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IVAN BIANCHI
Pelotas, 2007
Congelamento de sêmen suíno: estudo de
crioprotetores intra e extracelulares, metodologias de
congelamento e marcador molecular de
congelabilidade
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola
TESE
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IVAN BIANCHI
Congelamento de sêmen suíno: estudo de
crioprotetores intra e extracelulares, metodologias de
congelamento e marcador molecular de
congelabilidade
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia Agrícola
da Universidade Federal de Pelotas,
como requisito parcial à obtenção do
título de Doutor em Ciências (área do
conhecimento: Biotecnologia Agrícola).
Orientador:
Marcio Nunes Corrêa, Dr.
Prof° Adjunto, UFPEL
Co-Orientadores:
João Carlos Deschamps, PhD
Prof° Titular, UFPEL
Thomaz Lucia Jr., PhD
Prof° Adjunto, UFPEL
Pelotas, 2007
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Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901
Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
B577c Bianchi, Ivan
Congelamento de sêmen suíno: estudo de
crioprotetores intra e extracelulares, metodologias
de congelamento e marcador molecular de
congelabilidade / Ivan Bianchi ; orientador Marcio
Nunes Corrêa ; co-orientador João Carlos
Deschamps, Thomaz Lucia Jr. – Pelotas, 2007. –
94f. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia Agrícola. Centro de
Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas.
Pelotas, 2007.
1.Biotecnologia. 2.Amidas. 3.Suínos. 4.Sêmen
congelado. 5.Criopreservação. 6.Glicerol. I.Corrêa,
Marcio Nunes II.Deschamps, João Carlos. III.Lucia
Jr., Thomaz. IV.Titulo.
CDD: 636.408245
4
BANCA EXAMINADORA
Eraldo Lourenso Zanella, PhD
Prof° Adjunto, UPF
Fernando Pandolfo Bortolozzo, PhD
Prof° Associado, UFRGS
João Carlos Deschamps, PhD
Prof° Titular, UFPEL
Thomaz Lucia Jr., PhD
Prof° Adjunto, UFPEL
Marcio Nunes Corrêa, Dr.
Prof° Adjunto, UFPEL (Orientador)
5
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho...
Ao meu pai...
Vilson Caetano Bianchi (In memorian), pelo seu exemplo de bondade,
humildade, honestidade, generosidade e trabalho durante toda sua vida.
Pai, Sempre sentirei sua presença junto de mim...
A minha família...
Minha mãe Helena Bianchi e minha irmã Sílvia Bianchi pelo apoio que sempre
me deram.
Vocês são muito importantes na minha vida, que Deus sempre as ilumine...
A minha esposa...
Louise Trindade de Oliveira por todo seu carinho, incentivo, amor e sonhos
que temos para nossa vida juntos. Te admiro muito...
Lu, Sinceramente, Te Amo...
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AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal de Pelotas (UFPEL) e ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia Agrícola (PPGBA) pela oportunidade de realizar o
curso de Pós-Graduação.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão da bolsa de estudos.
Ao orientador Prof° Marcio Nunes Corrêa pela confiança depositada em
mim, seu exemplo de empenho, sinceridade, seu entusiasmo contagiante e amizade
durante todo o tempo.
Ao co-orientador Prof° João Carlos Deschamps pela valiosa orientação,
opiniões e sugestões no trabalho, seu exemplo de simplicidade além de nossas
conversas que muito contribuíram para o meu amadurecimento e formação.
Ao co-orientador Prof° Thomaz Lucia Jr. pela grande amizade, ensinamentos
transmitidos e momentos de descontração nos tempos vagos em todos esses anos
de convivência.
Aos membros da banca de Qualificação (Prof°
s
Eraldo Lourenso Zanella,
João Carlos Deschamps, Thomaz Lucia Jr. e Marcio Nunes Corrêa) e aos membros
desta banca de Defesa de Tese (integrantes da banca de qualificação além do Prof°
Fernando Pandolfo Bortolozzo) pela disponibilidade e colaborações para o trabalho.
A todos que participaram da realização das nove edições do “Curso Latino
Americano Teórico-Prático de Processamento de Sêmen e Inseminação Artificial em
Suínos” através do qual proporcionou os recursos financeiros para a realização do
projeto.
A todos que neste período participaram do Grupo PIGPEL, meus sinceros
agradecimentos pela colaboração na execução dos trabalhos, especialmente a
Kérlim Calderam, Elisângela Mirapalheta Madeira e Éder Francisco Maschio (fiéis
7
escudeiros), Rafael da Rosa Ulguim, Arlan Perondi, Naiana Oliveira Martins, Carine
Dahl Corcini, Fernando Rocha e José Luís Corezzolla.
Aos colaboradores do Centro Agropecuário da PALMA, local de alojamento
dos animais utilizados nos experimentos.
Aos colegas e amigos do Grupo de Pesquisa em Embriologia Molecular e
Transgênese Animal (EMTA) Tiago Collares, Paulo Varoni Cavalcanti, Vinicius
Farias Campos, Gissele Rambo, Priscila Marques Moura de Leon, Elisa Caroline da
Silva Santos pela valiosa ajuda nos experimentos.
A Empresa IRGOVEL que forneceu a alimentação dos animais utilizados nos
experimentos durante todo o tempo do trabalho.
As Empresas: Grupo Extremo Sul (Granja RETIRO) e Frigorífico CASTRO
pela fundamental parceria na realização do experimento In vivo.
As Empresas GENSUL Inseminação Artificial e IMV – IVP Brasil que
forneceram parte do material de consumo para os experimentos realizados.
Aos Professores da Universidade Estadual Paulista (UNESP-Botucatu/SP),
Drª Fernanda da Cruz Landim Alvarenga e Dr. Marco Antonio Alvarenga, além do
doutorando Antonio Sylvio Lopes de Medeiros pela importante ajuda na definição
dos crioprotetores e avaliações de fluorescência.
Ao Engenheiro Agrônomo Luis Antônio Suita de Castro da EMBRAPA Clima
Temperado pela realização dos trabalhos de Microscopia Eletrônica.
Aos laboratórios do Centro de Biotecnologia (CENBIOT) pela disponibilidade
da infra-estrutura e materiais utilizados na realização dos trabalhos.
Aos meus amigos e colegas de pós-graduação Érico Kunde Corrêa e
Géferson Fischer pelos trabalhos realizados e amizade conquistada.
Aos meus grandes amigos Érico Kunde Corrêa, Marcus Vinicius Figueira de
Alvarenga, Eduardo Schmitt, Marcelo Brandi Vieira, Vinícius Coitinho Tabeleão,
Lucas de Castilho Cadore, Rangel Guzzo, Rafael de Almeida, Roberta Dalmolin
Bergoli e Luciano Baroni, pelo incentivo em todos os momentos.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a
realização deste trabalho.
A graça da vida...
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EPÍGRAFE
“Somente a Educação poderá transformar um país verdadeiramente...”
Cristovam Buarque
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RESUMO
BIANCHI, Ivan. Congelamento de sêmen suíno: estudo de crioprotetores intra e
extracelulares, metodologias de congelamento e marcador molecular de
congelabilidade. 2007. 94f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia Agrícola. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Apesar do sêmen suíno congelado estar disponível comercialmente deste 1975, o
seu uso tem ocorrido somente em ocasiões específicas, pois, em relação ao uso de
sêmen refrigerado, requer duas a três vezes maior número de espermatozóides por
dose, o processamento do sêmen é trabalhoso, o tamanho da leitegada é diminuído
em um a três leitões por parto e a taxa de parição é menor. Dessa forma, a grande
maioria das inseminações artificiais nessa espécie utiliza sêmen diluído e
acondicionado no estado líquido entre 15 e 18 ºC. Os objetivos desta tese foram:
avaliar diferentes diluidores de resfriamento, metodologias de congelamento,
temperaturas de centrifugação, uso de crioprotetores intracelulares a base de
amidas e extracelulares baseados em lipoproteína de baixa densidade, além do
estudo de fatores protéicos presentes no plasma seminal nos resultados de
avaliações in vitro e in vivo de sêmen suíno congelado-descongelado. Foram
executados cinco experimentos com avaliações da qualidade do sêmen congelado-
descongelado, quatro experimentos com avaliações in vitro (motilidade e integridade
de membrana) e um experimento com fertilização in vivo. O tratamento utilizado
como controle foi o congelamento com glicerol na concentração de 3%. A melhor
curva de resfriamento após a coleta até 15 °C, foi atingida com o tempo de 120 min.
Foi identificado um fator de 26 kDa no plasma seminal, cuja ausência proporcionou
melhores resultados de integridade de membrana plasmática após o
descongelamento. O uso do crioprotetor intracelular dimetilacetamida na
concentração de 5%, proporcionou nas avaliações in vitro, resultados superiores ao
tratamento controle (glicerol 3%), não diferindo na avaliação in vivo. O presente
estudo demonstrou a relação de componentes do plasma seminal com a qualidade
espermática, além de apresentar um novo protocolo de congelamento-
descongelamento de sêmen suíno baseado no uso de dimetilacetamida 5%.
Palavras-chave: Amidas. Sêmen congelado. Suíno. Criopreservação. Glicerol.
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ABSTRACT
BIANCHI, Ivan. Freezing of boar semen: study of penetrating and
nonpenetrating cryoprotectants, freezing methods and freezability molecular
marker. 2007. 94f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia Agrícola. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Although boar semen is available in the frozen format since 1975, its use has been
restricted to very specific situations for many reasons: it requires spermatozoa
concentration per dose twice to three times higher than that for cooled semen; semen
processing is labor intensive; and farrowing rate and litter size are reduced. Thus,
most of the artificial inseminations in swine are performed at the day of semen
collection or at most at the following day, using liquid semen conditioned between 15
and 18 ºC. The aims of this thesis were: to evaluate distinct extenders for cooling
semen, methods for freezing, centrifugation temperatures, the use of amides as
penetrating cryoprotectants and of low density lipoprotein as nonpenetrating
cryoprotectants, and the presence of specific protein factors in seminal plasma in the
results that could be associated with boar semen freezability. Five experiments have
been executed: four with evaluations in vitro (motility and cell membrane integrity);
and one with fertilization in vivo. The control treatment was the freezing with glycerol
at 3% concentration. The semen processing method that provide more efficient
results consisted of semen cooling during 120 min up to a centrifugation temperature
of 15 °C. We also identified a 26 kDa factor in the seminal plasma that is associated
with maintenance of the integrity of the sperm cell membrane post-thawing.
Additionally, parameters of semen quality in vitro with the use of dimetilacetamide at
5% were better than those observed with the most used penetrating cryoprotectant
(glycerol 3%) as control, although no difference between those cryoprotectants was
observed in vivo. This study demonstrated the association of components in the
seminal plasma with the sperm quality, and presenting an alternative protocol of
semen freezing-thawed boar semen based in the use of dimetilacetamide at 5%.
Keywords: Amides. Frozen semen. Swine. Cryopreservation. Glycerol.
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SUMÁRIO
Página
Banca Examinadora_________________________________________________ 4
Dedicatória ________________________________________________________ 5
Agradecimentos ____________________________________________________ 6
Epígrafe ___________________________________________________________ 8
Resumo ___________________________________________________________ 9
Abstract _________________________________________________________ 10
Sumário __________________________________________________________ 11
1. Introdução Geral ________________________________________________ 12
2. Objetivos _______________________________________________________ 16
3. Artigo I: Efeito de diferentes diluidores e períodos de resfriamento sobre a
motilidade de sêmen suíno criopreservado ____________________________ 17
4. Artigo II: Evaluation of cryoprotectant properties of different amides in the boar
semen freezing __________________________________________________ 31
5. Artigo III: Efeito do uso de gema de ovo e lipoproteína de baixa densidade na
criopreservação de sêmen suíno ____________________________________ 47
6. Artigo IV: Inseminação artificial pós-cervical de leitoas com sêmen suíno
criopreservado utilizando dimetilacetamida e glicerol ____________________ 58
7. Artigo V: Identificação de um fator de 26 kda no plasma seminal associado a
integridade de membrana de espermatozóides suínos pós-descongelamento _ 73
8. Conclusões Gerais ______________________________________________ 87
9. Considerações Finais ____________________________________________ 88
10. Referências ____________________________________________________ 91
1
2
1. INTRODUÇÃO GERAL
A grande maioria das inseminações artificiais (IA) em suínos realizadas no
mundo utiliza sêmen diluído e acondicionado no estado líquido entre 15 e 18 ºC, por
um período de 1 a 5 d, sendo que 85% destas são realizadas no dia da coleta do
sêmen ou no dia seguinte (JOHNSON et al., 2000). Entretanto, a temperatura de
estocagem de 15 a 18 °C limita o transporte do sêmen, pois exige caixas térmicas
específicas para esta faixa de temperatura, além de restringir o tempo de vida útil do
sêmen. Alguns diluentes têm sido desenvolvidos a fim de possibilitar o
prolongamento no tempo de estocagem do sêmen de 3 para 5-7 d (LEVIS, 2000), ou
o seu armazenamento a 5 °C (CORRÊA et al., 2004). Ainda que a utilização da IA
em suínos esteja aumentando, sua expansão poderia ser incrementada se técnicas
como a criopreservação (congelamento) do sêmen possibilitasse adequados
resultados de fertilidade, tal como ocorre na espécie bovina (DESCHAMPS et al.,
1997; WATSON, 2000). Afora esta questão, a IA e o sêmen congelado apresentam
vantagens de relevada importância para os sistemas de produção, pois favorecem o
uso em escala de animais geneticamente superiores (BORTOLOZZO et al., 2005;
GERRITS et al., 2005). No entanto, apesar do sêmen suíno congelado estar
disponível comercialmente deste 1975, o seu uso tem ocorrido somente em ocasiões
específicas, como em casos de importação de genética, visando à produção de
reprodutores (JOHNSON e LARSSON, 1985). A IA com sêmen suíno congelado
requer duas a três vezes mais espermatozóides por dose, o processamento do
sêmen é trabalhoso, o tamanho da leitegada é diminuído em um a três leitões por
parto e a taxa de parição é menor. Esses fatores inviabilizam economicamente seu
uso em sistemas de produção, quando comparada a IA com sêmen acondicionado
refrigerado na forma líquida (JOHNSON, 1985; ERIKSSON et al., 2001; ROCA et al.,
2003; SARAVIA et al., 2005).
1
3
A diminuição da fertilidade do sêmen suíno congelado é resultado de danos
na capacidade funcional dos espermatozóides devido ao choque térmico
(ALTHOUSE et al., 1998; JOHNSON et al., 2000; WATSON, 2000). Outro aspecto
relevante, diz respeito ao estresse osmótico provocado pela adição das soluções
crioprotetoras que provocam a desidratação celular ocasionando altas
concentrações intracelulares de sais (BALL e VO, 2001). As alterações decorrentes
do choque térmico e estresse osmótico irão provocar alterações estruturais e
funcionais da célula espermática (PURSEL et al., 1972; PURSEL e JOHNSON,
1975; BUHR, 1991; BUHR et al., 1994). Tais alterações implicam em um efeito
negativo sobre a motilidade espermática e sobre trocas metabólicas através das
membranas celulares, que podem influenciar negativamente os processos de
capacitação espermática e o mecanismo de fertilização (WATSON, 1996; NARDID
et al., 1997), ou até mesmo levar à morte celular (DE LEEUW et al., 1991; WATSON,
1996).
A composição da membrana plasmática do espermatozóide suíno difere da
membrana plasmática de outros mamíferos, tais como o touro, que são mais
resistentes ao congelamento. Essa diferença está relacionada ao tipo de fosfolipídio
predominante e à relação colesterol/fosfolipídio (PARKS e LYNCH, 1992). As
espécies de animais cujos espermatozóides possuem maior resistência ao
congelamento, contêm uma alta relação colesterol/fosfolipídio na membrana (BUHR
et al., 1994; BUHR et al., 2000).
Para o congelamento de sêmen são utilizados crioprotetores intracelulares e
extracelulares, cuja finalidade é proteger a célula espermática das lesões
provocadas pelo congelamento e descongelamento celular (KAROW, 2005). O
princípio da técnica de congelamento celular consiste na diminuição do metabolismo
e na desidratação da célula através do uso de crioprotetores intracelulares (baixo
peso molecular) e extracelulares (alto peso molecular). Essas soluções
crioprotetoras normalmente têm um caráter de hiperosmolaridade que reduzem o
ponto de congelamento para –5 a –7 ºC, interagem e estabilizam as membranas
celulares e atuam como tampão salino no combate aos efeitos deletérios das altas
concentrações de eletrólitos nas células desidratadas (DE LEEUW et al., 1993;
NICOLA, 1997).
Os protocolos de congelamento para sêmen suíno convencionalmente
utilizados, baseiam-se no método descrito por Westendorf et al. (1975), em que o
1
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plasma seminal é retirado somente quando a curva de resfriamento atingir 15 °C, e
no protocolo de Paquignon et al. (1974), pelo qual imediatamente após a coleta do
ejaculado é feita à remoção do plasma seminal através de centrifugação. Ambos os
métodos utilizam o glicerol como crioprotetor intracelular e a gema de ovo como
crioprotetor extracelular. No entanto, o glicerol em determinadas concentrações, tem
um potencial efeito citotóxico na célula espermática em detrimento das suas
características benéficas como crioprotetor (ALMLID e JOHNSON, 1988; HOLT,
2000; WATSON, 2000). Além disso, os radicais hidroxila do glicerol podem ligar-se
entre si, diminuindo a probabilidade de ligações com as moléculas de água, sendo
assim, uma característica desfavorável ao processo de criopreservação (WOWK et
al., 1999). Dessa forma, a ineficiência do congelamento do sêmen suíno é também
atribuída aos crioprotetores e diluentes utilizados, sugerindo que outras soluções
crioprotetoras e metodologias de congelamento sejam testadas (KUSTER e
ALTHOUSE, 1999; BUHR et al., 2000; MEDEIROS et al., 2002b).
Estudos com a utilização de crioprotetores em substituição ou associação
com o glicerol têm sido conduzidos com obtenção de bons resultados em eqüinos,
através do uso de diferentes amidas (MEDEIROS et al., 2002a; VIDAMENT et al.,
2002). A dimetilacetamida é um crioprotetor largamente utilizado nos protocolos de
criopreservação de espermatozóides de peixes (CABRITA et al., 1998; OGIER DE
BAULNY et al., 1999) e de aves (TSELUTIN et al., 1999), trazendo benefícios a
estas espécies na resposta pós-descongelamento.
As amidas possuem um mecanismo de ação crioprotetor diferente do
glicerol, devido sua estrutura molecular e sua habilidade de permear a membrana
celular. O mecanismo de ação das amidas é devido seu grupamento funcional
amina, o qual contém nitrogênio, portanto, quimicamente distinto do grupamento
funcional do glicerol que são as hidroxilas. As amidas realizam ligações de
hidrogênio com a molécula da água em três sítios de ligação. Além disso, devido ao
menor peso molecular e viscosidade das amidas em relação ao glicerol, elas
possuem maior permeabilidade de membrana, diminuindo a possibilidade de danos
celulares causados por estresse osmóticos (BALL e VO, 2001). Desta forma
supõem-se que as amidas possuam uma forma mais eficaz de realizar a coligação
com a molécula da água, desempenhando um mecanismo crioprotetor celular mais
eficiente que o glicerol (BALL e VO, 2001; KAROW, 2001). Entretanto, estes
crioprotetores intracelulares não têm sido testados para sêmen suíno.
1
5
Como crioprotetor externo, a gema de ovo é usualmente adicionada aos
diluidores dos protocolos de congelamento de sêmen suíno (PAQUIGNON et al.,
1974; WESTENDORF et al., 1975). Entretanto, a gema de ovo contém substâncias
que podem dificultar o metabolismo, diminuindo a motilidade espermática (PACE e
GRAHAM, 1974), além de ter risco de contaminação por microorganismos, por se
tratar de um composto de origem orgânica (BOSSEAU et al., 1998). O efeito
crioprotetor da gema de ovo é dado pela fração de lipoproteínas de baixa densidade
(LDL), as quais atuam na superfície da membrana plasmática restaurando a perda
de fosfolipídios e colesterol (BERGERON et al., 2004). A substituição da gema de
ovo por LDL foi benéfica para a manutenção da qualidade espermática em sêmen
de cães, quando preservado a temperatura de refrigeração a 5°C ou congelado
(VARELA JÚNIOR, 2005). Enquanto que LDL na concentração de 8% pode
substituir a gema de ovo na composição do diluente utilizado para criopreservar
sêmen eqüino (MARTIN, 2005). A ação crioprotetora da LDL purificada da gema de
ovo (MOUSSA et al., 2002) na preservação de espematozóides suínos foi estudada
por DEMANIOWICZ e STRZEZEK (1996) com o uso de sêmen refrigerado, portanto,
em estado líquido. Entretanto, este crioprotetor extracelular pouco tem sido testado
para o congelamento de sêmen suíno.
Outro fator importante relacionado ao uso de sêmen congelado é a grande
variabilidade observada entre machos, cujos fatores que influenciam as diferenças
observadas na sobrevivência espermática e aos processos de congelamento e
descongelamento, ainda não estão bem elucidados (ROCA et al., 2006).
Alguns autores (JOBIM et al., 2004) sugerem que há diferenças nas
proteínas do plasma seminal de touros com boa e má resposta ao congelamento,
sugerindo o estudo dessas proteínas do plasma como marcadores de
congelabilidade. A influência do plasma seminal na qualidade espermática é
contraditória, tendo sido observado que a sua presença provocou maior
sensibilidade ao choque térmico (PURSEL et al., 1972). Porém, em outro estudo a
remoção do plasma não interferiu na viabilidade pós-descongelamento (SALAMON,
1973). No entanto, as diferenças observadas na congelabilidade entre machos
suínos, podem ser atribuídas à influência genética, podendo ser identificada através
de marcadores de moleculares do ejaculado (THURSTON et al., 2001; THURSTON
et al., 2002).
1
6
2. OBJETIVOS
Os objetivos desta tese foram:
1. Verificar o efeito de diferentes diluidores e períodos de estabilização durante o
resfriamento do sêmen, sobre a motilidade pré-congelamento e após o
descongelamento;
2. Estudar a criopreservação de sêmen suíno através do uso de crioprotetores
intracelulares a base de amidas, em diferentes concentrações, relacionados
com a motilidade e integridade da membrana plasmática no sêmen
descongelado;
3. Avaliar o uso de diferentes temperaturas de centrifugação do sêmen sobre os
parâmetros de motilidade e integridade da membrana plasmática após o
descongelamento;
4. Identificar marcadores moleculares no plasma seminal, relacionados com a
integridade de membrana plasmática do sêmen descongelado;
5. Analisar o uso de gema de ovo e lipoproteína de baixa densidade (LDL) na
composição dos diluidores utilizados no resfriamento e congelamento do
sêmen, sobre a motilidade e integridade da membrana plasmática após o
descongelamento;
6. Comparar a fertilidade in vivo de sêmen suíno congelado à base de amida em
relação ao uso de glicerol.
1
7
3. ARTIGO I: Efeito de diferentes diluidores e períodos de
resfriamento sobre a motilidade de sêmen suíno criopreservado
Submetido: Revista Brasileira de Reprodução Animal
(Formatado segundo as normas da revista)
Ivan Bianchi; Marcio Nunes Corrêa; Thomaz Lucia Jr., Érico Kunde Corrêa;
Kérlin Calderam; João Carlos Deschamps
1
8
Resumo
O objetivo deste trabalho foi comparar o uso de diferentes diluidores e períodos de
estabilização utilizados no pré-congelamento, sobre a motilidade do sêmen suíno
após o congelamento. Foram utilizados durante o resfriamento do sêmen até 15 °C,
dois diluentes com crioprotetor extracelular na composição: PIGPEL-5 (gema de
ovo) e PIGPEL+ (lipoproteína de baixa densidade) e um diluente sem crioprotetor
(BTS). Também foram utilizados dois períodos de estabilização até 15 °C: padrão
(270 min) e curto (120 min). A motilidade a 5 °C e pós-descongelamento (10 e 30
min) foi maior (P < 0,05) para o BTS, em relação a PIGPEL-5 e PIGPEL+. A
motilidade no resfriamento curto foi superior (P < 0,05) ao padrão a 5 °C e pós-
descongelamento. O uso de diluente sem crioprotetor extracelular foi mais eficiente
no período de resfriamento até 15 °C, enquanto que a redução do período de
estabilização foi associado a melhora da qualidade do sêmen descongelado.
Palavras-chave: Lipoproteína de baixa densidade, gema de ovo, criopreservação,
sêmen suíno.
Abstract
The aim of this study was to compare the use of different extenders and stabilization
periods before freezing on the motility of boar semen after thawing. Two extenders
were used during cooling up to 15 °C including different nonpenetrating
crioprotectants: PIGPEL-5 (egg yolk) and PIGPEL+ (low density lipoprotein) and one
extender without crioprotectant (BTS). Also, two stabilization periods were tested:
control (270 min) and short (120 min). The motility at 5°C and post-thawing (10 and
30 min) was better (P < 0.05) for BTS than for both PIGPEL-5 and PIGPEL+. The
motility was better (P < 0.05) after short cooling than for the control both at 5 °C and
post-thawing. The use of extender without nonpenetrating crioprotectant was more
efficient during the stabilization period and the short cooling was associated with
better motility post-thawing.
Keywords: Low density lipoprotein, egg yolk, cryopreservation, boar semen.
1
9
Introdução
O sêmen suíno refrigerado entre 15-18 °C é utilizado na maioria das
inseminações artificiais (IA). Os índices de fertilidade com IA são similares aos
obtidos com monta natural, quando o sêmen refrigerado é utilizado até 72 h após o
início do armazenamento, mas aproximadamente 85% das IA são realizadas no dia
da coleta do sêmen ou no dia seguinte (Johnson et al., 2000). O diluente mais
utilizado para sêmen suíno refrigerado é o Beltsville Thawing Solution (BTS),
desenvolvido por Pursel & Johnson (1975) inicialmente para sêmen congelado,
sendo, posteriormente, adaptado para o acondicionamento de sêmen à 15-18 ºC.
Alguns diluentes foram desenvolvidos para permitir maior tempo de armazenagem
de 5-7 d (Levis, 2000), ou a 5 °C (Corrêa et al., 2004).
A IA e o congelamento do sêmen são biotécnicas reprodutivas importantes
para aumentar a eficiência de produção dos rebanhos, especialmente devido ao uso
em maior escala de animais geneticamente superiores (Bortolozzo et al., 2005;
Gerrits et al., 2005). Porém, durante os processos de resfriamento, congelamento e
descongelamento os espermatozóides são expostos a várias situações adversas a
sua homeostase, tornando-se susceptíveis aos choques térmico e osmótico, que
podem promover alterações estruturais e funcionais na célula espermática, com
prejuízos para a motilidade e nas trocas que ocorrem através da membrana
plasmática (Buhr, 1991; Buhr et al., 1994). Em função destas injúrias celulares, pode
ocorrer o comprometimento dos processos de capacitação e fertilização (Hinkovska-
Galcheva et al., 1989; Hofmo & Almlid, 1991; Watson, 1996; Nardid et al., 1997), ou
mesmo a morte celular (De Leeuw et al., 1991; Watson, 1996).
Apesar do uso de sêmen suíno congelado ter sido disponibilizado desde
1975, nas IA de rotina em granjas ele não é difundido, em função da obtenção de
taxas de parição de 50-70% e de um total de 7-10 leitões nascidos por leitegada, o
que é consideravelmente inferior aos índices obtidos com sêmen refrigerado. Além
disso, doses inseminantes de sêmen congelado exigem número de espermatozóides
duas a três vezes maiores do que com sêmen refrigerado, para compensar os
possíveis danos celulares associados ao congelamento (Johnson, 1985; Wagner &
Thibier, 2000; Eriksson et al., 2001).
A maioria dos protocolos de congelamento utilizados atualmente é baseada
no método descrito por Westendorf et al. (1975) (WE), no qual o plasma seminal é
retirado quando a curva de resfriamento atingir 15 °C. O sêmen suíno, antes do
2
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congelamento, precisa passar por um período de estabilização (tempo de
resfriamento), para que os componentes do diluente possam interagir com as
estruturas moleculares da membrana da célula espermática, e também para que
estas estruturas se adaptem à exposição a baixas temperaturas, com a finalidade de
aumentar a resistência espermática ao choque térmico (Garcia Casado et al., 2001).
No protocolo WE, a gema de ovo é adicionada aos diluidores, a fim de proteger a
membrana da célula espermática das injúrias provocadas por baixas temperaturas,
especialmente abaixo de 15 °C. O efeito crioprotetor da gema de ovo é dado pela
fração de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (Watson, 1981; Bergeron et al.,
2004). A ação crioprotetora da LDL purificada da gema de ovo sobre a preservação
de sêmen suíno foi comprovada por Demaniowicz & Strzezek (1996). O diluente
PIGPEL-5 (Corrêa et al., 2004), desenvolvido para o acondicionamento de sêmen
suíno a 5 °C, possui 2% de gema de ovo na sua composição.
Os resultados insatisfatórios obtidos com sêmen suíno congelado, em geral,
são atribuídos à ineficiência dos diluentes e crioprotetores, o que sugere que novas
soluções crioprotetoras e métodos diferentes de congelamento devam ser testados
(Kuster & Althouse, 1999; Buhr et al., 2000).
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes crioprotetores bem
como de métodos de congelamento sobre a motilidade do sêmen suíno.
Material e Método
Coleta de amostras
Foram utilizados dois machos suínos cruzados (Landrace x Large White)
com aproximadamente 18 meses de idade, os quais apresentavam fertilidade
conhecida e eram mantidos em baias individuais, sob as mesmas condições
ambientais, na Estação Experimental da Palma, Universidade Federal de Pelotas.
Foram coletados dez ejaculados de cada macho. As coletas foram
realizadas através do método da mão-enluvada (Bearden & Fuquay, 1997a), usando
um copo plástico protegido por um copo isotérmico recoberto por gaze, a fim de
separar a fração do ejaculado rica em gel. Somente a porção do ejaculado com a
maior concentração espermática foi utilizada para ser criopreservada. As porções
menos concentradas foram descartadas. Após a coleta do ejaculado, a
concentração de células espermáticas foi realizada através do hematocitômetro.
Também foi avaliada a motilidade espermática (0 a 100%), por microscopia ótica de
21
contraste de fases em aumento de 200x (Bearden & Fuquay, 1997b). Somente
ejaculados com motilidade > 70% foram utilizados.
Processamento e criopreservação do sêmen
Imediatamente após a coleta do sêmen, uma alíquota de 10 ml da fração
rica em espermatozóides foi diluída (1:1, v/v), em tubo cônico de 50 ml, em cada um
de três diluentes: BTS (Levis, 2000), PIGPEL-5 (Corrêa et al., 2004) e PIGPEL-5,
com substituição dos 2% de gema de ovo por quantidade equivalente de LDL
(PIGPEL+). A LDL foi obtida através de protocolo descrito por Moussa et al. (2002).
Para cada um dos três diluentes, foram feitas duas amostras, considerando dois
tempos de resfriamento. No tempo de resfriamento denominado Padrão, após a
diluição inicial em cada um dos três diluidores de resfriamento, os frascos
permaneciam 90 min a 24 °C e, após, 180 min a 15 °C. No tempo de resfriamento
denominado Curto, após a diluição inicial, os frascos permaneciam 60 min a 24 °C e,
após, 60 min a 15 °C.
Após atingirem 15 °C, os tratamentos foram submetidos à centrifugação (800
x g por 10 min), para retirada do plasma seminal. O pellet de espermatozóides obtido
da centrifugação foi re-suspenso no diluidor de resfriamento WE (80%, v/v, de
solução de lactose a 11%; 20%, v/v, gema de ovo; pH de 6,1) para uma
concentração de 450 x 10
6
espermatozóides/ml. Após, 2 ml da solução foram
transferidos para tubos cônicos de 15 ml, realizando-se o resfriamento por 90 min à
5 °C, nos dois métodos de resfriamento (Padrão e Curto). Aos 5 °C, os tubos
cônicos com 2 ml de espermatozóides diluídos foram re-suspensos em 1 ml do
diluidor de congelamento WE (89,5% de diluidor de resfriamento WE + 1,5% Orvus
Ex Paste, Equex-Paste
1
e 9% glicerol, v/v; pH de 6,8) para uma concentração final
de 300 x 10
6
espermatozóides/ml e 3% de glicerol. Após a adição do diluidor de
congelamento, em cada um dos seis tratamentos de cada macho (três diluentes e
dois tempos de resfriamento), o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5 ml, com
concentração de 150 x 10
6
espermatozóides/palheta. As palhetas foram congeladas
horizontalmente, 5 cm acima do vapor de nitrogênio líquido, por 20 min, sendo após
armazenadas em nitrogênio líquido a -196 °C até o descongelamento.
Descongelamento das palhetas
Para o descongelamento das palhetas foi utilizado o protocolo de 37 °C por
20 s, em banho-maria com circulação de água.
1
Minitüb, Germany
2
2
Avaliações de qualidade de sêmen
Após a adição do diluidor de congelamento a 5 °C, uma amostra de sêmen
foi incubado em tubos cônicos de 15 ml a 37 °C, para a avaliação da motilidade
espermática pré-congelamento, através de microscopia ótica com contraste de fases
a 200 x (Bearden & Fuquay, 1997b).
Conforme o tempo de descongelamento, as palhetas foram re-suspensas
(1:10, v/v) em tubos cônicos de 15 ml (Peña et al., 2003), nos respectivos diluentes
utilizados no período de resfriamento até 15 °C (BTS, PIGPEL-5 e PIGPEL+) e
incubados a 37 °C. A avaliação da motilidade espermática foi realizada aos 10 e 30
min após o descongelamento. Todas as avaliações foram feitas pelo mesmo técnico.
Análise estatística
Para cada macho no método WE, seguiu-se um delineamento fatorial 3 x 2,
representando as combinações de diluentes e tempo de resfriamento,
respectivamente. A fim de isolar o efeito dos tratamentos (diluente e tempo de
resfriamento), sobre a motilidade no pré-congelamento e após o descongelamento
(10 e 30 min) foi feita análise de variância com medidas repetidas, incluindo a
estimativa do efeito de cada coleta e o efeito de cada macho dentro de cada
tratamento. Comparação de médias foi feita através do método LSD (least significant
difference), usando o procedimento GLM (general linear models) (SAS, 1999).
Resultados e Discussão
Efeito do diluente
Antes do congelamento, observou-se que o sêmen diluído sem a presença
de crioprotetor extracelular durante a curva de resfriamento até 15 °C (BTS),
apresentou motilidade superior (P < 0,05) aos tratamentos que continham
crioprotetor, tanto PIGPEL-5 como o PIGPEL+ (Tab. 1). A substituição da gema de
ovo por LDL não influenciou a motilidade pré-congelamento (P > 0,05). A motilidade
aos 10 e 30 min após o descongelamento foi superior (P < 0,05) para o tratamento
utilizando o diluente BTS durante o resfriamento do sêmen até 15 °C (Tab. 1), sendo
que não houve diferença (P > 0,05) entre os diluentes PIGPEL-5 e PIGPEL+,
durante a curva de resfriamento até 15 °C nos dois momentos da avaliação após o
descongelamento (Tab. 1).
A presença de crioprotetor extracelular (gema de ovo ou LDL) durante o
período de resfriamento acima de 15 °C influenciou negativamente a motilidade do
2
3
sêmen submetido à criopreservação. Bergeron et al. (2004) e Manjunath et al. (2002)
comprovaram que a LDL presente na gema do ovo promove a entrada de fosfolipídio
e colesterol na membrana, além de formar um complexo com as proteínas do
plasma seminal, prevenindo a saída de fosfolipídio e colesterol da membrana
espermática. Os diluentes PIGPEL-5 e PIGPEL+, que possuem crioprotetor
extracelular em sua composição, possivelmente não influenciaram a viabilidade
espermática a 5 °C e no pós-congelamento, talvez pelo baixo conteúdo de gema de
ovo e LDL utilizados na composição do diluente (2%), o que não possibilitou
intensificar os mecanismos de proteção propostos por Bergeron et al. (2004) e
Manjunath et al. (2002). Portanto, uma maior inclusão de gema de ovo e LDL pode
ser necessária, para aumentar a eficiência destes diluentes.
Efeito do tempo de resfriamento
No pré-congelamento, a motilidade não diferiu (P > 0,05) entre o tempo de
resfriamento padrão (64,2%) e o curto (64,3%). Após o descongelamento foi
observada diferença na motilidade (P < 0,05) entre os tempos de resfriamento
padrão e curto aos 10 min (35% e 39%, respectivamente), e aos 30 min (32% e
35%, respectivamente).
A motilidade do sêmen submetido ao tempo de resfriamento curto até 15 °C
não diferiu no tempo de resfriamento padrão utilizado convencionalmente, na
avaliação pré-congelamento, tendo sido superior no pós-descongelamento (10 e 30
min). Eriksson & Rodriguez-Martinez (2000) observaram uma melhora de 5% e 4%
na integridade de membranas para os períodos de incubação de 10 e 20 h a 17 °C,
respectivamente, em relação à incubação a 15 °C por 3 h. De maneira similar,
Katzer et al. (2001) observaram que incubação prévia ou diminuição lenta da
temperatura foi associada com redução na sensibilidade do sêmen ao resfriamento a
5 °C. Porém, Garcia-Casado et al. (2001) não observaram efeito na motilidade pós-
congelamento em função de incubação pré-congelamento por 2,5, 3,5 ou 26 h.
Também não foram observados efeitos sobre a motilidade de amostras de sêmen
incubado a 15 °C por 3 ou 24 h, ou sobre as taxas de prenhez obtidas
posteriormente com este sêmen (Guthrie & Welch, 2005). Neste estudo, o tempo de
120 min para o resfriamento até 15 °C foi suficiente para que as células
espermáticas se estabilizassem no diluente em relação ao volume utilizado,
adquirindo resistência ao choque térmico, o que proporciona uma sensível redução
no tempo necessário para a execução do processo de congelamento. Além disso,
2
4
em função do menor tempo de permanência do sêmen em temperatura acima de 15
°C, a produção de catabólitos será menor, em função da redução no metabolismo
celular, havendo menor risco de proliferação bacteriana (Althouse & Lu, 2005).
Neste estudo, houve redução na motilidade na avaliação realizada pré-
congelamento (a 5 °C) e após o uso do diluidor de congelamento. Estes efeitos
podem ser atribuídos a danos irreversíveis na célula espermática em função do
choque térmico que ocorre durante o processo de congelamento e descongelamento
e, também, ao choque osmótico provocado pelas altas concentrações intracelulares
de sais, resultantes do processo de desidratação a que a célula é submetida
(Woelders et al., 2005). A redução da motilidade especialmente nas avaliações pós-
descongelamento, pode estar associado a um efeito citotóxico devido à presença de
glicerol no diluidor de congelamento (Almlid & Johnson, 1988; Holt, 2000).
A motilidade foi usada neste trabalho como único parâmetro de avaliação,
em função ser um bom indicador de integridade e funcionalidade das membranas
celulares (Gadea, 2005), apresentar boa correlação com o número de
espermatozóides por ovócito penetrado (Hammitt et al., 1989), taxa de fertilização in
vivo (Xu et al., 1996; Flowers & Tumer, 1997; Gadea & Matás, 2000; Brito et al.,
2003), taxa de parição e tamanho total de leitegada (Selles et al., 2003; Gadea, et
al., 1998, 2004). Gallant et al. (1993), ao compararem o efeito de diferentes diluentes
na criopreservação de espermatozóide de salmão, trabalharam com apenas um
método de avaliação, em virtude do elevado número de tratamentos estudados.
Os melhores resultados de motilidade obtidos neste estudo são
comparáveis, ou mesmo superiores, aos obtidos em alguns estudos (Eriksson et al.,
2001, 2002; Garcia-Casado et al., 2001; Córdova et al., 2002; Roca et al., 2003; Holt
et al., 2005; Guthrie & Welch, 2005), porém, inferiores aos descritos por Maldjian et
al. (2005).
Conclusão
A motilidade do sêmen após o descongelamento foi superior nos
tratamentos em que foi utilizado o diluidor BTS, sem o componente crioprotetor, e no
período de resfriamento curto (120 min), durante o resfriamento do sêmen até 15 °C.
2
5
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3
0
Tabela 1: Motilidade espermática ( erro padrão) nos diferentes momentos de
avaliação em função do diluente utilizado durante o resfriamento até 15 °C
Diluente
Momento da avaliação
Pré-congelamento
a 5 °C
Descongelamento
10 min
Descongelamento
30 min
BTS
68 0,8
a
43
1,7
a
37 1,5
a
PIGPEL-5
62 0,8
b
34
1,7
b
32 1,5
b
PIGPEL+
63 0,8
b
33
1,7
b
31 1,5
b
ab
Médias na coluna com letras diferentes diferem estatisticamente (P < 0,05)
31
4. ARTIGO II: Evaluation of cryoprotectant properties of different
amides in the boar semen freezing
Submetido: Cryobiology
(Formatado segundo as normas da revista)
Ivan Bianchi; Kérlin Calderam; Éder Francisco Maschio; Elisângela Mirapalheta
Madeira; Rafael da Rosa Ulguim; Denise Calisto Bongalhardo; Érico Kunde
Corrêa; Thomaz Lucia Jr.; João Carlos Deschamps; Marcio Nunes Corrêa
3
2
Abstract
The main objective of this study was to evaluate the amide use in the freezing boar
semen. The study consisted of two experiments. Semen from four boars was frozen
using four cryoprotectants: glycerol at the concentration of 3% (Gly) and three
amides at 5%: methylformamide (MF); dimethylformamide (DMF); and
dimethylacetamide (DMA). Two centrifugation temperatures were evaluated: 15 °C
(T15); and 24 °C (T24). In Experiment 1 (EXP1), all the four cryoprotectants and both
centrifugation temperatures were compared. In Experiment 2 (EXP2), only the
amides were used, at concentrations of 3, 5 and 7%, considering the same two
centrifugation temperatures. In both experiments, sperm motility and membrane
integrity post-thawing were compared across treatments and temperatures. In EXP1,
sperm membrane integrity was higher for MF, DMF and DMA than for Gly (P < 0.05).
Also, sperm motility for DMF and DMA were superior to that observed with Gly (P <
0.05), but no differences were observed between MF and Gly (P > 0.05). In EXP2,
generally, amide inclusion at 5% provided better results for sperm motility and
membrane integrity than inclusion at 3% and 7% (P < 0.05). There was no difference
in sperm motility between DMA and DMF (P > 0.05), but motility was higher for both
amides than for MF (P < 0.05). Sperm membrane integrity was superior for DMA than
for DMF and MF (P < 0.05). Both sperm motility and membrane integrity were also
superior for T15 than for T24 (P < 0.05) in the two experiments. These results
indicate that DMA at 5% with T15 can replace glycerol in boar semen
cryopreservation protocols.
Key Words: Amides, Glycerol, Cryopreservation, Centrifugation, Boar semen.
3
3
Introduction
Most of the artificial inseminations (AI) in swine are performed using semen
extended and stored in liquid state at temperatures between 15 and 18 ºC, during 1
to 5 d. Nearly 85% of those AI are conducted at the day of semen collection or at the
following day [29]. Some extenders have been developed to store semen at the
mentioned temperatures from 3 to 5-7 d [36], or even at lower temperatures such as
5 °C [11]. However, despite of the fact that it is commercially available since 1975,
frozen swine sperm have been used only in very specific conditions, such as for
importing genetics to produce breeding stock [31]. AI with frozen semen not only
requires two to three times more sperm per dose, but also leads to reduction in both
farrowing rate and litter size, when compared to AI with cooled semen, which impairs
its commercial use [14,18,30,52,54].
Glycerol is the most used intracellular cryoprotectant in swine sperm
cryopreservation protocols, usually at the concentration of 3% [30,38,52,63].
However, despite its beneficial action as a cryoprotectant, glycerol is potentially
cytotoxic in some concentrations [1,25,30,62], also having a contraceptive effect in
some species [23,27,49,55].
The inefficiency on the cryopreservation of swine sperm is attributed to both
the extenders and cryoprotectants commonly used, which indicates that other
cryoprotectant solutions should be tested [7,34,41]. However, studies reporting the
use of alternative cryoprotectants to freeze boar sperm are limited. In equine, sperm
cryopreservation faces challenges similar to those reported for swine. In that specie,
studies reported acceptable results using amides as cryoprotectants rather than
glycerol [2,19,40,61], but such intracellular cryoprotectants have not been tested in
swine.
The objective of this study was to evaluate the effect of the methylformamide
(MF), dimethylformamide (DMF) and dimethylacetamide (DMA) as intracellular
cryoprotectants, in different concentrations and centrifugation temperatures, in
comparison with glycerol, in boar semen freezing protocols.
3
4
Materials and Methods
Two experiments were conducted, both using four crossbred boars
(Landrace x Large White) having approximately 24 months of age and known fertility.
The boars were housed in individual pens, under the same environmental conditions,
at the Palma Experimental Station of the Universidade Federal de Pelotas (Brazil).
Semen collections were performed using the gloved-hand technique [5],
using a plastic glass protected by an isothermic vacuum bottle covered with gauze, to
separate the gel-rich fraction of the ejaculate. Only the sperm-rich fraction of the
ejaculate was used for freezing [46,63]. After collection, sperm motility was evaluated
using a phase contrast optical microscopy, under 200x magnification [6]. Only
ejaculates having motility equal or higher than 70% were processed.
Experiment 1
Ten ejaculates were collected from each male. Immediately after collection,
two 20 ml samples from the sperm-rich fraction were placed into 50 ml conic tubes
and diluted (1:1, v/v) in Beltsville Thawing Solution (BTS) [50]. After dilution, semen
was refrigerated for 60 min at 24 °C.
Two semen centrifugation temperatures were tested: 15 °C (T15) and 24 °C
(T24). For T24, semen samples were cooled up to 24 °C and then centrifuged at 800
x g during 10 min (SORVALL
®
RC6). The supernatant was discarded and the sperm
pellet was resuspended in the cooling extender (80%, v/v, lactose solution at 11%;
20%, v/v, egg yolk) up to a final concentration of 450 x 10
6
sperm/ml, and
subsequently cooled up to 15 °C during 60 min. For T15, after cooling at 24 °C,
semen samples were kept cooled during additional 60 min until reaching 15 °C. At
that temperature, samples were centrifuged at 800 x g during 10 min
(SORVALL
®
RC6). After centrifugation, all the procedures were the same described
above for T24. For both T24 and T15, cooling up to 5 °C was conducted during 90
min.
During the freezing process, four intracellular cryoprotectants were used:
Glycerol
2
(C
3
H
8
O
3
), N-Methylformamide
3
(C
2
H
5
NO), N,N-Dimethylformamide
4
(C
3
H
7
NO) and N,N-Dimethylacetamide
5
(C
4
H
9
NO), with molecular weights of 92.09;
59.07; 73.10 and 87.12, respectively. Glycerol (GLY) was used at a final
2
G 4094 - Merck
3
M 2769 - Sigma
4
D 4254 - Sigma
5
D 5511 - Sigma
3
5
concentration of 3% [63] and all the 3 amides at 5% final concentration. Therefore,
the combination of cryoprotectants and centrifugation temperatures followed a 4 x 2
factorial design. The freezing extenders to be added at 5 °C were prepared with the
cooling extender plus 1.5% Orvus Ex Paste, Equex-Paste
6
and the respective
cryoprotectants up to the final concentration described above (v/v).
When the treatments reached 5 °C, 2 ml from each 50 ml tube were
transferred to 15 ml conic tubes and then 1 ml of one of the four cryoprotectant
extenders was added. Semen was stored in 0.5 ml straws so each straw would have
150 x 10
6
spermatozoa. Straws were frozen horizontally, 5 cm above the nitrogen
vapor for 20 min, and stored in liquid nitrogen until thawing.
Experiment 2
Ten semen collections were conducted for each of the four males. Semen
processing and cryopreservation procedures were identical to those described for
experiment 1. The same two centrifugation temperatures were tested (15 °C e 24
°C). However, only the 3 amides (MF, DMF e DMA) were used as intracellular
cryoprotectants for freezing, all tested in three distinct concentrations (3, 5 and 7%),
thus composing a 3 X 3 X 2 factorial structure. The freezing extenders were added at
5 °C, including the cooling extender with the addition of 1.5% Orvus Ex Paste
(Equex-Paste) up to the same final concentration mentioned above (v/v).
Thawing
In both experiments, the straws were thawed at 37 °C during 20 s, and
resuspended in a conic tube containing 10 ml of BTS previously warmed to 37 °C
(1:20, v/v) [47].
Sperm Motility and Membrane Integrity Analysis
Semen samples were incubated during 10 min in water bath at 37 °C and the
sperm motility was evaluated by phase contrast optical microscopy at 200 x
magnification [6,39].
After the evaluation of sperm motility, sperm membrane integrity was
evaluated through fluorescence [22], using the Carboxifluorescein Diacetate
7
(CFDA)
and Propidium Iodide
8
(IP) markers. The evaluation was conducted using an
epifluorescent microscope (Olympus BX 51, America INC), through WU filter
6
Minitüb, Germany
7
C 5041 - Sigma
8
P 4170 - Sigma
3
6
excitation under 400x magnification. Two hundred spermatozoa were counted in the
same slide and classified as intact (green fluorescence) or damaged (red
fluorescence).
Both evaluations were performed by the same technician and were identical
for both experiments.
Statistical Analysis
Experiment 1 evaluated the effects of the four cryoprotectants and the two
centrifugation temperatures on sperm motility and membrane integrity, whereas
Experiment 2 evaluated the effect of the use of the three amides as cryoprotectants,
three different concentrations and the two centrifugation temperatures on the same
dependent variables. Analysis of variance with repeated measures were used for
statistical comparisons in both experiments, considering all potential interactions
among independent variables. The subsequent comparisons among means were
conducted through the Tukey´s test. Additionally, Pearson´s correlation coefficients
were generated to evaluate the linear association between estimates of sperm
motility by optical microscopy and sperm membrane integrity obtained by fluorescent
markers. All analyses were performed with the same statistical program [57].
Results
Experiment 1
Post-thawing sperm motility did not differ (P > 0.05) between DMA (53.8%)
and DMF (50.6%), but both those estimates were higher (P < 0.05) than those for MF
(43.2%) and GLY (38.1%), which did not differ from each other (P > 0.05). Motility for
samples centrifuged at 15 °C was higher (P < 0.05) than that observed for those in
T24 (52.8% vs. 40.0%, respectively).
The sperm membrane integrity after thawing for DMA (50.9%) did not differ
(P > 0.05) from that observed for DMF (47.9%), but it was higher (P < 0.05) than for
MF and GLY (43.3% and 34.4%, respectively). Membrane integrity did not differ
between DMF and MF, whereas GLY presented the lowest frequency of
spermatozoa having intact membrane. Samples centrifuged at 15 °C presented a
higher percent of spermatozoa having intact membranes (P < 0.05) than those
centrifuged at 24 °C (49.0% vs. 39.3%, respectively). Estimates of sperm motility and
membrane integrity presented a high positive correlation (r = 0.92, P < 0.0001).
3
7
Experiment 2
There was a significant cryoprotectant by concentration interaction
influencing both sperm motility and membrane integrity post-thawing (P < 0.05), as
shown in Table 1. Samples conditioned in DMA at 5% presented higher motility and
membrane integrity (P < 0.05) than those extended in MF at any concentration, DMF
at 7% and DMA at 3%. There was a high positive correlation (r = 0.92, P < 0.0001)
between estimates of sperm motility and membrane integrity.
Table 1: Post-thawing sperm motility and membrane integrity according to
cryoprotectant and concentration
Cryoprotectant Concentration (%)
Motility (%
SE) Membrane integrity (%
SE)
DMA 3
46.6
2,1
bc
45.2 2,6
bcd
5
53.8
1,7
a
50.9 1,9 ª
7
48.9
2,3
abc
46.7 2,7
abc
DMF 3
47.9
1,8
abc
46.3 2,2
bcd
5
50.6
1,9
ab
47.9 2,1
ab
7
44.1
2,0
c
42.3 2,3
d
MF 3
44.3
1,9
c
43.4 2,2
cd
5
43.2
2,4
c
43.3 2,5
cd
7
34.8
2,1
d
34.7 2,5
e
Means followed by distinct superscripts differ by P < 0.05
The centrifugation temperature also influenced sperm motility after thawing,
being higher (P < 0.05) in T15 (51.8%) than in T24 (40.3%). Sperm membrane
integrity in T15 was higher (P < 0.05) than in T24 (49.8% and 39.3%, respectively).
Discussion
This study indicates that amides, especially DMA and DMF, can successfully
replace glycerol as intracellular cryoprotectants for frozen boar semen, as reported in
equine [19,40,56,61], roosters [60], fish [31,43], geese [37] and rabbits [21]. The best
motility results obtained in this study are comparable to those obtained by other
authors [10,13,14,16,20,24,52,54,64], and close to some of the best results obtained
with frozen boar semen [38]; all those results obtained using glycerol as
3
8
cryoprotectant. Glycerol is an alcohol that contains three functional hydroxyl groups,
which can accept one hydrogen from the water molecule in six different binding sites,
decreasing formation of ice crystals [12]. However, in some concentrations, glycerol
has a potential cytotoxic effect [1,25,62]. In boar semen cryopreservation protocols,
the final maximum concentration of glycerol is commonly 3% [13,30,38,52,63]. Also,
glycerol hydroxyl radicals may bind among them, decreasing the probability of
binding with water molecules, which is an undesirable characteristic related to
increased viscosity [32]. The replacement of the hydroxyl groups with carboxyl (-
OCH
3
) conferred lower viscosity and better binding activity, but the resulting
substance presented high cellular toxicity [65]. On the other hand, amides are formed
by two functional groups: one amine (containing nitrogen); and one carboxylic acid
(containing oxygen). The cryoprotectant action of the amides can be attributed to
their molecular structure and to their ability to permeate the cell membrane, since
their functional groups bind to the hydrogen from the water molecules in three sites.
So, amides likely bind to water molecules more efficiently than glycerol [4,32].
Furthermore, due to their lower molecular weight and viscosity in comparison to
glycerol, amides have higher membrane permeability, decreasing the possibilities of
cellular damage caused by osmotic stress [4].
In our study, the use of DMA and DMF at 5% was associated with improved
sperm motility and membrane integrity after thawing, in comparison with glycerol at
3%, which is the most common choice for boar semen freezing protocols. Also,
results with DMA were better than those with MF, although DMF and MF presented
similar results. Therefore, DMA could generally be considered more efficient than the
other tested amides, especially considering the results observed for sperm
membrane integrity. DMA is largely used as cryoprotectant in fish [8,43,44] and
poultry [60] semen freezing protocols, being associated with benefits for the post-
thawing response. In one study with poultry semen, the use of glycerol was related to
lower frequency of morphologic sperm abnormalities than dimethylsulfoxide (Me
2
SO)
and DMA [60], but samples conditioned with DMA presented better post-thawing
fertility than those conditioned with glycerol. Our results indicate that the
concentration of 5% provided better results for sperm motility and membrane integrity
after thawing, in comparison with 3%. When used in fish semen cryopreservation
protocols, DMA concentrations vary from 10 to 15% [43].
3
9
The centrifugation temperature also influenced post-thawing sperm motility
and membrane integrity. The better frequencies for both estimates were observed in
T15, with longer exposure of sperm cells to both the seminal plasma and the
extender. For T15, it was necessary to use a refrigerated centrifuge to stabilize the
temperature; otherwise the heat generated during the centrifugation time would raise
the temperature up to nearly 24 °C, which could reduce the efficiency of such
protocol. The objective of using T24 was to optimize the protocol, using a non-
refrigerated bench centrifuge, common in most laboratories, since after centrifugation
at 24 °C, the temperature would remain stable. It is possible that better results could
be obtained with T24, if samples could be kept for at least 90 additional minutes at
the same temperature until centrifuged, so the total time from the semen collection to
centrifugation would be similar to T15.
Most of the boar semen freezing protocols currently used are based on
modifications of two methods: in the first one, the seminal plasma is removed by
centrifugation, immediately after the ejaculate collection [45]; whereas in the second,
the seminal plasma is removed only when the freezing curve reaches 15 °C [63]. The
influence of seminal plasma on sperm quality is controversial since its presence may
be associated with higher sensitivity to cold shock [51] and its removal may have no
effect in post-thaw viability [53]. Also, no influence of the presence of seminal plasma
on semen quality was observed when seminal plasma was added to the sperm rich
fraction of the ejaculate [29]. In studies with mini-pigs, it was concluded that seminal
plasma contains factors that modify the sperm cell before freezing, reducing its ability
to penetrate oocytes in vitro, after freezing [33]. Deleterious effects of the presence of
seminal plasma, were also reported for semen stored for at least 6 h before
cryopreservation [42]. On the other hand, beneficial effects related to the presence of
seminal plasma proteins were reported in many studies [9,17,35,48]. Some authors
[28] report that bulls having different levels of response with frozen semen would
have differences in the protein content of their seminal plasma, suggesting that such
proteins could be markers related to semen freezability. Such differences may be
related to individual differences in freezability [26], as well as genetic influences, as
observed in boars [58,59].
The correlations between motility and membrane integrity observed in this
study are in agreement with those reported by other authors [15].
4
0
The results of this study indicate that the use of DMA and DMF as
cryoprotectants at the concentration of 5% and centrifuged at 15 °C provided sperm
motility and membrane integrity similar or superior to those observed using glycerol
at 3%.
41
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4
7
5. ARTIGO III: Efeito do uso de gema de ovo e lipoproteína de baixa
densidade na criopreservação de sêmen suíno
4
8
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de lipoproteína de baixa densidade (LDL)
em comparação com o uso de gema de ovo, na composição dos diluidores de
resfriamento e congelamento de sêmen suíno. Foram avaliados parâmetros
espermáticos in vitro, de sêmen de seis machos suínos submetidos ao
congelamento-descongelamento. O uso de gema de ovo na composição dos
diluidores determinou após o descongelamento maior motilidade espermática (53,7 x
37,3%, P < 0,05), e maior integridade de membrana avaliada pela fluorescência
(49,0 x 43,7%, P < 0,05). A integridade de membrana avaliada pelo choque
hiposmótico não diferiu (P > 0,05) entre gema (32,7%) e LDL (30,2%). O uso de
gema de ovo foi o crioprotetor extracelular mais eficiente na composição dos
diluidores de resfriamento e congelamento utilizados para sêmen suíno.
Palavras-Chaves: Crioprotetor extracelular, Lipoproteína de baixa densidade,
Sêmen, Suíno.
Summary
The aim of this study was to compare the use of low density lipoprotein (LDL) and of
egg yolk, in the composition of cooling and freezing extenders for boar semen.
Parameters of semen quality of six boars were evaluated in vitro after thawing.
Extenders having egg yolk presented better post-thawing motility (53.7 x 37.3%, P <
0.05) and membrane integrity evaluated by fluorescence (49.0 x 43.7%, P < 0.05).
Membrane integrity evaluated by hypoosmotic swelling test did not differ (P > 0.05)
between egg yolk (32.7%) and LDL (30.2%). The extender including egg yolk was
more efficient than that using LDL as a nonpenetrating cryopreservation for boar
semen.
Key-Words: Nonpenetrating cryoprotectants, Low density lipoprotein, Semen, Swine.
4
9
Introdução
O congelamento do sêmen é uma biotécnica reprodutiva importante para
aumentar a eficiência de produção dos rebanhos, especialmente devido ao uso em
maior escala nos programas de inseminação artificial (IA) de animais geneticamente
superiores (GERRITS et al., 2005). No entanto, a expansão da IA em suínos tem
sido limitada devido à baixa fertilidade da célula espermática de suínos após o
descongelamento. A criopreservação do sêmen suíno implica na diminuição da
fertilidade (PARKS e GRAHAN, 1992), possivelmente devido a danos provocados
nas membranas celulares (WATSON e PLUMMER, 1985; MAXWELL e JOHNSON,
1997). A integridade estrutural e funcional das membranas são, portanto,
fundamental para a viabilidade do espermatozóide.
A gema de ovo é amplamente utilizada nos protocolos de congelamento de
sêmen. Sua ação crioprotetora é devido à fração de lipoproteína de baixa densidade
(LDL). Vários estudos têm demonstrado que a LDL pode aumentar a resistência
espermática contra o choque térmico, melhorar a motilidade, a integridade do
acrossoma e da membrana plasmática (GRAHAM e FOOTE, 1987; DEMANIOWICZ
e STRZEZEK, 1996; MOUSSA et al., 2002; HU et al., 2006). Evidências têm
mostrado que os danos espermáticos resultantes do processo de congelamento-
descongelamento podem ser minimizados pelos crioprotetores e pelas curvas de
resfriamento otimizadas (JOHNSON et al., 2000).
Trabalhos com o uso de LDL, na composição de diluentes utilizados para
sêmen foram em diferentes espécies. A substituição da gema de ovo por LDL foi
benéfica para a manutenção da qualidade espermática em sêmen de cães, quando
preservado a temperatura de refrigeração a 5°C ou congelado (VARELA JUNIOR,
2005). Enquanto que, LDL na concentração de 8%, pode substituir a gema de ovo
na composição do diluente utilizado para criopreservar sêmen eqüino (MARTIN,
2005). A ação crioprotetora da LDL purificada da gema de ovo (MOUSSA et al.,
2002) na preservação de espematozóides suínos foi estudada por DEMANIOWICZ e
STRZEZEK (1996), com o uso de sêmen refrigerado, portanto, em estado líquido.
HU et al. (2006), encontraram que LDL na concentração de 9% foi benéfica para
manutenção de parâmetros de avaliação seminal de sêmen suíno congelado.
O objetivo deste trabalho foi comparar o uso de gema de ovo e de LDL, na
composição dos diluidores de resfriamento (DR) e congelamento (DC) utilizados na
5
0
criopreservação de sêmen suíno, sobre parâmetros de avaliação espermática in vitro
de sêmen congelado-descongelado.
Material e Método
Foram utilizados seis machos suínos cruzados (Landrace x Large White),
com aproximadamente 18 meses de idade, que apresentavam fertilidade conhecida
e que eram mantidos em baias individuais sob as mesmas condições ambientais, na
Estação Experimental da Palma, Universidade Federal de Pelotas. Para cada macho
foram realizadas 10 coletas, feitas através do método da mão-enluvada (BEARDEN
e FUQUAY, 1997a), usando um copo plástico recoberto por gaze protegido por um
copo isotérmico, a fim de separar a fração do ejaculado rico em gel. Somente foram
utilizados neste estudo, ejaculados com motilidade maior que 80% no momento da
coleta.
Imediatamente após a coleta do sêmen, para cada macho foram coletadas
duas alíquotas de 20 ml da fração rica em espermatozóides (SPTZ), sendo diluídas
(1:1, v/v) em tubo cônico de 50 ml com BTS (LEVIS, 2000).
O método de congelamento foi o descrito por Westendorf et al. (1975) e
Bordignon et al. (1996), com modificações feitas por Bianchi et al. (2006a; 2006b). O
tratamento utilizado como controle foi preparado utilizando-se a gema de ovo como
crioprotetor extracelular. Na curva de resfriamento, após a diluição inicial, os frascos
permaneciam 60 min a 24 °C e, após, 60 min a 15 °C. Ao atingirem 15 °C, os
tratamentos foram submetidos à centrifugação (800 x g por 10 min), para retirada do
plasma seminal. O pellet de SPTZ obtido da centrifugação foi re-suspenso no
diluidor de resfriamento (DR) GEMA utilizado como controle (80%, v/v, de solução de
lactose a 11%; 20% gema de ovo, v/v) e no DR LDL (80%, v/v, de solução de lactose
a 11%; 20% LDL, v/v), para uma concentração de 450 x 10
6
SPTZ/ml. A LDL foi
obtida através de protocolo descrito por Moussa et al. (2002). Após realizou-se o
resfriamento por 90 min a 5 °C. Os tratamentos GEMA e LDL foram re-suspensos
quando atingiram 5 °C no diluidor de congelamento GEMA a base do crioprotetor
intracelular dimetilacetamida (DMA) (83,5% de DR GEMA + 1,5% Orvus Ex Paste,
Equex-Paste e 15% DMA, v/v) e no diluidor de congelamento LDL também a base
do crioprotetor DMA (83,5% de DR LDL + 1,5% Orvus Ex Paste, Equex-Paste e 15%
DMA, v/v). As concentrações finais foram de 300 x 10
6
SPTZ/ml e 5% de DMA.
51
Após a adição do diluidor de congelamento, o sêmen foi envasado em
palhetas de 0,5 ml, com 150 x 10
6
SPTZ/palheta. As palhetas foram congeladas
horizontalmente, 5 cm acima do vapor de nitrogênio líquido por 20 min, sendo após
armazenadas em nitrogênio líquido a -196 °C. O descongelamento das palhetas foi
realizado a 37 °C por 20 s em banho-maria com circulação de água. As palhetas
foram re-suspensas (1:20, v/v) em tubos cônicos de 15 ml (PEÑA et al., 2003), no
diluente BTS incubado a 37 °C.
Os valores de pH e osmolalidade do sêmen e diluidores utilizados estão
apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Valores de pH e osmolalidade do sêmen e diluidores utilizados.
Item avaliado
Valor obtido
pH Osmolalidade, mOsm/kg H
2
O
Sêmen 7,3 307
BTS 7,2 357
Diluidor de resfriamento GEMA 6,1 381
Diluidor de resfriamento LDL 6,1 431
Diluidor de congelamento GEMA 6,8 3.337
Diluidor de congelamento LDL 6,6 3.323
A avaliação da motilidade espermática foi realizada através de microscopia
ótica (200 x), 10 min após o descongelamento (BEARDEN e FUQUAY, 1997b). Após
a avaliação da motilidade foi feita à avaliação da integridade de membrana
plasmática dos SPTZ por fluorescência (HARRISON e VICKERS, 1990), através das
sondas Diacetato de Carboxifluoresceína (CFDA) e Iodeto de Propídio (IP). A
avaliação foi feita em microscópio de epifluorescência (Olympus BX 51, América
INC), através de excitação em filtro WU sob aumento de 400x. Foram contados 100
espermatozóides em uma mesma lâmina e classificadas conforme sua coloração em
íntegros (espermatozóides corados em verde em toda sua extensão) e lesados
(espermatozóides corados em vermelho).
A integridade funcional da membrana espermática foi testada também
através do teste do choque hiposmótico (CHIPO) (VASQUEZ et al., 1997). A
avaliação foi feita utilizando-se câmara de Neubauer e microscopia óptica com
contraste de fases, em aumento de 400x, procedendo-se à contagem de 100
5
2
células, registrando o número de células que apresentavam cauda do
espermatozóide normal em relação àquelas que estavam dobrada ou enrolada. O
valor que foi utilizado para análise do CHIPO, correspondeu à diferença obtida entre
o número de espermatozóides com cauda dobrada e enrolada, observadas no teste
realizado com a solução hiposmótica (0 mOsm/kg) e isosmótica (312 mOsm/kg).
As variáveis dependentes consideradas foram: percentual de motilidade,
espermatozóides com membrana íntegra no descongelamento no teste da
fluorescência e para o CHIPO. Foi gerada análise de variância pelo modelo linear
através de medidas repetidas, a fim de isolar o efeito de cada coleta e de cada
macho sobre os parâmetros avaliados. A comparação de médias foi feita no teste de
Tukey. Todas as análises foram através do programa Statistix® (2004).
Resultados e Discussão
Os resultados das avaliações de motilidade, SPTZ com membrana íntegra
na fluorescência e membrana reagida no choque hiposmótico após o
descongelamento, estão apresentados na Tabela 2. O uso de gema de ovo na
composição dos diluidores de congelamento e resfriamento proporcionou melhores
resultados (P < 0,05) após o congelamento para motilidade e integridade de
membrana avaliada por fluorescência em relação ao uso de LDL, mas não diferiu (P
> 0,05) na integridade de membrana pelo choque hiposmótico.
Tabela 2. Resultados de motilidade e integridade de membrana do sêmen
descongelado.
Avaliação GEMA LDL
Motilidade, % 53,7
a
37,3
b
SPTZ com membrana íntegra na fluorescência, % 49,0
a
43,7
b
SPTZ com cauda reagida no choque hiposmótico, % 32,7
a
30,2
a
a, b
Médias com letras diferentes na mesma linha diferem estatisticamente (P < 0,05)
A complexidade estrutural da membrana espermática, bem como, a etapa
durante o processo de congelamento que mais altera a dinâmica estrutural da
membrana e como os componentes crioprotetores interagem com esta, ainda não
estão bem esclarecidos. Isso dificulta a adoção de medidas com o objetivo de
5
3
melhor proteger a membrana durante o processo de criopreservação (PARKS e
GRAHAM, 1992).
Moussa et al. (2002), determinaram a inclusão de LDL em 8% para o
congelamento de sêmen de touro. Estudos de criopreservação de sêmen de cães
(VARELA JÚNIOR, 2005) e de garanhão (MARTIN, 2005), também estabeleceram a
utilização de 8% de LDL. Trabalho com uso de LDL na crioreservação de sêmen
suíno foi realizado por Hu et al. (2006). Esses autores encontraram que a
concentração de 9% de LDL determinou os melhores resultados de motilidade e
integridade de acrossoma e membrana.
O efeito crioprotetor da gema de ovo é dado pela fração de lipoproteína de
baixa densidade. É mencionado que a LDL pode se aderir à membrana celular
durante o processo de preservação espermática (GRAHAM e FOOT, 1987),
promovendo uma película interfacial entre os ácidos graxos da membrana e a água
(ANTON et al., 2003). Além disso, a LDL permite a entrada de fosfolipídio e
colesterol na membrana, formando um complexo com as proteínas do plasma
seminal que previne a saída de fosfolipídio e colesterol da membrana espermática
(MANJUNATH et al., 2002; BERGERON et al., 2004).
Neste estudo, o percentual de inclusão de LDL no diluidor de resfriamento foi
de 6% enquanto que no diluidor de congelamento foi de 5%. Dessa forma, o uso de
LDL nos diluidores em substituição a gema de ovo, possivelmente não influenciou a
viabilidade espermática devido à baixa inclusão do crioprotetor, em relação aos 9%
estabelecidos em outro trabalho (HU et al., 2006).
He et al. (2001), obtiveram redução na sensibilidade de espermatozóides
suínos submetidos a criopreservação, através da incorporação de microvesículas de
lipídios específicos na forma de lipossomas. Além disso, Bergeron et al. (2004),
demonstraram, que o tempo mínimo de incubação do sêmen com LDL deve ser de 4
h, a fim de que a lipoproteína possa interagir com a membrana celular.
Dessa forma, além do baixo percentual de inclusão de LDL neste estudo, o
uso da molécula complexa de lipoproteína ao invés do uso de microvesículas e o
curto período de incubação do sêmen na presença dos diluidores com LDL, 1,5 h ao
invés das 4 h preconizadas, são as hipóteses para que não tenha se observado os
benefícios crioprotetores da fração de lipoproteína.
Os métodos de avaliação utilizados permitem avaliação da viabilidade
espermática. No entanto, não permitem uma análise mais detalhada sobre a real
5
4
ação dos tratamentos sobre a membrana celular, sugerindo desta forma, o emprego
de métodos ultra-estruturais mais específicos para verificar esse efeito.
Conclusão
Neste estudo o uso de gema de ovo ao invés de LDL como crioprotetor
extracelular na composição dos diluidores de resfriamento e congelamento,
proporcionou melhores resultados de motilidade e integridade de membrana
plasmática de espermatozóides suínos criopreservados.
5
5
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5
8
6. ARTIGO IV: Inseminação artificial pós-cervical de leitoas com
sêmen suíno criopreservado utilizando dimetilacetamida e glicerol
5
9
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso da dimetilacetamida (DMA) e glicerol na
criopreservação de sêmen suíno, sobre resultados de fertilização in vivo. Foram
sincronizadas 60 leitoas pré-púberes e inseminadas com o uso de sêmen congelado
com glicerol 3% (30 fêmeas) e DMA 5% (30 fêmeas). O método de inseminação
utilizado foi o pós-cervical, com concentração de 1 x 10
9
espermatozóides viáveis
por dose. Após 36 a 40 h da inseminação, as fêmeas foram abatidas e realizada a
contagem de corpos hemorrágicos (CH) nos ovários. Foi realizada a lavagem dos
ovidutos das fêmeas, verificando o número de estruturas recuperadas (oócitos e
embriões), calculando-se as taxas de concepção e fertilização. A média de CH nas
fêmeas do grupo glicerol 3% não diferiu (P > 0,05) daquelas do grupo DMA 5% (10,4
x 10,2, respectivamente). Não houve diferença (P > 0,05) nas taxas de recuperação
de estruturas entre os grupos glicerol 3% (68,9%) e DMA 5% (66,9%). Os resultados
obtidos nos grupos glicerol 3% e DMA 5% para as taxas de concepção (73,3 x
76,6%) e fertilização (48,6 x 59,4%) não apresentaram diferença (P > 0,05). Os
resultados obtidos indicam o uso de DMA 5% como um substituto potencial ao
glicerol 3% nos protocolos de congelamento de sêmen suíno.
Palavras-Chaves: Inseminação artificial, Congelamento, Amidas, Glicerol, Suínos.
6
0
Summary
The objective of this study was to evaluate the use of dimethylacetamide (DMA) in
boar semen cryopreservation fertilization in vivo. Sixty pre-pubertal gilts were
synchronized and inseminated with semen including either glycerol 3% or DMA 5%
as cryoprotectants (n = 30 for both groups). Artificial insemination was conducted
with the intrauterine method using doses with 1 x 10
9
viable spermatozoa. The gilts
were slaughtered 36-40 h after the insemination and the hemorrhagic bodies (CH) in
the ovaries were counted. The oviducts were washed, so oocytes and embryos could
be recovered to determine the conception and fertility rates. The average CH
obtained with glycerol 3% did not differ (P > 0.05) from those observed with DMA
(10.4 x 10.2, respectively). Recovery rates also did not differ (P > 0.05) between
groups (68.9% with glycerol and 66.9% with DMA). Conception (73.3 x 76.6%) and
fertility rate (48.6 x 59.4%) were also similar (P > 0.05) for glycerol and DMA,
respectively. Those results indicate that DMA 5% can replace glycerol 3% in the
composition of extenders for frozen boar semen.
Key-Words: Artificial Insemination, Cryopreservation, Amides, Glycerol, Swine.
61
Introdução
Na espécie suína os primeiros animais produzidos por inseminação artificial
(IA) com sêmen congelado só foram obtidos em 1970 (POLGE et al., 1970), cerca de
20 anos após a descoberta do efeito crioprotetor do glicerol sobre gametas (POLGE
et al., 1949). No entanto, o uso de sêmen suíno congelado determina a queda de 20
a 30% nos resultados de taxa de parição e dois a três leitões a menos por leitegada
(JOHNSON, 1985). Dessa forma, a sua utilização fica condicionada apenas em
situações específicas, tais como a produção de reprodutores em núcleos genéticos
(CRABO, 1990). A grande sensibilidade do espermatozóide (SPTZ) ao choque
térmico é o que impede a utilização em maior escala do sêmen congelado nesta
espécie.
O glicerol é normalmente o crioprotetor de eleição para o congelamento de
sêmen na maioria das espécies de mamíferos. Estudos com a utilização de
crioprotetores em substituição ou associação com o glicerol têm sido conduzidos
com obtenção de bons resultados, especialmente em eqüinos com o uso de
diferentes amidas (ALVARENGA et al., 2000; GRAHAN, 2000; MEDEIROS et al.,
2002; VIDAMENT et al., 2002). Amidas também são utilizadas nos protocolos de
congelamento de sêmen de aves (LUKASZEWICZ et al., 2004) e de peixes (OGIER
DE BAULNY et al., 1999). A superioridade do uso de dimetilacetamida em relação
ao glicerol sobre parâmetros de avaliação in vitro de sêmen suíno congelado, foi
demonstrada por Bianchi et al. (2006a; 2006b).
O uso de sêmen congelado através da IA intracervical, normalmente são
utilizadas doses de 5-6 x 10
9
SPTZ (BORDIGNON et al., 1996; ROCA et al., 2003), o
que é consideravelmente superior a dose convencional de 3 x 10
9
SPTZ utilizada
com sêmen refrigerado (SERRET et al., 2005). Alguns trabalhos têm apresentado
promissores resultados de fertilidade utilizando sêmen suíno congelado (ERIKSSON
et al., 2002; ROCA et al., 2003; ROCA et al., 2006). A melhora nos resultados
obtidos é resultante da adaptação de protocolos de criopreservação, além do
desenvolvimento de novos métodos de IA, tais como o intra-uterino profundo,
utilizando doses de até 150 x 10
6
SPTZ. Outro método de IA que tem sido testado,
especialmente com o emprego de sêmen refrigerado, é o pós-cervical (WATSON e
BEHAN, 2002; BENNEMANN et al., 2004; SERRET et al., 2005), através do qual
tem se alcançado sucesso com emprego de doses de 1 x 10
9
SPTZ. Martinez et al.,
(2006), comparando IA intra-uterina profunda em relação ao método convencional
6
2
intracervical encontraram 21% de fertilizações unilaterais, associadas ao método
intra-uterina profunda, ainda que tivessem utilizado sêmen refrigerado.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso da dimetilacetamida (DMA) e
glicerol na criopreservação de sêmen suíno, sobre as taxas de concepção e
fertilização in vivo, utilizando inseminação artificial pós-cervical.
Material e Método
Coleta de sêmen
Foi utilizado sêmen de um macho suíno cruzado (Landrace x Large White),
com aproximadamente 24 meses de idade, que apresentava fertilidade conhecida,
estava em regime rotineiro de coleta e era mantido em baia individual na Estação
Experimental da Palma (Universidade Federal de Pelotas). O ejaculado foi coletado
através do método da mão-enluvada (BEARDEN e FUQUAY, 1997a), usando um
copo plástico protegido por um copo isotérmico recoberto por gaze, a fim de separar
a fração do ejaculado rico em gel que era descartada. A condição mínima para o
ejaculado ser processado foi de motilidade espermática e integridade de membrana
por fluorescência superior a 80% e 70%, respectivamente no momento da coleta.
Processamento do ejaculado e criopreservação
Imediatamente após a coleta do sêmen, a fração rica em espermatozóides
(SPTZ) foi diluída (1:1, v/v), em tubo em BTS (LEVIS, 2000). O método de
congelamento utilizado foi o descrito por Westendorf et al. (1975) e Bordignon et al.
(1996), com modificações feitas por Bianchi et al. (2006a, 2006b). A curva de
resfriamento após a diluição inicial foi de 60 min a 24 °C e, após, 60 min a 15 °C. Ao
atingir 15 °C, foi realizada a centrifugação (800 x g por 10 min), para a retirada do
plasma seminal. O sedimento de espermatozóides (SPTZ) obtido da centrifugação
foi re-suspenso no diluidor de resfriamento (DR) GEMA (80%, v/v, de solução de
lactose a 11%; 20% gema de ovo, v/v), num volume suficiente para que cada ml
mantivesse uma concentração de 450 x 10
6
de SPTZ. Após realizou-se o
resfriamento por 90 min até 5 °C, quando foi re-suspenso nos diluidores de
congelamento (DC) a base dos crioprotetores Glicerol
9
(C
3
H
8
O
3
) e N,N-
Dimetilacetamida
10
(C
4
H
9
NO), com pesos moleculares de 92,09; e 87,12,
respectivamente.
9
G 4094 - Merck
10
D 5511 - Sigma
6
3
Os DC foram elaborados a partir do DR, sendo o DC composto de glicerol
(89,5% de DR GEMA + 1,5% Orvus Ex Paste, Equex-Paste e 9% de Glicerol, v/v), e
o DC dimetilacetamida (83,5% de DR GEMA + 1,5% Orvus Ex Paste, Equex-Paste e
15% de DMA, v/v).
A quantidade de DC acrescentada foi de 1:2, ou seja, para cada 2 ml de
sêmen com DR foi adicionado 1 ml de DC. Nesta proporção obteve-se uma
concentração final de 3% para o congelamento com glicerol (WESTENDORF et al.,
1975) e a 5% para DMA (BIANCHI et al., 2006a; 2006b).
Em seguida a adição do DC o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5 ml,
contendo a concentração de 150 x 10
6
SPTZ/palheta. As palhetas foram congeladas
horizontalmente em vapor de nitrogênio líquido, 5 cm acima do nível do nitrogênio, a
uma temperatura aproximada de -90 °C por um período de 20 min, sendo após
mergulhadas em nitrogênio líquido a -196 °C e mantidas até o descongelamento.
Os valores de pH e osmolalidade do sêmen e dos diluidores utilizados no
processamento para resfriamento e congelamento do sêmen estão apresentados na
Tabela 1.
Tabela 1. Valores de pH e osmolalidade do sêmen e diluidores utilizados.
Item avaliado
Valor obtido
pH Osmolalidade, mOsmol/kg H
2
O
Sêmen 7,5 302
BTS 6,9 332
Diluidor de resfriamento Gema de Ovo 6,1 351
Diluidor de congelamento Glicerol 6,7 1.990
Diluidor de congelamento DMA 6,7 3.343
Avaliações in vitro do sêmen descongelado
As palhetas foram descongeladas a 37 °C por 20 s, sendo re-suspensas em
tubo cônico contendo 10 ml de BTS previamente aquecido a 37 °C (1:20, v/v) (PEÑA
et al., 2003).
Motilidade
Após o descongelamento, foi feita a incubação em banho-maria a 37 °C por
10 min e avaliada a motilidade (0 a 100 %) através de microscopia ótica com
contraste de fases em aumento de 200 x (BEARDEN e FUQUAY, 1997b).
6
4
Integridade de membrana espermática através de sonda fluorescente
Após a avaliação da motilidade e vigor foi feita à avaliação da integridade de
membrana espermática por fluorescência (HARRISON e VICKERS, 1990), através
das sondas Diacetato de Carboxifluoresceína
11
(CFDA) e Iodeto de Propídio
12
(IP). A
avaliação foi feita em microscópio de epifluorescência (Olympus BX 51, América
INC), através de excitação em filtro WU sob aumento de 400x. Foram contados 200
espermatozóides em uma mesma lâmina e classificadas conforme sua coloração em
íntegros (corados em verde em toda sua extensão) e lesados (corados em
vermelho).
Integridade de membrana espermática através do choque hipoosmótico
A integridade funcional da membrana espermática foi testada também
através do teste do choque hiposmótico (CHIPO) (VASQUEZ et al., 1997). A
avaliação foi feita utilizando-se câmara de Neubauer e microscopia óptica com
contraste de fases, em aumento de 400x, procedendo-se à contagem de 100
células, registrando o número de células que apresentavam cauda do
espermatozóide normal a àquelas que estavam dobrada ou enrolada. O valor que foi
utilizado para análise do CHIPO, correspondeu à diferença obtida entre o número de
espermatozóides com cauda dobrada e enrolada, observadas no teste realizado
com a solução hiposmótica (0 mOsm/kg) e isosmótica (312 mOsm/kg).
Avaliação in vivo
Para avaliação da capacidade fertilizante in vivo do sêmen congelado em
glicerol e dimetilacetamida, 60 leitoas pré-púberes (30 para cada grupo) com peso
médio de 86,5 kg e idade de 155 d foram tratadas com 1000 UI de eCG
13
(sendo
considerado hora 0) e 70-72 h após com de 500 UI de hCG
14
(CORRÊA et al.,
2006). Ambos os hormônios foram administrados por via intramuscular. Entre 31-34
h após a aplicação do hCG as leitoas foram inseminadas ao acaso, independente
dos sinais de cio e abatidas entre 36 a 40 h após a IA (BORDIGNON et al., 1996).
Para elaboração das doses inseminantes, foi feito o descongelamento das
palhetas do tratamento correspondente (glicerol ou DMA) em banho-maria a 37 °C
por 20 s imediatamente antes de cada IA. Após o descongelamento, o conteúdo das
palhetas foi posto em uma dose de 60 ml de BTS em temperatura de 37 °C
11
C 5041 - Sigma
12
P 4170 - Sigma
13
NOVORMON® - DASPET
14
CHORAGON® - Droga Rápida
6
5
(BORDIGNON et al., 1996), a fim de atingir uma concentração de 1 x 10
9
SPTZ
vivos (baseados na análise prévia da motilidade espermática).
O método de IA utilizado foi o pós-cervical utilizando-se a pipeta
DeepGoldingPig
15
, que é fixada na cérvix e possui um cateter com um
prolongamento de 20 cm, que permite a deposição do sêmen no corpo do útero
(WATSON e BEHAN, 2002; SERRET et al., 2005).
No frigorífico as genitálias das fêmeas foram coletadas e transportadas para
o laboratório, onde se determinou a taxa de ovulação para cada fêmea, a partir da
contagem do número de corpos hemorrágicos em cada ovário. Para a colheita das
estruturas (oócitos e embriões), cada oviduto (direito e esquerdo) foi lavado com 20
ml de PBS (solução de tampão fosfato) no sentido útero-ovário, sendo que o
conteúdo lavado dentro de uma placa de petri e realizada a procura em lupa.
Para cada fêmea foram determinadas as taxas de recuperação (TR) e
fertilização (TF), a partir das seguintes fórmulas:
Taxa de recuperação (TR%)
TR =(n°oócitos e/ou embriões recuperados / n°corpos hemorrágicos contados) x 100
Taxa de fertilização (TF%)
TF = (n° de embriões / n° de estruturas recuperadas) x 100
Análise estatística
Estatísticas descritivas foram calculadas para as avaliações espermáticas in
vitro, manifestação de cio, número de corpos hemorrágicos, oócitos, embriões, taxa
de recuperação e fertilização.
A análise de concepção entre os grupos glicerol e DMA foi avaliada pelo qui-
quadrado. As variáveis dependentes consideradas na análise de variância foram:
número de corpos hemorrágicos; oócitos; embriões; taxas de recuperação e
fertilização. A variável independente considerada foi o crioprotetor utilizado (glicerol
ou DMA). A comparação de médias foi feita pelo teste de Tukey. Todas as análises
foram através do Statistix® (2004).
15
IMV
6
6
Resultados e Discussão
Os resultados de avaliação in vitro do sêmen após a coleta e após o
descongelamento estão apresentados na Tabela 2. A sensibilidade do
espermatozóide suíno ao processo de congelamento-descongelamento é
evidenciada na comparação dos resultados das avaliações do sêmen após a coleta,
com os resultados obtidos após o congelamento. A comparação entre os
crioprotetores glicerol e DMA nas avaliações após o descongelamento, evidencia-se
a superioridade dos resultados de motilidade e integridade de membrana por
fluorescência obtidos no tratamento com DMA. Para a elaboração das doses
inseminantes foi utilizado o resultado de motilidade obtido após o descongelamento
(Tabela 2), calculando-se dessa forma a quantidade de palhetas utilizadas a fim de
atingir 1 x 10
9
SPTZ viáveis por dose.
Tabela 2. Parâmetros de avaliação do sêmen após a coleta e após o congelamento.
Parâmetro avaliado
Momento da avaliação
Pós-coleta
Pós-descongelado
Glicerol DMA
Motilidade, % 85,0 53,0 65,0
Integridade de membrana por fluorescência, % 77,0 45,0 53,0
Integridade de membrana pelo CHIPO*, % 35,0 26,0 28,0
*CHIPO: Choque hipoosmótico
Em todas as fêmeas utilizadas no trabalho foram encontrados nos ovários
folículos pré-ovulatórios e/ou corpos hemorrágicos, demonstrando que todas
responderam ao protocolo hormonal utilizado. O número de corpos hemorrágicos,
taxa de recuperação e os resultados de concepção e fertilização para cada grupo,
estão apresentados na Tabela 3. A média de corpos hemorrágicos foi superior
àquelas obtidas por Corrêa et al. (2006), porém, inferiores as de Bordignon et al.
(1996), enquanto que as taxas de recuperação obtidas se assemelham aos dados
desses autores. Este trabalho foi realizado com o uso de leitoas pré-púberes, que
embora tenham respondido ao protocolo hormonal, a taxa de ovulação é baixa
quando comparado ao uso de fêmeas multíparas (ROCA et al., 2003).
6
7
Tabela 3. Taxa de recuperação de estruturas e efeito do tratamento sobre a
fertilidade.
Parâmetro
Tratamento
Glicerol 3% DMA 5%
Leitoas inseminadas 30 30
Corpos hemorrágicos 306 299
Taxa de recuperação, % 68,9 66,9
Taxa de concepção, % 73,3 76,6
Taxa de fertilização, % 48,6 59,4
Os dados não diferem (P > 0,05).
Usando sêmen congelado, Bordignon et al. (1996) conseguiram 85% de taxa
de concepção trabalhando com leitoas pré-púberes sincronizadas, no entanto
utilizando IA intracervical com doses de 6 x 10
9
SPTZ. Roca et al. (2003) obtiveram
em torno de 79% de taxa de prenhez aos 28 d, com o emprego de sêmen congelado
através do método de IA intra-uterina profunda com dose de 1 x 10
9
SPTZ e na IA
intracervical com doses com 6 x 10
9
SPTZ, porém utilizando fêmeas multíparas.
Eriksson et al. (2002) utilizando IA intracervical com sêmen congelado em fêmeas
multíparas, alcançaram 72% de taxa de parto, usando protocolo com duas
inseminações por estro, com concentração de 5 x 10
9
SPTZ por dose. Taxa de
prenhez de 40% aos 28 é citada com o uso de IA intra-uterina profunda utilizando
dose de 1 X 10
9
de SPTZ (WONGTAWAN et al., 2006).
Não houve diferença entre os grupos glicerol e DMA na taxa de concepção
(P > 0,05), e os resultados se assemelharam aos relatados com o uso de sêmen
congelado. A taxa de fertilização do grupo glicerol é comparável à obtida por
Bordignon et al. (1996), porém a fertilização do grupo DMA é superior aos resultados
desses autores. Porém, os resultados neste estudo são oriundos de IA pós-cervical
com doses de 1 X 10
9
de SPTZ, ao contrário das doses de 5-6 X 10
9
de SPTZ,
embora utilizando IA intracervical. Além disso, descatam-se os resultados obtidos
através do uso de DMA, pois, a maioria dos trabalhos utilizando sêmen suínos
congelado, baseiam-se no uso de glicerol.
Não foi encontrada diferença (P > 0,05) na taxa de fertilização entre os
grupos glicerol e DMA. No entanto o grupo DMA é superior 10% em relação ao
glicerol, além do que possui uma tendência de maior taxa de concepção.
6
8
Além disso, há que se destacar os resultados da avaliação espermática pós-
descongelamento. Baseado nas avaliações de motilidade a fim de elaborar as doses
inseminantes, foram necessárias 10 palhetas do tratamento DMA, enquanto que
para atingir a mesma concentração foram utilizadas 13 palhetas de glicerol. Essa
diferença de 30% torna o processo com o uso de DMA mais eficiente, resultando em
um melhor aproveitamento do ejaculado.
Devido ao fato do uso de IA com sêmen congelado, especial atenção deve
ser dada ao momento da IA, pois, há um menor período necessário para a
capacitação dos espermatozóides, além do menor tempo de permanência destes no
oviduto (JOHNSON, 1985; ROCA et al., 2003). Com o protocolo hormonal utilizado,
a estimativa é de que os animais ovularam 42±2 h após a aplicação do hCG
(SRIKANDAKUMAR e DOWNEY, 1989; HUHN et al., 1996). A taxa de fertilização
com sêmen descongelado pode diminuir quando as fêmeas são inseminadas mais
do que 4 horas antes ou após a ovulação (WABERSKI et al., 1994). No entanto, não
foi feito o acompanhamento da dinâmica folicular. Dessa forma, o momento da IA
pode ter influenciado especialmente a taxa de fertilização, e melhores resultados
poderão ser obtidos com a IA realizada o mais próximo possível do momento da
ovulação, acompanhado através de ultra-sonografia.
Conclusões
Os resultados obtidos na fertilização in vivo com sêmen suíno congelado
com DMA permitem considerá-la como um substituto ao glicerol nos protocolos de
congelamento.
6
9
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7
3
7. ARTIGO V: Identificação de um fator de 26 kDa no plasma
seminal associado a integridade de membrana de espermatozóides
suínos pós-descongelamento
Submetido: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
(Formatado segundo as normas da revista)
I. Bianchi; T. Collares; V.F. Campos; P.V. Cavalcanti; C. Kaefer; Corrêa, E.K.;
O.A. Dellagostin; T. Lucia Jr.; J.C. Deschamps; M.N. Corrêa
7
4
Resumo
A compreensão de mecanismos moleculares envolvidos nos processos de
maturação de espermatozóides e associação com componentes do plasma seminal,
tem fornecido informações para a determinação de marcadores bioquímicos
associados com a qualidade do sêmen. A aplicação de marcadores bioquímicos
para identificar propriedades biológicas do sêmen pode providenciar informações
específicas sobre a funcionalidade espermática durante o congelamento do sêmen.
O presente estudo teve por objetivo identificar polipeptídeos associados à
integridade de membrana plasmática (IMP) de espermatozóides suínos após o
processo de congelamento/descongelamento. O perfil protéico do plasma seminal
em SDS-PAGE demonstrou a presença de 09 bandas polipeptídicas com pesos
moleculares variando de 11 a 122 kDa. Dentre essas, uma banda de 26 kDa
demonstrou associação com a IMP. A presença desta banda foi associada com a
baixa IMP (< 55%). Em contraste, não foi observada a associação das outras
bandas detectadas com a IMP. Estes dados sugerem que proteínas presentes no
plasma seminal suíno interagem com a superfície da membrana plasmática do
espermatozóide, indicando a necessidade de novos estudos para elucidar o
processo fisiológico dessas associações.
Palavras-chave: Proteínas seminais, Criopreservação, Sêmen, Marcador
bioquímico.
7
5
Abstract
The knowledge about the molecular mechanisms involved in the sperm maturation
process and their associations with seminal plasma components has helped to detect
biochemical markers of semen quality. The application of those markers to identify
biological properties of the semen may generate specific information about the sperm
function during cryopreservation. The aim this study was to identify polypeptides in
boar seminal plasma that could be associated to plasma membrane integrity (IMP) of
thawed spermatozoa. The SDS-PAGE profile of boar seminal plasma demonstrated
the presence of 9 bands with molecular ranging from 11 to 122 kDa. One of those
bands (26 kDa) was associated with IMP. The presence of this band was associated
with reduced IMP (< 55%). Our data indicate that seminal plasma proteins interact
with the plasma membrane of boar spermatozoa, which opens promising possibilities
for further studies to investigate these associations.
Keywords: Seminal proteins, Cryopreservation, Semen, Biochemistry marker.
7
6
Introdução
O plasma seminal é um fluido com papel essencial para funções
espermáticas in vivo, desde a ejaculação, até a fertilização (Kraus et al., 2005). O
plasma seminal contém diferentes componentes, entre estes, proteínas, as quais
são os maiores constituintes orgânicos do fluido seminal, apresentando fundamental
importância fisiológica ao sêmen, estando presente na forma de distintos complexos
associados. A composição, a conformação e o tamanho destas proteínas são
específicos para cada espécie, as quais são estáveis também sob determinadas
condições (Jelínková et al., 2003).
O evento da fertilização nos mamíferos inclui interações bioquimicamente
reguladas, tais como: ligação de proteínas seminais na superfície dos
espermatozóides durante a ejaculação, interação de proteínas de membrana dos
espermatozóides com células epiteliais do oviduto, capacitação espermática,
reconhecimento dos gametas, ligação entre os gametas, reação acrossômica,
penetração do espermatozóide na zona pelúcida e fusão dos gametas (Jansen et al.,
2001; Suarez et al., 2001; Strzezek et al., 2005). A membrana plasmática do
espermatozóide sofre extensivas remodelações quando o espermatozóide interage
com proteínas do plasma seminal durante a ejaculação. Neste sentido, dois tipos de
interações protéicas podem estar envolvidos nesse processo: a interação de
proteínas com a membrana espermática e interações mútuas entre proteínas de
formas monoméricas (Manásková et al., 2003).
Outras funções e características dos espermatozóides que podem ser
influenciadas por proteínas do plasma seminal, incluem a capacitação e reação
acrossômica (Manjunath; Thérien, 2002), bem como a motilidade espermática (Curi
et al., 2003), e a integridade genômica (Chen et al., 2002). Desta forma, com a
caracterização de proteínas presentes no plasma seminal de diferentes espécies,
alguns desses polipeptídeos vêm sendo utilizados como marcadores seletivos de
fertilidade e de congelabilidade do sêmen (Killian et al., 1993; Roncoletta et al.,
1999; Jobim et al., 2004; Moura et al., 2006). Um estudo de Nauc e Manjunath
(2000) demonstrou que proteínas do plasma seminal bovino (BSP) possuem a
propriedade de ligação à superfície do espermatozóide, diminuindo sua quantidade
após a criopreservação do sêmen, sugerindo alguma relação com a congelabilidade
do sêmen. Entretanto, ainda é desconhecida a influência destas proteínas sobre o
processo de criopreservação do sêmen. Roncoletta et al. (1999) demonstraram que
7
7
a presença de um fator polipeptídico de 61 kDa no plasma seminal está associado
com a alta congelabilidade do sêmen de touros da raça Gir. Contudo, não foram
encontrados dados relacionando proteínas do plasma seminal com a integridade da
membrana plasmática de sêmen suíno criopreservado.
Este trabalho teve por objetivo identificar polipeptídeos provavelmente
associados à integridade de membrana plasmática de sêmen suíno submetido ao
congelamento e descongelamento.
Material e Método
Animais
Foram utilizados três machos suínos adultos mantidos sob as mesmas
condições ambientais e de manejo. Para a coleta, processamento e criopreservação
do sêmen foram realizadas seis coletas de cada macho. As coletas foram realizadas
através do método da mão-enluvada (Bearden; Fuquay, 1997), usando um copo
plástico protegido por um copo isotérmico recoberto por gaze, a fim de separar a
fração do ejaculado rico em gel. Somente a porção do ejaculado com maior
concentração espermática foi utilizada para o processo de congelamento
(Westendorf et al., 1975; Bordignon et al., 1996).
Criopreservação, envase e descongelamento
Imediatamente após a coleta do sêmen, para cada macho foi obtida da
fração rica em espermatozóides uma alíquota de 20 ml em tubo cônico de 50 ml, e
diluída (1:1, v/v) no diluente Beltsville Thawing Solution (BTS) (Levis, 2000). Após a
diluição inicial foi feito o resfriamento por 60 min a 24 °C, e seguiu-se o resfriamento
por mais 60 min até 15 °C, quando então foi feita a centrifugação a 800 x g por 10
min (SORVALL
®
RC6). O sobrenadante foi descartado e o pellet de espermatozóides
foi re-suspenso no diluidor de resfriamento (80%, v/v, de solução de lactose a 11%;
20%, v/v, gema de ovo) para uma concentração de 450 x 10
6
espermatozóides/ml. O
resfriamento foi realizado durante 90 min até 5 °C. No processo de congelamento foi
utilizada a N,N-Dimetilacetamida (DMA) (C
4
H
9
NO) com peso molecular de 87,12
como crioprotetor intracelular. O diluidor de congelamento a ser adicionado a 5 °C foi
elaborado a partir do diluidor de resfriamento, acrescido de 1,5% do detergente
Orvus Ex Paste, e o respectivo crioprotetor para concentração final de 5%, v/v, (DMA
5%). O envase das doses de sêmen foi feito em palhetas de 0,5 ml, com 150 x 10
6
espermatozóides/palheta. As palhetas foram congeladas horizontalmente, 5 cm
7
8
acima do vapor de nitrogênio líquido, por 20 min, sendo após armazenadas em
nitrogênio líquido a -196 °C até o descongelamento. As palhetas foram
descongeladas a 37 °C por 20 s, sendo re-suspensas em tubo cônico contendo 10
ml de BTS previamente aquecido a 37 °C (1:20, v/v).
Caracterização das proteínas do plasma seminal (SDS-PAGE)
Uma alíquota de sêmen após a coleta foi centrifugada (2000 x g, 10 min,
4 ºC) logo após a coleta. O plasma seminal foi congelado e mantido em nitrogênio
líquido. Para a análise as amostras foram descongeladas e recentrifugadas (3000 x
g, 10 min, 4 °C), para eliminar possível contaminação com espermatozóides. O
plasma seminal foi diluído três vezes em solução fisiológica (NaCl 0,9%). Cada
amostra foi preparada para a corrida com 50 µl de plasma seminal e 25 µl de tampão
de amostra (Glicerol; Tris-Hcl 0,6173M - pH 6,8; B-mercaptoetanol; SDS 10%; azul-
de-bromofenol; H
2
O), após foram submetidas à fervura por 10 min para
desnaturação protéica.
A eletroforese unidimensional SDS-PAGE (Laemmili, 1970) foi realizada com
o sistema BIO-RAD Mini-Protean 3 Cell® (Bio-Rad Laboratories, USA). Foram
usados géis concentrados a 15%. As amostras foram concentradas a 50 V por 20
min, e a corrida a 100 V por aproximadamente 2 h. Como padrão foi utilizado o
marcador de peso molecular BenchMark Protein Ladder™ (Invitrogen®, Carlsbad,
USA). Os géis foram corados a temperatura ambiente com Coomassie Brilliant Blue
em over-night. Os géis foram analisados com o software TotalLab TL 100 v. 2006
(Nonlinear Dynamics, UK).
Avaliação da integridade de membrana plasmática (IMP) de espermatozóides
(SPTZ)
Após o descongelamento foi feita à avaliação da IMP espermática por
fluorescência (Harrison; Vickers, 1990), através das sondas Diacetato de
Carboxifluoresceína (CFDA) e Iodeto de Propídio (IP). Após incubação em
temperatura de 22 °C por 15 min foi feita a avaliação em microscópio de
epifluorescência (Olympus BX 51, América INC), através de excitação em filtro WU
sob aumento de 400x. Foram contados 200 espermatozóides em uma mesma
lâmina e classificadas conforme sua coloração em íntegros (corados em verde em
toda sua extensão) ou lesados (corados em vermelho).
Após o descongelamento das palhetas foi feita a distribuição de freqüências
dos resultados de IMP dos espermatozóides e feita à categorização em menor de
7
9
55% e igual ou maior que 55%. Com isso foi relacionado à integridade no
descongelamento com a presença ou ausência de cada banda protéica no plasma
seminal.
Resultados e Discussão
No total, foram detectadas nove bandas protéicas no perfil eletroforético do
plasma seminal dos machos analisados (Tab. 1). O peso molecular das bandas
variou de 11 a 122 kDa. Foram observadas diferenças individuais no padrão do perfil
eletroforético entre as amostras analisadas. Muitas proteínas com peso molecular
semelhante ao das bandas detectadas neste experimento foram identificadas nos
bancos de dados in silico. Uma banda de 26 kDa (Fig. 1) apresentou uma
associação com a IMP. Foi observado que, em 88% das amostras que
apresentavam IMP ≥ 55%, a banda de 26 kDa estava ausente (Tab. 2). Por outro
lado, não foi observada a associação de outras bandas detectadas com a
integridade de membrana. O plasma seminal contém fatores protéicos específicos
que provocam importantes efeitos tanto na capacidade de fertilização do
espermatozóide quanto na fisiologia reprodutiva da fêmea (Strzezek et al., 2005).
Entretanto, os efeitos biológicos específicos das proteínas do plasma seminal nas
funções espermáticas são complexos e não compreendidos totalmente. Nos bancos
de dados in silico foi encontrado um grupo protéico com peso molecular de
aproximadamente 26 kDa chamado Sialoproteínas, que tem por função a inibição da
aglutinação das cabeças dos espermatozóides. A deficiência deste grupo pode
comprometer o potencial espermático de fertlização (Strzezek et al., 2002). Usando
eletroforese bidimensional (2D-PAGE), Flowers (2001) demonstrou a importância
biológica de duas proteínas (26 kDa, pI 6,2; 55 kDa, pI 4,8) presentes no plasma
seminal de suínos, relacionadas com altas taxas de parição (em torno de 86%).
Killian et al. (1993) associaram quatro proteínas do plasma seminal com a fertilidade
de touros. Duas proteínas (26 kDa, pI 6,2; 55 kDa, pI 4,5) foram detectadas em
touros de alta fertilidade e outras duas (16 kDa, pI 4,1; 16 kDa, pI 6,7) estavam
presentes em touros de baixa fertilidade.
A maioria das características da superfície dos espermatozóides é adquirida
no epidídimo (processo de maturação) e na ejaculação pela adsorção de
componentes específicos do plasma seminal (Amann et al., 1993). É geralmente
aceito que a ligação de algumas proteínas do plasma seminal estabiliza
8
0
componentes da membrana plasmática, mascara antígenos expostos na superfície
celular e previne contra a reação acrossômica prematura (Strzezek et al., 2005). É
bem conhecido que a adsorção de elementos pela superfície celular é um processo
dependente da temperatura. No caso de células espermáticas a adsorção pode ser
afetada por temperaturas de congelamento, dessa forma a adsorção de proteínas no
sêmen congelado pode ser diferente daquele mantido à temperatura ambiente (De
Leeuw et al., 1990). No presente estudo, os espermatozóides foram separados do
plasma seminal e congelados, o que não impede a possível influência deste fluido
sobre as células espermáticas durante o período de processamento.
Em estudos realizados com suínos miniatura observou-se que o plasma
seminal contém fatores que modificam a célula espermártica antes do congelamento
e reduzem a capacidade de penetração no oócito após o congelamento (Kawano et
al., 2004). Evidências têm demonstrando o papel de proteínas do plasma seminal na
tecnologia de preservação do sêmen suíno (Centurion et al., 2003; Caballero et al.,
2004a; Caballero et al., 2004b; Ceremades et al., 2004). A suplementação de
diluentes de sêmen com espermadesinas PSP-I/PSP-II purificadas tem um efeito
benéfico na viabilidade de espermatozóides preservados (Centurion et al., 2003).
Entretanto, outros estudos demonstraram que a suplementação de diluentes de
congelamento com essas espermadesinas PSP-I/PSP-II não influenciou a
sobrevivência dos espermatozóides pós-descongelamento, mas teve um efeito
inibitório na capacidade de fertilização desses espermatozóides descongelados
(Caballero et al., 2004a; Ceremades et al., 2004). Apesar disso, o papel biológico
dessas espermadesinas na fisiologia espermática ainda não é bem conhecido. Por
outro lado, efeitos benéficos das proteínas do plasma seminal são relatados em
alguns trabalhos (Castellini et al., 2000, Garner et al., 2001). Jobim et al. (2004)
demonstraram que há diferenças nas proteínas do plasma seminal de touros com
boa e má resposta ao congelamento, sugerindo o estudo dessas proteínas do
plasma como marcadores de congelabilidade. O uso de marcadores bioquímicos
para a identificação de propriedades biológicas do sêmen poderá ajudar a
desenvolver novos critérios que são precisos e objetivos na predição e
melhoramento da fertilidade de machos (Fraser et al., 2006).
81
Conclusão
Neste estudo é demonstrada a associação de um fator polipeptídico que
possui 26 kDa, com a baixa integridade de membrana plasmática do espermatozóide
suíno após o congelamento/descongelamento. Além disso, essa banda polipeptídica
pode representar até mais de uma proteína com várias diferenças entre elas.
Trabalhos futuros de proteômica devem ser realizados a fim de caracterizar esta
banda protéica. A compreensão e o controle de mecanismos envolvidos na
fertilidade, são de fundamental importância para o máximo desempenho da
reprodução animal artificial.
8
2
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8
5
Tabela 1. Distribuição de bandas protéicas detectadas no plasma seminal suíno,
através de SDS-PAGE, com a média de peso molecular e o desvio padrão em kDa.
Bandas Protéicas
Peso Molecular (kDa)
Média DP
1 122 2,5
2 96 2,3
3 85 2,9
4 63 1,2
5 43 2,0
6 26 0,6
7 17 0,6
8 14 0,2
9 11 0,1
Figura 1. Banda de 26 kDa do plasma seminal suíno
26 kDa
8
6
Tabela 2: Presença (Sim) e Ausência (Não) de proteínas no plasma seminal relacionado com IMP >55% descongelado
Macho Perfil
Banda, kDa, n (%)
122 96 85 63 43 26 17 14 11
1 Sim 5 (83) 6(100) 6 (100) 6 (100) 6(100) 2 (33) 3 (50) 6 (100) 6 (100)
1 Não 1 (17) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (67) 3 (50) 0 (0.0) 0 (0.0)
2 Sim 3 (60) 3 (60) 5 (100) 5 (100) 2 (40) 0 (0.0) 3 (60) 5 (100) 5 (100)
2 Não 2 (40) 2 (40) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (60) 5(100) 2 (40) 0 (0.0) 0 (0.0)
11 Sim 3 (60) 3 (60) 5 (100) 5 (100) 3 (60) 0(100) 4 (80) 5 (100) 5 (100)
11 Não 2 (40) 2 (40) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (40) 5(100) 2 (40) 0 (0.0) 0 (0.0)
Total Sim 11(69) 12(75) 16 (100) 16(100) 11(69) 2 (12) 10 (62) 16 (100) 16 (100)
Total Não 5 (31) 4 (25) 0 (0.0) 0 (0.0) 5 (31) 14(88) 6 (38) 0 (0.0) 0 (0.0)
8
7
8. CONCLUSÕES GERAIS
Foi estabelecido um novo protocolo para o processo de congelamento do
sêmen suíno, alterando o período de resfriamento até 15 °C para 120 min e uso de
dimetilacetamida na concentração de 5% como crioprotetor intracelular.
Foi identificado que a ausência de um fator de 26 kDa no plasma seminal
suíno, esteve associado a melhora na integridade de membrana plasmática de
espermatozóides após o descongelamento.
8
8
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A viabilização da utilização do congelamento de sêmen na espécie suína
parece estar na dependência, não só de um melhor conhecimento estrutural da
célula espermática, mas também do esclarecimento do efeito das substâncias
utilizadas durante o processo de congelamento e descongelamento, além das
interações entre os componentes da célula espermática e o plasma seminal.
O presente trabalho apresenta a melhora nos resultados de avaliações in
vitro após o descongelamento, através do uso de crioprotetores a base de amidas
em relação ao uso convencional de glicerol e de alterações no protocolo de
congelamento. Além disso, demonstra possíveis relações de proteínas presentes no
plasma seminal com os resultados de integridade de membrana após o
descongelamento.
As avaliações in vitro do sêmen utilizadas neste trabalho foram: motilidade
óptica, vigor espermático, morfologia, concentração, osmolalidade, pH, integridade
de membrana através de sondas fluorescentes (iodeto de propídio e diacetato de
carboxifluoresceína) e integridade de membrana espermática pelo choque
hiposmótico.
Para melhor avaliação do sêmen há necessidade de intensificar o uso de
outros métodos de avaliação. Isso permitirá acumular um conjunto de informações, a
fim de elucidar a relação dos resultados de avaliações in vitro com àqueles obtidos
com o descongelamento, bem como, com os resultados in vivo, que ainda não estão
completamente compreendidas. Algumas alternativas de análise são:
8
9
Uso de conjunto de sondas fluorescentes para avaliação da integridade de
membrana plasmática e acrossomal, função mitocondrial e compactação da
cromatina;
Métodos de avaliação espermática computadorizados (CASA);
Integridade de DNA (teste cometa);
Fertilização in vitro (FIV);
Teste de penetração espermática;
Citometria de fluxo;
Análise da ultra-estrutura celular através do uso da microscopia eletrônica de
transmissão e varredura.
O método de biologia molecular utilizado neste estudo foi a eletroforese
unidimensional, que indicou a possibilidade de relações de proteínas do plasma
seminal com a integridade espermática. Este efeito deve ser melhor investigado,
incrementando o uso da eletroforese bi-dimensional, a fim de propiciar o estudo mais
específico dessas proteínas, o que poderá vir a confirmar possíveis marcadores de
congelabilidade e verificar o efeito individual e genético nos resultados obtidos.
Os resultados obtidos neste trabalho com o uso alternativo de crioprotetores
intra e extracelulares, sugerem que um estudo mais aprofundado do uso combinado
de amidas e destas com glicerol e também, de outros possíveis crioprotetores e/ou
aditivos podem trazer resultados ainda melhores. Substâncias como os lipossomos
(microvesículas de lipídios obtidas por sonicação), biopolímeros tais como a xantana
e os bloqueadores da formação de gelo poderão ser avaliados como
crioprotetores/aditivos e mensurada sua influência na dinâmica da membrana
plasmática e, portanto, aumentando a resistência celular às injúrias do
congelamento.
Trabalhos mais simples, que poderão trazer informações importantes, como
investigar o uso de palheta de diferentes volumes, ou mesmo o uso de diferentes
concentrações espermáticas serão importantes para adicionar conhecimento sobre o
congelamento de sêmen.
Neste trabalho o congelamento de sêmen foi realizado de forma manual. Os
resultados de congelamento poderão ser otimizados com o uso de equipamentos
9
0
automatizados de congelamento e descongelamento, que reduzirá o viés de
execução da técnica.
O processamento de sêmen congelado, em escala comercial, necessitará de
investimento em equipamentos, alguns deles muito caros, necessários ao processo
de congelamento e descongelamento. A centrifugação do sêmen é passo
fundamental da técnica, a fim de eliminar o excesso de plasma seminal e concentrar
o ejaculado. Esta etapa foi realizada de duas formas neste trabalho. A primeira com
centrífuga refrigerada a temperatura de 15 °C, com sucesso. A segunda realizada na
temperatura de 24 °C com centrífuga convencional, sem êxito. No entanto, podem-
se investigar alternativas de protocolos a fim de evitar o uso de centrifugação
refrigerada a 15 °C, que muito colaborará para o processo de congelamento em
escala comercial, simplificando o processo.
Os resultados de fertilidade obtidos são satisfatórios, especialmente
considerando o fato da concentração espermática utilizada, em função do uso do
método de inseminação artificial pós-cervical. Assim, o uso de doses mais
concentradas com este método de inseminação poderá trazer ainda melhores
resultados. Outro estudo fundamental será o uso de sêmen congelado através da
inseminação intra-uterina profunda.
Os resultados in vivo foram obtidos através da sincronização de leitoas pré-
púberes. Deve-se investigar também o uso desta metodologia através de
inseminações de fêmeas multíparas, especialmente com ovulações espontâneas.
Os dados de fertilização através da avaliação de clivagem permitiram inferir
sobre o uso de crioprotetores alternativos ao uso de glicerol. Porém há necessidade
de se avaliar o desenvolvimento embrionário. Isto responderá a indagação de que
com o uso de sêmen congelado, se houver a clivagem, o desenvolvimento
embrionário ocorrerá normalmente, ou se, o processo de congelamento poderá
comprometer o DNA celular, ainda assim permitindo a clivagem, porém inibindo o
desenvolvimento embrionário.
Para que esses trabalhos possam ser realizados são fundamentais a
participação e visão multidisciplinar, dado os desafios que o processo de
congelamento impõem. Dessa forma, parcerias interinstitucionais, de grupos de
pesquisa das áreas afins e destas com a iniciativa privada são imprescindíveis e
devem ser buscadas.
91
10. REFERÊNCIAS
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