( PDF ) Ação reversora in vitro e in vivo do verapamil da resistência de haemonchus contortus à ivermectina

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

AÇÃO REVERSORA IN VITRO E IN VIVO DO VERAPAMIL

SOBRE A RESISTÊNCIA DE Haemonchus contortus À

IVERMECTINA.

Fernando de Almeida Borges

Orientador: Prof. Dr. Alvimar José da Costa

Co-orientador: Prof. Dr. Marcelo Beltrão Molento

JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL

2007

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

AÇÃO REVERSORA IN VITRO E IN VIVO DO VERAPAMIL

SOBRE A RESISTÊNCIA DE Haemonchus contortus À

IVERMECTINA.

Fernando de Almeida Borges

Orientador: Prof. Dr. Alvimar José da Costa

Co-orientador: Prof. Dr. Marcelo Beltrão Molento

Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de

Jaboticabal, como parte das exigências para a

obtenção do título de Doutor em Medicina

Veterinária (Patologia Animal)

JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL

DEZEMBRO DE 2007

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DADOS CURRICULARES DO AUTOR

FERNANDO DE ALMEIDA BORGES – filho de José Machado Borges e Zilda

Therezinha de Almeida Borges, nascido em 28 de outubro de 1978, no município de

Uberaba – MG. Médico Veterinário, graduado pela Universidade Federal de Uberlândia

em janeiro de 2001. Iniciou, no mesmo ano, suas atividades como pesquisador no

Centro de Pesquisas em Sanidade Animal (CPPAR), FCAVJ/UNESP, onde

permaneceu até maio 2007, quando então, foi aprovado em concurso público para o

cargo de professor de Parasitologia e Doenças Parasitárias, no curso de Medicina

Veterinária, na Universidade estadual de Maringá – campus avançado de Umuarama,

Paraná. Em dezembro de 2007 foi aprovado no concurso público para Professor

Assistente de Doenças Parasitárias para o curso de Medicina Veterinária na

Universidade Federal do Mato Grosso do Sul.

iii

Dedico este trabalho à Dra. Johanna

Martha Kopte, em reconhecimento

ao seu apoio, exemplo de

profissionalismo.e ao suporte dado

para a realização desta tese.

Agradecimentos

Agradeço a Deus.

Ao Prof. Dr. Alvimar José da Costa, não apenas por sua orientação em meu doutorado,

mas por todas as oportunidades, ensinamentos, apoio e confiança. Minha gratidão é o

mínimo que posso oferecer-lhe.

Ao Prof. Dr. Marcelo Beltrão Molento, meu co-orientador e amigo.

Aos professores que aceitaram compor as bancas de qualificação e defesa: Prof. Dr.

Gilson, Prof. Dr. Adjair, Prof. Dr. Alessandro Amarante, Dra. Giane, Prof. Dr. Flávio e

Prof. Dr. Edanir, por sua imensurável contribuição.

A todos aqueles com quem tive a oportunidade de conviver no CPPAR, mais do que

colegas de trabalho, amigos e companheiros: Carol, Welber, Rafael, Cláudio, Tiago,

Daniel, Luis Fernando, Mário, Vando, Roberto, Marina, Lívia, Tatisa, Thaís, Nancy,

Fortunato Alexandre, Ana Lúcia, Jouvana, Cláudia, Paulo e Walter

Ao pessoal do LBM/FCAVJ, especialmente à profa. Maria Ines Tiraboschi Ferro.

À meus pais, Zilda e José por sempre estarem ao meu lado.

Aos meus irmãos Fabiano e Flávia, por tudo o que construímos juntos e com quem

sempre poderei contar.

À família Vieira: Orestes, Yvone, Karina e Gustavo, pela torcida e apoio.

À Juliana Arena Galhardo, por sua presença, dedicação, companheirismo e amor.

A todos aqueles que consideraram esta vitória como se fosse deles próprios.

À Fapesp, pela concessão do auxílio financeiro (processo 04/12803-1), sem o qual não

seria possível a realização deste projeto.

SUMÁRIO

ASSUNTO PÁGINA

LISTA DE TABELAS...........................................................................................

LISTA DE FIGURAS............................................................................................

viii

RESUMO.............................................................................................................

SUMMARY...........................................................................................................

I. INTRODUÇÃO..................................................................................................

II. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................

III. OBJETIVOS..................................................................................................

IV. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................

4.1. Caracterização de estirpes de Haemonchus contortus resistente e

susceptível à ivermectina...............................................................................

4.2. Manutenção da estirpe pura de H. contortus resistente a

ivermectina.....................................................................................................

4.3. Avaliação da atividade reversora do verapamil: teste in vitro –

migração de larvas em gel de ágar................................................................

4.4 Avaliação da atividade reversora do verapamil: teste in vivo – avaliação

anti-helmíntica em ovinos experimentalmente infectados..............................

4.5 Estudo genotípico relacionado à glicoproteína P e canais de cloro

ativados por glutamato na estirpe de H. contortus resistente à

ivermectina.....................................................................................................

4.6 Análise estatística....................................................................................

V. RESULTADOS................................................................................................

5.1 Caracterização de estirpes de Haemonchus contortus resistente e

susceptível à ivermectina...............................................................................

5.2. Avaliação da atividade reversora do verapamil: teste in vitro –

migração de larvas em gel de agar................................................................

5.3 Avaliação da atividade reversora do verapamil: teste in vivo – avaliação

anti-helmíntica em ovinos experimentalmente infectados..............................

5.4 Estudo genotípico relacionado à glicoproteína P e canais de cloro

ativados por glutamato na estirpe de H. contortus resistente à ivermectina..

VI. DISCUSSÃO..................................................................................................

VII. CONCLUSÕES.............................................................................................

VIII. REFERÊNCIAS............................................................................................

LISTA DE TABELAS

TABELA PÁGINA

Tabela 1. Contagens de OPG, sexo, e peso no período pré-tratamento dos ovinos

experimentais, naturalmente infectados por Haemonchus contortus (cepa R).

CPPAR/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.................................................................

Tabela 2. Grupos experimentais e respectivos tratamentos aplicados às larvas de

Haemonchus contortus no teste de migração em gel de ágar.

CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil......................................................

Tabela 3. Grupos experimentais e respectivos tratamentos administrados nos

ovinos experimentalmente infectados com larvas de Haemonchus contortus

resistente à ivermectina. CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

Tabela 4. Quantificação de Haemonchus contortus recolhidos de ovinos dos

grupos controle e tratado, necropsiados no sétimo dia pós-tratamento; percentuais

de eficácia da ivermectina1%. Médias aritméticas. CPPAR/UNESP, Jaboticabal -

SP, Brasil...................................................................................................................

Tabela 5. Quantificação de Haemonchus contortus recolhidos de ovinos dos

grupos controle e tratado, necropsiados no sétimo dia pós-tratamento; percentuais

de eficácia da ivermectina1% e análise estatística. Médias geométricas.

CPPAR/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil...................................................................

Tabela 6. Número médio de larvas de Haemonchus contortus sobreviventes e

percentuais de eficácia da ivermectina em diferentes diluições, isoladamente

(Grupo I) e associada ao Verapamil (Grupo II), provenientes do teste in vitro.

CPPAR/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil..................................................................

Tabela 7. Número médio de larvas de Haemonchus contortus sobreviventes e

percentuais de eficácia do verapamil em diferentes diluições, isoladamente (Grupo

III) e associado à ivermectina (Grupo IV)...................................................................

Tabela 8. Contagens médias de OPG*, realizadas em ovinos dos grupos controle

e tratados. CPPAR/UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil. Médias aritméticas................

Tabela 9. Contagens médias de Haemonchus contortus, realizadas em ovinos dos

grupos controle e tratados CPPAR/UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil. Médias

geométricas................................................................................................................

Tabela 10. Matriz de identidade das sequências de bases das amostras

submetidas a diferentes tratamentos* e amplificadas com o iniciador PGP2............

vii

Tabela 11. Matriz de identidade das sequências de bases das amostras

submetidas a diferentes tratamentos* e amplificadas com o iniciador MXD..............

Tabela 12. Matriz de identidade das sequências de bases das amostras

submetidas a diferentes tratamentos* e amplificadas com o iniciador F4275............

Tabela 13. Matriz de identidade das sequências de bases das amostras

submetidas a diferentes tratamentos* e amplificadas com o iniciador R603.............

viii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA PÁGINA

Figura 1. Placa de Petri contendo o aparato utilizado no teste de migração de larvas

em gel de Agar..............................................................................................................

Figura 2. Estufa do tipo BOD onde foram mantidas as placas de Petri,

demonstrando exposição a uma fonte de luz incandescente de 60W..........................

Figura 3. Número de Haemonchus contortus recolhidos de ovinos dos grupos

controle e tratado, necropsiados no sétimo dia pós-tratamento. Médias

geométricas. CPPAR/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.........................................

Figura 4. Percentuais de eficácia (médias geométricas) da ivermectina 1% em

ovinos naturalmente infectados e necropsiados no sétimo dia pós-tratamento.....

Figura 5. Curva dose x resposta da ivermectina contra a cepa de Haemonchus

contortus resistente (grupo I) e resultado do cálculo da

DL50................................................

Figura 6. Curva dose x resposta da ivermectina associada a 2mM de verapamil

(grupo II) contra a cepa de Haemonchus contortus resistente e resultado do cálculo

da DL50........................................................................................................................

Figura 7. Número médio e desvio padrão de larvas da cepa de Haemonchus

contortus resistente, sobreviventes ao tratamento com verapamil em diferentes

diluições, isoladamente (GrupoIII) e associado à ivermectina (Grupo

IV)...............................

Figura 8. Eletroforese em gel de agarose 1% de produto da reação em cadeia da

polimerase (PCR), a partir de amostras de Haemonchus contortus, submetido a

diferentes tratamentos............................................................................................

Figura 9. Sequências alinhadas dos produtos das sete amostras de Haemonchus

contortus, submetidas a diferentes tratamentos*, amplificados por meio da PCR,

utilizando-se o iniciador PGP-2................................................................................

Figura 10. Sequências alinhadas dos produtos das sete amostras de Haemonchus

contortus, submetidas a diferentes tratamentos*, amplificados por meio da PCR,

utilizando-se o iniciador MXD..................................................................................

Figura 11. Eletroforese em gel de agarose 1% de produto da reação em cadeia da

polimerase (PCR), a partir de amostras de Haemonchus contortus, submetido a

diferentes tratamentos.............................................................................................

Figura 12. Sequências alinhadas dos produtos das sete amostras de Haemonchus

contortus, submetidas a diferentes tratamentos*, amplificados por meio da PCR,

utilizando-se o iniciador F4275................................................................................

Figura 13. Sequências alinhadas dos produtos das sete amostras de Haemonchus

contortus, submetidas a diferentes tratamentos*, amplificados por meio da PCR,

utilizando-se o iniciador R603.................................................................................

Figura 14. Desenho esquemático da glicoproteína P na membrana celular. ..............

Ação reversora in vitro e in vivo do verapamil sobre a resistência de Haemonchus

contortus à ivermectina.

RESUMO

A presente pesquisa teve como objetivo caracterizar e isolar uma estirpe de

campo de Haemonchus contortus resistente à ivermectina, avaliar a ação reversora do

verapamil, por meio de testes in vitro (migração de larvas em gel de ágar) e in vivo

(redução de OPG e necropsias parasitológicas), e realizar a análise de genes

relacionados à glicoproteína-P e canais de cloro ativados por glutamato (GP-P e

HcGluCL). A estirpe de H. conctortus isolada apresentou elevada resistência à

ivermectina, sendo observada eficácia ínfima de 6,59%. O verapamil isoladamente não

apresentou efeito nematodicida, porém, em concentrações crescentes, associado à

ivermectina (DL50-4,317μmol) proporcionou aumento de eficácia contra a cepa

resistente de H. contortus, alcançando o percentual de 94,3% (verapamil 100 mmol). Os

resultados do teste anti-helmíntico controlado, em que foram utilizados 42 ovinos

experimentalmente infectados com H. contortus resistente à ivermectina, revelaram que

o verapamil apresentou uma atividade de reversão parcial significativa (P<0,05) da

resistência. Pela análise genotípica efetuada nas sete amostras desta população de H.

contortus, submetidas aos diferentes tratamentos com ivermectina, verapamil ou

associação entre estas drogas, verificou-se similaridade em relação à glicoproteína-P e

pouca semalhança em relação aos canais de cloro ativados por glutamato..

Palavras-chave: fosfo-glicoproteína, Haemonchus contortus, ivermectina, resistência,

reversão, verapamil.

Verapamil in vitro and in vitro reversing action in Haemonchus contortus

ivermectin resistance.

SUMMARY

The present work aimed to identify and isolate a field ivermectin-resistant

Haemonchus contortus strain, evaluate the effect of verapamil as a P-GP modulator

agent by in vitro (agar gel larval migration assay) and in vivo (FECRT and controlled

test), and analyze the genes related to the P-glycoprotein (P-GP) and H. contortus

glutamate chloride (HcCluCl) chanel expression. The H. contortus field strain isolated

was highly resistant to ivermectin, showing only 6.59% of efficacy. Verapamil alone

didn’t show any in vitro anthelmintic action but increasing concentrations of this drug

associated to ivermectin (LD50-4.317μmol) resulted in higher efficacy, when compared

to ivermectin alone, with 94.3% efficacy in the 100 mmol concentration. The results of

the anthelmintic controlled test, in wich it was used 42 sheep experimentally infected

with the field ivermectin-resistant H. contortus strain, showed a significant (P<0,05)

parcial ivermectin resistance reversion by verapamil. The genomic analysis of the seven

samples from this H. contortus resistant population submited to diferent treatment with

ivermctin, verapamil and the association between theese two drugs, showed similarity in

the genes related to the expression of P-GP and high polimorfism related to HcGluCL

Keywords: Haemonchus contortus, ivermectin, P glycoprotein, resistance, reversion,

verapamill.

I. INTRODUÇÃO

A produção de lã e carne ovina desempenha importante papel sócio-econômico

no Brasil. O rebanho ovino brasileiro está estimado em 15.588.041 animais (IBGE,

2005). Ao contrário do que ocorria no passado, quando a maior parte dos criatórios

encontrava-se na região sul, atualmente, 58,44% deste rebanho pertence à região

nordeste, onde predominam ovinos com pelagem curta, e apenas 28,56% à região sul,

onde a maioria é lanada.

A ovinocultura, embora tenha sofrido com a diminuição do comércio internacional

da lã, principalmente por Japão e Austrália, e também pela competição com a

agricultura, especialmente na região sul do Brasil, continua, ainda, uma atividade

rentável. Segundo DORNELLES (2002), é o setor mais lucrativo da pecuária,

propiciando rápida recuperação do capital empregado. Além disto, possui grande

importância social, representando significativa fonte de renda para a produção

agropecuária familiar, fixando o homem no campo.

As infecções parasitárias causadas por nematódeos gastrintestinais representam

grave problema sanitário na pecuária ovina, sendo responsáveis por grandes perdas

econômicas. Dentre os helmintos, o Haemonchus contortus destaca-se como sendo o

de maior importância econômica no Brasil. Este parasito apresenta grande capacidade

de adaptação a adversidades climáticas, podendo ser encontrado até mesmo no

Círculo Ártico (LINDQUIST et al., 2001). Possui maior intensidade de infecção dentre os

demais nematódeos em ovinos nos estados de São Paulo (AMARANTE, 1995), Santa

Catarina (PALOSCHI & RAMOS, 1991), Paraná (CUNHA FILHO et al., 1998) e Rio

Grande do Sul (BORBA, 1996). Sua patogenicidade é caracterizada pelo intenso

hematofagismo na fase adulta (PRADHAN & JOHNSTONE, 1972). Além dos danos à

mucosa gástrica na forma inibida, a ação deste parasito causa queda na produção e na

qualidade da lã, redução no ganho de peso (20 a 60%) e mortalidade (20 a 40%)

(ECHEVARRIA, 1988).

O método mais empregado no controle de verminoses de ruminantes domésticos

é o uso de produtos químicos. Porém, a utilização de anti-helmínticos como ferramenta

exclusiva de controle, tem seu futuro comprometido devido ao progressivo aumento do

número de casos de resistência e à falta de perspectiva de descoberta de novas

moléculas com propriedades terapêuticas antiparasitárias. Desta forma, é importante

adotar medidas que prolonguem a vida útil das drogas disponíveis no mercado, assim

como meios de controle complementares (FAO, 2003).

Estes fatores têm levado ao desenvolvimento de pesquisas de controles

complementares, tais como pastejo alternado (FERNANDES et al., 2004), seleção de

animais geneticamente resistentes (AMARANTE & AMARANTE, 2003) e controle

biológico utilizando fungos nematófagos ( ARAÚJO et al., 2004), dentre outros. Uma

nova alternativa que está sendo pesquisada é a utilização de drogas com atividade

reversora na resistência a anti-parasitários, a chamada "reversão química da

resistência", que poderia prolongar o uso de importantes grupos químicos como os

benzimidazóis e as lactonas macrocíclicas.

II. REVISÃO DE LITERATURA

A resistência às drogas é atualmente o maior entrave no controle de parasitos

dos animais de produção (NARI & EDDI, 2003). É definida como a habilidade de uma

população de parasitos em tolerar doses de drogas que seriam letais para a maioria

dos indivíduos de uma população normal (susceptível) desta mesma espécie (STONE,

1972). Esta é uma característica genética, portanto, herdável.

Os benzimidazóis, introduzidos no mercado em 1962, foram os primeiros anti-

helmínticos com amplo espectro de ação, apresentando elevada eficácia contra

nematódeos gastrintestinais. No entanto, já em 1964 foram encontradas cepas de

campo de H. contortus resistentes a este grupo químico (CONWAY, 1964; DRUDGE et

al., 1964). No Brasil, a resistência deste parasito a este princípio ativo foi relatada pela

primeira vez em 1967 no Rio Grande do Sul por SANTOS & GONÇALVES (1967).

A partir de 1979, surgiu outro grupo químico de amplo espectro de ação,

denominado lactonas macrocíclicas (LM). Tais compostos resultam do processo de

fermentação de um actinomiceto do gênero Streptomyces, encontrado no solo (BURG

et al., 1979). A este grupo pertencem as avermectinas (a sem + verm verme + ect

ectoparasita + in produto farmacêutico): ivermectina, abamectina, doramectina,

eprinomectina e selamectina.

O produto semi-sintético, 22,23 – dihidroavermectin B

, ou ivermectina, foi o

primeiro entre as LM a ser comercializado (CHABALA et al., 1980; EGERTON et al.,

1980) e graças a sua elevada eficácia contra artrópodes e nematódeos, segurança

clínica e novo modo de ação, tornou-se o tratamento de escolha para parasitoses de

bovinos, ovinos, caprinos, suínos e eqüinos (CAMPBELL et al., 1983; CAMPBELL &

BENZ, 1984).

O exato mecanismo de ação das LM ainda não está esclarecido, devido a

algumas características da droga, tais como, apresentar vários locais de ação, várias

espécies alvo com sensibilidades diferentes a seu efeito e pouca solubilidade em

soluções aquosas (TURNER & SCHAEFFER, 1989).

A primeira hipótese formulada para explicar o modo de ação das LM constitui em

sua atuação como agonistas do ácido gama amino butírico (GABA), aumentando a

permeabilidade dos íons cloro (Clˉ), resultando em paralisia muscular (MELLIN et al.,

1983; ALBERT et al., 1986).

Esta hipótese poderia explicar porque as avermectinas não agem sobre

cestódeos e trematódeos, uma vez que estes não possuem receptores GABA. Sua

baixa toxicidade para os mamíferos é explicada pela impossibilidade de atravessar a

barreira hematocefálica, não atingindo, assim, os receptores GABA restritos quase

exclusivamente ao sistema nervoso central (MARTIN et al., 2002). Recentemente,

confirmou-se que os receptores GABA estão associados ao modo de ação das LM nos

insetos (LUDMERER et al., 2002).

Observações de alguns autores desencadearam a hipótese de que poderia haver

outro mecanismo de ação nos nematódeos. SCOTT & DUCE (1987) demonstraram que

feixes musculares específicos do gafanhoto (Schistocerca gregaria) que recebem

apenas inervação excitatória, não sendo sensíveis ao GABA, exibiram resposta

irreversível à ivermectina. MARTIN & PENNIGTON (1988), utilizando um modelo

experimental com Ascaris suum, observaram que não houve ação da ivermectina nos

canais GABA, mas sim em canais diferentes de cloro. Outro fato que suporta esta

hipótese é a presença, em mamíferos, de receptores GABA periféricos, que não

possuem barreira protetora como os do sistema nervoso central, estando vulneráveis a

ação destas drogas. Deste modo, como explicar porque as LM não agem nestes

receptores e não causam efeitos nos mamíferos?

O uso do nematódeo de vida livre Caenorhabditis elegans permitiu estudos mais

aprofundados sobre o modo de ação de drogas anti-helmínticas. A primeira descoberta

importante, com este tipo de estudo, foi que a ivermectina liga-se especificamente a

proteínas de membrana deste nematódeo (SCHARFFER & HAINES, 1989).

Posteriormente, outros autores (SCHAEFFER et al., 1989, 1990; ARENA et al., 1995)

apontaram a presença de um possível receptor para ivermectina em nematódeos.

A manipulação do material genético de C. elegans permitiu a descoberta dos

canais de cloro potencializados pelo glutamato (GluCl), sensíveis à ivermectina e

presentes apenas em invertebrados (ARENA et al., 1991,1992). Os receptores GluCl

possuem duas subunidades, α e β, a primeira é sensível às avermectinas e a segunda

ao glutamato (CULLY et al. 1994). Estes receptores estão presente em diversos locais

do organismo dos invertebrados. Deste modo, as LM possuem vários locais de ação,

bloqueando transmissões interneurais de nervos excitatórios, agindo diretamente sobre

a musculatura (KASS et al., 1980), causando paralisia, principalmente da faringe

(GEARY et al., 1993). Há evidências da presença de receptores em células musculares

do aparelho reprodutivo de Ascaris (FELLOWES et al. 2000), o que pode explicar a

ação destas drogas na fertilidade e ovipostura dos nematódeos.

Em 1985, 33 meses após a introdução da ivermectina na África do Sul, foi

constatado o primeiro relato de resistência, quando foi observada redução na eficácia

anti-helmíntica em ovinos que haviam sido tratados 26 vezes ao longo de 32 meses.

Estes animais eram parasitados por Ostertagia spp., Trichostrongylus spp.,

Nematodirus spp., e em menor intensidade, por Haemonchus spp. Após os sucessivos

tratamentos com ivermectina, todos gêneros de nematódeos haviam sido eliminados,

exceto Haemonchus spp (CARMICHAEL et al., 1987).

Resistência à ivermectina também foi registrada em H. contortus no estado do

Rio Grande do Sul em 1989 em ovinos que haviam recebido 32 tratamentos no decorrer

de 54 meses. Ao final deste período, foi observado um acentuado declínio da eficácia

contra vermes adultos (apenas 59%) (ECHEVARRIA & TRINDADE, 1989). Outro

estudo, realizado no mesmo Estado, investigou 29 rebanhos de ovinos, sendo

observada resistência em H. contortus à ivermectina, em oito deles (FARIAS et al.,

1997). Em Santa Catarina, a resistência deste nematódeo à ivermectina (0,2 mg/kg) foi

constatada em 77% dos 65 rebanhos estudados (RAMOS et al., 2002). Entre dez

propriedades avaliadas na região de Londrina, oito apresentaram ocorrência de

resistência, prevalecendo o gênero Haemonchus spp. (CUNHA FILHO et al., 1998).

Também no Paraná, SOCCOL et al. (1996) relacionaram casos clínicos agudos, e

mortalidade causados por H. contortus resistente à ivermectina. Em São Paulo, foi

avaliada a eficácia anti-helmíntica da ivermectina (0,2 mg/kg) em nove propriedades

rurais, sendo observada ineficácia da droga em quatro delas (AMARANTE et al., 1992).

Melo et al. (2003), no Ceará, avaliaram a eficácia de oxfendazole, levamisole e

ivermectina em 25 rebanhos (16 de ovinos, 7 de caprinos e 2 mistas) e observaram

prevalência da resistência em 88%, 41% e 59% rebanhos ovinos e 87.5%, 75% e

37.5% em caprinos, respectivamente, sendo Haemonchus o principal gênero. Em

alguns destes trabalhos estão relatados casos de resistência múltipla desta espécie a

diversos grupos químicos, demonstrando a gravidade do problema.

A resistência de Haemonchus spp. às lactonas macrocíclicas é controlada por

um gene único e completamente dominante, quando em estágio larval e ligado ao sexo

no estágio adulto, estando mais presente em fêmeas (LE JAMBRE et al., 2000).

Modelos matemáticos sugerem que o desenvolvimento de resistência às lactonas

macrocíclicas se desenvolve mais rapidamente que para os benzimidazóis, nos quais é

determinada por mais de um gene (BARNES et al., 1995).

Nos nematódeos, o fenômeno da mutação parece estar ausente, sendo a

resistência causada pela seleção dentro de uma população de genes que conferem

esta característica, pela sua existência, antes do primeiro contato com a droga

(MCKENZIE, 1985). Neste processo, ocorrem três fases: na inicial há baixa freqüência

de indivíduos resistentes na população; na intermediária, com a contínua exposição à

droga, há aumento dos indivíduos heterozigotos (SR); na última fase, os indivíduos

homozigotos (RR) predominam na população e não são eliminados pela droga

(PRICHARD et al., 1990).

As características genéticas que conferem resistência são traduzidas em

diferentes modificações bioquímicas e moleculares que determinam a diminuição do

efeito da droga contra o parasito. Podem ocorrer as seguintes modificações: alterações

de sistemas enzimáticos necessários para que se produza o efeito da droga, diminuição

do número e/ou da afinidade dos receptores aos quais a droga se liga, modificações

estruturais que reduzem a captação do princípio ativo, aumentem do metabolismo

enzimático e/ou efluxo (MOTTIER & LANUSSE, 2001).

O mecanismo de resistência a lactonas macrocíclicas pode ser resultado de mais

de uma alteração genética (KÖHLER, 2001). Comparações entre o polimorfismo de

cepas de H. contortus sensível e resistente à ivermectina revelaram que há seleção de

um gene que codifica sub-unidades de canais de cloro ativados por glutamato (GluCl)

(BLACKHALL et al., 1998a), os quais estão relacionados ao mecanismo de ação deste

grupo químico (CULY et al., 1994; ARENA et al., 1995).

Estudos com Caenorhabditis elegans, que teve todo seu genoma seqüenciado,

revelaram alterações dos genes denominados Dyf, que expressam produtos

responsáveis pela captação da ivermectina na cutícula do nematódeo, causando

resistência nos parasitos, que tornam-se menos permeáveis à droga (DENT et al.,

2000).

O primeiro gene, associado à resistência das lactonas macrocíclicas em H.

contortus foi o PGP-A, responsável pela expressão de uma glicoproteína de membrana,

a fosfo-glicoproteína (GP-P), membro da família dos transportadores tipo ABC com

cassete de ligação com ATP (XU et al., 1998). Muitos organismos, inclusive os

vertebrados, possuem GP-P que age como transportadora na membrana plasmática,

retirando componentes estranhos à célula, estando, também, envolvida nos precessos

de absorção, distribuição, metabolismo e excreção de compostos xenobióticos

(MEALEY, 2004).

A GP-P está sendo muito estudada, pois o aumento de sua expressão está

relacionado à resistência de células cancerígenas humanas à quimioterápicos, uma vez

que age transportando a droga para fora da célula tumoral. Este fenômeno é

denominado resistência múltipla a drogas (RMD), pois pode envolver vários grupos

químicos (JULIANO & LING, 1976; GOTTESMAN & PASTAN, 1993). Resistência

múltipla a drogas também é observada em parasitos do gênero Trypanosoma,

protozoário de grande importância para o homem e para os animais (KERBOEUF et al.,

2003).

A primeira evidência de que as lactonas macrocíclicas poderiam interagir com a

GP-P surgiu ao acaso, quando camundongos, cujo gene mdr1a (responsável pela

expressão de GP-P) havia sido bloqueado, apresentaram infestação por sarna e

necessitaram de tratamento, sendo aplicado ivermectina spray. Após tratamento, os

camundongos apresentaram sintomas neurotóxicos e, decorridas 24 horas, estavam

todos mortos. Descobriu-se que nestes camundongos havia um defeito na barreira

hemato-encefálica, sendo encontrada concentração de ivermectina no sistema nervoso

central 100 vezes maior que em animais normais (SCHINKEL et al., 1994).

Em H. contortus, o RNAm relacionado à expressão de GP-P localiza-se

predominantemente no tecido do trato digestivo, destacando-se a faringe (SMITH &

PRICHARD, 2002). Neste segmento anatômico há intenso transporte de membrana,

deste modo, esta proteína participaria da excreção, no trato digestivo, de moléculas de

drogas, como as lactonas macrocíclicas.

A clara evidência de associação entre genes da GP-P e a resistência a lactonas

macrocíclicas sugere que estes genes possam ser marcadores moleculares úteis para

seu diagnóstico (PRICHARD, 2002). Até o momento, sabe-se que existem três

homólogos de GP-P relacionados a resistência à ivermectina em H. contortus (XU et al.,

1998; LE JAMBRE et al., 1999; SANGSTER et al., 1999).

Considerando o surgimento de estirpes de nematódeos com resistência múltipla

às drogas e o fato dos princípios ativos disponíveis para o controle químico poderem

ser considerados um recurso não renovável, a procura por medidas que possam

reverter o quadro de resistência aos atuais grupos químicos parasiticidas pode trazer

uma importante alternativa no controle anti-parasitário. Existem diferentes estratégias

de reversão que estão sendo avaliadas por diversos autores, entre elas: reversão

natural, diluição dos genes resistentes, substituição total de populações e utilização de

drogas moduladoras.

A técnica da reversão natural consiste em um retorno à susceptibilidade quando

da ausência da pressão de seleção pela droga por longos períodos (acima de 10 anos).

Segundo esta teoria, os parasitos dentro de uma população que possuem os genes que

conferem a resistência a determinado princípio ativo estão, inicialmente, em frequência

muito baixa por apresentarem menor vantagem de sobrevivência quando comparados

aos nematódeos susceptíveis. A população resistente que foi selecionada com o uso de

determinado princípio ativo, normalmente, apresenta-se em desvantagem biológica em

relação aos parasitos susceptíveis, assim sendo, na ausência da seleção por anti-

helmínticos, a população susceptível teria a tendência a predominar novamente

(JACKSON & COOP, 2000). Porém, segundo SANGSTER (1999), os isolados de

parasitos resistentes apresentam pouca ou nenhuma tendência a reverterem à

susceptibilidade. Tal fato se deve à permanência de alelo para a resistência na

população, mesmo após um longo período de desuso de determinada droga. Assim, a

reutilização do princípio ativo precedente do processo de reversão, pode resultar em

um retorno rápido da resistência.

Os resultados obtidos pela técnica da reversão natural são controversos.

BORGESTEEDE & DUYN (1989) não observaram aumento de susceptibilidade ao

benzimidazole contra um isolado resistente de H. contortus após seis anos de

suspensão do uso desta molécula. WARUIRU (1997) também observou que uma

população de H. contortus manteve a resistência a benzimidazol e levamizol, apesar do

fato desta cepa não ter sido exposta a estes princípios ativos durante quatro anos, em

um rebanho ovino em Kênia. Por outro lado, MELO et al. (2004) observaram em uma

propriedade no Estado do Ceará, onde houve suspensão do uso de benzimidazóis em

ovinos durante dois anos, aumento da eficácia de 91% em 2001 para 97% em 2003.

WYK & VAN SCHALKWYK (1990) propuseram a diluição dos genes da

resistência em H. contortus por meio de infecções artificiais com populações de

parasitos susceptíveis. Com o objetivo de obter resultados sob condições de campo,

todos os animais de duas propriedades, onde havia resistência múltipla a drogas, foram

medicados com uma formulação altamente eficaz e inoculados com larvas de uma

estirpe susceptível. Os resultados demonstraram aumento da susceptibilidade das

populações desta espécie nas duas áreas, inclusive nos parasitos presentes nos

animais que nasceram naquelas pastagens após o início do experimento e que não

haviam sido inoculados.

A técnica de reversão da resistência por meio da substituição total de uma

população de Teladorsagia circuncincta resistente a benzimidazóis por outra

susceptível, foi avaliada na França por MOUSSAVOU-BOUSSOUGOU et al. (2006).

Foram utilizados diferentes piquetes onde havia histórico de resistência a

benzimidazóis, com freqüência genotípica de até 89%, os quais permaneceram sem

animais durante sete meses. Prosseguindo, os piquetes receberam ovinos

experimentalmente infectados por um isolado de T. circuncincta susceptível a

benzimidazóis. Em período pré determinado, estes ovinos foram tratados com

fenbendazole, sendo observada eficácia entre 97% e 99% na redução da carga

parasitária e freqüência da resistência entre 0 e 3% na avaliação genotípica desta

população após a substituição e o tratamento com benzimidazol. Segundo estes

autores, para o estabelecimento desta nova população de helmintos deve-se evitar

tratamentos com benzimidazóis durante dois anos e apontaram, ainda, a necessidade

do monitoramento da eficácia por um longo período, alertando para algumas possíveis

dificuldades na introdução de uma nova população de nematódeos em uma

propriedade, entre elas, o risco de emergência de novos patógenos.

Segundo JACKSON & COOP (2000), o sucesso da reversão depende da

frequência dos genes de resistência na população parasitária, podendo ocorrer pouca

ou nenhuma reversão quando houver predominância de homozigotos resistentes. Por

outro lado, quando a maioria for heterozigota, a chance de reversão é maior.

Atualmente, um conceito muito utilizado no tratamento químico de células

tumorais é a reversão da resistência múltipla a fármacos, empregando-se drogas

moduladoras. Estes moduladores agem competindo com as drogas de interesse

terapêutico por locais de ligação na GP-P, impedindo que sejam retiradas da célula alvo

e/ou inibindo a hidrólise de ATP (WATANABE et al., 1995, GARRIGOS et al., 1997).

O verapamil é um bloqueador de canais de cálcio (TSURUO et al., 1981) que

está sendo utilizado com esta finalidade. O primeiro estudo a respeito do uso de

verapamil como agente modulador reversor de resistência a anti-helmínticos foi

realizado por BEUGNET et al. (1997), sendo observada reversão parcial da resistência

de H. contortus a benzimidazóis por meio de teste in vitro de eclodibilidade de ovos. O

aumento da atividade anti-helmíntica de ivermectina e de moxidectina, associados ao

verapamil, foi observado em um modelo experimental utilizando gerbils

experimentalmente infectados com larvas de H. contortus resistentes (MOLENTO &

PRICHARD, 1999). O estudo in vitro de migração de larvas em gel também demonstrou

que há aumento de eficácia destas associações medicamentosas, contra cepas de H.

contortus resistente a estas lactonas macrocíclicas (MOLENTO & PRICHARD, 2001).

Experimento realizado com ovinos demonstrou que o verapamil, administrado via

subcutânea (3mg/kg, 3x), proporcionou aumento significativo dos parâmetros

farmacocinéticos como área sob a curva e pico de concentração máxima de

ivermectina, administrada via oral (MOLENTO et al., 2004). Segundo os autores, o

verapamil inibe a ação de GP-P presente no fígado e no intestino, reduzindo a excreção

biliar, além de aumentar a absorção intestinal da droga.

O verapamil é considerado modulador de GP-P de primeira geração e outras

drogas estão sendo estudadas para esta finalidade. Segundo MEALEY (2004), diversos

principios ativos poderiam ser utilizados como inibidores seletivos de GP-P, entre eles

os anti-depressivos floxetina, erva-de-São-João e paroxetina; os agentes

antimicrobianos eritomicina, itraconazol e cetoconazol; os opióides metadona e

pentazocina; os antiarrítmicos cardíacos verapamil, amiodarona, carvedilol, quinidina e

nicardipina; imunosupressores, incluindo a cyclosporina, tacrolimus e outros, como

bromocriptina, clorpromazina e tamoxifen.

Reversão altamente significativa (acima de 50%) da resistência ao tiabendazol foi

obtida em ovos de H. contortus previamente expostos a lecitina, sendo desconhecido

ainda o exato mecanismo de ação (KERBOUEF et al., 2002). RIOU et al. (2003)

observaram que a composição da membrana celular, especialmente os lipídios,

condiciona a atividade da GP-P, havendo aumento da resistência anti-helmíntica em H.

contortus quando há redução de colesterol e, o efeito contrário, quando há acréscimo

desta substância. O efeito de itraconazol e valspodar como moduladores de GP-P foi

observado por BALLENT et al. (2006) por meio de testes in vitro e in vivo.

LIFSCHITZ et al. (2002) após a administração de loperamida, juntamente a

moxidectina em ovinos, observaram que o uso de estratégias baseadas na combinação

de endectocidas e substratos de GP-P aumentam a biodisponibilidade da droga, e,

conseqüentemente, a eficácia anti-helmíntica contra nematódeos resistentes. O mesmo

efeito foi observado por DUPUY et al. (2003) em ovinos medicados com quercetina e

moxidectina.

A redução dos investimentos na descoberta de novas drogas anti-parasitárias,

pela indústria farmacêutica veterinária ou por centros de pesquisas e o limitado

conhecimento da biologia básica dos parasitos, caminho que poderia apontar para

novos mecanismos de ação de drogas, diminuem a perspectiva do surgimento de

novos grupos químicos, especialmente aqueles com excelente ação endectocida, como

as lactonas macrocíclicas (GEARY & THOMPSON, 2003). Desta forma, qualquer

medida que possibilite o prolongamento do período de utilização deste grupo químico é

importante.

III. OBJETIVOS

Em face à ausência de trabalhos com a avaliação de bloqueadores da GP-P em

ovinos experimentalmente infectados, assim como de estudos moleculares de estirpe

brasileira de campo de H. contortus resistente à ivermectina, os objetivos do presente

trabalho foram:

1. caracterização e isolamento de estirpes de campo de H. contortus resistente e

susceptível à ivermectina;

2. avaliar a ação do verapamil como reversor da resistência à ivermectina em H.

contortus, por meio de testes in vitro e in vivo;

3. caracterização molecular de pontos de mutação gênica relacionados à expressão

de glicoproteína P em H. contortus resistente à ivermectina, submetido a diferentes

tratamentos.

IV. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Caracterização de estirpes de Haemonchus contortus resistente e

susceptível à ivermectina

Foram feitas várias tentativas para encontrar uma estirpe de H. contortus

sensível à ivermectina. Dezoito propriedades rurais no Estado de São Paulo foram

visitadas, sendo colhidas amostras de fezes de 850 ovinos para realização de exames

coprológicos (contagens de OPG e coproculturas) antes e após o tratamento com

ivermectina, via subcutânea (200 μg/kg de peso vivo).

A estirpe de H. contortus resistente à ivermectina foi obtida de ovinos

pertencentes ao setor de ovinocultura da Faculdade de Ciência Agrárias e Veterinárias

de Jaboticabal - Unesp, onde eram criados cerca de 150 animais da raça Ile de France,

mantidos em pastagens do gênero Cynodon sp. Estes animais eram submetidos a

freqüentes tratamentos anti-helmínticos ao longo do ano, utilizando-se diversos

princípios ativos, conforme a disponibilidade. Devido ao histórico do rebanho e à

realização de exames coproparasitológicos prévios, os quais levantaram a suspeita de

ineficácia da ivermectina, realizou-se um teste anti-helmíntico controlado (necropsias),

seguindo-se a metodologia recomendada por WOOD et al. (1995).

Dez ovinos naturalmente infectados por nematódeos, incluindo o gênero

Haemonchus sp foram selecionados, por meio de três contagens diárias consecutivas (-

3, -2 e -1) de ovos por grama de fezes (OPG) (GORDON & WHITLOCK, 1939) em,

sendo o diagnóstico genérico quantificado por meio de coproculturas (Robert &

O’Sulivan, 1950). Os animais foram listados em ordem decrescente pelo número médio

de OPG e distribuídos em dois grupos com cinco repetições cada. Os dois ovinos com

contagens mais elevadas foram destinados à repetição número um, os dois seguintes à

repetição dois e assim, consecutivamente, até a constituição das cinco repetições. Após

sorteio, um dos grupos foi tratado com ivermectina, via subcutânea (200 µg/kg de peso

vivo) e outro mantido como controle (não tratado), conforme demonstrado na Tabela 1.

Tabela 1. Contagens de OPG, sexo, e peso no período pré-tratamento dos ovinos

experimentais, naturalmente infectados por Haemonchus contortus.

CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

-3 -2 -1 Média

5 M 400 525 470 465 20 -

6 M 800 755 830 795 20 -

10 M 600 675 650 642 20 -

13 M 475 425 500 467 20 -

18 M 525 500 550 525 20 -

579

2 M 675 600 625 633 21,7 0,43

5 M 750 875 775 800 20,5 0,41

6 F 225 250 200 225 19,0 0,38

7 F 625 500 525 550 18,4 0,37

113 M 550 500 625 558 17,0 0,34

553

Média

Sexo

Dose

(ml)

Controle

Ivermectina

Média

Ovino

Tratamento

Contagens de OPG/Dias pré-tratamento

Peso

(kg)

No sétimo dia pós-tratamento os ovinos foram sacrificados e submetidos à

necropsia parasitológica para estimativa da carga parasitária. O sistema digestório foi

separado, por meio de ligaduras duplas, nos diferentes segmentos anatômicos

(abomaso, duodeno, jejuno, íleo, ceco, cólon e reto), sendo seus conteúdos removidos,

e as mucosas raspadas. O material obtido foi lavado em tamis (0,297mm e tyler 48) e a

parte sólida retida, fixada em solução de formol 10% a 80

C. Apesar da localização de

H. contortus ser restrita ao abomaso, durante a necropsia pode haver passagem do

material presente neste órgão para outros compartimentos do sistema digestório, o que

justifica a pesquisa deste parasito nos diferentes segmentos anatômicos.

Para digestão da mucosa abomasal foi empregada metodologia preconizada por

WOOD et al. (1995), ou seja, o órgão foi imerso em solução de pepsina 1% e ácido

clorídrico 3% a 37

C durante cinco horas.

A colheita, contagem e identificação genérica dos parasitos presentes em cada

órgão foram efetuadas em microscópio estereoscópio. O diagnóstico específico foi

realizado por meio de microscopia de luz comum (LEVINE, 1968; COSTA, 1982; UENO

& GONÇALES, 1998).

4.2. Isolamento e manutenção da estirpe pura de H. contortus resistente à

ivermectina

Fêmeas de H. contortus foram colhidas de abomaso de ovinos, pertencentes ao

mesmo rebanho no qual a estirpe havia sido caracterizada como resistente à

ivermectina (item 4.1) e imediatamente colocadas em placas de Petri contendo solução

fisiológica, sendo mantidas em estufa a 36

C durante duas horas para realização de

ovipostura. Posteriormente, os ovos foram colocados em vermiculita e mantidos a 27

durante dez dias, quando foram obtidas larvas de terceiro estádio.

Dois ovinos, com idade entre dois e quatro meses, foram adquiridos e medicados

com anti-helmínticos até apresentarem-se livres de infecção por H. contortus.

Posteriormente, foram infectados com 1000 larvas e permaneceram no setor de ovinos

do Centro de Pesquisa em Sanidade Animal (CPPAR/UNESP), em baias suspensas

individuais que impossibilitavam possíveis reinfecções helmínticas, recebendo silagem

de milho e água ad libitum.

4.3. Avaliação da atividade reversora do verapamil: teste in vitro – migração

de larvas em gel de ágar

4.3.1 Larvas infectantes (L3) de H. contortus

Larvas (L3) de H. contortus da cepa resistente, oriundas de coproculturas

realizadas com amostras de fezes dos ovinos experimentalmente infectados, foram

utilizadas para avaliação in vitro da reversão da resistência à ivermectina pelo

verapamil.

4.3.2 Produtos

Ivermectina 0,08% (Ivomec

Solução Oral, Merial Saúde Animal).

Verapamil (Sigma, St Luis, Missouri).

4.3.3 Procedimentos experimentais

Foi utilizada a metodologia de D’ASSONVILLE et al. (1996) modificada por

MOLENTO & PRICHARD (2001).

Número variável de larvas infectantes (L3) de H. contortus foi colocado em

contato com solução de hipoclorito de sódio 0,08%, em estufa tipo B.O.D. à

temperatura de 27

C, durante aproximadamente duas horas. Quando mais de 90% das

larvas viáveis estavam sem a bainha, o material foi lavado três vezes com água

destilada e separado em alíquotas de 0,5 mL. A esta alíquota foi adicionado 0,5 mL de

solução contendo os tratamentos em diferentes concentrações, conforme o grupo

experimental (Tabela 2). Após homogeneização, esta solução contendo larvas e a

droga foi mantida em estufa a 27

C, durante seis horas. Decorrido este período, foi

adicionado 1 mL de solução de ágar (1,4%) a 45

C. A solução final (2mL) contendo

ágar, larvas e a droga foi transferida para uma placa de Petri contendo um aparato

especial (Figua 1) e mantida em estufa a 27

C, onde foi exposta a uma fonte de luz

incandescente de 60W, durante 18 horas (Figura 2.).

Este aparato especial consiste em um cilindro de plástico (0,8 cm de altura x 3,0

cm de diâmetro) sobreposto a duas telas metálicas, uma delas com abertura de 38 µm

e outra com abertura maior (Figura 1). A placa de Petri contendo o aparato foi

previamente preenchida com 22 mL de água destilada e mantida em congelador. A

água congelada deve cobrir as telas metálicas e o fundo do cilindro plástico, deixando

espaço suficiente neste para a solução final.

Figura 1. Placa de Petri contendo o aparato utilizado no teste de migração de larvas em

gel de ágar

Figura 2. Estufa do tipo BOD onde foram mantidas as placas de Petri, demonstrando

exposição a uma fonte de luz incandescente de 60W.

Como a exposição à luz estimula a movimentação das larvas que sobrevivem à

ação da droga, consideradas resistentes, migraram para fora do ágar, passando pelas

telas metálicas, indo para a porção aquosa, presente na placa de Petri. Esta porção

líquida foi transferida para um tubo plástico de 50 mL. Após sedimentação, o

sobrenadante foi retirado, mantendo volume de 10 mL no tubo. Deste volume, foram

retiradas três alíquotas homogêneas (vortex) de 1 mL para quantificação das larvas. O

resultado das contagens de larvas em cada alíquota foi multiplicado por 10. O

experimento foi realizado em triplicata.

4.3.5 Grupos experimentais do teste in vitro

Tabela 2. Grupos experimentais e respectivos tratamentos aplicados às larvas de

Haemonchus contortus no teste de migração em gel de ágar. CPPAR/FCAV/UNESP,

Jaboticabal - SP, Brasil.

Grupo

Tratamento

Concentrações

Ivermectina

1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 e 256 µM

Ivermectina +

Verapamil

1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 e 256 µM de

ivermectina + 2 mM de verapamil

III

Verapamil

1, 2, 5, 10 e 100 mM

Ivermectina +

Verapamil

DL50 de ivermectina + 0, 1, 2, 5, 10 e 100 mM

de verapamil

Em cada grupo experimental houve uma triplicata que recebeu apenas água

destilada, servindo como controle para o cálculo de eficácia.

4.4 Avaliação da atividade reversora do verapamil: teste in vivo – avaliação anti-

helmíntica em ovinos experimentalmente infectados.

Os procedimentos experimentais foram realizados seguindo a metodologia

preconizada pelos guias internacionais para avaliação de anti-helmínticos para

ruminantes, "World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology"

(WOOD et al., 1995) e "International Co-operation on Harmonisation of Technical

Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products" (VERCRUYSSE et al.,

2001).

4.4.1 Local

Os animais foram mantidos, durante o período experimental, em baias individuais

pertencentes ao setor de ovinos do CPPAR/FCAVJ/UNESP”.

4.4.2 Seleção de ovinos

50 ovinos, sem raça definida, foram adiquiridos de um rebanho, pesados

individualmente e identificados com a colocação de brincos numerados na orelha direita

e medicados com a associação albendazole 2,0%, cloridrato de levamisole 2,55% e

ivermectina 0,08%

, via oral, na dose de 1mL/4kg de peso vivo, visando a eliminação

das infecções naturais por helmintos gastrintestinais. Todos os animais foram mantidos,

ao longo do experimento, em baias que impossibilitavam possíveis reinfecções

helmínticas.

4.4.3 Desafio

Cada animal foi inoculado, via oral, no mesmo dia para todos os grupos

experimentais, com 15 mL de água contendo 8460 larvas infectantes (L3) de H.

contortus resistente à ivermectina.

4.4.4 Delineamento experimental

Entre os 50 ovinos infectados experimentalmente, foram selecionados 42

animais por meio de três contagens consecutivas de OPG (32, 33 e 34 dias pós-

inoculação). Os animais foram listados em ordem decrescente pelo número médio de

OPG e distribuídos em sete grupos com seis repetições cada. Os sete ovinos com

Trimix

– Merial Saúde Animal Ltda.

contagens mais elevadas foram destinados à repetição número um, os sete seguintes à

repetição dois e assim, consecutivamente, até a constituição das seis repetições. Após

sorteio, foram realizados os seguintes tratamentos, via subcutânea, no 35

dia pós-

inoculação, nos grupos experimentais, conforme demonstrado na Tabela 3.

Tabela 3. Grupos experimentais e respectivos tratamentos administrados nos ovinos

experimentalmente infectados com larvas de Haemonchus contortus resistente à

ivermectina. CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

Grupo

ovinos

OPG

(-3,-2 e-1)

Tratamento

Dose

3520

Controle

3532

Ivermectina 1%

200μg de ivermectina/kg

III

3569

Verapamil

(oleoso)

3mg de verapamil/kg

3532

Verapamil

(aquoso)

3mg de verapamil/kg (3x)

3415

Ivermectina 1%

+ Verapamil

(aquoso)

200μg de ivermectina/kg + 3mg de

verapamil/kg (3x)

3584

Ivermectina 1%

+ Verapamil

(oleoso)

200μg de ivermectina/kg + 3mg de

verapamil/kg

VII

3656

Ivermectina 2%

+ Verapamil

(oleoso)

400μg de ivermectina/kg + 3mg de

verapamil/kg

Os ovinos pertencentes aos grupos IV e V receberam três doses de verapamil 3

mg/kg, via subcutânea, a cada 12 horas. Esta dose é a que apresenta menor ocorrência

de reação no local de administração em ovinos, utilizando-se como veículo solução

salina (Molento et al. 2004).

4.4.5 Exames coprológicos

Foram realizados novos exames coprológicos para avaliação do efeito dos

medicamentos na redução das contagens de ovos de nematódeos (OPG) no dias 1, 2,

3, 5 e 7 pós-tratamento (DPT) .

4.4.6 Necropsias parasitológicas

Foram realizadas necropsias parasitológicas no sétimo dia DPT, segundo

metodologia descrita no item 2.1, exceto na forma de conservação dos parasitos, sendo

utilizado álcool absoluto.

4.5 Estudo genotípico relacionado à glicoproteína P e canais de cloro ativados

por glutamato na estirpe de H. contortus resistente à ivermectina

4.5.1 Amostras de parasitos

50 exemplares de H. contortus machos, foram colhidos à necropsia do abomaso

de ovinos de cada grupo experimental (Tabela 3) e imediatamente lavados quatro

vezes com solução RPMI, acondicionados individualmente em tubos tipo eppendorf,

congelados e mantidos em temperatura de –20

C até o momento de sua utilização.

4.5.2 Extração de DNA

O DNA total de cada amostra foi extraído utilizando o DNeasy® Tissue Kit - Qiagen,

segundo protocolo preconizado pelo fabricante, que utiliza a tecnologia avançada da

membrana de gel de sílica. Trata-se de um processo rápido e eficiente de purificação

do DNA celular total, sem necessidade de extração orgânica ou precipitação com

etanol. Cada amostra de DNA foi eluída em 150 μL de Buffer AE (10 mM de Tris-HCl;

0,5 mM de EDTA; pH 9.0).

4.5.3 Amplificação de DNA relacionado à PG-P

Um fragmento de DNA, relacionado à expressão de GP-P, foi amplificado por

meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). A amplificação foi realizada com uma

solução de reação de 50 μL, contendo 5 μL 10x de Taq Buffer, 5 μL 2 mM dNTPs (Dntp

Set - Eppendorf

), 2 μL 50 mM MgCl

, 1 μL de 20mM de primer solutions, 1 U Taq

polimerase (Platinum Taq Dna Polimerase High Fidelity - Invitrogen

), 2 ng DNA

template e água até completar 50 μL. Um iniciador direto PGP2s (5’-3’) com a seguinte

seqüência: GAAATGACTCAAGCACAAG e um iniciador reverso MX-D (5’-3’) com a

seqüência AGACAAAGACATTCAGAG (invitrogen

) foram empregados para amplificar

um fragmento de DNA de 840-bp que codifica a região de ligação de ATP em GP-P e

é altamente conservada, com 85-94% de homologia a GP-P ou proteínas relacionadas

à resistência múltipla, oriundas de outras fontes (BLACKHALL et al., 1998a).

Após desnaturação inicial a 95

C, durante quatro minutos, foram realizados 40

ciclos de desnaturação a 95

C durante 15 segundos, anelamento a 53

C durante 30

segundos e alongamento a 70

C durante um minuto e 30 segundos, após a realização

dos ciclos, foi mantida a temperatura de 70ºC por cinco minutos (termociclador PTC-

100 MJResearch Inc

Alíquotas dos produtos da PCR foram analisados em eletroforese em ágar gel

contendo brometo de etídio (0,5 mg/mL). Os produtos restantes foram purificados

utilizando QIAquick (Qiagen) e eluído em água para seqüenciamento.

4.5.4 Amplificação de DNA relacionado aos canais de cloro ativados por

glutamato (GluCl)

Para a amplificação de um fragmento de DNA relacionado à expressão dos

canais de cloro ativados por glutamato, preparou-se uma solução de reação contendo 5

μL 10x de Taq Buffer, 5 μL 2 mM dNTPs (Dntp Set - Eppendorf

), 2 μL 50 mM MgCl

, 1

μL de 20mM de primer solutions, 1 U Taq polimerase (Platinum Taq Dna Polimerase

High Fidelity - Invitrogen

), 2 ng DNA template e água até completar 50 μL. Um

iniciador direto F4275 (5’-3’) com a seguinte seqüência: GAA TTT TTC TTA CAG GTT

GG e um iniciador reverso R603 (5’-3’) com a seqüência CGG TTT TTC CTC TTT CCA

(invitrogen

Após desnaturação inicial a 94

C, durante três minutos, foram realizados 40

ciclos de desnaturação a 94

C durante 15 segundos, anelamento a 53

C durante 25

segundos e alongamento a 72

C durante 20 segundos. Após a realização dos ciclos, foi

mantida a temperatura de 72ºC por cinco minutos.

Alíquotas dos produtos da PCR foram analisados em eletroforese em ágar gel

contendo brometo de etídio (0,5 mg/mL). Os produtos restantes foram purificados

utilizando QIAquick (Qiagen) e eluído em água para seqüenciamento.

4.5.5 PCR para Sequenciamento

As reações para o seqüenciamento foram realizadas em microplacas utilizando

0,5 μL dos terminadores Big Dye, 2 μL de Primer, 1 μL de DNA plasmidial, 3,5 μL de

tampão Save Money 2,5 X e completando a reação com H

O mili-Q estéril para 10 μL.

Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram os mesmos da amplificação. A

reação foi submetida a um termociclador (PTC-100 MJResearch Inc

) seguindo o

mesmo programa utilizado anteriormente

4.5.6 Lavagem dos produtos da PCR

Após a reação, as amostras foram preparadas para o seqüenciamento, sendo

adicionados 80 μL de isopropanol 75%, em seguida, as placas foram vedadas com

selos de alumínio e agitadas levemente. Posteriormente, as amostras permaneceram

durante 15 minutos em temperatura ambiente e centrifugadas a 4000g, por 30 minutos,

a 20ºC. Descartado o sobrenadante, as placas foram deixadas por cinco minutos,

invertidas em papel absorvente. Nelas, foram adicionados 200 μL de etanol 70%, sendo

então novamente seladas e centrifugadas a 4000g, por 10 minutos, a 20ºC. Esta última

operação foi repetida novamente. Foi colocado um pedaço fino de papel absorvente

sob a placa e esta, invertidamente, centrifugada por 20 segundos em aceleração um e

breque um. Na seqüência, a placa foi seca por cinco minutos na bomba de vácuo.

Em seguida, as amostras foram ressuspendidas com 9μL de Hi-Di Formamide –

Catálogo – P/N 4311320 ABI Prism) e desnaturadas a 95º C por cinco minutos e

colocadas no gelo por mais dois minutos.

O sequenciamento dos produtos da PCR foi realizado no seqüenciador modelo

ABI 3700 – Perkin Elmer.

4.5.7 Análise dos resultados do sequenciamento

As sequências de bases obtidas foram alinhadas utilizando-se o programa

Bioedit Sequence Alignment Editor (HALL, 1999) . Para o conjunto de sete amostras

amplificadas com cada um dos quatro iniciadores (PGP2, MXD, F 4275 e R603), foram

contruídas as matrizes de identidade por meio deste mesmo programa.

Foram pesquisadas analogias com sequências depositadas no banco de dados

Genbank, por meio do endereço eletrônico: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

4.6 Análise estatística

Nas avaliações anti-helmínticas em ovinos (itens 4.1 e 4.4), foi utilizado um

delineamento do tipo em blocos casualizados. Para Análise de Variância dos dados

obtidos, utilizou-se uma transformação [log (x + 1)], preconizada por LITTLE & HILLS

(1978). As análises foram realizadas aplicando-se o teste F e as médias foram

comparadas pelo teste de Tukey, utilizando-se o Software SAS (1996).

Para o cálculo da eficácia terapêutica das formulações ensaiadas, foi utilizada a

fórmula recomendada por WOOD et al. (1995).

100x

controle grupo do helmintos de número do Média

tratadogrupo do - controle grupo do

helmintos de número do Média helmintos de número do Média

eficácia de Percentual

Para a avaliação da atividade reversora do verapamil: teste in vitro – migração de

larvas em gel de ágar, calculou-se a DL50 de ivermectina contra a cepa resistente

isolada de H. contortus, sendo utilizadas diluições de 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128

μMol de ivermectina/0,5 mL (Grupo I). Dos resultados obtidos, construiu-se uma curva

sigmóide da relação dose x resposta, sendo os dados das contagens de larvas que

migraram pelo gel (sobreviventes) transformados em logaritmo e, posteriormente,

normalizados, utilizando o programa GraphPad Prism. Version 4.0 (GraphPad Software,

San Diego, California,. USA, http://www.graphpad.com), utilizando-se a seguinte

equação:

Y=(100*X^-1.039) / [(DL50^-1.039) + (X^-1.039)]

Em que:

X= logaritmo da concentração

Y= número de larvas

V. RESULTADOS

5.1 Caracterização de estirpes de Haemonchus contortus resistente e susceptível

à ivermectina

Não foi possível caracterizar uma estirpe de campo de H. contortus susceptível à

ivermectina no Estado de São Paulo Os percentuais de redução de OPG, nos 18

rebanhos ovinos avaliados, demonstraram claramente a insensibilidade, das diferentes

estirpes encontradas, à ivermectina. A maior eficácia encontrada foi de 75 % em uma

propriedade rural onde não é realizado o controle de verminoses com ivermectina há

mais de dois anos.

Em relação à estirpe resistente, a quantificação de H. contortus recuperados

após a necropsia de ovinos tratados e controle está condensada nas Tabelas 4 (médias

aritméticas) e 5 (média geométrica) e ilustrada na Figura 3. Os percentuais de eficácia e

os resultados da análise estatística efetuada estão também registrados na Tabela 5 e

na Figura 4

Observou-se maior número de H. contortus nos animais tratados com

ivermectina do que nos ovinos não tratados (grupo controle), particularmente, em

relação ao número de machos deste parasito (Tabela 4). Porém, quando estes dados

foram transformados em log (x+1), médias geométricas, houve um ajuste e o número

total de H. contortus presentes nos animais tratados foi estatisticamente inferior (P<

0,05) ao dos animais controle (Tabela 5). Resultado aceitável em face da discrepância

observada no número de nematódeos recuperados no abomaso do ovino número sete.

Tabela 4. Quantificação de Haemonchus contortus recolhidos de ovinos dos grupos

controle e tratado, necropsiados no sétimo dia pós-tratamento; percentuais de eficácia

da ivermectina1%. Médias aritméticas. CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP,

Brasil.

média

113

média

Eficácia (%)

Total de Haemonchus contortus

Total

Ovino

Tratamento

Machos

Fêmeas

373

214

255,8

294

191

579

103

199

154

205

179

93,4

94,6

424

194

127

162,4

96,4

155

137

157

100

111

0,00

3,11

0,00

Controle

Ivermectina

Tabela 5. Quantificação de Haemonchus contortus recolhidos de ovinos dos grupos

controle e tratado, necropsiados no sétimo dia pós-tratamento; percentuais de eficácia

da ivermectina1% e análise estatística. Médias geométricas. CPPAR/FCAV/UNESP,

Jaboticabal - SP, Brasil.

total

média

89,55

90,59

180,31

113

total

média

95,03

66,11

168,42

Eficácia (%)

Ovino

Tratamento

Total de Haemonchus contortus

Machos

Fêmeas

Total

0,00

27,02

6,59

9,9121

9,1340

11,1448

0,1229

2,2900

2,2553

2,5729

2,1072

1,9445

2,3324

0,0333

Probabilidade de significância do

valor de F

Valor de F

0,0848

0,0174

0,1531

0,0482

1,8633

2,1903

2,3139

2,4698

1,6128

11,2921

2,7634

9,7845

9,8091

Ivermectina

1,7404

1,2788

1,1461

1,4624

2,6284

2,1931

2,0043

1,8751

2,0492

2,1987

2,1399

2,0170

2,3010

1,7243

Controle

2,0000

1,9085

1,9777

1,7160

100

120

140

160

180

200

Machos Fêmeas Total

de H. contortus

Controle Ivermectina

Figura 3. Número de Haemonchus contortus recolhidos de ovinos dos grupos controle

e tratado, necropsiados no sétimo dia pós-tratamento. Médias geométricas.

CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

-10

-5

Machos Fêmeas Total

Eficácia (%)

Figura 4. Percentuais de eficácia (médias geométricas) da ivermectina 1% em ovinos

naturalmente infectados e necropsiados no sétimo dia pós-tratamento.

CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

A ivermectina 1% apresentou eficácia nula (-33,97%) quando calculada por meio

de médias aritméticas e alcançou 6,59% utilizando-se médias geométricas, sendo,

desta maneira, demonstrada claramente a resistência desta população de H. contortus.

5.2. Avaliação da atividade reversora do verapamil: teste in vitro – migração de

larvas em gel de agar.

Na Figura 5 está apresentada a curva sigmóide da relação dose x resposta,

utilizando-se apenas ivermectina em concentrções crescentes (Grupo I). O valor da

DL50 de ivermectina foi de 4,317 μMol, obtido por meio de análise de regressão não

linear, com 95% de probalilidade deste valor encontrar-se entre 3,045 e 5,900 μMol

A curva sigmóide da relação dose x resposta da ivermectina associada a 2mM de

verapamil (Grupo II) está apresentada na Figura 6.

Os percentuais de eficácia da ivermectina em diferentes concentrações

isoladamente (Grupo I) e associada ao verapamil (Grupo II) estão apresentados na

Tabela 6.

-10

100

110

120

-6

-5

-4

EC50

4.317e-006

concentração de ivermectina ( mol)

número de larvas

Figura 5. Curva dose x resposta da ivermectina contra a cepa de Haemonchus

contortus resistente (grupo I) e resultado do cálculo da DL50. CPPAR/FCAV/UNESP,

Jaboticabal - SP, Brasil.

-10

100

110

120

-6

-5

-4

EC50

4.239e-006

concentração de ivermectina ( mol)

número de larvas

Figura 6. Curva dose x resposta da ivermectina associada a 2mM de verapamil (grupo

II) contra a cepa de Haemonchus contortus resistente e resultado do cálculo da DL50.

CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

Tabela 6. Número médio de larvas de Haemonchus contortus sobreviventes e

percentuais de eficácia da ivermectina em diferentes diluições, isoladamente (Grupo I) e

associada ao Verapamil (Grupo II), provenientes do teste in vitro.

CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

Na Tabela 7, estão registrados as médias de larvas sobreviventes à exposição

ao verapamil em concentrações crescentes (Grupo III) e da associação deste com a

ivermectina DL50 (Grupo IV), assim como os percentuais de eficácia.

Tabela 7. Número médio de larvas de Haemonchus contortus sobreviventes e

percentuais de eficácia do verapamil em diferentes diluições, isoladamente

(Grupo III) e associado à ivermectina (Grupo IV). CPPAR/FCAV/UNESP,

Jaboticabal - SP, Brasil.

Ivermectina

(μM/0,5 ml)

Número de

larvas

Eficácia

Ivermectina

(μM/0,5 ml)

Número de

larvas

Eficácia

zero* 572 - zero* 2197 -

1 548 4,2 1 2050 6,69

2 474 17,2 2 2357 0,00

4 356 37,8 4 1063 51,62

8 278 51,4 8 1057 51,89

16 288 49,7 16 857 60,99

32 358 37,4 32 823 62,52

64 246 56,9 64 817 62,83

128

210 63,3

128 530 75,88

* As triplicatas receberam apenas água destilada, servindo como grupo controle

Grupo I: Ivermectina

Grupo II: Ivermectina + 2 mM Verapamil

Verapamil

(m mol)

Número de

larvas

Eficácia

Verapamil

(m mol)

Número de

larvas

Eficácia

zero* 467 - zero 219 53,1

1 420 10,0 1 310 33,6

2 417 10,7 2 177 62,1

5 417 10,7 5 157 66,4

10 430 7,9 10 180 61,4

100 458 1,9 100 27 94,3

* As triplicatas receberam apenas água destilada, servindo como grupo controle

Grupo III: Verapamil

Grupo IV: Ivermectina (LD50) +

Verapamil

100

200

300

400

500

sem ivermectina

com ivermectina (LD50)

[verapamil] mmol

número de larvas

100

200

300

400

500

sem ivermectina

com ivermectina (LD50)

[verapamil] mmol

número de larvas

Figura 7. Número médio e desvio padrão de larvas da cepa de H. contortus resistente,

sobreviventes ao tratamento com verapamil em diferentes diluições, isoladamente

(GrupoIII) e associado à ivermectina (Grupo IV). CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal -

SP, Brasil.

Os resultados de contagens de larvas após tratamento com verapamil

isoladamente e DL50 de ivermectina + verapamil, grupos III e IV, respectivamente,

estão ilustrados na Figura 7.

O verapamil isoladamente não apresentou ação nematodicida (Grupo II), mesmo

em altas concentrações (100mM).

A ivermectina associada ao verapamil (grupo II), quando comparada a esta

lactona macrocíclica administrada isoladamente (grupo I), apresentou percentuais de

eficácia superiores, exceto na concentração de 2μM/0,5mL. Observou-se que na

concentração de 128μM/0,5mL de ivermectina houve aumento de 12,55% de eficácia

quando adicionou-se 2mM de verapamil (Tabela 6).

Em contraste a estes resultados, a DL50 da ivermectina associada ao verapamil,

contra a estirpe resistente de H. contortus (Figura 6), permaneceu semelhante à da

ivermectina isolada (Figura 5).

Os resultados apresentados na Tabela 7 demonstram que concentrações

crescentes de verapamil associado à ivermectina (DL50) resultaram em aumento dos

percentuais de eficácia da ivermectina contra a cepa resistente de H. contortus (Grupo

IV). Verapamil na concentração de 1 mM não causou aumento na eficácia da

ivermectina, porém, nas concentrações de 2, 5 e 10, observou-se efeito reversor à

resistência, com acrécimo de 8,3% a 13,3% na eficácia antihelmíntica. A ivermectina

(DL50) administrada isoladamente apresentou eficácia de 53,1% contra larvas da

estirpe resistente de H. contortus, enquanto esta mesma concentração de ivermectina

associada a 100 mM de verapamil atingiu eficácia de 94,3%, ou seja, aumento de

41,2%.

5.3 Avaliação da atividade reversora do verapamil: teste in vivo – avaliação anti-

helmíntica em ovinos experimentalmente infectados.

Os resultados das contagens médias aritiméticas de OPG em ovinos dos grupos

controle e tratados estão inseridos na Tabela 8.

A quantificação de H. contortus recolhidos nos abomasos dos em ovinos

pertencentes aos controle e tratados, assim como os percentuais de eficácia, estão

apresentados nas Tabelas 9 (médias aritiméticas) e 10 (médias geométricas).

Ao final do estudo, não foi observada qualquer reação, de natureza local ou

sistêmica, em decorrência da administração de verapamil e de ivermectina.

Os resultados das contagens de OPG (Tabela 8) demonstram que houve

aumento do número de ovos de H. contortus eliminados junto às fezes dos animais de

todos os grupos, tratados e não tratado, em relação ao dia zero. Em relação ao grupo

controle, apenas o tratamento ivermectina 1% + verapamil 15% (veículo oleoso)

apresentou eficácia anti-helmíntica, embora tenha sido um valor muito reduzido

(14,84%).

O verapamil administrado isoladamente, assim como foi observado nos

resultados do teste in vitro, não apresentou atividade anti-helmíntica.

TABELA 8. Contagens médias de OPG*, realizadas em ovinos dos grupos controle e

tratados. Médias aritméticas. CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

1 3 5 7

Média 3533 2777 2348 4563 8166

Eficácia (%) - 17,48 46,90 9,88 0,00

Média 3569 3373 5970 5947 10363

Eficácia (%) - 0,00 0,00 0,00 0,00

Média 3533 3617 4095 7429 11576

Eficácia (%) - 0,00 7,40 0,00 0,00

Média 3415 4292 3608 4963 10006

Eficácia (%) - 0,00 18,41 1,99 0,00

Média 3585 2145 2432 4069 6165

Eficácia (%) - 36,27 45,00 19,64 14,84

Média 3657 2910 2591 5594 8130

Eficácia (%) - 13,51 41,41 0,00 0,00

Controle Média 3520 3365 4423 5063 7240

TRATAMENTO

Contagens de OPG / Dias pós-tratamento

Ivermectina 1%

Verapamil (veic.

oleoso)

Verapamil (veic.

aquoso) 3X

Ivermectina 1% +

Verapamil aquoso

Ivermectina

1%+Verapamil 15%

Ivermectina

2%+Verapamil 15%

Observou-se ineficácia da ivermectina administrada isoladamente, o que

confirma o fenótipo de resistência na estirpe de H. contortus, isolada e inoculada nos

ovinos experimentais (Tabela 9).

A ivermectina administrada concomitantemente ao verapamil em veículo aquoso,

porém em formulações distintas, apresentou eficácia de 36,02%, sendo 29,89% contra

machos e 42,15% contra as fêmeas de H. contortus. Este valor foi 4,65 vezes maior que

o apresentado pelo endectocida administrado isoladamente (7,75%). Estes resultados

demonstram uma reversão parcial da resistência deste nematódeo à ivermectina.

TABELA 9. Contagens médias de Haemonchus contortus, realizadas em ovinos dos

grupos controle e tratados. Médias geométricas. CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal -

SP, Brasil.

Machos Fêmeas Total

Média

408 506 937

Eficácia (%)

9,43 7,26 7,75

Média

480 597 1087

Eficácia (%)

0,00 0,00 0,00

Média

338 440 789

Eficácia (%)

24,95 19,43 22,35

Média

316 316 650

Eficácia (%)

29,89 42,15 36,02

Média

415 566 995

Eficácia (%)

7,97 0,00 2,14

Média

468 538 1042

Eficácia (%)

0,00 1,34 0,00

Controle Média

451 546 1016

Número de Haemonchus contortus

Verapamil (veic.

aquoso) 3X

Ivermectina 1% +

Verapamil aquoso

Ivermectina

1%+Verapamil 15%

Ivermectina

2%+Verapamil 15%

TRATAMENTO

Ivermectina 1%

Verapamil (veic.

oleoso)

A associação verapamil e ivermectina (1% ou 2%) em uma mesma formulação,

contendo veículo oleoso, não causou aumento na eficácia anti-helmíntica da

ivermectina contra esta estirpe resistente de H. contortus, sendo encontrado elevado

número de parasitos nos animais tratados.

5.4 Estudo genotípico relacionado à glicoproteína P e canais de cloro ativados

por glutamato na estirpe de H. contortus resistente à ivermectina

5.4.1 Glicoproteína P

Os fragmentos de DNA amplificados por meio da PCR, foram analisados em

eletroforese em ágar gel (1%) contendo brometo de etídio (Figura 8). As sete amostras,

oriundas de ovinos submetidos a tratamento com ivermectina, verapamil e/ou a

associação entre estes dois fámacos, apresentaram uma banda com o tamanho de

aproximadamente 840 pares de base, o que indica que esta população de H. contortus

após exposição ou não aos tratamentos supracitados, apresentou o mesmo padrão em

relação a este gene.

Figura 8. Eletroforese em gel de agarose 1% de produto da reação em cadeia da polimerase

(PCR), a partir de amostras de H. contortus, submetido a diferentes tratamentos: (M) Marcador

de peso molecular 1 Kb DNA Ladder; 1) Controle. (2) Ivermectina, sc (200 mcg/kg); (3)

Verapamil veículo oleoso (3 mg/kg); (4) Verapamil veículo aquoso (3 mg/kg, 3x a cada 12

horas); (5) Ivermectina, sc (200 mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg, 3x a cada 12 horas); (6)

Ivermectina, sc (200 mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg); (7) Ivermectina, sc (400 mcg/kg) +

Verapamil (3 mg/kg)

1 2 3 4 5 6 7

506 bp

1018 bp

As seqüência de bases do produtos de PCR obtidos com os iniciadores PGP2S e

MX-D a partir do DNA genômico de amostras de H. contortus submetidas a diferentes

tratamentos, estão apresentadas nas Figuras 9 e 10.

As matrizes de identidade das sequências, obtidas após amplificação com estes

dois iniciadores, estão inseridas nas Tabelas 9 e 11.

Não foi observada nenumha homologia com qualquer seqüência depositada no

GenBank.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 PGP2 GAGAGGAGTTTTNGGTCAGACNCCTTCGTTTTTCATCTATACGTACCCGCNNTGCGTAGTCAGAGCCTGNAGTTTCATAGTGAAGACCTCCCTTGTATGT

2 PGP2 GAGAGGAGTTTTNGGTCAGANCNGTTCGTTTTTCATCTAAACGTACCCGTAGTGCGTAGTCAGAGCCTGAAGTTTCATAGTGAAGACCTCCCTTGTATGT

3 PGP2 GAGAGGAGTTNGGTCAGATCCCTTCGTTTTTCATCTATACGTACCTCNCNNTGCGTANNCAGAGNCTGNNGTTTCATAGTGAAGACCTCCCTTGTATGTT

4 PGP2 GAGAGGAGTTTTAGGTCAGANCCGTTCGTTTGTCATCTAAACGTACCCGTAGTGCGTAGTCAGAGCCTGAAGTTTCATAGTGAAGACCTCCCTTGTATGT

5 PGP2 GAGAGGAGTTTTAGGTCAGACCAGTTCGTTTTTCATCTAAACGTACCCGTAGTGCGTAGTCAGAGCCTGAAGTTTCATAGTGAAGACCTCCCTTGTATGT

6 PGP2 GAGAGGAGTTTTAGGTCANNCCAGTTCGTTTNTCATCTAAACGTANCCNTAGTGCGTANTCAANGCCTGAAGTTTCATAGTGAAGACCTCCCTTGTATGT

7 PGP2 GAGAGGAGTTTTAGGTCAGANTCCTTCGTTTTTCATCTAAACGTACCCGCAGTGCGTAGTCAGAGCCTGAAGTTTCATAGTGAAGACCTCCCTTGTATGT

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 PGP2 TTTTGATTGCGAATCGGACGCTCATAATCGCAGAGGTCAACCAACTCGGCGACTTCAACCAATCCAGCGCCATTGATTGACGCAAAAGCGTCGAGCGCTA

2 PGP2 TTTTGATTGCGAATCGGACGCTCATAATCGCAGAGGTCAACCAACTCGGCGACTTCAACCAATCCAGCGCCATTGATTGACGCAAAAGCGTCGAGCGCTA

3 PGP2 TTNGATTGCGAATCGGACGCTCATAATCGCAGAGGTCAACCAACTCGGCGACTTCAACCAATCCNGCGCCATTGATTGACGCAAAAGCGTCGAGCGCTAA

4 PGP2 TTTTGATTGCGAATCGGACGCTCATAATCGCAGAGGTCAACCAACTCGGCGACTTCAACCAATCCAGCGCCATTGATTGACGCAAAAGCGTCGAGCGCTA

5 PGP2 TTTTGATTGCGAATCGGACGCTCATAATCGCAGAGGTCAACCAACTCGGCGACTTCAACCAATCCAGCGCCATTGATTGACGCAAAAGCGTCGAGCGCTA

6 PGP2 TTTTGATTGCGAATCGGACGCTCATAATCGCAGAGGTCAACCAACTCGGCGACTTCAACCAATCCAGCGCCATTGATTGACGCAAAAGCGTCGAGCGCTA

7 PGP2 TTTTGATTGCGAATCGGACGCTCATAATCGCAGAGGTCAACCAACTCGGCGACTTCAACCAATCCAGCGCCATTGATTGACGCAAAAGCGTCGAGCGCTA

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 PGP2 AGCGTCGGCCGGCAAGCGGCGTCAATCAGTGGCGCTGTGCTCACTTGAGAGCGCCGCTCGTCGATCGATACCACATGAGTCTGTGTTTGATACTTTTCCG

2 PGP2 AGCGTCGGCCGGCAAGCGGCGTCAATCAGTGGCGCTGTGCTCACTTGAGAGCGCCGCTCGTCGATCGATACCACATGAGTCTGTGTTTGATACTTTTCCG

3 PGP2 NCGTCGGCCGGCAAGCGGCGTCAATCAGTGGCGCTGTGCTCACTTGAGAGCGCCGCTCGTCNATCGATACCACATGAGTCTGTGTTTGATACTTTTCCGA

4 PGP2 AGCGTCGGCCGGCAAGCGGCGTCAATCAGTGGCGCTGTGCTCACTTGAGAGCGCCGCTCGTCGATCGATACCACATGAGTCTGTGTTTGATACTTTTCCG

5 PGP2 AGCGTCGGCCGGCAAGCGGCGTCAATCAGTGGCGCTGTGCTCACTTGAGAGCGCCGCTCGTCGATCGATACCACATGAGTCTGTGTTTGATACTTTTCCG

6 PGP2 AGCGTCGGCCGGCAAGCGGCGTCAATCAGTGGCGCTGTGCTCACTTGAGAGCGCCGCTCGTCGATCGATACCACATGAGTCTGTGTTTGATACTTTTCCG

PGP2 AGCGTCGGCCGGCAAGCGGCGTCAATCAGTGGCGCTGTGCTCACTTGAGAGCGCCGCTCGTCGATCGATACCACATGAGTCTGTGTTTGATACTTTTCCG

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 PGP2 ATTTGATTATTTGGCGTAGAGTCAGTTAGTTTTGATATATGGACTTGTTTTTTTNCNNTTTNANCNACGGAAGGAAGAAGGGANCAAANTTCCGCCTNTN

2 PGP2 ATTTGATTATTTGGCGTAGAGTCAGTTAGTTTTGATATATGGACTTGTTTTTTTNCNTTTTNGNCNACGGAGGTANGANGNGACAAANNTNCGCTNTNAN

3 PGP2 TTTGATTATTTGGCGTAGAGTCAGTTAGTTTTGATATATGGACTTGTTTTTTTNCTATTTNGACNACGGAGGTANGANGNGACAAAANTACGCCTNTNAT

4 PGP2 ATTTGATTATTTGGCGTAGAGTCAGTTAGTTTTGATATATGGACTTGTTTTTTTCNATTTTGACNACTGAGGNATGATGTGACAAAACTACGCTATTANG

5 PGP2 ATTTGATTATTTGGCGTAGAGTCAGTTAGTTTTGATATATGGACTTGTTTTTTTNCNATTTNNACNACGGAGGNANAANGNNACAAACCNNCCCTNTNAN

6 PGP2 ATTTGATTATTTGGCGTAGAGTCAGTTAGTTTTGATATATGGACTTGTTTTTTTNCATTTTGANCAACGGNGGANGANGGGACNAAACNTCCCCNTTNNN

7 PGP2 ATTTGATTATTTGGCGTAGAGTCAGTTAGTTTTGATATATGGACTTGTTTTTTTTCTATTTTGACNACGGNGGTANGANGNGANAAANCTNCCCTNTTAT

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 PGP2 ANAAAAAANCNCNAAGAACNNNNGTNAAANNANCTNNNCNCNTTTGGCNCAAACGGNACNTNGCNNNACAANNNANCNNNCCCNNNCAANAACNNTGGAC

2 PGP2 AAAAAANCNCNAAGNANCNCNGTNAAAANANNGTANCNCCTTNGGCGCAAACGGNACCTNGNNNNACAAGNNANCCNNNCCCGTCAAAAACNNTNGANGC

3 PGP2 GAAAAANCTCNGAGNACCTCTGTTAAAATANCGTATCACCTTTGGCGCAAACGGNACCTNGNNGTACAAGTGANCCNCNCCCGTCNAAAACNNTNGACGC

4 PGP2 AAAAANCTCTGAAGANCTCTGTTAAAATAACGTATCAGCTTTGGCGCAGANGGNANCTTGGCGTANAANTGANGCTATCGCGTCCAANANNCTTGACGCT

5 PGP2 NAAAAACCNCNAAGAACCNCNGTNAAANNANCNNANCACCTTNGGCNCAAACGGNNCNTNGNCNNACAATNNACCCNNNCCNNNCAAAAACCCTNGACCC

6 PGP2 AAAAANCNCCGAAGANCTNNNGTTAAANAANNTANCCNCNTTTGGCNNAAANGGANCNTGGNGTAAAAANGNNNCNNTCCCNNCCAAAAACCNTGGAGCN

7 PGP2 GAAAAANCNCNNAGGANCNNTGTTAAAANAACGTNTCACCTTTGGNGCAAACGGTACCTNGGNGTACAAGTGANNCTNNCCCGNCAAAAACNCTNGANNC

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 PGP2 GCNGTCNNNGAANGCCCCCCATNNTGGTTANNACCNCCNTNNTGGCATCAGAATCCGNGGGGATGNTGGTCCTNAAAAAATAAAAAGTNATTTCNAANAA

2 PGP2 NGTNNNNGGAANNCCCCCACNCNGGTTNATNCCNCCTTAGTGGCATCAGAATCCGNGGGGATGNTGGTNCTNATAAAATAAAAANGAATTTCCAAGAAAA

3 PGP2 NGTNCNNGGAAAGCCCCCACNCGGGTTTATACCACCNATNTGGCANCCGAATCCAGGNGANNGCGGTTCTTAGTCAAATTAGAAGGNATTTNCAAANATA

4 PGP2 GTACTCTGAAAGCNCCCACTCGTGTTTATACCATCNGTACTGNCATCAGAACCAGGTGAATGCTGTTCTTAATAGAATAGAAAGTANTTTCNAAAAANNT

5 PGP2 NNNANNCNNAANCCCCCNCCCCTGGTTNTTACNNCCNTNANGGCATCCNAACCCGGGGGANGGCGGTNCTNANAAAANAAAANNNATTTTCAAAAAAATC

6 PGP2 NNNNNCNGAAANCCCCCANNCCTGGTTANNCCNTCCGTANTGNCATCCGAANCNNGGGAATGNTGGTCCTAATANAATAAAAAGTANTTTCCAANAAATT

7 PGP2 NGTANTNNGAAANCCCCCACNCGGGTTTATACCNCCNNNNNGGCAATNGAATCCGGGGGAAGGNGGTTNTTAAAAAANAAAAAAGAATTTTCNANAATAT

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 PGP2 TATCCTNATAATCCATNCANGNTGACGAATNNATNNTNAATTAACCAACTGGCNTCNAAATGAGNGGAGAANANAATTTTNAAAANACNGAACNATTACN

2 PGP2 TTCTAATTATCCATNCATNNTGANNAAGCNATGGTTANTTTANCCACCCTGCCTCCAACTTGAGNGGANNATNAANTTTTTNAAAAATNCNGAACAATTA

3 PGP2 TTCNNATTAANCATTCANTGTGAACGAGNTNATNGTTNATTTANCCAACCTGCCTNCNACTNGANGTGGAAATGAGATTTTTNAAAAATANGNACNAATA

4 PGP2 TCCTANTAATCCATCGATGTGNACGAGTCNATGNTCATTTAGCCNACCTGNCNTCNANATGNAGTGGAGAATAAAATTTTTNAAAAAAACNGNACCANNA

5 PGP2 CNNATTATCCATCCANGNNGANNAATNNATNNTNCTTTNACCNNCCNNCNTCCAANNGANNGGAANAAAAAATTTTTNAAAAAACNGAACCNTNNCNAAN

6 PGP2 CCNAATAATCCATCNATGNGNACAAGTCNATGNTTATTTTNCCNACCTGCCCTCNANTGGAGTNGAAAANAAAAATTTTTANAAAANNGGNANCANTAAC

7 PGP2 TCNTATNANCCANTCNNTGTGNACNANNNANGGTTNNTTTNTCCANCCNGNCNNCCNCNTGAGGNGGANAAAAAANTTTTTAAAAANANGGANCANNTNN

710 720 730 740 750 760 770 780 790 800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 PGP2 AANTNCAANGGGATCCCTCCNGCTCCGAGTNCTATTTGGCCCCNNGAGAAAACCGANNACTTNCCGCNGGTGGTNAAAAANAACANAGANATCCGAANGC

2 PGP2 NCNAATGNNNAGAGGANTCCCTCCTGCCCCCGATGNNNCTNTTTGGCCCCCCTGAGGAANACCCGANNACTTNCCCCCNGGTNGNTNAAAATCAAANAAN

3 PGP2 NCGANNGTCAGAGGAATCCCTCCNGCCCCGGAGCCNCTNTTTNGCNCCCNTGAGNACANCCGAGCACNTNCCCGCCGGTNGNTNAAAATCANNCANATGA

4 PGP2 NCGAAATGTCNAGAGGTATCCCNNCCGGCTCCNGANGNCCCTNTTTGNCNCCCCNTGANGAACANCCNGAGCTACNNNCCCGCCGGGTCGNTTAAAAAAC

5 PGP2 TNNCANANGNNCCCTCCCGGCCCNGANGNCCNATTTNGNCCCCCNGAGGAANACCCNNCNNCNTNNCCNCCGGGNGGNTNAAAANNAAANCACNNNNCNC

6 PGP2 GAATGGNCAGANGNANCCCTCCCNNCCCNGAANGTCCCTATTTGGNCCCCCCNGAGNAAAACCCGACCACCTNGCCGNCGGGTCGGTNNAAATANAANCA

7 PGP2 NGANNGNNGNNAGGNGNCCCNCCNGCCCCNGAGGNNCNATTTNGGCCCCCCNGAGNAAAACNNNNNNACNANGCNGCNGGGGGGGNNNAAAAAAAANAAA

810 820 830

....|....|....|....|....|....|....|.

1 PGP2 TTGTNAAAANNNNNAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

2 PGP2 AGGNANCCGNAAGGNCTTNTNAAAAAANNNNNAAAN

3 PGP2 CCCCGGAAGGCNTTCAAANNNTNNCNAANNNNNNNN

4 PGP2 AAANCACATGNCCNCGNNAAGNTCTTTCNAAAAANN

5 PGP2 CNNAANNNCTNTNAAAAAAAAANNNNNNNNNNNNNN

6 PGP2 CATGNCANNNGNAAGGTTTNTNNAAAANNNANANAA

7 PGP2 NGNGNCCCNNNNGGNTTTTNNAAAAANNNANNAANN

Figura 9. Sequências alinhadas dos produtos das sete amostras de H. contortus,

submetidas a diferentes tratamentos*, amplificados por meio da PCR, utilizando-se o

iniciador PGP-2. CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

Tabela 10. Matriz de identidade das sequências de bases das amostras submetidas a

diferentes tratamentos* e amplificadas com o iniciador PGP2.

1 PGP2

2 PGP2

3 PGP2

4 PGP2

5 PGP2

6 PGP2

7 PGP2

1* PGP2

0,606

0,304

0,559

0,635

0,580

0,619

2* PGP2

0,606

0,420

0,647

0,694

0,680

0,751

3* PGP2

0,304

0,420

0,329

0,372

0,368

0,413

4* PGP2

0,559

0,647

0,329

0,601

0,688

0,617

5* PGP2

0,635

0,694

0,372

0,601

0,681

0,682

6* PGP2

0,580

0,680

0,368

0,688

0,681

0,675

7* PGP2

0,619

0,751

0,413

0,617

0,682

0,675

(1) Controle. (2) Ivermectina, sc (200 mcg/kg); (3) Verapamil veículo oleoso (v.o.) (3 mg/kg); (4)

Verapamil veículo aquoso (v.a.) (3 mg/kg, 3x a cada 12 horas); (5) Ivermectina, sc (200 mcg/kg) +

Verapamil (v.a.) (3 mg/kg, 3x a cada 12 horas); (6) Ivermectina, sc (200 mcg/kg) + Verapamil (v.o.) (3

mg/kg); (7) Ivermectina, sc (400 mcg/kg) + Verapamil (v.o.) (3 mg/kg).

Observou-se que as sete subpopulações, pertencentes à mesma população de

H. contortus resistente à ivermectina, expostas a sete diferentes tratamentos

apresentaram semelhança nas sequências de bases sequenciadas (Tabelas 10 e 11).

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 MXD GTTGCTTTGTNTTTCTACCGACCCGGCGGGCTCGGTAGCTCGGGTTGTTCCTCATGGGGAGTCAAAATAGTGACATCAGGAGCAGGAAGGGATACCTCTT

2 MXD GTTGCTTTGTTTTTCTACCGACCCGGCGGGCNAGGTAGCTCGGAGTTGTTCCTCATGGGGAGTCAAAATAGTGNCATCAGGAGCAGGAAGGGATGCCTCT

3 MXD GTTGCTTTGTTTTTCTACCGACCCGGCGGGCTAGGTAGCTCGGGTTGTTCCTCATGGGGAGNCAAAATAGTGACATCAGGAGCAGGGAAGGGATNCCTCT

4 MXD GTTGCTTTGTTTTTCTACCGACCCGGCGGGCTAGGTAGCTCGGGTTGTTCCTCATGGGGAGTCAAAATAGTGACATCAGGAGCAGGAAGGGATACCTCTT

5 MXD GTTGCTTTGTTTTTCTACCGACCCGGCGGGCNAGGTAGCTCGGGTTGTTCCTCATGGGGAGTCAAAATAGTGACATCAGGAGCAGGAAGGGATNCCTCTT

6 MXD GTTGCTTTGTNTTTCTACCGACCCGGCGGGCNAGGTAGCTCGGGTTGTTCCTCATGGGGAGTCAAAATAGTGACATCAGGAGCAGGAAGGGATACCTCTT

7 MXD GTTGCTTTGTTTTTCTACCGACCCGGCGGGCTAGGTAGCTCGGGTTGTTCCTCATGGGGAGTCAAAATAGTGACATCAGGAGCAGGGAAGGGATNCCTCT

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 MXD GACACTTCGCTACTGGTTCCGTATTTTCTAAAAAATCTTATTCTCCACTTCATGTCGAAGGCAGGTTGGCTAAATGAACATTGACTCGTTCACNTCGATT

2 MXD TGACACTTCGCTACTGGTTCCGTATTTTCTAAAAAATCTTATTCTCCACTTCATGTACGAAGGCAGGTTGGCTAAATGAACATTGACTCGTTCACNTCNA

3 MXD TGACACTTCGCTACTGGTTCCGTATTTTCTAAAAAATCTTNTTCTCCACTTCATGTCGAAGGCAGGTTGGCTAAATGAACATTGACTCGTTCACNTCNAT

4 MXD GACACTTCGCTACTGGTTCCGTATTTTCTAAAAAATCTTATTCTCCACTTCATGTCGAAGGCAGGTTGGCTAAATGAACATTGACTCGTTCACATCGATT

5 MXD GACACTTCGCTACTGGTTCCGTATTTTCTAAAAAATCTTATTCTCCACTTCATGTCGAAGGCAGGTTGGCTAAATGAACATTGACTCGTTCACATCGATT

6 MXD GACACTTCGCTACTGGTTCCGTATTTTCTAAAAAATCTTATTCTCCACTTCATGTCGAAGGCAGGTTGGCTAAATGAACATTGACTCGTTCACATCGATT

7 MXD TGACACTTCGCTACTGGTTCCGTATTTTCTAAAAAATCTTATTCTCCACTTCATGTCGAAGGCAGGTTGGCTAAATGAACATTGACTCGTTCACNTCGAT

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 MXD GATTAATAGGAGTATCTTCGAAACTACTTTCTATTCTATTAAGAACAGCATTCACCTGGATCTGATTGCAGTACTGATGGTATAAACACGAGTGGGCGCT

2 MXD TTGATTAATAGGANTATCTTCGAAACTACTTTCTATTCTATTAAGAACAGCATTCACCTGGATCTGATTGCAGTACTGATGGNATAAACACNAGTGGGCG

3 MXD TGATTAATAGGAGTATCTTCGAAACTACTTTCTATTCTATTAAGAACAGCATTCACCTGGATCTGATTGCAGTACTGATGGTATAAACACGAGTGGGCGC

4 MXD GATTAATAGGAATATCTTCGAAACTACTTTCTATTCTATTAAGAACAGCATTCACCTGGNTCTGATTGCAGTACTGATGGTATAAACACGAGTGGGCGCT

5 MXD GATTAATAGGAATATCTTCGAAACTACTTTCTATTCTATTAAGAACAGCATTCACCTGGATCTGATTGCAGTACTGATGGTATAAACACGAGTGGGCGCT

6 MXD GATTAATAGGANTATCTTCGAAACTACTTTCTATTCTATTAAGAACAGCATTCACCTGGATCTGATTGCAGTACTGATGGTATAAACACGAGTGGGCGCT

7 MXD TGATTAATAGGAATATCTTCGAAACTACTTTCTATTCTATTAAGAACAGCATTCACCTGGATCTGATTGCAGTACTGATGGTATAAACACGAGTGGGCGC

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 MXD TTCAGAGTACAGCGTCAAGCGTCTTCGACGCGATAGCGTCACTTGTACGCCAAGGTACCGTCTGCGCCAAAGCTGATACGTTATTTTAACAGAGCTCCTC

2 MXD CTTTCANAGTACANCGTCAAGCGTCNTCNACGCGATAGCGTCACGTTGTACGCCAAGGTACNGTCTGCGCCAAAGCTGATACNTTATTTTAACAGAGCTC

3 MXD TTTCAGAGTACAGCGTCAAGCGTCTTCGACGCGATAGCGTCACTTGTACGCCAAGGTACNGTCTGCGCCAAAGCTGATACNTTATTTTNACAGAGCTCCT

4 MXD TTCAGAGTACAGCGTCAAGCGTCTTCGACGCGATAGCGTCACTTGTACGCCAAGGTACCGTCTGCGCCAAAGCTGATACGTTATTTTAACAGAGCTCCTC

5 MXD TTCAGAGTACAGCGTCAAGCGTCTTCGACGCGATAGCGTCACTTGTACGCCAAGGTACCGTCTGCGCCAAAGCTGATACGTTATTTTAACAGAGCTCCTC

6 MXD TTCAGAGTACAGCGTCAAGCGTCTTCGACGCGATAGCGTCACTTGTACGCCAAGGTACCGTCTGCGCCAAAGCTGATACGTTATTTTAACAGAGCTCCTC

7 MXD TTTCAGAGTACAGCGTCAAGCGTCTTCGACGCGATAGCGTCACTTGTACGCCAAGGTACCGTCTGCGCCAAAGCTGATACGTTATTTTAACAGAGCTCCT

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 MXD AGAGCTTTTTCATAATAGCGTAGTTTTGTCACATCATACCTCAGTAGTCAAAATAGAAAAAAAACAGNNCCTNCNNNCAAAACCTACNGGNCCCNCCCCN

2 MXD CTCAGAGCTTTTTCATAATAGCGTAGTTTTGTCACATCATACCTCAGNAGTCNAAATAGAAAAAAAACAGCTCCTGCCNNCAAAANCTACTGGNCNCTCC

3 MXD CAGAGCTTTTTCATAATAGCGTAGTTTTGTCACATCATACCTCAGNAGTCAAAATAGAAAAAAAACAGNTCCTGCNTACAAAAACTANNNGACCNCTNCN

4 MXD AGAGCTTTTTCATAATAGCGTAGTTTTGTCACATCATACCTCAGTAGTCAAAATAGAAAAAAACNAGTCCNTATATCAAAACTAACTGACTCNACNCCAA

5 MXD AGAGCTTTTTCATAATAGCGTAGTTTTGTCACATCATACCTCANTAGTCAAAATAGAAAAAAANCAGNNCCTNNNTNAAAANCNACNGNNNCCTCCCCCA

6 MXD AGAGCTTTTTCATAATAGCGTAGTTTTGTCACATCATACCTCANTAGTCAAAATAGAAAAAAANCAGTNCCTNNNNCAAAACCTACNGGACCCNCCCCNA

7 MXD CAGAGCTTTTTCATAATAGCGTAGTTTTGTCACATCATACCTCAGTAGTCAAAATAGAAAAAAAACAGGTCCTTNTNNAAAANCTANNNGNCNCTCCNCC

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 MXD AAATATNCAATNCGGAAAGTTNNCNANCCCTGANCCCTGGNGGTNNCANNNACCAANNGGNNNNNNCAGNNNNNCACNNGCCCANGGANTGNNCCCGGCT

2 MXD CCCAANTATTCNNNNNGNNAANTGANCTACCNCTGACCNCTGGGGGTTTCNANNNACCAANNGGNNNNNNCANTNNNCNCCACCCGCCGNGGANTGAACC

3 MXD CCAAATATTCGANNCGGAAAAGTATCTAACNCTGGNCTCATGNGGTNTCGATCNNCNAGNGGNGNTCTCAAGTGANCACANGCCCGNGGANTNGACCCNA

4 MXD ATNATCCAATCGGAAAAGTATCAAACNCNGACNCCTGTGGTATCNANCGACGANCGGCGCTCTCCAGTGANCACAGCGCCACTGATTGACGCCGCTTGGC

5 MXD ANTATNCAATNCGGAAAGNTNNNAACCCCNNCNCCTGGNGGTNNCANNNACCAANGGNNNNNNCCAGNGANNCACGNGNCCANGGATGGACNCCGCNTGG

6 MXD ATTATNCAATNNGAAAAGTTTNCAACNCNNACCCCTGGGGNNTNNANNGNCGAANGGCGCTNTNCAGTGGNCNCCNNGCCCNTGGTTTGGCCCCGCNTGG

7 MXD AAATANNCAATNCGGAAANGTNNCAANCNCNGNCNCATGTGGTATCANNNNNCNAGCGGNGNNCNCAGGTGNGCACNNCGCCANNGATGGACGCCGCTGG

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 MXD GGCGGNCNAAGCCTAACNCTTGAANCCTTTGNCNCCATCCATGGGNCCTGGNTNGNTGNAATCCCCCAANTNGGTNAACCCCGCNAATTATNGCGTCCGA

2 MXD CGCCTGGCGGCCGAACCCTAANNCTTGAACNCTTTNNNNCCATCAATGGGGCCTGGATGGNTGAAANCCCCCAAATNGTTGAACCCCGGNAATTATAANC

3 MXD CTNGCGGGCCNACCCTAANCGCTCGNGACTTTNNCGCNATCANNGGCGCTGGATGGGTTAANCCCCCAANTNGNTGACCTCGCGATTATGAGCCCCNATN

4 MXD GGCCGACGCTTAACGCTCGACGCTTTTGCGTCAATCAATGGCGCTGGATTGGTTGAAGTCCCCNANTTGGTTGACCTCNGCGANTATGAGCGTCCGANTC

5 MXD CGGNCGGACCCTAACNCTCGANGCCTTTGCNNCNATCAATGGGGNCNGNATGGTTGAAATCCCCCANTTGGTNGACCTCCGCGATTANAACGNCCGATNN

6 MXD CGGNCCAANCCTAACGCTNGAAACCTTTGCGNCNATCNATGGGNCTGGGNTGGNTTAAATCCCCCAANTTGGTTNACCCNGGNAATTNGAGCGTCCNANN

7 MXD CGGGCCGACNCTTANCGCTGAACGCTTTTGCGTCATCCATGGGCNCTGGATGGGTTGAATNCCCCAAGTTGGTGGACCNCNGCNATNATGAGCGNCCAAT

710 720 730 740 750 760 770 780 790 800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 MXD NNCCCATCAAAAAANACANGGGAGGTCTNCCTANGAAACTNNGGCTCCGACTACNCNTNACGGTNCNTTNAATGAAAACNACNGGTCGACNAAAATTCCN

2 MXD CCCAATGCNNTCAAAAANNNAAAGGGNGGGTTCATANNAAACTCNGGCCGGACCACCNCNACGGTNCTTTNAATAAAAAAACNGGTCGACCAANNTNCNC

3 MXD CGCACCAAAACGTACAGGGGGGNCTCATANNNAACTNNGGCNTGACNCNCCNACGGTNCTTTNNATGAAAACNANNGGTCTGACNAANCTNCCCTCCTCT

4 MXD CCAATCAAAACATACNAGGGAGGNCTTCNNTATGAAACTTCAGGNTCTGACTACCCNTACGGGTACNTTNNATGAAAACGAANGGNCTGACCAAAACTCC

5 MXD CCATCNAAANNANCAAGGGAGGNCNNCCTAGGAAANTCNGGCNNGACTACCCCTANGGNACTTTTAATGAAAACNACNGGTNGACTAAACTCCTNTCCTC

6 MXD NCCATCNAAAACATANAGGGGAGGTCTNCNTANNAAACTNTGGNTNNGACTACCCNNTANGGNNANTTTAAATNAAAACNAACTGGTCNGACNAAAATTC

7 MXD TCGCATCAAAAACAACANGGGNGGGCTNCCTATGAAACTTTGGNTCGGACTACNCNCTACGGGNAGTTTNNATGAAAACAAANGGNCTGACCNAAACTNC

810 820 830 840

....|....|....|....|....|....|....|....|

1 MXD CTCCTCCCTGTNGAGACTGGGNNTGGANCNTCAAAAAANN

2 MXD TCCTCCCTGCNGAGAATGGNNNNNNATNTTCAAAAAANNN

3 MXD NTGTCGAGATGGGNNNNNNGANTTTCAAAANNNNNNTNAA

4 MXD TCTNCNTCCNTGGCNGAGATGGGNNNNNNNNCTTNNAAAN

5 MXD CNTGTCGAGATGGGGNNGNANNATTNAAAAANNNNNNNNN

6 MXD CCCTNCNTTCNTGGCNGAGATGGGNNNNNNNATNTTTNAA

7 MXD CCCNCCTCCCTGTCGAGATGGGNNNNNNANAATTTNAAAA

Figura 10. Sequências alinhadas dos produtos das sete amostras de H. contortus,

submetidas a diferentes tratamentos*, amplificados por meio da PCR, utilizando-se o

iniciador MXD. CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

Tabela 11. Matriz de identidade das sequências de bases das amostras submetidas a

diferentes tratamentos* e amplificadas com o iniciador MXD. CPPAR/FCAV/UNESP,

Jaboticabal - SP, Brasil.

1 MXD

2 MXD

3 MXD

4 MXD

5 MXD

6 MXD

7 MXD

1 MXD

0,328

0,347

0,670

0,684

0,667

0,390

2 MXD

0,328

0,365

0,318

0,314

0,320

0,383

3 MXD

0,347

0,365

0,359

0,357

0,358

0,670

4 MXD

0,670

0,318

0,359

0,683

0,751

0,420

5 MXD

0,684

0,314

0,357

0,683

0,754

0,382

6 MXD

0,667

0,320

0,358

0,751

0,754

0,464

7 MXD

0,390

0,383

0,670

0,420

0,382

0,464

1) Controle. (2) Ivermectina, sc (200 mcg/kg); (3) Verapamil veículo oleoso (3 mg/kg); (4) Verapamil

veículo aquoso (3 mg/kg, 3x a cada 12 horas); (5) Ivermectina, sc (200 mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg, 3x

a cada 12 horas); (6) Ivermectina, sc (200 mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg); (7) Ivermectina, sc (400

mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg)

5.4.2 Canais de cloro ativados por glutamato (HcGluCl)

Os produtos de PCR foram analisados em eletroforese em ágar gel (1%)

contendo brometo de etídio. Observou-se que as sete amostras apresentaram uma

banda de aproximadamente 200 pares de bases (pb), relacionada com a subunidade α

do canal HcGluCl bem definida e sem a presença de bandas inespecíficas (Figura 11).

Estes sete produtos de PCR foram seqüenciados e os resultados estão

apresentados nas Figuras 12 e 13, referentes aos iniciadores F4275 e R603,

respectivamente.

Figura 11. Eletroforese em gel de agarose 1% de produto da reação em cadeia da polimerase (PCR), a

partir de amostras de H. contortus, submetido a diferentes tratamentos: (M) Marcador de peso molecular

100 bp DNA Ladder Invitrogen

; 1) Controle. (2) Ivermectina, sc (200 mcg/kg); (3) Verapamil veículo

oleoso (3 mg/kg); (4) Verapamil veículo aquoso (3 mg/kg, 3x a cada 12 horas); (5) Ivermectina, sc (200

mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg, 3x a cada 12 horas); (6) Ivermectina, sc (200 mcg/kg) + Verapamil (3

mg/kg); (7) Ivermectina, sc (400 mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1F4275 CGATCGGCTTGATGTCAGACATGTGTAGTGTTNTCTGCTTCAGAGNCNTATACTACNTNTNCCCNTCGGTANGGCTNGNANGGNCTTCNAANTGTCNCTN

2F4275 CGNTCGCTTGATGTCAGACATGTGTAGTGGTTCTTGCTTCATACNCNTATCACTNCAAAGNCCTTCGGTAANNCTNGGANGGNCTTCNAANTNTCCCTNC

3F4275 CGNTCGCTTGATGTCAGAATGTGTAGTNNNNTTTGCTTCATACGCNTATACTACTNCCNACATCGGTAAGNCTTGGAAGGTCTTCAGANTGTCACTACCA

4F4275 GATNCGCNTGNTGTCAGACATGTGTAGTGNCNTTTGCTTCATACNCTTATCCTACAAACGACNTCGGTAAGGCTNCGANGGNCTTCNAATGTANCTACTA

5F4275 CGATTCGCTTGATGTCAGACATGTGTAGTGGTTNTTGCTTCATACGCNTATCACTACGATNGCCATCGGTAAGACTTGGAAGGTCTTCANAATNATCNCT

6F4275 GTGTAGTGGATTTTGCTTCATACGCCTATACTACNAAAGNCNTCGGTAAGACTTGGAAGGTCTTCAAANTATCNCTACCAGGGTANCAATCTATTTNCTT

7F4275 CGNTCGCTTGATGTCAGACATGTGTAGTGGTTNTTGCTTCATACNCTTNTCCTNCAAANNCCTTCGGTANNGCTNGNANGGCCTTCNAATTGTCCCTNCC

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1F4275 CCNGGGGAATCTNTTNNCTCTTCTGGNTTGGCTNCANNANNNCGGNGGGATAGGNGNAANGACGGACCGATNATANNNTGTATTGGTAGATCTNGTAGTA

2F4275 CNGGGNANCANTTTATTTNCTNGNTTGNCTCCANAATTCCGGNGGGAAGGNGNAAAACCGNACCGATNATANNNTNTATTGGTAGATCTNGTANTAGTTA

3F4275 GGGTATCNATTTCTTTTCTNGATTGTCTTCANGAATNCGGANGGATAGGNGGAAANACGGACCGNNNATNNNNNNANNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

4F4275 GGAGATCTACCAATTCTTTTGATTGCGTTTTTTCNANAGTACGGGATGGANAGAGGACGAACCGATNATANNNTGTATTGGTAGATCTNGTAGTAGTTAC

5F4275 NCCAGGGTATCAATTTATTTTCTNGATTGTCTTCAAAAANCCGGANGGAAGGAGNAAAAACNGACCGNCNNTNNNNTNTNTTGNTNNNTCTNGTNNTNNT

6F4275 GATTNCTTCAGAAAACCGGAGGGAAGGAGANGCCCCCCGGCCCNNAGNNNNNNANGNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNN

7F4275 NGGGNATCANTTNNTTTNCTGGNTTGCCTCCANNNTNNNGGTGGGATAGGAGAAAANNCGNACCGATNATANNNTNTATTGGTAGATCTNGTAGTAGTTA

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1F4275 GTTACATTTTGAAGTCNTTCGNNGCCTNNNTTTTGTGNNNTNGCNTANNNGNNNCTCCNTTNTTCGCNNNNNNNCNCCNNNANNNNTCAANNNNNNNNNN

2F4275 CNTTTTGAANTCNTTCGNAGCCNANNTTTTGTGNNNTNGCNNTNAGCNATCCCCNTCTTCNNNNTNNNNCNCNNTAANNNNTCAANNNNNNNNNNNNNNN

3F4275 NNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTT

4F4275 ATTTTGAAGTCNTTCGAAGCCTTNTCTTTTGTGTNNTNGCNTANNNNNAACTCCCTTCTTCGCNGNTANCCANCNNTAANNNNNTCAANNNNNNNNNNNN

5F4275 TACNTTTTGAAGTCNTTCNNAGCNNTNCNNNNNNNTNTNNCNNTNNNNNNNCNANNNNNTNNNNNNNNNNNCNCNNNNNNNNNTCANNNNNNNNNNNNNN

6F4275 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNCNAANNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNN

7F4275 CNTTTTGAANTCNTTCGNNNCCNTNTTTTTNTNGTGTNGCNNTNANCNANCTCNTTNNTTNNNNNTATNCNNCNNTAANNNNTCAANNNNNNNNNNNNNN

Figura 12. Sequências alinhadas dos produtos das sete amostras de H. contortus,

submetidas a diferentes tratamentos*, amplificados por meio da PCR, utilizando-se o

iniciador F4275. CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

1 2 3 4 5 6 7

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 R603 GTNTTGAAANCAGAAATGTATTGATCCCTNGTAGTGATATTCTGTAAGACCTTCCTCNTCTTNCCGANGTCTNTCGTANNATAGGCGTNCGAANGAAACN

2 R603 GTNTTGAAATCAGAAATGAATTGATCCCTGGTAGTGATATTCTGTGACCTTCCNCGTCTTACCGATGTCTTTCGTANTATAGGCGTNTGANNCAAATNCN

3 R603 N~TTGNANATCAGAAATGAATTGATCCCTNGTAGTGATATTCTGAAGACCTTCCNCNTCTTACCGATGTCTTTCGTANTATAGGCGTATGAAGNAAANTC

4 R603 GTNTTTCACCNANAAATGTATTGGTNNCTCNCNTATGANNTACATGTATTGCNGTCTTCCTCNNCCTNACGGATGTCNTTTGTAGTGNGTGCGTATGAAG

5 R603 GTCTTGAAAATCAGAAATAATTGATCCCTCGGTAGTGATATTCTGAAGACCTTCCACGTCTTACCGATGTCTTTCGTAGTATAGGCGTATGAAGCAAANN

6 R603 GTNTTGTANATCAAGAAAATGAATTGCATACCCNTTTGCNAGTGNATATTCTGAAGACCTTCCTTGNCTTACCGATGTCTTTCGTAGTATAGGCGTATGA

7 R603 ATCAAGAAATGTATTGATCCCTNNTAGTGATATTCNGAAGACCTTCCTNCTCTTACCGANGTCTNTCGTANNATAGGCGTNCGANNGAAATCCNNTNCNC

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

1 R603 CNANNCNCNTGGCNNGTCCGTNCGGCGNANNGGNGGCCNGCCNGNANGAAAAATNAATTCANNNNNNNNNNTNTNGNNNNNTNNNNTNNTNNTTNCNTTT

2 R603 NNTCNCNTGGNNGGTCCGTCAGGNGNATAGNNGGCCAGCNNGAAANAAAATTNNATTCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNTTN

3 R603 CANTNCCCTNGNCNGTCCGTCANGCGGATANNNGGCCAGCCNGNAAGAAAAATTNATTCANNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTNCNTTT

4 R603 CCCAATCCACTANNCTNGTCTGTACGTNGAGCGGGTGANCGGCCGACCTGNAAGTATCAATTCANNNNNNNNTNTNTTGGTAGATCTNGTAGTAGTTACA

5 R603 CCANTCCCCTNGNCNGTCCGTCANGCGGATANNNGGCCAACCNGNAAGAAAAATNNATTCANNNNNNNNNNNTNTNGNTNNNTCTNGTANTNNTTACNTT

6 R603 AGCAAAANCCACTCCCCTNGNCNGTCCGTCNNGNGGATANGCGGCCANCCNGTAANAAAAATNNANTCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

7 R603 NTGNCNGGTCCGTNCGGNGAANNGGNGNCCNGCNGGNANNAAAATTCNATTCANNNNNNNNNNTNNNGGNNNNNNNGTNTNANTTACNTTTTGANNTCNT

210 220

....|....|....|....|....

1 R603 TGNNNTCNTTCNNNNCNNNNTTTT

2 R603 NNNNTCNNNCNNNNCNNTNNNNNN

3 R603 TGNNNTCNNTCNNNNCNNNNNNNN

4 R603 TTTTGAAGTCATTCGNAGCCTNTT

5 R603 TTGNNNTCNTTCNNNNCNTNNTTT

6 R603 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

Figura 13. Seqüências alinhadas dos produtos das sete amostras de H. contortus,

submetidas a diferentes tratamentos*, amplificados por meio da PCR, utilizando-se o

iniciador R603. CPPAR/FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil.

Ao contrário do que foi observado para glicoproteína P, em relação à subunidade

α do canal HcGluCl, houve pouca similaridade entre as sete amostras, observando-se

menores valores na matriz de identidade (Tabelas 12 e 13).

Tabela 12. Matriz de identidade das sequências de bases das amostras submetidas a

diferentes tratamentos* e amplificadas com o iniciador F4275. CPPAR/FCAV/UNESP,

Jaboticabal - SP, Brasil.

1 F4275

2 F4275

3 F4275

4 F4275

5 F4275

6 F4275

7 F4275

1 F4275

0,252

0,269

0,207

0,422

0,224

0,228

2 F4275

0,252

0,283

0,377

0,228

0,256

0,612

3 F4275

0,269

0,283

0,335

0,397

0,470

0,370

4 F4275

0,207

0,377

0,335

0,228

0,249

0,446

5 F4275

0,422

0,228

0,397

0,228

0,349

0,221

6 F4275

0,224

0,256

0,470

0,249

0,349

0,266

7 F4275

0,228

0,612

0,370

0,446

0,221

0,266

Tabela 13. Matriz de identidade das sequências de bases das amostras submetidas a

diferentes tratamentos* e amplificadas com o iniciador R603. CPPAR/FCAV/UNESP,

Jaboticabal - SP, Brasil.

1 R603

2 R603

3 R603

4 R603

5 R603

6 R603

7 R603

1 R603

0,446

0,544

0,267

0,611

0,321

0,285

2 R603

0,446

0,486

0,250

0,325

0,388

0,281

3 R603

0,544

0,486

0,263

0,366

0,343

0,276

4 R603

0,267

0,250

0,263

0,258

0,209

0,200

5 R603

0,611

0,325

0,366

0,258

0,334

0,285

6 R603

0,321

0,388

0,343

0,209

0,334

0,281

7 R603

0,285

0,281

0,276

0,200

0,285

0,281

*1) Controle. (2) Ivermectina, sc (200 mcg/kg); (3) Verapamil veículo oleoso (3 mg/kg); (4) Verapamil

veículo aquoso (3 mg/kg, 3x a cada 12 horas); (5) Ivermectina, sc (200 mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg, 3x

a cada 12 horas); (6) Ivermectina, sc (200 mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg); (7) Ivermectina, sc (400

mcg/kg) + Verapamil (3 mg/kg)

VI. DISCUSSÃO

Devido à forma errônea como o controle de verminose em ovinos vem sendo

realizado na região sudeste do Brasil, sobretudo pelo uso indiscriminado de anti-

helmínticos, a prevalência de populações de helmintos, resistentes à ivermectina, tem

alcançado índices elevados, sendo observados casos de resistência múltipla às drogas,

como relatado por SOUTELLO et al. (2006) na região noroeste de São Paulo. Por esta

razão, não foi possível, identificar e isolar uma estirpe de H. contortus sensível à

ivermectina, que seria utilizada no estudo. A dificuldade encontrada para identificar uma

cepa sensível à ivermectina, ressalta, ainda mais, a importância de pesquisas em

medidas complementares e no desenvolvimento de drogas reversoras.

Os resultados do teste anti-helmíntico controlado realizado para a caracterização

da estirpe de campo de H. contortus demonstraram diferença na atividade nematodicida

da ivermectina em relação ao sexo do parasito, ou seja, eficácia nula contra os

indivíduos machos e 27,02% contra fêmeas. Segundo LE JAMBRE et al. (2000), a

resistência à ivermectina é uma característica genética completamente dominante e

ligada ao sexo, considerando-se os machos de H. contortus mais susceptíveis do que

as fêmeas, fato contrário ao observado neste experimento.

A eficácia contra H. conturtus apresentada pela ivermectina (6,59%) permite

inferir que esta população era resistente, uma vez que para uma estirpe de nematódeo

pode ser denominada resistente quando mais de 1000 vermes sobrevivem ao

tratamento ou quando a eficácia de um determinado princípio químico, calculada por

meio de médias geométricas, é inferior a 90% (FAO, 2004).

Quando foram utilizadas as médias aritméticas para o cálculo de eficácia anti-

helmíntica, observou-se eficácia nula da ivermectina, embora o recomendado seja a

utilização de médias geométricas que representam melhor a distribuição do número de

ovos ou da população de nematódeos em um grupo de animais, fornecendo, assim,

percentuais de eficácia mais precisos (WOOD et al., 1995).

A metodologia utilizada para a realização do teste de migração de larvas em gel

de ágar apresentou-se como uma forma prática, pouco onerosa e rápida para avaliação

de eficácia de formulações anti-helmínticas, mostrando-se, ainda, como uma possível

ferramenta para o diagnóstico de resistência de nematódeos parasitos de ruminantes.

MOLENTO & PRICHARD (2001), empregando a mesma metodologia, obtiveram

resultados semelhantes aos do presente trabalho. Foram utilizadas duas populações de

H. contortus selecionadas após 17 passagens (gerações) em ovinos para resistência à

ivermectina (IVF17) e à moxidectina (MOF17), sendo observadas eficácias de 41% e

63% para a moxidectina isoladamente e associada a 2nM de verapamil,

respectivamente, assim como 55% e 84% para a ivermectina, contra a estirpe MOF17.

Contra a população IVF17, foi observado efeito significativo (P<0,05) apenas na

associação moxidectina e verapamil.

A reversão parcial da resistência pelo verapamil em H. contortus também foi

observada por BEUGNET et al. (1997), utilizando teste in vitro de eclodibilidade de

ovos em isolados susceptíveis e resistentes a benzimidazóis. Observou-se redução da

DL50 de tiabendazole e albendazole quando associados ao verapamil, sendo este

efeito mais acentuado em populações resistentes do que nas sensíveis. Também não

foi observada reversão total da resistência após o uso de verapamil.

Os resultados do presente experimento estão de acordo com os encontrados

para outras drogas moduladoras da P-GP. A exposição prévia de ovos de H. contortus

à lecitina aglutinina de Lens culinaris (lentilha) resultou em redução da DL50 do

tiabendazol em 50,9% em uma estirpe susceptível e 47,2% e 27,4% em dois isolados

resistentes, sendo desconhecido ainda o exato mecanismo pelo qual isso ocorreu

(KERBOUEF et al., 2002). Estes resultados são contrários aos demais trabalhos

supracitados em que a ação de drogas moduladoras da GP-P foi mais acentuada em

estirpes resistentes.

O efeito de itraconazol e valspodar como moduladores de GP-P foi avaliado por

BALLENT ET AL. (2006) por meio de teste in vitro, empregando o modelo do saco

intestinal invertido, e in vivo. Observou-se que o acúmulo de ivermectina na parede

intestinal foi maior quando associada ao itraconazol (0,115 nmol/g/min) e ao valspodar

(0,238 nmol/g/min) do que quando administrada isoladamente (0,016 nmol/g/min),

devido à ação moduladora da GP-P, destas drogas. Segundo estes autores, os agentes

moduladores de GP-P podem ser uma ferramenta útil para melhorar os parâmetros

farmacocinéticos de anti-helmínticos.

Ivermectina e verapamil são substratos para a GP-P, sendo transportados por

esta proteína de membrana. No entanto, as taxas de efluxo destas drogas e dos demais

moduladores de GP-P são diferentes, ou seja, a afinidade, velocidade e quantidade de

transporte podem variar. Os fatores que influenciam na ligação e no transporte pela GP-

P ainda não foram totalmente elucidados. Aparentemente, interações hidrofóbicas são

responsáveis pela ligação entre a droga e a proteína, enquanto a carga catiônica

associada à lipofilicidade da droga está relacionada ao seu transporte (efluxo). Devido a

estas características, a ivermectina é transportada cerca de nove vezes a mais do que o

verapamil (POULIOT et al., 1997). Por este motivo, segundo estes autores, a

ivermectina representa um potente reversor de GP-P no tratamento de células

cancerígenas com resistência múltipla a drogas.

O estudo da composição físico química das drogas moduladoras de GP-P pode

indicar futuras moléculas com maior potencial de ligação e transporte por esta proteína,

com taxas de efluxo superiores à ivermectina, superando os resultados obtidos na

reversão da resistência à ivermectina pelo verapamil observados no presente trabalho e

na literatura (BEUGNET et al., 1997; MOLENTO & PRICHARD, 2001).

O teste in vivo demonstrou uma reversão parcial da resistência deste nematódeo

à ivermectina. Estes são os primeiros resultados na literatura demonstrando o efeito do

verapamil na reversão de resistência à ivermectina em ovinos experimentalmente

infectados com uma estirpe de campo de H. contortus.

BORGES et al. (2005) avaliaram a associação destas duas drogas por meio de

teste de redução de contagens de OPG em ovinos naturalmente infectados e

observaram 74,71% de eficácia no 14

dia pós-tratamento, enquanto a ivermectina

nesta mesma data apresentou eficácia nula.

MOLENTO & PRICHARD (1999) avaliaram o efeito reversor do verapamil por

meio de um modelo experimental utilizando gerbils (Meriones unguiculatus) infectados

com H. contortus, sendo observada eficácia de 26% para a ivermectina isolada e 48%

para a associação desta droga com o modulador de GP-P. utilizando este mesmo

modelo experimental, XU et al. (1998) observaram eficácia da ivermectina de 80% e

93% e da moxidectina de 70 e 96%, respectivamente na ausência e na presença de

verapamil contra uma estirpe de H. contortus selecionada artificialmente para

resistência à moxidectina durante 14 gerações (MOF14), sendo utilizada uma dose de

verapamil de 20 mg/kg, muito acima da empregada no presente trabalho (3mg/kg).

A associação verapamil e ivermectina (1% ou 2%) em uma mesma formulação,

contendo veículo oleoso, não causou aumento na eficácia anti-helmíntica da

ivermectina contra a estirpe resistente de H. contortus, sendo encontrado elevado

número de parasitos nos animais tratados. Estes resultados demonstraram a influência

da formulação na eficácia anti-helmíntica, visto que utilizando-se veículo aquoso, foram

obtidos resultados satisfatórios. O objetivo de utilizar um veículo oleoso para o

verapamil seria permitir uma absorção mais lenta no local de aplicação, uma vez que

esta droga é absorvida e eliminada muito rapidamente do organismo (MCTAVISH &

SORKIN, 1989), enquanto as lactonas macrocíclicas apresentam maior meia-vida de

absorção e tempo de residência médio mais prolongado. Estudos futuros sobre a

farmacocinética desta associação administrada em ovinos serão necessários para que

seja obtida uma formulação com veículo e concentração adequados.

No presente trabalho, foi observada diferença entre os resultados obtidos nos

testes in vitro e in vivo. tal diferença pode ser explicada pelo fato de terem sido

utilizadas altas concentrações de verapamil no teste in vitro, o que não seria possível

no teste in vivo devido à possível ocorrência de efeitos adversos, conforme descrito por

MOLENTO & PRICHARD (1999). Além disso, a interação organismo : droga : parasito é

eliminada nos estudos in vitro, sendo a atividade anti-parasitária relacionada à presença

de uma concentração ativa da droga no local de ação, por um determinado período de

tempo.

região de análise

genômica

loop citoplasmático

região de ligação de ATP

região de ligação

de ATP

intracelular

extracelular

membrana

plasmática

domínios de

transmembrana

Os produtos de PCR obtidos no presente trabalho, com os iniciadores PGP2S e

MX-D a partir do DNA genômico amplificam uma região que codifica uma porção do

loop citoplasmático central da estrutura da GP- P (Figura 14), segundo BLACKHALL et

al (1998a).

Figura 14. Desenho esquemático da glicoproteína P na membrana celular. O quadrado

indica, aproximadamente, a região do DNA genômico amplificada por PCR (extraído de

BLACKHALL et al., 1998a).

A presença de polimorfismo genético associado à resistência a ivermectina,

evidencia o envolvimento da glicoproteína P neste mecanismo, uma vez que maior

quantidade desta glicoproteína poderia resultar em maior efluxo da droga. No entanto,

parece não haver um aumento no número de cópias desta estrutura em parasitos

resistentes, mas sim, a expressão de diferentes alelos deste gene (BLACKHALL et al.,

1998a; XU et al., 1998).

ZUBIETA (2005), na Argentina, estudou a variação genética relacionada à

codificação da GP-P e da subunidade α dos receptores de cloro ativados por glutamato

(HcGluCl), entre estirpes de H. contortus resistentes e sensíveis à ivermectina, por meio

da técnica de Polimorfismo de DNA amplificado randomicamente (Random Amplified

Polymorphic Dna - RAPD). O autor estabeleceu um padrão diferencial de bandas de

amplificação com RAPD-PCR apenas para os receptores GluCl entre estas duas

estirpes. Não foi possível realizar um padrão para a fosfo-glicoproteína devido a

presença de uma banda de amplificação inespecífica. Segundo SANGSTER et al.

(1999), a GP-P faz parte de uma grande família de proteínas codificadas por genes que

apresentam uma grande quantidade de alelos. Provavelmente, esta grande variedade

seria responsável por amplificações inespecíficas.

No presente trabalho, os produtos de PCR foram do tamanho esperado (840 bp),

seguindo descrição de BLACKHALL et al. (1998a). Porém, após o sequenciamento, não

se observou homologia com qualquer seqüência depositada no GenBank, nem mesmo

com a aquela da qual foram extraídos os iniciadores utilizados na PCR (PGP-A,

GenBank No. AF003908). É necessário cautela na extrapolação de resultados obtidos

de estirpes selecionadas em laboratório para estirpes de campo, pois, no

desenvolvimento das estirpes de laboratório poderia haver perda na variabilidade

genética da população, o que não ocorreria na seleção natural presente na estirpe de

campo (BLACKHALL et al., 1998a). Desta forma, os resultados obtidos no presente

trabalho poderiam, possivelmente, ser uma constatação deste conceito.

O desenvolvimento de marcadores moleculares para os genes que estejam

relacionados à sobrevivência de H. contortus aos tratamentos com anti-helmínticos

pode ser uma importante ferramenta no diagnóstico precoce da resistência, permitindo

que seja detectada quando a freqüência de genes resistentes ainda é baixa. Isso

representa uma grande vantagem em relação às demais técnicas de diagnóstico, pois,

realizado precocemente, pode-se adotar medidas para seu controle. Segundo LE

JAMBRE et al. (2000), no caso de nematódeos gastrintestinais, especialmente para o

grupo das lactonas macrocíclicas, seria importante dispor de técnicas que detectam a

freqüência do fenótipo resistente na população, quando esta ainda for abaixo de 1%.

Os resultados deste experimento demonstram a participação do gene

relacionado à GP-P no processo de resistência de H. contortus à ivermectina e reforça

a necessidade de mais estudos envolvendo outras estirpes resistentes de campo e,

também, de uma estirpe sensível à ivermectina. A pesquisa de polimorfismo do gene

relacionado a GP-P foi prejudicada pela ausência de uma estirpe sensível, que seria

comparada à estirpe resistente isolada.

Além do efluxo de ivermectina pela GP-P, outro mecanismo molecular da

resistência são alterações nos recptores nos canais de cloro ativados por glutamato

(HcGluCl). Estes canais são constituídos por três subunidades: α, ativada pela

ivermectina; β, ativada por glutamato e δ que tem apenas a função estrutural (CULLY et

al., 1994). A ivermectina apresenta um comportamento dual nestes receptores, ou seja,

em baixas concentrações atua como potencializadora do glutamato e em altas

concentrações esta molécula liga-se direta e irreversivelmente ao canal de cloro,

ativando-o e, conseqüentemente, causando paralisia flácida em invertebrados (CULLY

et al., 1994).

Aparentemente, isolados de H. contortus resistentes apresentam alterações na

quantidade de sítios α e β nos canais de cloro ativados por glutamato, com evidente

aumento destes últimos, que não são receptores para a ivermectina, o que reduz a

eficácia do anti-helmíntico (HEJMADI et al., 2000). BLACKHALL et al. (1998b)

demonstraram o aumento da freqüência de um alelo do gene da subunidade α de

HcGluCL em populações de H. contortus resistentes a avermectinas.

No presente trabalho, observou-se que as sete amostras apresentaram uma

banda de aproximadamente 200 pares de bases (pb), relacionada com a subunidade α

do canal HcGluCl bem definida e após o seqüenciamento dos produtos da PCR, houve

pouca similaridade entre as amostras, podendo indicar diferença na seleção após

tratamento com ivermectina, verapamil ou a associação entre ambas drogas. Estas

alterações também podem indicar a participação deste gene no mecanismo molecular

de resistência à ivermectina nesta população de campo de H. contortus.

Desta forma, a reversão apenas parcial da resistência à ivermectina observada

no presente trabalho pode ser justificável devido à participação de mais de um

mecanismo molecular de resistência e não apenas a GP-P. Ou seja, o verapamil age

apenas sobre um mecanismo de resistência, a GP-P, e não sobre as alteração nos

receptores HcGluCl.

O verapamil mostrou-se um eficiente modulador da glicoproteína-P, porém outros

mecanismos de resistência à ivermectina estão presentes em H. contortus. As

formulações avaliadas no teste in vivo não apresentaram o elevado percentual de

eficácia observado no teste in vitro, provavelmente devido a diferenças de concentração

e à interação organismo:droga. Estes resultados demonstram o potencial do uso de

drogas reversoras de resistência e a necessidade de estudos utilizando o modelo

animal e não apenas testes in vitro.

VI. CONCLUSÕES

1. A dificuldade na obtenção de uma estirpe de H. conturtus sensível à

ivermectina reforça a grave situação da resistência anti-helmíntica em ovinos no Estado

de São Paulo

2 Os resultados obtidos por meio de teste in vitro permitem inferir que o

verapamil é um potente reversor da resistência à ivermectina.

3 O efeito da formulação na eficácia anti-helmíntica, observado no teste in

vivo, demonstra a necessidade de novos estudos, incluindo a farmacocinética de

verapamil e ivermectina em ovinos.

4 GP-P e HcGluCl participaram do mecanismo molecular de resistência à

ivermectina desta estirpe de campo de H. conturtus .

5 O uso de drogas moduladoras de GP-P podem ser uma importante

ferramenta no controle de populações de helmintos resistentes às lactonas

macrocíclicas e merecem outros estudos.

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