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IRINA NASTASSJA RIEDIGER
COMPARAÇÃO DOS DIAGNÓSTICOS SOROLÓGICO E
MOLECULAR DA LEPTOSPIROSE HUMANA NA REGIÃO
METROPOLITANA DE CURITIBA, PARANÁ.
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Biologia Celular e Molecular, Programa de
Pós-Graduação do Departamento de Biologia
Celular e Molecular, Setor de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Alexander Welker Biondo
CURITIBA
2007
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
A minha mãe, Eliana, por
incansavelmente me ensinar que aquilo
que se sabe nunca se perde.
Ao meu amor, Carlos Caetano, por me
mostrar que a felicidade está nas
pequenas coisas.
ii
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AGRADECIMENTOS
A todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização deste estudo.
Tenho certeza de que a colaboração de cada um foi imprescindível para a
elaboração e execução bem sucedidas deste trabalho. Agradeço em especial:
A Deus, por me conceder a oportunidade de aprofundar meus estudos e me
presentear com um projeto tão bonito. Por me fortalecer e estar ao meu lado,
iluminando meu caminho, mesmo nos momentos mais difíceis.
Ao Prof. Dr. Alexander Welker Biondo, orientador desse trabalho, meu mais sincero
respeito e admiração. Agradeço por confiar a mim esse projeto e por proporcionar,
além de inestimável crescimento técnico e científico, uma visão social e integrativa
da pesquisa e da Ciência.
A Equipe do Serviço de Epidemiologia do Hospital das Clínicas da UFPR, em
especial a Dr
a
. Suzana Dal Ri Moreira, pela confiança e preciosa colaboração na
seleção de pacientes desde o princípio deste estudo.
Minha gratidão a Cláudia Helena Zen, Déborah Munhoz Buba e Helena Leiko
Misugi, da Seção de Biologia Molecular do LACEN-PR, pela amizade e apoio
irrestrito. A minha colega e amiga Sueli Massumi Nakatani pelo incentivo, pelas
discussões técnico-científicas e pela generosidade em partilhar sua experiência.
A Irene Skraba e Didiane Tscha, da Seção de Virologia do LACEN-PR, minha
gratidão pela doação das cepas, pelo acesso aos resultados dos testes ELISA e
pelo espírito de cooperação sempre que precisei.
iii
Meus agradecimentos à direção do Laboratório Central do Estado do Paraná, em
especial a Dr
a
. Célia Fagundes da Cruz e ao Dr. Marcelo Pilonetto, que viabilizaram
a execução prática deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Helio Langoni (UNESP – Botucatu) e sua equipe, em especial a Leila
Ullmann e Juliano Hoffmann, pela colaboração e pelo processamento dos testes de
microaglutinação.
A Juliana, Jackeline, Ane, Catherine, Carolini e Elis pelo auxílio fundamental no
processamento das amostras. A Fernanda Fortes, pelo esforço conjunto no
levantamento de dados. A Marina Gonçalves, pela amizade, dedicação e ajuda
providencial na organização e execução prática do estudo.
Ao Prof. Dr. Albert Ko e sua equipe (CPqGM – FIOCRUZ/BA), pelas sugestões e
pela gentileza e prontidão no empréstimo da câmara de Petroff-Hausser.
A Yatiyo Moriya, da Seção de Imunologia do LACEN-PR, e a Anaclete Felini, da
Seção de Virologia do LACEN-PR, pela seleção criteriosa das amostras positivas
para controle patológico de hepatite A aguda e dengue.
A Celina de Oliveira Poersch, do Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP),
pela doação das amostras para controle patológico de dengue e acesso aos
respectivos resultados de PCR.
A Prof
a
. Dr
a
. Claudia Nunes dos Santos, do Instituto de Biologia Molecular do Paraná
(IBMP-FIOCRUZ/PR), e a Dr
a
. Jaqueline Mendes de Oliveira, do Instituto Oswaldo
Cruz (IOC-FIOCRUZ/RJ), pela cessão dos primers e acesso aos protocolos de
iv
amplificação, o que possibilitou estudar molecularmente os grupos-controle
patológicos de dengue e hepatite A.
A Maria Ângela Teixeira e Maria Luiza Gonçalves, do Centro de Diagnóstico Marcos
Enrietti, pelo apoio técnico, receptividade e permissão para uso de equipamentos e
instalações durante a fase inicial desse projeto.
A Dr
a
. Noemi Farah Pereira, da Seção de Imunogenética do HC-UFPR, por seu
exemplo, pelo estímulo e por despertar em mim a curiosidade científica.
A Secretaria de Estado da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (SETI-PR), pelo
suporte financeiro.
A minha mãe, Eliana, pela dedicação, pelo incentivo para que eu retomasse os
estudos e por estar sempre presente na minha vida.
Ao meu esposo, Carlos Caetano, pela compreensão nas horas de ausência, pelo
apoio nas horas de cansaço, pelo incentivo nos momentos de dúvida, pela paciência
nos momentos de crise e por sua admiração ao meu trabalho. Isso faz as
dificuldades valerem à pena!
Aos meus amigos da Academia de Ballet Quebra-Nozes, em especial a Aline
Miyazato, por me ensinar que com perseverança e paciência é possível superar os
obstáculos mais difíceis.
Ao meu querido cão, Mignon, pela companhia e lealdade irrefutáveis, especialmente
durante a redação desta dissertação.
v
“Só sabemos com exatidão quando sabemos pouco;
à medida que vamos adquirindo conhecimentos,
instala-se a dúvida.”
(Johann Goethe)
vi
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................. XII
1 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................2
1.1 BACTERIOLOGIA.............................................................................................3
1.2 PATOGÊNESE DA LEPTOSPIROSE...............................................................8
1.3 ASPECTOS CLÍNICOS...................................................................................15
1.4 EPIDEMIOLOGIA DA LEPTOSPIROSE .........................................................18
1.5 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL...................................................................24
2 OBJETIVOS...........................................................................................................31
3 METODOLOGIAS..................................................................................................33
3.1 VALIDAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DA TÉCNICA DE PCR....................................34
3.2 DEFINIÇÃO DO LIMITE DE DETECÇÃO DOS SISTEMAS DE PCR.............37
3.3 AVALIAÇÃO DOS SISTEMAS DE PCR FRENTE À COLEÇÃO DE CEPAS .38
4 RESULTADOS.......................................................................................................41
4.1 EVALUATION OF SERUM, PLASMA AND WHOLE BLOOD SPECIMENS
FOR MOLECULAR DETECTION OF Leptospira spp.
..........................................42
4.2 USE OF A secY GENE FRAGMENT FOR MOLECULAR IDENTIFICATION OF
Leptospira spp.
......................................................................................................55
4.3 USE OF URINE AND BLOOD SAMPLES FOR PCR DIAGNOSIS OF HUMAN
LEPTOSPIROSIS
.................................................................................................68
5 DISCUSSÃO..........................................................................................................86
6 CONCLUSÕES......................................................................................................95
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................97
8 ANEXOS..............................................................................................................110
vii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
TABELA 1 - SÉRIE HISTÓRICA DE CASOS DE LEPTOSPIROSE
CONFIRMADOS E NOTIFICADOS NO SINAN..............................
22
MAPA 1 - ESTADO DO PARANÁ DIVIDIDO EM REGIONAIS DE SAÚDE.... 23
TABELA 2 - DISTRIBUIÇÃO DE CASOS DE LEPTOSPIROSE POR
REGIONAL DE SAÚDE, 2000 A 2007*...........................................
23
FIGURA 1 - COMPARAÇÃO DO LIMITE MÍNIMO DE DETECÇÃO DOS
SISTEMAS A/B E G1/G2................................................................
37
FIGURA 2 - AMPLIFICAÇÃO DE CEPAS-PADRÃO DE Leptospira spp
PELOS CONJUNTOS DE INICIADORES A/B E G1/G2.................
39
TABELA 3 - CEPAS DE REFERÊNCIA UTILIZADAS NO ESTUDO.................. 40
viii
LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS
% - por cento
°C - Graus Celsius
CD - Cluster of differentiation
CDME - Centro de Diagnóstico Marcos Enrietti
CIC - Cidade Industrial de Curitiba
CN - Controle negativo
CP - Controle positivo
DNA - Ácido Desoxirribonucléico
dNTP - Desoxirribonucleosídeo Trifosfatado
DO - Densidade Ótica
EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético
ELISA - Enzime Linked Immunosorbent Assay
et al. - Abreviatura da expressão latina et alii, para demais colaboradores
fg - Fentograma (10
-15
g)
G - Giros
GLP - Glicolipoproteínas
HC-UFPR - Hospital das Clínicas da Universidade Federal do Paraná
IgG - Imunoglobulina G
IL - Interleucina
IgM - Imunoglobulina M
IFN-γ - Interferon γ
Kb - Kilobase
KCl - Cloreto de Potássio
LACEN-PR - Laboratório Central do Estado do Paraná
LPS - Lipopolissacarídeos
MAT - Microscopic Agglutination Test
ix
Mb - Megabases
MgCl
2
- Cloreto de Magnésio
ml - Mililitro
mM - Milimolar
MP - Marcador de Massa Molecular
NaCl - Cloreto de Sódio
ng - Nanograma (10
-9
g)
NK - Natural Killer Cell
nm - Nanômetro
Pb - Pares de Bases
PBS - Salina tamponada com fosfatos
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
pg - Picograma (10
-12
g)
pH - Potencial Hidrogeniônico
pmol - Picomol
rpm - Rotações por minuto
RNA - Ácido Ribonucléico
SESA-PR - Secretaria de Estado da Saúde, Paraná
TBE - Tampão Tris-Borato-EDTA
Th1 - Linfócito T auxiliar 1
Th2 - Linfócito T auxiliar 2
TLR - Toll-like receptor
TNFα - Fator de Necrose Tumoral α
Tris - Hidroximetilaminometano
U - Unidade
UFPR - Universidade Federal do Paraná
UV - Radiação Ultravioleta
V - Volt
x
µg - Micrograma (10
-6
g)
µM - Micromolar
xi
RESUMO
A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial que apresenta
sintomas clínicos não-específicos, cujo diagnóstico definitivo depende de testes
laboratoriais. Amostras de sangue total, plasma e soro contaminadas in vitro foram
submetidas à PCR em sistemas monoplex e duplex, utilizando dois conjuntos de
iniciadores previamente descritos (G1/G2 e A/B). Posteriormente, amostras clínicas
de sangue e urina foram amplificadas com os mesmos iniciadores para o diagnóstico
da leptospirose. Amplificações com os iniciadores G1/G2 apresentaram sensibilidade
de 60,7% e especificidade de 65,8%, contra 7,1% e 94,7% obtidas com os
iniciadores A/B. Sensibilidade e especificidade gerais da PCR foram 53,6% e 63,2%,
respectivamente. Sessenta e seis amostras clínicas foram testadas por ELISA IgM,
MAT e PCR de sangue e urina, acompanhadas de 15 amostras pareadas. A
detecção do DNA das leptospiras por PCR ocorreu a partir do primeiro dia de
doença, enquanto a detecção dos anticorpos pelo MAT só foi possível a partir do
quinto dia. Nossos resultados sugerem que amostras de sangue são mais
apropriadas para a investigação clínica da leptospiremia, frente a amostras de
plasma ou soro. Essas amostras apresentaram limite mínimo de detecção de 5x10
3
,
5x10
4
e 5x10
6
células/ml, respectivamente. Apesar da amplificação parcial do gene
secY ser utilizada para a detecção de leptospiras patogênicas, o seqüenciamento
desses produtos de PCR não permitiu a genotipagem da cepa infectante. A PCR foi
menos sensível (53,6%) do que o ELISA IgM (85,7%) ao longo do curso da doença.
Entretanto, a PCR realizada em amostras de sangue ou urina permitiu o diagnóstico
precoce em 71,4% dos pacientes cuja soroconversão foi confirmada pelo MAT.
Assim, a PCR constitui uma ferramenta complementar na primeira fase da doença,
especialmente quando não é possível detectar anticorpos específicos pelas técnicas
sorológicas, permitindo a confirmação precoce da infecção e o diagnóstico
diferencial de outras doenças febris.
xii
ABSTRACT
Leptospirosis is a worldwide zoonosis of nonspecific clinical symptoms, which
definitive diagnosis relies on laboratorial tests. Whole blood, plasma and serum
samples in vitro contaminated were submitted to both monoplex and duplex PCR
assays using previously described protocols (G1/G2 and A/B). Next, whole blood and
urine clinical specimens were amplified with the same primers for diagnosis of
leptospirosis. G1/G2-primed amplifications showed sensitivity of 60.7% and
specificity of 65.8%, compared to 7.1% and 94.7% of the A/B-primed reactions.
Overall PCR sensitivity and specificity was 53.6% and 63.2%, respectively. Sixty-six
clinical samples tested by IgM ELISA, MAT and blood and urine PCR, along with 15
paired samples. PCR detection of leptospiral DNA occurred from the first day of
illness, while antibodies detection by MAT was possible from the fifth day. Our results
suggest that whole blood specimens are more appropriate for clinical investigation of
leptospiremia, when compared to plasma or serum samples. Those samples had
minimal detection limit of 5x10
3
, 5x10
4
e 5x10
6
cells/ml, respectively. Although PCR
of secY gene fragment has been used for diagnosis of pathogenic leptospires,
sequencing of respective amplicons does not allow genotyping of the infecting strain.
PCR was less sensitive (53.6%) than IgM ELISA (85.7%) throughout the course of
the disease. However, PCR performed on blood or urine samples permitted early
diagnosis in 71.4% of patients whose seroconversion was confirmed by MAT. Thus,
PCR constitutes a complementary tool in the first phase of the illness, especially
when no specific antibodies can be detected by serological techniques, allowing early
confirmation of the infection and differential diagnosis from other infectious febrile
diseases.
xiii
INTRODUÇÃO
1
INTRODUÇÃO
A presente dissertação de mestrado faz parte de projeto intitulado “Vigilância
descentralizada da leptospirose humana e animal no Estado do Paraná”, aprovado
junto à Secretaria de Estado de Ciência e Tecnologia e Ensino Superior (SETI-PR)
segundo edital CP 01/2004 e aprovado junto ao Comitê de Ética em Pesquisas
Envolvendo Seres Humanos do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do
Paraná (UFPR).
O referido projeto objetivou: a descentralização do diagnóstico sorológico da
leptospirose por ELISA (IgM) no Estado do Paraná a partir da capacitação de
laboratórios em núcleos macro-regionais estratégicos; o desenvolvimento, validação
e implantação no LACEN-PR de metodologias moleculares para uso complementar
ao MAT e ELISA IgM no diagnóstico da leptospirose humana e animal. Ainda, o
projeto teve por objetivo a consolidação do Laboratório Central do Estado do Paraná
(LACEN-PR) como laboratório de referência para o diagnóstico confirmatório da
leptospirose humana na região Sul do Brasil.
O presente estudo de mestrado foi desenvolvido no Setor de Biologia
Molecular do LACEN-PR e incluiu a seleção, otimização e validação de um método
molecular para o diagnóstico precoce da leptospirose humana. Durante o período do
estudo, foram avaliados os casos suspeitos de leptospirose atendidos pela equipe
médica do Hospital de Clínicas da UFPR, mediante seleção do Serviço de
Epidemiologia do mesmo hospital.
Pretende-se, com a análise, discussão e divulgação científica dos resultados
dessa dissertação, o desenvolvimento de um programa de capacitação e atualização
das equipes médicas e de vigilância epidemiológica das Regionais de Saúde quanto
à solicitação, interpretação e limitações dos testes sorológicos e moleculares para o
diagnóstico da leptospirose humana.
Os resultados obtidos estão descritos nessa dissertação em formato de
publicação e enquadrados no capítulo “Resultados”. Essa iniciativa visa acelerar a
divulgação científica dos dados encontrados e permitir que o Comitê de Avaliação
contribua com críticas e sugestões tanto à forma quanto ao conteúdo dos trabalhos
propostos.
2
1 REVISÃO DE LITERATURA
REVISÃO DE LITERATURA
3
A leptospirose é uma antropozoonose de distribuição mundial (ROMERO et
al., 2003), com importância epidemiológica nos contextos urbano e rural, em países
de clima tropical e temperado (MERIEN et al., 1992; EDWARDS et al., 1986). Exibe
evidente caráter sazonal, que coincide com o período chuvoso do ano
(PAPPACHAN et al., 2005). A ocorrência da leptospirose está intimamente
relacionada à situação sócio-econômica e sanitária da população, apresentando,
portanto, incidências distintas entre as diferentes classes sociais. Enquanto nos
países desenvolvidos a leptospirose é considerada uma patologia reemergente
(MEITES et al., 2004) e ocupacional, a mesma constitui um problema de saúde
pública nos países em desenvolvimento, como o Brasil, que carecem da estrutura
sanitária básica (McBRIDE et al., 2005).
1.1 BACTERIOLOGIA
1.1.1 Taxonomia
A leptospirose é causada por bactérias da ordem Spirochetales, família
Leptospiraceae, gênero Leptospira. Anteriormente a 1989, esse gênero era dividido
em duas espécies: Leptospira interrogans, que compreendia todas as cepas
patogênicas; e Leptospira biflexa, que compreendia as cepas saprofíticas isoladas
do ambiente. As duas espécies eram diferenciadas pela capacidade de crescimento
a 13°C na presença de 8-azaguanina e pela incapacidade da L. biflexa formar
células esféricas em NaCl 1 M (LEVETT, 2001; JOHNSON & HARRIS, 1967).
L. interrogans e L. biflexa foram divididas em inúmeros sorovares, definidos
com base em diferenças e similaridades antigênicas no teste de absorção de
aglutinação cruzada. Sorovares com similaridades antigênicas foram agrupados em
sorogrupos, de modo que há mais de 250 sorovares patogênicos descritos,
distribuídos em 25 sorogrupos. Algumas vezes, cepas diferentes, apresentando
pequenas diferenças antigênicas, são classificadas como pertencentes ao mesmo
sorovar (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003).
Em virtude de estudos de variabilidade genética, a classificação fenotípica
das leptospiras tem gradativamente dado lugar à classificação genotípica, na qual
REVISÃO DE LITERATURA
4
várias espécies de leptospiras, além de L. interrogans e L. biflexa, foram
estabelecidas com bases moleculares (YASUDA et al., 1987). Genomoespécies são
definidas como um grupo de sorovares de Leptospiraceae cujo DNA é relacionado
em 70% ou mais a uma temperatura ótima de associação de 55°C, é relacionado em
60% ou mais a uma temperatura estringente de anelamento de 70°C, e em que o
DNA relacionado contém 5% ou menos de divergência de bases (KAUFMANN et al.,
2006). A classificação genotípica das espécies não coincide com a classificação
fenotípica, de modo que sorovares patogênicos e saprofíticos podem ser descritos
na mesma genomoespécie. Portanto, a classificação fenotípica em sorogrupos e
sorovares não é capaz de predizer a espécie genotípica da cepa bacteriana. Além
disso, as características fenotípicas usadas para diferenciar L. interrogans sensu lato
de L. biflexa sensu lato não diferenciam as espécies na classificação genotípica
(LEVETT, 2001).
A reclassificação das leptospiras com base no genótipo é taxonomicamente
correta. Entretanto, gera confusão para os microbiologistas e clínicos, que estão
habituados ao sistema fenotípico corrente de classificação em sorogrupos e
sorovares. A existência de L. interrogans e L. biflexa como espécies sensu stricto no
sistema de classificação genotípica gera ainda mais equívocos de nomenclatura. É
importante que a classificação empregada esteja de acordo com a metodologia
utilizada: nomenclatura fenotípica para classificação sorológica; nomenclatura
genotípica para classificação molecular. Atualmente, estão descritas 16
genomoespécies de leptospiras, além de mais uma genomoespécie proposta
(KAUFMANN et al., 2006).
1.1.2 Microbiologia
As leptospiras são espiroquetas altamente espiraladas, medindo de 6 a 20 µm
de comprimento e cerca de 0,1 µm de diâmetro. As células têm extremidades
pontiagudas que, diferentemente de outros espiroquetas, apresentam forma de
gancho. Dois filamentos axiais (flagelos periplásmicos) com inserções polares estão
localizados no espaço periplasmático (WOLGEMUTH et al., 2006; LEVETT, 2001). A
forma helicóide cilíndrica e a movimentação dos dois flagelos periplásmicos
permitem que as bactérias penetrem ativamente nos tecidos do hospedeiro através
REVISÃO DE LITERATURA
5
do movimento de saca-rolhas (BINDER et al., 1998). Todas as leptospiras
patogênicas apresentam, como os demais espiroquetas, uma arquitetura de
membrana distinta. Essa estrutura apresenta similaridades tanto com bactérias
Gram-positivas quanto Gram-negativas. Assim como nas primeiras, a membrana
interna (citoplasmática) é intimamente relacionada à parede celular de
peptidioglicanos. Já a membrana externa fornece proteção para alguns antígenos,
como o endoflagelo, em relação ao ambiente externo. Entretanto, a membrana
externa dos espiroquetas parece ser fluida e lábil, em comparação com a membrana
externa das bactérias Gram-negativas. Paralelamente, a membrana externa das
leptospiras e demais espiroquetas parece ter baixa densidade de proteínas
transmembrana e grande quantidade de lipoproteínas (HAAKE & MATSUNAGA,
2005). Os LPS da parede celular das leptospiras possuem composição química e
características tintoriais similares aos das bactérias gram-negativas, mas
apresentam atividade endotóxica menor. As leptospiras são bactérias
microaerofílicas e apresentam crescimento ótimo entre 28 e 30°C, produzindo
catalase e oxidase. Crescem em meio simples suplementado com vitaminas (B
2
e
B
12
), ácidos graxos de cadeia longa e sais de amônio. Ácidos graxos são utilizados
como fonte primária de carbono e metabolizados por β-oxidação (LEVETT, 2001).
1.1.3 Genômica
Até o momento, foram seqüenciados os genomas de dois agentes
causadores de leptospirose: L. interrogans sorovar Lai cepa 56601 (REN et al.,
2003) e L. interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 (NASCIMENTO et
al., 2004a). Os dados obtidos revelaram que o genoma das leptospiras está
distribuído em dois cromossomos circulares: CI, com aproximadamente 4,3 Mb, e
CII, com cerca de 350 kb (NASCIMENTO et al., 2004b). Apesar da maioria dos
genes relacionados ao crescimento e à viabilidade estarem localizados no
cromossomo CI, muitos genes essenciais, como NADH desidrogenase e aqueles
relacionados à biossíntese do heme, estão situados no cromossomo CII. Isso leva a
crer que o cromossomo CII é parte integrante do genoma e que não se originou de
transferência lateral (REN et al., 2003).
REVISÃO DE LITERATURA
6
Os genes rRNA não estão organizados em operons, como na maioria das
bactérias, mas sim distribuídos ao longo do cromossomo CI. Ambos os genomas
revelaram número muito pequeno de cópias dos genes rrf, rrs e rrl, que codificam as
subunidades ribossômicas 5S, 16S e 23S, respectivamente (NASCIMENTO et al.,
2004a). Esse achado pode explicar parcialmente o crescimento fastidioso das
leptospiras (REN et al., 2003).
A análise comparativa dos dois genomas revelou a presença da via de β
oxidação completa, bem como dos intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos
e da via glicolítica - com exceção da hexoquinase (NASCIMENTO et al., 2004b; REN
et al., 2003). Também foi evidenciado que o mecanismo de importação de glicose
envolve simporte glicose-sódio dependente de gradiente de sódio através da
membrana bacteriana, ao contrário de outras bactérias que importam açúcares
através de fosfotransferases de membrana. Portanto, a incapacidade em utilizar
glicose como fonte de carbono pode ser em parte explicada pela dificuldade em
importar essa molécula do meio (NASCIMENTO et al., 2004b).
Genes relacionados à cadeia respiratória estão presentes, confirmando o
caráter aeróbio obrigatório dos organismos desse gênero. A síntese de ATP é
realizada por uma ATPase de membrana similar à da maioria das eubactérias, mas
com organização diferente das de outros espiroquetas, como Borrelia burgdoferi e
Treponema pallidum (WENHAI et al., 2004). Esses fatos são compatíveis com a
noção de que esses organismos geram ATP através de fosforilação oxidativa (REN
et al., 2003).
A habilidade em tolerar a radiação UV, à qual as leptospiras estão
constantemente expostas durante o estágio de vida livre de seu ciclo de vida, é
facilitada pela presença de um conjunto completo de proteínas de reparo do DNA
por excisão de bases, bem como fotoliases e enzimas relacionadas ao reparo de
bases alquiladas (NASCIMENTO et al., 2004b).
O ciclo de vida da Leptospira requer a capacidade de responder a um
repertório amplo de condições ambientais. Assim, os mecanismos de transdução de
sinais são mediados por ao menos 79 genes que codificam componentes de vias de
transdução de sinal mediadas por fosforilação (NASCIMENTO et al., 2004b).
Os mecanismos de virulência das leptospiras patogênicas, como motilidade e
resposta quimiotáxica, permitem a penetração nos tecidos dos hospedeiros durante
REVISÃO DE LITERATURA
7
a infecção. Ambos os genomas contêm ao menos 50 genes relacionados à
motilidade e o aparato de quimiotaxia parece ser mais complexo do que o de outros
espiroquetas (NASCIMENTO et al., 2004b; REN et al., 2003).
Os LPS de membrana distinguem a superfície das leptospiras de outras
bactérias da ordem Spirochetales. Mudanças nos genes envolvidos no aparato de
biossíntese de LPS – principalmente nas cadeias laterais de carboidratos. Essa
flexibilidade pode ser um mecanismo de adaptação a novas espécies de
hospedeiros, além de estar envolvida na diversidade de sorovares patogênicos.
Como os dois genomas seqüenciados pertencem ao mesmo sorogrupo
(Icterohaemorrhagiae), genes relacionados à síntese da cadeia principal dos LPS
mostram pequena divergência (NASCIMENTO et al., 2004b).
Leptospiras patogênicas requerem vários tipos de proteínas de superfície com
o intuito de colonizar e sobreviver no mamífero hospedeiro. As proteínas de
superfície podem ser classificadas como porinas não-específicas, canais específicos
para aquisição de nutrientes, canais de efluxo, lipoproteínas, adesinas,
glicoproteínas, proteínas periféricas e proteínas de manutenção. Com exceção das
glicoproteínas e proteínas periféricas, as demais proteínas de superfície possuem
domínios transmembrana. A análise do genoma de uma cepa do sorovar
Copenhageni revelou 83 proteínas de membrana externa em arranjo β pregueado,
distribuídas entre as classificações citadas anteriormente (NASCIMENTO et al.,
2004b). A colonização dos tecidos, essencial para o estabelecimento da doença,
pode ser mediada por adesinas. As leptospiras parecem expressar dois tipos de
adesinas: integrinas e proteínas contendo domínios do tipo Big - Bacterial
Immunoglobulin-Like (NASCIMENTO et al., 2004b). Esses domínios estão
envolvidos nos processos de adesão e invasão das células hospedeiras em Yersinia
pseudotuberculosis e Escherichia coli. Uma nova família de proteínas contendo
domínios Big foi descrita em leptospiras patogênicas e chamada de Lig – Leptospiral
Immunoglobulin-Like. A perda das proteínas Lig e da expressão de seus transcritos
de RNA foi correlacionada com a perda de virulência em cepas patogênicas
(MATSUNAGA et al., 2003). Ao contrário do que ocorre com os LPS, acredita-se que
as proteínas de membrana sejam altamente conservadas e por esse motivo há
grande interesse nessas moléculas para o desenvolvimento de testes sorológicos
mais precisos e vacinas mais efetivas (HAAKE & MATSUNAGA, 2005).
REVISÃO DE LITERATURA
8
A disseminação pelos órgãos do hospedeiro é provavelmente o resultado da
translocação rápida através das monocamadas celulares, que pode ser mediada
pela secreção de enzimas capazes de destruir as membranas das células do
hospedeiro. Estão presentes em ambos os genomas genes relacionados à síntese
de hemolisinas (como esfingomielinase C), fosfolipase D e proteases (incluindo
colagenase, metaloprotease e termolisina), que tanto podem ser transportadas para
a membrana celular como lipoproteínas quanto podem ser secretadas para o meio
extracelular (REN et al., 2003). O sorovar Lai codifica ainda três proteínas que
possuem grande homologia com proteínas animais relacionadas à homeostase, não
descritas em nenhuma outra espécie bacteriana. É possível que os danos ao epitélio
mediados pela colagenase durante a infecção e os efeitos subseqüentes das demais
proteínas e fatores bacterianos possam levar à perda da homeostase, em adição
aos efeitos propostos para os LPS. Esse modelo é consistente com as
manifestações clínicas da leptospirose, principalmente o dano às membranas das
células endoteliais dos pequenos vasos sanguíneos (REN et al., 2003).
1.2 PATOGÊNESE DA LEPTOSPIROSE
A infecção por Leptospira spp. pode acometer diversas espécies de
mamíferos, entre elas o homem. Os animais contaminados – incluindo o homem –
podem ser divididos em hospedeiros de manutenção e hospedeiros acidentais. A
patologia se mantém na natureza pela infecção crônica e endêmica dos túbulos
renais dos hospedeiros de manutenção, com os quais as bactérias mantêm uma
relação comensal. O hospedeiro de manutenção é uma espécie em que a infecção é
endêmica e normalmente transmitida entre os animais por contato direto. Espécies
distintas de roedores podem ser hospedeiras de manutenção de diferentes
sorovares dos sorogrupos Icterohaemorrhagiae e Ballum. Animais domésticos e de
produção também podem ser hospedeiros de manutenção: bovinos podem alojar os
sorovares Hardjo, Pomona e Grippotyphosa; suínos podem albergar os sorovares
Pomona e Bratislava; ovinos podem alojar Hardjo e Pomona; e cães podem abrigar
o sorovar Canicola (LEVETT, 2001).
A especificidade dos LPS de membrana em relação ao hospedeiro de
manutenção pode ser uma estratégia de evasão imune que permite ao espiroqueta
REVISÃO DE LITERATURA
9
persistir nos rins do animal durante toda a sua vida sem, no entanto, desencadear
uma resposta inflamatória. A habilidade das leptospiras em persistir nos túbulos
renais dos mamíferos reflete uma forma altamente evoluída de parasitismo e sugere
uma relação ancestral entre o mamífero e a leptospira nele residente (HAAKE &
MATSUNAGA, 2005). Essas infecções são normalmente assintomáticas ou
subclínicas. Animais de outras espécies podem ser contaminados pelo contato com
a urina do hospedeiro de manutenção, tornando-se então hospedeiros acidentais.
Essas infecções são normalmente sintomáticas, visto que não há relação comensal
entre a bactéria e seu hospedeiro acidental, o que estimula resposta inflamatória
(LEVETT, 2001).
1.2.1 Fisiopatologia
A transmissão da leptospirose ocorre pelo contato direto ou indireto com o
material biológico de um animal contaminado – especialmente de roedores. As
principais formas de contaminação estão relacionadas ao contato ocupacional
(BACTERIÓL et al., 2005; BELMACHER et al., 2004; NATARAJASEENIVASAN et
al., 2002; CAMPAGNOLO et al., 2000; HERNANDEZ et al., 1999. MOLL van
CHARANTE et al., 1998), recreacional (BOLAND et al., 2004; GROBUSH et al.,
2003; MORGAN et al., 2002) ou acidental (AOKI et al., 2001), direto ou indireto, com
a urina de animais infectados.
Através da secreção de enzimas líticas (como a colagenase) e do movimento
ativo de saca-rolhas, as leptospiras penetram ativamente no organismo do
hospedeiro através de cortes ou abrasões na pele, através das mucosas, inclusive
conjuntiva, ou ativamente através da pele íntegra após imersão prolongada em água
contaminada. Os locais invadidos propiciam uma localização segura para a
multiplicação bacteriana e sua manutenção e eliminação intermitente do organismo
do hospedeiro, garantindo assim a perpetuação do ciclo zoonótico na natureza
(LEVETT, 2001).
A penetração ativa das leptospiras patogênicas pode ser direcionada por
quimiotaxia, o que raramente acontece nas cepas saprofíticas (YURI et al., 1993).
Além disso, foi demonstrado que a transição das leptospiras patogênicas do
ambiente para o organismo do hospedeiro é sinalizada, entre outros fatores, pela
REVISÃO DE LITERATURA
10
osmolaridade fisiológica. A migração de um ambiente de baixa osmolaridade (fora do
hospedeiro) para um ambiente de osmolaridade maior (dentro do organismo do
hospedeiro) induz um aumento da expressão das proteínas de membrana externa
LigA e LigB (MATSUNAGA et al., 2007), fato diretamente relacionado a um aumento
na adesão das leptospiras a proteínas da matriz extracelular, principalmente
colágeno, laminina, fibronectina e fibrinogênio. A adesão de LigA e LigB a múltiplos
ligantes presentes em diferentes tecidos sugere que essas proteínas podem estar
envolvidas nos estágios de colonização inicial e disseminação da leptospirose
(CHOY et al., 2007; BARBOSA et al., 2006). As leptospiras são capazes de aderir a
diferentes tipos celulares. A aderência envolve as duas extremidades celulares da
bactéria, ao contrário do que ocorre com Treponema pallidum, que só adere às
células através de uma das extremidades. Também foram encontradas bactérias
localizando-se no interior do citoplasma das células hospedeiras em experimentos in
vitro (THOMAS & HIGBIE, 1990). Apesar disso, não foram encontradas evidências
de multiplicação intracitoplasmática bacteriana ou qualquer perturbação às
estruturas celulares citoesqueléticas ou de membrana. Isso sugere que as
leptospiras são bactérias invasivas, mas não intracelulares facultativas. O caráter
invasivo é um fator de virulência importante, visto que permite às bactérias
atravessar rapidamente monocamadas celulares através da translocação celular, o
que as protege do ataque de células do sistema imunológico e facilita a entrada e
saída da corrente sangüínea para infectar órgãos-alvo, como rins (BAROCCHI et al.,
2002).
A caracterização e comparação dos proteomas de membrana externa de
leptospiras expressos em cultivo in vitro e durante o processo patológico apontam
um aumento significativo na expressão das proteínas de membrana Loa22 e LipL32,
contra uma diminuição na expressão das demais proteínas hidrofóbicas (NALLY et
al., 2007). Estudos recentes demonstram que um mutante exibindo inserção do
transposon no gene loa22 se tornou avirulento em um modelo animal, através de
estudos utilizando mutagênese randômica por transposon. A posterior
complementação da cepa loa22
-
por inserção cromossômica do gene loa22 mostrou
que a perda da virulência era decorrente da inativação do loa22 e não de um sítio
secundário de mutação. Esses resultados demonstram que a proteína Loa22 é
REVISÃO DE LITERATURA
11
essencial para o processo de infecção in vivo por leptospiras patogênicas (RISTOW
et al., 2007).
As lesões tissulares encontradas na leptospirose são caracterizadas pela
ocorrência de danos celulares importantes, mesmo na presença de poucos
microorganismos, sugerindo o envolvimento de fatores tóxicos do hospedeiro e do
espiroqueta, associada ao fenômeno de aderência das bactérias às células
(DIAMENT et al., 2002). Os peptidioglicanos das leptospiras patogênicas estão entre
as moléculas que podem ativar diretamente as células vasculares endoteliais por
aumentar sua adesão a neutrófilos, e podem estar envolvidos no mecanismo de
inflamação local e sistêmica na leptospirose (DOLHNIKOFF et al., 2007).
Durante a infecção, a lise das leptospiras mediada pela resposta imune do
hospedeiro libera GLP citoplasmáticas. Entre os vários antígenos isolados de
leptospiras, a fração de ácidos graxos insaturados não-esterificados (ácidos oléico,
linoléico, palmítico, palmitoléico e mirístico) das endotoxinas do tipo GLP extraídos
de leptospiras patogênicas induzem ativação de células polimorfonucleadas, com
liberação de citocinas pró-inflamatórias como TNFα e interleucinas (BURTH et al.,
2005; DORIGATTI et al., 2005; DIAMENT et al., 2002). Os ácidos graxos não-
esterificados ligam-se à albumina para o transporte pela corrente sangüínea, o que
neutraliza seus efeitos citotóxicos. Entretanto, na presença de grandes quantidades
dessas moléculas os sítios de ligação da albumina são saturados. Essa saturação
pode ser devida tanto ao aumento da quantidade de ácidos graxos circulantes
quanto à presença de bilirrubina, que compete pelos mesmos sítios de ligação à
albumina. Sabe-se que um dos mecanismos responsáveis pela citotoxicidade dos
ácidos graxos não-esterificados é a alteração da fluidez de membrana e a
conseqüente interferência na atividade de diversos mecanismos de transporte
transmembrana, incluindo o transporte ativo de Na
+
e K
+
. O comprometimento do
transporte transmembrana desses íons em células alveolares pode ter papel crucial
no desenvolvimento de edema pulmonar, através de perturbações à atividade da
Na
+
,K
+
-ATPase (BURTH et al., 2005). Foi demonstrado que uma fração de GLP
extraída de leptospiras patogênicas inibe seletivamente várias isoformas de Na
+
,K
+
-
ATPase. Postulou-se que a quantidade de GLP gerada a partir das bactérias
encontradas em infecções in vivo é suficiente para inibir completamente a isoforma
renal (YOUNES-IBRAHIM et al., 1997). Apesar de essa situação ser extrema, uma
REVISÃO DE LITERATURA
12
inibição parcial seria suficiente para induzir alterações patológicas. A comparação
interespécies mostrou que tanto isoformas de Na
+
,K
+
-ATPase de espécies
suscetíveis quanto de espécies resistentes à doença são sensíveis à inibição por
GLP. Isso sugere que a resistência de uma espécie à doença não resulta da
resistência das suas células à ação das GLP, mas sim da quantidade de toxina
liberada a nível tissular, que varia com o grau de colonização dos tecidos, que por
sua vez depende de respostas imunológicas espécie-específicas. A avaliação
desses achados sugere que as inibições celulares induzidas pela inibição da Na
+
,K
+
-
ATPase em tecidos infectados pode ser responsável por vários sintomas, em
particular aqueles associados a desordens eletrolíticas, como distúrbios eletrolíticos
renais, arritmia cardíaca e diarréia. Dependendo do grau de intensidade da inibição
enzimática, os sintomas podem variar de disfunções metabólicas discretas à falência
de órgãos (YOUNES-IBRAHIM et al., 1997).
Acredita-se que a hemorragia pulmonar causada pelas leptospiras seja
desencadeada por vasculite capilar associada a toxinas. O tecido pulmonar de
pacientes com leptospirose usualmente apresenta contagem de organismos menor
do que o tecido renal ou hepático, sugerindo que as anormalidades pulmonares
podem ser devidas à exposição a toxinas circulantes produzidas pelo patógeno em
sítios distantes como fígado (DOLHNIKOFF et al., 2007). O estudo do tecido
pulmonar de pacientes que foram a óbito por leptospirose mostrou edema dos
septos intra-alveolares; infiltrado inflamatório com predomínio de macrófagos,
linfócitos e plasmócitos; tumefação endotelial e hemorragia alveolar. Não foram
encontradas evidências de formação de trombos ou de coagulação intravascular
disseminada. Antígenos de leptospiras foram detectados por imunohistoquímica na
superfície luminal do endotélio e no citoplasma das células endoteliais. Apesar de a
quantificação não correlacionar com a intensidade das lesões, é possível que a
detecção de leptospiras intactas e material antigênico granular nas células
endoteliais indique que a pneumopatia seja desencadeada diretamente pelas
leptospiras ou por seus produtos tóxicos (DOLHNIKOFF et al., 2007). A reprodução
do padrão de infecção humano em primatas, utilizando cepas isoladas de pacientes
com quadro pulmonar severo mostrou hemorragia intra-alveolar com infiltrado
inflamatório intersticial. Esse é um achado morfológico peculiar que parece ser
produzido por uma resposta inflamatória intensa com extravasamento de eritrócitos
REVISÃO DE LITERATURA
13
para o exterior dos capilares. Entretanto, ressalta-se que esses dados não são
encontrados em outras síndromes de fragilidade capilar que progridem para
síndrome angústica respiratória aguda, como dengue hemorrágica ou síndrome
pulmonar da hantavirose. A presença de material antigênico foi encontrada no
parênquima pulmonar, intimamente associada com áreas de alteração histológica
(PEREIRA et al., 2005).
A relação entre o sorovar infectante e as manifestações clínicas ainda não
está bem caracterizada, mas há evidências de que a sintomatologia e sua
intensidade possam estar relacionadas ao sorovar infectante (GOLDSTEIN et al.,
2006).
1.2.2 Resposta imune à infecção
O sistema imune dos mamíferos consiste de imunidade inata e adaptativa. O
sistema imune adaptativo é mediado por células T antígeno-específicas e por células
B. O sistema imune inato é filogeneticamente conservado e é o primeiro a ser
ativado na defesa do hospedeiro contra microorganismos patogênicos.
Recentemente, surgiu grande interesse na imunidade inata com a descoberta de
receptores de patógenos codificados por linhagens germinativas, chamados Toll-like
receptors (SHRÖPPEL & HE, 2006). Parece que os TLR controlam a ativação da
resposta imune adaptativa. Esses receptores reconhecem especificamente padrões
moleculares associados a patógenos e expressos pelos agentes infecciosos, como
componentes microbianos exógenos como LPS (TLR4), lipoproteínas e
peptidioglicanos (TLR1, -2, -6), RNA viral (TLR3), dinucleotídeos guanosina-citosina
não-metilados de origem bacteriana ou viral (TLR9) e moléculas endógenas como
proteína do choque térmico e moléculas da matriz extracelular. Quando esses
receptores são estimulados, a sinalização mediada pelos TLR ativa vias de
transdução de sinal (fator nuclear κB, fator nuclear p38, IL-6, fator regulatório de
interferon), que induzem a expressão de citocinas, quimiocinas e proteínas celulares
de membrana relacionadas à resposta inflamatória (SHRÖPPEL & HE, 2006). As
leptospiras são capazes de ativar macrófagos através de interações dos LPS com
CD14, receptor que reconhece vários antígenos bacterianos, e TLR2. Comprovou-se
que os macrófagos ativados produzem IL-12, a citocina mais potente em induzir a
REVISÃO DE LITERATURA
14
produção de IFN-γ. O IFN-γ é uma citocina pró-inflamatória pluripotente produzida
principalmente por células T ativadas e células NK e desempenha um papel central
na defesa do hospedeiro contra patógenos intracelulares. A IL-12 liberada pelos
macrófagos estimula a diferenciação de linfócitos T CD4
+
em células Th1 produtoras
de IFN-γ, o que sugere a indução de resposta imune celular (de FOST et al., 2003).
Apesar das leptospiras serem consideradas organismos extracelulares, o IFN-γ pode
contribuir para a imunidade contra essas bactérias por ativar macrófagos e promover
a produção de IgG2. Enquanto IgG1 e IgG2 agem como opsoninas, aumentando
potencialmente o número de leptospiras fagocitadas, somente IgG1 é capaz de fixar
complemento – o que pode ser um importante mecanismo efetor para o controle da
leptospirose (NAIMAN et al., 2002).
TLR são diferencialmente expressos em leucócitos e células não-imunes e
parecem regular aspectos importantes da resposta imune inata e adaptativa. Células
epiteliais tubulares estão entre as células não-imunes que expressam TLR,
sugerindo que esses receptores podem contribuir para a ativação da resposta imune
em caso de dano túbulo-intersticial. A ativação dos TLR pode ser crucial no
desenvolvimento de quadros como choque séptico, síndromes com resposta
inflamatória sistêmica e resposta imune local, pois induz a maturação de células
dendríticas e ativação de macrófagos tissulares. A ativação dos macrófagos
promove secreção local de citocinas e quimiocinas e contribui para a inflamação
local e acumulação linfocitária. Já a maturação das células dendríticas leva à
migração celular do sítio danificado para os linfonodos regionais para apresentar
antígenos e sinais pró-inflamatórios a células T, o que é um pré-requisito para o
estabelecimento da resposta imune adaptativa (ANDERS et al., 2004).
Experimentos in vitro mostram que a liberação de quimiocinas pró-
inflamatórias por células epiteliais túbulo-proximais, induzida por proteínas de
membrana extraídas de leptospiras patogênicas, é mediada por TLR2. Esses
resultados implicam a participação crucial da imunidade inata (via TLR2) na
patogênese da nefrite túbulo-intersticial induzida por leptospiras (HUNG et al., 2006;
YANG et al., 2006).
A segunda fase da leptospirose aguda é chamada de fase imune, na qual o
desaparecimento dos organismos da corrente sanguínea coincide com o
aparecimento de anticorpos circulantes. Foi demonstrado que os principais
REVISÃO DE LITERATURA
15
antígenos das leptospiras reconhecidos pela resposta imune humoral humana
incluem LipL32 (principal lipoproteína de membrana), LipL41 e proteínas de choque
térmico obtidas da fração citoplasmática das bactérias, como GroEL e DnaK
(GUERREIRO et al., 2001). Foi proposto que a imunidade protetora e a
hipersensibilidade patológica sejam fatores a influenciar a gravidade dos sintomas e
há indícios de que a severidade da doença de Weil possa estar associada à
intensidade da resposta imune humoral contra as leptospiras (DOLHNIKOFF et al.,
2007).
1.3 ASPECTOS CLÍNICOS
A leptospirose está associada com uma grande variedade de manifestações
clínicas, que podem variar desde infecções subclínicas até óbito por hemorragia
pulmonar (DOUDIER et al., 2006).
1.3.1 Leptospirose anictérica
A maior parte dos casos de infecção por leptospiras em humanos é subclínica
ou com sintomatologia muito branda (FAUCHER et al., 2004; SILVA et al., 2003).
Nesses casos o paciente raramente procura atendimento médico e estima-se que
haja subnotificação dessa patologia (McBRIDE et al., 2005; SILVA et al., 2003). Uma
proporção menor de pacientes (casos confirmados) apresenta uma síndrome
anictérica febril de instalação súbita, cujos principais sintomas são febre, calafrios,
mialgias, cefaléia, dores abdominais, dores retro-orbitais, fotofobia, alterações
conjuntivais e rash cutâneo, podendo ocorrer também encefalite, miosite e
pneumonite (LEVETT, 2001). Como a sintomatologia é inespecífica, deve-se
proceder ao diagnóstico diferencial com infecção por vírus influenza (ALEXANDER
et al., 1963), HIV (HUDSON et al., 1997), dengue (LEVETT, 2001; KEE et al., 1994;
RAMACHANDRAN et al., 1973), hantavirose (SPICHLER et al., 2005; ANTONIADIS
et al., 1995), febre amarela (BINDER et al., 1998) e algumas infecções bacterianas,
como brucelose e ricketsiose (SLACK et al., 2007). A taxa de mortalidade é baixa e
os sintomas normalmente desaparecem em uma semana, coincidindo com a
soroconversão (FAUCHER et al., 2004).
REVISÃO DE LITERATURA
16
1.3.2 Leptospirose ictérica
Cerca de 10% dos casos de leptospirose se apresentam como uma síndrome
ictérica febril - Síndrome de Weil, cuja evolução clínica é rápida e progressiva
(LEVETT, 2001). As complicações clínicas dessa forma de manifestação enfatizam
o caráter multisistêmico da doença (LEVETT, 2001). Alguns sintomas associados à
Síndrome de Weil são febre, icterícia (MORGAN et al., 2002), insuficiência renal
aguda (ABDULKADER, 1997; MERIEN et al., 1995; EDWARDS et al., 1988),
trombocitopenia ou pancitopenia (STEFOS et al., 2005; ROMERO et al., 2003;
MERIEN et al., 1992; EDWARDS et al., 1982), comprometimento pulmonar
(SPICHLER et al., 2005; ROMERO et al., 1998; SEHGAL et al., 1995; IM et al.,
1989; TURNER, 1970), alterações cardíacas (KEE et al., 1994) e comprometimento
ocular (RATHINAM, 2005). A taxa de mortalidade nesses casos varia de 15 a 40%.
Os principais fatores de risco envolvidos com o prognóstico e a evolução clínica dos
pacientes são hipotensão, oligúria e anormalidades à auscultação cardíaca
(DOUDIER et al., 2006).
A icterícia típica da Síndrome de Weil é devida a níveis séricos de bilirrubina
bastante elevados (EDWARDS et al., 1990), mas não está associada à necrose
hepatocelular (RAMOS-MORALES et al., 1959). Simultaneamente, ocorre elevação
moderada nos níveis séricos de transaminases e fosfatase alcalina. A bilirrubinemia
sérica costuma ser desproporcionalmente alta quando comparada às outras provas
de função hepática (AHMAD et al., 2005).
A leptospirose severa causa uma forma única de insuficiência renal aguda
não-oligúrica e hipocalêmica, caracterizada por nefrite túbulo-intersticial, incluindo
edema intersticial e infiltrados celulares na área túbulo-intersticial (YANG et al.,
2001). Paralelamente ao caráter invasivo das leptospiras, vários componentes
bacterianos como lipopolissacarídeos, peptidioglicanos e proteínas da membrana
externa – principalmente glicolipoproteínas – podem levar a um aumento da
atividade monocitária através da interação com receptores celulares, especialmente
do tipo CD. Citocinas pró-inflamatórias, como TNFα e interleucinas, são liberados e
induzem um processo inflamatório através da geração de vários mediadores
vasoativos e inflamatórios e moléculas de adesão. Tanto a resposta de linfócitos Th1
quanto de Th2 são envolvidas, resultando em nefropatia imuno-mediada. A
REVISÃO DE LITERATURA
17
estimulação da expressão de TNFα leva à ativação do fator nuclear kB, que é
responsável pela patogênese da glomerulonefrite e da nefrite túbulo-intersticial
(VISITH & KEARKIAT, 2005). As principais características desses quadros são
redução da reabsorção proximal e aumento da excreção distal de sódio, além de
perda de potássio (SEGURO et al., 1990; WINEARLS et al., 1984).
1.3.3 Outras manifestações clínicas
A trombocitopenia ocorre em mais de 50% dos casos e está relacionada ao
desenvolvimento de falência renal aguda (STEFOS et al., 2005; EDWARDS et al.,
1982). Os principais mecanismos de patogênese envolvem o consumo de plaquetas
devido a um possível quadro de destruição imuno-mediada. Além disso, pode
ocorrer redução na síntese de plaquetas pelos megacariócitos da medula óssea,
independentemente da instalação do quadro de coagulação intravascular
disseminada (STEFOS et al., 2005).
Os quadros de meningite e meningoencefalite associados à leptospirose são
caracterizados por meningite asséptica (ROMERO et al., 1998). A pressão liquórica
apresenta-se normal ou levemente aumentada, com predomínio de infiltrado
linfocitário. A quantidade de proteínas pode ser normal ou levemente aumentada,
enquanto o nível de glicose liquórica normalmente é normal. Em pacientes com
icterícia severa, pode ocorrer xantocromia (AHMAD et al., 2005).
A incidência do envolvimento pulmonar na leptospirose tem crescido nos
últimos anos e pode ocorrer nas formas ictéricas e anictéricas da doença. A
hemorragia alveolar se apresenta com tosse, dispnéia e hemoptise, com hemorragia
pulmonar de intensidade suficiente para levar à morte (IM et al., 1989). Ao raio-X de
tórax, achados como infiltrado alveolar bilateral, consolidação e efusão pleural
podem ser observados mesmo quando a sintomatologia pulmonar é discreta
(MÁRQUEZ-MARTÍN et al., 2006; SPICHLER et al., 2006; KARANDE et al., 2005;
ZAKI et al., 1996). A forma pulmonar severa é a manifestação clínica mais grave da
leptospirose. Os sintomas pulmonares normalmente surgem entre o quarto e o sexto
dia de doença e podem levar à morte em menos de 72 horas, com taxa de
mortalidade de até 60%. Três variáveis foram independentemente associadas à
REVISÃO DE LITERATURA
18
mortalidade: instabilidade hemodinâmica, creatinina sérica superior a 265,2 µM e
potássio sérico superior a 4,0 mM (DOLHNIKOFF et al., 2007).
1.3.4 Manejo terapêutico
O tratamento depende da severidade e duração dos sintomas. Normalmente
a antibioticoterapia é baseada em penicilina G (WATT et al., 1988) ou doxiciclina
(McCLAIN et al., 1984) e demonstrou reduzir a severidade e duração dos sintomas
(McBRIDE et al., 2005; EDWARDS et al., 2004). Outro benefício é a prevenção da
leptospirúria ou redução do seu tempo de duração (McBRIDE et al., 2005; SILVA et
al., 2003; BINDER et al., 1998; EDWARDS et al., 1988). Pacientes que apresentam
a forma severa da doença necessitam de reposição hidro-eletrolítica agressiva a fim
de prevenir ou reverter a instalação do quadro inicial de insuficiência renal aguda.
Os pacientes que, apesar desses esforços, desenvolvem insuficiência renal,
necessitam de diálise peritoneal ou hemodiálise. As manifestações clínicas de
comprometimento pulmonar devem ser tratadas com uso de oxigenação e, em casos
mais severos, de ventilação com pressão positiva (EDWARDS & LEVETT, 2004).
1.4 EPIDEMIOLOGIA DA LEPTOSPIROSE
1.4.1 Epidemiologia no contexto mundial
A leptospirose é uma antropozoonose com incidência mundial e afeta tanto a
população urbana quanto a rural em países com clima tropical (ROMERO et al.,
2003; KO et al., 1999), subtropical (MEITES et al., 2004) ou temperado (JANSEN et
al., 2005). Essa patologia exibe claro caráter sazonal em regiões tropicais, em que o
período chuvoso do ano é marcado por altas temperaturas (McBRIDE et al., 2005;
PAPACHAN et al., 2005; ROMERO et al., 2003). A leptospirose está descrita nos
cinco continentes (FERRO et al., 2006; SAMBASIVA et al., 2003; SEIJO et al., 2002;
KO et al., 1999).
Em virtude de sua relação com a condição sanitária, a globalização e a
desigualdade social produziram padrões epidemiológicos diferentes entre as classes
REVISÃO DE LITERATURA
19
sociais (McBRIDE et al., 2005). Tradicionalmente reconhecida nos países
desenvolvidos como doença ocupacional (CAMPAGNOLO et al., 2000;
HERNANDÉZ et al., 1999), hoje a leptospirose é cada vez mais associada a
atividades recreacionais (NAKAMURA et al., 2006), eventos esportivos (BOLAND et
al., 2004; MORGAN et al., 2002), viagens e turismo de aventura (GROBUSH et al.,
2003; SEJVAR et al., 2003), sendo também descrita como patologia reemergente
(MEITES et al., 2004). Já nos países em desenvolvimento, a epidemiologia da
leptospirose está intimamente relacionada às condições sócio-econômicas da
população (ROMERO et al., 2003; SILVA et al., 2003). O crescimento da população
urbana sem acesso à estrutura sanitária básica – água tratada e encanada, rede de
coleta e tratamento de esgoto, coleta de lixo doméstico, políticas governamentais
para controle de zoonoses - produziu condições ecológicas ideais para a infecção a
partir de roedores, favorecendo a instalação de um quadro endêmico em países
como o Brasil (McBRIDE et al., 2005; ROMERO et al., 2003; SILVA et al., 2003, KO
et al., 1999).
1.4.2 Epidemiologia no contexto nacional
O Brasil sofreu uma transformação demográfica intensa no período entre as
décadas de 60 e 90 devido ao processo de migração interna. Esse fenômeno levou
a um aumento de cerca de 350% na população urbana. Uma das conseqüências
dessa mudança foi o estabelecimento de favelas urbanas, nas quais a ausência de
serviços sanitários básicos levou à instalação de um quadro ecológico que favoreceu
a transmissão da leptospirose mediada por roedores (McBRIDE et al., 2005; KO et
al., 1999). Possivelmente, o aspecto demográfico pode ser uma das explicações
para que, apesar de a patologia ser descrita em todo o território nacional, haja maior
prevalência nas regiões Sudeste, Sul e Nordeste, respectivamente. Além disso,
estima-se que o número de casos clínicos seja superior devido principalmente à falta
de diagnóstico conclusivo e à subnotificação (McBRIDE et al., 2005). Em 2006,
foram confirmados 3.823 casos de leptospirose no Brasil.
O perfil epidemiológico da população afetada no Brasil consiste de adultos
jovens, do sexo masculino, residentes em áreas urbanas e contaminados a partir de
exposição ocupacional (GONÇALVES et al., 2006; VIEIRA et al., 2005; ROMERO et
REVISÃO DE LITERATURA
20
al., 2003; KO et al., 1999). No Brasil, acredita-se que a maioria dos casos urbanos
seja devida à infecção por cepas do sorogrupo Icterohaemorrhagiae (ROMERO et
al., 2003; PEREIRA et al., 2000; KO et al., 1999), o que fortalece o papel do rato
doméstico como principal reservatório, uma vez que Rattus rattus e R. norvergicus
são os carreadores mais comuns desse sorogrupo (KO et al., 1999).
1.4.3 Epidemiologia no Estado do Paraná
Em 2006, foram confirmados 1.045 casos de leptospirose na região Sul, dos
quais 218 ocorreram no Estado do Paraná (BRASIL, 2006). A taxa de mortalidade
acumulada no Estado nos últimos seis anos é de 12,5%, sendo significativamente
maior do que a dos demais Estados da região Sul (Santa Catarina acumula 5,8% e
Rio Grande do Sul acumula 6,3%).
Os municípios do Estado do Paraná foram distribuídos em 22 Regionais de
Saúde. Há grande discrepância entre o número de casos de leptospirose notificados
por cada Regional. Dentre os casos notificados em 2006, 48% são relativos à 2ª
Regional de Saúde, que atende Curitiba e região metropolitana (SESA-PR, 2005).
Em 1995, devido a um aumento mundial no número de casos de doenças
emergentes e reemergentes, vários países propuseram à Organização Mundial da
Saúde (OMS) a revisão do sistema de notificação existente, com base em agravos,
para um sistema de notificação sindrômico. Esse conceito surge de um grupo de
doenças com semelhanças de sinais e sintomas e que se apresentam dentro de um
contexto epidemiológico. A vigilância sindrômica é uma estratégia de vigilância
epidemiológica que se baseia na detecção de um conjunto de manifestações clínicas
comuns a um grupo de doenças, visando captar o maior número de casos,
contribuindo para a adesão precoce e precisa de medidas de controle (MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2004).
No Brasil, em meados de 2002, se iniciou a implantação do sistema de
Vigilância Epidemiológica das Síndromes Febris Íctero-Hemorrágicas Agudas (VE-
SFIHA) em três municípios do Estado do Amazonas. Um passo muito importante
para alcançar os objetivos propostos por esse modelo de vigilância foi o
fortalecimento dos laboratórios de saúde pública, com a formação de uma rede de
laboratórios de vigilância que cooperam entre si e trabalham de forma integrada.
REVISÃO DE LITERATURA
21
Este esforço colaborativo teve muitas dimensões, cujo denominador comum foi o
conceito de prática em uma rede funcional. Os resultados obtidos no Amazonas e
emergências epidemiológicas em outros Estados fizeram com que o processo de
implantação da VE-SFIHA fosse desencadeado no Rio Grande do Sul e Tocantins
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
A Vigilância Sindrômica das Síndromes Íctero-Febris Agudas (VS-SIFA) foi
implantada no Paraná em maio de 2000, tornando o Estado a primeira Unidade da
Federação a implantar esse modelo de vigilância epidemiológica. A VS-SIFA integra
a investigação dos agentes etiológicos das hepatites virais, leptospirose, malária por
Plasmodium falciparum e febre amarela, utilizando um modelo baseado no sistema
de investigação de hepatites virais, implantado no Paraná em 1993. Para tal, foi
necessária uma ampla discussão e integração dos diversos departamentos
envolvidos na Secretaria de Estado da Saúde (SESA-PR, 2001). Considera-se como
caso todo indivíduo com início agudo de icterícia e febre, sem outro diagnóstico
clínico confirmado. A notificação é feita a partir da primeira suspeita diagnóstica. Em
caso de exame negativo e confirmação de outro diagnóstico, descarta-se a primeira
notificação e notifica-se a doença confirmada. É realizada a investigação laboratorial
sistemática do agente etiológico, de forma seqüencial a partir da primeira suspeita. A
pesquisa seqüencial das hepatites virais e da leptospirose é realizada
automaticamente em todos os casos de síndrome íctero-febril aguda, considerando
sempre a principal suspeita diagnóstica. A pesquisa dos agentes dos demais
agravos incluídos na VS-SIFA - malária e febre amarela - leva sempre em
consideração os aspectos epidemiológicos (SESA-PR, 2001).
REVISÃO DE LITERATURA
22
TABELA 1 - SÉRIE HISTÓRICA DE CASOS DE LEPTOSPIROSE CONFIRMADOS E NOTIFICADOS NO SINAN
2001 2002 2003 2004 2005 2006
Total
Rondônia 2 4 1 2 3 8
20
Acre 8 18 15 4 20 466
531
Amazonas 28 25 27 34 43 55
212
Roraima 0 0 0 0 0 2
2
Para 102 166 109 157 162 69
765
Amapá 0 14 92 26 44 80
256
Região Norte
Tocantins 2 0 4 0 6 1
13
Maranhão 32 27 20 25 14 33
151
Piauí 1 0 0 0 0 4
5
Ceara 53 44 85 103 62 84
431
Rio Grande do Norte 8 10 9 12 5 7
51
Paraíba 2 18 21 44 17 15
117
Pernambuco 326 310 203 374 338 183
1734
Alagoas 71 81 47 98 71 77
445
Sergipe 50 23 12 26 32 39
182
Região
Nordeste
Bahia 113 121 120 129 211 144
838
Minas Gerais 35 38 163 83 93 53
465
Espírito Santo 104 39 27 219 178 274
841
Rio de Janeiro 268 206 242 289 307 206
1518
Região Sudeste
São Paulo 782 634 562 727 776 919
4400
Paraná 186 249 315 205 341 218
1514
Santa Catarina 328 194 309 302 406 319
1858
Região Sul
Rio Grande do Sul 1133 458 571 166 344 508
3180
Mato Grosso do Sul 8 5 9 4 15 10
51
Mato Grosso 0 8 3 12 10 10
43
Goiás 2 4 3 6 3 5
23
Região Centro-
Oeste
Distrito Federal 33 20 39 49 38 34
213
Total 3677 2716 3008 3096 3539 3823 19859
Fonte: Ministério da Saúde / SVS – Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN)
REVISÃO DE LITERATURA
23
TABELA 2
– DISTRIBUIÇÃO DE CASOS DE LEPTOSPIROSE POR
REGIONAL DE SAÚDE, 2000 A 2007*
MAPA 1 - ESTADO DO PARANÁ DIVIDIDO EM
REGIONAIS DE SAÚDE
Fonte: Secretaria de Estado da Saúde (SESA-PR)
* dados parciais
Fonte: Secretaria de Estado da Saúde (SESA-PR)
2000 – 2007*
1ª R. S. Paranaguá 98
2ª R. S. Curitiba 1084
3ª R. S. Ponta Grossa 49
4ª R. S. Irati 12
5ª R. S. Guarapuava 27
6ª R. S. União da Vitória 5
7ª R. S. Pato Branco 16
8ª R. S. Francisco Beltrão 26
9ª R. S. Foz do Iguaçu 31
10ª R. S. Cascavel 55
11ª R. S. Campo Mourão 16
12ª R. S. Umuarama 5
13ª R. S. Cianorte 7
14ª R. S. Paranavaí 7
15ª R. S. Maringá 63
16ª R. S. Apucarana 52
17ª R. S. Londrina 63
18ª R. S. Cornélio Procópio 37
19ª R. S. Jacarezinho 22
20ª R. S. Toledo 26
21ª R. S. Telêmaco Borba 19
22ª R. S. Ivaiporã 12
REVISÃO DE LITERATURA
24
1.5 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O diagnóstico laboratorial consiste de ensaios sorológicos baseados em
reações imunológicas ou demonstração de antígenos do agente; demonstração
microbiológica do agente etiológico ou pesquisa molecular do material genético
bacteriano.
1.5.1 Métodos sorológicos
A maioria dos casos de leptospirose é diagnosticada por métodos sorológicos.
Os anticorpos são detectáveis no soro em aproximadamente sete dias após o início
dos sintomas. Os métodos sorológicos podem ser divididos em dois grupos: gênero-
específicos e sorogrupo-específicos (LEVETT, 2001).
O MAT é o teste de referência no diagnóstico laboratorial da leptospirose
(FAUCHER et al., 2004; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003; KO et al., 1999;
BINDER et al., 1998). A base diagnóstica do MAT é formada pela reação de
aglutinação entre os anticorpos presentes no soro dos pacientes e o antígeno-O dos
LPS de membrana das leptospiras. Nesse ensaio, uma diluição seriada 1:2 do soro
do paciente (enquanto houver positividade) reage com suspensões dos antígenos
vivos de uma bateria de sorovares de Leptospira spp. Em seguida, as reações são
examinadas microscopicamente em campo escuro para determinação do título da
aglutinação, que ocorre em virtude da presença de anticorpos contra Leptospira spp.
no soro do paciente. O MAT é capaz de fornecer resultados sorogrupo-específicos
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003). O MAT é um teste indireto, não sendo
capaz de diferenciar infecções ativas de inativas. Pode ser bastante difícil interpretar
os resultados em pacientes que foram previamente vacinados, infectados ou são
originários de áreas endêmicas (LUCCHESI et al., 2004; BAJANI et al., 2002). Outra
desvantagem importante é que o resultado fornecido pelo MAT pode depender da
avaliação do aumento do título de reatividade, o que requer a análise de pelo menos
duas amostras pareadas, colhidas com intervalo de 15 dias. Isso faz com que os
resultados do MAT não sejam gerados de maneira rápida o suficiente para permitir o
diagnóstico precoce da infecção (BAJANI et al., 2003; KEE et al., 1994). O MAT é
REVISÃO DE LITERATURA
25
um teste complexo em relação à execução, controle de qualidade e interpretação
(TURNER, 1970). É necessário manter uma coleção de culturas vivas de leptospiras,
subcultivadas semanalmente. Desse modo, é necessário checar periodicamente
cada uma das cepas para contaminação cruzada. Caso não se adote um sistema de
controle da qualidade, o risco de ocorrência de resultados falsos é grande
(CHAPPEL et al., 2004). Além disso, o resultado do teste também pode ser afetado
pela qualidade do meio de cultura utilizado e pela experiência do técnico operador
(LEVETT, 2001).
O método de ELISA IgM é utilizado como teste de triagem devido à
combinação de sensibilidade, especificidade, rapidez, capacidade de processamento
e facilidade na execução. Com a aplicação dessa técnica ao diagnóstico da
leptospirose, tornou-se possível pesquisar anticorpos da classe IgM. Durante o curso
da doença, esses anticorpos são detectáveis no soro humano em torno de sete dias
após a instalação dos sintomas. Este ensaio consiste na reação de soros humanos
com antígenos solúveis e purificados de leptospiras obtidos a partir de cultura in vitro
e previamente adsorvidos nas cavidades de microplacas. Caso as amostras
contenham anticorpos direcionados contra as leptospiras, estes se ligarão aos
antígenos adsorvidos na fase sólida (BRASIL, 2005). Apesar de ser bastante
empregado para o diagnóstico da leptospirose, o teste ELISA IgM apresenta
sensibilidade e especificidade menores quando comparado com o MAT,
especialmente na avaliação de amostras obtidas na primeira semana após o início
dos sintomas e em amostras de indivíduos provenientes de áreas endêmicas
(BLACKSELL et al., 2006). Além disso, é necessário levar em consideração que
anticorpos anti-leptospiras da classe IgM podem ser detectados no soro dos
pacientes durante anos após a infecção (McBRIDE et al., 2007; ABDULKADER et
al., 2002). Estudos mostram que, em comparação com outros testes sorológicos, o
teste ELISA IgM apresenta melhor desempenho quando avaliadas sensibilidade e
especificidade para amostras coletadas na segunda semana após a instalação da
sintomatologia (EFFLER et al., 2002). A avaliação de um ensaio desse tipo utilizado
pelos Laboratórios de Saúde Pública do Brasil mostra que o teste apresenta
especificidade satisfatória e que a sensibilidade aumenta significativamente quando
da análise de amostras obtidas na fase convalescente da patologia. Esses dados
REVISÃO DE LITERATURA
26
sugerem que essa ferramenta diagnóstica é útil no processo de vigilância da
leptospirose urbana no Brasil (McBRIDE et al., 2007).
Com o intuito de desenvolver novos testes diagnósticos com alta sensibilidade
na fase aguda da patologia, tem-se focado primariamente na detecção de anticorpos
IgM a partir da ligação a preparações de antígenos celulares. A molécula
imunodominante nessas preparações parece ser um antígeno amplamente reativo
que possui um epítopo dissacarídeo presente tanto em leptospiras não-patogênicas
quanto em outras espécies bacterianas outras que não Leptospira spp. Testes
sorológicos baseados em antígenos recombinantes podem alcançar sensibilidade e
especificidade mais altas em virtude da maior concentração de antígenos
imunoreativos e da ausência das moléculas inespecíficas presentes nas
preparações celulares (NEVES et al., 2007; FLANNERY et al., 2001). Portanto, o
antígeno ideal seria um alvo principal na resposta imune do hospedeiro, expresso
somente pelas cepas patogênicas de Leptospira spp. e conservado entre os mais de
200 sorovares associados à doença humana em diferentes regiões geográficas e
situações epidemiológicas. Já o teste ideal deveria ser capaz de discriminar entre a
leptospirose e um amplo espectro de doenças agudas febris com apresentações
clínicas semelhantes (FLANNERY et al., 2001). Estudo recente mostra que
imunoensaios utilizando a proteína recombinante Lig como antígeno para pesquisa
de anticorpos anti-LigB IgM apresentam melhor performance em comparação aos
testes que utilizam antígenos celulares totais no que tange à sensibilidade e
especificidade (CRODA et al., 2007). Além disso, esse teste permite diferenciar
resposta imune à infecção recente daquela remanescente de uma infecção anterior,
o que é essencial em áreas endêmicas e de alta transmissão.
O ensaio de hemaglutinação indireta utiliza células recobertas com antígenos
de Leptospira spp. para a pesquisa de anticorpos anti-leptospira. A presença de
anticorpos específicos leva à hemaglutinação celular, cuja leitura é realizada em
microplacas com fundo em U. Esse método mostrou-se pouco sensível para a
análise de amostras obtidas nas duas primeiras semanas após o desenvolvimento
dos sintomas. A análise de amostras obtidas após esse período levou a um aumento
da sensibilidade. A sensibilidade dessa técnica é relacionada com os critérios
utilizados para definição dos casos positivos e depende diretamente do sorogrupo
infectante. Como esse teste é disponível comercialmente, nem sempre os antígenos
REVISÃO DE LITERATURA
27
fixados às células correspondem às cepas circulantes num determinado local, o que
pode levar a resultados falso-negativos (EFFLER et al., 2000).
Os ensaios do tipo dipstick consistem de uma versão simplificada do teste
ELISA IgM, em que um antígeno de Leptospira spp. amplamente reativo é fixado a
um suporte sólido e colocado em contato com amostras de soro. A revelação é feita
utilizando um conjugado anti-IgM estabilizado e corado como sistema sinal, ao invés
do sistema de detecção enzimático utilizado no ELISA IgM. Estudos mostram
concordância entre a sensibilidade e a especificidade obtidas para o teste dispstick e
ELISA IgM (SMITS et al., 1999; GUSSENHOVEN et al., 1997). As vantagens dessa
técnica incluem sua independência em relação a aparato laboratorial e refrigeração
dos insumos, podendo inclusive ser realizado em campo. Além disso, utiliza
pequeno volume de amostra e fornece resultados em cerca de três horas (SMITS et
al., 1999).
O método de imunocromatografia por fluxo lateral (lateral-flow) consiste de
uma tira de nitrocelulose que possui em uma extremidade o conjugado anti-IgM
humana marcado com ouro e na outra extremidade um pad de absorção. O antígeno
de Leptospira spp. é depositado na forma de uma linha na fita de nitrocelulose. A
extremidade contendo o conjugado é colocada em contato com o soro do paciente.
Quando há presença de anticorpos da classe IgM na amostra, os mesmos se ligam
aos antígenos e são revelados pela ligação do conjugado marcado (SMITS et al.,
2001). Estudos demonstram que esse método apresenta boa correlação tanto com o
teste dipstick quanto com ELISA IgM, uma vez que os três são baseados no mesmo
princípio metodológico. A maior vantagem dessa técnica é a simplicidade para a
execução, uma vez que os insumos não requerem refrigeração e a execução da
técnica dispensa o uso de aparato laboratorial, utilizando pequeno volume de
amostra. Além disso, o lateral-flow fornece resultados em apenas 15 minutos,
podendo ser utilizado a campo ou mesmo dentro das unidades hospitalares como
teste rápido para triagem (SEHGAL et al., 2003; SMITS et al., 2001).
O teste de imunofluorescência direta poder ser utilizado para a pesquisa de
antígenos de Leptospira spp. em amostras clínicas, sendo especialmente útil para
avaliação de produtos de biópsia obtidas post mortem antes da soroconversão. Para
tanto, incuba-se o corte histológico frente a um pool de antisoros marcados com
fluoresceína. Em seguida, procede-se a leitura em microscópio de fluorescência.
REVISÃO DE LITERATURA
28
Estudos mostram que, apesar de ser mais sensível do que o cultivo, essa técnica
não apresenta sensibilidade satisfatória. Isso se deve, entre outros fatores, à
pequena quantidade de leptospiras presente nos tecidos, falta de uniformidade nos
cortes histológicos ou perda de integridade dos antígenos durante o processamento
das amostras (BROWN et al., 2003).
O teste de imunofluorescência indireta pode ser utilizado para a pesquisa de
anticorpos anti-leptospira no soro de pacientes. Para isso, testa-se o soro diluído
seriadamente contra antígenos de Leptospira spp. previamente fixados a lâminas de
microscopia. Adiciona-se então um conjugado anti-imunoglobulina humana titulado e
procede-se a leitura em microscópio de fluorescência. A classe de imunoglobulinas a
ser pesquisada depende da especificidade do conjugado utilizado – anti-IgM ou anti-
IgG. Estudos mostram que essa técnica apresenta sensibilidade e especificidade
satisfatórias quando comparadas com o MAT. A especificidade depende diretamente
do antígeno de Leptospira spp. utilizado no ensaio. Esse método apresenta riscos de
infecção ocupacional reduzidos em comparação ao MAT, uma vez que é possível
utilizar cepas não-patogênicas como antígeno fixado (AGUDELO-FLÓREZ et al.,
2006).
1.5.2 Métodos microbiológicos
Dentre os métodos microbiológicos utilizados está a pesquisa de leptospiras
por microscopia em campo escuro. Apesar de ser tradicionalmente relacionada ao
diagnóstico da leptospirose e à detecção da leptospirúria, essa técnica apresenta
sensibilidade e especificidade muito baixas. Além disso, a interpretação do exame é
subjetiva e dependente da experiência do observador, o que em muitos casos pode
levar a diagnósticos equivocados na presença de estruturas como fibras têxteis e
extrusões celulares (CHANDRASEKARAN & GOMATHI, 2004).
Outro método microbiológico associado ao diagnóstico de pacientes com
leptospirose é o cultivo da bactéria. O meio de Ellinghausen, McCullough, Johnson e
Harris (EMJH) é o meio de cultura mais utilizado para o crescimento de leptospiras
(ELLINGHAUSEN & McCULLOUGH, 1965). Apesar de o isolamento permitir o
diagnóstico direto, o crescimento das leptospiras é lento e as culturas devem ser
mantidas por até 12 semanas antes de serem descartadas como negativas.
REVISÃO DE LITERATURA
29
Subcultivos puros em meio líquido normalmente apresentam crescimento em 10 a
14 dias. Apesar de apresentar alta especificidade, esse método é pouco usado para
fins diagnósticos devido à baixa sensibilidade e ao longo período necessário para o
crescimento bacteriano. Como o tempo necessário para a liberação de um resultado
pode chegar a três meses, a cultura é usada como método confirmatório, associada
ao ELISA e ao MAT. Entretanto, o isolamento das bactérias tem importância
fundamental nas investigações epidemiológicas, sendo pré-requisito essencial para
a identificação da cepa envolvida em surtos ou epidemias, ou mesmo circulante em
determinada área geográfica (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003).
1.5.3 Métodos moleculares
As ferramentas de biologia molecular têm-se destacado em virtude das
dificuldades e limitações técnicas dos métodos sorológicos e microbiológicos
empregados no diagnóstico da leptospirose. Os métodos moleculares são
reconhecidamente específicos, já que é possível estudar seletivamente uma região
do genoma exclusiva de determinado organismo. A sensibilidade é assegurada pelo
emprego da PCR, uma poderosa ferramenta molecular capaz de amplificar
seqüencial e exponencialmente a região genômica de interesse. As técnicas
moleculares têm sido empregadas com sucesso em várias áreas, sendo
especialmente úteis no diagnóstico de patologias infecciosas causadas por bactérias
de crescimento lento ou não-cultiváveis, como por exemplo, Mycobacterium
tuberculosis (EISENACH, 1990), Mycobacterium leprae (MARTINEZ et al., 2006) e
Treponema pallidum (WENHAI et al., 2004). Além disso, as técnicas moleculares
permitem o estudo e detecção dos patógenos em vários materiais biológicos, como
sangue total (FONSECA et al., 2006), soro (MERIEN et al., 1992; GRAVEKAMP et
al., 1993), urina (LUCCHESI et al., 2004; BAL et al., 1994; VAN EYS et al., 1989),
líquor (ROMERO et al., 1998), sêmen (HEINEMAN et al., 2000), produtos de biópsia
(MARTINEZ et al., 2006), entre outros.
O método de PCR é uma ferramenta sensível e específica no diagnóstico da
leptospirose, quando comparada com os métodos microbiológicos convencionais
quanto à análise de sangue total (KOSITANONT et al., 2007; FONSECA et al., 2006;
MERIEN et al., 1992), soro (GRAVEKAMP et al., 1993), urina (LUCCHESI et al.,
REVISÃO DE LITERATURA
30
2004; BAL et al., 1994; MERIEN et al., 1992; VAN EYS et al., 1989) e líquor
(ROMERO et al., 1998). Além disso, a PCR é tecnicamente mais simples do que o
MAT, o que viabiliza sua implantação em um número maior de laboratórios. Alguns
sistemas moleculares são sensíveis o suficiente para detectar uma cópia do genoma
de leptospira por mililitro de amostra (BAL et al., 1994; GRAVEKAMP et al., 1993;
MERIEN et al., 1992), mas a maioria dos sistemas apresenta sensibilidade em torno
de 10 a 100 cópias do genoma de leptospiras por mililitro de amostra (KEE et al.,
1994; FONSECA et al., 2006). Em alguns casos, a PCR é usada em associação com
técnicas de hibridização pós-PCR, o que aumenta a sensibilidade do sistema
(GRAVEKAMP et al., 1993; MERIEN et al., 1992; FONSECA et al., 2006). Na
presença de quantidade neste nível de grandeza, as técnicas até hoje utilizadas,
entre elas a pesquisa em campo escuro e a cultura, podem não ser capazes de
detectar os agentes infecciosos. Alguns estudos demonstram que, por serem
capazes de detectar a doença em estágios distintos, os métodos sorológicos e
moleculares podem fornecer resultados discordantes, porém complementares
(KOSITANONT et al., 2007; FONSECA et al., 2006; OOTEMAN et al., 2006; BAL et
al., 1994; KEE et al., 1994). As limitações inerentes aos métodos moleculares
incluem alto custo dos equipamentos e insumos, imprescindível adequação física
para áreas pré e pós-amplificação e necessidade de mão-de-obra qualificada. Por
fim, a avaliação das variáveis tempo, sensibilidade, especificidade e custo-beneficío
mostra que a PCR é um método bastante atraente e promissor quando destinado ao
diagnóstico precoce da leptospirose (FONSECA et al., 2006; OOTEMAN et al., 2006;
VAN EYS et al., 1989).
31
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
32
O diagnóstico precoce da leptospirose humana é crucial para a intervenção
terapêutica apropriada e prevenção da instalação de formas sintomatológicas graves
como insuficiência renal aguda e comprometimento pulmonar. No Brasil, a maioria
dos casos de leptospirose é diagnosticada por métodos sorológicos, principalmente
por testes ELISA IgM. Entretanto, anticorpos da classe IgM são detectáveis no soro
somente cerca de sete dias após o início dos sintomas. Consequentemente, os
testes sorológicos apresentam sensibilidade e especificidade baixas durante a
primeira semana de sintomatologia, estando sujeitos a fornecer resultados falso-
negativos. Apesar de técnicas moleculares como PCR serem empregadas com
sucesso para o diagnóstico precoce da leptospirose, há poucos estudos
comparativos entre as metodologias descritas na literatura. Também permanece
incerto qual o período pós-infecção necessário para que essas metodologias
forneçam resultados informativos. Do mesmo modo, não está clara qual a amostra
clínica mais adequada para utilização nesses ensaios. Com a elucidação dessas
questões, seria possível tirar máximo proveito da tecnologia molecular, oferecendo
um teste com altas sensibilidade e especificidade, utilizando DNA obtido da melhor
amostra clínica possível, colhida no período clínico mais adequado. Esses avanços
trariam benefícios como maior confiabilidade e clareza na interpretação dos
resultados obtidos e racionalização do uso do teste molecular.
Desse modo, o objetivo geral desse estudo foi avaliar o diagnóstico molecular
como ferramenta auxiliar aos testes sorológicos (MAT e ELISA IgM) no diagnóstico
da leptospirose humana em pacientes da região metropolitana de Curitiba.
Os objetivos específicos do presente trabalho foram:
1. Determinar a melhor amostra sangüínea para a pesquisa da leptospiremia
humana por métodos moleculares.
2. Comparar os resultados dos sistemas de PCR com os resultados dos métodos
sorológicos – ELISA IgM e MAT - em casos clínicos de leptospirose em pacientes
humanos.
3. Comparar o desempenho de dois sistemas de PCR entre si na detecção de
Leptospira spp. em amostras de sangue total e urina humanas para verificar a
sensibilidade e a especificidade de cada sistema molecular usando MAT como
padrão-ouro.
33
3 METODOLOGIAS
METODOLOGIAS
34
Os experimentos a seguir, embora não constituam contribuição à literatura
científica, foram fundamentais para a validação e otimização das metodologias
empregadas nesse estudo.
3.1 VALIDAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DA TÉCNICA DE PCR
3.1.1 Extração do DNA das amostras clínicas
Para a extração do DNA, 200 µl de amostra biológica (sangue total, soro ou
plasma) foram aplicados a uma coluna de captura do kit de extração GENERATION
Capture Column Kit (GENTRA SYSTEMS, Minneapolis, MN, USA). Após incubação
por 45 minutos a temperatura ambiente, deu-se prosseguimento à técnica seguindo
as instruções do fabricante. A DNA foi eluído em 100 µl do Tampão de Eluição. As
amostras de DNA foram identificadas numericamente, de forma seqüencial, sem
menção ao nome ou situação sorológica dos indivíduos.
3.1.2 Seleção dos sistemas de PCR e otimização dos parâmetros de amplificação
Para amplificação do DNA das amostras clínicas foram avaliados dois
sistemas de reação diferentes previamente descritos na literatura. O primeiro utiliza
iniciadores capazes de amplificar um fragmento do gene rrs 16S do genoma de
Leptospira spp. (MERIEN et al., 1992). O segundo sistema utiliza iniciadores
específicos para amplificação de um fragmento do gene secY do genoma das
espécies patogênicas de Leptospira spp., exceto L. kirschneri (GRAVEKAMP et al.,
1993).
Ambos os sistemas de PCR selecionados foram submetidos a uma etapa de
otimização para confirmação da concentração ótima de MgCl
2
e da temperatura
ideal de anelamento dos iniciadores. Para tanto, foram preparadas três misturas de
reação com concentrações de MgCl
2
de 1,5; 2,0 e 2,5 mM, cada uma em quantidade
suficiente para amplificação de 12 replicatas de uma mesma amostra de DNA
(cultivo de L. interrogans sorovar Icterohaemorrhagiae cepa RGA). As 36 replicatas
foram submetidas à ciclagem padrão (GRAVEKAMP et al., 1993; MERIEN et al.,
METODOLOGIAS
35
1992) com gradiente de temperatura de 12 pontos (temperatura de anelamento
descrita para os iniciadores ± 5°C) em termociclador Mastercycler gradient
(Eppendorf, Hamburg, Germany). Após análise eletroforética dos resultados (ver
item 3.1.2), os parâmetros com melhor desempenho foram selecionados para
amplificação das amostras clínicas, como segue.
Os iniciadores utilizados na reação de amplificação parcial do gene rrs 16S
tinham as seguintes seqüências nucleotídicas: A - 5’ GGC GGC GCG TCT TAA ACA
TG 3’; B - 5’ TTC CCC CCA TTG AGC AAG ATT 3’. O DNA extraído de todas as
amostras clínicas foi amplificado conforme protocolo de PCR descrito anteriormente
(MERIEN et al., 1992), com algumas modificações.
A amplificação do DNA foi realizada num volume final de 50 µl. A mistura de
reação consistiu de 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,4); 2 mM de MgCl
2
, 1
µM de cada iniciador (A e B), 200 µM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) e
1,25 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O volume da
mistura de reação foi corrigido com água ultrapura para 45 µl. A seguir foram
adicionados 5 µl de DNA extraído.
Para a reação de PCR foi utilizado um termociclador GeneAmp PCR System
9700 (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). O primeiro ciclo de amplificação
consistiu de desnaturação a 94°C por 3 minutos, anelamento dos iniciadores a 61°C
por 1min30s e extensão a 72°C por 2 minutos. Os 29 ciclos seguintes consistiram de
desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento dos iniciadores a 61°C por 1min30s
e extensão a 72°C por 2 minutos. Uma etapa final de 10 minutos a 72°C conferiu
extensão completa aos iniciadores. Essa reação gerou produtos de PCR de 331 pb.
Todas as baterias de reação foram acompanhadas por um controle negativo
de amplificação (5 µl de água ultrapura) e um controle positivo de amplificação (5 µl
de DNA de L. interrogans sorovar Icterohaemorrhagiae cepa RGA).
Os iniciadores utilizados na reação de amplificação parcial do gene secY
tinham as seguintes seqüências nucleotídicas: G1 - 5’ CTG AAT CGC TGT ATA AAA
GT 3’; G2 - 5’ GGA AAA CAA ATG GTC GGA AG 3’. O DNA extraído de todas as
amostras clínicas foi amplificado conforme protocolo de PCR descrito anteriormente
(GRAVEKAMP et al., 1993), com algumas modificações.
A amplificação do DNA foi realizada num volume final de 50 µl. A mistura de
reação consistiu de 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,4),2 mM de MgCl
2
, 1
METODOLOGIAS
36
µM de cada iniciador (G1 e G2), 200 µM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP e
dGTP) e 1,25 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O volume
da mistura de reação foi corrigido com água ultrapura para 45 µl. A seguir foram
adicionados 5 µl de DNA extraído.
Para a reação de PCR foi utilizado um termociclador GeneAmp PCR System
9700 (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). O primeiro ciclo consistiu de
desnaturação a 94°C por 5 minutos, anelamento dos iniciadores a 55°C por 1 minuto
e extensão a 72°C por 2 minutos. Os 34 ciclos seguintes consistiram de
desnaturação a 94°C por 1min30s, anelamento dos iniciadores a 55°C por 1 minuto
e extensão a 72°C por 2 minutos. Uma etapa final de 10 minutos a 72°C conferiu
extensão completa aos iniciadores. Essa reação gerou produtos de PCR de 285 pb.
Todas as baterias de reação foram acompanhadas por um controle negativo
de amplificação (5 µl de água ultrapura) e um controle positivo de amplificação (5 µl
de DNA de L. interrogans sorovar Icterohaemorrhagiae cepa RGA).
3.1.3 Eletroforese dos produtos de PCR
Os produtos de PCR obtidos (15 µl) e 6 ng de marcador de peso molecular
100 bp DNA Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) foram aplicados em gel de
agarose tipo II eletroendosmose 0.09-0.13 mr (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a
1,5% impregnado com brometo de etídio (0,5 µg/ml), utilizando 2,5 µl de Blue
Loading Buffer para o carregamento. Os produtos foram então separados por
eletroforese horizontal usando TBE 1X como tampão de corrida, sob 160 V por 45
minutos. Em seguida, o gel de agarose foi exposto à luz ultravioleta em
transiluminador para revelação dos fragmentos separados e comparação do
tamanho dos fragmentos do produto da PCR com aqueles gerados pelo marcador
de peso molecular. O gel foi fotografado e a imagem foi digitalizada em sistema de
foto-documentação Kodak Digital Science – Eletrophoresis Documentation and
Analysis System 120 (Kodak, Rochester, NY, USA). A definição de resultados
positivos e negativos baseou-se na identificação visual das bandas no gel de
agarose. O observador ignorava a identificação e a situação sorológica das amostras
avaliadas em cada gel.
METODOLOGIAS
37
3.2 DEFINIÇÃO DO LIMITE MÍNIMO DE DETECÇÃO DOS SISTEMAS DE PCR
Para verificar o limite de detecção dos sistemas de PCR em estudo, o número
de células bacterianas (L. interrogans sorovar Copenhageni cepa M20) foi
determinado utilizando uma câmara de contagem de Petroff-Hausser (Hausser
Cientific, Horsham, PA, USA). As bactérias foram cultivadas em meio Fletcher
líquido, incubadas a 28°C por seis dias. O caldo de cultura foi diluído 1:10 em PBS
1X (pH 7,2) e 5 µl foram adicionados à câmara de contagem. Após 15 minutos, as
células foram observadas em microscopia em campo escuro e o número de células
foi determinado conforme preconizado pelo fabricante do citômetro. Em seguida, a
concentração foi ajustada com PBS 1X (pH 7,2) para 5x10
7
células/ml, com
subseqüente diluição 1:10 em PBS 1X até a concentração final de 5x10
1
células/ml.
O DNA de uma alíquota de 500 µl de cada diluição foi extraído por exposição a 94°C
por 10 minutos. O DNA foi então amplificado conforme descrito no item 3.1.1 e
submetido à eletroforese conforme item 3.1.2.
FIGURA 1 - COMPARAÇÃO DO LIMITE MÍNIMO DE DETECÇÃO DOS SISTEMAS
A/B E G1/G2
A
B
Limite mínimo de detecção dos conjuntos de iniciadores A/B (A) e G1/G2 (B). Poços 1 a 7: L.
interrogans sorovar Copenhageni cepa M20 em diluição seriada 1:10 partindo de 5x10
7
células/ml até
5x10
1
células/ml. MP: marcador de peso molecular de 100 pb. CN: controle negativo. CP: controle
positivo.
Os resultados demonstraram que o limite de detecção teórico é de 25
células ou 5x10
2
células/ml (cerca de 250 fg) para o sistema A/B e de 2,5 células ou
5x10 células/ml (cerca de 25 fg) para o sistema G1/G2.
METODOLOGIAS
38
3.3 AVALIAÇÃO DOS SISTEMAS DE PCR FRENTE À COLEÇÃO DE CEPAS-
PADRÃO
Após seleção e otimização dos sistemas de PCR a serem utilizados, os
mesmos foram avaliados frente ao painel de cepas-padrão mantido no laboratório
para execução do MAT.
Para a extração do DNA, a turbidez de uma alíquota de 5 ml de cada cepa-
padrão cultivada em meio de Fletcher líquido foi ajustada com PBS 1X para igualar-
se à turbidez do tubo n° 1 da escala de McFarland, o que equivale a
aproximadamente 3x10
7
células/ml. Uma alíquota de 1 ml foi submetida à
centrifugação a 13.000 rpm, por 20 minutos a 4°C. Em seguida os sobrenadantes
foram removidos e o sedimento foi ressuspendido no líquido remanescente. Foi
adicionado 1 ml de PBS 1X a cada microtubo, com homogeneização subseqüente.
As amostras foram submetidas à nova centrifugação – 13.000 rpm por 20 minutos a
25°C. Em seguida, os sobrenadantes foram removidos e o sedimento foi
ressuspendido no líquido remanescente. Foram adicionados 100 µl de PBS 1X a
cada amostra, que foi incubada em bloco seco a 94°C por 10 minutos. O DNA obtido
foi então estocado a -20°C.
As amostras de DNA obtidas foram amplificadas e os produtos de PCR foram
submetidos à eletroforese conforme descrito nos itens 3.1.2 e 3.1.3.
Todas as cepas avaliadas geraram produtos de PCR de tamanho compatível com o
esperado para os dois sistemas de amplificação. Apesar de haver detecção, o DNA
das cepas classificadas como Leptospira kirschneri teve rendimento menor do que
as demais quando amplificado pelos iniciadores G1/G2.
Os sistemas de PCR em avaliação nesse estudo estão descritos há tempos
na literatura (GRAVEKAMP et al., 1993; MERIEN et al., 1992) e têm sido
extensivamente estudados para aplicação diagnóstica. Desde sua descrição, ambos
os sistemas moleculares foram avaliados quanto à especificidade analítica frente a
diversos microorganismos patogênicos, por diferentes grupos científicos, com
resultados consoantes. Em virtude da inacessibilidade a cepas bacterianas de
referência padrão ATCC
TM
, foram considerados nesse estudo os resultados dos
testes de especificidade publicados anteriormente (FONSECA et al., 2006;
OOTEMAN et al., 2006; GRAVEKAMP et al., 1993; MERIEN et al., 1992).
METODOLOGIAS
39
FIGURA 2 – AMPLIFICAÇÃO DE CEPAS-PADRÃO DE Leptospira spp. PELOS
CONJUNTOS DE INICIADORES A/B E G1/G2
A B
Amplificação das cepas-padrão de Leptospira spp. pelos sistemas A/B (A) e G1/G2 (B). MP: Marcador
de peso molecular de 100 pb. Poços 1 a 22: sorovares Australis (1), Autumnalis (2), Bataviae (3),
Bratislava (4), Canicola (5), Copenhageni (6), Djasiman (7), Hardjo (8), Hebdomadis (9),
Icterohaemorrhagiae (10), Pomona (11), Pyrogenes (12), Saxkoebing (13), Wolfii (14), Celledoni (15),
Panamá (16), Cynopteri (17), Grippotyphosa (18), Javanica (19), Sejroe (20), Tarassovi (21) e
Shermani (22).
METODOLOGIAS
40
TABELA 3 – CEPAS DE REFERÊNCIA UTILIZADAS NO ESTUDO
Genomoespécie Sorovar Cepa
Leptospira interrogans
Australis Ballico
Autumnalis Akiyami A
Bataviae Van Tienem
Bratislava Jez-Bratislava
Canicola Hond Utrecht IV
Copenhageni M20
Djasiman Djasiman
Hardjo Hardjioprajitno
Hebdomadis Hebdomadis
Icterohaemorrhagiae RGA
Pomona Pomona
Pyrogenes Sallinem
Saxkoebing Mus 24
Wolffi 3705
Leptospira borgpetersenii
Javanica Veldrat Batavia 46
Sejroe M84
Tarassovi Perepelitsin
Leptospira kirschneri
Cynopteri 3522 C
Grippotyphosa Moskva V
Leptospira nogushii
Panama CZ 214 K
Leptospira santarosai
Shermani LT 821
Leptospira weilii
Celledoni Celledoni
41
4 RESULTADOS
42
4.1 EVALUATION OF SERUM, PLASMA AND WHOLE BLOOD SPECIMENS FOR
MOLECULAR DETECTION OF Leptospira spp.
Irina Nastassja Riediger
a,*
, Sueli Massumi Nakatani
a
, Alexander Welker Biondo
b
a
Laboratório Central do Estado do Paraná, LACEN-PR, Curitiba, Brazil.
b
Dual affiliation, Departamento de Medicina Veterinária, Setor de Ciências Agrárias,
Universidade Federal do Paraná – UFPR, Curitiba, Brazil, and Department of
Veterinary Pathobiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana IL, USA.
Running title: Plasma, serum and whole blood for Leptospira spp. PCR detection
Corresponding author: Irina Nastassja Riediger. LACEN-PR, Divisão de
Epidemiologia e Controle de Doenças, Seção de Biologia Molecular. Rua Sebastiana
Santana Fraga, n° 1001, Guatupê, São José dos Pinhais, Paraná, Brazil, 83060-500.
Tel: +55 (41) 3299-3266; +55 (41) 3299-3212.
email: [email protected]
43
ABSTRACT
Laboratory diagnosis of leptospirosis in the past several decades has been based on
immunomethods, which are unreliable for prompt diagnosis and clinical decision-
making. Although molecular methods have been widely used for more rapid and
reliable diagnosis, it is still unclear which is the most adequate clinical sample for
detection of circulating leptospires. The aim of this study was to evaluate the best
specimen for leptospiremia detection, as well as to suggest an endogenous gene
(beta globin) as internal control for DNA extraction and amplification. Whole blood,
plasma and serum specimens were submitted to both monoplex and duplex PCR
assays using previously described protocols. Results indicated that whole blood
samples allow a higher sensitivity in the amplification of extracted DNA when
compared to plasma or serum obtained in the same conditions, with the advantage of
eliminating the centrifugation steps. PCR with DNA extracted from serum specimens
presented lower sensitivity when compared to other specimens. Beta globin partial
amplification was detected in both monoplex and duplex PCR assays using whole
blood DNA samples, adequately working as internal control for both DNA extraction
and amplification. However, partial amplification of the beta globin gene in a separate
monoplex assay may be a more efficient internal control approach for both extraction
and PCR amplification. In conclusion, our results suggest that whole blood
specimens are more appropriate for clinical investigation of leptospiremia, when
compared to plasma or serum samples.
Keywords: duplex, Leptospira spp., monoplex, whole blood.
44
INTRODUCTION
Leptospirosis is a worldwide distributed anthropozoonosis which presents
epidemiological importance in both urban and rural areas (ROMERO et al., 2003).
The infection, acquired by contact with urine from animal reservoirs or contaminated
environment, produces a variety of non specific symptoms (McBRIDE et al., 2005;
KO et al., 1999). Clinical presentation ranges from subclinical disease to severe
syndromes of multisystem complications, which have been associated with high
case-fatality rates (DOLHNIKOFF et al., 2007). Two distinct clinical phases of the
Leptospira spp. infection are, in general, preceded by a brief incubation period. First
phase is marked by leptospiremia, which occurs within the first week of the acute
disease; second phase, or immune phase, is characterized by the presence of
circulating antibodies and shedding of leptospires in urine of infected patients
(FAINE, 1993).
Laboratory diagnosis of leptospirosis has been traditionally performed by
detection of circulating antibodies in patient serum (KOSITANONT et al., 2007;
LEVETT, 2001) such as microscopic agglutination test (MAT) and enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA). However, consistent results may be only obtained
during the immune phase of the illness. Thus, these confirmatory immunomethods
have been used in the past several decades and are unreliable for clinical decision-
making (KO et al., 1999; FAINE, 1993).
Early diagnosis of leptospirosis is of extreme importance, since antibiotic
therapy is more effective when initiated in the acute phase of disease. Thus, early
detection requires a rapid and sensitive test, which also should be easy to perform
(FONSECA et al., 2006; OOTEMAN et al., 2006). Molecular methods have been
45
widely used for diagnosis of leptospirosis (MERIEN et al., 2005; KEE et al., 1994;
GRAVEKAMP et al., 1993; MERIEN et al., 1992), showing that rapid detection of
Leptospira sp by PCR may precede antibody detection and overcome the
requirement for isolation and culture (OOTEMAN et al., 2006).
The choice of an adequate clinical sample is a critical step for molecular
detection of a pathogenic microorganism. However, it is still unclear whether serum
(OOTEMAN et al., 2006; GRAVEKAMP et al., 1993), whole blood (FONSECA et al.,
2006; MERIEN et al., 1992) or buffy coat samples (KOSITANONT et al., 2007) are
more adequate for molecular detection of leptospires. Since leptospires are cell
adherent bacteria, but not facultative intracellular (BAROCCHI et al., 2002
), detection
limit of leptospiral DNA may be higher on blood cellular fraction than on non-cellular
fractions (serum or plasma). Accordingly, the aim of this study was to evaluate the
best clinical specimen for leptospiremia detection, as well as to suggest an
amplification approach using an endogenous gene (beta globin) as internal control
for DNA extraction and amplification.
MATERIALS AND METHODS
Samples. Whole blood, plasma and serum specimens were evaluated in order to
determine the most adequate biological material for the detection of circulating
leptospires. Whole blood (collected in EDTA) and serum samples from a healthy
individual were sauced with L. interrogans serovar Copenhageni strain M20. Bacterial
cell counting was performed in Petroff-Hausser cytometer, followed by contamination
of one milliliter of both whole blood and serum samples with 5x10
7
leptospires. The
46
contaminated samples were serially diluted by tenfold dilution until 5x10
1
cells/ml.
The original samples were used as diluents. After the removal of 200 µl for DNA
extraction, each whole blood dilution sample was centrifuged to obtain the equivalent
plasma sample, which was also submitted to DNA extraction.
DNA extraction. Commercial kit GENERATION Capture Column Kit (GENTRA
SYSTEMS, Minneapolis, MN, USA) was used for DNA extraction from 200 µl of
whole blood, plasma and serum samples, according to the manufacturer’s
instructions.
Monoplex PCR. All samples were amplified using two different sets of primers.
Primers used for partial secY gene amplification had the following nucleotide
sequence: G1 - 5’ CTG AAT CGC TGT ATA AAA GT 3’ and G2 - 5’ GGA AAA CAA
ATG GTC GGA AG 3’ (GRAVEKAMP et al., 1993). Reaction mixture consisted of 5
µl of extracted DNA, 50 mM of KCl, 10 mM of tris-HCl (pH 8.2), 2mM of MgCl
2,
1 µM
of each primer (G1 and G2), 200 µM of each dNTP (dATP, dTTP, dCTP e dGTP),
and 1.25 U of Taq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) to a final
volume of 50 µl. The first cycle consisted of denaturation at 94°C for 5 minutes,
annealing at 55°C for 1 minute and extension at 72°C for 2 minutes. The following 34
cycles consisted of denaturation at 94°C for 1.5 minutes, annealing at 55°C for 1
minute and extension at 72°C for 2 minutes, with a final step of 10 minutes at 72°C.
Primers used for partial rrs 16S gene amplification had the following nucleotide
sequence: A - 5’ GGC GGC GCG TCT TAA ACA TG 3’ and B - 5’ TTC CCC CCA
TTG AGC AAG ATT 3’ (MERIEN et al., 1992). Reaction mixture was similar to
described above for G1/G2 primer set. The first cycle consisted of denaturation at
94°C for 3 minutes, annealing at 61°C for 1.5 minute and extension at 72°C for 2
minutes. The following 29 cycles consisted of denaturation at 94°C for 1 minutes,
47
annealing at 61°C for 1.5 minute and extension at 72°C for 2 minutes, with a final
step of 10 minutes at 72°C. Positive and negative controls were used in each PCR
reaction.
Duplex PCR. To evaluate the best beta globin amplification strategy, DNA obtained
from whole blood samples was amplified with primer sets A/B or G1/G2 in a duplex
assay, using the same reaction conditions and cycling parameters used for monoplex
assays, added 0.5 µM of βglobP1 (5’ TAG TCC CAC TGT GGA CTA CTT 3’) and
βglobP2 (5’ CCT GAG AGC TTG CTA GTG ATT 3’) primers. Positive and negative
controls were used in each PCR reaction.
DNA detection. PCR products were applied to 1.5% agarose gel stained with
ethidium bromide and separated by horizontal electrophoresis. Following, the gel was
exposed to ultraviolet light to reveal predicted size fragments of 285 bp for G1/G2
set; 331 bp for A/B set and 620 bp for βglobP1/ βglobP2 set. Positive samples were
defined on basis of visual detection of specific bands on the agarose gel.
RESULTS
The results obtained for whole blood, serum and plasma samples for
monoplex PCR are shown in Figure 1 (A/B set) and Figure 2 (G1/G2 set). A
comparison of results obtained for whole blood samples under monoplex and duplex
amplification conditions for each primer set is shown in Figures 3 and 4.
DISCUSSION
The evaluation of our results indicated that whole blood samples allow a
higher sensitivity in the amplification of the respective extracted DNA when compared
48
to plasma or serum obtained in the same infecting conditions. A similar study has
found that also buffy coat (peripheral white blood samples) showed higher positivity
in the molecular detection of leptospires when compared to plasma and serum
samples (KOSITANONT et al., 2007). According to these authors, the reason for the
higher rate of leptospiral DNA detection in buffy coat samples may be the
internalization of leptospires by circulating leucocytes. We believe that this may also
occur with whole blood specimens, with the advantage of eliminating the
centrifugation steps. Furthermore, as previously mentioned, since leptospires are cell
adherent but not intracellular (BAROCCHI et al., 2002), detection limit of leptospiral
DNA should be higher on blood cellular fraction than on non-cellular fractions (serum
and plasma). PCR used in the present study with DNA extracted from serum
specimens presented lower sensitivity when compared to a similar protocol using
primer set G1/G2.
Beta globin partial amplification was detected in both monoplex and duplex
PCR assays using whole blood DNA samples, adequately working as internal control
for both extraction and amplification. Even though it was possible to detect beta
globin amplification in duplex PCR, the sensitivity of A/B and G1/G2 primer sets was
lower when compared to monoplex assays. Once duplex assays are based on
competitive amplification, presence of fewer molecular targets of leptospiral DNA
may have favored the amplification of more abundant beta globin gene. We were
unable to detect beta globin partial amplification from DNA isolated from plasma or
serum samples (data not shown), possibly due to absence of cellular contents. To
our knowledge, there is no previous report on the use of endogenous beta globin
49
gene as an internal control for the molecular detection of leptospires isolated from
blood specimens.
The detection limit of leptospiral DNA from whole blood samples on both
assays showed lower sensitivity when compared to those obtained from pure
cultured bacteria (MERIEN et al., 1992; GRAVEKAMP et al., 1993). Although with
limited clinical significance, these results may suggest interference of inhibitory
compounds in blood such as hemoglobin derivatives, over the amplification reaction,
as has been previously suggested (KOSITANONT et al., 2007; BOOM et al., 1990).
In summary, our results suggest that whole blood specimens are more
appropriate for clinical investigation of leptospiremia when compared to plasma or
serum samples. Besides, partial amplification of the beta globin gene in a separate
monoplex assay may be an efficient internal control approach for both extraction and
PCR amplification.
AKNOWLEDGMENTS
This study was partially supported by grants from SETI (Secretaria de Estado de
Ciência, Tecnologia e Ensino Superior), Paraná State, Brazil.
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Paulo 45, 245-248.
52
Figure 1. Sensitivity evaluation of primer set A/B on monoplex assay using whole blood (A), serum (B)
and plasma (C) samples. M: Molecular size marker. Lanes 1 to 7: samples spiked with L. interrogans
serovar Copenhageni strain M20 (from 5x10
7
cells/ml to 5x10
1
cells/ml). NC: negative control. PC:
positive control.
53
Figure 2. Sensitivity evaluation of primer set G1/G2 on monoplex scheme using whole blood (A),
serum (B) and plasma (C) samples. M: Molecular size marker. Lanes 1 to 7: samples spiked with L.
interrogans serovar Copenhageni strain M20 (from 5x10
7
cells/ml to 5x10
1
cells/ml). NC: negative
control. PC: positive control.
54
Figure 3. Sensitivity comparison for primer set A/B on monoplex (A) and duplex (B) assays, for DNA
isolated from whole blood samples. M: Molecular size marker. Lanes 1 to 7: samples spiked with L.
interrogans serovar Copenhageni strain M20 (from 5x10
7
cells/ml to 5x10
1
cells/ml). NC: negative
control. PC: positive control.
Figure 4. Sensitivity comparison for primer set G1/G2 on monoplex (A) and duplex (B) assays, for
DNA isolated from whole blood samples. M: Molecular size marker. Lanes 1 to 7: samples spiked with
L. interrogans serovar Copenhageni strain M20 (from 5x10
7
cells/ml to 5x10
1
cells/ml). NC: negative
control. PC: positive control.
55
4.2 USE OF A secY GENE FRAGMENT FOR MOLECULAR IDENTIFICATION OF
Leptospira spp.
Irina Nastassja Riediger
a,*
, Sueli Massumi Nakatani
a
, Alexander Welker Biondo
b
a
Laboratório Central do Estado do Paraná, LACEN-PR, Curitiba, Brazil.
b
Dual affiliation, Departamento de Medicina Veterinária, Setor de Ciências Agrárias,
Universidade Federal do Paraná – UFPR, Curitiba, Brazil, and Department of
Veterinary Pathobiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana IL, USA.
Running title: secY in Leptospira identification
Corresponding author: Irina Nastassja Riediger. LACEN-PR, Divisão de
Epidemiologia e Controle de Doenças, Seção de Biologia Molecular. Rua Sebastiana
Santana Fraga, n° 1001, Guatupê, São José dos Pinhais, Paraná 83060-500. Tel:
+55 (41) 3299-3266; +55 (41) 3299-3212.
Email: [email protected]
56
ABSTRACT
Leptospirosis is a worldwide zoonosis of nonspecific clinical symptoms,
which definitive diagnosis relies on laboratorial tests. Although the microscopic
agglutination test (MAT) is considered the reference diagnostic test, molecular
diagnostic tools have been developed and utilized due to their higher sensitivity and
specificity. In the present study, sequencing of secY gene fragment was evaluated for
Leptospira identification. Different pathogenic leptospires (standard strains) were
amplified and sequenced in order to verify their genetic variability and potential use in
molecular identification. Results showed minimal variation of analyzed fragment,
which did not permit identification of tested strains. In conclusion, although PCR of
secY gene fragment has been used for diagnosis of pathogenic leptospires,
sequencing of respective amplicons does not allow species identification.
Key-words: Leptospira spp., genotypes, secY gene, identification.
57
INTRODUCTION
Leptospirosis is an anthropozoonosis with worldwide relevance, being
particularly important in developing countries (11). Disease exhibits a seasonal
pattern with highest incidence in the rainy season, and is directly related to the social
and economical conditions of the affected population (11, 13).
Leptospirosis presents highly variable and nonspecific symptoms, which may
difficult clinical diagnosis. Thus, laboratorial diagnosis is essential for definitive
diagnosis and infection confirmation. Tests routinely employed include serological
and microbiological techniques. Among serological tests, the microscopic
agglutination test (MAT) is considered the gold standard method for laboratorial
diagnosis of leptospirosis (3, 5, 9), and is the only serological test that allows
infecting serogroup identification (11). However, MAT is an indirect test, thus not
capable of differentiating actively infected patients from convalescents. Results may
be difficult to interpret in previously vaccinated, exposed or chronically infected
patients, particularly in patients from endemic areas (2, 12). MAT results may not be
reliable on acute phase of disease, since agglutination depends on the presence of
detectable antibodies. Furthermore, MAT requires the analysis of paired samples,
which may not always be available. MAT is also a very laborious method, involving
the maintenance of a bacterial culture set, permanent quality control and expertise in
result interpretation (11).
Molecular biology tools have been proposed due to difficulties and technical
limitations of traditional techniques applied to leptospirosis diagnosis (2, 7, 12).
Molecular methods, particularly polymerase chain reaction (PCR), are reportedly
specific and sensitive for Leptospira diagnosis (11, 13). Molecular techniques have
58
been especially useful for the diagnosis of clinical pathogens, which genetic material
may be isolated from the most diverse samples (7, 12). Although PCR is considered
quite sensitive and specific for leptospirosis diagnosis in blood (11), serum (14), urine
(12) and liquor (13) samples, most molecular systems do not allow infecting
genomospecies identification (11, 13).
SecY fragments generated by primer set G1/G2 constitute a reliable molecular
diagnostic tool for Leptospira (7), but to the authors knowledge there is no study on
either its sequence analysis or its potential use for genotypic classification of
Leptospira from clinical samples. Accordingly, in the present study we evaluated
sequences of a secY gene fragment from pathogenic Leptospira strains generated by
a PCR system designed for diagnostic purposes, in order to verify its potential use for
molecular identification of Leptospira genomospecies.
MATERIALS AND METHODS
Samples. Twenty two reference strains, recommended by the World Health
Organization and used in MAT, were analyzed in this study as described in Table 1.
DNA extraction. For DNA extraction, the turbidity of a 5 ml aliquot of each reference
strain maintained in liquid Fletcher medium was adjusted with PBS 1X to equal the
turbidity of first tube in McFarland scale, which means approximately 3x10
7
leptospires/ml. Bacteria were then incubated in a dry bath at 94°C for 10 minutes.
Resultant DNA was stocked at -20°C until PCR was performed.
PCR. Primers used for partial secY gene amplification had the following nucleotide
sequence: G1 - 5’ CTG AAT CGC TGT ATA AAA GT 3’; G2 - 5’ GGA AAA CAA ATG
GTC GGA AG 3’ (7). Extracted DNA from all cultures was amplified by PCR,
59
essentially as previously described. Reaction mixtures consisted of 5 µl of extracted
DNA, 50 mM of KCl, 10 mM of Tris-HCl (pH 8.2), 2 mM of MgCl
2,
1 µM of each primer
(G1 and G2), 200 µM of each dNTP (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) and 1.25 U of Taq
DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) to a final volume of 50 µl. The first
PCR cycle consisted of denaturation at 94°C for 5 minutes, annealing at 55°C for 1
minute and extension at 72°C for 2 minutes. The following 34 cycles consisted of
denaturation at 94°C for 1.5 minutes, annealing at 55°C for 1 minute and extension at
72°C for 2 minutes, with a final step of 10 minutes at 72°C.
DNA detection and purification. PCR products were separated by horizontal
electrophoresis on 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide (0.5 µg/ml) to
reveal fragments of 285 bp predicted size. Fragments were purified using the kit
PureLink™ PCR Purification (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), as recommended by
the manufacturer. Purified PCR products were quantified using horizontal
electrophoresis with 470 ng of Low Mass DNA Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA) as quantification standard. Samples were then diluted to1.3 ng/µl in ultrapure
water and stocked at 4°C until utilized for sequencing.
Sequencing reaction: purified PCR products were submitted to sequencing in both
sense and anti-sense directions using Big Dye Terminator cycle sequencing kit v. 2
(Applied Biosystems, Foster, CA, USA), following manufacturer’s instructions.
Sequencing reaction products were purified, dehydrated and ressuspended in 10 µl
of formamide Hi-Di (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). Samples were denatured
at 96°C for 3 minutes and immediately submitted to detection using ABI 3130
sequencer analyzer (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). Sequencing data were
analyzed using SeqScape (Applied Biosystems, Foster, CA, USA).
60
RESULTS
It was possible to detect PCR products of the predicted size for all the 22
strains tested. However, those strains classified as L. kirschneri rendered reduced
PCR products yields (Figure 1). DNA from strains Mus 24 and Celledoni rendered
low quality DNA sequences and thus were not included in the analysis. Sequences of
secY gene fragment for the remaining 18 Leptospira reference strains were analyzed,
compared and submitted to GenBank (deposit number from DQ882850 to
DQ882868). Region of highest nucleotide polymorphism is presented in Figure 2.
DISCUSSION
In the present study, a secY gene fragment, routinely used for molecular
diagnosis of Leptospira spp., was not able to molecularly identify the infecting strain.
Comparative leptospiral sequences showed minimal nucleotide polymorphism in the
evaluated secY region, not being sufficient for individual identification of each species
and respective strains tested, even in the highest polymorphic region (see Figure 1).
Although secY region studied reveals to be insufficient for genotype identification
when solely used, it may be used for exclusion of infecting genotype, or in
association to MAT and epidemiological data.
Other genomic regions of Leptospira have been tested for potential molecular
identification, including rRNA 16S and 23S genes, O antigen synthase and insertion
sequences (16). Besides, different approaches have been proposed to individualize
each genotype, such as RFLP, RAPD, PFGE, DNA sequencing and ribotyping (10).
61
These methods, when applied to the mentioned regions and fragments,
allowed molecular classification of some strains. However, as in the present study,
they were unable to genotype clinically relevant strains, particularly those related to
serovars Icterohaemorrhagiae, Copenhageni and Canicola. In addition, the genotypic
classification obtained by some of these studies conflicted with the phenotypic
classification produced by MAT (1, 13). A recently described method based on
multiple loci sequence typing (MLST) was able to differentiate the main clinically
relevant strains, including the three mentioned above (1). Unfortunately, MLST still
presents important technical limitations, which strongly restrain its application to
diagnostic routine.
Even though clinical relevance of genotyping the infecting Leptospira strains is
still controversial in either human or canine patients (4, 5, 6), it has clearly an
important impact on epidemiological surveillance (11, 13, 16).
Although the original article on G1 and G2 primers has referred an inability to
amplify the pathogenic Leptospira kirschneri strains (7), in the present study we were
capable to successfully amplify DNA from this species (data not shown). This
observation has been reported before (15).
In conclusion, although G1/G2-primed PCR of secY gene has been routinely
used for pathogenic Leptospira diagnosis, sequencing of respective fragments does
not permit the identification genomospecies.
AKNOWLEDGMENTS
The present study was partially funded by SETI - Secretaria de Estado da
Ciência, Tecnologia e Ensino Superior do Paraná, Brazil.
62
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63
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64
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Kalambaheti. 2007. Molecular typing of Leptospira spp. based on putative O-
antigen polymerase gene (wzy), the benefit over 16S rRNA gene sequence.
271:170-179.
65
Table 1. Leptospira spp. reference strains used in the study.
Genomic species Serovar Strain
Leptospira interrogans
Australis Ballico
Autumnalis Akiyami A
Bataviae Van Tienem
Bratislava Jez-Bratislava
Canicola Hond Utrecht IV
Copenhageni M20
Djasiman Djasiman
Hardjo Hardjioprajitno
Hebdomadis Hebdomadis
Icterohaemorrhagiae RGA
Pomona Pomona
Pyrogenes Sallinem
Saxkoebing Mus 24
Wolffi 3705
Leptospira borgpetersenii
Javanica Veldrat Batavia 46
Sejroe M84
Tarassovi Perepelitsin
Leptospira kirschneri
Cynopteri 3522 C
Grippotyphosa Moskva V
Leptospira nogushii
Panama CZ 214 K
Leptospira santarosai
Shermani LT 821
Leptospira weilii
Celledoni Celledoni
66
Figure 1. Amplification of Leptospira spp. standard strains by primer set G1/G2. M: Molecular size
marker. Wells 1 to 22: strains belonging to serovars Australis (1), Autumnalis (2), Bataviae (3),
Bratislava (4), Canicola (5), Copenhageni (6), Djasiman (7), Hardjo (8), Hebdomadis (9),
Icterohaemorrhagiae (10), Pomona (11), Pyrogenes (12), Saxkoebing (13), Wolfii (14), Celledoni (15),
Panamá (16), Cynopteri (17), Grippotyphosa (18), Javanica (19), Sejroe (20), Tarassovi (21) and
Shermani (22).
67
Figure 2. Region of highest genetic polymorphism of secY gene fragment (1-100 bp) for
each tested strain of Leptospira spp. Complete nucleotide sequences are available in GenBank
(DQ882850 to DQ882868).
68
4.3 USE OF URINE AND BLOOD SAMPLES FOR PCR DIAGNOSIS OF HUMAN
LEPTOSPIROSIS
Irina Nastassja Riediger
a,*
, Suzana Dal Ri Moreira
b
, Irene Skraba
a
, Juliano Leônidas
Hoffmann
c
, Leila Ullmann
c
, Sueli Massumi Nakatani
a
, Helio Langoni
c
, Alexander
Welker Biondo
d
a
Laboratório Central do Estado do Paraná, LACEN-PR, Curitiba, Brazil.
b
Serviço de Epidemiologia, Hospital das Clínicas da Universidade Federal do
Paraná, Curitiba, Brazil.
c
Departamento de Higiene e Saúde Pública Veterinária, Universidade Estadual
Paulista – UNESP, Campus of Botucatu, São Paulo, Brazil.
d
Dual affiliation, Departamento de Medicina Veterinária, Setor de Ciências Agrárias,
Universidade Federal do Paraná – UFPR, Curitiba, Brazil, and Department of
Veterinary Pathobiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana IL, USA.
Running title: PCR diagnosis of human leptospirosis
*Corresponding author: Irina Nastassja Riediger. LACEN-PR, Divisão de
Epidemiologia e Controle de Doenças, Seção de Biologia Molecular. Rua Sebastiana
Santana Fraga, n° 1001, Guatupê, São José dos Pinhais, Paraná, Brazil, 83060-500.
Tel: +55 (41) 3299-3266; +55 (41) 3299-3212.
email: [email protected]
69
ABSTRACT
Laboratory diagnosis of leptospirosis has conventionally been performed either by
culture or detection of antibodies in serum samples. However, reliable results in
microscopic agglutination test (MAT) require analysis of paired serum samples, which
may not always be available. In the present study we compared two distinct PCR
assays using previously described primer pairs (G1/G2 and A/B) in urine and blood
samples for clinical diagnosis of leptospirosis. A total of 66 clinical samples tested by
IgM ELISA, MAT and blood and urine PCR, along with 15 paired samples, were
evaluated. PCR detection of leptospiral DNA occurred prior to MAT, by evaluation of
paired samples. G1/G2-primed amplifications showed significantly greater sensitivity
and specificity than A/B in clinical samples. Overall PCR sensitivity and specificity
was 53.57% and 63.16%, respectively. In conclusion, although we found PCR to be
less sensitive when compared to serological tests throughout the course of the
disease, our results show that PCR performed on blood or urine samples may be a
complementary tool in the first phase of the illness, specially when no specific
antibodies can be detected by serological techniques, allowing early confirmation of
the infection and differential diagnosis from other infectious febrile diseases.
Keywords: blood, diagnosis, urine, leptospirosis, microscopic agglutination test, PCR.
70
INTRODUCTION
Leptospirosis is a zoonotic infection that currently affects urban populations in
the five continents, with higher incidence in tropical climates (SAMBASIVA et al.,
2003; PLANK et al., 2000). Leptospirosis is a common cause of febrile illness with
protean manifestations in developing countries, where uncontrolled growth of slum
population, poverty and poor sanitation favor rodent-borne transmission (McBRIDE et
al., 2005; KO et al., 1999).
Clinical presentation ranges from subclinical infection to severe syndromes
with multiple site complications, which have been associated with high case-fatality
rates (DOLHNIKOFF et al., 2007). A brief incubation period often precedes the two
distinct clinical phases of Leptospira spp. infection. The first week of disease is
marked by leptospiremia, which is responsible for the acute phase of illness. The
second phase, or immune phase, is characterized by presence of circulating
antibodies and shedding of leptospires in urine (LEVETT, 2001).
Laboratory diagnosis has conventionally been performed either by culture or
demonstration of antibodies against leptospires in serum samples (KOSITANONT et
al., 2007) with employment of techniques such as microscopic agglutination test
(MAT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). MAT is considered the
serological reference method and allows serological classification of infecting
serovar. However, reliable results require analysis of paired serum samples, which
may not always be available. Besides, cross reaction between related serovars often
turns result interpretation into a difficult task (OOTEMAN et al., 2006; LEVETT,
2001).
71
Early case definition requires a diagnostic test that is rapid, sensitive and easy
to carry out. Rapid diagnosis is crucial to increase the chance of successful antibiotic
treatment and to reduce tissue damage in human infections. Molecular methods have
been widely used for diagnosis of leptospirosis (MERIEN et al., 2005; KEE et al.,
1994; GRAVEKAMP et al., 1993; MERIEN et al., 1992), suggesting that rapid
detection of Leptospira by PCR may precede antibody detection and overcome the
requirement for isolation and culture (OOTEMAN et al., 2006).
The aim of the present study was to compare two distinct PCR assays using
urine and blood samples with IgM ELISA and MAT for diagnosis of leptospirosis.
MATERIALS AND METHODS
Samples. Blood, urine and serum samples were collected from 92 patients clinically
suspected of leptospirosis. Patient selection was based on available samples, with at
least one IgM ELISA and one PCR performed on either blood or urine. Samples from
40 patients with acute hepatitis A and from 40 patients with dengue, as determined
by immunological tests, were used as negative controls.
Serological tests. Serum samples from patients were submitted to IgM ELISA using
the kit supplied by Bio-Manguinhos (Bio-Manguinhos, Rio de Janeiro, Brazil), as
recommended by the manufacturer. Absorbance value was used to assign samples
as positive, negative or not determined.
MAT was performed as established by World Health Organization, using a
battery of 29 reference strains (provided by Adolfo Lutz Institute, Sao Paulo), as
described on Table 1. End-point was defined by at least 50% agglutination with one
or more serovars, visualized under dark-field microscopy. Patients were designated
72
as laboratory-confirmed cases upon demonstration of a fourfold rise in titer between
paired serum samples or by agglutination titer equal or greater than 800 in a single
serum sample. Probable cases were defined as presenting titers between 100 and
400. Unconfirmed cases exhibited negative results (OOTEMAN et al., 2006).
DNA isolation. Commercial kit GENERATION Capture Column Kit (GENTRA
SYSTEMS, Minneapolis, MN, USA) was used according to the manufacturer’s
instructions for DNA extraction of patients’ whole blood and controls’ serum samples,
as well as artificially infected whole blood specimens. DNA from clinical and artificially
infected urine samples was isolated as previously described (LUCCHESI et al.,
2004).
Cultured bacteria were washed twice in phosphate-buffered saline (PBS) 1x
pH 7.2, followed by DNA thermal release upon incubation in dry bath at 94°C for 10
minutes. Extracted DNA was stocked at -20°C until PCR was performed.
Polymerase Chain Reaction. All DNA samples were amplified using two primer
pairs (G1: 5’ CTG AAT CGC TGT ATA AAA GT 3’ and G2: 5’ GGA AAA CAA ATG
GTC GGA AG 3’; A: 5’ GGC GGC GCG TCT TAA ACA TG 3’ and B: 5’ TTC CCC
CCA TTG AGC AAG ATT 3’), as previously described by GRAVEKAMP et al. (1993)
and MERIEN et a (1992). PCR was carried out in a final volume of 50 µl containing 5
µl of extracted DNA, 50 mM of KCl, 10 mM of Tris-HCl (pH 8.2), 2mM of MgCl
2,
1 µM
of each primer (G1 and G2; or A and B), 200 µM of each dNTP (dATP, dTTP, dCTP
e dGTP) and 1.25 U of Taq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Amplification program for primers G1 and G2 consisted of an initial cycle of
denaturation at 94°C for 5 minutes, annealing at 55°C for 1 minute and extension at
72°C for 2 minutes. The following 34 cycles consisted of denaturation at 94°C for 1.5
minutes, annealing at 55°C for 1 minute and extension at 72°C for 2 minutes, with a
73
final elongation step of 10 minutes at 72°C. For primers A and B, the reaction
mixtures were incubated at 94°C for 3 minutes for denaturation, 61°C for 1.5 minute
for annealing and at 72°C for 2 minutes for extension, and then subjected to 29
cycles of denaturation at 94°C for 1 minutes, annealing at 61°C for 1.5 minute and
extension at 72°C for 2 minutes, with a final elongation step of 10 minutes at 72°C.
All whole blood DNA samples were subjected to partial amplification of beta globin
gene as control for the presence of inhibitory compounds. Two controls were added
to each PCR set: ultrapure water as negative control for the amplification reaction,
and DNA obtained from L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae strain RGA as
positive control.
Molecular detection of dengue virus and Hepatitis A virus were performed as
previously described (POERSCH et al., 2005; PAULA et al., 2004).
DNA sequencing. PCR products of both Leptospira cultures (table 1) and clinical
specimens were sequenced in both orientations by the dideoxy-chain termination
method using Big Dye Terminator cycle sequencing kit v. 2.0 (Applied Biosystems,
Foster City, USA), according to the manufacturer’s instructions. Products were
detected on ABI 3130 sequence analyzer (Applied Biosystems, Foster City, USA).
Determination of detection limit. Spiked samples were prepared by mixing 900 µl
of whole blood and urine from a healthy individual with 100 µl of a bacterial
suspension (L. interrogans serovar Copenhageni strain M20) at a concentration of
5x10
7
cells/ml, as determined by cell counting on a Petroff-Hausser chamber.
Biological samples from the same healthy individual were used as negative controls
for PCR. Five microliters of DNA were used as template in PCR as described above.
Two experiments were carried out in order to determine the detection limit of PCR
assays. For the first experiment, spiked whole blood and urine samples described
74
above were serially diluted by tenfold dilution in the original samples until reaching
the concentration of 50 cells/ml. The second experiment was performed with tenfold
dilutions of L. interrogans serovar Copenhageni strain M20 in PBS 1X (pH 7.2), in
concentrations ranging from 5x10
7
to 50 cells/ml. All dilution samples from both
experiments were submitted to DNA extraction and PCR amplification as described
above.
Results analysis. Analysis of the results was carried out using Epi Info version 3.4.1
RESULTS
The detection limit was verified in two different experiments. PCR products
obtained from amplification of serial dilutions of bacterial DNA isolated from culture
could be visualized in agarose gel up to a concentration of 5x10
2
cells/ml. In the
second assay, DNA isolated from artificially infected urine samples could be
visualized in agarose gel up to a dilution of 5x10
2
cells/ml. The last dilution point that
could be visualized in gel for similarly infected blood samples was 5x10
3
cells/ml
(data not shown).
Serum, blood and urine samples from 66 patients were tested by MAT, IgM
ELISA and PCR and included for analysis. Among the total, 15 were confirmed-cases
diagnosed by MAT, of which 10 (66.67%) showed positive PCR amplification; 5
(38.46%) out of the 13 probable-cases were PCR positive, as were 14 (36.84%) of
the 38 unconfirmed-cases in MAT (Table 2).
Out of 20 positive blood PCR samples, 14 (70.0%) were obtained within the
first 8 days of disease. In 3 blood samples, detection of leptospiral DNA was obtained
within 2 days after the onset of symptoms. All the 16 positive matched urine samples
75
were collected within day 3 and day 12
after the first symptoms. Both IgM ELISA and
MAT showed greater positivity between days 3 and 12 after the onset of symptoms
(Table 3).
A second serum sample (paired sample) was collected in fifteen of the 66
patients, with an average interval of 10 days. Although all the first serum samples
were negative by MAT, analysis of the results of second samples showed
seroconversion in 7 cases. At the time of first MAT sample collection, blood
specimens obtained for 3 of these 7 cases yielded positive PCR results; while PCR
performed on urine samples was positive for 2 of the 7 samples, rendering overall
positive results for 5 (71.42%) out of 7 cases. No PCR positive results were observed
in blood or urine specimens collected during the convalescent phase of disease for
the 7 seroconverted patients, as well as from samples obtained from the remaining 8
negative cases in MAT.
Sensitivity of IgM ELISA was found to be 85.71% when compared to MAT.
When both primer pairs and both biological sample types (blood and urine) were
considered, PCR sensitivity was 53.57%. No difference in sensitivity was found
between the analysis of whole blood and urine samples using G1/G2 primer pair. A/B
primer set showed lower sensitivity for both clinical specimens, despite of 100%
specificity for blood samples analysis. When each primer set and each clinical
specimen was considered, PCR sensitivity was higher for G1/G2 primer pair than for
A/B set for both blood and urine specimens, as shown in Table 4.
DNA sequencing was performed for G1/G2-primed PCR products from clinical
specimens of 7 patients and 18 reference strains. All DNA sequences presented the
predicted size of 285 bp. Sequence analysis revealed high homology between
76
products obtained from clinical specimens and those generated by some L.
interrogans serovars.
Beta globin partial amplification was detected for all 82 blood samples
evaluated. Thirty one (77.50%) out of the 40 acute hepatitis A control samples
yielded specific amplification by nRT-PCR. Among dengue control samples, viral
RNA was demonstrated in 30 (75.0%) specimens by nRT-PCR. None of 80 control
samples was positive for leptospiral DNA for neither primer pairs.
DISCUSSION
In the present study, molecular (PCR) and serological (MAT and IgM ELISA)
techniques were compared for diagnosis of human leptospirosis.
Differences in PCR detection limit observed between bacteria recovered from
culture medium and clinical specimens may be due to inhibitory compounds present
in clinical samples, such as hemoglobin and its derivatives, as previously proposed
(BOOM et al., 1991; FONSECA et al., 2006a; FONSECA et al., 2006b). Although
both urine and blood samples were obtained from a healthy individual and
contaminated in vitro with leptospira, PCR analytical sensitivity was higher in urine
samples when compared to blood samples. However, other inhibitory compounds
generated as consequence of Leptospira infection, such as products of renal failure
or inflammation process, may lead to a different inhibition pattern of PCR performed
in clinical specimens.
The main challenge in the leptospirosis approach is to define the diagnosis
when results of MAT and other serological tests are negative (FONSECA et al.,
2006a). Prior reports have found concurrent positive PCR and negative MAT results,
77
but majority of cases were not followed and data interpretation was difficult
(FONSECA et al., 2006a; FONSECA et al., 2006b; OOTEMAN et al., 2006; KEE et
al., 1994; BAL et al., 1994). In the present study, PCR performed on urine and blood
samples early detected leptospiral DNA in 71.42% of seronegative patients, all later
confirmed by paired MAT seroconversion. Hence, PCR positive results in blood or
urine specimens obtained from MAT seronegative patients may be due to early
diagnosis rather than being PCR false-positive results. These data reinforce that
PCR might potentially be used as a valuable complementary tool to the early
diagnosis of leptospirosis.
In addition to shedding of leptospires in urine during the first 10 days of
disease, we have found evidence of long-term shedding, as a clinical urine sample
collected 130 days after the acute phase of disease was positive by PCR (data not
shown), suggesting persistent infection. Previous studies report molecular detection
of leptospires shedding in urine one year after the first symptoms (BAL et al., 1994).
As patients from both studies had been submitted to antibiotic therapy, these data
suggest that some antibiotics used for leptospirosis treatment may not achieve
sufficient concentration in kidneys to eradicate leptospires.
The overall sensitivity of PCR using both G1/G2 and A/B primer sets and urine
and blood samples was 53.57%. However, the best sensitivity for PCR assays
(60.71%) was achieved in this work when G1/G2 primer set and both biological
samples (blood and urine) were considered. The first description of G1/G2 primer
pair reported a sensitivity of 50.0% on serum samples (GRAVEKAMP et al., 1993).
Our results corroborate with similar studies using the same primer set in clinical
samples, which have found sensitivity varying from 28.0% in urine samples to 62.0%
in blood and/or urine samples (BAL at al., 1994; BROWN et al., 1995). Studies
78
conducted in Brazil using the same primers have also shown varying sensitivity from
34.0% in serum samples (OOTEMAN et al., 2006), 65.0% in buffy coat and/or urine
samples (FONSECA et al., 2006a), and 57.6% in both blood and urine samples
(FONSECA et al., 2006b).
Primer set G1/G2 was described as part of a molecular system capable of
amplifying DNA from 7 pathogenic Leptospira species, but not L. kirschneri
(GRAVEKAMP et al., 1993). However, we were able to generate PCR products of the
correct size for this species, probably due to the large amount of DNA obtained from
culture of this pathogenic species (Grippotyphosa and Cynopteri) as previously
reported (OOTEMAN et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2003).
In the present study the IgM ELISA sensitivity was found to be 85.71%, with
specificity of 56.76%. A recent study using the same commercial kit reported
sensitivity of 75.5% and specificity 93.3% (McBRIDE et al., 2007). Since IgM ELISA
have shown to detect antibodies even several months after infection, the discrepancy
in specificity may be due to false-positive results, as previously referred (McBRIDE et
al., 2007; ABDULKADER et al., 2002), and observed on two positive ELISA results
within first days after the onset of symptoms.
In conclusion, although we found PCR to be less sensitive when compared to
serological tests throughout the course of the disease, our results show that PCR
performed on blood or urine samples may be a complementary tool in the first phase
of the illness, specially when no specific antibodies can be detected by serological
techniques, allowing early confirmation of the infection and differential diagnosis from
other infectious febrile diseases.
79
AKNOWLEDGMENTS
This study was partially supported by grants from SETI (Secretaria de Estado de
Ciência, Tecnologia e Ensino Superior), Paraná State, Brazil.
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82
Table 1. Leptospires used in the study.
Genomic species Serovar Strain
Leptospira interrogans
Australis Ballico
Autumnalis Akiyami A
Bataviae Van Tienem
Bratislava Jez-Bratislava
Canicola Hond Utrecht IV
Djasiman Djasiman
Hardjo Hardjioprajitno
Hebdomadis Hebdomadis
Copenhageni M20
Icterohaemorrhagiae RGA
Pomona Pomona
Pyrogenes Sallinem
Saxkoebing Mus 24**
Sentot Sentot*
Szwajizak Szwajizak*
Wolffi 3705
Leptospira biflexa
Andamana CH 11*
Patoc Patoc 1*
Leptospira borgpetersenii
Castellonis Castellon 3*
Hardjo (hardjobovis) Sponselee*
Javanica Veldrat Batavia 46
Mini Sari*
Sejroe M84
Tarassovi Perepelitsin
Leptospira kirschneri
Butembo Butembo*
Cynopteri 3522 C
Grippotyphosa Moskva V
Leptospira nogushii
Panama CZ 214 K
Leptospira santarosai
Shermani LT 821
Leptospira weilii
Celledoni Celledoni
*
strains used only for MAT assays
**strain used only for molecular assays
83
Table 2. IgM ELISA and PCR results for leptospirosis diagnosis, stratified according
to MAT results.
MAT (n = 66) IgM ELISA* Blood PCR Urine PCR PCR**
pos neg pos neg pos neg pos neg
Laboratory-confirmed cases (n = 15) 15 0 7 8 6 9 10 5
Laboratory-probable cases (n = 13) 9 4 2 11 4 9 5 8
Unconfirmed cases
(n = 38) 16 21 10 28 6 32 14 24
Total 40 25 19 47 16 50 29 37
* 1 case not-determinate
** PCR results of either blood or urine samples
84
Table 3. MAT, IgM ELISA and PCR positive results for leptospirosis obtained from
analysis of 66 clinical samples, stratified according to days after onset of symptoms.
Days* (n = 66) MAT** IgM ELISA Blood PCR Urine PCR PCR***
1 to 2 0 2 3 0 3
3 to 4 5 7 6 7 9
5 to 8 7 16 5 4 8
9 to 12 14 11 5 5 9
> 12 2 4 1 0 0
*days after onset of symptoms
** Confirmed or probable cases
*** Either blood or urine samples
85
Table 4. Sensitivity and specificity of IgM ELISA and PCR assays when compared to
MAT for diagnosis of leptospirosis in 66 clinical samples.
PCR
G1/G2 primer pair A/B primer pair Either PCR**
n = 66 IgM ELISA Urine Blood Either* Urine Blood Either*
Sensitivity 85.71% 35.71% 35.71% 60.71% 7.14% 3.57% 7.14% 53.57%
Specificity 56.76% 73.68% 73.68% 65.79% 94.74% 100% 94.74% 63.16%
*PCR performed on either blood or urine samples
**PCR using either primer set and clinical samples.
86
5 DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
87
Com o objetivo de adequar os parâmetros de PCR previamente descritos
para os sistemas moleculares selecionados para uso nesse estudo, desenvolvemos
uma etapa de validação e otimização metodológica prévia ao estudo das amostras
clínicas. As técnicas moleculares utilizadas apresentaram boa concordância com
estudos anteriores, em que houve descrição do limite de sensibilidade do sistema de
iniciadores A/B em 1 pg (MERIEN et al., 1992) e do sistema G1/G2 em 10 células
(FONSECA et al., 2006; GRAVEKAMP et al., 1993).
Houve amplificação do DNA de todas as cepas-padrão testadas com a
utilização de ambos os sistemas de PCR. Apesar da descrição inicial do sistema
G1/G2 afirmar que esse conjunto de iniciadores não é capaz de amplificar as cepas
de L. kirschneri (GRAVEKAMP et al., 1993), no presente estudo essas cepas foram
amplificadas, apesar de apresentarem padrão de amplificação menos intenso que as
demais cepas. Como já havia sido previamente relatado, o uso de quantidades
relativamente grandes de DNA – como no caso de DNA isolado a partir de cultivo in
vitro – pode levar à amplificação do DNA de L. kirschneri pelo conjunto de
iniciadores G1/G2 (OOTEMAN et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2003).
Posteriormente à etapa de otimização das metodologias moleculares,
realizamos um estudo comparativo para determinar a melhor amostra clínica para
pesquisa de leptospiras circulantes (leptospiremia), conforme descrito no primeiro
artigo da seção “Resultados”. A avaliação dos dados obtidos indicou que amostras
de sangue total apresentam sensibilidade maior na amplificação do DNA quando
comparadas com DNA de amostras de plasma ou soro obtidas nas mesmas
condições de contaminação in vitro. Um estudo similar descreveu que buffy coat
apresentou maior sensibilidade na detecção de leptospiras quando comparado com
amostras de plasma e soro (KOSITANONT et al., 2007). De acordo com esses
autores, a razão para o maior limite de detecção do DNA das leptospiras em
amostras de buffy coat seria a internalização das bactérias nos leucócitos
circulantes. É possível que isso também justifique o que ocorre com amostras de
sangue periférico, com a vantagem de que esse material dispensa a etapa de
centrifugação necessária para a obtenção do buffy coat a partir do sangue total.
Como as leptospiras são bactérias aderentes, mas não intracelulares obrigatórias
(BAROCCHI et al., 2002), o limite de detecção para o DNA dessas bactérias deveria
ser maior na fração celular sangüínea (sangue total e buffy coat) do que na fração
DISCUSSÃO
88
acelular (soro e plasma). O protocolo de PCR utilizando o conjunto de iniciadores
G1/G2 empregado nesse estudo apresentou sensibilidade menor quando
comparado com um protocolo similar utilizando o mesmo conjunto de iniciadores
(OOTEMAN et al., 2006).
Paralelamente, tentamos definir qual seria o impacto da amplificação
concomitante de um gene endógeno (beta globina) sobre a sensibilidade dos
sistemas moleculares voltados à detecção do DNA de Leptospira spp. A
amplificação parcial do gene da beta globina foi detectada tanto em sistemas
monoplex quanto em sistemas duplex utilizando amostras de DNA obtidas a partir de
sangue total, de modo a agir adequadamente como controle interno para extração e
amplificação do DNA. Apesar de ter sido possível detectar a amplificação da beta
globina nos sistemas duplex, a sensibilidade analítica dos conjuntos de iniciadores
específicos A/B e G1/G2 foi menor quando comparada com aquela dos sistemas
monoplex. Mesmo que a amplificação no sistema duplex tenha base não-
competitiva, a presença de pequena quantidade de alvos moleculares de Leptospira
spp. pode ter favorecido a amplificação do gene da beta globina, presente em
quantidade maior. Não foi possível detectar a amplificação parcial do gene da beta
globina no DNA isolado a partir de amostras de plasma ou soro (dados não
apresentados), possivelmente em virtude da ausência de DNA genômico humano,
presente em material celular. Aparentemente, não há relato prévio do uso do gene
endógeno da beta globina como controle interno para a detecção molecular de
leptospiras obtidas a partir de amostras de sangue total.
O limite de detecção em amostras de sangue total tanto nos ensaios
monoplex quanto duplex foi menor quando comparado com aquele obtido a partir de
culturas bacterianas puras (GRAVEKAMP et al., 1993; MERIEN et al., 1992). Apesar
do limitado significado clínico, esses resultados sugerem que compostos inibitórios
presentes no sangue, como derivados da hemoglobina, possam interferir na reação
de amplificação por PCR, como foi previamente sugerido (FONSECA et al., 2006a;
BOOM et al., 1990).
Os fragmentos do gene secY gerados pelo conjunto de iniciadores G1/G2
constituem uma ferramenta molecular confiável para o diagnóstico das leptospiras
(FONSECA et al., 2006a; FONSECA et al., 2006b; OOTEMAN et al., 2006; BAL et
al., 1994; GRAVEKAMP et al.
, 1993), mas não há estudos publicados quanto à
DISCUSSÃO
89
análise das seqüências do gene secY ou seu uso potencial para a classificação
genotípica das leptospiras presentes em amostras clínicas. No segundo artigo da
seção “Resultados”, comparamos seqüências parciais do gene secY de leptospiras
patogênicas para verificar seu potencial uso na identificação molecular dos
genótipos de Leptospira spp.
O seqüenciamento do fragmento do gene secY gerado pela amplificação com
os iniciadores G1/G2 não foi capaz de genotipar molecularmente a cepa infectante.
A comparação das seqüências de DNA obtidas para as várias cepas de referência
estudadas mostrou mínimo polimorfismo genético na região estudada, o que não foi
suficiente para a classificação molecular da bactéria. Apesar de o polimorfismo
presente na região avaliada do gene secY ser insuficiente para a genotipagem, a
utilização conjunta dessa informação com os dados epidemiológicos pode sugerir o
genótipo infectante.
Outras regiões genômicas das leptospira têm sido testadas para potencial
identificação molecular, incluindo os genes rRNA 16S e 23S, o antígeno-O da
sintase e seqüências de inserção (WANGROONGSARB et al., 2007). Além disso, a
utilização de diferentes abordagens moleculares têm sido propostas para a
genotipagem, com a aplicação de técnicas como RFLP, RAPD, PFGE,
seqüenciamento de DNA, ribotipagem, MLVA e MLST (KOSITANONT et al., 2007).
Essas metodologias permitem a classificação molecular de algumas cepas,
mas até o presente momento essas técnicas não foram capazes de caracterizar
individualmente os principais genótipos de relevância clínica, principalmente aqueles
relacionados aos sorovares Canicola, Copenhageni e Icterohaemorrhagiae.
Paralelamente, a classificação obtida a partir de vários desses métodos moleculares
é muitas vezes conflitante com a classificação fenotípica obtida a partir do MAT
(AHMED et al., 2006; McBRIDE et al., 2005). Recentemente, foi descrita uma
metodologia empregando a tipagem de seqüência de múltiplos loci (MLST), capaz
de diferenciar as principais cepas clinicamente relevantes, incluindo aquelas citadas
acima (AHMED et al., 2005). Infelizmente, essa técnica apresenta uma série de
dificuldades técnicas, o que restringe bastante sua aplicação à rotina diagnóstica.
Apesar de a identificação dos genótipos apresentar relevância clínica
controversa tanto em infecções humanas quanto animais (GOLDSTEIN et al., 2006;
ESEN et al., 2004; FAUCHER et al., 2004), essa informação tem um impacto
DISCUSSÃO
90
claramente importante nas investigações epidemiológicas (McBRIDE et al., 2005;
LEVETT, 2001).
A definição precoce dos casos de leptospirose requer um método diagnóstico
rápido, sensível e de fácil execução. O diagnóstico precoce é crucial para aumentar
as chances de antibioticoterapia bem-sucedida e reduzir os riscos de danos
teciduais em infecções humanas. Os métodos moleculares têm sido amplamente
utilizados para o diagnóstico da leptospirose humana (MERIEN et al., 2005; KEE et
al., 1994; GRAVEKAMP et al., 1993; MERIEN et al., 1992), sugerindo que a
detecção rápida das leptospiras pela PCR pode preceder a detecção de anticorpos
específicos e suplantar a necessidade de isolamento e cultura (OOTEMAN et al.,
2006). No terceiro artigo proposto na seção “Resultados”, realizamos a comparação
de dois ensaios de PCR distintos utilizando amostras clínicas de sangue total e urina
com os testes sorológicos ELISA IgM e MAT para verificar o impacto sobre o
diagnóstico da leptospirose humana.
Diferenças no limite de detecção dos sistemas de PCR entre DNA bacteriano
obtido de meio de cultura e de amostras clínicas podem ser devidas à presença de
compostos inibitórios, como hemoglobina e seus derivados, como já mencionado
(BOOM et al., 1991; FONSECA et al., 2006a; FONSECA et al., 2006b). Apesar de as
amostras de sangue e urina serem obtidas de um indivíduo saudável e
contaminadas in vitro com leptospiras, a sensibilidade analítica da PCR foi maior
para amostras de urina do que para amostras de sangue. Entretanto, outros
compostos inibitórios gerados como conseqüência da infecção por Leptospira, como
produtos da insuficiência renal e do processo inflamatório, podem levar a um padrão
de inibição diferente na PCR realizada a partir de amostras clínicas, contaminadas in
vivo.
O principal desafio no diagnóstico laboratorial da leptospirose é definir o caso
quando os resultados do MAT e das provas sorológicas são negativos (FONSECA et
al., 2006a). Relatos anteriores descrevem a ocorrência simultânea de resultados de
PCR positivos e de MAT negativos, mas não houve seguimento da maioria dos
casos relatados e a interpretação dos dados se tornou difícil (FONSECA et al.,
2006a; FONSECA et al., 2006b; OOTEMAN et al., 2006; KEE et al., 1994; BAL et al.,
1994). No presente estudo, a PCR realizada a partir de amostras de sangue ou urina
detectou precocemente o DNA das leptospiras em 71,4% dos pacientes
DISCUSSÃO
91
soronegativos, com soroconversão posterior confirmada com análise pelo MAT de
amostras pareadas. Assim sendo, resultados de PCR positivos em amostras de
sangue ou urina obtidas de pacientes soronegativos pelo MAT podem ser devidos
ao diagnóstico precoce, ao invés de constituírem resultados moleculares falso-
positivos. Esses achados reforçam que a PCR pode potencialmente ser uma
ferramenta complementar útil para o diagnóstico precoce da leptospirose.
Além de detectar a eliminação de leptospiras na urina durante os primeiros 10
dias após a instalação dos sintomas, foram encontradas evidências de eliminação a
longo prazo. Uma amostra clínica de urina coletada 130 dias após a instalação da
fase aguda da doença apresentou resultados de PCR positivos (dados não
apresentados), sugerindo infecção persistente. Estudos anteriores relatam a
detecção molecular de leptospiras eliminadas na urina até um ano após os primeiros
sintomas clínicos. Como os pacientes desse e daquele estudo foram submetidos à
terapia antimicrobiana, os dados sugerem que alguns antibióticos utilizados no
tratamento da leptospirose podem não alcançar concentração renal suficiente para
eliminar as bactérias (BAL et al., 1994). A fim de verificar o grau de infecção dos
túbulos renais, avaliar sua persistência e eventual impacto sobre o sistema renal do
indivíduo seria necessário monitorar periodicamente a excreção de leptospiras na
urina de pacientes com diagnóstico confirmado de leptospirose, por um período de
aproximadamente 12 meses após a instalação sintomatológica. A partir dos dados
obtidos nesse modelo, seria possível definir com maior exatidão a relevância da
leptospirúria tanto para o diagnóstico laboratorial quanto para a evolução clínica do
paciente.
A sensibilidade total da PCR considerando os conjuntos de iniciadores G1/G2
e A/B e amostras de sangue e urina foi de 53,6%. Entretanto, a melhor sensibilidade
nos ensaios de PCR (60,7%) foi alcançada quando somente os iniciadores G1/G2 e
ambas as amostras biológicas foram consideradas. A primeira descrição dos
iniciadores G1/G2 relatou sensibilidade de 50,0% em amostras de soro
(GRAVEKAMP et al., 1993). Os resultados do presente estudo corroboram com
estudos similares utilizando o mesmo conjunto de iniciadores, em que foram
encontradas sensibilidades variando entre 28,0% em amostras de urina e 62,0% em
amostras de sangue e/ou urina (BROWN et al., 1995; BAL et al., 1994). Estudos
conduzidos no Brasil utilizando o mesmo sistema de PCR também mostram variação
DISCUSSÃO
92
na sensibilidade, com 34,0% em amostras de soro (OOTEMAN et al., 2006), 65,0%
em amostras de buffy coat ou urina (FONSECA et al., 2006a) e 57,6% em amostras
tanto de sangue quanto de urina (FONSECA et al., 2006b).
No presente trabalho, a sensibilidade observada para o teste ELISA IgM foi
85,7%, com especificidade de 56,8%. Um estudo recente usando o mesmo kit
comercial reportou sensibilidade de 75,5% e especificidade de 93,3% (McBRIDE et
al., 2007). Uma vez demonstrado que o ELISA IgM detecta anticorpos específicos
meses após a infecção, a discrepância observada na especificidade do teste pode
ser devida a resultados falso-positivos, como referido previamente (McBRIDE et al.,
2007; ABDULKADER et al., 2002) e provavelmente observado nesse estudo nas
duas amostras com resultados positivos de ELISA IgM nos dois primeiros dias após
a instalação sintomatológica.
Apesar da PCR convencional utilizando os iniciadores G1/G2 permitir o
diagnóstico precoce da leptospirose humana, o limite mínimo de detecção obtido
para amostras de sangue total, a partir do protocolo de PCR utilizado no presente
estudo, requer ao menos 5x10
3
bactérias/ml. Essa carga bacteriana parece só estar
presente nos quadros de leptospirose grave, como casos fatais com envolvimento
pulmonar (SEGURA et al., 2005), o que impossibilita o diagnóstico precoce em
casos brandos. Desse modo, o diagnóstico molecular poderia ser melhorado
utilizando a tecnologia de PCR em tempo real. Com o emprego do sistema de
monitoramento TaqMan
®
,
seria possível alcançar a sensibilidade e a especificidade
obtidas em ensaios de hibridização pós-PCR, conjugadas à amplificação em tempo
real. Com a metodologia de PCR em tempo real, seria possível eliminar as etapas de
processamento pós-PCR, diminuindo o risco de contaminações e conseqüentes
resultados falso-positivos, além de reduzir o tempo necessário para a liberação do
resultado. Por sua natureza quantitativa, a PCR em tempo real também permitiria
mensurar a carga bacteriana nas amostras analisadas, fornecendo um resultado
mais informativo e preciso do que o resultado qualitativo da PCR convencional.
Até o momento foram propostos alguns alvos potenciais para sistemas de
detecção em tempo real, como rRNA 16S (SMYTHE et al., 2002) e rRNA 23S (WOO
et al., 1997). Como esses genes são altamente conservados e estão presentes em
todos os genótipos de Leptospira, independentemente de seu potencial patogênico,
a amplificação desses alvos moleculares pode levar a resultados falso-positivos e a
DISCUSSÃO
93
quantificações não-confiáveis devido à detecção de genótipos saprofíticos
eventualmente presentes nas amostras. Mais recentemente, foram descritos
sistemas de detecção utilizando como alvos moleculares genes codificantes para
fatores de virulência ou proteínas de membrana envolvidas na patogênese, como
lipL32 (LEVETT et al., 2005) e os genes ligA e ligB (PALANIAPPAN et al., 2005).
Outros alvos potenciais para os ensaios de PCR em tempo real seriam lipL41,
lipL45, ompL1 e loa22, genes codificantes de proteínas de membrana externa com
potencial imunogênico importante cuja expressão está aumentada durante o
processo de infecção do hospedeiro (NALLY et al., 2007; RISTOW et al., 2007).
Outro avanço seria a utilização de técnicas de extração de DNA baseadas no
método de Boom (BOOM et al., 1990), com a utilização de sílica magnetizada. Como
padrão-ouro para extração de DNA, essa tecnologia confere alta eficiência à
extração de DNA com esgotamento das amostras (TANG et al., 2005). Além disso, o
DNA extraído apresenta rendimento e pureza superiores aos obtidos com as
técnicas convencionais (SCHUURMAN et al., 2007; TANG et al., 2005). A
possibilidade de automação reduziria os riscos de contaminação cruzada entre as
amostras, além de permitir o processamento de um número maior de amostras
simultaneamente (LOENS et al., 2007; STEVENS et al., 2007). Além disso, a
automação promoveria a uniformização das etapas no processo de extração do
DNA, minimizando variações de rendimento ou pureza decorrentes do processo
manual. Paralelamente, as técnicas de extração baseadas no método de Boom são
mais versáteis do que as técnicas baseadas em colunas de eluição, permitindo a
extração concomitante de DNA a partir de uma gama mais ampla de amostras
clínicas. Isso permitiria padronizar um único método de extração de DNA para
amostras de sangue total, soro, plasma, urina e biópsias, facilitando a avaliação
comparativa dos resultados obtidos.
O LACEN-PR dispõe, em seu parque tecnológico, dos aparatos necessários
tanto para o desenvolvimento de testes na plataforma PCR em tempo real quanto
para a automação da extração do DNA pelo método de Boom. A utilização conjunta
dessas duas tecnologias elevaria o diagnóstico molecular da leptospirose humana a
nível quantitativo, com aumento da sensibilidade e da especificidade do teste.
A implantação de um teste para o diagnóstico molecular da leptospirose
humana representa um grande avanço em relação às ferramentas laboratoriais
DISCUSSÃO
94
disponíveis, uma vez que permite o diagnóstico dessa doença a partir do primeiro
dia após a infecção, quando comparado com os 7 dias necessários para o
diagnóstico sorológico. Com isso, pode-se aumentar a captação de casos pelo
sistema de vigilância VE-SIFA, instalar antibioticoterapia adequada mais
precocemente e facilitar o diagnóstico em casos de manifestações atípicas, como
quadros pulmonares graves e meningites.
95
6 CONCLUSÕES
CONCLUSÕES
96
As amostras de sangue total colhido em EDTA apresentaram melhor
desempenho do que as amostras de plasma e soro na pesquisa molecular da
leptospiremia humana, em virtude do maior limite de detecção.
A análise de amostras clínicas pareadas de pacientes com leptospirose
mostrou que os métodos moleculares permitem a detecção do DNA bacteriano em
amostras de sangue total ou urina anteriormente à soroconversão. Esse fato
demonstra que os métodos moleculares avaliados permitem o diagnóstico precoce
da infecção.
O conjunto de iniciadores G1/G2 apresentou maiores sensibilidade e
especificidade na análise de amostras de sangue total e urina quando comparado
com o conjunto de iniciadores A/B.
97
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110
8 ANEXOS
ANEXO 1
111
ANEXO 1. DADOS BRUTOS EPIDEMIOLÓGICOS
Identificação do paciente Registro Idade Sexo Profissão Bairro Município
R. A. B. U-01 15 M Estagiário Jd. Filadelfia Araucária
M. P. C. U-02 19 F Estudante Bockman Paranaguá
C. J. M. S. S e U-03 32 M Pintor Jd. Itambé Colombo
J. J. A. S e U-04 45 M Morador de rua Sítio Cercado Curitiba
L. R. D. S. S e U-05 15 M Estudante CIC Curitiba
J. V. S. U-06 47 M Desempregado Centro Itaperucu
R. A. B. C. S e U-07 33 F do lar Vila Nova Matinhos
C. L. S. U-08 65 F Zeladora CIC Curitiba
M. S. S-09 19 M Repositor de atacado Pilarzinho Curitiba
E. G. (NÃO CONSIDERADO) S e U-11 33 F do lar Lagoinha Mandirituba
H. R. S e U-12 27 M Operador de empilhadeira Rio Pequeno São José dos Pinhais
L. F. S e U-13 59 F Aposentada Ribeirão Vermelho Quitandinha
J. M. S. S e U-14 66 M Lavrador CIC Curitiba
B. M. S. S-15 16 M Estudante Bom Jesus Rio Negro
B. M. S. S-16 16 M Estudante Bom Jesus Rio Negro
D .G. D. S-17 27 M Auxiliar de produção Umbará Curitiba
L .C M. A. S e U-18 12 M Estudante Vila Verde/CIC Curitiba
J. L. G. S e U-19 12 M Estudante Tibotuva Campo Largo
A. M. B. S e U-20 47 F Doméstica Jd. Santa Cândida Colombo
J. A. S e U-21 20 M Servente Jd. Graziele Almirante Tamandaré
S. S. I. S e U-22 43 M Instrutor de trânsito Vila Juliana Piraquara
A. F. B. (NÃO CONSIDERADO) S e U-23 40 M Pedreiro Xaxim Curitiba
E. S. F. U-24 7 M Estudante Jd. Guaratuba Colombo
A .A. N. F. (NÃO CONSIDERADO) U-25 13 M Estudante Jd. Planalto Almirante Tamandaré
A. M. S-26 53 M Funcionário da SANEPAR Sitio Cercado Curitiba
A. M. S e U-27 53 M Funcionário da SANEPAR Sitio Cercado Curitiba
ANEXO 1
112
Identificação do paciente Registro Idade Sexo Profissão Bairro Município
F. M. B. O. S e U-28 23 F Aux. escritório Iguaçu Fazenda Rio Grande
N .G. R. J. So e L-29 13 M Não informado Não informado Paranaguá
A. S. S e U-30 56 M Autônomo Pinheirinho Curitiba
F. M. B. O. (NÃO CONSIDERADO) S e U-31 23 F Aux. escritório Iguaçu Fazenda Rio Grande
A. A. S e U-32 17 M Técnico em informática Santa Cândida Curitiba
T. K. S e U-33 61 M Aposentado Cajuru Curitiba
M. R. C. S e U-34 20 M Pintor Não informado Almirante Tamandaré
F. A. L. N. S e U-35 9 M Estudante CIC Curitiba
E. E. S. B. M (post mortem) So e L-36 5 M Menor Não informado Londrina
L. R. C. S e U-37 27 M Pintor Centro Rebouças
B. S. P. S e U-38 13 M Estudante Centro Araucária
J. C. D. A. S e U-39 11 M Estudante Morro Grande Colombo
P. H. S. B. S e U-40 13 M Estudante CIC Curitiba
A. J. C. P. S e U-41 42 M Auxiliar de enfermagem Capão da Imbuia Curitiba
A. J. C. P. S e U-42 42 M Auxiliar de enfermagem Capão da Imbuia Curitiba
L. S. M. S e U-43 13 M Estudante Rio Verde Colombo
Z. A. S. U-44 25 F Não informado Não informado Não informado
R. M. S. S e U-45 29 M Marceneiro Capão Raso Curitiba
E. C. R. S e U-46 29 M Pedreiro Planta Santa Colombo
L. O. A. S e U-47 69 F do lar Não informado Não informado
E. C. R. S-48 29 M Pedreiro Jd Bom Pastor Campo Magro
T. A. L. S e U-49 17 M Estudante Bacacheri Curitiba
B. M. M. S e U-50 15 M Estudante Vila Alto Pinheiro Almirante Tamandaré
F. F. P. S e U-51 14 M Estudante Uberaba Curitiba
N. F. A. S e U-52 60 F Catadora de Papel Portão Curitiba
P. C. F. S e U-53 81 F do lar Ilegível Rio Branco do Sul
P. C. F. (2ª amostra) S e U-54 81 F do lar Ilegível Rio Branco do Sul
ANEXO 1
113
Identificação do paciente Registro Idade Sexo Profissão Bairro Município
S. L. F. S e U-55 25 M Catador de papel Jd. Guairatuba Colombo
F. O. U-56 25 M Estudante São Gabriel Colombo
G. B. S. S e U-57 30 M Motorista Prado Colombo
R. C. S e U-58 36 M Caseiro de chácara Bairro Alto Antonina
S. S. G. S e U-59 27 M Desempregado Conjunto Residencial Pinhais
F. O. (2ª amostra) S e U-60 25 M Estudante São Gabriel Colombo
M. J. S. S e U-61 12 M Estudante Afonsa Pena São José dos Pinhais
C. R. R. S e U-62 17 M Latoeiro Parque São Jorge Almirante Tamandaré
J. N. S e U-63 19 F Estudante Bairro Alto Curitiba
C. R. R. (2ª amostra) S e U-64 17 M Latoeiro Parque São Jorge Almirante Tamandaré
C. A. O. S e U-65 45 F Comerciante Xaxim Curitiba
M. J. S. (2ª amostra) S e U-67 12 M Estudante Afonsa Pena São José dos Pinhais
R. L. S. S-68 32 M Não informado Sítio Cercado Curitiba
T. P. A. S-69 68 F Não informado Não informado Não informado
C. A. O. (2ª amostra) S e U-70 45 F Comerciante Xaxim Curitiba
P. C. B. M. S e U-71 18 M Auxiliar de serviços gerais Jd. Bonilaura Pinhais
A. R. B. S e U-72 32 F do lar Afonso Peba São José dos Pinhais
S. A. I. S e U-73 22 M Estudante Santa Felicidade Curitiba
G. W. C. R. S e U-74 16 M Estudante Santa Felicidade Curitiba
C. A. M. M. (NÃO CONSIDERADO) S e U-75 7 F Estudante Bairro Alto Curitiba
D. M. R. (NÃO CONSIDERADO) S e U-76 12 M Estudante Cajuru Curitiba
B. R. M. S e U-77 14 M Estudante Não informado Não informado
R. D. S. S e U-78 19 M Desempregado Alto da XV Curitiba
V. Q. S e U-79 Não informado M Serralheiro Não informado Não informado
O. B. F. S e U-80 41 M Motoboy Tatuquara Curitiba
J. G. S. S. S-81 11 m M Não informado Não informado Não informado
R. P. (NÃO CONSIDERADO) S-82 25 M Tratorista Pinheirinho Curitiba
ANEXO 1
114
Identificação do paciente Registro Idade Sexo Profissão Bairro Município
S. M. D. S e U-83 45 F do lar Não informado Não informado
R. D. S. S e U-84 19 M Estudante Não informado Não informado
E. P. L. S e U-85 24 M Pedreiro Campo de Santana Curitiba
J. M. J. S e U-86 13 M Estudante Borda do Campo São José dos Pinhais
J. R. S. U-88 37 M Pintor Alto Boqueirão Curitiba
R. P. U-89 25 M Tratorista Pinheirinho Curitiba
L. F. C. G. S e U-90 80 M Aposentado Não informado Não informado
J. A. D. S e U-91 19 M Estudante Capão de Imbuia Curitiba
S. M. D. S e U-92 45 F do lar Capão da Imbuia Curitiba
E. C. S e U-93 28 M Mecânico Campo Comprido Curitiba
T. D. S e U-94 14 F Estudante
Esginia Maria Curitiba
E. C. S e U-95 28 M Mecânico Campo Comprido Curitiba
N. C. C. F. S e U-96 Não informado F Menor Não informado Não informado
J. F. F. S e U-97 11 M Menor São João Batista Almirante Tamandaré
C. L. S. (NÃO CONSIDERADO) U-98 67 F Aposentada Não informado Não informado
A. B. C. S-100 Não informado F Não informado Não informado Não informado
J. B. S. S-101 43 M Não informado Andracana Londrina
T. B. L. S e U-102 Não informado M Não informado Não informado Não informado
T. B. L. (NÃO CONSIDERADO) S e U-103 Não informado M Não informado Não informado Não informado
M. S. B. M. (NÃO CONSIDERADO) S e U-105 10 M Estudante Jardim Atuba Pinhais
S. A. I. (NÃO CONSIDERADO) S eU-106 22 M Estudante Santa Felicidade Curitiba
W. D. A. U-107 25 M Pedreiro Bairro Alto Curitiba
ANEXO 2
115
ANEXO 2. DADOS BRUTOS LABORATORIAIS
Identificação do paciente Registro Início dos sintomas Data da coleta Dias PCR sangue PCR urina 1ª ELISA 2ª ELISA MAT
R. A. B. U-01 1/8/2005 4/8/2005 3 ANR* D* NR* ANR TNR*
M. P. C. U-02 1/4/2005 10/8/2005 130 ANR D R* ANR TNR
C. J. M. S. S e U-03 4/8/2005 15/8/2005 11 ND* D R R R
J. J. A. S e U-04 13/9/2005 27/9/2005 14 ND ND R ANR NR
L. R. D. S. S e U-05 15/10/2005 21/10/2005 6 ND ND NR R TNR
J. V. S. U-06 14/10/2005 22/10/2005 8 ANR ND NR NR TNR
R. A. B. C. S e U-07 6/11/2005 8/11/2005 2 D ND NR ANR TNR
C. L. S. U-08 31/10/2005 8/11/2005 8 ANR D R ANR TNR
M. S. S-09 5/11/2005 10/11/2005 5 D ANR R ANR TNR
E. G. (NÃO CONSIDERADO) S e U-11 12/12/2005 20/12/2005 8 ND ND ANR ANR TNR
H. R. S e U-12 26/12/2005 2/1/2006 7 ND ND R ANR R
L. F. S e U-13 2/1/2006 11/1/2006 9 ND ND NR ANR NR
J. M. S. S e U-14 28/12/2005 13/1/2006 16 ND ND R NR NR
B. M. S. S-15 31/12/2005 2/1/2006 2 ND ANR NR ANR TNR
B. M. S. S-16 26/12/2005 2/1/2006 7 ND ANR NR ANR TNR
D .G. D. S-17 14/1/2006 26/1/2006 12 ND ANR R ANR R
L .C M. A. S e U-18 26/1/2006 3/2/2006 8 ND ND R ANR TNR
J. L. G. S e U-19 27/1/2006 7/2/2006 11 ND ND NR ANR TNR
A. M. B. S e U-20 2/2/2006 8/2/2006 6 ND ND R ANR NR
J. A. S e U-21 20/2/2006 6/3/2006 14 ND ND R ANR P*
S. S. I. S e U-22 1/3/2006 9/3/2006 8 ND ND I* NR TNR
A. F. B. (NÃO CONSIDERADO) S e U-23 4/3/2006 22/3/2006 18 ND ND ANR ANR TNR
E. S. F. U-24 1/4/2006 13/4/2006 12 ANR ND NR NR TNR
A .A. N. F. (NÃO CONSIDERADO) U-25 9/4/2006 13/4/2006 4 ANR D ANR R R
A. M. S-26 22/6/2006 26/6/2006 4 ND ND NR ANR P
A. M. S e U-27 21/6/2006 26/6/2006 5 ND ND NR ANR TNR
ANEXO 2
116
Identificação do paciente Registro Início dos sintomas Data da coleta Dias PCR sangue PCR urina 1ª ELISA 2ª ELISA MAT
F. M. B. O. S e U-28 20/6/2006 6/7/2006 16 ND ND NR ANR NR
N .G. R. J. So e L-29 Não informado 3/6/2006 Não informado So = ND L = ND R ANR TNR
A. S. S e U-30 9/7/2006 18/7/2006 9 ND D NR NR P
F. M. B. O. (NÃO CONSIDERADO) S e U-31 20/6/2006 20/7/2006 30 ND ND ANR ANR TNR
A. A. S e U-32 10/8/2006 22/8/2006 12 ND ND NR ANR NR
T. K. S e U-33 18/8/2006 28/8/2006 10 ND ND NR ANR P
M. R. C. S e U-34 30/8/2006 4/9/2006 5 ND ND R ANR R
F. A. L. N. S e U-35 31/8/2006 4/9/2006 4 ND ND R ANR P
E. E. S. B. M (post mortem) So e L-36 7/9/2006 10/9/2006 3 So = ND L = D NR ANR NR
L. R. C. S e U-37 2/7/2006 25/9/2006 75 ND ND I R NR
B. S. P. S e U-38 17/9/2006 26/9/2006 9 D D NR ANR NR
J. C. D. A. S e U-39 12/10/2006 18/10/2006 6 D D R ANR TNR
P. H. S. B. S e U-40 15/10/2006 20/10/2006 5 ND D R ANR R
A. J. C. P. S e U-41 17/10/2006 31/10/2006 14 ND ND NR ANR TNR
A. J. C. P. S e U-42 17/10/2006 9/11/2006 23 ND ND NR ANR TNR
L. S. M. S e U-43 19/11/2006 21/11/2006 2 ND ND R ANR NR
Z. A. S. U-44 Não informado 20/11/2006 Não informado ND D NR ANR NR
R. M. S. S e U-45 17/11/2006 24/11/2006 7 ND ND R ANR NR
E. C. R. S e U-46 21/11/2006 24/11/2006 3 ND D R ANR NR
L. O. A. S e U-47 24/11/2006 27/11/2006 3 D D NR R R
E. C. R. S-48 21/11/2006 24/11/2006 3 ND ANR R ANR NR
T. A. L. S e U-49 1/12/2006 5/12/2006 4 ND ND NR ANR NR
B. M. M. S e U-50 6/12/2006 13/12/2006 7 ND ND NR R NR
F. F. P. S e U-51 8/12/2006 15/12/2006 5 ND D R R P
N. F. A. S e U-52 8/12/2006 20/12/2006 12 ND ND R R P
P. C. F. S e U-53 14/12/2006 20/12/2006 6 D ND NR ANR NR
P. C. F. (2ª amostra) S e U-54 14/12/2006 22/12/2006 8 D ND R ANR R
ANEXO 2
117
Identificação do paciente Registro Início dos sintomas Data da coleta Dias PCR sangue PCR urina 1ª ELISA 2ª ELISA MAT
S. L. F. S e U-55 16/12/2006 27/12/2006 11 D D R ANR TNR
F. O. U-56 28/12/2006 4/1/2007 7 ANR ND NR ANR NR
G. B. S. S e U-57 3/1/2007 8/1/2007 5 ND ND NR ANR NR
R. C. S e U-58 2/1/2007 8/1/2007 6 D ND R ANR NR
S. S. G. S e U-59 27/12/2006 8/1/2007 12 D ND R ANR P
F. O. (2ª amostra) S e U-60 29/12/2006 9/1/2007 11 D ND R ANR R
M. J. S. S e U-61 12/1/2006 16/1/2007 4 D D R R R
C. R. R. S e U-62 Não informado 16/1/2007 Não informado ND ND NR ANR TNR
J. N. S e U-63 7/1/2007 17/1/2007 10 D ND NR NR P
C. R. R. (2ª amostra) S e U-64 13/1/2007 17/1/2007 4 D ND NR ANR NR
C. A. O. S e U-65 14/1/2007 22/1/2007 8 D ND R ANR NR
M. J. S. (2ª amostra) S e U-67 11/1/2007 24/1/2007 13 ND ND R ANR TNR
R. L. S. S-68 Não informado 24/1/2007 Não informado ND ND NR ANR NR
T. P. A. S-69 Não informado 23/1/2007 Não informado ND ND R ANR P
C. A. O. (2ª amostra) S e U-70 15/1/2007 22/1/2007 7 ND D R ANR NR
P. C. B. M. S e U-71 24/1/2007 31/1/2007 7 ND ND I R NR
A. R. B. S e U-72 31/1/2007 2/2/2007 2 D ND NR ANR NR
S. A. I. S e U-73 3/2/2007 5/2/2007 2 D ND R R NR
G. W. C. R. S e U-74 26/1/2007 6/2/2007 11 ND D R ANR P
C. A. M. M. (NÃO CONSIDERADO) S e U-75 27/1/2007 4/2/2007 8 ND ND ANR ANR TNR
D. M. R. (NÃO CONSIDERADO) S e U-76 6/2/2007 9/2/2007 3 ND ND ANR ANR TNR
B. R. M. S e U-77 18/2/2007 23/2/2007 5 D D NR R R
R. D. S. S e U-78 27/2/2007 6/3/2007 7 D D NR ANR TNR
V. Q. S e U-79 1/3/2007 7/3/2007 7 D D R ANR TNR
O. B. F. S e U-80 27/2/2007 8/3/2007 10 ND ND R ANR P
J. G. S. S. S-81 28/2/2007 1/3/2007 2 D ANR NR ANR NR
R. P. (NÃO CONSIDERADO) S-82 25/2/2007 9/3/2007 12 D ANR ANR R TNR
ANEXO 2
118
Identificação do paciente Registro Início dos sintomas Data da coleta Dias PCR sangue PCR urina 1ª ELISA 2ª ELISA MAT
S. M. D. S e U-83 6/3/2007 12/3/2007 6 ND ND NR R TNR
R. D. S. S e U-84 Não informado 6/3/2007 Não informado D D NR ANR NR
E. P. L. S e U-85 12/3/2007 20/3/2007 8 ND ND R ANR NR
J. M. J. S e U-86 11/3/2007 20/3/2007 9 ND ND R ANR NR
J. R. S. U-88 26/2/2007 9/3/2007 11 ANR ND NR R R
R. P. U-89 25/2/2007 12/3/2007 15 ANR ND R ANR R
L. F. C. G. S e U-90 Não informado 22/3/2007 Não informado D ND NR NR NR
J. A. D. S e U-91 4/3/2007 23/3/2007 19 ND ND R R TNR
S. M. D. S e U-92 6/3/2007 23/3/2007 17 ND ND R R TNR
E. C. S e U-93 24/3/2007 29/3/2007 5 ND ND R R NR
T. D. S e U-94 25/3/2007 4/4/2007 10 ND ND NR ANR NR
E. C. S e U-95 24/3/2007 4/4/2007 11 ND ND R ANR P
N. C. C. F. S e U-96 Não informado 13/4/2007 Não informado D ND R R R
J. F. F. S e U-97 13/4/2007 24/4/2007 9 D ND R ANR R
C. L. S. (NÃO CONSIDERADO) U-98 30/3/2007 24/4/2007 26 ANR ND ANR ANR TNR
A. B. C. S-100 Não informado Não informado Não informado ND ANR I ANR NR
J. B. S. S-101 7/4/2007 13/4/2007 Não informado ND ANR NR ANR NR
T. B. L. S e U-102 19/5/2007 Não informado Não informado ND ND NR ANR NR
T. B. L. (NÃO CONSIDERADO) S e U-103 Não informado Não informado Não informado ND ND ANR ANR TNR
M. S. B. M. (NÃO CONSIDERADO) S e U-105 14/6/2007 20/6/2007 6 ND ND ANR ANR TNR
S. A. I. (NÃO CONSIDERADO) S eU-106 3/2/2007 25/6/2007 22 ND ND ANR ANR TNR
W. D. A. U-107 16/6/2007 25/069/07 9 ANR ND NR ANR TNR
*ANR: amostra não recebida; D: detectável; ND: não detectável; R: reagente; I: inconclusivo; NR: não reagente; TNR: teste não realizado; P: provável.
ANEXO 3
119
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