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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CENTRO DE AQÜICULTURA DA UNESP
CÂMPUS DE JABOTICABAL
“Aspectos estruturais do hepatopâncreas,
desenvolvimento ovocitário e caracterização hormonal
de fêmeas de Macrobrachium amazonicum durante as
fases de maturação gonadal”.
M.Sc. Karina Ribeiro
Bióloga
Jaboticabal-SP
outubro/2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CENTRO DE AQÜICULTURA DA UNESP
CÂMPUS DE JABOTICABAL
“Aspectos estruturais do hepatopâncreas,
desenvolvimento ovocitário e caracterização hormonal
de fêmeas de Macrobrachium amazonicum durante as
fases de maturação gonadal”.
Tese de Doutorado apresentada ao
Centro de Aqüicultura da Unesp,
como parte das exigências para
aquisição do Título de Doutor em
Aqücultura.
Pós-graduanda: Karina Ribeiro
Orientadora: Profa. Dra. Irene B. Franceschini Vicentini
Jaboticabal-SP
outubro/2006
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Dedico este trabalho à minha eterna ORIENTADORA
Profa. Dra. Irene Bastos Franceschini Vicentini
Professora, orientadora, “mãe científica”, colega de profissão e
principalmente AMIGA.
Com ela aprendi muito mais que CIÊNCIA.
À você professora sou grata pelos conselhos que auxiliaram no meu
crescimento profissional, científico e muitas vezes pessoal.
“Mestre é aquele que caminha com o tempo, propondo paz, fazendo comunhão,
despertando sabedoria. Mestre é aquele que estende a mão, inicia o diálogo e encaminha
para a aventura da vida. Não é só aquele que ensina fórmulas, regras, raciocínios, mas
aquele que também questiona e desperta para a realidade. Não é aquele que dá de seu
saber, mas aquele que faz germinar o saber do discípulo. Feliz é aquele que tranfere o
saber e aprende o que ensina!”
Cora Coralina
Homenagem
Aos meus pais por serem o maior motivo da minha persistência, pela
educação, apoio e confiança em mim investidos.
Ao meu pai Carlos pelo exemplo de amor, honestidade e força;
À minha mãe Marina pelo exemplo de mulher, inteligência, capacidade e
coragem.
Obrigada pelos ensinamentos, pelos sermões, pelas palmadas e, principalmente pelos
exemplos.
Obrigada pelos agrados e principalmente pelos desagrados.
Assim, eu pude ver que na vida nem tudo é como a gente quer.
Aprendi a ter limites a ser mais “gente”.
Obrigada pelas preocupações
sei que muitas vezes fui (e ainda sou) causa de inapetência e insônia.
Obrigada pela caminhada, pela luta, pela lida.
Aprendi com vocês:
a ter coragem e a não desanimar.
Obrigada pelas mãos entrelaçadas na minha,
doando-me confiança,
na certeza de estar indo por caminhos seguros
e na certeza de que terei sempre onde amparar
caso eu tropece.
(Mena Moreira)
À minha irmã Katia pela fidelidade, confiança e principalmente pela AMIZADE!
Agradecimentos Especiais
Eduardo Makoto Onaka, Mariana Cutolo Araujo e Fabiana Rizzi Bozzo, por
serem muito mais que amigos. Pelo carinho e companherismo durante toda a
pós-graduação e pela amizade que com certeza será ETERNA!
"O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com
que acontecem.
Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas
incomparáveis".
(Fernando Pessoa)
Luciene Patrici Papa
Pela Ajuda, companherismo e auxílio, pelo exemplo de competência, mas
principalmente pela amizade.
Julio Marques Junior, Mariana Santos Silva
Por serem os “irmãos caçulas” que compartilharam momentos maravilhosos e
que me ensinaram muito.
“Amigo é coisa para se guardar. No lado esquerdo do peito, mesmo que o tempo e
a distância digam não”.
(Fernando Brant e Milton Nascimento)
Tiago Tobias Freitas
Pelo carinho, paciência, amor e principalemente pelo respeito.
É incrível, nada desvia o Destino.
Hoje tudo faz sentido.
E ainda há tanto a aprender
(Jorge Vercilo)
AGRADECIMENTOS
A Deus e a todas as minhas proteções, por me darem a força necessária para
enfrentar os obstáculos do dia a dia.
Aos membros da Banca do Exame Geral de Qualificação: Profa. Dra. Silvana B.
Artoni, Profa. Dra. Laura Satiko Okada Nakaghi e Profa. Dra. Maria Teresinha
Siqueira Bombonato, pelas preciosas contribuições para melhoras deste trabalho.
Aos membros da Banca examinadora: Prof. Dr. Antonio Marcos Orsi, Profa. Dra.
Maíra Aparecida Stefanini , Profa. Dra. Margarida Barros, Profa. Dra. Maria
Teresinha Siqueira Bombonato, pelas oportunas sugestões e contribuições para
melhoras deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Wagner Cotroni Valenti, por contribuir para minha formação com
suas experiências e por ser exemplo de determinação.
Aos amigos que me auxiliaram na execução deste trabalho: José Roberto
Polachini, Mariana C. Araújo, Eduardo M. Onaka, Luciene P. Papa, Alessandra
Guerra Messias e Julio Marques Junior. Muito obrigada pela preciosa ajuda!
A Maria Helena, técnica do Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de
Biociência da UNESP/Botucatu, pelo processamento do material destinado à
Microscopia Eletrônica de Transmissão.
Aos Professores da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
(UTAD)/Portugal: Prof. José Julio Gonçalves Barros Martins, Profa. Dra. Anabela
Gouveia Antunes Alves, Prof. Dr. Paulo José Azevedo Pinto Rema, pela
maravilhosa recepção e por estarem sempre acessíveis.
A Técnica do Laboratório de Fisiologia Animal da Universidade de Trás-os-
Montes e Alto Douro (UTAD), Carla Alexandre F. Coutinho pela valiosa ajuda na
extração hormonal.
À professora do departamento de patologia clínica Profa. Dra. Anabela Gouveia
Antunes Alves por disponibilizar-se a nos auxiliar nas análises de
imunohistoquímica.
Às sempre amigas Luciene Patrici Papa e Kátia Ribeiro, pelo auxílio nos processos
finais das correções da tese.
Aos Professores do Laboratório de Morfologia de Organismos Aquáticos da
UNESP/Campus de Bauru:
Prof. Dr. Carlos Alberto Vicentini por ser além de um eterno mestre, um
exemplo de dignidade e profissionalismo;
Profa. Dra. Maria Terezinha Siqueira Bombonato, por se tornar uma amiga
e ser exemplo de força e coragem.
Aos amigos do Laboratório de Morfologia de Organismos Aquáticos da
UNESP/Campus de Bauru pela amizade, convívio e espírito de equipe!
Aos amigos do Setor de Carcinicultura de Jaboticabal/SP por compartilharem
todos os momentos em que estive presente.
Aos funcionários do CAUNESP pelo convívio prontidão e amizade.
Aos meus ETERNOS amigos do CAUNESP: Veralice (Veroka), Valdecir (Vardeça),
Marcio (Perereca) e Roberto (Robert) por serem muito mais que amigos.
Aos amigos de Pós-Graduação: Mariana, Eduardo (Twin), Fabiana R. Bozzo, Jaime,
Camilo, Fabio, Ana, Peter, Luciana, Leo "Bacarin", Ana Elisa, Cris, Fabiana B.,
Fabiana P., Fabiana Garcia, Leo Taschibana, Nilton (Paraca), Laurindo, Michele,
Daniela, Vanessa, ,,,,entre tantos, pela gratificante convivência!
Em especial ao “irmão” conquistado: José Julio Martins por ser minha familia em
Portugal, e pelo apoio e exemplo de honestidade e coragem.
À todos os que passaram pelo CAUNESP e que deixaram saudades;
A todos aquele que direta ou indiretamente me auxiliaram na conclusão deste
trabalho o meu Muito obrigada!
"TALVEZ NÃO TENHAMOS CONSEGUIDO FAZER O
MELHOR, MAS LUTAMOS PARA QUE O MELHOR FOSSE
FEITO.
NÃO SOMOS O QUE DEVERÍAMOS SER; NÃO SOMOS O
QUE IREMOS SER. MAS, GRAÇAS A DEUS, NÃO
SOMOS O QUE ÉRAMOS".
MARTIN LUTHER KING
SUMÁRIO
Resumo 01
Abstract 02
Introdução Geral 04
Objetivo 07
Literatura
Aparelho Reprodutor Feminino 08
Hepatopâncreas 14
Sistema Hormonal 20
Material e Métodos
Animais 26
Índices Gonadossomáticos (IGS) e Hepatossomáticos (IHS): 26
Análise de microscopia de luz e eletrônica 26
Caracterização hormonal 28
Extração de esteróides 29
Determinação de esteróides por rádio imuno-ensaio 29
Resultados
Valores dosÍndices Gonadossomáticos (IGS) e Hepatossomáticos (IHS):
31
Estrutura ovariana 31
Estrutura do hepatopâncreas 35
Quantificação hormonal 38
Documentação fotográfica 42
Discussão 75
Conclusões 89
Referências Bibliográficas 90
Aspectos estruturais do hepatopâncreas, desenvolvimento ovocitário e
caracterização hormonal de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum
durante as
fases de maturação gonadal
RESUMO
O presente trabalho realizou o estudo dos aspectos estruturais do
hepatopâncreas, ovários e da caracterização hormonal de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, nos diferentes estágios de maturação gonadal. Para
tanto utilizaram-se 150 fêmeas adultas subdivididas entre os cinco diferentes
estágios de maturação ovariana. Após serem capturados os animais foram pesados
e mortos por choque térmico. Ovários e hepatopâncreas foram coletados e pesados
individualmente para obtenção dos índices gonadossomático (IGS) e
hepatossomático (IHS). Para as análises de microscopia de luz e eletrônica de
transmissão, ovários e hepatopâncreas foram fixados em solução de Karnovsky e
seguiram os procedimentos de rotina de inclusão. Os ovários, hepatopâncreas e
hemolinfa destinados à quantificação hormonal foram armazenados em ependorfes
e preservados em nitrogênio líquido a -70ºC, para posterior processamento de
radioimunoensaio visando avaliação das concentrações de estradiol, progesterona e
testosterona. Os resultados relacionados ao IGS e IHS demonstram uma correlação
inversa entre os ovários e o hepatopâncreas nos diferentes estágios de maturação
gonadal. Em relação ao desenvolvimento ovariano, observa-se a distribuição de
cinco tipos celulares ao longo dos cinco estágios de maturação gonadal. Desta
forma encontram-se as ovogônias ou células germinativas mais jovens no estágio I
de maturação ovariana. As células pré-vitelogênicas, observadas a partir do estágio
II, apresentam vesículas de retículo endoplasmático rugoso. Essas vesículas são
importantes nas fases de vitelogênese endógena e exógena. Os ovócitos em
vitelogênese inicial, característicos do estágio III, apresentam a deposição de vitelo
endógeno. As células em vitelogênese avançada, próprias do estágio IV de
maturação gonadal, são o alvo principal da vitelogênese exógena. No estágio V de
maturação observa-se a formação do córion no ovócito maduro. Em relação ao
hepatopâncreas, observa-se que este órgão é formado por um conjunto de túbulos
hepatopancreáticos, revestidos por epitélio pseudo-estratificado composto por cinco
tipos celulares, sendo eles, célula E (indiferenciada), célula F (fibrilar), célula B
(vesicular), célula R (reabsortiva) e célula M (basal). Estas células apresentam
características morfológicas relacionadas às funções de digestão e assimilação de
nutrientes, assim como a de reserva energética, fundamental para os processos
reprodutivos. A quantificação hormonal em fêmeas de Macrobrachium amazonicum
teve o propósito de investigar a correlação entre os diferentes estágios de
maturação ovariana e os níveis de hormônios esteróides (estradiol, progesterona e
testosterona) presentes nos ovários, hepatopâncreas e hemolinfa. Com relação ao
estradiol e a progesterona nota-se alta concentração nos estágios I e II, coincidindo
com a fase de preparo para a vitelogênese, e queda progressiva no decorrer dos
estágios seguintes de maturação gonadal, atingindo sua menor concentração no
momento da desova. Já a testosterona não demonstra grandes alterações durante o
ciclo reprodutivo.
Palavras-chave: Macrobrachium amazonicum, estrutura, ovário, hepatopâncreas,
esteróides, ciclo reprodutivo
Structural features of the hepatopancreas, oocytes development and hormonal
characteristics of femeales of the freshwater prawn,
Macrobrachium
amazonicum
, during gonadal maturation
ABSTRACT
This study described the structural aspects of the hepatopancreas and
ovaries, and the hormonal features of females of the freshwater prawn
Macrobrachium amazonicum, during the reproductive cycle. The specimens were
captured and killed by thermic chock. The gonadosomatic (GSI) and hepatosomatic
(HSI) indices were calculated as the percentage of the weight of the gonad and
hepatopancreas to total body weight, respectively. Ovaries and hepatopancreas were
fixed in Karnovsky solution and destined to light and ultrastructural microscopy
studies. Small portions of the ovary, hepatopancreas and hemolymph were frozen in
liquid nitrogen, for later steroid quantification (estradiol, progesterone and
testosterone). The relationships between GSI and HSI demonstrate an inverse
correlation between ovary and hepatopancreas during the maturation cycle. The
oocytes distribution is variable depending on the ovarian maturation degree. The
ovary in stage I consists of oogonia. The ovary in stage II consists mainly by
previtellogenic oocytes that possess vesicles of the endoplasmic reticulum. These
vesicles are important to endogenous and exogenous vitelogenesis. Initial
vitellogenic oocytes are mainly observed in the ovary in stage III and possess
vitelline reserve, called as endogenous vitelogenesis. Ovary in stage IV is composed
of late vitellogenic oocytes that uptake exogenous vitellogenin. Mature oocytes
present a corion formation. The hepatopancreas is composed by tubules that are
lined by a pseudostratified epithelium, which consists of five cell types, identified as E
(embryonic), F (fibrillar), B (blisterlike), R (resorptive) and M (basal). These cells
present relationships with digestion and nutrient storage, which are very important for
the reproductive processes. The involvement of steroids (estradiol, progesterone and
testosterone) in the ovarian maturation in Macrobrachium amazonicum shows that
the levels of estradiol and progesterone increase steadily during stages I and II,
which coincides with the previtellogenic phases. Estradiol and progesterone start a
progressive decrease throughout the remaining ovarian maturation stages. The
lowest levels of these hormones are observed at stage V. Testosterone shows
relatively constant concentration throughout the five stages of ovarian maturation.
Key words: Macrobrachium amazonicum, structure, ovary, hepatopancreas, steroids,
reproductive cycle
INTRODUÇÃO
A carcinicultura de água doce tem sido reconhecida como forma de produção
de crustáceos com baixo impacto ambiental (New et al., 2000). Além disso, este é
um dos setores que mais cresce no mundo (Valenti, 2002). Os dados da FAO (2002)
indicam que o volume de Macrobrachium rosenbergii cultivado aumentou de 21.000
para 118.500 toneladas no período de 1990 a 2000. A produção de Macrobrachium
nipponense alcançou 100.000 toneladas na China em 2000 (Miao e Ge, 2002).
Estes dados indicam que o setor cresceu mais de 1000% na última década do último
milênio (Valenti, 2002). Em 2001, a produção mundial de camarões de água doce
ultrapassou 300.000 toneladas, movimentando mais de US$ 1 bilhão (Valenti, 2002).
Já em 2002, somente a produção mundial de Macrobrachium rosenbergii foi
estimada em 195.000 toneladas e movimentou aproximadamente US$ 617 milhões
(FAO, 2004).
Embora os camarões de água doce ainda ocupem posição inferior aos
marinhos na produção mundial, eles apresentam várias vantagens tais como maior
resistência a doenças, maturação e larvicultura mais simples, independência da
água salgada na fase de crescimento (engorda), sistema de produção compatível
com pequenas propriedades e menor impacto ambiental (New, 1995; Valenti, 1996;
New, 2000). Além disso, o cultivo de camarões de água doce apresenta
características que favorecem o cultivo sustentável em empresas que usam mão-de-
obra familiar (Valenti, 1998; New et al., 2000).
Até o presente, Macrobrachium rosenbergii é a única espécie cultivada no
Brasil em escala comercial. O cultivo é realizado em pequenas propriedades,
distribuídas em 16 estados brasileiros, tendo o Espírito Santo como o principal
produtor. Este estado detem 1/3 de toda a produção brasileira (Moraes-Riodades,
2004). Atualmente, essa produção encontra-se estabilizada em 400 toneladas
anuais (Valenti, 2004).
A carcinicultura de água doce no Brasil está embasada em uma única espécie
exótica, e portanto, ela corre riscos com o surgimento de problemas como doenças.
Este problema ao afetar a epécie pode causar colapso no setor produtivo. Além
disso, Macrobrachium rosenbergii é uma espécie de origem asiática e não há
estudos referentes ao impacto da liberação dessa espécie em ambientes naturais
brasileiros. O escape de espécies exóticas cultivadas tem sido responsável por
vários problemas ambientais, tais como a competição e/ou predação em relação às
espécies nativas, alterações de habitats e disseminação de patógenos (Bridger e
Garber, 2002; Myrick, 2002). O grande desenvolvimento da produção de
Macrobrachium nipponense na China mostra a importância e a viabilidade do uso
das espécies nativas para o cultivo. No Brasil encontra-se naturalmente três
espécies de camarões de água doce com grande potencial para cultivo:
Macrobrachium acanthurus, Macrobrachium amazonicum e Macrobrachium carcinus
(Valenti, 1993). Embora alguns aspectos da biologia dessas espécies já tenham sido
estudados, faltam pesquisas direcionadas para o desenvolvimento de tecnologia de
produção.
Entre os camarões nativos, a espécie Macrobrachium amazonicum merece
destaque. Esta espécie é conhecida como camarão regional no estado do Pará
(Moraes-Riodades et al., 1999), camarão canela e camarão sossego (Valenti, 1985)
e, atualmente vem sendo chamado de camarão-da-amazônia. Esse camarão
apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo desde a Venezuela até o estado
do Paraná e habitam as bacias Amazônica, do Orenoco, do São Francisco, do
Paraná, rios do Nordeste e do Centro-Oeste (Holthuis, 1952; Davant, 1963; Bialetzki
et al., 1997). Supõe-se que esta espécie possa ter sido introduzida em algumas
dessas regiões, mas está totalmente adaptada (Gurgel e Matos, 1984; Magalhães,
1999).
O Macrobrachium amazonicum é um camarão pequeno, que pode alcançar até
16 cm e 30 g (Valenti et al., 2003). Sua carne apresenta textura mais firme e sabor
mais acentuado em relação à carne da espécie Macrobrachium rosenbergii e, por
isso, é bem mais aceita nos mercados consumidores (Moraes-Riodades et al.,
1999). Essa espécie é amplamente consumida pelas populações de rendas baixa,
média e alta da região amazônica (Moraes-Riodades e Valenti, 2001) e pela
população rural da região Nordeste (Gurgel e Matos, 1984). Esta espécie é
encontrada em quase todo o território nacional e, portanto, o seu cultivo na maior
parte do país, não oferece riscos de introdução de espécies exóticas na natureza por
escape de viveiros de aqüicultura. Apresentando assim características importantes
de espécies com potencial para a Aquicultura. No entanto o Macrobrachium
amazonicum vem sendo largamente utilizado em pesca artesanal na região
Nordeste (Gurgel e Matos, 1984) e nos estados do Pará e Amapá (Odinetz-Collart,
1987; Odinetz-Collart e Moreira, 1993). Desta forma, faz-se necessários estudos que
gerem informações para subsidiar tecnicas de produção, seja através dos sistemas
de cultivo comercial, ou através de exploração racional dos estoques naturais,
evitando-se os riscos do seu esgotamento. No entanto, alguns testes de larvicultura
e engorda desta espécie foram realizados no estado do Pará em 1996, mas não
tiveram continuidade devida à falta de tecnologia adequada (Moraes-Riodades et al.,
1999).
Com o intuito de ampliar a produção da espécie Macrobrachium amazonicum,
muitos estudos vem sendo realizado, principalmente em relação à ecologia e
biologia pesqueira de populações naturais (Odinetz-Collart, 1987; 1991a; 1991b;
Odinetz-Collart e Moreira, 1993; Odinetz-Collart e Magalhães, 1994). Foram
investigados outros aspectos, tais como a fecundidade (Lobão et al., 1986; Scaico,
1992; Odinetz-Collart e Rabelo, 1996), o desenvolvimento gonadal (Bragagnoli e
Grotta, 1995), o desenvolvimento larval (Guest, 1979; Romero, 1982; Barreto e
Soares, 1982; Magalhães, 1985; Lobão et al., 1987; Rojas et al., 1990), e a
alimentação e manutenção dos animais em laboratório (Alves, 1986; Roverso et al.,
1990; Lobão et al., 1994).
Nos últimos anos, outros fatores vêm sendo investigados sobre a biologia do
camarão Macrobrachium amazonicum, como por exemplo: testes de laboratório
sobre técnicas de estocagem, alimentação, manutenção e crescimento de pós-
larvas (Barreto e Soares, 1982; 1982b; Lobão et al., 1987; 1994; 1996; Rojas et al.,
1990; Roverso et al., 1990) e adultos (Alves, 1986). Portanto, a avaliação do
potencial das espécies de crustáceos para a produção, assim como, os
aprimoramentos de técnicas que melhorem seu cultivo estão embasados na
ampliação dos conhecimentos sobre ecologia e biologia das espécies. Estes dados
referem-se a estudos envolvendo o crescimento e a reprodução dos animais.
Entretanto no ano de 2000 desenvolveu-se um programa multi-institucional e
multidisciplinar iniciado sob a liderança do Centro de Aqüicultura da UNESP –
CAUNESP. Este projeto esta inserido neste programa multi-institucional que visa
desenvolver um pacote tecnológico de produção sustentável para o cultivo de
Macrobrachium amazonicum (Valenti et al., 2003)
OBJETIVOS
Caracterizar por meio de microscopias de luz e eletrônica de transmissão a
maturação ovocitária nos diferentes estágios de maturação em fêmeas de
Macrobrachium amazonicum;
Caracterizar por meio de microscopias de luz e eletrônica de transmissão a
organização celular do hepatopâncreas em fêmeas de Macrobrachium
amazonicum;
Determinar a presença e as concentrações dos esteróides estradiol,
progesterona e testosterona nos ovários, hepatopâncreas e hemolinfa de
fêmeas de Macrobrachium amazonicum em diferentes estágios de maturação
gonadal utilizando técnicas de Rádio Imuno Ensaio (RIA).
LITERATURA
Aparelho reprodutor feminino
Nos decápodas, o aparelho reprodutor das fêmeas é constituído por um par
de ovários associados aos ovidutos que se abrem nos gonóporos localizados na
base do terceiro par de pereiópodos (Kroll et al., 1992). Algumas fêmeas
apresentam estruturas especializadas para receber o esperma, como a espermateca
em decápodas (Kroll et al., 1992). A espermateca pode ser caracterizada como
invaginação do exoesqueleto, modificação do oviduto ou ainda, simplesmente um
canal para armazenar ou receber o espermatóforo (Adiyod e Subramoniam, 1983).
Em Inachus falangeus a espermateca é conectada ao oviduto e está ligada ao ovário
e à camada externa do corpo (Diesel, 1990). Os carídeos retêm seus ovos nos
pleópodos, localizados abaixo do abdômem onde serão mantidos por longo período
de incubação até a sua eclosão (Choy, 1986). Desta forma, fêmeas maduras de
Macrobrachium rosenbergii apresentam uma câmara de ovos formada pela primeira,
segunda e terceira pleuras abdominais. Camarões do gênero Macrobrachium
apresentam cerdas reprodutivas, no tórax e nos pleópodos, funcionalmente distintas
e denominadas cerdas de ovoposição e ovígeras, respectivamente. As cerdas de
ovoposição são permanentes e são encontradas nos últimos pares de pereiópodos.
Essas cerdas apresentam a função de guiar e fixar os ovos em direção à câmara
ovígera nos pleópodos, durante a desova. Estas cerdas são encontradas nos
pleópodos após a muda de pré-desova e, assim retêm os ovos durante o
desenvolvimento embrionário das larvas (Nagamine e Knight, 1980). Cabe destacar,
que essas características não existem nos peneídeos, pois estes liberam seus ovos
diretamente na água (Ismael e New, 2000).
Com especial ênfase aos ovários dos decápodas, estes órgãos estão
localizados na região dorsal do intestino. Eles são parcialmente fusionados na região
cefalotorácica, consistindo de um par de cornos e vários lobos laterais. Em
peneídeos, os lobos se estendem no cefalotórax ao longo do comprimento do
abdômen até o telson (Kroll et al., 1992). Em espécies do gênero Macrobrachium,
como por exemplo em Macrobrachium rosenbergii, ovários totalmente desenvolvidos
se encontram apoiados dorsalmente no estômago e hepatopâncreas, logo atrás dos
olhos, podendo adentrar até o primeiro segmento abdominal (Ling, 1969). Assim, os
ovários desta espécie se desenvolvem em direção à parte posterior do cefalotórax, e
quando maduros tornam-se facilmente identificáveis por transparência da carapaça,
como uma grande massa alaranjada (Sagi e Ra’Anan, 1985). O tamanho, cor e
textura dos ovários modificam-se conforme seu grau de amadurecimento
(O’Donovan et al., 1984). A coloração dos ovários resulta do acúmulo de
vitelogenina contendo pigmentos do tipo carotenóides (Charniaux-Cotton, 1980).
Os ovários dos decápodas estão envoltos por uma cápsula de tecido
conjuntivo que se invagina formando septos, os quais suportam o epitélio
germinativo. O epitélio germinativo origina as ovogônias e as células foliculares
(Adiyodi e Subramoniam, 1983; Bell e Lightner, 1988). Em peneídeos, os septos de
tecido conjuntivo separam o ovário em subunidades, sendo que cada uma está
constituída de epitélio germinativo e células foliculares (Johnson, 1980; Bell e
Lightner, 1988). Na espécie Homarus americanus uma espessa lâmina basal de
tecido conjuntivo fibroso sustenta o epitélio germinativo, circundando os folículos e
as células musculares na parede do ovário (Talbot, 1981). Essa característica foi
identificada na espécie Homarus americanus (Talbot, 1981), porém esta camada
muscular está geralmente ausente em ovários de crustáceos (Adiyodi e
Subramoniam, 1983). Ainda, no tecido conjuntivo presente nos ovários de
crustáceos, observam-se sinusóides e vasos hemolinfáticos (Johnson, 1980; Bell e
Lightner, 1988).
O epitélio germinativo, também denominado de zona de proliferação pode ser
observado tanto na periferia como no centro dos ovários da maioria das espécies de
decápodas. As faixas de zona de proliferação constituem a camada germinal das
ovogônias (Kroll et al., 1992). Estas zonas de proliferação podem variar em relação
às espécies, devido à pressão exercida pela produção e crescimento dos ovócitos.
Esta pressão pode causar translocação da zona germinativa, como ocorre em
Carcinus maenas, no qual essa zona se desloca da região periférica para a central
(Laulier, 1974). Em Penaeus setiferus, a zona germinativa se encontra na posição
médio-ventral da parede dos lobos (Bell e Lightner, 1988). Quando ocorre a
maturação, os ovócitos se movem para a periferia do ovário e os lobos se expandem
no espaço hemocélico. Já em Penaeus vannamei as ovogônias da zona germinativa
se dividem tornando-se ovócitos pré-vitelogênicos e se movem da região periférica
para a região central do ovário (Bell e Lightner, 1988).
As células foliculares são as únicas células não germinativas que estão
presentes no ovário dos crustáceos (Kroll et al., 1992). Durante o desenvolvimento
ovocitário e a vitelogênese, as células foliculares se movem, juntamente com os
ovócitos do epitélio germinativo para a zona de crescimento folicular. Essas células
permanecem aderidas à periferia dos ovócitos (Laulier e Demeusy, 1974). Esse
processo é denominado de foliculogênese (Adiyodi e Subramoniam, 1983). As
células foliculares parecem ter importante papel nos processos de vitelogênese nos
decápodas. Observações realizadas por Adiyodi e Subramoniam (1983) descrevem
que a foliculogênese é um pré-requisito para a captação de proteínas de vitelo no
ovócito e é provavelmente estimulada pelos altos índices hormonais. Em Penaeus
japonicus o vitelo sintetizado pelas células foliculares é secretado na hemolinfa e
captado pelo ovócito (Yano e Chinzei, 1987). A passagem do vitelo para o interior
dos ovócitos é facilitada por espaços intercelulares localizados entre as células
foliculares (Adiyodi e Subramoniam, 1983). Em Penaeus monodon as células
foliculares estão sempre presentes e se renovam após cada ovulação (Charniaux-
Cotton, 1980; Tan-Fermin e Pudadera, 1989).
Os ovários de crustáceos apresentam diferentes fases de maturação
constituíndo um ciclo reprodutivo (Chang e Shih, 1995). O estudo deste ciclo
reprodutivo é fundamental para que haja melhor controle do crescimento e da
reprodução de animais mantidos em cativeiro ou ainda, para estoque de
reprodutores (Kroll et al., 1992; Medina et al., 1996). Apesar das observações
macroscópicas auxiliarem na classificação dos estágios de maturação ovariana, faz-
se necessário o conhecimento morfológico do desenvolvimento gonadal, uma vez
que auxiliará na aplicação prática tanto no manejo dos reprodutores, como nas
larviculturas de camarões (Sagi e Ra’Anan, 1985).
Meusy e Payen (1988) separaram os estágios de desenvolvimento ovariano
em pré-vitelogênese, vitelogênese, crescimento e maturação ovocitária. Estudos
realizados sobre a maturação gonadal em fêmeas de Macrobrachium acanthurus,
estabeleceram quatro estágios de maturação ovariana, de acordo com
características macro e microscópicas dos ovários (Carvalho e Pereira, 1981). Os
estágios descritos por esses autores são estágio I ou imaturo; estágio II ou em
maturação, sendo que este compreende três sub-estágios; estágio III ou maduro; e
estágio IV ou pós-eliminação total, compreendendo dois sub-estágios. Os sub-
estágios só puderam ser estabelecidos a partir de análises das características
histológicas ovarianas. Estudos comparativos dos processos de maturação
ovocitária de Macrobrachium amazonicum e Macrobrachium acanthurus revelaram
que a maturação ovocitária é semelhante em ambas as espécies, no que diz
respeito à multiplicação das células foliculares, ao aumento do volume ovocitário e à
proliferação do tecido conjuntivo frouxo (Chaves e Magalhães, 1993).
As mudanças histológicas ocorridas no ovário do camarão de água doce
Macrobrachium borelli, revelaram que a época de reprodução abrange o período de
outubro a janeiro (Verdi, 1996). Este autor enfatiza ainda, que os ovários são do tipo
senerônico, ou seja, apresenta somente uma camada de ovócitos que se
desenvolve em cada ciclo. Em outras espécies os ovócitos permanecem em estado
latente até que ocorra a desova das camadas maduras, o que indica o início de um
novo ciclo. Este fato sugere que em Macrobrachium borelli, haja desovas sucessivas
a partir da recuperação do período pós-desova, mas não uma segunda desova no
mesmo período reprodutivo.
Chang e Shih (1995) analisaram o ciclo reprodutivo da maturação ovariana
em Macrobrachium rosenbergii e constataram cinco estágios reprodutivos. Os
estágios II, III e IV apresentaram o maior crescimento ovariano, confirmado pelo
índice gonadossomático (IGS). O diâmetro dos ovócitos também foi analisado e
demonstrou aumento correspondente ao IGS. A classificação da maturação ovariana
foi baseada em características externas correlacionadas aos tamanhos de ovócitos,
ao crescimento ovariano e à histologia ovariana. Os ovários foram preparados para
muda e desova após atingirem o estágio V (Chang e Shih, 1995).
Em relação às características celulares Adiyodi e Subramoniam (1983)
dividiram a ovogênese em fase de proliferação, na qual as ovogônias são
produzidas e fase de diferenciação que ocorre a partir da fase pré-vitelogênica, na
qual as ovogônias se desenvolvem. Na fase proliferativa, as ovogônias são
produzidas por mitose na zona germinativa durante toda a vida reprodutiva das
fêmeas e assim permanecem até ser iniciada a gametogênese (Kroll et al., 1992).
Este processo tem sido descrito em espécies de carídeos como Lysmata seticaudata
e Pandalus borealis (Charniaux-Cotton, 1980). Na fase de diferenciação, os ovócitos
primários, derivados das ovogônias secundárias, passam para a zona de
crescimento, onde imediatamente passam para a fase de prófase I da meiose. No
estágio paquíteno da prófase I da meiose, os ovócitos cessam sua divisão e
atividade metabólica. Nesta fase, ocorrem mudanças nuclear e citoplasmática,
aumento de tamanho celular e organização dos ovócitos na porção distal dos
ovários (Adiyodi e Subramoniam, 1983). Quando os ovócitos maduros estão prontos
para a ovulação ocorre a continuidade da divisão meiótica (Yano, 1988). Em
Penaeus aztecus, durante primeira fase meiótica ocorre a formação de vesículas
corticais na periferia do citoplasma do ovócito maduro (Clark et al., 1980).
Em decápodas, a ovogênese foi frequentemente estudada com o uso da
microscopia de luz (Yano, 1988; Medina et al., 1996). Entretanto, estudos das
estruturas reprodutivas dos decápodas vêm sendo realizados com auxílio da
microscopia eletrônica de varredura e transmissão, para auxiliar num melhor
entendimento do ciclo reprodutivo (Kroll et al., 1992). Estudos determinaram que o
crescimento dos ovócitos envolvem as células germinativas e vitelogênicas. As
ovogônias quando presentes na zona germinativa se desenvolvem em ovócitos
imaturos, apresentando núcleo grande e arredondado contendo cromatina granular.
Essas células posteriormente se desenvolvem em ovócitos pré-vitelogênicos que
apresentam núcleo central e nucléolos (Browdy, 1989). Os ovócitos pré-
vitelogênicos, dos decápodas, são caracterizados pelo aumento de atividade das
organelas citoplasmáticas. O acúmulo dos ribossomos e o desenvolvimento de
retículo endoplasmático promovem o aumento dos elementos vesiculares no
citoplasma (Charniaux-Cotton, 1980). Em Penaeus keraturus, o retículo
endoplasmático é originado a partir de expansões do envelope nuclear e contém
pequenos grânulos densos. Pequenas vesículas de lipídios são formadas pelo
retículo endoplasmático liso, que posteriormente recebem material do complexo de
Golgi. Os ovócitos estão envoltos por uma única camada de células foliculares
achatadas, exceto na região onde ovócitos vizinhos formam pontes intercelulares
(Carvalho et al., 1998a). Essas observações sugerem a formação endógena de
vitelo, que é decorrente de atividades do envelope nuclear, retículo endoplasmático
e complexo de Golgi. Quanto à ultraestrutura, a maior parte dos estudos foram
realizados apenas com relação à produção de vitelo, e formação e função dos
grânulos corticais (Zerbib, 1979). Recentemente foram descritas as células pré-
vitelogênicas e vitelogênicas presentes nos ovários de Penaeus keraturus (Carvalho
et al., 1998b). Em Callinectes sapidus, grande inclusão de corpúsculos de gordura é
denominado de complexo núcleo-vitelo, e é predominante nas fases finais dos
ovócitos pré-vitelogênicos. Este complexo desaparece quando é iniciado o estágio
de vitelogênese (Johnson, 1980). Esta fase é primeiramente chamada de
vitelogênese primária, ou vitelogênese endógena, na qual o ovócito passa a
acumular vitelo endógeno e termina quando o ovócito atinge o diâmetro
característico de cada espécie.
A vitelogênese secundária, ou vitelogênese exógena, acontece quando o
crescimento dos ovócitos se torne sincronizado. A vitelogenina, que é a precursora
do vitelo, está presente na hemolinfa e é captada pelo ovário por endocitose (Kroll et
al., 1992). A origem da vitelogenina não está bem estabelecida e pode variar entre
as espécies. Assim, a vitelogênese reúne componentes orgânicos e inorgânicos
para a formação de vitelo, os quais são encontrados nos ovócitos. Durante a
vitelogênese endógena ocorrem muitas mudanças citoplasmáticas nos ovócitos,
como o acúmulo de material granular denso em vesículas do retículo
endoplasmático rugoso (Charniaux-Cotton, 1980). No final da fase de pré-
vitelogênese dos ovócitos de algumas espécies de decápodas, ocorre a saída de
material nucleolar para o citoplasma, provavelmente dando início à síntese de vitelo
(Adiyodi e Subramoniam, 1983; Rankin e Davis, 1990). A transferência desse
material nucleolar ocorre por meio da formação de vesículas a partir da fusão da
membrana nuclear mais externa. Ressalta-se que o material nucleolar da vesícula
encontra-se entre a dupla membrana nuclear. A transferência do material nucleolar
também pode ocorrer através dos poros da membrana do núcleo (Adiyodi e
Subramoniam, 1983). Este movimento pode representar a transferência de RNA ou
RNAm do núcleo para o citoplasma da célula (Adiyodi e Subramoniam, 1983). Assim
sendo, pode-se inferir que a vitelogênese é um período importante no ciclo
reprodutivo de fêmeas de crustáceos, sendo caracterizado por aumento massivo da
concentração de vitelogenina na hemolinfa havendo um conseqüente
desenvolvimento ovocitário (Wallace et al., 1967; Kerr, 1969; Fyffe e O'Connor,
1974; Meusy, 1980; Charniaux-Cotton, 1985; Lee e Puppione, 1988; Nelson et al.,
1988). Porém, a produção de vitelo ainda é muito discutida, uma vez que não se
sabe se sua origem é endógena, exógena ou ainda, se seria uma combinação de
ambos os processos (Zerbib, 1979; Charniaux-Cotton, 1980; Schade e Shivers,
1980).
Estudos realizados em Penaeus japonicus demonstraram a presença de
microvilos na membrana plasmática apical dos ovócitos suportando a hipótese de
produção exógena de vitelo (Schade e Shivers, 1980). Ainda na espécie Penaeus
japonicus, com o emprego de estudos imunológicos, foi determinada presença de
vitelo e vitelogenina no tecido adiposo sub epidermico (Yano e Chinzei, 1987)
caracterizando-se uma possível produção exógena. No entanto, nesta espécie ainda
foi observada produção de vitelo pelas células foliculares as quais o liberam na
hemolinfa, sendo depois capturadas pelos ovócitos (Yano e Chinzei, 1987).
Hepatopâncreas
O hepatopâncreas recebe diferentes denominações como fígado, pâncreas,
glândula do intestino médio, glândula gástrica, glândula digestiva, cecos anteriores,
divertículo digestivo, órgão digestivo, glândula intestinal média e hepatopâncreas
(Gibson e Barker, 1979). Este órgão, na maioria dos crustáceos, está associado ao
intestino médio e apresenta diferentes níveis de complexidade dentre as espécies
estudadas. Dentre os decápodas, o hepatopâncreas é particularmente bem
desenvolvido e forma uma rede complexa de ductos e túbulos em fundo cego que
ocupa a maior parte da cavidade cefalotorácica (Gibson e Barker, 1979).
Esta glândula consiste de duas metades que se dispõem uma de cada lado
da linha horizontal média do corpo animal. Cada metade apresenta três lobos que
são conectados separadamente ao estômago e intestino médio por um ducto
primário, que se divide em ductos secundários em cada lóbulo. Os ductos
secundários se ramificam amplamente em dúctulos, sendo que cada um termina em
um complexo de túbulos em fundo cego (Factor, 1981; Franceschini-Vicentini et al.,
2006). O hepatopâncreas é morfologicamente similar na maioria dos decápodas
(Gibson e Barker, 1979), apesar do número de lobos poder variar nas diferentes
espécies (Icely e Nott, 1992). As espécies Penaeus ssp (Vogt, 1985; Lovett e Felder,
1989) e Caridina laevis (Pillai, 1960) apresentam apenas um lobo em cada metade
do hepatopâncreas. Entretanto o hepatopâncreas do Astacus astacus não é um
órgão compacto como nos demais decápodas. Este órgão está dividido em duas
metades, que não se conectam (Vogt et al., 1989).
Os túbulos digestivos estão imersos e suportados em tecido conjuntivo
constituído por fibras colágenas bem definidas, que apresentam uma variedade de
estruturas características incluindo-se sinusóides hemolinfáticos, células circulantes
da hemolinfa e fibroblastos (Factor e Naar, 1985; 1990; Franceschini-Vicentini et al.,
2006). Células contráteis contendo feixes de miofilamentos ocupam o espaço entre a
membrana basal e a lâmina própria do túbulo hepatopancreático. Essas células
contráteis apresentam processos em disposição circular e longitudinal ao túbulo
formando uma malha de tecido contrátil ao redor da lâmina basal do tubulo (Factor e
Naar, 1985; Icely e Nott, 1992).
Os túbulos hepatopancreáticos com fundo cego podem estar divididos em
regiões distal, média e proximal, relativamente ao trato digestório principal (Vogt et
al., 1989; Franceschini-Vicentini et al., 2006). Internamente esses túbulos são
revestidos por epitélio colunar simples (Factor e Naar, 1985; Icely e Nott, 1992;
Brunet et al., 1994; Corrêa Jr. et al., 2002). Quatro tipos celulares têm sido
identificados no epitélio de revestimento dos túbulos do hepatopâncreas em
decápodas. Os tipos celulares são classificados como células E (embrionária), R
(reabsortiva), F (fibrilar) e B (vesicular), de acordo com o esquema proposto por
Jacobs (1928) e Hirsch e Jacobs (1928).
A localização daqueles tipos celulares citados varia ao longo do comprimento
do túbulo hepatopancreático (Icely e Nott, 1992; Corrêa Jr. et al., 2002). As células E
estão restritas à região distal em fundo cego. Já as células R ocorrem ao longo de
todo o comprimento do tubo. As células F ocorrem principalmente na região distal,
enquanto as células B localizam-se na região proximal do túbulo hepatopancreático.
Apenas as células R revestem os dúctulos e os ductos secundários do
hepatopâncreas (Icely e Nott, 1992). Em alguns decápodas foi identificado um quinto
tipo celular denominado de célula M (basal) (Al-Mohanna et al., 1985b; Franceschini-
Vicentini et al., 2006). Este tipo celular está disperso em todo o comprimento do
túbulo e apóia-se na membrana basal do epitélio, porém não mantém contato com o
lúmen do hepatopâncreas (Icely e Nott, 1992; Franceschini-Vicentini et al., 2006).
As células E são indiferenciadas e apresentam núcleo grande que ocupa a
maior parte do volume citoplasmático (Al-Mohanna et al., 1985b; Icely e Nott, 1992).
O citoplasma apresenta pouco retículo endoplasmático rugoso e liso, mitocôndrias,
vesículas limitadas por membranas e muito complexo de Golgi (Icely e Nott, 1992).
Esse tipo celular é responsável pela renovação celular do epitélio dos túbulos
hepatopancreáticos (Icely e Nott, 1992). Durante os estágios de pós-muda, o núcleo
celular é proeminente, e não apresenta sinais de divisão mitótica. Porém, no estágio
de intermuda, estas células apresentam alta atividade mitótica após a alimentação
(Al-Mohanna et al., 1985a). Durante estágios iniciais da pré-muda, as células E
apresentam mitose sendo esta a principal característica dessas células nesse
período. A atividade mitótica diminui progressivamente e cessa antes da ecdise (Al-
Mohanna e Nott, 1989). A divisão contínua da célula E parece estar relacionada com
a extrusão da célula B do epitélio de revestimento do túbulo hepatopancreático e,
desta forma, provavelmente poderia prover células adicionais uma vez que os
túbulos crescem em comprimento a cada muda (Al-Mohanna e Nott, 1989).
As células F apresentam núcleo localizado próximo à região basal da célula.
O citoplasma apresenta retículo endoplasmático rugoso extenso com numerosos
ribossomos tanto aderidos à membrana quanto dispersos no citoplasma, e
numerosas mitocôndrias distribuídas por todo o citoplasma das células. Os
complexos de Golgi apresentam cisternas dilatadas e são comumente encontrados
(Icely e Nott, 1992; Vogt, 1992). A parte luminal dessas células apresenta microvilos
que estão banhados por uma camada entérica. Estas células são especializadas em
sintetizar e secretar enzimas digestivas durante algumas fases do ciclo alimentar
(Icely e Nott, 1992). Após a ingestão de alimento estas células apresentam
numerosos grânulos de zimogênio. Esses grânulos estão localizados na região
apical do citoplasma e são aparentemente sintetizados pelo retículo endoplasmático
rugoso e empacotados pelo complexo de Golgi (Al-Mohanna et al., 1985a). Desta
forma, as células F sintetizam e secretam zimogênio para realizar digestão
extracelular. Subseqüentemente, estas células captam material para a digestão
intracelular e se diferenciam em células B (Al-Mohanna et al., 1985a).
As células F apresentam ainda um grande vacúolo supranuclear, podendo
formar um reservatório de atividade digestiva latente antes da alimentação (Al-
Mohanna et al., 1985a). Quando se inicia o estágio de intermuda, a freqüência das
células F é marcadamente reduzida, particularmente nas regiões média e proximal
dos túbulos hepatopancreáticos. Isso ocorre devido à diferenciação das células F em
B (Al-Mohanna et al., 1989). A freqüência das células F permanece reduzida ao
longo do período de intermuda, e presumivelmente continuarão a se diferenciar em
células B. Além disso, no início do estágio de pré-muda essas células apresentam
freqüência mínima dentre as células epiteliais e estão restritas à região
imediatamente proximal à zona de divisão celular (Al-Mohanna et al., 1989).
As células B são diferenciadas a partir das células F e estão envolvidas com a
digestão intracelular (Al-Mohanna e Nott, 1986). São as maiores dentre os tipos
celulares do hepatopâncreas e apresentam um grande vacúolo envolto por uma fina
camada de citoplasma. O núcleo está restrito à região basal da célula. O citoplasma
apresenta retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias e complexo de Golgi (Icely e
Nott, 1992). Logo após a alimentação, a porção apical da membrana das células B
desenvolve invaginações, as quais se estendem como canais para dentro das
células, produzindo as vesículas pinocíticas. Próximo a este complexo pinocitótico
está localizado um sistema de vacúolos subapicais que apresenta material granular
intravascular. Esses vacúolos coalescem com os corpos digestivos, sendo que estes
ocupam quase todo o volume celular. Com o progresso da pinocitose, a camada
entérica sobre os microvilos torna-se menos conspícua e o citoplasma é reduzido a
uma fina camada marginal na célula. O núcleo está comprimido e localizado na
região basal junto com o retículo endoplasmático rugoso e poucas mitocôndrias (Al-
Mohanna e Nott, 1986).
Com o avanço do processo de digestão intracelular, pequenas regiões
translúcidas aparecem na matriz dos corpos digestivos. Essas regiões aumentam
em volume e são completamente substituídas por um material condensado nas
inclusões digestivas. Essas inclusões formam grandes vacúolos contendo material
amorfo envolto por corpos circulares e estruturas membranosas. As regiões
translucentes fundem-se para formar grandes vacúolos digestivos. No final do
processo de digestão intracelular as células B estão caracterizadas por grande
vacuolização. Há uma tendência dos vacúolos aumentarem progressivamente de
tamanho e se movem basalmente. Eventualmente há um único vacúolo grande
contendo esferas densas (Al-Mohanna e Nott, 1986).
Após a digestão celular, as células B iniciam a fase de extrusão. Nessa fase
as microvilosidades são reduzidas em número e o citoplasma apical está muito
reduzido. Um único vacúolo é formado ocupando grande parte do volume celular. O
citoplasma contém na região basal poucas mitocôndrias envoltas por retículo
endoplasmático rugoso e núcleo achatado (Al-Mohanna e Nott, 1986).
As células mais abundantes nos túbulos hepatopancreáticos dos decápodas
são as células R. O núcleo dessas células localiza-se na região basal, tendendo a
ser pequeno e conter menos cromatina que os núcleos dos demais tipos celulares.
O citoplasma apresenta retículo endoplasmático liso associado às invaginações da
membrana basal celular, mas também pode ocorrer no citoplasma apical em um
estágio específico do ciclo digestivo. Apresenta ainda pouco retículo endoplasmático
rugoso, ribossomos livres e numerosas mitocôndrias localizadas principalmente na
região apical do citoplasma. O complexo de Golgi está ativo na região medial da
célula e apresenta-se associado ao retículo endoplasmático liso na região basal da
célula. Esse complexo apresenta cisternas achatadas e produz vesículas elétron-
densa, as quais coalescem em corpos multivesiculares e são acumuladas em
vacúolos supranucleares (Icely e Nott, 1992).
As células R absorvem nutrientes solúveis do lúmen do intestino e os estocam
sob a forma de lipídios e glicogênio (Al-Mohanna e Nott, 1989). Desta forma, as
células R constituem o principal local de estocagem de lipídios e glicogênio (Icely e
Nott, 1992). Essencialmente, a função das células R é absorver metabólitos
difusíveis do lúmen hepatopancreático, e ainda metabólitos difusíveis e pequenas
partículas da hemolinfa. Esses metabólitos e partículas são estocados como lipídios
e glicogênio no citoplasma (Al-Mohanna e Nott, 1987a).
As células M são conhecidas pelo acúmulo contínuo de material orgânico
denso, o qual ocupa todo o volume celular. Os precursores da síntese desse
material orgânico são provavelmente derivados da hemolinfa ou das células B e R
vizinhas, uma vez que não há associação direta das células M com o lúmen
hepatopancreático. Desta forma não há evidências de atividade pinocítica na
membrana celular e o transporte deve ocorrer por difusão (Al-Mohanna et al.,
1985b). Essas células, ainda, não apresentam borda em microvilos (Al-Mohanna e
Nott, 1987b).
As células M também são responsáveis pelo material de origem protéica
estocado no hepatopâncreas (Al-Mohanna et al., 1985b). Essas células sofrem
mudanças na freqüência e na estrutura, durante o ciclo de muda do animal (Al-
Mohanna e Nott, 1987a). Cada célula acumula material de origem protéica dentro de
um vacúolo maciço, durante o período de intermuda, sendo esse material utilizado
durante os períodos de pré-muda e pós-muda (Al-Mohanna e Nott, 1989). Esse
corpo denso acumulado não é derivado de um sistema de digestão intracelular, uma
vez que não há evidências de material membranoso ou particulado remanescente de
um processo digestivo (Al-Mohanna et al., 1985b).
As células M tendem a ser arredondadas, permanecendo em contato com a
lâmina basal e, ocasionalmente, podem produzir extensões citoplasmáticas com
ramificações entre as células vizinhas, exibindo características de células em
estágios iniciais de atividade celular (Al-Mohanna et al., 1985b). Nessas células
jovens, o núcleo está rodeado por uma fina camada de citoplasma, que apresenta
retículo endoplasmático reduzido e complexo de Golgi com pequenas cisternas,
contendo material elétron-denso, e apenas alguns ribossomos, mitocôndrias e
partículas semelhantes à glicogênio (Al-Mohanna et al., 1985b).
As células localizadas na região medio-distal dos túbulos hepatopancreáticos
apresentam complexo de Golgi proeminente e bem desenvolvido, com numerosas
vesículas. Essas vesículas aparentemente representam estágios para a formação de
grânulos grandes e densos, com acúmulo progressivo e formação de um aspecto
diferenciado das células nesse estágio de desenvolvimento. Os grânulos densos
também parecem emergir envoltos de membrana, com inclusões semi-densas,
contendo material granular. Esses grânulos parecem estar em estágio intermediário
para a formação de corpos densos grandes e imaturos. O retículo endoplasmático
rugoso torna-se mais evidente do que nos estágios iniciais de atividade das células
M. Ribossomos livres estão presentes no citoplasma, ocorrendo sozinhos ou como
poliossomos (Al-Mohanna et al., 1985b). O complexo de Golgi produz vesículas, que
estão aderidas diretamente aos corpos elétron-densos imaturos. Esses aspectos
parecem ser um processo contínuo de “amalgamação” de todas as inclusões,
visando formar características de um único corpo denso no citoplasma, durante a
migração da célula M através dos túbulos hepatopancreáticos (Al-Mohanna et al.,
1985b). Com o aumento do tamanho do corpo denso, o citoplasma é reduzido a uma
fina camada e o núcleo vai se tornando comprimido em um lado da célula. Ao
mesmo tempo, longas lamelas de retículo endoplasmático rugoso desenvolvem-se e
tornam-se mais conspícuas (Al-Mohanna et al., 1985b).
Células M com corpo denso único e maturo são sempre encontradas na
região apical do túbulo hepatopancreático. Esses corpos densos estão envoltos por
endomembrana e contém matriz homogênea com alta elétron-densidade. O
citoplasma circundante contém retículo endoplasmático rugoso e um único e
proeminente complexo de Golgi, com poucas mitocôndrias e partículas semelhantes
a glicogênio. O complexo de Golgi apresenta cisternas achatadas que contém
material de baixa elétron-densidade (Al-Mohanna et al., 1985b).
Sistema hormonal
Apesar do importante crescimento de cultivo de camarão de água doce no
contexto mundial, estudos específicos sobre o sistema endócrino de decápodas vem
sendo realizados principalmente em lagostins, caranguejos e lagostas (Huberman,
2000). Embora esses estudos possam ser utilizados como referência, existe a
necessidade de se aprofundar os conhecimentos da fisiologia e, especialmente, da
endocrinologia em diferentes espécies de camarões (Huberman, 2000). Assim
sendo, os avanços nos estudos relacionados à fisiologia, bioquímica, endocrinologia,
nutrição, patologia e genética têm resultado em que novas e avançadas tecnologias
as quais vem contribuir para o desenvolvimento tecnológico e consequente aumento
de lucratividade na produção de camarão (Huberman, 2000).
O descobrimento do sistema endócrino de crustáceos foi realizado por meio
de estudos sobre o papel da glândula androgênica, utilizando-se crustáceos não
decápodas (Charniaux-Cotton, 1954). Porém, a grande maioria dos estudos desse
sistema, em crustáceos, têm sido com decápodas (Fingerman, 1987). O sistema
endócrino de decápodas é formado por epitélio não neural e por epitélio neural. O
epitélio não neural apresenta estruturas endócrinas típicas, como as glândulas
androgênicas. Já o epitélio neural apresenta componentes neuroendócrinos, como a
glândula do seio (Fingerman, 1992). Os decápodas apresentam glândulas
neuroendócrinas bem definidas, que atuam como órgãos neurohemais (Fingerman,
1992). Um órgão neurohemal consiste principalmente de terminações axoniais de
células neuroendócrinas e estruturas de produção e estocagem de neurohormônios
localizadas próximas ao sistema vascular (Carlisle e Knowles, 1953).
Estudos pioneiros sobre a endocrinologia de crustáceos foram realizados por
Koller (1925; 1927). O autor demonstrou que mudanças de coloração do camarão
Crangon crangon eram realizadas por substâncias circulantes do tecido hemal.
Utilizando o camarão de água doce Palaemonetes vulgaris, Perkins (1928)
determinou que o pedúnculo ocular é a fonte de substâncias de concentração de
pigmento. Atualmente, essas substâncias foram reconhecidas como sendo de
natureza hormonal (Fingerman, 1992). Hanström (1933) estudando o sistema
nervoso central de crustáceos descreveu a glândula do seio. Em estudos posteriores
observou-se que este órgão é o local de estocagem de hormônios
cromatoforotrópico (Hanström, 1933). Já a natureza neurohemal da glândula do seio
foi demonstrada por Bliss (1951) e Passano (1951). Estudos subseqüentes
realizados por vários autores revelaram que o complexo neurohemal da glândula do
seio é o maior centro neuroendócrino dos crustáceos (Fingerman, 1992).
O controle endócrino da reprodução tem sido investigado em vários
crustáceos (Fingerman, 1987). Entretanto, a manipulação hormonal para a
reprodução de camarões está limitada à ablação do pedúnculo ocular para a
indução do desenvolvimento ovariano e da ovoposição. Isso se deve ao fato de que
a função individual e a grande diversidade dos hormônios que envolvem a
reprodução de camarão, ainda não foi suficientemente elucidada (Okumura, 2004).
O progresso para o desenvolvimento de novas tecnologias da manipulação
hormonal depende do entendimento da endocrinologia dos camarões (Okumura,
2004).
O complexo órgão X/glândula do seio é o centro produtor do hormônio inibidor
da gônada (HIG) em fêmeas de decápodas. Este complexo é encontrado na região
do pedúnculo ocular e após a sua extirpação observa-se o desenvolvimento precoce
das gônadas (Fingerman, 1987). Esse complexo foi primeiramente demonstrado
para Palaemon serratus por Panouse (1943, 1944) e confirmado em muitos outros
decápodas (Quackenbush e Hernkind, 1981; Chim et al., 1983; Anilkumar e Adiyodi,
1985). O hormônio (HIG) não é nem sexo-específico e nem espécie-específico
(Fingerman, 1987).
Outro neurohôrmonio que influencia a atividade reprodutiva dos crustáceos é
o hormônio estimulador da gônada (HEG) que aumenta a atividade reprodutiva das
fêmeas (Fingerman, 1987; 1992). Este é produzido pelo órgão Y, uma glândula
localizada no segmento maxilar, sendo formado por apenas um tipo celular com
característica de secreção de esteróides (Fingerman, 1992). Os esteróides são
sintetizados a partir do colesterol (Lehninger, 1995). Entretanto os crustáceos não
sintetizam colesterol, e sua fonte se dá por meio da dieta. Kanazawa e Teshima
(1971) demonstraram que o camarão Penaeus japonicus é capaz de produzir
esteróides a partir do colesterol sintetizado no próprio organismo, sugerindo que
deva ocorrer biossíntese funcional de colesterol em alguns crustáceos.
O efeito dos hormônios de vertebrados na reprodução dos crustáceos vem
sendo cada vez mais estudado (Fingerman, 1987). O controle hormonal da síntese
de vitelogenina e a maturação ovocitária já foram bem descritos em vertebrados
ovíparos (Tata e Smith, 1979; Wallace e Selman, 1981). Em decápodas, a
maturação gonadal de fêmeas é influenciada por fatores hormonais e neurais
(Subramoniam, 2000). Estes fatores incluem hormônios de neuropeptídeos, como o
hormônio estimulador do desenvolvimento da gônada e o hormônio inibidor da
vitelogenina, que determinam efeitos agonísticos e antagonísticos, respectivamente,
durante a vitelogênese (Warrier et al., 2001).
Vários hormônios esteróides de vertebrados têm sido encontrados no
hepatopâncreas, ovário e hemolinfa de várias espécies de crustáceos (Couch et al.,
1987; Van Beek e De Loof, 1988; Fairs et al., 1989; Quinitio et al., 1991). Porém, a
função biológica desses hormônios ainda não foi totalmente esclarecida, embora sua
presença em fluídos biológicos e no ovário tenha sido documentada (Couch et al.,
1987; Jeng et al., 1978; Fairs et al., 1989). No camarão de água doce
Macrobrachium rosenbergii, o estradiol induz a biossíntese do 17β-hidroxiesteróide
dehidrogenase, sendo esta a principal enzima envolvida no metabolismo de
esteróide. Estudos também indicaram a capacidade de resposta do ovário à adição
exógena da 17β-progesterona e 17β-estradiol (Yano, 1987). No camarão Penaeus
monodon, tanto os níveis de vitelogenina sérica quanto os níveis de 17β-estradiol e
progesterona na hemolinfa não diferiram quantitativamente durante os diferentes
estágios de maturação ovariana (Quinitio et al., 1994).
Dentre os vários hormônios responsáveis pela ovogênese e vitelogênese,
podem-se destacar os esteróides, como a progesterona e o estradiol, encontrados
nos ovários, hepatopâncreas e hemolinfa dos crustáceos (Couch et al., 1987; Van
Beek e De Loof, 1988; Fairs et al., 1989; Quinitio et al., 1991). Estudos realizados
por Yano e Itakura (1998) descreveram a síntese de vitelogenina "in vitro" em
ovários incubados com 17β-estradiol. Em Penaeus monodon, amostras de hemolinfa
nos diferentes estágios de maturação ovariana demonstraram oscilações nos níveis
séricos de vitelogenina juntamente com os níveis de estradiol e progesterona
(Quinitio et al., 1994).
Trabalhos indicaram que os esteróides apresentam osciliações em seus
níveis de acordo com os estágios de maturação dos ovócitos e, consequentemente,
dos ovários (Couch et al., 1987; Quinitio et al., 1994). Em fêmeas de Scylla serrata
foi encontrado grande aumento de estradiol durante o estágio de vitelogênese nos
ovários e no hepatopâncreas (Warrier et al., 2001). Quando a síntese de
vitelogenina alcançou o seu pico, o hepatopâncreas apresentou concentração
máxima de estradiol. Estudos anteriores têm reportado a habilidade do estradiol em
estimular enzimas de lipogênese e de transporte de íons no camarão de água doce
Macrobrachium rosenbergii (Gosh e Ray, 1993). Embora haja discordância quanto
ao local de síntese de vitelogenina em crustáceos, Rani e Subramoniam (1997)
demonstraram que o hepatopâncreas de Scylla serrata é o local principal de síntese
de vitelogenina. Esses autores demonstraram que o hepatopâncreas apresenta o
máximo da capacidade de síntese de vitelogenina no estágio I da vitelogênese.
Warrier et al. (2001) estudando a mesma espécie, sugeriram que o alto nível de
estradiol encontrado no hepatopâncreas está relacionado com os processos
vitelogênicos e, assim como nos vertebrados, participa da regulação da síntese de
vitelogenina.
Na espécie Crassotrea gigas, foi demonstrado que a vitelogênese é
controlada pelo 17β-estradiol (Li et al., 1998). O estradiol também induz o aumento
do crescimento de ovócitos em peixes (Takanashi e Kanatani, 1981). Em
crustáceos, assim como em vertebrados, a vitelogênese parece estar sob a
influência de vários hormônios (Warrier et al., 2001). O 17β-estradiol pode funcionar
como parte do sistema multihormonal, por meio da ativação da síntese de
vitelogenina e da ativação também de outros caminhos metabólicos. Adicionalmente,
o estradiol também pode ter efeito cumulativo com outros hormônios influenciando a
vitelogênese.
A regulação da vitelogênese também ocorre quando os neuropeptídeos, os
ecdisteróides e os esteróides de vertebrados são ativados em diferentes estágios da
vitelogênese (Warrier et al., 2001). Altos índices de progesterona também foram
observados em animais no estágio de vitelogênese em Scylla serrata (Warrier et al.,
2001). Entretanto, em contraste ao caminho do estradiol, o maior nível de
progesterona foi encontrado no ovário e na hemolinfa, os quais eram muito maiores
que as concentrações de estradiol. Estas observações sugerem a possibilidade de
que o hepatopâncreas possa ser o local de biossíntese do hormônio progesterona, o
qual poderia ser transportado através da hemolinfa para o ovário (Warrier et al.,
2001).
Estudos anteriores tinham demonstrado que a progesterona estimula a
maturação ovariana no camarão Parapanaeopss hardwickii (Kulkarni et al., 1979) e
que a 17α-progesterona facilita a liberação de vitelogenina na hemolinfa de Penaeus
japonicus (Yano, 1987). Assim, como nos vertebrados, a progesterona ovariana no
Scylla serrata possivelmente proporcione a estimulação da maturação ovocitária
possivelmente pelo desencadeamento do rompimento da vesícula germinativa
(Warrier et al., 2001). Durante o pico de vitelogênese, o hepatopâncreas apresentou
a maior concentração de estradiol, enquanto o ovário mostrou o nível máximo de
progesterona em Scylla serrata. Isso pode indicar duas possibilidades, onde o
estradiol e a progesterona possam apresentar diferentes locais de origem ou esses
hormônios são sintetizados no mesmo tecido (hepatopâcreas) e posteriormente
transportados para o ovário pela hemolinfa (Warrier et al., 2001).
MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Fêmeas de Macrobrachium amazonicum foram capturadas nos viveiros de
reprodutores existentes no setor de Carcinicultura do Centro de Aqüicultura da
UNESP, Campus de Jaboticabal. Os viveiros mostravam parâmetros da qualidade
de água adequados para o cultivo dos animais. A temperatura permaneceu em 28,5
± 0,5 ºC, o nívei de oxigênio determinado foi de 6,5 ± 0,5 mg/L com saturação
equivalente a 80 ± 0,5 %, e o pH estava em faixas medias de 8,2 ± 0,1. Referente ao
nível de compostos nitrogenados obteve-se média de 2,5 ± 1,5 mg/L para amônia e
15 ± 1,0 mg/L de nitrito.
As fêmeas capturadas foram separadas em diferentes grupos de acordo com
os estágios de maturação ovariana. Para tanto realizaram-se observações
macroscópicas do ovário, seguindo os métodos de Chang e Shih (1995), adaptados
para Macrobrachium amazonicum. Para o desenvolvimento da tese foram utilizados
um total de 150 exemplares de fêmeas.
Índice Gonadossomático (IGS) e Índice Hepatossomático (IHS)
No momento das coletas, os animais foram individualmente pesados e
posteriormente mortos por choque térmico. Coletaram-se os ovários e o
hepatopâncreas. A determinação dos IGS e IHS foi realizada com base na seguinte
relação:
Análises em microscopias de luz e eletrônica
Para as realizações das análises em microscopias de luz e eletrônica de
transmissão das células ovarianas e hepatopancreáticas, utilizaram-se 15 animais
em diferentes estágios de maturação gonadal. Destes, 10 animais foram destinados
IHS ou IGS (%)
Peso do órgão
Peso do corpo
X
100
=
às análises em microscopia de luz e 5 para análises em microscopia eletrônica. Para
tanto, as fêmeas capturadas foram mortas por choque térmico e posteriormente
dissecadas.
Os ovários e hepatopâncreas, utilizados para as análises em microscopia de
luz foram individualmente coletados e fixados em solução de Karnovsky (1965)
durante 24 horas. Após esse período o material recebeu banhos de tampão fosfato e
posteriormente de álcool 70%, sendo mantido neste meio até sua inclusão em
historesina. Depois das rotinas de inclusão, obteveram-se cortes de 2 µm que foram
corados com Hematoxilina e Eosina e solução de Azul de toluidina. Análises e
fotodocumentação foram realizadas em fotomicroscópio Olympus B Max-50. O
processamento do material em historesina e sua análise foram feitas no Laboratório
de Morfologia de Organismos Aquáticos da Faculdade de Ciências da
UNESP/Bauru.
Os materiais obtidos para as análises ultraestruturais das células ovarianas e
hepatopancreáticas foram individualmente coletados e cortados em fragmentos de
aproximadamente 1mm de aresta. Os fragmentos foram fixados em solução de
Karnovsky (1965) durante 12 horas. Posteriormente os materiais foram pós fixados,
por 12 horas, em solução de tetróxido de ósmio a 2% em tampão fosfato (0,1M e pH
7,3) e após esse período ocorreu nova troca de tampão fosfato e o material
permaneceu por mais 2 horas. Seguindo as técnicas preconizadas para microscopia
eletrônica de transmissão, o material tissular foi desidratado em banhos gradativos
de Acetona (50%, 70%, 90% e 100%). A seguir passou pelo processo de infiltração
em solução 1:1 de araldite e acetona e pré-inclusão em solução de araldite. Ambos
os procedimentos foram executados em estufa a 37ºC, durante 1 hora. A inclusão se
fez em solução nova de araldite mantida em estufa a 58ºC, durante 48 horas.
Para a determinação dos campos de estudo fizeram-se cortes de 0,5µm
corados com Azul de toluidina obtidos com o uso de micrótomo equipado com
navalha de vidro. Cabe destacar que os cortes semi finos assim como os campos
foram observados em microscopia de luz. Após escolha dos campos, obtiveram-se
cortes ultrafinos (50 a 70nm) do material feitos em ultramicrótomo Ultratome III, LKB
equipado com navalha de diamante. Os cortes ultrafinos foram distendidos com
vapor de xilol, coletados em telas de cobre sem filme de suporte e contrastados
duas vezes. A primeira contrastação ocorreu no escuro durante 20 minutos com o
uso de acetato de uranila em solução de álcool 50%. Posteriormente os cortes foram
lavados em álcool 50% e novamente contrastados com citrato de chumbo durante
10 minutos, seguida de várias lavagens em água destilada (Reynolds, 1963). Os
cortes foram levados ao microscópio de transmissão Philips EM 301 e fotografados
com filme preto e branco de 35 mm. O processamento e a análise dos materiais
foram realizados no Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biociências da
UNESP /Botucatu.
Caracterização hormonal:
Para a determinação do perfil hormonal utilizaram-se 15 fêmeas para cada
estágio de maturação gonadal perfazendo um total de 75 animais. Todos os
materiais coletados ou seja, hemolinfa, hepatopâncreas e ovários, foram utilizados
para a extração e quantificação de esteróides.
Após choque térmico, com auxílio de seringa e agulha rinsadas em EDTA,
coletou-se hemolinfa, na região da cavidade pericárdica, que foi transferida para
ependorfes. Coletaram-se os ovários e o hepatopâncreas que individualmente foram
também acondicionados em ependorfes. Em seguida, os ependorfes devidamente
identificados foram acondicionados em galões de nitrogênio líquido até o término de
cada coleta. Posteriormente, estes ependorfes foram transferidos para Freezer a -
70ºC no qual permaneceram até processamento.
Todo o material coletado para a extração de esteróides foi adequadamente
embalado, identificado e enviado para o Laboratório de Fisiologia do Departamento
de Zootecnia da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro – Portugal, onde
foram processados. Após ser entregue ao Laboratório de Fisiologia avaliaram-se as
condições dos materiais que foram imediatamente rearmazenado em freezeres a -
80ºC, permanecendo até as análises.
Para a realização das técnicas de extração hormonal os ependorfes foram
retirados dos Freezeres, por alguns minutos, e tanto as amostras tissulares dos
ovários como as de hepatopâncreas foram homogeneizadas no interior dos seus
respectivos ependorfes. Retirou-se uma pequena amostra de cada material que,
após ser pesada, foi acondicionada em tubos de centrífuga. A hemolinfa, com o uso
de micropipetas, foi quantificada e transferida para outro ependorfe.
Extração de Esteróides:
Para a extração de esteróides, os tubos de centrífuga receberam 3 mL de éter
etílico e foram levados ao vortex por 30 segundos visando homogeneização do
material. Posteriormente os tubos foram transferidos para centrífugas de alta
rotatividade sendo mantidos a 4000 rpm durante 5 minutos. Estes tubos foram
acondicionados em Freezer a -70ºC permitindo a separação das fases orgânica e
inorgânica, a partir do congelamento da fase inorgânica (líquida). Desta forma, a
fase orgânica (não congelada) foi transferida para um outro tubo. Esse tubo foi
acondicionado em decantador sob fluxo de azoto a 35ºC para secagem do material.
Estes procedimentos foram repetidos mais de três vezes. Após isso, os tubos secos
foram tampados e mantido em Freezer a -20ºC.
Determinação de Esteróides por Radio Imuno-Ensaio (RIA):
Os tubos secos contendo os extratos de hemolinfa, ovário e hepatopâncreas
foram utilizados para se estimar a presença de estradiol, testosterona e 17β
progesterona imuno-reativos. Os “kits” hormonais continham os reagentes e tubos
apropridos para a leitura de absorbância do material. As técnicas utilizadas para a
leitura estiveram de acordo com o protocolo de Oreczyk et al. (1974).
Assim, para a ressuspenção do material adicionaram-se nos tubos secos,
provindos da extração hormonal, tampão gelatina (GPBS) (tampão fosfato de sódio
0,1M e pH 7.2, contendo 0,15M de NaCl e 0,1% de gelatina) e metanol. Os tubos
foram agitados em vortex e, de acordo com as especificações de cada “kit”,
pequenas porções do material foram tranferidas para os tubos de leitura. Adicionou-
se aos tubos o material radioativo e então, os tubos para a leitura de estradiol e
progesterona foram incubados em temperatura ambiente por 3 horas. Já os tubos
para leitura de testosterona foram incubados em banho maria a 40ºC. Desta forma,
com emprego de um leitor de raios gama LKB Wallac acoplado a um computador
dotado de “software” próprio, obteveram-se as curvas padrão individuais para cada
hormônio dando-se início a leitura do material. Ressata-se que os resultados foram
expressados em função do peso inicial das amostras depositadas nos tubos. Os
dados obtidos foram calculados e as unidades das amostras foram padronizadas.
Destaca-se que a leitura do material ocorreu nas dependências da Escola Técnica
Agronômica da cidade de Bragança – Portugal. Para análise e conformação final dos
dados aplicou-se o teste “t” de Tukey e utilizou-se o programa “Statistical Analyses
System (SAS) Versão 9.1 for Windows (USA)”.
RESULTADOS
Valores dos Índices gonadossomático e hepatossomático
Os pesos relativos dos ovários e do hepatopâncreas nos diferentes estágios
de maturação foram calculados como porcentagens do peso total do corpo dos
animais, determinando-se o índice gonadossomático (IGS) e o índice
hepatossomático (IHS), respectivamente (Tabela 1). Fêmeas de Macrobrachium
amazonicum com ovários em estágio final de maturação, em estágio V,
apresentaram os maiores IGS quando comparadas às fêmeas em estágio I, II, III e
IV (p<0,01) (Tabela 1). Os IHS das fêmeas de Macrobrachium amazonicum não
apresentaram diferença significativa entre os estágios II, III e IV de maturação
gonadal. O mesmo ocorre entre os estágios I e V. Assim, fêmeas em estágios II, III e
IV de maturação ovariana apresentaram os maiores IHS quando comparados aos
IHS de fêmeas em estágio I e V (p<0,01) (Tabela 1).
Tabela 1. Determinação percentual dos índices gonadossomático (IGS) e
hepatossomático (IHS) de fêmeas de Macrobrachium amazonicum nos diferentes
estágios de maturação ovariana.
Estágios de maturação
Índices
I II III IV V
IGS
0,51 ± 0,07 D 0,67 ± 0,07 D 1,92 ± 0,68 C 4,85 ± 0,71 B 9,05 ± 0,65 A
IHS
2,63 ± 0,84 B 3,71 ± 0,69 A 4,33 ± 0,67 A 3,63 ± 0,58 A 2,41 ± 0,72 B
Médias na mesma linha seguidas de letras iguais não diferem entre si (p<0,01).
Estrutura ovariana
Estudos macroscópicos e microscópicos dos ovários de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum permitiram a determinação de cinco estágios de
maturação gonadal. Esses estágios são classificados como I, II, III, IV e V (Fig. 1).
Dentre esses estágios observam-se diferentes tipos celulares, que são denominados
de ovogônia, ovócito pré-vitelogênico, ovócito em vitelogênese inicial, ovócito em
vitelogênese avançada e ovócito maduro. Em Macrobrachium amazonicum, a
distribuição desses diferentes tipos celulares nos ovários varia dependendo do grau
de maturação em que essas células se encontram. Desta forma, as células mais
jovens são comumente observadas na região central e as células maduras na
periferia do órgão (Fig. 2).
No estágio I de maturação ovariana, os ovários são pequenos, incolores e
apresentam consistência gelatinosa. O ovários são pares, fusionados na região
cranial, estão localizados no cefalotórax sobre o hepatopâncreas, e não são visíveis
através da carapaça por transparência. Neste estágio ovariano observa-se a zona
proliferativa na região central do órgão, onde se encontram as ovogônias. Estas
células apresentam citoplasma pouco evidente e núcleo esférico com grande
acúmulo de granulações e nucléolo evidente. Observam-se ainda ovogônias em
divisão celular (Fig. 3). As observações ultraestruturais revelam que o núcleo das
ovogônias possui cromatina dispersa, e o citoplasma apresenta mitocôndrias e
acúmulo de material elétron-denso disposto próximo à membrana nuclear (Fig. 4).
Os ovários em estágio II de maturação apresentam coloração esbranquiçada.
Nesse estágio observam-se aumentos no tamanho e no volume do ovário, e sua
visualização ainda é difícil por transparência através da carapaça. Nesta fase de
maturação ovariana encontram-se principalmente os ovócitos pré-vitelogênicos
próximos à região central do ovário. Estas células apresentam formato poliédrico
com citoplasma basófilo, e núcleo com granulações discretas e presença de um a
dois nucléolos (Fig. 5). Esse tipo celular está localizado próximo às ovogônias e
pode ser também encontrado no estágio I de maturação ovariana.
Ultraestruturalmente, os ovócitos pré-vitelogênicos apresentam concentração
de organelas na região perinuclear (Fig. 6), enquanto na região periférica do
citoplasma esse acúmulo se torna menos comum. O núcleo dessas células é
excêntrico, grande e oval. Os nucléolos estão próximos à membrana nuclear e são
compostos por uma massa de grânulos fibrilares grande e densa (Fig. 6). No
nucleoplasma pode ser observado também grande quantidade de material fibrilar
disperso (Fig. 7). O envelope nuclear apresenta numerosos poros (Fig. 6 e Fig. 8).
Ainda na região perinuclear podem-se observar nuages formadas por material
granuloso e fibrilar (Fig. 9). A maioria das organelas observada no citoplasma
apresenta aspecto membranoso (Fig. 8). O retículo endoplasmático está formado
por expansões finas e longas da membrana externa do núcleo e contínuo à cisterna
perinuclear. Tanto o envelope nuclear quanto o retículo endoplasmático não
apresentam ribossomos aderidos à sua membrana (Fig. 7). Observam-se ainda os
dictiossomos (Fig. 8), que são vesículas formadas por membrana, e vários corpos
multivesiculares (Fig. 9) localizados na região perinuclear.
No estágio III de maturação ovariana, os ovários apresentam coloração
esverdeada e cromatóforos em sua região dorsal. Esses órgãos são túrgidos e
encontram-se apoiados na parte posterior do estômago. Neste estágio de maturação
é possível a visualização do ovário por transparência através da carapaça. Ovócitos
em vitelogênese inicial são frequentemente observados e exibem citoplasma com
basofilia menos acentuada, aumento do volume celular e presença de vesículas
incolores (Fig. 10), e o núcleo possui de um a dois nucléolos evidentes. No início da
fase de vitelogênese inicial as vesículas incolores estão dispersas no citoplasma, e
em seguida se organizam e formam as vesículas corticais dispersas na periferia do
citoplasma deste ovócito (Fig. 11). Estas vesículas incolores caracterizam os
ovócitos em vitelogênese inicial. Nessa fase de maturação celular os ovócitos
apresentam-se envoltos por células foliculares (Fig. 10). Essas células foliculares
apresentam núcleo central e citoplasma evidente com discreta basofilia (Fig. 11). A
ultraestrutura dos ovócitos em vitelogênese inicial evidencia o retículo
endoplasmático rugoso em formato vesicular contendo matriz fibrilar granulosa (Fig.
12). Essas vesículas localizam-se na região cortical do citoplasma (Fig. 13), assim
como, mitocôndrias (Fig. 14) e gotas lipídicas.
No estágio IV de maturação ovariana os ovários apresentam-se túrgidos,
volumosos e de coloração esverdeada mais intensa quando comparada ao estágio
III. Os ovários ocupam grande parte da cavidade do celoma ao nivel do cefalotórax e
são facilmente observados por transparência através da carapaça. Nesse estágio os
ovários ultrapassam os dentes epigástricos do rostro (Fig. 1) e recobrem mais da
metade do estômago. Ainda nesse estágio observam-se principalmente os ovócitos
em vitelogênese avançada (Fig. 15). Estas células apresentam núcleo basófilo e
citoplasma acidófilo contendo vesículas incolores e vesículas vitelínicas (Fig. 15). Os
ovócitos em vitelogênese avançada são caracterizados, sob microscopia de luz, pela
presença de vesículas vitelínicas na região central do citoplasma. Essas vesículas
apresentam-se arredondadas e exibem diferentes intensidades de acidofilia, isto é,
exibem conteúdo claro e escuro (Fig. 15). Os ovócitos em vitelogênese avançada
apresentam envoltório folicular composto por células mais achatadas que as
observadas ao redor dos ovócitos em vitelogênese inicial. As células foliculares que
envolvem os ovócitos em vitelogênese avançada apresentam, ainda, núcleo
alongado e citoplasma basófilo (Fig. 16).
A ultraestrutura dos ovócitos em vitelogênese avançada evidencia núcleo com
um a dois nucléolos grandes localizados na região perinuclear. O citoplasma
apresenta abundância de retículo endoplasmático rugoso com aspecto vesicular
contendo material fibrilar (Fig. 17), e mitocôndrias com cristas de formato alongado.
Observa-se ainda que as vesículas de retículo endoplasmático se fundem
freqüentemente formando vesículas maiores (Fig. 17). As vesículas de retículo
endoplasmático fundidas estão preenchidas por material com diferentes elétron-
densidades (Fig. 18).
No estágio V de maturação ovariana, os ovários são mais volumosos e
túrgidos, e de coloração verde intenso. Estes órgãos preenchem toda a cavidade
cefalotorácica e se estendem da região entre os olhos pedunculados até o primeiro
segmento abdominal, sendo facilmente observado por transparência através da
carapaça (Fig. 1). A cápsula ovariana é muito tênue e rompe-se com leve
compressão. A zona germinativa aparece em pontos dispersos da gônada, sendo
comprimida pelos ovócitos maduros. O citoplasma dos ovócitos maduros é acidófilo
e apresenta vesículas lipídicas e vitelínicas distribuídas por todo o citoplasma (Fig.
19). O aumento destas vesículas vitelínicas desloca algumas vesículas lipídicas para
a periferia celular (Fig. 20). Nesta fase as células foliculares se restringem a um
cordão de células pavimentosas pouco evidentes e com núcleos achatados (Fig. 20).
Entre o ovócito maduro e as células foliculares, evidencia-se uma fina camada
basófila definida como córion (Fig. 20).
A ultraestrutura do citoplasma dos ovócitos maduros evidencia vesículas de
vitelo em maturação e maduras (Fig. 21), além de retículo endoplasmático liso com
grande quantidade de material elétron-denso no interior (Fig. 21). Ainda no
citoplasma, observam-se túbulos concêntricos de retículo endoplasmático liso que
não apresentam material elétron-denso em seu interior (Fig. 21). A superfície do
ovócito maduro apresenta microvilosidades (Fig. 22). Observa-se ainda a deposição
de material elétron-denso no espaço entre as microvilosidades (Fig. 22) e os
prolongamentos das células foliculares (Fig. 22 e Fig. 23). Nessa região elétron-
densa forma-se uma camada amorfa e espessa, denominada de córion. O córion é
resultado da deposição de material na superfície externa da membrana plasmática
do ovócito maduro onde permanecem as microvilosidades dessa célula (Fig. 24 e
Fig. 25). Nota-se que a membrana plasmática da célula folicular perde seus
prolongamentos tornando-se regular no momento em que o córion é estabelecido
(Fig. 25).
Estrutura do hepatopâncreas
O hepatopâncreas de Macrobrachium amazonicum é um órgão maciço,
friável, de coloração amarelo-acastanhada, e está revestido por uma cápsula de
tecido conjuntivo. Este órgão ocupa grande parte da cavidade cefalotorácica e está
organizado em lobos direito e esquerdo. Cada lobo é constituído por uma série de
túbulos secretores ou lóbulos hepatopancreáticos que se iniciam em fundo cego,
cujos lúmens correm em direção à abertura do hepatopâncreas no estômago,
denominada túbulo principal. Cada túbulo secretor está revestido por epitélio
pseudo-estratificado que se apóia na membrana basal respectiva (Fig. 26). Dois
túbulos secretores adjacentes apresentam entre si discreto tecido conjuntivo frouxo
com células mioepiteliais, que delimitam o espaço hemolinfático por onde corre
hemolinfa (Fig. 26). Cada túbulo pode ser diferenciado em três regiões: proximal
(próxima do túbulo principal), média e distal (região do fundo cego) (Fig. 27). O
epitélio dos túbulos hepatopancreáticos consiste de cinco tipos celulares, sendo
eles, célula E (indiferenciada), célula F (fibrilar), células B (vesicular), célula R
(reabsortiva) e célula M (basal).
À microscopia de luz as células E são cúbicas e apresentam citoplasma
basófilo, núcleo arredondado e proeminente, com vários nucléolos (Fig. 28). Esse
tipo celular apresenta região livre com borda em escova (Fig. 29) e está localizado
na região distal do túbulo hepatopancreático. Por se tratar de uma célula
indiferenciada, é frequente a observação de divisão mitótica para renovação do
epitélio tubular (Fig. 28). Essas células E quando analisadas sob aspecto
ultraestrutural, apresentam núcleo grande que ocupa a maior parte do volume
citoplasmático (Fig. 30). A cromatina nuclear é granulosa havendo núcleolos bem
evidentes (Fig. 31). O citoplasma apresenta retículo endoplasmático rugoso (Fig.
32), retículo endoplasmático liso e mitocôndrias (Fig. 33).
Outro tipo celular observado são as células F, que se apresentam cilíndricas e
com região conspícua de borda em escova (Fig. 34) núcleo da célula F é grande e
arredondado, e o citoplasma apresenta intensa basofilia quando comparado aos dos
demais tipos celulares (Fig. 34). Células F podem ser encontradas em toda a
extensão do túbulo hepatopancreático, sendo mais facilmente observadas próximas
às células E. Ultraestruturalmente as células F apresentam microvilos no ápice
celular (Fig. 35). Na região apical do citoplasma observam-se pequenos vacúolos
com diferentes elétron-densidades e logo abaixo grandes vacúolos supranucleares
(Fig. 35). O citoplasma apresenta retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias e
proeminente complexo de Golgi (Fig. 36). O núcleo está localizado próximo à região
basal da célula e mostra contorno irregular e contém cromatina granulosa (Fig. 37).
Os túbulos hepatopancreáticos apresentam ainda célula do tipo B que exibem
formato globular com núcleo basal achatado (Fig. 38). Seu citoplasma apresenta
vários vacúolos apicais pinocíticos e um grande vacúolo subapical que ocupa a
maior parte do citoplasma (Fig. 38). As células B são abundantes na região distal e
média dos túbulos, diminuindo sua freqüência à medida que o túbulo secretor se
aproxima do túbulo principal, ou seja, na região proximal. Ultraestruturalmente as
células B apresentam um grande vacúolo envolto por uma fina camada de
citoplasma. O núcleo está restrito à região basal da célula e apresenta cromatina
granulosa e nucléolos evidentes (Fig. 39). Na região apical do citoplasma das
células B observam-se numerosas vesículas pinocíticas (Fig. 40). Próximo a estas
vesículas pinocíticas evidenciam-se grandes vacúolos supranucleares (Fig. 40). O
citoplasma apresenta retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias e complexo de
Golgi (Fig. 41). As células B liberam vesículas juntamente com parte do citoplasma
apical para o lúmen do ducto hepatopancreático (Fig. 42).
As células R observadas no hepatopâncreas são cilíndricas e apresentam
uma conspícua região livre com borda em escova (Fig. 43). Essas células
apresentam núcleo arredondado predominantemente basal (Fig. 43 e Fig. 44). O
citoplasma das células R apresenta vacúolos subapicais característicos (Fig. 43).
Esse tipo celular é o mais numeroso e está localizado nas regiões proximal e média
dos túbulos hepatopancreáticos. A ultraestrutura das células R revela numerosos
microvilos no ápice celular mostrando características de célula absortiva (Fig. 44). O
núcleo está localizado na região basal e exibe tamanho menor e cromatina menos
granulosa quando comparado aos núcleos dos demais tipos celulares (Fig. 45). Com
referência ao núcleo, observa-se que os nucléolos presentes ocupam a região
perinuclear (Fig. 45). O citoplasma apresenta retículo endoplasmático liso
freqüentemente observado na região basal da célula (Fig. 45), mas também pode
ser ocasionalmente visualizado no ápice celular (Fig. 46). Esse tipo celular
apresenta ainda retículo endoplasmático rugoso, ribossomos livres e numerosas
mitocôndrias localizadas principalmente na região apical do citoplasma (Fig. 46). O
complexo de Golgi apresenta cisternas achatadas e pode ser visualizado nas
regiões média e basal da célula R.
As células M apresentam formato triangular com ápice arredondado (Fig. 47).
Seu núcleo é basal e arredondado com vários nucléolos, e o citoplasma apresenta
intensa basofilia (Fig. 47). Essa célula apresenta-se apoiada na membrana basal e
seu ápice não alcança o lúmen do túbulo hepatopancreático, e não apresenta
portanto região livre com borda em escova (Fig. 47). Estudos ultraestruturais
revelaram que as células M apresentam núcleo arredondado com contorno irregular
ocupando quase todo o volume celular. A cromatina nuclear apresenta grandes
grumos localizados próximos à região da carioteca e há nucléolo evidente (Fig. 48).
Outro padrão nuclear observado nas células M evidencia núcleo alongado, com
contorno regular, sendo deslocado do centro celular (Fig. 49). Nas células onde o
núcleo encontra-se deslocado para a periferia celular verifica -se a presença de uma
vesícula grande e pouco elétron-densa (Fig. 49). No citoplasma das células M
observam-se retículo endoplasmático, ribossomos livres e mitocôndrias (Fig. 49).
Quantificação hormonal
A quantificação hormonal em fêmeas de Macrobrachium amazonicum teve o
propósito de estabelecer correlação entre os diferentes estágios de maturação
ovariana e os níveis de hormônios esteróides (estradiol, progesterona e
testosterona), presentes nos ovários, hepatopâncreas e hemolinfa. Com relação às
concentrações de estradiol nos ovários, nota-se queda progressiva no nível de
estradiol a partir do estágio I de maturação ovariana. Desde o estágio II até o estágio
IV observa-se queda acentuada diferindo dos demais estágios de maturação
ovariana (p<0,01) (Tabela 2). Quanto ao hepatopâncreas de Macrobrachium
amazonicum, o comportamento das concentrações de estradiol nos estágios I, IV e
V de maturação ovariana não apresentou diferença entre si, porém diferem dos
estágios II e III (p<0,01) (Tabela 2). A hemolinfa apresenta concentração de estradiol
crescente entre os estágios I e II de maturação gonadal. O maior valor para a
concentração de estradiol é encontrado no estágio II de maturação ovariana. A partir
do estágio II, o estradiol apresenta queda acentuada até o estágio III (p<0,01)
(Tabela 2). O estágio III apresenta concentração de estradiol diferente dos demais
estágios de maturação ovariana (p<0,01) (Tabela 2). A partir do estágio IV, esta
concentração diminui discretamente até atingir o estágio V de maturação ovariana
(Tabela 2).
Tabela 2. Níveis médios das concentrações de estradiol nos ovários (pg/g),
hepatopâncreas (pg/g) e hemolinfa (pg/mL) de fêmeas de Macrobrachium
amazonicum nos diferentes estágios de maturação ovariana.
Estágios de Órgãos
maturação
Ovário Hepatopâncreas Hemolinfa
I
1144,38 ± 120,55 A
443,99 ± 39,96 B
881,47 ± 41,77 B
II
1181,36 ± 45,89 A
619,18 ± 69,11 A
1612,37 ± 140,35A
III
548,19 ± 28,26 B
286,40 ± 24,69 C
608,39 ± 24,64 C
IV
440,74 ± 30,85 B
392,92 ± 32,72 B
453,62 ± 16,59 D
V
185,27 ± 22,40 C
465,63 ± 17,41 B
409,31 ± 31,25 D
Médias na mesma coluna seguidas de letras iguais não diferem entre si (p<0,01).
Ovários e hepatopâncreas de fêmeas de Macrobrachium amazonicum nos
diferentes estágios de maturação ovariana, apresentam características semelhantes
às concentrações de progesterona. Estas concentrações apresentam queda
progressiva de acordo com os estágios de maturação ovariana. Ressalta-se que,
entre os estágios I e III de maturação ovariana, a queda é mais acentuada quando
comparada com o intervalo entre os estágios III e V de maturação ovariana (p<0,01)
(Tabela 3). Entretanto, na hemolinfa a concentração de progesterona demonstrou
aumento (p<0,01) entre os estágios I e II de maturação, quando atinge seu valor
máximo. Entre os estágios II e III vê-se queda brusca na concentração de
progesterona (p<0,01). A partir do estágio III de maturação ovariana observa-se
queda suave na concentração de progesterona até o estágio IV, atingindo sua
menor concentração no estágio V (p<0,01) (Tabela 3).
Tabela 3. Níveis médios das concentrações de progesterona nos ovários (pg/g),
hepatopâncreas (pg/g) e hemolinfa (pg/mL) de fêmeas de Macrobrachium
amazonicum nos diferentes estágios de maturação ovariana.
Estágios de Órgãos
Maturação Ovário Hepatopâncreas Hemolinfa
I
9601,48 ± 1051,25 A 12542,70 ± 544,37 A 5340,30 ± 428,19 B
II
9108,48 ± 1110,45 A 10209,48 ± 766,72 B 8398,75 ± 609,34 A
III
4579,16 ± 439,35 B 3358,80 ± 170,52 C 3528,00 ± 261,36 C
IV
3929,44 ± 82,13 B 2326,62 ± 105,71 D 2967,29 ± 210,85 C
V
1598,98 ± 119,50 C 1371,93 ± 73,98 E 2176,25 ± 53,11 D
Médias na mesma coluna seguidas de letras iguais não diferem entre si (p<0,01).
As concentrações de testosterona, tanto nos ovários quanto no
hepatopâncreas de fêmeas de Macrobrachium amazonicum apresentam seus
maiores valores no estágio I de maturação (Tabela 4). A partir deste estágio a
concentração deste hormônio inicia queda progressiva até o estágio V de maturação
(p<0,01) (Tabela 4). Ressalta-se que apesar da concentração de testosterona ser
semelhante no estágio V de maturação ovariana para ovários e hepatopâncreas, os
valores iniciais da concentração deste hormônio são diferentes para ambos os
órgãos, estando em maior concentração no ovário (Tabela 4). Já na hemolinfa as
concentrações de testosterona aumentam entre os estágios I e II de maturação
ovariana (p<0,01). A partir do estágio II a concentração deste hormônio diminui
progressivamente no decorrer do amadurecimento ovariano (p<0,01) (Tabela4).
Tabela 4. Níveis médios das concentrações de testosterona nos ovários (pg/g),
hepatopâncreas (pg/g) e hemolinfa (pg/mL) de fêmeas de Macrobrachium
amazonicum nos diferentes estágios de maturação ovariana.
Estágios de Órgãos
Maturação Ovário Hepatopâncreas Hemolinfa
I
31565,59 ± 4640,99 A 16790,81 ± 1471,93A 11842,37 ± 69,77 B
II
22307,94 ±2515,63 B 12185,04 ±1386,03 B 24952,35 ± 894,00 A
III
10493,74 ± 1057,66 C 5928,47 ± 220,02 C 10666,68 ± 596,84 B
IV
14143,16 ± 1096,62 C 3428,44 ± 135,54 D 8405,09 ± 774,70 C
V
3461,43 ± 612,95 D 2327,80 ± 167,21 D 7686,55 ± 603,09 C
Médias na mesma coluna seguidas de letras iguais não diferem entre si (p<0,01).
Figura 1: Esquema evidenciando os estágios I a V, respectivamente, de maturação
ovariana de Macrobrachium amazonicum. Sendo as observações realizadas sob
transparência de carapaça (C). Destacam-se a localização do dente epigástrico
(DE), olhos pednculados (Cabeça de seta) e ovários (OV) em desenvolvimento. (4X)
Figura 2: Vista panorâmica do ovário de Macrobrachium amazonicum, evidenciando-
se as regiões central (C) e periférica (P) do órgão. Azul de toluidina (100X).
Figura 3. Fotomicrografia do ovário de Macrobrachium amazonicum, evidenciando
região central do ovário destacando ovogônias (cabeça de seta) que apresentam
núcleo esférico com grande acúmulo de material granular (→). Observam-se ainda
ovogônias em divisão (*). Azul de toluidina (500X).
Figura 4. Ultraestrutura de ovogônias de Macrobrachium amazonicum, evidenciando
núcleo (N) e material fibrilar (*) aderido à membrana nuclear (entre cabeça de setas).
Destaca-se a presença de mitocondrias (m) no citoplasma. (7.650X).
Figura 5: Fotomicrografia do ovário de Macrobrachium amazonicum, evidenciando
ovócitos pré-vitelogênicos de formato poliédrico citoplasma basófilo (*), núcleos
arredondados (n) e presença de 1 a 2 nucléolos (→). Azul de toluidina (500X).
Figura 6: Ultraestrutura de ovócitos pré-vitelogênicos de Macrobrachium
amazonicum evidenciando organelas na região perinuclear (*) e nucléolo (nl)
próximo a membrana nuclear (entre cabeças de setas). Destaca-se ainda a
presença de poros (→) na membrana nuclear dos ovócitos. (22.650X).
Figura 7: Ultraestrutura de ovócitos pré-vitelogênicos de Macrobrachium
amazonicum evidenciando a formação de retículo endoplasmático liso (*) a partir da
membrana externa do núcleo (cabeça de seta). Destaca-se a presença de material
fibrilar disperso no nucleoplasma dessas células (estrela). (37.350X).
Figura 8: Ultraestrutura de ovócitos pré-vitelogênicos de Macrobrachium
amazonicum evidenciando poros no envoltório nuclear (seta) e organelas com
aspecto membranoso (*). Destaca-se ainda a presença dos dictiossomas (cabeça de
seta). (42.000X).
Figura 9: Ultraestrutura de ovócitos pré-vitelogênicos de Macrobrachium
amazonicum com presença de nuages (ng) e corpos multivesiculares (→).
(42.000X).
Figura 10: Fotomicrografia do ovário de Macrobrachium amazonicum evidenciando
vesículas corticais incolores (→) na periferia celular dos ovócitos em vitelogênese
inicial envoltos por células foliculares (*). Azul de toluidina (200X).
Figura 11: Fotomicrografia do ovário de Macrobrachium amazonicum evidenciando
células foliculares envolvendo os ovócitos em vitelogênese inicial. As células
foliculares apresentam citoplasma pouco basófilo (*) e núcleo arredondado (n).
Destaca-se ainda a presença de vesículas corticais (→) na periferia do citoplasma
do ovócito em vitelogênese inicial. Azul de toluidina (500X).
Figura 12: Ultraestrutura do ovócito em vitelogênese inicial de Macrobrachium
amazonicum evidenciando retículo endoplasmático em aspecto vesicular (cabeça de
seta) contendo matriz fibrilar. (41.500X).
Figura 13: Ultraestrutura do ovócito em vitelogênese inicial de Macrobrachium
amazonicum evidenciando vesículas presentes na região cortical do citoplasma (*).
(6.500X).
Figura 14: Ultraestrutura do ovócito em vitelogênese inicial de Macrobrachium
amazonicum evidenciando mitocôndrias (m) presentes no citoplasma. (107.500X).
Figura 15: Fotomicrografia do ovário de Macrobrachium amazonicum evidenciando
ovócitos em vitelogênese avançada com vesículas lipídicas (cabeça seta) e
inclusões de vitelo na região central da célula (→). Azul de toluidina (350X).
Figura 16: Fotomicrografia do ovário de Macrobrachium amazonicum evidenciando o
envoltório folicular dos ovócitos em vitelogênese avançada. As células foliculares
apresentam citoplasma basófilo (*) e núcleos alongados (→). Azul de toluidina
(500X).
Figura 17: Ultraestrutura do ovócito em vitelogênese inicial de Macrobrachium
amazonicum evidenciando fusão das vesículas formadas por retículo
endoplasmático rugoso (cabeça de seta) contendo material fibrilar (*). (62.000X).
Figura 18: Ultraestrutura do ovócito em vitelogênese inicial de Macrobrachium
amazonicum evidenciando vesículas de vitelo com diferentes elétrondensidade.
(3.800X).
Figura 19: Fotomicrografia do ovário de Macrobrachium amazonicum evidenciando
ovócitos maduros com vesículas lipídicas (→) e inclusões vitelínicas (*). Azul de
toluidina (150X).
Figura 20: Fotomicrografia do ovário de Macrobrachium amazonicum evidenciando
camada de alvéolo cortical (*) dos ovócitos maduros. Observa-se ainda células
foliculares (seta) e córion (entre cabeças de setas). Azul de toluidina (300X).
Figura 21: Ultraestrutura de ovócito maduro de Macrobrachium amazonicum
evidenciando retículo endoplasmático contendo material elétron-denso (estrela),
vesículas de vitelo em maturação (→) e maduras (*). (4.900X).
Figura 22; Ultraestrutura de ovócito maduro de Macrobrachium amazonicum
evidenciando local de microvilosidades entre o ovócito (cabeças de setas) e as
células foliculares (→). (42.000X).
Figura 23: Ultraestrutura de ovócito maduro de Macrobrachium amazonicum
evidenciando formação do córion (*). (22.500X).
Figura 24: Ultraestrutura de ovócito maduro de Macrobrachium amazonicum
evidenciando o córion ( } ). Destaca-se as microvilosidades da membrana do ovócito
maduro (entre cabeças de setas). (7.750X).
Figura 25: Ultraestrutura de ovócito maduro de Macrobrachium amazonicum
evidenciando a membrana plasmática (entre cabeças de setas) da célula folicular
(CF) sem interdigitações. (42.000X).
Figura 26: Fotomicrografia do hepatopâncreas de Macrobrachium amazonicum,
evidenciando túbulo secretor revestido por epitélio pseudo-estratificado ({) se
apoiando à membrana basal (→) e espaço hemolinfático (*). Azul de toluidina
(100X).
Figura 27: Fotomicrografia do hepatopâncreas de Macrobrachium amazonicum,
observando-se a região proximal (P), média (M) e distal (D) dos túbulos secretores.
Azul de toluidina (100X).
Figura 28: Fotomicrografia do hepatopâncreas de fêmeas de Macrobrachium
amazonicum, mostrando núcleos arredondados das células E (→). Observa-se ainda
célula E em metáfase (cabeça de seta). Azul de toluidina (400X).
Figura 29: Fotomicrografia do hepatopâncreas de Macrobrachium amazonicum,
destacando a região distal do túbulo hepatopancreático com células E (estrela).
Destaca-se a região de borda em escova presentes neste tipo celular (cabeça de
seta). Azul de toluidina (200X).
Figura 30: Ultraestrutura da célula E, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se o núcleo (N) e citoplasma (C).
(3.160X).
Figura 31: Ultraestrutura da célula E, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se cromatina nuclear (*) e nucléolos
(cabeças de setas). (3.280X).
Figura 32: Ultraestrutura da célula E, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se a presença de retículo endoplasmático
rugoso (*) no citoplasma. (57.500X).
Figura 33: Ultraestrutura da célula E, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se a presença de retículo endoplasmático
liso (cabeça de seta) e mitocôndrias (m) no citoplasma. (47.900X).
Figura 34: Fotomicrografia do hepatopâncreas de Macrobrachium amazonicum,
evidenciando células F com núcleo arredondado (cabeça de seta), citoplasma
basófilo (*) e a presença de região de borda em escova (estrela). Azul de toluidina
(1000X).
Figura 35: Ultraestrutura da célula F, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, evidenciando microvilos apicais (cabeças de setas),
pequenos vacúolos apicais (→) e grandes vacúolos supranucleares (*). (4.650X).
Figura 36: Ultraestrutura da célula F, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se mitocôndrias (M), cisternas achatadas
do complexo de Golgi (*) e retículo endoplasmático rugoso (cabeça de seta).
(13.250X).
Figura 37: Ultraestrutura da célula E, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, evidenciando membrana irregular do núcleo (→),
cromatina granular (cg). (23.000X).
Figura 38: Fotomicrografia do hepatopâncreas de Macrobrachium amazonicum,
evidenciando célula B com núcleo basal achatado (cabeça de seta), vacúolos
apicais pinocíticos (*) e grande vacúolo subapical (v). Azul de toluidina (500X).
Figura 39: Ultraestrutura da célula B, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se núcleo ovalado com cromatina
granulosa (*) e nucléolos evidentes (cabeças de setas). (5.950X).
Figura 40: Ultraestrutura da célula B, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando complexo apical de vesículas pinocíticas
(→), e grandes vacúolos supranucleares (*). (45.350X).
Figura 41: Ultraestrutura da célula E, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se o complexo de Golgi (CG). (9.750X).
Figura 42: Ultraestrutura da célula B, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, evidenciando liberação de vesículas (→) e parte do
citoplasma apical (*) no lúmen hepatopancreático. (7.750X).
Figura 43: Fotomicrografia do hepatopâncreas de Macrobrachium amazonicum,
evidenciando célula R com núcleo basal (cabeça de seta), vacúolos supranucleares
(*). Destaca-se ainda a presença da região de borda em escova (estrela). Azul de
toluidina (1.000X).
Figura 44: Ultraestrutura da célula R, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se borda em escova (*) e vacúolos sub
apicais (v). (17.000X).
Figura 45: Ultraestrutura da célula R, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando a presença de núcleo (n) com nucléolo
evidente (estrela) e retículo endoplasmático liso (*) na região basal. (5.750X).
Figura 46: Ultraestrutura da célula R, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando as mitocôndrias (m), retículo
encoplasmático liso (cabeça de seta) e rugoso (seta). (62.000X).
Figura 47: Fotomicrografia do hepatopâncreas de Macrobrachium amazonicum,
evidenciando célula M com citoplasma intensamente basófilo (*). Azul de toluidina
(500X).
Figura 48: Ultraestrutura da célula M, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se cromatina nuclear (cabeças de setas)
aderida à membrana do núcleo e nucléolo (NC). (9.750X).
Figura 49 Ultraestrutura da célula M, presente no hepatopâncreas de fêmeas de
Macrobrachium amazonicum, destacando-se núcleo alongado (N), retículo
endoplasmático liso (*) e mitocôndrias (cabeça de seta). Destaca-se ainda a
presença de vacúolo grande e pouco elétron-denso (estrela). (10.750X).
DISCUSSÃO
Fêmeas de M. amazonicum apresentam os maiores índices
gonadossomáticos em espécimems com ovários no estágio V de maturação.
Trabalhos realizados com fêmeas de Macrobrachium rosenbergii capturados na
natureza, demonstraram que, o ovário durante a maturação, aumenta de peso
devido ao acúmulo de lipídio e proteínas de vitelo no interior das células ovocitárias
(Lee e Chang, 1997; Cavalli et al., 2000; 2001). O vitelo é utilizado como alimento
endógeno para as larvas recém-eclodidas, proporcionando a sua sobrevivência nos
primeiros estágios de desenvolvimento (Lee e Chang,1997). Nos estágios IV e V de
maturação ovariana de Macrobrachium rosenbergii observou-se o maior acúmulo de
vitelo no órgão (Lee e Chang, 1997). Essas observações corroboraram o encontrado
em Macrobrachium amazonicum, onde, o maior valor de IGS foi observado em
fêmeas no estágio V de maturação gonadal, indicando um maior acúmulo de vitelo
nos ovócitos maduros. Cavalli et al. (2001) sugerem que os lipídios depositados nos
ovócitos são transferidos diretamente do hepatopâncreas para os ovários durante a
maturação gonadal. Em fêmeas de Macrobrachium amazonicum as análises
referentes ao IHS revelaram a influência dos estágios de maturação ovariana nos
valores médios do peso do hepatopâncreas.
Os hepatopâncreas de Macrobrachium amazonicum com ovários nos estágios
II, III e IV de maturação apresentaram médias de IHS maiores do que nos animais
com ovários em estágios de maturação I e V. Isto ocorreu devido ao fato que fêmeas
nos estágios II, III e IV de maturação ovariana estavam acumulando reserva
energética ao nível do hepatopâncreas. Esta reserva seria possivelmente mobilizada
para as células ovocitárias, em desenvolvimento no ovário, semelhantemente ao que
fora encontrado para Macrobrachium roserbergii (Cavalli et al., 2001). Caberia
ressaltar que os IHS das fêmeas em estágio II, III e IV de maturação ovariana não
apresentaram diferenças significativas, muito embora o estágio III de maturação
ovariana indicasse o período no qual existiu o maior acúmulo de reserva energética
no hepatopâncreas. Esta reserva seria posteriormente transferida para células
ovocitárias em maturação a partir do estágio IV de maturação gonadal. Estudos
realizados com fêmeas maduras de Penaeus monodon demonstraram que boa parte
da reserva de energia acumulada no hepatopâncreas é utilizada para o metabolismo
do animal, principalmente durante a desova (Millamena e Pascual, 1990). Da mesma
forma, Cavalli et al. (2001) relataram que em fêmeas de Macrobrachium rosenbergii
houve diminuição da atividade alimentar relacionada com a muda pré-desova
contribuindo para o declínio de lipídios estocados no hepatopâncreas nos estágios I
e V de maturação ovocitária. Trabalhos realizados com diversas espécies marinhas
como Metapenaeus affinis (Teshima e Kanazawa, 1983), Penaeus indicus (Galois,
1984) e Penaeus monodon (Millamena e Pascual, 1990), demonstraram que boa
parte das reservas lipídicas presentes no hepatopâncreas foram utilizadas durante a
maturação gonadal. Desta forma, acredita-se que a reserva energética que vem
sendo acumulada no hepatopâncreas de fêmeas de Macrobrachium amazonicum
seja importante para a conclusão da ovogênese, uma vez que essa reserva está
diretamente relacionada com o metabolismo animal e com a atividade de maturação
gonadal.
Os ovários de crustáceos apresentaram diferentes estágios de maturação
constituindo um ciclo reprodutivo (Chang e Shih, 1995). O estudo deste ciclo
reprodutivo é fundamental para que haja melhor controle no crescimento e na
reprodução dos animais mantidos em cativeiro e ainda, para estoque de
reprodutores (Kroll et al., 1992; Medina et al., 1996). As observações macroscópicas
realizadas em Macrobrachium amazonicum demonstraram a existência de cinco
estágios ovarianos sendo eles os estágios de I a V considerando-se primeiramente o
tamanho e a coloração dos ovários durante o seu amadurecimento. Características
semelhantes foram relatadas por Chang e Shih (1995) para a espécie
Macrobrachium rosenbergii, já para fêmeas de Macrobrachium acanthurus foram
descritos quatro estágios de maturação ovariana (Carvalho e Pereira, 1981).
O tamanho, cor e textura dos ovários de crustáceos modificam-se conforme
seu grau de amadurecimento (O’Donovan et al., 1984) e sua coloração resulta do
acúmulo de vitelogenina contendo pigmentos carotenóides (Charniaux-Cotton,
1980). Em Macrobrachium amazonicum, assim como em Macrobrachium acanthurus
(Carvalho e Pereira, 1981), os ovários, a medida que amadurecem, apresentaram
coloração esverdeada. Já em Macrobrachium rosenbergii os ovários maduros
apresentaram coloração alaranjada (Chang e Shih, 1995). A diferença de cor
apresentada pelas espécies citadas se deve, ao tipo de carotenóide assimilado ser
possivelmente espécie específico.
As observações microscópicas demonstraram a existência de cinco tipos
celulares presentes nos ovários em diferentes estágios de maturação, em
Macrobrachium amazonicum. Esses tipos celulares são: ovogônias, ovócitos pré-
vitelogênicos, ovócitos em vitelogênese inicial, ovócitos em vitelogênese avançada e
ovócitos maduros; também observadas por Chaves e Magalhães (1993) em
Macrobrachium amazonicum coletados na natureza, e por Carvalho e Pereira
(1981), em Macrobrachium acanthurus.
No estágio I do desenvolvimento ovariano de Macrobrachium amazonicum
foram encontradas as ovogônias. Essas células apresentam características muito
semelhantes às observadas em outras espécies de Macrobrachium como em
Macrobrachium rosenbergii (Chang e Shih, 1995) e Macrobrachium acanthurus
(Carvalho e Pereira, 1981). Estudos relacionados à maturação das células
germinativas determinaram que as ovogônias se encontram na zona germinativa, ou
zona de proliferação, do ovário (Browdy, 1989). Esta zona germinativa em
Macrobrachium amazonicum foi observada na região central de cada metade
ovariana. Estas observações diferem das características encontradas em Penaeus
setiferus (King, 1948) e Penaeus stylirostris (Bell e Lightner, 1988) nos quais se
observou a zona germinativa na região medial e ventral da cada lobo ovariano.
Porém em Penaeus indicus notou-se a zona germinativa na região ventral e lateral
dos ovários (Subrahmanyam, 1963). Desta forma, a localização da zona germinativa
pode variar entre as espécies de Decápodas. Cumpre destacar que em ovários
maduros de Macrobrachium amazonicum a zona germinativa não foi principalmente
observada na região central do órgão mas sim em pontos dispersos do parênquima
gonadal. Isso ocorreu provavelmente devido à pressão exercida pelo crescimento
das células germinativas e pelo aumento do número de ovócitos maduros,
proporcionando a dispersão da zona germinativa durante a maturação ovariana.
Em ovários de Macrobrachium amazonicum no estágio II de maturação
observaram-se ovócitos pré-vitelogênicos com núcleo apresentando mais de um
nucléolo. No entanto, Chaves e Magalhães (1993) descreveram a existência de um
único nucléolo presente nos ovócitos pré-vitelogênicos desta mesma espécie.
Estudos sobre a microscopia eletrônica de ovócitos pré-vitelogênicos de
Macrobrachium amazonicum demonstraram características semelhantes às
observadas em ovócitos de Orchestia gammarella (Charniaux-Cotton, 1980) e
Penaeus kerathurus (Carvalho et al., 1998a). Nestas células de Macrobrachium
amazonicum observou-se o desenvolvimento do retículo endoplasmático que, de
acordo com Charniaux-Cotton (1980), promove o aumento dos elementos
vesiculares no citoplasma. Em Penaeus keraturus, verificou-se que o retículo
endoplasmático origina-se a partir de expansões do envelope nuclear e que contém
pequenos grânulos em seu interior (Carvalho et al., 1998a). Esses grânulos também
foram encontrados em peneídeos (Rankim e Davis, 1990) e para Homarus
americanus (Schade e Schivers, 1980). Em Macrobrachium amazonicum observou-
se padrão semelhante, onde os grânulos estavam presentes no interior de
expansões do envelope nuclear sendo depois transferidos ao retículo
endoplasmático. Desta forma, observa-se o início da vitelogênese endógena e o
preparo do ovócito para a vitelogênese exógena a qual ocorrerá durante o
amadurecimento celular. Observações semelhantes foram descritas para Penaeus
keraturus em que os ovócitos pré-vitelogênicos iniciaram a vitelogênese endógena a
partir da formação de um sistema de endomembranas composto pelo retículo
endoplasmático associado ao complexo de Golgi (Carvalho et al., 1998a).
Os ovócitos em vitelogênese inicial foram comumente encontrados em
ovários no estágio III de maturação de Macrobrachium amazonicum. Essas células
apresentam vesículas corticais incolores e dispersas pelo citoplasma,
semelhantemente ao que fora descrito para os ovócitos de Macrobrachium
rosenbergii (Chang e Shih, 1995) e de Pandalus kessleri (Quinitio et al., 1989).
Porém, o mesmo não ocorreu naquelas células ovocitárias de Penaeus monodon
(Bell e Lingther, 1988), que exibiram hastes corticais ao invés de vesículas corticais.
As vesículas corticais incolores de Macrobrachium acanthurus são consideradas de
natureza fosfolipídica e apresentam grande importância após a fecundação devido
ao seu envolvimento com a síntese de membranas celulares (Gomes et al., 1979).
Ainda no estágio III de maturação ovariana os ovócitos em vitelogênese inicial de
Macrobrachium amazonicum se apresentaram envoltos por células foliculares. A
presença de células foliculares também foi descrita em diversas espécies de
Decápodas como Macrobrachium rosenbergii (Chang e Shih, 1995), Penaeus
Japonicus (Yano e Chinzei, 1987) e Callinectes sapidus (Johnson, 1980). O papel
das células foliculares ainda é discutido. O formato e o tamanho destas células
estariam intimamente relacionados com a sua atividade biossintética (Chang e Shih,
1995). As células foliculares são fundamentais na captação de proteínas de vitelo
para dentro dos ovócitos, nos crustáceos (Adiyodi e Subramoniam, 1983). Em
Penaeus japonicus foi demonstrado que a vitelogenina pôde ser sintetizada nas
células foliculares, secretadas na hemolinfa e captadas pelos ovócitos (Yano e
Chinzei, 1987). Assim, pode-se sugerir que em Macrobrachium amazonicum as
células foliculares apresentem atividade de síntese semelhante à encontrada em
Penaeus japonicus (Yano e Chinzei, 1987). Isso ao fato de apresentarem alteração
na forma e no tamanho, quando rodeiam ovócitos em diferentes estágios de
maturação.
Ovócitos em vitelogênese inicial de Macrobrachium amazonicum exibiram
células foliculares de aspecto cúbico e com alta atividade biosintética. Desta forma,
a síntese de vitelogenina nas células foliculares (Yano e Chinzei, 1987)
provavelmente esteja contribuindo para o acúmulo de vitelo no ovócito, uma vez que
neste estágio de maturação ovariana observou-se o início da vitelogênese exógena
de modo semelhante ao proposto para Penaeus japonicus (Yano e Chinzei, 1987). A
vitelogênese exógena representa a mobilização de vitelogenina encontrada nas
células foliculares e hepatopâncreas para os grânulos vitelínicos presentes no
citoplasma dos ovócitos (Yano e Chinzei, 1987). Em Macrobrachium amazonicum a
primeira fonte de vitelogenina exógena a ser disponibilizada para o ovócito originou-
se das células foliculares. Neste estágio de maturação ovariana a participação do
hepatopâncreas na vitelogênese exógena ainda não foi significativa, tendo em vista
que neste momento encontrou-se o maior índice hepatossomático (IHS), o qual
apresentava queda drástica apenas nos próximos estágio de maturação.
Ainda em relação aos ovócitos em vitelogênese inicial de Macrobrachium
amazonicum, observou-se que essas células apresentaram grande número de
vesículas formadas por retículo endoplasmático rugoso contendo grânulos e material
fibrilar. Em Penaeus aztecus e Penaeus setiferus não foram observadas vesículas
oriundas do retículo endoplasmático rugoso (Duronslet et al., 1975). Já em Penaeus
kerathurus (Carvalho et al., 1998b) e em outras espécies de peneídeos
(Papathanassiou e King, 1984; Rankin e Davis, 1990; Yano et al., 1996) observou-se
a presença de muitas vesículas de retículo endoplasmático rugoso no citoplasma
dos ovócitos em vitelogênese inicial. Em Penaeus kerathurus o retículo
endoplasmático rugoso apresentou padrão morfológico característico da espécie.
Neste caso o retículo apresentava cisternas dilatadas que se anastomosavam por
pontes denominadas “lamellae annulate” (Carvalho et al., 1998b). Entretanto, esse
tipo de estrutura e mudanças morfológicas no retículo endoplasmático rugoso não
foram observadas em Macrobrachium amazonicum. Nesta espécie foi frequente a
coalescência de vesículas do retículo endoplasmático rugoso sem a formação das
lamelas anulares nos ovócitos em vitelogênese avançada, característicos dos
ovários em estágio IV de maturação gonadal ao invés de aparecer nos ovócitos em
vitelogênese inicial.
Os ovários de Macrobrachium amazonicum em estágio IV de maturação
apresentaram além das células citadas, ovócitos em vitelogênese avançada. Esta
característica também é observada em Macrobrachium rosenbergii (Chang e Shih,
1995). Contudo em Macrobrachium acanthurus, observaram-se ovócitos em
vitelogênese avançada a partir do estágio II de maturação ovariana (Carvalho e
Pereira, 1981). Esta diferença na organização ovariana se deveu ao fato de
Macrobrachium acanthurus apresentar desovas parceladas, ou seja, as desovas que
ocorrem independente do estágio de maturação ovariana. Logo, Macrobrachium
acanthurus apresenta várias desovas em um mesmo ciclo reprodutivo enquanto que
Macrobrachium amazonicum (Chaves e Magalhães, 1993) e Macrobrachium
rosenbergii (Chang e Shih, 1995) apresentam uma única desova, ou seja, uma
desova total ocorrendo no mesmo ciclo reprodutivo.
Os ovócitos em vitelogênese avançada de Macrobrachium amazonicum foram
caracterizados pela coalescência e vesículas do retículo endoplasmático rugoso, e
pela deposição de vitelo em vesículas vitelínicas de diferentes elétron-densidades,
observadas na região central do citoplasma. Em Penaeus kerathurus as diferentes
elétron-densidades exibidas pelo conteúdo das vesículas vitelínicas estavam
relacionadas ao grau de maturação do vitelo. As vesículas claras costumamente
estão em início de maturação, enquanto as escuras contém vitelo maduro (Carvalho
et al., 1998b).
Outro fato importante a ser considerado quanto às diferentes elétron-
densidade das vesículas vitelínicas é a origem da vitelogenina, a qual é precursora
do vitelo (Avarre et al., 2003; Lee e Chang, 1997). Essa origem pode ser endógena,
quando ocorre a produção de vitelogenina no ovócito; exógena, quando essa
produção é extra-ovocitária; ou ainda ocorrem ambas as origens (Kroll et al., 1992;
Avarre et al., 2003). Quando a vitelogenina for de origem exógena provavelmente a
sua maior produção ocorreria no hepatopâncreas (Tseng et al., 2001; Kung e tal.,
2004). Neste caso a vitelogenina é secretada na hemolinfa e alcançará a superfície
do ovócito, sendo estocada em vesículas citoplasmáticas (Avarre et al., 2003). Estas
vesículas se fundirão com vesículas contendo vitelo de origem endógena,
produzindo assim vesículas com diferentes elétron-densidades (Carvalho et al.,
1998b). Tendo em vista os ovócitos em vitelogênese avançada de Macrobrachium
amazonicum encontraram-se vesículas coalescidas do retículo endoplasmático
rugoso e vesículas vitelínicas com diferentes elétron-densidades, sugerindo que a
produção das vesículas vitelínicas de Macrobrachium amazonicum pudesse ser
semelhante àquleas produzidas em ovócitos de Penaeus kerathurus.
No estágio V de maturação gonadal de Macrobrachium amazonicum
encontraram-se principalmente ovócitos maduros com grande deposição de vitelo no
citoplasma. Essa deposição de vitelo distribuída por todo o citoplasma dos ovócitos
maduros também fora descrita para Macrobrachium rosenbergii (Chang e Shih,
1995), Macrobrachium acanthurus (Carvalho e Pereira, 1981) e Pandalus kessleri
(Quinitio et al., 1989). Outra característica que os ovócitos maduros de diferentes
espécies de crustáceos apresentam é a presença as vesículas lipídicas localizadas
na periferia do citoplasma, constituindo a camada de alvéolo cortical (Goudeau e
Lachaise, 1980; Goudeau, 1984; Bell e Lightner, 1988). Este tipo de deposição
lipídica não foi encontrada aqui em Macrobrachium amazonicum, em Macrobrachium
rosenbergii (Chang e Shih, 1995) e nem em Macrobrachium acanthurus (Carvalho e
Pereira, 1981). Sugere-se que os alvéolos corticais, geralmente encontrados em
peneídeos, possuem a função de proteção ovocitária quando os ovos são lançados
em ambiente marinho (Clark et al., 1980; Clark et al., 1990).
Em ovócitos maduros de Macrobrachium amazonicum observou-se a
formação do córion como resultado da deposição de material amorfo na supefície
externa da membrana plasmática. Esta estrutura é formada nos momentos finais da
vitelogênese nos decápodas (Talbot, 1981). De acordo com Papathanassiou e King
(1984) o córion ao ser formado torna-se uma camada contínua que separa o ovócito
das células foliculares. Desta forma, no momento da ovulação, as células foliculares
de Penaeus monodon e Penaeus vannamei (Kroll et al., 1992) se mantém no ovário
e participam do próximo ciclo reprodutivo. Assim, em Macrobrachium amazonicum
provavelmente o córion desempenhe a função de manutenção das células
foliculares no ovário tendo em vista o curto período de tempo observado entre um
ciclo reprodutivo e outro. Cabe destacar que no estágio IV de maturação ovariana de
Macrobrachium amazonicum foi observada uma queda drástica do IHS e o aumento
significativo do IGS indicando a mobilização de reserva do hepatopâncreas para os
ovários confirmando a significativa contribuição do hepatopâncreas para a
vitelogênese exógena.
O ciclo reprodutivo de Macrobrachium amazonicum envolve as atividades
inerentes ao ovário e ao hepatopâncreas. Estes dois órgãos trabalham de forma
sincronizada estabelecendo o período de cada ciclo reprodutivo. O
comprometimento do hepatopâncreas com a reprodução é melhor visualizado em
animais a partir do estágio III de maturação ovariana.
O hepatopâncreas é uma glândula pertencente ao intestino médio que
apresenta a função de metabolizar produtos de reserva energética (Garcia et al.,
2002). Essa reserva é utilizada durante a maturação ovariana (Millamena e Pascual,
1990; Cavalli et al., 2001). Desta forma o conhecimento das células
hepatopancreáticas é importante para o entendimento do processo reprodutivo em
camarões. Existem cinco tipos celulares que compõem o epitélio secretor do túbulo
hepatopancreático, as quais se distribuem ao longo do comprimento destes túbulos,
conforme foi descrito para os demais decápodas (Al-Mohanna et al., 1985; Al-
Mohanna e Nott, 1989; Johnston et al., 1998; Souza e Petriella, 2000; Correa et al.,
2002), e para Macrobrachium amazonicum (Franceschini-Vicentini et al., 2006).
Dentre os diferentes tipos de células estudadas no epitélio do hepatopâncreas
de Macrobrachium amazonicum as células E são observadas somente na porção
distal de cada túbulo secretor, de acordo com o proposto para alguns decápodas
(Icely e Nott, 1992; Franceschini-Vicentini et al., 2006). As células E de
Macrobrachium amazonicum mostravam núcleo grande, ocupando a maior parte do
volume citoplasmático, e cromatina granulosa com alguns núcleolos bem evidentes.
Essas características são típicas de células embrionárias (Vogt et al., 1985) e
sugerem o envolvimento das células E na renovação de todos os tipos celulares que
compõem o epitélio tubular (Icely e Nott, 1992). Isso de acordo com o que foi
proposto para Penaeus vannamei (Caceci et al., 1988) e para Homarus americanus
(Icely e Nott, 1992). Neste estudo, além das características morfológicas,
observaram-se algumas figuras de mitose nas células E de Macrobrachium
amazonicum indicando o seu provável envolvimento com a renovação do epitélio
secretor do túbulo hepatopancreático, concordantemente com o proposto por Icely e
Nott (1992).
Em Macrobrachium amazonicum as células F foram observadas em toda a
extensão dos túbulos do hepatopâncreas, entretanto foram mais facilmente
identificadas na porção distal, próximas às células E. Esta característica difere do
que foi observado em Penaeus semisulcatus (Al-Mohanna e Nott, 1989) e em
Penaeus vannamei (Caceci et al., 1988), que apresentaram células F apenas nas
regiões proximal e medial dos túbulos hepatopancreáticos. Quanto a função
desempenhada pelas células F de Macrobrachium amazonicum, o retículo
endoplasmático rugoso e o complexo de Golgi observados com cisternas dilatadas
justificavam a presença de intensa síntese de substâncias. Ademais, os vacúolos
supranucleares observados em Macrobrachium amazonicum poderiam estar
associados à liberação destas substâncias no lúmem do hepatopâncreas.
Características semelhantes foram propostas para Penaeus sp. (Icely e Nott, 1992).
As células F de Penaeus semisulcatus (Al-Mohanna e Nott, 1989) e de
Astacus sp. (Vogt et al., 1989) são responsáveis pela síntese de enzimas, e, as
cisternas dilatadas do complexo de Golgi estão intimamente relacionadas com a
produção de vacúolos enzimáticos, utilizados durante as fases de digestão (Icely e
Nott, 1992). Ressalta-se que em Macrobrachium amazonicum as células F
apresentaram vesículas pinocitóticas no citoplasma apical. O acúmulo destas
vesículas pinocitóticas altera a característica da célula F que passa a ser chamada
de célula B. Esta transformação da célula F em célula B foi proposta também para
Penaeus semissulcatus (Al-Mohanna e Nott, 1989). Acreditando-se ser o mesmo
“modelo” válido para Macrobrachium amazonicum, aqui estudado.
Assim sendo, as células B observadas em Macrobrachium amazonicum
principalmente nas regiões média e distal dos túbulos, diminuem a sua freqüência à
medida que o túbulo secretor se aproxima do túbulo principal. Entretanto, Al-
Mohanna e Nott (1989) verificaram a presença destas células na região média e
proximal dos túbulos em Penaeus semisulcatus. As observações das células B em
Macrobrachium amazonicum demonstraramm núcleo adistrito à região basal e
presença de grandes vacúolos supranucleares, além de inúmeras vesículas
pinocitóticas encontradas na região apical das células. O conjunto das vesículas
pinocitóticas foi denominado de complexo apical por Loizzi (1971). Este complexo
apical é encontrado em Penaeus vannamei (Caceci et al., 1988) e em Penaeus
monodon (Vogt et al., 1985). A presença de vesículas pinocíticas na região apical do
citoplasma das células B de Macrobrachium amazonicum suporta a hipótese de que
estas células possam absorver substâncias do lúmem hepatopancreático. Desta
forma se propõem que as células B de Macrobrachium amazonicum sejam
responsáveis pela digestão intracelular e conseqüente secreção apócrina de acordo
com o proposto para Penaeus semisulcatus (Al-Mohanna e Nott, 1985a; Al-Mohanna
e Nott, 1989). Uma vez que o produto dessa digestão soma-se ao produto da
digestão extracelular ocorrida no lúmem do túbulo hepatopancreático, a assimilação
destes nutrientes é realizada por outro tipo celular denominado de célula R (Al-
Mohanna e Nott, 1987a).
A célula R, presente nos túbulos hepatopancreáticos de Macrobrachium
amazonicum é o tipo celular mais observado, sendo facilmente visualizado nas
regiões média e proximal dos túbulos. Fato semelhante também foi observado em
Penaeus semisulcatus (Al-Mohanna e Nott, 1989) e em Penaeus vannamei (Caceci
et al., 1988). Análises referentes à microscopia eletrônica de transmissão revelam
que a célula R de Macrobrachium amazonicum apresenta características absortivas
e de reserva. As características absortivas são atribuídas à presença de
microvilosidades na borda apical, associadas às mitocôndrias, e às características
de reserva de nutrientes, sendo referentes ainda à presença de vacúolos
supranucleares, similar ao observado em Penaeus semisulcatus (Al-Mohanna e
Nott, 1987a). A reserva de nutrientes nas células R de Macrobrachium amazonicum
pode ser a responsável pelo elevado índice hepatossomático (IHS) observado em
animais com ovário no estágio III de maturação. Neste estágio, as células R
provavelmente alcancem o nível máximo de acúmulo de reserva energética, e a
partir desse estágio este material de reserva se mobiliza para os ovócitos em
maturação. Este fato é justificado pela queda progressiva do IHS em fêmeas com
ovários em estágio IV e em estágio V de maturação ovariana. O menor IHS
encontrado em fêmeas com estágio V de maturação ovariana ocorre provavelmente
quando a célula R já transferiu sua reserva para os ovócitos que se encontravam
maduros. Atividade semelhante das células R foi proposta em Penaeus semisulcatus
no qual estas reservas foram metabolizadas durante o ciclo reprodutivo (Al-Mohanna
e Nott, 1987a).
O quinto tipo celular observado ao longo do túbulo hepatopancreático de
Macrobrachium amazonicum é a célula M. Este tipo celular também foi observado
em Penaeus semisulcatus (Al-Mohanna et al., 1985b; Al-Mohanna e Nott, 1987b;
1989) e em Homarus americanus (Icely e Nott, 1992). Entretanto não foi observado
em Penaeus vannamei (Caceci et al., 1988), Astacus astacus (Vogt et al., 1989) e
em Palaemonetes argentinus (Sousa e Petriella, 2000).
A célula M de Macrobrachium amazonicum apresentou acúmulo de
substâncias, porém o seu ápice não atingiu o lúmen tubular e conseqüentemente
não apresentou microvilosidades apicais e nem vesículas de pinocitose. Assim, o
material acumulado poderia ser consequência da síntese intracelular ou ainda uma
difusão a partir da hemolinfa, como foi proposto para Penaeus semisulcatus (Al-
Mohanna et al., 1985b; Al-Mohanna e Nott, 1987b). O acúmulo de material provocou
deformação no núcleo das células M de Macrobrachium amazonicum, que passa do
tamanho grande e localizado no centro da célula para a forma alongada estando
deslocado para a periferia celular. Este comportamento também foi observado em
Penaeus semisulcatus (Al-Mohanna et al., 1985b; Al-Mohanna e Nott, 1987b; Icely e
Nott, 1992).
O material acumulado pela célula M pode estar envolvido com o processo do
ciclo de muda do animal, conforme proposto em Penaeus semisulcatus (Al-Mohanna
e Nott, 1987b). Nesta espécie o material acumulado é mobilizado para a hemolinfa
e, consequentemente é transportado até os locais de síntese e desenvolvimento de
novos tecidos, durante o período de muda. No entanto, a função da célula M
permanece obscura e se tornam imperativas outras observações que esclareçam o
seu envolvimento no ciclo de vida de Macrobrachium amazonicum.
Associando a correlação entre o ovário e o hepatopâncreas, a concentração
de esteróides em Macrobrachium amazonicum é importante para o entendimento
das mudanças ocorridas no animal durante o ciclo reprodutivo. Sabe-se que os
hormônios esteróides participam do controle dos mecanismos de reprodução dos
crustáceos (Quinitio et al., 1991; Subramoniam, 2000). A produção e a presença de
esteróides na hemolinfa, hepatopâncreas e ovários de crustáceos tem sido alvo de
muitos estudos devido a sua resposta fisiológica quanto à maturação ovariana
(Yano, 1987; Couch et al., 1987; Quackenbush, 1994; Shih, 1997). Entretanto,
muitos trabalhos demonstraram a capacidade dos crustáceos em produzir uma
variedade de esteróides típicos dos vertebrados (Subramoniam, 2000). O autor
descreveu que os esteróides apresentam características instáveis em suas
concentrações durante os processos de maturação gonadal. Fêmeas de
Macrobrachium amazonicum apresentaram variação na concentração dos
esteróides estradiol, progesterona e testosterona nos ovários, hepatopâncreas e
hemolinfa nos diferentes estágios de maturação gonadal.
O estradiol e a progesterona estão intimamente relacionados aos estágios de
maturação ovariana de Macrobrachium amazonicum, enquanto a testosterona não
mostra grande alteração durante o ciclo reprodutivo. Esta correlação hormonal
também foi encontrada em Penaeus monodon (Quinitio et al., 1994) e em Pandalus
kessleri (Quinitio et al., 1991). Com relação a testosterona, o seu envolvimento no
ciclo reprodutivo provavelmente se deva ao fato de ser um hormônio precursor do
estradiol na síntese bioquímica (Kanazawa e Teshima, 1971; Summavielle et al.,
2003; Martins et al, 2007). O estradiol e a progesterona apresentaram aumento
significativo na sua concentração nos estágios I e II do ciclo de maturação ovariana
que coincidiu com o início do período pré-vitelogênico. A partir desta fase, de acordo
com as características morfológicas exibidas pelos ovócitos pré-vitelogênicos,
iniciou-se a vitelogênese endógena, ou seja, observaram-se síntese e conseqüente
acúmulo de vitelo no retículo endoplasmático rugoso. Processo semelhante também
foi a descrita em Malacostracas (Chaniaux-Cotton, 1985; Chaniaux-Cotton e Payen,
1988) e em Homarus americanus (Couch et al., 1987). Desta forma, em
Macrobrachium amazonicum faz-se necessária alta concentração de estradiol, tanto
para o preparo dos ovócitos para as vitelogêneses endógena e exógena quanto para
estimular a produção de vitelo no hepatopâncreas.
O estágio III de maturação ovariana de Macrobrachium amazonicum coincidiu
com o início da vitelogênese exógena. Esta vitelogênese envolve a transferência de
vitelo do hepatopâncreas para o ovário e conseqüentemente para dentro do ovócito.
Neste estágio notou-se uma queda brusca na concentração de estradiol no ovário,
hepatopâncreas e hemolinfa, coincidindo com o início da transferência de material
de reserva do hepatopâncreas para os ovócitos em crescimento. O nível de estradiol
cai progressivamente até o estágio V de maturação ovariana, enquanto o índice
gonadossomático alcança os seus níveis mais altos. Assim, se sugere que o
estradiol é fundamental durante as fases de síntese e armazenamento de vitelo,
tanto nos ovócitos como no hepatopâncreas, não sendo necessário no momento da
transferência de reserva do hepatopâncreas para o interior dos ovócitos.
Com relação à vitelogênese ainda foi observado que a progesterona em
Macrobrachium amazonicum mostrou queda progressiva a partir do início da
vitelogênese no estágio II de maturação ovariana. Ocorrencia semelhante foi
descrita em Pandalus kessleri (Quinitio et al., 1991). Segundo a literatura
especializada a progesterona estimula o desenvolvimento do ovário no camarão de
água doce Parapenaeopsis hardwickii (Kulkarni et al., 1979) e nos camarões
marinhos Metapenaeus ensis (Yano, 1985) e Penaeus stylifera (Nagabhushanam et
al., 1990). No entanto ainda não está bem estabelecido se a progesterona age no
animal como promotor direto dos eventos reprodutivos, ou se seria convertida em
outro esteróide correlato necessário para o desenvolvimento ovocitário (Quinitio et
al. (1991).
Caberia ressaltar que que em crustáceos segundo Gunamalai et al. (2006), a
síntese de estradiol e progesterona poderia estar ocorrendo nas células foliculares
ovarianas sendo os hormônios liberados na hemolinfa visando alcançar o
hepatopâncreas, e então estimular a síntese de vitelo e o metabolismo de lipídios.
Todavia, em Macrobrachium amazonicum as células foliculares apresentaram
caracaterísticas morfológicas de síntese somente a partir do estágio III de maturação
ovariana, coincidindo com o momento de queda abrupta na concentração destes
hormônios. Logo se sugere que a síntese de progesterona e estradiol em
Macrobrachium amazonicum possa ser realizada por outro grupo celular, que
apresente características tipicamente endócrinas. Não se descarta a hipótese do
envolvimento das células R e B, presentes no hepatopâncreas, com a síntese
desses hormônios durante o ciclo reprodutivo, face aos resultados aqui obtidos.
No momento da desova em Macrobrachium amazonicum os hormônios
progesterona, testosterona e estradiol atingiriam os seus níveis mais baixos. Desta
forma a desova poderia ser estimulada pela baixa concentração destes hormônios
ou ainda por algum outro fator hormonal derivado do metabolismo destes esteróides,
sendo desencadeante desse processo. É certo que sistema endócrino de crustáceos
necessita de maiores investigações no sentido de se esclarecer a origem, natureza o
mecanismo de ação dos hormônios esteróides atuantes durante o ciclo de vida do
animal.
CONCLUSÕES
As características morfológicas da distribuição das células germinativas em
fêmeas de Macrobrachium amazonicum ao longo do ciclo reprodutivo
comprovam o fato dos animais apresentarem uma única desova a cada ciclo
reprodutivo;
A presença do córion nos ovócitos maduros contribui para a manutenção das
células foliculares nos ovários durante as desovas, devido ao rápido intervalo
observado entre uma desova e o início de um novo ciclo reprodutivo;
As características morfológicas dos ovócitos e a correlação entre os índices
gonadossomáticos e hepatossomáticos ao longo do ciclo reprodutivo de
Macrobrachium amazonicum indicam a presença de vitelogênese endógena e
exógena;
As células que constituem o túbulo hepatopancreático apresentam
características morfológicas relacionadas às funções de digestão e assimilação
de nutrientes, assim como a de reserva energética fundamental para os
processos reprodutivos;
O processo reprodutivo em Macrobrachium amazonicum é regulado por
hormônios esteróides e necessita de altas concentrações de estradiol e
progesterona no início do ciclo de maturação ovariana, e a necessidade de
baixas concentrações desses hormônios para desencadear o mecanismo de
desova.
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