabela 1.
Apesar do elevado potencial nutritivo das folhas de mandioca, seu
consumo está limitado pela presença de alguns fatores antinutricionais, entre
eles as lectinas. Apesar de seus possíveis efeitos deletérios, as lectinas despertam
interesse científico quando utilizadas de forma purificada, em pesquisas
biológicas para fins de diagnósticos clínicos e investigação de estrutura de
proteína e carboidratos em células (Silva & Silva, 2000), encontrando também
diversas outras aplicações biológicas. Dessa forma, além de suplemento
alimentar, a folha de mandioca poderia ser utilizada também como uma fonte de
lectinas.
6
TABELA 1 Composição centesimal (g 100 g-
1
) e fatores antinutricionais (g 100
g matéria seca
-1
) da farinha de folhas de mandioca (Manihot
esculenta Crantz cv. Cacao).
Constituintes Teores
Umidade 8,31 ± 0,04
Extrato etéreo 9,20 ± 0,03
Proteína bruta 29,86 ± 0,10
Fibra (FDN
b
) 26,50 ± 2,61
Lignina 16,80 ± 0,40
Cinza 6,51 ± 0,52
ENN
c
19,98 ± 2,74
Saponina 1,07 ± 0,09
Polifenóis 4,72 ± 0,64
Cianeto 123,61 ± 13,12
Lectina
d
4,00
e
a
Médias de três determinações ± desvio padrão.
b
FDN- fibra detergente neutro.
c
ENN- extrato não nitrogenado
d
Fonte: Pereira (2007)
e
O valor expressa o inverso do título da maior diluição na base 2, em número de
unidades hemaglutinantes (UH), em cada 100µL de amostra utilizados no ensaio com
sangue humano tipo A Rh +.
Fonte: adaptado de Melo et al. (2007).
2.2 Lectinas
2.2.1 Considerações gerais
Lectinas são proteínas que reconhecem e se associam de forma
reversível, com alta afinidade e especificidade a carboidratos, sem, contudo,
promover modificações químicas na estrutura covalente dos mesmos e sem
apresentarem atividade enzimática (Gabius et al., 2002; Loris, 2002; Peumans &
Van Damme, 1995).
Embora muitas lectinas reconheçam e se liguem a açúcares simples, tais
como glicose, manose, galactose, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina
ou fucose, a afinidade é muito maior para com os constituintes de glicoproteínas:
7
ácido siálico e N-acetilgalactosamina,
contendo cadeias de glicanos, encontrados
em animais e seres humanos (Peumans & Van Damme, 1996).
A região de interação com açúcares é denominada domínio
reconhecedor de carboidratos (DRC) que é altamente conservada em cada tipo
de lectina (Ni & Tizard, 1996). O processo de interação a carboidratos ocorre
por meio de interações do tipo ligações de hidrogênio e interações de Van der
Waals, entre as hidroxilas dos carboidratos e os resíduos de aminoácidos do sítio
ativo da lectina (Weis & Drickamer, 1996).
Ao interagirem com gliconjugados da superfície celular, as lectinas
podem promover a formação de ligações cruzadas entre células adjacentes,
causando aglutinação das mesmas (Peumans & Van Damme, 1995). Quando o
carboidrato reconhecido pela proteína localiza-se na superfície de hemácias,
desencadeia o processo de hemaglutinação (Alonso et al., 2001).
A primeira descrição de uma lectina de planta foi feita por Stillmark, em
1889, que isolou, a partir de Ricinus communis, uma proteína tóxica,
denominada ricina, com capacidade de aglutinar eritrócitos de humanos e
animais (Liener, 1980; Sharon & Lis, 2004).
O termo “lectina”, do latim legere = escolher, foi proposto, em 1954,
por Boyd & Shapleigh, para denotar a habilidade de ligar-se especificamente a
células vermelhas do sistema ABO de grupos sangüíneos (Vasconcelos &
Oliveira, 2004).
As lectinas inicialmente foram designadas de hemaglutininas, termo
derivado de sua capacidade de aglutinar células vermelhas do sangue. Somente
em 1952, foi demonstrado que a propriedade de aglutinação das lectinas estava
baseada numa atividade específica de ligação com açúcar na superfície celular
(Watknis & Morgan, 1952). A partir de então, estas proteínas puderam ser
distinguidas de outras proteínas com base num critério funcional bem definido.
8
Por esta razão, atualmente, as lectinas são consideradas proteínas ligantes de
carboidratos em vez de hem (aglutininas).
As lectinas são geralmente ricas em aminoácidos ácidos e básicos e
pobres em aminoácidos contendo enxofre, sendo a maioria de glicoproteína com
conteúdo de açúcar variável. Lectinas são, geralmente, glicosiladas e compostas
de 2 ou 4 protômeros, ligadas não covalentemente. O peso molecular das
lectinas de plantas varia de 8,5 a 265 kDa, como em Urtica dióica, conhecida
como urtiga (Broekaert et al., 1989) e Phaseolus lunatus – feijão-lima (Moreira
et al., 1991), respectivamente.
Algumas lectinas são classificadas como metaloproteínas, pois
requerem, para a sua atividade hemaglutinante, a presença de íons Ca
2+
e Mn
2+
,
para estabilizar os sítios de ligação dos açúcares (Weis & Drickamer, 1996).
Lectinas vegetais apresentam alta estabilidade a variações de
temperatura e pH, e resistem a uma grande variedade de enzimas proteolíticas,
característica comum à maioria das proteínas que estejam diretamente
envolvidas no mecanismo de defesa de plantas (Peumans & Van Damme, 1995).
Muitas proteínas relatadas como de defesa, por exemplo, inibidores de proteases
(Ryan, 1990), proteínas fungicidas (Broekaert et al., 1992) e inibidores de α-
amilase (Boehlmann et al., 1988), sobrevivem a tratamentos que inativariam
proteínas celulares normais.
2.2.2 Distribuição e função das lectinas nas plantas
As lectinas são encontradas em muitos organismos, sendo amplamente
distribuídas entre vegetais, vírus, bactérias, mamíferos e vários grupos de
invertebrados (Gerlach et al., 2005; Kilpatrick, 2002).
Em vegetais, elas são detectadas em centenas de espécies de plantas. A
maioria das lectinas vegetais é obtida de semente, embora a sua presença já
9
tenha sido observada em todos os tipos de tecidos vegetativos, como casca,
folhas, caule, frutos e raízes (Sharon & Lis, 2001).
As lectinas de sementes são obtidas, principalmente, de leguminosas,
onde são acumuladas no período de maturação e desaparecem após a
germinação. As lectinas constituem cerca de 10% das proteínas totais de
semente, porém, a quantidade isolada é pequena: varia entre 0,1%-1% deste total
(Alencar et al., 2005; Loris, 2002; Sharon & Lis, 2004).
O fato de as lectinas terem larga distribuição em plantas sugere alguma
importância fisiológica para estas substâncias (Etzler, 1985; Liener,1976).
Entretanto, as funções fisiológicas das lectinas vegetais ainda não foram
completamente elucidadas, embora muitas hipóteses tenham sido sugeridas.
Alguns exemplos podem ser citados, como: manutenção e armazenamento,
interação planta-microrganismo, defesa contra ataque de insetos e fungos,
estimulação mitogênica no processo de germinação, transporte de carboidratos e
extensão da parede celular (Santos, 2004). Adicionalmente, algumas plantas
respondem a infecções ou a lesões, produzindo lectinas (Millar, Allen & Smith,
1992).
Diversos experimentos indicam, ainda, que as lectinas vegetais são
também proteínas de defesa contra animais herbívoros e possuem função na
simbiose entre as bactérias fixadoras de nitrogênio (Rhizobium spp) e as raízes
de leguminosas (Cavada et al., 2001).
2.2.3 Classificação das lectinas vegetais
As lectinas de plantas representam um grupo muito heterogêneo. Estas
proteínas diferem entre si, tanto em relação às propriedades bioquímicas e físico-
químicas, quanto à sua estrutura molecular, o que está intimamente relacionado
com a especificidade por monossacarídeos e a sua atuação biológica.
10
De acordo com a sua estrutura, as lectinas foram subdivididas em cinco
classes principais: merolectinas, hololectinas, quimerolectinas, superlectinas e
multilectinas (Van Damme et al., 1998), descritas a seguir:
1. as merolectinas que, possuindo apenas um domínio ligante a açúcares,
podem se ligar a células, produzindo modificações fisiológicas nas mesmas,
sem, no entanto, serem capazes de aglutiná-las;
2. as hololectinas que possuem mais de um domínio ligante e que se
destacam pela sua característica mais marcante, a de aglutinar célula e
glicoconjugados;
3. as quimerolectinas que possuem, pelo menos, dois domínios com
atividades distintas: um capaz de se ligar a carboidratos e glicoconjugados
(domínio B, ligante) e outro capaz de exercer uma atividade enzimática;
4. as superlectinas que correspondem a um tipo especial de
quimerolectinas, no qual os dois domínios são ligantes, no entanto, apresentam
especificidades distintas;
5. as multilectinas lectinas que apresentam dois sítios ligantes, idênticos,
com características de se ligarem a açúcares distintos (galactose e manose).
Recentes avanços na bioquímica, clonagem molecular e análise
estrutural das lectinas têm revelado a ocorrência de famílias, divididas de acordo
com a estrutura e a evolução conhecidas das proteínas. Entre elas, podem-se
destacar as lectinas de leguminosas (Rabijins et al., 2000), as proteínas
inativadoras do ribossomo tipo-2 (Van Damme et al., 2000b), as lectinas
ligadoras de quitina (Stoeva et al., 2001) que contém domínios específicos, as
lectinas de monocotiledôneas ligadoras de manose (Van Damme et al., 2000a) e
as lectinas relacionadas à Jacalina (Bourne et al., 1999). As lectinas de
leguminosas e as lectinas ligadoras de quitina constituem as classes com maior
número (>100) de lectinas já identificadas.
11
Algumas lectinas, entretanto, não se encaixam no sistema de
classificação ou não podem ser classificadas porque não existem informações
disponíveis sobre suas seqüências (Van Damme et al., 1998).
2.2.4 Atividade antinutricional
As lectinas, quando ingeridas com os alimentos, podem reconhecer
resíduos de carboidratos presentes nas células intestinais, ligando-se aos mesmos
(Vasconcelos & Oliveira, 2004). O fato de as lectinas reconhecerem e ligarem-se
a receptores glicosilados presentes nas células intestinais confere a estas
proteínas propriedades negativas quanto à interferência nos processos de
digestão, absorção e utilização de nutrientes, devido à paralisação do transporte
desses nutrientes e à absorção de substâncias nocivas. No entanto, o exato
mecanismo de ação das lectinas ainda não está claro (Czapla, 1997; Nevel et al.,
1998; Tinjuangjun, 2002).
A diminuição da absorção de nutrientes, com conseqüente perda de
proteínas e outros materiais celulares de origem endógena, leva a uma rápida
perda de peso e inibição do crescimento de animais experimentais (Sgarbieri,
1987). Além dos efeitos degenerativos nas membranas celulares, as lectinas
mostraram a capacidade de inibir várias enzimas intestinais (Vasconcelos &
Oliveira, 2004).
Efeitos deletérios sistêmicos em vários órgãos e tecidos também podem
ocorrer a partir da absorção intestinal, por endocitose e posterior exocitose de
lectinas, com liberação na circulação sistêmica (Pusztai & Bardocz, 1996;
Vasconcelos & Oliveira, 2004).
Os possíveis efeitos adversos de lectinas em humanos podem ser
inferidos somente de experimentos com animais de laboratório. Sob esse
aspecto, as alterações observadas no intestino e outros órgãos de camundongos,
ratos e porcos demonstraram que as lectinas são capazes de provocar reações
12
específicas importantes sob o aspecto de segurança alimentar (Peumans & Van
Damme, 1996).
2.2.5 Aplicações biotecnológicas das lectinas vegetais
As especificidades das lectinas com relação aos diferentes carboidratos
possibilitam a sua utilização em diferentes áreas biológicas e médicas.
Em glicobiologia e glicobioquímica, as lectinas vegetais são utilizadas
na investigação estrutural e funcional de carboidratos complexos, de
glicoproteínas e para examinar mudanças decorrentes de processos fisiológicos e
patológicos na superfície celular (Gabius et al., 2002; Rüdiger et al., 2000).
As lectinas podem ainda ser imobilizadas em suportes inertes (como por
exemplo géis), devido à sua especificidade por carboidratos e são utilizadas em
matrizes comerciais de afinidade, empregadas na purificação e na caracterização
de polissacarídeos e gliconjugados (Lima et al., 1997).
A caracterização de grupos sangüíneos é também uma das muitas
aplicações atribuídas a essa classe de proteínas. Lectinas de Lotus
tetragonolobus (Lótus) e Ulex europaeus (Tojo), ambas específicas de fucose,
são empregadas para identificar células tipo O; a lectina de Dilichos biflorus é
usada para distinguir entre os subgrupos A1 e A2 e a aglutinina de amendoim,
específica para Gal(β1-3)GalNAc, é empregada na detecção de poliaglutinação,
uma condição que acompanha processos de infecção viral e bacteriana, nos quais
eritrócitos humanos tornam-se aglutináveis por anticorpos normalmente
presentes no soro de indivíduos adultos (Lis & Sharon, 1998).
As lectinas possuem várias aplicações também na área da medicina,
sendo promissoras no campo da imunologia, uma vez que estimulam a
mitogênese de linfócitos (Sharon & Lis, 2004). Muitas dessas proteínas
possuem, ainda, a capacidade de aglutinar e identificar células malignas e
13
reduzir o potencial tumoral nas células cancerosas (Singh, Singh & Kamboj,
2004).
Algumas lectinas de plantas já estão sendo empregadas no diagnóstico e
na terapêutica do câncer. Como exemplos podem ser citadas a lectina de
Agaricus bisporus (champignon), utilizada na inibição de proliferação de células
tumorais em câncer de cólon e a aglutinina de Helix pomatia, que vem sendo
utilizada na identificação de tumores (Parslew et al., 1999).
A habilidade das lectinas de plantas para interagirem com carboidratos
expostos na superfície de bactérias e fungos impede o desenvolvimento destes
microrganismos. Além disso, essa propriedade tem possibilitado o uso dessas
proteínas como ferramenta na identificação de bactérias patogênicas
(Grahamstown & Van Staden, 2002). A lectina de folha de Morus alba causou a
aglutinação da bactéria fitopatogênica Pseudomonas syringae pv mori
(Ratanapo, Ngamjunyaporn & Chulavatnatol, 2001).
Ciopraga et al. (1999) estudaram o efeito da aglutinina de germe de trigo
sobre Fusarium graminearum e Fusarium oxysporum e mostraram que a ligação
dessa lectina à parede celular dos fungos afetou o compartimento interno e o
crescimento dos germens, o que pôde ser comprovado pelas mudanças drásticas
na morfologia dos fungos, tais como a lise das hifas e o extravasamento do
conteúdo celular.
As lectinas podem também ligar-se a receptores glicoprotéicos do trato
digestivo de insetos e provocar efeitos deletérios locais ou sistêmicos que podem
repelir ou retardar o crescimento ou, até mesmo, matar o inseto (Peumans et al.,
2000).
A ação fungicida, antimicrobiana e inseticida das lectinas torna viável o
uso dessas proteínas como agentes defensivos de pragas na agricultura.
14
2.3 Fungos fitopatogênicos
Os fungos são organismos eucarióticos e, em sua maioria, filamentosos,
que ocorrem no solo como células ou estruturas de repouso (esporos), como
hifas (filamentos microscópicos) ou micélio (conjunto de hifas). Não possuem
clorofila, sendo, portanto, heterotróficos, e obtêm energia de compostos
orgânicos. Embora não sejam predominantes, em termos numéricos,
representam 70%-80% da biomassa microbiana da maioria dos solos. Sua
ocorrência está diretamente relacionada ao teor de matéria orgânica, sendo
também influenciada pelo pH e umidade do solo. Predominam em solos ricos
em matéria orgânica e com pH na faixa ácida. Milhares de espécies, pertencentes
a todas as classes, já foram isoladas do solo, sendo a maioria pertencente à classe
Deuteromycetes. Os fungos mais representativos do solo são espécies dos
gêneros Aspergillus, Penicillium, Rhizoctonia, Alternaria, Colletotrichum,
Phytium, Fusarium, Phytophtora, Mucor, Rhizopus, Phycomyces, Verticillium,
Pilobulus, Humicola, Gaeumannomyces e Chaetomium (Siqueira & Franco,
1988).
A parede celular dos fungos é altamente versátil, sendo continuamente
expandida durante o crescimento e extensivamente remodelada durante o
desenvolvimento. Quimicamente, a parede contém de 80% a 90% de
polissacarídeos, sendo o restante constituído de proteínas e lipídeos. Em
algumas espécies, são encontradas quantidades apreciáveis de pigmentos
(melanina), polifosfatos e íons inorgânicos.
Fisicamente, a parede celular é formada por microfibrilas entrelaçadas,
embebida numa matriz amorfa. Quitina e celulose são os principais componentes
microfibrilantes da maioria dos fungos filamentosos, enquanto que, nas
leveduras ou fungos unicelulares, a parede contém, principalmente, glicanas não
celulósicas. Proteínas e vários polissacarídeos (glicanas, mananas, galactanas e
heteropolissacarídeos) são as principais substâncias cimentantes. Os
15
monossacarídeos mais freqüentemente encontrados na parede celular dos fungos
são: D-glicose, N-acetil-D-glicosamina, D-manose, D-galactose, D-
galactosamina, L-fucose, D-glicosamina, D-xilose e ácido D-glicurônico.
Desses, glicose, N-acetil-D-glicosamina e manose são encontrados na maioria
dos fungos. Ocasionalmente, ramnose, ribose e arabinose podem ser observadas
(Bartinicki-Garcia, 1968).
Os fungos exercem papel de grande relevância nos diferentes
ecossistemas que integram. A principal função desses microrganismos resulta da
sua atividade heterotrófica sobre restos vegetais depositados no solo e a
formação de relações simbióticas, mutualistas (micorrizas) e parasíticas
(doenças) com as plantas. São importantes agentes de controle biológico de
outros fungos e nematóides fitopatogênicos (Boleti, 2003).
Do ponto de vista humano, os fungos podem ter um lado positivo e
outro negativo. Positivamente, são utilizados na indústria, na medicina e na
alimentação, entre outras áreas. Por outro lado, são maléficos, podendo causar
doenças em homens e animais. Além disso, são os principais causadores de
doenças em plantas, acarretando sérios prejuízos na agricultura mundial
(Bergamim Filho, Kimati & Amorin, 1995).
2.3.1 Atividade fungicida das lectinas de plantas
Uma vez que as lectinas de plantas não podem penetrar no citoplasma
das células de fungos, devido à presença de uma compacta e rígida parede
celular, uma interferência no crescimento e no desenvolvimento desses
organismos (alterações na estrutura e nos processos intracelulares) parece
improvável. Entretanto, efeitos indiretos, baseados na ligação das lectinas a
carboidratos expostos na superfície da parede celular dos fungos, são possíveis
(Peumans & Van Damme, 1995).
16
Existem vários relatos, na literatura, de lectinas que apresentaram efeitos
inibitórios no crescimento de fungos: lectinas de folha de Ginkgo biloba,
(conhecida como Ginkgo) inibiu o crescimento das hifas de Pellicularia sasakii
Ito (Huang, Xie & Gong, 2000); lectina de Talisia esculenta (conhecida como
pitomba) inibiu o crescimento dos fungos em 280 µg, quando foram incubadas
na presença de Fusarium oxysporum, Colletotrichum lindemuthianum e
Saccharomyces cerevisae (Freire et al., 2002); lectina de Pouteria torta
(conhecida como curriola) inibiu o crescimento de Fusarium oxysporum e
Colletotrichum musae (Boleti, 2003).
2.3.2 Fusarium oxysporum
Visto que a atividade fungicida da lectina de folha de mandioca será
avaliada sobre o fungo Fusarium oxysporum, segue uma breve descrição dele.
Os fungos Fusarium oxysporum pertencem ao reino Fungi, divisão
Eumycota, subdivisão Deuteromycotina, classe Hyphomycetes, ordem
Moniliales, família Moniliaceae e gênero Fusarium. Sua fase teleomórfica
(sexual) pertence à ordem Hypocreales e gênero Nectria (Lacaz, Porto &
Martins, 1998).
De acordo com Guarro & Gene (1992), as culturas de Fusarium spp são
caracterizadas pelo crescimento rápido da colônia, com micélio aveludado e
levemente cotonoso, opaco ou discretamente brilhante. Após sete a dez dias de
incubação, a 25ºC, o fungo pode apresentar características de pigmentação do
micélio de cor rosa, púrpura, cinza ou amarela, sendo essas características
importantes para a identificação das espécies.
Podem causar diversas doenças graves no sistema radicular de plantas,
como tombamento, podridão de raízes e murchas, podendo, algumas espécies,
produzir poderosas toxinas (Kpefenning, 1999). Esse fungo tem alta capacidade
17
de sobrevivência, havendo relatos de sua permanência no solo por mais de 20
anos, na ausência do hospedeiro (Stover, 1972).
Um exemplo típico de prejuízo causado especificamente pelo Fusarium
oxysporum f.sp. cubense é o mal-do-panamá em bananeiras, também conhecido
como fusariose ou murcha-de-fusarium (Pereira et al., 1999). A espécie
Fusarium oxysporum produz doenças também em tomate, batata-doce, pêra,
ataca as folhas de cana-de-açúcar, café e feijão.
A busca por produtos naturais, que possam ser usados como agentes
potencialmente úteis ao combate de pragas e patógenos que causam prejuízos a
culturas socioeconômicas importantes, contribui para amenizar o problema do
uso de inseticidas e fungicidas sintéticos, utilizados no combate de pragas e
doenças. Além de serem onerosos para a maioria das colheitas, esses produtos
resultam em contaminação ambiental e induzem o surgimento de espécies
resistentes (Macedo et al., 2000).
Diante disso e dos prejuízos gerados à agricultura mundial pela ação dos
fungos da espécie Fusarium oxysporum, além do característico crescimento
rápido de sua colônia, a lectina da folha de mandioca será avaliada quanto à
capacidade inibitória sobre essa espécie fúngica.
18
3 MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi conduzido nos departamentos de Química (DQI),
Biologia (DBI - Setor de Fisiologia Vegetal e Biologia Molecular) e de
Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras (UFLA).
3.1 Material biológico e reagentes
A cultura do fungo Fusarium oxysporum foi obtida da micoteca do
Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras.
Os reagentes usados para eletroforese foram: acrilamida,
metilenobisacrilamida, TEMED, SDS, Coomassie R–250 e os padrões de massa
molecular foram de marca Sigma e o persulfato de amônio da Merck.
O tubo para diálise e o corante Coomassie Blue G–250, utilizado na
determinação de proteínas, foram da marca Sigma.
Os demais reagentes foram de grau analítico de marcas variadas.
3.2 Colheita, secagem das folhas de mandioca e preparo da farinha de
folhas de mandioca
Folhas maduras de mandioca (Manihot esculenta Crantz), cultivar
Cação, originárias da Fazenda Rio Grande, município de Lavras, MG, foram
colhidas, aos 12 meses de idade da planta e transportadas para o Laboratório de
Bioquímica do DQI/UFLA. As folhas foram lavadas em água corrente e água
destilada, colocadas em bancada para escorrer e, em seguida, secas em estufa
ventilada, à temperatura de 30ºC a 35ºC. Os pecíolos foram retirados após 24
horas de secagem e permaneceram na estufa por mais 24 horas. Em seguida, as
folhas foram passadas em moinho tipo Willy e a farinha obtida foi armazenada
em geladeira, em frasco hermeticamente fechado.
19
3.3 Métodos de extração das proteínas
Para escolher o método de extração das proteínas da farinha de folhas de
mandioca (FFM) que proporcionasse maior quantidade de proteína e maior
atividade hemaglutinante, foram testados dois extratores: água destilada e
solução salina tamponada (NaCl 0,15 mol L
-1
, tampão fosfato pH = 7,4).
A proporção de FFM e extrator foi de 1:20 (m/v), de acordo com Pereira
(2007). A mistura foi colocada sob agitação mecânica por quatro tempos de 15,
60, 120 e 180 minutos, à temperatura ambiente. Depois, a suspensão foi filtrada
em tecido de organza e centrifugada, a 8.000 x g, por 15 minutos, A 7ºC e o
sobrenadante recolhido.
O resíduo de cada tempo de extração obtido foi submetido a duas
reextrações sucessivas nas mesmas condições e os sobrenadantes reunidos
(extrato protéico) para a determinação do teor protéico e atividade
hemaglutinante. O extrato protéico, antes de ser submetido à dosagem de
proteínas, foi precipitado com solução de ácido perclórico 1,0 mol L
-1
, na
proporção 1:1, por um tempo de 15 minutos em banho de gelo e, depois,
centrifugado, a 2.300 x g, por 10 minutos. Em seguida, o pellet foi
ressuspendido em solução de NaOH 0,1 mol L
-1
. Esse procedimento foi adotado
para remover possíveis interferentes presentes no extrato protéico.
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado
com três repetições, compondo um esquema fatorial 2 x 4, em que se avaliaram
a utilização de dois extratores, água destilada e solução salina tamponada, e o
tempo de extração (15, 60, 120 e 180 minutos). As variáveis analisadas foram
rendimento protéico e atividade hemaglutinante no extrato protéico. Os
resultados observados para o rendimento protéico foram submetidos à análise de
variância. Para o estudo das médias, foram realizados o teste de Tukey e a
análise de regressão.
20
3.4 Dosagem de proteínas
A concentração de proteínas obtidas foi determinada pelo método de
Bradford (1976). Este método é baseado na interação entre o corante coomassie
blue de proteínas, que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou
aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular
e o corante provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma
aniônica, que absorve fortemente em 595 nm (Compton & Jones, 1985). A
concentração de proteína foi avaliada utilizando-se albumina sérica bovina como
padrão.
O rendimento protéico da extração das proteínas da FFM foi expresso
em g 100g de FFM
-1
.
3.5 Atividade hemaglutinante
A atividade hemaglutinante (AH) foi realizada segundo a metodologia
descrita por Calderón de la Barca, Ochoa & Valencia (1985). A AH foi realizada
em placas de microtitulação contendo 8 fileiras de 12 poços cada, os quais foram
preenchidos com 100µL de solução salina tamponada e, em seguida, acrescidos
com igual volume de amostra nos primeiros poços da fileira. A amostra foi
submetida a uma série de diluições na base 2 (2
0
, 2
1
, 2
2
, 2
3
, etc.), em triplicata,
com homogeneização e transferência de 100µL para o poço seguinte até o
penúltimo poço da fila.
Em seguida, a amostra diluída foi incubada com 100µL de suspensão de
hemácias a 2%. A suspensão de eritrócitos foi preparada com 5mL de sangue
humano tipo A Rh positivo, ao qual foram adicionados 250µL de solução de
citrato de sódio 8%. A mistura foi lavada com solução salina tamponada (NaCl
0,15 mol L
-1
, tampão fosfato pH 7,4) e centrifugada, a 1.620 x g, por 15 minutos
à temperatura ambiente, até a obtenção de uma massa de eritrócitos íntegro,
livre de soro e de material hemolisado. O sobrenadante obtido foi descartado e o
21
precipitado foi submetido à diluição em solução salina tamponada (NaCl 0,15
mol L
-1
, tampão fosfato pH 7,4), obtendo-se uma solução de eritrócitos 2% (v/v).
Foram realizadas leituras da aglutinação das hemácias visualmente, após
60 e 90 minutos. Os resultados foram expressos em número de unidades
hemaglutinantes (UH), que é calculado a partir do inverso do título da maior
diluição que ainda apresentou aglutinação visível e em atividade específica,
obtida pelo cálculo de UH mg de proteína
-1
. Por exemplo: considerando uma
diluição 2
2
, o seu título igual a 1/4 e o volume de amostra utilizado no ensaio de
100µL, define-se que a atividade hemaglutinante será de 4 UH 100µL
-1
. Os
poços que continham somente a suspensão de eritrócitos serviram como
controle.
3.6 Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante
O efeito da temperatura sobre a AH da lectina da FFM foi analisado
utilizando alíquotas do extrato protéico da FFM (1mL), as quais foram
submetidas a diferentes temperaturas: 40º, 60º, 70º, 80º e 90
o
C, por 30 minutos,
em 3 repetições. Depois, foram resfriadas em banho de gelo e as alíquotas
submetidas à dosagem de proteínas e ensaio de AH.
3.7 Efeito de cátions divalentes (Ca
2+
e Mn
2+
) na atividade hemaglutinante
Para a verificação do efeito dos cátions Ca
+2
e Mn
+2
sobre a AH, o
extrato protéico obtido da FFM foi dialisado contra EDTA 0,2mol L
-1
, por 48
horas, com 3 trocas diárias, seguindo-se diálise contra NaCl 0,15mol L
-1
, por 24
horas e usado para o ensaio da AH. Como controle utilizou-se o extrato protéico
não-dialisado contra EDTA.
O efeito desses cátions divalentes na aglutinação de hemácias também
foi avaliado isoladamente. Para isso, incubaram-se 100µL de uma suspensão de
eritrócitos a 2%, com 100µL das seguintes soluções: solução salina 0,15mol L
-1
,
22
contendo CaCl
2
nas concentrações de 1, 3 e 5mmol L
-1
; solução salina 0,15mol
L
-1
, contendo MnCl
2
nas concentrações de 1, 3 e 5mmol L
-1
e solução salina
0,15mol L
-1
, contendo CaCl
2
e
MnCl
2
nas concentrações de 1, 3 e 5mmol L
-1
.
Como controle, utilizaram-se 100µL da suspensão de eritrócitos 2% e 100µL de
solução salina. A aglutinação das hemácias foi avaliada após 60 minutos de
incubação.
3.8 Precipitação das proteínas e diálise
O extrato protéico obtido de 25g de FFM, tendo como extrator a água
(1:20, m/v) em um tempo de extração de 15 minutos, foi submetido à
precipitação em 3 repetições
O sulfato de amônio foi usado como agente precipitante. Ao extrato
protéico adicionou-se sulfato de amônio sólido, até atingir 80% de saturação
(Pereira, 2007). Para atingir esta saturação, a quantidade de sulfato de amônio
adicionada foi de 561g/1.000mL (Scopes, 1993). Durante a adição do sal, o
extrato bruto foi mantido em recipiente com gelo, sob agitação magnética e
acompanhamento da variação de pH (Cooper, 1942). Em seguida, a mistura foi
colocada em repouso, em geladeira, durante 24 horas. Após esse período, a
mistura foi centrifugada, a 8.000 x g, por 15 minutos, a 7
o
C. O precipitado
obtido foi redissolvido em solução NaCl 0,15mol L
-1
e dialisado extensivamente
contra a mesma solução (tubo para diálise benzoilado 32 mm com limite de
exclusão de 2 kDa, volumes de 2L de solução de NaCl 0,15mol L
-1
, 3 trocas
diárias, durante 72 horas, em geladeira e agitação magnética) para a retirada do
sulfato de amônio. A suspensão obtida foi submetida à dosagem de proteínas e
ao ensaio de AH.
23
3.9 Purificação parcial das proteínas
Uma coluna de vidro 2 x 40cm foi empacotada com a resina Sepharose
CL-4B, de acordo com as instruções do fabricante. A coluna foi equilibrada com
NaCl 0,15mol L
-1
, até que a leitura em 280 nm permanecesse constante, com
valores abaixo de 0,02. Em seguida, foi aplicado o volume de 30mL (5,84 mg de
proteína) da suspensão (extrato protéico precipitado a 80% dialisado contra
NaCl 0,15mol L
-1
), em um fluxo constante de 1mL/min, com o auxílio de uma
bomba peristáltica (Pharmacia Biotech). As corridas cromatográficas foram
realizadas em geladeira, à temperatura de 4ºC.
As proteínas não retidas foram eluídas com a mesma solução de
equilíbrio e as proteínas com afinidade pela matriz estacionária foram eluídas
com a solução de equilíbrio (NaCl 0,15mol L
-1
) contendo galactose 0,1mol L
-1
.
O eluato foi continuamente recolhido em frações de 2,5mL, com o auxílio de
coletor de frações e monitorado por espectrofotômetro, em 280 nm.
Posteriormente, a coluna foi lavada com 100mL de etanol 80%, para
avaliar se todas as proteínas foram retiradas da coluna, e a solução de lavagem
recolhida submetida à leitura em espectrofotômetro, a 280nm.
As frações do pico foram reunidas, as proteínas quantificadas e
liofilizadas até peso constante. Para a solução obtida da lavagem da coluna com
etanol 80%, realizou-se diálise (tubo para diálise benzoilado 32 mm com limite
de exclusão de 2 kDa, volumes de 1L de água, 3 trocas
diárias, durante 24 horas,
em geladeira e agitação magnética). Em seguida, o material dialisado foi
também liofilizado. Ambos os liofilizados foram submetidos ao ensaio de AH e,
ainda, as frações do pico liofilizadas foram submetidas à eletroforese em gel de
poliacrilamida.
24
3.10 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS
No intuito de avaliar o grau de pureza das amostras protéicas, bem como
obter uma estimativa da massa molecular da lectina, realizou-se a eletroforese
em gel de poliacrilamida em presença de SDS (PAGE-SDS), segundo o método
descrito por Laemmli (1970).
O gel de separação da amostra foi feito em uma concentração de 12,5%
(a uma proporção de acrilamida/bisacrilamida 37,5:1) e preparado em tampão
tris/HCl 1,5mol L
-1
, pH 8,8, contendo SDS 0,4%, TEMED (concentrado) e
persulfato de amônio 10%. A concentração do gel superior ou de empilhamento
foi de 6% e foi preparado em tampão tris/HCl 0,5mol L
-1
, pH 6,8, contendo
0,4% de SDS, TEMED (concentrado) e persulfato de amônio 10%.
As amostras foram dissolvidas em tampão tris/HCl 62,5mmol L
-1
, pH
6,8, contendo 10% de glicerol, 2% de SDS, 5% de 2-β-mercaptoetanol e 200mg
de azul de bromofenol, sendo, em seguida, imersas em água de ebulição por
cinco minutos.
Para a corrida eletroforética, foi utilizado o tampão glicina/tris-HCl
0,192 mol L
-1
, 25mmol L
-1
, pH 8,3, contendo 0,1% de SDS. A eletroforese
PAGE-SDS foi realizada em um sistema duplo de placas (electrophoresis power
supply EPS 1001 - Amersham pharmacia biotec), a 60 volts, durante,
aproximadamente, cinco horas. Como marcadores de massa molecular, foram
utilizados: albumina sérica bovina (66kDa), ovoalbumina (45kDa),
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (36kDa), anidrase carbônica (29kDa),
tripsinogênio (24kDa), inibidor de tripsina de soja (20,1kDa) e lactoalbumina
(14,2kDa).
Os géis, depois de retirados das placas, foram corados com Comassie
Blue R–250 (2,5mg mL
-1
), etanol a 50% e ácido acético 10% em água, por 24
horas. As bandas protéicas foram descoradas após imersão do gel em uma
solução descorante (ácido acético 10% e etanol 5% em água).
25
A distância percorrida pelos marcadores de massa molecular e pelas
amostras foi calculada em centímetros e utilizada nos cálculos de regressão
linear para estimar a massa molecular das amostras.
3.11 Avaliação da atividade fungicida
A amostra utilizada na avaliação da atividade fungicida foi obtida
conforme descrito no item 3.8 (Material e métodos), exceto que o precipitado
protéico foi redissolvido em água e dialisado contra a mesma. Após a diálise, a
suspensão foi submetida à liofilização até peso constante.
O liofilizado nas concentrações de 100, 50, 10 e 1 µg mL
-1
foi, então,
incorporado ao meio de cultura BDA (batata, dextrose, ágar) previamente
esterilizado e fundido à temperatura de 45º–50°C. O tratamento controle
continha apenas BDA puro.
Em placas de Petri de 9cm de diâmetro, previamente esterilizadas em
forno específico por 90 minutos, foram adicionados, aproximadamente, 25 mL
de meio de cultura na concentração de amostra correspondente, em 4 repetições.
Após a solidificação, discos de, aproximadamente, 9mm de diâmetros contendo
micélios do fungo Fusarium oxysporum (retirados de colônia com 6 dias em
BDA) foram repicados para o centro das placas, as quais foram vedadas com
filme plástico e colocadas em incubadora com “biological oxygen demand”
(BOD), a 25°C .
A medição do crescimento micelial da cultura de Fusarium oxysporum
foi realizada no sétimo dia após a inoculação dos fungos. Para tal, foram
traçadas duas retas pela placa de Petri, passando pelo centro do disco de 9mm,
uma perpendicular à outra. As leituras foram realizadas pela medição do
diâmetro de crescimento das colônias (médias de duas medidas diametralmente
opostas) (Balbi-Peña et al., 2006). A porcentagem de inibição do crescimento
micelial foi calculada para cada dosagem em relação ao controle.
26
O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado com
quatro repetições, em que se avaliaram cinco tratamentos (quatro concentrações
da amostra e um controle). A variável analisada foi o crescimento micelial da
cultura de fungos, e os resultados foram submetidos à análise de variância.
27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Métodos de extração das proteínas
A análise de variância para o rendimento protéico de extração mostrou
efeito altamente significativo (p≤ 0,01) para o tempo e para o extrator, havendo
também interação significativa entre esses dois fatores (Tabela 1 A do Anexo).
Diante deste resultado, fez-se o desdobramento de tempo dentro de cada extrator
e, em seguida, foi feito o desdobramento do extrator dentro de cada tempo.
A análise de regressão detectou aumento linear no rendimento protéico
com o aumento do tempo de extração, quando o extrator utilizado foi a solução
salina. No entanto, quando o extrator utilizado foi a água destilada, houve um
decréscimo do rendimento protéico em um intervalo de extração compreendido
entre 15 e, aproximadamente, 79 minutos. A partir deste ponto, o rendimento
começou a aumentar com o aumento do tempo de extração (Figura 1).
Na Tabela 2 são apresentados os rendimentos médios da extração das
proteínas, considerando-se os extratores utilizados. Para o tempo de extração de
quinze minutos, não houve diferença significativa entre os dois extratores
utilizados. Para os demais tempos de extração, a solução salina proporcionou
maior extratibilidade protéica, o que está intimamente ligado ao aumento da
força iônica do meio, e o conseqüente aumento da solubilidade das proteínas.
As atividades hemaglutinantes obtidas para cada método de extração
estão apresentadas na Tabela 3. A água destilada com um tempo de extração de
15 minutos apresentou maior atividade hemaglutinante (AH). Observou-se que,
com o aumento do tempo de extração, houve um decréscimo da atividade. Isso
ocorreu, provavelmente, porque, com tempos maiores de extração, as proteínas
da FFM ficam por tempo relativamente maior sob agitação constante, o que
pode contribuir para a desnaturação das proteínas, levando a alterações em sua
28
conformação protéica, resultando no decréscimo ou, até mesmo, na perda da sua
atividade.
FIGURA 1 Curvas e equações de regressão representativas dos valores de
rendimento protéico de dois extratores, em função do tempo de
extração. UFLA/DQI, Lavras, MG, 2008.
TABELA 2 Rendimentos médios de proteína (g 100g
-1
) da farinha de folhas de
mandioca. UFLA/DQI,Lavras, MG, 2008.
Tempo de extração (minutos)
Extrator 15 60 120 180
Água destilada 0,64 a 0,59 a 0,63 a 0,68 a
Solução salina
*
0,60 a 0,66 b 0,76 b 0,82 b
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a
5% de probabilidade.
*
Solução de NaCl 0,15mol L
-1
com tampão fosfato pH 7,4.
y = 0,0014x + 0,5827
R
2
= 0,9899
y = 0,000007x
2
- 0,0011x + 0,6442
R
2
= 0,8557
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200
tempo de extração (min)
rendimento protéico g/100g FFM
extrator salina extrator água
29
TABELA 3 Atividade hemaglutinante com dois extratores e vários tempos de
extração. UFLA/DQI. Lavras, MG, 2008.
Atividade hemaglutinante
Tempo
(minutos)
Extrator
Proteína
(µg/100µL)
(UH
b
/100µL)
Atividade
específica
(UH/mg
proteína)
15
Água destilada
Solução salina
a
10,67
10,00
8
4
749,8
400,0
60
Água destilada
Solução salina
9,83
11,00
4
ND
c
406,92
-
120
Água destilada
Solução salina
10,50
12,67
2
ND
190,48
-
180
Água destilada
Solução salina
11,33
13,67
1
ND
88,26
-
a
NaCl 0,15mol L
-1
com tampão fosfato pH 7,4.
b
Inverso do título da maior diluição na base 2, em número de unidades hemaglutinantes
(UH).
c
Não detectada.
Assim, optou-se por extrair as proteínas da FFM, utilizando-se água
destilada como extrator, com o tempo de 15 minutos, uma vez que esta
metodologia, embora não represente aquela de maior rendimento protéico,
proporcionou a maior AH.
O estudo da atividade hemaglutinante no extrato bruto foi válido
também para confirmar a presença de lectina na FFM, o que já havia sido
observado por alguns pesquisadores (Melo et al., 2007; Pereira, 2007; Wobeto et
al., 2007).
30
4.2 Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante
O efeito da temperatura na AH da lectina da FFM, avaliado em
diferentes temperaturas, é mostrado na Figura 2.
FIGURA 2 Efeito da temperatura na atividade hemaglutinante da lectina da
farinha de folhas de mandioca. Atividade hemaglutinante
determinada após 30 minutos de incubação, nas referidas
temperaturas. UFLA/DQI, Lavras, MG, 2008.
A lectina da FFM teve sua AH estável na faixa de temperatura de 40º a
70
o
C, após 30 minutos de exposição. Observou-se um decréscimo de 50% e
62,5% na atividade nas temperaturas de 80º e 90
o
C, respectivamente. Esses
resultados são compatíveis com algumas lectinas de plantas, como a de sementes
de Erythrina speciosa (Corticeira), que teve a sua atividade hemaglutinante
estável até 65ºC (Konozy et al., 2003), a de sementes de Bauhinia pentandra
0
20
40
60
80
100
120
40 50 60 70 80 90 100
Temperatura
o
C
Atividade Hemaglutinante
residual (%)
31
(Silva, Horta & Moreira, 2001) e a de Talisia esculenta (Freire et al., 2002), que
não apresentaram diminuição significativa da atividade hemaglutinante até a
temperatura de 70
o
C.
A acentuada estabilidade em amplas faixas de temperatura é uma
característica de lectinas de plantas e está diretamente envolvida com o
mecanismo de defesa que estas substâncias desempenham nos vegetais
(Peumans et al., 1995).
4.3 Efeito de cátions divalentes (Ca
2+
e Mn
2+
) na atividade hemaglutinante
Algumas lectinas requerem, para sua AH, a presença de íons Ca
2+
e
Mn
2+
, para estabilizar os sítios de ligação dos açúcares (Weis & Drickamer,
1996). A fim de verificar se a lectina da FFM requer, para a sua atividade, estes
íons, o extrato protéico da FFM foi submetido à diálise contra EDTA (quelante
de metais) e apresentou AH. Os valores encontrados em 100µL do extrato não-
dialisado e dialisado foram 4UH e 2UH, respectivamente. Esse decréscimo da
AH no extrato protéico dialisado pode ser atribuído ao aumento de volume do
extrato que ocorreu após a diálise, resultando em sua diluição. Ou, ainda, à
própria remoção de íons que poderiam estar superestimando a aglutinação
(Tabela 4). Este resultado sugere que a lectina da folha de mandioca parece não
ser dependente dos cátions divalentes Ca
2+
e Mn
2+
para exercer sua AH.
A lectina de sementes de Pouteria torta (Boleti, 2003), quando incubada
com ácido EDTA 0,025mol L
-1
e ácido EGTA 0,025mol L
-1
, mostrou perda da
atividade biológica, demostrando ser dependente de íons Ca
2+
, Mn
2+
e Mg
2+
. No
entanto, quando Ca
2+
(12,5mmol L
-1
) e Mn
2+
(12,5mmol L
-1
) foram adicionados
ao ensaio de hemaglutinação, a atividade da lectina de Pouteria torta foi
restaurada.
Resultado semelhante pode ser observado para a lectina da esponja
marinha Tedania ignis (Dias, 2006), cuja atividade hemaglutinante no extrato
32
bruto só foi detectada após a adição dos íons Ca
2+
e Mn
2+
, na concentração de
25mmol L
-1
.
TABELA 4 Aglutinação de hemácias incubadas com soluções salinas contendo
diferentes concentrações de Ca
2+
e Mn
2+
e da mistura de ambos os
íons, na ausência de lectina. UFLA/DQI, Lavras, MG, 2008.
Soluções de NaCl 0,15mol L
-1
Aglutinação de hemácias
contendo Ca
2+
1mmol L
-1
negativo
3mmol L
-1
negativo
5mmol L
-1
positivo
contendo Mn
2+
1mmol L
-1
positivo
3mmol L
-1
positivo
5mmol L
-1
positivo
contendo Ca
2+
e Mn
2+
1mmol L
-1
positivo
3mmol L
-1
positivo
5mmol L
-1
positivo
O mecanismo de ação destes íons na atividade hemaglutinante de
algumas lectinas de plantas é ainda desconhecido. Sabe-se somente que eles
estão associados a uma série de aminoácidos que participam da ligação ao
carboidrato (Moreira et al., 1991, Murdock et al., 2002). Todavia, segundo
Rüdiger (1998), cátions divalentes em altas concentrações são capazes de
aglutinar células e, para garantir que a aglutinação está sendo mediada pela
33
lectina, exige-se que ocorra a inibição dessa atividade com a adição de
carboidratos.
Por isso, a influência de íons Ca
2+
e Mn
2+
, isoladamente, na aglutinação
de hemácias foi analisada e os resultados apresentados na Tabela 4. Verifica-se
que, em todas as soluções salinas incubadas com uma suspensão de hemácias, a
2%, houve aglutinação destas células, exceto naquelas contendo 1 e 3mmol L
-1
de Ca
2+
. Esse resultado confirma que os cátions Ca
2+
e Mn
2+
parecem exercer
papel hemaglutinante e, quando adicionados ao ensaio de hemaglutinação,
podem superestimar o valor desta atividade.
Diante dos resultados, torna-se necessária uma investigação mais
detalhada sobre a real influência de cátions divalentes na atividade
hemaglutinante de lectinas.
4.4 Precipitação das proteínas e diálise
A dosagem de proteínas e a AH determinadas no extrato protéico e no
extrato protéico precipitado com sulfato de amônio 80% estão apresentadas na
Tabela 5. Observa-se que, após a precipitação das proteínas com sulfato de
amônio, a recuperação protéica foi de, aproximadamente, 58%.
TABELA 5 Proteína total e atividade hemaglutinante no extrato protéico e no
precipitado com sulfato de amônio a 80%. UFLA/DQI, Lavras,
MG, 2008.
Amostra Proteína total
(mg)
Atividade hemaglutinante
(UH
c
mg proteína
-1
)
Extrato protéico
a
41,58 ± 5,42 2.164,00 ± 386,00
Precipitado 80%
b
24,05 ± 3,21 2.856,00 ± 430,00
a
O extrato protéico foi obtido de 25g de farinha de folhas de mandioca.
b
Extrato protéico precipitado com sulfato de amônio a 80%.
c
Inverso do título da maior diluição na base 2, em número de unidades hemaglutinantes
(UH).
Valores são a média de três repetições ± desvio padrão.
34
Pereira (2007), trabalhando também com a proteína da FFM, obteve
uma recuperação de 11%. Essa diferença na recuperação se deve,
provavelmente, ao método de extração e precipitação das proteínas que diferiu
em alguns aspectos, entre eles a membrana de diálise empregada. Em testes
preliminares, a diálise das proteínas precipitadas foi feita com a mesma
membrana utilizada por Pereira (membrana de celulose, 25mm com limite de
exclusão de 12kDa). Nestes testes, a recuperação obtida foi de 20,5%. Contudo,
ao substituir a membrana de diálise por outra de limite de exclusão de 2kDa, a
recuperação teve um acréscimo significativo, visto que, com a membrana
utilizada anteriormente, proteínas com peso molecular inferior a 12,5kDa
estavam, provavelmente, sendo excluídas juntamente com o sulfato de amônio e
outras moléculas de baixo peso molecular.
4.5 Purificação parcial das proteínas
Na Figura 3 está representado o perfil cromatográfico da amostra em
coluna Sepharose CL-4B. O perfil mostra apenas um pico compreendido,
aproximadamente, entre as frações 24 e 51, obtido a partir da eluição das
proteínas não-ligadas à coluna. O perfil de eluição se repetiu a cada corrida
cromatográfica realizada.
A resina Sepharose CL-4B (gel de agarose) foi utilizada como um
ligante para proteínas com afinidade por polissacarídeos. Este tipo de
metodologia já foi usado anteriormente por alguns pesquisadores que utilizaram
essa matriz como ligante para purificar lectinas (Dias, 2006; Silva, Horta &
Moreira, 2001).
Neste tipo de cromatografia (por bioafinidade), a eluição do material
retido pode ser feita empregando-se o próprio ligante. Nesse caso, haverá uma
competição entre o ligante unido à matriz e o ligante em solução (galactose) pela
substância alvo (lectina), promovendo a sua eluição (Collins et al., 1997).
35
FIGURA 3 Perfil cromatográfico do precipitado protéico da farinha de folhas de
mandioca. UFLA/DQI, Lavras, MG, 2008.
Coluna Sepharose 4B - CL: 2mm x 200mm, volume aproximado de
63mL. Frações de 2,5mL foram coletadas sob um fluxo constante de
1mL/minuto e lidas em espectrofotômetro em 280 nm. Após a
aplicação da amostra, a coluna foi lavada com NaCl 0,15mol L
-1
para a eluição das proteínas não ligadas. As proteínas retidas na
coluna foram eluídas com a mesma solução contendo galactose
0,1mol L
-1
.
No caso da lectina da folha de mandioca, nenhum pico foi detectado
após a aplicação da solução contendo o ligante (galactose).
A formação do complexo lectina-galactose pode ocorrer de forma
específica por meio da ligação do açúcar com o sítio receptor de carboidratos
presente na molécula da lectina ou, de forma não específica, na qual a interação
das proteínas com o ligante envolve ligações fracas, como interações iônicas e
hidrofóbicas ou ligações de hidrogênio.
Diante dos resultados, duas hipóteses foram levantadas quanto à
interação da lectina com a matriz estacionária da coluna: 1) o sítio de ligação ao
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
020406080100
Frações
Absorbância nm
G
A
L
A
C
T
O
S
E
36
carboidrato da lectina da FFM não apresenta especificidade pelo ligante
(galactose); nesse caso, a interação ocorre de forma não específica e a eluição
com a solução salina (NaCl 0,15mol L
-1
) foi suficiente para romper as ligações
fracas entre a proteína e o ligante da coluna; 2) as proteínas foram separadas em
função da massa molecular, visto que o gel de agarose (fase estacionária) é
constituído de ligações intercruzadas, que fornecem poros, nos quais as
proteínas de peso molecular elevado emergem da coluna mais cedo que as
proteínas de baixo peso molecular, ocorrendo, assim, a separação.
Ensaios de inibição da atividade hemaglutinante por galactose devem
ser realizados, a fim de esclarecer as hipóteses aqui levantadas.
A concentração de proteína total do pico foi de 1,75mg, o que
corresponde a uma recuperação de apenas 29,91%, haja vista que foram
aplicados na coluna 5,84 mg de proteína.
Diante da baixa recuperação, a coluna foi lavada com uma solução de
etanol 80%, a fim de remover proteínas que pudessem estar ainda retidas na
coluna. A solução de lavagem foi recolhida e submetida à leitura em
espectrofotômetro a 280nm, obtendo-se uma leitura de 1,00, sugerindo, assim, a
presença de proteína na solução.
A atividade hemaglutinante foi detectada apenas no pico da coluna, com
título de hemaglutinação igual a 0,5UH.
4.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS
O perfil eletroforético das etapas de purificação da lectina da folha de
mandioca está representado na Figura 4.
O pico com atividade hemaglutinante (pista 2) apresentou três bandas
protéicas, com pesos moleculares aparentes de 64, 61 e 58 kDa. Pesos
moleculares obtidos de lectinas vegetais são muito variáveis, como, por
exemplo, da Urtica dióica (Broekaert et al., 1989), com peso molecular de
37
8,5kDa e Phaseolus lunatus (Moreira et al., 1991), com peso molecular de
265kDa.
FIGURA 4 Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%), com SDS das
frações de purificação da lectina da farinha de folhas de mandioca.
Marcadores de massa molecular (pista 1): albumina sérica bovina
(66kDa), ovoalbumina (45kDa), gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase (36kDa), anidrase carbônica (29kDa), tripsinogênio
(24kDa), inibidor de tripsina de soja (20,1kDa) e lactoalbumina
(14,2kDa); pico não retido proveniente da coluna Sepharose CL-
4B (pista 2). UFLA/DQI. Lavras, MG, 2008.
29
66
45
36
24
20,1
14,2
1 2
38
4.7 Avaliação da atividade fungicida
Os resultados dos bioensaios realizados com o extrato protéico da FFM
precipitado com sulfato de amônio a 80%, sobre o fungo Fusarium oxysporum
estão ilustrados na Figura 5 e os dados do crescimento micelial estão
apresentados na Figura 6.
FIGURA 5 Bioensaio realizado com o extrato protéico da FFM precipitado com
sulfato de amônio a 80%, sobre o crescimento micelial do fungo
Fusarium oxysporum. UFLA/DQI, Lavras, MG, 2008.
1µg/mL 10µg/mL
50µg/mL
100µg/m
Controle
39
FIGURA 6 Efeito do extrato protéico da FFM precipitado com sulfato de
amônio a 80% sobre o crescimento micelial do fungo Fusarium
oxysporum. UFLA/DQI, Lavras, MG, 2008.
A análise de variância para o crescimento micelial do fungo Fusarium
oxysporum não foi significativa (Tabela 2A do Anexo). Isso indica que, nas
concentrações utilizadas, 100, 50, 10 e 1 µg mL
-1
, não houve atividade inibitória
da lectina da FFM sobre o crescimento desse fungo.
Não existem informações, na literatura, sobre o efeito fungitóxico da
lectina da FFM sobre o Fusarium oxysporum. No entanto, existem relatos de
lectinas vegetais com ação fungicida sobre essa espécie, como a lectina de
Talisia esculenta, na concentração de 280µg mL
-1
(Freire et al., 2002) e lectina
de Pouteria torta na mesma concentração (Boleti, 2003).
Diante disso, novos ensaios, com concentrações mais elevadas, devem
ser realizados, para confirmar ou não os resultados aqui obtidos.
7
7,5
8
8,5
9
0 20 40 60 80 100
concentração (micrograma/mL)
crescimento micelial (cm)
40
5 CONCLUSÕES
A metodologia mais adequada para a extração das proteínas da FFM é a
utilização de água destilada como extrator, na proporção 1:20 (m/v), em um
tempo de 15 minutos, por ter apresentado maior atividade hemaglutinante.
A lectina da FFM é estável em ampla faixa de temperatura (40º-70
o
C),
por 30 minutos, e não depende de íons metálicos, como Ca
2+
e Mn
2+
, para
exercer sua atividade hemaglutinante.
Os cátions Ca
2+
(5mmol L
-1
), Mn
2+
(1, 3 e 5mmol L
-1
) e a mistura de
ambos (1, 3 e 5mmol L
-1
), quando adicionados ao ensaio de hemaglutinação,
provocam a aglutinação de hemácias.
Na purificação das proteínas da FFM, obteve-se apenas um pico, no qual
foi detectada atividade hemaglutinante. O pico ativo da coluna apresentou 3
bandas protéicas de 64, 61 e 58 kDa, respectivamente.
O extrato protéico da FFM precipitado com sulfato de amônio a 80%
não afetou o crescimento do fungo Fusarium oxysporum nas concentrações
utilizadas no bioensaio, sendo a concentração máxima utilizada de 100µg mL
-1
.
41
6 PERSPECTIVAS
Como sugestões para futuros trabalhos, sugerem-se:
• realizar ensaios de inibição da atividade hemaglutinante por açúcares, a
fim de determinar a especificidade da lectina da FFM, e aperfeiçoar a
metodologia de purificação empregada;
• caracterizar a lectina da FFM quanto à composição e seqüência em
aminoácidos;
• realizar novos ensaios com o extrato protéico da FFM precipitado com
sulfato de amônio a 80%
sobre o crescimento do fungo Fusarium
oxysporum, utilizando concentrações mais elevadas e realizar também o
ensaio para outros fungos fitopatogênicos.
42
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51
ANEXO
ANEXO A Página
TABELA 1 A Resumo da análise de variância para o rendimento
protéico das extrações......................................................
52
TABELA 2 A Resumo da análise de variância para o crescimento
micelial do fungo Fusarium oxysporum...........................
52
52
TABELA 1 A Resumo da análise de variância para o rendimento protéico das
extrações.
FV GL SQ QM
Tempo 3 0,0727 0,0242**
Extrator 1 0,3682 0,0368**
Tempo*Extrator 3 0,0302 0,0101**
Erro 16 0,0176 0,0011
Coeficiente de variação (%) 4,93
Média geral (%) 0,67
**
Significativo, a 1% de probabilidade, pelo teste F.
TABELA 2 A Resumo da análise de variância para o crescimento micelial do
fungo Fusarium oxysporum.
FV GL SQ QM
Concentração 4 1,4992 0,3748
ns
Erro 15 2,2431 0,1495
Coeficiente de variação (%) 4,93
Média geral (cm) 7,85
ns
Não significativo, a 5% de probabilidade, pelo teste F.
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