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UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE – UNIVALE
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO EFEITO CICATRIZANTE DE DIFERENTES
FORMULAÇÕES FITOTERÁPICAS DO EXTRATO DE REPOLHO (Brassica
oleracea var. capitata) EM COELHOS
DANILO DOS SANTOS MATOS
GOVERNADOR VALADARES - MG
MARÇO DE 2008
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DANILO DOS SANTOS MATOS
AVALIAÇÃO DO EFEITO CICATRIZANTE DE DIFERENTES
FORMULAÇÕES FITOTERÁPICAS DO EXTRATO DE REPOLHO (Brassica
oleracea var. capitata) EM COELHOS
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
em Ciências Biológicas da Universidade Vale do Rio
Doce, para obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas na área de Imunopatologia das Doenças
Infecciosas e Parasitárias.
ORIENTADOR: PROF. Dr. MARCELO BARRETO DA SILVA
(FAAG-UNIVALE)
GOVERNADOR VALADARES – MG
MARÇO DE 2008
2
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EXECUÇÃO DO TRABALHO:
Laboratório de Pesquisa em Biofármacos da Universidade Federal de Viçosa
(UFV),Viçosa, MG.
COLABORADORES:
Universidade Vale do Rio Doce
Alexandre Sylvio Vieira da Costa
(FAAG)
Prof. Carlos Alberto Silva
(FACS)
Universidade Federal de Viçosa
Prof. Dr. Cláudio César Fonseca
(DUT)
Prof.ª Dra. Tânia Toledo de Oliveira
(DBB)
Prof. Dr. Sergio Pinto Luis da Matta
(DBG)
INSTITUIÇÕES FINANCIADORAS:
Doctor Pharma, farmácia de Manipulação.
Unimed, Cooperativa de Trabalho Médico – Governador Valadares.
3
DEDICATÓRIA
A Deus: criador e propiciador da força para
realização deste trabalho.
Às mulheres da minha vida: Eliza, Danuza
e Letícia, que apoiaram e ajudaram meu
caminhar.
“O temor do Senhor é o princípio da
sabedoria”
Livro de Salmos cap. 111, v. 10 - Bíblia Sagrada.
4
ii
AGRADECIMENTOS
Ao professor Dr Marcelo Barreto da Silva, pela confiança, exemplo e apoio;
À Professora Dra. Tânia Toledo de Oliveira e Dr. Tânus Jorge Nágem pela
receptividade e paciência no desenvolvimento do trabalho como estagiários na UFV;
Aos professores Dr. Cláudio César Fonseca pela colaboração com a análise
histopatológica e Dr .Paulo Roberto Cecon com a análise estatística dos resultados;
À Doctor Pharma, farmácia de manipulação, pela ajuda para o desenvolvimento do
trabalho;
Aos funcionários José Geraldo (Laboratório de Biofármacos – UFV), José Maria
(Laboratório de Botânica – UNIVALE) e Wesley Costa Soares (Laboratório de
Farmacotécnica – UNIVALE) pelo apoio e ajuda;
A UNIVALE pelo ensino oferecido e as oportunidades;
A todos os professores e colegas, que no decorrer deste trabalho, através de sua
compreensão e conhecimento, direcionaram os estudos para que fossem consolidados.
Meus sinceros agradecimentos
5
iii
BIOGRAFIA
DANILO DOS SANTOS MATOS, filho de Ataíde dos Santos Lima e Eliza Matos
dos Anjos Lima, nasceu em 31 de janeiro de 1983 em Teófilo Otoni – MG.
No período de março 2003 a janeiro de 2006, trabalhou como bolsista do programa
de Iniciação Científica da Universidade Vale do Rio Doce – UNIVALE em parceria com
a farmácia de manipulação Doctor Pharma e realizou 3 estágios na Universidade Federal
de Viçosa, onde foram desenvolvidos os experimentos deste trabalho.
Foi representante discente das câmaras de Colegiado, Congregação e Consepe
durante os anos de 2004 a 2005 e graduou-se pela UNIVALE em Farmácia, habilitação
farmacêutico, no ano de 2005.
Em Março de 2006 iniciou o curso de mestrado no programa de pós graduação em
Imunopatologia das Doenças Infecto Contagiosas como bolsista de aperfeiçoamento da
Doctor Pharma & UNIVALE e foi representante discente do colegiado até 2007.
Atualmente é farmacêutico responsável técnico e Coordenador das farmácias
hospitalares UNIMED, Cooperativa de Trabalho Médico em Governador Valadares e
professor adjunto das disciplinas de Patologia, Farmacobotânica e Ética Farmacêutica na
Universidade Presidente Antônio Carlos em Teófilo Otoni - UNIPAC.
6
iv
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. vi
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................ vi
RESUMO .................................................................................................................................... vii
ABSTRACT ................................................................................................................................ viii
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 09
2. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................................... 11
3. OBJETIVO ................................................................................................................................. 12
3.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................................ 12
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 12
4. REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................................. 13
4.1. O REPOLHO (Brassica oleracea var. capitata) E O TRATAMENTO DE FERIDAS ..... 13
4.2. A ESPÉCIE .......................................................................................................................... 15
4.3. O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO ................................................................................ 15
4.4. KOLLAGENASE
®
COMO MEDICAMENTO CICATRIZANTE ................................... 19
5. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................ 21
5.1. PREPARO DAS FORMULAÇÕES A SEREM UTILIZADAS NOS TESTES ................. 21
5.2. ANIMAIS ............................................................................................................................ 21
5.3. PROCEDIMENTO PARA EXECUÇÃO DAS FERIDAS ................................................. 22
5.4. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ...................................................................................... 22
5.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................. 23
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 24
6.1. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DO TECIDO CICATRIZADO DE COELHOS .......... 35
7. CONCLUSÕES .......................................................................................................................... 34
8. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................ 35
ANEXO I (TABELA) ................................................................................................................ 41
ANEXO I (ARTIGO SUBMETIDO) ......................................................................................... 43
7
v
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Evolução da cicatrização de lesões cutâneas em coelhos (Oryctolagus cuniculatus):
ABCD - tratamento com Pomada Brassica sp. EFGH - tratamento com Emulsão de
Brassica sp. IJKL - tratamento Spray anti-séptico Brassica sp. MNOP tratamento
com pomada Kollagenase
®
(controle positivo). QRST tratamento solução fisiológica
0,9% (controle negativo)
®
no primeiro, quinto, décimo e décimo sétimo dias de
tratamentos. ................................................................................................................................ 25
FIGURA 2:
Análises da regressão da variável área da lesão, em centímetros quadrados em
função do tempo de cicatrização do 3º ao 15º dia nos períodos para os respectivos
tratamentos A: Pomada Brassica, B: Emulsão Brassica, C: Anti-séptico Brassica, D:
Controle negativo (Solução fisiológica 0,9%), E: Controle Positivo (Kollagenase
®
) e
F: todos os tratamentos em coelhos (Oryctolagus cuniculatus). .......................................
26
FIGURA 3:
Análises da regressão das variáveis área da lesão em centímetros quadrados em
função do tempo (17 dias) levando em consideração o desvio padrão das médias de
cada tratamento A: Pomada Brassica, B: Emulsão Brassica, C: Anti-séptico
Brassica, D: Controle negativo (Solução fisiológica 0,9%), E: Controle Positivo
(Kollagenase
®
) em coelhos (Oryctolagus cuniculatus). ....................................................
28
FIGURA 4: Fotomicrografia da pele de coelhos (Oryctolagus cuniculatus):ABC_ Pomada
Brassica sp; DEF_ Emulsão Brassica sp; GHI_ Spray anti-séptico Brassica sp;
JKL_ pomada Kollagenase®; MNO_ Solução fisiológica 0,9%. Epiderme e derme,
Camada papilar da derme (cpd) e Camada reticular da derme (crd), respectivamente
(HE. 100x) ....................................................................................................................... 33
LISTA DE TABELAS
Tabela 01:
Valores médios da área de regressão (cm²) da ferida em coelhos (Oryctolagus
cuniculatus) para seus respectivos tratamentos, em 17 dias. ............................................
27
Tabela 02:
Taxas de cicatrização por animal, em porcentagem, levando em consideração a regressão
em função da variável área da lesão em centímetros e o tempo de cicatrização do 3º ao
15º dia nos períodos da regressão cicatricial para os respectivos tratamentos e as
variações em porcentagem (Oryctolagus cuniculatus)...............................................................
29
Tabela 03:
Valores médios, em micrômetros, das áreas de epiderme e derme das lesões cicatrizadas
da pele de coelhos (Oryctolagus cuniculatus) submetidos a respectivos
tratamentos........................................................................................................................................
31
8
vi
RESUMO
A pesquisa na área de produtos naturais tornou-se um fato de relevância e grande
valorização em todos os paises desenvolvidos, principalmente devido à possibilidade de
descoberta de novos fármacos que poderão ser utilizados para fins terapêuticos. Dentro
desta perspectiva, o grupo pesquisa Bioplanta da Univale, em parceria com a equipe de
desenvolvimento tecnológico da farmácia de manipulação Doctor Pharma Ltda,
desenvolveu uma alternativa para o tratamento de feridas na região de Governador
Valadares: a Pomada de Repolho (Brassica oleracea var. capitata). Assim, o objetivo
deste trabalho foi avaliar o efeito cicatrizante de diferentes fórmulas farmacêuticas
fitoterápicas (pomada, spray e suspensão/ emulsão) à base do extrato glicólico de B.
oleracea em coelhos (Oryctolagus cuniculatus), tendo como controle positivo a
Kollagenase
®
e controle negativo a Solução fisiológica 0,9%. Foram utilizadas 30
fêmeas de mesma idade e peso aproximados, divididos em 5 grupos de 6 animais em
condições naturais de temperatura e alimentação controlada. As feridas foram induzidas
durante 5 dias com anestesia local e aplicação de ácido clorídrico 10% duas vezes ao
dia. Após este processo os animais passaram por 17 dias de tratamento com aplicações
dos tratamentos duas vezes ao dia e medições com paquímetro e fotografias diárias das
lesões. Ao final dos tratamentos das feridas, os animais foram eutanasiados e o tecido
cicatrizado foi submetido à análise histopatológica com medições de epiderme e derme
em 10 diferentes pontos por corte. Os resultados revelaram haver melhor organização
dos queratinócitos da epiderme dos animais submetidos ao tratamento com pomada
Brassica, emulsão Brassica e Kollagenase
®
(controle positivo). As fórmulas
farmacêuticas testadas mostraram-se tão eficazes quanto a Kollagenase
®
e muito
superiores a nível histológico, qualitativo e quantitativo quando comparados ao controle
negativo. Os resultados evidenciaram as propriedades cicatrizantes do repolho e da
eficácia do seu extrato na fórmula de pomada e emulsão Brassica.
Palavras chave: Cicatrização, Produtos naturais
Área do conhecimento: Fitoterapicos 2.14.00.01
9
vii
ABSTRACT
The research in the area of natural products became a fact of relevance and great
valorization in all of the developed countries, mainly due to the possibility of discovery
of new drugs that can be used for therapeutic ends. Inside of this perspective, the group
researches Bioplanta of Univale, in partnership with the team of technological
development of the manipulation drugstore Doctor Pharma Ltda, developed an
alternative for the treatment of wounds in Governador Valadares area: the Ointment of
Cabbage (Brassica oleracea). Like this, the objective of this work was to evaluate the
healing effect of different pharmaceutical phitoterapics formulations (ointment, spray
and suspension / emulsion) to the base of the extract glycolic of B. oleracea in rabbits
(Oryctolagus cuniculatus), tends as positive control Kollagenase® and negative control
the physiologic Solution 0,9%. 30 females of same age and weight were used
approximated, divided in 5 groups of 6 animals in natural conditions of temperature and
controlled feeding. The wounds were induced for 5 days with local anesthesia and
application of hydrochloric acid 20% twice a day. After this process the animals went
twice by 17 days of treatment with applications of the treatments to the day and
measurements with paquimetre and daily pictures of the lesions. At the end of the
treatments of the wounds, the animals were eutanasiateds and the scarred fabric was
submitted to the hystopatologic analysis with epidermis measurements and dermis in 10
different points. The results revealed there to be better possible organization of the
keratinocits of the epidermis of the animals submitted to the treatment with ointment
Brassica, emulsion Brassica and Kollagenase® (it controls positive). The tested
pharmaceutical formulations were shown as effective as Kollagenase® and very
superiors at level histological, qualitative and quantitative when compared to the
negative control. The results showed strong evidences of the healing properties of the
cabbage and of the effectiveness of his extract in the ointment formulations and
emulsion Brassica.
10
viii
1. INTRODUÇÃO
A pesquisa na área de produtos naturais tornou-se um fato de relevância e grande
valorização em todos os paises desenvolvidos, principalmente devido à possibilidade de
descoberta de vários princípios ativos que poderão ser utilizados para fins terapêuticos
(Jamal, 2002).
O crescimento do mercado de plantas medicinais se deve, principalmente, à
grande tendência da busca por medicamentos fitoterápicos, vinculada especialmente a
fatores socioeconômicos, de manutenção das tradições, à falência do sistema oficial da
saúde, à mudança de paradigmas humanos e ao desenvolvimento de uma farmacologia
natural científica, ética e responsável (Moreira et al., 2001).
Alguns agentes medicinais comumente usados para o tratamento de várias
condições patológicas têm sua origem na medicina popular (Noormohamed et al.,
1994). Dentre as várias conseqüências destas patologias destacam-se as lesões de pele,
que correspondem a aproximadamente 30% das indicações de utilização de plantas
medicinais. Embora não haja dados precisos no Brasil, alguns trabalhos demonstram
que o impacto psíquico, social e econômico da cronificação de lesões, em especial as
úlceras crônicas dos pés e pernas, representam a segunda causa de afastamento do
trabalho (Ereno, 2003).
Mandelbaum et al. (2003) afirmam que tentativas humanas de intervir no
processo de cicatrização das feridas, acidentais ou provocadas intencionalmente como
parte da realização de procedimentos, remontam à Antigüidade, demonstrando que
desde então já se reconhecia a importância de protegê-las de forma a evitar que se
complicassem e repercutissem em danos locais ou gerais para o paciente.
O reparo de lesões não é um simples processo linear no qual fatores de
crescimento disparam a proliferação celular, e sim uma integração de processos
interativos dinâmicos, que envolve mediadores solúveis, elementos figurados do
sangue, produção de matriz extracelular e células parenquimatosas (Junqueira &
Carneiro, 1998).
11
Existem varias substâncias naturais amplamente utilizadas para a cicatrização de
feridas cutâneas, destacando-se o mel (Oryan & Zaker, 1998), a própolis (Silveira &
Raiser, 1995), as folhas de Aloe Vera (Chitahra et al., 1995). O repolho (Brassica
oleraceae var. capitata) , vegetal rico em vitamina C, aumenta a resistência às infecções
e ajuda na cicatrização (Kurilich et al, 1999). Durante seis séculos foi utilizado pelos
romanos tanto internamente como externamente por suas propriedades adstringentes e
na forma de cataplasmas, no tratamento de feridas (Balbach & Boarim,1993; Veiga,
2005; Ferradeira, 2003).
Neste contexto, observou-se que um grupo de enfermeiras de alguns dos
hospitais da cidade de Governador Valadares vinha, há mais de 20 anos, empregando
um emplastro manufaturado com folhas de Brassica sp no tratamento de feridas na pele
de pacientes, obtendo um efeito cicatrizante muito significativo (Ferradeira, 2003;
Veiga, 2005). Este procedimento apresentava bons resultados, porém sua estética e a
praticidade deixariam a desejar.
De posse destes dados, a equipe de desenvolvimento tecnológico da Doctor
Pharma Ltda, farmácia de manipulação, no ano de 2002, elaborou uma pomada com a
folha da Brassica sp. Após realizar teste de estabilidade farmacotécnica como pH ideal
(apoximadamente 6,8), densidade, viscosidade e compatibilidades de bases
farmacêuticas e extratos em diversas concentrações foram obtidos resultados que
possibilitaram a incorporação da base aos extratos glicólicos de Brassica. Este produto
foi disponibilizado para as enfermeiras que utilizaram e registraram informalmente
resultados satisfatórios da pomada no seu efeito cicatrizante.
Diante dos resultados obtidos e, em decorrência da demanda pelo produto no
mercado local e regional, onde a pomada já é comercializada e consagrada pelo uso, a
Doctor Pharma se associou à Universidade Vale do Rio Doce, através do grupo de
pesquisa Bioplanta, no intuito da realização de testes que comprovaram cientificamente
em estudos pré-clinico efeito cicatrizante significativo em cobaio (Cavia cobaya)
(Freire et al., 2003), hamsters (Phodopus campbelli) (Silva et al., 2005) e ratos Wistar
(Rattus norvegicus) (Sarandy, 2007).
Assim, a proposta do presente trabalho foi avaliar o efeito cicatrizante de
diferentes formulações fitoterapicas à base de extrato glicólico de Brassica oleracea em
coelhos (Oryctolagus cuniculatus).
12
2. JUSTIFICATIVA
A utilização de plantas medicinais e a fitoterapia encontram-se em expansão em
todo o mundo, constituindo um mercado farmacêutico altamente promissor.
Levantamentos realizados em diferentes paises evidenciaram que a utilização das
plantas medicinais vem se tornando cada vez mais populares.
Na área de produtos cicatrizantes, as poucas alternativas industrializadas de
tratamento são caras e de difícil acesso e as alternativas mais populares são apenas
baseadas em conhecimentos empíricos, requerendo maior cuidado e orientação
profissional durante o preparo e utilização, fazendo com que esta área de novas
descobertas tenha a necessidade de novos produtos alternativos, porém com preços
acessíveis.
Este trabalho foi realizado diante desta realidade e se justifica pela busca de uma
descrição mais específica (qualitativa e quantitativa) da utilização das propriedades
cicatriciais da espécie Brassica sp.
13
3 . OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar o efeito, na cicatrização, de diferentes formas farmacêuticas
fitoterápicas (spray, loção e pomada) à base do extrato glicólico de Brassica em coelhos
(Oryctolagus cuniculus).
Objetivos específicos
Comparar a taxa de cicatrização levando em consideração o tempo de tratamento
e a regressão diária das feridas;
Comparar a ação das formas farmacêuticas à base de Brassica com Kollagenase
®
,
produto consagrado no mercado para tratamento de feridas através de análise
macro e microcópicas;
14
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1. O REPOLHO (Brassica oleracea var. capitata) E O
TRATAMENTO DE FERIDAS
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 80% da população
mundial utiliza principalmente a medicina tradicional para suprir as necessidades de
assistência médica primária (Farnsworth, 1985). Esse conhecimento etnofarmacológico
tem sido usado como ponto de partida para o delineamento experimental visando a
descoberta de novos fármacos (Elizabetsky, 1987).
Estas novas descobertas devem se tornar mais acessíveis às pessoas, mediante o
desenvolvimento de tecnologias mais simples e baratas, igualmente eficientes e que
utilizem matérias-primas encontradas em regiões menos desenvolvidas (Ereno, 2003).
A cicatrização de feridas é um processo complexo classicamente dividido em
um estágio inflamatório/degradativo precoce, com pico nas primeiras horas após a
injúria, seguido por granulação e posteriormente por epitelização (Politis &
Dmytrowich, 1998).
Segundo Clark (1993), os eventos da cicatrização dos tecidos podem ser
divididos em três fases, que não são mutuamente excludentes, mas sobrepostas no
tempo. Estas fases são nomeadas de inflamação, formação de tecido de granulação com
deposição de matriz extracelular e remodelação tecidual.
O processo de cicatrização é caracterizado pelo preenchimento de determinado
espaço e selado pela cicatriz. Entretanto, este quadro pode ser alterado pela presença ou
ausência de bactérias, tipo de ferida (aberta/ fechada), grau de suprimento sanguíneo,
tipo de tecido lesado etc. (Manjo & Joris, 1996).
A cicatriz passa a apresentar a forma do tecido originalmente destruído acrescida
de fibras colágenas. Observa-se apoptose dos fibroblastos e das células endoteliais, e os
eosinófilos aparecem nas últimas fases da reparação, presumindo que possam estar
ligados a fatores de crescimento.
Qualquer lesão que leve á descontinuidade da pele pode ser chamada de ferida.
As feridas têm diversas causas:
- trauma - mecânico, químico, físico;
- intencional - cirurgia;
- isquemia- p.ex., úlcera arterial da perna;
15
- pressão- p.ex., úlcera de decúbito;
Quando um tecido íntegro sofre uma agressão, seja ela de natureza infecciosa ou
não, ele responde no sentido de restaurar a integridade perdida. Esta resposta complexa
do organismo, denominada inflamação, é um mecanismo de defesa do corpo contra
agressões, pois propicia o acúmulo e ativação de células fagocitárias no local da injúria,
o que contribui para a eliminação de microorganismos. É também essencial para a
restauração dos tecidos, sendo que a cicatrização não ocorre sem a inflamação (Siqueira
Júnior & Dantas, 2000).
O processo de reparo existe para restaurar a integridade anatômica e funcional
do tecido durante resposta inflamatória e depois que esta desapareceu. A cura de uma
ferida é uma sucessão complexa de eventos bioquímicos e celulares em resposta à lesão
tecidual. Para que um ferimento seja curado com êxito, os eventos devem se suceder
numa seqüência apropriada e o resultado final, geralmente uma cicatriz de tecido
conjuntivo, representa o somatório deste processo. Os processos que envolvem o reparo
de uma ferida devem ser controlados com precisão, caso contrário eles podem se
descontrolar, com resultados destrutivos (Trowbridge & Emling, 1996).
Segundo Cotran et al. (2000), uma variedade de agentes lesivos – ao mesmo
tempo em que provocam dano no interior da célula – disparam uma série de eventos não
apenas para conter a lesão, mas também para preparar as células que não foram
letalmente danificadas para a replicação necessária à substituição das células mortas.
Siqueira Júnior & Dantas (2000) enfatizam que o reparo tecidual inicia-se com a
hemostasia, visando a bloquear a perda de sangue por vasos rompidos durante a lesão
do tecido ou órgão.
O tratamento de feridas deve ser visto como algo dinâmico, pois à medida que
avança o conhecimento técnico-científico nesta área, a abordagem terapêutica também
deve incorporar estes conhecimentos. Os produtos para tratamentos de feridas podem
ser reunidos em dois grandes grupos: agentes tópicos e curativos. Os agentes tópicos
(pomadas, spray, emulsões) são aqueles aplicados diretamente sobre o leito da ferida ou
destinados à limpeza ou proteção da área em seu redor. Os curativos, também chamados
por alguns autores de cobertura, é o recurso que cobre uma ferida, com o objetivo de
favorecer o processo de cicatrização e protegê-la contra agressões externas, mantendo-a
úmida e preservando a integridade de sua região periférica (Siqueira Júnior & Dantas
2000).
Nos trabalhos de Veiga (2005) na prefeitura de Governador Valadares, foram
16
relatados casos clínicos, com utilização da pomada de Brassica como um eficiente
agente tópico no tratamento de úlceras crônicas como debridante químico e estimulante
direto do processo cicatricial. Durante o acompanhamento de 8 pacientes relatados por
Veiga (2005), nenhum apresentou qualquer tipo de reação alergênica, o que poderia
comprometer a utilização do produto em trabalhos posteriores.
4.2. A ESPÉCIE
Brassica oleracea é uma hortaliça anual da família Brassicaceae, que tem como
região de origem a Costa Norte Mediterrânea, Ásia Menor e Costa Ocidental Européia.
Em sua forma selvagem, o repolho era utilizado pelos Egípcios, sendo que o seu uso
generalizou-se com as invasões arianas entre 2500 e 2000 AC. Por ser considerado uma
fina iguaria pelos gregos e romanos, era cultivado em suas diversas formas. Acredita-se
que o repolho tenha sido introduzido na Europa pelos celtas no século IX. Na América,
o repolho foi trazido pelos conquistadores europeus por volta do século XV (Fracaro et
al, 1999; Monsale & Cano, 2003; De Carvalho, 2007).
A espécie em estudo apresenta caule curto, direto, sem ramificações. Tem folhas
arredondadas e cerosas, havendo superposição das folhas centrais, formando uma
“cabeça” compacta. Foi desenvolvida, originalmente para as condições européias,
fazendo com que temperaturas mais elevadas ocasionem a formação de “cabeças”
pouco compactas, ou total ausência delas. Pelo melhoramento genético foram obtidos
cultivares adaptados a temperaturas elevadas, ampliando consequentemente os períodos
de plantio e de colheita (Filgueira, 2000).
Segundo Balbach & Boarim (1993), a Brassica oleracea é uma espécie de couve
com folhas enoveladas, tipo globo, com excelentes propriedades nutritivas e medicinais.
Ela pertence à família Brassicaceae (Cruciferae), uma família botânica que abrange o
maior numero de culturas oleráceas (Filgueira, 2000).
4.3. O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO
Segundo Junqueira & Carneiro (1995), os tecidos dos diversos órgãos do corpo
são constituídos por células e pela matriz extracelular, que é produzida pelas células.
Apesar da complexidade do organismo dos mamíferos, há apenas quatro tipos básicos
17
de tecidos: o epitelial, o conjuntivo, o muscular e o nervoso. Os epitélios apresentam, na
sua superfície de contato com o tecido conjuntivo, uma estrutura chamada lâmina basal.
Em determinadas regiões do organismo verifica-se, em continuação à lâmina
basal, um acúmulo de fibras reticulares e complexos de proteínas e glicoproteínas,
formando um conjunto que é visível ao microscópio de luz. A associação da lâmina
basal com esta estrutura chama-se membrana basal. Nos epitélios sujeitos a atrito forte,
como na pele, a lâmina basal fixa-se ao tecido conjuntivo subjacente por meio de finas
fibras de colágeno tipo VII, chamadas fibrilas de ancoragem (Siqueira Jr. & Dantas,
2000).
Durante os processos de cicatrização na regeneração do tecido muscular liso e
dos prolongamentos das células nervosas, por exemplo, as células migram apoiadas e
guiadas pelas lâminas basais. O movimento de células requer um substrato sólido onde
elas se possam apoiar (suspensas em meio líquido, as células são imóveis) (Junqueira &
Carneiro, 1995).
As células epiteliais apresentam intensa adesão mútua e são especialmente
desenvolvidas nos epitélios sujeitos a fortes trações e pressões, como no caso da pele. O
conjunto formado pelas zônulas de oclusão e de adesão constitui o complexo unitivo e é
responsável por uma estrutura há muito conhecida como rede terminal, visível ao
microscópio óptico, em preparados adequadamente corados. Certas estruturas
predominam num pólo, enquanto outras predominam no outro pólo, conforme a
atividade funcional da célula (Trowbridge & Emling, 1996).
Os epitélios de revestimento podem ter uma ou mais camadas de células e estão
sempre apoiadas numa camada de tecido conjuntivo que contém os vasos sanguíneos
cujo sangue nutre o epitélio.
No epitélio estratificado, a classificação baseia-se na forma das células da
camada mais superficial do epitélio. Os epitélios estratificados mais freqüentes são os
pavimentosos, os prismáticos e o de transição. O epitélio estratificado pavimentoso é
encontrado principalmente na pele é constituído por várias camadas celulares, sendo que
as células vão achatando à medida que se aproximam da superfície.
Os vasos sanguíneos não penetram nos epitélios, de modo que a nutrição destes
é feita por difusão através do tecido conjuntivo, da membrana basal e de um número
variável de camadas celulares, para atingir as células mais superficiais dos epitélios
estratificados.
18
O objetivo do reparo tecidual é restaurar a continuidade entre as margens da
ferida e restabelecer as características morfofuncionais do órgão ou tecido afetado. Para
tal, o organismo lança mão de células progenitoras indiferenciadas (células tronco da
epiderme), encontradas em quantidades reduzidas em tecidos adultos. Tais células
servem de fonte para originar novas células especializadas, durante a remodelação ou o
reparo tecidual (Siqueira Jr. & Dantas, 2000).
A variabilidade e a complexidade clínicas de cicatrização têm, historicamente,
limitado avanços tecnológicos no sentido de otimizar o reparo celular. Entretanto, ainda
prevalece a busca pela identificação de fatores determinantes e facilitadores deste
evento. Apesar do grande incentivo, as investigações a respeito da modulação clínica e
farmacológica do reparo tecidual ainda apresentam dados inconclusivos referentes às
melhores alternativas de tratamento e cuidados com feridas (Jorge & Dantas, 2003).
A cicatrização representa a substituição do tecido lesado por um tecido
conjuntivo de natureza fibroblástica. Este tipo de reparo pode resolver o problema da
perda de substância e restaurar a continuidade do tecido, porém as células
queratinolíticas altamente especializadas estarão perdidas, sendo substituídas por células
morfológica e funcionalmente diferentes, implicando prejuízo funcional, seqüela
comum verificada após a ocorrência deste processo de reparo (Siqueira Jr. & Dantas,
2000).
A formação de cicatriz é uma conseqüência inevitável das feridas com perda de
tecido. Quanto mais colágeno é formado dentro da ferida, mais capilares são
reabsorvidos e mais fibroblastos desaparecem, o tecido torna-se relativamente avascular
e a cicatriz é formada. A formação de cicatriz é o estágio final da reparação por fibrose
(Trowbridge & Emling, 1996).
Dentre os fatores sistêmicos que podem afetar de maneira adversa a reparação da
ferida, a circulação prejudicada é um deles. Não há substrato para as células
metabolicamente ativas na reparação da ferida. A principal causa da circulação
prejudicada é a aterosclerose. Úlceras crônicas de pele são encontradas no local de
reparação em indivíduos com aterosclerose avançada, sendo particularmente comum
entre diabéticos (Trowbridge & Emling, 1996).
Os processos que envolvem o reparo de uma ferida devem ser controlados com
precisão, pois, eles podem se descontrolar, com resultados destrutivos. O quelóide, uma
cicatriz de tecido conjuntivo exuberante, é um exemplo de controle inadequado do
reparo, que ocorre em resposta a um ferimento cutâneo (Carvalho, 2002).
19
Avaliar e documentar a evolução da ferida é imperativo para se determinar o
tratamento apropriado para cada caso. Isto deve ser feito de forma sistemática, desde a
ocorrência da lesão até a sua completa resolução (Jorge & Dantas, 2003) seguindo fase
a fase como descrito abaixo.
_ Fase de inflamação
Inflamação é a resposta do corpo à lesão tecidual. Não importa se os fatores que
causaram sejam térmicos, químicos, traumáticos ou biológicos; na maioria das vezes
ocorre uma interrupção do fluxo vascular da área lesionada (Carvalho, 2002).
A lesão tecidual geralmente vem acompanhada da ruptura dos vasos sangüíneos,
resultando em hemorragia. Um episódio hemorrágico é controlado pela combinação de
fenômenos que se desenvolvem na intimidade dos tecidos lesados (Siqueira Junior. &
Dantas, 2000).
A fase inflamatória caracteriza-se pelos sinais típicos do processo localizado
como dor, rubor, calor, tumor (edema) e, freqüentemente, a perda da função local, que
começa no momento em que ocorre a lesão tecidual e se estende por um período de três
a seis dias. Nesse período, o organismo é estimulado a utilizar complexos mecanismos
tais como a formação de trombos por meio da agregação plaquetária, a ativação do
sistema de coagulação, o desbridamento da ferida e a defesa contra infecções visando à
restauração tecidual (Silva et al., 2005).
O colágeno é o principal componente da cicatriz de tecido conjuntivo maturo.
Na ferida em processo de cura, fibroblastos produtores de colágeno são recrutados das
margens da ferida e induzidos a sintetizar essa proteína, num processo seletivo
conhecido como fibroplasia. Ocorre neovascularização concorrentemente com
fibroplasia, de modo que novos capilares são gerados dos tecidos viáveis na borda da
ferida, migrando até o espaço da ferida. A contração da ferida faz com que suas margens
se aproximem mais e, se o tecido original estava revestido por uma superfície epitelial,
a reepitelização começa a cobri-la (Carvalho, 2002).
_ Fase proliferativa
Em um período de 24 horas ocorre a proliferação de células que são
responsáveis pelo reparo da ferida. Neste instante, a área lesada apresenta-se preenchida
por um tecido isquêmico e danificado, ou por coágulo sangüíneo, formado na fase
anterior (Siqueira Junior & Dantas, 2000).
20
A atividade predominante nesse período são as mitoses celulares, que se
estendem por aproximadamente três semanas (Jorge & Dantas, 2003).
As características básicas desta fase são o desenvolvimento do tecido de
granulação composto por capilares e a reconstituição da matriz extracelular, com a
deposição de colágeno, fibronectina e outros componentes protéicos. Os principais
agentes estimulantes para a síntese desses componentes são as células endoteliais, os
fibroblastos e os queratinócitos (Jorge & Dantas, 2003).
_ Fase de remodelação tecidual
A fase reparadora tem início por volta da terceira semana após a ocorrência da
ferida e se estende por até dois anos, dependendo do grau, extensão e local da lesão. Os
eventos que ocorrem nesta fase são: a diminuição progressiva da vascularização, dos
fibroblastos, o aumento da força tênsil e a reorientação das fibras do colágeno (Jorge &
Dantas, 2003).
Durante a remodelação há mudanças profundas na forma, volume e resistência
do tecido de reparo. Este está representado por um tecido conjuntivo denso, onde
predominam fibras colágenas, apresentando ainda uma proporção elevada de reciclagem
de colágeno, porém mais lenta do que na fase proliferativa. Ocorre também aumento na
resistência do tecido de reparo, embora isto aconteça mais lentamente nesta fase
(Siqueira Junior & Dantas, 2000).
As estruturas resultantes desse processo tornam-se mais bem organizadas à
medida que sofrem maturação, pois o volume da cicatriz diminui gradualmente e a
coloração passa, aos poucos, de vermelho para o branco pálido, característica do tecido
cicatricial (Jorge & Dantas, 2003).
A remodelação realiza-se por um processo de degradação da matriz intra e
extracelularmente, sendo este último mediado pela ação das metaloproteinases da
matriz.
4.4. KOLLAGENASE
®
COMO MEDICAMENTO
CICATRIZANTE (Benitz & Oliveira Filho, 2006/2007)
A Kollagenase
®
(Cristália - Reg. MS n 1.0298.0049), um fibrinolítico de uso
adulto com ações terapêuticas cicatrizantes, possui indicações para úlceras, escaras,
21
queimaduras e feridas. É utilizada aplicando-se localmente sobre a região afetada, uma
vez ao dia ou mais se as bordas das lesões ficarem sujas.
Seu princípio ativo é a colagenase, uma enzima que tem por substrato o
colágeno nativo e desnaturado, o principal constituinte (75% do peso seco) da pele. É
extraída do meio de cultivo do Clostridium histolyticum sendo utilizada para remover os
restos celulares e extra-celulares do tecido necrosado. Contribui para a neoformação de
tecido e reepitelização das úlceras e escaras dérmicas. O colágeno do tecido sadio ou
neoformado não é atacado pela colagenase. Apresenta-se como creme, pomada ou
ungüento estéril para aplicação tópica com 250U por grama.
22
5.0. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. PREPARO DAS FORMULAÇÕES A SEREM UTILIZADAS NOS
TESTES
As plantas de Brassica oleracea var Capitata foram cultivadas na horta orgânica
da FAAG - Faculdade de Ciências Agrárias da UNIVALE e posteriormente enviadas
para a confecção dos extratos.
O extrato foi preparado no laboratório de Farmacotécnica da Univale e as
diferentes formulações foram preparadas na empresa parceira do projeto e
posteriormente disponibilizadas para os ensaios. Foram seguidos os procedimentos
padrão de controle de qualidade utilizando extrato glicólico de folhas maceradas de
Brassica em concentração de 20% para base de vaselina e lanolina 1x1 de concentração
para cada grama no extrato.
A metodologia exata de preparo das formulações das bases dos medicamentos,
com as devidas proporções, estão em vias de patente e registro junto à ANVISA, para
medicamentos fitoterápicos e necessita de sigilo junto a este trabalho, sendo, portanto
revelada somente em partes.
5.2. ANIMAIS
Foram utilizadas 30 fêmeas de coelhos (Oryctolagus cuniculus) albinos, adultas,
provenientes do Biotério Central do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da
Universidade Federal de Viçosa UFV. Os animais foram mantidos em condições
naturais de luz, umidade e temperatura em gaiolas individuais de aproximadamente 0,5
m
2
. Os coelhos possuíam peso médio de 1.950 ± 130 g e idade média de 12 (doze)
semanas, tendo recebido ração comercial Nutricoelhos
®
(Soma Indústria e Comércio de
Alimentos Ltda), na quantidade de 120 g/dia/coelho e água à vontade, através de
bebedouros com bicos dosadores acoplados às gaiolas durante todo o período
experimental.
23
5.3. PROCEDIMENTO PARA EXECUÇÃO DAS FERIDAS
Este teste foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais com
Atividades Biológicas (Biofármacos), vinculado ao Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG.
Os animais foram separados aleatoriamente em 5 grupos, cada grupo com 6
indivíduos. Todos os grupos tiveram as feridas limpas com solução fisiológica de
cloreto de sódio 0,9% duas vezes ao dia (antes de cada tratamento com as pomadas, de
manhã e à noite).
As feridas cutâneas foram induzidas, uma em cada animal após anestesia local
utilizando Lidocaína 2%, no dorso posterior utilizando ácido clorídrico 10% mediante
área delimitada de aproximadamente 7 cm
2
, utilizando forma de metal, durante 5 dias (2
vezes ao dia). A área lesada foi previamente limpa com solução fisiológica 0,9% e
tratada com o produto referente a cada grupo do experimento, duas vezes ao dia.
Seguindo metodologia proposta por Jorge & Dantas (2003) para tratamento de
feridas por segunda intenção (bordas expostas), foi feita a limpeza com gaze umedecida
em solução fisiológica 0,9%, antes da aplicação dos tratamentos, duas vezes ao dia, com
o intuito de remoção do tecido desvitalizado. Estes animais receberam os tratamentos,
conforme descrição a seguir.
Todos os grupos foram tratados durante 17 dias (final do processo cicatricial) e
os animais foram divididos da seguinte forma para receber o tratamento 2 vezes ao dia:
grupo um tratados com pomada Brassica oleracea; grupo dois com emulsão Brassica
oleracea; grupo três com spray anti-séptico Brassica oleracea; grupo quatro com
pomada Kollagenase
®
(controle positivo) e grupo cinco com solução fisiológica 0,9%
(controle negativo), constituindo de animais onde as feridas não receberam qualquer
tipo de tratamento.
5.4. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Ao final do experimento os animais foram eutanasiados e os fragmentos de
tecido cicatricial foram retirados e fixados em formaldeído 10% em tampão fosfato de
sódio, por 24 horas. Foram obtidos cortes de 4µm em micrótomo rotativo (Reichert-
jung 2045 Multicut
®
), os quais foram corados com hematoxilina (1 a 2 minutos), em
seguida lavados em água corrente por 10 minutos (diferenciação) e corados com eosina
24
(30 segundos a 1 minuto), depois lavando em água destilada, desidratando, diafanizando
e montando seguindo metodologia padrão do laboratório.
As preparações histológicas foram fotografadas com câmera digital Cyber Shot
Sony (5.1 mega pixel’s de resolução) acoplada ao microscópio, para proceder à análise
histopatológica da cicatrização.
A epiderme e a derme foram medidas em 10 pontos do corte para cada animal,
utilizando microscópio e régua de escala micrométrica com valores calibrados em
comparação com uma régua micrométrica de especificidade conhecida.
5.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizados de acordo
com as aferições de epiderme e derme e também por tempo de cicatrização individual
em 6 repetições por grupo de tratamento (medições diárias). A análise estatística
permitiu comparar a variação entre os grupos de animais da regressão das feridas dia a
dia em função do tempo. Baseado nas formas das curvas das médias das variáveis
determinadas ao longo do tempo, foi estimulado o modelo quadrático por função
polinomial de segunda ordem (Y= ax² - bx + c tempo) de regressão para cada animal
tratado em função do tempo dos 17 dias de experimento.
As análises, utilizando teste de Tukey, objetivam constatar se algum dos
tratamentos era altamente correlacionado com a regressão das feridas através de análise
estatística da medias dos grupos por área da lesão.
25
6.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A FIGURA 1 apresenta o aspecto visual da regressão das lesões cutâneas de um
elemento de cada grupo de tratamento. Os indivíduos foram numerados ao acaso, sendo
escolhido o mesmo indivíduo de cada grupo para exposição das fotos. Na figura
observa-se o acompanhamento do processo de cicatrização das feridas, desde o primeiro
até o décimo sétimo dia dos diversos tratamentos.
A observação macroscópica das feridas mostrou que os animais submetidos aos
tratamentos com pomada fitoterápica e emulsão Brassica sp (FIGURA 1 C e H)
apresentaram resultados mais homogêneos quando em comparação com o controle
negativo (FIGURA 1 T).
Uma das hipóteses para esse resultado é a presença de flavonoides, ressaltada
nos trabalhos de Lorenzi & Matos (2002), que são substâncias utilizadas na elaboração
de medicamentos, utilizados no tratamento de doenças circulatórias, hipertensão e que
agem como co-fator da vitamina C, o que contribui para a síntese de colágeno
importante no processo cicatricial (Simões et al, 2003).
A presença de Caroteno, Tocoferol de Vitamina C (Kirilich, 1999) também
parece ser um indicativo das propriedades cicatrizantes da Brassica oleracea, pois os
mesmos contribuem para o desenvolvimento dos processos síntese de colágeno e
fechamento das feridas (Simões et al, 2003).
26
FIGURA 1: Evolução da cicatrização de lesões cutâneas em coelhos (Oryctolagus
cuniculatus): ABCD - tratamento com Pomada Brassica sp. EFGH - tratamento com
Emulsão de Brassica sp. IJKL - tratamento Spray anti-séptico Brassica sp. MNOP
tratamento com pomada Kollagenase
®
(controle positivo). QRST tratamento solução
fisiológica 0,9% (controle negativo)
®
no primeiro, quinto, décimo e décimo sétimo dias
de tratamentos.
27
C D
E
F
G
H
I
J
K
L
Q
R
S
T
A
B
M
N
O P
De acordo com a FIGURA 2 (A e E), as áreas das lesões dos tratamentos com
pomada Brassica e Kollagenase
®
foram mais homogêneas quanto à área da lesão
regredida (y
> 0,0338x² e 0,0805x²) respectivamente. Apesar de a pomada ter
apresentado uma área da lesão menor em relação aos outros tratamentos, a regressão dia
a dia foi maior que o controle positivo e proporcionalmente maior que a solução
fisiológica a 0,9% (controle negativo) (FIGURA 2_Regressão dos 5 tratamentos)
FIGURA 2: Análises da regressão da variável área da lesão, em centímetros quadrados
em função do tempo de cicatrização do 3º ao 15º dia nos períodos para os respectivos
tratamentos A: Pomada Brassica, B: Emulsão Brassica, C: Anti-séptico Brassica, D:
Controle negativo (Solução fisiológica 0,9%), E: Controle Positivo (Kollagenase
®
) e F:
todos os tratamentos em coelhos (Oryctolagus cuniculatus).
28
Ao final do processo cicatricial, por volta do 14º dia de tratamento a Emulsão
Brassica já havia apresentado o final do processo cicatricial em quase todos os animais
tratados, apresentando uma curva mais homogênea (FIGURA 2 B)
Foi observada variação significativa, (TABELA 1) entre os tratamentos com
emulsão e pomada, principalmente quando comparados com a Kollagenase
®
. No 2º, 3º,
16º E 17º dias com os tratamentos. A área inicial do tratamento com Pomada Brassica
apresentou menor média dos grupos em relação aos outros tratamentos devido à maior
heterogeneidade dos resultados por animal (FIGURA 2). Este resultado é explicado pelo
fato de que medicamentos que deixam a ferida úmida induzem um processo
inflamatório inicial essencial para a cicatrização (Mandelbaum, 2003).
TABELA 1: Valores médios da área de regressão (cm²) da ferida em coelhos
(Oryctolagus cuniculatus) para seus respectivos tratamentos, em 17 dias.
DT
Pomada
Brassica sp.
Emulsão
Brassica sp.
Anti-séptico
Brassica sp.
Solução
Fisiologia 0,9%
Kollagenase
®
DMS
CV
(%)
1 6,690 a 9,816 a 8,863 a 7,621 a 9,453 a 3,99 27,75
2 5,463 b
9,816 a
8,863 ab 7,621 ab 9,453 ab
4,11 29,36
3 6,392 b
11,738 a
11,680 a 10,032 ab 11,060 a
4,52 26,38
4 5,953 a 9,299 a 10,180 a 8,065 a 9,980 a 5,06 34,26
5 5,247 a
8,246 a
8,600 a 7,175 a 9,060 a
4,54 34,93
6 4,795 a 7,103 a 6,157 a 6,797 a 7,798 a 3,49 31,51
7 3,857 a
6,225 a
5,128 a 4,950 a 6,257 a
4,05 45,18
8 3,042 a 4,142 a 3,673 a 4,115 a 4,862 a 4,12 61,15
9 1,905 a 2,085 a 2,538 a 2,547 a 2,696 a 2,55 63,75
10 1,700 a
1,030 a
1,480 a 2,177 a 2,132 a
2,08 71,75
11 1,383 a 0,806 a 1,611 a 1,725 a 1,918 a 1,96 77,62
12 0,993 a
0,482 a
1,176 a 1,317 a 1,297 a
1,63 90,98
13 0,649 a 0,318 a 0,819 a 1,357 a 1,051 a 1,33 93,36
14 0,707 a 0,276 a 0,921 a 1,230 a 0,770 a 1,30 100,07
15 0,601 a 0,261 a 0,670 a 1,101 a 1,601 a 1,45 100,84
16 0,378 a 0,112 b 0,410 a 0,511 a 0,700 a 0,45 104,20
17 0,000 b
0,000 b
0,207 b 0,348b 0,545 a
0,319 109,65
As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na linha não diferem entre si ao nível de 1% de
probabilidade para o teste de TUKEY; DT: Dia de tratamento. DMS: Diferença Média Significativa, CV:
Coeficiente de Variação em porcentagem.
29
FIGURA 3: Análises da regressão das variáveis área da lesão em centímetros quadrados
em função do tempo (17 dias) levando em consideração o desvio padrão das médias de
cada tratamento A: Pomada Brassica, B: Emulsão Brassica, C: Anti-séptico Brassica,
D: Controle negativo (Solução fisiológica 0,9%), E: Controle Positivo (Kollagenase
®
)
em coelhos (Oryctolagus cuniculatus).
A partir do quarto dia a diferença estatística significativa se equiparou entre os
tratamentos, porém o processo cicatricial desencadeados pelo tratamento com Emulsão
apresentou ao final do processo cicatricial (por volta do 10º dia de tratamento) um
excelente desempenho demonstrado através da diferença estatística significativa e
chegada ao ponto zero de cicatrização e uma menor média que nos outros tratamentos.
Isso se explica pela variação dos tamanhos das feridas entre os tratamentos (coeficiente
30
de variação crescente) e a DMS decrescente entre os animais de cada tratamento,
(TABELA 2), indicando um processo de regressão cicatricial pronunciado,
principalmente quando observado a emulsão brassica em comparação com o controle
negativo (FIGURA 2).
De acordo com a FIGURA 3 as médias das áreas das lesões do tratamento com
Pomada e Emulsão Brassica sp foram mais regulares quanto à área da lesão regredida,
atingindo primeiro o “ponto zero” de cicatrização.
A redução final foi maior na Emulsão Brassica sp do que o controle positivo
(Kollagenase
®
) e proporcionalmente maior que a solução fisiológica a 0,9% (controle
negativo) (TABELA 2). Isso se explica pelo fato dos animais tratados com o Controle
Negativo apresentarem feridas mais secas. Segundo Mandelbaum (2003), feridas
superficiais abertas e ressecadas reepitelizam mais lentamente e inumeros curativos são
utilizados para produzir umidade no local, melhorando 35% a 45% a taxa de
cicatrização das feridas.
TABELA 2: Taxas de cicatrização por animal, em porcentagem, levando em
consideração a regressão em função da variável área da lesão em centímetros e o tempo
de cicatrização do 3º ao 15º dia nos períodos da regressão cicatricial para os respectivos
tratamentos e as variações em porcentagem (Oryctolagus cuniculatus).
Tratamento REP1 REP2 REP3 REP4 REP5 REP6 CV (%) Média
Pomada Brassica sp. 68,24 78,76 81,62 71,99 100,00 67,41 46,80 78,00 a
Emulsão Brassica sp. 100,00 86,47 100,00 100,00 77,67 71,22 53,50 89,23 a
Anti-séptico Brassica sp. 81,65 100,00 92,73 76,11 89,15 48,16
45,17
81,30 a
Pomada Kollagenase
®
97,15 72,77 72,25 83,34 71,24 83,36 48,00 80,02 a
Solução fisiológica 0,9% 68,10 82,74 61,64 77,11 81,73 69,29 69,29 73,43 a
As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na coluna não diferem entre si ao nível de 1% de
probabilidade para o teste de TUKEY. CV: Coeficiente de Variação em porcentagem, REP: Repetição.
A TABELA 2 mostra que as taxas de cicatrização por animal, levando em
consideração a regressão em função da variável área da lesão em centímetros quadrados
e o tempo de cicatrização do dia 3° até o 15° dia. A tabela mostra que em alguns
indivíduos tratados com Emulsão Brassica sp e Pomada Brassica sp o processo
31
cicatricial total chegou a 100% de contração e re - eptelização da ferida.
Isso se deve principalmente ao processo inflamatório inicial proporcionado e à
debridação da ferida causado pelo efeito local da Emulsão e da Pomada Brassica, o que
faz com que a cicatriz desenvolva uma quantidade estatisticamente significativa de
fibras colágenas tipo I e III ao longo de toda a derme e uma nova proliferação de tecido
conjuntivo ao longo de toda a epiderme quando comparadas com outros tratamentos
(Sarandy, 2007).
Mesmo não havendo diferença estatística Significativa (TABELA 2) a taxa de
cicatrização da média do tratamento com Emulsão Brassica foi aproximadamente 18%
mais rápida quando comparadas a outro controle negativo, sendo um indicativo de uma
cicatriz mais bem formada devido ao maior tempo de formação.
6.1. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DO TECIDO CICATRIZADO
DE COELHOS
Os tratamentos com anti-séptico Brassica sp (FIGURA 4D) e com emulsão de
Brassica sp (FIGURA 4G) desencadearam a formação de vasos próximo à região da
epiderme, mas a camada córnea não se reestruturou completamente ao longo da
superfície epidérmica.
Os tratamentos com pomada de Brassica e emulsão Brassica apresentaram
camadas córneas mais unificadas e densas (FIGURA 4A e 4D) quando comparado com
o tratamento com Kollagenase
®
(FIGURA 4J) e com a solução fisiológica a 0,9%
(FIGURA 4M).
Melhor organização pôde ser observada ao longo de toda epiderme dos 4
tratamentos comparados com o controle negativo, havendo diferença significativa entre
a espessura da epiderme dos mesmos quando comparado com a espessura da epiderme
do grupo controle negativo, que recebeu tratamento com solução fisiológica 0,9%.
A taxa de divisão de células tronco e o momento de saída da camada basal são os
principais pontos de regulação de uma renovação adequada da epiderme (Gonçalves,
2006). Assim, à medida que o epitélio sofre espessamento, as células tornam - se mais
colunares e a atividade mitótica aumenta, ocorrendo diferenciação celular e
queratinização nas células epiteliais mais superiores da ferida (Lima de Moura, 2004),
conforme observado neste trabalho (TABELA 3)
32
Isso pode ser explicado pela riqueza de Glucosinolatos de vários grupos
constituintes (Kushad, et al 1999), caracterizando à Brassica oleracea, propriedades
anti-oxidantes e interativas com o alfa-tocoferola e vitaminas importantíssimas na
síntese do colágeno e de células tronco epiteliais (Siqueira Jr. & Dantas, 2000).
Outro fator importante é a atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-
positivas, leveduras e outros patógenos comuns em feridas cirúrgicas, abscessos e
feridas infectantes (Sarandy, 2002), o que possibilita a formação de uma cicatriz mais
regular ao longo de toda a superfície da pele tratada com Emulsão e Pomada Brassica
sp.
TABELA 3: Valores médios, em micrômetros, das áreas de epiderme e derme das
lesões cicatrizadas da pele de coelhos (Oryctolagus cuniculatus) submetidos a
respectivos tratamentos.
Tratamento Derme Epiderme
Pomada Brassica sp. 44,89 ± 2,48 a 1,33 ± 0,11 b
Emulsão Brassica sp. 33,32 ± 1,75 a 1,53 ± 0,08 b
Anti-séptico Brassica sp. 33,99 ± 3,11 a 1,49 ± 0,46 b
Pomada Kollagenase
®
33,91 ± 2,89 a 1,35 ± 0,17 b
Solução fisiológica 0,9% 31,59 ± 5,45 a 0,67 ± 0,45 a
CV (%) 32,81 12,54
As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na coluna não diferem entre si ao nível de 5% de
probabilidade para o teste de TUKEY. CV: Coeficiente de Variação em porcentagem. DMS: Diferença
Média Significativa
33
FIGURA 4: Fotomicrografia da pele de coelhos (Oryctolagus cuniculatus):ABC_
Pomada Brassica sp; DEF_ Emulsão Brassica sp; GHI_ Spray anti-séptico Brassica
sp; JKL_ pomada Kollagenase®; MNO_ Solução fisiológica 0,9%. Epiderme e derme,
Camada papilar da derme (cpd) e Camada reticular da derme (crd), respectivamente
(HE. 100x). Cc: Camada córnea da epiderme; Cb: Camada basal da epiderme; m:
músculo; Seta cheia: Vasos sanguíneos; Seta vazia: Fibras.
34
A derme dos tratamentos com pomada de Brassica sp. (FIGURA 4B), emulsão
Brassica sp. (FIGURA 4F) e anti-séptico Brassica sp (FIGURA 4H) apresentaram
fibras colágenas melhor agrupadas e melhor organização quando comparadas às dermes
do grupo tratado com solução fisiológica 0,9% (FIGURA 4O).
Também foi observada maior vascularização do que nos demais tratamentos, o
que é um indicativo de um processo cicatricial mais avançado. Não houve diferença
significativa da espessura da derme em cada grupo (TABELA 3).
A derme do controle negativo (solução fisiológica 0,9%) apresentou fibras
colágenas menos agrupadas (FIGURA 4L). As dermes dos tratamentos com Brassica sp
apresentaram feixes de fibras colágenas aparentemente maiores que os da derme do
controle positivo (FIGURA 4K), porém o espessamento da derme não foi expresso de
forma significativa nos tratamentos em relação o controle negativo (solução fisiológica
0,9%) (TABELA 3).
Os tratamentos com pomada de Brassica. (FIGURA 4C) e anti-séptico Brassica
sp (FIGURA 4I) apresentaram melhor organização na derme reticular, quando
comparada ao tratamento com solução fisiológica 0,9% (FIGURA 4O), o que se
justifica pelo fato do processo cicatricial acontecer das camadas mais profundas da pele
(onde a vascularização é mais pronunciada) em direção às superficiais. Os três
tratamentos à base de Brassica apresentaram, possivelmente, fibras colágenas melhor
agrupadas por análise visual e, portanto, apresentaram resultados mais eficazes para o
fechamento e cobertura das áreas lesadas.
A resistência da cicatriz é depende tanto da quantidade do colágeno como da
organização (Biondo-Simões, 2005). Esta questão também foi comprovada no trabalho
de Sarandy (2007), onde se observou, de forma quantitativa, uma indução da produção
de fibras colágenas tipo I e II na utilização da Emulsão Brassica em comparação com
Solução fisiológica 0,9% (Controle Negativo).
35
7. CONCLUSÕES
Os resultados deste estudo permitiram aprofundar a avaliação da eficácia das
diferentes formulações de Brassica, compreendendo e conhecendo melhor os fatores
cicatriciais agregados. Concluiu-se que:
Pela mensuração do tamanho das lesões, a pomada fitoterápica à base de
Brassica sp e a emulsão Brassica sp apresentaram melhores resultados devido à maior
homogeneidade da regressão.
Quanto à análise histopatológica houve maior organização das fibras colágenas
da derme dos animais submetidos ao tratamento com pomada fitoterápica Brassica e
Kollagenase, porém os melhores resultados foram expressos pela Emulsão Brassica, por
proporcionar uma melhor formação da camada córnea da epiderme e uma diferença
estatística na espessura das fibras conjuntivas de forma visualmente melhor.
As avaliações histológicas qualitativas e quantitativas demonstraram a eficácia
medicamentosa sobre a cicatrização cirúrgica em feridas por segunda intenção e
recomenda-se o acoplamento a algum modelo de quantificação de fibras colágenas (tipo
I e III) e células teciduais para melhores esclarecimentos e aprofundamento de análise.
36
7.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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42
ANEXO I
(TABELAS)
43
TABELA 1B: Análise de variância da área de feridas em coelhos (Oryctolagus cuniculatus) em função
do tratamento em 17 dias utilizando tratamentos com pomada, spray, emulsão de
Brassica, Kollagenase ® e Solução fisiológica 0,9%.
DIA 1 G.L. S.Q. Q.M. F DIA 2 G.L. S.Q. Q.M. F.
TRAT. 4 40.8396 10.2099 1.84 NS TRAT. 4 75.0782 18.7695 3.21 *
RES. 25 138.6976 5.5479 RES. 25 146.3869 5.8555
TOTAL 29 179.53 TOTAL 29 221.4651
Média 8.4887 D.P. 2.3554 Média 8.2410 D.P. 2.4198
DIA 3 G.L. S.Q. Q.M. F. DIA 4 G.L. S.Q. Q.M. F.
TRAT. 4 111.7850 27.9462 3.95 * TRAT. 4 72.8366 18.2091 2.05 NS
RES. 25 177.0800 7.0832 RES. 25 221.8992 8.8760
TOTAL 29 288.8650 TOTAL 29 294.7357
Média 10.0907 D.P. 2.6614 Média 8.6963 D.P. 2.9793
DIA5 G.L. S.Q. Q.M. F. DIA6 G.L. S.Q. Q.M. F.
TRAT. 4 55.5436 13.8859 1.94 NS TRAT. 4 30.9327 7.7332 1.83 NS
RES. 25 179.3657 7.1746 RES. 25 105.8877 4.2355
TOTAL 29 234.9093 TOTAL 29 136.8204
Média 7.6674 D.P. 2.6785 Média 6.5305 D.P. 2.0580
DIA7 G.L. S.Q. Q.M. F. DIA8 G.L. S.Q. Q.M. F.
TRAT. 4 24.0064 6.0016 1.05 NS TRAT. 4 10.7664 2.6916 0.46 NS
RES. 25 142.4691 5.6988 RES. 25 147.1260 5.8850
TOTAL 29 166.4755 TOTAL 29 157.8924
Média 5.2836 D.P. 2.3872 Média 3.9672 D.P. 2.4259
DIA9 G.L. S.Q. Q.M. F. DIA10 G.L. S.Q. Q.M. F.
TRAT. 4 2.7694 0.6923 0 .31 NS TRAT. 4 5.4567 1.3642 0.91 NS
RES. 25 56.3269 2.2531 RES. 25 37.4143 1.4966
TOTAL 29 59.0963 TOTAL 29 42.8710
Média 2.3544 D.P. 1.5010 Média 1.7050 D.P. 1.2233
DIA11 G.L. S.Q. Q.M. F. DIA12 G.L. S.Q. Q.M. F.
TRAT. 4 4.3920 1.0980 0.82 NS TRAT. 4 2.8454 0 .7113 0.77 NS
RES. 25 33.4014 1.3361 RES. 25 22.9617 0.9185
TOTAL 29 37.7934 TOTAL 29 25.8071
Média 1.4891 D.P. 1.1559 Média 1.0534 D.P. 0.9584
DIA13 G.L. S.Q. Q.M. F. DIA14 G.L. S.Q. Q.M. F.
TRAT. 4 3.7295 0,9324 1.51 NS TRAT. 4 3.4596 0.8649 1.47 NS
RES. 25 15.4573 0.6183 RES. 25 14.7060 0.5882
TOTAL 29 TOTAL 29 18.1655
Média 0.8422 D.P. 0.7863 Média 0.7664 D.P. 0.7670
DIA15 G.L. S.Q. Q.M. F. DIA16 G.L. S.Q. Q.M. F.
TRAT. 4 6.4046 1.6011 2.20 NS TRAT. 4 1.0979 0.2745 1.42 NS
RES. 25 18.2280 0.7291 RES. 25 4.8336 0.1933
TOTAL 29 24.6326 TOTAL 29 5.9315
Média 0.8467 D.P. 0.8539 Média 0.4220 D.P. 0.4397
DIA17 G.L. S.Q. Q.M. F.
TRAT. 4 1.2235 0.3059 8.63 **
RES. 25 0,8862 0,0354
TOTAL 29 2.1096
Média 0.1717 D.P. 0.1883
NS
F não significativo; * F significativo ao nível de 1% ** F significativo ao nível de 5% de probabilidade para teste
de Tukey; CV(%): Coeficiente de variação em porcentagem. Média: Média Geral, D.P.: Desvio Padrão Geral,
TRAT.: Tratamento, RES.: Resíduo, G.L.: Graus de Liberdade, Q.M.: Quadrado médio.
44
ANEXO I
(ARTIGO SUBMETIDO)
45