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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
Diogo Teruo Hashimoto
Caracterização citogenética e molecular de híbridos interespecíficos
das espécies Piauçu (Leporinus macrocephalus) e Piapara
(Leporinus elongatus), utilizados na piscicultura brasileira
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista – UNESP, como parte dos requisitos
para a obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas. Área de Concentração: Genética.
Orientador: Dr. Fábio Porto-Foresti
Botucatu, 2008
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“Tentemos ensinar generosidade e altruísmo, porque nascemos
egoístas. Compreendamos o que nossos próprios genes
egoístas tramam, porque assim, pelo menos, poderemos ter a
chance de frustrar seus intentos, uma coisa que nenhuma outra
espécie jamais aspirou fazer.”
(Richard Dawkins)
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7
RESUMO
Dentre as metodologias clássicas de manipulação genética mais comumente aplicada nas
pisciculturas, a hibridação interespecífica visa principalmente ao aumento da produtividade e à
obtenção de linhagens estéreis. Contudo, híbridos interespecíficos de peixes podem
representar sérios riscos biológicos ao meio ambiente, “contaminando geneticamente”
estoques naturais ou cultivados e competindo de diversas formas com as linhagens parentais.
Assim, torna-se de grande importância a caracterização e monitoramento genético de híbridos
produzidos em pisciculturas, identificando as linhagens parentais e os produtos híbridos de
maneira clara e acessível. No presente estudo, com a aplicação de técnicas citogenéticas e
moleculares foi caracterizada uma linhagem híbrida de exemplares de “Piaupara”,
diferenciando-a de seus respectivos parentais, fêmea de Leporinus macrocephalus (Piauçu) e
macho de Leporinus elongatus (Piapara). Através das metodologias citogenéticas, foi
observado que tanto os parentais Leporinus macrocephalus e L. elongatus quanto o híbrido
“Piaupara”, apresentaram número diplóide de 54 cromossomos dos tipos meta e
submetacêntricos, morfologicamente muito semelhantes e indistinguíveis pela análise com
Giemsa, não sendo possível diferenciá-los. Com relação à marcação da região organizadora
de nucléolo (NOR), as espécies parentais demonstraram somente um par cromossômico
portador da NOR, com diferentes tamanhos e formas, o que permitiu diferenciar o híbrido
“Piaupara” tanto pela técnica de nitrato de Prata quanto pelo método de FISH com sonda
ribossômica 18S. O padrão de bandamento C mostrou que cada espécie parental apresenta
um par de cromossomos com blocos heterocromáticos exclusivos e diferenciados, os quais
foram considerados bons marcadores específicos e, desta forma possibilitaram a identificação
do híbrido. A aplicação da técnica de FISH com sonda sexo-específica demonstrou marcações
consideradas como diagnósticas pelos padrões espécie e sexo-específicos, diferenciando as
espécies parentais e consequentemente, o híbrido “Piaupara”. Analisando citogeneticamente o
fenômeno da dominância nucleolar com a coloração por Prata, verificaram-se diferenças de
atividade nucleolar no híbrido “Piaupara”, em que a NOR do cromossomo herdado de L.
elongatus foi dominante em relação à de L. macrocephalus. A aplicação da técnica de FISH
8
com sonda 18S demonstrou que o DNA ribossômico não foi perdido no híbrido e assim, que os
sítios ribossômicos provenientes de L. macrocephalus realmente estavam inativados. Um fato
interessante em relação à diferença entre a região nucleolar das espécies parentais foi a
associação da NOR com blocos heterocromáticos em L. elongatus detectada pelos métodos de
FISH e pela banda C, sendo considerado o principal fator citogenético para explicar o
estabelecimento desse fenômeno. Em relação aos métodos moleculares, através de reações
PCR Multiplex e PCR-RFLP, análises envolvendo o DNA mitocondrial 16S e o gene nuclear α-
tropomiosina demonstraram diferentes perfis eletroforéticos entre L. macrocephalus e L.
elongatus. Porém, somente o gene nuclear possibilitou a clara distinção entre parentais e o
híbrido, pois este revelou um padrão heterozigótico com as bandas diagnósticas herdadas de
ambas as espécies. Para o gene mitocondrial, o híbrido apresentou o mesmo padrão
observado em L. macrocephalus, o que mascara sua identificação. Contudo, como o DNA
mitocondrial em animais apresenta característica peculiar de herança materna, as análises
confirmaram L. macrocephalus como parental materno. A simplicidade e rapidez destas
técnicas poderão facilitar a implementação rotineira do monitoramento da produção de
híbridos nas pisciculturas, e por fim, delinear planos de conservação biológica para um
manejo adequado dos estoques naturais e cultivados de peixes.
9
ABSTRACT
Among the most applied classic methodologies of genetic manipulation in fish culture, the
interspecific hybridization aims the increase of productivity and the formation of sterile lineages.
However, fish interspecific hybrids can represent serious biological risks to the environment,
"genetically contaminating” natural or cultivated fish supplies and competing in various ways
with the parental species. Therefore, it becomes a great importance the characterization and
genetic monitoring of hybrids produced in fish farm, identifying in clear and accessible way
parental and hybrid species. In the present study, a hybrid lineage of "Piaupara" was
characterized through cytogenetic and molecular techniques in order to differentiate it from its
respective parental, female Leporinus macrocephalus (Piauçu) and male Leporinus elongatus
(Piapara). Through the cytogenetic methodologies, it was observed that both Leporinus
macrocephalus and L. elongatus parental as the hybrid "Piaupara" present a diploid number of
54 chromosomes of meta and submetacentric types, morphologically very similar and
indistinguishable in the analysis with Giemsa, not being possible to differentiate them. In the
nucleolus organizer region (NOR) staining, the parental species demonstrated only one
chromosomal pair bearing NOR, however, of different sizes and/or forms, what allowed to
differentiate the hybrid "Piaupara" both by the Silver nitrate technique and the FISH method with
18S ribosomal probe. C-Band standard showed that each parental species presents a pair of
chromosomes with exclusive and differentiated heterochromatic blocks, which have been
considered good markers to differentiate them and thus allowing the identification of the hybrid
possible. The application of FISH method with sex-specific probe demonstrated markers
considered as diagnosis for the sex-specific standards species, differentiating the parental
species and consequently, the hybrid "Piaupara". Analyzing cytogenetically the nucleolar
dominance phenomenon with the Silver coloration, differences in the nucleolar activity were
verified in the hybrid "Piaupara", where the NOR of the chromosome inherited of L. elongatus
was dominant in relation to the one of L. macrocephalus. The application of the FISH technique
with 18S probe showed that the ribosomal DNA was not lost in the hybrid and thus the
10
ribosomal sites proceeding from L. macrocephalus really were inactive. An interesting fact
relating to the differences between the parental species nucleolar regions, was the association
of the NOR with heterochromatic blocks in L. elongatus detected by the FISH and C-band
methods, being considered the main cytogenetic factor to explain how this phenomenon is
defined. In relation to the molecular methods, through reactions PCR Multiplex and PCR-RFLP,
analysis involving the mitochondrial DNA 16S and nuclear gene -tropomyosin demonstrated
different electrophoretic profiles between L. macrocephalus and L. elongatus. However, only the
nuclear gene allowed the clear distinction between parental and the hybrid, therefore this
disclosed a heterozigose standard with the diagnostic bands inherited of both species. As
regards the mitochondrial gene, the hybrid presented the same standards observed in L.
macrocephalus, which masks its identification, however, as the mitochondrial DNA in animals
presents peculiar characteristics of maternal inheritance, the analysis confirmed that L.
macrocephalus is the maternal parental. The simplicity and rapidity of these techniques will be
able to facilitate the routine monitoring implementation of the hybrids production in fish culture,
and finally, delineate plans of biological conservation for an adequate handling of the natural
and cultivated fish supplies.
11
SUMÁRIO
Pg.
1 INTRODUÇÃO __________________________________________
1
1.1 Programas de hibridação interespecífica ___________________
4
Aspectos gerais
_________________________________________
4
Riscos causados pela hibridação interespecífica
___________________
8
1.2 Considerações sobre as espécies parentais e seus híbridos ___ 10
1.3 Métodos na detecção de hibridação ______________________ 12
1.3.2 Estudos citogenéticos na identificação de híbridos
____________
14
Aspectos gerais
________________________________________
14
Estudos citogenéticos no gênero Leporinus
______________________
15
Cromossomos sexuais no gênero Leporinus
______________________
18
Fenômeno de dominância nucleolar em híbridos interespecíficos
________
20
1.3.1 Estudos moleculares na identificação de híbridos
_____________
24
O valor do DNA mitocondrial e nuclear na identificação de híbridos
_______
28
1.4 Objetivos ___________________________________________ 30
2 MATERIAIS E MÉTODOS _________________________________
32
2.1 Materiais ____________________________________________
33
2.2 Métodos ____________________________________________ 38
Métodos para as análises citogenéticas ___________________ 38
2.2.1 Estimulação de mitoses
__________________________
_____
38
2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos de peixes
______________
39
2.2.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (NORs)
_______
40
2.2.4 Caracterização da heterocromatina constitutiva
______________
41
2.2.5 Hibridização fluorescente in situ (FISH) com sondas específicas de
DNA
_______________________________________________
41
2.2.6 Estudos cariotípicos
________________________________
46
2.2.7 Montagem dos cariótipos
_____________________________
46
2.2.8 Marcação dos exemplares
________________________
____
46
12
Métodos de análises moleculares ________________________
47
2.2.9 Extração e purificação de DNA
_________________________
48
2.2.10 Amplificação do gene mitocondrial 16S e nuclear -tropomiosina ___
50
2.2.11 Purificação dos produtos amplificados por PCR
_____________
51
2.2.12 Reação de amplificação para o sequenciamento
_____________
52
2.2.13 Limpeza dos fragmentos marcados
_____________________
52
2.2.14 Análises de PCR Multiplex __
________________________
__
53
2.2.15 Análises de PCR-RFLP __
____________________________
54
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO _____________________________
56
3.1 Capítulo 1
___________________________________________________
58
3.2 Capítulo 2
___________________________________________________
78
3.3 Capítulo 3
___________________________________________________
92
3.4 Capítulo 4
___________________________________________________
107
4 DISCUSSÃO GERAL ____________________________________ 128
5 CONCLUSÕES _________________________________________ 133
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _________________________ 137
13
1. INTRODUÇÃO
O termo “Aqüicultura” designa todas as formas de cultivo de organismos
aquáticos, animais e vegetais, tanto em águas continentais como em ambientes
marinhos. A piscicultura é o ramo da aqüicultura que trata exclusivamente de
programas de cultivo e manejo de peixes (Pillay e Kutty, 2005). Dentro da
aqüicultura, em produção mundial, a atividade de piscicultura corresponde à maior
fração, principalmente quando se trata da piscicultura continental. Em 1998, por
exemplo, a piscicultura alcançou o percentual de 98% dos cultivos mundiais,
correspondendo, naquele mesmo ano, cerca de 17 milhões de toneladas de peixes
de água doce produzidas (FAO, 2000). Já em 2004, este valor ultrapassou os 23,8
milhões de toneladas, com uma taxa da média anual de crescimento de 5,2% entre
o período de 2000-2004 (FAO, 2007).
A aqüicultura no Brasil tem se desenvolvida muito modestamente quando
comparada com outros países do mundo e frente às expressivas potencialidades de
recursos do país. Em 2004, por exemplo, a aqüicultura continental brasileira
produziu 179.737,5 toneladas de peixes e 993 toneladas de outros animais
aquáticos (crustáceos, moluscos e anfíbios) (IBAMA, 2005). Os grandes problemas
da aqüicultura brasileira são a falta de organização do sistema de transferência de
tecnologia, a carência de pesquisa aplicada, do ordenamento e desenvolvimento,
bem como a distribuição dos produtos pesqueiros (Castagnolli, 1995).
No entanto, a piscicultura vem assumindo um importante papel na economia
nacional, como uma alternativa de diversificação de negócios agropecuários,
otimizando recursos disponíveis e resíduos não aproveitados em propriedades
rurais. Estudos que analisam os fatores econômicos evidenciam uma tendência
crescente dessa atividade em todas as regiões do Brasil e dão suporte à expansão
14
das criações de peixes, principalmente no estado de São Paulo (Scorvo-Filho et al.,
1998). A médio prazo a aqüicultura será o setor do país que mais oferecerá
possibilidades de aumento da produção de pescado, sendo necessários estudos que
possibilitem a formulação de um programa de desenvolvimento para esta área,
levando-se em conta as diferentes regiões brasileiras (Camargo e Pouey, 2005).
A partir dos anos 80, abordagens genéticas passaram a contribuir de maneira
efetiva nos programas de criação de peixes (Foresti, 2000; Hulata, 2001). Com o
emprego de técnicas clássicas e modernas, tornou-se possível a manipulação
cromossômica e a obtenção de linhagens que apresentem vantagens para a
comercialização (Toledo-Filho et al., 1996; Porto-Foresti e Foresti, 2004). Os
principais estudos genéticos aplicados nas pisciculturas mundiais e em particular,
nas brasileiras, foram revisados na década de 90 numa série de publicações
denominada “Cadernos de Ictiogenética” (Toledo-Filho et al., 1992, 1994, 1996,
1998 e 1999). Segundo os autores, a genética aplicada à piscicultura abrange quatro
principais áreas que estão intimamente interligadas:
Manipulação genética, a qual envolve metodologias clássicas (seleção,
hibridação e endogamia) e modernas (biotecnologia e engenharia genética)
destinadas ao aumento da produtividade e à obtenção de linhagens estéreis,
monosexuais e hormonalmente revertidas;
Manejo genético, que consiste na aplicação de procedimentos destinados
a atenuar possíveis efeitos biológicos danosos provocados pelas linhagens
geneticamente manipuladas;
Monitoramento genético, cuja finalidade de detectar através de
marcadores genéticos os níveis de consangüinidade, heterozigose, hibridação e
introgressão em estoques de peixes;
15
Conservação genética, que compreendem objetivos de detecção e
manutenção de bancos genéticos de espécies nativas e a avaliação continuada dos
potenciais riscos biológicos de estoques de peixes geneticamente manipulados.
Atualmente, a maioria das linhagens de peixes geneticamente melhoradas que
alcançam a indústria da aqüicultura foram desenvolvidas através de métodos
tradicionais de manipulação genética, que incluem seleção, hibridação e endogamia
(Hulata, 2001). Entre estas clássicas metodologias de cruzamentos, a hibridação
interespecífica constitui um dos métodos mais utilizados tradicionalmente nas
pisciculturas mundiais e brasileiras, cujos resultados, no entanto, são de
interpretação difícil e detalhada (Toledo-Filho et al., 1994).
1.1 Programas de Hibridação Interespecífica
Aspectos gerais
O processo da hibridação consiste no acasalamento de indivíduos ou grupos
geneticamente diferentes e pode envolver cruzamentos dentro de uma espécie
(cruzamento de linhagens) ou cruzamentos entre espécies separadas (hibridação
interespecífica). Esta técnica de reprodução é muito usada para produzir organismos
aquáticos com características desejáveis específicas ou melhoramento geral de
seus desempenhos na aqüicultura. Geralmente, resulta na produção de prole que
apresenta um desempenho melhor do que a média de ambas as espécies parentais
(vigor híbrido ou heterose positiva) (Bartley et al., 2001).
Segundo Chevassus (1983), os estudos de hibridação em peixes iniciaram-se
ao final do século dezenove e tiveram impulso a partir de 1919 na América do Norte,
com Carl Leavitt Hubbs e seus colaboradores que, ao estudarem peixes de água
doce, acumularam evidências de que cruzamentos entre espécies desse grupo eram
16
freqüentes na natureza. Em estudos realizados com híbridos de espécies do gênero
Lepomis, Hubbs (1955) começou a compreender melhor fatos básicos do processo
de hibridação interespecífica e as vantagens apresentadas por este processo. Os
exemplares híbridos das espécies estudadas geralmente apresentavam
características taxonômicas intermediárias entre as espécies parentais, podendo até
mesmo superá-las em certos aspectos, tais como crescimento rápido, maior brilho e
intensidade de coloração, domínio no ambiente, e até maior capacidade de capturar
o alimento. Em resumo, tais híbridos apresentaram “vigor híbrido” ou “heterose”.
Verifica-se atualmente que entre os peixes, a hibridação é um fenômeno
bastante comum (Schwartz, 1981; Bartley et al., 2001; Scribner et al., 2001;
Allendorf et al., 2001), se comparado ao que ocorre nos diversos grupos de
vertebrados (Campton, 1987; Allendorf e Waples, 1996). Isto ocorre pela própria
condição ecofisiológica do grupo, que apresenta características peculiares, entre
elas a fertilização externa, mecanismos de isolamento, competição por territórios de
desova, abundância de espécies e sobrevivência em ambientes limitados (Hubbs,
1955; Campton, 1987). Além do mais, metade da ocorrência de eventos de
hibridação em peixes tem sido atribuída a intervenção humana, como observado por
Scribner et al. (2001), com as atividades de aqüicultura sendo o principal fator,
seguidas de introduções de espécies fora do seu local de origem e alterações ou
perda de habitats.
Recentemente, Bartley et al. (2001) revisaram uma ampla aplicação da
produção artificial de híbridos interespecíficos em aqüiculturas. Nesta revisão, de
uma perspectiva comercial, foi observado que vários híbridos são favorecidos em
situações em que a produção pode ser aumentada e direcionada para algumas
características físicas ou fisiológicas desejáveis. Em muitos casos, híbridos mostram
uma relativa propensão para características de desempenho economicamente
17
viáveis, fornecendo métodos não-biotécnológicos para a transferência potencial de
características desejáveis, além da possibilidade de combinar múltiplas
características num simples produto.
O uso de programas de hibridação em piscicultura tem sido utilizado em
inúmeras espécies de peixes a fim de produzir animais estéreis e que possuam
melhor desempenho que as espécies parentais (vigor híbrido), como o aumento da
taxa de crescimento, melhor qualidade da carne, resistência a doenças e
capacidade de tolerar variações ambientais, além do aperfeiçoamento de diversas
outras características a fim produzir peixes mais proveitosos para o cultivo (Bartley
et al., 2001). Segundo Toledo-Filho et al. (1998), o uso de programas de hibridação
em piscicultura tem sido aplicado para diversos fins, tanto em programas de
melhoramento genético de fenótipos com baixa herdabilidade e produção de
híbridos com heterose, como na produção de linhagens estéreis, monossexuais,
poliplóides, andro e ginogenéticas.
No Brasil, o uso da metodologia de hibridação artificial em peixes teve início
cerca de 30 anos atrás envolvendo tilápias e foi realizada pelo Departamento de
Obras Contra a Seca (DNOCS), no Nordeste (Toledo-Filho et al., 1998).
Subseqüentemente, utilizando a mesma tecnologia, o Centro de Pesquisa e Gestão
de Recursos Pesqueiros Continentais (CEPTA - Pirassununga, SP) produziu, em
1985, o “Tambacu”, híbrido interespecífico entre fêmea de Tambaqui (Colossoma
macropomum) e macho de Pacu (Piaractus mesopotamicus) (Bernardino et al.,
1986). Atualmente, a produção de híbridos de peixes envolvendo várias espécies
Neotropicais se tornou uma prática comum no Brasil, resultando em produtos viáveis
e, algumas vezes, de grande interesse para os produtores (Senhorini, comunicação
pessoal).
18
Tabela 1 – Linhagens de híbridos interespecíficos entre espécies Neotropicais possíveis
de serem produzidas artificialmente nas pisciculturas brasileiras.
Riscos causados pela hibridação interespecífica
Segundo Toledo-Filho et al. (1994), existem sérios problemas práticos a
serem solucionados em programas de hibridação artificial, que estão relacionados
aos produtos genéticos resultantes de uma hibridação bem sucedida, às
metodologias genéticas mais apropriadas para a identificação dos produtos da
hibridação, à avaliação da fertilidade ou esterilidade dos híbridos e aos potenciais
GERAÇÃO PARENTAL
Parental Fêmea Parental Macho
Produto
Híbrido
Tambaqui
Colossoma macropomum
Pacu
Piaractus mesopotamicus
“Tambacu”
Pacu
Piaractus mesopotamicus
Tambaqui
Colossoma macropomum
“Paqui”
Tambaqui
Colossoma macropomum
Pirapitinga
Piaractus brachypomus
“Tambatinga”
Pirapitinga
Piaractus brachypomus
Tambaqui
Colossoma macropomum
“Pirambaqui”
Pacu
Piaractus mesopotamicus
Pirapitinga
Piaractus brachypomus
“Patinga” ou
“papi”
Pirapitinga
Piaractus brachypomus
Pacu
Piaractus mesopotamicus
“Pirapicu”
Piauçu
Leporinus macrocephalus
Piapara
Leporinus elongatus
“Piaupara”
Piapara
Leporinus elongatus
Piauçu
Leporinus macrocephalus
“Piapaçu”
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
Cachara
Pseudoplatystoma fasciatum
“Pintachara”
Cachara
Pseudoplatystoma fasciatum
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
“Cachapinta”
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
Jurupoca
Hemiosorubim platyrhynchos
“Pintajuru”
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
Pirarara
Phractocephalus hemioliopterus
“Pintapira”
Cachara
Pseudoplatystoma fasciatum
Pirarara
Phractocephalus hemioliopterus
“Cachapira”
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
Jandiá
Leiarius marmoratus
“Pintadiá”
Jandiá
Leiarius marmoratus
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
“Janditado”
Matrinchã
Brycon sp.
Piracanjuba
Brycon orbignyanus
“Matrinjuba”
Piracanjuba
Brycon orbignyanus
Matrinchã
Brycon sp.
“Piracanchã”
19
riscos biológicos destes para a integridade genética das espécies parentais
cultivadas e selvagens.
Em estoques cultivados, a grande semelhança morfológica dos híbridos com
os seus parentais podem causar misturas ocasionais e resultar na formação de
plantéis de reprodutores contendo indivíduos portadores de esterilidade zigótica ou
gamética. Segundo Ferguson e Thorpe (1991), em pisciculturas da Hungria e da ex-
Tchecoslováquia, a presença de híbridos nos estoques parentais de carpas cabeça-
grande e prateada, detectados numa proporção de cerca de 2 a 8%, foi considerada
a causa dos problemas de “contaminação genética” nestes estoques. Já em relação
aos estoques selvagens, os impactos genéticos dos híbridos tornam-se bem mais
difíceis de serem previstos, uma vez que variam de intensidade conforme os
indivíduos apresentem fertilidade total, parcial ou nula, ou ainda, se são
provenientes de parentais nativos ou exóticos (Ferguson e Thorpe, 1991).
Os híbridos parcialmente férteis ou os que apresentam fertilidade total são os
que oferecem maiores riscos às populações selvagens, pois podem realizar
introgressões provocando “contaminação genética”, e desta forma, até causar a
extinção de um dos parentais (Allendorf e Leary, 1988; Rhymer e Simberloff, 1996;
Epifanio e Philipp, 2001; Rosenfield et al., 2004; Konishi e Tanaka, 2004). Os efeitos
nocivos da hibridação, principalmente devido à introgressão, têm causado a extinção
de muitas populações e espécies de plantas e animais (Rhymer e Simberloff, 1996;
Allendorf et al., 2001). Segundo Ryman e Utter (1987), os cruzamentos artificiais
entre os esturjões “sterlet” e “beluga” (importante fonte produtora de caviar)
provocaram uma alta incidência de híbridos, os quais foram soltos na natureza e
consequentemente, deixaram as espécies parentais em risco de extinção.
De acordo com Hulata (1995), a esterilidade de híbridos pode ser uma
qualidade importante em programas que visam reduzir os possíveis impactos em
20
estoques naturais em casos de escapes da aqüicultura. Entretanto, apesar de
híbridos estéreis serem fisiologicamente incapazes de retrocruzar com os parentais,
podem competir por espaço e alimento com os peixes selvagens. Ao mesmo tempo,
híbridos com esterilidade zigótica apresentam desenvolvimento gonadal parcial e
características sexuais secundárias, de forma que podem ocorrer cruzamentos mal
sucedidos com as espécies parentais, não redundando em descendência viável, o
que a longo prazo, pode interferir negativamente na dinâmica reprodutiva das
espécies parentais (Toledo-Filho et al., 1994).
No Brasil, apesar da constatação de que a produção de híbridos
interespecíficos atualmente já se tornou uma prática comum nas pisciculturas,
poucos são os estudos sobre as vantagens da produção de híbridos entre as
espécies Neotropicais e à avaliação dos reais impactos genético-ecológicos que
esses animais apresentam para as populações selvagens e cultivadas. Na literatura,
estudos neste sentido estão disponíveis em sua maioria para híbridos entre as
espécies Piaractus mesopotamicus X Colossoma macropomum e Pseudoplatystoma
corruscans X Pseudoplatystoma fasciatum, demonstrando que estes animais são
vantajosos e já comercializados em aqüicultura (Ribeiro et al., 1995; Coelho e
Cyrino, 2006; Faustino et al., 2007; Godinho, 2007). No entanto, também já se
verificou que estes podem apresentar fertilidade e retrocruzar com as espécies
parentais (Almeida-Toledo et al., 1996; Senhorini, comunicação pessoal), o que
revela o perigo e eminente possibilidade de atuação destes animais no meio
ambiente e nas comunidades selvagens.
Esta preocupação ainda aumenta quando se leva em consideração os
escapes de indivíduos híbridos que ocorrem em pisciculturas, que pode ser
considerado um dos principais meios de dispersão de espécies exóticas em novos
ambientes (Welcomme, 1988; Agostinho e Julio, 1996; Orsi e Agostinho, 1999). Uma
21
recente forma de comercialização e lazer que rapidamente se difundiu no Brasil,
denominado “pesque-pague”, também representa importantes riscos adicionais, uma
vez que os escapes são considerados inevitáveis, principalmente devido ao
despreparo dos proprietários em relação à conservação ambiental (Fernandes et al.,
2003). Os escapes com a água efluente, o esvaziamento dos tanques durante o
manejo e, principalmente, o rompimento ou transbordamento desses em razão de
picos de cheias não previstos durante a construção, são as principais vias de
introdução de espécies exóticas pelas atividades de cultivo (Orsi e Agostinho, 1999).
1.2 Considerações sobre as espécies parentais e seus híbridos
A família Anostomidae, relacionada dentro da ordem dos peixes
Characiformes, compreende um grupo de 12 gêneros e apresenta uma ampla
distribuição na América do Sul e Central, com representantes em todas as bacias
hidrográficas brasileiras (Géry, 1977; Garavello e Britski, 2003). Leporinus (87
espécies) e Schizodon (14 espécies) são os gêneros mais representativos dessa
família (Garavello e Britski, 2003). Dos gêneros citados, o grupo dos Leporinus
destaca-se pela presença de algumas espécies com grande valor econômico, tais
como o Piauçu, Leporinus macrocephalus; a Piapara, L. elongatus; o Piau, L. friderici
e a Piava, L. obtusidens (Castagnolli, 1992).
Segundo Reynalte-Tataje e Zaniboni-Filho (2005), espécies do gênero
Leporinus, em especial L. macrocephalus e L. elongatus, apresentam características
zootécnicas bastante interessantes e promissoras para o cultivo em programas de
piscicultura, entre elas a facilidade de reprodução em cativeiro, idade e tamanho na
maturidade sexual após o 1º ano de vida, tolerância ao manejo e fácil aceitação de
ração.
22
Em geral, espécies de Leporinus como o Piauçu e a Piapara, possuem
grande aceitação no mercado, pois são muito apreciadas por colecionadores de
peixes ornamentais devido à beleza dos juvenis, e ainda pelos pescadores
comerciais e esportivos por apresentarem excelente qualidade de carne e
comportamento agressivo quando os adultos são capturados em anzol (Reynalte-
Tataje e Zaniboni-Filho, 2005). Tais características as tornam muito procuradas
pelos criadores que fornecem peixes aos empreendimentos de “pesque-pague”.
Em termos de hibridação interespecífica, os cruzamentos entre estas
espécies podem gerar diferentes híbridos como a “Piaupara”, resultante do
cruzamento da fêmea de L. macrocephalus e macho de L. elongatus, e o “Piapapi”,
do cruzamento entre fêmea de L. elongatus com o macho de L. macrocephalus.
Para estes híbridos ainda não há estudos descritos na literatura informando sobre
suas possíveis vantagens e/ou desvantagens em relação aos parentais. Porém, o
fato de que estão sendo produzidos rotineiramente nas pisciculturas e os potenciais
riscos que podem representar ao meio ambiente, demonstram a necessidade da
aquisição de informações e estabelecimento de estratégias para caracterização e
monitoramento genético envolvendo estes híbridos.
1.3 Métodos na detecção de hibridação
Tendo em vista os eminentes riscos biológicos que os híbridos representam
para as populações selvagens e cultivadas, podendo “contaminar geneticamente” os
estoques ou ainda competir de diversas formas com as linhagens parentais, é de
grande importância que os resultados obtidos pela hibridação interespecífica sejam
devidamente analisados sob os pontos de vista zootécnicos e também genéticos
(Toledo-Filho et al., 1994). Segundo estes autores, com o conhecimento do perfil
23
genético desses animais através programas efetivos de caracterização e
monitoramento genético, em associação ao uso de práticas corretas de manejo, os
possíveis problemas decorrentes do uso de animais geneticamente manipulados em
programas de cultivo poderiam ser minimizados e até evitados.
A caracterização e a identificação genética de estoques que sofreram
manipulação genética são procedimentos bastante recomendáveis para as estações
de piscicultura que utilizam técnicas de melhoramento animal (Toledo-Filho et al.,
1994; Ocalewicz et al., 2006; Porto-Foresti et al., 2006). O monitoramento genético
de produtos resultantes de processos de hibridação interespecífica consiste no uso
de metodologias que possibilitam encontrar características diagnósticas que
identifiquem, de maneira clara e acessível, parentais e híbridos (Toledo-Filho et al.,
1994; Ocalewicz et al., 2006).
Para a identificação dos produtos híbridos, existem diversas metodologias
propostas na literatura. Segundo Scribner et al. (2001), numa revisão sobre os
métodos empregados para identificar eventos de hibridação em peixes, relatou que
a maioria dos trabalhos na identificação de híbridos empregam os métodos
morfológicos (45%), seguidos de alozimas (35%), DNA mitocondrial (12%), DNA
nuclear (4%) e cariótipos (2%). De acordo com estes dados, foram observados que
os estudos de hibridização frequentemente têm se baseado em critérios
morfológicos ou merísticos. Contudo, considera-se que os resultados obtidos com
esta metodologia podem ser duvidosos e ofuscados quando utilizados como a única
fonte de análise (Neff e Smith, 1978), particularmente para indivíduos híbridos além
da geração F
1
.
Sabe-se que através de exames visuais da morfologia externa e mesmo de
características morfométricas e merísticas, nem sempre é fácil uma identificação
segura de parentais e híbridos. As características merísticas em peixes, mesmo as
24
que se mostram intermediárias nos híbridos, são de uso limitado porque geralmente
apresentam herança poligênica e sua distribuição pode superar à dos parentais
(Campton, 1987; Toledo-Filho et al., 1994). De acordo com Toledo-Filho et al.
(1994), quando se utilizam somente métodos morfológicos na identificação de
híbridos de peixes, pode ocorrer uma subestimativa da freqüência dos híbridos,
como no caso de híbridos entre as espécies Piaractus mesopotamicus X Colossoma
macropomum, especialmente quando são analisados exemplares jovens.
Os interesses na identificação genética de híbridos interespecíficos aliado aos
recentes avanços na tecnologia molecular têm disponibilizado uma gama
considerável de marcadores genéticos, o que possibilita a correta identificação de
híbridos, além de permitir análises fundamentais em busca de dados sobre os
eventos de hibridação e introgressão (Scribner et al., 2001).
1.3.1 Estudos citogenéticos na identificação de híbridos
Aspectos gerais
Efetivamente, de acordo com uma revisão realizada por Oliveira et al.
(2006a), os primeiros trabalhos publicados sobre citogenética de peixes Neotropicais
foram realizados na década de 70 e atualmente, vários outros têm sido desenvolvido
com uma ampla abrangência dos grupos de peixes, resultando em uma considerável
quantidade de conhecimentos disponíveis.
Segundo Porto-Foresti et al. (2006), até recentemente, os exames cariotípicos
nos peixes eram considerados principalmente como uma ferramenta para estudos
básicos e evolutivos, não sendo utilizados no manejo e monitoramento de estoques.
Quando análises convencionais não são suficientes para caracterizar precisamente
os indivíduos, a identificação pode ser baseada em marcadores cromossômicos
25
estruturais. Entre os marcadores cromossômicos mais utilizados em peixes têm-se a
detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (NORs) através do nitrato de
Prata, a caracterização da heterocromatina constitutiva pela técnica de banda C, a
incorporação da 5-bromodioxiuridina (5-Brdu), a coloração por fluorocromos base-
específicos e a localização de seqüências específicas com o uso da hibridação
fluorescente in situ (FISH) (Ocalewicz et al., 2006; Porto-Foresti et al., 2006).
Os métodos citogenéticos, além de serem considerados de baixo custo,
constituem uma maneira bastante precisa de se verificar tanto os níveis de ploidia
como a procedência dos complementos cromossômicos dos parentais nos produtos
resultantes de hibridação interespecífica em peixes (Toledo-Filho et al., 1994;
Ocalewicz et al., 2006). Segundo Almeida-Toledo et al. (1987), pacus e tambaquis
diplóides e seus híbridos recíprocos apresentaram um cariótipo idêntico em número
e morfologia. Além disso, um híbrido triplóide proveniente destes mesmos
cruzamentos também foi encontrado, o qual apresentava um cariótipo com 81
cromossomos (3n).
Em alguns estudos citogenéticos de produtos resultantes da hibridação
interespecífica, as espécies parentais e seus híbridos podem apresentar diferentes
composições cariotípicas relacionadas a diferenças no número diplóide, fórmula
cariotípica e/ou número fundamental, de tal maneira que, híbridos podem ser
caracterizados pela simples diferença de morfologia de alguns cromossomos entre
as espécies parentais (Kossowski et al., 1983; Manosroi et al., 2003; Park et al.,
2003).
Nos casos em que híbridos e parentais apresentam o mesmo cariótipo (iguais
em número e morfologia), torna-se necessário o emprego de técnicas de colorações
diferenciadas e bandamentos cromossômicos na tentativa de encontrar um
marcador que os diferencie. Tais recursos metodológicos, através da banda C,
26
permitiram a perfeita identificação dos parentais e dos híbridos obtidos dos
cruzamentos entre Pacu (Piaractus mesopotamicus) e Tambaqui (Colossoma
macropomum) (Almeida-Toledo et al., 1987). Outros estudos similares com a
identificação de híbridos por bandamentos cromossômicos também podem foram
realizados, tais como os híbridos entre espécies de carpas (Almeida-Toledo et al.,
1995) e entre espécies de “catfish” (Zhang e Tiersch, 1997).
Estudos citogenéticos no gênero Leporinus
Estudos citogenéticos no gênero Leporinus iniciaram-se a cerca de 30 anos
com os trabalhos de Galetti et al. (1981a, b), sendo que atualmente pode-se
encontrar uma soma significativa de trabalhos contribuindo para um melhor
entendimento da estrutura cromossômica deste grupo. Além disso, estes estudos
envolvem uma ampla variedade de polimorfismos, que incluem desde a ocorrência
de cromossomo B (Venere et al., 1999), polimorfismos de DNA ribossômicos (Galetti
et al., 1995b; Martins e Galetti, 1999), padrão de heterocromatina (Galetti et al.,
1991a, b; Koehler et al., 1997; Margarido e Galetti, 2000), evento de poliploidia
(Molina et al., 2007), até um claro sistema de determinação sexual ZZ:ZW (Galetti et
al., 1981a; Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et al., 1998).
Leporinus compartilha um cariótipo muito similar com outros gêneros da
família Anostomidae. Estudos cariotípicos realizados em representantes destes
gêneros evidenciaram um cariótipo básico composto por 54 cromossomos, dos tipos
meta e submetacêntrico (Galetti et al., 1981b; Galetti et al., 1991a). Embora estas
características demonstrem uma presença constante e com uma conservada
estabilidade cariotípica, eventos interessantes de rearranjos cromossômicos
parecem ter ocorrido (Galetti et al., 1984; Galetti et al., 1991a).
27
Análises citogenéticas básicas realizadas em três gêneros da família
Anostomidae (Leporinus, Leporellus e Schizodon) demonstraram que, a princípio,
estes possuem grande similaridade cariotípica (Galetti et al., 1981b). A posterior
utilização de diferentes metodologias, como a impregnação pelo nitrato de Prata, foi
satisfatoriamente resolutiva na caracterização de algumas espécies do grupo.
Apesar de existir uma tendência a um par de cromossomos portadores de NORs,
essas se encontraram em diferentes cromossomos ou em distintas posições nos
cromossomos de algumas espécies de Leporinus e também em gêneros da família
Anostomidae (Galetti et al., 1984; Galetti et al., 1991a, b; Koehler et al., 1997;
Margarido e Galetti, 2000). Além disso, apesar desta tendência, é importante
destacar casos isolados de NORs múltiplas com uma alta variabilidade inter e intra -
individual em duas espécies de Leporinus (Galetti et al., 1991a; Galetti et al., 1995a
e b). Provavelmente, estas diferenças poderiam estar relacionadas com eventos de
translocações e/ou inversões, bem como transposições, representando marcadores
citogenéticos para estas espécies (Galetti et al., 1984; Galetti et al., 1991a; Galetti et
al., 1995a; Koehler et al., 1997).
Outra característica interessante que evidencia alterações na microestrutura
cariotípica em espécies deste grupo é o padrão da heterocromatina constitutiva
(Galetti et al., 1991a, b). Estudos em espécies de Leporinus e em gêneros da família
Anostomidae demonstraram diferenças quantitativas e qualitativas nos padrões de
bandamento C e de fluorocromos base-específicos, o que revelou que a
heterocromatina tem representado um papel importante na evolução cromossômica
dos Anostomídeos (Galetti et al., 1991a, b; Koehler et al., 1997; Margarido e Galetti,
2000). Desta forma, estes distintos padrões de heterocromatina possibilitaram que
os autores sugerissem que rearranjos (inversões e/ou transposições) ou
modificações qualitativas poderiam ter agido como fatores controladores de
28
pequenas alterações nas suas estruturas cariotípicas. Além do mais, a associação
da heterocromatina com as NORs nas espécies estudadas também poderia estar
influenciando estas alterações cromossômicas (Galetti et al., 1991a, b; Koehler et
al., 1997; Margarido e Galetti, 2000).
Considera-se, assim, que a localização da NOR e o padrão de
heterocromatina observada em diferentes cromossomos ou posições diferentes no
cromossomo, podem se constituir em potenciais marcadores para a identificação de
híbridos interespecíficos envolvendo as espécies Leporinus macrocephalus e
Leporinus elongatus.
Cromossomos sexuais no gênero Leporinus
Apesar da maioria das espécies de peixes não apresentarem cromossomos
sexuais diferenciados, um interessante aspecto encontrado em peixes Neotropicais
é a sua enorme diversidade referente aos mecanismos cromossômicos de
determinação de sexo, que incluem desde fêmeas ou machos heterogaméticos, até
sistemas simples (XX:XY e ZZ:ZW) ou múltiplos (X
1
X
2
Y, XY
1
Y
2
e ZW
1
W
2
) (Almeida-
Toledo e Foresti, 2001). Além disso, dois novos sistemas de heteromorfismo
cromossômico ligado ao sexo já foram relatados para as espécies Neotropicais, com
a descrição do sistema XO para uma espécie do gênero Ancistrus (Alves et al.,
2006) e Z
1
Z
1
Z
2
Z
2
:Z
1
W
1
Z
2
W
2
para a espécie Leporinus elongatus (Parise-Maltempi et
al., 2007). Em uma recente revisão, Oliveira et al. (2006a) apontaram a presença de
40 espécies com heterogamia feminina, enquanto 22 espécies apresentavam
heterogamia masculina.
Na maioria dos casos, a diferença entre os homólogos sexuais envolve blocos
heterocromáticos e este fato é muito bem estabelecido em sistemas do tipo ZZ:ZW,
em que perda ou ganho de heterocromatina são as principais causas de
29
diferenciação entre estes cromossomos sexuais (Haaf e Schmid, 1984; Galetti e
Foresti, 1986; Feldberg et al., 1987; Moreira-Filho et al., 1993; Venere et al., 2004;
Vicari et al., 2006). Já os sistemas múltiplos geralmente envolvem rearranjos
cromossômicos Robertsonianos ou translocação em tandem, sendo que algumas
vezes podem resultar em perda de heterocromatina (Almeida-Toledo et al., 1988;
Bertollo et al., 1997; Almeida-Toledo et al., 2000).
No gênero Leporinus (Anostomidae), sete espécies apresentam o sistema
simples de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW (Galetti et al., 1981a; Galetti e
Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et al., 1998). Neste sistema, um
cromossomo de tamanho grande do tipo subtelocêntrico e com o braço longo
totalmente heterocromático é o típico cromossomo W, presente somente no cariótipo
de fêmeas; em contraste, o cromossomo Z, presente em ambos os sexos, é um
submetacêntrico e apenas heterocromático na porção final do braço longo (Galetti et
al., 1981a; Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et al., 1998).
Galetti e Foresti (1986 e 1987) sugeriram que este mecanismo de
diferenciação foi originado apenas uma vez durante a história evolutiva deste grupo,
sendo compartilhado pelas espécies por meio de um ancestral comum. A
diferenciação deste típico sistema cromossômico sexual ZW em Leporinus se deu
por uma inicial heterocromatinização de um dos cromossomos do par por meio da
incorporação e desenvolvimento de seqüências de DNA satélites específicas. Em
seguida, um processo de acúmulo desta heterocromatina, possivelmente
acompanhado de mudanças qualitativas, resultou na diferenciação do cromossomo
W (Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a).
Atualmente, após estudos com várias formas de bandamento, entre elas
corantes fluorescentes base-específicos e a incorporação de 5-Brdu, foram
verificadas diferentes tipos de heterocromatina no cromossomo W, o que indica certo
30
nível de diferenciação e heterogeneidade deste cromossomo e que modificações
espécie-específicas tenham ocorrido neste grupo (Nakayama et al., 1994; Molina et
al., 1998; Molina e Galetti, 2006).
Apesar deste peculiar padrão ZZ:ZW encontrado em sete espécies de
Leporinus, dois novos relatos de cromossomos sexuais no gênero foram descritos
recentemente, com um atípico e morfologicamente diferente ZZ:ZW em L. aff.
brunneus (Venere et al., 2004) e um sistema múltiplo Z
1
Z
1
Z
2
Z
2
:Z
1
W
1
Z
2
W
2
para a
espécie L. elongatus, que aparentemente apresentava o sistema ZZ:ZW padrão do
gênero (Parise-Maltempi et al., 2007). Neste último, através do isolamento de um
novo elemento repetitivo e seu uso como sonda sexo-específica pela técnica de
FISH, somado com informações de Ag-NOR e bandamento C, foi inferido que L.
elongatus apresenta preferencialmente um sistema múltiplo de cromossomos
sexuais envolvendo os cromossomos portadores da NOR.
Esta última descrição representa novas perspectivas para verificar se este
DNA repetitivo está distribuído diferentemente nos cromossomos sexuais de outras
espécies de Leporinus, e desta forma, pode gerar marcadores sexo-específicos na
identificação de híbridos envolvendo as espécies Leporinus macrocephalus e
Leporinus elongatus.
Fenômeno de dominância nucleolar em híbridos interespecíficos
Nos animais podem ser encontradas duas classes distintas de genes que
codificam RNA ribossômico (RNAr), a classe maior do DNA ribossomal (DNAr) 45S
composta pelos genes 18S, 5.8S e 28S e a classe menor de DNAr 5S (Long e
Dawid, 1980). As regiões organizadoras de nucléolo (NOR) são loci genéticos em
eucarionte em que os genes que codificam o precursor dos três maiores RNAr estão
agrupados em centenas ou milhares de cópias, coletivamente abrangendo milhões
31
de pares de bases ao longo do cromossomo (Ritossa e Spiegelman, 1965; Wallace
e Birnstiel, 1966; Phillips et al., 1971). A transcrição dos genes do RNAr pela RNA
polimerase I resulta na formação de um nucléolo (Karpen et al., 1988), a região
nuclear onde ocorre a biogênese dos ribossomos.
Dominância nucleolar é considerada um fenômeno epigenético observado em
células de híbridos interespecíficos em que a NOR proveniente de uma espécie
parental é dominante em relação à outra, ou seja, enquanto a NOR de um parental é
ativa a outra é silenciada. Este fenômeno foi descrito primeiramente em híbridos de
plantas do gênero Crepis por Navashin em 1934 e atualmente muitos estudos estão
sendo realizados no intuito de descobrir quais os mecanismos pelos quais a
dominância se estabelece (Pikaard, 2000a, b; McStay, 2006).
De acordo com Pikaard (2000a), nos estudos de Navashin com híbridos
interespecíficos de plantas do gênero Crepis, foi observado que constrições
secundárias de um cromossomo eram herdadas de apenas uma das espécies
parentais nos exemplares híbridos da F
1
. Quando isso ocorria, independente de qual
espécie da geração parental no cruzamento, a partir de um retrocruzamento
apropriado era possível resgatar o nucléolo reprimido, demonstrando que a
formação nucleolar do cromossomo não foi alterada ou perdida no híbrido. Esse
fenômeno foi inicialmente denominado de “differential amphiplasty”. Também em
1934, McClintock fez uma importante descoberta mostrando que as constrições
secundárias correspondiam intimamente aos sítios de formação do nucléolo. Após
algumas décadas, o fenômeno descrito por Navashin foi finalmente interpretado
como a manifestação citológica da falha na produção de um conjunto de genes
RNAr de um dos parentais e passou a ser conhecido como dominância nucleolar
(Honjo e Reeder, 1973).
32
Experimentos complementares sobre o nucléolo sugeriram posteriormente
que a transcrição de apenas um conjunto de genes RNAr de um parental é a
explicação molecular para a dominância nucleolar (Chen e Pikaard, 1997).
Presumivelmente, a transcrição de genes RNAr durante a intérfase de alguma forma
reduz sua condensação na metáfase, dessa maneira explicando o aparecimento das
constrições secundárias, que constituem os sítios cromossômicos onde o nucléolo
se forma durante a intérfase (Wallace e Langridge, 1971).
Este fenômeno tem sido bem caracterizado em numerosos híbridos
interespecíficos de plantas (Martini et al., 1982; Flavell et al., 1988; Chen e Pikaard,
1997; Chen et al., 1998; Lewis e Pikaard, 2001), porém estudos em alguns animais
também se mostraram importantes tais como em híbridos de Drosophila (Durica e
Krider, 1978; Oliveira et al., 2006b; Commar et al., 2007) e sapos Xenopus (Honjo e
Reeder, 1973; Reeder e Roan, 1984; Caudy e Pikaard, 2002), enquanto em peixes
são encontrados poucos relatos na literatura (Ueda et al., 1988; Ueda e Kobayashi,
1990, Gold et al., 1991).
Como em outros fenômenos epigenéticos, modificações na cromatina forçam
o silenciamento dos genes RNAr de um dos parentais na dominância nucleolar. No
entanto, os mecanismos que discriminam qual conjunto RNAr parental é dominante
ou silenciado ainda não estão claros (Pikaard, 2000a). Algumas possibilidades
incluem diferenças em relação à afinidade espécie-específico com os fatores de
transcrição dos genes RNAr, outras relacionadas a hipótese de “enhancer
imbalance” (desequilíbrio de reforços), enquanto algumas sugerem que o contexto
cromossômico é mais importante do que a seqüência do gene RNAr, implicando em
mecanismos que afetam toda a NOR ou até mesmo grandes domínios
cromossômicos (Pikaard, 2000a). Em geral, dominância nucleolar parece ser uma
33
conseqüência da divergência evolutiva dos genes RNAr e/ou dos mecanismos de
regulação da transcrição (Wallace e Langridge, 1971; Reeder, 1985).
Entre as várias hipóteses sobre a dominância nucleolar, a hipótese de
“enhancer imbalance” tem sido mais amplamente estudada. Esta situação foi
descoberta pela primeira vez entre híbridos de sapos Xenopus laevis e X. borealis
(Reeder, 1985) e se baseia no fato de que elementos repetitivos podem servir como
enhancers, que são segmentos de DNA que influenciam os promotores para a
transcrição dos genes ribossômicos (Reeder, 1985; Caudy e Pikaard, 2002).
Os enhancers compartilham de certa similaridade com o domínio do gene
promotor de tal forma que favorece a idéia de que enhancer e promotor ligam um ou
mais fatores essenciais de transcrição em comum. Indiferente do preciso mecanismo
pelo qual agem, todas as evidências disponíveis sugerem que o gene promotor
adjacente a numerosos enhancers tem uma forte vantagem sobre um promotor
adjacente a poucos enhancers (Reeder e Roan, 1984). Os genes RNAr de X. laevis
e X. borealis apresentam diferentes tipos e números de elementos repetitivos em
seus espaçadores intergênicos. Isto sugere um modelo em que o maior número de
enhancers de X. laevis poderia retirar um fator e seqüestrá-lo, de forma a impedir os
genes RNAr de X. borealis de acessar os fatores (Reeder e Roan, 1984; Reeder,
1985). Experimentos em que minigenes de RNAr de X. laevis e X. borealis foram
coinjetados dentro de oócitos mostraram que os minigenes de X. laevis foram
preferencialmente transcritos, de acordo com a situação que ocorre nos híbridos, em
que somente genes RNAr de X. laevis são ativos (Reeder e Roan, 1984).
Uma característica recorrente da dominância nucleolar, tanto em plantas
como em animais, é que a NOR da mesma espécie é sempre silenciada,
independente dos efeitos maternais ou paternais. Essa descoberta sugere que
diferenças fundamentais ditam os conjuntos de genes RNAr dominantes e
34
reprimidos em um híbrido, possivelmente por causa de diferenças espécie-
específicas nos sistemas de transcrição dos progenitores (Reeder, 1985; Pikaard,
2000a).
Até hoje, a escolha dos mecanismos pela qual NOR inteira ou subconjuntos
de genes RNAr são silenciados ocasionando inativação, ainda permanecem uma
questão intrigante (Preuss e Pikaard, 2007). Recentes estudos moleculares
evidenciam que silenciamento gênico na dominância nucleolar é freqüentemente
resultado de efeitos combinados do remodelamento da cromatina, metilação do DNA
e modificações de histona específicas (Chen e Pikaard, 1997; Chen et al., 1998;
Richards e Elgin, 2002; Grummt e Pikaard, 2003).
Desta maneira, como este é um fenômeno bem documentado em várias
espécies de plantas e animais, porém pouco estudado em híbridos de peixes, os
híbridos interespecíficos entre L. macrocephalus e L. elongatus podem ser
considerados como um excelente material de estudo para adicionar dados a respeito
deste mecanismo que ainda precisa ser esclarecido.
1.3.2 Estudos moleculares na identificação de híbridos
A partir do final da década de 1960, deu-se início ao uso de marcadores
moleculares na detecção e descrição da diversidade biológica e os anos
subseqüentes assistiram a uma revolução na biologia molecular. Passaram a ser
desenvolvidos métodos mais acurados para a observação e o estudo da estrutura
molecular de proteínas e de ácidos nucléicos, proporcionando grandes avanços no
que diz respeito às metodologias de pesquisa, biotecnologia molecular e
bioinformática (Moritz e Hillis, 1996).
O desenvolvimento dos marcadores genético-moleculares tem impactado a
pesquisa em quase toda área biológica, incluindo a aqüicultura, onde tais
35
marcadores têm se tornado importantes ferramentas para fornecer informações a
respeito da variabilidade genética e endogamia, relacionamentos de parentesco,
identificação de híbridos e linhagens em programas de cultivo (García de Leon et al.,
1998; Spidle et al., 2004; Vandeputte et al., 2004; Liu e Cordes, 2004). Atualmente,
uma ampla variedade de marcadores tem sido desenvolvida para diferentes
espécies utilizadas na aqüicultura mundial (Liu e Cordes, 2004). O interesse na
caracterização e identificação de híbridos em pisciculturas e também estudos
envolvendo hibridações naturais tem disponibilizado uma gama considerável de
marcadores moleculares na literatura. Entre os mais utilizados estão marcadores do
tipo RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) (Calcagnotto, 1998; Perez et
al., 1999), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Elo et al., 1997; Liu et al.,
1999), SPAR (Single Primer Amplification Reaction) (Fonteles et al., 2005) e AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism) (Congiu et al., 2001; Young et al., 2001).
Os procedimentos para obtenção de marcadores do tipo RAPD foram
desenvolvidos primeiramente em 1990 (Welsh e McClelland, 1990; Williams et al.,
1990) usando a PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar aleatoriamente
segmentos anônimos do DNA nuclear com um par idêntico de primers de 8-10 pb de
comprimento. Como os primers são curtos e são usadas temperaturas relativamente
baixas de anelamento (frequentemente 36-40ºC), a probabilidade de amplificar
produtos múltiplos é grande, com cada produto possivelmente representando um
locus diferente. No estudo de híbridos realizado por Elo et al. (1997), através desta
metodologia estes autores conseguiram obter fragmentos que permitiram a
separação dos parentais e híbridos entre espécies de salmonídeos. Liu et al. (1999),
analisando híbridos de bagres e seus parentais também encontraram bandas de
ambos os parentais nos híbridos, conseguindo diferenciá-los.
36
Já a metodologia de SPAR, da mesma forma que o RAPD, também se baseia
na amplificação por PCR de fragmentos aleatórios do DNA. No entanto, consiste da
utilização de regiões genômicas flanqueadas por microssatélites, de tal forma que
para a reação de amplificação são usados primers únicos de seqüências repetitivas
simples (Gupta et al., 1994). No Brasil, Fonteles (2002) utilizou-se desta técnica para
identificação de híbridos artificiais entre espécies parentais do gênero Piaractus.
Fonteles et al. (2005) também conseguiram estabelecer relações de parentesco
entre diferentes espécies de carpas e seus híbridos interespecíficos.
A técnica RFLP baseia-se na produção de fragmentos moleculares através da
digestão do DNA por enzimas de restrição, o que resulta em fragmentos cujos
números e o tamanho podem variar entre indivíduos, populações e espécie.
Tradicionalmente, fragmentos genômicos foram separados usando a análise de
“Southern blot” (Southern, 1976), em que o DNA genômico é digerido, sujeitado a
eletroforese através de um gel de agarose, transferido a uma membrana e
visualizado pela hibridização por sondas específicas. Este método já foi utilizada na
identificação de híbridos artificiais por Calcagnotto (1998) e Perez et al. (1999).
Primeiramente empregada por Vos et al. (1995), AFLP é uma técnica
baseada na PCR que combina as forças e supera as fraquezas dos métodos de
RFLP e RAPD. A característica exclusiva da técnica é a adição de adaptadores aos
fragmentos de DNA gerados por digestão enzimática do DNA genômico total. Como
os adaptadores têm seqüências conhecidas e são ligadas às extremidades dos
fragmentos, estes podem ser usados como sítios de primers para a amplificação por
PCR. O principal alvo da variação genética é o mesmo que RFLP, mas em vez de
analisar um locus de cada vez, permite a análise de muitos loci simultaneamente.
Como exemplo, Young et al. (2001) usaram a técnica de AFLP para gerar 133
37
marcadores polimórficos, das quais 23 foram diagnósticos na distinção de híbridos e
suas espécies parentais de truta Oncorhynchus mykiss irideus e O. clarki clarki.
Mais recentemente, ainda em relação ao método de RFLP, a maioria das
análises substitui o método “Southern blot” com as técnicas baseadas na reação de
PCR (PCR-RFLP). Assim, após a amplificação de uma região conhecida, os
produtos de PCR podem ser digeridos com enzimas de restrição e serem
visualizados por simples eletroforese devido à grande quantidade de DNA produzida
por esta técnica. A técnica PCR-RFLP apresenta uma considerável redução do
tempo de execução, no custo e complexidade (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Desta
maneira, tem sido utilizada com sucesso na diferenciação e identificação forense de
espécies de peixes (Cocolin et al., 2000; Wolf et al., 2000; Hold et al., 2001; Hsieh et
al., 2005 e 2007), sendo bastante promissora para análises aplicadas à piscicultura,
principalmente na identificação de híbridos e diferenciação das espécies parentais.
Outro método muito eficaz e rápido, porém não utilizado na caracterização de
híbridos, é a técnica PCR Multiplex com “primers” espécie-específicos. Este método
consiste em utilizar “primers” espécie-específicos para um determinado locus, o qual
difere de uma a poucas substituições nucleotídicas para as espécies a serem
analisadas, de tal forma que testes podem ser multiplexados, isto é, duas ou mais
reações de PCR podem ser aplicadas simultaneamente no mesmo tubo (Henegariu
et al., 1997; Markoulatos et al., 2002). Esta técnica tem se demonstrado importante
na diferenciação e identificação de espécies, o que também a torna promissora para
a identificação de híbridos. Atualmente suas finalidades variam desde o
monitoramento da qualidade de água (Abd-El-Haleem et al., 2003), determinação
sexual (Seddon, 2005) e aplicações em programas de conservação (Chapman et al.,
2003; Magnussen et al., 2007; Apostolides et al., 2007) até o uso em identificação
forense (Trotta et al., 2005; Marshall et al., 2007).
38
O valor do DNA mitocondrial e nuclear na identificação de híbridos
Estudos moleculares têm usado o DNA mitocondrial (DNAmt) por serem muito
menor que o DNA nuclear (aproximadamente 5 vezes menor); por existirem várias
cópias do DNAmt dentro da célula (versus somente 1 ou 2 cópias de DNA nuclear);
e finalmente pelo fato dos íntrons estarem ausentes (Sotelo et al., 1993).
Conseqüentemente, o DNAmt é uma ferramenta útil para estudos filogenéticos e de
evolução em animais, por seu modo de herança uniparental, taxa relativa rápida de
substituição de base, falta de recombinação e fácil isolamento (Moritz et al., 1987;
Saccone, 1994). Por isso, a maioria das análises filogenéticas e de identificação de
espécies tem se baseado em regiões conservadas do genoma mitocondrial
(DNAmt), em especial o DNA ribossomal 16S (Meyer, 1993; Orrell e Carpenter,
2004; Calcagnotto et al., 2005; Pardo et al., 2005; Gagnaire et al., 2007).
Em relação às regiões do genoma nuclear, os íntrons (seqüências não-
traduzidas que medeiam seqüências codificadoras polipeptídicas no genoma
nuclear) são fontes potencialmente ricas de marcadores espécie-específicos para
estudos de hibridação. Enquanto isso, por serem não-funcionais, os íntrons
acumulam mutações com uma taxa mais rápida do que as seqüências codificadoras
nucleares e desta forma, têm sido usados com freqüência em diferenciação de
espécies, estudos filogenéticos e populacionais (Palumbi e Baker, 1994; Friesen et
al., 1999; Friesen, 2000; Calcagnotto et al., 2005; Avelino, 2007).
Segundo Toledo-Filho et al. (1994), os marcadores mitocondriais e nucleares
têm fornecido valiosas informações na identificação de híbridos recíprocos e na
detecção de eventos históricos de hibridação em peixes, nos quais, a médio e longo
39
prazos, os genes de uma das espécies são lentamente incorporados ao patrimônio
genético de outras espécies por meio da introgressão. Como o DNA mitocondrial em
animais apresenta característica peculiar de herança materna (Moritz et al., 1987),
este tipo de marcador é extremamente útil para detectar a direção do evento de
hibridização, uma vez que identifica os parentais maternos, no entanto, não tem a
capacidade de ser utilizado para estimar taxas de introgressão e hibridação. Por
outro lado, visto que híbridos e seus descendentes herdam DNA nuclear de ambas
as espécies parentais, somente através dos marcadores nucleares eventos de
hibridação e introgressão podem ser detectados, entretanto, é fundamental utilizar o
DNAmt em conjunto com os marcadores genéticos nucleares, pois os resultados de
ambos se complementam (Scribner e Avise, 1993 e 1994a, b; Rosenfield et al.,
2000; Scribner et al., 2001).
1.4 Objetivos
Como a produção de híbridos interespecíficos é uma prática comum nas
pisciculturas e considerando que os estudos genéticos em híbridos ainda são
escassos e, em sua maioria, não estão relacionados a projetos de cultivo, este
estudo teve como principais objetivos:
1. Diferenciar e identificar geneticamente espécies de peixes de interesse comercial,
que representam as linhagens parentais das espécies Leporinus macrocephalus
(Piauçu) e Leporinus elongatus (Piapara), e seus respectivos híbridos
interespecíficos (“Piaupara” e “Piapapi”), que atualmente são produzidas em
pisciculturas do Brasil;
40
2. Analisar através de várias formas de bandamentos cromossômicos, quais
marcadores citogenéticos são diagnósticos e que permitam a precisa identificação
de indivíduos parentais e híbridos;
3. Verificar e estabelecer marcadores moleculares diagnósticos, tanto mitocondriais
quanto nucleares, de forma a fornecer suporte para outros projetos de hibridação e
principalmente, tornar o monitoramento genético de híbridos acessível e rotineiro;
4. Promover a ordenação de dados biológicos das espécies parentais e das
linhagens híbridas que representem informações importantes com relação à
dinâmica do processo de hibridação, tanto para fins de pesquisa básica como para
fins comerciais.
41
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais
Tendo em vista o interesse de caracterizar geneticamente representantes das
linhagens parentais das espécies Leporinus macrocephalus (Piauçu) (Figura 1a) e
Leporinus elongatus (Piapara) (Figura 1b) e seus respectivos híbridos (Figura 1c),
foram coletados exemplares do estoque de cultivo provenientes da piscicultura
Kabeya (Penápolis, SP) (Figura 2). Os estoques parentais de L. elongatus e L.
macrocephalus cultivados nesta piscicultura foram derivados de amostras de peixes
coletados no pantanal Sul Mato-grossense.
Figura 1 - Exemplar de Piauçu (Leporinus macrocephalus) (a), de Piapara (Leporinus elongatus) (b) e
exemplares de seu respectivo híbrido interespecífico (“Piaupara”).
b
a
c
42
A piscicultura Kabeya (Figura 2), situada em Glicério, região de Penápolis,
SP, possui completa infra-estrutura para comercialização de peixes. O interesse
desta empresa estava inicialmente voltado à engorda de peixes, mas se deparou
com um mercado escasso na produção de alevinos, surgindo a partir daí uma nova
meta, relacionada à reprodução destes organismos. Na área comercial, atende a
pisciculturas, pesque-pagues e associações de criadores. Por mais de dez anos
dedica-se à criação e comercialização de alevinos ou exemplares juvenis de
diversas espécies tropicais.
Os peixes coletados foram transportados para o laboratório a fim de
processamento do material. Nas análises cromossômicas, para a obtenção de
cromossomos mitóticos, foram extraídos fragmentos de tecido da porção anterior do
rim dos exemplares, enquanto que para os estudos moleculares foram coletadas
amostras de sangue, fígado ou nadadeira com o intuito de se proceder à extração e
purificação do DNA. A seguir, os peixes foram numerados e registrados em caderno
Figura 2
-
Piscicultura
Kabeya
(Penápolis, SP)
.
43
de campo. Por fim, os animais utilizados nos estudos genéticos foram fixados em
formol 10%, conservados em etanol 70%, identificados e depositados na coleção de
peixes do Laboratório de Genética de Peixes da UNESP, Campus de Bauru, SP.
Em uma primeira etapa de coleta, foram analisados citogeneticamente 19
exemplares de Leporinus macrocephalus (Piauçu) e 20 exemplares de Leporinus
elongatus (Piapara), provenientes da piscicultura Kabeya (Penápolis, SP) (Tabela 1).
Além destes animais, 30 exemplares adicionais foram também marcados com tags
(marcadores magnéticos) (Figura 3a e 3b) e mantidos vivos em tanques da
piscicultura Kabeya. De todos os animais analisados citogeneticamente e
identificados com marcadores magnéticos, foram coletadas amostras de material
biológico (fígado, sangue ou nadadeira) e preservados em etanol 95% para a
realização das análises moleculares (Figura 3c).
Tabela 1 - Propriedade, espécies de peixes e número de exemplares analisados e marcados das
espécies parentais utilizadas nos programas de hibridação.
Local de Coleta Espécie Número de exemplares
Analisados Marcados
Piauçu - Leporinus macrocephalus 19 30 Piscicultura Kabeya
(Penápolis, SP)
Piapara - Leporinus elongatus 20 30
Nesta fase do trabalho, tomou-se o cuidado para que os animais utilizados
nas análises fossem representantes de gerações parentais provenientes de capturas
na natureza e não decorrentes de gerações sucessivas (F
1
, F
2
,...), resultantes de
programas de reprodução induzida nas instalações da piscicultura Kabeya, o que
evitou a possibilidade de possível “contaminação genética” das amostras.
44
Figura 3 - Marcação de exemplares com tags magnéticos. (a) introdução de um pequeno tag na
região dorsal da musculatura do animal. Após a introdução do tag, sempre que necessário este pode
ser identificado com um equipamento leitor (b). Coleta de material para análises moleculares (c).
Em uma segunda etapa de coleta, a partir de cruzamentos interespecíficos
artificiais realizados na piscicultura Kabeya, deu-se início ao estudo do processo de
hibridação entre as espécies Leporinus macrocephalus e Leporinus elongatus,
originando os híbridos interespecíficos “Piaupara” (fêmea de L. macrocephalus e
macho de L. elongatus) e “Piapaçu” (fêmea de L. elongatus e macho de L.
macrocephalus) (Figura 4).
Após o período de crescimento, foram analisados citogeneticamente 21
exemplares do híbrido interespecífico “Piaupara” (Tabela 2). Não foi possível
analisar geneticamente o híbrido interespecífico “Piapaçu”, pois em todos os
cruzamentos realizados os indivíduos não sobreviveram após a primeira semana de
eclosão, tornando-se inviável seu desenvolvimento e criação nas instalações da
piscicultura Kabeya. No intuito de verificar se este fenômeno também ocorria em
outras pisciculturas, foram realizadas visitas e entrevistas com outros criadores,
sendo obtidas informações sobre a dificuldade de produção do híbrido
interespecífico “Piapaçu”, o que sugere a ocorrência de uma possível inviabilidade
a
b
c
45
deste híbrido similarmente em outras instalações de produtores e pisciculturas em
geral. Análises específicas para verificar esta suposta inviabilidade se mostram
extremamente necessárias.
CRUZAMENTOS
Fêmea Piauçu
L. macrocephalus
X Macho Piapara
L. elongatus
Fêmea Piapara
L.
elongatus
X Macho Piauçu
L. macrocephalus
“P i a u p a r a”
“P i a p a ç u”
Figura 4 - Esquema dos cruzamentos envolvendo as espécies parentais originando seus
respectivos híbridos interespecíficos.
Além dos animais estudados citogeneticamente, também foram marcados 30
exemplares adicionais com tags (marcadores magnéticos) (Figura 3a e 3b) e
mantidos vivos em tanques da piscicultura Kabeya. De todos os animais analisados
citogeneticamente e identificados com marcadores magnéticos foram coletadas
amostras de material biológico (fígado, sangue ou nadadeira) e preservados em
etanol 95% para a realização das análises moleculares (Figura 3c).
Tabela 2 - Propriedade e número de exemplares híbridos estudados e marcados.
Local de Coleta Espécie Número de exemplares
Analisados
Marcados
“Piaupara”
(fêmea do piauçu e macho da piapara)
21 30 Piscicultura Kabeya
(Penápolis, SP)
“Piapaçu”
(fêmea da piapara e macho da piauçu)
0 0
46
2.2 Métodos
Métodos para as análises citogenéticas
Nas análises citogenéticas foram utilizados os métodos de estimulação de
mitoses (Lozano et al., 1988; Oliveira et al., 1988), preparações diretas de células
renais in vivo (Foresti et al., 1981), coloração das regiões organizadoras de nucléolo
(NORs) com nitrato de Prata (Howell e Black, 1980), caracterização dos padrões de
heterocromatina constitutiva pela banda C (Sumner, 1972) e hibridização
fluorescente in situ (FISH) (Porto-Foresti et al., 2002). Algumas modificações foram
realizadas nessas técnicas como padronização. Para montagem dos cariótipos,
utilizou-se a técnica descrita por Levan et al. (1964). A marcação dos exemplares
seguiu o procedimento descrito por Porto-Foresti (2001).
2.2.1 Estimulação de mitoses
Com o objetivo de se obter maior número de mitoses foi utilizada a técnica de
estimulação de divisão celular por injeção de uma solução de fermento biológico,
descrita inicialmente por Cole e Leavens (1971) para anfíbios e répteis, utilizada por
Lee e Elder (1980) para pequenos mamíferos e por Lozano et al. (1988) e adaptada
por Oliveira et al. (1988) para peixes. O procedimento utilizado consistiu em:
1 preparar uma solução de fermento biológico (Fleischmann) na seguinte proporção:
0,5 g de fermento, 0,5 g de açúcar e 7 ml de água destilada;
2 incubar a solução em uma estufa (37°C) por cerca de 30 min;
3 injetar a solução na região dorso-lateral do peixe, na proporção de 1 ml por 100 g
de peso do animal, 24 h antes da técnica de preparação cromossômica;
4 manter o animal em aquário bem aerado.
47
2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos de peixes
A técnica utilizada para obtenção de cromossomos metafásicos in vivo foi a
descrita por Foresti et al. (1981) e utilizada com algumas modificações. O
procedimento consistiu em:
1 injetar, na região intra-abdominal, solução aquosa de colchicina (0,025%) na
proporção de aproximadamente 0,5 ml / 100 g de peso do animal;
2 deixar o peixe em aquário bem aerado, por um período de 50 min;
3 sacrificar o animal, retirando a parte anterior do rim. Transferir o material para uma
pequena cuba de vidro, contendo 7 ml de uma solução hipotônica de KCL (0,075M);
4 dissociar o material com o auxílio de pinças de dissecção, complementando esse
processo com o auxílio de uma pipeta Pasteur, até que se obtenha uma solução
aquosa homogênea;
5 transferir a solução obtida para um tubo de centrífuga e depositar este no interior
de uma estufa a 37°C por 21 min;
6 retirar o tubo da estufa, colocando 7 gotas de fixador gelado (metanol e ácido
acético na proporção de 3:1, respectivamente); agitar levemente a mistura com uma
pipeta Pasteur e deixar repousar por 5 min à temperatura ambiente;
7 adicionar cerca de 6 ml de fixador e novamente agitar a mistura; levar à centrífuga
(900 ± 100 rpm) por 10 min;
8 retirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 7 ml de fixador; centrifugar
por 7 min a 900 ± 100 rpm;
9 repetir o item 8 por duas ou três vezes, para uma completa fixação e lavagem das
células em suspensão;
10 pingar o material em lâminas e deixar secar ao ar;
11 as lâminas foram guardadas no congelador, conservando-as para aplicação das
técnicas de bandamento cromossômico.
48
2.2.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (NORs)
O procedimento utilizado seguiu a técnica descrita originalmente por Howell e
Black (1980), sendo utilizadas duas soluções:
• Solução A (solução coloidal reveladora): 1 g de gelatina muito bem dissolvida em
50 ml de água destilada. Acrescentou-se 0,5 ml de ácido fórmico.
• Solução B (solução de nitrato de Prata): 1 g de AgNO
3
dissolvida em 2 ml de
água destilada. Depois de preparadas essas soluções foram mantidas em frascos
escuros, a 4°C.
O procedimento para a coloração das NORs foi o seguinte:
1 hidrolisar o material contido nas lâminas por 3 min em HCl 1N a 60°C;
2 secar as lâminas. Pingar uma gota da solução A e duas gotas da solução B sobre
o material na lâmina e cobrir com lamínula;
3 deixar as lâminas sobre um suporte no interior de um banho-maria a 60°C. Em
alguns minutos (aproximadamente 3), a mistura das soluções se torna marrom
dourada. Lavar a lâmina em água destilada, retirando a lamínula e deixar secar;
4 corar com Giemsa na proporção de 1:30 em tampão fosfato (pH = 6,7) por
aproximadamente 10 seg;
5 deixar secar ao ar.
2.2.4 Caracterização da heterocromatina constitutiva
Para a caracterização da heterocromatina constitutiva (banda C), foi utilizada
a técnica descrita por Sumner (1972) com algumas modificações, que consistiu em:
1 hidrolisar o material contido nas lâminas por 30 minutos em HCl 0,2N e a
temperatura ambiente. Posteriormente lavar com água destilada;
2 passar por uma solução de BaOH
2
a 5% por cerca de 7 segundos a 60
o
C.
Posteriormente lavar com água destilada;
49
3 banhar em HCl 1N a 60
o
C e então lavar novamente com água destilada;
4 incubar por 20 minutos em 2xSSC (pH=6,8) a 60
o
C e lavar com água destilada;
5 corar por aproximadamente 30 minutos com Giemsa a 7,5% em tampão fosfato
(pH=6,7).
2.2.5 Hibridização fluorescente in situ (FISH) com sondas específicas de DNA
Para realização da técnica de hibridização fluorescente in situ foram utilizadas
3 seqüências de DNA como sondas: sonda de DNA ribossômico (DNAr) 18S, obtida
de Oreochromis niloticus, preparada e cedida pelo Dr. Cláudio de Oliveira; sonda
sexo-específica isolada de Leporinus elongatus, preparada e cedida pela Drª.
Patricia Pasquali Parise Maltempi; e sonda de genoma total extraída de preparações
cromossômicas de L. macrocephalus, obtida no presente estudo conforme descrito
no item 2.2.5.2 Inicialmente, as sondas de DNAr 18S e sexo-específica foram
marcadas com biotina-dATP pela técnica de nick translation, segundo as instruções
do fabricante (Bionick
TM
Labelling System-Gibco.BRL). Por outro lado, na sonda de
genoma total a marcação se baseou na incorporação do nucleotídeo Tetramethyl-
rhodamine-5-dUTP (Roche Diagnostics) pela técnica de PCR. Após a marcação,
procedeu-se a técnica de hibridização utilizada por Porto-Foresti et al. (2002).
2.2.5.1 Marcação do DNA pela técnica de nick translation
Para marcação com biotina-dATP o protocolo utilizado consistiu em:
1 em um tubo de 0,5 ml preparar uma solução contendo 5 µl de uma solução de 10X
dNTP (contendo 0,1 mM de biotina-dATP), 5 µl de uma solução tamponada de
enzimas (0,0075 unidades/µl de DNAse I e 0,5 unidades/µl de DNA polimerase I), 1
µg de DNA e água para um volume final de 45 µl. Misturar a solução em um vórtex e
centrifugar brevemente a 14.000 rpm;
50
2 incubar a 16°C por 1h. O aumento ou a diminuição no tempo de incubação leva a
produção de segmentos de DNA mais curtos ou mais longos, respectivamente;
3 adicionar 5 µl de um tampão de bloqueio (stop buffer). Remover os nucleotídeos
não incorporados através da precipitação do DNA em etanol conforme descrito
abaixo;
4 adicionar 5 µl de uma solução a 3 M de acetato de sódio e 120 µl de etanol
absoluto gelado (-20°C). Misturar os componentes invertendo várias vezes o tubo
contendo a mistura e incubar a -70°C por 30 min ou -20°C por 2 h;
5 centrifugar a 14.000 rpm por 10 min. Remover e descartar o sobrenadante;
6 ressuspender o DNA em 500 µl de etanol a 75% gelado (-20°C). Centrifugar a
14.000 rpm por 10 min. Remover o sobrenadante e secar o DNA a temperatura
ambiente;
7 adicionar 20 µl de uma solução de hibridação (50% formamida deionizada, 10%
dextran sulfate, 2XSSC e 20 mg/ml de albumina fetal bovina).
8 estocar a solução a -20°C.
2.2.5.2 Obtenção e marcação da sonda genômica por PCR
Uma alíquota (3 µl) da preparação cromossômica de L. macrocephalus
conservada em metanol foi colocada em tubo de micro centrífuga (0,5 ml). Em
seguida, o tubo foi mantido aberto na estufa a 37ºC para permitir a evaporação do
metanol. Após a secagem, a preparação cromossômica (pellet) foi ressuspendido na
solução de PCR.
A amplificação do DNA foi feito conforme descrito por Telenius et al. (1992),
utilizando o primer degenerado DOP com os seguintes reagentes: 10 µl de água
miliQ autoclavada, 2 µl do tampão da Thermosequenase 10x, 4 µl da solução de
dNTP (2,5 mM de cada nucleotídeo), 2 µl de primer DOP 5’- CCG ACT CGA GNN
51
NNN NAT GTG G -3’ (25 M). Esta mistura foi aquecida a 90ºC por 10 minutos,
centrifugada para evitar a evaporação e finalmente adicionada 2 µl da enzima
Thermosequenase (4U l
-1
). O seguinte programa de PCR foi aplicado: 95ºC por 3
minutos, seguido por 10 ciclos de 94ºC/1,5 min, 30ºC/3 min e subindo a 72ºC em 4
minutos (aproximadamente 0.2ºC seg
-1
), e então 35 ciclos de 94ºC/1,5 min, 56ºC/1,5
min e 72ºC/1,5 min. Os resultados foram verificados em um gel de agarose 1% e,
quando positivo, pequenas alíquotas do produto de PCR foram então marcadas para
o procedimento de FISH repetindo 35 ciclos de 94ºC/1,5 min, 56ºC/1,5 min e
72ºC/1,5 min, mas com a presença do nucleotídeo marcado Tetramethyl-rhodamine-
5-dUTP (Roche Diagnostics) na concentração de 20 M. Após a PCR, adicionar
20 µl da solução de hibridação e estocar a -20ºC.
2.2.5.3 Hibridação
1 incubar as lâminas em uma solução contendo 200 µl de 2XSSC (pH=7,0) e 2 µl de
RNAse (100 mg/ml) em uma câmara úmida a 37°C por 1 h;
2 em um coplin de vidro preparar 40 ml de uma solução de desnaturação (70%
Formamida, 2XSSC) e aquecer a 70°C em um banho-maria. Colocar as lâminas na
solução de desnaturação e incubar por 5 min;
3 desidratar as lâminas em séries de etanol a 70%, 85% e 100% a -20 °C por 3 min
cada. Deixar as lâminas secando ao ar;
4 misturar 7,5 µl da solução das sondas + 7,5 µl da solução de hibridação. No caso
em que se utilizarem duas sondas ao mesmo tempo colocar 7,5 µl de cada sonda,
com volume final de 15 µl (sonda sexo-específica + sonda genoma total). Utilizar
reagente de detecção apenas para a sonda marcada indiretamente;
5 desnaturar as sondas incubando-as em um banho-maria a 100°C por 10 min;
52
6 colocar a solução da sonda desnaturada em cada lâmina e cobrir com lamínula.
Selar as bordas da lamínula com cimento de borracha;
7 incubar as lâminas a 37°C por cerca de 15 h (overnight) em uma câmara úmida;
8 remover o cimento de borracha e as lamínulas. Lavar as lâminas duas vezes em
uma solução de 50% formamida/2XSSC por 10 min cada. Nesse passo a
estringência da reação pode ser aumentada ou diminuída na mesma proporção em
que a concentração de formamida é aumenta ou diminuída;
9 lavar as lâminas duas vezes em 2XSSC por 10 min a 42°C. Lavar as lâminas duas
vezes em 4XSSC por 10 min a 42°C;
10 remover as lâminas da solução de 4XSSC. Aplicar em cada gota de suspensão
celular 60 µl do reagente de detecção (avidina marcada com FITC) e cobrir com uma
lamínula de plástico. Incubar as lâminas a 37°C por 15 a 60 min em uma câmara
úmida;
11 remover as lamínulas. Lavar as lâminas duas vezes em uma solução de PBD
(PBS com 1% de Triton X-100) por 5 min a temperatura ambiente;
12 lavar as lâminas em uma solução de PBS (tampão fosfato) por 5 min a
temperatura ambiente.
Amplificação do sinal
1 para amplificar o sinal das sondas marcadas com biotina deve-se remover as
lâminas da solução de PBS e aplicar 60 µl do anticorpo anti-avidina para cada gota
de suspensão celular. Cobrir com uma lamínula de plástico e incubar as lâminas a
37°C por 1 h em uma câmara úmida; Para as seqüências com um número grande de
cópias procedeu-se diretamente com a contra-coloração e análise em microscópio
de fluorescência;
53
2 remover as lamínulas. Lavar as lâminas duas vezes em uma solução de PBD por 5
min a temperatura ambiente;
3 lavar as lâminas em uma solução de PBS por 5 min a temperatura ambiente;
4 remover as lâminas da solução de PBS e aplicar em cada gota de suspensão
celular 60 µl do reagente de detecção (avidina-FITC) e cobrir com uma lamínula de
plástico. Incubar as lâminas a 37°C por 15 a 60 min em uma câmara úmida;
5 remover as lamínulas. Lavar as lâminas duas vezes em uma solução de PBD por 5
min a temperatura ambiente;
6 contra-corar com 15 µl de uma solução de iodeto de propídio/antifade ou DAPI.
As lâminas foram fotografadas em fotomicroscópio Olympus, modelo BX50,
equipado com Epi-Fluorescência.
2.2.6 Estudos cariotípicos
A partir dos dados obtidos através das análises e contagens dos
cromossomos em cerca de 30 metáfases de cada indivíduo estudado, procurou-se
estabelecer um número diplóide modal para os exemplares de cada espécie.
Assim, as melhores metáfases ou as que apresentaram uma melhor
dispersão e morfologia mais nítida dos cromossomos foram fotografadas em
fotomicroscópio da marca OLYMPUS, modelo BX50, com objetiva de imersão de
100X. O filme utilizado foi o AGFA HDP e as cópias dos negativos foram feitas em
papel fotográfico Kodabromide F3.
2.2.7 Montagem dos cariótipos
Os cromossomos recortados e dispostos em cartolina com fita adesiva foram
inicialmente arranjados de acordo com seu tamanho e morfologia, sendo
54
classificados como metacêntricos (M), submetacêntricos (SM), subtelocêntricos (ST)
e acrocêntricos (A), emparelhados com seus prováveis homólogos e dispostos em
ordem decrescente de tamanho para a organização final do cariótipo, conforme
descrito por Levan et al. (1964).
2.2.8 Marcação dos exemplares
Tendo em vista a realização de um trabalho de caracterização genética dos
indivíduos utilizados como reprodutores, os exemplares foram marcados com tags e
mantidos vivos em tanques da piscicultura Kabeya. Os tags são pequenos
bastonetes de metal magnetizado, que apresentam sistema de identificação
semelhante ao código de barras, atualmente empregado para identificação de
diversos produtos.
O procedimento de marcação dos exemplares seguiu o descrito por Porto-
Foresti (2001) que consistiu em:
1 primeiramente deve-se anestesiar o animal em uma solução de 2 g de anestésico
(benzocaína) em 20 L de água;
2 introduzir o tag na região lombar esquerda, perto da nadadeira dorsal do animal,
com o auxílio de uma seringa injetora;
3 pressionar o êmbolo, que desloca o tag para fora da agulha, introduzindo-o na
musculatura do animal;
4 após a introdução do tag no animal, sempre que necessário este pode ser
identificado com o auxílio de um equipamento leitor. A identificação é feita
passando-se o leitor sobre a região onde foi introduzido o tag e a leitura é feita
diretamente no mostrador;
No caso da morte do animal ou na desativação do experimento, os tags
podem ser reutilizados após sua limpeza. Este procedimento é realizado retirando-
55
se o tag do animal, lavando com água, esterilizando em álcool 70% e colocando-o
novamente na seringa injetora.
Métodos de análises moleculares
Para as análises moleculares foram utilizados os métodos de extração e
purificação do DNA total baseados no kit comercial “Wizard Genomic DNA
Purification Kit - Promega”. Em seguida, foram amplificadas e seqüenciadas regiões
do gene mitocondrial 16S e do nuclear -tropomiosina de 3 exemplares de cada
espécie parental. A partir do alinhamento das seqüências pelo programa ClustalW
(Thompson et al., 1994), encontraram-se alguns sítios polimórficos espécie-
específicos para o uso das técnicas de PCR-RFLP e PCR Multiplex. A primeira foi
baseada em mapas de restrição gerados pelo programa NEBcutter V2.0 (Vincze et
al., 2003), enquanto na segunda foram desenhados primers espécies-específicos
com auxílio do programa NetPrimer disponível no site
<http://www.premierbiosoft.com/netprimer>.
2.2.9 Extração e purificação de DNA
Foram utilizados dois protocolos de extração de DNA (protocolo A e B),
baseados no kit comercial “Wizard Genomic DNA Purification Kit – Promega”, com
algumas diferenças de acordo com o tecido. O protocolo A foi empregado para
extração de DNA de tecidos sólidos, no caso o fígado e nadadeira, enquanto o
protocolo B foi utilizado para amostras de sangue. A quantificação foi realizada em
gel de agarose 1% através da comparação do DNA extraído com o padrão do ladder
“Low DNA Mass Ladder – Invitrogen”, que possui peso molecular e concentrações
conhecidos.
56
Protocolo A
1 numerar duas séries de tubos de microcentrífuga (1,5 ml);
2 retirar um pequeno pedaço de tecido, adicionar nos tubos de microcentrífuga e
colocar na estufa por aproximadamente 10 min;
3 adicionar 600 l de “Nuclei Lysis Solution” ao tecido;
4 adicionar 5 l de “Proteinase K”;
5 colocar no banho-maria a 60º C por aproximadamente 2 h (misturar algumas
vezes);
6 retirar do banho-maria e deixar voltar a temperatura ambiente;
7 adicionar 3 l de “RNAse” e colocar no banho-maria a 37º C por 30 min;
8 retirar e deixar voltar a temperatura ambiente;
9 adicionar 200 l de “Protein Precipitation Solution” e misturar;
10 levar ao gelo por 5 min.
11 centrifugar por 4 min a 13.000 rpm;
12 transferir o sobrenadante para a segunda série de tubo de microcentrífuga
contendo 600 l de Isopropanol e misturar por inversão;
13 centrifugar por 4 min a 13.000 RPM e descartar o sobrenadante;
14 adicionar 600 l de Etanol 70% a temperatura ambiente e centrifugar por 4 min a
13.000 rpm;
15 descartar o sobrenadante e deixar secar em temperatura ambiente por 1 h;
16 adicionar 100 l de “DNA Rehydration Solution” por 1 h a 65º C ou 24 h a 4ºC.
Protocolo B
1 colocar uma pequena quantidade de sangue (ponta de uma espátula pequena) em
um tubo de microcentrífuga (1,5 ml);
2 adicionar 900 µl de “Cell Lysis Solution” ao tubo e homogeneizar a amostra;
57
3 incubar a solução homogeneizada por 10 min em temperatura ambiente. Inverter o
tubo 2 ou 3 vezes durante este período;
4 centrifugar a amostra por 20 s a 14000 rpm;
5 descartar o sobrenadante sem tocar no pellet;
6 homogeneizar as amostras no vórtex o tempo suficiente para ressuspender o
material;
7 adicionar 300 µl de “Nuclei Lysis Solution” ao tubo e utilizar a ponteira para
homogeneizar a amostra, pipetando de 5-6 vezes;
8 incubar a solução por 30 min a 37º C no banho-maria;
9 adicionar 1,5 µl de RNase e inverter o tubo 25 vezes;
10 incubar por mais 30 min à 37º C. Esperar esfriá-las por 5 min e continuar os
procedimentos;
11 adicionar 100 µl de “Protein Precipitation Solution” e misturar rapidamente no
vórtex;
12 centrifugar por 3 min a 14000 rpm;
13 remover o sobrenadante com cuidado e transferi-lo para outro tubo com 300 µl de
isopropanol a temperatura ambiente;
14 inverter os tubos gentilmente até que os filamentos de DNA tornem-se visíveis;
15 centrifugar por 1 min a 14000 rpm e remover o sobrenadante invertendo o tubo
cuidadosamente;
16 adicionar 300 µl de etanol 70% (com a ponteira voltada para parede do tubo para
não soltar o pellet do fundo do tubo). Não é necessário homogeneizar a amostra;
17 centrifugar 1 min a 14000 rpm;
18 deixar o DNA secar em temperatura ambiente por 1 h;
19 adicionar 75 µl de “DNA Rehydration Solution” por 1 h a 65º C ou 24 h a 4ºC.
58
2.2.10 Amplificação do gene mitocondrial 16S e nuclear -tropomiosina
As condições da PCR padrão bem como a relação dos conjuntos de primers
utilizados para amplificação de parte do gene mitocondrial 16S e nuclear -
tropomiosina estão descritas nas Tabelas 3 e 4. As reações foram realizadas no
termociclador Mastercycler personal (Eppendorf) com um volume final de 25 µl
contendo as seguintes concentrações: tampão da Taq polimerase 1X; MgCl
2
1,3 mM;
100 M de cada dNTP; 0,1 M de cada primer universal; 10-50 ng de DNA genômico e
0,5 U de Taq polimerase (Invitrogen). Os fragmentos de DNA foram aplicados em um
gel de agarose 1,0%, para verificar o resultado da amplificação por PCR.
Tabela 3 - Condições da reação de PCR.
Tabela 4 - Primers universais utilizados para amplificação de parte do gene mitocondrial e nuclear. 16S =
gene ribossômico 16S; Trop = -tropomiosina; F = Forward; R = Reverse.
2.2.11 Purificação dos produtos amplificados por PCR
Protocolo do PEG (PolyEthylene Glycol) desenvolvido por Travis Glenn,
disponível no endereço < http://www.uga.edu/srel/DNA_Lab/PEG_Precip’00.rtf>:
1 adicionar 25 l de polietileno glicol (PEG) 20%-NaCl 2,5 M ao produto de PCR
amplificado (25 l). Misturar com a pipeta várias vezes;
Gene Desnaturação 95º C Ciclos Extensão 72º C
16S 5 min 35x 95ºC/30 s, 52ºC/45 s, 72ºC/20 s 7 min
Trop 5 min 35x 95ºC/30 s, 60ºC/45 s, 72ºC/08 s 7 min
Primer Seqüência dos primers Referência
16S F
16S R
5’- ACGCCTGTTTATCAAAAACAT -3’
5’- CCGGTCTGAACTCAGATCACGT -3’
Kocher et al., 1989;
Calcagnotto et al., 2005
Trop F
Trop R
5’- GAGTTGGATCGGGCTCAGGAGCG -3’
5’- CGGTCAGCCTCTTCAGCAATGTGCTT -3’
Friesen et al., 1999;
Calcagnotto et al., 2005
59
2 colocar a 37ºC em estufa ou termociclador por 15 min;
3 centrifugar a 14.000 rpm por 15 min a temperatura ambiente;
4 aspirar o sobrenadante;
5 adicionar 63 l de álcool etílico 80% e esperar 2 min;
6 centrifugar a 14.000 rpm por 1 min a temperatura ambiente;
7 aspirar o sobrenadante;
8 adicionar 63 l de álcool etílico 80% e esperar 2 min;
9 centrifugar a 14.000 rpm por 1 min a temperatura ambiente;
10 aspirar o sobrenadante;
11 secar em estufa a 37ºC por cerca de 10 min;
12 eluir em TE (100 mM Tris-CL e 10 mM EDTA - pH 8.0) adicionando 12,5l e
aguardar pelo menos 30 min antes de utilizar o produto limpo.
2.2.12 Reação de amplificação para o sequenciamento
Os produtos amplificados e purificados foram utilizados como moldes para as
reações de sequenciamento com o kit DYEnamic Terminator Cycle Sequencing
(Amersham Biosciences), utilizando o primer Forward universal para cada gene
(Tabela 5). Para cada seqüência gênica realizou-se uma réplica. A reação de
sequenciamento seguiu os seguintes parâmetros: um ciclo inicial a 95ºC por 2 min, e
25 ciclos de 95ºC/45s, 50ºC/30s e 60ºC/2min.
Tabela 5 - Reagentes e volumes da reação de sequenciamento.
Reagente Volume
Produtos da PCR 3 l
Buffer 2 l
Pré-mix 2 l
Primer Forward universal (3 M)
2 l
60
2.2.13 Limpeza dos fragmentos marcados
1 adicionar 1,0 l de acetato de sódio 1,5M/EDTA 250 mM a cada tubo;
2 adicionar 80 l de etanol 95% para cada reação e misturar no vórtex;
3 centrifugar a 16.000 rpm por 20 min a 4ºC;
4 remover o sobrenadante por aspiração;
5 adicionar 400 l de etanol 70%;
6 centrifugar a 16.000 rpm por 10 min a 4ºC;
7 remover o sobrenadante por aspiração;
8 deixar secar na estufa a 37ºC por 30 min, protegido da luz.
As seqüências foram determinadas no seqüenciador automático ABI PRISM
TM
377 DNA Sequencer (Perking-Elmer) e posteriormente serão depositadas no GenBank
do National Center of Biotechnology Information (NCBI), vinculado ao National Institute
of Health (NIH).
2.2.14 Análises de PCR Multiplex
As seqüências parciais dos genes foram alinhadas através do programa
ClustalW (Thompson et al., 1994) implementado no programa BIOEDIT (Hall, 1999),
para verificar pontos de mutação em que foram desenhados os primers. As
condições ideais dos primers foram seguidas de acordo com modelos teóricos
descritos na literatura (Rychlik et al., 1990; Burpo, 2001) e analisados através do
programa NetPrimer, disponível no site do PREMIER Biosoft International
<http://www.premierbiosoft.com/netprimer>.
Para a reação de PCR Multiplex os primers espécie-específicos utilizados
estão descritos na Tabela 6. Já as condições das reações foram mantidas de acordo
com a Tabela 3, enquanto as concentrações dos reagentes foram alteradas de
61
acordo com Henegariu et al. (1997) e Markoulatos et al. (2002), visto que alguns loci
apresentaram dificuldades de amplificação. Para o gene mitocondrial 16S as
concentrações foram: tampão da Taq 0,6X; MgCl
2
1,3 mM; 200 M de cada dNTP;
primer 16S F 0,3 M; primer 16S R 0,2 M; 0,1 M de cada primer espécie-específico;
10-50 ng de DNA genômico e 0,5 U de Taq polimerase (Invitrogen). Para o gene
nuclear -tropomiosina as concentrações foram: tampão da Taq 1,2X; MgCl
2
1,3 mM;
100 M de cada dNTP; 0,1 M de cada primer universal e espécie-específico; 10-50 ng
de DNA genômico e 0,5 U de Taq polimerase (Invitrogen).
Tabela 6 - Primers espécie-específicos utilizados em reação Multiplex. 16S = gene ribossômico 16S;
Trop = -tropomiosina; Lm = L. macrocephalus; Le = L. elongatus; F = Forward; R = Reverse.
2.2.15 Análises de PCR-RFLP
As regiões seqüenciadas foram submetidas ao programa NEBcutter V2.0
(Vincze et al., 2003) para gerar mapas de restrição, tornando possível encontrar
enzimas específicas para as espécies parentais analisadas. Amplificações de PCR,
de acordo com o item 2.2.10, foram submetidas à restrição enzimática numa reação
com volume final de 8l contendo as seguintes concentrações e condições: 4 l de
produto de PCR; tampão da enzima 1X e 5 U da enzima de interesse (New England
Biolabs Inc). O produto final foi incubado à 37ºC em banho-maria durante 4 h.
Primer
Seqüência dos primers Referência
16S LmF
16S LeF
5’- GCTAAAACCCGATCAACGAAA -3’
5’- ACAACTTAAGCCAACCGTGTT -3’
Presente trabalho
Trop LeF
Trop LmR
Trop LmF
5’- GGTGTGTATTGTATAAAGACTTACACC -3’
5’- ACATGACCTGATACGACACATGCA -3’
5’- TCATAGCATGGAACACGTTGC -3’
Presente trabalho
62
Os fragmentos de DNA das análises PCR-RFLP e PCR-Multiplex foram
aplicados em um gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio (1 ng/ml),
visualizados em luz ultravioleta e capturados pela câmera digital OLYMPUS
(CAMEDIA - C-5060 5.1 Megapixel).
63
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados e a discussão dos dados obtidos nas análises citogenéticas e
moleculares encontram-se apresentados na forma de capítulos, referentes aos
tópicos abordados. As citações bibliográficas referentes a cada capítulo estão
discriminadas no item Referências Bibliográficas, visando otimizar a apresentação
da Dissertação.
Capítulo 1 – Cytogenetic markers as diagnoses in the identification of the hybrid
between Piauçu (Leporinus macrocephalus) and Piapara (Leporinus elongatus). Este
artigo foi submetido à revista Genetics and Molecular Biology, tendo sido escrito de
acordo com as normas da revista e na língua que é publicada (inglês).
Capítulo 2 – Identificação de híbridos entre as espécies Leporinus macrocephalus e
Leporinus elongatus (Characiformes, Anostomidae) utilizando sonda de DNA
repetitivo ligada ao sexo.
Capítulo 3 – Dominância nucleolar em híbridos dos peixes Neotropicais Leporinus
macrocephalus e Leporinus elongatus (Characiformes, Anostomidae).
Capítulo 4 – Marcadores moleculares de PCR-RFLP e PCR Multiplex para rápida
identificação de híbridos dos peixes Neotropicais Leporinus macrocephalus e
Leporinus elongatus (Characiformes, Anostomidae).
64
C
C
A
A
P
P
Í
Í
T
T
U
U
L
L
O
O
1
1
Cytogenetic markers as diagnoses in the identification of the
hybrid between Piauçu (Leporinus macrocephalus) and Piapara
(Leporinus elongatus)
65
ABSTRACT
The genetic monitoring of interspecific hybrids involves the application of methodologies able
to provide an easy and indubitable genetic characterization of both parental and hybrid
individuals. In the present work, cytogenetic techniques were used to identify a hybrid
lineage of “Piaupara” in order to caracterize them in relation to the parental species,
Leporinus macrocephalus (Piauçu) and L. elongatus (Piapara). The cytogenetic analysis
revealed that L. macrocephalus presented 2n=54 chromosomes and a nucleolar organizer
regions (NOR) at the telomere of the long arm of the submetacentric chromosome pair 2.
Analysis of constitutive heterochromatin (C-banding) revealed a conspicuous block at the
pericentromeric region on the long arm of a submetacentric chromosome pair. L. elongatus
presented the same diploid number, 2n=54, and a karyotypic formula similar to that of L.
macrocephalus. The NORs were also at the telomere of the long arm of the submetacentric
pair 2, which was morphologically different from that of L. macrocephalus. Heterochromatic
blocks were observed at both telomeres of a submetacentric chromosome pair. The hybrid
“Piaupara” presented the same diploid number (2n=54) and karyotypic formula as the
parental species and there were no visible differences between parental and hybrid
individuals. Differently from the Giemsa staining, NOR and C-banding analysis showed
marked differences which allowed the identification of the hybrids by the different morphology
and/or size of the chromosomes carrying the NORs and patterns of heterochromatin
distribution in their chromosomes. Such genetic studies are important for fish culture since
they can provide tools for monitoring natural and artificial hybridization. They are also useful
in biological conservation programmes and in the proper management of natural and reared
fish stocks.
Key words: Interspecific hybrid; Fish culture; Fish cytogenetics
66
INTRODUCTION
Biological sciences and, particularly, biotechnological studies have played a
major role on the development of fish culture over the last decades. The
improvement of current methodologies and its application in studies of fish biology
and genetics are necessary to develop a better genetic management of both captive
stocks and natural populations (Porto-Foresti and Foresti, 2004).
Interspecific hybridization focused on productivity increase and formation of
sterile lineages represents one of the main classic methods of genetic manipulation
applied in fish farms. Most of natural fish hybrids are found in continental waters,
where the frequency of hybridization and speciation is remarkably higher than that
found in marine species, in which hybrids are generally rare (Hubbs, 1955).
The use of artificial hybridization in fish was initiated about 30 years ago in
Brazil by the Departamento de Obras Contra a Seca (DNOCS) and involved different
species of tilapias (Toledo-Filho et al., 1998). Nowadays, it involves a large number
of interspecific crosses among Neotropical fish species (Table 1). In this way, the
widespread production of interspecific hybrid fishes justifies their effective
characterization and the elaboration of monitoring programmes at the production
level.
The expressive results obtained with the use of interspecific hybridization
techniques in fish need to be carefully interpreted in face of the potential biological
risks that hybrids pose to the environment. If fertile, they can genetically contaminate
both natural and reared parental stocks (Ryman and Utter, 1987). Otherwise, in
natural habitats, they may compete in different ways with parental lineages (Toledo-
Filho et al., 1994). Therefore, the genetic identification, characterization and
monitoring of hybrids produced by fish breeding farms may provide important
67
information which could be used in hybridization programmes applied to fish culture.
Currently, interspecific hybrid individuals between the species Piauçu
(Leporinus macrocephalus) and Piapara (L. elongatus) are being produced in
Brazilian fish cultures. The parental species belong to the family Anostomidae, which
comprises twelve identified genera and represents an important freshwater fish group
widespread throughout the Neotropical region (Géry, 1977; Garavello and Britski,
2003). The most representative genera of this family are Leporinus (87 species) and
Schizodon (14 species) (Garavello and Britski, 2003), and in the Leporinus group
many species constitute important fishery resource to specific communities, such as
L. macrocephalus, L. elongatus and L. obtusidens.
Although the presence of 54 chromosomes remains constant within the
species of the family Anostomidae (Galetti et al., 1981b), interesting chromosome
rearrangements seem to have occurred in this group. Galetti et al. (1991b) reported
perceptible C-banding patterns differences in chromosomes of representatives of the
family Anostomidae and, furthermore, Galetti et al. (1984) demonstrated that the
nucleolus organizer regions (NORs) are located on different chromosomes or at
distinct chromosome positions. These characteristics can be used as a tool for
unambiguous species identification in this family.
Besides the occurrence of normal homomorphic karyotypes in some Leporinus
species, the occurrence of a ZZ/ZW sex chromosomes system was also observed
(Galetti et al., 1981a; Galetti and Foresti, 1986, 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et
al., 1998). In these species, a large and almost fully heterochromatic subtelocentric is
a typical W chromosome, only present in the female karyotype. In contrast, the Z
chromosome present in both sexes is heterochromatic on the final portion of the long
arm of a medium-size submetacentric chromosome.
68
As the production of interspecific hybrids is currently a common practice
among fish breeders, the major goal of the present work was to characterize and
differentiate parental species of Leporinus and their artificial interspecific hybrid. We
aimed at providing a better understanding on the dynamics of the interspecific
hybridization processes in fish, at supporting projects on fish hybridization developed
by farmers, and at establishing guidelines for biological conservation programmes
involving these species.
MATERIAL AND METHODS
From the parental lines, 19 specimens of Piauçu (Leporinus macrocephalus)
and 20 individuals of Piapara (Leporinus elongatus) were cytogenetically analyzed.
Crosses performed between these species resulted in the production of the
interspecific hybrid “Piaupara” – the lineage obtained by using females of Piauçu and
males of Piapara. The cytogenetic analysis in hybrids comprised 21 individuals of
“Piaupara”. All the specimens analyzed were obtained from the stock belonging to
the Kabeya Aquaculture, Penápolis (SP), Brazil and were identified and deposited in
the fish collection of the Laboratory of Fish Genetics, UNESP, Bauru (SP), Brazil.
Before sacrifice, the animals were inoculated with a yeast cell suspension to
increase the number of metaphase cells (Oliveira et al., 1988). Chromosome
preparations were obtained from gill and kidney tissues using the technique
described by Foresti et al. (1981). Silver staining of the nucleolus organizer regions
followed the technique of Howell and Black (1980) and C-banding was performed
according to Sumner (1972). Chromosome morphology was determined on the basis
of arm ratio as proposed by Levan et al. (1964) and the chromosomes were
69
classified as metacentric (M), submetacentric (SM), subtelocentric (ST) and
acrocentric (A).
RESULTS AND DISCUSSION
The study of interspecific hybrids depended on the cytogenetic identification of
the parental species Piauçu (Leporinus macrocephalus) and Piapara (L. elongatus),
thus chromosome preparations both species were obtained.
Cytogenetic identification of Piauçu (L. macrocephalus) and Piapara (L. elongatus)
Nineteen specimens of L. macrocephalus (Piauçu) (five females and 14
males) were analyzed. They presented a diploid number of 2n=54 and their
karyotypes were similar to that described by Galetti and Foresti (1987). The
fundamental number (FN) in this species was 108 and the chromosome formula
comprised meta- and submetacentric chromosomes and a ZZ/ZW sex chromosome
pair (Figure 1a).
Twenty specimens of L. elongatus (Piapara) (eight females and 12 males)
were analyzed. The specimens showed 2n=54, with a karyotype composed of meta-
and submetacentric chromosomes and a fundamental number (FN) equal to 108,
confirming previous reports by Galetti and Foresti (1986), Koehler et al. (1997) and
Molina et al. (1998). This species also presented the ZZ/ZW sex chromosome
system (Figure 1b).
According to Vari (1983), the family Anostomidae shares the same
phylogenetic unit with Curimatidae, Prochilodontidae and Chilodontidae. Karyotypic
studies carried out in representatives of the Anostomidae family showed a basic
karyotype composed of 54 mostly meta- and submetacentric chromosomes (Galetti
70
et al., 1981b; Galetti et al., 1991b), similar to the karyotypes of Leporinus
macrocephalus and L. elongatus herein studied. Furthermore, the cytogenetic
analysis confirmed the occurrence of a chromosomal heteromorphism related to sex
in both species (Figures 1a and 1b) previously observed in some Leporinus species
(Galetti et al., 1981a; Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et
al., 1998).
Analysis in three genera of the family Anostomidae (Leporinus, Leporellus and
Schizodon) demonstrated that, superficially, they have a great karyotypic similarity
(Galetti et al., 1981b). Further cytogenetic analysis applying silver nitrate staining of
the nucleolus organizer regions (NORs) were informative enough to characterize
some species in this group. Although exist a trend to a single NOR-bearing pair, the
NORs were at different chromosome positions. The differences might be related to
chromosome rearrangements as translocations and/or inversions, thus representing
cytogenetic markers for these species (Galetti et al., 1984; Galetti et al., 1991a, b;
Galetti et al., 1995a; Koehler et al., 1997).
Silver nitrate staining on chromosome preparations of L. macrocephalus and
L. elongatus revealed the presence of a single chromosome pair bearing ribosomal
cistrons in both species. The NORs were located at a terminal position on the long
arm of a submetacentric chromosome (pair 2) in both species (Figures 1a and 1b -
inbox). However, as the NOR-bearing chromosomes in each species have different
sizes and/or morphologies, they can be useful cytological markers for the
identification of interspecific hybrids between these species.
C-banding of Leporinus macrocephalus and L. elongatus chromosomes
revealed the presence of heterochromatic blocks over centromeric and
pericentromeric regions of some chromosomes in both species. In L. macrocephalus,
conspicuous interstitial blocks were present in the pericentromeric region at the long
71
arms of the submetacentric chromosomes of the third pair (Figure 2a - inbox). In L.
elongatus, additional telomeric blocks were detected on both arms of the medium-
sized submetacentric chromosomes of the second pair (Figure 2b - inbox). The
telomeric heterochromatic blocks were associated to the nucleolus organizer regions,
in accordance with previous data for some other species of the genus (Galetti et al.,
1991a, b; Koehler et al., 1997; Margarido e Galetti, 2000).
The heteromorphic sex chromosomes of both species followed the
morphological and structural patterns of Z and W chromosomes previously reported
in Leporinus species, with heterochromatic regions occupying nearly entirely the long
arms of W chromosome and the final portion of the long arms of Z chromosome
(Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et al., 1998).
Interspecific differences related to constitutive heterochromatin evidenced by
C-banding patterns have already been described in some Leporinus species. While
some of them presented a low amount of heterochromatin, such as L. piau, others
like L. amblyrhyncus and L. taeniatus present heterochromatic blocks distributed over
centromeric and telomeric regions. Furthermore, in L. striatus, interstitial blocks of
heterochromatin were also reported (Galetti et al., 1991a). The different patterns of
heterochromatin described in some species of this group suggest that some
rearrangements might have played a controlling role on the structural karyotypic
changes (Galetti et al., 1991a). Other species, with reduced amounts of
heterochromatin, possibly presented a differentiation pattern associated with
qualitative and quantitative changes in their heterochromatic segments (Galetti et al.,
1991b).
C-banding and NORs distribution allowed the characterization of chromosome
markers in both parental species, which constitute important tools in the identification
of the parental lineages and hybrids.
72
Cytogenetic identification of the hybrid “Piaupara”
Twenty-one individuals of the hybrid “Piaupara” (eight males and 13 females)
obtained through crosses between Piauçu females and Piapara males were
analyzed. The results revealed a diploid number of 2n=54 in all individuals, with a
fundamental number of 108 and a chromosome formula composed of meta- and
submetacentric chromosomes, besides ZZ/ZW sex chromosomes (Figure 3).
Due to the morphological similarity between the karyotypes of the parental
species, the “Piaupara” hybrid presented the same diploid number and karyotypic
formula described in Leporinus macrocephalus (Piauçu) and L. elongatus (Piapara),
thus preventing its identification. There are well documented cases of hybrids and
their parental species sharing an identical karyotype, such as in hybrids between
pacu (Piaractus mesopotamicus) and tambaqui (Colossoma macropomum), which
have 2n=54 and karyotypes composed of 20 metacentric and 34 submetacentric
chromosomes (Almeida-Toledo et al., 1987). A similar situation has been reported in
natural hybrids resulting from crosses between Cichla monoculus and Cichla
temensis by Brinn et al. (2004), who detected 2n=48 acrocentric chromosomes in
hybrids and parental specimens.
In other cases of interspecific hybridization in fish, the parental species and
their interspecific hybrids presented distinct karyotypes. That was the case of a
hybridization program involving two species with 2n=54 but distinct karyotypic
formulas. Tambaqui (Colossoma macropomum) females were crossed with pacu-
peva (Mylossoma duriventris) males and the crosses resulted in hybrid individuals
with 54 chromosomes, which were identified by an acrocentric marker chromosome
inherited from the male parental species (Kossowski et al., 1983).
73
The cytogenetic analysis carried out in the hybrid “Piaupara” also revealed that
the particular ZZ/ZW sex chromosome heteromorphism found in the parental species
(Figure 3), is also present in the hybrid individuals and linked to sex determination.
In the hybrid individuals the submetacentric NOR-bearing chromosomes had
different morphologies and were apparently not homologous (Figure 4). After Silver
nitrate staining the following NORs distribution was observed: 20,21% of the cells
presented the NORs in the chromosomes of a submetacentric pair with different
morphologies; 78,42% of the cells presented a NOR in one chromosome of the pair,
identified as a component of the Leporinus elongatus karyotype; and 1,37% of the
cells presented the NOR in one chromosome identified as being from L.
macrocephalus (Table 2 and Figure 5).
This variation in the NORs distribution is due to the fact that the Silver nitrate
staining detects active NORs, since it stains not the rDNA but rather a set of acidic
proteins associated with the process of ribosome production (Howell, 1977; Jordan,
1987). Thus, the difference in activity found in the rDNA sites in the hybrids, which
present a frequent activity of the NOR from the L. elongatus NOR-bearing
chromosome, may indicate the occurrence of nucleolar dominance. This
phenomenon has already been identified in hybrids of cyprinid fishes (Gold et al.,
1991) and other organisms, such as in the wheat Aegilops umbellulata (Martini et al.,
1982), in Xenopus hybrids (Reeder and Roan, 1984) and in hybrids of Drosophila
(Durica and Krider, 1978).
C-banding in “Piaupara” revealed the presence of heterochromatic blocks at
centromeric and pericentromeric regions of some chromosomes (Figure 6). Besides
that, it showed an evident heterochromatic block near the pericentromeric region of
one chromosome (Figure 6 - inbox), analogous to that described in Leporinus
macrocephalus, and subtle staining at telomeric regions in both arms of one
74
chromosome (Figure 6 - inbox), similar to that found in L. elongatus. Thus, the typical
heterochromatic blocks from each parental species were present in the hybrid
“Piaupara” in single chromosomes, demonstrating that chromosome features
inherited from both parental species can be identified as specific parental markers in
the hybrids.
C-banding also revealed that the hybrid sex chromosomes have the same
morphological and structural patterns reported in both parental species, L.
macrocephalus and L. elongatus, i.e., almost entirely heterochromatic long arms in
the W chromosome and heterochromatin in the final portion of the long arms of Z
chromosomes (Figure 6).
When hybrids and parental individuals present similar karyotypes the use of
differential staining techniques and chromosome banding are required to provide
distinguishable chromosomal markers. C-banding allowed the precise identification of
the parental species and the hybrids obtained from crosses between pacu (Piaractus
mesopotamicus) and tambaqui (Colossoma macropomum) (Almeida-Toledo et al.,
1987). C-banding in the cichlid fish species Cichla monoculus and C. temensis and
their hybrids revealed a very similar banding pattern distribution hindering the
distinction between the parental and the hybrid specimens (Brinn et al., 2004).
In the present work, Ag-NORs and C-banding proved to be informative and
allowed the identification of specific chromosome markers of the parental sets in the
hybrids. The use of chromomycin A
3
and in situ hybridization with the 18S probe will
allow a better identification of the NORs sites in “Piaupara”. It may also lead to a
better comprehension of the process of nucleolar dominance that may be occurring
in these individuals.
Cytogenetic markers can be very useful for the characterization and
differentiation between parental species and artificial or natural interspecific hybrid
75
lineages or individuals. Cytogenetic information can contribute to a better
understanding of the dynamics of the interspecific hybridization process in fish, and
provide support for hybridization projects and biological conservation programmes.
ACKNOWLEDGMENTS
F.P.F. was supported by a fellowship from Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP). This work was supported by grants from Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
76
Table 1 - A list of fish species and crosses that produce hybrids identified through
the parental species.
PARENTAL GENERATION
Parental Female Parental Male
HYBRID
Tambaqui
Colossoma macropomum
Pacu
Piaractus mesopotamicus
“Tambacu”
Pacu
Piaractus mesopotamicus
Tambaqui
Colossoma macropomum
“Paqui”
Tambaqui
Colossoma macropomum
Pirapitinga
Piaractus brachypomus
“Tambatinga”
Pirapitinga
Piaractus brachypomus
Tambaqui
Colossoma macropomum
“Pirambaqui”
Pacu
Piaractus mesopotamicus
Pirapitinga
Piaractus brachypomus
“Patinga” ou “Papi”
Pirapitinga
Piaractus brachypomus
Pacu
Piaractus mesopotamicus
“Pirapicu”
Piauçu
Leporinus macrocephalus
Piapara
Leporinus elongatus
“Piaupara”
Piapara
Leporinus elongatus
Piauçu
Leporinus macrocephalus
“Piapaçu”
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
Cachara
Pseudoplatystoma reticulatum
“Pintachara”
Cachara
Pseudoplatystoma reticulatum
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
“Cachapinta”
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
Jurupoca
Hemiosorubim platyrhynchos
“Pintajuru”
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
Pirarara
Phractocephalus hemioliopterus
“Pintapira”
Cachara
Pseudoplatystoma reticulatum
Pirarara
Phractocephalus hemioliopterus
“Cachapira”
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
Jandiá
Leiarius marmoratus
“Pintadiá”
Jandiá
Leiarius marmoratus
Pintado
Pseudoplatystoma corruscans
“Janditado”
77
Table 2 – Distribution of NOR-bearing chromosomes after Silver nitrate staining in the interspecific
“Piaupara” hybrids.
Metaphases with active NOR in
two chromosomes (one of each
parental)
Metaphases with active
NOR only in the L.
elongatus chromosome
Metaphases with active
NOR only in the L.
macrocephalus chromosome
Total of analyzed
cells (%)
59 (20,21%) 229 (78,42%) 4 (1,37%) 292 (100%)
78
Figure 1 - Giemsa-stained karyotype (female and male) of Leporinus macrocephalus (Piauçu) (a) and
Leporinus elongatus (Piapara) (b). Inbox, the NOR-bearing chromosome pair 2.
79
Figure 2 - C-banded karyotypes (female and male) of Leporinus macrocephalus (Piauçu) (a) and
Leporinus elongatus (Piapara) (b). The marker chromosomes are shown in detail (inbox).
80
Figure 3 - Karyotype of female (a) and male (b) individuals of the interspecific hybrid “Piaupara” (2n=54).
Inbox, the NOR-bearing chromosome pair.
81
Figure 4 - NOR-bearing chromosomes (Silver nitrate staining) in the parental species Leporinus
elongatus (a) and L. macrocephalus (b) and NOR-bearing chromosomes in the interspecific hybrid
“Piaupara” (c).
82
Figure 5 - Metaphases of the interspecific hybrid “Piaupara” (Silver nitrate staining). In (a), a
heteromorphic submetacentric chromosome pair with one homologue from L. elongatus (arrow) and
the other from L. macrocephalus (arrow); in (b), the L. elongatus homologue of the pair (arrows); and
in (c), the L. macrocephalus homologue of the heteromorphic pair (arrows).
83
Figure 6 - C-banded karyotypes of the parental species Leporinus elongatus (a) and L.
macrocephalus (b) and of the interspecific hybrid “Piaupara” (c). The marker chromosomes from
each parental species are shown in detail in the interspecific hybrid.
84
C
C
A
A
P
P
Í
Í
T
T
U
U
L
L
O
O
2
2
Identificação de híbridos entre as espécies Leporinus macrocephalus e
Leporinus elongatus (Characiformes, Anostomidae) utilizando sonda de
DNA repetitivo ligada ao sexo
85
RESUMO
Híbridos interespecíficos de peixes podem representar importantes avanços na exploração
zootécnica de representantes deste grupo animal, contudo podem se constituir em sérios
riscos biológicos ao meio ambiente e às populações naturais. Logo, torna-se de grande
importância a caracterização e monitoramento genético de híbridos produzidos em
pisciculturas, identificando de maneira clara e acessível, os componentes das gerações
parentais e híbridos. No presente estudo, caracterizou-se através da técnica de hibridização
in situ por meio de uma sonda sexo-específica exemplares de peixes híbridos “Piaupara”,
diferenciando-os de seus respectivos parentais, fêmea de Leporinus macrocephalus
(Piauçu) e macho de Leporinus elongatus (Piapara). A aplicação desta metodologia
demonstrou um padrão de hibridização diferente entre machos e fêmeas de L. elongatus e
L. macrocephalus, principalmente devido ao fato de algumas regiões dos cromossomos
portadores da NOR de L. elongatus apresentarem homologia com a sonda. Desta forma, as
marcações obtidas foram consideradas como diagnósticas pelos padrões espécie e sexo-
específicos, diferenciando as espécies parentais. Isto permitiu encontrar um claro modelo
sexo-específico na distinção do híbrido “Piaupara”, comprovando que esta técnica fornece
um bom marcador para a caracterização do híbrido entre L. macrocephalus e L. elongatus.
Além disso, os dados obtidos mostraram-se como importantes recursos metodológicos para
a compreensão dos sistemas cromossômicos sexuais no gênero Leporinus, adicionando
informações sobre a origem e estabelecimento de um novo sistema sexual recentemente
descrito para o gênero Leporinus.
Palavras-chave: sonda sexo-específica; híbridos interespecíficos; citogenética de peixes
86
INTRODUÇÃO
Apesar da maioria das espécies de peixes não apresentarem cromossomos
sexuais diferenciados, um interessante aspecto encontrado em peixes Neotropicais é a
enorme diversidade de mecanismos de diferenciação sexual que inclui desde fêmeas
ou machos heterogaméticos, até sistemas simples (XX:XY e ZZ:ZW) ou múltiplos
(X
1
X
2
Y, XY
1
Y
2
e ZW
1
W
2
) (Almeida-Toledo e Foresti, 2001). Na maioria dos casos a
diferença entre os homólogos sexuais envolve blocos heterocromáticos e este fato é
muito bem estabelecido em sistemas ZZ:ZW, em que perda ou ganho de
heterocromatina são as principais causas de diferenciação entre estes cromossomos
(Haaf e Schmid, 1984; Galetti e Foresti, 1986; Moreira-Filho et al., 1993; Venere et al.,
2004; Vicari et al., 2006). Já os sistemas múltiplos de heteromorfismos ligados ao sexo
geralmente envolvem rearranjos cromossômicos Robertsonianos ou translocação em
tandem, sendo que algumas vezes podem resultar em perda de heterocromatina
(Almeida-Toledo et al., 1988; Bertollo et al., 1997; Almeida-Toledo et al., 2000a).
No gênero Leporinus (Anostomidae), sete espécies apresentam o sistema
simples de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW (Galetti et al., 1981a; Galetti e Foresti,
1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et al., 1998). Segundo estes autores, neste
sistema sexual, um grande cromossomo subtelocêntrico e com o braço longo
totalmente heterocromático é o típico cromossomo W, presente somente no cariótipo
de fêmeas; em contraste, o cromossomo Z, presente em ambos os sexos, é um
submetacêntrico e heterocromático apenas na porção final do braço longo.
Recentemente, dois novos relatos de cromossomos sexuais no gênero
Leporinus foram descritos, com um mecanismo atípico e morfologicamente diferente
ZZ:ZW em L. aff. brunneus (Venere et al., 2004) e um sistema múltiplo
Z
1
Z
1
Z
2
Z
2
:Z
1
W
1
Z
2
W
2
para a espécie L. elongatus, que aparentemente apresentava o
87
sistema ZZ:ZW padrão do gênero (Parise-Maltempi et al., 2007). Neste último, através
do isolamento de um novo elemento repetitivo e seu posterior uso como sonda sexo-
específica pela técnica de FISH, somado com informações de Ag-NOR e bandamento
C, foi inferido que L. elongatus apresenta preferencialmente um sistema múltiplo de
cromossomos sexuais envolvendo os cromossomos portadores da NOR.
Atualmente, cruzamentos interespecíficos para produção de linhagem híbrida
envolvendo as espécies Piauçu (Leporinus macrocephalus) e Piapara (Leporinus
elongatus) estão sendo produzidos em pisciculturas brasileiras sem qualquer
monitoramento. A hibridação interespecífica visa principalmente ao aumento da
produtividade e a obtenção de linhagens estéreis (Bartley et al., 2001). No entanto,
híbridos de peixes podem representar sérios riscos biológicos ao meio ambiente,
“contaminando geneticamente” estoques naturais ou cultivados e competindo de
diversas formas com as linhagens parentais (Ryman e Utter, 1987; Toledo-Filho et al.,
1994; Allendorf et al., 2001). Logo, torna-se de grande importância a caracterização e
monitoramento genético de híbridos produzidos em pisciculturas, identificando de
maneira clara e acessível, as formas parentais e os híbridos.
A partir desta nova ocorrência de cromossomos sexuais em L. elongatus, os
objetivos deste estudo foram verificar se o DNA repetitivo isolado de L. elongatus está
distribuído diferentemente nos cromossomos sexuais de L. macrocephalus e assim,
buscar marcadores sexo-específicos na identificação de híbridos envolvendo estas
espécies, que fornecerão subsídios para um monitoramento adequado nas
pisciculturas e na orientação de programas de conservação biológica.
88
MATERIAIS E MÉTODOS
Na linhagem parental, 19 exemplares de Leporinus macrocephalus (14
machos e 5 fêmeas) e 20 indivíduos de Leporinus elongatus (12 machos e 8
fêmeas) foram analisados citogeneticamente. Cruzamentos artificiais realizados
entre estas espécies resultaram na produção do híbrido interespecífico “Piaupara”,
usando como fêmeas L. macrocephalus e como machos L. elongatus, cujas análises
genéticas compreenderam 21 exemplares (8 machos e 13 fêmeas). Todas as
amostras foram obtidas do estoque pertencente à Piscicultura Kabeya, Penápolis
(SP), Brasil, que também é o local onde os híbridos foram produzidos artificialmente.
Os componentes dos estoques parentais de L. elongatus e L. macrocephalus,
cultivados nesta piscicultura, foram coletados na região do Pantanal Sul mato-
grossense. Os exemplares analisados foram identificados e depositados na coleção
de peixes do Laboratório de Genética de Peixes, UNESP, Bauru (SP), Brasil.
Para os estudos citogenéticos, os exemplares foram previamente submetidos à
técnica de estimulação mitótica (Oliveira et al., 1988). Em seguida, as preparações
cromossômicas foram obtidas de fragmentos de tecidos de rins e brânquias, utilizando o
método descrito por Foresti et al. (1981). A morfologia cromossômica foi determinada de
conformidade com o proposto por Levan et al. (1964). Para realização da técnica de
hibridização fluorescente in situ foram utilizadas a sonda sexo-específica (LeSpeI)
isolada de Leporinus elongatus, preparada e cedida pela Dra. Patricia Pasquali Parise
Maltempi e a sonda de genoma total extraída de preparações cromossômicas de L.
macrocephalus. A marcação da sonda sexo-específica foi por meio da incorporação da
biotina-dATP pela técnica de nick translation (Bionick
TM
Labelling System-Gibco.BRL).
A sonda de genoma total foi marcada com o nucleotídeo Tetramethyl-rhodamine-5-
dUTP (Roche Diagnostics) pela técnica de PCR. Após as marcações, procedeu-se a
89
técnica de hibridização utilizada por Porto-Foresti et al. (2002). As lâminas foram
contra-coradas com iodeto de propídio ou DAPI.
Para a extração da sonda genômica, alíquotas (3 µl) do material citogenético
de Leporinus macrocephalus foram colocadas em tubo de microcentrífuga e
mantidas na estufa a 37ºC permitindo a evaporação do metanol. Em seguida, o
material (pellet) foi ressuspendido na solução de PCR e as reações foram realizadas
de acordo com Telenius et al. (1992), com um volume final de 20 µl: 1x tampão da
Thermosequenase, 150 µM de cada dNTP e 2 M do primer DOP (5’-
CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG -3’). A solução foi aquecida a 90ºC por 10 min e
posteriormente, adicionado 2 µl da enzima Thermosequenase (4U l
-1
). O programa
da PCR consistiu em: desnaturação inicial a 95ºC/3 min e 10 ciclos de 94ºC/1,5 min,
30ºC/3 min e 72ºC aquecido lentamente em 4 min (aproximadamente 0,2ºC seg
-1
),
seguidos por 35 ciclos de 94ºC/1,5 min, 56ºC/1,5 min e 72ºC/1,5 min. Alíquotas (2 µl)
do produto de PCR foram então marcadas para o procedimento de FISH repetindo
35 ciclos de 94ºC/1,5 min, 56ºC/1,5 min e 72ºC/1,5 min, com a presença de 20 M
do nucleotídeo Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP (Roche Diagnostics). Após a PCR,
adicionou-se 20 µl da solução de hibridação (50% formamida deionizada, 10%
dextran sulfate, 2XSSC e 20 mg/ml de albumina fetal bovina).
RESULTADOS
A aplicação da técnica de hibridização in situ através da sonda sexo-
específica (LeSpeI), isolada de L. elongatus por restrição enzimática (Parise-
Maltempi et al., 2007), demonstrou que nas preparações cromossômicas dos
indivíduos parentais e híbridos não houve homologia entre a sonda e o cromossomo
Z, pois não ocorreu hibridização. No entanto, por esta metodologia encontraram-se
90
diferentes padrões sexo-específicos entre os parentais L. macrocephalus e L.
elongatus.
Em fêmeas de L. macrocephalus observou-se apenas algumas regiões do
cromossomo W hibridizadas, sendo três evidentes marcações localizadas na região
distal do braço longo e distribuídas de forma intercalada em outras regiões
cromossômicas (Figura 1a). Já nos exemplares machos, nenhum cromossomo
mostrou homologia pela sonda LeSpeI e desta maneira, utilizou-se a sonda de
genoma total conjuntamente como controle da técnica, que hibridizou em todos os
cromossomos, principalmente nas regiões de DNA repetitivo dos telômeros e
centrômeros (Figura 1b).
Figura 1 - Metáfase de fêmea (a) de L. macrocephalus marcada pela sonda LeSpeI, evidenciando o
cromossomo W (seta). Em (b), metáfase de macho de L. macrocephalus evidenciando somente
marcação pela sonda genoma total.
As fêmeas de L. elongatus também revelaram o cromossomo W hibridizado
em alguns loci, com três marcações localizadas na região distal do braço longo e
distribuídas de forma intercalada em outras regiões cromossômicas, revelando o
mesmo padrão do cromossomo W de L. macrocephalus. Além disso, apresentaram
marcações na região telomérica do braço curto e outras dispersas no braço longo de
um cromossomo submetacêntrico, enquanto o seu homólogo apresentou marcado
b
a
91
somente a região telomérica do braço curto. Estes cromossomos foram identificados
como o par cromossômico portador da NOR, evidenciado pela constrição secundária
e por ser o par número 2 do cariótipo, como descrito por outros autores (Koehler et
al., 1997; Hashimoto et al., Capítulo 1). Os machos também apresentaram
marcações nos cromossomos portadores da NOR. Contudo, as marcações foram
iguais em ambos os cromossomos homólogos, onde apenas a região telomérica do
braço curto teve homologia com a sonda (Figura 2).
Figura 2 - Metáfases de fêmea (a) e macho (b) de L. elongatus, marcadas pela sonda LeSpeI. Abaixo
esquemas evidenciando os pares cromossômicos da NOR e sexuais.
Ao se aplicar a técnica de FISH com a sonda sexo-específica nas
preparações cromossômicas do híbrido “Piaupara” observou-se o padrão de
hibridização esperado, conforme representado na Figura 3a, em que as fêmeas
apresentaram hibridizado o cromossomo W proveniente de L. macrocephalus e
somente um cromossomo portador da NOR herdado de L. elongatus (Figura 3b). Os
b
a
ZW
NOR
NOR
ZZ
92
machos tiveram apenas um cromossomo da NOR proveniente de L. elongatus
marcado pela sonda (Figura 3c).
DISCUSSÃO
No gênero Leporinus, tendo em vista as similaridades dos cromossomos Z e
W indicadas pela coloração convencional e pelo bandamento C, foi sugerido que
Figura 3
-
Representação esquemática do padrão esperado para o híbrido (
a
). Metáfases
de fêmea (b) e macho (c) do híbrido “Piaupara” marcadas pela sonda LeSpeI.
b
c
a
93
este sistema seja único, envolvendo os mesmos cromossomos em todas as
espécies que os apresentam (Galetti e Foresti, 1986 e 1987). Segundo os autores,
este sistema deve ter se desenvolvido através de um processo de
heterocromatinização em um cromossomo Z indiferenciado. Um processo posterior
de acúmulo desta heterocromatina, possivelmente acompanhado de mudanças
qualitativas, resultou na diferenciação do cromossomo W (Galetti e Foresti, 1986 e
1987; Galetti et al., 1995a). Esta hipótese é corroborada com a aplicação de outras
técnicas citogenéticas por Molina e Galetti (2006) e também no presente estudo, em
que se observou uma família de DNA repetitivo marcado pela sonda apenas no
cromossomo W e ausente no cromossomo Z, o que evidencia um acúmulo de
heterocromatina e mudanças qualitativas na diferenciação do W.
A aplicação da sonda LeSpeI pela técnica de FISH, que identifica regiões de
DNA satélite nos cromossomos de Leporinus elongatus (Parise-Maltempi et al.,
2007), possibilitou encontrar um padrão de distribuição no cromossomo W similar
entre as duas espécies parentais (L. elongatus e L. macrocephalus), o qual poderia
ser explicado pela ocorrência de duplicações em tandem envolvendo estas regiões.
Esta situação em comum para as duas espécies reforça a hipótese proposta
inicialmente por Galetti e Foresti (1986 e 1987), em que este mecanismo de
diferenciação foi originado apenas uma vez durante a história evolutiva deste grupo
e compartilhado pelas sete espécies tendo por origem um ancestral comum. O uso
de outras técnicas citogenéticas também tem sido útil na confirmação da
heterogeneidade e na caracterização de diferentes padrões de heterocromatina nos
cromossomos sexuais das espécies de Leporinus (Nakayama et al., 1994; Molina et
al., 1998; Molina e Galetti, 2006), sugerindo que modificações espécie-específicas
tenham ocorrido neste grupo, dando origem à diversificação.
94
Um estudo envolvendo a produção de sondas de DNA sexo-específicas foi
realizado anteriormente por Nakayama et al. (1994) na espécie L. elongatus. Neste
estudo, os autores isolaram duas seqüências relacionadas aos cromossomos
sexuais desta espécie: L’5 que hibridizou com ambos os cromossomos Z e W e L’46
que marcou parte de uma região cromossômica específica do W. Estas seqüências
aparentemente não apresentaram nenhuma significância biológica, desde que não
são parte de seqüências codificantes e também não mostraram clara similaridade
com qualquer seqüência conhecida e nem com o elemento LeSpeI (Nakayama et al.,
1994; Parise-Maltempi et al., 2007). No entanto, estas seqüências podem
representar uma acumulação no genoma que, direta ou indiretamente favoreceram a
diferenciação dos cromossomos sexuais, como visto no presente estudo para as
espécies L. elongatus e L. macrocephalus.
Segundo Porto-Foresti et al. (2006), até recentemente os estudos cariotípicos
nos peixes eram considerados principalmente como uma ferramenta para estudos
básicos e evolutivos e pouco utilizados no manejo e monitoramento de estoques.
Contudo, o emprego de marcadores citogenéticos tem sido considerado muito eficaz
e acessível na identificação de híbridos, tendo como principal objetivo a
caracterização e diferenciação das espécies parentais e das linhagens de híbridos
interespecíficos artificiais (Toledo-Filho et al., 1994; Ocalewicz et al., 2006). Segundo
os autores, além de serem considerados de baixo custo, os métodos citogenéticos
constituem uma maneira bastante precisa de se verificar tanto os níveis de ploidia
como a procedência dos complementos cromossômicos dos parentais nos produtos
resultantes da hibridação interespecífica em peixes.
Entre as espécies de peixes Neotropicais, estudos citogenéticos visando a
caracterização de híbridos foram realizados com as espécies Piaractus
mesopotamicus x Colossoma macropomum e Leporinus macrocephalus x Leporinus
95
elongatus (Almeida-Toledo et al., 1987; Hashimoto et al., Capítulo 1). Para estas
espécies, híbridos e parentais apresentaram números diplóides iguais, com cariótipo
similar em número e morfologia, não sendo possível diferenciá-los com o uso das
técnicas citogenéticas usuais. Nestes casos, bandamentos cromossômicos
específicos e técnicas de coloração diferenciadas foram também utilizados na
tentativa de encontrar marcadores diferenciais.
No estudo de Hashimoto et al. (Capítulo 1), como os cariótipos de híbridos
“Piaupara” e os respectivos parentais se demonstraram indistinguíveis após
coloração com Giemsa, a aplicação da técnica de banda C e a coloração por nitrato
de Prata revelaram ser muito eficientes como diagnósticos na correta identificação
das espécies parentais e do híbrido. Assim, o estudo envolvendo a identificação
destes híbridos demonstrou a necessidade de se obter vários marcadores como
forma de enriquecer a análise. Neste sentido, a aplicação da técnica de FISH com
sonda sexo-específica também evidenciou marcações diagnósticas em
cromossomos de L. elongatus que diferiram de L. macrocephalus, principalmente
por regiões dos cromossomos portadores da NOR de L. elongatus que se
apresentaram diferenciadas pela sonda, determinando um padrão espécie e sexo-
específico na diferenciação destas espécies.
Consequentemente, a aplicação desta metodologia possibilitou encontrar um
claro modelo sexo-específico na identificação do híbrido “Piaupara”, comprovando
que este método fornece um bom marcador citogenético para diferenciação de
parentais e híbridos. Evidenciado pelas características herdadas de apenas um
conjunto cromossômico de cada parental, considera-se que o cromossomo
marcador na identificação do híbrido é o cromossomo portador da NOR de L.
elongatus, cujo diagnóstico decorre da presença de marcações em um único
representante do par cromossômico.
96
Segundo Parise-Maltempi et al. (2007), as diferentes marcações envolvendo
os cromossomos da NOR em L. elongatus revelaram um novo sistema sexual para a
espécie. De acordo com os autores, avaliando a presença de dois cromossomos
exclusivos em fêmeas de L. elongatus, considera-se que estes deveriam ser
identificados como W
1
e W
2
, em que o cromossomo W representa o W
1
e o
cromossomo da NOR, que apresenta um bloco intersticial marcado pela presença do
elemento LeSpeI, corresponderia ao W
2
. Diante disso, foi proposto que o sistema
cromossômico sexual simples ZW primeiramente descrito por Galetti et al. (1981a)
seria preferencialmente um sistema múltiplo do tipo Z
1
Z
1
Z
2
Z
2
:Z
1
W
1
Z
2
W
2
, em que o
par portador da NOR, equivalente ao par 2 do cariótipo, estaria representando os
componentes Z
2
W
2
.
Como observado no presente estudo, o DNA repetitivo LeSpeI localizado no
braço longo do cromossomo W e em algumas regiões do par portador da NOR de L.
elongatus compartilham de uma natureza comum. De acordo com Parise-Maltempi
et al. (2007), este padrão repetitivo disperso no genoma do segmento LeSpeI sugere
que esta seqüência poderia pertencer à classe de elementos transponíveis
dispersos (TE) (Oliveira et al., 1999; Bodvarsdottir e Anamthawat-Jonsson, 2003;
Ziegler et al., 2003). Porém, apesar do processo de hibridização Southern blot
usando LeSpeI gerar bandas entre 450 e 3.000 pb, como observado para maioria
dos TE (Tafalla et al., 2006), não foi possível identificar características de TE nos
fragmentos isolados de LeSpeI (Parise-Maltempi et al., 2007). Desta forma, não se
pode descartar a hipótese de que durante a evolução destes cromossomos possam
ter ocorrido rearranjos estruturais, tais como translocação e duplicações, que
possibilitariam explicar este grau de homologia entre o cromossomo W e o par
portador da NOR encontrado em L. elongatus. Esta situação pode ser reforçada
devido aos indícios da presença de NOR no cromossomo W de L. elongatus,
97
aumentando a similaridade entre estes cromossomos, como descrito por Molina e
Galetti (2006), quando a identificação da Ag-NOR é realizada em preparações
cromossômicas previamente submetidas à substância 5-BrdU.
Já em L. macrocephalus, verifica-se que não existe dispersão de
heterocromatina no cromossomo portador da NOR, demonstrando que os elementos
transponíveis repetitivos não se dispersaram no genoma desta espécie ou que
rearranjos cromossômicos envolvendo estas regiões não teriam ocorrido. Também
deve ser considerada a hipótese da ocorrência de alguma destas situações seguida
da perda posterior desta heterocromatina durante a história evolutiva da espécie.
Considera-se que os dados apresentados contribuem com subsídios para um
melhor monitoramento da hibridação interespecífica envolvendo estas espécies e
outros projetos de hibridação a serem desenvolvidos em pisciculturas brasileiras. De
outro lado, as informações geradas podem contribuir para a melhor compreensão
dos sistemas cromossômicos sexuais no gênero Leporinus, adicionando dados
sobre a origem e estabelecimento deste novo sistema sexual.
98
C
C
A
A
P
P
Í
Í
T
T
U
U
L
L
O
O
3
3
Dominância nucleolar em híbridos dos peixes Neotropicais Leporinus
macrocephalus e Leporinus elongatus (Characiformes, Anostomidae)
99
RESUMO
Dominância nucleolar é considerada um fenômeno epigenético comum em híbridos
interespecíficos, em que conjuntos de genes RNA ribossômicos herdados de um parental
são preferencialmente transcritos em relação ao outro. No presente trabalho, é descrito a
ocorrência de dominância nucleolar em peixes da linhagem híbrida “Piaupara”, resultante do
cruzamento entre fêmea de Leporinus macrocephalus (Piauçu) e macho de L. elongatus
(Piapara). As análises demonstraram que, no híbrido, a região nucleolar do cromossomo
herdado de L. elongatus apresentou maior atividade, com expressão gênica em 100% das
células, enquanto que a de L. macrocephalus apareceu ativa numa freqüência de 11,6%. A
aplicação da técnica de hibridização in situ com sonda 18S mostrou que o DNA ribossômico
da formação nucleolar não foi perdido no híbrido, pois os resultados demonstraram
invariavelmente marcações em dois cromossomos, cada um proveniente de um dos
parentais. Estes dados confirmam que nas células coradas pela Prata onde apenas uma
NOR estava ativa, ocorreu o efeito de dominância nucleolar, apesar desta ser uma
dominância parcial. Um aspecto interessante em relação à diferença entre a região
organizadora nucleolar das espécies parentais foi a associação da NOR com blocos
heterocromáticos, evidenciada em L. elongatus. Do ponto de vista citogenético, sugere-se
que a presença de DNA repetitivo associada à NOR em L. elongatus possa se constituir
num elemento determinante no estabelecimento do processo de dominância nucleolar. Esse
é o primeiro relato de dominância nucleolar em peixes Neotropicais e o híbrido “Piaupara”
demonstrou ser um modelo de estudo interessante e promissor em análises enfocando o
melhor entendimento deste fenômeno nesses peixes.
Palavras-chave: dominância nucleolar; híbridos interespecíficos; citogenética de peixes
100
INTRODUÇÃO
Duas classes distintas de genes que codificam RNA ribossômico (RNAr)
podem ser encontradas nos animais, sendo a classe maior do DNA ribossomal
(DNAr) 45S composta pelos genes 18S, 5.8S e 28S e a classe menor de DNAr 5S
(Long e Dawid, 1980). As regiões organizadoras de nucléolo (NORs) são loci
genéticos em eucariontes em que os genes que codificam o precursor dos três
maiores segmentos de RNAr estão agrupados em centenas ou milhares de cópias,
coletivamente abrangendo milhões de pares de bases ao longo do cromossomo
(Ritossa e Spiegelman, 1965; Wallace e Birnstiel, 1966; Phillips et al., 1971). A
transcrição dos genes RNAr pela RNA polimerase I resulta na formação do nucléolo,
a região nuclear onde ocorre a biogênese dos ribossomos (Karpen et al., 1988).
Dominância nucleolar é considerada um fenômeno epigenético observado em
células de híbridos interespecíficos, em que a NOR proveniente de uma espécie
parental é dominante em relação à outra, ou seja, enquanto a NOR de um parental é
ativa a outra é silenciada. Este fenômeno foi descrito primeiramente em híbridos de
plantas do gênero Crepis por Navashin em 1934, e atualmente muitos estudos estão
sendo realizados no intuito de desvendar os mecanismos pelo qual a dominância se
estabelece (Pikaard, 2000a, b; McStay, 2006).
Como em outros fenômenos epigenéticos, modificações na cromatina forçam
o silenciamento dos genes RNAr de um dos parentais na dominância nucleolar. No
entanto, os mecanismos que discriminam qual conjunto RNAr parental é o
dominante ou o silenciado ainda não estão claros (Pikaard, 2000a). Em geral,
dominância nucleolar parece ser uma conseqüência da divergência evolutiva dos
genes RNAr e/ou seus mecanismos de regulação da transcrição (Wallace e
Langridge, 1971; Reeder, 1985).
101
Um mecanismo considerado muito importante na dominância nucleolar se
baseia no modelo de “enhancer imbalance” (desequilíbrio de reforços),
primeiramente estudado entre híbridos do anfíbio Xenopus laevis e X. borealis
(Reeder e Roan, 1984; Reeder, 1985; Caudy e Pikaard, 2002). Este modelo se
baseia no fato de que um maior número de elementos repetitivos (enhancer) e
diferenças na seqüência dos espaçadores intergênicos do DNAr 45S de uma
espécie, poderia retirar fatores essenciais da transcrição, de forma a deixar os genes
RNAr da outra espécie inativos por impedir de acessá-los.
O fenômeno de dominância nucleolar tem sido bem caracterizado em
numerosos híbridos interespecíficos de plantas (Martini et al., 1982; Flavell et al.,
1988; Chen e Pikaard, 1997; Chen et al., 1998; Lewis e Pikaard, 2001) e do mesmo
modo, estudos também têm se mostrado importante em alguns animais como em
híbridos de Drosophila (Durica e Krider, 1978; Oliveira et al., 2006b; Commar et al.,
2007) e anfíbios Xenopus (Honjo e Reeder, 1973; Reeder e Roan, 1984; Caudy e
Pikaard, 2002), enquanto em peixes são restritos a poucos dados apenas descritivos
(Ueda et al., 1988; Ueda e Kobayashi, 1990, Gold et al., 1991).
Um novo relato deste fenômeno em peixes foi descrito por Hashimoto et al.
(Capítulo 1) em híbridos interespecíficos da família Anostomidae, no entanto o
principal objetivo do trabalho foi buscar marcadores citogenéticos diagnósticos que
diferenciassem parentais e híbridos. Nestas análises, o estudo de marcação da NOR
pelo nitrato de Prata demonstrou variações na expressão destas regiões no híbrido,
com uma maior atividade da NOR herdada de um dos parentais, caracterizando uma
descrição prévia sobre a ocorrência do processo de dominância nucleolar.
Deste modo, para um melhor entendimento sobre este efeito nucleolar nestes
peixes, o objetivo deste estudo foi analisar citogeneticamente o fenômeno de
102
dominância nucleolar em híbridos interespecíficos artificiais, resultantes do
cruzamento entre fêmeas de Leporinus macrocephalus e machos de L. elongatus.
MATERIAIS E MÉTODOS
Na linhagem parental, 19 exemplares de Leporinus macrocephalus (14
machos e 5 fêmeas) e 20 indivíduos de Leporinus elongatus (12 machos e 8
fêmeas) foram analisados citogeneticamente. Cruzamentos artificiais realizados
entre estas espécies resultaram na produção do híbrido interespecífico “Piaupara”, a
linhagem entre fêmeas de L. macrocephalus e machos de L. elongatus, cujas
análises citogenéticas compreenderam 21 exemplares (8 machos e 13 fêmeas).
Todas as amostras estudadas foram obtidas do estoque pertencente à Piscicultura
Kabeya, Penápolis (SP), Brasil, que também é o local onde os híbridos foram
produzidos artificialmente. Os estoques parentais de L. elongatus e L.
macrocephalus cultivados nesta piscicultura, foram derivados de amostras de peixes
coletados no pantanal Sul Mato-grossense. Os peixes analisados foram identificados
e depositados na coleção de peixes do Laboratório de Genética de Peixes, UNESP,
Bauru (SP), Brasil.
Para os estudos citogenéticos, os exemplares foram previamente submetidos à
técnica de estimulação mitótica (Oliveira et al., 1988). Em seguida, preparações
cromossômicas foram obtidas de fragmentos de tecidos de rins e brânquias, utilizando
o método descrito por Foresti et al. (1981). A coloração por nitrato de Prata das regiões
organizadoras de nucléolo foi realizada de acordo com Howell e Black (1980) e
análises de heterocromatina constitutiva foram realizadas com base na técnica de
bandamento C (Sumner, 1972). Para realização da técnica de hibridização
fluorescente in situ foram utilizadas a sonda sexo-específica (LeSpeI) isolada de
103
Leporinus elongatus, preparada e cedida pela Dra. Patricia Pasquali Parise
Maltempi, e a sonda de DNA ribossômico 18S obtida de Oreochromis niloticus,
preparada e cedida pelo Dr. Cláudio de Oliveira. As sondas foram marcadas por
meio da incorporação da biotina-dATP pela técnica de nick translation (Bionick
TM
Labelling System-Gibco.BRL). Após as marcações, procedeu-se a técnica de
hibridização utilizada por Porto-Foresti et al. (2002) e as lâminas foram contra-
coradas com DAPI.
A morfologia cromossômica foi determinada de conformidade com o proposto
por Levan et al. (1964), com os cromossomos sendo classificados em metacêntrico
(M), submetacêntrico (SM), subtelocêntrico (ST) e acrocêntrico (A).
RESULTADOS
Os resultados da análise citogenética nas espécies parentais e no híbrido
mostraram identidade no número diplóide de 54 cromossomos e na morfologia
cromossômica dos tipos meta e submetacêntricos, além da ocorrência de
heteromorfismo cromossômico sexual do tipo ZZ/ZW. A identificação das NORs por
meio da coloração com Prata revelou nas espécies Leporinus macrocephalus e L.
elongatus apenas um par de cromossomos portadores de cístrons ribossômicos. A
NOR localizou-se na posição terminal de um par cromossômico submetacêntrico em
ambas as espécies (Figura 1), no entanto, os pares cromossômicos de uma espécie
em relação à outra apresentaram diferenças de tamanhos e/ou formas.
104
Figura 1 - Metáfases das espécies parentais L. macrocephalus (a) e L. elongatus (b) submetidas à
coloração de Prata. Setas indicam os pares portadores da NOR.
A aplicação do bandamento C em preparações cromossômicas das espécies
parentais possibilitou observar no cromossomo da NOR de L. elongatus a presença
de blocos heterocromáticos associados com a região da constrição secundária
(NOR), diferentemente de L. macrocephalus em que não foi observada esta situação
(Figura 2). Desta forma, em exemplares de L. elongatus, utilizou-se a técnica de
hibridização in situ com a sonda de DNA repetitivo LeSpeI, demonstrando que estes
blocos heterocromáticos associados com a NOR também apresentaram homologia
com a sonda LeSpeI, pois foram hibridizados pela mesma (Figura 3). Além disso,
observaram-se várias outras marcações distribuídas nos cromossomos da NOR e no
cromossomo W. As fêmeas tiveram o cromossomo W hibridizado em alguns loci,
além de regiões do par cromossômico portador da NOR, porém com diferentes
marcações entre os homólogos; em contrapartida, os machos também
demonstraram marcações nos cromossomos da NOR, que se apresentaram
semelhantes em ambos os cromossomos homólogos.
a
b
105
Figura 2 - Cromossomos portadores da NOR de L. macrocephalus (
1
) e L. elongatus (
2
). (a)
representação esquemática, (b) coloração com nitrato de Prata, (c) bandamento C, com
heterocromatina associada à constrição secundária apenas em L. elongatus e (d) FISH
demonstrando homologia da sonda de DNA repetitivo LeSpeI com a heterocromatina.
Figura 3 - Metáfases de macho (a) e fêmea (b) de L. elongatus, submetidas à técnica de FISH com a
sonda LeSpeI. Estrela mostra as marcações no cromossomo W e as setas indicam os cromossomos
portadores da NOR marcados pela sonda, com a heterocromatina associada à constrição secundária
(NOR) também exibindo marcações.
Em metáfases do híbrido “Piaupara”, as regiões nucleolares herdadas de cada
parental revelaram diferenças de atividade gênica pela técnica de nitrato de Prata. De
um total de 1.710 células analisadas, 88,4% (1.512 metáfases) apresentaram NOR
ativa em apenas um cromossomo, identificado como proveniente de L. elongatus,
a
b
a
2
b
2
c
2
a
1
b
1
c
1
d
2
106
enquanto que somente 11,6% (198 metáfases) revelaram atividade da NOR em
dois cromossomos, que não são homólogos, tendo em vista as diferenças em
relação às suas morfologias, sendo um herdado de L. elongatus e o outro de L.
macrocephalus (Figura 4). Nos híbridos, as diferenças de atividade da NOR se
apresentaram similares entre indivíduos machos e fêmeas.
Figura 4 - Metáfases do híbrido “Piaupara” corado com nitrato de Prata. Em (a),
marcação apenas no
cromossomo proveniente de L. elongatus, e em (b), dois cromossomos marcados (um de cada parental).
Setas escuras indicam o cromossomo da NOR de L. elongatus e seta clara de L. macrocephalus.
Utilizando o método de FISH com sonda de DNAr 18S, as análises em
preparações cromossômicas do híbrido “Piaupara” mostraram marcações presentes
na região telomérica do braço longo de dois cromossomos submetacêntricos, que se
apresentaram diferentes em relação às suas morfologias, indicando não serem
homólogos e correspondendo aos cromossomos portadores da NOR das espécies
parentais (Figura 5).
a
b
107
Figura 5 - Metáfases do híbrido interespecífico “Piaupara”, submetidas à técnica de FISH com sonda de
DNAr 18S. Marcações de DNAr 18S estão indicadas por setas brancas no cromossomo de L. elongatus
e setas azuis de L. macrocephalus.
DISCUSSÃO
No presente estudo, as características citogenéticas de Leporinus
macrocephalus e L. elongatus obtidas com dados de número diplóide, número
fundamental, cromossomos sexuais, padrões de bandamento C e NOR estão de
acordo com os resultados recentemente discutidos por Hashimoto et al. (Capítulos 1
e 2). Com relação às regiões nucleolares, o par cromossômico portador da NOR de
L. macrocephalus apresentou diferente tamanho e/ou morfologia em relação ao de
L. elongatus, demonstrou ser um fato fundamental para as análises de dominância
nucleolar na linhagem híbrida “Piaupara”. Diferentemente, em estudos de híbridos
de ciprinídeos (Gold et al., 1991), apenas a morfologia dos cromossomos não foi o
suficiente para distinguir o cromossomo parental portador da NOR que o
apresentava ativo no híbrido, sendo necessário utilizar o bandamento G para tal
diferenciação.
108
Sabe-se que as NORs representam regiões dos cromossomos envolvidas na
transcrição dos genes ribossômicos e, de acordo com sua atividade na intérfase que
precede à mitose, podem ser visualizadas após coloração com nitrato de Prata
(Goodpasture e Bloom, 1975; Miller et al., 1976; Howell e Black, 1980). A coloração
pelo nitrato de Prata detecta NORs ativas, uma vez que o material corado não é o
DNAr mas sim um conjunto de proteínas ácidas envolvidas no processo de produção
dos ribossomos (Howell, 1977; Jordan, 1987), tornando o uso desta coloração uma
excelente ferramenta que permite o estudo de atividade dos genes ribossômicos
através da citogenética.
Em referência a estes aspectos, as variações encontradas pela coloração de
Prata em metáfases do híbrido “Piaupara” são devidas a diferenças de atividade da
NOR herdada de cada parental, em que a maior porcentagem das células
analisadas teve a região nucleolar ativa apenas no cromossomo proveniente de
Leporinus elongatus. Tais variações são decorrentes do fenômeno epigenético de
dominância nucleolar.
No intuito de verificar a integridade do DNA ribossômico na formação nucleolar e
que possuíam dois sítios de NORs potencialmente ativos em todas as células dos
indivíduos híbridos, aplicou-se a técnica de hibridização in situ com sonda 18S, que
revela o segmento genômico constituinte da NOR independente de sua atividade,
como documentado por outros estudos (Galetti et al., 1995b; Fujiwara et al., 1998;
Ferro et al., 2001; Nirchio et al., 2007). Os resultados demonstrando invariavelmente
marcações em dois cromossomos, cada um proveniente de um parental, confirmam a
ocorrência do efeito de dominância nucleolar nas células coradas pela Prata em que
apenas uma NOR estava ativa. Este fenômeno também pode ser descrito como uma
dominância parcial, como também relatado por outros autores (Honjo e Reeder, 1973;
Gold et al., 1991; Oliveira et al., 2006b).
109
Assim, considerando que todas as células apresentavam os genes
ribossômicos responsáveis pela formação nucleolar de ambos parentais, pode-se
observar citogeneticamente que no híbrido a região nucleolar do cromossomo
herdado de L. elongatus apresentou maior atividade, com expressão gênica em
100% das células, enquanto que a de L. macrocephalus apareceu ativa somente
numa freqüência de 11,6%. Tais dados indicam que a NOR proveniente de
Leporinus elongatus mostrou ser dominante em relação à de L. macrocephalus,
estando ativa na maioria das células. Neste caso, enquanto a NOR de um parental é
ativa a outra é silenciada.
Do ponto de vista citogenético, em relação aos mecanismos pela qual esta
dominância é definida, um dado interessante a ser discutido é a presença de blocos
heterocromáticos associados com o DNA ribossômico em L. elongatus. Esta
situação parece identificar a ocorrência do modelo de “enhancer imbalance”,
primeiramente descrita em híbridos de anfíbios Xenopus (Reeder e Roan, 1984;
Caudy e Pikaard, 2002) e encontrada em situações similares em outros organismos
(Simeone et al., 1985; Reeder, 1985; Goodrich-Young e Krider, 1989). Isto porque a
heterocromatina geralmente é composta por DNA altamente repetitivo (Haaf et al.,
1993; Reed e Phillips, 1995; Garrido-Ramos et al., 1998; Mestriner et al., 2000;
Phillips e Reed, 2000; Mantovani et al., 2004), e como proposto no modelo acima, a
presença de DNA repetitivo na região dos espaçadores intergênicos do DNAr 45S
de L. elongatus pode servir como enhancers, que influenciam os promotores para a
transcrição dos genes ribossômicos (Reeder e Roan, 1984; Labhart e Reeder, 1985;
Simeone et al., 1985; Pikaard et al., 1990; Caudy e Pikaard, 2002), de forma a
interferir no acesso dos fatores de transcrição aos genes RNAr em Leporinus
macrocephalus.
110
Recentemente, em estudos realizados por Parise-Maltempi et al. (2007), uma
nova família de DNA altamente repetitivo nos cromossomos sexuais foram
identificadas e isoladas de L. elongatus. Quando este DNA repetitivo é utilizado
como sonda para ser aplicado pela técnica de FISH em metáfases de L. elongatus,
os resultados demonstraram homologia com as regiões heterocromáticas
associadas à NOR, além das marcações nos cromossomos sexuais descritas
anteriormente por Parise-Maltempi et al. (2007) e Hashimoto et al. (Capítulo 2). A
partir da constatação desta similaridade, estudos por meio de técnicas moleculares
tornam-se promissoras, principalmente no sentido de se identificar a relação,
localização e organização estrutural destas seqüências associadas às regiões
organizadoras de nucléolo em L. elongatus, visto que em L. macrocephalus esta
situação não foi observada (Hashimoto et al., Capítulo 2).
Outro fato a ser investigado refere-se aos indícios da presença de DNAr no
cromossomo sexual W de L. elongatus, como descrito por Molina e Galetti (2006),
quando a identificação da Ag-NOR é realizado em preparações cromossômicas
previamente submetidas à substância 5-BrdU. Isto porque em espécies de
Drosophila do complexo mulleri, a NOR é encontrada tanto em um
microcromossomo quanto no cromossomo sexual X, possibilitando que diferentes
situações de dominância nucleolar, provavelmente influenciadas pela presença ou
ausência do cromossomo X, sejam observadas entre machos e fêmeas envolvendo
híbridos de algumas destas espécies (Bicudo e Richardson, 1977; Durica e Krider,
1977 e 1978; Commar et al., 2007). Entretanto, em nossos dados não foram
observadas diferenças significativas entre machos e fêmeas de “Piaupara”, mesmo
porque o cromossomo W na fêmea do híbrido é herdado de L. macrocephalus.
Assim, para melhor elucidar estas situações seria necessário tanto verificar se L.
macrocephalus também apresenta NOR no cromossomo W, quanto realizar análises
111
no híbrido recíproco “Piapaçu”, que poderá indicar se a NOR do cromossomo W de
L. elongatus pode exercer alguma influência de dominância na manifestação da
ação gênica destes segmentos.
Dominância nucleolar também pode ser uma conseqüência de um processo
regulatório que controla a dosagem efetiva de genes RNAr até mesmo em espécies
puras (não-híbridas) (Pikaard, 2000a). As regiões nucleolares podem ser
consideradas loci bastante ativos, calculado por volta de 40-80% de transcrição
nuclear em células em crescimento (Jacob, 1995). Assim, um sistema de
compensação de dosagem poderia explicar a dominância nucleolar parcial relatada
no híbrido “Piaupara”. Isto porque a pequena taxa de atividade dos genes
ribossômicos de L. macrocephalus possivelmente seja devida a um mecanismo
secundário de compensação de dosagem para suprir as necessidades celulares dos
ribossomos na síntese de proteínas.
Uma característica recorrente da dominância nucleolar, tanto em plantas
como em animais, é que a NOR da mesma espécie é sempre silenciada
independente dos efeitos maternais ou paternais. Essa descoberta sugere que
diferenças fundamentais ditam os conjuntos de genes RNAr dominante e reprimido
em um híbrido, possivelmente por causa de diferenças espécie-específica nos
sistemas de transcrição dos progenitores (Reeder, 1985; Pikaard, 2000a).
Alguns estudos anteriores demonstraram que o efeito maternal pode
influenciar na dominância nucleolar, como é o caso de híbridos de peixes
ciprinídeos, em que a dominância sempre é do cromossomo herdado do parental
materno, indicando que possivelmente algum tipo de efeito citoplasmático ou
materno está relacionado com a atividade da transcrição de genes RNAr (Gold et al.,
1991). No caso do híbrido “Piaupara”, o cromossomo dominante é o herdado de L.
elongatus, que é o parental paterno, demonstrando que nesta dominância não há
112
influência de algum fator citoplasmático ou materno, e que provavelmente a
dominância deve-se a diferenças do conjunto de genes RNAr entre as espécies
parentais.
Até hoje, a escolha dos mecanismos pela qual todo segmento genômico da
NOR ou subconjuntos de genes RNAr são silenciados por inativação, ainda
permanecem uma questão intrigante (Preuss e Pikaard, 2007). Estudos moleculares
recentes evidenciam que o silenciamento gênico na dominância nucleolar é
freqüentemente resultado de efeitos combinados do remodelamento da cromatina,
metilação do DNA e modificações de histona específicas (Chen e Pikaard, 1997;
Chen et al., 1998; Richards e Elgin, 2002; Grummt e Pikaard, 2003).
A ocorrência do processo de dominância nucleolar em híbridos de peixes
Neotropicais fornece um excelente material de estudo para o uso de metodologias
moleculares mais específicas, apresentando-se como um modelo promissor de
estudos enfocando o melhor entendimento e funcionamento deste mecanismo. Os
resultados deste trabalho, além de serem os primeiros relatos desse mecanismo em
peixes Neotropicais, servem como subsídios para a avaliação deste mecanismo
epigenético em outros híbridos envolvendo diferentes espécies de peixes, bem como
podem adicionar informações relacionadas ao intenso polimorfismo da NOR em
peixes Neotropicais, relatado em diversos trabalhos citogenéticos (Foresti et al.,
1981; Almeida-Toledo et al., 2000b).
113
C
C
A
A
P
P
Í
Í
T
T
U
U
L
L
O
O
4
4
Marcadores moleculares de PCR-RFLP e PCR Multiplex para rápida
identificação de híbridos dos peixes Neotropicais Leporinus
macrocephalus e Leporinus elongatus (Characiformes, Anostomidae)
114
RESUMO
Híbridos interespecíficos de peixes podem representar sérios riscos biológicos ao meio
ambiente. Logo, o monitoramento genético de organismos produzidos pela hibridação
interespecífica visa a aplicação de metodologias capazes de fornecer, de maneira clara e
acessível, a identificação genética de indivíduos híbridos e os respectivos parentais
envolvidos no processo. No presente trabalho, técnicas moleculares foram estabelecidas
para identificar a linhagem híbrida “Piaupara” e diferenciá-las de seus parentais, fêmea de
Leporinus macrocephalus (Piauçu) e macho de L. elongatus (Piapara). Através de reações
PCR Multiplex e PCR-RFLP, análises envolvendo o DNA mitocondrial 16S e o gene nuclear
α-tropomiosina demonstraram diferentes perfis eletroforéticos entre L. macrocephalus e L.
elongatus. Porém, somente o gene nuclear possibilitou a clara distinção entre parentais e o
híbrido, pois este revelou um padrão heterozigótico com as bandas diagnósticas herdadas
de ambas as espécies. Já para o gene mitocondrial, o híbrido apresentou o mesmo padrão
observado em L. macrocephalus, o que mascara sua identificação. No entanto, como o DNA
mitocondrial em animais apresenta característica peculiar de herança maternal, as análises
confirmaram que L. macrocephalus é o parental materno. As metodologias utilizadas
mostraram que o uso em conjunto dos marcadores de gene mitocondrial e nuclear são
excelentes ferramentas de baixo custo e rápida execução tanto na identificação de híbridos,
quanto na distinção entre híbridos recíprocos. A simplicidade e rapidez destas técnicas
poderão facilitar a implementação rotineira do monitoramento e fiscalização da produção de
híbridos nas pisciculturas, e por fim, delinear planos de conservação biológica para o
manejo adequado dos estoques naturais e cultivados de peixes.
Palavras-chave: híbridos interespecíficos; marcadores moleculares
115
INTRODUÇÃO
Programas de hibridação em piscicultura têm sido utilizado envolvendo
inúmeras espécies de peixes com a finalidade de produzir animais estéreis ou que
apresentem melhor desempenho que as espécies parentais (vigor híbrido). As
características zootécnicas buscadas geralmente envolvem o aumento da taxa de
crescimento, melhor qualidade da carne, resistência a doenças e capacidade de
tolerar variações ambientais, além do melhoramento de diversas outras
características a fim produzir peixes mais proveitosos para o cultivo (Bartley et al.,
2001).
Os resultados obtidos com o uso de técnicas de hibridação interespecífica em
peixes necessitam ser cuidadosamente interpretados frente aos potenciais riscos
biológicos que os indivíduos híbridos podem representar ao meio ambiente. Se
férteis, podem contaminar geneticamente estoques parentais cultivados ou naturais
(Ryman e Utter, 1987). Caso contrário, em habitats naturais, podem competir de
diferentes maneiras com as linhagens parentais (Toledo-Filho et al., 1994).
Conseqüentemente, a caracterização e monitoramento genético de híbridos
produzidos nas pisciculturas são práticas de grande importância e devem
necessariamente acompanhar os programas de hibridação.
Atualmente, uma ampla variedade de marcadores tem sido desenvolvida para
diferentes espécies utilizadas em programas na aqüicultura (Liu e Cordes, 2004). O
interesse na caracterização de híbridos em pisciculturas e também estudos
envolvendo hibridações naturais tem disponibilizado uma gama considerável de
marcadores moleculares na literatura. Entre os mais utilizados estão marcadores do
tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Elo et al., 1997; Liu et al., 1999),
Microssatélites (Hänfling et al., 2005), SPAR (Single Primer Amplification Reaction)
116
(Fonteles et al., 2005), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
(Calcagnotto, 1998; Perez et al., 1999) e AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism) (Congiu et al., 2001; Young et al., 2001).
Os métodos de PCR-RFLP e PCR Multiplex com primers espécie-específicos,
considerados de rápida execução, baixo custo e complexidade, praticamente ainda
não foram utilizados na caracterização de híbridos e em geral, na aqüicultura. Estas
técnicas se apresentam isoladamente como importantes ferramentas na
diferenciação e identificação de espécies, com vários estudos relacionados à
conservação biológica e a identificação forense de espécies de peixes (Cocolin et
al., 2000; Wolf et al., 2000; Chapman et al., 2003; Trotta et al., 2005; Hsieh et al.,
2005 e 2007; Magnussen et al., 2007).
Atualmente, cruzamentos interespecíficos para produção de linhagem híbrida
envolvendo as espécies Piauçu (Leporinus macrocephalus) e Piapara (Leporinus
elongatus) estão sendo realizados em pisciculturas brasileiras sem qualquer
monitoramento. As espécies parentais pertencem ao mais representativo gênero da
família Anostomidae, um importante grupo de peixes de água doce distribuído na
região Neotropical (Géry, 1977; Garavello e Britski, 2003),
além de muitas espécies
constituírem importantes recursos pesqueiros com grande valor econômico, tais
como L. macrocephalus, L. elongatus e L. obtusidens.
Como a produção de híbridos interespecíficos é uma prática comum nas
pisciculturas atuais e conhecendo-se os reais riscos que podem representar, o
objetivo do presente trabalho foi diferenciar as espécies parentais e uma linhagem
de híbridos artificiais através da aplicação conjunta das técnicas de PCR-RFLP e
PCR Multiplex, fornecendo suporte para outros projetos de hibridação e tornando o
monitoramento genético de híbridos um processo acessível e rotineiro.
117
MATERIAIS E MÉTODOS
Na linhagem parental, 49 exemplares de Leporinus macrocephalus (Piauçu) e
50 indivíduos de Leporinus elongatus (Piapara) foram analisados geneticamente.
Cruzamentos artificiais realizados entre estas espécies resultaram na produção do
híbrido interespecífico “Piaupara”, a linhagem entre fêmeas de L. macrocephalus e
machos de L. elongatus, cujas análises genéticas compreenderam 51 exemplares.
Todas as amostras estudadas foram obtidas do estoque pertencente à Piscicultura
Kabeya, Penápolis (SP), Brasil, que também é o local onde os híbridos foram
produzidos artificialmente. Os estoques parentais de L. elongatus e L.
macrocephalus cultivados nesta piscicultura, foram derivados de amostras de peixes
coletados no pantanal Sul Mato-grossense. Os peixes analisados foram depositados
na coleção de peixes do Laboratório de Genética de Peixes, UNESP, Bauru (SP),
Brasil.
Extração de DNA
A extração de DNA foi baseada no protocolo do kit comercial “Wizard
Genomic DNA Purification Kit – Promega”, com algumas modificações de acordo
com o tecido utilizado (sangue, fragmentos de nadadeira ou fígado). A integridade e
a quantidade de DNA das amostras foram analisadas em gel de agarose 1%. Para
quantificação do DNA utilizou-se comparações diretas com um marcador padrão de
peso molecular e concentração conhecidos (Low DNA Mass Ladder - Invitrogen).
Sequenciamento do gene nuclear e mitocondrial
As condições de aplicação da técnica padrão de PCR bem como a relação dos
conjuntos de primers utilizados para amplificação de parte do gene mitocondrial 16S e
nuclear -tropomiosina estão descritas nas Tabelas 1 e 2. As reações foram realizadas
118
em termociclador Mastercycler personal (Eppendorf), com um volume final de 25 µl
contendo as seguintes concentrações: tampão da Taq polimerase 1X; MgCl
2
1,3 mM;
100 M de cada dNTP; 0,1 M de cada primer universal; 10-50 ng de DNA genômico e
0,5 U de Taq polimerase (Invitrogen). Após a reação de PCR, os produtos foram
purificados e utilizados como molde para as reações de sequenciamento com o kit
DYEnamic Terminator Cycle Sequencing (Amersham Biosciences) utilizando o primer
Forward universal para cada gene e analisados no seqüenciador automático ABI
PRISM
TM
377 DNA Sequencer (Perking-Elmer). Para evitar possíveis polimorfismos
intra-específicos, as seqüências deste estudo foram comparadas com amostras de
outras localidades seqüenciadas por Avelino (2007).
Tabela 1 - Condições da reação de PCR.
Tabela 2 - Primers universais e espécie-específicos utilizados para amplificação de parte do gene
mitocondrial e nuclear. 16S = gene ribossômico 16S; Trop = -tropomiosina; F = Forward; R = Reverse.
Gene Desnaturação 95º C Ciclos Extensão 72º C
16S 5 min 35x 95ºC/30 s, 52ºC/45 s, 72ºC/20 s 7 min
Trop 5 min 35x 95ºC/30 s, 60ºC/45 s, 72ºC/08 s 7 min
Primer
Seqüência dos primers Referência
16S F
16S R
5’- ACGCCTGTTTATCAAAAACAT -3’
5’- CCGGTCTGAACTCAGATCACGT -3’
Kocher et al., 1989;
Calcagnotto et al., 2005
Trop F
Trop R
5’- GAGTTGGATCGGGCTCAGGAGCG -3’
5’- CGGTCAGCCTCTTCAGCAATGTGCTT -3’
Friesen et al., 1999;
Calcagnotto et al., 2005
16S LmF
16S LeF
5’- GCTAAAACCCGATCAACGAAA -3’
5’- ACAACTTAAGCCAACCGTGTT -3’
Presente trabalho
Trop LeF
Trop LmR
Trop LmF
5’- GGTGTGTATTGTATAAAGACTTACACC -3’
5’- ACATGACCTGATACGACACATGCA -3’
5’- TCATAGCATGGAACACGTTGC -3’
Presente trabalho
119
PCR-RFLP
Para encontrar regiões de clivagem espécie-específicos através dos mapas
de restrição, as seqüências de interesse foram submetidas ao programa NEBcutter
V2.0 (Vincze et al., 2003), possibilitando a escolha de enzimas espécie-específicas.
Amplificações de PCR foram submetidas à restrição enzimática numa reação com
volume final de 8 l contendo as seguintes concentrações e condições: 4 l de
produto de PCR; tampão da enzima 1X e 5 U da enzima de interesse (New England
Biolabs Inc). O produto final foi incubado à 37ºC em banho-maria durante 4 h.
PCR Multiplex
As seqüências parciais dos genes foram alinhadas através do programa
ClustalW (Thompson et al., 1994) implementado no programa BIOEDIT (Hall, 1999),
para verificar pontos de mutação em que foram desenhados os primers. As
condições ideais dos primers foram seguidas de acordo com modelos teóricos
descritos na literatura (Rychlik et al., 1990; Burpo, 2001) e analisados através do
programa NetPrimer disponível no site do PREMIER Biosoft International
<http://www.premierbiosoft.com/netprimer>. Para a reação de PCR Multiplex os
primers espécie-específicos utilizados estão descritos na Tabela 2. Já as condições
da reação foram mantidas de acordo com a Tabela 1, enquanto as concentrações
dos reagentes foram alteradas de acordo com (Henegariu et al., 1997; Markoulatos
et al., 2002), visto que alguns loci apresentaram dificuldades de amplificação. Para o
gene mitocondrial 16S as concentrações foram: tampão da Taq 0,6X; MgCl
2
1,3 mM;
200 M de cada dNTP; primer 16S F 0,3 M; primer 16S R 0,2 M; 0,1 M de cada
primer espécie-específico; 10-50 ng de DNA genômico e 0,5 U de Taq polimerase
(Invitrogen). Para o gene nuclear -tropomiosina as concentrações foram: tampão da
Taq 1,2X; MgCl
2
1,3 mM; 100 M de cada dNTP; 0,1 M de cada primer universal e
120
espécie-específico; 10-50 ng de DNA genômico e 0,5 U de Taq polimerase
(Invitrogen).
Os fragmentos de DNA das análises PCR-RFLP e PCR-Multiplex foram
aplicados em um gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio (1 ng/ml),
visualizados em luz ultravioleta e capturados pela câmera digital OLYMPUS
(CAMEDIA - C-5060 5.1 Megapixel).
RESULTADOS
Os resultados do sequenciamento revelaram seqüências parciais do gene
mitocondrial 16S e do gene nuclear -tropomiosina com algumas diferenças de
composição nucleotídica entre as espécies parentais (Figura 1), permitindo análises
de sítios de restrição enzimática e o desenho de primers espécie-específicos.
121
Figura 1 - Alinhamento das seqüências parciais de L. macrocephalus e L. elongatus. Em (a) o gene
mitocondrial 16S e em (b) o gene nuclear -tropomiosina. Pontos (.) indicam igualdade de seqüências e hífens
(-) representam inserção ou deleção. As seqüências sublinhadas são os sítios das enzimas de restrição. As
regiões realçadas são locais dos primers espécie-específicos, com as setas claras de L. macrocephalus e
escuras de L. elongatus, indicando os sentidos forward ( ) e reverse ( ).
Análises comparativas entre as seqüências dos indivíduos deste estudo com
seqüências de indivíduos oriundos de bacias hidrográficas diferentes, apresentadas
por Avelino (2007), denotaram a presença de discretas variações nucleotídicas entre
as populações. Contudo, nos pontos de reconhecimento das enzimas de restrição
selecionadas e nos sítios de ligação dos primers espécie-específicos não foram
encontrados polimorfismos intra-populacionais e entre populações de bacias
hidrográficas distintas. Em Avelino (2007), as amostras de L. elongatus
compreendiam os rios Paraná, Paranapanema, Tietê e Uruguai, pertencentes à
bacia do Prata, além de amostras da bacia do rio São Francisco; já os indivíduos de
L. macrocephalus pertenciam ao rio Taquari, bacia do rio Paraguai.
a
b
122
PCR-RFLP
As regiões seqüenciadas foram submetidas ao programa NEBcutter V2.0
(Vincze et al., 2003), que gerou diferentes mapas de restrição para as espécies
analisadas ilustrados nas Figuras 2 e 3 para os genes 16S e -tropomiosina,
respectivamente. A análise dos mapas de restrição possibilitou verificar várias
enzimas espécies-específicas capaz de serem utilizadas com o objetivo de
diferenciação. No entanto, preferiu-se utilizar a enzima Acc I para o gene
mitocondrial 16S e a enzima Nsi I para o gene nuclear -tropomiosina, ambos com
ação enzimática apenas em L. macrocephalus. Os sítios de clivagem de cada
enzima estão evidenciados na Figura 1.
a
b
Figura 2
-
Mapas de restrição do gene mitocondrial 16S para a espécie L. macrocephalus (
a
) e L.
elongatus (b). Em destaque, a enzima Acc I, com sítio de restrição apenas em L. macrocephalus.
123
Figura 3 - Mapas de restrição do gene nuclear -tropomiosina para a espécie L. macrocephalus (a) e
L. elongatus (b). Em destaque, a enzima Nsi I, com sítio de restrição apenas em L. macrocephalus.
Primeiramente, amplificações do gene mitocondrial 16S com o uso dos
primers universais e uma posterior análise em gel de agarose 1,5%, revelaram
fragmentos de aproximadamente 600 pb, tanto para os exemplares da geração
parental como para os indivíduos híbridos (Figura 4). Em seguida, as amostras de
PCR foram submetidas à clivagem pela enzima Acc I, apresentando diferenças entre
os padrões eletroforéticos das linhagens parentais. A espécie L. elongatus manteve
seu perfil eletroforético contendo uma única banda de quase 600 pb, pois não houve
sítio de clivagem da enzima. Já L. macrocephalus apresentou duas bandas
diagnósticas, uma de aproximadamente 400 pb e outra de cerca de 200 pb, produtos
resultantes da ação da enzima Acc I que clivou o fragmento gênico. A aplicação
c
d
124
desta técnica nas amostras de “Piaupara” revelou o mesmo perfil eletroforético
observado no parental materno L. macrocephalus (Figura 5).
Figura 4 - Gel de agarose 1,5% de PCR do gene 16S de L. macrocephalus (1-3), “Piaupara” (4-6) e
L. elongatus (7-9). L, 1 Kb Plus DNA Ladder.
Figura 5 - Gel de agarose 1,5% de PCR do gene 16S clivado pela enzima Acc I, em L.
macrocephalus (1-3), “Piaupara” (4-6) e L. elongatus (7-9). L, 1 Kb Plus DNA Ladder.
Da mesma forma, amplificações do gene -tropomiosina com os primers
universais revelaram fragmentos de 300 pb para todas as amostras (Figura 6). Em
seguida, as amostras de PCR foram submetidas à clivagem pela enzima Nsi I,
apresentando diferenças entre as linhagens parentais. L. elongatus manteve seu
perfil eletroforético contendo uma única banda de 300 pb, pois não houve sítio de
650
pb
-
200
pb
-
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9
650
pb
-
400
pb
-
200
pb
-
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9
125
clivagem da enzima. Já L. macrocephalus apresentou duas bandas diagnósticas,
com cerca de 190 pb e 110 pb, que são os produtos resultantes da ação da enzima
Nsi I. Diferentemente, no híbrido observou-se um padrão de três marcadores, sendo
dois herdados de L. macrocephalus e um de L. elongatus, o que possibilitou sua
identificação pelo diagnóstico heterozigótico aos parentais (Figura 7).
Figura 6 - Gel de agarose 1,5% de PCR do gene -tropomiosina de L. macrocephalus (1-3),
“Piaupara” (4-6) e L. elongatus (7-9). L, 1 Kb Plus DNA Ladder.
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9
650
pb
-
300
pb
-
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9
300
pb
-
200
pb
-
100
pb
-
Figura
7
-
Gel de agarose 1,5% de PCR do gene -tropomiosina clivado pela enzima Nsi I. L.
macrocephalus (1-3), “Piaupara” (4-6) e L. elongatus (7-9). L, 1 Kb Plus DNA Ladder.
126
PCR Multiplex
Para o gene mitocondrial 16S foram desenhados primers para cada espécie,
ambos em locais distintos no sentido Forward, com o primer 16S LmF (específico
para L. macrocephalus) envolvendo uma região com 7 mutações e o primer 16S LeF
(específico para L. elongatus) englobando 5 mutações (Figura 1a e Tabela 2). Com
base no princípio de que a Taq polimerase não apresenta atividade 3’-5’
exonuclease, cujo mau pareamento entre a extremidade 3’ do primer e o DNA molde
resulta na dificuldade do início da amplificação (Rychlik, 1995), aumentou-se a
especificidade dos primers desenhando-os em sítios bem polimórficos e
principalmente com uma mutação localizada na extremidade 3’, como em outros
trabalhos descritos na literatura (Marshall et al., 2007; Apostolidis et al., 2007).
Estas condições se demonstraram restritas para o gene -tropomiosina, pois
os primers tiveram que ser desenhados aproveitando-se um mesmo sítio polimórfico.
Em L. elongatus foi selecionada uma região no sentido Forward (Trop LeF),
enquanto que para L. macrocephalus escolheu-se uma região no sentido Reverse
(Trop LmR), ambas envolvendo apenas duas mutações. Outra condição testada foi
utilizando o primer L. macrocephalus no sentido Forward (Trop LmF) envolvendo
somente uma mutação (Figura 1b e Tabela 2). Em testes preliminares este último
primer demonstrou uma especificidade menor. Desta forma, preferiu-se utilizar o
primer Trop LmR no presente trabalho.
Assim, análises de amplificações do DNA mitocondrial 16S em reação
Multiplex demonstraram diferentes padrões eletroforéticos entre L. macrocephalus e
L. elongatus (Figuras 8 e 9). Como controle da reação, ambos apresentaram um
fragmento de 600 pb aproximadamente, produto resultante dos primers universais.
Além disso, L. macrocephalus demonstrou um fragmento diagnóstico com cerca de
200 pb, enquanto que L. elongatus apresentou uma banda de 380 pb, ambos
127
resultantes dos primers específicos e considerados marcadores para estas espécies.
No entanto, esta diferença não foi suficiente para a identificação do híbrido, que
demonstrou um perfil eletroforético similar ao de L. macrocephalus (Figura 9).
Figura 8 - Sítios de reconhecimento e orientação dos primers universais (setas fechadas) e primers
espécie-específicos (setas abertas) das regiões amplificadas do gene mitocondrial 16S.
Figura 9 - Gel de agarose 1,5% de PCR Multiplex do DNA mitocondrial 16S. L. macrocephalus (1-3),
“Piaupara” (4-6) e L. elongatus (7-9). L, 1 Kb Plus DNA Ladder.
Da mesma forma, a reação PCR Multiplex do gene -tropomiosina também
gerou distintos perfis eletroforéticos (Figuras 10 e 11). Devido aos primers
universais, as duas espécies tiveram um fragmento de aproximadamente 300 pb.
Por outro lado, L. macrocephalus apresentou um fragmento diagnóstico de cerca de
130 pb, enquanto que L. elongatus uma banda de 220 pb, ambos resultantes dos
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9
650
pb
-
400
pb
-
200
p
b
-
Seqüência parcial do gene 16S
Primer
16S LeF
Primer Universal
16S F
Primer Universal
16S R
Fragmento de L. macrocephalus ~ 200pb
Fragmento de L. elongatus ~ 380 pb
5’
5’
Fragmento universal 16S ~ 600 pb
3’
3’
Primer
16S LmF
Seqüência parcial do gene 16S
Primer
16S LeF
Primer Universal
16S F
Primer Universal
16S R
Fragmento de L. macrocephalus ~ 200pb
Fragmento de L. elongatus ~ 380 pb
5’
5’
Fragmento universal 16S ~ 600 pb
3’
3’
Primer
16S LmF
128
primers específicos (Trop LmR e Trop LeF) e considerados marcadores para estas
espécies. Já no híbrido “Piaupara”, observou-se um padrão heterozigótico em
relação aos parentais com 2 bandas diagnósticas, uma de aproximadamente 130 pb,
herdada da espécie L. macrocephalus e a outra, com cerca de 220 pb, proveniente
de L. elongatus, além do fragmento gerado pelos primers universais (Figura 11).
Figura 10 - Sítios de reconhecimento e orientação dos primers universais (setas fechadas) e
primers espécie-específicos (setas abertas) das regiões amplificadas do gene -tropomiosina.
Seqüência parcial do gene -tropomiosina
Primer
Trop LeF
Primer
Trop LmR
Primer Universal
Trop F
Primer Universal
Trop R
Fragmento de L. macrocephalus ~ 130pb
Fragmento de L. elongatus ~ 220pb
5’
5’
Fragmento universal -tropomiosina ~ 300pb
3’
3’
Seqüência parcial do gene -tropomiosina
Primer
Trop LeF
Primer
Trop LmR
Primer Universal
Trop F
Primer Universal
Trop R
Fragmento de L. macrocephalus ~ 130pb
Fragmento de L. elongatus ~ 220pb
5’
5’
Fragmento universal -tropomiosina ~ 300pb
3’
3’
30
0
pb
-
200
pb
-
100
pb
-
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 11
-
Gel de agarose 1,5% de PCR Multiplex do DNA nuclear -tropomiosina. L.
macrocephalus (1-3), “Piaupara” (4-6) e L. elongatus (7-9). L, 1 Kb Plus DNA Ladder.
129
DISCUSSÃO
Genes mitocondriais são altamente conservados entre os vertebrados,
apresentam modo de herança uniparental, taxa relativa rápida de substituição de
base, falta de recombinação e fácil isolamento (Moritz et al., 1987; Kocher et al.,
1989), e por isso, a maioria das análises filogenéticas e de identificação de espécies
tem se baseada em regiões conservadas do genoma mitocondrial (DNAmt), em
especial o DNA ribossomal 16S (Meyer, 1993; Orrell e Carpenter, 2004; Calcagnotto
et al., 2005; Pardo et al., 2005; Gagnaire et al., 2007). De outro lado, por serem não-
funcionais, os íntrons nucleares acumulam mutações com uma taxa mais rápida do
que fazem as seqüências codificadoras nucleares e desta forma, são usados cada
vez mais em diferenciação de espécies, estudos filogenéticos e populacionais
(Palumbi e Baker, 1994; Friesen et al., 1999; Friesen, 2000; Calcagnotto et al., 2005;
Avelino, 2007).
Em ambos os casos, nossos dados mostraram que as seqüências
nucleotídicas do DNAmt 16S e do gene α-tropomiosina, apesar de serem
consideradas regiões conservadas, são suficientemente divergentes para permitirem
a discriminação de espécies próximas, visto que a ocorrência de algumas mutações
pontuais mostraram resultados significativos para diferenciação de Leporinus
macrocephalus e L. elongatus. Tais variações são resultados de inserções, deleções
ou substituições de bases (transição ou transversão) que permitiram o desenho de
primers e a seleção de enzimas espécie-específicas, revelando que diferenças em
apenas dois nucleotídeos foram suficientemente informativas na aplicação da
metodologia PCR Multiplex, enquanto que para o PCR-RFLP o polimorfismo de um
simples nucleotídeo já foi satisfatório.
130
Especial atenção foi tomada para se evitar que possíveis polimorfismos intra-
específicos interferissem na especificidade das análises e de um futuro
monitoramento envolvendo estes híbridos. Assim, utilizou-se como referência um
recente trabalho de Avelino (2007) sobre relações filogenéticas das espécies de
Leporinus com base em caracteres moleculares, que entre outros incluíam o gene
mitocondrial 16S e o nuclear α-tropomiosina. Neste estudo, foi fundamental o fato de
que as localidades de amostragem compreendiam justamente as regiões em que
estas espécies estão distribuídas, de acordo com uma recente revisão publicada por
Garavello e Britski (2003), que para L. elongatus são as bacias do Prata e São
Francisco, enquanto que para L. macrocephalus é na bacia do rio Paraguai. Quando
estes dados foram comparados com os de nossa análise, não foram verificadas
variações entre os pontos polimórficos espécie-específicos, demonstrando que o
conservadorismo das regiões gênicas analisadas torna o uso destas metodologias
de ampla aplicação.
Marcadores moleculares nucleares e mitocondriais têm fornecido valiosas
informações na detecção de eventos de hibridação e na identificação de híbridos
recíprocos (Scribner e Avise 1993, 1994a, b; Rosenfield et al., 2000). Da mesma
forma, os resultados do presente trabalho demonstraram que apesar de ambos os
marcadores terem sido eficientes na diferenciação das espécies parentais, somente
o gene nuclear possibilitou a clara distinção entre parentais e o híbrido “Piaupara”.
Como os híbridos interespecíficos possuem genoma nuclear de ambos parentais, as
análises PCR Multiplex e PCR-RFLP do gene α-tropomiosina revelaram um padrão
heterozigótico com as bandas diagnósticas herdadas de ambas as espécies
parentais.
Já em relação ao gene mitocondrial, as análises do híbrido “Piaupara”
resultaram no mesmo padrão eletroforético de L. macrocephalus, o que mascara sua
131
identificação. No entanto, como o DNA mitocondrial em animais apresenta
característica peculiar de herança materna (Moritz et al., 1987), os dados
confirmaram que L. macrocephalus é a linhagem parental materna, o que demonstra
a eficácia deste tipo de marcador na diferenciação de híbridos recíprocos. Tal
discriminação é importante, visto que híbridos recíprocos podem apresentar
diferentes características zootécnicas e biológicas (Tave, 1993; Toledo-Filho et al.,
1998; Fonteles, 2002).
A identificação de híbridos com base na morfologia, ecologia e
comportamento, acaba sendo difícil e na maioria das vezes, confusa e incerta.
Atualmente, existem diversas metodologias genéticas que podem ser aplicadas na
identificação de híbridos de peixes (Scribner et al., 2001). Dentre os marcadores
moleculares, as estratégias de PCR Multiplex e PCR-RFLP mostraram ser eficientes
metodologias, de rápida execução e baixo custo, por permitirem diagnósticos
através de uma simples reação de PCR e baseadas em simples polimorfismos de
nucleotídeos. Consequentemente, a simplicidade e rapidez destas técnicas poderão
facilitar a implementação rotineira do monitoramento da produção de híbridos nas
pisciculturas e, por conseguinte, delinear planos de conservação biológica para o
manejo adequado de estoques naturais e cultivados de peixes.
A grande vantagem da aplicação da técnica de PCR Multiplex em relação á
de PCR-RFLP é que a primeira não requer passos adicionais de restrição
enzimática, eliminando assim quaisquer análises pós-PCR, inclusive tempo e custos
associados. Porém, algumas limitações em relação ao desenho dos primers devem
ser levadas em consideração, principalmente visando uma boa especificidade e
eficácia na sua aplicação. Assim, é necessário escolher primers com temperaturas
de anelamento similares, evitar a formação de estruturas secundárias e também
desenvolver primers espécie-específicos que produzam fragmentos de tamanhos
132
diferentes e facilmente distinguíveis, conforme documentado em outros trabalhos
(Pank et al., 2001; Marshall et al., 2007; Apostolidis et al., 2007; Gagnaire et al.,
2007).
No Brasil, apesar da constatação de que a produção de híbridos
interespecíficos atualmente já se tornou uma prática comum nas pisciculturas,
poucos são os estudos sobre as potenciais vantagens da produção de híbridos entre
as espécies de peixes Neotropicais e a avaliação dos reais impactos genético-
ecológicos que esses animais podem apresentar para as populações selvagens e
cultivadas. Na literatura, estudos neste sentido estão disponíveis em sua maioria
para híbridos entre as espécies Piaractus mesopotamicus x Colossoma
macropomum e Pseudoplatystoma corruscans x Pseudoplatystoma reticulatum,
demonstrando que estes animais podem ser vantajosos e utilizáveis na aqüicultura
(Ribeiro et al., 1995; Coelho e Cyrino, 2006; Faustino et al., 2007; Godinho, 2007).
No entanto, também já se verificou que estes híbridos podem ser férteis e
retrocruzarem com as espécies parentais (Almeida-Toledo et al., 1996; Senhorini,
comunicação pessoal), o que revela o potencial e eminente possibilidade de atuação
destes animais no meio ambiente e nas comunidades selvagens.
Neste contexto, é de grande importância que os resultados obtidos pela
técnica de hibridação interespecífica sejam devidamente analisados sob os pontos
de vista zootécnico e também genético (Toledo-Filho et al., 1994). Deste modo, é
essencial a aplicação do monitoramento genético de forma rotineira na fiscalização
dos programas de híbridação, principalmente verificando se produtos híbridos são
comercializados e manejados corretamente nas pisciculturas e ainda se existem
eventuais “misturas” entre estoques parentais e híbridos.
Os resultados na diferenciação das espécies L. macrocephalus e L. elongatus
e na identificação da linhagem híbrida “Piaupara” mostraram que o uso em conjunto
133
dos marcadores de genes nucleares e mitocondriais podem ser considerados
excelentes ferramentas genéticas, fornecendo subsídios para caracterização de
outros produtos híbridos atualmente produzidos nas pisciculturas brasileiras. Este
trabalho também serve como suporte para estudos em populações naturais, tanto na
detecção de eventos naturais de hibridação, quanto para verificar possíveis escapes
de híbridos provenientes de pisciculturas.
134
4 DISCUSSÃO GERAL
Atualmente, abordagens genéticas vêm contribuindo efetivamente nos
programas de criação de peixes. Entre as metodologias clássicas de manipulação
genética, a hibridação interespecífica constitui um dos métodos mais utilizados
tradicionalmente nas pisciculturas mundiais e brasileiras, cujos seus resultados, no
entanto, são de interpretação difícil e detalhada.
Numa perspectiva comercial, vários híbridos são favorecidos em situações
que a produção pode ser aumentada e direcionada para algumas características
físicas ou fisiológicas desejáveis. Os programas de hibridação em piscicultura têm
sido utilizados em inúmeras espécies de peixes a fim de produzir animais estéreis e
que possuam melhor desempenho que as espécies parentais. Desta forma, são
visados principalmente para o aumento da taxa de crescimento, melhor qualidade da
carne, resistência a doenças e capacidade de tolerar variações ambientais, além de
outras características a fim produzir peixes mais proveitosos para o cultivo.
No entanto, híbridos interespecíficos de peixes representam sérios riscos
biológicos ao meio ambiente. Os híbridos parcialmente férteis ou os que apresentam
fertilidade total são os que oferecem maiores riscos às populações selvagens, pois
podem “contaminar geneticamente” os estoques por meio de introgressões e, desta
forma, até causar a extinção de um dos parentais. Já os híbridos com esterilidade
zigótica, devido a cruzamentos mal-sucedidos, podem interferir na dinâmica
reprodutiva das espécies parentais, enquanto os híbridos estéreis podem competir
por espaço e alimento com os peixes selvagens.
Atualmente, cruzamentos interespecíficos para produção de linhagem híbrida
envolvendo as espécies Piauçu (Leporinus macrocephalus) e Piapara (Leporinus
elongatus) estão sendo produzidos sem qualquer monitoramento em pisciculturas
135
brasileiras. Para estes híbridos, ainda não há estudos descritos na literatura
informando sobre suas possíveis vantagens e/ou desvantagens em relação aos
parentais. Porém, o fato de que estão sendo produzidos rotineiramente nas
pisciculturas e os potenciais riscos que podem representar ao meio ambiente,
demonstram a necessidade da aquisição de informações e estabelecimento de
estratégias para caracterização e monitoramento genético envolvendo estes
híbridos.
Por meio de exames visuais da morfologia externa e mesmo de
características morfométricas e merísticas, a identificação segura de parentais e
híbridos nem sempre é fácil e pode ser considerada duvidosa. A situação torna-se
mais complicada especialmente quando os animais são juvenis, que é a principal
fase em que os peixes são comercializados e deste modo, permitindo a distribuição
de híbridos sem qualquer controle. Assim, a aplicação de metodologias genéticas no
diagnóstico de híbridos, tais como os citogenéticos e moleculares, é o primeiro
passo a ser realizado visando um correto monitoramento destes híbridos em
pisciculturas. A aplicação destas técnicas pode envolver metodologias de difícil
execução e custo elevado, ou técnicas viáveis e de baixo custo.
Através de metodologias citogenéticas, os resultados do presente estudo
demonstraram que os bandamentos cromossômicos são excelentes marcadores
genéticos que podem ser facilmente aplicados na caracterização de produtos
resultantes da hibridação interespecífica. A aplicação destes bandamentos nos
cromossomos das espécies Leporinus macrocephalus e L. elongatus revelaram
marcações exclusivas e diferenciadas em distintos pares cromossômicos que foram
considerados marcadores para estas espécies e desta forma, permitiram verificar a
correta procedência dos complementos cromossômicos das espécies parentais nos
produtos híbridos.
136
Assim, tanto as metodologias clássicas de bandamento C e coloração com
nitrato de Prata, quanto o emprego da técnica de hibridização fluorescente in situ
(FISH) permitindo a localização de seqüências específicas de DNA, mostraram ser
bastante eficientes como diagnósticos na precisa identificação das espécies
parentais e do híbrido. Além disso, ainda contribuíram de forma significativa com
subsídios para melhor conhecimento dos mecanismos da evolução cromossômica
no gênero Leporinus, bem como para obter dados biológicos a respeito dos
fenômenos genéticos envolvidos no processo de hibridação, como a dominância
nucleolar, que geralmente ocorre em híbridos interespecíficos de várias espécies de
plantas e outros animais.
Já em relação às metodologias moleculares, ambas as estratégias de PCR-
RFLP e PCR Multiplex permitiram perfeitos diagnósticos das espécies parentais e do
híbrido “Piaupara” através de uma simples reação de PCR e baseadas em simples
polimorfismos de nucleotídeos. A grande vantagem da PCR Multiplex é que esta
técnica não requer passos adicionais de restrição enzimática, e assim, eliminando
quaisquer análises pós-PCR, inclusive tempo e custos associados. Porém, algumas
limitações em relação ao desenho dos primers devem ser levadas em consideração,
principalmente visando uma boa especificidade e eficácia na sua aplicação.
As metodologias mostraram que o uso em conjunto dos marcadores de gene
mitocondrial e nuclear são excelentes ferramentas, consideradas de baixo custo e
rápida execução, tanto para caracterização de híbridos quanto para verificar a
direção dos cruzamentos. A simplicidade e rapidez destas técnicas poderão facilitar
a implementação rotineira do monitoramento da produção de híbridos nas
pisciculturas, e por fim, delinear planos de conservação biológica para um manejo
adequado dos estoques naturais e cultivados de peixes.
137
As análises citogenéticas e moleculares apresentadas neste estudo
demonstraram a ampla aplicabilidade e eficácia que os marcadores genéticos
representam na piscicultura, por meio da caracterização de estoques e diferenciação
de híbridos. Tanto as metodologias citogenéticas quanto as genético-moleculares,
têm suas indicações, vantagens e desvantagens de acordo com o problema
biológico em questão, sendo que o uso em conjunto destes marcadores pode
proporcionar informações complementares, enriquecendo a análise e respondendo
às questões de forma mais precisa.
138
5 CONCLUSÕES
Os resultados das análises citogenéticas por vários métodos de bandamentos
cromossômicos e das análises moleculares através dos métodos de PCR-RFLP e
PCR Multiplex, em amostras do híbrido interespecífico “Piaupara e suas espécies
parentais Leporinus macrocephalus e Leporinus elongatus, permitiram concluir que:
1- As espécies parentais Leporinus macrocephalus e Leporinus elongatus, e o
híbrido interespecífico “Piaupara”, apresentaram cariótipos similares em número
diplóide e fórmula cariotípica, portanto, após coloração com Giemsa não foi possível
diferenciar as espécies parentais de seus híbridos;
2- As espécies parentais demonstraram somente um par cromossômico portador
da NOR, no entanto, de diferentes tamanho e/ou formas, o que permitiu diferenciar o
híbrido “Piaupara” tanto pela técnica de nitrato de Prata quanto pelo método de
FISH com sonda ribossômica 18S;
3- O padrão de bandamento C mostrou que cada espécie parental apresenta um
par de cromossomos com blocos heterocromáticos exclusivos e diferenciados,
sendo considerados bons marcadores para diferenciá-las, e desta forma,
possibilitando a identificação do híbrido “Piaupara”;
4- O híbrido “Piaupara” apresentou uma variação de atividade da NOR, em que
a região nucleolar do cromossomo herdado de L. elongatus se demonstrou
dominante em relação ao de L. macrocephalus, evidenciando o fenômeno de
dominância nucleolar;
139
5- A aplicação da técnica de FISH com sonda sexo-específica demonstrou
marcações consideradas como diagnósticas pelos padrões espécie e sexo-
específicos, diferenciando as espécies parentais e consequentemente, o híbrido
“Piaupara”;
6- Os resultados citogenéticos adicionaram dados para melhor conhecimento
dos mecanismos da evolução cromossômica no gênero Leporinus, em especial ao
sistema cromossômico de determinação sexual;
7- Através de reações PCR Multiplex e PCR-RFLP, análises envolvendo o DNA
mitocondrial 16S e o gene nuclear α-tropomiosina demonstraram diferentes padrões
eletroforéticos entre L. macrocephalus e L. elongatus, diferenciando estas espécies;
8- O gene nuclear possibilitou a clara distinção entre parentais e o híbrido, pois
revelou um padrão heterozigótico com as bandas diagnósticas herdadas de ambas
as espécies;
9- Para o gene mitocondrial, o híbrido apresentou o mesmo padrão de L.
macrocephalus, o que mascara sua identificação, no entanto, demonstra a eficácia
deste marcador na diferenciação de híbridos recíprocos;
10- A vantagem da PCR Multiplex em relação a PCR-RFLP é que não requer
passos adicionais de restrição enzimática, e assim, considerada de menor custo e
aplicação mais rápida;
11- A simplicidade, rapidez e baixo custo das técnicas PCR Multiplex e PCR-
RFLP poderão facilitar a implementação rotineira do monitoramento e fiscalização da
140
produção de híbridos nas pisciculturas, e por fim, delinear planos de conservação
biológica para um manejo adequado dos estoques naturais e cultivados de peixes.
141
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