ads:
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
TECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E
SOROTIPIFICAÇÃO DE Listeria monocytogenes E
Listeria innocua ISOLADAS EM MATADOURO -
FRIGORÍFICO DE SUÍNOS DA REGIÃO DAS MISSÕES -
RS
LIZIANE SCHITTLER
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Pelotas, sob a
orientação do Prof. Dr. Wladimir
Padilha da Silva, como requisito parcial
do Programa de Pós-Graduação em
Ciência e Tecnologia Agroindustrial, à
obtenção do título de Mestre em
Ciências (M.S.).
PELOTAS
Rio Grande do Sul - Brasil
Maio de 2005
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Schittler, Liziane
S329c Caracterização molecular e sorotipificação de Listeria monocytogenes e Listeria
innocua isoladas em matadouro - frigorífico de suínos da região das Missões – RS /
Liziane Schittler. – 2005.
f.
Bibliografia
Orientador: Wladimir Padilha da Silva.
Co-orientador: Eduardo César Tondo.
Dissertação (mestrado) –Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Agronomia
Eliseu Maciel, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2005.
1. Listeria monocytogenes. 2. Sorologia. 3. Suíno. 4. Listeria innocua. I. Silva,
Wladimir Padilha da. II. Tondo, Eduardo César. III. Título.
CDD 576.163
Catalogação-na-Publicação (CIP) elaborada por Tarcila Peruzzo CRB 14-1027
ads:
LIZIANE SCHITTLER
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E
SOROTIPIFICAÇÃO DE Listeria monocytogenes E
Listeria innocua ISOLADAS EM MATADOURO -
FRIGORÍFICO DE SUÍNOS DA REGIÃO DAS MISSÕES -
RS
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Pelotas, sob a
orientação do Prof. Dr. Wladimir
Padilha da Silva, como requisito parcial
do Programa de Pós-Graduação em
Ciência e Tecnologia Agroindustrial, à
obtenção do título de Mestre em
Ciências (M.S.).
Equipe de orientação:
Orientador: Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva,
Co - orientador Prof. Dr. Eduardo César Tondo - UFRGS
APROVADA: 15 de maio de 2005
Prof. Dr. Celso Medina Fagundes
Prof. Dr Pedro Luiz Antunes
Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por tudo.
Aos meus pais pela vida, pelo amor, pelo exemplo de garra e família.
Ao meu esposo e filha, pelo incentivo, paciência e amor, incríveis e
indispensáveis para a conclusão desta etapa.
Aos meus irmãos, Daniela, Michele e Guilherme, que estando perto ou
longe, sempre estiveram presentes, mesmo que apenas em pensamento.
À Universidade Federal de Pelotas e ao Departamento de Ciência e
Tecnologia Agroindustrial pela oportunidade de realizar o curso de Pós-
Graduação.
À Universidade Regional do Noroeste do Estado do RS pela confiança e
apoio.
Ao Instituto Oswaldo Cruz ( FIOCRUZ), em especial ao Dr. Ernesto
Holfer, do Laboratório de Zoonoses Bacterianas do Departamento de
Bacteriologia , pela sorotipificação das linhagens.
iv
Ao Professor Wladimir Padilha da Silva pela valiosa orientação,
confiança e amizade durante o curso e execução do trabalho.
Ao Professor Eduardo César Tondo pelo incentivo, Co-orientação,
amizade e ensinamentos transmitidos.
Ao estagiário Carlos Henrique Pagno pela dedicação e amizade.
Aos funcionários, estagiários e grandes amigos dos Laboratórios do
Núcleo de Alimentos da UNIJUÍ - Campus Santa Rosa, Gislaine, Vanessa
Schley, Vanessa Pieniz, Leidi, Fabiane, Franciele , Marga e Graciele pelo
apoio.
Aos amigos Andréia Saldanha de Lima e Fernando Zocche, pela ajuda,
amizade, incentivo.
As amigas que nunca esquecerei Cristina e Silvana, pelo apoio e
carinho.
Aos amigos da MICROBIAL, Ana, Márcia, Elen, Rodrigo, Cátia, incentivo
e auxílio em todos os momentos.
As minhas amigas Vera e Ângela, pelo incentivo e apoio.
A todos os professores e funcionários do Departamento de Ciência e
Tecnologia Agroindustrial, pelo apoio, em especial aos professores Germano,
Ferri, Celso, Álvaro e Manoel, pela amizade e incentivo.
Ao colega Márcio, do Laboratório de Biologia Molecular, pelo apoio
técnico e amizade.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma
para a realização deste trabalho.
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS ..................................................................................... iii
ÍNDICE............................................................................................................v
LISTA DE TABELAS ..................................................................................... vii
LISTAS DE FIGURAS....................................................................................ix
SUMÁRIO........................................................................................................x
SUMMARY.................................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................1
2. REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................3
2.2 Listeria monocytogenes.........................................................................4
2.3 Listeriose ...............................................................................................5
2.4 L. monocytogenes e sua relação com a indústria de alimentos.............7
2.5 Ocorrência de infecções alimentares por L. monocytogenes ................8
2.6 Detecção..............................................................................................10
2.7 Utilização de biologia molecular para subtipificação de L.
monocytogenes .........................................................................................10
2.8 Sorotipificação.....................................................................................13
3. MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................15
3.1 Descrição do estabelecimento estudado.............................................15
3.2 Amostragem ........................................................................................15
3.2.1 Amostra de água...........................................................................16
3.2.2 Amostras das câmaras frias..........................................................16
3.2.3 Amostras superficiais das carcaças..............................................16
3.2.4 Amostras das facas.......................................................................17
3.2.5 Amostras de conteúdo cecal (fezes).............................................17
3.2.6 Amostras das mãos dos operadores.............................................17
3.2.7 Amostras dos ralos........................................................................18
3.3 Isolamento e identificação de Listeria spp...........................................18
3.3.1 Enriquecimento seletivo ................................................................18
3.3.2 Enriquecimento secundário...........................................................18
3.3.3 Isolamento.....................................................................................19
vi
3.3.4 Seleção e purificação das colônias suspeitas de Listeria spp.......19
3.3.5 Identificação bioquímica de Listeria spp........................................19
3.4 Sorotipificação das linhagens de Listeria spp......................................21
3.5 Análise do polimorfismo do DNA por amplificação aleatória (RAPD) ..21
3.5.1 Preparo das células.......................................................................21
3.5.2 RAPD ............................................................................................22
3.6 Análise dos Resultados .......................................................................22
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................23
4.1 Ocorrência de Listeria spp...................................................................23
4.2 Sorotipificação de Listeria spp.............................................................27
4.3 Caracterização molecular por RAPD das linhagens de L.
monocytogenes e L. innocua.....................................................................29
5. CONCLUSÕES .........................................................................................36
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................37
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 - Características fenotípicas empregadas para diferenciação
de Listeria spp
20
Tabela 2 – Ocorrência de Listeria monocytogenes e Listeria innocua
em 105 amostras obtidas de um frigorífico de suínos, localizado na
Região das Missões-RS
23
Tabela 3 – – Freqüência de Listeria innocua e Listeria monocytogenes
no ambiente, utensílios, manipuladores e em carcaças de um frigorífico
de suínos da região das Missões - RS
24
Tabela 4 - Freqüência, número, percentagem e sorologia de
Listeria
innocua e Listeria monocytogenes. coletadas em um frigorífico de
suínos na região das Missões-RS
28
Tabela 5 – Perfis genéticos das linhagens de Listeria innocua e Listeria
monocytogenes isoladas em um frigorífico de suínos, localizado na
região das Missões -RS
32
viii
Tabela 6 – Distribuição das 20 linhagens de Listeria monocytogenes e
Listeria innocua em uma linha de abate de um frigorífico de suíno,
localizado na região das Missões – RS, conforme o resultado de
sorologia e RAPD
33
Tabela 7 – Distribuição por amostra e por coleta dos perfis gerados por
RAPD de linhagens de L. monocytogenes e L. innocua
coletadas em
um frigorífico de suínos localizado na região das Missões – RS
34
LISTAS DE FIGURAS
Página
FIGURA 1: Análise eletroforética em gel de agarose 1,5% : padrões
de bandas dos perfis sendo que a 01 de Listeria monocytogenes e
Listeria innocua as identificadas como 10, 02, 03, 04 de, obtidos com
o primer UBC 155; (M) Marcador de peso molecular Ladder 100pb
30
FIGURA 2: Análise eletroforética em gel de agarose 1,5% : padrões
de bandas dos perfis sendo que I é de Listeria monocytogenes e as
B, A, E , F são de Listeria innocua, obtidos com o primer UBC 127;
(M) Marcador de peso molecular Ladder 100pb
31
SUMÁRIO
SCHITTLER, Liziane. M.S. Universidade Federal de Pelotas. Maio de 2005.
Ocorrência e caracterização molecular e sorotipificação de Listeria
monocytogenes e Listeria innocua isoladas em um frigorífico de suínos da
Região das Missões – RS. Orientador: Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva. Co-
orientador: Prof. Eduardo César Tondo.
Listeria monocytogenes é uma bactéria amplamente distribuída na natureza,
apresenta alta capacidade de colonizar superfícies e de formar biofilmes em
plantas de processamentos de alimentos. Destaca-se dentre os mais
importantes microrganismos causadores de infecções alimentares, por ser
agente da listeriose, doença grave que pode levar a aborto, problemas
neurológicos e distúrbios gastrintestinais, sendo a carne importante veículo de
transmissão dessa doença à humanos O objetivo deste trabalho foi investigar a
ocorrência e caracterizar L. monocytogenes e Listeria innocua em uma linha de
abate de um matadouro-frigorífico de suínos situado na Região das Missões,
RS. Listeria spp. foi avaliada na água, câmaras frias, carcaças, facas, fezes,
mãos de manipuladores e ralos, e as linhagens isoladas foram submetidas a
sorotipificação e a tipificação molecular através da análise do polimorfirmo do
DNA por amplificação aleatória (RAPD) com os primers UBC 155 e UBC 127. A
ocorrência de L. monocytogenes foi de 0,95%, e de L. innocua, 18,1%, em 105
amostras analisadas, sendo as câmaras frias o ponto de maior isolamento. A
maior parte das linhagens de L. innocua foi não tipificável, e daquelas
xi
sorotipificáveis, os sorovares 6a e 6b foram os prevalentes. Somente uma
linhagem de L. monocytogenes foi isolada, a partir de um ralo, e pertencia ao
sorovar 4b. O RAPD gerou 15 perfis genéticos combinados. Há contaminação
por L. monocytogenes e L. inoccua no frigorífico avaliado, sendo a
contaminação cruzada importante nessa indústria, tendo em vista que algumas
linhagens de L. innocua são persistentes no local.
SUMMARY
SCHITTLER, Liziane. MS. Universidade Federal de Pelotas (Federal University
of Pelotas). Maio,2005. Occurrence and molecular characterization and
sorotipificação of Listeria monocytogenes and Listeria innocua isolated in one
swine frigorific from the Missions Region - RS. Adviser: Dr. Wladimir Padilha da
Silva.
Listeria monocytogenes is bacterium widely distributed in nature which presents
high capacity to colonize surfaces and form biofilms in food processing plants. It
distinguishes itself among the most important and dangerous microorganisms
that cause food-borne diseases, such as listeriosis, a serious disease that
causes abortion, neurological and gastrointestinal disorders, being the meat its
main vehicle for transmission to humans. The aim of the present paper was to
investigate the occurrence and molecularment characterization and
sorotipificação of Listeria monocytogenes and Listeria innocua isolated in one
swine frigorific from the Missions Region – RS. Listerias spp. was evaluated in
water, cold chambers, carcasses, knives, faeces, hands and drains and the
strains obtained went through serotyping and molecular typing through the
analysis by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) with UBC 155 e
UBC 127 primers. The occurrence of L. monocytogenes was of 0,95% and of
L. innocua, 18,1%, in 105 samples assayed, being the cold chambers the major
point of isolation. Most of the L. innocua strains were not serotypable and, from
those serotypable, the serovars 6a and 6b were prevalent. Only one L.
xiii
monocytogenes strain was isolated, from a drain, and it belonged to serovar 4b.
RAPD produced 15 genetic combined profiles. There is contamination by L.
monocytogenes e L. inoccu in the swine frigorific, and this cross contamination
in this plant is considered important, since some L. innocua strains persist in the
local.
1. INTRODUÇÃO
Listeria monocytogenes é um patógeno transmitido por alimentos, de
grande importância para a saúde pública, uma vez que pode causar uma das
mais severas infecções alimentares, que é a listeriose.
No Japão, se estima uma incidência anual de 0,65 casos de listeriose por
um milhão de habitantes, enquanto na Europa, há uma estimativa de 1 a 15
casos por milhão de habitantes (Okutani et
. al., 2004). De acordo com o CDC
(Center for Disease Control and Prevention), em Atlanta (EUA), houve a
notificação de 696 casos de listeriose no ano de 2003. No Brasil, ainda não há
informação exata da incidência de listeriose em humanos, entretanto, diversos
trabalhos recentes relatam a presença da L. monocytogenes em diferentes
alimentos (Lima, 2004; von Laer, 2004; Antoniollo et al., 2003).
Dentre os alimentos cuja presença de L. monocytogenes tem sido relatada,
destacam-se a carne e derivados, em parte devido a associação entre esse
microrganismo e infecções em animais, os quais, muitas vezes, apresentam-se
assintomáticos. Outro aspecto a ser considerado é que outras espécies de
Listeria também têm sido observadas em animais e, conseqüentemente, em
alimentos, e que tais microrganismos têm sido considerados como indicadores
da presença de L. monocytogenes. Em vista disso, os animais podem
disseminar essa bactéria através das fezes ou secreções, contaminando o
ambiente ou os alimentos, tanto na propriedade produtora como na indústria de
2
processamento. Se animais infectados com esse microrganismo são abatidos
em matadouro-frigorífico, por exemplo, pode-se esperar que a contaminação se
propague durante as operações de processamento, principalmente se o
estabelecimento operar sem condições higiênicas adequadas.
Dentro de matadouros-frigoríficos ou de indústrias de processamento, L.
monocytogenes pode colonizar superfícies de equipamentos e utensílios e
formar biofilmes, tornando-se endêmica no ambiente e aumentando, dessa
forma, a probabilidade de contaminar a linha de produção e os alimentos ali
produzidos. Além disso, esse microrganismo apresenta a capacidade de
multiplicação sob temperaturas de refrigeração, sendo possível, portanto, o seu
desenvolvimento em câmaras frias ou ao longo da cadeia de frio, na qual a
carne é comumente armazenada.(Jay, 2005)
Ainda que a legislação brasileira vigente (RDC nº 12, da ANVISA) não
estipule a pesquisa de L. monocytogenes em carnes comercializadas no Brasil,
na Circular Nº354/2004, o Departamento de Inspeção de Produtos de origem
Animal (DIPOA) estabelece diretrizes para prevenção da contaminação com L.
monocytogenes em produtos de origem animal prontos para o consumo, as
quais devem ser consideradas pelos estabelecimentos envolvidos na produção
dos alimentos em questão.
Em vista disso, objetivou-se avaliar a ocorrência e caracterizar
molecularmente e sorologicamente L. monocytogenes e L. innocua isoladas em
matadouro-frigorífico de suínos localizado na região das Missões-RS.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Listeria spp.
O gênero Listeria foi considerado, durante muitos anos, como
monoespecífico, contendo apenas a espécie Listeria monocytogenes (Ryser &
Marth, 1999).
Atualmente, esse gênero é composto por seis espécies: Listeria
monocytogenes, L. seeligeri, L. ivannovii, L. innocua, L. welshimeri e L. grayi
(ICMSF, 1998). Com exceção de L. grayi, todas as demais são contaminantes
de alimentos. As espécies L. innocua, L. seeligeri e L. welshimeri são
consideradas avirulentas. L. ivannovii é patogênica para ovinos e caprinos e L.
monocytogenes prima-se em importância como patógeno para o homem e
animais (Trabulsi et
al., 1999).
Segundo o Manual de Bergey (Hensyl, 1994), Listeria é um bacilo
pequeno (0,5 µm de diâmetro e 1-2 µm de comprimento), microaerófilo,
anaeróbio facultativo, regular, Gram-positivo, que pode se apresentar em
unidades ou em cadeias pequenas. Não forma esporos, produz catalase, mas
não oxidase. É móvel a 25ºC, com movimento característico de tombamento, e
é imóvel a 35ºC. A multiplicação ocorre rapidamente na maioria dos meios
bacteriológicos utilizados na rotina laboratorial (Ryser & Donnelly, 2001).
4
As bactérias desse gênero são ubíquas, encontrando-se amplamente
distribuídas na natureza, fato que explica a facilidade com que são encontradas
em toda a cadeia dos alimentos, desde a produção até alimentos prontos para
o consumo (Beuchat, 1996). São comumente encontradas em águas
residuárias, rios (Farber & Perterkin, 1991), solo, plantas, particularmente em
vegetais em decomposição (Ryser & Marth, 1999) e ambientes úmidos ou
secos (Comi et al., 1992). Também podem ser encontradas em várias espécies
de mamíferos, tanto domésticos como selvagens, em aves e em algumas
espécies de peixes e crustáceos (Uhitil et al., 2004), já tendo sido isoladas em
fezes de homens e em insetos (Lim, 1998). É provável que de 1 a 10% da
população humana sejam portadores de L. monocytogenes no intestino
(Forsythe, 2002).
2.2 Listeria monocytogenes
A descrição dessa espécie ocorreu há mais de 60 anos, quando Murray
e seus colaboradores, em 1926, classificaram uma bactéria Gram-positiva, não
esporulada, causadora de enfermidades em carneiros e cobaias. Os autores
denominaram Bacterium monocytogenes, uma vez que esse microrganismo
infectava os monócitos (leucócitos) do sangue (Gombas et. al., 2003).
As primeiras descrições de infecções em animais e seres humanos por
Listeria monocytogenes remontam ao final do século XIX (Gray & Killinger,
1966). Desde então, diversas infecções por esse microrganismo têm sido
descritas em uma grande variedade de animais, incluindo bovinos, ovinos,
aves, roedores, suínos e, também, seres humanos (Farber & Peterkin, 1991).
L. monocytogenes é considerada a única espécie de Listeria que é
patogênica para humanos, enquanto L. ivanovii é descrita como causadora
ocasional de aborto em animais (Murray et al.,1999).
É uma bactéria ubíqua, que embora não seja esporulada, tem
capacidade de se desenvolver em condições nas quais os microrganismos
patogênicos, tem dificuldade para se multiplicar. Os limites de temperatura para
o crescimento são -0,4ºC até 45ºC, o pH entre 4,4 e 9,6, com um crescimento
ótimo em pH 7,0 (Jay, 2005). Um importante fator coadjuvante é sua
5
capacidade para multiplicar-se em temperaturas de refrigeração, evidenciando
a necessidade de controle mais intenso em alimentos refrigerados (ICMSF,
1998).
Listeria monocytogenes é uma bactéria intracelular facultativa,
apresentando como importante fator de patogenicidade sua habilidade em
sobreviver e multiplicar-se dentro de células do hospedeiro, bem como em
células fagocitárias desse hospedeiro. Em resumo, a bactéria liga-se às células
da mucosa intestinal e é, então, absorvida por meio de fagocitose induzida, na
qual o microrganismo é engolfado através da formação de pseudópodos,
internalizando-se em uma vesícula no interior da célula do hospedeiro. Antes
da formação do fagolisossoma, que destruiria o microrganismo, a membrana
dessa vesícula é rompida pela listeriolisina O, secretada pela bactéria,
liberando-a no citoplasma da célula. No citoplasma celular, L. monocytogenes
produz enzimas que polimerizam a actina do citoesqueleto celular, facilitando
seu deslocamento intracelular, bem como enzimas que destroem a membrana
da célula do hospedeiro, promovendo sua disseminação para células
adjacentes. Uma vez dentro da nova célula, repete-se o ciclo. Além disso, se a
bactéria entrar nos monócitos, macrófagos ou leucócitos polimorfonucleares,
pode disseminar-se pela corrente sangüínea, levando à septicemia, podendo
chegar ao cérebro e, provavelmente, migrar da placenta para o feto em
mulheres grávidas (Forsythe,2002).
Dados coletados nos Estados Unidos indicam que nos últimos anos está
ocorrendo um declínio na incidência de infecções causadas por alguns
patógenos como, por exemplo, Campylobacter spp. e por alguns sorovares de
Salmonella. Entretanto, o mesmo estudo mostra que o número de infecções
causadas por Listeria não tem diminuído significativamente (CDC, 2004).
2.3 Listeriose
A doença listeriose é uma infecção que pode ser transmitida à humanos
através de várias vias, entretanto, a via alimentar parece ser a mais
preocupante. Ressalta-se que o risco de desenvolver uma infecção por L.
monocytogenes após a ingestão de um alimento contaminado é baixo para a
6
população em geral (CDC, 1999), embora possa ocasionalmente ocorrer em
indivíduos considerados fora do grupo de risco para a doença (Ryser &
Donnelly, 2001). No entanto, é particularmente importante para gestantes,
indivíduos com síndrome de imunodeficiência adquirida ou portadores de HIV,
com cirrose, carcinoma ou outras doenças que provoquem comprometimento
do sistema imunológico (Dhanashree et. al, 2003). Idosos e recém-nascidos
também são suscetíveis à listeriose, e enquadrados como indivíduos de alto
risco (FDA, 2003).
A listeriose humana pode se manifestar de duas formas: a forma mais grave
compromete principalmente o sistema nervoso central, provocando meningite,
encefalite, septicemia e abscessos, ou o sistema reprodutivo, provocando
aborto no 2º ou 3º trimestre de gestação ou nascimento de feto prematuro; a
forma mais branda ocorre em nível gastrintestinal, é autolimitante e não
invasiva, caracterizando-se por febre, diarréia, náusea, vômito, dor de cabeça e
mialgia, após 12 a 24 horas de ingestão do alimento contaminado (Salamina et
al., 1996).
Apesar de L. monocytogenes causar uma doença de baixa morbidade (0,3
– 1 caso / 100.000 pessoas / ano) nos Estados Unidos, sua importância está na
elevada mortalidade associada a ela (FDA, 2003).
A dose infectante ainda não foi estabelecida, entretanto, informações
obtidas a partir de alimentos contaminados com L. monocytogenes e
envolvidos em surtos, indicam que populações entre 10
3
-10
4
Unidades
Formadoras de Colônia por grama (UFC g
-1
) de alimento foram suficientes para
causar a doença (Duffy et al., 1999). Entretanto, estudo realizado na Finlândia
indica que a exposição da população de risco a doses baixas (0,3 NMP g
-1
) de
L. monocytogenes, por períodos prolongados, pode também levar ao
desenvolvimento da doença (Maijala et al., 2001).
Dentre os alimentos já envolvidos nos surtos de listeriose, têm-se leite cru e
pasteurizado, queijos, carnes bovina, suína, de aves e seus derivados, frutos
do mar, além de produtos de origem vegetal, crus ou processados, e refeições
preparadas (Franco & Landgraf, 1996; Ryser & Donnelly, 2001).
Embora se saiba que a maioria dos casos de listeriose é devido à infecção
por meio de alimentos, observou-se que pessoas que trabalham com animais
infectados podem apresentar lesões cutâneas localizadas, e que alguns
7
laboratoristas têm contraído, acidentalmente, infecções oculares através da
manipulação com cultivos de Listeria (ICMSF,1998).
2.4 L. monocytogenes e sua relação com a indústria de alimentos
L. monocytogenes não tem causado prejuízos tão somente para a saúde
pública. Nos Estados Unidos, vários produtos alimentícios têm sido recolhidos
em nível de varejo por apresentarem contaminação por esse patógeno, o que
traz grandes impactos econômicos para a indústria responsável. Wong et al.
(2000) relatam os recalls, ou recolhimentos de alimentos, coordenados pela
FDA (Food and Drug Administration – U.S.A) resultantes de contaminação
biológica, efetuados entre os anos de 1994 e 1998. De um total de 1.328
alimentos recolhidos no período, L. monocytogenes foi responsável por 61,2%
dos casos, seguido por Salmonella spp. e Staphylococcus aureus,
representando 10,8% e 5,2% dos recolhimentos, respectivamente.
Os prejuízos desses recalls não se restringem apenas aos custos
envolvidos no recolhimento e destruição do produto, afetando, também, a
credibilidade da marca comercial, podendo comprometer a comercialização
futura.
A entrada de L. monocytogenes em plantas de processamento de alimentos
pode ter origem no solo ou poeira, presentes nas roupas e sapatos dos
funcionários, dos equipamentos transportados; de animais que excretam a
bactéria ou têm sua pele ou superfície contaminados; e podem ser carreados
por humanos saudáveis (Rocourt & Cossart, 1997).
A contaminação de produtos ocorre mais comumente durante o
processamento e é freqüente resultar da persistência de linhagens na
microbiota da planta processadora de alimentos (Autio et al., 2002; Von Laer,
2004). Plantas de processamento de carnes, aves, peixe e leite podem ser
contaminadas com L. monocytogenes, e análises dessa contaminação têm
mostrado que a bactéria pode sobreviver nestes locais por um longo período.
Alguns equipamentos desempenham papel importante na persistência dessa
contaminação, especialmente aqueles que apresentam estrutura complexa, o
qual não permite uma higiene eficiente (Lundén et al., 2003 a; Lima, 2004).
8
Assim como outras bactérias patogênicas de importância em alimentos, L.
monocytogenes pode fixar-se e formar biofilme em diferentes tipos de
superfícies, inclusive aço inoxidável, vidro e borrachas. Essa formação de
biofilme foi observada em plantas processadoras de carnes e de leite (Jacquet
et al., 1994). Uma vez formado o biofilme, a remoção do microrganismo é muito
difícil através das práticas normais de limpeza, haja vista que o microrganismo
fica protegido de agentes sanitizantes e de antimicrobianos (Ryser & Marth,
1999), favorecendo inclusive, o desenvolvimento de resistência aos
desinfetantes, pela exposição a concentrações subletais. Para prevenir o
aparecimento de linhagens resistentes tem sido proposta a rotatividade de
desinfetantes usados na indústria de alimentos (Lundén et al., 2003 b).
Autio et al. (2000), avaliaram 5 plantas de processamento de suínos e
relataram que L. monocytogenes pode ser facilmente detectado dentro de
abatedouro, vindo a contaminar o produto final. Nas plantas de abate de suínos
estudadas, os autores isolaram o microrganismo em 10% dos drenos, mesas e
portas e de 20% das serras. Em dois dos 10 estabelecimentos estudados,
Listeria monocytogenes também foi isolada de carcaças. As amostras
provenientes do ambiente foram coletadas antes do início do abate, justificando
a necessidade de procedimentos eficazes que promovam uma correta limpeza
e desinfecção das instalações antes do início das atividades.
Garantir a inocuidade de alimentos depende de minimizar a contaminação
inicial por microrganismos patogênicos e o seu desenvolvimento durante o
processamento (manipulação) e estocagem (Stekelenburg, 2003). O APPCC
(Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle) é um programa preventivo,
estruturado, sistemático e documentado, que tem sido proposto para garantir
alimentos seguros. A inclusão de L. monocytogenes na lista de organismos a
serem avaliados em um plano APPCC sofreu, recentemente, um impulso na
busca por um método de detecção apropriado para seu monitoramento na
planta, assegurando, desta forma, a produção de alimentos inócuos (Silva et
al., 2003).
2.5 Ocorrência de infecções alimentares por L. monocytogenes
9
Um dos primeiros surtos relatados ocorreu nas províncias marítimas do
Canadá, em 1981. Foram contaminadas 34 crianças e sete adultos, havendo
mortalidade superior a 28%. A fonte de contaminação, de acordo com estudos
epidemiológicos e avaliação microbiológica, foi uma salada de repolho (Schlech
et al.,1983). Em 1983, um surto em ocorrido em Massachusetts (EUA),
envolvendo 42 pessoas adultas e sete crianças, causou 14 mortes, sendo a
infecção atribuída ao leite pasteurizado procedente de um rebanho
apresentando listeriose (Fleming et al., 1985). Entretanto, alguns casos de
listeriose são esporádicos, não estão relacionados com outros casos ou com
um alimento específico.
Os alimentos mais comumente envolvidos são o queijo branco (Schuchat et
al., 1992), patê (Mc Laurghlin et al., 1991), salsichas de Frankfurt consumidas
sem aquecimento, e molhos insuficientemente cozidos (Schuchat et al., 1992).
Um dos maiores surtos de listeriose humana ocorreu em Los Angeles,
Califórnia (EUA), em 1985, onde houve 86 casos, dos quais 67% envolviam
mulheres gestantes e seus bebês. Foi isolado L. monocytogenes dos pacientes
e de quatro pacotes de um queijo tipo frescal, estilo Mexicano (Jay, 1996).
Outro surto envolvendo queijo ocorreu em “Canton of Vaud”, na Suíça,
envolvendo queijo “vacherin”, que também é um tipo de queijo mole
(Nascimento, 1994). Em 2000, nos Estados Unidos, registraram-se 29 casos de
listeriose associados ao consumo de carne de peru, dos quais houve 4 mortes
e 3 abortos.
Os dados reais referentes ao número de casos e surtos de listeriose não
são conhecidos, principalmente no Brasil, entretanto, diversos estudos
reportam a ocorrência da doença. GELLIN et al. (1991), calcularam que o
número de mortes por listeriose em 1986, nos EUA, foi de 450, de um total de
1.700 casos, perfazendo 26% de mortalidade. Dados apresentados pelo
ICMSF (1998) citam que de março a dezembro de 1992, 279 casos da doença
foram registrados na França, proporcionando 63 mortes e 22 abortos. Dados
do CDC (Center for Diseases Control) revelam que no ano de 2000,
aproximadamente 2500 casos de listeriose foram registrados nos Estados
Unidos, estimando que 500 desses casos foram fatais.
10
2.6 Detecção
Os métodos de detecção de L. monocytogenes em alimentos utilizam,
como agentes de seletividade, principalmente sua capacidade de crescer em
baixas temperaturas e sua resistência a vários antibióticos. A técnica de
enriquecimento a frio em meios não seletivos ainda é considerada a mais
segura para o sucesso das análises, porém em função do longo tempo de
análise requerido, tem sido substituída pelo enriquecimento em meios
seletivos. Esses meios geralmente são caldos nutritivos suplementados com
vários agentes antimicrobianos, sendo mais utilizados o ácido nalidíxico, a
acriflavina e a cicloeximida (Silva et al., 1997).
Os protocolos de dois métodos, o do FDA (Food and Drug
Administration) (Hitchins, 1998) e o do USDA – FSIS (Johnson, 1998), são os
mais comumente usados nos Estados Unidos para pesquisa de L.
monocytogenes. Muitos relatos encontrados comparam estes métodos,
demonstrando que cada um possui vantagens e desvantagens quando
utilizados para isolamento desse microrganismo em um determinado tipo de
alimento (Donnely, 1999).
Segundo Norton (2002), o método do FDA é mais eficiente para
isolamento do patógeno quando baixas populações de Listeria spp. estão
presentes, como ocorre quando células do microrganismo foram submetidas a
diferentes injúrias. Já o método USDA-FSIS, que usa duas etapas de
enriquecimento, possui alta sensibilidade para as amostras com elevada
microbiota acompanhante.
Em geral, o método do FDA tem sido adotado para produtos lácteos e o
método USA para produtos cárneos (Warburton et al., 1992)
2.7 Utilização de biologia molecular para subtipificação de L.
monocytogenes
Avanços nos estudos de biologia molecular propiciaram o
desenvolvimento e emprego de vários métodos de tipificação molecular,
seguros para rastear a origem da contaminação microbiana em plantas de
11
processamento de alimentos. Dentre estes métodos, análises de DNA
genômico baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR – “Polymerase
Chain Reaction”) têm demonstrado ser rápidas, sensíveis e seguras para
determinar relações entre organismos patogênicos.
PCR é uma técnica que permite amplificação in vitro de segmentos de
DNA, usando dois primers que hibridizam com as fitas opostas, em regiões que
flanqueiam o segmento a ser amplificado (Zaha, 2001). A reação de PCR
baseia-se no anelamento e extensão enzimática de um par de
oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA fita simples) utilizando
iniciadores (primers) que delimitam a seqüência de DNA de fita dupla alvo da
amplificação. Estes primers são sintetizados artificialmente, de maneira que
suas seqüências de nucleotídeos sejam complementares a seqüências
específicas que flanqueiam a região alvo (Ferreira & Grattapagia, 1998).
Um ciclo de PCR envolve três etapas: desnaturação, anelamento e
extensão. A fita dupla do DNA alvo é desnaturada através da elevação da
temperatura para 92/95ºC. Na etapa de anelamento, a temperatura é
rapidamente reduzida a temperaturas entre 35ºC e 60ºC, dependendo
essencialmente do tamanho e seqüência do primer utilizado, permitindo a
hibridização DNA-DNA de cada primer com as seqüências complementares.
Em seguida, a temperatura é elevada para 72ºC para que a enzima TaqDNA
polimerase realize a extensão a partir de cada terminal 3’ dos primers. Essa
extensão envolve a adição de nucleotídeos utilizando como molde a seqüência
alvo, de maneira que uma cópia dessa seqüência é feita no processo. Esse
ciclo é repetido por algumas dezenas de vezes. Uma vez que a quantidade de
DNA da seqüência alvo dobra a cada ciclo, a ampliação segue uma progressão
geométrica de maneira que, depois de apenas 20 ciclos, é produzido mais de
um milhão de vezes a quantidade inicial da seqüência alvo. Essa escala de
amplificação permite, portanto, iniciar com quantidades mínimas de DNA (da
ordem de alguns picogramas ou nanogramas) e terminar a reação com
grandes quantidades de DNA de uma seqüência específica de interesse
(Ferreira & Grattapagia, 1998).
A técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) é uma
variação do protocolo de PCR tradicional, onde se utiliza um único primer, com
aproximadamente dez pares de bases, apresentando seqüência de
12
nucleotídeos arbitrária (Williams et al., 1990). Quando submetidos a PCR,
estes iniciadores arbitrários irão resultar na ampliação de uma ou mais
seqüências de DNA, gerando conjuntos de fragmentos que funcionam como
marcadores genéticos. O número e o tamanho destes fragmentos são à base
da tipificação de uma linhagem bacteriana.
A natureza molecular do polimorfismo RAPD não é inteiramente
conhecida. Sabe-se, porém, que a reação RAPD favorece a ampliação de
segmentos onde a complementariedade entre o primer e o sítio de iniciação no
DNA–molde é mais alta. A possibilidade de detectar polimorfismo do DNA sem
necessidade do conhecimento prévio da seqüência alvo é a principal vantagem
dessa técnica em relação a técnica original de PCR (Ferreira & Grattapagia,
1998).
RAPD tem sido utilizado para avaliação dos pontos críticos de
contaminação por Listeria em plantas de processamento de alimentos
(Lawrence & Gilmour, 1994; Destro, 1996; Wagner et al, 1996; Angrigheto,
2000; Aguado et al., 2001; Vogel et al., 2001; Aguado et al., 2004), e para a
tipificação de linhagens de várias espécies bacterianas, entre elas L.
monocytogenes (Farber & Addison, 1994; Kerr et al., 1995, Byun et al., 2001;
Martinez et al., 2002; Lima, 2004), mostrando ser uma técnica de excelente
reprodutibilidade e poder discriminatório.
Os primeiros trabalhos utilizando RAPD para tipificação de L.
monocytogenes começaram a ser publicados em 1992, quando Mazurier &
Wernars (1992) utilizaram RAPD na tipificação de 60 linhagens de Listeria de
diversos biotipos e sorotipos. O emprego desta técnica possibilitou a
diferenciação entre linhagens de espécies diferentes e também entre linhagens
de uma mesma espécie ou sorotipo.
Lawrence & Gilmour (1994) utilizaram RAPD e Eletroforese de Enzima
Multilocus (MEE) para determinar as fontes de contaminação por L.
monocytogenes em uma planta de processamento de aves e derivados, na
Irlanda do Norte. Esses autores verificaram a presença de um genótipo
endêmico aquela planta de processamento, o qual estava presente desde o
ambiente onde as aves vivas eram recebidas, até o ambiente do produto
cozido, indicando uma contaminação contínua do ambiente e dos
13
equipamentos. Linhagens desse genótipo foram também isoladas da matéria-
prima, mas não do produto final logo após a cocção.
O uso de técnicas moleculares tem aumentando, em especial o RAPD, por
ser simples, rápida e de baixo custo, permitindo a investigação da origem da
contaminação de um alimento, enquanto técnicas tradicionais de cultivo
permitem, no máximo, condenar um alimento contaminado com L.
monocytogenes. Somente entendendo como essa contaminação ocorre, é
possível estabelecer estratégias para diminuir ou eliminar os pontos ou rotas de
contaminação e fornecer um alimento seguro ao consumidor.
Lima (2004), por exemplo, utilizaram RAPD para avaliar a disseminação de
L. monocytogenes em uma planta de processamento de Lingüiça mista frescal,
descrevendo que a técnica apresentou reprodutibilidade e poder discriminatório
elevado, tendo sido capaz de identificar linhagens persistentes na linha de
processamento.
2.8 Sorotipificação
A sorotipificação tem sido uma ferramenta clássica para estudos
epidemiológicos e de casos esporádicos de listeriose (Ryser & Marth, 1999).
Apesar de não ser necessária para confirmação de L. monocytogenes, é muito
empregada para determinar a prevalência de sorotipos específicos em estudos
epidemiológicos, bem como para avaliar a rota de contaminação ambiental
(Bennett & Weaver, 2001).
L. monocytogenes pode ser dividida em subtipos por vários métodos, sendo
o mais comum, aquele baseado no reconhecimento de antígenos de superfície
(somático e flagelar) por anticorpos específicos (Franco, Landgraf, 1996.) São
conhecidos 13 sorotipos, mas somente três (4b, 1/2a e 1/2b) são responsáveis
por 89 a 96% dos casos de listeriose humana (ICMSF, 1996; Swaminathan,
2001; Tompkim, 2002), com predomínio do sorotipo 4b nos casos de doença
(Zheng & Kathariou, 1995; Louie et al., 1996). Esse sorotipo (4b) é responsável
por 33 a 50% de casos esporádicos em humanos (Swaminathan, 2001).
O antígeno flagelar, assim como o antígeno somático deve ser
identificado para linhagens dos sorotipos 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b e 3c, pois os
demais sorotipos têm o mesmo antígeno flagelar (A, B e C). Os sorotipos c,
14
1/2b, 1/2c, 3a, 3b e 3c podem ser identificados com 2 antisoros O (1 com
anticorpos para o fator I e, o outro, com anticorpos para ambos os fatores, I e
II) e 3 antisoros H (1 com anticorpo para os fatores A e B, 1 reagindo com C e 1
reagindo com D). O antisoro O para os fatores V e VI, VII e IX, VIII, X, XI e XV,
permite que as linhagens dos sorotipos 4a, 4b, 4c, 4d, 5, 6a, e 6b possam ser
tipificadas (Ryser & Marth, 1999).
L. monocytogenes sorotipo 4b foi responsável por 60% dos casos de
listeriose humana reportados no Japão, enquanto que as do sorotipo 1/2b
foram responsáveis por cerca de 30% (Nakama et al.1998), predominância
similar a relatada em outros países (Mc Lauchlin, 1991, Faber & Peterkin,
1991). Entretanto, o número de casos por linhagens do sorogrupo 1/2 tem
aumentado nos últimos anos ( Loncarevic et al.,1998).
A sorotipificação é apropriada para separar um grande número de
linhagens, porém, apresenta baixo poder discriminatório e, embora as
linhagens envolvidas em surtos e casos esporádicos de listeriose normalmente
pertençam aos mesmos sorotipos, uma tipificação com técnicas que
apresentem maior poder discriminatório ainda se faz necessária. A
reprodutibilidade da sorologia é boa para os sorotipos 1/2a e 4b, mas o mesmo
não pode ser dito para os demais sorotipos (Unnerstad et al., 1999).
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Descrição do estabelecimento estudado
O presente trabalho foi realizado em um matadouro-frigorífico de suínos,
inspecionado pelo Serviço de Inspeção Federal (SIF), situado na Região das
Missões, no Rio Grande do Sul. O estabelecimento abate 21.000 suínos/mês e
industrializa cerca de 1.100 T/mês de produtos. A comercialização de seus
produtos ocorre no mercado interno e externo, mantendo negócios com os
países da Argentina, Uruguai, Albânia, Lituânia, Hong Kong e Rússia, sendo o
principal produto de exportação, a carne suína in natura.
3.2 Amostragem
As amostragens foram mensais, durante 5 meses consecutivos, entre os
meses de novembro de 2003 e março de 2004, seguindo método preconizado
pela APHA (2001). Os pontos de amostragem foram: água, câmaras frias,
carcaças, facas, fezes, mãos dos operadores e ralos, perfazendo 105
amostras. O material foi coletado durante o processo de abate, acondicionado
em caixas isotérmicas contendo gelo, e transportado ao laboratório de
16
Microbiologia de Alimentos da UNIJUÍ – Universidade Regional do Noroeste do
Estado do RS, onde foi imediatamente analisado.
3.2.1 Amostras de água
Foram coletadas diretamente da torneira, na qual se realizou
primeiramente a limpeza com álcool 70%, seguida de flambagem do bocal da
torneira e, após 3 minutos de escoamento da água, efetuou-se a coleta em
saco estéril específico para coleta de água, sem a presença de tiosulfato de
sódio. A amostra era imediatamente armazenada em caixa isotérmica contendo
gelo e encaminhada ao laboratório para realização das análises
microbiológicas.
3.2.2 Avaliação das câmaras frias
As câmaras frias foram amostradas através de swabs de algodão
estéreis, umedecidos em caldo de Enriquecimento para Listeria formulação
UVM (Oxoid
), utilizando-se de moldes estéreis de aço inoxidável de 25cm
2
,
em 5 pontos diferentes do piso e parede da câmara fria. Após a coleta, os 5
swabs foram colocados em um mesmo frasco contendo 25mL de caldo UVM,
formando uma amostra composta. As amostras foram identificadas e
armazenadas em caixas isotérmicas contendo gelo e transportadas até o
laboratório para efetuar análise.
3.2.3 Amostras superficiais das carcaças
Cada carcaça foi amostrada em 5 pontos, através de swabs de algodão
estéreis, umedecidos em caldo UVM, utilizando-se moldes estéreis de aço
inoxidável com área de 25cm
2
, totalizando uma área amostral de 125 cm
2
.
Após a coleta, os 5 swabs foram colocados em um mesmo frasco contendo
25mL de caldo UVM, formando uma amostra composta. As amostras foram
17
identificadas, armazenadas em caixas isotérmicas contendo gelo, e
transportadas até o laboratório para efetuar análise.
3.2.4 Avaliação das facas
As facas foram amostradas em conjunto, onde cada amostra constava
de três unidades amostrais, através de swabs estéreis, que foram umedecidos
em caldo UVM e, logo após, aplicados em toda a superfície da lâmina, de uma
extremidade a outra, mudando de direção entre um movimento e outro. Logo
após a coleta, os três swabs foram colocados em um mesmo frasco contendo
9mL de caldo UVM, identificadas, armazenadas em caixas isotérmicas
contendo gelo, e transportadas até o laboratório para efetuar análise.
.
3.2.5 Amostras de conteúdo cecal (fezes)
Foram coletadas, aproximadamente, 50g de fezes de cada animal. A
coleta foi realizada após a evisceração, através de incisão na porção cecal do
intestino, utilizando-se bisturi devidamente esterilizado e, em seguida, as fezes
foram coletadas em saco estéril, o qual foi mantido em caixa isotérmica
contendo gelo até o momento da análise.
3.2.6 Avaliação das mãos dos operadores
As mãos dos operadores foram amostradas através de swabs estéreis,
umedecidos em caldo UVM, os quais foram aplicados em toda a superfície da
mão, de uma extremidade a outra. A amostragem foi realizada de forma
composta, onde cada amostra representava 3 unidades amostrais. Logo após a
coleta, os swabs foram colocados em frasco contendo 9mL de caldo UVM,
identificados, armazenadas em caixas isotérmicas contendo gelo, e
transportadas até o laboratório para efetuar análise.
18
3.2.7 Avaliação dos ralos
Os ralos foram amostrados através de swabs estéreis, os quais foram
umedecidos em caldo UVM e aplicados nas extremidades e no interior do ralo.
Em seguida, os swabs foram colocados em frasco contendo 9 mL de caldo
UVM, identificadas, armazenadas em caixas isotérmicas contendo gelo, e
transportadas até o laboratório para efetuar análise.
3.3 Isolamento e identificação de Listeria spp.
O isolamento e a identificação em nível de espécie foram realizados
segundo método proposto pelo Ministério da Agricultura do Brasil (Portaria nº
26, de 05 de abril de 1999), descrito brevemente a seguir:
3.3.1 Enriquecimento seletivo
As amostras coletadas com swabs foram inoculadas e transportadas em
Caldo UVM, sendo incubadas ao chegarem ao laboratório. Com relação às
amostras de água, uma alíquota de 10mL foi transferida para 90mL de Caldo
de Enriquecimento para Listeria UVM. Das amostras de fezes dos animais
pesou-se 10g e adicionou-se 90mL de Caldo UVM.
Todas as amostras foram incubadas a 30ºC por 24 horas.
3.3.2 Enriquecimento secundário
Após o período de 24 horas de incubação em caldo UVM, transferiu-se
0,1mL de cada um dos tubos de ensaio contendo caldos de pré-
enriquecimento, para tubos contendo 10mL de Caldo Fraser (Oxoid
),
acrescentado de suplemento SR 156E (Oxoid
), os quais foram incubados a
35ºC por 24-48 horas.
19
3.3.3 Isolamento
Após a incubação por 24-48 horas em Caldo Fraser (Oxoid
), as
amostras foram semeadas em ágar Oxford (Oxoid
) adicionado de suplemento
SR140E (Oxoid
) e em ágar Palcam (Oxoid
) acrescentado de suplemento
SR150E (Oxoid
), a fim de obter o isolamento de colônias típicas de Listeria
spp.
3.3.4 Seleção e purificação das colônias suspeitas de Listeria spp
Foram selecionadas 3 a 5 colônias de cada um dos meios seletivos, com
características típicas de Listeria spp., ou seja, colônias negras contendo halo
negro com centro côncavo.
As colônias escolhidas foram semeadas em tubos de ensaio contendo
Ágar Soja Triptona (MercK
) enriquecido com 0,6% de extrato de levedura
(MercK
) (TSA-YE) e incubadas a 35ºC por 24 horas. Após o período de
incubação, as colônias isoladas foram submetidas a identificação através de
testes bioquímicos.
3.3.5 Identificação bioquímica de Listeria spp.
Para identificação em nível de espécie, seguiu-se o protocolo
preconizado pelo Ministério da Agricultura do Brasil (Portaria nº 26, de 05 de
abril de 1999), utilizando-se os testes de catalase, motilidade a 25ºC, ß–
hemólise em Ágar sangue de cavalo e fermentação de carboidratos (dextrose,
ramnose, xilose e manitol). As reações típicas das diversas espécies de Listeria
estão representadas na Tabela 1.
Para o teste da catalase foi preparada uma suspensão bacteriana em
uma lâmina de microscopia, previamente desengordurada com etanol
comercial, a partir de cultivo recente em TSA-YE e uma alçada de solução
20
salina 0,85% esterilizada. À suspensão foi adicionada uma gota de água
oxigenada a 3%, verificando-se, por até 2 minutos, o surgimento ou não de
bolhas de oxigênio, como conseqüência da presença ou não da enzima.
Os isolados a serem testados foram inoculados em tubos contendo 4mL
de Motility Test Medium (Difco
), com o auxílio de agulha de inoculação. Após,
os tubos foram incubados a 25ºC, por um período de até 7 dias, com
observações diárias, a fim de constatar a presença da motilidade típica de
Listeria spp., ou seja, aspecto de guarda-chuva no terço superior do ágar,
indicando a característica de microaerofilia.
TABELA 1- Características fenotípicas empregadas para diferenciação de
Listeria spp
L.
monocytogenes
L.
seeligeri
L.
ivanovii
L.
innocua
L.
welshimeri
L.
grayi
Catalase
+ + + + + +
Motilidade tipo
guarda-chuva
+ + + + + +
B -hemólise
+ + + - - -
Fermentação
de:
Dextrose
+ + + + + +
Manitol
- - - - - -
Xilose
- + + - + -
Ramnose
+ - - V V -
(Adaptado de Holt et al., 1994) V = Variável , + = Positivo, - = Negativo
O teste da ß-hemólise foi realizado em placas de petri contendo ágar
Sangue de Cavalo (TSA-Sangue), demarcadas em sua porção inferior de modo
a identificar 20 espaços, onde cada um recebeu uma picada do respectivo
isolado a ser testado. Após inoculação, as placas foram invertidas e incubadas
a 35ºC por até 48 horas, sendo, então, examinadas de forma a identificar
zonas de clareamento ao redor do crescimento (hemólise), provocadas pela
produção de ß-hemolisina.
Para o teste de fermentação de açúcares utilizaram-se placas de petri
contendo ágar Púrpura de Bromocresol (Oxoid
), acrescido dos respectivos
21
açúcares dextrose (Reagen
), ramnose (Reagen
), xilose (Reagen
), ou
manitol (Reagen
), com concentração final de 1%. Essas placas foram
demarcadas em sua porção inferior, identificando 12 espaços e, em cada
espaço, foram inoculadas, por picada, as culturas a serem testadas. Após
inoculação, as placas foram incubadas invertidas por 24 horas a 35ºC. O
surgimento de halo amarelo ao redor da picada, após a incubação, indicava
resultado positivo, ou seja, o microrganismo foi capaz de produzir ácido a partir
do substrato (açúcar) fornecido.
3.4 Sorotipificação das linhagens de Listeria spp.
Todas as linhagens identificadas como Listeria spp. foram cultivadas em
tubos contendo TSA-YE, incubadas a 37ºC por 24 horas, e enviadas ao
Laboratório de Zoonoses Bacterianas do Departamento de Bacteriologia do
Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), no RJ, onde foram submetidas a
sorotipificação.
3.5 Análise do polimorfismo do DNA por amplificação aleatória (RAPD)
3.5.1 Preparo das células
As linhagens de L. monocytogenes e L. inoccua spp. foram semeadas
em Caldo Triptona de Soja (MercK) com 0,6% de Extrato de Levedura (TSB-
YE) e incubadas a 35ºC por 18 horas, sob agitação. Após, foram centrifugadas
a 4000 g por 15 minutos, e as células foram suspensas em 1mL de solução
salina 0,85%, sendo transferidas para tubos tipo Eppendorf estéreis. Essa
suspensão de células foi centrifugada a 16.250 g por 5 minutos (Centrífuga
Jouan
®
), o sobrenadante foi removido, e o precipitado suspenso em 500µL de
água destilada estéril. As suspensões foram diluídas com água destilada estéril
até densidade ótica 1,8 a 600nm (A
600
) (Espectrofotômetro UV/visível Ultrospec
2000, Pharmacia
®
). Essa suspensão, contendo aproximadamente 10
7
células
por µL, foi usada na reação de amplificação.
22
3.5.2 RAPD
Para a amplificação do DNA cromossomal foi utilizada a técnica de RAPD,
conforme protocolo proposto por Destro (1996) e adaptado por Lima (2004),
utilizando-se dois primers, separadamente: UBC155 e UBC127 (Invitrogen
TM
).
A amplificação foi realizada em uma solução com volume final de 25µL
contendo 20mM Tris HCl (pH 8,4), 50mM KCl, 25mM MgCl2, 2,5mM de dNTPs,
1,5µM do primer (UBC155 e UBC127), 3µL da suspensão de células e 1,5U de
Taq DNA Polimerase (Invitrogen
TM
).
A mistura foi termociclada (Termociclador PTC-100, MJ Research
®
) nas
seguintes condições: 1 ciclo de 92ºC por 5 min; 35 ciclos de 92ºC por 1 min,
35ºC por 1 min e 72ºC por 2 min. Após, 1 ciclo de 72ºC por 10 min. As
amostras foram, então, mantidas a 4ºC até o momento da eletroforese. O
produto de cada reação foi analisado em gel de agarose (Backer Analyzed)
1,5% e comparado com padrão de peso molecular Ladder 100 pb (Gibco
BRL
®
).
Após a corrida, os géis foram fotografados sob transiluminação em luz
ultravioleta (TFX 35M, Life Technologies, Gibco BRL
®
). Os padrões de bandas
originados foram comparados e as linhagens agrupadas. A seqüência dos
primers utilizados foi:
primer UBC 155: 5’ – CTG GCG GCT G – 3’
primer UBC 127: 5’ – ATC TGG CAG C – 3’
3.6 Análise dos Resultados
Os padrões de bandas gerados com cada primer foram comparados
visualmente e as linhagens agrupadas conforme seus perfis genéticos.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Ocorrência de Listeria spp.
De um total de 105 amostras analisadas, 20 (19,4%) apresentaram
contaminação por Listeria spp. L. innocua foi isolada em 19 (18,1%) das 105
amostras analisadas, enquanto L. monocytogenes foi encontrada em apenas
uma delas (0,95%), como pode ser visualizado na Tabela 2.
Tabela 2 – Ocorrência de Listeria monocytogenes e Listeria innocua em 105
amostras obtidas de um matadouro-frigorífico de suínos, localizado na Região
das Missões-RS
Espécie Nº de amostras positivas (%)
L. monocytogenes 1 (0,95%)
L. innocua 19 (18,1%)
Através da Tabela 2 observa-se que L. innocua foi a espécie prevalente
encontrada neste estudo, seguida por L. monocytogenes, semelhantemente ao
descrito por outros autores, tanto em amostras ambientais quanto em
alimentos, que também encontraram ocorrência de L. inoccua superior a das
outras espécies (Barbalho et al. 2005.; Aguado et al., 2005; Dhanashree et al.,
2003).
24
Sammarco et al. (1997) também pesquisaram a ocorrência de Listeria
spp. dentro do ambiente de abatedouros de suínos, na Itália, porém
encontraram 1,4% de L. innocua e 1,4% de L. monocytogenes dentre as 219
amostras analisadas. Van Den Elzen & Snijders (1993), na Holanda, avaliaram
três abatedouros de suínos, um de bovino e uma unidade de distribuição de
carnes, investigando os pontos críticos de controle para L. monocytogenes. De
um total de 343 amostras provenientes de ambiente, utensílios, equipamentos
e de mãos de operadores, 39 (11,4%) amostras foram positivas para L.
monocytogenes.
Pela Tabela 3 pode-se verificar que L. innocua foi isolada das câmaras
frias, facas, fezes dos animais, mãos de operadores e ralos, enquanto L.
monocytogenes só foi isolada a partir de uma amostra de ralo.
Tabela 3 – Freqüência de Listeria innocua e Listeria monocytogenes no
ambiente, utensílios, manipuladores e em carcaças, em um matadouro-
frigorífico de suínos da região das Missões-RS
Amostras
Nº de
amostras
analisadas
Nº (%) de
amostras
positivas para
L. innocua
Nº (%) de amostras
positivas para
L. monocytogenes
Água 15 0 (-) 0 (-)
Câmara fria 15 8 (53,3%) 0 (-)
Carcaça 15 0 (-) 0 (-)
Faca 15 4 (20%) 0 (-)
Fezes 15 2 (13,3%) 0 (-)
Mãos 15 3 (15%) 0 (-)
Ralos 15 2 (13,3%) 1 (6,6%)
TOTAL
105 19 1
Listeria innocua e Listeria monocytogenes não foram isoladas da água
utilizada para o abastecimento do matadouro-frigorífico, a qual era proveniente
de poços artesianos, mas recebia tratamento prévio com cloro livre (1,0ppm)
antes de entrar na rede de água de abastecimento da indústria. Resultado
semelhante também foi encontrado por Barbalho et. al. (2005), os quais não
isolaram Listeria spp. nas amostras de água do pré-chilling e do chilling em
plantas de abates de aves, com concentração de 102 e 156ppm de cloro,
respectivamente. Por outro lado, Genigeorgis et
al. (1989) isolaram L.
25
monocytogenes em 12,5% das amostras de água, com uma concentração de
20 a 25ppm de cloro. A utilização de 1,0ppm de cloro livre pode explicar a
ausência de Listeria spp. nas amostras analisadas neste trabalho, embora não
se possa descartar a ausência do microrganismo no poço de origem (CDC,
2005)
Dentre as 15 amostras das facas, 4 (20%) apresentaram Listeria spp. A
existência de utensílios contaminados por Listeria spp. é uma indicação de
limpeza e sanificação inadequadas, além de poderem ser responsáveis pela
contaminação cruzada, bem como pela manutenção de Listeria spp. em
plantas de processamento de alimentos (Unnerstad, et al.1996; Miettinem et.
al., 1999a). No frigorífico investigado, as facas eram sanificadas em água a
85°C durante a operação de abate, temperatura suficiente para inativar células
de Listeria spp. (Jay, 2005), contudo, foram coletadas de instrumentos em uso,
sugerindo uma contaminação das carcaças antes da higienização final com
água clorada.
No entanto, L. innocua e L. monocytogenes não foram isoladas nas 15
amostras de carcaças suínas analisadas (Tabela 3). Já Kanuganti (2002) e
Antoniollo (2001) isolaram L. monocytogenes em 4% e 4,3% das amostras de
carcaças suínas e ovinas, respectivamente. Embora não tenha sido isolada
Listeria spp. nas carcaças, deve-se considerar que as amostragens foram
efetuadas logo após a desinfecção com água clorada (1ppm) e
armazenamento em câmara fria, os quais foram realizados sempre em um
tempo não superior a 2 horas após o abate. Nesse sentido, Saide-Albornoz et
al. (1995) afirmam que produtos nos quais inicialmente havia níveis não
detectáveis de L. monocytogenes, podem apresentar resultado positivo após
serem submetidos a um período de conservação sob refrigeração.
Confirmando essa informação, Antoniollo (2001) obteve um aumento da taxa
de detecção de Listeria spp., da ordem de 6,98%, nas carcaças submetidas a
uma temperatura de refrigeração m torno de 0°C por 24 horas.
Os locais que apresentaram maior contaminação por Listeria spp. foram
as câmaras frias, sendo que das 15 amostras analisadas, oito (53,3%) estavam
contaminadas, como pode ser observado através da Tabela 3. Tal fato pode
ser explicado pela menor freqüência de higienização desses locais, quando
comparados com os demais pontos do abatedouro, bem como pela
26
temperatura dessas câmaras frias, as quais eram mantidas em temperaturas
em torno de 2ºC.
Não existem dados disponíveis a cerca do isolamento de Listeria em
câmaras frias de indústrias de alimentos. Entretanto, por seu caráter
psicrotrófico, esse microrganismo, uma vez presente nesse ambiente, poderá
ter seu crescimento facilitado, como tem sido relatado em estudos realizados
em refrigeradores domésticos. Azevedo et al. (2005), em Portugal, avaliaram
Listeria spp. em refrigeradores domésticos, os quais eram mantidos em
temperaturas entre 2 e 12ºC. De um total de 86 refrigeradores amostrados, três
apresentaram contaminação por L. monocytogenes, quatro por L. grayi, e um
por L. innocua. No entanto, Jackson et al. (1993), nos EUA, não isolaram L.
monocytogenes nas 195 amostras de refrigeradores analisadas.
Nesta pesquisa, 13,3% das 15 amostras de fezes dos suínos analisados
apresentaram L. innocua (Tabela 3). Já Fenlon et al. (1996) não detectaram
Listeria spp. em amostras de fezes de suínos e frangos, e sugeriram que a
presença desse microrganismo deve estar relacionada com a dieta, uma vez
que os animais alimentados com silagem, excretaram a bactéria, ao passo que
animais alimentados com pastagens ou com alimentação industrializada, não
excretaram Listeria spp. Cabe ressaltar que os suínos avaliados nesse
experimento foram alimentados, em todas as fases de seu crescimento,
exclusivamente com rações industrializadas. A presença de Listeria spp. nas
fezes dos animais é indicativa de que essa pode ser a fonte de contaminação
da linha de abate.
Quanto as mãos dos manipuladores analisados, três (15%) das 15
amostras coletadas apresentaram L. innocua. Os resultados obtidos por
Genigeorgis et al. (1990), avaliando plantas de processamento de alimentos
vistoriadas por inspeção federal, nos EUA, foram superiores aos encontrados
na presente pesquisa, tendo em vista que encontraram 10% de contaminação
por L. monocytogenes nesse tipo de amostra. Da mesma forma, Von Laer
(2004) encontrou 20% de L. monocytogenes em mãos de manipuladores em
planta processamento de lingüiça mista frescal, no Brasil. Assim como com os
utensílios, a presença de Listeria spp. nas mãos de manipuladores de
alimentos demonstra inadequação dos procedimentos de lavagem e
sanificação, bem como podem ser fontes de contaminação cruzada.
27
Quanto aos ralos analisados, seis (40%) de 15 amostras apresentaram
Listeria spp, sendo que em um deles foi encontrado L. monocytogenes. Essas
altas porcentagens já eram esperadas, uma vez que toda a água utilizada após
higienização passa por esses ralos.
A contaminação em plantas de processamentos de alimentos por outras
espécies de Listeria que não L. monocytogenes indica que, mesmo que a
amostra não apresente o patógeno, possui características que propiciam o seu
desenvolvimento, uma vez que todas as espécies de Listeria apresentam alta
homologia entre os genomas (o que as torna muito semelhantes
fenotipicamente), além de apresentarem a mesma ecologia (Ryser & Marth,
1999). Dessa forma, a presença de L. innocua em um ambiente é indicativa de
maior probabilidade da ocorrência de L. monocytogenes (Antoniollo, 2001),
portanto, o resultado observado no presente estudo, permite inferir que não se
pode descartar a presença das outras espécies de Listeria na indústria
avaliada.
O isolamento de L. monocytogenes na amostra proveniente dos ralos,
demonstra a presença desse microrganismo no ambiente do frigorífico
abatedouro e que, provavelmente, foi carreado para o ralo através das
operações de limpeza. Dessa forma, mesmo que não tenha sido isolada nos
outros pontos amostrados, a bactéria pode estar presente em demais locais do
abatedouro. Resultado semelhante foi encontrado por Autio et. al. (2000), ao
analisarem plantas de abate de suínos, os quais isolaram L. monocytogenes
em 10% dos drenos amostrados. Já Lima (2004) e Von Laer (2004), não
isolaram esse microrganismo em amostras provenientes de drenos e ralos.
4.2 Sorotipificação de Listeria spp.
Após o isolamento, as 19 linhagens de L. innocua e uma linhagem de L.
monocytogenes obtidas foram submetidas a sorotipificação, das quais, 52,63%
(10) das linhagens de L.innocua não puderam ser identificadas
sorologicamente (NT), 31,58% (6) pertenciam ao sorotipo 6a, 15,79% (3)
pertenciam ao sorotipo 6b e a linhagem de L. monocytogenes pertencia ao
28
sorotipo 4b. A distribuição dos resultados obtidos na sorotipificação das
amostras analisadas, pode ser observada na Tabela 4.
Tabela 4 – Freqüência, número, percentagem e sorologia de Listeria innocua e
Listeria monocytogenes. coletadas em um matadouro-frigorífico de suínos na
região das Missões-RS
Amostras (n
0
)
L. innocua
número/percentagem
(sorotipo)
L. monocytogenes
número/percentagem
(sorotipo)
Água (15)
0/0,0
0/0,0
Câmara fria (15)
3/20 (6a)
3/20 (NT)
2/13,3 (6b)
0/0,0
Carcaça
0/0,0
0/0,0
Facas (15)
4/26,6 (NT)
0/0,0
Fezes (15)
2/13,3 (6a)
0/0,0
Mãos (15)
2 /13,3 (NT)
1/6,7 (6b)
0/0,0
Ralos (15)
1/6,7 (NT)
1/6,7 (6a)
1/6,7 (4b)
NT: não tipificadas sorologicamente
Uma única linhagem de L. monocytogenes foi isolada neste estudo,
sendo esta oriunda de uma amostra de ralo, amostrado na terceira coleta, e
pertencente ao sorovar 4b. A presença de L. monocytogenes do sorotipo 4b
deve ser encarada com preocupação, pois este tem sido envolvido não
somente em infecções esporádicas, mas também em diversos surtos (Tran &
Kathariou, 2002). Os maiores surtos registrados ocorreram na Escócia (salada
de repolho cru), Califórnia (queijo Jalisco), Suíça (Queijo Vacherin Mont d’Or),
29
França (geléia de língua de porco) e Estados Unidos (cachorro-quente)
(Anonymous, 1999) e foram provocados por esse sorotipo. Faber & Perterkin
(1991), estudaram 2344 casos de listeriose humana, em 11 países, e relataram
que 67,8% destes casos foram causados por L. monocytogenes do sorogrupo
4.
Diversos autores, no Brasil e no exterior, têm divulgado resultados sobre
os principais sorotipo/sorogrupos de L. monocytogenes presentes em alimentos
e/ou plantas de processamento de alimentos. No Brasil, merecem destaque os
estudos de Hofer, Ribeiro e Feitosa (2000), que investigaram os principais
sorotipos de Listeria spp. isolados de várias fontes, entre 1971 e 1997, e
demonstraram a presença e a prevalência dos sorotipos 4b, 1/2a e 1/2b de L.
monocytogenes em produtos cárneos. Já Antoniollo (2001), Lima (2004) e Von
Laer (2004), avaliaram os principais sorotipos de L. monocytogenes presentes
em plantas de processamento de alimentos, em Pelotas, RS, encontrando 1c,
4b, 1b, como os prevalentes.
A presença de linhagens de L. innocua, pertencentes ao sorotipo 6a em
31,58% das amostras analisadas (Tabela 4), é um resultado preocupante, pois
Perrin et al. (2003) relatam o caso de uma senhora de 62 anos, internada em
um hospital da França com bacteremia bastante avançada, e que veio a falecer
40 horas após a internação. Foi realizada uma cultura a partir de seu sangue
onde foi isolado um microrganismo que, a princípio, foi identificado como L.
monocytogenes. Devido a severidade do caso, a linhagem foi enviada ao
Instituto Pasteur (referência para L. monocytogenes) para identificação e
sorotipificação, sendo identificada, surpreendentemente, como L. innocua
sorovar 6a.
4.3 Caracterização molecular por RAPD das linhagens de L.
monocytogenes e L. innocua
As 19 linhagens de L. innocua e a linhagem de L. monocytogenes foram
submetidas a tipificação molecular através da análise do polimorfirmo do DNA
por amplificação aleatória (RAPD), com os primers UBC 155 e UBC 127. Esses
30
mesmos primers foram utilizados por Cabrita et al. (2004), Lima (2004) e
Farber & Addison (1994), para caracterização molecular de L. monocytogenes.
O primer UBC 155 permitiu a discriminação de L. inoccua e L.
monocytogenes em 12 perfis de DNA. Com esse primer, o maior número de
linhagens pertenceu aos perfis denominados arbitrariamente de 1 e 2, os quais
foram compostos por 6 (30%) e 3 (15%) linhagens (Tabela 5), respectivamente.
Na Figura 1, podem-se visualizar alguns perfis identificados pelo primer UBC
155, para as linhagens de L. innocua e L. monocytogenes.
M 01 10 02 03 04
FIGURA 1: Análise eletroforética em gel de agarose 1,5%: padrões de bandas
dos perfis RAPD sendo 01 Listeria monocytogenes e 10, 02, 03, 04, Listeria
innocua, obtidos com o primer UBC 155; (M) Marcador de peso molecular
Ladder 100pb
600pb
→
→→
→
31
M I B A E F
FIGURA 2: Análise eletroforética em gel de agarose 1,5% : padrões de bandas
dos perfis RAPD sendo I Listeria monocytogenes e B, A, E , F, Listeria innocua,
obtidos com o primer UBC 127; (M) Marcador de peso molecular Ladder 100pb
Com o primer UBC 127 foram identificados 12 perfis de DNA, com 1 a 5
bandas, para as linhagens de L. innocua e L. monocytogenes. O maior número
de linhagens pertenceu aos perfis denominados arbitrariamente de A e B,
compostos por 7 (35%) e 3 (15%), respectivamente. Na Figura 2, podem-se
visualizar alguns perfis, gerados com o primer UBC127.
Convencionou-se chamar de “perfis RAPD combinados” (Tabela 5),
aqueles padrões gerados pela combinação dos perfis de RAPD produzidos
individualmente com os primers UBC 155 e UBC 127. Dessa forma, as
linhagens de L. monocytogenes e L. innocua foram distribuídas em 15 perfis
RAPD combinados. Em cada um desses perfis foram alocados de 1 a 5
linhagens de L. monocytogenes e L. innocua. Os perfis compostos com
maiores números de linhagens foram o 1A e 2B, respectivamente (Tabela 6).
É importante frisar que com os primers utilizados (UBC 155 e UBC 127)
a linhagem de L. monocytogenes, apresentou perfil genético exclusivo.
600pb
→
→→
→
32
Tabela 5 – Perfis genéticos das linhagens de Listeria innocua e Listeria
monocytogenes isoladas em um matadouro-frigorífico de suínos, localizado na
região das Missões -RS
Origem
Número da
linhagem
Perfil simples
Primer 155 Primer 127
Perfil RAPD
combinado
Mãos 10 1 A 1A
Mãos 11 1 A 1A
Facas 12 1 A 1A
Facas 13 1 A 1A
Ralos 14 1 A 1A
Câmara Fria 15 1 L 1L
Câmara Fria 16 2 B 2B
Câmara Fria 17 2 B 2B
Ralos 18 2 H 2H
Câmara Fria 19 3 D 3D
Mãos 20 3 G 3G
Fezes 21 4 E 4E
Câmara Fria 22 5 C 5C
Câmara Fria 23 6 A 6A
Faca 24 7 A 7A
Fezes 25 8 F 8F
Câmara Fria 26 9 B 9B
Ralo 27 10 I 10I
Câmara Fria 28 11 M 11M
Faca 29 12 J 12J
Na Tabela 6 pode ser observado que o RAPD com o conjunto de primers
utilizado, permitiu a diferenciação entre as linhagens pertencentes a um mesmo
sorotipo.
33
Tabela 6 – Distribuição das 20 linhagens de Listeria monocytogenes e
Listeria innocua isoladas em uma linha de abate de um matadouro-frigorífico de
suínos, localizado na região das Missões – RS, avaliada por sorologia e RAPD
Perfil
combinado
Sorotipo Nº das linhagens
Total de linhagens
1ª NT 10;11;12;13;14 5
1L NT 15 1
2B 6a 16;17 2
2H 6a 18 1
3D 6b 19 1
3G 6b 20 1
4E 6a 21 1
5C NT 22 1
6A NT 23 1
7A NT 24 1
8F 6a 25 1
9B 6a 26 1
10I 4b 27 1
11M 6b 28 1
12J NT 29 1
NT: não tipificadas sorologicamente
Como exemplo, pode-se citar a linhagem de L. monocytogenes, sorotipo
4b, que apresentou um perfil único com cada um dos dois primers utilizados e
perfil combinado único, o qual foi identificado como 10I (Tabela 6). Com relação
a L. innocua, duas linhagens (14 e 18) que foram isoladas no mesmo local de
amostragem (ralo) e que foram classificadas, através da sorotipificação, como
não tipificável (NT) e 6a (Tabela 4), apresentaram dois perfis compostos
diferentes: 1A e 2H, respectivamente.
As linhagens de L. innocua isoladas das câmaras frias foram aquelas
que demonstraram a maior diversidade de sorotipos (Tabela 4), apresentando
3 (20%) do sorotipo 6a, 2 (13,3%) do 6b e 3 (20%) não tipificáveis (NT). Na
primeira coleta foram isoladas duas linhagens, as quais apresentaram perfis
combinados distintos (5C e 6A), como pode ser visualizado na Tabela 7. Essas
duas linhagens não foram tipificáveis (NT) através da sorologia. Na segunda
coleta foi isolada uma linhagem de L. innocua, pertencente ao sorotipo 6b, a
qual apresentou perfil composto único (3D). Na terceira coleta foi isolada uma
linhagem de L. innocua pertencente ao sorotipo 6a, a qual apresentou perfil
composto único: 9B. Na quarta coleta foram isoladas duas linhagens de L.
34
innocua, pertencentes ao sorotipo 6a, que apresentaram o mesmo perfil (2B).
Já na quinta coleta foram isoladas 2 linhagens, das quais uma não foi tipificável
(NT) através da sorologia e, a outra, classificada como 6b, as quais
apresentaram perfis compostos únicos e distintos (1L e 11M).
Somente na terceira e quarta coletas foram isoladas linhagens de L.
innocua nas facas amostradas. Na terceira coleta, as 2 linhagens isoladas não
foram passíveis de sorotipificação (NT), porém, apresentaram perfis genéticos
compostos distintos entre si (1A e 7A), conforme observado na Tabela 7. É
interessante frisar que linhagens pertencentes a esse mesmo perfil 1A, também
foram isoladas nas coletas 1 e 2 (Tabela 7) a partir de mãos de operadores, e
de ralos, sugerindo que essa linhagem persistiu no frigorífico estudado, o que
também foi observado por Lima (2004) e von Laer (2004), que avaliando a
disseminação de L. monocytogenes em linhas de processamento de alimentos,
verificaram que determinadas linhagens eram recorrentes ao longo do tempo
de amostragem, contribuindo para a contaminação cruzada do produto final.
Tabela 7 – Distribuição por amostra e por coleta dos perfis gerados por RAPD
de linhagens de L. monocytogenes e L. innocua coletadas em um matadouro-
frigorífico de suínos localizado na região das Missões – RS
Tipo de amostra
1
a
Coleta
2
a
Coleta
3
a
Coleta
4
a
Coleta
5
a
Coleta
Água - - - - -
Câmara fria 5C; 6A 3D 9B 2B 1L;11M
Carcaça - - - - -
Mãos 1A
a
3G - - -
Facas - - 1A
a
; 7A 12J -
Fezes 4E 8F - - -
Ralos - 1A
a
2H; 10I - -
- Listeria spp não detectada
a
indica que o grupo foi encontrado em outras coletas e/ou tipo de amostra
L. innocua do sorotipo 6a foi isolada nas amostras de fezes (Tabela 4).
Já nas amostras das mãos de manipuladores verificou-se a presença de três
linhagens desse microrganismo, sendo uma do sorotipo 6b e 2 não tipificáveis
(NT), semelhantemente ao reportado por Barbalho et al. (2004) os quais
observaram que L. innocua isoladas a partir de mãos e luvas de operadores em
35
plantas de processamento de frangos pertenciam aos sorotipos 6a, 6b,
enquanto algumas não foram tipificáveis (NT).
Através dos resultados encontrados nesta pesquisa, observa-se que o
matadouro-frigorífico avaliado, mesmo sendo fiscalizado pelo Serviço de
Inspeção Federal, tendo implantado Boas Práticas de Fabricação (BPF) e o
sistema de Análise de Perigo e Pontos Críticos de Controle (APPCC),
apresenta contaminação por L. monocytogenes e L. innocua, demonstrando a
persistência desses microrganismos no ambiente do frigorífico e a dificuldade
para sua eliminação.
5. CONCLUSÕES
Há Listeria monocytogenes e Listeria innocua no matadouro-frigorífico
de suínos avaliado.
A linhagem de L. monocytogenes pertence ao sorotipo 4b, denotando
preocupação com relação à saúde pública.
As amostras provenientes das câmaras frias apresentaram maior
número de linhagens de Listeria innocua e diversidade de sorotipos;
Os primers utilizados foram eficientes para caracterização molecular,
uma vez que L .monocytogenes apresentou perfil único, o qual foi diferente das
linhagens de L. innocua, que apresentou 12 perfis diferentes.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGUADO, V.; VITAS, A. I.; GARCÍA-JALON, I. Randomo Ampllified
Polymorphic DNA typing appied to study of cross-contamination by Listeria
monocytogenes in processed food products. Journal of Food Protection,
v.64, n.5, p.716-720, 2001.
AGUADO, V., VITAS, A. I.; GARCÍA-JALON, I. Caracterization of Listeria
monocytogenes and Listeria innocua from vegetable plant by RAPD and
REA. International Journal of Food Microbiology, v.90, p.341-347, 2005.
ANGRIGHETO, C. Disseminação de Listeria monocytogenes em uma linha
de produção de “nuggets” congelados de frango. São Paulo, 2000, 51f.
Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) – Programa de Pós-
Graduação em Ciência dos Alimentos, Universidade de São Paulo, 2000.
ANTONIOLLO, P. C. Listeria spp. em ovinos e carcaças ovinas em nível de
abatedouro. Pelotas, 2001. 83f. Dissertação (Mestrado em Ciência e
Tecnologia Agroindustrial) – Pós-graduação em Ciência e Tecnologia
Agroindustrial, Universidade Federal de Pelotas, 2001.
ANONYMOUS. Update: multistate outbreak of listeriosis – United States,
1998-1999. Morb. Mortal. Wkly. Rep.47: 1117-1118. 1999.
APHA. Compendium of Methods for Microbiological Examination of
Foods. 4
rd
ed. Washington D.C.: American Public Health Association, 2001.
AUTIO, T., SÄTERI, T., FREDRIKSSON-AHOMAA, M., RAHKIO, M., LUNDÉN,
J., KORKEALA, H. Listeria monocytogenes contamination pattern in pig
slaughterhouses. Journal Food Protection, v.63, n.10, p.1438-1442, 2000.
38
AUTIO, T., LUNDÉN, J., FREDRIKSSON-AHOMAA, M.; BJÖRKROTH, J.;
SJÖBERG, A.; KORKEALA, H. Similar Listeria monocytogenes pulsed-field
detected in several foods originationg from different sources. International
Journal of Food Microbiology, v.77, p.83-93, 2002.
AZEVEDO, I., REGALO, M., MENA, C., ALMEIDA, G., CARNEIRO, L.,
TEXEIRA, P., HOGG, T, GIBBS, P. A. Incidence of Listeria spp. in domestic
refrigeradors in Portugal. Food Control, v.16, p.121-124, 2005.
BARBALHO, T. C. F., ALMEIDA, P. F., ALMEIDA, R. C. C., HOFER, E.
Prevalence of Listeria spp. et a poultry processing plant in Brasil and a
phage test for rapid confirmation of suspect. Food Control, n.16, p.211-216,
2005.
BENNETT, R. W.; WEAVER, R. E. Serodiagnosis of Listeria monocytogenes.
In: Bacteriological Analytical Manual (BAM). Cap.11, 8
a
ed., 2001.
BEUCHAT, L.R. Listeria monocytogenes: incidence on vegetables. Food
Control,Letchworth, v.7, n.4/5, p.223-228, 1996.
BRASIL. Portaria nº 26 do Ministério da Agricultura, de 05 de abril de 1999.
Estabelece as metodologias para Pesquisa de.Listeria monocytogenes
Diário Oficial da União nº 89,12 de maio de 1999. Seção 1, p.71-74.
BRASIL. RDC nº 12 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, de 02 de
janeiro de 2001. Oficializa Regulamento Técnico sobre Padrões
Microbiológicos para Alimentos. http://www.anvisa.gov.br/legis/idex.htm.
Acesso: 03/05/2002.
BRASIL. Circular nº 354 do Ministério da Agricultura, pecuária e
Abastecimento, DIPOA. de 25 de julho de 2004. Assunto: Prevenção da
contaminação com Listeria monocytogenes em produtos de origem animal
prontos para consumo.
BYUN, S. K., JUNG, S.C., YOO,H. S. Random amplification of polymorphic
DNA typing of Listeria monocytogenes isolated from meat. International
Journal of Food Microbiology, v.69, p.227-235, 2001.
CABRITA, P., CORREIA, S., DIAS, S. F., BRITO, L. Genectic characterization
of Listeria monocytogenes food Isolates and pathogenic potencial within
serovars 1/2a and 1/2b. Sistem. Applied Microbiology, v.27, p.454-461,
2004.
CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). Multistate
outbreakof listeriosis – United States. Disponível em:
http://www.cdc.gov/od/oc/media/pressrel/r990114.htm. Acesso em: 17 mar.
1999.
CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). Preliminary
39
FoodNet Data on the incidence of infection with pathogens transmitted
commonly through food – selected sites – United States. Disponível em:
http://www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5316a2.htm. Acesso em:.
30/04/2004.
CENTER OF DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Division of bacterial
and mycotic diseases. Dispunível em:
http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/listeriosisg.htm. Acesso em
29/03/2004.
CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). Safe water
system (sws) - effect of chlorination on inactivanting selected
microorganisms.
http://www.cdc.gov/safewater/about_pages/chlorinationtab
le.ht m#chlorvirus . Acesso 10/08/2005.
COMI, G.; FRIGERIO, R.; CANTONI, C. Listeria monocytogenes serotypes in
Italy meat products. Letter Applied Microbiology, v.15, p.168-171, 1992.
DESTRO, M.T.; LEITÃO, M. F. F.; FARBER, J. M. Use of molecular typing
methods to trace the dissemination of Listeria monocytogenes in a shrimp
processing planta. Applied and Environmental Microbiology, v.62, n.2,
p.705-711, 1996.
DHANASHREE, B., OTTA, S. K.; KARUNASAGAR, I., GOEBEL, W. Incidence
of Listeria spp. In clinical and food samples in Mangalore, India. Food
Microbiology, v.20, p.447-453, 2003.
DONNELLY, C.W. Conventional methods to detect and isolate Listeria
monocytogenes. In: RYSER, E.T.; MARTH, E.H. Listeria, listeriosis, and
food safety. 2.ed. New York: Marcel Dekker, p.225-260, 1999.
DUFFY, G.; CLOAK, O.M.; SHERIDAN, J.J.; BLAIR, I.S.; McDOWELL, D.A.
The development of a combined surface adhesion and polymerase chain
reaction technique in the rapid detection of Listeria monocytogenes in meat
and poultry. Int. Journal. Food Microbiol., Amsterdam, v.49, p.151-159,
1999.
FARBER, J.M.; PETERKIN, P.I. Listeria monocytogenes a food-borne
pathogen. Microbiology Reviews, v. 55, p. 511-576, 1991.
FARBER, J. M.; ADDISON, C. J. RAPD typing for distinguishing species and
strains in the genus Listeria. Journal of Appied Bacteriology, v.77, n.3,
p.242-250, 1994.
FENLON, D. R.; WILSON, J.; DONACHIE, W. The incidence and level of
Listeria monocytogenes contamination of food sources at primary production
and initial processing. Journal of Applied Bacteriology, v.81, n.6, p641-
650, 1996.
40
FLEMING, D.W.; COCHI, S.L.; MCDONALD, K.L. et al., Pasteurized milk as a
vihicle of infection in na outbreak of listeriosis. New England Journal of
Medicine, v. 312, n.7, p. 404-407, 1985.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores
moleculares em análise genética. 3
a
ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN,
1998, 220p.
FORSYTHE, S. J. Microbiologia da segurança alimentar. Porto Alegre:
Artmed, 2002. 424p.
FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA). Quantitative assessment of
relative risk to public health from foodborne Listeria monocytogenes
among selectedcategories of ready-to-eat foods. Disponível em:
http://www.cfsan.fda.gov./~dms/lmr2-2.html#Listeriosis. Acesso em: 21 set.
2003.
FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São
Paulo: Atheneu, 1996. 182p.
GELLIN, B.G.; BROONE, C.V.; BIBB, W.F. et al.. The epidemiology of
listerioses in the United States – 1986. American Journal of
Epidemiology, v. 133 n. 392, p.392-401, 1991.
GENIGEORGIS, C.A.; DUTULESCU, D.; GARAYZABAL, J. F. Prevalence of
Listeria spp. in poultry meat at the supermarket and slaughterhouse.
Journal of Food Protection, Ames, v.52, p618-624, 1989.
GENIGEORGIS, C.A., OANCA, P., & DUTULESCU, D. Prevalence of Listeria
spp. in turkey meat at the supermarket and slaughterhouse level. Journal of
Food Protection, Ames, v.53, n.9, p112, 1990.
GRAY, M.L.; KILLINGER, A.H.) Listeria monocytogenes and listeric infections.
Bacteriology Review, v.30, p.309-382, 1966.
HENSYL, W.R., ed. Bergey’s manual of determinative bacteriology. [edited
by] John G. Holt...[et al.].- Edição 9th.ed. Imprenta Baltimore: Willians &
Wilkins, 1994. 787p.
HITCHINS, A.D. Listeria monocytogenes. In: UNITED STATES. Food and Drug
Administration. Bacteriological Analytical Manual. Edição 8th.ed.
Imprenta Gaithersburg, Md.: AOAC International, 1998. cap.10, p.10.01-
10.13.
HOFER, E., RIBEIRO, R., & FEITOSA, D.P. Species and Serovars of the genus
Listeria isolated from different sources in Brasil from 1971 to 1997.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v.95, 615-620,
2000.
41
HOLT, J.G. et.al. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9.ed.
Baltimore: Williams & Wilkins, 1994.
INTERNATIONAL COMMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS
FOR FOODS (ICMSF). Microrganisms in foods 5. In: Microbiological
specifications of food pathogens. Imprenta London: Blakie Academic &
Professional, Descr.Fis. 513p, 1996.
INTERNATIONAL COMISSION ON MICROBIOLOGICAL ESPECIFICATIONS
FOR FOODS (ICMSF). Microorganismos de los alimentos – Métodos de
muestro para análises microbiológicas: Princípios y aplicaciones
especificas. Traduzido por Juan Antonio Ordóñez Pereda e Marco Antonio
Dáz Hernández. Vol.II. Zaragoza: Acribia, 1998, 165p.
JACKSON, T.C., ACUFF, G. R.,LUCIA, L.M, PRASAI, R.K., BENNER, R.A,
TERRY, C.T. Survey of residential refrigerators for the presence of Listeria
monocytogenes. Journal of Food Protection, v.56, p.874-875, 1993.
JACQUET, C.; CATIMEL, B.; BROSCH, R.; BUCHRIESER, C.; DEHAUMONT,
P.; JEONG, D.K.; FRANK.; J.F. Grown of Listeria monocytogenes at 10°C in
biofilms with microorganisms isolated from meat and dairy processing
environments. Journal of Food Protection, v.57, p.576-586,1994.
JAY, J. Listeriosis and Listeria momocytogenes. Food Microbiology. 5.ed.
Chapmam & Hall, 1996.
JAY, J. Microbiologia dos alimentos. Editora ArtMed, 2005, 100p.
JOHNSON, J.L. USDA-FSIS microbiology laboratory guidebook.
Washington: U.S.Department of Agriculture, 1998. v.1 apud NORTON, D.M.
Polymerase chain reaction-based methods for detection of Listeria
monocytogenes: toward real-time screening for food and environmental
samples. Journal. AOAC Int., Gaithersburg, v.85, n.2, p.505-515, 2002.
KANUGANTI, S. R., WESLEY, I. V., REDDY, P. G., MCKEAN, J., HURD, H.S.
Detection of Listeria monocytogenes in Pigs and Pork. Journal of Food
Protection, v.65, n.9, p.1470-1474, 2002.
KERR, K.G.; KITE, P.; HERITAGR, J.; HAWKERY, P.M. Typing of
epidemiologically associated enviromental and clinical strains of Listeria
monocytogenes by random amplication of polymorphic DNA. Journal of
Food Protection, v.58, p.609-613, 1995.
LAWRENCE, L. L.; GILMOUR, A. Incidence of Listeria spp. And
L.monocytogenes in a poultry processingironmental and in poutry products
and their rapid confirmation by multiplex PCR. Applied and Environmental
Microbiology, v.60, p.4600-4604, 1994.
LIM, D. Microbiology. 2ed. McGraw-Hill, 1998. Cap.20: Food and Industrial
Microbiology, p.613.
42
LIMA, A. S. Disseminação de Listeria monocytogenes no processamento
de lingüiça mista frescal avaliando sorologia e RAPD . Pelotas, 2004.
69f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia Agroindustrial) – Pós-
graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Universidade Federal de
Pelotas, 2004.
LONCAREVIC, S., DANIELSSON-THAM, M. L., MARTENSSON, L., RINGNER,
A., RUNEHAGEN, A., THAM, W., A case of foodborne listeriosis in Sweden.
Letters in Applied Microbiology, v.24, p.65-68,1998.
LOUIE, M.; JAYARATNE, P.; LUCHSINGER, I.; DEVENISH, J.; YAO, J.;
SCHLECH, W.; SIMOR, A. Comparison of ribotyping, arbitrarily primed
PCR, and pulsed field gel electrophoresis for molecular typing of Listeria
monocytogenes. J. Clin. Microbiol., Washington, v.34, p.15-19, 1996.
LUDÉN, J. M., AUTIO, T. J., SJÖBERG A.-M, KORKEALA, H.J. Persistent and
nonpersistent Listeria monocytogenes contamination in meat and poultry
processing plants. Journal Food Protection, v.66, n.11, p.2062-2069,
2003a.
LUNDÉN, J., AUTIO, T.; MARKKULA, A., HELLSTRÖM, S., KORKEALA, H.
Adaptative and cross-adaptative responses of persistent and non-persistent
Listeria monocytogenes strains to disinfectants. International Journal of
Food Microbiology, v.82, p.265-272, 2003b.
MAIJALA, R.; LYYTIKAINEN, O.; JOHANSSON, T. Exposure of Listeria
monocytogenes in an outbreak caused by butter. In: INTERNATIONAL
SYMPOSIUM ON PROBLEMS OF LISTERIOSIS (ISOPOL), 14, Mannheim,
2001.Book of abstracts. Alemanha, 2001. p.165. S.l.: s.n.
MARTINEZ, I.; RORVIK, L.M., BROX, V.; LASSEN, J.; SEPPOLA, M.; GRAM,
L.;VOGEL, B.F. Ggenetic variability among isolates of Listeria
monocytogenes frm food products, clinical samples and processing
environments, estimated by RAPD typing. International Journal of Food
Microbiology, v.2634, p.1-13, 2002;
MAZURIER, S. –I.; WERNARS, K. Tiping of Listeria strains by random
amplification of polymorphic DNA. Research Microbiology, Paris, v.143,
p.499-505, 1992.
MC LAUCHLIN, J.; HALL, S.M.; VELAMI, S.K.; GILBERT, R.J. Human
listeriosis and paté: apossible association. British Medical Journal v. 303,
p.773-775, 1991.
MIETTINEN, M. K., SITONEM, A; HEISKANEN, P.; HAAJANEN, H.;
BJORKROTH, K.J.; KORKELA, H. J. Molecular epidemiology of and
outbreak of febrile gastroenteritis caused by Listeria monocytogenes in cold-
smoked rainbow trout. Journal Clinical Microbiology, v.68, n.7, p.2358-
2360,1999.
43
MURRAY, E.G.D.; WEBB, R.A.; SWARM, M.B.R. A disease of rabbis
characterised by a large mononuclear leucocytoses, caused by a
undescribed bacillus Bacterium Monocytogenes (n.sp). Journal of
Pathotogical Bacteriology, v. 29 p.407-439, 1926.
MURRAY, P.R.; BARON, E.J.; PFALLER, M.A.; TENOVER, F.C.; YOLKEN, R.
H. Manual of Clinical Microbiology. Whashinton DC: ASM Press, 1999,
870p.
NAKAMA, A., TERAO, M., KOKUBO, Y., ITOH, T., MARUYAMA, T.,
KANEUCHI, C., McLAUCHLIN, J. A comparison of Listeria monocytogenes
serovar 4b isolates of clinical and food origin in Japan by pulsed-fiels gel
electrophoresis. International Journal of Food Microbiology, v.42, p.201-
206, 1998.
NASCIMENTO, F.G.M.; CULLOR,S.J. Listeriose Humana – Epidemiologia e
Fontes de Contaminação. Higiene Alimentar, v.8, n.32, p.13-17, 1994.
NORTON, D.M. Polymerase chain reaction-based methods for detection of
Listeria monocytogenes: toward real-time screening for food and
environmental samples. Journal. AOAC Int., Gaithersburg, v.85, n.2, p.505-
515, 2002.
OKUTANI, A.; OKADA, Y.; YAMAMOTO,S.; IGIMI,S. Overview of Listeria
monocytogenes contamination in Japan. International Journal of Food
Microbiology, v.93, p.131-140, 2004.
PERRIN, M., BEMER, M., DELAMARE, C. Fatal case of Listeria innocua
bacteremia. Journal of Clinical Microbiology, 2003.
ROCOURT, J., COSSART, P. Listeria monocytogenes. IN: DOYLE, M.P.,
BEUCHAT, L.R., MONTVILLE, T.J. EDS. Food microbiology:
Fundamentals and frontiers. Washington: ASM Press, 1997. P.337-352.
RYSER, E.T., MARTH, E.H. Listeria, listeriosis, and food safety. New York:
Marcel Dekker, 1999. 738p.
RYSER, E.T.; DONNELLY, C.W. Listeria. In: DOWNES, F.P.; ITO, K., eds.
Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4.
ed.Washington: APHA, 2001. p.343-353.
SAIDE-ALBORNOZ, J., KNIPE, C.L., MURANO, E.A., BERAN, G.W.
Contamination of pork carcasses during slaughter, fabrication, and chilled
storage. Journal of Food Protection, v.58, n.9, p.993-997, 1995.
SALAMINA, G.; DONNE, E.D.; NICCOLINI, A.; PODA, G.; CESARONI, D.;
BUCCI, M.;FINI, R.; MALDINI, M.; SCHUCHAT, A.; SWAMINATHAN, B.;
BIBB, W.;ROCOURT, J.; BINKIN, N.; SALMOSO, S. A foodborne outbreak
44
of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect.,
Cambridge, v.117, p.429- 436, 1996.
SAMMARCO, M.L., RIPABELLI, G., RUBERTO, A., IANNITTO, G., GRASSO,
GM. Prevalence of Salmonelae, Listeriase, and Yersiniae in the
slaughterhouse environment and on work surfaces, equipment, and workers.
Journal of Food Protection, v.60, n.4, p.367-371, 1997.
SCHLECH, F.; LAVIGNE, P.M. et al., Epidemic listeriosis – evidencefor
transmission by food. New England Journal of Medicine, v.308, n.4,p.
203-208, 1983.
SCHUCHAT A.; DEAVER, K., J.D. et al., Role of foods in sporadic listeriosis:
I.Case control study of dietary risk factors. Journal of the American
Medical Associetion, v. 267, p. 2041-2045, 1992.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, A.C.V.; SILVEIRA, A.F.N. Manual de Métodos de
Análise Microbiológica de Alimentos. São Paulo: Livraria Varela, 1997.
SILVA, E.O.T.R., SOUZA, L.P., BALIAN, S.C. Isolamento e Identificação de
Listeria spp, em quartos dianteiros de bovinos desossados. Higiene
Alimentar, v.13, n.63, p.38-42, 1999.
SILVA, I.M.M.; ALMEIDA, R.C.C.; ALVES, M.A.O.; ALMEIDA, P.F. Occurrence
of Listeria spp. in critical control points and the environmental of Minas
Frescal cheese processing. International Journal of Food Microbiology,
v.81, p.241-248, 2003.
STEKELENBURG, F. K. Enhanced inhibition of Listeria monocytogenes in
Frankfurter sausage by the addition of potassium lactate and sodium
diacetate mixtures. Food Microbiology, v.20, p.133-137, 2003.
SWAMINATHAN, B.; BARRETT , T. J.;HUNTER, S. B.; TAUXE, R. V.
PulseNet: the molecular subtyping network for foodborne bacterial diease
surveillance, United States. Emerging Infectious Disease, v.7, n.3, p.383-
389, 2001.
SWAMINATHAN, B. Listeria monocytogenes .In M. P. Doyle, L.R. Beuchat, and
R. T. J. Montville (ed). Food Microbiology. ASM Press. Washington, D.C.
p.383-410. 2000
TRABULSI, L.R.; ALTHERTHUM, F.; GOMPERTZ, O.F.; CANDEIRAS, J.A.N.
Microbiologia. São Paulo: Atheneu, 3.ed., 1999. 586p.
TRAN, H.T., KATHARIOU, S. Restriction Fragment Length Polymorphisms
Detected with Novel DNA Probes Differentiate among Diverse Lineages of
Serogroup 4 Listeria monocytogenes and Identify Four Distingt Lineages in
Serotype 4b. Appied and Environmental Microbiology, v.68, p.50-64,
2002.
45
TOMPKIM,R. B. Control of Listeria monocytogenes in the Food-processing
Environment. Journal of Food Protection, v.65, p.709-725, 2002.
UHITIL, S., JAKSIC, S., PETRAK, T., MEDIC, H., GUMHALTER-KAROLYI, L.
Prevalence of Listeria monocytogenes and the other Listeria spp. In cakes in
Croatia. Food Control, v. 15, n.3, p.213-216, 2004.
UNNERSTAD, H.; NILSSON, I., ERICSSON, H; DANIELSSON-THAM, M-L.,
BILLE, J., BANNERMAN, E., TRAM, W. Division of Listeria monocytogenes
serovar 1/2a strains into two groups by PCR and restricion enzime anlysis.
Appied and Environmental Microbiology, v.65,n.5, p.2054-2056, 1999.
VAN DEN ELZEN, A. M. G.; SNIJDERS, J. M. A. Critical points in meats
production lines regarding the introduction of Listeria monocytogenes.
Veterinary Quarterly, The Hage, v.15, n.4, p.143-145, 1993.
VITAS, A.I., AGUADO, V., GARCIA-JALON, I. Occurence of L. monocytogenes
in fresh and processed foods in Navarra (Spain). International Journal of
Food Microbiology, v.90, p.349-356, 2004.
VOGEL, B. F,; JORGENSEN, L.V.; OENIYI.; HUSS, H.H.; GRAM, L. Diversity
of L. monocytogenes isolates from cold-smoked salmon produced in
different smokehouses as assassed by Randomo Ampllified Polymorphic
DNA analyses. International Journal of Food Microbiology, v.65, p.83-
92, 2001.
VON LAER, A., Mapeamento da contaminação por Listeria monocytogenes
em uma planta de processamento de lingüiça mista frescal através de
sorologia e PFGE. Pelotas, 2004.79f. Dissertação (Mestrado em Ciência e
Tecnologia Agroindustrial) – Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel,
UFPeL, 2004.
WAGNER, M.; MADERNER, A.; BRANDL, E. Randomo Ampllified Polymorphic
DNA for tracing and molecular epidemiology of Listeria monocytogenes
contamination in a cheese plant. Journal of Food Protection, v.59, n.4,
p.384-389, 1996.
WILLIAMS, J. G.; KUBELINK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, L.A. & TINGEY,
S.V. DNA polymorphism amplifield by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nucleic Acids Research, 18, p.6531-6535, 1990.
WARBURTON, D.W.; FABER, J.M. et al.,Comparison of methods for optimum
detection of stressed and low levels of Listeria monocytogenes. Food
Microbiology, v. 9, n.2, p.127-145, 1992.
WONG, S., STREET, D., DELGADO, S.I., KLONTZ, K.C. Recalls of foods and
cosmetic due to microbial contamination reported to the U.S. Food and
Drung Administration. Journal Food Protection, v.63, n.8, p.1113-1116,
Aug.2000.
46
ZAHA, A. Biologia Molecular Básica. Porto Alegre: Mercado Aberto, 3 ed.,
2001. 336p.
ZHENG, W.; KATHARIOU, S. Differentiation of epidemic-associated strains of
Listeria monocytogenes by restriction fragment lenght polymorphism in a
gene region essential for growth at low temperatures (4 °C). Appl. Environ.
Microbiol.,Washington, v.61, p.4310-4314, 1995.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
