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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
“ESTUDOS ESTRUTURAIS COM FOSFOLIPASES A
2
HOMÓLOGAS DO
VENENO DE SERPENTES DO GÊNERO Bothrops:
PROPOSIÇÃO DE UM NOVO SÍTIO MIOTÓXICO”
JULIANA IZABEL DOS SANTOS
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biociências, Câmpus de Botucatu,
UNESP, para obtenção do título de
Mestre em Biologia Geral e Aplicada
BOTUCATU - SP
2007
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
“ESTUDOS ESTRUTURAIS COM FOSFOLIPASES A
2
HOMÓLOGAS DO
VENENO DE SERPENTES DO GÊNERO Bothrops:
PROPOSIÇÃO DE UM NOVO SÍTIO MIOTÓXICO”
JULIANA IZABEL DOS SANTOS
DR. MARCOS ROBERTO DE MATTOS FONTES
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biociências, Câmpus de Botucatu,
UNESP, para obtenção do título de
Mestre em Biologia Geral e Aplicada
BOTUCATU - SP
2007
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Agradecimentos
Ao professor Dr. Marcos Roberto de Mattos Fontes, por me confiar este trabalho, pelas
oportunidades e também pelas conversas e dicas que me propiciaram crescimento
científico;
Ao prof. Dr. Andreimar Martins Soares, pelo fornecimento das amostras que foram
utilizadas neste trabalho;
À Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa concedida
(processo no. 05/52565-5);
Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), por disponibilizar suas instalações
para as coletas de dados;
Aos mestrandos Carlos Alexandre Henrique Fernandes e Matheus Fazian Ige Gondo, por
ajudas valiosas em vários momentos;
À Cilene do Carmo Frederici Padilha, pelas ajudas quando necessitei;
Aos professores Dr. Ney Lemke e Dr. Roberto Morato Fernandez, que me ajudaram nas
análises finais deste trabalho.
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas ................................................................................................................................ I
Lista de Figuras .......................................................................................................................................... II
Lista de Tabelas .......................................................................................................................................... V
Resumo ......................................................................................................................................................... VI
Abstract ........................................................................................................................................................VII
1. Introdução ................................................................................................................................................. 1
1.1. A importância do estudo estrutural de proteínas de venenos de serpentes do gênero Bothrops ................. 1
1.2. Fosfolipases A
2
: componentes protéicos de elevado interesse científico e biotecnológico ........................ 2
1.3. Fosfolipases A
2
de venenos de serpentes (sPLA
2
s do grupo IIA) ............................................................... 4
1.4. Asp49-PLA
2
s X Lys49-PLA
2
s: aspectos funcionais e estruturais .............................................................. 7
1.5. Receptores do tipo M: internalização de fosfolipases A
2
........................................................................... 9
1.6. Proteínas inibitórias de PLA
2
s encontradas no plasma de alguns animais ................................................ 9
1.7. Algumas técnicas utilizadas com a finalidade de auxiliar na compreensão da relação estrutura
-função das fosfolipases A
2
de venenos de serpentes ....................................................................................... 10
1.7.1. Cristalografia de Raios X ....................................................................................................................... 10
1.7.2. Mutação sítio-dirigida ............................................................................................................................. 11
1.7.3. Modificações químicas de resíduos específicos ..................................................................................... 12
1.7.3.1. Modificação química com p-BPB ....................................................................................................... 12
1.7.3.2. Modificação química com NBSF ........................................................................................................ 13
1.7.3.3. Modificação química com NPSC ........................................................................................................ 14
1.7.3.4. Modificaçã química de resíduos de lisina ............................................................................................ 14
1.7.3.5. Modificação química com CNBr ......................................................................................................... 15
1.7.4. Simulações de Dinâmica Molecular ....................................................................................................... 15
2. Objetivos................................................................................................................................................... 17
3. Material e Métodos ............................................................................................................................. 18
3.1. Purificação da proteína alvo a partir do veneno ........................................................................................ 19
3.2. Amostras utilizadas no trabalho ................................................................................................................ 19
3.2.1. A Proteína BthTX-I ................................................................................................................................ 19
3.2.2. A Proteína PrTX-I .................................................................................................................................. 20
3.2.3. α-tocoferol .............................................................................................................................................. 20
3.3. Cristalização e co-cristalização .................................................................................................................. 20
3.4. Coleta de dados de difração de raios X ..................................................................................................... 24
3.5. Elucidação de estruturas tridimensionais ................................................................................................... 25
4. Resultados e Discussão
.................................................................................................................................... 26
4.1. Estudos estruturais com a PrTX-I nativa e complexada α-tocoferol e da BthTX-I complexada
com α-tocoferol................................................................................................................................................. 26
4.2. Comparação de Lys49-PLA
2
s nativas e complexadas ............................................................................... 44
4.3. Estabelecimento de interações entre as Lys49-PLA
2
s de venenos de serpentes e membranas
musculares ........................................................................................................................................................ 48
4.4. Conformação dimérica biologicamente ativa para as Lys49-PLA
2
s ......................................................... 54
4.5. Considerações Finais ................................................................................................................................. 57
5. Conclusões ............................................................................................................................................... 60
6. Referências Bibliográficas ………….................................................................................................61
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema mostrando o sítio de clivagem da PLA
2
num fosfolipídio de
membrana e os mediadores inflamatórios resultantes desta ação.........................................................1
Figura 2 - Representação esquemática do enovelamento típico de uma PLA
2 .
................................. 2
Figura 3 – Figura ilustrativa dos resíduos do sítio catalítico de Asp49-PLA
2
s que
possiblita coordenação do Ca
2+
e região análoga das Lys49-PLA
2
s ................................................. 2
Figura 4 - Etapas para resolução de uma estrutura protéica por difração de raios X através
de Substituição Molecular ...................................................................................................................3
Figura 5 - Representação esquemática da Curva de Solubilidade para proteínas ............................. 5
Figura 6 - Placa de cristalização ........................................................................................................ 8
Figura 7 – Microbridge ..................................................................................................................... 9
Figura 8 - Sitting drop: esquema mostrando os componentes do sistema ...................................... 10
Figura 9 – Cristais das proteínas ..................................................................................................... 11
Figura 10 – Diagrama de Ramachandran para o a PrTX-I nativa e para os complexos
PrTX-I / αT e BthTX-I / αT .............................................................................................................. 13
I
Figura 11 – Comparação entre as regiões do “sítio ativo” para a PrTX-I nativa e a
complexada ....................................................................................................................................... 14
Figura 12 – Figura representando as três estruturas elucidadas, juntamente com os
ligantes e íons que interagem com cada uma delas .......................................................................... 14
Figura 13 – Figura ilustrativa das interações que ocorrem na PrTX-I nativa e nos
complexos PrTX-I / αT e BthTX-I / αT ........................................................................................... 24
Figura 14 – Deslocamento do Trp77 nas formas complexadas (BthTX-I/αT e PrTX-I/αT)
pela presença de uma molécula de PEG 4000 interagindo com as mesmas ..................................... 23
Figura 15 – Sobreposição de um dos monômeros de cada uma das estruturas elucidadas
mostrando os diferentes padrões de estrutura quaternária das formas complexadas em
relação à PrTX-I nativa ..................................................................................................................... 32
Figura 16 – Figura mostrando que as Tyr119 das proteínas complexadas sofrem uma
reorientação conformacional em um de seus monômeros comparadas à forma nativa,
o que permite que as mesmas passem a estabelecer pontes de hidrogênio entre si .......................... 33
Figura 17 – Diagrama representativo do fator temperatura (“B factor”) das proteínas
PrTX-I nativa, PrTX-I/αT e BthTX-I/ αT ........................................................................................ 35
Figura 18 – Comparação entre os dímeros das estruturas elucidadas mostrando que
a presença dos ligantes provocou um deslocamento dos loops de ligação do Ca
2+
entre si para as moléculas de α-tocoferol ................................................................................ 32
II
Figura 19 – Figura ilustrativa do esquema utilizado para medir ângulos de torção
e abertura entre os monômeros de uma mesma estrutura ................................................................. 45
Figura 20 – Figura ilustrativa dos diferentes padrões de estrutura quaternária para as
Lys49-PLA
2
s nativas e complexadas ............................................................................................... 45
Figura 21 – Figura ilustrativa dos diferentes padrões dos resíduos Tyr119 e His120
nas formas nativas e complexadas .................................................................................................... 34
Figura 22 – Diagrama representativo do fator temperatura (“B factor”) de todas as
proteínas comparadas neste trabalho ................................................................................................ 34
Figura 23 –Representação do sítio miotóxico das Lys49- PLA
2
s ................................................... 23
Figura 24 – Alinhamento de Asp49-PLA
2
s e Lys49-PLA
2
s de veneno de serpentes
da subfamília Crotalinae presentes no NCBI ................................................................................... 40
Figura 25 –Representação esquemática do sítio miotóxico da PrTX-I interagindo
com membrana muscular .................................................................................................................. 43
Figura 26 –Figura representando a localização do sítio miotóxico das Lys49-PLA
2
s
em ambas as conformações possíveis ............................................................................................... 23
Figura 27 - Figura representando as duas conformações diméricas possíveis para as
Lys49-PLA
2
s .................................................................................................................................... 33
III
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Condições de cristalização para as proteínas PrTX-I nativa, PrTX-I /αT e
BthTX-I / αT .................................................................................................................................... 12
Tabela 2 – Estatísticas de coleta de dados de difração de raios X e refinamento das
proteínas cristalizadas ....................................................................................................................... 12
Tabela 3 – R.m.s.d. para sobreposição de Cα entre os monômeros (“A” X “B”) de
uma mesma estrutura ........................................................................................................................ 12
Tabela 4 – R.m.s.d. para sobreposição de Cα entre monômeros de diferentes
estruturas .......................................................................................................................................... 12
Tabela 5 – Ângulos de Torção e Abertura para as estruturas elucidadas ........................................ 12
Tabela 6 – Resíduos da interface protéica das estuturas elucidadas ................................................ 12
Tabela 7 – Códigos de acesso no PDB e dados de refinamento das proteínas
utilizadas nas comparações ............................................................................................................... 12
Tabela 8 – R.m.s.d. para sobreposição de Cα entre os monômeros de uma mesma
estrutura ............................................................................................................................................ 12
Tabela 9 – Ângulos de Torção e Abertura para as proteínas em análise ......................................... 12
Tabela 10 – Códigos utilizados no alinhamento das seqüências para representar
as fosfolipases A
2
de venenos de serpentes da subfamília Crotalinae ............................................. 12
Tabela 11 – Análise da área de interface para os dois possíveis estados
oligoméricos de complexação das Lys49-PLA
2
s ............................................................................. 12
IV
Resumo
Os aspectos científico, médico e social que envolvem as serpentes do gênero
Bothrops são de grande interesse para o Brasil, visto que estes animais são responsáveis por
cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem em nosso país. Assim, devido à vasta
variedade de efeitos farmacológicos das proteínas que compõem os venenos destes répteis,
o estudo aprofundado destas toxinas pode ser de grande utilidade na busca de novos
medicamentos. Um dos principais componentes do veneno botrópico são as fosfolipases A
2
(PLA
2
s)
,
enzimas com atividade catalítica sobre fosfolipídios de membrana e que também
apresentam diversas outras atividades, dentre as quais podemos citar a atividade miotóxica.
O presente trabalho mostra o estudo de duas PLA
2
s miotóxicas de venenos de
serpentes nas formas nativa e complexadas com α-tocoferol, um inibidor destas toxinas ,
através da técnica de cristalografia de raios X; além disso, estudos estruturais comparativos
entre as estruturas obtidas e outras já existentes também foram realizados na tentativa de
conhecer melhor o modo de interação destas proteínas com a membrana muscular. Após as
análises, apontamos os resíduos que provavelmente constituem o sítio miotóxico das PLA
2
s
de serpentes do gênero Bothrops. O conhecimento deste sítio pode ser bastante importante
para que estas sejam inibidas de maneira efetiva, o que pode levar ao desenvolvimento de
terapias mais eficazes no que diz respeito ao envenenamento botrópico.
V
VI
Abstract
Scientific, medical and social aspects related to snakes from Bothrops genus are
very important for Brazil because these animals are responsible for approximately 90 % of
ophidian accidents. Considering the broad spectrum of pharmacological effects of the
proteins present in these reptile venoms, a deeper study of these toxins can be very
important to the search of new drugs. One of the major components from bothropic venom
are phospholipases A
2
(PLA
2
s), enzymes that present catalytic activity against membrane
phospholipids and also present many pharmacological activities, as mytoxic activity, for
example.
The present work shows the study of two Lys49-PLA
2
s from snake venoms on their
native and complexed forms with α-tocopherol, an inhibitor of these toxins, by X-ray
crystallographic techniques; additionally, comparative structural studies were performed
between the structures obtained and others already available in order to better understand
the interaction between these proteins and muscle membranes. After these analyses, we
pointed out the residues that probably constitute the myotoxic site of PLA
2
s from Bothrops
genus. The knowledge of this site can be very important for the effective inhibition of these
toxins leading to the development of more efficient therapies against bothropic
envenomation.
1. INTRODUÇÃO
As serpentes sempre despertaram curiosidade e fascínio entre os homens, fato este comprovado
pela influência que estes animais exerceram e exercem em vários aspectos da vida humana através de
mitos, símbolos e religiões. Este interesse também se refletiu na ciência, com a conseqüente realização de
muitos estudos a respeito das propriedades e componentes dos venenos de serpentes. A importância dada a
tais estudos é claramente evidenciada pelo grande volume de artigos que tratam do estudo dos venenos
destes animais e seus constituintes publicados em periódicos especializados em toxinologia (Guimarães &
Carlini, 2004), bem como em outros periódicos de notável reconhecimento científico.
Os primeiros registros de acidentes ofídicos no Brasil datam de 1560 e o início da produção de soro
antiofídico se deu somente em 1901, com Vital Brazil (Melgarejo, 2003). Desde então vários avanços já
foram conquistados, porém mais estudos para melhorar a eficácia das terapias em relação a este problema
ainda merecem ser realizados, já que os efeitos locais provocados pelo envenenamento não conseguem ser
evitados somente com o uso da soroterapia.
1.1. A importância do estudo estrutural de proteínas de venenos de serpentes do gênero Bothrops
No Brasil, o estudo dos venenos de serpentes do gênero Bothrops e potenciais moléculas inibitórias
das frações biologicamente ativas destes venenos é especialmente relevante uma vez que há 24 espécies
pertencentes a este gênero em nosso país, sendo responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos que
aqui ocorrem (França & Malaque, 2003; Melgarejo, 2003). Além disso, devido à grande variedade de
efeitos farmacológicos e bioquímicos apresentados pelas proteínas que compõem os venenos destes
répteis, o estudo aprofundado destas toxinas, combinadas ou não a inibidores, pode ser de grande utilidade
para o desenvolvimento de novos medicamentos. As informações adquiridas através destes estudos
também podem contribuir de forma decisiva para a aquisição de novos e importantes dados a respeito de
processos bioquímicos, fisiológicos e patológicos que ocorrem nos seres vivos, já que as fosfolipases têm
participação em uma ampla gama de processos e são expressas em vários tecidos, onde desempenham
diferentes funções.
1
1.2. Fosfolipases A
2
: componentes protéicos de elevado interesse científico e biotecnológico
Os venenos botrópicos contêm uma ampla gama de toxinas, sendo um de seus principais
componentes as fosfolipases A
2
(PLA
2
s) (PLA
2
- E.C.3.1.1.4), enzimas com atividade catalítica sobre
fosfolipídios de membrana e que também apresentam diversas atividades farmacológicas. As PLA
2
s
catalisam mais especificamente a hidrólise da ligação sn-2 de substratos fosfolipídicos, convertendo-os em
ácido graxos e lisofosfolipídios (Dennis, 1994; Balsinde et al., 1999) (Figura 1). O ácido aracdônico e o
ácido oléico, dois ácidos graxos produzidos pela ação das fosfolipases A
2
são importantes fontes de
estocagem energética, sendo que o ácido aracdônico também age como segundo mensageiro (Gijon &
Leslie, 1999; Berk & Stump, 1999) e como precursor de eicosanóides, que são potentes mediadores de
inflamação (Waite, 1987; Austin & Funk, 1999; Devillier et al., 1999) (Figura 1). Os eicosanóides,
atuando como hormônios, têm efeitos fisiológicos profundos a baixíssimas concentrações, porém um
acréscimo nestas concentrações pode conduzir ao estado inflamatório (Needleman et al., 1986). Já os
lisofosfolipídeos, outro produto dessa catálise, são importantes na sinalização celular e perturbação de
membranas (Moolenaar et al.,1997). Desta maneira, enzimas que catalisam a síntese destes compostos e os
receptores aos quais eles se ligam são alvos importantes para a pesquisa na área farmacêutica. Desde que a
PLA
2
é uma das enzimas envolvidas na produção de eicosanóides, sua inibição tem grande significância
terapêutica. Assim sendo, o desenho de inibidores específicos é uma opção importante na produção de
agentes antiinflamatórios baseados na estrutura das moléculas envolvidas no processo. A vitamina E é um
possível agente antiinflamatório, pois atua como inibidor tanto de fosfolipases quanto das ciclooxigenases
(Zingg & Azzi, 2004).
A primeira vez que se estudou a atividade enzimática, hoje denominada atividade PLA
2
, foi na
década de 1890, utilizando-se venenos de serpentes (Stephens et al., 1898). Mais tarde, descobriu-se que a
atividade catalítica dessas pequenas enzimas secretadas é dependente de íons cálcio e ainda, que elas são
caracterizadas por possuírem uma grande quantidade de pontes dissulfeto, além de uma histidina (His) e
um ácido aspártico (Asp) catalíticos (conhecido como díade catalítica).
2
Figura 1 - Esquema mostrando o sítio de clivagem da PLA
2
num fosfolipídio de membrana e os mediadores
inflamatórios resultantes desta ação
Inicialmente, as PLA
2
s foram divididas em dois grupos, classificação esta baseada nas posições das
pontes dissulfeto (Heinrikson et al., 1977; Dufton & Hider,1983). Já Six & Dennis (2000) classificaram
estas enzimas em 11 grupos, sendo os principais critérios de classificação: a seqüência de aminoácidos e o
padrão de pontes dissulfeto (Renetseder et al., 1985). Com o constante avanço das técnicas de
seqüenciamento e caracterização estrutural, novas PLA
2
s foram e continuam sendo descobertas, sendo
necessária uma constante revisão para atualização de seus grupos e subgrupos. Assim, Schaloske & Dennis
(Schaloske & Dennis, 2006) classificaram as PLA
2
s em 15 diferentes grupos, que podem ser diferenciados
em cinco tipos de enzimas: as PLA
2
s secretadas (sPLA
2
s), as PLA
2
s citosólicas (cPLA
2
s), as PLA
2
s Ca
2+
independentes (iPLA
2
s), os fatores de ativação plaquetária do tipo acetilhidrolases (PAF-AH) e as PLA
2
s
lisossomais. As PLA
2
s intracelulares se encontram freqüentemente associadas a membranas e estão
envolvidas no metabolismo de lipídios, transdução de sinal, além de outras funções celulares essenciais
(Mukherjee et al., 1994). Já as extracelulares são as encontradas, por exemplo, em sucos pancreáticos de
mamíferos e venenos de serpentes, abelhas e lagartos (Waite, 1987). Segundo a classificação de Six &
Dennis (2000), as PLA
2
s encontradas em venenos de serpentes da família Viperidae (que é, ainda,
subdividida nas subfamílias Crotalinae e Viperinae) é classificada no grupo IIA (uma subdivisão do grupo
II, que abrange 7 subgrupos), juntamente com PLA
2
s de tecidos não pancreáticos de mamíferos e as
fosfolipases de líquido sinovial humano (Six & Dennis, 2000). Essa classificação é baseada na
similaridade de seqüências, especificidade de pontes dissulfeto e posição dos loops (Heinrikson et al.,
1977; Dufton & Hider,1983; Wery, 1991).
3
1.3. Fosfolipases A
2
de venenos de serpentes (sPLA
2
s do grupo IIA)
As sPLA
2
s de venenos de serpentes são proteínas pequenas (14-18 kDa), com um alto grau de
similaridade seqüencial e estrutural, possuindo geralmente 5 a 8 pontes de sulfeto; necessitam de Ca
2+
para catálise e possuem uma histidina (His) catalítica ao lado de um conservado ácido aspártico (Asp)
(Dennis, 1994; Schaloske & Dennis, 2006); apresentam, em sua seqüência primária, cerca de 122
aminoácidos que seguem o modelo de numeração de uma PLA
2
de pâncreas bovino (Renetseder et al.,
1985), indo do resíduo 1 ao 133. Embora tanto o grupo I quanto o grupo II das PLA
2
s apresentem sete
pontes dissulfeto, o grupo I apresenta uma ponte unindo os resíduos de cisteína Cys 11 e 77, ausente no
grupo II que, no entanto, apresenta uma ponte alternativa entre a Cys51 e a Cys133. Deve-se notar, no
entanto, que há três seqüências relatadas na família Viperidae que possuem apenas seis pontes dissulfeto
(Botes & Viljoen, 1976; Joubert et al., 1983; Siddiqi et al., 1991).
Três regiões retêm um significativo grau de similaridade entre as PLA
2
s do grupo II, contribuindo
para a formação de elementos estruturais altamente conservados nas estruturas secundária e terciária,
incluindo uma hélice N-terminal, as regiões do sítio ativo e de ligação do cálcio, junto com os aminoácidos
que formam o canal hidrofóbico (Arni & Ward, 1996). Sua estrutura terciária básica é caracterizada pela
presença de uma α-hélice na região N-terminal (“h1”) (cujos resíduos formam a canal hidrofóbico das
PLA
2
s), uma hélice curta (short helix), um loop de ligação de cálcio, uma segunda α-hélice (“h2”), duas
folhas β-pregueadas antiparalelas (β-wing), uma outra α-hélice (“h3”) e por fim, uma região bastante
flexível, denominada C-terminal (Figura 2). As regiões “h2” e β-wing formam o sítio catalítico das PLA
2
s
(Arni & Ward, 1996; Ward et al., 1998a). Esse “enovelamento” típico é determinado, em grande parte,
pelas pontes dissulfeto.
Além da ocorrência na natureza de PLA
2
s monoméricas, estudos mostram a existência de estruturas
cristalinas com várias conformações quaternárias: monômeros (Holland et al., 1990; Scott et al., 1992),
dímeros (Brunie et al., 1985; Arni et al., 1995; Marchi-Salvador et al., 2006; Corrêa et al., 2006, Takeda et
al., 2004; dos Santos et al., 2005), trímeros (Fremont et al., 1993) e tetrâmeros (Marchi-Salvador et al.,
2005). Estudos estruturais com Lys49-PLA
2
s de venenos de Bothrops asper (Arni et al., 1995) mostram a
ocorrência de um dímero formado por interações entre resíduos localizados nas regiões N-terminal e de β-
wing.
4
Figura 2 - Representação esquemática do enovelamento típico de uma PLA
2
. Figura feita usando o programa Pymol
(DeLano, 2002).
Uma característica estrutural marcante das fosfolipases das classes I e II é a presença de duas
grandes α-hélices antiparalelas ligadas por pontes dissulfeto (hélices 2 e 3), em que as cadeias laterais de
resíduos hidrofílicos geralmente estão voltadas para o solvente enquanto que as de resíduos hidrofóbicos
estão para o interior da proteína, com exceção dos resíduos que formam a região catalítica (His48, Asp49,
Asp99 e Tyr52). O íon cálcio é um co-fator essencial para a catálise: este é coordenado por dois átomos de
oxigênio carboxilados de Asp49 e três átomos de oxigênio de resíduos situados na região denominada loop
de ligação do cálcio (Tyr28, Gly30 e Gly32). Duas moléculas de água estruturalmente conservadas
completam a coordenação (Figura 3a). A substituição do cálcio por outro íon divalente, como cádmio ou
bário, resulta numa significativa redução dessa atividade (Yu et al., 1993).
5
Figura 3 – Figura ilustrativa dos resíduos do sítio catalítico de Asp49-PLA
2
s que possiblita coordenação do Ca
2+
e
região análoga das Lys49-PLA
2
s. (a) Região de ligação do íon Ca
2+
(“calcium binding loop”) de uma PLA
2
cataliticamente ativa de Naja naja naja (Asp49-PLA
2
). (b) Região análoga à região de ligação do Ca
2+
de uma
miotoxina II (PLA
2
homóloga) cataliticamente inativa de Bothrops asper (Lys49-PLA
2
) (Arni & Ward, 1996 e Ward
et al., 1998b).
Além da atividade catalítica, as PLA
2
s encontradas em venenos de serpentes exibem uma gama de
atividades farmacológicas: neurotoxicidade, miotoxicidade, cardiotoxicidade, efeitos na agregação de
plaquetas, ação anti-coagulante, efeitos convulsivos, atividade hipotensiva, capacidade hemolítica e de
indução de edema, dentre outros efeitos (Chang et al., 1977; Bon et al., 1979; Condrea et al., 1981; Huang,
1984; Mebs, 1986; Kini & Evans, 1989; Rosenberg, 1990; Gerrard et al., 1993; Lloret & Moreno, 1993;
Gutiérrez & Lomonte, 1997; Kini, 1997; Paramo et al., 1998; Andrião-Escarso et al., 2000 e 2002; Beers
et al., 2002;). Estes efeitos podem ser independentes da atividade catalítica (Lomonte & Gutiérrez, 1989;
Homsi-Brandenburgo et al., 1988; Chwetzoff et al., 1989a; Soares et al., 2001a; Soares et al., 2003a;
Angulo et al., 2005).
Diante de diversos estudos de isolamento e caracterização das PLA
2
s, descobriu-se que há um
subgrupo destas, onde uma substituição natural (mutação) ocorre na posição 49: a substituição do ácido
aspártico (Asp) por uma lisina (Lys) nesta posição específica deu origem a um grupo de proteínas que
recebem o nome de PLA
2
s homólogas ou Lys49-PLA
2
s (Maraganore et al., 1984; Francis et al., 1991;
Homsi-Brandenburgo et al., 1988; Ward et al., 1995). Apesar de não apresentarem atividade catalítica,
estas possuem atividade miotóxica (Maraganore et al., 1984).
6
1.4. Asp49-PLA
2
s X Lys49-PLA
2
s: aspectos funcionais e estruturais
Num primeiro momento, acreditava-se que as fosfolipases tinham como única função a lise de
fosfolipídios de membrana. Porém, com o avanço das técnicas de biologia molecular foi possível a
identificação e caracterização de uma grande quantidade destas enzimas, propiciando o conhecimento de
uma variada gama de atividades exercidas por suas diferentes isoformas. As Lys49-PLA
2
s (ou PLA
2
s
homólogas), por exemplo, são caracterizadas por apresentarem atividade miotóxica apesar de não serem
cataliticamente ativas. A mutação natural (Asp49 → Lys) que caracteriza este grupo de PLA
2
s impede a
coordenação do íon Ca
2+
, invibializando a reação catalítica,: conforme afirmaram Scott et al. (1992). A
presença da Lys no lugar do Asp na posição mencionada torna impossível a coordenação do íon Ca
2+
, já
que o nitrogênio Nε da Lys ocupa a posição que seria ocupada pelo íon a ser coordenado (Figura 3b) e,
conseqüentemente, inviabiliza a ocorrência da reação catalítica.
A região do sítio catalítico das PLA
2
s, bem como a região do canal hidrofóbico, eram tidas como as
responsáveis por todas as atividades destas enzimas. Porém, dados mais atuais mostram que as atividades
farmacológicas apresentadas pelas mesmas, embora possam ter alguma relação com o sítio ativo e / ou
com o canal hidrofóbico, apresentam outros “sítios” que são característicos de cada uma delas (Soares et
al., 2001a; Soares et al., 2003a). Um exemplo disto são as PLA
2
s homólogas, que apresentam um
pronunciado efeito miotóxico tanto in vivo quanto in vitro (Gutierrez & Lomonte, 1997) e são capazes de
romper membranas biológicas e sintéticas (Rufini et al., 1992). Atualmente acredita-se que a região C-
terminal destas PLA
2
s homólogas seja a responsável pelo dano à membrana muscular (Núñez et al., 2001;
Lomonte et al., 2003a; Lomonte et al., 2003b; Chioato et al., 2002; Ambrosio et al., 2005; Chioato et al.,
2007), não tendo, portanto, tal atividade, relação direta com o “sítio catalítico”. O aparecimento de regiões
específicas como sendo responsáveis por diferentes atividades farmacológicas pode ser explicado em
termos evolutivos, levando em consideração que estas proteínas evoluíram / evoluem de uma forma
particular (como é o caso de toxinas em geral e das imunoglobulinas, por exemplo) sob pressão seletiva do
meio (Kini et al., 1999; Ogawa et al., 1992; Nakashima et al., 1993; Nakashima et al., 1995). Os resíduos
que mais sofreram / sofrem pressão seletiva são aqueles que se acomodam na superfície protéica, já que
esta é a região que entra diretamente em contato com seus alvos (Kini et al., 1999). A partir destes e de
outros dados, Lee et al. (2001) sugeriram que a lisina presente na posição 122, resíduo bastante conservado
nas Lys49-PLA
2
s, tem importância relevante no mecanismo de ação destas PLA
2
s: a Lys122 polariza a
ligação peptídica entre os resíduos Gly29 e Cys30 (resíduos estes que fazem parte do canal hidrofóbico),
favorecendo, desta forma, a retenção do produto da catálise (ácido graxo) no sítio ativo da proteína. A não
liberação deste produto (ácido graxo) explica, de acordo com os autores, a reduzida ou inexistente
atividade catalítica desta classe de proteínas. Por outro lado, este ácido graxo “preso” ao sítio catalítico e
7
ao canal hidrofóbico, auxilia na expressão da atividade miotóxica das PLA
2
s homólogas (Ambrosio et al.,
2005).
Experimentos de mutagênese sítio-dirigida realizados por Ward et al. (2002) em BthTX-I (Lys49-
PLA
2
) onde a lisina da posição 49 foi substituída (mutada) por um ácido aspártico demonstraram que esta
proteína continuou não apresentando atividade catalítica, sugerindo que a perda desta atividade não está
somente relacionada à mutação da D49 → K e sim a um conjunto de outros fatores estruturais, tal como a
interação da região do C-terminal (mais especificamente a Lys122) com a ligação peptídica entre os
resíduos 29 e 30. Entretanto, uma análise mais cuidadosa de oito estruturas diméricas de Lys49-PLA
2
s
feita por Magro et al. (2003) mostrou que a interação entre a Lys122 e a Cys29 está presente, em ambos os
monômeros das Lys49-PLA
2
s diméricas somente nos complexos formados entre proteínas e moléculas de
ácido graxo (PrTX-II, MjTX-II e NumMT-I) (Lee et al., 2001; Watanabe et al., 2005; de Azevedo et al.,
1999). Para aquelas estruturas que não apresentam a ligação de nenhuma molécula de ácido graxo, a
Lys122 mostra uma conformação alternativa em um ou em ambos os monômeros. Lomonte et al. (1994a)
e Gutiérrez & Lomonte (1995) propuseram, como forma de explicar estes fatos, que as regiões C-terminais
dos monômeros das Lys49-PLA
2
s, ricas em resíduos hidrofóbicos e básicos, seriam as responsáveis pelos
mecanismos em questão: tais porções se insinuariam através das membranas (celulares ou artificiais),
promovendo a desestabilização destas, ou atuariam como “âncoras”, possibilitando o contato de sítios
protéicos reativos desconhecidos. Ward et al. (2002), através de experimentos de mutagênese sítio-dirigida
também propõe que o C-terminal é essencial para a expressão da atividade miotóxica da proteína e para o
mecanismo de rompimento de membranas. Mais recentemente, Ambrosio et al. (2005) sugeriram que a
retenção do ácido graxo no sítio ativo da Lys49-PLA
2
s provocaria uma mudança conformacional da
proteína que justificaria este pronunciado efeito miotóxico e a capacidade de romper membranas. Esta
mudança conformacional consistiria numa maior exposição de resíduos hidrofóbicos do C-terminal ao
solvente, provocando o surgimento de interações eletrostáticas entre a membrana e lisinas do C-terminal,
que auxiliariam na inserção deste através das membranas. Outros experimentos com peptídeos sintéticos
correspondentes aos aminoácidos 115 ao 129 da região do C-terminal também ressaltam a importância
desta região, bem como sua composição (aminoácidos básicos e hidrofóbicos em posições específicas)
para a atividade miotóxica destas isoformas das Asp49-PLA
2
s (Núñez et al., 2001; Lomonte et al., 2003a;
Lomonte et al., 2003b; Chioato et al., 2002; Chioato et al., 2007).
8
1.5. Receptores do tipo M: internalização de fosfolipases A
2
Em 1990, foi identificado um receptor em membranas de células musculares esqueléticas de
coelhos, com os quais as PLA
2
s de veneno de serpentes interagem (Lambeau et al., 1990). Além de serem
expressos em células musculares, estes também são encontrados em outros tecidos, com pulmão, ovário e
fígado (Lambeau et al., 1991; Hseu et al., 1997). Este receptor, conhecido como receptor do tipo M,
embora apresente baixa identidade (29%) com receptores de manose de macrófagos, possuem grande
similaridade em termos de estrutura terciária com os mesmos (Taylor et al., 1990; Ezekowitz et al., 1990).
Assim como os receptores dos macrófagos, a função destes receptores é propiciar a internalização de
proteínas que interagem com os mesmos (Pontow et al., 1992). Este receptor (M-type receptor) apresenta
um domínio N-terminal rico em cisteínas (“cystein-rich domain”), um domínio do tipo semelhante à
fibronectina tipo II (“fibronectin-like type II domain”) e uma repetição em tandem de 8 a 10 domínios do
tipo CRD (domínios de reconhecimento de carboidratos) na sua porção extracelular (que corresponde a
mais de 90% do tamanho do receptor), uma pequena porção transmembrânica e outra pequena porção
intracelular, cuja função é ainda pouco conhecida (Drickamer et al., 1996). As PLA
2
s de venenos de
serpentes podem, portanto, agir diretamente na membrana ou via receptor. Existe ainda, no plasma de
alguns animais, proteínas circulantes correspondentes a uma região da porção extracelular deste receptor
que age como um inibidor destas proteínas. A forma solúvel deste receptor também já foi encontrada em
humanos (Ancian et al., 1995).
Este conhecimento pode nos auxiliar a explicar o porquê as Lys49-PLA
2
s atuarem mais
especificamente em membranas musculares.
1.6. Proteínas inibitórias de PLA
2
s encontradas no plasma de alguns animais
Nos últimos anos foram identificadas diversas proteínas circulantes no plasma de serpentes (Faure,
2000; Fortes-Dias, 2002; Lizano et al., 2003) e de alguns mamíferos (Neves-Ferreira et al., 2000; Trento et
al., 2001; Soares et al., 1997; Rocha et al., 2002) que ajudam a entender o porquê as serpentes não sofrem
ação de seu próprio veneno ou mesmo porquê alguns animais são “resistentes” ao envenenamento ofídico:
estes animais apresentam, no seu plasma, proteínas circulantes que atuam como inibidores das toxinas
presentes no veneno. Já são conhecidas diversas moléculas inibitórias para as atividades hemorrágica,
neurotóxica e miotóxica, dentre outras (Inoue et al., 1991; Lizano et al., 1997; Perez & Sanchez, 1999E),
as quais são classificadas em três tipos: α,β e γ, de acordo com suas características estruturais, baseadas em
motifs comuns encontrados em outras proteínas que possuem diversas propriedades fisiológicas (Thwin et
9
al., 2002). Interessantemente, os inibidores do tipo α são glicoproteínas ácidas constituídas de várias
subunidades com similaridade seqüencial com os domínios tipo CRD encontrados em lectinas do tipo C
(Hattori et al., 1995; Schevitz et al., 1995; Satake et al., 2004), e nos receptores do tipo M, citados
anteriormente.
1.7. Algumas técnicas utilizadas com a finalidade de auxiliar na compreensão da relação estrutura-
função das fosfolipases A
2
de venenos de serpentes
As relações estrutura-função de muitas PLA
2
s de venenos de serpentes têm sido extensivamente
investigadas com uso de várias metodologias, tais como modificações químicas de resíduos específicos,
mutações sítio-dirigidas, técnicas cristalográficas, espectrofotométricas e fluorimétricas, além da
ressonância magnética nuclear e de estudos da interação com inibidores e substratos naturais ou artificiais
(Soares & Giglio, 2003). Apesar de poucas conclusões a respeito da “expressão” das diferentes atividades
das fosfolipases de venenos de serpentes terem sido obtidas até o presente momento, muitos dados já
foram gerados por diversos estudos. Assim, o que se busca atualmente é relacionar um aminoácido / grupo
de aminoácidos a determinadas atividades (atividades específicas, tais como: atividade miotóxica,
atividade hemorrágica, atividade catalítica, etc...). Com este propósito, algumas metodologias como, por
exemplo, mutação sítio-dirigida (testadas in vitro e in vivo), cristalografia de raios X (com proteínas na sua
forma nativa, modificadas quimicamente e na forma de complexos com inibidores sintéticos ou naturais) e
SAXS (espalhamento de raios X a baixo ângulo) estão sendo empregadas para se tentar entender melhor os
mecanismos usados por estas enzimas para que estas exerçam seus efeitos. As técnicas mais usadas serão
descritas a seguir.
1.7.1. Cristalografia de Raios X
O estudo cristalográfico de proteínas nas suas formas nativa e complexadas pode ser bastante
interessante, pois permite conhecer a estrutura tridimensional destas e analisar regiões/aminoácidos
específicos, bem como suas possíveis interações com seus ligantes (inibidores, por exemplo). A estrutura
de diversas PLA
2
s de venenos de serpentes já foram elucidadas e depositadas no PDB (Protein Data Bank:
http://www.pdb.org/pdb/home/home.do
), tanto na sua forma nativa quanto complexadas com inibidores
(Ambrosio et al., 2005, Chandra et al., 2002; da Silva-Giotto et al., 1998; Magro et al., 2003; Magro et al.,
2004; Magro et al., 2005; Murakami et al., 2005; Murakami et al., 2007; Watanabe, et al., 2005; etc...).
10
Existem ainda, na literatura e no banco de dados (PDB), alguns modelos de estruturas que, a princípio,
deveriam corresponder a formas nativas, mas que, por algum motivo (problemas de purificação, por
exemplo) apresentam um composto interagindo com as mesmas. Isso traz a possibilidade de realização de
estudos comparativos entre diversas isoformas das enzimas em questão.
Alguns possíveis candidatos a inibidores destas enzimas já são conhecidos, como por exemplo, o
ácido rosmarínico (Ticli et al., 2005), a vitamina E (Chandra et al., 2002), suramina (Murakami et al.,
2005), moléculas de PEG (Murakami et al., 2007). Nos últimos anos, a literatura vem apontando um
grande número de trabalhos onde extratos vegetais apresentam excelentes atividades antiofídicas (Martz,
1992; Melo et al., 1994; Mors et al., 2000; Izidoro et al., 2003; Soares et al., 2004; Maiorano et al., 2005;
Oliveira et al., 2005; da Silva et al., 2005). Soares et al. (2005) lista diversas substâncias, entre elas, alguns
compostos fenólicos, esteróides e terpenóides, que mostraram possuir propriedades inibitórias frente a
venenos brutos e toxinas de várias serpentes da família Viperidae, e dentro dela, muitas espécies do gênero
Bothrops. Proteínas isoladas do plasma de alguns animais (como mencionado há pouco) também
apresentam grande potencial para a inibição, ainda que parcial, de algumas das atividades destas proteínas
(Marcussi et al., 2007).
Diante do grande número de compostos isolados com possível potencial inibitório, testes de
cristalização com complexos formados entre as enzimas e seus inibidores podem gerar dados para uma
posterior análise estrutural visando o conhecimento dos sítios específicos de interação entre eles (enzima-
inibidor). Assim, o uso desta e de várias outras metodologias pode levar ao desenvolvimento de novas
terapias antiofídicas e de novos medicamentos antiinflamatórios.
1.7.2. Mutação sítio-dirigida
Os experimentos de mutação sítio-dirigida são bastante válidos quando se suspeita do envolvimento
de um aminoácido / grupo de aminoácidos em determinada atividade. Um exemplo da aplicação deste tipo
de técnica pode ser dada pela suspeita da relação entre o resíduo Lys122 e a atividade miotóxica, conforme
Lee et al. (2001) propuseram. A possível relação entre estes pode ser confirmada pela mutação do resíduo
122 e posterior análise in vitro e / ou in vivo do efeito de tal mutação na atividade miotóxica. Assim, vários
resíduos possivelmente relacionados a algumas das atividades farmacológicas apresentadas pelas PLA
2
s, já
foram testados através deste experimento (Chioato et al., 2007; Ward et al., 1998b, Ward et al., 2002). Os
resíduos que mostraram guardar relação com a atividade miotóxica são os encontrados no C-terminal
(resíduo 115 ao 125), bem como resíduos ao redor do aminoácido 37 e Lys7 do N-terminal (Chiato et al,
2007). A atividade bactericida também parece guardar relação com a região C-terminal das PLA2s; porém,
resíduos específicos ainda não são conhecidos (Lomonte et al., 2003a; Chioato et al., 2007).
11
1.7.3. Modificações químicas de resíduos específicos
Outra técnica que parece ser bastante valiosa na tentativa de correlacionar a estrutura com a função
das PLA
2
s é a modificação química de resíduos específicos. Dentre as substâncias mais empregadas para
tais modificações estão o brometo de p-bromofenacila (p-BPB), o fluoreto de p-nitrobenzenosulfonila
(NBSF) e o cloreto de o-nitrofenilsulfenila (NPSC). A modificação de resíduos de lisina através da
acetilação dos mesmos e a clivagem dos primeiros aminoácidos do N-terminal através do CNBr (brometo
de cianogênio) também é possível. Estas modificações químicas trazem diversos efeitos às atividades
enzimática, tóxicas e farmacológicas desta classe de proteínas. Entretanto, o mecanismo através do qual
isto é possível é ainda pouco conhecido. Assim, o estudo estrutural destas fosfolipases modificadas poderá
contribuir de maneira bastante importante para elucidar este mecanismo que, conhecido, pode trazer
relevantes informações a respeito da relação estrutura-função desta classe de proteínas.
1.7.3.1. Modificação química com p-BPB
A modificação química de resíduos de histidina é possível através da alquilação dos mesmos
através do p-BPB. Este composto está sendo bastante utilizado devido à sua especificidade em modificar
resíduos de His, já que nas PLA
2
s este aminoácido na posição 48, como já foi mencionado, é bastante
importante para a atividade catalítica das mesmas.
A primeira modificação desse tipo foi feita com uma PLA
2
pancreática bovina que, após
alquilada com p-BPB, perdeu totalmente a atividade enzimática (Volwerk et al., 1974). Desde então, a
alquilação da His48 com BPB tem sido freqüentemente usada em estudos das relações entre as atividades
tóxicas e enzimáticas das PLA
2
s presentes em venenos de Naja sp (Roberts et al., 1977; Babu & Gowda,
1991), Trimeresurus sp (Miyake et al., 1989; Wang & Teng, 1990), Crotalus sp (Ownby et al., 1999;
Soares et al., 2001b) e Bothrops sp (Diaz et al., 1993; Andrião-Escarso, 2000), entre outros.
Espécies do gênero Bothrops têm sido muito estudadas, pois em seu veneno são encontradas
diferentes isoformas de PLA
2
s, que muitas vezes apresentam diferenças significativas com relação à sua
toxicidade, embora tenha sua estrutura quaternária bastante conservada. A bothropstoxina-II (BthTX-II),
por exemplo, isolada do veneno de Bothrops jararacussu, foi identificada como uma Asp49-PLA
2
básica
cataliticamente ativa, enquanto em bothropstoxina-I (BthTX-I) uma Lys49-PLA
2
básica, essa atividade
está ausente (Homsi-Brandeburgo et al., 1988; Cintra et al., 1993; Pereira et al., 1998). Uma outra
diferença importante é que a BthTX-II apresenta apenas 25% da atividade catalítica de BthA-I, uma outra
Asp49-PLA
2
de caráter ácido encontrada no mesmo veneno (Andrião-Escarso et al., 2002).
A alquilação de His48 com BPB em algumas Asp49-PLA
2
s ácidas levou à perda total da
atividade catalítica e redução considerável das atividades farmacológicas, o que sugere que os efeitos
12
biológicos dependem da integridade da região responsável pela manifestação da atividade catalítica
(Serrano et al., 1999; Fuly et al., 2000). Esta mesma modificação química, quando feita em PrTX-III (de
Bothrops pirajai) e BthTX-II, duas Asp49-PLA
2
s básicas, inibiu quase totalmente as atividades catalítica,
anti-coagulante, miotóxica e citotóxica (Diaz-Oreiro & Gutiérrez, 1997; Andrião-Escarso et al., 2000;
Soares et al., 2001a, Soares & Giglio, 2003). Estes resultados mostram que His48 é essencial para a
hidrólise de fosfolipídeos e que esses efeitos farmacológicos são dependentes, ainda que parcialmente, da
atividade catalítica (Soares et al., 2001a; Soares & Giglio, 2003). Outras atividades (indução de edema e
disrrupção de lipossomos), no entanto, não apresentaram redução da mesma magnitude, o que sugere uma
dissociação parcial desses sítios farmacológicos e o catalítico.
Com relação às Lys49-PLA
2
s, que não apresentam atividade catalítica, a alquilação de His48
levou a uma redução de 40-50% na atividade miotóxica, 85-90% na citotoxicidade e 15-20% na
capacidade de induzir formação de edema, sem alteração significativa em sua habilidade de disrrupção de
lipossomos (Díaz et al., 1993; Rodrigues et al., 1998; Toyama et al., 1998; Soares et al., 2000a,b, 2001a,
Soares & Giglio, 2003). Estes resultados sugerem a existência de regiões distintas do sítio ativo que são
responsáveis, ainda que parcialmente, por essas propriedades farmacológicas (Soares & Gíglio, 2003).
1.7.3.2. Modificação química com NBSF
A presença de resíduos de tirosina (Tyr) conservados em quase todas as PLA
2
s de venenos de
serpentes sugere que estes desempenham algum papel importante na função dessas moléculas (Verheij et
al., 1981; Soons et al., 1986; Andrião-Escarso et al., 2000). Estes resíduos específicos podem ser
modificados através da sulfonação pelo NBSF.
A modificação da notexina, uma neurotoxina pré-sináptica do veneno de Notechis sculatu, com
NBSF resultou na sulfonação de três aminoácidos (Tyr7, 70 e 77) (Yang & Chang, 1991). A modificação
de Tyr7 ou 77 reduziu em 80% a toxicidade desta enzima; já quando ambos foram modificados
simultaneamente, a redução chegou a 98%. No entanto, a atividade catalítica apresentou diminuição menos
significativa (cerca de 30%) e, quando a modificação foi apenas de Tyr77, houve um aumento de 80%
nesta atividade. Esses resultados sugerem a presença de duas regiões funcionais distintas associadas com
estes efeitos nessa neurotoxina pré-sináptica (Yang & Chang, 1991).
A sulfonação das Tyr52 e 73, resíduos que participam indiretamente na estabilização do sítio
catalítico das Asp49-PLA
2
s (Kuipers et al., 1990; Dupureur et al., 1992) pelo NBSF levou a uma redução
parcial da atividade catalítica nas Asp49-PLA
2
s miotóxicas PrTX-III e BthTX-II (Andrião-Escarso et al.,
2000; Soares et al., 2001a). Já nas Lys49-PLA
2
s PrTX-I e BthTX-I, que possuem um único resíduo de Tyr
modificado (aminoácido 119) a atividade miotóxica foi afetada em aproximadamente 30%, a diminuição
13
da atividade de rompimento de lipossomos foi menor que 20% e a atividade bactericida também não
mostrou diminuição muito relevante (Soares & Giglio, 2003).
1.7.3.3. Modificação química com NPSC
A sulfonação de resíduos triptofano (Trp) é outra modificação química que interfere com as
atividades das PLA
2
s. O tratamento de Lys49-PLA
2
s com NPSC resultou em modificações químicas de
cerca de 50% dos resíduos de Trp - provavelmente o Trp77 (Soares et al., 2000 a,b; 2001a). Tal
modificação covalente, quando feita em MjTX-II de Bothrops moojeni, levou a uma leve redução da
letalidade e da miotoxicidade e grande redução do bloqueio neuromuscular (Soares et al., não publicado).
Em Lys49-PLA
2
s miotóxicas, a sulfonação com NPSC afeta tanto a miotoxicidade quanto a
citotoxicidade, embora esta última pareça ser mais afetada por este tipo de modificação química (Soares et
al., 2000a,b; 2001a ; Soares & Giglio, 2003).
1.7.3.4. Modificação química de resíduos de lisina
A maioria das PLA
2
s tóxicas são proteínas básicas que possuem grande porcentagem de
aminoácidos hidrofóbicos e catiônicos. Já foram relatados muitos estudos onde o efeito da modificação
química de resíduos de lisina (aminoácido hidrofílico carregado positivamente) sobre as atividades
catalítica e farmacológicas foram avaliados (van Ejik et al., 1983; Yang & Chang, 1989; Takasaki et. al.,
1990; Babu & Gowda, 1994; Chang et al., 1994, Yang, 1997). A carbamilação de 9 entre 10 resíduos de
Lys em N. nigricollis (Asp49-PLA
2
) e de 3 lisinas dentre 5 em N. n. atra reduziu ou aboliu completamente
a letalidade das mesmas, assim como seus efeitos anti-coagulante, efeitos hemolítico e neurotóxico,
embora nenhuma relação com a atividade enzimática tenha sido observada (Condrea et al., 1981; Condrea
et al., 1993). A acetilação de resíduos de lisina de três miotoxinas básicas de PLA
2
s do gênero Bothrops
(PrTX-I, PrTX-III e BnSP-7), provocou completa perda de basicidade destas enzimas e reduziu
drasticamente as atividades miotóxica, bactericida e capacidade de indução de edema (Soares et al.,
2000b; Soares et al., 2001a; Soares & Giglio, 2003). O que vem sendo proposto é a possibilidade de que
regiões básicas de PLA
2
s neurotóxicas e miotóxicas podem favorecer a interação destas enzimas com as
cargas negativas de membranas musculares e nervosas (Karlsson & Pongsawasdi, 1980; Gutiérrez &
Lomonte, 1995), o que explicaria, pelo menos em parte, o modo de ação das mesmas.
14
1.7.3.5. Modificação química com CNBr
A clivagem dos primeiros oito aminoácidos da região N-terminal de PLA
2
s é possível através do
tratamento destas proteínas com brometo de cianogênio (CNBr) (Yang & Chang, 1988; Chwetzoff et al.,
1989a,b), já que grande parte destas enzimas apresentam um resíduo de metionina (Met) como oitavo
aminoácido (Ward et al., 1998a,b; Ownby et al., 1999). A remoção deste octapeptídeo do monômero A de
uma PLA
2
com atividade neurotóxica pré-sináptica causou um decréscimo em sua atividade enzimática
(Yang & Cahng, 1988). Também através de estudos com PLA
2
s tratadas com CNBr, Chu et al. (1993)
propôs que Met8 deve ser um resíduo importante para a interação destas enzimas com a membrana do
terminal nervoso.
A clivagem do octapeptídeo N-terminal em PLA
2
s de serpentes do gênero Bothrops mostrou uma
redução nas atividades miotóxica e citotóxica, redução na formação de edema, da atividade bactericida e
da capacidade de romper lipossomos (Díaz et al., 1994, Soares et al., 2000b, Soares et al., 2001a). Ao
contrário das outras modificações químicas, ao analisar estes resultados devemos considerar ainda o fato
de a ausência dos oito primeiros aminoácidos da porção N-terminal destas proteínas alterar a estrutura
secundária das mesmas, conforme demonstrado por Soares et al. (2001a).
1.7.4. Simulações de Dinâmica Molecular
A dinâmica molecular é uma técnica que nos permite estudar, de maneira teórica, o comportamento
de estruturas tridimensionais de macromoléculas em solução. Através de técnicas de simulações que
podem ser realizadas por computadores podemos então ter uma visão mais completa do comportamento
dinâmico das macromoléculas, estando elas sozinhas (na forma nativa) ou formando complexos com
inibidores ou outras proteínas, por exemplo (McCommon, 1987). Assim, estudos de dinâmica molecular
podem também ser interessantes para complementar outros estudos e por isso vem sendo realizados de
uma forma bastante expressiva nos últimos anos, já que estes experimentos podem ser feitos até mesmo em
computadores considerados de baixa performance. Este método, baseado em cálculos clássicos, possibilita
o estudo da dinâmica de modelos de estruturas tridimensionais de proteínas, através da utilização de
campos de força conservativos que utilizam as propriedades físico-químicas e bioquímicas dos átomos e
moléculas de um sistema para determinar suas coordenadas cartesianas finais (Berendsen et al., 1995). No
entanto, até o momento, poucas estruturas de proteína de venenos de serpentes foram determinadas com
base neste método. Chuang et al. (1996) estudaram a estrutura da waglerina I, uma neurotoxina de
Trimeresurus wagleri, através de ressonância magnética nuclear (NMR) e de simulações de dinâmica
molecular. Da mesma forma, Mazzi et al. (2007) realizaram comparações estruturais entre um modelo
15
16
teórico do domínio catalítico da BjussuMP-I (uma metaloprotease de classe PIII de Bothrops jararacussu)
através desta metodologia.
Considerando o fato de que todas as metodologias têm suas limitações e por isso o uso de
diferentes metodologias muitas vezes se faz necessário na tentativa de esclarecer um determinado
“problema biológico”, as simulações de dinâmica molecular, área ainda pouco explorada, podem auxiliar
de maneira bastante significativa no estudo do entendimento das relações estrutura-função das PLA
2
s.
2. OBJETIVOS
O presente trabalho tem como finalidade estudar Lys49-PLA
2
s de venenos de serpentes nas formas
nativas e/ou complexadas com α-tocoferol, um inibidor destas toxinas, através de cristalografia de raios X,
bem como realizar estudos estruturais comparativos entre estas e outras PLA
2
s homólogas já resolvidas e
depositadas no banco de dados na tentativa de melhor entender a relação estrutura-função destas proteínas.
17
3. MATERIAL E MÉTODOS
O fluxograma da Figura 4 mostra, de maneira simplificada, as etapas para resolução de uma estrutura
protéica por difração de raios X.
Clonagem, expressão e produção da
proteína alvo recombinante
Purificação da proteína alvo a
partir do veneno bruto
Obtenção de cristais convenientes para
difração de raios X
Coleta de dados de difração de raios X
Processamento dos dados de difração de raios
X e caracterização inicial dos cristais
Resolução do problema das fases
pelo método da Substituição
Molecular
Refinamento/Modelagem
Análise da qualidade do modelo
Modelo final
Figura 4 - Etapas para resolução de uma estrutura protéica por difração de raios X através de Substituição Molecular
18
3.1. Purificação da proteína alvo a partir do veneno
No caso das PLA
2
s, a purificação é geralmente conduzida a temperatura ambiente, sem perda da
atividade enzimática, em duas etapas: (a) Filtração em Sephadex ou HPLC de fase reversa seguido de (b)
uma coluna de troca iônica (Gutierrez & Lomonte, 1995) Outra possibilidade é a utilização de
cromatografia de afinidade, explorando o princípio pelo qual as miotoxinas básicas interagem com a
heparina (Soares et al., 2000b). Desta forma, pode-se utilizar uma coluna de afinidade em heparina-
agarose.
3.2. Amostras utilizadas no trabalho
As amostras protéicas utilizadas, fornecidas por nosso colaborador (Prof. Dr. Andreimar Martins
Soares), foram purificadas a partir do veneno bruto, não sendo, portanto, recombinantes.
As proteínas em estudo apresentam alto grau de identidade (diferem apenas em dois aminoácidos):
Lys49-PLA
2
s do veneno de Bothrops jararacusu e do veneno de Bothrops pirajai. As amostras nos foram
fornecidas na forma liofilizada, não cabendo, portanto, a purificação das mesmas durante o trabalho.
3.2.1. A Proteína BthTX-I
A BthTX-I, fosfolipase A
2
homóloga (miotóxica) de Bothops jararacussu, é uma enzima que,
embora cataliticamente inativa, é capaz de desintegrar fosfolipídios de membrana por um mecanismo
independente de cálcio (da Silva-Giotto et al., 1998).
A purificação desta proteína é possível através da combinação de filtração em gel (Sephadex G-75)
e cromatografia de troca iônica (SP-Sephadex C-25); seu peso molecular é de aproximadamente 13 kDa e
seu pI = 8,2 (Homsi-Brandeburgo et al., 1988).
Esta proteína já foi cristalizada na sua forma nativa em duas conformações diferentes: forma
“aberta” e forma “fechada”. Os cristais pertencem ao grupo espacial P3
2
21 e P3
1
21, respectivamente (da
Silva-Giotto et al., 1998). Após a resolução destas estruturas, foram encontradas duas moléculas por
unidade assimétrica (da Silva-Giotto et al., 1998). As estruturas descritas não estão disponíveis no banco
de dados (PDB). As coordenadas da BthTX-I utilizadas nesta dissertação foram fornecidas pelo Prof. Dr.
Richard John Ward.
19
3.2.2. A Proteína PrTX-I
A PrTX-I é também uma Lys49-PLA
2
miotóxica, porém isolada do veneno de Bothrops pirajai.
Esta proteína contém 121 aminoácidos, pH 8,3 e seu peso molecular é de aproximadamente 13kDa
(Mancuso et al., 1995; Toyama et al., 1998). A mesma possui alta similaridade sequencial com a proteína
BthTX-I do veneno de Bothrops jararacussu, apresentando somente 2 aminoácidos diferentes desta.
Esta enzima foi cristalizada na sua forma nativa e pertence ao grupo espacial P2
1
2
1
2
1
, apresentando
duas moléculas na unidade assimétrica. Os dados foram coletados a 2,8 Å de resolução (de Azevedo Jr. et
al., 1998). Esta estrutura também não se encontra disponível no banco de dados (PDB).
3.2.3. α-tocoferol
O α-tocoferol (vitamina E) é um composto lipofílico e um possível candidato a agente
antiinflamatório, pois atua como inibidor tanto de fosfolipases quanto das ciclooxigenases (Zingg & Azzi,
2004). Este composto já foi cristalizado na forma de complexo com uma Asp49-PLA
2
do veneno de
Daboia russeli pulchella, resultando em 50% de inibição desta (Chandra et al, 2002). Estudos realizados
por nossos colaboradores com este inibidor também resultaram numa inibição de 50% de atividade das
Lys49-PLA
2
s PrTX-I
e BthtX-I (resultados não publicados).
O inibidor (α-tocoferol) utilizado durante os experimentos foi adquirido da Sigma-Aldrich e
apresenta pureza superior a 99%.
3.3. Cristalização e co-cristalização
Para a cristalização / co-cristalização foi utilizado o processo de salting-out, que consiste na preparação
de uma solução de um agente precipitante (sal, polietilenoglicol – PEG, ou solvente orgânico) e proteína
(ou proteína-ligante), com posterior aumento gradativo da concentração do agente precipitante até se
alcançar o ponto de supersaturação da proteína ou do complexo proteína-ligante, ocorrendo, então,
precipitação ou cristalização. A cristalização ocorrerá somente se o processo for bastante lento; é
importante lembrar que, em termos termodinâmicos, o estado de menor energia para o complexo é a forma
cristalina.
Um método bastante eficiente para o aumento gradativo da concentração do agente precipitante é a
difusão de vapor (McPherson, 2003. Neste método, em um recipiente fechado, são colocadas duas
soluções que podem realizar trocas apenas pela fase gasosa. Uma das soluções é formada por um agente
precipitante com alta concentração e a outra, pelo mesmo agente mais a proteína (e o ligante, quando
20
houver). Como o volume do agente precipitante depositado no poço (sistema fechado) é infinitamente
maior que o volume do mesmo na gota, após algum tempo, a concentração final da solução de dentro do
poço será igual à concentração da solução da gota, onde está a proteína (isso ocorrerá devido à difusão de
vapor provocada pelas diferentes concentrações iniciais entre a gota e a solução do poço).
Para a obtenção de cristais de qualquer proteína, as moléculas desta devem ser levadas à
supersaturação, estado termodinamicamente instável, podendo resultar em uma fase cristalina ou amorfa,
quando retorna ao equilíbrio (Figura 5). É importante lembrar que o cristal apresenta ordem em sua
estrutura interna e que esse arranjo é periódico. Em condições de supersaturação, o sistema caminha para o
estado de equilíbrio, no qual a proteína se encontra entre uma fase sólida e uma fase solúvel. Nestas
condições, ligações químicas novas e estáveis são energeticamente favoráveis. Podemos, então, dizer que a
proteína cristaliza porque sua energia livre diminui com o aumento das interações favoráveis (MacPherson,
2003).
A supersaturação pode ser obtida pela evaporação lenta do solvente ou pela variação de alguns
parâmetros, como pH, força iônica, tipo de íon, temperatura e concentração do solvente orgânico, que
podem ser usados para diminuir a solubilidade da proteína, tornando a solução saturada ou supersaturada
(Blundell & Johnson, 1976). A solução supersaturada eventualmente dá origem aos núcleos, alguns dos
quais crescerão e se tornarão cristais maiores. O processo pode ser dividido em três estágios: nucleação,
crescimento e cessação de crescimento (Kobe et al., 1999).
A nucleação, onde ocorre formação dos primeiros agregados ordenados, é o processo inicial na
obtenção de cristais, os quais representam a fase sólida de uma proteína. Quando o núcleo atinge um
tamanho crítico, começa a fase de crescimento. Um cristal pequeno pode crescer pela incorporação de
átomos (moléculas) nas suas faces planas em duas dimensões ou em espiral, ou sobre defeitos na superfície
do cristal, incorporando moléculas via interações tridimensionais. O mecanismo dependerá da energia das
interações entre os constituintes do cristal nas direções consideradas. A morfologia do cristal corresponde
diretamente à taxa de crescimento de cada face: faces crescidas lentamente serão maiores e bem
desenvolvidas, enquanto as que crescem mais rapidamente tendem a ser menores. A taxa de crescimento é,
geralmente, diretamente proporcional à supersaturação da solução e à solubilidade da molécula num dado
solvente, sendo também fortemente influenciada pela presença de impurezas, já que a nucleação pode
ocorrer sobre as mesmas. O crescimento de um cristal cessa provavelmente quando há acúmulo de defeitos
dentro da rede cristalina, impedindo desta forma a continuação do crescimento de suas faces (McPherson,
2003).
21
Figura 5 - Representação esquemática da Curva de Solubilidade para proteínas
Para cristalizar uma proteína, deve-se fazer uma procura das melhores condições de crescimento
dos cristais. Isto é feito utilizando-se várias combinações dos fatores já descritos (pH, tampão,
concentração / tipo do agente precipitante, temperatura de cristalização, força iônica da solução, etc...).
Normalmente, o processo é feito sob temperatura constante (geralmente 4ºC ou 18
o
C), variando-se a
concentração, tipos de agentes precipitantes e pHs. Para tanto pode-se utilizar o método da matriz esparsa
(Jancarik e Kim, 1991) ou alguma variação desta metodologia, no qual é coberto um grande número de
condições de cristalização (utilizando-se diferentes sais, precipitantes e pHs) em menos de uma centena de
soluções.
Para os testes de cristalização da proteína nativa em estudo foi utilizada a técnica de hanging drop. Nas
tentativas de co-cristalização deu-se preferência à técnica de sitting drop, já que esta técnica permite um
melhor contato entre a proteína e seu inibidor (α-tocoferol). Em ambos os casos são utilizados placas de
cristalização (Figura 6) e no sitting drop são também utilizadas microbridges (Figura 7).
A técnica de hanging drop é muito parecida com a de sitting drop, porém a diferença é que na primeira
a gota que contém a solução de proteína fica “suspensa”, aderida à lamínula (Figura 8); já na outra, a gota
fica “sentada”, já que é depositada sobre a microbridge (Figura 8). Usaremos esta técnica para co-
cristalizar proteínas com inibidores, que neste caso é o α-tocoferol. Como a vitamina E é viscosa e deve
ficar em contato com a proteína, demos preferência a esta técnica. Ambas as técnicas seguem o mesmo
princípio: salting-out.
22
O procedimento para utilização da técnica de sitting drop se dá da seguinte forma: a solução preparada,
contendo o agente precipitante, é inserida em um dos poços; a vitamina E é então colocada em contato com
a microbridge de forma a espalhar-se pela superfície da mesma; em seguida, a proteína é colocada sobre a
vitamina E, ambas permanecendo em contato por certo tempo à temperatura controlada para que ocorra
uma maior interação entre α-tocoferol e a proteína em questão, possibilitando, assim, um maior contato
entre ambas (com isso, espera-se que a vitamina E se ligue a algum sítio da fosfolipase, já que esta já foi
descrita como inibidor de PLA
2
s); após, um certo volume da solução do poço é colocada sobre a proteína +
α-tocoferol. Após este procedimento, a microbridge é inserida no poço, o qual é tampado com uma
lamínula de vidro, vedando-se o sistema com uma graxa especial para que as trocas que ocorrerão a partir
de então se dêem somente entre os componentes do sistema – com isso elimina-se a interferência do
ambiente (Figura 8). No hanging drop, a gota é depositada diretamente sobre a lamínula, não necessitando
assim do uso da microbridge.
Figura 7 – Microbridge
Figura 6 - Placa de cristalização
23
Figura 8 - Sitting drop: esquema mostrando os componentes do sistema
3.4. Coleta de dados de difração de raios X
A coleta de dados de difração de raios X é muito importante, pois constitui a única fonte de dados
através da qual podemos obter a estrutura cristalográfica (Blundell & Johnson, 1976). Os dados são obtidos
quando um feixe de raios X, após incidir sobre um material cristalino, sofre difração. Estes dados podem
ser obtidos através da utilização de uma fonte de raios X convencional, com um ânodo rotatório, ou raios
X de um síncrotron (como o existente no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, Campinas - SP). Nestes
equipamentos, o cristal de proteína é colocado em um loop cujo diâmetro seja adequado para abrigar o
cristal. No loop também é necessária a presença da solução-mãe (solução que proporcionou a nucleação e
crescimento do cristal), ou uma solução similar, e normalmente é necessária a adição de um crioprotetor
(como, por exemplo, o glicerol) para impedir a formação de cristais de gelo ao redor do cristal em estudo,
ou para que este não sofra danos irreversíveis e seja perdido. O cristal é, então, exposto ao feixe de raios X
e também a um fluxo de nitrogênio gasoso, à temperatura controlada (normalmente 100 K). Isto permite
um aumento no tempo de coleta, pois promove aumento no tempo útil do cristal comparado com coletas
sem o congelamento do cristal (cristal montado em capilar). Para que seja possível a obtenção de um bom
conjunto de dados, os cristais devem apresentar um tamanho que pode variar entre 0,1 e 1,0 mm.
O loop montado é alinhado ao feixe de raios X de tal maneira que, durante os movimentos
oscilatórios que o mesmo sofrerá, o cristal fique exposto à radiação de maneira homogênea (McRee,
1993).
Inicialmente, pode-se determinar a partir deste conjunto de dados informações como grupo
espacial, parâmetros de rede do cristal, número de monômeros da proteína na unidade assimétrica
cristalina e previsão da porcentagem de solvente no cristal.
24
25
O processamento dos dados obtidos é feito utilizando-se o programa DENZO/SCALEPACK, que é
largamente utilizado pela comunidade cristalográfica (Otwinowski e Minor, 1997).
3.5. Elucidação de estruturas tridimensionais
A determinação da estrutura tridimensional de uma proteína requer vários passos, conforme já
demonstrado pela Figura 4. Após a coleta de dados de difração de raios X, estes têm que ser processados e
a partir de então, os mesmos são utilizados para dar início à determinação do modelo estrutural. A
determinação de uma estrutura protéica pode ser feita através do método de Substituição Molecular,
utilizando-se o programa AMoRe – Automated Package for Molecular Replacement (Navaza, 1994).
Porém, uma restrição para o uso deste método consiste na necessidade de uma alta similaridade seqüencial
entre a proteína em estudo e a proteína que servirá de modelo, cuja estrutura deve ser conhecida. O
procedimento baseia-se no fato de proteínas com seqüências semelhantes de aminoácidos possuírem
enovelamentos similares (McRee, 1993; Drenth, 1994).
Após o processamento dos dados provenientes da coleta de dados de difração de raios X, é gerado
um mapa de densidade eletrônica e inicia-se o refinamento da estrutura. O modelo gerado pela substituição
molecular é, então, refinado até a máxima concordância entre dados experimentais e a estereoquímica da
molécula, o que pode ser feito utilizando-se os programas CCP4 (para refinamento de corpo rígido) e o
CNS (ciclos de refinamento de posição dos átomos e do fator de temperatura B) (Brünger, 1992; Brünger
et al.,1998). Durante as etapas de refinamento, ajustes manuais do modelo à densidade eletrônica são feitos
utilizando-se, por exemplo, o programa gráfico “O” (Jones et al., 1990). A qualidade estereoquímica do
modelo obtido pode ser checada pelo programa “Procheck” (Laskowski et al., 1993), através de vários
parâmetros como o G-factor geral e o Gráfico de Ramachandran.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Estudos estruturais com a PrTX-I nativa e complexada α-tocoferol e da BthTX-I complexada
com α-tocoferol
As proteínas em estudo foram inicialmente dissolvidas em água ultra-pura, e durante os testes de
cristalização as mesmas estavam na concentração de 12 mg/ml (dos Santos et al., 2007). Inicialmente, os
testes foram realizados com um quite de 50 soluções prontas da Hampton Research. Para a montagem das
placas foi utilizado 1μl de solução do poço, 1μl de solução protéica e 1μl de vitamina E (no caso dos
complexos) na gota e o método utilizado foi o sitting-drop, no caso dos complexos, e o hanging-drop, para
a PrTX-I nativa (dos Santos et al., 2007). Todos os cristais (Figura 9) foram obtidos em soluções de
cristalização similares, com exceção da temperatura de cristalização para o complexo BthTX-I-αT (Tabela
1). Os cristais difrataram a: 1,65Å - PrTX-I nativa, 1,87Å - PrTX-I-αT e 1,83Å - BthTX-I-αT (Tabela 2;
dos Santos et al., 2007).
Figura 9 – Cristais das proteínas. A) PrTX-I-nativa; B) PrTX-I / αT; C) BthTX-I / αT
Tabela 1
– Condições de cristalização para as proteínas PrTX-I nativa, PrTX-I /αT e BthTX-I / αT
PrTX-I nativa PrTX-I / αT BthTX-I / αT
0,1M Tris HCl pH 7,8
0,2M sulfato de lítio
Solução de cristalização
30% PEG 4000
Temperatura de cristalização
25
o
C 25
o
C 18
o
C
Após a obtenção dos dados de difração de raios X, a estrutura dos mesmos pôde ser elucidada. A
estrutura da BnSP-7 nativa (Magro et al., 2003) foi utilizada como modelo para elucidação das estruturas
em questão. Na Tabela 2 estão os dados referentes aos conjuntos de dados obtidos.
26
Tabela 2 – Estatísticas de coleta de dados de difração de raios X e refinamento das proteínas cristalizadas
PrTX-I nativa
PrTX-I/αT BthTX-I/αT
a = 38,9 a = 38,4
a = b = 55,9 b = 71,4 b = 70,1
c = 127,9 c = 44,3 c = 43,9
Cela unitária (Å)
β = 102,3
o
β = 102,23
o
Grupo espacial P3
1
21 P2
1
P2
1
Resolução (Å) 40-1,65 (1,71-1,65)
a
40-1,87 (1,94-1,87)
a
40-1,83 (1,9-1,83)
a
Reflexões únicas 27251 (2648)
a
19407 (1927)
a
19435 (1824)
a
Dados completos (%) 94,9 (94,0)
a
98,9 (98,2)
a
96,2 (92,0)
a
R
merge
b
(%) 8,4 (52,5)
a
6,0 (20,6)
a
6,8 (33,5)
a
Fonte de radiação Syncrothron (LNLS - MX1)
Temperatura de coleta dos dados (K)
100
I/σ(I)
12,0 (2,0)
a
19,3 (3,9)
a
22,76 (2,36)
a
Coeficiente de Matthews V
M
(Å
3
/Dalton) 2,06 2,15 2,14
Moléculas na unidade assimétrica
2
Conteúdo de solvente (%) 40,3 42,7 42,4
R
crys
c
(%)
21,4 18,29 19,49
R
free
d
(%)
25,8 24,31 24,33
Gráfico de Ramachandran
Resíduos na região mais favorável (%)
90,9 90,8 89,3
Resíduos em regiões adicionais porém permitidas (%)
8,2 8,7 10,2
Resíduos em regiões generosamente / não permitidas (%)
1,0 0,5 0,5
a
Números em parênteses são para a faixa de mais alta resolução.
b
R
merge
= Σ
hkl
(Σ
i
(|I
hkl,i
-<I
hkl
>|))/Σ
hkl,i
<I
hkl
>, onde I
hkl,i
é a intensidade de
uma medida individual de uma reflexão com índices de Miller h, k e l, e <I
hkl
> é a intensidade média daquela reflexão. Calculado para I
> -3σ (I).
c
R
crys
= Σ
hkl
(||Fobs
hkl
- Fcalc
hkl
||)/|Fobs
hkl
|
, onde |Fobs
hkl
|e |Fcalc
hkl
| são as amplitudes dos fatores de estrutura observados e
calculados.
d
R
free
é equivalente ao R
crys
, porém calculado com 5% das reflexões omitidas do processo de refinamento.
Em todos os casos, os dados foram processados utilizando-se o programa DENZO/SCALEPACK
(Otwinowski et al, 1997). Após um ciclo de refinamento de corpo rígido e um do tipo simulated annealing,
foi gerado um mapa de densidade eletrônica para modelagem utilizando o programa gráfico “O” (Jones et
al., 1990). Todos os ciclos de refinamento de posição e do fator de temperatura foram executados através
do programa CNS (Brünger et al., 1992). Entre os ciclos de refinamento foram gerados mapas de
densidade eletrônica (MDEs) e “omit maps” com coeficiente 3⎮F
obs
⎟-2⎟F
calc
⎟ para que as correções
manuais de posição dos aminoácidos pudessem ser feitas. Durante a fase de modelagem e refinamento das
estruturas foram adicionadas 432, 356 e 246 moléculas de solvente aos modelos da PrTX-I nativa, PrTX-I /
27
αT e BthTX-I / αT, respectivamente. Em determinadas regiões onde a densidade eletrônica mostrou-se
demasiadamente fraca ou ambígua, mesmo após vários ciclos de refinamento, optou-se por executar a
troca (mutação) de alguns resíduos por outros de glicina ou alanina. Na PrtX-I nativa foram feitas as
seguintes mutações no monômero A: Phe3→Ala, Lys69→Ala e Lys70→Ala; e no monômero B:
Arg34→Ala, Lys53→Ala, Lys57→Ala, Lys70→Gly, Lys115→Ala, Lys116→Ala, Lys127→Ala e
Lys129→Ala. No complexo PrTX-I-αT foram realizadas quatro mutações - no monômero A: Lys70→Gly
e Gln86→Gly, e no monômero B: Asp79→Ala e Lys129→Ala. Já no complexo BthTX-I-αT foram feitas
as mutações no monômero A: Lys36→Ala, Lys69→Ala, Lys70→Ala, Lys78→Ala e Lys122→Gly e no
monômero B: Lys69→Ala e Pro132→Ala. Tal prática é justificável pelo fato de que, devido à falta de
dados experimentais nas regiões com MDEs imprecisos, é grande a possibilidade da modelagem incorreta
dos resíduos originais, o que introduz erros estatísticos consideráveis ao modelo. Assim sendo, a troca de
resíduos dotados de grandes cadeias laterais por outros de peso molecular menor (glicina e alanina)
minimiza estas possíveis incorreções estatísticas. Embora o seqüenciamento da BthTX-I indique uma
leucina na posição 116 (Cintra et al., 1993), a densidade eletrônica indicou a possibilidade de modelagem
de uma lisina nesta posição, sugerindo um erro no seqüenciamento desta proteína.
As estruturas resolvidas apresentam uma qualidade estereoquímica melhor que o esperado para
estruturas com as mesmas resoluções, como indicado pelo G-factor geral. A análise dos modelos também
mostra que a grande maioria dos resíduos das estruturas apresenta uma combinação adequada dos ângulos
ϕ
e
ψ
, sendo este, portanto, um resultado bastante satisfatório. (Tabela 2; Figura 10). Os resíduos
encontrados nas regiões não permitidas e generosamente permitidas do gráfico de Ramachandran (Asn87 e
Asp132) fazem parte de regiões bastante flexíveis destas PLA
2
s, o que justifica a dificuldade de
modelagem destes resíduos pela falta de densidade eletrônica para modelá-los na posição correta.
Na região correspondente ao sítio ativo da PrTX-I nativa foram encontradas algumas moléculas
de água, enquanto no sítio das complexadas foram encontradas os anéis cromanol das moléculas de αT
(Figura 11).
28
PrTX-I nativa PrTX-I / αT
BthTX-I / αT
Figura 10 – Diagrama de Ramachandran para o a PrTX-I nativa e para os complexos PrTX-I / αT e
BthTX-I / αT
29
Figura 11 – Comparação entre as regiões do “sítio ativo” para a PrTX-I nativa e a complexada. (a) Figura com
mapa de densidade eletrônica 3|Fobs|-2|Fc| ilustrando o “sítio ativo” da PrTX-I / αT comparativo à mesma região da
PrTX-I nativa (b); (c) Mapa de densidade eletrônica 3|F
obs
|-2|F
c
| mostrando a densidade que corresponde à molécula
de α-tocoferol situada no sítio hidrofóbico do monômero A do complexo PrTX-I / α-tocoferol. Figura feita usando o
programa “O” (Jones et al., 1990).
30
31
A estrutura geral de uma Lys49-PLA
2
(Figura 2) se apresentou conservada em todos os casos
(PrTX-I nativa e complexos). Na forma nativa da PrTX-I foram encontrados íons sulfato e Tris (2-amino-
2-(hidroximetil) propano-1,3-diol), além de moléculas de água (Figura 12). Já nas formas complexadas,
além de moléculas de água e alguns íons sulfato, há duas moléculas de αT e uma molécula de PEG 4000
(polietilenoglicol) (Figura 12). As moléculas de αT interagem com as proteínas por seus canais
hidrofóbicos e por seus sítios ativos, essencialmente por contatos hidrofóbicos nos dois complexos (Figura
13). Há ainda, interações por contatos hidrofóbicos entre ambas as moléculas de vitamina E no caso da
PrTX-I / αT (Figura 13b; Figura13c). As moléculas de PEG interagem com um dos monômeros de cada
um dos complexos provocando um leve deslocamento do Trp77 em um dos monômeros (Figura 14), fato
este que leva à estabilização da Lys7 deste mesmo monômero (Figura 13). Isto também ocorre no outro
monômero, onde é possível visualizar a molécula de PEG ao redor da Lys7 por simetria cristalográfica.
Alguns outros resíduos da proteína também interagem com este ligante por meio de contatos hidrofóbicos
(Figura 13b; Figura 13d). A estabilização da Lys7 nesta região se dá por de pontes de hidrogênio e por
contatos hidrofóbicos (Figura 13b; Figura 13d). Os íons que interagem com a forma nativa da proteína
apresentam baixa ocupação, ao contrário do que ocorre nos complexos. A maioria deles interage com
resíduos da região C-terminal da proteína, merecendo destaque as interações com os resíduos Lys 20,
Lys115 e Arg 118 (Figuras 13a,13b, 13d; Figura 23).
A sobreposição entre os monômeros de cada uma das proteínas mostra que há variações em
algumas regiões da estrutura destas enzimas, sendo que a mais significativa ocorre na região C-terminal da
proteína nativa em relação às formas complexadas, e em menor escala em outras regiões, como as das
folhas β e a do loop de ligação do Ca
2+
(Tabela 3).
A sobreposição dos monômeros das três proteínas mostra que os complexos são praticamente
idênticos (Tabela 4; Figura 15) Já a comparação entre os dímeros dos complexos PrTX-I/αT e BthTX-I/αT
e a forma nativa mostra que há um deslocamento entre os monômeros dos complexos devido à interação
do ligante com a proteína (Figura 15).
PrTX-I nativa
PrTX-I / αT BthTX-I / αT
Figura 12 – Figura representando as três estruturas elucidadas, juntamente com os ligantes e íons que interagem com cada uma delas.
Em verde, estão representados os íons; em amarelo, moléculas de polietilenoglicol (PEG) e em alaranjado, moléculas de α-tocoferol (vitamina E).
32
33
PrXT-I nativa
Interações da interface dimérica
(a)
Íons interagindo com a PrTX-I
Figura 13 – Figura ilustrativa das interações que ocorrem na PrTX-I nativa e nos complexos PrTX-I / αT e BthTX-I / αT. (a) Interações entre os monômeros
da PrTX-I nativa e desta com íons.
PrXT-I /
α
T
34
Figura 13 (continuação) – (b) Interações
entre os monômeros da PrTX-I / αT e desta com a moléculas de PEG e de αT (“TIV”) que interagem com a estrutura.
Interações da molécula de PEG
Interações da molécula “TIV”
Interações da interface dimérica
(b)
35
Figura 13 (continuação) – (c) Interações
da PrTX-I / αT com íons e com um das moléculas de αT (“VIT”) que interagem com a estrutura em estudo
PrXT-I /
α
T X íons sulfato
Interações da molécula “VIT”
PrXT-I /
α
T
(c)
BthXT-I /
α
T
36
Interações da molécula de PEG
Interações da molécula “VIT”
Interações da interface dimérica
(d)
Figura 13 (continuação) – (d) Interações
entre os monômeros da BthTX-I / αT e desta com a moléculas de PEG e de αT (“VIT”) que interagem com a estrutura.
37
BthTX-I / αT X íons sultato
Interações da molécula “TIV”
BthXT-I / αT
(e)
Figura 13 (continuação) – (e) Interações
da BthTX-I / αT com íons e com um das moléculas de αT (“TIV”) que interagem com a estrutura em estudo.
Figura 14 – Deslocamento do Trp77 nas formas complexadas (BthTX-I/αT e PrTX-I/αT) pela presença de uma
molécula de PEG 4000 interagindo com as mesmas. Figura feita usando o programa Pymol (DeLano, 2002).
Tabela 3 – R.m.s.d. para sobreposição de Cα entre os monômeros (“A” X “B”) de uma mesma estrutura
(PrTX-I nativa e complexos)
Lys49-PLA
2
Geral “h1”
loop
Ca
2+
“h2”
folhas
β
“h3” C-term
PrTX-I / αT 0,822 0,107 0,900 0,200 0,095 0,256 0,703
BthTX-I / αT 0,757 0,07 0,949 0,188 0,130 0,235 0,578
PrTX-I
1,037 0,167 0,538 0,183 0,306 0,108 2,092
Tabela 4 – R.m.s.d. para sobreposição de Cα entre monômeros de diferentes estruturas
Monômero A Monômero B
PrTX-I-nativa PrTX-I/αT BthTX-I/αT PrTX-I-nativa PrTX-I/αT BthTX-I/αT
Mon. A
PrTX-I-nativa
- 1,004 1,004
PrTX-I/αT
1,004 - 0,231
BthTX-I/αT
1,004 0,231 -
Mon. B
PrTX-I-nativa
- 0,644 0,600
PrTX-I/αT
0,644 - 0,231
BthTX-I/αT
0,600 0,231 -
38
Figura 15 – Sobreposição de um dos monômeros de cada uma das estruturas elucidadas mostrando os diferentes
padrões de estrutura quaternária das formas complexadas em relação à PrTX-I nativa. Figura feita usando o
programa Pymol (DeLano, 2002).
Os dímeros dos modelos estruturais apresentados são mantidos nesta conformação principalmente
por interações hidrofóbicas entre os resíduos presentes na interface dos monômeros, conforme
demonstrado nas Figuras 13a, 13b e 13d. Porém, interações entre os monômeros dos complexos através de
pontes de hidrogênio também são observadas (Figura 13a, 13b e 13d). É importante ressaltar o
estabelecimento de novas interações através de pontes de hidrogênio quando os complexos com αT se
formam. Enquanto para a PrTX-I as pontes de hidrogênio se estabelecem entre os resíduos
Asn17(A):Tyr119(B), Asn17(A):His120(B) e Val31(A):Lys69(B); para os complexos são estabelecidos
contatos entre os resíduos Asn17(B):Tyr119(A) e Tyr119(A):Tyr119 (B) (Figura 13a, 13b e 13d; análises
no programa MolTalk – http://i.moltalk.org/). Assim, para que interações entre as Tyr119 dos monômeros
dos complexos se estabeleçam, este resíduo, em um dos monômeros, sofre uma reorientação espacial
(rotação de cerca de 180
o
) (Figura 16). Essas mudanças conformacionais provocadas pela interação da
proteína com o ligante conferem maior estabilidade aos complexos, diminuindo seus fatores de
temperatura, conforme demonstrado pela Figura 17, tornando os monômeros mais simétricos entre si
(Tabela 3).
39
Figura 16 – Figura mostrando que as Tyr119 das proteínas complexadas sofrem uma reorientação conformacional
em um de seus monômeros comparadas à forma nativa, o que permite que as mesmas passem a estabelecer pontes de
hidrogênio entre si. Figura feita usando o programa Pymol (DeLano, 2002).
Figura 17 – Diagrama representativo do fator temperatura (“B factor”) das proteínas PrTX-I nativa, PrTX-I/αT e
BthTX-I/αT. Regiões com maior fator temperatura são mostradas em vermelho e com menor fator temperatura, em
azul. Figura feita usando o programa Pymol (DeLano, 2002).
A comparação entre a estrutura da PrTX-I complexada com αT e a da PrTX-I nativa, as quais
foram cristalizadas nas mesmas condições físico-químicas, mostra que não há modificações estruturais
acentuadas em suas estruturas secundárias e terciárias. A obtenção de cristais das proteínas nativa e
complexadas em diferentes grupos espaciais (Tabela 2) já apontava para possíveis mudanças na
conformação oligomérica devido a presença do ligante. As mudanças mais pronunciadas que foram
40
observadas se deram pela interação das moléculas de αT no sítio hidrofóbico destas proteínas resultando
no deslocamento do loop de ligação do Ca
2+
(esta região foi “empurrada” para melhor acomodar as
moléculas de αT) (Figura 18) e também da região C-terminal. Com isso, não só o grau de abertura entre os
monômeros foi alterado, mas também houve mudança na orientação de um monômero em relação ao outro
num eixo diferente do que caracteriza o ângulo de abertura. De maneira a quantificar esta reorientação, foi
desenvolvido um modelo do dímero onde foram considerados dois ângulos: Φ (grau de abertura entre os
monômeros) e Ψ (grau de torção entre os monômeros) (Figura 19). No caso das proteínas complexadas a
mudança nos ângulos de torção em relação à nativa mostra que há uma tendência de os monômeros se
reorientarem buscando se posicionar em um mesmo plano (Tabela 5; Figura 19b). Esta reorientação dos
monômeros ocorre, conforme já mencionado, devido à interação do ligante com a proteína, conduzindo a
uma minimização das diferenças entre os monômeros, conforme observado na Tabela 3 (r.m.s.d. geral).
Conseqüentemente, os monômeros dos complexos passam a interagir através de resíduos diferentes
comparados à estrutura da PrTX-I nativa, mostrando uma tendência de manter contatos pelos mesmos
resíduos de cada monômero, diferentemente do que ocorre com a nativa (Tabela 6), refletindo a tendência
de os monômeros de cada complexo estarem alinhados em um mesmo plano (Tabela 5; Tabela 19b).
Figura 18 – Comparação entre os dímeros das estruturas elucidadas mostrando que a presença dos ligantes
provocou um deslocamento dos loops de ligação do Ca
2+
entre si para “abrigar” as moléculas de α-tocoferol. Figura
feita usando o programa Pymol (DeLano, 2002).
41
Tabela 5 – Ângulos de Torção e Abertura para as estruturas elucidadas
Ângulo ψ (Torção) Ângulo Φ (Abertura)
PrTX-I
60
o
7
o
PrTX-I / αT
41
o
12
o
BthTX-I / αT
40
o
11
o
Tabela 6 – Resíduos da interface protéica das estuturas elucidadas (Análise no programa PISA)
Resíduos na Interface
Mon A
PrTX-I-Nat
2 3 5 6 7 9 10 17 18 19 20 23 24 30 31 32 72 120 121 122
PrTX-I/αT
2 3 10 17 19 20 24 31 32 69 70 119 121 122 123
BthTX-I/αT
2 3 10 17 18 19 20 23 24 30 32 69 119 121 122
Mon B
PrTX-I-Nat
1 2 3 17 19 24 31 32 33 69 70 72 119 120 121 122 123 125 129
PrTX-I/αT
2 3 10 17 18 19 20 24 32 69 72 119 121
BthTX-I/αT
1 2 3 17 19 20 24 31 32 33 69 70 72 119 120 121 122
42
Caracterização do Ân
g
ulo de Torção
(
ψ
)
B
A
x
z
y
PrTX-I nativa
PrTX-I /
Figura 19 – Figura ilustrativa do esquema utilizado para medir ângulos de torção e abertura entre os monômeros de uma mesma estrutura. (A) Para realizar as
medidas, consideramos três pontos (caracterizados pelas coordenadas x, y, e z dos C
α
dos resíduos Arg43 (em “h2”), Glu97 (em “h3”) e Glu108 (em “h3”) –
marcados em verde na figura) que podem caracterizar um plano (contido nos eixos x e z) ou vetores. (B) Caracterização do Ângulo de Torção (ψ): medida
realizada através do produto escalar entre os 2 vetores considerados (marcados em azul). Em verde, seta identificando as possibilidades de movimentação de um
monômero em relação ao outro. (C) Caracterização do Ângulo de Abertura (Φ): medida realizada através do produto vetorial entre os 2 vetores considerados
(marcados em azul). Em verde, seta identificando as possibilidades de movimentação de um monômero em relação ao outro.
α
T
PrTX-I nativa
PrTX-I /
α
T
C
Caracterização do Ân
g
ulo de Abertura
(
φ
)
43
4.2. Comparação de Lys49-PLA
2
s nativas e complexadas
Os resultados da sobreposição dos monômeros foram também comparados com outras estruturas de
Lys49-PLA
2
s diméricas existentes no banco de dados - PDB (Tabela 7). Da comparação entre as estruturas
nativas e complexadas existentes no banco de dados, nota-se uma tendência de maior concordância (menor
r.m.s.d.) entre os monômeros dos complexos em relação às formas nativas (Tabela 8), as quais podem ser
agrupadas em duas classes, segundo sua estrutura quaternária: com ligantes e sem ligantes (Figura 20). As
formas nativas, se comparadas às complexadas, apresentam uma desordem maior na região do C-terminal
(como já havia sido observado para a PrTX-I nativa), mais especificamente entre os resíduos 119 a 125,
com exceção da proteína miotoxina II de Bothrops asper (Tabela 8). Isto mostra, como já mencionado, que
as estruturas complexadas tendem a apresentar uma maior simetria entre os monômeros, o que leva alguns
resíduos, principalmente aqueles presentes na região C-terminal, a se reorganizarem quando há interação
com um ligante. Os prováveis resíduos responsáveis por este fato são a Tyr119 e a His120 - a reorientação
que ocorre com as Tyr119 e, conseqüentemente, com as His120 dos complexos há pouco apresentados na
Figura 16, também foi observada em todas as outras estruturas complexadas comparadas (Figura.21).
Diante de tais mudanças, estas estruturas provavelmente se tornam mais estáveis, fato este que pode ser
demonstrado pela diminuição do fator temperatura das estruturas de uma forma geral (Figura 22). Em
todos os complexos analisados também é nítida a tendência de os monômeros se reorientarem entre si na
tentativa de ficarem alinhados em um mesmo plano (se comparados com as formas nativas)– o que pode
ser demonstrado pelo menor ângulo de torção nas formas complexadas (com exceção da PrTX-II
complexada com ácidos graxos) (Tabela 9). Esta nova orientação dos monômeros entre si quando há
interação com um ligante provavelmente tem grande importância para a manifestação da atividade
miotóxica destas proteínas e das Lys49-PLA
2
s de uma forma geral.
Tabela 7 – Códigos de acesso no PDB e dados de refinamento das proteínas utilizadas nas comparações
PrTX-I BnSP-7 BnSP-6 BthTX-I
BaspTX-
II
PrTX-I /
αT
BthTX-I
/ αT
MjTX-II
/ ácido
esteárico
PrTX-II /
ácido
graxo
BaspTX-
II /
suramina
Grupo espacial
P3
1
21 P3
1
21 P3
1
21 P3
1
21 P2
1
2
1
2
1
P2
1
P2
1
P2
1
2
1
2
1
P2
1
P2
1
2
1
2
1
Resolução (Å)
2,2 2,2 2,9 2,1 2,8 1,87 1,83 1,8 2,04 1,7
Mols. na unid. assim.
2 2 2 2 2 2
2
2 2 2
R
crys
(%)
19,38 20,8 18,6 18,7 16,5 18,9
20,22
16,6 17,6 20,6
R
free
(%)
24,79 26,6 25,5 27,4 - 24,26
25,05
24,7 26,8 24,0
Código do PDB
2Q2J 1PAO 1PC9 - 1CLP 2OS4
-
1XXS 1QLL 1Y4L
44
Tabela 8 – R.m.s.d. para sobreposição de Cα entre os monômeros de uma mesma estrutura
Lys49-PLA
2
Geral “h1”
loop
Ca
2+
“h2”
folhas
β
“h3” C-term
MjTX-II / ácido esteárico 0,260 0,099 0,088 0,195 0,117 0,044 0,276
BaspTX-II / suramina 0,676 0,107 0,663 0,375 0,111 0,133 0,61
PrTX-II / ácido graxo 0,246 0,038 0,029 0,050 0,022 0,043 0,027
PrTX-I / αT
0,822 0,107 0,900 0,200 0,095 0,256 0,703
Complexadas
BthTX-I / αT
0,757 0,070 0,949 0,188 0,130 0,235 0,578
BaspTX-II 0,596 0,456 0,498 0,401 0,444 0,302 0,696
BnSP-7 0,957 0,189 0,29 0,173 0,329 0,141 2,083
BnSP-6 0,958 0,202 0,229 0,221 0,142 0,133 2,059
BthTX-I 0,999 0,153 0,411 0,177 0,192 0,158 2,141
Nativas
PrTX-I 1,037 0,167 0,538 0,183 0,306 0,108 2,092
Figura 20 – Figura ilustrativa dos diferentes padrões de estrutura quaternária para as Lys49-PLA
2
s nativas e
complexadas. (A) Sobreposição entre as proteínas nativas listadas na Tabela 7. Em verde, a proteína BaspTX-II em
destaque, já que esta apresenta um padrão de estrutura quaternária diferente de todas as outras Lys49-PLA
2
s nativas
comparadas. (B) Sobreposição entre as proteínas complexadas listadas na Tabela 7. Em ciano, a proteína PrTX-II /
ácido graxo em destaque, já que esta apresenta um padrão de estrutura quaternária diferente de todas as outras
Lys49-PLA
2
s complexadas comparadas. (C) Comparação entre os diferentes padrões de estrutura quaternária para as
formas nativas e complexadas existentes no banco de dados. Figuras feita usando programa “O” (Jones et al., 1900).
45
Tabela 9 – Ângulos de Torção e Abertura para as proteínas em análise
Ângulo ψ (Torção) Ângulo Φ (Abertura)
BaspTX-II
44
o
22
o
BnSP-7
60
o
6
o
BnSP-6
60
o
6
o
Nativas
BthTX-I
61
o
6
o
PrTX-I
60
o
7
o
PrTX-I / αT
41
o
12
o
BthTX-I / αT
40
o
11
o
MjTX-II / ácido esteárico 52
o
20
o
Basp-TX-II / suramina
51
o
15
o
Complexadas
PrTX-II / ácido graxo
81
o
23
o
Figura 21 – Figura ilustrativa dos diferentes padrões dos resíduos Tyr119 e His120 nas formas nativas e
complexadas. (A) Figura ilustrativa da sobreposição entre as proteínas nativas e complexadas utilizadas nas
comparações realizadas neste trabalho (listadas na Tabela 7 e apresentadas na Figura 20). (B) Figura ilustrando um
aumento (“zoom”) na região destacada em (A) para melhor demonstrar o diferente padrão dos resíduos Tyr119 e
His120 nas formas nativas e complexadas das proteínas em comparação. Em verde, novamente destacamos a
proteína BaspTX-II nativa que além de não seguir o padrão de uma estrutura nativa (Figura 20), se comporta como
uma proteína complexada. Figuras feitas usando o programa “O” (Jones et al., 1990).
46
Figura 22 – Diagrama representativo do fator temperatura (“B factor”) de todas as proteínas comparadas neste trabalho (Tabela 7). Regiões com maior
fator temperatura são mostradas em vermelho e com menor fator temperatura, em azul. Figura feita com o programa Pymol (De Lano, 2002).
BaspTX-II
BnSP-7
PrTX-I nativa
N
A
T
I
V
A
S
BnSP-6
MjTX-II / ác. esteárico
BthTX-I /
α
T
PrTX-I / αT
C
O
M
P
L
E
X
A
D
A
S
PrTX-II / ác. graxo
BaspTX-II / suramina
47
4.3. Estabelecimento de interações entre as Lys49-PLA
2
s de venenos de serpentes e membranas
musculares
Conforme exposto, a interação entre as Tyr119 nos dímeros protéicos parece bastante importante
para conferir maior estabilidade aos complexos, pois diante das novas interações estabelecidas quando há
interação entre as moléculas de um ligante e as fosfolipases, os complexos assumem uma forma mais
simétrica (se compararmos seus monômeros entre si). A importância do resíduo Tyr119 para a atividade
miotóxica já foi inclusive demonstrada por experimentos de mutação sítio-dirigida (Chioato et al., 2007).
Bahnson et al., em 2005, utilizando estudos de PLA
2
s de pâncreas bovino, sugeriu a importância da
interação de íons em regiões específicas de proteínas, mostrando que a interação de íons carregados
negativamente (como íons sulfato, por exemplo) com regiões específicas de PLA
2
s, podem indicar a(s)
região(ões) destas enzimas que interagem com a membrana. Assim, a análise da estrutura da PrTX-I-αT e
da BthTX-I-αT, bem como das estruturas de outros complexos (apresentados na Figura 7) mostrou a
existência de íons interagindo com alguns resíduos destas Lys49-PLA
2
s (para as formas nativas não há
descrição de íons no arquivo depositado no banco de dados - PDB, o que torna impossível analisá-las em
relação a este aspecto). Vários estudos apontam o C-terminal destas proteínas como sendo a região
responsável pela atividade miotóxica das mesmas (Chioato et al., 2002; Chioato et al., 2007, Lomonte et
al, 2003b, Núnez et al., 2001; Ward et al., 2002). Nestes estudos os principais resíduos apontados são os
resíduos 115-116 ao 129. Anteriormente, mencionamos a existência de íons sulfato e / ou tris interagindo
com as estruturas complexadas com α-tocoferol, merecendo destaque os íons que interagem com os
resíduos Lys20, Lys 115 e Arg118 da proteína nativa e do complexo, embora na forma nativa os íons
apresentem menor ocupação. Assim, estes dados nos levam a acreditar que esta é a região que representa o
sítio miotóxico das Lys49-PLA
2
s (Figura 23). A interação entre as Tyr119 dos monômeros dos complexos
parece ser também de fundamental importância no estabelecimento da lesão muscular devido à sua
localização (Figura 23b) - estes resíduos de tirosina estão posicionados logo abaixo dos resíduos
identificados como integrantes do sítio miotóxico, propiciando, desta forma, uma melhor sustentação para
que o “ataque” à membrana ocorra. É importante ressaltar que a orientação das Tyr119 nas formas nativas
não permite o estabelecimento de contatos (ponte de hidrogênio) entre as mesmas; a única exceção é a
estrutura da BaspTX-II nativa.
Uma análise das seqüências primárias de Lys49-PLA
2
s mostra, ainda, que os resíduos mencionados
como sendo importantes para o estabelecimento da lesão muscular (Lys20, Lys115 e Arg118) são
conservados (Figura 24): o resíduo Lys115 é, provavelmente, restrito às PLA
2
s básicas e os resíduos
Lys20, Arg118 e Tyr119 aparecem somente em Lys49-PLA
2
s do gênero Bothrops, o que corrobora com o
48
49
sítio proposto, já que para atividades restritas a um determinado grupo de fosfolipases, espera-se que os
resíduos determinantes de tal atividade sejam particulares a este grupo.
Considerando o fato dos ligantes examinados (αT, ácidos graxos e PEG 4000 – no caso da
BaspTX-II complexada com suramina) interagirem com as estruturas analisadas pelas mesmas regiões
protéicas, guardarem grande similaridade em termos estruturais e ainda a hipótese lançada por Ambrosio et
al. (2005) de que a interação de Lys49-PLA
2
s com ácidos graxos auxilia na “expressão” da atividade
miotóxica de tais enzimas, podemos propor que a atuação das PLA
2
s de venenos de serpentes se dá por um
mecanismo evolutivo de “colaboração” entre as Asp49-PLA
2
s e as Lys49-PLA
2
s: a atuação das Asp49-
PLA
2
s (enzimas cataliticamente ativas) em membranas leva à liberação de lisofosfolipídios e ácidos
graxos. Os ácidos graxos liberados pela ação das fosfolipases cataliticamente ativas interagem com o canal
hidrofóbico das Lys49-PLA
2
s, ativando-as. Esta “ativação” acontece devido às modificações estruturais
provocadas pela interação com ácidos graxos (ou outros ligantes de estrutura química similar), conforme
relatado anteriormente. Os resíduos que formam o sítio miotóxico assumem então uma conformação
específica ao mesmo tempo em que se dá a reorientação das Tyr119, permitindo, desta forma, que a
interação com a membrana ocorra, o que leva à lesão das fibras musculares (Figura 25).
Uma outra consideração importante a se fazer é que a forma dimérica assumida pela proteína em
solução potencializa o efeito miotóxico da mesma, já que os sítios de interação com a membrana de ambos
os monômeros estão dispostos lado a lado (Figura 26a). Isto justifica a reorientação dos monômeros para
um mesmo plano (Tabela 9) quando há interação de um ligante no canal hidrofóbico e também o fato de as
Lys49-PLA
2
s agirem na forma de dímero e não como monômeros (da Silva-Giotto et al., 1998; Arni et al.,
1999). Com esta nova conformação, os sítios de interação com a membrana, estando lado a lado,
propiciam também uma melhor “ancoragem” na mesma, o que torna a ação da enzima mais eficiente.
(a)
(b)
(c)
(d)
50
Figura 23 –Representação do sítio miotóxico das Lys49-PLA
2
s. (a) Representação da região básica na superfície de Lys49-PLA
2
s complexadas (aqui
representada pela PrTX-I / αT) que interagem com íons carregados negativamente (aqui representados por íons sulfato). (b) Figura idêntica à mostrada em (a),
porém com a superfície semi-transparente para visualização da interação entre as Tyr119, bem como sua disposição em relação ao sítio miotóxico das Lys49-
PLA
2
s. (c) Ampliação da região correspondente ao sítio miotóxico das Lys49-PLA
2
s mostrado em (b). (d) Distâncias (Å) entre os resíduos componentes do sítio
miotóxico e átomos dos íons sulfato com os quais interagem.
51
Figura 24 – Alinhamento de Asp49-PLA
2
s e Lys49-PLA
2
s de veneno de serpentes da subfamília Crotalinae presentes no NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez
) (Somente PLA
2
s com 121 e 122 aminoácidos em suas seqüências primárias estão representadas). (a) Asp49-PLA
2
s e Lys49-
PLA
2
s. (b) Alinhamento das Lys49-PLA
2
s apresentadas em (a); em destaque, resíduos que constituem o provável sítio miotóxico destas proteínas. Para ver códigos,
consultar a Tabela 10.
115
118
20
20
122 48
(a)
(b)
Tabela 10 – Códigos utilizados no alinhamento das seqüências para representar as fosfolipases A
2
de
venenos de serpentes da subfamília Crotalinae (família Viperidae)
Código NCBI
Serpente (Crotalinae)
Ghal-1
P14421
Gloydius halys
Smil
AAR14160.1
Sistrurus miliarius streckeri
Tste-1
AAP48901.1
Trimeresurus stejnegeri
Tgra-1
P81479
Trimeresurus gramineus
Tgra-2
P81480
Trimeresurus gramineus
Gblo-1
P20249
Gloydius blomhoffi
Gshe
AAR11860.1
Gloydius shedaoensis
Ghal-4
AAB71849.1
Gloydius halys
Bpic
Q9I8F8
Bothrops pictus
Cada
P00623
Crotalus adamanteus
Apis-1
A53872
Agkistrodon piscivorus
Tgra-3
P81478
Trimeresurus gramineus
Tpun
AAR14170.1
Trimeresurus puniceus
Vste-1
P82896
Viridovipera stejnegeri
Pmuc
Q91506
Protobothrops mucrosquamatus
Tfla-1
1202299A
Trimeresurus flavoviridis
Ghal-6
AAB71844.1
Gloydius halys
Gblo-2
P04417
Gloydius blomhoffi
Asp49-PLA
2
s
Tfla-2
1301360A
Trimeresurus flavoviridis
Cgod
P81165
Cerrophidion godmani
(GodMT-II)
Anum
P82950
Atropoides nummifer
(NumMT-II)
Apis-3
P04361
Agkistrodon piscivorus piscivorus
Bpir-1
P58399
Bothrops pirajai
(PrTX-I)
Bpir-2
P82287
Bothrops pirajai
(PrTX-II)
Bjar-1
AAB25286.1
Bothrops jararacussu
(BthTX-I)
Basp
P24605
Bothrops asper
(BaspTX-II)
Bmoo-2
Q9I834
Bothrops moojeni
(MjTX-II)
Bmoo-1
P82114
Bothrops moojeni
(MjTX-I)
Tgra-4
2202353A
Trimeresurus gramineus
Lys49-PLA
2
s
Vste-2
AAP48896.1
Viridovipera stejnegeri
52
Figura 25 –Representação esquemática do sítio miotóxico da PrTX-I interagindo com membrana muscular. (a) Em
azul, resíduos que compõem o sítio miotóxico interagindo com íons sulfato, que mimetizam a cabeça polar de
fosfolipídios de membrana. (b) Modelo representativo da Lys49-PLA
2
interagindo com a membrana (fora de escala).
(b)
(a)
Figura 26 –Figura representando a localização do sítio miotóxico das Lys49-PLA
2
s em ambas as conformações
possíveis. (a) Em azul, resíduos que constituem o sítio miotóxico no dímero alternativo (roxo). Em amarelo, as
Tyr119 de ambos os monômeros. (b) Idem ao (a), porém o dímero convencional está representado em ciano e as
Tyr119, em alaranjado. Figuras feitas usando o programa Pymol (DeLano, 2002).
53
4.4. Conformação dimérica biologicamente ativa para as Lys49-PLA
2
s
Experimentos de eletroforese e análises espectroscópicas demonstraram que as Lys49-PLA
2
s
existem como dímeros em solução (da Silva-Giotto et al., 1998; Arni et al., 1999). Para a BnSP-7 a forma
dimérica foi encontrada tanto in vivo quanto demonstrada experimentalmente através de eletroforese
(Soares et al., 2000b), onde esta proteína se mostrou estável até mesmo após aquecimento na presença de
1% de SDS.
Recentemente as estruturas de Lys49-PLA
2
s vêm sendo discutidas, já que o arranjo cristalino da
qual as mesmas são inferidas não nos permitem apontar a forma dimérica biologicamente ativa. Pela
observação da rede cristalina da PrTX-I nota-se que há duas possibilidades de dímeros. Uma delas, adotada
em diversas estruturas de Lys49-PLA
2
s já elucidadas, relaciona os monômeros por um eixo de ordem dois
perpendicular às regiões dos
β
-wings, sendo estabilizada por interações de resíduos destas e das hélices N-
terminais, envolvendo resíduos estritamente conservados em Lys49 PLA
2
s: Gln11, Glu12, Trp77 e Lys80,
possibilitando uma relativa flexibilidade entre os monômeros (Ward et al., 1998a; Magro et al., 2003). Em
2003, Lomonte et al. (Lomonte et al., 2003a) propuseram um mecanismo de ação, baseado nesta
conformação dimérica adotada até então, para a atuação destas PLA
2
s homólogas na membrana que pode
ser importante para as atividades farmacológicas das mesmas. No entanto, a estrutura cristalográfica da
BaspTX-II complexada com suramina (um composto simétrico polisulfonado) elucidada recentemente foi
resolvida numa conformação dimérica alternativa (Murakami et al., 2005). A estrutura cristalina deste
complexo revelou que somente uma molécula de suramina interage com ambos os monômeros da proteína.
Se esta estrutura fosse resolvida utilizando como modelo o dímero convencional, uma porção significativa
da molécula de suramina não interagiria com nenhuma porção da proteína, ficando esta parte exposta ao
solvente (Figura 27). Assim, o uso da conformação alternativa para este modelo dimérico foi fundamental
para uma estrutura coerente (Figura 27). Para os complexos PrTX-I / αT e BthTX-I / αT também há
restrições quanto ao uso do dímero convencional como modelo para a resolução de suas estruturas: o
melhor modelo de conformação dimérica para a complexação com as moléculas do ligante é a alternativa,
já que nesta as moléculas de αT ficam totalmente “inseridas” no dímero (e assim não são expostas ao
solvente). Assim, se o modelo dimérico convencional fosse adotado para a estrutura em questão, as
moléculas lipossolúveis de αT ficariam expostas ao solvente. Esta nova conformação adotada para estes
complexos é estabilizada por contatos entre os loops de ligação do Ca
2+
e a região C-terminal de ambos os
monômeros, formando uma rota de comunicação entre os “sítios ativos” de ambos os monômeros.
54
Figura 27 - Figura representando as duas conformações diméricas possíveis para as Lys49-PLA
2
s. Em ciano, o
dímero convencional e em roxo, o dímero alternativo. A molécula de suramina (em amarelo) demonstra que o
dímero alternativo é a conformação oligomérica ideal para a complexação com este inibidor. Figura feita usando o
programa Pymol (DeLano, 2002).
Um outro fator que nos leva a acreditar no dímero alternativo como melhor representante da
unidade biológica funcional é o fato de os sítios miotóxicos de ambos os monômeros se apresentarem
dispostos lado a lado, mostrando assim uma colaboração entre eles para poder melhor ancorar a proteína (o
dímero) na membrana, conforme descrito anteriormente (Figura 26a). Se considerarmos o dímero
convencional, estes sítios ficariam de lados opostos, fazendo com que o modo de ação destas enzimas
fosse menos eficaz ou mesmo inviável (Figura 26b). Assim, para dar maior embasamento a estes fatos,
analisamos as possibilidades de interface para os modelos estruturais com o programa PISA (Protein
Interfaces, Surfaces and Assemblies - http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html
) (Tabela 11). Este
programa analisa os contatos na interface protéica para todas as possibilidades de simetria cristalográfica e
calcula qual a interface com maior probabilidade de ocorrer em solução. Apesar da variabilidade dos
resultados, todas as Lys49-PLA
2
s mostraram que o dímero alternativo apresenta a forma biológica com
maior probabilidade de ocorrer em solução, já que apresenta maior área de interface e melhores valores de
energia livre para as interfaces hidrofóbicas (Tabela 11). Assim, os contatos da interface das estruturas
cristalográficas resolvidas tendo como modelo o dímero convencional provavelmente não condizem com a
forma encontrada em solução. Recentes dados de espalhamento de raios X a baixo ângulo (Murakami et
55
56
al., 2007) para a proteína BthTX-I nativa, mostram que a conformação alternativa também é tida como a
que melhor representa o envelope protéico teórico.
Tabela 11 – Análise da área de interface para os dois possíveis estados oligoméricos de complexação das
Lys49-PLA
2
s
Dímero Alternativo Dímero Convencional
A interface (A
2
) A
i
G (Kcal/M) A interface (A
2
) A
i
G (Kcal/M)
Nativas
BaspTX-II 500,9 -11,2 365,5 -0,3
BnSP-7 622,9 -10,3 494,2 -1,3
BnSP-6 604,1 -9,6 505,1 -1,7
PrTX-I-nativa 667,5 -12,9 475,3 -0,9
Complexadas
PrTX-I / αT 518,6 -11,6 361,9 -0,4
BthTX-I / αT
503,7 -11,8 379,9 0,1
MjTX-II / ác. esteárico 485,6 -8,1 331,1 0,1
BaspTX-II / suramina 526,1 -10,3 361,3 0
PrTX-II / ác. graxo 692,7 -17,7 429,6 1,4
Dados obtidos em 21/06/2007 (14:57h) no programa PISA; A
i
G: indica o ganho de energia livre de solvatação com a
formação da interaface, em Kcal/mol. (Valores negativos de A
i
G correspondem a interfaces hidrofóbicas, ou
afinidade protéica positiva).
4.5. Considerações Finais
As estruturas resolvidas apresentaram uma boa qualidade estereoquímica. Apesar de a densidade
eletrônica para algumas regiões dos anéis cromanol das moléculas de αT não terem se apresentado
perfeitamente nítidas, excluímos a possibilidade de haver PEG no canal hidrofóbico pela comparação com
a PrTX-I nativa (cristalizada nas mesmas condições físico-químicas da PrTX-I / αT), já que a mesma não
possuía qualquer densidade eletrônica na região que pudesse corresponder a tal molécula.
Em 2001, Lee et al. propuseram que a interação entre a Lys122 (resíduo altamente conservado em
Lys49-PLA2s – Figura 24) e a Cys29 seria responsável pela hiperpolarização entre os resíduos Cys29 e
Gly30, o que propiciaria ao ácido graxo manter-se “ligado” à proteína. Assim sendo, estes ácidos graxos
serviriam como âncora hidrofóbica auxiliando na interação da proteína com fosfolipídeos de membrana,
sendo este mecanismo de grande importância para a atividade miotóxica das Lys49-PLA
2
s (Ambrosio et
al., 2005). A análise das estruturas complexadas mostrou que a interação entre os resíduos Lys122 e Cys29
não ocorre nas estruturas complexadas com αT aqui mostradas. Este fenômeno também não foi observado
para a estrutura da BaspTX-II complexada com suramina (Murakami et al., 2005). Apesar disto, o não
estabelecimento de interações entre estes dois resíduos nos complexos agora citados não contrariam a
importância da Lys122 para o estabelecimento da lesão de membranas musculares, que já foi inclusive
demonstrada por experimentos de mutação sítio-dirigida (Chioato et al., 2002). O que se observou nas
comparações realizadas é que tanto a Lys122 como a Phe3 sofreram deslocamento pela presença dos
ligantes nas formas complexadas, existindo um “padrão de comportamento” para estes resíduos nos
complexos que é diferente das formas nativas. Esse deslocamento faz com que as Lys122, antes expostas
ao solvente (conformação apresentada por um dos monômeros das formas diméricas nativas), passem a
apontar para o loop de ligação do Ca
2+
e, em alguns casos, estabeleçam contatos com a Cys29. A
observação deste “padrão de comportamento” também foi importante pelo fato de estes dois resíduos das
moléculas de BaspTX-II nativa se comportarem como os das proteínas complexadas. Em várias outras
análises realizadas (Tabela 8; Tabela 9; Figura 20; Figura 21; Figura 22; Tabela 11) esta estrutura
apresentou o mesmo padrão dos complexos, apesar de ter sido descrita como nativa (Arni et al., 1995).
Assim, a presença de ácidos graxos (por problemas de purificação, como já foi relatado por Lee et al., em
2001 para a PrTX-II complexada com ácido graxo) ou mesmo moléculas de PEG provenientes da solução
de cristalização podem ter interagido com o canal hidrofóbico desta proteína; pelo fato de a mesma ter sido
resolvida e refinada a 2,8Å de resolução, estes ligantes podem não ter sido percebidos durante o
refinamento. O complexo formado entre a PrTX-II e ácidos graxos também apresentou certo desvio do
padrão dos complexos, porém não conseguimos explicar o porquê de tal fato (Tabela 9; Tabela 11)
57
A importância de alguns dos resíduos que constituem o sítio de interação com a membrana
muscular, como a Arg118, Tyr119 e Lys122 já foram demonstrados experimentalmente (por mutação sítio-
dirigida) (Chioato et al., 2002; Chioato et al., 2007), o que confere maior credibilidade aos resultados aqui
demonstrados, embora a mutação do resíduo Lys115 não tenha demonstrado diminuição significativa da
atividade miotóxica nos testes in vivo (Chioato et al., 2002; Chioato et al., 2007). A Lys16, resíduo
bastante próximo aos íons no sítio miotóxico também pode fazer parte deste; porém durante nossas
análises, este resíduo não se mostrou disposto adequadamente para estabelecer interações com os íons
diretamente (interações entre a Lys16 e íons só ocorrem há uma distância de pouco mais de 4.0 Ǻ).
Lomonte et al. (Lomonte et al., 1994a) demonstraram, através de experimentos com peptídeos
sintéticos, que os resíduos 115-119 interagem com a heparina, embora com menor avidez do que a proteína
como um todo (ensaios com base na miotoxina II de Bothrops asper). A heparina é capaz de neutralizar a
atividade miotóxica de PLA
2
s (Lomonte et al., 1994a), mostrando que o sítio miotóxico por nós
identificado inclui resíduos já identificados anteriormente como sendo parte do sítio de interação para
inibidores destas enzimas. Considerando que o ácido rosmarínico também neutraliza a miotoxicidade da
BthTX-I (Lys49-PLA
2
) e da BthTX-II (Asp49-PLA
2
miotóxica com baixa atividade catalítica) (Ticli et al.,
2005), provavelmente esta neutralização ocorre pela interação do inibidor com o sítio identificado.
A hipótese de ativação das Lys49-PLA
2
s de veneno de serpentes do gênero Bothrops pela presença
de moléculas de ácido graxo (ou moléculas de estrutura química similar, como por exemplo, PEG ou αT)
no canal hidrofóbico justifica a conservação desta região nas Lys49-PLA
2
s, sendo tal característica de
fundamental importância para que as mesmas exerçam sua atividade. Soares et al. (Soares et al., 2001b;
Soares et al., 2003a) demonstraram que a atividade miotóxica de Lys49-PLA
2
s e Asp49-PLA
2
s não é
totalmente independente da atividade catalítica mostrando que, apesar dos resíduos que constituem o sítio
miotóxico não estarem relacionados espacialmente com o sítio catalítico, o primeiro depende, de alguma
maneira, da conservação de outras regiões importantes presentes / conservadas nas Asp49-PLA
2
s para a
expressão da atividade miotóxica. Isso pode ser explicado pelo fato de a presença de ácidos graxos (ou
outros) no canal hidrofóbico das Lys49-PLA
2
s provocarem uma reorientação de resíduos do C-terminal, o
que acreditamos ser fundamental para a ativação destas enzimas. Isto também pode ser confirmado pela
falta de densidade eletrônica para as Lys 115 e Lys116 da PrTX-I nativa, que apresentam alta flexibilidade
quando o sítio miotóxico não está “ativado”.
O motivo da especificidade de atuação das Lys49-PLA
2
s em membranas musculares é ainda
desconhecido, podendo o mesmo se dar por interação com um receptor ou ainda por aceptores expostos na
membrana (Lomonte et al., 2003b). Apesar desta questão ainda não ter sido esclarecida, experimentos com
peptídeos sintéticos que simulam o C-terminal na forma dextrógera sugerem que, havendo um receptor /
58
59
aceptor que garanta tal especificidade, a interação com os mesmos provavelmente não ocorre através da
região C-terminal da proteína (Lomonte et al., 2003b). A conservação de resíduos específicos, conforme
demonstrado no alinhamento de seqüências primárias de PLA
2
s, formando uma região bastante básica que
identificamos como sendo o sítio miotóxico destas fosfolipases, nos leva a acreditar que eles são realmente
os responsáveis pela expressão da atividade de dano à membrana muscular destas proteínas. Porém, a
maioria deles, sendo conservados somente em Lys49-PLA
2
s de serpentes do gênero Bothrops, mostra que
provavelmente o sítio miotóxico das Lys49-PLA
2
s não é constituído pelos mesmos resíduos em todas elas,
o que restringe os resultados aqui obtidos para as Lys49-PLA
2
s do gênero Bothrops.
5. CONCLUSÕES
Os resultados aqui mostrados evidenciaram a importância de estudos estruturais, já que somente a
análise de seqüências primárias não garante uma visão da distribuição espacial dos resíduos das proteínas
após o enovelamento das mesmas, impossibilitando assim a visualização de regiões / aminoácidos que
estão próximos quando as mesmas assumem suas estruturas terciárias / quaternárias, e são importantes para
a determinação de seus sítios farmacológicos, como no caso das Lys49-PLA
2
s.
A comparação entre os modelos obtidos, pelo fato de as proteínas terem sido cristalizadas nas
mesmas condições, possibilitou a observação de mudanças conformacionais importantes e, juntamente
com as outras análises realizadas, nos permitiu realizar importantes inferências sobre o modo de interação
das Lys49-PLA
2
s de veneno botrópico com membranas musculares. O conhecimento do sítio responsável
pela atividade de dano à membrana das Lys49-PLA
2
s de serpentes do gênero Bothrops é de grande
interesse biotecnológico, podendo levar ao desenvolvimento de novos fármacos, sendo estes específicos
para o bloqueio da lesão muscular. Com isso, as terapias podem se tornar mais eficientes, o que leva à
possibilidade de o tratamento por envenenamento botrópico ter maiores chances de sucesso.
Estas comparações também nos mostraram a importância da conservação do canal hidrofóbico nas
fosfolipases homólogas, já que este é fundamental para permitir as mudanças conformacionais que levam à
ativação das mesmas. Além disso, a proposição da conformação dimérica alternativa para as fosfolipases
em questão como representante da unidade biológica é a mais coerente (de acordo com os dados
discutidos) e, portanto, deve ser utilizada para a elucidação e análise de outras estruturas de Lys49-PLA
2
s.
60
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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