( PDF ) Estudo histoquímico e ultra-estrutural da distribuição das fibras da matriz extracelular na prega vocal humana fetal no período perinatal

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Luciana Miwa Nita

Estudo histoquímico e ultra-estrutural

da distribuição das fibras da matriz

extracelular na prega vocal humana

fetal no período perinatal

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para obtenção

do título de Doutor em Ciências

Área de concentração: Otorrinolaringologia

Orientador: Prof. Dr. Domingos Hiroshi Tsuji

São Paulo

2008

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Nita, Luciana Miwa

Estudo histoquímico e ultra-estrutural da distribuição das fibras da matriz

extracelular na prega vocal humana fetal no período perinatal / Luciana Miwa Nita.

-- São Paulo, 2008.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Departamento de Oftalmologia e Otorrinolaringologia.

Área de concentração: Otorrinolaringologia.

Orientador: Domingos Hiroshi Tsuji.

Descritores: 1.Cordas vocais 2.Feto 3.Matriz extracelular 4.Ligamentos

5.Colágeno 6.Tecido elástico 7.Laringe 8.Tecido conjuntivo

USP/FM/SBD-056/08

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Aos meus pais, Yoshihiro e Ana,

pelo amor, pela dedicação,

pelo exemplo, a minha gratidão eterna.

Ao meu esposo, Tsuneyoshi,

pelo apoio e pela compreensão,

com todo o meu amor.

AGRADECIMENTOS

Agradeço

Ao Prof. Dr. Domingos Tsuji, orientador desta tese, meu mestre, com muita

admiração, em quem gostaria de me espelhar pelo seu exemplo como

profissional e pela amizade enriquecedora.

À Profa. Dra. Elia Caldini, chefe do Laboratório de Biologia celular, por toda

a sua contribuição e amor à pesquisa, por seus admiráveis caráter e

dedicação, um exemplo de profissional e pessoa.

Ao Prof. Dr. Ricardo Ferreira Bento, Professor Titular da Disciplina de

Clínica Otorrinolaringológica da Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo pela constante e incansável luta em prol de nossa Clínica, por

todas as oportunidades que ofereceu desde o nosso ingresso na

especialidade.

Ao Prof. Dr. Aroldo Miniti, ex-Professor Titular da Disciplina de Clínica

Otorrinolaringológica da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo, por todo o seu empenho nestes anos dedicados à nossa Clínica.

Ao Prof. Dr. Ossamu Butugan, por todos os conselhos e ensinamentos

transmitidos com muita sabedoria durante estes anos de nossa formação.

Aos Prof. Dr. Ivan Miziara, Dr. Henry Koishi, Dr. Luiz Antonio Figueiredo,

Dr. Michel Cahali, Prof. Dr. Richard Voegels, pelas observações

pertinentes e valiosas por ocasião do nosso exame de qualificação.

Ao Prof. Dr. Luiz Ubirajara Sennes, Coordenador do Programa de Pós-

graduação em Otorrinolaringologia da Faculdade de Medicina da USP, pelo

incentivo à pesquisa e dedicação aos pós-graduandos.

Ao Dr. Rui Imamura, por todos os seus inestimáveis ensinamentos,

conselhos e contribuições, especialmente na área de Laringologia.

Ao Prof. Dr. Hiroyuki Fukuda, Professor e Chefe do Tokyo Voice Center,

por toda a sua dedicação e gentileza com que me acolheu durante o estágio

no exterior.

Ao Prof. Dr. Hélio Élkis, Docente do Departamento de Psiquiatria da

FMUSP, pelo incentivo à pesquisa nos tempos da faculdade.

Ao Prof. Dr. Paulo Saldiva, Professor Titular do Departamento de Patologia

da FMUSP, pelo seu incentivo à realização desta pesquisa e por seus

valiosos conselhos.

À Dra. Claudia Battlehner, do Departamento de Patologia da FMUSP, por

todos os seus ensinamentos durante o desenvolvimento do estudo.

A todos os funcionários do Laboratório de Biologia Celular (LIM 59) do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP, pelo carinho com

que sempre me acolheram e, em especial, à Íris Amorim e ao Dr. Marcelo

Ferreira Alves, por sua dedicação na confecção do material estudado e ao

seu auxílio direto no desenvolvimento deste estudo.

Ao Prof. Dr. Carlos Augusto G. Pasqualucci, diretor do SVOC-USP, que

permitiu o acesso às laringes utilizadas, e a todos seus funcionários, em

especial ao Sr. Nilton que tornou possível a obtenção do material de estudo.

Aos Drs. Adriana Hachiya, Clarissa Komatsu, Fabio Lorenzetti,

Francisco Amorim, Leila Freire, Maura Neves, Patricia Santoro, Renata

Marcondes, Ronaldo Frizzarini e Saramira Bohadana, meus queridos

amigos e companheiros de profissão, com quem sei poder contar sempre.

Aos amigos do Grupo de Laringologia do Departamento de

Otorrinolaringologia do HCFMUSP, Drs. Christian Wiikmann, Daniel

Chung, Erich Melo, Flavio Sakae, João Ximenes, Natasha Braga, Rafael

Cahali, Raquel Tavares, Rogério Buhler, pelo companheirismo nestes

anos de Pós-graduação e tantas sugestões a este trabalho.

À Dra. Silvia Pinho, Fonoaudióloga da área de voz, por seus

enriquecedores conhecimentos e colaboração profissional.

Aos meus amigos, Drs. Elder Goto, Fabrizio Romano, Gilberto

Takahashi, Ítalo Medeiros, Lucinda Simoceli, Marcio Nakanishi, Marcus

Lessa, Milton Takeuti, pelos valiosos exemplos e conselhos.

Aos meus amigos, Drs. Adriana Yoshimura, Alexandre Mitsuuchi, Bráulio

de Oliveira, Fabiana Hashimoto, Fabio Imoto, Felipe Vanderlei,

Fernanda Pereira, Humberto Kishi, Jacqueline Hirahara, Luci Kimura,

Marcos Ozaki, Otávio Ninomiya, Paolo Biseli e Vivian Lanzarini, pelo

apoio desde os tempos de faculdade.

A Bárbara, Edzira, Jacira, Jorge, Luci, Lúcia, Márcia, Marileide e Ofélia,

funcionárias da Clínica de Otorrinolaringologia do HCFMUSP que, sempre

com muita gentileza, me auxiliam desde os tempos da residência.

Aos meus familiares pelo apoio e suporte durante todos os obstáculos

enfrentados nos anos de minha formação. A meus irmãos, Meiri e

Leonardo, pelo apoio constante em todas as situações.

Ao cadáver desconhecido.

Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento

desta publicação:

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals

Editors (Vancouver)

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi,

Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso,

Valéria Vilhena. 2a ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação;

2005.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals

Indexed in Index Medicus.

SUMÁRIO

Lista de figuras

Lista de abreviaturas e siglas

Lista de símbolos

Resumo

Summary

Instructions to authors

Artigo

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................1

2 OBJETIVOS ................................................................................................7

3 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................9

3.1 Aspectos gerais sobre o tecido conjuntivo .............................................10

3.1.1 As fibras do sistema elástico ...............................................................11

3.1.1.1 Biossíntese e caracterização dos diferentes tipos de fibras do

sistema elástico ...........................................................................................12

3.1.1.2 Distribuição diferencial e características funcionais das fibras

do sistema elástico ......................................................................................14

3.1.2 O sistema colagênico ..........................................................................17

3.2 Estrutura histológica da lâmina própria de pregas vocais de adultos .....20

3.3 Estrutura histológica de pregas vocais de fetos, neonatos e crianças....24

4 CASUÍSTICA E MÉTODOS ......................................................................27

4.1 Aspectos éticos ......................................................................................28

4.2 Casuística ..............................................................................................28

4.3 Métodos para estudo em microscopia de luz .........................................31

4.3.1 Método da Hematoxilina-Eosina .........................................................31

4.3.2 Método da Picrossírius-Polarização ....................................................31

4.3.3 Método de Resorcina-Fucsina de Weigert com prévia oxidação

pela oxona ...................................................................................................33

4.4 Método para estudo em microscopia eletrônica de transmissão ...........34

5 RESULTADOS ..........................................................................................36

5.1 Distribuição das fibras dos sistemas colagênico e elástico ....................37

5.2 Aspecto ondulado das fibras de colágeno ..............................................39

5.3 Interação entre as células e as fibras da matriz extracelular ..................40

6 DISCUSSÃO .............................................................................................51

7 CONCLUSÕES .........................................................................................62

8 REFERÊNCIAS ........................................................................................64

Apêndice

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Processamento do material de estudo ...................................... 30

Figura 2 - Corte histológico horizontal de prega vocal direita de feto

de oito meses, corado com HE ................................................. 41

Figura 3 - Micrografia de corte histológico equivalente ao da figura

dois observado em maior aumento........................................... 41

Figura 4 - Corte histológico adjacente ao da figura 2 corado com

Picrossírius e observado com luz convencional.........................42

Figura 5 - Corte histológico adjacente ao da figura 2 corado com

Picrossírius e observado sob polarização..................................42

Figura 6 - Corte histológico equivalente ao da figura 5 em maior

aumento ....................................................................................43

Figura 7 - Corte histológico horizontal de prega vocal de feto de 8

meses, corado com Resorcina-fucsina com oxidação

prévia .........................................................................................43

Figura 8 - Corte histológico coronal de região intermacular de prega

vocal de feto de 7 meses, corado com Resorcina-fucsna

com oxidação prévia ..................................................................44

Figura 9 - Micrografia de outra região do mesmo corte da figura 8............44

Figura 10 - Corte histológico horizontal de prega vocal de feto de 9

meses corado com Resorcina-fucsina com oxidação prévia......45

Figura 11 - Micrografia de outra região do mesmo corte da figura 10..........45

Figura 12 - Micrografia eletrônica da região superficial da lâmina

própria de prega vocal de feto de 9 meses ................................46

Figura 13 - Micrografia eletrônica de outro fragmento da mesma prega

vocal mostrada na figura 13.......................................................46

Figura 14 - Micrografia eletrônica de grande aumento .................................47

Figura 15 - Micrografia eletrônica de um fragmento de lâmina própria

da prega vocal fetal....................................................................47

Figura 16 - Corte histológico horizontal de prega vocal de feto de 8

meses, corado com Picrossírius, observado com luz

convencional ..............................................................................48

Figura 17 - Micrografia eletrônica de prega vocal de feto de 8 meses .........48

Figura 18 - Micrografia eletrônica de grandíssimo aumento obtida de

prega vocal de feto de 9 meses .................................................49

Figura 19 - Micrografia eletrônica de grande aumento de prega vocal

de feto de 8 meses.....................................................................49

Figura 20 - Micrografia eletrônica de prega vocal de feto de 9 meses .........50

Figura 21 - Micrografia eletrônica de região superficial da prega vocal

de feto de 9 meses.....................................................................50

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CAPPesq Comissão para Análise de Projetos de Pesquisa

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

F Feminino

HC Hospital das Clínicas

HE Hematoxilina e Eosina

LIM Laboratório de Investigação Médica

M Masculino

SVOC- USP Serviço de Verificação de Óbitos da Capital da Universidade

de São Paulo

et al. e outros

LISTA DE SÍMBOLOS

α alfa

cm centímetro

Da dalton

g grama

HCl ácido hidroclorídrico

Kb quilobite

KV quilovolt

M massa molar

mg miligrama

mL mililitro

nm nanômetro

NaCl cloreto de sódio

número

OsO4 Tetróxido de ósmio anidro

C grau Celsius

µg micrograma

% porcentagem

RESUMO

Nita LM. Estudo histoquímico e ultra-estrutural da distribuição das fibras da

matriz extracelular na prega vocal humana fetal no período perinatal. Tese

(doutorado). São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo;

2008.

Acredita-se que nos humanos, o ligamento vocal se desenvolva após

o nascimento. No entanto, não há consenso na literatura sobre qual a faixa

etária de seu aparecimento. Muitos estudos indicam que no neonato, a

lâmina própria da prega vocal apresenta-se com algumas fibras esparsas

sem uma organização particular. O principal objetivo deste estudo foi obter

informação a respeito das fibras colagênicas e do sistema elástico (sob a luz

dos conhecimentos atuais sobre a matriz extracelular), na lâmina própria de

pregas vocais de fetos no período perinatal. Laringes obtidas por autópsia de

fetos entre sete a nove meses foram estudadas através de microscopia de

luz e eletrônica de transmissão. Fibras contendo colágeno foram

identificadas através do Método da Picrossírius-polarização, fibras do

sistema elástico foram descritas utilizando-se o método de Resorcina-fucsina

de Weigert após oxidação com oxona. Os resultados histoquímicos

coincidem com as observações da microscopia eletrônica, evidenciando

populações de fibras de colágeno segregadas em diferentes compartimentos

na lâmina própria. Assim, em sua região central as fibras de colágeno se

mostraram finas, fracamente birrefringentes de coloração esverdeada,

enquanto que as regiões superficiais e profundas apresentaram fibras

grossas de colágeno com forte birrefringência de cor vermelho-amarelada,

quando estudadas através do método da Picrossírius-polarização. Estas

características sugerem que as fibras finas da região central são compostas

principalmente por colágeno tipo III, enquanto o colágeno tipo I predomina

nas regiões superficial e profunda, em concordância com as observações da

literatura relacionada com o estudo da prega vocal de adultos. Assim como o

componente colagênico, as fibras do sistema elástico mostraram uma

distribuição diferencial ao longo da lâmina própria. Em certo sentido, esta

distribuição é complementar àquela das fibras de colágeno: a região central,

na qual fibras colagênicas eram escassas e finas, apresentou maior

densidade de fibras do sistema elástico, em comparação às regiões

superficial e profunda. Assim, a presença de um padrão de distribuição

diferencial das fibras da matriz extracelular na prega vocal humana fetal

equivalente à descrição clássica do ligamento vocal adulto nos permitiu

concluir que o ligamento vocal já está presente ao nascimento. As

implicações funcionais destes achados foram discutidas. O conceito corrente

de que os estímulos externos, como a fonação, são essenciais para a

determinação da estrutura em camadas da lâmina própria, faz com que

nossos resultados sejam surpreendentes ao evidenciar a presença de uma

distribuição complexa e organizada dos componentes do tecido conjuntivo

na lâmina própria de pregas vocais de fetos no período perinatal. A idéia de

que a contribuição genética poderia desempenhar um papel importante na

organização destas camadas, independentemente do estímulo mecânico,

poderia explicar melhor a presença das estruturas observadas já ao

nascimento, uma vez que o mecanismo genético pode agir antes de

qualquer estímulo mecânico externo, como a fonação.

Descritores: 1.Cordas vocais 2.Feto 3.Matriz extracelular 4.Ligamentos

5.Colágeno 6.Tecido elástico 7.Laringe 8.Tecido conjuntivo

SUMMARY

Nita LM. Histochemical and ultrastructural study on the distribution of the

extracellular matrix fibers in the human fetal vocal fold. Thesis. São Paulo:

“Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2008.

It is currently believed that, in humans, the vocal ligament develops after

birth. However, there is no consensus in the literature about the age of its

surge. Most papers describe that in the newborn, the lamina propria shows

the presence of some sparse fibers without any particular organization. The

main purpose of this study was to obtain information regarding collagenous

and elastic system fibers (in the light of the current knowledge on

extracellular matrix) in the lamina propria of fetal vocal fold. Larynges

obtained from autopsy of human fetuses aged seven to nine months were

studied by means of light and electron microscopy. Collagen containing fibers

were assessed by the Picrosirius-polarization method, elastic system fibers

were described using Weigert’s resorcin-fuchsin with previous oxidation with

oxone. The histochemical results coincide with the electron microscope

observations in showing collagen populations segregated into different

compartments of the lamina propria. Thus, in its central region the collagen

shows up as thin, weakly birefringent, greenish fibers while the superficial

and deep regions consist of thick collagen fibers which display a strong

birefringence of red or yellow color when studied with the aid of the

Picrosirius-polarization method. These characteristics strongly suggest that

the thin fibers in the central region are composed mainly of type-III collagen,

whereas type-I collagen predominates in the superficial and deep regions, in

agreement with the observations in the literature pertaining to studies of adult

vocal folds. As well as collagen, the elastic system fibers show a differential

distribution throughout the lamina propria. This distribution is complementary,

in a sense, to that of the collagen fibers: the central region, with thin

collagenous fibers, presents the greatest density of elastic system fibers in

comparison to the superficial and deep regions. Thus, the presence of a

differential distribution of the extracellular matrix fibers in the fetal vocal fold

equivalent to the classical description of the adult vocal ligament allowed the

conclusion that a vocal ligament is already present in the newborn. The

functional implications of the foregoing findings are discussed. Current ideas

sustaining that stimuli like phonation are essential to the determination of the

layered structure of the lamina propria would make it surprising that a

newborn baby could present a complex and organized distribution of

connective tissue components as our results show to be the case. The idea

that genetic contrivance instead should play a role in the organization of

these layers seems to explain better the observed structures once it would

act before any mechanical stimulus similar to phonation could take place.

Descriptors: 1.Vocal cords 2.Fetus 3.Extracellular matrix 4.Ligaments

5.Collagen 6.Elastic tissue 7.Larynx 8.Connective tissue

Journal of Anatomy

Published on behalf of the Anatomical Society of Great Britain and Ireland

Edited by:

Gillian Morriss-Kay

Print ISSN: 0021-8782

Online ISSN: 1469-7580

Frequency: Monthly

Current Volume: 210 / 2007

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THE PRESENCE OF A VOCAL LIGAMENT IN FETUSES: A HISTOCHEMICAL

AND ULTRASTRUCTURAL STUDY

Journal: Journal of Anatomy

Manuscript ID: JANAT-2008-0026

Manuscript Type: Original Paper

Date Submitted by the

Author:

16-Jan-2008

Complete List of Authors: Nita, Luciana; University of São Paulo School of Medicine,

Department of Otolaryngology

Battlehner, Claudia; University of São Paulo School of Medicine,

Laboratory for Cell Biology, Department of Pathology

Ferreira, Marcelo; University of São Paulo School of Medicine,

Laboratory for Cell Biology, Department of Pathology

Imamura, Rui; University of São Paulo School of Medicine,

Department of Otolaryngology

Sennes, Luiz; University of São Paulo School of Medicine,

Department of Otolaryngology

Caldini, Elia; University of São Paulo School of Medicine, Laboratory

for Cell Biology, Department of Pathology

Tsuji, Domingos; University of São Paulo School of Medicine,

Department of Otolaryngology

Key Words:

Vocal cord, Vocal ligament, Fetuses, Extracellular matrix, Collagen,

Elastic fibre, Ultrastructure

Journal of Anatomy

For Peer Review Only

Introduction

Phonation is a complex phenomenon that involves many different systems. The

voice is produced through vibration of vocal folds and modified by the resonance of

supraglottic vocal tract. However, the initial stage of vocal production is a purely

mechanical phenomenon, directly dependent on appropriate vibration of vocal folds.

Since Hirano (1974) described the layered structure of the vocal fold lamina

propria (superficial, intermediate and deep layer), many studies have been carried out to

better understand the structural organization of the extracellular elements in the lamina

propria of the vocal fold, both by means of light and electron microscopy. It is known

that the distribution of extracellular matrix collagenous and elastic fibres is directly

related with viscoelastic and biomechanical properties the vocal folds, with functional

implications. (Gray et al., 2000).

Despite the extensive literature about the structure of lamina propria of vocal folds

in adults, there are few studies in children and neonates. It was reported that there is no

vocal ligament at birth (Sato & Hirano, 1995; Ishii et al., 2000; Sato et al., 2001; Hartnick

et al., 2005), but there is no agreement on what is the age which the vocal ligament as

known as in adults is finally present. Lamina propria of children’s vocal fold was

described as entirely similar to Reinke’s space (superficial layer of lamina propria) of

adult vocal folds, with large amount of amorphous substance and sparse fibres that do not

display a differential distribution pattern (Campos Bañales et al., 1995; Sato & Hirano,

1995; Ishii et al., 2000; Sato et al., 2001).

However, it had been also described that, in larynges of children as young as 3 to

8 months, the small amount of collagen fibres of the lamina propria is distributed into two

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layers, such as in adults: one layer was located immediately beneath the epithelium and

the other one located in the zone adjacent to the vocal muscle (Hammond, 2000).

Despite this controversy about the distribution of extracellular matrix components

of vocal fold lamina propria, it has been properly demonstrated that after birth, it

continues its process of development and maturation up to the highly complex structure

of adult vocal fold, under exogenous stimuli, mainly phonation (Hartnick et al., 2005).

Based on these observations, we hypotese that it would be important to describe,

in the light of current knowledge of the ultrastructural patterns and the histochemical

proprieties of the elastic and collagenous systems fibres, the structural organization of the

lamina propria of the fetal vocal fold in the perinatal period.

Methods

Tissue collection

The protocol was approved by ethics committee of the Hospital das Clínicas, Medical

School, University of São Paulo. Eighteen human larynges excised from 7

to 9

month

fetus within 24 hours post-mortem were obtained during necropsies. In this study we

included anatomic pieces without noticeable macroscopic affections in the area of the

larynx and without macerated cells from individuals free of apparent congenital disorder.

Each larynx was sagitally sectioned and the two hemilarynges were immediately

immersed in the appropriate fixative.

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Light microscopy

Tissues were fixed in 4% neutral, phosphate-buffered, paraformaldehyde for 6 h at room

temperature, dehydrated in graded concentrations of alcohol, embedded in paraffin.

Randomly chosen right or left vocal folds were horizontally or coronally sectioned at 5

µm. Serial sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E), Picrosirius-

hematoxylin (Junqueira et al., 1978) and Weigert's resorcin–fuchsin with previous

oxidation with oxone (Caldini et al., 1990).

When the Picrosirius-stained slides are observed with the aid of polarization microscopy,

the method becomes specific for oriented collagen molecules, in the sense that only these

structures present an enhancement of their natural birefringence when observed under

polarized light (Junqueira et al., 1978).

All three types of elastic system fibres (oxytalan, elaunin and the elastic fibre proper) are

stained when the tissue is oxidized prior to staining by Weigert's resorcin–fuchsin

(Battlehner et al., 2003).

Electron microscopy

Specimens obtained from the lamina propria region of the vocal folds were fixed in 2%

glutaraldehyde dissolved in 0.15M phosphate buffer at pH 7.2 for 1h, followed by post-

fixation in 1% osmium tetroxide dissolved in 0.9% sodium chloride for 1h. Fixed

material was stained in block in 0.5% aqueous uranyl acetate overnight. After this

procedure, the samples were dehydrated in graded acetone series, and embedded in

Araldite resin. Ultrathin sections, at 70nm were obtained by using a diamond knife at an

LKB ultratomicrotome, placed on 200-mesh copper grids and double-stained by uranyl

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acetate and lead citrate. The grids were studied and micrographed in a Jeol 1010

transmission electron microscope operating at 80 kV.

Results

Our observation on the structure of the fetal vocal fold confirmed the descriptions

available in the literature. The coronal and horizontal sections show that the normal vocal

fold may be described as a structure formed by different tissues which, from the lumen to

deeper regions, comprises: (1) the lining epithelium, (2) the lamina propria and (3) the

skeletal muscle layer. The lamina propria is the connective tissue between the basal

lamina of the epithelium and the vocal muscle. When studied with H&E staining it was

not possible to identify any pattern of extracellular matrix fibres distribution through the

entire lamina propria (Fig. 1A).

Slides stained with Picrosirius were carefully examined under polarized light. With this

method, the thickness of the fibre determines its color of birefringence. Thick fibres are

yellow to red and thin fibres appear as greenish structures. The vocal fold lamina propria

studied by the Picrosirius polarization method showed the presence of two distinct

collagen populations segregated into different compartments: the collagen in the central

region showed up as thin, weakly birefringent greenish fibres, contrasting with the

subepithelial and the deep region where strongly birefringent, thick, yellow to red fibres

could be seen; these fibres were arranged in parallel to the major axis of the vocal fold

(Figs. 1B and 1C).

After careful examination of the slides stained by Weigert's resorcin–fuchsin with

previous oxidation, it was possible to describe the distribution of the elastic system fibres.

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They were distributed through all the lamina propria of fetal vocal fold, presenting two

regions of higher densities: (1) a well delimited region in the central zone of lamina

propria rich in elastic fibres, and (2) a palisade of thick fibres was visible just beneath the

epithelial basement membrane; their orientation is such that they are roughly parallel to

the long axes of the vocal fold (Figs. 2A and 2B).

Ultrathin sections confirmed that the lamina propria of vocal folds contains both

extracellular matrix fibrillar components: fibres of the elastic system appear interspersed

with fibrils of the collagenous system. The fibrillar elements of both systems are disposed

parallel to the long axis of the vocal fold. The conspicuous presence of fibroblasts (that

characteristically exhibit long cytoplasmic processes) was often observed among the

fibres of the elastic system and the collagenous fibrils. It was also possible to identify a

great quantity of elastic system fibres in the central regions of the lamina propria of fetal

vocal fold (Fig. 3). These fibres correspond to those that markedly reacted when observed

under the light microscope in the preparations stained by Weigert´s resorcin-fuchsin

method.

The collagen fibres found in the lamina propria of fetal vocal folds resembled typical

collagen fibres of connective tissues. These fibres consist of parallel arrays of collagen

fibrils. Longitudinal aspects of collagenous fibres revealed their profile as a slight

undulating course (crimp). (Figs. 4A and 4B)

Discussion

The main purpose of this study was to obtain information regarding collagenous and

elastic system fibres (in the light of the current knowledge on extracellular matrix) in the

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lamina propria of fetal vocal fold. The histochemical results coincide with the electron

microscope observations in showing collagen populations segregated into different

compartments of the lamina propria. Thus, in its central region the collagen shows up as

thin, weakly birefringent, greenish fibres while the superficial and deep regions consist of

thick collagen fibres which display a strong birefringence of red or yellow color when

studied with the aid of the Picrosirius polarization method. These characteristics strongly

suggest that the thin fibres in the central region are composed mainly of type-III collagen,

whereas type-I collagen predominates in the superficial and deep regions, in agreement

with the observations in the literature pertaining to studies of adult vocal folds. (Melo et

al., 2003; Tateya et al., 2005).

As well as collagen, the elastic system fibres show a differential distribution throughout

the lamina propria. This distribution is complementary, in a sense, to that of the collagen

fibres: the central region, with thin collagenous fibres presents the greatest density of

elastic system fibres in comparison to the superficial and deep regions.

Classically, the histological structure of the newborn and infant vocal folds is described

as different from that of the adults: the entire lamina propria appears as a uniform

structure. However, under polarization microscopy, we could observe strong

birefringence in the upper region of the lamina propria and in the adjacent zone to vocal

muscle in the newborn vocal fold, suggesting the high content of collagenous fibres. In

opposite, the middle region appears weakly birefringent, suggesting a small amount of

collagen. These findings are consistent with our observation of the relative great amount

of elastic system fibres in the middle region of lamina propria, forming the elastic portion

of the vocal ligament.

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The compounds of amorphous fundamental substance, mainly represented by

proteoglycans, glycoproteins and water, together with elastic fibres, directly affect tissue

viscosity and promote the absorption of the impact shock between vocal folds during

vibration. Collagen component, in turn, is responsible for maintaining structural

resistance. The division of lamina propria in layers is based on differential distribution of

these fibrous elements (Hammond et al., 1997; Sato et al., 2001).

It is difficult to determine the individual contributions of biological components to

mechanical property. As connective tissues have a predominantly mechanical function it

is of importance to understand how the constituent chemical components (collagen,

glycosaminoglycans, elastic fibres, minerals, water) provide the tissue with its

mechanical attributes. These attributes, however, vary markedly among different

connective tissues. For instance, tendon has high collagen content, orientated fibrils, and

a low glycosaminoglycan content. Other specialized tissues, such as the ligamentum

nuchae, are rich in elastic fibres and their mechanical properties are greatly influenced by

this component (Parry & Craig, 1988). In terms of their mechanical role, connective

tissues must have some appropriate combination of two basic attributes – an ability to

withstand high tensile or compressional stresses and the ability to recover shape and form

when stresses are removed.

Our results were different from those in the literature for some reasons: (1) we used

horizontal sections, in order to analyze the vocal fold in its entire anterior-posterior

extension, from its connection to the thyroid cartilage to the insertion in the vocal fold of

thyroid cartilage, and (2) the histochemical methods used in this study had not been

applied to analyze the fibres of extracellular matrix of the vocal folds of fetuses.

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For elastic system fibres identification, the Verhoeff´s method describes selectively

elastic fibres proper, but elaunin and oxytalan fibres are not stained. Conversely,

Weigert's resorcin-fuchsin method is more sensitive and it stains elaunin fibres as well.

Oxytalan fibres remain undetectable unless they are submitted to oxidation first.

As to collagen system fibres, Mallory, Masson and van Gieson methods have been used,

but they do not identify reticular fibres nor collagen in basal membrane. Sirius red, an

acid staining substance, strongly reacts with collagen molecules, because they are rich in

basic amino acids. In addition to strong reaction, the staining molecule is a long molecule

that promotes intensification of its natural birefringence because many staining molecules

are aligned parallel to the longitudinal axis of each collagen molecule (Montes, 1996).

Thus, we used in this study histochemical methods that enable the identification of the

three types of fibres of elastic system and fibrillar collagen, whose findings were

confirmed by transmission electron microscopy.

Current ideas sustaining that stimuli like phonation are essential to the determination of

the layered structure of the lamina propria would make it surprising that a newborn baby

could present a complex and organized distribution of connective tissue components as

our results show to be the case. The idea that genetic contrivance instead should play a

role in the organization of these layers seems to explain better the observed structures

once it would act before any mechanical stimulus similar to phonation could take place.

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Fig. 1. Two adjacent serial horizontal sections from an 8-months-

old fetus right vocal fold

stained with hematoxylin-eosin (1A) or with Picrosirius shown by conventional (1B) and

polarizing (1C) illumination. In 1A, the vocal fold can be seen in its entire antero-

posterior extension, from the thyroid cartilage (TC) up to the vocal process (VP) of the

arytenoid cartilage (AC) and in its entire latero-medial extension, between the vocal

muscle (VM) and the epithelium (black arrow). The anterior comissure tendon (ACT) can

be seen, linking the vocal fold to the thyroid cartilage; observe that anterior macula flava

(AMF) and posterior macula flava (PMF) are easily identified, but no 'fibres' can be

distinguished as such in the lamina propria with this staining. Figures 1B and 1C are

photomicrographs of the same field shown by conventional (1B) and polarizing (1C)

illumination. Observe that all structures that are deeply stained with Picrosirius in the

photomicrography obtained with conventional illumination (1B) are collagenous. When

viewed by polarized light (1C), these fibres are disclosed as birefringent structures that

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shine against a dark background. In 1B, it is possible to observe the collagen fibres in the

superficial and deep layers of lamina propria (LP). The central layer corresponds to an

area of fibre rarefaction, where collagen is less densely packed. This is confirmed in 1C,

where it is possible to observe that the thick collagen fibres present in superficial and

deep layers form strongly birefringent sheaths that are continuous with the

perichondrium of the arytenoid cartilage (AC) and with the anterior commissure tendon

(ACT), but in the central layer the sparse collagenous structures show up as thin, weakly

birefringent, greenish fibres.

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Fig. 2A - Horizontal section from an 8-months-old fetus vocal fold stained by Weigert's

resorcin-fuchsin after oxidation. T

he elastic system fibres of fetal vocal fold are disclosed.

Although they are present through all the lamina propria, it is possible to observe a

sharply defined region (between arrows) rich in organized elastic system fibres that ran

parallel to the major axis of the vocal fold and inserted in both anterior and posterior

maculae (AMF and PMF, respectively). This region corresponds to the central layer of the

lamina propria that displays sparse collagenous fibres (described in Figure 1B and 1C).

The comparison of these pictures suggests that the lamina propria is not a homogeneous

structure from the point of view of the distribution of collagenous and elastic system

fibres. Figure 2B corresponds to a higher magnification from the same section stained for

elastic system, whose fibres appear roughly parallel to the epithelial lining. Note the

continuous sub-epithelial palisade of elastic system fibres (arrow heads). The superficial

layer presents only a few elastic system fibres (arrow), in contrast to subjacen

t layer that

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shows up bundles of elastic fibres (asterisk).

142x166mm (150 x 150 DPI)

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Fig. 3. Transmission electron micrograph obtained from a coronal section of an 8-month-

old fetus vocal fold. This picture illustrates the abundance of fibrous elements in the

extracellular matrix of the lamina propria midportion. Observe that elastic system fibres

(E), as well as collagen fibrils (C), appear cross-sectioned. This aspect is suggestive of a

highly organized structure formed by assembled bundles distributed in the same

direction, characterizing the ligamentous nature of connective tissue prese

nt in the vocal

fold lamina propria of the fetuses at perinatal period. The bottom region of the picture is

occupied by portions of two fibroblasts (F).

116x103mm (150 x 150 DPI)

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Fig. 4A. Horizontal section from a fetal vocal cord stained with Picrosirius photographed

under conventional illumination. The epithelium is in the upper region. A small part of the

intermacular region of lamina propria is shown. The assembled bundles formed from

collagen fibres (arrows) display the same orientation (i.e. parallel to the long axis of the

vocal fold). Note that the fibres present slight undulations (crimp) showing a wavy

appearance. This configuration is typical in structures like tendons and ligaments. The

picture 4B corresponds to an electron micrograph from a fetal vocal fold showing a

fibroblast between two mature elastic fibres (E). Ultrastructurally, they are characterized

by a central core of amorphous and homogeneous material (elastin) surrounded by

microfibrils. The right upper region of the picture is occupied by densely packed parallel

collagen fibrils (C) running in the same direction and presenting an undulatly course. This

profile corresponds to the ultrastructural pattern of the

crimped collagen fibres pointed in

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figure 4A.

120x176mm (150 x 150 DPI)

Page 17 of 14 Journal of Anatomy

INTRODUÇÃO

Introdução 2

1 INTRODUÇÃO

A evolução filogenética da laringe possibilitou ao homem, além das

funções básicas de respiração e proteção das vias aéreas, a função

fonatória. Este processo evolutivo permitiu o desenvolvimento da fala, o

principal meio utilizado pelo ser humano para a comunicação. É também

uma capacidade do ser humano o controle extremamente fino da emissão

vocal, com a produção de sons que variam em intensidade e freqüência.

Todos esses processos envolvem mecanismos complexos, desde o controle

pelo sistema nervoso central até o nível periférico, com a voz sendo

produzida através da vibração das pregas vocais na laringe e modificada

pela ressonância e articulação do trato vocal supraglótico. Porém, o estágio

inicial da produção da voz é um fenômeno puramente mecânico, diretamente

dependente da vibração adequada das pregas vocais (ISSHIKI et al., 1999).

Para que a vibração das pregas vocais possa ocorrer de modo

adequado, é necessária uma mobilidade eficiente da mucosa. HIRANO

(1974) descreveu histologicamente a estrutura em camadas da prega vocal

humana (epitélio, tecido conjuntivo e músculo vocal). Além disso, propôs a

divisão deste tecido conjuntivo em camada superficial, intermediária e

profunda. Baseado neste modelo, HIRANO desenvolveu a teoria do

complexo corpo-cobertura, segundo a qual a cobertura mucosa move-se

sobre um corpo relativamente estacionário: o músculo vocal e o ligamento

vocal.

Introdução 3

A lâmina própria corresponde ao tecido conjuntivo localizado entre o

epitélio de revestimento e o músculo vocal. Este conjuntivo não é

homogêneo, mas apresenta distintas regiões caracterizadas pela distribuição

diferencial dos elementos constituintes da matriz extracelular. Esta

compartimentalização relaciona-se diretamente com propriedades

biomecânicas (GRAY, 2000; IMAMURA et al., 2003), desempenhando um

papel importante no comportamento vibratório da prega vocal.

Os principais componentes da matriz extracelular são classificados de

acordo com seu arranjo, formando ou não estruturas fibrilares. As proteínas

fibrilares são representadas pelas fibras que constituem os sistemas

colagênico (fibras colágenas e fibras reticulares) e elástico (fibras

oxitalânicas, elaunínicas e elásticas propriamente ditas – aqui enumeradas

em gradiente crescente de elasticidade). Já o componente não fibrilar da

matriz extracelular corresponde à substância fundamental amorfa,

constituída principalmente pelos proteoglicanos, glicoproteínas e água de

solvatação.

Estes elementos conferem à matriz extracelular as suas propriedades

biomecânicas. Deste modo, a viscosidade tecidual, a elasticidade e a

capacidade de suportar forças compressivas (como a absorção de choque

do impacto entre as pregas vocais durante a vibração) devem-se aos

componentes da substância fundamental amorfa e à elastina presente nas

fibras do sistema elástico. Por sua vez, o componente colágeno é

responsável pela resistência às forças tênseis.

Introdução 4

O estudo da distribuição e a caracterização das proteínas fibrilares

nas camadas da lâmina própria são importantes para se compreender a

capacidade da prega vocal de manter a sua arquitetura sem restrição da

movimentação livre da mucosa, mesmo quando submetida a variados tipos

de forças, seja durante a sua vibração ou pela ação da musculatura

intrínseca da laringe.

A maioria dos autores baseia-se na distribuição diferencial da

substância fundamental amorfa e das fibras dos sistemas elástico e

colagênico para identificar três diferentes estratos ou camadas na lâmina

própria da prega vocal: superficial, intermediária e profunda.

As fibras colagênicas (colágenas e reticulares) têm sido

exaustivamente estudadas na lâmina própria da prega vocal, através de

métodos histológicos, bioquímicos, imuno-histoquímicos e ultra-estruturais,

tendo se estabelecido que realmente estas se apresentem distribuídas

diferencialmente na lâmina própria. Estudos mais recentes sugerem que na

camada superficial, imediatamente abaixo do epitélio, existe uma trama de

fibras colágenas densamente agregadas (colágeno I) distribuídas em todas

as direções do espaço; logo abaixo, ocorre uma zona rica em delgadas

fibras reticulares (colágeno tipo III) dispostas em forma de rede, e, mais

profundamente, na região próxima ao músculo vocal, ocorre uma camada de

fibras colagênicas densamente agregadas (colágeno tipo I).

A distribuição das diferentes fibras do sistema elástico começou a ser

estudada recentemente sob a luz dos novos conhecimentos sobre as

características tintoriais e ultra-estruturais de suas microfibrilas e da elastina.

Introdução 5

No entanto, o emprego de colorações antigas, da rotina histopatológica,

como a hematoxilina férrica de Verhoeff, permite observar que, na lâmina

própria da prega vocal do adulto, as fibras elásticas se concentram na sua

região intermediária.

Ainda que a descrição da constituição específica e dos limites de cada

uma destas camadas seja controversa na literatura, e mesmo que esteja

baseada apenas em critérios morfológicos que carecem de correlação

funcional, esta classificação tem sido a base para a definição de estruturas

anatômicas e para as correlações fisiopatológicas. Um exemplo desta

afirmação é o fato de que a estrutura denominada ligamento vocal

corresponde à associação entre as camadas intermediária (rica em fibras

elásticas) e profunda (rica em fibras colágenas).

Apesar da literatura extensa sobre a estrutura da lâmina própria das

pregas vocais em adultos, existem poucos estudos sobre pregas vocais de

fetos e crianças. A lâmina própria da prega vocal infantil é descrita como

sendo constituída por grande quantidade de substância amorfa e esparsas

fibras que não seguem um padrão de direção (SATO e HIRANO, 1995;

CAMPOS BAÑALES et al., 1995; ISHII et al., 2000; SATO et al., 2001).

Alguns trabalhos afirmam que o ligamento vocal é inexistente ao nascimento

(SATO et al., 1995; ISHII et al., 2000; SATO et al., 2001; HARTNICK et al.,

2005), permanecendo uma indefinição sobre qual exatamente a faixa etária

na qual ocorre o surgimento do ligamento vocal estruturalmente semelhante

ao do indivíduo adulto.

Introdução 6

No entanto, HAMMOND et al. (2000) foram explícitos ao descrever a

existência de fibras colágenas distribuídas de forma compartimentalizada

(como ocorre no adulto) na lâmina própria de prega vocal de crianças de 3 a

8 meses de idade, correspondendo a duas bandas de maior concentração:

uma mais superficial, logo abaixo do epitélio, e outra, mais profunda,

adjacente ao músculo vocal.

Desta forma, observamos que a informação sobre a estrutura

histológica da corda vocal infantil, além de escassa é também contraditória.

Está bem demonstrado que mesmo após o nascimento, a prega vocal

continua o seu processo de amadurecimento (HARTNICK et al., 2005). Uma

revisão da literatura sobre a estrutura da lâmina própria das pregas vocais

demonstra sua complexidade no estágio final do desenvolvimento. No

entanto, pouco se sabe sobre a organização da lâmina própria da prega

vocal ao nascimento. Acreditamos que este seja um ponto de interesse, uma

vez que, é sobre esta base estrutural que ocorrerá o desenvolvimento a

partir dos estímulos exógenos, no caso a fonação.

Além disso, do ponto de vista clínico, seria importante que

organização estrutural da lâmina própria da prega vocal fosse bem descrita

para que houvesse embasamento científico para tomada de condutas

(cirúrgicas ou não) para o tratamento das lesões que acometam as pregas

vocais na faixa etária infantil.

OBJETIVOS

Objetivos 8

2 OBJETIVOS

Tendo em vista:

a) a escassez de trabalhos na literatura sobre a estrutura da

prega vocal no período perinatal;

b) a controvérsia sobre a faixa etária na qual ocorre o

aparecimento do ligamento vocal e a compartimentalização da

lâmina própria da prega vocal humana, e

c) a importância do estudo da distribuição dos elementos fibrosos

da matriz extracelular para a compreensão da biomecânica da

vibração da prega vocal,

o objetivo deste estudo foi descrever, sob a luz dos atuais conhecimentos

sobre a matriz extracelular, o padrão de distribuição das fibras dos sistemas

colagênico e elástico na lâmina própria de pregas vocais de fetos humanos

no último trimestre da gestação, através do emprego de métodos de

identificação em microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão.

REVISÃO DE LITERATURA

Revisão de Literatura 10

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Aspectos gerais sobre o tecido conjuntivo

Os tecidos conjuntivos funcionam principalmente através de seus

componentes extracelulares, no que diferem dos demais tecidos. De fato, o

componente principal e mais abundante do tecido conjuntivo é a matriz

extracelular. Os tecidos conjuntivos são estruturas biológicas complexas,

formadas por uma variedade de componentes químicos distintos. Esses

tecidos contêm células “nativas” (como fibroblastos, condrócitos, osteócitos),

células relacionadas à atividade de patrulha imunológica (como

polimorfomonucleares, macrófagos, mastócitos), vasos sangüíneos, nervos

e toda a gama de componentes da matriz extracelular, como o colágeno (na

sua fibrilar e não fibrilar), os proteoglicanos, as fibras do sistema elástico,

glicoproteínas adesivas, além de água de solvatação e minerais. A

quantidade relativa de cada um dos componentes varia significativamente

em cada tecido conjuntivo em particular e também com a idade (PARRY e

CRAIG, 1988).

Além de fornecer o suporte estrutural para os tecidos, a matriz se

constitui em importante meio através do qual transitam informações entre as

células, participando direta ou indiretamente de uma série de processos que

incluem morfogênese, diferenciação e migração celulares. O tecido

conjuntivo também participa ativamente nos processos de reparo e fibrose,

quando ocorrem interações dinâmicas e complexas entre os elementos

matriciais. As diversas concentrações e associações dos componentes da

Revisão de Literatura 11

matriz extracelular resultam em adaptações específicas às necessidades

funcionais em cada órgão e cada componente participa na construção de

uma matriz perfeitamente talhada para as necessidades individuais das

células num determinado órgão, permitindo a manutenção da homeostase, a

diferenciação em cada estágio do desenvolvimento e adaptações face a

novos estímulos (MONTES, 1996).

3.1.1 As fibras do sistema elástico

O sistema elástico é composto por fibras elásticas, fibras elaunínicas

e fibras oxitalânicas. As fibras elásticas são conhecidas dos anatomistas há

mais de um século por suas propriedades tintoriais características, que se

devem à presença da elastina (seu principal componente - ao redor de 90%).

Em 1958, FULLMER e LILLIE descreveram as fibras oxitalânicas e, em

1965, GAWLIK descreveu um outro tipo de fibra do tecido conjuntivo à qual

denominou elaunínica.

Diversos indícios apontam para o fato de que os três tipos diferentes

de fibras do sistema elástico pertençam a uma série contínua, sendo a

ordem cronológica durante a histogênese a de fibras oxitalânicas, fibras

elaunínicas e fibras elásticas. Observações das fibras do sistema elástico

em vários animais, particularmente invertebrados, sugerem que as fibras

oxitalânicas e elaunínicas são precursoras não só ontogenéticas, mas

também filogenéticas das fibras elásticas propriamente ditas dos mamíferos

(BRADAMANTE e SVAJGER, 1977; SAGE e GRAY, 1979).

Nos três tipos de fibras ocorrem feixes de microfibrilas (denominadas

“microfibrilas da fibra elástica" por ROSS e BORNSTEIN, 1969) com

Revisão de Literatura 12

quantidades crescentes de elastina associada, segundo a seqüência:

oxitalânica, elaunínica e elástica. Outro ponto de interesse é que todas as

observações ao microscópio eletrônico mostram que as microfibrilas

constituintes das fibras oxitalânicas têm o mesmo diâmetro daquelas que

circundam o cerne de elastina presente nas fibras elásticas maduras; e

estudos imuno-histoquímicos também mostram pouca diferença entre elas

(STREETEN e LICARI, 1983; GIBSON e CLEARY, 1987).

3.1.1.1 Biossíntese e caracterização dos diferentes tipos de fibras

do sistema elástico

Ao se discutir tecidos elásticos, deve-se diferenciar os termos

“elastina” e “fibras elásticas”. A fibra elástica é a estrutura complexa

encontrada na matriz extracelular, que contém elastina, proteínas

microfibrilares, lisil-oxidase e proteoglicanos. A elastina é a proteína

predominante de uma fibra elástica madura, sendo responsável por sua

propriedade mecânica característica de recolhimento elástico. É uma

proteína quimicamente inerte e extremamente hidrofóbica, cuja resistência à

dissolução é tão grande que, antes da descoberta de seu precursor solúvel

(a tropoelastina), só era possível definir a elastina em termos operacionais e

qualitativos como o resíduo protéico insolúvel que restava após a

solubilização de todos os componentes do tecido (PARTRIDGE, 1962). Além

de suas propriedades físicas incomuns, a elastina é estável em condições

fisiológicas permanecendo nos tecidos por todo o tempo de vida do

organismo (LEFEVRE e RUCKER, 1980; SHAPIRO et al., 1991).

Revisão de Literatura 13

Apesar dos avanços na compreensão da complexidade estrutural das

microfibrilas, os mecanismos de sua efetiva participação na fibrilogênese

permanecem especulativos. O fato de que agregados de microfibrilas

assumem a forma e a orientação das supostas fibras elásticas levou ROSS

et al. (1977) a sugerir que as microfibrilas direcionariam a morfogênese das

fibras elásticas agindo como moldes para a deposição de elastina. Parece

que as microfibrilas conseguem alinhar as moléculas de tropoelastina (que é

a forma solúvel secretada pelas células) de uma maneira precisa, de modo a

justapor os locais das ligações cruzadas nas moléculas, antes que eles

possam ser oxidados pela lisil-oxidase (ROSENBLOOM et al., 1993).

Em certas regiões anatômicas específicas, encontram-se feixes de

microfibrilas (atualmente conhecidos como fibras oxitalânicas), em tecidos

que não contêm elastina, mesmo quando maduros. Em outras localizações,

mesmo em animais adultos, todos os espécimes estudados sempre

apresentam grumos de material amorfo entremeados aos feixes de

microfibrilas (padrão que corresponde ao aspecto ultra-estrutural das fibras

elaunínicas) e que nunca dão origem a fibras elásticas completamente

maduras. Estas observações mostraram que nem todos os feixes de

microfibrilas estão destinados a servir como molde para a deposição de

elastina dando origem a fibras elásticas propriamente ditas.

Com base nestes achados, COTTA-PEREIRA et al. (1976)

propuseram que as referidas fibras do sistema elástico (fibras oxitalânicas e

fibras elaunínicas) representam interrupções em estágios sucessivos do

desenvolvimento das fibras elásticas. Assim, um feixe de microfibrilas pode

Revisão de Literatura 14

tanto ser o precursor de uma fibra do sistema elástico (tenha ela moderadas

ou grandes quantidades de elastina) quanto permanecer como uma entidade

independente, própria do tecido conjuntivo (as assim chamadas fibras

oxitalânicas).

Esta foi a razão pela qual FULLMER (1960) propôs que fosse usado o

termo fibras oxitalânicas para designar as fibras que jamais dão origem a

fibras elásticas, mesmo em tecidos adultos, e que o termo fibras pré-

elásticas fosse usado no caso de tecidos elásticos em desenvolvimento,

para designar estruturas em processo de maturação.

3.1.1.2 Distribuição diferencial e características funcionais das

fibras do sistema elástico

As fibras do sistema elástico não se apresentam homogeneamente

distribuídas nos tecidos, sendo que em compartimentos distintos dos vários

órgãos seus componentes diferem tanto qualitativa quanto

quantitativamente. Com o emprego de diversos métodos de investigação, foi

demonstrada a existência de uma distribuição diferencial das fibras do

sistema elástico em vários órgãos, a saber: pele (COTTA-PEREIRA et al.,

1976; JUNQUEIRA et al., 1983), cartilagem hialina (COTTA-PEREIRA et al.,

1984), mucosa das vias aéreas (BÖCK e STOCKINGER, 1984), nervos

(FERREIRA et al., 1987) e tendões (CALDINI et al., 1990).

A existência de uma distribuição diferencial destas fibras nos tecidos é

sugestiva de que o grau variável de elasticidade que cada uma das distintas

fibras do sistema elástico apresenta, imprime versatilidade ao sistema. É a

elastina quem confere elasticidade às fibras (ROSS e BORNSTEIN, 1969),

Revisão de Literatura 15

assim, as fibras elásticas, que apresentam a maior quantidade de elastina,

têm as propriedades elastoméricas mais evidentes, já as fibras oxitalânicas

não se distendem sob tensão (ROSS, 1973) e atuam impedindo o

estiramento das estruturas presentes nas regiões onde elas ocorrem,

enquanto as fibras elaunínicas têm um grau intermediário de elasticidade

(COTTA-PEREIRA et al., 1984).

Assim, as fibras elásticas propriamente ditas aparecem como um dos

principais constituintes de tecidos conjuntivos que possuem propriedades

elastoméricas, tais como o pulmão, os ligamentos elásticos e as paredes das

artérias. As fibras oxitalânicas têm sido localizadas em regiões onde o tecido

conjuntivo está sujeito a tensões mecânicas tais como: no periodonto

humano (FULLMER e LILLIE, 1958), na junção dermo-epidérmica (COTTA-

PEREIRA et al., 1976), na zônula ciliar (STREETEN e LICARI, 1983), e

também no endoneuro de todos os nervos estudados (FERREIRA et al.,

1987), na membrana basal espessa da traquéia e da mucosa bronquiolar

humanas (BÖCK e STOCKINGER, 1984), na matriz interterritorial da

cartilagem hialina (COTTA-PEREIRA et al., 1984), nos filamentos de

ancoragem dos capilares linfáticos (GERLI et al., 1990) e na lâmina própria

dos túbulos seminíferos (BÖCK, 1978).

As fibras elaunínicas têm sido localizadas na interface entre a derme

papilar e reticular (COTTA-PEREIRA et al., 1976), na região intermediária do

"tendão elástico" do músculo eretor do pelo em humanos (RODRIGO et al.,

1975), nos anéis paralelos que rodeiam a porção secretora das glândulas

sudoríparas écrinas, na camada condrogênica do pericôndrio das cartilagens

Revisão de Literatura 16

hialinas (COTTA-PEREIRA et al., 1984), no epineuro de todos os nervos

estudados (FERREIRA et al., 1987), na camada sub-epitelial da traquéia e

da mucosa bronquiolar em humanos (BÖCK e STOCKINGER, 1984) e na

região intermediária do ligamento anular da articulação entre o estribo e a

janela oval (SOUZA et al., 1991).

A presença de fibras oxitalânicas na zônula ciliar e no ligamento

periodontal foi interpretada como uma evidência de que estes feixes de

microfibrilas podem desempenhar um papel estrutural independente de sua

função na elastogênese. As microfibrilas parecem ter uma função de

ancoragem, ligando o cristalino ao corpo ciliar no olho, conectando o osso e

o cemento do dente no ligamento periodontal e ligando a epiderme à derme

subjacente, na pele. O componente microfibrilar pode ter uma função similar

nas fibras elásticas, ancorando a elastina amorfa à matriz circundante

(GIBSON e CLEARY, 1987).

A elastina se distribui sob a forma de fibras interligadas de três modos

morfologicamente distintos: em ligamentos elásticos, nos pulmões e na pele,

as fibras são pequenas alongadas e apresentam comprimento variável; na

maioria das artérias, como a aorta, as fibras elásticas formam lâminas ou

lamelas, já nas cartilagens elásticas se observa um arranjo tridimensional de

fibras grandes, muito anastomosadas, em favo de mel (MECHAM e

HEUSER, 1991). Essas estruturas complexas e distintas parecem surgir em

conseqüência à intensidade e a direção das forças aplicadas ao tecido.

Revisão de Literatura 17

3.1.2 O sistema colagênico

Os colágenos constituem uma família de proteínas fibrosas bem

características, encontradas em todos os animais multicelulares, produzidas

por diversos tipos de células, e que se distinguem em composição química,

propriedades físicas, morfologia, distribuição nos tecidos e funções. São as

proteínas mais abundantes nos mamíferos, constituindo cerca de 25% da

sua massa protéica total.

A principal característica de uma molécula de colágeno típica,

conhecida pelos histologistas como tropocolágeno, é a estrutura longa e

rígida de sua fita tripla helicoidal na qual três cadeias polipepitídicas de

colágeno, chamadas cadeias α, estão enroladas umas nas outras

(ALBERTS et al., 2002).

Existem vários tipos de cadeia α de colágeno e, portanto existem

vários tipos de colágeno. Assim sendo, há os colágenos que formam fibrilas,

os que formam fibras, os que se associam aos colágenos fibrilares e aqueles

que formam estruturas em rede. Atualmente são conhecidos mais de 20

diferentes tipos de colágeno. Os colágenos que formam fibrilas são os tipos

I, II, III, V, VI, VII e XI; e suas estriações transversais típicas das fibrilas

colágenas são conseqüências do arranjo das moléculas de tropocolágeno

(ALBERTS et al., 2002). Tais estriações são facilmente identificadas nas

micrografias eletrônicas. Aparecem como períodos de 64 nm, cada período

formado por duas faixas, uma clara e outra escura.

Os principais tipos de colágeno encontrados nos tecidos conjuntivos

são os tipos I, II, III, IV, V e VII (ALBERTS et al., 2002). Os colágenos dos

Revisão de Literatura 18

tipos I, II, e III são os principais constituintes de fibrilas e fibras intersticiais

que contêm colágeno.

O tipo I, o mais comum, forma fibras grossas, conhecidas como

fibras colágenas, presentes no tecido conjuntivo propriamente dito, no osso,

dentina, cemento, tendão, fáscias, cápsulas dos órgãos, ligamentos, região

profunda da derme; constitui cerca de 90% do colágeno do organismo.

(MONTES, 1996). Caracteriza-se por formar fibras grossas, resistentes a

tensão, formadas por fibrilas grossas densamente empacotadas, de

diâmetro heterogêneo, com média de 50 a 60 nm. Estas fibrilas se

polimerizam e formam fibras de 2 a 10 µm de diâmetro, correspondentes às

clássicas fibras colágenas da microscopia de luz (que podem, ainda, se

associar formando feixes de fibras) e aparecem principalmente em

localizações sujeitas a grandes forças de tensão. Observadas sob

microscopia de luz, as fibras colágenas são acidófilas, corando-se de róseo

pela técnica da hematoxila-eosina, de azul pelo Tricrômio de Mallory e de

verde pelo de Masson. As fibras colágenas são birrefringentes, pois são

constituídas por moléculas alongadas e paralelas entre si. Desse modo,

quando examinadas ao microscópio de polarização, entre filtros Polaroid

cruzados, estas fibras aparecem brilhantes, contra um fundo escuro.

O colágeno do tipo II é encontrado em cartilagens elásticas e

hialinas, no humor vítreo e no estroma da córnea de embriões. Suas fibrilas

apresentam-se mais delgadas que as do colágeno do tipo I (medindo de 20

a 30 nm de diâmetro). Sua molécula é um homotrímero das cadeias alfa-1 e

interage intensamente com os proteoglicanos da matriz extracelular. Esta

Revisão de Literatura 19

interação é responsável, nas cartilagens, por sua resistência a forças

compressivas.

O colágeno tipo III, geralmente co-distribuído com o colágeno tipo I,

está presente em órgãos e tecidos que necessitam de um arcabouço

estrutural maleável, como a região superficial da pele, a camada média dos

vasos sanguíneos, a mucosa dos órgãos do trato digestório, respiratório e

reprodutor e órgãos parenquimatosos como baço, fígado, medula óssea e

pulmões. Durante os processos de reparo e nas fibroses em geral, assim

como no desenvolvimento fetal, o colágeno III é o primeiro a ser depositado,

sendo mais tarde substituído pelo colágeno do tipo I, nas regiões sujeitas a

grandes forças de tensão. O colágeno do tipo III forma fibrilas de 35 a 55 nm

de diâmetro, que são frouxamente empacotadas, com grande quantidade de

substância amorfa entre si, formando fibras frouxas e flexíveis de 0,5 a 2 µm

de diâmetro, conhecidas como fibras reticulares, devido à sua característica

de formar tramas de sustentação para células nos órgãos parenquimatosos.

Nos preparados corados pela hematoxilina-eosina, as fibras reticulares não

são visíveis, sendo sua identificação, em geral, realizada por meio de

impregnações argênticas. Em virtude de sua afinidade pelos sais de prata,

são chamadas também de fibras argirófilas do conjuntivo. Aparecem pretas

nos processos de impregnação pela prata, enquanto as fibras colágenas

tomam uma tonalidade castanha (MONTES, 1996).

O colágeno tipo IV não é um constituinte dos tecidos conjuntivos. Está

presente nas lâminas basais. Suas moléculas se organizam formando uma

espécie de malha frouxa e porosa, que interage com outras moléculas das

Revisão de Literatura 20

lâminas basais, principalmente a laminina, a fibronectina e o heparam

sulfato, porém não se polimeriza em fibrilas. É sintetizado pelas células

epiteliais, células musculares e outras células que possuem lâmina basal.

O colágeno tipo VII é o principal componente das fibrilas de

ancoragem, estruturas subepiteliais que promovem a interação biomecânica

entre as fibrilas de colágeno do tecido conjuntivo com a membrana basal

epitelial (WETZELS et al., 1991; DIKKERS et al., 1993; GRAY et al., 1995).

3.2 Estrutura histológica da lâmina própria de pregas vocais de adultos

HIRANO (1974) foi um dos pioneiros em descrever a estrutura

histológica da prega vocal e correlacioná-la com a fisiologia da produção

vocal. A partir da descrição da divisão da estrutura em epitélio, tecido

conjuntivo e músculo vocal, introduziu a teoria de corpo-cobertura para a

vibração das pregas vocais, segundo a qual a cobertura móvel, constituída

pela membrana mucosa, pode vibrar sobre o corpo estacionário, constituído

pelo músculo vocal e pela estrutura subjacente à qual denominou cone

elástico.

As extremidades anterior e posterior da porção membranosa da prega

vocal humana são denominadas, respectivamente, mácula flava anterior (ou

nódulo elástico) e mácula flava posterior, entre as quais está disposto o

ligamento vocal. A mácula flava anterior se insere no pericôndrio da

cartilagem aritenóidea através do tendão da comissura anterior; a mácula

flava posterior conecta-se ao processo vocal da cartilagem aritenóidea. Nos

adultos, ambas as máculas são compostas por grande quantidade de fibras

Revisão de Literatura 21

elásticas e de colágeno que se continuam com as do ligamento vocal (SATO

e HIRANO, 1995a,b,c; SATO et al., 2003). As máculas flavas de pregas

vocais infantis são ricas em fibroblastos que produzem muitas fibras da

matriz extracelular; esta densidade celular diminui com a idade. Com estes

achados, SATO e HIRANO (1995b,c) sugerem que as máculas flavas

desempenham um papel importante na formação do ligamento vocal.

Na lâmina própria das pregas vocais adultas, inicialmente, foram

descritas fibras colágenas grossas na região profunda da lâmina própria,

formando feixes que correm paralelos à borda livre das pregas vocais (ISHII

et al., 1996; MILUTNOVIC et al., 1998; GRAY, 2000). Posteriormente, foram

descritas tramas de fibras finas, caracterizadas como fibras reticulares, nas

camadas superficial e intermediária (SATO, 1998; SATO et al., 2002).

Recentemente, estudando a distribuição das fibras de colágeno

através do método da Picrossírius-polarização, MELO et al. (2003) mostram

a existência de duas bandas de fibras colágenas grossas densamente

organizadas: uma logo abaixo do epitélio e outra na região profunda da

lâmina própria; entre estas bandas localiza-se uma delicada rede de fibras

colagênicas finas. Uma vez que o método permite estudar a agregação e a

orientação destas fibras, os autores propõem um modelo no qual as bandas

superficial e profunda seriam os elementos de transmissão de força,

enquanto que a região central, por ser mais flexível, seria o elemento vibrátil

do sistema. Devido às características de birrefringência mostradas pelo

colágeno da prega vocal, os autores sugerem ainda que as fibras das

Revisão de Literatura 22

bandas superficial e profunda seriam constituídas por colágeno do tipo I e as

fibras finas da região central seriam compostas por colágeno tipo III.

Em relação à caracterização quanto ao tipo de colágeno presente na

lâmina própria da prega vocal, alguns estudos imuno-histoquímicos

estabelecem que colágenos dos tipos I e III encontram-se mais amplamente

distribuídos, enquanto que os tipos IV e V se localizam na membrana basal

dos epitélios de revestimento e glandulares e na lâmina basal endotelial

(TATEYA et al., 2006). PAULSEN et al. (2000) descrevem a existência de

colágeno tipos I e III nas máculas flavas e nas regiões de inserção do

ligamento vocal. Fibrilas de colágeno tipo VII estão co-distribuídas com os

outros tipos de colágeno na região mais superficial da lâmina própria e

desempenham importante função de ancoragem entre os elementos da

matriz extracelular e a lâmina basal epitelial (WETZELS et al., 1991;

DIKKERS et al., 1993; GRAY et al., 1995;). TATEYA et al. (2006)

estabelecem que as grossas fibras grossas localizadas na região superficial

da lâmina própria são constituídas por colágeno tipo I, o que confirma a

proposta de MELO et al. (2003).

Quanto à presença das fibras do sistema elástico na lâmina própria da

prega vocal humana, alguns autores referem que as fibras do sistema

elástico, de um modo geral, apresentam-se em menor quantidade na

camada superficial, com aumento da concentração na camada intermediária

e redução da concentração na camada profunda (HAMMOND et al., 1998,

RAMOS et al., 2005).

Revisão de Literatura 23

Os estudos em microscopia eletrônica de transmissão de ISHII et al.

(1996), SATO e HIRANO (1997) e HAMMOND et al. (1997) mostram que na

prega vocal estão representados os três tipos fibras do sistema elástico

(elásticas propriamente ditas, elaunínicas e oxitalânicas), sendo que na

região superficial predominam as fibras elaunínicas e oxitalânicas, enquanto

que na zona intermediária predominam fibras elásticas propriamente ditas.

Já os estudos através de microscopia eletrônica de varredura são

inconclusivos, devido à dificuldade de distinguir fibras de colágeno e fibras

elásticas entre si. ISHII et al. (1996), utilizando técnicas de digestão para a

retirada do colágeno da prega vocal e microscopia eletrônica de varredura,

sugerem que há fibras elásticas distribuídas em toda a extensão da prega

vocal, sendo mais finas na região superficial e mais grossas nas zonas

intermediária e profunda, o que vai de encontro aos achados da microscopia

eletrônica de transmissão (descritos anteriormente), uma vez que as fibras

oxitalânicas são mais delgadas que as demais.

MILUTNOVIC et al. (1998), através de microscopia de luz e eletrônica

de varredura, descreve a distribuição espacial das fibras e de outras

estruturas em pregas vocais de adultos. Sugere que a disposição de

diversas estruturas histológicas paralelamente à borda livre das pregas

vocais demonstra um alto ajuste às necessidades fonatórias durante o

processo de vibração das mesmas.

Além da descrição dos padrões de distribuição e dos tipos de fibras

da matriz extracelular na lâmina própria das pregas vocais, estuda-se a sua

influência sobre a biomecânica da vibração das mesmas. São encontradas

Revisão de Literatura 24

diferenças nas características das curvas de tensão-deformação entre as

regiões da lâmina própria, entre ambos os sexos e entre as faixas etárias,

correlacionando-se com diferenças de quantidade e qualidade das fibras

colagênicas e do sistema elástico (GRAY et al., 2000; CHAN et al., 2007).

3.3 Estrutura histológica de pregas vocais de fetos, neonatos e

crianças

Em contraste com a estrutura histológica das pregas vocais humanas

de adultos, sugere-se que durante o período fetal e ao nascimento ainda não

ocorra uma compartimentalização da lâmina própria quanto à distribuição

das fibras da matriz extracelular (SUBOTIC et al., 1984; CAMPOS BAÑALES

et al., 1995; HIRANO et al., 1999; SATO et al., 2001; HARTNICK et al.,

2005). Adicionalmente, relata-se que o ligamento vocal não está presente ao

nascimento (SATO e HIRANO, 1995b; SATO et al., 2001; HARTNICK et al.,

2005).

O papel das máculas flavas na organização da lâmina própria tem

sido considerado muito importante, inclusive sugerindo-se sua participação

como fonte de fibras da matriz extracelular para toda a estrutura (SUBOTIC

et al., 1984; SATO et al., 1995; CAMPOS BAÑALES et al., 1995; HIRANO et

al., 1999; SATO et al., 2001; SATO et al., 2003).

Alguns autores descrevem as características das fibras da matriz

extracelular presentes na lâmina própria das pregas vocais imaturas.

SUBOTIC et al. (1984) em estudo de laringes de fetos no segundo trimestre

gestacional, utilizando cortes horizontais preparados com colorações

Revisão de Literatura 25

hematoxilina-eosina, Van Gieson, combinação Mallory-Azan e Paraldeído-

fucsina para fibras elásticas, descrevem a presença de redes irregulares de

fibras reticulares e fibras de aspecto ondulado dispostas paralelamente à

borda livre e em toda a extensão da lâmina própria da prega vocal. Referem

ainda que não são encontradas fibras elásticas. CAMPOS BAÑALES et al.

(1995), em estudo no qual analisa cortes horizontais de pregas vocais de

fetos no mesmo período gestacional, utilizando técnicas de coloração com

hematoxila-eosina, Tricrômio de Masson e Van Gieson (para fibras

colágenas), Gomory (para fibras reticulares) e orceína (para fibras elásticas),

também descrevem a presença de fibras colágenas com as mesmas

características, mas referem que em suas amostras não foram encontradas

fibras reticulares. HARTNICK et al. (2005), descrevem a presença de

esparsas fibras reticulares e elásticas entremeadas a uma população celular

de grande densidade em toda a extensão da lâmina própria de pregas

vocais de neonatos.

BUHLER et al. (2007) descrevem o arranjo do colágeno na lâmina

própria de laringe de fetos, através de cortes coronais na porção média da

região membranosa das pregas vocais. Com a utilização de colorações de

hematoxilina-eosina, método da Picrossírius-polarização e imuno-

histoquímica, identificam fibras colágenas dispostas em arranjo de cesta de

vime, distribuídas por toda a sua espessura. Seus estudos morfométricos

não permitem a caracterização de uma distribuição diferencial do colágeno

nas diferentes regiões da lâmina própria.

Revisão de Literatura 26

No entanto, através do uso de medidas quantitativas relativas da

distribuição do colágeno na lâmina própria de pregas vocais, HAMMOND et

al. (2000) descrevem que já nos lactentes de 3 a 8 meses encontra-se um

padrão de distribuição do colágeno semelhante ao do adulto, principalmente

nas regiões mais superficiais, próximas ao epitélio de revestimento, e

adjacentes ao músculo vocal.

ISHII et al. (2000), em estudo no qual emprega técnicas de digestão

para a retirada do colágeno e das fibras elásticas em diferentes amostras de

prega vocal, observa em microscopia eletrônica de varredura, a presença de

duas regiões distintas na lâmina própria de pregas vocais de fetos e

neonatos, uma esparsa. Sugere que esta estrutura bilaminar deva ser uma

condição preparatória imatura, a qual será posteriormente modificada ou

reabsorvida e substituída por uma estrutura mais desenvolvida consistindo

no ligamento vocal e nas máculas flavas.

CASUÍSTICA E MÉTODOS

Casuística e Métodos 28

4 CASUÍSTICA E MÉTODOS

4.1 Aspectos éticos

Esta pesquisa foi aprovada sob o protocolo de número 132/04, pela

Comissão Análise de Projetos de Pesquisa – CAPPesq da Diretoria Clínica

do Hospital das Clínicas e da Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo, em 25 de março de 2004.

4.2 Casuística

Para o presente estudo foram utilizadas 18 laringes humanas

excisadas de cadáveres de fetos de sete a nove meses de desenvolvimento,

coletadas dentro de 24 horas após o óbito, obtidas por autópsia do Serviço

de Verificação de Óbitos da Capital, no período de novembro de 2005 a

setembro de 2007.

Foram incluídas no estudo somente peças anatômicas sem alterações

macroscópicas observáveis em região de arcabouço laríngeo ou na região

das pregas vocais. Outros critérios de exclusão foram: laringes de fetos

macerados e laringes de indivíduos com alterações congênitas de qualquer

outro órgão. A causa do óbito não foi levada em consideração.

As características dos indivíduos estudados podem ser observadas na

Tabela 1.

Casuística e Métodos 29

Tabela 1 - Características dos indivíduos incluídos na casuística

Caso Sexo Idade gestacional (meses) Altura (cm) Peso (g) Causa do óbito

1 F 7 40 2020 Indeterminada

2 M 7 35 1200 Indeterminada

3 M 7 35 900 Indeterminada

4 F 7 35 1500 Indeterminada

5 M 7 40 1600 Indeterminada

6 M 8 45 2000 Indeterminada

7 M 8 40 2400 Indeterminada

8 F 8 40 1600 Indeterminada

9 M 8 45 2000 Indeterminada

10 F 8 45 2400 Indeterminada

11 M 8 45 2200 Indeterminada

12 F 9 50 2950 Indeterminada

13 M 9 50 2600 Indeterminada

14 M 9 50 3500 Indeterminada

15 F 9 50 3400 Indeterminada

16 M 9 50 2200 Indeterminada

17 M 9 50 2800 Indeterminada

18 F 9 45 3100 Indeterminada

Após dissecção das estruturas adjacentes, a laringe foi seccionada

verticalmente em sua porção mediana, obtendo-se assim, duas hemilaringes

para preparo histológico, como pode ser observado na figura 1.

Figura 01 – Laringe de feto de 8 meses após a dissecção de

estruturas adjacentes ilustrando o processamento para obtenção

do material de estudo. A: visão frontal da laringe; B: visão posterior

da laringe, ilustrando a linha de secção para exposição das pregas

vocais. C: visão posterior da laringe após secção mostrando as

pregas vocais e a comissura anterior; as hemilaringes foram

separadas pela linha de secção marcada. D: aspecto de corte

sagital mediano de hemilaringe esquerda mostrando os planos dos

cortes histológicos obtidos para este estudo (plano horizontal

marcado em azul e plano coronal marcado em preto).

Casuística e Métodos 31

4.3 Métodos para estudo em microscopia de luz

Para estudo sob microscopia de luz, 28 hemilaringes (oito

hemilaringes de fetos de sete meses, dez hemilaringes de fetos de oito

meses e dez hemilaringes de fetos de nove meses) foram fixadas em

paraformaldeído 4% com tampão fosfato por 24 horas. Após a fixação, as

peças foram dissecadas de modo a permanecer somente a estrutura da

prega vocal, com o cuidado de se preservar as suas inserções anterior (na

cartilagem tireóidea) e posterior (na cartilagem aritenóidea). Posteriormente,

os fragmentos foram submetidos a desidratação em álcool e embebição em

parafina para confecção dos blocos.

As pregas vocais direita e esquerda foram escolhidas aleatoriamente

para cortes horizontais ou coronais. De cada fragmento escolhido foram

obtidos cortes seriados de 5µm de espessura em diferentes profundidades

do fragmento. Para comparação do conteúdo fibrilar na matriz extracelular,

conjuntos de cortes histológicos adjacentes foram processados pelos

seguintes métodos de identificação:

4.3.1 Método da Hematoxilina-Eosina

Os cortes histológicos foram corados pelo método de rotina da

Hematoxilina e Eosina (HE), para avaliação histopatológica.

4.3.2 Método da Picrossírius-polarização

Os cortes histológicos foram desparafinados, hidratados e corados

durante uma hora em uma solução 0,1% de Sirius Red (Sirius Red F 3B 200,

Casuística e Métodos 32

Mobay Chemical Co., Union, NJ, EUA) dissolvido em ácido pícrico aquoso

saturado. Os cortes foram lavados durante cinco minutos em água corrente

e contra-corados com hematoxilina de Harris fresca durante dois minutos.

Foram observados sob microscopia de luz normal e sob luz polarizada

contra um fundo escuro, para análise das fibras que contém colágeno.

Princípio fundamental do método da Picrossírius-polarização:

O corante Sirius Red é uma molécula alongada, de peso molecular

1372 Da, que possui seis grupamentos sulfônicos ácidos e quatro

grupamentos cromofóricos diazóicos. Demonstrou-se que os grupamentos

sulfônicos do corante interagem fortemente com os aminoácidos básicos das

moléculas dos diferentes tipos de colágeno, sendo assim, muito apropriado

para corar o colágeno em cortes histológicos (MONTES et al., 1985). Os

quatro grupamentos cromofóricos conferem alto índice de extinção ao

produto da interação, possibilitando a detecção, por meio de eletroforese em

gel de poliacrilamida, de 5,76 µg de colágeno/mg de proteína (LOPEZ-DE

LEON e ROJKIND, 1985).

A coloração pelo Picrossírius faz com que um grande número de

moléculas do Sirius Red (de caráter ácido e alongadas) se oriente

paralelamente ao longo do maior eixo das moléculas de colágeno,

promovendo o aumento considerável da birrefringência natural das fibrilas e

fibras de colágeno, quando observadas sob luz polarizada (JUNQUEIRA et

al., 1979; MONTES, 1996). O aumento da birrefringência promovido pelo

método da Picrossírius-polarização é portanto específico para as estruturas

Casuística e Métodos 33

colágenas compostas por agregados de moléculas orientadas. Desse modo,

quando examinadas ao microscópio de polarização, entre filtros Polaroid

cruzados, estas fibras aparecem brilhantes, contra um fundo escuro.

4.3.3 Método de Resorcina-Fucsina de Weigert com prévia

oxidação pela oxona

Esta é uma coloração para elastina, que demonstra fibras elásticas,

elaunínicas e oxitalânicas conferindo-lhes uma cor púrpura. O procedimento

foi realizado segundo MONTES (1996).

Preparo do corante:

Um grama de fucsina básica e dois gramas de resorcina foram

adicionados a 100 mL de água destilada aquecida, fervidos até a dissolução

completa. Após, foram adicionados 25 mL de uma solução de cloreto férrico

30% preparada recentemente. A fervura foi continuada por quatro minutos.

Após resfriamento e filtragem da solução, o precipitado acumulado no papel

de filtro foi secado em um forno elétrico a 56º. C. Em seguida, dissolveu-se o

total de precipitado em 100 mL de etanol 95% aquecido. Após resfriamento

foi adicionado 1 mL de ácido hidroclorídrico concentrado (HCl).

Método:

Os cortes histológicos foram desparafinados e levados até água,

tratados com solução aquosa de Oxona a 10% (composto monopersulfato,

Du Pont, Wilmington, Delaware, EUA) por 40 minutos. Depois de lavados em

água corrente por cinco minutos, foram lavados em uma série de etanol de

concentrações de 70 a 95%, e colocados na solução corante por uma hora

Casuística e Métodos 34

em temperatura ambiente. Após este tempo na solução corante, foram

lavados em água corrente por cinco minutos, a coloração de fundo foi

removida por meio de uma solução de álcool etílico 1% (1 mL de HCl

concentrado e 99 mL de etanol 70%) por alguns segundos e os cortes

observados ao microscópio de luz, com o cuidado de evitar a descoloração

das fibras mais finas. Os cortes foram lavados em água corrente e

desidratados em álcool, diafanizados e montados.

4.4 Método para estudo em microscopia eletrônica de transmissão

O material utilizado na obtenção dos cortes ultrafinos constituiu-se de

pequenos fragmentos de tecido de diferentes regiões de prega vocal de

quatro indivíduos (um feto de sete meses, um de oito meses e dois de nove

meses), e foi processado seguindo rotina utilizada no Laboratório de Biologia

Celular da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, resumida

nas seguintes etapas: 1) Fixação por imersão em solução de glutaraldeído

(Polaron, Watford, Inglaterra) 2,0%, em tampão fosfato de sódio e potássio

0,15 M, pH 7,2. A fixação deu-se durante 2 horas, à temperatura ambiente.

2) Lavagem em Solução de Lavagem (NaCl 6,0g, sacarose 73,0 g, água

destilada 1000 ml). 3) Pós-fixação numa solução de OsO4 (Tetróxido de

ósmio anidro; Fisher, New York, EUA) a 1,0%, em solução de lavagem,

durante 1 hora, a 4°C. 4) Rápida lavagem, seguida de pós-fixação por 18

horas em solução de acetato de uranila (Reidel e Haen, Hannover,

Alemanha) 0,5%, dissolvido na mesma solução de lavagem. 5) Desidratação

em gradiente de etanol (50%, 70%, 90% e 100%) durante 1 hora. 6) Pré-

Casuística e Métodos 35

embebição processada em misturas de etanol e resina (1:1, 1:2 e 1:3)

durante 3 horas e embebição em resina pura durante 24 horas.

A resina utilizada para inclusão foi Araldite (Ladd Research Industries,

Inc., Burlington, Vermont, EUA). Os fragmentos de tecido incluídos foram

mantidos em estufa a 58°C durante 72 horas. Os blocos foram cortados em

um ultramicrótomo LKB (modelo 8800 ultratome III), com a obtenção de

cortes semifinos (1µm) que foram corados a quente (a aproximadamente

70°C) em solução de Azul de Toluidina (Carbonato de Sódio 1,25g, Azul de

Toluidina O (E.Merck, Alemanha) 0,50g e água destilada 50,00 ml).

Cortes ultrafinos, prateados, de aproximadamente 70 nm de

espessura, foram obtidos no mesmo ultramicrótomo e contrastados por

acetato de uranila a 2,0%, durante 30 minutos, e por citrato de chumbo a

0,5%, durante 10 minutos. O material foi estudado e micrografado em

microscópio eletrônico Jeol, operado a 80 KV, no Centro Multiusuário de

Microscopia Eletrônica do Laboratório de Biologia Celular do Hospital das

Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (LIM 59).

RESULTADOS

Resultados 37

5 RESULTADOS

5.1 Distribuição das fibras dos sistemas colagênico e elástico

O material obtido por autópsia mostrou-se suficientemente íntegro

para permitir o estudo histológico da lâmina própria das pregas vocais em

todos os espécimes coletados.

Os achados foram os mesmos em todas as amostras,

independentemente da idade fetal ou do sexo. Em secções horizontais de

pregas vocais, observamos no nível glótico, com a coloração de HE, sua

extensão completa desde a cartilagem tireóidea até a inserção na cartilagem

aritenóidea. Observamos a estrutura em camadas classicamente descrita na

literatura, constituída por epitélio, lâmina própria e músculo vocal. Nos fetos,

a coloração pela HE revelou uma lâmina própria constituída por tecido

conjuntivo frouxo entre o processo vocal da cartilagem aritenóidea e a

cartilagem tireóidea, com a qual está conectada através do tendão da

comissura anterior. A presença das máculas flavas anterior e posterior,

classicamente descritas na literatura também foram confirmadas. Nos cortes

submetidos a esta coloração não foi possível distinguir nenhuma estrutura

com aspecto de ligamento ou compartimentalização em camadas na lâmina

própria (Figuras 2 e 3).

Os cortes histológicos de prega vocal fetal corados com Picrossírius e

observados com luz convencional permitiram evidenciar uma grande

quantidade de fibras de colágeno na lâmina própria. Quando estes cortes

foram estudados em microscopia de polarização, estas fibras mostraram-se

Resultados 38

como estruturas birrefringentes brilhando contra um fundo escuro com

distribuição heterogênea na lâmina própria: na região mais superficial da

lâmina própria e imediatamente superficial ao músculo observou-se maior

birrefringência (sugerindo áreas de maior concentração de fibras de

colágeno), enquanto que, na região central, observou-se uma fraca

birrefringência, sugerindo pequena concentração de estruturas colagênicas

(Figuras 4 a 5). Esta distribuição diferencial do colágeno permitiu

caracterizar uma compartimentalização da lâmina própria da prega vocal

fetal.

Quanto à inserção da prega vocal na cartilagem tireóidea, o método

da Picrossírius-polarização permitiu observar que as duas regiões ricas em

colágeno na lâmina própria são contínuas com tendão da comissura anterior

e separadas entre si pela ocorrência da mácula flava anterior (Figura 6).

Os cortes teciduais corados pelo método de resorcina-fucsina de

Weigert após oxidação permitiram observar a distribuição diferencial das

fibras do sistema elástico na lâmina própria da prega vocal. Na região central

intermacular, notou-se um acúmulo de fibras do sistema elástico

organizadas paralelamente ao maior eixo da prega vocal. Além disso,

observou-se a presença de uma lâmina de fibras elásticas, também

paralelas entre si região, imediatamente na zona sub-epitelial (Figuras 7, 8 e

9).

Assim como as fibras colagênicas, as fibras do sistema elástico

presentes na lâmina própria da prega vocal também se continuaram com as

estruturas localizadas anterior e posteriormente. Na região anterior, esta

Resultados 39

continuidade se deu em toda a região da mácula flava (Figura 10), com

inserção no tendão da comissura anterior, enquanto que na região posterior

as fibras se inseriram na cartilagem elástica do processo vocal (Figura 11).

Os achados da microscopia eletrônica confirmaram as observações

feitas na microscopia de luz. Na região superficial da lâmina própria, a

microscopia eletrônica revelou a presença de fibras de colágeno formadas

por fibrilas densamente empacotadas, entremeadas por alguns perfis de

fibras do sistema elástico (Figura 12). Na região central da lâmina própria, as

fibras do sistema elástico predominaram nas imagens, ao lado de finas fibras

de colágeno (Figura 13).

O estudo detalhado, ao nível ultra-estrutural, permitiu observar que os

três tipos de fibras do sistema elástico (elásticas propriamente ditas,

elaunínicas e oxitalânicas) estavam presentes na lâmina própria da prega

vocal fetal (Figuras 14 e 15).

5.2 Aspecto ondulado das fibras de colágeno

Em todos os espécimes estudados, o método da Picrossírius-

polarização mostrou grande quantidade de fibras de colágeno de aspecto

ondulado distribuídas pela lâmina própria da prega vocal (Figura 16). A

microscopia eletrônica confirmou estes achados, revelando a co-localização

das fibras colágenas onduladas e das fibras do sistema elástico (Figura 17).

Supõe-se que esta configuração permite o alongamento da fibra de colágeno

mesmo com pequenas forças de tensão até o ponto em que as ondulações

Resultados 40

desapareceriam. O retorno ao padrão ondulado inicial ocorreria pela ação

das fibras elásticas que se recolhem quando cessam as forças de tensão.

5.3 Interação entre as células e as fibras da matriz extracelular

As microfibrilas que compõem as fibras do sistema elástico

apareceram em muitas localizações interagindo com a superfície celular,

com as fibrilas de colágeno e com a lâmina basal do epitélio de revestimento

(Figuras 18, 19 e 20, respectivamente), reforçando a idéia de que funcionam

como fibras de ancoragem da matriz extracelular. Na região da lâmina basal

foi possível observar também a presença de fibrilas de colágeno tipo VII, que

ancoram proteínas da lâmina basal às finas fibrilas de colágeno subjacentes

(Figura 21).

Figura 2 – Corte histológico horizontal de prega vocal direita de feto de 8 meses,

corado com HE. A prega vocal pode ser visualizada em toda sua extensão ântero-

posterior, desde a cartilagem tireóidea (CT) até o processo vocal (PV) da cartilagem

aritenóidea (CA) e em toda sua extensão latero-medial, desde o músculo vocal (MV)

até o epitélio de revestimento (seta preta). Conectando a prega vocal à cartilagem

tireóidea, observa-se o tendão da comissura anterior (TCA).

A lâmina própria (LP) compreende a região de tecido conjuntivo localizada entre o

epitélio de revestimento e o músculo vocal. Através desta coloração este tecido

conjuntivo pode ser classificado pelos critérios da Histologia Clássica, como tecido

conjuntvo frouxo, que se caracteriza pela escassez de fibras da matriz extracelular e

maior densidade de células.

As máculas flavas aparecem como duas regiões de maior concentração celular nas

extremidades anterior (mácula flava anterior, MFA) e posterior (mácula flava posterior,

MFP) da prega vocal.

Figura 3 – A imagem corresponde a um aumento maior de um corte histológico

equivalente ao mostrado na Figura 2, evidenciando parte da mácula flava anterior

(MFA). As células das máculas mostram-se densamente agrupadas com núcleos

arrendondados, enquanto que o restante da lâmina própria as células estão

distribuídas esparsamente e apresentam núcleos fusiformes. A matriz extracelular da

lâmina própria, observada neste maior aumento, apresenta delgadas fibras esparsas

(evidentes na região marcada com asterisco). Estas fibras estão coradas em róseo

pela eosina e podem ser caracterizadas como fibras colágenas. Notar que não é

possível identificar nenhuma compartimentalização da lâmina própria que fosse

definida pela distribuição diferencial dos seus elementos.

MFA

MFP LP

TCA

Figura 4 – Corte histológico corado com Picrossírius, contracorado pela Hematoxilina,

e observado com luz convencional. Notar que este corte é adjacente àquele mostrado

na Figura 2. O Picrossírius cora o colágeno fibrilar em vermelho profundo, que aparece

destacado na lâmina própria. Comparar a melhor definição do colágeno com esta

técnica em relação à coloração pelo HE, mostrada na Figura 2. Deste modo, é

possível identificar na lâmina própria (LP) duas regiões com maior concentração de

fibras de colágeno: uma mais próxima ao epitélio de revestimento e outra adjacente ao

músculo vocal (MV). Estas regiões estão marcadas com asteriscos.

Figura 5 – Quando o mesmo corte corado pelo Picrossírius é observado em

microscopia de polarização, a birrefringência normal do colágeno aparece intensificada

e as estruturas que contém colágeno mostram-se como estruturas birrefringentes

brilhando contra um fundo escuro. O aumento de birrefingência nos cortes corados

pelo Picrossírius estudados sob luz polarizada se mostra específica para o colágeno.

Reparar que as mesmas regiões da lâmina própria, também apontadas com

asteriscos na Figura 4 como ricas em colágeno, mostram-se com intensa

birrefringência. Notar que estas faixas de fibras colagênicas se continuam, por um

lado, com o pericôndrio da cartilagem aritenóidea (CA) e, pelo outro lado, com o

tendão da comissura anterior (TCA). A região central da lâmina própria (assinalada

com uma barra) mostra apenas algumas fibras de colágeno fracamente

birrefringentes.

TCA

200µm

Figura 6 –. Imagem mostrando do mesmo corte histológico mostrado na Figura 5, em

aumento maior. A região central da figura é ocupada pela mácula flava anterior (MFA).

Observar que as faixas de maior concentração de colágeno (asteriscos) contornam a

mácula flava anterior e se inserem no tendão da comissura anterior (TCA). Notar a

riqueza de fibras colágenas do tendão, que aparecem como uma compacta massa de

fibras colágenas grossas, orientadas paralelamente entre si, desde a mácula flava

anterior até o pericôndrio da cartilagem tireóidea (CT). A barra assinala a região do

ligamento vocal como definida na literatura; com esta técnica é possível evidenciar a

porção colagênica do ligamento vocal já desenvolvida na camada profunda da lâmina

própria.

Figura 7 – Corte histológico horizontal de prega vocal de 8 meses, corado com

Resorcina-fucsina com oxidação prévia. Com esta coloração é possível evidenciar

simultaneamente todos os tipos de fibras do sistema elástico. Notar que esta

micrografia corresponde a um maior aumento se comparado ao da Figura 6. Aqui vê-

se somente a região intermacular da prega vocal. A barra assinala a região do

ligamento vocal como definida na literatura; com esta técnica é possível evidenciar a

porção elástica do ligamento vocal já desenvolvida na camada intermediária da lâmina

própria, localizada entre os dois estratos ricos em colágeno (asteriscos, ver Figuras 5

e 6). Reparar que na região sub-epitelial é possível observar a presença de uma

delgada zona rica em fibras do sistema elástico (seta vermelha); MV: músculo vocal.

MFA

TCA

100µm

Figura 8 - Corte coronal de região intermacular de prega vocal esquerda de feto de 7

meses, corado com Resorcina-fucsna com oxidação prévia. A distribuição das fibras

do sistema elástico pode ser facilmente evidenciada nesta micorgrafia de maior

aumento. Uma vez que estas fibras se organizam paralelamente ao maior eixo da

prega vocal, é possível observá-las cortadas transversalmente nos cortes coronais.

A letra E marca o epitélio de revestimento. Reparar as fibras do sistema elástico

alinhadas na região sub-epitelial (seta vermelha). O restante da figura corresponde à

região da lâmina superficial da lâmina própria (asterisco), que possui esparsas fibras

do sistema elástico. Esta é uma região dominada por grande quantidade de fibras

colagênicas, como demonstrado nas Figuras 4, 5 e 6.

Figura 9 –Micrografia do mesmo corte da Figura anterior, obtida da região central da

lâmina própria. É possível observar uma grande quantidade de perfis transversais de

fibras do sistema elástico, que preenchem esta região pobre em fibras colagênicas,

como demostrado nas Figuras 4, 5 e 6.

Figura 10 - Micrografia de corte horizontal da prega vocal de feto de 9 meses de

idade, corado com Resorcina-fucsina, após oxidação. Notar que as fibras do sistema

elástico (seta) se dispõem ao longo do maior eixo da prega vocal e se continuam com

aquelas da mácula flava anterior (MFA). Esta região é especialmente rica em fibras do

sistema elástico. Notar que estas fibras são mais escassas no tendão da comissura

anterior (TCA).

Figura 11 – Micrografia obtida do mesmo corte histológico da figura anterior,

mostrando a região posterior da prega vocal. Notar na extremidade da cartilagem

aritenóidea a presença do processo vocal (PV), que se caracteriza pela grande

quantidade de fibras elásticas, correspondendo à descrição de cartilagem elástica pela

Histologia Clássica. Nesta localização, as fibras do sistema elástico se continuam com

àquelas presentes na mácula flava posterior (MFP), que por sua vez, se continuam

com as fibras presentes na região central da lâmina própria. Reparar que a mácula

flava posterior contém menor quantidade de fibras do sistema elástico que a mácula

flava anterior (ver figura 10).

MFA

TCA

MFP

Figura 12 – Micrografia eletrônica da região superficial da lâmina própria de prega

vocal de feto de 9 meses. A Figura mostra parte do citoplasma de dois fibroblastos (F)

rodeados pela matriz extracelular. As fibras de colágeno (C) aparecem constituídas

por suas fibrilas (a maioria delas cortadas transversalmente). Reparar que as fibras do

sistema elástico (setas) mostram-se como delgadas fibras de perfil compacto

imiscuídas por entre as fibras de colágeno.

Figura 13 – Micrografia eletrônica de outro fragmento da mesma prega vocal

mostrada na figura anterior. Esta imagem é representativa do aspecto observado na

região central da lâmina própria de todos os espécimes estudados. Nesta região

também são encontrados fibrblastos (F) como o principal tipo celular presente. O

componente colágeno (C) aparece sob a forma de fibras formadas por fibrilas finas

dispostas em várias direções do espaço (aparecem em perfis longitudinais e

transversais). Observam-se grossas fibras do sistema elástico (E), cortadas

transversalmente, que pela compactação do seu cerne amorfo de elastina, podem ser

classificadas como fibras elásticas propriamente ditas (maduras).

1µm

Figura 14 – Micrografia eletrônica de grande aumento mostrando parte de um

fibroblasto (F) e componentes da matriz extracelular ao seu redor, principalmente

fibrilas de colágeno (C) e parte de uma fibra elástica propriamente dita (E). Essa

apresenta-se constituída por grande quantidade de material amorfa (elastina) e alguns

componentes microfibrilares ao seu redor. Notar a interação existente entre estas

microfibrilas da fibra elástica e a membrana celular (seta).

Figura 15 – Micrografia eletrônica de um fragmento de lâmina própria da prega vocal

fetal. A matriz extracelular presente entre as duas porções celulares (fibroblastos, F)

apresenta fibrilas de colágeno cortadas transversalmente (C) e diferentes perfis de

elementos do sistema elástico. Na periferia do fibroblasto da região superior esquerda

da figura aparecem fibras oxitalânicas (Ox), constituídas apenas por microfibrilas,

enquanto que na periferia do fibroblasto embaixo à direita, observa-se uma fibra

elaunínica (Eln), composta por microfibrilas e acúmulos esparsos de elastina amorfa.

Eln

Figura 16 – Corte histológico horizontal de prega vocal humana de feto de 8 meses,

corado com Picrossírius-hematoxilina, observado em luz convencional. As setas

apontam algumas das fibras de colágeno presentes na lâmina própria que exibem

perfil ondulado (crimp). Esta configuração é típica de estruturas como tendões e

ligamentos.

Figura 17 - Micrografia eletrônica de prega vocal de feto de 8 meses. Observar a

presença de uma fibra de colágeno com aspecto ondulado. Este padrão é facilmente

diagnosticado em microscopia eletrônica uma vez que uma mesma fibra apresenta

regiões em corte transversal (à direita da letra C) e outras em corte longitudinal (à

esquerda da letra C). Observar que a presença de uma fbra elástica propriamente dita

adjacente à fibra de colágeno e a um fibroblasto (F).

50µm

3 µm

Figura 18 – Micrografia eletrônica de gradíssimo aumento obtida de prega vocal de

feto de 9 meses, mostrando um prolongamento celular revestido externamente por

microfibrilas do sistema elástico (seta). Estas são inestensíveis e conferem resistência

mecânicas às estruturas nas quais se inserem.

Figura 19 – Micrografia eletrônica de grande aumento obtida de prega vocal de feto de

8 meses, mostrando um conjunto de fibras elaunínicas (Eln) e várias fibrilas de

colágeno cortadas transversalmente (C). No centro da figura é possível observar que

as microfibrilas de uma das fibras elaunínicas interagem diretamente com uma fibrila

de colágeno (que aparece cortada longitudinalmente, seta).

Eln

0.5 µm

Figura 20 - Micrografia eletrônica de prega vocal obtida de feto de 9 meses. Na

região superior da imagem é possível observar a partes da porção basal de duas

células do epitélio de revestimento (Epit.). Estas estão separadas do tecido conjuntivo

(TC) subjacente pela lâmina basal (setas curtas). Observar uma longa fibra

oxitalânica (setas), cortada longitudinalmente, que se insere na lâmina basal.

Figura 21 - Micrografia eletrônica de região superficial da prega vocal obtida de feto

de 9 meses. È possível observar a lâmina basal (setas curtas) que separa as células

do epitélio de revestimento (Epit.) do tecido conjuntivo subjacente (TC). Logo abaixo

da lâmina basal, notam-se fibrilas de ancoragem constituídas por colágeno tipo VII

(seta vermelha). Essas fibrilas promovem a interação biomecânica entre as fibrilas de

colágeno do conjuntivo (seta roxa) e a lâmina basal, especificamente nas regiões em

que aparecem os hemidesmossos na célula epitelial. Os hemidesmossos

correspondem a estruturas especializadas de adesão entre a célula epitelial e a lâmina

basal. Os hemidesmossos ancoram, do lado citoplasmático, os filamentos de

citoqueratina da célula epitelial (asteriscos), enquanto que, do lado da matriz

extracelular, interagem com as proteínas da lâmina basal, garantindo a continuidade

molecular entre o tecido epitelial e o tecido conjuntivo. Uma vez que as fibrilas de

colágeno VII (vistas nesta figura), juntamente com as fibras oxitalânicas (mostradas na

Figura anterior) se inserem diretamente na lâmina basal, sugere-se que estas

estruturas constituam a base morfofuncional sobre a qual se dá a transdução do sinal

biomecânico célula-matriz e vice-versa.

Epit

1 µm

0.5µm

DISCUSSÃO

Discussão 52

6 DISCUSSÃO

O principal objetivo deste estudo foi obter informações a respeito das

fibras do sistema elástico e colagênico (sob a luz dos conhecimentos atuais

sobre a matriz extracelular), na lâmina própria de pregas vocais fetais no

período perinatal.

Os resultados histoquímicos coincidem com as observações da

microscopia eletrônica, mostrando populações de colágeno segregadas em

diferentes compartimentos da lâmina própria. Assim, em sua região central,

as fibras de colágeno se mostraram finas, fracamente birrefringentes de

coloração esverdeada enquanto que as regiões superficiais e profundas

apresentaram fibras grossas de colágeno que mostraram uma forte

birrefringência de cor vermelho-amarelada, quando estudadas através do

método da Picrossírius-polarização. Estas características sugerem

fortemente que as fibras finas da região central são compostas

principalmente por colágeno tipo III, enquanto o colágeno tipo I predomina

nas regiões superficial e profunda, em concordância com as observações da

literatura relativa ao estudo da prega vocal de adultos (HAMMOND et al.,

2000; MELO et al., 2003).

Assim como o componente colagênico, as fibras do sistema elástico

mostraram uma distribuição diferencial ao longo da lâmina própria. Em certo

sentido, esta distribuição foi complementar àquela das fibras de colágeno: a

região central, na qual fibras colagênicas eram escassas e finas, apresentou

Discussão 53

maior densidade de fibras do sistema elástico, em comparação às regiões

superficial e profunda.

É difícil determinar as contribuições individuais dos componentes

biológicos às propriedades biomecânicas. Como os tecidos conjuntivos

apresentam predominantemente uma função mecânica, é importante se

compreender como os constituintes químicos (colágeno,

glicosaminoglicanos, fibras elásticas, minerais e água) fornecem ao tecido

seus atributos mecânicos. No entanto, estas características variam entre os

diferentes tipos de tecidos conjuntivos. Por exemplo, os tendões possuem

um conteúdo maior de colágeno, fibrilas orientadas e menor quantidade de

glicosaminoglicanos; outros tecidos especializados, tais como o ligamento

nucal, são ricos em fibras elásticas e suas propriedades mecânicas são

intensamente influenciadas por este componente (PARRY e CRAIG, 1988).

Em termos de sua função mecânica, os tecidos conjuntivos devem

apresentar combinações apropriadas de dois atributos básicos – a

habilidade de resistir a grandes forças tênseis ou compressivas e a

habilidade de recuperar sua forma e posição quando as forças cessam.

A acústica da fonação depende criticamente da biomecânica da

vibração das pregas vocais, a qual é ditada pela interação das forças

glóticas aerodinâmicas com as propriedades biomecânicas dos tecidos

constituintes da prega vocal. A morfologia e a razão entre fibras elásticas e

colágeno são consideradas como os principais fatores que determinam as

propriedades físicas de cada camada da prega vocal.

Discussão 54

Neste sentido, as fibras elásticas longitudinais permitem uma rápida

restauração da prega vocal para a posição original após seu estiramento

longitudinal pela contração do músculo cricotireóideo. Assim sendo, as fibras

elásticas desempenhariam um papel importante no mecanismo fonatório por

restaurar rapidamente o tom natural da prega vocal.

É interessante observar que o presente estudo mostrou que as

inserções da prega vocal nas extremidades anterior e posterior são

diferentes entre si: enquanto que, na extremidade anterior, o tendão da

comissura é rico em fibras colágenas e possui poucos elementos do sistema

elástico, o processo vocal da extremidade posterior é uma região que, por

sua natureza simultaneamente cartilaginosa e elástica, não apresenta fibras

de colágeno (apenas fibrilas), sendo porém, rica em elementos elásticos.

Certamente, estas características teciduais conferem propriedades

biomecânicas diferentes às duas extremidades da prega vocal. Uma vez que

a região posterior apresenta maior mobilidade promovendo a adução

durante a fonação e a abdução para permitir a respiração é de se esperar

que a estrutura apresente uma grande capacidade de retornar à sua posição

original, de maneira rápida e eficiente.

As fibras colagênicas da lâmina própria sofrem estiramento a cada

alongamento da prega vocal; a grande concentração de fibras elásticas na

inserção posterior da prega vocal permitiria que esta região de intensa

movimentação recuperasse rapidamente sua forma e posição, de modo a

proporcionar a capacidade de adaptação necessária para que a regulação

Discussão 55

fina da contração da musculatura intrínseca da laringe seja traduzida de

maneira extremamente rápida e eficaz em variações da qualidade vocal.

Os cortes horizontais corados com Picrossírius mostram que as fibras

colagênicas apresentaram um padrão morfológico ondulado (crimp). Que

seja do nosso conhecimento, esta observação é inédita na prega vocal, tanto

para jovens como para adultos. De modo geral, as fibras colágenas de

tendões e ligamentos apresentam crimps quando estão no estado relaxado;

estes crimps desaparecem quando o tecido é estirado. Este fato demonstra

a importância da existência dos crimps como um mecanismo de

complacência através do qual a pequena variação do comprimento

resultante do alongamento das regiões de colágeno “crimpado” previne o

dano à estrutura como um todo durante o estágio inicial de uma contração

muscular vigorosa (CALDINI et al., 1990; FEITOSA et al., 2002).

Segundo estudos biomecânicos, a presença de crimps das fibras

colagênicas permite que ocorra seu estiramento mesmo com pequena força

aplicada até o ponto em que os crimps se alongam. A partir deste ponto, a

quantidade de força necessária para se conseguir um mesmo grau de

estiramento torna-se comparativamente muito maior. Esta organização

estrutural do colágeno é característica de ligamentos, tendões e de tecidos

localizados em regiões submetidas a forças tênseis no organismo (SHAH et

al., 1977), atuando de modo a manter a integridade estrutural, capacidade

de alongamento e elasticidade dos tecidos.

Estes conceitos podem ser aplicados à prega vocal, uma vez que esta

é submetida a forças constantes, de diferentes tipos, intensidades e

Discussão 56

velocidades conforme a atividade da musculatura intrínseca da laringe.

Nossos achados demonstraram que, desde a idade fetal, a prega vocal

humana apresenta uma estrutura preparada a submeter-se a forças de

tensão. A presença de fibras elásticas dispostas paralelamente às fibras

colagênicas com crimp levam à suposição que estas podem ser

responsáveis pelo retorno do colágeno à sua configuração original após a

retirada da força de alongamento, o que em última instância promoveria o

retorno à configuração original da estrutura como um todo (CALDINI et al.,

1990).

A melhor compreensão das contribuições biomecânicas das

diferentes proteínas fibrilares presentes nas pregas vocais poderia facilitar a

bioengenharia de construção de tecidos e materiais implantáveis para o

tratamento de distúrbios vocais. Assim, é interessante que se conheça a sua

organização ao nascimento, além das modificações sofridas ao longo da

vida.

Nossos achados indicaram que, já em fetos de sete meses de idade,

a lâmina própria da prega vocal humana apresenta uma complexa

organização estrutural de suas fibras, muito semelhante àquela encontrada

no adulto. Em contraste com a descrição clássica na literatura para pregas

vocais de fetos e neonatos, encontramos uma organização estrutural na

região central da lâmina própria que pode ser considerada semelhante

àquela do ligamento vocal descrito em adultos.

Ainda que CAMPOS BAÑALES et al. (1995) tenham considerado que

o ligamento vocal do adulto corresponde somente à faixa de tecido

Discussão 57

conjuntivo rico em fibras elásticas, a maioria dos autores considera que o

ligamento vocal é constituído pelas camadas intermediária e profunda da

lâmina própria (SATO e HIRANO, 1995; HIRANO et al., 1999; GRAY, 2000).

Assim sendo, a descrição clássica consagrada preconiza que o ligamento

vocal é composto por fibras colágenas densamente empacotadas e por

fibras elásticas. Estas fibras estão alinhadas paralelamente e cursam na

direção ântero-posterior entre a cartilagem tireóidea e o processo vocal da

cartilagem aritenóidea.

O fato de que nossos resultados mostraram a presença de grande

quantidade de fibras do sistema elástico na camada central da lâmina

própria e grande quantidade de fibras colágenas na região profunda da

lâmina própria permite afirmar que o ligamento vocal já está presente ao

nascimento com a mesma organização estrutural do adulto.

Do ponto de vista clínico, mesmo nos dias atuais, os critérios de

indicação e princípios da fonomicrocirurgia em idade infantil não estão bem

estabelecidos. Alguns autores indicam que deve-se evitar ao máximo a

manipulação cirúrgica das pregas vocais infantis pelo fato do ligamento vocal

não estar completamente formado; outros sugerem que as lesões devem ser

removidas para que o seu desenvolvimento histológico não seja

comprometido. Além disso, atualmente os estudos indicam que não é só a

manipulação do ligamento um fator crucial no sucesso de uma

fonomicrocirugia. A presença dos proteoglicanos e os componentes da zona

da membrana basal são fatores que devem ser levados em consideração,

portanto futuros estudos complementares sobre a estrutura das pregas

Discussão 58

vocais infantis seriam necessários. Uma vez que nossos resultados

mostraram a semelhança estrutural da prega vocal fetal com àquela do

adulto, acreditamos que a indicação e a realização de fonomicrocirurgia em

crianças devam seguir os mesmos fundamentos daqueles dos adultos.

O fato de que, somente este nosso trabalho tenha observado a

distribuição diferencial dos elementos fibrosos na matriz extracelular da

lâmina própria da prega vocal fetal pode ser atribuído a algumas razões: (1)

é necessário estudar esta distribuição utilizando cortes horizontais de prega

vocal, como aqueles deste trabalho, de forma a evidenciar, em um único

preparado histológico, toda sua extensão ântero-posterior; (2) é necessário

aplicar os diferentes métodos histoquímicos específicos para identificação

das fibras da matriz extracelular em cortes histológicos seriados, para que a

comparação dos resultados fornecidos por cada um dos métodos possa ser

feita de maneira fidedigna.

Pela técnica de hematoxilina-eosina, tanto as fibras do sistema

elástico quanto as finas fibras de colágeno não são identificados, como

pudemos comprovar em nossos achados. Para identificação das fibras do

sistema elástico foram utilizados, até o momento, técnicas de coloração que,

embora consagradas para rotina histopatológica (como a hematoxilina férrica

de Verhoeff, a orceína e a aldeído-fucsina) apresentam uma sensibilidade

inferior ao método da resorcina-fucsina aplicado após oxidação do corte

histológico. O método de Verhoeff demonstra seletivamente as fibras

elásticas totalmente maduras, porém as fibras elaunínicas e oxitalânicas não

são coradas. Por outro lado, o método de resorcina-fucsina de Weigert é

Discussão 59

mais sensível e assim, também cora fibras elaunínicas. Fibras oxitalânicas

permanecem indetectáveis a menos que sejam antes oxidadas (MONTES,

1996).

Enquanto nas secções coradas pelo Picrossírius o colágeno adquire

uniformemente a cor vermelho profundo (tornando possível definir

precisamente sua distribuição), em secções coradas pela técnica

rotineiramente usada do Tricrômio de Mallory, Masson e van Gieson, o

colágeno é corado irregularmente, com coloração de algumas fibras e de

outras não, o que dificulta a demonstração, de forma inequívoca, de sua

presença (JUNQUEIRA e MONTES, 1983).

De modo a contornar estas dificuldades, utilizamos neste estudo

métodos histoquímicos que permitiram a identificação dos três tipos de fibras

do sistema elástico e do colágeno fibrilar. Além disso, realizamos

observações ultra-estruturais em microscópio eletrônico de transmissão, que

permitem o diagnóstico inequívoco dos diferentes tipos de fibras da matriz

extracelular, além de evidenciar a interação dos diversos componentes entre

si e com as células.

A grande quantidade de tempo despendida na observação das

lâminas histológicas e na caracterização de diferentes compartimentos da

lâmina própria nos levou a uma visão crítica das descrições morfológicas

encontradas na literatura. Um dos pontos que merece atenção é a clássica

divisão da lâmina própria em três camadas (superficial, intermediária e

profunda). Embora a camada superficial de fibras colágenas seja bem

definida já no feto de sete meses, não foi possível a distinção do limite entre

Discussão 60

a camada profunda da lâmina própria e o epimísio do músculo vocal. Neste

ponto nossas observações concordaram com HAMMOND et al. (2000),

estudando a prega vocal adulta. Com base nestas observações, pode-se

sugerir que, talvez, a camada profunda da lâmina própria corresponda

simplesmente ao epimísio do músculo vocal. Esta proposta ganha

consistência quando se observa que as fibras da matriz extracelular desta

camada profunda penetram no músculo vocal, separando os fascículos

musculares, como é classicamente descrito para as bainhas conjuntivas

(epimísio, perimísio e endomísio) que revestem qualquer tecido muscular.

Estas ponderações nos levam a acreditar que as análises quantitativas da

distribuição dos elementos da matriz extracelular nas diferentes camadas da

lâmina própria devam ser interpretadas com cautela.

O conceito corrente de que os estímulos externos, como a fonação,

são essenciais para a determinação da estrutura em camadas da lâmina

própria, faz com que nossos resultados sejam surpreendentes ao evidenciar

a presença de uma distribuição complexa e organizada dos componentes do

tecido conjuntivo na lâmina própria de pregas vocais de fetos no período

perinatal. A idéia de que a contribuição genética poderia desempenhar um

papel importante na organização destas camadas, independentemente do

estímulo mecânico, poderia explicar melhor a presença das estruturas

observadas já ao nascimento, uma vez que o mecanismo genético pode agir

antes de qualquer estímulo mecânico externo, como a fonação.

O padrão de distribuição diferencial das fibras dos sistemas

colagênico e elástico sugere fortemente que o colágeno em co-evolução

Discussão 61

com o sistema elástico (e provavelmente com outras macromoléculas da

matriz extracelular) têm contribuído amplamente para acomodar a

diversidade funcional (MONTES, 1996). De fato, na prega vocal ainda no

período perinatal, foi possível detectar os três tipos de fibras do sistema

elástico. A diferença na qualidade da elasticidade apresentada por estas

fibras, desde as oxitalânicas (inelásticas) até as fibras elásticas com muita

elastina, confere uma característica multi-facetada ao sistema.

A matriz extracelular da prega vocal fetal apresenta exuberantes

elementos ancoragem: as fibrilas de colágeno VII estavam presentes em

grande quantidade na região da lâmina basal e as microfibrilas das fibras

oxitalânicas apareceram ancoradas na lâmina basal do epitélio, na superfície

celular, nas fibrilas de colágeno e em outras estruturas da matriz.

A interação dos elementos da matriz entre si e com as células faz

com que a estrutura se comporte funcionalmente como um todo e

corresponde à base morfológica do fenômeno de transdução dos estímulos

mecânicos da matriz para as células. A comunicação dinâmica entre as

células e os componentes da matriz influencia processos celulares como

migração, proliferação e sobrevivência, regula os processos de diferenciação

e reparo tecidual, além de modular a resposta celular a fatores de

crescimento e citocinas (FUJA et al., 2006).

O conhecimento sobre a interação entre as células da prega vocal e a

matriz extracelular circundante poderá contribuir muito na compreensão do

desenvolvimento normal da laringe, de suas patologias e no

desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas.

CONCLUSÕES

Conclusões 63

7 CONCLUSÕES

Em contraste com a descrição clássica na literatura para pregas

vocais de fetos e neonatos, nossos resultados histoquímicos coincidentes

com as observações da microscopia eletrônica evidenciaram a presença de

um padrão de distribuição diferencial das fibras da matriz extracelular na

prega vocal humana fetal. Este padrão mostrou-se equivalente à descrição

da lâmina própria da prega vocal de adultos. Adicionalmente, a observação

da presença de grande quantidade de fibras do sistema elástico na camada

central da lâmina própria e grande quantidade de fibras colágenas na região

profunda da lâmina própria permite afirmar que o ligamento vocal já está

presente ao nascimento com a mesma organização estrutural do adulto.

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