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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
CARACTERIZAÇÃO PATOTÍPICA DE ISOLADOS DE Escherichia coli
OBTIDOS DE SUÍNOS: PRESENÇA DE PLASMÍDEOS E PERFIL DE
RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS.
MATEUS MATIUZZI DA COSTA
Tese apresentada ao Programa de Pós
-Graduação em Biologia Celular e
Molecular da UFRGS como um dos
requisitos para obtenção do grau de
Doutor.
Profª. Dr
a
. Irene Silveira Schrank
Orientadora
Profª. Dr
a
. Agueda Castagna de Vargas
Co-Orientadora
Porto Alegre, maio de 2007.
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
I
Este trabalho foi realizado nos laboratórios do
Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul (UFRGS), Universidade Federal
de Santa Maria (UFSM) e Universidade do Oeste de
Santa Catarina (UNOESC), sendo financiado pela
Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio Grande do
Sul (FAPERGS) e pela Coordenadoria de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior
(CAPES).
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e a minha família pelo apoio incondicional e razão da minha vida, sem a
qual este trabalho não seria possível, nem teria sentido;
Agradeço ao Gabriel e Dona Erani pelo apoio, amizade e carinho em todos os momentos
do doutorado;
As professoras Irene Silveira Schrank e Agueda Castagna de Vargas pela orientação, apoio
e por confiar em mim. Além do modelo profissional pelo qual devo agradecer sempre;
Aos professores Augusto Schrank, Marilene Henning Vainstein e Henrique Ferreira pela
leitura, críticas e sugestões realizadas ao longo do estudo, que foram essenciais para o
desenvolvimento do trabalho e evolução profissional;
Ao Guilherme, Franciele e Shana, os quais foram essenciais para execução do trabalho e
demonstraram amizade ao longo destes anos. Muito obrigado pelo apoio sempre que
necessitei;
A Cristina e Sonia pelo apoio técnico, ombro e amizade em todos os momentos;
As equipes dos laboratórios de microbiologia da UNOESC, LABAC da UFSM, 222 da
UFRGS e microbiologia da UNIVASF, pelo apoio, carinho e amizade sem o qual este
trabalho não seria possível;
A Silvia e Luciano, bem como os demais funcionários de PPGBCM e Centro de
Biotecnologia da UFRGS pelo auxílio e apoio na execução do doutorado;
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para execução deste trabalho.
IV
SUMÁRIO
Lista de Abreviações, Símbolos e Unidades..............................................................................
vi
Lista de Tabelas.........................................................................................................................
ix
Lista de Figuras.......................................................................................................................... x
Resumo......................................................................................................................................
xi
Abstract......................................................................................................................................
xiv
Capítulo 1
– Introdução..............................................................................................................
02
Capítulo 2 – Patotipos de Escherichia coli na suinocultura e resistência aos
antimicrobianos.......................................................................................................................
13
Resumo......................................................................................................................................
14
Abstract......................................................................................................................................
15
Suinocultura moderna e o uso de antimicrobianos ...................................................................
16
Infecções ocasionadas por E. coli nos suínos...........................................................................
17
Transferência da resistência em bactérias................................................................................
22
Resistência de E. coli aos antimicrobianos................................................................................
24
Impacto ambiental do uso de antimicrobianos na suinocultura ................................................
26
Perspectivas: Alternativas ao uso de antimicrobianos..................................……………...........
28
Conclusão............…………………………………………………...................………………..........
30
Referências bibliográficas...................…………………………………………………….…...........
31
Capítulo 3 – Virulence factors, antimicrobial resistance and plasmid content of clinical and
environmental Escherichia coli swine isolates from southern Brazil.….……………..................
41
Abstract….………………………………………………………………………………………………
43
Introduction…………….………………………………………………………………………………..
44
Materials and Methods…….……………………………………………………………....................
46
Bacterial isolates and culture conditions …………………………………………………………... 46
Resistance to antimicrobial drugs ……………………………………..…......……………………... 46
Total DNA extraction and PCR…………..………..……….………………………………………...
46
Plasmidial DNA extraction……..…………………………………………………………..................
47
Statistical analysis……………………………………………………………………………………...
47
Results and Discussion………………………………………………………………………………..
48
Acknowledgments .....................................................................................................................
51
References ……………………………………………………………………………………………..
51
Capítulo 4
– Virulence factors and antimicrobial resistance of Escherichia coli isolated from
urinary tract of swine in southern Brazil…………………………………......................................
58
Abstract….………………………………………………………………………………………………
60
Introduction…………….………………………………………………………………………………..
61
Materials and Methods…….………………………..………………………………………………...
63
Bacterial strains and culture conditions…..……………………………….…………………………
63
Resistance to antimicrobial drugs ……………………………………..…......……………………..
63
Total DNA extraction and PCR …………..………..……….………………………………………...
63
Plasmidial DNA extraction……………………………………………………………………............
64
Statistical analysis ……….……………………………………………………………………............
64
Results and Discussion………………………………………………………………………………..
65
References ……………………………………………………………………………………………..
67
Capítulo 5 - Discussão...............................................................................................................
76
Referências Bibliográficas..........................................................................................................
86
Curriculum vitae resumido do autor...........................................................................................
101
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
ºC Graus Celsius
- Resultado negativo
μg
Micrograma
μl
Microlitro
μM
Micromolar
+ Resultado positivo
AEEC
E. coli (Attaching effacing E. coli)
AMI Amicacina
AMP Ampicilina
AMPc Adenilato fosfato cíclico
BFP Pili formadora de vesícula (Bundle forming pillus)
CFL Cefalexina
CLO Cloranfenicol
CNF Fator citotóxico necrosante (Cytotoxic necrotizanting factor)
COL Colistina
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTPs Mistura de nucleotídeos (A, C, G e T)
EAF Fator de aderência de EPEC (EPEC adherence factor)
EDEC E. coli associada a doença do edema
EHEC E. coli entero-hemorrágica
EIEC E. coli entero-invasiva
ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked immunosorbent assay)
ENO Enrofloxacina
EPEC ou PEPEC E. coli enteropatogência
ETEC E. coli enterotoxigênica
ESP Proteína secretada pela EPEC (EPEC secreted protein)
EUA Estados Unidos da América
EXPEC E. coli causadora de infecções extra-intestinais
F4 Antígeno fimbrial do tipo K88
F5 Antígeno fimbrial do tipo K99
F6 Antígeno fimbrial do tipo 987P
FLF Florfenicol
GALT Tecido linfóide associado ao intestino (Gut associated lymphoid
tissue)
GEN Gentamicina
GMPc Guanilato fosfato cíclico
HAMR Hemaglutinação não depende da presença ou ausência de
manose
HAMS Hemaglutinação dependente da ausência de manose
IgA Imunoglobulina A
IgG Imunoglobulina G
kb Quilobase
KDa Quilodalton
LEE
Lócus de Locus enterocite effacement
LT Enterotoxina termolábil
M Molar
MDR Resistência múltipla as drogas (Multi drug resistance)
min Minuto
mL Mililitro
mM Milimolar
MMA Mastite, metrite e agalactia
N Número
NEO Neomicina
ng Nanograma
NOR Norfloxacina
OMP Proteínas externas de superfície (Outer major proteins)
pb Par de base
PCR Reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction)
pH Potencial de hidrogênio
R Resistente ou resistência
s Segundo
SEPEC E. coli septicêmica
SISCAL Sistema intensivo de criação de suínos ao ar livre
STa e STb Enterotoxinas termoestáveis do tipo A e B
STEC ou VETEC E. coli produtora de toxina shiga
STx Shiga toxina
SUT Sulfazotrim
Taq DNA pol DNA polimerase de Thermus aquaticus (Thermus aquaticus DNA
polymerase)
TET Tetraciclina
Th1 Linfócito T auxiliar do tipo 1 (T helper type 1)
Th2 Linfócito T auxiliar do tipo 2 (T helper type 2)
TIR Receptor translocado para intimina (Translocated intimin receptor)
TRI Trimethoprim
U Unidade
UFC Unidade formadora de colônia
UPEC E. coli uropatogênicas
USP Proteína especifica de E. coli uropatogênicas (Uropathogenic
specific protein)
UTI Infecções do trato urinário (Urinary tract infections)
UV Ultravioleta
V Volt
VT Vero toxina
LISTA DE TABELAS
Introdução
Tabela 1. Principais patotipos de E. coli que ocasionam enfermidades nos
suínos..............................................................................................................................
5
Capítulo 3
Table 1. Distribution of virulence factors in neonatal colibacilosis, healthy feces and
environment
E. coli isolates.....……………………..……………........................................
56
Table 2. Percent of resistant E. coli isolates from clinical, non-diarrheic pigs and
environment to antimicrobial drugs……………………….…………………………………
57
Capítulo 4
Table 1. Resistance patterns of urinary E.coli isolates from swine in Southern Brazil… 73
Discussão
Tabela 1. Isolados de E. coli de origem urinária, entérica e ambiental demonstrando
resistência simultânea aos grupos de antimicrobianos e presença de DNA
plasmidial……………………………………………………………………………………….
79
Tabela 2. Perfil de fímbrias e toxinas amplificadas por PCR nos isolados de E. coli
provenientes de suínos com diarréia..............................................................................
82
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 4
Figure 1. Antimicrobial drugs resistance patterns of urinary E. coli isolates
from swine in Southern of Brazil……………………..………………………….
74
Figure 2: PCR amplification of UPEC genes….………………………………….
75
RESUMO
A disseminação dos patógenos na criação dos suínos tem estimulado o
uso de drogas antimicrobianas na prevenção das enfermidades. Entretanto, essa
prática está associada à seleção de bactérias resistentes, além da presença de
resíduos de antimicrobianos nos alimentos de consumo humano. Particularmente
para E. coli, esse problema agrava-se, em face do curto intervalo entre gerações
e a capacidade de troca da informação genética entre as bactérias, que ocorre,
principalmente, pela presença de elementos genéticos móveis como os
plasmídeos. Os objetivos da presente tese experimento foram realizar o
isolamento, identificação, determinação do perfil de sensibilidade aos
antimicrobianos, bem como a caracterização patotipica e da presença de DNA
plasmidial em isolados de E. coli obtidos de criatórios suínos dos Estados do Rio
Grande do Sul e Santa Catarina. As amostras foram identificadas de acordo com
suas características morfológicas e bioquímicas, sendo então genotipificadas por
PCR para determinação dos patotipos ETEC (F4, F5, F6, F18, ST e LT), STEC
(eae, Bfp e STx) e UPEC (sfa, pap, cnf, hly, iha e usp). Em seguida, o perfil de
resistência aos antimicrobianos foi realizado pelo método de difusão em disco
Kirby-Bauer modificado. A presença de DNA plasmidial foi avaliada pela técnica
de lise alcalina. Foram obtidos 64 isolados clínicos de suínos com diarréia, sete
isolados de fezes de suínos saudáveis e nove amostras de meio ambiente dos
criatórios suínos (cinco de swabs das instalações, duas de rações, uma de inseto
e uma da esterqueira). Nos casos de infecção urinária, foram isoladas 82
amostras de E. coli. A hemólise foi verificada em 31,48% (51/162) isolados
clínicos, 2,47% (4/162) isolados de fezes de suínos saudáveis, 1,23% (2/162)
isolados do ambiente de criação e 2,47% (4/162) isolados obtidos de fêmeas com
infecção urinária. Os fatores de virulência detectados por PCR nas E. coli de
origem entérica e ambiental foram: STb 33,75% (27/80), LT 28,75% (23/80), F18
21,25% (17/80), F4 15% (12/80), STa 16,25% (13/80), F5 10% (8/80), F41 8,75%
(7/80) e STx 2,5% (2/80), enquanto que nas E. coli de origem urinária foram
observados: pap 10,97% (9/82), iha 9,75% (8/82), sfa 6,09% (5/82), F4 4,87%
(4/82), F5 4,87% (4/82), F6 1,21% (1/82) e F41 1,21% (1/82) hlyA 10,97% (9/82),
LT 8,53% (7/82), STa 7,31% (6/82) and STb 4,87% (4/82). A resistência aos
antimicrobianos foi alta para todos os tipos de amostras, sendo que nos isolados
entéricos e de ambiente esta foi maior para tetraciclina e sulfazotrim, enquanto
que nas UPEC a maior resistência ocorreu para penicilina, lincomicina,
eritromicina e tetraciclina. Os plasmídeos foram encontrados em 87,5% (70/80)
dos isolados entéricos e ambientais e em 39,02% (32/82) das amostras de
infecção urinária. Com o presente estudo observou-se que os fatores de virulência
encontram-se amplamente distribuídos entre os isolados obtidos de leitões com
diarréia. A resistência múltipla aos antimicrobianos foi verificada independe da
fonte de isolamento. Esta pode estar associada em parte à presença de
plasmídeos nos isolados. Desta forma torna-se importante que os técnicos
estejam conscientes sobre a importância do uso racional dos antimicrobianos e o
desenvolvimento de pesquisas a cerca de alternativas para controle da
enfermidade, incluindo vacinas e probióticos.
ABSTRACT
The pathogens dissemination around the swine breeding increased the
antimicrobial drug use for disease prevention leading to resistant bacteria
selection and food residues. Mainly in E. coli, this problem is dangerous due the
short time generation and the bacteria skills to horizontal transference of genetic
information by plasmids. The goals of this study were to perform isolation,
identification, determination of antimicrobial resistance patterns, and molecular
characterization of E. coli strains, from swine production systems in Southern of
Brazil. The samples were identified according to morphological and biochemical
tests. The genotypification of different pathotype was performed by PCR. This way
we characterized the E. coli isolates as: ETEC (F4, F5, F6, F18, ST and LT
genes), STEC (eae, Bfp and STx genes) and UPEC (sfa, pap, cnf, hly, iha and usp
genes). After, the resistance patterns were evaluated by modified Kirby-Bauer
diffusion disk method. The plasmidial DNA presence was determined by alkaline
lyses extraction. Sixty four samples from diarrheic piglets, seven from healthy pig
feces, and nine from environment (five from facilities swabs, two from food, one
from insect and one from waste) E. coli isolates were obtained. From the urinary
tract, we isolated 82 E. coli strains from infected sows. The haemolysis was
verified in 31,48% (51/162) of diarrheic piglets, 2,47% (4/162) of healthy pigs
feces, 1,23% (2/162) environment and 2,47% (4/162) urinary E. coli isolates. The
virulence factors detected by PCR in enteric and environment E. coli were: STb
33,75% (27/80), LT 28,75% (23/80), F18 21,25% (17/80), F4 15% (12/80), STa
16,25% (13/80), F5 10% (8/80), F41 8,75% (7/80) and STx 2,5% (2/80), while in
urinary E. coli were: pap 10,97% (9/82), iha 9,75% (8/82), sfa 6,09% (5/82), F4
4,87% (4/82), F5 4,87% (4/82), F6 1,21% (1/82), F41 1,21% (1/82) hlyA 10,97%
(9/82), LT 8,53% (7/82), STa 7,31% (6/82) and STb 4,87% (4/82). The
antimicrobial resistance was high to all E. coli tested strains, being enteric and
environment isolates more resistant to tetracycline and
trimethoprim:sulfamethoxazole, while in urinary infections. The highest resistance
values were noticed to penicillin, lincomicin, erithromicin and tetracycline.
Plasmids were encountered in 87,5% (70/80) of enteric and environment isolates
and in 39,02% (32/82) of urinary ones. In conclusion, the present study verified the
widely presence of virulence factors among E. coli isolates from diarrheic piglets.
The multi -drug resistance was found no depending of E. coli source. This
resistance may be in part associated to plasmid presence in E. coli from Southern
of Brazil isolates. In this way the veterinary knowledge about the rational use of
antimicrobial drugs and research about alternative techniques, as vaccination and
probiotics is very important.
1
Capítulo 1
Introdução
2
INTRODUÇÃO
A suinocultura é uma atividade de grande importância para a economia
mundial. No Brasil existem, atualmente cerca de 200 frigoríficos, que foram
responsáveis pelo abate de 33,9 milhões de suínos no ano de 2004. Na região sul
do país 23 suínos são terminados por matriz ao ano, cujo índice de produtividade
é semelhante ao de grandes produtores mundiais de suínos, como Alemanha,
EUA, Canadá e Dinamarca. Aproximadamente 65% da produção brasileira é
destinada ao mercado interno, sendo que o consumo per capita brasileiro
aumentou de 7,87Kg/hab/ano em 1988, para 12,1Kg/hab/ano em 2004
(ABIPECS, 2006). No mundo, o consumo da carne suína também vem
aumentando cerca de 2% ao ano, desde 1970, quando era de 9,2Kg/hab/ano,
sendo esperado que, até 2015, chegue a 17,9Kg/hab/ano. Mesmo assim,
destaca-se que a China continua sendo o maior consumidor e produtor mundial
de carne suína. O Brasil é o terceiro país em produção e o quinto em consumo.
Nosso país é o terceiro maior exportador mundial, atrás da União Européia e do
Canadá (PORKWORLD, 2006). A consolidação do Brasil como grande exportador
da carne suína está diretamente ligada ao uso de tecnologias modernas,
melhores índices de produtividade e qualidade do produto, bem como a
adequação às exigências dos diferentes mercados importadores.
A produção brasileira de suínos tem sofrido várias modificações
tecnológicas, como a maior intensificação na produção, melhorias genéticas e
nutricionais, que objetivam a maior qualidade do alimento ofertado aos animais.
Em 2016, o Brasil vai exportar 60% da soja mundial, o que garante alimento
barato e em grande quantidade para os suínos. Depois de duas décadas de
intenso trabalho, obteve-se uma melhoria na carne suína que refletiu numa
redução de 31% na gordura, 10% do colesterol e 14% das calorias (ABIPECS,
2006). No entanto, com essas modificações tecnológicas houve uma maior
predisposição dos animais ao estresse, o que propiciou a ocorrência de diversas
enfermidades. Nesse contexto, as doenças respiratórias e entéricas têm destaque
na suinocultura moderna, constituindo-se em um grande problema, pois se
3
mantêm, apesar dos esforços de técnicos e de pesquisadores ligados à
suinocultura.
Escherichia coli é uma bactéria bacilar, gram negativa, anaeróbica
facultativa, possuidora de flagelos peritríquios e cápsula. As colônias em meio
sólido podem ser observadas após 24horas de incubação e variam seu aspecto
de rugoso a mucóide. Alguns isolados são hemolíticos em Ágar sangue. No Ágar
Mac Conkey, estas bactérias fermentam a lactose, o que constitui uma importante
característica que a diferencia de outros patógenos entéricos, como a Salmonella
spp. A espécie é identificada fenotipicamente através de várias características
bioquímicas, como ausência da enzima citocromo oxidase, produção de indol,
redução de nitratos, fermentação da glicose e outros carboidratos, com produção
de ácido e gás. Além destas a ausência da produção de H
2
S em meios
específicos também é característica de E. coli (QUINN et al., 1994, STROHL et
al., 2004).
O intestino grosso, principalmente o cólon, é o habitat deste
microrganismo, tanto no homem como nos animais. Logo, as fezes são a principal
fonte de contaminação dos suínos dentro de uma granja. O número de E. coli no
intestino grosso é de aproximadamente 10
7
UFC por grama de conteúdo
intestinal, sendo estas bactérias responsáveis por menos de 1% da contagem
total de bactérias. Uma vez eliminadas no meio ambiente, essas bactérias podem
sobreviver por longos períodos, que podem alcançar mais de 11 semanas, desde
que em condições ideais, como baixa temperatura e umidade adequada
(BURROWS & RANKIN, 1970; BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999).
A tipificação sorológica de E. coli é muito importante para classificação da
espécie. Esta é fundamentada na presença de diferentes antígenos somáticos,
capsulares, flagelares e fimbriais. Para determinação dos padrões de antígenos
presentes em E. coli são utilizados anti-soros, contudo estes possuem uma
aplicação limitada, pois estão disponíveis apenas para um grupo reduzido de
cepas (BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999). Além dos antígenos
descritos acima, vários outros fatores são considerados de grande importância à
classificação bacteriana, em especial aqueles relacionados diretamente à
4
patogenicidade do microrganismo. Entre estes fatores, podemos citar exotoxinas,
associadas à perda de líquidos no intestino, a endotoxina presente na parede
celular, hemolisinas, sideróforos e adesinas (BERTSCHINGER &
FAIRBROTHER, 1999).
Os principais patotipos responsáveis por enfermidades nos criatórios
suínos são apresentados na tabela 1 sendo E. coli enterotoxigênica (ETEC), E.
coli enteropatogência (EPEC), E. coli Shiga toxigência ou verotoxigênica (STEC
ou VETEC), E. coli uropatogênica (UPEC) e E. coli enteroinvasiva (EIEC) (CHOI &
SCHIFFERLI, 2001, BRITO et al., 2004, GYLES & FAIRBROTHER, 2004). Um
conjunto particular de genes é necessário, para que a E. coli ocasione uma
determinada enfermidade. Logo, conforme o padrão de genes associados à
patogenicidade de um isolado, este pode ser classificado nos diferentes patotipos
de E. coli. Esta caracterização pode também ser realizada por PCR, que permite
definir com precisão o potencial patogênico de E. coli (TENG et al., 2004). A
genotipificação de isolados de E. coli pela técnica de PCR tem sido amplamente
utilizada (SARIDAKIS et al., 1997; BRITO et al., 1999; SILVEIRA et al., 2001;
AMEZCUA et al., 2002; BEIER et al., 2005). Nas diarréias em leitões, os isolados
patogênicos demonstram ao menos um dos seguintes fatores de virulência:
fímbrias K88-F4, K99-F5, 987P-F6, F18, F107 e F41, e toxinas LT, STa e STb.
Por outro lado, isolados obtidos de casos de doença do edema possuem a fímbria
F18 e a toxina STx2e. As E. coli associadas a infecções urinárias apresentam
geralmente as fímbrias F1, FP (operon pap) e os fatores de virulência CNF1 e
CNF2, bem como a hemolisina codificada pelo gene hlyA (BRITO et al., 2004).
Cepas de E. coli obtidas de casos de infecções extra-intestinais normalmente são
identificadas pela amplificação dos genes IpaH, responsável pela invasão
sistêmica de E. coli intestinais (TENG et al., 2004). A maior parte dos fatores de
patogenicidade está agrupada em plasmídeos e podem facilmente ser transferido
entre isolados. Segundo os mesmos autores a classificação de E. coli
nos
diferentes patotipos pode ser dificultada pela troca de genes entre diferentes
isolados.
5
Tabela 1. Principais patotipos de E. coli que ocasionam enfermidades nos suínos.
Patotipo Fatores de Virulência Doença
ETEC
Toxina termoestável dos
tipos a e b (STa e STb)
Toxina termolábil dos tipos I
e II (LT I e LT II)
Fímbrias: F4, F5, F18, 987P
e F41
Colibacilose neonatal
Diarréia pós-demame
EPEC – AEEC Intimina (eae)
Receptor translocado de
intimina (tir)
Proteínas do sistema de
secreção (EspA, EspB e
EspD)
Enterotoxina (EspC)
Diarréia pós-desmame
STEC – VETEC- EHEC-
EDEC
Fímbria: F18a
Shiga-Like Toxina ou
Verotoxina (Stx2e ou VT)
Doença do Edema
ExPEC – SEPEC – UPEC –
EIEC
Aerobactina
Fímbrias: P, S e X
Fator Citotóxico
Necrotizante (CNF1 e
CNF2)
Septicemias
Infecções urinárias
ETEC: E. coli enterotoxigênica, EPEC: E. coli enteropatogênica, AEEC: E. coli Attaching
Effacing, STEC: E. coli produtora de Shiga toxina, VETEC: E. coli verotoxigênica, EHEC:
E. coli hemorrágica, EDEC: E. coli causadora da doença do edema, ExPEC: E. coli
extra-intestinal, SEPEC: E. coli septicêmica, UPEC: E. coli uropatogênica, EIEC: E. coli
entero-invasiva Fonte: Adaptado de CHOI & SCHIFFERLI, 2001; BRITO et al., 2004;
GYLES & FAIRBROTHER, 2004.
Infecções ocasionadas por E. coli geram um grande impacto à suinocultura
mundial. Elas podem ocorrer tanto em leitões, no caso da colibacilose neonatal e
septicemias que ocasionam a morte de animais jovens. Nessas situações, a
bactéria pode tanto ser um patógeno primário, como estar associada a outros
agentes que comprometam a imunidade dos animais. Nas fêmeas adultas podem
ser observadas diversas manifestações clínicas, como mastites, que podem afetar
até 82% das porcas com agalactia e as infecções urinárias, onde a E. coli está
6
associada a diversos outros patógenos na etiologia inespecífica da enfermidade
(BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999). A bacteriúria está associada a
distúrbios reprodutivos, como a mastite-metrite-agalactia (MMA). Estas são
comuns nas fêmeas de descarte, sendo que nestes casos a E. coli é a bactéria
isolada com maior freqüência (PORTO et al., 2003).
As diarréias nos suínos não podem ser analisadas como um fenômeno
unifatorial e sim dependente de diversos aspectos além da virulência bacteriana,
como a pouca ingestão de colostro, contaminação ambiental, estresse, presença
de receptores no intestino delgado dos leitões, entre outros. As porcas são
consideradas a principal fonte de infecção para os leitões, sendo que a
contaminação também pode ocorrer após a ingestão de bactérias presentes no
meio ambiente (GYLES & FAIRBROTHER, 2004). Nos leitões, as enfermidades
de maior relevância são as diarréias e a doença do edema. As diarréias ocorrem
em animais neonatos e no pós-desmame estando associadas a patotipos
específicos de E. coli, como ETEC e EPEC. As E. coli ETEC produzem diversos
fatores de virulência, como fímbrias K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F107 (F18) e
F41 e as exotoxinas termoestáveis (STa e STb) e termolábil (LT). A toxina LT se
apresenta muito semelhante a toxina da cólera. As toxinas ST provocam uma
elevação nos níveis celulares de GMPc, por ativar a enzima guanilato-ciclase,
enquanto que a toxina LT, por estímulo da enzima adenilato-ciclase, acarreta um
aumento no nível de AMPc (STROHL et al., 2004). Estes dois sinalizadores
(GMPc e AMPc) induzem uma hipersecreção de íons cloreto e água das células,
o que impede absorção de sódio. Assim, ocorre uma alteração no balanço hidro-
eletrolítico nos enterócitos, que provoca a perda de água e eletrólitos pelo
organismo, levando a diarréia e desidratações severas, que podem ocasionar
índices elevados de mortalidade nas granjas (HENTON & HUNTER, 1994). O
principal sinal clínico observado na colibacilose neonatal é a diarréia aquosa e
amarelada, que provoca desidratação em até 24 horas. O diagnóstico da
colibacilose neonatal é realizado pela análise dos sinais clínicos, dados
epidemiológicos, sendo que não ocorrem lesões específicas na necropsia. O
exame laboratorial é realizado pelo envio de conteúdo intestinal e fezes para o
laboratório, a fim de ser realizado o isolamento e caracterização do agente
7
(SOBESTIANSKI et al., 1999). A técnica de PCR demonstrou ser muito
importante para caracterização da patogenicidade dos isolados
(BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999).
A E. coli EPEC provoca uma diarréia moderada associada à má-absorção
de nutrientes, devido ao encurtamento das microvilosidades intestinais observada
num processo patogênico denominado de attaching effacing (AN et al., 2000).
Esta lesão é associada à presença de uma proteína denominada intimina, a qual
se liga na superfície do enterócito. A intimina provoca um rearranjo nos filamentos
de actina do citoesqueleto celular, levando a um encurtamento das
microvilosidades e a formação de um pedestal onde a bactéria se aloja. Com isto,
ocorre a perda da capacidade de absorção de nutrientes pelas células intestinais
(GYLES & FAIRBROTHER, 2004, STROHL et al., 2004).
A doença do edema é outra enfermidade de importância à suinocultura
ocasionada por E. coli STEC. A mortalidade nos lotes pode chegar a 100%,
entretanto em média esta é menor que 10%. Estas bactérias possuem uma alta
relação evolutiva com as EPEC. Entretanto a STEC possui “shiga” toxinas, sendo
importante nos suínos a presença da STx2e. Esta toxina é encontrada no genoma
de um fago temperado, o qual é encontrado em diversos sorotipos de E. coli, bem
como em outros membros da família Enterobacteriaceae (DOUGAN et al., 2001;
TOTH et al., 2003). As fímbrias relacionadas à adesão de cepas causadoras da
doença do edema são a F18a/b. Após a infecção e adesão ao trato intestinal,
estes microrganismos multiplicam-se e produzem os sinais clínicos característicos
da doença do edema (HENTON & HUNTER, 1994; MOXLEY, 2000). As “shiga”
toxinas são produzidas e absorvidas para a circulação sistêmica. Os efeitos desta
toxina estão envolvidos com a inativação da síntese protéica em células do
endotélio vascular do intestino delgado, tecidos subcutâneos e encéfalo. Esta
lesão nas células endoteliais, induz ao aparecimento do edema e sinais nervosos
característicos da enfermidade (HENTON & HUNTER, 1994). A suscetibilidade
dos animais à infecção por STEC é muito variável. A resistência natural à doença
ocorre pela ausência de expressão de receptores (F18a/b) no intestino dos
animais (MOXLEY, 2000). A doença do edema aparece normalmente de 4 a 14
dias após o desmame. Animais filhos de primíparas apresentam uma maior
8
predisposição, pois ocorre uma menor transmissão da imunidade passiva. Um ou
mais animais podem ser encontrados mortos sem apresentar sinais evidentes.
Além da mortalidade, outros sinais clínicos observados são incoordenação
motora, cegueira, dispnéia, edema de pálpebras, paralisia, tremores, convulsões
e movimentos de pedalagem. Geralmente o histórico e os achados clínicos são
conclusivos, sendo que o exame histopatológico do encéfalo e isolamento puro de
E. coli patogênica no intestino permite a confirmação do diagnóstico
(SOBESTIANSKI et al., 1999).
As infecções do trato urinário, também chamada muitas vezes de cistite,
decorrem da penetração e multiplicação de microrganismos nas vias urinárias,
podendo atingir todo aparelho urinário ou parte dele (SOBESTIANSKI et al.,
1999). As fêmeas suínas estão mais sujeitas a estas infecções, devido a fatores
anatômicos, fisiológicos e de manejo, como a proximidade das extremidades
distais dos tratos digestivo e urinário, o estresse hídrico e baias mal
dimensionadas (SOBESTIANSKY et al., 1991). As infecções do trato urinário dos
suínos influenciam negativamente os índices de produtividade da suinocultura. Os
prejuízos associados a esta doença estão ligados a doenças puerperais,
infertilidade, gastos com medicamentos, redução de peso dos leitões e
mortalidade (BRITO et al., 2004). As infecções urinárias na porca geralmente
evoluem sem manifestação de sinais evidentes, passando muitas vezes
despercebidas pelo produtor e médico veterinário. Alguns dos sinais observados
são apatia, febre, dificuldade de levantar e permanecer em estação, alteração na
cor e cheiro da urina e descarga vulvar purulenta ou sanguinolenta. As alterações
nas características físico-químicas e do sedimento da urina são muito importantes
para detecção de animais enfermos. O exame bacteriológico com cultivo é
utilizado para determinar o agente etiológico e no estabelecimento de uma terapia
(SOBESTIANSKI et al., 1999). As E. coli uropatogênicas (UPEC) são a principal
causa de infecção do trato urinário em mulheres e são também associadas à
morte e descarte de fêmeas suínas adultas (BRITO et al., 1999; PORTO et al.,
2003). Segundo BRITO et al. (2004) como a E. coli é encontrada normalmente na
urina de porcas saudáveis torna-se fundamental a caracterização de isolados
patogênicos. Entre os fatores associados à patogenicidade de UPEC em
9
humanos e suínos estão a produção de hemolisinas, aerobactinas, fímbrias não
hemaglutinantes (987P), de hemaglutinação dependente da ausência de manose
(HAMS) e de hemaglutinação não-dependente da presença ou ausência de
manose (HAMR), presença de cápsula, resistência ao soro e produção do fator
citotóxico necrotisante (CNF) (SILVEIRA et al., 2001, BRITO et al., 2004). Nos
seres humanos, a importância das chaperonas associadas à membrana externa
da parede celular e formação de um biofilme no interior da vesícula urinária têm
se mostrado importante para patogenia das UPEC (KAU et al., 2005).
As drogas antimicrobianas (antibióticos e quimioterápicos) podem ser
utilizadas tanto no tratamento de infecções nos animais, bem como aplicadas nas
rações, para promover o crescimento e melhorar a eficiência alimentar do plantel
(BARCELLOS & SOBESTIANSKY, 1998). Quando administradas em doses
subclínicas na alimentação de animais aparentemente saudáveis estes
medicamentos recebem o nome de promotores de crescimento. Essas drogas
atuam no controle profilático de infecções pela destruição de bactérias
patogênicas que realizariam aderência ao trato digestório e provocariam
enfermidades. Da mesma forma inibiriam microrganismos competidores dos
produtores de vitaminas. O controle de doenças subclínicas é fundamental para
que os animais manifestem todo o seu potencial genético para crescimento e
produção de carne (BARCELLOS, 2005).
Embora o uso destes fármacos seja muito importante na suinocultura, sua
adoção descontrolada e abusiva tem alertado pesquisadores das áreas da saúde
humana e animal, para os potenciais riscos envolvidos nestas práticas.
Atualmente, são muitos patógenos humanos e animais com multi-resistência às
drogas antimicrobianas reforçando as evidências de que a emergência destas
bactérias está associada intimamente ao uso dos promotores de crescimento. A
presença de resíduos de antibióticos nos alimentos também deve ser
considerada, tendo em vista o desenvolvimento de reações de hipersensibilidade
(WALLMANN, 2006). Esta preocupação também tem se estendido a outros
setores da produção animal, como a aqüicultura, especialmente nas regiões onde
dejetos da produção suinícola são empregados para alimentação de peixes e
camarões (CABELLO, 2006).
10
Um dos problemas relacionados à disseminação da resistência aos
antimicrobianos, especialmente em E. coli, é o fato desta bactéria possuir um
intervalo entre gerações muito curto e dispor de mecanismos de transferência de
material genético. O principal mecanismo de transferência da multi-resistência aos
antimicrobianos em E. coli parecem ser os plasmídeos. Estes elementos podem
ser transferidos via conjugação entre duas bactérias pela formação de uma pili F.
Associado a isto, os plasmídeos podem facilmente receber outros genes de
resistência aos antimicrobianos via integração mediada por integrons e
transposons (SHERLEY et al., 2004). MORO et al. (2000) comprovaram que o
estresse térmico aumenta a quantidade de E. coli no intestino dos animais, bem
como facilita sua eliminação do trato digestório para o meio ambiente. Isto ocorre
provavelmente pela redução no tempo de trânsito do conteúdo intestinal. A
situação se torna preocupante especialmente nos criatórios suínos. Esta se
justifica pela disseminação e contato das bactérias, tanto no trato digestório, como
no ambiente da granja e até mesmo na água, onde os dejetos dos suínos são
lançados sem o devido tratamento. Vários estudos têm demonstrado a maior
resistência aos antimicrobianos de bactérias do meio ambiente, onde ocorre a
produção animal intensiva, particularmente aqueles aonde os antimicrobianos são
utilizados em maior quantidade (SCHMIDT et al., 2000; DOCIC & BILKEI, 2003;
HART et al., 2004; HATHA et al., 2005; PARVEEN et al., 2006;). Esta habilidade
da E. coli em colonizar e persistir em diferentes ambientes facilita o seu contato
com o homem, o que pode significar um grande risco à saúde pública (BEIER et
al., 2005).
Esta situação tem preocupado e estimulado os pesquisadores à busca de
alternativas para resolução deste problema, que vão desde o uso de
microrganismos benéficos ao trato digestório, para competir com a flora intestinal
patogênica, utilização de fitoterápicos e homeopatia para tratar e prevenir
enfermidades nos suínos e até alterações profundas no manejo dos animais. O
sistema intensivo de criação de suínos ao ar livre (SISCAL) vem ganhando
espaço na suinocultura nacional, pois tem como prioridade o bem-estar animal,
reduzir o estresse dos animais e desta forma a ocorrência de enfermidades, o que
implica diretamente na diminuição do uso de agentes antimicrobianos (DALLA
11
COSTA et al., 2001). Além disto, a pressão para retirada dos promotores de
crescimento na suinocultura é grande por parte do mercado consumidor interno e
principalmente externo. Desde 2006, a União Européia não permite a importação
de carne de países onde sejam utilizados promotores de crescimento nos
animais, o que tem forte reflexo sobre o produto brasileiro (SANTOS & GIL-
TURNES, 2005).
Alternativa interessante ao uso dos promotores de crescimento, são as
vacinas, que podem induzir uma forte imunidade nos leitões protegendo-os das
enfermidades provocadas por E. coli. A imunidade colostral via IgA e IgG é muito
importante no controle da enfermidade e a vacinação é fundamental para que
níveis adequados destas imunoglobulinas e outros fatores específicos como
transferrinas e lactoferrinas sejam passados das porcas aos leitões,
principalmente no caso das fêmeas de primeira cria (marrãs). Devido a grande
variabilidade genética, antigênica e de virulência nos isolados de E. coli torna-se
recomendável o uso de vacinas autógenas. Muitas das vacinas disponíveis para
profilaxia e controle da colibacilose e doença do edema empregam a metodologia
utilizada na biotecnologia. Podem ser utilizadas fímbrias e toxinas purificadas,
bem como vacinas de DNA e subunidade protéicas (KEN & BILKEI, 2003;
RIISING et al., 2005; SIMIONATTO et al., 2005). Concomitante a utilização das
vacinas é fundamental a redução da contaminação ambiental que é realizada pela
correta higiene das instalações (GYLES & FAIRBROTHER, 2004).
No Brasil, poucos são os estudos recentes envolvendo a caracterização
molecular de isolados de E. coli, bem como contemplando a resistência destas
bactérias aos agentes antimicrobianos (BRITO et al., 2004). Este fato ressalta a
importância de trabalhos visando à caracterização da patogenicidade dos isolados
de E. coli no nosso país, bem como da determinação de sua resistência às drogas
mais comumente empregadas na terapia e na prevenção de infecções à
suinocultura brasileira. Estes dados são muito importantes para guiar os clínicos
com relação as melhores opções terapêuticas para tratamento, controle e
profilaxia da infecção por E. coli nos suínos, bem como auxiliar na escolha de
cepas bacterianas adequadas à utilização na elaboração de vacinas, mais
eficientes e com um menor impacto ambiental e à saúde pública.
12
Tendo em vista o exposto anteriormente, os objetivos do presente estudo
são:
• Determinar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de isolados de E.
coli obtidos de casos clínicos (entéricos e urinários), de fezes de suínos
saudáveis e do ambiente de granjas da região sul do país;
• Verificar a resistência múltipla aos antimicrobianos nos isolados;
• Determinar o conteúdo de DNA plasmidial nesses isolados;
• Caracterizar os principais patotipos encontrados nos isolados clínicos
(entéricos e urinários), nas fezes de suínos saudáveis e no ambiente
através da técnica de PCR multiplex;
• Produzir subsídios para adoção de uma antibioticoterapia racional,
compreensão da epidemiologia da enfermidade e produção de vacinas de
maior eficácia.
13
Capítulo 2
Patotipos de Escherichia coli na suinocultura e resistência aos
antimicrobianos
A ser submetido à revista Ciência Rural
14
PATOTIPOS DE Escherichia coli NA SUINOCULTURA E RESISTÊNCIA AOS
ANTIMICROBIANOS
Escherichia coli PATHOTYPES IN SWINE PRODUCTION AND ANTIMICROBIAL
DRUGS RESISTANCE
Mateus Matiuzzi da Costa
1,2
, Shana de Souto Weber
2
, Franciele Maboni
3
,
Andréia Inês Ferronato
1
, Irene Silveira Schrank
2
, Augusto Schrank
2
, Marilene
Henning Vainstein
2
, Agueda Castagna de Vargas
3*
Resumo
A suinocultura moderna tem propiciado a obtenção de índices produtivos
positivos, entretanto tem predisposto os suínos a um grande número de doenças.
O surgimento destas enfermidades estimulou o uso indiscriminado das drogas
antimicrobianas na prevenção de infecções. Escherichia coli é um dos principais
patógenos da suinocultura e se caracteriza pela grande resistência aos agentes
antimicrobianos. A habilidade deste patógeno na transmissão horizontal da
resistência aos antimicrobianos decorre de vários mecanismos genéticos e possui
sérias implicações à saúde pública. Dentre os problemas associados à
disseminação da resistência múltipla aos antimicrobianos, podemos citar a
contaminação do homem e dos animais por bactérias patogênicas de difícil
terapia, principalmente através dos alimentos e do ambiente contaminados. Esta
revisão tem como objetivo abordar aspectos relevantes da E. coli relativos ao seu
potencial patogênico em suínos e à sua resistência às drogas antimicrobianas.
Além disto, também apresenta algumas das alternativas aos usos destes
fármacos na suinocultura.
Palavras- Chave: E. coli, suínos, resistência, antimicrobianos, meio ambiente.
15
_______________________________________
1. Colegiado de Zootecnia, Universidade Federal do Vale do São Francisco (Campus Petrolina),
Petrolina, PE, Brasil.
2. Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.
3. LABAC, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil.
* Autor para correspondência:
Mateus Matiuzzi da Costa
Colegiado de Zootecnia - Universidade Federal do Vale do São Francisco
Rua da Simpatia, 179
CEP 56304-440, Petrolina - PE - Brasil
E-mail: [email protected]
Abstract
The modern porcine practice has provided positive results in pork meat
production, however this practice predisposes the animals to a large number of
diseases. The possibility to adquire the large variety of infectious diseases induced
the pork producers the utilization of antimicrobials drugs, known as growth
promoters. Escherichia coli is one of the most important pathogens in swine
production systems e has been characterized by multi-resistance to antimicrobial
drugs. The ability of these bacteria to horizontal spread of antibiotic resistance is
associated to several genetic mechanisms and has many public health regards.
Among the problems associated to spread of multi-resistance are the man and
animal contamination with difficult therapy against pathogenic bacteria, mainly by
contamination of their food and environment. This review aim to discuss important
aspects related to the pathogenic potential of E. coli on swine and its resistance to
antimicrobial drugs. Besides, we present some alternatives to antimicrobial drugs
on swine production.
Key-Words: E. coli, swine, resistance, antimicrobial drugs, environment.
16
Suinocultura moderna e o uso de antimicrobianos
No Brasil, a partir da década de 70, a criação de suínos passou por
diversas modificações. Através da intensificação na produção, de melhorias
genéticas e nutricionais, uma melhor produtividade foi obtida. Porém, essa
intensificação predispôs os animais ao estresse, trazendo um maior risco de
aquisição de doenças (LOVEDAY, 1994). Mesmo com os esforços para controle
das enfermidades gastro-intestinais, estas são responsáveis por inúmeras perdas
na produção de suínos. As diarréias são principalmente observadas em neonatos
e animais após o desmame. Enquanto as perdas econômicas associadas à
mortalidade são evidentes, a redução no desempenho nem sempre é detectada
pelo produtor, ocasionando prejuízos consideráveis (COOPER, 2000; WILLS,
2000).
Os antimicrobianos são amplamente utilizados para prevenir ou tratar
infecções microbianas nos animais e no homem, sendo utilizados para acelerar o
crescimento e desempenho dos animais, inclusive na aqüicultura (KUMMERER,
2004). A veiculação de antimicrobianos nas rações de suínos tem sido bastante
discutida (LA FUENTE et al., 2005). O uso abusivo destas drogas está associado
a diversos problemas, como a presença de resíduos na carne e transmissão de
bactérias resistentes para o meio ambiente, animais e o próprio homem, com
risco potencial à saúde pública (DUNLOP et al., 1999; SCHMIDT et al., 2000,
WHITE et al., 2006).
Dados norte americanos indicam que 40% do total de drogas
antimicrobianas produzidas são utilizadas para alimentação animal, em especial
dos suínos. A contaminação do meio ambiente constitui-se num sério risco,
17
principalmente a contaminação da água que recebe dejetos de suínos, bovinos e
aves não tratados corretamente (PETERSEN et al., 2002). Tendo em vista que os
ecossistemas humanos, suínos e bovinos são intimamente relacionados pelas
cadeias produtivas de alimentos, a transferência de bactérias resistentes é muito
importante, levando em conta não só o consumo de alimentos, como também o
caráter ocupacional desta infecção (SCHROEDER et al., 2002).
Infecções ocasionadas por E. coli nos suínos
A colibacilose é a enfermidade entérica de maior impacto na suinocultura,
especialmente em animais neonatos e no pós-desmame. Essa doença pode ser
ocasionada por cepas enterotoxigênicas de Escherichia coli (ETEC). Para o
desenvolvimento da enfermidade, as bactérias precisam aderir-se a mucosa
intestinal e produzir uma ou mais enterotoxinas termolábeis (LT I e LT II), e
termoestáveis (STa e STb), que levam ao desenvolvimento de diarréia e
desidratação, podendo resultar na morte dos animais. Os tipos de fímbrias
comumente associados com a doença nos animais domésticos são K88 (F4), K99
(F5), 987P (F6), F41 e F18 (HENTON & HUNTER, 1994; DEAN-NYSTROM et al.,
1997; GYLES & FAIRBROTHER, 2004). A maior prevalência da infecção e de
morte em suínos ocorre no período de 12 horas até quatro dias após o
nascimento (COOPER, 2000). A colibacilose neonatal ocorre pela ingestão de
bactérias de origem materna e ambiental, ausência das defesas naturais, como
flora normal do intestino e barreira gástrica, presença de receptores para fímbria
nos recém-nascidos e a alta susceptibilidade dos animais às enterotoxinas
produzidas por E. coli (GYLES & FAIRBROTHER, 2004). Associados a estes
18
fatores, a inadequada ingestão de colostro pelos leitões é considerada como um
dos principais fatores predisponentes (HENTON & HUNTER, 1994).
O estresse e a redução nos níveis de anticorpos recebidos passivamente
desempenham um importante papel na infecção por ETEC em suínos
desmamados. O desmame altera a fisiologia dos animais e induz a uma elevação
do pH estomacal, provocando redução na atividade bactericida gástrica (HENTON
& HUNTER, 1994). A diarréia pós-desmame está associada à elevação do
número de E. coli hemolíticas em relação às não-hemolíticas no trato
gastrointestinal; decorrente principalmente pela troca da dieta dos leitões
(COOPER, 2000; GYLES & FAIRBROTHER, 2004).
E. coli enteropatogênica (EPEC) também pode determinar um sério
impacto à suinocultura por estar envolvida no desenvolvimento de diarréias
neonatais e pós-desmame associadas à má absorção de nutrientes (AN et al.,
2000). Contudo, poucos são os dados relativos a prevalência da infecção por esta
bactéria nos suínos, em especial no Brasil. A importância clínica destas bactérias
tem sido relatada em outras espécies animais, como ruminantes, cães, macacos
e no próprio homem (BEAUDRY et al., 1996; SARIDAKIS et al., 1997;
CARVALHO et al., 2003; NAKAZATO et al., 2004; TENG et al., 2004).
As E. coli EPEC aderem-se ao intestino delgado e grosso dos animais,
produzindo uma lesão denominada attaching effacing. Neste processo, os
enterócitos são degenerados e uma leve inflamação da lâmina própria pode ser
observada, principalmente no íleo. O duodeno e o ceco são os locais onde ocorre
a maior colonização (BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999; AN et al., 2000).
A lesão de attaching effacing é caracterizada pela adesão de uma proteína
19
localizada na superfície da bactéria, denominada intimina, à superfície do
enterócito. A intimina provoca um rearranjo no citoesqueleto da célula,
particularmente nos filamentos de actina, levando a um encurtamento das
microvilosidades dos enterócitos e a formação de um pedestal onde a bactéria se
aloja. Com isto, ocorre a perda da capacidade absortiva do epitélio intestinal
(GYLES & FAIRBROTHER, 2004).
Os fatores de patogenicidade associadas à lesão de attaching effacing são
codificados por uma ilha de patogenicidade denominada LEE (locus enterocite
effacement), a qual se constitui num cluster de genes com 35kb (PERNA et al.,
1998). A LEE codifica importantes fatores para a aderência bacteriana, como a
intimina, codificada pelo gene eae, bem como uma série de proteínas secretadas,
as Esps (EPEC secreted proteins). Estas quando polimerizadas formam uma
estrutura filamentosa semelhante a uma agulha, característica do sistema de
secreção do tipo III. Por este sistema é injetado na célula hospedeira, um receptor
para intimina, também presente na ilha de patogenicidade, denominado Tir
(translocated intimin receptor) (AN et al., 2000; CLEARY et al., 2004). Várias
adesinas têm sido estudadas como fatores de patogenicidade nas E. coli EPEC,
porém a que tem demonstrado maior importância é a Bundle forming pillus (BFP).
Esta fímbria, codificada por um plasmídeo (EAF-EPEC Adherence Factor) de
cerca de 80kb, tem se mostrado importante para a interação célula-célula e a
formação da microcolônia, bem como para a dispersão das bactérias deste
arranjo. Estudos apontam que esta fímbria é muito importante para adesão inicial
da bactéria aos enterócitos (CLEARY et al., 2004). Contudo, tanto amostras
EAF+, quanto EAF – têm sido isoladas de E. coli envolvidas em diarréias no
20
homem (GIRÃO et al., 1999). Cepas atípicas de EPEC, que possuem homólogos
da LEE, mas que diferentemente das demais, não apresentam plasmídeos
contendo os genes de aderência, têm demonstrado aderência difusa (GARTNER
& SCHMIDT, 2004).
Outra importante enfermidade, ocasionada por E. coli verotoxigênicas
(STEC, VETEC ou EHEC) em leitões recém desmamados é a doença do edema.
Estas E. coli possuem uma alta relação com as EPEC. As duas possuem a LEE,
entretanto a STEC possui importantes shiga toxinas, sendo a STx2e considerada
importante para suínos. Esta toxina é encontrada como parte do genoma de um
fago temperado, o qual se integra ao genoma da célula hospedeira sendo
encontrado em diversos sorotipos de E. coli e em outros membros da família
Enterobacteriaceae (DOUGAN et al., 2001; TOTH et al., 2003). Depois de uma
infecção inicial do trato intestinal, estes microrganismos se aderem e se
multiplicam no interior do intestino delgado (HENTON & HUNTER, 1994;
MOXLEY, 2000). A fímbria F18a/b está relacionada à adesão de cepas
causadoras da doença do edema. Durante a multiplicação da bactéria, a shiga
toxina é produzida e absorvida pela circulação sistêmica, onde induz a inativação
da síntese protéica em células do endotélio vascular do intestino delgado, em
tecidos subcutâneos e no encéfalo. A destruição das células endoteliais leva ao
aparecimento do edema e de sinais nervosos característicos da enfermidade
(HENTON & HUNTER, 1994). A suscetibilidade dos animais à infecção por EHEC
varia, sendo relacionada a um mecanismo genético. A resistência natural à
doença do edema ocorre pela não-expressão de receptores (F18a/b) no intestino
dos animais (MOXLEY, 2000).
21
As infecções do trato urinário nada mais são do que a penetração e
multiplicação de microrganismos nas vias urinárias. As fêmeas estão mais
sujeitas a essas infecções devido a uma série de diferenças anatômicas e
fisiológicas, tais como a proximidade entre o ânus e a vagina (SOBESTIANSKY et
al., 1991). As infecções do trato urinário dos suínos influenciam negativamente os
índices de produtividade da suinocultura. Os prejuízos associados a essas
infecções estão ligados às doenças puerperais, infertilidade, gastos com
medicamentos, redução de peso dos leitões e mortalidade (BRITO et al., 2004).
As E. coli uropatogênicas (UPEC) são a principal causa de infecção do trato
urinário em mulheres, e são também associadas à morte de fêmeas suínas
(BRITO et al., 1999; PORTO et al., 2003). Segundo BRITO et al. (2004), como as
E. coli são encontradas normalmente na urina de porcas saudáveis, torna-se
fundamental a sua diferenciação de amostras patogênicas. Entre os fatores
associados à patogenicidade de UPEC em humanos e suínos estão a produção
de hemolisinas, aerobactinas, fímbrias não hemaglutinantes 987P (F6), fímbrias
de hemaglutinação dependente da ausência de manose (HAMS), fímbrias não-
dependentes da presença ou ausência de manose (HAMR), cápsula, resistência
ao soro e produção do fator citotóxico necrotisante (CNF) (SILVEIRA et al., 2001;
BRITO et al., 2004). Nos seres humanos, as chaperonas associadas à membrana
externa da parede celular e a formação de um biofilme no interior da vesícula
urinária têm-se mostrado importante à patogenia das UPEC (KAU et al., 2005).
Conforme HENTON & HUNTER (1994), a maioria das cepas patogênicas
de E. coli isoladas de suínos são hemolíticas, sendo, no entanto, esta
característica não verificada para as outras espécies domésticas. Na maior parte
22
dos casos, somente o isolamento de E. coli a partir de amostras de fezes e
conteúdo intestinal pode não ser suficiente para o diagnóstico da enfermidade.
Nestes casos, é necessária a biotipificação de fímbrias e toxinas. A biotipificação
dos isolados pode ser realizada por soro-aglutinação, ELISA, imunofluorescência
e PCR (genotipificação) (BRITO et al., 1999; WILLS, 2000; DO et al., 2006).
Transferência da resistência em bactérias
A resistência bacteriana às drogas tem sido tema de estudo por diversos
pesquisadores, e constituindo-se em um grande desafio aos profissionais da área
da saúde. A origem desta resistência nem sempre é clara (KRUSE & SORUM,
1994), muitos pensam que esta se desenvolve somente após o uso das drogas
antimicrobianas, porém a grande variedade de genes envolvidos na resistência
indica uma origem e evolução muito antiga. Dados de pesquisa apontam que
estes genes estariam envolvidos com a proteção aos antibióticos produzidos por
outras bactérias, como Streptomyces spp. presente no solo (SUMMERS, 1996;
D’COSTA et al., 2006).
A transferência de genes entre as bactérias foi primeiramente descrita em
1928, em estudos de virulência de pneumococos em camundongos. Muitos dos
genes adquiridos desta forma podem carrear informações deletérias às bactérias
receptoras, reduzindo sua população, outras informações são neutras, enquanto
algumas, que conferem vantagem seletiva aos microrganismos, podem ser
carreadas por plasmídeos e disseminar-se rapidamente numa população
bacteriana (THOMAS & NIELSEN, 2005).
23
A transformação é o processo pelo qual o DNA pode ser absorvido a partir
do ambiente onde a bactéria se encontra. O DNA pode persistir por muitas horas
ou dias no meio ambiente e ser incorporado por microrganismos aptos. A
transformação natural envolve a competência da bactéria receptora, ou seja,
permissividade à entrada do DNA exógeno. Esta capacidade já foi comprovada,
em condições naturais, para E. coli (BAUR et al., 1996) e outras bactérias de solo,
como Pseudomonas stutzeri e Acinetobacter sp. (VRIES et al., 2001). DNA puro
com potencial para transferência pode ser obtido de diferentes fontes como solo,
água, fezes, silagem, saliva humana, alimentos e rações (THOMAS & NIELSEN,
2005).
A conjugação envolve a troca de DNA por plasmídeos via formação de pili
sexual ou pili F. A pili comunica o citoplasma de duas células e permite tanto a
passagem de plasmídeos, como de segmentos de DNA cromossomal
(SUMMERS, 1996). Os integrons são pequenos plasmídeos que utilizam outros
maiores para sua replicação e transmissão, enquanto que os transposons são
seqüências de DNA de replicação e transmissão integradas em um genoma.
Estas duas moléculas são muito importantes para o desenvolvimento de
resistência múltipla às drogas antimicrobianas (SHERLEY et al., 2004).
Tendo em vista os aspectos negativos da transferência de informação
gênica entre as bactérias, não é surpreendente que exista uma série de
obstáculos a serem vencidos para que estes eventos aconteçam. Entre estes
podemos citar a exclusão de superfície, que é muito importante para conjugação,
uma vez que reduz a receptividade à pili F e a presença de endonucleases, que
reconhecem seqüências específicas do DNA exógeno e o clivam. Este último
24
processo é menos freqüente, pois quanto menor for a seqüência de DNA
adquirido, menor será a probabilidade de ocorrência de sítios de clivagem
(FROST et al., 1994; JELTSCH, 2003; THOMAS & NIELSEN, 2005). Além disto, o
estabelecimento, a replicação, a transcrição e a tradução de seqüências
estranhas ao hospedeiro também podem ser bloqueadas (THOMAS & NIELSEN,
2005).
Resistência de E. coli aos antimicrobianos
A E. coli é uma das espécies onde cepas multi resistentes aos
antimicrobianos têm emergido rapidamente nos últimos anos (SHERLEY et al.,
2004). Estudo realizado na Suíça com E. coli VETEC, têm apontado para uma
resistência às tetraciclinas, sulfonamidas e estreptomicina, usadas
indiscriminadamente na alimentação de suínos no país (STEPHAN &
SCHUMACHER, 2001). Mesmos achados foram obtidos em amostras de animais
submetidos ao abate em Portugal (PENA et al., 2004). DUNLOP et al. (1998), nos
EUA, verificaram a presença de isolados com uma resistência de 71% à
tetraciclina, mas esta foi considerada baixa, tendo em vista pesquisas de outros
países onde esta droga é utilizada nas rações dos suínos. No Canadá, BOERLIN
et al. (2005) demonstraram que existe uma grande diferença na resistência aos
antimicrobianos entre isolados de ETEC e outros comensais.
E. coli é uma das principais espécies onde plasmídeos contendo genes
envolvidos no processo de resistência múltipla aos antimicrobianos vêm sendo
descobertos. Esta característica está relacionada a sua grande distribuição
ambiental e propensão a albergar elementos genéticos móveis, em especial os
25
plasmídeos. A conjugação, transposição e recombinação são amplamente
incriminadas com a evolução da resistência bacteriana às drogas antimicrobianas.
Eventos de transposição e integração são importantes mediadores da resistência
múltipla às drogas antimicrobianas dentro da família Enterobacterioaceae
(SCHROEDER et al., 2002; SHERLEY et al., 2004). O uso de antimicrobianos não
pode ser considerado a única pressão de seleção para bactérias resistentes. Os
plasmídeos podem carrear genes com diferentes funções, tais como: fatores de
virulência, adesinas, toxinas, resistência a metais pesados e genes de
metabolismo de substratos incomuns (LAZZAR et al., 2003; SHERLEY et al.,
2004). Desta forma, desinfetantes e suplementos alimentares podem apresentar
uma importante força de seleção para bactérias resistentes em uma propriedade
(YATES et al., 2004). Também a resistência a um antimicrobiano pode ajudar na
co-seleção de resistências as outras drogas, nos casos de resistência múltipla
aos antimicrobianos (BLICKWEDE & SCHWARZ, 2004). Plasmídeos contendo
genes de resistência aos antimicrobianos e enterotoxinas são descritos, desta
forma a resistência pode ser esperada em isolados clínicos (DUNLOP et al.,
1999). No entanto, estudos realizados em bovinos têm apontado que estas
características nem sempre são encontradas em associação (ORDEN et al.,
1999; STEPHAN & SCHUMACHER, 2001; BETTELHEIM et al., 2003).
Em muitos casos a resistência a uma determinada droga pode se estender
a outras ligadas geneticamente. Como exemplo temos a gentamicina,
amplamente usada na suinocultura, cujo gene de resistência está localizado num
plasmídeo, que também codifica caráter de resistência para tetraciclina,
sulfonamidas e penicilinas (DUNLOP et al., 1999). Os mesmos autores alertam
26
para grande concentração de bactérias contendo estes plasmídeos nas fezes dos
animais. Estudo realizado por BETTELHEIM et al. (2003) comprovou que em
bovinos, como nos seres humanos, as mães são a principal fonte de
contaminação de E. coli resistentes aos neonatos, e que estas bactérias fazem
parte da microflora intestinal. O que também pode ser esperado para os suínos
(GYLES & FAIRBROTHER, 2004).
Após o uso de uma droga antimicrobiana, principalmente as de amplo
espectro, pode-se observar a elevação do percentual de cepas resistentes entre
bactérias patogênicas e comensais (WHITE et al., 2006). Segundo DUNLOP et al.
(1998), a redução no tratamento de animais com grupos de antimicrobianos de
largo espectro pode auxiliar na redução da prevalência de E. coli resistentes em
suínos. Porém, trabalho recente apontou que uma vez adquiridos os genes e
elementos móveis responsáveis pela resistência, estes representam um custo
muito baixo à bactéria. Desta forma, a E. coli tende os manter, indicando que a
redução na resistência aos antimicrobianos pela remoção na pressão de seleção,
ou seja, na alimentação dos animais com antibióticos, pode, no mínimo, ser um
processo muito lento (ENNE et al., 2005). Desta forma é importante a
manutenção de investimentos no sentido de conservar a sanidade dos animais,
reduzindo a necessidade de antimicrobianoterapia (WALLMANN, 2006).
Impacto ambiental do uso de antimicrobianos na suinocultura
A contaminação do meio ambiente constitui-se num sério risco,
principalmente a partir da água que recebe dejetos de suínos e aves tratados
incorretamente (PETERSEN et al., 2002). Além disto, bactérias com pouca
27
patogenicidade para humanos, mas resistentes aos agentes antimicrobianos,
podem passar esta característica para os patógenos humanos através de
plasmídeos R (DUNLOP et al., 1999). Bactérias patogênicas para o homem
podem ser disseminadas para o meio ambiente a partir de dejetos e podem ser
encontradas contaminando águas superficiais, como rios e lagos. Estudos
apontam uma relação entre a detecção de bactérias resistentes aos
antimicrobianos e a presença de contaminação por esgoto nos rios (FERREIRA et
al., 2003; KUMMERER, 2004). O dejeto suíno pode carrear inúmeros patógenos
bacterianos humanos, como Salmonella sp., E. coli e Campylobacter sp.
(VANOTTI et al., 2005). O tratamento dos dejetos suínos parece ser eficiente na
redução nas contagens de Salmonella sp., contudo, particularmente a S.
Typhimurium, pode ainda ser isolada (SCHMIDT & CARDOSO, 2003).
Em condições naturais em um rio não poluído existem pouquíssimas
bactérias resistentes a antimicrobianos. Isto pode ser explicado pela ausência de
uma pressão de seleção; contudo nos ambientes poluídos pela ocupação
humana, a resistência aos antimicrobianos é frequentemente observada
(MCARTHUR & TUCKFIELD, 2000; VILANOVA et al., 2004; SHEHANE et al.,
2005). Os coliformes totais, coliformes fecais, presença de E. coli e Enterococcus
sp. são utilizados como indicadores da qualidade microbiológica de águas e dos
riscos à saúde pública (MEAYS et al., 2004).
A presença de E. coli e outros coliformes fecais na água indica a
contaminação pelas fezes de animais, tais como os suínos e o do próprio homem
(FEUERPFEIL & STEZLER, 1992; QUINN et al., 1994). Estes microrganismos
têm demonstrado uma grande habilidade em resistir a diversos esquemas de
28
tratamento de dejetos, sendo muitas delas resistentes aos antimicrobianos
(VILANOVA et al., 2004). A principal fonte de contaminação da água por bactérias
multi-resistentes é a presença de dejetos sólidos e líquidos de animais, bem como
excrementos de origem humana (REINTHALER et al., 2003).
Um estudo reportou que muitos eventos de transmissão de plasmídeos de
resistência em E. coli podem ocorrer na água superficial ou no esgoto. Esses
eventos acontecem principalmente quando a concentração das bactérias for alta,
o que maximizaria o contato e a possibilidade de conjugação (REINTHALER et
al., 2003). Outros apontam que contagens superiores a 10
3
UFC/ml podem ser
encontradas em unidades de tratamento de esgoto e estariam associadas a uma
resistência bacteriana seis vezes superior ao esperado (STEZLER & ZIEGERT,
1988).
Perspectivas: Alternativas ao uso de antimicrobianos
Os problemas associados à utilização de drogas antimicrobianas na
suinocultura têm despertado nos pesquisadores a busca por alternativas que
diminuam os riscos de infecções nestes animais. Entre essas alternativas
podemos citar os probióticos, prébioticos e acidificantes (LA FUENTE et al.,
2005). Os probióticos são preparados com microrganismos vivos que atuam pela
biorregulação da microbiota intestinal e estímulo da fisiologia intestinal através da
produção de compostos, como vitaminas, enzimas e ácidos orgânicos (KRITAS &
MORRISON, 2005). A presença de tais microrganismos no intestino tem sido
associado à redução na contagem de E. coli hemolítica nos intestinos de leitões
(SCHAREK et al., 2005). Além disto, estes agentes também são importantes
29
estimuladores do sistema imunológico do hospedeiro, em especial de
imunoglobulina A (IgA), imunoglobulina G (IgG) e da atividade dos macrófagos
(KOENEN et al., 2004). Os prébioticos, como os ácidos graxos voláteis, são
compostos que auxiliam o crescimento seletivo da microbiota intestinal não
patogênica (LIU et al., 2003).
Os acidificantes atuam pela redução no pH, estimulando a proliferação de
Lactobacillus sp. reduzindo a multiplicação de bactérias patogênicas, como
Salmonella sp. e E. coli, no intestino (FRANCO et al., 2005; TSAI et al., 2005).
Entre os principais ácidos orgânicos que servem de suplemento nas rações
animais, podemos citar o acético, benzóico, cítrico, fórmico, fumárico, láctico,
fosfórico, propiônico, sórbico e tartárico (LA FUENTE et al., 2005). Além das
propriedades antimicrobianas, os acidificantes melhoram a digestibilidade de
outros componentes, como proteínas e aminoácidos, melhorando a eficiência
enzimática, sendo desta forma de grande importância à nutrição animal (BLANK
et al., 1999).
A vacinação de porcas antes do parto tem sido de grande utilidade no
controle da colibacilose (BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999). O colostro
das fêmeas imunizadas contém quantidades suficientes de imunoglobulinas para
proteção dos filhotes. Dentre estas, podemos citar a IgA e IgG, que
desempenham o papel de proteger os filhotes na fase inicial de sua vida. Quanto
maior o número de parições, maior a proteção transmitida da fêmea aos filhotes
(NETO et al., 2001). Este fato é verdadeiro especialmente para fêmeas de
primeira cria oriundas de propriedades, onde as enfermidades ocasionadas por E.
coli são raras ou inexistentes (RIISING et al., 2005). Além disto, o colostro contém
30
fatores específicos como transferrinas e lactoferrinas, que auxiliam na prevenção
das enfermidades ocasionadas por E. coli (HENTON & HUNTER, 1994). Vários
trabalhos apontam a eficiência das vacinas para controle da colibacilose e da
doença do edema (KEN & BILKEI, 2003). Muitas destas vacinas empregam
tecnologia atuais, como o uso de fímbrias ou toxinas purificadas, e vacinas de
DNA ou subunidade protéica (RIISING et al., 2005; SIMIONATO et al., 2005,
LIANG et al., 2006). A estimulação oral dos leitões com fímbria purificada (F4) tem
sido eficiente em estimular uma imunidade de mucosa nas placas de Peyer. Esta
imunidade é muito importante, principalmente para redução da diarréia pós-
desmame, que ocorre numa fase de vida dos animais, onde os anticorpos
maternos transmitidos pelo colostro não são protetores (SNOECK et al., 2006).
A identificação dos fatores de virulência associados à patogênese da
enfermidade, e as técnicas de DNA recombinante têm permitido o surgimento de
vacinas mais eficientes na proteção dos animais. Nos casos de falhas vacinais, a
caracterização dos isolados envolvidos e o uso de vacinas autógenas se
apresentam muito importante (BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999).
Conforme os mesmos autores, a prevenção das infecções intestinais por E. coli,
em suínos, envolve a redução no número de E. coli patogênicas no meio
ambiente através da adoção de boas práticas de higiene, melhora no manejo e
provisão de uma imunidade completa aos animais.
Conclusão
Tendo em vista o discutido neste trabalho, podemos concluir que o uso
indiscriminado de antimicrobianos na suinocultura pode apresentar sérios reflexos
31
à produção dos animais, à saúde pública e ao meio ambiente. Uma vez adquirida
pela E. coli, a resistência aos antimicrobianos pode ser transmitida a outros
isolados e mantida por um longo período de tempo. Logo, a conscientização dos
técnicos é fundamental, bem como a realização de estudos com o objetivo de
dimensionar este problema, aplicar e descobrir novas estratégias alternativas ou
complementares ao uso racional de drogas antimicrobianas na suinocultura.
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42
Capítulo 3
Virulence factors, antimicrobial resistance and plasmid content of
clinical and environmental Escherichia coli swine isolates from
Southern of Brazil.
Submetido à revista Current Microbiology
43
Virulence factors, antimicrobial resistance and plasmid content of clinical
and environmental Escherichia coli swine isolates from Southern of Brazil.
Running head: Virulence factors and antimicrobial resistance of E. coli
Mateus M Costa
1,3
, Guilherme Drescher
3
, Franciele Maboni
2
, Shana S Weber
1
,
Augusto Schrank
1
, Marilene H Vainstein
1
, Irene S Schrank
1
, Agueda C Vargas
2
,
1
Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de
Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, C.P. 15005, CEP:
91501-970, Porto Alegre, RS, Brazil.
2
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Rurais,
Universidade Federal de Santa Maria, CEP: 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.
3
Colegiado de Zootecnia, Universidade Federal do Vale do São Francisco, CEP:
89820-000, Petrolina, Pernambuco, Brazil.
Correspondence to Agueda C Vargas
Laboratório de Bacteriologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva,
Universidade Federal de Santa Maria.
Prédio 44, sala 5137
CEP 97105-900 Santa Maria, RS.
Phone: (55) 55 3220 9391 Fax: (55) 55 3220 8257
E-mail:[email protected]
44
Abstract
Escherichia coli infections account for significative economic losses in swine
production around the world. Antibiotic therapy is widely used to control and prevent
swine infections. However, the abusive consumption of these drugs associated to the
presence of chemical residues in food and the spread of resistant bacteria to
environment are the main factor of risks to public health. Here, we report virulence
factors and antimicrobial resistance patterns from E. coli isolates from Southern of
Brazil. A total of 80 E. coli isolates were evaluated, being 64 from clinical samples
(intestinal content and fragments of organs from diarrheic piglets), 7 from feces of
clinically healthy piglets and sows and 9 environmental samples (5 from facilities
swabs, 2 from feed, 1 from insect and 1 from waste). Molecular characterization was
performed by PCR detection of fimbriae and toxin genes and plasmid content
determination. The isolates were also characterized according to their resistance or
sensitivity to the following drugs: ampicillin, trimethoprim:sulfamethoxazole,
tetracycline, amikacine, colistin, norfloxacin, florfenicol, enrofloxacin, cefalexin,
trimethoprim, neomycin, cloramphenicol and gentamicin. From 80 E. coli isolates,
66.67% were classified as enterotoxigenic E. coli (ETEC), 3.1% were shiga toxin
producing E. coli (STEC) and 30.15% showed a non specific pattern and were
unclassified. One fecal isolate from non-diarrheic piglet was classified as ETEC by
PCR. Clinical isolates showed resistance mainly for tetracycline,
trimethoprim:sulfamethoxazole. Plasmidial DNA was observed in 70 isolates, being
78.5 % of clinical isolates, 8.57% of non-diarrheic feces and 12.8% environment
isolates.
45
Introduction
Neonatal colibacillosis is one of the important disease of swine herds around
the world [6, 18]. Different pathotypes are associated with neonatal and post-weaning
diarrhea as enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) and Attaching Effacing or
enteropathogenic E. coli (AEEC). The edema disease is caused by a Shiga toxin
producing E. coli (STEC). These diseases are associated with high mortality rates in
young piglets [10, 17]. ETEC adheres to small intestine by fimbriae (F4, F5, F6, F41
and F18) and produce enterotoxins (STa, STb and LT) that interact with enterocytes
causing water and electrolytes hyper secretion, impairing nutrient absorption [1, 4].
The hemolysins are considered an important marker of ETEC virulence from swine
[12]. The piglet contamination occurs from sow or environmental contact and the
disease produces very high mortality rates in the first 12 hours of life. Host
susceptibility is associated to several factors such as the presence of intestinal E. coli
fimbriae receptors, poor hygiene, stress, and colostrum ingestion quantity [4].
Antimicrobials have been commonly used to control and prevent E. coli
infections in swine herds [12, 17, 19]. However, the abusive administration of the
antimicrobial drugs causes many problems as residual contamination of pork meat
and potential risks for consumers [3, 14]. Considering that human, bovine and swine
ecosystems are highly interconnected by food production chain, the dissemination of
resistant bacteria should be avoided [22, 24, 27].
The occurrence of multi-resistant E. coli isolates has rapidly increased in
recent years [28]. In swine, a survey performed in Sweden for the detection of STEC,
showed the presence of strains with high resistance to tetracyclines,
sulfamethoxazole and streptomycin, drugs widely used as grow promoters [29].
46
Similar results were also reported in E. coli isolates from beef cattle and poultry [18,
23]. Significant differences in antimicrobial susceptibility patterns was found between
swine ETEC and commensal bacteria, showing that illness animals is a important
source of resistant bacteria to healthy animals [7].
Plasmids carrying multiple drug resistance genes are frequently detected in E.
coli [27, 28]. Plasmids may carry genes with different functions as: antibiotic
resistance, adhesins, toxins, resistance to heavy metals and assimilation of unusual
nutrients [28]. Therefore, the antimicrobial therapy may not be the unique selection
pressure to raise resistant bacteria and the use of disinfectants could be considered
important to co-selection of pathogenic resistant bacteria to antimicrobial compounds
[31, 32]. The co-selection of genes coding for resistance and enterotoxin production
was reported, as well as the multiple antimicrobial drugs resistance among clinical
isolates [14]. In many cases the resistance to some antibiotic may be extended to the
others [6, 16].
The drug resistance of E. coli isolates is a very important issue and this
problem can only be solved by interdisciplinary efforts [30]. The correct use of
antimicrobial therapy by clinicians is very important to reduce possible failures [10].
According to DUNLOP et al. [13], a reduction in the use of growth promoters can help
to minimize the dissemination of resistant E. coli for both the environment and the
man. However it has been demonstrated that once acquired by E. coli the resistance
genes are not rapidly lost [15]. In our study, we characterized molecularly the
virulence factors and drug resistance profile of swine E. coli isolates from Southern of
Brazil.
47
Materials and Methods
Bacterial isolates and culture conditions
E. coli strains were isolated from clinical cases of neonatal colibacillosis
(intestine contents and fragments of liver and lungs), from non-diarrheic piglets and
sows feces, and from the environment (food, insects and facilities). Samples were
collected from swine breeding farms in Southern of Brazil, in sterile bags and swabs
and transported in Stuart modified medium at 4
o
C to the laboratory. The samples
were streaked on ovine blood agar and Mac Conkey agar and kept at 37
o
C for 48
hours. Putative E. coli colonies were identified by morphology and biochemical tests
according to Quinn et al. [26].
Resistance to antimicrobial drugs
The Kirby-Bauer disc diffusion test [2] was used to determine the resistance to
antimicrobial drugs of E. coli isolates. The follow drugs were tested: ampicillin (10μg),
trimethoprim:sulfamethoxazole (25μg), tetracycline (30μg), amikacine (30μg), colistin
(25μg), norfloxacin (10μg), florfenicol (30μg), enrofloxacin (5μg), cefalexin (30μg),
trimethoprim(25μg), neomycin (30μg), cloramphenicol (30μg) and gentamicin (30μg).
Total DNA extraction and PCR
Total DNA was extracted by boiling methodology. Briefly, pure cultures were
suspended in sterile Milli-Q water, boiled for 5 min and immediately immersed on ice.
After centrifugation at 13.000 rpm for 2 min, the DNA was recovered from the
supernatant. The E. coli isolates were characterized by multiplex PCR for fimbrial
and toxin genotypification by amplification of the follows regions: STa, STb, LT, STx
48
F4, F5, F6, F41 and F18, as previously described [11]. The presence of attaching
effacing E. coli (AEEC) was evaluated, as described by Nakazato et al. [21]. The
PCR reactions were performed in 25μL reactions containing 100ng of DNA template,
primers (30pmol each), Taq buffer (10mM Tris, 50mM KCl, 2.5mM MgCl
2
), 200mM
dNTPs, 1 U of Taq DNA polymerase (Cenbiot-Enzymes, UFRGS, Brazil).
Amplification was performed in 35 cycles, of 45s at 94
o
C, 1 min at 55
o
C, and 45s at
72
o
C. After amplification, a 7 μL aliquot was submitted to electrophoresis for 30 min
at 100V in a 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide. Amplification products
were visualized and photographed under UV illumination. Amplification identities
were confirmed by sequencing in an automated DNA sequencer MEGABACE 1000
using the Dynamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia
Biotech).
Plasmidial DNA extraction
Plasmidial extraction from E. coli isolates was performed by alkaline lysis, as
previously described [5]. The presence of plasmidial DNA was confirmed by
electrophoresis in 0.7% agarose gels. The plasmids were visualized and
photographed under UV illumination.
Statistical analysis
The difference among the E. coli isolates resistance patterns was evaluated by
Z test of two proportions with normal approximation. The level of significance of α =
0.05 and the cut off point for Zα5% = 1.96 were adopted. The relationship among the
frequencies of haemolysis and virulence factors was done by chi-square test.
49
Results and Discussion
We have analyzed 80 E. coli isolates, being 64 from clinical cases of E. coli
infections, 7 from feces of clinically healthy piglets and sows and 9 from
environmental samples (from facilities swabs (5), feed (2), insect (1) and waste (1)).
The results of haemolysis in blood agar and PCR for fimbrial and enterotoxin
determination in the E. coli isolates are summarized in Table 1. Haemolysis is
normally a marker of virulence in E. coli [4]. In our study we found 57 hemolytic
isolates, being 79.7% (51/64) of diarrheic piglets, 57.1% (4/7) from healthy pig feces
and 22.2% (2/9) from environment (Table 1). The haemolysis show statistically
relationship (P<0.05) with detection of virulence factors by PCR.
From the 64 clinical isolates, 43 were classified as ETEC and two as STEC.
Nineteen E. coli clinical isolates gave negative results in the multiplex PCR for
virulence markers and could not be typified. One isolated from healthy piglet feces
was classified as ETEC. None isolate was confirmed as AEEC in this study.
In the clinical isolates, the most prevalent virulence factors were STb (26), LT
(23), F18 (17), F4 (12) and STa (13). Thirteen clinical isolates presented LT and STb
genes, six isolates only the STb gene and six isolates the STa and STb genes. The
detection of genes coding for all enteroxoxins was observed in two isolates.
According to Celemin et al. [9], the enterotoxin coding genes LT and STb, or LT, STa
and STb are expected to be found in ETEC. Only in one isolate from non-diarrheic
piglet feces was detected the STb gene by PCR. Therefore, E. coli isolates from
healthy swine and environment samples show a lower pathogenic potential. The STb
alone causes only lost of fluids on the piglets intestinal mucosa, without drastic
effects proper of colibacillosis diarrhea [8]. However, the pathogenicity of ETEC may
50
be increased by associated infections with other intestinal pathogens [20]. New
vaccines strategies are being developed, using fimbrial and enterotoxins purified
from E. coli [4], therefore the knowledge of the molecular patterns of E. coli isolates is
very important.
The determination of the pathogenic bacteria susceptibility patterns to
antimicrobial drugs is important to guide the therapy, that will reduce the economic
loses due to E. coli infections [10, 17]. The resistance patterns of E .coli isolates from
Southern of Brazil are presented in Table 2. The majority of the clinical E. coli
isolates revealed resistance to tetracycline and trimethoprim:sulfamethoxazole
(significative effect P<0.05) and very few isolates were resistant to florfenicol. These
results are in according to others studies that evaluated the resistance patterns of E.
coli isolates from slaughtered swine, specially related to resistance to tetracycline
and trimethoprim:sulfamethoxazole [1, 3, 10, 17, 18, 23, 29].
Boerlim et al. [7] found a significant difference in antimicrobial susceptibility
patterns among pathogenic and commensal E. coli isolates. In our study, the
resistance was higher for all E. coli isolates tested and no significative (P>0.05)
differences were detected related to the source of these samples (diarrheic, non-
diarrheic piglets and environment). The drugs tested in the present study are widely
employed to animal production in Brazil. The improper veterinary use of these drugs
increases the resistance to animal pathogenic bacteria and could generate impact to
human health by food and feces residues from swine herds [22, 24, 27]. The
potential risk of the dissemination of resistant bacteria from animal farming to the
environment and the man was determinate by detection and determination of
conjugative plasmids in bacteria isolate from water [24], meat producing animals and
man [27]. According to Wallmann [31], strategies to avoid the spread of resistance to
51
antimicrobial drugs involve the control of antimicrobial use in the food-producing
chain.
In our work plasmid was observed in 55 (85.93%) clinical and 6 (85.71%) non-
diarrheic feces and 9 (100%) environmental E. coli isolates (data not shown). The
plasmid occurrence was higher among clinical isolates showing simultaneous
resistance from 5 to 7 antimicrobial drugs. Plasmids in E. coli carry multiple
resistance genes. The higher resistance of E. coli is related to wide distribution of
bacteria and ability to maintain genetic mobiles elements [6, 16, 27, 32]. The co-
selection of resistance and enterotoxin production genes was reported, as well as the
multiple antimicrobial drugs resistance among clinical isolates [14]. Many clinical and
environmental E. coli isolates revealed multiple resistances even in the absence of
plasmidial DNA. The resistance to antimicrobial drugs may be associated to others
different genetic mechanisms. Chromossomal mediated resistance genes are
described for several antimicrobial compounds, as enrofloxacin beta lactams and
biocides, as chlorexidine [3, 25].
Antimicrobial drugs have been used for decades to control swine diseases and
improve animal performance [3, 12]. Our results demonstrate the resistance pattern
to antimicrobials drugs in swine clinical, feces and environment E. coli isolates in
Southern of Brazil. In part, these findings may be associated with plasmids, although
this is matter for future studies. The majority of E. coli isolated was molecularly
characterized as ETEC, by using a multiplex PCR technique. This information is
important to guide clinicians about antimicrobial therapy choices and vaccine
development and strategies to be adopted in Brazil.
52
Acknowledgments
This work was supported by grants from Fundação de Amparo a Pesquisa do
Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) and Fundação de Apoio a Tecnologia e
Ciência – UFSM (FATEC). Mateus Matiuzzi da Costa was a recipient of a doctoral
fellowship from Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior
(CAPES).
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57
Tables
Table 1. Distribution of virulence factors in neonatal colibacilosis, healthy feces and
environment E. coli isolates.
Virulence factors
Isolates n
a
H
b
STa
c
STb
c
LT
c
STx
c
F4
c
F5
c
F6
c
F41
c
F18
c
Clinical 64 51 13 26 23 2 12 8 0 7 17
Non-diarrheic feces 7 4 0 1 0 0 0 0 0 0 0
Environment 9 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Total 80 57 13 27 23 2 12 8 0 7 17
a
number of E. coli isolates
b
haemolytic in blood agar
c
PCR results for the fimbrial and toxins amplifications
58
Table 2. Percent of resistant E. coli isolates from clinical, non-diarrheic pigs and
environment to antimicrobial drugs.
Drug Isolates
Clinical
(n = 64)
Non-diarrheic pigs feces (n = 7) Environment
(n = 9)
Ampicillin 42.19
a
42.86
a,c
30.00
a
Trimethoprim:sulfamethoxazole 62.50
a,b
28.57
a
40.00
a
Tetracycline 68.75
a,b
42.86
a
60.00
a
Amikacine 37.50
a
42.86
a
20.00
a
Colistin 28.13
a
42.86
a
10.00
a
Norfloxacin 35.94
a
28.57
a
20.00
a
Florfenicol 12.50
a,b
14.92
a,c
00.00
a,d
Enrofloxacin 29.69
a
28.57
a
20.00
a
Cefalexin 43.75
a
28.57
a
40.00
a
Trimethoprim 42.19
a
14.29
a
40.00
a
Neomycin 32.81
a
28.57
a
50.00
a
Cloramphenicol 20.31
a,b
28.57
a
20.00
a
Gentamicin 39.06
a
71.43
a,c
60.00
a
a: Non Statistically difference besides E. coli groups (P>0.05)
b:Statistically difference in clinical isolates group (P<0.05)
c: Statistically difference in non-diarrheic pig feces E. coli isolates (P<0.05)
d: Statistically difference in environment E. coli isolates (P<0.05)
n: number of isolates.
59
Capítulo 4
Virulence factors and antimicrobial resistance of Escherichia coli
isolated from urinary tract of swine in Southern of Brazil.
A ser submetido à revista Brazilian Journal of Medical and Biological
Research
Virulence factors and antimicrobial resistance of Escherichia coli isolated from
urinary tract of swine in Southern of Brazil.
M.M. Costa
1,3
, G. Drescher
3
, F. Maboni
2
, S.S. Weber
1
, S.A. Botton
2
, M.H. Vainstein
1
,
I.S. Schrank
1
and A.C. Vargas
2
1
Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia, Centro de Biotecnologia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.
60
2
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Rurais,
Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil.
3
Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade do Oeste de Santa Catarina -
Campus Xanxerê, Xanxerê, SC, Brasil.
Molecular characterization and antimicrobial resistance of E. coli
E. coli, antimicrobial drugs, resistance, plasmid, UPEC, sows
Research supported by Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio Grande
do Sul (FAPERGS) and Fundação de Amparo a Tecnologia e Ciência – UFSM
(FATEC). Mateus Matiuzzi da Costa was a recipient of a doctoral fellowship from
Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES).
Address for correspondence:
A.C. Vargas, LABAC, DMVP, CCR, UFSM
Prédio 44, sala 5137
97105-900 Santa Maria, RS, Brasil.
Fax: +55-55-3220-8257
E-mail: [email protected]
Abstract
The urinary infections in sows are responsible for economic losses in Brazil.
Escherichia coli is one of most frequent agent associated to urinary tract infections
(UTI) in man and animals. Antimicrobial drugs are commonly used to threat and
prevent UTI in swine herds. The present study has the purpose to determine the
molecular and resistance patterns of E. coli isolates from urinary tract of swine in
Southern of Brazil. Eighty two E. coli isolates from urinary vesicle and urine of sows
61
were evaluated. Molecular characterization of samples was performed by PCR
detection of virulence factors from ETEC (F4, F5, F6, F18, F41, ST and LT), STEC
(eae, Bfp and STx) and UPEC (sfa, pap, cnf, hly, iha, usp). From a total of 82 E. coli
isolates, thirty four (38.63%) harbored one or more virulence factors. The frequency
of virulence factors genes detected by PCR were: pap (10.97%), hlyA (10.97%), iha
(9.75%), LT (8.53%), STa (7.31%) sfa (6.09%), F4 (4.87%), F5 (4.87%), STb
(4.87%), F6 (1.21%) and F41 (1.21%). Isolates were resistant to penicillin (n= 78),
lincomycin (n= 77), erythromycin (n= 76), tetracycline (n= 74), amoxicillin (n= 68),
ampicillin (n= 61), josamycin (n= 65), norfloxacin (n= 48), enrofloxacin (n= 47),
gentamicin (n= 32), neomycin (n= 31), apramycin (n= 25), colistine (n= 25) and
cefalexin (n= 5). A number of 32 (39.02%) E. coli isolates harbored plasmids.
Virulence characteristics of both UPEC and ETEC and high resistance to
antimicrobial drugs were found in E. coli isolated from swine urinary tract in Southern
of Brazil.
Introduction
The urinary tract infection (UTI) is defined by the presence of bacteria in the
urinary tract (1). The disease is associated to many factors, as microorganisms,
husbandry, feeding, poor hygiene in housing and animal conditions (2). Escherichia
coli is one of most important pathogen isolated from UTI and causing a significant
percentage of death and discard of diseased sows (3).
62
In human, the disease is associated to many virulence factors present in the
uropathogenic E. coli (UPEC), including haemolysin, aerobactin, adhesins, serum
resistance, cytotoxic necrotizing factor (CNF), capsule production and uropathogenic-
specific protein (4-6). E. coli adhesion to host cells is important to bacteria infection
and persistence in urinary fluxes (7,8) and can be mediated by several types of
fimbriae (2). Fimbriae associated to UPEC are classified by its haemagglutination
activity, especially in human eritrocytes (9). E. coli fimbriae associated to UTI are the
non-haemagglutinating 987P (F6) fimbria, mannose sensitive haemmagglutination
type 1 fimbria and mannose-resistant haemagglutination P, M and S fimbriae. P and
M types of fimbriae are associated with blood group antigen and the S type with sialic
acid binding. The genes involved in biosynthesis of fimbria and adhesins present in
UPEC are organized in operons denominated pap and sfa, coding for P and S
fimbrial adhesins (10-12). IrgA homologue adhesin (iha) is an outer membrane
protein (OMP) found mainly in UPEC and others extra-intestinal pathogenic E. coli
being also involved in bacterial adherence (13).
Toxins produced by E. coli may cause inflammatory response of urinary
infections (14). Two toxin types are associated to UPEC. The alfa-haemolysin (hly)
and cytotoxic necrotizating factor 1 (CNF 1) are involved in host cell destruction
necessary to bacteria persistence in urinary tract (3,15). The presence of CNF 1 in E.
coli is associated to reduction in reactive oxygens species release from host cells
and mutation in cnf gene reduce the pathogenicity of UPEC (16). Toxins from
enterotoxigenic E. coli were described in swine urinary E. coli isolates as heat-labile
toxin (LT) and vero toxin (VT). However these toxins were not present in human
isolates (3).
63
The antibiotic therapy is commonly used to control and prevent urinary
infections in sows, but this practice may select resistant bacteria (1,2). The
resistance to antimicrobial drugs may be carried by plasmids, as well as
chromosomal mutations that occur spontaneously (17,18). Multi-drug resistance have
been reported in human and swine E. coli isolated from urinary tract (3,18,19). The
biofilm formation is responsible for persistent of E. coli in urinary infections and for
the resistance to antimicrobial therapy in human (15,20). Bacteria forming biofilm are
more resistant to antimicrobial drugs than in the planktonic free states, like was
determined in other veterinary pathogens, as Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas
hydrophila and Staphylococcus aureus, (21).The purpose of the present study was to
determinate the pathotype, the plasmidial DNA content and the patterns of resistance
to antimicrobial drugs in E. coli isolates from swine females with UTI.
Materials and Methods
Bacterial strains and culture conditions
Eighty two E. coli strains were isolated from sows with urinary infections
according to microbiologic and urinary physic chemical patterns (1). The E. coli were
isolated from urinary vesicle and urine samples were collected from swine breeding
farms in Southern of Brazil, in sterile bags and forward to laboratory at 4
o
C in Stuart
modified medium. The samples were streaked on Blood agar and Mac Conkey agar.
After 48 hours at 37
o
C, one putative E. coli colony was identified by morphology and
biochemical tests according to Quinn et al. (22).
64
Resistance to antimicrobial drugs
The Kirby-Bauer disc diffusion test (23) was used to determine the
resistance to antimicrobial drugs of E. coli isolates. The following drugs were tested:
amoxicillin (10 μg), ampicillin (10 μg), tetracycline (30 μg), norfloxacin (10 μg),
enrofloxacin (5 μg), cefalexin (30μg), neomycin (30 μg) and gentamicin (30 μg).
penicillin (10 μg), lincomycin (2 μg), erythromycin (15 μg), apramycin (15 μg),
josamycin (30 μg) and colistin (10 μg).
Total DNA extraction and PCR
Pure cultures were suspended in sterile ultra pure water, boiled for 5 minutes
and immediately immersed on ice. After centrifugation at 13.000 rpm for 2 minutes,
the DNA was recovered from the supernatant. The E. coli isolates were characterized
by multiplex PCR for fimbrial and toxin genotypification by using the amplification of
follow regions: STa, STb, STx, cnf, hly, LT, F4, F5, F6, F41, F18, Bfp, eae, sfa, pap,
iha and usp, as previously described (3,6, 12,24-27). The PCR methodologies were
performed in 25 μL reactions containing 100 ng of DNA template, primers (30 pmol
each), Taq buffer (10 mM Tris, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl
2
), 200 μM dNTPs, 1 U of
Taq DNA polymerase (Cenbiot-Enzymes/UFRGS, Porto Alegre, RS, Brazil).
Amplification was carried out in 35 cycles, of 45 s at 94
o
C, 1 min at 55
o
C, and 45 s at
72
o
C. One aliquot of 7 μL was submitted to electrophoresis in 1.5% agarose gel
stained with ethidium bromide for 30 min at 100 V. Products were visualized and
photographed under UV illumination. Amplicons identities were confirmed by
sequencing in an automated DNA sequencer MEGABACE 1000 using the Dynamic
ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech).
65
Plasmidial DNA extraction
Plasmidial DNA extraction from E. coli isolates was performed by alkaline
lysis, as previously described (3). The presence of plasmidial DNA was confirmed by
electrophoresis in 0.7% agarose gels for one hour at 50 V. The plasmids were
visualized and photographed under UV illumination.
Statistical analysis
The difference among E. coli isolates resistance patterns was evaluated by Z
test of two proportions with normal approximation. The level of significance of α =
0.05 and the cut off point for Zα5% = 1.96 were adopted.
Results and Discussion
The results of PCR genotypification of E. coli isolates are summarized in figure
1. From eighty two E. coli isolates, 34 (38.63%) harbored one or more virulence
factor revealed by PCR amplification. UPEC were found in 14.63% (12/82), ETEC in
15.85% (13/82) and in 10.97% (9/82) were amplified virulence factors of both, ETEC
and UPEC. Brito et al. (3) described the occurrence of ETEC and UPEC in swine
with UTI. According to Russo and Jonhson (28) the current E. coli pathotype
classification are performed by a combination of virulence traits, and not by
genetically source. However these genes may be horizontally transferred by genetic
elements, like plasmids or lysogenic phage, leading to erroneous classification.
ETEC were reported in swine urinary strains suggesting the ascending intestinal
origin of UTI (3). The same observation was made by Starcic (29) that reports the
isolation of UPEC in dogs with diarrhea.
66
The pathogenesis of urinary tract infections depends of the E. coli ability to
adhere, persist and multiply in the host (2,15). The genes involved in bacteria
adherence detected in our study were pap (10.97%), iha (9.75%), sfa (6.09%), F4
(4.87%), F5 (4.87%), F6 (1.21%) and F41 (1.21%). The pap, iha and sfa elements
are reported as important to adhesion of UPEC (10,13). Pap gene was found in
54.8% of Brazilian UPEC isolates studied by Brito et al. (3), although in our study, the
frequency of these gene was lower (10.97%). According to Brito (30) afa, Bfp and sfa
adhesins were not found in UPEC isolates from Brazil. In our study we found sfa in
6.09% E. coli isolates. The F4 and F5 fimbriae genes were amplified alone or in
association with virulence factors typical of UPEC.
The presence of haemolysis in blood agar was observed in four isolates,
although the hlyA gene was detected by PCR in nine isolates. This difference may be
associated to silent expression or mutation in hly genes in E. coli (31,32). Haemolytic
E. coli isolates are considered highly virulent in human due to their ability to lyses of
host red blood cells (5). According to Schimidt & Karch (31), the haemolysis in blood
agar is not sufficient for E. coli characterization and other techniques, like PCR, are
necessary. Brito et al. (3) reported the presence of 25.8% of haemolytic UPEC
isolates; however Carr & Walton (33) did not find haemolysis in E. coli isolated from
swine with urinary infections. In our study LT, STa and STb toxins genes commonly
found in ETEC were detected, respectively, in 8.53%, 7.31% and 4.87% of E. coli
isolates. LT was previously described in swine UPEC by Brito et al. (3).
Uropathogenic specific protein (USP) has been used to identify UPEC in
human and pets (10,4). The presence of usp gene in dog and cat E. coli isolates
permitted the proposition of the role these animals as an alternative reservoir for
human UTI (6). In contrast, we amplified usp gene in only one E. coli isolated and
67
this may suggest genotypic differences among swine and human urinary E. coli
isolates.
The resistance to antimicrobials drugs was disseminated among UPEC
isolates (Figure 1). Brito et al. (3) report a higher resistance of swine UPEC to
tetracycline and ampicillin. Multi-drug resistance in UTI E. coli isolates is a serious
concern in human health, but in dog and cat is rare and associated always with
recurrent infections (18,34). In swine UPEC 95.12% (78/82) were resistant to four or
more antimicrobial groups (Table 1), that is characteristic of multi-drug resistance or
MDR (18). The more frequent patterns of resistance were to beta lactam, lincomicin,
tetraciclyne, quinolone, macrolide, aminoglycoside and polymixin groups (Table 1).
Plasmids and other genetic elements, like integrons, may be encountered in UPEC
and are associated to coding virulence factors and MDR (2,3,18). In our study
plasmids were found in 39.02% (32/82) of E. coli isolates.
Some E. coli isolates maintain virulence factors of both ETEC and UPEC
simultaneously, suggesting the elevated genetic relationship among urinary and
intestinal strains. Multi-drug resistance was widely found in swine urinary isolates.
This information is important to E. coli diseases understanding, as well as to suggest
antimicrobial therapy choices.
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73
Table 1. Resistance patterns of urinary E. coli isolates from swine in Southern Brazil.
Resistance pattern
Number of isolates
B-lac+linc 3
B-lac+linc+mac 1
B-lac+tet+quin+mac 1
B-lac+linc+mac+pol 1
B-lac+quin+linc+mac 1
B-lac+tet+linc+mac 11
B-lac+tet+linc+mac+amino 2
B-lac+tet+linc+mac+clo 4
B-lac+tet+quin+linc+mac 5
B-lac+tet+linc+mac+pol+clo 1
B-lac+tet+quin+mac+amino+clo 1
B-lac+tet+linc+mac+amino+clo 2
B-lac+tet+linc+mac+amino+pol 2
B-lac+tet+quin+linc+mac+amino 2
B-lac+tet+quin+linc+mac+pol 3
B-lac+tet+quin+linc+mac+clo 6
B-lac+tet+linc+mac+amino+pol+clo 1
B-lac+tet+quin+linc+mac+pol+clo 1
B-lac+tet+quin+linc+mac+amino+pol 5
B-lac+tet+quin+linc+mac+amino+clo 20
B-lac+tet+quin+linc+mac+amino+pol+clo 10
B-lac: beta lactam, tet: tetracycline, quin: quinolone, linc: Lincomycin, mac:
macrolyde, amino: aminoglycoside, pol: polymixin, clo: cloramphenicol (35).
74
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pen
Li
n
E
r
i
Tet
A
mo
Jos
Amp
Nor
E
no
Gen
N
eo
Apr
Col
C
e
f
Percentual of resistance
Figure 1. Antimicrobial drugs resistance patterns of urinary E.
coli isolates from swine in Southern of Brazil. Penicillin (Pen),
Lincomycin (Lin), Erythromycin (Eri), Tetracycline (Tet),
Amoxicillin (Amo), Josamycin (Jos), Ampicillin (Amp),
Norfloxacin (Nor), Enrofloxacin (Eno), Gentamicin (Gen),
Neomycin (Neo), Apramycin (Apr), Colistin (Col) and Cefalexin
(Cef).
75
Figure 2. PCR amplification of UPEC genes.
Lane 1 (from the top to the bottom): sample
presenting usp (1000 bp), iha (827 bp), sfa
(410 bp) and pap (328 bp), Lane 2 (from the
top to the bottom): sample presenting hly (1117
bp), iha (827 bp) and pap (328 bp), Lane 3:
negative control and Lane 4: 400bp DNA
Ladder.
1 2 3 4
2040 bp
1632 bp
1193 bp
841 bp
402 bp
76
Capítulo 5
Discussão
77
DISCUSSÃO
A suinocultura brasileira caracteriza-se pela grande intensificação na
produção, a qual tem garantido ao Brasil lugar de destaque na suinocultura mundial.
Esta intensificação tem predisposto os animais a diferentes enfermidades,
principalmente pelas condições de manejo que trabalham com a alta lotação animal,
induzindo a um acúmulo de dejetos e gases tóxicos e redução na imunidade dos
suínos. A infecção por Escherichia coli está entre as principais preocupações para
os suinocultores no mundo. Estes microrganismos possuem uma ampla distribuição
nos diferentes hospedeiros e no meio ambiente, bem como apresentam multi-
resistência aos antimicrobianos (PARVEEN et al., 2006, PATERSON et al., 2006).
Diversas manifestações são observadas nos suínos enfermos, entre elas diarréias
(colibacilose neonatal e diarréia pós-desmame), sinais nervosos (doença do edema),
cistite (infecção urinária) e outras infecções extra-intestinais (GYLES &
FAIRBROTHER, 2004). Nas infecções urinárias, os prejuízos podem acarretar
perdas de 160 dólares por porca enferma antes e após o parto, devido,
principalmente a gastos com medicamentos e redução no número de leitões e
mortalidade de leitões (SOBESTIANSY et al., 1999).
Visando uma maior produtividade e a prevenção de doenças bacterianas nos
plantéis suínos, drogas antimicrobianas vêm sendo empregadas. O uso
indiscriminado destes fármacos pode acarretar graves problemas, que vão desde a
contaminação dos produtos de origem animal por antimicrobianos até a seleção de
bactérias resistentes, que podem facilmente chegar ao ser humano através da cadeia
produtiva da carne suína e seus derivados (WALMANN, 2006, WHITE et al., 2006).
Esta contaminação pode ocorrer, também, através de rios ou peixes contaminados
78
por dejetos dos animais contendo bactérias resistentes (PARVEEN et al., 2006). O
entendimento de todos os aspectos relacionados à resistência bacteriana, sejam
estes ecológicos, genéticos e bioquímicos são fundamentais para a busca de
alternativas que objetivem reduzir o problema (WHITE et al., 2006). Desta forma
somente com uma visão interdisciplinar será possível minimizar os riscos associados
à antibioticoterapia convencional (WALMMAN, 2006).
No presente estudo a resistência aos antimicrobianos foi observada em todos
os isolados, tanto de amostras clínicas (entéricas e urinárias) como de fezes de
suínos saudáveis e do ambiente de criação, o que demonstra uma grande
disseminação da resistência ao longo dos anos em diferentes propriedades nos
estados do sul do Brasil. A resistência simultânea também foi observada em nosso
estudo e pode ser visualizada na Tabela 1.
Em nosso estudo, 95,12% (78/82) isolados de E. coli de origem urinária e
63,75% (51/80) isolados de origem entérica e ambiental apresentaram resistência a
mais de três grupos de drogas antimicrobianas testadas. Este critério é considerado
fundamental para o estabelecimento da resistência múltipla (RIJAVEK et al., 2006).
A multi-resistência pode ser mediada e transmitida por plasmídeos, os quais foram
detectados em nossos experimentos, tanto em isolados de E. coli entéricos, de meio
ambiente e urinários (Tabela 1). Os plasmídeos são considerados os principais
elementos genéticos móveis de transmissão de resistência nas enterobactérias
(SHERLEY et al., 2004, PATERSON et al., 2006, RIJAVEK et al., 2006).
Tabela 1. Isolados de E. coli de origem urinária, entérica e ambiental,
demonstrando resistência simultânea aos grupos de drogas antimicrobianas e
presença de plasmídeos.
Resistência múltipla
E. coli urinária E. coli intestinal e meio ambiente
79
Número de
grupos de
antimicrobianos*
presença
de
plasmídeo
ausência
de
plasmídeo
Total presença
de
plasmídeo
ausência
de
plasmídeo
Total
1 0 0 0 3 0 3
2 0 2 2 11 0 11
3 1 0 1 14 0 14
4 5 9 14 12 4 16
5 6 5 11 20 4 24
6 8 9 17 9 1 10
7 9 18 27 2 0 2
8 3 7 10 0 0 0
Total 32 50
82
71 9
80
*Grupos de antimicrobianos testados segundo BARCELLOS & SOBESTIANSKY
(1998): beta lactâmicos: Penicilina, ampicilina, cefalexina, amoxacilina; Quinolonas:
Norfloxacina, enrofloxacina; Tetraciclina; Lincomicina; Aminoglicosídeos: Gentamicina,
neomicina, apramicina, amicacina; Sulfazotrim; Trimetoprim; Macrolídeos: Josamicina,
eritromicina; Polimixina: Colistina; Cloranfenicol: Cloranfenicol e florfenicol.
As drogas as quais as bactérias apresentaram maior resistência foram a
tetraciclina e sulfazotrim para isolados obtidos de leitões enfermos, leitões sadios e
seu ambiente. Nos isolados obtidos de fêmeas com infecção urinária a penicilina,
lincomicina, eritromicina e tetraciclina demonstraram alta resistência (P<0,05). Estes
compostos antimicrobianos possuem grande uso na suinocultura brasileira
(BARCELOS & SOBESTIANSKI, 1998). O uso das drogas antimicrobianas de modo
indiscriminado tem sido relatado por diversos estudos como uma forte pressão de
seleção, que está associada a resistência tanto de bactérias patogênicas, como das
comensais (DUNLOP et al., 1998; PARVEEN et al., 2006; WHITE et al., 2006). Nos
isolados analisados neste trabalho, a resistência às drogas antimicrobianas foi maior
(estatisticamente significante, P<0,05) nos isolados de E. coli obtidos de fêmeas com
infecção urinária. O isolamento de bactérias resistentes às drogas antimicrobianas
de casos de infecções urinárias recorrentes tem sido um problema tanto para
medicina humana, bem como para a veterinária (HAGMAN & GREKO, 2005,
80
ZHANEL, et al., 2006). Um dos fatores associados ao difícil tratamento de infecções
ocasionadas por E. coli no trato urinário é a formação de biofilmes (SCHREMBI et
al., 2003, SOTO et al., 2006). A organização das células nos biofilmes se dá pela
formação de uma matriz de biopolímeros que envolve as bactérias e as une a uma
determinada superfície. Este arranjo é associada à troca horizontal de material
genético e resistência, tanto as drogas antimicrobianas, como aos radicais livres
produzidos pelos neutrófilos (SOTO et al., 2006).
Os dados acima apresentados reforçam a idéia de que os profissionais de
medicina veterinária e outros relacionados à área de produção animal, devem aplicar
seus conhecimentos com a finalidade de estabelecer uma antibioticoterapia racional
e busca de alternativas para minimizar o uso destes fármacos na produção animal.
Entre estas alternativas encontram-se os probióticos. Probióticos são descritos como
organismos vivos que quando administrados de modo adequado ajudam a manter a
saúde do hospedeiro (De ANGELIS et al., 2006). Estes microrganismos influenciam
de modo positivo a colonização do intestino, bem como o estímulo do sistema
imunológico dos animais, especificamente o tecido linfóide associado ao intestino
(GALT). Estas bactérias também são fundamentais à tolerância aos antígenos de
origem alimentar (MOREAU & CORTHIER, 1998; COX et al., 2002). A
suplementação de leitões e porcas com Enterococcus faecium apresentou um efeito
positivo sobre a colonização prévia e desafio por E. coli enteropatogênica
(SCHAREK et al., 2005). Este efeito também foi observado para Salmonella spp.,
empregando Lactobacillus spp. em suínos e aves (TSAI et al., 2005, DE ANGELIS et
al., 2006).
A acidificação do trato digestório e urinário apresenta efeito bactericida sobre
diversos patógenos. Além disto, estas mesmas condições de pH no intestino
81
permitem a proliferação de Lactobacillus spp., que bloqueiam possíveis receptores
para colonização e proliferação de E. coli e produzem substâncias que afetam de
modo negativo a maior parte das bactérias gram negativas (TSILOYIANNIS et al.,
2001). Os principais acidificantes utilizados na suinocultura brasileira são o cloreto
de amônio e o ácido cítrico. Estes compostos atuam reduzindo temporariamente o
pH da urina, bem como aumentando a ingestão de água pelas fêmeas, que estão
diretamente relacionados com as reduções dos quadros infecciosos
(SOBESTIANSKY et al., 1999). O uso de fitoterápicos em suínos também tem sido
descrito, tendo apresentado efeitos benéficos, como a redução nos casos de
colibacilose neonatal e diarréia pós-demasme, assim como a redução na resistência
dos isolados de E. coli (DOCIC & BILKEI, 2003).
Em nosso estudo os principais fatores de patogenicidade detectados por PCR
nos isolados de E. coli obtidos de casos clínicos foram a presença dos genes para
STb (26), LT (23), F18 (17), F4 (12), STa (12), F5 (9), F41 (7) e STx (2), os quais
podem ser observados em diversas combinações (Tabela 2). Esta heterogeneidade
no perfil de fímbrias e toxinas ressalta a importância de vacinas autógena, ou que
contenham na sua composição fímbrias e toxinas próprias da propriedade ou da
região.
Tabela 2. Perfil de fímbrias e toxinas amplificadas por
PCR nos isolados de E. coli provenientes de suínos
com diarréia.
Padrão Número de Isolados
F4 1
F5 3
STa 1
STb 1
LT 3
82
F4, STa 1
F5, LT 1
F5, STa 3
F18, LT 1
F18 STx 1
F4, F18 1
F41, STb 3
STb, LT 6
F4, LT, STb 1
F4, F18, LT 3
F4, STb, LT 1
F5, STa, STb 1
F18, LT, STb 4
F18, STa, STb 1
F41, LT, STb 1
F4, F18, STa, STb 2
F18, F41, STa, STb 1
F4, F18, LT, STb, STa 1
F18, F41, STa, STb, STx 1
F4, F18, F41, STa, STb, LT 1
As vacinas são muito utilizadas para controle das infecções nos seres
humanos e nos animais (TIZARD, 2000) e bacterinas contendo E. coli inativadas por
formol são amplamente utilizada para prevenir a infecção nos leitões. E. coli
enterotoxigênicas são caracterizadas pela presença de fímbrias e toxinas, as quais
podem ser adquiridas pelos plasmídeos (CHU et al., 2005). A colonização bacteriana
é produzida por fímbrias e a determinação dos principais mecanismos de ação
destes elementos é fundamental ao esclarecimento das interações entre as ETEC e
seus hospedeiros (GUERRANT et al., 1999). As fímbrias F4 e F18 são muito
importantes na patogenia da enfermidades nos suínos. Enquanto a F4 e a F18 são
associadas às ETEC, a F18 é associada também as VETEC (VERDONCK et al.,
2002). As fímbrias são filamentos proteináceos, que são expressas na superfície da
bactéria e interagem com receptores nas células do intestino do hospedeiro (VAN
DER STEDE et al., 2002). A resistência à infecção por E. coli é conferida pela
ausência de receptores, a qual é determinada por um gene autossômico recessivo
83
nos leitões (VERDONCK et al., 2002). Para a fímbria F4, a subunidade FaeG é
descrita como a porção da adesina envolvida na aderência bacteriana (VERDONCK
et al., 2004). As fímbrias são interessantes para a contrução de vacinas, pois além
de se localizarem em alta quantidade na superfície da bactéria, estas possuem uma
característica polimérica que é altamente imunogênica (VERDONCK et al., 2005).
Nossos dados concordam com os da literatura que sugere que as fímbrias do
padrão STb and LT seriam encontradas com maior freqüência em ETEC. Segundo
RIISING et al. (2005) a incorporação de toxinas, especificamente a LT, em vacinas
contendo misturas de fímbrias (F4, F5 e F6) purificadas melhorou os níveis de
proteção em suínos desafiados.
A determinação do potencial de virulência dos isolados de E. coli é muito
importante para a seleção de cepas vacinais, sendo um critério muito utilizado para
determinação do potencial patogênico nos isolados de E. coli a presença de
hemólise (BRITO et al., 2004). Contudo isolados não hemolíticos também possuem
potencial patogênico. SCHIERACK et al. (2006) ao estudarem o potencial
enterotoxigênico de E. coli isoladas de suínos saudáveis verificaram a ausência de
correlação entre a presença de hemólise e dos fatores de virulência. Em nosso
estudo 51 (79%) isolados de E. coli entérica e 10 (12,5%) isolados de origem
urinária foram hemolíticos ou apresentaram o gene da alfa hemolinisa (hlyA), o que
sugere a maior associação entre hemólise e virulência nos isolados de origem
intestinal (p<0,05).
E. coli pode ser agrupada em quatro grupos filogenéticos principais: grupos A,
B1, B2 e D. A maior parte dos isolados comensais pertencem ao grupo A, enquanto
que as E. coli extra-intestinais aos grupos B2 e D (CLERMONT et al., 2000). O
grupo B2 é o que apresenta maior transferência via elementos genéticos móveis
84
(JOHNSON et al., 2001; SKURNIK et al., 2005). Em nosso estudo, vários isolados
de E. coli foram negativos à pesquisa de fatores de virulência analisados por PCR,
sendo 19 isolados de suínos com diarréias, 6 de suínos saudáveis, 9 de amostras
obtidas de meio ambiente e 46 isolados de fêmeas com infecção urinária. Contudo,
esses isolados foram obtidos de animais enfermos, portanto a caracterização do
potencial real de patogenicidade dos isolados torna-se necessária em estudos
futuros. Este auxiliará na escolha de futuras cepas vacinais.
Além de conter na sua composição fímbrias e toxinas próprias das cepas
patogênicas de E. coli, uma vacina para colibacilose deve induzir mecanismos de
proteção de mucosas. A imunidade de mucosas tem início pelo estímulo do tecido
linfóide associado ao intestino, localizado na lâmina própria. O estímulo
particularmente das placas de Peyer, leva a diferenciação de plasmócitos e
produção de IgA (COX et al., 2002; VERDONCK et al., 2005). As vacinas contendo
bactéria ou proteínas purificadas são utilizadas na vacinação de fêmeas prenhas, as
quais transferiram os anticorpos produzidos aos leitões através do colostro (TIZARD,
2000). A IgA deve ser considerada o principal indicador de uma imunidade de
mucosas apropriada (SARRAZIN & BERTSHINGER, 1997). Níveis protetores de
IgA podem ser obtidos via imunização parenteral de porcas, contudo para tal são
importantes a dose, número de aplicações e local da aplicação (VAN DER STEDE et
al., 2002). Esta forma de vacinação é eficaz na redução dos índices de colibacilose
neonatal, principalmente em fêmeas primíparas provenientes de rebanhos sem
problemas com a infecção por E. coli que comprovadamente possuem pouco o
nenhum título de anticorpos contra os principais fatores de virulência deste patógeno
(RIISING et al., 2005).
85
Embora a vacinação das porcas, com conseguinte passagem de
imunoglobulinas no colostro seja eficaz na profilaxia da colibacilose neonatal, na
diarréia pós-desmame estes anticorpos são ineficientes. Esta falha na resposta
imunológica se deve a diminuição na resposta passiva nos animais após o
desmame, o que torna necessária uma estimulação no mecanismo de proteção de
mucosas (VERDONCK et al., 2002; LIANG et al., 2006). Nos leitões, o uso de
vacinação parenteral, além de produzir uma proteção parcial, requere um manejo
diferenciado, que produz estresse e gera custos adicionais (LIANG et al., 2006).
Para produção de altos níveis de IgA, estratégias de vacinação oral são muito
importantes, uma vez que a imunização parenteral não produz níveis adequados
desta imunoglobulina no intestino (VERDONCK et al., 2005). Antígenos solúveis
administrados por via oral podem induzir a tolerância oral, contudo o uso de
antígenos particulados ou replicantes induzem imunidade ativa (COX et al., 2002;
VERDONCK et al., 2005). A dose do antígeno também é muito importante no
sentido do padrão de resposta imunológica obtida. O uso de altas doses de proteína
solúvel estimulam uma diferenciação de Th-1, o qual está relacionado a resposta
celular, enquanto que baixas doses induzem a diferenciação de Th-2, que estimula a
multiplicação de plasmócitos produtores de IgA (VAN DER STEDE et al., 2002). No
desenvolvimento de vacinas orais para os suínos deve-se ter em conta que a ação
enzimática ao longo da passagem da vacina pelo trato digestório induz significativas
variações antigênicas (SNOECK et al., 2004). Os mesmos autores comprovaram
que a imunização oral induz uma menor proteção, quando comparada a imunização
direta no lúmen do intestino delgado. Este problema tem sido resolvido pela
vacinação dos leitões por pellets, que liberam os antígenos somente no jejuno
(SNOECK et al. 2004).
86
Outras estratégias de vacinação também têm sido estudadas para melhoria
nos níveis de proteção dos leitões tanto nas primeiras horas de vida, como no
período pós-desmame. Estes envolvem estratégia de vacinação oral, contendo
antígenos fímbriais recombinantes administrados oralmente e protegidos da
degradação no trato digestório (COX et al., 2002; VERDONCK et al., 2002;
VERDONCK et al., 2005). LIANG et al. (2006) demonstrou que antígenos de F4
produzidos em plantas transgênicas apresentaram boas propriedades imunológicas,
quando administradas oralmente. Tendo como objetivo melhorar o desafio oral de
antígenos de E. coli administrados por via oral adesinas de F5 foram expressas em
Lactobacillus acidophilus dando origem a uma probiovacina (CHU et al., 2005).
Vacinas de DNA também têm sido estudadas empregando, por exemplo, o gene
faeC da fímbria F4 (SIMIONATTO et al., 2005).
Dada a importância da infecção por E. coli no rebanho suíno brasileiro, os
esforços técnicos no sentido de controle e profilaxia da enfermidade e o amplo uso
de antimicrobianos para prevenção da enfermidade o presente estudo chega as
seguintes conclusões:
- ETEC foram detectadas tanto em isolados entéricos (42 isolados), como em
urinários(13 isolados);
- STEC foi identificada em dois isolados entéricos;
- UPEC foram detectados em 12 dos isolados de E. coli obtidos de fêmeas
com infecção urinária, sendo que em nove isolados foram detectados fatores
de virulência de ETEC e UPEC simultaneamente;
- A maior parte dos isolados de E. coli foram resistentes a mais de três
antimicrobianos testados, independente de sua fonte de isolamento;
87
- A resistência múltipla aos antimicrobianos foi verificada tanto em isolados de
E. coli de origem urinária (95,12%), como entérica e ambiental (63,75%);
- Plasmídeos foram encontrados na maioria dos isolados E. coli obtidos de
suínos diarréicos (55/64-85,93%), das fezes de suínos saudáveis (6/7-
85,71%) e do ambiente de criação (9/9-100%), sendo estes detectados com
menor freqüência nos isolados de origem urinária (32/82-40%).
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100
CURRICULUM VITAE
Maio/2007
DADOS PESSOAIS
Nome: Mateus Matiuzzi da Costa
Nome em citações bibliográficas: COSTA, M. M.
Sexo: Masculino
Filiação: Olmiro Beltrame da Costa e
Olinda Matiuzzi da Costa
Nascimento: 05/04/1976 - Santa Maria/RS - Brasil
Carteira de Identidade: 6049494948 SSP - RS - 07/08/1992
CPF: 803.979.560-53
Endereço residencial: Rua Jatobá, 51
Bairro Jatobá - Petrolina
56332-210, PE - Brasil
Telefone: (87) 3861.8571
Endereço profissional: Universidade Federal do Vale do São Francisco
Colegiado de Zootecnia, Campus da FEX
Rua da Simpatia, 179
Centro - Petrolina
56304-440, PE - Brasil
Telefone: (87) 3986.3800 Fax: (87) 3986.3804
URL da home page: http://www.univasf.edu.br
Endereço eletrônico: e-mail para contato: [email protected]
e-mail alternativo: [email protected]
FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO
2001 - 2002 Mestrado em Biologia Celular e Molecular.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre,
Brasil
Título: Aplicação do gene apxIVA para o diagnóstico da
pleuropneumonia suína
Ano de obtenção: 2003
Orientadora: Irene Silveira Schrank
Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior
Palavras-chave: pleuropneumonia, gene apxIVA, 16SrDNA, suínos
Áreas do conhecimento: Microbiologia Aplicada, Doenças Infecciosas
de Animais
Setores de atividade: Produção animal, inclusive serviços veterinários
1995 - 2000 Graduação em Medicina Veterinária.
Universidade Federal de Santa Maria, UFSM, Santa Maria, Brasil
101
ATUAÇÃO PROFISSIONAL
1 Fundação Universidade Federal do Vale do São Francisco - UNIVASF
Vínculo institucional
2006 - Vínculo: Servidor público, Enquadramento funcional: Professor
Microbiologia e Imunologia, Regime: Dedicação Exclusiva
Atividades
08/2006 - Atual Projetos de pesquisa, Colegiado de Zootecnia
Participação em projetos:
1. Diagnóstico e caracterização dos agentes etiológicos da mastite em
ovinos e caprinos no Município de Petrolina e região
2. Efeito de extratos fitoterápicos sobre agentes bacterianos
08/2006 - Atual Graduação, Zootecnia
Disciplinas Ministradas:
1. Doenças Infecto Contagiosas
2. Imunologia
3. Microbiologia
2 Pontificia Universidade Católica do Paraná - PUCPR
Vínculo institucional
2004 - 2004 Vínculo: Celetista, Enquadramento funcional: Professor de
Microbiologia, Carga horária: 18, Regime: Parcial
Atividades
03/2004 - 12/2004 Projetos de pesquisa, Curso de Medicina Veterinária
Participação em projetos:
1. Efeito do probiótico sacharomyces cerevisae sobre a flora intestinal de
tilápia do nilo.
03/2004 - 12/2004 Graduação, Medicina Veterinária
Disciplinas Ministradas:
1. Microbiologia
3 Universidade do Oeste de Santa Catarina - UNOESC
Vínculo institucional
2003 - 2006 Vínculo: Celetista, Enquadramento funcional: Professor de
Microbiologia e Medicina Veterinária Preventiva, Carga horária:
20, Regime: Parcial
Atividades
2003 - 06/2006 Projetos de pesquisa, Curso de Medicina
Veterinária
Participação em projetos:
102
1. Flora microbiana das carpas (C. carpio)
2. Agentes etiológicos da mastite ovina
3. Agentes etiológicos da mastite bovina no Município de Xanxerê e região
4. Avaliação de anticorpos contra o vírus da leucose enzoótica bovina no
Município de Xanxerê e região
5. Caracterização microbiológica da água do Rio Ditinho
6. Determinação do conteúdo de plasmídeos em isolados clínicos e
ambientais de E. coli
2003 - 06/2006 Graduação, Medicina Veterinária, Engenharia
Florestal e Zootecnia
Disciplinas Ministradas:
1. Biologia Celular e Molecular
2. Administração e Planejamento em Saúde Pública
3. Epidemiologia e Saúde Pública
4. Doenças Infecto Contagiosas
5. Imunologia
6. Microbiologia
4 Universidade Federal de Santa Maria - UFSM
Vínculo institucional
1995 - Vínculo: colaborador, Enquadramento funcional: Colaborador em
projetos de pesquisa, Regime: Parcial
Atividades
2000 - Atual Projetos de pesquisa, DMVP
Participação em projetos:
1. Caracterização isolados classificados bioquimicamente como Rhodococcus
equi e obtidos de búfalos e javalis
2. PCR multiplex para caracterização da família dos genes vap em R. equi
3. Padronização e validação de métodos para a detecção de organismos
genéticamente modificados (OGMs) em alimentos
4. Laboratório de expressão de proteínas e antígenos na Região Central do
Estado
5. Reação em cadeia da polimerase múltipla para caracterização de isolados
clínicos e ambientais de R. equi do Brasil
6. Caracterização antigênica de proteínas de superfície (S-Layer) de
Campylobacter fetus isoladas de bovinos
7. Caracterização molecular e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de
isolados de Escherichia coli obtidas em criatórios suínos da Região Sul do
Brasil
8. Caracterização Molecular de Isolados de Streptococcus equi
9. Clonagem e expressão do gene vapA de R. equi
10. Clonagem e expressão do gene da proteína de superfície (SAP)
11. Padronização da técnica de PCR para diangóstico da campilobacteriose
genital bovina
2000 - Atual Pesquisa e Desenvolvimento, DMVP
Linhas de Pesquisa:
103
1. patogenicidade de patógenos de interesse veterinário
5 Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS
Vínculo institucional
2003 - Vínculo: Doutorando, Enquadramento funcional: Aluno do
PPGBCM, Carga horária: 20, Regime: Parcial
2001 - 2002 Vínculo: Mestrado, Enquadramento funcional: Aluno do
PPGBCM, Carga horária: 20, Regime: Parcial
Atividades
03/2001 - Atual Projetos de pesquisa, Centro de Biotecnologia
Participação em projetos:
1. Genes envolvidos na patogenicidade de Actinobacillus pleuropneumoniae
LINHAS DE PESQUISA
1 Patogenicidade de patógenos de interesse veterinário
PROJETOS
Efeito de extratos fitoterápicos sobre agentes bacterianos
Situação: Desativado; Natureza: Outra
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Patrícia
Alves Batista; Maria da Conceição Aquino de Sá; Carla Samantha
Rodrigues Silva
2006 - Atual Diagnóstico e caracterização dos agentes etiológicos da mastite em
ovinos e caprinos no Município de Petrolina e região
Descrição: A produção de ovinos e caprinos é uma atividade
econômica de importância ao Município de Petrolina e região. A mastite
em ovinos e caprinos está associada a sérios prejuízos nos criatórios
ovinos, sejam de aptidão leiteira ou de corte. A mastite nestes animais
está associada a redução brusca na produção de leite, a qual pode
ocasionar a morte dos cordeiros. Para o diagnóstico da mastite, vários
testes podem ser conduzidos, como o teste de CMT (realizado a
campo) e WS e isolamento e cultivo, realizados no laboratório. O
presente estudo tem por objetivo a caracterização dos principais
agentes bacterianos envolvidos com a mastite em ovinos e caprinos,
bem como determinar a sua sensibilidade aos antimicrobianos. Para
tanto, leite será colhido em diversas propriedades do Município de
Petrolina e região. As amostras serão remetidas ao laboratório, onde
serão realizados os testes de WS para determinar o grau de inflamação
da glândula mamária, bem como o isolamento bacteriano. Após a
identificação por testes bioquímicos, as bactérias serão submetidas ao
teste de sensibilidade aos antimicrobianos Kirb Bauer modificado.
104
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (3);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Patrícia Alves
Batista; Maria da Conceição Aquino de Sá; Carla Samantha Rodrigues
Silva
2005 - Atual PCR multiplex para caracterização da família dos genes vap em
R. equi
Descrição: As vap (virulence associated proteins) são marcadores da
virulência de R. equi para os potros. Recentemente, vários genes
codificando uma família gência para as proteíans Vap foram
encontradas. Entretanto, o papel na patogenese da infecção, bem
como a distribuição destes genes nos isolados de R. equi ainda não
são claros. O presente estudo tem por objetivo caracterizar a presença
dos genes da família vap através da técnica de PCR multiplex. Para tal,
isolados clínicos e ambientais de R. equi obtidos de diferentes origens,
como eqüinos e seu ambiente, bovinos, aves, suídeos, bulbalinos e
seres humanos serão analisados. Com este estudo pretende-se auxiliar
na compreensão da participação das proteínas vap nas enfermidades
ocasionadas por R. equi.
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (2); Mestrado acadêmico (1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Agueda Castagna Vargas
(Responsável); Cristina Costa Krewer; Guilherme Drescher
2005 - 2006 Agentes etiológicos da mastite ovina
Descrição: A mastite em ovinos está associada a sérios prejuízos nos
criatórios ovinos, sejam de aptidão leiteira ou de corte. A mastite nestes
animais está associada a redução brusca na produção de leite, a qual
pode ocasionar a morte dos cordeiros. Para o diagnóstico da mastite,
vários testes podem ser conduzidos, como o teste de CMT (realizado a
campo) e WS e isolamento e cultivo, realizados no laboratório. O
presente estudo tem por objetivo a caracterização dos principais
agentes bacterianos envolvidos com a mastite em ovinos, bem como
determinar a sua sensibilidade aos antimicrobianos. Para tanto, leite
será colhido em diversas propriedades do estado de SC e RS. As
amostras serão remetidas ao laboratório, onde serão realizados os
testes de WS para determinar o grau de inflamação da glândula
mamária, bem como o isolamento bacteriano. Após a identificação por
testes bioquímicos, as bactérias serão submetidas ao teste de
sensibilidade aos antimicrobianos Kirb Bauer modificado.
Situação: Concluído; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (2);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Guilherme
Drescher; Samara Paula Mattiello; Marlon Nadal Maciel
2004 - 2006 Caracterização microbiológica da água do Rio Ditinho
Descrição: A água é um dos principais alimentos para os seres
humanos e para os animais. A criação de suínos é responsável por
graves impactos ambientais, especialmente quando os dejetos não são
105
tratados de forma adequada. O presente estudo tem por objetivo
caracterizar a qualidade microbiológica da água do Rio Ditinho em SC,
bem como verificar a ocorrência de resistência aos antimicrobianos em
bactérias isoladas da água e do sedimento do rio. Para tal, amostras de
água serão colhidas e o número de coliformes totais e fecais
determinado pela técnica do NMP. Bactérias serão isoladas da água e
do sedimento do rio, sendo, após, identificadas e submetidas ao teste
de sensibilidade aos antimicrobianos Kirb Bauer modificado.
Situação: Concluído; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (2);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Lilian Kolling;
Gabriela Salami; Vlademir Martarello; Gracielli Barbieri
2004 - Atual Avaliação de anticorpos contra o vírus da leucose enzoótica bovina no
Município de Xanxerê e região
Descrição: A leucose enzoótica bovina (LEB) é provocada por um
retrovírus, sendo associada a inúmeras perdas nos rebanhos bovinos
leiteiros do mundo. As perdas decorrem tanto do desenvolvimento de
tumorações nos animais, como pela imudepressão associada com
infecções secundárias. As últimas ocasionam os principais prejuízos
ligados a enfermidade e muitas vezes não são percebidas pelo
produtor. Nos Estados do PR e RS, vários estudos foram conduzidos
no intuito de determinar a prevalência de LEB. Contudo, no Estado de
SC estes não foram conduzidos. O objetivo do presente estudo é
determinar a prevalência de anticorpos contra a leucose enzoótica
bovina em propriedades do Município de Xanxerê, SC. Para tal, soro
de bovinos leiteiros serão colhidos e submetidos ao teste de
imunodifusão em gel de agar (IDGA).
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (2);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Cristina Costa
Krewer; Guilherme Drescher; Samara Paula Mattiello
2004 - 2005 Efeito do probiótico sacharomyces cerevisae sobre a flora intestinal de
tilápia do nilo
Descrição: A tilápia do nilo (O. niloticus) é uma das espécies de peixe
de maior cultivo no mundo. No Brasil, a região oeste do Paraná possui
uma grande importância à piscicultura brasileira. Tendo em vista a
melhoria da produtividade, os peixes passaram a ser criados de forma
intensiva, o que favorece o estresse. Neste momento, os animais se
tornam susceptíveis à infecções, especialmente as bacterianas. O S.
cerevisae vem sendo amplamente utilizado como probiótico para
reduzir estas infecções em diversas espécies animais. Nos peixes,
ainda são poucos os estudos a respeitos das interações destes
microrganismo com a microbiota normal e patogênica. Em nosso
estudo, caracterizaremos esta interação, bem como determinaremos a
microbiota de tilápias. Para tanto, amostras do intestino delgado de
alevinos alimentados com S. cerevisae como probiótico serão pesados
e submetidos a contagem de bactérias totais, de coliformes totais e de
S. cerevisae.
106
Situação: Concluído; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (3);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Marlise
Terezinha Mauerwerk; Milton César Moura; Fabio Meurer; A. Freccia;
A.F. Doblinski
2004 - Atual Padronização e validação de métodos para a detecção de organismos
geneticamente modificados (OGMs) em alimentos
Descrição: O mercado da soja é o setor mais importante da pauta de
exportações do agronegócio brasileiro. Atualmente, a comercialização
de sementes transgênicas concentra-se, essencialmente, em três
culturas: soja, milho e algodão. Nos dias atuais, o cultivo e o comércio
de organismos geneticamente modificados (OGM's) vêm assumindo
um importante papel econômico e social e está em franca ascensão.
Com isso, existe a polêmica da liberação ou não desses para o
consumo humano e/ou animal. Muitas empresas estão preocupadas
em informar aos consumidores que seus produtos não contêm
transgênicos, já que estes ainda não são bem aceitos por uma grande
parcela da sociedade. Ressalta-se a importância da existência de
instituições capazes de detectar a presença de OGMs e quantificá-los
nos alimentos de consumo. Prevendo esta demanda, o LABAC
(Laboratório de Bacteriologia do CCR/UFSM), junto ao Grupo de
Soluções Tecnológicas, está desenvolvendo metodologias para
determinar a presença e quantificar os resíduos de transgênicos em
amostras de DNA extraídas de grãos e de produtos derivados, com
base na técnica de amplificação de fragmentos de DNA denominada
reação em cadeia da polimerase (PCR, de polymerase chain reaction).
Para a detecção de amostras transgênicas, será utilizado a Região
promotora 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). Serão
testados diferentes protocolos para a preparação e o isolamento do
DNA das amostras a serem avaliadas, com posterior análise do
conteúdo de OGM's nas amostras e padronização da técnica de PCR
em tempo real (Real-time PCR).
Situação: Em Andamento; Natureza: Extensão
Alunos envolvidos: Graduação (2);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Cristina Costa Krewer; Agueda
Castagna de Vargas (Responsável)
2004 - Atual Caracterização isolados classificados bioquimicamente como R. equi e
obtidos de búfalos e javalis
Descrição: O R. equi é um cocobacilo gram positivo responsável por
infecções no ser humano e nos animais. Bactérias classificadas através
de testes bioquímicos padrão para R. equi foram obtidas de casos de
mastite e pneumonia em búfalos e javalis. Estes isolados serão
submetidos a testes moleculares confirmatórios, como PCR para
amplificação de rDNA 16S e sequenciamento de DNA utilizando
primers universais. Este estudo propiciará um melhor entendimento da
patogenicidade de R. equi nestes animais, bem como a discussão de
métodos alternativos e de maior precisão para identificação desta
espécie.
107
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (3); Mestrado acadêmico (1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Cristina Costa Krewer; Agueda
Castagna de Vargas (Responsável); Lilian Kolling; Guilherme Drescher
Número de produções C,T & A: 1/
2004 - Atual Flora microbiana das carpas (C. carpio)
Descrição: As carpas (C. carpio) são peixes de importância econômica
à piscicultura mundial. As bactérias são importantes agentes
patogênciso nos peixes e estão associadas a diversos prejuízos pelo
gasto com técnicos e medicamentos, redução na produtividade e
mortalidade dos animais. O presente estudo objetiva determinar a flora
microbiana com potencial patogênico em C. carpio, bem como
determinar a sua sensibilidade aos antimicrobianos. No estudo,
amostras foram colhidas de diferentes órgãos nos animais, pele,
intestino, estômago, brânquias e rins. Estas foram, então, semeadas
em AS e submetidas a identificação por testes bioquímicos e tintoriais.
Em seguida, o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi
determinado pelo teste de Kirb Bauer modificado.
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (3);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Lilian Kolling;
Guilherme Drescher; Andréia Inês Ferronato
2004 - Atual Laboratório de expressão de proteínas e antígenos na Região Central
do Estado do RS
Descrição: O sequenciamento de ácidos nucléicos tornou-se hoje uma
ferramenta fundamental em muitas áreas, sendo utilizado na pesquisa
básica e nas pesquisas aplicadas a inúmeros problemas das áreas da
saúde, da agricultura e meio ambiente. Tendo em vista o rápido
progresso obtido no campo da genômica, e pelo crescente emprego de
métodos moleculares de diagnóstico, baseados em PCR hibridização
de ácidos nucleicos e análise de regiões específicas de rDNA, espera-
se um crescimento para as aplicações do sequenciamento de DNA.
Atualmente, a expressão de proteínas recombinantes vem sendo uma
técnica amplamente utilizada para a obtenção de antígenos para
vacinas e testes de diagnósticos, bem como para produção de
medicamentos e estudos de caracterização molecular de proteínas de
interesse. No estado do RS, poucos são os centros de pesquisa onde
esta tecnologia vem sendo utilizada. Na Universidade Federal de Santa
Maria existe a carência de um laboratório especializado na expressão
de proteínas recombinantes. Neste sentido, o laboratório de
bacteriologia do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da
UFSM vem desenvolvendo projetos de pesquisa nesta área.
Consideramos que o fato de a UFSM ter sido escolhida para sediar um
dos laboratórios de sequenciamento da Rede Sul de Análises de
Genomas e Biologia Estrutural reflete a importância regional da
instituição e o potencial da mesma. Deste modo, a implantação de um
laboratório de expressão de proteínas e antígenos subsidiado permitirá
a realização de trabalhos em diferentes linhas de pesquisa.
108
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Cristina Costa Krewer; Agueda
Castagna de Vargas (Responsável)
2003 - Atual Caracterização molecular e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos
de isolados de Escherichia coli obtidas em criatórios suínos da Região
Sul do Brasil
Descrição: Entre as enfermidades entéricas a de maior relevância à
produção suinícola de nosso país, podemos citar a colibacilose. Essa
enfermidade distribuição mundial e possui difícil controle, mesmo com
os esforços realizados pela comunidade técnico- científica. Está
associada a infecção por diferentes patotipos de Escherichia coli no
trato intestinal, podendo levar a diferentes síndromes: (em especial)
diarréias neonatais e pós desmame, bem como pela doença do edema.
Além disto, a E. coli pode atuar associada a outros agentes infecciosos,
ocasionando sérios prejuízos, quer seja, pela mortalidade dos animais,
redução no ganho de peso e aumento dos custos com medicamentos e
serviços veterinários. Logo, tornam-se importantes estudos envolvendo
a determinação do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de
isolados clínicos e ambientais de E. coli, bem como a capacidade de
transmissão da resistência múltipla a outros isolados. Além disso, a
caracterização dos principais patotipos de E. coli encontrados nas
granjas e sua relação genética é fundamental para compreensão da
epidemiologia da enfermidade e obtenção de dados de interesse para à
produção e desenvolvimento de vacinas com maior eficiência para a
profilaxia da enfermidade. O presente trabalho tem por objetivo realizar
o isolamento, identificação, determinação do perfil de sensibilidade aos
antimicrobianos e capacidade de transmissão da resistência múltipla a
outros isolados. Da mesma forma, a caracterização dos principais
patotipos de E. coli encontrados nas granjas produtoras de suínos nos
estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina e a relação genética
entre isolados clínicos e ambientais de E. coli. Produzindo assim,
subsídios para adoção de uma antibioticoterapia racional,
compreensão da epidemiologia da enfermidade e produção de vacinas
com maior eficiência..
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (3); Mestrado acadêmico (1); Doutorado
(1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Mariana Sá e Silva; Agueda
Castagna de Vargas (Responsável); Irene Schrank; Shana Weber;
Lilian Kolling; Guilherme Drescher; Franciele Maboni
Financiador(es): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico-CNPq
2003 - Atual Caracterização antigênica de proteínas de superfície (S-Layer) de
Campylobacter fetus isoladas de bovinos
Descrição: As bactérias da espécie Campylobacter fetus são
responsáveis por perdas econômicas tanto na pecuária leiteira como
na de corte por causar a Campilobacteriose genital Bovina (CGB), uma
109
doença reprodutiva que tem como característica principal a repetição
de cios, o aumento no intervalo entre partos e abortos esporádicos,
Esta bactéria tem a capacidade de sofrer em ambientes hostis,
rearranhos genômicos, os quais modificam epitopos reconhecidos por
anticorpos do hospedeiro, burlando o sistema imune e fazendo com
que a infecção torne-se persistente em alguns animais. Deste modo, o
conhecimento das proteínas se superfície (S-layer) imunogênicas tem
grande importância para a produção de vacinas que possam proteger
de maneira eficaz os animais da infecção por Campylobacter fetus.
Este trabalho tem por objetivo caracterizar antigenicamente as
proteínas de superfície que tenham capacidade imunogênica, testadas
com anticorpos monoclonais produzidos em coelhos.
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (2); Mestrado acadêmico (1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Cristina Costa Krewer; Agueda
Castagna de Vargas (Responsável); Luciane Ribeiro Viana; Jackeline
Kirinus
2003 - Atual Clonagem e expressão do gene vapA de R. equi
Descrição: A virulência de R.equi ocorre pela presença de um
plasmídeos que contém o gene vapA. Com o objetivo de produzir
insumos no estudo de alternativas sorológicas para identificação de
animais infectados, será selecionado o gene completo que codifica
para a proteína VapA, para ser clonado e expresso. O fragmento do
gene vapA será obtido por PCR, utilizando iniciadores específicos. O
fragmento de 570pb, após será subclonado em vetor pUC18 clivado
com a enzima SmaI e defosforilado, ,será eletroporado em células de
Escherichia coli XL1 Blue. Um clone pUC vapA será digerido com
EcoRI e BamHI e o fragmento de 570pb purificado e clonado em vetor
de expressão pGEX 4T1.Posteriormente serão feitos estudos da
caracterização imunológica da proteína recombinante..
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (1); Mestrado acadêmico (1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Cristina Costa
Krewer; Mariana Sá e Silva; Agueda Castagna de Vargas
2003 - Atual Determinação do conteúdo de plasmídeos em isolados clínicos e
ambientais de E. coli
Descrição: A colibacilose é uma das prinicpais enfermidades
bacterianas dos suínos. Diferentes patotipos de E. coli tem sido
associados ao desenvolvimento de enfermidade nestes animais. os
fatores de virulência necessários a patogenicidade bacteriana bem
como genes de resistência aos antimicrobianos podem ser codificados
em plasmídeos. estes elementos genéticos móveis tem sido associada
com a transferência da informação gênica nestes isolados. Logo, a
determinação da sua presença em isolados clínicos e ambientais de E.
coli é fundamental para entendimento do potencial patogênico destes
isolados. O presente estudo tem por finalidade determinar a presença
de plasmídeos em isolados clínicos e ambientais de E. coli, bem como
a determinação do seu potencial de transferência.
110
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (3); Doutorado (1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Agueda
Castagna de Vargas; Ederson Bisognin Bortolotto; Guilherme Drescher;
Franciele Maboni
2003 - 2006 Agentes etiológicos da mastite bovina no Município de Xanxerê e
região
Descrição: A mastite em bovinos está associada a sérios prejuízos nos
criatórios. A mastite nestes animais pode ser classificada como
subclínica, clínica e crônica. Para o diagnóstico da mastite vários testes
podem ser conduzidos, como o teste de CMT (realizado a campo) e
CCS, WS e isolamento e cultivo, realizados no laboratório. O presente
estudo tem por objetivo a caracterização dos principais agentes
bacterianos envolvidos com a mastite em bovinos do Município de
Xanxerê e região, bem como determinar a sua sensibilidade aos
antimicrobianos. Para tal, leite será colhidos em diversas propriedades
dos Estados do PR, SC e RS. As amostras serão remetidas ao
laboratório, onde serão realizados os testes de WS para determinar o
grau de inflamação da glândula mamária, bem como o isolamento
bacteriano. Após a identificação por testes bioquímicos as bactérias
serão submetidas ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos Kirb
Bauer modificado.
Situação: Concluído; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (3);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa (Responsável); Lilian Kolling;
Guilherme Drescher; Andréia Inês Ferronato; Samara Paula Mattiello;
Patrícia Bordignon
2002 - 2006 Reação em cadeia da polimerase múltipla para caracterização de
isolados clínicos e ambientais de Rhodococcus equi do Brasil
Descrição: Rhodococcus equi é um microrganismo do solo que causa
broncopneumonia piogranulomatosa, linfadenite mesentérica e enterite
ulcerativa em potros com menos de 6 meses de idade. A doença pode
ser endêmica em algumas regiões ou esporádica em outras,
dependendo de condições físicas e de manejo. . A virulência de R. equi
está relacionada com a capacidade do microrganismo de impedir a
fagocitose e multiplicar no interior dos macrófagos, resistindo à
eliminação pulmonar e esplênica pelo hospedeiro. Esta atividade é
conferida por antígenos termorregulados com 15-17KDa, codificados
por plasmídeos de 85-90Kb. Pesquisas relatam que os antígenos de
15-17 KDa são encontrados em todos os isolados clínicos de R. equi
obtidos de potros, bem como em algumas amostras ambientais. Todas
as cepas que apresentam esta proteína são virulentas para
camundongos, sugerindo seu importante papel na patogênese da
infecção por R. equi e sua utilidade como marcador da virulência desta
bactéria. Entretanto, amostras desprovidas de plasmídeo de virulência
são capazes de ocasionar infecções nos homens e animais. Assim, a
PCR multiplex pode ser uma alternativa para diagnosticar de maneira
rápida e eficiente a presença desse gene de virulência que codifica
111
para a proteína VAP do Rhodococcus equi isolado dos animais.
Situação: Concluído; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (2); Mestrado acadêmico (1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Cristina Costa Krewer; Irene
Silveira Schrank; Agueda Castagna de Vargas (Responsável); Andreia
Henzel
2002 - Atual Clonagem e expressão do gene da proteína de superfície (SAP)
Descrição: Entre as enfermidades reprodutivas que afetam os bovinos,
a campilobacteriose venérea bovina (CVB) é de grande relevância,
uma vez que por passar muitas vezes desapercebida, pode ocasionar
sérios prejuízos aos produtores. A CVB é causada principalmente pelo
Campylobacter fetus e em particular pela subespécie venerealis. O
habitat natural do C.fetus subespécie venerealis é o sistema
reprodutivo bovino. proteínas de alto peso molecular presentes na
superfície bacteriana (Surface Array Protein - SAP), devido aos seu
importante papel na patogênese da enfermidade, são candidatas
potenciais para o desenvolvimento de métodos sorológicos de
diagnóstico e para o preparo de vacinas. Porém as características de
cultivo da bactéria muitas vezes dificultam estes estudos. Neste
sentido, o uso de proteínas recombinantes pode ser de grande
utilidade, permitindo a obtenção de altos níveis de proteínas a um custo
relativamente baixo. Os objetivos deste projeto são a clonagem e
caracterização do gene sap do Campylobacter fetus, expressão de
SAP recombinantes, testando sua reatividade imunológica.
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (2); Mestrado acadêmico (1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Agueda Castagna Vargas
(Responsável); Luciane Ribeiro Viana; Jackeline Kirinus
2002 - 2006 Padronização da técnica de PCR para diagnóstico da
campilobacteriose genital bovina
Descrição: A importância da bovinocultura de corte para o país e os
baixos índices reprodutivos decorrentes de problemas infecciosos
levam a busca de metodologias eficazes para o diagnóstico e controle
destas enfermidades. A Campilobacteriose Venérea Bovina (CVB), cuja
principal manifestação é a redução nos índices de parição (devido ao
aborto e infertilidade), apesar de acarretar prejuízos, tem passado
completamente despercebida, devido a natureza subclínica e a
dificuldade de diagnóstico. Ela é causada pelo Campylobacter fetus
subespécie fetus e venerealis, uma bactéria microaerófila, que além de
requerer condições especiais de transporte e cultura, apresenta o
crescimento fastidioso e inatividade bioquímica. A técnica de PCR
(Reação em Cadeia da Polimerase) vem sendo utilizada na
identificação de bactérias de difícil isolamento e classificação, porque
detecta fragmentos específicos do DNA bacteriano, que se mantém
íntegro, mesmo com o agente inviável, diminuindo-se então os
cuidados na colheita e conservação das amostras. A padronização da
PCR espécie-específica para Campylobacter fetus que está sendo
proposta pelo presente estudo, tem a intenção de facilitar e apressar o
112
diagnóstico da Campilobacteriose venérea permitindo uma correta
estimativa de sua prevalência em nossos rebanhos.
Situação: Concluído; Natureza: Outra
Alunos envolvidos: Graduação (2); Mestrado acadêmico (1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Agueda Castagna Vargas
(Responsável); Luciane Ribeiro Viana; Jackeline Kirinus; Ana Claudia
Groff
2001 - Atual Caracterização Molecular de Isolados de Streptococcus equi
Descrição: A adenite eqüina é uma doença contagiosa aguda
caracterizada por inflamação mucopurulenta do trato respiratório
superior dos eqüinos. é causada pelo S. equi subesp. equi, um agente
b-hemolítico pertencente ao grupo C Lancefield. Outros agentes
pertencentes ao mesmo grupo como S. equi subesp. zooepidemicus
são freqüentemente isolados de amostras clínicas como contaminantes
secundários. A diferenciação fenotípica entre estas subespécies é
pequena e tradicionalmente é baseada em testes de fermentação de
açucares, entretanto existem cepas de S.equi subesp. equi atípicas
que apresentam diferentes padrões de fermentação, dificultando ainda
mais sua diferenciação, gerando identificaçãoes falhas. O presente
trabalho tem por objetivo realizar uma caracterização molecular de
isolados de S.equi obtidos de casos clínicos de adenite eqüina. Para
tal, seqüências conservadas da região HSP60 serão amplificadas por
PCR utilizando-se primers degenerados, e após a amplificação os
fragmentos obtidos serão seqüenciados e analisados. Espera-se que a
análise destes fragmentos permita a caracterização dos isolados e
diferenciação das subespécies de S.equi.
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (2); Mestrado acadêmico (2);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Cristina Costa Krewer; Mariana
Sá e Silva; Agueda Castagna de Vargas (Responsável); Jackeline
Kirinus
Financiador(es): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico-CNPq
Número de produções C,T & A: 1/
2001 - Atual Genes envolvidos na patogenicidade de Actinobacillus
pleuropneumoniae
Descrição: O projeto visa o estudo dos genes envolvidos na
patogenicidade da bactéria Actinubacillus pleuropneumoniae. Visa
também o desenvolvimento de métodos rápidos de diagnóstico desta
espécie.
Situação: Em Andamento; Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (3); Mestrado acadêmico (2); Doutorado
(1);
Integrantes: Mateus Matiuzzi da Costa; Irene Silveira Schrank
(Responsável); Catia Cilene Klein; Sergio Ceroni da Silva; Shana
Weber
113
REVISOR DE PERIÓDICO
1 Ciência Rural
Vínculo
2003 - Vínculo: Revisor da Revista Ciência Rural
ÁREAS DE ATUAÇÃO
1 Medicina Veterinária Preventiva
IDIOMAS
Compreende: Inglês (Bem), Espanhol (Pouco)
Fala: Inglês (Bem), Espanhol (Pouco)
Lê: Inglês (Bem), Espanhol (Bem)
Escreve: Inglês (Bem), Espanhol (Pouco)
PRODUÇÃO EM C, T & A
Produção bibliográfica
Artigos completos publicados em periódicos
1. COSTA, M. M., SILVA, M. S. E., SPRICIGO, D. A., WITT, N., MARCHIORO, S. B.,
KOLLING, L., VARGAS, A. C. Caracterização epidemiológica, molecular e perfil de
resistência aos antimicrobianos de amostras de Escherichia coli isoladas de
criatórios suínos do sul do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.26, p.5-8, 2006.
2. COSTA, M. M., KREWER, C. C., MACHADO, S. A., FIGHERA, R. A., GRAÇA, D.
L., VARGAS, A. C., MATTOSGUARALDI, A. L., ILHA, M. R. S. Pathogenecity of
Rhodococcus equi isolates from human, horse clinical and environment in
immunodeficient mice. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.26, p.167-170, 2006.
3. COSTA, M. M., VARGAS, A. C., GROFF, A. C. M., KIRINUS, J., VIANA, L. R.,
SILVA, M. S. E. PCR for the diagnosis of bovine genital campylobacteriosis.
Veterinary Microbiology, 2006.
4. COSTA, M. M., VARGAS, A. C., SILVA, M. S. E., GROFF, A. C. M., BARRETTA,
C., BOTTON, S. A. Phenotypical assays and partial sequencing of the hsp60 gene
for identification of Streptococcus equi. Current Microbiology, 2006.
5. MEURER, F., HAYASHI, C., COSTA, M. M., MAUERWERK, V., FRECCIA, A.
Utilização de Saccharomyces cerevisae como probiótico para tilápias do nilo durante
o período de reversão sexual submetidas a um desafio sanitário. Revista Brasileira
de Zootecnia / Brazilian Journal of Animal Science, v.35, p.1881-1886, 2006.
114
6. COSTA, M. M., VARGAS, A. C., SPRICIGO, D. A., VIANA, L. R., CECIM, M.
Isolamento de Campylobacter jejuni em feto ovino abortado: relato de caso. Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.57, p.317-320, 2005.
7. COSTA, M. M., VARGAS, A. C., KREWER, C. C., GROFF, A. C. M., VIANA, L. R.,
SPRICIGO, D. A., KIRINUS, J. Susceptibilidade antimicrobiana de Campylobacter
fetus subespécie venerealis isolado de bovinos. Pesquisa Veterinária Brasileira,
v.25, p.1-3, 2005.
8. COSTA, M. M., KLEIN, Catia Cilene, BALESTRIM, Raquel, SCHRANK, Augusto,
SLVA, S. C., PIFFER, Itamar Antonio, SCHRANK, Irene Silveira, VAZ, C. S. L.,
COLLARES, R. M. Aspectos fenotípicos, genotípicos e de diagnóstico da bactéria A.
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VIANA, L. R. Atividade antimicrobiana in vitro de extrato alcoólico de propólis.
Ciência Rural, v.34, p.159-163, 2004.
10. COSTA, M. M., KLEIN, Catia Cilene, BALESTRIM, Raquel, SCHRANK, Augusto,
PIFFER, Itamar Antonio, SILVA, Sergio Ceroni da, SCHRANK, Irene Silveira.
Evaluation of PCR based on gene apxIVA associated to 16S rDNA sequencing for
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12. VARGAS, A. C., COSTA, M. M., VAINSTEIN, M. H., KREUTZ, L. C., NEVES, J.
P. Campylobacter fetus subspecies venereallis surface array protein from bovine
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14. COSTA, M. M. Agentes infecciosos isolados de Chinchilla laniger: Relato de
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15. COSTA, M. M., BOIJINK, C. L., BRANDÃO, D. A., VARGAS, A. C., RENOSTRO,
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(Rhamdia quelen). Ciência Rural, v.31, p.497-501, 2001.
16. COSTA, M. M., BOIJINK, C. L., BRANDÃO, D. A., RENOSTRO, A. V., VARGAS,
A. C. Inoculação de suspensão bacteriana de Plesiomonas shigelloides em Jundiá,
Rhamdia quelen (TELEOSTEI:PIMELODIDAE). Ciência Rural, v.31, p.497-501,
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17. COSTA, M. M., LOUGERCIO, A. P., SILVA, W. P., ALEIXO, J. A. G., VARGAS,
A. C. Listeria monocytogenes: Um importante patógeno de origem alimentar. Revista
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Higiene Alimentar, v.15, p.39-48, 2001.
18. COSTA, M. M., SILVA, D. A., VARGAS, A. C., ALIEVI, M., SCHOELER, J. E.,
SILVA, T. R. Gluconato de clorexidina ou álcool-iodo-álcool na anti-sepsia de campo
operatório em cães. Ciência Rural, v.30, p.431-437, 2000.
19. COSTA, M. M. Identificação de bactérias isoladas de jundiás (Rhandia quelen)
cultivados em sistemas semi-intensivo. Ciência Rural, v.30, p.293-298, 2000.
20. COSTA, M. M., HEADLEY, S. A., GRAÇA, D. L., VARGAS, A. C. Canine
destemper virus uifection with secondary Bordetella bronchiseptica pneumonia in
dogs - Case report. Ciência Rural, v.29, p.741-743, 1999.
21. COSTA, M. M., LAZZARI, A., DUTRA, V., FLORES, L. A., VARGAS, A. C.
Aspectos epidemiológicos do Rhodococcus equi em eqüinos do município de Bagé,
RS, Brasil. Ciência Rural, v.27, p.441-446, 1997.
22. COSTA, M. M., LAZZARI, A., DUTRA, V., ARAUJO, L., CASTAGNA, L.,
VARGAS, A. C. Patogenicidade de isolados clínicos e ambientais do Rhodococcus
equi em camundongos. Veterinária Técnica, v.7, p.24-30, 1997.
Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos
(completo)
1. COSTA, M. M., FERREIRA, B. J. M., OLIIVEIRA, J. S., BORGES, M. M.,
MULLER, M., MEURER, F. AGENTES BACTERIANOS ISOLADOS DA GLÂNDULA
MAMÁRIA DE OVINOS In: IV Congresso Nordestino de Produção Animal, 2006,
Petrolina. Anais do IV Congresso Nordestino de Produção Animal. Petrolina:
EMBRAPA, 2006. p.1146-1148
2. MEURER, F., COLPINI, L. M. S., COSTA, M. M., SILVA, M. S. E.,
BOMBARDELLI, R. A. DENSIDADE DE ESTOCAGEM DA TILÁPIA DO NILO
DURANTE A PRIMEIRA QUINZENA DA In: IV Congresso Nordestino de Produção
Animal, 2006, Petrolina. Anais do IV Congresso Nordestino de Produção Animal.
Petrolina: EMBRAPA, 2006. p.198-200
3. OLIVEIRA, J. S., SILVA, C. S. R., GALVAO, G. A., MEURER, F., COSTA, M. M.
FITOPLÂNCTON NA ALIMENTAÇÃO DE PEIXES EM CRIATÓRIO DO MUNICIPIO
DE PETROLINA In: IV Congresso Nordestino de Produção Animal, 2006, Petrolina.
Anais do IV Congresso Nordestino de Produção Animal. PETROLINA:
EMBRAPA, 2006. p.188-190
4. COSTA, M. M., OLIIVEIRA, J. S., MEURER, F., MELO, K. C. B., OLIVEIRA, S. T.
L. MICROBIOTA BACTERIANA DE CARPAS (“Cyprinus carpio”) CULTIVADAS EM
SISTEMA SEMIINTENSIVO In: IV Congresso Nordestino de Produção Animal, 2006,
Petrolina. Anais do IV Congresso Nordestino de Produção Animal. Petrolina:
EMBRAPA, 2006. p.191-193
5. MEURER, F., SILVA, M. S. E., COLPINI, L. M. S., COSTA, M. M., FRECCIA, A.,
116
MAUERWERK, V. NÍVEL DE ARRAÇOAMENTO NA REVERSÃO SEXUAL DA
TILÁPIA DO NILO In: IV Congresso Nordestino de Produção Animal, 2006,
Petrolina. Anais do IV Congresso Nordestino de Produção Animal. Petrolina:
EMBRAPA, 2006. p.201-204
6. COSTA, M. M., VARGAS, A. C., MEURER, F., MULLER, M., MOURA, M. C.
CONTROLE MICROBIOLÓGICO DE FILÉS DE TILÁPIA DO NILO
(“OREOCHROMIS NITICUS”) E JUNDIÁ (“RHAMDIA” SP.) In: 41ª Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Zootecnia, 2004, Campo grande, MS. 41ª Reunião Anual
da Sociedade Brasileira de Zootecnia, 2004.
7. COSTA, M. M., BOBLINSKI, A. F., HAYASHI, C., MEURER, F., PIETROBELLI, L.,
MULLER, M. MICROFLORA INTESTINAL DE TILÁPIA DO NILO (“OREOCHROMIS
NILOTICUS”) ALIMENTADAS COM RAÇÃO CONTENDO PROBIÓTICO
(“SACCHAROMYCES CEREVISIAE”) In: 41ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Zootecnia, 2004, Campo Grande, MS. 41ª Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de Zootecnia, 2004.
8. COSTA, M. M., HAYASHI, C., MEURER, F., FRECCIA, A., MULLER, M.,
BOSCOLO, R. J. USO DA SACCHAROMYCES CEREVISIAE COMO PROBIÓTICO
PARA TILÁPIA DO NILO (OREOCHROMIS NILOTICUS) DURANTE O PERÍODO
DE REVERSÃO SEXUAL In: 41ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Zootecnia, 2004, Campo Grande, MS. 41ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Zootecnia, 2004.
9. COSTA, M. M., GROFF, A.C.M., SILVA, M. S. E. SUSCEPTIBILIDADE
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SC. XXII Congresso Brasileiro de Microbiologia2003, 2003.
10. COSTA, M. M., BOIJINK, C. L., VARGAS, A. C., RADUNZ, J. L., BRANDÃO, D.
A. Efeito da inoculação de suspensão bacteriana de Piesiomonas shigelloides e da
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In: XXXVI REUNIAO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 1998,
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11. COSTA, M. M., LAZZARI, A., DUTRA, V., CASTAGNA, L., PEDROZO, A. F.,
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contra o Rhodococcus equi no soro de eqüinos vacinados. In: JORNADA
INTEGRADA DE PESQUISA E EXTENSÃO E ENSINO III. JORNADA INTEGRADA
DE PESQUISA E EXTENSÃO E ENSINO III, 1996. p.580-580
Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos
(resumo)
1. BIONDO, N., PRESOTTO, R., COSTA, M. M., HERMES, R. A., DRESCHER, G.,
KREWER, C. C. AGENTES FÚNGICOS DA DERMATOFITOSE NOS CÃES E
GATOS DE In: V Seminário de Iniciação Científica da UNOESC, 2006, Videira.
Anais do V Seminário de Iniciação Científica da UNOESC. Joaçaba: UNOESC,
117
2006.
2. MATTIELLO, S. P., DRESCHER, G., KOLLING, L., MATTIELLO, M., COSTA, M.
M., ROCHA, D., KREWER, C. C. APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE CONTAGEM DE
BACTÉRIAS EM TANQUE (CBT) PARA MONITORAMENTO DA MASTITE BOVINA
EM PROPRIEDADE DO MUNÍCIPIO DE XANXERÊ – SC In: V Seminário de
Iniciação Científica da UNOESC, 2006, Videira. Anais do V Seminário de Iniciação
Científica da UNOESC. Joaçaba: UNOESC, 2006.
3. PICCINI, C., ROCHA, D., BORDIGNON, P., COSTA, M. M., KOLLING, L.,
DRESCHER, G., KREWER, C. C. AVALIAÇÃO DE VACINAS CONTRA A
PNEUMONIA MICOPLÁSMICA DOS SUÍNOS In: V Seminário de Iniciação Científica
da UNOESC, 2006, Videira. Anais do V Seminário de Iniciação Científica da
UNOESC. Joaçaba: UNOESC, 2006.
4. DRESCHER, G., COSTA, M. M., MACIEL, M. N., MATTIELLO, S. P., PICCINI, C.
Caracterização bioquímica e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de isolados
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Estadual de Medicina Veterinária. Gramado: SOVERGS, 2006.
5. DRESCHER, G., PRESOTTO, R., MATTIELLO, S. P., COSTA, M. M., PICCINI,
C., FERRONATO, A. I., KREWER, C. C. CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA
DE R. equi E GENE VapA ATRAVÉS DO PCR MULTIPLEX In: V Seminário de
Iniciação Científica da UNOESC, 2006, Videira. Anais do V Seminário de Iniciação
Científica da UNOESC. Joaçaba: UNOESC, 2006.
6. WEBER, S., COSTA, M. M., SILVA, M. S. E., MABONI, F., FERRONATO, A. I.,
DRESCHER, G., VARGAS, A. C., SCHRANK, Irene Silveira. Caracterização
molecular e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos em isolados clínicos e
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XXVREGEM, 2006. p.102-102
7. COSTA, M. M., PRATI, L. A., SELLIG, A., SONAGLIO, F. Identificação e perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos dos microrganismos de maior freqüência em
cadelas e gatas submetidas a ovariohisterectomia In: XVII Congresso Estadual de
Medicina Veterinária, 2006, Gramado. Anais do XVII Congresso Estadual de
Medicina Veterinária. Porto Alegre: SOVERGS, 2006.
8. BORDIGNON, P., SIMON, A., FERRONATO, A. I., MATTIELLO, S. P.,
DRESCHER, G., COSTA, M. M., KREWER, C. C. TUBERCULOSE BOVINA NO
OESTE DE SC - RELATO DE CASOS In: V Seminário de Iniciação Científica da
UNOESC, 2006, Videira. Anais do V Seminário de Iniciação Científica da
UNOESC. Joaçaba: UNOESC, 2006.
9. COSTA, M. M., PRADO, J. O. O., PICCINI, C., DRESCHER, G., FERRONATO, A.
I., VIEL, F. AGENTES ETIOLÓGICOS DA MASTITE BOVINA NA REGIÃO DE
XANXERÊ In: IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE
PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E
118
EXTENÇÃO, 2005, Joaçaba-SC. IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III
SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO,
PESQUISA E EXTENÇÃO. Joaçaba: UNOESC, 2005. v.I. p.36-36
10. COSTA, M. M., KOLLING, L., DRESCHER, G., PICCINI, C., MATTIELLO, S. P.
ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA NO
REBANHO LEITEIRO DO MUNICÍPIO DE XANXERÊ E REGIÃO In: IV SEMINÁRIO
DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA
INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005, Joaçaba-SC. IV
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE
MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO. Joaçaba:
UNOESC, 2005. v.I. p.37-37
11. COSTA, M. M., KOLLING, L., CORSO, B. M., KREUTZ, L. C., BORDIGNON, P.
ASPÉCTOS VISUAIS DE ACONDICIONAMENTO E DE CONSUMO DE OVOS DE
GALINHA COMERCIALIZADOS EM CHAPECÓ-SC In: IV SEMINÁRIO DE
INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA
INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005, Joaçaba-SC. IV
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE
MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO. Joaçaba:
UNOESC, 2005. v.I. p.38-38
12. COSTA, M. M., FERRONATO, A. I., DRESCHER, G., KOLLING, L.,
BORDIGNON, P. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE
ISOLADOS DE RHODOCOCCUS EQUI E ESPÉCIES RELACIONADAS In: IV
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE
MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005, Joaçaba-SC.
IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II
MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO. Joaçaba-
SC: UNOESC, 2005.
13. COSTA, M. M., FERRONATO, A. I., PICCINI, C., PRADO, J. O. O., PRESOTTO,
R. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS
ANTIMICROBIANOS DE ISOLADOS DE E. COLI UROPATOGÊNICAS EM SUÍNOS
In: IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II
MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005,
Joaçaba-SC. IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE
PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E
EXTENSÃO. Joaçaba-SC: UNOESC, 2005.
14. COSTA, M. M., BIANCHESSI, B., DRESCHER, G., PRESOTTO, R., BIONDO,
N., INVITI, F. CONTAGEM BACTERIANA DE INTESTINO DE CARPAS (CYPRINUS
CARPIO) E TILÁPIAS (OREOCHROMIS NILOTICUS) In: IV SEMINÁRIO DE
INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA
INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005, Joaçaba-SC. IV
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE
MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO. Joaçaba-SC:
UNOESC, 2005.
15. COSTA, M. M., MATTIELLO, S. P., SALAMI, G., MARTARELLO, V., PIVA, J.
119
IDENTIFICAÇÃO E PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS DE
BACTÉRIAS OBTIDAS DE ÁGUA E LODO DO RIO DITINHO In: IV SEMINÁRIO DE
INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA
INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005, Joaçaba-SC. IV
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE
MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO. Joaçaba-SC:
UNOESC, 2005.
16. COSTA, M. M., SARTORETTO, A., PRADO, J. O. O., KOLLING, L.,
DRESCHER, G., MATTIELLO, M. ISOLAMENTO DE NOCARDIA BRASILIENSIS
EM CASO DE LINFADENITE INTRAMAMÁRIA EM BOVINOS: RELATO DE CASO
In: IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II
MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005,
Joaçaba-SC. IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE
PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E
EXTENSÃO. Joaçaba-SC: UNOESC, 2005.
17. COSTA, M. M., KOLLING, L., PRADO, J. O. O., PICCINI, C., BIANCHESSI, B.
MICROBIOTA BACTERIANA DE CARPAS (CYPRINUS CARPIO) CULTIVADAS EM
SISTEMA SEMI - INTENSIVO In: IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III
SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO,
PESQUISA E EXTENSÃO, 2005, Joaçaba-SC. IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO
CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE
ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO. Joaçaba-SC: UNOESC, 2005.
18. COSTA, M. M., MARTARELLO, V., BARBIERI, G., SALAMI, G., BIONDO, N.
NÚMERO MAIS PROVÁVEL DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS NAS ÁGUAS
DO RIO DITINHO - DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ESCHERICHIA COLI In:
IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II
MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005,
Joaçaba-SC. IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE
PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E
EXTENSÃO. Joaçaba-SC: UNOESC, 2005.
19. COSTA, M. M., FERRONATO, A. I., SARTORETTO, A., PICCINI, C.,
FORCHESATTO, S. PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS DE
BACTÉRIAS OBTIDAS DE CARPAS (CYPRINUS CARPIO) In: IV SEMINÁRIO DE
INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE MOSTRA
INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005, Joaçaba-SC. IV
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE
MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO. Joaçaba-SC:
UNOESC, 2005.
20. COSTA, M. M., MAUERWERK, M. T., MOURA, M. C., PIETROBELLI, L.,
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arachnoides(Atelinae, Primates) In: XI Congresso Brasileiro de Primatologia, 2005,
Porto Alegre. XI Congresso Brasileiro de primatologia - Livro de Resumos, 2005.
21. COSTA, M. M., CORSO, B. M., BORTOLOTTO, E. B., DRESCHER, G.,
120
BORDIGNON, P. PESQUISA DE COLIFORMES E SALMONELLA SPP. EM ÁGUA
CONSUMIDA NOS AVIÁRIOS DO MUNICÍPIO DE CHAPECÓ, SC In: IV
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II MIEPE
MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 2005, Joaçaba-SC.
IV SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA/ III SEMINÁRIO DE PESQUISA/ II
MIEPE MOSTRA INTEGRADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO. Joaçaba-
SC: UNOESC, 2005.
22. VARGAS, A. C., COSTA, M. M., HENZEL, A., SPRICIGO, D. A., KREWER, C.
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Microrganismos, 2004, Gramado. XXIV Reunião da Sociedade de Genética de
Microrganismos, 2004. v.01. p.93-93
23. WEBER, S., COSTA, M. M., SILVA, Sergio Ceroni da, SCHRANK, I. Clonagem e
expressão em E.coli do gene apxIVA de Actinobacillus pleuropneumoniae In: XXIV
Reunião da Sociedade de Genética de Microrganismos, 2004, Gramado. XXIV
Reunião da Sociedade de Genética de Microrganismos, 2004. v.01. p.109-109
24. COSTA, M. M., PIETROBELLI, L., BOBLINSKI, A. F., FRECCIA, A., MULLER,
M., NICOLA, P. A. CONTROLE MICROBIOLÓGICO DE FILÉS CONGELADOS DE
TILÁPIA E JUNDIÁ In: XII Seminário de iniciação Científica e VI Mostra de Pesquisa
da PUCPR, 2004, Curitiba, PR. Caderno de Resumos, 2004.
25. COSTA, M. M., FRECCIA, A., BOBLINSKI, A. F., PERTILE, D., NICOLA, P. A.
DENSIDADE POPULACIONAL SOBRE A SOBREVIVÊNCIA DA TILÁPIA DO NILO
DURANTE A PRIMEIRA QUINZENA DA REVERSÃO SEXUAL In: XII Seminário de
Iniciação Científica e VI Mostra de Pesquisa da PUCPR, 2004, Curitiba, PR.
Caderno de Resumos, 2004.
26. VARGAS, A. C., COSTA, M. M. Diagnóstico e Pesquisa empregando métodos
moleculares em bacteriologia veterinária In: XXIV Reunião da Sociedade de
Genética de Microrganismos, 2004, Gramado. XXIV Reunião da Sociedade de
Genética de Microrganismos, 2004. v.01. p.46-46
27. COSTA, M. M., FRECCIA, A., MEURER, F., VARGAS, A. C., PIETROBELLI, L.
DINÂMICA NA COLONIZAÇÃO MICROBIANA DO TRATO DIGESTIVO DE LARVAS
DE TILÁPIA DO NILO (Oreochromis niloticus) COM E SEM A SUPLEMENTAÇÃO
DE Saccharomyces cerevisae In: VIII Encontro Brasileiro de Patologistas de
Organismos Aquáticos, 2004, Laguna. RESUMOS, 2004.
28. CASTRO, L., COSTA, M. M., ALIEVI, M., CHEMALE, G., SCHRANK, Irene
Silveira, ZAHA, A., VAINSTEIN, M. H., FERREIRA, H.B. Expressão e avaliação do
potencial imunodiqagnóstico das proteínas recombinantes p36 e NRDF de
Mycoplasma hyopneumoniae na pneumonia micoplásmica suína In: XXIV Reunião
da Sociedade de Genética de Microrganismos, 2004, Gramado. XXIV Reunião da
Sociedade de Genética de Microrganismos, 2004. v.01. p.217-217
29. COSTA, M. M., FRECCIA, A., MEURER, F., MULLER, M., MAUERWERK, M. T.,
BELE, D.C. MICROBIOTA INTESTINAL DE TILÁPIA DO NILO (Oreochromis
121
niloticus) ALIMENTADAS COM RAÇÃO CONTENDO PROBIÓTICO
(Saccharomyces cereviseae) In: VIII Encontro Brasileiro de Patologia de Organismos
Aquáticos, 2004, Laguna. RESUMOS, 2004.
30. COSTA, M. M., MEURER, F., PIETROBELLI, L., MOURA, M. C., PERTILE, D.,
MAUERWERK, V. MICROFLORA INTESTINAL DE TILÁPIA DO NILO
ALIMENTADAS COM LEVEDURA VIVA COMO PROBIÓTICO In: XII Seminário de
Iniciação Científica e VI Mostra de Pesquisa da PUCPR, 2004, Curitiba, PR.
Caderno de Resumos, 2004.
31. VARGAS, A. C., COSTA, M. M., VIANA, L. R., SPRICIGO, D. A., KIRINUS, J.,
GROFF, A. C. M. Padronização da técnica de PCR para o diagnóstico da
campilobacteriose venérea bovina In: XXIV Reunião da Sociedade de Genética de
Microrganismos, 2004, Gramado. XXIV Reunião da Sociedade de Genética de
Microrganismos, 2004. v.01. p.94-94
32. COSTA, M. M., FRECCIA, A., MEURER, F., KRAMPE, C. R., BELEN, D. C. USO
DA LEVEDURA VIVA COMO PROBIÓTICO PARA LARVAS DE TILÁPIA DO NILO
In: XII Seminário de Iniciação Científica e VI Mostra de Pesquisa da PUCPR, 2004,
Curitiba, PR. Caderno de Resumos, 2004.
33. COSTA, M. M., FRECCIA, A., PERTILE, D., MEURER, F., MOURA, M. C. USO
DA LEVEDURA VIVA COMO PROBIÓTICO PARA LARVAS DE TILÁPIA DO NILO
COM DESAFIO SANITÁRIO In: XII Seminário de Iniciação Científica e VI Mostra de
Pesquisa da PUCPR, 2004, Curitiba, PR. Caderno de Resumos, 2004.
34. COSTA, M. M., MEURER, F., A.Freccia, V. Mauerwerk, DOBLINSKI, A.,
HAYASHI, C. USO de Saccharomyces cerevisiae COMO PROBIÓTICO PARA
ALEVINOS DE TILÁPIA DO NILO(Oreochromis niloticus) COM DESAFIO
SANITÁRIO In: VIII Encontro Brasileiro de Patologistas de Organismos Aquáticos,
2004, Laguna. RESUMOS, 2004.
35. COSTA, M. M., ALMEIDA, E. R., SANTOS, L. F. B., KOLLING, L., MARCHIORO,
S. B., KIRINUS, J., BORTOLOTTO, E. B., VARGAS, A. C., BUZATO, A. M.,
FAVERO, J. G. T. ENZILIMP AS-500 R: ESTUDO DA ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA E NO TRATAMENTO DOS DEJETOS SUÍNOS In: II Congresso
Intercursos do Centro de Ciências Sociais Aplicadas, V Seminário de Iniciação
Científica, 2003, Xanxerê, SC. II CONCESA, 2003.
36. COSTA, M. M., ALMEIDA, E. R., SANTOS, L. F. B., KOLLING, L., MARCHIORO,
S. B., KIRINUS, J., BUZATO, A. M., FAVERO, J. G. T., BORTOLOTTO, E. B.,
VARGAS, A. C. ENZILIMP: Estudo da atividade antimicrobiana e no tratamento de
dejetos suínos In: II Congresso Intercursos do centro de Ciências Sociais Aplicadas;
V seminário de Iniciação científica, 2003, Xanxerê. Anais do II CONCESA. Xanxerê:
New Print, 2003. v.I. p.215-215
37. SANTOS, L. F. B., KOLLING, L., ALMEIDA, E. R., SPRICIGO, D. A.,
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clínicos e ambientais de Rhodococcus equi In: II Congresso Intercurso do Centro de
Ciências Sociais Aplicadas; V Seminário de Iniciação Científica, 2003, Xanxere.
122
Anais do II CONCESA. Xanxere: New Print, 2003. p.239-239
38. COSTA, M. M., SANTOS, L. F. B., KOLLING, L., ALMEIDA, E. R.,
BORTOLOTTO, E. B., SPRICIGO, D. A., VARGAS, A. C. SUSCETIBILIDADE DE
ISOLADOS CLÍNICOS E AMBIENTAIS DE Rhodococus equi AOS AGENTES
ANTIMICROBIANOS In: II Congresso Intercursos do Centro de Ciências Sociais
Aplicadas, V Seminário de Iniciação Científica, 2003, Xanxerê, SC. II CONCESA,
2003.
39. COSTA, M. M., BALESTRIM, Raquel, KLEIN, Catia Cilene, PIFFER, I., SLVA, S.
C., SCHRANK, I. Aplicação da técnica de PCR para o gene apxIVA associada ao
seqüenciamento do rDNA 16S na caracterização de A. pleuropneumoniae e
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VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS DE SUÍNOS, 2001, Porto Alegre. X
CONGRESSO DA ASSOCIAÇÃO BRASIELIRA DE VETERINÁRIOS
ESPECIALISTAS DE SUÍNOS, 2002. p.25-25
40. COSTA, M. M., DUTRA, V., WEISS, L. H. N., SPRICIGO, D. A., NAKZATO, L.,
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caracterização de fímbrias e toxinas de isolados de Escherichia coli obtidos de
suínos com colibacilose neonatal. In: XXIII REUNIÃO DE GENÉTICA DE
MICRORGANISMOS, 2002, Pirenópolis. XXIII REUNIÃO DE GENÉTICA DE
MICRORGANISMOS, 2002.
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PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) PARA DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO
POR Campylobacter fetus EM BOVINOS. In: XVII JORNADA ACADÊMICA
INTEGRADA DA UFSM, 2002, Santa Maria-RS. ANAIS DA XVII JORNADA
ACADÊMICA INTEGRADA SANTA MARIA, 2002.
42. COSTA, M. M., KREWER, C. C., SILVA, M. S. E., LAZZARI, A.,
MATTOSGUARALDI, A. L., NAPOLEÃO, F., VAINSTEIN, M. H., SCHRANK, Irene
Silveira, SCHRANK, Augusto, VARGAS, A. C. Utilização da técnica de PCR
multiplex para caracterização molecular de isolados de Rhodococcus equi de haras
da região de Bagé, RS, Brasil. In: XXIII REUNIÃO DE GENÉTICA DE
MICRORGANISMOS, 2002, Pirenópolis. XXIII REUNIÃO DE GENÉTICA DE
MICRORGANISMOS, 2002.
43. COSTA, M. M., LOUGERCIO, A. P., HENZEL, A., KREWER, C. C., VIANA, L. R.,
VARGAS, A. C. Isolamento de Salmonella sp. Em linguiças suínas tipo frescal
comercializadas em Santa Maria, RS. In: XV JORNADA INTEGRADA DE
PESQUISA EXTENSÃO E ENSINO, 2000, Santa Maria. XV JORNADA
INTEGRADA DE PESQUISA EXTENSÃO E ENSINO, 2000.
44. COSTA, M. M., LAZZARI, A., RENOSTRO, A. V., WITT, N., VARGAS, A. C.
Avaliação in vitro do efeito antibacteriano na própolis. In: XIV CONGRESSO
ESTADUAL DE MEDICINA VETERINÁRIA & III CONGRESSO DE MEDICINA
VETERINÁRIA DO CONE SUL, 1999, Gramado. XIV CONGRESSO ESTADUAL DE
MEDICINA VETERINÁRIA & III CONGRESSO DE MEDICINA VETERINÁRIA DO
123
CONE SUL, 1999. p.317-317
45. COSTA, M. M., MACHADO, S. A., FERNANDES, A. F., DEZEN, D., VARGAS, A.
C. Inoculação de isolados clínicos e ambientais do Rhodococcus equi em
camundongos imunossuprimidos In: XX CONGRESSO BRASILEIRO DE
MICROBIOLOGIA, 1999, Salvador. XX CONGRESSO BRASILEIRO DE
MICROBIOLOGIA, 1999. p.164-164
46. COSTA, M. M., NAPOLEÃO, F., CAMELLO, T., VARGAS, A. C., ROSA, A.,
MATTOSGUARALDI, A. L. Pesquisa de plasmídeo de virulência de 85-90 Kb pela
técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) em amostras de Rhodococcus
equi de ongens diversas - meio ambiente, animais e humanos In: XX CONGRESSO
BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 1999, Salvador. XX CONGRESSO
BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 1999. p.99-99
47. COSTA, M. M., KREWER, C. C., NAPOLEÃO, F., CAMELLO, T., VARGAS, A.
C., MATTOSGUARALDI, A. L. Pesquisa de portadores de Rhodococcus equi entre
trabalhadores rurais. In: XX CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA,
1999, Salvador. XX CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 1999.
48. COSTA, M. M., CASTAGNA, L., BOIJINK, C. L., VARGAS, A. C. Avaliação da
sensibilidade aos antimicrobianos de bactérias isoladas de jundiá (Rhamdia quelen)
In: XIII JORNADA ACADÊMICA INTEGRADA, 1998, Santa Maria, 1998. p.354-354
49. COSTA, M. M., WEISS, L. H. N., LAZZARI, A., KLAUSS, M., PEDROZO, A. F.,
CASTGANA, L., VARGAS, A. C. Botulismo em bovinos confinados no RS: relato de
caso. In: XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINARIA, 1997,
Gramado, 1997. p.308-308
50. COSTA, M. M., WEISS, L. H. N., LAZZARI, A., CASTAGNA, L., ARAUJO, L.,
FERNANDES, A. F., FRANCISCATTO, C., VARGAS, A. C. Patogenicidade de
Isolados Clínicos eAmbientais do Rhodococcus equi em camundongos In:
CONGRESSO BRASILEIRO, 1997.
51. COSTA, M. M., FERNANDES, A. F., WEISS, L. H., FERNANDES, A. F.,
VARGAS, A. C. Agentes microbianos mais comuns nas otites e dermatites de
caninos em Santa Maria - RS In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA
VETERINARJA, XXIV, 1996, Goiânia. CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA
VETERINARJA, XXIV, 1996. p.57-57
52. COSTA, M. M., FONTANA, F. Z., WEISS, L. H. N., LAZZARI, A., FERREIRA, G.
L., FLORES, L. A., VARGAS, A. C. Efeito in vitro do Extrato de Própolis e
antimicrobianos nos agentes mais comuns nas otites e dermatites de caninos. In:
JORNADA INTEGRADA DE PESQUISA EXTENSÃO E ENSINO, II., Santa Maria.
JORNADA INTEGRADA DE PESQUISA EXTENSÃO E ENSINO, II, 1995. p.522-
522
53. COSTA, M. M., LAZZARI, A., FERNANDES, A. F., MEDEIROS, M., VARGAS, A.
C. Perfil de sensibilidade bacteriana 'in vitro´a norfloxacin. In: JORNADA
INTEGRADA DE PESQUISA EXTENSÃO E ENSINO, II., 1995, Santa Maria.
124
JORNADA INTEGRADA DE PESQUISA EXTENSÃO E ENSINO, II., 1995. p.417-
417
Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos
(resumo expandido)
1. COSTA, M. M., SILVA, M. S. E., WEBER, S., KOLLING, L., DRESCHER, G.,
VARGAS, A. C., SCHRANK, Irene Silveira, MABONI, F. Resistência ao
antimicrobianos e presença de plasmídeos em isolados clínicos e ambientais de
Escherichia coli In: XII Congresso Brasileiro de Veterinários Especialistas em
Suínos, 2005, Fortaleza. Anais do XII Congresso Brasileiro da ABRAVES.
Fortaleza: Comissão Científica do XII congresso da ABRAVES, 2005. v.2. p.7-8
2. COSTA, M. M., KLEIN, Catia Cilene, PIFFER, Itamar Antonio, SILVA, Sergio
Ceroni da, SCHRANK, I. Actinobacillus pleuropneumoniae e espécies relacionadas:
Genes apxIVA e rDNA 16S In: XI Congresso da ABRAVES, 2003, Goiânia. Anais do
XI Congresso da ABRAVES. Concórdia: Embrapa, 2003. v.II. p.21-22
3. VARGAS, A. C., SILVA, M. S. E., COSTA, M. M., GROFF, A.C.M., WITT, N.,
KOLLING, L. Perfil epidemiológico, molecular e de resistência aos antimicrobinaos
de amostras de Escherichia coli isoladas de criatórios suínos In: XI Congresso da
ABRAVES, 2003, Goiânia. Anais do XI Congresso da ABRAVES. Concórdia:
Embrapa, 2003. v.II. p.3-4
Orientações e Supervisões concluídas
Iniciação científica
1. Guilherme Drescher. Anticorpos contra o vírus da leucose enzoótica bovina
no rebanho leiteiro do Município de Xanxerê e região. 2005. Iniciação científica -
Universidade do Oeste de Santa Catarina
2. Cristiano Piccini. Avaliação de vacina comercial contra a pneumonia
enzoótica dos suínos. 2004. Iniciação científica - Universidade do Oeste de Santa
Catarina
3. Guilherme Drescher. Caracterização molecular de isolados de R. equi obtidos
de búfalos e javalis. 2004. Iniciação científica - Universidade do Oeste de Santa
Catarina
4. Andreia Ines Ferronato. Caracterização molecular e perfil de sensibilidade aos
antimicrobianos de isolados de E. coli uropatogênica. 2004. Iniciação científica -
Universidade do Oeste de Santa Catarina
5. Lyvia Maria Benedect. Padronização da técnica da PCR para detecção de E.
coli verotoxigênicas em produtos carneos suínos. 2004. Iniciação científica -
Universidade do Oeste de Santa Catarina
125
6. Lilian Kolling. Caracterização molecular, perfil de sensibilidade aos
antimicrobianos em isolados de E. coli obtidos de criatórios suínos. 2003.
Iniciação científica - Universidade do Oeste de Santa Catarina
Participação em eventos
1. XI CONGRESSO DA ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE VETERINÁRIOS
ESPECIALISATAS DE SUÍNOS, 2003. (Congresso) XI CONGRESSO DA
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS DE SUÍNOS.
2. XXIII REUNIÃO DA SOCIEDADE DE GENÉTICA DE MICRORGANISMOS, 2002.
(Encontro) XXIII REUNIÃO DA SOCIEDADE DE GENÉTICA DE
MICRORGANISMOS.
3. CURSO DE BIOINFORMÁTICA APLICADA, 2001. (Outra) CURSO DE
BIOINFORMÁTICA APLICADA.
4. CURSO TEÓRICO-PRÁTICO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES EM E.COLI, 2001. (Outra) CURSO TEÓRICO-PRÁTICO DE
PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM E.COLI.
5. ENCONTRO DA RED DE INVESTIGACION Y ENTRENIAMENTO EN
ENFERMEDADESPARASITARIAS DEL CONO SUR DE AMERICA LATINA, 2001.
(Encontro) ENCONTRO DA RED DE INVESTIGACION Y ENTRENIAMENTO EN
ENFERMEDADESPARASITARIAS DEL CONO SUR DE AMERICA LATINA.
6. X CONGRESSO DA ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE VETERINÁRIOS
ESPECIALISTAS DE SUÍNOS, 2001. (Congresso) X CONGRESSO DA
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS DE SUÍNOS.
7. MINI-CURSO: DIAGNÓSTICO DA CISTICERCOSE, 2000. (Outra) MINI-CURSO:
DIAGNÓSTICO DA CISTICERCOSE.
8. CURSO AVANÇOS EM REPRODUÇÃO BOVINA, 1999. (Outra) CURSO
AVANÇOS EM REPRODUÇÃO BOVINA.
9. CURSO DE CARDIOLOGIA E EMERGÊNIAS VETERINÁRIAS, 1999. (Outra)
CURSO DE CARDIOLOGIA E EMERGÊNIAS VETERINÁRIAS.
10. CURSO: DIAGNÓSTICO LABORATORIAL E BASTONETES GRAM
NEGATIVOS, 1999. (Outra) CURSO: DIAGNÓSTICO LABORATORIAL E
BASTONETES GRAM NEGATIVOS.
11. CURSO INTERNACIONAL DE REPRODUÇÃO E CLÍNICA EQUINA, 1999.
(Outra) CURSO INTERNACIONAL DE REPRODUÇÃO E CLÍNICA EQUINA.
12. UTILIZAÇÃO DE MÉTODOS RÁPIDOS PARA OTROLE DE PATÓGENSO NA
INDÚSTRIA DE ALIMENTOS, 1999. (Outra) UTILIZAÇÃO DE MÉTODOS RÁPIDOS
PARA OTROLE DE PATÓGENSO NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS.
126
13. XX CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 1999. (Congresso) XX
CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA.
14. II CONGRESSO DE MEDICINA VETERINÁRIA DO CONE SUL, XIII
CONGRESSO ESTADUAL DE MEDICINA VETERINÁRIA E XXV CONGRESSO
BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 1998. (Congresso) II CONGRESSO
DE MEDICINA VETERINÁRIA DO CONE SUL, XIII CONGRESSO ESTADUAL DE
MEDICINA VETERINÁRIA E XXV ONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA
VETERINÁRIA.
15. SEMINÁRIO MILLIPORE DE MICROBIOLOGIA DE ÁGUAS DE BEBIDA, 1998.
(Seminário) SEMINÁRIO MILLIPORE DE MICROBIOLOGIA DE ÁGUAS DE
BEBIDA.
16. SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE HERPESVÍRUS BOVINOS E VÍRUS DA
DIARRÉIA VIRAL BOVINA, 1998. (Simpósio) SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE
HERPESVÍRUS BOVINOS E VÍRUS DA DIARRÉIA VIRAL BOVINA.
17. VIII ENCORTE- ENCRONTRO DE RAÇAS BOVINAS DE CORTE DO CENTRO
DO ESTADO DO RS, 1998. (Encontro) VIII ENCORTE- ENCRONTRO DE RAÇAS
BOVINAS DE CORTE DO CENTRO DO ESTADO DO RS.
18. CURSO DE ATUALIZAÇÃO SOBRE PARASITOSES DE RUMINANTES-
EPIDEMIOLOGIA E CONTROLE, 1997. (Outra) CURSO DE ATUALIZAÇÃO
SOBRE PARASITOSES DE RUMINANTES-EPIDEMIOLOGIA E CONTROLE.
19. CURSO DE ENFERMIDADES CONFUNDÍVEIS COM FEBRE AFTOSA, 1997.
(Outra) CURSO DE ENFERMIDADES CONFUNDÍVEIS COM FEBRE AFTOSA.
20. XV SEMINÁRIO DE EXTENSÃO UNIVERSITÁRIA DA REGIÃO SUL, 1997.
(Seminário) XV SEMINÁRIO DE EXTENSÃO UNIVERSITÁRIA DA REGIÃO SUL.
21. ENCONTRO INTERNACIONAL DE VIROLOGIA MOLECULAR, 1996.
(Encontro) ENCONTRO INTERNACIONAL DE VIROLOGIA MOLECULAR.
22. SEMANA ACADÊMICA DO CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 1995.
(Outra) SEMANA ACADÊMICA DO CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA.
INDICADORES DE PRODUÇÃO
Produção bibliográfica
Artigos completos publicado em periódico.................................................. 22
Comunicações em anais de congressos e periódicos................................ 67
Produção técnica
Trabalhos técnicos (consultoria).................................................................. 1
Orientações
127
Orientação concluída (iniciação científica).................................................. 6
Eventos
Participações em eventos (congresso)....................................................... 4
Participações em eventos (seminário)........................................................ 2
Participações em eventos (simpósio)......................................................... 1
Participações em eventos (encontro)......................................................... 4
Participações em eventos (outra)............................................................... 11
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