( PDF ) Estudo de diferentes isolados de Paracoccidioides brasiliensis quanto ao padrão de adesão e expressão de ligantes da matriz extracelular

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

"JÚLIO DE MESQUITA FILHO"

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CÂMPUS DE ARARAQUARA

“Estudo de diferentes isolados de Paracoccidioides brasiliensis quanto ao

padrão de adesão e expressão de ligantes da matriz extracelular.

Orientadora: Profa. Dra. Maria José Soares Mendes Giannini

Orientada: Julhiany de Fátima da Silva

ARARAQUARA

2008

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Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

"JÚLIO DE MESQUITA FILHO"

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CÂMPUS DE ARARAQUARA

“Estudo de diferentes isolados de Paracoccidioides brasiliensis quanto ao

padrão de adesão e expressão de ligantes da matriz extracelular.

Trabalho apresentado à Comissão examinadora

para a obtenção do título de Mestre no Programa de Pós

Graduação em Análises Clínicas da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas de Araraquara da Universidade

Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” - UNESP.

Orientadora: Profa. Dra. Maria José Soares Mendes Giannini

Orientada: Julhiany de Fátima da Silva

ARARAQUARA

2008

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Ficha Catalográfica

Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Silva, Julhiany de Fátima da

S586e Estudo de diferentes isolados de Paracoccidioides brasiliensis

quanto ao padrão de adesão e expressão de ligantes da matriz

extracelular. / Julhiany de Fátima da Silva. – Araraquara, 2008.

72 f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de

Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós

Graduação em Análises Clínicas

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini

. 1.Paracoccidioidomicose. 2.Adesão a matriz extra celular.

3.Micologia. I.Giannini, Maria José Soares Mendes, orient. II. Título.

CDD: 616.969

CAPES: 40300005

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micologia Clínica da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas-UNESP Araraquara. Recebeu apoio

financeiro da Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),

da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (CAPES) e do

PADC-FCFAr.

“Não importa onde você parou...

Em que momento da vida você cansou...

O que importa é que sempre é possível e necessário

RECOMEÇAR.

Recomeçar é dar uma nova chance a si mesmo...

É renovar as esperanças na vida

E o mais importante...

Acreditar em você de novo.

Sofreu muito neste período?

Foi aprendizado...

Chorou muito?

Foi limpeza da alma...

Ficou com raiva das pessoas?

Foi para perdoa-las um dia...

Sentiu-se só por diversas vezes?

Foi porque fechaste a porta até para os anjos...

Acreditou em tudo que estava perdido?

Era o início da tua melhora...

Onde você quer chegar?

Ir alto?

Sonhe alto...

Queira o melhor do melhor...

Se pensarmos pequeno

Coisas pequenas teremos...

Mas, se desejarmos fortemente o melhor...

E, principalmente...

Lutarmos pelo melhor...

O melhor vai se instalar em nossa vida.

Porque sou do tamanho daquilo que vejo,

E não do tamanho da minha altura.”

ORAÇÃO DA SERENIDADE

Senhor, fazei-me instrumento de vossa paz.

Onde houver ódio, que eu leve o amor;

Onde houver ofensa, que eu leve o perdão;

Onde houver discórdia, que eu leve a união;

Onde houver dúvida, que eu leve a fé;

Onde houver erro, que eu leve a verdade;

Onde houver desespero, que eu leve a esperança;

Onde houver tristeza, que eu leve a alegria;

Onde houver trevas, que eu leve a luz.

Ó Mestre, Fazei que eu procure mais

Consolar, que ser consolado;

compreender, que ser compreendido;

amar, que ser amado.

Pois, é dando que se recebe,

é perdoando que se é perdoado,

e é morrendo que se vive para a vida eterna.

Concedei-me Senhor, a serenidade necessária para aceitar as coisas que eu não

posso modificar, coragem para modificar aquelas que eu posso, e sabedoria para

distinguir uma das outras.

DEDICO

Em especial, ao meu filho Giulliano, que veio para iluminar os meus dias, a força

necessária para eu lutar em todos eles. A minha primeira conquista, talvez a mais

gratificante de todas elas.VOCÊ É A RAZÃO DA MINHA VIDA.

À minha família (Mãe, Pai, Daiany, Caio, Giu, Vó Quinha, meus tios Samuel e

Cássia e aos meus primos Samuel e Leonardo) pela força, compreensão,

paciência, solidariedade e respeito. Por acreditarem e me incentivarem em todos

os momentos. Por me auxiliarem a superar todas as dificuldades e chegar até o

final. Pelo amor e pelo carinho, mesmo diante de todas as adversidades.

AMO MUITO VOCÊS.

À Profa Dra Maria José Soares Mendes Giannini (Zezé) pelo exemplo. Uma

pessoa fantástica em todos os aspectos.

Obrigada pela oportunidade, pelo convívio, pelos ensinamentos, pela paciência e

por lançar desafios todos os dias. Você me fez crescer muito mais do que eu

poderia imaginar.

AGRADECIMENTOS

Á LIGAÇÃO COVALENTE, Bia, Carol, Camila, Joyce, Maira e Maisa, que mesmo

geograficamente distante, estiveram presentes me apoiando para vencer mais

essa etapa. Vocês foram e são fundamentais nas minhas conquistas.

Às minhas amigas da cultura celular, Pat e Ju Monteiro, que muito me ensinaram

e me incentivaram para chegar até aqui.

À Rô e à Tosca, as minhas “mães” no laboratório, pela paciência, ensinamentos e

convívio.

Aos meus companheiros de pós graduação, Marcelo, Ana Marisa, Tati, Lili, Aline,

José Nelson, Regina pelo convívio, pela paciência e por compartilhar todas as

dificuldades e desafios encontrados nessa etapa.

Ao Marcelo, pela paciência nipônica em todos os momentos me auxiliando na

execução deste trabalho.

À Tatiane e à Marilía (Chuchu) pelas boas conversas até São Carlos.

A todos os estagiários da Micologia, Pi, Dri, Roberta, Marina, Ju Pitica, Fábio,

Natália, Carol, Fer, Marciano, Alex Rodrigo, Gabi, Flávia pelo auxílio, por

proporcionar a oportunidade de ensino e também pelas boas risadas.

Aos que já concluíram a passagem por esse laboratório, (Pat, Lilian, Rosana,

Susana, Simone, Gerson...), mas que deixaram muitos ensinamentos e também

muitas saudades. .

Á Eliana e a Tirene, pela paciência, dedicação, boa vontade e boas risadas

durante esse período.

À Profa Dra Christiane Pienna Soares, pela oportunidade inicial, pelo apoio e

também pelos ensinamentos.

Á todos os agregados da Micologia, Bel Cito, Marisa Imuno, Gustavo, pela

colaboração e pelo bom convívio.

Á Ana Carolina Malaspina, pelo auxílio nas análises utilizando o Bionumerics.

Às meninas da pós-graduação, Laura, Sônia e Claudia, pela paciência e todo o

apoio técnico para a realização deste trabalho.

A FAPESP, ao PADC-FCFAr e à CAPES pelo apoio financeiro.

A todos aqueles que por ventura eu tenha me esquecido, mas que acreditaram

em mim e me deram força para concluir este trabalho, e, especialmente àqueles

que duvidaram, pois estes últimos me deram a oportunidade de provar o quão

eles estavam enganados.

SUMÁRIO

PAG

Resumo 1

Abstract 3

I. Introdução 5

II. Proposição 14

III. Objetivos específicos 14

IV. Metodologia 15

1. Microrganismo 15

2. Cultura de células 15

2.1. Infecção de P. brasiliensis à células epiteliais 16

3. Extração de DNA genômico 16

3.1. Análise por RAPD-PCR 17

3.2. PCR fingerprinting 17

3.3. Análise de dados 18

4. Preparo de extratos de P. brasiliensis 18

5. Análise protéica por eletroforese bidimensional 18

6. Caracterização de proteínas de P. brasiliensis como ligantes de

componentes da MEC por Far-western

V. Resultados 20

1. Testes de infecção de P. brasiliensis em cultura de células epiteliais 20

2. RAPD-PCR dos isolados de P. brasiliensis após o reisolamento 21

3. PCR fingerprinting 22

a)M13 22

b)GACA4 23

4. Análise dos perfis genotípicos obtidos 24

5. Análise protéica por eletrofores bidimensional e caracterização das

proteínas como ligantes da MEC por Far-western

VI. Discussão 42

VII. Conclusões 49

VIII. Referencias Bibliográficas 50

Interactions of Paracoccidioides brasiliensis with host cells: recent advances

LISTA DE FIGURAS

PAG

Figura 1: Comparação da capacidade de infecção dos isolados de P.

brasiliensis avaliados antes e após o reisolamento por período de

incubação de 5 horas com células A549.

Figura 2: RAPD - PCR demonstrativo dos isolados de P. brasiliensis após

o reisolamento, amplificados com a seqüência iniciadora 4 do sistema

comercial Ready-to-Go (GE Healthcare).

Figura 3: Amplificação com a sequência minisatélite M13 dos isolados de

P. brasiliensis após o reisolamento.

Figura 4: Amplificação com a sequência microsatélite (GACA)

dos

isolados de P. brasiliensis após o reisolamento.

Figura 5: Dendrograma dos isolados de P. brasiliensis após o

reisolamento, obtido pela análise dos produtos de amplificação com a

seqüência iniciadora OPJ4 do sistema comercial Ready-to-Go.

Figura 6: Dendrogramas dos isolados de P. brasiliensis após o

reisolamento, obtido pela análise dos produtos de amplificação com a

seqüência iniciadora M13

Figura 7: Dendrograma dos isolados de P. brasiliensis após o

reisolamento, obtido pela análise dos produtos de amplificação com a

seqüência iniciadora (GACA)

Figura 8: Eletroforese bidimensional do extrato “cell free” de isolado 01R3

de P. brasiliensis após reisolamento

Figura 9: Diagrama representativo das proteínas do extrato “cell free” do

isolado 01 de P. brasiliensis capazes de se ligarem aos componentes da

MEC

Figura 10: Eletroforese bidimensional do extrato “cell free” do isolado

113R3 de P. brasiliensis após reisolamento

Figura 11: Diagrama representativo das proteínas do extrato “cell free” de

isolado 113 de P. brasiliensis capazes de se ligarem aos componentes da

MEC.

Figura 12: Eletroforese bidimensional de antígeno “cell free” do isolado 35

265 de P. brasiliensis após reisolamento.

Figura 13: Diagrama representativo das proteínas do extrato “cell free” de

isolado 265 de P. brasiliensis capazes de se ligarem aos componentes da

MEC.

Figura 14: Eletroforese bidimensional de antígeno “cell free” do isolado

339 de P. brasiliensis após reisolamento.

Figura 15: Ensaio de Far Western do antígeno “cell free” do isolado 339

de P. brasiliensis demonstrando à capacidade de ligação das isoformas

da gp43 à laminina, à fibronectina e ao colágeno tipo I antes e após o

reisolamento.

Figura 16: Diagrama representativo das proteínas do extrato “cell free” de

isolado 265 de P. brasiliensis capazes de se ligarem aos componentes da

MEC

LISTA DE TABELAS

PAG

10.

Tabela 1: Descrição dos isolados de acordo com a capacidade de

infecção às células A549

11.

Tabela 2: Correlação entre quatro isolados de P. brasiliensis, antes e

após reisolamento de cultura de células, suas proteínas expressas, a

variação de massa molecular (MM) e dos pIs.

12.

Tabela 3: Proteínas dos extratos “cell free” de quatro isolados de P.

brasiliensis com capacidade de ligação à MEC

13.

Tabela 4: Proteínas do extrato “cell free” de isolado 01 de P. brasiliensis

capazes de se ligarem aos componentes da MEC

14.

Tabela 5: Proteínas do extrato “cell free” de isolado 113 de P. brasiliensis

capazes de se ligarem aos componentes da MEC

15.

Tabela 6: Proteínas do extrato “cell free” de isolado 265 de P. brasiliensis

capazes de se ligarem aos componentes da MEC

16.

Tabela 7: Proteínas do extrato “cell free” de isolado 339 de P. brasiliensis

capazes de se ligarem aos componentes da MEC

Tabela 8: Proteínas ligantes aos componentes da MEC presentes em

mais de um isolado de P. brasiliensis

Tabela 9: Proteínas de P. brasiliensis capazes de se ligar a mais de um

constituinte da MEC

LISTA DE ABREVIATURAS

Porcentagem

µµ

µg

Micrograma

µµ

µL

Microlitro

µµ

µm

Micrômetro

ADS

Fator de ribosilação de ADP (difosfato de adenina)

ALS

Alanina sintetase

ATV

Solução de tripsina-EDTA-versene (Adolfo Lutz)

CaCl

Cloreto de cálcio

CES

Tampão constituído de citrato de sódio, EDTA e sorbitol

CHS

Quitina sintetase

Centímetro

CTAB

Cloreto de Cetil Trimetil Amônio

DNA

Ácido deoxiribonucleico

EDTA

Ácido etilenodiaminotetracético

ESTs

Expressed Sequence Tags

fase L

Fase leveduriforme de P. brasiliensis

fase M

Fase miceliana de P. brasiliensis

FKS

β 1,3 glucana sintetase

Grama

Glicoproteína

GAPDH

Gliceraldeído-3- fosfato d eidrogenase

Gir2

Girase-2

GPI

Glicosyl phosphatidil inositol

Hora

Hsp

Proteínas de choque térmico

kDa

Kilodalton

Molaridade

Megabase

MEC

Matriz extracelular

MgCl

Cloreto de magnésio

Massa molecular

Espectrometria de massa

Miligrama

min

Minuto

Mililitro

Milimolar

NaCl

Cloreto de sódio

NaOH

Hidróxido de sódio

Nanograma

Nanômetro

nº

Número

ºC

Graus Celsius

Pares de base

Pb Paracoccidioides brasiliensis

PBS

Tampão salina fosfato

PBS-T

Tampão salina fosfato com 0,05% de tween-20

PBS-T-BSA

Tampão salina-fosfato acrescido de Tween20 e soroalbumina bovina

PCM

Paracoccidioidomicose

PCR

Reação em cadeia da polimerase

PRRs

Proteínas com regiões ricas em prolina

RAPD

Polimorfismos de DNA pela amplificação randomizada

(Random Amplified Polymorphic DNA)

RFLP

Polimorfismos gerados pelo fragmento de restrição

(Restriction Fragment Length Polymorphisms)

RNA

Ácido ribonucléico

rpm

Rotações por minuto

SDS

Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE

Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio

SFB

Soro fetal bovino

TBE

Tampão constituído de tris, ácido bórico e EDTA

TdT

Deoxinucleotidil terminal transferase

Tampão constituído de tris e EDTA

UPGMA

Unweighted Pair-Group Method, Arithematic averages

RESUMO

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico causador da

paracoccidioidomicose, doença de comprometimento orgânico múltiplo e de

evolução prolongada. A virulência de P. brasiliensis pode ser atenuada ou perdida

após subseqüentes ciclos de subcultivos durante longos períodos e restabelecida

após inoculações em animais ou pela passagem em cultura de células. Um

aspecto importante na interação entre P.brasiliensis e seu hospedeiro é a

habilidade do fungo em aderir aos componentes da matriz extracelular. O

entendimento e identificação destas moléculas revestem-se de importância na

descoberta de tratamentos eficientes para as micoses sistêmicas. Assim, neste

trabalho, foram estudados 13 diferentes isolados de P. brasiliensis quanto ao

padrão de infecção à cultura de células epiteliais pulmonares (A549),

genotipagem com os iniciadores OPJ4, M13 e GACA4 empregando as técnicas

de RAPD e PCR fingerprinting, bem como a verificação de proteínas expressas

diferencialmente, e sua capacidade de ligação a componentes da matriz

extracelular (MEC). Os diferentes isolados de P. brasiliensis apresentaram maior

capacidade de infecção após reisolamento de células epiteliais. As amostras mais

aderentes foram Pb18, Pb2508 e Pb2367 e as menos aderentes foram Pb2669,

Pb2508 e Pb2367. Quanto aos genótipos, perfis diferenciais foram observados e

correlação com padrão de infecção e distribuição geográfica foi observada para

alguns isolados com dois dos iniciadores (OPJ4 e M13). A análise protéica dos

extratos “cell free” de P. brasiliensis, por eletroforese bidimensional também

forneceu perfis diferenciais entre as amostras subcultivadas e reisoladas e 62

ligantes de colágeno tipo I, 18 de laminina e 23 de fibronectina de um total de 420

proteínas expressas foram observados. Os isolados Pb01 e Pb339 apresentaram

ligantes para fibronectina apenas após o reisolamento, mostrando que

aparentemente estes ligantes possam ter papel na patogenicidade. O mesmo

ocorreu com Pb01 para colágeno. O isolado Pb113, mesmo após reisolamento,

não apresentou ligantes de laminina, enquanto que Pb265 não apresentou

ligantes para fibronectina. Assim, de acordo com estes dados pode-se verificar

que dependendo do isolado tem-se diferentes padrões de ligantes a MEC.

Número expressivo de proteínas, com características de ligantes a MEC, foi

observado chamando atenção de sua maior expressão após reisolamento em

culturas celulares. Assim pode ser predito que se poderá encontrar múltiplas

adesinas, distintas dependendo da condição do microambiente. Deve-se imaginar

que esta multiplicidade seja maior à medida que o microrganismo tem capacidade

de se alojar em diferentes tecidos. Este perfil diferencial de ligantes de MEC

sugere a habilidade de expressão destes ligantes durante a interação fungo-

hospedeiro.

ABSTRACT

Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus, ethiologic agent of

paracoccidioidomycosis, disease of multiple organic implications and prolonged

evolution. P. brasiliensis virulence can be attenuated or lost after subsequent

cycles of subcultive for during long periods and reestablished after by the passage

in animals or in the epithelial cells culture. The success of colonization is a

complex event, generally involving a ligand coded by the pathogen (adhesins) and

a cell receptor. An important aspect in the interaction between P.brasiliensis and

your host is the ability to adhere to matrix extracelular components (ECM). This

fungal employs a series of strategies to colonize and to disseminate, including

ligands. The understanding and identification of these molecules is very important

in the discovery of efficient treatments for the systemic mycoses. The aim of this

study was to investigate the P. brasiliensis infection pattern to the pulmonary

epithelial cells (A549), the molecular typing by RAPD and PCR fingerprinting

using, respectively, the primers OPJ4, M13 and GACA4, as well as the protein

expressed and the ligand to ECM of the different strains. All P. brasiliensis isolates

presented different capacity to adhere to epithelial cells. The most and less

adherent isolates were respectively Pb18, Pb2508ar and Pb2367ar, and

Pb2669ar, Pb113 e Pb2663ar. Regarding the genomic polymorphisms, differential

RAPD´s profiles and PCR fingerprinting were observed and a relative correlation

with the infection pattern and geographical distribution could be observed. The

profile of four P. brasiliensis “cell-free” extracts from subcultivated and reisolated

strains was analysed by two-dimensional electrophoresis. Differentially expressed

proteins were identified. Furthermore, a lot of ligands were observed to ECM

components, 62 ligands to collagen type I, 23 to fibronectin, and 18 to laminin of a

total of 420 proteins. The isolates Pb01 and Pb339 presented fibronectin ligands

only after reisolated from epithelial cells, apparently showing that these ligands

may have role in pathogenicity. The same occurred with Pb01 to collagen. The

Pb113, even after reisolated, did not present laminin ligands, whereas Pb265 not

presented fibronectin ones. Thus, this study suggested that different patterns of

the ECM ligands could occur depending on the isolate. On the other hand, multiple

adhesins can appear, depending on the condition of the microenvironment. We

could imagine that this diversity is greater as the microorganism is capable to

accommodate in different tissues.

Expressive number of proteins, with characteristics of ECM ligands, was observed

mainly after passage in the epithelial cultures. These differential profile ligands

could be associated of the capability of this fungal to express different proteins in

fungal-host interaction.

I. INTRODUÇÃO

O aumento das doenças fúngicas tornou-se um problema significante de

saúde pública, afetando parte da população mundial e causando

conseqüentemente diminuição da qualidade e da expectativa de vida. A

paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose de grande importância em razão da

gravidade de algumas de suas formas anátomo-clínicas e de suas taxas de

mortalidade (LACAZ et al., 1994; BITTENCOURT et al., 2005). A PCM tem como

principal agente etiológico Paracoccidioides brasiliensis que é fungo dimórfico que

cresce na fase miceliana (M), saprobiótica, em temperaturas de 25

a 27

C, sob a

forma de colônias cotonosas e esbranquiçadas. Em meios enriquecidos a 37º C

desenvolve-se a fase leveduriforme (L) que constitui a forma parasitária do fungo,

apresentando-se como células arredondadas, de parede dupla e brotamentos

múltiplos característicos, com estruturas fúngicas semelhante às encontradas nos

tecidos (LACAZ, 1994).

De acordo com a seqüência de subunidades 28S e 18S do RNA

ribossomal, Paracoccidioides brasiliensis tem relação filogenética com os demais

fungos termo-dimórficos (PETERSON E SIGLER, 1998, BIALEK et al., 2000).

Assim, este fungo é classificado taxonomicamente no Reino Fungi, Divisão

Eumycota, Subdivisão Ascomycota, gênero Paracoccidioides e espécie

brasiliensis (GUARRO et al., 1999). O fungo apresenta 4-5 cromossomos, com

variações de 2-10 Mb (MONTOYA et al., 1997;). O tamanho do genoma foi

calculado em 30 Mb (CANO et al., 1998), com aproximadamente 7.500 a 9.000

genes, números que estão de acordo com o calculado em genomas de fungos

pertencentes aos ascomicetos.

Isolados de P.brasiliensis diferem quanto à morfometria, número de brotos,

capacidade de conversão de micélio para levedura e velocidade de crescimento

(SVIDZINSKI et al.,1999; KASHINO et al., 1987). A variabilidade genética foi

verificada nos últimos anos através de várias metodologias, como eletroforese de

campo pulsado (MONTOYA et al., 1997; FEITOSA et al., 2003), RAPD (Random

Amplified Polymorphic DNA), (CALCAGNO et al., 1998; SOARES et al., 1995).

Em alguns trabalhos foi utilizada esta ultima metodologia para investigar a

possível relação entre isolados de P. brasiliensis e origem geográfica, virulência

ou tipo de patologia (SOARES et al., 1995 ; CALCAGNO et al. 1998; MOLINARI-

MADLUM et al., 1999; McEWEN et al., 2000; TOTTI et al., 1999; MOTTA et al.,

2002; KUROKAWA et al., 2005). Recentemente, foi proposta a existência de três

diferentes espécies filogenéticas (S1, PS2 e PS3) em P. brasiliensis (MATUTE et

al., 2006). Para tanto, compararam as seqüências de oito regiões de cinco loci

diferentes do genoma, correspondentes aos genes que codificam quitina sintetase

2 (CHS2), ß-1,3 glucana sintetase (FKS), α-tubulina, fator de ribosilação de ADP

(ADS), e o antígeno gp 43 (PbGP43). Baseado no polimorfismo deste último, 17

isolados provenientes de pacientes com as formas pulmonares e linfáticas foram

analisados e seis genótipos foram descritos (MORAIS et al., 2000; CARVALHO et

al., 2005). No entanto, em poucos casos alguma associação foi encontrada e a

literatura ainda é controversa (HAHN et al., 2003). Poucos trabalhos apresentam

correlação positiva entre grupos genéticos e virulência (CARVALHO et al., 2005;

MOLINARI-MADLUM et al., 1999).

A via inalatória foi sugerida como o principal acesso das formas

infectantes do fungo ao pulmão, pelos dados obtidos em estudos experimentais

(Mc EWEN et al., 1987), pela existência de infecções assintomáticas ou

subclínicas (LACAZ et al., 1959; POSADA 1968), pelo prolongado período de

incubação da doença (MOLESE et al., 1957; OLIVEIRA & BAPTISTA, 1960;

PEREIRO, 1974) e a demonstração de involução de lesões pulmonares no

homem (MOTTA, 1956). Assim, esta via foi sugerida como a principal para a

penetração do fungo no hospedeiro. As manifestações clínicas da micose podem

ser variadas, desde lesões cutâneas e/ou em mucosas, podendo ocorrer

comprometimento orgânico múltiplo e a doença pode ser de curso mais rápido, no

caso das formas aguda/subaguda ou de evolução prolongada, na forma crônica

(FRANCO et al., 1994).

Os agentes de micoses sistêmicas possuem alguns fatores que permitem o

seu crescimento nas condições adversas proporcionadas pelo hospedeiro, que

podem contribuir para o desenvolvimento da doença (CASADEVALL &

PIROFSKI, 1999). A interação entre os determinantes de virulência do agente e

os mecanismos de defesa do hospedeiro resulta num processo complexo cujo

conhecimento permite melhor entendimento da patogênese das micoses

sistêmicas. Assim, P. brasiliensis possui mecanismos que o capacitam a aderir,

extravasar e invadir barreiras impostas pelos tecidos do hospedeiro (MENDES-

GIANNINI et al. 1994; LOPES et al., 1985; LENZI et al., 2000), sintetizando várias

substâncias que participam direta ou indiretamente da relação parasito-

hospedeiro. A estrutura antigênica de P. brasiliensis é bastante complexa; cerca

de 60 componentes solúveis foram descritos incluindo glicoproteínas e proteínas

com e sem atividade enzimática (YAZÁRBAL, 1982). Estudos da correlação entre

alguns destes componentes e seu papel na virulência estão entre os assuntos

abordados de grande importância.

A diferenciação da fase miceliana para a leveduriforme, dependente de

temperatura é essencial na ocorrência da PCM (SAN-BLAS et al., 1982). Durante

esse processo, modificações na composição de parede celular, composta de

quitina e glucanas são as mais conhecidas. Tanto em P. brasiliensis quanto em

outros fungos patogênicos, a quitina representa um importante componente da

parede celular relacionada a várias funções na morfogênese, integridade da

parede, desenvolvimento de conidióforos, ou estruturação de moléculas como

adesinas (SAN-BLAS et al., 2002). A quitina está presente em ambas as fases

(miceliar e leveduriforme), mas na leveduriforme a quantidade deste

polissacarídeo é três vezes maior, além disso a conformação das glucanas

também é diferente, sendo que isolados menos virulentos tem menor quantidade

α-1,3 glucana. Assim, foi sugerido um possível papel desses polissacarídeos na

patogenicidade desse fungo (SAN-BLAS & SAN-BLAS, 1994). Paralelamente, nas

últimas décadas estudos de genes e proteínas envolvidos na transição de fases

ou relacionados à virulência foram feitos e dois projetos genômicos foram

concluídos, além de outros estudos, contribuindo para aumentar o conhecimento

de genes deste fungo (FELIPE et al., 2005; GOLDMAN et al., 2003; MARQUES et

al.,2004; NUNES et al., 2005; TAVARES et al., 2007). No entanto, os estudos

para comprovação de genes envolvidos em virulência demandam a obtenção de

mutantes, cujo desenvolvimento exige sistemas de transformação e outros, pouco

estabelecidos neste fungo (ALMEIDA et al., 2007).

A estabilidade da virulência em diferentes isolados de P. brasiliensis é

assunto importante em abordagens envolvendo o estudo da virulência deste

fungo. Esta pode ser atenuada ou perdida após subseqüentes ciclos de

subcultivos durante longos períodos (BRUMMER et al, 1990) e restabelecida após

inoculações em animais (CASTANEDA et al., 1987) ou através da passagem por

culturas celulares (ANDREOTTI et al., 2005).

Esforços no sentido de caracterizar a composição antigênica e de

identificar um antígeno espécie-específico levaram diferentes autores a estudar a

glicoproteína de 43kDa (gp43) considerada como molécula antigênica altamente

específica para o diagnóstico sorológico da paracoccidioidomicose (CAMARGO et

al., 1988; MENDES-GIANNINI et al., 1989; PUCCIA et al., 1991) e que também

estaria envolvida nos mecanismos de adesão de P. brasiliensis (VICENTINI et

al.,1994; ANDRÉ et al., 2004; HANNA et al., 2000; MENDES-GIANNINI et al.,

2000). Outros compostos de P. brasiliensis também foram estudados quanto a

sua capacidade de produzir resposta imunológica em hospedeiros, entre estas

proteínas foram descritas as de 57, 48 e 45kDa (CASOTTO, 1990; FERREIRA-

DA-CRUZ et al., 1992), uma proteína recombinante de 27kDa (ORTIZ et al. 1996;

ORTIZ et al., 2000) e um antígeno circulante de 87kDa (GÓMEZ et al., 1998) que

revelou homologia com proteínas de choque térmico (Hsp) de vários organismos

(DIEZ et al., 2002). Seis componentes sintetizados preferencialmente na fase

leveduriforme de P. brasiliensis foram identificados sendo altamente homólogos a

catalase, frutose-1,6-bifosfato, aldolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase,

malato desidrogenase e trifosfato isomerase de várias origens (FONSECA et al.,

2001). Outra proteína aracterizada foi a Hsp60 de P. brasiliensis e sua proteína

recombinante foi reconhecida por soros de pacientes com paracoccidioidomicose

(CUNHA et al. 2002; IZACC et al., 2001). COSTA et al., 2002 estudaram as

proteínas de 39 e 78kDa presentes na fase leveduriforme de P. brasiliensis em

que o sequenciamento de aminoácidos revelou identidade a manosil e

glicosiltransferases de várias origens.

Os modelos envolvendo técnicas de culturas de células de mamíferos

podem ser utilizados no intuito de se estudar a interação parasito-hospedeiro.

MENDES-GIANNINI et al., (1994) utilizaram culturas de células da linhagem Vero

(rim de macaco verde da África) e demonstraram que P. brasiliensis deve

apresentar mecanismos de adesão e de invasão. P. brasiliensis (isolado 113) foi

capaz de aderir (MENDES-GIANNINI et al., 1992), e de invadir células epiteliais

de linhagem contínua (MENDES-GIANNINI et al., 2000; MENDES-GIANNINI et

al., 1994). HANNA (1995) e UEMURA (1996) estudaram a cinética do processo

de interação de P. brasiliensis às culturas celulares Vero e HeLa, respectivamente

e, os prováveis fatores envolvidos nesta interação. P. brasiliensis foi capaz de

aderir às células epiteliais e os isolados mais virulentos para animais

apresentavam maior capacidade de adesão (HANNA et al., 2000). A adesão de P.

brasiliensis às células foi feita aparentemente por um pequeno túbulo (HANNA,

1995; HANNA, 1996; UEMURA, 1996) e ao redor da área de adesão do fungo à

célula epitelial puderam ser observadas alterações nas membranas celulares,

com presença de cavitações circunscritas ao redor do elemento fúngico e também

vacúolos, resultantes provavelmente dos produtos extracelulares do fungo ou

através de um processo fagocitário da própria célula hospedeira (MONTEIRO DA

SILVA et al., 2001).

O sucesso de colonização dos tecidos do hospedeiro pelo fungo é,

portanto, um evento complexo, geralmente envolvendo um ligante codificado pelo

patógeno e um receptor da célula. A adesão é conferida por uma classe de

proteínas especiais presentes na parede celular denominadas de adesinas. O

conhecimento da composição da parede celular e dos componentes exocelulares

dos fungos contribui para a identificação de ligantes na superfície celular de

patógenos. Fibrinogênio, sistema complemento e vários componentes da matriz

extracelular estão entre as proteínas do hospedeiro que podem se ligar às

proteínas da parede celular dos fungos. Estes componentes podem funcionar

como adesinas capazes de mediar interações do fungo com tecidos do

hospedeiro durante a infecção.

Os avanços na caracterização de P. brasiliensis têm redundado também

em maior conhecimento das adesinas deste fungo. Castro et al., 2005 realizaram

um rastreamento das proteínas GPI ancoradas deste fungo, entre estas, há

adesinas ligantes da matriz extracelular. Da mesma forma, Tomazett et al., 2005

estudaram as enzimas possivelmente envolvidas na biossíntese e remodelagem

de polissacarídeos da parede celular, que tem potencial de influenciar na adesão

às células do hospedeiro. Uma das estratégias possivelmente utilizadas pelo

patógeno e depreendidas a partir de análises de redundância de ESTs no

processo infeccioso (BAILÃO et al., 2006; 2007; BASTOS et al., COSTA et al.,

2007), seria a expressão de genes relacionados ao seu micro nicho, envolvendo

adaptação às condições do hospedeiro, e conseqüentemente, também podem

influenciar no padrão de adesinas.

Em geral, os genes envolvidos em adesão não são constitutivamente

expressos, mas sim ativados quando induzidos quando interagem no sítio de

infecção no hospedeiro (CHENG et al., 2005). Uma indicação da variabilidade e

da especificidade sítio-infecção de diferentes adesinas refere-se ao modelo de

Candida albicans, em que vários genes são diferencialmente expressos

dependendo do hospedeiro. Mais especificamente, os genes ALS2, 3, 6, 7 e 9 são

altamente expressos, enquanto ALS4 e ALS5 são reprimidos em modelo de

candidíase vaginal (CHENG et al., 2005). Por outro lado, isolados orais mostram

expressão forte de ALS1, 2, 3, 4, 5 e 9, enquanto ALS6 e ALS7 são reprimidos

(GREEN et al., 2004). Esta expressão diferencial reflete a habilidade de

expressão de adesinas em determinada condição. O uso de moléculas de

superfície, entre outras, faz parte das estratégias do microrganismo para evadir-

se do sistema imune e para a sua própria sobrevivência no hospedeiro. Adesinas

estão sujeitas a trocas epigenéticas subteloméricas, resultando em padrões de

expressão não determinados previamente. Assim, genes relacionados a estas

apresentam repetições internas seqüenciais que levam a eventos de

recombinação e a formação de novas adesinas, oferecendo assim para os fungos

um reservatório de propriedades de adesão (VERSTREPEN & KLIS, 2006).

Análise de adesinas de C. albicans identificou pelo menos 60 alelos diferentes do

gene ALS7 (ZHANG et al., 2003). Estes aspectos de adesão fúngica exemplificam

a plasticidade e a capacidade de adaptação a ambientes diversos. Esta variação

pode prover a diversidade funcional em moléculas de superfície que permitem

adaptação rápida ao meio ambiente ou como mecanismo de escape do sistema

imune. Assim, ativação de adesinas em patógenos humanos acontece quando as

células percebem uma mudança no hospedeiro, permitindo adesão a seus tecidos

para estabelecer uma colônia ou biofilme do microrganismo patogênico

(VERSTREPEN et al., 2004; DOMERGUE et al., 2005; LEVDANSKY et al., 2007).

No entanto, as exatas condições que permitem esta variabilidade são ainda

motivo de muito estudo em vários fungos

Alguns dos ligantes fúngicos envolvidos na interação com a MEC foram

identificados a nível molecular (TRONCHIN et al., 1997; YAN et al., 1998; GAUR

e KLOTZ, 1997; LOPEZ-RIBOT et al.,1999; KLOTZ et al., 1993; BROMLEY e

DONALDSON, 1996; GIL et al., 1996). Moléculas com características de ligantes

a laminina foram descritas em Candida albicans (SAKATA et al., 1999;

BOUCHARA et al., 1990; LOPEZ-RIBOT et al.,1994, VERSTREPEN & KLIS,

2006), Aspergillus fumigatus (TRONCHIN et al., 1993; GAUR & KLOTZ, 1997),

Histoplasma capsulatum (McMAHON et al., 1995), Penicillium marneffei

(HAMILTON et al., 1998; HAMILTON et al., 1999) Blastomyces dermatitidis

(BRANDHORST et al., 2003) e Coccidioides immitis (HUNG et al., 2002) Fungos

e bactérias expressam em sua parede celular, proteínas com regiões ricas em

prolina (PRRs), e estas também devem estar envolvidas no processo de adesão

aos tecidos do hospedeiro (PERFECT et al. 1998; STAAB et al., 1999).

Algumas moléculas de P.brasiliensis já foram identificadas como ligantes

de componentes da matriz extracelular. A gp43 foi a primeira a ser identificada

como ligante de laminina (HANNA, 1995; VICENTINI et al., 1994; ANDRÉ et al.,

2004). A glicoproteína de 43kDa tem papel na aderência desde que soro anti-gp

43 inibiu o processo de adesão em 85% (HANNA et al., 2000). Estudos adicionais

mostraram que em ensaios de afinidade de ligação, a gp43 foi capaz de se ligar

tanto à fibronectina quanto à laminina. Esta ligação foi inibida quando células Vero

foram tratadas com peptídeo 1 da gp43, peptídeos sintéticos derivados da

laminina (YIGRS) e fragmentos de ambos componentes de matriz (seqüência

RGD), indicando que a gp 43 (particularmente o peptídeo 1), participaria mais

efetivamente do processo de adesão (MENDES-GIANNINI et al., 2006). Uma

adesina de 30 kDa de P. brasiliensis, com capacidade de ligação à laminina foi

isolada sendo mais expressaem isolado de P. brasiliensis que apresentava alta

capacidade de adesão (ANDREOTTI, 2002; ANDREOTTI et al., 2005). P.

brasiliensis também apresenta em sua superfície celular duas proteínas com

massas moleculares de 19 e 32 kDa que interagem com diferentes proteínas da

MEC, tais como laminina, fibronectina e fibrinogênio (GONZALEZ et al., 2005). A

proteína gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (GAPDH) P. brasiliensis foi capaz

de se ligar a laminina, colágeno I e fibronectina. O tratamento de formas

leveduriformes de P. brasiliensis com anti-GAPDH e de pneumócitos com GAPDH

recombinante promoveu a inibição da infecção do fungo às células epiteliais

(BARBOSA et al., 2006). Recentemente, foi isolada e caracterizada uma proteína

de 70KDa, denominada paracoccina, capaz de se ligar a N-acetil-glucosamina

(COLTRI et al, 2006, GANIKO et al., 2007). Ainda, Pereira et al. (2007)

identificaram a triosefosfato isomerase de P. brasiliensis que, através de ensaios

de inibição com peptídeos, foi capaz de se ligar preferencialmente à laminina.

Muitos genes têm sido descritos como provavelmente envolvidos na

sobrevivência de P. brasiliensis no hospedeiro. Entre estes há aqueles que

codificam para proteínas essenciais para a vida do fungo, assim como aqueles

envolvidos na interação com seu hospedeiro, caracterizando o fenótipo

patogênico (BAILÃO et al., 2006; BASTOS et al., 2007; FELIPE et al., 2005;

GOLDMANN et al., 2003; TAVARES et al., 2007). A disponibilidade da seqüência

genômica e as novas técnicas de ionização em espectrometria de massa têm

permitido o desenvolvimento de metodologias para o estudo em nível protéico da

totalidade das proteínas expressas por um genoma de um organismo ou uma

célula (WESTERMEIER et al., 2002).

A análise proteômica despertou considerável atenção e importância desde

a revelação que o genoma humano constitui-se de menos genes que

originalmente estimado (VENTER et al. 2001). Assim, a informação genética

sozinha é insuficiente para explicar eventos biológicos e padrões de expressão do

RNAm e nem sempre se correlacionam com o nível de expressão protéica

(ANDERSON et al., 1997). Os produtos gênicos finais, representados pelas

proteínas, precisam ser estudados para o completo entendimento e determinação

do padrão de expressão nos tecidos. A análise protéica requer várias técnicas

analíticas, incluindo separação eletroforética e espectrometria de massa para

identificação.

Proteínas envolvidas em processos biológicos são detectadas por

mudanças quantitativas, forma de regulação e modificações pós-traducionais. O

primeiro passo de análise, a expressão proteômica, implica na separação e

detecção de proteínas por eletroforese bidimensional de alta resolução, seguida

pela identificação e caracterização das proteínas de interesse por espectrometria

de massa (MS). O passo final é o entendimento das vias biológicas incluindo as

funções de todas as proteínas e complexos envolvidos. Então, a análise

proteômica pode ser aplicada para a identificação de alvos na descoberta de

novas drogas; na identificação de marcadores na pesquisa clínica; no

desenvolvimento de fármacos,, na análise de interações protéicas e na

observação de modificações pós-traducionais (WESTERMEIER et al., 2002).

Com esse intuito, o proteoma de diferentes microrganismos foi

desenvolvido. A análise proteômica e subproteômica em C. albicans permitiu

avanços no entendimento do dimorfismo, resposta do hospedeiro, composição da

parede celular, fatores de virulência, resistência às drogas, identificação de

proteínas envolvidas no metabolismo e virulência (PITARCH et al., 2003;

PITARCH et al., 1999; PARDO et al, 2000; PITARCH et al., 2002; HERNÁNDEZ

et al., 2004; EBANKS et al., 2006). As proteínas secretadas por Aspergillus flavus

também foram analisadas por abordagem proteômica (MEDINA et al., 2005). Esta

abordagem em Saccharomyces cerevisiae permitiu a identificação de 32

proteínas envolvidas na biogênese da parede celular, enzimas glicolíticas,

proteínas de choque térmico (Hsp) e outras envolvidas em outros processos

(PARDO et al. 2000), além da caracterização de Gir2, uma proteína de 34KDa,

altamente ácida e com migração eletroforética anômala (ALVES et al., 2004).

Já com P.brasiliensis, a abordagem proteômica permitiu o isolamento e

caracterização de uma endoproteinase de 29 KDa e pI 5.8 com alta homologia

com a triosefosfato isomerase (PEREIRA et al., 2007), uma adesina de 30 kDa

(ANDREOTTI et al., 2005), duas de 19 e 32 KDa da fase miceliana (GONZÁLEZ

et al., 2005) e a gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (GAPDH) (BARBOSA et

al., 2006). Várias proteínas da matriz podem ser receptores potenciais para os

microrganismos. A laminina foi a primeira destes componentes a ser implicada na

patogênese da paracoccidioidomicose (VICENTINI et al., 1997). Nosso grupo vem

trabalhando nesta abordagem e outros componentes da matriz como colágeno

tipo I e IV, fibronectina e entactina estão envolvidos na adesão aos tecidos do

hospedeiro (MENDES GIANNINI et al., 2006). Porém, pelo exposto, pode-se

verificar que os dados ainda são bastante fragmentados, não se conhecendo se

estas adesinas estão presentes em diferentes isolados e se condições diferentes

alteram o seu padrão de expressão.

II. PROPOSIÇÃO

A interação de P. brasiliensis com células epiteliais do hospedeiro humano

pode ser determinante para a evolução da infecção e para a diversidade de

formas clínicas na PCM. Assim, neste trabalho pretendeu-se estudar diferentes

isolados de P. brasiliensis para verificar o seu padrão genotípico e de infecção de

células epiteliais pulmonares, bem como o de proteínas com capacidade de

ligação aos componentes da matriz extracelular.

III. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar os perfis genotípicos pelas técnicas de RAPD-PCR e PCR

fingerprinting de 13 isolados de P. brasiliensis após passagem por cultura de

células.

• Verificar capacidade de infecção dos isolados de P. brasiliensis, antes e após

o reisolamento de cultura de células epiteliais e correlacionar com os perfis

genotípicos.

• Verificar a expressão de proteínas, de quatro diferentes isolados de P.

brasiliensis e aquelas antes e após passagem por cultura celular, com

capacidade de ligação a componentes da matriz extracelular.

• Verificar o padrão de expressão de proteínas de quatro diferentes isolados de

P. brasiliensis antes e após reisolamento da cultura de células epiteliais.

• Verificar o padrão de expressão de proteínas com características de ligantes a

componentes da matriz extracelular.

IV. METODOLOGIA

1. Microrganismo

Foram empregados os seguintes isolados de P.brasiliensis na fase

leveduriforme nos ensaios de infecção e de genotipagem: Pb 113, Pb 265 e Pb

18, procedentes da micoteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo (FM-USP), Pb 01 e Pb1578R procedentes da micoteca de M.R.R.Silva,

IPTSP, UFG, Goiânia, Brasil e os isolados Pb 1921, Pb 1934, Pb 2367, Pb 2493,

Pb 2508, Pb 2663, Pb 2669 e Pb2681 de pacientes com paracoccidioidomicose

da região de Araraquara – SP (Pb1921 isolado em 16/07/1998, Pb1934 isolado

em 12/08/1998, Pb2367 isolado em 05/07/2000, Pb2493 isolado em 19/04/2002,

Pb2508 isolado em 10/06/2002, Pb2663 isolado em 21/02/2006, Pb2669 isolado

em 17/03/2006 e Pb2681 isolado em 22/05/2006). No estudo de ligantes da matriz

extracelular foram empregados os isolados Pb 113, Pb 265, Pb 18 e Pb 339. Este

projeto foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Esses isolados foram

cultivados na fase leveduriforme a 36ºC em meio sólido de Fava-Netto (FAVA

NETTO, 1951), por sete dias com subcultivo contínuo. Para a recuperação da

virulência, os isolados foram passados em monocamadas de células epiteliais por

três vezes consecutivas e então foram reisolados em meio de Fava-Netto.

2. Cultura de células.

Foi utilizada a linhagem de pneumócitos A549, células epiteliais de pulmão

humano (obtidas do Banco de Células do Rio de Janeiro) cultivadas em meio

HAM F-12 (Cultilab) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab) e

mantidas a temperatura de 36.5

C. Decorridos 3 a 4 dias, as garrafas de células

foram submetidas à tripsinização. Para isso, a monocamada celular formada foi

lavada com 1 mL de ATV-solução de tripsina 0,2% e Versene 0,02% (Adolfo Lutz)

e, após lavagem, esta foi desprezada e acrescentado mais 1 mL de ATV.

Seguidos 1-2 minutos, as células foram homogeneizadas com volumes variados

do meio HAM F-12, acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB). Nesta etapa, a

tripsina (ATV) foi neutralizada pelo soro fetal bovino presente no meio de cultura e

o volume total da suspensão celular foi transferido para outras garrafas, de modo

a se obter uma concentração celular de 10

células/mL.

2.1. Infecção por P. brasiliensis à monocamada de células A549.

Os ensaios de infecção foram realizados sobre lamínulas em placas de 24

orifícios. A monocamada celular foi formada por aproximadamente 24h em meio

HAM-F12 (Cultilab), em seguida, cada orifício foi inoculado com 300µL da

suspensão padronizada de P.brasiliensis em PBS acrescida de 300µL de meio

HAM-F12 (Cultilab). A seguir, as células infectadas foram incubadas a 36,5ºC, por

5h. As lamínulas foram coradas por Giemsa e observadas em microscópio óptico

e contagens do número de fungos (aderidos e invadidos) foram realizadas em

5000 células, determinando-se a porcentagem total de infecção para a avaliação

da quantidade de fungos e determinação da capacidade de infecção de cada um

dos isolados da monocamada de células epiteliais antes e após o reisolamento.

3. Extração do DNA genômico dos isolados de P. brasiliensis

O DNA dos isolados de P. brasiliensis foi extraído de acordo com Lasker et

al., 1992. As células leveduriformes foram lisadas em 100 mg/mL de Lysing

Enzyme from Trichoderma harzianum (Sigma L1412) em tampão CES (Citrato de

sódio 20mM, EDTA 50mM, Sorbitol 0,9M) a 30°C por 3 horas, sob agitação. Os

protoplastos obtidos foram lavados adequadamente por centrifugação com

tampão de estabilização CES. Em seguida, adicionou-se 500 µL de tampão de

lise (Tris 10mM, EDTA 1mM, pH 8,0, N – lauryl sarcosine (1%) e

650µg/mLproteinase K-GIBCO) e incubou-se a 65°C po r 1 hora. Após este

período, 200 µL de NaCl 5M foram adicionados e incubou-se a 65°C por 10

minutos. Em seguida, adicionou-se 100 µL de solução 10% de CTAB/NaCl 4,1%e

incubou-se novamente a 65°C por 20 minutos. Adicion ou-se RNAse A 50 µg/mL

(Roche Diagnóstica) a 37°C por 1 hora. Duas extraçõ es, com igual volume de

clorofórmio isoamílico (24:1), foram realizadas com centrifugação em 17500xg por

10 minutos. O DNA foi precipitado com igual volume de isopropanol a – 20°C por

30 minutos. Outra centrifugação foi feita a 17500 x g /10 min e depois foi feita

lavagem com etanol 70%. Em seguida, foi feita outra centrifugação em 17500xg

por 5 minutos a 4°C. Após isto, o DNA obtido foi se co, ressuspenso em Tampão

TE (Tris 40mM, EDTA 2mM, pH7.5) a 37°C por 1h. A de terminação da pureza do

DNA foi feita pela relação da leitura espectrofotométrica em densidade óptica a

260nm e 280nm e a quantificação, pela densidade óptica 260nm. (SAMBROOK et

al., 2001). A eletroforese foi feita em gel 1% de agarose com tampão TBE (Tris

45mM, Ácido Bórico 45mM, EDTA 10mM pH7,5 ) 1x. A corrida foi realizada

durante 1 hora e visualizada através de brometo de etídio em luz ultravioleta.

3.1 Análise por RAPD-PCR

A tipagem molecular dos isolados de P. brasiliensis foi realizada pela

reação de RAPD ("Random Amplified Polymorphic DNA") com o Sistema

comercial Ready to go (GE Healthcare). Foi utilizada a seqüência iniciadora 4 do

sistema comercial Ready to go / RAPD Analysis Beads – GE Healthcare (5´-

d[AAGAGCCCGT]-3´). Cada mistura reacional de RAPD continha 30ηg/µL de

DNA de P. brasiliensis, 25pmol da sequencia iniciadora 4 do Sistema comercial

Ready to go e a mistura liofilizada deste mesmo Sistema comercial (contém

0,4mM de uma mistura de dNTP, 3mM de MgCl

e Taq DNA polymerase). A

amplificação foi feita no termociclador (Perkin Elmer, mod Gene Amp PCR

System 9700) através do seguinte ciclo: desnaturação de 95°C durante 5 minutos

e 45 ciclos de 95°C por 1 minuto, 36°C por 1 minuto e 72°C por 2 minutos. Os

produtos de amplificação obtidos foram analisados por eletroforese em gel de

agarose 2.0% em tampão TBE 1x durante 2 horas e 30 minutos a 150 volts.

Como marcador molecular foi usado 100 pb “Ladder” (GIBCO). Foi realizada

coloração com brometo de etídio na concentração de 0,5·g/mL, visualização à luz

ultravioleta e fotodocumentação.

3.2.PCR fingerprinting

Foram utilizadas as seqüências minisatélite específica do fago tipo-

selvagem M13 (GAGGGTGGCGGTTCT) e a microsatélite específica (GACA)

Cada mistura reacional continha 30ηg/µL de DNA de P. brasiliensis, 25pmol de

cada seqüência iniciadora específico e a mistura liofilizada do Sistema comercial

Ready to go (contém 0,4mM de uma mistura de dNTP, 3mM de MgCl

e Taq DNA

polymerase). A amplificação foi feita no termociclador (Perkin Elmer, mod Gene

Amp PCR System 9700) por 35 ciclos de 94°C por 20 s egundos, 50°C por 1

minuto e 72°C por 20 segundos, seguidos por uma ext ensão final a 72ºC por 6

minutos. Os produtos de amplificação obtidos foram analisados por eletroforese

em gel de agarose 2.0% em tampão TBE 1x durante 2 horas e 30 minutos a 150

volts. Como marcador molecular foi usado 100 pb “Ladder” (GIBCO). Foi realizada

coloração com brometo de etídio na concentração de 0,5·g/mL e visualização à

luz ultravioleta com fotodocumentação.

3.3 Análise de Dados

A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o programa

computacional Bionumerics (Applied Maths) e os dendrogramas foram

construídos por UPMGA (Unweighted Pair-Group Method, Arithematic averages).

4. Preparo dos extratos de P. brasiliensis

O extrato cell-free foi obtido dos diferentes isolados de P. brasiliensis (Pb

113, Pb 265, Pb 18 e Pb 339), na fase leveduriforme (L) antes e depois do

reisolamento do fungo para isolamento e caracterização de proteínas

relacionadas com infecção diferencial observada anteriormente. A concentração

protéica dos extratos foi quantificada pelo método de Lowry et al. (1951) e pelo

método de Bradford (BioRad) e em seguida as amostras foram avaliadas por

SDS-PAGE.

5. Análise protéica por eletroforese bidimensional.

Os componentes protéicos dos isolados de P. brasiliensis foram

primeiramente submetidos à focalização isoelétrica, utilizando o sistema Ettan

IPGphor 3 (GE Healthcare). A segunda dimensão, realizada para a separação das

proteínas de acordo com a massa molecular, foi realizada em gel de

poliacrilamida 12.5% de acordo com Laemmli, 1970. Os géis foram corados

utilizando Azul de Comassie Brilhante G250 segundo Neuhoff et al. (1988).

6. Caracterização de proteínas de P. brasiliensis como ligantes de proteínas

da matriz extracelular por Far-Western.

Para caracterizar proteínas diferencialmente expressas envolvidas na

interação P. brasiliensis – matriz extracelular foi realizada a técnica de Far-

Western. Para tanto, os extratos cell-free dos isolados antes e após o

reisolamento foram submetidos à eletroforese bidimensional, posteriormente

transferidos para membranas de nitrocelulose, e nesta foi realizada a técnica de

Far-Western. Nessa etapa, as membranas foram bloqueadas com leite 5% e BSA

1% por 4h, em seguida foram incubadas com laminina (Sigma-Aldrich),

fibronectina (Sigma-Aldrich), colágeno tipo I (Sigma-Aldrich) por 90 min. Depois

de lavadas por três vezes com PBS-T(PBS acrescido de 0,25% de Tween 20) ,

foram adicionados, no título 1:100, os anticorpos primários adequados (anti-

laminina (DAKO Cytomation), anti-fibronectina (DAKO Cytomation) e anti-

colágeno tipo I (Sigma-Aldrich)) e incubados por 18h. Mais uma vez as

membranas foram lavadas com PBS-T e o anticorpo secundário anti-rabbit IgG

conjugado com peroxidase (Santa Cruz Biotecnologies) foi adicionado no título

1:5000. Finalmente, as membranas foram lavadas com PBS-T e foi adicionado

peróxido de hidrogênio, luminol e ácido cumárico para então ser realizada a

revelação.

V. RESULTADOS

1. Testes de infecção de P. brasiliensis em cultura de células epiteliais

O ensaio de infecção foi realizado com os seguintes isolados de P. brasiliensis

antes e após o reisolamento: Pb 113, Pb 265, Pb 18, Pb 01, Pb1578R, Pb 1921,

Pb 1934, Pb 2367, Pb 2493, Pb 2508, Pb 2663, Pb 2669 e Pb2681. O período de

infecção analisado foi de 5h, tempo suficiente para o fungo ser internalizado.

Foram realizadas contagens do número de fungos (aderidos e invadidos) em

5000 células, determinando-se a porcentagem total de infecção. As amostras

reisoladas de P. brasiliensis foram capazes de apresentar padrão de infecção de

células A

549

mais eficientemente, que aquelas subcultivadas in vitro como

mostrado na figura 1 e também relacionados na tabela 1.

Figura 1: Comparação da capacidade de infecção dos isolados (Pb01, Pb18, Pb265, Pb113,

Pb1921, Pb1934, Pb2367, Pb2493, Pb2508, Pb1578, Pb2663, Pb2669 e Pb2681) de P.

brasiliensis avaliados antes e após o reisolamento, por período de incubação de 5 horas com

células A549. O gráfico representa a porcentagem total de infecção de cada isolado com valores

significantes de p<0,05.

Pb2669Pb2493

Pb2681

Pb2508

Pb1578

Pb2663

Pb265

Pb18

Pb1934

Pb113

Pb2367

Pb1921

Pb01

após a passagem por cultura de células

antes da passagem por cultura de células

Porcentagem de infecção (%)

Isolados

Tabela 1: Descrição dos isolados de acordo com a capacidade de infecção às células A549.

Isolado Origem % de Infecção antes

reisolamento

% de Infecção após

reisolamento

Nº de vezes de

aumento da % de

infecção

Pb01

Goiânia 6,5 28,5 6,4

Pb1578

Goiânia 7,0 25,0 3,6

Pb18

São Paulo 17,0 46,0 2,8

Pb113

São Paulo 9,0 14,0 1,4

Pb265

São Paulo 9,0 29,5 3,3

Pb1921

Araraquara 8,5 27,5 3,0

Pb1934

Araraquara 12,5 23,0 1,7

Pb2367

Araraquara 7,5 37,5 4,7

Pb2493

Araraquara 12,5 28,5 2,2

Pb2508

Araraquara 9,0 51,0 5,6

Pb2663

Araraquara 6,0 12,0 2,0

Pb2669

Araraquara 5,0 18,0 3,6

Pb2681

Araraquara 14,0 28,0 2,0

2. RAPD-PCR dos isolados de P. brasiliensis após o reisolamento

A análise do padrão genotípico foi realizada apenas nas amostras

reisoladas após passagem em culturas celulares. A amplificação do DNA através

da técnica de RAPD-PCR gerou perfis que variaram de quatro a oito fragmentos,

com massa de 0,13 a 1,8 Kb, com polimorfismos como demonstrado na figura 2.

Figura 2: RAPD - PCR demonstrativo dos isolados de P. brasiliensis após o reisolamento,

amplificados com a seqüência iniciadora 4 do sistema comercial Ready-to-Go (GE Healthcare) em

gel de agarose 2% revelado com brometo de etídio. MM: marcador molecular 100pb (Gibco), 1-

Pb01, 2-Pb18, 3-Pb113, 4-Pb265, 5-Pb1578, 6-Pb1921, 7-Pb1934, 8-Pb2367, 9-Pb2493, 10-

Pb2508, 11-Pb 2663, 12-Pb 2669 e 13-Pb2681.

3. PCR Fingerprinting

Para ampliar a investigação dos perfis genotípicos, também foi realizada

esta técnica e foram utilizadas as seqüências minisatélite específica do fago tipo-

selvagem M13 (GAGGGTGGCGGTTCT) e a microsatélite específica (GACA)

a) M13:

A amplificação do DNA dos isolados após o reisolamento apresentaram

perfis que variaram de 3 a 7 fragmentos, com tamnahos de 0,1 a 1,8 Kb, como

demonstrado na figura 3.

600 -

2000 -

MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 MM

600 -

2000

MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 MM

600

2000

Figura 3: Amplificação com a sequência minisatélite M13 dos isolados de P. brasiliensis após o

reisolamento em gel de agarose 2% revelado com brometo de etídio. MM: marcador molecular

100pb (Gibco), 1-Pb01, 2-Pb18, 3-Pb113, 4-Pb265, 5-Pb1578, 6-Pb1921, 7-Pb1934, 8-Pb2367, 9-

Pb2493, 10-Pb2508, 11-Pb 2663, 12-Pb 2669 e 13-Pb2681.

b) (GACA)

Com a seqüência microsatélite (GACA)

os perfis variaram de 3 a 7

fragmentos, com fragmentos de 0,2 a 2,0Kb, como demonstrado na figura 4.

Figura 4: Amplificação com a sequência microsatélite (GACA)

dos isolados de P. brasiliensis

após o reisolamento em gel de agarose 2% revelado com brometo de etídio. MM: marcador

molecular 100pb (Gibco), 1-Pb01, 2-Pb18, 3-Pb113, 4-Pb265, 5-Pb1578, 6-Pb1921, 7-Pb1934, 8-

Pb2367, 9-Pb2493, 10-Pb2508, 11-Pb 2663, 12-Pb 2669 e 13-Pb2681.

4. Análise dos perfis genotípicos obtidos

Os dendrogramas obtidos pela análise do RAPD e do PCR fingerprinting

estão demonstrados nas figuras 5-7. Os perfis de RAPD e PCR-fingerprinting

foram analisados de acordo com a presença ou ausência de fragmentos claros e

definidos a partir das imagens digitalizadas capturadas dos géis (Figuras 2, 3 e 4)

e utilizadas para a confecção dos dendrogramas.

Os isolados apresentaram similaridade entre 0,20 a 1,0 quando foi utilizada

a seqüência número 4 (OPJ4) do sistema comercial Ready to go (GE Healthcare).

O dendrograma obtido com esta seqüência mostrou alta heterogeneidade entre

os isolados. A média do coeficiente de similaridade foi de 0,45 ± 0,3. Estes foram

distribuídos em dois grupos principais, com baixa similaridade entre eles. O grupo

I subdividiu-se em três subgrupos, envolvendo isolados com similaridade em torno

de 60%. Um clone envolveu três isolados de Araraquara (Pb1921, Pb2508 e

Pb2367) e similaridade de 60% entre os três subgrupos. O isolado 01R

apresentou identidade de 90% com o isolado Pb1578, que é proveniente da

mesma região do país e ambos com Pb18 em torno de 70% (Figura 6). No grupo

II, formado apenas com três isolados, dois tinham 1,0 de similaridade (2663 e

2669) e correlação de 70% com o isolado 2681.

Os isolados de Araraquara foram distribuídos entre o grupo I e II, sendo

que o este último concentrou apenas aqueles desta região. A mediana dos

índices de infecção dos grupos I e II foi em torno de 28,5 e 19%, respectivamente.

Os dois isolados de Goiânia apresentaram índices de similaridade altos e

aproximados em relação ao de infecção, em torno de 26%. Os dois clones,

presentes em grupos distintos com baixa similaridade entre si, envolveram

isolados de Araraquara com índices de infecção diversos, o primeiro com média

de aproximadamente 39% e o outro 15%.

Figura 5: Dendrograma dos isolados de P. brasiliensis após o reisolamento, obtido pela análise

dos produtos de amplificação com a seqüência iniciadora OPJ4 do sistema comercial Ready-to-

Go.

O dendograma obtido pela análise do PCR fingerprinting com o iniciador

M13 demonstrou que a similaridade para os isolados após o reisolamento variou

de 0,20 a 1,0. A média do coeficiente de similaridade foi de 0,47 ± 0,3. Treze

isolados estavam distribuídos em dois agrupamentos, com três clones. O primeiro

clone (Pb2367 e Pb2508) apresentou similaridade de 70% com os acima

descritos, formando um subgrupo, com os isolados de Araraquara. Outro

subgrupo incluía Pb01R e Pb1578R, com coeficiente em torno de 75%, mas com

similaridade em torno de 50% em relação ao subgrupo acima descrito (Figura 6).

O grupo II englobava seis isolados, com um clone formado com Pb113 e Pb1934

e com similaridade de 75% com Pb2493. Estes três isolados apresentaram

relação com Pb265 em torno de 70%. Outros dois isolados que incluíam Pb18 e

1921 apresentaram similaridade de 80% entre si. O índice de similaridade entre

os dois grupos foi de 30%.

Os isolados agruparam-se de maneira não muito homogênea em relação

ao padrão de infecção e a localização geográfica. Os isolados de Araraquara

foram distribuídos entre o grupo I e II, sendo que o I concentrou apenas aqueles

desta região. A mediana dos índices de infecção dos grupos I e II foi em torno de

28,5 e 28%, respectivamente, sendo que dois dos isolados com os maiores

índices de infecção ficaram no subgrupo I e o outro no II. Os dois isolados de

Goiânia apresentaram índices de similaridade altos e aproximados em relação ao

de infecção, em torno de 26%. Os dois clones, presentes no grupo I

apresentaram similaridade de 70% e envolveram isolados de Araraquara com

índices de infecção diversos, o primeiro com média de 20% e o outro 44%. O

terceiro clone, presente no subgrupo II, com baixa similaridade em relação aos do

grupo I, apresentou média de infecção de 18,5%.

Figura 6: Dendrogramas dos isolados de P. brasiliensis após o reisolamento, obtido pela análise

dos produtos de amplificação com a seqüência iniciadora M13.

Por fim, o dendrograma obtido pela análise do PCR fingerprinting com o

iniciador (GACA)

mostrou que a similaridade para os diferentes perfis também

variou de 0,20 a 1,0. A média do coeficiente de similaridade foi de 0,70 ± 0,2. Este

iniciador amplificou seqüências que mostrou homogeneidade maior entre os

isolados. Doze isolados estavam distribuídos em três agrupamentos com

coeficiente de similaridade em torno de 0,70 entre eles (Figura 7). O grupo I

subdividiu-se em três subgrupos. O primeiro formado por um clone com os

isolados Pb2681, Pb113 e Pb265, que compartilhavam similaridade de 90% com

Pb1921. Estes quatro isolados apresentavam similaridade em torno de 80% com

Pb18 e correlação com mais três isolados (1934, 2367, 2663). O subgrupo II

também apresentou um clone que incluíu os isolados Pb1578 e 2493 que foram

similares em torno de 80% a 2669. O isolado 2508 apareceu isoladamente com

índice de similaridade em torno de 70% aos outros subgrupos, enquanto que o

isolado Pb1 apareceu em outro grupo com identidade menor que 40% com os

outros isolados.

Os isolados agruparam-se de maneira não muito homogênea em relação

ao padrão de infecção e a localização geográfica. Os isolados de Araraquara

estavam concentrados somente no grande grupo I, em que apareceram também

os de São Paulo e um de Goiânia. Assim, este iniciador apresentou a menor

relação com área geográfica. Os dois clones, presentes em subgrupos distintos

com similaridade em torno de 70% entre si, envolveram isolados de São Paulo e

de Araraquara com índices de infecção diversos, o primeiro com média de

aproximadamente 24% e o outro 26%.

Figura 7: Dendrograma dos isolados de P. brasiliensis após o reisolamento, obtido pela análise

dos produtos de amplificação com a seqüência iniciadora (GACA)

5. Análise protéica através eletroforese bidimensional e caracterização das

proteínas ligantes de matriz extracelular por Far western

Extratos “cell-free” dos isolados Pb01, Pb265, Pb113 e Pb339 de P.

brasiliensis foram preparados antes e após reisolamento. O extrato 339 foi

introduzido, por se tratar do principal isolado empregado por grande número de

pesquisadores no preparo de antígenos. O perfil eletroforético destes extratos

apresentou proteínas que variaram de 109 a 14 kDa, com a diferença

principalmente relacionada à intensidade e ao número de fragmentos protéicos

majoritários. As concentrações protéicas dos extratos foram determinadas e em

média encontravam-se em torno de 5,0 mg/mL.

Os reisolados apresentaram maior expressão de proteínas em relação aos

subcultivados. O número de espécies protéicas, as massas moleculares (MM) e

os pIs determinados estão demonstrados na tabela 1.

O ensaio de Far Western foi utilizado para caracterizar as proteínas de P.

brasiliensis ligantes às proteínas da matriz extracelular. Várias proteínas

apresentaram capacidade de ligação com a laminina, fibronectina e colágeno tipo

I, que estão sumarizadas na tabela 2.

Tabela 2: Correlação entre os extratos de quatro isolados de P. brasiliensis, antes e após

reisolamento de cultura de células, suas proteínas expressas, a variação de massa molecular

(MM) e dos pIs.

Isolado Nº DE ESPÉCIES

PROTÉICAS

VARIAÇÃO DE MM*

(kDa)

VARIAÇÃO DE

Pb01

41 85 - 22 8.7 – 3.0

Pb01R3*

196 96 - 11 10.0 – 3.0

Pb113

15 90 - 10 10.0 – 3.0

Pb113R3*

135 90 - 10 10.0 – 3.0

Pb265

122 86 - 8 8.5 – 3.3

Pb265R3*

177 65 - 17 8.3 – 3.0

Pb339

18 64 - 10 9.7 – 3.2

Pb339R3*

51 96 - 10 10.0 – 3.0

*R3- amostra reisolada

Tabela 3: Proteínas dos extratos cell-free de quatro isolados de P. brasiliensis com capacidade de

ligação à MEC.

*R3- amostra reisolada

No extrato Pb01, 41 proteínas foram expressas, enquanto após o

reisolamento 196 proteínas foram observadas (PB01R3); 171 proteínas foram

diferencialmente expressas nessa amostra e 25 foram comuns (matches) as duas

(Figura 8). Quanto à capacidade de ligação a laminina, Pb01 apresentou seis

ligantes enquanto Pb01R3 apresentou 26, sendo quatro deles comuns às duas

amostras. Quanto à capacidade de ligação a fibronectina e ao colágeno tipo I,

somente Pb01R3 apresentou 15 e 10 ligantes, respectivamente (Figura 9 e

Tabela 4).

Amostra Ligantes de

laminina

Proteínas

comuns

Ligantes de

Fibronectina

Proteínas

comuns

Ligantes de

Colágeno I

Proteínas

Comuns

Pb01

06 00 00

Pb01R3*

26 04 15 00 10 00

Pb113

00 00 09

Pb113R3*

00 00 04 00 16 02

Pb265

00 00 00

Pb265R3*

06 00 00 00 27 00

Pb339

03 00 06

Pb339R3*

03 03 03 00 08 00

Figura 8: Eletroforese bidimensional do extrato “cell free” de isolado 01R3 de P. brasiliensis após

reisolamento corada por Coomassie Blue. As proteínas circuladas em vermelho estavam

presentes tanto antes quanto após o reisolamento (matches).

kDa

Figura 9: Diagrama representativo das proteínas do extrato “cell free” do isolado 01 de P.

brasiliensis capazes de se ligarem aos componentes da MEC. * Os ligantes estão representados

na tabela 4.

Tabela 4: Proteínas do extrato “cell free” de isolado 01 de P. brasiliensis capazes de se ligarem

aos componentes da MEC.

pI MM (Da)

MEC

pI MM (Da)

MEC

4,9 59634 Lm 5,4 41264 Fn, CI*

4,8 59102 Lm 7,2 41037 Lm

4,7 58575 Lm 5,4 40035 Fn

7,5 58313 Lm 6,0 39815 Lm

5,9 56766 Lm 4,9 39597 Lm, Fn*

7,2 57793 Lm 8,5 38103 Lm

5,7 56766 Lm 7,9 38103 Fn

5,9 53795 Lm 7,5 37790 Fn

5,6 53077 Lm 5,9 37894 Fn

5,2 52840 Lm 6,2 35769 Lm

5,2 46403 Lm 7,2 35378 Fn

4,9 46195 CI 7,0 35281 CI

4,4 45579 CI 5,5 33029 Lm, Fn*

5,7 45172 Lm 5,1 32668 Lm, Fn*

5,5 44769 Lm 5,5 31608 Lm, Fn, CI**

5,3 44769 Lm, Fn* 6,9 30415 Fn

6,2 44171 CI 7,8 28773 Fn, CI*

6,4 43582 CI 6,2 28914 Fn

4,7 42882 CI 6,8 27528 CI

5,8 41491 Fn

*Proteínas ligantes de dois componentes da MEC

** Proteínas ligantes de três componentes da MEC

O extrato Pb113 apresentou 15 proteínas expressas, 135 após

reisolamento (PB113R3), sendo 132 diferencialmente expressas nesta amostra e

três comuns (matches) as duas (Figura 10). Quanto à capacidade de ligação a

fibronectina, somente Pb113R3 apresentou quatro ligantes; ao colágeno tipo I,

Pb113 apresentou nove enquanto em Pb113R3 aumentou para 16, sendo dois

comuns às duas amostras e quanto à capacidade de ligação à laminina nenhum

ligante foi encontrado (Figura 11 e Tabela 5).

Figura 10: Eletroforese bidimensional do extrato “cell free” do isolado 113R3 de P. brasiliensis

após reisolamento corada por Coomassie Blue. As proteínas circuladas em vermelho estavam

presentes tanto antes quanto após o reisolamento (matches).

kDa

Figura 11: Diagrama representativo das proteínas do extrato “cell free” de isolado 113 de P.

brasiliensis capazes de se ligarem aos componentes da MEC. * Os ligantes estão representados

na tabela 5.

Tabela 5: Proteínas do extrato “cell free” de isolado 113 de P. brasiliensis capazes de se ligarem

aos componentes da MEC.

pI MM (Da)

MEC

pI MM (Da)

MEC

4,0 48120 CI 7,2 39223 Fn

6,1 47122 CI 6,6 36927 Fn

5,9 47122 CI 6,4 32731 Fn

5,7 46925 CI 6,2 32951 Fn

4,1 46534 CI 5,1 31865 CI

6,6 40020 CI 5,4 32079 CI

6,2 40020 CI 5,2 29720 CI

O extrato Pb265 apresentou 122 proteínas expressas, 177 após

reisolamento (PB265R3), sendo 147 proteínas diferencialmente expressas, dentre

essas, apenas 30 foram comuns (matches) às duas amostras (Figura12). Quanto

à capacidade de ligação aos componentes da MEC, somente Pb265R3

apresentou seis ligantes a laminina, 27 ao colágeno tipo I, e nenhum ligante foi

encontrado à fibronectina (Figura 13 e Tabela 6) .

Figura 12: Eletroforese bidimensional de antígeno “cell free” do isolado 265 de P. brasiliensis após

reisolamento corada por Coomassie Blue. As proteínas circuladas em vermelho estavam

presentes tanto antes quanto após o reisolamento (matches).

kDa

Figura 13: Diagrama representativo das proteínas do extrato “cell free” de isolado 265 de P.

brasiliensis capazes de se ligarem aos componentes da MEC. * Os ligantes estão representados

na tabela 6.

Tabela 6: Proteínas do extrato “cell free” de isolado 265 de P. brasiliensis capazes de se ligarem

aos componentes da MEC.

pI MM (Da) MEC

pI MM (Da)

MEC

4,8 65122 CI

5,2 43436 CI

7,0 64858 CI

5,4 42040 CI

4,5 63040 CI

6,8 39490 CI

5,9 60777 CI

6,5 38745 CI

5,6 57185 Lm

7,3 37500 CI

6,9 55808 CI

6,5 36493 CI

7,3 54465 Lm

7,0 35321 CI

5,9 53370 Lm

6,1 34466 CI

5,6 53587 Lm, CI*

5,2 31165 CI

6,4 52510 CI

5,4 30996 CI

4,8 52297 CI

5,4 29574 CI

4,7 50216 CI

5,2 29715 CI

6,6 48808 Lm

5,9 28129 CI

6,3 47633 Lm, CI

6,2 25876 CI

8,3 47056 CI

5,7 22372 CI

4,3 44878 CI

*Proteínas ligantes de dois componentes da MEC

Por fim, a amostra protéica Pb339 apresentou 18 proteínas expressas, 51

proteínas após reisolamento (PB339R3), sendo 43 diferencialmente expressas,

dentre essas, apenas 08 foram comuns (matches) às duas amostras (Figura 14).

Quanto à capacidade de ligação a laminina, em ambas as amostras, três ligantes

foram encontrados, sendo idênticos as isoformas da gp43, com pIs de 6.3, 5.9 e

5.7 (Figura 15 A e B); em relação à fibronectina, apenas Pb339R3 apresentou três

ligantes (Figura 15C) e ao colágeno tipo I (Figura 15C) , seis e oito ligantes,

respectivamente antes (Pb339) e depois (Pb339R3), mas nenhum foi comum às

duas amostras (Figura 16 e Tabela 7).

Figura 14: Eletroforese bidimensional de antígeno “cell free” do isolado 339 de P. brasiliensis após

reisolamento corada por Coomassie Blue. As proteínas circuladas em vermelho estavam

presentes tanto antes quanto após o reisolamento (matches).

kDa

Figura 15: Ensaio de Far Western do antígeno “cell free” do isolado 339 de P. brasiliensis

demonstrando à capacidade de ligação a laminina antes (A) e após (B) o reisolamento das

isoformas da gp43 de pIs 6.3, 5.9 e 5.7; e também a capacidade de ligação a fibronectina e ao

colágeno tipo I apenas após o reisolamento (C) das isoformas da gp43 de pIs 6.7, 6.6 e 5.5.

Figura 16: Diagrama representativo das proteínas do extrato “cell free” de isolado 265 de P.

brasiliensis capazes de se ligarem aos componentes da MEC. * Os ligantes estão representados

na tabela 7.

Tabela 7: Proteínas do extrato “cell free” de isolado 339 de P. brasiliensis capazes de se ligarem

aos componentes da MEC.

pI MM (Da) MEC

5,1 56346 CI

4,9 48398 CI

6,6 42581 CI

6,8 42269 CI

6,7 42581 Fn, CI*

6,6 39565 Fn, CI*

5,5 38231 Fn, CI*

1,6 27389 CI

*Proteínas ligantes de dois componentes da MEC

Diante dos dados apresentados, as proteínas presentes em mais de um

isolado de P. brasiliensis estão representadas na tabela 8 e aquelas que foram

capazes de se ligar a mais de um componente da MEC foram representadas na

tabela 9.

Tabela 8: Proteínas ligantes aos componentes da matriz extracelular, presentes em mais de um

isolado de P. brasiliensis

Isolados pI MM (kDa) MEC

01R3, 113R3 e 339R3 6,6 38 Fn*

01R3, 265R3 7,3 53

01R3, 265R3 5,9 55 Lm

01R3, 265R3 5,7 57 Lm

265R3, 339R3 6,5 43 Lm

265R3, 339R3 6,7 43 Lm

265R3, 113R3 5 35

***

265R3, 113R3 6,7 38 CI

339R3, 113R3 5,3 40 CI

339R3, 113R3 6,7 41 CI

01R3, 113R3 4,5 42 CI

01R3, 265R3 5,3 43 CI

01R3, 339R3 6,2 44 CI

01R3, 265R3 4,3 45 CI

265R3, 113R3 6 47 CI

339R3, 113R3 5,6 46 CI

339R3, 113R3 5,4 46 CI

265R3, 113R3 6,2 47 CI

265R3, 339R3 5,6 51 CI

Fibronectina, **Laminina, ***Colágeno tipo I

Tabela 9: Proteínas de P. brasiliensis capazes de se ligar a mais de um constituinte da MEC.

Isolado pI MM (kDa) MEC

01R3 5,3 43

, Fn

01R3 5,4 41

Fn, CI

***

01R3 4,9 39 Lm, Fn

01R3 5,5 33 Lm, Fn

01R3 5,1 32 Lm, Fn

01R3 5,5 31 Lm, Fn, CI

01R3 7,8 26 Fn, CI

265R3 5,6 53 Lm, CI

265R3 6,3 47 Lm, CI

339R3 5,7 42 Fn, CI

339R3 5,6 39 Fn, CI

339R3 5,5 39 Fn, CI

*Fibronectina, **Laminina, ***Colágeno tipo I

DISCUSSÃO

As propriedades de P. brasiliensis tais como composição da parede celular

(α-1,3-glucana), capacidade de crescimento à 37

C, dimorfismo, produção da

gp43, proteinases, e capacidade de adesão a células do hospedeiro são

relevantes e podem exercer um papel crítico na infecção (SAN-BLAS & SAN-

BLAS, 1994; KUROKAWA et al., 1998; HOGAN et al., 1996; BRITTO et al., 1973;

MENDES-GIANNINI et al., 2007). Este fungo após subcultivos sucessivos altera o

seu padrão de patogenicidade, o que pode ser revertido pelo reisolamento do

agente após passagem em animal, ou de culturas celulares recuperando assim

provavelmente alguns fatores de virulência (BRUMMER et al.,1990; ANDREOTTI,

2005). A maioria dos estudos tem focado dois isolados, Pb18 e Pb01, o que

contribuiu para aumentar o conhecimento que se tem hoje deste microrganismo

(MOTTA et al., 2002; BAILÃO et al., 2006; ANDRADE et al., 2007; NUNES et al.,

2005; FELIPE et al., 2005). Outros isolados como Pb339 e Pb113 foram

principalmente empregados no estudo de extratos antigênicos em reações

sorológicas (DEL NEGRO et al., 2000; CAMARGO et al.,2003).

Procurando ampliar o conhecimento deste fungo, no presente trabalho

pretendeu-se estudar 13 diferentes isolados antes e após o reisolamento através

da passagem por cultura de células para verificar a sua capacidade de infecção

aos pneumócitos (linhagem A549). Nossos resultados mostraram padrões de

infecção diferenciais entre as amostras subcultivadas e reisoladas, sendo que

todas as amostras reisoladas demonstraram maior capacidade de infecção

quando comparada com as subcultivadas in vitro. Comparando-se os diferentes

isolados, verificou-se que o aumento na capacidade de infecção variou de 1,4 a

6,4 vezes, após reisolamento do agente e que os diferentes isolados

apresentaram índices de infecção variáveis.

Estudos têm demonstrado a capacidade de adesão e invasão de P.

brasiliensis (MENDES-GIANNINI et al., 1994), sendo o fenômeno de aderência

variável dependendo do isolado (HANNA et al., 2000). Em estudos empregando

cultura de células epiteliais foi observado que Pb18, considerada mais patogênica

para animais e mais aderente, após vários subcultivos perdia esta capacidade,

havendo, portanto relação entre virulência e capacidade de adesão. Amostras

recém isoladas, tanto de animais como de culturas celulares, recuperavam a

capacidade de aderir e invadir células epiteliais. Andreotti et. al., 2005 verificaram

um componente de 30kDa foi mais expresso após reisolamento do isolado Pb18,

mostrando assim, que uma proteína com característica de adesina poderia estar

envolvida na virulência deste fungo. Ainda, os isolados de P. brasiliensis não têm

comportamento homogêneo como descrito por vários autores e estes dados

referem-se às diferenças nos componentes da parede celular (SAN-BLAS & SAN-

BLAS, 1982), às características morfológicas, à taxa de crescimento (KASHINO et

al., 1985), à composição antigênica, em infecções experimentais (BIAGIONI et al.,

1986; KASHINO et al., 1985, SINGER-VERMES et al., 1989, SINGER-VERMES

et al., 1994) e também nos padrões de adesão, como demonstrado anteriormente

(HANNA et al., 2000) e confirmado neste estudo com isolados recentes de

pacientes (Araraquara - SP) e outros já estudados. Pb18 foi o mais aderente

mesmo sem reisolamento, mas após, os isolados considerados menos

patogênicos e com aderência menor, como Pb265, passaram a ter padrão de

infecção semelhante ao dos isolados de Araraquara, mas menor que 30%. Assim,

o padrão de infecção acima de 30% incluía somente os isolados Pb18, Pb2508 e

Pb2367, e abaixo de 20% Pb2669, Pb113 e Pb2663. Os isolados Pb2669 e

Pb2663 também apresentavam menor capacidade de adesão antes de reisolado.

Desta maneira estudos posteriores deverão ser realizados para verificar se estas

mudanças de padrão estariam relacionadas com algum componente como foi

verificado por Andreotti et.al.,2005.

Por outro lado, com o progresso de técnicas de biologia molecular foi

possível investigar a diversidade de patógenos baseada em suas características

genômicas (CLARK & LANIGAN, 1993). A técnica do RAPD foi utilizada para

detectar estas variações entre isolados de vários fungos causadores de doença

em humanos entre eles P. brasiliensis (CALCAGNO et al., 1998; BAGAGLI et al.,

1998; MOLINARI-MADLUM et al., 1999; SOARES et al., 1995). Neste estudo

foram avaliados treze isolados de P. brasiliensis correlacionando sua virulência

(capacidade de adesão em células epiteliais) com padrões em RAPD e PCR

fingerprinting. Os resultados com dois iniciadores (OPJ4 e M13) mostraram grau

de similaridade baixo entre os isolados, mas aparentemente houve relação entre

distribuição geográfica e os padrões de infecção. Por outro lado, embora o grau

de similaridade fosse maior com GACA4, os isolados agruparam-se de maneira

não muito homogênea em relação ao padrão de infecção e a localização

geográfica. O iniciador GACA4 agrupou os isolados em índices ao redor de 70%.

Um dado que chama atenção é quanto ao agrupamento em torno de índices de

similaridade ao redor de 90% e 75% dos isolados de Goiânia (Pb01 e Pb1578),

agrupados por dois dos iniciadores (OPJ4 e M13), mas bastante distinto no caso

de GACA4. Por outro lado com esta seqüência iniciadora foi observada

diferenciação do isolado Pb01 em relação aos demais. Os isolados empregados

neste estudo foram de regiões próximas geograficamente falando, mesmo assim,

apresentaram índices de similaridade distintos principalmente com GACA4, ao

contrário dos resultados de CALCAGNO et al (1998) que demonstraram que

diferenças genéticas poderiam estar associadas com diferentes regiões

geográficas, mas não com diferentes manifestações clínicas de

paracoccidioidomicose.

Fatores múltiplos podem contribuir para a grande variabilidade genética no

genoma de P. brasiliensis, bem como de outros fungos, como observado neste

estudo e em outros empregando métodos moleculares. Neste trabalho

empregando três iniciadores, pode-se verificar que pelo menos em dois destes, os

isolados com maior ou menor grau de infecção agruparam-se no mesmo clone ou

em subgrupos aproximados. No entanto, foi observado que isolados com índices

maiores e menores de infecção muitas vezes estavam no mesmo clone. Ao

contrário, MOLINARI-MADLUM et al (1999) demonstraram que padrões em RAPD

foram correlacionados com o grau de virulência de isolados de P. brasiliensis. Já

MOTTA et al (2002) estudaram a diferença entre a amostra 18 de P. brasiliensis

com virulência atenuada após subcultivos e amostras 18 após passagem e

reisolamento em animais e demonstraram que estas apresentaram capacidades

diferentes de infectar camundongos, mas padrões idênticos no RAPD, mostrando

100% de similaridade entre estas amostras. Contrariamente, Andreotti, 2002

verificou que as duas amostras de Pb18 apresentavam padrões diferenciais

quanto adesão a células epiteliais bem como diferentes perfis no RAPD. Quando

foi empregado o iniciador OPJ4 foi obtido um fragmento de 300bp para Pb18b,

não observada no perfil de Pb18

a. Então a diferença encontrada no RAPD foi

relacionada ao padrão diferencial de adesão de P. brasiliensis a células epiteliais,

em contraste aos resultados de Motta et al., (2002). Esta banda quando clonada e

sequenciada foi caracterizada como adaptina, que pode ter papel na virulência

deste fungo (ANDREOTTI et al., 2007). Por outro lado, a utilização em nosso

estudo de GACA4 mostrou o aparecimento de uma banda homogênea de

aproximadamente 900pb em todos os isolados, com exceção de Pb2669, obtido

de lesão de pele o que o torna diferente dos demais isolados da região de

Araraquara. Esse achado pode ter significado como marcador genético.

P. brasiliensis produz uma série de substâncias com características

antigênicas ou não que podem ser liberadas ou produzidas durante o crescimento

fúngico. Tais substâncias interagem com o hospedeiro de várias maneiras,

provavelmente nos processos adesivos e/ou com o sistema imune. O papel da

maioria dos componentes deste fungo, na patogenia da doença e na resposta

inflamatória do hospedeiro, é ainda desconhecido. Diferentes componentes estão

presentes no extrato denominado “cell-free” que foi primeiro utilizado por BLOTTA

E CAMARGO (1993). Este preparado corresponde aos componentes mais

superficiais da célula fúngica e são provavelmente os que mais diretamente

entram em contato com as células do hospedeiro. Em nosso estudo este extrato

foi preparado de quatro diferentes isolados, antes e após passagem em cultura de

células e os padrões eletroforéticos mostraram primeiramente diferenças em

relação à intensidade e ao número de fragmentos majoritários. Extratos protéicos

de diferentes microrganismos têm sido caracterizados por eletroforese

bidimensional, que além de diferenciar proteínas por massa molecular, também

as separam de acordo com seu pI (ponto isoelétrico). Em P. brasiliensis esta

metodologia foi utilizada para caracterizar novos antígenos da fase leveduriforme

do fungo e comparar a expressão destes com a fase miceliana (FONSECA et al.,

2001). No intuito de melhor caracterizar e diferenciar os perfis protéicos das

amostras antes e após o reisolamento, esta metodologia foi empregada, também

como etapa inicial para a verificação da capacidade de ligação destas proteínas

aos componentes da MEC e para a verificação de perfis diferenciais entre os

isolados. Maior expressão de proteínas nas amostras após a passagem por

cultura de células também foi demonstrada em relação às amostras subcultivadas

in vitro. Os isolados Pb01 e Pb339 apresentaram ligantes para fibronectina

apenas após o reisolamento, mostrando que aparentemente estes ligantes

possam ter papel na patogenicidade. O mesmo ocorreu com Pb01 para colágeno.

O isolado Pb113, mesmo após reisolamento, não apresentou ligantes de laminina,

enquanto que Pb265 não apresentou ligantes para fibronectina. Assim, de acordo

com estes dados pode-se verificar que dependendo do isolado tem-se diferentes

padrões de ligantes a MEC. P. brasiliensis é capaz de causar doença em

humanos e a determinação da diferença entre estes isolados tem sido útil para

identificar características imunológicas e bioquímicas relacionadas à virulência

(SINGER-VERMES et al, 1978).

Uma das facetas importantes de P.brasiliensis é a sua habilidade de aderir

aos componentes de matriz extracelular, bem como a células epiteliais

pulmonares. Este para colonizar e disseminar-se usa uma gama extensa de

estratégias, incluindo as adesinas (MENDES-GIANNINI et al., 2006).

Desta forma,

proteínas do hospedeiro como laminina, colágeno, fibronectina, fibrinogênio e o

componente C

do complemento estão sendo estudadas como ligantes dos

microrganismos (PATTI et al.,1994).

Neste estudo, a proteína de 38 kDa, pI 6,6, ligante de fibronectina estava

presente em três dos quatro extratos avaliados, e a de 31 kDa, pI 5,5, presente no

isolado Pb01 reconheceu os três componentes da MEC estudados. As outras 18

proteínas foram expressas em pelo menos dois dos extratos estudados, como

ligantes de laminina e/ou colágeno tipo I. Dentre essas podemos citar como

ligantes de laminina as seguintes proteínas: 53 kDa e pI 7,3; 55 kDa e pI 5,9; 57

kDa e pI 5,7 presentes em Pb01R3 e Pb265R3; 43 kDa e pI 6,5; 43 kDa e pI 6,7

presentes em Pb265R3 e Pb339R3. Quanto aos ligantes de colágeno tipo I,

presentes em mais de um isolado, podemos citar: 35 kDa e pI 5,0 presente em

Pb265R3 e Pb113R3; 40 kDa e pI 5,3; 41 kDa e pI 6,7 presentes em Pb339R3 e

Pb113R3; 42 kDa e pI 4,5 presente em Pb01R3 e Pb113R3; 43 kDa e pI 5,3

presente em Pb01R3 e Pb265R3; 44 kDa e pI 6,2 presente em Pb01R3 e

Pb339R3; 45 kDa e pI 4,3 presente em Pb01R3 e Pb265R3; 47 kDa e pI 6,0

presente em Pb265R3 e Pb113R3; 46 kDa e pI 5,6; 46 kDa e pI 5,4 presentes em

Pb339R3 e Pb113R3; 47 kDa e pI 6,2 presente em Pb265R3 e Pb113R3; 51 kDa

e pI 5,6 presente em Pb265R3 e Pb339R3.

Neste trabalho também se identificou diferentes proteínas expressas por P.

brasiliensis capazes de se ligar a diferentes constituintes da MEC

simultaneamente, dentre as quais podemos citar as proteínas no isolado Pb01:

45kDa, pI 5,3 ligante de laminina e fibronectina ; 41kDa, pI 5,4 ligante de

fibronectina e colágeno tipo I; 39kDa, pI 4,9 ligante de laminina e fibronectina ;

33kDa, pI 5,5 ligante de laminina e fibronectina ; 32kDa, pI 5,1 ligante de laminina

e fibronectina ; 31kDa, pI 5,5 ligante de laminina e fibronectina e colágeno tipo I ;

26kDa, pI 7,8 ligante de fibronectina e colágeno tipo I ; no isolado Pb265, 53kDa,

pI 5,6 ligante de laminina e colágeno tipo I ; 47kDa, pI 6,3 ligante de laminina e

colágeno tipo I ; e no isolado 339, a de 42kDa, pI 5,7 ligante de fibronectina e

colágeno tipo I ; 39kDa, pI 5,6 ligante de fibronectina e colágeno tipo I ; 39kDa, pI

5,5 ligante de fibronectina e colágeno tipo I. A identificação e caracterização de

adesinas fungicas têm nos últimos anos sido otimizada pelos avanços da biologia

molecular e mais recentemente pelo sequenciamento dos genomas de boa parte

destes fungos. Algumas adesinas dos fungos estudados foram descritas, mas

ainda não foram estudadas de maneira mais global. Alem disso, dos dados

gerados pelo conhecimento que se tem de leveduras como Candida albicans, que

tem a maioria das adesinas caracterizadas, pode ser predito que se poderá

encontrar múltiplas adesinas, distintas dependendo da condição do

microambiente. Deve-se imaginar que esta multiplicidade seja maior à medida

que o microrganismo tem capacidade de se alojar em diferentes tecidos. Estas

adesinas podem ser codificadas por um ou mais genes. Várias proteínas têm sido

descritas neste fungo e entre elas temos uma triose fosfato isomerase de 29kDa,

pI 5,8 (PEREIRA et al., 2004); uma formamidase de 45kDa (BORGES et al.,

2005); uma N-acetil beta –D- glucosaminidase de 64,7kDa, pI 6,35 (SANTOS et

al., 2004); uma proteína ribossomal de14,5kDa, pI 11,0 (JESUÍNO et al., 2004);

uma catalase de 61kDa, pI 6,2 (MOREIRA et al., 2004). Algumas das proteínas

descritas podem estar relacionadas a estas. Por outro lado, algumas proteínas

foram descritas como tendo importante papel em sua patogênese (BARBOSA et

al., 2006; PEREIRA et al., 2007; GONZALEZ et al., 2005; VICENTINI et al., 2004;

ANDREOTTI et al., 2005; MENDES-GIANNINI et al., 2006). Entre estas se tem a

gp43 (VICENTINI et.al.,1994), a de 19 e 32kDa, pI 6,6 (GONZALEZ et.al.,2005); a

GPDH, 36kDa, pI 6,8 (BARBOSA et.al.,2006), a de 30kDa, pI 4,9 (ANDREOTTI

et.al.,2005). Em nosso estudo as isoformas da gp43 de pIs 6.0 e 6.3 (presente no

isolado Pb339 e Pb265) e 5.7 (presente apenas no isolado Pb339) reagiram com

laminina, enquanto as isoformas de pI 6.7, 6.6 e 5.5 (presente apenas no isolado

Pb339) foram capazes de se ligar à fibronectina e ao colágeno tipo I , confirmando

dados anteriores e aumentando o nosso conhecimento das diferentes isoformas

da gp43 que reagem com componentes da MEC. Em trabalhos anteriores, esta

proteína foi também reconhecida como provável adesina para laminina e

fibronectina, entre outros componentes (MENDES-GIANNINI et al., 2006). Assim,

ampliando estes dados, descreveu-se aqui que os vários isoformas podem reagir

diferentemente com componentes da MEC, dependendo do isolado.

Os ligantes para componentes da MEC possuem uma distribuição

característica na superfície de células leveduriformes (HANNA et al., 2000;

MONTEIRO DA SILVA et al., 2001) e foi demonstrado um padrão de

reconhecimento diferencial ao se compararem estes componentes da MEC frente

aos componentes antigênicos das cepas Pb18 e Pb265 (VICENZI, 2000;

MENDES-GIANNINI et al., 2000). Experimentos de inibição mostraram que o

tratamento do fungo com laminina e fibronectina e seus peptídeos sintéticos

reduziram a aderência a células Vero (MENDES-GIANNINI et al., 2000;

MENDES-GIANNINI et al., 2006), provavelmente, componentes diferenciais

também estão presentes nestes dois isolados levando a diferença na adesão e

conseqüentemente na sua virulência.

Mais recentemente tem sido depreendido que uma das estratégias

possivelmente utilizadas por este patógeno no processo infeccioso (BAILÃO et al.,

2006; 2007; BASTOS et al.2007, COSTA et al., 2007), seria a expressão de

genes relacionados ao seu micronicho, envolvendo adaptação às condições do

hospedeiro, que pode também estar relacionado à captação de micro nutrientes e

influenciar no padrão de adesinas, conforme demonstrado recentemente, quando

isolado de P.brasiliensis expressou número maior de proteínas com

características de adesinas após reisolamento de animais, de culturas de células

epiteliais, ou na presença de sangue (ANDREOTTI et al., 2005; DONOFRIO,

2006). P.brasiliensis é considerado um fungo intracelular facultativo, mas este

pode aderir e invadir células epiteliais in vivo e in vitro (HANNA et al., 2000;

MENDES-GIANNINI et al., 2000; De BRITO et al.,1973).

P. brasiliensis pode desenvolver vários fenótipos (crescimento, invasão e

metástase) dependendo do isolado, o hospedeiro e outros fatores (MENDES-

GIANNINI et al., 2000). Assim, o patógeno pode provavelmente regular a

expressão de adesinas para sobreviver e causar doença. Esta expressão

diferencial refletiria a habilidade de expressão de ligantes mais efetivas em

determinada condição.

VII. CONCLUSÕES

 O reisolamento de P. brasiliensis aumentou a capacidade de infecção dos

isolados testados demonstrando que a virulência pode ser atenuada com

subseqüentes ciclos de subcultivo e recuperada através da passagem por cultura

de células.

 Perfis diferenciais de RAPD e PCR fingerprinting foram observados e também

correlação com área geográfica e padrão de infecção pode ser observada.

 A análise protéica dos extratos “cell free” de P. brasiliensis, por eletroforese

bidimensional também forneceu perfis diferenciais entre as amostras

subcultivadas e reisoladas.

 Foi observada diferença na expressão de ligantes à MEC dependendo do

isolado.

 Diferentes isoformas da gp43 reagiram com diferentes componentes da MEC,

incluindo colágeno tipo I.

 Foi verificado a presença em três dos quatro isolados avaliados de um ligante

à fibronectina de 38kDa e pI6.6 e de um ligante aos três componentes da MEC de

31kDa e pI5.5.

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