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i
SANDRA CERQUEIRA PEREIRA
SILÍCIO COMO POTENCIALIZADOR DA ATIVIDADE DE
ENZIMAS DE DEFESA À FERRUGEM EM PLANTAS DE CAFÉ
E SOJA
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Agrícola, para
obtenção do título de Magister
Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2007
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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e
Classificação da Biblioteca Central da UFV
T
Pereira, Sandra Cerqueira, 1980-
P436s Silício como potencializador da atividade de enzimas
2007 de defesa à ferrugem em plantas de café e soja / Sandra
Cerqueira Pereira. – Viçosa, MG, 2007.
ix, 70f. : il. (algumas col.) ; 29cm.
Orientador: Maria Goreti de Almeida Oliveira.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de
Viçosa.
Referências bibliográficas: f. 55-70.
1. Enzimas - Análise. 2. Silício. 3. Café - Resistência à
doenças e pragas. 4. Soja - Resistência à doenças e pragas.
5. Ferrugem-do-cafeeiro. 6. Ferrugem-da-soja. I. Universi-
dade Federal de Viçosa. II.Título.
CDD 22.ed. 572.7
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SANDRA CERQUEIRA PEREIRA
SILÍCIO COMO POTENCIALIZADOR DA ATIVIDADE DE
ENZIMAS DE DEFESA À FERRUGEM EM PLANTAS DE CAFÉ
E SOJA
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Agrícola, para
obtenção do título de Magister
Scientiae.
APROVADA: 31 de julho de 2007
______________________________
Prof. Luiz Orlando de Oliveira
____________________________
Prof. Fabrício de Ávila Rodrigues
(Co-Orientador)
______________________________
Prof.ª Márcia Rogéria de Almeida Lamêgo
______________________________
Prof. Laércio Zambolim
(Co-Orientador)
______________________________
Prof.ª Maria Goreti de Almeida Oliveira
(Orientadora)
ii
Aos meus pais, Osório e Olga, exemplos de vida,
integridade e sabedoria, meus eternos educadores.
Iluminaram meu caminho ensinando que a mais
importante forma de se viver é através da infindável
busca pelo conhecimento,
MINHA HOMENAGEM
Aos meus pais, Osório e Olga, e meus
irmãos, Leonardo e Soraia, pelo
apoio e compreensão, com amor,
OFEREÇO E DEDICO
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me proporcionado a chance de completar este trabalho e por
ter me acolhido com um amor imensurável nas horas em que mais precisei.
Aos meus pais, Osório e Olga, meus irmãos Leonardo e Soraia, minha “tia-
mãe” Maria da Penha e meu avô Sebastião, por todo incentivo, carinho, amor e,
sobretudo pela compreensão nas horas mais difíceis, e toda família, que foram a base
de minha vida e o caminho para esta conquista.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular, pela oportunidade de realização do curso.
A todos os professores que tanto contribuíram para minha formação
acadêmica e crescimento profissional, além de todos os funcionários que fazem parte
deste feliz ambiente em que pude conviver.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão da bolsa de estudos.
À Professora Maria Goreti de Almeida Oliveira, pela orientação,
ensinamentos, estímulo e, sobretudo, pela amizade.
Ao Professor Fabrício de Ávila Rodrigues, pela dedicação absoluta, afeto e
todo conhecimento transmitido.
Ao Professor Laércio Zambolim e Dra. Eunize Maciel Zambolim, pela
oportunidade e apoio incondicional.
Aos Professores Sebastião Tavares de Rezende e Efraim Lázaro Reis, pela
colaboração indispensável e afeição.
À amiga e comparte de trabalho, Vivian Carré Missio com quem compartilhei
buscas, dúvidas e descobertas e que tanto me ajudou, e aos amigos do Laboratório da
Interação Planta-Patógeno do Departamento de Fitopatologia, em especial Dalila e
Natália.
Às amigas e companheiras de bancada Angélica e Lílian, pelo apoio em todos
os momentos, trocas de conhecimento, convívio, dificuldades e incertezas que
enfrentamos juntas, sem contar as longas horas de trabalho.
iv
Aos amigos do Laboratório de Enzimologia, Bioquímica de Proteínas e
Peptídeos do BIOAGRO: Fabrício, Fernanda, Thiago, Maíra, Gepoliano, Isabela,
Zaira, Fabrícia, Kênia, Luciana, Franciny, Eduardo, Liliane e Anderson, e aos demais
colegas pela cooperação, convivência diária, respeito, afeição e pelos momentos de
descontração.
Ao Senhor Fausto, que não mediu esforços para me ajudar, alegrar (“só Jesus,
ta ligado”) e pela amizade verdadeira, e aos funcionários Eduardo, Bruna, Naldo,
Sandra, Ricardo, Camila, Alessandra, Edson, Gláucia e Marlene, pela respeitosa
convivência e carinho.
Às amigas do curso de Bioquímica Agrícola Ana Paula, Solange, Eleonice e
Eliene, por todo carinho e ajuda, pela amizade e companheirismo, além das horas e
horas de estudo e convívio no decorrer do curso.
Aos colegas do Laboratório de Proteção de Plantas, Laboratório de
Biotecnologia do Cafeeiro, Laboratório de Proteína, Laboratório Biomol e
Laboratório de Proteômica, em especial Jonas, Toninho, Sérgio Milagres, Robson,
Márcia Flores, Daniela, Rita, Márcia, Clever e Paulo, pelo auxílio contínuo e
amizade.
Ao grande amigo e irmão Abelardo pelo apoio incondicional em todos os
momentos, pela amizade verdadeira, pelo socorro nas horas ruins e pelas boas risadas
e aventuras vividas, por ser um exemplo de ser humano.
Às amigas e irmãs Clarisse, Caroline, Raquel, Andréia, Mariana, Fernanda,
Cláudia, Mariana Mayra, Silvana e ao amigo Nilo pela grande e eterna amizade,
compreensão, apoio imprescindível, além das ocasiões felizes e inesquecíveis que
vivemos juntos.
Aos amigos Felipe, Flávio, Patrick e Vagner, pela convivência e ajuda, além
da paciência e por me permitirem fazer da casa deles a minha casa, em especial ao
Élcio, que foi meu ombro amigo muitas e muitas vezes, ouvindo e aconselhando,
além de todos os amigos do Edifício Rayane.
Finalmente, aos demais amigos e familiares que, de alguma forma,
contribuíram para a realização deste trabalho, seja direta ou indiretamente, com
palavras de consolo e estímulo, ou trabalhando lado a lado na construção deste sonho
que se realiza, a minha eterna e sincera gratidão.
v
BIOGRAFIA
SANDRA CERQUEIRA PEREIRA, filha de Osório Berto Pereira
e Olga Cerqueira Pereira, nasceu na cidade de Manhuaçu, MG, no dia 29
de dezembro de 1980.
Em 2004, graduou-se em Química pela Universidade Federal de
Viçosa (UFV), nas modalidades Licenciatura e Bacharelado.
Em 2005, ingressou no Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Agrícola em nível de mestrado na Universidade Federal de
Viçosa (UFV).
vi
SUMÁRIO
RESUMO.............................................................................................................viii
ABSTRACT...................................................................................................................... ix
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 01
2. REFERENCIAL TEÓRICO....................................................................................... 04
2.1. Aspectos gerais sobre a cultura do cafeeiro e a ferrugem........................................ 04
2.2. Aspectos gerais sobre a cultura da soja e a ferrugem asiática.................................. 07
2.3. A utilização do Acibenzolar-S-Metil na indução de resistência.............................. 09
2.4. Ativação de mecanismos de defesa.......................................................................... 11
2.5. Utilização de silicatos na indução de resistência a doenças..................................... 16
3. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 19
3.1. Ensaios em casa de vegetação.................................................................................. 19
3.1.1. Cultura do cafeeiro.......................................................................................... 19
3.1.2. Cultura da soja ................................................................................................ 20
3.2. Ensaios bioquímicos ................................................................................................ 21
3.2.1. Cultura do cafeeiro.......................................................................................... 21
3.2.2. Cultura da soja ................................................................................................ 22
3.3. Determinação da atividade enzimática em plantas de café e soja............................ 22
3.3.1.
β
-1,3-glucanases.............................................................................................. 22
3.3.2. Quitinases........................................................................................................ 23
3.3.3. Lipoxigenases.................................................................................................. 24
3.3.4. Fenilalanina amônia-liase................................................................................ 25
3.3.5. Peroxidases...................................................................................................... 26
3.3.6. Polifenoloxidases ............................................................................................ 27
4. RESULTADOS ............................................................................................................ 29
4.1. Experimento com Cafeeiro ..................................................................................... 29
4.1.1. Severidade da ferrugem .................................................................................. 29
4.1.2. Teores foliares de silício e potássio ............................................................... 30
4.1.3. Atividade enzimática....................................................................................... 31
4.1.3.1.
β
-1,3-glucanases..................................................................................... 31
4.1.3.2. Quitinases............................................................................................... 32
vii
4.1.3.3. Lipoxigenases......................................................................................... 33
4.1.3.4. Fenilalanina amônia-liase....................................................................... 34
4.1.3.5. Peroxidases............................................................................................. 36
4.1.3.6. Polifenoloxidases ................................................................................... 37
4.2. Experimento com Soja ............................................................................................ 38
4.2.1. Severidade da ferrugem asiática ..................................................................... 38
4.2.2. Teores foliares de silício e potássio ............................................................... 40
4.2.3. Atividade enzimática....................................................................................... 40
4.2.3.1.
β
-1,3-glucanases..................................................................................... 40
4.2.3.2. Quitinases............................................................................................... 41
4.2.3.3. Lipoxigenases......................................................................................... 43
4.2.3.4. Fenilalanina amônia-liase....................................................................... 44
4.2.3.5. Peroxidases............................................................................................. 45
4.2.3.6. Polifenoloxidases ................................................................................... 47
5. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 49
6. CONCLUSÕES............................................................................................................ 54
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 55
viii
RESUMO
PEREIRA, Sandra Cerqueira, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, Julho de 2007.
Silício como potencializador da atividade de enzimas de defesa à ferrugem
em plantas de café e soja. Orientador: Maria Goreti de Almeida Oliveira. Co-
Orientadores: Fabrício de Ávila Rodrigues, Laércio Zambolim e Eunize Maciel
Zambolim.
A ferrugem (Hemileia vastatrix) e a ferrugem asiática (Phakopsora
pachyrhizi) têm reduzido significativamente a produtividade, respectivamente, das
culturas do café e da soja. O silício (Si) é considerado um elemento benéfico às
plantas, pois aumenta a resistência delas às doenças e ao ataque de pragas. Em
resposta a infecção por patógenos, as plantas ativam diferentes mecanismos de
defesa entre eles o aumento na atividade de enzimas como as β-1,3-glucanases
(GLU) e as quitinases (QUI) que catalisam a hidrólise de componentes da parede
celular fúngica; a fenilalanina-amônia-liase (PAL) e as peroxidases (POD) que são
importantes no processo da lignificação; as polifenoloxidases (PPO) que catalisam a
formação de quinonas e as lipoxigenases (LOX) que catalisam a degradação de
ácidos graxos. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal
verificar se a aplicação foliar de silicato de potássio (SP) reduziria a severidade
dessas ferrugens potencializando o aumento na atividade das enzimas GLU, QUI,
PAL, POD, PPO e LOX. Plantas de soja e de café inoculadas ou não inoculadas com
P. pachyrhizi e H. vastatrix, respectivamente, foram pulverizadas com SP via foliar.
Utilizaram-se como tratamentos controle, a pulverização com água e com o indutor
de resistência Acibenzolar-S-Metil (ASM). A aplicação foliar de SP e de ASM
reduziu a severidade das ferrugens em comparação ao tratamento com água. As
atividades das enzimas GLU, QUI, PAL, POD, PPO e LOX foram exclusivamente
potencializadas após a infecção pelos patógenos. A redução na severidade das
ferrugens deve-se à polimerização do silicato de potássio na superfície foliar que
possivelmente, dificultou a penetração dos fungos ou afetou a viabilidade das suas
estruturas reprodutivas.
ix
ABSTRACT
PEREIRA, Sandra Cerqueira, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, July of 2007.
Silicon as a potentiater of the activity of enzymes related to the defense to
rust in coffee and soybean plants. Adviser: Maria Goreti de Almeida Oliveira.
Co-Advisers: Fabrício de Ávila Rodrigues, Laércio Zambolim and Eunize Maciel
Zambolim.
The coffee leaf rust (Hemileia vastatrix) and asian soybean rust (Phakopsora
pachyrhizi) can significantly reduce yield, respectively, on coffee and soybean crops.
Silicon (Si) is a beneficial element to plants because it increases host resistance to
pests and diseases. In response to infection by pathogens, plants activate many
mechanisms of defense such as an increase in the activity of the enzymes β-1.3-
glucanases (GLU) and chitinases (QUI) that degrade fungus cell wall; phenylalanine
ammonia-lyase (PAL) and peroxidases (POD) which are important in the
lignification; polyphenoloxidases (PPO) that catalyzes the formation of quinones and
lipoxygenases (LOX) that degrade fatty acids. In this context, the present study
aimed to investigate if the application of potassium silicate (PS) can reduce rust
severities on coffee and soybean plants mainly through the increase in the activity of
GLU, QUI, PAL, POD, PPO and LOX. Soybean and coffee plants inoculated or not
inoculated with P. pachyrhizi and H. vastatrix, respectively, were sprayed with PS.
As control treatments, plants were sprayed with water and Acibenzolar-S-Methyl
(ASM). The foliar applications of PS and ASM decreased rust severities on both
coffee and soybean plants. The activity of GLU, QUI, PAL, POD, PPO and LOX
increased upon pathogens infection. The reduction on rust severities was due to the
polymerization of PS on leaf surface that possibly affected fungus penetration or
somehow the viability of their reproductive structures.
1
1. INTRODUÇÃO
O café e a soja são importantes culturas para o país. São produtos de
exportação gerando divisas e contribuindo para o aumento do Produto Interno Bruto.
Geram emprego na agricultura, principalmente o café, ajudando na fixação do
homem ao campo, pois mais de 70% das propriedades de café do país tem em média
15 a 30 mil pés de café. A soja pode ser empregada na alimentação de seres humanos
(farinha, carne e óleo) e animais (farelo), podendo ainda ser aplicada na produção do
biodisel, um combustível que visa à redução da poluição nas grandes metrópoles.
Entretanto, torna-se necessária a adoção de um conjunto de medidas integradas para
dar sustentabilidade a tais culturas. No tocante às doenças, têm-se verificado sérias
perdas, sendo que a ferrugem é a principal causa de inúmeros prejuízos.
O emprego de fungicidas é a única medida disponível para o controle da
doença e como conseqüência, exige altos investimentos com defensivos agrícolas.
Além do mais, a dificuldade de se desenvolver variedades com resistência completa à
ferrugem causada pelos fungos Phakopsora pachyrhizi e Hemileia vastatrix para o
benefício dos produtores de soja e café, respectivamente, ainda demandará vários
anos de pesquisa, devido a grande variabilidade fisiológica dos patógenos. A busca
por medidas de controle alternativo, como a resistência induzida por nutrientes na
defesa da planta, que não polui e que pode ser empregada de imediato, constitui uma
forte demanda do setor produtivo e um desafio à pesquisa.
A nutrição de plantas determina em grande parte a sua resistência ou
susceptibilidade a doenças, sua estrutura morfológica ou histológica, a função de
tecidos para rápida ou lenta patogênese, a virulência e habilidade do patógeno para
sobreviver. Os elementos minerais são necessários para síntese de barreiras químicas
e físicas, ou mudança de substâncias ao redor do sítio de infecção e estão envolvidos
em todo mecanismo de defesa das plantas como um componente integral da célula,
substrato, enzimas, ou como ativadores, inibidores, e reguladores do metabolismo.
Uma planta estressada nutricionalmente é mais susceptível, pois se altera a
resistência do hospedeiro devido à mudança em caminhos metabólicos que afeta a
produção de barreiras mecânicas, fisiológicas ou compostos inibitórios, dificultando
a inibição da germinação, crescimento, penetração ou atividade enzimática do
patógeno.
2
O silício (Si) é considerado como elemento benéfico para as plantas. A
presença desse elemento tem sido relacionada principalmente ao aumento da
resistência contra pragas e doenças e tolerância à toxidez. Os efeitos do Si são
usualmente expressos sob condições de estresse, tanto abiótico como biótico.
Estruturalmente, proporcionam mudanças anatômicas nos tecidos, como células
epidérmicas com a parede celular mais espessa devido à deposição de sílica,
favorecendo a melhor arquitetura das plantas, além de aumentar a capacidade
fotossintética e resistência às doenças. O Si ativa genes envolvidos na produção de
compostos secundários do metabolismo, como os polifenóis e enzimas relacionadas
com os mecanismos de defesa, além da produção suplementar de toxinas que podem
agir como substâncias inibidoras ao patógeno.
A resistência de um hospedeiro, dentro do contexto da fisiologia do
parasitismo, pode ser definida como a capacidade da planta em atrasar ou evitar a
entrada e/ou a subseqüente atividade de um patógeno em seus tecidos. Cada
interação hospedeiro-patógeno pode ser encarada como uma luta entre dois
organismos pela sobrevivência. Os fatores de resistência incluem aqueles já presentes
nas plantas antes do contato com os patógenos ou os que se mostram ausentes ou
presentes em baixos níveis antes da infecção, sendo produzidos ou ativados em
resposta à presença dos patógenos. Dentre esses fatores estão as respostas
bioquímicas que ocorrem nas células do hospedeiro produzindo substâncias que se
mostram tóxicas ao patógeno ou criam condições adversas para o crescimento do
mesmo no interior da planta. Neste contexto, várias enzimas têm sua produção e/ou
atividade alteradas nas plantas em resposta à presença de patógenos.
As β-1,3-glucanases (EC 3.2.1.39) catalisam a hidrólise das β-1,3-glucanas.
As quitinases (EC 3.2.1.14) catalisam a hidrólise da quitina (um polímero de N-
acetilglucosamina). A fenilalanina amônia-liase (EC 4.3.1.5) exerce papel
fundamental catalisando a conversão de L-fenilalanina a ácido trans-cinâmico. As
peroxidases (EC 1.11.1.7) catalisam a oxidação de componentes celulares, tais como
H
2
O
2
ou peróxidos orgânicos. As polifenoloxidases (EC 1.10.3.1) catalisam dois
tipos de reações, ambas envolvendo oxigênio, sendo a primeira corresponde à
hidroxilação de monofenóis formando orto-difenóis e a segunda à oxidação de orto-
difenóis formando orto-quinonas. As lipoxigenases (EC 1.13.11.12) catalisam a
adição do oxigênio molecular ao sistema pentadieno dos ácidos graxos
polinsaturados, formando hidroperóxidos dos ácidos graxos correspondentes.
3
É de suma importância que se intensifiquem as pesquisas no que dizem
respeito ao emprego da tecnologia baseada na suplementação com Si, que é uma
técnica sustentável com enorme potencial para diminuir o uso de agroquímicos e
aumentar a produtividade por meio de uma nutrição mais equilibrada e
fisiologicamente mais eficiente na indução de resistência a doenças. Com o propósito
de contribuir para o esclarecimento dos mecanismos bioquímicos envolvidos neste
processo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a relação existente entre o
processo de resistência das culturas de café e soja e a atividade de enzimas
envolvidas no sistema de defesa. Plantas inoculadas e não inoculadas com os
respectivos fungos causadores da ferrugem do café (H. vastatrix) e ferrugem asiática
da soja (P. pachyrhizi) foram tratadas com silicato de potássio em aplicação via
foliar, para comparação com plantas previamente tratadas com água e plantas
tratadas com um indutor de resistência reconhecido comercialmente Acibenzolar-S-
Metil (ASM).
4
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. Aspectos gerais sobre a cultura do cafeeiro e a ferrugem
O café é economicamente o segundo mais importante produto comercializado
no mundo, além disso, é um dos principais produtos agrícolas de exportação
brasileira. Destaca-se por sua ampla área de cultivo, apresentando, portanto, grande
importância econômica. Nos últimos dez anos, o Brasil colheu em média cerca de 30
milhões de sacas de café por ano. Minas Gerais é o maior Estado produtor, com cerca
de 50% da produção nacional, seguido pelos Estados do Espírito Santo, São Paulo e
Paraná. Em média, o Brasil exporta um volume de café entre 70 e 80 milhões de
sacas de 60 kg, contribuindo com uma participação de 23% no mercado mundial. As
duas espécies de café crescentes comercialmente no Brasil são Coffea arábica L.
(Café Arábica) e Coffea canephora L. (Café Robusta), as quais representam 70% e
30%, respectivamente, da produção mundial (MATIELLO et al., 2002).
A cafeicultura impõe um constante desafio aos produtores, devido ao grande
número de doenças e pragas que ocorrem durante praticamente todo o ciclo. Como
toda cultura em geral, está sujeita à incidência de problemas fitossanitários de origem
biótica e abiótica que atacam as diferentes partes da planta, influindo direta ou
indiretamente na produção. As limitações fitossanitárias têm-se acentuado com a
expansão da cultura nos mais variados tipos de clima e solo. Os incentivos ao
aumento de produtividade, da qualidade do produto, de competitividade e de lucro,
agregam-se aos fatores de geração das ações de risco ambiental, uma vez que
incentivam a intensificação da exploração do ambiente natural e o uso de tecnologias
que, se usadas de forma incorreta, levarão à degradação dos ecossistemas e à
diminuição da qualidade do meio ambiente.
Muitos países estão envolvidos na produção, comercialização e consumo de
café. O produto é muito apreciado devido a características organolépticas e efeito
estimulante. Contudo, um dos grandes obstáculos à exploração da cafeicultura é a
susceptibilidade das plantas à ferrugem. No Brasil, estima-se em média 30% de
perdas na produção quando as condições climáticas tornam-se favoráveis ao
patógeno (ZAMBOLIM et al., 2002). Sob condições de estiagem prolongada, nos
períodos de maior severidade, as perdas na produção podem chegar a mais de 50%
(ZAMBOLIM et al., 1997). A ferrugem ataca as plantações de café em todas as
5
regiões do mundo onde esta rubiácea é cultivada. No Brasil, foi constatada em 1970,
ao sul da Bahia. Quatro meses depois a doença foi encontrada em todas as lavouras
de café do país. Logo se disseminou por todos os países produtores de café das
Américas do Sul, Central e Norte (ZAMBOLIM et al., 2005a).
A principal vantagem do cultivo da espécie Coffea arábica L. sobre a espécie
Coffea canephora L. é a superioridade, mundialmente conhecida, da sua qualidade
de bebida. Entretanto, a maior desvantagem é sua grande susceptibilidade a várias
doenças e pragas. Dentre elas, a principal doença é a ferrugem, que é causada pelo
fungo Hemileia vastatrix Berk. & Br., que parasita a folha do cafeeiro (VÁRZEA et
al., 2002). O fungo H. vastatrix foi detectado pela primeira vez no ano de 1869, no
Ceilão, atual Siri Lanka, ocasionando o fim do cultivo do cafeeiro e a mudança de
hábito de consumo de café para o chá nas ilhas britânicas em menos de 20 anos
(BERGAMIN FILHO & KIMATI, 1995). No Brasil, foram relatadas 12 raças
fisiológicas de Hemileia vastatrix Berk. & Br. em cafeeiros, sendo predominante a
raça II (ZAMBOLIM et al., 2005b). A cultivar Catuaí Vermelho corresponde a uma
recombinação resultante de um cruzamento artificial entre as variedades Caturra
Amarelo e Mundo Novo de C. arabica (FAZUOLI et al., 2002). É uma cultivar que
apresenta ampla capacidade de adaptação e alta qualidade de bebida, entretanto, é
susceptível a maioria das raças de H. vastatrix.
O fungo H. vastatrix, pertence à ordem Uredinales e família Pucciniaceae,
sendo parasita biotrófico exclusivo do gênero Coffea. As características que
distinguem o gênero Hemileia são: penetração e esporulação através dos estômatos e
uredósporos reniformes equinulados dorsalmente e lisos dorsalmente (ZAMBOLIM
et al., 2005a). H. vastatrix se desenvolve na superfície abaxial das folhas, a partir da
germinação dos uredósporos na presença de água e temperatura favorável, podendo
emitir até três tubos germinativos. Há formação de apressório na extremidade do
tubo germinativo, usualmente sobre um estômato, em seguida dando origem a hifa de
penetração (peg de penetração) a qual após atravessar o ostíolo do estômato,
diferencia-se em vesícula sub-estomática. O desenvolvimento subseqüente da hifa de
infecção na câmara sub-estomática leva à colonização das células subsidiárias e do
mesófilo, com formação do micélio intercelular e em seguida, dos haustórios,
responsáveis pela absorção de nutrientes pelo patógeno, dentro das células do
hospedeiro (ZAMBOLIM et al., 2002; 2005a).
6
O vento é o principal agente de disseminação da ferrugem do cafeeiro a
longas distâncias, sendo que a curtas distâncias a chuva tem papel primordial. As
condições favoráveis à germinação dos uredósporos ocorrem à noite, pois a luz inibe
a germinação e o crescimento do tubo germinativo. Temperatura em torno de 22ºC, e
altitudes de 550 até 850m favorecem a doença. Os sintomas podem ser observados
na face inferior das folhas, onde aparecem manchas de coloração amarelo-pálida, de
aspecto pulverulento (uredósporos) e coloração amarelo-alaranjada características.
Na face superior das folhas observam-se manchas cloróticas amareladas, que
posteriormente necrosam. Os principais prejuízos ocasionados pela ferrugem
consistem na redução de área foliar, pela formação de lesões e queda precoce das
folhas, assim como a seca de ramos laterais, com gradual deformação das plantas.
Quando a desfolha ocorre antes do florescimento, pode interferir no desenvolvimento
dos botões florais e na frutificação, e se ocorrer durante a formação dos frutos pode
haver má formação de grãos, afetando a produtividade (ZAMBOLIM et al., 2005a).
A ocorrência e a intensidade de doenças dos cafeeiros são influenciadas por
fatores como a virulência do patógeno, a resistência das plantas, o estado nutricional
e ainda, os fatores ligados ao ambiente, como temperatura, chuva, intensidade de
ventos, umidade relativa, luz e disponibilidade de nutrientes no solo (CARVALHO
et al., 2002). Boa parte desses fatores pode ser manejada de alguma forma, obtendo-
se diminuição do inóculo, aumento na resistência dos cafezais às doenças ou
promoção de condições menos favoráveis ao desenvolvimento dos patógenos. Na
atualidade, as medidas de controle se baseiam quase exclusivamente no método
químico, podendo-se citar, a aplicação via solo, com uso de fungicidas sistêmicos
granulados, que podem ser misturados com inseticidas, e a aplicação via foliar, por
meio da utilização de produtos de contato e/ou sistêmicos (SILVA et al., 1997).
O uso indiscriminado e excessivo de agroquímicos, o cultivo intenso e a
perda de vegetação têm levado ao desequilíbrio ecológico do solo, resultando no
decréscimo da contribuição dos processos biológicos para a nutrição de plantas e
para o controle biológico natural de pragas e doenças, além de outros efeitos, como a
poluição ambiental e a contaminação de alimentos e matérias-primas. Conscientes
disso, os pesquisadores buscam hoje soluções mediante o manejo integrado da
cultura do cafeeiro, visando ao controle dos problemas fitossanitários que afetam a
plantação, com a redução dos impactos causados ao agroecossistema. Para tanto,
uma alternativa adequada e eficiente seria o desenvolvimento de cultivares
7
resistentes, o que reduziria o número de pulverizações com fungicidas, substituindo,
de maneira vantajosa, as variedades tradicionais altamente susceptíveis. No entanto,
o contínuo aparecimento de novas raças tem ocasionado a quebra de resistência das
cultivares produzidas pelos melhoristas com o intuito de conseguir resistência
duradoura a este patógeno (VÁRZEA et al., 2002).
2.2. Aspectos gerais sobre a cultura da soja e a ferrugem asiática
A soja é originária das regiões norte e central da China, onde foi domesticada
há cerca de 5 mil anos, o que faz dela uma das plantas cultivadas mais antigas.
Embora natural da China, os Estados Unidos hoje lideram sua produção. No início do
século XX, os pesquisadores descobriram o valor que a soja oferecia em termos de
proteína e óleo, assim elevando seu prestígio como alimento humano. A produção de
soja como mercadoria de qualidade expandiu a partir da década de 20. Dentre os
grandes produtores mundiais de soja, o Brasil figura como o que apresenta as
melhores condições de expandir a produção e promover o esperado aumento da
demanda mundial. O crescimento e aumento da capacidade competitiva da soja
brasileira sempre estiveram associados aos avanços científicos e à disponibilidade de
tecnologias do setor produtivo (EMBRAPA, 2007).
O Brasil é responsável por cerca de 30% da produção mundial, com a safra de
2005 ao redor de 51 milhões de toneladas. O país é o segundo maior produtor e
exportador de soja em grão, farelo e óleo. O chamado Complexo Soja é um dos
principais itens da Balança Comercial Brasileira e exportou cerca de US$8 bilhões
em 2005, colocando o país na liderança mundial nas exportações do setor em valor
(ABIOVE, 2007). De acordo com o Departamento de Agricultura dos Estados
Unidos, o país produziu cerca de 80 milhões de toneladas de soja em 2005, volume
que esteve disponível na temporada comercial de agosto de 2005 a setembro de
2006. A soma de 107 milhões de toneladas da safra sul-americana, 17 milhões de
toneladas da China e 17 milhões do resto do mundo, resultam em uma produção
global igual a 221 milhões de toneladas de soja na temporada 2005/2006
(ROESSING, 2007).
A soja Glycine max (L.) Merrill é uma planta pertencente à família das
leguminosas. É uma excelente fonte de proteína de uso animal e humano
(GUIMARÃES et al. 2001) e sua cultura representa um dos elementos mais fortes da
8
economia do Brasil, em função do seu grande valor sócio-econômico, determinado
pelas inúmeras aplicações de seus produtos e subprodutos, além da expressão no
mercado interno e externo. Por esses motivos recebe intensa atenção da pesquisa,
para obtenção de informações que possibilitem aumentos na produtividade. Para que
se consigam maiores rendimentos por área, é indispensável, além do emprego de
técnicas adequadas de cultivo, a utilização de sementes de alta qualidade, expressa
pelos atributos genéticos, físicos, fisiológicos e sanitários (BRACCINI, 2003).
Apesar da grande evolução do melhoramento de soja no Brasil, a
monocultura e a adoção de manejo inadequado têm favorecido ao surgimento de
doenças. O crescimento da cultura da soja nas regiões de cerrado do Brasil central
permitiu, sob condições climáticas favoráveis, a ocorrência de grande número de
patógenos, principalmente fúngicos. Uma das doenças mais importantes neste setor é
a ferrugem asiática causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi H. Sydow & Sydow,
que possui alto potencial de dano à lavoura, podendo causar rápido amarelecimento e
queda prematura de folhas, o que prejudica a formação de grãos (YORINORI et al.,
2003). Foi identificada pela primeira vez no Continente Americano em março de
2001 no Paraguai e em maio do mesmo ano, no Brasil, a oeste e norte do Paraná
(ALMEIDA et al., 2005). Em função de sua fácil disseminação com o vento pode ser
encontrada em praticamente todas as regiões produtoras do Brasil com reduções de
até 75% de produtividade (YORINORI, 2002).
O fungo P. pachyrhizi pertence à ordem Uredinales e família
Phakopsoraceae, sendo parasita biotrófico (ZAMBENEDETTI, 2005). A penetração
na folha do hospedeiro é direta entre as junções da célula epidérmica. Para germinar
os uredósporos precisam formar um tubo germinativo curto, delimitado por um
apressório, terminando em um septo. Da base do apressório, desenvolve um peg de
penetração que penetra pela cutícula do hospedeiro e pela parede da célula
epidermal. Uma vez dentro da célula epidermal o peg de penetração expande-se para
formar a vesícula epidermal e logo depois a hifa de penetração que atravessa a célula
da epiderme e emerge no espaço intercelular e no tecido do mesófilo. Um septo é
formado na porção intercelular da hifa de penetração, enquanto a hifa primária se
estende para formar a hifa secundária (ZAMBENEDETTI et al., 2007).
Neste tipo de penetração pode ocorrer uma série de eventos que levam à
formação de barreiras estruturais pela planta, os quais podem levar à resistência ao
patógeno. Os sintomas podem ser observados de maneira mais característica nas
9
folhas, iniciando como minúsculos pontos (no máximo 1 mm de diâmetro) mais
escuros que o tecido sadio da folha, com correspondente protuberância (urédio) na
face inferior da folha. Progressivamente os urédios abrem-se em um minúsculo poro,
expelindo os uredósporos. À medida que prossegue a esporulação, o tecido da folha
ao redor dos urédios adquire coloração castanha formando lesões visíveis em ambas
as faces da folha. Os urédios que deixaram de esporular apresentam pústulas,
nitidamente, com os poros abertos. As folhas infectadas amarelam, secam e caem
prematuramente (ALMEIDA et al., 2005).
O controle da ferrugem asiática requer diversas medidas conjuntas. Quando a
doença já está instalada, o uso de fungicidas é, até o momento, o principal método de
controle. Outras medidas de controle são: utilizar cultivares mais precoces, semeadas
no início da época recomendada para cada região; evitar o prolongamento do período
de semeadura; vistoriar as lavouras; observar se há condições de temperatura e alta
umidade, favoráveis ao patógeno (YORINORI & WILFIDO, 2002). Ainda não se
têm entre as cultivares recomendadas materiais com bom nível de resistência, devido
em parte à recente ocorrência da doença no país e ao fato do fungo possuir diversas
raças com genes múltiplos de virulência (SINCLAIR & HARTMAN, 1995). Apesar
de todos os esforços da área de melhoramento genético e biotecnológico na obtenção
de cultivares resistentes às doenças mais destrutivas, a cultura da soja ainda não pode
abrir mão da proteção química com fungicidas, pois só produz econômica e
estavelmente se for adequadamente protegida (AZEVEDO, 2001).
2.3. A utilização do Acibenzolar-S-Metil na indução de resistência
A constante necessidade humana de controlar as doenças ocorrentes em
plantas exploradas economicamente tem ocasionado graves desequilíbrios no
ambiente, devido ao uso indiscriminado de defensivos químicos, resultando na
contaminação de alimentos, animais e reservas hídricas, além de provocar a seleção
de novas raças mais agressivas (BONALDO et al., 2005). E neste contexto, uma
sociedade cada vez mais preocupada com o meio ambiente, a utilização de produtos
ecologicamente corretos, de baixo custo e com bom nível de controle, representa um
avanço na agricultura (GUZZO et al., 2001). A indução de resistência em plantas
contra fitopatógenos representa um método alternativo no controle de doenças, a qual
ativa os mecanismos de defesa latentes na planta. A defesa induzida envolve um
10
sistema de vigilância da planta hospedeira, que reconhece de alguma forma o contato
estabelecido com o patógeno, seguido pela transdução de sinais, alertando sobre a
presença do mesmo, e por fim, envolve a expressão de genes relacionados à defesa
(LAMB et al., 1989).
A resistência de um hospedeiro, dentro do contexto da fisiologia do
parasitismo, pode ser definida como a capacidade da planta em atrasar ou evitar a
entrada e/ou a subseqüente atividade de um patógeno em seus tecidos. Cada
interação hospedeiro-patógeno pode ser encarada como uma luta entre dois
organismos pela sobrevivência. As plantas podem se defender dos agentes
fitopatogênicos passiva ou ativamente. Os fatores de resistência pré-formados
incluem aqueles já presentes nas plantas antes do contato com os patógenos. No caso
dos pós-formados, estes se mostram ausentes ou presentes em baixos níveis antes da
infecção, sendo produzidos ou ativados em resposta à presença dos patógenos.
Dentre esses fatores estão as respostas bioquímicas que ocorrem nas células do
hospedeiro produzindo substâncias que se mostram tóxicas ao patógeno ou criando
condições adversas para o crescimento do mesmo no interior da planta
(PASCHOLATI & LEITE, 1995).
A resistência induzida consiste no aumento do nível de resistência por meio
da utilização de agentes externos (indutores), sem qualquer alteração do genoma da
planta, sendo estes agentes bióticos ou abióticos (RESENDE et al., 2004). Pode
ocorrer em condições controladas e também no campo, além de exibir vantagens
como: efetividade contra vírus, bactérias, fungos e nematóides; estabilidade devido à
ação de diferentes mecanismos de resistência; caráter sistêmico, persistente e natural
da proteção; transmissão por enxertia; economia metabólica e utilização do potencial
genético para resistência em todas as plantas susceptíveis (PASCHOLATI, 2002).
Como desvantagens: é resistência parcial, incompleta e que pode requerer
reativações temporárias. Por outro lado, por ser parcial e inespecífica, a resistência
induzida não impõe pressão de seleção sobre o patógeno, dificultando assim a quebra
de resistência (SILVA & RESENDE, 2001).
Resistência sistêmica adquirida (RSA) e resistência sistêmica induzida (RSI)
são fenômenos distintos, mas fenotipicamente semelhantes, no sentido de que as
plantas após exposição a um agente indutor têm seus mecanismos de defesa ativados
não apenas no sítio de indução, como também em outros locais distantes dele, de
forma mais ou menos generalizada (STICHER et al., 1997). Assim, tem-se assumido
11
que a RSA envolve o acúmulo de proteínas-RP (proteínas relacionadas à patogênese)
como mecanismos induzidos de defesa da planta, sendo sua indução salicilato-
dependente, podendo resultar em alterações visuais (necroses, por exemplo) na
planta que sofreu indução e é geralmente induzida por patógenos ou ativadores
químicos. No caso da RSI, não há acúmulo de proteínas-RP, a planta que sofreu
indução não exibe alterações, o agente indutor é usualmente um microorganismo
não-patogênico e sua indução não é salicilato-dependente, havendo outra rota de
sinalização associada à jasmonatos e etileno (BONALDO et al., 2005).
Entre os agentes químicos abióticos, o produto Acibenzolar-S-Metil (ASM)
interfere nos processos fisiológico-bioquímicos das plantas, sendo um promissor
indutor de resistência vegetal, possibilitando a proteção em condições de campo,
contra um amplo espectro de patógenos em diversos cultivos (GÖRLACH et al.,
1996). Em 2001 essa substância foi registrada no Brasil, sob a marca comercial
Bion
®
como o primeiro representante de uma nova classe de produtos para a proteção
de diversas culturas, os ativadores de plantas (CASTRO, 2002). A molécula do
produto é um éster S-metil do ácido benzo (1,2,3) tiadiazole-7carbotióico, a qual tem
sido empregada como indutor de resistência em várias espécies vegetais como
pepino, fumo, tomate, trigo e inclusive café com redução da severidade da doença
em até 60% (NOJOSA, 2003). O referido composto tem se mostrado mais eficiente
na indução de resistência quando comparado ao ácido salicílico (AS), além de
apresentar baixa fitotoxidez (GÖRLACH et al., 1996). Apesar de apresentar
mecanismo de ação como mensageiro secundário semelhante ao AS, o ASM parece
atuar independente de qualquer molécula sinal, levando à expressão de genes
relacionados à RSA (BENHAMOU & BÉLANGER, 1998).
2.4. Ativação de mecanismos de defesa
Diversos mecanismos podem ser ativados durante o fenômeno de indução de
resistência (CAVALCANTI et al., 2005). A comparação dos níveis de síntese de
proteínas entre tecidos infectados e sadios revela que os tecidos infectados sofrem
aumento considerável desta atividade. A planta procura ativar todas as linhas de
defesa para evitar o estabelecimento de relações parasitárias e o patógeno tenta
anular o efeito inibitório gerado (GÓMEZ-GOMEZ, 2004). Dentre algumas
proteínas produzidas ligadas à reação de hipersensibilidade, encontram-se proteínas
12
relacionadas com a patogênese (RESENDE et al., 2000). Enzimas envolvidas na
respiração, enzimas envolvidas com a fotossíntese e enzimas relacionadas com o
metabolismo de fenilpropanóides exibem aumentos na atividade em tecidos
infectados e têm sido sistematicamente correlacionadas com a ativação de
mecanismos de reparo dos tecidos infectados e/ou injuriados (LEITE &
PASCHOLATI, 1995).
As
β
-1,3-glucanases (1,3-
β
-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.39)
(ENZYME NOMENCLATURE, 2007) catalisam a hidrólise das
β
-1,3-glucanas. São
comumente encontradas nas plantas e essa evidente abundância está relacionada com
o envolvimento no mecanismo de defesa à ação de patógenos (SIMMONS, 1994).
São importantes para diversos processos fisiológicos nos vegetais (MOROHASHI &
MATSUSHIMA, 2000). O tipo de infecção e a histologia têm indicado que a
resistência da planta à ferrugem das folhas está intimamente associada a um
mecanismo de resposta de hipersensibilidade (HR) (JACOBS et al., 1996). O HR,
por sua vez, é acompanhado pela indução de numerosos componentes de defesa, ou
seja, a acumulação de proteínas relacionadas com a patogênese. Entre elas, as
β
-1,3-
glucanases tem recebido considerável atenção por ser forte inibidora do crescimento
de muitos fungos em cultura, indicando que elas podem ter uma função direta como
antifúngicas (JI & KUC, 1996; MAUCH et al., 1988).
Essas hidrolases ocorrem normalmente nas plantas (flores, folhas e raízes) e
podem estar envolvidas na defesa das mesmas contra fungos, uma vez que os
polímeros acima se mostram como os principais constituintes da parede celular
fúngica, provocando a liberação de elicitores oligossacarídicos (HAM et al., 1991;
OKINAKA et al., 1995). O potencial antimicrobiano das
β
-1,3-glucanases tem sido
testado com sucesso in vivo pela manipulação de sua expressão em plantas
transgênicas (JACH et al., 1995). Relativamente pouco se sabe a respeito do tempo
de indução do mecanismo de resposta de defesa durante as infecções de ferrugem
(ANGUELOVA-MERHAR et al., 2001). Além disso, a atividade dessas enzimas
também pode ser elevada nos tecidos vegetais em resposta à infecção e a tratamentos
hormonais e químicos. Exibem formas ácidas e básicas. As formas básicas ocorrem,
de modo geral, intracelularmente (nos vacúolos) e as ácidas, extracelularmente (nos
espaços intercelulares) (LEITE & PASCHOLATI, 1995).
13
As quitinases (poly [1,4-(N-acetyl-
β
-D-glucosaminide)] glycanohydrolase,
EC 3.2.1.14) (ENZYME NOMENCLATURE, 2007) catalisam a hidrólise da quitina
(um polímero de N-acetilglucosamina). Nenhum substrato para este grupo de
enzimas tem sido identificado em plantas, entretanto, quitina é um componente da
parede celular de fungos e exoesqueletos de artrópodes, organismos que incluem
muitos patógenos e pestes importantes (WEN-CHI et al., 1998). As plantas
respondem ao ataque de microorganismos, insetos e animais pela indução de genes
que codificam diversas proteínas, que podem estar relacionadas com a defesa (BOL
et al., 1990; BOWLES, 1990; COLLINGE et al., 1993; DIXON & HARRISON,
1990; LINTHORST, 1991; PUNJA & ZHANG, 1993). Estudos com plantas
transgênicas mostram aumento na síntese de quitinases relacionado com a
diminuição dos danos causados pelos patógenos (BROGLIE et al., 1991).
Essas hidrolases ocorrem normalmente nas plantas (folhas, flores e raízes) e
são induzidas como resultado de infecções patogênicas bem como por agentes
abióticos (LEE & HWANG, 1996; NEUHAUS, 1999). É um potente inibidor do
crescimento de fungos em cultura, o que indica sua atuação antifúngica nas plantas
(MAREK et al., 2000). Além disso, a atividade dessas enzimas também pode ser
elevada nos tecidos vegetais em resposta à infecção e a tratamentos hormonais e
químicos. As quitinases atuam em pH ácido e básico. As formas básicas ocorrem, de
modo geral, intracelularmente (nos vacúolos) e as ácidas, extracelularmente (nos
espaços intercelulares). Vários trabalhos indicam que as formas extracelulares
possuem uma função imediata na defesa das plantas, com ação direta sobre as hifas
invasoras (ação fúngica). Esta ação provoca a liberação de elicitores
oligossacarídicos a partir das paredes fúngicas (LEAH et al., 1991; LEITE &
PASCHOLATI, 1995; MOHAMMADI et al., 2002).
As lipoxigenases (linoleate:oxygen 13-oxidoreductase, EC 1.13.11.12)
(ENZYME NOMENCLATURE, 2007) estão amplamente distribuídas em plantas e
animais superiores. Catalisam a adição do oxigênio molecular ao sistema cis, cis-1,4-
pentadieno dos ácidos graxos polinsaturados, formando hidroperóxidos dos ácidos
graxos correspondentes e contêm ferro não-heme, necessário para sua atividade
catalítica (BUNKER et al., 1995; MACK et al., 1987; VICK & ZIMMERMAN,
1987). As lipoxigenases vegetais utilizam ácido linolênico ou ácido linoléico como
substrato e estão envolvidas na biossíntese de compostos regulatórios, como o ácido
jasmônico (FARMER & RYAN, 1992; FORTUNATO et al., 2007), crescimento e
14
desenvolvimento (SIEDOW, 1991), senescência (ROUET-MAYER et al., 1992),
germinação de sementes (PARK et al., 1994), resposta a ferimento (VIEIRA et al.,
2001), reserva vegetativa (STEPHENSON et al., 1998) e resistência a insetos e
patógenos (BELL & MULLET, 1993; BOHLAND et al., 1997; FIDANTSEF &
BOSTOCK, 1998; HEITZ et al., 1997; SARAVITZ & SIEDOW, 1996).
Durante um processo de estresse ocorrem danos físicos às células e, em razão
disso, uma degradação seqüencial de lipídeos pode ser iniciada pelas lipoxigenases.
Essas formam hidroperóxidos dos ácidos graxos, que são rapidamente metabolizados
para formar vários produtos (SILVA et al, 2001). Dentre estes, estão a traumatina,
envolvida na resposta a ferimentos e na indução da divisão celular e formação de
calos (SIEDOW, 1991), o ácido jasmônico, associado à ativação de genes que
codificam para a síntese de proteínas de reserva e inibidores de proteases (MELAN
et al., 1993), os aldeídos voláteis e oxiácidos, que causam efeito inibitório sobre o
crescimento de fungos patogênicos (VAUGHN & GARDNER, 1993), insetos e
protozoários (CROFT et al., 1993).
A fenilalanina amônia-liase (L-phenylalanine ammonia-lyase EC 4.3.1.5)
(ENZYME NOMENCLATURE, 2007) exerce papel fundamental catalisando a
conversão de L-fenilalanina a ácido trans-cinâmico (SCHUSTER & RÉTEY, 1995;
SMITH & BANKS, 1986), numa reação de deaminação (CAMPOS et al., 2003).
Esta reação é considerada um passo essencial na via de fenilpropanóides porque
provê um ponto de entrada para a biossíntese de um grande número de produtos
derivados do esqueleto de fenilpropano e tem sido extensivamente estudada pela
importante participação no fenômeno de resistência sistêmica adquirida (MORAES,
1998). Estes produtos incluem lignina e fitoalexinas isoflavonóides, ambos
envolvidos nas reações de defesa das plantas (HAHLBROCK & SCHEEL, 1989). A
síntese de fenilpropanóides é ativada como uma resposta ao estresse que inclui a
infecção por patógenos.
Lignina é o produto principal do metabolismo de fenilpropanóides e o
depósito de lignina para reforçar as paredes celulares das plantas é um mecanismo de
defesa induzido usado para proteção contra invasão de patógenos (LAMB et al.,
1989; LIANG et al., 1989). A inibição específica de lignificação através de
inibidores da enzima aumenta a susceptibilidade à doença da ferrugem causada por
fungos. A indução da lignificação está diretamente correlacionada com síntese
aumentada desta enzima e de enzimas adicionais envolvidas no metabolismo de
15
fenilpropanóides (MOERSCHBACHER et al., 1990). O mecanismo de resistência
das plantas SAR induzido por patógenos ou agentes químicos possui um grande
espectro de atuação no processo de defesa. As fitoalexinas, substâncias antibióticas
de baixo peso molecular (PELICICE et al., 2000; SEKI et al., 1999), e as enzimas
que catalisam sua síntese aparecem em baixas concentrações ou ausentes em plantas
saudáveis, mas elas podem ser sintetizadas quando as plantas são expostas a certos
estresses bióticos e abióticos (CHET, 1993).
As peroxidases (donor; hydrogen-peroxide oxidoreductase, EC 1.11.1.7)
(ENZYME NOMENCLATURE, 2007) catalisam a oxidação de componentes
celulares, tais como H
2
O
2
ou peróxidos orgânicos (KVARATSKHELIA et al., 1997).
Em plantas, constituem proteção antioxidativa. A atividade de peroxidases pode
aumentar em plantas submetidas a diversos tipos de estresse (ROSSI & LIMA,
2001). Sob condições de estresse, as plantas tendem a aumentar a atividade de
peroxidases e, às vezes, são as primeiras a terem atividade alterada,
independentemente do substrato utilizado ou do estresse aplicado (SIEGEL, 1993). A
existência de múltiplas formas de peroxidase em plantas é conhecida há anos, mas a
relação das isoenzimas com suas funções biológicas específicas não está clara.
Contudo, aumentos na atividade de peroxidases são relatados durante a infecção de
plantas superiores por patógenos. Sugere-se que as diferentes formas de peroxidases
que tem sua atividade aumentada durante a infecção atuam inibindo o crescimento
dos patógenos, talvez através da participação na biossíntese de compostos fenólicos
(SEEVERS et al., 1971).
Os compostos fenólicos são antifúngicos, antibacterianos e antivirais
reconhecidos e ocorrem em plantas. O primeiro passo do mecanismo de defesa em
plantas envolve uma acumulação rápida de fenóis no local da infecção que restringe
ou reduz a velocidade do crescimento dos patógenos. Além disso, as peroxidases
podem oxidar fenóis para formar quinonas, mais tóxicos e que também exercem um
papel integrante dentro do sistema de defesa dos vegetais (GOGOI et al., 2001). Em
plantas, o aumento da produção de radicais superóxidos e de H
2
O
2
é uma
característica comum de respostas de defesa para desafiar os patógenos microbianos
e os elicitores (BESTWICK et al., 1998; LAMB & DIXON, 1997). Aumentos na
atividade de peroxidases durante as interações incompatíveis planta-patógeno são
intimamente associados com uma progressiva incorporação de compostos fenólicos
dentro da parede celular (FINK et al., 1991; GRAHAM & GRAHAM, 1991;
16
MILOSEVIC & SLUSARENKO, 1996; REIMERS et al., 1992). Tem sido proposto
que um rápido aumento de H
2
O
2
intra ou extracelular está envolvido na indução ou
execução do mecanismo HR (LEVINE et al., 1994; LOW & MERIDA, 1996).
As polifenoloxidases (1,2-benzenediol: oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.1)
(ENZYME NOMENCLATURE, 2007) ocorrem em plantas, animais, e fungos
(WHITAKER, 1994). Estas enzimas contêm cobre no centro ativo e catalisam dois
tipos de reações, ambas envolvendo oxigênio. A primeira reação corresponde à
hidroxilação de monofenóis formando orto-difenóis e a segunda à oxidação de
ortodifenóis formando orto-quinonas. As polifenoloxidases atuam sobre uma grande
variedade de substratos. Citam-se p-cresol, tirosina e ácido p-cumárico como
substratos monofenólicos, enquanto catecol, diidroxifenilalanina e ácido clorogênico
substratos difenólicos. As polifenoloxidases estão envolvidas no escurecimento de
frutas, vegetais, cereais e leguminosas (GOMES et al., 2001). A mudança indesejável
na cor, no sabor e na textura das frutas e dos vegetais é associada com as
polifenoloxidases, que são pertencentes ao grupo das oxirredutases (CLEMENTE &
PASTORE, 1998).
Polifenoloxidases são enzimas que freqüentemente aumentam sua atividade
em resposta ao estresse, e um de seus principais papéis parece ser o de promover a
proteção da célula (SIEGEL, 1993; SOARES et al., 2004). Participa de um variado
número de reações, e por esta razão exibe um dos graus de maior versatilidade que
qualquer outra enzima (TROIANI et al., 2003). Podem catalisar inúmeras reações de
oxidação nas plantas (McLELLAN & ROBINSON, 1984), embora a peroxidase
também esteja envolvida na oxidação enzimática (VALERO et al., 1988). A
importância da atividade das polifenoloxidases na resistência a doenças deve-se
provavelmente à propriedade de oxidar compostos fenólicos em quinonas, os quais
são muito mais tóxicos aos microorganismos do que o fenol original, e à sua ação
protetora no local do ferimento.
2.5. Utilização de silicatos na indução de resistência a doenças
A nutrição de plantas determina em grande parte a sua resistência ou
susceptibilidade a doenças, sua estrutura morfológica ou histológica, a função de
tecidos para rápida ou lenta patogênese, a virulência e habilidade do patógeno para
sobreviver. Os elementos minerais são necessários para síntese de barreiras químicas
17
e físicas, ou a mudança de substâncias no metabolismo ao redor do sítio de infecção.
A resistência também pode ser concedida pela ausência de um nutriente essencial à
atividade patogênica. Quando a demanda metabólica por determinado nutriente é
maior que seu suprimento pelo meio externo, diversos mecanismos são acionados
para a manutenção do equilíbrio bioquímico e fisiológico da planta. O principal
método de controle das inúmeras patogenias é o químico, contudo, uma prática
alternativa é manejar a nutrição mineral para aumentar a resistência à doença
(MARSCHNER, 1995). Dentre os nutrientes minerais utilizados, o Silício (Si)
destaca-se por reduzir a severidade de importantes doenças (EPSTEIN, 1999).
O Si é o segundo elemento mais abundante da crosta terrestre. Encontra-se na
solução do solo na forma monomérica ou ácido monosilícico (H
4
SiO
4
), prontamente
absorvido pelas plantas (KORNDÖRFER, 2006). O Si é classificado por muitos
autores como elemento benéfico ou útil devido aos efeitos positivos observados,
como maior tolerância ao déficit hídrico, maior resistência à toxidade de metais
pesados, e maior resistência a doenças e pragas (POZZA, et al., 2004a). Resultados
promissores foram encontrados em vários patossistemas, como redução da brusone,
mancha parda e queima das bainhas em plantas de arroz, cercosporiose do cafeeiro,
cancro da haste em plantas de soja e gomose em citrus e menor incidência de oídio
em plantas de aveia, pepino, melão e uva, quando as culturas foram adubadas com Si
(BOWEN et al., 1992; CARVER et al., 1998; DATNOFF et al., 1991; 1997;
FAGGIANI, 2002; LIMA, 1998; MENZIES et al., 1992; POZZA et al., 2004b;
RODRIGUES, 2000; SANTOS, 2002; SAMUELS et al., 1991).
O efeito do Si no controle de doenças de plantas, seu modo de ação e sua
atuação na epidemia de diversos patossistemas ainda não estão totalmente
esclarecidos. Existe a hipótese de formação de barreira física, fundamentada na
forma do Si acumular-se nas plantas. Em seu movimento ascendente via apoplasto
desde as raízes até as folhas, o Si polimeriza-se nos espaços extracelulares,
acumulando-se nas paredes das células epidérmicas das folhas e dos vasos do ximela
(FAWE et al., 2001). Contudo, a alteração da nutrição da planta promovida pela
suplementação silicatada e a observação de aumento na atividade de enzimas e
presença de fitoalexinas levantaram também a hipótese de seu envolvimento na
indução das reações de defesa da planta (BÉLANGER et al., 2003; BÉLANGER &
MENZIES, 2003; POZZA et al., 2004; RODRIGUES et al., 2003). Os estudos de Si
no controle de doenças tiveram início com monocotiledôneas, pois estas absorvem
18
grandes quantidades deste nutriente, porém o interesse pelo estudo em patossistemas
envolvendo dicotiledôneas surgiu na segunda metade do século passado,
centralizando-se principalmente nos estudos com oídios.
O Si é absorvido pelas plantas como ácido monosilícico, porém seu teor é
variável entre as espécies. São classificadas como plantas acumuladoras de Si
aquelas cujos teores são superiores a 1% na matéria seca e não-acumuladoras plantas
com menos de 0,5% (MARSCHNER, 1995). Como exemplos de plantas
acumuladoras têm-se as gramíneas como arroz, cana-de-açúcar, trigo e cevada, já as
plantas não-acumuladoras podem ser exemplificadas pelo tomate, batata e café.
Ainda existem as plantas intermediárias na absorção de Si cujos teores variam entre
0,5 a 1% na matéria seca, sendo que a soja, morango e pepino exemplificam esta
classe (MA et al., 2001). A diferença no acúmulo de Si entre as espécies de plantas, é
resultado da diferença na habilidade de absorver silício, e desta maneira as plantas
também são classificadas quanto à absorção em: as que apresentam absorção ativa,
mais rápido que a absorção da água, passiva, similar a do fluxo da água, e as que
rejeitam, absorvendo mais lentamente que a absorção de água (MA & TAKAHASHI,
2002; TAKAHASHI et al., 1990).
As principais fontes de Si utilizadas são as escórias siderúrgicas (silicato de
cálcio - CaSiO
3
), resíduos provenientes da metalurgia do ferro no Brasil e Japão
obtido de usinas de aço e da fabricação de fosfato tricálcico nos Estados Unidos
(GASCHO, 2001). Trabalhos recentes apontam como uma excelente fonte de Si,
auxiliando na correção do pH do solo e promovendo o incremento de acúmulo de Si
em espécies como o capim braquiária (PRADO et al., 2007), aumentando a
concentração de Si disponível no solo (FONSECA et al., 2007), redução na
concentração de Al trocável no perfil do solo e aumento na produção de cana-de-
açúcar (NOLLA & KORNDÖRFER, 2007) e ainda maior disponibilidade de P no
solo e aumento da produção de tubérculos de batata (CRUSCIOL et al., 2007). Como
fontes de silício existem ainda: silicato de magnésio (MgSiO
3
), proveniente de
siderurgia, embora com baixa solubilidade (GASCHO, 2001); wollastonita, como
silicato de cálcio puro, a qual é amplamente empregada na pesquisa (RODRIGUES,
2000); o silicato de sódio (Na
2
SiO
3
) como fonte para aplicação via foliar e solo; e o
silicato de potássio (K
2
SiO
3
) utilizado em solução nutritiva e via foliar,
principalmente visando o controle de doenças (KANTO et al., 2004; LIANG, et al.,
2005; MENZIES et al., 1992).
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Ensaios em casa de vegetação
3.1.1. Cultura do cafeeiro
Mudas de cafeeiro da variedade Catuaí Vermelho 44 com 3 pares de folhas
abertos, altamente susceptível à ferrugem, provenientes do banco de germoplasma do
Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de Viçosa-MG, foram dispostas
em bandejas num delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 4.
Um total de 90 mudas de cafeeiro foram utilizadas por cada tratamento. Os fatores
estudados foram: inoculação ou não inoculação da face inferior das folhas das mudas
de café com H. vastatrix e aplicação dos seguintes tratamentos: 1- pulverização com
água destilada (controle); 2- pulverização com silicato de potássio na dose de 35 g/L
e pH 10,2; 3- pulverização com silicato de potássio na dose de 35 g/L e pH 5,5
(correção do pH feita com solução de H
3
PO
4
5 M); 4- pulverização com
Acibenzolar-S-Metil (ASM) (padrão de indução de resistência) na dose de 200 µg/L.
Pulverizou-se o 2
o
e o 3
o
par de folhas de cada muda de cafeeiro com cada um
dos tratamentos listados acima utilizando um atomizador Paasche (modelo VL-SET)
alimentado por sucção, considerando-se o primeiro par de folhas abaixo da gema
apical. Vinte quatro horas após a aplicação dos tratamentos, foi realizada a
inoculação da face abaxial dos dois pares de folhas (2º e 3º) de cada muda, com uma
suspensão de uredósporos de H. vastatrix de concentração 1 mg/mL, com auxílio de
um atomizador Paasche (modelo VL-SET) alimentado por sucção.
O inóculo foi obtido a partir de plantas de cafeeiro (cv. Catuaí vermelho 44)
com sinais de ferrugem causados pela raça II de H. vastatrix. Recolheram-se os
uredósporos com o auxílio de um pincel de cerdas macias, raspando-se suavemente
as pústulas da superfície abaxial das folhas. Após a inoculação, as plantas foram
transferidas para câmara úmida (UR > 95%, 23-25ºC), onde permaneceram no escuro
por 48 h. Após esse período, as mudas foram levadas para câmara de crescimento a
22ºC, onde permaneceram durante a condução dos experimentos.
Avaliou-se o número de pústulas por folha de cada muda e a severidade final
da ferrugem aos 36 dias após inoculação das mudas. Um total de 55 folhas por
tratamento foi utilizado para avaliação desses dois componentes de resistência. A
20
severidade da ferrugem foi avaliada seguindo uma escala desenvolvida por
KUSHALAPPA & CHAVES (1978).
Folhas de mudas de cafeeiro de cada tratamento e repetição foram coletadas
ao final do experimento para determinação do teor foliar de Si e de K. As folhas
foram lavadas com água de torneira, seguida por água deionizada e uma solução de
HCl 0,1 M, finalizando o enxágüe com água deionizada. Em seguida, as folhas foram
secas em estufa com ventilação forçada de ar a 60ºC por 72 h, sendo então trituradas
em moinho tipo Wiley equipado com peneira de 20 mesh. A metodologia proposta
por KORNDÖRFER et al. (2004) foi utilizada para determinação do teor foliar de Si.
A determinação do teor foliar de K foi realizada por digestão nitroperclórica e
espectrofotometria de absorção atômica (SILVA et al., 1999).
3.1.2. Cultura da soja
Um total de 8 sementes de soja da variedade Conquista, altamente susceptível
à ferrugem asiática, provenientes do banco de germoplasma do Departamento de
Fitotecnia da Universidade Federal de Viçosa-MG, foram plantadas em vasos com
capacidade para 2 Kg. Após a germinação, efetuou-se o desbaste, deixando-se 4
plantas por vaso. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente
casualizado em esquema fatorial 2 x 4 com 5 repetições. Os fatores estudados foram:
inoculação ou não inoculação da face inferior das folhas das plantas de soja com P.
pachyrhizi e aplicação dos seguintes tratamentos: 1- pulverização com água destilada
(controle); 2- pulverização com silicato de potássio na dose de 40 g/L e pH 10,2; 3-
pulverização com silicato de potássio na dose de 40 g/L e pH 5,5 (correção do pH
feita com solução de HCl 6 M); 4- pulverização com Acibenzolar-S-Metil (ASM)
(padrão de indução de resistência) na dose de 0,625 g/L.
A face inferior das folhas de cada planta de soja (estádio V6) foi pulverizada
com cada um dos tratamentos listados acima utilizando um atomizador Paasche
(modelo VL-SET) alimentado por sucção 24 h antes da inoculação com P.
pachyrhizi. Após esse período, as plantas foram inoculadas com a suspensão de
uredósporos com o auxílio de um atomizador Paasche (modelo VL-SET) alimentado
por sucção. Após a inoculação, as plantas foram transferidas para câmara úmida (UR
> 95%, 23-25ºC), onde permaneceram no escuro por 24 h. Após esse período, as
21
plantas foram levadas para casa de vegetação (UR ≈ 75%, 22 ± 2°C), onde
permaneceram durante a condução dos experimentos.
Para produção de inóculo, as plantas de soja foram inoculadas com P.
pachyrhizi e mantidas em casa de vegetação. O inóculo utilizado no experimento foi
obtido mergulhando-se as folhas de soja com sinais de ferrugem em solução de
gelatina 5g/L e Tween 80 a 0,01 %, em água destilada e esterilizada. As folhas foram
raspadas com pincel pêlo de camelo número 4 para remover o uredósporos. Após
raspagem, a suspensão de uredósporos foi filtrada em gaze e a concentração do
inóculo de P. pachyrhizi foi ajustada para 10
5
/mL.
Avaliou-se a severidade da ferrugem asiática aos 16 dias após inoculação das
plantas de soja utilizando-se 1 folha (3 folíolos) por planta. A severidade da ferrugem
asiática foi avaliada utilizando uma escala proposta por GODOY et al. (2006). Os
dados de severidade em cada folha da planta por tratamento e repetição foram
submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos comparadas pelo teste
de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Folhas de plantas de soja de cada tratamento e repetição foram coletadas ao
final do experimento para determinação do teor foliar de Si e de K. As folhas foram
lavadas com água de torneira, seguida por água deionizada e uma solução de HCl 0,1
M, finalizando o enxágüe com água deionizada. Em seguida, as folhas foram secas
em estufa com ventilação forçada de ar a 60ºC por 72 h, sendo então trituradas em
moinho tipo Wiley equipado com peneira de 20 mesh. A metodologia proposta por
KORNDÖRFER et al. (2004) foi utilizada para determinação do teor foliar de Si. A
determinação do teor foliar de K foi realizada por digestão nitroperclórica e
espectrofotometria de absorção atômica (SILVA et al., 1999).
3.2. Ensaios bioquímicos
3.2.1. Cultura do cafeeiro
Para determinação da atividade de enzimas relacionadas com a defesa do
cafeeiro à ferrugem, coletaram-se folhas de mudas de café aos 1, 2, 4, 14 e 36 dias
após a inoculação com H. vastatrix. Folhas de mudas de cafeeiro não inoculadas
também foram coletadas nessas mesmas datas. Cada amostra coletada foi composta
por 3 folhas retiradas de cada muda para cada enzima por tratamento, perfazendo um
22
total de 3 amostras, sendo que 3 mudas (repetições) foram envolvidas para cada
amostra coletada. As amostras foram armazenadas individualmente em pacotes de
papel alumínio e imediatamente congeladas em N
2
líquido, sendo, em seguida,
armazenadas em freezer -80°C para posterior análise. De cada extrato foliar obtido
procederam-se aos ensaios enzimáticos em triplicata. As médias dos valores da
atividade de cada enzima em cada época de coleta, dentro de cada tratamento, entre
as plantas inoculadas e não inoculadas foram comparadas pelo teste t ao nível de 5%
de probabilidade.
3.2.2. Cultura da soja
Para determinação da atividade de enzimas relacionadas com a defesa da soja
à ferrugem asiática, coletaram-se folhas das plantas de soja às 24, 36, 48, 168 e 384 h
após a inoculação com P. pachyrhizi. Folhas de plantas de soja não inoculadas
também foram coletadas nessas mesmas épocas. Cada amostra coletada foi composta
por 3 folíolos (1 folha) retirados de cada planta para cada enzima por tratamento,
perfazendo um total de 3 amostras, sendo que 3 plantas (repetições) foram
envolvidas para cada amostra coletada. As amostras foram armazenadas
individualmente em pacotes de papel alumínio e imediatamente congeladas em N
2
líquido, sendo, em seguida, armazenadas em freezer -80°C para posterior análise. De
cada extrato foliar obtido procederam-se aos ensaios enzimáticos em triplicata. As
médias dos valores da atividade de cada enzima em cada época de coleta, dentro de
cada tratamento, entre as plantas inoculadas e não inoculadas foram comparadas pelo
teste t ao nível de 5% de probabilidade.
3.3. Determinação da atividade enzimática em plantas de café e soja
3.3.1.
β
-1,3-glucanases (GLU)
A obtenção do extrato foliar foi feita segundo metodologia descrita por
LANNA et al. (1996). Amostras de folhas foram pesadas e imediatamente
congeladas em N
2
líquido. Em seguida, foram trituradas no almofariz até obtenção de
um pó fino. Feito isso, adicionou-se polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1% (p/v), ou
seja, 1 g de PVPP para cada 100 mL de meio de extração que foi adicionado, e
23
fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1mM, cuja quantidade foi calculada com base
no volume final da extração. Posteriormente, macerou-se em tampão para extração
fosfato de sódio 50 mM pH 6,5 na proporção de 1:3 (p/v), isto é, a cada 1 g de
material vegetal foram adicionados 3 mL de tampão. Preparou-se uma seringa com
um pequeno pedaço de gaze, dobrado em quatro camadas, umedecida com água e foi
feita a filtração do macerado obtido para tubos de centrífuga. Estabilizou-se a
centrífuga nas condições necessárias, a saber: velocidade: 20.000 x g; temperatura:
4°C; tempo: 25 minutos. O sobrenadante após a centrifugação é o extrato bruto e foi
armazenado à 4°C para posterior detecção da atividade enzimática. Uma alíquota do
extrato foi utilizada para determinação da concentração de proteínas seguindo o
procedimento desenvolvido por WARBURG & CHRISTIAN (1941).
A atividade de
β
-1,3-glucanases nas amostras foi determinada conforme
método descrito por LEVER (1972), com modificações: ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNS) em substituição à hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (MILLER, 1956). A
mistura de reação, que foi incubada a 45°C por 30 minutos, continha 230 μL do
tampão de reação acetato de sódio 100 mM pH 5,0, 250 μL da solução de substrato
laminarina 4 mg/mL e 20 μL do extrato vegetal. Após esse período, foram
acrescentados 1 mL de DNS, e em seguida esta mistura foi aquecida a 100°C por 5
minutos. Após resfriamento em gelo até temperatura de 30°C, as amostras tiveram a
absorbância determinada no comprimento de onda 540 nm em um ensaio
colorimétrico no espectrofotômetro. Todas as incubações foram realizadas em
triplicatas. Subtraiu-se o valor de absorbância de cada amostra do valor de
absorbância do controle (uma mistura idêntica à da amostra, com a reação paralisada
no início). Os resultados foram expressos em unidades de absorbância.min
-1
/mg de
proteína (atividade específica).
3.3.2. Quitinases (QUI)
A obtenção do extrato foliar foi feita segundo metodologia descrita por
LANNA et al. (1996). Amostras de folhas foram pesadas e imediatamente
congeladas em N
2
líquido. Em seguida, foram trituradas no almofariz até obtenção de
um pó fino. Feito isso, adicionou-se polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1% (p/v), ou
seja, 1 g de PVPP para cada 100 mL de meio de extração que foi adicionado, e
24
fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1mM, cuja quantidade foi calculada com base
no volume final da extração. Posteriormente, macerou-se em tampão para extração
fosfato de sódio 50 mM pH 6,5 na proporção de 1:3 (p/v), isto é, a cada 1 g de
material vegetal foram adicionados 3 mL de tampão. Preparou-se uma seringa com
um pequeno pedaço de gaze, dobrado em quatro camadas, umedecida com água e foi
feita a filtração do macerado obtido para tubos de centrífuga. Estabilizou-se a
centrífuga nas condições necessárias, a saber: velocidade: 20.000 x g; temperatura:
4°C; tempo: 25 minutos. O sobrenadante após a centrifugação é o extrato bruto e foi
armazenado à 4°C para posterior detecção da atividade enzimática. Uma alíquota do
extrato foi utilizada para determinação da concentração de proteínas seguindo o
procedimento desenvolvido por WARBURG & CHRISTIAN (1941).
A atividade de quitinases nas amostras foi determinada conforme método
descrito por HARMAN et al. (1993) e ROBERTS & SELITRENNIKOFF (1988). A
mistura de reação, que foi incubada a 37°C por 2 horas, continha 470 μL do tampão
de reação acetato de sódio 50 mM pH 5,0, 10 μL da solução de substrato p-
nitrofenil-β-D-N,N´-diacetilquitobiose (PNP) 2 mg/mL e 20 μL do extrato vegetal.
Após esse período, foram acrescentados 0,5 mL de carbonato de sódio (Na
2
CO
3
) 0,2
M. Posteriormente, as amostras tiveram a absorbância determinada no comprimento
de onda 410 nm em um ensaio colorimétrico no espectrofotômetro. Todas as
incubações foram realizadas em triplicatas. Subtraiu-se o valor de absorbância de
cada amostra do valor de absorbância do controle (uma mistura idêntica à da
amostra, com a reação paralisada no início). Os resultados foram expressos em
unidades de absorbância.min
-1
/mg de proteína (atividade específica).
3.3.3. Lipoxigenases (LOX)
A obtenção do extrato foliar foi feita segundo metodologia descrita por
PEIXOTO (1998). Amostras de folhas foram pesadas e imediatamente congeladas
em N
2
líquido. Em seguida, foram trituradas no almofariz até obtenção de um pó
fino. Feito isso, adicionou-se polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1% (p/v), ou seja, 1 g
de PVPP para cada 100 mL de meio de extração que foi adicionado. Posteriormente,
macerou-se em tampão para extração fosfato de potássio 100 mM pH 6,8 contendo
fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1mM e ácido etilenodiamino tetra-acético
25
(EDTA) 0,1 mM, na proporção de 1:3 (p/v), isto é, a cada 3 g de material vegetal
foram adicionados 9 mL de tampão. Preparou-se uma seringa com um pequeno
pedaço de gaze, dobrado em quatro camadas, umedecida com água e foi feita a
filtração do macerado obtido para tubos de centrífuga. Estabilizou-se a centrífuga nas
condições necessárias, a saber: velocidade: 12.000 x g; temperatura: 4°C; tempo: 20
minutos. O sobrenadante após a centrifugação é o extrato bruto e foi armazenado à
4°C para posterior detecção da atividade enzimática. Uma alíquota do extrato foi
utilizada para determinação da concentração de proteínas seguindo o procedimento
desenvolvido por WARBURG & CHRISTIAN (1941).
A atividade de lipoxigenases nas amostras foi determinada conforme método
descrito por AXELROD et al. (1981). A mistura de reação que continha 2.000 μL do
tampão de reação fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 e 30 μL da solução de substrato
linoleato de sódio 10 mM foi levada ao banho-maria à temperatura de 25°C para
estabilização por aproximadamente 4 minutos. Ao meio de reação foram adicionados
30 μL do extrato vegetal e, então, o aumento na absorbância foi registrado no
comprimento de onda 234 nm em um ensaio colorimétrico no espectrofotômetro
durante um período de 3 minutos em intervalos de 30 segundos. Todas as incubações
foram realizadas em triplicatas. A atividade da enzima foi medida utilizando-se para
os cálculos o coeficiente de extinção molar 25.000 M
-1
.cm
-1
(AXELROD et al.,
1981). Posteriormente, os resultados foram divididos pela concentração de proteínas
no extrato e foram expressos em M.min
-1
/mg de proteína (atividade específica).
3.3.4. Fenilalanina amônia-liase (PAL)
A obtenção do extrato foliar foi feita segundo metodologia descrita por
CAHILL & McCOMB (1992). Amostras de folhas foram pesadas e imediatamente
congeladas em N
2
líquido. Em seguida, foram trituradas no almofariz até obtenção de
um pó fino. Posteriormente, macerou-se em tampão para extração borato de sódio 0,1
M pH 8,8 contendo polivinilpirrolidona (PVP) 5% (p/v) e β-mercaptoetanol 20 mM,
na proporção de 1:100 (p/v), isto é, a cada 0,1 g de material vegetal foram
adicionados 10 mL de tampão. Preparou-se uma seringa com um pequeno pedaço de
gaze, dobrado em quatro camadas, umedecida com água e foi feita a filtração do
macerado obtido para tubos de centrífuga. Estabilizou-se a centrífuga nas condições
26
necessárias, a saber: velocidade: 12.000 x g; temperatura: 4°C; tempo: 10 minutos. O
sobrenadante após a centrifugação é o extrato bruto e foi armazenado à 4°C para
posterior detecção da atividade enzimática. Uma alíquota do extrato foi utilizada para
determinação da concentração de proteínas seguindo o procedimento desenvolvido
por WARBURG & CHRISTIAN (1941).
A atividade de fenilalanina amônia-liase nas amostras foi determinada
conforme método descrito por CAHILL & McCOMB (1992). A mistura de reação
que continha 1.000 μL do tampão de reação borato de sódio 0,2 M pH 8,8 e 1.000 μL
da solução de substrato
L-fenilalanina 0,1 M foi levada ao banho-maria à temperatura
de 30°C para estabilização por aproximadamente 4 minutos. Ao meio de reação
foram adicionados 1000 μL do extrato vegetal e, então, o aumento na absorbância foi
registrado no comprimento de onda 290 nm em um ensaio colorimétrico no
espectrofotômetro durante um período de 5 minutos em intervalos de 60 segundos.
Todas as incubações foram realizadas em triplicatas. A atividade da enzima foi
medida utilizando-se para os cálculos o coeficiente de extinção molar 10
4
mM
-1
.cm
-1
(ZUCKER, 1965). Posteriormente, os resultados foram divididos pela concentração
de proteínas no extrato e foram expressos em M.min
-1
/mg de proteína (atividade
específica).
3.3.5. Peroxidases (POD)
A obtenção do extrato foliar foi feita segundo metodologia descrita por
PEIXOTO (1998). Amostras de folhas foram pesadas e imediatamente congeladas
em N
2
líquido. Em seguida, foram trituradas no almofariz até obtenção de um pó
fino. Feito isso, adicionou-se polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1% (p/v), ou seja, 1 g
de PVPP para cada 100 mL de meio de extração que foi adicionado. Posteriormente,
macerou-se em tampão para extração fosfato de potássio 100 mM pH 6,8 contendo
fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1mM e ácido etilenodiamino tetra-acético
(EDTA) 0,1 mM, na proporção de 1:10 (p/v), isto é, a cada 0,3 g de material vegetal
foram adicionados 3 mL de tampão. Preparou-se uma seringa com um pequeno
pedaço de gaze, dobrado em quatro camadas, umedecida com água e foi feita a
filtração do macerado obtido para tubos de centrífuga. Estabilizou-se a centrífuga nas
condições necessárias, a saber: velocidade: 12.000 x g; temperatura: 4°C; tempo: 15
minutos. O sobrenadante após a centrifugação é o extrato bruto e foi armazenado à
27
4°C para posterior detecção da atividade enzimática. Uma alíquota do extrato foi
utilizada para determinação da concentração de proteínas seguindo o procedimento
desenvolvido por WARBURG & CHRISTIAN (1941).
A atividade de peroxidases nas amostras foi determinada conforme método
descrito por KAR & MISHRA (1976). A mistura de reação que continha 950 μL de
água destilada, 750 μL do tampão de reação fosfato de potássio 100 mM pH 6,8, 600
μL da solução de substrato pirogalol 100 mM e 600 μL de peróxido de hidrogênio
100 mM foi levada ao banho-maria à temperatura de 25°C para estabilização por
aproximadamente 4 minutos. Ao meio de reação foram adicionados 100 μL do
extrato vegetal e, então, o aumento na absorbância foi registrado no comprimento de
onda 420 nm em um ensaio colorimétrico no espectrofotômetro durante um período
de 5 minutos em intervalos de 60 segundos. Todas as incubações foram realizadas
em triplicatas. A atividade da enzima foi medida utilizando-se para os cálculos o
coeficiente de extinção molar 2,47 mM
-1
.cm
-1
(CHANCE & MAEHLEY, 1955).
Posteriormente, os resultados foram divididos pela concentração de proteínas no
extrato e foram expressos em M.min
-1
/mg de proteína (atividade específica).
3.3.6. Polifenoloxidases (PPO)
A obtenção do extrato foliar foi feita segundo metodologia descrita por
PEIXOTO (1998). Amostras de folhas foram pesadas e imediatamente congeladas
em N
2
líquido. Em seguida, foram trituradas no almofariz até obtenção de um pó
fino. Feito isso, adicionou-se polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1% (p/v), ou seja, 1 g
de PVPP para cada 100 mL de meio de extração que foi adicionado. Posteriormente,
macerou-se em tampão para extração fosfato de potássio 100 mM pH 6,8 contendo
fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1mM e ácido etilenodiamino tetra-acético
(EDTA) 0,1 mM, na proporção de 1:3 (p/v), isto é, a cada 1 g de material vegetal
foram adicionados 3 mL de tampão. Preparou-se uma seringa com um pequeno
pedaço de gaze, dobrado em quatro camadas, umedecida com água e foi feita a
filtração do macerado obtido para tubos de centrífuga. Estabilizou-se a centrífuga nas
condições necessárias, a saber: velocidade: 12.000 x g; temperatura: 4°C; tempo: 15
minutos. O sobrenadante após a centrifugação é o extrato bruto e foi armazenado à
4°C para posterior detecção da atividade enzimática. Uma alíquota do extrato foi
28
utilizada para determinação da concentração de proteínas seguindo o procedimento
desenvolvido por WARBURG & CHRISTIAN (1941).
A atividade de polifenoloxidases nas amostras foi determinada conforme
método descrito por KAR & MISHRA (1976). A mistura de reação que continha
1550 μL de água destilada, 750 μL do tampão de reação fosfato de potássio 100 mM
pH 6,8 e 600 μL da solução de substrato pirogalol 100 mM foi levada ao banho-
maria à temperatura de 25°C para estabilização por aproximadamente 4 minutos. Ao
meio de reação foram adicionados 100 μL do extrato vegetal e, então, o aumento na
absorbância foi registrado no comprimento de onda 420 nm em um ensaio
colorimétrico no espectrofotômetro durante um período de 5 minutos em intervalos
de 60 segundos. Todas as incubações foram realizadas em triplicatas. A atividade da
enzima foi medida utilizando-se para os cálculos o coeficiente de extinção molar
2,47 mM
-1
.cm
-1
(CHANCE & MAEHLEY, 1955). Posteriormente, os resultados
foram divididos pela concentração de proteínas no extrato e foram expressos em
M.min
-1
/mg de proteína (atividade específica).
29
4. RESULTADOS
4.1. Experimento com Cafeeiro
4.1.1. Severidade da ferrugem
A maior severidade da ferrugem e o maior número de pústulas por folha
ocorreu no tratamento 1 (Figura 1). Nos tratamentos 2, 3 e 4 essas variáveis foram
reduzidas, principalmente no tratamento 4, onde observou-se uma redução de 63 e
69%, respectivamente, na severidade da ferrugem e número de pústulas por folha em
comparação ao tratamento 1, indicando o potencial do Acibenzolar-S-Metil como
indutor de resistência. Ao comparar o tratamento 2 com o tratamento 1, observou-se
uma redução de 24 e 25%, respectivamente, nas variáveis A e B, enquanto houve
uma redução de 53 e 50% quando comparou-se o tratamento 3 em relação ao
tratamento 1. Estes resultados foram coerentes com a sintomatologia da ferrugem em
folhas de cafeeiro que receberam a aplicação dos diferentes tratamentos (Figura 2).
Figura 1. Severidade da ferrugem do cafeeiro (A) e número de pústulas por folha (B)
aos 36 dias após inoculação das plantas que receberam os seguintes tratamentos: 1-
controle (água); 2- silicato de potássio (pH 10,2); 3- silicato de potássio (pH 5,5) e 4-
Acibenzolar-S-Metil.
0
5
10
15
20
1234
0
4
8
12
(B)
(A)
Pústulas/folha
Tratamentos
Severidade (%)
0
5
10
15
20
1234
0
4
8
12
(B)
(A)
Pústulas/folha
Tratamentos
Severidade (%)
30
Figura 2. Sintomatologia da ferrugem na face inferior das folhas de cafeeiro que
receberam os seguintes tratamentos: controle (água) (1); silicato de potássio (pH
10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e Acibenzolar-S-Metil (4).
4.1.2. Teores foliares de silício e potássio
Observa-se que, independente dos tratamentos utilizados e da inoculação ou
não inoculação das plantas, não houve variação nos teores foliares de Si e de K
(Tabela 1). A redução da severidade e do número de pústulas por folha deve ser
atribuída ao silicato aplicado, uma vez que as folhas foram lavadas antes das
análises, retirando todo o silício polimerizado presente sobre a superfície da folha. A
diferença observada entre os dois tratamentos com silicato de potássio na redução da
doença foi notável no tratamento 3 (Figura 2).
Tabela 1. Teores foliares de Si e K em PNI e PI com Hemileia vastatrix.
Si (%) K (%)
Tratamentos
PNI PI
PNI PI
controle (água) 0,39 0,51 2,70 2,64
silicato de potássio (pH 10,2) 0,37 0,42 2,93 2,59
silicato de potássio (pH 5,5) 0,33 0,48 2,62 2,74
Acibenzolar-S-Metil 0,41 0,44 2,67 2,77
PNI = plantas não inoculadas; PI= plantas inoculadas.
1
2
4
3
1
2
4
3
31
4.1.3. Atividade enzimática
4.1.3.1.
β
-1,3-glucanases (GLU)
Observa-se que a atividade de GLU em folhas de plantas inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) diminuiu de 1 a 4 dias após inoculação e
aumentou a partir do 4° dia, atingindo um pico aos 36 dias (Figura 3). Este aumento
coincidiu com o aparecimento das pústulas nas folhas aos 14 dias aproximadamente.
Em folhas de plantas não inoculadas a atividade da enzima diminuiu no período de 1
a 2 dias e aumentou a partir do 2° dia com tendência a se manter constante após os
36 dias.
Figura 3. Curvas de progresso da atividade enzimática de GLU em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de GLU diminuiu no período de 1 a 2 dias em folhas de
plantas inoculadas e não inoculadas com o patógeno (Figura 3). Nas folhas de plantas
inoculadas, a atividade da enzima foi maior do que em folhas de plantas não
inoculadas de 4 a 14 dias após inoculação, porém níveis similares de atividade
ocorreram aos 36 dias.
Observou-se uma oscilação na atividade de GLU no tratamento
correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 5,5 (Figura 3). Houve um
0
3
6
9
1 2 4 14 36
PNI PI
0
3
6
9
PNI PI
Atividade Especifica (Abs.min
-1
.mg
-1
)x10
3
PNI PI
1 2 4 14 36
PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(1) (2)
(3) (4)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
0
3
6
9
1 2 4 14 36
PNI PI
0
3
6
9
PNI PI
Atividade Especifica (Abs.min
-1
.mg
-1
)x10
3
PNI PI
1 2 4 14 36
PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(1) (2)
(3) (4)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
32
decréscimo da atividade enzimática no período de 1 a 2 dias em folhas de plantas
inoculadas e não inoculadas com o patógeno. Nas folhas de plantas inoculadas, a
atividade da enzima foi maior do que em folhas de plantas não inoculadas de 2 a 4
dias após inoculação, com tendência a se manter crescente após os 14 dias.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de GLU em folhas de plantas inoculadas foi maior que em folhas de plantas
não inoculadas em quase todas as épocas de coletas, atingindo um pico aos 4 dias
após inoculação com o patógeno (Figura 3). Nas folhas de plantas não inoculadas, a
atividade da enzima permaneceu constante no decorrer do tempo.
4.1.3.2. Quitinases (QUI)
Observa-se que a atividade de QUI em folhas de plantas inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) diminuiu de 1 a 14 dias após inoculação e
aumentou a partir do 14° dia, atingindo um pico aos 36 dias (Figura 4). Este aumento
coincidiu com o aparecimento das pústulas nas folhas aos 14 dias aproximadamente.
Em folhas de plantas não inoculadas a atividade da enzima manteve-se com
tendência constante no decorrer das épocas de coletas.
Figura 4. Curvas de progresso da atividade enzimática de QUI em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
Épocas de coletas (dias)
PNI PI
0
300
600
900
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
(2)
(3)
(4)
Atividade Específica (Abs.min
-1
.mg
-1
)x10
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300
600
900
PNI PI
(1)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Épocas de coletas (dias)
PNI PI
0
300
600
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1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
(2)
(3)
(4)
Atividade Específica (Abs.min
-1
.mg
-1
)x10
6
0
300
600
900
PNI PI
(1)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
33
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de QUI permaneceu constante no período de 1 a 4 dias
em folhas de plantas inoculadas e não inoculadas com o patógeno (Figura 4). Nas
folhas de plantas inoculadas, a atividade da enzima manteve-se com constante até o
14° dia, mantendo tendência crescente após os 14 dias. Nas folhas de plantas não
inoculadas a atividade foi maior do que em plantas inoculadas de 4 a 14 dias, porém
níveis similares de atividade ocorreram aos 36 dias.
Observou-se no tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio
pH 5,5 que a atividade de QUI em folhas de plantas inoculadas foi maior que em
plantas não inoculadas de 1 a 2 dias após inoculação (Figura 4). No período de 2 a 4
dias a atividade em folhas de plantas inoculadas decresce, permanecendo constante
no decorrer das coletas, enquanto a atividade das plantas não inoculadas aumenta,
permanecendo constante ao longo do tempo.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de QUI em folhas de plantas inoculadas foi oscilante no período de 1 a 14
dias, mantendo-se com tendência constante após o 14° dia (Figura 4). Nas folhas de
plantas não inoculadas a atividade enzimática permaneceu constante de 1 a 4 dias e
em seguida aumentou até o 14° dia, atingindo um pico, mantendo-se com tendência
decrescente aos 36 dias.
4.1.3.3. Lipoxigenases (LOX)
Observa-se que a atividade de LOX em folhas de plantas inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) diminuiu de 1 a 4 dias após inoculação e
aumentou a partir do 4° dia, com tendência a se manter constante aos 36 dias (Figura
5). Este aumento coincidiu com o aparecimento das pústulas nas folhas aos 14 dias
aproximadamente. Em folhas de plantas não inoculadas o perfil foi similar ao das
plantas inoculadas, exceto que após o 14° dia houve decréscimo da atividade.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de LOX decresceu no período de 1 a 4 dias em folhas de
plantas inoculadas e não inoculadas com o patógeno, sendo a atividade da enzima
maior nas plantas não inoculadas do que nas plantas inoculadas (Figura 5). Nas
folhas de plantas inoculadas, a atividade da enzima foi maior que nas plantas não
inoculadas a partir do 4° dia, porém níveis similares ocorreram aos 36 dias.
34
Figura 5. Curvas de progresso da atividade enzimática de LOX em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
Observou-se no tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio
pH 5,5 que a atividade de LOX em folhas de plantas inoculadas foi menor que em
plantas não inoculadas durante todas as épocas de coletas, sendo similares aos 4 dias
após inoculação (Figura 5). Nas folhas de plantas inoculadas a atividade oscilou,
permanecendo constante após o 14° dia, enquanto nas folhas de plantas não
inoculadas a atividade foi constante de 1 a 2 dias, decrescendo ao longo do tempo.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de LOX em folhas de plantas não inoculadas foi oscilante durante todas as
épocas de coletas, atingindo um pico aos 2 dias e mantendo-se com tendência
decrescente após o 14° dia (Figura 5). Nas folhas de plantas inoculadas a atividade
enzimática diminuiu de 1 a 2 dias após inoculação e em seguida manteve-se com
tendência crescente até os 36 dias.
4.1.3.4. Fenilalanina amônia-liase (PAL)
Observa-se que a atividade de PAL em folhas de plantas inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) diminuiu de 1 a 2 dias após inoculação e
aumentou a partir do 2° dia, com tendência a se manter constante após os 14 dias
(Figura 6). Este aumento coincidiu com o aparecimento das pústulas nas folhas aos
0,0
0,8
1,6
2,4
PNI PI
PNI PI
0,0
0,8
1,6
2,4
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(2)
(3)
(4)
(1)
Atividade Específica (µM.min
-1
.mg
-1
)
*
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*
*
*
*
*
*
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*
*
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*
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0,8
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2,4
PNI PI
PNI PI
0,0
0,8
1,6
2,4
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(2)
(3)
(4)
(1)
Atividade Específica (µM.min
-1
.mg
-1
)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
35
14 dias aproximadamente. Em folhas de plantas não inoculadas a atividade manteve-
se constante durante todas as épocas de coletas.
Figura 6. Curvas de progresso da atividade enzimática de PAL em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de PAL decresceu no período de 1 a 4 dias em folhas de
plantas inoculadas e não inoculadas com o patógeno (Figura 6). Nas folhas de plantas
inoculadas, a atividade da enzima aumentou até o 14° dia, atingindo um pico
similarmente às plantas não inoculadas, porém após os 14 dias a atividade manteve-
se com tendência constante nas plantas não inoculadas, enquanto decresceu nas
inoculadas aos 36 dias.
Observou-se no tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio
pH 5,5 que a atividade de PAL em folhas de plantas inoculadas foi menor que em
plantas não inoculadas durante todas as épocas de coletas, sendo similares apenas de
2 a 4 dias após inoculação (Figura 6). Nas folhas de plantas inoculadas a atividade
foi constante até os 14 dias, apresentando tendência crescente após o 14° dia,
enquanto nas plantas não inoculadas a atividade foi decrescente de 1 a 2 dias e seguiu
aumentando ao longo do tempo.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de PAL em folhas de plantas não inoculadas manteve-se com tendência
crescente durante todas as épocas de coletas até os 36 dias, similarmente ao perfil das
0
300
600
900
PNI PI
PNI PI
0
300
600
900
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(2)
(3)
(4)
(1)
Atividade Específica (µM.min
-1
.mg
-1
)
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0
300
600
900
PNI PI
PNI PI
0
300
600
900
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(2)
(3)
(4)
(1)
Atividade Específica (µM.min
-1
.mg
-1
)
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
36
plantas inoculadas a partir do 2° dia (Figura 6). Nas folhas de plantas inoculadas a
atividade enzimática diminuiu de 1 a 2 dias após inoculação.
4.1.3.5. Peroxidases (POD)
Observa-se que a atividade de POD em folhas de plantas inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) aumentou de 1 a 2 dias após inoculação e
diminuiu a partir do 2° dia, com tendência a se manter crescente após os 4 dias
(Figura 7). Este aumento coincidiu com o aparecimento das pústulas nas folhas aos
14 dias aproximadamente. Em folhas de plantas não inoculadas a atividade decresceu
de 1 a 4 dias e em seguida aumentou até os 36 dias, sendo que a atividade destas foi
maior que a atividade das plantas inoculadas durante todas as épocas de coletas.
Figura 7. Curvas de progresso da atividade enzimática de POD em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de POD decresceu no período de 1 a 4 dias em folhas de
plantas inoculadas e em seguida aumentou até o 14° dia, atingindo um pico com
tendência decrescente aos 36 dias (Figura 7). Nas folhas das plantas não inoculadas a
atividade foi oscilante durante todas as épocas de coletas, com tendência crescente
após os 14 dias.
0,0
2,0
4,0
6,0
PNI PI PNI PI
0,0
2,0
4,0
6,0
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(2)
(3)
(4)
Atividade Específica (M.min
-1
.mg
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)
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*
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*
*
*
*
*
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*
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*
*
0,0
2,0
4,0
6,0
PNI PI PNI PI
0,0
2,0
4,0
6,0
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(2)
(3)
(4)
Atividade Específica (M.min
-1
.mg
-1
)
(1)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
37
Observou-se no tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio
pH 5,5 que a atividade de POD em folhas de plantas inoculadas foi oscilante no
decorrer do tempo, onde aumentou de 1 a 2 dias após inoculação, atingindo um pico
e manteve-se decrescente após o 14° dia (Figura 7). Nas folhas de plantas não
inoculadas a atividade decresceu de 1 a 4 dias, manteve tendência crescente após o 4°
dia, alcançando um pico aos 14 dias e em seguida decresceu aos 36 dias.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de POD diminuiu de 1 a 2 dias em folhas de plantas inoculadas e não
inoculadas com o patógeno (Figura 7). Nas folhas das plantas inoculadas a atividade
manteve-se com tendência crescente a partir do 2° dia até os 36 dias. Nas folhas de
plantas não inoculadas a atividade enzimática oscilou ligeiramente a partir do 2° dia,
decrescendo após os 14 dias.
4.1.3.6. Polifenoloxidases (PPO)
Observa-se que a atividade de PPO aumentou de 1 a 2 dias após inoculação e
diminuiu a partir do 2° dia em folhas de plantas inoculadas e não inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) (Figura 8). Em folhas de plantas inoculadas
a atividade cresceu a partir do 14° dia. Este aumento coincidiu com o aparecimento
das pústulas nas folhas aos 14 dias aproximadamente. Em folhas de plantas não
inoculadas a atividade manteve-se crescente a partir do 4° dia, sendo que a atividade
destas foi maior que a atividade das plantas inoculadas durante quase todas as épocas
de coletas.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de PPO oscilou ligeiramente ao longo do tempo em
folhas de plantas inoculadas, porém aumentou mais abruptamente de 1 a 2 dias,
atingindo um pico e mantendo tendência constante após os 14 dias (Figura 8). Nas
folhas das plantas não inoculadas a atividade foi crescente de 1 a 4 dias, com
tendência constante após o 4° dia durante as épocas de coletas até os 36 dias.
Observou-se no tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio
pH 5,5 que a atividade de PPO foi crescente de 1 a 2 dias após inoculação em folhas
de plantas inoculadas e não inoculadas com o patógeno (Figura 8). Nas folhas das
plantas inoculadas a atividade diminuiu até o 4° dia e manteve-se crescente no
38
decorrer do tempo, até os 36 dias. Nas folhas de plantas não inoculadas a atividade
manteve tendência constante após o 2° dia durante todas as épocas de coletas.
Figura 8. Curvas do progresso da atividade enzimática de PPO em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de PPO aumentou de 1 a 2 dias em folhas de plantas inoculadas ou não
inoculadas com o patógeno (Figura 8). Nas folhas das plantas inoculadas a atividade
manteve-se constante até os 4 dias após inoculação, apresentando tendência crescente
a partir do 14° dia. Nas folhas de plantas não inoculadas a atividade enzimática
decresceu até o 4° dia, mantendo-se constante até os 36 dias.
4.2. Experimento com Soja
4.2.1. Severidade da ferrugem asiática
Os menores valores de severidade da ferrugem ocorreram nos tratamentos 3 e
4, os quais foram significativamente diferentes dos tratamentos 1 e 2 (Figura 9).
Houve uma redução de 44 e 77%, respectivamente, na severidade da ferrugem dos
tratamentos 3 e 4 em comparação ao tratamento 1 (controle). O silicato de potássio
no pH 5,5 mostrou-se com eficiência semelhante ao padrão de indução de resistência
comercial Acibenzolar-S-Metil em reduzir a severidade da ferrugem asiática da soja.
0,0
0,4
0,8
1,2
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
0,0
0,4
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1,2
PNI PI PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(2)
(3)
(4)
Atividade Específica (M.min
-1
.mg
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*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
0,0
0,4
0,8
1,2
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
0,0
0,4
0,8
1,2
PNI PI PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(2)
(3)
(4)
Atividade Específica (M.min
-1
.mg
-1
)
(1)
0,0
0,4
0,8
1,2
1241436
PNI PI
1241436
PNI PI
0,0
0,4
0,8
1,2
PNI PI PNI PI
Épocas de coletas (dias)
(2)
(3)
(4)
Atividade Específica (M.min
-1
.mg
-1
)
(1)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
39
Ao comparar o tratamento 2 com o tratamento 1 observou-se uma redução de apenas
14% na severidade da ferrugem. Estes resultados foram coerentes com a
sintomatologia da ferrugem asiática em folhas de soja que receberam a aplicação dos
diferentes tratamentos (Figura 10).
Figura 9. Severidade da ferrugem asiática da soja aos 21 dias após inoculação das
plantas que receberam os seguintes tratamentos: 1- controle (água); 2- silicato de
potássio (pH 10,2); 3- silicato de potássio (pH 5,5) e 4- Acibenzolar-S-Metil. Médias
seguidas pelas mesmas letras, não diferem estatisticamente, ao nível de 5% de
probabilidade, pelo teste de Tukey.
Figura 10. Sintomatologia da ferrugem asiática na face inferior das folhas de soja
que receberam os seguintes tratamentos: controle (água) (1); silicato de potássio (pH
10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e Acibenzolar-S-Metil (4).
1
2
4
3
1
2
4
3
0
3
6
9
12
1234
a
b
c
d
Tratamentos
Severidade (%)
0
3
6
9
12
1234
a
b
c
d
Tratamentos
Severidade (%)
40
4.2.2. Teores foliares de silício e potássio
Observa-se que, independente dos tratamentos utilizados e da inoculação ou
não inoculação das plantas, não houve variação nos teores foliares de Si e de K
(Tabela 2). A redução da severidade deve ser atribuída ao silicato aplicado, uma vez
que as folhas foram lavadas antes das análises, retirando todo o silício polimerizado
sobre a superfície da folha. A diferença observada entre os dois tratamentos com
silicato de potássio na redução da doença foi notável no tratamento 3 (Figura 10).
Tabela 2. Teores foliares de Si e K em PNI e PI com Phakopsora pachyrhizi.
Si (%)
K (%)
Tratamentos
PNI PI PNI PI
controle (água) 1,38 1,51 1,13 0,99
silicato de potássio (pH 10,2) 1,25 1,54 1,33 1,06
silicato de potássio (pH 5,5) 1,29 1,57 1,29 1,14
Acibenzolar-S-Metil 1,32 1,61 1,33 1,10
PNI = plantas não inoculadas; PI= plantas inoculadas.
4.2.3. Atividade enzimática
4.2.3.1.
β
-1,3-glucanases (GLU)
Observou-se que a atividade de GLU em folhas de plantas inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) diminuiu de 24 a 36 horas após inoculação
e aumentou a partir da 36ª hora atingindo um pico às 168 horas (Figura 11). Este
aumento coincidiu com o aparecimento dos sintomas da ferrugem nas folhas às 168
horas aproximadamente. Em folhas de plantas não inoculadas a atividade da enzima
foi oscilante durante todo o tempo, sendo que na maior parte das épocas de coletas
ela foi menor que a atividade nas plantas inoculadas.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de GLU aumentou no período de 24 a 48 horas em
folhas de plantas inoculadas e em seguida oscilou até as 384 horas, com tendência
crescente (Figura 11). Nas folhas de plantas não inoculadas, a atividade da enzima
diminuiu de 24 a 48 horas, e seguiu perfil oscilante até as 384 horas, com tendência
41
decrescente. As plantas inoculadas e não inoculadas com o patógeno tiveram níveis
similares de atividade às 168 horas.
Figura 11. Curvas de progresso da atividade enzimática de GLU em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
Observou-se uma similaridade nos perfis de atividade de GLU no tratamento
correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 5,5 em folhas de plantas
inoculadas e não inoculadas com o patógeno, diferenciando nos níveis de atividade
mais elevados nas plantas inoculadas do que nas plantas não inoculadas (Figura 11).
Nas folhas de plantas inoculadas a atividade da enzima apresentou tendência
crescente ao longo do tempo, enquanto nas folhas de plantas não inoculadas mostrou-
se constante até as 168 horas, onde passou a aumentar.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de GLU em folhas de plantas inoculadas foi significativamente maior que
em folhas de plantas de soja não inoculadas em todas as épocas de coletas, atingindo
um pico de atividade máxima às 168 horas após inoculação com o patógeno (Figura
11). Nas folhas de plantas não inoculadas, a atividade da enzima seguiu perfil similar
ao das plantas inoculadas ao longo do tempo, porém com níveis significativamente
mais baixos que nas plantas inoculadas, o que mostrou o potencial do ASM em
induzir resistência.
4.2.3.2. Quitinases (QUI)
Épocas de coletas (horas)
0
15
30
45
24 36 48 168 384
PNI PI
24 36 48 168 384
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Atividade Específica (Abs.min
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)x10
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(3) (4)
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*
Épocas de coletas (horas)
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PNI PI
24 36 48 168 384
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PNI PI
PNI PI
Atividade Específica (Abs.min
-1
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)x10
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(3) (4)
(1)
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*
*
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*
*
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*
*
*
*
42
Observou-se que a atividade de QUI em folhas de plantas inoculadas e não
inoculadas com o patógeno e que receberam a aplicação de água (controle) seguiram
perfis enzimáticos similares durante todas as épocas de coletas (Figura 12). A
atividade diminuiu de 24 a 36 horas após inoculação e aumentou a partir da 36ª hora
atingindo um pico às 168 horas. Este aumento coincidiu com o aparecimento dos
sintomas da ferrugem nas folhas inoculadas às 168 horas aproximadamente. Em
seguida houve um decréscimo na atividade da enzima até as 384 horas.
Figura 12. Curvas de progresso da atividade enzimática de QUI em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de QUI aumentou no período de 24 a 168 horas em
folhas de plantas inoculadas, atingindo um pico e em seguida decresceu até as 384
horas (Figura 12). Nas folhas de plantas não inoculadas, a atividade da enzima
diminuiu de 24 a 36 horas, aumentou até a 48ª hora e manteve tendência decrescente
no decorrer das épocas de coletas até as 384 horas.
Observou-se uma similaridade nos perfis de atividade de QUI no tratamento
correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 5,5 em folhas de plantas
inoculadas e não inoculadas com o patógeno no período de 36 a 168 horas,
diferenciando nos níveis de atividade mais elevados nas plantas inoculadas do que
nas plantas não inoculadas (Figura 12). Nas folhas de plantas inoculadas a atividade
0
200
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PNI PI
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Épocas de coletas (horas)
(2)
(3)
(4)
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PNI PI
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PNI PI
Épocas de coletas (horas)
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Atividade Específica (Abs.min
-1
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)x10
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*
*
43
da enzima apresentou tendência decrescente após as 168 horas, enquanto nas folhas
de plantas não inoculadas mostrou-se constante.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de QUI em folhas de plantas inoculadas foi maior que em folhas de plantas
não inoculadas em todas as épocas de coletas, exceto às 384 horas, atingindo um pico
às 168 horas após inoculação com o patógeno (Figura 12). Nas folhas de plantas não
inoculadas, a atividade da enzima seguiu perfil similar, porém com níveis mais
baixos que nas plantas inoculadas.
4.2.3.3. Lipoxigenases (LOX)
Observou-se que a atividade de LOX em folhas de plantas inoculadas com o
patógeno e que receberam a aplicação de água (controle) foi menor que em folhas de
plantas não inoculadas em quase todas as datas de coletas (Figura 13). Nas folhas de
plantas inoculadas a atividade manteve-se com tendência decrescente até as 168
horas e a partir desta aumentou até as 384 horas. Este aumento coincidiu com o
aparecimento dos sintomas da ferrugem às 168 horas aproximadamente. Nas folhas
de plantas não inoculadas a atividade da enzima aumentou de 24 a 36 horas e em
seguida tendeu a decrescer até as 168 horas, quando passou a ser constante.
Figura 13. Curvas de progresso da atividade enzimática de LOX em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
0
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PNI PI
PNI PI
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Épocas de coletas (horas)
(2)
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-1
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PNI PI
24 36 48 168 384
PNI PI
Épocas de coletas (horas)
(2)
(3) (4)
(1)
Atividade Específica (µM.min
-1
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)
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*
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*
*
*
*
44
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de LOX aumentou no período de 24 a 36 horas em
folhas de plantas inoculadas, atingindo um pico e em seguida decresceu até as 384
horas (Figura 13). Nas folhas de plantas não inoculadas, a atividade da enzima
diminuiu no decorrer das épocas de coletas de 24 a 168 horas e manteve tendência
crescente até as 384 horas.
Observou-se uma oscilação no perfil de atividade de LOX no tratamento
correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 5,5 em folhas de plantas
inoculadas com o patógeno (Figura 13). A atividade aumentou no período de 24 a 36
horas e diminuiu a partir das 168 horas nas plantas inoculadas e não inoculadas,
porém com intensidades distintas, além disso, apresentaram um ponto de
similaridade às 48 horas após inoculação.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de LOX seguiu perfil enzimático similar em folhas de plantas inoculadas e
não inoculadas em todas as épocas de coletas, porém com níveis diferentes (Figura
13). A atividade da enzima aumentou de 24 a 48 horas e em seguida houve um
decréscimo até as 168 horas após inoculação com o patógeno. Após as 168 horas a
atividade apresentou tendência crescente.
4.2.3.4. Fenilalanina amônia-liase (PAL)
Observou-se que a atividade de PAL em folhas de plantas inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) foi maior que em folhas de plantas não
inoculadas de 24 a 48 horas, seguindo perfil enzimático similar tendendo a decrescer
no decorrer destas datas (Figura 14). Posteriormente, a atividade aumentou até as 168
horas, atingindo um pico. Este aumento coincidiu com o aparecimento dos sintomas
da ferrugem nas folhas às 168 horas aproximadamente. Após as 168 horas a
atividade enzimática diminuiu até as 384 horas.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de PAL aumentou no período de 24 a 168 horas em
folhas de plantas inoculadas, atingindo um pico e em seguida decresceu até as 384
horas (Figura 14). Nas folhas de plantas não inoculadas, a atividade da enzima
45
diminuiu no decorrer das épocas de coletas de 24 a 48 horas e manteve tendência
constante até as 384 horas.
Figura 14. Curvas de progresso da atividade enzimática de PAL em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
Observou-se um perfil similar de atividade de PAL no tratamento
correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 5,5 em folhas de plantas
inoculadas e não inoculadas com o patógeno de 24 a 168 horas, em que a atividade
manteve-se crescente no decorrer destas épocas (Figura 14). Posteriormente às 168
horas a atividade continuou aumentando para as plantas inoculadas e diminuiu para
as plantas não inoculadas até as 384 horas.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de PAL apresentou-se constante no período de 24 a 168 horas em folhas de
plantas não inoculadas e em seguida diminuiu até as 384 horas (Figura 14). Nas
folhas de plantas inoculadas a atividade da enzima diminuiu de 24 a 36 horas e em
seguida houve um aumento no decorrer das épocas de coletas até as 384 horas após
inoculação com o patógeno.
4.2.3.5. Peroxidases (POD)
Observou-se que a atividade de POD em folhas de plantas inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) foi maior que nas plantas não inoculadas
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300
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PNI PI
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PNI PI
24 36 48 168 384
PNI PI
Épocas de coletas (horas)
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Atividade Específica (µM.min
-1
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)
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46
em quase todas as datas (Figura 15). A atividade foi oscilante ao longo do tempo,
atingindo pico às 48 horas após inoculação. Nas plantas não inoculadas a atividade
enzimática diminuiu de 24 a 36 horas, permaneceu constante até as 168 horas e em
seguida manteve-se com tendência decrescente até as 384 horas.
Figura 15. Curvas de progresso da atividade enzimática de POD em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de POD aumentou no período de 24 a 36 horas em
folhas de plantas inoculadas e em seguida manteve-se constante até as 384 horas
(Figura 15). Nas folhas de plantas não inoculadas, a atividade da enzima diminuiu de
24 a 36 horas, aumentou até às 48h, voltando a diminuir até as 384 horas, seguindo
perfil enzimático com níveis menores que as plantas inoculadas.
Observou-se um perfil de atividade de POD no tratamento correspondente à
aplicação de silicato de potássio pH 5,5 em folhas de plantas inoculadas com níveis
maiores que as plantas não inoculadas com o patógeno no decorrer das épocas de
coletas (Figura 15). Nas plantas inoculadas a atividade apresentou tendência
decrescente, enquanto nas plantas não-inoculadas a atividade da enzima manteve-se
constante ao longo do tempo.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de POD apresentou-se maior em folhas de plantas inoculadas do que em
plantas não inoculadas em quase todas as épocas de coletas (Figura 15). Nas folhas
0
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Épocas de coletas (horas)
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Épocas de coletas (horas)
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Atividade Específica (M.min
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47
de plantas inoculadas a atividade da enzima aumentou após as 168 horas, enquanto
nas plantas não inoculadas a atividade apresentou decréscimo neste mesmo período
até as 384 horas após inoculação com o patógeno.
4.2.3.6. Polifenoloxidases (PPO)
Observou-se que a atividade de PPO em folhas de plantas inoculadas que
receberam a aplicação de água (controle) foi menor que em folhas de plantas não
inoculadas em quase todas as épocas de coletas (Figura 16). Nas plantas não
inoculadas a atividade enzimática manteve-se decrescente no decorrer das épocas de
coletas até as 168 horas, onde apresentou tendência crescente. Nas plantas inoculadas
a atividade apresentou-se oscilante ao longo do tempo, atingindo um pico às 168
horas e posteriormente houve um decréscimo até as 384 horas.
Figura 16. Curvas de progresso da atividade enzimática de PPO em plantas não
inoculadas (PNI) e inoculadas (PI) que receberam os seguintes tratamentos: controle
(água) (1); silicato de potássio (pH 10,2) (2); silicato de potássio (pH 5,5) (3) e
Acibenzolar-S-Metil (4). Os asteriscos indicam que os valores médios são
significativamente diferentes entre PNI e PI em cada época de coleta, ao nível de 5%
de probabilidade pelo teste t.
No tratamento correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 10,2
observou-se que a atividade de PPO oscilou no período de 24 a 48 horas em folhas
de plantas inoculadas, enquanto decresceu em plantas não inoculadas (Figura 16).
Após a 48ª hora os perfis enzimáticos foram similares para as plantas inoculadas ou
não com o patógeno, porém apresentando níveis de atividade distintos, mantendo
tendência decrescente após as 168 horas.
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24 36 48 168 384
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Épocas de coletas (horas)
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Atividade Específica (M.min
-1
.mg
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2,0
4,0
6,0
24 36 48 168 384
PNI PI
24 36 48 168 384
PNI PI
Épocas de coletas (horas)
(2)
(3)
(4)
Atividade Específica (M.min
-1
.mg
-1
)
(1)
*
*
*
*
*
*
*
*
48
Observou-se um perfil oscilante de atividade de PPO no tratamento
correspondente à aplicação de silicato de potássio pH 5,5 em folhas de plantas
inoculadas no decorrer das épocas de coletas (Figura 16). A atividade da enzima
decresceu após as 168 horas. As folhas das plantas não inoculadas apresentaram
atividade maior que as plantas inoculadas em quase todas as datas, decrescendo de
24 a 26 horas, aumentando até as 48 horas, onde seguiu com tendência constante até
as 384 horas.
No tratamento correspondente à aplicação de ASM observou-se que a
atividade de PPO apresentou perfil idêntico em folhas de plantas inoculadas e não
inoculadas com o patógeno ao longo do tempo, inclusive em termos de valores
(Figura 16). A atividade manteve-se decrescente até a 48ª hora, aumentou até as 168
horas e em seguida diminuiu até as 384 horas.
49
5. DISCUSSÃO
A aplicação foliar de silicato de potássio e de Acibenzolar-S-Metil nos
experimentos de cafeeiro e soja reduziram alguns componentes de resistência em
resposta à infecção por H. vastatrix e P. pachyrhizi, respectivamente, em comparação
ao tratamento controle. Estes resultados estão de acordo com diversos estudos com
os mais variados patossistemas em que o uso da nutrição mineral através da
utilização de Si e a indução de resistência através da utilização do ASM, reduziram a
severidade da ferrugem e de diversas doenças em várias culturas importantes
(AMARAL, 2005; BÉLANGER, et al., 2003; BOKSHI et al., 2003; CARVER,
1998; DANTAS et al., 2004; FAGGIANI, 2002; FAIZE et al., 2004; GUZZO et al.,
2004; LIMA, 1998; POZZA et al., 2004; RODRIGUES, 2000; RODRIGUES et al.,
2006; SOUZA et al., 2007).
Houve uma diferença na severidade e número de pústulas por folha da
ferrugem do cafeeiro e na severidade da ferrugem asiática da soja entre os dois
tratamentos com silicato de potássio (tratamentos 2 e 3). A aplicação no pH 5,5
apresentou menor severidade que a aplicação no pH 10,2. Isto pode ser devido ao
fato de que em valores de pH alcalinos, onde o silicato é mais estável, a solução não
se polimeriza tão prontamente quanto em pH mais ácido, e com isso a barreira física
seria estabelecida mais rapidamente no tratamento 3 do que no tratamento 2. Não se
deve descartar a possibilidade de ter ocorrido efeito do potencial osmótico gerado
pela presença do silicato sobre a folha, podendo ter afetado a viabilidade dos
uredósporos (BOWEN et al., 1992).
No que se refere à ativação de respostas bioquímicas da planta em defesa ao
ataque por H. vastatrix através da alteração nos níveis enzimáticos, pôde-se observar
que atipicamente as enzimas POD, PPO e GLU não tiveram seus valores de atividade
aumentados quando inoculadas com o fungo no tratamento controle. Por outro lado,
as enzimas QUI, PAL e LOX apresentaram aumento nas suas atividades quando as
plantas foram inoculadas, o que é coerente com alguns estudos em que os autores
investigaram as alterações das enzimas QUI, PAL e LOX em resposta à inoculação
de fitopatógenos (ANGUELOVA-MERHAR et al., 2001; ROJAS et al., 1993;
SILVA et al., 2002).
Na cultura da soja, observou-se que as enzimas PPO, LOX, QUI e PAL
também não tiveram seus valores de atividade aumentados quando inoculadas com o
50
fungo no tratamento controle. Estes resultados discordam de alguns autores que
estudaram a atividade das enzimas PPO, LOX, QUI e PAL em resposta às infecções
patogênicas (AMARAL, 2005; MOHAMMADI et al., 2001; ROJAS et al., 1993;
SILVA et al., 2002;). Por outro lado, as enzimas GLU e POD apresentaram aumento
nos níveis de suas atividades quando as plantas foram inoculadas, corroborando com
alguns autores que estudaram as enzimas GLU e POD (ANGUELOVA-MERHAR et
al., 2001; XUE, et al., 1998).
Não se deve descartar a hipótese de terem ocorrido mudanças nas isoformas
das enzimas impossíveis de serem medidas ou que essas mudanças tenham
acontecido em períodos diferentes das épocas de coleta, podendo ter afetado seus
padrões enzimáticos (RESENDE et al., 2000). Além disso, as isoformas de enzimas
presentes nas plantas variam quantitativa e qualitativamente, de acordo com a
espécie, o tecido vegetal, o estádio fenológico e a influência do ambiente
(GALSTON & DAVIES, 1969). Outros fatores tais como a luz, a temperatura, o pH
ou qualquer outro tipo de estresse, podem contribuir para tais mudanças na
diversidade de isoformas dessas enzimas (SIEGEL, 1993).
Alguns trabalhos com estudo do efeito de indutores na resistência de cafeeiro
a H. vastatrix e Cercospora coffeicola mostraram aumentos nas atividades das
enzimas POD e PPO em relação a plantas sadias, que receberam a aplicação de ASM
(AMARAL, 2005; NOJOSA, 2003). De um outro lado, estudos com indução de
resistência de feijoeiro à murcha-de-curtobacterium mostraram certa ineficiência do
ASM em maximizar a atividade destas enzimas (SOARES et al., 2004). Este
resultado suporta a hipótese de que este pode não ser o mecanismo pelo qual ASM
ativa alguma resposta de defesa (RODRIGUES et al., 2006). Além disso, no presente
trabalho, observou-se que a atividade de LOX em folhas de plantas de soja foi menor
em plantas inoculadas do que em plantas não inoculadas, tratadas com ASM.
Os estudos sobre o efeito dos indutores de resistência sobre a atividade das
proteínas-RP mostram na sua maioria aumento na atividade das enzimas GLU e QUI.
Essas hidrolases estão envolvidas diretamente na degradação da parede celular de
fungos fitopatogênicos, especialmente aqueles ditos hemibiotróficos e necrotróficos
(ANGUELOVA-MERHAR et al., 2001; RODRIGUES et al., 2005). Trabalhos a
respeito da indução de resistência na proteção do mamão contra podridões pós-
colheita mostraram aumento na atividade de GLU, bem como de QUI em trabalhos
com resistência do cafeeiro à H. vastatrix e resistência à murcha-de-Fusarium em
51
caupi (DANTAS et al., 2004; GUZZO et al., 2004; RODRIGUES et al., 2006). No
presente trabalho, observou-se que a atividade de QUI foi maior em folhas de mudas
de café inoculadas do que em plantas não inoculadas, porém ao se comparar as
plantas tratadas com ASM com estas plantas controle, verificou-se que o ASM
induziu a expressão de QUI. Resultado diferente ocorreu no experimento com
plantas de soja.
Estudos com a enzima chave na etapa inicial do processo de lignificação
relacionados com a resistência da pêra japonesa à Venturia nashicola, mostraram que
o ASM contribuiu para maximizar a atividade enzimática de PAL (FAIZE et al.,
2004). Outro estudo importante mostrou acréscimos na atividade de PAL em feijão
em resposta à Colletotrichum lindemuthianum, embora se tenha utilizado o Ácido
Salicílico (AS) ao invés do ASM (CAMPOS et al., 2003). Não foram encontrados na
literatura trabalhos com LOX, a qual está envolvida na degradação de ácidos graxos
na membrana plasmática, utilizando-se o ASM. Porém, vários trabalhos relatam o
aumento da atividade frente ao ataque por insetos, patógenos ou ferimentos
(FORTUNATO et al., 2004; 2007).
O interesse pelo estudo de patossistemas envolvendo plantas dicotiledôneas
controladas por Si surgiu dos resultados promissores obtidos com monocotiledôneas,
pois estas absorvem grandes quantidades deste elemento via solo (BÉLANGER et
al., 2003; DATNOFF et al., 1997; EPSTEIN, 2001; RAID et al., 1992;). Além destes
estudos, outro trabalho relata o efeito do Si no controle de várias doenças do arroz,
planta tipicamente acumuladora de Si (DATNOFF et al., 1991). Entretanto, no
presente estudo trabalhou-se com cafeeiro, planta que se sabe até o presente
momento não tratar de uma acumuladora de Si, e plantas de soja, intermediárias no
acúmulo de Si.
O controle da ferrugem observado no presente estudo através da nutrição
mineral com a aplicação de Si via foliar deve ser atribuído ao silicato aplicado, uma
vez que antes das análises dos teores foliares de Si serem feitas, as folhas foram
lavadas e retirou-se todo o Si depositado sobre a superfície das mesmas. Com isso,
pode-se inferir que o controle da doença deve ter sido principalmente por meio da
barreira física criada pela polimerização do silicato de potássio, dificultando a
penetração do patógeno, ou até mesmo inviabilizando a sua estrutura reprodutiva.
Isso contribuiu de forma significativa para o decréscimo do número de pústulas por
folha e severidade da ferrugem do café e severidade da ferrugem asiática da soja.
52
Neste trabalho, as atividades de todas as enzimas expressas pelas folhas do
cafeeiro e da soja, tratadas com silicato de potássio via foliar em plantas inoculadas e
não inoculadas com o patógeno não mostraram, em geral, níveis diferentes das
atividades enzimáticas observadas no tratamento controle. Esta observação leva a
crer que a indução destas enzimas foi exclusivamente potencializada pela presença
do patógeno e não pela aplicação do Si. Além disso, vários aspectos devem ter
contribuído para essa paridade entre os tratamentos, especialmente fatores inerentes
ao erro experimental como, por exemplo, alterações na fisiologia das plantas.
Vários autores relatam que o Si pode atuar como barreira estrutural de modo a
impedir a penetração de fungos e afetar os sinais entre o hospedeiro e o patógeno,
resultando na ativação mais rápida e extensiva dos mecanismos pós-formados de
defesa (CHÉRIF et al., 1992; 1994; EPSTEIN, 1999). Neste contexto, o que pode ter
acontecido para que os componentes de resistência avaliados tenham sido diminuídos
foi a ação deste elemento proporcionando células epidérmicas com a parede celular
mais espessa devido à deposição de sílica nas mesmas (BLAICH & GRUNDHÖ
FER, 1998). Este fato pode ter favorecido a resistência às ferrugens.
A presença do Si na camada externa da epiderme foi observada por Carver et
al. (1987). Outros autores observaram que a complexação do Si com compostos
fenólicos na parede das células epidérmicas pode reduzir e dificultar a expansão das
lesões, bem como a intensidade da doença, por tornar as células mais rígidas (KIM et
al., 2002; RODRIGUES et al., 2001). Essas constatações podem afetar a
epidemiologia da doença reduzindo a penetração e contribuindo para menor
esporulação do fungo. Caso os eventos aqui observados seguiram realmente estas
observações, pode-se deduzir que a planta então não precisaria usar seus recursos
metabólicos para investir em respostas de defesa.
Na literatura, os trabalhos a respeito da aplicação foliar de Si relacionada com
respostas através dos mecanismos bioquímicos são raros. Contudo, um trabalho nesta
área avalia esses aspectos na cultura do pepino inoculada com Podosphaera xanthii
(LIANG et al., 2005). No referido estudo, verificou-se aumentos significativos da
atividade das enzimas POD, PPO, PAL e QUI após inoculação das plantas em
comparação com plantas sadias. Porém, estes resultados são devidos à aplicação do
Si via raiz. Outro estudo corrobora com estas conclusões (YANG et al., 2003).
No que diz respeito à aplicação foliar de Si, Gozzo (2003) afirma que a
inoculação das plantas pode ocasionar RSA, porém o Si via foliar não seria capaz de
53
induzir tal resposta. Em adição, Samuels et al. (1991) afirma que uma vez depositado
na parede celular, o Si é imobilizado e não é mais retranslocável. O trabalho
realizado por Liang et al. (2005) que corrobora os resultados aqui apresentados,
mostrou que as atividades das enzimas POD, PPO, PAL e QUI não apresentaram
alteração significativa em resposta à infecção, em plantas tratadas com Si via foliar e
obteve o mesmo resultado em plantas não inoculadas tratadas com este elemento.
Além desses autores, outros estudos do efeito da aplicação foliar de Si para
controle de oídio em pepino, melão, abóbora e uva mostraram que este elemento
aplicado via foliar reduziu a severidade das doenças. Contudo, isto deveria ser
atribuído ao papel de atuação físico deste elemento, depositando-se na superfície das
folhas e/ou por efeito osmótico do silicato de potássio aplicado via foliar em uma alta
concentração (BOWEN et al., 1992; MENZIES et al., 1992). Estes autores também
mostraram que a função do Si aplicado via raiz aumentou a resistência dessas
plantas, porém por meio da ativação de mecanismos pós-formados de defesa.
54
6. CONCLUSÕES
A aplicação foliar de silicato de potássio reduziu significativamente a
ferrugem nas folhas das mudas de cafeeiro e a ferrugem asiática em folhas das
plantas de soja.
O tratamento com silicato de potássio via foliar no pH 5,5 foi mais efetivo
que o tratamento com silicato de potássio no pH 10,2 na redução dos componentes de
resistência.
A aplicação foliar de Acibenzolar-S-Metil reduziu expressivamente a
ferrugem no experimento de café e a ferrugem asiática no experimento da soja.
Não houve variação nos teores foliares de Si e K, independente dos
tratamentos e da inoculação ou não inoculação das plantas de café e soja.
A indução das enzimas GLU, QUI, LOX, PAL, POD e PPO foram
exclusivamente potencializadas pela presença do patógeno.
O Si via foliar deve ter atuado por meio da barreira física criada pela
polimerização do silicato de potássio, com efeito negativo sobre o estabelecimento
do patógeno.
55
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