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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
PEDRO AUGUSTO PINTO BONNASSIS
CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS FÚNGICOS
ECTOMICORRÍZICOS NA PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO E NA
COLONIZAÇÃO RADICULAR DE Eucalyptus dunnii Maiden
Florianópolis, agosto de 2007
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PEDRO AUGUSTO PINTO BONNASSIS
CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS FÚNGICOS
ECTOMICORRÍZICOS NA PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO E NA
COLONIZAÇÃO RADICULAR DE Eucalyptus dunnii Maiden
Dissertação de Mestrado apresentada como
requisito parcial à obtenção de grau de Mestre.
Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia, da
Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientadores: Profª Dra Vetúria Lopes de Oliveira
e Prof. Dr. Germano Nunes Silva Filho
Florianópolis, agosto de 2007
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A minha Avó Geni Kumm Pinto (in memorian)
“Estuda meu filho, estuda!”
AGRADECIMENTOS
• À professora Dra. Vetúria Lopes de Oliveira, pela orientação, apoio, amizade e por todo o
aprendizado que obtive nos últimos 8 anos.
• Ao professor Dr. Germano Nunes Silva Filho pelo apoio e orientação.
• À professora Dra. Zaida Inês Antoniolli, pela orientação e amizade.
• Aos colegas de laboratórios: Bianca Lucchesi, Carla Maísa, Everton Angioletto, Gisela
Dalcin, Leyza Paloschi, Liz Cristina, Luciano Alves, Luiz Afonso, Márcio Rossi e Paulo
Duarte por todo o apoio e pelos momentos agradáveis durante todo esse tempo de
convivência.
• Aos colegas da Universidade Federal de Santa Maria, Manoeli Lupatini e Ricardo Steffan
pela orientação, receptividade e companheirismo.
• Ao Engenheiro Agrônomo Luiz Afonso Borges de Souza, por todo o apoio, pela pessoa
especial que é, e por ter se tornado um grande amigo.
• À minha filha Luiza, por quem meu coração bate mais forte, por toda a alegria que me
proporciona a cada dia.
• Aos meus pais, João Batista Bonnassis Jr. e Sandra Pinto, pelo carinho, amor e toda a
educação que recebi, sem os quais, nada seria possível.
• Aos meus irmãos, Renata e João Paulo, simplesmente por existirem, e à minha avó Geni
(in memorian) pelo constante incentivo. Amo vocês.
• À mãe de minha filha, Silvana, eterna parceira, por tudo que vivemos juntos e pela
pessoa especial que é em minha vida.
• A todos os professores que passaram pela minha vida e que contribuíram para a minha
formação pessoal e acadêmica.
• A todos os meus grandes amigos (Luis Ragga, Nélio Herzman, Alexandre Gobbo, Fábio
Fúria, Guilherme Fialho, Luciano Moreira, Jerônimo Júnior, Juliana Bosa, Noam Wolter,
Ney Zunino) pelos ótimos momentos vividos e pela ajuda na formação da minha
personalidade.
• Aos meus irmãos da banda Faraway, Jera, Mércia, Anderson, Rodrigo, Felipe e Taísa pela
compreensão e pela convivência agradável, em todo esse tempo.
• À Julie Philippe pelo apoio fantástico na reta “finalíssima”.
• Às demais pessoas que, mesmo não citadas, contribuíram de alguma forma para a
realização deste trabalho.
Muito obrigado!
SUMÁRIO
LISTA DE QUADROS................................................................................................viii
LISTA DE TABELAS............................................................................................ ....... ix
LISTA DE FIGURAS................................................................................................ ... xi
RESUMO............................................................................................................. ..... xiv
ABSTRACT……………………………………………………………………. ................. xv
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS................................................... ........... xvi
INTRODUÇÃO.............................................................................................................1
CAPÍTULO 1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.........................................................................................5
CAPÍTULO 2
CRESCIMENTO DE MUDAS DE Eucalyptus dunnii INOCULADAS COM ISOLADOS
DE FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS, INDIVIDUALMENTE OU EM MISTURA, SOB
CONDIÇÕES DE CASA DE VEGETAÇÃO .............................................................. 13
2.1 INTRODUÇÃO.................................................................................................13
2.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................14
2.2.1 Isolados fúngicos utilizados.......................................................................14
2.2.2 Produção do inóculo fúngico .....................................................................14
2.2.3 Preparo do substrato de plantio ................................................................15
2.2.4 Germinação das sementes .......................................................................15
2.2.5 Inoculação e condução do experimento....................................................16
2.2.6 Avaliação dos resultados ..........................................................................17
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................19
2.4 CONCLUSÕES................................................................................................40
CAPITULO 3
MORFOTIPAGEM DE ECTOMICORRIZAS OBTIDAS ATRAVÉS DE SÍNTESE IN
VITRO........................................................................................................................ 41
3.1 INTRODUÇÃO.................................................................................................41
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................42
3.2.1 Isolados fúngicos utilizados.......................................................................42
3.2.2 Obtenção das plântulas de Eucalyptus dunnii sob condições assépticas.43
3.2.3 Inoculação das plântulas...........................................................................43
3.2.4 Avaliação dos resultados ..........................................................................44
vii
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................45
3.3.1 Aspecto das raízes colonizadas pelos diferentes isolados fúngicos
ectomicorrízicos .................................................................................................46
3.4 CONCLUSÕES................................................................................................52
CAPÍTULO 4
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Chondrogaster angustisporus, ISOLADO
UFSC-Ch163..............................................................................................................54
4.1 INTRODUÇÃO.................................................................................................54
4.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................55
4.2.1 Extração do DNA do isolado fúngico ectomicorrízico UFSC-Ch163,
Chondrogaster angustisporus ............................................................................55
4.2.2 Amplificação e seqüenciamento da região ITS do DNA de Chondrogaster
angustisporus, isolado UFSC-Ch163 .................................................................57
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................58
4.3.1 Seqüenciamento da região ITS de Chondrogaster angustisporus, isolado
UFSC-Ch163......................................................................................................58
4.4 CONCLUSÕES................................................................................................61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................62
ANEXO 1
PROTOCOLO DE PREPARO DE 1 L DA SOLUÇÃO P-B (MOLIBDATO DE
AMÔNIO)...............................................................................................................70
ANEXO 2
PROTOCOLO DE PREPARO DA SOLUÇÃO P-C (ÁCIDO 1-AMINO-2-NAFTOL-4-
SULFÔNICO).........................................................................................................71
ANEXO 3
FICHA DE DESCRIÇÃO DE MORFOTIPOS DE ECTOMICORRIZAS .................72
ANEXO 4
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS ECTOMICORRIZAS .....................73
viii
LISTA DE QUADROS
Quadro 2.1. Isolados de fungos ectomicorrízicos da coleção da UFSC utilizados
nesse estudo .........................................................................................14
Quadro 2.2. Esquema dos diferentes tratamentos de inoculação de mudas de
Eucalyptus dunnii por fungos ectomicorrízicos......................................17
Quadro 3.1. Características morfológicas externas e internas das micorrizas..........45
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Altura média de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de
cultivo sob condições de casa de vegetação..........................................21
Tabela 2.2. Diâmetro de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de
cultivo sob condições de casa de vegetação..........................................23
Tabela 2.3. Matéria seca da parte aérea de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas
com fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do
tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação..........................25
Tabela 2.4. Matéria seca do sistema radicular de plantas de Eucalyptus dunnii
inoculadas com fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura,
em função do tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação ...26
Tabela 2.5. Matéria seca total de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com
fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do
tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação..........................28
Tabela 2.6. Comprimento radicular de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com
fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do
tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação..........................30
Tabela 2.7. Relação entre a matéria seca do sistema radicular e da parte aérea de
plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos,
isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob
condições de casa de vegetação............................................................32
x
Tabela 2.8. Acúmulo de fósforo (P) na parte aérea de plantas de Eucalyptus dunnii
inoculadas com fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura,
em função do tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação ...34
Tabela 2.9. Teor (%) de fósforo (P) na parte aérea de plantas de Eucalyptus dunnii
inoculadas com fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura,
em função do tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação ...36
Tabela 2.10. Comprimento radicular colonizado de plantas de Eucalyptus dunnii
inoculadas com fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura,
em função do tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação ...37
Tabela 2.11. Porcentagem de colonização radicular de plantas de Eucalyptus dunnii
inoculadas com fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura,
em função do tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação ...39
Tabela 4.1. Afinidade entre Chondrogaster angustisporus, isolado UFSC-Ch163, e
os dez fungos mais estreitamente relacionados de acordo com a
seqüência da região ITS do gene rRNA................................................... 60
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1. Altura das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de
vegetação. Os valores correspondem à média dos três meses de
avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as
mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p ≤0,05)].........................................................................20
Figura 2.2. Diâmetro do caule das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com
fungos ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa
de vegetação. Os valores correspondem à média dos três meses de
avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as
mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p ≤0,05)].........................................................................22
Figura 2.3. Matéria seca da parte aérea das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas
com fungos ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em
casa de vegetação. Os valores correspondem à média dos três meses de
avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as
mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p ≤0,05)].........................................................................24
Figura 2.4. Matéria seca radicular das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com
fungos ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa
de vegetação. Os valores correspondem à média dos três meses de
avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as
mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p ≤0,05)].........................................................................26
Figura 2.5. Matéria seca total das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com
fungos ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa
de vegetação. Os valores correspondem à média dos três meses de
xii
avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as
mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p ≤0,05)].........................................................................27
Figura 2.6. Comprimento radicular total das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas
com fungos ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em
casa de vegetação. Os valores correspondem à média dos três meses de
avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as
mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p ≤0,05)].........................................................................29
Figura 2.7. Relação entre a matéria seca do sistema radicular e da parte aérea de
mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos
isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de vegetação. Os
valores correspondem à média dos três meses de avaliação,
compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as mesmas letras
não diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p
≤0,05)]. ....................................................................................................31
Figura 2.8. Acúmulo de P total na parte aérea das mudas de Eucalyptus dunnii
inoculadas com fungos ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura,
cultivadas em casa de vegetação. Os valores correspondem à média dos
três meses de avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias
indicadas com as mesmas letras não diferem significativamente entre si
de acordo com o teste de Tukey (p ≤0,05)]. ............................................33
Figura 2.9. Teor de P na parte aérea das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas
com fungos ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em
casa de vegetação. Os valores correspondem à média dos três meses de
avaliação, compreendendo 15 repetições por tratamento [Médias
indicadas com as mesmas letras não diferem significativamente entre si
de acordo com o teste de Tukey (p ≤0,05)]. ............................................35
Figura 3.1. Aspecto geral do dispositivo de síntese micorrízica in vitro, mostrando o
micélio do fungo crescendo sobre raízes de Eucalyptus
dunnii....................................................................................................... 46
xiii
Figura 3.2. Raízes de Eucalyptus dunnii cultivadas sob condições axênicas. (a) raiz
não colonizada coberta pelo micélio do isolado SA9 e (b) sua secção
transversal. (c) Ectomicorriza formada pelo isolado UFSC-Pt132 e a
respectiva (d) secção transversal. (e) Aspecto geral da ectomicorriza
formada pelo isolado UFSC-Ch163 e (f) secção transversal da mesma
micorriza. (g) Ectomicorriza formada pelo isolado UFSC-Pt188 e (h) sua
secção transversal. M = Manto; RH = rede de Hartig..............................47
Figura 3.3. Secções transversais de ectomicorrizas de Eucalyptus dunnii em
detalhes. (a) Raiz de E. dunnii inoculada com o isolado SA9 e não
colonizada, sem manto e rede de Hartig aparentes e (b) com pêlos
radiculares. (c) Detalhe do manto e (d) rede de Hartig formados pelo
isolado UFSC-Pt132. (e) Manto, rede de Hartig, hifas extra-matriciais e (f)
fíbulas de ectomicorriza formada pelo isolado UFSC-Ch163. (g) Manto e
(g, e) rede de Hartig formados pelo isolado UFSC-Pt188. P = pêlos
radiculares; M = manto; RH = rede de Hartig; HE = hifas extra-matriciais;
F = fíbula .................................................................................................50
Figura 4.1. Seqüência de nucleotídeos da região ITS do fungo ectomicorrízico
Chondrogaster angustisporus, isolado UFSC-Ch163, gerada pelo
software Seqman, DNASTAR. A região sublinhada representa a porção
do gene rRNA que codifica para a subunidade 5,8S do RNA ribossômico.
Região ITS1: 1 – 238; 5,8S: 239 – 399; região ITS2: 400 –
610........................................................................................................... 58
Figura 4.2. Dendrograma baseado na seqüência da região ITS de Chondrogaster
angustisporus isolado UFSC-Ch163 obtido com o programa Clustal
DNASTAR. As seqüências de outras espécies foram obtidas junto ao
GenBank - National Center of Biotechnology Information (NCBI). ..........59
xiv
RESUMO
Inúmeros estudos já foram desenvolvidos para selecionar fungos
ectomicorrízicos (fECM) eficientes para inoculação de plantas de interesse
silvicultural. A maioria deles analisou o efeito da inoculação individual dos fungos
sobre o crescimento das plantas. Embora importantes para o desenvolvimento de
inoculantes e técnicas de inoculação, estes não reproduzem fielmente as condições
naturais. Sabe-se que a ocorrência simultânea de vários fECM na mesma planta
pode contribuir para maiores benefícios através de diferentes mecanismos. Assim, o
objetivo deste trabalho foi o de testar o efeito da inoculação de diferentes fECM,
individualmente ou em combinações, na absorção de fósforo e promoção do
crescimento de mudas de Eucalyptus dunnii. Para isso, foram conduzidos estudos
envolvendo os seguintes aspectos: efeito da inoculação de isolados de fECM,
aplicados individualmente e em mistura, no crescimento de E. dunnii sob condições
de casa de vegetação; caracterização anatômica e morfológica (morfotipagem) das
micorrizas formadas axenicamente por cada isolado nas raízes dessa planta; e
seqüenciamento da região ITS do gene rRNA do isolado de Chondrogaster
angustisporus, UFSC-Ch163. Em casa de vegetação, utilizando-se substrato
esterilizado, verificou-se que a inoculação das plantas com maior número de
isolados de fECM promoveu maior absorção de P e maior crescimento do que o
tratamento sem inoculação e aqueles envolvendo apenas um isolado, notando-se
maior eficiência nas combinações que envolviam o isolado UFSC-Pt188, Pisolithus
microcarpus. A inoculação individual das mudas com o isolado UFSC-Pt132 não
teve efeito sobre as variáveis analisadas. Na síntese micorrízica in vitro, apenas três
isolados formaram micorrizas: UFSC-Pt132, UFSC-Ch163 e UFSC-Pt188. O isolado
SA9 (Scleroderma flavidum) não formou micorrizas detectáveis. As micorrizas dos
isolados UFSC-Pt132 e UFSC-Pt188, da espécie Pisolithus microcarpus,
apresentaram as mesmas características morfológicas e anatômicas, não sendo
possível a distinção entre eles através da morfotipagem. As micorrizas formadas
pelo isolado UFSC-Ch163 (Chondrogaster angustisporus), porém, foram bastante
distintas. Quando a seqüência da região ITS do gene rRNA de C. angustisporus
UFSC-Ch163 foi analisada em conjunto com as dez mais similares obtidas no NCBI
Genbank, esse isolado formou um agrupamento separado com um fECM não
identificado e não cultivado, oriundo do arquipélago das Seychelles. A porcentagem
de similaridade entre a seqüência de C. angustisporus e as dos dez fungos
ectomicorrízicos mais similares, disponíveis no NCBI, variou de 82 a 100 %,
demonstrando uma afinidade significativa com espécies dos gêneros
Gloeocantharellus, Ramaria, Gautieria, Gomphus, Hysterangium e Sphaerobolus,
reforçando a recente proposta que classifica o gênero Chondrogaster na subclasse
Phallomycetidae, formada pelo agrupamento das ordens Gomphales e Phallales,
com base nas seqüências dos genes nuc-LSU-rRNA e mt-SSU-rRNA e de proteínas.
Palavras-chave: Competitividade, Eficiência, Morfotipagem, Seqüenciamento, ITS
xv
ABSTRACT
Several studies have been performed to select efficient ectomycorrhizal fungi
(ECMf) to be employed on inoculation programmes in forest nurseries. The majority
of them has analyzed the effect of single isolates on plant growth. Although these
studies have been very important for developing techniques of inoculum production
and of inoculation, they do not represent the real situation found in natural conditions
where roots are simultaneously colonized by different fungi and may take advantage
of several beneficial mechanisms. In this context, the main objective of this work was
to evaluate the effect of the inoculation of Eucalyptus dunnii seedlings with different
ectomycorrhizal isolates, applied individually or in combination, on phosphorus (P)
uptake and plant growth. Studies were then performed involving the following
aspects: effect of the inoculation of plants with ECM isolates, applied individually and
in mixture on growth of E. dunnii seedlings growing in a sterilized substrate in
greenhouse conditions; morphotyping of ectomycorrhizas formed by these isolates
on roots of E. dunnii under aseptical conditions in growth chamber; and sequencing
of the ITS region of the rRNA gene of the isolate UFSC-Ch163 (Chondrogaster
angustisporus). In greenhouse, it was observed that the plants inoculated with
several isolates presented a higher content of P in their shoots, higher height and
higher dry matter content than plants inoculated with single isolates and the
uninoculated plants. This was particularly the case when the inoculum contained the
isolate UFSC-Pt188, Pisolithus microcarpus. On the other hand, the single
inoculation of seedlings with the isolate UFSC-Pt132, also a P. microcarpus, had no
effect on these variables. After five weeks in growth chamber, plants aseptically
growing in presence of ectomycorrhizal isolates formed mycorrhizas with only three
of them, UFSC-Pt132, UFSC-Ch163 and UFSC-Pt188. Isolate SA9 (Scleroderma
flavidum), did not promoted any detectable colonization. Mycorrhizas formed by the
isolates UFSC-Pt132 and UFSC-Pt188, both of the species Pisolithus microcarpus,
presented the same morphological and anatomical characteristics indicating that
morphotyping is not a convenient technique to differentiate them when associated to
eucalypt roots. Mycorrhizas formed by the isolate UFSC-Ch163 (Chondrogaster
angustisporus) were of a quite different morphotype. The sequence of the ITS region
of the rRNA gene of C. angustisporus UFSC-Ch163 showed 100 % similarity with a
unidentified and uncultivated ECMf from Seychelles available in the National Center
for Biotechnology Information (NCBI) Genbank. The nucleotide sequence similarity
among this isolate and NCBI sequences ranged from 82 to 100 % for both regions.
Its similarity with those obtained from species of other putative ECMf of the genera
Gloeocantharellus, Ramaria, Gautieria, Gomphus, Hysterangium and Sphaerobolus
supports the recent proposal that places Chondrogaster in the new subclass
Phallomycetidae formed by the gomphoid-phalloid group, based in the sequences of
the genes nuc-LSU-rRNA and mt-SSU-rRNA and of proteins.
Key words: Competitiveness, Efficiency, Morphotyping, Sequencing, ITS
xvi
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
∅
diâmetro
µg
micrograma(s)
µL
microlitro
µm
micrômetro
µM
micromolar
µg.mL
-1
microgramas por mililitro
marca registrada
ATP adenosina trifosfato
B boro
BAM bactérias auxiliadoras da micorrização
BOD demanda bioquímica de oxigênio
ºC grau(s) Celsius
cf. confronte, compare
cm centímetro(s)
cm.planta
-1
centímetro(s) por planta
CO
2
dióxido de carbono
Cu cobre
dNTP desoxirribonucleotídeos
Fe ferro
fECM fungo(s) ectomicorrízico(s)
g grama(s)
g.L
-1
grama(s) por litro
g.planta
-1
grama(s) por planta
h hora(s)
ITS
internal transcribed spacer
K potássio
L litro(s)
M molar
m metro(s)
Mg magnésio
mg miligrama(s)
min minuto(s)
xvii
mL mililitro(s)
mm milímetro(s)
mM minimolar
MNM meio Melin-Norkrans modificado
Mn manganês
Mo molibdênio
N nitrogênio
ng nanograma(s)
nm nanômetro(s)
P fósforo
p≤
probabilidade menor ou igual
pb pares de base
P-B solução de molibdato de amônio
P-C solução de ácido-1-amino-2-naftol-sulfônico
PCBs bifenis policlorinados
PCR
Polymerase Chain Reaction
PEG polietileno glicol
planta
-1
por planta
POPs poluentes orgânicos persistentes
PVC policloreto de vinila
PVLG álcool polivinílico ao lactoglicerol
rcf
relative centrifugal force
rpm rotações por minuto
s segundo(s)
UV Ultravioleta
V:V volume por volume
Zn Zinco
INTRODUÇÃO
Diversos fungos podem estabelecer simbioses mutualísticas com plantas,
formando estruturas denominadas micorrizas. Este termo (do grego mykes = fungo e
rhiza= raiz) foi proposto por Frank em 1885, quando observou que essas
associações não constituíam casos de parasitismo entre o fungo e a planta, mas que
resultavam em benefícios para ambos.
Nessas associações, os fungos micorrízicos aumentam a captura de vários
nutrientes do solo e sua translocação à planta hospedeira. A distribuição difusa do
micélio no solo ao redor das raízes, alcançando distâncias maiores do que as
atingidas pela raiz não colonizada, proporciona uma maior capacidade de absorção
de nutrientes, principalmente de fósforo (P), nitrogênio (N) e potássio (K). Além
disso, as mudanças na arquitetura radicular, com maior intensidade de ramificação,
aumentam a superfície de contato com o solo. As raízes colonizadas possuem maior
longevidade, e uma maior resistência a patógenos, a elementos tóxicos presentes
no solo e a condições extremas de temperatura, acidez e umidade.
Ao se associarem com as raízes, os fungos ficam protegidos da intensa
competição microbiana da rizosfera, além de se beneficiarem de vários compostos
produzidos pela planta hospedeira, como carboidratos, aminoácidos e vitaminas.
Como resultado, as plantas colonizadas apresentam maior sobrevivência e
crescimento em solos com deficiência de nutrientes como N, P e K do que as plantas
não colonizadas.
Dentre os diferentes tipos de micorrizas, as vesículo-arbusculares e as
ectomicorrizas são consideradas as mais importantes sob o ponto de vista ecológico
e econômico. As primeiras, devido ao grande número de plantas hospedeiras e, a
sua ocorrência em grande parte dos ecossistemas, principalmente tropicais e
subtropicais. Elas são encontradas em espécies vegetais de interesse agronômico,
para produção de alimentos e fibras. As ectomicorrizas são encontradas em plantas
de interesse florestal e silvicultural, principalmente em regiões temperadas. Embora
estime-se que ocorram em somente cerca de 3 % dos vegetais superiores, as
ectomicorrizas são predominantes nas essências florestais mais utilizadas em
silvicultura intensiva no mundo (Pinaceae, Myrtaceae e Fagaceae), envolvendo uma
2
grande variedade de espécies fúngicas, principalmente dos filos Ascomycota e
Basidiomycota.
Vários gêneros de fungos são capazes de formar associações
ectomicorrízicas, como por exemplo: Amanita, Boletus, Chondrogaster,
Descomyces, Laccaria, Lactarius, Lycoperdon, Pisolithus, Ramaria, Rhizopogon,
Scleroderma, Suillus e Thelephora, entre outros. Na maioria dos casos, as plantas
crescendo sob condições de campo encontram-se colonizadas por diferentes
fungos.
Além dos benefícios citados anteriormente, há, também, o aumento na
resistência e sobrevivência dessas plantas hospedeiras em áreas contaminadas com
metais ou outras substâncias tóxicas. Uma variedade de fungos ectomicorrízicos tem
demonstrado capacidade de degradar cinco das principais classes dos chamados
poluentes orgânicos persistentes (POPs). Entende-se que há também um benefício
para o ecossistema, já que a inoculação das plantas com fungos micorrízicos pode
diminuir significativamente a quantidade de fertilizantes requerida para o cultivo de
vegetais.
As espécies do gênero Eucalyptus encontram-se entre aquelas que se
beneficiam da associação ectomicorrízica. No Brasil, os eucaliptos são as essências
florestais mais importantes, com cerca de 6 milhões de hectares plantados. Sua
exploração é responsável por grande parte do sucesso da atividade florestal
brasileira, principalmente dos setores ligados à produção de papel e celulose.
Embora seja uma atividade das mais produtivas, o cultivo do eucalipto no
Brasil encontra limitações no que diz respeito à fertilidade do solo, pois é feito,
geralmente, em solos pobres. Isso contribui para aumentar a importância dos fungos
ectomicorrízicos (fECM).
Estudos sobre a diversidade, a dinâmica das populações de fECM e suas
relações com os hospedeiros poderão contribuir para uma melhor compreensão
sobre a biodiversidade da região, a seleção de fECM eficientes e o controle da
micorrização.
Inúmeros estudos têm sido desenvolvidos por diferentes autores, em
diferentes regiões, visando selecionar fungos ectomicorrízicos eficientes para
inoculação de plantas de interesse silvicultural. Entretanto, todos eles tinham como
objetivo avaliar o efeito individual dos isolados fúngicos na colonização e na
3
promoção do crescimento. Embora esses resultados sejam de grande importância
para o aperfeiçoamento das técnicas de produção de inoculantes e de inoculação,
as situações estudadas não representam de maneira fiel os eventos que devem
ocorrer sob condições naturais de campo.
A inoculação das plantas com isolados individuais deixa de considerar as
interações entre diferentes fungos ectomicorrízicos, assim como as interações
destes com a microbiota do solo em geral. Tais interações são, no entanto,
importantes e devem ser consideradas nas estratégias de micorrização controlada.
A ocorrência simultânea de diferentes espécies desses fungos no mesmo
sistema radicular pode resultar da complementação fisiológica observada em
interações sinérgicas. Essa complementação entre diferentes espécies ou isolados
de fECM também pode se dar em benefício da planta hospedeira.
Assim, é importante comparar o efeito de diferentes combinações de fECM
em relação ao procedimento de inoculação individual, visando explorar de maneira
mais eficiente os benefícios advindos da simbiose ectomicorrízica.
A identificação de cada isolado colonizando o sistema radicular é de grande
importância para a complementação de tais resultados. Métodos tradicionais de
caracterização anatômica e morfológica (morfotipagem) têm sido empregados em
conjunto com as modernas ferramentas de biologia molecular para o
reconhecimento da espécie fúngica presente na raiz e um melhor conhecimento a
respeito da comunidade micorrízica local.
Nesse âmbito, o principal objetivo deste trabalho foi o de testar o efeito da
inoculação de diferentes fECM, aplicados isoladamente ou em mistura, na
colonização, absorção de fósforo e promoção do crescimento de mudas de
Eucalyptus dunnii.
Para isso, foram conduzidos estudos envolvendo os seguintes aspectos:
1. Efeito da inoculação dos isolados SA9, UFSC-Pt132, UFSC-Ch163, UFSC-Pt188,
aplicados individualmente e em mistura, no crescimento de E. dunnii sob condições
de casa de vegetação;
2. Caracterização anatômica e morfológica (morfotipagem) das micorrizas formadas
por cada isolado fúngico nas raízes de E. dunnii;
4
3. Extração, amplificação e seqüenciamento da região ITS do gene rRNA do isolado
UFSC-Ch163, Chondrogaster angustisporus, a partir do micélio obtido em cultura
pura.
CAPÍTULO 1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Estima-se que 75-80% das plantas formam associações simbióticas
mutualísticas com as raízes de certas espécies de fungos (SMITH & READ, 1997).
Tais associações, denominadas micorrizas, caracterizam-se pela colonização das
raízes pelo fungo e pelos benefícios mútuos para ambos os simbiontes, o fungo e a
planta. As micorrizas teriam desempenhado um papel fundamental na colonização
do ambiente terrestre pelas plantas (PIROZYNSKI & MALLOCH, 1975;
PIROZYNSKI, 1981).
Quando associados às raízes, os fungos micorrízicos favorecem a absorção
de vários nutrientes do solo e sua translocação à planta hospedeira. A distribuição
difusa do micélio aumenta a superfície de contato das raízes com o solo,
proporcionando uma maior absorção de nutrientes, principalmente de nitrogênio (N),
fósforo (P) e potássio (K) (SMITH & READ, 1997). Este fenômeno é particularmente
importante em relação ao P, já que a maior parte deste mineral encontra-se sob
formas indisponíveis aos vegetais nos solos das regiões tropicais e subtropicais
(RAIJ et al., 1982). Além disso, o P é pouco móvel no solo, tornando-se um dos
principais fatores limitantes ao crescimento das plantas (PAUL & CLARK, 1989).
Os fungos micorrízicos também podem aumentar a absorção de nutrientes
através da exsudação de compostos quelantes e da mobilização de nutrientes
escassos (MARSCHNER & DELL, 1994). As raízes colonizadas possuem maior
longevidade, e uma maior resistência a patógenos, a elementos tóxicos presentes
no solo e a condições extremas de temperatura, acidez e umidade (ALLEN, 1991).
Em contrapartida, os fungos associados às raízes, além de se protegerem da
intensa competição microbiana da rizosfera, se beneficiam de vários compostos
produzidos pela planta hospedeira, como carboidratos, aminoácidos e vitaminas
(SMITH & READ, 1997). Como resultado, as plantas adquirem maior biomassa e
crescem melhor em solos com deficiência de nutrientes como N, K e P que as
plantas não colonizadas (GARBAYE, 1990; SMITH & READ, 1997).
6
Além dos benefícios para a planta e para o fungo, entende-se que há,
também, benefícios econômicos e ambientais, já que a colonização das plantas com
fungos ectomicorrízicos pode diminuir significativamente a quantidade de fertilizantes
e agroquímicos requeridos para o cultivo de vegetais (MARX, 1991; MARX et al.,
1992).
Dentre os vários grupos de micorrizas, as micorrizas vesículo-arbusculares e
as ectomicorrizas são as mais importantes sob o ponto de vista ecológico e
econômico. Este último grupo apresenta uma importância ainda maior no que diz
respeito à silvicultura intensiva. Embora ocorram em apenas cerca de 3% dos
vegetais superiores, as ectomicorrizas envolvem uma grande variedade de espécies
fúngicas, principalmente dos filos Basidiomycota e Ascomycota, e são
predominantes nas essências florestais mais utilizadas em silvicultura no mundo
(espécies das famílias Pinaceae, Myrtaceae e Fagaceae) (WILCOX, 1990;
ALEXOPOULOS et al., 1996; SMITH & READ, 1997).
Estima-se que existam mais de 6 mil espécies de fungos ectomicorrízicos.
Considerando-se que apenas 5% da diversidade fúngica do planeta é conhecida,
com aproximadamente 80.000 espécies descritas (KIRK et al., 2001), de um total
estimado de 1,5 milhão de espécies (HAWKSWORTH, 1991, 1993), pode-se supor
que o número de espécies de fungos ectomicorrízicos seja ainda maior.
As espécies do gênero Eucalyptus encontram-se entre aquelas que formam
ectomicorrizas e se beneficiam dessa associação. No Brasil, os eucaliptos são as
essências florestais mais importantes, com cerca de 6 milhões de hectares
plantados. Sua exploração é responsável por grande parte do sucesso do setor
florestal brasileiro, principalmente na obtenção de madeira para a produção de papel
e celulose (EMBRAPA, 2003).
Embora seja uma atividade das mais produtivas, o cultivo do eucalipto no
Brasil encontra fatores limitantes no que diz respeito à fertilidade do solo. A maioria
dos solos do território nacional utilizados para plantios florestais é de baixa fertilidade
(RAIJ, 1991), o que torna ainda maior a importância dos fungos ectomicorrízicos
(fECM). Além disso, as mudas, tanto nos viveiros como no campo, são susceptíveis
a ataques de fungos patogênicos. Por isso, há um grande interesse no uso de
fungos ectomicorrízicos como agentes de controle biológico (SMITH & READ, 1997).
Algumas interações entre os microrganismos da rizosfera de uma micorriza, a
micorrizosfera, são bem estudadas e apresentam exemplos importantes no que diz
7
respeito à saúde e crescimento das plantas. Entre elas, encontra-se a inibição, por
fungos micorrízicos, de infecções das raízes. As doenças radiculares constituem um
dos principais fatores limitantes à produção vegetal. Fungos do gênero Fusarium,
Phytophthora, Pythium e Rhizoctonia são conhecidos patógenos de vegetais que
infectam as raízes e/ou produzem toxinas, matando a planta ou reduzindo sua
capacidade de absorver água e nutrientes (GARBAYE, 1991). Quando a simbiose
ainda não está estabelecida, esses patógenos apresentam certa vantagem
competitiva sobre os fungos micorrízicos, devido a sua maior capacidade saprofítica,
ainda que alguns fungos micorrízicos produzam compostos antibióticos que
contribuem para minimizar esta desvantagem.
Quando a simbiose já se estabeleceu, os fECM passam de uma condição de
desvantagem para uma situação de vantagem competitiva sobre os patógenos de
raiz. Nesse momento, os fECM não mais competem pelo substrato e se tornam mais
eficientes na produção de antibióticos. Além disso, os fECM passam a funcionar com
uma verdadeira barreira física para os patógenos, devido à presença do manto
fúngico cobrindo a raiz. Marx (1972) afirma que fECM, como Pisolithus tinctorius,
apresentam essa capacidade protetora apenas quando o manto fúngico já está
completamente formado, diferentemente de outros, como Laccaria laccata e Suillus
luteus, que apresentam uma ação preventiva anterior à formação do manto,
possivelmente devido à produção de antibióticos.
Existem ainda registros de efeitos protetores estimulados por um terceiro
organismo de vida livre. Stack & Sinclair (1975), apud Garbaye (1991), observaram
que as raízes de Pseudotsuga menziesii eram protegidas da ação de Fusarium
oxysporum pela presença de microrganismos antagonistas ao patógeno. Esses
antagonistas seriam estimulados pela presença na rizosfera do fECM Laccaria
laccata, mesmo antes de a colonização micorrízica se estabelecer.
Alguns estudos mostram que podem haver outros benefícios indiretos às
raízes hospedeiras. Marx (1972) sugere que o estabelecimento da simbiose
ectomicorrízica aumenta drasticamente o conteúdo de polifenóis ou terpenos das
raízes, inibindo o crescimento de patógenos radiculares. Sylvia & Sinclair (1983) e
Smith & Read (1997) sugerem que a produção de compostos fenólicos pelos tecidos
vegetais, em resposta à presença de fungos micorrízicos, pode ser responsável pela
redução de doenças causadas por Fusarium oxysporum em Pseudotsuga menziesii,
Picea abies e Pinus sylvestris.
8
Marx (1969) encontrou que os fungos ectomicorrízicos Pisolithus tinctorius e
Thelephora terrestris reduzem o impacto do patógeno de raiz Phytophthora
cinnamomi, quando inoculados em mudas de Pinus spp. Para esse autor, a rede de
Hartig bloqueia o avanço do patógeno para o interior da raiz, funcionando como uma
barreira mecânica. Além disso, outros mecanismos de inibição de patógenos podem
estar envolvidos.
Há vários registros da produção de antibióticos por fungos ectomicorrízicos.
Kope & Fortin (1990) sugerem que há uma proteção fornecida pela colonização
ectomicorrízica das raízes com a produção de antibióticos por parte de fungos
ectomicorrízicos. Num estudo de seleção dos fungos ectomicorrízicos, esses autores
encontraram que metabólitos excretados pelo fungo produziram uma mudança na
morfologia das hifas de outros fungos na rizosfera. Mais especificamente, Pisolithus
tinctorius produziu metabólitos que causaram lise de hifas e outras mudanças
morfológicas que indicaram uma disfunção celular em alguns fitopatógenos. Essa
inibição de um fitopatógeno por um fungo ectomicorrízico, pode servir como uma
ferramenta poderosa no controle biológico de doenças de plantas.
Além disso, a produção de antibióticos por fungos ectomicorrízicos pode ser
de fundamental importância no que diz respeito à persistência da espécie no
ambiente. Para um fungo ectomicorrízico permanecer competitivo em um ambiente
continuamente em mudança, como é aquele em torno da raiz do hospedeiro, são
necessários diversos mecanismos de sobrevivência, incluindo a produção de
antibióticos. Por sua vez, tal habilidade pode ser importante no estabelecimento da
simbiose, considerando-se que muitos organismos de vida livre são antagonistas de
fungos micorrízicos durante o seu crescimento sobre a superfície da raiz, na fase
que antecede a colonização pelo fungo.
Alguns trabalhos têm mostrado que quando estão em abundância na
rizosfera, alguns microrganismos podem inibir drasticamente a colonização
micorrízica e, conseqüentemente, o crescimento das plantas (KEAST & TONKIN,
1983). Muitas espécies de bactérias e fungos como Trichoderma spp. são parasitas
de fungos ectomicorrízicos (SUMMERBELL, 1989), enquanto que outros
microorganismos, como protozoários e nematóides, se alimentam do micélio desses
fungos. Além disso, bactérias e fungos freqüentemente produzem substâncias
tóxicas (antibióticos), ou competem com fungos micorrízicos por exsudatos das
raízes requeridos para o estabelecimento da simbiose (BRIAN et al., 1945).
9
Outras espécies bacterianas, porém, podem beneficiar essa relação
simbiótica. É o caso das bactérias auxiliadoras da micorrização (BAM), assim
denominadas por Garbaye & Bowen (1989). Segundo Oliveira & Garbaye (1989),
entre os mecanismos que podem influenciar o estabelecimento da simbiose estão a
produção de substratos carbonados que podem ser utilizados pelo fECM como fonte
de carbono, ou de fatores de crescimento (hormônios, vitaminas e aminoácidos), a
detoxificação do ambiente, a mineralização de compostos orgânicos complexos e a
liberação de nutrientes aos simbiontes, ou, ainda, a produção de enzimas
celulolíticas que facilitam a penetração do fungo na raiz.
Num estudo recente, Aspray et al. (2007) verificaram que um dos mecanismos
de ação de certas bactérias do solo, Paenibacillus sp. e Burkolderia sp., consistia na
modificação da arquitetura radicular, aumentando a intensidade de dicotomia das
raízes curtas. Como já mencionado, a maior ramificação do sistema radicular
contribui para o aumento da interface raiz-solo e, por conseguinte, para um maior
potencial de captação de nutrientes e água.
Desse modo, essas bactérias podem contribuir para o sucesso da
colonização micorrízica, melhorando as condições de sobrevivência das plantas
hospedeiras em seu ambiente.
Além dos benefícios proporcionados às plantas pelas ectomicorrizas, citados
anteriormente, há o aumento na resistência e sobrevivência dessas plantas
hospedeiras em áreas contaminadas com metais ou outras substâncias tóxicas.
Uma variedade de fECM já foi estudada e muitos dos isolados mostraram
capacidade de degradar cinco das principais classes dos chamados poluentes
orgânicos persistentes (POPs). Donnelly e Fletcher (1995) encontraram que 14 dos
21 fECM estudados por eles apresentavam capacidade para degradar bifenis
policlorinados (PCBs), um resíduo da indústria de lubrificantes com alta persistência
no ambiente ao se ligar a partículas do solo. Algumas espécies mostram-se capazes
de degradar diclorofenol e trinitrotolueno, outros poluentes orgânicos (MEHARG et
al., 1997a e 1997b).
Embora a degradação desses poluentes por fECM seja, em geral, menos
eficiente que aquela promovida por fungos saprófitas, como os fungos da podridão
branca (GRAMSS et al., 1999), existem alguns fatores que devem ser considerados,
como por exemplo, a velocidade relativa de crescimento dos fungos e a persistência
destes no solo. Neste sentido, os fECM mostram-se promissores, pois muitos podem
10
persistir no solo por muitos anos, podendo auxiliar no estabelecimento de novas
espécies em áreas sujeitas a essas condições adversas. Assim, as associações
ectomicorrízicas podem ser úteis na recuperação de áreas degradadas, tornando as
plantas hospedeiras mais aptas a colonizar áreas poluídas (CAIRNEY et al., 2000).
Embora presentes em muitos ecossistemas florestais, as diferentes espécies
ou isolados de fECM variam em sua capacidade de promover benefícios a seu
hospedeiro (MARX & CORDELL, 1989). Por essa razão, Garbaye (1984) aconselha
a adoção de um programa de controle da micorrização, através do qual as plantas
seriam inoculadas com fungos previamente testados quanto a sua infectividade e
eficiência na promoção do crescimento da planta. Tal programa visa assegurar a
colonização micorrízica e o bom desempenho das plantas, em solos com baixos
teores de nutrientes ou com outras condições adversas. Essa prática surge como
uma alternativa ao uso de fertilizantes, podendo contribuir para diminuir os custos de
produção e a poluição do meio ambiente (GARBAYE, 1990).
Com o objetivo de selecionar fungos ectomicorrízicos eficientes para o
controle da micorrização de Eucalyptus dunnii no Brasil, Souza (2003) encontrou
que, embora vários fECM fossem capazes de colonizar as raízes dessa planta,
alguns apresentaram maior agressividade na colonização radicular. Dos isolados
testados, alguns foram mais eficientes na promoção do crescimento da parte aérea
das plantas enquanto outros foram mais eficientes na absorção de fósforo (SOUZA
et al., 2004). Pode-se, portanto, perceber que a introdução de isolados capazes de
beneficiar diferentes funções da planta hospedeira poderia permitir explorar ainda
mais os benefícios advindos dessa simbiose, com resultados significativos na
produtividade das plantações.
Embora diversos autores tenham feito estudos visando a seleção de fungos
ectomicorrízicos eficientes para inoculação de plantas de interesse silvicultural
(GARBAYE, 1984; OLIVEIRA et al., 1994; SOUZA, 2003; SOUZA et al., 2004;
OLIVEIRA et al., 2006), todos eles limitaram-se a avaliar o efeito individual dos
isolados fúngicos na colonização e na promoção do crescimento vegetal. Tais
resultados são de grande importância no que diz respeito ao aperfeiçoamento das
técnicas de micorrização controlada, mas as situações estudadas não representam
de maneira fiel o que ocorre no solo sob condições naturais. Esses resultados
aplicam-se perfeitamente às condições de viveiro (produção de mudas) onde os
substratos de plantas são desinfetados e permitem a introdução de isolados de
11
fECM selecionados. Entretanto, uma vez no solo das plantações, não se sabe qual
será o comportamento do fungo introduzido frente aos outros fECM naturalmente
presentes no local.
As interações entre fungos ectomicorrízicos, assim como as interações
microbianas em geral, são também importantes e devem ser consideradas nas
estratégias de micorrização controlada. Estas podem ser naturalmente negativas ou
positivas. Em alguns casos, podem envolver a produção de substâncias químicas
inibidoras. Pesquisas realizadas com um isolado de Cenococcum geophilum, que
produzia compostos antifúngicos com atividade inibitória contra diversos outros
fungos filamentosos, indicaram que essa atividade seria responsável pelas
freqüentes interações negativas observadas entre C. geophilum e outras espécies
de fungos ectomicorrízicos (KRYWOLAP, 1964, apud KOIDE et al., 2004).
Mas interações positivas entre fungos ectomicorrízicos também têm sido
observadas. A ocorrência simultânea de diferentes espécies desses fungos pode
resultar da complementação fisiológica observada em interações de
protocooperação. Por exemplo, uma espécie pode secretar enzimas que lhe
permitam ser superior na aquisição do nitrogênio (N) de fontes orgânicas, enquanto
outras podem secretar enzimas que lhe permitam ser mais eficiente na aquisição de
fósforo (P). Vivendo em associação próxima, ambas as espécies podem adquirir o N
e o P necessários a seu crescimento e melhorar seu desempenho (KOIDE et. al.,
2004).
Essa complementação entre diferentes espécies ou isolados de fECM
também pode se dar em benefício da planta hospedeira. Souza (2003) observou
que, enquanto alguns isolados de fECM contribuíam para uma maior acumulação de
biomassa na parte aérea de plantas de Eucalyptus dunnii, outros promoviam uma
maior acumulação de fósforo.
Assim, é importante comparar o efeito de diferentes combinações de fECM
em relação ao procedimento de inoculação individual, visando explorar de maneira
mais eficiente os benefícios advindos da simbiose ectomicorrízica.
Nesse contexto, a identificação dos diferentes fungos presentes no sistema
radicular das plantas é de grande importância, de modo a confirmar a participação
de cada isolado nos efeitos sobre as variáveis estudadas. A caracterização
anatômica e morfológica (morfotipagem) das ectomicorrizas constitui a forma
clássica para distinguir as raízes colonizadas (CHILVERS, 1968; AGERER, 1994),
12
separando tipos de ectomicorrizas com base em características morfológicas e
anatômicas e assumindo que cada tipo (morfotipo) coincide com uma espécie ou
grupos de espécies.
Além disso, técnicas mais recentes, utilizando ferramentas de biologia
molecular, têm sido empregadas para a identificação de fungos ectomicorrízicos,
quando estes já se encontram associados ao sistema radicular hospedeiro,
independentemente de variação ambiental (EGGER, 1995). Essa identificação pode
ser feita através da análise de polimorfismo (RFLP: Restriction Fragment Length
Polymorphisms) ou do seqüenciamento de certas regiões do DNA que tenham sido
amplificadas pela técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) (GARDES &
BRUNS, 1993). Para amplificação por PCR, têm sido escolhidas regiões do DNA de
caráter altamente conservado, mas que ainda apresentam certa variabilidade entre
as espécies, como é o caso do espaçador interno ITS presente no gene rRNA (RNA
ribossômico). Diversos primers têm sido desenvolvidos para amplificar essa região
do DNA que se mostra como uma ferramenta útil para estudos taxonômicos e
filogenéticos (WHITE et al., 1990; MARTIN & RYGIEWICZ, 2005).
A aplicação dessas diferentes estratégias possibilitará o reconhecimento dos
simbiontes e fornecerá importantes subsídios aos estudos aplicados sobre a
associação micorrízica.
CAPÍTULO 2
CRESCIMENTO DE MUDAS DE Eucalyptus dunnii INOCULADAS COM
ISOLADOS DE FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS, INDIVIDUALMENTE OU EM
MISTURA, SOB CONDIÇÕES DE CASA DE VEGETAÇÃO
2.1 INTRODUÇÃO
Os benefícios advindos da associação micorrízica estão bem documentados
na literatura. Vários autores afirmam que plantas inoculadas com fungos
ectomicorrízicos na fase de viveiro apresentam maior taxa de sobrevivência,
resistência a doenças e a estresses ambientais e maior crescimento quando
transplantadas para o campo (MOLINA & TRAPPE, 1984; SMITH & READ, 1997;
MARX & CORDELL, 1989). No entanto, a inoculação com uma espécie de fungo
ectomicorrízico não representa de forma mais adequada as condições naturais, onde
encontram-se várias espécies de fungos ectomicorrízicos e outros microrganismos.
Do ponto de vista da promoção do crescimento vegetal, muitas interações
positivas entre microrganismos têm sido observadas (KOIDE et al., 2004). Deste
modo, os fungos ectomicorrízicos que coexistem num mesmo ambiente devem
apresentar interações, sejam elas positivas ou negativas. É importante conhecer tais
interações, já que a introdução de isolados, atuando sobre a planta através de
diferentes mecanismos, pode aumentar ainda mais os benefícios advindos dessa
simbiose, revelando possíveis efeitos sinérgicos entre eles no que diz respeito à
promoção do crescimento vegetal. Assim, é importante testar os efeitos da
inoculação mista de isolados de fECM, e compará-los à inoculação individual desses
fungos.
14
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1 Isolados fúngicos utilizados
Foram estudados isolados da coleção de fECM do Laboratório de
Ectomicorrizas da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) (Quadro 2.1).
Esses isolados foram escolhidos com base nos resultados de SOUZA (2003) e
SOUZA et al. (2004), por apresentaram eficiência na promoção do crescimento das
mudas de Eucalyptus dunnii. As culturas puras desses fungos foram originalmente
obtidas de carpóforos coletados em plantações de Eucalyptus spp. e são mantidas
através de repicagens periódicas para meio de cultura Melin-Norkrans Modificado
sólido (MNM) (MARX, 1969), em placas de Petri, em incubadora do tipo B.O.D. a 25
± 1 °C.
Cada isolado foi repicado a partir das culturas da coleção para meio de
mesma composição (placas-matrizes), sob condições assépticas em capela de fluxo
laminar. As placas foram incubadas a 25 ± 1 ºC em incubadora tipo B.O.D. até o
momento da utilização das culturas, cerca de 20 dias após.
Quadro 2.1. Isolados de fungos ectomicorrízicos da coleção da UFSC utilizados nesse estudo
Isolado Espécie Hospedeiro
SA 9 Scleroderma flavidum E. et. E.
Eucalyptus camaldulensis
Dehnh.
UFSC-Pt132
Pisolithus microcarpus (Cooke &
Massee) Cunn.
Eucalyptus dunnii Maiden
UFSC-Ch163
Chondrogaster angustisporus
Giachini, Castellano, Trappe &
Oliveira
Eucalyptus dunnii Maiden
UFSC-Pt188
Pisolithus microcarpus (Cooke &
Massee) Cunn.
Eucalyptus sp.
2.2.2 Produção do inóculo fúngico
Para a produção do inóculo fúngico a ser usado na inoculação das plantas,
culturas em meio MNM, com 20 dias de idade foram utilizadas para obtenção de
discos de meio (8 mm de diâmetro) contendo micélio a partir da extremidade das
15
colônias. Esses discos foram colocados em meio fresco MNM sólido, em placas de
Petri, para ser testados quanto à viabilidade e ausência de contaminações. Após 2-3
dias, quando o micélio voltou a crescer nas bordas dos discos e nenhuma
contaminação foi observada, os discos de micélio foram colocados em 25 mL de
MNM líquido em frascos tipo erlenmeyer, de 250 mL de capacidade, seguindo-se de
incubação a 25 ± 1 ºC durante 20 dias em incubadora B.O.D.
Após esse período, o micélio produzido foi fragmentado em liquidificador
esterilizado durante 5 s a 3600 rpm, sob condições assépticas de fluxo laminar, e a
suspensão miceliana assim obtida foi utilizada para inocular 300 mL de substrato
sólido constituído de uma mistura de turfa, vermiculita, na proporção de 1:4 (V:V), e
200 mL de meio MNM líquido, em frascos tipo conserva de 900 mL. Essa mistura
tinha sido previamente submetida a dois ciclos de esterilização em autoclave a 121
ºC. O primeiro durante 60 min, antes da adição do meio de cultura, e o segundo
durante 20 min, após a adição de meio.
Os frascos foram mantidos em B.O.D. a 25 ± 1 ºC, na ausência de luz,
durante cerca de 2 meses, até que toda a parte visível do substrato apresentasse
colonização miceliana.
2.2.3 Preparo do substrato de plantio
O substrato de plantio, constituído por turfa e vermiculita, na proporção de 1:3
(V:V), foi previamente esterilizado em autoclave a 121 ºC por 60 min. A esse
substrato adicionou-se uma solução nutritiva contendo os seguintes elementos (mg
por planta): K, 16; Mn, 0,15; Mg, 3; Zn, 0,0375; Cu, 0,125; Mo, 0,05; B, 0,05; e Fe,
0,375 (BOUGHER et al., 1990). A fonte de nitrogênio, nitrato de amônia (NH
4
NO
3
),
foi aplicada em 5 parcelas ao longo do experimento, de modo a obter 35 mg por
planta, tendo a primeira sido aplicada aos 15 dias após o plantio.
O fósforo (P) foi adicionado na forma de Ca(H
2
PO
4
)
2
H
2
O e administrado em
solução na dose de 0,5 mg de P por planta, de acordo com recomendação de Souza
(2003).
2.2.4 Germinação das sementes
As sementes de E. dunnii, fornecidas pela empresa RIGESA, Três Barras -
SC, foram desinfetadas em álcool 70 % por 1 minuto, lavadas em água destilada e
16
esterilizada por três vezes consecutivas, e então transferidas para uma solução de
germinação de ácido bórico (3 µM), glicose (2 g.L
-1
) e sulfato de cálcio (500 µM),
esterilizada, com pH 5,7. Esses procedimentos foram feitos sob condições
assépticas de capela de fluxo laminar. As sementes foram deixadas nessa solução
durante 3 dias, à temperatura ambiente, sob agitação constante.
2.2.5 Inoculação e condução do experimento
Após 2 meses de crescimento o inóculo fúngico (micélio + substrato sólido) foi
retirado dos frascos e lavado com água destilada estéril (ALVES et al., 2001). Em
seguida, o inóculo de cada isolado foi adicionado ao substrato de plantio,
individualmente ou em mistura. Neste último caso, combinou-se o inóculo dos
diferentes isolados, de modo a obter combinações com dois isolados, três e,
finalmente, quatro, conforme mostrado no quadro 2.2. Também foi preparado um
tratamento testemunha não inoculado. Para efeito de melhor visualização os
tratamentos serão exibidos sem o código UFSC e as letras que o precedem. Por
exemplo: UFSC-Ch163 será tratado como isolado 163.
A inoculação foi feita antes da semeadura, adicionando-se 10 % do
inoculante, de cada fungo ou das misturas, ao substrato de plantio, totalizando 6 mL
por tubete. Foi feita uma homogeneização manual do inoculante sob condições
assépticas. O tratamento testemunha recebeu a mesma quantidade de turfa-
vermiculita-MNM não inoculada, produzida e submetida às mesmas condições de
incubação que o inoculante.
O substrato foi distribuído em tubetes cônicos de PVC de 60 mL, previamente
desinfetados com hipoclorito de sódio (1 %), durante 24 horas e lavados em água
destilada. Os tubetes foram, então, distribuídos em bandejas de poliestireno e cada
um deles recebeu 4-5 plântulas depositadas a aproximadamente 1 cm de
profundidade. Em seguida, o substrato foi umedecido com água destilada
esterilizada. Após a inoculação e o plantio, as plantas foram mantidas em casa de
vegetação e regadas diariamente com água destilada esterilizada. Para cada
tratamento, foram estabelecidas 15 plantas. Após uma semana, foi feito o desbaste
deixando-se apenas uma planta por tubete.
17
Quadro 2.2. Esquema dos diferentes tratamentos de inoculação de mudas de Eucalyptus dunnii por
fungos ectomicorrízicos
Tratamentos
Testemunha (não inoculada) 132 + 163
SA9 132 + 188
132 (UFSC-Pt132) 163 + 188
163 (UFSC-Ch163) SA9 + 132 + 163
188 (UFSC-Pt188) SA9 + 132 + 188
SA9 + 132 SA9 + 163 + 188
SA9 + 163 132 + 163 + 188
SA9 + 188 SA9 + 132 + 163 + 188
2.2.6 Avaliação dos resultados
O estudo completo teve duração de três meses em casa de vegetação.
Durante esse período, amostras de cinco plantas de cada tratamento foram
coletadas a cada 30 dias e analisadas quanto aos seguintes aspectos: altura, peso
de matéria seca, diâmetro do caule, colonização radicular, porcentagem e acúmulo
de P, comprimento radicular e relação raiz/parte aérea.
As raízes foram imersas em um becker com água durante alguns segundos,
para facilitar a separação do substrato de plantio, e então lavadas cuidadosamente
em água corrente. A parte aérea foi separada do sistema radicular e colocada em
estufa a 70 ± 1 °C para determinação do peso da matéria seca.
O sistema radicular de cada planta foi dividido em duas amostras e em cada
amostra as raízes foram cortadas em secções de cerca de 2 cm. Determinou-se o
peso de matéria fresca das duas amostras e uma delas, com peso em torno de 0,1
g, foi destinada à avaliação da colonização micorrízica, sendo conservada em
solução salina sob refrigeração por no máximo 12 horas. A outra amostra foi secada
em estufa a 70 ± 1 ºC, juntamente com a parte aérea, para determinação do peso da
matéria seca. Com esse procedimento, pôde-se, mais tarde, determinar o peso de
matéria seca total do sistema radicular.
18
A infectividade dos isolados foi avaliada pela determinação da porcentagem
de colonização radicular, de acordo com a técnica das intersecções de Giovanetti &
Mosse (1980), modificada por Brundrett et al. (1996).
Para determinação do teor de P nos tecidos das plantas, empregou-se a
técnica descrita por Tedesco et al. (1995), utilizando-se, para isso, a parte aérea
moída em moinho com lâminas de aço inoxidável. Do material moído, foram
separadas amostras de 0,200 g que foram misturadas a 1 mL de H
2
O
2
(30 %), 2 mL
de H
2
SO
4
concentrado e 0,7 g da mistura de digestão, contendo 100 g de Na
2
SO
4
,
10 g de CuSO
4
.5H
2
O e 1 g de selênio. A digestão foi realizada em bloco digestor a
180 °C, até a completa evaporação da água. Em seguida, a temperatura foi
aumentada para 380 °C, sendo mantida por mais 1 h após o extrato atingir uma
coloração amarelo-esverdeada.
Após digestão e resfriamento adicionou-se, então, um pouco de água
destilada para evitar a solidificação da amostra. Posteriormente, completou-se o
volume para 50 mL com adição de água destilada. Em seguida, as soluções foram
agitadas com ar comprimido e os extratos foram decantados durante 24 hs, antes de
se retirarem as alíquotas para a análise.
Alíquotas de 1 mL de cada extrato, juntamente com 2 mL de água destilada, 3
mL da solução P-B e 3 gotas da solução P-C (ANEXOS 1 e 2 respectivamente),
foram transferidas para copos plásticos descartáveis e submetidos à agitação
manual. Após 20 min de descanso da mistura, determinou-se a absorbância de cada
amostra em comprimento de onda de 660 nm, em espectrofotômetro marca
Jenway
, modelo 6100. Os valores obtidos foram corrigidos pelos valores das
provas em branco e, em seguida, determinaram-se os teores de fósforo. Para isso,
utilizou-se a equação de regressão de uma curva padrão de fósforo, obtida com o
emprego de soluções com teores de P conhecidos (P: 0, 0,5, 1,0, 2,0, 3,5 e 5,0
µg.mL
-1
). O conteúdo de P das amostras (µg.mL
-1
) foi transformado em porcentagem
de P e acúmulo de P na parte aérea (µg por planta).
Os resultados de teor e acúmulo de P na parte aérea das plantas foram
submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p ≤
0,05), utilizando-se o programa StatGraphics Plus
®
.
19
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Analisando-se as onze variáveis estudadas neste trabalho, verificou-se que
em seis delas foram apresentadas diferenças estatísticas significativas entre os
tratamentos de inoculação, considerando-se todo o período experimental. As
variáveis com maiores efeitos significativos foram altura, matéria seca (parte aérea,
raiz e total) e acúmulo de P (Figuras 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 e 2.8; Tabelas 2.1, 2.3, 2.4, 2.5
e 2.8).
Os efeitos positivos da inoculação foram particularmente maiores nos
tratamentos onde ocorreu a inoculação simultânea de vários isolados quando
comparados à inoculação de isolados individuais e à testemunha, não inoculada.
No caso da altura das plantas, dois tratamentos se destacaram dos demais,
considerando-se a média ao final dos 3 meses do experimento (Figura 2.1). As
plantas inoculadas com a mistura de todos os isolados (SA9+132+163+188),
juntamente com as plantas inoculadas com a mistura dos isolados SA9+188, foram
aquelas que apresentaram os maiores valores de altura, com diferenças de
aproximadamente 18 % em relação às plantas do tratamento testemunha não
inoculadas. Um grupo intermediário com 13 tratamentos veio logo em seguida, com
valores mais baixos que os dois primeiros, porém com altura média maior que
aquela apresentada pelas plantas inoculadas com o isolado 132, que foram aquelas
com os menores valores de altura.
O aumento nos valores de altura ao longo dos três meses de experimento
(Tabela 2.1) não foi regular, sendo mais intenso no primeiro e no segundo mês e
menor no terceiro, para todos os tratamentos. A média de altura, considerando-se
todos os tratamentos, aumentou de 9,73 cm.planta
-1
, no primeiro mês, para 20,15
cm.planta
-1
, no segundo, um aumento de 120 %. Do segundo para o terceiro mês,
porém, o aumento foi de apenas 15 %.
Esse efeito deve estar relacionado à redução na quantidade dos nutrientes
disponíveis, o que explicaria uma maior velocidade de crescimento no início do
cultivo e a redução desta ao longo do período. Além disso, no final do terceiro mês,
o espaço físico do tubete disponível para o sistema radicular começa a se tornar um
fator limitante ao crescimento.
20
Altura
ab
ab
b
ab
ab
ab
ab
a
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
a
15,00
16,00
17,00
18,00
19,00
20,00
Te
s
t
em
un
h
a
SA9
1
32
1
63
188
SA9+
1
32
SA9+
1
63
S
A9+
188
1
32
+16
3
132+188
163
+
188
SA9+132+1
6
3
S
A9+13
2
+1
8
8
S
A9
+
1
63
+1
88
132
+
16
3
+18
8
S
A9
+132
+1
63+
1
8
8
Tratamento
cm.planta
-1
Figura 2.1. Altura das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos isoladamente
ou em mistura, cultivadas em casa de vegetação. Os valores correspondem à média dos três meses de
avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as mesmas letras não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤0,05)].
A análise isolada dos valores de cada mês (Tabela 2.1) revela que diferenças
estatísticas significativas entre os tratamentos de inoculação surgiram apenas no
segundo mês, com destaque para as plantas inoculadas com a mistura dos isolados
SA9+132+163, que apresentaram os maiores valores de altura, e para as plantas
inoculadas com o isolado 132, aplicado individualmente, que apresentaram os
menores valores. Para este último tratamento, o efeito negativo sobre a altura das
plantas também foi verificado no terceiro mês.
Embora as diferenças estatísticas realcem apenas os dois tratamentos
citados com os maiores valores de altura, notou-se uma tendência de aumento
desses valores nos tratamentos envolvendo maior número de isolados, como pode
ser observado na figura 2.1.
21
Tabela 2.1. Altura média de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos,
isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação
Altura (cm.planta
-1
)*
Tratamentos 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 9,2 A 18,0 ABC 21,70 A
SA9 7,7 A 20,8 ABC 22,36 A
132 10,5 A 16,5 C 19,90 A
163 10,9 A 20,4 ABC 24,02 A
188 7,6 A 20,3 ABC 22,40 A
SA9+132 11,4 A 22,0 AB 23,84 A
SA9+163 8,1 A 19,1 ABC 26,93 A
SA9+188 11,4 A 22,5 AB 25,04 A
132+163 7,3 A 20,5 ABC 28,23 A
132+188 8,6 A 20,64 ABC 24,28 A
163+188 12,3 A 18,76 ABC 22,00 A
SA9+132+163 9,7 A 22,78 A 23,66 A
SA9+132+188 10,8 A 17,10 BC 22,88 A
SA9+163+188 10,4 A 22,46 AB 23,48 A
132+163+188 9,4 A 19,14 ABC 21,12 A
SA9+132+163+188 10,3 A 21,36 ABC 26,80 A
Média 9,7 c 20,2 b 23,7 a
*Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
Com relação ao diâmetro do caule, não foram observadas diferenças
significativas entre os tratamentos quando se consideram as médias de todo o
período experimental (Figura 2.2).
Porém, considerando-se os valores dos diferentes períodos isoladamente
(Tabela 2.2), foram observadas diferenças entre os tratamentos de inoculação no
terceiro mês. As plantas dos tratamentos SA9, 163, 188, SA9+163, 163+188 e
SA9+132+163+188, apresentaram maiores valores de diâmetro do caule que as
plantas dos demais tratamentos. Já as plantas inoculadas com a mistura
SA9+163+188, apresentaram diâmetro mais reduzido que as demais.
Apesar de a análise estatística indicar diferenças entre tratamentos no
terceiro mês, os valores são muito próximos. Souza (2003) considera que as
medidas de diâmetro do caule têm pouca utilidade para avaliar o efeito da
inoculação nesta fase do desenvolvimento das plantas, pois a resposta inicial da
colonização micorrízica está associada ao aumento de captação e aproveitamento
de água e nutrientes, tendo maior reflexo na produção de ramos e folhas (SMITH &
READ, 1997). Assim, os valores de matéria seca é que são considerados as
22
variáveis mais úteis para medir o efeito de tratamentos de inoculação micorrízica
sobre o crescimento das plantas (MARX, 1980; MARX et al., 1991).
Diâmetro
a
a
a
a
aa
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
0,12
0,17
0,22
0,27
Testemu
nh
a
S
A9
1
3
2
163
18
8
SA
9
+132
SA
9
+163
SA
9
+188
13
2
+1
6
3
132+188
16
3
+1
8
8
SA9+132+163
S
A9+132
+
18
8
S
A
9
+
16
3
+1
8
8
13
2
+1
6
3+
1
88
SA9+1
3
2+163
+
18
8
Tratamentos
cm.planta
-1
Figura 2.2. Diâmetro do caule das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos
isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de vegetação. Os valores correspondem à média dos
três meses de avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as mesmas letras não
diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤0,05)].
Na média dos três meses, as plantas dos tratamentos SA9+163+188 e
SA9+132+163+188 se destacaram positivamente com relação à matéria seca da
parte aérea, com valores significativamente maiores que os das plantas dos demais
tratamentos (Figura 2.3). Interessante notar que o primeiro tratamento citado
(SA9+163+188) foi aquele com os menores valores de diâmetro, o que demonstra a
falta de correlação entre o diâmetro e a matéria seca, pelo menos nessa fase do
desenvolvimento das plantas, conforme mencionado anteriormente (SOUZA, 2003).
Outros tratamentos que se destacaram em relação à matéria seca, na média
geral do período experimental, foram SA9+132+188 e 132+163+188 (Figura 2.3).
Um grupo intermediário de dez tratamentos apresentou valores significativamente
semelhantes entre si. Por fim, dois tratamentos apresentaram valores mais baixos
que os demais, o tratamento testemunha e o tratamento 132. Mais uma vez, as
plantas inoculadas com o isolado UFSC-Pt132 apresentaram valores inferiores às
dos demais tratamentos.
23
Tabela 2.2. Diâmetro de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos,
isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação
Diâmetro (cm.planta
-1
)*
Tratamento 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 0,10 A 0,19 A 0,25 ABC
SA9 0,08 A 0,24 A 0,29 A
132 0,13 A 0,21 A 0,28 AB
163 0,10 A 0,20 A 0,29 A
188 0,10 A 0,22 A 0,30 A
SA9+132 0,14 A 0,22 A 0,27 AB
SA9+163 0,08 A 0,22 A 0,31 A
SA9+188 0,12 A 0,24 A 0,28 AB
132+163 0,07 A 0,21 A 0,27 AB
132+188 0,09 A 0,22 A 0,26 ABC
163+188 0,14 A 0,24 A 0,28 A
SA9+132+163 0,12 A 0,23 A 0,27 AB
SA9+132+188 0,10 A 0,20 A 0,27 AB
SA9+163+188 0,11 A 0,24 A 0,18 C
132+163+188 0,11 A 0,21 A 0,20 BC
SA9+132+163+188 0,10 A 0,20 A 0,28 A
Média 0,11 c 0,22 b 0,27 a
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
A análise de matéria seca da parte aérea ao longo dos três meses de
experimento mostra que já no primeiro mês as diferenças foram significativas entre
os tratamentos, com destaque para a mistura 163+188. As diferenças entre
tratamentos foram mais marcantes no segundo mês de cultivo, com os valores mais
altos sendo encontrados para os tratamentos SA9+163+188 e SA9+132+163+188.
Essa tendência se consolida na média geral desses tratamentos (Tabela 2.3).
Dentre os tratamentos com os menores valores de matéria seca, destacaram-
se a testemunha e o tratamento 132. Com relação ao terceiro mês, não houve
diferença significativa, mas a exemplo do mês anterior, pode-se notar uma tendência
de valores mais altos na parte inferior da tabela, ou seja, referentes aos tratamentos
que envolveram maior número de isolados.
No entanto, é importante salientar que ao longo do terceiro mês ocorreu uma
severa queda de folhas das mudas que pode ter influenciado nos resultados,
minimizando as diferenças estatísticas entre os tratamentos ao fim do período de
cultivo.
24
Matéria seca - parte aérea
bc
abc
c
abc
abc
abc
abc
abc
abc
abc
abc
abc
a
a
ab
a
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
Test
e
m
u
nh
a
SA9
132
163
18
8
SA9+1
3
2
SA
9
+1
6
3
SA9
+1
88
132+163
132+1
8
8
16
3+
1
88
SA
9
+
13
2+163
SA9+132+188
SA9+163+
1
88
132+163+
18
8
SA9+132+163+
1
88
Tratamentos
g.planta
-1
Figura 2.3. Matéria seca da parte aérea das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de vegetação. Os valores
correspondem à média dos três meses de avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas
com as mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤0,05)].
Ainda com relação ao período total do experimento, pode-se afirmar que a
velocidade de crescimento da parte aérea das plantas foi levemente menor do
segundo para o terceiro mês quando comparada ao ganho de peso nos dois
primeiros meses. A matéria seca média nos períodos aumentou de 0,16 para 0,71
g.planta
-1
, do primeiro para o segundo mês, representando um aumento de 340 %.
Do segundo para o terceiro mês, entretanto, o aumento foi de apenas 45 %. Os
valores de matéria seca da parte aérea entre os três períodos foram
significativamente diferentes.
Com relação à matéria seca do sistema radicular, não foram observadas
diferenças entre os tratamentos quando se consideram os resultados gerais dos três
meses de casa de vegetação (Figura 2.4). Notou-se, porém, mais uma vez uma
tendência de valores maiores nos tratamentos envolvendo maior número de
isolados, quando comparados aos valores observados nos tratamentos com a
inoculação individual dos isolados ou, ainda, com a testemunha não inoculada, que
apresentou o mais baixo valor dentre todos os tratamentos.
25
Tabela 2.3. Matéria seca da parte aérea de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de casa de
vegetação
Matéria seca (g.planta
-1
)*
Tratamento 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 0,11 AB 0,54 BC 0,80 A
SA9 0,09 ABC 0,74 ABC 0,85 A
132 0,16 AB 0,53 C 0,76 A
163 0,19 AB 0,71 ABC 0,98 A
188 0,13 AB 0,69 ABC 1,01 A
SA9+132 0,24 AB 0,64 ABC 0,99 A
SA9+163 0,11 AB 0,75 ABC 1,20 A
SA9+188 0,18 AB 0,77 ABC 0,97 A
132+163 0,08 AB 0,71 ABC 0,95 A
132+188 0,12 AB 0,65 ABC 1,06 A
163+188 0,26 A 0,70 ABC 0,96 A
SA9+132+163 0,18 AB 0,77 ABC 1,08 A
SA9+132+188 0,15 AB 0,70 ABC 1,25 A
SA9+163+188 0,22 AB 0,90 A 1,12 A
132+163+188 0,12 AB 0,75 ABC 1,23 A
SA9+132+163+188 0,15 AB 0,80 AB 1,21 A
Média 0,16 c 0,71 b 1,03 a
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
O aumento da matéria seca de raiz ao longo dos três meses foi constante,
indicando um crescimento regular nesse período (Tabela 2.4).
A análise mês a mês revela diferenças significativas entre os tratamentos
apenas no primeiro mês, com destaque para a mistura 163+188 (Tabela 2.4). Nos
dois meses seguintes, as diferenças não foram significativas, apesar de apontarem
uma tendência de resultados menos favoráveis para os tratamentos com apenas um
isolado e para a testemunha. As plantas deste último tratamento, juntamente com
aquelas inoculadas somente com o isolado UFSC-Pt132, foram aquelas com os
menores valores de matéria seca de raiz.
Cabe ressaltar que as plantas desses dois tratamentos foram aquelas com os
menores valores de altura, diâmetro do caule e matéria seca da parte aérea,
conforme apresentado anteriormente. Esses resultados, considerados em conjunto,
reforçam os comentários feitos anteriormente a respeito da ausência de eficiência
por parte do isolado UFSC-Pt132, quando inoculado em separado dos demais.
26
Matéria seca - raiz
a
a
a
aaa
aa
a
a
a
a
aa
a
a
0,13
0,15
0,17
0,19
0,21
0,23
Testemunha
SA9
1
32
163
188
S
A9+
1
32
S
A9+
1
63
S
A9+
1
88
132
+
16
3
132
+
18
8
1
63
+
18
8
S
A9+
1
32
+163
S
A9+
1
32
+188
SA9+163+1
8
8
1
3
2+
16
3+
1
88
SA9+
13
2
+16
3
+1
8
8
Tratamentos
g.planta
-1
Figura 2.4. Matéria seca radicular das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de vegetação. Os valores
correspondem à média dos três meses de avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas
com as mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤0,05)].
Tabela 2.4. Matéria seca do sistema radicular de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de casa de
vegetação
Matéria seca (g.planta
-1
)*
Tratamentos 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 0,03 AB 0,15 A 0,28 A
SA9 0,02 B 0,15 A 0,35 A
132 0,03 AB 0,11 A 0,30 A
163 0,03 AB 0,16 A 0,31 A
188 0,03 AB 0,16 A 0,31 A
SA9+132 0,05 AB 0,16 A 0,29 A
SA9+163 0,03 AB 0,19 A 0,35 A
SA9+188 0,05 AB 0,19 A 0,35 A
132+163 0,02 B 0,17 A 0,33 A
132+188 0,02 B 0,17 A 0,33 A
163+188 0,07 A 0,16 A 0,33 A
SA9+132+163 0,04 AB 0,17 A 0,33 A
SA9+132+188 0,04 AB 0,19 A 0,40 A
SA9+163+188 0,05 AB 0,18 A 0,39 A
132+163+188 0,03 AB 0,17 A 0,38 A
SA9+132+163+188 0,02 B 0,16 A 0,37 A
Média 0,04 c 0,16 b 0,34 a
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
27
Matéria seca total
c
abc
c
abc
abc
abc
abc
abc
abc abc
abc
abc
a
a
ab
a
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
T
e
s
t
e
mu
n
h
a
SA9
132
163
1
8
8
SA
9
+132
S
A9
+
1
6
3
SA9+1
8
8
1
3
2
+
16
3
132
+
188
163+1
8
8
S
A9
+
1
3
2
+1
6
3
SA9+132
+
188
SA
9
+163+1
8
8
132+163+188
S
A
9+
1
3
2
+163
+
1
8
8
Tratamentos
g.planta
-1
Finalmente, quando se consideram os valores de matéria seca total, três
tratamentos se destacaram dentre todos como aqueles que promoveram a maior
acumulação de biomassa, confirmando a tendência que já vinha sendo apontada na
análise das variáveis discutidas anteriormente. Foram eles os tratamentos
SA9+132+188, SA9+163+188 e SA9+132+163+188 (Figura 2.5). As plantas desses
três tratamentos apresentaram os maiores valores de matéria seca total, com 0,90,
0,95 e 0,91 g planta
-1
. Comparadas às plantas testemunhas, o ganho de matéria
seca com a inoculação das plantas com esses isolados, variou entre 40 e 48 %, um
valor considerável.
Em segundo lugar ficaram as plantas inoculadas com a mistura 132+163+188
(Figura 2.5). Os menores valores de matéria seca total na média geral do
experimento foram apresentados pelas plantas dos tratamentos testemunha e do
tratamento de inoculação com o isolado UFSC-Pt132.
Figura 2.5. Matéria seca total das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos
isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de vegetação. Os valores correspondem à média dos
três meses de avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas com as mesmas letras não
diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤0,05)].
Como ocorreu em relação às variáveis anteriormente analisadas, os
resultados apontam para a superioridade dos tratamentos contendo maior número
de isolados. Essa tendência pode ser percebida a partir do segundo mês, embora
apenas um tratamento (SA9+163+188) tenha sido, nesse período, estatisticamente
diferente dos demais (Tabela 2.5).
28
No terceiro mês não foram detectadas diferenças importantes entre os
tratamentos, embora se observe a mesma correlação positiva entre matéria seca e
número de isolados envolvidos. A queda de folhas, já relatada em parágrafo anterior
relativo à matéria seca da parte aérea, foi, possivelmente, o fator responsável por
esses resultados.
É possível, porém, que tais diferenças, mais evidentes no início do crescimento
das plantas, tenham diminuído ao longo do tempo devido ao limitado espaço físico
dentro dos tubetes, como foi comentado anteriormente. Assim, à medida que o
crescimento vegetal foi ficando limitado pelo pequeno espaço disponível, as diferenças
entre os tratamentos foram se tornando menores. A matéria seca total é considerada
por muitos autores como a variável ideal para se avaliar o efeito de tratamentos de
inoculação ectomicorrízica por avaliar a planta por inteiro e, assim, indicar o tratamento
mais eficiente em termos de produção de biomassa (MARX, 1980; MARX et al., 1991).
Tabela 2.5. Matéria seca total de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos,
isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de casa de vegetação
Matéria seca (g.planta
-1
)*
Tratamentos 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 0,15 AB 0,69 B 1,08 A
SA9 0,10 B 0,90 AB 1,20 A
132 0,19 AB 0,64 B 1,06 A
163 0,22 AB 0,87 AB 1,30 A
188 0,16 AB 0,86 AB 1,32 A
SA9+132 0,30 AB 0,80 AB 1,28 A
SA9+163 0,14 AB 0,93 AB 1,55 A
SA9+188 0,22 AB 0,96 AB 1,32 A
132+163 0,10 AB 0,88 AB 1,28 A
132+188 0,14 AB 0,82 AB 1,39 A
163+188 0,32 A 0,87 AB 1,29 A
SA9+132+163 0,23 AB 0,95 AB 1,40 A
SA9+132+188 0,19 AB 0,85 AB 1,66 A
SA9+163+188 0,26 AB 1,08 A 1,51 A
132+163+188 0,15 AB 0,92 AB 1,61 A
SA9+132+163+188 0,18 AB 0,96 AB 1,58 A
Média 0,19 c 0,87 b 1,36 a
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
Os menores valores de comprimento radicular foram observados nas plantas
do tratamento testemunha (Figura 2.6). Diversos autores têm observado uma
correlação positiva entre o comprimento radicular total e a colonização radicular por
29
Comprimento radicular
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
aa
14
18
22
26
30
T
e
st
e
mu
n
ha
SA9
1
3
2
163
1
8
8
S
A
9+132
SA9+163
SA9
+
18
8
13
2
+163
13
2
+188
1
63+188
SA9
+
132+163
S
A
9
+
132+18
8
SA9
+
163+188
132+
1
6
3+188
SA
9
+132+163+188
Tratamentos
m.planta
-1
fungos ectomicorrízicos (SOUZA et al., 2004; OLIVEIRA, 2004). Os resultados
obtidos neste trabalho corroboram essa afirmação.
Isto pode ser observado também no terceiro mês, ao final do experimento, e
essa tendência já podia ser notada a partir do segundo mês, justamente quando
foram observadas as primeiras evidências de colonização ectomicorrízica (Tabela
2.6). Ressalte-se que ao final do período experimental, três meses, os dois
tratamentos com maiores valores de comprimento radicular (SA9+188 e
SA9+163+188) foram, justamente, os que apresentaram altos níveis de comprimento
radicular colonizado e de porcentagem de colonização, quando comparados aos
outros tratamentos como se pode notar na tabela 2.6.
É sabido que os fungos ectomicorrízicos, juntamente com as bactérias que os
acompanham, estimulam as raízes a produzir padrões de ramificação diferentes (SMITH
& READ, 1997; ASPRAY et al., 2007). Essa mudança na arquitetura radicular promove o
aumento do comprimento radicular além de proporcionar uma maior superfície de contato
entre a planta e o solo. Como principal conseqüência, aumenta-se a absorção de
nutrientes e melhora-se a nutrição da planta, resultando em maior crescimento.
Figura 2.6. Comprimento radicular total das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de vegetação. Os valores
correspondem à média dos três meses de avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas
com as mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤0,05)].
A relação entre o peso de matéria seca do sistema radicular e o peso de
matéria seca da parte aérea (Figura 2.7, Tabela 2.7), aqui denominada relação
30
raiz/parte aérea (R/PA), também foi analisada, pois tem sido aceita a idéia de que
esta relação aumentaria com a presença do fungo na raiz, como conseqüência do
maior crescimento desta (ALVES et al., 2001). No entanto, os resultados observados
demonstram exatamente o oposto. O tratamento que apresentou a maior relação
R/PA foi o tratamento testemunha. Por outro lado, o tratamento envolvendo a
mistura dos quatro isolados (SA9+132+163+188), que apresentou os maiores
valores de altura e matéria seca, foi aquele com os menores valores de relação
raiz/parte aérea.
Tabela 2.6. Comprimento radicular de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de casa de
vegetação
Comprimento radicular (m.planta
-1
)*
Tratamentos 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 4,72 A 13,20 A 29,42 A
SA9 3,19 A 18,21 A 48,23 A
132 4,88 A 12,32 A 36,41 A
163 6,79 A 17,00 A 41,68 A
188 4,22 A 16,76 A 39,55 A
SA9+132 4,72 A 18,84 A 35,00 A
SA9+163 3,23 A 21,63 A 49,69 A
SA9+188 5,08 A 21,95 A 55,38 A
132+163 2,39 A 18,10 A 36,72 A
132+188 3,58 A 16,48 A 37,02 A
163+188 6,50 A 18,00 A 49,30 A
SA9+132+163 3,49 A 24,61 A 31,62 A
SA9+132+188 3,52 A 23,57 A 42,79 A
SA9+163+188 4,57 A 24,11 A 53,57 A
132+163+188 3,60 A 24,69 A 45,37 A
SA9+132+163+188 3,70 A 18,88 A 49,54 A
Média 4,26 c 19,27 b 42,58 a
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
Isto corrobora os resultados encontrados por Guehl et al. (1990). Dosskey et
al. (1992) observaram efeito semelhante em mudas de Pseudotsuga menziesii
inoculadas com fungos micorrízicos. Nesses estudos, essa relação também diminuiu
nas plantas inoculadas em comparação com as plantas não inoculadas.
31
Relação raiz/parte aérea
a
ab
ab
ab ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
b
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
Testemunha
S
A
9
132
163
188
S
A
9+
13
2
S
A
9+1
6
3
SA9+188
13
2
+163
13
2+
188
16
3+1
88
S
A9+132+163
SA
9+1
3
2+18
8
S
A9+163+188
132+
1
63+
18
8
S
A
9
+13
2
+163+188
Tratamentos
relação raiz/parte aérea
Figura 2.7. Relação entre a matéria seca do sistema radicular e da parte aérea de mudas de Eucalyptus
dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de
vegetação. Os valores correspondem à média dos três meses de avaliação, compreendendo 15
repetições. [Médias indicadas com as mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo
com o teste de Tukey (p ≤0,05)].
A diminuição da relação raiz/parte aérea nos tratamentos de inoculação indica
maior crescimento da parte aérea em relação à raiz. Isto assim ocorre devido ao
efeito positivo proporcionado pelos fungos ectomicorrízicos, propiciando um aumento
na eficiência da translocação de nutrientes para a parte aérea da planta (SMITH &
READ, 1997).
A absorção de P pelas plantas foi outra variável em cujos resultados se pode
observar a eficiência de atuação de fungos ectomicorrízicos. Neste caso, observou-se
que as plantas do tratamento 132+163+188, seguidas pelas plantas dos tratamentos
SA9+132+163+188 e SA9+132+188, foram aquelas com os maiores valores de P na
parte aérea. Esses tratamentos estão entre aqueles que envolvem maior número de
isolados. Essa tendência pode ser notada observando-se os dados da Figura 2.8. Os
tratamentos contendo apenas um isolado só não apresentaram resultados mais baixos
que o tratamento 132+188, o que reforça a idéia de que tratamentos envolvendo maior
números de isolados produzem melhor efeito no crescimento vegetal.
32
Tabela 2.7. Relação entre a matéria seca do sistema radicular e da parte aérea de plantas de Eucalyptus
dunnii inoculadas com fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de
cultivo sob condições de casa de vegetação
Relação raiz/parte aérea*
Tratamentos 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 0,30 A 0,28 A 0,36 A
SA9 0,19 B 0,21 A 0,40 AB
132 0,20 AB 0,22 A 0,40 AB
163 0,19 AB 0,22 A 0,34 AB
188 0,21 AB 0,23 A 0,31 AB
SA9+132 0,23 AB 0,25 A 0,30 AB
SA9+163 0,22 AB 0,25 A 0,28 AB
SA9+188 0,25 AB 0,25 A 0,37 AB
132+163 0,27 AB 0,24 A 0,36 AB
132+188 0,21 AB 0,25 A 0,32 AB
163+188 0,26 AB 0,24 A 0,36 AB
SA9+132+163 0,23 AB 0,22 A 0,30 AB
SA9+132+188 0,26 AB 0,27 A 0,32 AB
SA9+163+188 0,21 AB 0,21 A 0,40 AB
132+163+188 0,22 AB 0,23 A 0,31 AB
SA9+132+163+188 0,16 B 0,20 A 0,31 B
Média 0,22 b 0,24 b 0,34 a
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
Quando se analisa a evolução do acúmulo de fósforo na parte aérea ao longo
do período experimental (Tabela 2.8), pode-se notar que os valores aumentaram até
o segundo mês de idade das plantas. Nesse período, o aumento foi da ordem de
160 %. Do segundo para o terceiro mês, entretanto, ocorreu uma queda acentuada
nos valores desse elemento nos tecidos, passando de 122 para 54 µg.planta
-1
.
A queda de folhas no decorrer do terceiro mês de crescimento, relatada
anteriormente, poderia ser cogitada para explicar esse efeito não fosse pelo fato de
os valores de matéria seca da parte aérea terem continuado a aumentar, mesmo
com essa queda. Por outro lado, é possível que esse fenômeno possa ter
contribuído para diminuição nos valores de P considerando-se o fato de que, com a
queda das folhas, os tecidos da parte aérea ficaram representados em maior
proporção pelos ramos, onde existe grande quantidade de células mortas e menor
atividade metabólica.
33
Fósforo - parte aérea
bcde
de
de
de
de
de
cde
cde
cde
e
de
cde
abc
abcd
a
ab
0,00
25,00
50,00
75,00
100,00
125,00
150,00
T
estemunh
a
SA
9
13
2
163
18
8
S
A
9
+13
2
SA
9
+163
SA9
+
188
13
2+1
6
3
132+18
8
163+18
8
S
A9+132+16
3
S
A
9
+13
2+
18
8
SA9+163+18
8
13
2
+163+18
8
S
A
9
+13
2+
163+
1
8
8
Tratamentos
µg.planta
-1
Figura 2.8. Acúmulo de P total na parte aérea das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de vegetação. Os valores
correspondem à média dos três meses de avaliação, compreendendo 15 repetições. [Médias indicadas
com as mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤0,05)].
Ora, sabe-se que o P se concentra justamente nas partes mais ativas das
plantas, como flores, folhas e brotos, onde participa da síntese de ATP e de outros
eventos do metabolismo celular. Por essa razão, mesmo que os valores de matéria
seca da parte aérea tenham continuado a aumentar do segundo para o terceiro mês,
é coerente que os valores de P diminuam, já que ao final do terceiro mês havia
menor proporção de folhas em relação aos ramos.
Observou-se que as plantas apresentavam no terceiro mês uma coloração
arroxeada que, segundo Brundrett et al. (1996), é um sintoma de deficiência de P
em espécies de Eucalyptus. Segundo Dell et al. (1995), apud Brundrett et al. (1996),
a concentração adequada de P em E. urophylla é de 1,9-4,0 mg por grama de
matéria seca. Neste caso, mesmo os valores mais altos encontrados neste trabalho,
nas plantas dos tratamentos 132+163+188 e SA9+132+163+188, que foram de 0,2 e
0,17 mg P.g matéria seca
-1
, respectivamente, ainda estão muito abaixo daqueles
considerados ideais por este autor.
34
Tabela 2.8. Acúmulo de fósforo (P) na parte aérea de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de casa de
vegetação
P na parte aérea (µg.planta
-1
)*
Tratamentos 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 33,1 AB 138,4 BCD 53,6 AB
SA9 24,2 B 107,9 CD 48,5 B
132 23,2 AB 85,3 CD 29,1 B
163 28,3 AB 94,4 CD 37,8 B
188 26,8 B 85,2 CD 56,8 AB
SA9+132 22,6 AB 64,1 D 63,1 AB
SA9+163 21,5 B 90,3 CD 94,5 A
SA9+188 58,6 AB 70,1 CD 53,2 AB
132+163 37,5 AB 98,2 CD 38,4 B
132+188 27,9 B 58,3 D 52,7 AB
163+188 54,0 AB 83,7 CD 40,5 B
SA9+132+163 74,0 AB 103,1 CD 40,0 B
SA9+132+188 51,5 AB 226,9 AB 60,2 AB
SA9+163+188 56,5 AB 167,5 ABC 73,9 AB
132+163+188 148,3 A 213,7 AB 60,6 AB
SA9+132+163+188 55,3 AB 260,0 A 62,5 AB
Média 46,5b 121,93 a 54,10 b
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
Quando os valores de acúmulo de P das plantas dos diferentes tratamentos
foram transformados em porcentagem, observou-se a mesma tendência, onde as
plantas inoculadas com a mistura dos isolados 132+163+188 destacaram-se das
demais por apresentarem a maior porcentagem de P nos tecidos, com uma média
geral de 0,05 (Figura 2.9). Mais uma vez, observa-se que os tratamentos contendo
maior número de isolados apresentaram maior contribuição aos valores das
variáveis analisadas.
35
Teor de fósforo (%)
ab b
bb
b
b
b
b
ab
bb
ab
ab
ab
a
ab
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Tes
te
m
u
n
ha
SA9
1
32
1
63
18
8
SA9+132
SA9
+
163
SA
9+1
8
8
132+
1
6
3
13
2
+
1
8
8
1
6
3
+
1
8
8
SA9+132+163
SA
9
+
1
3
2
+
1
88
SA
9
+
1
6
3
+
1
88
132+163+188
SA
9+1
3
2
+
1
6
3+18
8
Tratamentos
% fósfor
o
Figura 2.9. Teor de P na parte aérea das mudas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos isoladamente ou em mistura, cultivadas em casa de vegetação. Os valores
correspondem à média dos três meses de avaliação, compreendendo 15 repetições por tratamento
[Médias indicadas com as mesmas letras não diferem significativamente entre si de acordo com o teste de
Tukey (p ≤0,05)].
Quando se analisa a evolução dos teores de P ao longo do período
experimental (Tabela 2.9), observa-se uma tendência ligeiramente diferente daquela
observada em relação à evolução do acúmulo de P mostrada na tabela 2.8. Neste
caso, ocorreu uma significativa redução do teor de P nos tecidos do primeiro ao
terceiro mês de cultivo, com valores médios de 0,035, 0,017 e 0,005 %, para o
primeiro, segundo e terceiro mês de crescimento, respectivamente. Tal redução
deve ter sido provocada pelo aumento do peso de matéria seca resultante do
crescimento das plantas (Figura 2.5).
A colonização micorrízica foi detectada somente a partir do segundo mês de
crescimento das plantas, porém ainda de forma muito incipiente. Apenas dois
tratamentos (188 e 163+188) apresentaram colonização micorrízica nesse momento,
e com níveis de colonização muito baixos. Isso acentuou-se no terceiro mês, tanto
na intensidade da colonização, como no número de tratamentos.
36
Tabela 2.9. Teor (%) de fósforo (P) na parte aérea de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de casa de
vegetação
P na parte aérea (%)*
Tratamentos 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 0,030 AB 0,023 ABC 0,007 AB
SA9 0,037 AB 0,015 BC 0,006 ABC
132 0,015 B 0,016 BC 0,004 BC
163 0,016 AB 0,014 C 0,004 BC
188 0,026 B 0,012 C 0,006 ABC
SA9+132 0,010 B 0,010 C 0,006 ABC
SA9+163 0,018 B 0,012 C 0,008 A
SA9+188 0,034 AB 0,010 C 0,005 ABC
132+163 0,052 AB 0,014 C 0,004 BC
132+188 0,024 B 0,009 C 0,005 ABC
163+188 0,022 B 0,013 C 0,004 BC
SA9+132+163 0,059 AB 0,013 C 0,003 C
SA9+132+188 0,037 AB 0,028 AB 0,005 ABC
SA9+163+188 0,040 AB 0,020 ABC 0,007 AB
132+163+188 0,111 A 0,029 A 0,005 ABC
SA9+132+163+188 0,039 AB 0,033 A 0,005 ABC
Média 0,035 a 0,017 b 0,005 b
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
Ao final do período experimental, apresentaram colonização os tratamentos
188, SA9+188, 132+163, 163+188, SA9+132+163, SA9+132+188, SA9+163+188 e
SA9+132+163+188, sendo o tratamento SA9+163+188 aquele que apresentou o
maior valor de colonização em todo o experimento. É importante notar que este
tratamento é justamente um dos que apresentou melhores resultados com relação
ao crescimento quando se observam as variáveis discutidas anteriormente.
Quando se observa a tabela 2.10, nota-se uma tendência de os tratamentos
envolvendo misturas de isolados apresentarem maiores níveis de colonização,
embora isso não seja respaldado pela análise estatística. Com exceção do
tratamento 188, os outros que continham apenas um isolado não apresentaram
colonização micorrízica.
No entanto, é possível que a operação de lavagem das raízes logo após a
sua coleta tenha contribuído para eliminar muitas raízes curtas, as mais susceptíveis
à colonização pelo fungo ectomicorrízico e, ao mesmo tempo, as mais frágeis e
fáceis de perder durante a manipulação e lavagem das raízes. Assim, seria possível
37
considerar que a baixa intensidade de colonização observada após a coleta das
plantas, não seja aquela realmente existente durante a condução do mesmo.
Por essas razões, sugere-se que em trabalhos futuros o processo de lavagem
das raízes seja substituído por outro procedimento menos agressivo, de forma a
preservar melhor as micorrizas. Esta limitação da técnica já foi também, apontada
por Souza (2003) e Alves (2006).
Embora os níveis de colonização tenham se mostrado baixos, e
considerando-se a possibilidade de erro experimental em função das lavagens das
raízes, é importante salientar que foi observada uma intensificação da colonização
em função da idade das plantas.
Tabela 2.10. Comprimento radicular colonizado de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com fungos
ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de casa de
vegetação
Comprimento radicular colonizado (cm.planta
-1
)*
Tratamento 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 0,0 A 0,0 A 0,0 A
SA9 0,0 A 0,0 A 0,0 A
132 0,0 A 0,0 A 0,0 A
163 0,0 A 5,9 A 0,0 A
188 0,0 A 0,0 A 0,0 A
SA9+132 0,0 A 0,0 A 0,0 A
SA9+163 0,0 A 0,0 A 48,6 A
SA9+188 0,0 A 0,0 A 16,8 A
132+163 0,0 A 0,0 A 0,0 A
132+188 0,0 A 1,0 A 0,0 A
163+188 0,0 A 0,0 A 9,8 A
SA9+132+163 0,0 A 0,0 A 0,7 A
SA9+132+188 0,0 A 0,0 A 72,5 A
SA9+163+188 0,0 A 0,0 A 0,0 A
132+163+188 0,0 A 0,0 A 0,9 A
SA9+132+163+188 0,0 A 0,0 A 0,0 A
Média 0,0 a 0,43 a 9,33 a
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
Os efeitos positivos no crescimento e absorção de P em decorrência da
inoculação com fungos ectomicorrízicos foram evidentes, ainda que a colonização
radicular tenha se mostrado baixa. É possível que a presença dos isolados fúngicos
no ambiente rizosférico tenha influenciado positivamente o crescimento das plantas.
Muitos fungos ectomicorrízicos têm mostrado capacidade de solubilizar fosfatos e de
38
produzir substâncias promotoras de crescimento (NARLOCH, 2002). Lapeyrie et al.
(1991) observaram que vários fungos ectomicorrízicos têm capacidade de solubilizar
fosfatos. Dentre eles um isolado de Pisolithus tinctorius. Narloch (2002) verificou que
o fungo ectomicorrízico Rhizopogon vulgaris (isolado UFSC-Rh106) apresentou bom
potencial de solubilização de fosfatos.
Os valores de porcentagem de colonização radicular, da mesma forma que
aqueles de comprimento radicular colonizado, foram baixos. A porcentagem máxima
encontrada foi de 0,407 % e 0,207 %, para os tratamentos SA9+163+188 e
SA9+188, respectivamente. Esses valores podem ser considerados muito baixos se
comparados aos encontrados por outros autores estudando a colonização
ectomicorrízica em Eucalyptus dunnii (ALVES et al., 2001) e em E. diversicolor
(BOUGHER et al., 1990), por outros fungos ectomicorrízicos.
Os níveis de colonização também são baixos se comparados aos valores
observados por Souza (2003), neste caso utilizando os mesmos isolados
empregados no presente estudo, sob as mesmas condições de substrato e
adubação. Esse autor observou valores de 10 % de colonização nas mudas
inoculadas com o isolado UFSC-Pt188, 7 % nas mudas inoculadas com o isolado
UFSC-Ch163 e 4 % para aqueles inoculadas com o isolado UFSC-Pt132. Porém, à
semelhança do que foi observado no presente estudo, o isolado SA9 também não
apresentou colonização detectável.
Por outro lado, os valores de porcentagem de colonização estão mais
próximos daqueles observados por Alves (2006) em mudas de Eucalyptus dunnii
inoculadas com diferentes isolados fúngicos ectomicorrízicos e crescendo em
substrato com rochas como fonte de potássio e de fósforo. Nesse estudo, observou-
se baixa porcentagem de colonização para a maioria dos isolados, inclusive para um
dos empregados neste estudo, o isolado UFSC-Ch163, que não apresentou níveis
detectáveis de colonização. Já o isolado UFSC-Pt188, no trabalho de Alves (2006),
apresentou níveis bem mais elevados de colonização do que o encontrado no
presente estudo, com valores variando de 4 a 15 %, dependendo do tipo de rocha
utilizada como fonte fósforo.
39
Tabela 2.11. Porcentagem de colonização radicular de plantas de Eucalyptus dunnii inoculadas com
fungos ectomicorrízicos, isoladamente ou em mistura, em função do tempo de cultivo sob condições de
casa de vegetação
% Colonização radicular*
Tratamento 1 mês 2 meses 3 meses
Testemunha 0 0 0
SA9 0 A 0 A 0 A
132 0 A 0 A 0 A
163 0 A 0,28 A 0 A
188 0 A 0 A 0 A
SA9+132 0 A 0 A 0 A
SA9+163 0 A 0 A 0,62 A
SA9+188 0 A 0 A 0,55 A
132+163 0 A 0 A 0 A
132+188 0 A 0,06 A 0 A
163+188 0 A 0 A 0,38 A
SA9+132+163 0 A 0 A 0,02 A
SA9+132+188 0 A 0 A 1,22 A
SA9+163+188 0 A 0 A 0 A
132+163+188 0 A 0 A 0,02 A
SA9+132+163+188 0 A 0 A 0 A
Média 0 a 0,023 a 0,19 a
* Os valores representam a média de 5 plantas por tratamento. Médias seguidas pela mesma letra
maiúscula, na coluna, e minúscula na linha, não diferem significativamente entre si de acordo com o
teste de Tukey (p≤0,05).
Essas comparações reforçam a hipótese de que as raízes finas colonizadas
tenham sido perdidas durante a lavagem e revelam uma limitação metodológica para
os trabalhos com essa planta. Em E. dunnii, as micorrizas apresentaram-se muito
frágeis e com dimensões bastante reduzidas. As medidas dessas estruturas obtidas
por síntese in vitro forneceram valores de comprimento variando de 0,4 a 5 mm,
dependendo do fungo simbionte. A maioria apresentou comprimento de 1-2 mm. A
espessura variou de 0,1 a 1,1 mm.
Os resultados deste estudo confirmam a superioridade de alguns isolados
fúngicos ectomicorrízicos na promoção de benefícios à planta hospedeira,
anteriormente sugerida por Souza (2003), Souza et al. (2004) e Alves (2006),
notadamente em relação ao isolado UFSC-Pt188, Pisolithus microcarpus.
Além disso, observou-se que a inoculação das plantas com misturas de
diferentes isolados pode propiciar maiores benefícios às plantas que a inoculação
individual com cada isolado. Tal abordagem, além de simular com mais fidelidade as
condições naturais de campo, onde as plantas estão sujeitas à colonização
40
simultânea de suas raízes por diferentes fungos ectomicorrízicos presentes no local,
tem a vantagem de tirar proveito dos diversos mecanismos de ação que esses
fungos apresentam para beneficiar seus hospedeiros.
Com base nesses resultados, recomenda-se que novos estudos envolvendo a
inoculação das plantas com diferentes isolados sejam desenvolvidos. Cuidado
especial deve ser dado à melhoria das técnicas de avaliação da colonização
radicular, procurando-se evitar as limitações impostas pelas operações de coleta e
lavagem das raízes.
A padronização do inóculo fúngico também deve ser buscada de modo a
assegurar que todos os isolados sejam adicionados em quantidades semelhantes ao
substrato de crescimento das plantas. Nesse caso, novas formas de produção do
inóculo devem ser empregadas, como por exemplo o inóculo em gel de alginato de
cálcio, onde uma quantidade conhecida de micélio é imobilizada em cápsulas de
alginato (ROSSI, 2006).
2.4 CONCLUSÕES
• A inoculação das plantas com maior número de isolados fúngicos
ectomicorrízicos promove maior absorção de P e maior crescimento quando
comparada à inoculação envolvendo apenas um isolado e ao tratamento sem
inoculação;
• As misturas envolvendo o isolado UFSC-Pt188 promovem maior crescimento
das mudas de Eucalyptus dunnii;
• O isolado UFSC-Pt132, quando aplicado isoladamente ao substrato de
plantio, não proporciona efeitos favoráveis sobre a nutrição e o crescimento
das mudas de Eucalyptus dunnii;
• É necessário desenvolver procedimentos que permitam identificar os
diferentes fungos quando presentes simultaneamente no sistema radicular
das plantas de modo a confirmar a participação de cada isolado nos efeitos
sobre as variáveis estudadas.
CAPITULO 3
MORFOTIPAGEM DE ECTOMICORRIZAS OBTIDAS ATRAVÉS DE
SÍNTESE IN VITRO
3.1 INTRODUÇÃO
Os estudos que visam comparar a capacidade de colonização radicular
(infectividade) e a eficiência de fungos ectomicorrízicos na promoção do crescimento
das plantas, quando aplicados individualmente ou em consórcio, exigem o
reconhecimento de cada fungo ou isolado quando presente na própria micorriza. O
reconhecimento pode ser feito com base nas características anatômicas e
morfológicas das micorrizas de cada fungo. Para isso, são necessários estudos
preliminares de síntese micorrízica in vitro sob condições assépticas.
A formação de ectomicorrizas pode ser induzida in vitro pela exposição das
raízes das plantas hospedeiras ao micélio do fungo ectomicorrízico em um ambiente
que favoreça o crescimento de ambos (BRUNDRETT et al., 1996). Para isso,
existem várias técnicas descritas na literatura. Essa produção monoxênica de
micorrizas foi descrita pela primeira vez por Melin (1921, 1922 apud YANG &
WILCOX, 1983). Posteriormente, outros pesquisadores fizeram modificações e
adaptações desenvolvendo, assim, novas técnicas.
Técnicas como a do sandwich-paper descrita por Chilvers et al. (1986) e a do
celofane sobre ágar (BURGESS et al., 1994) permitem um contato íntimo entre o
fungo ou isolado de interesse com determinada planta, propiciando a formação de
ectomicorrizas em condições axênicas. Na técnica do sandwich-paper, o fungo e o
sistema radicular da planta são colocados dentro de pequenos sacos de papel,
crescendo juntos até estabelecerem a simbiose. Na técnica do celofane sobre ágar,
o sistema planta-fungo é colocado sobre um disco de papel celofane numa placa de
Petri contendo meio de cultura. O celofane é usado para impedir que as raízes
cresçam para dentro do meio de cultura, ao mesmo tempo que permite a passagem
dos nutrientes contidos no meio de cultura.
42
Na técnica proposta por Yang & Wilcox (1983), a planta e o fungo são
colocados entre uma folha de papel de filtro e a parede de um tubo de ensaio
preenchido com uma mistura turfa-vermiculita umidificada com meio de cultura
líquido MNM.
Essas técnicas têm se mostrado úteis para avaliar a compatibilidade entre o
fungo e planta e, também, para observação e descrição de características gerais das
micorrizas. Assim, por meio dessas técnicas, podem ser estudadas, tanto as
características macroscópicas, como, padrões de ramificação; a presença de
rizomorfas; cor, aspecto e textura do manto, quanto às características
microscópicas, como detalhes do manto e da rede de Hartig.
As micorrizas formadas por meio dessas técnicas podem ser facilmente
separadas do resto do sistema radicular e submetidas, por inteiro ou seccionadas, a
preparações microscópicas. Essas preparações permitem descrever as
características microscópicas das micorrizas como o número e a organização das
camadas do manto, a anatomia da rede de Hartig, as ornamentações, a presença de
cistídeos e as hifas emanantes, dentre outras. A este procedimento de descrição dá-
se o nome de morfotipagem.
Os objetivos principais deste estudo foram:
• Caracterizar os morfotipos formados por cada isolado fúngico ectomicorrízico em
mudas de Eucalyptus dunnii.
• Avaliar a infectividade de diferentes isolados de fECM em Eucalyptus dunnii sob
condições assépticas de síntese in vitro.
Para isso, algumas dessas técnicas de síntese micorrízica in vitro foram
testadas, tendo sido escolhida a técnica em tubo por ter se mostrado mais eficiente
no que diz respeito à manipulação, à assepsia e à observação das micorrizas
durante o crescimento das plantas.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
3.2.1 Isolados fúngicos utilizados
Foram estudados os mesmos isolados de fECM utilizados no estudo em casa
de vegetação descrito no capítulo 2.
Cada isolado foi repicado a partir das culturas da coleção para meio de
mesma composição (placas-matrizes), sob condições assépticas em capela de fluxo
43
laminar. As placas foram mantidas incubadas a 25 ± 1 ºC em incubadora tipo B.O.D.
até o momento de utilização das culturas, cerca de 20 dias após.
3.2.2 Obtenção das plântulas de Eucalyptus dunnii sob condições assépticas
A esterilização da superfície das sementes de E. dunnii foi efetuada pela
imersão em etanol (70 %), durante 30 s, sob agitação, seguindo-se de uma lavagem
em água destilada estéril. Em seguida, as sementes foram imersas em hipoclorito de
sódio (1 %), durante 20 min e lavadas três vezes em água destilada estéril. Após
esse tratamento, foram semeadas em meio de germinação sólido, contendo ácido
bórico (3 µM), glicose (2 g.L
-1
) e sulfato de cálcio (500 µM), pH 5,7, ágar-ágar (7 g.L
-
1
), em placas de Petri (∅=100 mm). Todo esse processo foi realizado sob condições
assépticas de fluxo laminar. As placas foram incubadas em câmara de crescimento a
25 ± 1 °C, com fotoperíodo de 24 horas durante 2 semanas.
Após a germinação, as plântulas foram transferidas, sob condições
assépticas, para tubos de vidro (20 cm x 2,5 cm) contendo uma mistura turfa-
vermiculita (30 mL por tubo), na proporção de 1:20 (V/V). Uma folha de papel de
filtro de 11 cm x 11 cm foi colocada entre o substrato de plantio e a parede do tubo.
Esse substrato foi, então, umedecido com cerca de 10 mL de água e
esterilizado em autoclave a 121 °C, durante 20 min. Posteriormente, adicionaram-se
10 mL de meio de cultura MNM por tubo e procedeu-se a uma segunda esterilização
sob as mesmas condições de tempo e temperatura. Antes da esterilização, os tubos
foram fechados com duas camadas de papel celofane.
Em cada tubo, uma plântula de E. dunnii com duas semanas de idade, foi
colocada com as raízes dispostas entre a folha de papel de filtro e a parede do tubo,
de modo a permitir a visualização periódica do sistema radicular (Figura 3.1). O
sistema foi colocado em câmara de crescimento com temperatura de 25 ºC ± 2 e
fotoperíodo de 12 horas.
3.2.3 Inoculação das plântulas
Discos de meio de cultura de 8 mm de diâmetro, cobertos de micélio, foram
retirados das bordas das colônias em placas de Petri, com cerca de 20 dias de
crescimento. Esses discos foram colocados em meio fresco MNM-ágar, em placas
de Petri, para confirmar sua viabilidade e ausência de contaminações. Após 2 dias,
44
quando o micélio voltou a crescer nas bordas dos discos, e nenhuma contaminação
foi observada, os discos foram transferidos para os tubos de síntese onde já se
encontravam as plântulas. Esses discos foram depositados de cada lado das raízes,
também entre o papel de filtro e a parede do tubo. O conjunto foi incubado em
câmara de crescimento sob condições controladas de temperatura e luminosidade.
Preparou-se, também, um tratamento testemunha não inoculado. Os tubos
foram novamente fechados com papel celofane, sob condições assépticas, em
capela de fluxo laminar, e as plantas foram devolvidas à câmara de crescimento com
fotoperíodo de 12 horas.
3.2.4 Avaliação dos resultados
Após 5 semanas em câmara de crescimento, as plantas foram retiradas dos
tubos, separando-se o sistema radicular da parte aérea e as características
morfológicas externas e internas das micorrizas foram avaliadas.
As características externas das micorrizas foram examinadas sob microscópio
estereoscópico, com aumento de até 30X. As micorrizas foram separadas das
demais raízes e classificadas conforme o tipo morfológico aparente. As micorrizas de
cada tipo foram depositadas em diferentes poços de placas do tipo ELISA contendo
solução salina (0,85 % de NaCl).
Sob microscópio estereoscópico, foram anotadas as características de cor do
manto, padrão de ramificação, textura do manto, presença de hifas extra-matriciais e
de rizomorfas, forma da ponta da raiz e outras características conforme o quadro
3.1. Essa descrição macroscópica foi feita de acordo com catálogos de Ingleby et al.
(1990), Agerer (1987-1993) e Goodman et al. (1996-1998). O modelo das fichas de
descrição utilizadas nesta etapa é apresentado no Anexo 3.
Posteriormente, as diferentes micorrizas foram depositadas em tubos do tipo
Eppendorf, devidamente catalogadas e congeladas à temperatura de -20 ºC, para
posterior estudo das características microscópicas. Antes do congelamento, as
micorrizas foram fotografadas ao microscópio estereoscópico.
Para a caracterização microscópica, as micorrizas foram cortadas em secções
de 20-30 µm em criomicrótomo e observadas sob microscópio óptico em aumentos
de 400X a 1000X. Antes da observação, as secções foram colocadas sobre uma
lâmina de vidro para microscopia e, simultaneamente, fixadas e coradas com uma
45
mistura contendo uma gota de PVLG (16,6 g de álcool-polivinílico + 100 mL de água
destilada + 100 mL ácido lático + 10 mL de glicerina) e uma gota de solução de azul
de algodão (0,05 %) ao lactoglicerol (0,04 g de azul de metila + 10 mL de ácido lático
+ 20 mL de glicerina + 10 mL de água destilada).
Ao microscópio, foram anotadas as características do manto, da rede de
Hartig, de hifas extra-matriciais e outras (Anexo 4), que também foram descritas de
acordo com catálogos de descrição (INGLEBY et al., 1990; AGERER, 1987-1993;
GOODMAN et al., 1996-1998) (Quadro 3.1). As secções foram fotografadas ao
microscópio óptico.
Quadro 3.1. Características morfológicas externas e internas das micorrizas
Morfologia das micorrizas
• intensidade de ramificação
• padrões de ramificação
Manto
• textura
• cor
• organização das hifas na superfície
• presença de fíbulas, cistídeos, exsudatos
Rede de Hartig
• presença
• espessura
• número de camadas
• organização das hifas em cada camada
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após cinco semanas, os tubos de síntese in vitro foram abertos e seu
conteúdo examinado quanto à presença de ectomicorrizas. Na maioria dos tubos,
fungo e planta cresceram normalmente, com o micélio avançando por cima do
sistema radicular e crescendo sobre as raízes (Figura 3.1).
No entanto, analisando-se minuciosamente as raízes de forma individual,
apenas três, dos quatro isolados, formaram ectomicorrizas. Foram eles: UFSC-
46
Pt132, UFSC-Ch163 e UFSC-Pt188. As plantas inoculadas com o isolado SA9, um
Scleroderma flavidum, não apresentaram colonização detectável, embora fosse
possível observar a presença de micélio cobrindo as raízes. As características das
raízes e/ou micorrizas formadas por cada isolado estão descritas a seguir:
Figura 3.1. Aspecto geral do dispositivo de síntese micorrízica in vitro, mostrando o micélio do fungo
crescendo sobre raízes de Eucalyptus dunnii
3.3.1 Aspecto das raízes colonizadas pelos diferentes isolados fúngicos
ectomicorrízicos
a) Isolado SA9, Scleroderma flavidum
Os exemplares observados apresentaram uma delicada camada de hifas
brancas cobrindo as raízes, não constituindo um manto verdadeiro, resultando apenas
do crescimento do micélio sobre a raiz (Figura 3.2a). Além disso, os segmentos de raiz
não apresentaram ramificações ou quaisquer outras características que indicassem
colonização micorrízica. Esses segmentos mediam entre 0,5 e 1,5 mm de comprimento.
Confirmando esta afirmação, a observação dos cortes transversais (Ø=150 µm)
sob microscopia óptica, não revelou qualquer presença de manto fúngico ou rede de
Hartig nas raízes. Não obstante a ausência dessas estruturas, ainda foram observados
pêlos radiculares, um indicativo da ausência de colonização ectomicorrízica (Figura
3.2b).
Micélio em
crescimento
Raiz de E. dunnii
47
Figura 3.2. Raízes de Eucalyptus dunnii cultivadas sob condições axênicas. (a) raiz não colonizada
coberta pelo micélio do isolado SA9 e (b) sua secção transversal. (c) Ectomicorriza formada pelo isolado
UFSC-Pt132 e a respectiva (d) secção transversal. (e) Aspecto geral da ectomicorriza formada pelo
isolado UFSC-Ch163 e (f) secção transversal da mesma micorriza. (g) Ectomicorriza formada pelo isolado
UFSC-Pt188 e (h) sua secção transversal. M = Manto; RH = rede de Hartig.
b
a
0,4mm
28µm
0,5mm
c
d
M
RH
60µm
0,2mm
0,5mm
f
h
g
RH
35µm
35µm
e
RH
M
M
b
48
b) Isolado UFSC-Pt132, Pisolithus microcarpus
As micorrizas formadas por esse isolado e mudas de E. dunnii,
caracterizaram-se pelo aspecto levemente tortuoso, com ramificações irregulares, ou
retas, quando não ramificadas. O comprimento dos segmentos variou entre 0,3 e 4,5
mm. O manto tinha uma textura granulada de cor marrom escuro, ou marrom claro
nas regiões mais jovens (Figura 3.2c). Apresentava hifas de cor amarelada
emanando de alguns pontos, mas não bastante organizadas para caracterizar uma
rizomorfa. Alguns exemplares parecendo mais velhos apresentavam cor mais escura
e um manto mais compacto, com menos hifas emanando.
Ao microscópio óptico, o manto apresentou apenas uma camada, compacta,
com hifas alongadas, do tipo sinênquima em rede (net synenchyma), e media
aproximadamente 38 µm de espessura. Observou-se a presença de estruturas
semelhantes a grânulos, que aparentavam ser as extremidades de cada hifa. A rede
de Hartig, facilmente visualizada mas de difícil definição, pareceu ser do tipo
classificada por Goodman et al. (1996-1998), como comum e amplamente
distribuída, apresentando linhas de hifas palmadas e simples, penetrando apenas
até a primeira camada de células do córtex da raiz (Figura 3.2d). Não foram
observados fíbulas nas hifas que emanavam do manto.
Essa rede de Hartig com baixo grau de penetração no córtex radicular
caracteriza as micorrizas do tipo superficial amplamente encontradas em
Angiospermae (CHILVERS, 1968; SMITH & READ, 1997).
c) Isolado UFSC-Ch163, Chondrogaster angustisporus
Muitas raízes estavam cobertas por hifas de cor branca, mas não
aparentavam aspectos de raízes colonizadas, ou estavam ainda iniciando o
processo de colonização. Algumas pontas de raízes curtas (0,1 a 0,6 mm) e sem
ramificação, apresentavam colonização, com manto de cor marrom claro e textura
levemente granulada. Não foram observadas rizomorfas, mas haviam algumas hifas
de cor clara emanando do manto o que dava um leve aspecto feltroso (Figura 3.2e).
Analisando-se as secções transversais sob microscopia óptica, o manto
revelou-se formado por apenas uma camada, densa e fina, com aproximadamente 8
µm de espessura, do tipo sinênquima em rede (net synenchyma), de hifas
alongadas, sem espaço entre as células, com exceção das mais externas, dispostas
mais frouxamente (Figura 3.2f). As hifas emanando do manto apresentavam fíbulas
49
(Figura 3.3) e mediam aproximadamente 2,5 µm de espessura, sendo mais
espessas que as hifas do manto. A rede de Hartig, embora fosse facilmente visível,
era de difícil definição, mas aparentava ser do tipo palmada, à semelhança da rede
de Hartig do morfotipo anterior. Essa rede, também como no caso precedente,
penetrava apenas até a primeira ou, em alguns pontos, até à segunda camada de
células do córtex da raiz.
Importante salientar que esse isolado é de uma espécie nova encontrada e
descrita pela primeira vez no Brasil por Giachini et al. (2000) e esta é a primeira
descrição das micorrizas formadas por essa espécie.
d) Isolado UFSC-Pt188, Pisolithus microcarpus
As micorrizas formadas por este isolado estavam sob uma densa camada de
hifas de tonalidade ferruginosa, marrom-amarelada, que escureciam facilmente
quando injuriadas. Após a remoção destas hifas, as micorrizas apresentavam-se
tortuosas, com ramificações irregulares, algumas do tipo monopodial pinada e outras
não ramificadas (Figura 3.2g), com o comprimento dos segmentos variando entre 0,2
e 5 mm. O manto, de cor marrom, com a tonalidade variando de clara a escura,
apresentou textura granulosa, com hifas de cor amarelada emanando de alguns
pontos. Em apenas um exemplar foi observada a presença de rizomorfas, formadas
por hifas da mesma cor do manto. Foram observados, também, micorrizas de menor
espessura e com manto menos denso, apresentando hifas frouxamente dispostas de
cor marrom cobrindo as raízes, tratando-se, possivelmente, de micorrizas ainda em
processo de formação.
50
Figura 3.3. Secções transversais de ectomicorrizas de Eucalyptus dunnii em detalhes. (a) Raiz de E.
dunnii inoculada com o isolado SA9 e não colonizada, sem manto e rede de Hartig aparentes e (b) com
pêlos radiculares. (c) Detalhe do manto e (d) rede de Hartig formados pelo isolado UFSC-Pt132. (e)
Manto, rede de Hartig, hifas extra-matriciais e (f) fíbulas de ectomicorriza formada pelo isolado UFSC-
Ch163. (g) Manto e (g, e) rede de Hartig formados pelo isolado UFSC-Pt188. P = pêlos radiculares; M =
manto; RH = rede de Hartig; HE = hifas extra-matriciais; F = fíbula
5 µm
25 µm
10 µm
15 µm
15 µm
15 µm
8 µm
5 µm
PR
M
RH
M
RH
HE
F
M
RH
a
b
c
d
e
f
g
h
51
Microscopicamente, as micorrizas apresentaram manto com apenas uma
camada compacta de células alongadas, com aproximadamente 34 µm de
espessura, do tipo sinênquima em rede (net synenchyma), com estruturas
semelhantes a grânulos, possivelmente representando as extremidades das hifas
(Figura 3.2h). O manto apresentou hifas emanando de alguns pontos, em que não
foram observadas fíbulas. A rede de Hartig atingia apenas a primeira camada células
do córtex da raiz e era do tipo palmada, considerada por Goodman et al. (1996-
1998) como sendo do tipo comum e amplamente distribuída.
Notou-se que os dois isolados da espécie Pisolithus microcarpus, UFSC-
Pt132 e UFSC-Pt188, apresentavam o mesmo morfotipo, apesar de se diferenciarem
em seus aspectos culturais (cor das colônias, velocidade de crescimento) (Souza,
2003) e de infectividade e eficiência simbióticas, conforme pode ser visto no capítulo
2 da presente dissertação, onde foi demonstrado que o isolado UFSC-Pt132
apresentava baixa intensidade de colonização das raízes de E. dunnii e pouco ou
nenhum efeito sobre o crescimento ou a nutrição fosfatada dessa planta.
A dificuldade de se distinguir entre micorrizas formadas por diferentes
isolados de uma mesma espécie fúngica, demonstra a falta de adequação da
morfotipagem como estratégia para quantificar a colonização radicular simultânea
desses isolados quando aplicados em inoculantes mistos. Ou, ainda, para distinguir
sob condições de viveiro as micorrizas formadas por isolados introduzidos pela
inoculação e as formadas por eventuais contaminantes fúngicos ectomicorrízicos da
mesma espécie. Entende-se, assim, que seja necessária a aplicação de outros
métodos para a distinção das micorrizas formadas por cada um destes isolados,
como por exemplo, técnicas utilizando ferramentas de biologia molecular.
A morfotipagem é, por outro lado, bastante útil quando se trata de distinguir
micorrizas formadas por fungos de natureza taxonômica distinta. No caso do isolado
de C. angustisporus, UFSC-Ch163, suas micorrizas foram bastante distintas das
micorrizas dos isolados de Pisolithus, discutidos anteriormente.
A técnica de síntese in vitro em tubos mostrou-se adequada para a formação
de ectomicorrizas em E. dunnii. A ausência de micorrizas nas plantas inoculadas
com o isolado SA9, Scleroderma flavidum, parece ser devida à falta de infectividade
desse fungo em relação a essa planta. Num experimento em casa de vegetação,
52
Souza (2003) também observou esse fenômeno de falta de infectividade desse
isolado em relação à mudas de E. dunnii.
É possível que esse fungo, isolado de plantações de E. camaldulensis na
Austrália, não apresente compatibilidade simbiótica com a espécie E. dunnii, embora
esse pareça ser um fenômeno raro na associação ectomicorrízica em espécies do
gênero Eucalyptus. Exemplos de especificidade são mais comum entre fungos
ectomicorrízicos e plantas de diferentes táxons. Giachini et al. (2000, 2004)
observaram esse fenômeno entre espécies do gênero Scleroderma em relação a
Eucalyptus spp. e Pinus spp. em plantações de Santa Catarina. Scleroderma
areolatum, S. bougheri e S. cepa, só foram encontradas associadas a Eucalyptus
spp., enquanto que S. citrinum, S. uruguayense e S. floridanum só foram observadas
em plantações de Pinus spp.
Entretanto, não se pode descartar a hipótese de uma especificidade de grau
mais elevado entre esse isolado e espécies diferentes de Eucalyptus. Oliveira et al.
(1994) apresentaram evidências significativas de ocorrência de compatibilidade
espécie-específica entre alguns fungos ectomicorrízicos e as espécies E. dunnii e E.
viminalis, sob condições controladas de casa de vegetação.
Sugere-se que mais estudos sejam realizados, envolvendo outras técnicas de
síntese in vitro para confirmar a possibilidade do estabelecimento de simbiose entre
o isolado SA9 e E. dunnii.
Os resultados demonstram que a morfotipagem não apresenta sensibilidade
suficiente para distinguir isolados da mesma espécie quando associados às raízes
hospedeiras. Porém, a técnica mostra-se adequada quando se trata de diferenciar
micorrizas formadas por fungos de diferentes grupos taxonômicos.
Para ser amplamente aceita, esta última afirmação deverá ser, porém, testada
com novos estudos envolvendo maior número de fungos pertencentes a diferentes
gêneros e famílias.
3.4 CONCLUSÕES
• As micorrizas formadas por Chondrogaster angustisporus, isolado UFSC-Ch163,
são bastante distintas das micorrizas de Pisolithus microcarpus e podem ser
diferenciadas por morfotipagem;
53
• As ectomicorrizas formadas pelos isolados UFSC-Pt132 e UFSC-Pt188, da
espécie Pisolithus microcarpus, apresentam as mesmas características
anatômicas macroscópicas e microscópicas, não sendo possível a distinção
através de técnicas de morfotipagem;
• O isolado SA9, Scleroderma flavidum, não forma ectomicorrizas em Eucalyptus
dunnii nas condições de síntese axênica empregada neste estudo;
• A técnica de síntese axênica em tubos é adequada para a síntese de
ectomicorrizas a partir de fungos ectomicorrízicos e plântulas de Eucalyptus
dunnii.
CAPÍTULO 4
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Chondrogaster angustisporus,
ISOLADO UFSC-Ch163
4.1 INTRODUÇÃO
Esta parte do estudo foi realizada na Universidade Federal de Santa Maria
(UFSM), RS, no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Solos, Centro de
Ciências Rurais, sob a supervisão da Professora Zaida Inês Antoniolli.
A dificuldade de se obter um produto de amplificação para a maioria dos
isolados impediu que fosse feito seqüenciamento de todos durante o estágio na
UFSM. Entretanto, novas tentativas de amplificação permitiram obter DNA suficiente
para o seqüenciamento do isolado UFSC-Ch163. Esse isolado teve sua região ITS
submetida a seqüenciamento após a amplificação. Atenção especial foi dada a esse
isolado, por pertencer a uma espécie nova, descoberta no Brasil e recentemente
descrita por Giachini et al. (2000). Além disso, esse isolado tem se mostrado
eficiente na promoção do crescimento de Eucalyptus dunnii (SOUZA et al., 2004) e
vem sendo estudado pelo Laboratório de Ectomicorrizas da UFSC com vistas à
produção de inoculantes comerciais para aplicação em viveiros (ROSSI, 2006).
Chondrogaster angustisporus Giachini, Castellano, Trappe & Oliveira, é um
fungo hipógeo, encontrado no solo, solitário, ou mais freqüentemente em grupos de
várias frutificações, embebidas numa massa miceliana profusa e branca, sob E.
dunnii Maiden, em Santa Catarina (GIACHINI et al., 2000). Essa espécie também foi
coletada na Austrália por J. M. Trappe, M. A. Castellano, A. W. Claridge, e N.
Malajczuk, na Austrália, sob Eucalyptus spp., e em Montevidéu, Uruguai, por V. L.
Oliveira e G. Malvarez, sob E. grandis (GIACHINI et al., 2000). Mais recentemente,
C. angustisporus foi observada em plantações de eucalipto na Espanha por Alvarez
& Cerceda (2005).
A biologia molecular mostra-se como uma importante ferramenta de estudo,
pois permite identificar a espécie fúngica quando esta já se encontra associada ao
55
sistema radicular hospedeiro, desde que seja feita a escolha adequada das técnicas
e das ferramentas moleculares a serem empregadas. A caracterização das
comunidades micorrízicas utilizando técnicas de biologia molecular envolve a
extração de DNA fúngico nas raízes colonizadas; a amplificação deste DNA pela
técnica de PCR (MULLIS & FALOONA, 1987), utilizando iniciadores (primers)
específicos para fungos; digestão por enzimas de restrição para produzir padrões de
fragmentos específicos para cada isolado, ou mesmo o seqüenciamento de regiões
específicas de certos genes.
A escolha da região ITS baseia-se em seu caráter altamente conservado nos
organismos, aliado a uma certa variabilidade que permite a distinção entre espécies
e até mesmo entre indivíduos diferentes (isolados) (WHITE et al., 1990; EGGER,
1995).
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1 Extração do DNA do isolado fúngico ectomicorrízico UFSC-Ch163,
Chondrogaster angustisporus
A cultura matriz desse isolado faz parte da coleção de culturas de fungos
ectomicorrízicos do Laboratório de Ectomicorrizas da Universidade Federal de Santa
Catarina. O fungo foi isolado a partir de carpóforos coletados em plantação de E.
dunnii em Correia Pinto, SC, em 1997 por A. J. Giachini e V. L. Oliveira (GIACHINI et
al., 2004).
Na coleção de culturas de fungos ectomicorrízicos do Depto. de Microbiologia
e Parasitologia da UFSC, esse fungo é mantido em meio MNM sólido, no qual a
sacarose, presente no meio original (Melin-Norkrans) na concentração de 2,5 g.L
-1
(NORKRANS, 1949), é substituída pela glicose na concentração de 10 g.L
-1
(MARX,
1969). A esse meio, são adicionados 2 g.L
-1
de carvão ativado para prolongar a
viabilidade das culturas.
Como a maior parte dos fungos ectomicorrízicos já estudados, C.
angustisporus, isolado UFSC-Ch163, apresenta crescimento lento em laboratório
quando comparado a microrganismos de vida livre. Em meio líquido, esse isolado
apresenta uma velocidade específica de crescimento (µ
X
) de 0,19.dia
-1
, e uma
produtividade de 0,26 g.L
-1
dia
-1
(ROSSI, 2006).
56
O fungo foi cultivado em 25 mL de meio MNM em frascos do tipo erlenmeyer,
durante 20 dias, à temperatura de 25
o
C ± 1, em incubadora do tipo B.O.D. Após
esse período, os tapetes micelianos formados na superfície do meio foram
assepticamente transferidos para frascos reagentes em borosilicato com tampa
rosqueável, com 100 mL de capacidade e, em seguida, congelados à temperatura
de -20 ºC, até o momento de serem transportados de Florianópolis a Santa Maria,
onde foram realizados os procedimentos de biologia molecular. O transporte deu-se
em caixas de isopor providas de gelo seco. Chegando ao local de destino o material
foi novamente colocado em congelador até o momento da extração do DNA.
Antes de iniciar a extração, os frascos foram deixados à temperatura
ambiente para descongelamento do micélio. Para evitar interferências nas reações
de PCR e no seqüenciamento, o excesso de líquido foi retirado com o auxílio de
papel absorvente. Pela mesma razão, foram retirados os pedaços de meio de cultura
sólido, remanescentes dos discos de micélio utilizados para iniciar as culturas em
meio líquido.
Depois de seco, o micélio foi colocado em um gral de porcelana, com o auxílio
de uma espátula esterilizada, e congelado com um jato de nitrogênio (N
2
) líquido.
Imediatamente após, o micélio foi macerado com pistilo até ser transformado em pó.
O micélio utilizado para esse fim foi produzido conforme descrito no item 4.2.1. Para
o seqüenciamento, cerca de 300 mg micélio fresco foram empregados e a extração
do DNA foi realizada conforme técnica descrita por Roy et al. (1992). O micélio foi
inicialmente congelado em nitrogênio líquido e macerado em 600 µL de 2 % CTAB
[100 mL de água ultrapura, 1,4 M NaCl, 20 mM de EDTA, 2 % de CTAB, 100 mM de
Tris-HCl, a pH 8,0]. Após a maceração, a suspensão miceliana foi homogeneizada
durante 1 min e incubada em banho-maria a 65 ºC durante 60 min. Após a
incubação, foi feita uma nova homogeneização durante 5 min, adicionando-se uma
solução de fenol-clorofórmio-álcool isoamil (25:24:1), seguida por centrifugação a
18.894 rcf, rotor 12130, durante 10 min a 4
o
C, numa centrífuga 4K15 da marca
Sigma Laboratory.
O sobrenadante foi descartado e o pellet resultante foi lavado em 100 µL de
etanol 80 % gelado. Após 5 min, o pellet foi novamente centrifugado a 18.894 rcf
durante 10 min. Eliminou-se, então, o sobrenadante e, após evaporação do etanol, o
pellet foi ressuspendido em 50 µL de água ultra pura e armazenado em congelador,
a -20 ºC.
57
Após a extração do DNA, o material foi tratado com uma solução de RNAase (10
mg.mL
-1
) correspondendo a 2 % do volume a 37 ºC em banho-maria, durante 30
min. A presença de DNA nesse material foi verificada através de eletroforese em gel
de agarose (1,2 %) contendo 0,5 µL de brometo de etídio.
4.2.2 Amplificação e seqüenciamento da região ITS do DNA de Chondrogaster
angustisporus, isolado UFSC-Ch163
A amplificação da região ITS do isolado UFSC-Ch163 foi feita com primers
específicos para fungos asco e basidiomicetos: ITS1 (5’ TTC CGT AGG TGA ACC
TGC GG 3’) e ITS4 (5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’) (WHITE et al., 1990). A
reação de amplificação (PCR) foi feita com 1,0 µL do DNA; 2,5 µL de o tampão de
PCR 10X; 3,0 µL dos dNTPs (1,5 mM); 2,0 µL de MgCl
2
(20 mM); 3,0 µL de cada
primers (25 pmoles); 0,5 U de Taq polimerase (5 U.µL
-1
); e 10,5 µL de água
ultrapura.
A amplificação ocorreu num termociclador modelo PTC-100 da MJ Research,
INC, com as seguintes condições: primeira extensão a 94 ºC durante 30 s;
desnaturação a 94 ºC durante 45 s, temperatura de anelamento de 55 ºC (30 s)
durante 35 ciclos com uma extensão final a 72 ºC durante 10 min. O produto de PCR
foi submetido a eletroforese em gel de agarose 1,2 % (P:V) em tampão TBE
(SAMBROOK et al., 1989), corado com brometo de etídio e observado sob luz UV
(360 nm). Esse produto foi mantido sob refrigeração, a 4 ºC, até o momento de sua
utilização.
Antes do seqüenciamento, esse produto foi purificado de acordo com
Sambrook et al. (1989). Primeiramente, o produto recebeu igual volume de PEG
8000 a 13 % PEG (10 mL de água ultrapura, 1,3 g de PEG e 0,94 g de NaCl) (DUNN
& BLATTNER, 1987) e foi mantido sob refrigeração durante 12 h. Após esse tempo,
a amostra foi centrifugada a 18.894 rcf durante 15 min. A solução de PEG foi, então,
eliminada e foram adicionados 200 µL de uma solução de álcool etílico a 70 %. Uma
nova centrifugação de 18.894 rcf foi aplicada durante 10 min. O álcool foi eliminado
e o DNA foi ressuspendido em água ultra pura.
O seqüenciamento foi feito usando uma cópia de DNA de dupla fita oriunda
do produto de PCR (70 ng) e 1 µM de cada um dos primers ITS1 e ITS4, seguindo-
se as instruções do protocolo fornecido pelo fabricante do seqüenciador Mega BACE
58
500, da Amersham Biosciences. As seqüências foram editadas com o programa
EditSeq e alinhada através do programa MegaAlign DNASTAR (Lasergene, 1994).
As seqüências obtidas foram comparadas com seqüências disponíveis no banco de
genes NCBI Blast Genbank (ALTSCHUL et al., 1997).
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1 Seqüenciamento da região ITS de Chondrogaster angustisporus, isolado
UFSC-Ch163
A amplificação do gene rRNA de Chondrogaster angustisporus (isolado
UFSC-Ch163), com os primers ITS1 e ITS4 produziu um fragmento de 610 pb,
compreendendo as regiões ITS1 e ITS2, incluindo a porção codificando para a
subunidade 5,8S (Figura 4.1). Para este isolado fúngico, essas regiões
apresentaram um total de 237 e 210 pb, respectivamente. A seqüência insere-se na
mesma amplitude de comprimento das regiões ITS1 e ITS2 de outros fungos
ectomicorrízicos, disponíveis no banco de dados do "National Center for
Biotechnology Information (NCBI) Genbank", apesar da variação observada entre as
diferentes espécies ou isolados.
Quando a seqüência de C. angustisporus UFSC-Ch163 foi analisada em
conjunto com as dez seqüências mais similares obtidas no NCBI Genbank,
observou-se a formação de dois grupos distintos, indicando que C. angustisporus é
um isolado diferente (Figura 4.2). Na árvore filogenética obtida, o comprimento de
cada par de ramos representa a distância entre os pares de seqüência calculada
com base no alinhamento das seqüências.
Figura 4.1. Seqüência de nucleotídeos da região ITS do fungo ectomicorrízico Chondrogaster
angustisporus, isolado UFSC-Ch163, gerada pelo software Seqman, DNASTAR. A região sublinhada
representa a porção do gene rRNA que codifica para a subunidade 5,8S do RNA ribossômico. Região
ITS1: 1 – 238; 5,8S: 239 – 399; região ITS2: 400 – 610.
59
Considerando-se as dez seqüências mais similares a C. angustisporus,
quando a seqüência desse fungo (EF989122) foi comparada às seqüências
registradas no NCBI Genbank, esse isolado formou um agrupamento (cluster)
separado com um fungo ectomicorrízico não identificado e não cultivado, registrado
no NCBI sob o número AM412270, oriundo do arquipélago das Seicheles
(TEDERSOO et al., 2007). As nove outras seqüências, registros DQ365637,
AM412270, AJ408353, AF377077, AJ292294, AY872281, DQ672289, DQ974736 e
DQ365606, formaram agrupamentos separados.
Figura 4.2. Dendrograma baseado na seqüência da região ITS de Chondrogaster angustisporus isolado
UFSC-Ch163 obtido com o programa Clustal DNASTAR. As seqüências de outras espécies foram obtidas
junto ao GenBank - National Center of Biotechnology Information (NCBI).
A porcentagem de similaridade entre a seqüência da região ITS de C.
angustisporus, isolado UFSC-Ch163, e as seqüências dessa mesma região dos dez
fungos ectomicorrízicos com maior porcentagem de similaridade, disponíveis no
NCBI, variou de 82 a 100 % (Tabela 4.1). Esses resultados indicam uma afinidade
significativa entre Chondrogaster angustisporus e espécies dos gêneros
Gloeocantharellus, Ramaria, Gautieria, Gomphus, Hysterangium e Sphaerobolus,
além do elevado grau de similaridade (100 %) com a seqüência de um fungo
ectomicorrízico não identificado coletado nas Seicheles, também disponível no
banco de dados do NCBI.
Características morfológicas já foram usadas para descrever a espécie
Chondrogaster angustisporus (GIACHINI et al., 2000). O presente estudo constitui-
60
se no primeiro seqüenciamento da região ITS desse fungo ectomicorrízico coletado
em plantações de Eucalyptus dunnii, em Santa Catarina. Verificou-se que a
seqüência da região ITS de C. angustisporus apresenta grande similaridade em
relação às seqüências da região ITS de outros fungos ectomicorrízicos obtidas por
outros autores e disponíveis no banco de genes do NBCI.
Tabela 4.1. Afinidade entre Chondrogaster angustisporus, isolado UFSC-Ch163, e os dez fungos mais
estreitamente relacionados de acordo com a seqüência da região ITS do gene rRNA
Organismo
Identidade
(%)
Registro* Referências
Gomphus clavatus
90 DQ365637 Dunham et al. (2006)
fEMC, não cultivado 100 AM412270 Tedersoo et al. (2007)
Ramaria cedretorum
91 AJ408353 Daniels et al. (2001)
Gautieria sp. 90 AF377077 Bidartondo et al. (2001)
Ramaria botrytis
91 AJ292294 Daniels et al. (2001)
Gloeocantharellus purpurascens
91 AY872281 Hughes et al. (2004)
Basidiomiceto não cultivado 90 DQ672289 Midgley et al. (2007)
Hysterangium sp. 82 DQ974736 Smith et al. (2007)
Ramaria sp. 91 DQ365606 Dunham et al. (2006)
Sphaerobolus sp. 90 DQ979014 Tlapa et al. (2006)
Chondrogaster angustisporus
100 EF989122 Este trabalho
* Número de registro do GenbanK – National Center of Biotechnology Information (NCBI).
(site: www.ncbi.nlm.nih.gov)
fEMC: fungo ectomicorrízico
O alto grau de similaridade com espécies dos gêneros Gloeocantharellus,
Ramaria, Gautieria, Gomphus, Hysterangium e Sphaerobolus, reforça a recente
proposta que classifica o gênero Chondrogaster numa nova subclasse,
Phallomycetidae, formada pelo agrupamento das ordens Gomphales e Phallales,
baseada nas seqüências dos genes nuc-LSU-rRNA e mt-SSU-rRNA e de proteínas
(HOSAKA et al., 2006).
O sucesso no seqüenciamento da região ITS de C. angustisporus com os
primers ITS1 e ITS4, indica a boa adequação desses primers para a amplificação
dessa região em fungos (WHITE et al., 1990; PRITSCH et al., 2000; WRIGHT et al.,
2000). Esse seqüenciamento vem contribuir para uma melhor compreensão da
diversidade genética dos fungos ectomicorrízicos que é, ainda, muito deficiente na
maioria dos casos. Acredita-se que a região ITS em fungos apresenta uma evolução
muito lenta contendo, assim, uma variação na seqüência de nucleotídeos que é
61
adequada ao estudo das relações filogenéticas em nível molecular entre espécies ou
isolados (AMICUCCI et al., 1998; FARMER et al., 1998).
A seqüência da região ITS obtida poderá facilitar o desenvolvimento de
primers específicos para uso em procedimentos confiáveis de identificação ou
detecção de Chondrogaster angustisporus, independentemente das condições
ambientais ou dos hospedeiros. Isso contribuirá para estudos da diversidade de
plantas hospedeiras, permitindo estabelecer se esse fungo é um simbionte
específico de plantas do gênero Eucalyptus, como indicam as informações
disponíveis até o momento, ou se este é capaz de se associar a outras plantas da
família Myrtaceae, de grande importância em florestas sub-tropicais do Brasil (Mata
Atlântica), ou mesmo de outras famílias. No sul do Brasil, as plantações de
Eucalyptus spp. convivem, lado a lado, com plantações de Pinus spp. e com áreas
de florestas nativas.
O desenvolvimento de técnicas confiáveis para a identificação desse fungo
também é importante para a implantação de programas de controle da micorrização,
quando for necessária a detecção dos fungos nas raízes das plantas inoculadas no
viveiro e após seu transplantio para o campo. Isso permitirá acompanhar sua
persistência nas raízes em presença dos fungos naturalmente presentes nesses
locais.
Novos estudos são, no entanto, necessários para comparar a seqüência da
região ITS do isolado UFSC-Ch163 a outros isolados da mesma espécie ou mesmo
a outras espécies do gênero Chondrogaster, de modo a esclarecer o polimorfismo
em nível inter e intraespecífico dessa região do gene rRNA desse promissor fungo
ectomicorrízico.
4.4 CONCLUSÕES
• Os primers ITS1 e ITS4 são adequados para o seqüenciamento da região ITS de
Chondrogaster angustisporus;
• Chondrogaster angustisporus apresenta grande afinidade filogenética com outros
fungos ectomicorrízicos da subclasse Phalomycetidae;
• A obtenção da seqüência de Chondrogaster angustisporus, UFSC-Ch163, pode
contribuir para o desenvolvimento de técnicas confiáveis para a identificação
desse isolado.
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ANEXO 1
PROTOCOLO DE PREPARO DE 1 L DA SOLUÇÃO P-B (MOLIBDATO DE
AMÔNIO)
a) Dissolver 3,8 g de molibdato de amônio [(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2
O] em 150 mL de água
destilada previamente aquecida a 60 °C, em copo de becker de 200 mL;
b) Deixar esfriar, transferir para um balão volumétrico de 200 mL e completar o
volume com água destilada;
c) Transferir para um frasco com capacidade de 1 L;
d) Em outro balão, colocar 80 mL de água destilada;
e) Adicionar 70,7 mL de HCl concentrado (d=1,191; 37,7% e 12,31N) e agitar;
f ) Completar o volume com água destilada e agitar;
g) Transferir para o frasco de 1 L, onde já se encontra a solução de molibdato de
amônio, e agitar;
h) Adicionar 600 mL de água destilada, utilizando balão volumétrico de 200 mL, e
agitar bem para perfeita homogeneização.
ANEXO 2
PROTOCOLO DE PREPARO DA SOLUÇÃO P-C (ÁCIDO 1-AMINO-2-NAFTOL-4-
SULFÔNICO)
a) Preparar um estoque de pó redutor, misturando e triturando em almofariz os
seguintes reagentes:
- 2,5 g de ácido1-amino-2-naftol-4-sulfônico,
- 5 g de sulfito de sódio (Na
2
SO
3
),
- 146 g de metabissulfito de sódio (Na
2
S
2
O
5
);
b) Guardar o pó redutor em vidro fosco, envolto com folha de papel alumínio (no
máximo por 40 dias);
c) Dissolver 32 g do pó redutor em 200 mL de água destilada morna (50 - 60°C), em
copo de becker de 1000 mL;
d) Transferir para um recipiente escuro e deixar em repouso até cristalizar (3 a 6
dias);
e) Filtrar o cristalizado e guardar a solução (no máximo por 3 semanas).
ANEXO 3
FICHA DE DESCRIÇÃO DE MORFOTIPOS DE ECTOMICORRIZAS
Morfotipo nº.:
DATA DE COLETA:
ESPÉCIE HOSPEDEIRA:
❖ MORFOLOGIA DO SISTEMA - Lupa
RAMIFICAÇÃO: monopodial pinada, monopodial piramidal, dicotômica, irregular,
coralóide, tuberculada, não ramificada, outra____________________
FORMA DA EXTREMIDADE: reta, como corrente de contas, com ápices mais largos do
que as bases, sinuosa, outra____________________
COMPRIMENTO TOTAL: ________________cm
COR: + JOVENS:_______________ + VELHOS:_______________
ÁPICES
:_______________
TEXTURA: lisa, finamente granulada, grosseiramente granulada, feltrosa,
aveludada, verrugosa, lanosa, cotonosa, filamentosa, com espinhos curtos, com
espinhos longos, outra________________
BRILHO: sem brilho, brilhante, reflete a luz, outro____________________
VISIBILIDADE DO TECIDO DO HOSPEDEIRO ATRAVÉS DO MANTO: sim não
❖ MORFOLOGIA DO MICÉLIO - Lupa
LIGAÇÃO: em um só ponto, ao longo da superfície e ficando próxima a ela, em forma
de leque
FREQÜÊNCIA: ausente, raro, comum
SUPERFÍCIE: lisa, peluda, outra____________________
❖ ANATOMIA DO MANTO - M. O.
REDE DE HARTIG: presente ausente
CÉLULAS ESPECIALIZADAS: laticíferas, oleíferas, cistídeos,
outras____________________
FREQÜÊNCIA: ausentes, raras, comuns
SUPERFÍCIE MAIS EXTERNA TIPO: prosênquima frouxo, prosênquima organizado como
rede, sinênquima organizado como rede, sinênquima irregular intercalado,
sinênquima irregular não intercalado, sinênquima regular
SUPERFÍCIE MAIS INTERNA TIPO: prosênquima frouxo, prosênquima organizado como
rede, sinênquima organizado como rede, sinênquima irregular intercalado,
sinênquima irregular não intercalado, sinênquima regular
❖ PROVÁVEL ESPÉCIE:
ANEXO 4
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS ECTOMICORRIZAS
Prosênquima feltroso:
camada frouxa, não organizada, com espaços entre hifas abundantes; hifas
distintamente alongadas, semelhantes às hifas extra-matriciais.
Prosênquima em rede:
camada frouxamente organizada; com espaços entre hifas ainda visíveis; células
distintamente alongadas; hifas mais largas e mais curtas e ramificadas que as hifas
extra-matriciais.
Sinênquima em rede:
camada compacta, sem espaços visíveis entre hifas; hifas alongadas
Sinênquima irregular intercalado:
camada compacta, sem espaços visíveis entre hifas; hifas não alongadas; semelhante a
um quebra-cabeça.
Sinênquima irregular não intercalado:
camada compacta, sem espaços entre hifas; hifas não alongadas, geralmente arredondadas.
Sinênquima irregular:
camada compacta, sem espaços entre hifas; hifas com paredes em
linha reta.
Organização das hifas no manto
Textura do manto
Tipos de rede de Hartig Ornamentações do manto
Ramificação do sistema
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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