( PDF ) Considerações sobre os gêneros ouratea e luxemburgia, estudo químico de duas espécies de Ochnaceae: Ouratea hexasperma St. Hil E Ouratea cuspidata St. Hil e atividades biológicas

UFRRJ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE

QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

QUÍMICA ORGÂNICA.

TESE

CONSIDERAÇÕES SOBRE OS GÊNEROS OURATEA E

LUXEMBURGIA, ESTUDO QUIMICO DE DUAS ESPÉCIES DE

OCHNACEAE: Ouratea hexasperma St. Hil E Ouratea Cuspidata

St. Hil E ATIVIDADES BIOLOGICAS.

LUCIANO RAMOS SUZART

2007

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UFRRJ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS/DEPARTAMENTO DE

QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ORGÂNICA.

TESE

CONSIDERAÇÕES SOBRE OS GÊNEROS OURATEA E

LUXEMBURGIA, ESTUDO QUÍMICO DE DUAS ESPÉCIES DE

OCHNACEAE: Ouratea hexasperma St. Hil E Ouratea cuspidata St.

Hil E ATIVIDADES BIOLÓGICAS.

LUCIANO RAMOS SUZART

Orientador: Prof. Dr. Mário Geraldo de Carvalho

Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Auxiliadora Coelho Kaplan

2007

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA

CONSIDERAÇÕES SOBRE OS GÊNEROS OURATEA E

LUXEMBURGIA, ESTUDO QUÍMICO DE DUAS ESPÉCIES DE

OCHNACEAE: Ouratea hexasperma St. Hil E Ouratea cuspidata St. Hil E

ATIVIDADES BIOLOGICAS.

LUCIANO RAMOS SUZART

Sob a Orientação do Professor

Dr. Mário Geraldo de Carvalho

Co-Orientação da professora

Dra. Maria Auxiliadora Coelho Kaplan

Tese submetida como requisito

parcial para obtenção do grau de

Doutor em Ciências, no Programa

de Pós-Graduação em Química

Orgânica, Área de Concentração

em Química Produtos Naturais

Seropédica, RJ

fevereiro de 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA

LUCIANO RAMOS SUZART

Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências, no

Programa de Pós-Graduação em Química Orgânica, área de Concentração em Química de

Produtos Naturais.

TESE APROVADA EM -----/-----/------

Dr. Mário Geraldo de Carvalho (DEQUIM-UFRuralRJ)

(Orientador)

Dra. Maria Auxiliadora Coelho Kaplan (NPPN-UFRJ)

(Co-Orientadora)

Dra. Maria Raquel Figueiredo (Far-Manguinhos/FIOCRUZ)

.

Dra. Lavínia de Carvalho Brito (DBB/LARAMG-UERJ)

Dr. Antonio Jorge R. da Silva (NPPN-UFRJ)

Dr. Marco Edílson Freire de Lima (DEQUIM-UFRuralRJ)

Dr.Victor Marcus Rumjanek (DEQUIM-UFRRJ)

À Elise Regina Rodrigues Carvalho

Pelo amor, compreensão e pelo incentivo necessário para enfrentar este desafio.

À Colomba Ribeiro da Costa (In Memorian).

Por em vida ter incentivado e contribuído para meu desenvolvimento.

Se o homem não sabe a que porto se dirige, nenhum vento lhe será favorável.

(Sêneca, filosofo latino, 4 a.C. – 65 d. C.)

AGRADECIMENTOS

- Ao Prof. Dr. Mário Geraldo de Carvalho pela amizade, orientação, ensinamentos, meu

sincero respeito e a sua família pela forma calorosa com que sempre fui recebido.

- À Prof

a

Dra Maria Auxiliadora Coelho Kaplan, pelo constante apóio,incentivo,

ensinamentos e principalmente pela amizade, mais uma vez minha sincera gratidão;

- À Prof

a

Dra Rosane Nora Castro por estar sempre de prontidão, toda vez que necessitei de

seu auxílio;

- Aos professores do do PPGQO pela formação e evolução profissional;

- Dra Tânia Sarmento e á Dra Maria de Fátima Agra que me cederam a espécie Ouratea

hexasperma para o estudo.

Ao Prof. Dr. Edilberto Rocha Silveira do CENAUREM, Curso de Pós-graduação em Química

Orgânica da UFC pela obtenção dos espectros a 500 MHz;

- A FIOCRUZ (CIVA),Erika e Pedro pela obtenção de espectros a 500 MHz;

- A Faculdade de Farmácia USP-Ribeirão Preto pelos espectros de massas de alta resolução ;

- Ao Prof. Dr. Ronald Bastos Freire (IB-UFRRJ), juntamente com a aluna de mestrado Renata

da Silva Ribeiro pela realização dos teste antiparasitários;

- Aos técnicos do ICE-UFRRJ, Francis, Eli, Carlão, Fábio, Maurício, Rui, Aldir, Conceição,

Áurea Tatagiba (In Memoriam);

- Aos amigos do LQPN-UFRuralRJ: Virginia, Mário Sérgio, Marli,Juliana, Ildomar, Luiz

Roberto (Pilha), Maritza, pela amizade e pelos momentos de alegrias, tristeza e desespero que

passamos, mas que certamente fortaleceram nossos elos E ao mais recente amigo Eduardo

(Ceará) a quem desejo muito sucesso;.

- À amiga Virginia Claudia, cuja agitação e inconformidade, em alguns momentos me

serviram como estimulo;.

- À Maritza Cardozo pela alegria de uma convivência feliz e harmoniosa.;

-À Lorena, aluna de iniciação científica, pela amizade e auxílio durante a realização deste

trabalho;

-Aos demais alunos de iniciação cientifica Ana Paula, Aline, Alessandra, Jose Geraldo, pela

amizade e agradável convivência;

- A todos os colegas do PPGQO pelo bom convívio;

- Especial aos amigos Cláudio, Ari; Andréa Rosane, Bauer,

- Á Regina, grande amiga e parceira durante toda esta trajetória;

- Desde já a banca examinadora pelas sugestões e correções sugeridas a esse trabalho;

- À UFRRJ pela oportunidade e tão agradável acolhimento;

- Ao Cnpq pela concessão da bolsa de estudos e a CAPES e FAPERJ pelo apoio financeiro

aos projetos do nosso grupo de pesquisa;

- Á turma das sextas-feiras no Bar do Arnaldo com discussões complementares a formação

Prof

a

.Áurea, Prof. Braz, Prof. Waldomiro, Ildomar, Regina, Heloisa, Juliana, Ari, Kenia,;

- Aos meus familiares pelo apoio e confiança depositada;

- À minha mãe, manifestação de Deus em minha vida;

- A todos que de alguma forma me ajudaram na realização desse trabalho;

- E a cima de tudo a DEUS.

ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS

I

ÍNDICE DE TABELAS

VII

ÍNDICE DE ESQUEMAS

VIII

ÍNDICE DE FLUXOGRAMAS

IX

ÍNDICE DE QUADROS

X

LISTA DE ABREVIATURAS

XI

RESUMO

XII

ABSTRACT

XIII

INTRODUÇÃO

1

CONSIDERAÇÕES SOBRE OS GENEROS Ouratea E Luxemburgia

(OCHNACEAE)

4

PARTE EXPERIMENTAL

12

ESTUDO QUÍMICO DE ESPÉCIES DE OURATEA

12

EQUIPAMENTOS E REAGENTES 12

REAÇÕES DE DERIVAÇÃO 13

Reação de metilação com diazometano

13

Reação de acetilação.

13

Ouratea hexasperma St. Hil

14

MATERIAL VEGETAL. 14

ELABORAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS 14

Ouratea cuspidata St. Hil.

19

MATERIAL VEGETAL 19

E

LABORAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS 20

RESULTADOS E DISCUSSÃO

24

Identificação dos constituintes isolados de inflorescência de Ouratea

hexasperma (St. Hil).

26

Campesterol (1), Estigmasterol (2) e Sitosterol (3)

26

3-β-O-β-D-glicopiranosil sitosterol (4)

30

3-β-O-β-D-tetracetil glicopiranosil sitosterol (4a)

31

3-β-O–acil–olean–12-en–28-óico (5)

32

Rutina (6)

36

Orientina e Vitexina (7+8)

42

Swertisina (9)

53

Swertiajaponina (10)

57

Identificação dos constituintes isolados do caule de Ouratea hexasperma

(St. Hil).

57

Ácido 2,4-diidroxifenil acético (11)

63

3,4’,5-triidroxi-6-δ,δ-dimetilalil -7-O-β-D-glicopiranosil-flavanona (12)

66

3,4’,5-triidroxi-6-δ,δ-dimetilalil -7-O -β-D-glicopiranosil-flavona (13)

79

3,4’-dimetoxi-5-hidroxi-6-δ,δ-dimetilalil-7-O-β-D glicopiranosil–flavona (13a)

88

3,5,4’,2’’3’’,4’’,6’’heptaacetil-6-δ,δ-dimetilalil7-O-β-D-glicopiranosilflavona(13b)

90

Identificação dos constituintes isolados das folhas de Ouratea cuspidata.

St Hil

95

Lupeol (14), α-Amirina,(15) β-Amirina.(16)

95

Amentoflavona (17)

96

Tetrametilamentoflavona (17a)

100

Peracetilamentoflavona (17b)

109

Putraflavona (18)

113

5,7,4’ triidroxi-3’,5’ dimetoxi-flavona (19)

127

Identificação dos constituintes isolados de caule de Ouratea cuspitada

(St Hil)

132

1-Metil βD-glucopiranosil (20)

132

4’, 3, 5, 7-tetraidroxi-3’-metoxi flavonol (21)

134

5, 4’,7-triidroxi-3’-metoxi-3-β-O-galactopiranosil flavona (22)

136

ASPECTOS GERAIS DA BIOSSÍNTESE DE CONSTITUINTES DE O. hexasperma E

O. cuspidata.

140

Atividade Biológica.

Preparação das Amostras 147

Ensaios de bioproteção contra a geração de radicais livres 147

Teste de ação antiparasitária 149

Curva de crescimento 149

Teste de exclusão do Azul de Trypan 150

Medidas de atividade mitocondrial 153

Atividade Antiinflamatória 155

Avaliação da capacidade de fagocitose dos macrófagos 155

CONCLUSÃO

158

REFERÊNCIAS

159

I

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1

Dímeros de flavonóides 5

Figura 2

Estrutura de flavonóides isolados de espécies de Ouratea e

Luxemburgia

9

Figura 3

Espestro de RMN

1

H das substâncias 1+2+3 em CDCl

3

(200

MHz).

27

Figura 4:

Espectro de RMN de

13

C das substâncias 1+2+3 CDCl

3

(200

MHz).

27

Figura 5

Cromatograma da mistura dos esteróides 1+2+3. Indicando os

picos de 1 e 2.

28

Figura 6

Espectro de massas de (1) comparado com biblioteca do aparelho 28

Figura 7

Espectro de massas de (2) comparado com biblioteca do aparelho. 29

Figura 8

Espectro de massas de (3) comparado com biblioteca do aparelho. 29

Figura 9

Espectro de I V da substância 4. 30

Figura 10

Espectro de RMN de

1

H da substância 4 em piridina d

5

. (200

MHz)

30

Figura 11

Espectro de RMN

1

H (200 MHz, em CDCl

3

) da substância 4a 31

Figura 12

Espectro de RMN

1

H da substância 5 em CDCl

3.

(200MHz). 34

Figura 13

Espectro de RMN

13

C da substância 5 em CDCl

3

. (50MHz). 34

Figura 14

Expansão do espectro de RMN

13

C da substância da 5 entre 15 a

56 ppm em CDCl

3.

(50MHz)

35

Figura 15

Espectro de I V da substância 6 38

Figura 16

Espectro de RMN

1

H (200 MHz) da substância 6 em DMSO-d

6

38

Figura 17

Expansão do espectro de RMN

1

H (200 MHz DMSO-d

6

) da

substância 6 entre 1–8 ppm.

39

Figura 18

Espectro de

13

C (BBD 50 MHz) da substância 6 em DMSO-d

6

. 40

Figura 19

Espectro de RMN de

13

C (BBD e DEPT 50 MHz) da substância 6

em DMSO-d

6

.

41

Figura 20

Espectro de I V da mistura de substâncias 7+8. 45

Figura 20

Espectro de RMN

1

H (400MHz) da mistura das substâncias 7+8

em DMSO-d

6

.

45

Figura 21

Expansão do espectro de RMN

1

H (400 MHz) da mistura 7+8 em

DMSO-d

6

entre 6,2 – 8,2 ppm.

46

Figura 22

Expansão do espectro de RMN

1

H (400 MHz) na região de

açúcares entre 3–5 ppm da substância 7+8.

47

Figura 23

Espectro de RMN

13

C (100 MHz) da mistura das substâncias 7+8.

em DMSO-d

6

.

47

Figura 24

Expansão do espectro de RMN

13

C (100 MHz) da mistura das

substâncias 7+8 entre 145–183 ppm em DMSO-d

6

.

48

Figura 25

Expansão do espectro de RMN

13

C (100 MHz) da mistura das

substâncias 7+8 entre 97–130 ppm em DMSO-d

6

.

48

Figura 26

Expansão do espectro de RMN

13

C (100 MHz) da mistura das

substâncias 7+8 em DMSO-d

6

.

49

Figura 27

Espectro RMN

13

C DEPT 100 MHz substância 7+8.em DMSO-d

6

50

II

Figura 28

Mapa de contorno HMQC (400/100 MHz DMSO-d

6

) na região de

C-sp

2

(95-132 ppm) da mistura das substâncias 7+8.

51

Figura 29

Mapa de contorno de HMQC (400/100 MHz DMSO-d

6

) das

substâncias 7+8 na região de C-sp

3

(30 – 85 ppm).

52

Figura 30

Espectro de RMN

1

H (500 MHz) da substância 9 em DMSO-d

6

55

Figura 31

Espectro de RMN-NOEDIFF (200 MHz DMSO-d6) da substância

9.

56

Figura 32

Espectro de RMN

1

H (200 MHz, DMSO-d

6

) da substância 10 59

Figura 33

Espectro de RMN

13

C (50 MHz, DMSO-d

6

) da substância 10. 60

Figura 34

Espectro de RMN–NOEDIFF (200 MHz) da substância 10. 61

Figura 35

Espectro de I V da substância 11. 63

Figura 36

Espectro de RMN

1

H (200 MHz CD

3

OD) da substância 11 64

Figura 37

Espectro de RMN

13

C(BBD 50MHz DMSO-d

6

) da substância 11. 64

Figura 38

Cromatograma da substância 11 65

Figura 39

Espectro de massas da substância 11. [ Coluna CPSIL8CB (30m x

0,25 x 0,25mm), Temperatura: 180C/1min-10C/min–290/20min.

Ionização: EI (70eV)].

65

Figura 40

Espectro de RMN

1

H (200 MHz) DMSO-d

6

. (Região 8,0-12 ppm é

apresentada no centro da figura).

71

Figura 41

Espectro de RMN

13

C(BBD, 50 MHz) DEPT θ= 135, DMSO-d6

da substância 12

72

Figura 42

Mapa de contorno HETCOR (200/50 MHz DMSO-d

6

) da

substância 12

73

Figura 43

Mapa de contorno COLOC (200/50 MHz) DMSO-d

6

da substância

12

74

Figura 44

Mapa de contorno

1

Hx

1

H COSY da substância 12. 75

Figura 45

Espectro de NOEDIFF (200 MHz) DMSO-d

6

substância 12, com

impureza de 13.

76

Figura 46-a

Espectro de massas de alta resolução da substância 12 obtido com.

Ionização elétron spray (IES) e detecção de íons negativos.

77

Figura 46-b

: Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico m/z 553

(46-a) da substância 12 obtido com Ionização electrospray (IES) e

detecção de íons negativos.

77

Figura 46-c

Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico 517 (46-a)

da substância 12. obtido com Ionização electrospray (IES) e

detecção de íons negativos.

78

Figura 46-d

Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico 515 (46-a)

da substância 12. obtido com Ionização electrospray (IES) e

detecção de íons negativos

78

Figura 47

Espectro de RMN

1

H (200 MHz) DMSO-d

6

da substância 13

Substancia 12.*

82

Figura 48

Espectro de RMN

13

C (BBD), DEPT θ 135 (50 MHz DMSO-d6)

da substância 13.

83

Figura 49:

Mapa de contorno HETCOR (50 MHz DMSO-d

6

) da substância

13.

84

Figura 50

Mapa de contorno

1

Hx

1

H COSY (200 MHz DMSO-d

6

)

de 13 85

III

Figura 51-a

Espectro de massas de alta resolução da substância 13, obtido com

Ionização elétron Spray (IES) e detecção de íons negativos.

86

Figura 51-b

Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico 515 (51-a)

da substância 13, obtido com Ionização elétron Spray (IES) e

detecção de íons negativos

86

Figura 51-c

Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico 399 (51-a)

da substância 13, obtido com Ionização elétron Spray (IES) e

detecção de íons negativos

87

Figura 52

Espectro de RMN-NOEDIFF (200 MHz DMSO-d

6

) da substncia

13a

89

Figura 53

Espectro de RMN

1

H (200 MHz DMSO-d

6

) da substância 13b 90

Figura 54

Espectro de RMN 1H (200 MHz DMSO-d

6

) expansão da região

entre 2,7-1,0 ppm da substância 13b.

91

Figura 55

Modelos para atribuição dos dados de RMN

13

C do derivado

acetilado (13b).

92

Figura 56

Espectro de RMN

13

C (BBD 50 MHz CDCl

3

) do derivado 13b. 93

Figura 57

Espectro de RMN

1

H (200MHz, CDCL

3

) das substância 14, 15, e

16.

95

Figura 58

Espectro de RMN

1

H (200 MHz, CD

3

COCD

3

) da substância 17 98

Figura 59

Espectro de RMN

13

C (200 Mhz, CD

3

COCD

3

) da substância 17 99

Figura 60

Espectro de RMN

1

H (500 MHz CDCl

3

) substância 17a. 102

Figura 61

Expanção do espectro de RMN

1

H (500MHz CDCl

3

) substância

17a entre 6,5 a 8,5ppm.

102

Figura 62

Mapa de contorno RMN 2D HMQC

(500 MHz CDCl

3

) ampliado

em 6,3 – 8,0 ppm da substância 17a

103

Figura 63

Mapa de contorno RMN 2D de HMBC (500 MHz CDCl

3

)

ampliado em 6,5–7,5 ppm da substância 17a.

104

Figura 64

Mapa de contorno RMN 2D de HMBC (500 MHz CDCl3)

ampliado em 6,5 – 7,3 ppm da substância 17a

105

Figura 65

Mapa de conotorno de HxH COSY (500 MHz, CDCl

3

) da

substância 17a

106

Figura 66

Mapa de contorno de RMN-2D HMBC (500 MHz, CDCl3)

ampliado em 3,7 – 4,0 ppm. Da substância 17a

107

Figura 67

Mapa de cotrono RMN 2D NOESY (500 MHz, CDCl

3

) ampliado

em 3,7 – 4,0 ppm da substância 17a

108

Figura 68

Espectro de RMN

1

H (200 MHz, CDCl

3

) do derivado 17b 111

Figura 69

Espectro de RMN

13

C (BBD, 50 MHz CDCl

3

) do derivado 17b 111

Figura 70

Expansão do espectro de RMN

13

C (BBD, 50 MHz CDCl

3

) do

derivado 17b. Entre a região 105-180 ppm.

112

Figura 71

Espectro de RMN

1

H (500 MHz, DMSO-d

6

) da substância 18 115

Figura 72

Espectro de RMN

1

H (500 MHz, DMSO –d

6

) da substância 18

ampliado entre 6,2 – 8,2 ppm.

116

Figura 73: Mapa de contornode

1

Hx

1

H COSY (500 MHz, DMSO-d

6

) da

substância 18.

117

Figura 74

Espectro de RMN

13

C(BBD 500 MHz, DMSO-d

6

) da substância

18

118

Figura 75

Expanção Figura 74 entre 92–135 ppm. 118

IV

Figura 76

Expanção do espectro de RMN

13

C (BBD, 500 MHz, DMSO-d6)

da substância 18, entre 155 – 185 ppm

119

Figura 77

Mapa de contorno HMQC (500/125 MHz, DMSO-d

6

) da

substância 18.

120

Figura 78

Mapa de contorno HMBC ( 500/125 MHz, DMSO –d

6

) da

substância 18

121

Figura 79

Mapa de contorno HMBC (500/125 MHz, DMSO –d

6

) da

substancia 18 entre 101–125 ppm.

122

Figura 80

Mapa de contorno HMBC (500/125 MHz, DMSO- d

6

) da

substância 18, entre 157–169 ppm.

123

Figura 81

Mapa de contorno HMBC (500/125 MHz, DMSO –d

6

) da

substância 18, entre 96 – 108 ppm.

124

Figura 82

Mapa de contorno HMBC (500/125 MHz, DMSO –d

6

) da

substância 18, entre 159 – 169 ppm

125

Figura 83

Espectro de RMN-NOEDIFF da substância 18 126

Figura 84

Espectro de RMN

1

H ( 200 MHz, CDCl

3

) da substância 19 129

Figura 85

Espectro de RMN

13

C (50 MHz, CDCl

3

) da substância 19 129

Figura 86

Espectro de RMN-NOEDIFF da substância 19 130

Figura 87

Espectro de RMN

1

H (200 MHz, DMSO-d

6

) da substância 20 133

Figura 88

Espectro de RMN

13

C (BBD 50 MHz, DMSO-d

6

) da substância 20 133

Figura 89

Espectro de RMN

1

H (200 MHz, DMSO-d

6

) da substancia 21 134

Figura 90

Espectro de RMN

1

H NOEDIFF ( 200 MHz DMSO-d

6

)da

substância 21

135

Figura 91

Espectro de RMN

1

H NOEDIFF ( 200 MHz DMSO-d

6

)da

substância 21

135

Figura 92

Espectro de RMN

1

H (500 MHz DMSO-d

6

) da mistura contento a

substância 22

137

Figura 93

Expansão do espectro de RMN

1

H(500 MHz, DMSO-d6) da

mistura contendo a substância 22 entre as regiões 4,5-8,0 ppm

137

Figura 94

Espectro de RMN

13

C (125 MHz DMSO-d

6

) da fração contendo a

substância 22. * Sinais de outros glicosideos presentes na fração

138

Figura 95

Expanção da figua 94 na região entre 115-180 ppm 138

Figura 96

Espectro de RMN

13

C (DEPT 135, 125 MHz DMSO-d

6

)

expandido entre as regiões 55-85 ppm da fração contendo a

substância 22. * Sinais de outros glicosideos presentes na fração

139

Figura 97

Curva padrão de malonildialdeído (MDA) gerada através da indução de

radicais livres , medidos espectrofotométricamente a 532nm frente a um

padrão de malonildialdeído adquirido comercialmente (Fisher, USA,

AC14861-1000). Os resultados representam a média de quatro

repetições adicionadas do erro padrão (p≤0,01)

148

Figura 98

Figura 98: Ensaio de redução de radicais livres com extratos de

Ouratea cuspidata. Concentrações diferentes do extrato metanólico

(barras negras), do extrato hexânico (barras cinzas) e do extrato acetato

de etila (barras listradas) foram adicionadas a sistema biológico gerador

de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os tubos foram

lidos a 540 nm e a concentração de TBARS determinada contra uma

curva padrão malonildialdeído (barra branca) em nnMoles por mL. Os

resultados são a média de quatro repetições acrescidas do erro padrão

(p≤0,5). O círculo evidência a maior eficiência bioprotetora da fração

metanólica em relação às demais

148

V

Figura 99

Curva de crescimento de promastigotas de Leishmania (Viannia)

braziliensis (L566+OCMeOH) em meio axênico bifásico (NNN)

adicionado de 16 mg/mL de extrato metanólico de Ouratea cuspidata

(OCMeOH), em relação ao sistema controle (L566) constituído de

promastigotas não expostas ao extrato. Os resultados expressam a média

de quatro observações turbidimétricas, adicionadas do erro padrão (

p≤0,01).

150

Figura 100

Viabilidade de promastigotas de Leishmania braziliensis (L566) e de

macrófagos peritoneais (Mφ) de hamsters (Crycetus crycetus) frente a

diferentes concentrações do extrato metanólico de Ouratea cuspidata .

Os pontos assinalados representam a média de quatro observações

adicionadas do erro padrão. As diferenças foram analisadas através de

ANOVA, sendo considerados significativas quando p≤0,05.

152

Figura 101

Alterações morfológicas de promastigotas de Leishmania braziliensis

(L566) e de macrófagos peritoneais (Mφ) de hamsters (Crycetus

crycetus) frente a diferentes concentrações do extrato metanólico de

Ouratea cuspidata . Os pontos assinalados representam a média de

quatro observações adicionadas do erro padrão. As diferenças foram

analisadas através de ANOVA, sendo considerados significativas

quando p≤0,05

152

Figura 102

Medidas de Absorbância da atividade enzimática mitocondrial em

macrófagos peritoneais (Mφ) de hamsters (Cricetus cricetus), através da

dosagem de formazana, gerada pelo desdobramento fisiológico do

brometo de metiltetrazólico (MTT), após exposição por 24 horas a

diferentes concentrações do extrato metanólico de Ouratea cuspidata

(OCMeOH). N= 5 (p≤0,05

154

Figura 103

Medidas de Absorbância da atividade enzimática mitocondrial em

promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (L566) através da

dosagem de formazanas, geradas pelo desdobramento fisiológico do

brometo de metiltetrazólico (MTT), após exposição por 24 horas a

diferentes concentrações do extrato metanólico de Ouratea cuspidata

(OCMeOH). N= 5 (p≤0,05)

154

Figura 104

Percentual de endocitose de parículas inertes (Zymozan) em macrófagos

peritoneais de hamsters (Cricetus cricetus) tratados com diferentes doses

do extrato metanólico de Ouratea cuspidata (OCMeOH) durante duas

horas a 37°C, 5% CO

2

, em comparação ao controle constituído por

células não tratadas. Os resultados estão expressos como sendo a média

de quatro repetições por concentração analizada adicionados do erro

padrão (p≤0,01).

156

Figura 105

Percentual de bioproteção contra a geração de radicais livres por

diferentes concentrações da fração metanólica de Ouratea cuspidata

(OCMeOH). Os resultados representam a média de quatro repetições de

ensaios realizados “in vitro” onde as diferentes concentrações do extrato

vegetal foram adicionadas sobre sistema gerador de substâncias reativas

ao ácido tiobarbitúrico (TBARS).

156

VI

Figura 106

Curva de regressão linear evidenciando a hormese bioprotetora obtida

pela adição da fração metanólica de Ouratea cuspidata (OCMeOH)

sobre sistema biológico sujeito à indução de radicais livres reativos ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os resultados estão representados como a

média de quatro repetições acrescidos do erro padrão (p≤0,01).

157

VII

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1

Ocorrência de flavonóides em espécies dos gêneros Ouratea e Luxemburgia

(Ochnaceae.)

7

Tabela 2

Dados de RMN

13

C da substância 5 comparada com a literatura 32

Tabela 3

Atribuição dos dados de RMN

1

H e de

13

C da substância 6 e comparação com

deslocamentos químicos de carbono 13 registrados na literatura

37

Tabela 4

Dados de RMN

1

H e

13

C incluindo acoplamento heteronuclear (HMQC) da

substância 7 e comparação com δ

H

e δc da orientina

43

Tabela 5

Dados de RMN

1

H e

13

C incluindo acoplamento heteronuclear (HMQC) da

substância 8 e comparação com δ

H

e δc da vitexina

44

Tabela 6

Dados de RMN

1

H (500 MHz) e RMN

13

C (125 MHz)da substância 9 em

DMSO-d

6

comparado com a literatura em D

3

COD (KUMARASAMY, et. al,

2004). ª DMSO-d

6

;

b

D

3

COD

54

Tabela 7

Dados de RMN

1

H e

13

C (200 MHz, 50 MHz) (DMSO-d

6

) da substância 10 e

comparação com valores de deslocamento químico de carbono-13 da

literatura (KUMARASAMY, et. al., 2004).

58

Tabela 8

Dados de RMN

1

H (200 MHz) e

13

C (BBD, 50 MHz), em CD

3

OD 61

Tabela 9

Dados de RMN

1

H * (δ, J Hz, DMSO-d

6

) (200 MHz)

13

C (50 MHz) da

substância 12

68

Tabela 10

Dados de RMN

1

H e

13

C (200 e 50 MHz, DMSO-d

6

) da substância 12 com

parados com dados de RMN

1

H e

13

C (500 e 125 MHz, DMSO-d

6

) do modelo

da literatura

69

Tabela 11

Dados de RMN

1

H e

1

H-

1

H-COSY (200 MHz)

13

C , 2D HETCOR, em

DMSO-d

6

da substância 13

80

Tabela 12

Tabela de dados de RMN

13

C e 1H de 13b comparados com dados de RMN

13

C de modelos da literatura (SILVA 2002; BASTOS et al., 2002)

92

Tabela 13

Dados de RMN

1

H e

13

C (200 MHz , 50 MHz, D

3

CCOCD

3

) da substância 17 97

Tabela 14

Dados de RMN

1

H (500 MHz),

13

C (125 MHz) 1D e 2D da substância 17a

(CDCl

3

).

101

Tabela 15

Dados de RMN

1

H e

13

C (200 e 50 MHz CDCl

3

) do derivado 17b comparado

com valores de RMN

1

H e

13

C (400 e 100 MHz CDCl

3

) da literatura

(VELANDIA et al, 2002)

110

Tabela 16

Dados de RMN

1

H e

1

H-

1

H-COSY (500MHz)

13

C (125MHz) e 2D da

substância 18 em DMSO-d

6

114

Tabela 17

Dados espectrométricos de RMN

1

H-NOEDIFF da substância 18 115

Tabela 18

-Dados de RMN

1

H e

13

C (200 MHz e 50 MHz, em CDCl

3

) da substância 19

e comparação com RMN

1

H

e

13

C (400 MHz e 100 MHz, em DMSO-d

6

) da

literatura (KWABARA et al., 2003).

128

Tabela 19

Dados espectrométrico de experimento RMN

1

H NOEDIFF da substância 19 128

Tabela 20

Dados de RMN

13

C(BBD, 50 MHz DMSO-d

6

) da substância 20 comparada

com valores da literatura

132

Tabela 21

Dados de RMN

1

H e

13

C (500 e 125 MHz DMSO-d

6

) do constituinte

majoritário da fração da fração 22 (5,4’,7-triidroxi-3’-metoxi-3-β-O-D-

galactopiranosil flavona com valores da literatura (CARVALHO et al., 2001

e DANIEL, 2004).

136

VIII

ÍNDICE DE ESQUEMAS

Esquema 1

Proposta de fragmentação e constituição dos íons compatíveis com os

valores dos picos detectados nos espectros de massas de 12.

70

Esquema 2

Proposta de fragmentação e constituição dos íons compatíveis com os

valores dos picos detectados nos espectros de massa de 13.

81

Esquema 3

Rota biossintética geral para flavonóides. (Adaptado de DEY et al., 1997;

DEWICK, 1997).

141

Esquema 4

Proposta biossintética de dimerização na formação da amentoflavona e

putraflavona

142

Esquema 5

Proposta biossintética da formação das substâncias 12 e 13 (adaptado de

DEWICK, 1997).

143

Esquema 6

Proposta biogenética para os esteróides isolados de O. cuspidata e O.

hexasperma (Adaptado de MANN,1994; DEWICK, 1997)

145

Esquema 7

Rota biossintética de formação dos triterpenos isolados das espécies O.

cuspidata e O. hexasperma. (Adaptado de DEWIK, 1997)

146

IX

ÍNDICE DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1

Preparação e fracionamento do extrato metanólico da inflorescência

de O. hexasperma St. Hil

16

Fluxograma 2

Fracionamento cromatográfico da fração OHIMAc 17

Fluxograma 3

Preparação e fracionamento do extrato metanolico do caule de O.

hexasperma st. Hil.

19

Fluxograma 4

Preparação e fracionamento cromatográfico dos extratosdas folhas

de Ouratea cuspidata

21

Fluxograma 5

Preparação e fracionamento cromatográfico do extrato metanólico

do caule de Ouratea cuspidata

23

X

ÍNDICE DE QUADROS

Quadro 1

Constituintes químicos isolados de inflorescência de Ouratea

hexasperma

25

Quadro 2

Constituintes químicos isolados de caules de Ouratea hexasperma 62

Quadro 3

Constituintes químicos isolados de folhas de Ouratea cuspidata 94

Quadro 4

Constituintes químicos isolados de caules de Ouratea cuspidata; 131

XI

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

δ

deslocamento químico (ppm)

ν

estiramento

M

+

íon molecular

AcOEt acetato de etila

CC cromatografia em coluna (pressão atmosférica)

CCDP cromatografia em camada delgada preparativa

CCDA cromatografia em camada delgada analitica

CG-EM cromatografia em fase gasosa acoplado ao espectro de massas

CDCl

3

clorofórmio deuterado

COLOC COrrelation spectroscopy via log-range couplings

COSY COrrelated SpectroscopY

d

dubleto

dd

duplo dubleto

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO-d

6

dimetilsulfóxido deuterado

EM espectroscopia de massas

eV. electron volt

HBBD(BBD) Hydrogen Band Broad Decoupled

HETCOR Heteronuclear correlated spectroscopy

HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation

HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence

Hz hertz

IV infravermelho

J

constante de acoplamento em Hertz

m

multipleto

m/z

relação carga/massa

MeOH metanol

Me metila

NOE Nuclear Overhauser Effect

NOESY Nuclear Overhauser and Exchangue Spectroscopy

OMe metoxila

P.F. ponto de fusão

RMN

1

H ressonância magnética nuclear de hidrogenio

RMN

13

C ressonância ragnética ruclear de carbono-13

s

singleto

sl

singleto largo

t

tripleto

OBS.: As abreviatura e símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta relação,

encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas universalmente.

XII

RESUMO

Além das considerações sobre a diversidade flavonoídica dos gêneros Ouratea e

Luxemburgia, desenvolveram-se o estudo químico de duas espécies de Ouratea (Ochnaceae):

O. cuspidata, coletada na restinga do município de Barra de Maricá-RJ e O. hexasperma,

coletada na região de tabuleiro, município de João Pessoa-PB, Brasil. As substâncias descritas

nesta investigação fitoquímica foram isoladas através de partição com solventes e técnicas

cromatográficos de extratos obtidos através de maceração a frio com hexano, acetato de etila e

metanol. As estruturas foram determinadas através da análise de dados fornecidos por

espectrometria na região do infravermelho, de massas, RMN

1

H e

13

C (técnicas 1D e 2D) das

substâncias naturais e de alguns derivados. Do extrato metanólico das inflorescências de O.

hexasperma foram isolados campesterol, sitosterol, estigmasterol, ácido 3-β-O-acil-olean-12-

en-28-óico, 3-β-O-D-glicopiranosil-sitosterol, os flavonóides, orientina, vitexina, rutina,

swertisina e swertiajaponina; do extrato metanólico dos caules dessa espécie isolaram-se o

ácido 1,5-diidroxifenilacético, 3,4’,5-triidroxi-6-prenil-7-O-βD-glicosil-flavanona e 3,4’,5-

triidroxi-6-prenil-7-O-β-D-gli-copiranosil-flavona. Das folhas de O. cuspidata foram isolados

lupeol, α-amirina, β-amirina, amentoflavona, putraflavona e 5,7,4’-triidroxi-3’,5’-dimetoxi-

flavona. Esse estudo com os caules dessa espécie forneceu 4’,3,5,7-tetraidroxi-3’-metoxi-

flavonol, 4’,3,5,7-tetraidroxi-3’-metoxi-3-β-O-D-galctopiranosil-flavona e metil-β-D-

glicopira-nosídeo. Os glicosil-prenil-flavonóides são novos na literatura. Os extratos de O.

cuspidata foram submetidos à avaliação de atividade antiparasitária frente a Leishmania

brasiliensis.

XIII

ABSTRACT

Besides the considerations concerning the flavonoidic biodiversity of Ouratea and

Luxemburgia genera, the chemical study of two Ouratea (Ochnaceae) species was achieved.

O. cuspidata, collected in the beach ridge of Barra de Maricá township, RJ and O.

hexaseperma, collected in tabuleiro region, João Pessoa township, PB, Brazil. The described

substances in this phytochemical investigation were isolated using solvent partition and

chromatographyc technique of the extract obtained by cold maceration with hexane, ethyl

acetate and methanol. The structures were determined by IR, MS and

1

H and

13

C NMR (1D

and 2D techniques) analysis of natural substances and of some derivatives. From the

inflorescence methanol extract of O. hexasperma were isolated campesterol, sitosterol,

stigmasterol, 3-β-O-acyl-olean-12-en-28-oic acid, sitosterol-3-O-βD-glycopyranoside, the

flavonoids, orientin, vitexin, rutin, swertisin and swertiajaponin; from the methanolic extract

of stem of this specie the 1,5-dihydroxyphenylacethyc acid, flavanone-3,4’,5-trihydroxi-6-

prenyl-7-O-βD-glycopyranoside, and flavone-3,4’,5-trihydroxi-6-prenyl-7-O-βD-

glycopyranoside were isolated. From the O. cuspidata leaves were isolated lupeol, α-amyrin,

β-amyrin, amentoflavone, putraflavone and 5,7,4’-trihydroxy-3’,5’-dimethoxy-flavone. The

same study of the stem of this specie yielded 4’,3,5,7,-tetrahydroxy-3’-methoxy-flavonol,

4’,3,5,7-tetrahydroxy-3’-methoxy-3-β-OD-galactopiranosyl-flavone and methyl-βD-

glycopiranoside. The glycopiranosyl-prenyl-flavonoids are new in the literature. The extracts

of O. cuspidata were avaluated as antiparasitic against Leishmania brasiliensis.

1

INTRODUÇÃO

O Brasil é certamente um dos países que possui maior diversidade de plantas

terrestres, comportando entre 15 a 20% de todas as espécies conhecidas. Nesse sistema as

Angiospermae destacam-se constituindo cerca de 16 a 20% do total mundial. Esses valores

representam uma fração substancial da diversidade do globo mas, junto com uma condição

privilegiada, impõe ao Brasil uma grande responsabilidade na exploração, utilização e

preservação dessa biodiversidade.(SHEPHERD, 2002).

As principais causas da perda da diversidade genética têm sido associadas à

destruição, fragmentação dos ecossistemas e aos estresses ambientais como a poluição e as

mudanças climáticas globais. A preocupante taxa de extinção de espécies vegetais leva à

necessidade de se considerar urgente o estabelecimento de políticas e ações de conservação.

Entre as diversas ações de proteção dos ecossistemas, está a avaliação do conhecimento

etnobotânico acumulado há milênios pelas comunidades a eles associadas além dos estudos

químico e farmacológico das espécies para, através de dados científicos, dar orientações no

uso popular de plantas.(NODARI, et al., 2000).

Nesses estudos estão incluídas as formas de preservar as espécies, levando em

consideração o ambiente no qual as mesmas se desenvolvem. O entendimento que

microconstituintes respondendo pela utilidade das diferentes partes das plantas dependem do

ecossistema onde elas se desenvolvem, é um dos fatores mais relevantes sobre a utilização de

espécies vegetais.

A química de produtos naturais está inserida no contexto da biodiversidade, pois além

do conhecimento dos constituintes químicos relacionados às espécies em estudo, gera também

informações para o entendimento de outras áreas de conhecimento como ecologia química,

quimiotaxonomia, etnofarmacologia, genética, farmacologia, bioquímica, etc. Os profissionais

da área de química de produtos naturais sempre deram maior atenção ao estudo das

substâncias micromoleculares, mas ultimamente têm produzido trabalhos com estruturas mais

complexas, não se limitando às substâncias elaboradas via processos do metabolismo especial.

O avanço tecnológico tem permitido o aperfeiçoamento da ligação entre os trabalhos de

química de produtos naturais, bioquímica e farmacologia. A evidência disso pode ser

confirmada pelos surgimento de novos títulos de divulgações cientificas como:

“Phytomedicine”, “Biochemical Systematics and Ecology”, “Journal Nat. Cancer Inst.”,

Journal Med. Biol. Res.”, etc além da exigência no mercado de trabalho de profissionais com

formação mais diversificada.

Em todo este contexto o parâmetro mais considerado sobre o conhecimento cientifico

de plantas está relacionado aos estudos que contribuem para indústria farmacêutica,

procurando soluções para os problemas relacionados com a saúde humana.

Diferentes classes químicas de produtos naturais originaram diversos fármacos, de

distintas categorias terapêuticas. Curare, alcalóide tetraidroquinolínico, originários da flora da

América do Sul, inspirou os bloqueadores ganglionares representados, entre outros, pelo

hexametoneo, succinilcolina e pancurônio. Os alcalóides indólicos diméricos vincristina e

vimblatina são fármacos eficazes no tratamento de leucemia infantil e são isolados da Vinca

rosea pela empresa farmacêutica Eli Lilly. O diterpeno paclitaxel extraído de Taxus brevifolia

Nutt, é importante antitumoral útil no tratamento do câncer de ovários e mama. É importante

ressaltar que sua atividade biológica foi detectata na década de sessenta e o produto entrou no

mercado quase 25 anos após seu isolamento. Os glicosídeos de Digitalis, que apesar de

apresentarem reduzido índice terapêutico, são empregados até hoje como cardiotônicos em

virtude de não ter sido identificado um substituto adequado com as mesmas propriedades e

mais seguro. Eles podem ser considerados como um dos mais antigos produtos naturais de

2

origem vegetal com aplicação terapêutica. (BARREIROS et al, 2001, SCHENKEL, et al,

2000).

Uma outra forma de fazer uso das virtudes terapêuticas das plantas, sem

necessariamente isolar suas substâncias, é através dos fitoterápicos. Medicamentos originados

exclusivamente de material botânico integral ou seus extratos usados com o propósito de

tratamento médico. Esse tipo de medicamento tem se mostrado atraente principalmente pela

indústria farmacêutica de países desenvolvidos as quais se caracterizam pela alta tecnologia e

rápido crescimento, buscando novas oportunidades de diversificação. A maior restrição que se

tinha para o emprego desses medicamentos era a dificuldade de sua reprodutibilidade e em

quantificar seus constituintes e realizar o seu controle de qualidade. Isso deixava em dúvida

sua eficácia clínica e sua segurança.

O aprimoramento da tecnologia farmacêutica, permitindo melhor controle de

qualidade baseado na moderna tecnologia de isolamento, identificação, determinação

estrutural e quantificação de substâncias químicas vem tornando possível a produção de

fitoterápicos seguros, eficazes e com efeito totalmente reprodutível. Por outro lado os avanços

na pesquisa de fitoterápicos em nível farmacológico e molecular permitiram constatar que

essesprodutos apresentam um mecanismo de ação total ou parcialmente esclarecidos, com

avaliação toxicológica segura e estudos de farmacologia pré-clinicos e clínicos realizados

segundo as normas que regem os processos de validação de fármacos puros. Exemplos podem

ser citados: Hyperium perforatum (erva de São João) largamente prescrito na Europa para

tratamento de distúrbios psíquicos, sua atividade antidepressiva sobre o SNC é devida a

presença de naftodiantronas como a hipericina, pseudohipericina e isohipericina; e as

xantinas; outro exemplo, Serenoa repens cujo extrato lipoesterólico é usado no tratamento da

hiperplasia benigna da próstata. Sua ação baseia-se na inibição da enzima 5α-redutase. Esse

extrato age melhorando tanto as complicações urológicas como as inflamatórias, ou seja, age

em diferentes alvos bioquímicos responsáveis pela etiologia da doença o que seria difícil com

o uso de um único fármaco sintético para o tratamento desta patologia. Outros exemplos: o

Tanacetum partenium empregado para o tratamento da enxaqueca; Allium sativum, usado no

tratamento de problemas cardiovasculares e redução do colesterol; Echinacea púrpurea,

empregada como antiinflamatório e imunoestimulante, são alguns dos fitoterapicos que foram

analisados por vários estudos clínicos(YUNES et. al.,2001, CALIXTO 2001).

A indústria brasileira de fitoterápico é constituída por empresas de pequeno ou médio

porte, fundamentadas apenas no uso popular das plantas sem nenhuma comprovação pré-

clinica, nem clínica, não podendo portanto ser competitiva em nível nacional e muito menos

internacional. Caso os investimentos das empresas em pesquisa, controle de qualidade etc.,

não venham a ocorrer, a defasagem em relação as empresas de fitoterapicos de outros países

irá se ampliar. Como essas empresas estão se internacionalizando, eventualmente associadas

ou incorporadas as multinacionais do setor farmacêutico é razoável supor que o futuro da

produção brasileira de fitoterápicos dependerá diretamente das estratégias das grandes

empresas. O incentivo ao desenvolvimento da indústria de fitoterapico nacional seria uma

política estratégica para a conservação e aproveitamento racional da nossa biodiversidade

(FERREIRA et. al., 1998).

O grupo de pesquisa em química de produtos naturais da UFRRJ tem registrado,

dentre outros trabalhos, estudos de espécies do gênero Ouratea e Luxemburgia (Ochnaceae)

dando valiosas contribuições para o conhecimento da química dessa família, propiciando

subsídios para avaliações quimiotaxonômicas, além de apresentar substâncias com

importantes atividades biológicas contribuindo para busca de novos fármacos (SUZART, et

al.2007). A quantidade de resultados obtidos até o momento com estudo de espécies desses

gêneros orientou a fazer uma coletânia de informações relacionadas a esses gêneros e fazer

considerações sobre eles constituindo o capítulo II deste trabalho

3

Outro objetivo deste trabalho é dar continuidade ao estudo químico de espécies

de Ochnaceae desenvolvendo estudo de Ouratea hexasperma e Ouratea cuspidata. Apesar de

haver estudos anteriores dessas espécies, principalmente de O. hexasperma coletada na

Amazônia (Moreira, 1994, 1999 ) e coletada na Mata Atlântica, Nordeste do Brasil (Daniel,

2005), o estudou versou apenas as folhas dessa planta. Dando continuidade ao estudo desse

material foi desenvolvida a pesquisa com os galhos e inflorescências da planta. Em relação a

O cuspidata fez-se apenas uma comunicação divulgando a presença de carboidratos (SILVA,

et al., 1997). Além do isolamento e identificação dos constituintes das diferentes partes dessas

espécies, procurou-se dentro do possível, preparar derivados dos constituintes verificando a

probabilidade de registrar substâncias novas na literatura; fazer a completa atribuição de

dados espectrométricos das substâncias naturais isoladas e derivados e fazer avaliação de

atividades biológicas de alguns constituintes ou extratos.

.

4

CONSIDERAÇÕES QUIMIOSISTEMATICAS E FARMACOLOGICAS

SOBRE OS GENEROS

Ouratea E.Luxemburgia (OCHNACEAE)

O levantamento na literatura sobre os constituintes químicos desses gêneros (Tabela 1)

permitiu tirar deduções e fazer considerações sobre a biodiversidade da classe de substâncias

mais freqüentes e constatar seus aspectos farmacológicos.

A família Ochnaceae pertence à ordem Theales (DAHLGREN, 1980)

e compreende

cerca de 28 gêneros e 400 espécies de ampla distribuição nas regiões tropicais e subtropicais

de todo o mundo. No Brasil, ocorrem aproximadamente 9 gêneros com 105 espécies

(JOLY,1988). São plantas essencialmente arbóreas ou arbustivas. As espécies de Ouratea

espalhadas pelo país recebem designações específicas como Angelim (Ouratea vaccinoides),

Caju Bravo (Ouratea floribunda e Ouratea salicifolia) e Coração de Bugre (Ouratea

parviflora). Ouratea floribunda e Ouratea castanaefolia são empregadas em ornamentação

urbana. No Nordeste as espécies desse gênero são conhecidas como batiputá (BARROSO,

1986).

As espécies de Ochnaceae, são capazes de biossintetizar flavonóides e biflavonóides,

sendo essa família mais bem representada pelos gêneros Ouratea, Luxemburgia, Ochna e

Lophira. (TIH et al.,1989; TIH, et al., 1992; MESSANGA,et al., 2002;

LIKHITWITAYAWUID, 2001). A freqüência e a diversidade estrutural dos biflavonóides em

espécies desses gêneros permitem utilizá-los como marcadores taxonômicos.

Os biflavonóides constituem uma classe de flavonóides diméricos, diferenciando-se de

outros oligômeros como as proantocianidinas, devido a origem biogenética das unidades

constituintes. A maioria dos representantes dessa classe de produtos naturais é formada pelos

dímeros flavona-flavona, flavona-flavanona, flavanona-flavanona além de ocorrer, mais

raramente, os dímeros de chalconas e de isoflavonas. Quando as duas unidades são iguais

constituem os bisflavonóides e quando as duas unidades são diferentes são os biflavonóides.

As ligações entre as unidades flavonoídicas podem ser C-C ou C-O-C envolvendo os anéis A,

B ou C dos monômeros (Figura 1 Pág, 5). Raramente ocorre alteração no padrão de

oxigenação dos precursores, sendo garantida a oxigenação em 5, 7 e 4' e raramente uma

oxidação adicional em 3'. Podem ocorrer oxidações nas posições 6, 8 ou 3' e quando isso

acontece é, certamente, proveniente da outra unidade ligada nessa posição via C-O-C

(XXXIV, Figura 2, pág, 9). A primeira biflavona, foi isolada em 1929 e é conhecida como

gingentina. Desde então mais de mil biflavonóides foram isolados de plantas e muitas

atividades biológicas, têm sido relacionadas a essa classe de substâncias (LIN et., al 1999).

Utiliza-se a numeração dos biflavonóides atribuindo números ordinários para os anéis A e C e

primados (′) para o anel B de um dos monômeros. Para a segunda unidade empregam-se

números ordinários duplamente primados (′′) para os núcleos A e C e números ordinários

triplamente primados (′′′) para o núcleo B. De acordo com os átomos de carbonos envolvidos

na ligação entre as unidades, os dímeros são classificados em grupos de biflavonóides

(Figura-1),(SIMÕES et al., 2001, CHARI, et. al., 1977, DORA, et. al., 1991) além dos

dímeros de chalconas: C-3→O-C-4''' (luxenchalconas) (DE CARVALHO et al., 2004) e C-

3'→C3'' (brackeninas) (DREWES, et al., 1984) e dos dímeros de isoflavonas C-2→C-2''

(hexaspermonas) (MOREIRA et al.,1994), sem destacar os dímeros com duas ligações entre

as unidades. Certos grupos hidroxila podem apresentar-se metilados originando os respectivos

éteres metílicos que, às vezes, recebem nomes especiais (MOREIRA, et. al., 1999; FELICIO

et al., 1995; VELANDIA et al., 2002; DANIEL et al., 2005).

5

2

3

4

6

8

4'

5'

6'

9

10

7

5

O

OO

O

R

2'

3'

Ο

O

ΟΟ

Ο

3'

2'

5

7

10

9

Ο

O

Ar

Ο

8

6

4

3

2

6'

4'

5'

2"

3"

9"

7"

5"

4'

2'

6'

4

3

2

2"

4'"

Chalconas

Isofla vanona s

Flavonas/Flavanonas

Figura-1. Dímeros de flavonóides.

3'

C-6→C-8'': agatisflavona

C-8→ C-8'': cupressuflavonas

C-3'→ C-8'': amentoflavonas

C-3',5'→ C-6'': robustaflavonas

C-2→C-8'': garcinias

C-3'→C-3'': chamejasminas

C-4'-O→ C-8'': lanaraflavonas

C-3'→O-C-4'': ochanaflavonas

Nos casos dos gêneros Ouratea e Luxemburgia, além de alguns monômeros, tem-se

detectado com freqüência a presença de bi- ou bisflavonóides. Destacando-se as

hexaspermonas (IV-VI), amentoflavonas (XI, XVIII, XXIV), agatisflavonas (XII),

robustaflavona (XXIV) e lanaraflavonas (XV-XVII, XXXIV) em Ouratea, Figura 2. Em

Luxemburgia foram detectados os biflavonóides derivados de chalconas, luxenchalcona

(XXV, C-3'→O-C-4''') e ochnaflavona (XX, também C-3'→O-C-4'''), Figura 2, que pode ter

como precursor a luxenchalcona. Isso permite perceber a diferença entre esses gêneros sendo

que Luxemburgia próximo ao gênero Ochna, que metabolizam com freqüência os dímeros de

chalconas (PEGNYEMB, et. al., 2001). Por outro lado Ouratea tem tendência em metabolizar

com mais freqüência os dímeros de flavonas. A ocorrência de biflavonóides nos gêneros

Ouratea e Luxemburgia permite destacar a importância da química dos mesmos como

potencial farmacológico e considerar substâncias dessa classe como marcadores

quimiotaxonômicos.

Flavonóides identificados nos gêneros Ouratea e Luxemburgia

Além dos flavonóides e biflavonóides, esses gêneros são bioprodutores de outras

classes de metabólitos especiais como triterpenos, diterpenos, depsídeos, ésteres graxos, e

triglicerídeos (VELANDIA et al., 2002; FELICIO et. al., 2004; DE CARVALHO et al., 2000

e 2002; VELANDIA, et al., 1998). Entre essas classes de substâncias os biflavonóides

recebem destaque na literatura, devido a freqüência e abundância com que são encontrados

nesses gêneros e cuja diversidade estrutural é devida, principalmente, aos diferentes padrões

de ligações entre seus monômeros.

Do gênero Ouratea foram isolados biflavonóides dos grupos amentoflavona (XI),

agatisflavona (XXXV), bigenkanina (VIII), podocarpusflavona (XVIII), lanaraflavona (XV)

e seus derivados além de outros derivados de lofironas (XXXII), calodeninas (XXVIII,

XXXI) e flavumonas (XXIX, XXX). A junção de isoflavanonas (C-2→C-2'') deu origem às

hexaspermonas A, B e C (IV; V; VI), respectivamente. A ligação tipo C-O-C é característica

das ochnaflavonas (C-3'→O-C-4'''), das lanaraflavonas (C-4'-O→C-8'') e do grupo das

ochnaflavonas (XX) que ocorrem em espécies de Luxemburgia (DE CARVALHO et al.,

6

2004; OLIVEIRA et. al.,2002) e Ochna (LIKHITWITAYAWUID, 2001). Desse gênero

foram isoladas as chalconas, XXII, XXIII e a bichalcona XXV (C-3→O- C-4'',), Figura 2.

Uma característica do gênero Ouratea é a ligação entre seus monômeros, sendo as

mais abundantes C-3→C-8'' e C-6→C-8'', acrescentando uma variação no padrão de

metilação. No caso dos derivados da agatisflavona (C-6→C-8'') a metilação é mais freqüente

na posição 7 (X). Com ligações (C-O-C), foram isolados os dímeros (C-4'-O→C-8'') e (C-

3'→O-C-4'''), incluindo a ligação entre os monômeros das bichalconas, que são característicos

do gênero Luxemburgia

,

(DE CARVALHO et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2002), enquanto

que de Ouratea isolaram-se os derivados de lanaraflavona (C-4'-O-C-8'') com diferentes

padrões de metilação (XVI, XVII, XXXIV). A forma de ligação e os tipos de monômeros

podem ser usados como diferenciadores entre esses gêneros. A diferença principal entre

ambos é que em Ouratea a biflavona mais abundante é a 7''- metilagatisflavona (X) e de

Luxemburgia a diidroochnaflavona (XX), Figura 2.

As flavonas e flavonóis (3-oxiflavonas) glicosilados são descritos como bioprodutos

de espécies de Ouratea e Luxemburgia. São geralmente derivados da luteolina (5,7,3',4'-

tetraidroxiflavona, XXXVI) e de quercetina (3,5,7,3',4'-pentaidroxiflavona, XXXVII),

podendo ser, inclusive, metilados. A rutina (3-O-rutinosil quercetina, XIX) foi isolada de

Luxemburgia nobilis (OLIVEIRA et al.,2002) e de Ouratea semisserrata (VELANDIA et al.,

2002). Das flores de Luxemburgia octandra foram isolados dois flavonóides 8-C-glicosilas

(XXVI, XXVII), Figura 2. A glicose aparece como o único carboidrato encontrado até o

momento, entre os flavonóides C-glicosilas isolados de espécies desses gêneros. Chama

atenção a presença de isoflavonóides clorados, monoméricos , isolados somente de O.

semisserata (XIII, XIV), além de chalconas presentes em duas espécies do gênero

Luxemburgia (XXII, XXIII).

Aspectos farmacológicos e importância econômica de algumas espécies estudadas.

A avaliação dos trabalhos na literatura permitiu verificar a existência de vários estudos

farmacológicos tanto com frações de extratos brutos como com biflavonóides naturais e seus

derivados isolados de espécies do gênero Ouratea e Luxemburgia.

Os biflavonóides 7′′-O-metilagatisflavona (O. hexasperma), e a amentoflavona (O.

semisserrata) e o derivado acetilado da amentoflavona apresentaram atividade inibitória da

DNA topoisomerase humana tipo I. Potente atividade sobre a inibição do crescimento de

células de carcinoma de Ehrlich, porém, apenas a agatisflavona apresentou atividade sobre a

inibição da DNA topoisomerase humana tipo II-α e inibição de 42% do crescimento de

células de leucemia humana K562. (GRYNBERG et al., 2002; DE CARVALHO et al., 2002)

As biflavonas 6→6′′- begenkwanina e a 7,7''-dimetoxiagatisflavona isoladas da O. spectabilis

apresentaram atividade inibitória sobre a enzima aldose redutase de cristalino bovino. O

aumento da atividade dessa enzima está relacionado com a patogênese da maioria das

complicações da diabetes como cataratas, retinopatia, neuropatia (FELICIO, et. al., 1995).

O

extrato hidroetanólico e a fração acetato de etila de O semiserrata apresentaram efeito

vasodilatador endotélio-dependente e atividade antiipertensiva in vitro, inibindo a conversão

da enzima angiotensina I(ACE) (CORTES et al.,2002). O extrato aquoso de Ouratea sp.,

contendo proantocianidinas, mostrou atividade antitumoral contra o carcinossarcoma de

Walker 256 e sarcoma 180 em ratos (SAMPAIO et al., 1975; OLIVEIRA et al., 1972). O óleo

extraído do extrato hexânico dos frutos de Ouratea parviflora apresentou atividade

antibacteriana e antifúngica (MARCOL et al., 1988). Os biflavonóides isolados de O.

spectabilis, O. multiflora e O. parviflora mostraram inibição da produção de aflatoxina por

Aspergillus flavus (GONÇALEZ, et al., 2001).

7

Neste estudo foi verificado que as substâncias mais significativas do gênero Ouratea

são os biflavonóides com ligação interflavonoídica do tipo C-C, sendo o representante mais

abundante o derivado 7''-O-metilagatisflavona. Por outro lado o gênero Luxemburgia é

caracterizado pela ligação do tipo C-O-C, cujo componente mais abundante a 2′′-

diidroochnaflavona, além das chalconas presentes apenas em espécies desse gênero, tanto na

forma monomérica como nas bichalconas.

A distribuição do grupo de produtos naturais formados por acoplamento de duas

unidades flavonoídicas nos gêneros Ouratea e Luxemburgia e o levantamento de suas

propriedades biodinâmicas permitiram: caracterizá-los como marcadores quimiotaxonômicos

para os referidos táxons, propor uma nomenclatura com notação para esse grupo de

substâncias e evidenciar suas potencialidades farmacológicas.

Apesar dessas espécies não serem tão conhecidas na medicina popular, a freqüência

das biflavonas é indicativo de ótimas perspectivas para se tornarem constituintes de

medicamentos.

Tabela 1. Ocorrência de flavonóides em espécies dos gêneros Ouratea e Luxemburgia

(Ochnaceae.)

Flavonóide Espécie. Ref.

proantocianidina I

Ouratea sp.

MARCOL et

al, 1988.

catequina II

Ouratea sp.

MARCOL et

al, 1988.

cianidina III

O. affinis

Gonçalez et.

al,2001

cianidina III

O. calantha

Gonçalez et.

al,2001

5-OH-4’,7-OMe-2/3- trans-isoflavonona (2→2”)–5”-OH 4’”

7”- OMe -2''/3''- trans–isoflavanona. (hexaspermona A, IV)

O. hexasperma

MOREIRA

et.al, 1994

5-OH -4

’

,7- OMe-2/3- trans-isoflavanona (2→2

’’

)-4

”’

OH

5

”

,7

”

-OMe -2''/3''-

trans-isoflavanona. (hexaspermona B, V)

O. hexasperma

MOREIRA

et.al, 1994

5-OH - 4

’

,7- OMe -2/3-trans-isoflavanona-(2→2

’’

)-4

”’

,5

’’

-

OH-7

”

-OMe -2''/3''-trans-isoflavanona. (hexaspermona C, VI)

O. hexasperma

MOREIRA

et.al, 1994

5,7,4

’

-OMe-isoflavona (VII)

O. hexasperma

MOREIRA

et.al, 1994

6,6”- bigenkanina (VIII) O. spectabilis

FELICIO

et.al.1995

4′,5- OH-7-metoxiflavona (6→8)-5′′,4′′′- OH- 7′′-OMe-

flavona (7,7′′-O-dimetilagastiflavona, IX)

O. spectabilis

FELICIO

et.al.1995

4′,5,7- OH-flavona (6→8′′) 5′′,4′′′ -OH -7′′-OMe-flavona

(7′′-O-metilagatisflavona, X)

O. hexasperma

MOREIRA et.

al. 1999

4’,5,7-OH-flavona-(3’→8”)-4”’,5”,7”-OH-flavona.

(amentoflavona, XI)

O. multifora

MONACHE

et. al, 1967

3-OH -4

’

,5,7-OMe-flavona-(6→8

’’

)- 3

’’

-OH -3

’’’

,4

’’’

,5

”

,7

”

-

OMe-flavona (XII)

O. multifora

MONACHE

et. al, 1967

3

’

,6,8-cloro-4

’

,5-OH-7-OMe-isoflavona (XIII)

O. semisserata

VELANDIA,

et al 2002

3

’

,5

’

,6,8-cloro-4

’

,5-OH-7-OMe-isoflavona (XIV)

O. semisserata

VELANDIA,

et al 2002

5,7-OH-flavona-(4’→O→8

’’

)- 4

’”

,5

”

,7

’’

-OH-flavona (XV)

O. semisserata

VELANDIA,

et al 2002

8

Tabela 1 Continuação

Flavonóide Espécie. Ref.

5-OH-7-OMe-flavona-(4’→O→8

’’

)-4

’’’

,5

”

,7

’’

- OH-flavona

(XVI)

O. semisserata

VELANDIA,

et al 2002

5-OH-7-OMe-flavona-(4’→O→8

’’

)-5

”

,7

’’

-OH-4

’’’

-OMe-

flavona (XVII)

O. semisserata

VELANDIA,

et al 2002

4’,5,7-OH-flavona-(3’→8”)-4”’,5”,7”- OH-flavona.

(amentoflavona XI)

O. semisserata

VELANDIA,

et al 2002

4′5,7- OH-flavona-(3′→ 8′′)-5′′,7′′-OH– 4′′′-OMe-flavona

(podocarpusflavona XVIII)

O. semisserata

VELANDIA,

et al 2002

3-O-α-L- raminosil (1→6)-β-D-glicopiranosil-quercetina

(rutina, XIX)

O. semisserata

VELANDIA,

et al 2002

3-O-α-L- raminosil (1→6)-β-D-glicopiranosil-quercetina

(rutina, XIX)

Luxemburgia

nobilis

*CARVALHO

et al 2002

4′,5,7-OH- flavona-(3′→O→4′′′)-5′′,7′′- OH-flavanona (XX)

Luxemburgia

nobilis

*CARVALHO

et al 2002

Epicatequina, (XXI)

Luxemburgia

nobilis

*CARVALHO

et al 2002

2,4,3′4′-OH-chalcona (3-hidroxiisoliquiritigenina, XXII)

Luxemburgia

nobilis

*CARVALHO

et al 2002

2,4,4′- OH- chalcona (isoliquiritigenina, XXIII)

Luxemburgia

nobilis

*CARVALHO

et al 2002

4’,5,7-OH- flavona-(3’→8”)-4”’,5”,7”- OH-flavona.

(amentoflavona, XI)

Luxemburgia

nobilis

*CARVALHO

et al 2002

4′,5,7-OH-flavona-(3′→6)-4′′′,5′′,7′′-OH-flavona

(robustaflavona, XXIV)

Luxemburgia

nobilis

*CARVALHO

et al 2002

4,2′,4′-OH- chalcona-(3→O→4′′)-2′′′,4′′′-OH-chalcona

(luxenchalcona, XXV)

Luxemburgia

octandra.

*CARVALHO

et al, 2004

2,4,3′4′- OH- chalcona (3-hidroxiisoliquiritigenina, XXII)

Luxemburgia

octandra.

*CARVALHO

et al, 2004

2,4,4′ -OH- chalcona (isoliquiritigenina, XXIII)

Luxemburgia

octandra.

*CARVALHO

et al, 2004

4′,5,7-OH- flavona-(3′→O→4′′′)-5′′,7′′- OH-flavanona (XX)

Luxemburgia

octandra.

*CARVALHO

et al, 2004

5,7,3′,4′-OH- 8 -C- glicopiranosil-flavona (XXVI)

Luxemburgia

octandra.

ALVES.C.C

2003

5,3,4-OH- 7-OMe-8-C- glicopiranosil-flavona (XXVII)

Luxemburgia

octandra..

ALVES. C. C

2003

calodenina B (XXVIII) O. flava

GARTLAN et

al, 1980

flavumona A (XXIX) O. flava

GARTLAN et

al, 1980

flavumona B (XXX) O. flava

GARTLAN et

al, 1980

calodenina C (XXXI) O. flava

GARTLAN et

al, 1980

lophirona A (XXXII) O. flava

GARTLAN et

al, 1980

4

’

,5-OMe - 6,7- metilenodioxi-isoflavona (XXXIII) O. flava

GARTLAN et

al, 1980

5-OH -7- OMe - flavona-(4′→O→8′′)-5′′,4′′′′- OH - , 7′′′-

OMe flavona (7,7′′-O-dimetillanaraflavona, XXXIV)

O. hexasperma

DANIEL et.

al.,2005

9

Tabela 1 Continuação

Flavonóide Espécie. Ref.

4′,5,7- OH- flavona- (6→8′′)-5′′,4′′′- OH- 7′′- OMe-flavona.

(7′′-O-metilagastiflavona, X)

O. hexasperma

DANIEL et.

al.,2005

4′,5,7-OH - flavona(6→8′′)- 4′′′,5,′′7′′-OH- flavona.

(agastiflavona XXXV)

O. hexasperma

DANIEL et.

al.,2005

epicatequina (XXI)

O. hexasperma

DANIEL et.

al.,2005

6-C-glicopiranosil-luteolina (XXXVI)

O. hexasperma

DANIEL et.

al.,2005

3-O-glicopiranosil-quercetina (XXXVII)

O. hexasperma

DANIEL et.

al.,2005

8-C-β-D-glicopiranosil 2′′-O-β-D- glicopiranosil-luteolina

(XXXVIII)

O. hexasperma

DANIEL et.

al.,2005

* DE CARVALHO.

Figura 2 Estrutura de flavonóides isolados de espécies de Ouratea e Luxemburgia.

O

OH

HO

OH

OMe

OH

I

II

O

OH

OMe

OH

HO

III

+

O

OH

HO

IV: R=H, R

1

=Me

V

: R=Me, R

1

=H

VI:

R=R

1

=H

O

Me O

OH

OMe

H

O

OR

OMe

R

1

O

H

O

VII

O

MeO

OMe

VIII

O

OOH

O

HO

OH

MeO

OMe

OH

O

HO

OH

HO OH

OR

O

XI: R=H

XVIII: R=Me

XIX: R=R1=Me

X: R=H, R1=Me

O

OOH

OH

O

OH

HO

RO

OR

1

O

OH

O

OMe

MeO

O

OH

OMe

MeO

OH

XII

O

OH

HO

OH

OMe

OH

I

II

O

OH

OMe

OH

HO

III

+

O

OH

HO

IV: R=H, R

1

=Me

V

: R=Me, R

1

=H

VI:

R=R

1

=H

O

Me O

OH

OMe

H

O

OR

OMe

R

1

O

H

O

VII

O

MeO

OMe

VIII

O

OOH

O

HO

OH

MeO

OMe

OH

O

HO

OH

HO OH

OR

O

XI: R=H

XVIII: R=Me

XIX: R=R1=Me

X: R=H, R1=Me

O

OOH

OH

O

OH

HO

RO

OR

1

O

OH

O

OMe

MeO

O

OH

OMe

MeO

OH

XII

10

Continuação figura 2.

XIII: R=H

XIV: R=Cl

O

Cl

MeO

Cl

OH

R

Cl

OH

O

XV: R=R

1

=H

XVI: R=Me, R

1

=H

XVII: R=R

1

=Me

O

RO

OH

O

HO

O

OR

1

O

OH

O

OH

HO

OH

O

HO

OH

XIX

XX

O

OH

O

HO

OH

O

OH

XXI

O

OH

HO

R

1

R

O

HO

XXII: R=R

1

=OH

XIII: R=OH, R

1

=H

O

HO

OH

O

HO

OH

XXIV

XXV

O

OH

O

OH

O

HO

XIII: R=H

XIV: R=Cl

O

Cl

MeO

Cl

OH

R

Cl

OH

O

XV: R=R

1

=H

XVI: R=Me, R

1

=H

XVII: R=R

1

=Me

O

RO

OH

O

HO

O

OR

1

O

OH

O

OH

HO

OH

O

HO

OH

XIX

XX

O

OH

O

HO

OH

O

OH

XXI

O

OH

HO

R

1

R

O

HO

XXII: R=R

1

=OH

XIII: R=OH, R

1

=H

O

HO

OH

O

HO

OH

XXIV

XXV

O

OH

O

OH

O

HO

11

Continuação da figura 2.

O

OH

O

RO

O

OH

XXVI: R=H

XXVII: R=CH

3

OH

O

OH

O

HO

OH

XXX

O

HO

H

OH

H

O

H

HO

OH

H

OH

XXXI

OH

O

HO

O

H

HO

XXXII

O

OMe

O

XXXIII

O

OH

MeO OH

O

M

eO

OH

O

XXXIV

XXXV

O

OH

HO

XXXVI

O

HO

OH

O

HO

XXXVII

O

OH

HO

OH

O

HO

OH

O

OH

O

HO

OH

O

OH

O

OH

HO

OH

O

XXXVIII

OR

O

RO

R

1

OR

O

XXVIII: R=R1=H

XXIX: R=H,R1=OH

O

OH

O

RO

O

OH

XXVI: R=H

XXVII: R=CH

3

OH

O

OH

O

HO

OH

XXX

O

HO

H

OH

H

O

H

HO

OH

H

OH

XXXI

OH

O

HO

O

H

HO

XXXII

O

OMe

O

XXXIII

O

OH

MeO OH

O

M

eO

OH

O

XXXIV

XXXV

O

OH

HO

XXXVI

O

HO

OH

O

HO

XXXVII

O

OH

HO

OH

O

HO

OH

O

OH

O

HO

OH

O

OH

O

OH

HO

OH

O

XXXVIII

OR

O

RO

R

1

OR

O

XXVIII: R=R1=H

XXIX: R=H,R1=OH

12

PARTE EXPERIMENTAL

ESTUDO QUÍMICO DE ESPÉCIES DE OURATEA

EQUIPAMENTOS E REAGENTES.

- Os pontos de fusão foram determinados em placa de aquecimento Reicherd, acoplada

a um microscópio ou em aparelho MEL–TEMP II, Laboratory Devices USA, utilizando

capilar e sem correção dos valores obtidos.

- Os espectros de absorção no infravermelho (IV) foram registrados em um

espectrofotômetro Perkin-Elmer , modelo 1600 com transformada de Fourier, em pastilhas de

KBr ou em filmes sobre cela de NaCl.

- Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio ( RMN

1

H) e carbono

(RMN

13

C) foram registrados em espectrômetros Bruker AC (200 (200MHz), Varian Unit-

400 (400MHz), Varian unit-500 (500MHz). Os solventes utilizados foram clorofórmio

deuterado (CDCl

3

), metanol deuterado (D

3

COD), acetona deuterada (D

3

CCOCD

3

),

dimetilsufóxido deuterado (DMSO-d

6

), utilizando como referência interna o tetrametilsilano

(TMS) ou residuo do solvente utilizado. Os deslocamentos químicos (δ) são indicados em

ppm e as constantes de acoplamentos (J) em Hertz (Hz).

- Os espectros de massas de alta resolução foram obtidos por ionização electrospray

(EM-IES) em um espectrômetro ultrOTOF

Q

-ESI-TOF Mass Spectrometer da Bruker

Daltonics, Billerica, MA, EUA. Condições do experimento: Bomba de Infusão, fluxo 300µl/h.

Fase móvel para solubilização: água. O modo de detecção: Negativo.

Os espectros de massas de baixa resolução foram registrados em espectrômetro de

massas computadorizado HP-5897A de analisador de ionização por impacto de elétrons, 70

eV acoplado a um cromatógrafo com fase gasosa HP-5880A.

- As cromatografias em coluna foram realizadas com gel sílica (230-400 e 70-230

mesh, Vetec), e sobre Sephadex LH-20(Sigma, USA).

- Cromatografia em camada preparativa foram realizadas em gel silica 60 PF

254

da

Merck e da Vetec sobre suporte de vidro e espessura de 1mm. As substâncias foram

detectadas por irradiação com lâmpada ultravioleta (254 e 366nm).

- As cromatografias em camada delgada analítica foram realizadas em cromatofolhas

de gel de Sílica 60 F

254

e como reveladores foram usados, além da detecção por irradiação

ultravioleta (254 e 366), reagentes Liebermann-Burchard, Iodo, solução de AlCl

3

-EtOH

(1%), sulfato cérico (1%)-H

2

SO

4

(10%), reagente de Godin (DOMINGUEZ, 1973 e MATOS,

1988).

- Os solventes utilizados para extração, técnicas cromatográficas e reações foram todos

grau P. A. da industria química Vetec. Alguns solventes comerciais foram destilados antes de

serem utilizados (metanol, hexano, diclorometano, acetato de etila e clorofórmio).

13

REAÇÕES DE DERIVAÇÃO.

A preparação de derivados acetilados e metoxilados das substâncias isoladas foram

feitas para facilitar a análise dos dados espectrométricos,e inclusive em analises com algumas

técnicas especiais de RMN, devido aumento da solubilidade destes compostos em

clorofórmio.

Reação de metilação com diazometano.

A solução de diazometano foi preparada de acordo com a metodologia experimental

descrita na literatura (VOGEL, 1989). Adicionou-se a solução etérea do diazometano em

excesso as substâncias dissolvidas em clorofórmio ou metanol. Os derivados metilados foram

obtidos após evaporação do solvente.

Reação de acetilação.

A reação de acetilação das substâncias foi feita adicionando-se piridina/anidrido

acético (1:1, v.v.) nas amostras. Após repouso de 48 horas a temperatura ambiente foi

adicionada água gelada (25,0 ml) e em seguida extraído com clorofórmio (3x). A solução

clorofórmica foi lavada com HCl (10%) para eliminar a piridina e em seguida lavou-se várias

vezes com água destilada. A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro e evaporada

em rotavapor , obtendo-se as substâncias acetiladas (SHRINER, 1979).

14

Ouratea hexasperma (St. Hil).

MATERIAL VEGETAL.

O material vegetal, inflorescência e galhos foram coletados na região do tabuleiro,

município de João Pessoa–PB, em dezembro de 2003 e identificado pela Doutora Maria de

Fátma Agra. Uma exsicata desta espécime (N° 3497) está depositada no herbário Prof. Lauro

Pires Xavier (JPB–21438), Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brasil.

ELABORAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS.

a) Inflorescências.

As inflorescências secas e moídas (330,0 g) foram submetidas a extração por

maceração dinâmica com metanol. O extrato foi filtrado e a remoção do solvente foi feita

através de destilação sob pressão reduzida, fornecendo o extrato OHIM (Ouratea hexasperma

Inflorescência Metanol) (50,0 g).

O extrato obtido OHIM (50,0 g) foi solubilizado em metanol-água (8:2) e submetido a

partição líquido/líquido com os solventes hexano e acetato de etila fornecendo

respectivamente, as frações OHIMH (12,1 g) e OHIMAc (8,2 g). (Fluxograma 1 Pág-16).

A fração OHIMH (12,1 g) foi cromatografada em coluna de gel sílica com gradiente

de polaridade crescente de mistura binária dos solventes: hexano, acetato de etila e metanol

gerando 40 frações de 125 ml. As frações 30-35 forneceram um precipitado que foi

recromatografado sob as mesmas condições gerando 20 novas frações.

A fração 4 desta coluna forneceu um pó branco identificado como o triterpeno 5 (3β-

O-acil-olean-12-en-28-oico) [(116,0 mg); P.F. 110°C; RMN

1

H (CDCl

3

, 200 MHz) δ: 5,24

(sl, H-12); 4,47 (t, J=7,6Hz, H-3); 2,77 (dl, J=10, H-18); 2,26 (t, J=7,2Hz, H-21); 0,71-1,90(8

x CH

3

) (Figura 12, pág.34). RMN

13

C (CDCl

3

, 50MHz) δ: 15,32 (C-25); 16,68 (C-26); 22,66

(C-24); 23,54 (C-30); 25,14 (C-27); 25,87 (C-23); 33,03 (C-29); 122,48 (C-12); 143,55 (C-

13), 173,72 (C-1’); 184,58 (C-28); 80,51 (C-3)] (Figura 13 pág, 34).

As frações 11-12 foram identificadas como a mistura dos esteróides Campesterol (1),

Estigmasterol (2), Sitosterol (3)[(95 mg), P.F.:120°C, RMN

1

H (CDCl

3

, 200 MHz) δ: 5,33

(sl, H-6); 5,18 (m, H-22, 23); 3,54 (m, H-6); 0,64-0,97 (Me

(s)

) (Figura 3 Pág 27). RMN

13

C

(CDCl

3

, 50MHz) δ (ppm) 140,68 (C-5), 138,28 (C-22); 129,18(C-23); 121,63 (C-6), 71,69

(C-3) (Figuras 4, pág 27). EM (IE, 70eV): 400 (60%); 413 (25%); 414 (33%)] (Figuras 6, 7,

8, págs 28, 29)

A fração OHIMAc (8,2 g) foi cromatografada em coluna de gel.sílica Iniciou-se a

eluição com clorofórmio e foi desenvolvida aumentando-se a polaridade do eluente pela

adição gradativa de metanol até metanol (100%), foram recolhidas 15 frações de 125 ml.

(Fluxograma 2, pág-17)

A fração 1 forneceu um precipitado branco amorfo que após purificação com metanol,

filtração e secagem foi identificado como a saponina 3-O-β-D-glicopiranosil sitosterol

(4)[(160,0 mg), P.F. 300ºC IV: (KBr)ν

max

cm

-1

:

3394 (ν

O-H

); 2957, 2921, 2851 (ν

C-H

);1460,

1379 (δ

C-H

), 1075, 1025 (ν

C-O

)(Figura 9 pág 30); RMN

1

H (Piridina-d

5

200 MHz) δ: 5,33 (sl,

H-6); 5,1(d, J=8,0Hz, H-1’), 0,82-1,04 (6 x CH

3

) (Figura 10 pág 30)] O derivado 4a foi

obtido através do tratamento de 4 (50,0 mg) com anidrido acético e piridina. A fração 3

15

apresentou um precipitado solúvel em metanol que foi submetido a uma coluna de Sephadex

LH–20 eluida com metanol, recolhendo-se 20 frações de 15 ml.

As frações 3-5 forneceram um sólido amarelo identificado como mistura dos

flavonóides orientina (7) e vitexina (8). [(15,0 mg), P.F. 260°C; IV: (KBr)ν

max

cm

-1

3384,

3246 (ν

O-H

); 1655 (ν

C=O

); 1614, 1508, 1428, (ν

C=C

); 1094, 1041 (ν

C-O

). Flavonóide 7

(Orientina) RMN

1

H (DMSO-d

6

400 MHz,) δ: 6,64 (s, H-3), 6,27 (s, H-6), 7,48 (s, H-2’);

6,85 (d,J=8,0Hz, H-5’); 7,52 (d, J=8,0Hz, H-6’) 4,68 (d, J=10,0Hz, H-1’’); 3,82(m, H-2’’);

3,35 (m, H-3’’); 3,25 (m, H-4’’); 3,35 (m, H-5’’); 3,78 (m, H-6’’); 13,17(s, HO-5); RMN

13

C

(DMSO-d

6

100 MHz,)] (Figura 23, Pág-47,Tabela 4, pág-43) Flavonóide 8 (Vitexina) RMN

1

H (DMSO-d

6

400 MHz,) δ: 6,78 (s, H-3), 6,27 (s, H-6), 8,02 (d, J=8,0Hz , H-2’,6’); 6,89

(d,J=8,0Hz, H-3’, 5’); 4,68 (d, J=10,0Hz, H-1’’); 3,82(m, H-2’’); 3,25 (m, H-3’’); 3,35 (m, H-

4’’); 3,25 (m, H-5’’); 3,78 (m, H-6’’); 13,17(s, HO-5); RMN

13

C (DMSO-d

6

100 MHz,)]

(Figura 23 pág-47, Tabela 5, Pág-44).

As frações 7-10 foram reunidas e identificadas como o flavonóide Rutina (6) [(170,0

mg) P.F. 190ºC; IV: (KBr)ν

max

cm

-1

3423 (ν

O-H

); 1654 (ν

C=O

); 1504, 1458 (ν

C=C

); 1063, 1012

(ν

C-O

); RMN

1

H (DMSO-d

6

200 MHz,) δ: 6,19 (d, J=1,9 Hz, H-6); 6,35 (d, J=1,9 Hz, H-8);

7,51 (s, H-2’); 6,82 (d, J=8,0 Hz, 5’); 7,55 (D, J=8,0 Hz, 6’); 5,32 (d, J= 8,0 Hz, H-1’’); 3,25

(sl, H-2’’); 3,28 sl, H-3’’); 3,66 (sl, H-4’’); 3,22 (sl, H-5’’); 3,72 (sl, H-6’’), 4,36 (sl, H-1’’’);

3,05 (sl, H-2’’’); 3,37 (sl, H-3’’’); 3,00 (sl, H-4’’’); 3,09 (sl, H-5’’’); 0,97 (sl, H-6’’’); 12,57

(s, HO-5)] (Figura 17, pág). RMN

13

C (DMSO-d

6

50 MHz,)] (Figura 18 pág-40, Tabela 3

Pág-37).

As frações 11-20 foram reunidas e purificadas em nova coluna de Sephadex LH–20

eluida sob as mesmas condições. A fração 3 um pó amarelo foi identificada como flavonóide

Swertisina (9),(5,0 mg). RMN

1

H (DMSO-d

6

,

500 MHz) δ: 6,81 (s, H-3); 6,51 (s, H-8);

8,02(d, J=8,5 Hz, H-2’, 6’); 6,89 (d, J= 8,5 Hz, H-3’, 5’); 4,72 (d, J= 10,0 Hz, H-1’’); 3,25-

3,60 (H-açucar); 3,86 (s, MeO) (Figura 30 pág-55).

As frações 5–8 foram reunidas e delas obitido o flavonóide Swertiajaponina (10)

[(23,0 mg). RMN

1

H (DMSO-d

6

500 MHz,) δ (ppm) 6,79 (s, H-3); 6,59 (s, H-8); 7,55(s, H-

2’); 6,92 (d, J= 8,6 Hz, H-5’); 7,56 (m, H-6’)4,76 (d, J= 10,0 Hz, H-1’’); 3,25-3,50 (H-

açucar); 3,88 (s, MeO) (Figura 32 pág-59). RMN

13

C (DMSO-d

6

50 MHz,)] (Figura 33 pág-

60, Tabela 7 Pág-58).

16

Fluxograma 1: Preparação e fracionamento do extrato metanólico da inflorescência

de O. hexasperma St. Hil.

Inflorescência

O. hexasperma

330,0g

Maceração dinâmica

(metanol)

Extrato metanolico

OHIM (50,0 g)

Resíduo

Partição MeOH/H

2

O (8:2)

Hexano

Fração Hexano

OHIMH 12,1 g

Fração Acetato de etila

OHIMAc 8,2 g

Solução aquosa

I

Acetato de etila

Solução aquosa

II

30 – 35

2,0 g

4

11-12

116,0 mg

5

95,0 mg

1, 2, 3

FE: silica gel

FM: hexano/act./MeOH

FE: silica gel

FM: hexano/act./MeOH

O

OH

O

()

n

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25 26

27

28

29

30

5

HO

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

HO

1

Inflorescência

O. hexasperma

330,0g

Maceração dinâmica

(metanol)

Extrato metanolico

OHIM (50,0 g)

Resíduo

Partição MeOH/H

2

O (8:2)

Hexano

Fração Hexano

OHIMH 12,1 g

Fração Acetato de etila

OHIMAc 8,2 g

Solução aquosa

I

Acetato de etila

Solução aquosa

II

30 – 35

2,0 g

4

11-12

116,0 mg

5

95,0 mg

1, 2, 3

FE: silica gel

FM: hexano/act./MeOH

FE: silica gel

FM: hexano/act./MeOH

30 – 35

2,0 g

4

11-12

116,0 mg

5

95,0 mg

1, 2, 3

FE: silica gel

FM: hexano/act./MeOH

FE: silica gel

FM: hexano/act./MeOH

O

OH

O

()

n

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25 26

27

28

29

30

5

O

OH

O

()

n

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25 26

27

28

29

30

5

HO

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

HO

1

17

Fluxograma 2: Fracionamento cromatográfico da fração OHIMAc

OHIMAC

8,2 g

CC

FE: Silica gel

FM: CHCl

3

/MeOH

1

(160,0 mg)

4

3

400,0 mg

FE: Sephadex LH – 20

FM:MeOH

3 – 5

(15,0 mg)

7 + 8

7 -10

(170,0 mg)

6

11 – 20

(200 ,0 mg)

3

(5,0 mg)

9

5 - 8

(23,0 mg)

10

FE: Sephadex LH -20

FM: MeOH

1

(35,0 mg)

4a

Piridina

Anidrido acetico

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

OR

R

O

RO

OR

4 R = H

4a R = Ac

7 R

1

= H; R

2

= OH

8 R

1

= R

2

= H

O

OR

1

HO

OH O

R

2

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

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4

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5

''

6

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O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

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6

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6

1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

'''

2

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3

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4

'''

5

'''

6

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O

OH

6

O

H

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

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4

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5

'

6

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1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

10

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

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5

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6

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1

''

2

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3

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4

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5

''

6

''

CH

3

O

9

OHIMAC

8,2 g

CC

FE: Silica gel

FM: CHCl

3

/MeOH

1

(160,0 mg)

4

3

400,0 mg

FE: Sephadex LH – 20

FM:MeOH

3 – 5

(15,0 mg)

7 + 8

7 -10

(170,0 mg)

6

11 – 20

(200 ,0 mg)

3

(5,0 mg)

9

5 - 8

(23,0 mg)

10

FE: Sephadex LH -20

FM: MeOH

1

(35,0 mg)

4a

Piridina

Anidrido acetico

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

OR

R

O

RO

OR

4 R = H

4a R = Ac

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

OR

R

O

RO

OR

4 R = H

4a R = Ac

7 R

1

= H; R

2

= OH

8 R

1

= R

2

= H

O

OR

1

HO

OH O

R

2

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

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5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

7 R

1

= H; R

2

= OH

8 R

1

= R

2

= H

O

OR

1

HO

OH O

R

2

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

6

1

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2

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3

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4

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5

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6

''

1

'''

2

'''

3

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4

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5

'''

6

''''

O

OH

6

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

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4

'

5

'

6

'

6

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

'''

4

'''

5

'''

6

''''

O

OH

6

O

H

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

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5

''

6

''

CH

3

O

10

O

H

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

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2

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5

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CH

3

O

9

18

b) Caule.

O caule seco e moído (410,0 g) foi submetido ao processo de maceração dinâmica com

metanol a temperatura ambiente. O extrato líquido foi filtrado e então concentrado em

evaporador rotativo sob pressão reduzida fornecendo o extrato seco OHGM (Ouratea

hexasperma Galhos Metanol) (44,0 g). O extrato (OHGM) foi submetido a filtração seletiva

em gel sílica com os solventes diclorometano e acetato de etila que após a remoção do

solvente em evaporador rotativo forneceu as respectivas frações: OHGMD ( 193,0 mg) e

OHGMAc (16,5 g).

A fração OHGMAc foi cromatografada em coluna de gel sílica eluida com mistura dos

solventes diclorometano / metanol com gradiente de polaridade crescente até metanol 100%,

gerando 30 subfrações. Essas foram analisadas por CCDA e reunidas conforme seu perfil

cromatográfico. A fração 4 apresentou um precipitado branco, identificado como os esteróides

estigmasterol (2) e sitosterol (3) (25,0 mg); a fração 6 apresentou um pó amorfo de difícil

solubilidade nos solventes orgânicos e posteriormente identificado como a saponina 3-β-O-β-

D-glicopiranosil sitosterol (4) (40,0 mg) As frações 8-9 ( 20,0 mg) foram reunidas e

submetidas à cromatografia em camada delgada preparativa, fornecendo uma resina

avermelhada identificada como a substância ácido 1,5-diiroxifenilacetico (11) [(5,0 mg) IV.:

(KBr)ν

max

cm

-1

:

3437 (ν

O-H

); 1695 (ν

C=O

); 1390, 1293 (ν

C-O

) RMN

1

H (D

3

COD), 200 MHz).δ

6,85(d, J=8,0 Hz, H-3); 6,20 (dd, J= 8,0 e 2,4 Hz, H-4); 6,28 (d, J= 2,4 Hz, H-6); 3,4 (s, 2H-

7). RMN

13

C (D

3

COD), 50 MHz) δ 156,7 (C-1); 115,4 (C-2); 130,2 (C-3); 104,9 (C-4); 158,9

(C-5); 104,1 (C-6); 43,7 (C-7); 176,9 (C-8)].

As frações 11–15 foram reunidas e purificas em coluna de Sephadex LH–20 eluida

com metanol e forneceu um pó amarelo identificado como o glicopiranosil diidroflavonol

prenilado (12). [(50,0 mg) P.F.:173ºC RMN

1

H (DMSO-d

6

200 MHz).δ 5,11 (d, J= 11,0 HZ,

H-2); 4,55 (m, H-3); 6,22 (s, H-8); 7,30 (d, J= 8,0 HZ, H-2’, 6’); 6,79 (d, J= 8,0 Hz H-3’, 5’);

4,92 (d, J= 8,0 Hz, H-1’’); 3,29 (m, H- 2’’, 3’’); 3,18 (m, H-4’’); 3,35 (m H-5’’); 3,50 (m, 2H-

6’’); 3,31 e 3,14 (m, 2H-1’’’); 5,17 (dd, H-2’’’); 1,61 (s Me-4’’’);1,75 (s, Me-5’’’);12,04

(OH-5) RMN

13

C (DMSO-d

6

50 MHz). (Figura 41,Tabela 9 Pág-72,68).

As frações 20–23 foram também reunidas e purificadas nas mesmas condições e

forneceu um pó amarelo e identificado como o glicopiranosil flavonol prenilado (13). [(80,0

mg) P.F.: 180º C RMN

1

H (DMSO-d

6

) 200 MHz).δ (ppm) 6,89 (s, H-8); 8,08 (d, J= 8,8 Hz

H-2’, 6’); 6,95 (d, J= 8,8 Hz H-3’, 5’); 4,90 (d, J= 8,0 Hz H-1’’); 3,29 (m, H-2’’); 3,33(m,

3’’); 3,36 (m, H-4’’); 3,44 (m, H-5’’); 3,51 (m, 2H-6’’); 3,31 e 3,27 (m, 2H-1’’’); 5,08 (dd, H-

2’’’); 1,64 (s, Me-4’’’); 1,77 (s, Me-5’’’). RMN

13

C (DMSO-d

6

) 50 MHz). (Figura 47,pág-

82 e Tabela 11 Págs-80).

Foram preparados dois derivados de 13. O tratamento de 13 (20,0 mg) com

diazometano forneceu o derivado 7-glicosil-6-prenil-3,4’-dimetoxi-5-hidroxi-flavona (13a)

(12,0 mg). O tratamento de 13 (35,0 mg) com piridina e anidrido acético forneceu o derivado

3,5,4’,2’’,3’’,4’’,6’’-heptacetil-7-0-β-glicopiranosil flavona (13b) (20,0 mg).

19

Fluxograma 3 Preparação e fracionamento do extrato metanólico do caule de O.

hexasperma St. Hil.

Ouratea cuspidata (St. Hil).

MATERIAL VEGETAL.

O material vegetal, folhas e caules de Ouratea cuspidata foram coletados na restinga

do município de Barra de Maricá, Rio de Janeiro, RJ, em setembro de 2002 e identificado pela

Dra. Luci de Senna Valle Uma excicata (N° 206313) desta espécie esta depositada no

herbário do Museu Nacional do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

2

3

4

5

6

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10

O

OAc

AcO

H

O

OAc

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13b

Caule

410,og

OHGM

44,0g

Resíduo

OHGMD

193,0 mg

OHGMAc

16,5g

Filtração silica gel

1) Diclorometano

2) Acetato de etila

Evaporação

4

25,0 mg

2, 3

8 - 9

20 ,0mg

11 – 15

75,0 mg

20 – 23

105,0mg

6

40,0 mg

4

5 ,0mg

11

50,0mg

12

CCDP

80,0 mg

13

FE: Silica gel

FM: CH

2

Cl

2

/MeOH

Sephadex LH 20

MeOH

Maceração dinâmica

MeOH

10,0mg

13a

Diazometano

20,0mg

13b

Piridina

anidridoacetico

HO

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

46

11

12

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14

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20

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O

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13b

Caule

410,og

OHGM

44,0g

Resíduo

OHGMD

193,0 mg

OHGMAc

16,5g

Filtração silica gel

1) Diclorometano

2) Acetato de etila

Evaporação

4

25,0 mg

2, 3

8 - 9

20 ,0mg

11 – 15

75,0 mg

20 – 23

105,0mg

6

40,0 mg

4

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11

50,0mg

12

CCDP

80,0 mg

13

FE: Silica gel

FM: CH

2

Cl

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/MeOH

Sephadex LH 20

MeOH

Maceração dinâmica

MeOH

10,0mg

13a

Diazometano

20,0mg

13b

Piridina

anidridoacetico

HO

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

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Filtração silica gel

1) Diclorometano

2) Acetato de etila

Evaporação

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11 – 15

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20 – 23

105,0mg

6

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4

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11

50,0mg

12

CCDP

80,0 mg

13

FE: Silica gel

FM: CH

2

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Sephadex LH 20

MeOH

Maceração dinâmica

MeOH

10,0mg

13a

Diazometano

20,0mg

13b

Piridina

anidridoacetico

Caule

410,og

OHGM

44,0g

Resíduo

OHGMD

193,0 mg

OHGMAc

16,5g

Filtração silica gel

1) Diclorometano

2) Acetato de etila

Evaporação

4

25,0 mg

2, 3

8 - 9

20 ,0mg

11 – 15

75,0 mg

20 – 23

105,0mg

6

40,0 mg

4

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11

50,0mg

12

CCDP

80,0 mg

13

FE: Silica gel

FM: CH

2

Cl

2

/MeOH

Sephadex LH 20

MeOH

Maceração dinâmica

MeOH

10,0mg

13a

Diazometano

20,0mg

13b

Piridina

anidridoacetico

HO

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

46

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13a

20

ELABORAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS.

a) Folhas

As folhas após terem sido secas a sombra em temperatura ambiente e moídas em

moinho de facas (580,0 g) foram submetidas a extração por maceração dinâmica em

seqüência com hexano, acetato de etila e metanol . Os extratos foram filtrados e os solventes

removidos até completa secura em evaporador rotativo sob pressão reduzida e ar quente

fornecendo respectivamente os extratos OCFH (29,69 g) (Ouratea cuspidata Folha Hexano);

OCFAc (36,2 g) (O. cuspidata Folha Acetato); OCFM (117,0g)(O. cuspidata Folha

Metanol).

O extrato OCFH (14,0 g) foi submetido à filtração seletiva em sílica com

diclorometano. A fração diclorometano (OCFHD 3,03 g) foi cromatografada em coluna de gel

de sílica e eluida com mistura de solventes hexano, acetato de etila, metanol em gradiente de

polaridades crescentes gerando 35 frações de 125 ml. As frações 8–14 foram reunidas pois

apresentaram um precipitado branco identificado como a mistura dos esteróides estigmasterol

(2) e sitosterol (3) (35,0 mg). (Fluxograma 4, Pág-21)

A fração 17–22 apresentou precipitado branco (20,0 mg) identificado como mistura

dos triterpenos lupeol (14),α-amirina (15), β-amirina (16) [P.F. 180ºC RMN

1

H (CDCl

3

, 200

MHz) δ: 5,15 (M, H-12 (16); 5,10 (m, H-12 (15); 4,65 (d, J=2,2 Hz, H-29a .(14)); 4,54 (d,

J=1,28 Hz H-29b (14)); 3,24 (dd, J= 10,0; 7,2 Hz, Hβ-3); 0,76-1,10 (Me

(s)

)] (Figura 57 pag-

95)

O extrato OCFAc (36,2 g) foi solubilizado em metanol-água (8:2) e submetido a

partição líquido/líquido com clorofórmio fornecendo respectivamente, as frações OCFAcH

(2,49 g) e OCFAcC (11,43 g). Da fração OCAcC houve a formação de um precipitado

solúvel em metanol, que foi submetido a uma coluna de Sephadex LH–20 eluida com metanol

gerando 10 fração de 50 ml.

As frações 5–7 foram reunidas e forneceram um prepitado amarelo, solúvel em

metanol identificado como a biflavona Amentoflavona (17). (95,0 mg.) RMN

1

H

(D

3

CCOCD

3

, 200 MHz) δ: 6,65 (s, H-3); 6,22 (d, J= 2,0 Hz, H-6); 6,51 (d, J= 2,0 Hz, H-8);

8,12 (d, J= 2,2 Hz, H-2’); 7,23 (d, J= 8,8 Hz, H-5’); 8,02 (dd, J= 8,8; 2,2 Hz, H-6’); 6,72 (s,

H-3’’); 6,43 (s, H-6’’); 7,64 (d, J= 8,8 Hz, H-2’’’, 6’’’); 6,82 (d, J=8,8 Hz, H-3’”, 5’”), 13,6

(s, OH), 12,99 (s, OH);(Figura 58, pág-.98) RMN

13

C (D

3

CCOCD

3

), 50 MHz,)] (Figura 58

Tabela 13 Pág-97).

A água–mãe da fração OCAcC foi submetida a uma coluna de gel sílica eluida com a

mistura dos solventes hexano/acetato de etila, metanol com gradiente de polaridade crescente

até metanol 100% gerando 80 frações 125 ml. As frações 12–35 foram reunidas, purificadas e

identificadas como a biflavona 17 (25,0 mg). A substancia 17 foi tratada com diazometano

produzindo o derivado metilado tetrametilamentoflavona (17a) (12,0 mg), e também tratada

com piridina e anidrido acetido obtendo-se o derivado acetilado peracetilamentoflavona

(17b).(19,0 mg)(Paginas 100 e 109..)

As frações 45–61 forneceu um precipitado amarelo solúvel em metanol que foi

identificado como biflavona putraflavona18. (110,0 mg) P.F. 256ºC; RMN

1

H (DMSO-d

6

,

500 MHz)δ: 6,90 (s, H-3); 6,36 (d, J= 1,9 HZ, H-6); 6,76 (sl, H-8); 8,09 (m, H-2’, 6’); 7,15

(d, J= 9,1 Hz, H-5’); 6,91 (s, H-3’’); 6,40 (s, H-6’’); 7,68 (d, J= 8,7 Hz, 2’’’, 6’’’); 6,93 (d, J=

8,7 Hz, H- 3’’’, 5’’’); 12,91 (s, HO-5); 13,07 (s, HO-5’’); 3,83 (s, MeO-7); 3,75 (s, MeO-

4’’’); (Figura 71 pág.115 ); RMN

13

C (DMSO-d

6

, 125 MHz,)] (Figura 72, pág-116 Tabela

16 Pág-114).

O extrato metanolico OCFM (30,0 g) foi fracionado numa coluna cromatográfica

contendo gel sílica. Iniciou-se a eluição com acetato de etila aumentando a polaridade do

21

eluente pela adição gradativa de metanol até metanol 100%. Obtiveram-se 60 frações. As

frações 8–10 forneceram novamente o biflavonoide amentoflavona (17) (15,0 mg).

As frações 15–20 forneceu pó amarelo identificado como flavonoide 5,7,4’-triidroxi-

3’,5’-dimetoxi-flavona (19). (10,0 mg) [RMN

1

H CDCl

3

, 200 MHz) δ: 6,97 (s, H-3); 6,19 (d,

J= 2,1 Hz, H-6), 6,55 (d, J= 2,1 Hz, H-8); 7,31 (s, H-2’, 6’); 3,87 (s MeO-3’, 5’), (Figura 84 e

85 pág-129, Tabela 18 pág-128.) RMN

13

C (CDCl

3

, 50 MHz,)]

Fluxograma 4: Preparação e fracionamento cromatográfico dos extratos das folhas de

Ouratea cuspidata

OCFAcC

11,43 g

CC

FE: silica gel

FM: hex / acet /MeOH

Folhas

O. cuspidata

580,0g

Maceração dinâmica

OCFH

13,6 g

OCFAc

36,0g

Acetato de

etila

OCFM

130,0 g

MeOH

Hexano

MeOH:água (8;2)

cloroformio

CC

FE: Silica gel

FM: hex / acet /MeOH

Filtração silica gel

diclorometano

OCFHD

3,30g

17 - 22

8 - 14

2, 3

35,0 mg

14, 15, 16

20,0 mg

8 - 10 15 - 20

17

15,0 mg

19

10,0 mg

CC

FE:silica gel

FM:hex / acet / MeOH

H

2

0Mãe

17

95,0 mg

5 - 7

precipitado

45 - 61

CC

FE: Sephadex LH20

FM: MeOH

18

110,0 mg

12 - 35

17

25,0 mg

17a

12,0 mg

17b

19,0 mg

Diazometano

Piridina

Anidrido acetico

H

O

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

R

1

HO

R

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

20

21

22

2324

25

26

28

29

HO

27

30

14

O

OOR

1

R

2

O

OR

3

O

R

6

O

OR

5

OR

4

17- R

1

= R

2

= R

3

= R

4

= R

5

= R6= H

17a- R1= R5= H; R2= R3= R4 = R6= CH

3

17b- R1= R2= R3= R4= R5= R6= Ac

O

OH O

O

OH O

OC H

3

OH

CH

3

O

HO

18

OCFAcC

11,43 g

CC

FE: silica gel

FM: hex / acet /MeOH

Folhas

O. cuspidata

580,0g

Maceração dinâmica

OCFH

13,6 g

OCFAc

36,0g

Acetato de

etila

OCFM

130,0 g

MeOH

Hexano

MeOH:água (8;2)

cloroformio

CC

FE: Silica gel

FM: hex / acet /MeOH

Filtração silica gel

diclorometano

OCFHD

3,30g

17 - 22

8 - 14

2, 3

35,0 mg

14, 15, 16

20,0 mg

8 - 10 15 - 20

17

15,0 mg

19

10,0 mg

CC

FE:silica gel

FM:hex / acet / MeOH

H

2

0Mãe

17

95,0 mg

5 - 7

precipitado

45 - 61

CC

FE: Sephadex LH20

FM: MeOH

18

110,0 mg

12 - 35

17

25,0 mg

17a

12,0 mg

17b

19,0 mg

Diazometano

Piridina

Anidrido acetico

H

O

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

R

1

HO

R

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

20

21

22

2324

25

26

28

29

HO

27

30

14

O

OOR

1

R

2

O

OR

3

O

R

6

O

OR

5

OR

4

17- R

1

= R

2

= R

3

= R

4

= R

5

= R6= H

17a- R1= R5= H; R2= R3= R4 = R6= CH

3

17b- R1= R2= R3= R4= R5= R6= Ac

OCFAcC

11,43 g

CC

FE: silica gel

FM: hex / acet /MeOH

Folhas

O. cuspidata

580,0g

Maceração dinâmica

OCFH

13,6 g

OCFAc

36,0g

Acetato de

etila

OCFM

130,0 g

MeOH

Hexano

MeOH:água (8;2)

cloroformio

CC

FE: Silica gel

FM: hex / acet /MeOH

Filtração silica gel

diclorometano

OCFHD

3,30g

17 - 22

8 - 14

2, 3

35,0 mg

14, 15, 16

20,0 mg

8 - 10 15 - 20

17

15,0 mg

19

10,0 mg

CC

FE:silica gel

FM:hex / acet / MeOH

H

2

0Mãe

17

95,0 mg

5 - 7

precipitado

45 - 61

CC

FE: Sephadex LH20

FM: MeOH

18

110,0 mg

12 - 35

17

25,0 mg

17a

12,0 mg

17b

19,0 mg

Diazometano

Piridina

Anidrido acetico

OCFAcC

11,43 g

CC

FE: silica gel

FM: hex / acet /MeOH

Folhas

O. cuspidata

580,0g

Maceração dinâmica

OCFH

13,6 g

OCFAc

36,0g

Acetato de

etila

OCFM

130,0 g

MeOH

Hexano

MeOH:água (8;2)

cloroformio

CC

FE: Silica gel

FM: hex / acet /MeOH

Filtração silica gel

diclorometano

OCFHD

3,30g

17 - 22

8 - 14

2, 3

35,0 mg

14, 15, 16

20,0 mg

8 - 10 15 - 20

17

15,0 mg

19

10,0 mg

CC

FE:silica gel

FM:hex / acet / MeOH

H

2

0Mãe

17

95,0 mg

5 - 7

precipitado

45 - 61

CC

FE: Sephadex LH20

FM: MeOH

18

110,0 mg

12 - 35

17

25,0 mg

H

2

0Mãe

17

95,0 mg

5 - 7

precipitado

45 - 61

CC

FE: Sephadex LH20

FM: MeOH

18

110,0 mg

12 - 35

17

25,0 mg

17a

12,0 mg

17b

19,0 mg

Diazometano

Piridina

Anidrido acetico

H

O

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

R

1

HO

R

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

20

21

22

2324

25

26

28

29

HO

27

30

14

O

OOR

1

R

2

O

OR

3

O

R

6

O

OR

5

OR

4

17- R

1

= R

2

= R

3

= R

4

= R

5

= R6= H

17a- R1= R5= H; R2= R3= R4 = R6= CH

3

17b- R1= R2= R3= R4= R5= R6= Ac

O

OOR

1

R

2

O

OR

3

O

R

6

O

OR

5

OR

4

17- R

1

= R

2

= R

3

= R

4

= R

5

= R6= H

17a- R1= R5= H; R2= R3= R4 = R6= CH

3

17b- R1= R2= R3= R4= R5= R6= Ac

O

OH O

O

OH O

OC H

3

OH

CH

3

O

HO

18

O

OH O

O

OH O

OC H

3

OH

CH

3

O

HO

18

22

b) Caule

O caule após ter sido seco a sombra em temperatura ambiente e moído em moinho de

facas, (650,0 g) foi submetido à extração por maceração dinâmica com metanol. O extrato

metanólico foi filtrado e o solvente removidos até completa secura em evaporador rotativo

sob pressão reduzida fornecendo o extrato OCGM (Ouratea Cuspidata Galho Metanol).

O extrato metanolico dos galhos OCGM ( 130,0 g) foi submetido ao processo de

filtração seletiva em gel de sílica com os solventes hexano, acetato de etila e metanol gerando

as respectivas frações OCGMH (8,0 g), OCGMAc (38,0g) e OCGMM (65,0).

A fração OCGMH (8,0g) foi cromatografada em coluna de gel de sílica e

eluida com mistura dos solventes hexano, acetato de etila, metanol em gradiente de

polaridades crescentes até metanol 100%, gerando 25 frações de 125 mL. Essas frações foram

reunidas conforme seu perfil em CCDA. As frações 5-10 apresentaram um precipitado branco

que foi identificado como a mistura dos esteróides estgmasterol (2) e sitosterol (3) (25,0 mg).

A fração 12-15 apresentou precipitado branco identificado como a mistura dos triterpenos

Lupeol (14), α-amirina (15), β-amirina( 16). (30,0mg). (Fluxograma 5 pág-23)

A fração OCGMAc (20,0 g) foi submetida ao mesmo tratamento cromatográfico e nas

mesmas condições que a fração OCGMH. Gerando 50 frações de 125 mL. As frações 8-13

foram reunidas e forneceu uma substância pastosa (80,0 mg) identificada como o carboidrato

1-Metil-β-D-glicopiranosil (20) [RMN

13

C DMSO-d

6

, 50 MHz) δ: 105,3 (C-1); 77,9 (C-3);

77,8 (C-5); 71,5 (C_4); 62,6 (C-6); 57,3 (OCH

3

)].

A reunião das frações 25-26 seguida de sua purificação em coluninha de gel de sílica

eluida com Hexano:acetato de etila (4:6) forneceu pó amarelo (8,0 mg) identificado como o

flavonóide 4’,3,5,7-tetraidroxi-3’-metoxi-flavonol (21). RMN

1

H DMSO-d

6

, 200 MHz) δ:

12,5 (HO-5); 7,93 (s,H-2’);7,49 (d, J=8,0 Hz, H-6’); 6,92 (d, J= 8,0 Hz, H-5’); 6,38 (sl, H-8);

6,15 (sl, H-6); 3,82 (s, MeO-3’)].

As frações 42-48 (3,30 g) foram reunidas e recromatografadas em gel de sílica e eluida

com mistura de solventes hexano, acetato de etila, metanol em gradiente de polaridade

crescente até metanol 100% gerando 20 frações de 50 mL a fração 15 apresentou uma mistura

de flavonóides e carboidratos contendo como substância majoritária o flavonóide 4’,5,7-

triidroxi-3’-metoxi-3-β-O-galactopiranosil (22); RMN

1

H DMSO-d

6

, 200 MHz) δ: 6,2 (sl, H-

6); 6,4 (sl, H-8); 7,9 (d, J=2,oHz, H-2’); 6,9 (d, J= 8,0 Hz, H-5’); 7,5 (dd, J= 8,0 e 2,0 Hz H-

6’); 5,56 (d, J= 7,0 Hz, H-1’’); 3,9-3,1(m, H-2’’,3’’,4’’.5’’,6’’); 3,83 (s, MeO-3’); 12,5 (HO-

5). RMN

13

C DMSO-d

6

, 50 MHz) (Figura 92 pag ).

23

Fluxograma 5: Preparação e fracionamento cromatográfico do extrato metanólico do

caule de Ouratea cuspidata

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

22

OCGM

(650,0g)

Filtração seletica

1) Hexano

2) Acetato etila

3) Metanol

OCGMH

(8,0g)

OCGMM

(65,0g)

CC

FE: Gel silica

FM: hex/acet/MeoH

OCGMAc

(20,0g)

5-10 12-15

Cristalização

MeOH

2 e 3

(25,0mg)

14,15 e 16

(30,0mg)

CC

FE: Gel silica

FM: hex/acet/MeoH

8-13 25-26 42-48

20

(80,0mg)

21

(8,0mg)

Mistura+

22

(12,0mg)

H

O

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

20

21

22

2324

25

26

28

29

HO

27

30

14

R

1

HO

R

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

O

HO

OH

OCH

3

O

21

1

2

3

4

5

6

O

OCH

3

OH

HO

20

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

22

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

22

OCGM

(650,0g)

Filtração seletica

1) Hexano

2) Acetato etila

3) Metanol

OCGMH

(8,0g)

OCGMM

(65,0g)

CC

FE: Gel silica

FM: hex/acet/MeoH

OCGMAc

(20,0g)

5-10 12-15

Cristalização

MeOH

2 e 3

(25,0mg)

14,15 e 16

(30,0mg)

CC

FE: Gel silica

FM: hex/acet/MeoH

8-13 25-26 42-48

20

(80,0mg)

21

(8,0mg)

Mistura+

22

(12,0mg)

OCGM

(650,0g)

Filtração seletica

1) Hexano

2) Acetato etila

3) Metanol

OCGMH

(8,0g)

OCGMM

(65,0g)

CC

FE: Gel silica

FM: hex/acet/MeoH

OCGMAc

(20,0g)

5-10 12-15

Cristalização

MeOH

2 e 3

(25,0mg)

14,15 e 16

(30,0mg)

CC

FE: Gel silica

FM: hex/acet/MeoH

8-13 25-26 42-48

20

(80,0mg)

21

(8,0mg)

Mistura+

22

(12,0mg)

H

O

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

20

21

22

2324

25

26

28

29

HO

27

30

14

R

1

HO

R

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

O

HO

OH

OCH

3

O

21

O

HO

OH

OCH

3

O

21

1

2

3

4

5

6

O

OCH

3

OH

HO

20

1

2

3

4

5

6

O

OCH

3

OH

HO

20

24

RESULTADOS E DISCUSSÕES.

Antes do início da década de 70, a determinação da estrutura de um produto natural,

necessitava-se de um longo período de tempo e uma grande quantidade de substâncias. Isto,

porque essas análises baseavam-se fundamentalmente em métodos de degradação, e derivação

porque os métodos físicos eram menos informativos como UV, IV, RMN com baixa

resolução. Hoje são mais usadas as técnicas espectroscópicas são mais informativas. Além da

espectrometria no infravermelho (IV) e espectrometria de massas, a ressonância magnética

nuclear tem sido aprimorada a cada dia gerando mais informações e tornando as análises mais

interessantes.

Esse constante desenvolvimento da RMN com ímãs supercondutores, com a

introdução das técnicas de pulso e da transformada de Fourier, não somente aumentaram a

sensibilidade dos equipamentos, mas também abriram caminho para o desenvolvimento de

várias técnicas especiais canalizando melhores informações estruturais.

Hoje, as técnicas mono e bidimensionais são superiores ao número de duzentas, porém

só algumas dezenas são usadas com mais freqüência..

Para um químico de produtos naturais, os fundamentos físicos e matemáticos, sobre os

quais são baseadas essas técnicas, não são essenciais. O mais importante é o uso adequado

delas.

Mesmo com toda essa evolução dos métodos físicos, é muito importante para a

elucidação estrutural o conhecimento do metabolismo condutor à formação dos representantes

das diferentes classes das substâncias naturais. O conhecimento dos precursores e, as vezes,

das etapas necessárias para elaborações desses constituintes naturais é a base fundamental de

raciocínio para a determinação estrutural das substâncias isoladas.

O estudo químico de O.hexasperma e O. cuspidata levou ao isolamento, purificação e

determinação estrutural de trinta e duas substâncias naturais e de cinco derivados obtidos dos

produtos naturais. Essas informações estão sistematizadas em quatro quadros:

Quadro 1 Constituintes químicos isolados de inflorescências de Ouratea hexasperma;

Quadro 2 Constituintes químicos isolados de caules de Ouratea hexasperma;

Quadro 3 Constituintes químicos isolados de folhas de Ouratea cuspidata;

Quadro 4 Constituintes químicos isolados de caules de Ouratea cuspidata;

25

Quadro 1 - Constituintes químicos isolados de inflorescência de Ouratea

hexasperma.

HO

1

HO

2

HO

3

O

OH

HO

OH

4

O

OH

O

()

n

5

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

O

OH

6

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

7

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

8

O

OH

O

OH

HO

H

CH

3

O

10

O

OH

OCH

3

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

9

Derivado Obtido a partir da substância 4

4

6

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

Ac

AcO

OAc

4a

HO

1

HO

1

HO

2

HO

2

HO

3

HO

3

O

OH

H

O

HO

OH

4

O

OH

H

O

HO

OH

4

O

OH

O

()

n

5

O

OH

O

()

n

5

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

O

OH

6

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

O

OH

6

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

7

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

7

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

8

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

8

O

OH

O

OH

HO

H

CH

3

O

10

O

OH

O

OH

HO

H

CH

3

O

10

O

OH

OCH

3

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

9

O

OH

OCH

3

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

9

Derivado Obtido a partir da substância 4

4

6

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

Ac

AcO

OAc

4a

4

6

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

Ac

AcO

OAc

4a

26

Identificação dos constituintes isolados de inflorescência de Ouratea

hexasperma (St. Hil).

Mistura de esteróides, Campesterol (1), Estigmasterol (2) e Sitosterol (3)

Os esteróides 1, 2 e 3 foram obtidos em mistura e identificados através da análise dos

espectros de IV, RMN

1

H e

13

C e comparação com dados descritos na literatura

(CARVALHO et al., 2001, VEGA et. al. 2001) e principalmente pela análise com CG-EM

O espectro de RMN

1

H (Figura 3, pág-27) mostra sinais entre δ

H

0,64–0,97

correspondentes aos grupos metílicos. O multipleto em δ

H

3,54 corresponde aos hidrogênios

carbinólicos H–3, o singleto largo em δ

H

5,33 representa o hidrogênio olefínico H–6 e o

multipleto em δ

H

5,18 corresponde aos H–22 e H–23 característico da ligação dupla do

estigmasterol. O espectro de RMN

13

C (Figura 4, pág-27) revela a presença de sinais de

carbonos olefínicos δ

CH

121,63 atribuído a C–6 do campesterol (1), estigmasterol (2) e

sitosterol (3) δ

CH

138,28 e 129,18 (C–22 e23 de 2), um sinal de carbono quaternário olefínico

com δc 140,68 (C–5, 1, 2e 3) e um carbono carbinólico δ

CH

71,69 (C-3) comum aos três

esteróides. Essas análises permitiram propor a presença de 2 e 3 nessa fração pois são os

esteroides mais freqüentes em vegetais.

Considerando que os espectros de RMN

1

H e

13

C dessa mistura não garantem a

presença de apenas 2 e 3, uma vez que a multiplicidade dos sinais na região de metila não

permite distinguir as possíveis ramificações da cadeia aberta dos esteróides. Por isso decidiu-

se fazer análise adicional dessa amostra com CG-EM. Essa análise permitiu detectar além de

2 e 3 um terceiro componente (1) (TR: 17,82; 18,26 e 19,47) para 1, 2 e 3, respectivamente

(Figura 5). Os espectros de massas correspondentes a cada componente apresenta os

respectivos valores de m/z de fragmentos inclusive o do pico do íon molecular (M

+.

) de 1:

(400u, 50%); 2: 413u M

+.

+1, 25%); 3: 414u, 30%) (Figuras 6, 7, 8). A comparação desses

espectros com a biblioteca (REPLIB NIST Library) permitiu caracterizar cada componente.

46

29

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

2 - Estigmasterol

46

29

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

2 - Estigmasterol

4

6

HO

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

1 - Campesterol

4

6

HO

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

1 - Campesterol

46

29

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

H

O

23

3 - Sitosterol

46

29

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

H

O

23

3 - Sitosterol

27

Figura 3 Espectro de RMN

1

H das substâncias 1 + 2 + 3 em CDCl

3

(200 MHz).

Figura 4: Espectro de RMN de

13

C das substâncias 1 + 2+3 CDCl

3

(200 MHz).

C - 6

C - 22

C - 23

C - 5

C - 3

C - 6

C - 22

C - 23

C - 5

C - 3

H - 6

H - 3

H – 22, 23

Região de metilas

4

6

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

46

29

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

46

29

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

H

O

23

1

23

H - 6

H - 3

H – 22, 23

Região de metilas

H - 6

H - 3

H – 22, 23

Região de metilas

4

6

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

46

29

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

46

29

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

24

25

26

2

7

28

1

2

3

5

7

8

9

10

H

O

23

1

23

28

Figura 5: Cromatograma da mistura dos esteróides 1 + 2 + 3. Indicando os picos de 1

e 2.

Figura 6: Espectro de massas de (1) comparado com biblioteca do aparelho.

4

6

HO

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

1 - Campesterol

46

29

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

2 - Estigmasterol

A

4

6

HO

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

1 - Campesterol

46

29

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

2 - Estigmasterol

A

4

6

HO

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

1 - Campesterol

4

6

HO

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

1 - Campesterol

46

29

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

2 - Estigmasterol

46

29

H

O

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

2 - Estigmasterol

A

29

Figura 7: Espectro de massas de (2) comparado com biblioteca do aparelho.

Figura 8: Espectro de massas de (3) comparado com biblioteca do aparelho.

30

Substância 4. (3-β-O-β-D-glicopiranosil sitosterol)

A substância 4 apresentou-se como um sólido branco insolúvel nos solventes

freqüentemente usados para registrar os espectros de RMN. O espectro no IV apresentou

absorções em 3.394 cm

-1

devido a estiramento de O-H e as absorções em 2.957, 2.921, 2.870,

1.467, 1.379 cm

-1

que são ν

C-H

de grupos, CH

2

e CH

3

; 1.649 ν

C=C

, e 1075 e 1025 de ν

C-O

(Figura 9, pág-30). Os dados do espectro de IV, as propriedades dessa substância e as feições

dos sinais no espectro de RMN

1

H permitiram pensar no sitosterol glicosilado. Nesta análise

considerou-se o sinal do H-1’ sobreposto pelo sinal da H

2

O do solvente δ

H

5,1 (d, 8,8 Hz)

(Figura 10 pag 30) deduzido pelo espectro do padrão (CARDOZO, 2006) correspondendo a

um hidrogênio anomérico. Os sinais correspondentes a grupos metílicos entre δ

H

0,82–1,04 e

um sinal de hidrogênio olefínico em δ

H

5,33 (sl, H–6) além de outros sinais do açúcar entre

3,8–4,7. Estas informações e a análise por CCDA da amostra com padrão isolado de Laseguea

erecta levaram a identificação de 4 como sendo o esteróide glicosilado 3-β-O-βD-

glicopiranosil sitosterol.

Figura 9: Espectro de I. V. da substância 4.

Figura 10: Espectro de RMN de

1

H da substância 4 em piridina d

5

. (200 MHz)

ν

O-H

ν

CH

ν

CH

ν

C=C

ν

C-O

ν

O-H

ν

CH

ν

CH

ν

C=C

ν

C-O

4

6

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

OH

HO

OH

4

H - 6

H – 2'

Metilas

H – 1’

4

6

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

OH

HO

OH

4

H - 6

H – 2'

Metilas

H – 1’

31

Derivado 4a. (3-β-O-β-D-tetracetil glicopiranosil sitosterol)

A substância 4 (3-β-O-β-D-glicopiranosil sitosterol 50,0 mg) foi submetida à reação de

acetilação com anidrido acético e piridina, obtendo-se o derivado 4a. O ponto de fusão do

derivado 4a (P.F: 170ºC) e os deslocamentos químicos de RMN

1

H deste derivado mostra

sinais dos hidrogênios do açúcar (δ

H

4,25 dd J=4,0 e 12 ,0 Hz; δ

H

4,09 dl,12,0 Hz, H-6’); δ

H

4,62(J= 8Hz, H-1’) e os δ

H

3,66 (m , H-5’); δ

H

4,96 (tl, H-2’); δ

H

5,03 (tl, H-4’) e δ

H

5,22 (tl,

H-3’). O H-6 apresenta deslocamento em δ

H

5,38 e aos grupos metilas das acetoxilas

absorvem na região de 2,25 a 2,01 ppm.(Figura 11, pág-31). Estes dados estão de acordo

com a literatura (KOJIMA et al., 1990).Permitindo identificá-lo como 3-β-O-β-D-tetraacetil

glicopiranosil sitosterol e confirmando a substância natural 4 como o 3-β-O-β-D-

glicopiranosil sitosterol.

Figura 11 : Espectro de RMN

1

H (200 MHz, em CDCl

3

) da substância 4a

H-3

H-5’

H-6’b

H-6’a

H-1’

H-2’

H-4’

H-3’

H-6

H

3

CC=O

H

3

CC=O

4

6

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

OAc

AcO

OAc

H-3

H-5’

H-6’b

H-6’a

H-1’

H-2’

H-4’

H-3’

H-6

H

3

CC=O

H

3

CC=O

4

6

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

'

O

OAc

AcO

OAc

32

Substância 5. (3β-O–acil–olean–12-en–28-óico.)

O espectro de RMN

1

H mostrou sinais em δ

H

0.71, 0.82, 0.84, 0.87, 0.90 e 1.90

correspondente a sete grupos metila podendo então se tratar de uma estrutura triterpênica: um

tripleto em δ

H

0.87 (H

3

C-CH

2

),δ

H

2.26 de grupo metilênico alfa a carbonila (t, J= 7,2Hz, H-

2’), sinais em δ

H

2,77 (dl, J= 10,0 Hz, H–18), δ

H

4,47 (t, J= 7,6Hz, H–3) e δ

H

5,24 (sl, H–12)

(Figura 12). Estes dados permitiram propor estrutura de triterpeno e a feição do sinal do H-18

está de acordo com o da série oleanano com carbonila em C-28. O valor do δ

H

do H-3 e o

tripleto representante do H-2’ justificam a inclusão de uma unidade acila na posição 3

constituindo um éster do ácido triterpênico. O espectro de RMN

13

C (BBD) (Figuras 13,

14,pág-35,35) apresentou além dos sinais de grupos metílicos [δc 15.32 (C–25), 16.68 (C–

26), 17,14 (C–24), 22,66 (C–30), 25.14 (C–27), 25.87 (C–23), 33.03 (C–29)], os sinais de

carbonos olefínicos em 122.48, e 143.55, duas carbonilas δc 173.72 (éster) e 184.58 (ácido).

O sinal em δc 80,51 é compatível com o valor do deslocamento químico do C-3, sustentando

o grupo O-acila.

A análise destes dados espectrais e a comparação com dados registrados na literatura

(DE CARVALHO, et al 2001) (Tabela 2 pag-32.), permitiram identificar o triterpeno como

sendo o ácido 3β-O–acil–olean–12-en–28 oico.

COOH

O

( )

n

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

2324

25

26

27

28

29

30

33

Tabela 2: Dados de RMN

13

C da substância 3β-O–acil–olean–12-en–28-óico (5) comparada

com (DE CARVALHO et al. 2001;)

Substância 5 Literatura

C

δH δc δc

1 38,00 38,2

2 23,54 26,7

3 4,54(t, J=8,8Hz) 80,51 80,9

4 37,67 37,9

5 55,22 55,2

6 18,11 18,2

7 32,45 32,8

8 39,21 39,3

9 47,49 47,6

10 36,94 37,1

11 22,78 23,7

12 5,24(sl) 122,48 121,6

13 143,55 145,2

14 41,46 42,0

15 27,63 26,2

16 25,87 26,7

17 31,91 32,5

18 2,77(dl, J=10 Hz) 46,49 47,2

19 45,79 46,7

20 30,63 31,0

21 33,76 34,6

22 34,82 33,0

23 27,99 28,3

24 17,14 16,7

25 15,32 15,3

26 16,68 16,8

27 25,14 25,9

28 184,58 184,0

29 33,03 33,0

30 22,66 23,2

O

()

n

173,72

(173,68)

34,82

(34,79)

25,14

(25,15)

31,91

(31,91)

29,66 – 29,15

(29,,70 – 29,15)

22,78

(22,64)

14,11

(14,12)

( ) : Valores da Literatura (SOBRINHO, et al., 1991)

O

()

n

173,72

(173,68)

34,82

(34,79)

25,14

(25,15)

31,91

(31,91)

29,66 – 29,15

(29,,70 – 29,15)

22,78

(22,64)

14,11

(14,12)

( ) : Valores da Literatura (SOBRINHO, et al., 1991)

34

Figura 12: Espectro de RMN

1

H da substância 5 em CDCl

3.

(200MHz).

Figura 13: Espectro de RMN

13

C da substância 5 em CDCl

3

. (50MHz).

C - 28

C - 13

C - 12

C - 3

C - 1'

C - 28

C - 13

C - 12

C - 3

C - 1'

COOH

O

( )

n

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

2324

25

26

27

28

29

30

H - 12

H - 3

H - 18

H -2’

CH

3

COOH

O

( )

n

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

2324

25

26

27

28

29

30

H - 12

H - 3

H - 18

H -2’

CH

3

35

Figura 14: Expansão do espectro de RMN

13

C da substância da 5 entre 15 a 56 ppm

em CDCl

3.

(50MHz)

C - 5

C - 9

C -18

C - 19

C - 14

C - 8

C

-

1

C - 4

C - 10

C -22

*

C - 21

C - 29

*

C

-

7

C – 17 *

C

-

2

0

C

-

2

3

C

-

1

5

C

-

1

6

C – 25 *

C - 2

C

-

1

C -30

C -6

C

-

2

4

C -26

C -25

*

Unidade Acila

C - 5

C - 9

C -18

C - 19

C - 14

C - 8

C

-

1

C - 4

C - 10

C -22

*

C - 21

C - 29

*

C

-

7

C – 17 *

C

-

2

0

C

-

2

3

C

-

1

5

C

-

1

6

C – 25 *

C - 2

C

-

1

C -30

C -6

C

-

2

4

C -26

C -25

*

Unidade Acila

C - 5

C - 9

C -18

C - 19

C - 14

C - 8

C

-

1

C - 4

C - 10

C -22

*

C - 21

C - 29

*

C

-

7

C – 17 *

C

-

2

0

C

-

2

3

C

-

1

5

C

-

1

6

C – 25 *

C - 2

C

-

1

C -30

C -6

C

-

2

4

C -26

C -25

*

Unidade Acila

*

Unidade Acila

36

Substância 6 (Rutina)

O espectro de IV do.substância 6 apresentou sinais de absorção no IV em 3.423,cm

-

1

(ν

OH

), 1.654 cm

-1

(ν

C=O

), 1.504, 1.458 cm

-1

ν

C=C

(anel aromático), 1063-1012 cm

-1

de ν

C-O

.

(Figura 15 Pág-38). As análises em CCDA e revelação com AlCl

3

indicou a substância como

um flavonóide.

O espectro de RMN

1

H (Figura 16, pág-38 Tabela 3 pág-37) dessa substância

apresentou sinais de hidrogênio em anel aromático cujas feições são compatíveis com anel

trissubstituido [δ

H

7,51 (s, H-2'), 7,55 (dl, J= 8,0 Hz, H-6'), 6,82 (d, J= 8,0 Hz, H-5')] Os sinais

em δ

H

6,16 (d, J=1,9 Hz), 6,35(d, J= 1,9 Hz) representam os hidrogênios 6 e 8 do anel A do

flavonóide. O singleto em δ

H

12,6 foi atribuído a uma grupo hidroxila quelada (HO-5). A

ausência de um sinal representante do H-3 permitiu propor a presença de um substituinte

nesse carbono. As duas unidades de carboidratos foram identificadas por dois sinais de

hidrogênios anoméricos em δ

H

5,32 (d, J= 8,0 Hz H-1'') e 4,36 (s, H-1''') ligados aos carbonos

δc 101,2, 100,78, respectivamente. O sinal δ

H

0,96 (d, J= 6,0 Hz, H-6''') ligado ao carbono δc

17,78 serviu para propor a rhamnose como um dos carboidratos. A comparação dos demais

sinais de deslocamentos químicos de carbono presentes nos espectros de RMN

13

C (BBD e

DEPT, Figuras 18, 19 pags-40,41 , Tabela 3 pag-37) com os valores atribuídos para a

glicose e rhamnose permitiram identificar estas duas unidades de açúcar.

Os dados discutidos acima e a comparação com valores descritos na literatura

(AGRAWAL, 1989, VELANDIA et al., 2002) possibilitaram definir a substância 6 como

sendo 3 (β-O-β-D–glicopiranosil-6–1-O-β-L–rhamnopiranosil-quercetina conhecida como

rutina. Esta substância foi isolada anteriormente de O. semiserrata (VELANDIA, 2002)e

Luxemburgia nobilis (OLIVEIRA et al., 2002).

O

OH

H

O

OH O

O

OH

HO

O

H

OH

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

6

1

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2

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3

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4

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5

''

6

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1

'''

2

'''

3

'''

4

'''

5

'''

6

''' '

37

Tabela 3: Atribuição dos dados de RMN

1

H e de

13

C da substância Rutina (6) e

comparação com deslocamentos químicos de carbono 13 registrados na literatura

(AGRAWAL, 1989).

Substância 6 Literatura

δ

C

δ

H

δ

C

δ

C

2 - 156,61 156,60

3 - 133,29 133,60

4 177,36 177,40

5 12,57 (s, OH) 161,25 161,20

6 6,19 (d, J=1,9 Hz) 98,78 98,80

7 - 164,41 163,90

8 6,35 (d, J= 1,9Hz) 93,66 93,60

9 - 156,49 156,40

10 - 103,88 104,20

1’ - 121,16 121,60

2’ 7,51(s) 115,25 115,30

3’ - 144,79 144,60

4’ - 148,49 148,30

5’ 6,82 (d, J= 8,0 Hz) 116,25 116,50

6’ 7,55 (d, J= 8,0 Hz) 121,62 121,60

1’’ 5,32 (d, J=8,0 Hz) 101,24 101,50

2’’ 3,25 (sl) 74,10 74,20

3’’ 3,28 (sl) 75,90 76,10

4’’ 3,66 (sl) 70,55 70,80

5’’ 3,22 (sl) 76,43 76,80

6’’ 3,72 (sl) 67,03 67,10

1’’’ 4,36 (s) 100,78 100,70

2’’’ 3,05 (sl) 70,40 70,40

3’’’ 3,37 (sl) 70,00 70,40

4’’’ 3,00 (sl) 71,85 72,20

5’’’ 3,09 (sl) 68,27 68,20

6’’’ 0,97 (d, J= 6,0 Hz) 17,78 17,50

O

OH

H

O

OH O

O

OH

HO

O

H

OH

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

6

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

'''

4

'''

5

'''

6

''' '

38

Figura 15: Espectro de I. V. da substância Rutina (6).

Figura 16: Espectro de RMN

1

H (200MHz) da substância Rutina (6) em DMSO-d

6

(Ver expansão).

ν

OH

ν

C=O

ν

C=C (Ar

)

ν

C-O

ν

OH

ν

C=O

ν

C=C (Ar

)

ν

C-O

HO - 5

H – 2’

H – 6’

H – 5’

H - 8

H - 6

H – 1’ ’

H – 1’ ’ ’

H – 6’ ’’

HO - 5

H – 2’

H – 6’

H – 5’

H - 8

H - 6

H – 1’ ’

H – 1’ ’ ’

H – 6’ ’’

39

Figura 17: Expansão do espectro de RMN

1

H (200MHz DMSO d

6

) da substância

Rutina (6) entre 1–8 ppm.

H – 2’

H – 6’

H -5’

H -8

H -6

H -1’’

H -1’’’

H -6’’’

Região de açucares

O

OH

H

O

OH O

O

OH

HO

O

OH

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

6

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

'''

4

'''

5

'''

6

''''

H – 2’

H – 6’

H -5’

H -8

H -6

H -1’’

H -1’’’

H -6’’’

Região de açucares

H – 2’

H – 6’

H -5’

H -8

H -6

H -1’’

H -1’’’

H -6’’’

Região de açucares

O

OH

H

O

OH O

O

OH

HO

O

OH

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

6

1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

'''

2

'''

3

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4

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5

'''

6

''''

O

OH

H

O

OH O

O

OH

HO

O

H

OH

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

6

1

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2

''

3

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4

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5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

'''

4

'''

5

'''

6

''' '

40

Figura 18: Espectro de

13

C (BBD 50MHz) da substância Rutina (6) em DMSO-d

6

.

4

7

5

9/2

4’

3’

3

6’

1’

5’

2’

10

1’’

1’’’

6

8

5’’3’’

2’’

4’’’

4’’

2’’’

3’’’

5’’’

6’’

6’’’

4

7

5

9/2

4’

3’

3

6’

1’

5’

2’

10

1’’

1’’’

6

8

5’’3’’

2’’

4’’’

4’’

2’’’

3’’’

5’’’

6’’

6’’’

4

7

5

9/2

4’

3’

3

6’

1’

5’

2’

10

1’’

1’’’

6

8

5’’3’’

2’’

4’’’

4’’

2’’’

3’’’

5’’’

6’’

6’’’

O

OH

H

O

OH O

O

OH

HO

O

H

OH

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

6

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

'''

4

'''

5

'''

6

''' '

41

Figura 19; Espectro de RMN de

13

C (BBD e DEPT 50 MHz) da substância Rutina (6)

em DMSO-d

6

.

C -6’’

C -1’’’

C -1’’

C - 6

C - 8

C -6’’’

C -6’’

C -1’’’

C -1’’

C - 6

C - 8

C -6’’’

O

OH

H

O

OH O

O

OH

HO

O

H

OH

2

3

4

5

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

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6

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6

1

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2

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3

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5

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6

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1

'''

2

'''

3

'''

4

'''

5

'''

6

''' '

42

Substância 7 + 8.(Orientina e Vitexina)

Além da indicação de flavonóide pela análise com CCDA revelada com AlCl

3

, o

espectro obtido na região de I V dessa fração revelou presença de sinais de absorção intensa

em 3.384 cm

-1

, 3.246 cm

-1

(atribuido ao estiramento de grupos hidroxílicos); absorção em

1.655 cm

-1

, (referente estiramento de carbonila conjugada); 1.614, cm

-1

, 1.508 cm

-1

, 1.428 cm

-

1

ν

C=C

(de anel aromático) e 1094-1041 estiramento ν

C-O

que são compatíveis com essa classe

de metabolitos naturais. A análise detalhada dos espectros de RMN permitiram identificar

dois flavonóides 7 e 8.

O espectro de RMN

1

H dessa fração apresentou singletos em δ

H

6,64 (H-3, 7), δ

H

6,78

(H-3, 8) e δ

H

6,27 (H-6, 7 e 8). A diferença na intensidade dos sinais permitiu supor a mistura

de duas substâncias. Os sinais δ

H

7,48 (sl), 6,85 (d, J= 8,0Hz) e 7,52 (d, J= 8,0Hz) foram

atribuídos a três átomos de hidrogênio em anel aromático (H-2', 5', 6') de um sistema ABC no

anel B da substância (7). A presença do sistema AA’BB’ foi evidenciado pelos sinais em δ

H

8,02 (d, J= 8,0 Hz, H-2', 6') e 6,89 (d, J= 8,0Hz, H–3', 5') que foram atribuidos a substância

(8). Ainda analisando o espectro RMN

1

H é verificado um sinal em δ

H

4,68 (d, J= 10 Hz)

referente a um hidrogênio anomérico cujo valor é compativel para C–glicosídeos. Os demais

sinais na região de carboidrato e a análise dos espectros de RMN

13

C (BBD e DEPT) e

comparação com dados da literatura (AGRAWAL, 1989) permitiram identificar a unidade β-

D–glicopiranosila em cada uma das substância (7) e (8). A ausência de um carbono em torno

de 94 ppm para HC–8 e o sinal de carbono quaternário em 104,42 ppm permitiu localizar o

carboidrato em 8. Esses valores e os demais valores de δc, δ

H,

δ

CH2

são semelhantes aos da

literatura (Tabela 4, Pág-43) para os flavónoides C-glicosilados 7 e 8.

Além dessas observações a análise do mapa de contorno HMQC (Figuras 28 e 29

pags-51,52) permitiu a correta atribuição dos deslocamentos químicos de H e C de cada

componente da mistura. Conduzindo a identificaçao da substância (7) como sendo a orientina

e a substância (8) como a vitexina. A orientina foi anteriormente isolada de Luxemburgia

octandra (ALVES, 2003) e a vitexina de Piptadenia gonoacantha (CARDOZO, 2006).

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

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5

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6

''

8

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

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4

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5

'

6

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1

''

2

''

3

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4

''

5

''

6

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8

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

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4

''

5

''

6

''

7

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

7

43

Tabela 4: Dados de RMN

1

H e

13

C incluindo acoplamento heteronuclear(HMQC) da

substância orientina (7) e comparação com δ

H

e δc da orientina.(ZHOU et. al. 2005).

Substância 7 Orientina

C HMQC HMQC

2 163,95 - 164,16 -

3 102,32 6,64 (s) 102,41 6,65(s)

4 181,88 - 182,03 -

5 160,25 13,17(s, OH) 160,47 13,17(s, OH)

6 98,01 6,27 (s) 98,31 6,25(s)

7 162,43 - 162,80 -

8 104,42 - 104,65 -

9 155,87 - 156,01 -

10 103,91 - 103,99 -

1’ 121,88 - 121,97 -

2’ 113,93 7,48(s) 114,07 7,44(d,j=2,1Hz)

3’ 145,67 - 145,95 -

4’ 149,47 - 149,90 -

5’ 115,52 6,85(d, J= 8,0 Hz) 115,78 6,90(d, J= 8,2Hz)

6’ 119,23 7,52(d, J= 8,0 Hz) 119,45 7,50(dd, J=2,1 e 8,oHz)

1’’ 73,25 4,68(d, J= 10,0Hz) 73,50 4,72(d, J= 9,0Hz)

2’’ 70,71 3,82(m) 70,90 3,82(t, J= 9,6Hz)

3’’ 78,63 3,35(m) 78,88 3,24(m)

4’’ 70,41 3,25(m) 70,83 3,37(t, J= 9,4Hz)

5’’ 81,87 3,35(m) 82,04 3,21(m)

6’’ 61,50 3,78(m) 61,76 3,75(dd, J= 1,4/11,6Hz)

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

7

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

7

44

Tabela 5: Dados de RMN

1

H e

13

C incluindo acoplamento heteronuclear(HMQC) da

substância vitexina (8) e comparação com δ

H

e δc da vitexina.(ZHOU et. al. 2005).

Substância 8 vitexina

C HMQC HMQC

2 163,82 - 164,98 -

3 102,32 6,78 (s) 102,51 6,94(s)

4 181,96 - 182,73 -

5 160,00 13,17(s, OH) 160,28 13,17(s, OH)

6 98,01 6,27 (s) 98,45 6,44(s)

7 162,43 - 162,31 -

8 104,42 - 104,56 -

9 155,87 - 155,64 -

10 103,91 - 104,07 -

1’ 121,48 - 122,07 -

2’ 128,83 8,02(d, J= 8,0Hz) 128,99 8,26(d, J= 8,7Hz)

3’ 115,68 6,89(d, J=8,0Hz) 115,01 7,05(d, J= 8,7Hz)

4’ 161,00 - 161,32 -

5’ 115,68 6,89(d, J= 8,0 Hz) 115,01 7,05(d, J= 8,7Hz)

6’ 128,83 8,02 (d, J= 8,0 Hz) 128,99 8,26(d, J= 8,7Hz)

1’’ 73,25 4,68(d, J= 10,0Hz) 73,93 4,94(d, J= 9,8Hz)

2’’ 70,42 3,82(m) 71,03 3,82(t, J= 9,6Hz)

3’’ 78,52 3,25(m) 79,01 3,24(m)

4’’ 70,71 3,35(m) 70,20 3,37(t, J= 9,4Hz)

5’’ 81,72 3,25(m) 81,29 3,21(m)

6’’ 61,16 3,78(m) 61,36 3,75(dd, J= 1,4/11,6Hz)

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

8

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

8

45

Figura 20: Espectro de I V da mistura de substâncias 7 + 8.

Figura 20: espectro de RMN

1

H (400MHz) da mistura das substâncias 7 + 8 em

DMSO-d

6

.

ν

OH

ν

C=O

ν

c=c(Ar)

ν

c-O

ν

OH

ν

C=O

ν

c=c(Ar)

ν

c-O

46

Figura 21: Expansão do espectro de RMN

1

H (400 MHz) da mistura 7 +8 em DMSO-

d

6

entre 6,2 – 8,2 ppm.

H - 2‘, 6‘ (8)

H - 6‘ (7)

H - 2‘ (7)

H - 3‘, 5‘ (8)

H - 5‘( 7)

H – 3 (8)

H – 3 (7)

H – 6 (8), (7)

H - 2‘, 6‘ (8)

H - 6‘ (7)

H - 2‘ (7)

H - 3‘, 5‘ (8)

H - 5‘( 7)

H – 3 (8)

H – 3 (7)

H – 6 (8), (7)

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

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4

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5

''

6

''

8

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

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7

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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5

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6

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8

O

OH

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

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5

'

6

'

1

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2

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3

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5

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6

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8

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

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7

O

OH

HO

OH O

OH

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

7

47

Figura 22: Expansão do espectro de RMN

1

H (400 MHz) na região de açúcares entre

3–5 ppm da mistura das substâncias 7 + 8.

Figura 23: Espectro de RMN

13

C (100 MHz) da mistura das substâncias 7 + 8. em

DMSO-d

6

.

H - 1'‘( 7 )( 8 )

Região de açucar

H - 1'‘( 7 )( 8 )

Região de açucar

48

Figura 24: Expansão do espectro de RMN

13

C (100 MHz) da mistura das substâncias

7 +8 entre 145–183 ppm em DMSO-d

6

.

Figura 25: Expansão do espectro de RMN

13

C (100 MHz) da mistura das substâncias

7 +8 entre 97–130 ppm em DMSO-d

6

.

C

–

4

(

8

)

C -4(7)

C – 2(7)

C – 2(8)

C -7(7)(8)

C – 5, 4’(8)

C – 5(7)

C – 9(7)(8)

C -4’(7)

C – 3’(7)

C

–

4

(

8

)

C -4(7)

C – 2(7)

C – 2(8)

C -7(7)(8)

C – 5, 4’(8)

C – 5(7)

C – 9(7)(8)

C -4’(7)

C – 3’(7)

c – 6‘(8 )

c - 1‘(7)

C - 1‘(8)

C - 6‘(7)

C -3' 5‘(8 )

C - 5‘(7)

C - 2‘(7)

C -8(8)

C – 8(7)

C -10(7),(8)

C – 3(7),(8)

C -6 (7).(8 )

c – 6‘(8 )

c - 1‘(7)

C - 1‘(8)

C - 6‘(7)

C -3' 5‘(8 )

C - 5‘(7)

C - 2‘(7)

C -8(8)

C – 8(7)

C -10(7),(8)

C – 3(7),(8)

C -6 (7).(8 )

49

Figura 26: Expansão do espectro de RMN

13

C (100 MHz) da mistura das substâncias

7 + 8 em DMSO-d

6

.

C – 1’’(7)(8)

C – 2’’(7)

C – 3’’(7)

C – 3’’(8)

C –2’’/ 4’’(7)/(8)

C – 5’’(8)

C – 5’’(7)

C – 6’’(7)

C – 6’’(8)

C – 1’’(7)(8)

C – 2’’(7)

C – 3’’(7)

C – 3’’(8)

C –2’’/ 4’’(7)/(8)

C – 5’’(8)

C – 5’’(7)

C – 6’’(7)

C – 6’’(8)

50

Figura 27: Espectro de RMN de

13

C DEPT (100 MHz) da mistura substância 7 + 8.em

DMSO-d6

C – 2’,6’(8)

C – 6’(7)

C – 3’,5’(8)

C – 5’(7)

C – 2’(7)

C – 3(8)

C – 6(7)(8)

C – 5’’(8)

C – 3’’(8)

C – 1’’(7)(8)

C – 2’’/4’’(8)/(7)

C – 6’’(8)

C – 6’’(7)

C – 5’’(7)

C – 3’’(7)

C – 2’’(7)

C – 2’,6’(8)

C – 6’(7)

C – 3’,5’(8)

C – 5’(7)

C – 2’(7)

C – 3(8)

C – 6(7)(8)

C – 5’’(8)

C – 3’’(8)

C – 1’’(7)(8)

C – 2’’/4’’(8)/(7)

C – 6’’(8)

C – 6’’(7)

C – 5’’(7)

C – 3’’(7)

C – 2’’(7)

O

H

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

8

O

H

HO

OH O

O

H

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

7

O

H

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

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2

''

3

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4

''

5

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6

''

8

O

H

HO

OH O

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

''

6

''

8

O

H

HO

OH O

O

H

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

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5

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6

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

''

7

O

H

HO

OH O

O

H

O

OH

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

7

51

Figura 28: Mapa de contorno HMQC (400/100 MHz DMSO-d

6

) na região de C-sp

2

(95-132 ppm) da mistura das substâncias 7 + 8.

C -2’/6’

H - 2’/6’

(8)

H -3’/5’

C -3’/5’

(8)

H -3

C -3

(8) (7)

H -3

C -3

C -6

H - 6

(7)(8)

C - 5’

H – 5’

(7)

C -2’

H -2’

(7)

C – 6’

H – 6’

(7)

C -2’/6’

H - 2’/6’

(8)

H -3’/5’

C -3’/5’

(8)

H -3

C -3

(8) (7)

H -3

C -3

C -6

H - 6

(7)(8)

C - 5’

H – 5’

(7)

C -2’

H -2’

(7)

C – 6’

H – 6’

(7)

52

Figura 29: Mapa de contorno de HMQC (400/100 MHz DMSO-d

6

) mistura das

substâncias 7 + 8 na região de C-sp

3

(30 – 85 ppm).

C - 1’’

H – 1’’

(7)(8)

C – 6’’

H – 6’’

(8)

C -6’’

H -6’’

(7)

C -2’’

H -2’’

(7)(8)

C - 4’’

H – 4’’

(8)

C – 4’’

H – 4’’

(7)

C - 3’’

H - 3’’

(7)

C – 3’’

H - 3’’

(8)

C – 5’’C – 5’’

H - 5’’H - 5’’

(7)(8)

C - 1’’

H – 1’’

(7)(8)

C – 6’’

H – 6’’

(8)

C -6’’

H -6’’

(7)

C -2’’

H -2’’

(7)(8)

C - 4’’

H – 4’’

(8)

C – 4’’

H – 4’’

(7)

C - 3’’

H - 3’’

(7)

C – 3’’

H - 3’’

(8)

C – 5’’C – 5’’

H - 5’’H - 5’’

(7)(8)

C - 1’’

H – 1’’

(7)(8)

C – 6’’

H – 6’’

(8)

C -6’’

H -6’’

(7)

C -2’’

H -2’’

(7)(8)

C - 4’’

H – 4’’

(8)

C – 4’’

H – 4’’

(7)

C - 3’’

H - 3’’

(7)

C – 3’’

H - 3’’

(8)

C – 5’’C – 5’’

H - 5’’H - 5’’

(7)(8)

53

Substância 9 (swertisina)

A análise em CCDA e comparação dos espectros dessa fração com as de 7 e 8

permitiu identificá-la como outro flavonóide C-glicosilado. O espectro de RMN

1

H (Figura

30, pág-55) apresentou além dos singletos em δ

H

6,81, δ

H

6,51, referentes ao hidrogênios H–3

e H–8 respectivamente; os sinais característicos de um sistema AA’BB’ [δ

H

8,02 (d, J= 8,5

Hz, H–2’,6”) e δ

H

6,89 (d, J= 8,5 Hz, H–3’,5’)]. A presença de dubleto em δ

H

4,72(J= 10 Hz)

referente a um hidrogênio anomérico H–1’’ pemitiu surgerir uma flavona C–glicosilada. O

singleto em δ

H

3,86 é representante de um grupo metoxila na molécula. Não se percebeu sinal

de hidrogênio quelado conforme em 7 e 8. Os experimentos de RMN

1

H-NOEDIFF (Figura

31, pág-56) permitiu definir as posições do grupo metoxila e do açúcar. Foram feitas

irradiações em δ

H

3,86 (OMe) e observou-se nOe em δ

H

6,51 (H–8), indicando que o grupo

metoxila esta no C–7. Irradiação em δ

H

6,51 (H–8) gerou nOe na metoxila, confirmando a

observação anterior. Irradiando o dubleto do hidrogênio anomérico em δ

H

4,72 gerou fraco

nOe na metoxila (δ

H

3,86) e não gerou nOe nos hidrogênios 3’,5’, confirmando que o grupo

glicosila deve estar no C–6 ao lado das metoxilas. O dubleto na freqüência dos H-2’,6’,

resultante de nOe devido a irradiação no singleto em δ

H

6,81 (H-3), confirmou a atribuição

dessa freqüência para esse hidrogênio.

Estas análises permitiram definir a estrutura de 9 como 5,4’-diidroxi-7-metoxi-6-C-

glipiranosil-flavona. A comparação dos deslocamentos químicos dos hidrogênios com a

substância 7 e com valores descritos na literatura (KUMARASAMY et al., 2004) para

swertisina isolada de Alliaria petiolada (Tabaela 6, pág-54) confirma essa estrutura. Essa

substância foi isolada pela primeira vez da espécie Swertia japonica (KOMATSU et al.,

1966).

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

9

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

9

54

Tabela 6: Dados de RMN

1

H (500MHz) e RMN

13

C (125 MHz)da substância 9 em

DMSO-d

6

comparado com a literatura D

3

COD (KUMARASAMY, et. al, 2004). ª DMSO-d

6

;

b

D

3

COD

Substância 9

a

Subst. 8

a

|Literatura

b

C

δ

H

δ

H

δ

H

(D

3

COD)

2 - -

3 6,81(s) 6,78 (s) 6,54

4 -

5 -

6 - 6,27 (s)

7 - -

8 6,51 - 6,60

9 - -

10 - -

1’ - -

2’,6’ 8,02 (d, J= 8,5 Hz) 8,02(d, J= 8,0Hz) 7,78

3’,5’ 6,89 (d, J= 8,5 Hz) 6,89(d, J=8,0Hz) 6,87

4’ - -

1’’ 4,72 (d, J= 10,0Hz) 4,68(d, J= 10,0Hz)

2’’ 3,25(m) 3,82(m)

3’’ 3,25(m) 3,25(m)

4’’ 3,35(m)

5’’ 3,25(m)

6’’ 3,78(m)

OMe 3,86(s) -

OH-5 ? 13,17(s, OH)

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

9

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

9

55

Figura 30: Espectro de RMN

1

H (500 MHz) da substância 9 em DMSO-d

6

H – 2’,6’

H -3’,5’

H -3

H - 8

H -1’’

OMe

H – 2’,6’

H -3’,5’

H -3

H - 8

H -1’’

OMe

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

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5

''

6

''

CH

3

O

9

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

9

56

Figura 31: Espectro de RMN-NOEDIFF (200 MHz DMSO-d6) da substância 9.

H -2’,6’

H – 3’,6’

H - 3

H - 8

H – 1’’

O

M

e

H - 8

H -1’’

OMe

H - 8

OMe

H - 3

H – 2’,6’

H -2’,6’

H – 3’,6’

H - 3

H - 8

H – 1’’

O

M

e

H - 8

H -1’’

OMe

H - 8

OMe

H - 3

H – 2’,6’

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

CH

3

O

57

Substancia 10. (swertiajaponina).

As mesmas análise feitas com a fração contendo a substância 9 foram feitas com essa

fração Isso conduziu a proposta de um flavonóide. A diferença entre os espectros dessa

substância e os de 9 está nas feições dos sinais de um anel aromatico. O espectro de RMN

1

H

(Figura 32, pág-59) apresentou singletes em δ

H

6,79 (H-3); δ

H

6,59 (H-8) e os sinais

característicos de sistema ABC para o anel C de uma flavona: δ

H

6,92 (d, J= 8,6 Hz, H-5’); δ

H

7,55 ( sl, H-2’); δ

H

7,56 (m, H-6’). As mesmas observações feitas para a substância 7 e 8

discutidas anteriormente foram feitas para a substância 10, chegando-se a conclução que esta

substância é um flavonóide C-glicosilado mas, entretanto, com grupo metoxila adicional.

Esses grupos estão representados pelos sinais em δ

H

3,88 (s, OMe); δ

H

4,76 (d, J=10Hz, H–

1’’) e multipleto entre 3,0 e 3,7 ppm. Os sinais no espectro de RMN

13

C são compatíveis com

o grupo glicosila em 6 [δ

CH

-

8

94,9; δ

C-6

108,56] e o valor (56.7) para a metoxila. Os demais

valores de deslocamento químico estão de acordo com o anel B diidroxilado e o anel A

sustentando a unidade de açúcar, um grupo hidroxila em 5 e a metoxila em 7 (Tabela 7, pág-

58). Essas deduções foram confirmadas pela análise dos espectros obtidos com experimento

de NOEDIFF (Figura 34, pág-61). Foram feitas irradiações em δ

H

3,88 (OMe) e observou-se

sinal de nOe em δ

H

6,59 (H–8); indicando que o grupo metoxila está no C-7; irradiação em δ

H

6,59 (H-8) gerou nOe na metoxila (δ

H

3,88); irradiando no δ

H

6,79 (H-3) observou-se nOe em

δ

H

7,55 (H-2’) confirmando não haver substituinte na posição 3 nem na posição 2’. A

comparação desses dados com valores da literatura (KUMARASAMY et. al., 2004)

confirmam a proposta da 6-C-glicosil-7-metoxi-5,3’,4’-triidroxiflavona para 10. Essa

substância foi isolada de Swertia japonica e de Alliaria petiolatados. É conhecida como

swertiajaponina (KOMATSU et al., 1966, KUMARASAMY, et. al., 2004). A Tabela 7 pág-

58) mostra a completa atribuição dos dados de RMN

1

H e

13

C e comparação com os valores

divulgados por KUMARASAMY et. al. (2004).

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

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4

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5

'

6

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

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CH

3

O

10

58

Tabela 7: Dados de RMN

1

H e

13

C (200 MHz, 50MHz) (DMSO-d

6

) da substância

swertiajaponina (10) e comparação com valores de deslocamento químico de carbono-13 da

literatura (KUMARASAMY, et. al., 2004).

Substância 10 Literatura

C

δc δ

H

δc

2 164,54 - 164,8

3 102,28 6,79 (s) 102,5

4 182,25 - 182,7

5 161,29 - 160,8

6 108,56 - 108,4

7 163,30 - 163,4

8 94,94 6,59 (s) 90,0

9 155,60 - 157,6

10 104,41 - 104,0

1’ 121,69 - 122,1

2’ 113,95 7,55 (s) 112,9

3’ 145,90 - 145,2

4’ 150,01 - 149,0

5’ 115,61 6,92 (d, J= 8,6 Hz) 115,6

6’ 119,51 7,56 (m) 119,1

1’’ 73,12 4,76 (d, J= 10 Hz) 74,0

2’’ 70,65 3,50(m) 71,4

3’’ 78,73 3,50(m) 78,9

4’’ 70,65 3,50(m) 70,6

5’’ 82,09 3,50(m) 81,4

6’’ 61,60 3,50(m) 61,7

OMe 56,58 3,88 (s) 56,0

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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6

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CH

3

O

10

59

Figura 32: Espectro de RMN

1

H (200MHz, DMSO-d

6

) substância swertiajaponina

(10).

H - 3

H - 8

H -1’’

H – 2’

H – 6’

OMe

Região de açucar

H – 5’

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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6

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CH

3

O

10

H - 3

H - 8

H -1’’

H – 2’

H – 6’

OMe

Região de açucar

H – 5’

H - 3

H - 8

H -1’’

H – 2’

H – 6’

OMe

Região de açucar

H – 5’

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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6

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CH

3

O

10

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

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4

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5

'

6

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1

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2

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3

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4

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5

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6

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CH

3

O

10

60

Figura 33: Espectro de RMN

13

C (50 MHz, DMSO-d

6

) substância swertiajaponina

(10).

C - 4

C - 2

C - 7

C - 5

C - 9

C – 4’

C – 3’

C – 1’

C – 6’

C – 5’

C – 2’

C - 6

C - 10

C -3

C - 8

C – 5’’

C – 3’’

C – 1’’

C – 2’’, 4’’

C – 6’’

OMe

C - 4

C - 2

C - 7

C - 5

C - 9

C – 4’

C – 3’

C – 1’

C – 6’

C – 5’

C – 2’

C - 6

C - 10

C -3

C - 8

C – 5’’

C – 3’’

C – 1’’

C – 2’’, 4’’

C – 6’’

OMe

O

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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6

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CH

3

O

10

61

Figura 34 : Espectro de RMN–NOEDIFF (200 MHz) da swertiajaponina 10.

H - 3

H - 8

H – 6’

H – 5’

H – 1’’

OMe

OMe 7

H - 8

H -3

H – 2’

H - 3

H – 2’

H - 3

H - 8

H – 6’

H – 5’

H – 1’’

OMe

H - 3

H - 8

H – 6’

H – 5’

H – 1’’

OMe

OMe 7

H - 8

H -3

H – 2’

H - 3

H – 2’

O

H

OH

O

OH

HO

H

2

3

45

6

7

8

9

10

1

'

2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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6

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CH

3

O

62

Quadro 2 - Constituintes químicos isolados de caule de Ouratea

hexasperma St Hil

H

O

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

' O

O

OH

HO

OH

4

HO

OH

O

1

2

3

4

5

6

7

8

11

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

'

5

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6

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1

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1

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2

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6

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1

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2

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13

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

H

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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2

3

12

Derivados obtidos a partir da substância 13

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

OCH

3

OCH

3

H

2

'

3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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1

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3

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4

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5

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13a

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OAc

AcO

H

O

OAc

H

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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5

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13b

H

O

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

' O

O

OH

HO

OH

4

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

1

2

3

5

7

8

9

10

29

1

' O

O

OH

HO

OH

4

HO

OH

O

1

2

3

4

5

6

7

8

11

HO

OH

O

1

2

3

4

5

6

7

8

11

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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1

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6

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13

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10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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5

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6

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1

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13

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7

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9

10

O

OH

HO

H

O

OH

H

2

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5

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6

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1

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7

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9

10

O

OH

HO

H

O

OH

H

2

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6

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1

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1

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5

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2

3

12

Derivados obtidos a partir da substância 13

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

OCH

3

OCH

3

H

2

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3

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4

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5

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6

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1

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13a

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

OCH

3

OCH

3

H

2

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5

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6

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1

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1

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5

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13a

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OAc

AcO

H

O

OAc

H

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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6

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1

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2

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4

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5

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13b

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OAc

AcO

H

O

OAc

H

2

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4

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5

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6

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1

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2

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5

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6

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1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

13b

63

Identificação dos constituintes isolados do caule de Ouratea hexasperma (St.

Hil).

Substância 11 (ácido 2,4-diidroxifenil acético).

O espectro no IV (Figura 37 Pág-64 ) mostra bandas de absorção características de

ácidos: 3.437 cm

-1

(estiramento OH); 1.695 cm

-1

(estiramento de C=O) 1.293 cm

-1

(estiramento C-O).

O espectro de RMN

1

H (Figura 36 Pág-64 ) mostra sinais de hidrogênios em anel

aromático em δ

H

6,85(d, J=8,0 Hz, H-6); 6,28 (d, J= 2,4 Hz H-3) 6,20 (dd, J= 8,0 e 2,4 Hz, H-

5); além de um singleto em 3,4 (CH

2

-7). Os dados detectados no espectro de carbono

desacoplado de RMN

13

C (Figura.37, Pág-64.) estão de acordo com a proposta deduzida com

a análise acima (Tabela 8, pág-61 ). A inserção dessa amostra no cromatógrafo a gás

acoplado com espectrômetro de massas forneceu o pico com TR 2,88 min. O espectro de

massas apresentou picos cujos valores registrados são compatíveis com a estrutura do acido

1,5 diidroxi-fenilacetico. (Figura 38, 39 Pag-65)

Tabela 8: Dados de RMN

1

H (200 MHz) e

13

C (BBD, 50 MHz), em CD

3

OD.

Figura 35: Espectro de I V da substância ácido 1,5-diidroxifenil acético (11).

C

δc δ

H

1 115,4 -

2 156,7 -

3 104,1 6,28 (d, J= 2,4

4 158,9 -

5 104,9 6,20(dd, J= 8,0 e 2,4 Hz)

6 130,2 6,85(d, J= 8,0 Hz))

7 43,7 3,4(s, 2H)

8 176,9 -

HO

OH

O

ν

OH

ν

C=O

ν

C-O

ν

OH

ν

C=O

ν

C-O

-

H

2

O

C

OH

HO

O

m/z 150 (100)

+

OH

O

OH

HO

M

+

168

64

Figura 36: Espectro de RMN

1

H (200 MHz CD

3

OD) da substância ácido 2,4-

diidroxifenil acético (11).

Figura 37: Espectro de RMN

13

C(BBD 50MHz DMSO-d

6

.) substância 11.

C

8

C

-

4

C - 2

C - 6

C - 1

C - 5

C

-

3

C

-

7

OH

O

OH

HO

1

2

3

4

5

6

7

8

C

8

C

-

4

C - 2

C - 6

C - 1

C - 5

C

-

3

C

-

7

OH

O

OH

HO

1

2

3

4

5

6

7

8

OH

HO

OH

O

H -6

H - 3

H -5

H - 7

OH

HO

OH

O

H -6

H - 3

H -5

H - 7

65

Figura 38: Cromatograma da substância 11

Figura 39 Espectro de massas da substância 11. [ Coluna CPSIL8CB (30m x 0,25 x

0,25mm), Temperatura: 180C/1min-10C/min–290/20min. Ionização: EI (70eV)].

66

Substância 12 ( 3,4’,5-triidroxi-6-γ,γ dimetil-alil-7-O-β-D-glicosil-flavanona)

O espectro de RMN

1

H de 12 (Figura 40 Pág.71) apresenta sinais de hidrogênios de

anel aoromático para substituído δ

H

7,30 (d, 8,0 Hz, 2H); 6,79 (d, 8,0 Hz, 2H) que podem ser

atribuídos a hidrogênios do anel B do flavonoíde. O sinal em δ

H

6,22 (s, 1H) representa um

hidrogênio do anel A. Além dos sinais múltiplos em 5,2-4,9 e 4,7-4,5 e 3,5-3,0 aparecem dois

sinais simples em 1,61 e 1,75 compativeis com grupos metilas de unidade prenila. Estes dados

permitiram propor a presença de uma unidade de açúcar e um grupo prenila na molécula. Esta

dedução foi confirmada pela análise dos espectros de RMN

13

C (BBD e DEPT (Figura 41

pág-72) que apresentou dois sinais de CH

3

(25,7 e 17,18) dois sinais de CH

2

(21,03 e 60,74)

além de 11 sinais de CH. Esses dados são compatíveis com os carbonos metínicos sp

2

do

flavonoíde [94,15, (C-8); 129,7, (C-2’, 6’); 115,11, (C-3’, 5’); com os da prenila [122,55, (C-

2’’’); 21,03 (C-1’’’); 25,7 e 17,68 (C-4’’’ e 5’’’)]. Os demais sinais de carbonos hidrogenados

7 CH e 1 CH

2

pode ser representantes de uma glicose [100,5 (C-1’’); 77,19 (C-5’’); 76,7 (C-

3’’); 73,4 (C-2’’); 69,1 (C-4’’) e 60,7 (CH

2

-6’’)] e de dois carbonos sp

3

do flavonoíde [83,2

(C-2) e 71,85 (C-3)]. A análise do espectro de correlação heteronuclear a uma ligação

1

J

CH

(Figura 42 pág-73 ) permitiu confirmar as freqüências de absorção dos hidrogênios ligados

aos respectivos carbonos das unidades da molécula (Tabela 9 pag-68 ). O dubleto em 5,84

pode ser atribuído ao OH ligado a carbono 3 do flavononol uma vez que não apareceu sinal de

acoplamento com

1

J

CH

. Os sinais de carbonos quaternários (Figura.41 Pág-72) com δ

C

199,7

(C=O); 163,2; 160,6; 159,6; 157,96; 130,67; 127,6; 109,87; 101,83 possui valores

compatíveis com carbonos quaternários das unidades propostas (Tabela 9 pág-68)O valor CH

94,15 é compatível com o valor do CH-8 do anel A de flavonoides e o δ

C

109,87 pode ser

atribuído ao C-6 sustentando o grupo prenila. Se esse grupo estivesse ligado no C-8 deveria

aparecer um δ

CH

em torno de 98 ppm. Esta dedução foi também confirmada pelos sinais de

interação heteronuclear

1

H x

13

C no mapa de contorno (COLOC,

2,3

J

CH

). Este espectro

apresenta sinais entre C-9 (160,6) com o sinal do H-8 (6,22) e entre C-6 (109,87) e H-

1’’’(3,31, m) e entre o carbono 2’’’ com os hidrogenios das metilas (H-4’’’ e H-5’’’). Os

sinais de

3

J

CH

com os carbonos metílicos 4’’’ e 5’’’ permitiram confirmar a freqüência de

absorção dos H-2’’’ e dos carbonos metínicos 2’ e 6’ com os sinais 5,11 permitiram confirmar

essa freqüência para o H-2. Dentro do multiplete entre 5,2-4,9 aparece um sinal que pode ser

interpretado como dubleto (11 Hz) esse pode ser usado para informar a freqüência para H-2

trans ao H-3. Outra justificativa para essa atribuição é o

1

J

CH

com os respectivos carbonos

(Tabela 9 pág-68, Figura 42 Pág-73). A comparação dos espectros de 12 com os de 13

serviu para confirmar as atribuições para HC-2, HC-3, e HO-3 os sinais desses núcleos não

aparecem em 13.

A análise de uma fração contento as substâncias 12+13 (sendo 12 em maior

quantidade) usando experimento 1D para detectar NOE (NOEDIFF, Figura 45 pág-76)

permitiu tirar algumas conclusões que podem ser utilizadas como confirmação adicional para

a proposta estrutural de 12, a irradiação na freqüência δ

H

4,92 do hidrogênio ligado ao

carbono (1’’, δ

CH

: 100,15) gerou NOE no H-8 (6,22);(Figura 45-e) irradiação na freqüência

de H-2’’’ e H-2 (≅ 5,1) gerou fraco NOE nas metilas e não gerou NOE no H-3 (Figura 45-c)

os demais experimentos não foram conclusivos. Estas análises e comparação com dos dados

de modelo da literatura(Tabela 10 pag-69) permitiram propor para 12 a estrutura da 3,4’,5-

triidroxi-6-prenil-7-O-β-D-glicosil-flavanona. Após essa proposta registraram-se espectros de

massas desse material com sistema de ionização eletron Spray usando H

2

O como dispersante

(Figuras 46-a, 46-b, 46-c e 46-d págs-77 e 78). O espectro de massas obtido na primeira

ionização (Fig 46-a pag-77) apresentou como principais picos m/z 607, 553, 515, 399, 355 e

255. No esquema 1 pág-70 são propostas partículas responsáveis pelos respectivos íons

negativos detectados. Os espectros obtidos da 2ª Ionização dos íons detectados em 46-a

67

(Figura 46-b, 46-c e 46-d pág-77,78 ) forneceu picos que permitiu deduzir que os íons com

m/z 517 e 515 são responsáveis pelos picos em m/z 355 e 327 (Figura 46-c e 46-d pág-78). O

pico 553 é de 517 com duas moléculas de H

2

O (Fig 45-b pág-77) o 517 produz o 515 e o pico

em m/z 255 é formado pelo fragmento 219 com uma molécula de H

2

O (Fig 46-c pág-78) uma

vez que este não aparece nos demais espectros. Esses fragmentos confirmam a estrutura

proposta. Além dessa substância ser nova na literatura esse é o primeiro registro de

flavonoídes prenilados em Ouratea.

O modelo I utilizado corresponde a uma substância que difere de 12 apenas na

hidroxila adicional em 3’. Essa substância foi isolada da espécie Ochna integerrima

(Ochnaceae) sendo o único exemplo de flavonoíde prenilado nessa família

(LIKHITWITAYAWUID, et al., 2001).

OH

H

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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Modelo I

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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3

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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OH

H

Substância 12

OH

H

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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3

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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Modelo I

OH

H

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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5

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6

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1

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2

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3

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Modelo I

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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OH

H

Substância 12

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

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1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

'''

OH

H

Substância 12

68

Tabela 9: Dados de RMN* (δ, J Hz, DMSO-d

6

)

1

H (200 MHz)

13

C (50 MHz) da substância 12.

*Espectro 2D de correlação homonuclear (

1

H x

1

H COSY), heteronuclear (

1

H x

13

C-

COSY) e espectros de RMN 13C(BBD e DEPT) e NOEDIFF

b

foram usados nas

atribuições desses valores.

1

Hx

13

C HETCOR

1

J

CH

1

Hx

13

C COLOC

1

H x

1

H Cosy

NOE

b

C

δc δ

H

2

J

CH

3

J

CH

2 83,2 5,11(d,J= 11,0Hz) H-3

3 71,85 4,55(m) H-2, HO-3 H-2

4 199,70 - H-2

5 159,59

OH - 12,04 (s) H-3

6 109,87 - H-1’’’ H-8, H-2’’’

7 163,24 - H-8

8 94,15 6,22 (s)

9 160,63 - H-8

10 101,83 - H-8

1’ 127,61 - H-3’, 5’

2’ 129,71 7,30(d,J= 8,0Hz) H-2 H-6’

3’ 115,11 6,79(d,J= 8,0Hz) H-5’

4’ 157,96 - H-3’, 5’ H-2’,6’

5’ 115,11 6,79(d,J= 8,0Hz) H-3’

6’ 129,71 7,30(d,J= 8,0Hz) H-2 H-2’

1’’ 100,15 4,92(d,J= 8,0Hz) H-2’’ H-8,H-2’’

2’’ 73,43 3,29 (m) H-1’’

3’’ 76,70 3,29 (m)

4’’ 69,60 3,18 (m)

5’’ 77,19 3,35 (m)

6’’ 60,74 3,50 (m)

1’’’ 21,03 3,31 e 3,14 (m) 1’’’(a)(b) / 2’’’

2’’’ 122,55 5,17(dd,) H-4’’’,5’’’ 1’’’(a) (b)

3’’’ 130,67 - H-5’’’ H-4’’’

4’’’ 25,70 1,61 (s) H-5’”, H-2’”

5’’’ 17,68 1,75 (s) H-4’”, H-2’”

HO-3 - 5,34(d)

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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6

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1

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2

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3

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5

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OH

H

12

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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6

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1

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2

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3

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4

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5

'''

OH

H

12

69

Tabela 10: Dados de RMN

1

H e

13

C (200 e 50 MHz, DMSO-d

6

) da substância 3,4’,5-

triidroxi-6-prenil-7-O-β-D-glicosil-flavanona (12) com parados com dados de RMN

1

H e

13

C

(500 e 125 MHz, DMSO-d

6

) do modelo da literatura.

Substancia 12 Modelo I (LIKHITWITAYAWUID,2001)

C

δc δ

H

δc δ

H

2 83,2 5,11(d,J= 11,0Hz) 83,3 5,01 (d,11,0 Hz)

3 71,85 4,55(m) 71,8 4,55 (d, 11,0 Hz)

4 199,70 - 199,0 -

5 159,59 159,5 -

OH - 12,04 (s) -

6 109,87 - 109,7 -

7 163,24 - 163,1 -

8 94,15 6,22 (s) 94,0 6,22 (s)

9 160,63 - 160,5

10 101,83 - 101,7

1’ 127,61 - 128,0

2’ 129,71 7,30(d,J= 8,0Hz) 115,4 6,88 (sl)

3’ 115,11 6,79(d,J= 8,0Hz) 145,0

4’ 157,96 - 145,9

5’ 115,11 6,79(d,J= 8,0Hz) 115,2 6,74 (sl)

6’ 129,71 7,30(d,J= 8,0Hz) 119,5 6,74 (sl)

1’’ 100,15 4,92(d,J= 8,0Hz) 100,1 4,91 (d, 7,6 Hz)

2’’ 73,43 3,29 (m) 73,3 3,27 (m)

3’’ 76,70 3,29 (m) 76,6 3,27 (m)

4’’ 69,60 3,18 (m) 69,6 3,14 (m)

5’’ 77,19 3,35 (m) 77,1 3,40 (m)

6’’ 60,74 3,50 (m) 60,6 3,43 (m) 36,5 (dd 11,3; 1,8 Hz)

1’’’ 21,03 3,31 e 3,14 (m) 20,9 3,38 (m)

2’’’ 122,55 5,17(dd,) 122,5 5,17 (dd, 7.0; 7,0 Hz)

3’’’ 130,67 - 130,5 -

4’’’ 25,70 1,61 (s) 25,6 1,61 (s)

5’’’ 17,68 1,75 (s) 17,8 1,71 (s)

OH

H

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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6

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1

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4

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5

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Modelo I

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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5

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6

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1

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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OH

H

Substância 12

OH

H

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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6

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1

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2

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4

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5

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Modelo I

OH

H

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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5

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6

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1

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1

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6

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1

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2

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3

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Modelo I

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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2

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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OH

H

Substância 12

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

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4

'

5

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6

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1

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1

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2

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4

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5

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6

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1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

OH

H

Substância 12

70

CO

Esquema 1. Proposta de fragmentação e constituição dos íons compatíveis com

os valores dos picos detectados nos espectros de massas de 12 (figuras: 46-a; 46-b;

46-c e 46-d).

O

OH

OOH

O

OH

H

O

HO

OH

.

-

O

-

OOH

RO

OH

12 C

26

H

30

O

11

(m/z 518 u, 10%)

R=glic: m/z 517

R=H: m/z 355

O

-

O

O.

gliO

O.

m/z 515

O

-

OH

HO

OH

m/z 327

OH

HO

O

-

HO

O

162

o

m/z 219

(a)

+H

2

O

EM-IES (46-a)

m/z: (íon; %)

607(M - H + 5xH

2

O; 20%)

553 (M - H + 2xH

2

O; 80%)

517 (M - H; 90%)

515 (M - H - H

2

; 100%)

399 (12)

355 (60)

255 (219 + H

2

O); 10%)

EM/EM-IES (46-b; 46-c; 46-d); m/z* (%)

(*)

(46-b)

(46-c)

(46-d)

515 (45); 355(100)

515 (45); 355(100); 327(15); 219(20)

335(100); 327(15)

71

Figura 40: Espectro de RMN

1

H (200 MHz) DMSO-d

6

. (Região 8,0-12 ppm é

apresentada no centro da Figura).

H – 3’/5’

H – 2’/6’

H

-

8

OH - 5

OH - 7

OH – 4’

H – 1’’

H – 2’’’/ 2

H

-

3

H – 1’’’a

H – 1’’’b

M

e

M

e

H – 3’/5’

H – 2’/6’

H

-

8

OH - 5

OH - 7

OH – 4’

H – 1’’

H – 2’’’/ 2

H

-

3

H – 1’’’a

H – 1’’’b

M

e

M

e

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

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4

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5

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6

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1

'

1

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2

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

'''

OH

H

12

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

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4

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5

'

6

'

1

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

OH

H

12

72

Figura 41: Espectro de RMN

13

C(BBD, 50MHz) DEPT θ= 135, DMSO-d6 da

substância 3,4’,5-triidroxi-6-prenil-7-O-β-D-glicosil-flavanona (12)

C – 2’ / 6’

C – 2’’’

C 3’ / 5’

C – 1’’

C - 8

C - 2

C - 3

C – 4’’

C – 2’’

C – 3’’

C – 5’’

C – 6’’ C – 1’’’

C – 4’’’ C –

C - 7

C - 9

C - 5

C – 4’

C - 4

C – 3’’’

C – 1’

C - 6

C - 10

C – 2’ / 6’

C – 2’’’

C 3’ / 5’

C – 1’’

C - 8

C - 2

C - 3

C – 4’’

C – 2’’

C – 3’’

C – 5’’

C – 6’’ C – 1’’’

C – 4’’’ C –

C - 7

C - 9

C - 5

C – 4’

C - 4

C – 3’’’

C – 1’

C - 6

C - 10

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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OH

H

12

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

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3

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4

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5

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6

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1

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1

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

'''

OH

H

12

73

Figura 42: Mapa de contorno HETCOR (200/50 MHz) DMSO-d

6

da substância

3,4’,5-triidroxi-6-prenil-7-O-β-D-glicosil-flavanona (12).

C – 5’’’

C – 4’’’

C – 1’’’

C – 6’’

C – 4’’

C

-

3

C

–

2

’’

C – 3’’ / 5’’

C

-

2

C - 8

C

–

1

’

C – 3’ / 5’

C – 2’ / 6’

C

–

2

’

H – 4’’’

H – 5’’’

H – 1’’’a

H – 1’’’b

H – 6’’a

H – 6’’b

H – 4’’

H - 3

H – 2’’

H – 3’’ / 5’’

H - 2

H – 1’’

H - 8

H – 3’ / 5’

H – 2’ / 6’

H -2’’’

C – 5’’’

C – 4’’’

C – 1’’’

C – 6’’

C – 4’’

C

-

3

C

–

2

’’

C – 3’’ / 5’’

C

-

2

C - 8

C

–

1

’

C – 3’ / 5’

C – 2’ / 6’

C

–

2

’

C – 5’’’

C – 4’’’

C – 1’’’

C – 6’’

C – 4’’

C

-

3

C

–

2

’’

C – 3’’ / 5’’

C

-

2

C - 8

C

–

1

’

C – 3’ / 5’

C – 2’ / 6’

C

–

2

’

H – 4’’’

H – 5’’’

H – 1’’’a

H – 1’’’b

H – 6’’a

H – 6’’b

H – 4’’

H - 3

H – 2’’

H – 3’’ / 5’’

H - 2

H – 1’’

H - 8

H – 3’ / 5’

H – 2’ / 6’

H -2’’’

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

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1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

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5

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OH

H

12

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

OH

H

12

74

Figura 43: Mapa de conotorno COLOC (200/50 MHz) DMSO-d

6

da substância

3,4’,5-triidroxi-6-prenil-7-O-β-D-glicosil-flavanona (12).

C – 4’’’

C – 5’’’

C - 8

C 10

C

-

6

C – 3’/ 5’

C – 2’’’

C – 1’

C

–

2

’

/

6

’

C – 3’’’

C – 4’

C - 9

C - 7

C -

4

H – 5’’’

H – 4’’’

H – 1’’’

H - 2

H

-

8

H – 3’ / 5’

H – 2’ / 6’

C – 2’’’

H – 4’’’ J

3

C – 2’’’

H – 5’’’ J

3

C – 3’’’

H – 4’’’ J

2

C – 3’’’

H – 5’’’ J

2

C – 5’’’

H – 4’’’ J

3

C – 5’’’

H – 5’’’ J

1

C – 4’’’

H – 4’’’ J

1

C – 4’’’

H – 5’’’ J

3

C – 6

H – 1’’’ J

2

C – 4

H – 2 J

3

C – 2’ / 6’

H – 2 J

3

C – 7

H – 8 J

2

C – 9

H – 8 J

2

C – 4’

H – 2’ / 6’ J

3

C – 2’ / 6’

H – 2’ / 6’ J

1

C – 3’ / 5’

H – 3’ / 5’ J

1

C – 4’

H – 3’ / 5’ J

2

C – 1’

H – 3’ / 5’ J

3

C – 6

H – 8 J

3

C – 10

H – 8 J

3

C – 6

H – 2’’’ J

3

C – 4’’’

H – 2’’’ J

3

C – 5’’’

H – 2’’’ J

3

H - 2’’’

C – 4’’’

C – 5’’’

C - 8

C 10

C

-

6

C – 3’/ 5’

C – 2’’’

C – 1’

C

–

2

’

/

6

’

C – 3’’’

C – 4’

C - 9

C - 7

C -

4

H – 5’’’

H – 4’’’

H – 1’’’

H - 2

H

-

8

H – 3’ / 5’

H – 2’ / 6’

C – 4’’’

C – 5’’’

C - 8

C 10

C

-

6

C – 3’/ 5’

C – 2’’’

C – 1’

C

–

2

’

/

6

’

C – 3’’’

C – 4’

C - 9

C - 7

C -

4

C – 4’’’

C – 5’’’

C - 8

C 10

C

-

6

C – 3’/ 5’

C – 2’’’

C – 1’

C

–

2

’

/

6

’

C – 3’’’

C – 4’

C - 9

C - 7

C -

4

H – 5’’’

H – 4’’’

H – 1’’’

H - 2

H

-

8

H – 3’ / 5’

H – 2’ / 6’

C – 2’’’

H – 4’’’ J

3

C – 2’’’

H – 5’’’ J

3

C – 3’’’

H – 4’’’ J

2

C – 3’’’

H – 5’’’ J

2

C – 5’’’

H – 4’’’ J

3

C – 5’’’

H – 5’’’ J

1

C – 4’’’

H – 4’’’ J

1

C – 4’’’

H – 5’’’ J

3

C – 6

H – 1’’’ J

2

C – 4

H – 2 J

3

C – 2’ / 6’

H – 2 J

3

C – 7

H – 8 J

2

C – 9

H – 8 J

2

C – 4’

H – 2’ / 6’ J

3

C – 2’ / 6’

H – 2’ / 6’ J

1

C – 3’ / 5’

H – 3’ / 5’ J

1

C – 4’

H – 3’ / 5’ J

2

C – 1’

H – 3’ / 5’ J

3

C – 6

H – 8 J

3

C – 10

H – 8 J

3

C – 6

H – 2’’’ J

3

C – 4’’’

H – 2’’’ J

3

C – 5’’’

H – 2’’’ J

3

H - 2’’’

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

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4

'''

5

'''

OH

H

12

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

OH

H

12

75

Figura 44 ; Mapa de contorno

1

Hx

1

H COSY da substância 12.

H-1’’’(a)

H-1’’’(b)

H-2’’’

H-1’’’(a)

H-2’’’

H-1’’

H-2’’

HO-3

H-3

H-2

H-3

H-2’, 6’

H-3’, 5’

H-1’’’(a)

H-1’’’(b)

H-2’’’

H-1’’’(a)

H-2’’’

H-1’’

H-2’’

HO-3

H-3

H-2

H-3

H-2’, 6’

H-3’, 5’

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

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2

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3

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4

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5

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6

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1

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2

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3

''''

4

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5

'''

OH

H

12

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

OH

H

12

76

Figura 45: Espectro de experimento de NOEDIFF (200 MHz) DMSO-d

6

da substância

3,4’,5-triidroxi-6-prenil-7-O-β-D-glicosil-flavanona (12), com impureza de 13.

H - 3

H - 2

OH -3

H – 2 / 2’’’

Me-5’’’

H – 1’’

H

-

8

H 2’’’

H – 1’’’

*

H

O

(

1

3

)

HO(12)

*HO(13)

HO(12)

*H-2’, 6’(13)

*

H

-

3

’

,

5

’

(

1

3

)

HO-3 (12)

H-2’’

H

-

2

’

(

b

(

a

(c)

(d)

(

e

H - 3

H - 2

OH -3

H – 2 / 2’’’

Me-5’’’

H – 1’’

H

-

8

H 2’’’

H – 1’’’

H - 3

H - 2

OH -3

H – 2 / 2’’’

Me-5’’’

H – 1’’

H

-

8

H 2’’’

H – 1’’’

*

H

O

(

1

3

)

HO(12)

*HO(13)

HO(12)

*H-2’, 6’(13)

*

H

-

3

’

,

5

’

(

1

3

)

HO-3 (12)

H-2’’

H

-

2

’

(

b

(

a

(c)

(d)

(

e

OH

H

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

O

H

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

77

Figura 46-a: Espectro de massas de alta resolução da substância 12 obtido com.

Ionização elétron spray (IES) e detecção de íons negativos.

Figura 46-b: Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico m/z 553 (46-a) da

substância 12 obtido com Ionização elétron spray (IES) e detecção de íons negativos.

a

353327

aa

353327

bb

78

Figura 46-c: Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico 517 (46-a) da

substância 12. obtido com Ionização elétron spray (IES) e detecção de íons negativos.

Figura 46-d: : Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico 515 (46-a) da

substância 12. obtido com Ionização elétron spray (IES) e detecção de íons negativos.

cc

dd

79

Substância 13 (3,4’,5-triidroxi-6-γ,γdimetil-alil-7-O -β-D-glicopiranosil-flavona)

As mesmas frações que forneceram 12 continham esta substância com as mesmas

propriedades cromatográficas.

A comparação dos espectros de RMN

1

H e

13

C de 13 com os de 12 permitiu perceber

que a única diferença entre as estruturas é na dupla ligação (∆

2,3

) tendo como esqueleto básico

uma flavona. Os espectros de RMN

1

H de 13 (Figuras 47, Pág-82) apresenta os dubletos δ

H

8,08 (H-2’, 6’) e 6,95 (H-3’, 5’) do sistema aromático para substituído (anel B) da flavona. O

sinal do H-8 aparece em 6,89 (s, 1H). Os demais sinais são compatíveis com as unidades de

açucar e prenila. O mapa de contorno (Figura 50 pág-85) do espectro

1

Hx

1

H COSY confirma

o sistema AA’BB’ do anel B da flavona e permite perceber sinais de acoplamento do 1’’ com

H-2’’ e do H-1’’’ com H-2’’’ (5,08) (Tabela 11 pág-80 ) A análise dos espectros de RMN

13

C (BBD e DEPT, Figura 48 pág-83) e do HETCOR de 13 permitiu deduzir alguns valores

de δ

H

e de δ

C

e a comparação com modelo da literatura (Mod-1) (LIKHITWITAYAWUID, et

al., 2001) e com 12 permitiu compor a tabela 11 pág-80 com as atribuições dos

deslocamentos químicos dos carbonos e hidrogênios de 13. As mesmas análises com EM-IES

(Figura 51-a-c,págs 86,86 esquema 2 Pag-81)foi feita com essa substância e os dados estão

relacionados no esquema 2 Pág 81. Esses dados confirmam valor da massa de 13 e revela que

os sinais dos picos em m/z 353, 219 são formados a partir do 515 e o 399 é um de 219 com

glicose mais uma molécula de H

2

O. Na segunda ionização o carboidrato sofre fragmentação

formando outros picos de menor m/z.

A preparação de derivados de 13 forneceu dois produtos 13a (pág-88)e 13b(Pág-90)

que serviram para confirmar a proposta.estrutural dessa substância como 3,5,4’-triidroxi-7-O-

β-D-glicopiranosil-6-prenil-flavona

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

80

Tabela 11: Dados de RMN

1

H e

1

H-

1

H-COSY (200 MHz)

13

C , 2D HETCOR, em

DMSO-d

6

da substância 13.

HETCOR H x H

COSY

C

δc δ

H

2 153,99 H-3

3 136,07 H-2

4 176,15 -

5 159,59 -

OH - 12,04 (s) H-3

6 111,76 -

7 147,38 -

8 93,19 6,89 (s)

9 160,60 -

10 104,41 -

1’ 121,64 -

2’ 129,91 8,08(d,J= 8,8Hz) H-3’/5’

3’ 115,54 6,95(d,J= 8,8Hz) H-2’/6’

4’ 156,41 -

5’ 115,54 6,95(d,J= 8,8Hz) H-2’/6’

6’ 129,91 8,08(d,J= 8,8Hz) H-3’/5’

1’’ 100,38 4,90(d,J= 8,0Hz)

2’’ 73,39 3,29 (m)

3’’ 76,76 3,33 (m)

4’’ 69,68 3,36 (m)

5’’ 77,24 3,44 (m)

6’’ 60,68 3,51 (m)

1’’’ 21,27 3,31 e 3,27 (m) 1’’’/ 2’’’

2’’’ 122,20 5,08(dd,) 1’’’(a) (b)

3’’’ 130,70 -

4’’’ 25,58 1,64 (s)

5’’’ 17,82 1,77 (s)

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

81

Esquema 2. Proposta de fragmentação e constituição dos íons compatíveis com

os valores dos picos detectados nos espectros de massas de 13 (figuras: 51-a; 51-b

e

51-c).

O

OH

OOH

O

OH

H

O

HO

OH

.

-

O

-

OOH

RO

OH

13

C

26

H

28

O

11

(m/z 516 u, 30%)

R=glic: m/z 515

R=H: m/z 353

OH

HO

O

-

HO

O

162

o

m/z 219

(a)

+H

2

O

EM-IES (51-a)

m/z: (íon; %)

605(M - H + 5xH

2

O; 10)

551 (M - H + 2xH

2

O; 10)

515 (M - H; 100)

399 (219 + [162] + H

2

0; 15)

353(2)

255 (219 + H

2

O); 1)

EM/EM-IES (51-b; 53-c); m/z* (%)

(*)

(51-b)

(51-c)

353(100); 219(10)

219(100)

O

OH

HO

OH

HO

m/z 162

.

-

o

82

Figura 47: Espectro de RMN

1

H (200 MHz) DMSO-d

6

da substância 13.

* Substancia 12.

H – 2’ / 6’

H – 3’ / 6’

H - 8

H – 2’’’

H – 1’’’a/b

**

*

Me

H – 2’ / 6’

H – 3’ / 6’

H - 8

H – 2’’’

H – 1’’’a/b

**

*

Me

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

83

Figura 48 Espectro de RMN

13

C (BBD), DEPT θ 135 (50 MHz DMSO-d6) da

substância 13.

C - 2

C - 3

C - 4

C -5

C - 6

C - 7

C - 8

C

-

9

C - 10

C – 1’

C 2’ / 6’

C – 3’ / 5’

C – 4’

C – 1’’’

C – 2’’’

C – 3’’’

C

–

4

’

C – 5

’

C – 1’’

C – 2’’

C – 3’’

C – 4’’

C – 5’’

C – 6’’

C - 2

C - 3

C - 4

C -5

C - 6

C - 7

C - 8

C

-

9

C - 10

C – 1’

C 2’ / 6’

C – 3’ / 5’

C – 4’

C – 1’’’

C – 2’’’

C – 3’’’

C

–

4

’

C – 5

’

C – 1’’

C – 2’’

C – 3’’

C – 4’’

C – 5’’

C – 6’’

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

84

Figura 49: Mapa de contorno HETCOR (50 MHz DMSO-d

6

) da substância 13.

H – 2’/ 6’

H – 3’/5’

H - 8

H – 2’’’

H – 1’’

Me a

Me b

C – 2’/6’

C – 2’’’

C – 1’’

C – 3’/5’

C - 8

C –

4

C –

5

C – 2’/6’

H – 2’/6’

C – 3’/5’

H - 3’/5’

C – 8

H - 8

C – 2’’’

H – 2’’’

C – 1’’

H – 1’’

C – 4’’’

Me b

C -5’’’

Me a

H – 2’/ 6’

H – 3’/5’

H - 8

H – 2’’’

H – 1’’

Me a

Me b

C – 2’/6’

C – 2’’’

C – 1’’

C – 3’/5’

C - 8

C –

4

C –

5

C – 2’/6’

H – 2’/6’

C – 3’/5’

H - 3’/5’

C – 8

H - 8

C – 2’’’

H – 2’’’

C – 1’’

H – 1’’

C – 4’’’

Me b

C -5’’’

Me a

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

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2

''

3

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4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

85

Figura 50; Mapa de contorno

1

Hx

1

H COSY (200 MHz DMSO-d

6

)

da sunbstância 13.

H – 2’ / 6’

H – 3’ / ‘5

H – 1’’’a

H – 2’’’

H – 1’’’b

H – 2’’’

H – 1’’

H – 2’’

H – 2’ / 6’

H -3’ / 5’

H – 2’’’

H – 1’’

H – 2’ / 6’

H – 3’ / ‘5

H – 1’’’a

H – 2’’’

H – 1’’’b

H – 2’’’

H – 1’’

H – 2’’

H – 2’ / 6’

H -3’ / 5’

H – 2’’’

H – 1’’

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

86

Figura 51-a :Espectro de massas de alta resolução da substância 13, obtido com

Ionização elétron Spray (IES) e detecção de íons negativos.

Figura 51-b :Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico 515 (51-a) da

substância 13, obtido com Ionização elétron Spray (IES) e detecção de íons negativos.

aa

bb

87

Figura 51-c :Espectro de massas de alta resolução MS/MS do pico 399 (51-a) da

substância 13, obtido com Ionização elétron Spray (IES) e detecção de íons negativos.

CC

88

Derivado 13a (3,4’-dimetoxi-5-hidroxi-6-prenil-7-O-glicosil–flavona

A substância 13 foi submetida à reação de metilação com diazomento gerando a

substância 13a. No seu espectro de RMN

1

H são observados os mesmos sinais de 13 além dos

sinais em δ

H

3,87 e 3,85 referentes aos grupos metila adicionados pela reação. Através deste

derivado foi possível confirmar a localização dos grupos OH livres da flavona e do prenila em

13. Esta confirmação foi feita através de experimento com NOEDIFF com irradiação nos

grupos metoxila (Figura 52-c e 52-d pág-89) que revelou NOE nos hidrogênios H-3’, 5’(3,87

MeO-4’) e no H-2’, 6’(3,85,MeO-3). Isso confirma que os demais substituintes no flavonol

estão localizados no anel A. Outra informação relevante foi o NOE observado no H-1’’ com

irradiação na freqüência do H-8 que confirma a localização do açúcar (Figura 52 pag 89).

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

OCH

3

OCH

3

H

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

89

Figura 52: espectro de RMN-NOEDIFF (200 MHz DMSO-d

6

) da substancia 13a

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OH

HO

H

O

OH

OCH

3

OCH

3

H

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

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4

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5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

nOe

H – 2’,6’

H – 3’,5’

H - 8

Meo4’

Meo-3’

H-1’’

OH

H-8

H-1’’

Meo-4’

H-3’,5’

Meo-3

H-2’,6’

a

b

c

d

H – 2’,6’

H – 3’,5’

H - 8

Meo4’

Meo-3’

H-1’’

OH

H-8

H-1’’

Meo-4’

H-3’,5’

Meo-3

H-2’,6’

H – 2’,6’

H – 3’,5’

H - 8

Meo4’

Meo-3’

H-1’’

OH

H-8

H-1’’

Meo-4’

H-3’,5’

Meo-3

H-2’,6’

a

b

c

d

90

Derivado 13b (3, 5, 4’,2’’,3’’,4’’,6’’-heptaacetil-6-prenil-7-O-glicopiranosil-flavona)

A substância 13 foi submetida a reação de acetilação com piridina e anidrido acético

produzindo o derivado acetilado 13b. O espectro de RMN

1

H (200MHz) apresentou além dos

demais sinais sete sinais dos grupos acetoxilas (Figura 53 pág-90) revelando a reação nos

grupos hidroxilas aromáticos e do açúcar.

Considerando que este derivado é novo utilizaram-se de modelos de estruturas

semelhantes (Mod-2, Mod- 3 e Mod-4) (SILVA, 2002; BASTOS et al., 2002)(Figura 55 pag-

92) para comparar os dados de RMN

13

C e fazer as atribuições dos deslocamentos químicos

registrados no espectro (Figura 56 pág-93) conforme mostrado na tabela.12 Pág-92

Figura 53: Espectro de RMN

1

H (200 MHz DMSO-d

6

) da substância 13b

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OAc

AcO

H

O

OAc

H

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

H-2’,6’

H-3’,5’

H

-

8

H- 1’’’

Me-5

Me-4

Acetoxilas

H-2’’’

H-1’’

H-3’’

H

-

6

’

H-2’’, 4’’, 3’’

H-2’,6’

H-3’,5’

H

-

8

H- 1’’’

Me-5

Me-4

Acetoxilas

H-2’’’

H-1’’

H-3’’

H

-

6

’

H-2’’, 4’’, 3’’

91

Figura 54 Espectro de RMN 1H (200 MHz DMSO-d

6

) expansão da região entre 2,7-

1,0 ppm da substância 13b.

O

Ac

O

A

c

OAc

O

A

c

OAc

Me-5

Me-4

O

A

c

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OAc

AcO

H

O

OAc

H

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

O

Ac

O

A

c

OAc

O

A

c

OAc

Me-5

Me-4

O

A

c

O

Ac

O

A

c

OAc

O

A

c

OAc

Me-5

Me-4

O

A

c

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OAc

AcO

H

O

OAc

H

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

92

Figura 55:Modelos para atribuição dos dados de RMN

13

C do derivado acetilado

(13b).

Tabela 12 Tabela de dados de RMN

13

C e

1

H de 13b comparados com dados de

RMN

13

C de modelos da literatura (SILVA 2002; BASTOS et al., 2002)

Modelo 2 Modelo 3 Derivado 13b

C

δ

C

δ

C

δ

C

δ

H

2 154,0 144,0 148,0 -

3 133,7 134,0 133,7 -

4 170,1 170,0 170,1 -

5 152,0 150,0 154,3 -

6 108,0 114,0 120,5 -

7 163,8 154,0 155,8 -

8 98,8 109,0 98,4 7,01 (s)

9 158,2 157,0 158,8 -

10 111,1 114,9 112,5 -

1’ 127,0 127,4 127,2 -

2’,6’ 129,5 - 129,5 7,82 (d, J=8,0 Hz)

3’,5’ 121,9 - 122,0 7,26 (d, j= 8,0 Hz)

4’ 150,7 - 152,7 -

*1’’ 95,8 100,8 5,23 (sl)

*2’’ 70,3 70,9 5,0 (m)

*3’’ 72,2 72,5 5,0 (m)

*4’’ 68,2 68,0 5,0 (m)

*5’’ 72,3 72,5 4,0 (m)

*6’’ 61,7 62,0 4,23 (s)

1’’’ 29,7 3,29 (d J= 8,0 Hz)

2’’’ 123,1 5,36 (m)

3’’’ 128,8 -

4’’’ 25,6 1,64 (s)

5’’’ 17,9 1,77 (s)

OCOCH

3

167,9-169,4

OCOCH

3

20,6-21,2

O

3

HCO

O

Mod-2

O

R

O

7

2

61

,

7

68

,

2

72

,

2

70

,

3

Mod-4*

O

Mod-3

O

3

HCO

O

Mod-2

O

3

HCO

O

Mod-2

O

R

O

7

2

61

,

7

68

,

2

72

,

2

70

,

3

Mod-4*

O

R

O

7

2

61

,

7

68

,

2

72

,

2

70

,

3

Mod-4*

O

Mod-3

O

Mod-3

93

Figura 56 : Espectro de RMN

13

C (BBD 50 MHz CDCl

3

) do derivado 13b.

OCOCH

3

C-9

C

-

7

C-5

C-4’

C-2

C-3

C-2’,5’

C-3’’’

C

-

1

’

C-2’’’

C-3’, 5’

C

-

6

C-10

C-1’’

C-8

C-3’’,5’’

C-2’’

C-4’’

C-6’’

C

-

1

’’’

C-4’’’

C

-

5

’

OCOCH

3

OCOCH

3

C-9

C

-

7

C-5

C-4’

C-2

C-3

C-2’,5’

C-3’’’

C

-

1

’

C-2’’’

C-3’, 5’

C

-

6

C-10

C-1’’

C-8

C-3’’,5’’

C-2’’

C-4’’

C-6’’

C

-

1

’’’

C-4’’’

C

-

5

’

OCOCH

3

2

3

4

5

6

7

8

9

10

O

OAc

AcO

H

O

OAc

H

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

1

'

1

''

2

''

3

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4

''

5

''

6

''

1

'''

2

'''

3

''''

4

'''

5

'''

94

Quadro-3 - Constituintes químicos isolados das folhas de Ouratea

cuspidata St. Hil

R

1

HO

R

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

HO

14

O

OOH

H

O

OH

O

HO

OH

17

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

18

O

OH

OCH

3

OCH

3

HO

OH

19

HO

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

Derivados obtidos a partir da substância 17

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

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3

'

8

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2

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2

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5

6

8

9

10

1

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5

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6

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2

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3

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4

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5

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6

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9

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10

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1

'' '

3

'' '

5

'' '

6

'' '

2

'' '

17a

O

17b

R

1

HO

R

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

HO

14

HO

14

O

OOH

H

O

OH

O

HO

OH

17

O

OOH

H

O

OH

O

HO

OH

17

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

18

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

18

O

OH

OCH

3

OCH

3

HO

OH

19

O

OH

OCH

3

OCH

3

HO

OH

19

HO

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

Derivados obtidos a partir da substância 17

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

'' '

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'' '

3

'' '

5

'' '

6

'' '

2

'' '

17a

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

'' '

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'' '

3

'' '

5

'' '

6

'' '

2

'' '

17a

O

17b

O

17b

95

Identificação dos constituintes isolados das folhas de Ouratea cuspidata. St

Hil

.

Substâncias 14, 15 e 16 Lupeol, α-amirina, β-amirina.

As estruturas dos três componentes da mistura foram definidas pela interpretação do

espectro de RMN

1

H (Figura 57, pág 95), reconhecendo-se a presença dos sinais

correspondentes aos grupos metila ligados a carbono sp

3

em δ

H

0,76 – 1,10 e sp

2

δ

H

1,65.

Sinais de hidrogênio carbinólicos metínicos em δ

H

3,24 ( dd J= 10,0 Hz e J= 7,2 Hz, Hβ-3) e

de hidrogênios olefinicos em δ

H

5,15 (m H–12 de 16), 5,10 (m, H–12 de 15), 4,65 (d, J=

2,2Hz H–29a de 14) e 4,54 (d, J= 1,28 Hz H–29b de 14). A analise dos dados espectrais e a

comparação com amostra padrão da mistura em CCDA e com espectros dessa mistura

isolados de outras espécies vegetais como Luxemburgia nobilis (OLIVEIRA 2000); e

Parahancornia amapá (VELLOSO, 1998) permitiu identificar os três isômeros triterpênicos

da mistura como sendo Lupeol (14), α-amira (15) e β-amirina (16).

Figura 57; Espectro de RMN

1

H (200MHz, CDCl

3

) das substância 14, 15, e 16

Lupeol, α-amirina, β-amirina.

H – 29b (14)

H

–

2

9

a

(

1

4

)

H -3

H – 12 (16)

H 12 (15)

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

20

21

22

2324

25

26

28

29

HO

27

30

14

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

R

1

HO

R

27

29

28

26

25

24

23

22

21

20

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

H – 29b (14)

H

–

2

9

a

(

1

4

)

H -3

H – 12 (16)

H 12 (15)

H – 29b (14)

H

–

2

9

a

(

1

4

)

H -3

H – 12 (16)

H 12 (15)

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

20

21

22

2324

25

26

28

29

HO

27

30

14

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

R

1

HO

R

27

29

28

26

25

24

23

22

21

20

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

96

Substância 17 (Amentoflavona)

A fração contendo essa substância apresentou-se como um sólido amorfo amarelado

cuja revelação em CCDA com AlCl

3

foi compatível com flavonóide. O espectro de RMN

1

H

(Figura 58 pág-98), apresentou dois sinais simples referentes a grupos hidroxila quelados (δ

H

13,16 e 12, 99) sinais indicativos de biflavonóides (VELANDIA, 2002). Essas observações

permitiram fazer a análise dos espectros direcionando as conclusões para o dímero Na região

de hidrogênios em anel aromáticos foi observado os sinais: em δ

H

8,12 (d, J= 2,2 Hz, H–2’);

8,02 (dd, J= 2,2 e 8,4 Hz H – 6’) e 7,23 (d, J= 8,4 Hz, H–5’) compatíveis com um sistema

ABC de um anel B com 3’, 4’ quaternário de um flavonóide; δ

H

em 7,64 (d, J= 8,8 Hz H–2’’’

e 6’’’); 6,82 (d, J= 8,8 Hz, H–3’’’ e 5’’’) característico de um anel para substituido, δ

H

6,51

(d, J= 2,0 Hz H–8), 6,22 (d, J= 2,0 Hz H–6) indicando um sistema de hidrogenios em anel

aromático com acoplamento meta; e δ

H

6,72 (s, H–3’’); 6,65 (s, H–3), 6,43 (s, H–6’’)

surgerindo indicar que a substância 17 possui duas unidades de flavonas cuja ligação entre as

unidades envolve um carbono do anel A. O valor dos deslocamentos químicos do H-2’ (8,12)

e a ausência de um sinal compatível para H-8 permitiu pensar em uma estrutura do grupo das

amentoflavonas (SUZART et al., 2007; VELANDIA et al., 2002)

O espectro de RMN

13

C ( BBD) (figura 59 Pág-99) mostrou 30 sinais de carbonos

dentre os quais foi possível observar os carbonos metínicos do sistema de acoplamento meta

no anel A de flavonoide δc 94,49 (C–8), δc 99,43 (C–6); carbonos metínicos do sistema

AA’BB’ δc 116,38 (C–3’’’ e C–5’’’), δc 129,09 (C–2’’’ e C–6’’’). O sinal de CH em 101,40

(C-6’’) esta de acordo com dados de amentoflavonas. Além dos sinais para as duas carbonilas

conjugadas δc 183,16 e 182,77.

A ligação interflavonoídica pôde ser confirmada através do deslocamento

químico do C-3’ que, quando comparado com o da apigenina {∆

δ

C: 120,54 (17) − 116,09

(apg.) = 4,45} apresentou deslocamento para campo mais baixo por estar mais desprotegido.

Logo envolvido na ligação com a outra unidade de flavonóide. Esta dedução confirma a

observação acima com referencia ao δ

H

-2’. OH–6’’ apresenta-se como um sinal simples não

ocorrendo o acoplamento meta com o H–8’’ como foi observado para outra unidade.

Comparando o deslocamento químico do C–8’’ com o da apigenina constata-se que C–8’’

também esta mais desprotegido{ ∆

δC

C: 105,19 (17) − 95 (apg.) = 11,19}. Estas observações

surgerem a ligação entre os dímeros estar ocorrendo entre C–3’ de uma apigenina com o C–

8’’ da outra unidade. As observações acima juntamento com a comparção dos valores de

deslocamentos químicos de carbono com valores descritos na literatura (VELANDIA et. al.

2002) e comparação com amostra padrão em CCDA confirma que a substância 17 é o

biflavonóide amentoflavona.

Considerando que apenas a comparação de dados de RMN pode acarretar em erro

sempre que possível deve-se preparar derivados para confirmar a proposta. Por isso preparou-

se dois derivados17a.e 17b.

O

OH

H

O

OH O

116

,

09

94

,

00

8

3

'

Apigenina

O

HO

OH

O

OH

HO

OH

120

,

54

116

,

3

8

6

''

3

'

105

,

19

substância

17

97

Tabela 13: Dados de RMN

1

H e

13

C (200 MHz , 50 MHz D

3

CCOCD

3

) da substância

amentoflavona (17).

C

δc δ

H

VELANDIA et al, 2002

2 164,78 - 165,12

3 103,38 6,65 (s) 103,78

4 182,77 - 183,47

5 162,33 - 162,83

6 99,43 6,22 (d, J= 2,0 Hz) 99,75

7 161,51 - 163,37

8 94,49 6,51 (d, J= 2,0 Hz) 94,81

9 155,81 - 156,15

10 105,04 - 105,38

1’ 122,97 - 123,31

2‘ 132,64 8,12 (d, J= 2,2 Hz) 132,61

3’ 120,54 - 120,90

4’ 158,54 - 158,51

5’ 117,17 7,23 (d, J= 8,8 Hz) 117,53

6’ 128,54 8,02 (dd, J= 8,8 3 2,2Hz) 128,83

2’’ 164,57 - 165,12

3’’ 103,92 6,72 (s) 104,32

4’’ 183,16 - 183,08

5’’ 162,15 - 162,66

6’’ 101,40 6,43 (s) 99,80

7’’ 163,02 - 164,91

8’’ 105,19 - 104,44

9’’ 159,99 - 160,30

10’’ 105,19 - 105,56

1’’’ 123,03 - 123,41

2’’’/6’’’ 129,09 7,64 (d, J= 8,8 Hz) 129,14

3’’’/5’’’ 116,28 6,82 (d, J= 8,8 Hz) 116,73

4’’’ 162,48 - 161,83

OH 13,16

OH 12,99

O

OOH

HO

OH

O

HO

OH

98

Figura 58 Espectro de RMN

1

H (200 MHz, CD

3

COCD

3

) da substância amentoflavona

(17).

H - 6

H – 2’

H -6’

H – 2’’’/6’’’

H

–

5

’

H 3’’’/5’’’

H -3’’

H -3

H - 8

H – 6’’

OH

H - 6

H – 2’

H -6’

H – 2’’’/6’’’

H

–

5

’

H 3’’’/5’’’

H -3’’

H -3

H - 8

H – 6’’

OH

O

OOH

HO

OH

O

HO

OH

99

Figura 59: Espectro de RMN

13

C (200 Mhz, CD

3

COCD

3

) da substância

amentoflavona (17).

100

Derivado 17a (Tetrametilamentoflavona)

O produto 17a foi obtido da reação de metilação com diazometano da substância

amentoflavona (17). Esta reação incorpora diazometano nas hidroxilas livres e fazendo-se a

análise dos espectros confirma-se o padrão de substituição e a conexação entre as unidades.

O espectro de RMN

1

H (Figura 60 Pag-102) do derivado metilado 17a, mostra dois

sinais em campo baixo δ

H

13,11 e 12, 79 indicando a presença de dois grupos hidroxilas

quelados, além de 4 sinais simples δ

H

3,87, 3,85, 381, 3,80 correspondentes as metilações das

hidroxilas livres 7, 4’, 7’’ e 4’’’. O mapa de contorno HMQC (Figura 62,Pág-103) da

substância 17a mostra correlação para 12 carbonos sp

2

(CH) (Tabela 14 Pag-101). Os

carbonos quaternários tiveram seus deslocamentos determinados através da análise do mapa

de contorno HMBC (Figura 65, 64 Pag-105, 106) mostrando seus acoplamentos

.

O mapa de

contorno (Figura 65 Pag-106)

1

Hx

1

H-COSY apresenta os acoplamentos do sistema AA’BB’

(H–2’’’ e 6’’’ com H–3’’’ e 5’’’) e acoplamento do sistema ABC H–6’ com H–5’.

As posições das metoxilas foram definidas por meio do mapa de contorno NOESY

(Figura 67 pag-108) onde é observado nOe entre a MeO-7’’ (δ

H

3,87) com H–6’’ (δ

H

6,44) ;

entre Meo-7 (δ

H

3,85) com H–6 e H–8 entre Meo-4’ (δ

H

3,81) com H–5’ e entre Meo-4’’’ δ

H

3,80 com H–3’’’ e 5’’’ . Esses dados permitiram definir os deslocamentos químicos dos

hidrogênios de cada metoxila e com a análise do espectro HMBC definiu-se os δ

C

dos

carbonos C-7; 7’’; 4’ e 4’’’. Outra confirmação obtida deste experimento é a conexão C-

3’→C-8’’ devido ao nOe no H-5’ e MeO 4’. Se esta metoxila estivesse em 3’ daria nOe no H-

2’. Além do nOe no H-6’’ gerado pela MeO-7’’; o acoplamento a três ligações entre o H-5’

(δ

H

7,17)e o C-3’ (δ

C

122,0) e entre H-6’’ e C-8’’(HMBC, Figura 64 Pag-105) confirma a

ligação das unidades de flavona através dos C-3’ e 8’’. A tabela 14 pág-101 mostra a

completa atribuição dos dados de RMN

1

H e

13

C de 17a. Os valores dos deslocamentos

químicos dos carbono C–5’, C–6, C–6’’, C–8, C–8’’ C–3’’’ e 5’’’ que estão em posição orto

às metoxilas possuem deslocamentos químicos menores do que os respectivos carbono de 17.

Nesses casos ocorre a proteção gama das metoxilas 4’, 7, 7’’, 4’’’sobre esses núcleos. Esse

derivado está registrado na literatura, (VELANDIA, et al 2002).

101

Tabela 14; Dados de RMN

1

H (500 MHz),

13

C (125 MHz) 1D e 2D da substância 17a

(CDCl

3

).

C

δc

a

δ

H

HMBC

b

H xH cosy NOESY

2

J

ch

3

J

ch

2 163,9 - H - 3

3 103,7 6,61 (s)

4 183,0 - H - 3

5 ? -

6 98,1 6,37 (d,J= 1,85Hz) Meo-7

7 165,9 - Meo-7

MeO-7 ? 3,85 (s) H-6 / H-8

8 93,1 6,44 (d, J=1,85Hz) Meo-7

9 ?

10 105,1 H-3

1’ 123,6 H-3

2’ 131,2 7,88 (s)

3’ 122,5 - H-5’

4’ 161,0 - MeO-4’

MeO-4’ ? 3,81 (s) H-5’

5’ 111,2 7,17 (d, J= 8,8Hz) H-6’ MeO-4’

6’ 129,0 7,98 (dd, J= 1,8/6,6Hz) H-5’

2’’ 164,1 - H-3’’ H-2’’’/6’’’

3’’ 104,9 6,64 (s)

4’’ 182,5 H-3’’

5’’ ?

6’’ 95,6 6,54 (s) MeO-7’’

7’’ 163,0 MeO-7’’

MeO-7’’ ? 3,87 (s) H-6’’

8’’ 104,9 H-6’’

9’’ ?

10’’ 105,9 H-3’’ /H-6’’

1’’’ 123,3 H-3’’

2’’’/6’’’ 129,0 7,48 (d, J= 8,8Hz) H-3’’’/5’’’

3’’’/5’’’ 114,8 6,84 (d, J= 8,8Hz) H-2’’’/6’’’ MeO-4’’’

4’’’ 162,8 H-3’’’/5’’’ MeO-4’’’

MeO-4’’’ ? 3,80 (s) H-3’’’/5’’’

Aguardando espectro da região que fornece esses valores.

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

102

Figura 60: Espectro de RMN

1

H (500 MHz CDCl

3

) substância (17a).

Figura 61: Expanção do espectro de RMN

1

H (500MHz CDCl

3

) substância

tetrametilamentoflavona (17a) entre 6,5 a 8,5ppm.

H -6’

H -2’

H -2’’’/6’’’

H -5’

H -3’’’/5’’’

H – 3’’

H - 3

H -6’’

H -8

H -6

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

OH O

O

OH O

H -6’

H -2’

H -2’’’/6’’’

H -5’

H -3’’’/5’’’

H – 3’’

H - 3

H -6’’

H -8

H -6

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

OH O

O

OH O

103

Figura 62: Mapa de contorno RMN 2D HMQC

(500 MHz CDCl

3

) ampliado em 6,3 –

8,0 ppm da substância 17a

H - 6

H - 8

H – 6’’

H - 3

H – 3’’

H – 3’’’/5’’’

H – 5’

H – 2’’’/6’’’

H – 2’

H – 6’

H – 6

C - 6

H – 8

C - 8

H – 6’’

C – 6’’

H – 3’’

C – 3’’

H – 3

C - 3

H – 3’’’/5’’’

C – 3’’’/5’’’

H – 5’

C – 5’

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’’/6’’’

H -2’

C -2’

H -6’

C -6’

H - 6

H - 8

H – 6’’

H - 3

H – 3’’

H – 3’’’/5’’’

H – 5’

H – 2’’’/6’’’

H – 2’

H – 6’

H – 6

C - 6

H – 8

C - 8

H – 6’’

C – 6’’

H – 3’’

C – 3’’

H – 3

C - 3

H – 3’’’/5’’’

C – 3’’’/5’’’

H – 5’

C – 5’

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’’/6’’’

H -2’

C -2’

H -6’

C -6’

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

104

Figura 63: Mapa de contorno RMN 2D de HMBC (500MHz CDCl

3

) ampliado em

6,5–7,5 ppm da substância tetrametilamentoflavona 17a.

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

H - 8

H – 6’’

H - 3

H – 3’’

H – 3’’’/5’’’

H – 5’

H – 2’’’/6’’’

H–6’’

C–7’’

H -3

C - 2

H – 3’’

C – 2’’

H – 3’’’/5’’’

C – 4’’’

H – 3’’

C – 4’’

H – 3

C - 4

J

3

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’

H - 8

H – 6’’

H - 3

H – 3’’

H – 3’’’/5’’’

H – 5’

H – 2’’’/6’’’

H–6’’

C–7’’

H -3

C - 2

H – 3’’

C – 2’’

H – 3’’’/5’’’

C – 4’’’

H – 3’’

C – 4’’

H – 3

C - 4

J

3

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’

105

Figura 64: Mapa de contorno RMN 2D de HMBC (500MHz CDCl3) ampliado em 6,5

– 7,3 ppm da substância tetrametilamentoflavona (17a).

H - 8

H – 6’’

H

-

3

H – 3’’

H – 5’

H – 3’’’/5’’’

H – 6’’

C – 8’’

H -6’’

C – 10’’

H – 3

C - 10

H – 3’’

C -10’’

H -3

C – 1’

H – 3’’

C – 1 ’’’

H – 5’

C – 3’

H - 8

H – 6’’

H

-

3

H – 3’’

H – 5’

H – 3’’’/5’’’

H – 6’’

C – 8’’

H -6’’

C – 10’’

H – 3

C - 10

H – 3’’

C -10’’

H -3

C – 1’

H – 3’’

C – 1 ’’’

H – 5’

C – 3’

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

106

Figura 65: Mapa de conotorno de HxH COSY (500 MHz, CDCl

3

) da substância 17a.

H

–

6

’

H – 2’

H – 2’’’/6’’’

H – 5’

H -3’’’/5’’’

H – 6’

H – 5’

H – 6’

H – 2’’’/6’’’

H – 3’’’/6’’’

H – 3’’’/5’’’

H – 2’’’/6’’’

H

–

6

’

H – 2’

H – 2’’’/6’’’

H – 5’

H -3’’’/5’’’

H – 6’

H – 5’

H – 6’

H – 2’’’/6’’’

H – 3’’’/6’’’

H – 3’’’/5’’’

H – 2’’’/6’’’

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

107

Figura 66 Mapa de contorno de RMN-2D HMBC (500 MHz, CDCl3) ampliado em

3,7 – 4,0 ppm. Da substância 17a.

MeO-4’’’

MeO-4’

MeO-7

MeO-7’’

M e O -4 ’’’

C – 4 ’’’

MeO-4’

C – 4’

161,0

162,8

165,9

163,0

MeO- 7

C - 7

MeO- 7’’

C – 7’’

MeO-4’’’

MeO-4’

MeO-7

MeO-7’’

M e O -4 ’’’

C – 4 ’’’

MeO-4’

C – 4’

161,0

162,8

165,9

163,0

MeO-4’’’

MeO-4’

MeO-7

MeO-7’’

M e O -4 ’’’

C – 4 ’’’

MeO-4’

C – 4’

161,0

162,8

165,9

163,0

MeO- 7

C - 7

MeO- 7’’

C – 7’’

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

108

Figura 67: Mapa de cotrono RMN 2D NOESY (500 MHz, CDCl

3

) ampliado em 3,7 –

4,0 ppm da substância 17a

H - 6

H - 8

H – 6’’

H - 3

H – 3’’

H – 3’’’/5’’’

H – 5’

MeO-7

H - 6

MeO-7

H - 8

MeO- 4’’’

H – 3’’’/5’’’

MeO-4’

H – 5’

Meo-7’’

H – 6’’

MeO -4’’’

MeO- 4’

MeO-7

MeO- 7’’

H - 6

H - 8

H – 6’’

H - 3

H – 3’’

H – 3’’’/5’’’

H – 5’

MeO-7

H - 6

MeO-7

H - 8

MeO- 4’’’

H – 3’’’/5’’’

MeO-4’

H – 5’

Meo-7’’

H – 6’’

MeO -4’’’

MeO- 4’

MeO-7

MeO- 7’’

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

NOE

109

Derivado 17b. (Amentoflavona Peracetilada).

O derivado 17b foi obtido através da reação de acetilação da substância 17 com

piridina e anidrido acético. A analise do espectro de RMN

1

H do derivado 17b (Figura 68

Pág-111) quando comparado com o da substância 17 foram observados desaparecimento dos

singletes δ

H

13,16 e 12,99 e surgimento de sinais adicionais nas freqüências 2,45; 2,40; 2,28;

2,23; 2,05; 2,01 ppm referentes aos grupos acetoxilas incorcoparados à molécula. O espectro

de RMN

13

C (Figuara 69 pág-111) mostra deslocamento químico referentes as carbonilas do

grupo acetato na região entre 169,4-167,9 e 21,08-20,59 para as metilas desse grupo. São

também observado diferenças acentuadas em alguns deslocamentos químicos de carbono que

são compatíveis com as alterações eletrônicas provocadas pela conversão dos grupos hidroxila

em grupos acetoxila (Figuara 70 pág-112.) (CARVALHO, et al., 1993).

Os dados espectrais fornecidos pelos espectros de RMN

1

H e

13

C do derivado 17b

confirmam a estrutura e as atribuições do δ

H

e δ

C,

de

17. Considerando-se obviamente as

modificações previstas com base nos efeitos eletrônicos e estéricos incorporados pela

derivação. Os deslocamentos químicos de carbonos do derivado 17b foram atribuídos com

base nos valores descritos na literatura (VELANDIA et al., 1997, 2002).

O

110

Tabela 15 Dados de RMN

1

H e

13

C (200 e 50 MHz CDCl

3

) do derivado 17b

comparado com valores de RMN

1

H e

13

C (400 e 100 MHz CDCl

3

) da literatura

(VELANDIA et al, 2002)

Derivado 17b

(VELANDIA et al, 2002

C

δC δH δ

C

2 161,0 161,0

3 108,81 6,64(s) 108,86

4 176,22 - 176,16

5 150,14 - 150,20

6 113,93 6,75 113,96

7 154,11 - 154,13

8 109,08 7,46 109,09

9 157,54 - 157,57

10 114,78 - 114,91

1’ 127,88 - 128,78

2’ 129,88 8,04 (m) 129,92

3’ 125,0 - 125,05

4’ 151,90 - 151,41

5’ 123,91 6,98 (d) 123,94

6’ 127,30 8,04 (m) 127,89

2’’ 161,66 - 161,66

3’’ 108,20 6,66 (s) 108,24

4’’ 176,22 - 176,34

5’’ 150,14 - 149,97

6’’ 115,24 6,989 (sl) 114,91

7’’ 151,90 - 151,93

8’’ 117,02 - 117,06

9’’ 155,11 - 155,11

10’’ 115,24 115,29

1’’’ 127,88 128,19

2’’’,6’’’ 127,30 7,48 (d) 127,32

3’’’,5’’’ 122,42 7,06 (d) 122,45

4’’’ 153,32 - 153,36

OCOCH

3

169-167,9 - 169-167,9

OCOCH

3

21,.08-20,59 2,01-2,45

O

111

Figura 68 Espectro de RMN

1

H (200 MHz, CDCl

3

) do derivado 17b.

Figura 69 Espectro de RMN

13

C (BBD, 50 MHz CDCl

3

) do derivado 17b.

H-2’,6’

H-2’’’,6’’’

H-8

3’’’,5’’’

H-5’

H-6

H-3’’

H-3

Acetoxilas

O

H-2’,6’

H-2’’’,6’’’

H-8

3’’’,5’’’

H-5’

H-6

H-3’’

H-3

Acetoxilas

O

OCOCH

3

OCOCH

3

O

OCOCH

3

OCOCH

3

O

112

Figura 70 Expansão do espectro de RMN

13

C (BBD, 50 MHz CDCl

3

) do derivado

17b. Entre a região 105-180 ppm.

4,4’’

OCOCH

3

2’’

2(161,0)

9

9’’(155,11)

7

4’’’

7’’,4’

5, 5’’

2’

1’, 1’’’

6’, 2’’’,6’’’

3’(125,0)

5’

3’’’, 5’’’

8’’ 6’’

10

6

8

3’’

3

O

4,4’’

OCOCH

3

2’’

2(161,0)

9

9’’(155,11)

7

4’’’

7’’,4’

5, 5’’

2’

1’, 1’’’

6’, 2’’’,6’’’

3’(125,0)

5’

3’’’, 5’’’

8’’ 6’’

10

6

8

3’’

3

O

113

Substância 18 (Putraflavona)

O espectro de RMN

1

H (Figura 71 Pág-115) da substância 18 mostra dois sinais

singletos em δ

H

13,07 e δ

H

12,97 correspondentes a hidroxilas queladas. Na região de

hidrogênios em aneis aromáticos foram observados três sinais em δ

H

8,06 (m, H–2’ e 6’), e

7,17 (d, J= 9,1 Hz, H–5’) de um anel B trissubstituido. Os sinais em δ

H

7,68 (d, J= 8,7 Hz, H–

2’’’ e 6’’’); 6,93 (d, J= 8,7 Hz H–3’’’e 5’’’) para um sistema AA’BB’e os sinais em δ

H

6,76

(d, J= 1,9 Hz H–8); 6,36 (d, J= 1,9 Hz H–6) de dois hidrogênios meta do anel A de um

flavonóide. Os sinais em δ

H

6,91, 6,90 e 6,40 representam os hidrogênios 3’’, 3, 6’’ das

unidades de flavona. (Figura 72 Pág-116)

O mapa de contorno 2D de

1

Hx

1

H COSY (Figura 73 Pág-117,) mostra os

acoplamentos entre hidrogênios H–5’ com H–6’; H–2’ com H–6’; e do H–2’’’, 6’’’ com H–

3’’’, 5’’’, e do H-6 com H-8. Estas análises confere à substância 18 o mesmo esqueleto que o

da biflavona 17. Diferindo apenas pela presença no espectro de RMN

1

H (Figura 71 pág-115)

de dois sinais simples δ

H

3,82, δ

H

3,75 referentes a grupos metoxila.

O espectro de RMN

13

C (BBD Figura 74 Pág-118) mostra duas carbonilas conjugadas

δc 182,0, δc 181,0; sinais de δ

CH

114,49 (C–3’’’ e 5’’’); 127,99 (C–2’’’ e 6’’’); 92,67 (C–8);

98,08 (C–6); δ

CH3

em 56,05 e 55, 51 para as metoxila.

Os mapas de contorno 2D de HMQC (Figura 77 Pág-120) mostra acoplamento para

12 carbonos metínicos com os respectivos hidrogênios (Tabela 16 Pág-114). A atribuição dos

deslocamentos químicos dos carbonos quaternários foram feitos através da análise dos mapas

de contorno 2D HMBC (

2

J

CH

,

3

J

CH

)

(Figuras 78-82 Págs-,121-125).

A posição de cada hidroxila quelada foi determinada através do mapa de contorno 2D

HMBC (

2

J

CH

) (Fifgura 81 Pag-124) no qual é observado acoplamento a duas ligações entre

δc 161,12 (C-5) com δ

H

12,9 (OH–5); δ

C

160,56 (C–5’’) com δ

H

13,07 (OH–5’’). Os sinais de

acoplamento a longa distância (

3

J

CH

) entre os carbonos 6 (δ

CH

: 98,08) e 10 (104,7) e o (HO-5

e entre HO-5’’ e os carbonos 6’’ (98,91) e C-10’’ (104,22) e (

3

J

CH

) entre δ

H

8,06 (H-2’) com

o C-8’’ (104,22) confirmam a proposta da amentoflavona.(Tabela 16 pág-114) para a

substância 18.

Para definir a posição das metoxilas fez-se análise com experimentos de RMN-

NOEDIFF com irradiação nas metoxilas. Irradiação em 3,75 gerou nOe em 6,36 (H-6) e 6,76

(H-8) e irradiação em 3,85 gerou nOe em 6,93 (H-3’’’,5’’’) (Tabela 17 pág-115). Esses

dados permitiram localizar as metoxilas (δ

H

3,75) em 7 e a metoxila δ

H

3,85 em 4’’’. A tabela

16 pág-114)mostra as atribuições dos demais sinais detectados nos espectros 2D. A estrutura

de 18 ficou assim definida como 7, 4’’’ dimetilamentoflavona sendo conhecida com

putraflavona. Esta substância foi isolada de Putranjiva roxburghii Wall (GARG et al., 1971) e

é a primeira vez que esta sendo registrada no gênero Ouratea os dados de RMN

13

C está

sendo descrito pela primeira vez.

Substâncias semelhantes foram isoladas dos extratos das folhas de Ouratea

semiserrata através do travalho de VELANDIA (1997) que usou as técnicas usuais de

cromatografia de adsorção e o trabalho de Bosso (2004) que além de usar fracionamento

cromatográfico em gel sílica, utilisou a técnica HPLC-DAD, UV e RMN

1

H (incluindo

NOEDIFF) para identificar outros flavonóides não isolados anteriormente com as técnicas

usuais. Estes biflavonóides são: Amentoflavona, 4’-metil-amentoflavona (Podocarpusflavona-

A); 7-metil-amentoflavona (Podocarpusflavona) e 7,4’-dimetil-amentoflavona

(Podocarpusflavona-B), (BOSSO, 2004).

114

Tabela 16: Dados de RMN

1

H e

1

H-

1

H-COSY (500MHz)

13

C (125MHz) e 2D da

substância putraflavona (18) em DMSO-d

6

HMQC HMBC HxH COSY

C

δc δ

H

2

J

CH

3

J

CH

2 164,13 - H-3 H-2’, H-6’

3 103,10 6,90 (s)

4 182,12 - H-3

5 161,12 - H-6, OH -5

OH-5 12,91

6 98,08 6,36 (d,J= 1,9Hz) OH- 5 H-8

7 165,12 - Meo-7

Meo-7 56,05 3,83

8 92,67 6,76 (s l) H-6

9 157,32 - H-8

10 104,70 - OH-5, H-6, H-3 H-8

1’ 120,80 - H-3

2’ 131,42 8,06 (m)

3’ 120,24 -

4’ 157,32 -

5’ 116,42 7,15 (d,J= 9,1 Hz) H-6’

6’ 127,99 8,06 (m) H-5’

2’’ 163,16 - H-3’’ H-2’’’/6’’’

3’’ 103,55 6,91 (s)

4’’ 181,94 H-3’’

5’’ 160,56 H-6’’, OH-5’’

OH-5’’ 13,07

6’’ 98,91 6,40 (s) OH-5’’

7’’

8’’ 104,22 H-6’’, H-2’

9’’ 154,57

10’’ 104,22 OH-5’’, H-6’’, H-3’’

1’’’ 122,99 H-3’’

2’’’/6’’’ 127,99 7,68 (d,J= 8,7 Hz) H-3’’’/5’’’

3’’’/5’’’ 114,49 6,93 (d,J= 8,7 Hz) H-2’’’/6’’’

4’’’ 162,20 H-3’’’/5’’’ H-2’’’/6’’’, MeO-4’’’

MeO-4’’’ 55,51 3,75 (s)

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

115

Tabela 17: Dados espectrométricos de RMN

1

H-NOEDIFF da substância 18

Figura 71: Espectro de RMN

1

H (500MHz, DMSO-d

6

) da substância putraflavona

(18).

H Irradiado NOE

δ

H

δ

H

(mult. Hz)

H

3,83

Meo-7

6,76 (s l), 6,36 (d,J= 1,9Hz)

8 e 6

3,75

Meo-4’’’

6,93 (d,J= 8,7 Hz)

3’’’ e 5’’’

6,90

3

8,06 (s l) e 8,04 9 (s l)

2’ e 6’

6,91

3’’

7,68 (d,J= 8,7 Hz)

2’’’ e 6’’’

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

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3

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4

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5

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6

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9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

NOE

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

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3

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4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

116

Figura 72: Espectro de RMN

1

H (500MHz, DMSO –d

6

) da substância Putraflavona

(18) ampliado entre 6,2 – 8,2 ppm.

H – 2’

H – 6’

H – 2’’’/6’’’

H – 5’

H – 3’’’/5’’’

H – 3’’

H - 3

H

-

8

H – 6’’

H - 6

H – 2’

H – 6’

H – 2’’’/6’’’

H – 5’

H – 3’’’/5’’’

H – 3’’

H - 3

H

-

8

H – 6’’

H - 6

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

117

Figura 73: Mapa de contornode

1

Hx

1

H COSY (500 MHz, DMSO-d

6

) da substância

putraflavona (18).

H – 2’

H – 6’

H -2’’’/6’’’

H – 5’

H – 3’’’/5’’’

H – 3’’

H

-

3

H - 8

H – 6’’

H - 6

H – 6’

H – 2’

H – 6’

H – 5’

H -2’’’/6’’’

H -3’’’/5’’’

H – 8

H - 6

H – 6

H - 8

H – 3’’’/5’’’

H – 2’’’/6’’’

H – 5’

H – 6’

H – 2’

H – 6’

H -2’’’/6’’’

H – 5’

H – 3’’’/5’’’

H – 3’’

H

-

3

H - 8

H – 6’’

H - 6

H – 6’

H – 2’

H – 6’

H – 5’

H -2’’’/6’’’

H -3’’’/5’’’

H – 8

H - 6

H – 6

H - 8

H – 3’’’/5’’’

H – 2’’’/6’’’

H – 5’

H – 6’

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

118

Figura 74: Espectro de RMN

13

C(BBD 500MHz, DMSO-d

6

) da substância 18.

Figura 75 :Expanção do Espectro de RMN

13

C(BBD 500MHz, DMSO-d

6

) da

substância putraflavona (18) entre 92–135 ppm.

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

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6

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2

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3

''

4

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5

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6

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9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

C -2’

C – 2’’’/6’’’

C – 6’

C – 1’’’

C – 3’

C – 5’

C

–

3

’

/

5

’

C

-

1

0

C

-

1

0

’

C

–

3

’

C

-

3

C – 6’’

C

-

6

C - 8

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

C – 8’’

C -2’

C – 2’’’/6’’’

C – 6’

C – 1’’’

C – 3’

C – 5’

C

–

3

’

/

5

’

C

-

1

0

C

-

1

0

’

C

–

3

’

C

-

3

C – 6’’

C

-

6

C - 8

7

4

'

7

''

4

'''

3

'

8

''

2

'

2

3

4

5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

''

3

''

4

''

5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

C – 8’’

119

Figura 76: Expanção do espectro de RMN

13

C (BBD, 500MHz, DMSO-d6) da

substância putraflavona (18), entre 155 – 185 ppm

7

4

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7

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4

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3

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8

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2

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2

3

4

5

6

8

9

10

1

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5

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6

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2

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3

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4

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5

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6

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9

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10

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1

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3

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5

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6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

C - 4

C – 4’’

C - 7

C - 2

C – 2’’

C – 4’’’

C - 5

C – 5’’

C – 9 / C – 4’

C -9’’

C - 4

C – 4’’

C - 7

C - 2

C – 2’’

C – 4’’’

C - 5

C – 5’’

C – 9 / C – 4’

C -9’’

120

Figura 77: Mapa de contorno HMQC (500/125 MHz, DMSO-d

6

) da substância

putraflavona (18).

H – 2’

C – 2’

H – 6’

C – 6’

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’’/6’’’

H – 5’

C – 5’

H – 3’’’/5’’’

C - 3’’’/5’’’

H – 3

C - 3

H - 3’’

C – 3’’

H – 8

C - 8

H – 6

C - 6

H – 6’’

C – 6’’

H-2’/6’

H - 2’’’/6’’’

H – 5’

H -3’’’/5’’’

H - 3’’

H - 3

H - 8

H – 6’’

H -6

C - 8

C - 6

C – 6’’

C - 3

C – 3’’

C – 3’’’/5’’’

C – 5’

C

-

2

’

/

6

’

/

C

-

6

’

C – 2’

H – 2’

C – 2’

H – 6’

C – 6’

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’’/6’’’

H – 5’

C – 5’

H – 3’’’/5’’’

C - 3’’’/5’’’

H – 3

C - 3

H - 3’’

C – 3’’

H – 8

C - 8

H – 6

C - 6

H – 6’’

C – 6’’

H-2’/6’

H - 2’’’/6’’’

H – 5’

H -3’’’/5’’’

H - 3’’

H - 3

H - 8

H – 6’’

H -6

H – 2’

C – 2’

H – 6’

C – 6’

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’’/6’’’

H – 5’

C – 5’

H – 3’’’/5’’’

C - 3’’’/5’’’

H – 3

C - 3

H - 3’’

C – 3’’

H – 8

C - 8

H – 6

C - 6

H – 6’’

C – 6’’

H-2’/6’

H - 2’’’/6’’’

H – 5’

H -3’’’/5’’’

H - 3’’

H - 3

H - 8

H – 6’’

H -6

C - 8

C - 6

C – 6’’

C - 3

C – 3’’

C – 3’’’/5’’’

C – 5’

C

-

2

’

/

6

’

/

C

-

6

’

C – 2’

7

4

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7

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9

10

1

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5

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6

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2

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9

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10

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1

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3

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5

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6

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2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

121

Figura 78 ; Mapa de contorno HMBC ( 500/125MHz, DMSO –d

6

) da substância

putraflavona (18).

3

J

CH

H – 2’ / 6’

C - 2

3

J

CH

H – 2’’’/6’’’

C – 4’’’

3

J

CH

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’

2

J

CH

H – 3’’’/5’’’

C – 4’’’

2

J

CH

H – 3

C – 2

2

J

CH

H – 3’’

C – 2’’

2

J

CH

H – 8

C - 9

2

J

CH

H – 3’’

C – 4’’

2

J

CH

H – 6’’

C – 5’’

2

J

CH

H – 6

C – 5

2

J

CH

H – 3

C – 4

H – 2’/6’

H -2’’’/6’’’

H

–

3

’

’’

/

5

’

’’

H

-

3

H - 8

H – 6’’

H - 6

C

-

4

C – 4’’

C - 2

C – 2’’

C – 4’’’

C - 5

C – 5’’

C - 9

H -3’’

3

J

CH

H – 2’ / 6’

C - 2

3

J

CH

H – 2’’’/6’’’

C – 4’’’

3

J

CH

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’

2

J

CH

H – 3’’’/5’’’

C – 4’’’

2

J

CH

H – 3

C – 2

2

J

CH

H – 3’’

C – 2’’

2

J

CH

H – 8

C - 9

2

J

CH

H – 3’’

C – 4’’

2

J

CH

H – 6’’

C – 5’’

2

J

CH

H – 6

C – 5

2

J

CH

H – 3

C – 4

H – 2’/6’

H -2’’’/6’’’

H

–

3

’

’’

/

5

’

’’

H

-

3

H - 8

H – 6’’

H - 6

3

J

CH

H – 2’ / 6’

C - 2

3

J

CH

H – 2’’’/6’’’

C – 4’’’

3

J

CH

H – 2’’’/6’’’

C – 2’’

2

J

CH

H – 3’’’/5’’’

C – 4’’’

2

J

CH

H – 3

C – 2

2

J

CH

H – 3’’

C – 2’’

2

J

CH

H – 8

C - 9

2

J

CH

H – 3’’

C – 4’’

2

J

CH

H – 6’’

C – 5’’

2

J

CH

H – 6

C – 5

2

J

CH

H – 3

C – 4

H – 2’/6’

H -2’’’/6’’’

H

–

3

’

’’

/

5

’

’’

H

-

3

H - 8

H – 6’’

H - 6

C

-

4

C – 4’’

C - 2

C – 2’’

C – 4’’’

C - 5

C – 5’’

C - 9

H -3’’

7

4

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1

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6

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2

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O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

122

Figura 79: Mapa de contorno HMBC (500/125 MHz, DMSO –d

6

) da substancia

putraflavona (18) entre 101–125 ppm.

7

4

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7

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6

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10

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1

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2

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O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

H – 2’

C – 8’’

H – 3’’

C – 10’’

H – 3

C - 3

H – 8

C -10

H – 6’’

C – 10’’

H – 6’’

C – 8’’

H – 6

C - 10

H – 5’

C – 3’

H – 3’’’/5’’’

C – 1’’’

H – 3’’

C – 1’’’

H – 3

C – 1’

H -2’

H – 6’

H – 5’

H

–

3

’

/

5

’

H -3’’

H

-

3

H - 8

H – 6’’

H

-

6

C – 1’’’

C – 1’

C – 3’

C – 5’

C – 3’’’/5’’’

C - 10

C – 10’’

C –8’’

C – 3’’

C

-

3

H – 2’

C – 8’’

H – 3’’

C – 10’’

H – 3

C - 3

H – 8

C -10

H – 6’’

C – 10’’

H – 6’’

C – 8’’

H – 6

C - 10

H – 5’

C – 3’

H – 3’’’/5’’’

C – 1’’’

H – 3’’

C – 1’’’

H – 3

C – 1’

H -2’

H – 6’

H – 5’

H

–

3

’

/

5

’

H -3’’

H

-

3

H - 8

H – 6’’

H

-

6

C – 1’’’

C – 1’

C – 3’

C – 5’

C – 3’’’/5’’’

C - 10

C – 10’’

C –8’’

C – 3’’

H – 2’

C – 8’’

H – 3’’

C – 10’’

H – 3

C - 3

H – 8

C -10

H – 6’’

C – 10’’

H – 6’’

C – 8’’

H – 6

C - 10

H – 5’

C – 3’

H – 3’’’/5’’’

C – 1’’’

H – 3’’

C – 1’’’

H – 3

C – 1’

H -2’

H – 6’

H – 5’

H

–

3

’

/

5

’

H -3’’

H

-

3

H - 8

H – 6’’

H

-

6

H – 2’

C – 8’’

H – 3’’

C – 10’’

H – 3

C - 3

H – 8

C -10

H – 6’’

C – 10’’

H – 6’’

C – 8’’

H – 6

C - 10

H – 5’

C – 3’

H – 3’’’/5’’’

C – 1’’’

H – 3’’

C – 1’’’

H – 2’

C – 8’’

H – 3’’

C – 10’’

H – 3

C - 3

H – 8

C -10

H – 6’’

C – 10’’

H – 6’’

C – 8’’

H – 6

C - 10

H – 5’

C – 3’

H – 3’’’/5’’’

C – 1’’’

H – 3’’

C – 1’’’

H – 3

C – 1’

H -2’

H – 6’

H – 5’

H

–

3

’

/

5

’

H -3’’

H

-

3

H - 8

H – 6’’

H

-

6

C – 1’’’

C – 1’

C – 3’

C – 5’

C – 3’’’/5’’’

C - 10

C – 10’’

C –8’’

C – 3’’

C

-

3

123

Figura 80: Mapa de contorno HMBC (500/125 MHz, DMSO- d

6

) da substância

putraflavona (18), entre 157–169 ppm.

OH – 5

C - 5

OH – 5’’

C – 5’’

4

J

CH

OH – 5

C - 7

OH - 5

OH – 5’’

C – 5’’

C - 5

C - 7

OH – 5

C - 5

OH – 5’’

C – 5’’

4

J

CH

OH – 5

C - 7

OH - 5

OH – 5’’

OH – 5

C - 5

OH – 5’’

C – 5’’

4

J

CH

OH – 5

C - 7

OH - 5

OH – 5’’

C – 5’’

C - 5

C - 7

7

4

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7

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4

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3

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8

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2

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2

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5

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6

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2

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3

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4

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5

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6

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9

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10

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1

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3

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5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

124

Figura 81: Mapa de contorno HMBC (500/125 MHz, DMSO –d

6

) da substância

putraflavona (18), entre 96 – 108 ppm.

OH – 5

C - 6

OH – 5

C - 10

OH – 5’’

C – 6’’

OH – 5’’

C – 10’’

OH - 5

OH – 5’’

C - 6

C - 10

C

–6

’

C – 10’’

OH – 5

C - 6

OH – 5

C - 10

OH – 5’’

C – 6’’

OH – 5’’

C – 10’’

OH - 5

OH – 5’’

OH – 5

C - 6

OH – 5

C - 10

OH – 5’’

C – 6’’

OH – 5’’

C – 10’’

OH - 5

OH – 5’’

C - 6

C - 10

C

–6

’

C – 10’’

7

4

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7

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4

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3

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5

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2

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9

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10

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1

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3

'''

5

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6

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2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

125

Figura 82 Mapa de contorno HMBC (500/125 MHz, DMSO –d

6

) da substância

putraflavona (18), entre 159 – 169 ppm.

Meo – 4’’’

M

eO

-

7

MeO – 4’’’

C – 4’’’

MeO – 7

C - 7

C – 4’’’

C - 7

Meo – 4’’’

M

eO

-

7

MeO – 4’’’

C – 4’’’

MeO – 7

C - 7

Meo – 4’’’

M

eO

-

7

MeO – 4’’’

C – 4’’’

MeO – 7

C - 7

C – 4’’’

C - 7

7

4

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7

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4

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2

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2

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9

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1

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5

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6

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2

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3

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4

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5

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6

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9

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10

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1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

126

Figura 83 Espectro de RMN-NOEDIFF (200 Mhz) da substância putraflavona (18).

H-3

H

-

3

’

H

-

3

’

H-2’,6’

H-2’’’, 6’’’H-2’’’, 6’’’

H-3

H

-

3

’

H

-

3

’

H-2’,6’

H-2’’’, 6’’’H-2’’’, 6’’’

H-8

H-6

H-8

Meo-7

H-3’’’,5’’’

Meo-4’’’

H-8

H-6

H-8

Meo-7

H-3’’’,5’’’

Meo-4’’’

7

4

'

7

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4

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3

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8

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2

'

2

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5

6

8

9

10

1

'

5

'

6

'

2

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3

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4

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5

''

6

''

9

''

10

''

1

'''

3

'''

5

'''

6

'''

2

'''

O

OH O

O

OH O

OCH

3

OH

CH

3

O

HO

NOE

127

Substância 19. (5,7,4’ triidroxi-3’,5’ dimetoxi-flavona)

O espectro de RMN

1

H (Figura 84 pág-129) apresenta um sinal simples em δ

H

12,95

evidenciando grupo hidroxila formando ligação de hidrogênio. Sinais em δ

H

7,31 (s 2H, H-2’

e 6’); 6,97 (s, H–3); 6,55(d, J= 2,1 Hz, H-8); 6,19 (d, J= 2,1 Hz, H–6) e 3,87 ( s, 6H. 2x

MeO). A análise desses dados permitiu sugerir uma flavona com anel A contendo hidrogênio

com acoplamento meta e o anel B trisubstituido contendo dois hidrogênios equivalentes

representados por um singleto. O espectro de RMN

13

C (Figura 85 pág-129) mostra entre os

sinais os representantes de carbonila conjugada δc 181,94 (C–4) e δ

CH

98,97 (C–6); 94,34 (C–

8) e as duas metoxilas 56,50. A Tabela 18 pág-128 mostra as atribuições dos deslocamentos

químicos de hidrogênio e carbono de 19.

Experimento de RMN

1

H NOEDIFF (Figura 86, pág-130 Tabela 19 pág-128)

permitiu determinar a posição dos substituintes do anel B. Irradiação na freqüência das

metoxilas obteve-se nOe nos H-2’,6’(δ

H

7,31); irradiando na freqüência do H–3(6,97) obteve-

se nOe no H–2’,6’; irradiando na freqüência dos hidrogenios H–2’ e 6’ (7,31) obteve-se nOe

no H-3 (6,97) e nas metoxilas (3,87). Esses dados confirmam a localização das metoxilas em

3’ e 5’ ficando um grupo OH em 4’. As análises acima e comparação com valores descritos na

literatura (KUWABARA, et al., 2003) concluímos que a substância 19 é o flavonoide 5,7,4’-

triidroxi-3’,5’-dimetoxi-flavona, anteriormente isolada de Agelaea pentagyna (Connaraceae).

O

OH

OCH

3

OCH

3

H

O

OH

128

Tabela 18 -Dados de RMN

1

H e

13

C (200MHz e 50 MHz, em CDCl

3

) da substância 19 e

comparação com RMN

1

H

e

13

C (400MHz e 100 MHz, em DMSO-d

6

) da literatura

(KWABARA et al., 2003).

Tabela 19: Dados espectrométrico de experimento RMN

1

H NOEDIFF da substância

19.

Substância 19

KWABARA et al., 2003

C

δc δ

H

δc δ

H

2 163,78 - 163,6 -

3 103,86 6,97 (s) 103,5 6,97 (s)

4 181,94 - 181,7 -

5 161,54 157,3 -

OH -5 12,95

6 98,97 6,19 (d, J= 2,1Hz) 98,8 6,21(d, J=2,0 Hz)

7 164,30 - -

8 94,34 6,55 (d, J= 2,1 Hz) 94,1 6,56( d, J=2,0 Hz)

9 157,48 - 161,3 -

10 104,40 - 103,6 -

1’ 120,51 - 120,3 -

2’ 105,0 7,31 (s) 104,3 7,32 (s)

3’ 148,32 - 148,1 -

MeO-3’ 56,50 3,87 (s) 56,3 3,89 (s)

4’ 139,98 - 139,8 -

5’ 148,32 - 148,1 -

Meo-5’ 56,50 3,87 (s) 56,3 3,89 (s)

6’ 105,0 7,31 (s) 104,3 7,32 (s)

H irradiado NOE

δ

H

δ

H

(Mult Hz)

H

3,87 (s) MeO-3’, 5’ 7,31 (s) 2’ e 6’

6,97 (s) 3 7,31 (s) 2’ e 6’

7,31 (s) 2’ e 6’ 6,97 (s) e 3,87 (s) 3 e Meo 3’, 5’

O

OH

OCH

3

OCH

3

H

O

OH

2

'

3

'

3

NOE

129

Figura 84: Espectro de RMN

1

H ( 200 MHZ, CDCl

3

) da substância 19.

Figura 85: Espectro de RMN

13

C (50 MHz, CDCl

3

) da substância 19.

OH -5

H -2’ / 6’

H

-

3

H - 8

H - 6

Meo 3’ / 5’

O

OH

OCH

3

OCH

3

HO

OH

2

'

3

'

3

6

8

5

OH -5

H -2’ / 6’

H

-

3

H - 8

H - 6

Meo 3’ / 5’

O

OH

OCH

3

OCH

3

HO

OH

2

'

3

'

3

6

8

5

C -4

C - 7

C

-

3

C - 5

C - 9

C – 3’ / 5’

C – 4’

C -1’

C - 10

C

–

2

’

/

6

’

C - 3

C - 6

C - 8

MeO -3’ / 5’

C -4

C - 7

C

-

3

C - 5

C - 9

C – 3’ / 5’

C – 4’

C -1’

C - 10

C

–

2

’

/

6

’

C - 3

C - 6

C - 8

MeO -3’ / 5’

130

'

Figura 86: Espectro de RMN-NOEDIFF da substância 19.

H -2’ / 6’

H - 3

MeO 3’ /5’

H -2’ / 6’

H - 3

H -2’ / 6’

H - 3

MeO 3’ /5’

H -2’ / 6’

H - 3

MeO 3’ /5’

H -2’ / 6’

H - 3

H -2’ / 6’

H - 3

MeO 3’ /5’

NOE

O

OH

OCH

3

OCH

3

H

O

OH

2

'

3

'

3

6

8

5

131

Quadro 4 - Constituintes químicos isolados de caules de Ouratea

cuspidata St Hil

H

O

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

R

1

HO

R

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

20

21

22

2324

25

26

28

29

HO

27

30

14

1

2

3

4

5

6

O

OCH

3

OH

HO

20

O

HO

OH

OCH

3

O

21

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

22

H

O

2 :

22, 23

3 : 22, 23-

diidro

22

23

R

1

HO

R

15: R = Me, R

1

= H

16: R = H , R

1

= Me

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

20

21

22

2324

25

26

28

29

HO

27

30

14

1

2

3

4

5

6

O

OCH

3

OH

HO

20

1

2

3

4

5

6

O

OCH

3

OH

HO

20

O

HO

OH

OCH

3

O

21

O

HO

OH

OCH

3

O

21

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

22

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

22

132

Identificação dos constituintes isolados de caule de Ouratea cuspitada (St

Hil

)

Substância 20 (1-Metil βD-glucopiranosil).

A substância apresentou-se com um material pastoso. O espectro de RMN

1

H (Figura

87 pág 133) apresentou sinais entre 4,2-3,18 ppm compatíveis com deslocamentos químicos

de carboidratos. O espectro de RMN

13

C (Figura 88 Pag 133) apresentou sinais cujos valores

foram comparados com os da literatura (BREITMAIER et al, 1989) e levou a concluir que a

substância 20 é o carboidrato 1-Metil βD-glucopiranosil.

Tabela 20:Dados de RMN

13

C(BBD, 50 MHz DMSO-d

6

) da substância 20 comparada

com valores da literatura

Substancia 20 Breitmaier et at., 1989

C

δ

C

δ

C

1 105,33 103,40

2 74,99 73,40

3 77,86 75,20

4 70,0 71,55

5 77,98 75,20

6 62,67 61,40

OCH

3

57,33 57,50

1

2

3

4

5

6

O

OCH

3

OH

H

O

HO

133

Figura 87 Espectro de RMN

1

H (200 MHz, DMSO-d

6

) da substância 20.

Figura 88: Espectro de RMN

13

C (BBD 50 MHz, DMSO-d

6

) da substância 20.

C-3,5

C-1

C

-

2

C-6

O

C

H

3

C-4

C-3,5

C-1

C

-

2

C-6

O

C

H

3

C-4

134

Substância 21 (4’, 3, 5, 7-tetraidroxi-3’-metoxi flavonol)

A análise feita em CCDA revelada com AlCl

3

indicou tratar-se de um flavonóide. O

espectro de RMN

1

H desta fração mostrou dois singletos δ

H

6,38; e 6,15 compatíveis com H-8

e H-6 do anel A de um flavonoíde; um singleto 3,82 é freqüência característica de metoxila.

Além de outros sinais δ

H

7,93 (s); 7,49 (d, J= 8,28 Hz), 6,92 (d, J= 8,30 Hz) de um anel

aromático trissubstituido. A ausência de um singleto atribuível ao H-3 permitiu propor a

estrutura de um flavonol. O experimento de RMN

1

H NOEDIFF permitiu determinar a

posição dos substituintes do anel B. Irradiação na freqüência 7,93 (s, H-2’) obteve-se NOE na

freqüência da metoxila, e irradiação na freqüência da metoxila gerou NOE no H_2’ isso

mostra que a metoxila esta ligada no C-3’. (Figura 90 Pág-135 ). Irradiação na freqüência

5,56 não é observado NOE levando a concluir que este sinal é de impureza na amostra.

(Figura 91 pág-135). Estas análises permitiram propor para 21 a estrutura do. 4’, 3, 5, 7-

tetraidroxi-3’-metoxi flavonol. A comparação da substância 21 com 22 em CDDA eluída com

CH

2

Cl

2

/MeOH (8;2) apresentou Rf

s

diferentes sendo 21 menos polar.

Figura 89: Espectro de RMN

1

H (200 MHz, DMSO-d

6

) da substancia 21.

H-2’

H-6’

H-5’

H-8

H-6

Meo-3’

*

OH-5

O

HO

OH

OCH

3

OH

2

3

'

4

'

5

6

'

5

'

1

'

2

'

6

7

8

9

10

H-2’

H-6’

H-5’

H-8

H-6

Meo-3’

*

OH-5

O

HO

OH

OCH

3

OH

2

3

'

4

'

5

6

'

5

'

1

'

2

'

6

7

8

9

10

135

Figura 90: Espectro de RMN

1

H NOEDIFF ( 200 MHz DMSO-d

6

)da substância 21.

Figura 91: Espectro de RMN

1

H NOEDIFF ( 200 MHz DMSO-d

6

)da substância 21.

O

HO

OH

OCH

3

OH

2

3

'

4

'

5

6

'

5

'

1

'

2

'

6

7

8

9

10

NOE

H-2’

H

-

6

’

H-5’

H-8

H-6

Meo-3’

H-2’

c

d

H-2’

H

-

6

’

H-5’

H-8

H-6

Meo-3’

H-2’

c

d

H-2’

H-6’

H-5’

H-8

H-6

H-2’

H-8

*

MeO-3’

a

b

H-2’

H-6’

H-5’

H-8

H-6

H-2’

H-8

*

MeO-3’

H-2’

H-6’

H-5’

H-8

H-6

H-2’

H-8

*

MeO-3’

a

b

136

Fração 22 (5, 4’,7-triidroxi-3’-metoxi-3-β-O-galactopiranosil flavona

A analise dos espectros de RMN

1

H e

13

C (BBD e DEPT) (Figuras 92-96, pág-137-

139)da fração 22 contendo mistura de flavonóides glicosilados permitiu detectar como

principal componente a 5, 4’,7-triidroxi-3’-metoxi-3-β-O-galactopiranosil flavona. Esta

proposta foi feita através de comparação dos deslocamentos químicos de carbonos registrados

nos espectros pelos sinais mais intensos com valores da literatura (CARVALHO et al., 2001 e

Daniel, 2004) conforme registrado na tabela 21 ´pág-136. Os demais sinais podem ser de

outro (s) glicosideos contendo a glicose e ou a rhamnose como carboidrato.

Tabela 21: Dados de RMN

1

H e

13

C (500 e125 MHZ DMSO-d

6

) do constituinte

majoritário da fração da fração 22 (5,4’,7-triidroxi-3’-metoxi-3-β-O-D-galactopiranosil

flavona com valores da literatura (CARVALHO et al., 2001 e Daniel, 2004).

5, 4’, 7-triidroxi-3’-metoxi-3-β-O-D-galactopiranosil

Refer. Literat.

C

δ

C

δ

H

δ

C

2 156,2 - 156,2

3 133,1 - 135,4

4 177,3 - 177,7

5 161,2 - 161,3

6 98,8 6,2 (sl) 98,8

7 165,3 - 164,2

8 93,7 6,4 (sl) 93,7

9 156,5 - 156,4

10 103,7 - 104,2

1’ 121,1 - 121,9

2’ 112,9 7,9 (d, J= 2,0 Hz) 113,9

3’ 146,0 - 145,1

4’ 149,5 - 147,1

5’ 115,9 6,9 (d, J= 8,0 Hz) 115,3

6’ 122,0 7,5 (dd, J= 8,0 e 2,0 Hz) 102,0

1’’ 100,9 5,56 (d, J= 7,0 Hz) 73,3

2’’ 74,1 3,9-3,1 (m) 75,2

3’’ 76,2 “ 71,3,

4’’ 69,4 “ 77,3

5’’ 77,2 “ 61,9

6’’ 60,4 “

OCH

3

55,5 3,83 (s, 3H)

OH 12,5 (sl)

O

H

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

137

Figura 92 Espectro de RMN

1

H (500 MHz DMSO-d

6

) da mistura contento a

substância 22.

Figura 93: Expansão do espectro de RMN

1

H(500 MHz, DMSO-d6) da mistura

contendo a substância 22 entre as regiões 4,5-8,0 ppm.

H-2’

H-6’

H-5’

H-8

H

-

6

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

O

OH

H

-

1

’

H-2’

H-6’

H-5’

H-8

H

-

6

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

O

OH

H

-

1

’

138

Figura 94 Espectro de RMN

13

C (125 MHz DMSO-d

6

) da fração contendo a

substância 22. * Sinais de outros glicosíeos presentes na fração.

Figura 95: Expansão da figua 94 na região entre 115-180 ppm..

C-4

C-7

C

-

5

C-9

C

-

2

C

-

2

C

-

4

’

C

-

3

’

C-3

C-1’

C-6’

C-2’

C

-

1

0

C-1’’

C-6

C-8

C-5’’

C-3’’

C-4’’

C

-

6

’

CH

3

C-4

C-7

C

-

5

C-9

C

-

2

C

-

2

C

-

4

’

C

-

3

’

C-3

C-1’

C-6’

C-2’

C

-

1

0

C-1’’

C-6

C-8

C-5’’

C-3’’

C-4’’

C

-

6

’

CH

3

C-4

C-5

C-9

C-2

C-4’

C-3’

C

-

3

C-1’

C-5’

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

C-4

C-5

C-9

C-2

C-4’

C-3’

C

-

3

C-1’

C-5’

C-4

C-5

C-9

C-2

C-4’

C-3’

C

-

3

C-1’

C-5’

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

139

Figura 96: Espectro de RMN

13

C (DEPT 135, 125 MHz DMSO-d

6

) expandiado entre

as regiões 55-85 ppm da fração contendo a substância 22. * Sinais de outros glicosídeos

presentes na fração.

C-5’’

C-3’’

C-2’’

C-4’’

C

-

3

’

C-5’’

C-4’’’

C-3’’,2’’’

C-4’’,2’’’,5’’’

C-5’’’

C-6’’

OC

H

3

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

C-5’’

C-3’’

C-2’’

C-4’’

C

-

3

’

C-5’’

C-4’’’

C-3’’,2’’’

C-4’’,2’’’,5’’’

C-5’’’

C-6’’

OC

H

3

C-5’’

C-3’’

C-2’’

C-4’’

C

-

3

’

C-5’’

C-4’’’

C-3’’,2’’’

C-4’’,2’’’,5’’’

C-5’’’

C-6’’

OC

H

3

O

HO

O

OH

OCH

3

O

OH

140

ASPECTOS GERAIS DA BIOSSÍNTESE DE CONSTITUINTES DE O. hexasperma E O.

cuspidata.

FLAVONÓIDES.

Os flavonóides compreendem uma larga família de metabolitos especias que têm parte

de sua estrutura derivada do chiquimato e parte da via dos policetídeos. Sua biossíntese

procede via condensação de uma unidade 4–hidroxicinamoil-CoA com três unidades da

malonil-CoA, produzindo estilbeno (resveratrol) ou chalconas (narigenina–chalcona) a

depender da natureza da enzima que catalisa a reação estilbeno sintase ou chalcona sintase

respectivamente. Os padrões de oxigenação nos anéis aromáticos ilustram as partes oriundas

do chiquimato e da via do acetato. Os flavonóides isolados neste trabalho indicam que sua

síntese foi mediada via a chalcona sintase.

Chalconas agem como precursoras para uma vasta extensão de derivados de

flavonóides encontrados por todo reino vegetal. Maior parte contém anel heterocíclico com

seis membros formado por ataque nucleofilico, tipo adição de Michael, produzindo flavonona

(ex narigenina). Essa isomerização pode ocorrer sendo que quimicamente, condições ácidas

favorecem a flavonona e condições básicas a chalconas, mas na natureza a reação é catalizada

por enzimas esterioespecíficas. A partir do esqueleto básico de flavononas podem ser

formados uma variedade de flavonóides (Ex.: flavonas, flavonol, falvononol, antocianidinas

etc). Modificações no padrão de hidroxilação nos dois anéis aromáticos podem acontecer.

Geralmente ocorrem nas flavonas ou diidroflavononol. Podem ocorrer também metilação e

dimetilalilação aumentando assim a variedade estrutural destes compostos. Ocorrem também

flavonóides glicosilados que são solúveis em água (Esquemas 3, 5 pág-141 e 143). Eles são

geralmente encontrados conjugados com açúcares como as pentoses: D-apiose, L- arabinose,

L- ramnose e D-xilose; as hexoses: D-glicose, D-galactose, D-alose, e os ácidos D-

galacturônico e D-glicurônico. Podem também, estar associados a dissacarídeos e a

trissacarídeos. São responsáveis pelas cores das flores, frutos, algumas folhas e asas de

insetos. Os biflavonoides constituem uma classe de flavonóides dímeros. A maioria dos

representantes dessa classe de produtos naturais é formada pelos dímeros flavona-flavona,

flavona-flavanona, flavanona-flavanona além de ocorrer, mais raramente, os dímeros de

chalconas e de isoflavonas, (Esquema 4, pág-142).

141

Esquema 3 Rota biossintética geral para flavonóides. (Adaptado de DEY et al., 1997;

DEWICK, 1997)..

SCoAO

O

OO

OH

O

HO

OH

Claisen

(chalcona sintase)

narigenina-chalcona

(uma chalcona)

O

HO

OH O

OH

ataque nucleofilico tipo-Michael

da OH a α,β cetona insaturada

narigenina

(um flavonoide)

SCoA

O

OO

O

OH

3 x malonil-CoA

CO

2

OH

H

O

OH

Aldol

(Estibeno sintase

)

resveratrol

(um estilbeno)

CoAS

O

OH

4 – hidroxicinamoil-CoA

Chalcona isomerase

Flavona sintase

Flavona sintase II

Isoflavona sintase Flavonona 3 hidroxilase

O

HO

OH O

OH

Flavona

O

HO

OH O

OH

diidroflavonol

O

HO

OH O

OH

Flavonol sintase

Flavonol

O

HO

OH O

OH

Isoflavona

SCoAO

O

OO

OH

O

HO

OH

Claisen

(chalcona sintase)

narigenina-chalcona

(uma chalcona)

O

HO

OH O

OH

ataque nucleofilico tipo-Michael

da OH a α,β cetona insaturada

narigenina

(um flavonoide)

SCoAO

O

OO

OH

O

HO

OH

Claisen

(chalcona sintase)

narigenina-chalcona

(uma chalcona)

O

HO

OH O

OH

ataque nucleofilico tipo-Michael

da OH a α,β cetona insaturada

narigenina

(um flavonoide)

SCoA

O

OO

O

OH

3 x malonil-CoA

CO

2

OH

H

O

OH

Aldol

(Estibeno sintase

)

resveratrol

(um estilbeno)

CoAS

O

OH

4 – hidroxicinamoil-CoA

SCoA

O

OO

O

OH

3 x malonil-CoA

CO

2

OH

H

O

OH

Aldol

(Estibeno sintase

)

resveratrol

(um estilbeno)

CoAS

O

OH

4 – hidroxicinamoil-CoA

Chalcona isomerase

Flavona sintase

Flavona sintase II

Isoflavona sintase Flavonona 3 hidroxilase

O

HO

OH O

OH

Flavona

O

HO

OH O

OH

diidroflavonol

O

HO

OH O

OH

Flavonol sintase

Flavonol

O

HO

OH O

OH

Isoflavona

142

Esquema 4 : Proposta biossintética de dimerização na formação da amentoflavona e

putraflavona.

O

RO

OH

O

RO

OH

O

OH

O

R

O

OH

H

+

H

+

O

OR

O

OH

O

R

OH

O

OH

OR

RO

O

OR

O

HO

OH

(A)

(B)

O

RO

OH

O

OR

OH

O

(A)

(B)

isomerase

R=H = Amentoflavona

R=CH

3

= Putraflavona

O

OOH

OH

OR

RO

OH

HO

143

Esquema 5: Proposta biossintética da formação das substâncias 12 e 13 (adaptado de

DEWICK, 1997).

O

H

O

OH

O

HO

OH

O

2

2-oxoglutarato

O

HO

OH

diidroflavononol

flavonol

O

2

2-oxoglutarato

O

H

O

OH

O

HO

OH

O

2

2-oxoglutarato

O

HO

OH

diidroflavononol

flavonol

O

2

2-oxoglutarato

(I) Reação de glicosilação

O

OH

O P

H

HO

OH

Glicose 1-P

+ UTP*

O

OH

OP

H

HO

OH

P

U

HO

OH

+

UDP

(II) Reação de alquilação

O

OH

O

OH

HO

OH

H

OPP

O

OH

O

OH

HO

OH

H

OH

O

OH

H

O

HO

OH

(I) Reação de glicosilação

O

OH

O P

H

HO

OH

Glicose 1-P

+ UTP*

O

OH

OP

H

HO

OH

P

U

HO

OH

+

UDP

(II) Reação de alquilação

O

OH

O

OH

HO

OH

H

OPP

O

OH

O

OH

HO

OH

H

OH

O

OH

H

O

HO

OH

144

ESTEROIDES E TRITERPENO

Tanto os esteroides como triterpenos e saponinas são formados pela via do ácido

acético/ácido mevalônico. Nesta via, três unidades de AcetilCoA sofrem condensações para

formar o pirofosfato de isopentenila (IPP) que sofre isomerização para pirofosfato de

dimetilalila (DMAPP). Estes são os precursores básicos dos terpenóides e esteróides que

sofrerão polimerização dando origem a moléculas de cadeias carbônicas crescentes de cinco

átomos de carbono. A reação do IPP com seu isômero DMAPP formam o trans –pirofosfato

de geranila (GPP), a partir do qual podem ser formados os demais terpenos. Novas ligações

cabeça-cauda entre GPP e IPP resultarão em pirofosfato de farnesila (FPP) e pirofosfato de

geranilgeranila com 15 e 20 átomos de carbono respectivamente. O farnesilpirofosfato é o

intermediário para a biossíntese dos sesquiterpenos (C15), (C20), triterpenos (C30), e

esteróides C18-29). Duas moléculas de FPP se unem cauda-cauda para formar o

hidrocarboneto esqualeno, principal precursor dos esteroides, triterpenos. Após sua formação

o esqualeno sofre oxidação gerando o esqualeno epóxi (óxido de esqualeno),que sofre

ciclização catalisada por flavoproteina e pelos cofatores NADPH e O

2..

Na etapa seguinte uma

enzima ciclase modifica a conformação do òxido de esqualeno para cadeira-cadeira-cadeira-

barco, e através de vários rearranjos 1,2-metil é formado o carbocation damarenil. O

carbocation damarenil é muito instável e sofre novamente migrações do tipo 1,2-alquil para

formar o cátion bacharenil Acredita-se que a passagem do cátion terciário (damarenil) para o

secundário (Bacharenil) seja resultado de transformações enzimáticas. Novas migrações

formam o sistema pentacíclico do cátion lupenila terciário precursor dos esqueletos do tipo

ursano e oleanano (Esquema 6 pág-145).

Já para formar os esteróides o oxido de esqualeno com conformação cadeira-barco-

cadeira-barco, cicliza após vários rearranjos do tipo 1,2 formando o cicloartenol. O

cicloartenol após clivagem oxidativa de três metilas forma os esteroides (Esquema 5 pág-

143). (DEWICK, 2002).

145

Esquema 6 Proposta biogenética para os esteroides isolados de O. cuspidata e O.

hexasperma (Adaptado de MANN,1994; DEWICK, 1997).

PPO

*

HH

*

OPP

*

H

OPP

*

H

*

H

*

H

*

H

(NADPH)

*

H

(Esqualeno)

O

2

NADP

H

Oxido de esqualeno

O

H+

Rearanjo

HO

H

O

[O] das metilas

C-4 e C-14 até COOH

e perda de CO

2

.

H

O

S

CH

3

HO

H

2

C

H

H+

HO

H

S

CH

3

HO

H

H+

[H]

HO

SITOSTEROL

Glicosilação

Gli-O

3β-O-βD-GLICOPIRANOSIL SITOSTEROL

HO

H

+

HO

Estigmasterol

PPO

*

HH

*

OPP

*

H

OPP

*

H

*

H

*

H

*

H

(NADPH)

*

H

(Esqualeno)

O

2

NADP

H

Oxido de esqualeno

O

H+

Rearanjo

HO

H

HO

H

O

[O] das metilas

C-4 e C-14 até COOH

e perda de CO

2

.

H

O

S

CH

3

H

O

S

CH

3

HO

H

2

C

H

HO

H

2

C

H

H+

HO

H

S

CH

3

HO

H

S

CH

3

HO

H

H+

HO

H

H+H+

[H]

HO

SITOSTEROL

HO

SITOSTEROL

Glicosilação

Gli-O

3β-O-βD-GLICOPIRANOSIL SITOSTEROL

Gli-O

3β-O-βD-GLICOPIRANOSIL SITOSTEROL

HO

H

+

HO

H

+

HO

Estigmasterol

HO

Estigmasterol

146

Esquema 7; Rota biossintetica de formação dos triterpenos isolados nas espécies O.

cuspidata e O. hexasperma. (Adaptado de DEWIK, 1997).

H+

O

Óxido 2,3-esqualeno

H

HO

H

Cátion damarenil

HO

H

Cátion bacharenil

HO

H

Cátion lupenil

HO

H

Cátion oleanil

HO

H

Oleanano

HO

H

β Amirina

HO

H

Α Amirina

HO

H

Lupeol

H+

O

Óxido 2,3-esqualeno

H

HO

H

Cátion damarenil

HO

H

Cátion damarenil

HO

H

Cátion bacharenil

HO

H

Cátion bacharenil

HO

H

Cátion lupenil

HO

H

Cátion lupenil

HO

H

Cátion oleanil

HO

H

Cátion oleanil

HO

H

Oleanano

HO

H

Oleanano

HO

H

β Amirina

HO

H

β Amirina

HO

H

Α Amirina

HO

H

Α Amirina

HO

H

Lupeol

HO

H

Lupeol

147

Atividade Biológica.

Os ensaios de atividade biológica foram realizados no Laboratório de

Imunofarmacologia e Imunologia Parasitária do Departamento de Biologia Animal – IB da

UFRRJ sob orientação do Professor Dr. Ronald Bastos Freire e consistiram de testes de

bioproteção contra radicais livres, atividade antiparasitária frente a Leishmania brasiliensis,

efeitos antiinflamatórios e a associação entre a bioproteção química

Preparação das Amostras.

Para a realização de todos os ensaios biológicos os extratos hexano, acetato de etila e

metanol de Ouratea cuspidata St. Hil foram previamente solubilizados em PBS (solução

salina tamponada com fosfato) e esterelizados por filtração através de membranas com 0,22µ

de diâmetro (Nalgene, USA). O material solubilizado e esterelizado foi identificado e

acondicionado à temperatura de -20°C para seu uso nas diferentes etapas dos ensaios

biológicos.

Ensaios de bioproteção contra a geração de radicais livres

Diferentes concentrações dos extratos metanólico, hexânico e acetato de etila de

Ouratea cuspidata foram adicionadas a sistema biológico gerador de substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS), constituída de 0,2 mL de uma suspensão contendo 16 mg/mL

de membranas de eritrócitos de carneiro, 2 mM de deoxirribose, 100 mM de FeCl

3

. Cada

frasco foi incubado a 45°C durante 60 minutos e adicionado de 0,65 mL de solução de ácido

Tiobarbitúrico (TBA) previamente dissolvido em acetonitrila numa concentração de

10,3mM. Após incubação a 95-100 °C 10 min, os tubos foram lidos a 540 nm e a

concentração de, TBARS determinada contra uma curva padrão malonildialdeído em nnMoles

por mL.

A curva padrão obtida para o sistema controle, na ausência dos extratos, apresentou

grande reprodutibilidade, com R

2

superior a 0,9 e tendência exponencial, com correlação

direta entre a concentração de malonildialdeído (MDA) e a absorbância observada a 532 nm

(Figura 97). Nos ensaios de bioproteção, pela franca diminuição de produtos reativos ao

ácido tiobarbitúrico (Figura 98), ficou evidente que o extrato OCMeOH, de maior polaridade,

apresentou atividade protetora, com eliminação de TBARS. Na concentração de 0,2 mg/mL

houve a diminuição de 98% das substâncias oxigênio-reativas. Nas concentrações de 25 e de

60 mg/mL, entretanto, esta atividade bioprotetora mostrou-se progressivamente diminuída,

com a detecção respectiva de 71% e 24,4%. Os demais extratos avaliados não apresentaram

ação inibitória da geração de radicais livres nessas concentrações. De outro modo, ficou

evidente que todos os extratos apresentaram potencial tóxico, uma vez que induziram a

formação de concentrações elevadas de radicais livres, quando adicionados na concentração

de 100mg/mL. A produção de TBARS foi entre duas a quatro vezes maior que a concentração

de radicais livres produzidos pelo sistema controle.

148

Figura 97; Curva padrão de malonildialdeído (MDA) gerada através da indução de

radicais livres , medidos espectrofotométricamente a 532nm frente a um padrão de

malonildialdeído adquirido comercialmente (Fisher, USA, AC14861-1000). Os resultados

representam a média de quatro repetições adicionadas do erro padrão (p≤0,01).

Figura 98: Ensaio de redução de radicais livres com extratos de Ouratea cuspidata.

Concentrações diferentes do extrato metanólico (barras negras), do extrato hexânico

(barras cinzas) e do extrato acetato de etila (barras listradas) foram adicionadas a sistema

biológico gerador de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os tubos

foram lidos a 540 nm e a concentração de TBARS determinada contra uma curva padrão

malonildialdeído (barra branca) em nnoMoles por mL. Os resultados são a média de

quatro repetições acrescidas do erro padrão (p≤0,5). O círculo evidência a maior eficiência

bioprotetora da fração metanólica em relação às demais.

R

2

0,9841 =

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 12,5 25 50 100

nmoles MDA

Absorbância 532 nm

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

0 0,2 25 60 100

Concentração (mg/mL)

MDA (nMol/mL)

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

0 0,2 25 60 100

Concentração (mg/mL)

MDA (nMol/mL)

149

Teste de ação antiparasitária

Devido ao fato de que o extrato metanólico apresentou melhor atividade bioprotetora

em concentrações atóxicas para o sistema hospedeiro. Os demais extratos não foram

ensaiados por apresentarem toxidade resídual. Assim, realizaram-se ensaios para

determinação dos efeitos do extrato metanólico sobre o crescimento, desenvolvimento e

metabolismo de formas promastigotas de Leishmania brasiliensis. Para tanto, inóculos

contendo 10

4

formas promastigotas do parasito (cepa L566-FIOCRUZ) foram cultivados, a

27ºC, em tubos de ensaio contendo 4,0 mL de meio de infusão de cérebro e coração (BHI)

adicionado de 10% de soro fetal bovino, e de diferentes concentrações dos extratos (2, 4, 8,

32, 64, mg/mL). Em intervalos de 12 horas, foram colhidas alíquotas de 0,1 mL de cada tubo

para realização de ensaios de contagem dos parasitas em câmara de Neubauer ao microscópio

ótico comum, originando dados quantitativos e morfológicos do parasito sob as diferentes

concentrações de exposição aos extratos. Concomitantemente foram realizados testes de

exclusão do Azul de Trypan (Viabilidade) e ensaios de biotransformação do azul de tetrazólio

(atividade enzimática-mitocondrial). Todos os ensaios foram realizados com quatro repetições

e comparativamente analisados, em relação a cultivos parasitários na ausência de drogas, ou

aditivos extras. Os resultados foram estatisticamente avaliados usando ANOVA. Os dados

que apresentaram diferenças em relação ao controle foram expressos como a média das

repetições adicionada do desvio padrão ou do erro padrão para cada ponto, sendo

considerados significativos os dados com p≤ 0,5.

Uma vez que as formas promastigotas de Leishmania não penetram ativamente nas

células do hospedeiro, sua capacidade infectante é considerada bem sucedida quando o

parasito é fagocitado. Por conta disso, foram utilizados, também, ensaios de viabilidade e

funcionalidade de fagócitos de hospedeiro vertebrado com a finalidade de se observar a

alteração anti-fagocitária de constituintes do extrato vegetal capazes de interferir

prematuramente no ciclo biológico parasitário, evitando sua assimilação em macrófagos de

um sistema hospedeiro (roedor) e conseqüente implantação da doença (leishmaniose

tegumentar americana). Desta forma, os resultados obtidos nessa segunda fase experimental

permitiram, também, a avaliação do potencial antiinflamatório dos extratos.

Curva de crescimento parasitário.

Foi empregada a metodologia clássica da avaliação numérica de formas parasitarias

desenvolvidas em meio acelular, conforme descrito na literatura (JENSEN, 1983). Para cada

cultivo iniciado, foi elaborado uma curva de crescimento, onde as absorbâncias das

suspensões celulares, tratadas com as diferentes concentrações de extratos vegetais, foram

colorimétricamente medidas no comprimento de onda de 540 nm. Os valores turbidimétricos

obtidos foram associados à quantificação hemocitométrica (câmara de Neubauer) das

alíquotas dos tratamentos nos diferentes intervalos de tempo, gerando curvas de crescimento

quantitativo das formas promastigotas em meio axênico frente aos extratos. Os resultados

evidenciaram um efeito estimulador da proliferação de promastigotas de L. braziliensis

quando tratadas com o extrato metanólico (Figura 97 pág-148).

150

Figura 99: Curva de crescimento de promastigotas de Leishmania (Viannia)

braziliensis

(L566+OCMeOH) em meio axênico bifásico (NNN) adicionado de 16

mg/mL de extrato metanólico de

Ouratea cuspidata (OCMeOH), em relação ao sistema

controle (L566) constituído de promastigotas não expostas ao extrato. Os resultados

expressam a média de quatro observações turbidimétricas, adicionadas do erro padrão (

p≤0,01).

Teste de exclusão do Azul de Trypan (Viabilidade):

Para realização dos ensaios de viabilidade, empregou-se a metodologia descrita por

(SAVOIA et al., 2002), que foi aplicada tanto em promastigotas quanto em fagócitos do

hospedeiro submetidos aos diferentes tratamentos com extrato vegetal. Os resultados serviram

para comparar o efeito antiparasitário com a toxidade relativa das substâncias biologicamente

ativas contidas no extrato da planta.

a) Em promastigotas de L. braziliensis:

No ensaio com promastigotas L566, alíquotas referentes aos diferentes tratamentos

foram adicionadas de 10% de uma solução de azul Trypan-CI23850(J.T. Baker

Chemical Co., USA) e mantidas em repouso por dez minutos à temperatura ambiente.

Em seguida as células foram centrifugadas sob baixa rotação(100

rpm/10minutos/27ºC) em centrifuga clínica convencional Ecelsa 2, mod 205

(FANEM, Brasil). O sobrenadante contendo o corante não absorvido foi descartado e,

ao sedimento, adicionou-se solução salina tamponada com fosfato (PBS -8,0 g NaCl,

0,2g KCl, 1,44g Na

2

HPO

4

, 0,24g KH

2

PO

4

, H

2

O q.s.p 1000mL, pH 7,2-7,4) em volume

equivalente ao da alíquota inicial. As células coradas (mortas) foram quantificadas

hemocitometricamente (câmara de Neubauer) sob aumento de 400

X

em microscópio

ótico comum BX-41 (Olympus, Japão), em relação às células viáveis, que não foram

permeáveis ao corante, para a estimativa do percentual de viabilidade. Assim, os

valores numéricos foram aplicados à formula:

V% = NCV – NCM x 100

TCC

Onde, V% = Percentual de Viabilidade; NCV = Numero de células vivas;

NCM = Numero de células mortas; TCC = Total de células contadas

0

0,5

1

1,5

0 6 12 24 48 72

Tempo de incubação (horas)

Absorbância (540nm)

L566+OCMeOH

L566

0

0,5

1

1,5

0 6 12 24 48 72

Tempo de incubação (horas)

Absorbância (540nm)

L566+OCMeOH

L566

151

b) Em macrófagos do hospedeiro vertebrado

No ensaio com macrófagos do hospedeiro vertebrado foram utilizados lavados

peritoneais de acordo com a metodologia descrita na literatura (HERSCOWITZ et al.,

1981), adaptada para nossas condições experimentais, de acordo com (HERZOG-

SOARES et al., 2004). Os macrófagos foram obtidos de Hamsters (Crycetua crycetus)

adultos jovens, gerando suspensões contendo 10

6

celulas/mL em meio RMPI-1640

(Difco-Inglatera), isento de soros, antibióticos ou aditivos. As suspensões foram

divididas em alíquotas de 1mL sobre as quais foram adicionadas diferentes

concentrações do extrato vegetal. As células submetidas aos diferentes tratamentos

foram mantidas, durante 24 horas a 37°C, 5% CO

2.

Ao final do período de incubação,

as diferentes suspensões celulares foram adicionadas de Azul de Trypan e submetidas

às avaliações microscópicas para a caracterização da viabilidade e de alterações

morfológicas relacionadas ao processo de morte celular programada (morte natural),

ou apoptose. A avaliação da apoptose foi realizada de acordo com as metodologias

descritas por (SHWARTZ, et al 1995).

Nesse ensaio foi observado que as formas promastigotas permaneceram viáveis em

todas as concentrações do extrato (Ouratea cuspidata metanolico) OCMeOH, entretanto

alterações morfológicas foram observadas partir da exposição à concentração equivalente a 2

mg/10

6

L566/mL. A exposição às concentrações de 8, 16 e 32 mg de OCMeOH/10

6

L566/mL,

respectivamente causou a deformação de 62%, 78% e 98% das células que perderam suas

características de forma, tornando-se totalmente redondas, mas ainda com flagelos, sugerindo

tratarem-se de células defectivas e não de formas amastigotas.

A viabilidade das células hospedeiras, macrófagos (Mφ) foi mais afetada quando

comparadas com as promastigotas (L566). Entretanto, nas concentrações do extrato

OCMeOH de 2 e 4 mg/10

6

Mφ/mL 99% das células se apresentavam viáveis, enquanto que

alterações morfológicas extensas já aconteciam nas formas parasitárias submetidas a

tratamento idêntico. A viabilidade dos macrófagos (Mφ), diminuiu gradativamente a partir da

exposição à concentração de OCMeOH equivalente a 8, 16, 32 mg/10

6

Mφ/mL, onde

observou-se viabilidade de 87%, 78% e 70%, respectivamente. Em relação a alterações

morfológicas, os macrófagos (Mφ) foram menos afetados que as L566. As alterações foram

visualizadas somente em Mφ tratados com as doses iguais ou superiores a 4 mg de

OCMeOH/10

6

Mφ/mL. Nesta concentração 7% das células apresentaram alguma alteração

morfológica. Nas concentrações de 16 e 32 mg de OCMeOH/10

6

Mφ/mL as alterações

morfológicas foram compatíveis com as ocorrentes em processos apoptóticos, com

fragmentação nuclear, aparecimento de bolhas citoplasmáticas e fragmentação celular. Nas

concentrações de 16 e 32 mg de OCMeOH/10

6

Mφ/mL foram observadas alterações em 40%

e 62%, dos Mφ tratados, respectivamente.

152

Figura 100: Viabilidade de promastigotas de Leishmania braziliensis (L566) e de

macrófagos peritoneais (M

φ) de hamsters (Crycetus crycetus) frente a diferentes

concentrações do extrato metanólico de

Ouratea cuspidata . Os pontos assinalados

representam a média de quatro observações adicionadas do erro padrão. As diferenças

asterisco) foram analisadas através de ANOVA, sendo considerados significativas quando

p≤0,05.

Figura 101: Alterações morfológicas de promastigotas de Leishmania braziliensis

(L566) e de macrófagos peritoneais (M

φ) de hamsters (Crycetus crycetus) frente a

diferentes concentrações do extrato metanólico de

Ouratea cuspidata . Os pontos

assinalados representam a média de quatro observações adicionadas do erro padrão. As

diferenças asterisco) foram analisadas através de ANOVA, sendo considerados

significativas quando p≤0,05.

0

20

40

60

80

100

120

02481632

Cocentração (mg/10

6

células/ mL)

Viabilidade (%)

0

20

40

60

80

100

120

02481632

Concentração (mg/10

6

células/mL)

Alterações morfológicas (%)

153

Medidas de atividade mitocondrial (metabolismo enzimático intermediário).

O efeito dos tratamentos sobre a atividade enzimática-mitocondrial foi medida

através da metodologia descrita na literatura ( BERG et al., 1994, DUTTA et al., 2005), onde

a taxa de atividade das desidrogenases mitocondriais, foi aferida através do desdobramento do

azul de Tetrazólio (MTT), assimilado pelas células viáveis, com a geração de formazanas

intracelulares. Os produtos corados passam ao sobrenadante dos cultivos quando as

suspensões celulares livres do excesso de MTT não assimilado (lavadas com PBS) são

rompidas pela adição de dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 5%. Ocorre a geração

proporcional de cor nos sobrenadantes que foi medido espectrofotometricamente (492nm)

gerando dados proporcionais onde a coloração citoplasmática das células tratadas foi

proporcional a atividade enzimática intracelular, permitindo, assim, estimar a potencialidade

metabólica celular nos diferentes tratamentos realizados.

Nas avaliações realizadas com as promastigotas L566, células foram previamente

cultivadas em meio BHI em microplacas de fundo chato com 96 orifícios, contendo 10

6

formas promastigotas por mL e tratadas com as diferentes concentrações de extrato vegetal

durante 24 horas. Posteriormente, as células foram centrifugadas o meio de cultura foi

aspirado e as células foram ressuspendidas com 100 µL de uma solução de MTT em solução

salina tamponada com fosfato (PBS), na concentração de 2 mg/mL e encubadas durante

quatro horas a 37 °C na ausência de luz. Os cristais de formazana oriundos da redução

enzimática do corante pelas células viáveis, foram dissolvidos em DMSO. A atividade

mitocondrial foi estimada através de leitura espectofotométrica a 492nm.

A intensidade da cor azulada desenvolvida nas células controle, foi considerada como

representando 100 % de viabilidade em todas as medidas realizadas. Todas as comparações

posteriores foram baseadas nesse critério de referência. Comparativamente foram realizados

testes de controle negativo, onde a absorbância do MTT e do veículo, nas diluições de 1:1

foram avaliadas, na ausência de células.

Os resultados indicaram haver alteração das funções mitocondriais nos Mφ tratados,

que apresentaram diminuição da capacidade de desdobrar o metiltetrazólico em cristais de

formazana pelos macrófagos (Mφ) tratados, quando comparados com o controle (Mφ não

tratados) (Figura 102 pág-154). Nesse caso, a atividade mitocondrial foi gradativamente

afetada, sendo diretamente relacionada ao aumento das concetrações de OCMeOH.

Foi observada uma diminuição da atividade enzimática intracelular em 13,51%, 33,7%

e 51,35%, nos tratamentos com 8, 16 e 32 mg de OCMeOH/10

6

Mφ/mL .

Embora as L566 também tenham sido afetadas pelo tratamento, tal efeito não

apresentou correlação direta entre a dose de OCMeOH e a diminuição da atividade enzimática

(Figura103pág-154). Embora tenha havido uma diminuição de 26% da atividade

mitocondrial parasitária em L566 tratadas com 4mg /10

6

L566/mL, em relação ao tratamento

com 2 mg/10

6

L566/mL, a atividade mitocondrial das promastigotas foi sempre superior a

atividade detectada nas L566 não tratadas (controle), sugerindo terem sido a uma aceleração

metabólica induzida pelo tratamento com OCMeOH. Nas concentrações 8, 16, 32 mg de

OCMeOH/10

6

L566/mL houve um aumento de 220%, 389% e 480%, respectivamente, na

atividade enzimática parasitária. O aumento na atividade metabólica mitocondrial evidenciado

nas formas L566 apresentou correlação direta com o aumento das taxas de proliferação celular

observado nas avaliações do crescimento de promastigotas frente às mesmas concentrações de

OCMeOH (Figura 99 pág-150), sugerindo que constituintes do extrato possam afetar mitose

parasitária.

154

Figura 102 : Medidas de Absorbância da atividade enzimática mitocondrial em

macrófagos peritoneais (M

φ) de hamsters (Cricetus cricetus), através da dosagem de

formazana, gerada pelo desdobramento fisiológico do brometo de metiltetrazólico (MTT),

após exposição por 24 horas a diferentes concentrações do extrato metanólico de

Ouratea

cuspidata

(OCMeOH). N= 5 (p≤0,05).

Figura 103: Medidas de Absorbância da atividade enzimática mitocondrial em

promastigotas de

Leishmania(Viannia) braziliensis (L566) através da dosagem de

formazanas, geradas pelo desdobramento fisiológico do brometo de metiltetrazólico

(MTT), após exposição por 24 horas a diferentes concentrações do extrato metanólico de

Ouratea cuspidata (OCMeOH). N= 5 (p≤0,05).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

2481632

OCMeOH (mg/10 células/mL)

Absorbância (492nm)

Controle

M

Φ

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

2481632

OCMeOH (mg/10 células/mL)

Absorbância (492nm)

Controle

M

Φ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

02481632

OCMeOH (mg/10 células/mL)

Absorbância (492nm)

L566

Controle

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

02481632

OCMeOH (mg/10 células/mL)

Absorbância (492nm)

L566

Controle

155

Atividade Antiinflamatória

A atividade antiinflamatória foi estimada em macrófagos peritoneais de

mamíferos hospedeiros e consistiu nas avaliações da viabilidade, morfologia e atividade

enzimática, associadas a ensaios de avaliação da atividade fagocitária para partículas inertes.

Todas as metodologias empregadas nesses ensaios foram inicialmente baseadas naquelas

descritas por (HERSCOWITZ et al 1981).

Avaliação da capacidade de fagocitose dos macrófagos

A capacidade de fagocitose dos macrófagos peritoniais dos hamsters foi avaliada pelo

método previamente descrito por (TORRES-SANTOS et al., 1999). Os macrófagos foram

cultivados em quatro repetições na presença de 5 concentrações de extratos vegetaais

(2mg/mL, 4mg/mL, 8mg/mL, 16mg/mL e 32mg/mL) por 2 horas. As células foram

centrifugadas a 600rpm/10

0

C por 15 minutos (três vezes), para a retirada do sobrenadante e

novamente acrescidas de meio RPMI-1640 adicionado de uma suspensão de Zymozan

equivalente a uma concentração de 5-10mg/mL de partículas inertes para cada 10

6

macrófagos

peritoneais. Após 1 hora de incubação a 37

0

C (5% CO

2

) as células foram novamente

centrifugas por três vezes consecutivas, para a retirada das partículas de Zymosan que não

foram fagocitadas. As células foram fixadas e coradas pelo Panótico (hematoxilina-Eosina), e

avaliadas quanto à capacidade fagocítica, de acordo com a seguinte fórmula:

IF = Número de Mφ que fagocitaram 3 ou mais partículas X 100

Número total de Mφ contados

Onde IF corresponde ao índice fagocítico (%) e Mφ corresponde aos macrófagos.

Os resultados foram comparados aos controles constituídos de Mφ não tratados

e expressos em percentuais de atividade fagocítica.

A capacidade fagocítica, assim determinada, diminuiu drasticamente à partir da

exposição à concentração de OCMeOH equivalente a 16 mg/10

6

Mφ/mL, onde observou-se

uma capacidade de ingestão equivalente a 8% da capacidade fagocítica observada nos

controles (Mφ não tratados). A exposição à concentração de 32 mg de OCMeOH/10

6

Mφ/mL

causou uma inibição de 98% da capacidade fagocítica em relação ao controle. A perda da

função fagocitária foi irreversível, uma vez que os macrófagos tratados com as doses

limitantes do extrato vegetal, quando lavados por centrifugações seqüenciais e adicionados

em meio de cultivo livre de aditivos, na presença de soro fetal bovino inativado, não

recuperaram suas funções metabólicas.

156

Figura 104: Percentual de endocitose de parículas inertes (Zymozan) em macrófagos

peritoneais de hamsters (

Cricetus cricetus) tratados com diferentes doses do extrato

metanólico de

Ouratea cuspidata (OCMeOH) durante duas horas a 37°C, 5% CO

2

, em

comparação ao controle constituído por células não tratadas. Os resultados estão expressos

como sendo a média de quatro repetições por concentração analizada adicionados do erro

padrão (p≤0,01).

A avaliação das alterações morfofisiológicas presentemente detectadas sugeriu que

OCMeOH exerce efeitos distintos para ambos, células hospedeiras e promastigotas. Tal

possibilidade foi corroborada através de ensaios de bioproteção in vitro, nos quais

comprovou-se que as doses atóxicas para as células hospedeiras corresponderam àquelas que

melhor eliminaram substâncias oxigênio-reativas ocorrentes pela indução artificial de TBARS

em membranas eritrocitárias, através de mecanismos não enzimáticos (Figuras 97 pág-148 e

105 pág-156).

Figura 105: Percentual de bioproteção contra a geração de radicais livres por diferentes

concentrações da fração metanólica de

Ouratea cuspidata (OCMeOH). Os resultados

0

50

100

0 2 4 8 16 32

mg/10

6

células/mL)

Fagocitose (%)

Controle

OCMeOH

0

50

100

0 2 4 8 16 32

mg/10

6

células/mL)

Fagocitose (%)

Controle

OCMeOH

-130

-80

-30

20

70

00,22560100

OCMeOH (mg/mL)

Bioproteção (%)

157

representam a média de quatro repetições de ensaios realizados “in vitro” onde as diferentes

concentrações do extrato vegetal foram adicionadas sobre sistema gerador de substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS).

Neste experimento, foi confirmada a ação bioprotetora em doses decrescentes de

OCMeOH, onde a concentração de 0,2 mg/mL foi capaz de proteger 98% das membranas

quanto à formação de peróxidos de lipídeos e formação de TBARS. A concentração de 100

mg/mL (500 vezes maior) induziu a formação de TBARS adicionais no sistema, que

apresentou concentração de radicais livres 1,3 vezes maior que o sistema de experimental

utilizado. As concentrações de 25 mg/mL (125 vezes maior) e de 60 mg/mL (300 vezes

maior), apresentaram percentual de bioproteção de 71% e 24%, respectivamente. Sugerindo

ter ocorrido o efeito farmacológico, comum em plantas com atividade medicinal, denominado

de hormese, onde as doses mais baixas de um extrato exercem efeito biológico mais

pronunciado que aquelas mais elevadas (Figura 106).

Figura 106; Curva de regressão linear evidenciando a hormese bioprotetora obtida pela

adição da fração metanólica de

Ouratea cuspidata (OCMeOH) sobre sistema biológico

sujeito à indução de radicais livres reativos ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os

resultados estão representados como a média de quatro repetições acrescidos do erro

padrão (p≤0,01).

No presente ensaio pôde-se notar uma intensa atividade biológica sobre a proliferação

parasitária e concomitante efeito antiinflamatório decorrente da paralisação metabólica nas

células hospedeiras. Nesse contexto, a atividade antiparasitária exercida pelos constituintes

presentes no extrato OCMeOH estariam relacionados à inibição da fagocitose dos parasitas

que, por não penetrarem ativamente nas células do hospedeiro, estariam mais expostos aos

efeitos locais da droga

R

2

= 0,9762

0

20

40

60

80

100

120

0,2 25 60

OCMeOH (mg/mL)

Bioproteção (%)

158

Conclusão.

O estudo sobre a diversidade flavonoídica dos gêneros Ouratea e Luxemburgia

permitiu verificar que que as substâncias mais significativas do gênero Ouratea são os

biflavonóides com ligação interflavonoídica do tipo C-C, sendo o representante mais

abundante o derivado da agatisflavona. Por outro lado o gênero Luxemburgia é caracterizado

pela ligação do tipo C-O-C, cujo componente mais abundante a 2′′-diidroochanaflavona, além

das chalconas presentes apenas em espécies desse gênero, tanto na forma monomérica como

nas bichalconas A distribuição do grupo de produtos naturais formados por acoplamento de

duas unidades flavonoídicas nos gêneros Ouratea e Luxemburgia e o levantamento de suas

propriedades biodinâmicas permitiram: caracterizá-los como marcadores quimiotaxonômicos

para os referidos táxons, propor uma nomenclatura com notação para esse grupo de

substâncias e evidenciar suas potencialidades farmacológicas. Apesar dessas espécies não

serem tão conhecidas na medicina popular, a freqüência das biflavonas é indicativo de ótimas

perspectivas para se tornarem constituintes de medicamentos.

Este é o primeiro estudo químico de inflorescência de Ouratea hexasperma e revelou a

presença de glicosídeos não isolados anteriormente de Ouratea e, inclusive, permitiu verificar

que, certamente, nessa parte da planta não são metabolisados biflavonas.

Quanto ao estudo químico de caule de O. hexasperma permitiu identificar duas

substâncias novas a serem registradas na literatrura e verificar que espécies desse gênero

podem metabolisar flavonóides prenilados.

O estudo químico de folhas e caule de Ouratea cuspidata levou ao isolamento de

substâncias pertencentes as classes de metabólitos identificados em outras espécies de

Ouratea. A presença de biflavonóides do grupo da amentoflavona foi confiramda nessa parte

da planta. Tanto o biflavonóide putraflavona como a monoflavonoide tricina são registradas

pela primeira vez no gênero Ouratea.

A avaliação da atividade biológica dos extratos das folhas de Ouratea cuspidata

revelou que em baixas concentrações o extrato metanólico apresenta maior atividade

antiparasitária frente a Leishmania braziliensis, maior ação bioprotetora contra radicais livres

e antiinflamatória. Esses resultados demonstram que folhas dessa espécie podem ser

empregadas como fonte de fármaco na terapêutica contra Leishmaniose.

159

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