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Patricia Sayuri Suzuki
Papel do Torque Teno Vírus (TTV) e do
polimorfismo do gene CCR5 no desenvolvimento do
câncer cervical.
Londrina 2008
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
EXPERIMENTAL
Papel do Torque Teno Vírus (TTV) e do
polimorfismo do gene CCR5 no desenvolvimento do
câncer cervical.
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Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Patologia Experimental da Universidade Estadual
de Londrina como requisito para obtenção do título de mestre.
Orientadora: Profª Drª Maria Angelica Ehara Watanabe
Londrina
2008
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Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca
Central da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
S968p Suzuki, Patrícia Sayuri.
Papel do Torque Teno Vírus (TTV) e do polimorfismo do gene CCR5 no desenvolvimento do
câncer cervical / Patrícia Sayuri Suzuki. – Londrina, 2008.
119f. : il.
Orientador: Maria Angelica Ehara Watanabe.
Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental) - Universidade Estadu-
al de Londrina,
Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental, 2008.
Inclui bibliografia.
1. Patologia experimental – Teses. 2. Colo uterino – Câncer – Teses. 3. Pó-
limorfismo
(Genética) – Teses. 4. TTV (Vírus) – Teses. I
. Watanabe, Maria Angelica Ehara. II.
Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-
Graduação
em Patologia Experimental. III. Títu-lo.
CDU 616-092
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Papel do Torque Teno Vírus (TTV) e do
polimorfismo do gene CCR5 no desenvolvimento do
câncer cervical.
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Patologia
Experimental da Universidade Estadual de
Londrina como requisito para obtenção do
título de mestre.
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Profª. Drª. Maria Angelica Ehara Watanabe
Universidade Estadual de Londrina
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Prof. Drª. Jeane Eliete Laguila Visentainer
Universidade Estadual de Maringá
__________________________________________
Prof. Dr. Emerson José Venâncio
Universidade Estadual de Londrina
Londrina,___de______________de 2008.
Este trabalho foi desenvolvido com
apoio financeiro (bolsa de Mestrado)
da Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior –
CAPES.
"Um pouco de ciência nos afasta de Deus.
Muito, nos aproxima."
Louis Pasteur
“Cada pessoa que passa em nossa vida, passa sozinha, é porque
cada pessoa é única e nenhuma substitui a outra! Cada pessoa que passa em nossa
vida passa sozinha e não nos deixa só porque deixa um pouco de si e leva um
pouquinho de nós. Essa é a mais bela responsabilidade da vida e a prova de que as
pessoas não se encontram por acaso”.
Charles Chaplin
Dedico aos meus pais Joaquim Satoru Suzuki e
Sofia Firoco Suzuki que são exemplos de
dedicação, perseverança, amor e fé.
A eles meu eterno amor e agradecimento.
Aos meus irmãos Rogério Yukio Suzuki e Fábio Mineo Suzuki
que sempre estiveram ao meu lado
me incentivando e proporcionando momentos
de muitas alegrias.
AGRADECIMENTOS
À professora e orientadora Drª Maria Angelica Ehara Watanabe, pela calorosa
acolhida, pela paciência, pelo exemplo de dedicação e amor à ciência, mas sobretudo, por me
mostrar a alegria das descobertas científicas, por acreditar na minha capacidade e pelas
constantes palavras de incentivo.
Ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental pelo incentivo à pesquisa
e apoio Institucional.
Aos Professores Dr. Emerson José Venâncio e Dra. Tânia Longo Mazzuco que
aceitaram o convite de fazer parte de minha banca de qualificação e muito contribuíram para
a forma final desta dissertação.
À professora Drª Halha Ostrensky Saridakis, ao professor Ms Jair Tonon e aos
técnicos Pedro Sebastião Raimundo Dionísio Filho e Jesus Antônio Vargas pelo apoio, sem o
qual não teria sido possível a realização do sonho de fazer mestrado.
Às minhas amigas Cristina Mitsue Miyauti, Josiane Valadão da Silva e Flávia Midori
pelo ombro amigo, pelo apoio constante e pelos belos momentos na faculdade e tardes
gastronômicas.
À minha tia, Alice Imamura e sua família que me acolheram com muito carinho e
amor, amenizando assim as saudades de casa.
Aos amigos de laboratório Juliana Laino do Val Carneiro, Mateus Nóbrega Aoki,
Julie Massayo Maeda Oda, Marla Karine Amarante e Roberto Iemitsu Tatakihara pela
paciência, incentivo e por ter tornado esses anos de mestrado tão alegre e inesquecíveis.
À Professora Ms Karen Brajão de Oliveira, pela amizade e pela ajuda na realização
dos experimentos e importante auxílio na parte final deste trabalho.
Às Professoras Drª Maria Helena P. Fungaro e Drª Marcia Cristina Furlanetto, pela
amizade, pelos alegres momentos e pela disponibilização dos aparelhos de seus laboratórios.
Aos colegas de mestrado, pelo companheirismo e motivação durante todas as fases e
dificuldades encontradas durante este trabalho.
Aos colegas dos laboratórios vizinhos Francine de Paula, Lara Ferracin, Daniele
Sartoli, Ligia Uno Lunardi, Carla Beatriz Fier, Fernando Yuldi Ashikaga, Juliana Rota,
Marcelo Tempesta, Daniel Favero e Leandro de Barros Ferrari pela alegre convivência e
amizade.
Aos funcionários do Setor de Arquivo do Ambulatório do Hospital de clínicas e do
Hospital Universitário, em especial à Dulce, pelo auxílio prestado durante a consulta dos
prontuários dos pacientes inseridos no estudo.
A todos os pacientes e doadores inseridos no estudo, pois sem eles não seria possível
a realização deste trabalho.
Aos professores de mestrado pelo conhecimento transmitido, o qual será de
fundamental importância na vida profissional.
À professora Ms Vera Lúcia Hideko Tatakihara pelo auxílio e disposição em
esclarecer minhas dúvidas sobre HPV.
A Deus por seu infinito amor, por me agraciar com uma família e amigos ímpares,
cujo apoio foi essencial para realização deste trabalho.
SUZUKI, Patrícia Sayuri. Papel do Torque Teno Vírus (TTV) e do polimorfismo do gene
CCR5 no desenvolvimento do câncer cervical. Trabalho de Dissertação de Mestrado –
Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental, Departamento de Ciências
Patológicas, Centro de Ciências Biológicas - Universidade Estadual de Londrina.
RESUMO
Papilomavirus humano (HPV) de alto risco é um fator necessário para o desenvolvimento de
câncer cervical uterino. Contudo, somente uma pequena proporção de mulheres infectadas
pelo HPV desenvolverá câncer cervical; muitos outros co-fatores podem aumentar a
persistência da infecção e sua oncogênese. O Torque Teno Vírus (TTV) e o polimorfismo do
gene para o receptor de quimiocina 5 podem agir como co-fatores para carcinogênese
cervical. TTV é um vírus não-envelopado, circular, DNA fita simples e seu papel patogênico
ainda não foi elucidado. Este trabalho teve como objetivo investigar a relação do TTV em
pacientes coinfectados com HPV no desenvolvimento do câncer cervical uterino. A presença
do TTV foi investigada no sangue periférico de 117 indivíduos, por PCR nested utilizando
um conjunto de oligos iniciadores para a região N22 da ORF-1 e para a análise do
polimorfismo do gene CCR5 foram utilizados oligos inciadores sintetizados de acordo com a
seqüência no GenBank AF009962. A presença do DNA do TTV foi observada em 18,6%
(08/43) dos pacientes negativos para HPV, e em 24,32% (18/74) dos pacientes sugestivos
para infecção por HPV. O TTV também foi investigado em pacientes sugestivos para
infecção por HPV sem câncer e com câncer. O DNA do TTV foi significantemente mais
prevalente em pacientes sugestivos para HPV com câncer 57,14% (8/14) do que nos
pacientes sugestivos para HPV sem câncer (16,67%) (10/60). O genótipo selvagem para o
polimorfismo do gene CCR5 foi igualmente prevalente nos pacientes HPV negativo (38/43)
e naqueles pacientes com colpocitologia oncótica sugestiva para infecção por HPV (70/74).
Foi verificado neste trabalho, que a presença da infecção por TTV pode ser um fator de risco
para o desenvolvimento de câncer em pacientes co-infectados por HPV-TTV, e o
polimorfismo do CCR5 não apresenta associação com o câncer cervical. Contudo, mais
estudos são necessários para elucidar o papel do TTV no desenvolvimento de câncer cervical
relacionado ao HPV.
Palavras-chave: DNA TTV, HPV, CCR5, Câncer cervical uterino.
SUZUKI, Patricia Sayuri. Role of Torque Teno Virus (TTV) and polymorphism of CCR5
gene in the cervical cancer development. Trabalho de Dissertação de Mestrado – Programa
de Mestrado em Patologia Experimental, Departamento de Ciências Patológicas, Centro de
Ciências Biológicas - Universidade Estadual de Londrina.
ABSTRACT
High-risk human papillomaviruses (HPVs) are a required factor for cervical uterine cancer
development. However, only a small proportion of HPV-infected women will develop
cervical cancer; several other cofactors may enhance persistent infection and oncogenesis.
Torque Teno Virus (TTV) and genetic polymorphism for chemokine receptor 5 may act as
cofactor for cervical carcinogenesis. TTV is an unenveloped, circular, single-strand DNA
and its pathological role remains unclear. The aim of this work was to investigate the
association of TTV in patients coinfected with HPV in the cervical cancer development.
The presence of TTV was investigated in the peripheral blood of 117 Brazilian women by
nested PCR, using a set of primers for the N22 region of the large ORF-1 and the analyze
CCR5 polymorphism was using primers wich GenBank acession AF009962. TTV DNA
presence was observed in 18.6% (08/43) of HPV negative individuals and in 24.32% (18/74)
HPV suggestive patients. TTV presence was also investigated in the HPV suggestive patient
group, for comparison of cancer and noncancer patients. TTV DNA was significantly more
prevalent among HPV suggestive patients presenting cancer (57.14%; 08/14) compared to
HPV suggestive noncancer patients (both 16.67%; 10/60). The wild type polymorphism of
CCR5 gene was prevalent both in the HPV negative (38/43) and patients with oncotic
colpocytology suggestive for HPV (70/74). In this work, was verified that the presence of
TTV infection could be a risk factor for cancer development in patients with co-infection for
HPV-TTV, and there was no association with CCR5 polymorphism. However, further
studies are required to clarify the influence of TTV in the cervical cancer development.
Keywords: TTV DNA, HPV, CCR5, Cervical cancer.
LISTA DE FIGURAS
Revisão Bibliográfica
Figura 1 Vírus HPV próximo a uma célula epitelial 19
Figura 2 Distribuição mundial do HPV16 e HPV18 20
Figura 3 Prevalência da infecção por HPV, lesões pré-cancerosas e câncer
cervical pela idade da mulher
21
Figura 4 Papanicolaou – Células escamosas maduras 22
Figura 5 Organização Genômica do TTV 27
Figura 6 Receptor de Quimiocina 5 (CCR5) 34
Resultados
Figura 1 Faixa etária dos pacientes 47
Figura 2 Distribuição mundial do HPV16 e HPV18 em mulheres com
citologia normal e mulheres com carcinoma cervical invasivo
48
Figura 3 Faixa etária dos pacientes sugestivo para HPV e com câncer 48
Figura 4 Detecção de Gardnerella vaginalis e Trichomonas vaginalis em
pacientes sugestivos para HPV e com câncer
49
Figura 5 Detecção do TT vírus por através da PCR 50
Figura 6 Detecção do TTV em pacientes HPV negativos e pacientes
sugestivos para infecção por HPV
51
Figura 7 Seqüênciamento automático do produto de clonagem do TTV 52
Figura 8 Detecção do TTV em pacientes sugestivos para HPV sem câncer e
com câncer
52
Figura 9 Análise genotípica do receptor de quimiocina 5 em pacientes HPV
negativo
53
Figura 10 Relação do polimorfismo do gene CCR5 com TTV 54
Figura 11 Relação do polimorfismo do gene CCR5 com TTV em pacientes
sugestivos para HPV
55
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Freqüência alélica e genotípica para os alelos Δ32 e wt do CCR5 53
Tabela 2 Relação do polimorfismo do gene CCR5 com HPV e TTV 54
Tabela 3 Relação do polimorfismo do gene CCR5 com TTV em pacientes
sugestivos para HPV sem câncer e com câncer
55
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ALT Alanina Aminotransferase
APC Célula Apresentadora de Antígeno
ATPase Adenosina Trifosfatase
CCL4 Ligante do CCR4
CCL5 Ligante do CCR5
CCR3 Receptor de quimiocina 3
CCR5 Receptor de quimiocina 5
CCR5/∆32 Gene CCR5 com deleção de 32 pares de bases
CIN Neoplasia Intraepitelial Cervical
CMBKR5 Locus gênico localizado no cromossomo 3
CMI Imunidade Mediada por Células
CNS Conselho Nacional de Saúde
CsCl Cloreto de césio
CXC Quimiocina da família CXC
CXCR1 Receptor de quimiocina 1
CXCR2 Receptor de quimiocina 2
DNA Ácido Desoxiribonucléico
DO Densidade Óptica
EDTA Ácido Dietilenoaminotetraacetato Dissódico
HIV Vírus da Imunodeficia Humana
HLA Antígeno Leucocitário Humano
HPV Papilomavírus Humano
HSIL Lesão Intraepitelial de Alto Grau
HWE Equilíbrio de Hardy-Weinberg
IgA Imunoglobulina A
IgG Imunoglobulina G
IL-8 Interleucina 8
INCA Instituto Nacional de Câncer
JEC Junção Escamo-Colunar
LC Células de Langerhans
LSIL Lesão Intraepitelial de Baixo Grau
MCP-3 Proteína quimiotática de monócitos -3
MHC Complexo de Histocompatibilidade Principal
MIP-α e β Proteína Inflamatória de Macrófago alfa e beta
NCBI Centro Nacional de informação Biotecnológica
NIC Neoplasia Intraepitelial Cervical
ORF Sequência de leitura aberta
PBMC Células mononucleares do sangue periférico
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
RANTES Regulada sob ativação, expressa e secretada por células T normais
S100 Proteína ligante de cálcio
SDF-1
Fator Derivado do Estroma da Medula Óssea 1
SDS Duodecil Sulfato de Sódio
Th1 Linfócito T auxiliar CD4
+
1
TTV Torque Teno Virus
TZ Zona de Transformação
UTR Região não codificadora
WHO Organização mundial da saúde
∆32/∆32 Gene CCR5 com deleção de 32 pares de bases homozigoto
SUMÁRIO
1. Introdução........................................................................................................18
1.1. Câncer cervical ....................................................................................................18
1.2. Genótipo e distribuição do HPV...........................................................................19
1.3. Imunologia da infecção........................................................................................23
1.4.Torque Teno Virus.....................................................................................................25
1.4.1 Aspectos gerais ...............................................................................................................25
1.4.2. Aspectos moleculares....................................................................................................... 26
1.4.3. Aspectos patológicos........................................................................................................ 28
1.4.4. Aspectos imunológicos.....................................................................................................29
1.5.Quimiocinas.............................................................................................................30
1.5.1 Receptores de quimiocinas .......................................................................................... 32
1.5.2. Receptores de quimiocina 5............................................................................................32
2. Justificativa.......................................................................................................37
3. Objetivos...........................................................................................................38
3.1. Geral .......................................................................................................................38
3.2. Específicos..............................................................................................................38
4. Materiais e Métodos........................................................................................39
4.1. População estudada.............................................................................................39
4.2.Análise citológica....................................................................................................39
4.3. Análise molecular..................................................................................................39
4.3.1. Obtenção do DNA .............................................................................................................40
4.3.2. Detecção qualitativa do TTV............................................................................................. 40
4.3.2.1. Clonagem ...............................................................................................................41
4.3.2.1.1. Purificação das amostras ...............................................................................41
4.3.2.1.2. Preparação de células competentes...........................................................42
4.3.2.1.3. Reação de ligação...........................................................................................42
4.3.2.1.4. Transformação...................................................................................................43
4.3.2.1.5. Extração do DNA plasmidial (Mini-Prep) ......................................................44
4.3.2.2. Seqüênciamento .....................................................................................................44
4.3.3. Análise do polimorfismo do gene CCR5 pela reação em cadeia da polimerase
(PCR) ............................................................................................................... 45
4.4. Análise Estatística...................................................................................................46
5. Resultados ........................................................................................................47
6. Discussão..........................................................................................................56
7. Conclusão ........................................................................................................62
8.Referências Bibliográficas...................................................................................63
Anexo I.....................................................................................................................80
Anexo II....................................................................................................................81
Anexo III...................................................................................................................83
Anexo IV..................................................................................................................84
Anexo V...................................................................................................................98
Anexo VI................................................................................................................108
18
1.INTRODUÇÃO
1.1. CÂNCER CERVICAL
Câncer cervical é uma denominação habitualmente utilizada para designar o câncer
da cérvice uterina, sendo este tipo o que mais afeta as mulheres nos países em
desenvolvimento. É estimado que esta patologia foi responsável por quase 260.000 mortes
em 2005, as quais 80% ocorreram em países em desenvolvimento (WHO, 2007).
O trato genital inferior feminino compreende quatro regiões anatômicas: o intróito, o
qual está recoberto por um epitélio escamoso estratificado queratinizado parecido com a
pele; a mucosa vaginal, a qual é recoberta por um epitélio escamoso estratificado não-
queratinizado, aglandular; a ectocérvice, a qual é recoberta por uma mucosa
histologicamente similar à da vagina; a endocérvice, que consiste num epitélio colunar com
numerosas glândulas ( pseudo-glândulas) (Pudney et al, 2005).
A zona de transformação (TZ) ou junção escamo-colunar (JEC) representa uma
transição entre a ectocérvice e endocérvice, sendo o principal local de infecção pelo
papilomavírus humano (HPV) (Pudney et al, 2005). É estimado que o HPV cause
aproximadamente meio milhão de novos cânceres a cada ano (WHO, 2007).
O HPV é um vírus DNA dupla-fita circular, com aproximadamente 8000 pares de
bases contidos num capsídeo icosaédrico de aproximadamente 55nm de diâmetro (Munger et
al., 2004; Sinal & Woods, 2005) e infecta as células da pele ou mucosa (de Villiers, 1997)
(Figura 1).
19
Figura 1. Vírus HPV (seta) próximo a uma célula epitelial. Microfotografia computadorizada
demonstrando o HPV próximo a célula. Fonte. NEWSWEEK health for life.
http://www.msnbc.msn.com/id/12333785/site/newsweek/page/0/
1.2. GENÓTIPO E DISTRIBUIÇÃO DO HPV
O HPV apresenta mais de 100 genótipos, os quais foram numerados de acordo com a
ordem de descoberta (de Villiers, 1997). Os HPVs são geralmente agrupados de acordo com
sua associação com câncer cervical ou lesões pré-cancerosas e sua seqüência genômica: HPV
com alto risco de câncer (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82),
tipos de alto risco de prováveis causadores de câncer (26, 53 e 66) e tipos de baixo risco de
câncer (6, 11, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89). HPVs de baixo risco são encontrados
principalmente em verrugas genitais, enquanto HPVs de alto risco são encontrados em
câncer cervical e lesões pré-cancerosas (Munoz et al, 2003).
HPV16 e HPV18 são dois tipos de HPV altamente carcinogênicos, sendo
responsáveis por 70% do câncer cervical e, aproximadamente, 50% da neoplasia
intraepitelial cervical (NIC III) (Smith et al., 2007); em contraste, HPV 6 e HPV 11 são
responsáveis por, aproximadamente, 90% das verrugas genitais (Schiffman et al., 2007). A
distribuição geográfica do HPV de alto risco está mostrada na figura 2.
20
Figura 2. Distribuição mundial do HPV16 e HPV18 em mulheres com citologia normal e mulheres com
carcinoma cervical invasivo. Segundo a Organização Mundial da Saúde em relação à distribuição geográfica,
a maior incidência de câncer cervical ocorre em países em desenvolvimento.
Fonte: WHO 2007. http://www.who.int/hpvcentre/statistics/statistics_map_ICO.pdf
A maior prevalência de HPV é observada em mulheres sexualmente ativas menores
de 25 anos de idade. O HPV genital é encontrado em aproximadamente 10-40% dessas
mulheres. A maioria dessas infecções parece ser auto-limitada e não está associada com
alterações citológicas detectáveis pela triagem do Papanicolaou. Uma minoria de mulheres
HPV-positivo desenvolvem alterações citológicas de baixo grau (Becker et al,1991; de
Villiers et al,1992; Schiffman, M.H., 1992). A maior incidência de lesões de alto grau é em
mulheres com mais de 25 anos de idade, enquanto que a maior incidência de câncer cervical
é em mulheres com mais de 35 anos (Schiffman, M.H., 1992). Estes achados sugerem que
HPV de alto risco, normalmente, produz uma infecção inaparente transitória na área cérvico-
vaginal. Algumas mulheres desenvolvem uma infecção persistente nesse tecido, talvez como
resultado de um mecanismo de defesa deficiente. Lesões persistentes podem progredir para
câncer cervical nessas mulheres (Lowy et al, 1994) (Figura 3).
21
Figura 3. Prevalência da infecção por HPV, lesões pré-cancerosas e câncer cervical pela idade da mulher.
Maior incidência de lesões pré-cancerosas em mulheres acima de 25 anos e maior prevalência de câncer
cervical em mulheres acima de 35 anos de idade.
Fonte: WHO 2005
http://www.who.int/reproductive-health/publications/hpvvaccines/text.pdf
O rastreamento com o esfregaço de Papanicolaou é muito eficaz na prevenção do
câncer cervical porque a maioria dos cânceres é precedida por uma lesão pré-cancerosa. Essa
lesão pré-cancerosa pode permanecer em um estágio não invasivo durante um período muito
longo de tempo (por exemplo, 20 anos) e desprender células anormais que podem ser
detectadas pelo exame citológico (Robbins & Cotran, 2007), no qual podemos observar a
presença de coilócitos, os quais são células atípicas com uma cavitação ou auréola
perinuclear no citoplasma (Richart, 1990) e constituem um sinal patognomônico de infecção
por HPV (Figura 4).
22
Figura 4. Células escamosas maduras. O coilócito (seta), patognomônico de infecção por HPV
visualizado pelo método de Papanicolaou. Aumento 400x.
Fonte: Centro Integrado de Colposcopia e Citopatologia.
http://www.cicc.com.br/miniatlas.asp
Quanto à análise das lesões por esfregaço, o sistema neoplasia intraepitelial cervical
(NIC) foi introduzido em 1973 e é baseado na arquitetura tecidual (Richart, 1973). NIC I
refere-se às células anormais ocupando 1/3 da região mais superficial do estrato epitelial
cervical, NIC II indica que 2/3 do epitélio está sendo ocupado e NIC III indica que toda
camada epitelial está ocupada. NIC I, NIC II e NIC III descrevem diferentes processos –
NIC I indica uma infecção por HPV auto-limitada, e NIC II ou NIC III são efetivos
precursores de câncer cervical (Kiviat & Koutsky, 1993). Em 1988 foi introduzido outro
sistema da classificação, o Sistema Bethesda que classifica as anormalidades citológicas em:
lesão intraepitelial de baixo grau (LSIL) ou lesão intraepitelial de alto-grau (HSIL) (Solomon
et al, 2002). LSIL corresponde ao NIC I e infecção por HPV; e HSIL corresponde ao NIC II,
NIC III e carcinoma in situ.
Existem dois tipos principais de câncer cervical: carcinoma de células escamosas e
adenocarcinoma. Aproximadamente, 80% dos cânceres cervicais são carcinoma de células
23
escamosas, enquanto os 20% restantes são adenocarcinomas e câncer cervical de outras
origens (DiSaia, 1997).
1.3. IMUNOLOGIA DA INFECÇÃO POR HPV
Estudos recentes têm demonstrado haver um microambiente imunológico no trato
genital feminino, e a resposta imune é afetada por hormônios bem como infecções e
processos inflamatórios (Pudney et al., 2005).
A imunidade humoral no trato genital feminino é mediada pela ação das
imunoglobulinas IgA e IgG secretadas em abundância na lâmina própria da endocérvice e
em escassez na vagina (Cohen & Anderson, 1999). Entretanto, ao contrário da resposta
humoral do pulmão e intestino, há um predomínio de IgG ao invés da IgA no trato genital
(Johansson & Lycke, 2003).
Tem sido documentado que outros mecanismos participam na resposta imune
humoral, tais como produção de moléculas antimicrobianas como lisozimas, lactoferrinas,
inibidor da serina leucócito protease, alfa- e beta-defensinas todas essas moléculas são
produzidas pelo epitélio celular e outros locais no trato genital feminino (Johansson &
Lycke, 2003).
A imunidade mediada por células (IMC) no trato genital feminino (em mulheres sem
inflamação) é mediada por células T (predominantemente células T CD8+) e células
apresentadoras de antígenos (CPA), aos quais estão prevalentemente localizadas na zona de
transformação e ectocérvice. Em contraste, na mucosa vaginal normal há poucas células T e
APCs (Pudney et al., 2005).
Estudos epidemiológicos têm revelado que mulheres HPV soropositivas apresentam
alto risco para neoplasias cervicais (De Sanjose et al., 1996; Lehtinen et al., 1996).
24
Anticorpos para HPV são marcadores para exposição a essa infecção (De Sanjose et al.,
1996), sendo que produção de anticorpos é importante na prevenção da transmissão e
reinfecção do HPV. Muitos anticorpos são tipo específicos e aparecem de seis meses a um
ano após a infecção pelo HPV, sendo que a IgG está associada com a persistência da
infecção pelo HPV (Burd, 2003).
A eficácia do sistema imune mediado por células depende da identificação do
antígeno e sua apresentação a uma população de linfócitos apropriados. As células de
Langerhans (LC) são as principais células apresentadoras de antígenos responsáveis pela
resposta imune cutânea e das mucosas no baixo trato genital feminino. Elas são células
dendríticas especializadas, e expressam moléculas como CD1a (T6), adenosia-trifosfatase
(ATPase), complexo de histocompatibilidade principal (MHC), moléculas coestimulatórias,
S100 uma proteína ligante de cálcio envolvida na regulação de uma série de processos
celulares, incluindo sinalização imune, entre outras (Tay et al., 1987a ; Klingman & Hilt,
1998; Schafer & Heizmann, 1996).
A infecção pelo HPV parece depletar seletivamente a subpopulação de LCs S100+ ou
alterar a expressão de S100, levando a um defeito na habilidade de sinalização das LCs
Taube et al., (2007). Tay et al. (1987b) demonstraram uma redução de 60% do CD1a (T6),
ATPase, MHC II em pacientes com HPV e neoplasia intraepitelial cervical (NIC) e uma
quase completa ausência de LC S100. Connor et al. (1999) observaram uma similar redução
de LC S100+ em lesões intraepiteliais cervicais.
Outro mecanismo pelo qual o HPV evade do sistema imune mediado por células é
pela diminuição da expressão de antígeno leucocitário humano (HLA). Constitutivamente,
LCs expressam moléculas de MHC II, contudo, a infecção por HPV 16 e HPV 18 leva a uma
diminuição na expressão dessas moléculas no epitélio cervical (Gonçalves et al., 2004).
25
O desenvolvimento de câncer cervical está fortemente associado com infecção genital
de tipos oncogênicos de papilomavirus humano. Como a maioria das mulheres infectadas por
HPV nunca desenvolveu câncer, parecem ser necessários fatores adicionais. A relativa
importância de fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento do tumor cervical ainda é
desconhecida (Zheng et al, 2006). Um dos possíveis fatores pode estar relacionado à
infecção conjunta com outros vírus, como foi reportado por Szládek et al (2005), os quais
sugeriram que a coinfecção do TORQUE TENO VIRUS (TTV) genogrupo 1 e HPV,
promoveriam a progressão do carcinoma de células escamosas da laringe e estaria associada
com um prognóstico desfavorável; além disso, Figueiredo et al (2007) relataram um possível
envolvimento do TTV na patogênese do Linfoma de Hodgkin em adultos jovens. No
entanto, não há relatos sobre o papel do TTV na patogênese do câncer cervical promovido
por HPV oncogênico.
1.4. TORQUE TENO VIRUS
1.4.1 ASPECTOS GERAIS
O Torque Teno Vírus (TTV) foi inicialmente identificado por Nishizawa et al. em
1997, em pacientes com elevados níveis de alanina aminotransferase (ALT), porém
negativos para hepatites de A a G. Esse vírus tem seu nome associado às iniciais do primeiro
paciente investigado pelo grupo de Nishizawa (paciente TT), contudo essas iniciais também
podem designar transfusion-transmitted vírus (Bendinelli et a.l, 2001; Nishizawa et al.,
1997) ou ainda, como foi recentemente proposto por taxonomistas, Torque Teno Vírus
(Abraham, 2005).
26
O papel patogênico do TTV ainda permanece sob discussão, uma vez que,
inicialmente, pensava-se ser patogênico para o fígado, o que sugeriria uma falência hepática
fulminante (Nishizawa et al 1997). Porém, não há manifestações clínicas exclusivas
associadas ao TTV e ainda a infecção ativa por TTV é altamente prevalente entre indivíduos
aparentemente saudáveis. Por isso, acredita-se que o TTV é essencialmente desprovido de
potencial patogênico. Estudos estão sendo realizados com o genótipo 1 do TTV, pela
possibilidade de induzir doença no ser humano, além de sua prevalência e distribuição
mundial ( Bendinelli et al., 2001).
1.4.2.ASPECTOS MOLECULARES
O TTV é um vírus não envelopado cujo genoma consiste em uma molécula circular
de DNA fita simples, com polaridade negativa e um comprimento de aproximadamente 3,8
kb (Mushahwar et al., 1999). Inicialmente, foi proposto um genoma viral linear, mas após a
análise realizada por seqüenciamento foram evidenciadas duas extremidades conectadas por
uma região rica em G+C de aproximadamente 100 nucleotídeos, formando uma molécula
circular covalentemente fechada (Okamoto et al, 1998a).
O TTV tem uma densidade de 1,31-1,34 g/mL em CsCl (Mushahwar et al., 1999;
Miyata et al., 1999). O genoma do TTV tem duas ou três possíveis Regiões de leitura aberta
(Open Reading Frame) (ORFs) capazes de codificar proteínas de 770 aa (ORF1), 202 aa
(ORF2) e 105 aa (ORF3) (Figura 5) (Miyata et al.,1999).
27
Figura 5. Organização genômica do TTV mostrando o DNA circular, simples-fita de polaridade negativa
encapsulado dentro do vírion. Posições nucleotídicas do isolado TA278. O esquema mostra as ORFs 1, 2 e 3, a
região UTR, bem como outras regiões importantes como a região N22, muito utilizada para estudos
epidemiológicos e genotipagem (Bendinelli et al., 2001).
Muitos estudos indicaram um grau elevado de diversidade genética para o TTV. O
genoma inteiro foi seqüenciado para os isolados de SANBAN e de TA 278 (Hijikata et al.,
1999), os quais representam duas variantes genotípicas. A organização genética do genoma
era similar em dois isolados: duas regiões de leitura aberta (ORF1 e ORF2) foram alinhadas
pelos domínios TATA Box, sinal de poliadenilação e por um segmento curto, rico em GC
que se localizam no meio da região não traduzida. A identidade total da seqüência de
nucleotídeos entre os dois isolados eram 56.7%, significativamente abaixo da encontrada
entre TA278 e GH1 (93%) (Mushahwar et al., 1999).
Inicialmente, acreditava-se que o TTV fosse semelhante aos parvovírus (Okamoto et
al, 1998b; Miyata et al, 1999), mas estruturas biofísicas e moleculares observadas por
Hijikata et al (1999), levaram Bendinelli et al, (2001) a enfatizar sua semelhança com os
circovírus que, conforme Todd et al. (1990) possuem genomas circulares não-segmentados
com capsídeos isométricos possuindo uma simples proteína estrutural viral, com ausência de
lipídeos e carboidratos.
28
Os TTVs apresentam um grande grau de divergência na seqüência genômica
(Khudyakowv et al., 2000; Mushahwar I.K., 2000; Okamoto et al., 1999) e essa expressiva
divergência reflete na identificação em mais de 30 genótipos, a maioria dos quais foram
identificados com base no estudo filogenético da região N22, localizada na ORF-1. Esses
genótipos são classificados em 5 grupos: grupo 1 composto pelos genótipos 1-6; grupo 2 dos
genótipos 7,8,17,22 e 23; grupo 3 de 11 genótipos (9-16 e 18-20); grupo 4 de nove
genótipos, e grupo 5 de três genótipos (Peng et al., 2002).
1.4.3. ASPECTOS PATOLÓGICOS
O papel patogênico do TTV ainda é pouco discutido. TTV originalmente foi
demonstrado como sendo um vírus patogênico para o fígado, sugerindo ser o causador da
falência hepática fulminante (Nishizawa et al., 1997). Posteriormente, Kato et al, (2000), em
seus estudos clínicos, concluíram que níveis séricos de TTV não afetam a lesão hepática.
O TTV pode causar uma infecção transitória ou persistente. No Brasil, nos estados de
São Paulo e Pará, o TTV foi encontrado em pacientes com hepatopatias crônicas (Takahashi
et al, 2000), e no Japão, foi encontrado em 47% de casos de hepatites fulminantes e crônicas
não A-G, em 38% de casos de cirrose de etiologia não conhecida e 12% de doadores de
sangue (Kato et al., 1998; Okamoto et al, 1998a; Simmonds et al, 1998). Sua presença
também foi relatada em indivíduos saudáveis na Europa e nos Estados Unidos. Os genótipos
1 e 2 do TTV são os mais comuns no mundo todo (Okamoto et al., 2000a).
Pouco se sabe sobre quais células ou qual órgão abriga e libera continuamente o TTV
para a circulação (Maggi et al., 2001). O DNA do TTV tem sido detectado no fígado e na
bile em concentrações 10-100 vezes maiores do que o encontrado nas amostras de plasmas
29
correspondentes, e em baixas concentrações nos extratos fecais (Okamoto et al., 1998a;
Ukita et al., 1999; Rodriguez-Inigo et al., 2000).
O TTV também tem sido detectado nas células mononucleares do sangue periférico
(PBMC) e na medula óssea (Okamoto et al., 2000a,b) sugerindo que este vírus poderia
replicar nas células linfóides, bem como nos hepatócitos. Além disso, culturas de PBMCs
estimuladas com fitohemaglutinina (PHA) têm demonstrado infectar outras células e liberar
consideráveis quantidades de TTV para o sobrenadante na cultura celular (Maggi et al.,
2001; Mariscal et al., 2002). Previamente, Yu et al., em 2002, reportaram uma distribuição
preferencial do vírus em células CD19+ (Células B) entre os vários componentes das
PBMCs, enquanto Maggi et al. (2003) encontraram em crianças com doença respiratória
aguda, uma correlação inversa entre carga do TTV e porcentagem de células T totais e
células T helper, e uma direta correlação com porcentagem de células B.
Demonstrou-se que o TTV está presente no núcleo e no citoplasma de algumas
células mononucleadas do sangue periférico. É possível que a infecção de células do sistema
imune possa facilitar o escape do vírus da resposta imune. Tem sido sugerido que, atuando
como um cavalo de Tróia (“Trojan horse”), o TTV quando no sangue periférico, as células
podem servir como um reservatório para infecções crônicas e para a transmissão (Allan et
al., 1994; Berns, 1990; Zhong et al, 2002).
A transmissão do TTV provavelmente ocorra parenteralmente, transplacentariamente
ou ainda pela via oral-fecal (Okamoto et al., 1998a; Kanda et al., 1999; Morrica et al., 2000).
Chan et al. (2001) relataram a susceptibilidade da cérvice uterina à infecção pela maioria dos
genótipos de TTV, sugerindo uma possível transmissão sexual.
1.4.4.ASPECTOS IMUNOLÓGICOS
30
Pouco se sabe sobre a vigilância imunológica do hospedeiro e da presença de
anticorpos anti-TTV na circulação sangüínea. Ott et al. (2000), confirmaram a existência de
uma resposta imune contra o TTV em amostras de soro de doadores de sangue de pacientes
com hepatites de etiologia desconhecida, e também no soro de crianças e animais como
cachorros, gatos, cabras, carneiros e coelhos. Foi observada a presença de anticorpos contra a
região C-terminal da proteína recombinante ORF1 com 98.6% de reatividade sorológica,
indicando a alta prevalência de infecção em pacientes com hepatite de etiologia
desconhecida. Poucos estudos vêm sendo realizados para detecção de anticorpos anti-TTV,
talvez devido à limitada compreensão sobre as respostas imunes induzidas pelo vírus e a
dificuldade na obtenção de antígenos. Em um estudo realizado por Ott et al. (2000) na
França, foi verificada elevada prevalência de anticorpos TTV-específicos (98%), enquanto
que a detecção do TTV por PCR foi de 76,1%, nas mesmas amostras, indicando que a
utilização da proteína recombinante da região ORF-1 poderia representar uma ferramenta útil
no diagnóstico da infecção pelo TTV e tornaria possível a avaliação da resposta imune
desenvolvida contra o vírus. Porém, estudos complementares devem ser realizados para
investigar uma possível reação-cruzada com proteínas de outros organismos, principalmente
entre vírus de mesma espécie.
1.5. QUIMIOCINAS
Expressão de genes da resposta imune tem sido correlacionada com a patogênese do
câncer cervical (Ghaderi et al., 2000). Dentre os produtos de genes envolvidos no
recrutamento de macrófagos para a mucosa cervical, as citocinas e a expressão de seus
receptores têm demonstrado provável função na imunidade contra o tumor cervical (Ghaderi
et al., 2000; Kleine-Lowinski. et a.l, 1999; Ohta. et al., 2002).
31
As quimiocinas constituem uma grande família de mediadores inflamatórios e
imunológicos, e apresentam algumas similaridades com as citocinas, bem como diferenças
claras. Assim como as citocinas, as quimiocinas são proteínas secretórias produzidas por
leucócitos e células teciduais constitutivamente ou após indução, e exercem seus efeitos
localmente de forma autócrina ou parácrina. Entretanto, as quimiocinas são muito menores
que as citocinas e desempenham sua atividade via receptores com sete α-hélices
transmembrana acoplados à proteína G, os quais são típicos para atração de leucócitos
(Baggiolini, 2001).
Quimiocinas são constituídas de 70 a 130 aminoácidos com quatro resíduos de
cisteína conservados (Baggiolini et al., 1994, 1997). Como proteínas secretórias, são
sintetizadas com uma seqüência guia de 20-25 aminoácidos, a qual é retirada antes de sua
liberação. Duas famílias principais, CXC e CC, também conhecidas como α e β quimiocinas,
são distinguidas de acordo com a posição dos dois primeiros resíduos de cisteína, os quais
são separados por um aminoácido variável (CXC) ou são adjacentes (CC). As cisteínas
formam duas pontes dissulfeto (Cys1 → Cys3 e Cys2 → Cys4), o que confere às
quimiocinas sua estrutura tri-dimensional. As pontes dissulfeto mantêm as regiões amino-
terminais juntas, o que é essencial para sua atividade biológica (Baggiolini, 2001).
Em soluções concentradas, diversas quimiocinas se associam para formarem dímeros
(Clore et al., 1990; Baldwin et al., 1991). A estrutura geral dos dímeros é diferente para
quimiocinas CXC e CC. Originalmente, acreditava-se que interagiam com seus receptores
através de mecanismos distintos, entretanto descobriu-se que a tendência de formar dímeros
varia, e que algumas quimiocinas são sempre monoméricas, como a MCP-3 (Kim et al.,
1996).
Uma nomenclatura sistemática para as quimiocinas e para seus receptores se tornou
necessária com a descoberta de muitas moléculas novas. Esta classificação (Zlotnik &
32
Yoshie, 2000) baseia-se no princípio estabelecido para os receptores na Conferência Gordon
sobre Citocinas Quimiotáticas de 1966. Os receptores são definidos como CXC, CC, XC e
CX3C, seguidos pela letra R (receptor) e um número. As quimiocinas são definidas seguindo
o mesmo padrão, baseado em sua estrutura, seguidas pela letra L (ligante) e pelo número de
seu gene. Enquanto que a nomenclatura sistemática tem sido adotada para os receptores, a
maioria das quimiocinas ainda é distinguida por seus nomes tradicionais (Baggiolini, 2001).
1.5.1. RECEPTORES DE QUIMIOCINAS
Seis receptores para quimiocinas CXC e dez para CC já foram identificados, além dos
receptores para a linfotactina e fractalcina. A maioria dos receptores reconhece mais de uma
quimiocina e muitas quimiocinas se ligam a mais de um receptor (Baggiolini, 2001).
Contudo os receptores CC ligam-se somente às quimiocinas CC, e do mesmo modo os
receptores CXC ligam-se somente às quimiocinas CXC. Esta restrição ligante-receptor
provavelmente está relacionada às diferenças estruturais entre as quimiocinas CC e CXC, as
quais têm estruturas primárias, secundárias e terciárias similares, mas quaternárias diferentes
(Lodi et al., 1994).
Estudos relacionados à identificação dos domínios das quimiocinas que estão
envolvidos na sua ligação com o receptor e sua ativação foram descritos primeiramente com
a IL-8. A sequência da região amino terminal foi revelada como essencial na atividade da IL-
8 (Hebert et al., 1991; Clark-Lewis et al., 1991, 1993), e após a clonagem dos receptores de
IL-8, verificou-se que tal seqüência é essencial para sua ativação através da ligação a
quimiocinas (Baggiolini et al., 1994, 1997). Entretanto, os efeitos da IL-8 não podem ser
mimetizados com oligopeptídeos contendo a seqüência Glu-Leu-Arg-Cys (Clark-Lewis et
al., 1993). Estes resultados indicam que outros sítios de reconhecimento são necessários.
(Clark-Lewis et al., 1995, 1993). O sucesso destes experimentos motivou estudos similares
33
com muitas outras quimiocinas, os quais confirmaram a importância da região amino
terminal para a ativação do receptor. Estudos mais recentes com o SDF-1 (CXCL12), o
ligante específico para o CXCR4 – o qual é amplamente expresso em leucócitos e células de
tecidos e também é um co-receptor para o HIV (Murphy et al., 2000) – levou à identificação
de seqüências para o reconhecimento e ativação do receptor (Crump et al., 1997; Zlotnik &
Yoshie, 2000). Os primeiros resíduos amino terminais, Lys-Pro, são essenciais para a
ativação: a deleção da lisina diminui drasticamente sua atividade, enquanto que a deleção de
ambos aminoácidos inativa totalmente a quimiocina (Crump et al., 1997).
Coletivamente os estudos das relações estruturais com a atividade mostraram que as
quimiocinas CXC e CC têm dois sítios principais de interação com seus receptores, um
situado no domínio amino terminal e o outro no “loop” rígido após a segunda cisteína.
Ambos são mantidos próximos por pontes dissulfeto (Baggiolini, 2001).
A identificação de um grande número de receptores de quimiocinas e a caracterização
de sua seletividade e expressão em diferentes tipos de leucócitos tem fornecido informações
sobre a regulação do tráfego de leucócitos na saúde e doença. Fagócitos sangüíneos
expressam diferentes tipos e combinações de receptores de quimiocinas, CXCR1 e CXCR2,
os receptores de IL-8, são encontrados exclusivamente em neutrófilos, os quais estão
envolvidos principalmente da defesa contra bactérias. Monócitos, eosinófilos e basófilos
compartilham alguns receptores e expressam outros com exclusividade (CCR3 em
eosinófilos e basófilos e CCR5 em monócitos) e, portanto, podem ser recrutados
seletivamente por quimiocinas apropriadas (Baggiolini, 2001).
1.5.2.RECEPTOR PARA QUIMIOCINA 5 (CCR5)
O CCR5 (Figura 6), receptor de quimiocinas da família CC (β-quimiocinas),
apresenta sete domínios transmembrana hidrofóbicos e exerce sua atividade via proteína G.
34
Liga-se às quimiocinas RANTES (CCL5), MIP-1a (CCL3) e MIP-1β (CCL4) (Samson et
al.,1996) e é codificado pelo locus CMBKR5 localizado no cromossomo 3 (Zimmerman et
al.,1997).
Figura 6 - Receptor de Quimiocina 5 (CCR5). Estrutura dos aminoácidos do CCR5 com sete domínios
transmembrana hidrofóbicos. Fonte: Center for Disease Control and Prevention.
http://www.aegis.com/pubs/cdc_eid/1997/EID3302-Figf1.gif
O receptor CCR5 está envolvido na quimiotaxia de leucócitos para os sítios de
inflamação (Murphy et al., 1994; Baggiolini, 1998; Proost et al., 1996). Desempenha um
importante papel no recrutamento de macrófagos, monócitos e células T na inflamação
(Panzer et al., 2005; Spagnolo et al., 2005) e é normalmente expresso em linfócitos T e
células dendríticas, dirigindo a resposta imune preferencialmente para Th1 (Loetscher et al.,
1998).
Foi identificado um polimorfismo no gene do receptor CCR5, o qual consiste na
deleção de 32 pares de bases, sendo denominado de CCR5D32 (Liu et al., 1996). Esta
variante resulta em uma forma não funcional de receptor, impedindo a sua interação com
suas quimiocinas ligantes (Smith et al., 1997; Yang et al., 2004; Sidoti et al., 2005).
35
O alelo CCR5D32 é comum entre europeus caucasóides (freqüência alélica 0,05 -
0,15), porém raro ou ausente na maioria dos outros grupos étnicos, como nativos africanos e
ameríndios (McNicholl et al., 1997; Martinson et al., 1997; Anzala, et al., 1998; Stephens et
al., 1998; Leboute et al., 1999; Martinson et al., 2000). A ausência desta variante também foi
relatada na população nativa da América do Sul, em populações nativas da Amazônia
brasileira (Leboute et al., 1999; Chies e Hutz, 2003) e também em asiáticos (O'Brien &
Moore, 2000; Wang et al., 2003; Chang et al., 2005).
As diferenças na distribuição mundial do alelo CCR5D32 podem ser explicadas pela
hipótese de que esta mutação surgiu na população caucasóide (Libert et al., 1998) e teve sua
freqüência rapidamente aumentada devido a forte pressão seletiva, possivelmente originada
por patógenos que infectam macrófagos: Yersinia pestis, Shigella, Salmonella ou
Mycobacterium tuberculosis (Lenski et al., 1988; Stephens et al., 1998). Muito
provavelmente teve sua origem na Islândia (fr=0.14; Martinson et al., 1997), e
aparentemente esta deleção disseminou-se nos séculos VIII, IX e X com os ataques Vikings
(Poser et al., 1994).
Diversos estudos sustentam que a deleção CCR5D32 poderia estar associada à
resistência à infecção pelo HIV (Dean et al., 1996; Samson et al., 1996; Liu et al., 1996;
Zuniga et al., 2003), e que confere proteção contra asma, artrite reumatóide, esclerose
múltipla, e rejeição de enxerto renal em caucasóides (Zuniga et al., 2003).
Análises in vitro de monócitos de portadores CCR5D32 demonstraram uma reduzida
resposta quimiotática aos ligantes do CCR5 (Panzer et al., 2005). Uma vez que a molécula
de CCR5 é normalmente expressa em macrófagos, linfócitos T e células dendríticas e dirige
a resposta imune, preferencialmente, para o padrão Th1 (Loetscher et al., 1998) e como a
resposta Th1 está associada com a inflamação, o alelo CCR5D32 não funcional resulta em
36
uma resposta Th1 menos efetiva, consequentemente levando a um estado inflamatório mais
brando (Chies & Hutz, 2003).
37
2. JUSTIFICATIVA
Segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA), o câncer de colo do útero é a terceira
neoplasia maligna mais comum entre as mulheres, sendo superado pelo câncer de pele (não-
melanoma) e pelo câncer de mama. Ela ainda é a quarta causa de morte por câncer em
mulheres.
O desenvolvimento do câncer cervical está fortemente relacionado com a infecção genital
de papilomavírus humano (HPV) oncogênico, contudo, a importância dos fatores genéticos e
ambientais no desenvolvimento de tumor cervical ainda não tem sido esclarecida.
Zheng et al. (2006) relataram que a deleção de 32 pares de bases no gene do receptor de
quimiocina 5 está discretamente associada com um aumento do risco de infecção por HPV.
Tem sido sugerido que o TTV pode ser um vírus co-infectante que promoveria o efeito
patológico de outros agentes infecciosos como o HPV. Alguns autores têm sugerido que a
coinfecção do TTV genogrupo 1 e HPV, promoveria a progressão do carcinoma de células
escamosas da laringe e estaria associada ao prognóstico desfavorável; além disso há relatos
de um possível envolvimento do TTV na patogênese do Linfoma de Hodgkin em adultos
jovens.
Pensava-se que o TTV seria um novo candidato a vírus da hepatite e apesar do seu
papel na doença hepática permanecer controverso, e seu potencial patogênico seja totalmente
caracterizado, será relevante investigar as implicações da co-infecção do TTV com outros
vírus. Portanto este trabalho tem como proposta, investigar se o TTV e o polimorfismo do
gene CCR5 poderiam influenciar na patogênese do HPV, e assim favorecer o
desenvolvimento do câncer cervical em pacientes coinfectadas por HPV-TTV.
38
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL:
Avaliar a presença do Torque Teno Vírus (TTV) e o polimorfismo do receptor de
CCR5 em pacientes negativos para infecção pelo papilomavírus humano (HPV) e pacientes
com colpocitologia oncótica sugestiva para infecção por HPV.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
A) Analisar a faixa etária dos grupos HPV negativo e sugestivo para infecção por HPV;
B) Analisar a microbiota da região cérvico-vaginal em pacientes sugestivos para HPV
com câncer;
C) Investigar a presença do TTV:
· Em pacientes negativos para infecção por HPV e em pacientes sugestivos
para infecção por HPV sem e com câncer.
D) Seqüenciar e comparar as amostras positivas para o TTV, com as seqüências
depositadas no GenBank;
E) Realizar análise genotípica para o polimorfismo do receptor de quimiocina CCR5 em
pacientes negativos para HPV e pacientes sugestivos para infecção por HPV.
39
4. MATERIAIS E MÉTODOS:
4.1. POPULAÇÃO ESTUDADA
As amostras utilizadas neste trabalho foram provenientes do Hospital de Clínicas da
Universidade Estadual de Londrina e da Universidade Estadual de Maringá, as quais
constituíram de dois grupos: 43 pacientes HPV negativo (controle negativo) e 74 pacientes
sugestivos para infecção por HPV, diagnosticados pelo método de Papanicolaou. Este
projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa da Universidade Estadual de
Londrina, estando de acordo com a Resolução 196/96 - CNS.
4.2. ANÁLISE CITOLÓGICA
Esta etapa do trabalho foi realizada no Hospital Regional Universitário da
Universidade Estadual de Londrina e da Universidade Estadual de Maringá. Para a coleta das
amostras cérvico-vaginais, as pacientes foram aconselhadas a não fazerem uso de duchas
higiênicas, nem medicamentos nas 48 horas que precediam a coleta do exame, bem como
fazer abstinência sexual no mesmo período. As amostras foram coletadas utilizando o
espéculo vaginal para visualização do colo uterino; com a espátula de Ayre, foi realizado o
raspado da ectocérvice; e com a escova cervical, (cytobrush), a coleta endocervical. O
esfregaço cérvico-vaginal foi fixado com etanol absoluto (fixador celular), a fim de evitar a
ação de enzimas autolíticas, as quais poderiam alterar a morfologia celular. A coloração foi
realizada de acordo com o Método de Papanicolaou (Anexo I).
A análise da microbiota vaginal foi realizada no Hospital de Clínicas da Universidade
Estadual de Londrina, através da bacterioscopia ao Gram e exame a fresco (Anexo II).
40
4.3. ANÁLISE MOLECULAR
4.3.1 OBTENÇÃO DO DNA
Para obtenção do DNA, foi coletada uma alíquota de sangue periférico por punção
venosa, com tubos de coletas a vácuo, com anticoagulante EDTA. A técnica utilizada para a
extração do DNA origina uma molécula de alto peso molecular e consiste basicamente no
rompimento enzimático de membranas celulares, eliminação de proteínas e ácidos graxos por
ação de solventes orgânicos e precipitação do DNA com etanol (Miller et al, 1988).
Ressuspendeu-se o DNA obtido em 50 mL de água ultra pura (água milli-Q)
autoclavada. A concentração do DNA foi determinada por espectrofotometria a 260 nm
(UV-1650 PC/ UV-Visible Spectrophotometer, Shimadzu, Japan), usando a seguinte
fórmula: densidade óptica obtida a 260 nm (DO
260
) x diluição x 50 = mg de DNA. A
concentração foi ajustada para 0,1 mg/ mL e as amostras foram mantidas a -20ºC até a etapa
da PCR para detecção qualitativa do TTV. A integridade do DNA extraído foi analisada por
eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo e visualizado em
transluminador UV.
4.3.2 DETECÇÃO QUALITATIVA DO TTV
A presença do TTV foi determinada pela nested PCR utilizando quatro
oligonucleotídeos iniciadores, descritos por Nishizawa et al (1997) e confirmados de acordo
com a seqüência no GenBank AB008394.
1º PCR
- RD037 primer sense: 5´ GCA GCA GCA TAT GGA TAT GT 3´
- RD038 primer anti-sense: 5´ TGA CTG TGC TAA GGC CTC TA 3´
2º PCR
- RD051 primer sense: 5´ CAT ACA CAT GAA TGC CAG GC 3´
- RD052 primer anti-sense: 5´ GTA CTT CTT GCT GGT GAA AT 3´
41
O produto da PCR desse sistema é um fragmento de DNA de 197 pb localizado na
seqüência aberta de leitura 1 (ORF 1) denominada região N22.
As condições das duas reações de amplificação foram as mesmas, e foi realizada
utilizando as soluções: 10X PCR Buffer, MgCl
2
(50 mM), dNTP (1,25 mM), Primer sense
(2,5 µM),Primer anti-sense (2,5µM),H
2
O estéril ultra pura (milli-Q), Taq Polimerase (1,25
U/reação) (INVITROGEN life technologies- Brasil). Amostra de DNA genômico/ produto
do PCR 1 (0,1 µg/µl).
A reação de amplificação foi realizada no termociclador PCR Sprint-Thermo
Hybaid
â
(Biosystems, Barcelona, Spain), onde a temperatura inicial de desnaturação foi de
94ºC por dez minutos, seguida de 35 ciclos de trinta segundos a 94ºC para separar a dupla
fita de DNA, 30 segundos a 55ºC para temperatura de anelamento e quarenta e cinco
segundos a 72ºC para extensão das cópias, com extensão final de 10 minutos a72ºC. Todas
as reações foram efetuadas com um controle negativo (ausência de DNA) para assegurar a
não contaminação com ácidos nucléicos, e com um controle positivo, no qual utilizou-se
DNA de amostra previamente testada e sequenciada. As amostras foram analisadas e
visualizadas em gel de poliacrilamida 10%, coradas com nitrato de prata.
4.3.2.1 CLONAGEM
A fim de verificar a especificidade dos primers utilizados na detecção do TTV, os
produtos de PCR nested das amostras positivas para o TTV foram clonados.
4.3.2.1.1 PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS
As amostras positivas para TTV foram purificadas, com o objetivo de eliminar restos
de primers e fragmentos inespecíficos. Inicialmente 15 mL do produto da PCR nested TTV
42
foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,4% e corados com brometo de etídeo
e o fragmento de 197pb do TTV a ser analisado foi recortado e purificado utilizando o
sistema de extração o QIAgen - QIAquick Gel Extraction Kit Protocol, seguindo as
instruções do fabricante.
4.3.2.1.2 PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES
Foram inoculadas 20 mL de Escherichia coli, da linhagem Top-10, em um tubo de
ensaio contendo 3 mL de meio Luria-Bertani (LB) líquido, e depois incubados por
aproximadamente 20 horas, em agitador horizontal a 180 rpm, a 37ºC. Após a incubação,
150 mL da cultura bacteriana foram inoculados em 5 mL de meio LB líquido e mantidos a
37ºC e 180 rpm em agitador horizontal, até atingir uma densidade óptica (DO
660
) de 0,4-0,6.
Em seguida o tubo foi mantido em banho de gelo por 5 min. e depois 3 mL dessa cultura
foram transferidos para 2 tubos de microcentrífuga (1,5 mL) e centrifugados a 5000 rpm, por
5 min.
O sobrenadante foi descartado por inversão do tubo e 500 mL de CaCl
2
( 50mM)
foram adicionados. Após homogeinização, juntou-se o conteúdo dos 2 microtubos mantendo-
o em banho de gelo por 10 min. Foi realizada nova centrifugação a 5000 rpm, por 5 min. Em
seguida, o sobrenadante foi descartado e ao sedimento foram adicionado 300 mL de CaCl
2
50mM e, depois, mantido em banho de gelo por mais 20 min. Ao final do tempo, as células
competentes foram aliquotadas (50 mL/tubo).
4.3.2.1.3 REAÇÃO DE LIGAÇÃO
Para a reação de ligação foi utilizado o vetor pCRâ4-TOPOâ, o qual permite
selecionar diretamente os recombinantes através da desativação do gene letal ccdB da
E.coli Top10 (Bernard & Couturier, 1992; Bernard et al., 1994; Bernard et al., 1993). Este
43
vetor contém o gene ccdB ligado à porção C-terminal do fragmento LacZα e a ligação do
produto de PCR interrompe a expressão do gene LacZα-ccdB (Anexo III). Deste modo,
somente haverá o crescimento de E. coli Top10 transformadas.
O vetor pCRâ4-TOPOâ apresenta a seguinte seqüência e característica
(www.invitrogen.com):
Para a ligação do produto de PCR purificado do TTV com o vetor pCRâ4-TOPOâ
(TTV-pCRâ4-TOPOâ) foram adicionadas num tubo de microcentrífuga (0,6mL) as
soluções: produto PCR purificado na proporção 1 vetor : 4 fragmento; solução de sal* 1
mL; Vetor pCR
â
4-TOPO
â
* 1 mL; água esterilizada qsp 6mL.
* INVITROGEN life technologies- Brasil
4.3.2.1.4 TRANSFORMAÇÃO
44
Foram utilizado 50 mL de células competentes, aos quais foram adicionados 3 mL do
produto da ligação (TTV-pCRâ4-TOPOâ). As células forarm mantidas em banho de
gelo por 20 min. Na seqüência, foram incubadas em banho-maria a 42ºC por 2 min. E, a
seguir, transferidas imediatamente para banho de gelo. Após adição de 1 mL de meio LB
líquido as células foram incubadas por 1 hora a 37ºC sob agitação (180 rpm). Ao final do
tempo, a amostra foi centrifugada a 5000 rpm, por 10 min., o sobrenadante foi descartado
e ao sedimento foram adicionados 100 mL de meio LB líquido. As amostras foram
inoculadas, com auxílio da alça de Drigalsk, em placas de petri contendo meio LB sólido
acrescido de gentamicina (50-100 mg/mL) e depois incubadas em estufa a 37ºC por 24
horas. As colônias isoladas foram utilizadas para extração de DNA plasmidial.
4.3.2.1.5 EXTRAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL (MINI-PREP)
A extração do DNA plasmidial foi realizada usando o sistema Kit GFX Micro
Plasmid Prep Kit (Amershan Pharmacia Biotech Incorporation, USA), seguindo as
instruções estabelecidas pelo fabricante.
4.3.2.2 SEQÜENCIAMENTO
O DNA plasmidial foi quantificado e submetido à reação de seqüenciamento no
termociclador Eppendorf mastercycler gradient com DYEnamic
TM
ET dye terminator cycle
sequencing kit (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Ohio, USA), onde foram realizados 30
ciclos de trinta segundos a 95ºC para desnaturar a dupla fita de DNA, quinze segundos a
53ºC para temperatura de anelamento e um minuto a 60ºC para extensão das cópias.
Os reagentes foram utilizados nas seguintes concentrações: DYEnamic ET reagent
premix 4µL; Primer M13 foward e M13 reverse (10pmoles) 2µL; TTV-pCRâ4-TOPOâ
(300 ng/µL) 4µL.
45
Foram utilizados os seguintes oligonucleotídoes iniciadores:
Primer sense (M13 Foward): GAC GTT GTA AAA CGA CGG CCA GT
Primer anti-sense (M13 Reverse): TTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC
Os produtos da reação de sequenciamento foram precipitados com 10mL de
água milli-Q autoclavada, 2 mL de acetato de amônio 7,5M estéril e 60mL de etanol 96%.
Centrifugados por 15 segundos a 300rpm e mantidos em repouso por 15 minutos a 25ºC.
Novamente centrifugados a 4000rpm a 25ºC por 45 minutos o sobrenadante vertido.
Adicionou-se 140mL de etanol 70% com posterior centrifugação a 4000rpm por 14 minutos.
O sobrenadante foi vertido, o sedimento seco foi mantido a 37ºC por 15 minutos e
ressuspendido em 10mL de tampão (Loading buffer for Mega Bace), após esta solução foi
submetida ao seqüenciamento no seqüenciador automático Mega Bace 1000
TM
(Amershan
Pharmacia Biotech – USA).
4.3.3 ANÁLISE DO POLIMORFISMO DO GENE CCR5 PELA REAÇÃO EM
CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Os primers para CCR5 utilizados para a amplificação do DNA foram sintetizados de
acordo com a seqüência GenBank AF009962.
- Primer sense: 5' ACC AGA TCT CAA AAA GAA 3’
- Primer anti-sense: 5' CAT GAT GGT GAA GAT AAG CCT CA 3'
A condição da reação de amplificação foi realizada utilizando-se as soluções: 10X
PCR Buffer *, MgCl
2
(50 mM) *, dNTP (1,25 mM) **, Primer sense (2,5 µM), * H
2
O
estéril ultra pura (milli-Q), Taq Polimerase (1,25 U/reação) *, Amostra de DNA genômico
(0,1 µg/µl).
* INVITROGEN life technologies – Brasil.
** Amershan Pharmacia Biotech Incorporation, USA.
46
A reação de amplificação foi realizada no termociclador PCR Sprint-Thermo
Hybaid
â
(Biosystems, Barcelona, Spain), onde a temperatura inicial de desnaturação foi de
94ºC por cinco minutos, seguida de 35 ciclos de um minuto a 94ºC para desnaturar a dupla
fita de DNA, um minuto a 58ºC para temperatura de anelamento e um minuto a 72ºC para
extensão das cópias, com extensão final de 10 minutos a 72ºC.
4.4.ANÁLISE ESTATÍSTICA
A freqüência do alelo Δ32 foi calculada como: [1 x (h + 2H)] / 2N, onde h representa o
genótipo heterozigoto, H o genótipo homozigoto e N o tamanho da amostra para cada
população. Os dados epidemiológicos foram determinados através do teste de χ
2
. Para todos
os dados, o nível de significância adotado foi de p<0,05. Para as características
demográficas, utilizou-se o teste t Student do programa Microcal Origin™ 4.1.
47
5. RESULTADOS
A análise colpocitológica do cérvix uterino dos pacientes que participaram deste
trabalho foi realizada método de Papanicolaou, sendo agrupados inicialmente em pacientes
negativos para HPV e pacientes com colpocitologia oncótica sugestiva para infecção por
HPV.
No presente trabalho, foram analisadas 117 amostras de sangue periférico,
provenientes de pacientes dos Hospitais de clínicas da Universidade Estadual de Londrina e
Universidade Estadual de Maringá. Sendo 43 amostras negativas para HPV e 74 amostras
sugestivas de infecção por este vírus.
Com relação à faixa etária, no grupo HPV negativo houve um maior número de
pacientes entre 51-60 anos e no grupo sugestivo para infecção por HPV, entre 31-40 anos
(Figura 1).
Figura 1. Faixa etária dos pacientes. No grupo HPV negativo houve um maior número de pacientes entre 51-
60 anos e no grupo sugestivo para HPV, entre 31-40 anos.
48
Dentre os pacientes sugestivos de infecção por HPV (n=74), 81% (60) não
apresentaram diagnóstico positivo para câncer e 19% (14) dos pacientes desenvolveram esta
doença (Figura 2).
Figura 2. Distribuição dos pacientes sugestivos para HPV. Dentre as amostras analisadas, em 81% dos
pacientes não foi detectado nenhum tipo de câncer enquanto que 19% dos pacientes apresentaram câncer
cervical, utilizando método de Papanicolaou, como descrito em Material e Métodos.
Dentre os pacientes com câncer cervical (14), 7 desenvolveram carcinoma
epidermóide invasor e 7 desenvolveram carcinoma in situ. Os pacientes apresentaram faixa
etária entre 29 e 44 anos (Figura 3), sendo que a maioria apresenta-se na faixa etária entre 35
a 40 anos.
Figura 3. Faixa etária dos pacientes sugestivos para HPV e com câncer. Neste grupo (n=14), houve um
discreto predomínio de pacientes com faixa etária entre 29-44
anos.
49
A próxima etapa deste trabalho foi verificar se os pacientes com carcinoma
apresentavam co-infecções para outros microrganismos, relacionados à microbiota da região
cérvico-vaginal. Para esta análise, foi realizada bacterioscopia ao Gram e exame a fresco
(Anexo II) a fim de detectar microrganismos presentes na região cérvico-vaginal em
pacientes com infecção sugestiva para HPV e com câncer. Foram detectados Gardnerella
vaginalis e Trichomonas vaginalis nestes pacientes (Figura 4).
Figura 4. Detecção de Gardnerella vaginalis e Trichomonas vaginalis em pacientes sugestivos para
HPV e com câncer. A detecção de agentes infecciosos da região cérvico-vaginal foi realizada através da
bacterioscopia ao Gram e exame a fresco.
A etapa seguinte deste trabalho foi detectar a presença do DNA do TTV no sangue
periférico de todas as amostras. Neste Laboratório, rotineiramente é realizada a análise da
integridade do DNA das amostras. Esta análise é realizada através de eletroforese em gel de
agarose 1% (m/v) corado com brometo de etídio e visualizado em ultra-violeta, apresentando
um perfil eletroforético típico de uma amostra íntegra. Todas as amostras apresentaram
bandas únicas com concentração compatível em relação ao padrão de DNA (100ng/ml),
demonstrando que não houve degradação das amostras de DNA durante sua extração e que
as mesmas estavam íntegras. A quantificação foi realizada em espectrofotômetro a 260 nm.
71%
7.1%
7.1%
14%
Gardnerella
Trichomonas+Gardnerella
Trichomonas
Ausência de Trichomas e Gardnerella
50
Além da análise da integridade através de perfil eletroforético, todas as amostras
foram amplificadas para o gene constitutivo CCR5, sendo portanto, amostras íntegras e
viáveis para detecção do DNA do TTV. A partir das amostras íntegras de DNA, realizou-se
PCR para o TTV, utilizando-se primers específicos, como descrito anteriormente.
Na Figura 5, o resultado da amplificação pode ser visualizado em gel de
poliacrilamida 10% (v/v), corado com prata. A detecção do TTV foi realizada pela PCR
nested nos grupos negativos para HPV e sugestivos para HPV.
Figura 5A
L 29 31 32 34 C+
200 pb
L 43 46 50 51 C+ C - BL
200 pb
Figura 5B
L 1 4 5 13 14 15 C+
200 pb
L 16 19 20 21 22 23 29 30 32 35 BL
200 pb
Figura 5. Detecção do TT vírus através da PCR. Figura 5APacientes negativos para HPV. Grupo controle
negativo. Figura 5B. Pacientes sugestivo para infecção por HPV. Gel de poliacrilamida 10% (v/v) corado com
prata. Onde L representa o Ladder 100pb. Amostras positivas para o TTV aprsentaram 197pb. C+ controle
positivo. C – controle negativo.
Relacionando a presença de TTV entre os grupos avaliados neste trabalho, no grupo
HPV negativo, 18.6% (8) dos pacientes estavam infectados pelo TTV e no grupo sugestivo
51
para HPV, 24.32% (18) dos pacientes apresentaram essa infecção (Figura 6). Aplicando-se o
teste de qui-quadrado, não houve diferença estatisticamente significativa entre os dois
grupos, embora tenha sido observada uma tendência no aumento de TTV nos pacientes HPV
sugestivos.
Figura 6. Detecção do TTV em pacientes HPV negativos comparados com pacientes sugestivos para
infecção por HPV. No controle negativo detectou-se 18.6% de TTV e 24.32% nos pacientes sugestivo de
infecção por HPV. Valor de qui-quadrado igual 0,516 e grau de liberdade igual a 1.
Com relação à idade, dentre o grupo HPV negativo, houve uma maior detecção do
TTV na faixa etária entre 41-60 anos e, dentre o grupo sugestivo de infecção por HPV,
houve uma maior prevalência na faixa etária entre 31-40 anos.
A fim de verificar a especificidade dos primers utilizados para detecção de TTV, as
amostras positivas foram clonadas e os plasmídeos extraídos foram seqüenciados. As
seqüências obtidas foram analisadas e comparadas com as seqüências disponíveis no
GenBank da NCBI (National Center for Biotechnology Information), onde estas seqüências
apresentaram identidade significativa com as seqüências do TTV cadastradas neste banco de
dados (E= 9
-87
). O número de acesso é AJ244132 e a seqüência está localizada na região
TTV + HPV -
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
18,6%
Número de pacientes
TTV + HPV +
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
24,32%
Número de pacientes
52
ORF1, entre as posições 61-301. O eletroferograma da seqüência obtida está representado na
Figura 7.
Figura 7. Seqüenciamento automático do produto de clonagem do TTV. A clonagem do TTV e a reação de
seqüenciamento foram realizadas segundo descrito em Materiais e Métodos. O cromatograma representa parte
da seqüência do fragmento de produto de PCR-nested.
A seguir, avaliou-se a presença do TTV no grupo dos pacientes sugestivos para HPV
e com câncer. Detectou-se TTV em 16,67% (10/60) dos pacientes sugestivos para HPV sem
câncer, e no grupo sugestivo para HPV com câncer detectou-se 57,14% (8/14). Através do
teste qui-quadrado verificou-se diferença estatisticamente significativa entre os grupos, com
p<0,05 (Figura 8).
Figura 8. Detecção do TTV em pacientes sugestivos para HPV sem câncer e com câncer. A detecção do
TTV foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. Em pacientes sem câncer houve uma menor
porcentagem de pacientes infectados pelo TTV quando comparado com os pacientes com câncer. Valor de qui-
quadrado igual a 10,07 e grau de liberdade igual a 1.
53
Neste trabalho, também foi realizada a análise genotípica para o polimorfismo
do receptor de quimiocina CCR5, utilizando-se as mesmas amostras de DNA empregadas
para detecção de TTV (Figura 9).
L 1 2 8 11 16 20 16 29 31 32 BL
200 pb
Figura 9. Análise genotípica do receptor de quimiocina 5 em pacientes HPV negativos. Gel de
poliacrilamida 10% (v/v) corado com prata. L representa o Ladder 100pb. Representação dos tipos de
genótipos através das amostras 1, 2, 11, 20, 29, 31, 32 (225pb) genótipo selvagem para o CCR5; amostra 8
genótipo heterozigoto (193pb e 225pb); e amostra 16 (193pb) - genótipo homozigoto para o alelo variante.
A análise do polimorfismo do gene CCR5 demonstra uma distribuição genotípica
similar entre os pacientes negativos para infecção por HPV e pacientes sugestivos para
infecção por HPV ( Tabela 1).
Tabela 1. Freqüência alélica e genotípica para os alelos Δ32 e wt do CCR5
Genótipo (117)
a
Freqüência alélica
Grupo
estudado
Número de
amostras
CCR5/CCR5
CCR5/D32 D32/ D32
wt
D32
HPV negativo
43 *
38 04 01 0.93 0.07
HPV sugestivo
74 ** 70 03 01 0.97 0.03
* Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) = 3,429
** HWE = 13,48
a
HPV negative patients X HPV suggestive patients χ² =1,47 (2 degrees of freedom; p>0.05)
Apesar do predomínio do genótipo selvagem (CCR5/CCR5), observou-se que 11,6%
dos pacientes HPV negativo apresentavam o alelo D32 e, dentre os pacientes sugestivos para
infecção por HPV, 5,4% apresentaram este alelo variante. Ambos os grupos apresentaram
54
um desvio significativo do equilíbrio de Hardy-Weinberg e esta diferença pode ser atribuída
ao pequeno número de amostras.
A próxima etapa deste trabalho foi analisar o polimorfismo do gene CCR5
relacionado com a presença do TTV. Observou-se uma distribuição genotípica semelhante
entre o grupo controle negativo para HPV e o grupo sugestivo para HPV, bem como uma
prevalência similar do TTV em ambos os grupos (Tabela 2 e Figura 10).
Tabela 2: Relação do polimorfismo do gene CCR5 com HPV e TTV
Figura 10. Relação do polimorfismo do gene CCR5 com TTV. Figura 10.A – Pacientes negativos para HPV.
Figura 10.B – Pacientes sugestivos para HPV. Em ambos os grupos não houve detecção do TTV em pacientes
com o genótipo homozigoto para o alelo variante.
No grupo sugestivo para HPV sem câncer, observa-se um predomínio de pacientes
com o genótipo selvagem para CCR5, mas sem infecção por TTV, já no grupo sugestivo
PACIENTES HPV NEGATIVO (n=43)
CCR5/CCR5
TTV -
CCR5/CCR5
TTV +
CCR5/Δ32
TTV -
CCR5/Δ32
TTV +
Δ32/ Δ32
TTV -
Δ32/ Δ32
TTV +
31 7 3 1 1 0
PACIENTES SUGESTIVOS PARA HPV (n=74)
54 16 1 2 1 0
55
para HPV com câncer, o que se observou foi uma maior ocorrência de pacientes com
genótipo selvagem para CCR5, mas com infecção por TTV (Figura 11).
Em ambos os grupos não houve detecção do TTV em pacientes com o genótipo
homozigoto para o alelo variante. Em pacientes sugestivo para HPV com câncer não houve
ocorrência de pacientes com genótipo heterozigoto na ausência de TTV (Tabela 3 e Figura
11).
Tabela 3. Relação do polimorfismo do gene CCR5 com TTV em pacientes sugestivos para HPV sem
câncer e com câncer.
Figura 11. Relação do polimorfismo do gene CCR5 com TTV em pacientes sugestivos para HPV. Figura
11.A – Pacientes sem câncer. Figura 11.B – Pacientes com câncer. Em ambos os grupos não houve relação
entre TTV e polimorfismo do gene CCR5 com valor de qui-quadrado igual 0,3962 e grau de liberdade igual a
dois, bem como nenhuma relação entre câncer e polimorfismo do gene CCR5, cujo qui-quadrado foi igual a
0,4453 e grau de liberdade igual a dois.
Dentre os sete pacientes que desenvolveram carcinoma epidermóide invasor, 6
apresentaram o genótipo selvagem para CCR5 e um paciente apresentou genótipo
heterozigoto para este gene, sendo este o único paciente que apresentou metástase.
PACIENTES SUGESTIVOS PARA HPV SEM CÂNCER (N=60)
CCR5/CCR5
TTV -
CCR5/CCR5
TTV +
CCR5/Δ32
TTV -
CCR5/Δ32
TTV +
Δ32/ Δ32
TTV -
Δ32/ Δ32
TTV +
48 (80%) 9 (15%) 1 (1,7%) 1 (1,7%) 1 (1,7%) 0
PACIENTES SUGESTIVOS PARA HPV COM CÂNCER (n=14)
6 (43%) 7 (50%) 0 1 (7,1%) 0 0
56
6. DISCUSSÃO
É estimado que o HPV cause aproximadamente meio milhão de novos cânceres todo
ano e, a maioria, em mulheres de países em desenvolvimento (WHO, 2007).
O HPV é a infecção viral sexualmente transmissível mais prevalente entre homens e
mulheres. É estimado que 80% dos adultos sexualmente ativos estejam infectados com pelo
menos um tipo de HPV (Baseman & Koutssky, 2005).
Neste trabalho, foram avaliadas 117 amostras de sangue periférico, sendo 43
amostras negativas para HPV, e 74 amostras sugestivas de infecção por este vírus; a faixa
etária predominante para este último grupo foi entre 31-40 anos (Figura 1). Dentre os
pacientes sugestivos para HPV, a faixa etária dos pacientes sem câncer foi de 13-81 anos e
dos os pacientes com câncer foi de 29-74 anos.
Ferlay et al (2001) relataram uma maior incidência de câncer cervical em mulheres
com faixa etária entre 55-64 anos. No presente trabalho, a incidência de câncer cervical foi
maior nas mulheres com faixa etária entre 29-44 anos (Figura 3), embora 11 pacientes
apresentavassem idade entre 41-74 anos.
Mikamo et al (1999) relataram a possibilidade de as lesões do câncer de cérvice
uterina promoverem condições favoráveis ao crescimento de Gardnerella vaginalis e outros
microrganismos anaeróbios, os quais levariam a uma vaginose bacteriana. Estes mesmos
autores detectaram Gardnerella vaginalis em 50% (10/20) dos pacientes e, destes, 80%
(8/10) apresentaram vaginose bacteriana. Em nosso estudo houve detecção de Gardnerella
vaginalis em 14,29% dos pacientes (2/14), Trichomas vaginalis em 7,14% dos pacientes
(1/14) e associação destes dois microrganismos em 7,14% dos pacientes (1/14). Essa baixa
incidência pode ser atribuída ao método de detecção empregado em nosso trabalho, o qual
foi realizado apenas pelo exame a fresco e pelo método de Gram (Figura 4).
57
Desenvolvimento do câncer cervical está fortemente relacionado com infecção
genital com tipos de HPV oncogênicos, contudo, parecem ser necessários fatores adicionais.
No entanto, a importância relativa dos fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento de
tumor cervical ainda não foi esclarecida (Zheng B. et al, 2006).
Tem sido sugerido que o TTV seja um vírus co-infectante que promoveria o efeito
patológico de outros agentes infecciosos (Szládek et al, 2005) como o HPV. Pensava-se que
o TTV pudesse ser um novo candidato a vírus da hepatite e apesar do seu papel na doença
hepática permanecer controverso, até que o seu potencial patogênico seja totalmente
caracterizado, será relevante investigar as implicações da co-infecção do TTV com outros
vírus (Thom e Petrik, 2007).
Moriyama et al. (2001) descreveram que a regeneração irregular de hepatócitos de
pacientes TTV positivo foi muito mais significativa do que em pacientes TTV negativo.
Kooistra et al. (2004) propuseram que a proteína indutora de apoptose derivada do TTV tem
uma ação preferencial em carcinoma hepatocelular derivado de células. Camci et al. (2002)
descreveram uma alta prevalência do TTV em pacientes com câncer.
Barril et al. (2000) verificaram a presença do TTV em soro e em células
mononucleares periféricas de pacientes ambulatoriais de diálise peritoneal, utilizando
primers para as regiões da ORF-1 e ORF-2 do TTV. Tem sido sugerido que células do
sangue periférico, nos quais o vírus esteja escondido como um “Cavalo de Tróia”, possam
servir como um reservatório de TTV, induzindo infecção e transmissão crônica em alguns
setores clínicos e epidemiológicos (Zhong et al, 2002).
Verificou-se que usando PCR com primers da região UTR, o DNA do TTV foi
detectado numa porcentagem muito maior nas amostras. O DNA do TTV foi detectado por
PCR UTR numa alta freqüência (93%) sem diferença na prevalência entre doadores de
sangue com níveis elevados de alanina amino transferase (ALT), daqueles com níveis
58
normais. Esses resultados, demonstrados por Ito et al. (1999), indicaram que a seleção dos
primers da PCR influencia na detecção do DNA do TTV. Além disso, estes resultados
sugerem que um restrito genótipo de TTV detectado pela PCR da região N22 pode ser
associado com danos hepáticos entre doadores de sangue. Demonstrou-se que a utilização de
primers N22 detecta grupos virais associados com hepatites de origem desconhecida. Hu et
al. (2005) investigaram a habilidade de um grupo de primers específicos detectar genótipos
de TTV conhecidos e verificaram que o set de primers RD0.37/0.38/0.51/0.52 somente
amplificam produtos de PCR para o genótipo 1. Desse modo, neste trabalho a presença do
DNA do TTV em células do sangue periférico foi investigado usando primers N22
específicos para TTV genótipo 1.
A detecção do TTV, nos grupos negativo para HPV e sugestivo para HPV, foi
realizada por PCR nested e a vizualização em gel de poliacrilamida 10% (v/v) (Figura 5); no
grupo HPV negativo foi detectado TTV em 18,6% dos pacientes e no grupo sugestivo para
HPV, foi detectado em 24,32% dos pacientes (Figura 6).
As amostras de TTV positivas foram clonadas e os plasmídeos extraídos foram
seqüenciados (Figura 7) e comparados com dados do GenBank, e os resultados
demonstraram homologia com a seqüência de TTV cadastrado neste banco de dados.
Outros fatores relacionados à infecção por HPV tais como, carga viral, integração
viral e múltiplas infecções podem modificar a interação biológica vírus-hospedeiro e
desempenhar um papel no desenvolvimento do câncer cervical. A detecção foi realizada para
analisar a possibilidade do TTV influenciar no desenvolvimento de câncer de colo do útero
pelo HPV.
No presente trabalho, detectou-se TTV em 16,67% (10/60) dos pacientes sugestivos
para HPV sem câncer, e no grupo sugestivo para HPV com câncer detectou-se 57,14% (8/14)
(Figura 8). Deste modo, o TTV pode estar influenciando o desenvolvimento de câncer pelo
59
HPV, talvez isso se deva ao fato de o TTV apresentar uma distribuição preferencial nas
células CD19+ (Células B) entre os vários componentes dos PBMCs, como foi reportado por
Yu et al., em 2002. É conhecido que a IgA (imunoglobulina A) anti-HPV está correlacionada
com o clearence viral (Burd, 2003). Uma vez que os linfócitos B podem estar sendo
alterados devido à infecção pelo TTV, o clearence viral pode não estar sendo realizado pelas
IgA HPV-específicos.
Na resposta imune celular, a resposta imune primária para o clearence do HPV
envolve células apresentadoras de antígeno, linfócitos T CD4, CD8 e citocinas co-
estimulatórias. Em mulheres imunossuprimidas, a incidência da infecção pelo HPV e
progressão para o câncer invasivo está aumentada (Arends et al., 1997).
Em relação à perda dos mecanismos de controle celular, o papel de leucócitos
antígeno-específico contra tumor tem sido considerado fator decisivo na patogênese do
câncer cervical (O’Brien et al, 2001; Evans et al., 1997). Estudos relacionados à investigação
de células imunológicas em neoplasias intraepiteliais cervicais avançadas demonstraram uma
diminuição significativa nos macrófagos intraepiteliais (Tay et al., 1987), células de
Langerhans (Spinillo et al., 1993) e linfócitos T citotóxicos (Evans et al., 1997).
É conhecido que citocinas têm potencial em estimular ativação de células T, contudo
o padrão de ativação pode distinguir para diferentes interações de citocinas-receptores
citocinas (Nanki & Lipsky, 2001).
Genes da resposta imune têm sido relacionados com a patogênese do câncer cervical
(Ghaderi M. et al, 2000). Dentre os produtos de genes envolvidos no recrutamento de
macrófagos para a mucosa cervical, citocinas e a expressão de seus receptores tem
demonstrado provável função na imunidade contra o tumor cervical (Ghaderi M. et al, 2000;
Kleine-Lowinski K. et al, 1999; Ohta M. et al, 2002). Uma vez que citocinas, quimiocinas e
radicais livres iniciam e perpetuam a resposta inflamatória, genes polimórficos ou variações
60
genéticas em genes relacionados à imunidade podem estar envolvidos com a persistência e
progressão do câncer (Moss e Blaser, 2005).
CCR5 desempenha um importante papel no recrutamento de macrófagos, monócitos,
e células T na inflamação (Panzer et al., 2005; Spagnolo et al., 2005) levando a uma resposta
imune envolvida no padrão de citocinas Th1 (Loetscher et al., 1998).
Recentes estudos têm demonstrado o envolvimento do CCR5 em várias doenças
humanas, abrangendo desde doenças infecciosas e inflamatórias até câncer (Balistreri et al.,
2007). Em 2006, Vaday et al. sugeriram que a patogênese do câncer de próstata é
influenciada pela inflamação, especialmente por citocinas inflamatórias tais como ligaante
do CCR5 (CCL5). Zheng et al (2006) relataram que a deleção de 32 pares de bases no gene
do receptor de quimiocina 5 está discretamente associada com um aumento do risco de
infecção por HPV.
Neste trabalho, diferentes genótipos de CCR5 foram analisadas (Figura 9), bem como
sua relação com infecção de HPV e TTV. Observou-se que o polimorfismo do gene CCR5
não está associado com aumento do risco de infecção por HPV (Figura 10); no entanto em
pacientes sugestivos para HPV, houve uma maior incidência de TTV em pacientes com
câncer e genótipo selvagem para CCR5 (50%) (Figura 11).
Clinicamente, a infecção por HIV está associada com aumento da incidência e
persistência da infecção por HPV, que por sua vez está associada com aumento na lesão
intraepitelial de alto grau e câncer cervical invasivo (Vermud et al, 1991; Sun et al, 1997).
Embora neste trabalho, cinco pacientes com HPV apresentaram coinfecção com HIV e
genótipo selvagem para o gene CCR5, nenhum deles desenvolveu câncer e apenas um
paciente apresentava infecção por TTV.
61
Não está bem estabelecido qual o primeiro local de infecção no trato genital feminino
pelo HIV-1+. Pudney et al. (2005) sugerem ser a cérvice o primeiro local de infecção por
este vírus, e inflamação neste local aumenta o risco de transmissão do HIV, uma vez que
cervicites e vaginites aumentam o número de linfócitos CD8+ e CD4+ intraepiteliais e
também de APCs.
62
7. CONCLUSÃO
Neste estudo, o TTV foi mais prevalente em pacientes sugestivos para HPV com
câncer cervical e o polimorfismo do gene para o receptor de quimiocina 5 não influencia na
evolução dessa doença. É possível que este vírus seja um fator de risco no desenvolvimento
de câncer nos pacientes com colpocitologia oncótica sugestiva de infecção por HPV.
63
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80
ANEXO I
COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU
As lâminas com as amostras foram mergulhadas em álcool absoluto por um período
mínimo de 12 horas e, a seguir, realizada a coloração de Papanicolaou: dez mergulhos em
soluções de álcool etílico 95%, 80%, 70% e 50%; mergulhou-se no corante Hematoxilina de
Harris por um minuto; colocou-se em água corrente para retirar o excesso de corante, em
seguida mergulhou-se em solução de álcool etílico 7%/0,5% ácido clorídrico, e em seguida
mergulhou-se em água corrente por 10 minutos. Na seqüência, foram realizados dez
mergulhos em soluções de álcool etílico 50%, 70%, 80%, 95% e deixou-se por 10 segundos
no corante Orange G; retirou-se e mergulhou-se dez vezes em solução alcoólica 95% por
duas vezes. Colocou-se no corante EA36/31 por um minuto, e em seguida fez-se dez
mergulhos em três cubas com álcool absoluto; terminou-se com dez mergulhos em três cubas
de xilol. Deixou-se secar espontaneamente e, então, foi aplicada uma leve camada de verniz
ou esmalte incolor.
81
ANEXO II 1
2
ANÁLISE DA MICROBIOTA CÉRVICO-VAGINAL 3
A análise da microbiota cérvico-vaginal foi realizada pela Bacterioscopia ao Gram e 4
exame a fresco. 5
No exame a fresco, o swab contendo material vaginal foi acondicionado num frasco com 6
solução fisiológica estéril 0,85% e uma gota deste foi depositada numa lâmina e coberto com 7
lamínula. A preparação foi visualizada em microscópio de campo claro em objetiva de 40X, no 8
qual pesquisou-se a presença de Trichomonas vaginalis, leveduras e de células alvo. 9
Para bacterioscopia ao Gram a leitura da lâmina foi realizado no microscópio com 10
objetiva de 1000X, uttilizando-se óleo de imersão. As estruturas visualizadas foram 11
quantificadas de 1 a 4+ (Tabela 1), tendo sido avaliada a redução de lactobacilos e o predomínio 12
de cocos Gram variável tipo Gardnerella vaginalis, bacilos curvos tipo Mobiluncus spp. e 13
bacilos Gram negativo pequenos tipo Prevotella spp. e Porphyromonas spp. 14
Para cada morfotipo foi verificado o valor correspondente na tabela 1. O escore 15
individual para os 4 morfotipos foram somados e um escore total foi dado para interpretação: 16
negativo para vaginose bacteriana (0-3), vaginose indeterminada (4-6) e vaginose bacteriana (7-17
10). 18
19
Tabela 1. Critérios Laboratoriais de Nugent: Avaliação da flora vaginal pela coloração de Gram. 20
21
Morfotipos ao Gram m.o/ campo 1000x Score
Lactobacillus Superior a 30 0
De 5 a 30 1
De 1 a 4 2
Inferior a 1 3
82
Ausência 4
Mobiluncus Superior a 5 2
Inferior a 1 até 4 1
Ausência 0
Superior a 30 4
Gardnerella vaginalis De 5 a 30 3
Ou De 1 a 4 2
Bacteroides Inferior a 1 1
Ausência 0
Interpretação: 1
Score de 0 a 3: secreções vaginais normais. 2
Score de 4 a 6: vaginose indeterminada. 3
Score superior ou igual a 7: vaginose bacteriana. 4
5
6
83
ANEXO III 1
CARACTERÍSTICAS DO VETOR pCR
â
4-TOPO
â
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
84
ANEXO IV 1
ARTIGO 1 2
TÍTULO: Torque Teno Virus (TTV) in patients suggestive for human papillomavirus: 3
investigating its association with cervical carcinoma. 4
5
ABSTRACT 6
Purpose The aim of the present study was to investigate Torque Teno Virus (TTV) presence in 7
human papillomavirus (HPV) suggestive women and in controls, in order to elucidate any 8
possible influence on cancer development. 9
Methods In the present study, TTV was investigated in the peripheral blood of 117 Brazilian 10
women by nested Polimerase Chain Reaction (PCR), using a set of primers located in the N22 11
region of the large Open Reading Frame 1 (ORF-1). 12
Results TTV DNA presence was observed in 18.6% (08/43) of HPV negative individuals and in 13
24.32% (18/74) HPV suggestive patients. TTV presence was also investigated in the HPV 14
suggestive patient group, for comparison of cancer and noncancer patients. TTV DNA was 15
significantly more prevalent among HPV suggestive patients presenting cancer (57.14%; 08/14) 16
compared to HPV suggestive noncancer patients (16.67%; 10/60). 17
Conclusions Thus, the presence of TTV infection could be a risk factor for cancer development 18
in patients suggestive of HPV presenting TTV coinfection. However, further studies are required 19
to clarify the influence of TTV in HPV pathogenesis. 20
21
Keywords: TTV DNA, HPV, cervical cancer 22
23
85
INTRODUCTION 1
2
Cervical cancer is cancer of the uterine cervix. It is a common cause of death among 3
middle-aged women (40-60 years old), with an estimated 493,000 new cases and 274,000 deaths 4
worldwide in 2002. Due to the overwhelming burden of this disease in developing countries, cervical 5
cancer is the second most common cause of cancer among women worldwide (1). Currently, the majority 6
of cases occur in developing countries, in which an estimated half million new cancer cases will present 7
human papillomavirus (HPV) comorbidity (2). 8
HPVs are small circular double-stranded DNA viruses, with approximately 8000 base pair (bp) 9
genomes encased in a naked icosahedral capsid about 55 nm in diameter (3). 10
Two major classes of genital HPV types have been identified, depending upon their 11
association with cervical cancer. The “low-risk” types, especially HPV6 and HPV 11, are almost 12
never found in cervical malignancies. In contrast, viral DNAs from the “high-risk” types are 13
identified in most cervical cancer cases, although the vast majority of lesions in which they are 14
found are nonmalignant HPV16 and HPV18 are the two most carcinogenic HPV types, and are 15
responsible for 70% of cervical cancer and about 50% of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 16
grade 3 (CIN3) (4) by contrast, HPV6 and HPV11 are responsible for about 90% of genital warts 17
(5). 18
Cervical cancer development is a multi-step process. The major steps are HPV infection 19
and HPV persistence for over one year, followed by slow progression to precancerous lesions 20
and, eventually, to invasive cancer. Most HPV infections resolve spontaneously in six to 12 21
months and the majority of precancerous lesions regress due to immune response. Since only a 22
small proportion of HPV infections will eventually lead to cervical cancer, other cofactors are 23
required for cervical cancer development (6). Cofactors that modify the risk in HPV DNA 24
86
positive women include the use of oral contraceptives for five or more years, smoking, high 1
parity and previous exposure to other sexually transmitted diseases (7). 2
Szládek et al (8) reported that coinfection with a virus named Torque Teno Virus (TTV), 3
belonging to genogroup 1, and HPV promotes the progression of squamous cell carcinoma of the larynx 4
and is associated with an unfavorable prognosis. This TT virus was first described in patients with 5
posttransfusion hepatitis by Nishizawa et al (9), who designated this agent as TTV after the initials of the 6
patient in whom it was discovered. The viral genome is a circular molecule of negative-sense single 7
stranded DNA of approximately 3.8 kb and is organized in at least two open reading frames and a 8
noncoding region (UTR) containing regulatory elements believed to be involved in virus replication (10). 9
Several studies have shown that TTV is distributed widely throughout the world 10
(11),(12). 11
No pathological role for TTV infection has been established; however, the high prevalence of the 12
virus in the general population leads to frequent coinfections with other viruses (13). The role of TTV in 13
HPV infection and progression to cervical cancer have never been related. 14
The aim of the present study was to investigate TTV presence in HPV suggestive women and in 15
controls, in order to elucidate any possible influence on cancer development. 16
17
METHODS 18
Patients. Following approval from the Human Ethics Committee of the Londrina State 19
University and Maringa State University, peripheral blood cells were collected from 117 20
Brazilian women. Molecular analyses were performed at the State University of Londrina, 21
Parana, Brazil. The samples were examined to investigate the presence of TTV and were 22
87
collected from women during routine Pap smears, while screening for cervical cancer. They 1
were divided into two groups, HPV suggestive and HPV negative groups. 2
TTV DNA Detection. Genomic DNA was isolated from 5 mL of peripheral blood cells (PBCs) 3
extracted from total blood in the presence of 0.2M NaCl, 0.25% SDS, for 4h at 37ºC. After 4
precipitation with ethanol, the pellets were dried and resuspended in 50 µL of milli-Q water. The 5
presence of TTV DNA was determined by nested PCR (Polymerase Chain Reaction) using a set 6
of four primers: in the first PCR, RD037 sense: 5´ GCA GCA GCA TAT GGA TAT GT 3´ and 7
RD038 anti-sense: 5´ TGA CTG TGC TAA GGC CTC TA 3´ were used and; in the second 8
PCR, RD051 sense: 5´ CAT ACA CAT GAA TGC CAG GC 3´ and RD052 anti-sense: 5´ GTA 9
CTT CTT GCT GGT GAA AT 3´ were used. The PCR product in this system is a DNA 10
fragment of 197bp located in a region of the large open reading frame (ORF-1) that has been 11
named region N22. Reaction conditions for the two PCR rounds were the same (20 mM Tris-12
HCl pH 8.4, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl
2
, 200 mM dNTP and 1.25 units of Taq polymerase) and 13
consisted of an initial denaturation step of 94
o
C for 5 min, followed by 35 cycles of 94
o
C for 1 14
min, 55
o
C for 1 min, 72
o
C for 1 min and a final extension of 72
o
C for 10min using a 15
thermocycler (PCR Sprint, ThermoHybaid, Ashford, Middlesex, UK). PCR products of 197bp 16
were analyzed by electrophoresis on 10% acrylamide gel and detected by a nonradioisotopic 17
technique using a commercially available silver staining method. 18
Sequencing. The PCR products were purified using the QIAquick Gel Extraction Kit Protocol 19
(QIAgen, Hilden, Germany). After purification, PCR
â
4-TOPO
â
Vector plasmid (Carlsba, 20
California, USA) was used for linked reaction and transformation into Escherichia coli DH5 in 21
accordance with the manufacturer’s instructions. Plasmid DNA was obtained using the GFX 22
Micro Plasmid Prep Kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc, Piscataway, NJ, USA). DNA was 23
sequenced using the DYEnamic
TM
ET dye terminator cycle sequencing kit (Amersham 24
88
Pharmacia Biotech Inc) in a MegaBace
TM
sequencer (Amersham Pharmacia Biotech Inc). 1
Sequence analysis of TTV was performed and compared with data in the NCBI-NIH database 2
(Blastn), available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast (14). 3
Statistical analysis 4
The data were analyzed by the Chi square (χ²) test, with the level of significance set at p<0.05. 5
Demographic characteristics were evaluated by ANOVA using Microcal Origin™ 4.1 software. 6
7
RESULTS 8
9
In this study, DNA samples from 117 Brazilian women aged 13-81 years-old were 10
analyzed, including 43 women negative for HPV and 74 patients suggestive of HPV after routine 11
Papanicolaou examinations (Table 1). 12
13
Table 1. Distribution of HPV negative individuals and HPV suggestive patients according to age. 14
HPV (-)
(43)
HPV+
(74)
Age (years) 13-28 3 12
29-44 8 35
45-60 18 19
61-76 10 7
77-92 4 1
15
16
Among the HPV suggestive women, an age prevalence of 29-44 years-old was found, 17
whereas among women negative for HPV an age prevalence of 45-60 years-old was found. 18
Among the 74 HPV suggestive women, observation showed that 60 (81%) were negative 19
and 14 (19%) presented a positive diagnostic for cancer, of which 10 patients developed invasive 20
epidermoid cancer. The age of the cancer patients ranged between 29 and 74 years-old. 21
89
In this work, TTV presence in peripheral blood cells was assessed in all samples, using 1
primers for the N22 region of the large ORF-1 that amplify a 197bp DNA fragment. Figure 1 2
shows the TTV DNA detection, which was amplified by nested PCR for HPV negative and HPV 3
suggestive patients. 4
5
200pb
L 29 31 32 34 C+
200pb
L 43 46 50 51 C+ BL
Figure 1A
6
7
8
200pb
200pb
Figure 1B
L 1 4 5 13 14 15 C+
L 16 19 20 21 22 23 29 30 32 35 BL
9
Figure 1. Detection of TT virus. 1A – HPV negative patients. 2A – HPV suggestive patients. PCR products were 10
submitted to electrophoresis in 10% silver-stained acrylamide gels. Amplicons of 197 bp correspond to TTV-DNA. 11
L – ladder 100 bp (Invitrogen); Bl – blank reaction; C+ – positive control for TTV . 12
13
TTV DNA presence was observed in 18.6% (08/43) of HPV negative individuals and in 14
24.32% (18/74) of HPV suggestive patients. TTV presence was also investigated in the HPV 15
suggestive patient group, in order to compare cancer and noncancer patients. TTV DNA was 16
significantly more prevalent in HPV suggestive patients presenting cancer (57.14%; 08/14) 17
compared to HPV suggestive noncancer patients (16.67%; 10/60) (Figure 2). 18
19
90
0
10
20
30
40
50
60
57,14%
16,67%
With cancer TTV+
Without cancer TTV+
Number of patients
1
Figure 2. Detection of TTV DNA in HPV suggestive patients. TTV detection was realized 2
as described in Material and Methods. A lower prevalence of TTV DNA occurred among noncancer patients when 3
compared to patients that developed cervical cancer. (c² = 10.07; 1 degree of freedom; p<0.01). 4
5
To analyze primer specificity, the samples were sequenced and compared with data in the 6
National Center for Biotechnology Information (NCBI) NIH database. The analysis 7
demonstrated that the amplified fragment was compatible with a sequence of TTV in the 8
GenBank, under accession AJ244132. 9
10
DISCUSSION 11
12
It is well established that high-risk HPV infection causes cervical cancer. HPV is the 13
most prevalent sexually transmitted viral infection among both men and women. It is estimated 14
that 80% of sexually active adults have been infected with at least one HPV type (15). 15
91
The present work analyzed DNA samples from 117 Brazilian women, including 43 1
individuals negative for HPV and 74 patients suggestive of HPV after routine Papanicolaou 2
examinations. 3
No difference in age range was observed between the HPV suggestive women who 4
presented no cancer and those that developed cervical cancer, with age ranging from 13-81 and 5
29-74 years-old, respectively. 6
Cancer progression was verified in 19% (14/74) of HPV suggestive women, of which 10 7
developed invasive epidermoid cancer. 8
Even though infection with oncogenic HPV genotypes is frequent among sexually active 9
women, most of cases are self-limiting; the development of malignant cervical lesions only 10
occurs in a small proportion of infected women that harbor persistent infections involving 11
oncogenic genotypes. 12
HPV infection alone is not sufficient to elicit cervical cancer development. Certain 13
endogenous and exogenous factors can act as cofactors by influencing the risk of HPV 14
persistence and cancer progression. TTV replication has been demonstrated in hepatocyte and 15
leukocyte cell lines (16). Barril et al (17) verified the presence of TTV in serum and peripheral 16
mononuclear cells from continuous ambulatory peritoneal dialysis using primers for the ORF1 17
and ORF 2 regions of TTV. It has been suggested that while concealed like a “Trojan horse”, 18
TTV in peripheral blood cells might serve as a TTV reservoir, inducing infection and 19
transmission chronicity in certain clinical and epidemiological settings (18). 20
TTV was originally thought to be a candidate for a new hepatitis virus and although its 21
role in liver disease remains controversial, until its pathogenic potential is fully characterized, it 22
will remain relevant to investigate its implications in individuals presenting coinfections with 23
other viruses (13). 24
92
This study investigated TTV DNA in the peripheral blood cells of HPV negative and 1
HPV suggestive patients. In the HPV negative individuals, 18.6% (8/43) presented TTV and 2
24.32% (18/74) HPV suggestive patients. Despite the fact that no statistically significant 3
differences occurred between these groups, TTV-DNA was higher in the HPV suggestive patient 4
group. Normally, RT-PCR products are detected in agarose gels, but all the products of this work 5
were detected in acrylamide gels, since these are more sensitive than agarose for this type of 6
detection. The cloned positive PCR samples were compared with the GenBank database and the 7
resulting sequences revealed confirmed identification with GenBank TTV sequences. 8
For TTV DNA detection, N22 primer sets were used. It has been verified that when using 9
PCR with UTR primers, TTV DNA is detected in a very high percentage of samples. TTV DNA 10
was detected by UTR PCR at a high frequency (93%), with no difference in prevalence between 11
blood donors presenting elevated ALT levels and those presenting normal levels. These results 12
demonstrated by Itoh et al (19) indicate that the selection of PCR primers influences TTV DNA 13
detection. Furthermore, these results suggest that restricted TTV genotypes detected by N22 14
PCR could be associated with liver damage among blood donors. The use of PCR with N22 15
primers was shown to detect viral strains associated with hepatitis of unknown etiology. Hu et al 16
(20) investigated the ability of specific primer sets to detect known TTV genotypes and verified 17
that the set of primers RD037/038/051/052 only amplified PCR products for genotype 1. 18
Therefore, in this work the presence of TTV DNA in the peripheral blood cells was investigated 19
using N22 primers specific for TTV genotype 1. 20
Other factors pertaining to HPV infection, such as variants, viral load, viral integration 21
and multiple infections may modify viral-host biological interaction and play a role in the 22
development of cervical cancer. 23
The irregular regeneration of hepatocytes in TTV positive patients has been described as 24
significantly higher than that found in TTV negative patients (21). Kooistra et al (22) has 25
93
proposed that TT virus-derived apoptosis-inducing protein preferentially induces apoptosis in 1
hepatocellular carcinoma-derived cells. Camci et al (23) described a high prevalence of TTV in 2
cancer patients. Therefore, the presence of TTV was also investigated regarding the HPV 3
suggestive patient group presenting cancer. TTV was significantly more prevalent among HPV 4
suggestive patients (57.14%; 8/14) than among detected HPV suggestive noncancer patients 5
(16.67%; 10/60) (p<0.01). 6
Many reports state that although TTV does not appear to contribute to the development of 7
human hepatocellular carcinoma from chronic liver disease, it may be a risk factor for the 8
development of hepatocellular carcinoma in patients presenting type C liver disease (24),(25). 9
In conclusion, TTV is more prevalent in patients suggestive of HPV presenting cervical 10
cancer. Although the pathogenesis of TTV remains unknown, it may be a risk factor for the 11
development of cancer in patients suggestive of HPV that present TTV coinfection. 12
13
ACKNOWLEDGEMENTS 14
The authors would like to acknowledge the volunteers who made this study possible. This study 15
was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), 16
the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and the Londrina 17
State University Coordination for Postgraduation (PROPPG-UEL). Patricia Sayuri Suzuki is a 18
fellow of CAPES. 19
20
94
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18
98
ANEXO V 1
ARTIGO 2 2
TÍTULO: Investigating association of chemokine receptor 5 (CCR5) polymorphism with 3
cervical cancer in human papillomavirus (HPV) suggestive patients. 4
ABSTRACT 5
Cervical cancer development is a multi-step process. The major steps are HPV infection 6
and HPV persistence for over one year, followed by slow progression to precancerous lesions, 7
and eventually to invasive cancer. It is known that chemokines are important determinants of the 8
early inflammatory response. Physiologically, chemokine receptors mediate the chemotaxis of T 9
cells and phagocytes to areas of inflammation. The CC chemokine receptor 5 (CCR5) gene 10
product is a member of the seven transmembrane G-protein-coupled receptor family, which 11
responds to normal beta-chemokine ligands, and is involved in the chemotaxis of leukocytes 12
toward inflammation sites. In the present study, polymerase chain reactions (PCR) in genomic 13
DNA samples, using specific CCR5 oligonucleotide primers surrounding the breakpoint 14
deletion, detected a 225bp product from the normal CCR5 allele and a 193bp product from the 15
32bp deletion allele. 16
The wild type genotype was prevalent in both group, but it wasn´t statistically significant 17
with χ² =1,519 (2 degrees of freedom; p>0.05). Once there is a small number of D32 allele 18
carriers, further studies are needs to clarify the role of CCR5 in the cervical cancer. 19
Keywords: cervical cancer, CCR5, HPV, 20
99
INTRODUCTION 1
There were about 500 000 incident cases of and 275 000 deaths due to cervical cancer 2
worldwide in the last years, equivalent to about a tenth of all deaths in women due to cancer 3
(Parkin et al., 2005). The burden of cervical cancer is disproportionately high (>80%) in the 4
developing world (Parkin and Bray, 2006). 5
Cervical cancer development is a multi-step process. The major steps are HPV infection 6
and HPV persistence for more than one year, followed by slow progression to pre-cancerous 7
lesions ant to invasive cancer. The risk factors for persistence and pre-cancer have not been 8
disentangled (Kjaer et al., 2006; Shiffman et al., 2007), as well the relative importance of genetic 9
and environment factors in the development of cervical tumors are not known yet (Zheng et al., 10
2006). 11
In addition to the loss of cellular control mechanisms, the role of antigen-specific tumor 12
infiltrating leukocytes and other immunocompetent cells have been considered as decisive 13
factors in cervical pathogenesis (O´Brien et al., 2001; Evans et al., 1997). As well microbial 14
persistence in or around epithelial cells may lead to a chronic inflammatory state resulting in 15
increased epithelial cell turnover, and provides a stimulus for recruitment and activation of 16
inflammatory cells from the blood stream (Moss and Blaser, 2005). 17
Chemokines and their receptors expression have shown a potential function in immunity 18
against cervical tumor (Ghaderi et al., 2000; Kleine-Lowinski et al., 1999; Ohta et al., 2002). 19
They are small chemotactic cytokines that direct the migration of leukocytes during 20
inflammation and organize homing of lymphocytes and macrophages into secondary lymphoid 21
organs. Chemokines also promote the adhesiveness of target cells, regulate angiogenesis and 22
may consequently control tumor growth (Rossi and Zlotnik, 2000). The receptors for 23
chemokines are mainly expressed on immune and inflammatory cells, such as B- and T-24
lymphocytes and professional antigen-presenting cells in which ligand-receptor interactions on 25
these cells lead to cell migration (Zheng et al., 2006). 26
Since cytokines, chemokines and free radicals initiate and perpetuate inflammatory 27
responses, gene polymorphisms or genetic variations in immune related genes might be related 28
to HPV persistence and progression to cancer (Moss and Blaser, 2005). 29
CC chemokine receptor 5 (CCR5) is involved in the chemotaxis of leukocytes toward 30
inflammatory sites (Baggiolini, 1998), and is present only in certain cell types, as lymphocytes, 31
dendritic cells and macrophages (Loetscher et al., 1998). 32
100
CCR5Δ32, a mutant allele of CCR5 receptor gene, has been characterized and it causes 1
significant defects in the chemotaxis mediated by CCR5 ligands. Therefore the aim of this study 2
was to investigate the association of human papillomavirus (HPV) infection and cancer 3
progression to chemokine receptor 5 (CCR5) polymorphism. 4
5
6
METHODS 7
8
Patients. Following approval from the Human Ethics Committee of Londrina State University 9
and Maringa State University, peripheral blood cells were collected from 117 Brazilian women. 10
Molecular analyses were performed at Londrina State University, Parana, Brazil. They were 11
divided into two groups, HPV suggestive and HPV negative groups. The samples were collected 12
from women under Pap smears routine proceedings for screening of cervical cancer. 13
DNA extraction: Genomic DNA was isolated from peripheral blood cells using the technique 14
described by Miller (1988). Briefly, DNA was extracted from whole blood in the presence of 15
0.2M NaCl and 0.25% SDS, for 4h at 37ºC. After precipitation with ethanol, the pellet was dried 16
and resuspended in 50µL of milli Q water. 17
CCR5 Genotyping. DNA was analyzed using polymerase chain reaction (PCR) with specific 18
primers for CCR5 which were, Primer sense: 5' ACC AGA TCT CAA AAA GAA 3’ and 19
Primer anti-sense: 5' CAT GAT GGT GAA GAT AAG CCT CA 3', GenBank Accession 20
number: AF009962. Reaction conditions for the PCR rounds were the same (20 mM Tris-HCl 21
pH 8.4, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 200mM dNTP and 1.25 units of Taq polymerase). PCR 22
procedure was 5 min denaturation at 94°C, 35 cycles of 1 min at 94°C, 1 min at 58°C and 1 min 23
at 72°C, and 10 min elongation at 72°C, carried out in a thermocycler (PCR sprint, 24
ThermoHybaid, Ashford, Middlesex, UK). All DNA amplification reactions were performed 25
with appropriate negative controls in parallel to detect contamination at each step of the 26
procedure. PCR products of 225 and 193 base pairs were analyzed by electrophoresis in a 10% 27
acrylamide gel and visualized using silver staining method. 28
Statistical analysis. Data were analyzed by the chi-square (²) test with the level of significance 29
set at p<0.05. Demographic characteristics were evaluated by ANOVA, Microcal Origin™ 4.1. 30
31
RESULTS 32
101
In this study DNA samples from 117 Brazilian women, aged 13-81 years old, were 1
analyzed, including 43 women negative for HPV and 74 patients suggestive of HPV after 2
Papanicolaou examinations (Table 1). 3
4
Table 1. Distribution of HPV negative patients and HPV suggestive patients according to age. 5
6
HPV (-)
(43)
HPV+
(74)
Age
(years)
13-28 3 12
29-44 8 35
45-60 18 19
61-76 10 7
77-92 4 1
7
8
Among the HPV suggestive women, an age prevalence of 29-44 years-old was found, 9
whereas among women negative for HPV was observed an age prevalence of 45-60 years-old. 10
Although there is a slightly prevalence of women aged 29-44 years old, there was no significant 11
difference when both groups were compared (p=0,36347). 12
Figure 1 shows a breakdown of genotypes, wild-type (CCR5/CCR5) and Δ32 allele. 13
14
200pb
L 1 2 3 BL
15
Figure 1. CCR5 Genotype. The PCR products were detected using silver staining method in 16
poliacrylamide gel. L: DNA Ladder 100 pb; 1, CCR5 wild type homozygous genotype (225 pb); 17
2 heterozygous genotype (193 pb and 225 pb); and 3 variant allele homozygous genotype (193 18
pb) and BL represents Blank reaction. 19
20
21
102
The analysis of CCR5 gene polymorphism shows that genotype distribution is similar 1
between HPV negative individuals and HPV suggestive patients (Table 2). 2
3
4
Table 2. Genotypic and allelic frequencies for the Δ32 and wt alleles of CCR5. 5
6
Genotype (117)
a
Allelic frequency
Study
subjects
Number of
samples
CCR5/CCR5 CCR5/Δ32 Δ32/ Δ32
wt
Δ32
HPV
negative
43
*
38 04 01 0.93 0.07
HPV
suggestive
74
**
70 03 01 0.97 0.03
*
HWE = 3,429 7
**
HWE = 13,48 8
a
HPV negative patients X HPV suggestive patients χ² =1,47 (2 degrees of freedom; 9
p>0.05) 10
11
12
Regarding genotype distribution, the HPV negative patients group is in accordance to 13
Hardy Weinberg equilibrium, however HPV suggestive patients group showed a significant 14
deviation from Hardy Weinberg equilibrium, what may be supported by the small sample 15
numbers. 16
In both groups, the wild type genotype was more prevalent, and there was no significant 17
difference in genotype and allele distribution between analyzed groups (p>0,05). In spite of the 18
wt/wt genotype predominance, 11,6% from HPV negative individuals were D32 allele carriers 19
comparing with 5,4% from HPV suggestive patients. 20
Among the 74 HPV suggestive women, 60 (81%) were negative and 14 (19%) presented 21
a positive diagnostic for cancer, of which 10 patients developed invasive epidermoid cancer. The 22
age of the cancer patients ranged between 29 and 74 years-old. 23
Among cervical cancer patients (n=14) 13 patients presented the wild type genotype and 24
only one patient presented the heterozygous genotype. 25
26
103
1
DISCUSSION 2
3
Human papillomavirus (HPV) is common throughout the world. Although most 4
infections with HPV cause no symptoms and are self-limiting, persistent genital HPV infection 5
can cause cervical cancer in women (zur Hausen, 1987; Walboomers et al., 1999). 6
The present work analyzed DNA samples from 117 Brazilian women, including 43 7
individuals negative for HPV and 74 HPV suggestive patients after routine Papanicolaou 8
examinations. 9
It was observed no difference in age range between HPV suggestive women without 10
cancer and the ones that developed cervical cancer, aged 13-81 and 29-74 years old, respectively. 11
Cancer progression was verified in 19% (14/74) of HPV suggestive women, of which 10 12
developed invasive epidermoid cancer. Since only a small proportion of HPV infections will 13
eventually lead to cervical cancer, other cofactors are needed for cervical cancer development 14
(Schiffman and Kjaer, 2003). The relative importance of genetic and environment factors in the 15
development of cervical tumors is not known yet (Zheng et al., 2006). 16
Chemokines are important determinants of the early inflammatory response. It is known 17
that chemokines have the potential to stimulate T-cell activation, although the pattern of 18
activation may differ for different chemokine-chemokine receptor interactions (Nanki and 19
Lipsky, 2001). CCR5 plays an important role in the recruitment of macrophages, monocytes and 20
T cells in inflammation (Panzer et al., 2005, Spagnolo et al., 2005) driving an immune response 21
involving a Th1 cytokine pattern (Loetscher et al., 1998). 22
The CC chemokine receptor 5 (CCR5) delta 32 variant results in a non-functional form of 23
the chemokine receptor, which is incapable of binding beta chemokines (RANTES, MIP-1alpha, 24
MIP-1beta). CCR5Δ32 causes significant defects in the chemotaxis mediated by these ligands, 25
once CCR5Δ32 deletion may alter expression or the function of the protein product (Yang et al., 26
2004; Smith et al., 1997). Recent evidence has also demonstrated the role of CCR5 in a variety 27
of human diseases, ranging from infectious and inflammatory diseases to cancer (Balistreri et al., 28
2007). 29
Host immunity, particularly T cell immunity (Th1/Th2 balance), plays an important role 30
in clinicopathological features of malignant disease (Fujii et al., 2004). Vaday et al. (2006) 31
suggested that the pathogenesis of prostate cancer is influenced by inflammation, specially by 32
inflammatory chemokines, such as CCL5 (RANTES). 33
104
Oliveira et al. (2007) has proposed that leishmaniasis patients with mucocutaneous 1
lesions present a stronger T-cell response and that delta32 carriers could have had a weaker 2
inflammatory immune response and migratory capacity due to the non-functional chemokine 3
receptor. 4
Although there was no difference in CCR5Δ32 distribution between assessed groups in 5
the present work, it was observed that 92,8% (13/14) of cancer patients presented the wild type 6
genotype, and only one patient presented the variant allele in heterozygous state. What may be 7
explained by a stronger inflammatory response, due HPV infection in wild type patients. 8
In conclusion, it was not observed any correlation between human papillomavirus (HPV) 9
infection and chemokine receptor 5 (CCR5) polymorphism. However, due to the small number 10
of Δ32 allele carriers examined and since CCR5 in an inflammatory chemokine, further studies 11
are needed to elucidate CCR5 role in cervical cancer pathogenesis. 12
13
ACKNOWLEDGEMENTS 14
This study was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - 15
CNPq, and Patricia Sayuri Suzuki received a fellowship from CAPES (Coordenação de 16
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES) and Pro-Reitoria de Pós-Graduação - 17
Londrina State University- PROPG-UEL. We acknowledge Prof. Philip Sidney Pacheco Badiz 18
for English correction 19
20
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14
15
16
108
ANEXO VI - CAPÍTULO DE LIVRO 1
2
TÍTULO DO LIVRO: Educar para a preservação da saúde e da qualidade de vida - 3
Organizador: Sandra Odebrecht Vargas Nunes. 4
5
CAPÍTULO 3 6
7
8
9
Maria Angelica Ehara Watanabe 10
Sandra Odebrecht Vargas Nunes 11
Patricia Sayuri Suzuki 12
13
14
15
16
Infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) 17
Infecção pelo Papilomavirus Humano (HPV) 18
Coinfecção pelo HIV e HPV 19
20
21
“Os homens que sabem o porquê, 22
podem adaptar-se a qualquer circunstância” 23
FREDERICH NIETZSCHE 24
25
109
1
Na adolescência, as relações sexuais têm início precoce e com maior número de 2
parceiros, o que contribui para aumentar a ocorrência das infecçõesw sexualmente transmissíveis 3
como por HIV e HPV. Entre adolescentes, o uso de preservativos é baixo e a atividade sexual 4
não é programada. Estudos brasileiros revelam que apenas um terço deles ou menos usa 5
preservativo em todas as relações sexuais. Segundo dados de pesquisa divulgados pelo 6
Ministério da Saúde, os mais baixos índices de uso de preservativos se encontram entre jovens 7
com 15 e 19 anos de idade. 8
3.2 Infecção pelo Papilomavirus Humano (HPV) 9
10
O condiloma acuminado é uma lesão na região genital, causada pelo vírus 11
Papilomavirus Humano (HPV). A doença é também conhecida como crista de galo, figueira ou 12
cavalo de crista. O HPV provoca verrugas com aspecto de couve-flor e de tamanhos variáveis 13
nos órgãos genitais. Pode ainda estar relacionado ao aparecimento de alguns tipos de câncer, 14
principalmente no colo do útero, mas também no pênis ou no ânus. Porém, nem todo caso de 15
infecção pelo HPV irá causar câncer. 16
A maioria destas infecções é temporária, porém uma pequena porção de mulheres 17
infectadas com subtipos de alto risco apresenta infecções persistentes e estão mais propensas a 18
desenvolver lesões cervicais malignas. A persistência da infecção pelo HPV é devida, 19
principalmente, a sua habilidade de evadir-se do sistema imune. Infecções são comumente 20
transmitidas por contato sexual e resultam inicialmente em lesões discretas. No Brasil, estima-se 21
que o câncer de colo do útero seja a quinta neoplasia maligna mais comum entre as mulheres, 22
sendo superado pelo câncer de pele (não-melanoma) e pelo câncer de mama. Estudos 23
epidemiológicos apontam para uma alta incidência de infecção em mulheres jovens e para um 24
decréscimo da infecção com a idade. Infecções persistentes representam o fator de risco mais 25
significativo para desenvolvimento de câncer cervical em mulheres idosas. 26
110
Papilomavirus humano (HPV) de alto risco é um fator necessário para o desenvolvimento 1
de câncer cervical. Contudo, somente uma pequena proporção de mulheres infectadas pelo HPV 2
desenvolverá câncer cervical; muitos outros co-fatores podem aumentar a persistência da 3
infecção e sua oncogênese. 4
Câncer cervical é o câncer da cérvice uterina, sendo este tipo o que mais afeta as 5
mulheres nos países em desenvolvimento. Tem sido estimado que esta patologia é responsável 6
por quase 260.000 mortes em 2005, os quais 80% ocorreram em países em desenvolvimento 7
(WHO, 2007). 8
O trato genital inferior feminino compreende quatro discretas regiões anatômicas 9
(Pudney et al., 2005): O intróito, o qual está recoberto por um epitélio escamoso estratificado 10
ceratinizado parecido com a pele; a mucosa vaginal, o qual é recoberto por um epitélio escamoso 11
estratificado não-ceratinizado, aglandular; a ectocérvice, o qual é recoberto por uma mucosa 12
histologicamente similar ao da vagina; a endocérvice, que consiste num epitélio colunar com 13
numerosas glândulas (pseudo-glândulas). 14
A zona de transformação (TZ) ou junção escamo-colunar (JEC) representa uma 15
abrupta transição entre a ectocérvice e endocérvice, sendo o principal local de infecção pelo 16
papilomavírus humano (HPV) (Pudney et al., 2005). É estimado que o HPV cause 17
aproximadamente meio milhão de novos cânceres cada ano (WHO, 2007). 18
O HPV é um vírus DNA dupla-fita circular, com aproximadamente 8000 pares de 19
bases contidos num capsídeo icosaédrico de aproximadamente 55nm de diâmetro (Munger et al., 20
2004; Sinal & Woods, 2005) e infecta as células da pele ou mucosa (de Villiers, 1997). 21
Existem mais de 100 genótipos de HPV conhecidos, os quais foram numerados de 22
acordo com a ordem de descoberta (de Villiers, 1997). 23
Diferentes HPVs são geralmente agrupados de acordo com sua associação com 24
câncer cervical ou lesões pré-cancerosas e sua seqüência genômica em: tipos de alto risco de 25
111
câncer (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82), tipos de prováveis 1
causadores de câncer de alto risco (26, 53 e 66) e tipos de baixo risco de câncer (6, 11, 42, 43, 2
44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89). HPVs de baixo risco são encontrados principalmente em verrugas 3
genitais, enquanto HPVs de alto risco são encontrados em câncer cervical e lesões pré-4
cancerosas (Munoz et a.l, 2003). 5
HPV16 e HPV18 são os dois tipos de HPV mais carcinogênicos, sendo responsáveis 6
por 70% do câncer cervical e aproximadamente 50% da neoplasia intraepitelial cervical (CIN3) 7
(Smith et al., 2007); em contraste HPV 6 e HPV 11 são responsáveis por aproximadamente 90% 8
das verrugas genitais (Schiffman et al., 2007). 9
Uma maior prevalência de HPV é encontrado em mulheres sexualmente ativas menores 10
de 25 anos de idade. O HPV genital é encontrado em aproximadamente 10-40% dessas 11
mulheres. A maioria dessas infecções parece ser auto-limitada e não está associada com 12
alterações citológicas detectáveis pela triagem do Papanicolaou. A minoria das mulheres HPV-13
positivo desenvolvem alterações citológicas de baixo grau (Becker et al.,1991; de Villiers et 14
al.,1992; Schiffman, M.H., 1992). A maior incidência de lesões de alto grau ocorrem em 15
mulheres com mais de 25 anos de idade, enquanto que a maior incidência de câncer cervical 16
ocorrem em mulheres com mais de 35 anos (Schiffman, M.H., 1992). Estes achados sugerem que 17
HPV de alto risco, normalmente produzem uma infecção inaparente transitória na área cérvico-18
vaginal. Algumas mulheres desenvolvem uma infecção persistente nesse tecido, talvez como 19
resultado de um mecanismo de defesa deficiente. Lesões persistentes podem progredir para 20
câncer cervical nessas mulheres (Lowy et al., 1994). 21
O rastreamento com o esfregaço de Papanicolaou é muito eficaz na prevenção do 22
câncer cervical porque a maioria dos cânceres é precedida por uma lesão pré-cancerosa. Essa 23
lesão pré-cancerosa pode permanecer em um estágio não invasivo durante um período muito 24
longo de tempo (por exemplo, 20 anos) e desprender células anormais que podem ser detectadas 25
112
pelo exame citológico (Robbins & Cotran, 2007) e são usualmente classificados em dois 1
sistemas (Richart, 1973). 2
O sistema Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) foi introduzido em 1973 e é 3
baseado na arquitetura tecidual (Richart, 1973). NIC1 refere-se à células anormais ocupando o 4
1/3 da região mais superficial do estrato epitelial cervical, NIC2 indica que 2/3 do epitélio está 5
sendo ocupado e NIC3 indica que toda camada epitelial está ocupada. NIC1, NIC2 e NIC3 6
descrevem diferentes processos – NIC1 indica uma infecção por HPV auto-limitada, e NIC2 ou 7
NIC3 são efetivos precursores de câncer cervical (Kiviat & Koutsky, 1993). Em 1988 foi 8
introduzido outro sistema da classificação, o Sistema Bethesda. Este classifica anormalidades 9
citológicas em: lesão intraepitelial de baixo grau (LSIL) ou lesão intraepitelial de alto-grau 10
(HSIL) (Solomon et al., 2002). LSIL corresponde ao NIC1 e infecção por HPV; e HSIL 11
corresponde ao NIC2, NIC3 e carcinoma in situ. 12
Existem dois tipos principais de câncer cervical: Carcinoma de células escamosas e 13
adenocarcinoma. Aproximadamente 80% dos cânceres cervicais são carcinoma de células 14
escamosas, enquanto os 20% restante são adenocarcinomas e câncer cervical de outras origens 15
(DiSaia PJ, 1997). 16
O desenvolvimento de câncer cervical está fortemente associado com infecção genital de 17
tipos oncogênicos de papilomavirus humano (HPV). Contudo a maioria das mulheres infectadas 18
por HPV nunca desenvolveram câncer, então, parecem ser necessários fatores adicionais. A 19
relativa importância de fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento do tumor cervical 20
ainda é desconhecida (Zheng et al., 2006). 21
22
23
3.3 Co-infecção pelo HPV e HIV 24
113
Estudos recentes têm demonstrado haver um microambiente imunológico no trato genital 1
feminino, e a resposta imune é afetada por hormônios bem como infecções e processos 2
inflamatórios (Pudney et al., 2005). 3
A imunidade humoral no trato genital feminino é mediada pela ação das imunoglobulinas 4
IgA e IgG secretadas em abundância na lâmina própria da endocérvice e em escassez na vagina 5
(Cohen & Anderson, 1999). Entretanto, ao contrário da resposta humoral do pulmão e intestino, 6
há um predomínio de IgG ao invés da IgA no trato genital (Johansson & Lycke, 2003). 7
Tem sido documentado, que outros mecanismos participam na resposta imune humoral, 8
tais como produção de moléculas antimicrobianas tais como lisozimas, lactoferrinas, inibidor da 9
serina leucócito protease, alfa- e beta-defensinas produzidas pelo epitélio celular e outros locais 10
no trato genital feminino (Johansson & Lycke, 2003). 11
A imunidade mediada por células (CMI) em mulheres sem inflamação é mediada por 12
células T (predominantemente céluas T CD8+) e células apresentadoras de antígenos (APC), os 13
quais estão prevalentemente localizados na zona de transformação (TZ) e ectocérvice. Em 14
contraste, na mucosa vaginal normal há poucas células T e APCs (Pudney et al., 2005). 15
Dentre as APCs, as células de Langerhans são as principais células responsáveis pela 16
resposta imune cutânea e das mucosas no baixo trato genital feminino. As células de Langerhans 17
são células dendríticas especializadas, e uma vez processado o antígeno, elas migram para fora 18
do epitélio até uma região rica em células T nos linfonodos e apresentam o antígeno processado, 19
induzindo assim a resposta imune primária (Taube et al., 2007). 20
Não está bem estabelecido qual o primeiro local de infecção no trato genital feminino 21
pelo HIV-1+. Pudney et al. (2005) sugerem ser a cérvice o primeiro local de infecção por este 22
vírus, e inflamação neste local aumenta o risco de transmissão do HIV, uma vez que cervicites e 23
vaginites aumentam o número de linfócitos CD8+ e CD4+ intraepiteliais e também de APCs. 24
114
Clinicamente, infecções por HIV estão associadas com um aumento na incidência e 1
persistência da infecção por HPV, o qual por sua vez está associado com um aumento na lesão 2
intraepitelial escamosa de alto grau e câncer cervical invasivo (Vermud et al., 1991; Sun et al., 3
1997). 4
Mulheres infectadas pelo HIV apresentam um aumento de 16 vezes do condiloma 5
venéreo e neoplasia intraepitelial, e um aumento de 3,3 vezes na recorrência e persistência da 6
neoplasia intraepitelial vulvar quando comparados com mulheres HIV negativo (Conley et al., 7
2002; Korn et al., 1996). 8
O subtipo HIV-2 é geralmente menos patogênico do que o HIV-1, na verdade, parece ser 9
uma forma atenuada deste último subtipo (Reeves & Doms, 2002). Indivíduos infectados com 10
HIV-2 geralmente têm um longo período de latência clínica (10 anos ou mais), resultando numa 11
taxa de mortalidade duas vezes menor quando comparados com os indivíduos infectados pelo 12
HIV-1 (Marlink et al., 1994; Whittle et al., 1994). Isto pode ser atribuído à baixa virulência, 13
menor declínio da contagem de células CD4, menor carga viral plasmática e um melhor controle 14
imune da replicação associado com HIV-2 relativo ao HIV-1 (Gottlieb et al., 2002; Zheng et 15
al.,2004). 16
Rowhani-Rahbar et al. (2007) demonstraram que pacientes HIV positivo apresentam uma 17
redução de 69% do clearance da infecção por HPV comparados com pacientes HIV negativo, e 18
dentre os pacientes HIV posivito, aqueles contaminados com o subtipo HIV-2 apresentaram um 19
clearance do HPV mais efetivo quando comparados com pacientes contaminados com o subtipo 20
HIV-1, no entanto, essa associação foi significantemente atenuada quando considerou-se a 21
contagem de células CD4 . 22
O IARC (International Agency for Research on Câncer) relata que o uso de 23
contraceptivos orais é um fator de risco para o câncer cervical em mulheres HPV positivo 24
(Syrjänem et al., 2006). Rezza et al. (1997) verificaram um aumento da lesão intraepitelial 25
115
escamosa em pacientes HIV positivo que usavam contraceptivos orais. Essa tendência pode ser 1
atribuída a um comportamento sexual diferente entre usuárias de contraceptivo oral, que muitas 2
vezes abandonam o uso de preservativos e com isso aumenta a transmissão de outros 3
microrganismos sexualmente transmissíveis tais como Clamydia trachomatis, o qual tem sido 4
relacionado em alguns estudos com aumento da persistência da infecção por HPV. 5
Indivíduos infectados com HIV constituem um grupo com maior predisposição a co-6
infecções diversas. A sobrevivência de pacientes infectados pelo HIV-1 é relacionada à 7
prevenção e ao tratamento eficazes de infecções oportunistas. 8
O Papiloma Vírus Humano ( HPV) tem recebido destaque uma vez que o vírus, pode 9
acarretar câncer de colo de útero e anal. Tem sido relatada a importância do profissional de 10
saúde intensificar o sistema de cuidado para o diagnóstico do HPV. 11
A co-infecção HIV / HPV pode diminuir o tempo da doença, aumentando as 12
chances do desenvolvimento de câncer. Como estratégia de diagnóstico, a indicação é a 13
realização de Papanicolau de 6 em 6 meses. Se o segundo exame for negativo, ele passa a ser 14
repetido apenas anualmente. A colposcopia é indicada apenas quando aparecerem células 15
atípicas no papanicolau. Também tem sido verificado aumento significativo do número de casos 16
de câncer anal em homens que fazem sexo com homens nos Estados Unidos infectados pelo 17
HPV. “A maioria das infecções é assintomática e não visível”. A incidência de câncer anal e 18
cervical em pessoas soropositivas é duas vezes maior, comparado às pessoas não infectadas pelo 19
HIV. É suposto que o HPV induz mudanças nas células. Há maior prevalência de câncer de colo 20
uterino entre mulheres negras americanas. A infecção pelo HPV em mulheres grávidas pode 21
gerar a contaminação da cavidade oral do bebê. 22
É amplamente documentado o maior risco de mulheres com imunossupressão 23
desenvolverem neoplasia intra-epitelial escamosa e neoplasia invasiva do trato genital. As 24
mulheres infectadas pelo HIV estão sob particular risco de desenvolvimento de neoplasias do 25
116
trato genital associadas ao HPV. Além disso, são reconhecidas as elevadas taxas de infecção 1
ano-genital pelo HPV e de neoplasias intra-epiteliais anais em homossexuais masculinos 2
infectados pelo HIV, bem como um aumento da freqüência de carcinoma anal invasivo entre 3
estes pacientes. 4
A imunossupressão associada ao HIV acelera ou modifica o curso clínico 5
habitualmente indolente da doença cervical causada pelo HPV. Este efeito pode variar de acordo 6
com o nível de disfunção imune, agravando-se nos casos de imunodeficiência mais avançada. 7
Portanto, o rastreamento e acompanhamento das pacientes infectadas pelo HIV é essencial para 8
que lesões precursoras intra-epiteliais sejam tratadas, evitando sua progressão para doença 9
cervical invasiva. 10
11
12
13
14
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