( PDF ) Expressão hereróloga da urease ubíqua de soja em Escherichia coli

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Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Centro de Biotecnologia

Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

Expressão da urease ubíqua de soja em Escherichia coli

Anne Helene Souza Martinelli

Dissertação submetida ao Programa de

Pós-graduação em Biologia Celular e

Molecular da UFRGS como requisito

parcial para obtenção do título de

Mestre.

Orientadora: Dra. Célia Regina R.S.

Carlini

Co-orientador: Dr. Giancarlo Pasquali

Porto Alegre

Agosto de 2007

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Livros Grátis

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Este trabalho foi realizado nos Laboratórios de Proteínas Tóxicas, do Departamento

de Biofísica, e Laboratório de Biologia Molecular Vegetal do Centro de Biotecnologia,

Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

RS, sob a orientação da Dra. Célia Regina R. S. Carlini e co-orientação do Dr.

Giancarlo Pasquali. Os auxílios financeiros foram obtidos do: CNPq, CAPES,

FAPERGS E FINEP.

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Agradecimentos

Agradeço:

Aos meus pais Sauro Luis Martinelli e Maria Elisabete Martinelli, e meus irmãos

Luiza, Nátali, Sauro, Daniel por todo amor, carinho, dedicação e apoio em todos os

momentos. Amo muito vocês.

Ao meu padrinho Jorge por todo apoio e carinho.

Ao meu amado Marco pelo amor, carinho, e compreensão nos momentos de

ausência; e também à sua família.

Á minha orientadora Célia pela oportunidade única de atuar em seu grupo de

pesquisa, por todo aprendizado e principalmente pela confiança e apoio.

Ao meu co-orientador Giancarlo pela confiança e oportunidade de iniciar trabalhos

na área de biologia Molecular.

Aos meus colegas do laprotox: Ju S., Vanessa, Arlete, Mel, Fer S., Evelyn, Fer M.,

Marina, Ângela M., Ângela P., Martha, Carol, Deiber, German, Rafael, Tinoko,

Diogo e Augusto, pela amizade, ajuda em todos os momentos, pelos risos na hora

do cafezinho. Obrigado a todos!!!!

À colega servidora Sílvia e ao Luciano da secretaria do programa de pós-

graduação.

Ao José Arthur, Nance e Kátia, do laboratório de Imunogenética em que atuo como

técnica de laboratório, pela compreensão e flexibilidade para que eu pudesse

realizar este trabalho.

A todos do laboratório de Imunogenética pelo apoio e amizade.

A todas as meninas do laboratório de Biologia Molecular vegetal: Fe B, Fe S., Dani,

Rochele, Ana P., Sinara, Michele, Luiza, Marina, pela amizade.

A Jacqueline e Débora que me ajudaram muito na realização do trabalho.

A Desireé, que me auxiliou muito no trabalho, e sempre mostrou muita paciência e

boa vontade em ajudar. Muito obrigado!!!!

As minhas amigas queridas da Unisinos, Raquel e Cátia, que mesmo longe me

apoiaram muito.

Ao professor Henrique pela revisão da dissertação e ótimas sugestões.

A todas as pessoas que de alguma forma me auxiliaram na realização deste

trabalho.

III

Abreviaturas

aa aminoácidos

ATG Códon de iniciação da transcrição: adenina, timina, guanina

BCA ácido bicinconínico

BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indocil fosfato

cDNA DNA complementar

CNTX canatoxina

Dose letal para 50% dos indivíduos testados

DNA ácido desoxirribonucléico

GST Glutationa-S-transferase

IgG Imunoglobulina G

IPTG isopropil-ßeta-D-tiogalactopiranosídeo

JBU Urease de Canavalia ensiformis

Kb Quilobases (1.000 pares de bases)

kDa Quilodaltons (1.000 daltons)

µg micrograma(s)

µL microlitro(s)

NBT azul de nitrotetrazolina

N-terminal Região amino-terminal de uma proteína

pb pare(s) de base(s)

PBS tampão fosfato-salino

PCR reação em cadeia da DNA-polimerase

PIXE indução de partículas por emissão de raio-X

p-OHMB p-hidroximercuriobenzoato de sódio

PVDF Difluoreto de polivinileno

SDS sódio-dodecilsulfato

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS

TBS tampão Tris-HCl salino

TTBS tampão Tris-HCl salino contendo 0,05% de tween 20

Tween 20 polioxietilenosorbitano

U unidades

Indice

1. Introdução.............................................................................................................................11

1.1 Ureases............................................................................................................................11

1.1.2 Ureases de semente de feijão-de-porco (Canavalia ensiformis)..............................12

1.1.3 Urease de soja..........................................................................................................14

1.1.4 Ureases: proteínas de defesa em plantas?................................................................16

1.2 Expressão de proteínas recombinantes ...........................................................................19

1.2.1 Sistema de expressão pGEX....................................................................................24

2. Objetivos...............................................................................................................................26

2.1 Objetivos gerais ..............................................................................................................26

2.2 Justificativa:....................................................................................................................26

2.3 Objetivos específicos......................................................................................................27

3. Materiais e Métodos..............................................................................................................28

3.1 Amplificação do cDNA da urease ubíqua de soja..........................................................28

3.1.1 pGPTV-JIT-urease...................................................................................................28

3.1.2 Reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) ........................................................30

3.2 Construção do vetor de expressão: .................................................................................30

3.2.1 Ligação do inserto e transformação de células de E. coli termocompetentes..........30

3.2.2 Seleção das colônias transformadas:........................................................................31

3.2.3. Seqüenciamento do plasmídeo pGEX-4T-2- urease a análise da seqüência ..........32

3.3 Expressão de urease ubíqua recombinante em E. coli:...................................................34

3.3.1 Transformação das células competentes para expressão.........................................34

3.3.2 Seleção de colônias recombinantes para expressão da proteína de fusão

(GST+urease).

...................................................................................................................34

3.3.3 Otimização das condições de expressão:.................................................................35

3.3.4 Solubilidade da proteína urease recombinante fusionada a GST.............................36

3.4 Expressão da urease ubíqua recombinante .....................................................................36

3.4.1 Purificação da proteína de fusão..............................................................................37

3.4.2 Purificação e clivagem de proteína de fusão GST-urease .......................................38

3.5 Atividade ureásica...........................................................................................................38

3.6 Determinação de Proteína...............................................................................................39

3.7 SDS-PAGE .....................................................................................................................39

3.8 Western blot....................................................................................................................39

3.9 ELISA.............................................................................................................................40

4. Resultados.............................................................................................................................42

4.1 Amplificação por PCR e subclonagem do cDNA da urease ubíqua...............................42

4.2. Seleção de clones para expressão ..................................................................................44

4.3 Otimização da expressão da urease ubíqua recombinante de soja..................................49

4.3 Purificação da proteína de fusão.....................................................................................53

4.4 Clivagem da proteína de fusão GST-urease com trombina............................................55

4.5 Atividade enzimática ......................................................................................................56

4.5 ELISA.............................................................................................................................59

5. Discussão ..............................................................................................................................62

6. Perspectivas...........................................................................................................................70

7. Referências............................................................................................................................71

VII

Abstract

Urease (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) is a nickel-dependent metalloenzyme, that

catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Ureases are

produced by many organisms, including plants, fungi and bacteria. Soybean

produces two isoenzymes, the ubiquitous urease, which is encoded by Eu4 gene and

is present in small amounts in all plant tissues, and the embryo-specific urease, which

is encoded by the Eu1 gene, and is synthesized only in the developing embryo. The

ubiquitous urease is responsible for recycling metabolically derived urea while the

role of the embryo-specific urease remains unkown. Previous studies had suggested

that the embryo-specific urease could be involved in plant defense. Since the

ubiquitous urease is found in low amounts in plant tissues making difficult to purify the

enzyme, little is known about this protein. In the present work, a system for the

expression and partial purification of soluble soybean ubiquitous urease was

established expressing a protein fusioned with glutathione S- transferase (GST). The

urease gene amplified by PCR was inserted into a pGEX-4T-2 GST fusion vector and

then expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant urease was partially

purified by a Glutathione Sepharose 4B affinity chromatography, yielding about 2 mg

protein/L of culture broth. The recombinant protein was tested for enzymatic activity

and imunoreactivity against anti Canavalia ensiformis antibodies. Successful

expression of ubiquitous urease in E. coli provides a way to produce this protein in

amounts enough for posterior studies and characterization.

VIII

Resumo

Ureases (uréia amino-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas níquel-

dependentes, que catalisam a hidrólise da uréia à amônia e dióxido de carbono. Elas

são produzidas por fungos, bactérias e plantas, mas não por animais. A soja produz

duas isoenzimas, a urease ubíqua, que é codificada pelo gene Eu4, presente em

pequenas quantidades em todos os tecidos da planta, e a urease embrião-

específica, codificada pelo gene Eu1, que é sintetizada apenas no embrião em

desenvolvimento. A urease ubíqua é responsável pela biodisponibilização de

nitrogênio para planta, enquanto o papel da embrião-específica permanece

desconhecido. Estudos prévios, sugerem que esta urease possa estar envolvida na

defesa da planta. Como a urease ubíqua é encontrada em pequenas quantidades

em todos tecidos da planta, tornando difícil sua obtenção, pouco é conhecido sobre

esta enzima. No presente trabalho, estabeleceu-se um sistema de expressão e

purificação parcial da urease ubíqua recombinante, expressa como uma proteína

fusionada a uma cauda de glutationa-S-transferase (GST). O gene da urease foi

amplificado por PCR e ligado em plasmídeo pGEX-4T-2 e expresso em Escherichia

coli BL21 (DE3). A urease recombinante foi parcialmente purificada em resina de

afinidade Glutationa Sepharose 4B, obtendo-se um rendimento de aproximadamente

2 mg/L de cultura. A proteína recombinante foi analisada para atividade enzimática e

imunorreatividade para anticorpos contra urease de Canavalia ensiformis. O sucesso

deste método de expressão da urease ubíqua da soja, permitirá a produção de

quantidades suficientes desta proteína para estudos posteriores de caracterização.

1. Introdução

1.1 Ureases

Ureases (uréia amino-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas que catalisam a

hidrólise da uréia à amônia e carbamato, o qual espontaneamente decompõe-se

para formar dióxido de carbono e uma segunda molécula de amônia. Elas são

produzidas por fungos, bactérias e plantas mas não por animais. As ureases de

plantas e fungos são proteínas homo-hexaméricas, ou seja, formadas por seis

subunidades idênticas (SIRKO & BRODZIK, 2000), enquanto as ureases bacterianas

são proteínas formadas por duas ou três subunidades distintas: UreA e UreB,

formando (AB)

, em Helicobacter pylori, e UreA, UreB e UreC formando (ABC)

outras bactérias, como Klebsiella aerogenes, como é mostrado na Figura 1 abaixo.

Figura 1: Comparação esquemática das subunidades estruturais das ureases de diferentes

organismos. Os valores em percentual, indicados abaixo de cada bloco, indica o grau de identidade

com a urease de C. ensiformis. O número de aminoácidos de cada bloco estão indicados a direita

(aa). (Adaptado de SIRKO & BRODZIK, 2000).

Em bactérias, a urease está envolvida como fator de virulência em infecções

humanas do trato urinário e gastro-intestinal (MOBLEY et al., 1995), favorecendo a

sobrevivência destes microrganismos em pH desfavorável, além de estar presente

em bactérias de solo e em bactérias anaeróbicas presentes em ruminantes,

favorecendo a reciclagem de compostos nitrogenados. Em plantas, a urease está

presente abundantemente na semente e distribuída nos demais tecidos, apesar da

uréia não ser um metabólito majoritário em plantas (POLACCO & HOLLAND, 1993;

SIRKO & BRODZIC, 2000) o que desperta curiosidade para estudo das funções

fisiológicas desta enzima nos vegetais. Apesar de diferenças na estrutura

quaternária entre as ureases, a identidade de seqüência primária é maior que 50%

entre bactérias e plantas, e com similaridades maiores que 70% dentro de cada

grupo (MOBLEY et al., 1995).

1.1.2

Ureases de semente de feijão-de-porco (Canavalia ensiformis)

O feijão-de-porco (Canavalia ensiformis), planta-modelo utilizada em nosso

laboratório, é uma leguminosa com alta resistência a insetos e possui várias

proteínas interessantes, como a lectina concanavalina A (SUMNER & HOWELL,

1936), a canatoxina (CARLINI & GUIMARÃES, 1981) e a urease, que foi a primeira

enzima a ser cristalizada (SUMNER, 1926) e a primeira metalo-enzima a ser

caracterizada (DIXON, 1975).

A urease de C. ensiformis constitui-se de uma cadeia polipeptídica com 840

aminoácidos e massa molecular de 90,77 kDa. A forma mínima da enzima ativa é

trimérica, com 270 kDa, e a enzima é encontrada em sua forma nativa como um

hexâmero de 540 kDa (ZERNER, 1991). Ela possui dois átomos de níquel no sítio

ativo, cada um coordenado por dois resíduos de histidina.

CARLINI & GUIMARÃES (1981), isolaram a CNTX, uma proteína tóxica a

insetos e mamíferos que anos mais tarde, foi caracterizada como uma isoforma de

urease (FOLLMER et al., 2001). A CNTX apresenta massa molecular de 184 kDa

quando analisada em gel-filtração em pH 7,5. Em SDS-PAGE, em meio redutor, sua

massa molecular é de 95 kDa, sugerindo que a forma nativa da proteína seja um

dímero mantido por ligações não covalentes. Além disso, é uma metalo-proteína

contendo zinco e níquel. A CNTX e a urease de C. ensiformis apresentam um alto

grau de homologia entre si (85%), mas a CNTX apresenta apenas 30 - 40% da sua

atividade enzimática sobre uréia em relação a urease majoritária.

A CNTX, quando injetada por via intraperitoneal, induz convulsão e morte de

ratos e camundongos, com uma DL

de 2 mg/kg, mas é inócua quando

administrada através de via oral nesses animais, provavelmente devido à sua

instabilidade em meio ácido (CARLINI et al., 1984; CARLINI & GUIMARÃES, 1991).

Ela também apresenta potente atividade inseticida (CARLINI et al.,1997; FERREIRA-

DA SILVA et al.,2000; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002), que está relacionada com

a clivagem da proteína por enzimas digestivas dos insetos, gerando um peptídeo de

10 kDa que é o agente responsável por essa atividade.

Estudos adicionais mostraram que quando a CNTX é tratada com um inibidor

irreversível de urease, ρ-hidroximercuriobenzoato, ela perde totalmente sua atividade

ureolítica, mas suas atividades biológicas permanecem inalteradas, sugerindo que

estas propriedades são independentes da atividade enzimática. A urease clássica

possui atividades biológicas descritas para a CNTX, como ativação plaquetária e

interação com gangliosídeos, mas não é letal por via intraperitoneal em

camundongos. As atividades citadas também são independentes da atividade

ureolítica (FOLLMER et al., 2001). Esse dado indica a existência, nestas proteínas,

de pelo menos dois domínios protéicos distintos, responsáveis por atividades

biológicas diferentes: um domínio com atividade hidrolítica sobre a uréia, suscetível

de inibição por agentes oxidantes; e pelo menos mais um domínio, responsável pela

toxicidade intraperitoneal da CNTX e outras propriedades farmacológicas

compartilhadas com a urease.

1.1.3

Urease de soja

A soja (Glycine max) possui duas isoformas de urease: a ubíqua, que está

presente em pequenas quantidades em todos os tecidos da planta, e uma segunda

isoenzima, designada embrião-específica, expressa no embrião em desenvolvimento

e preservada na semente madura, onde é encontrada em cerca de 1.000 vezes mais

abundância do que a urease ubíqua (POLACCO & SPARKS, 1982, POLACCO &

WINKLER, 1984). As isoformas de urease encontradas na soja, a embrião-específica

e a ubíqua, são altamente homólogas entre si (cerca de 85%) e também à urease de

C. ensiformis (TORISKI et al., 1994.) Cada isoenzima de urease parece ser

codificada por um único gene estrutural: Eu1 e Eu4 para a urease embrião-específica

e a ubíqua, respectivamente. Mutações em cada um dos genes afetam somente uma

das isoenzimas (MEYER-BOTHLING & POLACCO, 1987; POLACCO et al., 1989).

Um estudo realizado com plantas de soja mutantes mostrou que, com o

silenciamento da urease ubíqua, as plantas apresentaram anormalidades como

necroses nas extremidades das folhas e raízes, acúmulo de uréia nas folhas e

sementes, além de retardamento na germinação sugerindo um papel importante

desta enzima na reciclagem de derivados de uréia. Já a perda da urease embrião-

específica não acarretou danos visíveis à planta, sugerindo que esta enzima não

possua função fisiológica importante no metabolismo de nitrogênio (POLACCO &

HOLLAND, 1993).

Em culturas de cotilédones de ervilha e de soja, mostrou-se que as ureases

desempenham pouca ou nenhuma função na nutrição do embrião, visto que a uréia

comporta-se como uma fonte extremamente pobre de nitrogênio (POLACCO &

HOLLAND, 1993).

Estes dados são conflitantes, pois, se a urease embrião-específica não possui

papel relevante para a planta, por que esta apresentaria conteúdos elevados desta

proteína na semente? Tem sido proposto que, em decorrência da liberação

enzimática de amônia, esta isoforma possa estar envolvida na proteção da planta

contra insetos, fungos e agentes agressivos a semente. (POLACCO & HOLLAND,

1993).

1.1.4

Ureases: proteínas de defesa em plantas?

(CARLINI et al., 1997, FERREIRA-DASILVA et al., 2000) descreveram a

atividade inseticida da CNTX. Nestes trabalhos, insetos de diferentes ordens foram

testados e apenas foram suscetíveis os insetos Callosobruchus maculatus e

Rhodnius prolixus, cujos sistemas digestivos são baseados em enzimas proteolíticas

ácidas, do tipo catepsinas (TERRA et al., 1988). Nesse caso, o efeito inseticida não

está associado à atividade ureolítica da toxina, pois depende da formação de

peptídeos entomotóxicos a partir da hidrólise das proteínas por enzimas digestivas

dos insetos. Nesses estudos realizou-se a digestão in vitro da canatoxina com

enzimas obtidas da larva de C. maculatus. Obteve-se, desta forma, um conjunto de

peptídeos (10 – 15 kDa) tóxicos quando injetados ou ingeridos pelos barbeiros R.

prolixus. O fragmento mais tóxico (10 kDa); chamado de pepcanatox, foi

seqüenciado em sua região N- terminal. A partir desta seqüência, utilizando-se como

molde a seqüência da urease JBURE-II de Canavalia ensiformis, foi expresso em

Escherichia coli um peptídeo chamado de jaburetox-2 Ec (MULINARI et al., 2004),

que apresentou toxicidade à barata Blatela germanica ao inseto manchador-de-

algodão Dysdercus peruvianus (STANISÇUASKI et al., 2005). Em outro estudo

(FOLLMER et al., 2004), verificou-se que a urease embrião-específica da soja e a

urease majoritária de C. ensiformis, ambas purificadas a partir da semente,

apresentam atividade tóxica contra o inseto D. peruvianus, e são capazes de

promover a agregação de plaquetas de coelho. Neste mesmo trabalho, mostrou-se

que estas atividades são independentes da atividade ureolítica.

OLIVEIRA, et al., (1999) descreveram a atividade fungicida da CNTX sobre

alguns fungos filamentosos. Recentemente, nosso grupo descreveu a ação fungicida

das ureases vegetais (urease embrião-específica da soja, e a urease de C.

ensiformis) e urease bacteriana de Helicobacter pylori, sobre fungos fitopatogênicos.

Foram realizados ensaios de inibição de crescimento por difusão em disco de papel

(Figura 2), e por método de turbidimetria, bem como microscopia eletrônica de

transmissão de fungos afetados em que monitoramos a inibição em

espectrofotômetro. As três ureases estudadas apresentam atividade tóxica aos

fungos, mas as ureases vegetais foram mais potentes em relação à bacteriana

(BECKER-RITT et al., no prelo). Verificamos ainda que as propriedades antifúngicas

persistem na urease inibida por p-hidroximercuribenzoato, mostrando ser

independente da atividade enzimática.

Figura 2: Efeito da urease embrião-específica da soja sobre os fungos Penicillium herguei (A) e

Trichoderma viride (B).

Painel de esquerda: uma suspensão de 10

esporos foi incubada com 40 µL

da solução de proteína (12,5 µg proteína/µL) (1, 2,3) ou tampão (4) durante 2 horas a temperatura

ambiente, e inoculadas em placas contendo meio BDA, incubadas a 28°C por 48 horas.

Painel da

direita: 500 µg da proteína em 40 µL (1,2,3) ou somente tampão (4) foram pipetados em discos de

papel estéril e colocados em placas previamente inoculadas com os fungos. As placas foram

incubadas a 28°C por 48 horas. A urease inibiu o crescimento e a germinação dos esporos dos

fungos (BECKER-RITT et al., no prelo).

1.2 Expressão de proteínas recombinantes

Nem sempre é possível obter preparações enriquecidas de proteínas

específicas a partir de células, tecidos ou órgãos onde elas são naturalmente

encontradas. Para contornar estes problemas, surgiram técnicas para a expressão

em larga-escala de proteínas de diferentes organismos em células procarióticas. A

expressão de genes em E. coli, talvez seja a via mais utilizada para a produção de

proteínas recombinantes, devido a algumas características específicas deste

microrganismo, como: ser geneticamente bem caracterizado, manipulação simples

do microrganismo, baixo custo de cultivo, curto tempo necessário para obtenção de

grande quantidade da proteína desejada (HUNT, 2005), além da disponibilidade de

números cada vez maiores de vetores de clonagem e cepas mutantes de expressão,

permitindo seu uso para uma grande variedade de atividades, tais como: produção

de antígenos, vacinas, imunologia molecular, estrutural, além de estudos

bioquímicos (SALUTA et al., 1998).

Em geral, é difícil decidir qual é o melhor sistema plasmidial e cepa bacteriana

para expressão heteróloga de proteínas (TERPE, 2006). Entretanto, para esta

escolha, há alguns elementos essenciais que devem ser levados em consideração. A

expressão normalmente é induzida a partir de um plasmídeo que carrega um sistema

genético compatível. Os elementos genéticos de um plasmídeo de expressão

incluem a origem de replicação, um ou mais marcadores de resistência a antibiótico,

um promotor da transcrição, com ou sem a região iniciadora da tradução, bem como

a região terminadora da transcrição (SORENSEN, 2004).

Muitos vetores de expressão de proteínas recombinantes replicam-se a partir

do replicon ColE1 ou p15A. O ColE1, presente em plasmídeos de expressão

modernos, é derivado da família de plasmídeos pBR322 (15 a 20 cópias por célula

bacteriana) ou do pUC (500 a 700 cópias/ célula), e o replicom p15A é derivado do

pACYC184 (10 a 12 cópias/ célula). Além disso, o número de cópias de um

plasmídeo é controlado pela origem de replicação que preferencialmente replica na

conformação relaxada do plasmídeo (BANEYX, 1999).

Outro fator importante é a marca de resistência de um plasmídeo. Os

marcadores mais comuns são genes codificadores de proteínas de resistência a

ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Plasmídeos contendo o gene

bla, expressam a β-lactamase que confere resistência a ampicilina. Esta enzima é

secretada para o periplasma, onde catalisa a hidrólise do anel β-lactâmico das

penicilinas. A ampicilina presente no meio de cultivo é especialmente suscetível à

degradação, tanto pela β-lactamase ou por condições acídicas em culturas de alta

densidade. O efeito de degradação pode ser aliviado com uso de análogos mais

resistentes como a carbenicilina. A canamicina, o cloranfenicol e a tetraciclina

interferem na síntese de proteínas por se ligarem em áreas críticas do ribossomo

bacteriano. A canamicina é inativada no periplasma pela aminoglicosídeo-

fosfotransferase, e o cloranfenicol pelo produto do gene cat, a cloranfenicol-

acetiltransferase. De forma análoga, vários genes conferem resistência à tetraciclina

(CONNELL et al., 2003).

Para a expressão da proteína recombinante, em altos níveis, em E. coli é

necessário um promotor transcricional forte. O promotor do operon Lac de E. coli é o

mais comumente utilizado, sendo a molécula de açúcar isopropil-βeta-D-

tiogalactopiranosídeo (IPTG) o seu indutor (HANING et al., 1998). Aproximadamente

80% das proteínas utilizadas para análise de estrutura tridimensional submetida ao

banco de dados de proteínas (PDB) em 2003 foram obtidas a partir do sistema de

expressão em E. coli (SORENSEN, 2004). O sistema de expressão plasmidial pET

(Novagen), contendo promotor T7, foi de longe o mais utilizado nestes estudos.

Outro sistema muito utilizado é o pGEX (GE healthcare), que possui o promotor tac.

Outro fator decisivo para expressão de proteínas recombinantes é a escolha

da cepa de E. coli, entretanto grandes variedades de cepas podem ser usadas na

clonagem e na expressão. As cepas para expressão podem ser deficientes de

proteases naturalmente nocivas, mantendo a expressão do plasmídeo estável e

conferindo elementos genéticos relevantes para o sistema de expressão. A cepa

mais comumente utilizada é a E. coli BL21, por ser uma bactéria robusta, capaz de

se multiplicar rapidamente em meio de cultivo pobre, além de não ser patogênica. A

BL21 é deficiente em ompT e lon, duas proteases que podem interferir no isolamento

da proteína recombinante intacta.

Como foi dito anteriormente, um sistema de expressão para a produção de

proteínas recombinantes em E. coli normalmente envolve a combinação de

plasmídeo e uma cepa de bactéria (SORENSEN, 2005). O principal propósito da

expressão é obter um grande acúmulo da proteína-alvo na célula bacteriana,

preferencialmente na sua forma solúvel. Esta estratégia nem sempre é aceita pelo

sistema metabólico da bactéria, podendo ocorrer respostas ao estresse celular como

o acúmulo da proteína-alvo como agregados insolúveis, denominados corpos de

inclusão. Estes agregados protéicos em geral não permitem a adequada

conformação protéica e são biologicamente inativos (VILLAVERDE et al., 2003). O

agregado de proteínas recombinantes expressas em células bacterianas pode

algumas vezes resultar no acúmulo de altas concentrações de proteínas com folding

intermediário ou de processamento ineficiente das chaperonas. Na literatura estão

descritos alguns métodos para redirecionar corpos de inclusão para a fração

citoplasmática solúvel, ou modificar condições de expressão para obter a proteína na

forma solúvel (SORENSEN, 2005), como pode ser visto na Figura 3.

Figura 3. Desenho esquemático de passos para a obtenção de proteína recombinante em E. coli. A

proteína-alvo pode ser obtida na fração solúvel ou na forma de corpos de inclusão. (Adaptado de

SORENSEN et al., 2005 b).

Outro sistema muito utilizado é a expressão da proteína-alvo fusionada a uma

cauda de aminoácidos que pode ser mais tarde removida por clivagem. Exemplo

disto é a cauda de histidinas, amplamente utilizada em proteínas recombinantes

possibilitando a purificação com resinas de afinidade a metais. A introdução de uma

cauda pode trazer muitos benefícios como o aumento do rendimento da proteína, a

prevenção contra a proteólise, o aumento da solubilidade, além de facilitar o

processo de purificação (ARNAU et al., 2006). Por outro lado, a presença da cauda

pode afetar a proteína-alvo através de alteração da atividade enzimática e biológica,

por interferir na conformação correta da proteína. (CHANT et al., 2005).

1.2.1

Sistema de expressão pGEX

O sistema pGEX, apresentado por SMITH (1988), possui um sítio de

multiclonagem para ligação do gene de interesse, o qual será fusionado na sua

porção N-terminal a uma proteína do parasito Schistosoma japonicum, a Glutationa-

S-transferase (GST). Esta proteína, de 26 kDa, liga-se reversivelmente e com alta

afinidade à resina de Glutationa-Sepharose, permitindo a rápida purificação da

proteína de fusão, na maioria dos casos. A expressão de insertos clonados em vetor

pGEX é controlada pelo promotor tac induzido por IPTG. Todos os vetores pGEX são

construídos com um gene lacI

. O produto deste gene é uma proteína repressora

que se liga à região operadora do promotor tac, prevenindo sua expressão até a

indução com IPTG. Na Figura 4, está mostrado o mapa do vetor pGEX-4T-2 (GE

Healthcare).

Muitas cepas de E. coli podem ser usadas na clonagem e expressão de vetor

pGEX. A cepa mais comumente utilizada é a E. coli BL21, que como já descrito, é

deficiente em ompT e lon, duas proteases que podem degradar a proteína

recombinante quando presentes.

Figura 4. Mapa esquemático do vetor pGEX de fusão a Glutationa-S-transferase. Está sendo

mostrado o sítio de multiclonagem na versão do pGEX-4T-2 além do sítio de clivagem proteolítica por

trombina. (Figura retirada do manual do fabricante GE healthcare).

Apesar deste sistema de expressão em E. coli ser bem estabelecido, há varios

fatores que podem influenciar na obtenção da proteína de fusão na sua forma

solúvel e sua purificação, sendo muito importante a escolha da cepa de E. coli, a

otimização do processo de multiplicação bacteriana como temperatura e

concentração do indutor IPTG e nos diversos passos subseqüentes de purificação da

proteína (SALUTA, 1998).

2. Objetivos

2.1 Objetivos gerais

Clonagem e expressão heteróloga do gene estrutural da urease ubiqua de

soja, em células de Escherichia coli. Além disto, realizar a otimização das condições

de expressão, purificação parcial, e caracterização bioquímica da proteína, visando

estudos funcionais posteriores.

2.2 Justificativa:

Estudos anteriores de nosso grupo mostraram as ações inseticida, e fungicida

das ureases vegetais, incluindo a urease embrião-específica da soja. Entretanto, a

outra isoforma encontrada na soja, a urease ubíqua, foi pouco estudada, por ser

encontrada em pequenas quantidades em todos os tecidos da planta e assim,

dificultar a obtenção de quantidades suficientes desta proteína por métodos

convencionais de purificação. Além disto, na literatura está descrito que a provável

função desta isoforma é a disponibilização de nitrogênio para a planta, mas como as

duas isoformas da soja apresentam similaridade de 85% na sua seqüência de

aminoácidos, pode-se sugerir que a urease ubiqua também esteja envolvida na

proteção da planta, como é sugerido para a urease embrião-específica.

Um plasmídeo binário de expressão em planta, denominado pGPTV-JIT,

contendo o cDNA do gene estrutural da urease ubíqua, foi gentilmente cedido ao

nosso laboratório pelo pesquisador Dr. Mark Taylor (Scottish Crop Research

Institute, Escócia). Com este cDNA da urease ubíqua da soja, foi tentado sua

expressão em plantas de tabaco. Entretanto, não foi obtido êxito nesta tentativa. Foi

tentado também a expressão deste gene em Escherichia coli, utilizando plasmídeos

da versão pET. Também não foi obtido sucesso.

A partir disto, decidimos realizar a expressão desta proteína, utilizando outro

plasmídeo de expressão em E. coli, o sistema pGEX de fusão a GST, utilizamos este

mesmo cDNA a partir do plasmídeo cedido para nosso grupo. Desta forma procedeu-

se à clonagem e expressão da urease ubíqua, sem níquel, a fim de obter

quantidades suficientes para estudos funcionais posteriores.

2.3 Objetivos específicos

• Expressar a urease ubiqua recombinante, fusionada a GST, em E. coli;

• Otimizar as condições de expressão, para obter a proteína-alvo na fração

solúvel;

• Purificar a proteína recombinante utilizando cromatografia de afinidade;

• Clivar a proteína de fusão com trombina;

• Testar a atividade enzimática;

• Caracterizar a proteína recombinante por Western-blot e ELISA.

3. Materiais e Métodos

3.1 Amplificação do cDNA da urease ubíqua de soja

3.1.1

pGPTV-JIT-urease

O cDNA da urease ubíqua de soja foi gentilmente cedido ao nosso grupo pelo

pesquisador Dr. Mark Taylor (Scottish Crop Research Institute, Invergowrie,

Escócia). O cDNA veio ligado a um plasmídeo de expressão em plantas denominado

pGPTV-JIT (Figura 5). O cDNA de 2520 pb foi removido deste plasmídeo com a

enzima de restrição EcoRI (Fermentas) e ligado ao plasmídeo SK (+) pBluescript

(Stratagene) que havia sido previamente digerido por EcoRI e defosforilado com a

enzima fosfatase alcalina de camarões (Fermentas).

O plasmídeo SK(+)-urease foi seqüenciado no seqüenciador automático ABI

PRISM 3100 (Applied Biosystems) utilizando-se os primers universais M13 –40

Forward e SK-reverse. Um alinhamento por BLASTn (www.ncbi.org) foi realizado

para comparar nossa seqüência com a disponível no GenBank (No. Acesso

AJ276866). Após a análise da seqüência, foi encontrado um códon de terminação

antes do códon de início de tradução (ATG) e a falta de todo o códon de terminação.

Para corrigir estes erros, primers foram projetados para adicionar a trinca de

nucleotídeos ao final da seqüência a retirar o códon de terminação no início da

seqüencia sem que a seqüência de aminoácidos fosse comprometida. Os primers

utilizados foram: Seqüência Forward: 5’ TTA AAA ATG AAA CTG AGT CC 3’ e

seqüência reversa: 5’ TTA AAA GAG GAA GTA ATT TCG 3’. Utilizamos o programa

OligoTech para checar a Tm (temperatura na qual a metade dos oligonucleotídeos

estão anelados) e a formação de estruturas secundárias dos oligonucleotídeos,

assim como a temperatura necessária para romper estas estruturas.

Figura 5. Desenho esquemático do vetor de expressão binário pGPTV-JIT, contendo o cDNA da

urease ubíqua. O cDNA foi removido deste plasmídeo com a enzima de restrição EcoRI, subclonado

em plasmídeo SK (+) pBluescript (Stratagene) e seqüenciado.

3.1.2

Reação em cadeia da DNA polimerase (PCR)

A PCR foi realizada num volume final de 50 µL contendo 250 ng de cada

oligonucleotídeo, 10 mM de dNTPs, tampão da enzima na concentração final de 1x,

2,5 U de DNA polimerase pfu (Stratagene) e 50 ng de SK(+)-urease contendo a

seqüência da urease ubíqua de 2520 pb como molde. A amplificação foi realizada

em termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) e teve as

seguintes condições reacionais: desnaturação prévia a 94ºC por 3 min; 35 ciclos de

incubação a 94ºC por 30 seg (desnaturação), 41ºC por 30 seg (anelamento) e 72ºC

por 3 min (extensão). A fase de extensão final foi realizada a 72ºC por 5 min. O

produto da amplificação por PCR foi resolvido por eletroforese em gel de agarose a

0,8% corado com brometo de etídeo a 0,01 mg/L. O fragmento amplificado de

tamanho esperado foi removido do gel e purificado, utilizando-se o Kit de purificação

GFX

PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences), seguindo-

se as recomendações do fabricante.

3.2 Construção do vetor de expressão:

3.2.1

Ligação do inserto e transformação de células de E. coli

termocompetentes

O produto de PCR previamente purificado do gel foi fosforilado com a enzima

T4-polinucleotídeo quinase (Fermentas). A reação foi realizada nas seguintes

condições: 500 ng de DNA (produto de PCR), 1 U de enzima, 1 mM de ATP, tampão

de enzima na concentração final de 1x, volume final de reação de 20 µL. A reação foi

incubada a 37°C por 1 h. Após, a enzima foi inativada à temperatura de 65°C

durante 15 min.

O vetor de expressão pGEX-4T-2 (GE Healthcare) foi digerido com a enzima

de restrição Sma I (Fermentas) e defosforilado com a enzima Fosfatase alcalina de

camarão (Fermentas). A reação de digestão foi realizada utilizando-se tampão da

enzima na concentração de 1x, 500 ng de RNAse (GIBCO BRL), 30 U de enzima

Sma I , 5 µg de plasmídeo pGEX-4T-2 e volume final da reação de 30 µL. A reação

foi incubada a 37°C durante 3 horas. A reação de defosforilação foi realizada nas

seguintes condições: tampão de enzima na concentração final de 1x, 3 U de enzima

Tsap, 3 µg do plasmídeo digerido, e um volume final da reação de 40 µL. Foi

incubada a 65°C por 15 min, e inativada com 4 µL de stop buffer (GE Healthcare) a

65°C por 15 min.

A reação de ligação foi realizada com 280 ng do produto de PCR e 100 ng do

vetor pGEX-4T-2 tratado, 10 U da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen), tampão da

enzima na concentração final de 1x. Procedeu-se incubação à temperatura ambiente

por 16 h. Células competentes de E. coli DH10B foram transformadas com todo o

volume da reação de ligação, por choque térmico.

3.2.2

Seleção das colônias transformadas:

A seleção das colônias contendo o vetor foi realizada por meio da resistência

à carbenicilina. Desta forma, as bactérias transformadas foram semeadas em placas

de Petri contendo meio LB ágar e 100 µg/mL de carbenicilina. Somente as bactérias

contendo o vetor formaram colônias nestas condições. Para confirmar a presença do

inserto e a correta orientação do mesmo, foi realizada a extração de DNA plasmidial

de 6 colônias pelo método de lise alcalina (MANIATIS et al., 1982) e digestão com

enzima de restrição Xho I (Amersham). Esta enzima possui sítio interno na

seqüência da urease e no plasmídeo pGEX-4T-2. A reação de digestão foi realizada

utilizando-se: tampão da enzima na concentração final de1x, 2 µg de DNA

plasmidial, 500 ng de RNAse e 10 U de enzima. Os produtos da digestão foram

resolvidos em gel de agarose a 0,8% sendo que os fragmentos esperados possuem

1700 pb e 5770 pb.

3.2.3.

Seqüenciamento do plasmídeo pGEX-4T-2- urease a análise da

seqüência

A fim de confirmar os dados de orientação do inserto obtido pela análise de

restrição e verificar se houve correção dos erros encontrados anteriormente no

cDNA, foram projetados dois pares de primers para seqüenciar as extremidades do

inserto e internamente a seqüência da urease ubíqua.

O seqüenciamento das amostras foi realizado no Laboratório ACTGene

(Centro de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre, RS) utilizando o seqüenciador

automático ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer armado com capilares de 50 cm e

polímero POP6 (Applied Biosystems). Os DNAs-molde (30 a 45 ng) foram marcados

utilizando-se 3,2 pmol dos primers 5’-TGT CAA GTC AAG GTA CTG GAA GA-3’ , 5’

GTT CAG GTT GAA GCC ACC TT 3’, 5’ATG GTG ATC AAA GGT GGT GA 3’,

5’AAC TAC CAG CCT TGC CAA AT 3’ e 2 µL do reagente BigDye Terminator v3.1

Cycle Sequencing RR-100 (Applied Biosystems) em um volume final de 10 µL. As

reações de marcação foram realizadas em termociclador GeneAmp PCR System

9700 (Applied Biosystems) com uma etapa de desnaturação inicial a 96 ºC por 3 min

seguida de 25 ciclos de 96 ºC por 10 seg, 55 ºC por 5 seg e 60 ºC por 4 min. Após

marcadas, as amostras foram purificadas pela precipitação com isopropanol e

lavagem com etanol 70%. Os produtos precipitados foram diluídos em 10 µL de

formamida, desnaturados a 95 ºC por 5 min, resfriados em gelo por 5 min e

eletroinjetados no seqüenciador automático. Os dados de seqüenciamento foram

coletados utilizando-se o programa Data Collection v1.0.1 (Applied Biosystems) com

os parâmetros: Dye Set “Z”; Mobility File “DT3100POP6{BDv3}v1.mob”; BioLIMS

Project “3100_Project1”. Run Module 1 “StdSeq50_POP6_50cm_cfv_100”; e

Analysis Module 1 “BC-3100SR_Seq_FASTA.saz”.

Após seqüenciamento, fizemos análise de toda sequência da urease para

verificar se não havia mais qualquer códon de terminação que pudesse comprometer

a expressão da proteína recombinante. Para esta análise, utilizamos a ferramenta

“Translate a DNA sequence” (

www.expasy.ch/tools/dna.html).

3.3 Expressão de urease ubíqua recombinante em E. coli:

3.3.1

Transformação das células competentes para expressão

Células competentes de E. coli BL21 (DE3) (Stratagene) foram preparadas para

transformação por choque térmico (MANIATIS et al., 1982). Adicionou-se 1 µg do

vetor de expressão pGEX-4T-2-urease em 200 µl das células, que foram incubadas

no gelo por 30 min. Realizou-se o choque térmico por 2 min a 42º C. As células

foram colocadas novamente em gelo e adicionou-se 1 mL de meio de cultura LB (10

g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, em 1L de água

destilada, pH 7). A seguir, as células foram colocadas sob agitação de 150 rpm,

durante 60 min a 37

C. Após, as células foram semeadas em meio LB ágar,

contendo 100 µg/ml de carbenicilina. O controle utilizado foi a E. coli BL21 DE3

transformada apenas com o plasmídeo pGEX-4T-2 parental. A transformação foi

realizada nas mesmas condições descritas anteriormente.

3.3.2

Seleção de colônias recombinantes para expressão da proteína de fusão

(GST+urease).

Um total de sete colônias isoladas de E. coli BL21:pGEX-4T-2- foram usadas

para inocular tubos contendo 2 mL de meio 2x YT (16 g de triptona, 10 g de extrato

de levedura, 5 g de cloreto de sódio, em 1L de água destilada, pH 7,0) contendo

carbenicilina (100 mg/L) para verificar a expressão da proteína de fusão GST-urease.

As bactérias foram multiplicadas a 37°C, 150 rpm até atingir OD

600

de 0,7 e, a estas

adicionou-se 1 mM de IPTG. Após 3 h de indução, retirou-se alíquotas de 1 mL, que

foram centrifugadas e o sobrenadante desprezado. Adicionou-se aos sedimentos,

tampão de amostra suficiente para concentração final de 2x (tampão 6x: 0,35 M de

Tris-HCl, pH 6,8, 10% de SDS, 36% de glicerol, 5% de β-mercaptoetanol, 0,012% de

azul de bromofenol). As amostras foram fervidas e centifugadas. Aplicaram-se 20 µl

de cada amostra em gel de poliacrilamida a 10% (SDS-PAGE), posteriormente

corado com azul de Coomassie. A bactéria controle foi testada nas mesmas

condições descritas acima, mas por possuir o plasmídeo pGEX-4T-2 parental na

presença do indutor IPTG expressa apenas GST.

Um clone foi selecionado e feito estoque em glicerol para utilizá-lo na

expressão da proteína de fusão. Com este clone, foi realizada otimização das

condições de expressão, como descrito a seguir.

3.3.3

Otimização das condições de expressão:

O procedimento realizado foi igual ao descrito no item anterior, com

expressão-piloto de 2 mL para a amostra (E. coli transformada com o vetor pGEX-

4T-2-urease) e 2 mL para controle (E. coli transformada com o plasmídeo pGEX-4T-

2). Foram retiradas alíquotas de 1 mL após 1, 2, 3 e 16 h de indução da expressão

com IPTG nas concentrações de 0,1 mM e 1 mM, e temperaturas de 28 e 37°C.

Todas amostras foram igualadas pela mesma quantidade de células por OD

600.

amostras foram transferidas para microtubos, centrifugadas a 5.000 rpm durante 1

min, e o sobrenadante descartado. Ao sedimento celular foi adicionada quantidade

suficiente de tampão de amostra 2x. As amostras foram fervidas por 5 min,

centrifugadas e 20 µL do sobrenadante foram aplicados a SDS-PAGE 10%,

posteriormente corado com azul de Coomassie.

3.3.4

Solubilidade da proteína urease recombinante fusionada a GST

Foram determinadas as melhores condições de expressão para a obtenção de

maior rendimento da proteína, na forma solúvel, após a lise das células bacterianas.

O procedimento realizado foi igual ao descrito no item anterior, com expressão-piloto

de 2 mL de meio de cultura. Foram retiradas alíquotas de 1 mL após 1, 2, 3 e 16 h de

indução com IPTG nas concentrações de 0,1 mM e 1 mM, e temperaturas de 28 e

37°C. Todas as amostras foram igualadas para a mesma quantidade de células por

600.

As amostras foram transferidas para microtubos, centrifugadas, e o

sobrenadante descartado. O sedimento celular foi ressuspendido em 1mL de tampão

PBS 1x (140 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de cloreto de potássio, 100 mM de

fosfato de sódio

1,8 mM de fosfato de potássio, pH 7,3), lisado por ultrasom (6 vezes

de 30 s com intervalos de 30 s) em gelo, centrifugado a 12.000 rpm por 10 min. Aos

sobrenadantes foram aplicados tampão de amostra 2x, e 20 µL das amostras foram

resolvidas em SDS-PAGE 10%, posteriormente corado com azul de Coomassie e as

condições de expressão foram analisadas.

3.4 Expressão da urease ubíqua recombinante

Otimizadas as condições de expressão, realizou-se a expressão em maior

escala para proceder-se à purificação da proteína recombinante. O meio 2x YTA

(200 mL) contendo 100 mg/mL de carbenicilina e 1 µM de cloreto de níquel foi

inoculado com uma pré-cultura de E. coli transformada, na diluição de 1/100, e

incubada a 28°C com agitação de 180 rpm. Quando a absorbância em 600 nm

alcançou 0,7, a expressão da proteína de fusão foi induzida pela adição de IPTG na

concentração final de 0,1 mM. Após 16 h de indução, as células foram centrifugadas

por 10 min a 5.000 rpm, o sobrenadante descartado, e o sedimento celular foi

suspendido em 10 mL de tampão PBS 1x. As células foram lisadas por ultrasom (6

vezes de 30 s com intervalos de 30 s) em gelo, centrifugadas por 25 min a 12.000

rpm a 5°C. O sobrenadante foi mantido em gelo.

3.4.1

Purificação da proteína de fusão

Utilizaram-se 200 mL de cultura incubada a 28

C com agitação de 180 rpm,

indução com 0,1 mM de IPTG durante 16 h. Após a centrifugação e lise celular como

descrito no item anterior, o sobrenadante (10 mL) obtido foi submetido à

cromatografia de afinidade a glutationa, utilizando 1 mL da resina Glutationa

Sepharose 4B (GE Healthcare), com capacidade de reter 8 mg de proteína

recombinante com cauda de GST. A resina foi previamente equilibrada com 20

volumes de PBS 1x. O extrato de E. coli foi purificado em filtro com poros de 0,4 µm

e incubado com a resina. A amostra foi circulada pela coluna 3 vezes. As proteínas

não retidas foram eluídas com 10 mL de PBS 1x. A proteína de fusão retida (GST-

urease fusionada) foi eluída da coluna em frações de 0,5 mL de tampão de eluição

contendo glutationa reduzida (50 mM de Tris-HCl, 10 mM de glutationa reduzida, pH

8,0). As frações foram quantificadas por absorbância a 280 nm e analisadas por

SDS-PAGE e western-blot. Como controle, nos géis foi utilizada a urease JBU

purificada a partir da semente (FOLLMER et al., 2004a), e somente GST.

3.4.2

Purificação e clivagem de proteína de fusão GST-urease

No sistema de expressão pGEX-4T-2, a proteína recombinante possui um sítio

para clivagem proteolítica entre a GST e a proteína-alvo. Para se obter a urease livre

da GST é necessário fazer-se uma digestão com trombina. Esta digestão pode ser

realizada com a proteína fusionada imobilizada na coluna de purificação.

Para tanto, o extrato de E. coli foi preparado, sonicado, o sobrenadante

circulado pela resina e imobilizado com descrito acima. Com a proteina GST-urease

imobilizada na coluna, adicionou-se 10 U de trombina (Sigma) em tampão PBS 1x,

incubado durante 20 h à temperatura ambiente para ocorrer a clivagem. A urease

livre da cauda de GST foi eluída com tampão PBS 1x acrescido de 500 mM de

cloreto de sódio, pH 6,5. As amostras foram quantificadas pelo método de BCA (Bio-

Rad) a analisadas em SDS-PAGE 10%.

3.5 Atividade ureásica

Para ensaio da atividade ureásica, as amostras foram previamente dialisadas

contra o tampão 20 mM de Fosfato de sódio, 1 mM de EDTA, 5 mM de β-

mercaptoetanol pH 7,5, que é o tampão utilizado para estabilizar a enzima. Alíquotas

de 50 µL de solução de uréia (100 mM) foram misturadas com amostras de proteína,

e tamponadas com 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,5, obtendo volume final de

reação de 500 µL. A reação foi incubada por 30 min a 37 °C e a amônia formada foi

determinada colorimetricamente (WEATHERBURN, 1967).

3.6 Determinação de Proteína

A proteína total das frações foi determinada pelo método de BCA (Bio-Rad) de

acordo com instruções do fabricante. Para a quantificação de proteínas por BCA,

uma alíquota das amostras foi dialisada contra o tampão PBS 1x para se retirar a

glutationa reduzida, a qual pode interferir neste ensaio.

Alternativamente, a concentração de proteína nas amostras foi determinada por

absorbância a 280 nm em espectrofotômetro.

3.7 SDS-PAGE

As amostras foram resolvidas em gel de poliacrilamida a 10%, contendo 0,1% de

SDS, como descrito por LAEMMLI (1970). As eletroforeses foram conduzidas em

aproximadamente 90 min, sob voltagem constante de 200 v e temperatura de 4 °C.

O gel foi corado com azul de Coomassie. O marcador de massa utilizado foi o

BenchMark

Protein Ladder (Invitrogen).

3.8 Western blot

Depois de separadas por SDS- PAGE, as amostras foram transferidas por

gravidade para uma membrana de PVDF em tampão Tris-Glicina-SDS pH 8,3

contendo 20% de metanol. Após a transferência por 16 h à temperatura ambiente, a

membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado em tampão TBS (100 mM de

Tris-HCl, 1,5 M de cloreto de sódio, pH 7,5) contendo 0,05% de Tween 20 (TTBS).

Posteriormente, a membrana foi incubada com anticorpos anti-CNTX produzidos em

coelhos (FOLLMER et al., 2001), e anti-GST produzido em rato (Gentilmente cedido

pelo grupo do prof. Arnaldo Zaha) em diluição de 1:10000 e 1:2000, (v/v)

respectivamente, durante 2 h. Após três lavagens de 2 min cada, a membrana foi

incubada com anticorpos secundários anti-IgG de coelho e anti-IgG de rato,

respectivamente, ambos conjugados com a fosfatase alcalina (Sigma) em diluição de

1:15000 durante 2 h. A revelação colorimétrica foi feita usando BCIP a 0,015% e

NBT a 0,03% em tampão contendo 10 mM de Tris-HCl, pH 9,6, 100 mM de cloreto

de sódio e 5 mM de cloreto de magnésio (TOWBIN et al., 1991).

3.9 ELISA

Para realizar este ensaio, a urease recombinante clivada, a fusionada e o

GST foram concentrados e dialisados em cartuchos centricon (Millipore), com cortes

de 30 kDa para as ureases e de 10 kDa para o GST, por centrifugação de 4 vezes a

1200 rpm durante 15 min, contra tampão TBS.

Placas para ELISA (Nelge) foram sensibilizadas com 50 µL de amostra/poço (5 µg

de amostra diluídas em tampão TBS) durante 16 horas a 4°C. Após este período, as

placas foram bloqueadas com 5% de caseína em tampão TBS durante 1 h. Após 3

lavagens com TBS, as amostras foram incubadas com anticorpo primário anti-CNTX

com diluição de 1:10000 (v/v) durante 1 h. Após 3 lavagens, as amostras foram

expostas ao anticorpo secundário anti IgG de coelho, conjugado com fosfatase

alcalina (Sigma) em diluição de 1:15000 durante 1 hora. As amostras foram

reveladas com 50 µL/poço da solução de revelação contendo 1 mM de p-

nitrofenilfosfato, 10 mM de borato de sódio e 0,25 mM de cloreto de magnésio, pH

9,0. A absorbância foi medida a 405 nm, e comparada 5 µg de urease de C.

ensiformis nas mesmas condições, considerada 100%.

4. Resultados

4.1 Amplificação por PCR e subclonagem do cDNA da urease ubíqua

O cDNA da urease ubíqua de soja, clonado no plasmídeo pGPTV-JIT, foi

clivado com EcoRI e subclonado em plasmídeo SK(+) e seqüenciado. Os dados

obtidos no seqüenciamento mostraram que havia dois erros na sequência de

nucleotídeos quando comparada com a seqüência original depositada no Genbank

(No. Acesso AJ276866). Foi observada a presença de um códon de terminação

antes do códon de início da tradução (ATG) e faltavam três nucleotídeos do códon

de terminação da sequência. Para corrigir estes erros, primers foram projetados, e o

cDNA foi reamplificado por PCR como pode ser visto na Figura 6. Assim a região

codificadora do gene da urease possui tamanho de 2520 pb. O produto de PCR foi

purificado a partir de gel de agarose e ligado com sucesso no vetor de expressão

pGEX-4T-2 (desenho esquemático do plasmídeo mostrado na figura 4). A orientação

do inserto foi verificada por digestão com a enzima de restrição XhoI, sendo o

tamanho dos fragmentos esperados de 1700 pb e 5770 pb como é mostrado na

Figura 7. Os seis plasmídeos minipreparados resultaram positivos, ou seja, os

insertos encontravam-se na orientação correta.

Figura 6. Gel de agarose a 0,8% contendo o fragmento correspondente ao cDNA da urease ubíqua

de soja, reamplificado por PCR. M. Marcador 1. Amplificação do cDNA de tamanho de 2.700 pb.

Figura 7. Gel de agarose a 0,8% contendo os dois fragmentos resultantes da digestão do vetor

pGEX-4T-2 contendo o cDNA da urease ubíqua de soja. O plasmídeo foi digerido com a enzima de

restrição XhoI, para checar orientação do inserto. M. Marcador, 1-6. Fragmentos esperados da

digestão de 1.700 pb e 5.770 pb.

O produto da preparação de plasmídeos, mostrada na canaleta 2 da Figura 7,

contendo pGEX-4T-2-urease, foi utilizada em seqüenciamento para confirmar as

correções da seqüência e a fase de leitura. Na figura 8 está apresentada a

seqüência de nucleotídeos do inserto e a seqüência deduzida de aminoácidos. Em

colorido, está marcado o códon de início de tradução e no final o códon de

terminação que foi adicionado na reação de PCR. Esta análise mostrou que os erros

anteriormente detectados foram corrigidos com sucesso, que o inserto da urease

encontra-se na orientação correta e em fase de leitura com a seqüência de códons

do peptídeo da GST codificado no pGEX-4T-2. Esta mesma preparação plasmidial

utilizada no seqüenciamento foi usada para transformar células termocompetentes

de E. coli BL21 (DE3) com vistas à expressão da proteína recombinante.

4.2. Seleção de clones para expressão

Sete colônias de E. coli BL21 (DE3) transformadas com o plasmídeo pGEX4T-

2-urease e selecionadas em meio de cultura contendo antibiótico foram utilizadas

para inocular 2 mL de meio 2x YT contendo carbenicilina (100 mg/L) e induzidas com

1 mM de IPTG, a fim de selecionar clones para a expressão da proteína de fusão

(GST-urease). Após três horas de indução com IPTG em temperatura de 37°C, 1 mL

da cultura foi recuperada por centrifugação e tratada com tampão de amostra para

SDS-PAGE. Foi obtida uma banda diferencial no perfil da eletroforese do extrato de

células induzidas, em comparação com o controle (sem adição de IPTG), de

tamanho correspondente ao esperado para a proteína de fusão, isto é, de 120 kDa,

sendo 90 kDa correspondentes à urease e 26 kDa ao GST (Figura 9).

Todos os clones testados expressaram a proteína de fusão, mas o clone da

canaleta número 4, indicado com a seta na Figura 9, foi o que expressou a maior

quantidade da proteína e foi selecionado para dar continuidade ao trabalho. Com

este clone, foram feitas soluções-estoque em glicerol, mantidas em nitrogênio

líquido.

1 L K M K L S P R E I E K L D L H N A G Y

1 TTAAAAATGAAACTGAGTCCAAGGGAGATCGAGAAACTAGACCTGCATAATGCAGGCTAC

21 L A Q K R L A R G L R L N Y V E T V A L

61 CTTGCACAGAAACGCCTTGCTCGTGGTTTAAGGCTCAATTATGTTGAAACTGTGGCTCTC

41 I A T Q I L E F V R D G E K T V A Q L M

121 ATAGCAACACAGATTTTGGAATTTGTTCGTGATGGTGAAAAGACTGTTGCACAGCTAATG

61 C I G R E L L G R K Q V L P A V P H L V

181 TGCATTGGGAGAGAACTTCTGGGAAGGAAACAAGTTCTTCCAGCTGTTCCTCATCTTGTT

81 E S V Q V E A T F R D G T K L V T I H D

241 GAAAGTGTTCAGGTTGAAGCCACCTTTCGAGATGGTACTAAGTTAGTCACCATTCATGAC

101 L F A C E N G N L E L A L F G S F L P V

301 CTATTTGCTTGCGAGAATGGAAACCTTGAACTAGCATTATTTGGTTCTTTTCTTCCAGTA

121 P S L D K F T E N E E D H R T P G E I I

361 CCTTCACTTGACAAGTTTACAGAGAACGAAGAAGATCATAGAACTCCAGGTGAAATCATA

141 C R S E N L I L N P R R N A I I L R V V

421 TGTAGAAGTGAAAATCTGATTCTTAACCCCAGAAGGAATGCAATAATTCTCAGAGTTGTC

161 N K G D R P I Q V G S H Y H F I E V N P

481 AACAAGGGAGACAGACCAATTCAGGTTGGCAGCCACTATCATTTTATTGAAGTAAATCCT

181 Y L T F D R R K A Y G M R L N I A A G N

541 TATTTAACCTTTGATCGAAGGAAAGCATATGGCATGCGCCTCAATATAGCTGCTGGGAAT

201 A T R F E P G E C K S V V L V S I G G N

601 GCCACACGCTTTGAGCCAGGGGAATGTAAAAGCGTTGTGCTTGTAAGCATTGGAGGTAAC

221 K V I R G G N N I A D G P V N D S N C R

661 AAAGTCATCAGAGGAGGTAATAACATTGCCGATGGTCCAGTTAATGATTCTAATTGCAGA

241 A A M K A V V T R G F G H V E E E N A R

721 GCAGCCATGAAAGCTGTGGTCACAAGGGGATTTGGACATGTGGAAGAGGAAAATGCTAGG

261 E G V T G E D Y S L T T V I S R E E Y A

781 GAAGGTGTTACTGGAGAAGACTATTCATTAACTACAGTAATTTCTCGAGAGGAATATGCT

281 H K Y G P T T G D K I R L G D T D L F A

841 CACAAGTATGGCCCTACAACTGGTGACAAAATCCGTCTTGGTGATACTGACTTGTTTGCT

301 E I E K D F A V Y G D E C V F G G G K V

901 GAAATTGAAAAAGATTTTGCTGTCTATGGTGATGAATGTGTTTTTGGAGGTGGGAAAGTC

321 I R D G M G Q S S G H P P E G S L D T V

961 ATAAGAGACGGAATGGGTCAATCAAGTGGCCATCCACCTGAGGGCTCCTTGGATACTGTT

341 I T N A V I I D Y T G I I K A D I G I K

1021 ATAACAAATGCTGTGATCATTGATTATACTGGAATTATCAAAGCAGATATCGGTATTAAA

361 D G L I I S T G K A G N P D I M N D V F

1081 GATGGACTGATCATCTCAACAGGAAAAGCAGGAAATCCAGACATTATGAATGATGTATTT

381 P N M I I G A N T E V I A G E G L I V T

1141 CCTAATATGATAATTGGGGCTAATACCGAAGTTATTGCTGGAGAGGGCTTGATTGTGACA

401 A G A I D C H V H F I C P Q L V Y D A V

1201 GCTGGGGCTATAGATTGTCATGTGCATTTTATATGTCCTCAATTAGTATATGATGCCGTA

421 T S G I T T L V G G G T G P A D G T R A

1261 ACAAGTGGTATCACAACATTAGTGGGAGGAGGAACAGGACCAGCTGATGGAACACGTGCT

441 T T C T P A P N Q M K L M L Q S T D D M

1321 ACAACTTGTACACCAGCACCAAATCAGATGAAATTGATGCTACAATCAACAGATGACATG

461 P L N F G F T G K G N S A K P D E L H E

1381 CCTTTAAACTTTGGTTTCACTGGAAAAGGGAATAGTGCCAAACCTGATGAACTGCATGAA

481 I I R A G A M G L K L H E D W G T T P A

1441 ATAATCAGGGCTGGAGCTATGGGACTGAAGCTGCATGAGGACTGGGGAACTACACCGGCT

501 A I D S C L T V A D Q Y D I Q V N I H T

1501 GCAATAGACAGTTGTTTGACAGTTGCAGACCAATATGATATCCAGGTTAACATACATACT

521 D T L N E S G F V E H T I A A F K G R T

1561 GACACCTTAAACGAATCTGGATTTGTTGAACATACAATTGCTGCATTTAAAGGAAGAACT

541 I H T Y H S E G A G G G H A P D I I K V

1621 ATTCATACTTACCACAGTGAAGGAGCTGGTGGTGGCCATGCTCCAGATATCATAAAAGTA

561 C G E K N V L P S S T N P T R P Y T H N

1681 TGTGGTGAGAAGAATGTCCTACCCTCATCAACAAATCCCACACGTCCTTATACACATAAT

581 T I D E H L D M L M V C H H L N K N I P

1741 ACCATAGATGAGCATCTCGACATGTTGATGGTCTGCCATCATCTTAATAAGAATATTCCA

601 E D V A F A E S R I R A E T I A A E D I

1801 GAAGATGTAGCTTTTGCTGAATCAAGAATAAGAGCTGAAACAATTGCTGCTGAAGATATT

621 L H D K G A I S I I S S D S Q A M G R I

1861 TTACATGACAAGGGGGCAATTAGCATTATATCATCTGATTCACAGGCTATGGGTCGAATT

641 G E V I S R T W Q T A D K M K S Q R G P

1921 GGAGAGGTGATAAGCAGAACCTGGCAAACTGCTGATAAGATGAAGTCACAAAGAGGACCA

661 L Q P G E D N D N F R I K R Y V A K Y T

1981 CTGCAGCCTGGTGAAGACAATGACAACTTTCGGATCAAGCGTTATGTTGCAAAGTATACC

681 I N P A I A N G L S Q Y V G S V E A G K

2041 ATAAATCCAGCTATAGCGAATGGTTTGTCGCAATATGTTGGTTCAGTTGAGGCGGGTAAG

701 L A D L V L W K P S F F G A K P E M V I

2101 TTGGCTGATCTTGTATTATGGAAGCCGTCATTTTTTGGAGCAAAACCAGAAATGGTGATC

721 K G G E V A Y A N M G D P N A S I P T P

2161 AAAGGTGGTGAGGTTGCATATGCTAACATGGGTGACCCAAATGCAAGCATCCCAACACCT

741 E P V I M R P M F G A F G K A G S S H S

2221 GAACCGGTGATTATGAGGCCTATGTTCGGAGCATTTGGCAAGGCTGGTAGTTCACACTCC

761 I A F V S K A A L D E G V K A S Y G L N

2281 ATTGCTTTTGTGAGCAAGGCAGCTTTGGACGAAGGGGTGAAAGCTTCATATGGACTTAAC

781 K R V E A V K N V R K L T K R D M K L N

2341 AAGAGGGTGGAAGCTGTGAAGAATGTGAGGAAGCTCACCAAACGAGACATGAAACTGAAT

801 D T L P Q I T V D P E T Y T V T A D G E

2401 GACACTCTTCCACAAATCACTGTGGACCCAGAAACATACACAGTTACAGCAGATGGAGAG

821 V L T C T A A K T V P L S R N Y F L F -

2461 GTTCTCACCTGCACCGCAGCCAAGACTGTTCCTCTTTCTCGAAATTACTTCCTCTTTTAA

Figura 8. Seqüência do cDNA da urease ubíqua de soja. Na figura, está representada a sequência de

2.520 nucleotídeos amplificada por PCR, para adicionar os nucleotídeos que estavam faltando. Em

amarelo está mostrado o nucleotídeo que foi trocado (G por T) para eliminar o códon de terminação,

em verde está marcada a primeira metionina (codificada por ATG) e, em vermelho, o códon de

terminação da sequência. Para esta análise, foi utilizada a ferramenta disponível na página de

internet: www.expasy.ch/tools/dna.html.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

160 kDa

120 kDa

100 kDa

50 kDa

Figura 9. Gel de poliacrilamida a 10% em condições desnaturantes (SDS) para análise da expressão

da urease recombinante a partir de colônias de E. coli BL21 (DE3) transformadas com o plasmídeo

pGEX-T-2-urease. Legenda: M. marcador de massa molecular BenchMark

Protein Ladder

(Invitrogen); 1,3,5 e 8. Controle (sem indução com IPTG); 2,4,6 e 7. Amostras induzidas com 1 mM de

IPTG durante 2 horas a 37 °C; 9. 20 µg da Urease de Canavalia ensiformis (JBU). A seta indica a

banda de 120 kDa correspondente à proteína de fusão (GST+urease) e ao clone selecionado para

expressão desta proteína.

4.3 Otimização da expressão da urease ubíqua recombinante de soja

Diversas condições de expressão foram testadas, como pode ser visualizado

na Figura 10 (a e b). Não houve diferença significativa na quantidade de proteína

expressa nas diferentes condições testadas sem a lise das células bacterianas.

Entretanto, quando as células bacterianas foram rompidas por ultrasom, a urease

recombinante encontrou-se na fração solúvel (sobrenadante) apenas na condição de

indução da expressão com 0,1 mM de IPTG durante 16 h a 28 °C. A proteína de

fusão apresentou tamanho aproximado de 120 kDa, o qual corresponde exatamente

ao tamanho esperado: urease (~90 kDa) e GST (~26 kDa). A proteína recombinante

foi confirmada por Western-blot utilizando como anticorpo primário IgG anti-GST

(Figura 11, a e b). O western blot mostra que a bactéria está expressando, além da

urease inteira fusionada a GST, também fragmentos da proteína fusionados a GST.

Isto pode ocorrer por alguns motivos: se ocorrer falhas durante o processo de

tradução de proteínas, a fusão da cauda de GST à porção N- terminal da proteína

alvo favorecerá a tradução de fragmentos de urease fusionados a GST. Além disto, o

tempo de 16 h de indução, otimizado para expressão da proteína na forma solúvel,

também pode favorecer este efeito. Outra explicação provável ou possível é a

degradação por proteases, uma vez que, ao lisado de bactérias não foram

adicionados inibidores de proteases para se evitar a inibição da trombina no passo

posterior de clivagem da proteína de fusão.

M 1 2 3 4 5 6 7 8

240 kDa

120 kDa

100 kDa

90 kDa

IPTG _ 1 mM 0,1 mM 1 mM _ 0,1 mM 1 mM

Temperatura

28 °C 37 °C 37°C 28 °C 28 °C

3 horas 2 horas

Figura 10a. Análise em SDS-PAGE a 10% da urease ubíqua recombinante em diferentes tempos de

indução com IPTG. Legenda: M. Marcador de massa molecular

BenchMark

Protein Ladder

(Invitrogen); 1 e 5. Controle negativo (E. coli carregando apenas o plasmídeo vazio); 2. Três horas

após indução com 1mM de IPTG a 28 °C; 3. Três horas após indução com 0,1 mM de IPTG a 37 °C;

4. Três horas de indução com 1mM de IPTG a 37°C; 6. Duas horas de indução com 0,1 mM de IPTG

a 28 °C; 7. Duas horas de indução com 1 mM de IPTG a 28 °C, 8: Urease de Canavalia ensiformis

(JBU).

M 1 2 3 4 5 6 7

240 kDa

120 kDa

100 kDa

50 kDa

IPTG _ 0,1 mM 1 mM _ 0,1 mM 1 mM

Temperatura _

37 °C 37 °C _ 28 °C 28 °C

16 horas 16 horas

Figura 10 b. Análise em SDS-PAGE a 10% de urease ubíqua recombinante em diferentes tempos de

indução com IPTG. M: Marcador de massa molecular BenchMark

Protein Ladder (Invitrogen); 1 e 4:

Controle negativo (E. coli carregando apenas o plasmídeo vazio); 2: Dezesseis horas após indução

com 0,1mM de IPTG a 37 °C; 3: Dezesseis horas após indução com 1 mM de IPTG a 37 °C; 5:

Dezesseis horas de indução com 0,1mM de IPTG a 28°C; 6: Dezesseis horas de indução com 1 mM

de IPTG a 28 °C; 7: Urease de Canavalia ensiformis (JBU).

1 2 3 4 5 6

IPTG 0,1 mM 0,1 mM 1 mM _ 0,1 mM 0,1 mM 1 mM _

Temperatura

37 °C 28 °C 37 °C _ 37 °C 28 °C 37 °C _

3 horas 16 horas 3 horas 16 horas

Figura 11. Análise em SDS-PAGE a 10%, da proteína recombinante GST-urease produzida em

diferentes condições de expressão. (A) Amostras contendo extratos protéicos totais de células de E.

coli foram resolvidas em gel de poliacrilamida 10% e coradas com azul de Coomassie. Legendas: 1.

GST purificado; 2. Três horas de indução com 0,1 mM de IPTG a 37 °C; 3. Dezesseis horas de

indução com 0,1 mM e IPTG a 28 °C; 4. Dezesseis horas de indução com 1 mM de IPTG a 37 °C; 5.

Controle negativo (E. coli carregando o plasmídeo vazio), 6. JBU. (B) Amostras foram resolvidas em

gel de poliacrilamida 10% e as proteínas trasferidas para membrana de PVDF. A membrana foi

incubada com anticorpo monoclonal anti-GST e com IgG anti-rato conjugado com Fosfatase alcalina.

As canaletas são as correspondentes da Figura 11 (A). A seta indica a urease fusionada com

tamanho de 120 kDa.

4.3 Purificação da proteína de fusão

A purificação da proteína de fusão GST-urease ubíqua foi realizada por

cromatografia de afinidade, utilizando-se a resina Glutationa Sepharose. A partir da

expressão-piloto em 200 mL de meio de cultura, utilizando as condições de

expressão padronizadas, as células foram lisadas e o sobrenadante aplicado na

resina. As frações enriquecidas com a urease fusionada foram eluídas com tampão

de eluição contendo glutationa reduzida. Em paralelo, foi realizada também

expressão em 200 mL de cultura da E. coli Bl21 (DE3) carregando o plasmídeo

pGEX vazio capaz de permitir a expressão das proteínas da bactéria e GST. A

multiplicação e a expressão foram realizadas nas mesmas condições utilizadas no

item anterior. As células bacterianas também foram lisadas, centrifugadas e o

sobrenadante aplicado na coluna contendo a resina Glutationa Sepharose. As

frações das duas purificações foram analisadas em SDS-PAGE (Figura 12).

M 1 2 3

100 kDa

120 kDa

60 kDa

50 kDa

GST

Figura 12. Análise da purificação da proteína de fusão a partir da cultura em 200 mL de meio de

cultivo. As células de E. coli foram sonicadas, centrifugadas e o sobrenadante submetido à purificação

em cromatografia de afinidade, com a resina Glutationa Sepharose. Legendas: M. Marcador de massa

molecular BenchMark

Protein Ladder (Invitrogen); 1. 20 µg da fração eluída da coluna contendo

GST, 2. 20 µg da fração contendo GST-urease eluída da coluna, 3. 20 µg de JBU purificado da

semente.

4.4 Clivagem da proteína de fusão GST-urease com trombina

Para o ensaio foi realizada cultura de E. coli BL21 (DE3) em 200 mL de meio

de cultivo, nas condições de crescimento otimizadas anteriormente. As células foram

sonicadas, centrifugadas e o sobrenadante aplicado na resina Glutationa Sepharose.

A resina foi lavada com tampão para remoção de proteínas não-retidas. Foram

adicionadas à resina 10 U de trombina (Sigma) e a digestão foi deixada a

temperatura ambiente por 20 h. Após este período, a urease clivada foi eluída da

coluna com tampão PBS acrescido de cloreto de sódio para que a proteína se

desligasse da coluna. Como pode ser visto na Figura 13, após a clivagem, a urease

ubíqua recombinante apresentou o tamanho esperado de 90 kDa, o qual pode ser

comparado com o da urease de C. ensiformis.

As frações eluídas da coluna foram misturadas e o “pool” foi quantificado pelo

método de BCA. Foi obtida da cultura em 200 mL de meio de cultivo uma quantidade

final de 500 µg da proteína recombinante, sendo este um rendimento aproximado de

2,5 mg/L de meio de cultivo.

A identidade da urease após a clivagem, foi novamente analisada por SDS-

PAGE e Western blot, utilizando-se anticorpos anti-CNTX, para as frações contendo

a mistura de proteínas fusionada a GST e para a urease após a clivagem com

trombina. Como controle positivo utilizamos a urease de C. ensiformis. (Figura 14,a e

b). O Western blot confirmou a identidade da banda de ~120 kDa que representa a

urease fusionada a GST, e a da banda de ~90 kDa, representando a urease pós-

clivagem. O anticorpo também reconheceu bandas menores que devem

corresponder a fragmentos da urease fusionada, que mesmo após a cromatografia

de afinidade, permaneceram na mistura com a proteína-alvo, devido à fusão com a

cauda de GST, que possui afinidade pela glutationa imobilizada na resina. Estes

dados confirmaram resultados obtidos no primeiro Western blot com anticorpo anti-

GST, o qual mostrou fragmentos de diferentes tamanhos que foram reconhecidos

pelo anticorpo.

4.5 Atividade enzimática

Ensaios de atividade enzimática foram feitos para a proteína recombinante

fusionada a GST e, também, da urease pós-clivagem, ou seja, livre da cauda de

GST. Em nenhuma das duas situações foi detectada atividade ureásica da proteína.

Isto provavelmente ocorreu porque a E. coli BL21 (DE3) não possui as proteínas

acessórias necessárias para a montagem correta da proteína e/ou para promover a

inserção do níquel em seu sítio catalítico.

1 2 3

90 kDa

Figura 13. Análise da reação de clivagem da urease fusionada a GST, com trombina, para liberar a

urease recombinante. A reação de clivagem foi realizada com as amostras imobilizadas na coluna de

afinidade. Após 20 horas de reação à temperatura ambiente, as amostras foram eluídas da resina e

analisadas em gel de poliacrilamida a 10%. Legenda: 1. 20 µg de urease de C.ensiformis; 2 e 3. 20 µg

da fração contendo urease ubíqua recombinante após clivagem com trombina. A proteína clivada

apresenta após a clivagem o tamanho esperado de ~90 kDa.

1 2 3

A B

90 kDa

120 kDa

90 kDa

Figura 14. Análise por SDS-PAGE e Western-blot da proteína recombinante após clivagem com

trombina. (A). Gel de poliacrilamida a 10%. Legenda: 1. 20 µg urease de C. ensiformis (JBU); 2 e 3.

20 µg das frações contendo a mistura da urease fusionada a GST e da urease ubíqua após clivagem.

(B). Amostras foram resolvidas em gel de poliacrilamida a 10% e as proteínas foram trasferidas para

membrana de PVDF. A membrana foi incubada com anticorpo policlonall anti-CNTX e com IgG anti-

coelho conjugado com fosfatase alcalina. As canaletas são as correspondentes da figura 14 (A). As

setas indicam a urease fusionada com tamanho de 120 kDa, a urease clivada com tamanho de 90

kDa e a urease de Canavalia ensiformis com tamanho de 90 kDa.

4.5 ELISA

ELISA foi realizado para comparar a imunoreatividade das ureases purificadas

a partir da semente, que estão em seu dobramento protéico correto e possuem

atividade enzimática, em relação a urease ubíqua recombinante produzida em E.

coli. O resultado está mostrado nas Figuras 15 e 16. Na Figura 15, é mostrado em

gel de poliacrilamida a 10% a urease recombinante fusionada, a urease clivada, bem

como a GST livre após concentração e diálise em Centricon (Millipore) com cortes de

30 kDa e 10 kDa, respectivamente. Como foi utilizado anticorpo anti-urease de C.

ensiformis nos ensaios, o sinal obtido no ensaio para JBU foi considerado como

100%, e as demais amostras tiveram seu sinal calculado em relação a ela.

Como pode ser visto na Figura 16, todas as ureases apresentaram

imunoreatividade, inclusive a recombinante, reforçando sua identidade em relação as

ureases encontradas na semente. Outro dado importante foi que a urease

recombinante, após clivagem com trombina e retirada da cauda de GST, aumentou

significamente sua imunoreatividade, mostrando que esta cauda estava interferindo

na sua conformação e na exposição de seus epítopos.

1 2

A B

Figura 15. Amostras concentradas e dialisadas em centricon (Millipore) e resolvidas em gel de

poliacrilamida a 10%. Legenda: A: 1. 20µg urease de C. ensiformis, 2. Fração contendo GST

concentrado em centricon contendo membrana de 10 kDa. B: 1. Urease ubíqua recombinante clivada

e concentrada em centricon com membrana de 30 kDa. C: 1. Urease ubíqua recombinante fusionada

a GST, concentrada em centricon contendo membrana de 30 kDa.

% Imunoreatividade

100

Figura 16. ELISA para comparar a imunoreatividade das ureases vegetais purificadas a partir de

sementes, com a urease ubíqua recombinante. Para o ensaio foi utilizado 5 µg de cada uma das

amostras: (JBU) urease de Canavalia ensiformis, (emb. específica) urease embrião-específica de

soja. Para calcular a imunoreatividade, a urease de Canavalia ensiformis foi considerada 100% e as

demais foram calculadas em relação a ela.

5. Discussão

Neste trabalho descrevemos a expressão da urease ubíqua de soja em

Escherichia coli utilizando um sistema de expressão com fusão à GST. Por meio

dele, foi possível realizar a clonagem, a expressão e a padronização de um protocolo

capaz de permitir a obtenção de quantidades suficientes da proteína recombinante

para sua caracterização bioquímica e permitir a realização de estudos posteriores de

atividades biológicas e estruturais. A urease ubíqua recombinante não está

enzimaticamente ativa, mas será utilizada em testes de atividades biológicas como

atividade inseticida e fungicida, que são independentes da atividade ureolítica.

Estudos de correlação entre estrutura e função de proteínas são centrais no

processo de elucidação do mecanismo de ação e identificação de regiões

importantes para atividade biológica de proteínas. As ureases são enzimas com

seqüências de aminoácidos muito conservadas, desde as isoformas de um mesmo

organismo, até aquelas descritas em reinos distintos, como em bactérias, fungos e

plantas. O mecanismo de ação da atividade inseticida das ureases é dependente da

clivagem proteolítica da urease por enzimas digestivas do inseto, para ocorrer

liberação do peptídeo tóxico. Por outro lado, a urease de Bacillus pasteurii foi testada

(FOLLMER et al., 2004), e não apresentou toxicidade ao inseto Dysdercus

peruvianus. Entretanto, a urease embrião-específica da soja e JBU, que possuem a

região do peptídeo tóxico, apresentam toxicidade contra este mesmo inseto

(CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; STANISÇUASKI et al., 2005).

Entretanto, esta região do peptídeo tóxico não é responsável pela atividade

fungicida, como foi determinado para a urease de C. ensiformis, para a urease

embrião-específica da soja e urease de Helicobacter pylori (RITT et al., no prelo).

Confirmando esta hipótese, o peptídeo recombinante tóxico, derivado da JBU,

Jaburetox-2Ec (MULINARI et al., 2004), não apresentou atividade fungicida sobre

diferentes fungos testados (dados não publicados). Estes dados sugerem que existe

outra região da molécula da urease, não correspondente à do peptídeo, responsável

pela atividade contra fungos. Testes com a urease ubíqua recombinante para

verificar se esta apresenta as atividades descritas para outras ureases, corroborarão

com a idéia de que estas enzimas podem estar envolvidas na proteção da planta.

MONCRIEF & HAUSINGER (1996) obtiveram a clonagem e a expressão das

diferentes proteínas acessórias e realizaram estudos de suas funções na montagem

e na ativação da urease de Klebsiella aerogenes. MCGEE et al., (1999) relataram a

expressão da urease de H. pylori com as próprias proteínas acessórias, que

modulam a atividade enzimática, utilizando o plasmídeo pHP8080, e a cepa de E.

coli SE5000. Em relação a ureases vegetais, foi realizado o estudo e identificação

das proteínas acessórias AtUreD, AtUreF, AtUreG, necessárias para ativação da

urease de Arabidopsis thaliana (WITTE et al., 2005).

Nesse trabalho, o cDNA da urease ubíqua foi amplificado por PCR, clonado

em pGEX-4T-2 e inserido em E. coli BL21 (DE3). Os clones transformantes foram

testados e as condições de expressão foram otimizadas. A melhor condição de

expressão foi obtida com indução da cultura bacteriana com 1 mM de IPTG durante

16 h a 28 °C. Nas demais condições testadas, a proteína de fusão (GST-urease)

apresentou-se insolúvel após a lise das células bacterianas, formando agregados ou

corpos de inclusão.

Uma técnica recomendada para limitar a agregação de proteínas

recombinantes in vivo, consiste no cultivo das bactérias em temperaturas reduzidas

(SCHEIN, 1989). A reação de agregação é, em geral, favorecida pelas interações

hidrofóbicas e estas são fortemente dependentes de temperaturas altas

(KIEFHABER, 1991). A conseqüência direta da redução de temperatura é a

eliminação parcial de proteases “heat shock” induzidas em condições de super-

expressão, além do aumento da atividade e expressão de chaperonas em

temperaturas próximas de 30 °C (MOGK et al., 2002). Logo, o aumento da

estabilidade e do correto dobramento da proteína recombinante sob baixas

temperaturas pode ser explicado por estes fatores (SORENSEN et al., 2005).

Na descrição original do sistema de expressão pGEX, foi sugerido que a

maioria das proteínas fusionadas a GST ficariam na fração solúvel após a lise,

quando em presença de detergentes não-iônicos, como Triton X-100 (SMITH et al.,

1988). FRANGIONI et al., (1992) mostraram que muitas proteínas fusionadas a GST

podem ser solubilizadas com o detergente sarcosil, sendo que o tratamento

subseqüente com detergente não-iônico, permite que a proteína de fusão ligue-se

com maior afinidade à resina Glutationa~Sepharose. No entanto, no presente

trabalho, quando as células bacterianas foram lisadas em presença de tampão PBS

contendo Triton X-100, a proteína GST-urease ficou na fração insolúvel na maioria

das condições testadas.

Outra variável importante que afetou a ligação da proteína de fusão à resina é

o tempo de sonicação. Um tempo longo de sonicação pode levar à desnaturação da

GST e comprometer a sua ligação a Glutationa~Sepharose (FRANGIONI et al.,

1992). A melhor condição de lise por ultrasom neste trabalho foi a de 6 ciclos de 30 s

com intervalos de 30 s, em gelo.

Após a lise das células bacterianas, a fração solúvel contendo a proteína de

fusão foi aplicada na resina Glutationa-Sepharose visando sua purificação. A

presença da cauda de fusão na região N-terminal da proteína permite sua purificação

com apenas um passo cromatográfico. Como apresentado na Figura 12, a

cromatografia de afinidade foi insuficiente para se obter a proteína GST-urease

purificada. Provavelmente isto ocorreu devido à expressão de fragmentos da urease

fusionados à GST, favorecido pela fusão na porção N-terminal da proteína

recombinante, e/ou por clivagem de proteases produzidas pela bactéria.

São encontradas no mercado diversas enzimas proteolíticas usadas para a

clivagem de proteínas de fusão. Entretanto, há um grande número de problemas

associados a seus usos, por exemplo, a clivagem pode ser incompleta e causar a

diminuição do rendimento da proteína. Pode ainda deixar aminoácidos indesejados

na extremidade N- ou C- terminal, ou ocorrer clivagem interna da proteína

recombinante (HUNT, 2005). Em outros casos, a clivagem proteolítica é realizada

com sucesso, mas a proteína recombinante não permanece solúvel após a remoção

da cauda de fusão (ESPOSITO et al., 2006). Neste trabalho, a clivagem e a eluição

da proteína recombinante ainda podem ser otimizados, pois houve clivagem

incompleta da cauda GST da urease ubíqua recombinante. Assim, após a eluição

com PBS, obtivemos a urease ainda fusionada e a urease sem a cauda GST na

mesma fração. Um melhor resultado foi obtido aumentando-se o tempo de clivagem

de 16 h para 20 h além de alterações na condição de eluição, com a diminuição do

pH do tampão de 7,3 para 6,5, além da adição de 500 mM de cloreto de sódio,

resultando em frações distintas contendo a urease clivada e a fusionada. O

rendimento da urease clivada foi de aproximadamente 2,5 mg/L de cultura. FANG et

al., (2004) obtiveram um rendimento de 3-4 mg/L de cultura para a proteína TFF3 (31

kDa) de humanos em E. coli com plasmídeo pGEX-4T-1.

Após a clivagem com trombina, a urease ubíqua recombinante foi testada

quanto à sua atividade ureolítica. Nenhuma atividade foi detectada, sugerindo que a

urease não está ativa como enzima. Isto aconteceu, provavelmente, porque uma

ativação pós-traducional é necessária para todas as ureases (POLACCO &

HOLLAND, 1993) e a bactéria E. coli BL21 (DE3) não possui estas proteínas

acessórias necessárias para esta ativação. Este processo é bem conhecido para as

ureases de origem bacteriana, como as de Klebsiella aerogenes e de Helicobacter.

pylori. A urease bacteriana mais bem caracterizada do ponto de vista estrutural é a

da K. aerogenes. Os seis genes que constituem o operon da urease nesta bactéria

foram clonados e seqüenciados. Os genes ureA, ureB e ureC codificam as cadeias

polipeptídicas A, B e C que compõem essa enzima (formada por três subunidades) e

os genes ureD, ureE, ureF e ureG codificam as proteínas acessórias D, E, F, e G,

respectivamente, importantes para a incorporação dos átomos de níquel e ativação

da apoenzima urease (MULROONEY & HAUSINGER, 1990; MOBLEY et al., 1995).

A UreD parece ter função de chaperona, inserindo níquel na apourease (PARK et al.,

1994). A UreG contém o nucleotídeo de ligação ao “P-loop” essencial para a ativação

in vivo, enquanto a UreE contém uma região C-terminal rica em histidinas, sendo

capaz de ligar níquel, com ou sem o segmento rico em histidinas (BRAYMAN et

al.,1996). A urease de H. pylori possui massa molecular de aproximadamente 540

kDa. É uma metaloenzima níquel-dependente e hexamérica. O monômero desta

proteína é composto por duas cadeias polipeptídicas (UreA e UreB) em proporção de

1:1 (DUNN et al., 1990). Pelo menos sete genes estão envolvidos na produção desta

urease: os genes ureA e B codificam as duas subunidades que compõem a enzima,

enquanto que os genes ure E, F, G, H codificam proteínas acessórias responsáveis

pela incorporação do níquel no centro ativo da urease. O gene ureI codifica uma

proteína que atua como um canal na membrana externa, agindo na internalização da

uréia. Além desses genes, uma proteína transportadora de níquel é expressa a partir

do gene nixA (MOBLEY et al., 1995).

Em plantas, este processo ainda está pouco elucidado, em parte porque os

genes acessórios não estão em agrupamentos e, na maioria dos casos, não foram

identificados ou isolados. Em batata, foi caracterizado o gene da proteína acessória

da urease (ureG), demonstrando a sua capacidade de substituir o gene ureG de

bactéria, implicando em um envolvimento direto do gene ureG na ativação da urease

de planta (WITTE et al., 2001). Na soja, Eu2 e Eu3 foram identificados como genes

acessórios da urease. O gene Eu3 codifica a proteína de ligação de níquel, e

apresenta considerável identidade com o gene ureG de bactérias (FREYERMUTH et

al., 2000). A função da proteína codificada pelo gene Eu2 permanece desconhecida,

mas os parálagos UreD e UreF são possíveis candidatos para sua função

(BACANAMWO et al., 2002).

A obtenção de apourease (sem níquel) e sem atividade enzimática solúvel e

estável ao armazenamento era um dos objetivos desse trabalho. Estudos posteriores

para investigar quais atividades biológicas independentes de atividade ureolítica a

apourease eventualmente apresentará, facilitará estudos de estrutura frente a

função e o mapeamento de domínios responsáveis por essas atividade da proteína.

No teste de Elisa, a urease embrião-específica nativa apresentou ~ 45% do

reconhecimento da urease de C.ensiformis para o anticorpo policlonal anti-

canatoxina, sendo que essas ureases compartilham 80 % de identidade. Apesar de

poder ocorrer imunodominância do anticorpo a diferentes epitopos expostos na

proteína, o fato da urease ubíqua recombinante, desprovida de níquel, apresentar

cerca de 60% da imunorreatividade apresentada pela urease embrião específica

frente ao mesmo anticorpo, indica que a proteína recombinante adquiriu parte do

folding da proteína nativa. Como dito na introdução, as isoformas de urease da soja

têm 85 % de identidade na seqüência primária. Para realizar o ensaio de ELISA, foi

necessário concentrar as amostras utilizando o Centricon (Millipore). As duas formas

da proteína recombinante mostraram-se instáveis nesse processo de concentração,

e precipitaram quando mantidas em concentrações maiores do que 1mg/mL. Este

dado é interessante, pois a urease recombinante comportou-se de forma semelhante

às ureases purificadas a partir das plantas. (FOLLMER et al., 2001), mostraram que

a CNTX, isoforma da urease de C. ensiformis, é inativada no processo de

congelamento e descongelamento, e é instável se mantida em solução em

concentrações maiores do que 1mg/mL.

Por fim, o método de expressão da proteína recombinante, desenvolvido

neste trabalho, permitirá a obtenção em pequena e média escala da urease ubíqua

da soja, possibilitando estudos que antes eram inviáveis, devido à grande dificuldade

de obtenção e purificação desta isoforma a partir da planta. Assim poderão ser

realizados ensaios de toxicidade a fungos e insetos, agregação plaquetária,

determinação da presença de metais, além de estudos de cristalografia com a

proteína recombinante, tendo sido atingidos, desta forma, todos os objetivos

propostos para o presente trabalho.

6. Perspectivas

• Ensaios biológicos, com a urease ubíqua de soja recombinante, que são

independentes da atividade enzimática:

o Atividade inseticida;

o Atividade fungicida e/ou fungistática;

o Agregação plaquetária.

• Análise da estrutura tridimensional da proteína recombinante através de

ensaio de Dicroísmo circular, e cristalografia para comparação da estrutura da

proteína recombinante com as demais ureases vegetais (JBU de C. ensiformis

e urease embrião-específica da soja).

• Avaliação da presença de metais (níquel) na proteína recombinante, através

de ensaio de PIXE.

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Anexos

Anne Helene Souza Martinelli

Curriculum Vitae

Agosto/2007

Anne Helene Souza Martinelli

Curriculum Vitae

______________________________________________________________________________________

Dados Pessoais

Nome Anne Helene Souza Martinelli

Nascimento 05/10/1981 - PORTO ALEGRE/RS - Brasil

CPF 00368497070

______________________________________________________________________________________

Formação Acadêmica/Titulação

2005 Mestrado em Biologia Celular e Molecular.

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, Brasil

Título: Expressão da Urease Ubíqua de Soja em Escherichia coli.

Orientador: Célia Regina Carlini

1999 - 2004 Graduação em Ciências Biológicas.

Universidade do Vale do Rio dos Sinos, UNISINOS, Sao Leopoldo, Brasil

Título: "Toxicidade de Urease de Soja [Glycine max (L.) Merril] a Fitopatógenos"

Orientador: Lidia mariana Fiuza e Célia Regina Carlini

2000 - 2002 Ensino Profissional de nível técnico em Curso técnico em Biotecnologia.

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, Brasil

______________________________________________________________________________________

Atuação profissional

1. Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS

____________________________________________________________________________

Vínculo institucional

2001 - 2003 Vínculo: Bolsista , Enquadramento funcional: Iniciação Científica , Carga

horária: 20, Regime: Parcial

2003 - 2004 Vínculo: Bolsista , Enquadramento funcional: Iniciação Científica , Carga

horária: 20, Regime: Parcial

2004 - Atual Vínculo: Servidor público , Enquadramento funcional: Técnico de

Laboratório- àrea Biologia , Carga horária: 40, Regime: Integral

____________________________________________________________________________

Atividades

02/2001 - 06/2003 Estágio, Centro de Biotecnologia

Estágio:

Fermentação com microrganismos

06/2003 - Atual Pesquisa e Desenvolvimento, Instituto de Biociências

Linhas de Pesquisa:

Expressão heteróloga de ureases de soja em Escherichia coli. Efeito fungicida das ureases de

soja.

Página gerada pelo Sistema Currículo Lattes em 08/08/2007 às 11:27:47 Página 2 de 5

______________________________________________________________________________________

Linhas de pesquisa

1. Expressão heteróloga de ureases de soja em Escherichia coli. Efeito fungicida das

ureases de soja.

______________________________________________________________________________________

Idiomas

Inglês Compreende Bem , Fala Bem, Escreve Bem, Lê Bem

Espanhol Compreende Bem , Fala Pouco, Escreve Pouco, Lê Razoavelmente

Produção em C, T & A

______________________________________________________________________________________

Produção bibliográfica

Artigos completos publicados em periódicos

1. MITIDIERI, S., MARTINELLI, A. H. S., VAINSTEIN, M.

Enzymatic detergent formulation containing amylase from Aspergillus niger: A comparative study with

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2. MARTINELLI, A. H. S., MITIDIERI, S., VAINSTEIN, M.

Detergentes biológicos biodegradáveis. Avaliação das formulações do mercado. Biotecnologia Ciência &

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Artigos aceitos para publicação

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VAINSTEIN, M., OLIVEIRA, T., FIUZA, L. M., PASQUALI, G., CARLINI, C. R.

Antifungal Activity of Plant and Bacterial Ureases. Toxicon. , 2007.

Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos (resumo)

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VIII Reunião Anual do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular. , 2006.

Página gerada pelo Sistema Currículo Lattes em 08/08/2007 às 11:27:47 Página 3 de 5

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VII Reunião Anual do programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular do centro de

Biotecnologia. , 2005.

4. BECKER-RITT, A.B., MARTINELLI, A. H. S., PASQUALI, G., CARLINI, C. R.

Expression of soybean [Glycine max (L) Merrill] ubiquitous urease in tobacco (Nicotiana tobacum) and

antifungal activity of soybean ureases In: XXXIV Reunião Anual SBBq, 2005, Águas de Lindóia.

XXXIV Reunião Anual SBBq. , 2005.

5. MARTINELLI, A. H. S., BECKER-RITT, A.B., CARLINI, C. R.

Obtenção e purificação de urease de soja [Glycine max (L) Merril] e avaliação da sua toxicidade a

microrganismos fitopatogênicos. In: Mostra de Iniciação Científica da Unisinos, 2004, São Leopoldo.

Mostra de Iniciação Científica da Unisinos. , 2004.

6. BECKER-RITT, A.B., MARTINELLI, A. H. S., MITIDIERI, S., PASQUALI, G., CARLINI, C. R

Soybean (Glycine max (L.) Merril) ureases: expression in tobacco (Nicotiana tobacum) In: XXXIII Reunião

Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular- SBBq, 2004, Caxambu.

XXXIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular-SBBq. , 2004.

7. BECKER-RITT, A.B., MARTINELLI, A. H. S., MITIDIERI, S., PASQUALI, G., CARLINI, C. R

UREASE DE SOJA [Glycine Max (L) Merril]: SUPER EXPRESSÃO EM TABACO (Nicotiana Tobacum) In: V

Reunião Anual do Programa de Pós- Graduação em Biologia Celular e Molecular do Centro de

Biotecnologia da UFRGS., 2003, Porto Alegre.

V Reunião Anual do Programa de Pós- Graduação em Biologia Celular e Molecular do Centro de

Biotecnologia da UFRGS.. , 2003.

8. MARTINELLI, A. H. S., MITIDIERI, S., VAINSTEIN, M.

Produção de amilase para formulação de detergentes bioativos. In: IV Reunião Anualdo Programa de Pós-

Graduação em Biologia Celular e Molecular do Centro de Biotecnologia da UFRGS, 2002, Porto Alegre.

V Reunião Anualdo Programa de Pós- Graduação em Biologia Celular e Molecular do Centro de

Biotecnologia da UFRGS. , 2002.

9. MARTINELLI, A. H. S., MITIDIERI, S., VAINSTEIN, M.

Produção de amilase para formulação de detergentes biodegradáveis In: Salão de Iniciação Científica,

2002, Porto Alegre.

XIII Salão de Iniciação Científica. , 2002.

10. MARTINELLI, A. H. S., MITIDIERI, S., VAINSTEIN, M.

Produção de amilases para formulação de detergentes biodegradáveis. In: ENZITEC 2002, BRASÍLIA.

5 SEMINARIO BRASILEIRO DE TECNOLOGIA ENZIMÁTICA. BRASÍLIA: , 2002. v.5.

11. MARTINELLI, A. H. S., MITIDIERI, S., VAINSTEIN, M.

Produção e caracterização de uma amilase para formulação de detergentes biodegradáveis. In: Salão de

Iniciação Científica da UFRGS, 2002, Porto Alegre.

XIV Salão de Iniciação Científica da UFRGS. , 2002.

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Eventos

Participação em eventos

1. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXIV Reunião Anual SBBq, 2005. (Congresso)

Expression of soybean [Glycine max (L) Merrill] ubiquitous urease in tobacco (Nicotiana tobacum) and

antifungal activity of soybean ureases.

2. Apresentação de Poster / Painel no(a) Congresso Brasileiro de Entomologia, 2004. (Congresso)

Expressão de Ureases de Soja em Tabaco Nicotiana tobacum. Análise de Resistência a Insetos e

Fitopatógenos.

3. Apresentação de Poster / Painel no(a) ENZITEC 2002, 2002. (Congresso). Produção de amilases para

formulação de detergentes biodegradáveis

Totais de produção

Produção bibliográfica

Artigos completos publicado em periódico .....................................2

Artigos aceitos para publicação ............................................. 1

Comunicações em anais de congressos e periódicos (proceedings e suplementos)..11

Eventos

Participações em eventos (congresso)..........................................3

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