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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS
LIDIANE RAQUEL VEROLA MATAVELI
CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM MINIBIOSSENSOR
POTENCIOMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DE ADRENALINA EM
AMOSTRAS DE INTERESSE FARMACÊUTICO
ALFENAS/MG
2007
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LIDIANE RAQUEL VEROLA MATAVELI
CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM MINIBIOSSENSOR PARA
DETERMINAÇÃO DE ADRENALINA EM AMOSTRAS DE INTERESSE
FARMACÊUTICO
ALFENAS/MG
2007
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Alfenas, para obtenção do títu
lo
de Mestre em Ciências Farmacêuticas,
Área de Concentração: Análise Físico-
Química e Microbiológica de Fármacos
Orientador: Pedro Orival Luccas
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A DEUS ! AOS MEUS PAIS, IRMÃO E
TODA FAMÍLIA, QUE ACOMPANHOU
MINHA JORNADA E REZOU POR MIM
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Tantas pessoas para agradecer, me perdoem se esqueci algum nome...
Primeiro e como não poderia deixar de ser, primeiro tenho que agradecer ao meu
orientador Prof. Pedro ... quanto tempo me agüentando!! Obrigada por tudo.
Ao pessoal do laboratório. Tantas horas juntos, formamos uma família. Marina,
Adriano, Re, Naty, Gustavo, Gil, Marília, Lê, Camila, Ju ... OBRIGADA!
As meninas da República Malagueta que agüentaram meus “surtos” quando nada
dava certo no laboratório.
Professores!!! Principalmente a Prof.ª Maisa, Prof.ª Lúcia, Prof.º Célio e Prof.º
Alexandre que me ajudaram na realização deste trabalho.
Por último, mas muito importante Naty e Gu valeu pela ajuda!!
Meus sinceros agradecimentos
Se, a princípio, a idéia não é absurda, então não há esperança para
ela.
Albert Einstein
RESUMO
A polifenoloxidase (PFO) é uma enzima cúprica que catalisa a oxidação de difenóis
em quinonas e tem ampla distribuição entre os vegetais. A atividade dessa enzima
foi medida para a construção de um biossensor, para determinação de adrenalina, e
os melhores resultados foram obtidos com a banana (Musa sp.). O cálculo da
atividade enzimática proporcionou um valor de 974 UA (Unidades de Atividade). O
biossensor foi construído com pasta de carbono, 50 UA em tampão fosfato (pH=
7,00) suportada em agulha de aço inoxidável ou tubo de polietileno.
Constatou-se morosidade no restabelecimento da linha base a qual foi corrigida
com a adição de H
2
O
2
na solução diminuindo o tempo para 10 minutos. O
biossensor (com polietileno) apresentou resposta linear para adrenalina, em solução
tampão, entre 8,00x10
-9
e 8,00x10
-4
mol L
-1
(LD = 8,00x10
-9
mol L
-1
). Para amostras
de medicamentos os resultados obtidos com o método proposto e com o método
descrito na Farmacopéia Brasileira (1977) foram concordantes. Para amostras de
sangue, usando calibração por ajuste de matriz, a faixa linear foi de 8,00x10
-7
a
8,00x10
-3
mol L
-1
(LD = 8,00x10
-7
mol L
-1
). Obteve-se 89,4 % nos testes de
recuperação. Testes in vivo, onde os eletrodos foram inseridos na veia jugular de
ratos Wistar, apresentaram resultados promissores.
Palavras-chave: Adrenalina. Biossensores. Potenciometria.
ABSTRACT
Polyphenoloxidase (PPO) is a cupric enzyme that catalyzes the oxidation of
diphenols in quinones and is widely distributed among the vegetables. The activity of
this enzyme was measured for a biosensor construction for adrenaline determination,
and the banana (Musa sp.) extract presented better results. The calculation of the
enzymatic activity provided a value of 974 UA (Units of Activity). It was constructed
biossensor with: carbon paste containing 50 UA in phosphate buffer (pH=7,00), into
stainless steel needles or polyethylene tube. Slow reestablishment of the baseline
was evidenced and it was corrected with the addition of H
2
O
2
to the solution,
decreasing the return time to 10 minutes. The biosensor (with polyethylene) provides
a linear range from 8,00x10
-9
to 8,00x10
-4
mol L
-1
(LOD = 8,00x10
-9
mol L
-1
) in buffer
solution for adrenalin. The results obtained with the proposed method and the
Farmacopéia Brasileira (1977) was in agreement. For blood samples, using matrix
matching calibration, the linear range was from 8,00x10
-7
to 8,00x10
-3
mol L
-1
(LOD =
8,00x10
-7
). In the recovery tests, 89,4% of the added value was obtained. In vivo
studies, electrodes were inserted in the jugular vein of the Wistar rat and showed
promising results.
Keywords: Adrenaline. Biosensors. Potentiometry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Oclusão em matriz de polímero.................................................
Figura 2 - Microencapsulação....................................................................
Figura 3 - Adsorção física..........................................................................
Figura 4 - Ligação covalente em suporte...................................................
Figura 5 - Ligação cruzada.
Fonte:FATIBELLO, CAPELATTO
(1992)..........................................................................................
Figura 6 - Estrutura química da adrenalina: 1,2 –benzenodiol – 4 – (1-
hidroxi – 2 – metilamina etil).....................................................
Figura 7- Esquema dos procedimentos de preparação do extrato bruto
enzimático.................................................................................
Figura 8 - Reação da epinefrina em presença de PFO, resultando na
formação da epinefrinoquinona.................................................
Figura 9 - Procedimento adotado para medidas de atividade
enzimática.................................................................................
Figura 10 - Procedimento adotado para preparo da pasta de grafite......
Figura 11 - Desenho esquemático do minibiossensor...............................
Figura 12 - Sensor fabricado com tubo de polietileno 0,4 mm d. i.............
Figura 13 - Ratos utilizados para medidas in vivo com eletrodos
inseridos na cavidade peritoneal..............................................
24
25
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27
28
31
37
38
39
40
41
41
44
Figura 14 - Ratos utilizados para medidas in vivo com eletrodos
inseridos na veia jugular..........................................................
Figura 15 - Velocidade de reação para diferentes concentrações de
extrato bruto.............................................................................
Figura 16 - Medidas da atividade enzimática de: a : abobrinha; b : batata
doce..........................................................................................
Figura 17 - Medidas da atividade enzimática de: a : mandioca; b :
batata.......................................................................................
Figura 18 - Medidas da atividade enzimática de: a : inhame; b :
berinjela....................................................................................
Figura 19 - Medida da atividade enzimática de banana (Musa sp.): a : 1
dia após preparação; b- 4 dias após preparação; c : 8 dias
após preparação......................................................................
Figura 20 - Resultados obtidos para o biossensor de agulha com EBE
de banana com 50 unidades de enzima (em agulha). Curva
obtida com concentrações entre 1,50x10
-3
e 1,10x10
-2
mol L
-
1
, incrementos de 1,30x10
-3
mol L
-1
.........................................
Figura 21 - Estudo da influência da concentração de PFO na construção
de biossensores. Sinais obtidos para solução de adrenalina
8,00x10
-5
mol L
-1
em tampão fosfato pH=7,00. As barras
representam os desvios relativos para medidas em
triplicata....................................................................................
Figura 22 - Influência do pH na resposta do biossensor, soluções
aquosas de adrenalina (8,00x10
-5
mol L
-1
) em tampão
fosfato. As barras representam os desvios relativos para
leituras em triplicatas................................................................
44
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49
50
51
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55
56
Figura 23 - Biossensores construídos com tubos de polietileno de
calibres diferentes para terminações de 8,00x10
-5
e 8,00x10
-
4
mol L
-1
de adrenalina.............................................................
Figura 24 - Leitura de amostras de adrenalina 8,00x10
-5
mol L
-1
em: a :
tampão fosfato pH=7,00; b- amostra de sangue......................
Figura 25 - Curva analítica obtida para biossensor de polietileno em
tampão.....................................................................................
Figura 26 - Curva analítica obtida para biossensor de polietileno em
sangue......................................................................................
Figura 27 - Curva analítica de adrenalina, comprimento de onda: 280
nm............................................................................................
Figura 28 - Registros obtidos para injeção de adrenalina em um dos
animais utilizados.....................................................................
57
58
59
60
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65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Teor de proteína; atividade calculada através da fórmula
(F) e da curva de velocidade (C) seguidas de sua
atividade específica (AE) definida como unidade por
miligrama de proteína......................................................
Tabela 2 - Resposta de diferentes biossensores para solução:
1,50 x 10
-3
mol L
-1
de adrenalina em tampão fosfato
pH=7,00..........................................................................
Tabela 3 - Estudo de interferentes para solução 8,00x10
-5
mol L
-1
de adrenalina.................................................................
Tabela 4 - Determinação de adrenalina por espectrofotometria
UV e biossensor potenciométrico..................................
47
53
61
63
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Analitos determinados utilizando-se biossensores com
detecção potenciométrica..............................................
Quadro 2 - Analitos determinados usando biossensores com
detectores óticos............................................................
Quadro 3 - Analitos determinados utilizando-se biossensores
piezoelétricos................................................................
Quadro 4 - Técnicas utilizadas na determinação de adrenalina e
suas respectivas faixas de resposta..............................
Quadro 5 - Substâncias utilizadas no preparo do biossensor..........
Quadro 6 - Eletrodos para adrenalina encontrados na literatura......
19
20
21
33
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60
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÂO...........................................................................
1.1 BIOSSENSORES.......................................................................
1.2.1 Transdutores Amperométricos...............................................
1.2.2 Transdutores Coulométricos.......................................................
1.2.3 Transdutores Potenciométricos..................................................
1.2.4 Transdutores Condutométricos..................................................
1.2.5 Transdutores Óticos...................................................................
1.2.6 Cristais Piezoelétricos................................................................
1.3.1 Material Biológico: Enzimas.......................................................
1.3.2 Material Biológico: Tecidos........................................................
1.3.3 Material Biológico: Microorganismos.........................................
1.3.4 Material Biológico: Anticorpos ...................................................
1.3.5 Material Biológico: Ácidos nucléicos ..........................................
1.4 IMOBILIZAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO..........................
1.4.1 Oclusão em matriz de polímero .................................................
1.4.2 Microencapsulação.....................................................................
1.4.3 Adsorção física ..........................................................................
1.4.4 Ligação covalente em suporte....................................................
1.4.5 Ligação cruzada ........................................................................
1. 5 POLIFENOLOXIDASE................................................................
1.6 MEDIDAS DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA...................................
1.7 ADRENALINA.............................................................................
1.8. OBJETIVOS................................................................................
1.9. JUSTIFICATIVA..........................................................................
2 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................
2.1 REAGENTES.................................................................................
2.2 EQUIPAMENTOS..........................................................................
2.2.1 Outros Materiais.............................................................................
15
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35
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36
2.3.1 Obtenção do extrato bruto enzimático (EBE).................................
2.3.2 Determinação da atividade enzimática..........................................
2.3.3 Determinação da concentração de proteína total pelo
método de Biureto..........................................................................
2.3.4 Preparação do sensor ...................................................................
2.3.5 Preparo do eletrodo referência Ag/AgCl .......................................
2.3.6 Avaliação e caracterização do sensor ...........................................
2.3.7 Amostras .......................................................................................
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................
3.1 CÁLCULO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA .....................................
3.2 ESTUDO DA FONTE ENZIMÁTICA..............................................
3.3 CONSTRUÇÃO DOS SENSORES ...............................................
3.4 BIOSSENSORES UTILIZANDO TUBOS DE POLIETILENO........
3.5 CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS : BIOSSENSOR DE
POLIETILENO (D.I. 0,4 MM)..........................................................
3.6 ESTUDO DE INTERFERENTES...................................................
3.7 AVALIAÇÃO DA EXATIDÃO DO MÉTODO...................................
3.8 MEDIDAS IN VIVO ........................................................................
4 CONCLUSÕES ............................................................................
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética
APÊNDICE A – Artigo Publicado pela revista Infarma
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1 INTRODUÇÃO
A adrenalina é uma catecolamina liberada naturalmente no sangue circulante
pelo sistema nervoso simpático e pela medula supra renal. Em média, cerca de 80%
das catecolaminas liberadas pela medula das adrenais corresponde à adrenalina, a
qual apresenta ações farmacológicas por excitar os receptores α e β adrenérgicos,
atuando no coração, vasos sanguíneos, pressão arterial, metabolismo, sistema
nervoso central e musculatura lisa.
As concentrações fisiológicas das catecolaminas são na ordem de
nanomolares e picomolares. O método mais utilizado para a análise dessas
substâncias é a CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência), que requer um pré-
tratamento extensivo da amostra (SZEPONIK et al., 1995).
Dentre as alternativas utilizadas para determinação da adrenalina, cita-se o
biossensor. Trata-se de um sensor que utiliza um material biológico conectado a um
transdutor. Um biossensor eletroquímico tem sido definido como um dispositivo
integrado com conteúdo próprio, capaz de promover informação quantitativa ou
semi-quantitativa usando um elemento biológico específico de reconhecimento retido
em contato espacial direto com um elemento transdutor eletroquímico (THEVENOT
et al., 2001).
O material biológico é imobilizado em uma membrana adequada, que é
acoplada à superfície do transdutor. Esse dispositivo monitorará o desaparecimento
de algum reagente ou aparecimento de algum produto da reação do material
biológico com o substrato de interesse.
As principais características de um biossensor são: boa seletividade; relativo
baixo custo de construção e estocagem; potencial para miniaturização; facilidade de
automação e construção de equipamentos portáteis. Os elementos biológicos
utilizados podem ser: enzimas, extrato bruto enzimático, tecido animal e vegetal,
anticorpos, antígenos, células, organelas, ácido nucléico, receptores, sendo que a
escolha do elemento biológico do biossensor depende do analito estudado
(ROSATTO et al., 2001).
Os componentes biológicos mais utilizados são as enzimas, que catalisam
com grande eficiência as reações biológicas e possuem grande seletividade. A
imobilização da enzima no biossensor deve se dar de maneira adequada para não
desnaturar seu centro ativo. Alguns métodos utilizados para imobilização de enzimas
16
são: oclusão em gel, microencapsulação, adsorção física e/ou química, ligação
química covalente, ligação química covalente cruzada (WILSON; GIFFORD, 2005).
Quanto aos transdutores, nota-se a predominância do amperométrico,
seguido do potenciométrico. Contudo, menciona-se também condutométrico, ópticos
e cristais piezoelétricos.
1.1 BIOSSENSORES
O termo biossensor surgiu na literatura científica no fim dos anos 70.
Entretanto, o conceito e mesmo a comercialização dos biossensores veio antes
disso. O primeiro biossensor conhecido como “eletrodo de enzima” foi demonstrado
por Clark e Lyons (1962), quando acoplaram a enzima glicose oxidase a um
eletrodo amperométrico para medidas de O
2
. A oxidação catalisada pela enzima
diminuiu a quantidade de O
2
na solução teste. Essa diminuição foi registrada pelo
eletrodo e mostrou ser proporcional à concentração de glicose na amostra. Nos anos
que se seguiram, os eletrodos de enzima para uma variedade de outras substâncias
clinicamente importantes foram demonstrados acoplando as enzimas apropriadas ao
sensor eletroquímico. Então, Rechnitz et al. (1977) imobilizaram microorganismos
vivos na superfície de um eletrodo seletivo para o aminoácido arginina e
denominaram-no de sensor bio-seletivo, os autores afirmaram que deixar uma
enzima em seu ambiente natural aperfeiçoaria sua atividade biológica e melhoraria
as características do sensor. O sensor bio-seletivo foi depois encurtado para
biossensor e o termo se manteve popular para a união entre um material de origem
biológica e um transdutor físico - químico. Os “designs” e as aplicações dos
biossensores em vários campos da química analítica têm continuado a crescer
desde então.
Como aplicações práticas, biossensores para medição de glicose em sangue
integral, plasma e urina têm sido os mais estudados e comercializados ultimamente.
A necessidade de diagnosticar e gerenciar um problema mundial de saúde, que é a
diabetes mellitus, tem sido a força motora dos esforços acadêmicos e comerciais
para o desenvolvimento de biossensores de glicose.
17
Os aparelhos comerciais para medição de glicose são usados em vários
locais de cuidado à saúde incluindo laboratórios, hospitais, postos de saúde e por
pacientes para monitoramento próprio da glicose no sangue. A aplicação de
biossensores para monitoração de glicose é a razão principal para que o mercado
mundial desses aparelhos, em 2001, tenha sido estimado em US$1,5 bilhões
(NEWMAN et al., 2001).
De acordo com a IUPAC, um biossensor é definido como um tipo específico
de sensor químico que compreende um elemento de reconhecimento biológico e um
transdutor físico-químico (THÉVENOT et al., 2001). O elemento biológico é capaz de
reconhecer a presença, atividade ou concentração de um analito em solução. O
reconhecimento pode ser tanto por um processo de ligação quanto por uma reação
biocatalítica. A interação de um elemento de reconhecimento com o analito alvo
resulta em uma mudança mensurável na propriedade da solução, como a formação
de um produto. O transdutor converte a mudança na solução em um sinal elétrico
quantificável.
1.2.1 Transdutores Amperométricos
Biossensores baseados em transdutores eletroquímicos são os mais comuns
e mais frequentemente citados na literatura. A amperometria é a técnica
eletroquímica geralmente aplicada em biossensores disponíveis comercialmente. É
uma técnica eletroquímica que tira vantagem do fato de certas espécies químicas
serem oxidadas ou reduzidas em eletrodos de metais inertes quando se aplica um
potencial constante. Essas espécies químicas são conhecidas como substâncias
eletroativas. Três eletrodos compreendem uma célula amperométrica. O eletrodo de
trabalho é geralmente constituído de um metal como platina, carbono vítreo ou ouro.
Um eletrodo referência, geralmente Ag/AgCl que promove um potencial fixo contra o
qual o potencial aplicado no eletrodo de trabalho é medido e controlado, e um contra
eletrodo que possibilita a aplicação de potencial, juntamente com o eletrodo de
trabalho, no sistema em estudo. As espécies a serem monitoradas difundem para a
superfície do eletrodo, onde ocorre a reação de oxirredução. A corrente resultante
está relacionada à concentração do analito (D’ORAZIO, 2003).
18
1.2.2 Transdutores Coulométricos
Técnica eletroquímica relacionada com a amperometria, onde a quantidade
de carga (coulombs) passando entre 2 eletrodos é medida. A quantidade de carga é
diretamente proporcional à oxidação ou redução de uma substância eletroativa em
um dos eletrodos. O número de coulombs transferido nesse processo é relatado
como quantidade de substância eletroativa pela lei de Faraday:
n= Q/zF (1)
Sendo que z é o número de elétrons transferidos na reação de oxidação ou
redução, n é a quantidade de substância reduzida ou oxidada em moles, F é a
constante de Faraday (96,487 C/mol) e Q é a quantidade de carga passando através
da célula em coulombs (D’ORAZIO, 2003, p. 42).
Os biossensores coulométricos não são muito comuns. Como exemplos
pode-se citar a determinação de pesticidas organofosforados e também a
identificação de subespécies viáveis de Escherichia coli (EVERETT; RECHNITZ,
1998; ERTL et al.,2003).
1.2.3 Transdutores Potenciométricos
A potenciometria consiste na medida da diferença de potencial entre dois
eletrodos quando a corrente da célula é zero. Os dois eletrodos são conhecidos
como indicador e referência. O eletrodo indicador desenvolve um potencial variável
dependendo da atividade ou concentração do analito na solução esse potencial é
medido em relação a um eletrodo de referência. A mudança no potencial é
relacionada à concentração de maneira logarítmica (EGGINS, 1999).
Existem vários exemplos de biossensores utilizando detectores
potenciométricos, como pode ser visto no Quadro 1.
19
Quadro 1 - Analitos determinados utilizando-se biossensores com detecção potenciométrica.
Analito Autores
Uréia RAJESH et al.(2005)
Etanol ROTARIU; BALA; MAGEARU (2004)
Acetilcolinesterase REHER; LEPKA; SCHWEDT (2002)
Glicose KORMOS; SZIRÁKI; TARSICHE (2000)
Ácido L – Ascórbico FERNANDES; KUBOTA; NETO (1999)
Lisina SAURINA (1998)
Triglicerídeos REDDY et al. (2003)
1.2.4 Transdutores Condutométricos
Uma mudança na condutividade da solução tem sido usada como mecanismo
de transdução em biossensores baseados em enzimas. Condutometria é a medida
da habilidade de íons em solução de carregar corrente entre os eletrodos, quando
um potencial alternado é aplicado entre dois eletrodos inertes. Algumas reações
enzimáticas, produzindo uma mudança na força iônica da amostra, podem ser
monitoradas por dispositivos condutométricos. As aplicações de biossensores
condutométricos são limitadas e há necessidade de medir pequenas mudanças de
condutividade em meios com grande força iônica. Um eletrodo branco (controle)
deve ser usado (D’ORAZIO, 2003).
1.2.5 Transdutores óticos
Os transdutores óticos mais comuns são baseados nas técnicas: absorção,
refletância, luminescência, quimiluminescência, interferometria entre outras.
Os instrumentos óticos apresentam vantagens tais como dispensar o uso de
eletrodo de referência; ausência de interferência elétrica; um reagente imobilizado
não precisa estar em contato com as fibras óticas; os aparelhos utilizados são
altamente estáveis com relação à calibração; podem responder simultaneamente a
20
mais de um analito; têm potencial para um conteúdo maior de informações do que
os transdutores elétricos.
As desvantagens consistem em: funcionam somente se reagentes
apropriados forem desenvolvidos; sistemas sujeitos à interferência da luz do
ambiente; são de difícil miniaturização; são menos sensíveis; os tempos de resposta
podem ser longos (EGGINS, 1999).
No quadro a seguir estão listados alguns biossensores com detectores óticos.
Quadro 2 - Analitos determinados usando biossensores com detectores óticos.
Analito Autores
Glicose MORENO – BONDI et al.(1990)
Bilirrubina Sérica LI; ROSENWEIGZ (1997)
Colesterol TRETTNAK; WOLFSBEIM (1990)
Impurezas da Água FRENSE; MULLER; BECKMANN (1998)
L-alanina, α-quetoglutarato JANASEK; SPOHN (1999)
1.2.6 Cristais piezoelétricos
A microbalança piezoelétrica de cristal de quartzo (QMC) é um equipamento
de medida de massa, que opera de acordo com o princípio de Sauerbrey: qualquer
mudança na massa do cristal muda a freqüência natural de oscilação da QMC
proporcionalmente como descrito na equação:
∆F = -2,27 x 10
-6
. F
0
∆m/A (2)
Onde: F é a freqüência medida, F
0
é a freqüência fundamental do cristal de quartzo;
A é a área revestida e ∆m é a variação de massa devido à deposição na superfície
(SU; LI, 2001).
No quadro 3, podem ser observados alguns analitos determinados utilizando-
se biossensores piezoelétricos. Uma área que tem despertado grande atenção são
os cristais revestidos com anticorpos, que oferecem grande seletividade.
21
Quadro 3 - Analitos determinados utilizando-se biossensores piezoelétricos
.
Analito Autores
Anticorpos de BSA SHONS; DORMAN; NAJARIAN (1972)
Anticorpos para HIV KÖSSLINGER et al. (1994)
Pesticidas (atrazina) GUILBAULT; HOCK; SCHMID (1992)
Biossensores de DNA STORRI et al. (1998)
Cocaina ATILLI.; SULLEIMAN (1996)
Atropina WHANZI et al. (1993)
1.3.1 Materiais biológicos: Enzimas
Uma enzima é uma macromolécula complexa, geralmente uma proteína,
sendo que 1/3 das substâncias dessa classe contêm um grupo prostético que inclui
um ou mais átomos de metal. Em muitas enzimas, especialmente as utilizadas para
a construção de biossensores, o modo de ação envolve uma reação de oxidação ou
redução que pode ser detectada eletroquimicamente.
A utilização de enzimas na construção de biossensores possui certas
vantagens: elas se ligam ao substrato, são altamente seletivas, têm atividade
catalítica aumentando a sensibilidade, agem rapidamente. Algumas desvantagens
podem estar presentes: o custo da fonte, da extração, do isolamento e da
purificação das enzimas é muito alto. Além disso; há perda de atividade quando
imobilizadas em um transdutor; levando à desativação depois de um período curto
de tempo. Porém uma grande gama de enzimas está disponível comercialmente,
geralmente com características bem definidas e testadas (EGGINS, 1999).
Apesar das desvantagens mencionadas, as enzimas consistem do material
biológico mais utilizado para construção de biossensores.
Uma alternativa viável para contornar alguns pontos desfavoráveis na
utilização das enzimas, como estabilidade e alto custo, e que tem apresentado
desempenho satisfatório é o uso de extrato bruto enzimático, que além de ser mais
econômico e estável, possui um tempo de vida superior ao das enzimas purificadas
(FATIBELLO; VIEIRA, 2002).
22
1.3.2 Materiais biológicos: Tecidos
Tecidos de plantas e animais podem ser utilizados diretamente com mínima
preparação. Geralmente tecidos contêm uma multiplicidade de enzimas e podem
não ser tão seletivos quanto às enzimas purificadas. Entretanto as enzimas ficam
em seu ambiente natural e estão menos sujeitas a perda de atividade. Por outro lado
a resposta pode ser mais lenta, pois há uma maior diversidade de materiais para
que o substrato possa se difundir.
Microorganismos e tecidos são materiais que englobam diferentes meios que
envolvem as enzimas, o que resulta em diferentes vantagens e desvantagens. São
ambos mais baratos do que enzimas isoladas e os biossensores confeccionados
apresentam maior tempo de utilização. A enzima pode ser mais estável à inibição
por solutos, mudanças de temperatura e pH. A maior desvantagem é a falta de
seletividade, pois contêm uma mistura de enzimas (EGGINS, 1999).
1.3.3 Materiais biológicos: Microorganismos
Microorganismos podem assimilar compostos orgânicos resultando em
mudança da atividade respiratória, e podem assim produzir metabólitos eletroativos.
A utilização de microorganismos evita etapas de purificação, e preserva a
enzima em seu ambiente natural protegendo-a de inativação por agentes tóxicos
externos, tais como metais pesados (LEI; CHEN; MULCHANDANI, 2006).
Tem como vantagens: serem uma fonte de enzima mais barata do que
enzimas isoladas, menos sensíveis à inibição por solutos e mais tolerantes a
mudanças de temperatura e pH, têm maior tempo de vida. Suas desvantagens são:
algumas vezes têm maior tempo de resposta, tem tempos maiores de recuperação,
e tal como os tecidos, têm muitas enzimas o que pode diminuir a seletividade
(EGGINS, 1999).
23
1.3.4 Materiais biológicos: Anticorpos
Organismos desenvolvem anticorpos que são proteínas que podem se ligar
com um antígeno invasor e removê-lo. O analito de interesse se comporta então
como o antígeno.
Anticorpos têm sido usados em imunoensaios há muito tempo, utilizando a
alta seletividade decorrente do reconhecimento molecular dos anticorpos.
Esse tipo de material biológico é muito seletivo, ultra-sensível e se liga
fortemente. A grande desvantagem do uso desse tipo de material biológico é que
não há, na grande maioria das vezes, o efeito catalítico presente quando se utilizam
as enzimas (EGGINS, 1999).
1.3.5 Materiais biológicos: Ácidos nucléicos
A especificidade que surge das moléculas complementares de DNA para
duplicar ou hibridizar pelo pareamento de bases oferece uma maneira simples de
detectar seqüências marcadas de DNA em uma amostra.
Novas tecnologias de biossensores têm sido investigadas baseando-se na
imobilização de filamentos de DNA em diferentes transdutores físico-químicos que
convertem o evento da hibridização num sinal elétrico ou ótico.
Esses biossensores, têm grande aplicação em diagnóstico de doenças
hereditárias, monitoramento de expressão de genes e detecção rápida de infecções
patogênicas ( EGGINS, 1999).
1.4. IMOBILIZAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO
Existem muitos métodos de imobilização de material biológico, porém estes
não podem desnaturar o centro ativo das enzimas utilizadas nos biossensores,
24
E
E
E
E
E
E
E
E
devendo ser realizada por meio dos vários grupos que não possuem atividade
catalítica.
1.4.1 Oclusão em matriz de polímero
Envolve confinamento da enzima dentro dos espaços intersticiais das ligações
covalentes cruzadas de um polímero insolúvel (poliacrilamida, nylon, polímeros
condutores como o polipirrol, entre outros). Neste processo, o monômero, o
catalisador de polimerização e a enzima a ser ocluída são misturados em uma
solução tampão. A estrutura do polímero formada não permite a difusão de
moléculas grandes de enzima pelos espaços intersticiais, mas as moléculas
menores do substrato podem difundir-se livremente (CAPELATO; FATIBELLO
1992).
A vantagem desse método é que a reação entre substrato e enzima não sofre
grandes modificações, pois a imobilização praticamente não altera a estrutura da
enzima. Essa técnica possui algumas desvantagens: barreiras são criadas inibindo a
difusão do substrato que diminui a velocidade da reação e o tempo de resposta do
sensor; há perda de atividade enzimática através dos poros do gel (EGGINS, 1999).
Figura 1 - Oclusão em matriz de polímero.
25
E
E
E
E
E
E
1.4.2 Microencapsulação
Envolve o confinamento das enzimas em pequenas esferas de membranas
semipermeáveis com poros que permitem a livre movimentação de substrato e
produtos da reação enzimática. O principal tipo de membrana utilizada são as de
acetato de celulose, poliacrilamida, policarbamato, colágeno e polifluoretileno
(PTFE). Foi o método usado para o primeiro biossensor de glicose no eletrodo de
oxigênio (EGGINS, 1999).
Tem como vantagens a fixação próxima entre o material biológico e o
transdutor, e permite a imobilização simultânea de várias enzimas. Tem boa
estabilidade quando é exposto a mudanças de temperatura, pH, força iônica, E
0
e
concentração de substrato. Além disso, sua configuração limita a contaminação e a
biodegradação e ainda previne contaminação se usada ”in vivo”.
Porém, a necessidade de alta concentração de proteína para a
microencapsulação, a restrição de passagem de substrato de baixo peso molecular
através dos poros da membrana e dificuldades em se fixar essas microcápsulas na
base dos sensores dificulta a aplicação desta técnica.
Figura 2 - Microencapsulação.
1.4.3 Adsorção física
A adsorção do material biológico em suportes insolúveis resulta em interações
do tipo iônico, polar, ligações de hidrogênio ou hidrofóbicas. Muitas substâncias
26
E
E
E
E
adsorvem enzimas em suas superfícies, tais como alumina, celulose, grafite, sílica-
gel, vidro e colágeno. Nenhum reagente é necessário, não há passo de limpeza e há
menor ruptura da estrutura enzimática.
A grande vantagem desse método é a simplicidade e a grande variedade de
suportes que podem ser utilizados, possui, porém, a desvantagem de a enzima
adsorvida ser extremamente dependente de fatores tais como pH, solvente,
substrato e temperatura (SCOUTEN; LUONG; BROWN, 1995).
Figura 3 - Adsorção física.
1.4.4 Ligação covalente em suporte
Realizada por meio de ligação covalente de grupos funcionais não ativos da
enzima a grupos reativos (hidroxila, carbonila, fenol, tiol, imidazol, amino) ligados na
superfície sólida de um suporte insolúvel. Para proteger o sítio ativo, a reação é
conduzida na presença do substrato (EGGINS, 1999).
Os suportes insolúveis mais utilizados incluem polímeros sintéticos (agar-
agar, dextrana, sefarose, etc) e materiais inorgânicos (óxidos metálicos e pérolas de
vidro com porosidade controlada).
A vantagem desse método é que a enzima não será liberada durante o uso,
pois forma um complexo estável com o suporte mostrando-se assim satisfatório para
produção e comercialização. Como desvantagem, além do processo de imobilização
ser complicado e consumir tempo, existe a possibilidade de perda de atividade
devido à reação de imobilização envolver grupos funcionais necessários para a
27
E
E
E
E
E
E
E
atividade biológica, o que pode ser minimizado pela imobilização na presença do
substrato ou inibidor do material biológico (SCOUTEN; LUONG; BROWN, 1995).
Figura 4 - Ligação covalente em suporte.
1.4.5 Ligação cruzada
A ligação cruzada utiliza reagentes bifuncionais para ligar o biomaterial a
suportes sólidos. O método baseia-se na formação de partículas macroscópicas em
decorrência da formação de ligações cruzadas entre as moléculas de enzimas e/ou
moléculas de suporte inerte com reagentes funcionais. Alguns dos reagentes
utilizados são glutaraldeído, hexametileno diisocianato e 1,5 – dinitro – 2,4 –
difluorobenzeno (EGGINS, 1999).
É um procedimento simples que possibilita forte ligação química das
biomoléculas, também é muito usado na estabilização de enzimas adsorvidas
fisicamente que são covalentemente ligadas a um suporte. Existem algumas
desvantagens quando se utiliza esse método: além da reação utilizada ser de difícil
controle, causa danos à enzima, portanto é necessária uma grande quantidade
desta, além de limitar a difusão do substrato (SCOUTEN; LUONG; BROWN; 1995).
28
Figura 5 - Ligação cruzada. Fonte: FATIBELLO,
CAPELATTO (1992).
1. 5 POLIFENOLOXIDASE
A enzima utilizada no presente trabalho foi uma polifenoloxidase.
As enzimas polifenoloxidase (PFO), também conhecidas como catecol
oxidases, tirosinases ou catecolases, foram descobertas em 1985 por Bourquelot e
Bertrand e são amplamente distribuídas, ocorrendo em animais, plantas, fungos e
bactérias (ÜNAL, 2007).
PFO são enzimas com um centro dinuclear de cobre, que são capazes de
inserir oxigênio em um grupo hidroxila de um anel aromático existente, seguida pela
oxidação do difenol à quinona correspondente (MAYER, 2006). As quinonas são
compostos que podem espontaneamente complexar vários tipos de moléculas em
grandes estruturas, incluindo proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e carboidratos,
levando a formação de uma variedade de compostos escuros. Está então associada
à deterioração de alimentos, provocando o chamado escurecimento enzimático.
A função fisiológica da PFO em células de plantas está ainda indefinida,
porém muitos relatos indicam que seria de defender a planta contra patógenos e
ataques de insetos (MELO; SHIMIZU; MAZZAFERA, 2006). O fato da atividade da
PFO poder ser induzida por fatores bióticos e abióticos, como danos causados por
herbívoros, fungos e bactérias, danos mecânicos, regurgitação de insetos e por
tratamentos com compostos que sinalizam a via octadecanóide, é evidência
adicional do envolvimento das PFO nos mecanismos de defesa das plantas.
29
O modo de ação proposto para as PFO é baseado na sua capacidade de
oxidar compostos fenólicos quando o tecido é danificado (MELO, SHIMIZU,
MAZZAFERA, 2006). Nessa situação a ruptura dos plastídios, o compartimento
celular onde se encontra as PFO, leva a enzima a entrar em contato com os
compostos fenólicos liberado pela ruptura do vacúolo, a principal organela
armazenadora desses compostos.
As quinonas formadas podem agir de várias maneiras levando à proteção das
plantas por meio de sua alta capacidade de reagir com outros compostos celulares,
elas podem limitar o desenvolvimento de doenças nos locais infectados, prevenindo
o avanço da infecção e/ou gerando um ambiente tóxico que inibirá o crescimento
dos patógenos dentro da célula; através da habilidade de alquilar proteínas, ligando-
se covalentemente a aminoácidos susceptíveis a alquilação, como lisinas, cisteína e
metionina, reduzindo a biodisponibilidade dessas proteínas; capacidade de reagir
com outros compostos fenólicos, aumentado a formação de polímeros, ligações
covalentes e condensação com mais proteínas, levando a barreiras adicionais que
podem prevenir os patógenos de entrar na célula (MELO; SHIMIZU; MAZZAFERA,
2006).
1.6 MEDIDAS DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA
A atividade de enzimas pode ser medida pelo consumo de oxigênio utilizando-
se a técnica de Warburg ou um eletrodo de oxigênio, determinação com
Cromatografia Líquida de Alta Resolução (CLAE) com detecção eletroquímica e
também pode ser feita a determinação espectrofotométrica (DAWSON; MAGEE
1955; LI et al., 1988; SUMMER; MYRBACK, 1951).
Quanto às medidas espectrofotométricas, estas são utilizadas para se
acompanhar o desenvolvimento de uma reação enzimática que possua um produto
ou reagente que absorva radiação ultravioleta ou visível. Assim, em condições
adequadas, a velocidade da reação é proporcional à quantidade de enzima presente
no extrato. Como muitas enzimas ainda não são encontradas puras, não é possível
quantificá-las, sendo os resultados expressos em unidades de atividade (UA),
definidas arbitrariamente como a quantidade de enzima capaz de aumentar em
30
0,001 unidades de absorbância por minuto (LUPETTI et al., 2003; HARPER, 1973).
Para o cálculo da atividade geralmente é utilizada a fórmula abaixo que relaciona
variação de absorbância (∆ abs), variação de tempo (∆ T), o passo óptico (b) e um
determinado volume de amostra (V) (SUMMER ; MYRBACK, 1951):
A (atividade) = ∆ abs x 1000 / (∆T x b x V) (3)
Outra maneira de calcular UA é através da medida da velocidade de reação
para diferentes proporções de extrato e enzima, o que, em princípio, confere maior
confiabilidade aos resultados (HARPER, 1973).
1.7 ADRENALINA
No presente trabalho foi desenvolvido um biossensor para a determinação de
adrenalina.
A adrenalina (ou também chamada de epinefrina) é uma catecolamina,
liberada pelo sistema nervoso simpático e pela medula supra-renal e que atua na
regulação de várias funções fisiológicas, em particular na integração das respostas a
uma grande variedade de estresses (GILMAN, 1996). As catecolaminas são
necessárias para proporcionar respostas fisiológicas rápidas, em emergências tais
como frio, fadiga e choque. Neste sentido mobilizam o que se chama de mecanismo
de fuga ou luta (HARPER, 1973).
A adrenalina (Figura 6) funciona como hormônio atuando em locais distantes
na circulação, apresentando ações farmacológicas nos seguintes setores do
organismo (HARPER, 1973; SILVA, 2002):
- Sistema cardiovascular – causa vaso-dilatação nas arteríolas dos músculos
esqueléticos e vaso-constrição das artérias da pele, das mucosas e das vísceras
esplâncnicas. Também é eficaz como estimulante da ação cardíaca, aumenta
irritabilidade, ritmo, força de contração do miocárdio e o rendimento cardíaco.
Aumenta pressão sanguínea.
- Sistema nervoso central – os efeitos são em geral discretos e já que é uma
substância polar e tem dificuldade de atravessar a barreira hematoencefálica. Efeitos
31
OH
OH
OH NH
CH
3
que sugerem estimulação central, como ansiedade, inquietação, tremores, são
efetivamente decorrentes das ações respiratórias e metabólicas da adrenalina.
- Musculatura lisa das vísceras – causa relaxamento dos músculos lisos do
estômago, intestino, bronquíolos e bexiga urinária, juntamente com contração dos
esfíncteres no caso do estômago e bexiga. Outros músculos lisos podem ser
contraídos. O efeito relaxante da epinefrina sobre a musculatura lisa bronquiolar
torna este hormônio particularmente valioso no caso de ataques asmáticos.
Efeitos metabólicos: no fígado, estimula degradação do glicogênio, o que
contribui para capacidade desta substância de elevar a glicose do sangue. In vivo a
ação da adrenalina pode resultar em um aumento de glicogênio cardíaco, que
provavelmente é secundário à ação do hormônio sobre o tecido adiposo com
aumento dos ácidos graxos circulantes que são rapidamente utilizados como
combustível pelo coração. Embora a captação da glicose possa estar diminuída, a
glicose que chega ao coração é desviada preferencialmente para o glicogênio. In
vivo, os ácidos graxos do tecido adiposo são captados pelo fígado e metabolizados
através do ciclo Lynen. Os ácidos graxos finalmente ativam a reversão da via
glicolítica. Isto faz com que o lactato seja convertido a glicose e glicogênio. Desse
modo, apesar do efeito da epinefrina sobre a desintegração do glicogênio, no fígado,
o glicogênio hepático pode frequentemente ser aumentado quando a substância é
administrada in vivo.
Figura 6- Estrutura química da adrenalina: 1,2-benzenodiol -4-(1-hidroxi -2-metilamina etil).
As principais indicações da adrenalina como medicamento são: alívio de
broncoespasmo, em paradas cardíacas, em reações alérgicas graves e prolongar
ação de anestésicos (SILVA, 2002).
32
O perfil farmacológico da adrenalina é relacionado à dose administrada e
ligado à sua afinidade por receptores adrenérgicos – é um agonista dos receptores α
e β adrenérgicos.
A estimulação dos receptores α
1
e α
2
, que estão presentes em todos os vasos
sanguíneos (α
1
predominantemente nas artérias e α
2
predominantemente nas
veias), produz vaso constrição. A estimulação dos receptores β , presentes nos
vasos do coração (β
1
, β
2
) e nos vasos dos músculos esqueléticos (β
2
), e nas artérias
pulmonar, mesentérica superior e esplâncnica (β
2
), produz aumento das batidas do
coração, taxa do coração e rendimento cardíaco, com conseqüente vasodilatação.
Os efeitos da adrenalina na pressão sanguínea dependem de qual dos dois
sistemas de receptores é predominante. Isso por sua vez é influenciado pela
concentração de adrenalina no plasma, que depende do modo de administração e
dose injetada (NEAL, 2003).
Baixas doses de adrenalina estimulam receptores β
2
adrenérgicos
(1 a 2 µg
.min
-1
) resultam em vasodilatação arterial, enquanto em doses moderadas (2 a 10
µg .min
-1
) estimulam os receptores β
1
e β
2
, aumentado os efeitos inotrópicos e
cronotrópicos. Doses moderadas também estimulam os receptores α
2
, aumentando
o retorno venoso ao coração. Altas doses de adrenalina (>10 µg .min
-1
) causam
vaso constrição dos receptores α
1
e α
2
(NIEMI, 2005; NEAL, 2003).
A epinefrina é metabolizada na circulação, sistema nervoso central, fígado e
rim pela monoamina – oxidase (MAO) e catecol- (O) – metil – transferase (COMT).
Uma vez exposta a essas enzimas, a meia vida da adrenalina é muito curta.
Clinicamente, os efeitos de uma administração intravenosa de adrenalina durariam
menos que 3 minutos, enquanto se utilizada uma infusão não intravascular este
efeito dura de 40 a 120 minutos, dependendo de como o término do efeito é medido
(NEAL, 2003).
Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para a determinação de adrenalina
em várias amostras. Estes incluem ensaios fluorimétricos e espectrofotométricos e
métodos cromatográficos como cromatografia gasosa / espectrofotometria de massa
e CLAE com detecção eletroquímica. Desses métodos, a CLAE é o mais usado.
Extração preliminar e concentração são procedimentos necessários para medir as
concentrações de adrenalina no plasma. O pré-tratamento mais comum envolve
extração com alumina, com ou sem um passo de extração aniônica. Geralmente as
33
amostras são analisadas com cromatografia de fase reversa com reagentes de
pareamento iônico; outros métodos usam coluna de troca catiônica para separar as
aminas extraídas. Detecção eletroquímica, usando detecção amperométrica ou
coulométrica, é a mais comum para quantificar adrenalina (ROSANO; WHITLEY,
2003).
Alguns exemplos de técnicas de detecção de adrenalina estão mostrados no
Quadro 4.
Quadro 4 - Técnicas utilizadas na determinação de adrenalina e suas respectivas faixas lineares.
Técnica Faixa Linear Autor
Fluorimetria 1,4x10
-9
– 2,1x10
-6
mol L
-1
GUO et al. (2002)
Espectrofotometria
1-12 µg mL
-1
MEDINA; DE CÓRDOVA;
DIAZ (2000)
Voltametria cíclica 1x10
-6
– 1,3x10
-4
M LIU; HONMA. ZHOU (2005)
FIA com detecção
fluorimétrica
0,05-15 e 20-40 mg L
-1
TORRES ; ROMERO ;
CALATAYUD (1998)
Eletroquimiluminescência 2x10
-6
– 1x10
-4
mol L
-1
LI; CUI; LIN (2002)
Biossensor
potenciométrico
3x10
-7
– 3x10
-1
mol L
-1
MOREIRA; MAGALHÃES;
LUCCAS (2005)
Biossensor
amperométrico
5x10
-5
-3,5x10
-4
mol L
-1
FELIX; YAMASHITA;
ANGNES (2006)
Biossensor voltamétrico 2x10
-4
-1,2x10
-3
mol L
-1
CARUSO; VIEIRA;
FATIBELLO – FILHO (1999)
CLAE (detector
de fluorescência)
0 – 270 nmol L
-1
HANSEN et al. (1999)
1.8 OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivos:
Construir e caracterizar um minibiossensor empregando polifenoloxidase,
capaz de determinar adrenalina em amostras de interesse farmacêutico tais como
34
medicamentos e fluidos biológicos. Visando este objetivo, várias variáveis foram
estudadas: fonte de enzima; atividade enzimática, material e reagentes para a
construção do biossensor e características analíticas em termos de seletividade,
sensibilidade e exatidão.
Após a caracterização do biossensor, este foi avaliado para medidas em
medicamentos e in vivo.
1.9 JUSTIFICATIVA
A principal técnica que tem sido empregada para determinação de adrenalina
é a de CLAE o que se explica devido principalmente à sua excelente seletividade.
Contudo, considerando o alto custo de implantação e operação desta técnica, a
alternativa da determinação de adrenalina empregando biossensores é plausível.
Além disso, as dimensões do biossensor construído se mostram adequadas
para a possível utilização deste dispositivo in vivo, o que possibilitaria a monitoração
do analito de interesse dentro de um organismo.
A seletividade intrínseca do biossensor propiciada pela enzima e a rapidez
das análises unidas ao baixo custo de construção e implantação justificam a
pesquisa proposta.
35
2 MATERIAIS E MÉTODOS
Abaixo seguem equipamentos, reagentes e metodologias utilizadas no
presente trabalho.
2.1 REAGENTES
- Epinefrina (Sigma
®
) utilizada como padrão e para determinação da atividade
enzimática;
- Dihidrogenofosfato de potássio (Synth
®
) e hidróxido de sódio (Vetec
®
)
utilizados na obtenção do tampão fosfato;
- Polivinilpirrolidona (PVP) - Polyclar K-30 (Henrifarma
®
), utilizada como
preservante do extrato bruto enzimático;
- Poli (Cloreto de Vinila) – PVC (Merck
®
), utilizado no isolamento da parede
externa da agulha de aço inoxidável;
- Grafite (Synth
®
), vaselina (Rioquimica
®
), acrílico auto polimerizante (B&B
®
),
araldite
®
, cola de PVC (Akros
®
), e KCl (Merck
®
), utilizados no preparo da pasta de
grafite;
- Sulfato de cobre( Vetec
®
), tartarato de sódio e potássio (Mallinkrodt
®
), para
preparo do reagente de Biureto;
- Soroalbumina bovina (BSA), usado como padrão para quantificação de
proteínas totais;
- Ágar (Biotec
®
) usado para preparo do eletrodo referência (Ag/AgCl);
- Norepinefrina (Fluka
®
), dopamina (Sigma
®
), ácido L-ascórbico (Vetec
®
),
ácido úrico (Vetec
®
) e uréia (Vetec
®
), testados como interferentes;
- Ácido nítrico (Merck
®
) utilizado para descontaminação das agulhas e da
vidraria;
- Tetrahidrofurano - THF (Vetec
®
) utilizado na polimerização do PVC;
- Heparina (Bioclin
®
) utilizado como anticoagulante nas amostras de sangue;
- Cloridrato de Ketamina (König
®
), utilizado para anestesiar os ratos.
36
2.2 EQUIPAMENTOS
Os equipamentos utilizados no presente trabalho encontram-se no
Laboratório de Análise Química de Fármacos da Universidade Federal de
Alfenas.
- Espectrofotômetro –Shimadzu
®
UV 2401, utilizado na determinação da
atividade enzimática;
- Par de cubetas de quartzo com 1 cm de passo ótico (Hellma).
- Potenciômetro - Micronal
®
modelo B 374, utilizado para detecção dos sinais
potenciométricos;
- Centrífuga Excelsa Baby I – Fanem
®
, utilizada na preparação do extrato
bruto enzimático;
- Agitador magnético – Fisatom
®
, utilizado nos testes em célula de 30 mL;
- Balança analítica - Sartorius
®
modelo BP 210S para pesagem dos
reagentes;
- Amostrador automático descrito por FIGUEIREDO et al. (2006) para leitura
dos padrões e amostras;
- Microsoft Excel
e Origin
®
, utilizado para tratamento dos dados;
- Eletrodo de referência de calomelano Analyser
utilizado nas medidas com
biossensor de agulha;
- Fio de prata para confecção do eletrodo referência Ag/AgCl, retirado de
eletrodo de vidro Analyser
®
;
- Interface modelo Lab PC com resolução de 12 bits (National instruments
®
).
2.2.1 Outros Materiais
- Liquidificador – ARNO
®
e gazes (MedGauze
®
), utilizados no preparo do
extrato bruto enzimático;
- Agulhas de aço inoxidável Ibras
®
e tubos de poetileno 0,4 mm e 0,8 mm d. i
(Reyglass
®
), utilizados para a confecção dos minibiossensores.
37
3 min
100 mL tampão fosfato
0,100 mol L
-1
(pH = 7,00)
+
PVP
2,50 g
30 min
+
25,0g
2.3.1 Obtenção do extrato bruto enzimático (EBE)
Para obtenção do EBE de vários vegetais, fontes conhecidas de polifenol
oxidase tais como: abobrinha (Cucurbita pepo L.), batata doce (Ipomoea batatas (L.)
Lam), mandioca (Manihot sculenta), batata (Solanum tuberosum L.), inhame
(Colocasia sp.), berinjela (Sonalum melogena), banana (Musa sp.).
O seguinte procedimento foi adotado: uma massa de 25,0 g do vegetal
descascado foi picada e misturada com 100 mL de tampão fosfato 0,100 mol L
-1
,
preparado utilizando–se fosfato de potássio monobásico (KH
2
PO
4
) e o pH 7,00 foi
ajustado com hidróxido de sódio (NaOH). Ainda foram adicionadas 2,50 g de agente
protetor polivinilpirrolidona (PVP) e o extrato foi processado em um liquidificador
durante 3 min. A mistura foi filtrada em gaze dobrada em quatro e centrifugada a
5.000 rpm durante 30 min, a 25ºC. A solução sobrenadante foi armazenada no
refrigerador a 4ºC e usada como fonte enzimática
(ROSATTO et al., 2001;
FATIBELLO FILHO; VIEIRA, 2002; FATIBELLO FILHO; LUPETTI; RAMOS, 2003;
CARUSO; VIEIRA; FATIBELLO FILHO, 1999; SIGNORI; FATIBELLO, 1994)
.
O procedimento de obtenção do extrato está mostrado esquematicamente na
figura 7.
Figura 7: Esquema do procedimento de preparação do extrato bruto enzimático.
38
2.3.2 Determinação da atividade enzimática
A atividade da PFO presente no EBE de vegetais foi determinada em
triplicatas pela medida de absorbância em 410 nm, monitorando a formação da
epinefrinoquinona (CARUSO; VIEIRA; FATIBELLO FILHO, 1999) conforme reação
descrita na figura 8.
Figura 8 :Reação da epinefrina em presença de PFO, resultando na formação da
epinefrinoquinona.
Mediu-se a velocidade de reação para as misturas reacionais contendo
diferentes volumes de EBE de 0,05 a 0,20 mL, com incrementos de 0,05 mL , 2,40
mL de adrenalina 5,00x10
-2
mol L
-1
e completa-se o volume com tampão fosfato
0,100 mol L
-1
(pH = 7,00) para 3,00 mL em cubeta de quartzo. A atividade
enzimática é numericamente igual ao coeficiente angular do gráfico da velocidade
em função da quantidade de enzima multiplicado por mil (HARPER, 1973;
MOREIRA; MAGALHÃES; LUCCAS, 2005).
O procedimento adotado está esquematicamente mostrado na figura 9.
OH
OH
OH NH
CH
3
O
O
NH
CH
3
OH
Epinefrina
Epinefrinoquinona
PFO
39
0,05 a 0,2
0
mL de
extrato bruto
enzimático
+
2,4
0
mL
adrenalina 0,05
mol L
-1
+
Tampão fosfato
0,10 mol L
-1
(pH=7,00)
Figura 9 : Procedimento adotado para medidas de atividade enzimática
.
2.3.3 Determinação da concentração de proteína total pelo método de Biureto
Com o intuito de se verificar a estabilidade das proteínas no extrato bruto
enzimático e também calcular a atividade enzimática relativa, foram feitas
determinações de proteínas totais no extrato bruto enzimático empregando o método
de Biureto (SUMMER; MYRBÃCK, 1951).
A curva analítica foi preparada a partir de uma solução estoque de BSA de
1,000 g L
-1
. As concentrações estudadas foram de: 33,3 ; 100,0; 166,7; 233,3; 333,3;
400,0; 500,0 mg L
-1
. As leituras foram realizadas no espectrofotômetro a 540 nm.
Para as medidas de proteína no extrato bruto a volumes de 50, 100 e 150 µL
foram adicionado o reagente de Biureto, completou-se o volume para 6,0 mL e o
tubo foi levado ao banho maria por 15 min e as leituras foram feitas em 540 nm.
2.3.4 Preparação do sensor
A construção dos eletrodos foi realizada de maneira semelhante à proposta
por Abdel-Hamid; Atanasov e Wilkins(1995).
40
Uma agulha de aço inoxidável (calibre = 18) foi cortada em uma das
terminações para remover a tampa de plástico, e a extremidade foi alisada usando
lixa. A agulha foi mergulhada em ácido nítrico concentrado (ca. 10 segundos),
lavada com água destilada e seca.
A pasta de grafite foi obtida misturando-se grafite em pó e volumes variáveis
de PFO (foram testados biossensores contendo de 25 a 300 unidades de enzima)
em um almofariz com pistilo, por 20 minutos. Em seguida foi misturada vaselina, por
mais 20 minutos. Foi utilizada uma proporção de 75:25 % em massa de grafite e
vaselina (VIEIRA, 2000). A pasta foi introduzida no interior da agulha de aço
inoxidável ou tubo de polietileno (figura 10). Além da vaselina, outras substâncias
foram testadas para a confecção do biossensor de agulha inoxidável, como mostra o
quadro 5.
Quadro 5 : Substâncias utilizadas no preparo do biossensor
.
Substância Proporção (m/m)
Araldite® 75% grafite + 25% Araldite®
Cola PVC 75% grafite + 25% Cola PVC
KCl 75% grafite + 25% KCl
Acrílico auto - polimerizante 75% grafite + 25% Acrílico auto –
polimerizante
Figura 10 : Procedimento adotado para preparo da pasta de grafite.
0,375g
0,125g
20 min
20 min
+ EBE
Introdução na
agulha ou tubo
de polietileno
41
O interior da agulha faz o contato elétrico com a membrana de pasta de
grafite, e o exterior da agulha é isolado com um polímero PVC como mostra a figura
11.
Figura 11 : Desenho esquemático do minibiossensor construído com agulha.
Para a construção dos sensores com tubos de polietileno de 0,4 e 0,8
mm de diâmetro interno, um fio de cobre foi utilizado para fazer o contato elétrico.
Na figura 12 pode ser visto um dos biossensores construídos com tubo de
polietileno. Os biossensores de diâmetros diferentes foram testados em duas
concentrações: 8,00 x 10
-5
mol L
-1
e 8,00 x 10
-4
mol L
-1
.
Figura 12 : biossensor preparado com tubo de polietileno 0,4 mm d. i.
42
2.3.5 Preparo do eletrodo referência Ag/AgCl
Um tubo de polietileno de 0,40 mm d. i. foi preenchido com solução 3,00 mol
L
-1
de KCl. Para a ponte salina foram preparados 20,00 mL de uma solução saturada
de KCl e esta foi aquecida juntamente com 2,00 g de agar. Esta solução foi aspirada
para dentro do tubo de polietileno para que a ponta (± 1 cm) deste fosse preenchida
com a solução (LI et al., 2000).
O fio de Ag/AgCl utilizado na construção do eletrodo de referência foi retirado
de um eletrodo de vidro quebrado, considerando que as medidas de potencial foram
computadas como a diferença entre o sinal da linha base e valor máximo, tem se,
portanto que o valor absoluto do potencial do eletrodo de referência não influencia
na exatidão das medidas.
2.3.6 Avaliação e caracterização do sensor
Os sensores primeiramente foram testados com soluções padrão de
adrenalina (1,50x10
-3
a 1,10x10
-2
mol L
-1
com incrementos de 1,30x10
-3
mol L
-1
) em
uma célula (volume de 30 mL) agitada magneticamente. Um eletrodo comercial de
calomelano foi empregado como eletrodo de referência.
A resposta do sensor foi testada frente a interferentes fisiológicos comuns
(como norepinefrina, dopamina, ácido úrico, ácido L-ascórbico e uréia). Alíquotas de
soluções desses interferentes foram introduzidas na célula de medida a fim de
produzir concentrações próximas aos níveis fisiológicos dessas substâncias no
sangue total (YANG; ATANASOV; WILKINS., 1999; ABDEL-HAMID; ATANASOV;
WILKINS, 1995). A concentração de adrenalina foi mantida em 8,00 x 10
-5
mol L
-1
,
sendo que todas as soluções foram preparadas em tampão fosfato pH = 7,00. Todos
os interferentes foram testados em três concentrações diferentes conforme segue:
Para ácido ascórbico, cuja concentração normal no sangue é de 0,600
mg/100 mL, foram testadas soluções de 0,100; 0,600 e 1,70 mg/100 mL.
43
Para o ácido úrico, cuja concentração normal no sangue é de 70,0 mg L
-1
,
foram testadas soluções de 50,0, 70,0 e 140 mg L
-1
.
Quando a noradrenalina, que tem valor normal no sangue de 1,70 µg L
-1
, foi
testada as soluções foram de 0,850; 1,70 e 3,40 µg L
-1
.
Para o teste com uréia, que tem valor sanguíneo normal de 40,0 mg L
-1
, as
soluções eram de concentração 14,0, 40,0 e 80,0 mg L
-1
.
No teste com dopamina (concentração normal = 30,0 ng L
-1
) as solução
utilizadas foram 15,0, 30,0, 60,0 ng L
-1
.
2.3.7 Amostras
Amostras de medicamentos: foram utilizadas ampolas de solução aquosa
de adrenalina 1,000 g L
-1
sem tratamento, realizando apenas diluição para balão de
25 mL em HCl 0,01 mol L
-1
. As amostras foram adquiridas na clínica odontológica da
Universidade Federal de Alfenas.
Para validação, foram feitas comparações com o método descrito na
FARMACOPÉIA BRASILEIRA (1977). Segundo este método, fazendo-se uma
varredura no espectrofotômetro entre 230 e 350 nm, a epinefrina na presença de
1,00x10
-2
mol L
-1
de HCl apresenta absorção máxima em 280 nm.
Para a curva analítica foram utilizados padrões de 8,00x10
-5
; 1,60x10
-4
;
2,40x10
-4
; 3,10x10
-4
mol L
-1
.
Amostras de sangue: O sangue foi coletado utilizando-se duas gotas de
solução de heparina (comercial), para cada cinco mL de amostra. As amostras foram
diluídas 1:10 com soro fisiológico para o preparo dos padrões da curva analítica. As
concentrações estipuladas para a curva analíticas (10 padrões) foram de 8,00x10
-12
a 8,00x10
-3
mol L
-1
com incrementos de uma deca de unidade.
Medidas in vivo: Para as medidas in vivo, foram utilizados 5 ratos machos da
linhagem Wistar com idade entre 60 e 75 dias. O biossensor foi introduzido na veia
jugular ou cavidade peritoneal (Figuras 13 e 14) do animal.
Os animais foram anestesiados com cloridrato de ketamina para realização do
procedimento cirúrgico. Este trabalho teve aprovação do Comitê de Ética da
Universidade Federal de Alfenas (Anexo A).
44
Figura 13 : Ratos utilizados para medidas in vivo com eletrodos inseridos na cavidade peritoneal.
Figura 14 : Ratos utilizados para medidas in vivo com eletrodos inseridos na veia jugular.
45
Após implantação dos eletrodos no animal, cerca de 15 minutos foram
necessários para estabilizar a linha base. Partindo-se do princípio de que ratos
Wistar machos possuem aproximadamente 16,0 mL de sangue (BALASZCZUK et
al., 2002), os cálculos foram feitos para que ao injetar 0,300 mL de uma solução de
adrenalina 6,56x10
-5
mol L
-1
a concentração final do analito no sangue fosse de
1,23x10
-6
mol L
-1
. A mudança do potencial do eletrodo implantado no animal foi
monitorado.
46
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 CÁLCULO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Inicialmente foi obtido o extrato bruto enzimático de diferentes fontes
conforme descrito no item 3.2 abaixo. Para o cálculo da atividade enzimática (UA) foi
utilizada a técnica de medidas da velocidade da reação enzimática. A Figura 17
mostra as medidas em triplicata de 4 concentrações diferentes de extrato bruto
enzimático de banana. As médias das medidas foram inseridas nas curvas
apresentadas nas Figuras 15, 16, 17 e 18 cujos coeficientes angulares indicam o
valor de UA do extrato.
As atividades enzimáticas também foram medidas através da fórmula abaixo
e os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 1.
A (atividade) = ∆ abs x 1000 / (∆T x b x V)
Figura 15 - Velocidade de reação para diferentes concentrações de extrato bruto de banana
(Musa sp.).
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,05 mL
0,10 mL
0,15 mL
0,20 mL
Abs
Tempo (min)
47
Tabela 1 - Concentração de proteína; atividade calculada através da fórmula (F) e da curva de
velocidade (C) seguidas de suas atividades específicas (AE) definidas como unidade por
miligrama de proteína.
Dia Proteína
(mg mL
-1
)
Atividade da polifenol oxidase
F AE
F
*
C AE
C
*
1 16,81±0,61 952,8±27,5 56,93±6,75 1742±128,2
103,9±7,6
2 15,31±1,22 929,2±45,8 60,53±6,72 1985±67,68
129,6±4,4
3 16,04±0,89 897,9±10,1 55,98±4,89 2164±46,67
136,4±2,9
5 18,81±0,33 918,2±61,3 48,81±10,04
1376±103,2
73,13±5,5
6 18,13±0,57 864,0±37,8 47,66±9,03 2262±164,7
123,5±9,1
AE
F
= atividade específica calculada pela fórmula; AE
C
= Atividade específica calculada pela
velocidade da reação
.
Para a determinação de proteína total no extrato bruto (Tabela 1) foi
empregado o método do Biureto. A curva analítica apresentou a seguinte equação
(A = 0,0383C -0,0285, R
2
=0,9959). As concentrações de proteínas totais foram
empregadas para o cálculo da atividade específica, a qual leva em consideração não
apenas a atividade do extrato, mas também a concentração da enzima (Fatibello,
Vieira, 2000) e assim tem-se uma representação mais adequada da atividade
enzimática. Constatou-se que não houve uma degradação apreciável de proteínas
durante o período estudado e, portanto as atividades e atividades específicas
apresentaram perfis semelhantes em função do tempo.
3.2 ESTUDO DA FONTE ENZIMÁTICA
As medidas de atividades enzimáticas (conforme mencionado no item 3.1)
foram feitas com extratos extraídos dos seguintes vegetais: berinjela, mandioca,
inhame, abobrinha, batata doce, batata e banana, a fim de se obter a melhor fonte
enzimática. Os resultados obtidos estão mostrados nas Figuras 16, 17 e 18.
Alguns dos vegetais utilizados não apresentaram bons resultados em relação
à atividade enzimática, não pela ausência da enzima nestes, mas provavelmente
pela velocidade com que esta reage, o que pode ser evidenciado na medição da
atividade da berinjela (Figura 18b).
48
(a)
(b)
Figura 16 - Medidas da atividade enzimática de: a – abobrinha; b – batata doce .
0,05 0,10 0,15 0,20
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
y=0,345x + 0,0047
R
2
= 0,9974
Velocidade Enzimática
EBE (mL)
0,05 0,10 0,15 0,20
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
y = -0,0256 + 0,0391
R
2
= 0,2086
Velocidade Enzimática
EBE (mL)
49
(a)
(b)
Figura 17 - Medidas da atividade enzimática de: a – mandioca; b – batata.
0,05 0,10 0,15 0,20
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
y = 0,7307x + 0,0484
R
2
= 0,9564
Velocidade Enzimática
EBE (mL)
0,05 0,10 0,15 0,20
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
y = -0,0616x + 0,0203
R
2
= 0,9809
Velocidade Enzimática
EBE (mL)
50
(a)
Figura 18 - Medidas da atividade enzimática de: a – inhame ; b – berinjela.
0,05 0,10 0,15 0,20
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
y = 0,1091x + 0,0209
R
2
= 0,9462
Velocidade Enzimática
EBE (mL)
0,05 0,10 0,15 0,20
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
y = -0,2088x + 0,1793
R
2
= 0,2188
Velocidade Enzimática
EBE (mL)
(b)
51
Figura 19 - Medida da atividade enzimática de banana: a – 1 dia após preparação; b- 4 dias após
preparação; c – 8 dias após preparação.
0,05 0,10 0,15 0,20
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
y = 0,9082x + 0,0277
R
2
= 0,9398
Velocidade Enzimática
EBE (mL)
a
0,05 0,10 0,15 0,20
0,05
0,10
0,15
0,20
y = 0,9802x + 0,0167
R
2
= 0,9857
Velocidade Enzimática
EBE (mL)
b
0,05 0,10 0,15 0,20
0,10
0,15
0,20
0,25
y = 1,061x + 0,0347
R
2
= 0,9789
Velocidade Enzimática
EBE (mL)
c
52
Sendo a PFO uma família de enzimas (MAYER, 2006), os resultados
diferentes obtidos para os vegetais são justificados pela possível presença de
formas diferentes da enzima nos vegetais usados.
Os maiores valores foram obtidos com a medição da atividade da batata e da
banana. Porém para a batata o mesmo extrato medido (Figura 17) em que a
atividade calculada foi de 730 UA, após dois dias de preparação, mesmo com a
utilização do conservante PVP que se liga a fenóis impedindo a reação destes com a
PFO, como indica Rocha e Morais (2001), teve a atividade diminuída para 95 UA. A
utilização da batata foi então descartada devido à instabilidade do extrato.
Os melhores resultados foram obtidos para a banana sendo que o extrato
apresentou atividade durante pelo menos uma semana após a preparação (Figura
19). Utilizou-se então para a construção dos sensores, descritos a seguir, o extrato
deste vegetal. Parte dos estudos sobre atividade de polifenoloxidadase foi publicado
na revista Infarma, v. 19, n. 9/10, p. 33-35, 2007(APÊNDICE A).
3.3 CONSTRUÇÃO DOS SENSORES
Os primeiros minibiossensores foram construídos com agulha de aço
inoxidável e PVC como isolante.
Foram testados: vaselina, cola de PVC, Araldite®, PVC, KCl e acrílico auto-
polimerizante para compor a pasta de grafite. Como pode ser demonstrado pela
Tabela 2, não foram obtidos sinais utilizando-se o Araldite®, o PVC, a cola de PVC e
o KCl. Porém, os biossensores preparados com vaselina e acrílico auto-
polimerizante geraram resposta para o analito.
Considerando os resultados mencionados para o biossensor montado com a
agulha, optou-se pela utilização da pasta de grafite preparada com o acrílico devido
ao maior sinal obtido com o mesmo.
Para os biossensores confeccionados utilizando os tubos de polietileno, a
pasta de grafite introduzida foi a preparada com a vaselina que neste caso
apresentou melhores resultados e maior facilidade de introdução do material.
53
Vale lembrar que foram feitos eletrodos controle (sem enzima) e esses não
produziram sinais para adrenalina confirmando, portanto que a enzima PFO é a
responsável pelo potencial formado.
Tabela 2 - Resposta de diferentes biossensores para solução: 1,50 x 10
-3
mol L
-1
de adrenalina em
tampão fosfato pH=7,00.
Substância Resposta do sensor
Cola de PVC Não houve resposta
Araldite® Não houve resposta
PVC Não houve resposta
KCl Não houve resposta
Vaselina 80 mV
Acrílico auto-polimerizante 150 mV
Na Figura 20 estão apresentadas as medidas feitas utilizando-se um sensor
de acrílico auto-polimerizante e 50 unidades de enzima construído com agulha de
aço inoxidável. O procedimento para as medidas consistiu em introduzir o eletrodo
na célula de medida e efetuar adições sucessivas de quantidades constantes de
adrenalina resultando em concentrações de 1,50x10
-3
a 1,10x10
-2
mol L
-1
com
incrementos de 1,30x10
-3
mol L
-1
.
Foi observado um efeito de memória, i.e., o sinal do eletrodo não retorna à
linha base quando inserido em solução branco isso pode ser atribuído à possível
adsorção do analito na superfície do eletrodo. Contudo, houve boa linearidade
computando as diferenças de potenciais medidos antes e após a introdução do
eletrodo na solução.
Com o intuito de restabelecer a linha base foi empregada solução de peróxido
de hidrogênio (0,163 mol L
-1
) em tampão pH = 7,00. Os resultados obtidos com o
emprego de peróxido de hidrogênio foram satisfatórios, i.e., houve retorno à linha
base em aproximadamente 10 minutos. Isso ocorre provavelmente devido a
oxidação da enzima e dessorção da adrenalina na superfície do eletrodo.
54
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
E (mV)
Tempo (min)
-2,9 -2,8 -2,7 -2,6 -2,5 -2,4 -2,3 -2,2 -2,1
50
60
70
80
90
100
110
y = 73,403x + 262,69
R
2
= 0,99152
E (mV)
Log C
Figura 20 - Resultados obtidos para o biossensor de agulha com EBE de banana com 50 unidades
de enzima (em agulha). Curva obtida com concentrações entre 1,50x10
-3
e 1,10x10
-2
mol
L
-1
, incrementos de 1,30x10
-3
mol L
-1
.
O eletrodo construído com tubo de polietileno apresentou parâmetros
analíticos mais adequados para a aplicação pretendida e também uma maior
facilidade na construção, uma vez que dispensa o uso de isolamento com
membrana de PVC. Assim os demais experimentos foram feitos com eletrodos
construídos com tubos de polietileno.
3.4 BIOSSENSORES UTILIZANDO TUBOS DE POLIETILENO
O polietileno por sua natureza não condutora dispensa o uso do PVC para
formação de uma camada de isolamento. Para os experimentos utilizando esse tipo
de eletrodo, as medidas foram realizadas utilizando o amostrador automático
descrito por Figueiredo et al. (2006).
55
0 50 100 150 200 250 300
10
20
30
40
50
E (mV)
Unidades de enzima
Nos estudos da influência da quantidade de enzima, como pode ser visto na
Figura 21, o que apresentou melhores resultados foi o de 50 unidades, mesmo valor
encontrado por Moreira, Magalhães e Luccas (2005) utilizando como fonte
enzimática o inhame.
Foram testados tampões fosfato com pHs entre 6,0 e 8,0 (Figura 22), devido à
proximidade do pH sanguíneo. O pH escolhido para o tampão nos experimentos in
vitro foi de 7,00.
O pH ótimo para a enzima PFO é dependente da fonte da enzima e do
substrato utilizado. Ünal, M. Ü. (2007), trabalhando com banana (Musa cavendishii)
como fonte enzimática e catecol como substrato, encontrou 2 pHs ótimos: 5,50 e
7,00.
Figura 21 - Estudo da influência da concentração de PFO na construção de biossensores. Sinais
obtidos para solução de adrenalina 8,00x10
-5
mol L
-1
em tampão fosfato pH=7,00. As
barras representam os desvios relativos para medidas em triplicata.
56
6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
40
50
60
70
E (mV)
pH
Figura 22 - Influência do pH na resposta do biossensor, soluções aquosas de adrenalina (8,00x10
-5
mol L
-1
) em tampão fosfato. As barras representam os desvios relativos para leituras
em triplicatas.
Com relação ao diâmetro, os testes foram feitos com tubos de 0,4 e 0,8 mm
d.i., com biossensores construídos utilizando-se a mesma pasta de grafite.
Pode-se verificar observando a Figura 23 que os melhores resultados foram
obtidos com o biossensor de 0,8 mm d. i. Porém, como o intuito final do trabalho foi
o teste in vivo em ratos, o eletrodo escolhido para realização de experimentos
posteriores foi o de 0,4 mm d. i. devido ao calibre da veia jugular do animal.
Para experimentos com animais de maior porte (portanto veias de maior
calibre), o uso do eletrodo de 0,8 mm d. i. deve ser considerado.
57
0
50
100
150
200
250
8x10
-4
8x10
-5
E (mV)
Adrenalina (mol L
-1
)
0,4 mm
0,8 mm
Figura 23 - Biossensores construídos com tubos de polietileno de calibres diferentes para
terminações de 8,00x10
-5
e 8,00x10
-4
mol L
-1
de adrenalina.
Nos estudos do tempo de resposta para o sensor de polietileno, também foi
observado adsorção do analito no biossensor o que dificultou o retorno à linha base,
assim se fez necessária a utilização de peróxido de hidrogênio. As Figuras 24a e
24b apresentam leituras em triplicata de um padrão de adrenalina (8,00x10
-5
mol L
-1
)
preparado em tampão fosfato e em amostra de sangue respectivamente com um
tempo de leitura de 20 minutos em cada solução.
Após otimização, foi fixado, no amostrador automático os tempos de 10
minutos para a leitura do sinal do biossensor e 10 minutos para o retorno à linha
base, com essa temporização obteve-se boa precisão das medidas (0,94 % de
coeficiente de variação, n=10) e maior freqüência analítica.
58
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
E (mV)
Tempo (min)
Figura 24 - Leitura de amostras de adrenalina 8,00x10
-5
mol L
-1
em: a – tampão fosfato pH=7,00; b-
amostra de sangue.
a
b
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
E (mV)
Tempo (min)
59
-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
20
40
60
80
100
120
y = 19,122x + 185,56
R
2
= 0,98494
E (mV)
Log C
3.5 CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS – BIOSSENSOR DE POLIETILENO (D.I. 0,4
MM)
A Figura 25 apresenta a curva analítica de adrenalina em tampão fosfato pH =
7,00. O LD obtido foi de 8,00 x10
-9
mol L
-1
e a faixa de resposta linear foi de
8,00x10
-9
a 8,00 x10
-4
mol L
-1
.
Figura 25 - Curva analítica obtida para biossensor de polietileno em tampão fosfato
.
O eletrodo mostra-se, portanto mais sensível do que eletrodos já
mencionados na literatura (Quadro 6).
A Figura 26 apresenta a curva analítica de adrenalina em amostras de
sangue. Considerando que a amostra empregada nesse estudo apresentou
concentrações de adrenalina não detectável, a mesma pode ser utilizada para uma
calibração do tipo compatibilização de matriz. Assim, o LD obtido foi de 8,00 x10
-7
mol L
-1
e a faixa de resposta linear foi de 8,00x10
-7
a 8,00x10
-3
mol L
-1
. Os
coeficientes de variação das medidas em amostras aquosas e de sangue sempre
foram inferiores a 0,94% e 7,42% respectivamente, indicando a boa precisão das
medidas.
60
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
-20
0
20
40
60
80
100
y = 20,478x + 124,23
R
2
= 0,9948
E (mV)
Log C
Quadro 6 - Eletrodos para determinação de adrenalina
.
Autores LD (mol L
-1
) Faixa linear (mol L
-1
)
Moreira, L. N.; Magalhães, C. S.;
Luccas, P. O. (2005)
1,13 x 10
-5
2,00 x 10
-5
a 3,00x10
-2
Caruso, C. S.; Vieira, I. C.;
Fatibello, O. (1999)
8,20 x 10
-5
2,00 x 10
-4
a 1,20 x 10
-3
Felix, F. S.; Yamashita, M.;
Angnes, L. (2006)
1,50 x 10
-5
5,00 x 10
-5
a 3,40 x 10
-4
Este trabalho 8,00x10
-9
8,00x10
-9
a 8,00x10
-4
Figura 26 - Curva analítica obtida para biossensor de polietileno em sangue.
Outro fato importante foi a semelhança entre as sensibilidade obtidas em
soluções aquosas e amostra de sangue, 19,122 e 20,478 mV/deca, repectivamente,
o que o indica que o eletrodo não é susceptível a interferência da matriz.
Considerando que a reação de oxidação da adrenalina intermediada por PFO
envolve dois elétrons nota-se que a resposta do biossensor caracteriza-se como
sub-Nernstiniana.
61
3.6 ESTUDO DE INTERFERENTES
Foram testados os seguintes interferentes: ácido úrico, uréia, ácido ascórbico,
noradrenalina e dopamina. Para os testes, a quantidade de adrenalina mantida
durante todo o experimento foi de 8,00 x 10
-5
mol L
-1
. Todos os interferentes foram
estudados em três concentrações conforme descrito no item 2.3.6 .
As interferências mais severas foram observadas para o ácido ascórbico.
Esse composto provavelmente interage com a enzima PFO provocando redução da
mesma e alterando o sinal analítico. Problemas com ácido ascórbico também foram
encontrados em trabalhos com biossensores desenvolvidos por outros
pesquisadores: No trabalho desenvolvido por Abdel-Hamid, Atanasov, Wilkins (1995)
observou-se uma resposta relativa de 30% para ácido ascórbico para um biossensor
desenvolvido para glicose; também para medida de glicose no cérebro
(GEORGANOUPOLOU et al., 2000) a resposta do biossensor foi diminuída em até
30%, essa interferência foi considerada baixa pelos autores. Em ambos os trabalhos
não se fazem inferências sobre o mecanismo de atuação do interferente.
Cabe lembrar que as concentrações que causaram maior interferência, para o
ácido ascórbico, no presente trabalho, consistem de concentrações altas e
diferentes das que são normalmente encontradas no sangue, a concentração (2)
fisiológica ( 0,60 mg/100mL) apresentou interferência desprezível (2,22 %).
De modo geral, considerando a concentração geralmente encontrada nas
amostras de sangue (conc. 2-Tabela 3), as interferências não foram severas, com
exceção da noradrenalina e uréia, sendo possível corrigi-las empregando calibração
por compatibilização de matriz ou adições de padrão ( item 3.7).
Tabela 3 - Estudo de interferentes para solução 8,00x10
-5
mol L
-1
de adrenalina.
Interferente Conc. 01 Conc. 02 Conc. 03
Ácido Ascórbico + 24,97% + 2,22% + 113,40%
Noradrenalina - 20,04% - 20,37% + 8,20%
Uréia - 18,66% - 17,87% - 29,20%
Ácido Úrico - 2,02% - 3,81% - 0,90%
Dopamina + 5,67% - 5,82% - 8,90%
62
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
y = 3028,8x + 0,0063
R
2
= 0,98359
Abs
[mmol L
-1
]
3.7 AVALIAÇÃO DA EXATIDÃO DO MÉTODO
Para se avaliar a exatidão das medidas foi empregada comparação com o
método espectrofotométrico proposto na farmacopéia (FARMACOPÉIA, 1977), no
caso de amostras de medicamentos, e testes de adição e recuperação para
amostras de sangue.
A curva analítica para soluções aquosas de adrenalina em tampão fosfato pH =
7,00 em espectrofotômetro (Figura 27) apresentou boa linearidade na faixa de
concentração estudada.
Figura 27 - Curva analítica de adrenalina, comprimento de onda: 280 nm.
Devido à dificuldade para conseguir as amostras de medicamento, já que é
vendida somente em farmácias hospitalares, a comparação foi feita em apenas uma
amostra de medicamento. Os resultados estão mostrados na Tabela 4. A precisão
das medidas em ambos os métodos foram semelhantes (test-F) e os resultado
obtidos foram aprovados no teste-t com 95% de confiança.
63
Tabela 4 - Determinação de adrenalina por espectrofotometria UV e biossensor potenciométrico.
Amostra Valor rotulado
(g L
-1
)
Farmacopéia
(g L
-1
)
Biossensor
(g L
-1
)
1 1,000 1,026 ± 0,002
2 1,000 0,920±0,230
3 1,000
1,065 ± 0,001
Não determinado
Não determinado
1,190±0,145
Para verificar a exatidão das medidas em amostra de sangue, adicionou-se
2,73 x 10
-6
mol L
-1
de adrenalina a uma amostra e o valor recuperado foi de 2,44 x
10
-6
mol L
-1
, ou seja, 89,4%. O cálculo da concentração foi feito empregando a
calibração por compatibilização de matriz. Cabe mencionar que também a
quantidade de amostras de sangue foram limitadas uma vez que para o presente
trabalho utilizou-se apenas cinco animais para as medidas in vivo e in situ.
3.8 MEDIDAS IN VIVO
Como mencionado nos Materiais e Métodos (item 3.8), foram utilizados 5
ratos machos, da linhagem Wistar, com aproximadamente 350g.
Em dois dos ratos utilizados os eletrodos foram inseridos na cavidade
peritoneal (Figura 13), enquanto que os eletrodos foram inseridos nas veias
jugulares (Figura 14) dos três ratos restantes. O tempo para a realização do
procedimento cirúrgico e obter os sinais era de aproximadamente 2 h (duração do
tipo de anestesia aplicada). Antes que o animal recobrasse os sentidos, este era
sacrificado por aprofundamento da anestesia utilizando éter.
Nos animais em que o sensor foi inserido na cavidade peritoneal, não houve
resposta quando adrenalina foi injetada na corrente sanguínea do animal. Chegou-
se a conclusão que não há irrigação suficiente na região para que a adrenalina
injetada entre em contato com o sensor em quantidades suficientes para ser
detectada por este.
Quando os biossensores foram inseridos na veia jugular dos animais (Figura
14) obtiveram-se os sinais que estão apresentados na Figura 28. Não foi possível
esperar a estabilização da linha base devido ao tempo de anestesia do animal.
64
Contudo o tempo de resposta do eletrodo foi de aproximadamente quatro minutos.
Nos experimentos, foram injetadas quantidades de adrenalina que conferiam uma
concentração na circulação do animal de cerca de 1,23 x10
-6
mol L
-1
, esse valor foi
calculado considerando o volume médio de sangue de um animal (16 mL).
O primeiro sinal obtido foi de 20,5 mV, diminuindo para as injeções
posteriores da mesma concentração de adrenalina ( sinal 2: 9,47 mV; sinal 3: 4,87
mV). As concentrações de adrenalina calculadas com a curva analítica por
compatibilização de matriz (Figura 24) foram de 8,63x10
-6
, 2,49x10
-6
, 1,48x10
-6
, para
os sinais 1, 2 e 3 respectivamente, sendo portanto da mesma ordem de grandeza
que a concentração injetada. Assim, considerando a complexidade da amostra e do
experimento os resultados foram promissores. A diminuição da concentração obtida
nas injeções sucessivas de adrenalina pode estar relacionada com a metabolização
desse composto no animal.
Pode se notar também (Figura 28), que houve retorno a linha base, i.e., não
houve adsorção de adrenalina, como ocorreu em soluções aquosas e medidas in
vitro, esse fato pode ser atribuído a presença de oxigênio dissolvido na circulação do
animal que confere um caráter oxidante semelhante ao do peróxido de hidrogênio.
Outro fato importante é a rápida metabolização da adrenalina na circulação do
animal o que diminuiu sua concentração provavelmente em menos de dois minutos.
Para a determinação de adrenalina in vivo não foram encontrados trabalhos
na literatura. Mostra-se, porém importante para a verificação do aumento da
concentração do analito durante intervenções cirúrgicas, o que pode ser indicativo
de parada cardíaca.
65
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
10
20
30
40
50
60
Injeção 03
Injeção 02
Injeção 01
E (mV)
Tempo (min)
Figura 28 - Registros de medidas in vivo de adrenalina. As injeções consistem de 0,300 mL de
adrenalina 6,56x10
-5
mol L
-1
.
Para efeito de comparação pode-se mencionar algumas medidas in vivo com
outros sensores:
Para a determinação de catecolaminas, pode se mencionar o trabalho de Earl
et al., (1998), em que se implantaram os eletrodos, para medidas voltamétricas, no
cérebro de sagüis, embora os animais utilizados possuíssem porte parecido com o
dos ratos utilizados no presente trabalho, a preparação envolvendo a utilização dos
animais foi maior, tal como submetê-los a ciclos de claro/escuro. Os resultados
mostraram que a voltametria cíclica, neste caso, foi incapaz de detectar o analito em
concentrações inferiores a 10
-8
mol L
-1
e, portanto, não pode ser usada para
monitoração da dopamina na ausência de um estímulo que aumente a concentração
desta.
Pesquisas com biossensores para lactato inseridos em tecidos musculares
(WU et al., 2000) de camundongos, que são de fácil inserção pois foram
confeccionados com agulhas de acupultura, mostraram resultados satisfatórios
indicando aumento na concentração de ácido lático em 15% após o animal ser
submetido a 10 minutos de exercício. Apresentaram tempo de resposta de
aproximadamente 3 minutos e faixa linear entre 3,00x10
-6
e 5,40x10
-3
mol L
-1
para
calibração in vitro.
66
Estudos realizados para a implantação de biossensores para determinação de
glicose encontram-se mais avançados. Utilizam os mais diferentes modelos animais,
tais como camundongos, ratos, cães, chimpanzés e humanos (KOSCHWANEZ;
REICHERT, 2007). Estes biossensores podem ser tanto intravasculares quanto
subcutâneos, sendo que existem certas complicações para a implantação
intravascular quando são realizados experimentos de longa duração tais como
complicações tromboembólicas e a propagação de infecções (KOSCHWANEZ;
REICHERT, 2007).
Outro fato importante é dificuldade para se propor técnicas de calibração
confiável, uma vez, que geralmente a calibração in vivo é inviável, assim, como
alternativa se faz a calibração in vitro (YANG; ATANASOV; WILKINS -1999; ABDEL-
HAMID; ATANASOV; WILKINS, 1995).
Diante do exposto pode se afirmar que o presente trabalho apresenta
resultados preliminares, devido à pequena quantidade de amostras avaliadas, porém
promissores uma vez que aponta para a possibilidade de emprego de um eletrodo,
simples e de baixo custo, em determinação in vivo.
O grupo de Química Analítica Instrumental pretende dar continuidade a essa
linha de pesquisa e está verificando a possibilidade de estudos com animais
maiores.
67
4 CONCLUSÕES
Dentre os vegetais estudados para extração de extrato enzimático a banana
(Musa sp) foi o mais adequado. O biossensor construído com 50 UA foi o que
apresentou melhor resposta e o melhor pH foi de 7,00.
Eletrodos construídos com tubos de polietileno apresentaram resultados
melhores que os construídos com agulhas.
Para medidas em soluções aquosas e in vitro observou-se morosidade no
retorno a linha base o que pode ser contornado com o emprego de peróxido de
hidrogênio na solução branco. Para medidas in vivo não houve problema com
retorno a linha base o que pode ser atribuído ao oxigênio presente na corrente
sanguínea do animal o que confere um meio oxidante adequado para a resposta do
biossensor.
As principais características do eletrodo desenvolvido são: simplicidade de
preparo, baixo custo, tamanho adequado para medidas in vivo, e desempenho
satisfatórios, em termos de precisão e exatidão, para determinação de adrenalina
em amostras de medicamentos e sangue. Quanto a medidas in vivo, os resultados
preliminares foram promissores mostrando a possibilidade de utilização do
biossensor.
68
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Anexo A – Parecer do Comitê de Ética
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APÊNDICE A - Artigo publicado pela Revista Infarma
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