( PDF ) Caracterização funcional de genes codificadores de proteínas hipotéticas diferencialmente expressos durante a metaciclogênese de Trypanossoma Cruzi

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

HENRIQUE PRETI

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE GENES

CODIFICADORES DE PROTEÍNAS HIPOTÉTICAS

DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS DURANTE A

METACICLOGÊNESE DE TRYPANOSOMA CRUZI

CURITIBA

2007

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HENRIQUE PRETI

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE GENES

CODIFICADORES DE PROTEÍNAS HIPOTÉTICAS

DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS DURANTE A

METACICLOGÊNESE DE TRYPANOSOMA CRUZI

Dissertação apresentada ao departamento de

Biologia Celular e Molecular da Universidade

Federal do Paraná, como pré-requisito na obtenção

do título de Mestre em Biologia Celular e Molecular.

Orientador: Dr. Marco Aurélio Krieger

Co-orientador: Dr. Christian Macagnan Probst

CURITIBA

2007

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iii

Aos meus pais e minha amada,

a quem dedico todos meus passos.

Agradecimentos

Agradeço a todos meus amigos, colegas e profissionais que me acompanharam ao

longo desta curta jornada, preparando-me para a próxima.

Agradeço a diretoria do Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP), por

depositar confiança em mim e me proporcionar tal aprendizado.

A todos amigos os quais foram surgindo ao longo da minha vivência no IBMP.

Agradeço em especial ao Dr. Marco Aurélio Krieger, Dr. Christian Macagnan Probst e

Msc. Viviane Monteiro Góes, que conduziram com sapiência meus primeiros passos na

ciência.

Sumário

Agradecimentos.........................................................................................................................iv

Sumário ....................................................................................................................................v

Lista de Figuras .......................................................................................................................viii

Lista de Tabelas.........................................................................................................................xi

Resumo ..................................................................................................................................xii

Abstract .................................................................................................................................xiii

1 Introdução...................................................................................................................1

1.1 O Trypanosoma cruzi e o ciclo evolutivo...........................................................1

1.2 A doença de chagas ............................................................................................4

1.3 Características genômicas de T. cruzi ................................................................5

1.4 O Trypanosoma cruzi e a transcrição policistrônica ..........................................8

1.5 A regulação da expressão gênica em T. cruzi ..................................................11

1.6 A metaciclogênese............................................................................................13

1.7 O estudo genômico funcional de T. cruzi.........................................................16

1.8 Proteínas hipotéticas em T. cruzi......................................................................19

2 Objetivos...................................................................................................................21

2.1 Objetivo geral ...................................................................................................21

2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................21

3 Justificativas .............................................................................................................22

4 Material e Métodos...................................................................................................24

4.1 Confecção dos microarranjos de DNA.............................................................24

4.2 Arquitetura do microarranjo.............................................................................24

4.3 Desenho experimental ......................................................................................25

4.4 Fluxograma das etapas desenvolvidas..............................................................27

4.5 Análise dos dados gerados pelo microarranjo de DNA e seleção dos genes ...27

4.6 Amplificação dos genes....................................................................................36

4.7 Purificação dos produtos de PCR.....................................................................36

4.8 Clonagem e vetores ..........................................................................................37

4.8.1 Obtenção dos clones de entrada....................................................................39

4.8.2 Obtenção dos clones de expressão................................................................40

4.9 Expressão das proteínas....................................................................................41

4.10 Comprovação da expressão ..............................................................................42

4.11 Purificação das proteínas..................................................................................42

4.12 Obtenção dos anticorpos policlonais................................................................44

4.13 Verificações da qualidade dos soros obtidos utilizando ensaios de Western

blot. ..........................................................................................................................44

4.14 Ensaios de Western blot para determinação de expressão ...............................45

4.15 Análise dos resultados obtidos a partir dos ensaios de Western blot. ..............46

4.16 Imunolocalização por microscopia óptica........................................................46

5 Resultados.................................................................................................................48

5.1 Descrição inicial ...............................................................................................48

5.2 Genes selecionados a partir das análises de microarranjo de DNA .................48

5.3 Amplificação dos genes e purificação dos produtos ........................................49

5.4 Obtenção dos clones de entrada........................................................................50

5.5 Obtenção dos clones de expressão....................................................................51

5.6 Seqüenciamento dos clones obtidos .................................................................52

5.7 Expressão e purificação das proteínas..............................................................53

5.8 Obtenção dos anticorpos policlonais................................................................55

5.9 Imunolocalização por microscopia óptica........................................................55

5.10 Características gerais dos genes selecionados e resultados de western blot e

imunolocalização......................................................................................................................56

5.10.1 TcExp02A01, 8530.t00003, Proteína hipotética conservada ...................56

5.10.2 TcExp02A08, 8694.t00004, Proteína Hipotética .....................................61

5.10.3 TcExp02A09, 7626.t00009, Proteína hipotética conservada ...................62

5.10.4 TcExp02A10, 6680.t00001, Sterol 24-c-methyltransferase.....................65

5.10.5 TcExp02A02, 6996.t00063, Proteína Hipotética Conservada..................68

5.10.6 TcExp02A11, 8773.t00014, Proteína Hipotética .....................................71

5.10.7 TcExp02A12, 8364.t00002, Proteína Hipotética conservada ..................72

5.10.8 TcExp02B01, 8208.t00006, Ras-related protein rab-5.............................73

5.10.9 TcExp02A03, 7109.t00005, Proteína hipotética conservada ...................76

5.10.10 TcExp02B02, 8764.t00016, Proteína Hipotética......................................77

5.10.11 TcExp02B03, 8728.t00021, Proteína Hipotética Conservada..................78

5.10.12 TcExp02B04, 8257.t00019, DREV Metiltransferase...............................80

vii

5.10.13 TcExp02A04, 6896.t00027, Proteína Hipotética conservada ..................81

5.10.14 TcExp02B05, 7224.t00006, Proteína Hipotética......................................85

5.10.15 TcExp02B06, 6958.t00014, Proteína Hipotética Conservada..................85

5.10.16 TcExp02B07 8243.t00004, Dynein light chain 2B, cytoplasmic, putative..

..................................................................................................................87

5.10.17 TcExp02A05, 4715.t00001, Anti-silencing protein, ASF1-like...............89

5.10.18 TcExp02B08, 5595.t00003, Proteína hipotética.......................................91

5.10.19 TcExp02B09, 8171.t00006, Proteína Hipotética conservada...................92

5.10.20 TcExp02B10, 8416.t00006, Calcineurin B subunit, putative...................94

5.10.21 TcExp02A06, 8415.t00003, Proteína hipotética conservada ...................97

5.10.22 TcExp02B11, 7000.t00002, Proteína hipotética.......................................99

5.10.23 TcExp02B12, 8318.t00003, Proteína Hipotética conservada GTPase ...100

5.10.24 TcExp02C01, 7168.t00007, Syntaxin putative.......................................103

5.10.25 TcExp02A07, 5323.t00004, Proteína hipotética conservada .................106

5.10.26 TcExp02C02, 8359.t00034, Proteína Hipotética Conservada................108

5.10.27 TcExp02C03, 7741.t00008, Proteína Hipotética Conservada................110

5.10.28 TcExp02C04, 6996.t00038, Centrin Putative.........................................110

5.11 Consolidação dos resultados laboratoriais......................................................112

5.12 Análise comparada do transcriptoma e proteômica de T. cruzi .....................115

6 Discussão................................................................................................................118

7 Conclusões..............................................................................................................138

8 Perspectivas ............................................................................................................140

9 Referências bibliográficas ......................................................................................142

viii

Lista de Figuras

Figura 1.1 Ciclo de vida de T. cruzi. (modificado de www.dpd.cdc.gov/dpdx). __________________________ 2

Figura 4.1 Desenho experimental das hibridações realizadas. _____________________________________ 26

Figura 4.2. Fluxograma descritivo das etapas laboratoriais realizadas. ______________________________ 27

Figura 4.3 Agrupamento hierárquico dos dados de microarranjo disponíveis no IBMP. _________________ 30

Figura 4.4 Cluster contendo a sonda referente ao gene 4715.t00001, grupo 5._________________________ 31

Figura 4.5 Cluster contendo a sonda referente ao gene 5323.t00004, grupo 7._________________________ 31

Figura 4.6 Cluster contendo a sonda referente ao gene 6896.t00027, grupo 4._________________________ 32

Figura 4.7 Cluster contendo a sonda referente ao gene 6996.t00063, grupo 2._________________________ 32

Figura 4.8 Cluster contendo a sonda referente ao gene 7109.t00005, grupo 3._________________________ 33

Figura 4.9 Cluster contendo a sonda referente ao gene 8415.t00003, grupo 6._________________________ 33

Figura 4.10 Cluster contendo a sonda referente ao gene 8530.t00003, grupo 1.________________________ 34

Figura 4.11 Possibilidades de utilização do sistema Gateway a partir da obtenção do clone de entrada. ____ 37

Figura 4.12 Reação attB x attP. _____________________________________________________________ 38

Figura 4.13 Reação attL x attR ______________________________________________________________ 38

Figura 4.14 Vetor de entrada utilizado, pDONR 221(Invitrogen). ___________________________________ 39

Figura 4.15Vetor de expressão pDEST™17 (Invitrogen). _________________________________________ 39

Figura 5.1 Padrão eletroforético obtido a partir das amostras de pcr purificadas.______________________ 50

Figura 5.2 Perfil eletroforético dos produtos obtidos da PCR de colônia de clones de entrada.____________ 51

Figura 5.3 Perfil eletroforético dos clones de entrada purificados. __________________________________ 51

Figura 5.4 Perfil eletroforético dos produtos obtidos da PCR de colônia de clones de destinação. _________ 52

Figura 5.5 Perfil eletroforético dos clones de expressão purificados. ________________________________ 52

Figura 5.6 Perfil eletroforético (SDS-PAGE) contendo o gene ID. __________________________________ 54

Figura 5.7 Gráfico LogoPlot representando o padrão de conservação do domínio quinase. ______________ 57

Figura 5.8. Comparação entre TcExp02A01 e o domínio ALBA. ____________________________________ 58

Figura 5.9Análise de similaridade entre TcExp02A01 e ortólogos de outros eucariotos. _________________ 58

Figura 5.10 Análise de similaridade entre TcExp02A01 e ortólogos de protozoários.____________________ 59

Figura 5.11 Árvore filogenética das proteínas contendo os domínios ALBA e RGG-box. _________________ 60

Figura 5.12 Análise de expressão da proteína TcExp02A01 por western blot em extratos de T. cruzi. _______ 60

Figura 5.13 Imunolocalização de TcExp02A01. _________________________________________________ 61

Figura 5.14 Comparação entre TcExp02A08 e 7963.t00006._______________________________________ 62

Figura 5.15 Comparação entre TcExp02A09 e o domínio sacaropina desidrogenase. ___________________ 63

Figura 5.16 Comparação entre a proteína codificada por TcExp02A09 e os ortólogos encontrados.________ 63

Figura 5.17 Análise de similaridade entre TcExp02A09 e os ortólogos em G. violaceus e P. troglodytes. ____ 64

Figura 5.18. Análise de expressão da proteína TcExp02A09 por western blot em extratos de T. cruzi. ______ 64

Figura 5.19 Imunolocalização da proteína TcExp02A09. _________________________________________ 65

Figura 5.20 Comparação entre TcExp02A10 e o domínio Sterol_MT_C e Methyltransf_11. ______________ 66

Figura 5.21 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.___________________ 67

Figura 5.22. Análise de expressão da proteína TcExp02A10 por western blot em extratos de T. cruzi. ______ 67

Figura 5.23 Imunolocalização da proteína TcExp02A10. _________________________________________ 68

Figura 5.24 Gráfico LogoPlot representando o padrão de conservação do domínio quinase. _____________ 69

Figura 5.25. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio PKinase._________________________ 70

Figura 5.26 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.___________________ 71

Figura 5.27 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros tripanossomatídeos.____________ 73

Figura 5.28. Comparação entre TcExp02B01 e o domínio RAS_____________________________________ 74

Figura 5.29 Análise de similaridade entre TcExp02B01 e ortólogos de outros eucariotos.________________ 74

Figura 5.30. Análise de expressão da proteína TcExp02B01 por western blot em extratos de T. cruzi. ______ 75

Figura 5.31 Imunolocalização da proteína TcExp02B01. _________________________________________ 76

Figura 5.32. Comparação entre TcExp02A03 e o domínioFKBP_C. _________________________________ 76

Figura 5.33 Análise de similaridade entre TcExp02A03 e ortólogos de outros tripanossomatídeos._________ 77

Figura 5.34 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e L. infantum.________________________ 78

Figura 5.35 Gráfico HMM relativo o domínio zf-C2H2. __________________________________________ 79

Figura 5.36 Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio zf-C2H2. _________________________ 79

Figura 5.37 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.___________________ 80

Figura 5.38 Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio DREV. __________________________ 81

Figura 5.39 Análise de similaridade entre TcExp02B04 e os ortólogos de outros eucariotos. _____________ 81

Figura 5.40 Comparação entre a seqüência de T. cruzi e os domínios SWIM e zf-C3HC4 utilizando o programa

PFAM. _________________________________________________________________________________ 82

Figura 5.41. Gráfico HMM relativo ao domínio SWIM ___________________________________________ 83

Figura 5.42. Gráfico HMM do domínio zf-C3HC4 (RING).________________________________________ 83

Figura 5.43 Análise de similaridade entre TcExp02A04 e ortólogos de outros eucariotos. _______________ 84

Figura 5.44. Análise de expressão da proteína TcExp02A04 por western blot em extratos de T. cruzi. ______ 84

Figura 5.45. Alinhamento das proteínas de TcExp02B05 presentes em CL Brener. _____________________ 85

Figura 5.46 Gráfico HMM do domínio zf-CSL. _________________________________________________ 86

Figura 5.47 Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio zf-CSL.___________________________ 86

Figura 5.48 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.___________________ 87

Figura 5.49 Análise de expressão da proteína TcExp02B06 por western blot em extratos de T. cruzi. _______ 87

Figura 5.50. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio Roadblock/LC7. ___________________ 88

Figura 5.51. Análise de similaridade entreTcExp02B07 e ortólogos de outros eucariotos.________________ 88

Figura 5.52. Análise de expressão da proteína TcExp02B06 por western blot em extratos de T. cruzi. ______ 88

Figura 5.53 Imunolocalização de TcExp02B07. ________________________________________________ 89

Figura 5.54. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e os domínios Anti-silence. ____________________ 89

Figura 5.55. Gráfico HMM do domínio Anti-silence. _____________________________________________ 90

Figura 5.56. Análise de similaridade entre TcExp02A05 e ortólogos de outros eucariotos. _______________ 90

Figura 5.57. Análise de similaridade entre duas seqüências de T. cruzi CL Brener. _____________________ 91

Figura 5.58. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi, T. congolense e T. vivax. ______________ 92

Figura 5.59. Gráfico HMM do domínio PDC2-C. _______________________________________________ 93

Figura 5.60. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio PDC2_C. ________________________ 93

Figura 5.61. Análise de similaridade entre TcExp02B09 e ortólogos de outros eucariotos. _______________ 94

Figura 5.62. Gráfico HMM do domínio EF-hand. _______________________________________________ 95

Figura 5.63. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio EF-hand _________________________ 95

Figura 5.64. Análise de similaridade entre TcExp02B10 e ortólogos de outros eucariotos. _______________ 96

Figura 5.65. Análise de expressão da proteína TcExp02B10 por western blot em extratos de T. cruzi. ______ 96

Figura 5.66. Imunolocalização de TcExp02B10. ________________________________________________ 97

Figura 5.67. Gráfico HMM retirado do programa PFAM mostrando o grau de conservação em cada posição

aminoacídica do domínio PPR.______________________________________________________________ 97

Figura 5.68. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio PPR. ____________________________ 98

Figura 5.69. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos. __________________ 98

Figura 5.70. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros tripanossomatídeos. ___________ 99

Figura 5.71. Árvore filogenética mostrando as relações evolutivas da família de TcExp02B11.___________ 100

Figura 5.72. Gráfico HMM do domínio ArfGap. _______________________________________________ 101

Figura 5.73. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio ArfGap._________________________ 101

Figura 5.74. Análise de similaridade entre TcExp02B12 e ortólogos de outros eucariotos. ______________ 102

Figura 5.75. Análise de expressão da proteína TcExp02B12 por western blot em extratos de T. cruzi. _____ 102

Figura 5.76. Imunolocalização de TcExp02B12 ________________________________________________ 103

Figura 5.77. Gráfico HMM do domínio SNARE. _______________________________________________ 104

Figura 5.78. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio SNARE._________________________ 104

Figura 5.79. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos. _________________ 105

Figura 5.80. Análise de expressão da proteína TcExp02C01 por western blot em extratos de T. cruzi. _____ 105

Figura 5.81. Imunolocalização da proteína relativa ao gene 7168.t00007. ___________________________ 106

Figura 5.82. Comparação entre TcExp02A07 e o domínio PKinase. ________________________________ 107

Figura 5.83. Análise de similaridade TcExp02A07 e ortólogos de outros eucariotos.___________________ 107

Figura 5.84. Gráfico HMM do domínio TLD.__________________________________________________ 108

Figura 5.85. Comparação entre a TcExp02C02 e o domínio TLD. _________________________________ 109

Figura 5.86. Análise de similaridade entre TcExp02C02 e ortólogos de outros tripanossomatídeos. _______ 109

Figura 5.87. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e T. cruzi. _________________________ 110

Figura 5.88. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio EF-hand. _______________________ 111

Figura 5.89. Análise de similaridade entre TcExp02C04 e ortólogos de outros eucariotos. ______________ 111

Figura 5.90. Análise de expressão da proteína TcExp02C04 por western blot em extratos de T. cruzi. _____ 112

Figura 5.91. Imunolocalização de TcExp02C04. _______________________________________________ 112

Figura 5.92. Gráfico heatmap mostrando a correlação entre transcriptoma e proteoma.________________ 116

Figura 6.1. Imunolocalização de TcDhh1 e TcExp02A01. ________________________________________ 133

Lista de Tabelas

Tabela 4.1. Descrição dos genes selecionados para caracterização e sua classificação interna____________ 29

Tabela 4.2: Iniciadores construídos adaptados para plataforma Gateway

. ___________________________ 34

Tabela 5.1: Genes selecionados para caracterização. ____________________________________________ 49

Tabela 5.2 Resultados da expressão de proteínas na fase de teste e produção. _________________________ 54

Tabela 5.3 Tabela dos genes dos quais obteve-se anticorpo policlonal._______________________________ 55

Tabela 5.4. Eficiência de cada etapa de análise para as 28 proteínas analisadas. _____________________ 113

xii

Resumo

A análise por microarranjo da metaciclogênese de Trypanosoma cruzi resultou na

identificação de um conjunto de aproximadamente 1.000 genes diferencialmente expressos,

em sua maioria proteínas hipotéticas. Visando aumentar o conhecimento sobre a função

desses genes como a compreensão da expressão, função e regulação dos mesmos, com ênfase

nas proteínas hipotéticas, iniciou-se o presente trabalho. Inicialmente, sete proteínas

hipotéticas conservadas foram selecionadas, com base em sua confiabilidade de expressão

diferencial. Posteriormente, foi realizada uma clusterização hierárquica com diferentes dados

de metaciclogênese, para aumentar o grau de informação com relação aos padrões de

expressão. Dentro de cada cluster dos genes previamente selecionados, foram identificados

mais três genes distintos, codificando outra proteína hipotética conservada (gene secundário),

uma proteína hipotética (gene acessório) e uma proteína com função conhecida (gene guia).

Esses critérios visam aumentar a quantidade de proteínas hipotéticas sendo caracterizadas,

bem como ter elementos de referência para futuras análises. Estes 28 genes foram clonados

em um vetor de entrada (pDONR; Invitrogen), a partir do qual é possível inserir o gene de

interesse em outros vetores, os quais apresentam propriedades diferentes. Inicialmente,

realizamos a expressão em E. coli utilizando vetores de destinação (pDEST17, Invitrogen)

para obtenção de proteínas recombinantes. Dos 28 genes selecionados foram obtidos 27

clones de entrada, os quais foram totalmente transferidos para o pDEST17. Na etapa de

expressão, foram obtidas 19 proteínas, todas insolúveis, procedendo-se à obtenção de

anticorpos policlonais, através da inoculação em camundongos, sendo que obteve-se soros

para o reconhecimento de 18 proteínas recombinantes. Ao se realizar western blot para a

comprovação da expressão diferencial, a proteína nativa foi identificada adequadamente por

onze anticorpos, e o padrão de expressão diferencial, juntamente com outros 12 soros

existente no instituto, em sua grande maioria corrobora os resultados do microarranjo. Foram

verificados padrões de imunolocalização para 9 proteínas sendo 3 hipotéticas conservadas e 6

de função conhecida. Outros resultados obtidos por este trabalho foi o incremento nas

informações sobre os genes, com relação a aspectos bioinformáticos, possibilitando uma

melhor anotação e compreensão dos mesmos.

xiii

Abstract

Microarray analysis of T. cruzi metacyclogenesis resulted in the identification of

approximately 1,000 differentially expressed genes and several of them encode hypothetical

proteins. Aiming to increase the knowledge about the function of these genes, a better

understanding of the expression, function and regulation, with an emphasis on hypothetical

proteins, we have devised this work. Initially, seven conserved hypothetical proteins were

selected on basis of differential expression confiability. Subsequently, hierarchical clustering

was applied to the metacyclogenesis data and, within each cluster of genes previously

selected, were identified other three distinct genes, encoding another conserved hypothetical

protein (secondary gene), a hypothetical protein (accessory gene) and a protein with known

function (guide gene). This approach increases the expectation of having at least one

hypothetical protein better characterized, and also provides reference elements for future

analysis. These 28 genes were cloned in entry vector of the Gateway platform (pDONR;

Invitrogen), from which it is possible to insert the selected gene in other vectors, with

different functional characterization capabilities. Initially, the 28 selected genes were

expressed as proteins in E. Coli using appropriate destination vectors (pDEST17, Invitrogen),

obtaining a recombinant protein. Of the 28 selected genes, 27 entry clones were obtained,

which have been transferred to pDEST17. In the expression stage, we have obtained 19

proteins, all insoluble, which were used for polyclonal antibody production through

inoculation in mice, and we have obtained sera recognizing 18 recombinant proteins. Western

blot assay was performed aiming the differential expression analysis. The native protein was

identified properly by 11 antibodies, and the differential expression pattern, including other

12 sera available in the Institute, mostly corroborates the microarray results. Nine protein

were immunolocalized, 3 hypothetical protein and 6 of known function. Other results of this

work were a better annotation, using bioinformatics tools, producing an increase in the

functional knowledge of these proteins.

1 Introdução

1.1 O Trypanosoma cruzi e o ciclo evolutivo

O Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909) é um protozoário parasita pertencente ao reino

Protista, sub-reino Protozoa, filo Sarcomastighophora, sub-filo Mastighophora, classe

Zoomastighophora, ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, gênero Trypanosoma e

espécie Trypanosoma cruzi (LEVINE et al, 1980).

Os organismos da ordem Kinetoplastida apresentam uma especialização denominada

cinetoplasto, correspondendo a sua mitocôndria única, e composto por uma grande quantidade

de DNA em forma de bastão, o qual é denominado kDNA. Um dos critérios para se definir as

formas evolutivas presentes na família Trypanosomatidae é a posição do cinetoplasto em

relação ao núcleo (HOARE & WALLACE, 1966; MASLOW & SIMPSON, 1995). No T.

cruzi, as formas epimastigotas possuem o cinetoplasto em forma de bastão e em posição

anterior ao núcleo, constituído por um material filamentoso organizado em feixes de fibras

fortemente empacotados e perpendicularmente orientados ao eixo longitudinal do parasita. Já

as formas tripomastigotas possuem o cinetoplasto na região posterior, com uma forma mais

arredondada devido à diminuição no grau de empacotamento do kDNA. As formas

amastigotas apresentam o cinetoplasto de maneira muito semelhante aos epimastigotas

(SOARES, 1989).

O ciclo evolutivo do T. cruzi consiste na alternância entre dois vetores, um inseto

hematófago da família Reduviidae e um hospedeiro mamífero. Didaticamente, o ciclo é

iniciado quando o hospedeiro vertebrado é infectado pela forma tripomastigota metacíclica,

presente nas excreções eliminadas durante o repasto sanguíneo do inseto vetor. A infecção

ocorre devido à entrada da forma infectiva através de descontinuidades na epiderme, por

exemplo, a lesão causada pela picada do inseto hematófago, ou ainda por penetração pelas

membranas mucosas (BRENER, ANDRADE, BARRAL-NETO,2000; SOUZA, 2002).

As formas epimastigotas também podem penetrar por esse mesmo processo, porém são

destruídas por células fagocíticas, e não influem no restante do processo. Já os tripomastigotas

metacíclicos iniciam a invasão das células do hospedeiro, ao se aderirem à superfície celular,

sendo então, internalizados através da formação de pseudópodos. Uma vez dentro da célula,

os tripomastigotas estão agora envoltos por uma membrana formando o vacúolo parasitóforo.

Este vacúolo irá sofrer fusão com lisossomos da célula hospedeira, acidificando-o, e iniciando

o processo de diferenciação da forma tripomastigota para a forma amastigota, ocorrendo

também a dissolução da membrana por enzimas secretadas pela forma tripomastigota

(BURLEIGH, B.A.& WOOLSEY, 2002). A forma amastigota fica em contato com o

citoplasma da célula hospedeira, começando a se dividir por fissão binária. Depois de diversos

ciclos de divisão, inicia-se a transformação para as formas tripomastigotas sanguíneas, as

quais adquirem um longo flagelo e movimentação intensa, causando a ruptura da célula

hospedeira. Após a lise celular, as formas liberadas nas áreas extracelulares podem infectar

outras células do organismo ou então serem ingeridas pelo inseto vetor durante o repasto

sanguíneo (SOUZA, 2002).

No estômago do inseto vetor inicia-se o processo de diferenciação para a forma

epimastigota que, em seguida, migra para o intestino médio e posterior, aderindo-se à

superfície, na qual ocorre intensa multiplicação celular. Após esta fase, os epimastigotas

sofrem diferenciação para a forma tripomastigota metacíclica (infectante) na parte posterior

do aparelho digestivo, mais precisamente no reto, podendo serem eliminados, fechando o

ciclo Figura 1.1 (GARCIA & AZAMBUJA, 1991; SOUZA, 2002).

Esta passagem da forma epimastigota para tripomastigota metacíclica é denominada

metaciclogênese. Este processo possui um potencial excelente para o estudo dos mecanismos

envolvidos na regulação da expressão gênica do parasita (GOLDENBERG, 1990; 1991).

Figura 1.1 Ciclo de vida de T. cruzi. (modificado de www.dpd.cdc.gov/dpdx).

De maneira mais detalhada, no sistema digestivo do inseto vetor ocorrem várias

alterações químico-físicas que estimulam diretamente modificações na expressão gênica do

parasita, o que leva a alterações bioquímicas e morfológicas. Ao serem ingeridos, os parasitas

encontram um ambiente com mudanças na osmolaridade e concentração de nutrientes, devido

à presença de saliva e enzimas digestivas do estômago do inseto vetor. Além disto, existem

fatores hemolíticos que lisam as hemácias e podem afetar o parasita (GOLDENBERG, 1990;

KOLLIEN & SCHAUB, 2000). O estômago do inseto tem como função armazenar o sangue

obtido, concentrar as proteínas através da remoção da água, armazenar intracelularmente

lipídios e lisar a membrana dos eritrócitos. Nesta etapa, diversas enzimas agem e alteram o pH

como, por exemplo, fosfatases ácidas, lisozimas e aminopeptidases. Também é nesta porção

do tubo digestivo que ocorre a primeira diferenciação, a passagem da forma tripomastigota

sanguínea para a forma epimastigota (KOLLIEN & SCHAUB, 2000).

Os epimastigotas migram para o intestino do inseto, o qual possui enzimas que continuam

a digestão iniciada no estômago, e nesse local passam por diversos ciclos de divisão celular.

Devido à absorção dos nutrientes, a concentração dos mesmos começa a decair e supõe-se que

este estresse nutricional influencie na sinalização para o remodelamento da expressão gênica

dos parasitas, propiciando o desencadeamento da diferenciação. Na superfície da região

posterior do intestino, na camada cuticular do epitélio da glândula retal e do saco retal, ocorre

a adesão da forma epimastigota à essa camada, através da interação hidrofóbica do flagelo

com as estruturas citadas (ZELEDON et al,1997; KOLLIEN & SCHAUB, 2000). Estas

formas aderidas sofrem alongamento e torção, e transformam-se em tripomastigotas

metacíclicos.

Há várias evidências de fatores intrínsecos do sistema digestivo do inseto vetor que

estimulam o disparo da metaciclogênese em T. cruzi, como a composição da urina

descarregada no saco retal através dos túbulos de Malpighi (FRAIDENRAICH, et al,1993),

um peptídeo resultante da digestão da globina que pode ser capaz de ativar a enzima adenil-

ciclase parasitária, presente na forma epimastigota (SCHMIDT et al, 1997), AMP cíclico

presente na luz do intestino, a diminuição da concentração dos nutrientes devido ao processo

de absorção ou a períodos de falta de alimentação do inseto vetor (KOLLIEN & SCHAUB,

2000). No entanto, esses dados são preliminares, se conhecendo relativamente pouco sobre o

processo de metaciclogênese.

1.2 A doença de chagas

A doença de Chagas (Chagas, 1909) é característica do continente americano e está

atualmente distribuída em 21 países, atingindo México, parte da América Central e toda

América do Sul. Há aproximadamente 13 milhões de infectados (TDR,2005), e 120 milhões

correm risco de contaminação (www.who.int/tdr/diseases/chagas/ swg_chagas.pdf; acesso em

28/11/2007). A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado T. cruzi e a

transmissão ao homem pode ocorrer de diferentes formas. A forma mais comum é através de

insetos da família Reduviidae que infectam o hospedeiro mamífero durante o repasto

sanguíneo, através das fezes contaminadas com o parasita; outras formas, menos comuns, são,

por exemplo, por meio de transfusões sanguíneas, transmissão materno-fetal, acidentes

laboratoriais e ingestão de formas infectivas.

A doença se caracteriza por duas fases distintas. Na fase aguda pode ocorrer febre,

inflamação no local da infecção e nos nodos linfáticos, parasitemia elevada e

hepatoesplenomegalia. Porém, normalmente os sintomas não são perceptíveis, devido a sua

fraca intensidade. A fase crônica tem evolução lenta com sinais surgindo somente depois de

um período de 10 a 20 anos. Durante a fase crônica, podem ocorrer danos irreversíveis ao

coração, esôfago ou cólon, os quais apresentam alterações da inervação nervosa e dilatações.

A abordagem terapêutica mais utilizada visa o controle da parasitemia com a utilização de

quimioterapêuticos, já que não existe profilaxia eficiente por vacinação (COURA &

CASTRO, 2002; MARIN-NETO et al., 2002).

Com relação aos aspectos imunológicos básicos, a infecção por T. cruzi, como na dos

demais parasitas intracelulares, mobiliza múltiplos mecanismos humorais e celulares da

resposta imune adaptativa, bem como mecanismos inespecíficos da imunidade inata, os quais

levam à eliminação dos parasitas da circulação e a diminuição de sua replicação intracelular.

Todavia, o parasita possivelmente persiste indefinidamente, mesmo em níveis mínimos, assim

como a resposta imunológica contra o mesmo, resultando em acúmulo de lesões teciduais que

acabam por gerar, em alguns casos, alterações morfológicas e funcionais dos tecidos afetados

(BRENER, ANDRADE, BARRAL-NETO, 2000). O comportamento do sistema imune sobre

os diferentes estágios evolutivos do parasita é distinto. Um exemplo desta grande

complexidade de respostas é a ação da via alternativa do complemento: as formas não-

infectivas epimastigotas são lisadas por esta via, enquanto a forma infectiva tripomastigota é

resistente à ação lítica do complemento devido à expressão diferencial de proteínas de

membrana, como a gp160 e a T-DAF (NOGUEIRA et al, 1975;.NORRIS et al, 1991).

O controle da doença é realizado principalmente através da tentativa de erradicação do

inseto vetor de maior importância, o Triatoma infestans, através do uso de pesticidas. Porém o

fato de ser uma zoonose elimina a possibilidade de erradicação da doença, visto que várias

espécies silvestres atuam como reservatório natural e outras espécies de triatomíneos podem

transmitir a doença. A partir desta dificuldade, acrescido do alto custo econômico do combate

aos insetos, programa este descontinuado em boa parte da América Latina, o entendimento

das interações parasita-vetor, como os fatores que induzem o desenvolvimento dos vários

estágios do ciclo de vida, podem permitir o desenvolvimento de novas medidas de controle

desta parasitose (KOLLIEN & SCHAUB, 2000). O tratamento por quimioterápicos em

pacientes infectados visa à eliminação do parasita na forma aguda da doença, porém, como

normalmente a infecção passa despercebida, essa estratégia não apresenta resultados

epidemiológicos significativos. Portanto, estratégias visando o controle da Doença de Chagas

devem focar no bloqueio da infecção ou no tratamento dos pacientes cronicamente afetados.

1.3 Características genômicas de T. cruzi

O material genético do T. cruzi está localizado em duas estruturas: núcleo e mitocôndria,

sendo que o genoma nuclear do T. cruzi é estimado entre 40 e 50 Mb, dependendo da cepa

estudada (SIMPSON, 1987; ENGLUND et al, 1996). Em tripanossomatídeos, não existe

condensação cromossômica em nenhum estágio do ciclo celular, e a análise de seu cariótipo

necessita de técnicas diferenciadas, como eletroforese em campo pulsado e hibridação com

sondas teloméricas (VICKERMAN & TETLEY, 1977). Durante o ciclo celular, a cromatina

sofre alteração na sua distribuição, permanecendo concentrada no centro do núcleo, nas

formas não replicativas na fase G1, enquanto que na fase S está localizada na periferia nuclear

onde ocorre a replicação (ELIAS et al, 2002). O cariótipo é estável nas diferentes formas

evolutivas do parasita apesar da grande variabilidade intra-específica com relação à vasta

variabilidade cromossômica, tanto numérica quanto estrutural (AYMERICH &

GOLDENBERG, 1989; HENRIKSSON et al, 1995).

Uma das características mais marcantes dos tripanossomatídeos é o fato de que o genoma

mitocondrial está organizado em uma complexa rede de moléculas de DNA, localizadas em

uma região especializada denominada cinetoplasto. Esta rede é composta por maxicírculos e

minicírculos de DNA. O DNA do cinetoplasto (kDNA) corresponde a cerca de 20 a 25% do

DNA total do parasita e é formado por aproximadamente 10.000 a 20.000 minicírculos (1,4

kb em média) variando nas diferentes cepas (MACINA et al, 1985; ENGLUND et al, 1996).

Além dos minicírculos, existem também cerca de 20 a 50 maxicírculos (40 kb em média)

onde estão presentes genes que codificam proteínas e rRNAs mitocondriais. Os maxicírculos

e minicírculos estão relacionados em um processo denominado de editoração que consiste em

uma reação que envolve os RNAs mensageiros (mRNA) codificados pelo maxicírculos, bem

como a transcrição de RNA guia (gRNA) dos minicírculos. Este processo de editoração

consiste na adição ou deleção de bases principalmente uridinas do mRNA para que possam

ser corretamente traduzidos (STUART, 1995; HAJDUK et al, 1996; LUKES et al, 2002).

Em 2005 foi publicado o primeiro esboço referente à montagem do genoma de T. cruzi. A

cepa utilizada para o seqüenciamento foi a CL Brener, por ser uma das mais bem

caracterizadas experimentalmente. No entanto, acabou se revelando como tendo um genoma

muito complexo, dificultando sua montagem. A cepa CL Brener é híbrida, sendo que dados de

diferentes grupos (ZINGALES et al., 1997; BRISSE et al., 1998; MACHADO & AYALA,

2001; GAUNT et al., 2003; BRISSE et al., 2003 EL-SAYED et al., 2005a) são consistentes

com o fato de que ela é resultante de dois eventos distintos de hibridização.

O seqüenciamento foi feito através da técnica de whole genome shotgun (WGS), sendo

que o alto conteúdo de repetições do genoma e a sua natureza híbrida limitaram a eficiência

da estratégia de seqüenciamento progressivo de clones em cromossomos artificiais de

bactérias. O conteúdo repetitivo do genoma de T. cruzi foi inicialmente estimado em 35%

(AGUERO et al., 2000), mas acabou revelando-se acima de 50% (EL-SAYED et al., 2005a).

A montagem final do genoma reflete esses problemas, pois contém uma quantidade muito

grande de fragmentos genômicos para os quais não se sabe a sua localização cromossômica

exata. Estima-se que a cepa CL Brener contenha aproximadamente 64 cromossomos e que o

tamanho de seu genoma seja de 87 Mb, com base em análise densitométrica da separação por

PFGE (CANO et al., 1995). No entanto, os resultados do projeto de seqüenciamento do

genoma estimam que o genoma diplóide esteja entre 106,4 e 110,7 Mb. Desse total, 67 Mb

foram selecionados para anotação, consistindo de 5489 scaffolds, contendo 8740 contigs, os

quais representam o estado extremamente fragmentado da atual versão do genoma. A análise

da fração anotada, que perfaz 60,7 Mb, demonstra que 30,5 Mb são compostos de seqüências

encontradas pelo menos duas vezes, o que sugere que elas são oriundas dos diferentes

haplótipos que compõe o genoma da cepa CL Brener.

Conforme mencionado acima, aproximadamente metade do genoma do T. cruzi é

composta por seqüências repetitivas como famílias de proteínas de superfície,

retrotransposons e elementos subteloméricos. Foram identificados 23.216 elementos

codificadores de proteínas dos quais 11.398 possuem função conhecida confirmada

experimentalmente ou por homologia, 9.975 genes codificam proteínas hipotéticas

conservadas e 1.843 genes codificam proteínas hipotéticas. Além disso, 1.994 genes

codificam RNAs estruturais dentre eles: tRNA (RNA transportador) rRNA (RNA

ribossomal), snRNA (RNA pequeno nuclear), slRNA (RNA líder), srpRNA (Signal

Recognition Particle), snoRNA (RNA pequeno nucleolar) (EL-SAYED et al., 2005a). Alguns

genes codificadores de proteínas e diversos RNAs funcionais e estruturais no T. cruzi mais de

duas cópias no genoma diplóide, podendo estar em um único cromossomo ou em diferentes

cromossomos. Muitos genes podem apresentar de 4 a 200 repetições, organizados

normalmente em tandem. Esta organização é vista em diversos genes codificadores de

proteínas e RNAs como, por exemplo: proteínas de superfície, ubiquitina, proteínas de choque

térmico (HSPs), histonas, calmodulina, tubulinas e amastina (GONZÁLES et al, 1985;

DRAGON et al, 1987; MAINGON et al, 1988; REQUENA et al, 1988; SWINDLE et al,

1988; ASLUND et al, 1994; CHUNG et al, 1994; TEIXEIRA et al, 1994; VASQUEZ et al,

1994).

A estimativa do conteúdo gênico é de aproximadamente 12.000, sendo que dos 23.216

modelos gênicos preditos, 6.159 representam alelos presentes no haplótipo IIb, 6.043

representam alelos dos outros haplótipos e 10.368 representam seqüências que não puderam

ser atribuídas a um haplótipo (EL-SAYED et al., 2005a).

Com relação à análise de vias biológicas presentes em T. cruzi e as suas diferenças com

relação a outros organismos, um dos resultados mais impressionantes foi a ausência de

diversas classes de proteínas sinalizadoras importantes, como proteínas G heterotriméricas,

receptores do tipo serpentina, domínios de interação SH2 e SH3 e fatores de transcrição

regulatórios. Por outro lado, T. cruzi possui um conjunto muito grande e complexo de

proteína-quinases e proteína-fosfatases. Cerca de 167 proteína-quinases distintas foram

encontradas em T. cruzi, potencialmente ativas, sendo esse número duas vezes maior que o

presente em P. falciparum (WARD et al., 2004) e 30% maior que o de S. cerevisiae. Uma

peculiaridade é que a maioria das proteína-quinases de tripanossomatídeos é muito maior do

que o necessário para conter um domínio catalítico simples, sugerindo a existência de

domínios acessórios ainda não identificados e que muito de suas interações ainda está por ser

descoberta.

Os genomas de outros dois tripanossomatídeos, T. brucei (BERRIMAN et al., 2005) e

Leishmania major (IVENS et al., 2005), também foram publicados recentemente, o que

permitiu fazer comparações entre os três patógenos, que compartilham muitas estruturas

celulares, mas que possuem diferenças grandes em sua forma de interagir com o hospedeiro.

A análise do proteoma compartilhado por esses organismos revelou um conjunto de 6.158

grupos de genes ortólogos (COG, clusters of orthologous genes), bem como 1.014 COGs

compartilhados por somente dois dos tripanossomatídeos (EL-SAYED et al., 2005b).

Mesmo tendo divergido há mais de 200 milhões de anos (OVERATH et al., 2001;

STEVENS et al., 2001), os genomas desses tripanossomatídeos apresentam um grau muito

grande de conservação da sintenia. De todos os genes de T. brucei e L. major, 68 e 75%

respectivamente mantém sua sintenia. Além disso, a grande maioria (94%) dos COGs triplos

que formam o proteoma central dos três tripanossomatídeos está em regiões de sintenia

conservada.

1.4 O Trypanosoma cruzi e a transcrição policistrônica

Em eucariotos, éxons e íntrons alternam-se ao longo dos genes. O fenômeno de

transcrição é, na maioria dos casos, regulado por uma seqüência promotora a montante da

região codificadora. Ao transcrito primário, em sua extremidade 5’, é adicionado um resíduo

metil-guanosina-trifosfato (m7Gppp, ou cap) e, em sua extremidade 3’, uma cauda poli-A.

Pela reação de cis-splicing, são removidos os íntrons deste transcrito e o éxons são ligados

(PROUDFOOT et al., 2002).

Os tripanossomatídeos apresentam diferenças com relação a esse perfil. Até

recentemente, não havia nenhum indício da existência de íntrons nos genes desses

organismos. Essa visão foi modificada em 2000, quando foi identificado um íntron em um

gene codificador da enzima poli-A polimerase de T. cruzi e T. brucei (MAIR et al., 2000). A

existência de uma maquinaria de remoção de íntrons foi comprovada pela identificação de um

gene codificador do snRNA U1 em T. brucei (DJIKENGI et al., 2001), sendo que

posteriormente foi possível realizar a identificação do complexo ribonucleoprotéico associado

a esse RNA (PALFI et al, 2002). Recentemente, os mesmos pesquisadores ampliaram a

descrição desse complexo, incluindo duas proteínas, pouco similares a seus prováveis

homólogos em outros eucariotos, denominadas U1-70K e U1C (PALFI et al., 2005). Embora

a maquinaria de cis-splicing esteja presente, ela apresenta diferenças estruturais grandes com

relação à dos eucariotos superiores, e, embora seja possível a existência de outros exemplos,

somente um gene foi identificado como possuindo íntron em tripanossomatídeos até o

momento.

Geralmente, os genes em tripanossomatídeos estão distribuídos nos cromossomos de tal

forma que é possível ter ilhas de genes codificados na mesma fita de DNA que se estendem

por dezenas a centenas de genes (McDONAGH et al., 2000; WORTHEY et al., 2003;

MONNERAT et al., 2004; NILSSON & ANDERSSON, 2005; EL-SAYED et al, 2005b).

Essa organização é conservada em grande parte dos genomas de T. brucei e L. major (EL-

SAYED et al., 2005b), os quais são os tripanossomatídeos com o genoma mais bem

caracterizado, e, possivelmente, o mesmo deve ocorrer para T. cruzi. A razão da conservação

evolutiva dessa organização ainda não é conhecida.

Normalmente, a distância entre as regiões codificadoras é pequena, o que, em vista da

existência de regiões 5´ e 3´ não-traduzidas (UTR), significa que a região intergênica é muito

pequena.

A transcrição nos tripanossomatídeos produz unidades policistrônicas (VANHAMME &

PAYS, 1995; TEIXEIRA & DaROCHA, 2003) que são representadas por uma única

molécula de RNA geralmente contendo diversos genes que não são relacionados a uma

determinada via metabólica, como ocorre nos operons de procariotos. Além disso, os genes de

uma mesma unidade de transcrição policistrônica podem apresentar diferenças grandes nos

níveis de expressão, demonstrando a importância de mecanismos pós-transcricionais no

controle da expressão gênica (VANHAMME & PAYS, 1995). A molécula de RNA

policistrônica deve ser processada pelo mecanismo do trans-splicing (SUTTON &

BOOTHROYD, 1986), a fim de gerar unidades monocistrônicas traduzíveis.

No processo de trans-splicing, semelhante ao processo de cis-splicing, as unidades

codificadoras são separadas e é adicionada na extremidade 5’ uma seqüência extremamente

conservada, espécie-específica, de 39 nucleotídeos, denominada seqüência líder (SL) ou mini-

éxon (McCARTHY-BURKE et al., 1989; NILSEN, 1992). Nesta reação, participam duas

moléculas de RNA, uma doadora e outra aceptora. A doadora é um precursor do mini-éxon, e,

em T. cruzi, possui cerca de 110 nucleotídeos (ZWIERZYNSKI & BUCK, 1991). A aceptora

é o transcrito derivado da unidade policistrônica ao qual o mini-éxon é transferido. O

complexo enzimático envolvido nesta reação é semelhante ao descrito para a de cis-splicing

(LAIRD, 1989).

Os transcritos processados são estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-éxon (ULLU &

TSCHUDI, 1991) e pela adição de uma cauda poli-A, à extremidade 3’, sendo que a adição de

ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et al., 1993). Regiões ricas em

resíduos de pirimidinas, além da seqüência consenso (AG) para o trans-splicing, regulam a

adição do mini-éxon e da cauda poli-A. Deleções nestas regiões impedem o correto

processamento destes transcritos (MATTHEWS et al., 1994).

Os três tipos de RNA polimerase, I, II e III, descritos em eucariotos superiores, já foram

observados em tripanossomatídeos (CORNELISSEN et al., 1989; CORNELISSEN et al.,

1990; KOCK & CORNELISSEN, 1991). Os genes que codificam para as suas subunidades

principais foram clonados e caracterizados nestes protozoários (EVERS et al., 1989; JESS et

al., 1989; KOCK et al., 1988; SMITH et al., 1989). Embora tenham sido encontradas poucas

diferenças estruturais em relação às RNA polimerases de eucariotos superiores, destacando-se

a modificação da extensão terminal da RNA polimerase do tipo II, esta comporta-se de

maneira diferente em presença de inibidores específicos como, por exemplo, a α-amanitina.

Do mesmo modo, apresentam diferenças na dependência de Mn

, na utilização de fita

simples e no reconhecimento de promotores específicos. Em T. cruzi, apenas promotores

associados a genes ribossomais e ao mini-éxon foram caracterizados (DIETRICH et al., 1993;

NUNES et al., 1997). A atividade destes promotores de T. cruzi parece ser controlada por

fatores de transcrição que são cepa-específicos. Assim, o promotor ribossomal da cepa CL

não é funcional em outras cepas (TYLER-CROSS et al., 1995; NUNES et al., 1997). Em

outros tripanossomatídeos, promotores equivalentes e fatores de transcrição associados foram

descritos e caracterizados (DAS & BELLOFATTO, 2003; LANDFEAR, 2003).

Nestes parasitas, de modo geral, a RNA polimerase I transcreve os genes ribossomais e a

RNA polimerase III transcreve moléculas de RNA nucleolar e de transferência. Os genes do

mini-éxon são transcritos pela RNA polimerase II (GILINGER & BELLOFATTO, 2001), a

qual também transcreve os mRNAs. Contudo, as polimerases e os promotores associados à

transcrição dos genes que codificam proteínas ainda não foram identificados (LANDFEAR,

2003).

1.5 A regulação da expressão gênica em T. cruzi

Na maioria dos eucariotos, a regulação da expressão gênica é, em grande parte, realizada

no início da transcrição pela RNA polimerase II, sendo esta a enzima responsável pela

transcrição de genes codificadores de proteínas e genes de pequenos RNAs nucleares

envolvidos no processamento de outros RNAs. Os rRNAs 18S e 28S são transcritos pela

RNA polimerase I e a RNA polimerase III transcreve genes codificadores de tRNA, rRNA 5S

e pequenos RNAs nucleares e citoplasmáticos. No T. cruzi, a RNA polimerase I é responsável

pela transcrição de alguns genes codificadores de proteínas sendo esta a principal diferença

quando comparadas a outros eucariotos. Outra grande diferença é que aparentemente não

existe em tripanossomatídeos regulação por promotores específicos para polimerase II. Há

evidências de que a transcrição da maioria dos genes codificadores de proteínas é ubíqua

(VANHAMME & PAYS, 1995; CLAYTON, 2002). Com relação aos promotores, em

tripanossomatídeos não há evidências de sua existência para os genes codificadores de

proteínas, tendo sido identificados somente para os genes do mini-éxon. Assim, os

mecanismos de regulação da expressão gênica possivelmente ocorrem etapas posteriores à

transcrição, no que é denominado de regulação pós-transcricional.

Conforme descrito acima, a expressão gênica em T. cruzi apresenta diversas

características peculiares, como a transcrição policistrônica, o processo de trans-splicing

(editoração do RNA mensageiro), a edição do RNA mitocondrial e a transcrição dos genes

codantes de proteínas pela RNA polimerase do tipo I e a ausência de seqüências promotoras

típicas (TEIXEIRA & daROCHA, 2003). Todos esses elementos reforçam a idéia de que a

regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos possui características distintas com

relação à de outros organismos. O fato de que genes presentes na mesma unidade

policistrônica apresentam níveis de mRNA processado distintos reforça a idéia de que a

regulação seja ao nível pós-transcricional. Estas características específicas dos

tripanossomatídeos juntamente com a relevância médica o tornam um bom alvo para estudo

visando a melhor compreensão de sua biologia como, por exemplo, os mecanismos de

controles transcricionais e pós-transcricionais.

As formas epimastigotas e amastigotas, quando iniciam o processo de diferenciação para

as formas não replicativas e infectivas, apresentam uma grande diminuição na atividade da

RNA polimerase I e II, porém a redução no nível de transcrição é geral e não gene dependente

(ELIAS et al., 2001). Deste modo, é possível observar que a expressão de alguns genes pode

manter-se constante ou aumentar, mesmo com a queda dos níveis de transcrição (ABUIN et

al., 1999; TOMAS & KELLY, 1996; RECINOS et al., 2001). Também é possível observar

proteínas de expressão transiente nas formas em diferenciação (CONTRERAS et al., 1985).

Em T. cruzi, foi demonstrado que moléculas de RNA mensageiro podem ser mantidas

estáveis e não associadas a polissomos, desmobilizadas no citoplasma, sendo passíveis de

tradução in vitro (GOLDENBERG et al., 1985). Há evidências de que o controle da

associação à maquinaria de tradução seja o mecanismo principal na expressão de alguns genes

diferencialmente expressos durante a metaciclogênese de T. cruzi (ÁVILA et al., 2001;

DALLAGIOVANNA et al., 2001; FRAGOSO et al., 2003).

Além disso, experimentos realizados com o gene da amastina de T. cruzi e Leishmania

indicam que a sua expressão é dependente de seqüências contidas em sua região 3’-UTR. Tais

seqüências seriam responsáveis pela associação desta molécula de RNA mensageiro aos

polissomos e pelo aumento de sua taxa de tradução, sem que a estabilidade deste transcrito

fosse alterada (TEIXEIRA et al.,1994; TEIXEIRA et al.,1995; COUGHLIN et al., 2000;

BOUCHER et al., 2002).

A relevância da porção 3’-UTR na regulação da expressão gênica também pode ser

avaliada em experimentos de transfecção envolvendo genes estágio-específicos (gp85 em

tripomastigotas sangüíneos e amastigotas, gp72 em epimastigotas, gp82 em tripomastigotas

metacíclicos) ou de expressão constitutiva (gGAPDH e hsp60) e o gene da luciferase, como

gene repórter. Nestes ensaios, a região 3’-UTR dos genes em estudo foram inseridas logo

depois do gene da luciferase e, após a transfecção das diferentes formas evolutivas de T. cruzi

com estas construções, foi possível observar que construções com as regiões 3’-UTR

específicas justapostas ao gene da luciferase tiveram padrão de expressão idêntico aos de seus

genes de origem (NOZAKI & CROSS, 1995).

Por outro lado, há descrições de que a estabilidade dos transcritos de certos genes em

tripanossomatídeos varia ao longo do ciclo celular, alterando a sua expressão (HEHL et al.,

1994; BERBEROF et al., 1995; BLATTNER & CLAYTON, 1995; NOZAKI & CROSS,

1995; TEIXEIRA et al., 1995). Muitos fatores que contribuem para esta estabilidade foram

caracterizados (CLAYTON, 2002; D´ORSO et al., 2003; SBICEGO et al., 2003).

Seqüências presentes nas regiões intergênicas e 5’-UTR também podem estar

relacionadas à regulação da expressão gênica em T. cruzi. Recentemente, foi descrita uma

proteína que reconhece especificamente motivos poli [dT-dG] em fitas simples de

polinucleotídeos, os quais são muito freqüentes nas regiões intergênicas de T. cruzi, e que

pode estar envolvida em mecanismos de regulação gênica (DUHAGON et al., 2003).

1.6 A metaciclogênese

Durante o seu ciclo evolutivo o T. cruzi alterna entre diferentes tipos morfológicos com

propriedades características, incluindo a infectividade para o hospedeiro vertebrado (DE

SOUZA, 1984). Assim, o estudo do processo de diferenciação, além de permitir a melhor

compreensão de um fenômeno biológico básico, pode levar à identificação de alvos e

processos com potencialidade de contribuir na busca de agentes profiláticos para a doença de

Chagas. Nesse sentido, avanços significativos foram alcançados na tentativa de simular em

laboratório as condições naturais que podem levar o parasita a se diferenciar, possibilitando o

estudo da reprogramação gênica a que estes organismos são submetidos durante o processo de

diferenciação, sobretudo para as formas infectivas.

Uma etapa crucial do ciclo de vida do T. cruzi é a metaciclogênese, onde formas não

infectivas, epimastigotas, diferenciam-se em formas infectivas, tripomastigotas metacíclicas

(DE SOUZA, 1984). Esse processo é um modelo apropriado para o estudo dos mecanismos

envolvidos na regulação da diferenciação e da expressão gênica no parasito. Uma etapa

essencial para o aprofundamento do estudo desse processo biológico foi o desenvolvimento

de um meio com condições quimicamente definidas que mimetizam o processo que ocorre no

inseto vetor da doença de Chagas (CONTRERAS et al., 1985; BONALDO et al., 1988),

usando-se como padrão a cepa Dm28c de T.cruzi (CONTRERAS et al., 1988). A

compreensão desta etapa do ciclo do parasita sempre foi objeto de grande interesse pelo

potencial de contribuir para a elucidação dos mecanismos que modulam a expressão de genes

estágio-específicos, um processo de diferenciação e o estabelecimento da infectividade do

parasita.

A diferenciação de epimastigotas a tripomastigotas metacíclicos requer a adesão dos

epimastigotas a um substrato (BONALDO et al., 1988), semelhante ao que foi descrito para o

processo de metaciclogênese no interior do triatomíneo (SCHAUB, 1988). Os fenômenos de

adesão e de diferenciação celular são interrompidos se, após um período de estresse

nutricional, as condições de nutrição forem restauradas. Deste modo, é possível que o estresse

nutricional esteja associado à expressão de proteínas de adesão (FIGUEIREDO et al., 2000).

De fato, a metaciclogênese no inseto vetor ocorre na porção terminal do intestino do

triatomíneo onde ocorre a diminuição dos nutrientes devido a absorção dos mesmos pelo

inseto, bem como a utilização dos nutrientes pelos parasitas. Além disso, períodos sem

ocorrência de alimentação ocorrem ocasionando o estresse nutricional (KOLLIEN &

SCHAUB, 2000). Estudos de metaciclogênese in vitro demonstram a importância do estresse

nutricional no disparo da diferenciação (CONTRERAS et al., 1985). A escassez de nutrientes

está associada ao processo de acidificação do conteúdo do reservossomo e de ativação de suas

enzimas, com a degradação das proteínas acumuladas nessa organela, o que leva ao seu

desaparecimento, com a liberação dos aminoácidos para o citoplasma (SOARES et al., 1989;

URBINA, 1994; SOARES, 1999).

É razoável presumir que durante o processo de adesão, que é necessário porém não

suficiente para a diferenciação (BONALDO et al, 1988; KLEFFMANN et al., 1998), os

parasitas tenham a sua expressão gênica alterada a partir de sinais externos oriundos do

processo de adesão (GOLDENBERG et al., 1985). Outros fatores também foram descritos

como capazes de induzir o processo de metaciclogênese, tais como fatores séricos

(CONTRERAS et al., 1985, DUSANIC, 1980) e estresse nutricional (CASTELLANI et al.,

1967; CONTRERAS et al., 1985). Um fator importante como desencadeador da

metaciclogênese do T.cruzi é o AMP cíclico (cAMP) (GONZALES-PERDOMO et al., 1988),

já que aumentos na concentração intracelular deste elemento levam à transformação de

epimastigotas em tripomastigotas metacíclicos. O mecanismo através do qual o cAMP exerce

o seu efeito permanece indeterminado. Todavia é interessante notar que foram observadas

alterações nos níveis de expressão de proteína-quinases (ULLOA et al., 1988; OCHATT et

al., 1993), indicando o envolvimento de mensageiros secundários e a transdução de sinal

durante o processo.

No caso da metaciclogênese no inseto vetor, o cAMP é excretado pelo túbulos de

Malpighi (KOLLIEN & SCHAUB, 2000) e a atividade de adenilato ciclase é estimulada por

hemoglobina, normalmente encontrada no intestino do inseto vetor (FRAIDENRAICH et al.,

1993). Interessantemente, peptídeos sintéticos correspondentes à seqüência de alfa-globina

foram capazes de estimular a metaciclogênese quando adicionados à dieta dos triatomíneos

(GARCIA et al., 1995).

Outra alteração metabólica observada durante a metaciclogênese refere-se ao acúmulo de

lipídios e à mudança de composição lipídica do parasita, havendo redução dos níveis dos

ácidos mirístico e linoléico e aumento das concentrações dos ácidos palmítico, esteárico e

linolênico (ESTEVES et al., 1989). Logo após serem submetidas ao estresse nutricional in

vitro, as células em diferenciação são mais semelhantes às tripomastigotas do que às

epimastigotas, considerando o seu conteúdo lipídico (SOARES et al., 1989; ESTEVES et al.,

1989). Estas mudanças são também acompanhadas por modificações nos açúcares de

superfície (DE ANDRADE et al., 1991), acarretando em modificações na permeabilidade e

fluidez de membrana dos parasitos.

O processo de metaciclogênese também acarreta modificações no perfil de expressão

gênica dos parasitas, e as alterações no padrão de genes expressos podem preceder as

alterações morfológicas que ocorrem no processo de diferenciação (CONTRERAS et al.,

1985). Os níveis de transcrição são reduzidos durante o processo (GOLDENBERG et al.,

1985) e vários genes são transitoriamente expressos, com um perfil de regulação de sua

expressão nitidamente pós-transcricional, sendo que alguns deles foram caracterizados como

tendo seu mecanismo de regulação através de sua mobilização diferencial para os polissomos

(ÁVILA et al., 2001; DALLAGIOVANA et al., 2001; FRAGOSO et al., 2003). Seis horas

depois do início do processo de diferenciação, as formas epimastigotas em diferenciação

apresentam-se resistentes à lise pelo complemento, uma propriedade das formas

tripomastigotas metacíclicas (NOGUEIRA et al., 1975).

Outros fatores também foram descritos como capazes de afetar o processo de

diferenciação. Assim, inibidores de poli-ADP ribosilação (ISOLA et al., 1987) ou inibidores

de proteases (BONALDO et al., 1991) inibem o processo de diferenciação enquanto a L-

prolina estimula a diferenciação (CONTRERAS et al., 1985; HOMSY et al., 1989). É

interessante ressaltar que a L-prolina também foi descrita como um fator de estimulação da

diferenciação de amastigotas em tripomastigotas no interior das células do hospedeiro

vertebrado (TONELLI et al., 2004).

A presença e a concentração dos íons Ca

, K

, PO

e HCO

facilitam a

metaciclogênese, enquanto o ânion Cl

a impede (KRASSNER et al., 1991). As concentrações

de polifosfatos inorgânicos de cadeia longa e curta, nos acidocalcissomos do T. cruzi, elevam-

se durante a amastigogênese e na fase estacionária de crescimento das formas epimastigotas.

Estas concentrações são reduzidas em condições de estresse hiposmótico ou alcalino. A

hidrólise destas cadeias está associada à liberação de Ca

pelos acidocalcissomos e a

respostas rápidas do parasita às alterações ambientais. Portanto, os polifosfatos também

podem estar envolvidos na regulação da metaciclogênese (RUIZ et al., 2001).

A indução da metaciclogênese em meio quimicamente definido permite isolar células em

vários estágios de diferenciação. In vitro, a transferência de epimastigotas de um meio

nutricional rico para um meio sem qualquer fonte de carbono gera o estresse nutricional

necessário para o começo do processo (CONTRERAS et al., 1985; BONALDO et al., 1988;

CONTRERAS et al., 1988). Há duas décadas, a metaciclogênese in vitro tem sido o modelo

principal do nosso grupo, o qual está sendo utilizado para caracterizar a expressão gênica nas

diferentes etapas da metaciclogênese em T. cruzi e estudar os seus mecanismos de regulação

da expressão gênica (ÁVILA et al., 2003).

1.7 O estudo genômico funcional de T. cruzi

A partir de meados da década de 80, com a iniciativa do projeto genoma, inúmeros

organismos foram alvos de seqüenciamento genômico. Muitos consórcios para mapeamento e

seqüenciamento foram estabelecidos, e vários destes projetos já foram finalizados e diversos

outros estão em andamento. Com relação ao T. cruzi, o seqüenciamento já foi terminado e

publicado o primeiro esboço referente à montagem do seqüenciamento, conforme relatado

anteriormente. O próximo desafio após esta etapa consiste em compreender como os

conjuntos gênicos interagem através da regulação da expressão do genoma em diferentes

situações de interação do organismo com o ambiente e outros organismos. O principal

objetivo é compreender o funcionamento celular, visando o desenvolvimento de novas

abordagens terapêuticas, como vacinas e drogas, e melhoramentos no campo da agropecuária

e biotecnologia. O conhecimento apenas das seqüências gênicas e suas funções não garante a

compreensão dos processos acima citados, sendo necessário uma abordagem ampla, através

de inúmeras ferramentas que estão surgindo e sendo melhoradas constantemente (DHAND,

2000; LOCKHART & WINZELER, 2000; DEGRAVE, 2001; BLAXTER & IVENS, 1999;

YANG & SPEED, 2002). Visto esta necessidade, o Instituto de Biologia Molecular do Paraná

(IBMP) investiu em uma abordagem genômica funcional, primeiramente com a implantação

da plataforma de microarranjo de DNA bem como investimentos na área de bioinformática.

A técnica de microarranjo foi descrita inicialmente por SCHENA et al. (1995), em um

artigo descrevendo a aplicabilidade da técnica na quantificação de um conjunto restrito de

genes de Arabidopsis thaliana. Na sua forma mais geral, um arranjo de DNA é usualmente

um substrato, uma membrana de náilon ou nitrocelulose, vidro ou plástico, sobre o qual são

depositados diversos DNAs fita simples distintos com seqüências diferentes. Usualmente,

esse DNA é colocado de forma a criar estruturas localizadas que são arranjadas em um padrão

regular, semelhante a uma grade, dando-se o nome de sonda ao material que é depositado na

superfície do substrato. Se a quantidade de sondas distintas é grande e são utilizados sistemas

de produção robótica, as quais permitem a criação de uma densidade muito alta de sondas em

uma região muito pequena do substrato, dá-se o nome de microarranjo de DNA ao arranjo de

DNA resultante.

O material a ser colocado no microarranjo pode ser de diferentes tipos, de acordo com o

propósito do mesmo. Atualmente, os três tipos mais comumente encontrados de microarranjo

são os que contém como sonda produtos de PCR dupla fita (geralmente, oriundos de

bibliotecas de cDNA), oligonucleotídeos fita simples longos (entre 45 e 70 mer) e

oligonucleotídeos fita simples curtos (geralmente menores que 30 mer). Essas sondas

geralmente são complementares a regiões do genoma que codificam proteínas e, portanto, os

microarranjos são principalmente focados para a avaliação do transcriptoma codificador de

proteínas, embora qualquer tipo de avaliação por hibridação de ácidos nucléicos possa ser

implementado.

O microarranjo é colocado em contato com uma solução contendo a população de mRNA

que desejamos estudar, a qual é denominada normalmente de alvo, e essa preparação é

deixada sobre controle rigoroso de temperatura para que o pareamento das regiões

complementares na sonda e no alvo, que estão ambos em fita simples, possa ocorrer, no

fenômeno denominado hibridação. Após ocorrer a hibridação, as moléculas do alvo que não

estão pareadas ou que apresentem pareamento fraco são retiradas através de lavagens

sucessivas, que afetam fracamente a ligação dos alvos corretamente pareados com a sonda.

Finalmente, a ocorrência da hibridação é passível de ser quantificada, pois as moléculas da

população alvo foram marcadas com a adição de agentes fluorescentes ou radioativos, cujo

sinal pode ser captado por dispositivos especializados.

Recentemente, PROBST (2005) avaliou o transcriptoma de T. cruzi durante o processo de

metaciclogênese através do uso de um microarranjo de DNA contendo aproximadamente

6.200 sondas, desenvolvido no IBMP. Cerca de 1.500 genes foram identificados como

diferencialmente expressos durante esse processo, sendo que aproximadamente 700 são

proteínas hipotéticas.

Estes resultados constituem a primeira avaliação em larga escala da regulação dos

mecanismos de transcrição e tradução dos mRNAs. A complementação dessa análise com

outras abordagens relativas a diferentes níveis de organização biológica, como caracterização

protéica, interação entre proteínas, entre outros, permitirá a obtenção de resultados mais

robustos e com maior impacto no entendimento da biologia molecular do T. cruzi.

Dentre os métodos de análise em larga escala que complementam os resultados de

microarranjos, um dos mais diretamente relacionados e que pode ser feito, atualmente, de

maneira relativamente fácil, é a proteômica ou estudo do proteoma. Primeiramente o termo

proteoma foi utilizado para descrever conjuntos de proteínas codificadas pelo genoma

(WILKINS et al, 1996). Porém, atualmente a proteômica engloba não só a descoberta das

proteínas de uma célula, mas também a investigação de isoformas, modificações protéicas,

interações entre elas, descrição estrutural, construções de modelos de vias ou mapas de

interações (EISENBERG et al, 2000; PATTERSON & AEBERSOLD, 2003; TYERS &

MANN, 2003), entre outros.

A proteômica constitui-se em uma rica fonte de informação biológica decorrente do

envolvimento das proteínas em quase todas atividades biológicas, acrescido das diversas

propriedades que combinadas geram sistemas de grande complexidade. Baseado nisto, a

proteômica pode propiciar o entendimento dos mais variados sistemas biológicos. Esta

abordagem, bem como as outras abordagens referentes a genômica funcional, são

consideradas como sendo uma discovery science, ou seja, uma ciência baseada em

descobertas e não em hipóteses, com um enfoque mais investigativo, normalmente

fundamentadas na geração e obtenção de um grande número de dados, para permitir uma

visão mais ampla e completa dos processos. Por exemplo, o número de resultados

provenientes dos estudos de microarranjo gerou uma base de dados muito grande, permitindo,

juntamente com abordagens complementares, sugerir ou comprovar novas hipóteses. Em

resumo, com este grande número de resultados obtidos, pode-se integrar os dados, formular

teorias e caracterizar os mais variados sistemas (PATTERSON & AEBERSOLD, 2003). Ao

mesmo tempo, o excesso de resultados gerados bem como suas interrelações, podem gerar

dificuldades na comprovação biológica devido a grande complexidade.

A partir desta nova perspectiva, o objetivo principal é determinar como, quando e sobre

quais condições as proteínas foram geradas, modificadas, agregadas a complexos e

degradadas. Embasada por diversas técnicas de estudo, a proteômica abriu um campo sem

precedentes para pesquisas e seu uso é extremamente extenso. Muitos trabalhos já foram

publicados e é difícil se ter um panorama da sua aplicação, devido a sua extensão. Por

exemplo, em humanos já existem trabalhos mostrando resultados da análise proteômica do

nucléolo (ANDERSEN et al., 2002), da resposta ao interferon por células do fígado (YAN et

al., 2004), de estudo de nefropatia causada por diabete (THONGBOONKERD et al., 2004,

análise proteômica de câncer de ovário (WANG et al.,2004), entre outros.

Com relação à proteômica direcionada aos estudos de parasitas, existem também

inúmeras publicações com diversos parasitas e abordagens, como por exemplo, o estudo de

novos alvos terapêuticos e da resistência de Plasmodium falciparum (COOPER & CARUCCI,

2004), complexo de adesão do Toxoplasma gondii (ZHOU et al, 2004) e diferenciação de

estágio evolutivo de Leishmania mexicana (NUGENT et al, 2004). No caso do T. cruzi, a

avaliação proteômica das formas do ciclo evolutivo já foi publicada, evidenciando-se algumas

proteínas diferencialmente expressas (PABA et al, 2003, PABA et al, 2004; PARODI-

TALICE et al, 2004; ATWOOD et al., 2005).

Baseados na necessidade de obtenção de mais dados para serem agregados aos dados

provenientes da genômica e proteômica, visando a melhor compreensão dos processos

celulares e moleculares, diversas outras abordagens estão surgindo como, por exemplo,

metaboloma, ORFeoma, ribonoma, interatoma, entre outros. Todas elas geram um número

ainda maior de dados permitindo uma visão mais completa, ou sistêmica, dos processos

biológicos, dentro de uma nova área de pesquisa denominada biologia de sistemas (system

biology).

1.8 Proteínas hipotéticas em T. cruzi

Com a liberação dos dados do seqüenciamento do genoma, foi possível fazer uma análise

utilizando-se ferramentas de predição gênica para avaliar a classificação funcional de

proteínas. No caso do T. cruzi, sendo um organismo relativamente pouco estudado e distante

evolutivamente dos modelos biológicos mais clássicos, muitas regiões codificadoras preditas

não tiveram uma anotação funcional confiável e foram classificadas genericamente como

proteínas hipotéticas. Esse conjunto de genes, constituindo 52,3% das 22.570 proteínas

identificadas, é dividido em dois grupos, denominados hipotéticas conservadas, as quais

apresentam ortólogos em outros organismos, ou somente hipotéticas que, a princípio, seriam

restritas a T. cruzi. A proporção de proteínas hipotéticas de T. cruzi é alta, mas não difere

muito de outros organismos, mesmo aqueles melhor estudados.

Quando analisamos as formas infectivas, tripomastigotas e tripomastigotas metacíclicas

por microarranjo, observamos que uma grande proporção dos genes aumentados nessas fases

é composta por codificadores de proteínas hipotéticas. Portanto, para um melhor

entendimento do processo de metaciclogênese, é essencial o esclarecimento funcional das

proteínas codificadas por esses genes, por seu interesse biológico e pelo potencial como alvo

para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias.

2 Objetivos

2.1 Objetivo geral

Caracterizar genes codificadores de proteínas hipotéticas diferencialmente expressas em

tripomastigotas metacíclicos, selecionados a partir de dados provenientes da análise do ciclo

de vida de T. cruzi obtidos através da metodologia de microarranjo de DNA.

2.2 Objetivos Específicos

• Avaliar o perfil das proteínas hipotéticas diferencialmente expressas durante a

metaciclogênese;

• Selecionar genes codificadores de proteínas hipotéticas, baseado no perfil de

expressão diferencial;

• Avaliar características bioinformáticas das proteínas hipotéticas identificadas

como diferencialmente expressas durante o processo de metaciclogênese de T.

cruzi;

• Clonar os genes selecionados utilizando a metodologia Gateway®;

• Expressar os genes selecionados em E. coli;

• Obter anticorpos policlonais a partir das proteínas recombinantes expressas;

• Realizar ensaios de Western blot utilizando os soros obtidos;

• Analisar os dados de Western blot pela extração de intensidade a fim de verificar

variações durante a metaciclogênese e sua correspondência com as mudanças do

transcriptoma;

• Realizar imunolocalização por microscopia óptica a partir dos anticorpos

policlonais obtidos.

3 Justificativas

O protozoário flagelado T. cruzi é o causador da doença de Chagas, que atualmente,

atinge 17 milhões de pessoas em 21 países do continente americano, com 120 milhões de

pessoas correndo o risco de contaminação. Apesar de ser estudado há mais de noventa anos

sobre os diferentes aspectos envolvidos em sua patologia, sendo um dos parasitas mais

estudados, não existem vacinas ou medicamentos efetivos para o tratamento da doença. Na

escala evolutiva, o T. cruzi é classificado como um dos organismos eucarióticos mais antigos.

Algumas de suas características genômicas são peculiares, como por exemplo, mecanismos

singulares de expressão gênica, trans-splicing e editoração do RNA.

Inserido no ciclo evolutivo do parasita, o processo de diferenciação celular da

metaciclogênese é uma etapa importante onde ocorrem transformações estruturais e

bioquímicas já conhecidas. Sabendo-se que a diferenciação celular se dá com a transformação

de uma forma não infectante (epimastigota) para uma forma infectante (tripomastigota

metacíclico), é de extrema importância a compreensão dos mecanismos envolvidos com a

regulação da expressão gênica do parasita nesta fase do ciclo evolutivo.

Além disto, a velocidade com que novos genomas têm sido seqüenciados faz com que o

acúmulo de dados de seqüências de DNA não possa ser acompanhado no mesmo ritmo pela

elucidação da funcionalidade dos elementos neles codificados. A técnica de microarranjo

representa uma abordagem que visa, de forma inicial, categorizar a importância funcional

dessa informação.

Através de análise de clusterização hierárquica, por exemplo, é possível fazer inferências

sobre a função gênica. Entretanto, um grande número dos genes seqüenciados permanece

como codificadores de proteínas cuja função, em maior ou menor grau, é desconhecida.

Baseado neste panorama, a escolha de grupos gênicos co-regulados a partir dos dados obtidos

pela metodologia de microarranjo e programas de clusterização permite uma escolha bastante

robusta para a seleção de genes candidatos para a clonagem e caracterização funcional,

agregando assim um maior conhecimento acerca dos genes e possibilitando novas inferências

sobre as vias biológicas e suas interações.

Sendo assim, juntando esforços ao aumento do conhecimento referente ao T. cruzi, pode-

se salientar a necessidade da produção do ORFeoma, abordagem esta que permitirá agregar

outros aspectos com os dados de genômica e proteômica, já que o IBMP está desenvolvendo

vetores para o próprio T. cruzi, visando análises de co-localização, super-expressão, interação

e formação de complexos protéicos. Neste sentido, visando à implantação posterior de uma

plataforma mais robusta para a construção de uma biblioteca de clones, o presente trabalho

também visa identificar o conhecimento necessário para adquirir experiência de formação nas

técnicas utilizadas, juntamente com o desejo de se obter dados para comprovação de

resultados provenientes do microarranjo de DNA e proteômica desenvolvidos no IBMP.

Justificando e exemplificando a necessidade da produção do ORFeoma de T. cruzi, os

vetores que estão sendo desenvolvidos podem gerar dados, por exemplo, de localização e co-

localização celular, baseado em tecnologias de clonagens que permitem ingressar em

plataformas high-throughput com grande facilidade (RUAL et al,2004). Os dados de

localização celular podem fornecer vários indícios de função, estado de ativação, interação

com outras moléculas, fatores estes que podem indicar eventos de sinalização celular,

progressão do ciclo celular e mudanças ambientais (O’ROURKE et al, 2005).

4 Material e Métodos

A análise do processo de metaciclogênese pelo uso de microarranjos de DNA, através da

perspectiva de genômica funcional, foi realizada anteriormente no IBMP em uma tese de

doutoramento (PROBST, 2005). Devido à relevância da estruturação e resultados desse

trabalho para o desenvolvimento da presente dissertação, optou-se por fazer uma descrição

sucinta das etapas e informações essenciais contidas no mesmo, sendo importante reforçar que

essas etapas laboratoriais não foram realizadas no presente trabalho, mas por haver uma forte

ligação entre os mesmos, no sentido de continuidade, estão descritas em material e métodos.

O presente trabalho teve como ponto de partida o ítem 4.4 utilizando os resultados anteriores

de PROBST, 2005.

4.1 Confecção dos microarranjos de DNA

O nosso grupo trabalha com microarranjos desde 2001, quando saíram os primeiros

resultados preliminares utilizando esta metodologia. Desde 2003, possuímos a capacidade

plena do processo de produção e toda a manufatura e produção dos resultados, bem como

análise do microarranjo é feita no IBMP.

O microarranjo de Trypanosoma cruzi se encontra atualmente na sua versão 5.1

possuindo uma cobertura aproximada de 7000 genes.

4.2 Arquitetura do microarranjo

As sondas, compostas a partir de bibliotecas de EST de T. cruzi, em um total de 6.198

elementos, estão presentes em cada lâmina em três réplicas, cada uma delas contendo 16

setores de 20 colunas e 20 linhas, num total de 6.400 posições disponíveis, sendo que as

posições restantes (n=202) estão ocupadas por solução de espotagem (DMSO 50%), como

controle de fluorescência basal, ou vazias. Os 6.198 spots podem ser divididos em:

• 3.552 sondas individuais, amplificadas de DNA genômico de T. cruzi, oriundas da

segunda versão do microarranjo, obtidas a partir dos dados de EST disponíveis no

Genbank no ano de 2000.

• 2.354 sondas individuais, amplificadas de insertos em vetor Topo T-A (Invitrogen),

referentes à biblioteca de EST de epimastigotas, epimastigotas em estresse nutricional,

epimastigotas aderidos em 24 horas de diferenciação e tripomastigotas metacíclicos,

produzida no IBMP (PICCHI & PROBST, em preparação).

• 144 sondas referentes a 12 genes selecionados como controles de hibridação, por

apresentarem uma intensidade de sinal muito forte nos primeiros experimentos feitos.

(n= 8 a 20 sondas por gene, em número variável).

• 134 sondas referentes a genes selecionados, incluídos por serem de interesse às linhas de

pesquisa de outros grupos do IBMP ou colaboradores.

• sondas referentes ao genoma do endossimbionte de Crithidia deanei, utilizados como

controles negativos de DNA.

• 10 produtos da amplificação do gene Q do bacteriófago λQ, usado como controle

negativo ou positivo externo, caso adicionado o mRNA do gene à preparação do

material a ser hibridado.

Devido à complexidade e redundância da montagem atual do genoma de T. cruzi, é

possível fazer somente uma estimativa dos genes distintos que são reconhecidos por essas

sondas. Nossas estimativas atuais demonstram que um número mínimo de 4.000 e um

máximo de 5.000 genes estão sendo avaliados pela versão atual do microarranjo de T. cruzi.

4.3 Desenho experimental

Foram realizados dois experimentos distintos de metaciclogênese, denominados Met16 e

Met19. Em cada experimento, foram obtidas as amostras epimastigotas (Epi), epimastigotas

em estresse nutricional (Str), epimastigotas aderidos e em diferenciação por 3, 12 e 24 horas

(3h, 12h e 24h), das quais foram extraídos mRNA total e polissomal da mesma amostra

biológica.

Todos os pontos de cada metaciclogênese são oriundos do mesmo conjunto inicial de

epimastigotas em fase logarítmica de crescimento (Epi), para que as diferenças biológicas

inerentes a cada réplica biológica de metaciclogênese pudessem ser homogeneizadas

internamente.

As amostras de tripomastigotas metacíclicos foram obtidas separadamente das

metaciclogêneses descritas acima, constituindo-se em duas réplicas biológicas, as quais foram

comparadas com os epimastigotas de Met16 e Met19.

Cada metaciclogênese foi hibridada com microarranjos oriundos do mesmo lote de

fabricação, sendo utilizados três lotes distintos. As hibridações entre epimastigotas e

tripomastigotas metacíclicos foram realizadas com microarranjos provenientes de um quarto

lote.

Os diagramas representativos das hibridações realizadas podem ser vistos na Figura 4.1.

Figura 4.1 Desenho experimental das hibridações realizadas.

Met 16 e Met 19 são denominações de diferentes ensaios de metaciclogênese

Cada uma das unidades demonstradas na Figura 4.1 foi feita para as amostras de mRNA

total e polissomal correspondentes. A descrição de cada uma das unidades experimentais é a

seguinte:

Met19: nessa réplica biológica da metaciclogênese, foi utilizado o desenho em loop

clássico, descrito por KERR & CHURCHILL (2001). Nesse desenho experimental, cada

amostra é hibridada quatro vezes, com cada uma das outras quatro amostras do desenho,

sendo que o número de marcações é balanceado, isto é, cada amostra foi marcada o mesmo

número de vezes com cada um dos dois fluoróforos.

Met16: para essa réplica biológica da metaciclogênese, foi acrescentado ao loop clássico

uma hibridação em cada uma das amostras da parte externa do laço, criando uma réplica em

dye swap de cada uma das amostras temporalmente adjacentes.

Epi versus Meta: esse mesmo desenho de loop foi repetido para as duas réplicas

biológicas do experimento. A comparação entre Epi e Meta foi incluída dentro de um

contexto maior de comparação das formas principais do ciclo de vida de T. cruzi (PROBST et

al., em preparação). Como a comparação das formas metacíclica versus epimastigotas era de

interesse do presente projeto, foi incluída uma hibridação a mais, criando um dye swap entre

essas amostras.

4.4 Fluxograma das etapas desenvolvidas

No intuito de aumentar o conhecimento sobre proteínas hipotéticas diferencialmente

expressas durante a metaciclogênese, criou-se um conjunto de etapas laboratoriais seqüenciais

a serem seguidas, cujo fluxograma está representado na Figura 4.2.

Figura 4.2. Fluxograma descritivo das etapas laboratoriais realizadas.

4.5 Análise dos dados gerados pelo microarranjo de DNA e

seleção dos genes

As análises dos dados das hibridizações foram realizadas pelo setor de bioinformática do

nosso instituto, e baseiam-se em uma lista contendo as sondas que possuíram um perfil

diferencial de expressão, estando nelas contidos genes com uma expressão aumentada ou

diminuída no mínimo duas vezes nas formas tripomastigotas metacíclicas em relação às

formas epimastigotas.

Nesta lista estão contidos 912 sondas diferencialmente expressas conforme relatado

anteriormente, das quais foram selecionados os genes avaliados no presente trabalho.

Inicialmente, foram selecionados sete genes representados na Tabela 4.1, denominados

principais. A seleção destes genes foi realizada de acordo com o perfil de expressão durante a

metaciclogênese e características da sonda, ou seja:

• a sonda deveria estar diferencialmente expressa em metacíclicos, com um grau de

modulação de pelo menos duas vezes;

• o perfil da curva de hibridização durante a metaciclogênese deveria se apresentar de

forma coerente entre os diferentes pontos, evitando-se erros técnicos dependentes da

amostra;

• a proteína codificada deveria ser classificada como hipotética conservada, isto é, sua

função não foi atribuída e deve estar presente em outros organismos;

• a proteína deveria possuir um módulo conservado indicativo de função;

Após a escolha dos genes principais, os dados relativos a todos os genes diferencialmente

expressos dentro dos experimentos realizados no IBMP foram organizados pelo uso do

programa de agrupamento Cluster 3.0 (DE HOON et al., 2004), visando identificar grupos

gênicos co-regulados, de acordo com os padrões gerais de expressão conforme exemplificado

na Figura 4.3.

Dentro do grupo de cada gene principal, foram selecionados mais três genes distintos.

Com essa seleção, foram incluídos 21 novos genes, denominados secundários. O perfil de

cada cluster obtido pode ser verificados nas Figura 4.4 a Figura 4.10

Portanto, há sete conjuntos de quatro tipos distintos de genes, os quais podem ser

caracterizados da seguinte forma:

Gene principal: codifica uma proteína hipotética conservada com módulo funcional

identificado.

Gene secundário: representa uma redundância, também codificando uma proteína

hipotética conservada com módulo funcional identificado. Constitui-se em uma proteção nos

casos no qual os dados para o gene principal não forem obtidos e, quando não for esse o caso,

representa um segundo elemento co-regulado cuja caracterização funcional é de interesse.

Gene guia: codifica uma proteína cuja caracterização funcional é mais conhecida,

representando uma referência funcional para o cluster estudado. No entanto, não deve haver

caracterização funcional desse gene dentro do processo de metaciclogênese, possibilitando

que os resultados obtidos no presente trabalho sejam inéditos;

Gene acessório: codifica uma proteína hipotética, não classificada como conservada.

Esse grupo contém as proteínas cuja relação de ortologia com outros organismos não foi

identificada, podendo representar genes restritos a T. cruzi e, portanto, potencialmente de

grande interesse para o estudo de questões biológicas peculiares a esse parasita. No entanto,

também podem representar um erro de anotação, pela inexistência de corroboração em outros

organismos, consistindo em uma proteína que não existe no organismo estudado.

Tabela 4.1. Descrição dos genes selecionados para caracterização e sua classificação interna

Grupo ID IBMP Gene ID Classificação

TcExp02A01 8530.t00003 Gene Principal

TcExp02A08 8694.t00004 Gene Acessório

TcExp02A09 7626.t00009 Gene Secundário

TcExp02A10 6680.t00001 Gene Guia

TcExp02A02 6996_t00063 Gene Principal

TcExp02A11 8773.t00014 Gene Acessório

TcExp02A12 8364.t00002 Gene Secundário

TcExp02B01 8208.t00006 Gene Guia

TcExp02A03 7109.t00005 Gene Principal

TcExp02B02 8764.t00016 Gene Acessório

TcExp02B03 8728.t00021 Gene Secundário

TcExp02B04 8257.t00019 Gene Guia

TcExp02A04 6896.t00027 Gene Principal

TcExp02B05 7224.t00006 Gene Acessório

TcExp02B06 6958.t00014 Gene Secundário

TcExp02B07 8243.t00004 Gene Guia

TcExp02A05 4715.t00001 Gene Principal

TcExp02B08 5595.t00003 Gene Acessório

TcExp02B09 8171.t00006 Gene Secundário

TcExp02B10 8416.t00006 Gene Guia

TcExp02A06 8415.t00003 Gene Principal

TcExp02B11 7000.t00002 Gene Acessório

TcExp02B12 8318.t00003 Gene Secundário

TcExp02C01 7168.t00007 Gene Guia

TcExp02A07 5323.t00004 Gene Principal

TcExp02C02 8359.t00034 Gene Acessório

TcExp02C03 7741.t00008 Gene Secundário

TcExp02C04 6996.t00038 Gene Guia

Figura 4.3 Agrupamento hierárquico dos dados de microarranjo disponíveis no IBMP.

À esquerda, dendrograma representando a similaridade dos genes (linhas); cada coluna representa um

ponto experimental distinto. Em preto, expressão igual, em vermelho, expressão aumentada; em verde, expressão

diminuída.

Figura 4.4 Cluster contendo a sonda referente ao gene 4715.t00001, grupo 5.

Descrição da visualização veja Figura 4.3. Seta indica sonda relativa ao gene selecionado.

Figura 4.5 Cluster contendo a sonda referente ao gene 5323.t00004, grupo 7.

Descrição da visualização veja Figura 4.3. Seta indica sonda relativa ao gene selecionado.

Figura 4.6 Cluster contendo a sonda referente ao gene 6896.t00027, grupo 4.

Descrição da visualização veja Figura 4.3. Seta indica sonda relativa ao gene selecionado.

Figura 4.7 Cluster contendo a sonda referente ao gene 6996.t00063, grupo 2.

Descrição da visualização veja Figura 4.3. Seta indica sonda relativa ao gene selecionado.

Figura 4.8 Cluster contendo a sonda referente ao gene 7109.t00005, grupo 3.

Descrição da visualização veja Figura 4.3. Seta indica sonda relativa ao gene selecionado

Figura 4.9 Cluster contendo a sonda referente ao gene 8415.t00003, grupo 6.

Descrição da visualização veja Figura 4.3. Seta indica sonda relativa ao gene selecionado

Figura 4.10 Cluster contendo a sonda referente ao gene 8530.t00003, grupo 1.

Descrição da visualização veja Figura 4.3. Sta indica sonda relativa ao gene selecionado

Baseado nos critérios acima citados, os genes foram selecionados e foram desenhados

iniciadores para amplificação de toda a região codificadora, através do uso do software Primer

Select (Lasergene Inc.), com a inclusão de adaptadores específicos da plataforma Gateway

conforme detalhado na Tabela 4.2.

Tabela 4.2: Iniciadores construídos adaptados para plataforma Gateway

INICIADORES TM GENE Nome Iniciador

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCCTGCGTATCCGTCCC 57.0 8530.t00003 TcExp02A01F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATCTACACGGCGATCATTGCG 57.3 8530.t00003 TcExp02A01R1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACCGCCACGGGAGCCAC 58.8 8530.t00003 TcExp02A01R2

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGCAGCATCATTACGGGAAC 51.7 8530.t00004 TcExp02A01R3

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCCGGATGCCTCTATTCGTATTG 55.3 6996.t00063 TcExp02A02F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTGTTTTGAGTAAACTCTGTGGATTC 54.9 6996.t00063 TcExp02A02R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTCAGTGACAAAACACACATGCG 54.4 7109.t00005 TcExp02A03F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTTATTGAGCCATCAGAGGAATC 53.1 7109.t00005 TcExp02A03R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTCCCGAAGCGTGCCTTG 55.3 6896.t00027 TcExp02A04F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGCCTCCGTAACAAAATC 56.0 6896.t00027 TcExp02A04R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCAACGAGAGTTGAACTGCG 53.4 4715.t00001 TcExp02A05F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGTTTTAACCCTCTTGAGTGGC 54.6 4715.t00001 TcExp02A05R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTGGCGTTTCTTGATGGC 54.8 8415.t00003 TcExp02A06F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAAGACTTCTGGTGTACTTGGACTTCAC 55.4 8415.t00003 TcExp02A06R2

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAAGACTTCTGGTGTACTTGGCCTTC 56.1 8415.t00003 TcExp02A06R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTCATCTGAAATAGAACCGCATA 49.5 5323.t00004 TcExp02A07F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTTTGCATGGTTCGTGAA 49.3 5323.t00004 TcExp02A07R1

Tabela 4.2 (continuação)

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTGTTTTCATGCGTGGAGAAG 52.4 8694.t00004 TcExp02A08F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTACTTGCCGCCAATAAGC 50.1 8694.t00004 TcExp02A08R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAATGTCAAGGGAATTCTCACTG 54.5 7626.t00009 TcExp02A09F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCGCGGGTGTCGC 55 7626.t00009 TcExp02A09R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCAGCTGGGGCTCCTG 53.9 6680.t00001 TcExp02A10F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTCCTCGGCTTTTCACCAG 54.8 6680.t00001 TcExp02A10R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCGCACGAGTCCGACTCTTATC 57.7 8773.t00014 TcExp02A11F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGCAGTTCCTATTGCGCACAATTG 58.4 8773.t00014 TcExp02A11R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTCTTTTAGTTACGATAATGTGGTTGC 53.2 8364.t00002 TcExp02A12F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACCGTGGCGGGGAGC 54.6 8364.t00002 TcExp02A12R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATAGCGTCGGCAACGCCA 57.4 8208.t00006 TcExp02B01F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACAAGAGCATGTACCCGACGTCT 56.6 8208.t00006 TcExp02B01R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATCGCATCCGCTACGCCACACGCA 57.4 8208.t00006 TcExp02B01FMut

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACAGGAGCATGTACCACTTGTCTTTGAAGG 56.5 8208.t00006 TcExp02B01RMut

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAGTGTGAGCACCAGGACAAGCG 55.9 8764.t00016 TcExp02B02F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGAGTTCTTTTCTCCCTCCACCAG 55 8764.t00016 TcExp02B02R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGACGAATGAGTGGTACGACATGC 55.9 8728.t00021 TcExp02B03F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGACCTCTTCAATTTTGTCCGCAG 56.7 8728.t00021 TcExp02B03R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCACCCAACATCATGGATG 58.9 8257.t00019 TcExp02B04F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGCATCTATTCCTTCTTTGTGCTCG 58.6 8257.t00019 TcExp02B04R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGACGAGACTTCGCTCCCATC 53.6 7224.t00006 TcExp02B05F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGAGTCCGTGCCGTTGTG 53.3 7224.t00006 TcExp02B05R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGACACGTTTCACTACGAGGAG 56.2 6958.t00014 TcExp02B06F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGACGGAGACAAGGCAGAGTTCAC 56.7 7224.t00006 TcExp02B06R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAAATACATGCGGCTCAGG 57.7 8243.t00004 TcExp02B07F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTGTTTGATCTCCTGTACTACAACCAATAC 56.5 8243.t00004 TcExp02B07R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAATACATGCGGCTCAGG 50.6 8243.t00004 TcExp02B07F1Mut

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTGTTTGATCTCTTGTACTACAACCAATAC 51.1 8243.t00004 TcExp02B07R1Mut

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGACTTTTTCACTGTGCTGAACCAAC 56 5595.t00003 TcExp02B08F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAAGTAAGGGGCTAATCAAACGACTC 55.4 5595.t00003 TcExp02B08R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGACGGGAGTGTTGTTGGG 54.4 8171.t00006 TcExp02B09F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGAAGAATTTATAAATGAGCGAAGG 54.9 8171.t00006 TcExp02B09R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGGCGAGGGGTCTTCC 55.9 8416.t00006 TcExp02B10F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAATGGAGAGGCTAAGGCGATCTC 56.9 8416.t00006 TcExp02B10R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCGTTCTTGTCAGAGGCCGAATG 58.4 7000.t00002 TcExp02B11F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGGTAAGAAAACCACTTCTAGAGGGTAC 57.4 7000.t00002 TcExp02B11R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCGATCTTGCCAGCGACCGAATGTG 55.7 7000.t00002 TcExp02B11F2Mut

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGGTAAGAAAACCACTTCCAGAGGG 54.2 7000.t00002 TcExp02B11R2Mut

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCCGGAGGAGAAGGACC 55.2 8318.t00003 TcExp02B12F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATGGCAGCAGTAGTGGACGAG 54.5 8318.t00003 TcExp02B12R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGTCACGGGATCGTAC 56.9 7168.t00007 TcExp02C01F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGTCACCGCCTTCAAAAAGAG 56.3 7168.t00007 TcExp02C01R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGACGCGACGTCCGAACTC 57.3 8359.t00034 TcExp02C02F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATTACAGATGTGCCAGGCACGC 58.6 8359.t00034 TcExp02C02R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGACGCGACGACCGAACTCTG 53.4 8359.t00034 TcExp02C02F1Mut

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATTACAAATATGCCACGCTCTCTTATGTCC 53.8 8359.t00034 TcExp02C02R1Mut

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAGGATCCCATGGAGTTTATGAG 54.2 7741.t00008 TcExp02C03F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCAGTATACGTAACGGGCATC 55.2 7741.t00008 TcExp02C03R1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCAGTATACGTAACTGGCATTTCACAC 54.8 7741.t00008 TcExp02C03MutR1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTCGACAACACGCGCTGCTG 59.1 6996.t00038 TcExp02C04F1

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAATCCTCATCCTCTAGCATGATGGC 59.4 6996.t00038 TcExp02C04R1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTCGACAACAAGAGCAGCAGGGG 53.4 6996.t00038 TcExp02C04F1Mut

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATAATCTTCGTCATCTAACATGATGGCAAG 52.4 6996.t00038 TcExp02C04R1Mut

Iniciadores das seqüências nucleotídicas com adaptadores da plataforma Gateway (em negrito está a

sequência específica ao gene); TM (temperature melting); Gene (identificação do gene); Nome (controle

interno).

4.6 Amplificação dos genes

Para a amplificação dos genes, foram realizados testes objetivando a melhor performance

da reação, como utilização de gradiente de temperatura e concentração de reagentes. Neste

processo de testes e também na amplificação dos genes, foi utilizada a enzima High-Fidelity

Triple Master Enzyme (Eppendorf). A partir da padronização das condições de PCR, deu-se

inicio à amplificação dos genes.

As condições de amplificação foram as seguintes:

• 94°C por dois minutos;

• 10 ciclos de 94°C (30 segundos), 57°C (30 segundos) e 72°C (90 segundos);

• 25 ciclos de 94°C (30 segundos), 62°C (30 segundos) e 72°C (90 segundos).

Para os genes com tamanho maior de 1.500 pares de bases, o tempo de extensão foi

aumentado para 3 minutos.

As concentrações dos reagentes utilizados foram:

- Iniciadores forward e reverse (5 µM);

- DNA genômico (100 ng);

- 10x Tampão (High Fidelity Buffer) com Mg

(2,5 mM);

- dNTP (200 µM);

- Enzima Triple Master (0,05 U/µl);

- Água q.s.p. 50 µl.

Para os genes com tamanho maior de 1.500 pares de bases, a concentração da enzima

Triple Máster foi aumentada para 0,1 U/µl.

Após a amplificação dos produtos foram realizadas eletroforeses em gel de agarose para

verificação do qualidade da amplificação.

4.7 Purificação dos produtos de PCR

Para retirar pequenos fragmentos de DNA sintetizados e os iniciadores empregados,

provenientes do processo de PCR, foi utilizada a purificação baseada em polietilenoglicol ou

PEG (30% PEG 8000, 30mM MgCl

,). Ao produto de PCR acrescentou-se quatro volumes de

tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Em seguida acrescentou-se o PEG, 50%

v/v. Após, as soluções foram completamente homogeneizadas e colocadas sob centrifugação a

10.000 g por 15 minutos em temperatura ambiente. Após centrifugação, o sobrenadante foi

retirado cuidadosamente e descartado, e o pellet ressuspenso em 10 µl de tampão TE. Após

este processo de purificação, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose e

submetidas à dosagem utilizando espectrofotômetro.

4.8 Clonagem e vetores

Os produtos dos genes selecionados, após purificação, foram clonados em vetores do

sistema de clonagem comercial Gateway

(Invitrogen), cuja tecnologia é baseada em

recombinação utilizando seqüências sítio específicas do bacteriófago lambda (LANDY,

1989), possibilitando uma rápida e eficiente análise funcional das proteínas de interesse

(HARTLEY et al,2000).

O sistema Gateway

permite que, a partir do clone de entrada, seja feita a passagem do

inserto, de forma rápida e eficiente, para um segundo vetor, denominado de destino, que pode

ser dos mais variados tipos, de acordo com a necessidade de caracterização funcional, como

mostra a Figura 4.11.

Figura 4.11 Possibilidades de utilização do sistema Gateway a partir da obtenção do clone de

entrada.

(Fonte: www.invitrogen.com)

A recombinação entre os sítios do bacteriófago lambda acontece tanto no ciclo

lisogênico, entre os sítios attB e attP, resultando nos sítios attL e attR, quanto no ciclo lítico,

entre os sítios attL e attR, resultando novamente nos sítios attB e attP. Essas reações são

específicas e direcionais, pois attB1 e attP1, attB2 e attP2, attL1 e attR1, attL2 e attR2

recombinam somente entre si.(Figura 4.12 e Figura 4.13). A enzima utilizada na reação BP na

verdade é formada por uma integrase do bacteriófago lambda (Int) e um fator de integração ao

hospedeiro de E. coli (IHF).

Figura 4.12 Reação attB x attP.

O produto específico de pcr contendo o sítio attB1 e 2 é inserido no vetor escolhido (pDONR™221)

através da utilização da enzima BP clonase, recombinando com o sítio attP1 e 2 presente no vetor, formando um

novo sítio denominado de attL 1 e 2 no clone selecionado por antibiótico.

Figura 4.13 Reação attL x attR

O vetor de entrada contendo a seqüência do gene de interesse o qual possui o sítio attL 1 e 2 é

recombinado com o vetor de destinação (pDEST™17) através da utilização da enzima LR clonase,

recombinando com o sítio attR1 e 2 presente no mesmo.esta recombinação forma novamente o sítio attB 1 e 2 no

clone de destinação selecionado por antibiótico.

Para que um produto amplificado a partir de um determinado gene de interesse ingresse

nesta plataforma, escolhemos o vetor de entrada pDONR™221 (Invitrogen, Figura 4.14) que

possibilita a clonagem direcional de produtos de PCR.

Figura 4.14 Vetor de entrada utilizado, pDONR 221(Invitrogen).

A partir da obtenção dos clones de entrada, é possível inseri-los em diversas plataformas,

No presente trabalho, foi realizado a recombinação com o vetor pDEST™17 (Figura 4.15), o

qual é apropriado para a expressão heteróloga da proteína de interesse em E. coli, fusionada a

uma seqüência de seis histidinas em sua extremidade N-terminal.

Figura 4.15Vetor de expressão pDEST™17 (Invitrogen).

4.8.1 Obtenção dos clones de entrada

A inserção dos produtos de PCR no vetor de entrada se baseia na recombinação dos sítios

conforme descrito anteriormente. Aos produtos foram acrescidas as seqüências que possuem

os sítios de recombinação durante o processo de PCR, os quais recombinarão com os sítios

presentes no vetor pDONR™221.

A reação foi realizada conforme orientações do fabricante (Gateway BP clonase 2

Enzyme mix, Invitrogen). O processo consistiu em acrescentar 150 ng do produto de PCR

contendo o sítio attB, 150 ng do plasmídeo pDONR™221, e completando até 8 microlitros

com TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8). As reações foram incubadas a 25°C

por duas horas. Após esta etapa, foi adicionado 2 µg de proteinase K e a reação incubada por

10 minutos a 37°C.

Após a conclusão dessa etapa, foi realizada a transformação em células cálcio-

competente da linhagem de E.coli DH5α. Acrescentou-se 1 µl da reação BP a 50 µl de células

cálcio-competentes. Estas células permaneceram no gelo por 30 minutos e, em seguida, foram

incubadas a 42° C por 2 minutos, sendo colocadas novamente no gelo.

Após a transformação, as células cresceram em 1 ml de meio LB por uma hora a 37 °C,

para em seguida serem centrifugadas a 4000 g por 5 minutos e colocadas para crescer em

placa de LB contendo kanamicina (25mg/ml) a 37° C durante 15 horas.

Para verificar a presença de clones com os insertos de interesse, foram feitas master

plates e PCR de colônia, para a qual o protocolo seguido foi conforme o fabricante da enzima

Taq polimerase (Invitrogen). Após a finalização da PCR, foi realizada eletroforese em gel de

agarose para verificação e escolhas das colônias contendo os clones com o inserto correto. As

colônias selecionadas foram colocadas em placa contendo LB e kanamicina (25 mg/ml), por

15 horas a 37° C. Uma colônia de cada placa referente a cada um dos genes foi selecionada e

colocada em 10 ml de meio LB contendo kanamicina (25 mg/ml), por 15 horas a 37° C sob

agitação (220 RPM).

Após o crescimento em cultura do clone bacteriano, foi feita a purificação do plasmídeo

utilizando-se o produto comercial QIAprep Spin Miniprep (Quiagem) conforme orientações

do fabricante. Após a obtenção dos plasmídeos, fez-se a mensuração da concentração através

do uso de espectrofotômetro.

4.8.2 Obtenção dos clones de expressão

A troca de insertos entre os plasmídeos de entrada e destino, pDONR e pDEST,

denominada de reação LR, foi realizada conforme orientações do fabricante (Gateway LR

clonase 2 Enzyme mix, Invitrogen). Foi utilizado 150 ng de pDONR contendo o gene de

interesse, 150 ng do plasmídeo pDEST, e completando o volume até oito microlitros com TE

(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). A reação foi incubada a 25°C por duas horas.. Após

esta etapa, foi adicionado 2 µg de proteinase K e a reação incubada por 10 minutos a 37°C.

Após essa etapa, foi realizada a transformação de células cálcio-competentes da linhagem

de E.coli DH5α, conforme descrito anteriormente.

Após a transformação as células foram colocadas em 1 ml de meio LB por uma hora a 37

°C, para em seguida serem centrifugadas a 4000 g por 5 minutos e colocadas para crescer em

placa de LB contendo ampicilina (100 mg/l) a 37° C durante 15 horas.

A verificação da obtenção dos clones de destino foi realizada conforme descrito

anteriormente. As colônias selecionadas foram estriadas em placa contendo LB e ampicilina

(100 mg/l), a qual foi colocada em estufa a 37° C durante 15 horas. Uma colônia de cada

placa referente a cada um dos genes foi selecionada e colocada em 10 ml de meio LB

contendo ampicilina (100 mg/l), para obtenção dos plasmídeos, e deixar crescendo por 15

horas a 37° C sob agitação (220 RPM).

A purificação do plasmídeo foi realizada conforme descrito anteriormente.

4.9 Expressão das proteínas

Esta etapa visou a obtenção da proteína visando a inoculação em camundongos, para

obtenção de anticorpos policlonais. As células utilizadas para esta etapa foram da linhagem de

E.coli BL21(DE3) pLysE. A expressão das proteínas teve inicio com a transformação por

choque térmico das células. Em 50 µl de células, foram adicionados 300 ng de plasmídeo de

expressão contendo o gene de interesse. As células foram então mantidas por 30 minutos no

gelo e em seguida incubadas a 42° C por dois minutos voltando ao gelo por mais três minutos.

Após isto, foi acrescentado ao tubo 1 ml de meio LB, com posterior incubação a 37° C por 1

hora, sob agitação de 220 RPM. Após, as células foram inoculadas em meio LB contendo

cloranfenicol (25mg/l) e ampicilina (100mg/l) em uma diluição de 1/10 e deixado sob

agitação de 220 RPM a 37° C, durante 15 horas. Após este período, foi feito um novo inóculo

em uma diluição de 1/10 em um volume final de 250, 500 ou 1000 ml.

O inóculo foi colocado em meio LB contendo cloranfenicol (25mg/l) e ampicilina (100

mg/l). Após uma hora e meia a densidade óptica começou a ser monitorada, até que se

obtivesse o valor de 0,8 a 600 nm, sendo então adicionado IPTG (0,1 mM) visando a indução

da expressão da proteínas desejada. Imediatamente antes desta etapa, foi retirada uma alíquota

de 1 ml, a qual foi denominada de amostra não induzida. Esta amostra, juntamente com a

cultura induzida, foi colocada sob agitação a 37° C por duas horas.

Após duas horas de indução, a cultura foi centrifugada a 5000 RPM durante 15 minutos a

4° C; o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em tampão de sonicação (Tris-HCl

50 mM pH 8). Feito a ressuspensão, as células foram sonicadas por 20 segundos (potência 8),

repetindo-se esse processo por mais quatro vezes. Após esse procedimento, foi retirada uma

alíquota de 50 µl, denominada de amostra total. O restante foi centrifugado a 10.000 g por 15

minutos a 4°C para obtenção das frações denominadas solúveis e insolúveis.

A fração solúvel é constituída pelo sobrenadante obtido após a centrifugação, o qual foi

armazenado a -20°C. O pellet resultante foi ressuspenso em tampão de solubilização (uréia 8

M, imidazol 10 mM, NaCl 300 mM) e em seguida sonicado, conforme descrito acima, e

submetido a centrifugação (10.000 g por 15 minutos a 4°C) sendo então, o sobrenadante

denominado fração insolúvel, e armazenado a -20°C.

4.10 Comprovação da expressão

A verificação da expressão foi realizada através da técnica de SDS-PAGE com diferentes

concentrações de acordo com o peso molecular das proteínas, utilizando 30 mA de corrente

elétrica por gel. Os géis foram corados com azul de comassie por 30 minutos, sendo retirado o

excesso com solução de descoloração (metanol 30 %, ácido acético 10 %). Para a amostra

controle, a bactéria BL21(DE3) pLysE cresceu sem transformação em meio LB. As células

foram centrifugadas a 4.000 g durante 15 minutos a 4 °C e em seguida o pellet foi ressuspenso

em 1 ml de tampão Tris-HCl 50mM pH 8 e sonicado 5 vezes por 20 segundos. Foi separado

100 µl e adicionado 100 µl de Tris-HCl 50mM pH 8 e ainda 0,5 µl de DNAse NQI. O lisado

resultante foi incubado no gelo por uma hora e em seguida adicionou-se 50 µl de tampão de

desnaturação de proteína, e colocado em banho-maria a 90° durante dez minutos.

4.11 Purificação das proteínas

Após a obtenção das proteínas recombinantes e verificação da solubilidade, procedeu-se à

purificação através de cromatografia de afinidade por níquel (QIAexpress System, Quiagem)

e por eletroforese (SDS-PAGE).

O processo de purificação pode ser baseado em dois protocolos distintos de purificação,

podendo ser feita eluição por imidazol ou por acidificação do pH

O processo de purificação baseado no imidazol inicia-se com a lavagem das colunas e

equilíbrio das mesmas com a solução de lise (50 mM NaH

, 300 mM NaCl e 10mM

imidazol). Depois, os extratos protéicos são adicionados à coluna permitindo a fixação das

proteínas contendo cauda de histidina à resina e a solução que não se liga é coletada e

armazenada, sendo denominada de flow-through (FT). Para retirar proteínas contaminantes da

resina, foram feitas cinco lavagens com 10 ml de solução de lavagem (50 mM NaH

, 300

mM NaCl e 20mM imidazol), sendo que os materiais proveniente das lavagens foram também

armazenados para verificação da qualidade do processo de purificação. Seguindo o processo

de purificação foi feito então a eluição, sendo realizadas cinco eluições utilizando 0,5 ml de

solução de eluição (50 mM NaH

, 300 mM NaCl e 250mM imidazol) e armazenadas a –

20°C.

A purificação utilizando o decréscimo de pH inicia-se também com a lavagem das

colunas e equilíbrio das mesmas com a solução de lise (100 mM NaH

, 10 mM Tris-HCl,

8 M uréia, pH 8). Depois os extratos protéicos são adicionados à coluna permitindo a fixação

das proteínas, sendo o restante coletado e armazenado, sendo denominado de flow-through

(FT). As lavagens foram feitas com 10 ml de solução de lavagem (100 mM NaH

, 10 mM

Tris-HCl, 8 M uréia, pH 6,3), sendo que os materiais proveniente das lavagens armazenados

para verificação da qualidade do processo de purificação e armazenados a –20°C. Para as

eluições foi utilizado a solução de eluição (100 mM NaH

, 10 mM Tris-HCl, 8 M uréia)

sendo que, a cada duas eluições com 0,5 ml da solução citada, o pH foi sendo reduzido, na

seguinte ordem: 5,9; 4,5; 4,0 e 3,5. Os eluídos foram armazenados a –20°C.

Após cada processo de purificação, as amostras FT, os lavados e os eluídos foram

analisados por SDS-PAGE para verificar a qualidade da purificação. A concentração de

acrilamida utilizada variou entre 13 e 17% dependendo do tamanho esperado das proteínas,

utilizando 30 mA de corrente elétrica por gel. Os géis foram corados com azul de comassie

por 30 minutos, sendo retirado o excesso com solução de descoloração (metanol 30 %, ácido

acético 10 %).

Após a realização da primeira etapa de purificação por afinidade, a segunda etapa

baseada em separação por tamanho. Para isso, foi realizado um SDS PAGE em gel

preparativo. A concentração de acrilamida utilizada variou entre 13 e 17% dependendo do

tamanho esperado das proteínas, utilizando 15 mA de corrente elétrica por gel. Após o

término, o gel foi submetido à coloração por KCl 1 M, e a banda desejada excisada do gel..

Para retirar a proteína desejada da matriz do gel de acrilamida foi utilizado o processo de

eletroeluição. O material excisado foi colocado em uma membrana de diálise (Sigma-Aldrich)

e adicionou-se 1 ml de tampão de SDS-PAGE (Tris 25mM, Glicina 192mM, SDS 0,1%) e

lacrou-se as extremidades. Feito isto, as membranas foram colocadas dentro da cuba

eletroforética contendo tampão SDS-PAGE e submetidas a uma corrente de 50 mA por 2

horas. Após este período, o líquido presente dentro da membrana foi coletado e o processo foi

repetido.

A solução obtida foi submetida à eletroforese como descrito anteriormente. Com as

imagens dos géis em mãos, foi realizada a dosagem com o uso do programa Lab Works 3.0.2

(UVP Inc). Este software permite a extração das intensidades de sinal das bandas obtidas

permitindo assim a obtenção da concentração relativa de cada uma das proteínas, através da

comparação com o marcador de peso molecular, do qual possui concentração conhecida

(BenchMark Ladder™, Invitrogen).

4.12 Obtenção dos anticorpos policlonais.

As proteínas recombinantes foram inoculadas em camundongos da linhagem BALB/c,

sendo que para cada proteína foram utilizados 2 camundongos, cada qual inoculado por uma

diferente via: sub-cutânea ou intraperitonial. Foram realizadas quatro inoculações de

aproximadamente 50 µg de proteína em intervalos de 15 dias. A proteína foi emulsificada em

adjuvante completo de Freund (Sigma) na primeira inoculação, e em halogel (Serva) nas

inoculações subseqüentes. Sete dias após a última inoculação, procedeu-se à coleta do soro.

Os animais foram sedados utilizando-se 0,2 mg de cetamina (Syntec) e 2 mg de xilasina

(Vetbrands), coletando-se o sangue por punção cardíaca, o qual foi colocado por 5 minutos a

37°C e em seguida centrifugado por 10 minutos a 1.500 g, coletando-se o sobrenadante, o

qual foi armazenado a –20° C.

4.13 Verificações da qualidade dos soros obtidos utilizando ensaios

de Western blot.

Os soros obtidos foram testados para verificar a existência de anticorpos que reconheçam

a proteína recombinante e também se possuem reação contra extrato protéico da fase

epimastigota do T. cruzi.

A técnica de Western blot consiste na transferência de proteínas, previamente separadas

por SDS-PAGE, para um suporte sólido (membrana de nitrocelulose). O procedimento a

seguir foi executado segundo o método de TOWBIN et al. (1979). Após a eletroforese das

proteínas recombinantes e do extrato de epimastigota de T. cruzi, as proteínas foram

eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose utilizando 50 mA à 4°C por 2 h. Após

a transferência, a membrana de nitrocelulose foi corada com solução de Ponceau S para

verificar a qualidade da transferência sendo em seguida descorada com PBS/Tween 0,1% e

incubado em solução de bloqueio (5% de leite desnatado em PBS/Tween 0,1%) por 16 horas

a 4°C. Após essa incubação, a membrana foi colocada em 2 ml de solução de bloqueio

contendo o anticorpo primário (policlonal obtido) diluído na proporção de 1:200

permanecendo por 1 hora a temperatura ambiente e, em seguida, lavada três vezes por 5 min

com 50 ml de solução de bloqueio. Dois mililitros da solução contendo o anticorpo

secundário (policlonal), anti-IgG de camundongo conjugado com fosfatase alcalina

(Promega), diluído na proporção de 1:7.500, foram adicionados à membrana e incubou-se por

45 min. As membranas foram novamente lavadas 3 vezes (5 min) com 50 ml de PBS/Tween

0,1%. Para revelar as reações, foram utilizados 66 µl de NBT (cromógeno) e 33 µl de BCIP

(substrato), diluídos em 10 ml de tampão para fosfatase alcalina.

4.14 Ensaios de Western blot para determinação de expressão

Após a confirmação da reatividade do soro com a proteína recombinante, foram feitas

novas eletroforeses (SDS-PAGE) para cada um dos soros, utilizando extrato de T. cruzi das

fases: epimastigota, fase intermediária da metaciclogênese (aderido 24 horas) e tripomastigota

metacíclico. A partir dos géis obtidos na eletroforese, procedeu-se à realização da técnica de

Western blot conforme descrito no item anterior.

Visando aumentar a quantidade de proteínas distintas avaliadas, a fim de possibilitar um

conjunto de dados mais amplo, foram adicionados outros anti-soros disponíveis no IBMP,

referentes às proteínas. PEPCK (fosfoenolpiruvatocarboquinase, glicosomal, 7378.t00009

/7730.t00002), Kap3 (proteína associada ao cinetoplasto 3, 6032.t00002/6142.t00008), Kap4

(proteína associada ao cinetoplasto 4, 5609.t00004/5609.t00005/5785.t00001/5785.t00003/

5785.t00004), p22 (proteína associada ao kDNA p22, 5784.t00012/6036.t00001), proteína

ribossomal L26 (8487.t00016/6039.t00002/8822.t00013), proteína ribossomal S7

(7013.t00007/7013.t00003/7108.t00012), Nop56 (proteína nucleolar, 4745.t00005/

6845.t00001/6154.t00006), TcYchF (proteína de ligação ao RNA, 6380.t00002/8738.t00005),

TcS1A12 (ciclofilina A, 7143.t00030), TcS1B11 (flavoproteína, 4913.t00016), TcS1B12

(isomerase de enoil-CoA, 5420.t00004/6028.t00004) e TcS2E02 (subunidade do proteassomo

beta 6, 7369.t00005/7786.t00016).

A partir dos resultados obtidos, os soros que tiveram um padrão de reação fraco ou

inexistente foram submetidos à técnica de coloração por quimioluminescência utilizando o

produto ECL Western blotting detection reagents and analysis system (Amersham

Biosciences), devido à sua maior sensibilidade em relação ao protocolo de detecção descrito

no item 4.10. O protocolo foi seguido conforme orientações do fabricante.

4.15 Análise dos resultados obtidos a partir dos ensaios de

Western blot.

A membrana revelada pelo método colorimétrico ou o filme revelado pelo método de

quimioluminescência foram escaneados e a figura resultante foi analisada pelo programa

Scion Image v. 4.0.3.2 (Scion Corporation).

As imagens foram pré-processadas, fazendo-se a subtração da intensidade de fundo

(background) e a transformação da imagem, originalmente em escala de cores 24-bit para

uma imagem binária (preto e branco), utilizando-se um limiar de intensidade que permitisse a

correta identificação das bandas de interesse. Após essa etapa foram eliminados os pontos

relativos a artefatos na imagem e procedeu-se à quantificação dos parâmetros: número de

pixels da banda, intensidade mínima, máxima e média dos pixels, densidade integrada do

sinal. Esse último parâmetro foi utilizado para as análises subseqüentes de expressão protéica

diferencial.

4.16 Imunolocalização por microscopia óptica

Foram realizadas imunofluorescências utilizando os anti-soros obtidos, usando a forma

epimastigota do T. cruzi. Para cada anticorpo foi realizada uma diluição de 1:50 e 1:100.

Alguns ensaios foram repetidos com uma diluição menor, de 1:50 e 1:25, a fim de melhorar a

intensidade de sinal. Para os soros obtidos antes das inoculações das proteínas recombinantes

(pré-imune) foi utilizada a menor diluição como controle.

Os parasitas foram centrifugados a 7.000 RPM por 3 minutos e ressuspensos em PBS,

repetindo-se esse passo mais uma vez.

Acrescentou-se 50 µl de poli-L-lisina às lâminas e incubou-se a 37 °C por vinte minutos.

Após este período, as lâminas foram lavadas com água ultra-pura e secas na estufa a 37°C. Os

ensaios foram realizados em lâminas com dez campos limitados por teflon, sendo que cada

campo continha 2x10

parasitas, as quais foram colocadas a 28° C por uma hora em câmera

úmida. Após este período de incubação o excesso foi retirado e adicionado 20µl de para-

formaldeído por 15 minutos visando a fixação dos parasitas. Após, descartou-se o para-

formaldeído e a lâmina foi lavada com PBS 1x; em seguida, acresceu-se 20µl de cloreto de

amônio por 10 minutos para bloquear a fluorescência natural do para-formaldeído, e

novamente procedeu-se à lavagem da lâmina em PBS 1x. A próxima etapa consistiu na adição

de 20 µl de TRITON X-100 0,1% por 5 minutos e posterior lavagem por imersão, por 3 vezes,

em PBS 1x, sendo em seguida, adicionados 20µl de PBS 1x contendo soro de cabra 25% por

campo e deixadas por 16 horas a 4°C em câmara úmida, para realizar o bloqueio da lâmina.

Após essa etapa, foi retirada a solução de bloqueio e acrescentado 20 µl de solução de

bloqueio contendo o anticorpo primário (1/25, 1/50 e/ou1/100), permanecendo em câmara

úmida por uma hora a 37 °C. Após incubação, a lâmina foi lavada três vezes em PBS 1x por

imersão por 5 min e acrescentado o anticorpo secundário (anti-camundongo, fluoróforo alexa)

diluído (1:500) na solução de bloqueio, permanecendo por uma hora a 37 °C em câmara

úmida, protegido da luz. Depois deste período, a lâmina foi lavada em PBS 1x por 5 minutos

sendo repetida duas vezes o processo de lavagem, também protegido da luz, como todos

passos a diante. Para a coloração de núcleo e cinetoplasto, foi acrescentado 20 µl de solução

de bloqueio contendo DAPI em uma diluição 1:2000 permanecendo em temperatura ambiente

por 5 minutos, sendo este processo, seguido de 10 lavagens por cinco minutos cada utilizando

PBS 1X. Realizadas as lavagens foi adicionado a cada campo, 10 µl de n-propil-galato e as

lâminas lacradas utilizando lamínula de microscopia e selador (esmalte).

As lâminas foram observadas no microscópio de fluorescência (Nikon). As imagens

foram capturadas usando a câmara CoolSnap (Media Cybernetics) e analisadas com o

programa Image Pro-Plus v. 4.5.1.22 (Media Cybernetics).

Utilizando o programa citado para análise, as imagens foram trabalhadas controlando

brilho e contraste a fim de ressaltar os resultados para sua exibição. Além disso, as imagens

relativas à marcação por DAP normalmente resultando em fluorescência azul, foram

transformadas por alteração de canal para a cor vermelha, permitindo uma melhor

sobreposição de imagens, devido ao excesso de background obtido nas imagens. Assim

sendo, nas imagens mostradas no capítulo 5, a coloração vermelha nas fotos de

imunofluorescência, é referente a marcação com DAPI, ou seja, marcação de DNA

(cinetoplasto e núcleo).

5 Resultados

5.1 Descrição inicial

A caracterização do processo de metaciclogênese por microarranjo de DNA representa

somente o passo inicial na elucidação de seus mecanismos. Após a obtenção do conjunto

inicial de genes diferencialmente expressos é necessária a realização de diversos testes

visando entender melhor a função geral dessas proteínas e sua importância para o processo de

diferenciação. Isso é ainda mais relevante em T. cruzi, pois este é um organismo peculiar e

relativamente distante dos principais organismos modelos eucarióticos, fatores que

determinam um desconhecimento relativo de sua biologia molecular.

Nesse sentido, o presente trabalho representa a primeira abordagem comprobatória dentro

dessa mudança de paradigma de avaliação dos processos biológicos, apresentando diversas

características próprias que serão mais bem definidas nesse capítulo.

5.2 Genes selecionados a partir das análises de microarranjo de

DNA

Conforme descrito no item 4.5 foram selecionados sete genes diferencialmente expressos,

a partir dos dados de microarranjo de DNA, que foram organizados e selecionados de acordo

com o perfil de hibridização e características funcionais dos genes em questão, conforme os

critérios relatados anteriormente. Todos os genes principais selecionados apresentaram

ortólogos e domínios definidos pelo banco de dados PFAM, pois estes foram critérios de

seleção. A região gênica da qual a sonda é complementar encontra-se em sua grande maioria

(seis dos sete genes selecionados), próxima à região 3’ UTR do gene, o que indica uma boa

confiabilidade com relação ao perfil de hibridização da sonda, devido à característica inerente

ao processo de produção do material a ser hibridado, que tende a ser enriquecido em regiões

mais próximas à cauda poli-A. Apenas dois dos genes relacionados foram identificados na

análise do proteoma do T. cruzi, no trabalho publicado por ATWOOD et al, 2005. Embora a

presença de tal dado represente uma maior confiabilidade na existência funcional dessa

proteína, a ausência de identificação proteômica não constitui em evidência negativa forte,

pois essa técnica apresenta, atualmente, uma sensibilidade baixa. A existência de ortólogos

em organismos relacionados, o que dificilmente ocorreria em regiões não-codificadoras, por

outro lado, constitui uma evidência positiva da existência dessas proteínas.

Após esta primeira seleção, foram criados clusters para se selecionar novos genes, como

citado no 4.5, utilizando-se critérios semelhantes. Na Tabela 5.1 estão listados todos os genes

com suas nomenclaturas e principais características.

Tabela 5.1: Genes selecionados para caracterização.

ID IBMP Classificação Tamanho Módulos (Domínios) Proteômica Ortologos

TcExp02A01 Gene Principal 693 nt, 25 kDa ALBA Epi,Met,Ama,Tripo Tb, Lm

TcExp02A08 Gene Acessório 1368 nt, 52 kDa

TcExp02A09 Gene Secundário 1197 nt, 43 kDa Saccharopine dehydrogenase Meta Lm

TcExp02A10 Gene Guia 1080 nt, 41 kDa Sterol 24-c-methyltransferase, putative Epi Tb, Lm

TcExp02A02 Gene Principal 3126 nt, 117 kDa Protein kinase Tb, Lm

TcExp02A11 Gene Acessório 1644 nt, 61 kDa

TcExp02A12 Gene Secundário 1320 nt, 49 kDa Zinc finger C2H2-type) Tb

TcExp02B01 Gene Guia 681 nt, 24 kDa Ras-related protein rab-5, putative Tripo Tb, Lm

TcExp02A03 Gene Principal 3027 nt, 114 kDa FKBP-type Tb, Lm

TcExp02B02 Gene Acessório 1089 nt, 40 kDa

TcExp02B03 Gene Secundário 954 nt, 35 kDa Zinc finger, C2H2 type Tb, Lm

TcExp02B04 Gene Guia 1095 nt, 41 kDa DREV methyltransferase, putative Tb, Lm

TcExp02A04 Gene Principal 1353 nt, 51 kDa SWIM zinc finger Tb

TcExp02B05 Gene Acessório 1485 nt, 53 kDa

TcExp02B06 Gene Secundário 249 nt, 9 kDa CSL zinc finger Tb, Lm

TcExp02B07 Gene Guia 354 nt, 13 kDa Dynein light chain 2B, putative Tb, Lm

TcExp02A05 Gene Principal 606 nt, 22 kDa ASF1-like Tb, Lm

TcExp02B08 Gene Acessório 516 nt, 20 kDa

TcExp02B09 Gene Secundário 1035 nt, 38 kDa Programmed cell death protein 2 Tb, Lm

TcExp02B10 Gene Guia 531 nt, 20 kDa Calcineurin B subunit, putative Tb, Lm

TcExp02A06 Gene Principal 2247 nt, 86 kDa Signal peptide/PPR Repeat Tb, Lm

TcExp02B11 Gene Acessório 1905 nt, 72 kDa

TcExp02B12 Gene Secundário 963 nt, 37 kDa GTP-ase activating protein, Arf Tb, Lm

TcExp02C01 Gene Guia 909 nt, 36 kDa Syntaxin, putative Tb, Lm

TcExp02A07 Gene Principal 1362 nt, 51 kDa Kinase Meta Tb, Lm

TcExp02C02 Gene Acessório 1086 nt, 40 kDa TLD Tb, Lm

TcExp02C03 Gene Secundário 1209 nt, 48 kDa Tb

TcExp02C04 Gene Guia 546 nt, 21 kDa Centrin, putative Tb, Lm

Pb (pares de bases); KDa (kilodalton); X (não encontrado); Lmj (Leishmania major); Tbr (Trypanosoma

brucei).

5.3 Amplificação dos genes e purificação dos produtos

Dos 28 genes selecionados, todos foram amplificados com sucesso. Quanto à purificação

dos produtos resultantes da PCR, houve perda de material durante o processo. Para resolver

este problema, foi aumentado o número de ciclos na PCR de 30 para 35 visando o aumento da

quantidade dos produtos. Após essa modificação, obteve-se sucesso na purificação de todas

seqüências, conforme pode ser visto na Figura 5.1 para alguns genes selecionados. A

facilidade com que essa etapa foi concluída reforça a qualidade do processo de predição dos

iniciadores bem como a vantagem de se usar uma PCR com adaptadores externos, o que

permite a utilização de uma temperatura de anelamento mais estringente nos ciclos mais

tardios do processo de amplificação.

Figura 5.1 Padrão eletroforético obtido a partir das amostras de pcr purificadas.

As amostras numeradas de 1 a 7 e 9 a 15representam o perfil eletroforético obtido dos produtos de pcr

genes específicos contendo o sítio attB1 e 2. A amostra 8 é referente ao marcador de DNA(1 kb plus, Gibco),

com dois indicativos de tamanho em pares de bases (pb).

5.4 Obtenção dos clones de entrada

A etapa de clonagem para obtenção dos clones de entrada foi realizada com sucesso, não

necessitando qualquer alteração no protocolo descrito no capítulo 4. Na Figura 5.2 pode-se

verificar o perfil eletroforético obtido na PCR de colônia para seleção dos clones positivos e

na Figura 5.3 o perfil eletroforético dos plasmídeos contendo os insertos desejados já

purificados conforme o protocolo descrito. Esse resultado demonstra a confiabilidade da

plataforma escolhida para o desenvolvimento deste trabalho, bem como a facilidade na

obtenção futura de um número muito maior de clones de entrada contendo seqüências do T.

cruzi, com a intenção da construção do ORFeoma de T. cruzi.

Figura 5.2 Perfil eletroforético dos produtos obtidos da PCR de colônia de clones de entrada.

A numeração das colunas de 1 a 6 exemplificam o perfil eletroforético da pcr de colônia para 6 distintos

genes. A repetição das numerações é devida ao número de colônias testadas. A amostra 7 é referente ao

marcador de DNA(1 kb plus, Gibco), com dois indicativos de tamanho em pares de bases (pb).

Figura 5.3 Perfil eletroforético dos clones de entrada purificados.

A numeração das colunas de 2 a 15 exemplificam o perfil eletroforético obtidos a partir dos clones de

entrada contendo o gene de interesse para 13 distintos genes. A amostra 1 é referente ao marcador de DNA(1 kb

plus, Gibco), com dois indicativos de tamanho em pares de bases (pb).

5.5 Obtenção dos clones de expressão

Da mesma forma que em relação aos clones de entrada, a etapa de clonagem para a

obtenção dos clones de expressão foi realizada com sucesso, não necessitando qualquer

alteração no protocolo descrito no capítulo 4. Na Figura 5.4 pode-se verificar o perfil

eletroforético obtido na PCR de colônia para seleção dos clones positivos e na Figura 5.5 o

perfil eletroforético dos plasmídeos de expressão (pDEST) contendo os insertos desejados já

purificados conforme protocolo descrito. Estes resultados reforçam a eficácia do processo,

essencial para a clonagem futura em outros vetores de destino, como por exemplo, os que

estão sendo desenvolvidos no IBMP, com o intuito de obter informações em larga escala das

proteínas de T. cruzi.

Figura 5.4 Perfil eletroforético dos produtos obtidos da PCR de colônia de clones de destinação.

A numeração das colunas de 1 a 8 exemplificam o perfil eletroforético da pcr de colônia de clones de

destinação para 7 distintos genes. A repetição das numerações é devida ao número de colônias testadas. A

amostra 1 é referente ao marcador de DNA(1 kb plus, Gibco), com dois indicativos de tamanho em pares de

bases (pb).

Figura 5.5 Perfil eletroforético dos clones de expressão purificados.

A numeração das colunas de 1 a 5 e 7 a15 exemplificam o perfil eletroforético obtidos a partir dos clones

de destinação contendo o gene de interesse para 14 distintos genes. A amostra 6 é referente ao marcador de

DNA(1 kb plus, Gibco), com dois indicativos de tamanho em pares de bases (pb).

5.6 Seqüenciamento dos clones obtidos

As etapas de clonagem dos genes de interesse no vetor de entrada e de expressão

obtiveram um grau de sucesso absoluto (100%). Porém, o gene 8728.t00021 (TcExp02B03)

foi eliminado das etapas posteriores devido a um erro na construção do iniciador, pois foi

identificada uma deleção de um nucleotídeo em sua seqüência, o que acarretou uma mudança

de quadro de leitura na proteína recombinante expressa, sendo detectado pelos tamanhos dos

fragmentos obtidos e por seqüenciamento, já que todos foram submetidos a este tipo de

análise.

Através do seqüenciamento foi possível verificar e comprovar o grau de sucesso das

clonagens sendo que todos os 27 clones apresentaram inserção correta e seqüência gênica

esperada, nos clones de entrada e de expressão.

5.7 Expressão e purificação das proteínas

Na etapa de teste de expressão, a qual é realizada em um volume total de meio menor, foi

obtida a expressão de 13 proteínas (48,1%), em uma quantidade minimamente aceitável, de

acordo com uma avaliação subjetiva baseado na intensidade da coloração da banda da

proteína expressa. Das 14 proteínas não selecionadas, quatro (14,8%) foram classificadas

como de expressão duvidosa, nove (33,3%) como não expressas e uma (3,7%) como tendo

tamanho diferente do esperado.

Dentre os nove clones nos quais a expressão protéica foi classificada como inexistente no

teste, seis apresentavam um perfil minimamente sugestivo da existência de expressão em

baixíssima quantidade. Na tentativa de obtenção da expressão desses seis genes, a temperatura

durante a indução na fase de produção foi diminuída de 37°C para 22°C. Essa modificação do

protocolo resultou na indução de expressão de duas proteínas (33,3% do total testado).

Na fase de produção, as 13 proteínas que haviam sido consideradas como expressas na

fase de teste repetiram o mesmo resultado. Além disso, conforme mencionado acima, duas

proteínas, classificadas como não expressas na fase de teste, tiveram seu protocolo de indução

modificado na fase de produção, o que resultou na sua expressão. Finalmente, das quatro

proteínas classificadas como tendo expressão duvidosa na fase de teste, duas foram expressas

na fase de produção, após repetição do protocolo, o que sugere que razões técnicas pontuais

causaram a falha na etapa de testes.

Portanto, foi obtida a expressão, na fase de produção, de 19 proteínas (70,4% do total

inicial). Dos oito genes considerados como tendo uma expressão inexistente ou insuficiente

para o prosseguimento do trabalho, quatro são codificadores de proteínas hipotéticas e quatro

de proteínas hipotéticas conservadas. Dentre estas proteínas, somente uma (8694.t00004,

TcExp02A08) apresenta peptídeos identificados pelo trabalho de proteômica (ATWOOD,

2005). Metade das proteínas não expressas apresentam alto peso molecular, sendo este um

possível fator limitante na obtenção da expressão. Na Tabela 5.2 encontra-se o resultado das

expressões das proteínas.

Tabela 5.2 Resultados da expressão de proteínas na fase de teste e produção.

Gene ID Nomenclatura Pb / KDa Teste Produ

ão

8530.t00003 TcEx

02A01 693 nt

25 kDa E E

8694.t00004 TcExp02A08 1368 nt, 52 kDa N N

7626.t00009 TcExp02A09 1197 nt, 43 kDa ? E

6680.t00001 TcExp02A10 1080 nt, 41 kDa E E

6996.t00063 TcExp02A02 3126 nt, 117 kDa N N

8773.t00014 TcExp02A11 1644 nt, 61 kDa N N

8364.t00002 TcExp02A12 1320 nt, 49 kDa ? N

8208.t00006 TcExp02B01 681 nt, 24 kDa N E

7109.t00005 TcExp02A03 3027 nt, 114 kDa N N

8764.t00016 TcExp02B02 1089 nt, 40 kDa N E

8728.t00021 TcExp02B03 954 nt, 35 kDa X X

8257.t00019 TcExp02B04 1095 nt, 41 kDa E E

6896.t00027 TcExp02A04 1353 nt, 51 kDa E E

7224.t00006 TcExp02B05 1485 nt, 53 kDa N T

6958.t00014 TcExp02B06 249 nt, 9 kDa ? E

8243.t00004 TcExp02B07 354 nt, 13 kDa E E

4715.t00001 TcExp02A05 606 nt, 22 kDa T E

5595.t00003 TcExp02B08 516 nt, 20 kDa ? N

8171.t00006 TcExp02B09 1035 nt, 38 kDa E E

8416.t00006 TcExp02B10 531 nt, 20 kDa E E

8415.t00003 TcExp02A06 2247 nt, 86 kDa N N

7000.t00002 TcExp02B11 1905 nt, 72 kDa N N

8318.t00003 TcExp02B12 963 nt, 37 kDa E E

7168.t00007 TcExp02C01 909 nt, 36 kDa E E

5323.t00004 TcExp02A07 1362 nt, 51 kDa E E

8359.t00034 TcExp02C02 1086 nt, 40 kDa E E

7741.t00008 TcExp02C03 1209 nt, 48 kDa E E

6996.t00038 TcExp02C04 546 nt, 21 kDa E E

Pb (pares de base); KDa (kilodalton); E (proteína expressa); N (proteína sem expressão); T (tamanho não

esperado); ? (não conclusivo), X (clone excluído) Em cinza, genes principais.

A avaliação da ocorrência de expressão protéica foi realizada através do uso de SDS-

PAGE A Figura 5.6 mostra um padrão de expressão adequada bem como a qualidade obtida

dos géis.

Figura 5.6 Perfil eletroforético (SDS-PAGE) contendo o gene ID.

M (marcador de peso molecular, kDa); NI (fração não induzida); T (fração total); FS (fração solúvel); FI

(fração insolúvel); E (extrato controle pLysS).

Os 19 extratos contendo as proteínas recombinantes expressas foram então purificados

conforme descrito no item 4.11, sendo que 18 proteínas foram obtidas, possibilitando a

obtenção de anticorpos policlonais para cada uma delas. Uma das proteínas expressas foi

perdida durante o processo de purificação, devido a sua baixa expressão e necessidade de se

realizar duas etapas de purificação devido à contaminação.

5.8 Obtenção dos anticorpos policlonais

Das 18 proteínas obtidas, todas foram inoculadas em camundongos em duplicata

conforme descrito no item 4.12, sendo que ambos camundongos inoculados com a proteína

referente ao gene 8257.t00019 (TcExp02B04) morreram, o mesmo tendo ocorrido com um

camundongo inoculado com a proteína referente ao gene 8171.t00006 (TcExp02B09),

obtendo-se, ao final, 33 soros (91,6%) dos 36 possíveis.

Utilizando a metodologia de western blot, os soros obtidos foram testados contra as

proteínas recombinantes, sendo que todos os soros reconheceram suas respectivas proteínas.

Contra os extratos de T.cruzi, do 17 anti-soros testados, 10 reconheceram suas proteínas

(62,5% do total de anti-soros) com tamanho esperado, e um soro (6,25%), reconheceu

especificamente a banda, porém com tamanho acima do esperado. As outras cinco proteínas

(31,25%) não tiveram reação com o soro de modo satisfatório. Na Tabela 5.3 estão as

proteínas que possuem anticorpos policlonais com qualidade adequada nos ensaios de

Western blot utilizando extrato de T. cruzi.

Tabela 5.3 Tabela dos genes dos quais obteve-se anticorpo policlonal.

Nome interno Qualidade Função (Domínio)

TcExp02A01 Bom Proteína Hipotética Conservada_ALBA

TcExp02A04 Bom Proteína Hipotética Conservada_SWIM

TcExp02A09 Bom Proteína Hipotética Conservada (Saccharopine dehydrogenase)

TcExp02A10 Bom Sterol 24-c-methyltransferase, putative

TcExp02B01 Bom Ras-related protein rab-5, putative

TcExp02B06 Quimio Proteína Hipotética Conservada (CSL zinc finger)

TcExp02B07 Bom Dynein light chain 2B, cytoplasmic, putative

TcExp02B10 Bom Calcineurin B subunit, putative

TcExp02B12 Bom Proteína Hipotética Conservada (Putative GTP-ase activating)

TcExp02C01 Bom Syntaxin, putative

TcExp02C04 Bom Centrin, putative

Pb (pares de base); KDa (kilodalton);Quimio (anticorpo policlonal com teste positivo apenas com

quimioluminescência).

5.9 Imunolocalização por microscopia óptica

Conforme descrito no item 5.9 foram obtidos 11 soros policlonais com qualidade

adequada para análise por western blot do padrão de expressão protéica durante a

metaciclogênese, sendo que esses mesmo soros foram utilizados para os ensaios de

imunolocalização. Dos 11 soros testados, dois (TcExp02A04 e TcExp02B06) obtiveram um

padrão inadequado para análise, pois houve reação cruzada com o soro pré-imune, o que foi

identificado somente nessa etapa, sendo que ambos não apresentaram reação do soro pré-

imune na fase anterior.

5.10 Características gerais dos genes selecionados e resultados de

western blot e imunolocalização.

As características gerais dos genes como, por exemplo, aspectos gerais, homologias,

funções dentre outros aspectos, serão abordadas nos tópicos a seguir bem como os resultados

de western blot e imunolocalização por microscopia óptica.

5.10.1 TcExp02A01, 8530.t00003, Proteína hipotética conservada

Este gene é o principal do grupo 1 e possui em T. cruzi 616 pares de bases codificando

uma proteína hipotética conservada de 25 kDa, apresentando um domínio PFAM denominado

ALBA (Acetylation Lowers Binding Affinity). A proteína na qual esse domínio foi

identificado inicialmente está presente em arquebactérias possuindo aproximadamente 10 kDa

e tem como função cobrir o DNA sem descompactá-lo (BELL et al, 2002; SANDMAN e

REEVE, 2005).

Este domínio foi encontrado primeiramente em estudos de proteínas de arquebactérias

sendo mais tarde denominada de ALBA, havendo diversos sinônimos: DBNP-B, Sac10b,

Sso10b e Ssh10b. Esta proteína foi inicialmente caracterizada em algumas espécies de

Sulfolobus, possuindo 10 kDa e tendo sua função regulada através da desacetilação por Sir2 e

acetilação por PAT, regulando assim sua função mais conhecida, a de se ligar a fita dupla de

DNA (MARSH et al, 2005; VICTORIA et al, 2005).

Além de se ligar à fita dupla de DNA, acredita-se também que a proteína em questão

tenha capacidade de ligar-se ao RNA podendo estar associado com metabolismo e

estabilidade do RNA (BOHRMANN et al.,1994; ARAVIND et al., 2003;GUO et al., 2003;

MARSH et al., 2005).

O domínio ALBA apresenta uma conservação de vários aminoácidos como se pode

verificar na Figura 5.7. O gráfico representa o grau de conservação dos aminoácidos nas

posições formadoras do domínio em questão. No eixo X, a numeração é referente ao número

da posição aminoacídica e no eixo Y, ao grau de conservação do aminoácido em questão. Por

exemplo, na posição 40 (eixo X) existe a possibilidade de ocorrência de glicina e aspartato,

sendo que a glicina (letra G em maior tamanho) é muito mais conservada. Desta forma, pode-

se verificar outras regiões conservadas.

Figura 5.7 Gráfico LogoPlot representando o padrão de conservação do domínio quinase.

Representação do domínio ALBA no banco de dados PFAM, mostrando o grau de conservação em cada

posição aminoacídica. No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no

eixo lateral a entropia relativa, onde a altura da pilha das letras em cada posição representa entropia relativa da

distribuição das emissões dentro de algumas probabilidades em relação à distribuição de background dado por

todo o perfil. A dimensão relativa de uma letra exprime a probabilidade de presença na posição a partir de um

estado de distribuição. Em outras palavras: quanto maior a letra, maiores as informações sobre a respectiva

posição nas famílias protéicas. As letras são ordenadas por ordem decrescente em função da sua probabilidade.

A confiabilidade da identificação do domínio PFAM ALBA na proteína de T. cruzi é alta

(1e

-19

) e o padrão de similaridade pode ser visto na Figura 5.8. No genoma do T. cruzi existem

ainda mais duas proteínas que possuem o mesmo domínio, também classificadas como

proteínas hipotéticas, mas apresentam um peso molecular menor, similar ao gene identificado

em arquebactérias: 4859.t00002/4903.t00007 (13 kDa) e 4859.t00001/4903.t00006 (13,5

kDa). Interessantemente, esses dois genes estão localizados justapostos no genoma de T.

cruzi, mas são relativamente distintos entre si, pois mesmo sendo praticamente compostos

somente pelo domínio ALBA, apresentam somente 51% de aminoácidos idênticos.

Figura 5.8. Comparação entre TcExp02A01 e o domínio ALBA.

Comparação utilizando o programa PFAM. Entre as duas seqüências encontra-se a conservação

aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio na posição 26 da seqüência do T. cruzi e o término na

posição 100.

A comparação da seqüência de T. cruzi com o proteoma de organismos modelos (Figura

5.9) identificou proteínas potencialmente ortólogas em eucariotos superiores, cuja

similaridade maior se concentra na região do domínio ALBA, mas apresentando diversos

aminoácidos conservados localizados em regiões externas ao domínio.

Figura 5.9Análise de similaridade entre TcExp02A01 e ortólogos de outros eucariotos.

O Domínio ALBA está sendo demarcado abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior dos

alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

É possível verificar na Figura 5.9 a existência de uma região rica em repetições da

seqüência RGG, somente em tripanossomatídeos, não sendo encontrada nos demais

organismos representados. Esse motivo está associado à interação ao RNA (McBRIDE et al,

2005). reforçando o aspecto funcional de associação ao RNA de TcExp02A01. O alinhamento

dos ortólogos de TcExp02A01 em tripanossomatídeos e outros protistas pode ser visto na

Figura 5.10.

Figura 5.10 Análise de similaridade entre TcExp02A01 e ortólogos de protozorios.

Os Domínios ALBA e RGG estão sendo demarcados abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior

dos alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Em T. cruzi, T. vivax, T. congolense, T. gambiense e T. brucei, existem dois parálogos,

contíguos no genoma, que diferem entre si na sua extremidade carbóxi-terminal. No gênero

Leishmania, há somente um ortólogo. Também foi identificado um ortólogo no gênero

Plasmodium e em Dictyostelium discoideum. A árvore filogenética dessas proteínas pode ser

vista na Figura 5.11.

Ao se fazer uma busca pelo domínio ALBA e a existência de motivos RGG contíguos,

foram identificados genes somente nas espécies supra-citadas, em Arabidopsis thaliana (dois

genes) e mais um gene em Plasmodium falciparum, não tendo sido encontrado genes com

esse padrão em eucariotos superiores. Interessantemente, fungos não apresentam proteínas

com o domínio ALBA.

Figura 5.11 Árvore filogenética das proteínas contendo os domínios ALBA e RGG-box.

Quanto maior a distância entre as diferentes espécies menor a conservação das seqüências analisadas.

Dentro do fluxograma do presente trabalho, obteve-se sucesso para todas as etapas. O

resultado da análise por Western blot da metaciclogênese pode ser visto na Figura 5.12, na

qual observa-se claramente um padrão de diminuição durante a metaciclogênese, em relação a

epimastigotas, com 1,4 vez em parasitas em diferenciação por 24 horas e 1,9 vez em

tripomastigotas metacíclicos.

Figura 5.12 Análise de expressão da proteína TcExp02A01 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Os valores em verde representam diminuição da expressão em relação a epimastigotas.

A imunolocalização de TcExp02A01 apresentou um padrão granular por todo citoplasma

celular como pode ser observado na Figura 5.13.

Figura 5.13 Imunolocalização de TcExp02A01.

A) contraste diferencial de fase com sobreposição da figura B. B) Imunolocalização utilizando o anticorpo

policlonal específico (verde) e marcação do DNA (DAPI, vermelho); C) contraste diferencial de fase do soro

pré-imune. D) Imunofluorescência do soro pré-imune.

5.10.2 TcExp02A08, 8694.t00004, Proteína Hipotética

Este gene é o acessório do grupo 1 e possui em T. cruzi 1368 pares de bases codificando

uma proteína hipotética de 52,1 kDa, não apresentando domínios nos bancos de dados PFAM

e Interpro. Essa proteína foi anotada inicialmente como hipotética, isto é, além de não ter sua

função atribuível, também não havia sido encontrado ortólogos em outros organismos. No

entanto, com o avanço do seqüenciamento de outros tripanossomatídeos, foi possível

identificar um possível ortólogo em L. infantum, denominado LinJ31_V3.2550, com

aproximadamente 47% de similaridade. Portanto, sua anotação deve ser modificada para

proteína hipotética conservada.

Interessantemente, há uma proteína de T. cruzi, 7963.t00006, com um grau de

similaridade suficiente (37%) com TcExp02A08 para correlacionar essas duas proteínas entre

si. Esse outro gene, anotado como proteína hipotética conservada, possui um peso molecular

estimado de 65,5 kDa, não apresentando domínios protéicos identificados, e estando presente

em um número maior de tripanossomatídeos, incluindo L. major mas excluindo T. brucei. A

comparação entre TcExp02A08 e 7963.t00006 pode ser vista na Figura 5.14, no qual

evidencia-se que, embora relacionadas, apresentam divergência suficiente para serem

consideradas distintas evolutiva e funcionalmente.

É importante ressaltar que para ambos genes de T. cruzi só foi identificado ortologia com

o gênero Leishmania, uma possível indicação de adaptação funcional dessa proteína.

Figura 5.14 Comparação entre TcExp02A08 e 7963.t00006.

Na parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Este gene foi clonado, obtendo-se o vetor de entrada e de expressão. Porém não foi obtido

sucesso na etapa de expressão em E. coli.

5.10.3 TcExp02A09, 7626.t00009, Proteína hipotética conservada

Este gene está classificado como gene acessório do grupo 1 e possui em T. cruzi 1197

pares de bases codificando uma proteína hipotética conservada de 42,9 kDa, apresentando um

domínio denominado sacaropina desidrogenase ([N6-(glutaryl-2)-l-lysine:NAD

oxidoreductase (l-lysine forming)]). Na anotação original do genoma, esse domínio não foi

identificado. Em nossa análise apresentou um valor de confiabilidade de 1,4x10

-17

, e seu

ortólogo em L. major tem a anotação desse domínio, representando, portanto, uma falha na

anotação desse gene pelo consórcio de seqüenciamento. O domínio se estende por

praticamente toda a proteína, da posição 9 à 384, de um total de 399 aminoácidos, conforme

pode ser verificado na Figura 5.15. Não foram identificadas outras proteínas de T. cruzi com

esse domínio.

Esta enzima tem como função catalizar a etapa final da biossíntese de lisina (XU et al,

2007). Ao se comparar a seqüência protéica de TcExp02A09 com o proteoma de

tripanossomatídeos, foi possível evidenciar ortólogos em L. major (LmjF28.0380), L.

infantum (LinJ28_V3.0520) e T. vivax (tviv1669g12.p1k_6), o qual, atualmente, apresenta um

genoma parcialmente seqüenciado, não sendo identificado ortólogo em T. brucei e outras

Leishmanias. O alinhamento dos quatro ortólogos está representado na Figura 5.16 sendo

possível observar o grande grau de conservação de aminoácidos similares entre essas quatro

proteínas.

Figura 5.15 Comparação entre TcExp02A09 e o domínio sacaropina desidrogenase.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 9 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 384.

Figura 5.16 Comparação entre a proteína codificada por TcExp02A09 e os ortólogos encontrados.

O domínio sacaropina desidrogenase está delimitado abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior

dos alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Ao se ampliar a comparação a outros organismos, observa-se um grau de similaridade

relativamente alto com um grande número de organismos das mais diferentes divisões

filogenéticas, sendo que os mais próximos são proteobactérias (50% de similaridade em uma

região de 413 nucleotídeos, abrangendo toda a proteína), mas tendo um grau semelhante de

similaridade, em uma região menor compreendendo aproximadamente 150 aminoácidos

iniciais, com outros organismos das mais diferentes divisões filogenéticas.

O alinhamento de TcExp02A09 com a proteína mais similar em bactéria e em mamíferos

pode ser vista na Figura 5.17, sendo respectivamente uma cianobactéria, Gloeobacter

violaceus (e-value de 6e

-52

, 50% de similaridade), e chimpanzé, Pan troglodytes (e-value de

-32

, 46% de similaridade).

Figura 5.17 Análise de similaridade entre TcExp02A09 e os ortólogos em G. violaceus e P. troglodytes.

O domínio sacaropina desidrogenase está delimitado. Na parte superior encontra-se a numeração relativa à

posição aminoacídica.

As etapas do fluxograma de análise para este gene foram finalizadas com sucesso. O

resultado da análise por western blot da metaciclogênese pode ser visto na Figura 5.18, na

qual se observa claramente uma forte diminuição da expressão, em relação a epimastigotas, de

3,1 vezes em aderido 24 horas e de 1,5 vez em metacíclico. O anti-soro apresentou sinal em

uma faixa de peso molecular não esperado, próxima a 25 kDa, nas forma epimastigota e

aderido 24 horas.

Figura 5.18. Análise de expressão da proteína TcExp02A09 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular; ?: suposta degradação. Os valores em verde representam diminuição da expressão em a

epimastigotas.

É importante ressaltar, conforme mencionado acima, que TcExp02A09 é a única proteína

em T. cruzi que contém esse domínio e, portanto, a possibilidade de reação cruzada é remota,

não tendo sido evidenciado, também, indícios de degradação protéica. Uma hipótese a ser

testada é se essa proteína de ~25 kDa representa uma forma truncada de TcExp02A09.

A imunolocalização da proteína TcExp02A09 apresenta um padrão de

imunofluorescência difuso por todo citoplasma e também uma região de maior intensidade no

cinetoplasto, melhor evidenciada com um menor tempo de exposição (C) como pode ser

verificado na Figura 5.19.

Figura 5.19 Imunolocalização da proteína TcExp02A09.

A) contraste diferencial de fase com sobreposição de C. B) Imunolocalizaçao utilizando o anticorpo

policlonal específico (verde) e marcação do DNA (DAPI, vermelho) C) imunolocalização com menos exposição;

D) contraste diferencial de fase do soro pré-imune. E) Imunofluorescência do soro pré-imune.

5.10.4 TcExp02A10, 6680.t00001, Sterol 24-c-methyltransferase

Este gene é o gene guia do grupo 1 e possui em T. cruzi 1080 pares de bases codificando

uma proteína hipotética conservada de 40,5 kDa, a qual apresenta um domínio denominado

Sterol_MT_C (esterol metiltransferase C-terminal), sendo esta proteína a única em T. cruzi

com esse domínio. Este domínio é encontrado principalmente na região carbóxi-terminal de

metiltransferases de fungos e plantas envolvidas com a metilação de esteróis (BOUVIER-

NAVE et al,1998).

A comparação da região da proteína de T. cruzi com o domínio pode ser vista na Figura

5.20. Além de apresentar similaridade com esse domínio, entre as posições 216 e 351 (valor

de confiabilidade 2e

-55

), também apresenta similaridade com o domínio Methyltransf11

(metiltransferase, entre as posições 109 e 207, valor de confiabilidade 5e

-21

), o qual é

encontrado em proteínas que transferem grupamentos metil a partir de S-adenosil-L-

metionina (SAM) para átomos de nitrogênio, oxigênio ou carbono de DNA, RNA, proteínas

ou moléculas pequenas. Essas modificações apresentam funções regulatórias, estando

envolvida em processos de regulação da expressão gênica e diferenciação (PAWLAK et al,

2000).

Esses dois domínios, se estendendo por praticamente toda a proteína de 359 aminoácidos,

são compatíveis entre si e reforçam a confiabilidade da predição. No entanto, a anotação do

genoma pelo consórcio de seqüenciamento não identificou tais domínios, evidenciando mais

uma falha no processo, a qual, nesse caso, é menos problemático, pois a anotação funcional da

proteína a identifica corretamente como uma metiltransferase.

Figura 5.20 Comparação entre TcExp02A10 e o domínio Sterol_MT_C e Methyltransf_11.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 216 e o término na posição 351 com relação ao domínio Sterol_MT_C, e início na posição 109 e

término em 207 para o domínio Methyltransf_11.

A análise de TcExp02A10 com outros eucariotos organizados no banco de dados

Homologene pode ser vista na Figura 5.21. As regiões mais conservadas estão localizadas

dentro dos domínios, sendo que o domínio Methyltransf11 é mais conservado do que o

Sterol_MT_C. Os aminoácidos entre as posições 77 e 127 também apresentam um alto grau

de conservação, embora essa região não apresenta um domínio identificado. Esse último dado

sugere que as proteínas analisadas são ortólogas entre si e que tal região apresenta

importância funcional ou estrutural.

Baseado nestas análises pode-se verificar um padrão adequado de conservação do

domínio, existindo uma região inicial com menor similaridade entre as seqüências até a

posição aminoacídica 70, uma região mais conservada (entre 70 até 126) seguida do domínio

Methyltransf11 (132 até 232) e do domínio Sterol_MT_C (240 até 286) respectivamente.

Figura 5.21 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.

Os Domínios Metiltransferase 11 e Sterol_MT_C estão demarcados abaixo das seqüências analisadas. Na

parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

As etapas do fluxograma de análise para este gene foram finalizadas com sucesso. O

resultado da análise por western blot da metaciclogênese pode ser visto na Figura 5.22, na

qual se observa diminuição da expressão em relação a epimastigota de 2,1 vezes em aderido

24 horas e de 31 vezes em metacíclicos.

Figura 5.22. Análise de expressão da proteína TcExp02A10 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Os valores em verde representam diminuição da expressão em relação a epimastigotas

A imunolocalização da proteína TcExp02A10 apresentou um padrão difuso pelo

citoplasma, sem a existência de agrupamentos distinguíveis, como pode ser verificado na

Figura 5.23.

Figura 5.23 Imunolocalização da proteína TcExp02A10.

A) contraste diferencial de fase com sobreposição da figura B. B) Imunolocalizaçao utilizando o anticorpo

policlonal anti-6680.t00001. Em verde a marcação referente ao anticorpo específico e em vermelho a marcação

de DNA utilizando DAP. C) contraste diferencial de fase relativo ao soro pré-imune. D) Imunofluorescência

obtida com a utilização do soro pré-imune.

5.10.5 TcExp02A02, 6996.t00063, Proteína Hipotética Conservada

Este gene está classificado como o gene principal do grupo 2 e possui 3196 pares de

bases em T. cruzi, codificando uma proteína hipotética conservada de 117 kDa, a qual

apresenta um domínio de proteína-quinase. Esse domínio faz parte de um extenso grupo de

proteínas que compartilham um domínio catalítico conservado em serina/treonina e tirosinas

quinases, apresentando diversas glicinas conservadas em sua região aminoterminal, próximo a

um resíduo de lisina também conservado, o qual parece estar associado à ligação de ATP.

Além destes resíduos, existem resíduos de ácido aspártico conservados na região central do

domínio, os quais são importantes para a atividade catalítica da enzima. Estes resíduos estão

evidenciados na Figura 5.24. Essa família de proteínas está presente em eucariotos, vírus e

algumas bactérias.

Figura 5.24 Gráfico LogoPlot representando o padrão de conservação do domínio quinase.

Representação do domínio quinase no banco de dados PFAM, mostrando o grau de conservação em cada

posição aminoacídica. No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no

eixo lateral a entropia relativa. Os aminoácidos G (glicina), K (lisina) e D (ácido aspártico) característicos do

domínio estão demarcados em retângulos pretos.

Quando comparada a similaridade entre o domínio PKinase e a seqüência do T. cruzi,

verificou-se um valor de confiabilidade de 7,5e

-35

. O início do domínio na seqüência protéica

de TcExp02A02 ocorre na posição 666 e o seu término ocorre na posição 972 como mostra a

Figura 5.25. É interessante notar que embora essa proteína apresente 1041 aminoácidos,

somente 307 (29,5%) abrangem esse domínio. Como este domínio está localizado na

extremidade carbóxi-terminal, temos uma região relativamente ampla sem a evidência de

qualquer outro domínio em sua porção amino-terminal. Geralmente, proteína-quinases

apresentam domínios acessórios, que auxiliam na determinação de sua especificidade. A

ausência desses domínios acessórios em TcExp02A02, associado à existência de uma região

protéica grande sem domínios identificados, pode ser indício de que haja um domínio

acessório novo, uma situação relativamente comum em proteína-quinases de T. cruzi (EL-

SAYED et al, 2005a).

Figura 5.25. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio PKinase.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 666 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 972.

A identificação dos ortólogos em tripanossomatídeos foi realizada, tendo-se encontrado

em todos as espécies seqüenciadas até o momento. O alinhamento das seqüências protéicas

obtidas pode ser visto na Figura 5.26 e, de forma geral, podemos verificar que são bastante

conservada, mesmo na região não abrangendo o domínio quinase. As proteínas de T. vivax e

T. congolense são menores provavelmente porque estão incompletas, pois esses dois genomas

ainda estão em fase de montagem. Quando comparamos essa seqüência com outros

organismos, é obtido um número muito grande de seqüências cuja similaridade é ditada pela

região contendo o domínio, o que impossibilita a clara definição de homologia.

Um resultado interessante que resulta da comparação de TcExp02A02 com as proteínas

de outros organismos é a grande semelhança da região do domínio com proteínas anotadas

como quinase 2 do fator de iniciação da tradução 2 (EIF2AK2). Devido a isto, a anotação

dessa proteína em tripanossomatídeos é, em geral, derivada dessa similaridade. No entanto,

conforme mencionado acima, a região de similaridade está contida no domínio, o que

enfraquece a associação evolutiva. Interessantemente, as proteínas EIF2AK2 têm um tamanho

muito próximo ao do domínio quinase e, portanto, a região anterior ao domínio da proteína de

T. cruzi não poderia realmente apresentar similaridade com EIF2AK2. Uma possibilidade que

pode se aventar é a de que TcExp02A02 é realmente o ortólogo de EIF2AK2 e sofreu fusão

com outra proteína acessória que, em outros organismos, está separada. Ao se analisar

separadamente a região externa ao domínio, não foi encontrado similaridade com outras

proteínas, com exceção dos ortólogos em tripanossomatídeos.

Figura 5.26 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.

O Domínio Kinase está sendo demarcado abaixo das seqüências analisadas.

Este gene foi clonado, obtendo-se o vetor de entrada e de expressão, porém não foi

possível obter a expressão da proteína.

5.10.6 TcExp02A11, 8773.t00014, Proteína Hipotética

Este gene está classificado como gene acessório do gripo 2 e possui em T. cruzi 1644

pares de base codificando uma proteína hipotética de 61,4 kDa. Não apresenta similaridade

com proteínas de outros tripanossomatídeo e não foram identificados domínios protéicos

conservados. A análise comparativa de TcExp02A11 com todas as proteínas disponíveis no

Genbank, utilizando BLASTp, não mostrou nenhuma seqüência com similaridade confiável.

Este gene foi clonado, obtendo-se o vetor de entrada e de expressão, porém não foi

possível obter uma proteína expressa.

5.10.7 TcExp02A12, 8364.t00002, Proteína Hipotética conservada

Este gene é o secundário do grupo 2 e possui em T. cruzi 1320 pares de bases codificando

uma proteína hipotética conservada de 48,9 kDa, a qual não apresenta domínio predito pelo

programa PFAM, mas com a predição de um peptídeo sinal. Ao tentar se identificar ortólogos

por similaridade, foram identificadas somente seqüências em T. vivax, T. brucei, T.

congolense e T. b. gambiense, com e-value próximo a 1e10

-15

, um valor relativamente baixo.

No entanto, há indicação de ortologia entre os genes de T. cruzi e T. brucei na análise

disponível em http://www.genedb.org, a qual leva em consideração a conservação de sintenia,

além da similaridade de seqüência. Não foram identificados ortólogos em Leishmania, um

dado importante. De maneira geral, a conservação entre a seqüência de T. cruzi e os outros

tripanossomatídeos é baixa, como pode ser visto na Figura 5.27. Ela apresenta uma inserção,

entre os aminoácidos 96 e 132. Interessantemente, a região hidrofóbica presente na seqüência

de T. cruzi que caracterizaria o peptídeo sinal não é visto em nenhuma das outras seqüências

de tripanossomatídeos e a seqüência de T. cruzi apresenta uma metionina interna, logo a

jusante do peptídeo sinal, na posição 27. Esse padrão é indicativo de um erro de predição de

início da região codificadora, pois é um padrão recorrente na montagem do genoma de T.

cruzi.

Essa informação foi levada em conta na predição do iniciador forward utilizado no

presente trabalho e, portanto, a proteína recombinante produzida no presente trabalho teria um

peso molecular estimado de 45,7 kDa.

Em geral, cada gene apresenta mais de uma região codificadora identificada pelo projeto

genoma de T. cruzi, causada principalmente pela natureza híbrida da cepa selecionada para o

seqüenciamento. Muitas vezes, a predição do códon de início da tradução é diferente entre

essas duas seqüências, sendo que a seqüência com um códon de iniciação mais a montante

apresenta, muito freqüentemente, uma grande quantidade de timinas, a qual é traduzida para

fenilalanina, o que dá o caráter hidrofóbico a essa região.

No entanto, ao se comparar a seqüência cujo códon de iniciação está localizado mais a

jusante, ela apresenta uma região pré-ATG idêntica ao gene com a CDS maior, o que

reforçará o erro de predição. Além disso, os ortólogos em T. brucei e L. major, genomas cuja

montagem é melhor, não apresentam essa região hidrofóbica. É importante salientar que o

sinal de trans-splicing, o qual está presente geralmente em uma região muito próxima ao ATG

inicial, é rico em poli-pirimidinas.

Embora não tenham sido identificados domínios protéicos com um grau de confiabilidade

aceitável, há a predição de um domínio com valor de confiabilidade acima do limiar,

denominado zf-TRAF (PF02176), o qual é encontrado em algumas proteínas associadas com

o receptor do fator de necrose tumoral, o qual não ocorre em T. cruzi, indicando haver um

domínio zinc-finger degenerado em TcExp02A12.

Interessantemente, há diversos resíduos de histidina e cisteína conservados nos quatro

tripanossomatídeos selecionados: C227, C230, C247, C254, H243, H270 e H278. Esses

resultados reforçam a existência de um domínio relacionado aos de zinc finger ainda não bem

caracterizado.

Figura 5.27 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros tripanossomatídeos.

Na parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica. As

posições destacadas com retângulos pretos são relativos às histidinas e cisteínas conservadas descritas neste

trabalho.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão, porém não foi

possível obter uma proteína expressa.

5.10.8 TcExp02B01, 8208.t00006, Ras-related protein rab-5

Este gene está classificado como guia do grupo 2 e possui em T. cruzi 681 pares de bases

codificando uma proteína hipotética conservada de 24 kDa, a qual apresenta um domínio

denominado RAS da superfamília de pequenas GTPases. Essa família de proteínas é bastante

numerosa contendo algumas sub-famílias principais, como RAB, RAS, RAC, RAL, dentre

outras.

Ao analisar a seqüência em T. cruzi no programa PFAM pode-se encontrar uma alta

similaridade entre o domínio RAS e a seqüência de T. cruzi, com valor de confiabilidade de

-74

. O início do domínio na seqüência protéica de T. cruzi ocorre na posição 17 e seu

término na posição 190, como mostra a Figura 5.28, ocupando assim quase a totalidade da

seqüência aminoacídica.

Figura 5.28. Comparação entre TcExp02B01 e o domínio RAS

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 17 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 190.

A análise da seqüência de T. cruzi com o uso do programa BLASTp identificou diversos

genes similares, anotados como Rab5, reforçando a anotação correta desse gene e a

conservação grande desse domínio, de leveduras a humanos. A análise das seqüências

homólogas pode ser vista na Figura 5.29, verificando-se uma grande conservação do domínio,

com a existência de uma região inicial com menor similaridade entre as seqüências, seguida

de regiões com maior similaridade, separadas por seqüências específicas de

tripanossomatídeos e de A. thaliana (posição 69 a 89).

Figura 5.29 Análise de similaridade entre TcExp02B01 e ortólogos de outros eucariotos.

O domínio RAS está sendo demarcado abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior dos

alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

As proteínas com domínio Rab são encontradas na porção citosólica de membranas

intracelulares, sendo que essa localização é variável e determinada por modificações pós-

traducionais, em um motivo formado por cisteínas na região carbóxi-terminal. Acredita-se que

a função desta família de proteínas esteja relacionada com a regulação de vias intracelulares

de tráfego vesicular (ZERIAL & McBRIDE, 2001; LANZETTI et al, 2004). Mais

especificamente, a proteína RAB5 é uma pequena GTPase que está envolvida no controle do

tráfego intracelular, atuando como receptor da endocitose e na dinâmica endossomal. Dentro

desta perspectiva, Rab5 regula o transporte de vesículas, mediado por clatrina, entre a

membrana plasmática e os endossomos primários (recentes), além das fusões entre os

endossomos primários (ZERIAL & McBRIDE, 2001).

Para este gene todas as etapas laboratoriais foram realizadas com sucesso. O resultado da

análise por western blot de TcExp02B01 durante a metaciclogênese pode ser visto na Figura

5.30, onde pode ser observado um aumento, em relação a epimastigotas, de 7,7 vezes em

aderido 24 horas e de 1,5 vez em metacíclico. Esse resultado necessita de comprovação

devido ao fato de que a intensidade da banda de epimastigota e metacíclico é muito próxima

ao ruído de fundo. Embora a quantificação seja menos confiável, o padrão de aumento de

expressão em aderido 24 horas é evidente.

Figura 5.30. Análise de expressão da proteína TcExp02B01 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Os valores em vermelho representam aumento da expressão em relação a epimastigotas

Na Figura 5.31, pode-se verificar a localização da proteína TcExp02B01 entre o início do

flagelo e o cinetoplasto, em uma região bem definida. Esse local pode ser relativo a estruturas

no complexo de Golgi e bolsa paraflagelar.

Figura 5.31 Imunolocalização da proteína TcExp02B01.

A) contraste diferencial de fase com sobreposição da figura B. B) Imunolocalização utilizando o anticorpo

policlonal específico (verde) e marcação de DNA (DAPI, vermelho); C) contraste diferencial do soro pré-imune.

D) Imunofluorescência do soro pré-imune.

5.10.9 TcExp02A03, 7109.t00005, Proteína hipotética conservada

Este gene está classificado como o principal do grupo 3 e possui em T. cruzi 3027 pares

de bases codificando uma proteína hipotética conservada de 113,7 kDa, a qual apresenta um

domínio PFAM denominado genericamente de FKBP-type (peptidyl-prolyl Cis-trans

isomerase). Proteínas com esse domínio funcionam como receptores de dois

imunosupressores, FK506 e rapamicina, e também auxiliam no processo de dobramento

(folding) de proteínas, catalisando a isomerização cis-trans da prolina (BANG et al 2000).

O grau de confiabilidade da determinação desse domínio em T. cruzi é relativamente

baixo (0,044). Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentam a identificação desse

domínio, também com baixa probabilidade. Porém, a sua identificação nos três organismos

aumenta a verossimilhança de sua existência, sendo possivelmente degenerado. O início do

domínio na seqüência gênica relativa ao T. cruzi ocorre na posição 129 e termina na posição

232 como mostra a Figura 5.32.

Figura 5.32. Comparação entre TcExp02A03 e o domínioFKBP_C.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 129 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 232.

A seqüência deste gene possui homologia com T. brucei e L. major, de acordo com as

seqüências obtidas no GeneDB (http://www.genedb.org). A Figura 5.33 mostra o alinhamento

dessas proteínas demonstrando a similaridade entre os mesmas. Ao se comparar a seqüência

de T. cruzi com as proteínas presentes no Genbank, foi possível identificar similaridade com

proteínas de diversos outros organismos, mas com um grau de conservação mais baixo,

impossibilitando a diferenciação entre homologia ou conservação de domínio funcional.

Figura 5.33 Análise de similaridade entre TcExp02A03 e ortólogos de outros tripanossomatídeos.

O Domínio FKBP está delimitado. Na parte superior dos alinhamentos encontram-se a numeração relativa

à posição aminoacídica.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão, porém na expressão

não obtivemos resultados com os parâmetros já citados no item 4.9.

5.10.10 TcExp02B02, 8764.t00016, Proteína Hipotética

Este gene está classificado como acessório do grupo 3 e possui em T. cruzi 1089 pares de

bases codificando uma proteína hipotética de 40,3 kDa, apresentando dois domínios

denominados de ACP (Phosphopantetheine attachment site) e MYB-2 (Myb DNA-binding

domain repeat signature 2), preditos pelo programa PROSITE. No entanto, ambos domínios

apresentam uma porcentagem de predição de falso-positivos muito alta e, portanto, a

determinação dos mesmos não é confiável. Utilizando os programas PFAM e Interpro, não foi

possível encontrar domínios conhecidos a partir da seqüência de T. cruzi.

Inicialmente, esse gene foi classificado como codificando uma proteína hipotética, isto é,

sem ortólogos identificados até o momento. No entanto, com a liberação contínua de novos

genomas, foi possível identificar uma seqüência similar em L. infantum, com um e-value de

1e10

-7

. O alinhamento dessas duas seqüências pode ser visto na figura Figura 5.34,

evidenciando-se o baixo grau de similaridade entre essas duas seqüências, distribuída por

resíduos de aminoácidos dispersos por toda região codificadora, com somente um trecho

contendo mais do que três aminoácidos. Porém, a determinação de ortologia é relativamente

confiável, pois baseou-se no procedimento de reciprocal best hit. Além disso, foi identificado

um EST similar a esse gene, o que reforça a sua expressão e verossimilhança como proteína

real. Outro dado importante para reforçar esse resultado é a sua localização em um fragmento

cromossômico sem indícios de erro de montagem, o que muitas vezes cria artificialmente

proteínas inexistentes, as quais são classificadas como hipotéticas.

Figura 5.34 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e L. infantum.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão. A expressão foi

obtida, bem como o soro policlonal, porém só houve reconhecimento da proteína

recombinante. Quando utilizado extrato de T. cruzi não apresentou sinal.

5.10.11 TcExp02B03, 8728.t00021, Proteína Hipotética Conservada

Este gene está classificado como secundário do grupo 3 e possui em T. cruzi 954 pares de

bases codificando uma proteína hipotética conservada de 35,1 kDa, apresentando um domínio

PFAM denominado zf-C2H2 (Zinc Finger Protein C2H2). Este domínio representa o zinc

finger clássico e possui função ligadora a ácidos nucléicos (DNA e RNA) fazendo parte de

muitas proteínas associadas à expressão gênica. A característica principal deste domínio é a

conservação de duas cisteínas e duas histidinas. Na Figura 5.35 pode-se verificar a

conservação das cisteínas nas posições 3 e 7 e da histidina nas posições 20 e 24 na

representação em logo-plot do modelo do domínio disponível na base de dados PFAM.

Figura 5.35 Gráfico HMM relativo o domínio zf-C2H2.

Gráfico HMM retirado do programa PFAM mostrando o grau de conservação em cada posição

aminoacídica do domínio zf-C2H2. No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do

domínio e no eixo lateral a entropia relativa.

A comparação entre o domínio zf-C2H2 e TcExp02B03 pode ser vista na Figura 5.36, e o

valor de confiabilidade foi 1,3e

-5

. O início do domínio na seqüência gênica relativa ao T. cruzi

ocorre na posição 79 e termina na posição 102, evidenciando-se a conservação das duas

cisteínas e as duas histidinas.

Figura 5.36 Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio zf-C2H2.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 71 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 102.

A comparação da seqüência TcExp02B03 com o proteoma de outros organismos

identificou ortólogos apenas em tripanossomatídeos O alinhamento desses ortólogos obtido

pelo programa Clustal W é mostrado na Figura 5.37, podendo-se verificar a conservação das

duas cisteínas bem com das duas histidinas características do domínio em questão. Além do

domínio, este gene apresenta conservação nas outras regiões em relação às outras espécies,

sendo que as proteínas de Leishmania apresentam um tamanho maior.

Figura 5.37 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.

O Domínio zf-C2H2 está sendo demarcado abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior dos

alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Este gene foi inserido no vetor de entrada, porém após a clonagem e seqüenciamento, foi

verificado a falta de um nucleotídeo no iniciador forward ocasionando um desvio no código

de leitura esperado, inviabilizando o prosseguimento de sua análise.

5.10.12 TcExp02B04, 8257.t00019, DREV Metiltransferase

Este gene está classificado como guia do gripo 3 e possui em T. cruzi 945 pares de bases

codificando uma proteína de 35,2 kDa, apresentando um domínio PFAM denominado de

DREV. Não se conhece a função deste domínio, porém parece estar relacionado a outras

metiltransferases.

O valor de significância da comparação entre TcExp02B04 e o domínio predito foi de

3,5e

-59

, abrangendo praticamente a proteína inteira. A similaridade da comparação entre o

domínio DREV e a seqüência da proteína em questão pode ser vista na Figura 5.38.

A análise da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank utilizando o programa

BLASTp, resultou em várias seqüências com um valor de significância próximo a 1e

-38

, sendo

selecionadas duas seqüências que aparecem também no programa Homologene. Esse domínio

é conservado desde leveduras até humanos. A análise de seqüências homólogas pode ser vista

na Figura 5.39 podendo-se verificar a grande conservação do domínio.

Figura 5.38 Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio DREV.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 74 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 344.

Figura 5.39 Análise de similaridade entre TcExp02B04 e os ortólogos de outros eucariotos.

O Domínio DREV está sendo demarcado abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior dos

alinhamentos encontram-se a numeração relativa à posição nucleotídica.

Este gene foi clonado, obtendo-se o vetor de entrada e de expressão. A proteína foi

expressa, porém a obtenção do soro não foi possível devido à morte dos animais durante as

inoculações, não sendo possível a realização dos ensaios de western blot e nem

imunolocalização por microscopia óptica.

5.10.13 TcExp02A04, 6896.t00027, Proteína Hipotética conservada

Este gene está classificado como principal do grupo 4 e possui em T. cruzi 1353 pares de

bases codificando uma proteína hipotética conservada de 51,4 kDa, apresentando um domínio

denominado SWIM (Zinc Finger Protein SWIM, e-value de 3,2e10

-3

) e outro como zf-

C3HC4 (Zinc Finger Protein C3HC4 ou RING finger, e-value de 7,9e10

-4

), ambos preditos a

partir do banco de dados PFAM. Este último domínio não foi identificado pelo consórcio de

anotação do genoma de T. cruzi. O primeiro domínio citado é encontrado em bactérias,

arquebactérias e eucariotos, e sua conformação pode ser semelhante a dos domínios Zinc

finger zf-C2H2, sendo um domínio versártil, podendo interagir om DNA ou proteínas em

diferentes contextos (MAKAROVA et al., 2002). Já o domínio RING finger está presente em

proteínas que participam da via de ubiquitinação. A comparação dos domínios identificados

com a seqüência de TcExp02A04 pode ser observada na Figura 5.40. O domínio SWIM está

localizado entre os resíduos 49 e 79, e o zf-C3HC4 entre os resíduos 315 e 356.

Esse gene apresenta alguns outros domínios, parciais e com baixo valor de confiabilidade

(degenerados ou preditos erroneamente), que são funcionalmente relacionados aos domínios

supracitados: PHD (resíduos 131 a 181, e-value de 0,099), zf-B Box (resíduos 202 a 234, e-

value de 0,68). Isso pode indicar uma maior especialização dessa proteína, porém com

modificações dos domínios acessórios tornando sua identificação problemática.

Figura 5.40 Comparação entre a seqüência de T. cruzi e os domínios SWIM e zf-C3HC4 utilizando o

programa PFAM.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica.

O domínio SWIM possui como característica a conservação de 3 cisteínas e uma lisina

como pode ser visto na Figura 5.41. Já o domínio C3HC4 (RING) possui 3 cisteínas

conservadas seguida de uma lisina e 4 cisteínas, (Figura 5.42). Nota-se a grande variação nas

posições aminoacídicas das regiões adjacentes às posições conservadas em ambos os

domínios.

Figura 5.41. Gráfico HMM relativo ao domínio SWIM

Gráfico HMM retirado do programa PFAM mostrando o grau de conservação em cada posição

aminoacídica do domínio SWIM. No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do

domínio e no eixo lateral a entropia relativa. Os aminoácidos C (Cisteína) e K (Lisina) característicos do

domínio estão demarcados por retângulos pretos.

Figura 5.42. Gráfico HMM do domínio zf-C3HC4 (RING).

No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no eixo lateral a

entropia relativa. Os aminoácidos C (Cisteína) e K (Lisina) característicos do domínio estão demarcados por

retângulos pretos.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas presentes no Genbank,

utilizando o programa BLASTp, identificou várias seqüências com um valor de significância

próximo a 1e

-28

, sendo selecionadas duas seqüências que aparecem também no programa

Homologene. Esse domínio é conservado desde leveduras até humanos. A análise de

seqüências homólogas pode ser vista na Figura 5.43, podendo se verificar um padrão de

conservação dos dois domínios, bem como outras regiões de conservação.

Figura 5.43 Análise de similaridade entre TcExp02A04 e ortólogos de outros eucariotos.

O Domínio SWIM e RING finger estão sendo demarcados abaixo das seqüências analisadas. Na parte

superior dos alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Para este gene todas as etapas laboratoriais foram realizadas com sucesso. O resultado da

análise por western blot da metaciclogênese pode ser visto na Figura 5.44, onde pode ser

observado um forte aumento, em relação a epimastigotas, de 4,5 vezes em aderido 24 horas e

uma diminuição de 3,1 vezes em metacíclicos. A magnitude desse último resultado deve ser

considerada com cautela devido ao sinal fraco de epimastigota e metacíclico. No entanto, o

padrão de aumento em 24 horas e diminuição em metacíclicos é claro.

Figura 5.44. Análise de expressão da proteína TcExp02A04 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Valores em vermelho e verde representam, respectivamente, aumento e diminuição em relação a

epimastigotas

A imunolocalização foi realizada, porém apresentou reação cruzada com o soro pré-

imune, sendo assim, descartado o resultado a princípio.

5.10.14 TcExp02B05, 7224.t00006, Proteína Hipotética

Este gene está classificado como acessório no grupo 4 e possui em T. cruzi 1485 pares de

bases codificando uma proteína hipotética de 52,7 kDa. Este gene não apresentou domínios

previstos pelos programas PFAM e Interpro. Não foram identificados ortólogos em outros

organismos, mesmo incluindo os genomas recentemente seqüenciados. Esse gene apresenta

uma região poli-valina, entre os aminoácidos 45 e 50, a qual difere de tamanho entre os dois

alelos de CL Brener (6895.t00004 e 7224.t00006), além de duas regiões ricas em glutamina,

nas regiões 306 a 314 e 407 a 422, conforme pode ser visto na Figura 5.45. A implicação

funcional dessas seqüências não está estabelecida.

Figura 5.45. Alinhamento das proteínas de TcExp02B05 presentes em CL Brener.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão, porém obtivemos

uma expressão fraca de um produto com um tamanho maior do que o esperado, 90 kDa.O

anticorpo não reconheceu nenhum sinal no extrato de T. cruzi.

5.10.15 TcExp02B06, 6958.t00014, Proteína Hipotética Conservada

Este gene é o secundário do grupo 4 e possui em T. cruzi 249 pares de bases codificando

uma proteína hipotética de 9,2 kDa. Apresenta um domínio do tipo Zinc finger denominado

CSL. Este domínio está freqüentemente presente associado a DnaJ e também é encontrado nas

proteínas DPH3 e DPH4, as quais estão envolvidas na biossíntese de diftamida, um resíduo de

histidina modificado pós-traducionalmente, encontrado somente no fator de elongação da

tradução 2 (eEF-2), sendo conservada de arquebactérias a humanos e que serve como alvo

para a toxina da difteria (LIU et al, 2004).

Em T. cruzi, apenas esse gene foi identificado com confiabilidade (e-value de 1,3e

-10

)

como contendo o domínio zf-CSL. Este domínio é caracterizado pela conservação de 4

cisteínas, seguidas de uma leucina e de uma serina, como pode ser observado Figura 5.46. A

região de similaridade entre o domínio zf-CSL e a proteína TcExp02B06 pode ser vista na

Figura 5.47, a qual se extende por uma grande porção da proteína (dos resíduos 7 a 59, de um

total de 83 aminoácidos).

Figura 5.46 Gráfico HMM do domínio zf-CSL.

No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no eixo lateral a

entropia relativa. Os aminoácidos com maior valor de conservação característicos do domínio estão demarcados

por retângulos pretos.

Figura 5.47 Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio zf-CSL.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica.

Ao se realizar uma comparação da proteína TcExp02B06 com todas as proteínas

presentes no Genbank, através de um BLASTp, foi possível identificar possíveis ortólogos em

diversos organismos, como L. major, T. brucei, A. thaliana, H. sapiens, S. cerevisiae entre

outros eucariotos, com valor de significância próximo a 1e-17 para tripanossomatídeos e 1e-7

para outros organismos. O alinhamento das seqüências homólogas pode ser visto na Figura

5.48, no qual é possível verioficar que a maior similaridade está concentrada na região

relativa ao domínio zf-CSL. Todas essas proteínas apresentam um tamanho semelhante e

estão anotadas, geralmente, como DPH3 ou KTI11, isto é, uma das proteínas necessárias para

a síntese de diftamida, conforme mencionado acima.

Figura 5.48 Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.

O Domínio zf-CSL está sendo demarcados abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior dos

alinhamentos encontram-se a numeração relativa à posição nucleotídica.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão. A expressão foi

obtida, bem como o soro policlonal, porém com uma qualidade baixa, necessitando do

método de quimioluminescência para detectar a proteína no ensaio de western blot.

Apresentou um aumento de intensidade de sinal na fase tripomastigota metacíclico em relação

a forma epimastigota, de 1,5 vez, como pode ser verificado na Figura 5.49.

Figura 5.49 Análise de expressão da proteína TcExp02B06 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Os valores em vermelho e verde representam, respectivamente, aumento e diminuição da expressão

em relação a epimastigotas

A imunolocalização foi realizada, porém a permeabilização das células que ocorre

durante o processo de confecção das lâminas não ocorreu de forma adequada, impedindo a

obtenção de resultados. Este procedimento será repetido futuramente.

5.10.16 TcExp02B07 8243.t00004, Dynein light chain 2B, cytoplasmic,

putative

Este gene está classificado como guia do grupo 4 e possui em T. cruzi 354 pares de bases

codificando uma proteína hipotética conservada de 13,3 kDa, apresentando um domínio

PFAM denominado de Roadblock/LC7, com um valor de confiabilidade de 0,007, que se

extende por praticamente toda a proteína, dos resíduos 18 a 113, de um total de 118

aminoácidos (Figura 5.50). Este domínio está presente em uma família de proteínas que fazem

parte do complexo multimérico da dineína, mais precisamente encontrada no braço externo do

complexo, podendo estar associada com diferentes proteínas resultando em função reguladora

específica da dineína (PFISTER et al, 2006).

Figura 5.50. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio Roadblock/LC7.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp, identificou várias seqüências com um valor de significância próximo a

-35

para tripanossomatídeos e 1e

-9

para outros organismos, sendo que esse domínio é

conservado desde leveduras até humanos. A comparação das proteínas homólogas pode ser

vista na Figura 5.51.

Figura 5.51. Análise de similaridade entreTcExp02B07 e ortólogos de outros eucariotos.

O Domínio Roadblock/LC7 está sendo demarcados abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior

dos alinhamentos encontram-se a numeração relativa à posição nucleotídica.

Para este gene todas as etapas laboratoriais foram realizadas com sucesso. O resultado da

análise por Western blot da metaciclogênese pode ser visto na Figura 5.52, onde pode ser

observada um aumento de duas vezes em aderido 24 horas e de 4,3 vezes em metacíclicos, em

relação a epimastigotas.

Figura 5.52. Análise de expressão da proteína TcExp02B06 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Os valores em vermelho representam aumento da expressão em relação a epimastigotas

O padrão de localização encontrado para a proteína TcExp02B07, pode ser visto na

Figura 5.53, onde verifica-se a existência de fluorescência relativamente baixa no citoplasma,

com grânulos mais intensos na região do flagelo.

Figura 5.53 Imunolocalização de TcExp02B07.

A) contraste diferencial de fase com sobreposição da figura B. B) Imunolocalizaçao utilizando o anticorpo

policlonal específico (verde) e marcação do DNA (DAPI, vermelho); C) contraste diferencial do soro pré-imune.

D) Imunofluorescência do soro pré-imune.

5.10.17 TcExp02A05, 4715.t00001, Anti-silencing protein, ASF1-like

Este gene está classificado como o principal do grupo 5 e possui em T. cruzi 606 pares de

bases codificando uma proteína hipotética conservada de 22,2 kDa, apresentando um domínio

PFAM denominado de ASF1-LIKE (e-value de 4,9e

-13

), o qual constitui grande parte da

proteína, se estendendo do resíduo 1 até o 150, de um total de 202 aminoácidos (Figura 5.54).

Este domínio é bastante conservado evolutivamente e está relacionado com a inibição de

repressão gênica, atuando como chaperona de histonas, interagindo com as histonas H3 e H4

e o fator de deposição de histonas CAF-I. (MUNAKATA et al, 2000; DAGANZO et

al,2003). O gene CAF-I está presente em T. cruzi (4574.t00010/5857.t00006).

Figura 5.54. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e os domínios Anti-silence.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica.

O domínio Anti-Silence apresenta uma conservação de vários aminoácidos como pode-se

verificar na Figura 5.55, como: prolina, fenilalanina, tirosina, glicina, arginina, ácido

glutâmico e alanina.

Figura 5.55. Gráfico HMM do domínio Anti-silence.

No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no eixo lateral a

entropia relativa.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp, identificou várias seqüências com um valor de significância próximo a

-55

para tripanossomatídeos e 1e

-9

para outros organismos selecionados, , sendo que esse

domínio é conservado de leveduras a humanos. A comparação das proteínas homólogas pode

ser vista na Figura 5.56.

Figura 5.56. Análise de similaridade entre TcExp02A05 e ortólogos de outros eucariotos.

O Domínio Anti-silence está sendo demarcados abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior dos

alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão. A expressão foi

obtida, bem como o soro policlonal, porém só houve reconhecimento da proteína

recombinante. Quando utilizado extrato de T. cruzi não apresentou sinal adequado.

5.10.18 TcExp02B08, 5595.t00003, Proteína hipotética

Este gene está classificado como acessório do grupo 5 e possui em T. cruzi 516 pares de

bases codificando uma proteína hipotética de 19,5 kDa, não apresentando domínios

conhecidos nos bancos de dados PFAM, Interpro e Prosite. Apresenta a predição de quatro

regiões transmembranas que se extendem por praticamente toda a proteína; sendo esta

composta por aminoácidos hidrofóbicos em mais de 50% de seus resíduos, tendo 14 resíduos

básicos que são encontrados geralmente em diaminoácidos, conforme visto na Figura 5.57.

Figura 5.57. Análise de similaridade entre duas seqüências de T. cruzi CL Brener.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão, porém não foi obtida

a expressão dessa proteína.

A princípio, esses resultados indicariam uma possível falha na predição desse gene, pois é

uma proteína somente identificada em T. cruzi, apresenta uma hidrofobicidade grande e não

foi obtida expressão dessa proteína em E. coli. No entanto, ao se verificar a sonda que

hibridou com esse gene, foi identificado um EST (código de acesso AI717787) que se localiza

no final da região codificadora e no início da região 3’UTR do mRNA, sugerindo a sua

expressão natural. Além disso, com a liberação da seqüência do genoma de outros

tripanossomatídeos, foi possível identificar possíveis ortólogos em T. congolense e T. vivax,

conforme pode ser visto na Figura 5.58. Não foram identificados ortólogos nos outros

tripanossomatídeos: T. brucei, T. gambiense, L. major, L. infantum e L. brasiliensis. Esses

dados levam a mudar a anotação dessa proteína para hipotética conservada.

Esses resultados reforçam a noção de que essa proteína é possivelmente funcional,

estando conservada em alguns tripanossomatídeos, tendo sido perdida nos demais. A ausência

de expressão em E. coli pode ser devido a seu caráter hidrofóbico, o que reforça a importância

do estabelecimento de sistemas de expressão mais próximos evolutivamente a T. cruzi.

Figura 5.58. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi, T. congolense e T. vivax.

5.10.19 TcExp02B09, 8171.t00006, Proteína Hipotética conservada

Este gene está classificado como secundário do grupo 5 e possui em T. cruzi 1035 pares

de bases codificando uma proteína hipotética conservada de 38,2 kDa, apresentando um

domínio PFAM denominado de PDC2-C (Programmed cell death protein 2, C-terminal). A

proteína PDCD2 está localizada no citosol de células situadas no pólo oposto do centro

germinativo de centroblastos; e o homólogo em rato (RP8) foi relacionado com a morte

celular programada em timócitos. Foi demonstrado que interage com BCL6, um fator

transcricional do tipo Kruppel zinc finger, que é conservado evolutivamente. No entanto, não

foi identificado ortólogo de BCL6 em T. cruzi, tanto usando a similaridade primária de

seqüência pelo BLASTp quanto pela procura dos domínios presentes em BCL6 nas proteínas

de T. cruzi (domínios zf-C2H2 e BTB), os quais estão presentes em algumas proteínas de T.

cruzi, mas não são encontrados juntos.

O domínio PDC2-C apresenta uma conservação de vários aminoácidos como pode ser

verificado na Figura 5.59.

Figura 5.59. Gráfico HMM do domínio PDC2-C.

No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no eixo lateral a

entropia relativa.

Quando comparada a similaridade entre o domínio PDC2_C e a seqüência do T. cruzi,

verificou-se um valor de confiabilidade igual a 6e

-7

. O início do domínio na seqüência

protéica de T. cruzi ocorre na posição 131 e termina na posição 319 como mostra a Figura

5.60.

Figura 5.60. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio PDC2_C.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 131 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 319.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp, identificou ortólogos possíveis, geralmente anotados como programmed

cell death 2, em outros eucariotos (Figura 5.61).

Figura 5.61. Análise de similaridade entre TcExp02B09 e ortólogos de outros eucariotos.

O Domínio PDC2_C está sendo demarcado abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior dos

alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão. A expressão da

proteína foi obtida, bem como o soro policlonal. No entanto, só houve reconhecimento da

proteína recombinante, pois quando utilizado extrato de T. cruzi não apresentou sinal.

5.10.20 TcExp02B10, 8416.t00006, Calcineurin B subunit, putative

Este gene está classificado como guia do grupo 5 e possui em T. cruzi 531 pares de bases

codificando uma proteína de 19,5 kDa, apresentando três domínios denominados EF-hand.

Esse domínio pequeno, de 29 aminoácidos (Figura 5.62), está presente em um extenso grupo

de proteínas que possuem a função geral de ligação ao cálcio, as quais contém entre 2 e 11

cópias desse domínio.

Figura 5.62. Gráfico HMM do domínio EF-hand.

No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no eixo lateral a

entropia relativa.

A confiabilidade conjunta da identificação do domínio EF-hand em TcExp02B10 é de

8,8e

-17

, sendo que os domínios individuais apresentam uma confiabilidade próxima de 1e10

-4

Eles estão localizados nas posições 60, 97 e 138 da seqüência aminoacídica, possuindo 28

aminoácidos cada um (Figura 5.63).

Figura 5.63. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio EF-hand

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar a presença dos três

domínios já citados. A numeração existente se refere a posição aminoacídica que inicia e termina o domínio

dentro do gene em questão.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp, identificou várias seqüências com um valor de significância próximo a

-49

para tripanossomatídeos e 1e

-30

para outros organismos selecionados, sendo que esse

domínio é conservado de leveduras a humanos. A comparação das proteínas homólogas pode

ser vista na Figura 5.64.

Figura 5.64. Análise de similaridade entre TcExp02B10 e ortólogos de outros eucariotos.

O domínio EFhand está delimitado. Na parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações

relativas à posição aminoacídica.

Para este gene todas as etapas laboratoriais foram realizadas com sucesso. O resultado da

análise por Western blot da metaciclogênese pode ser visto na Figura 5.65, onde pode ser

observada um aumento de 1,7 vez em aderido 24 horas e uma diminuição de 4,1 vezes em

metacíclicos, em relação a epimastigotas. A magnitude desse último resultado deve ser

considerada com cuidado, pois não houve sinal em metacíclicos. No entanto, o padrão de

diminuição da expressão, de epimastigotas para metacíclicos, é evidente.

Figura 5.65. Análise de expressão da proteína TcExp02B10 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Os valores em vermelho e verde representam, respectivamente, aumento e diminuição da expressão

em relação a epimastigotas

O resultado da imunolocalização de TcExp02B10 pode ser visto na Figura 5.66, onde

percebe-se uma localização de fluorescência com menor intensidade na região ao redor do

núcleo e grânulos com fluorescência mais intensa no flagelo, na região mais extrema do

mesmo.

Figura 5.66. Imunolocalização de TcExp02B10.

A) contraste diferencial de fase com sobreposição da figura B. B) Imunolocalizaçao utilizando o anticorpo

policlonal específico (verde) e a marcação do DNA (DAPI, vermelho); C) contraste diferencial do soro pré-

imune. D) Imunofluorescência do soro pré-imune.

5.10.21 TcExp02A06, 8415.t00003, Proteína hipotética conservada

Este gene foi classificado como principal do grupo 6 e possui em T. cruzi 2257 pares de

bases codificando uma proteína hipotética conservada de 86 kDa, apresentando um domínio

denominado PPR. Esse pequeno domínio de 35 aminoácidos está ligado geralmente a RNA,

podendo participar de diversas vias, como por exemplo, metabolismo, estabilização e

processamento do RNA. Este domínio aparece em grandes quantidades nas proteínas de A.

thaliana e outros vegetais, porém também é encontrado em outros eucariotos. Possui presença

de alguns aminoácidos conservados no domínio, conforme pode ser visto na Figura 5.67.

Figura 5.67. Gráfico HMM retirado do programa PFAM mostrando o grau de conservação em cada

posição aminoacídica do domínio PPR.

No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no eixo lateral a

entropia relativa.

Quando comparada a similaridade entre o domínio PPR e TcExp02A06 verificou-se um

valor de confiabilidade de 0,0011. Os domínios iniciam em TcExp02A06 na posição

aminoacídica 69 terminando na posição 103 como pode ser visto na Figura 5.68,

evidenciando-se a ocorrência da maioria dos resíduos mais conservados.

Figura 5.68. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio PPR.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 69 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 103.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp, identificou seqüências com um valor de significância próximo a 1e

-149

somente para tripanossomatídeos, cujo alinhamento pode ser visto na Figura 5.69. É possível

evidenciar a alta conservação dessas seqüências, mesmo nas regiões além do domínio PPR;

outro aspecto que chama a atenção é a grande quantidade de resíduos básicos (K e R) e ácidos

(D e E), bem como prolina, que usualmente ocorrem em blocos.

Figura 5.69. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.

O Domínio PPR está sendo demarcado abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior dos

alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão, porém não foi obtida

a proteína expressa.

5.10.22 TcExp02B11, 7000.t00002, Proteína hipotética

Este gene está classificado como acessório no gripo 6 e possui em T. cruzi 1905 pares de

bases codificando uma proteína hipotética de 72,2 kDa. Não possui homólogos em outros

tripanossomatídeos e não apresenta domínios pelos bancos de dados PFAM, Interpro e

Prosite. Apresenta uma região transmembrana ou peptídeo sinal em sua região amino-terminal

e não apresenta ortólogos em outros organismos. No entanto, há um conjunto de proteínas

distintas em tripanossomatídeos que são similares a essa seqüência, apresentando também

uma região transmembrana em sua extremidade aminoterminal e a inexistência de domínios

funcionais identificados. O alinhamento protéico dessas seqüências pode ser visto Figura

5.70, demonstrando claramente a distinção de TcExp02B11 das demais, o que pode ser

melhor evidenciado na árvore filogenética representada na Figura 5.71.

Nessa figura pode se observar a existência de quatro grupos relativos a essa família

protéica; sendo que um dos grupos está presente em todos os tripanossomatídeos, incluindo o

único representante presente em Leishmania; um segundo grupo contém seqüências somente

de Trypanosoma, incluindo dois parálogos em T. vivax e os dois últimos grupos são

compostos por somente uma proteína de T. cruzi, sendo que um deles é representado pela

TcExp02B11.

Figura 5.70. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros tripanossomatídeos.

Na parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica

100

Figura 5.71. Árvore filogenética mostrando as relações evolutivas da família de TcExp02B11.

Quanto maior a distância entre as diferentes espécies menor a conservação das seqüências analisadas.

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão, porém não foi obtido

proteína expressa em E. coli.

5.10.23 TcExp02B12, 8318.t00003, Proteína Hipotética conservada GTPase

Este gene está classificado como secundário no grupo 6 e possui em T. cruzi 813 pares de

bases codificando uma proteína hipotética conservada de 31,2 kDa, apresentando um domínio

denominado ArfGap (ADP-Ribosilation Factor/GTP-ase Activating Protein). Esse domínio

PFAM é composto por 137 aminoácidos e possui função de hidrolisar GTP ligado à outra

molécula denominada de ARF, a qual está envolvida na regulação do tráfego de membranas e

o remodelamento de actina. Além disto, proteínas contendo o domínio em questão parecem

estar ligadas a outros processos independentes de ARF, como na formação de vesículas

revestidas. Possui como característica a presença de um domínio zinc-finger semelhante ao do

101

tipo GATA, além de outros aminoácidos conservados como asparagina, triptofano, tirosina,

histidina, arginina e serina como pode ser verificado na Figura 5.72 (RANDAZZO e

HIRSCH; 2003).

Figura 5.72. Gráfico HMM do domínio ArfGap.

No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no eixo lateral a

entropia relativa.

Quando comparada a similaridade entre o domínio ArfGap e a seqüência do T. cruzi,

verificou-se um valor de confiabilidade aproximadamente a 3,3e

-40

. O domínio inicia em

TcExp02B12 na posição aminoacídica 47 terminando na posição 168 como pode ser

verificado na Figura 5.73.

Figura 5.73. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio ArfGap.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 47 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 168.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp, identificou várias seqüências, com um valor de significância próximo a

-72

para T. brucei, 2e

-46

para L.major e 5e

-21

para diversos outros eucariotos, geralmente na

102

região contendo somente o domínio. A análise comparativa das seqüências homólogas pode

ser vista na Figura 5.74, evidenciando-se a grande conservação do domínio, mesmo em

espécies distantes evolutivamente.

Figura 5.74. Análise de similaridade entre TcExp02B12 e ortólogos de outros eucariotos.

O Domínio ArfGap está sendo demarcado abaixo das seqüências analisadas. Na parte superior dos

alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Para este gene todas as etapas laboratoriais foram realizadas com sucesso. O resultado da

análise por western blot da metaciclogênese pode ser visto na Figura 5.75, na qual observa-se

um forte aumento em aderido 24 horas (35 vezes) e metacíclicos (25 vezes) em relação a

epimastigotas. Esses valores de mudança devem ser considerados com cuidado, pois a

intensidade do sinal em epimastigotas é muito fraca. De qualquer forma, o padrão de aumento

durante a metaciclogênese é evidente.

Figura 5.75. Análise de expressão da proteína TcExp02B12 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Os valores em vermelho representam aumento da expressão em relação a epimastigotas

Quanto à localização da proteína TcExp02B12 pode-se verificar a sua localização entre o

flagelo e o cinetoplasto, conforme visto na Figura 5.76.

103

Figura 5.76. Imunolocalização de TcExp02B12

A) contraste diferencial de fase com sobreposição da figura B. B) Imunolocalizaçao utilizando o anticorpo

policlonal específico (verde) e marcação de DNA (DAPI, vermelho); C) contraste diferencial do soro pré-imune.

D) Imunofluorescência do soro pré-imune.

5.10.24 TcExp02C01, 7168.t00007, Syntaxin putative

Este gene está classificado como guia do grupo 6 e possui em T. cruzi 909 pares de bases

codificando uma proteína de 35,5 kDa. Apresenta função anotada como sintaxina possuindo

um domínio PFAM denominado SNARE, predito com um valor de confiança igual a 1e

-20

se extendo por aproximadamente 60 aminoácidos. O domínio está presente normalmente na

região carbóxi-terminal, possuindo uma região hidrofóbica com a função de ligação em

bicamadas lipídicas, podendo estar presente em diferentes membranas e compartimentos,

indicando sua especificidade para os eventos de fusão de membranas.

As proteínas da família SNARE são divididas basicamente em dois tipos, v-SNAREs e t-

SNAREs. Ambas participam do sistema de fusão de membranas, sendo que as proteínas

presentes nas vesículas são denominadas de v-SNAREs e as presentes na organela ou

membrana plasmática de t-SNAREs (de alvo, target). A sintaxina é enquadrada na classe de

proteínas t-SNAREs. Existe uma segunda nomenclatura proposta baseada em um único

resíduo presente no domínio que pode ser uma glutamina (Q-SNARE) ou uma arginina (R-

SNARE). Na maioria dos casos as proteínas presentes nas vesículas são do tipo R e na

membrana alvo do tipo Q (WEIMBS et al, 1997; FASSHAUER et al, 1998) Em

TcExp02C01, o domínio PFAM predito apresenta uma glutamina na posição 30 do domínio,

caracterizando-o como uma proteína do tipo Q-SNARE, mas também possui uma

conservação acentuada de leucina e isoleucina como pode ser visto na Figura 5.77.

104

Figura 5.77. Gráfico HMM do domínio SNARE.

No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no eixo lateral a

entropia relativa.

Quando comparada a proteína TcExp02C01 com o domínio SNARE, verifica-se que a

região de similaridade se inicia na posição aminoacídica 212 e termina na posição 274,

podendo-se notar a preservação do aminoácido glutamina na posição 30 do domínio como

pode ser verificado na Figura 5.78.

Figura 5.78. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio SNARE.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 212 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 274. Seta indicando a glutamina da posição 30.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp, identificou várias seqüências similares com um valor de significância

105

próximo a 1e

-100

para tripanossomatídeos e aproximadamente 1e-

para outros organismos

eucarióticos, sendo diversas anotadas como sintaxina 16. Embora a similaridade com as

seqüências de organismos eucarióticos mais distantes seja relativamente baixa, a região

similar se extende por praticamente toda a extensão da proteína, mesmo em regiões fora do

domínio PFAM, conforme visto na Figura 5.79.

Figura 5.79. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e outros eucariotos.

O Domínio Snare está sendo demarcado abaixo das seqüências analisadas, bem como a região

transmembrana característica. Na parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações relativas à

posição aminoacídica.

Para este gene todas as etapas laboratoriais foram realizadas com sucesso. O resultado da

análise por western blot da metaciclogênese pode ser visto na Figura 5.80, observando-se um

aumento claro de 3,2 vezes em metacíclicos, em comparação com epimastigotas.

Figura 5.80. Análise de expressão da proteína TcExp02C01 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Os valores em vermelho representam aumento da expressão em relação a epimastigotas

A imunofluorescência da proteína TcExp02C01 a localiza bem definidamente em uma

região próxima ao cinetoplasto estando entre este e o flagelo, como pode ser verificado na

Figura 5.81.

106

Figura 5.81. Imunolocalização da proteína relativa ao gene 7168.t00007.

A) contraste diferencial de fase com sobreposição da figura B. B) Imunolocalizaçao utilizando o anticorpo

policlonal anti-7168.t00007. Em verde a marcação referente ao anticorpo específico e em vermelho a marcação

de DNA utilizando DAP. C) contraste diferencial de fase relativo ao soro pré-imune. D) Imunofluorescência

obtida com a utilização do soro pré-imune.

5.10.25 TcExp02A07, 5323.t00004, Proteína hipotética conservada

Este gene está classificado como principal do grupo 7 e possui em T. cruzi 1362 pares de

bases codificando uma proteína de 51 kDa, a qual apresenta um domínio denominado

PKinase. Conforme mencionado anteriormente, esse domínio faz parte de um extenso grupo

de proteínas que compartilham um domínio catalítico conservado em serina/treonina e

tirosinas quinases tendo como características a presença de algumas glicinas conservadas na

região amino-terminal do domínio próximo a um resíduo de lisina, também conservado, o

qual parece estar associado à ligação de ATP. Além destes resíduos existem resíduos de ácido

aspártico conservados na região central do domínio sendo importantes para a atividade

catalítica da enzima, os quais podem ser vistos na Figura 5.24.

Quando comparado o domínio PKinase e a seqüência TcExp02A07, verificou-se um

valor de confiabilidade de 6e

-90

,. O início do domínio na seqüência gênica relativa ao T. cruzi

ocorre na posição 13 e termina na posição 302 como mostra a Figura 5.82.

107

Figura 5.82. Comparação entre TcExp02A07 e o domínio PKinase.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar o início do domínio

na posição 13 da seqüência do T. cruzi e o término na posição 302.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp, identificou várias seqüências, com um valor de significância em geral

muito alto, mesmo para organismos mais distantemente relacionados, devido ao fato de que o

domínio é extenso e relativamente conservado, conforme pode ser visto na Figura 5.83. De

maneira geral, a similaridade se restringe ao domínio e as proteínas mais similares estão

geralmente anotadas como uma quinase ativada por mitógeno (MAPK).

Figura 5.83. Análise de similaridade TcExp02A07 e ortólogos de outros eucariotos.

O domínio PKinase está delimitado. Na parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações

relativas à posição aminoacídica.

108

Este gene foi clonado obtendo-se o vetor de entrada e de expressão. A expressão foi

obtida em baixa quantidade porém não foi possível obtê-la purificada, devido à perda ao

longo do processo de purificação.

5.10.26 TcExp02C02, 8359.t00034, Proteína Hipotética Conservada

Este gene está classificado como acessório no grupo 7 e possui em T. cruzi 1086 pares de

bases codificando uma proteína hipotética conservada de 39,6 kDa, a qual apresenta um

domínio denominado TLD. Esse domínio não possui função conhecida, tendo sido proposto

por DOERKS et al, 2003 e postula-se que possua função enzimática. O domínio PFAM

predito possui 165 aminoácidos e apresenta alguns aminoácidos muito conservados como

pode ser visto na Figura 5.84.

Quando comparada a similaridade entre o domínio TLD e a seqüência do T. cruzi

TcExp02A07, o programa PFAM fornece dois alinhamentos, um com valor de significância

9e-07 contendo 54 aminoácidos e um maior com 205 aminoácidos com um valor de 4.5e-06

englobando o primeiro já citado. O início do domínio na seqüência gênica relativa ao T. cruzi

ocorre na posição 75 e termina na posição 307 como mostra a Figura 5.85

Figura 5.84. Gráfico HMM do domínio TLD.

No eixo inferior do gráfico estão numeradas as posições aminoacídicas do domínio e no eixo lateral a

entropia relativa.

109

Figura 5.85. Comparação entre a TcExp02C02 e o domínio TLD.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp identificou poucas seqüências similares, somente em tripanossomatídeos.

A comparação das seqüências homólogas pode ser vista na Figura 5.86.

Figura 5.86. Análise de similaridade entre TcExp02C02 e ortólogos de outros tripanossomatídeos.

O domínio TLD está delimitado. Na parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações

relativas à posição aminoacídica.

Este gene foi clonado, obtendo-se o vetor de entrada e de expressão. A expressão da

proteína foi obtida, bem como o soro policlonal, porém este só reconheceu a proteína

recombinante, não reagindo com o extrato de T. cruzi.

110

5.10.27 TcExp02C03, 7741.t00008, Proteína Hipotética Conservada

Este gene está classificado como secundário no grupo 7 e possui em T. cruzi 1209 pares

de bases codificando uma proteína hipotética conservada de 47,7 kDa, e não apresenta

domínios preditos na comparação com os bancos de dados PFAM ou Interpro. Só foi

encontrado um gene similar em T. brucei com um valor de significância relativamente alto,

-48

. Não foi identificado um gene similar em outros Trypanosomas e em Leishmania. A

análise das seqüências homólogas pode ser vista na Figura 5.87

Figura 5.87. Análise de similaridade entre seqüências de T. cruzi e T. cruzi.

Na parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações relativas à posição aminoacídica.

Este gene foi clonado, obtendo-se o vetor de entrada e de expressão. A expressão da

proteína foi obtida, bem como o soro policlonal, porém este só reconheceu a proteína

recombinante, não reagindo com o extrato de T. cruzi.

5.10.28 TcExp02C04, 6996.t00038, Centrin Putative

Este gene está classificado como guia do grupo 7 e possui em T. cruzi 546 pares de base

codificando uma proteína de 21 kDa, apresentando três domínios denominados EF-hand. Esse

pequeno domínio de 29 aminoácidos faz parte de um extenso grupo de proteínas que possuem

como função a ligação ao cálcio. A representação desse domínio, com suas posições mais

conservadas pode ser vista na Figura 5.62.

As centrinas são proteínas pertencentes à grande família das proteínas ligadoras de cálcio

e fazem parte do centrossomo, que estão associados aos centríolos, sendo uma das poucas

proteínas centriolares identificadas. São encontradas em todos eucariotos e são necessárias

para a duplicação dos centríolos, podendo estar envolvidas em outros processos celulares,

como excisão flagelar, exportação de mRNA nuclear e recombinação homóloga (ZAMORA

& MARSHALL, 2005).

A confiabilidade combinada da identificação dos domínios EF-hand é de 5e

-24

demonstrando confiabilidade adequada nas semelhanças das seqüências. Os domínios têm

seus inícios em T. cruzi nas posições 38, 114 e 150 da seqüência aminoacídica de

111

TcExp02C04, possuindo cada um deles 28 aminoácidos cada um dos 3 domínios, como pode

ser observdo na Figura 5.88.

Figura 5.88. Comparação entre a seqüência de T. cruzi e o domínio EF-hand.

Entre as duas seqüências encontra-se a conservação aminoacídica. Pode-se verificar a presença dos três

domínios já citados. A numeração existente se refere a posição aminoacídica que inicia e termina o domínio

dentro do gene em questão.

A comparação da seqüência de T. cruzi com as proteínas do Genbank, utilizando o

programa BLASTp, identificou várias seqüências, com um valor de significância igual a 3e

-73

para T. brucei, 1e

-60

para L.major, e aproximadamente 1e

-36

para outros organismos

selecionados. A análise das seqüências homólogas pode ser vista na Figura 5.89,

evidenciando-se a grande conservação, mesmo em regiões externas aos domínios.

Figura 5.89. Análise de similaridade entre TcExp02C04 e ortólogos de outros eucariotos.

O domínio EFhand está delimitado. Na parte superior dos alinhamentos encontram-se as numerações

relativas à posição aminoacídica.

Para este gene todas as etapas laboratoriais foram realizadas com sucesso. O resultado da

análise por western blot da metaciclogênese pode ser visto na Figura 5.90, observando-se um

aumento pouco pronunciado em aderido 24 horas e uma diminuição também moderada em

metacíclicos..

112

Figura 5.90. Análise de expressão da proteína TcExp02C04 por western blot em extratos de T. cruzi.

EPI: epimastigota; 24 AD: intermediária de diferenciação; META: metacíclico; M: Marcador de peso

molecular. Os valores em vermelho e verde representam, respectivamente, aumento e diminuição da expressão

em relação a epimastigotas.

A localização da proteína TcExp02C04 aparece bem definida, estando co-localizada com

o cinetoplasto, como pode ser visto na Figura 5.91.

Figura 5.91. Imunolocalização de TcExp02C04.

A) contraste diferencial de fase com sobreposição da figura C. B) Imunolocalizaçao utilizando o anticorpo

policlonal específico (verde). C) Sobreposição das imagens de fluorescência (vermelho, DAPI); D) contraste

diferencial do soro pré-imune. E) Imunofluorescência do soro pré-imune.

5.11 Consolidação dos resultados laboratoriais

O número de proteínas avaliadas foi relativamente grande e a análise é composta por

diversas etapas, tornando complexo todo o processo de produção. Conforme mencionado

acima, as etapas de expressão protéica e produção de anti-soros representaram os principais

gargalos em toda a análise. No entanto, isso representa aspectos gerais de todo o processo e,

devido à diversidade de elementos analisados, é possível esmiuçar melhor os padrões

observados. Na Tabela 5.4, está representada a eficiência para cada proteína e para cada etapa

estudada.

113

Tabela 5.4. Eficiência de cada etapa de análise para as 28 proteínas analisadas.

ID IBMP Classificação Tamanho Módulos (Domínios) C E P S

TcExp02A01 Gene Principal 693 nt, 25 kDa ALBA

TcExp02A08 Gene Acessório 1368 nt, 52 kDa Hypothetical protein

TcExp02A09 Gene Secundário 1197 nt, 43 kDa Saccharopine dehydrogenase

TcExp02A10 Gene Guia 1080 nt, 41 kDa Sterol 24-c-methyltransferase, putative

TcExp02A02 Gene Principal 3126 nt, 117 kDa Protein kinase

TcExp02A11 Gene Acessório 1644 nt, 61 kDa Hypothetical protein

TcExp02A12 Gene Secundário 1320 nt, 49 kDa Zinc finger C2H2-type

TcExp02B01 Gene Guia 681 nt, 24 kDa Ras-related protein rab-5, putative

TcExp02A03 Gene Principal 3027 nt, 114 kDa FKBP-type

TcExp02B02 Gene Acessório 1089 nt, 40 kDa Hypothetical protein

TcExp02B03 Gene Secundário 954 nt, 35 kDa Zinc finger, C2H2 type

TcExp02B04 Gene Guia 1095 nt, 41 kDa DREV methyltransferase, putative

TcExp02A04 Gene Principal 1353 nt, 51 kDa SWIM zinc finger

TcExp02B05 Gene Acessório 1485 nt, 53 kDa Hypothetical protein

TcExp02B06 Gene Secundário 249 nt, 9 kDa CSL zinc finger

TcExp02B07 Gene Guia 354 nt, 13 kDa Dynein light chain 2B, putative

TcExp02A05 Gene Principal 606 nt, 22 kDa ASF1-like

TcExp02B08 Gene Acessório 516 nt, 20 kDa Hypothetical protein

TcExp02B09 Gene Secundário 1035 nt, 38 kDa Programmed cell death protein 2

TcExp02B10 Gene Guia 531 nt, 20 kDa Calcineurin B subunit, putative

TcExp02A06 Gene Principal 2247 nt, 86 kDa Signal peptide/PPR Repeat

TcExp02B11 Gene Acessório 1905 nt, 72 kDa Hypothetical protein

TcExp02B12 Gene Secundário 963 nt, 37 kDa GTP-ase activating protein, Arf

TcExp02C01 Gene Guia 909 nt, 36 kDa Syntaxin, putative

TcExp02A07 Gene Principal 1362 nt, 51 kDa Kinase

TcExp02C02 Gene Acessório 1086 nt, 40 kDa TLD

TcExp02C03 Gene Secundário 1209 nt, 48 kDa Hypothetical protein conserved

TcExp02C04 Gene Guia 546 nt, 21 kDa Centrin, putative

C – clonagem; E- expressão; P- purificação; S – imunização; W – western; I - imunolocalização

Em nenhum dos sete grupos foi concluído o fluxograma para as quatro proteínas que o

constituem. Esse resultado havia sido previsto, sendo o grande motivador de se estabelecer as

medidas de redundância.

Somente o grupo 1 apresentou a obtenção de resultados completos para três dos quatro

genes. O gene acessório (proteína hipotética) foi o único não concluído, não se obtendo sua

expressão em E. coli. Inicialmente, poderia se supor que, pelo fato de ser classificada como

uma proteína hipotética, representaria um erro de predição e a região codificadora fictícia não

produziria aminoácidos viáveis. No entanto, foi possível identificar um ortólogo em L.

infantum, o que enfraqueceu essa hipótese.

114

Somente o grupo 6 apresentou a obtenção de resultados completos para dois dos quatro

genes analisados.Quatro grupos (2, 4, 5 e 7) obtiveram resultados completos para somente um

dos quatro genes, sempre o gene guia. O grupo 3 não obteve resultado completo para nenhum

de seus genes.

Existe uma diversidade de padrões de sucesso e parâmetros intrínsecos às proteínas. No

entanto, chama a atenção a associação entre obtenção de resultados completos e classificação

do gene como guia, isto é, aquele cuja função está melhor estabelecida. De um total de sete

genes guias, obteve-se resultados totais para seis (85,7%), sendo que a única falha foi devida à

morte dos dois camundongos inoculados com a proteína TcExp02B04. De um total de 21

genes codificadores de proteínas hipotéticas, obteve-se resultados totais para somente três

(14,3%). Uma análise pelo teste exato de Fisher mostrou que a probabilidade dessa proporção

ocorrer por acaso é de somente 0,1%.

Diversos fatores podem justificar essa associação. Um fator diretamente relacionado à

probabilidade de se obter uma reação do anticorpo em western e imunofluorescência (etapas

finais do fluxograma e necessárias para considerar como se obtendo resultados completos) é o

nível de expressão protéica proporcional. A princípio, genes com função conhecida são

constituintes de vias biológicas mais estudadas e, provavelmente, mais necessárias e expressas

em uma célula. Por outro lado, proteínas com função desconhecida (hipotéticas conservadas)

podem, a princípio, terem uma expressão menor, dificultando a identificação em western blot

e imunofluorescência. Esse ponto será avaliado futuramente ao se utilizar quantidades

maiores de extrato protéico de T. cruzi na análise por western e também pela realização da

imunofluorescência em tripomastigotas, já que a maioria das proteínas hipotéticas analisadas

apresenta um padrão de aumento durante a metaciclogênese.

A etapa de expressão protéica foi o maior gargalo do presente trabalho. No entanto, a

hipótese sugerida acima para explicar a discrepância entre os grupos dos genes guia

codificadores de proteínas hipotéticas não deve influenciar negativamente as proteínas

hipotéticas com relação à sua expressão em sistema heterólogo.

Com o intuito de avaliar essa hipótese, foi verificado que se obteve expressão para sete

proteínas dos genes guias (100%) e 11 dos genes codificadores de proteínas hipotéticas

(52,4%), sendo o valor de p calculado pelo teste exato de Fisher de 2,7%. Isso indica que já na

etapa de expressão há uma perda significativa estatisticamente de proteínas hipotéticas, em

relação às proteínas guias, o que indica que, além da hipótese sugerida acima, de nível de

expressão endógena da proteína em T. cruzi, outros fatores estão dificultando a obtenção de

115

resultados, nesse caso a expressão, para as proteínas hipotéticas. Uma possibilidade é o fato

de que na verdade essa proteína não ocorra naturalmente, representando um erro de predição,

e a tentativa de expressá-la em E. coli gere um polipeptídeo aberrante, o qual seria ou

degradado rapidamente ou letal à célula.

Os dados acima citados definem claramente uma associação entre eficiência do processo

de caracterização funcional e o grau de conhecimento sobre a função do gene. Antes de

podermos realizar uma análise mais profunda das causas relativas a esse perfil, é necessário

repetir futuramente os protocolos de expressão, western blot e imunolocalização. Isso se deve

ao fato de que para o presente trabalho definiu-se uma estratégia de avanço constante.

Portanto, é essencial testar outros métodos, para as etapas supracitadas, a fim de se obter um

conjunto mais amplo de dados, os quais serão analisados em detalhes para identificar

possíveis fatores determinantes da potencialidade de caracterização funcional.

5.12 Análise comparada do transcriptoma e proteômica de T. cruzi

Na Figura 5.92, é possível verificar os padrões de expressão diferencial avaliados pelo

microarranjo de DNA (transcriptoma) e pela quantificação baseada em western blot e

anticorpos policlonais (proteoma). Os valores relativos à expressão diferencial protéica são

relativos à epimastigotas e, portanto, a coluna relativa a essa amostra apresenta sempre um

sinal de não modulação; os valores relativos à expressão diferencial do mRNA também são

relativos a epimastigota, mas consistem em uma classificação discreta do padrão geral de

modulação nas amostras avaliadas (epimastigotas em estresse, em diferenciação por 3, 12 e 24

horas e metacíclicos) do experimento de metaciclogênese denominado Met16.

A classificação realizada nos dados de microarranjo favorece a representação da

tendência geral de modulação, diminuindo-se a complexidade inerente a esse processo de

quantificação. De maneira geral, os padrões de modulação que ocorrem nos níveis de mRNA

durante a metaciclogênese são relativamente monotônicos, conforme pode ser visto na Figura

4.4 a Figura 4.10, e a representação de uma tendência geral única é, geralmente, compatível

com todos os pontos avaliados.

Das 23 proteínas quantificadas pelo uso de anti-soro policonal, somente uma não

apresenta sonda no microarranjo de DNA, a GTPase TcYchF, a qual mostrou um padrão de

diminuição forte em sua expressão protéica na fase metacíclica, em comparação com

epimastigotas.

116

Figura 5.92. Gráfico heatmap mostrando a correlação entre transcriptoma e proteoma.

Em cada linha, proteínas estudadas; coluna – Epi, 24h e Met: extratos protéicos das fases epimastigota,

intermediária da diferenciação (24 horas) e tripomastigotas metacíclicos; MA – consolidação dos dados de

microarranjo em uma tendência geral A coloração indica o sentido da modulação, sendo preto, ausência;

vermelho, aumento; verde – diminuição; cinza – dado ausente. A graduação da cor indica o valor proporcional

de modulação, para os extratos protéicos (tons mais escuros, modulação menor; tons mais claros, maior) e a

tendência geral, para microarranjo (tom mais escuro, tendência moderada; mais claro, tendência forte).As letras

q e n no nome do elemento representam, respectivamente, quantificação por quimioluminescência e dados

normalizados para diminuir a variância.

De maneira geral, das 23 proteínas quantificadas, somente uma não apresentou padrão de

modulação durante a metaciclogênese, a subunidade beta 6 do proteassomo (TcS2E02). Isso

se deve provavelmente ao fato de que o sinal obtido para esse anticorpo foi muito fraco,

mesmo com o uso de quimioluminescência e, portanto, esse resultado foi considerado não

informativo.

Das 21 proteínas quantificadas e com dados do microarranjo, obteve-se resultados muito

correlatos, cujo grau de concordância depende da forma como é classificado o padrão geral de

metaciclogênese. Deve-se salientar a melhor qualidade do resultado obtido por

quimioluminescência em relação ao método colorimétrico, o que pode ser visto para as

proteínas identificadas por ambos os métodos (TcExp02B01, TcExp02B07 e TcExp02B10).

Esse resultado é esperado, devido à maior sensibilidade do método quimioluminescente e pelo

117

fato de que as proteínas analisadas por ambos os métodos foram justamente aquelas que

apresentaram um sinal muito fraco no método colorimétrico, sendo submetidas

subseqüentemente à quantificação por quimioluminescência.

Na análise mais estringente, 16 proteínas (76,2%) apresentaram um padrão coerente entre

proteoma e transcriptoma (TcExp02A01, TcExp02A09, TcExp02A10, TcExp02B07,

TcExp02B10, TcExp02B12, TcExp02C01, PEPCK, TcS1A12, TcS1B11, TcS1B12, Kap3,

S7, L26, NOP56 e p22). Os critérios utilizados para a análise mais estringente foram a

ocorrência de modulação dos níveis protéicos em 24 horas e/ou metacíclico, sendo que nos

casos no qual a modulação foi vista para somente uma das amostras, deveria haver ausência

total de modulação na outra.

Avaliou-se também a correlação entre transcriptoma e proteoma com um critério menos

estringente, no qual o perfil de expressão diferencial em metacíclico, quando divergente do

perfil de 24 horas aderido, não seria levado em consideração. De maneira geral, esse critério

menos estringente também pode ser definido como a comparação da correlação entre

transcriptoma e proteoma somente para 24 horas aderido, uma fase da diferenciação no qual a

tradução é mais ativa.

Na análise menos estringente, todas as proteínas apresentaram um padrão de correlação

geral entre transcriptoma e proteoma. As proteínas que foram incluídas no critério menos

estringente são TcExp02A04 (padrão de aumento geral no microarranjo de DNA, forte

aumento em 24 horas, forte diminuição em metacíclicos), TcExp02B01 (padrão de aumento

geral no microarranjo de DNA, forte aumento em 24 horas, moderada diminuição em

metacíclicos), TcExp02B06 (padrão de aumento geral no microarranjo, fraca diminuição em

24 horas, moderado aumento em metacíclicos), TcExp02C04 (padrão de aumento no

microarranjo de DNA, aumento moderado em 24 horas, forte diminuição em metacíclicos) e

Kap3 (padrão de aumento geral no microarranjo de DNA, forte aumento em 24 horas,

moderada diminuição em metacíclicos).

118

6 Discussão

O presente trabalho teve como objetivo principal a melhoria na caracterização funcional

de proteínas hipotéticas de T. cruzi que foram identificadas pelo uso de microarranjo de DNA

como moduladas durante um processo muito interessante de diferenciação celular, a

metaciclogênese, com ênfase em proteínas cuja expressão, medida a nível de mRNA

polissomal, estivesse relativamente aumentada durante o processo.

Devido à complexidade dos fenômenos biológicos, com seus elementos e dinâmicas

próprias, a genômica funcional não deve ser encarada como um resultado final, mas sim como

um meio de selecionar novos genes para caracterização e também elucidar aspectos destes

processos de difícil compreensão.

Com o crescente aumento do número de genomas completos seqüenciados, um grande

desafio para os pesquisadores é obter a compreensão da expressão, função e regulação de um

conjunto amplo, se não o total, de proteínas expressas no organismo. Através disto, será

possível melhorar a compreensão de como os processos biológicos ocorrem ao nível

molecular, como variam nos diferentes tipos de células, organismos, bem como nos estados

alterados como, por exemplo, doenças (PATTERSON & AEBERSOLD, 2003; ZHU & et al,

2003). Sabe-se hoje que um gene não necessariamente codifica apenas uma proteína: o

controle pós-transcricional como o splicing alternativo, poliadenilação, editoração do mRNA,

entre outros; bem como o controle pós-traducional, dos quais são conhecidos

aproximadamente 200 tipos diferentes, e ainda a proteólise e a compartimentalização, são

desafios para a compreensão dos sistemas (PANDEY & MANN, 2000; GRAVES &

HAYSTEAD, 2002). Visando isto, uma ferramenta que pode auxiliar e ser usada para se

alcançar parte dos objetivos dessa nova era, é o microarranjos de DNA.

Desde 2001, iniciamos o projeto de análise por genômica funcional de T. cruzi por

microarranjo, tendo recentemente incorporado abordagens proteômicas a esse arcabouço

analítico, o que permitiu a definição de um conjunto muito grande de genes diferencialmente

expressos, cuja implicação funcional aos processos biológicos estudados é relativamente

desconhecida. Devido ao caráter de análise em larga escala que obtemos com o estudo da

metaciclogênese por microarranjo de DNA, é necessária uma mudança na definição de

estratégias apropriadas para responder às perguntas criadas pelo estudo genômico funcional.

Portanto, é necessária a obtenção de dados de diversos elementos (genes, mRNA, proteínas)

relativos, de certa forma, mais ao organismo como um todo, do que a certas definições

119

simplificadas e arbitrárias de vias biológicas selecionadas, as quais geralmente são abordadas

pelo estudo de um ou pouco genes selecionados, a partir de conhecimento prévio já

estabelecido.

Nesse sentido, é essencial o estabelecimento de novas metodologias de análise e de novas

abordagens que permitam preencher as lacunas de conhecimento que temos, a fim de que

possamos tirar maior proveito dos dados que são gerados de forma exponencial e contínua.

Isso é especialmente importante no estudo da genômica funcional de T. cruzi, devido às

peculiaridades de sua biologia molecular, principalmente no tocante à regulação da expressão

gênica, bem como em razão da distância evolutiva grande em relação a outros organismos

bem estudados, o que dificulta o estabelecimento empírico de atribuições funcionais pela

simples similaridade de seqüência aminoacídica primária.

Derivando o conhecimento adquirido com o uso do microarranjo de DNA, iniciou-se no

ano de 2004 um projeto cujo principal objetivo é a determinação da estrutura tridimensional

de proteínas moduladas durante os processos biológicos de T. cruzi estudados, com ênfase na

metaciclogênese, o que permitirá a atribuição de função protéica não mais pela comparação

de sua estrutura primária, mas sim pela comparação da estrutura terciária, a qual é muito mais

informativa. Dentro do projeto de genômica estrutural de T. cruzi, optou-se pela criação dos

clones contendo os genes de interesse a serem estudados em vetores da plataforma Gateway

, o que permite uma maior automação do processo de clonagem e uma grande flexibilidade na

utilização posterior desses clones em outros sistemas de avaliação funcional, como vetores de

localização celular, de super-expressão induzida, de expressão em sistema homólogo e de

identificação de complexos de interação protéica, entre outros.

Desta forma, iniciou-se um segundo projeto derivado, o qual visa à criação de um

conjunto de vetores, dentro da plataforma Gateway

, que permitirão a avaliação dos genes

selecionados de acordo com os aspectos citados anteriormente. A seleção dos genes de T.

cruzi que estão sendo incorporados é baseada nos dados de expressão diferencial obtidos pelo

uso dos microarranjos e, atualmente, a base de dados existente no IBMP relativa ao

transcriptoma de T. cruzi é ampla, se estendendo além do processo de metaciclogênese.

Dentro desse contexto, a presente dissertação de mestrado se insere, constituindo-se na

primeira iniciativa de se aumentar o conhecimento funcional de uma parcela significativa de

genes diferencialmente expressos, identificados por microarranjo. Por consistir em uma

abordagem preliminar, a quantidade de genes estudados é relativamente grande quando

comparada a estudos usuais de biologia molecular, mas representa uma pequena parcela dos

120

genes modulados em um único processo de diferenciação. Por exemplo, os 28 genes

selecionados para esse trabalho constituem somente 2% dos aproximadamente 1200 genes

modulados com um grau aceitável de confiança durante o processo de metaciclogênese e

somente 0,3% dos aproximadamente 8000 genes distintos que estão presentes no genoma de

T. cruzi.

Portanto, existe uma defasagem entre nossa capacidade atual de preencher as lacunas de

informação funcional dos genes de T.cruzi e as demandas já existentes, criadas pelo uso de

ferramentas de análise em larga escala. Nesse sentido, estamos estabelecendo um terceiro

projeto amplo, denominado ORFeoma de T. cruzi, também inserido no projeto mais

abrangente do estudo da genômica funcional de T. cruzi. O objetivo principal desse projeto é

clonar todos os genes deste parasita em vetores de entrada da plataforma Gateway

possibilitando a avaliação de suas características funcionais, como localização celular, redes

de interação protéica e redes de regulação gênica, dentro de uma perspectiva em larga escala.

A presente dissertação de mestrado também se insere dentro desse projeto de ORFeoma,

por representar uma abordagem piloto da importância e viabilidade desse projeto maior, com

relação à potencialidade de gerar informações biológicas novas e interessantes.

Nesse sentido, optou-se pela seleção de genes diferencialmente expressos por

microarranjo durante a metaciclogênese, com ênfase nos que tivessem sua expressão relativa

aumentada durante o referido processo. Além disso, selecionou-se como genes candidatos

principais aqueles que estivessem anotados como proteínas hipotéticas conservadas com

domínio funcional identificado. A justificativa para tal seleção é feita da seguinte forma:

• Genes diferencialmente expressos: estariam sendo regulados no processo da

metaciclogênese e, portanto, teriam uma maior probabilidade de serem agentes

diretos das mudanças que ocorrem no mesmo;

• Expressão aumentada: de maneira geral, os genes que apresentam sua expressão

diminuída durante a metaciclogênese estão enriquecidos em proteínas com função

conhecidas e participantes de vias bioquímicas clássicas (PROBST, 2005), sendo

que o mesmo não ocorre para os genes com expressão relativa aumentada. Além

disso, genes cujo produto estivesse sendo requerido no processo de diferenciação

constituem um grupo de maior interesse;

• Proteínas hipotéticas: esses genes codificam para proteínas cuja atribuição

funcional é inexistente ou muito genérica, necessitando, portanto, de um

121

aprofundamento de suas características funcionais para que hipóteses sejam feitas

a respeito do que ocorre na metaciclogênese;

• Conservação evolutiva: aumentam a confiabilidade de que a proteína estudada

seja realmente encontrada no organismo;

• Domínio funcional: permitem a definição de diretrizes que auxiliam no

direcionamento do trabalho, uma necessidade vital para o desenvolvimento de

uma dissertação de mestrado em tempo hábil.

Visando conciliar duas necessidades divergentes, quer seja: a demanda pela geração de

uma grande quantidade de informações funcionais relativas aos genes diferencialmente

expressos durante a metaciclogênese; e a necessidade de obter resultados novos e

interessantes e claros dentro da perspectiva temporal de conclusão de uma dissertação de

mestrado, optou-se pela idealização lógica de uma linha de trabalho que avaliasse um

conjunto relativamente amplo de genes e a definição de salvaguardas necessárias para a

obtenção de resultados.

Dessa forma, definiu-se arbitrariamente que o conjunto primário de genes a serem

caracterizados funcionalmente seria em número de cinco, os quais foram denominados de

genes principais. Para evitar que falhas no fluxograma do presente trabalho, ilustrado na

Figura 4.2, impedissem a obtenção desse objetivo, criaram-se dois níveis de redundância: a

inclusão de dois genes principais adicionais e a seleção de outros sete genes com

características semelhantes aos genes principais, e que foram denominados de genes

secundários. Com isso, aumentou-se a probabilidade de que, ao final do trabalho, dados

funcionais fossem obtidos para pelo menos cinco genes codificadores de proteínas hipotéticas

conservadas, contendo domínio funcional caracterizado e diferencialmente expressos durante

a metaciclogênese.

A fim de estudar a coerência funcional dos padrões de co-expressão em T. cruzi, optou-se

por selecionar sete grupos com padrões distintos de expressão diferencial, e dentro de cada

um desses grupos, selecionou-se um gene principal e secundário. A partir dessa definição

metodológica, foi evidenciado que seria interessante acrescentar, dentro de cada grupo de co-

expressão, um terceiro gene, cujo conhecimento funcional fosse maior, isto é, cujas

características conhecidas fossem distintas das compartilhadas pelos genes principal e

secundário, o qual foi denominado de gene guia.

122

Como um dos objetivos de caracterização funcional do presente trabalho é a localização

celular dos genes selecionados, a inclusão de um gene cujo conhecimento funcional fosse

maior, incluindo a sua localização celular, possibilitaria a obtenção de resultados esperados

previamente, aumentando a confiabilidade dos resultados obtidos para as outras proteínas

menos caracterizadas.

Finalmente, incluiu-se em cada grupo um gene, denominado acessório, o qual

compartilha as características gerais dos genes principais e secundários, portanto aumentando

ainda mais a redundância. No entanto, o gene acessório possui duas características específicas

que diminuem a probabilidade de sucesso na sua caracterização funcional, qual seja a

inexistência de ortólogos em outros organismos e a ausência de domínios funcionais

caracterizados. Embora esses dois fatores possam indicar um possível erro de predição e uma

menor quantidade de informações prévias, eles também reforçam a possibilidade de que, ao se

caracterizar funcionalmente os mesmos, estejamos agregando informações mais interessantes,

inovadoras e diretamente relacionadas às peculiaridades de T. cruzi.

Dentro desse arcabouço lógico, definimos alguns objetivos práticos que deveriam ser

alcançados com relação a todo esse conjunto de genes:

• A obtenção de clones de entrada na plataforma Gateway

para todos os genes

selecionados;

• Expressão de proteína e produção de anti-soro para pelo menos 14 proteínas

(metade do conjunto total), sendo pelo menos sete proteínas hipotéticas (dos tipos

principal, secundário ou acessório).

• Imunolocalização de pelo menos cinco proteínas hipotéticas (dos tipos principal,

secundário ou acessório);

• Obtenção de western blot quantitativo, durante a metaciclogênese, para pelo

menos 10 proteínas distintas, independemente de seu tipo;

• Análise funcional detalhada de pelo menos uma proteína hipotética (dos tipos

principal, secundário ou acessório).

Com a definição desses objetivos práticos e com a inclusão de diversos níveis de

redundância na seleção dos genes candidatos seguiu-se uma abordagem de avanço seqüencial,

unidirecional, em relação ao fluxograma estabelecido. Isso se reflete na definição de somente

um protocolo para cada uma das etapas, com pequenos ajustes de acordo com a necessidade,

desde que não atrasassem a conclusão da etapa atual; e o prosseguimento para a etapa

123

seguinte com os elementos que fossem obtidos na etapa atual, sem que se realizasse uma nova

tentativa de obtenção.

Dos 28 genes iniciais, obteve-se a amplificação, clonagem em vetor de entrada (pDONR)

e passagem para vetor de destino para expressão protéica em E. coli (pDEST) para todos os

genes selecionados. Após a realização do seqüenciamento visando certificar a clonagem

correta do produto amplificado, evidenciou-se que para o clone TcExp02B03 havia uma

deleção de um nucleotídeo no iniciador forward, criando uma mudança no quadro de leitura,

o que levou à exclusão desse gene das etapas posteriores.

É possível evidenciar a alta eficiência do sistema de clonagem selecionado para o

presente trabalho, o que permite concluir que essa fase, na construção do ORFeoma completo

de T. cruzi, que se baseará na mesma plataforma, não consistirá em um ponto problemático

dentro da linha de produção de clones.

Após a obtenção dos clones de expressão, procedeu-se à expressão e purificação protéica

dos 27 clones restantes, etapa esta que representou um grande gargalo para o prosseguimento

da análise. Foi possível obter 19 proteínas expressas (70,4%), todas insolúveis. Como o

principal interesse da expressão protéica para o presente trabalho é a obtenção de anticorpos

policlonais para a realização de western blot quantitativo e imunolocalização, a insolubilidade

das proteínas não representou um resultado adverso e a expressão de todas as 19 proteínas foi

considerada de qualidade suficiente para o prosseguimento da análise. Deve-se salientar que

foi utilizado somente um único protocolo de expressão, dentro da lógica de trabalho adotada e

descrita acima, e que é muito provável que a utilização de outros protocolos possa,

futuramente, aumentar a quantidade de proteínas expressas e sua solubilidade.

Quanto ao processo de purificação das mesmas, foram utilizados três protocolos distintos

conforme descrito no item 4.11. Isso ocorreu devido às características individuais das

proteínas que podem responder melhor a diferentes condições de purificação. Primeiramente,

a purificação utilizando colunas baseadas na ligação da cauda de histidina ao níquel foi feita

por duas abordagens diferentes: purificação por eluição utilizando concentrações crescentes

de imidazol e por decréscimo do pH.

Mesmo após a realização desse processo de purificação por afinidade, foi possível

evidenciar proteínas contaminantes em pequena quantidade. Para aumentar o grau de pureza

das proteínas estudadas, optou-se pela realização de uma purificação por SDS-PAGE. No

final, das 19 proteínas obtidas na etapa de expressão, conseguiu-se 18 proteínas purificadas

(94,7% do conjunto purificado; 64,3% do conjunto total), tendo-se eliminado do restante do

124

processamento a proteína TcExp02A07, a qual já apresentava uma baixa expressão e devido a

perdas cumulativas durante as etapas de purificação.

Na etapa de obtenção de anticorpos policlonais, foram usados dois animais para cada

proteína, totalizando 36 camundongos, os quais foram inoculados em dois locais diferentes,

respectivamente pelas vias subcutânea e intra-peritoneal. Destes animais, três morreram no

decorrer do processo, sendo que dois haviam sido inoculados com a mesma proteína

(TcExp02B04) e, portanto, não foi possível o prosseguimento desta para as etapas

subseqüentes. Ao final, foram obtidos 33 soros (91,6% do total de animais inoculados),

referentes a 17 proteínas (60,7% do conjunto inicial). Dos 36 soros obtidos antes das

inoculações, denominados pré-imune, nenhum apresentou reação contra o extrato de T. cruzi,

permitindo assim a continuidade do processo, sem descarte ou troca de animal.

Visando a validação e verificação da qualidade dos soros, foram realizados ensaios de

western blot, divididos em duas etapas. Primeiramente, foram utilizados a proteína

recombinante e o extrato da forma epimastigota de T. cruzi, para verificar a qualidade do anti-

soro obtido. Na segunda etapa, foram utilizados extratos das formas epimastigota, fase

intermediária da diferenciação (aderido por 24 horas) e tripomastigota metacíclico, para

avaliar a expressão diferencial das proteínas durante a metaciclogênese. Nessa etapa foi

possível identificar os anti-soros com padrão de reação com qualidade aceitável e, após a

consolidação dos soros duplicados para uma mesma proteína, foram selecionados onze1 soros

(39,3% do conjunto total, 64,7% dos anti-soros produzidos), sendo este o segundo maior

obstáculo influenciando a produtividade do processo geral.

Conforme mencionado acima, os onze anti-soros foram empregados na análise por

western blot do padrão de expressão diferencial durante a metaciclogênese, associado a doze

anti-soros produzidos em outros projetos do IBMP, totalizando 23 proteínas diferencialmente

expressas durante a metaciclogênese.

Na literatura, existem diversos trabalhos utilizando microarranjos para avaliar a expressão

diferencial de tripanossomatídeos (DIEHL et al, 2002; GUIMOND et al., 2003; MINNING et

al., 2003; SAXENA et al., 2003; AKOPYANTS et al., 2004; ALMEIDA et al., 2004;

BAPTISTA et al., 2004; BREMS et al., 2005; BAPTISTA et al., 2006; HOLZER et al., 2006;

McNICOLL et al., 2006; LEIFSO et al., 2007; SAXENA et al., 2007; SRIVIDYA et al.,

2007). Esses trabalhos avaliam uma ampla gama de condições biológicas de diversos

organismos, incluindo o transcriptoma de T. cruzi (MINNING et al., 2003; BAPTISTA et al.,

2004; BAPTISTA et al., 2007). Uma característica geral desses trabalhos é a identificação de

125

um número muito pequeno de genes diferencialmente expressos, geralmente entre 0,5% e 5%

do total presente no microarranjo, mesmo quando comparando formas evolutivas funcional e

morfologicamente distintas entre si.

Esses resultados são diametralmente opostos aos obtidos por nosso grupo e, portanto,

cria-se um paradoxo cuja elucidação é crucial para a determinação da validade do estudo do

transcriptoma de tripanossomatídeos como uma ferramenta de análise biológica. Existem

diversas diferenças técnicas entre os trabalhos supracitados e os desenvolvidos no IBMP, os

quais, em conjunto, explicam em grande parte a diferença observada. Estes são,

resumidamente, o uso de mRNA polissomal, a amplificação do mRNA, a marcação da

segunda fita do cDNA, o uso de microarranjos baseados em ESTs e a maior quantidade de

replicatas de hibridação (PROBST, 2005).

No entanto, é necessária a comprovação dos resultados obtidos por nosso grupo, devido

ao seu impacto, o que foi feito utilizando-se quatro abordagens principais (PROBST et al., em

preparação):

• Análise do transcriptoma por PCR em tempo real quantitativa (qPCR):

corrobora os resultados do microarranjo. Porém, avalia a mesma representação de

expressão diferencial, o transcriptoma.

• Coerência funcional das modulações observadas: através da análise estatística

usando anotação funcional dos bancos de dados KEGG (Kyoto Encyclopaedia of

Genes and Genomes) e GO (Gene Ontology), evidenciar que as modulações

observadas são funcionalmente coerentes, o que evidencia que as mesmas são

importantes do ponto de vista funcional.

• Proteômica diferencial em larga escala: usando dados obtidos da análise

proteômica em larga escala, identificar proteínas diferencialmente expressas e

verificar se o mesmo padrão é observado nos dados do microarranjo.

• Proteômica diferencial em baixa escala: através da produção de anti-soros,

evidenciar padrões de expressão protéica diferencial por western blot.

Com os resultados obtidos para essas quatro abordagens diferentes, foi possível obter um

padrão geral de grande correlação entre as modificações transcriptômicas e proteômicas, o

que evidencia a qualidade dos resultados gerados pela análise de transcriptoma por

microarranjo realizada no IBMP. A análise realizada no presente trabalho, a quantificação por

126

western blot para 23 proteínas diferencialmente expressas, está dentro da metodologia da

quarta abordagem supracitada.

Conforme mencionado anteriormente, obteve-se um alto grau de concordância entre os

resultados de microarranjo e western blot, quando os dados quantitativos obtidos foram

analisados em relação a padrões gerais de aumento ou diminuição durante a metaciclogênese.

Segundo os critérios de alta e baixa estringência, respectivamente 76,2% e 95,2% dos

genes/proteínas estudados mostraram concordância, um resultado muito contundente e, de

certa forma, inesperado.

A importância da modulação do transcriptoma como elemento chave na modificação do

perfil protéico e, conseqüentemente, das características funcionais de uma célula, é um fato

basal na utilidade do uso de microarranjos para o estudo de processos biológicos. No entanto,

a comparação dos dados de transcriptoma e proteoma geralmente apresenta uma correlação

relativamente baixa (FUTCHER et al., 1999; IDEKER et al., 2001; GRIFFIN et al., 2002;

WASHBURN et al., 2003; BASLER et al., 2006; NISSOM et al., 2006; SCHERL et al.,

2006), embora alguns estudos mostrem o contrário (GYGI et al., 1999; UNWIN et al., 2005;

MIJALSKI et al., 2005).

Isso não é de todo inesperado, pois os níveis protéicos são ditados somente em parte

pelos níveis de mRNA, sendo que diversas outras fontes de controle, como degradação

protéica seletiva, podem modificar os níveis protéicos. Além disso, a quantificação por

proteômica e microarranjo são métodos relativamente ruidosos, sendo que até mesmo

diferentes plataformas comerciais de microarranjo apresentam correlação média entre os

resultados (JÄRVINEN et al., 2004), embora esses resultados possam variar de acordo com

os critérios utilizados (PETERSEN et al.,2005).

Independentemente do grau de concordância existente entre transcriptoma e proteoma, o

resultado principal da análise feita nesse trabalho é a determinação de que as diferenças

identificadas no microarranjo de T. cruzi, as quais são em grande número e destoando de

forma marcante dos demais estudos de transcriptoma de tripanossomatídeos, influem nos

níveis protéicos e, portanto, nas modulações que o T. cruzi tem que sofrer para alterar sua

composição protéica em resposta aos estímulos ambientais, externos ou internos.

Embora isso possa parecer óbvio à primeira vista, diversas observações podiam indicar o

contrário, as quais são:

127

• Diversos trabalhos demonstrando a ausência de modulação dos níveis de mRNA

em tripanossomatídeos, tendo sido inclusive sugerido que não haja regulação

significativa das proteínas nesses organismos (LEIFSO et al., 2007);

• As características peculiares de tripomastigotas metacíclicos, uma forma de

resistência cuja principal atribuição evolutiva é a infecção do hospedeiro

mamífero. Isso se reflete na ausência de replicação do DNA e menor taxa de

transcrição (ELIAS et al., 2001; ELIAS et al., 2002) e tradução (GOLDENBERG

et al., 1985) dessa fase, o que indicaria uma importância menor da quantificação

do mRNA em metacíclicos, mas não durante a metaciclogênese. Reforçando essa

menor influência dos níveis de mRNA mensageiro na produção protéica de

metacíclicos está a descrição de um mRNA que está associado a polissomos na

metaciclogênese, mas cuja proteína se encontra ausente (NARDELLI et al., 2007)

e a verificação, nos próprios dados de microarranjo da metaciclogênese de T.

cruzi, de que genes envolvidos na replicação de DNA e transcrição de RNA

estariam aumentados em metacíclicos (PROBST, 2005).

Com os resultados obtidos no presente trabalho, foi possível evidenciar que as

modificações que ocorrem no mRNA polissomal tem repercussão clara no proteoma de T.

cruzi, reforçando a utilidade da técnica de microarranjo no estudo de questões biológicas de T.

cruzi, bem como comprovando a confiabilidade do método de análise utilizado no projeto de

genômica funcional do IBMP. Esse resultado representa uma importante contribuição para o

melhor entendimento da biologia molecular de T. cruzi.

Com relação à alta concordância evidenciada entre transcriptoma e proteoma, diversos

fatores podem ser levantados para explicar esse resultado, os quais são:

• Utilização de mRNA polissomal, mais correlacionado com os níveis protéicos;

• Seleção de genes candidatos baseados em critérios mais intensos de

confiabilidade e expressão diferencial;

• Utilização de um método mais sensível e preciso de quantificação protéica,

imunoquantificação por western blot, ao invés de uma análise proteômica em

larga escala (MudPIT ou 2D-PAGE);

• Avaliação de um processo temporal, permitindo a compensação por defasagens da

repercussão de uma modificação nos níveis do mRNA e proteína.

128

Esse último ponto é especialmente relevante na comparação de baixa estringência entre o

transcriptoma e o proteoma. De maneira geral, a maioria dos eventos de modulação do mRNA

ocorre em uma fase relativamente inicial da metaciclogênese (ver Figura 4.4 a Figura 4.10),

permitindo a modificação dos níveis protéicos em parasitas em diferenciação por 24 horas; no

entanto, essa modulação do nível de mRNA poderia ter um impacto menor em tripomastigota

metacíclico, o qual apresenta uma diminuição da tradução (GOLDENBERG et al., 1985;

PROBST, 2005) e, conseqüentemente, os níveis protéicos existentes nessa fase do parasita

tenderiam a ser definidos mais pela meia-vida das proteínas, de acordo com a sua cinética de

degradação, do que pelos níveis de mRNA polissomal. Dessa forma, a análise com baixa

estringência evita a interferência de situações nas quais a meia-vida curta da proteína ditaria o

resultado final da quantificação por western blot em metacíclicos (no presente trabalho, quatro

das 21 proteínas analisadas ou 19% do total).

Outra importante contribuição do presente trabalho foi o aumento de informação obtido

para as proteínas estudadas, com relação a aspectos bioinformáticos de anotação e de

imunolocalização.

Com relação às proteínas do grupo 1, foi possível evidenciar que:

• TcExp02A01, previamente identificada como contendo um domínio relacionado à

interação com DNA nuclear ou RNA citoplasmático, é na verdade citoplasmática, pelos

dados de imunofluorescência obtidos. Além disso, identificou-se um domínio RGG-box,

presente somente em proteínas de protozoários, o qual também interage com RNA,

reforçando a importância dessa proteína como sendo de ligação ao RNA;

• TcExp02A08, inicialmente anotada como proteína hipotética, teve um ortólogo

identificado em L. infantum, e deve ser, portanto, renomeada para proteína hipotética

conservada;

• Anotação do domínio funcional sacaropina-desidrogenase para TcExp02A09 e sua

identificação como uma proteína citoplasmática relacionada provavelmente à biossíntese

de lisina;

• Anotação dos domínios funcionais metil-transferase e esterol-metiltransferase para

TcExp02A10, indicando sua ligação à uma família de metil-transferases associadas a S-

adenosil-metionina (SAM) e a determinação de sua localização citoplasmática por

imunofluorescência.

Com relação às proteínas do grupo 2, foi possível evidenciar que:

129

• TcExp02A02 é uma proteína-quinase e contém uma grande região protéica sem

domínios preditos. As proteínas de eucariotos superiores mais similares a ela estão

anotadas como quinase 2 do fator de iniciação da tradução (eIF2AK2). Em geral,

eIF2AK2 é composto somente pelo domínio quinase e, portanto, caso TcExp02A02 seja

realmente o ortólogo dessa proteína, possui uma região de ~600 aminoácidos a qual

potencialmente contém alguma estrutura funcional acessória.

• TcExp02A12 apresentou resíduos extremamente conservados de uma zinc finger,

porém não foi identificado um domínio claro nessa proteína. Portanto, essa proteína é

provavelmente uma zinc finger contendo um novo domínio ainda não caracterizado.

• TcExp02B01 está anotada como rab5 e foi feita sua localização em uma região entre o

cinetoplasto e o flagelo.

Com relação às proteínas do grupo 3, foi possível evidenciar que:

• TcExp02A03 é uma ciclofilina do tipo FKBP, contendo um domínio degenerado;

• TcExp02B02, inicialmente anotada como proteína hipotética, teve um ortólogo

identificado em L. infantum, e deve ser, portanto, renomeada para proteína hipotética

conservada.

Com relação às proteínas do grupo 4, foi possível evidenciar que:

• TcExp02B06 é uma proteína relacionada à via de produção da diftamida, uma

modificação pós-traducional de uma histidina, encontrada somente em eEF2. A via de

síntese da diftamida é composta por cinco genes, os quais foram totalmente identificados

em T. cruzi. TcExp02B06 é DPH3 e contém o domínio CSL, DPH4 (5788.t00002)

contém um domínio CSL degenerado em T. cruzi, associado a um domínio DnaJ, DPH1

(3750.t00001), DPH2 (4935.t00029) e DPH5 (10960.t00003).

• TcExp02B07 foi identificada como sendo uma proteína localizada preferencialmente

no flagelo.

Com relação às proteínas do grupo 5, foi possível evidenciar que:

• TcExp02B08, inicialmente anotada como proteína hipotética, teve ortólogos

identificados em T. congolense e T. vivax, e deve ser, portanto, renomeada para proteína

hipotética conservada;

130

• TcExp02B10 foi identificada como sendo uma proteína localizada preferencialmente

no flagelo.

Com relação às proteínas do grupo 6, foi possível evidenciar que:

• TcExp02B11, anotada inicialmente como uma proteína hipotética, realmente não

apresenta ortólogos em tripanossomatídeos. No entanto, uma análise mais detalhada a

identificou como membro de uma família de proteínas relacionadas, composta por

quatro grupos protéicos, sendo dois compartilhados em tripanossomatídeos e dois

restritos a T. cruzi, incluindo TcExp02B11. Essa família protéica tem como

características principais o fato de serem proteínas de membrana sem nenhum domínio

funcional identificado;

• TcExp02B12 foi localizada em uma região entre o flagelo e o cinetoplasto;

• TcExp02C01 foi localizada em uma região entre o flagelo e o cinetoplasto.

Com relação às proteínas do grupo 7, foi possível evidenciar que:

• TcExp02A07 é possivelmente uma MAP quinase;

• TcExp02C04 foi localizada preferencialmente no cinetoplasto.

As proteínas com imunofluorescência foram selecionadas para um maior detalhamento,

devido à importância da imunolocalização para a caracterização funcional. Dos onze soros

obtidos, dois foram eliminados devido à reação cruzada do soro pré-imune, observada

somente na imunofluorescência controle, pois todos soros pré-imunes não reagiram com um

extrato de T. cruzi na etapa inicial de seleção. Dos nove soros restantes, sete apresentaram um

padrão de localização bem definido, um soro produziu um padrão de dispersão no citoplasma,

e outro soro obteve um padrão mais intenso no cinetoplasto e um padrão disperso pelo

citoplasma.

A imunolocalização da proteína TcExp02A01 apresentou um padrão granular disperso

pelo citoplasma do parasita. O domínio ALBA, presente nesta proteína, está envolvido na

ligação a ácidos nucléicos. Dentro desta função primária, é descrita na literatura a capacidade

de atuar na compactação de DNA em arquebactérias (BELL et al., 2002; MARSH et al.,

2005; SANDMAN & REEVE, 2005) e de estar associada à ligação com RNA com função de

estabilização e/ou ligada ao metabolismo de RNA (ARAVIND et al., 2003; GUO et al., 2003;

MARSH et al., 2005).

131

Segundo ARAVIND et al. (2003), o domínio ALBA faz parte de uma superfamília com

função básica de ligação a ácidos nucléicos, sendo que em eucariotos a função está baseada na

similaridade entre algumas proteínas de função conhecida como a IF3-C (Fator de iniciação

da tradução 3)e YhbY (Domínio de ligação a RNA presente em bactérias e plantas). Outra

diferença é o tamanho das proteínas, pois em arquebactérias as proteínas com domínio ALBA

clássicas possuem em média 10 kDa, e em eucariotos possuem tamanhos variados, muitas

vezes maiores, o que ocorre com TcExp02A01.

É interessante ressaltar que em T. cruzi há quatro proteínas minimamente distintas

apresentando o domínio ALBA. TcExp02A01 na verdade é uma representação individual de

dois parálogos, justapostos no genoma, que são muito similares em toda a sua extensão,

diferindo somente nos últimos 10 aminoácidos de sua porção carbóxi-terminal. Esses dois

parálogos apresentam essas mesmas características nas outras espécies do gênero

Trypanosoma seqüenciadas, mas somente um ortólogo em Leishmania.

As outras duas proteínas contendo o domínio ALBA apresentam um tamanho (13kDa)

mais próximo ao das proteínas Alba clássicas de arquebactérias, sendo compostas

praticamente somente por esse domínio. Esses dois genes distintos também se encontram

justapostos no genoma de todos os tripanossomatídeos seqüenciados, mas apresentam

somente 41% de similaridade em sua seqüência aminoacídica.

Em TcExp02A01, existe uma região conservada na extremidade carbóxi-terminal rica em

argininas e glicinas, cujo motivo, denominado RGG-box, está presente em diversas proteínas

ligadoras de RNA (McBRIDE et al, 2005). O padrão granular distribuído pelo citoplasma,

encontrado na imunolocalização de TcExp02A01, associado a esse motivo de ligação ao

RNA, é compatível com a atividade relacionada ao metabolismo e/ou estabilização do RNA,

pois não foi encontrado indícios de presença de sinal da proteína no núcleo ou cinetoplasto.

A fim de identificar os possíveis ortólogos de TcExp02A01 em outros organismos, foi

feito uma procura bioinformática por proteínas contendo o domínio ALBA e pelo menos dois

motivos RGG presentes em uma mesma região. Interessantemente, o domínio ALBA não foi

encontrado em fungos (filamentosos ou leveduras) e somente em protozoários foram

identificadas proteínas contendo tanto o domínio ALBA quanto o motivo RGG (gêneros

Trypanosoma, Leishmania e Plasmodium e em D. discoideum), o que indica a restrição

evolutiva desse tipo protéico.

Devido ao padrão granular identificado para ALBA no citoplasma de T. cruzi e ao fato de

ter sido caracterizada como uma proteína de ligação ao RNA potencial, resolvemos avaliar se

132

essa proteína estaria associada a corpúsculos citoplasmáticos que ocorrem em T. cruzi

preferencialmente em situações de carência nutricional.

HOLETZ et al. (2007) identificaram a presença de uma RNA helicase, TcDhh1, em focos

citoplasmáticos os quais aumentavam em número em parasitas sobre estresse nutricional. A

helicase Dhh1 é um marcador de uma estrutura citoplasmática denominada P-bodies

encontrada em fungos e mamíferos, a qual está envolvida ou na degradação 5’-3’ de mRNAs

desadenilados e desencapados ou no armazenamento de mRNAs ainda tradutíveis.

CASSOLA et al. (2007) aprofundaram a caracterização molecular desses corpúsculos

citoplasmáticos e identificaram diversas outras proteínas como presentes, incluindo a própria

TcDhh1, TcXRNA (a enzima envolvida na degradação 5’-3’) e proteínas de ligação ao RNA

(TcUBP1, TcUBP2, TcRBP3, TcRBP4, TcRBP5a, TcRBP6b, TcPABP1, TcPABP2,

TceIF4E). Esses autores também evidenciaram a presença desses focos em parasitas sobre

privação de fonte de carbono. Baseado na composição identificada desses corpúsculos, foi

proposto que eles eram uma nova entidade de armazenamento de mRNA, pois eram

compostos de proteínas presentes tanto em p-bodies quanto em grânulos de estresse (SG),

duas estruturas distintas em eucariotos superiores. Possivelmente esses corpúsculos

constituem uma estratégia de proteção transiente de transcritos em situações de deprivação de

nutrientes (CASSOLA et al., 2007).

Visando identificar se TcExp02A01 está associada aos corpúsculos citoplasmáticos

identificados por HOLETZ et al. (2007) e CASSOLA et al. (2007), epimastigotas em fase

estacionária de crescimento foram submetidos a estresse nutricional em meio TAU, segundo o

protocolo de metaciclogênese in vitro (BONALDO et al., 1988), e foi realizada uma

imunofluorescência com anticorpos anti-TcDhh1 e anti-TcExp02A01, cujo resultado pode ser

visto na Figura 6.1. É possível identificar claramente que as proteínas TcDhh1 e TcExp02A01

apresentam-se co-localizadas em corpúsculos citoplasmáticos distintos, o que é evidenciado

em alguns parasitas. Interessantemente, em outros parasitas essas duas proteínas não

apresentam co-localização, estando ainda presentes em corpúsculos citoplasmáticos distintos.

Esse resultado sugere que os corpúsculos citoplasmáticos de T. cruzi são na verdade uma

população heterogênea e que a dinâmica de tradução, estocagem e degradação dos mRNAs é

complexa. Esses dados são preliminares e serão reanalisados futuramente. No entanto, é

possível evidenciar que TcExp02A01 é uma proteína citoplasmática de ligação ao mRNA que

se encontra, pelo menos parcialmente, associada às estruturas p-bodies-like de T. cruzi.

133

Figura 6.1. Imunolocalização de TcDhh1 e TcExp02A01.

Anti-TcDhh1 (verde, A), anti-TcExp02A01 (vermelho, B); C) sobreposição de A e B; D) contraste

diferencial de fase sobreposto a C. Setas amarelas, parasitas apresentando co-localização de TcDhh1 e

TcExp02A01; Setas verdes, parasitas mostrando corpúsculos citoplasmáticos contendo TcDhh1 e TcExp02A01

sem co-localização.

A definição de TcExp02A01 como uma proteína de ligação ao RNA reforça a necessitade

de caracterizar quais são os seus alvos moleculares, para que possamos aprofundar nosso

conhecimento sobre os mecanismos de regulação de expressão gênica pós-transcricional em

T. cruzi. Nesse sentido é necessário avaliar quais seriam os mRNAs associados a

TcExp02A01, além de identificar elementos presentes nas regiões 3’-UTR destes,

responsáveis pela interação mRNA-proteína.

A abordagem a ser realizada consistirá em se fazer uma imunoprecipitação de

TcExp02A01 em extrato protéico de T. cruzi e na identificação de mRNAs associados através

do uso de microarranjos de DNA, em uma abordagem denominada ribonômica. Após a

identificação desses alvos, será feita a procura de motivos seqüenciais presentes nas regiões

134

3’-UTR e compartilhados pelos mRNAs co-precipitados. Finalmente, a comprovação da

ligação entre TcExp02A01 e essas regiões do mRNA será feita através da técnica de EMSA

(electrophoretic mobility shit assay), que consiste na separação eletroforética de complexos

de proteína-mRNA, os quais são comparados com o padrão de mobilidade da seqüência de

RNA alvo. Caso haja interação entre a proteína analisada e a seqüência alvo de RNA, esse

complexo irá migrar diferentemente do RNA puro.

O gene codificador da proteína hipotética contendo o domínio sacaropina-desidrogenase

(TcExp02A09), responsável pela etapa final da biossíntese de lisina, apresentou na

imunolocalizaçao um padrão mais intenso de fluorescência na região do cinetoplasto seguida

de fluorescência dispersa pelo citoplasma. Este duplo padrão de localização encontrado pode

ser devido à inespecificidade do soro, visto que os ensaios de western blot revelaram o

reconhecimento de duas proteínas, uma com o tamanho esperado e outra com um tamanho

menor conforme mostrado na Figura .

Essa proteína é extremamente conservada em diversos organismos. Na tentativa de

identificar a proteína de tamanho inesperado, pretende-se a princípio realizar a verificação da

qualidade da proteína recombinante a fim de verificar possível contaminação. Outra

possibilidade é a separação das bandas por SDS-PAGE, seguida por identificação protéica por

espectometria de massa.

Outra forma de se obter o padrão de localização esperado de TcExp02A09 seria realizar a

imunolocalização em tripomastigota metacíclico, pois no ensaio de western blot a proteína

contaminante não foi identificada nessa fase.

Independentemente das análises a serem feitas, algumas observações indicam que essa

proteína é possivelmente mitocondrial. Em primeiro lugar, a busca de similaridade por

BLASTp identificou muitas proteínas de diversos organismos, desde cianobactérias até

mamíferos, com uma região de similaridade muito semelhante, o que indica conservação

funcional em um conjunto diverso de organismos evolutivamente distantes; além disso, a

imunolocalização apresenta um sinal forte no cinetoplasto. BLEMINGS et al. (1994) sugere a

ocorrência na mitocôndria de células do fígado de ratos, enquanto ZHU et al. (2000) sugere a

ocorrência desta enzima na parte citoplasmática em Arabidopsis thaliana.

Com relação à imunolocalização do gene TcExp02A10 que codifica uma proteína

hipotética conservada de 40,5 kDa, apresentando um domínio denominado de Sterol_MT_C

(Sterol methyltransferase C-terminal), verifica-se um padrão citoplasmático, com uma maior

emissão de fluorescência em torno da região nuclear. Este domínio está presente na região

135

carbóxi-terminal de metiltransferases, estando presente principalmente em fungos e plantas

envolvidos com metilação de esteróis (BOUVIER-NAVE et al., 1998). Em

tripanossomatídeos, ergosterol e esteróis alquilados na posição 24 são componentes presentes

em alta concentração nas membranas, uma situação semelhante a que ocorre em fungos e

plantas. A biossíntese de ergosterol e esteróis que necessitam desalquilação na posição 24 da

cadeia é um passo que não está presente na via do colesterol, presente nas células de

mamíferos. Para que esta síntese ocorra é necessária a presença da proteína 24-esterol

metiltransferase sendo esta a etapa chave na diferença da formação de ergosterol e colesterol

(GROS et al, 2006).

A imunolocalização da proteína referente ao gene TcExp02B01 apresentou um padrão

bem definido, localizando-se entre a bolsa paraflagelar e o cinetoplasto, região esta

normamelmente ocupada pelo Complexo de Golgi em T. cruzi. O domínio RAB é

característico de proteínas com função GTPase que está envolvida no controle do tráfego

intracelular, atuando como receptor da endocitose e na dinâmica endossomal. Dentro desta

perspectiva, Rab5 regula o transporte de vesículas, mediado por clatrina, entre a membrana

plasmática e os endossomos primários (recentes), além das fusões entre os endossomos

primários (ZERIAL & McBRIDE, 2001). Esses dados estão de acordo com a

imunolocalização encontrada, pois a região da bolsa paraflagelar é uma região de endocitose e

juntamente com o Complexo de Golgi, existe uma intensa atividade de tráfego vesicular. Em

L. donovani esta proteína está imunolocalizada em endossomos primários (MAROTTA et al.,

2006). Nos resultados de microarranjo e western blot encontramos um aumento na forma

intermediária aderido por 24 horas. ARARIPE et al (2005) sugerem, por RT-PCR, que esse

gene encontra-se aumentado na forma epimastigota, em relação a tripomastigotas. No entanto,

esse estudo se baseou na realização de RT-PCR semi-quantitativa a partir de RNA celular

total, o que impede a comparação com nossos dados, basados em mRNA polissomal.

O gene TcExp02B07 codifica uma proteína que possui um domínio roadblock/lc7,

característicos de proteínas do complexo multimérico da dineína. A dineína pode ser

classificada como citoplasmática ou axonemal e o domínio em questão faz parte das dineínas

citoplasmáticas, as quais podem ser divididas em dois grupos, de acordo com suas funções:

• Dineína citoplasmática do tipo 1: envolvida em diversas funções como organização

dos centríolos e migração nuclear durante a mitose, além do transporte de vesículas

endocíticas e lisossomais,

136

• Dineína citoplasmática do tipo 2: envolvida em transporte intraparaflagelar,

necessário para o funcionamento e montagem de cílios e flagelos (COLE, 2003; PFISTER

et al., 2006).

O domínio LC7 está classificado como dineína citoplasmática do tipo 2. O resultado de

imunolocalização mostra áreas concentradas em forma de grânulos ao longo do flagelo e

também um padrão difuso pelo citoplasma em menor intensidade. A imunomicroscopia

eletrônica poderá dar uma melhor localização desta proteína que juntamente com ensaios de

super-expressão poderão resultar em uma melhor caracterização no T.cruzi.

A proteína referente ao gene TcExp02B10 possui três domínios ligadores de cálcio, sendo

característico da sub-unidade B da calcineurina. Esta proteína participa da transdução de sinal

modulada por cálcio e calmodulina, sendo composta por duas sub-unidades de tamanhos

distintos, A (unidade catalítica, ~60 kDa) e B (unidade regulatória, ~19 kDa) (MORIYA et al

1995; MONDRAGON et al., 1997; ). Na forma epimastigota de T. cruzi, a imunolocalizaçao

desta proteína aparece em duas regiões de forma consistente: na extremidade flagelo com

maior intensidade de fluorescência e grânulos com uma intensidade menor em torno do

núcleo.

Devido às funções diversas que dependem deste tipo de sinalização por cálcio,

experimentos funcionais como inibidores de serina-treonina fosfatase juntamente com a

imunolocalização por microscopia eletrônica poderão resultar em melhor corroboração dos

resultados encontrados neste trabalho.

O gene TcExp02B12 apresentou um padrão de imunolocalização por microscopia óptica

muito semelhante ao encontrado para o gene TcExp02B01, localizando-se entre a bolsa

paraflagelar e o cinetoplasto. Este gene apresenta um domínio denominado ArfGap (ADP-

Ribosilation Factor/GTP-ase Activating Protein) com função de hidrolisar GTP ligado à outra

molécula denominada ARF, a qual está envolvida na regulação do tráfego de membranas,

remodelamento de actina e formação de vesículas revestidas (RANDAZZO & HIRSCH;

2003). Da mesma forma que o gene TcExp02B01, a localização encontrada é compatível com

a posição da via endocítica e/ou tráfego vesicular em T. cruzi.

A imunolocalização da proteína referenta ao gene TcExp02C01 apresentou um padrão de

imunolocalização semelhante ao encontrado para os genes TcExp02B01 e TcExp02B12. Essa

proteína possui função relacionada ao sistema de fusão de membranas de vesículas sendo

classificada como sendo uma sintaxina.

137

Estas três proteínas ligadas ao sistema endocítico e tráfego vesicular (TcExp02B01,

TcExp02B12 e TcExp02C01) serão alvo de estudos posteriores, mais aprofundados, de

localização utilizando microscopia de transmissão, para verificar sua localização de forma

mais precisa. Esse estudo será muito importante pois muito pouco é conhecido sobre o

sistema endocítico em T. cruzi, não havendo nenhuma publicação sobre sintaxina em T. cruzi.

A proteína referente ao gene TcExp02C04 é denominada de centrina sendo uma proteína

ligadora de cálcio presente no centrossomo, presente em todos os eucariotos e podendo

assumir diversas funções (ZAMORA & MARSHALL, 2005). Essa proteína foi localizada no

cinetoplasto da forma epimastigota de T. cruzi, porém este dado será investigado mais

minuciosamente com microscopia de transmissão. Em T. brucei a TbCen1 está localizada no

corpo basal e a estrutura bi-lobada próximo ao Complexo de Golgi. Devido à baixa

conservação de seqüência entre os tripanosomatídeos, as funções podem variar entre os

gêneros e espécies (SELVAPANDIYAN et al., 2007).

É interessante notar que os genes TcExp02B12 e TcExp02C01 fazem parte do mesmo

grupo de co-expressão no transcriptoma e que apresentaram o mesmo padrão de co-

localização na imunofluorescência. Devido ao pequeno número de grupos para os quais foi

possívei imunolocalizar mais do que uma proteína, esse resultado demonstra que é possível

identificar associações entre genes co-regulados, sendo que a ausência de outros exemplos é

principalmente devida à dificuldade de se obter resultados completos para a maioria dos genes

estudados. No entanto, o número de condições biológicas distintas avaliadas e utilizadas para

a análise de co-expressão ainda é baixo, reforçando a necessidade, e importância, de que a

base de dados transcriptômicos seja ampliada.

138

7 Conclusões

A partir do exposto nesse trabalho, pode-se concluir que:

• A seleção de genes candidatos para caracterização utilizando a técnica de microarranjo

de DNA é uma abordagem produtiva, priorizando candidatos mais informativos para a

análise de sua expressão, função e regulação, a partir de um conjunto mais amplo, se não o

total, de proteínas expressas no organismo;

• Na era da genômica funcional, onde começamos a tentar compreender melhor a

complexidade dos sistemas, torna-se necessário abordagens em larga escala visando

elucidar os processos celulares, sendo que para isso devemos utilizar plataformas

apropriadas. Nesse sentido, o sistema Gateway

mostrou-se eficaz na proposta de

clonagem e expressão, podendo ser otimizada utilizando vetores desenhados

especificamente. Sendo assim, pode-se afirmar que a metodologia escolhida representa

uma escolha acertada para a construção do ORFeoma de T. cruzi;

• O resultado das análises comparando western blot com microarranjo de DNA

apresentou um alto grau de correlação, comprovando a confiabilidade do método de

análise utilizado no projeto de genômica funcional do IBMP e a relevância das

modificações do transcriptoma na regulação da expressão gênica;

• A etapa de amplificação e clonagem dos genes foi obtida com sucesso em sua

totalidade. Duas etapas apresentaram um menor índice de sucesso, expressão protéica e

obtenção dos soros policlonais, as quais usualmente são gargalos em projetos desse tipo;

• O estudo dos genes selecionados proporcionou um incremento nas informações dos

mesmos, com relação a aspectos bioinformáticos de anotação e de imunolocalização.

• Os indícios encontrados para o gene TcExp02A01 como sendo codificador de uma

proteína ligadora de RNA e de estar localizado em corpúsculos citoplasmáticos

possivelmente relacionados ao armazenamento de mRNA abrem perspectivas para um

melhor aprofundamento do conhecimento sobre os mecanismos de regulação de expressão

gênica pós-transcricional em T. cruzi, especificamente sobre esse gene.

• Dentre os objetivos práticos definidos para esse trabalho, obtivemos o seguinte:

o Da clonagem de todos os genes na plataforma Gateway

, não conseguimos

somente um, devido a um erro na seqüência do primer forward;

139

o Da expressão da metade do conjunto total de proteínas e de pelo menos sete

proteínas hipotéticas, foram obtidas 19 proteínas expressas (67,8% do total) e

12 proteínas hipotéticas;

o Da imunolocalização de pelo menos cinco proteínas hipotéticas, obtivemos

somente três. No entanto, há mais duas candidatas óbvias, que apresentaram

sinal no western mas cuja imunofluorescência não ficou boa;

o Da obtenção de western blot quantitativo para pelo menos 10 proteínas,

conseguimos obter onze anti-soros e, agregando os anti-soros de outros

trabalhos, conseguimos a quantificação de 23 proteínas, todas realizadas nos

mesmos extratos de T. cruzi, constituindo-se em uma base de dados essencial

para a comprovação do impacto das modulações do transcriptoma nos níveis

protéicos.

o Da análise funcional detalhada de pelo menos uma proteína hipotética, foi

alcançando com a caracterização de TcExp02A01 como sendo uma proteína de

ligação ao RNA, associada a corpúsculos p-bodies-like. A identificação dos

seus alvos será feita no futuro próximo, complementando a sua caracterização

funcional. Além disso, para esse objetivo foi identificado diversas proteínas

associadas ao transporte vesicular, que em conjunto perfazem uma outra

anotação funcional e que, após a caracterização de sua localização mais

precisa, pelo uso de microscopia eletrônica de transmissão, completará a sua

caracterização funcional mínima.

140

8 Perspectivas

Uma das características principais desse trabalho foi a necessidade de abranger um

número relativamente grande de genes a serem caracterizados, com certeza acima da

capacidade de serem analisados em um prazo temporal de dois anos, relativo à uma

dissertação de mestrado. Ciente dessa limitação e não sendo possível, a priori, definir quais

seriam os genes mais fáceis de serem caracterizados, optou-se por incluir diversos níveis de

redundância e a definição de objetivos mínimos práticos, os quais, conforme mencionado

acima, foram quase que totalmente cumpridos.

De qualquer forma, dentro dessa abordagem unidirecional, diversos elementos foram

deixados durante o caminho e uma grande parte das perspectivas é relacionada aos mesmos:

• Expressão das proteínas que falharam nessa etapa, utilizando agora diversos

protocolos, modificando especialmente a cepa bacteriana utilizada, o tempo e

temperatura de indução e a concentração do indutor;

• Expressão de proteínas solúveis nos casos para os quais seria interessante fazer

uma caracterização bioquímica de sua função;

• Melhorar a quantidade e a qualidade da informação obtida com os ensaios de

western blot, ao se utilizar um conjunto mais amplo de amostras extraídas durante

a metaciclogênese (epimastigota em fase de crescimento logarítmica, epimastigota

em fase estacionária, epimastigotas estressados nutricionalmente, epimastigotas

aderidos e em diferenciação por 3, 6, 12, 18, 24 horas aderidos e tripomastigota

metacíclico), permitindo a identificação de pa drões de modulação temporal mais

precisos, e ao se quantificar o sinal da reação sob diversas perspectivas,

aumentando a confiabilidade da mensuração.

• Realizar imunolocalização por microscopia óptica em um conjunto mais amplo

de pontos da metaciclogênese (supracitados), em especial tripomastigotas

metacíclicos, para as proteínas analisadas por imunofluorescência de

epimastigotas no presente trabalho.

• Processar os anti-soros que apresentaram um padrão correto de identificação da

proteína recombinante, mas que não reconheceram o extrato de T. cruzi.

• Realizar imunolocalização por microscopia eletrônica das proteínas que

apresentaram um padrão adequado de imunolocalização por microscopia óptica.

141

• Com relação ao gene TcExp02A01, realizar ensaio de EMSA, imunoprecipitação,

ribonômica, e co-localização com marcadores específicos.

142

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