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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
MESTRADO
Análise da Estrutura e Herança dos Cromossomos
Supranumerários do Curimbatá (Prochilodus lineatus) Coletados no
Rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, SP
Tatiana Aparecida Voltolin
BOTUCATU, 2008
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
Tatiana Aparecida Voltolin
Análise da Estrutura e Herança dos Cromossomos Supranumerários
do Curimbatá (Prochilodus lineatus) Coletados no Rio Mogi-Guaçu,
Pirassununga, SP
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista, UNESP, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas. Área de Concentração: Zoologia.
Orientador: Dr. Fábio Porto-Foresti
BOTUCATU, 2008
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“Levantem os olhos sobre o mundo e vejam o
que está acontecendo a nossa volta, para que
amanhã não sejamos acusados de omissão, se
o homem, num futuro próximo, solitário e
nostálgico de poesia, encontrar-se sentado no
meio de um parque forrado de grama plástica,
ouvindo cantar um sabiá eletrônico, pousado
no galho de uma árvore de cimento armado.”
Manoel Pedro Pimentel
A minha família – Waldemar, Ester e Elvis, sempre
presentes em todas as etapas de minha vida.
Ao Nelson, pelo amor e carinho compartilhado
em todos os momentos de nossa vidas.
AGRADECIMENTOS
____________________________________________________________________
O meu agradecimento especial às instituições e pessoas que contribuíram de
alguma maneira para a realização deste trabalho, em particular:
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP –
05/58867-3), pelo auxílio concedido.
À Faculdade de Ciências da Universidade Estadual Paulista, câmpus de
Bauru e ao Departamento de Ciências Biológicas pelas condições oferecidas para a
realização deste trabalho.
Ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista, campus de
Botucatu, ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – AC. Zoologia, à
Seção de Pós-Graduação do Instituto e ao Departamento de Morfologia, pelo cordial
apoio.
Centro de Pesquisa e Gestão dos Recursos Pesqueiros Continentais/Instituto
Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, CEPTA/ICMbio, pela grandiosa
colaboração durante estes anos.
Ao Laboratório de citogenética molecular (Centro de Nacional de Energia
Atómica -Buenos Aires) pelo proveitoso estágio.
Ao Professor Fábio Porto-Foresti, pela oportunidade oferecida desde a
Iniciação Científica, pela atenciosa orientação, pelo apoio, incentivo e confiança
durante a realização deste trabalho e principalmente pelo seu dinamismo como
pesquisador.
Ao Professor Jehud Bortolozzi, pelo alegre convívio, carinhosa atenção e,
principalmente pelos valiosos ensinamentos como mestre e amigo durante estes
anos convivência.
Ao Professor Fausto Foresti, pelo incentivo, atenção e principalmente pelos
ensinamentos e sugestões as quais foram e sempre serão de grande valia no meu
caminho científico.
Ao pesquisador José Senhorini pela disponibilidade, ajuda e ensinamento
durante a Iniciação Científica e Mestrado, pelo trabalho realizado junto ao
CEPTA/ICMbio o qual foi de fundamental importância na concretização desta
pesquisa.
Aos amigos do Laboratório de Genética de Peixes (LaGenPe) da UNESP-
Bauru: Aline, Álvaro, Ana, Carol, Diogo, Fernanda, Jake, Josi, Keila Paiva, Luiza,
Nayara e Vanessa, pela harmoniosa convivência e pela amizade.
Aos amigos do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes da UNESP-
Botucatu, pela atenção e ajuda em diversas etapas deste trabalho.
Ao amigo Renato Devidé, pela amizade, agradável convívio e principalmente
por toda a ajuda na parte experimental e nas inúmeras idas e vindas ao
CEPTA/ICMbio.
Ao amigo Diogo, companheiro durante todos estes anos de existência do
LaGenPe, pela valiosa ajuda e harmoniosa convivência compartilhada dia-a-dia.
Aos docentes e servidores do Departamento de Ciências Biológicas da
UNESP de Bauru e do Departamento de Morfologia da UNESP de Botucatu, pela
atenção sempre dispensada.
A amiga e sempre amiga Sabrina, companheira em todas as horas, pelo
apoio, amizade e pelo incentivo nas realizações pessoais e profissionais.
Aos meus pais, Waldemar e Ester, simplesmente por tudo, pela vida, pelos
inigualáveis ensinamentos e por todo amor a mim dispensado onde quer que eu
estivesse durante todos estes anos. Obrigada por fazerem parte de minha vida.
Ao Elvis, meu irmão, pelo apoio durante toda minha formação profissional.
Ao Nelson, meu namorado, por todo amor e compreensão e principalmente
por estar ao meu lado durante a realização deste trabalho.
RESUMO
Prochilodus lineatus, popularmente conhecido como curimbatá, é considerado uma
espécie migradora por excelência. Endêmica dos rios sul-americanos, hoje
representa a grande biomassa de peixes da bacia do Paraná, sobretudo nos rios
Grande, Pardo e Mogi-Guaçu. Sob o ponto de vista citogenético, apresenta um
cariótipo bastante conservado exibindo um número diplóide de 2n=54 cromossomos
dos tipos meta e submetacêntricos como número fundamental igual a 108. Um
aspecto interessante nesta espécie é a presença de microcromossomos
supranumerários ou B no seu conjunto cariotípico, que apresentam diferenciações
de número e morfologia. Para esta espécie já foi registrada a presença de até 7
elementos extras, com variação inter e intra-individual. Os cromossomos B são
considerados elementos adicionais presentes em alguns indivíduos de algumas
espécies de plantas, fungos e animais e estudos intensivos têm sido realizados na
busca de um melhor entendimento sobre a origem, estrutura e função destes
elementos genômicos. Entretanto, o conhecimento sobre sua importância para a
espécie portadora ainda é pouco significativo. Assim, com base na ocorrência de
microcromossomos supranumerários em P. lineatus os principais objetivos deste
trabalho foram buscar respostas elucidativas sobre a dinâmica evolutiva, herança,
estrutura do DNA e origem destes elementos B nesta espécie. A caracterização
citogenética dos exemplares de curimbatás do rio Mogi-Guaçu realizada neste
trabalho revelou um número diplóide de 2n=54 cromossomos dos tipos meta e
submetacêntricos, além da presença de até 7 cromossomos supranumerários, com
número modal de 3 cromossomos B. A utilização de marcadores citogenéticos
(Giemsa, NOR e Banda C) e citogenético-moleculares (FISH) com sondas de genes
ribossômicos 5S e 18S confirmaram uma constituição cariotípica conservada para
esta espécie. Não foram observados clusters adicionais referentes aos DNAr 5S e
18S. Para um melhor entendimento sobre a herança destes elementos extras no
genoma desta espécie realizou-se um estudo do padrão de transmissão dos
cromossomos B por meio de cruzamentos controlados. Estes cruzamentos foram
realizados nas dependências do CEPTA/ICMbio, Pirassununga, SP. Análises
citogenéticas da geração filial revelaram um comportamento meiótico regular para os
elementos B, ou seja, o padrão de transmissão destes (KB= 0,48) foi consistente com
a expectativa de segregação mendeliana, intimamente relacionada à neutralidade
dos elementos. A dinâmica evolutiva dos cromossomos B é caracterizada por
rápidas invasões, seguidas de fases de neutralização, onde a freqüência destes é
estabilizadas pela ação de genes supressores. Nesta fase, os elementos B
promovem um processo de regeneração por meio de alterações nas seqüências de
seu DNA, que desencadeia a formação de novas formas variantes que poderão
substituir o B neutralizado, dando início a novas invasões. Este ciclo realizado pelos
cromossomos supranumerários vem sendo observado ocorrer na população de
Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu. Diferenças observadas na morfologia e
tamanho destes elementos extras poderiam estar relacionadas a modificações que
estes elementos vêm sofrendo ao longo do processo evolutivo. Tais alterações
podem desencadear a formação de novas variantes de B, as quais poderiam
substituir o cromossomo B considerado ancestral, promovendo novos processos de
invasão. O processo de invasão dos B no genoma desta espécie foi registrado no
final da década de 70 e início da década de 80. Nos anos 90 e até os dias atuais, a
freqüência dos cromossomos B está passando por uma fase de neutralização,
conforme dados levantados neste trabalho. Desta forma o padrão de herança
mendeliana observado em cruzamentos realizados na piscicultura pode retratar
fielmente a condição de neutralidades dos cromossomos B na população natural de
curimbatás deste rio. Diversos estudos têm sido realizados no intuito de identificar
seqüências específicas de DNA nos cromossomos através da utilização de sondas.
Com o objetivo buscar resposta sobre a origem e estrutura dos cromossomos B em
peixes, foram elaboradas diversas sondas de DNA e até o momento, a metodologia
empregada revelou sondas obtidas com o uso de enzimas de restrição. Neste
trabalho foram elaboradas e utilizadas duas sondas a partir do genoma da espécie
P. lineatus, sendo a PM1B uma sonda específica de cromossomo supranumerário
obtida por meio da técnica de microdissecção cromossômica e a PG0B, obtida a
partir do DNA total desta referida espécie. Com auxílio da técnica de hibridação in
situ fluorescente (FISH) estas sondas foram aplicadas em preparações
cromossômicas de exemplares de P. lineatus do rio Mogi-Guaçu. A sonda PG0B
revelou um compartilhamento de seqüências de DNA entre os cromossomos A e B,
principalmente nas regiões centroméricas e as evidências apresentadas são
consistentes com a hipótese de que certos elementos estruturais são comuns para
os cromossomos do complemento normal A e para os cromossomos B desta
espécie. A sonda PM1B, entretanto, encontrou homologia apenas nos cromossomos
supranumerários. Assim, diferentes hipóteses podem explicar os resultados. Se tais
elementos supranumerários tivessem sido originados a partir dos elementos A, os
cromossomos supranumerários teriam seguido uma evolução independente e
intensiva, determinando modificações profundas na seqüência de seu DNA. Por
outro lado não se pode descartar a possibilidade de que estes elementos sejam
originários de material genético completamente estranho à espécie, tendo sido nela
introduzido por processos de hibridação interespecífica. Não pode ser descartada,
contudo, a hipótese de que a falta de identidade entre os cromossomos do
complemento A e os supranumerários poderia também ser decorrente de um
processo de formação “de novo”, onde segmentos genômicos poderiam surgir em
decorrência de processos fisiológicos normais das células.
Palavras-Chave: Cromossomo B; Evolução do Cromossomo B; Herança Mendeliana;
Prochilodus lineatus; Citogenética de Peixes
ABSTRACT
Prochilodus lineatus, popularly known in Brazil as curimbatá, is considered a
migratory species per excellence. This species is endemic in South American rivers,
and today it represents the great fish biomass of Paraná Basin, above all in Grande,
Pardo and Mogi-Guaçu rivers. In cytogenetic point of view, it presents a very
conservative karyotype, exhibiting a diploid number of 2n=54 meta/submetacentric
type chromosomes, with a fundamental number equal to 108. An interesting aspect in
this species is the presence of supernumerary or B- microchromosomes in its
karyotypic complex, which one differentiate in number and morphology. It has been
already registered, for this species, the presence of up to 7 extra elements, ranging
inter- and intra-individually. B-chromosomes are considered additional elements that
are present in some species individuals of plants, fungi and animals. However,
intensive studies have been carried out through the years, targeting a better
understanding of these genomic segments. Nevertheless, little is known about its
importance for bearer species. Based on P. lineatus supernumerary chromosomes
occurrence, main objectives of this work were seek elucidative answers about
evolutionary dynamics, inheritance, DNA structure and B-elements origin in this
species. The accomplished cytogenetic characterization of Mogi-guaçu River
curimbatá exemplaries has shown a diploid number of 2n=54 meta/submetacentric
type chromosomes, besides the presence of up to 7 supernumerary chromosomes,
with a 3 B-chromosome modal number. Utilization of cytogenetical markers (Giemsa,
NOR and C-Banding) and Cytogenetic-molecular (FISH) with 5S and 18S ribosomal
gene probe has revealed a conserved karyotypic constitution. It was not observed
additional clusters, in relation to 5S and 18S DNAr. For a better understanding about
the extra elements inheritance in this species genome, a study about B-
chromosomes transmission pattern by controlled cross was fulfilled. These cross
were carried out at CEPTA/ICMbio, Pirassununga, SP. Filial generation cytogenetical
analyses have demonstrated a meiotic behavior of B-elements, i.e., transmission
pattern of these ones (KB= 0,48) was consistent with mendelian expectation. This
kind of mendelian inheritance presented in B-chromosomes is intimately associated
with neutrality. B-chromosomes evolutionary dynamics is characterized by fast
invasions followed by a neutralization stage, within they are stabilized by suppressor
genes. In this stage, B-elements advance a regeneration process by alterations in its
DNA sequences. This regeneration triggers the formation of B new variants, which
can replace neutralized B, initiating new invasions. This cycle, accomplished by
supernumerary chromosomes, has been observed in Mogi-Guaçu river Prochilodus
lineatus population. B invasion process in this species genome was registered on the
late 70’s and early 80’s. In the 90’s, and nowadays, B-chromosomes frequency is
undergoing by a neutralization phase, which one can be confirmed by this study. In
this way, mendelian inheritance pattern, observed in pisciculture realized cross, can
faithfully depict B-chromosome neutrality condition on curimbatá natural population of
this river. Several studies have been carried out targeting to identify specific DNA
sequences in chromosomes by probe utilization. Lots of probes were elaborated
aiming a seek of some answers to fish B-chromosomes origin and structure.
Nonetheless, so far, only probes got with restriction enzymes are known. In this work,
two probes were elaborated from P. lineatus species genome, PM1B, a
supernumerary chromosome specific probe got by chromosomic microdissection and
PG0B, got from total DNA of the referred species. With the help of fluorescent in situ
hybridization technique (FISH), these two probes, PM1B and PG0B, were used in
chromosomic preparations of Mogi-Guaçu river P. lineatus exemplaries. With PG0B
probe utilization, it was observed a DNA sequence compartment between A- en B-
chromosomes, mainly at centromeric regions. This evidence is consistent with
hypothesis of some structural elements are ordinary for A normal complement
chromosomes and for B-chromosomes for this species. PM1B probe, however, has
found homology only in supernumerary chromosomes. Thus, if such supernumerary
elements had been originated from A-elements, these microchromosomes would
have act on an intensive and independent evolution, determining profound
modifications in their DNA. On the other hand, On the other hand if it cannot discard
the possibility of that these elements are originary of completely strange genetic
material to the species, having been in the introduced one for processes of
interespecific hibridization. It cannot be discarded, however, the hypothesis of that
the identity lack between the chromosomes of the complement and the
supernumerary could also be recurrent of a process of formation "of new", where
genomics’ segments could appear in result of normal physiological processes of the
cells.
Key Words: B-chromosome, B-chromosome evolution, mendelian inheritance,
Prochilodus lineatus, Fish citogenetics.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL...............................................................................................02
1.1 Caracterísitcas Gerais da Família Prochilodontidae.......................................................02
1.2 Características citogenéticas do gênero Prochilodus com ênfase em Prochilodus
lineatus ...........................................................................................................................06
2 Cromossomos Supranumerários........................................................................................09
2.1 Origem dos cromossomos supranumerários...................................................................12
2.2 Dinâmica evolutiva dos cromossomos supranumerários ...............................................15
2.3 Cromossomos supranumerários em peixes ....................................................................17
2.4 Cromossomos supranumerários em Prochilodus, com ênfase em Prochilodus
lineatus ...........................................................................................................................21
2.5 Estudo da estrutura dos cromossomos supranumerários em Prochilodus com ênfase
Em Prochilodus lineatus ................................................................................................23
2.6 Objetivos ........................................................................................................................25
2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................28
2.1 Material ..........................................................................................................................28
2.2 Local de Coleta e Manutenção da Espécie.....................................................................29
2.3 Métodos ..........................................................................................................................35
2.3.1 Estimulação de Mitoses...............................................................................................36
2.3.2 Preparação direta para obtenção de cromossomos metafísicos...................................36
2.3.3 Utilização de Marcadores Citogenéticos e Citogenético-Moleculares........................40
2.3.3.1 Detecção das Regiões Oraganizadoras de Nucléolos (NORs) através da
Imprenação com nitrato de Prata (Ag-NO3) (FISH)................................................40
2.3.3.2 Carcterização da Heterocromatina Constitutiva.......................................................41
2.3.3.3 Localização Cromossômica por Hibridação in situ Fluorescente ............................42
2.3.3.3.1 Microdissecção cromossômica e amplificação por DOP-PCR Estudos
Cariotípicos ...........................................................................................................43
2.3.3.3.2 Obtenção da sonda genômica da espécie Prochilodus lineatus ............................46
2.3.3.3.3 Marcação do DNA pela técnica de nick translation..............................................47
2.3.3.3.4 Hibridação .............................................................................................................48
2.3.4 Estudos Cariotípicos....................................................................................................51
2.3.5 Marcação dos Exemplares...........................................................................................51
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................54
3.1 Capítulo 1 .......................................................................................................................56
3.2 Capítulo 2 .......................................................................................................................69
3.3 Capítulo 3 .......................................................................................................................81
3.4 Capítulo 4 .......................................................................................................................96
4 DISCUSSÃO GERAL...................................................................................................111
5 CONCLUSÕES .............................................................................................................117
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 INTRODUÇÃO GERAL
1.1 Características Gerais da Família Prochilodontidae
A fauna de peixes neotropicais é extremamente rica, incluindo 71 famílias e
4.475 espécies descritas (Reis et al., 2003). Entretanto uma estimativa em um
mesmo estudo sugere a existência de aproximadamente 6.000 espécies nos rios e
lagos da região neotropical. De acordo com Shaefer (1998) aproximadamente 8.000
espécies de peixes podem existir no neotrópico, correspondendo a
aproximadamente 25% de todas as espécies existentes. Entretanto, a fauna de
peixes de água continental do Brasil é a mais rica do mundo, com cerca de 2.587
espécies já descritas e existindo ainda, muitas desconhecidas (Buckup et al., 2007).
Os Characiformes constituem um grupo dominante entre os peixes de água
continental da América do Sul compreendendo formas herbívoras, iliófagas e
carnívoras, algumas das quais muito especializadas (Britisk et al., 1972). Dentre os
Characiformes destacam-se os peixes da família Prochilodontidae os quais podem
ser considerados um dos componentes mais importantes da pesca comercial e de
subsistência no ambiente neotropical da América do Sul (Castro & Vari, 2004). Desta
forma, compreende espécies com importante participação na constituição da fauna
dos rios neotropicais (Flecker, 1996). Os peixes desta família estão restritos em sua
distribuição geográfica à América do Sul (Mago-Leccia, 1972; Britisk, 1972) com
exceção do Chile, onde estas espécies não foram encontradas (Lowe-McConnell,
1975; Goulding, 1981; Vari, 1983).
A sistemática da família Prochilodontidae é um tanto complexa devido à
extraordinária estabilidade dos caracteres morfológicos e merísticos adotados para a
distinção das diferentes espécies (Mago-Leccia, 1972). Esta homogeneidade e
conservação dos caracteres taxonômicos pode ser explicada devido ao fato dessas
espécies estarem amplamente distribuídas ao longo das grandes bacias
hidrográficas da América do Sul, talvez por sua capacidade de efetuar grandes
migrações com propósito reprodutivo, dispersando, dessa maneira, populações em
grandes áreas (Mago-Leccia, 1972).
Todos os Prochilodontidae são iliófagos, possuindo assim algumas
adaptações anatômicas como boca em forma de ventosa para succionar o lodo do
fundo dos rios e retirar os detritos orgânicos. Apresentam tolerância ao ambiente em
que vivem, tais como mudança de pH, estratificação de temperatura elevada e
baixas concentrações de oxigênio (Mago-Leccia,1972). Além disso, a família
Prochilodontidae compreende espécies de tamanho variável alcançando mais de 50
centímetros de comprimento (Britski et al.,1988). Castro & Vari (2004) mostraram
que a família Prochilodontidae compreende 21 espécies distribuídas em três
gêneros: Ichthyoelephas (2 espécies), Prochilodus (13 espécies) e Semaprochilodus
(6 espécies).
O gênero Prochilodus é composto por espécies amplamente distribuídas em
águas sul-americanas, sendo considerados peixes de relevante importância para o
comércio e a pesca de subsistência (Mago-Leccia, 1972). Dentre todas as espécies
deste gênero, Prochilodus lineatus, popularmente conhecida como curimbatá é,
certamente, a mais estudada. Considerado um animal endêmico da bacia Platina,
apresenta uma alta capacidade migratória, sendo denominado peixe de piracema
(Godoy, 1975). Embora sua ocorrência seja intensa durante a migração reprodutiva,
exemplares desta espécie são capturados o ano todo em Cachoeira de Emas,
município de Pirassununga, SP (Godoy, 1975). Além disso, o curimbatá apresenta
elevado valor econômico pela facilidade de ser cultivado em rios, tanques e
represas. Possui uma carne com alto valor protéico e perfeito balanço de
aminoácidos essenciais (Lessi, 1968), também apresenta uma importância social
para a pesca artesanal, de subsistência e esportiva (Barbieri et al., 2004). Sua
adaptação à criação e reprodução em cativeiro torna esta espécie altamente
interessante para programas de piscicultura (Britski, 1972; Godoy, 1975; Castro,
1993). Neste aspecto, pesquisas relacionadas à reprodução induzida, manejo,
técnicas de cultivo, alimentação e crescimento, têm sido realizadas de modo
intensivo nas últimas décadas (Castagnolli & Cirino, 1980; Maiardes-Pinto et al.,
1984).
Um aspecto interessante em algumas espécies de peixes neotropicais é a
capacidade de realizar extensas migrações. A migração pode ser definida como
movimento resultante na mudança entre dois ou mais ambientes separados,
ocorrendo com uma periodicidade regular e envolvendo grande parte da população
(Northcote, 1984).
Variações no padrão de migração podem ocorrer, principalmente, devido a
diferenças ambientais tais como mudanças na temperatura da água, concentração
de CO2, fases da lua, entre outros (FAP 17, 1992). Peixes realizam deslocamentos
no meio aquático durante as diferentes fases de sua vida e com objetivos variados.
Muitas das espécies marinhas e de água doce, no entanto, não se deslocam e, por
isso, permanecem ao longo de toda sua vida em um ambiente comparativamente
restrito.
Os peixes de piracema, como são conhecidos no Brasil os que realizam
migrações reprodutivas, apresentam padrões de deslocamento de alta complexidade
(Godinho & Pompeu, 2003). Em razão dessa complexidade o estudo de padrões
migratórios de peixes brasileiros ainda é incompleto e muitas questões relativas ao
tema ainda estão para serem respondidas (Godinho, 2007). Existem espécies de
peixes que realizam extensivas migrações para a reprodução e/ou na busca de
alimentos em quase todas as bacias da América Latina (Petrere, 1985; Quirós, 1988;
Agostinho et al., 2003).
Os trabalhos pioneiros de Godoy (1975) demonstraram que espécies de
piracema do sistema dos rios Grande, Pardo, e Mogi-Guaçu deslocam-se do sítio de
alimentação situado no rio Grande, onde permanecem durante um longo período do
ano, até o sítio de desova no alto Mogi-Guaçu, num trajeto de aproximadamente 600
quilômetros.
Peixes do gênero Prochilodus são considerados os mais conspícuos,
abundantes e dispersos entre os peixes neotropicais habitantes dos rios sul
americanos, os quais fluem para o oceano Atlântico. Eles são migradores detritívoros
que abastecem a atividade pesqueira em muitas partes do continente (Welcome,
1979). O hábito detritívoro faz dos Prochilodus um elemento dominante na estrutura
trófica da comunidade aquática (Bowen, 1983; Flecker 1996). Nos últimos 40 anos, o
alvo de experimentos e observações tem enriquecido uma extensiva documentação
de movimentos anuais de grandes cardumes de Prochilodus juvenis e adultos
(Bonetto & Pignalberi 1964; Godoy, 1667, Bayley 1973).
A maioria das informações sobre migrações de peixes na América do Sul é
sobre o curimbatá (Prochilodus lineatus) (Godoy, 1959; 1962; 1967; 1972; 1987;
Petrere, 1985; Sverlij et al., 1993; Capeleti & Petrere, 2006). Segundo Godoy (1967)
a migração de P. lineatus envolve, sobretudo, os três rios da bacia do rio Paraná, ou
seja, rio Mogi-Guaçu, rio Pardo e rio Grande. Os curimbatás apresentam alta
capacidade migratória e estratificação quanto à distribuição de classes, comprimento
e grau de maturação, ou seja, os jovens permanecem nas lagoas de planície de
inundações até atingirem a idade adulta, por volta dos dois anos, quando se juntam
aos cardumes migrantes no período de reprodução que compreende os meses de
setembro a março (Godoy, 1975; Sverlij et al., 1993).
1.2 Características citogenéticas do gênero Prochilodus com ênfase em
Prochilodus lineatus
Em uma análise geral, os dados citogenéticos disponíveis indicam que estes
estudos estão concentrados principalmente na fauna de peixes neotropicais. Hoje,
existem informações citogenéticas disponíveis para cerca de 475 espécies de
Characiformes, 318 espécies de Siluriformes, 48 espécies de Gymnotiformes, 199
espécies não pertencentes à superordem Ostariophysi e 109 espécies de peixes
marinhos (Oliveira et al., 2006). Estes dados não incluem somente número e
estrutura dos cromossomos, mas também informações quanto à presença de
cromossomos sexuais, supranumerários e a localização das Regiões Organizadoras
de Nucléolos (NORs) (Almeida-Toledo et al., 2000).
Em todas as espécies do gênero Prochilodus o número diplóide encontrado é
2n=54 cromossomos, permitindo inferir a ocorrência de uma evolução cariotípica
predominantemente conservativa (Pauls & Bertollo, 1990). Dados citogenéticos
analisados na espécie Prochilodus lineatus em diferentes populações demonstraram
número diplóide de 54 cromossomos, sendo o cariótipo constituído por 40 do tipo
metacêntrico e 14 do tipo submetacêntrico, com número fundamental igual a 108
(Pauls & Bertollo, 1983, 1990; Oliveira et al., 1997; Cavallaro et al., 2000; Jesus &
Moreira-Filho 2003; Artoni et al., 2006). Além disso, os componentes destas
populações podem apresentar também de 0 a 7 microcromossomos
supranumerários ou B no seu complemento cariotípico (Pauls e Bertollo, 1983;
Oliveira et al., 1997; Cavallaro et al., 2000) que variam inter e intra-individualmente
(Pauls e Bertollo, 1983, 1990; Cavallaro et al., 2000; Jesus & Moreira-Filho 2003).
Artoni et al. (2006) ao estudar populações de Prochilodus lineatus da lagoa
Dourada, bacia do rio Tibagi, PR, observaram indivíduos com um número diplóide de
2n=54 básico, além da presença de até 3 microcromossomos B.
Alguns trabalhos descritos na literatura relatam que a técnica de detecção da
Região Organizadora de Nucléolo (NOR) por meio da impregnação por nitrato de
Prata, marcam um único par de cromossomo portador da NOR (Pauls & Bertollo,
1990; Maistro et al., 2000; Jesus & Moreira-Filho, 2003; Artoni et al. ,2006; Vicari et
al., 2006). Tais Regiões Organizadoras de Nucléolo são facilmente detectadas pela
impregnação por nitrato de Prata, sendo extensivamente utilizada em diversos
organismos. Entretanto, uma limitação apresentada pelo uso desta técnica refere-se
ao fato de que a Prata não se liga às regiões de DNAr, mas sim às proteínas
associadas a estrutura nucleolar, limitando-se a identificar somente as NORs que
estiverem ativas na intérfase procedente (Miller et al., 1976). Diante deste contexto,
localização das NORs por meio da hibridização isotópica ou não isotópica com
sondas RNAr ou DNAr em fixações cromossômicas tem sido uma técnica bastante
eficiente na localização e investigação de genes ribossomais (Long & Dawid, 1980).
O conhecimento sobre identificação e localização cariotípica dos genes
ribossomais 18S e 5S por meio da técnica de FISH (Hibridação in situ Fluorescente)
no genoma de espécies da família Prochilodontidae é ainda bastante restrito (Jesus
& Moreira-Filho, 2003). A localização in situ de genes ribossomais indicaram sintenia
para os sítios 18S e 5S DNAr em Prochilodus lineatus e Prochilodus argenteus
assim como polimorfismos no número de genes 18S (Jesus & Moreira-Filho, 2003;
Hatanaka & Galetti Jr., 2004).
Segundo Jesus & Moreira-Filho (2003), não foram encontrados clusters DNAr
5S ou DNAr 18S localizado nos microcromossomos B de Prochilodus lineatus,
embora alguns estudos tenham descrito a ocorrência de clusters de DNAr 18S
nestes cromossomos (Lopez-Lopez et al., 1994).
Utilizando ainda a técnica de FISH, foram relatados em P. lineatus a
localização cromossômica das famílias satélites SATH1 e SATH2, onde mostrou que
SATH1 está presente em um conjunto maior de cromossomos A do que a família
SATH2. Além disso, as seqüências SATH1 estão presentes em todos os
cromossomos B, enquanto que as SATH2 estão ausentes nestes (Jesus et al.,
2003).
Vários estudos de bandamento C têm sido realizados em representantes da
família Prochilodontidae principalmente na espécie P. lineatus. As análises em
preparações cromossômicas de curimbatá evidenciaram a presença de
heterocromatina constitutiva principalmente nas regiões pericentroméricas dos
cromossomos autossômicos (Maistro et al., 2000; Vicari et al., 2006; Artoni et al.,
2006). Os cromossomos supranumerários dessa espécie se caracterizam como
inteiramente heterocromáticos (Pauls & Bertollo, 1983, 1990; Cavallaro et al., 2000;
Jesus et al., 2003; Artoni et al., 2006). Entretanto, a espécie P. lineatus proveniente
da lagoa Dourada, bacia do rio Tibagi, PR, apresentaram um pequeno segmento de
banda C negativo na região pericentromérica de um cromossomo B metacêntrico
(Artoni et al., 2006).
2 Cromossomos Supranumerários
Os cromossomos supranumerários têm sido descritos em mais de 1300
espécies de plantas e quase 500 espécies de animais (Jones & Rees, 1982; Jones &
Puertas, 1993; Jones, 1995), além de várias espécies de fungos (Mills & McCluskey
1990; Miao et al., 1991 a,b; Tzeng et al., 1992; Gêiser et al., 1996; Leclair et al.,
1996).
Muitas hipóteses têm sido postuladas no intuito de buscar uma possível
definição para cromossomos supranumerários. Segundo Camacho et al. (2000) os
cromossomos B seriam cromossomos adicionais, dispensáveis os quais estão
presentes em alguns indivíduos de determinadas espécies e que provavelmente
teriam surgido dos cromossomos A, porém não seguindo seu caminho evolutivo.
Desde a sua descoberta no início do século passado por Wilson em 1907, a
manutenção dos cromossomos B nos organismos portadores tem sido
exaustivamente estudada (Jones & Rees, 1982; Jones, 1995; Camacho et al., 2000;
Puertas, 2002). Entretanto, a estrutura, função e ação destes cromossomos
supranumerários são particulares em diferentes grupos, tornando difícil buscar uma
conclusão geral sobre sua importância para a espécie (Oliveira et al., 1997).
Os cromossomos supranumerários são freqüentemente heterocromáticos e
geralmente não apresentam homologia com os cromossomos do complemento
normal (A), podendo variar tanto em número quanto em morfologia (Jones, 1991).
Devido a sua natureza heterocromática, são considerados praticamente inertes,
podendo conter um número relativamente pequeno de genes ou cístrons ativos
(Jesus et al., 2003).
Um estudo detalhado permitiu a Jones (1991) caracterizar os cromossomos
supranumerários ou B e diferenciá-los dos cromossomos A por apresentarem
algumas características específicas:
Não são cromossomos essenciais e, portanto, podem se apresentar em
alguns indivíduos de uma população ou não; não possuem homólogos, ou seja,
nunca emparelham entre si e nem com os cromossomos do complemento normal.
Portanto, não apresentam homologia com os cromossomos do complemento padrão;
são encontrados em organismos diplóides e poliplóides; apresentam freqüência
variável não só entre diferentes populações, como também inter e intra-
individualmente; são morfológica e estruturalmente diferentes dos elementos do
grupo (A), sendo geralmente menores que estes; são geneticamente inativos como
no milho, onde nunca aparecem nos mapas de ligação; a qualidade de seu DNA não
parece ser muito diferente daquela do genoma normal (A); mostram herança não
mendeliana, como resultado de uma instabilidade mitótica e meiótica e de vários
modos de deriva; em cruzamentos experimentais em muitas espécies eles são
transmitidos com uma freqüência mais alta que a esperada, conduzindo a um
acúmulo na progênie; sua significância adaptativa nas populações é desconhecida,
apesar de várias tentativas de ligá-los a variações fenotípicas e do meio ambiente.
Enfim, a origem dos cromossomos B é ainda controvertida.
Dois modelos são propostos para explicar a manutenção dos B em
populações naturais: o modelo heterótico e o modelo parasítico. De acordo com o
modelo heterótico proposto por White (1973), os cromossomos B seriam mantidos
graças às vantagens adaptativas que conferem aos seus portadores quando se
encontram em números baixos. Já o modelo parasítico proposto é discutido por
vários autores (Östergren, 1945; Nur, 1966 a, b; Nur, 1977; Jones, 1985; Shaw &
Hewitt, 1990) que consideram que os cromossomos B permanecem nas populações
em razão de seus próprios meios de acúmulo. Nesta segunda hipótese, esses
cromossomos se apresentariam como elementos parasitas, uma vez que sua
presença não traria vantagem aos seus portadores.
Segundo Volobujev (1981), os cromossomos B podem ser classificados em
três categorias de acordo com seu tamanho em relação aos cromossomos A. O
primeiro grupo consiste de cromossomos B cujo tamanho é menor do que os
menores cromossomos do complemento normal A; o segundo grupo consiste de
cromossomos B equivalentes em tamanho ao dos menores cromossomos do
complemento padrão A; e no terceiro grupo, os cromossomos supranumerários
podem ser maiores que os maiores cromossomos do complemento A.
Geralmente, a maioria dos genes contidos nos cromossomos B não se
expressam. Entretanto, quando ativos, podem afetar características quantitativas
para os indivíduos portadores, especialmente associadas com o vigor, sobrevivência,
fecundidade e fertilidade (Camacho et al., 2000). Estes efeitos são freqüentemente
deletérios, embora existam alguns exemplos de cromossomos B com efeitos
benéficos quando presentes em pequeno número (Jones & Rees, 1982). Muitos
cromossomos B têm sido encontrados portando genes ribossomais (Green 1990;
Beukeboom, 1994; Jones, 1995), embora na sua maior parte eles sejam inativos
(Donald et al., 1997). Alguns efeitos dos cromossomos B parecem ser atribuídos
diretamente ao produto de seus genes, como no caso de genes que controlam a
resistência para ferrugem nos cromossomos B de Avena sativa (Dherawattana &
Sadanaga, 1973) e genes que conferem a resistência a antibióticos em
cromossomos B do fungo Nectria haematococca, favorecendo esta patogenecidade
(Miao et al., 1991a). Estes exemplos indicam que nem todos os cromossomos B são
geneticamente inativos. Entretanto, mais informações tornam-se necessárias para
alicerçar a opinião mais aceita de que a maioria dos cromossomos B não apresenta
um grande número de genes ativos (Camacho et al., 2000).
2.1 Origem dos Cromossomos Supranumerários
Existem muitas teorias a respeito da origem dos cromossomos B. Duas
hipóteses gerais têm sido propostas para elucidar tal origem. Na primeira, hipótese
de origem intra-específica (Jamilena et al., 1994a, 1995b; Houben et al., 1996;
Peppers et al., 1997; Cabrero et al., 1999; Camacho et al., 2000), os cromossomos B
surgiram do complemento padrão A, porém seguiram um caminho evolutivo
independente. Por exemplo, um cromossomo B poderia se originar do próprio
conjunto polissômico dos cromossomos A, a partir de fragmentos cêntricos
resultantes da fusão de cromossomos A ou da amplificação da região
paracentromérica de fragmentos de cromossomos A. Uma clara evidência que
favorece esta hipótese foi obtida por Keyl & Hagele (1971) quando demonstraram
que os padrões de bandas nos cromossomos B de Chironomus plumosus eram
similares a encontrada próxima ao centrômero do quarto par cromossômico
autossômico. Na segunda hipótese, da origem interespecífica (Sapre & Deshpande,
1987; Eickbush et al., 1992; McVean, 1995; Schartl et al., 1997; Camacho et al.,
2000; Perfectti & Werren, 2001), os cromossomos B surgiram a partir de
acasalamentos interespecíficos entre espécies relacionadas pelo processo de
hibridização. A origem do cromossomo B como decorrência de processo de
hibridização foi comprovada por Perfectti & Werren (2001) ao observarem a
presença de cromossomos supranumerários em uma linhagem de vespas do gênero
Nasonia obtida a partir do cruzamento entre duas espécies diferentes, Nasonia
vitripennis e Nasonia giraulti.
Antes destas duas teorias sobre a origem dos cromossomos supranumerários
serem conhecidas, Volobujev (1981) postulou duas hipóteses para explicar a origem
destes elementos genômicos. A primeira propunha que os cromossomos B poderiam
ser relíquias de rearranjos estruturais que ocorreram durante a evolução de um
cariótipo ancestral. A outra teoria supunha que estes cromossomos poderiam
resultar de processos de não-disjunção cromossômica dos cromossomos sexuais ou
autossômicos, seguidos por um processo de inativação genética. Esta segunda
suposição pode ser relatada a partir do trabalho realizado por Salvador & Moreira-
Filho (1992) ao identificarem cromossomos supranumerários entre os componentes
uma população de Astyanax scabripinnis, proveniente do município de Campos do
Jordão. A origem deste elemento genômico nesta população estudada poderia estar
associada a não-disjunção mitótica do par cromossômico 1 durante a divisão celular,
seguido por um processo de heterocromatização comprovado pela técnica de
bandamento C.
No entanto, variáveis da teoria intra-específica obtiveram um enorme
embasamento nos estudos de cromossomos B em peixes. Mestriner et al. (2000);
Néo et al. (2000a); Jesus et al. (2003); Artoni et al. (2006) sugeriram a origem dos
cromossomos B por isocromossomos. Mestriner et al. (2000) e Néo et al. (2000a) ao
estudarem a espécie Astyanax scabripinnis detectaram por meio de bandamento C a
presença de seqüências repetitivas em ambos os braços do cromossomo B, de
modo semelhantes ao par 24 do conjunto cromossômico (A) mostrando, desta forma,
argumentos favoráveis da origem do cromossomo B em um processo de formação
de um isocromossomo.
Segundo Camacho et al. (2000), a caracterização molecular da seqüência de
DNA repetitivo específica para cromossomos B e que são compartilhadas também
por cromossomos A de outras espécies, fornecem subsídios que reforçam a hipótese
de origem intra-específica para estes elementos genômicos. Os cromossomos
sexuais também têm sido previamente propostos como ancestrais dos cromossomos
B desde que eles possam ser tolerados no estado polissômico (Hewitt 1973). Um
exemplo de cromossomo sexual que pode ter originado um cromossomo B é o caso
do cromossomo B2 do gafanhoto Eyprepocnemis plorans, onde o rearranjo de duas
seqüências repetitivas de DNA em seu respectivo centrômero coincide
especificamente com a do cromossomo X (López-León et al., 1994). Isto sugere que
o cromossomo B de E. plorans tenha sido derivado da região paracentromérica do
cromossomo X, com subseqüente amplificação de dois tipos de seqüências contidas
nele (Camacho et al., 2000). Contudo, hipóteses alternativas sobre a origem dos
cromossomos B têm surgido em decorrência do conhecimento da estrutura
molecular da identidade de fragmentos livres de DNA de origem não cromossômica,
comumente encontrado nos núcleos das células. A hipótese de que estes segmentos
genômicos supranumerários tenham surgido “de novo” a partir de processos de
construção e desmanche de segmentos genômicos nucleares, em um processo
fisiológico normal das células num modelo de desenvolvimento independente, não
pode ser descartada (Foresti, 1998). Diante disso, pode-se concluir que os
cromossomos supranumerários parecem não apresentar um modelo de origem
comum, ou seja, podem ter se originado de forma independente e seguindo
diferentes caminhos evolutivos.
2.2 Dinâmica evolutiva dos cromossomos supranumerários
De acordo com a presença de mecanismos de acumulação dos cromossomos
supranumerários e seus possíveis efeitos, dois modelos de equilíbrio podem ser
mencionados, o modelo heterótico e o parasítico (Rosetti et al., 2006). O modelo
heterótico aponta um balanço entre os efeitos positivos dos cromossomos B nas
formas hospedeiras quando eles ocorrem em baixo número e efeitos negativos
quando eles ocorrem em alto número. Entretanto, este modelo não contempla um
mecanismo de acumulação (White, 1973). O modelo parasítico proposto por
Östergren, (1945); Nur, (1966a,b, 1977), ou modelo egoísta, definido por Jones
(1985); Shaw & Hewitt, (1990), é considerado o mais comum entre os organismos
portadores. Este modelo assume que os cromossomos B são mantidos na
população por meio de mecanismos de acumulação, o qual contrabalanceia os
efeitos deletérios destes segmentos no genoma hospedeiro.
A dinâmica evolutiva dos cromossomos B parasitas parece ser caracterizada
por rápidas invasões em virtude do acúmulo, seguida por neutralização por meio da
evolução de genes supressores presentes nos cromossomos A, os quais eliminam
os efeitos do acúmulo de B (Camacho et al., 1997). No modelo proposto por estes
autores, o acúmulo de cromossomos B pode proporcionar um marcante aumento da
freqüência, em uma determinada população, em apenas 10 gerações.
O acúmulo dos cromossomos B nas populações portadoras depende de duas
importantes propriedades, definidas como o efeito no genoma hospedeiro e seu
padrão de transmissão (Camacho et al., 2000). Vários efeitos são teoricamente
possíveis diante da interação destas duas propriedades. Está claro que a origem dos
cromossomos B relaciona-se aos mecanismos de acumulação e a proliferação e
somente pode ser explicada em termos de efeitos benéficos proporcionados à
população hospedeira. Estas são as formas pelas quais estes cromossomos podem
aumentar sua freqüência e estabelecer polimorfismos na população natural. O
comportamento meiótico irregular pode auxiliar na fixação dos cromossomos B.
Entretanto, se o padrão de transmissão estiver abaixo da expectativa mendeliana,
estes são destinados à extinção por meio de forças ao acaso (Camacho et al., 2000).
Recentemente, um modelo de não equilíbrio de evolução dos cromossomos B
a longo prazo foi proposto por Zurita et al. (1998). De acordo com este modelo, um
cromossomo B parasítico, tendo perdido seu mecanismo de acumulação é destinado
a desaparecer rapidamente, lentamente ou muito lentamente da população, em um
longo processo de extinção ao acaso alcançando o estágio de neutralização. Diante
disso, uma nova variação de cromossomo B pode aparecer e reiniciar o ciclo
(Herrera et al., 1996).
Um exemplo clássico do surgimento de novas variantes de cromossomos B foi
registrado na população de gafanhoto Eypreponemis plorans. Os cromossomos B
desta espécie são considerados bastante mutáveis (Camacho et al., 1997).
Diferentes tipos de cromossomos B foram descritos em ocasião da translocação
entre os cromossomos A e B (Henriques-Gil et al., 1984; Henriques-Gil e Arana,
1990) e a freqüente geração de uma nova variante de B (Lópéz-Léon et al., 1994)
indica que o polimorfismo é muito dinâmico nesta população. A nova variante
apresenta um acúmulo de sua freqüência, aumentando a média do número de B por
indivíduo (Camacho et al., 1997).
2.3 Cromossomos Supranumerários em Peixes
Os cromossomos B são encontrados em aproximadamente 40 espécies de
peixes neotropicais de diferentes táxons, compreendendo cerca de 1,5% das
espécies de peixes com cariótipos analisados (Salvador & Moreira-Filho, 1992;
Oliveira et al., 1997).
Uma das primeiras descrições de supranumerários com características
pertinentes aos cromossomos B em peixes da região Neotropical refere-se aos
cromossomos adicionais encontrados em Prochilodus lineatus por Pauls & Bertollo
(1983). Entretanto, muitas outras espécies de peixes de diferentes gêneros e ordens
têm apresentado cromossomos supranumerários em seus cariótipos (Moreira-Filho
et al., 2001).
A ocorrência de cromossomos B entre os indivíduos de uma população pode
ser esporádica, ou ser comumente encontrada para muitas espécies, podendo
mostrar uma alta freqüência entre os indivíduos. É possível encontrar também
variações em relação à morfologia, tamanho e número desses supranumerários
(Pauls & Bertollo, 1983, 1990; Oliveira et al., 1997; Venere et al., 1999; Cavallaro et
al., 2000; Fernandes & Martins-Santos 2005; Artoni et al., 2006).
Morfologicamente, os cromossomos supranumerários podem diferir entre os
indivíduos de uma mesma espécie. Fernandes & Martins-Santos (2005) ao
analisarem citogeneticamente exemplares de Astyanax scabripinnis do córrego
Tatupeba, bacia do rio Ivaí, encontraram três citótipos distintos referentes à presença
de cromossomos supranumerários. No primeiro citótipo os indivíduos exibiam um
macrocromossomo B do tipo metacêntrico totalmente heterocromático, no segundo
citótipo os animais portavam macrocromossomos B do tipo metacêntrico,
submetacêntrico e acrocêntrico, sendo que estes se apresentaram parcialmente
heterocromáticos e no terceiro citótipo, os exemplares apresentaram
macrocromossomos B dos tipos metacêntrico e acrocêntrico parcialmente
heterocromáticos.
Em populações de Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu os
microcromossomos B mostraram diferentes formas, apresentando-se como
metacêntricos, submetacêntricos e acrocêntricos, sendo a forma metacêntrica a mais
freqüente (Artoni et al., 2006).
Com relação ao tamanho, os cromossomos supranumerários exibem uma
notável variação, ou seja, existe a ocorrência de macrocromossomos como nas
espécies do gênero Astyanax (Maistro, et al., 1992; Salvador & Moreira-Filho, 1992;
Vicente et al., 1996; Moreira-Filho et al., 2001; Ferro et al., 2003; Hashimoto et al., no
prelo); cromossomos supranumerários de tamanho médio, como em Rhamdia
(Fenocchio & Bertollo, 1990; Fenocchio et al., 2000) ou microcromossomos, como
em Prochilodus (Pauls & Bertollo, 1983, 1990; Venere et al., 1999; Cavallaro et al.,
2000; Oliveira et al., 2003).
Os cromossomos B também podem variar em número nas espécies
portadoras. Os microcromossomos B presentes em indivíduos da espécie P. lineatus
apresentaram um variação de até 7 cromossomos supranumerários (Pauls &
Bertollo, 1983; Oliveira et al., 1997; Cavallaro et al., 2000). Foresti et al. (1989)
detectaram a presença de até 8 pequenos cromossomos supranumerários em
Moenkhausia sanctaefilomenae e Oliveira & Foresti (1993) descreveram a ocorrência
de até 2 microcromossomos metacêntricos adicionais na espécie Steindachnerina
insculpta (Curimatidae).
Em espécies do gênero Astyanax também foram encontradas variações
quanto ao número de cromossomos supranumerários. Os macrocromossomos B de
Astyanax scabripinnis têm sido estudados mais intensamente nos anos recentes,
desde as investigações iniciais de Salvador & Moreira-Filho (1992) e Maistro et al.
(1992). A maioria dos exemplares estudados apresentaram uma variação de até 1
macrocromossomo B metacêntrico. A ocorrência de 2 cromossomos B apresenta-se
como uma condição rara nesta espécie. (Vicente et al., 1996).
Fenocchio & Bertollo (1990), em estudo citogenético realizado em Rhamdia
hilarii demonstraram que o número cromossômico desta espécie era de 2n=58,
existindo uma variação numérica no cariótipo dos exemplares analisados, com
indivíduos apresentando até 2n=63 cromossomos. Esta variação foi atribuída à
presença de cromossomos supranumerários mitoticamente instáveis nesta espécie.
Esta variação numérica dos cromossomos supranumerários pode ser
atribuída ao seu comportamento meiótico, ou seja, pode ocorrer disjunção irregular
das cromátides, onde a não existência de um emparelhamento de uma forma geral
pode resultar em alterações no número desses cromossomos nos diferentes
gametas (Beukeboom, 1994). Somando-se a tudo isto, pode-se incluir ainda
mecanismos de acumulação de cromossomos B, que algumas vezes ocorre na
meiose (Volobujev, 1981).
Apesar do aumento das informações disponíveis sobre a morfologia, herança,
estrutura e outros aspectos dos cromossomos B em peixes, a exata origem e
significância funcional destes elementos genômicos ainda permanece desconhecida
(Salvador & Moreira-Filho, 1992; Porto-Foresti et al., 1997; Jesus et al., 2003; Artoni
et al., 2006).
Ao estudarem a espécie Astyanax scabripinnis, Mestriner et al. (2000) e Néo
et al. (2000a), detectaram por meio de bandamento C a presença de seqüências
repetitivas em ambos os braços do cromossomo B, de modo semelhante ao par 24
do conjunto cromossômico (A), reforçando, desta forma, argumentos favoráveis
sobre a hipótese de origem destes macrocromossomos extras a partir de
isocromossomos.
Salvador & Moreira-Filho (1992) realizaram o estudo da origem dos
cromossomos supranumerários em uma população de Astyanax scabripinnis,
proveniente do município de Campos do Jordão e segundo estes autores, o
elemento B nesta população poderia estar associado a não-disjunção mitótica do
primeiro par cromossômico durante a divisão celular seguida por um processo de
heterocromatização comprovado pela técnica de bandamento C.
Porto-Foresti et al. (1997) analisaram a ocorrência de cromossomos
supranumerários na espécie Astyanax scabripinnis paranae em três trechos distintos
do córrego Cascatinha, um pequeno tributário do rio Tietê, Botucatu, SP, onde o
primeiro trecho analisado correspondia à cabeceira deste córrego localizado a 880
metros acima do nível do mar, o segundo trecho compreendia o curso médio do
córrego, a 860 metros acima do nível do mar e o terceiro trecho correspondia ao final
do curso do córrego antes de desaguar no rio Tietê com 820 metros de altitude.
As análises dos exemplares desta espécie coletados nestas três localidades
apresentaram um número diplóide de 2n=50 cromossomos, além da presença de um
macrocromossomo extra em 60% dos animais provenientes do primeiro trecho
analisado, enquanto nos demais trechos a freqüência foi cerca de 30%. Considerou-
se que as condições ambientais poderiam conferir uma vantagem seletiva para os
peixes habitantes da cabeceira deste córrego em relação aos peixes dos dois outros
trechos.
Estudos realizados em três populações de Astyanax scabripinnis provenientes
de localidades em diferentes altitudes de um mesmo riacho na região de Campos do
Jordão, SP, revelaram a presença de diferentes tipos de cromossomos B em relação
à morfologia e tamanho nas duas populações de maior altitude (1920 metros e 1800
metros), e sua ausência na população de baixa altitude (700 metros) (Néo et al.,
2000b). Portanto a presença destes elementos poderia ser determinada por
características ambientais favoráveis para a espécie (Néo et al., 2000b). Contudo,
com relação aos microcromossomos B ainda não há descrição de casos que
favoreçam a aceitação e aplicação de uma hipótese adaptativa (Alves & Martins-
Santos, 2002).
2.4 Cromossomos Supranumerários em Prochilodus, com ênfase em
Prochilodus lineatus
Estudos realizados por Pauls & Bertollo (1983, 1990) sobre citogenética de
peixes do gênero Prochilodus sugeriram a existência de uma acentuada
homogeneidade dos caracteres cariotípicos básicos. Vários trabalhos na literatura
mostram que exemplares de Prochilodus analisados citogeneticamente
apresentaram 2n=54 cromossomos dos tipos meta e submetacêntricos, com número
fundamental igual a 108 (Pauls e Bertollo, 1983, 1990; Oliveira et al., 1997; Cavallaro
et al., 2000; Jesus & Moreira-Filho 2003; Artoni et al., 2006). Diante disso, pode-se
afirmar que a família Prochilodontidae parece apresentar uma evolução
cromossômica predominantemente conservativa (Pauls & Bertollo, 1990).
Uma interessante característica de algumas espécies do gênero Prochilodus é
a presença de microcromossomos supranumerários, que foi primeiramente descrita
em Prochilodus lineatus por Pauls e Bertollo (1983). Nesta espécie, os cromossomos
B puderam ser facilmente identificados como microcromossomos heterocromáticos,
com freqüência variável de até 7 elementos inter e intra-individualmente (Pauls &
Bertollo, 1983; Oliveira et al., 1997; Cavallaro et al., 2000; Jesus et al., 2003).
Posteriormente, microcromossomos B foram identificados também em Prochilodus
brevis (= P. cearensis) por Pauls & Bertollo (1990). Além de apresentar todas as
características dos cromossomos B de P. lineatus, a espécie P. brevis apresentou
uma variação de 0 a 2 microcromossomos B. Venere et al. (1999) descreveram a
ocorrência de cromossomos B na espécie Prochilodus nigricans coletados no rio
Araguaia, sendo que um entre três exemplares analisados apresentou 2
microcromossomos supranumerários, os quais foram considerados totalmente
heterocromáticos após o bandamento C. Recentemente, Oliveira et al. (2003)
identificaram a presença de até 3 cromossomos supranumerários em alguns
indivíduos da espécie Prochilodus mariae provenientes da bacia do rio Orinoco, na
Venezuela.
Vários estudos (Pauls & Bertollo, 1990; Oliveira et al., 1997; Cavallaro et al.,
2000; Jesus et al., 2003, Artoni et al., 2006) têm mostrado que a espécie P. lineatus
é um dos modelos de peixes neotropicais mais utilizado para estudos concernentes
à origem, comportamento e evolução dos cromossomos B. Este fato pode estar
associado à facilidade de captura e reprodução em cativeiro que esta espécie
apresenta (Oliveira et al., 1997).
Os cromossomos B em peixes geralmente se apresentam heterocromáticos
quando submetidos ao bandamento C. Análises realizadas em preparações
cromossômicas de indivíduos da espécie P. lineatus oriundos do rio Mogi-Guaçu
confirmaram a presença de cromossomos B totalmente hetrocromáticos (Cavallaro
et al., 2000; Jesus & Moreira-Filho, 2003; Artoni et al., 2006).
Artoni et al. (2006) ao caracterizarem a espécie Prochilodus lineatus da lagoa
Dourada na bacia do rio Tibagi, Ponta Grossa no Estado do Paraná, Brasil,
observaram pequenos segmento Banda C negativos na região pericentromérica de
um cromossomo B metacêntrico .
2.5 Estudo da Estrutura dos Cromossomos Supranumerários em Prochilodus
Pouco é conhecido sobre a composição molecular do DNA satélite presente
especificamente nos cromossomos supranumerários de peixes (Jesus et al., 2003).
Os cromossomos B usualmente não se recombinam com os cromossomos do
complemento padrão A seguindo aparentemente um processo de evolução
independente (López-Léon et al., 1994; Camacho et al., 2000).
A composição e a estrutura dos cromossomos B de Prochilodus vêm sendo
analisada ao longo dos anos no intuito de esclarecer, principalmente, aspectos da
sua origem. Maistro et al. (2000) usando a enzima de restrição BamHI, observaram a
existência de diferentes classes de DNA altamente repetitivas nos genoma de P.
lineatus e também mostraram que a composição dos cromossomos B é diferente
daquela do seu conjunto autossômico. Considerando-se que os cromossomos B
provavelmente surgiram dos cromossomos A (Green, 1990; Beukeboom, 1994;
Camacho et al., 2000), indica que a existência de diferentes composições de
cromatina entre eles poderia indicar que a origem dos cromossomos B em P.
lineatus não seria um evento recente, apresentando um tempo suficiente para a
acumulação de algumas modificações na sua estrutura durante seu processo
evolutivo (Maistro et al., 2000).
Jesus et al. (2003) também estudaram a estrutura e origem dos
microcromossomos B de exemplares de P. lineatus provenientes do rio Mogi-Guaçu,
Pirassununga, SP, utilizando a enzima de restrição HindIII. Após a técnica de
hibridação in situ fluorescente (FISH) com o emprego das sondas SATH1 e SATH2
obtidas pela digestão enzimática, demonstraram que o DNA satélite SATH1 é
compartilhado entre os cromossomos A e B desta espécie, embora nem todos os
segmentos heterocromáticos dos cromossomos B sejam compostos por DNA
SATH1, indicando que outras famílias de DNA repetitivo possam estar presentes
nestes cromossomos. Artoni et al. (2006) ao utilizarem o DNA satélite SATH1 em
exemplares de populações de P. lineatus da lagoa Dourada, bacia do rio Tibagi, PR,
observaram que os sinais da sonda SATH1 apresentavam algumas diferenças nesta
população em comparação a dos exemplares provenientes do rio Mogi-Guaçu. As
diferenças entre estas duas populações mostraram que os cromossomos B podem
apresentar uma evolução independente.
O desenvolvimento metodológico da Biologia Molecular nas últimas décadas
possibilitou a amplificação de qualquer segmento de DNA através da aplicação de
técnicas como o DOP-PCR (DNA Degenerate Oligonucleotide-Primed), trazendo
grandes avanços na aplicação da citogenética molecular em muitos campos até
então inexplorados. A construção de sondas por microdissecção para pintura
cromossômica total (WCP: Whole Chromosome Painting), desenvolvida a partir da
década de 90 (Kao, 1990; Meltzer et al., 1992) tem sido amplamente utilizada em
vários grupos animais, assim como na citogenética humana. Entretanto, esta
metodologia começou a ser direcionada recentemente para estudos cromossômicos
em peixes que até então eram realizadas com o emprego de enzimas de restrição
(Diniz, 2007). Considera-se, a identificação de outras seqüências repetitivas no
genoma dos Prochilodus, por meio da técnica de microdissecção cromossômica
desencadeará uma melhor caracterização molecular e cromossômica destas
espécies, buscando esclarecimentos sobre sua origem, estrutura e sobre a herança
deste tipo de cromossomos.
2.6 Objetivos
Tendo em vista a ocorrência de cromossomos supranumerários em
Prochilodus lineatus nas populações naturais existentes no rio Mogi-Guaçu, os
objetivos gerais deste trabalho visaram realizar estudos sobre a dinâmica evolutiva,
herança, estrutura e possível origem destes elementos genômicos, com base na
caracterização citogenética desta espécie. Assim este estudo teve como principais
objetivos:
1) caracterizar a espécie Prochilodus lineatus por meio da utilização de marcadores
citogenéticos (Giemsa, NOR e Banda C), e citogenéticos-moleculares (FISH) com
a utilização de sondas dos genes ribossomais DNAr 5S e DNAr 18S;
2) efetuar cruzamentos dirigidos entre os indivíduos dos estoques reprodutores da
espécie P. lineatus mantidos para cultura, a fim de analisar o padrão de
transmissão dos cromossomos B para esta espécie, fornecendo informações
sobre a importância e viabilidade do uso de cruzamentos controlados na
compreensão do processo de manutenção dos cromossomos B desta espécie
nas populações selvagens;
3) avaliar a freqüência dos cromossomos supranumerários na população natural de
P. lineatus do rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, SP, buscando, desta forma,
informações sobre a dinâmica evolutiva destes elementos genômicos nesta
espécie;
4) buscar informações sobre a estrutura, composição e origem dos cromossomos
supranumerários na espécie P. lineatus por meio da utilização de sondas obtidas
a partir da técnica de microdissecção cromossômica do DNA total da espécie e
de seus respectivos cromossomos supranumerários;
5) contribuir com informações para o entendimento do papel desempenhado pelos
cromossomos B no genoma dos peixes e, de modo mais amplo, nos vertebrados.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material
A espécie estudada, Prochilodus lineatus, popularmente conhecida como
curimbatá, pertence à ordem Characiformes e à família Prochilodontidae. Os peixes
desta família atingem um tamanho médio de aproximadamente 50 centímetros
apresentando um corpo largo, comprido e recoberto por escamas médias ou
pequenas. Possuem espinho pré-dorsal e bífido. A boca é subterminal, geralmente
pequena, proctátil e provida de lábios grossos (Godoy, 1975). Compõem
taxonomicamente a família Prochilodontidae 21 espécies distribuídas em três
gêneros: Ichthyoelephas (2 espécies), Prochilodus (13 espécies) e Semaprochilodus
(6 espécies) (Castro & Vari, 2004).
Dentre todas as espécies destes gêneros, P. lineatus (Figura 1), é certamente,
a mais estudada. Considerado um animal endêmico da Bacia Platina, apresenta uma
alta capacidade migratória, sendo denominado um migrador por excelência (Godoy,
1975; Sverlij et al., 1993). Embora a constatação da sua ocorrência seja mais intensa
durante a atividade de migração reprodutiva, que ocorre freqüentemente entre os
meses de outubro a março, exemplares desta espécie podem ser capturados
praticamente durante o ano todo em Cachoeiras de Emas, município de
Pirassununga, SP (Godoy, 1975).
Figura 1. Exemplar da espécie de curimbatá (Prochilodus lineatus)
2.2 Local de Coleta e Manutenção da Espécie
Os peixes do rio Mogi-Guaçu realizam migração reprodutiva rio acima e
migração trófica rio abaixo (Godoy, 1975). O ecossistema habitado por estas
espécies na bacia do rio Paraná é formado por três rios: Grande, Pardo e Mogi-
Guaçu (Figura 2). O rio Mogi-Guaçu apresenta uma extensão de 473 quilômetros e
largura média aproximada de 60 metros. Sua nascente localiza-se a uma altitude de
1.600 metros e sua foz situa-se a 470 metros de altitude, sendo 84% de suas águas
situadas no Estado de São Paulo (Capeleti & Petrere, 2006).
Figura 2.
Rio Mogi-Guaçu na região da
Cachoeira de Emas, Pirassununga, SP.
O CEPTA é um Centro Especializado do Instituto Chico Mendes de
Conservação da Biodiversidade (CEPTA/ICMbio) (Figura 3). Criado em 1979, seu
objetivo é contribuir para o uso sustentável dos recursos ícticos tropicais, através da
geração, adaptação e difusão de conhecimentos científicos, tecnológicos e
ambientais em benefício da sociedade. Assim, o CEPTA realiza pesquisas de
biodiversidade dos recursos ícticos de águas continentais - recursos genéticos; uso
sustentável dos recursos pesqueiros (pesca e aqüicultura); melhoria da qualidade
ambiental; capacitação de recursos humanos e educação ambiental. O Centro tem
como objetivo o estabelecimento de parcerias com instituições nacionais e
internacionais, universidades, organizações não governamentais e com a iniciativa
privada, buscando sempre a consecução de suas competências.
Figura 3. Centro Nacional de Pesquisa de Peixes Tropicais/Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade (CEPTA/ICMbio), Pirassununga, SP.
Tendo em vista o interesse em caracterizar citogeneticamente a espécie
Prochilodus lineatus e identificar a freqüência, herança e origem de seus
cromossomos supranumerários, assim como buscar um entendimento sobre sua
dinâmica evolutiva ao longo dos anos, foram capturados 275 exemplares desta
espécie da população natural do rio Mogi-Guaçu, especificamente em Cachoeira de
Emas, município de Pirassununga, SP (Figura 4a). Após a captura, os animais foram
identificados e mantidos em tanques no CEPTA/ICMbio, no município de
Pirassununga, SP (Figura 3), após serem marcados com tag magnéticos (Figuras 4b
e 4c).
Figura 4. Captura (a) e identificação de exemplares utilizando marcadores magnéticos (tags). (b)
introdução de um pequeno tag na região dorsal do animal, próximo à nadadeira dorsal, com o auxílio de
uma seringa injetora que, ao ser pressionado o êmbolo, desloca o tag para fora da agulha, introduzindo-o
na musculatura do animal. Após a introdução do tag, sempre que necessário o animal pode ser
identificado com o auxílio de um equipamento leitor (c).
Cerca de 72 exemplares foram selecionadas para formarem os estoques de
reprodutores mantidos pelo CEPTA/ICMbio, sendo que todos estes animais foram
marcados com tags magnéticos (Figuras 4b e 4c) para facilitar sua identificação.
Com a finalidade de otimizar os cruzamentos dirigidos, considerou-se
imprescindível o conhecimento prévio do número de cromossomos supranumerários
entre estes parentais. Para isto, utilizou-se de uma técnica não invasiva, a cultura de
linfócitos, na elaboração das preparações cromossômicas. Desta forma, evitou-se o
sacrifício dos animais, além de possibilitar a elaboração dos cruzamentos dirigidos e
a reutilização destes peixes em estudos posteriores (Figuras 5 a e 5b).
b
c
a
Figura 5. Coleta de sangue para análises moleculares (a) e para a confecção de preparações
cromossômicas (b). O sangue foi deixado na seringa tempo suficiente para que ocorresse a separação
das hemácias e leucócitos (seta branca) (c). Lançamento dos leucócitos em meio de cultura (d)
Após a análise citogenética dos exemplares capturados e identificados, foram
registradas as freqüências dos cromossomos B e estes passaram a constituir a
geração parental. Com base nos valores de freqüência determinados, foram
selecionados 8 indivíduos, 6 machos e 2 fêmeas, formando 6 casais de reprodutores
(Figura 6). Após a elaboração desta matriz de cruzamentos realizou-se a reprodução
artificial induzida nas dependências do CEPTA/ICMbio Pirassununga, SP (Figura 7).
b a
c
d
Figura 6. Matriz de cruzamentos envolvendo exemplares de Prochilodus lineatus (machos e fêmeas)
identificados citogeneticamente sobre suas respectivas freqüências de cromossomos
supranumerários.
Os resultados desses cruzamentos deram origem à geração filial, sendo os
indivíduos estocados separadamente em tanques para crescimento e eventual
sacrifício. Os animais provenientes da geração filial foram sacrificados ao atingirem
um tamanho mínimo de cinco centímetros, para a confecção de preparações
cromossômicas no intuito de analisar a freqüência de cromossomos
supranumerários nos indivíduos resultantes de cada cruzamento.
CASAL 1
CASAL 2
Macho 2B
X
Fêmea 2B Macho 2B
X
Fêmea 2B
F
1
- Viveiro 17 F
1
- Viveiro 17
CASAL 3
CASAL 4
Macho 3B
X
Fêmea 3B Macho 3B
X
Fêmea 3B
F
1
- Viveiro 3 F
1
– Viveiro 3
CASAL 5 CASAL 6
Macho 4B
X
Fêmea 3B Macho 4B
X
Fêmea 3B
F
1
- Viveiro 26 F
1
- Viveiro 1
Figura 7 – Etapas da reprodução artificial induzida realizada no CEPTA/ICMbio, Pirassununga, SP.
Primeiramente realizou-se a extrusão dos ovócitos da fêmea da espécie Prochilodus lineatus (a);
estes ovócitos obtidos (b) foram divididos em pequenos recipientes (c) em seguida realizou-se o
processo de espermiação do macho desta mesma espécie (d) nos pequenos recipientes contendo os
ovócitos das respectivas fêmeas (e), para que ocorresse a ativação dos gametas no processo de
fecundação acrescentou-se água nos recipientes seguida por uma leve movimentação destas células
(f), os recipientes contendo os ovos fecundados (g) foram transferidos para incubadoras (h) para a
eventual eclosão (i). Transcorridos aproximadamente oito dias, os alevinos foram transferidos para
tanques de criação (j) no intuito de acelerar o crescimento.
j
i
f
a
b
c
d
e
f
g
h
j
i
Além dos animais estudados citogeneticamente, 50 exemplares de cada
viveiro resultantes dos 6 cruzamentos foram marcados com tags magnéticos (Figura
4) e mantidos vivos em tanques da piscicultura do CEPTA/ICMbio, Pirassununga. De
todos os animais analisados citogeneticamente e identificados com marcadores
magnéticos foram coletadas amostras de material biológico (sangue), para
realização posterior das análises moleculares (Figura 5b).
Em uma segunda fase deste trabalho buscou-se avaliar a freqüência dos
cromossomos supranumerários em três diferentes cardumes da população natural de
Prochilodus lineatus provenientes do rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, SP no intuito de
averiguar a dinâmica evolutiva atual dos cromossomos B nesta espécie. Para isto,
foram realizadas sucessivas capturas durante a estação reprodutiva a qual
correspondeu aos meses de dezembro de 2006, janeiro e março de 2007. Após a
captura, coletaram-se amostras de sangue de todos os indivíduos para a elaboração
de preparações cromossômica a cultura de linfócitos evitando o sacrifíco dos animais
e possibilitando sua utilização em estudos posteriores.
2.3 Métodos
Na análise citogenética das amostras foram utilizados os métodos de
estimulação de mitoses (Lozano et al., 1988; Oliveira et al., 1988), preparações
diretas de células renais in vitro (Foresti et al., 1993) e preparações diretas de
células renais in vivo (Foresti et al., 1981). Algumas modificações foram realizadas
nessas técnicas, ajustando-as para a espécie estudada.
2.3.1 Estimulação de Mitoses
Em algumas preparações cromossômicas foi utilizada a técnica de
estimulação de divisão celular, para obtenção de maior número de mitoses por
injeção de uma solução de fermento biológico, descrita inicialmente por Cole e
Leavens (1971) para anfíbios e répteis, utilizada por Lee & Elder (1980), para
pequenos mamíferos e por Lozano et al. (1988) e Oliveira et al. (1988) para peixes.
O procedimento utilizado consiste em:
1) preparar uma solução de fermento biológico (Fleischmann) na seguinte proporção:
0,5 g de fermento, 0,5 g de açúcar e 7 ml de água destilada;
2) incubar a solução em uma estufa (37°C) por cerca de 30 min;
3) injetar a solução na região dorso-lateral do peixe, na proporção de 1 ml por 100 g
de peso do animal. A injeção da quantidade total é realizada em duas doses, dividida
e aplicada no período de 48 h;
4) manter o animal em aquário bem aerado por um período de 24 a 48 horas.
2.3.2 Preparação Direta para Obtenção de Cromossomos Mitóticos de Peixes
2.3.2.1 Técnica de obtenção de cromossomos metafásicos in vivo
A técnica utilizada para obtenção de cromossomos metafásicos in vivo foi a
descrita por Foresti et al. (1981) e utilizada com algumas modificações. O
procedimento consiste em:
1) injetar, na região intra-abdominal, solução aquosa de colchicina (0,025%) na
proporção de aproximadamente 1 ml / 100 g de peso do animal;
2) deixar o peixe em aquário bem aerado, por um período de 50 min;
3) sacrificar o animal, retirando a parte anterior do rim. Transferir o material para uma
pequena cuba de vidro, contendo 7 ml de uma solução hipotônica de KCL (0,075M);
4) dissociar o material com o auxílio de pinças de dissecção, complementando esse
processo com o auxílio de uma pipeta Pasteur, até que se obtenha uma solução
aquosa homogênea;
5) transferir a solução obtida para um tubo de centrífuga e depositar este no interior
de uma estufa a 37°C por 21 min;
6) retirar o tubo da estufa, colocando 7 gotas de fixador gelado (metanol e ácido
acético na proporção de 3:1 respectivamente); agitar levemente a mistura com uma
pipeta Pasteur e deixar repousar por 5 min à temperatura ambiente;
7) adicionar cerca de 6 ml de fixador e novamente agitar a mistura; levar à centrífuga
(900 ± 100 rpm) por 10 min;
8) retirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 7 ml de fixador;
centrifugar por 7 min a 900 ± 100 rpm;
9) repetir o item 8 por duas ou três vezes, para uma completa fixação e lavagem das
células em suspensão;
10) pingar o material em lâminas;
11) deixar secar ao ar.
As lâminas podem ser guardadas no congelador durante muito tempo,
servindo, assim, para aplicação de várias técnicas de bandamento cromossômico.
2.3.2.2 Técnica de obtenção de cromossomos metafásicos in vitro
A técnica utilizada para obtenção de cromossomos metafásicos in vitro foi a
descrita por Foresti et al. (1993) e utilizada com algumas modificações. O
procedimento consiste em:
1) sacrificar o animal, retirando tecidos da parte anterior do rim, brânquias e
testículos no caso dos machos;
2) colocar os tecidos retirados em placas de Petri contento 6 ml de solução de Hanks
em temperatura ambiente;
3) dissociar o material, procurando obter uma suspensão de células. Para tal,
dissociar inicialmente o material com pinças de ponta fina e depois, homogeneizar
com auxílio de uma pipeta Pasteur;
4) retirar a suspensão celular da placa de Petri e transferí-la para um tubo de
centrífuga. Acrescentar 1 gota de solução de colchicina a 0,05% e agitar levemente.
5) transferir o tubo para o interior de uma estufa a 37°C por 15 min;
6) centrifugar o material a 1.000rpm por 8 min. Retirar e descartar o sobrenadante,
acrescentar 6 ml de solução hipotônica (KCl 0,075 M) e agitar levemente;
7) retornar o tubo para o interior da estufa a 37°C por 30 min;
8) retirar o tubo contendo suspensão de células da estufa, adicionar 5 gotas de
fixador gelado (metanol e ácido acético na proporção de 3:1 respectivamente) e
agitar levemente a mistura com uma pipeta Pasteur. Deixar repousar por 5 min em
temperatura ambiente;
9) adicionar cerca de 6ml de fixador e novamente agitar a mistura. Levar à centrífuga
(1000 ± 100 rpm) por 10 minutos;
10) retirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 6 ml de fixador novo.
Centrifugar por 7 minutos a 1000 ± 100 rpm;
11) repetir o item 8 por duas ou três vezes e fazer a suspensão final;
12) pingar o material em lâminas;
13) deixar secar e proceder à coloração.
As lâminas podem ser guardadas no congelador durante muito tempo,
servindo, assim, para aplicação de várias técnicas de bandamento cromossômico.
2.3.2.3 Técnica de obtenção de cromossomos metafásicos por meio de cultura de
linfócitos.
A cultura celular de linfócitos é muito utilizada para obtenção de preparações
cromossômicas em várias espécies de peixes. A mais importante característica
desta técnica diz respeito ao fato de que o animal não é sacrificado e pode ser
utilizado em pesquisas citogenéticas futuras ou em outras pesquisas. A técnica
utilizada foi a descrita por Fenocchio & Bertollo (1988), com algumas modificações, e
consiste em:
1) anestesiar o animal com solução de benzocaína (100 mg/l);
2) limpar a região caudal com álcool iodado e puncionar a veia caudal, retirando de 3
a 5 ml de sangue;
3) aguardar até separação do soro, linfócitos e hemácias e retirar os linfócitos para
serem colocados na cultura. Descartar o soro e as hemácias;
4) colocar os linfócitos em 5,2 ml de meio de cultura, que consiste em: 4 ml de meio
199 (sais de Earle) + 1 ml de soro bovino + 0,1 ml de antibiótico + 0,1 ml de PHA;
5) incubar a cultura a cerca de 28°C por 3 dias;
6) 15 minutos antes de colher a cultura, colocar 0,1 ml de solução aquosa de
colchicina a 0,025%;
7) para colher o material, centrifugar por 7 minutos a 700 ± 100 rpm e descartar o
sobrenadante;
8) acrescentar 7 ml de solução hipotônica (KCl 0,075M) e agitar levemente;
9) deixar o tubo no interior de uma estufa a 28°C por 30 minutos;
10) retirar da estufa, colocar 6 gotas de fixador gelado (metanol e ácido acético na
proporção de 3:1, respectivamente). Agitar levemente a mistura com uma pipeta
Pasteur e deixar repousar por 5 min a temperatura ambiente;
11) adicionar 6 ml de fixador e novamente agitar a mistura. Levar à centrífuga (900 ±
100 rpm) por 10 minutos;
12) retirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 6 ml de fixador.
Centrifugar por 7 minutos a 900 ± 100 rpm;
13) repetir o item 12 por duas ou três vezes;
14) pingar o material em lâminas;
15) deixar secar ao ar.
As lâminas são guardadas no freezer até o momento de aplicação da técnica
de coloração.
2.3.3 Utilização de Marcadores Citogenéticos e Citogenético-Moleculares
2.3.3.1 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (NORs) através da
Impregnação com Nitrato de Prata (Ag-NO
3
).
O procedimento utilizado seguiu a técnica descrita originalmente por Howell &
Black (1980), sendo utilizadas duas soluções:
• Solução A (solução coloidal reveladora): 1 g de gelatina muito bem dissolvida
em 50 ml de água destilada. Acrescentam-se 0,5 ml de ácido fórmico.
• Solução B (solução de nitrato de Prata): 1 g de AgNO
3
dissolvida em 2 ml de
água destilada. Depois de preparadas essas soluções devem ser mantidas em
frascos escuros, a 4°C.
O procedimento para a coloração das NORs é o seguinte:
1) hidrolisar o material contido nas lâminas por 3 min em HCl 1N a 60°C;
2) secar as lâminas. Pingar uma gota da solução A e duas gotas da solução B sobre
o material na lâmina e cobrir com lamínula;
3) deixar as lâminas sobre um suporte no interior de um banho-maria a 60°C. Em
alguns minutos (aproximadamente 3), a mistura das soluções se torna marrom
dourada. Lavar a lâmina em água destilada, retirando a lamínula e deixar secar;
4) corar com Giemsa na proporção de 1:30 em tampão fosfato (pH = 6,7) por
aproximadamente 10 seg;
5) deixar secar ao ar.
2.3.3.2 Caracterização da Heterocromatina Constitutiva
Para a caracterização da heterocromatina constitutiva (Bandas C), foi utilizada
a técnica descrita por Sumner (1972) com algumas modificações, que consiste em:
1) hidrolisar o material contido nas lâminas por 30 minutos em HCl 0,2N em
temperatura ambiente e posteriormente lavar com água destilada;
2) passar por uma solução de BaOH
2
a 5% por cerca de 7 segundos e
posteriormente lavar com água destilada;
3) banhar em HCl 1N a 60
o
C e então lavar novamente com água destilada;
4) incubar por 20 minutos em 2xSSC (pH=6,8) a 60
o
C e lavar com água destilada;
5) corar por aproximadamente 30 minutos com Giemsa a 7,5% em tampão fosfato
(pH=6,7).
2.3.3.3 Localização Cromossômica por Hibridação in situ Fluorescente (FISH).
A hibridação in situ fluorescente foi realizada utilizando as sondas DNAr 5S
obtida por PCR (Polimerase Chain Reaction) do DNA genômico de Prochilodus
lineatus usando o primer A(5’-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3’) e B(5’-
CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3’) (Pendás et al., 1994). A sonda DNAr 18S foi
obtida de Oreochromis niloticus, preparada e cedida pelo Dr. Cláudio de Oliveira. A
sonda específica de cromossomos supranumerários (PM1B) da espécie Prochilodus
lineatus foi obtida através da técnica de microdissecção cromossômica (Mühlmann et
al., 1995) descrita no item (2.3.3.3.1) e a sonda genômica (PG0B) da espécie P.
lineatus foi obtida a partir do DNA total desta mesma espécie, não portadora de
cromossomo B conforme descrito no item (2.3.3.3.2).
As sondas dos genes ribossomais 5S e 18S foram marcadas com biotina-
dATP pela técnica de nick translation, segundo as instruções do fabricante
(Bionick
TM
Labelling System-Gibco.BRL). As sondas específica (PM1B) e a
genômica (PG0B) foram marcadas pela técnica de PCR (Polimerase Chain
Reaction), com dUTP - Tetramethyl-rhodamine (Roche Diagnostics) e digoxigenina
dUTP (Roche Diagnostics), respectivamente. Após a marcação destas quatro
sondas, procedeu-se a técnica de hibridação descrita por Porto-Foresti et al. (2002).
2.3.3.3.1 Microdissecção cromossômica e amplificação por DOP-PCR
Nas preparações cromossômicas de Prochilodus lineatus (realizadas em
exemplares capturados no rio Mogi-Guaçu, SP) obtidas segundo a técnica já descrita
e após a fixação, armazenadas em metanol a 4°C. No momento da utilização as
células foram ressuspendidas em fixador (metanol e ácido acético) gotejadas em
uma lamínula limpa e coradas com Giemsa 5%.
2.3.3.3.1.1 Preparação das agulhas
Foram utilizados capilares de borosilicato com aproximadamente 1 milímetro
de diâmetro. Os capilares foram colocados em “pulley” (Narishige PC-10) (Figura 8)
e aquecidos, formando a ponta da agulha a ser utilizada. Após a preparação estas
foram armazenadas em um local protegido para evitar a contaminação.
Figura 8. Equipamento utilizado na obtenção de agulhas para a realização da microdissecção
cromossômica
2.3.3.3.1.2 Preparação do material (Mühlmann et al., 1995)
As preparações cromossômicas devem ser boa qualidade, com pouco contato
com ácido acético, sendo preferencialmente mantidas em metanol a -80ºC. A
suspensão celular deve ser pingada em uma lamínula bem limpa e as metáfases
devem ficar bem espalhadas para evitar a microdissecção de fragmentos de outros
cromossomos diferentes daquele desejado. Neste caso, a microdissecção foi feita no
cromossomo B de exemplar de Prochilodus lineatus portador de 1 cromossomo
supranumerário, proveniente do rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, S.P. Para a
realização desta técnica foi utilizado um microscópio invertido (Nikon) e um
micromanipulador manual (5171-Eppendorf) com uma agulha de vidro acoplada,
previamente esterilizada (Figura 9). Cerca de 5-10 cromossomos B foram
microdissectados e transferidos para um tubo Eppendorf.
Foram feitos 3 PCRs (Polimerase Chain Reaction). Na primeira PCR, foi feita
uma amplificação inespecífica do cromossomo inteiro, através de DOP-PCR
(Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR), utilizando-se o primer DOP (5’ CCG ACT
CGA GNN NNN NAT GTG G 3’), segundo Telenius et al. (1992). Seguiu-se uma
PCR convencional, para obtenção de um estoque da primeira PCR. Na terceira PCR,
também convencional, ocorreu a marcação dos produtos obtidos por
microdissecção.
Para a primeira PCR, preparou-se um tubo de 0,5 ml com uma reação de
DOP-PCR, que consistiu de 15,5 µl de água destilada esterilizada, 2 µl de tampão da
Termosequenase 10X, 4µl de dNTP (2,5 mM cada) e 2 µl primer DOP. O tubo com a
reação foi aquecido a 90ºC por 10 min. Esta solução foi centrifugada brevemente e
em seguida, adicionou-se 2,5 µl de 4U µl
-1
Termosequenase (Thermo Sequenase
Cycle Sequencing Kit - USB). As reações de PCR foram realizadas em um
Termociclador MasterCycler Gradient, da Eppendorf. Os produtos da PCR foram
aplicados em um gel de agarose 1%, corados com brometo de etídio e visualizados
em um transluminador de luz ultravioleta, verificando o tamanho dos fragmentos
amplificados, que se apresentaram entre 200 e 600 pb, após cada PCR. Foram
seguidas as seguintes condições: 94 ºC por 3 min., seguido por 12 ciclos a 94ºC por
1,5 min., 37 ºC por 2 min. subindo 0,2 ºC/s até 72 ºC e 72 ºC por 1,5 min, em
seguido foram realizados 30 ciclos de 94 ºC por 1,5 min., 62 ºC por 1 min e 72 ºC por
1,5 min.
Na segunda PCR, a reação constituiu-se de 33,5 µl de água destilada
esterilizada, 5 µl de tampão da Termosequenase 10X, 4µl de MgCl2, 2 µl de dNTP
(2,5 mM cada), 3 µl de DOP primer (100 µM) e 0,5 de Taq polymerase. Adicionou-se
2 µl do produto da primeira PCR, tendo como um volume final 50µl.
Na terceira PCR utilizou-se 32,5 µl de água destilada esterilizada, 5 µl de
tampão da Termosequenase 10X, 4µl de MgCl2, 2 µl de dNTP (2,5 mM cada), 1µl de
dUTP - Tetramethyl-rhodamine (Roche Diagnostics), 3 µl de DOP primer (100 µM) e
0,5 µl de 5U/µl Taq polymerase. Adicionou-se 2µl do produto da 2ª PCR, totalizando
um volume final de 50µl. A segunda e a terceira PCRs seguiram as seguintes
condições: 90 ºC por 3 min., seguido por 30 ciclos a 90ºC por 1,5 min., 56 ºC por 1,5
min. e 72 ºC por 1,5 min.
Por fim, foram adicionados 20 µl de solução de hibridação (50% formamida
deionizada, 10% de sulfato de dextrano, 2XSSC e 20 mg/ml de albumina fetal
bovina) ao DNA específico dos cromossomos supranumerários desta espécie. O
DNA marcado foi estocado a -20°C.
Figura 9. Obtenção da sonda específica de cromossomos supranumerários de Prochilodus lineatus por
microdissecção cromossômica. Microdissector Cromossômico (a) evidenciando a agulha de
microdissecção cromossômica (b) e o processo de microdissecção cromossômica (c).
2.3.3.3.2 Obtenção da sonda genômica da espécie Prochilodus lineatus
Uma alíquota (3µ) de fixação celular mantida em metanol foi colocada em um
tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. O tubo foi aberto e deixado na estufa a 37 ºC
permitindo a evaporação do metanol. Após a secagem da preparação cromossômico
(pellet) esta foi ressuspendida em uma solução de PCR.
A amplificação do DNA foi realizada segundo Telenius et al. (1992), os
seguintes reagentes foram adicionados no tubo: 10 µl de água MiliQ, 2 µl de tampão
da Termosequenase 10X, 4 µl de dNTP (2,5 mM cada), 2 µl de primer DOP,
(5’ CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G 3’) (25 µM). Esta solução foi aquecida a
90 ºC por 10 minutos. Esta solução foi centrifugada brevemente e em seguida,
adicionou-se 2,5 µl de 4U µl
-1
Termosequenase (Thermo Sequenase Cycle
Sequencing Kit - USB). As reações de PCR foram realizadas em um Termociclador
MasterCycler Gradient, da Eppendorf. Em seguida foi aplicado o seguinte programa:
94 ºC por 3 min., seguido por 10 ciclos a 94ºC por 1,5 min., 30 ºC por 2 min. subindo
a
b
c
0,2 ºC/s até 72 ºC, em seguida foram realizados 35 ciclos de 94 ºC por 1,5 min.,
56ºC por 1,5 min e 72 ºC por 1,5 min.
Os resultados foram observados em gel de agarose 1% e 2µl da alíquota do
produto da PCR foram marcadas com digoxigenina dUTP (20 µM dUTP) por PCR
utilizando 32,5 µl de água destilada esterilizada, 5 µl de 10X PCR reaction buffer,
4µl de MgCl2, 2 µl de dNTP (2,5 mM cada), 1µl de dUTP marcado, 3 µl de DOP
primer (100 µM) e 0,5 µl de 5U/µl Taq polymerase. Totalizando um volume final de
50µl. A reação de PCR seguiu às condições: 90ºC por 3 min., seguido por 30 ciclos a
90ºC por 1,5 min., 56ºC por 1,5 min. e 72ºC por 1,5 min.
Por fim, foram adicionados 20 µl de solução de hibridação (50% formamida
deionizada, 10% dextran sulfate, 2XSSC e 20 mg/ml de albumina fetal bovina) ao
DNA genômico desta espécie. O DNA marcado foi estocado a -20°C.
2.3.3.3.3 Marcação do DNA pela técnica de nick translation
Para marcação com biotina-dATP foi seguido o seguinte protocolo:
1) em um tubo de 0,5 ml preparar uma solução contendo 5 µl de uma solução de 10X
dNTP (contendo 0,1 mM de biotina-dATP), 5 µl de uma solução tamponada de
enzimas (0,0075 unidades/µl de DNAse I e 0,5 unidades/µl de DNA polimerase I), 1
µg de DNA e água para um volume final de 45 µl. Misturar a solução em um vórtex e
centrifugar brevemente a 14.000 rpm;
2) incubar a 16°C por 1h. O aumento ou a diminuição no tempo de incubação leva a
produção de segmentos de DNA mais curtos ou mais longos, respectivamente;
3) adicionar 5 µl de um tampão de bloqueio (stop buffer). Remover os nucleotídeos
não incorporados através da precipitação do DNA em etanol conforme descrito
abaixo;
4) adicionar 5 µl de uma solução a 3M de acetato de sódio e 120 µl de etanol
absoluto gelado (-20°C). Misturar os componentes invertendo várias vezes o tubo
contendo a mistura e incubar a -70°C por 30 min ou -20°C por 2 h;
5) centrifugar a 14.000 rpm por 10 min. Remover e descartar o sobrenadante;
6) ressuspender o DNA em 500 µl de etanol a 75% gelado (-20°C). Centrifugar a
14.000 rpm por 10 min. Remover o sobrenadante e secar o DNA a temperatura
ambiente;
7) adicionar 20 µl de uma solução de hibridação (50% formamida deionizada, 10%
de sulfato de dextrano, 2XSSC e 20 mg/ml de albumina fetal bovina). Estocar o DNA
a -20°C.
2.3.3.3.4 Hibridação
1) Incubar as lâminas em uma solução contendo 200 µl de 2XSSC (pH=7,0) e 2 µl de
RNAse (100 mg/ml) em uma câmara úmida a 37°C por 1 h;
2) em um coplin de vidro preparar 40 ml de uma solução de desnaturação (70%
Formamida, 2XSSC) e aquecer a 72°C em um banho-maria. Colocar as lâminas na
solução de desnaturação e incubar por 5 min;
3) desidratar as lâminas em banhos sucessivos em etanol a 70%, 80% e 100% a -
20°C por 3 min cada. Deixar as lâminas secando ao ar;
4) diluir as sondas em solução de hibridação na proporção de 7,5 µl de sonda para
7,5 µl de solução de hibridação. No caso de double FISH utilizar 7,5 µl de sonda
específica marcada pelo método direto e 7,5 µl de sonda genômica marcada pelo
método indireto;
5) desnaturar as sondas incubando-as em um banho-maria a 72°C por 10 min;
6) colocar 15 µl das sondas diluídas em cada lâmina e cobrir com lamínula. Selar as
bordas da lamínula com cimento de borracha;
7) incubar as lâminas a 37°C por cerca de 15 h (over night) em uma câmara úmida;
8) remover o cimento de borracha e as lamínulas. Lavar as lâminas duas vezes em
uma solução de 50% formamida/2XSSC por 10 min cada. Nesse passo a
estringência da reação pode ser aumentada ou diminuída na mesma proporção em
que a concentração de formamida é aumenta ou diminuída;
9) lavar as lâminas duas vezes em 2XSSC por 10 min a 42°C. Lavar as lâminas duas
vezes em 4XSSC por 10 min a 42°C;
10) remover as lâminas da solução de 4XSSC. Aplicar em cada gota de suspensão
celular 60 µl do reagente de detecção (avidina marcada com Fluoresceína para as
sondas dos genes ribossomais 5S e 18S, anti-digoxigenina marcada com
Fluoresceína para a sonda genômica da espécie Prochilodus lineatus; para a sonda
específica de cromossomos supranumerário não se realizou a detecção pois, esta foi
marcada diretamente com dUTP - Tetramethyl-rhodamine) e cobrir com uma
lamínula de plástico. Incubar as lâminas a 37°C por 15 a 60 min em uma câmara
úmida.
11) remover as lamínulas. Lavar as lâminas duas vezes em uma solução de PBD
(PBS com 1% de Triton X-100) por 5 min a temperatura ambiente;
12) lavar as lâminas em uma solução de PBS (tampão fosfato) por 5 min a
temperatura ambiente;
13) neste passo é possível ampliar o sinal das sondas aplicando uma solução de
anticorpo (anti-avidina para as sondas 5S e 18S e anti-digoxigenina-ratón para a
sonda genômica). Esta amplificação somente é necessária para seqüências
representadas por um reduzido número de cópias. Para as seqüências com um
grande número de cópias procedeu-se diretamente com a contra-coloração e análise
em microscópio de fluorescência (item 19) remover as lamínulas. Lavar as lâminas
duas vezes em uma solução de PBD por 5 min a temperatura ambiente;
14) para ampliar o sinal das sondas deve-se remover as lâminas da solução de PBS
e aplicar 60 µl de anti-avidina ou anti-digoxigenin-ratón a para cada gota de
suspensão celular. Cobrir com uma lamínula de plástico e incubar as lâminas a 37°C
por 1h em uma câmara úmida.
15) remover as lamínulas. Lavar as lâminas em uma solução de PBS por 5 min a
temperatura ambiente;
16) remover as lâminas da solução de PBS e aplicar em cada gota de suspensão
celular 60 µl do reagente de detecção (avidina marcada com Fluoresceína ou anti-
digoxigenina com Fluoresceína ) e cobrir com uma lamínula de plástico. Incubar as
lâminas a 37°C por 15 a 60 min em uma câmara úmida;
17) remover as lamínulas. Lavar as lâminas duas vezes em uma solução de PBD por
5 min a temperatura ambiente;
18) lavar as lâminas em uma solução de PBS por 5 min a temperatura ambiente;
19) contra-corar com 15 µl de uma solução de iodeto de propídio/antifade para
sondas marcadas com biotina e DAPI para sondas marcadas com digoxigenina;
20) selar as bordas da lamínula com esmalte e analisar em um microscópio de
fluorescência.
2.3.4 Estudos Cariotípicos
A partir dos dados obtidos através das análises e contagens dos
cromossomos em cerca de 30 metáfases de cada indivíduo estudado, procurou-se
estabelecer um número diplóide modal para os exemplares de cada espécie.
Assim, as melhores metáfases ou as que apresentaram melhor dispersão e
morfologia mais nítida dos cromossomos, foram fotografadas em fotomicroscópio
OLYMPUS, modelo BX50, com objetiva de imersão de 100X. O filme utilizado foi o
AGFA HDP e as cópias dos negativos foram feitas em papel fotográfico
Kodabromide F3.
2.3.4.1 Montagem dos Cariótipos
Os cromossomos recortados e dispostos em cartolina com fita adesiva foram
inicialmente arranjados de acordo com seu tamanho e morfologia, sendo
classificados como metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e
acrocêntricos (a), emparelhados com seus prováveis homólogos e dispostos em
ordem decrescente de tamanho, para a organização final do cariótipo, conforme
descrito por Levan et al. (1964).
2.3.5 Marcação dos Exemplares
Tendo em vista a realização de um trabalho de caracterização genética dos
indivíduos utilizados como reprodutores, exemplares das espécies foram marcados
com tags e mantidos vivos em tanques da piscicultura do CEPTA/ICMbio. Os tags
são pequenos bastonetes de metal magnetizados, que apresentam sistema de
identificação semelhante ao código de barras, correntemente empregado para
identificação de diversos produtos.
O procedimento de marcação dos exemplares segue o descrito por Porto-
Foresti (2001), que consiste em:
1) primeiramente deve-se anestesiar o animal em uma solução de 2 g de anestésico
(benzocaína) em 20 L de água;
2) introduzir o tag na região lombar esquerda, perto da nadadeira dorsal do animal,
com o auxílio de uma seringa injetora;
3) pressionar o êmbolo, que desloca o tag para fora da agulha, introduzindo-o na
musculatura do animal;
4) após a introdução do tag no animal, sempre que necessário este pode ser
identificado com o auxílio de um equipamento leitor. A identificação é feita passando-
se o leitor sobre a região onde foi introduzido o tag e a leitura é feita diretamente no
mostrador;
No caso da morte do animal ou na desativação do experimento, os tags foram
recuperados para serem reutilizados após sua limpeza. Este procedimento é
realizado retirando-se o tag do animal, lavando-o com água, esterilizando-o em
álcool 70% e colocando-o novamente na seringa injetora.
CAPÍTULO 1
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DA ESPÉCIE
Prochilodus lineatus DO RIO MOGI-GUAÇU,
PIRASSUNUNGA, SP
RESUMO
A família Prochilodontidae é caracterizada por apresentar uma constituição
cariotípica conservada. Dentro do gênero Prochilodus a espécie Prochilodus lineatus
é certamente a mais estuda sob o ponto de vista citogenético. Neste estudo realizou-
se a caracterização citogenética de exemplares de P. lineatus provenientes do rio
Mogi-Guaçu entre os anos de 2003 a 2007 através da utilização de marcadores
citogenéticos como Giemsa, NOR e Banda C e marcadores citogenético-moleculares
(FISH) na detecção dos genes ribossomais 5S e 18S. Todos os animais analisados
apresentaram 2n=54 cromossomos dos tipos meta/submetacêntricos, além da
presença de até 7 microcromossomos supranumerários. A NOR foi evidenciada em
apenas um par cromossômico mostrando-se polimórfica em tamanho. O padrão de
heterocromatina constitutiva esteve presente na região centromérica de todos os
cromossomos do complemento padrão A; entretanto, os microcromossomos
mostraram-se totalmente heterocromáticos pela técnica de Banda C. A distribuição
dos genes ribossomais 5S e 18S apresentou sintenia no par cromossômico portador
da NOR, não tendo sido observados clusters destes genes em outros cromossomos
do conjunto cariotípico. Apesar das características cariotípicas serem consideradas
conservadas entre os Prochilodus, pequenas diferenças na distribuição dos genes
ribossomais detectadas nesta espécie com relação a exemplares de P. lineatus de
outras localidades já descritas, podem estar associadas a diferenças evolutivas que
estas seqüências repetitivas vêm sofrendo ao longo dos anos.
INTRODUÇÃO
Os Peixes da família Prochilodontidae constituem espécies importantes para a
pesca comercial e de subsistência em ambientes neotropicais da América do Sul,
com exceção do Chile onde estas espécies não são encontradas (Lowe-McConnell,
1975; Goulding, 1981; Vari, 1983). Segundo Castro & Vari (2004) esta família
compreende 21 espécies distribuídas em três gêneros: Ichthyoelephas (2 espécies),
Prochilodus (13 espécies) e Semaprochilodus (6 espécies).
O gênero Prochilodus é composto por espécies amplamente distribuídas em
águas sul americanas sendo considerados peixes de relevante importância para o
comércio e à pesca de subsistência (Mago-Leccia, 1972). Dentre todas as espécies
deste gênero, Prochilodus lineatus, popularmente conhecida como curimbatá, é
certamente a mais abundante e a mais estudada (Godoy, 1975).
Informações cromossômicas sobre representantes do gênero Prochilodus têm
mostrado uma estrutura cariotípica conservada com 2n=54 cromossomos (Pauls &
Bertollo, 1983, 1990). Entretanto, poucas espécies e/ou populações apresentam
variações cariotípicas relacionada à presença de cromossomos supranumerários
como em P. lineatus (Pauls & Bertollo, 1983, 1990; Oliveira et al. 1997; Dias et al.,
1998; Maistro et al., 2000; Cavallaro et al., 2000; Jesus & Moreira-Filho, 2003; Artoni
et al., 2006). De conformidade com a maioria dos cariótipos dos peixes neotropicais,
a espécie P. lineatus contém somente um par de cromossomo com Região
Organizadora de Nucléolo (NOR) (Pauls & Bertollo, 1990).
A localização in situ dos genes ribossomais DNAr 5S e 18S indicam sintenia
na espécie P. lineatus e Prochilodus Argenteus, assim como polimorfismo no número
de genes 18S localizados nas Regiões Organizadoras de Nucléolo (Jesus & Moreira-
Filho, 2003; Hatanaka & Galetti Jr. 2004).
Vários estudos de bandamento C têm sido realizados em representantes da
família Prochilodontidae, inclusive na espécie Prochilodus lineatus. Um padrão de
heterocromatina constitutiva freqüentemente observado está presente na região
centromérica de todos os cromossomos do complemento padrão (A) na forma de
blocos bem caracterizados (Pauls & Bertollo, 1990; Cavallaro et al., 2000; Jesus &
Moreira-Filho 2003; Artoni et al., 2006). Os cromossomos supranumerários
geralmente se apresentam inteiramente heterocromáticos nesta espécie (Pauls &
Bertollo, 1990; Maistro et al., 2000; Cavallaro et al., 2000; Jesus & Moreira-Filho;
Artoni et al., 2006).
Apesar das características cromossômicas de P. lineatus serem consideradas
conservadas, o objetivo deste estudo foi caracterizar citogeneticamente exemplares
desta espécie provenientes do rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, SP buscando
similaridades e possíveis diferenças citogenéticas que possam ter ocorrido nesta
população ao longo dos anos.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram analisadas 275 espécies de P. lineatus provenientes do rio Mogi-
Guaçu, Pirassununga, SP, coletados entre os anos de 2003 a 2007. Estes
exemplares foram mantidos nos tanques do CEPTA/ICMbio, Pirassununga, SP para
a realização de estudos posteriores.
Cromossomos mitóticos foram obtidos por meio da técnica de cultura de
linfócito descrita por Fenocchio & Bertollo et al. (1988), com algumas modificações. A
montagem do cariótipo da espécie foi realizada de acordo com Levan et al. (1964).
Regiões Organizadoras de Nucléolo (NORs) foram identificadas no
complemento cromossômico utilizando a técnica de coloração por nitrato de Prata
desenvolvida por Howell & Black (1980) e os padrões de heterocromatina
constitutiva nas preparações cromossômicas foram obtidos segundo o método
proposto por Summer (1972).
A hibridação in situ fluorescente foi realizada de acordo com Porto-Foresti et
al. (2002) utilizando sondas de DNAr 5S obtidas por PCR (Polimerase Chain
Reaction) do DNA genômico de Prochilodus lineatus usando o primer A(5’-
TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3’) e B(5’-CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3’)
(Pendás, et al., 1994) e a sonda para DNAr 18S foi obtida de Oreochromis nicotilus,
preparada e cedida pelo Dr. Cláudio de Oliveira. As sondas foram marcadas com o
Bionick Labeling System-Gibco. BRL de acordo com as instruções do fabricante.
A hibridação in situ foi realizada utilizando avidina-Fluoresceína. As Sondas
5S e 18S foram desnaturadas em formamida 70%: 2xSSC por cinco minutos. O DNA
foi hibridado a 37°C overnigth em uma câmara úmida (1µg de sonda desnaturada,
formamida 50%; 10mg ml de sulfato de dextrano; 2xSSC, 5 mg ml de DNA de
esperma de salmão). As sondas hibridadas foram detectadas pela anti-avidina.
Posteriormente, as lâminas foram contracoradas com Iodeto de Propídio e
fotografadas em fotomicroscópio Olympus, modelo BX50 equipado com Epi-
Fluorescência.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os exemplares da espécie Prochilodus lineatus provenientes do rio Mogi-
Guaçu, Pirassununga, SP, coletados entre os anos de 2003 a 2007 apresentaram
uma constituição cariotípica composta de 2n=54 cromossomos dos tipos
meta/submetacêntricos, além da presença de até 7 cromossomos supranumerários,
sendo 2 cromossomos B o número modal para esta espécie (Figura 1). A
organização cromossômica referente à espécie estudada já tem sido descrita em
vários estudos citogenéticos realizados por Pauls & Bertollo (1983, 1990); Oliveira et
al. (1997); Cavallaro et al. (2000); Jesus & Moreira-Filho, (2003) e Artoni et al.
(2006).
Figura 1. Cariótipo da espécie Prochilodus lineatus com 2n=54 cromossomos dos tipos
meta/submetacêntrico (a); variação de até 7 microcromossomos supranumerários encontrada nos
exemplares desta espécie (b).
Com a utilização de técnica de detecção das Regiões Organizadora de
Nucléolo pela impregnação por nitrato de Prata observou-se marcação no braço
longo do segundo maior par de cromossomos metacêntricos do conjunto cariotípico
da espécie Prochilodus lineatus (Figura 2). Confirmando dados publicados por Pauls
a
b
& Bertollo, (1990) e Jesus & Moreira-Filho (2003) em estudos realizados também em
exemplares de curimbatás provenientes do rio Mogi-Guaçu. Além disso, constatou-
se a presença de polimorfismo quanto ao tamanho desta região encontrada nos
cromossomos homólogos.
A técnica de detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (NORs) tem
sido extensivamente estudada em peixes e é considerada um bom marcador
genético, auxiliando em estudos citotaxonômicos das espécies (Galetti Jr,1998). Esta
região cromossômica tem mostrado alta variabilidade nos diferentes grupos em
termos de número, localização e tamanho de cístrons ribossomais (Jesus & Moreira-
Filho, 2003). Como na maioria dos peixes neotropicais cariotipados, P. lineatus
apresenta somente um par de cromossomo portador de Região Organizadora de
Nucléolo (NOR) (Pauls & Bertollo, 1990; Maistro et al., 2000; Jesus & Moreira-Filho,
2003; Vicari et al., 2006; Artoni et al., 2006).
Maistro et al. (2000) ao estudarem a Região Organizadora de Nucléolo (NOR)
em P. lineatus do rio Mogi-Guaçu, encontraram uma marcação no braço longo do
terceiro par de cromossomo, além de um grande polimorfismo freqüentemente
encontrado neste segmento cromossômico. Já Vicari et al. (2006) ao estudarem
exemplares da espécie P. lineatus provenientes da lagoa Dourada bacia do rio
Tibagi, Ponta Grossa, PR, identificaram a NOR logo abaixo do centrômero na região
intersticial do braço longo do quarto par de cromossomos, além da presença de
polimorfismo de tamanho encontrado nestes cromossomos homólogos.
Polimorfismos de tamanhos da NOR são relativamente comuns em peixes
neotropicais (Foresti et al., 1981; Brum et al., 1998; Vicari et al., 2005).
Figura 2. Metáfases somáticas da espécie Prochilodus lineatus evidenciando o par portador da NOR
(setas) obtida de exemplares da população do rio Mogi-Guaçu
Em alguns exemplares de Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu, SP, Jesus
& Moreira-Filho (2003), detectaram NOR não somente em um par de cromossomos
metacêntricos, mas também foi observado um número variável de sítios ribossomais
(um ou dois pequenos sítios adicionais inativos), sugerindo polimorfismo numérico
interindividual nas regiões de DNAr 18S.
Uma limitação apresentada pelo uso desta técnica de NOR refere-se ao fato
de que a Prata não se liga às regiões de DNAr, mas sim às proteínas associadas à
estrutura nucleolar, limitando-se a identificar somente as NORs que estiverem ativas
na intérfase procedente (Miller et al., 1976). Assim, localização das NORs por meio
da hibridização isotópica ou não isotópica com sondas de RNAr ou DNAr em
fixações cromossômicas tem sido uma técnica bastante eficiente na investigação do
posicionamento dos genes ribossomais (Long & Dawid, 1980).
Para uma melhor caracterização das Regiões Organizadoras de Nucléolo em
P. lineatus foi realizada a técnica de hibridação in situ com a utilização dos gene
ribossomais DNAr 5S e 18S. Estes foram observados em uma condição de sintenia,
ou seja, o gene ribossomal 5S localizou-se subterminalmente no braço longo do
segundo par de um cromossomo metacêntrico adjacente à localização do gene 18S
(Figura 3), em concordância com os dados observados anteriormente por Jesus &
Moreira-Filho (2003), Hatanaka & Galetti Jr. (2004) e Vicari et al. (2006). Nenhum
cluster adicional foi encontrado nos cromossomos desta espécie com relação ao
gene 18S como observado por Maistro et al. (2000) e Vicari et al. (2000) e ao gene
5S descrito por Jesus & Moreira-Filho (2003) e por Vicari et al. (2006) ao estudarem
exemplares de Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu e da lagoa da Dourada,
respectivamente.
A organização sintênica dos genes ribossomais 5S e 18S constitui uma
situação rara entre os vertebrados. Além da descrição na espécie P. lineatus, esta
sintenia também foi observada em Salmo solar (Pendás et al.,1994), Oncorhynchus
mykiss (Móran et al., 1996), Astyanax (Almeida-Toledo et al., 2002) e em anfíbios
(Lucchini et al., 1993). Por outro lado, em várias espécies de peixes, este loci tem
sido mapeado em distintos cromossomos (Martínez et al., 1996; Morán et al.,1996;
Martins & Galetti, 2001; Born & Bertollo, 2000; Ferro et al., 2001; Vicente et al., 2001;
Wasko et., 2001), representando a condição mais freqüente descrita para
vertebrados (Lucchini et al.,1993; Drouin & Muniz de Sá, 1995; Suzuki et al., 1996).
Figura 3. Metáfase de Prochilodus lineatus evidenciando a localização do gene ribossomal 5S em (a)
e 18S em (b).
a
a
b
b
a
O mapeamento da localização do DNAr 5S em peixe tem demonstrado uma
alta freqüência para um único loci cromossômico, que poderia corresponder à
condição ancestral deste grupo (Martins & Galetti Jr., 1999).
Hatanaka & Galetti Jr., (2004) detectaram o gene DNAr 5S no braço longo do
cromossomo portador da NOR na espécie Prochilodus argenteus. Estes autores
confirmaram esta posição depois de análise seqüencial por meio da coloração por
nitrato de Prata, revelando que o gene 5S DNAr ocupa uma posição adjacente mais
terminal no cromossomo em relação ao gene ribossomal DNAr 18S. Além disso,
estes autores observaram também pequenos sinais fluorescentes ocasionalmente
identificados no terceiro par cromossômico indicando a presença de outros clusters
5S.
Jesus & Moreira-Filho, (2003) realizaram a hibridação in situ fluorescente em
exemplares de Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu com a sonda DNAr 18S
mostrando sinais fluorescentes localizados na região intersticial do braço longo do
segundo par cromossômico, correspondendo ao cromossomo portador da NOR.
Locus adicionais inativos do DNAr 18S também foram encontrados em alguns
indivíduos desta espécie. Polimorfismos numéricos da região ribossomal também
foram recentemente descritos em P. argenteus da bacia do rio São Francisco por
Hatanaka & Galetti Jr. (2004). Análises por hibridação in situ mostraram a presença
de três locus de DNAr 18S em adição aos dois comumente detectados pelo nitrato
de Prata. Estes clusters adicionais nesta espécie foram localizados somente nas
regiões teloméricas dos cromossomos.
Entretanto em P. lineatus estes clusters foram localizados na região
pericentromérica dos cromossomos (Jesus & Moreira-Filho, 2003) evidenciando,
desta forma, diferenças no padrão de distribuição do DNAr 45S no cariótipo destas
duas espécies. Ao lado de rearranjos cromossômicos, mecanismo de transposição
também tem sido considerado eventos responsáveis pela dispersão da NOR no
genoma dos diferentes grupos (Castro et al., 1996; Almeida-Toledo et al., 1996).
Genes ribossomais 5S ou 18S não foram localizados até o presente nos
microcromossomos B de P. lineatus. (Jesus & Moreira-Filho, 2003). Incluindo os
dados obtidos na análise dos exemplares desta mesma espécie realizada no
presente trabalho. A ausência de genes ribossomais nos cromossomos
supranumerários corresponde à condição mais comum e encontrada nos vários
organismos portadores de B.
A técnica de banda C tem se mostrado bastante útil nos estudos citogenéticos
de peixes permitindo a identificação das regiões de heterocromatina constitutiva.
Qualquer diferença na quantia ou distribuição de heterocromatina cromossomal pode
ser identificada pela técnica de bandamento C, que tem sido considerada como um
importante marcador em alguns grupos de peixes. Diferenças na distribuição de
segmentos positivos de Banda C podem indicar a caracterização de gêneros,
espécies e populações (Montovani et al., 2000).
Vários estudos de bandamento C têm sido realizados na família
Prochilodontidae, incluindo principalmente os representantes da espécie Prochilodus
lineatus. Neste trabalho foram observados blocos heterocromáticos conspícuos nas
regiões centroméricas dos cromossomos do complemento padrão e todos os
cromossomos supranumerários mostraram-se heterocromáticos (Figura 4). Estes
dados estão de acordo com as descrições feitas para esta espécie por Jesus &
Moreira-Filho, (2003) e Artoni et al. (2006).
Figura 5. Metáfase de Prochilodus lineatus evidenciando a presença de blocos conspícuos de
heterocromatina constitutiva nas regiões centroméricas dos cromossomos do conjunto cromossômica
A. Todos os cromossomos B mostraram-se heterocromáticos (setas).
Maistro et al. (2000) descreveram um padrão de heterocromatina constitutiva
para regiões centroméricas dos cromossomos do complemento A de curimbatás
capturados no rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, São Paulo, onde foi observada
claramente a presença de heterocromatina constitutiva também nas regiões
teloméricas. Entretanto, estas marcações não foram observadas nas preparações
analisadas no presente trabalho. Os autores confirmaram o caráter heterocromático
dos cromossomos supranumerários.
Artoni et al. (2006) ao caracterizarem a espécie Prochilodus lineatus da lagoa
Dourada na bacia do rio Tibagi, Ponta Grossa, PR, observaram padrões de
heterocromatina na região centromérica, assim como na região telomérica de alguns
pares de cromossomos do complemento A. Os cromossomos B desta espécie
analisada também se mostraram freqüentemente heterocromáticos. Entretanto, os
autores descrevem que, nas preparações analisadas um pequeno segmento da
Banda C negativo ocorreu na região pericentromérica de um cromossomo B
metacêntrico (Artoni et al., 2006).
Diante dos resultados obtidos neste trabalho podemos constatar que embora
constituição a cariotípica da espécie P. lineatus seja bem conservada, observaram-
se pequenas diferenças quanto à localização e distribuição dos genes ribossomais e
dos blocos de heterocromatina nos cromossomos desta espécie, quando
comparados a exemplares de diferentes localidades já descritas. Tais diferenças
podem estar associadas a modificações evolutivas que estas seqüências repetitivas
vêm sofrendo nestas populações.
CAPÍTULO 2
ANÁLISE DA HERANÇA DOS CROMOSSOMOS
SUPRANUMERÁRIOS DO CURIMBATÁ (Prochilodus lineatus)
RESULTANTES DE CRUZAMENTOS DIRIGIDOS EM MATRIZES NO
CEPTA/ICMbio, PIRASSUNUNGA, SP
RESUMO
Prochilodus lineatus é uma espécie bastante utilizada em projetos de
piscicultura principalmente no sul do Brasil. Sob o ponto de vista citogenético,
apresenta um cariótipo básico composto por 2n=54 cromossomos, além da presença
de até 7 cromossomos B ou supranumerários. Estes cromossomos extras são de
pequeno tamanho, freqüentemente heterocromáticos e geralmente não apresentam
homologia com o complemento padrão A, podendo variar tanto no número quanto na
morfologia. Intensos estudos têm sido realizados no intuito de buscar informações
sobre sua função, origem e herança nos organismos portadores. Diante disso, este
trabalho objetivou o estudo da herança dos cromossomos B resultantes de
cruzamentos dirigidos na espécie P. lineatus proveniente do rio Mogi-Guaçu,
Pirassununga, SP. Estes cruzamentos foram realizados no CEPTA/ICMbio,
Pirassununga, SP. Os dados obtidos sobre padrão de transmissão destes
microcromossomos mostraram-se consistentes (KB= 0,48), com a expectativa do
comportamento meiótico regular seguindo um modelo de transmissão mendeliano
(KB= 0,5). Observou-se, portanto, um processo de não acumulação destes
cromossomos B manifestado nas gerações filiais desta referida espécie. Estes
resultados parecem indicar que os cromossomos supranumerários presentes na
espécie P. lineatus de ocorrência no rio Mogi-Guaçu estão em uma fase de
neutralização, seguindo um padrão de herança mendeliana.
INTRODUÇÃO
Cromossomos B, supranumerários ou acessórios são elementos genômicos
extras, dispensáveis, presentes em alguns indivíduos de algumas populações em
muitas espécies de plantas, animais (Jones & Rees 1982; Jones & Puertas 1993;
Jones 1995) e em várias espécies de fungos (Mills & McCluskey 1990; Miao et al.,
1991 a,b; Tzeng et al., 1992; Gêiser et al., 1996; Leclair et al., 1996). A principal
característica destes é não recombinar com os cromossomos do complemento
padrão, seguindo seu próprio caminho evolutivo (Camacho et al., 2000). Embora
possa ser constatado um aumento no conhecimento destes elementos estruturais do
cariótipo das espécies, ainda pouco é sabido sobre sua estrutura, função e
comportamento, o que torna difícil uma conclusão geral sobre sua importância para a
espécie (Oliveira et al., 1997). Portanto, é essencial o conhecimento sobre os efeitos
dos cromossomos B e seus mecanismos de herança no intuito de se entender a
importância de sua presença no genoma dos indivíduos portadores (Camacho et al.,
1997).
Vários estudos têm sido realizados concernentes à herança dos
cromossomos B. Entretanto, quase todos os resultados demonstraram que estes
elementos usualmente exibem um mecanismo de acumulação que explicaria sua
natureza parasítica (Jones, 1991). De acordo com Carlson & Roseman (1992) estes
mecanismos de acumulação são suficientes para a manutenção do cromossomo B
em populações de milho; todavia, não pode ser considerado na diferenciação das
freqüências dos B entre outras diversas populações (Chiavarino et al., 1995; Naranjo
et al., 1995). A variação no padrão de transmissão dos cromossomos B é um
aspecto comum de herança, na qual a forma que estes são perdidos em algumas
progênies e aumentada em número em outras é sempre comparada à expectativa
Mendeliana (Chiavarino et al., 1998).
O controle genético do padrão desta transmissão tem sido demonstrado em
algumas espécies de animais como no gafanhoto Myrmeleotettix maculatus (Shaw &
Hewitt, 1985; Shaw et al., 1985); no bicho da farinha Pseudococus affinis, (Nur &
Brett, 1987, 1988); no gafanhoto Eyprepocnemis plorans (Herrera et al., 1996) e em
algumas plantas como, Hypochoeris maculata (Parker et al., 1982); Aegilops
speltoides (Cebriá et al., 1994) e em Allium schoenoprassum (Bougourd & Plowman,
1996).
De acordo com a presença de mecanismos de acumulação e seus possíveis
efeitos, dois modelos de equilíbrio podem ser mencionados. O modelo heterótico
aponta para um balanço entre os efeitos positivos dos cromossomos B nas formas
hospedeiras, quando eles ocorrem em baixo número e efeitos negativos quando eles
ocorrem em alto número. Entretanto, este modelo não contempla um mecanismo de
acumulação (White, 1973). O modelo parasítico proposto por Östergren (1945) e Nur
(1966a,b, 1977), ou modelo egoísta definido por Jones (1985) e Shaw & Hewitt
(1990), assume que os cromossomos B são mantidos na população por meio de
mecanismos de acumulação, os quais contrabalanceiam seus efeitos deletérios no
genoma hospedeiro.
Recentemente, um modelo de não equilíbrio da evolução dos cromossomos B
a longo prazo foi proposto por Zurita et al. (1998). De acordo com este modelo, um
cromossomo B parasítico que tendo perdido seu mecanismo de acumulação, estaria
destinado a desaparecer, quer de modo rápido, lento ou muito lentamente da
população, em um longo processo de extinção ao acaso, alcançando então um
estágio de neutralização. Diante disso, uma nova variação de cromossomo B poderia
aparecer e reiniciar o ciclo (Herrera et al., 1996).
A expectativa do padrão de transmissão mendeliana dos cromossomos B é
considerada 0,5, ou seja, de acordo com a lei de segregação proposta por Mendel a
transmissão de uma determinada característica envolveria a metade das
informações genéticas contidas em cada progenitor. Contudo, esta condição é
tipicamente baixa devido ao fato destes serem mitoticamente e/ou meioticamente
instável (Camacho et al., 2000). Muitos cromossomos B registraram um padrão de
transmissão claramente maior que 0,5, exibindo, desta forma, o mecanismo de
acumulação que é a mais importante propriedade dos cromossomos B parasíticos. A
acumulação pode ocorrer antes, durante e após a meiose (Jones, 1991). Segundo
Camacho et al. (2000), busca-se exaustivamente o principal mecanismo citológico
causador desta acumulação.
A primeira ocorrência de cromossomos B entre os peixes neotropicais foi
registrada por Pauls & Bertollo (1983) em Prochilodus lineatus. Entretanto, estudos
concernentes à herança dos cromossomos supranumerários em espécies de peixes
portadores são ainda bastante escassos (Oliveira et al., 1997). Este processo já foi
identificado em peixes como uma demonstração da herança paternal em peixes
ginogenético na espécie Poecilia formosa (Schartl et al., 1995). Posteriormente,
Oliveira et al. (1997) realizaram uma análise inicial do padrão de herança dos
cromossomos B em P. lineatus provenientes do rio Mogi-Guaçu por meio de
cruzamentos dirigidos. O padrão de transmissão observado foi de KB =0,511, que
consistente com a expectativa mendeliana (KB =0,5).
Com base nestas análises preliminares do padrão de herança dos
cromossomos supranumerários em peixes e de modo especial na espécie P.
lineatus, o presente estudo visou uma análise aprofundada do padrão de
transmissão dos elementos B em Prochilodus lineatus por meio de cruzamentos
dirigidos, estabelecendo relações de manutenção destes microcromossomos entre
os elementos componentes de populações naturais e na piscicultura.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram analisados citogeneticamente dois grupos de P. lineatus. O primeiro
era composto por seis casais formados pela combinação de gametas envolvendo
seis machos e duas fêmeas. A primeira fêmea portadora de 2B foi cruzada com um
macho portador 2B e com outro macho com 3B em seu conjunto caritotípico. A
segunda fêmea portadora de 3B foi cruzada com 2 machos portadores de 3B cada e
com outros 2 machos com 4B em seus conjuntos cariotípicos (Tabela 1). Os
indivíduos utilizados como geração parental foram capturados na população natural
do rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, São Paulo, Brasil. A reprodução induzida foi
realizada no Centro de Pesquisa e Gestão dos Recursos Pesqueiros
Continentais/Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade,
CEPTA/ICMbio, município de Pirassununga, SP.
Figura 1. Cruzamentos envolvendo as 2 fêmeas e os 6 machos distribuídos de acordo com a
presença de seus respectivos cromossomos supranumerários, formando os seis casais.
CASAL 1
CASAL 2
Macho 2B
X
Fêmea 2B Macho 2B
X
Fêmea 2B
CASAL 3
CASAL 4
Macho 3B
X
Fêmea 3B Macho 3B
X
Fêmea 3B
CASAL 5 CASAL 6
Macho 4B
X
Fêmea 3B Macho 4B
X
Fêmea 3B
O segundo grupo era composto por 63 indivíduos obtidos a partir dos
cruzamentos dirigidos representando a geração filial. Para fim de análise, os
indivíduos da geração filial resultante de cruzamentos onde os parentais
apresentavam número de cromossomos B iguais foram agrupados, resultando em, 3
possibilidades de 3 cruzamentos dirigidos (Figura 2)
CRUZAMENTOS TIPO A
2B X
2B
F1 = 17
Figura 2. Formação dos três tipos de casais de Prochilodus lineatus através do agrupamento dos
parentais com número igual de cromossomos B e suas repectivas gerações filiais (F1).
As preparações cromossômicas dos parentais foram obtidas por cultura de
linfócitos usando o método utilizado por Fenocchio & Bertollo (1988), com algumas
modificações. As preparações cromossômicas da geração filial foram obtidas
utilizando-se fragmentos de tecido do rim anterior pelo método utilizado por Foresti et
al. (1981). Todos os parentais foram marcados com tag magnéticos segundo Porto-
Foresti (2001) e mantidos em tanques no CEPTA/ICMbio para estudos posteriores.
A morfologia cromossômica foi determinada de conformidade com o proposto por
Levan et al. (1964), com os cromossomos sendo classificados em metacêntrico (m),
submetacêntrico (sm), subtelocêntrico (st) e acrocêntrico (a).
Para o estabelecimento do número modal de B, foram analisadas 30 células
com 2n=54 cromossomos em cada indivíduo. O padrão de transmissão dos
CRUZAMENTOS TIPO B
3B X
3B
F1 = 19
CRUZAMENTOS TIPO C
4B X
3B
F1 = 27
cromossomos B (KB) foi investigado usando o teste Z segundo López-Léon et al.,
(1992).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Foram analisados citogeneticamente 8 exemplares da geração parental e 63
indivíduos da geração filial obtidos através dos cruzamentos dirigidos de exemplares
desta espécie provenientes da população natural do rio Mogi-Guaçu, Pirassununga,
SP. Para fins de análise da amostragem da geração filial, os cruzamentos onde os
parentais apresentavam o mesmo número de cromossomos B foram agrupados,
formando 3 possibilidades de cruzamentos controlados (Figura 3). No primeiro tipo
de cruzamento, onde ambos os parentais apresentaram 2 cromossomos B, a
proporção de cromossomos B manifestada na geração filial foi de 35,8% dos
indivíduos portando 1 cromossomo B, 25% dos indivíduos apresentando 2, 25% dos
indivíduos apresentando 3 cromossomos B e 14,2% dos exemplares com 4
cromossomos B no seu conjunto genômico (Cruzamento Tipo A). No segundo tipo
de cruzamento, com ambos os parentais apresentando 3 cromossomos B, a
proporção manifestada na geração filial foi de 11% dos indivíduos portando 1
cromossomo B, 21% dos indivíduos apresentando 2 cromossomos B, 42% dos
exemplares portando 3 cromossomos B, 16% dos animais portando 4 cromossomos
B e 10% apresentando 5 cromossomos B (Cruzamento Tipo B). No terceiro e último
tipo de cruzamento, os machos portavam 4 cromossomos B as fêmea apresentavam
3 cromossomos B, a proporção manifestada na geração filial foi de 4% apresentando
1 cromossomo B, 22% portando 2 cromossomos B, 51% apresentando 3
cromossomos B, 12% portando 4 cromossomos B e 11% apresentando 5
cromossomos B (Cruzamento Tipo C). Estes dados representam a proporção de
cromossomos supranumerários transmitida à geração filial. Observou-se, com base
nestes cruzamentos, que o número dos cromossomos B manifestado na geração
filial nunca excede à somatória dos cromossomos B de seus respectivos parentais.
CRUZAMENTOS TIPO A
2B X
2B
1B
35,8%
2B
25%
3B
25%
4B
14,2%
Figura 3. Proporção de cromossomos B manifestada na geração F
1
provenientes de cruzamentos
induzidos a partir das respectivas gerações parentais.
O genoma de alguns organismos eucariótico não é composto somente por
genes encontrados no conjunto cromossômico A, mas também por elementos
supranumerários os quais parecem não obedecer às leis da herança mendeliana
(Camacho et al., 2000). Os cromossomos B são fragmentos de DNA dispensáveis,
portadores de alguns genes funcionais, exibindo um modelo irregular de transmissão
e em muitos casos diminuindo a aptidão dos indivíduos que os carregam (Bakkali et
al., 2002).
Informações sobre o padrão de transmissão dos cromossomos
supranumerários em peixes portadores são bastante escassos na literatura. Em uma
das poucas referências disponíveis Oliveira et al. (1997) descreveram resultados de
estudos prévios sobre à herança dos cromossomos supranumerários na espécie
Prochilodus lineatus, tendo observado que a transmissão destes microcromossomos
foi consistente com o modelo mendeliano (KB = 0,511). Estes autores estudaram o
CRUZAMENTOS TIPO B
3B X
3B
1B
11%
2B
21%
3B
42%
4B
16%
5B
10%
CRUZAMENTOS TIPO C
4B X
3B
1B
4%
2B
22%
3B
51%
4B
12%
5B
11%
padrão de transmissão destes elementos supranumerários na espécie em cativeiro,
estabelecendo relações entre o padrão de transmissão e manutenção dos B em
populações naturais e na piscicultura, conforme também realizado neste trabalho.
No presente trabalho, observou-se que o padrão de transmissão destes
elementos genômicos nas respectivas gerações foi consistente com a expectativa
mendeliana (KB=0,48) (tabela 1) reforçando, desta forma, os dados apresentados
por Oliveira et al. (1997).
Tabela1. Padrão de transmissão dos cromossomos B nos cruzamentos controlados da espécie
Prochilodus lineatus provenientes do rio Mogi-Guaçu. (KB, padrão de transmissão dos cromossomos
B; valores de Z maior que +1,96 indica acumulação dos cromossomos B e valores de Z menor que
-1,96 indica eliminação dos cromossomos B; NS não significante.
Os valores de KB obtidos sobre a freqüência dos cromossomos B encontrados
nos indivíduos resultantes dos diferentes cruzamentos realizados indicam que a
transmissão dos cromossomos B (KB=0,48) para a espécie P. lineatus seguiu um
padrão de herança mendeliana (KB=0,5). A possibilidade dos B serem acumulados
em um dos sexos e eliminados em outro pode não ser regra para o estudo da
herança dos cromossomos B nesta espécie. Uma vez que todos os cruzamentos
realizados até o presente momento envolveram machos e fêmeas portadoras de
cromossomos B. Tal constatação também foi evidenciada por Oliveira et al. (1997).
Tipos de Número de cromossomos B Índice de
Cruzamentos na geração F1 Média transmissão de B
ζ♂ ♀Ζ
0 1 2 3 4 5 6 7 Total de B KB Z P
2 2 7 4 4 2 17 2,0588 0,5147 0,1212 NS
3 3 2 4 8 3 2 19 2,9473 0,4912 -0,076 NS
4 3 1 6 14 3 3 27 3,0370 0,4338 -0,688 NS
Total 0 10 14 26 8 5 0 0 63 2,6810 0,48
A existência de um padrão de herança mendeliana dos cromossomos B em
Prochilodus lineatus observada após a reprodução induzida na piscicultura do
CEPTA/ICMbio representa o padrão de manutenção dos cromossomos B na
população natural do rio Mogi-Guaçu. Conforme já proposto por Cavallaro et al.
(2000) e Voltolin et al. (capítulo 3), os cromossomos supranumerários da população
natural do rio Mogi-Guaçu estariam passando por um processo de neutralização.
As condições de acúmulo, neutralização e extinção destes elementos
supranumerários estão relacionadas ao seu modo de transmissão entre as gerações
portadoras. O aumento da instabilidade meiótica acarreta acúmulo destes elementos
supranumerários na natureza e todo acúmulo é devido a um padrão de transmissão
acima da perspectiva mendeliana. No entanto, se os cromossomos B atingirem uma
estabilidade meiótica, o padrão de transmissão deverá ser coerente com a
expectativa mendeliana, repercutindo na fase de neutralização que foi observada
neste trabalho. Por fim, se registrada uma diminuição da freqüência dos elementos B
nas gerações, seu padrão de transmissão encontrar-se-á abaixo da expectativa
mendeliana, favorecendo a extinção destes elementos na população portadora.
Bakkali et al. (2002) analisaram a herança dos cromossomos
supranumerários em populações de gafanhotos Eyprepocnemis plorans, baseados
na expectativa de transmissão mendeliana (KB=0,5). Estes autores estudaram o
padrão de transmissão dos cromossomos B1 (originário da população ibérica) de
fêmeas desta espécie em três diferentes populações marroquinas, Mechra (próxima
a Mechra-bel-Ksiri); SO.DE.A. (próxima a Ksar-el-Kebir) e Simir (entre Ceuta e
Tetouan). Após a realização de cruzamentos dirigidos, constataram que a
transmissão dos cromossomos B1 na população de Mechra apresentou um processo
de acúmulo (KB=0,575) com relação ao padrão de transmissão mendeliano.
Entretanto, esta acumulação não foi observada nas outras duas populações, onde
SO.DE.A. apresentou uma transmissão de (KB=0,512) e Smir (KB=0,463). Estes
dados confirmaram a existência de diferentes estágios evolutivos para o mesmo
cromossomo B em diferentes populações. Sob o modelo de evolução a longo prazo,
a população de Mechra apresentou o polimorfismo B1 mais jovem no Marrocos,
onde ainda se observa um acúmulo deste tipo de cromossomo supranumerário
através das gerações. Nas outras duas populações de gafanhotos o processo de
transmissão dos cromossomos B1 mostrou-se neutralizado, seguindo desta forma
um padrão mendeliano (Bakkali et al., 2002).
O padrão de transmissão dos cromossomos supranumerários da espécie
Prochilodus lineatus foi consistente com a expectativa mendeliana e está relacionado
com a fase de neutralização destes supranumerários nas populações selvagens do
rio Mogi-Guaçu, conforme proposto por Oliveira et al. (1997) e Cavallaro et al.,
(2000). Considera-se que os dados obtidos reforçam as proposições destes autores
e contribuem para o entendimento da dinâmica evolutiva dos cromossomos
supranumerários em P. lineatus no rio Mogi
CAPÍTULO 3
DINÂMICA EVOLUTIVA DOS CROMOSSOMOS
SUPRANUMERÁRIOS DE Prochilodus lineatus (CHARACIFORMES,
PROCHILODONTIDAE)
RESUMO
Prochilodus lineatus é uma espécie de peixe formadora de grandes cardumes
que empreendem processos migratórios na época de reprodução. Além disso, é uma
espécie amplamente explorada e utilizada em projetos de cultura, particularmente no
sul do Brasil. O número diplóide de 2n=54 cromossomos caracteriza esta espécie,
além da presença de até 7 pequenos cromossomos supranumerários que são
freqüentemente encontrados nos indivíduos de diferentes populações. Entretanto, a
função e o efeito da presença dos cromossomos B no genoma desta espécie
constituem elementos de investigação. No presente trabalho realizou-se um estudo
da freqüência dos cromossomos supranumerários em P. lineatus de ocorrência no
rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, SP comparando-se a freqüência destes elementos
genômicos em diferentes estudos e sua ocorrência no período compreendido entre
os anos de 1979 a 2007, a fim de constatar a dinâmica do processo de acúmulo ou
neutralização da instabilidade mitótica dos cromossomos B nesta espécie. Também
foram estudados indivíduos componentes de diferentes cardumes com intuito de
averiguar a continuidade do processo de fixação populacional dos cromossomos B
de P. lineatus no rio. As evidências comparativas mostraram que o processo de
acúmulo (invasão) dos cromossomos supranumerários na espécie P lineatus foi
bastante marcante no início da década de 80 e atualmente passa por um processo
de neutralização. Considera que os dados obtidos em relação à dinâmica
populacional destes elementos extras e a averiguação das causas da tendência para
a neutralidade da instabilidade mitótica deste tipo de cromossomo entre os
representantes desta espécie neste ambiente, podem contribuir com informações
para a compreensão da sua origem e dispersão em outras populações de peixes.
INTRODUÇÃO
O gênero Prochilodus apresenta uma ampla distribuição nas bacias
hidrográficas brasileiras (Reis et al., 2003) e águas sul-americanas, sendo
considerados peixes de relevante importância para o comércio e a pesca de
subsistência (Mago-Leccia, 1972). Dentre as espécies deste gênero, Prochilodus
lineatus, popularmente conhecida como curimbatá é, certamente, a mais explorada e
estudada (Godoy, 1975; Sverlij et al., 1993). De acordo com Godoy (1975), P.
lineatus é uma espécie comum ao longo da bacia do rio Paraná, principalmente nos
rios Grande, Pardo e Mogi-Guaçu. Embora sua ocorrência seja detectada com maior
freqüência durante a migração reprodutiva, que ocorre entre os meses de outubro a
março, exemplares desta espécie podem ser capturados o ano todo ao longo destes
rios e na região de Cachoeira de Emas, município de Pirassununga, São Paulo
(Godoy, 1975).
Sob o ponto de vista citogenético, a espécie P. lineatus apresenta um número
diplóide de 2n=54 cromossomos, sendo o cariótipo formado por 40 cromossomos do
tipo metacêntrico e 14 cromossomos do tipo submetacêntrico, com número
fundamental igual a 108. Além disso, exemplares desta espécie usualmente podem
apresentar até 7 cromossomos supranumerários ou microcromossomos B nas suas
células somáticas (Pauls & Bertollo, 1983, 1990; Oliveira et al., 1997; Cavallaro et al.,
2000).
Supranumerários ou cromossomos B representam cromossomos adicionais
encontrados em plantas, animais (Jones & Rees, 1982; Jones & Puertas, 1993;
Jones, 1995) e em várias espécies de fungos (Mills & McCluskey, 1990; Miao et al.,
1991 a, b; Tzeng et al., 1992; Gêiser et al., 1996; Leclair et al., 1996). São
usualmente heterocromáticos e apresentam pouca homologia com os cromossomos
do complemento padrão (A), variando em número e morfologia. Devido sua natureza
heterocromática, eles são considerados materiais inertes, mas capazes de carregar
um pequeno número de genes ou cístrons ativos (Jesus et al., 2003).
Segundo Camacho et al. (2000) os cromossomos supranumerários seriam
cromossomos adicionais, dispensáveis, que estão presentes em alguns indivíduos
de determinadas espécies e que provavelmente teriam surgido dos cromossomos A,
seguindo, porém um caminho evolutivo próprio.
Duas hipóteses têm sido propostas para explicar a manutenção dos
cromossomos B na população natural. O modelo heterótico (Whitte, 1973)
argumenta que a não acumulação dos cromossomos B pode ser mantida porque os
efeitos benéficos nos indivíduos hospedeiros são manifestados com um pequeno
número de B e o modelo parasítico ou modelo egoísta (Östergren, 1945; Nur, 1966
a, b; Nur, 1977; Jones, 1985; Shaw & Hewitt, 1990) que propõe a manutenção dos
cromossomos B por ação de mecanismos de acúmulo, acúmulo meiótico, por
exemplo, o qual contrabalanceia seus efeitos deletérios na forma hospedeira.
A teoria parasítica sugere que os cromossomos B tendem a alcançar um
equilíbrio na freqüência, que seria contrabalanceado pela perda total dos efeitos
danosos na forma hospedeira. Contudo foi mostrado recentemente que o sistema de
cromossomo B pode entrar em um estado de não-equilíbrio realizando vários
estágios de acúmulo, neutralização e regeneração polimórfica (Camacho et al.,
1997). Como parasitas, os cromossomos B poderiam aumentar rapidamente sua
freqüência tornando-se pesado para o genoma hospedeiro, o qual seria responsável
pela supressão do acúmulo de B. Uma vez neutralizado, o B seria condenado à
extinção ao menos que uma nova variável de B ocorresse subseqüentemente
prolongando o polimorfismo (Camacho et al., 2000). A maioria dos cromossomos B
segue este modelo (Bakkali et al., 2002).
Com base na ocorrência de uma possível neutralização da instabilidade
mitótica dos cromossomos B em Prochilodus lineatus, proposta previamente por
Oliveira et al. (1997) e Cavallaro et al. (2000), no presente trabalho realizou-se um
estudo da freqüência dos cromossomos supranumerários em P. lineatus de
ocorrência no rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, SP, comparando-se a freqüência
destes elementos genômicos em diferentes estudos e sua ocorrência no período
compreendido entre os anos de 1979 a 2007, a fim de constatar a dinâmica dos
processos de acúmulo ou neutralização da instabilidade mitótica dos cromossomos
B nesta espécie. Além disso, objetivou-se estudar também indivíduos componentes
de diferentes cardumes com intuito de averiguar a continuidade do processo de
fixação populacional dos cromossomos B na espécie P. lineatus presente neste rio.
MATERIAL E MÉTODOS
Local de Coleta e Descrição da Espécie
P. lineatus (Teleostei, Characiformes, Prochilodontidae) é uma espécie de
peixe abundante na bacia do rio Paraná, especialmente nos rios Grande, Pardo e
Mogi-Guaçu (Godoy, 1975) (Figura 1) e tem sido extensivamente utilizada em
programas de aqüicultura no Brasil. Considerado um animal endêmico na bacia
Platina, apresenta alta capacidade de movimentação ao longo dos componentes
destas bacias hidrográficas sendo denominado migrador por excelência (Godoy,
1975; Sverlij et al., 1993).
No presente trabalho foram estudados indivíduos componentes de diferentes
cardumes totalizando 275 indivíduos coletado da população natural do rio Mogi-
Guaçu, Pirassununga, SP entre os anos de 2003 a 2007. Dentre os exemplares
analisados constituíram amostras componentes, três cardumes, os quais foram
capturados em dezembro de 2006, em janeiro e março de 2007 Todos estes
indivíduos coletados da natureza foram mantidos como estoques reprodutores nas
instalações do CEPTA/ICMbio, município de Pirassununga, SP. Para análise dos
dados dos exemplares coletados no período de 1979 a 1992, foram utilizados os
resultados disponíveis já descritos na literatura segundo Pauls & Bertollo (1983),
Cavallaro et al. (2000) e Oliveira et al. (1997).
Figura 1. Representação Geográfica da bacia do rio Paraná aparecendo em destaque os rios
Grande, Pardo e Mogi-Guaçu.
Análises Citogenéticas
As preparações cromossômicas da espécie em estudo foram realizadas
utilizando o método de cultura de linfócitos conforme descrito por Fenocchio &
Bertollo (1988), com algumas modificações.
A morfologia cromossômica foi determinada de conformidade com o proposto
por Levan et al. (1964), com os cromossomos sendo classificados em metacêntrico
(m), submetacêntrico (sm), subtelocêntrico (st) e acrocêntrico (a).
Análises Estatísticas
A freqüência dos cromossomos B foi obtida por meio do cálculo da média
ponderada. As análises estatísticas foram realizadas pelo teste não paramétrico de
Mann-Whitney, a fim de verificar a significância concernente ao aumento ou
diminuição da freqüência dos cromossomos supranumerários na espécie
Prochilodus lineatus. O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi utilizado na
análise das diferenças significativas entre a freqüência dos cromossomos B nos três
diferentes cardumes dessa espécie.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente trabalho confirma o número diplóide de 2n=54 cromossomos em
P. lineatus, conforme já observado por Pauls e Bertollo, (1983, 1990), Oliveira et al.
(1997), Cavallaro et al. (2000), Jesus & Moreira-Filho, (2003), Vicari et al. (2006) e
Artoni et al. (2006), além da presença de até 7 microcromossomos supranumerários
nos indivíduos das populações analisadas (Pauls e Bertollo, 1983, 1990; Oliveira et
al., 1997; Cavallaro et al., 2000). O número mais freqüentemente encontrado nos
indivíduos desta espécie foi de 2 microcromossomos que representa o número
modal. Embora indivíduos com 3 cromossomos tenham se apresentado com
freqüência elevada. Indivíduos sem cromossomos B e outros com até 7 elementos
extras também foram observados (Figura 2).
Figura 2. Freqüência dos cromossomos B na população natural de Prochilodus lineatus proveniente
do rio Mogi-Guaçu, exibindo o número modal de 2 microcromossomos supranumerários.
A ocorrência de cromossomos B entre os indivíduos de uma população pode
ser esporádica, freqüente, como ocorre com Prochilodus lineatus e outras espécies,
podendo mostrar uma alta freqüência entre os indivíduos. Além da variação
numérica é possível encontrar também variações em relação à morfologia e tamanho
desses supranumerários (Pauls & Bertollo, 1983, 1990; Oliveira et al., 1997; Venere
et al., 1999; Cavallaro et al., 2000).
A dinâmica evolutiva dos cromossomos B numa dada população parece ser
caracterizada por uma rápida invasão ou aumento do número de indivíduos
portadores (acúmulo), seguida por um período de pouca variação, determinada pela
evolução de genes supressores nos cromossomos A (neutralização), os quais
controlariam o acúmulo de cromossomos B (Camacho et al., 1997). Assim ocorreria
inicialmente uma fase de acúmulo, seguida pela estabilização em torno de um
número modal adaptado para a espécie no ambiente.
0B 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B
Três exemplos são conhecidos a respeito do aumento da freqüência
doscromossomos supranumerários em um curto período de tempo (Riviera et al.,
2004). Em um estudo da espécie de gafanhoto Eypreponemis plorans foi verificado
que o cromossomo parasita B24 recentemente invadiu a população de Torrox
(Málaga, sul da Espanha) e mostrou uma mudança significante na freqüência média
de B de 0,34 em 1984 para 0,98 em 1992 e 1,53 em 1994, substituindo o B2
neutralizado (Zurita et al. 1998). Em vespas Tryposeylon albitarse, a freqüência dos
cromossomos B aumentou de 0,133 para 0,962 na população de Nova Ilha (Porto
Firme, Brasil), entre 1997 e 1999, sugerindo uma rápida invasão dos cromossomos
B (Araújo et al., 2002). No peixe Prochilodus lineatus, do rio Mogi-Guaçu, foi
verificado um aumento da freqüência de 1,443 para 2,766 em menos de 10 anos
(Cavallaro et al., 2000).
Estudos sobre a freqüência de cromossomos B na espécie P. lineatus
provenientes do rio Mogi-Guaçu vêm sendo realizados desde o final da década de
70. As primeiras análises foram feitas por Pauls & Bertollo (1983) e Cavallaro et al.
(2000) em espécies de P. lineatus coletadas de 1979 a 1980 e de 1987 a 1989,
respectivamente. Este levantamento mostrou um aumento significativo da freqüência
dos cromossomos B de 1,341 para 2,766 durante este período (teste de Mann-
Whitney z= 5,18, P<0,0001) (Tabela 1). Posteriormente, Oliveira et al. (1997)
realizaram novo estudo sobre a freqüência dos cromossomos B de P. lineatus nesta
mesma localidade entre os anos de 1991 a 1992, tendo estes autores observado que
a freqüência média dos cromossomos B nos indivíduos sofreu um aumento com
relação os dados anteriores para 3,063. Contudo, tal variação não foi considerada
significativa (teste de Mann-Whitney z= 0,90, P= 0,37) (Tabela 1).
Tabela 1. Evolução da freqüência dos cromossomos B na população de Prochilodus lineatus do rio
Mogi-Guaçu
Os dados deste trabalho foram comparados com os já descritos na literatura
sobre a freqüência dos cromossomos supranumerários em Prochilodus lineatus
(Tabela 2), onde fica evidente nesta análise que houve um aumento significativo da
freqüência dos cromossomos B em relação àqueles obtidos por Pauls & Bertollo
(1983) nos anos de 1979 a1980, quando se observou uma freqüência de 1,341
(teste de Mann-Whitney z= 5,18, P< 0,0001) (Tabela 2).
Entretanto, ao comparar os dados do presente trabalho com os de Cavallaro
et al. (2000) pode-se constatar a ocorrência de estabilidade na freqüência dos
cromossomos supranumerários nos indivíduos sendo a média de cromossomos
agora encontrada de 2,614, semelhante à descrita por aqueles autores de 2,766
(teste de Mann-Whitney z= 0,8499, P= 0,3953) (Tabela 2). Os dados apresentados
no levantamento realizado por Oliveira et al. (1997), comprovam a ocorrência da
estabilidade mitótica dos cromossomos supranumerários na espécie P. lineatus onde
o valor médio da freqüência de cromossomos B encontrada foi de 3,063. Os dados
constados na tabela 1 revelam que houve uma diminuição da freqüência de
cromossomo B na população de Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu na
Freqüência de cromossomos B
Ano 0B 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B Total
Freqüência
média de B Referências
1979-80 18 5 13 6 0 2 0 0 44 1.341 Pauls e Bertollo (1983)
1987-89 1 11 22 21 15 7 0 0 77 2.766 Cavallaro et al. (2000)
1991-92 0 0 6 4 5 1 0 0 16 3.063 Oliveira et al. (1997)
2003-2007 8 26 101 84 39 11 5 1 275 2.614 Presente trabalho
comparação entre as duas últimas análises, mas esta redução não se mostrou
significativa (teste de Mann-Whitney z= 1,5020, P= 0,1330) (Tabela 2).
Tabela 2. Análise comparativa da freqüência dos cromossomos B do presente trabalho com os dados
já descritos na literatura a partir do ano de 1979.
Com o intuito de investigar o processo de continuidade da neutralização
imposto aos cromossomos supranumerários desta espécie analisou-se a freqüência
dos cromossomos B de três diferentes cardumes de Prochilodus lineatus
provenientes do rio Mogi-Guaçu coletados nos meses de dezembro de 2006, janeiro
e março de 2007. Nestes três cardumes observou-se uma estabilização da
freqüência destes cromossomos B, ou seja, a diferença na freqüência dos
cromossomos supranumerários nestes diferentes cardumes não foi significativa
(teste de Kruskal-Wallis H=2,623516, DF=2, P=0,2993) (Figura 3). Tal
homogeneidade entre os diferentes conjuntos populacionais, resultantes em
estabilização na freqüência dos cromossomos B, poderia ser devido ao fato de se
tratar de cardumes migradores coletados em um período bastante próximo, ou este
processo poderia estar associado a um intenso fluxo gênico entre estes três grupos.
Ano Freqüência de
B
Z P Referência
1979/1980 1,341 5,18 P<0,0001(s) Pauls & Bertollo (1983)
2003/2007 2,614 Presente trabalho
1987/1989 2,766 0,8499 P=0,3953(ns)
Cavallaro et al. (2000)
2003/2007 2,614 Presente trabalho
1991/1992 3,063 1,5020 P=0,1330(ns)
Oliveira et al. (1997)
2003/2007 2,614 Presente trabalho
Em uma segunda hipótese explicativa, a freqüência dos cromossomos B na
população de Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu encontrar-se-ia em um
processo de neutralização, pela suposta ação de genes supressores e o aumento da
freqüência somente ocorreria com o surgimento de novas variantes de cromossomos
B.
A análise da figura 3 ainda mostra que os cardumes quando considerados
separadamente apresentam uma freqüência de cromossomos supranumerários
característica, com distribuição diferenciada do número destes elementos nos
indivíduos.
Figura 3. Freqüência atual dos cromossomos supranumerários da espécie Prochilodus lineatus
provenientes do rio Mogi-Guaçu a partir da análise citogenética de três cardumes.
Os resultados obtidos das análises comparativas dos dados de freqüência
indicam que os cromossomos supranumerários da espécie P. lineatus no rio Mogi-
Guaçu estão passando por um processo de neutralização da instabilidade mitótica,
hipótese já previamente proposta por Oliveira et al. (1997) e Cavallaro et al. (2000),
onde tais evidências estão em concordância também com um modelo de evolução
em longo prazo para os cromossomos supranumerários proposto por Camacho et al.
(1997).
0
5
10
15
20
25
0B 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B
DEZ/06
JAN/07
MAR/07
Estes autores afirmaram que o processo de estabelecimento e fixação dos
sistemas de cromossomos B nas populações e espécies passa por sucessivos
estágios, sendo eles, parasita, neutro e novamente parasita em uma dinâmica de
não equilíbrio. Existem, pois, concordância deste modelo com o presente caso de
Prochilodus lineatus, pois o período entre os anos de 1979 e 1980 parece ter sido o
cenário para a parte final da rápida invasão dos cromossomos B nas populações da
bacia do rio Mogi-Guaçu. Em pouco menos de 10 anos a freqüência aumentou de
1,341 (Pauls & Bertollo, 1983) para 2,766 (Cavallaro et al., 2000) nos anos
posteriores e ainda para 3,063 (Oliveira et al. 1997) sem um aumento não
significativo dos cromossomos B nesta última fase. Nos anos de 2003 a 2007
deparou-se com uma diminuição não significativa desta freqüência para 2,614. Desta
forma, pode-se afirmar que a última grande invasão destes elementos
supranumerários parece ter ocorrido na década de 80 e a ausência de acumulação
observada por Oliveira et al. (1997), Cavallaro et al. (2000) e no presente trabalho
sugere que a freqüência dos cromossomos B desta espécie está se estabilizando em
um processo de neutralização (Figura 4).
Figura 4. Curva evidenciando o processo de neutralização dos cromossomos supranumerários da
espécie Prochilodus lineatus de ocorrência no rio Mogi-Guaçu.
1,341
2,766
3,063
2,614
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
1979-1980 1987-1989 1991-1992 2003-2007
Possivelmente, pode-se sugerir que os cromossomos B de Prochilodus
lineatus revelaram uma origem parasítica, como foi evidenciado nas análises
realizadas no período de 1979 a 1992 (Pauls & Bertollo, 1983; Oliveira et al., 1992;
Cavallaro, et al. 2000) e a partir de então este acúmulo parece ter sido neutralizado
conforme confirmado agora, com as análises realizadas no período de 2003 a 2007
relatado neste trabalho. A instabilidade mitótica pode ser importante no
estabelecimento inicial do processo de acumulação dos cromossomos B (Jones,
1991), no entanto, no presente caso, uma redução da freqüência dos cromossomos
B pode ter sido acompanhada pelo aumento na estabilidade mitótica (Oliveira et al.,
1997).
Considera-se, pois, que os dados resultantes deste estudo sobre a dinâmica
evolutiva dos cromossomos supranumerários da espécie P. lineatus provenientes do
rio Mogi-Guaçu parece indicar que os elementos B nesta população estão no final de
uma fase de um processo de neutralização que resulta em estabilidade mitótica nos
indivíduos e na população. Somente o surgimento de novas variantes de B poderia,
então, determinar o reaparecimento de novo processo de modificações na
freqüência dos cromossomos supranumerários.
CAPÍTULO 4
ORIGEM E EVOLUÇÃO DOS CROMOSSOMOS SUPRANUMERÁRIOS
DE Prochilodus lineatus (CHARACIFORMES, PROCHILODONTIDAE)
DETECTADA A PARTIR DE SONDAS CROMOSSÔMICAS
RESUMO
Estudos buscam analisar as seqüências de DNA presentes em cromossomos
supranumerários nos organismos portadores no intuito de elucidar a origem e
evolução destes elementos genômicos. Análises de DNA descritas para
cromossomo B em peixes sugerem predominantemente uma origem intra-específica.
Com o intuito de analisar a origem e evolução dos cromossomos B na espécie
Prochilodus lineatus, foram utilizadas duas sondas construídas a partir de seu
genoma, a PM1B, uma sonda específica de cromossomos supranumerários obtida a
partir da técnica de microdissecção cromossômica e a sonda PG0B, obtida a partir
do genoma total desta espécie. Com a utilização da sonda PG0B, observou-se um
compartilhamento de seqüências de DNA entre os cromossomos A e B,
principalmente nas regiões centroméricas. Esta evidência é consistente com a
hipótese de que certos elementos estruturais são comuns para cromossomos do
complemento normal e para os cromossomos B desta espécie. A sonda PM1B,
entretanto, apresentou homologia somente com a heterocromatina que compõe as
cromátides dos cromossomos B. Os dados são indicação da ausência de
homogeneidade estrutural entre os cromossomos B e os cromossomos do
complemento A. Assim, se tais elementos supranumerários tivessem sido originados
a partir dos elementos A estes microcromossomos teriam seguido uma evolução
independente e intensiva, determinando modificações profundas na seqüência de
seu DNA. Por outro lado, não pode ser excluída a possibilidade de uma origem
independente ou a partir de doadores externos deste material genético diferenciado
no genoma desta espécie, que seguiram, depois, seu processo próprio de
diferenciação individuo.
INTRODUÇÃO
Recentemente, seqüências de DNA presentes nos cromossomos B têm sido
estudas em alguns organismos (Camacho et al., 2000). As primeiras análises
realizadas nos anos de 1970 e 1980 demonstraram que os cromossomos B
continham DNA similar ao encontrado nos cromossomos do conjunto padrão A
(Jones & Rees, 1982). Com isso, estudos envolvendo isolamento, clonagem e
seqüenciamento de numerosos fragmentos de DNA repetitivos nos cromossomos B
de diversas espécies têm sido realizados a partir da década de 90 (Camacho et al.,
2000).
Algumas seqüências de DNA são específicas dos cromossomos B, entretanto,
outras são compartilhadas com aquelas encontradas nos cromossomos do
complemento padrão (A) (Beukeboom 1994; Hackstein et al., 1996; Camacho et al.,
2000, Jesus et al., 2003; Artoni et al., 2006). Os cromossomos supranumerários são
tipicamente compostos por seqüências de DNA repetitivas, as quais variam
dinamicamente em termos de tipos de repetições e número de cópias (Amos &
Dover,1981; Matzke et al., 1990; Sandery et al., 1990; Eickbush et al.,1992; Zeyl &
Green 1992; Wilkes et al., 1995; Franks et al., 1996; Camacho et al., 2000; Jesus et
al., 2003).
O simples fato de seqüências de DNA serem compartillhadas entre os
cromossomos A e B nos indivíduos portadores incita à hipótese da origem intra-
específica destes cromossomos extras (Cabrero et al., 1999; Camacho et al., 2000).
Por outro lado, as seqüências de DNA específicas de B podem ter surgido de uma
rápida diferenciação e evolução independente, ocasionando a perda de homologia
com as seqüências dos cromossomos A dos quais foram derivados (hipótese intra-
específica) (Jamilena et al., 1994, 1995; Houben et al., 1996; Peppers et al., 1997;
Cabrero et al., 1999; Camacho et al., 2000 entre outros) ou que os cromossomos B
tenham sido derivados de cromossomos introduzidos por meio de acasalamentos
interespecíficos (hipótese interespecífica) (Sapre & Deshpande, 1987; McVean,
1995; Schartl et al., 1995; Perfectti & Werren, 2001, entre outros). Neste caso
existem poucas descrições do surgimento de cromossomos acessórios (Perfectti &
Werren, 2001). A maioria das hipóteses, entretanto, tem se estabelecido a partir da
idéia de uma origem intra-específica, na qual os cromossomos B são derivados do
componente do complemento cromossômico da própria espécie pelo fato de
compartilharem seqüências de DNA homólogas (Camacho et al., 2000).
Na busca dos mecanismos de origem e evolução dos cromossomos
supranumerários vários estudos concernentes à análise das seqüências de seu DNA
têm sido realizados em diferentes organismos como insetos (Eickbush & Werren,
1992; López-León et al., 1994; Cabrero et al., 1999; Perfectti & Werren, 2001),
plantas (Cuadrado & Jouve, 1994; Jamilena et al., 1995; Franks et al., 1996) e
anfíbios (Sharbel et al., 1998), todavia, são escassos os trabalhos relativos às
análises das seqüências do DNA nos cromossomos B de peixes.
A ocorrência de cromossomos supranumerários já foi detectada em
numerosas espécies de peixes neotropicais, apresentando-se em diferentes
tamanhos, na forma de microcromossomos (Pauls & Bertollo,1983, 1990; Foresti et
al.,1989; Oliveira & Foresti, 1993); cromossomos de tamanho médio (Fenocchio &
Bertollo, 1990; Fenocchio et al., 2000) ou macrocromossomos (Maistro, et al., 1992;
Salvador & Moreira-Filho, 1992; Vicente et al., 1996; Moreira-Filho et al., 2001; Ferro
et al., 2003; Hashimoto et al., no prelo).
Com o advento da técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH) várias
sondas cromossômicas vêm sendo produzidas com o intuito de proporcionar um
melhor entendimento sobre questões evolutivas, filogenéticas e estruturais, entre
outras, no estudo de peixes neotropicais. Dentre as sondas já obtidas têm destaque
àquelas relativas a segmentos repetitivos do genoma, como a sonda As51 de
Astyanax scabripinnis obtida por Mestriner et al. (2000), sondas SATH1 e SATH2 de
Prochilodus lineatus (Prochilodontidae) obtida por Jesus et al. (2003) e a sonda 18S
DNAr de Prochilodus argenteus obtida por Hatanaka & Galletti (2004).
O método de construção de sondas por microdissecção para pintura
cromossômica total (WCP: Whole Chromosome Painting), desenvolvido e aplicado a
partir da década de 90 (Kao, 1990; Meltzer et al., 1992) tem sido amplamente
utilizado em vários grupos animais, assim como na citogenética humana. Entretanto,
esta metodologia só recentemente começou a ser direcionada para estudos
cromossômicos em peixes e a obtenção de sondas específicas de cromossomos
supranumerários neste grupo tornou-se uma prioridade na estruturação de mapas
genômicos. Até o presente momento, sondas para este tipo de polimorfismo
cromossômico, somente foram obtidas por meio da utilização de enzimas de
restrição.
Diante disso, o objetivo do presente estudo foi a obtenção de duas sondas a
partir do genoma de P. lineatus, uma obtida por microdissecção cromossômica do
cromossomo B da espécie portadora de 1 de um único elemento e a outra obtida do
genoma total de exemplares não portadores de B, no intuito de auxiliar nos estudos
sobre a origem e evolução destes elementos supranumerários em P. lineatus.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram analisados exemplares da espécie Prochilodus lineatus coletados no
rio Mogi-Guaçu, São Paulo, Brasil. Para o estudo das características
cromossômicas, os curimbatás foram submetidos à estimulação mitótica (Oliveira et
al., 1988) e posteriormente foi obtido suspensão direta de células renais de acordo
com método utilizado por Foresti et al. (1981).
Para realização da técnica de hibridização in situ fluorescente foram utilizadas
a sonda específica de cromossomo supranumerário (PM1B) isolada de P. lineatus e
a sonda de genoma total extraída de preparações cromossômicas de P. lineatus. A
marcação da sonda específica de cromossomo B foi feita por meio da incorporação
de dUTP - Tetramethyl-rhodamine (Roche Diagnostics) pela técnica de PCR. A
sonda de genoma total foi marcada com digoxigenina dUTP (Roche Diagnostics)
pela técnica de PCR. Após as marcações, procedeu-se a técnica de hibridização
utilizada por Porto-Foresti et al. (2002). As lâminas foram contracoradas com DAPI.
Já para a obtenção da sonda por microdissecção foi realizada de acordo com
Mühlmann et al., (1995) utilizando um microscópio invertido (Nikon) e um
micromanipulador manual (5171-Eppendorf) com uma agulha de vidro acoplada,
previamente esterilizada. Foram microdissectados cerca de 5 a 10 cromossomos B
de um exemplar de P. lineatus portador de apenas 1 elemento supranumerário, os
quais foram transferidos para um tubo de microcentrífuga contendo 0,5 ml da
solução para DOP-PCR, que consiste de 14,5 µl água MiliQ, 2 µl de tampão da
Thermosequenase 10X, 4µl de dNTP (2,5 mM cada) e 2 µl de 2µM primer DOP (5’
CCG ACT CGA GNN NNNNAT GTG G 3’) (Telenius et al., 1992). O tubo com a
solução foi aquecido para desnaturação inicial a 90ºC, por 10 min. Em seguida,
adicionou-se 2,5 µl de 4U/µl termosequenase (Thermo Sequenase CycleSequencing
Kit - USB). As reações de PCR foram realizadas em um Termociclador MasterCycler
Gradient da Eppendorf nas seguintes condições: 94ºC/3min, 12 ciclos a
94ºC/1,5min.; 37ºC/2min, 37ºC/1s (subindo 0,2ºC/s até 72ºC); 72ºC/2min seguido
por 30 ciclos a 94ºC/1,5 min.; 62ºC/1min; 72ºC/1,5 min. Após o DOP-PCR, realizou-
se uma PCR convencional com uma reação de 33,5 µl de água miliQ, 5 µl de
Tampão para PCR 10X, 4µl de MgCl2, 2 µl de dNTP (2,5 mM cada), 3 µl de 100 µM
DOP primer, 0,5 µl de 5U/µl de Taq polymerase e 2 µl do produto DOP-PCR. Por fim
realizou-se uma outra PCR para efetuar a marcação desta seqüência específica de
DNA utilizando 32,5 µl de água miliQ, 5 µl de tampão para a Taq 10X, 4µl de MgCl2,
2 µl de dNTP (2,5 mM cada), 1µl de dUTP Tetramethyl-rhodamine (Roche
Diagnostics), 3 µl de DOP primer (100 µM) e 0,5 µl de 5U/µl Taq polymerase.
Adicionou-se 2µl do produto da 2ª PCR, totalizando um volume final de 50µl. Tanto a
segunda como a terceira PCR foram realizadas nas seguintes condições: 90ºC –
3min, 30 ciclos a 90ºC – 1min e 30s; 56ºC – 1min e 30s; 72ºC – 1min e 30s.
Para a extração da sonda genômica, alíquotas (3 µl) do material citogenético
de P. lineatus foram colocadas em tubo de microcentrífuga e mantidos na estufa a
37ºC permitindo a evaporação do metanol. Em seguida, o material (pellet) foi
ressuspendido na solução de PCR e as reações foram realizadas de acordo com
Telenius et al. (1992), com um volume final de 20 µl: 1x tampão da
Thermosequenase, 150 µM de cada dNTP e 2 µM do primer DOP (5’-
CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG -3’). A solução foi aquecida a 90ºC por 10 min e
posteriormente, adicionado 2 µl da enzima Thermosequenase (4U µl
-1
). O programa
da PCR consistiu em: desnaturação inicial a 95ºC/3 min e 10 ciclos de 94ºC/1,5 min,
30ºC/3 min e 72ºC aquecido lentamente em 4 min (aproximadamente 0,2ºC seg
-1
),
seguidos por 35 ciclos de 94ºC/1,5 min, 56ºC/1,5 min e 72ºC/1,5 min. Alíquotas (2 µl)
do produto de PCR foram então marcadas para o procedimento de FISH repetindo
35 ciclos de 94ºC/1,5 min, 56ºC/1,5 min e 72ºC/1,5 min, com a presença de 20 µM
de digoxigenina dUTP. Após a PCR, adicionou-se 20 µl da solução de hibridação.A
detecção do sinal da sonda genômico foi realizado a partir da anti-digoxigenina-
Fluoresceína. Posteriormente, as lâminas foram contracoradas com DAPI e
fotografadas em fotomicroscópio Olympus, modelo BX50, equipado com Epi-
Fluorescência.
A morfologia cromossômica foi determinada de conformidade com o proposto por
Levan et al. (1964), com os cromossomos sendo classificados em metacêntrico (m),
submetacêntrico (sm), subtelocêntrico (st) e acrocêntrico (a).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram obtidas preparações cromossômicas de 50 exemplares de Prochilodus
lineatus, sendo identificados indivíduos com cariótipo contendo apenas os
cromossomos do complemento A (2n=54 cromossomos), sem cromossomos B.
Também foram identificados exemplares com até 7 cromossomos B em suas células
somáticas. Tais resultados já eram esperados uma vez que diferentes autores (Pauls
e Bertollo, 1983; Oliveira et al., 1997; Maistro et al., 2000; Cavallaro et al., 2000;
entre outros) já haviam descrito a ocorrência de até 7 elementos extras do genoma
de indivíduos desta espécie de ocorrência na bacia hidrográfica do rio Mogi-Guaçu.
O resultado da hibridação in situ com a sonda específica de cromossomos B
denominada de PM1B, revelou homologia apenas com o material genético que
compõe as cromátides dos elementos supranumerários da espécie Prochilodus
lineatus, não tendo sido detectada qualquer associação desta seqüência de DNA
com as dos cromossomos do complemento A (Figura 1).
Figura 1. Hibridação in situ fluorescente com a utilização da sonda PM1B em metáfases somáticas de
exemplares de Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu. Observa-se a marcação fluorescente apenas
nos cromossomos supranumerários.
Esta falta de homologia entre os segmentos de DNA presentes nas
cromátides dos cromossomos A e B pode ser confirmada através da utilização desta
mesma sonda em preparações cromossômicas de indivíduos não portadores de B,
onde não foi observado sinal fluorescente referente à presença da sonda PM1B
(Figura 2). Tal constatação indicou uma ausência de similaridade entre as
seqüências presentes nas cromátides dos cromossomos B, hibridadas com a sonda
PM1B, em relação às do complemento A, onde não se detectou sinais desta sonda.
Desta forma, pode-se confirmar uma evolução independente destes elementos
supranumerários nesta espécie.
Figura 2. Hibridação in situ fluorescente com a
sonda PM1B em preparação cromossômica de um
exemplar de Prochilodus lineatus não portador de
cromossomos B. Nota-se a ausência de marcação
com esta sonda nos cromossomos do complemento
padrão A.
Um aspecto intrigante dos cromossomos B é a obscura definição do seu
significado genético em termos de origem, função, propriedades adaptativas e
implicações evolutivas para os indivíduos portadores (Bougourd & Jones, 1997).
Vários estudos têm sido realizados objetivando o entendimento da origem e
evolução dos cromossomos supranumerários. Em geral, considera-se que estes
elementos genômicos possam ter uma origem intra-específica por não-disjunção
cromossômica (Volobujev, 1981) ou pela formação de isocromossomos (Mestriner et
al., 2000; Jesus et al., 2003; Artoni et al., 2006).
Com o intuito de estudar a origem dos cromossomos supranumerários da
espécie Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu, realizou-se a hibridação in situ com
a sonda genômica desta espécie, denominada de PG0B. As preparações revelaram
marcações fluorescentes principalmente nas regiões centroméricas e teloméricas
dos cromossomos do complemento A e também nas porções centoméricas dos
cromossomos supranumerários (Figura 4c-seta).
A aplicação da técnica de double FISH com as sondas PG0B e PM1B em
exemplares portadores de cromossomos supranumerários revelou sinais de
hibridação da sonda PG0B na região centromérica de todos os cromossomos A e
também nos centrômeros de seus supranumerários. Entretanto, a sonda PM1B
encontrou homologia apenas nos cromossomos supranumerários (Figura 3d), isto
confirma que o padrão de heterocromatina presente nas cromátides dos
cromossomos A e B diferem na composição do DNA.
Figura 4. Preparações cromossômicas da espécie P. lineatus coradas com DAPI (a); sonda PM1B
marcou somente os cromossomos B (b); enquanto a sonda PG0B marcou as regiões
pericentroméricas de todos os cromossomos do complemento padrão A e também dos cromossomos
supranumerários (c); em (d) hibridação dupla (double FISH) de metáfase somática utilizando a sonda
PM1B (vermelho) e a sonda genômica PG0B (verde).
Mestriner et al. (2000), descreveram a composição genética do DNA repetitivo
dos cromossomos B de Astyanax scabripinnis utilizando a sonda As51, obtida com a
utilização da enzima de restrição Kpnl. O padrão de hibridação in situ obtido com a
a
d
c
b
utilização desta sonda levou os autores a sugerir que a origem dos cromossomos B
em A. scabripinnis teria sido a partir da formação de isocromossomos, pois
seqüências repetitivas em ambos os braços do macrocromossomo B confirmaram os
resultados apresentados por Vicente et al. (1996), que encontraram característica da
heterocromatina do cromossomo B, idênticas às de um par de cromossomos do
conjunto A desta espécie.
Jesus et al. (2003), ao estudarem as seqüências de DNA dos cromossomos
da espécie Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu e principalmente a dos seus
cromossomos supranumerários, utilizaram as duas famílias de DNA satélite, SATH1
e SATH2. A localização cromossômica destas famílias de DNA repetitivo, a partir da
aplicação de técnica hibridação in situ demonstrou que a sonda SATH1, composta
de aproximadamente 900 pb, tinha identidade com a região pericentromérica do
grupo de cromossomos do complemento padrão, assim como de todos os
cromossomos B. Entretanto, a sonda SATH2, de aproximadamente 441 pb, marcou
apenas a região pericentromérica dos cromossomos A, não sendo observado em
nenhum cromossomo do complemento B. Estes autores também demonstraram que
nem todos os segmentos heterocromáticos dos cromossomos B desta espécie eram
compostos por DNA SATH1, indicando que outras famílias de DNA repetitivo
poderiam ocorrer nos elementos supranumerários. Reafirmaram, contudo, que as
similaridades na composição molecular entre os cromossomos A e B poderia sugerir
uma origem intra-específica dos cromossomos B nesta espécie.
Artoni et al. (2006), ao utilizarem sondas destas mesmas famílias de DNA
satélite, SATH1 e SATH2, no estudo de populações distintas de Prochilodus lineatus,
uma proveniente do rio Mogi-Guaçu, SP e outra oriunda da lagoa Dourada, bacia do
rio Tibagi, PR, observaram que nos exemplares do rio Mogi-Guaçu, três de quatro
cromossomos B analisados mostraram-se inteiramente composto por SATH1,
enquanto o outro B apresentou-se parcialmente marcado com esta sonda. Todavia,
na população da lagoa Dourada dois dos três cromossomos B mostraram sinais
fluorescentes parciais, enquanto que o cromossomo B restante não apresentou
marcações de DNA SATH1. Segundo estes autores, a diferente distribuição da
seqüência SATH1 nestas duas populações de P. lineatus pode revelar um processo
de evolução independente destes elementos supranumerários nos exemplares
destas localidades. A sonda SATH2 não apresentou homologia com os
cromossomos supranumerários em todos os indivíduos analisados.
No presente trabalho, com a utilização da sonda PG0B, confirmou-se que
certas estruturas cromossômicas, como as regiões centroméricas, podem apresentar
a mesma identidade estrutural, estando presente tanto nos cromossomos
supranumerários como nos do complemento A. Por outro lado, a ausência de
simetria de bandas de DNA compartilhadas pelas cromatinas dos cromossomos B
com o emprego da sonda PM1B, afasta a possibilidade da origem deste
cromossomo B ocorrer a partir da formação de isocromossomo nesta espécie,
conforme proposto ocorrer em P. lineatus (Jesus et al., 2003; Artoni et al., 2006).
Assim, a origem intra-específica por não disjunção cromossômica poderia ser
considerada (Jamilena et al., 1994a, 1995b; Houben et al., 1996; Camacho et al.,
2000; entre outros) para a espécie P. lineatus. A ocorrência de diferença entre a
composição do DNA da heterocromatina dos cromossomos A e B poderia ser
decorrente do fato de que após sua origem por não-disjunção cromossômica, o
segmento originário do cromossomo B teria seguido um caminho evolutivo
independente, acumulando profundas modificações na seqüência de seu DNA que o
teria tornado diferenciado do segmento cromossômico original.
A ausência de identidade entre os cromossomos supranumerários e os do
complemento A em Prochilodus lineatus, constatada pelos resultados de aplicação
da técnica de hibridação in situ com a sonda PM1B, resultante da microdissecção de
sonda de 1 cromossomo B de exemplar da própria espécie, leva à possibilidade do
mecanismo de origem dos cromossomos B ser decorrente de um processo de
hibridação interespecífica, conforme descrito em vespas do gênero Nansonia por
Perfectti & Werren (2001). O elemento novo introduzido seria uma região
heterocromática heteróloga ao genoma de P. lineatus e a interação teria ocorrido em
tempo recente. As modificações estruturais que ocorreram de modo dinâmico na
seqüência de DNA estão dando início ao processo de diferenciação dos
cromossomos extras, visualizado nas espécies portadores de 2 ou mais
cromossomos B (Figura 1).
Não pode ser descartada também a idéia de origem destes elementos extras
por um processo alternativo conforme proposto por Foresti (1998) onde tais
elementos poderiam surgir ao acaso “de novo”, como resultado do processo
fisiológico normal das células e serem submetidos ao processo seletivo.
Modificações morfológicas e estruturais ocorreram posteriormente.
Um estudo realizado por Maistro et al. (2000) utilizando enzima de restrição
na análise da estrutura dos cromossomos B em P. lineatus sugeriram que os
cromossomos A e B diferiram na composição genética, conforme observado também
neste trabalho. De acordo com estes autores, os cromossomos B teriam se originado
a partir dos cromossomos do complemento padrão A. Contudo de acordo com os
autores, o grau de dissimilaridade encontrado para os tipos de heterocromatina
sugeriu que a origem dos cromossomos supranumerários não teria sido um evento
recente e que importantes modificações tenham se acumulado durante o processo
evolutivo destes elementos estruturais do genoma.
Neste estudo, além da detecção de diferentes seqüências de DNA
compartilhadas pelas cromátides dos cromossomos supranumerários de Prochilodus
lineatus, também foram observadas diferenças de morfologia entre estes
cromossomos B nos exemplares analisados, sendo observados microcromossomos
dos tipos metacêntrico, submetacêntrico e acrocêntrico (Figura 5b). Como padrão
comum todos se apresentaram heterocromáticos quando submetidos à técnica de
badamento C (figura 5a), conforme descrito para indivíduos desta população por
Artoni et al. (2006). Estes mesmos autores estudaram que exemplares de P. lineatus
da lagoa Dourada, bacia do rio Tibagi, PR, mostraram pequenos segmentos de
banda C negativa na região pericentromérica do cromossomo B metacêntrico.
Figura 5. Bandamento C em células mitóticas de Prochilodus lineatus onde é evidente a condição
heterocromática dos cromossomos B (setas) (a). Destaque diferentes morfologias encontradas para
os cromossomos B; cromossomo acrocêntrico; cromossomo metacêntrico e cromossomo
submetacêntrico (b).
As variações na morfologia e tamanho dos cromossomos B têm sido descritas
para várias espécies sendo indicado que um tipo de cromossomo B é predominante
em uma determinada população (Jones & Rees, 1982). Em gafanhotos
Acrocêntrico
Metacêntrico
Submetacêntrico
a
b
Eyprepocnemis plorans, mais de 40 variantes de cromossomos B já foram descritas.
Cavallaro et al. (2000) ao estudar os cromossomos supranumerários de Prochilodus
lineatus em exemplares provenientes de seis diferentes localidades observaram que
em todas as populações analisadas foi detectada a presença de cromossomos B
polimórfico, tanto em tamanho quanto em morfologia, sendo, contudo, todos de
natureza heterocromática. Isto pode indicar que os cromossomos B estão passando
por mudanças constantes, que poderiam ocasionar o surgimento de novas variantes
de B e aumentando assim, a probabilidade de um novo processo de acúmulo em
populações onde a freqüência destes já se encontraria neutralizada (Zurita et al.,
1998).
Esta hipótese foi formulada por Cavallaro et al. (2000) para a população de P.
lineatus do rio Mogi-Guaçu e confirmada nos resultados apresentados recentemente
por Voltolin et al. (capítulo 3). No entanto, além destas modificações aparentemente
visíveis, as seqüências do DNA destes elementos também vêm sofrendo
modificações ao longo do processo evolutivo ao ponto de apresentarem fragmentos
de DNA diferentes na sua composição nos indivíduos portadores.
4 DISCUSSÃO GERAL
A espécie Prochilodus lineatus é bastante utilizada em programas de
piscicultura principalmente na porção sul do Brasil devido sua facilidade de criação e
reprodução em cativeiro. Além disso, é considerado um peixe de relevante
importância para o comércio e a pesca de subsistência. É denominado um migrador
por excelência. A presença deste animal na bacia do rio Paraná, principalmente nos
rios Grande, Pardo e Mogi-Guaçu é expressiva durante a estação reprodutiva a qual
compreende os meses de setembro a março. No entanto, exemplares desta espécie
podem ser capturados o ano todo em Cachoeira de Emas, município de
Pirassununga no Estado de São Paulo.
Estudos citogenéticos da espécie P. lineatus têm revelado uma estrutura
cromossômica conservada, ou seja, todos os indivíduos analisados até o presente
momento apresentaram um conjunto cariotípico composto por 2n=54 cromossomos,
sendo 40 cromossomos do tipo metacêntrico e 14 cromossomos do tipo
submetacêntrico com número fundamental igual a 108. Além de apresentarem até 7
microcromossomos os quais variam em número e morfologia. A presença de 2
cromossomos B foi considerado o número modal para a espécie.
A utilização de marcadores citogenéticos como Giemsa, NOR e Banda C e
citogenético-moleculares (FISH) com a utilização de genes ribossomais 5S e 18S
revelaram uma estrutura cariotípica bastante conservada para esta espécie. Embora
algumas diferenças quanto à localização e distribuição dos genes ribossomais e dos
blocos heterocromáticos nos cromossomos dos curimbatás do rio Mogi-Guaçu foram
observadas quando comparadas aos exemplares de diferentes localidades. Tais
diferenças podem estar associadas a modificações evolutivas que estas seqüências
repetitivas vêm sofrendo nesta população.
Os cromossomos supranumerários são considerados elementos dispensáveis
presentes no genoma de alguns indivíduos em algumas espécies de animais,
plantas e fungos. Estes elementos extras têm ganhado enorme atenção e exaustivos
estudos ainda estão sendo realizados no intuito de elucidarem algo sobre sua
origem, herança, estrutura do DNA, dinâmica evolutiva e função nos organismos
portadores.
Toda e qualquer análise relativa à herança de alguma característica deve ser
estudada sob uma expectativa mendeliana. Com base neste contexto foram
realizados cruzamentos dirigidos nas matrizes de curimbatás provenientes do rio
Mogi-Guaçu, onde os resultados demonstraram um padrão de herança mendeliana
para os cromossomos supranumerários desta referida espécie. Isto pode estar
relacionado a um processo de não-acumulação dos elementos B nesta população,
devido à estabilidade mitótica.
Os dados obtidos no presente trabalho, por meio dos cruzamentos realizados
na piscicultura serviram como ferramenta bastante útil no entendimento da dinâmica
evolutiva destes microcromossomos na população selvagem de Prochilodus lineatus
do rio Mogi-Guaçu.
A fim de constatar a dinâmica do processo de acúmulo ou neutralização dos
cromossomos supranumerários na espécie P. lineatus realizou-se neste trabalho um
estudo comparativo da freqüência dos microcromossomos B em P. lineatus de
ocorrência no rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, SP entre os anos de 2003 a 2007
comparando-se a freqüência destes elementos genômicos com diferentes estudos já
descritos na literatura. Além disto, dentro esta amostragem foram selecionados
indivíduos componentes de diferentes cardumes capturados entre 2006 e 2007 os
quais foram estudados citogeneticamente com intuito de averiguar a continuidade do
processo de fixação populacional dos cromossomos B de Prochilodus lineatus neste
rio. As evidências comparativas mostraram que o processo de invasão dos
cromossomos supranumerários na espécie P. lineatus foi bastante marcante no
início da década de 80 e hoje passa por um processo de neutralização.
Desta forma a detecção da herança mendeliana destes cromossomos B em
P. lineatus observada nos cruzamentos controlados realizado na piscicultura retrata
fielmente a condição de neutralidade quanto à presença destes microcromossomos
na população natural, pois toda a neutralização cromossômica está associada a uma
estabilidade mitótica e esta estabilidade é conseqüência de uma herança
mendeliana.
Uma das melhores formas de analisar a composição do DNA presente nos
cromossomos de maneira geral é por meio da construção de sonda do DNA
preterido. Inúmeros estudos sobre a estrutura do DNA dos cromossomos
supranumerários têm sido realizados com a utilização de sondas diversificadas.
Informações com relação à utilização de sondas para análise da origem e
estrutura dos cromossomos B em peixes são escassas na literatura. Com base nesta
afirmação realizou-se neste trabalho um estudo da origem e estrutura dos
microcromossomos B da espécie P. lineatus proveniente do rio Mogi-Guaçu a partir
da utilização de duas sondas: a PM1B, caracterizada como uma sonda específica de
cromossomos B da espécie P. lineatus obtida por meio da técnica de microdissecção
cromossômica e a sonda genômica PG0B, obtida a partir do DNA total desta mesma
espécie.
Com a utilização da sonda genômica PG0B em preparações cromossômicas
de P. lineatus provenientes do rio Mogi-Guaçu observou-se um compartilhamento
das seqüências de DNA entre os cromossomos A e B principalmente nas regiões
centroméricas. Esta evidência é consistente com a hipótese de que certos elementos
estruturais são comuns para os cromossomos do complemento normal e para os
cromossomos B da espécie. Entretanto, a sonda PM1B apresentou homologia
somente com a heterocromatina que compõe a cromátide do cromossomo B. Esta
ausência de homogeneidade estrutural entre os cromossomos B e os cromossomos
do complemento padrão indica uma evolução independente e intensiva dos
elementos supranumerários determinando modificações na sua seqüência de DNA.
Além disso, esta mesma sonda não detectou simetria com qualquer cromossomo do
complemento A desta espécie afastando a possibilidade da origem deste
microcromossomo por formação de isocromossomo.
A ausência de identidade entre os cromossomos supranumerários e os do
complemento A em P. lineatus, constatada pelos resultados de aplicação da técnica
de hibridação in situ com a sonda PM1B, de 1 cromossomos B de exemplar da
própria espécie, leva à possibilidade do mecanismo de origem dos cromossomos B
ser decorrente de um processo de hibridação interespecífica. O elemento novo
introduzido seria uma região heterocromática heteróloga ao genoma de P. lineatus e
a interação teria ocorrido em tempo recente.
Os cromossomos B dos curimbatás do rio Mogi-Guaçu também apresentaram
variação no tamanho e morfologia isto pode indicar que estes estão passando por
mudanças constantes as quais podem ocasionar o surgimento de variantes de B
aumentando, desta forma, as chances de novas invasões dos microcromossomos B
nessa população onde se encontram neutralizados. Além destas modificações
aparentemente visíveis as seqüências do DNA destes elementos também vêm
sofrendo modificações ao longo do processo evolutivo a ponto de apresentarem
fragmentos de DNA diferentes na sua composição nos indivíduos portadores.
5. CONCLUSÕES
Tendo em vista a problemática com relação à presença dos cromossomos
supranumerários em peixes portadores, este trabalho visou contribuir no
entendimento sobre a dinâmica evolutiva, herança, origem e estrutura dos
microcromossomos da espécie Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu,
Pirassununga, SP onde podemos concluir que:
1 A freqüência quanto ao número dos cromossomos supranumerários dos
exemplares de Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu apresentou uma variação
de até 7 cromossomos B, sendo 2 cromossomos considerado o número modal;
2 A média ponderada dos cromossomos B de Prochilodus lineatus do rio Mogi-
Guaçu ao longo dos anos apresentou uma diminuição não significativa com
relação aos dados de estudos anteriores, podendo constatar que os
cromossomos B nesta população se encontram em um processo de
neutralização;
3 A estabilização mitótica dos cromossomos supranumerários pode ser reafirmada
na atual população de Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu, por meio da
análise da freqüência dos cromossomos B em três cardumes migradores entre os
anos de 2006 a 2007;
4 A análise da herança dos cromossomos supranumerários da espécie Prochilodus
lineatus do rio Mogi-Guaçu está de acordo com a expectativa mendeliana.
Podendo afirmar que não está ocorrendo um processo de acumulação dos
cromossomos B nesta população, isto é, existe uma estabilidade mitótica dos B
no rio Mogi-Guaçu para esta espécie;
5 Com o emprego da sonda genômica, PG0B, observou-se a existência de um
compartilhamento de seqüências de DNA entre os cromossomos A e B
principalmente na região centromérica.
6 Com o emprego da sonda específica, PM1B, foi observado homologia somente
com a heterocromatina que compõe as cromátides dos cromossomos B;
7 A ausência de homogeneidade estrutural entre os cromossomos A e B, pode
indicar que mesmo se os cromossomos B tivessem se originados do conjunto
cromossômico A, estes microcromossomos teriam seguido uma evolução
independente com intensivas modificações na seqüência de seu DNA;
8 A falta de simetria de bandas de DNA compartilhadas entre os cromossomos A e
B afasta a possibilidade do surgimento do cromossomo B desta espécie ser pela
formação por isocromossomos;
9 Não foi observado identidade entre os cromossomos supranumerários e os do
complemento A, leva a possibilidade de um mecanismo de origem dos
cromossomos B por um processo de hibridação inter-específica;
10 Além das diferenças nas seqüências do DNA nos cromossomos B da espécie
Prochilodus lineatus do rio Mogi-Guaçu pode promover diferenças na morfologia
e tamanho destes elementos extras, onde foram encontrados cromossomos do
tipo metacêntrico, submetacêntrico e acrocêntrico, sendo o metacêntrico a forma
mais freqüente;
11 Diferenças encontradas na morfologia e seqüência do DNA que compõe os
cromossomos supranumerários da espécie Prochilodus lineatus podem estar
relacionadas a modificações que estes elementos vêm sofrendo ao longo dos
anos. Estas alterações podem desencadear a formação de novas variantes de B
as quais substituirão o B considerado ancestral promovendo, desta forma, novos
processos de invasões na população de curimbatás do rio Mogi-Guaçu.
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