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Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Físicas e Matemáticas
Departamento de Química
Pós-Graduação em Química
PATRÍCIA CARDOSO SEVERINO
ATIVIDADE DE MODELOS BIOMIMÉTICOS
DE FOSFATASES ÁCIDAS PÚRPURAS SOBRE
ÁCIDOS NUCLEICOS
Florianópolis – SC
2007
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PATRÍCIA CARDOSO SEVERINO
ATIVIDADE DE MODELOS BIOMIMÉTICOS
DE FOSFATASES ÁCIDAS PÚRPURAS SOBRE
ÁCIDOS NUCLEICOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Química, Centro de
Ciências Físicas e Matemáticas,
Universidade Federal da Santa Catarina,
como requisito parcial para a obtenção
do título de Doutora em Química.
Orientador: Prof. Dr. Hernán Terenzi
Florianópolis – SC
2007
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Aos meus pais João e Sonia e aos
meus dois amores Davi e Felipe.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais João e Sonia, por tudo que me ensinaram, pelo amor e
dedicação e pela confiança e esperança que sempre depositaram em mim.
Ao meu companheiro Davi, seu amor e paciência nas horas de desespero
durante esta jornada foram fundamentais para a conclusão de mais esta etapa.
Aos meus irmãos Sérgio e Thaise, mesmo longe, estamos mais unidos do
que nunca. Obrigada pelo carinho e incentivo.
Ao Professor Hernán Terenzi pela orientação e discussões entusiasmadas e
por acreditar que eu era capaz....
Ao Professor Ademir Neves, por sua paciência, incentivo e pelos
ensinamentos que contribuíram imensamente para meu crescimento profissional.
Aos colegas do LABEXGEN, Maurício Bof, Guilherme Razera, Javier
Vernal pelo apoio técnico, científico e principalmente emocional.
Aos “Pinkys” Franciele, Tassiele, Carolina, Viviane por terem me aturado,
pelo apoio e amizade.
Aos colegas do LABINC, Rosely, Anelise, Maurício, Rafael por terem a
paciência de esclarecer minhas dúvidas e pela ajuda indispensáveis na realização
deste trabalho.
Ao Departamento de Química e a Pós-Graduação em Química da UFSC
pela oportunidade.
À CAPES e demais órgãos de fomento pelo suporte financeiro.
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS............................................................................ 4
SUMÁRIO.............................................................................................. 5
LISTA DE FIGURAS............................................................................. 7
LISTA DE TABELAS............................................................................ 10
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................... 11
RESUMO................................................................................................ 12
ABSTRACT............................................................................................ 13
INTRODUÇÃO...................................................................................... 14
1.1 Estrutura do Ácido Desoxirribonucléico (DNA)........................ 14
1.1.1. DNA Plasmidial................................................................ 17
1.2 Nucleases.................................................................................... 19
1.3 Fosfatase Ácida Púrpura ........................................................... 22
1.4 Nucleases Químicas – Modelos de Fosfatases........................... 28
2. OBJETIVOS............................................................................................ 30
2.1 Objetivo geral.............................................................................. 30
2.2 Objetivo específico......................................................................
30
3. PARTE EXPERIMENTAL..................................................................... 31
3.1. MATERIAIS............................................................................... 32
3.1.1. Complexos FeZnOH e FeZnOAc......................................
34
3.1.2. Complexos FeCuOH e FeCuOAc..................................... 37
3.1.3. Complexos FeNiOAc........................................................ 38
3.1.4. Complexos FeMnOH........................................................ 39
3.2. MÉTODOS E INSTRUMENTAÇÃO........................................ 40
3.2.1. Preparação do DNA plasmidial......................................... 40
3.2.2. Eletroforese em gel de agarose..........................................
40
3.2.3. Teste de clivagem em diferentes pHs............................... 41
3.2.4. Cinética de clivagem do DNA plasmidial......................... 41
3.2.5. Captadores de radicais livres........................................... 42
3.2.6. Reação em condições anaeróbias...................................... 42
3.2.7. Espectrofotometria UV-Vis.............................................. 43
3.2.8. Teste com Distamicina..................................................... 44
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................. 46
4.1. Teste de clivagem em diferentes pHs e concentração do
complexo.....................................................................................
47
4.2. Cinética de clivagem do DNA plasmidial................................... 53
4.3. Teste de mobilidade e ligação do complexo FeNiOAc ao DNA 60
4.4. Efeito de captadores de radicais livres....................................... 63
4.5. Reação em condições anaeróbicas.............................................. 67
4.6. Espectrofotometria UV-Vis........................................................ 72
4.7. Teste com Distamicina................................................................ 81
5. CONCLUSÕES....................................................................................... 85
6. PERSPECTIVAS..................................................................................... 87
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................... 88
ANEXOS................................................................................................. 100
ANEXO 1................................................................................................ 101
ANEXO 2................................................................................................ 102
ANEXO 3................................................................................................ 103
ARTIGOS PUBLICADOS...................................................................... 104
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Desenho esquemático mostrando a estrutura de dupla-hélice do
DNA............................................................................................... 14
Figura 2. Diagrama mostrando a composição de um nucleotídeo................. 15
Figura 3. Diagramas estruturais das quatro bases nitrogenadas.................... 15
Figura 4. O pareamento de bases da dupla-fita de DNA............................... 16
Figura 5. As três diferentes formas do DNA plasmidial............................... 18
Figura 6. Representação em fita da estrutura global da PAP de batata doce
(A) e de porco (B).......................................................................... 24
Figura 7. Estruturas cristalinas dos sítios ativos das PAPs: (a) kbPAP (b)
ufPAP............................................................................................. 25
Figura 8. Representação esquemática para o sítio ativo das PAPs................ 25
Figura 9. Três possíveis mecanismos de reação para fosfatases................... 27
Figura 10. Mecanismo de reação proposto para a hidrólise do BDNPP pelos
complexos Fe—Zn e Fe—Cu.........................................................
29
Figura 11. Representações esquemáticas para o sítio ativo das fosfatases
ácidas púrpuras PAPs (acima) e da estrutura do ligante
H
2
BPBPMP................................................................................... 32
Figura 12. Diagramas ORTEP e esquemático para os cátions (A)
[Fe
III
Zn
II
L1(OAc)
2
]
+
; e (B) [Fe
III
Zn
II
L1(OH)(H
2
O)]
+
.................
34
Figura 13. Proposta para os equilíbrios observados nos complexos
FeZnOAc, FeCuOAc e FeNiOAc em solução, onde M = Zn
II
,
Cu
II
e Ni
II
..................................................................................... 35
Figura 14. Proposta para os equilíbrios observados para complexos
[Fe
III
Zn
II
L1(OH)(H
2
O)](ClO
4
)
2
e [Fe
III
Cu
II
L1(OH)(H
2
O)](ClO
4
)
2
em solução...................................................................................... 36
Figura 15. ORTEP e desenho esquemático para o cátion
[Fe
III
Cu
II
L1(OAc)
2
]
+
.....................................................................
37
Figura 16. ORTEP para o cátion [Fe
III
Ni
II
L1(OAc)
2
]
+
.................................. 38
Figura 17. ORTEP para o cátion [Fe
III
Mn
II
L1(OAc)
2
]
+
................................. 39
Figura 18. A: Estrutura Química da distamicina. B: Ligação específica da
distamicina (vermelho) ao sulco menor do DNA...........................
45
Figura 19. Clivagem do DNA pelo complexo FeCuOAc em diferentes pHs. 48
Figura 20. Clivagem do DNA em diferentes pHs pelo complexo FeCuOH. 48
Figura 21. Clivagem do DNA em diferentes pHs pelo complexo FeZnOAc. 49
Figura 22. Clivagem do DNA em diferentes pHs pelo complexo FeZnOH. 50
Figura 23. Teste de clivagem do DNA em diferentes pHs.............................. 51
Figura 24. Teste de atividade do DNA em diferentes pHs pelo complexo
FeNiOAc. ......................................................................................
53
Figura 25. Análise cinética da clivagem do DNA promovida pelo complexo
FeCuOAc........................................................................................
54
Figura 26. Análise cinética da clivagem do DNA promovida pelo complexo
FeZnOAc........................................................................................
55
Figura 27. Cinética de atividade do complexo sobre o DNA plasmidial
visualizada em gel de agarose 1%..................................................
59
Figura 28. Teste de interação do DNA pBSK II com o complexo FeNiOAc. 60
Figura 29. Estrutura e modo de ligação do Brometo de Etídio ao DNA. 62
Figura 30. Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de
radicais livres nas reações do complexo FeCuOAc....................... 64
Figura 31. Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de
radicais livres nas reações do complexo FeCuOH. ....................... 64
Figura 32. Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de
radicais livres nas reações do complexo FeZnOAc....................... 65
Figura 33.
Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de
radicais livres nas reações do complexo FeZnOH......................... 65
Figura 34. Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de
radicais livres em reações com o complexo FeNiOAc.................. 66
Figura 35. Clivagem do DNA plasmidial pelo complexo FeCuOAc em
condições anaeróbicas.................................................................... 68
Figura 36. Clivagem do DNA plasmidial pelo complexo FeCuOH em
condições anaeróbicas.................................................................... 68
Figura 37. Clivagem do DNA plasmidial pelo complexo FeZnOAc em
condições anaeróbicas.................................................................... 69
Figura 38. Clivagem do DNA plasmidial pelo complexo FeZnOH em
condições anaeróbicas.................................................................... 70
Figura 39. Clivagem do DNA plasmidial pelo complexo FeMnOH em
condições anaeróbicas.................................................................... 71
Figura 40. Titulação espectrofotométrica do complexo FeCuOAc com
DNA plasmidial pBSK II............................................................... 73
Figura 41. Titulação espectrofotométrica do complexo FeCuOH com DNA
plasmidial pBSK II......................................................................... 74
Figura 42. Espectro de absorvância corrigido do complexo FeNiOAc na
ausência (R1) e na presença ( R2 e R3) de concentrações
crescentes de DNA plasmidial. ..................................................... 75
Figura 43. Espectro UV-Vis do complexo FeZnOAc com DNA plasmidial
pBSK II. ........................................................................................
77
Figura 44. Titulação espectrofotométrica UV-Vis do complexo FeZnOH
com DNA plasmidial pBSK II. .....................................................
78
Figura 45. Titulação espectrofotométrica do complexo FeMnOH com CT-
DNA. .............................................................................................
79
Figura 46. Teste de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo FeCuOAc
na ausência e na presença do reagente intercalante Distamicina. 81
Figura 47.
Teste de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo FeCuOH
na ausência e na presença do intercalante Distamicina.................. 82
Figura 48. Estudo de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo
FeZnOAc na ausência e na presença de Distamicina. ................... 83
Figura 49. Estudo de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo FeZnOH
na ausência e na presença de Distamicina. ....................................
83
Figura 50. Análise de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo
FeMnOH na ausência e na presença do reagente intercalante
Distamicina.....................................................................................
84
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fórmula molecular dos complexos a serem utilizados
e sua designação neste trabalho...................................
33
Tabela 2. Parâmetros cinéticos para as reações de clivagem do
DNA, catalisada pelos complexos FeCuOAc,
FeCuOH, FeZnOAc, FeZnOH e FeMnOH.................. 56
Tabela 3. Constante de ligação intrínseca (Kb) e constante de
associação cinética (K
ass
) dos complexos metálicos
Fe
III
M
II
e comparação com outros compostos.............. 80
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
2,4-BDNPP bis(2,4-dinitrofenil)fosfato
A adenina
bsPAP Fosfatase Ácida Púrpura de Baço de Bovinos
C citosina
CH
3
CN Acetonitrila
CT-DNA DNA de timo de bezerro “Calf Thymus DNA”
DMSO dimetil sulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
E Eficiência catalítica
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
EPR Ressonância Paramagnética Eletrônica
f Fator catalítico
F I forma superenovelada do plasmídio
F II forma circular aberta do plasmídio
F III forma linear do plasmídio
FeCuOAc Complexo [Fe
III
Cu
II
L1(OAc)
2
] ClO
4
FeCuOH Complexo [Fe
III
Cu
II
L1(OH)(H
2
O)]ClO
4
FeMnOH Complexo [Fe
III
Mn
II
L1(OH)(H
2
O)]ClO
4
FeNiOAc Complexo [Fe
III
Ni
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
FeZnOAc Complexo [Fe
III
Zn
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
FeZnOH Complexo [Fe
III
Zn
II
L1(OH)(H
2
O)](ClO
4
)
2
G guanina
H
2
BPBPMP ou
L1
2-[N-bis-(2-piridilmetil)aminometil]-4-metil-6-[N-(2-
hidroxibenzil)(2-piridilmetil) aminometil]fenol
HEPES N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-áciso etanosulfônico
K
ass
Constante de associação
kbPAP Fosfatase Ácida Púrpura de feijão vermelho tipo
“kidney bean”
k
cat
Constante catalítica
kDa Quilo Daltons
Km Constante de Michaelis-Menten
k
obs
Constante de velocidade
kpb Quilobase – 1 Kpd corresponde a 1000 pares de base
M
II
Metal divalente
M
III
Metal trivalente
MOPS Ácido 3-[N-morfolino] propanosulfônico
pBSK II Plasmídeo Bluescript SK II
PAP Fosfatase Ácida Púrpura
pb pares de bases de DNA
PIPES Piperazina-N,N’-bis(ácido 2-etano sulfônico)
ratTRAP Fosfatase Ácida Púrpura Resistente ao Tartarato de
Ratos
rbPAP Fosfatase Ácida Púrpura de Ossos de Ratos
ufPAP Fosfatase Ácida Púrpura de Útero de Suínos
T timina
TBE tampão Tris/borato/EDTA
TRAP Fosfatase Ácida Púrpura Resistente ao Tartarato
Humana do Tipo 5
TRIS tris(hidroximetil) aminometano
UV-Vis ultravioleta-visível
RESUMO
As Fosfatases Ácidas Púrpuras (PAPs) pertencem a um grupo de
metaloenzimas da classe das hidrolases atuando na clivagem de ésteres de
fosfato, promovem a hidrólise de fosfoproteínas, nucleotídeos e
arilfosfatos. Complexos biomiméticos do sítio ativo das PAPs foram
sintetizados com o objetivo de elucidar o papel das PAPs nos sistemas
vivos e simultaneamente encontrar novas aplicações para estes complexos
como nucleases sintéticas. Com este intuito, foi testada a atividade de uma
série de complexos heterodinucleares Fe
III
M
II
, usando o ligante assimétrico
H
2
BPBPMP (L1). Os complexos são: FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc,
FeZnOH, FeMnOH e FeNiOAc.
O DNA plasmidial foi utilizado como modelo para testar a clivagem
da ligação fosfato pelos complexos. Foram testadas diferentes condições de
pH e concentração dos complexos. As reações também foram realizadas na
presença de captadores de radicais livres e na ausência de oxigênio. Para
verificar a interação complexo/DNA foram realizados experimentos com
Distamicina e titulação espectrofotométrica UV-Vis.
Todos os complexos, exceto FeNiOAc, foram capazes de clivar DNA
por um mecanismo hidrolítico em baixas concentrações do complexo (2,5
µM) a 37
o
C em pH próximo ao fisiológico (faixa de 6,0 a 7,0). O
complexo FeNiOAc não cliva o DNA, mas pode se ligar ao DNA e alterar
significativamente sua mobilidade. O complexo FeCuOAc é o mais ativo
da série apresentando uma aceleração de 2,71 x 10
7
vezes quando
comparado com o valor do DNA não catalisado, seguido por, FeMnOH,
FeZnOAc, FeCuOH e FeZnOH.
Palavras chave: complexo metálico, clivagem DNA, nucleases
sintéticas, PAPs.
ABSTRACT
Purple Acid Phosphatases (PAPs) are members of a group of
metalloenzymes included in the class of hydrolases acting in the cleavage
of phosphate esters, promote hydrolysis of phosphoproteins, nucleotides
and arilphosphates. Biomimetic complexes for the active site of PAPs were
synthesized in order to elucidate the role of PAPs in living systems and
simultaneously find new applications for these complexes as chemical
nucleases. In view of this we tested the activity of a series of hetero-
dinuclear Fe
III
M
II
complexes by using the unsymmetrical H
2
BPBPMP
ligand (L1). The complexes were: FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc,
FeZnOH, FeMnOH and FeNiOAc.
Plasmid DNA were used as a model to test the cleavage of phosphate
bond by the complexes. Different conditions of pH and complex
concentration were tested. The reactions were also cared out in the presence
of radical scavengers and in the absence of oxygen. To verify the
interaction complex/DNA experiments with Distamicin and
spectrophotometric titration were performed.
All the complexes, except FeNiOAc, were able to cleave DNA by a
hydrolytic mechanism even at low complex concentration (2,5 µM) at 37
o
C and near physiological pH (range 6,0 to 7,0). FeNiOAc complex did not
cleave DNA, but can bind DNA and change its mobility. FeCuOH complex
is the most active of this series with rate enhancement 2,71 x 10
7
times over
uncatalyzed double-stranded DNA cleavage, follow by FeMnOH,
FeZnOAc, FeCuOH, FeZnOH.
Key words:metallic complex, DNA cleavage, synthetic nuclease,
PAPs.
14
1. INTRODUÇÃO
1.1. Estrutura do Ácido Desoxirribonucléico (DNA)
O ácido desoxirribonucléico (DNA) é o responsável pelo armazenamento
e transmissão da informação genética e a descoberta da estrutura do DNA
por Watson e Crick, em 1953,
[1]
foi um evento grandioso na ciência que
originou disciplinas inteiramente novas e influenciou o curso de muitas
outras.
O modelo mostrou que o DNA é uma dupla-hélice e que as duas
fitas se enrolam em torno do eixo da hélice. As desoxirriboses ficam
externas em relação às bases nitrogenadas (Figura 1).
[2]
As ligações
fosfodiéster que unem os nucleotídeos nas duas fitas são antiparalelas: uma
na direção 5’ PO – 3’ OH e a outra na direção 3’ OH –5’ PO (Figura 4).
Figura 1. Desenho esquemático mostrando a estrutura de dupla-hélice
do DNA. (www.biomol.org/historia/propduplahelice.shtml)
15
O DNA é formado de ácido desoxirribonucléico. As fitas de DNA
são longos polímeros formados por milhões de nucleotídeos ligados uns
aos outros por ligações fosfodiéster. Individualmente, nucleotídeos
consistem de três partes distintas: Uma das quatro bases nitrogenadas,
desoxirribose (um açúcar de 5 carbonos) e um grupo fosfato (Figura 2).
[2, 3]
Figura 2. Diagrama mostrando a composição de um nucleotídeo.
As bases nitrogenadas podem ser bases purínicas, adenina (A) e
guanina (G) ou bases pirimidínicas, citosina (C) e timina (T). (Figura 3)
(A) (G)
( C) (T)
Figura 3. Diagramas estruturais das quatro bases nitrogenadas.
Duas características das bases nitrogenadas são importantes: sua
estrutura química e seu tamanho. A presença dos grupos carbonílico (C=O)
e amino (C-NH
2
) permitem as formações das ligações de hidrogênio entre
16
as bases. Assim, T que contém o grupo carbonílico pode parear com A que
contém um grupo amino, através de uma ligação de hidrogênio e C e G que
possuem tanto grupos carbonílicos quanto grupos amino podem formar
duas ligações de hidrogênio. Uma ligação de hidrogênio adicional é
formada entre os nitrogênios dos anéis aromáticos (Figura 4).
[2, 4]
Figura 4. O pareamento de bases da dupla-fita de DNA.
Nas células a molécula de DNA está altamente compactada,
superenovelada, que consiste no enrolamento da dupla-hélice sobre si
mesma.
Ligação
fosfodiéster
17
1.1.1. DNA Plasmidial
Os mecanismos de replicação do genoma, recombinação, transcrição,
reparo e condensação envolvem estados de superenovelamento do DNA.
Por isso, é bastante pertinente a escolha do DNA superenovelado
plasmidial como sistema modelo, uma vez que o superenovelamento do
DNA existe em vírus, animais e células humanas.
[5, 6]
Os plasmídeos são moléculas circulares duplas de DNA que estão
separadas do DNA cromossômico. Geralmente ocorrem em bactérias e por
vezes também em organismos eucarióticos (ex: o anel de 2-micra em
Saccharomyces cereviesiae). O seu tamanho varia entre 1 e 250 kbp
(milhares de pares de bases). Existem entre uma, até cinqüenta cópias de
um mesmo plasmídeo numa única célula. São ferramentas importantes nos
laboratórios de genética e bioquímica, onde são usados rotineiramente para
multiplicar (fazer muitas cópias de) ou expressar genes específicos. Outro
uso importante dos plasmídeos é a produção de grandes quantidades de
proteínas, por exemplo, a insulina, ou até mesmo antibióticos.
[2, 4]
Além disso, as propriedades das diferentes formas do DNA plasmidial
tornam os plasmídeos excelentes modelos para estudos de interação e
clivagem do DNA. Primeiramente, o superenovelamento faz com que a
molécula de DNA esteja tencionada (Forma I ou F I) e que ao sofrer um
corte em uma das fitas tenda a perder esta tensão, “desenrolando” a super-
hélice e passando para a forma circular aberta (Forma II ou F II). Um
segundo corte na fita oposta, leva à abertura do DNA circular gerando a
forma linear do plasmídeo (forma III ou F III) (Figura 5). Em segundo
lugar, as três diferentes formas do DNA plasmidial (F I, F II e F III)
apresentam mobilidades distintas umas das outras numa eletroforese em gel
de agarose. Esta distinção de mobilidade (F I > F III > F II), devido ao
diferente grau de compactação das moléculas, torna possível a completa
18
separação, e posterior quantificação, das formas do DNA plasmidial
(Figura 5).
[7, 8]
Figura 5 – As três diferentes formas do DNA plasmidial. (A) representação
esquemática das três diferentes formas das moléculas de DNA plasmidial.
(B) foto ilustrativa de um gel de agarose de amostras do plasmídio pBSK-
II, expostas a um complexo metálico capaz de gerar cortes nas fitas do
DNA. A última amostra se refere ao plasmídio pBSK-II digerido com a
enzima de restrição BamHI.
[8]
F II
F III
F I
Corte na
s fitas do DNA plasmidial
pBSK
-
II
+ BamHI
(A)
19
1.2. Nucleases
A excitação causada pela descrição da estrutura da dupla hélice do
DNA atraiu a atenção de muitos pesquisadores, particularmente por causa
das implicações biológicas do modelo e não tanto pelo modelo em si. A
importante questão que surgiria então era como ocorreria a transformação
da informação genética, contida no gene, em proteínas. Para se responder
às questões fundamentais de como funcionaria um gene seria necessário
quebrar o DNA em pedaços menores, mais manipuláveis, de um modo
específico e previsível.
[3]
A descoberta veio em 1968 quando Menelson e Yuan isolaram uma
enzima de restrição da bactéria Escherichia coli. Esta enzima, uma
nuclease, que poderia reconhecer uma seqüência definida no DNA e cortá-
lo especificamente.
[3]
As nucleases são enzimas capazes de clivar, ou cortar, a ligação
fosfodiester na molécula de ácido nucléico (DNA), são de importância
fundamental e grande utilidade. Um exemplo da utilidade das nucleases em
síntese orgânica é o uso na resolução de isômeros ópticos. Em
biotecnologia, utilizadas como endonucleases de restrição, desempenham
um papel chave na manipulação de genes, por sua capacidade de se ligar
especificamente ao DNA. A descoberta das nucleases de restrição resultou
no desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, em técnicas de
sequenciamento de DNA, técnicas de mapeamento genético e mapeamento
dos cromossomos humanos.
[9-12]
Todas estas metodologias, onde as nucleases desempenham um papel
importante, representam uma grande promessa para o futuro da
humanidade através do desenvolvimento da ciência, tecnologia e indústria.
Por esta e muitas outras razões, as nucleases têm recebido atenção tanto na
pesquisa básica como na aplicada.
[9]
20
Um aspecto comum da maioria dos trabalhos nesta área é a
convergência de estudos químicos e biológicos, através da utilização de
substratos “reais” como DNA e proteínas, analisando a atividade de
modelos de nucleases e peptidases.
[9, 13]
Os modelos de nucleases podem contribuir para nosso entendimento nos
mecanismos de reação e também podem ser utilizados como catalisadores,
atuando como enzimas. Por esta razão, químicos tanto da área de orgânica
quanto inorgânica têm se envolvido ativamente no desenvolvimento e
síntese de modelos de enzimas.
[9]
Nuclease P1
[14]
, Nuclease S1 de Aspergilus oryzae , fosfatase alcalina
[15]
, carboxipeptidase A
[13]
, anidrase carbônica , catalase
[16]
, catecol oxidase
[17]
e fosfatase ácida púrpura
[15, 18-20]
, são algumas das enzimas que
inspiraram pesquisadores a sintetizar modelos biomiméticos de
enzimas.
[9, 21, 22]
Diversos complexos modelo já sintetizados tiveram sua atividade
sobre biomoléculas descrita e são discutidas em algumas revisões na
literatura.
[9, 21-25]
Muitos destes complexos ajudaram a entender não
somente os mecanismos envolvidos em reações catalisadas por enzimas,
mas também demonstraram possuir propriedades como agentes
antitumorais
[26-29]
, antimicrobianos
[7]
ou atuando como nucleases e
peptidases.
[30-34]
Estes modelos são pequenas moléculas que são chamadas nucleases
artificiais ou nucleases químicas ou ainda, quimioenzimas.
[10]
Pelo fato de muitas enzimas que catalisam a hidrólise da ligação
fosfodiéster do DNA possuírem no seu sítio ativo íons metálicos,
atualmente existem cada vez mais nucleases químicas baseadas em
complexos di ou multi metálicos que incluem Fe, Zn, Cu, Co, Ln, Mn entre
outros.
[14, 35-40]
21
Uma das classes mais estudadas de nucleases são as Fosfatases Ácidas
Púrpuras (PAPs)
[22]
, sendo que diversas nucleases químicas que
mimetizam o seu sítio ativo já foram sintetizadas.
Como Hamilton e Kirby citam em seu artigo: “Virtualmente tudo que
entendemos sobre os sistemas biológicos é derivado do trabalho em
sistemas modelos”.
[41]
22
1.3. Fosfatases Ácidas Púrpuras
As fosfatases ácidas púrpuras (PAPs) compreendem uma família de
hidrolases ácidas binucleares que contém metais em seu sítio ativo. São
fosfomonoesterases e fofodiesterases não específicas que já foram descritas
em mamíferos, plantas, fungos e em algumas bactérias.
[42-45]
As PAPs em mamíferos já foram isoladas de fígado, baço de bovinos
(bsPAP), fluído alantóico de porco (uteroferrina - ufPAP) (Figura 6B), e de
vários outros tecidos.
[46-49]
As PAPs de mamíferos descritas até agora são
proteínas monoméricas com massa molecular de aproximadamente 35-40
kDa contendo Fe
III
Fe
II
no seu sítio ativo. O centro binuclear de ferro pode
apresentar dois estados de oxidação acessíveis: um Fe
III
Fe
II
cataliticamente
ativo, conhecido como “forma rosa” e outro Fe
III
Fe
III
inativo, conhecido
como “forma púrpura”. A cor púrpura característica é resultado da
transferência de carga tirosinato-Fe
III
a 560 nm.
[44-46]
Pesquisas médicas caracterizaram uma fosfatase ácida de tecidos
humanos, resistente a inibição por tartarato, que foi denominada fosfatase
ácida resistente ao tartarato (TRAP) humana do tipo 5. A fosfatase ácida
humana (TRAP), isolada de macrófagos e osteoclastos por Hayman e Cox,
é uma proteína lisossomal que apresenta duas isoformas, sendo que uma
delas é biologicamente inativa e possui peso molecular de
aproximadamente 38 kDa. Contém em seu sítio catalítico “clusters” di-
ferro-oxo, determinado por estudos de ressonância paramagnética
eletrônica. Homóloga a uteroferrina, em humanos, sua função é
desconhecida, porém proteínas desta classe estão envolvidas na catálise de
reações oxigênio dependentes.
[49]
Estudos demonstraram que os níveis de
fosfatase no soro humano podem ser medidos para diagnosticar e
estabelecer o estágio de câncer de próstata. Recentemente, também foi
23
demonstrado que os níveis de PAPs são extremamente elevados em células
de câncer de mama e em tumores de origem neuroendócrina.
[50]
As fosfatases ácidas púrpuras são expressas diferencialmente em
plantas dependendo do estágio de desenvolvimento e já foram isoladas de
uma grande variedade de plantas como feijão vermelho tipo “kidney bean”,
sementes de soja, batata doce (Figura 6A), arroz e folhas de espinafre.
[45, 47,
48]
No feijão vermelho, apresenta-se como um homodímero de massa
molecular 110 kDa contendo Fe
III
Zn
II
e teve sua estrutura determinada por
Sträter e refinada por Klabunde e colaboradores.
[45]
24
Figura 6. Representação em fita da estrutura global da PAP de batata
doce (A) e de porco (B). A PAP de batata doce é um homodímero; cada
subunidade contém dois domínios um N-terminal (em azul) de função
desconhecida e um domínio catalítico (em magenta). Os íons metálicos
estão representados na cor laranja para Fe
III
e azul para Mn
II
. As PAPs de
mamíferos são monoméricas e possuem somente um domínio. Em B, os
dois íons Fe são mostrados como esferas laranjas.
[51]
25
Figura 7. Estruturas cristalinas dos sítios ativos das PAPs: (a) kbPAP
(b) ufPAP.
A elucidação das estruturas cristalinas da ufPAP (1,55 Å) e da TRAP
de ratos (ratTRAP (2,7 Å) e rbPAP (2,2 Å)) permitiram constatar a
similaridade dos sítios ativos das PAPs de mamíferos e da kbPAP,
sugerindo que a catálise da reação de hidrólise de fosfatos deva ocorrer
através de um mecanismo similar (Figura 7). Um desenho esquemático
representando a composição de um sítio ativo comum para a forma ativa
das PAPs de mamíferos e de vegetais é mostrado na Figura 8.
[19]
HIS
H
IS
ASN
ASP
T
Y
R
ASP
HIS
OH
2
OH
NH
N
N
HN
M
+2
O
NH
2
N
NH
O
O
O
O
O
M
+3
OH
Figura 8. Representação esquemática para o sítio ativo das PAPs
.
26
As PAPs promovem a hidrólise de fosfoproteínas, nucleotídeos,
arilfosfatos.
[49]
Testes in vitro demonstraram que esta proteína pode servir
como catalisadora em reações de peroxidação levando a formação de íons
superóxido e íons hidroxila.
[47, 49]
Em plantas as PAPs são responsáveis pela
assimilação e manutenção dos níveis de fosfato, liberando fosfato de
esteres de fosfato e anidridos.
[47, 48]
Fosfatases ácidas púrpuras contendo centro Fe
III
M
II
(onde M pode ser
Fe ou Zn) em seu sítio ativo catalisam a hidrólise de éster de ácido
fosfórico ativado e anidridos,como ATP.
[45, 47, 51]
Mas o mecanismo de ação
destas enzimas ainda não está totalmente esclarecido. Por isso as PAPs têm
sido extensamente estudas com o intuito de investigar o papel dos metais e
do tipo de mecanismo envolvido. Três mecanismos já foram propostos. No
primeiro mecanismo (Figura 9a) o fosfato preferencialmente, se liga ao M
II
(Fe ou Zn). Subseqüentemente o fosfato é atacado pelo OH
-
ligado ao
Fe
III
. No segundo mecanismo (Figura 9b), o éster de fosfato faz uma ponte
entre Fe
III
e M
II
. A ponte µ-OH, covenientemente orientada, atua como um
nucleófilo e ataca o fosfato em ponte por trás. Em outro mecanismo (Figura
9c), o hidróxido ligado ao Fe
III
inerte atua como uma base geral para
deprotonar uma segunda molécula de água, que ataca o fosfato ligado ao
M
II
.
[15, 45, 52]
Recentemente, um quarto mecanismo foi descrito por Schenk e
colaboradores ao analisarem uma PAP de batata doce com centro metálico
FeMn. Neste mecanismo, um µ-oxo ponte, e não hidróxido é responsável
pelo ataque nucleofílico ao fosfato.
[47]
27
Figura 9. Três possíveis mecanismos de reação para fosfatases. (a) O
substrato monoester de fosfato preferencialmente se liga ao M
II
. O fosfato é
subseqüentemente atacado pelo OH
-
ligado ao Fe
III
. (b) Neste mecanismo, o
éster de fosfato faz uma ponte entre os dois centros metálicos e o µ-OH
então ataca nucleofilicamente o fosfato em ponte. (c) O hidróxido ligado ao
Fe
III
atua como uma base geral para deprotonar a molécula de água, que
ataca o fosfato ligado ao M
II
.
[15]
28
1.4. Nucleases Químicas – Modelos de Fosfatases
Para avaliar os mecanismos conflitantes propostos para a atividade das
PAPs, é de grande interesse que se desenvolvam modelos binuclares
contendo Fe
III
e M
II
para que possamos entender os diferentes aspectos
envolvidos na hidrólise de ligações fosfodiéster, além verificar o potencial
de utilização destes modelos de PAPs como nucleases químicas.
Para mimetizar os aminoácidos presentes no sítio ativo das PAPs têm
sido utilizados grupos imidazólicos, benzimidazólicos, piridínicos,
fenólicos, imínicos, amínicos e amídicos. Os grupos aromáticos podem
ainda possuir substituintes diversos em seus anéis.
O primeiro complexo descrito como modelo para as PAPs foi
publicado em 1995 por Sadler e colaboradores. Neves e colaboradores têm
apresentado complexos homo e heterobinucleares, com base no ligante não
simétrico H
2
BPBPMP capazes de atuar na hidrólise do substrato modelo
bis (2,4-dinitrofenil)fosfato (2,4-BDNPP).
[37, 39, 53-59]
Outros modelos, utilizando ligantes diferentes e com centros
bimetálicos também mostraram atividade sobre o 2,4-BDNPP
[18, 56, 60]
e
também sobre o monoester.
[61]
Alguns modelos biomiméticos de PAPs demonstraram eficiência na
hidrólise do substrato ativado 2,4-BDNPP, mas também foram capazes de
clivar o DNA, atuando como nucleases químicas.
[37, 39, 51, 61, 62]
A atividade catalítica de complexos modelo de PAPs contendo FeMn,
FeZn, FeCu e FeNi foi medida com o substrato ativado 2,4-BDNPP.
[51]
Para o complexo FeZn, foi postulado que a hidrólise do diéster ocorre por
um mecanismo similar ao proposto para a kbPAP, onde o substrato (ligado
como monodentado) é ativado pelo íon metálico divalente, seguido pelo
ataque nucleofílico intra-molecular do grupo OH
-
ligado ao Fe
III
no átomo
de fósforo (Figura 10A). (2) No entanto estudos realizados com o
29
complexo de FeCu , mostram que o sítio férrico pode estar
pentacoordenado, com ausência de uma molécula de água/hidróxido
terminal ligado ao Fe
III
.
[59]
Observações similares foram reportadas para a
PAP de porco. Então, similarmente as PAPs de porco e batata doce, o
complexo de FeCu utiliza o hidróxido/oxo ponte como um nucleófilo
(Figura 10B).
[51]
Figura 10. Mecanismo de reação proposto para a hidrólise do 2,4-
BDNPP pelos complexos FeZn e FeCu, respectivamente. No complexo
FeZn, o nucleófilo proposto está terminalmente coordenado ao Fe
III
(A),
enquanto no complexo FeCu, o nucleófilo proposto é o oxigênio da ponte
ligando os metais.
[51, 59]
30
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Este trabalho teve como objetivo analisar e caracterizar a atividade de
complexos biomiméticos do sítio ativo de Fosfatases Ácidas Púrpuras sobre
o ácido desoxirribonucléico (DNA).
2.2. Objetivos específicos
• Determinar a capacidade de clivagem de ácidos nucléicos por
complexos que mimetizam as PAPs.
• Determinar o tipo de interação entre os complexos e moléculas de
DNA.
• Identificar os locais de corte e/ou ligação dos complexos sobre
ácidos nucléicos.
• Determinar parâmetros cinéticos da reação de clivagem de DNA.
• Estudar os possíveis mecanismos envolvidos nas reações dos
complexos metálicos com DNA.
31
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. MATERIAIS
Experimentos envolvendo ácidos nucléicos requerem certos cuidados
especiais para evitar a quebra ou degradação das fitas de DNA pela
presença de nucleases ou outro contaminante qualquer nos reagentes,
vidraria ou plásticos utilizados nos testes. Por isso, todos os materiais
(tubos, ponteiras, vidraria) foram esterilizados por autoclavação ou foram
utilizados tubos e ponteiras, adquiridos comercialmente, estéreis com
certificado DNase, RNase “free”.
Os reagentes utilizados (TRIS, agarose, azul de bromofenol, brometo
de etídio, ácido bórico, EDTA, NaCl) eram específicos para utilização em
biologia molecular.
Os tampões biológicos (PIPES, MES, MOPS, HEPES) foram
esterilizados por filtração em filtros de 0,22 µm. Os solventes (etanol,
acetonitrila, DMSO, isopropanol) foram adquiridos de fontes comerciais e
apresentavam alto grau de pureza (para HPLC).
A água utilizada no preparo das soluções foi água ultrapura (filtro
Milli Q) ou água destilada autoclavada.
Os complexos utilizados neste trabalho foram sintetizados por alunos
do Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia do Departamento de
Química, Universidade Federal de Santa Catarina, sob orientação do Prof.
Dr. Ademir Neves. Estes complexos foram desenvolvidos buscando-se
mimetizar o sítio ativo de Fosfatases Ácidas Púrpuras. A série de
complexos utilizada, foi sintetizada a partir do ligante, H
2
BPBPMP ou L1,
2-[N-bis-(2-piridilmetil)aminometil]-4-metil-6-[N-(2-hidroxibenzil)(2-
piridilmetil) aminometil]fenol, mostrado na Figura 11.
[53]
Nos complexos
32
modelos testados, foi mantido o mesmo metal trivalente (Fe
III
) e variando
o metal divalente (Zn
II
, Ni
II
, Mn
II
ou Cu
II
).
HIS
H
IS
ASN
ASP
T
Y
R
AS
P
HI
S
OH
2
OH
NH
N
N
HN
M
+2
O
NH
2
N
NH
O
O
O
O
O
M
+3
OH
Figura 11. Representações esquemáticas para o sítio ativo das
fosfatases ácidas púrpuras PAPs (acima) e da estrutura do ligante
H
2
BPBPMP.
O ligante binucleante possue como braços pendentes os grupos amina,
piridina e fenol, que buscam mimetizar, respectivamente, os resíduos de
aminoácidos asparagina, histidina e tirosina presentes no sítio ativo das
fosfatases ácidas púrpuras.
[19]
Todos os complexos apresentam um arranjo heterodinuclear onde cada
íon metálico encontra-se coordenado por uma das metades do ligante
heptadentado L1 e ponteados pelo grupo fenolato 2,4,6-substituído. Os
metais divalentes (Zn
II
, Ni
II
ou Cu
II
) estão coordenados por dois átomos de
nitrogênio piridínicos e um nitrogênio da amina terciária, enquanto que o
íon Fe
III
encontra-se coordenado a um nitrogênio piridínico, um nitrogênio
da amina terciária e pelo oxigênio do fenolato terminal. Nos complexos
CH
3
OH
NN
N
N
N
H
O
33
[Fe
III
Zn
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
, [Fe
III
Ni
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
e
[Fe
III
Cu
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
, as duas posições de coordenação restantes dos
metais são ocupadas por pontes do tipo µ-acetato exógenas.
[19]
Os complexos descritos neste trabalho foram caracterizados através de
espectroscopia de infravermelho (IR), ressonância magnética nuclear de
hidrogênio (
1
H NMR) e carbono (
13
C NMR), no caso do ligante, e análise
elementar de carbono, hidrogênio e nitrogênio (CHN) e determinação da
estrutura por Raio X. Os resultados da análise elementar encontram-se
descritos na literatura juntamente com o procedimento experimental de
síntese de cada complexo.
[19, 55-57]
Ainda não foram publicados os dados
referentes ao complexo FeMnOH e para este trabalho nos baseamos nos
dados obtidos através do estudo do complexo FeMnOAc.
[55]
Para
simplificar a designação dos complexos para este trabalho, será utilizada a
seguinte nomenclatura mostrada na Tabela 1.
Tabela 1. Fórmula molecular dos complexos a serem utilizados, e sua
designação neste trabalho.
Complexo (fórmula molecular)
Nomenclatura
[Fe
III
Zn
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
FeZnOAc
[Fe
III
Zn
II
L1(OH)(H
2
O)](ClO
4
)
2
FeZnOH
[Fe
III
Cu
II
L1(OAc)
2
] ClO
4
FeCuOAc
[Fe
III
Cu
II
L1(OH)(H
2
O)]ClO
4
FeCuOH
[Fe
III
Ni
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
FeNiOAc
[Fe
III
Mn
II
L1(OH)(H
2
O)]ClO
4
FeMnOH
34
3.1.1- Complexos FeZnOH e FeZnOAc
Os complexos de fórmula molecular [Fe
III
Zn
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
e
[Fe
III
Zn
II
L1(OH)(H
2
O)](ClO
4
)
2
foram sintetizados pelo Doutor Maurício
Lanznaster (Figura 12).
[19, 56]
Os complexos contendo Zn como M
II
apresentam-se como modelos biomiméticos de Fosfatase Ácida Púrpura de
Feijões do Tipo “Red Kidney Bean”.
[45, 56]
Figura 12. Diagramas ORTEP e esquemático para os cátions (a)
[Fe
III
Zn
II
L1(OAc)
2
]
+
; e (b) [Fe
III
Zn
II
L1(OH)(H
2
O)]
+
.
[45, 56]
C44
C45
C43
C74
C46
N42
C73
C26
C20
O72
C41
C25
C2
O71
C21
C53
C54
N1
C11
C24
Zn1
C16
N52
C40
C22
O1
C55
C12
C23
C30
Fe1
C15
O20
C51
C5
N4
C56
C13
C14
O62
C50
C31
O61
C3
N32
C63
C36
C33
C64
C35
C34
3+
2+
Zn
N
Fe
N
O
CH
3
N
O
N
N
O
O
O
O
1
4
42
52
62
61
72
71
20
1
32
1
2+
2
4
4
3
3+
1
2
5
3
Zn
N
N
N
OH
O
CH
3
Fe
N
N
OH
2
O
C52
C53
C51
C54
N5
C55
O3
O4
O2
C42
C41
Zn
C43
Fe
C56
N3
C31
C46
C36
C32
C47
C35
C44
N1 O1
C45
C33
C34
C21
N4
N2
C19
C14
C22
C18
C13
C25
C15
C26
C23
C12
C24
C16
C11
C17
A
B
35
As curvas de equilíbrio potenciométrico obtidas para os complexos
FeZnOAc e FeCuOAc apresentam uma região tampão entre pH 4 e 9, que
corresponde à neutralização de três prótons. Esse fato indica a hidrólise dos
complexos em meio aquoso, onde as duas pontes µ-acetato são substituídas
por moléculas de água, as quais foram tituladas fornecendo três constantes
de protonação. Para o complexo FeZnOAc os valores de pKa são 4,84; 5,99
e 7,97. O complexo FeCuOAc tem valores de pKa 5,25; 6,20 e 7,82.
Em pH ~ 5 observa-se o primeiro pKa, correspondente a
desprotonação da molécula de água ligada ao íon Fe
III
com a formação da
espécie (HO)Fe
III
(µ-OAc)M
II
(OH
2
). Em pH ~ 6 é observado o segundo
pKa, atribuído a desprotonação de uma molécula de água para a formação
da ponte µ-hidróxido, imediatamente após a saída da segunda ponte
acetato. Finalmente, o terceiro pKa corresponde à desprotonação da
molécula de água ligada ao Zn
II
e é determinado em pH > 7, onde a espécie
(HO)Fe
III
(µ-OH)M
II
(OH) é formada (Figura 13).
[19, 56, 57]
Fe
O
M
O
O
O
O
Fe
O
M
O
OH
OH
2
H
Fe
O
M
OH
OH
2
?
OH
2
Fe
O
M
O
O
OH
2
OH
2
Fe
O
M
O
O
OH
OH
2
Fe
O
M
O
OH
OH
H
pKa1
pKa2
pKa3
III
II
III
III
IIIIIIIII
II
II
II
II
II
Figura 13. Proposta para os equilíbrios observados nos complexos
FeZnOAc, FeCuOAc e FeNiOAc em solução, onde M = Zn
II
, Cu
II
e
Ni
II
.
36
Os complexos contendo pontes do tipo µ-acetato, apresentaram um
comportamento similar aos complexos FeZnOH e FeCuOH, além da
determinação de um pKa intermediário em torno de 6,0, associado a
hidrólise da ponte µ-acetato para formação de uma ponte
µ-hidróxido. Estudos potenciométricos mostram que o complexo FeZnOH
apresenta dois prótons tituláveis, com valores de pKa = 4,66 e 8,25 que
correspondem, respectivamente, a desprotonação de duas moléculas de
água ligadas aos sítios de Fe
III
e Zn
II
. O mesmo comportamento foi
observado para o complexo FeCuOH, para o qual foram obtidos valores de
pKa = 5,23 e 7,82 (Figura 14).
[19, 56, 57]
Fe
O
M
O
OH
2
OH
2
H
Fe
O
M
O
OH
OH
2
H
Fe
O
M
O
OH
OH
H
pKa1
pKa2III
II
II
II
III
III
Figura 14. Proposta para os equilíbrios observados para complexos
[Fe
III
Zn
II
L1(OH)(H
2
O)](ClO
4
)
2
e [Fe
III
Cu
II
L1(OH)(H
2
O)](ClO
4
)
2
em
solução, onde M
II
= Zn
II
, Cu
II
.
37
3.1.2- Complexos FeCuOH e FeCuOAc
Os complexos de fórmula molecular [Fe
III
Cu
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
[Fe
III
Cu
II
L1(OH)(H
2
O)]ClO
4
, foram sintetizados pelo Doutor Maurício
Lanznaster (Figura 15).
[19, 56, 59]
Os complexos contendo Cu como M
II
apresentam-se como modelos biomiméticos de Fosfatase Ácida Púrpura de
Feijões do Tipo “Red Kidney Bean”.
[45, 56, 59]
Figura 15. ORTEP e desenho esquemático para o cátion
[Fe
III
Cu
II
L1(OAc)
2
]
+
.
C34
C35
C74
C33
C36
C73
N32
O71
C31
C3
O72
C50
C23
C13
C14
O20
N4
C56
Fe1
C24
C51
C30
C22
C12
C15
O1
C5
C40
C55
Cu1
N52
C25
N1
C11
C16
C21
C26
O61
C54
C53
C2
C20
C41
O62
C63
N42
C46
C64
C43
C45
C44
3+
2+
1
4
62
61
72
71
1
32
Fe
N
Cu
N
O
CH
3
N
O
N
O
O
O
N
O
42
52
20
38
3.1.3- Complexo FeNiOAc
O complexo FeNiOAc foi sintetizado pela Doutora Suzana Cimara
Batista (Figura 16). Estudos de titulação potenciométrica mostraram as
seguintes constantes de desprotonação pKa
1
5,3; pKa
2
6,8 e pKa
3
8,61. A
proposta para os equilíbrios observados pode ser vista na Figura 13. A
atividade catalítica sobre o substrato ativado 2,4-BDNPP foi máxima em
pH 6,0.
[57]
Figura 16. ORTEP para o cátion [Fe
III
Ni
II
L1(OAc)
2
]
+
.
[57]
39
3.1.4- Complexo FeMnOH
O complexo de fórmula molecular [Fe
III
Mn
II
L1(OH)(H
2
O)]ClO
4
, foi
sintetizado pelo Doutor Peter Karsten, como modelo biomimético para
Fosfatase Ácida Púrpura de batata doce (comunicação pessoal Laboratório
de Bioinorganica e Cristalografia-UFSC). Estudos anteriores com o
complexo [Fe
III
Mn
II
L1(OAc)
2
]ClO
4
para demonstrar a atividade catalítica
foram realizados experimentos com o substrato ativado 2,4-
bis(dinitrofenil)fosfato.
[45, 48, 63]
Este complexo demonstrou uma atividade
catalítica máxima em pH 6,7 e ainda foram determinados valores de pKa
5,8 e outro pKa 7,6, revelando que a reação depende da desprotonação da
molécula de água coordenada nas espécies cataliticamente ativa (Figura
17).
[55]
Figura 17. ORTEP para o cátion [Fe
III
Mn
II
L1(OAc)
2
]
+
.
40
3.2. MÉTODOS E INSTRUMENTAÇÃO
3.2.1. Preparação do DNA plasmidial
O DNA plasmidial foi extraído utilizando-se o sistema comercial
Concert High Purity Plasmid Purification System (Life Technologies) ou
HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagem) que utilizam a técnica de extração de
DNA por lise alcalina. Foram seguidas as recomendações descritas pelo
fabricante. As amostras foram observadas em gel 0,8 % (p/v). O DNA foi
quantificado em um espectrofotômetro (Ultrospec 2100 pro, Amersham
Bioscience) e congelado até o uso.
3.2.2. Eletroforese em gel de agarose
Para as eletroforeses de DNA plasmidial, foram preparados géis de
agarose de diferentes concentrações, podendo variar de 0,8 a 1%, utilizando
agarose NA (Amershan Pharmacia) ou Agarose Ultrapure (Promega) e
brometo de etídio para visualização do DNA (solução 10 mg/ml,
concentração final no gel 3 µg/ml).
[64]
A cada amostra de DNA, foi
adicionado tampão de amostra (50 mM Tris pH 7,5, 50 mM EDTA,
glicerol 50% e azul de bromofenol 0,01%), para aplicação no gel. Neste
tampão o Tris tem a função de tamponamento; glicerol ajuda a dar
densidade a amostra para que seja aplicada em um gel submerso; o azul de
bromofenol, permite que a distância percorrida pela amostra durante a
eletroforese seja monitorada a olho nu, uma vez que dá cor azul a amostra e
o EDTA (agente quelante de metais) interrompe a reação e ajuda a
preservar contra o ataque de nucleases.
41
As eletroforeses foram realizadas a 3 V/cm, em cubas horizontais
(Mini Gel Electrophoresis System – Mupid2, Cosmo Bio Co ou na cuba
Life Technologies 11x 14 cm), em tampão de corrida TBE 0,5x (TBE 10x:
0,89 M Tris pH 8,0; 0,89 M ácido bórico; 0,02 M EDTA).
[64]
Os géis foram visualizados e digitalizados num sistema de
fotodocumentação DigiDoc.It System (UVP), composto por um
transiluminador UV (λ = 302 nm) e uma câmera digital acoplada a um
microcomputador. Em seguida foram analisados (quantificação das bandas
resultantes) com o software LabWorks 4.0, UVP.
3.2.3. Teste de clivagem em diferentes pHs
Foram testadas, inicialmente as melhores condições para as reações de
clivagem. Os valores de pH testados foram baseados nos dados de titulação
potenciométrica dos complexos utilizados. O DNA plasmidial foi incubado
com diferentes concentrações de complexo por um período de tempo fixo
em diferentes condições de pH.
As amostras foram analisadas em gel de agarose e as bandas
resultantes quantificadas.
3.2.4. Cinética de clivagem de DNA plasmidial
Para a reação foi utilizado o DNA plasmidial de pBSK II que foi
incubado com concentrações variadas do complexo. A intervalos
determinados de tempo foi retirada uma alíquota da mistura reacional, que
foi adicionada a um tubo contendo tampão de corrida concentrado e então a
amostra foi congelada (- 20
o
C). Posteriormente as amostras foram aplicadas
em um gel de agarose 0,8%. Ao final da corrida as bandas foram
visualizadas no sistema de fotodocumentação e as bandas referentes às
42
formas superenovelada, circular e linear do plasmídio quantificadas
utilizando-se o programa LabWorks 4.0, UVP.
[4, 35, 65, 66]
O tratamento dos dados foi realizado através do método de
Lineweaver-Burke para a obtenção da constante catalítica (k
cat
) e constante
de Michaelis-Menten (K
m
), além do fator catalítico, definido pela razão
entre a constante catalítica e a constante da reação não catalisada (f = k
cat
/
k
não catalisada
), eficiência catalítica (E = k
cat
/ K
m
) e constante de associação
(K
ass
= 1 / K
m
).
[65]
3.2.5. Captadores de radicais livres
Alguns complexos metálicos, já descritos na literatura, clivam o DNA
através de um mecanismo oxidativo no qual radicais hidroxilas são
produzidos.
[67]
Foram realizadas reações por tempo fixo, na presença de
captadores de radicais livres, para verificar a presença de um provável
mecanismo oxidativo. Foram utilizados DMSO e glicerol em concentrações
variadas, e as amostras analisadas em gel de agarose e quantificadas, como
já descrito.
[37, 68]
3.2.6. Reação em condições anaeróbicas
Em reações de clivagem de DNA por complexos metálicos, podem
atuar tanto mecanismos hidrolítico como oxidativo. Para verificar o tipo de
mecanismo envolvido nas reações de clivagem DNA, e de como a presença
de oxigênio afeta a porcentagem de clivagem do DNA plasmidial foram
realizados testes sob atmosfera de argônio.
[67]
Os tampões, água, solução de DNA e solução de complexo foram
deaerados em uma bomba de vácuo, sob agitação. Após o processo, os
reagentes colocados em câmara de polietileno ou “glove bags” com luvas
43
acopladas onde foi borbulhado Argônio por cerca de 1 hora. A reação foi
preparada dentro da câmara, obedecendo às condições (tampão, pH)
estabelecidas nas reações de clivagem para cada complexo. Foram
utilizadas concentrações variadas do complexo. Os tubos lacrados, foram
colocados em um dessecador selado e colocado em uma estufa a 37
o
C.
Após a incubação por um tempo fixo, as amostras foram analisadas em gel
de agarose 0,8%, como descrito anteriormente para reações na presença de
oxigênio.
[38, 58, 69]
3.2.7. Espectrofotometria UV-Vis
A ligação através de intercalação, de complexos com a hélice de DNA
tem sido caracterizada classicamente por titulações espectrofotométricas,
acompanhando-se modificações na absorbância (hipocromismo) e de
deslocamento no comprimento de onda (deslocamento para o vermelho).
[4,
70-72]
Para verificar como os complexos testados interagem com o DNA
foram realizadas titulações com DNA de timo de bezerro (CT DNA) ou
DNA plasmidial pBSK II. A reação foi preparada com tampão apropriado
(determinado nos estudos cinéticos) e concentração fixa do complexo em
uma cubeta, onde foram adicionadas quantidades crescentes de DNA. Após
um minuto de cada adição foi feita a medida espectrofotométrica. Esta
técnica permitiu, além de mostrar o tipo de interação, o cálculo da
constante de associação intrínseca (Kb) do complexo com o DNA.
[57]
Neste experimento foi utilizado o espectrofotômetro Lambda-19
(Perkin-Elmer) no Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia, UFSC ou
Ultrospec 2100 Pro (Amersham Bioscience) no Laboratório de Expressão
Gênica para obtenção de espectros na faixa de 300 a 800 nm.
[36, 71, 72]
44
3.2.8. Teste com Distamicina
O
entendimento preciso das propriedades de ligação de complexos
metálicos ao DNA é importante por vários motivos, que incluem
abordagem terapêutica, estudo da conformação de ácidos nucléicos e novas
ferramentas para nanotecnologia.
[73]
Estudos de interação com
DNA/complexos ou fatores transcrição/DNA tem sido realizados utilizando
Distamicina.
[74]
A Distamicina é um ligante específico do sulco menor do DNA (figura
18 A), pertence a uma classe de antibióticos de ocorrência natural que
atuam como antivirais e antitumorais. É um dos agentes mais ativos e liga-
se a dupla fita de DNA em regiões ricas em A/T, interagindo com o sulco
menor e cobrindo de quatro a cinco bases (Figura 18 B).
[74, 75]
Para observar se a clivagem de DNA ocorre preferencialmente no
sulco menor ou no sulco maior, a distamicina foi pré-incubada com o DNA
plasmidial do pBSKII . Se a clivagem do plasmídio ocorre através do sulco
menor, com a adição do complexo, devido à presença da distamicina esta
clivagem deve ser inibida.
[73, 76]
Reações de inibição foram realizadas com a incubação prévia do DNA
plasmidial (50 µM pb) com distamicina (100 µM) por 30 minutos a
temperatura ambiente. Em seguida foi adicionado o complexo e a reação
foi incubada por 4 horas a 37
o
C. Após este período, as amostras foram
analisadas em gel de agarose e as bandas de DNA quantificadas.
45
Figura 18. A: Estrutura Química da distamicina. B: Ligação específica
da distamicina (vermelho) ao sulco menor do DNA (figura extraída do
sítio:http://www.pharmacy.umaryland.edu/courses/PHAR531/
lectures_old/ fig/ dna_fig8a.gif - acessada em 25/04/2006).
B
A
46
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Anteriormente à realização dos experimentos para clivagem de DNA
pelos complexos metálicos, foram efetuados uma série de testes para
verificar a solubilidade dos complexos. Devido a baixa solubilidade dos
complexos em água, esta possibilidade foi descartada. Outros solventes
como DMSO, Etanol foram capazes de solubilizar os complexos, no
entanto, estes solventes poderiam interagir com a molécula de DNA
interferindo nas reações. O DMSO poderia se ligar ao DNA, alterando sua
conformação e o Etanol na concentração necessária para solubilizar o
complexo impossibilitava a aplicação das amostras no gel de agarose, não
fornecendo densidade suficiente para as amostras submergirem nos poços
do gel.
Assim, como solvente foi utilizado acetonitrila em diferentes
porcentagens nas reações pois além de não interagir com a molécula de
DNA, segundo comunicação pessoal do Laboratório de Bioinorganica e
Cristalografia, os complexos em concentrações pequenas, seriam solúveis
em acetonitrila. Foi então padronizado para cada reação 25% (v/v) de
acetonitrila, o que impossibilitou a utilização de concentrações maiores dos
complexos. Abaixo da concentração de 25% os complexos precipitavam e
em concentrações maiores (50 e 75%) as amostras ao serem aplicadas no
gel de agarose não tinham densidade suficiente para entrar nos poços do
gel. Desta forma, todas as reações realizadas neste trabalho contem 25% de
acetonitrila.
47
4.1. Teste de clivagem em diferentes pHs e concentração do
complexo
Para determinar as condições ideais para a reação de clivagem do
DNA pelos complexos metálicos, foram testados diferentes pHs e
concentração dos complexos.
[77]
A Figura 19 mostra o resultado obtido da clivagem do DNA
plasmidial em pH 6,0, 6,5 e 7,0 pelo complexo FeCuOAc. Em pH 7,0
ocorre maior clivagem da Forma I (superenovelada), resultando em um
aumento proporcional da Forma II (circular); porém não ocorre o
aparecimento da Forma III (linear). Isto mostra que o complexo FeCuOAc
corta somente uma das fitas do DNA gerando a perda do
superenovelamento. Neste pH, segundo a curva de distribuição de espécies
(Anexo 1), existe a maior porcentagem da espécie (HO)Fe
III
(µ-
OH)Cu
II
(OH
2
). Já em pH 6 e 6,5 há uma diminuição na proporção desta
espécie e conseqüente diminuição da atividade de clivagem do DNA.
Os testes com complexo FeCuOH mostraram que o corte de uma única
fita de DNA ocorre de modo mais eficiente em pH 6,0 (Figura 20). Isto,
segundo a curva de distribuição de espécies (Anexo 2), indica que a
espécie, B (HO)Fe
III
(µ-OH)Cu
II
(OH
2
), é responsável por esta atividade.
Em pH 7,0 a atividade é bastante reduzida, o que pode indicar que nestas
condições de reação já esteja ocorrendo uma diminuição da porcentagem da
espécie B pela desprotonação da molécula de água ligada ao Cu
II
.
Estes resultados corroboram o mecanismo proposto para estes
complexos no qual o hidróxido ligado ao Fe
III
deve atuar como nucleófilo
durante a catálise.
[59]
48
50
60
70
80
90
100
0 20 40
[FeCuOAc] µM
% DNA F I
pH 6,0
pH 6,5
pH 7,0
[FeCuOAc] µM
0 10 20 40
A)
B)
C)
F I
F II
Figura 19. Clivagem do DNA pelo complexo FeCuOAc em diferentes pHs.
As reações foram realizadas com 50 µM pb de plasmídio pBSK II por 6
horas a 37°C variando-se a concentração do complexo conforme indicado
na figura. A) 25 mM PIPES pH 6,0; B) 25 mM PIPES pH 6,5 e C) 25 mM
MOPS pH 7,0 . Ao lado, gráfico da quantificação da Forma I.
50
60
70
80
90
100
0 20 40
[FeCuOH] µM
% DNA F I
pH 6,0
pH 6,5
pH 7,0
[FeCuOH] µM
0 10 20 40
A)
B)
C)
F I
F II
Figura 20. Clivagem do DNA em diferentes pHs pelo complexo FeCuOH.
As reações foram realizadas no volume final de 20 µl, 50 µM pb de
plasmídio pBSK II por 8 horas a 37°C variando-se a concentração final do
complexo. A) 10 mM PIPES pH 6,0; B) 10 mM PIPES pH 6,5 e C) 10 mM
PIPES pH 7,0 . Em pH 6,0 observa-se maior desaparecimento do DNA
superenovelado (F I) como mostrado no gráfico ao lado.
49
Na Figura 21 estão as fotos dos géis de agarose mostrando as reações
realizadas com o complexo FeZnOAc em diferentes pHs. Nesta figura a
maior atividade de clivagem do DNA ocorre em pH 6,5 enquanto em pH
7,0 a atividade está bastante reduzida. Nos dois pHs, segundo a curva de
distribuição de espécies (Anexo I) obtidas por Lanznaster, a espécie
(HO)Fe
III
(µ-OH)Zn
II
(OH
2
) é predominante.
[19]
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30
[FeZnOAc] µM
% DNA F I
pH 6,0
pH 6,5
pH 7,0
[FeZnOAc] µM
0 5 10 20
A)
B)
C)
F I
F II
Figura 21. Clivagem do DNA em diferentes pHs pelo complexo FeZnOAc.
As reações foram realizadas em volume final de 20 µl, com 50 µM pb de
plasmídio pBSK II por 6 horas a 37°C variando-se a concentração final do
complexo. A) 10 mM PIPES pH 6,0; B) 10 mM PIPES pH 6,5 e C) 10 mM
PIPES pH 7,0 . Ao lado, gráfico da quantificação das bandas da Forma I.
O complexo FeZnOH apresentou uma atividade maior em pH 6,5
(Figura 22), demonstrando que a espécie gerada (HO)Fe
III
(µ-OH)Zn
II
(OH
2
)
(Anexo 2) é a mesma necessária para que ocorra a clivagem do DNA pelo
complexo FeZnOAc. Este resultado está de acordo com os dados obtidos
para os complexos de zinco testados previamente por Lanznaster na
degradação do 2,4-BDNPP.
[19, 56]
50
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30
[FeZnOH] µM
% DNA F I
pH 6,0
pH 6,5
pH 7,0
[FeZnOH] µM
0 5 10 20
A)
B)
C)
F I
F II
Figura 22. Clivagem do DNA em diferentes pHs pelo complexo FeZnOH.
As reações foram realizadas com 50 µM de plasmídio pBSK II por 6 horas
a 37°C variando-se a concentração do complexo. A) 10 mM PIPES pH 6,0;
B) 10 mM PIPES pH 6,5 e C) 10 mM PIPES pH 7,0 . Em pH 6,5 observa-
se maior desaparecimento do DNA superenovelado (F I) .
Recentemente, Neves e colaboradores demonstraram que o complexo
FeZnOH apresenta um mecanismo similar ao proposto para PAP onde o
ataque nucleofílico é feito pelo OH terminal ligado ao Fe
III
.
[78]
No
complexo modelo de PAP [Fe
2
O(bipy)
4
(OH
2
)
2
](NO
3
)
4
descrito por Verge e
colaboradores
[60]
o nucleófilo proposto para degradação do BDNPP é o OH
ligado ao Fe enquanto o substrato permanece coordenado Fe(OH
2
). Além
disso, é importante salientar que segundo a estrutura de Raio X obtida para
a espécie ativa da enzima PAP de feijão vermelho tipo “kidney bean” a
esfera de coordenação dos íons Fe e Zn resultou no sítio ativo (HO)Fe
III
(µ-
OH)Zn
II
(OH
2
).
[45, 78]
51
A Figura 23 mostra os resultados dos testes de clivagem do DNA
plasmidial em diferentes concentrações do complexo FeMnOH, variando o
pH da reação. Neste experimento foram utilizadas as seguintes
concentrações finais: 50 µM pb DNA pBSK II; 5, 10, 20 e 40 µM
FeMnOH; 25 mM tampão (PIPES pH 6,0 e pH 6,5 e HEPES pH 7,0) a 37
o
C por 6 horas. Após a corrida em gel de agarose 0,8%, a diferença da
intensidade das bandas mostra que em tampão HEPES pH 7,0 há uma
atividade maior do complexo indicada pelo desaparecimento da Forma I do
DNA plasmidial e aumento da Forma II (DNA circular).
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30
[FeMnOH] µM
% DNA F I
pH 6,0
pH 6,5
pH 7,0
[FeMnOH] µM
0 5 10 20
A)
B)
C)
F I
F II
Figura 23. Teste de clivagem do DNA em diferentes pHs. As reações foram
realizadas com DNA pBSK II por 6 horas a 37°C variando-se a
concentração do complexo. A) 25 mM PIPES pH 6,0; B) 25 mM PIPES
pH 6,5 e C) 25 mM HEPES pH 7,0. O gráfico ao lado, representa a
quantificação da bandas da Forma I.
Para o complexo FeMnOH não foi determinada a curva de distribuição
de espécies, porém, como trata-se de uma forma isoestrutural em relação
aos complexos anteriores, a atividade deste complexo está dentro da faixa
de pH esperada.
52
Nas figuras 21, 22 e 23 pode ser observada a diminuição da
intensidade da Forma I com um aumento proporcional da Forma II. Porém,
assim como os complexos de FeCu, não foram observados o aparecimento
da Forma linear do plasmídio, indicando um único corte no DNA ou o
segundo corte está ocorrendo muito distante do primeiro. Isto porque para
que ocorra a passagem da Forma II (circular) para forma III (linear) é
necessário que haja um segundo corte na fita oposta do DNA a uma
distância de até 12 pares de base do primeiro corte.
[37]
Nos gráficos referentes à quantificação das bandas dos experimentos
foi demonstrada a dependência da clivagem do DNA em função do
aumento da concentração dos complexos. Para todos os complexos ocorre a
diminuição da intensidade da Forma I conforme aumenta a concentração do
complexo. As concentrações mostradas, correspondem às concentrações
finais na reação.
Todos os complexos, exceto FeNiOAc, foram capazes de clivar o
DNA em baixas concentrações em condições próximas as fisiológicas.
Os testes em diferentes pHs com o complexo FeNiOAc mostraram
maior atividade em pH 6,5 (Figura 24) que segundo os dados da curva de
distribuição de espécies (Anexo III) obtido por Batista e colaboradores
[57]
,
corresponde a maior proporção da espécie (HO)Fe
III
(µ-OAc)Ni
II
(OH
2
).
Este resultado sugere que a atividade depende da desprotonação da
molécula de água coordenada ao Fe
III
para que ocorra a interação com o
DNA. Possivelmente a manutenção da ponte acetato seja um fator
importante para a ligação com o DNA, já que em pH 7,0 onde há um
aumento da espécie (HO)Fe
III
(µ-OH)Ni
II
(OH
2
) ocorre uma diminuição da
atividade.
53
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80
[FeNiOAc] µM
% DNA F I
pH 6,0
pH 6,5
pH 7,0
[FeNiOAc] µM
0 5 10 20 40 80
A)
B)
C)
F I
F II
Figura 24. Teste de atividade do complexo FeNiOAc em diferentes pHs. As
reações foram realizadas com 50 µM pb plasmídio pBSK II por 16 horas a
37°C variando-se a concentração do complexo. A) PIPES 25 mM pH 6,0;
B) PIPES 25 mM pH 6,5 e C) MOPS 25 mM pH 7,0 . Em pH 6,5 foi
observado maior desaparecimento do DNA superenovelado (F I) mostrado
no gráfico ao lado.
É importante ressaltar que apesar da diminuição da intensidade das
bandas da Forma I, não ocorre o aparecimento proporcional da Forma II,
indicando que algum outro tipo de interação está ocorrendo entre o
complexo FeNiOAc e o DNA plasmidial.
4.2. Cinética de clivagem do DNA plasmidial
Após a determinação da melhor condição de pH para as reações foi
testada a clivagem do DNA em função do tempo e da variação da
concentração do complexo para obtenção dos parâmetros cinéticos da
reação. As reações foram realizadas com excesso de complexo em relação
ao substrato . O gráfico do logaritmo natural da intensidade da Forma I em
um determinado tempo dividido pela intensidade da Forma I no tempo
54
inicial (ln S/So) em função do tempo mostrou-se linear o que é indicativo
de uma reação de pseudo-primeira ordem com relação ao DNA.
Os resultados de k
obs
obtidos foram corrigidos levando-se em
consideração a hidrólise espontânea do DNA plasmidial pBSK II para cada
uma das condições de reação analisadas. As constantes de clivagem (k
obs
)
foram obtidas em várias concentrações e o gráfico de k
obs
versus a
concentração do complexo mostraram um comportamento de saturação
exemplificado aqui pelos gráficos obtidos com os complexos FeCuOAc
(Figura 25) e FeZnOAc (Figura 26).
0,0
1,5x10
-4
3,0x10
-4
4,5x10
-4
6,0x10
-4
0,0
5,0x10
-5
1,0x10
-4
1,5x10
-4
2,0x10
-4
2,5x10
-4
0,0
1,0x10
4
2,0x10
4
3,0x10
4
3,0x10
3
4,5x10
3
6,0x10
3
7,5x10
3
1/k obs
1/[FeCuOAc]
k
obs
s
-1
[FeCuOAc] mol.L
-1
Figura 25. Análise cinética da clivagem do DNA promovida pelo complexo
FeCuOAc. A concentração final do complexo variou de 10 a 160 µM. A
reação foi realizada em 25 mM MOPS pH 7,0, 37
o
C e o k
obs
determinado
para cada concentração.
55
0,0
1,0x10
-5
2,0x10
-5
3,0x10
-5
4,0x10
-5
0,0
5,0x10
-6
1,0x10
-5
1,5x10
-5
2,0x10
-5
2,5x10
-5
0,0
7,5x10
4
1,5x10
5
2,3x10
5
0,0
2,5x10
4
5,0x10
4
7,5x10
4
1,0x10
5
1/kobs
1/[FeZnOAc]
k
obs
s
-1
[FeZnOAc] mol.L
-1
Figura 26. Análise cinética da clivagem do DNA promovida pelo complexo
FeZnOAc. A concentração final do complexo variou de 5 a 40 µM. A
reação foi realizada em 10 mM PIPES pH 6,5, 37
o
C e o k
obs
determinado
para cada concentração.
Os estudos cinéticos da clivagem do DNA revelaram uma diminuição
da intensidade da Forma I e sob estas condições experimentais (pseudo
Michaelis-Menten) os parâmetros cinéticos foram obtidos. Na Tabela 2
estão apresentados os resultados dos parâmetros cinéticos obtidos para os
complexos FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc, FeZnOH e FeMnOH.
56
Tabela 2. Parâmetros cinéticos para as reações de clivagem do DNA,
catalisada pelos complexos FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc, FeZnOH e
FeMnOH.
FeCuOAc
FeCuOH FeZnOAc
FeZnOH FeMnOH
k
obs
3,69 x 10
3
4,08 x 10
4
2,64 x 10
4
1,59 x 10
5
1,61 x 10
4
k
cat
s
-1
2,71 x 10
-4
2,45 x 10
-5
3,79 x 10
-5
6,30 x 10
-6
6,19 x 10
-5
k
ass
mol
-1
L
2,53 x 10
4
3,36 x 10
4
6,79 x 10
4
3,81 x 10
4
1,53 x 10
4
Km mol L
-1
3,96 x 10
-5
2,98 x 10
-5
1,47 x 10
-5
2,63 x 10
-5
6,55 x 10
-5
E
(kcat/Km)
6,80 0,825 2,57 0,240
0,945
f
(kcat/knc)
2,7 x 10
7
2,45 x 10
6
3,79 x 10
6
6,30 x 10
5
6,19 x 10
6
Condições da reação incubada a 37
o
C em alíquotas de 20 µl, concentração final foi:
FeCuOAc: 90 µM pb DNA pBSK II; 25 mM MOPS pH 7,0; 10 a 320 µM [FeCuOAc];
FeCuOH: 50 µM pb DNA pBSK II; 10 mM PIPES pH 6,0; 5 a 80 µM [FeCuOH];
FeZnOAc: 50 µM pb DNA pBSK II; 10 mM PIPES pH 6,5; 5 a 80 µM [FeZnOAc];
FeZnOH: 50 µM pb DNA pBSK II; 10 mM PIPES pH 6,5; 5 a 80 µM [FeZnOH];
FeMnOH: 50 µM pb DNA pBSK II; 25 mM HEPES pH 7,0; 2,5 a 40 µM [FeMnOH].
Conforme observado na Tabela 2, o complexo FeCuOAc é o mais
efetivo na clivagem do DNA plasmidial entre os complexos da série
analisados, apresentando uma aceleração de 2,71 x 10
7
vezes quando
comparado com o valor do DNA não catalisado (k
nc
= 1,0 x 10
-11
s
-1
)
podendo ser considerado um dos complexos modelos mais efetivos
mimetizando a função de uma nuclease.
[35, 59, 61, 65]
Em contraste, o
complexo FeCuOH apresentou uma atividade muito menor, de
aproximadamente 11 vezes, quando comparado com o homólogo
FeCuOAc.
57
O mesmo comportamento foi observado para os complexos de FeZn,
onde FeZnOH foi capaz de clivar o DNA com aceleração da reação de
apenas 6,30 x 10
5
que é seis vezes menor que o obtido para o complexo
FeZnOAc em relação a clivagem do DNA não catalisado. O complexo
FeZnOH se mostrou o menos eficiente da série de complexos analisados
neste trabalho. Porém ao compararmos os valores obtidos da constante
catalítica dos complexos FeZn estes valores estão próximos as constantes
obtidas por Boseggia e colaboradores
[79]
para dois complexos de Zinco (3,2
x 10
-5
e 2,0 x 10
-6
s
-1
).
Interessante observar que em estudos realizados com o substrato 2,4-
BDNPP foram encontrados resultados similares de atividade sendo o
complexo FeCuOAc mais ativo que FeZnOAc.
[56, 59]
O complexo FeMnOH mostrou uma atividade intermediaria quando
comparado a seus homólogos isoestruturais FeCuOAc e FeZnOAc por
outro lado entre os complexos Fe
III
M
II
OH foi o mais ativo.
Existe uma diferença considerável de atividade entre os complexos
com FeCuOAc e FeZnOAc sugerindo que a composição do centro
metálico é importante na determinação da velocidade da reação. Também
quando comparados os valores de k
cat
para os complexos Fe
III
M
II
OH, o
complexo FeMnOH cliva mais eficientemente o DNA que os complexos
FeCuOH e FeZnOH, onde a atividade pode ser relacionada como
Mn>Cu>Zn, indicando a influência do M
II
na velocidade de reação.
Segundo Schenk e colaboradores a enzima PAP com centro Fe
III
Mn
II
demonstra uma atividade catalítica maior que as isoformas FeZn, FeFe.
[47]
No entanto, ao compararmos a atividade entre os complexos
Fe
III
M
II
OAc e Fe
III
M
II
OH é evidente que a atividade não está relacionada
somente a composição do centro metálico, mas também com estrutura dos
complexos que possuem pontes acetato (FeCuOAc e FeZnOAc) uma vez
que, são mais ativos que os complexos homólogos (FeCuOH e
58
FeZnOH).
[80]
Isto talvez seja devido a pequenas diferenças na estrutura
entre os complexos Fe
III
M
II
OAc e Fe
III
M
II
OH. Uma das hipóteses é que
pode estar ocorrendo um deslocamento na curva de distribuição de espécies
para os complexos Fe
III
M
II
OAc nas condições testadas neste trabalho e a
espécie envolvida na hidrólise do DNA ainda mantenha a ponte µ-OAc. A
presença da ponte OAc pode estar proporcionando uma maior “rigidez” ao
centro metálico
[81]
mantendo principalmente a orientação cis da água
coordenada ao M
II
e do OH (nucleófilo) ligado ao Fe
III
.
59
No experimento de cinética da atividade do DNA pelo complexo
FeNiOAc, as amostras foram analisadas em um gel de agarose mais
concentrado ( 1% p/v ) para possibilitar a melhor separação e a
visualização das bandas de DNA circular (Forma II). Surpreendentemente
foi observada uma diferença no padrão da migração do DNA
superenovelado, com retardamento da migração da banda no decorrer do
tempo (Figura 27). Desta forma não foi possível a quantificação das bandas
de DNA para obtenção dos padrões cinéticos uma vez que não está
ocorrendo clivagem do DNA
Figura 27. Cinética da atividade do complexo sobre o DNA plasmidial
visualizada em gel de agarose 1%. A reação foi realizada com 100 µM pb
de plasmídio pBSK II a 37°C com 160 µM de complexo em tampão 25
mM PIPES pH 6,5. A partir de 30 minutos de incubação observa-se uma
diferença na migração da Forma I do plasmídio (F I).
Este padrão de migração, onde a banda da Forma I migra mais
lentamente que o normal, que pode estar ocorrendo pela ligação do
complexo com o DNA e já foi observado em uma série de complexos
metálicos
[72, 79, 82]
e drogas antitumorais
[27, 83]
e antimicrobianas descritos na
literatura. . Estudos envolvendo a atividade de íons Ni
II
mostraram que este
metal é capaz de ligar ao DNA alterando sua conformação de B para Z-
DNA.
[84]
Tempo (mim)
0 15 30 60 120 180 360
F I
60
4.3. Teste de mobilidade e ligação do complexo FeNiOAc ao DNA
Com o intuito de verificar o tipo de interação entre o complexo
FeNiOAc e o DNA plasmidial foi preparada uma reação com volume final
de 240 µl (concentrações finais: 100 µM pb DNA, 320 µM FeNiOAc em
tampão 25 mM PIPES pH 6,5). A reação foi incubada a 37
o
C e a intervalos
de tempo determinados (indicados na Figura 28) foram retiradas duas
alíquotas de 20 µl cada. À primeira alíquota foi adicionado 5 µl de tampão
de corrida e imediatamente congelada (Figura 28 A); outra alíquota de 20
µl, foi precipitada com acetato de amônia e etanol (Figura 28 B).
[85]
Neste
último tratamento, ao se adicionar um sal concentrado, se a interação entre
os complexos e o DNA é fraca (tipo eletrostática) o complexo irá se
dissociar do DNA.
Figura 28. Teste de interação do DNA pBSK II com o complexo FeNiOAc. A) Gel de
agarose 1% mostrando alíquotas retiradas por 1 hora observa-se a alteração na migração
do DNA. B) Após a retirada de cada alíquota a amostra foi precipitada e o padrão de
migração do DNA plasmidial restabelecido.
Tempo (mim)
0 5 15 30 60
A)
B)
61
Observando o gel A fica evidente o retardamento da migração da
banda da Forma I, como mostrado anteriormente. No gel B das amostras
precipitadas o padrão de migração do DNA plasmidial é restabelecido
sugerindo que a interação ocorra de modo não covalente.
Como não ocorreu diminuição na intensidade das bandas no gel B,
podemos afirmar que o complexo FeNiOAc não é capaz de cortar o DNA
plasmidial nas condições testadas. A diminuição da intensidade das bandas
de DNA pode estar sendo ocasionada pela competição com a ligação do
brometo de etídio presente no gel sugerindo um possível mecanismo de
intercalação do FeNiOAc com o DNA.
[82, 86]
Wang e colaboradores
demonstraram que complexos de Ni competem ativamente com o brometo
na ligação ao DNA.
[87]
Este fato também explicaria a alteração no padrão de migração das
bandas do DNA, uma vez que no modelo de intercalação clássico ocorre
um alongamento das hélices do DNA conforme os pares de bases são
separados para acomodar o agente intercalante.
[72]
O brometo de etídio (Figura 29), por exemplo, um corante policíclico
aromático, quando intercala no DNA dupla fita a intercalação alonga a
hélice e altera a densidade de carga, alterando a mobilidade
eletroforética.
[88]
O brometo de etídio não é capaz de deslocar o complexo
FeNiOAc do DNA apesar de possuir uma constante de ligação maior (Kb)
como mostrado mais adiante na Tabela 3.
Mesmo não clivando o DNA, o complexo FeNiOAc se mostra
promissor no que diz respeito a sua utilização como uma molécula capaz de
se ligar ao DNA podendo ser utilizadas como sonda molecular para o
estudo da estrutura de ácidos nucléicos.
62
Figura 29. Estrutura e modo de ligação do Brometo de Etídio ao DNA.
63
4.4. Efeito de captadores de radicais livres
Como a participação de radicais livres na hidrólise do DNA por
complexos metálicos têm sido constantemente documentada na literatura
[7,
11, 67, 68, 89-94]
para verificar o tipo de mecanismo (hidrolítico ou oxidativo)
envolvido nas reações dos complexos analisados neste trabalho foram
realizados experimentos na presença de captadores de radicais OH.
Nas Figuras 30 e 31 estão mostrados os resultados da clivagem do
DNA pelos complexos FeCuOAc e FeCuOH, respectivamente. Os
captadores de radical hidroxila, dimetil sulfoxido (DMSO) e glicerol não
interferem com a atividade de clivagem dos complexos, sugerindo que
radicais hidroxila difusos não estão envolvidos na reação de clivagem do
DNA plasmidial.
Resultados semelhantes foram encontrados com os complexos
FeZnOAc (Figura 32) e FeZnOH (Figura 33). Tanto o complexo FeZnOAc,
quanto o complexo FeZnOH mantiveram as porcentagens de clivagem do
DNA superenovelado na presença dos captadores de radicais livres. Isto
sugere que os dois complexos atuem hidroliticamente na clivagem do
DNA.
64
FeCuOAc
0
20
40
60
80
100
c 1 c 2 5% DMSO 10% DMSO 5% Glicerol 10% Glicerol
% DNA superenovelado
Figura 30. Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de radicais
livres nas reações do complexo FeCuOAc. Foram utilizadas as concentrações de
captadores indicadas na figura, controle de DNA sem o complexo (c1), controle com 80
µM de complexo (c2) por 6 horas 37
o
C. Abaixo, gel de agarose 0,8% do experimento.
FeCuOH
0
20
40
60
80
100
c 1 c 2 5% DMSO 10% DMSO 5% Glicerol 10% Glicerol
% DNA Superenovelado
Figura 31. Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de radicais
livres nas reações do complexo FeCuOH. Foram utilizadas as concentrações finais de
captadores indicadas na figura, controle de DNA sem o complexo (c1), controle com 40
µM de complexo (c2). As reações foram incubadas a 37
o
C por 6 horas. Abaixo, gel de
agarose 0,8% do experimento.
65
FeZnOAc
0
20
40
60
80
100
c 1 c 2 5% DMSO 10% DMSO 5% Glicerol 10% Glicerol
% DNA superenovelado
Figura 32. Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de radicais
livres nas reações do complexo FeZnOAc. Foram utilizadas as concentrações de
captadores indicadas na figura, controle de DNA sem o complexo (c1), controle com 20
µM de complexo (c2) incubado por 4 horas 37
o
C. Abaixo, gel de agarose 0,8% do
experimento.
FeZnOH
0
20
40
60
80
100
c 1 c 2 5% DMSO 10% DMSO 5% Glicerol 10% Glicerol
% DNA superenovelado
Figura 33. Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de radicais
livres nas reações do complexo FeZnOH. Foram utilizadas as concentrações de
captadores indicadas na figura, controle de DNA sem o complexo (c1), controle com 20
µM de complexo (c2) incubado por 4 horas 37
o
C.
66
A ligação do DNA ao complexo FeNiOAc não é afetada pela adição
de captadores de radicais livres, como mostra a Figura 34, onde é visível o
desaparecimento da Forma I com um pequeno retardamento de migração.
Esta redução da intensidade da Forma I do DNA no entanto se dá
exclusivamente pela interação do complexo com DNA sem ocorrer corte
nas fitas uma vez que não há aparecimento da Forma II ou III como já
demonstrado em experimentos anteriores.
FeNiOAc
0
20
40
60
80
100
c 1 c 2 5% DMSO 10% DMSO 5% Glicerol 10% Glicerol
% DNA Superenovelado
Figura 34. Experimento utilizando DMSO e Glicerol como captadores de radicais livres
em reações com o complexo FeNiOAc. Foram utilizadas as concentrações de captadores
indicadas na figura, controle de DNA sem o complexo (c1), controle com 40 µM de
complexo (c 2). Abaixo, gel de agarose 0,8% do experimento.
67
4.5. Reação em condições anaeróbicas
Para confirmar que os complexos atuam na clivagem do DNA por um
mecanismo hidrolítico e para demonstrar que não existe participação do
oxigênio molecular, foram realizados testes em condições anaeróbicas e
como controle foram realizadas reações semelhantes na presença de
oxigênio. A possibilidade da presença de oxigênio residual sob condições
anaeróbicas foi monitorada pela realização de experimentos paralelos com
o sistema Fe(EDTA)
-2
/ditiotreitol.
[89]
Os resultados obtidos com os complexos FeCuOAc e FeCuOH
(Figuras 35 e 36, respectivamente) vêm confirmar os resultados do
experimento anterior. Estes dois complexos devem atuar via mecanismo
hidrolítico uma vez que não foram observadas alterações na clivagem do
DNA quando comparados os valores obtidos na presença (linhas 2 e 5) e na
ausência de oxigênio (linhas 8 e 11). A adição de DMSO nas reações não
influenciou a clivagem do DNA pelos complexos como mostrado nas
linhas (5 e 8).
Os controles realizados com o sistema Fe(EDTA)
-2
/ditiotreitol (linhas
3, 6, 9 e 12) demonstram que não há presença de oxigênio residual uma vez
que a degradação do DNA plasmidial foi totalmente inibida na ausência de
oxigênio (linhas 9 e 11).
68
FeCuOAc
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
% DNA pBSK II
Forma II
Forma I
Figura 35. Clivagem do DNA plasmidial pelo complexo FeCuOAc em condições
aeróbicas (linhas 1-6) e anaeróbicas (linhas 7-12); na ausência (1-3 e 7-9) e na presença
(4-6 e 10-12) de DMSO. Linhas 1, 4, 7 e 10 DNA plasmidial; linhas 2, 5, 8 e 11 DNA
na presença do complexo (40 µM final); 3, 6, 9 e 12 na presença de Fe(EDTA)
-
2
/ditiotreitol. Todas as reações foram incubadas a 37
o
C por 4 horas.
FeCuOH
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
% DNA pBSK II
Forma II
Forma I
Figura 36. Clivagem do DNA plasmidial pelo complexo FeCuOH em condições
aeróbicas (linhas 1-6) e anaeróbicas (linhas 7-12); na ausência (1-3 e 7-9) e na presença
(4-6 e 10-12) de DMSO. Linhas 1, 4, 7 e 10 DNA plasmidial; linhas 2, 5, 8 e 11 DNA
na presença do complexo (40 µM final); 3, 6, 9 e 12 na presença de Fe(EDTA)
-
2
/ditiotreitol. Todas as reações foram incubadas a 37
o
C por 4 horas.
69
Nas Figuras 37 e 38 estão representados os gráficos obtidos da
quantificação das bandas de DNA após a corrida em gel de agarose. Na
presença de DMSO não ocorreu inibição da clivagem do DNA pelos
complexos FeZn (linhas 5 e 11). Os complexos FeZn clivaram o DNA na
ausência de oxigênio (linhas 8 e 11) praticamente na mesma proporção que
o observado na presença de oxigênio (linha 2 e 5).
A degradação do DNA plasmidial observada pelo sistema Fe(EDTA)
-
2
/ditiotreitol na presença de oxigênio foi claramente reduzida em condições
anaeróbicas.
FeZnOAc
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
% DNA pBSK II
Forma II
Forma I
Figura 37. Clivagem do DNA plasmidial pelo complexo FeZnOAc em condições
aeróbicas (linhas 1-6) e anaeróbicas (linhas 7-12); na ausência (1-3 e 7-9) e na presença
(4-6 e 10-12) de DMSO. Linhas 1, 4, 7 e 10 DNA plasmidial; linhas 2, 5, 8 e 11 DNA
na presença do complexo (10 µM final); 3, 6, 9 e 12 na presença de Fe(EDTA)
-
2
/ditiotreitol. Todas as reações foram incubadas a 37
o
C por 4 horas.
70
FeZnOH
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
% DNA pBSK II
Forma II
Forma I
Figura 38. Clivagem do DNA plasmidial pelo complexo FeZnOH em condições
aeróbicas (linhas 1-6) e anaeróbicas (linhas 7-12); na ausência (1-3 e 7-9) e na presença
(4-6 e 10-12) de DMSO. Linhas 1, 4, 7 e 10 DNA plasmidial; linhas 2, 5, 8 e 11 DNA
na presença do complexo (10 µM final); 3, 6, 9 e 12 na presença de Fe(EDTA)
-
2
/ditiotreitol. Todas as reações foram incubadas a 37
o
C por 4 horas.
O complexo FeMnOH, assim como os demais complexos da série,
atua por um mecanismo hidrolítico conforme indicam os resultados
mostrados na Figura 39. No experimento realizado na ausência de oxigênio
(linhas 8 e 11) o aumento da intensidade da Forma II (circular) devido o
corte de uma das fitas da Forma I (superenovelada) não apresentou
diferença significativa quando comparado à mesma reação em condições
aeróbicas (linhas 2 e 5).
71
FeMnOH
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
%DNA pBSK II
Forma II
Forma I
Figura 39. Clivagem do DNA plasmidial em condições aeróbicas (linhas 1-6) e
anaeróbicas (linhas 7-12); na ausência (1-3 e 7-9) e na presença (4-6 e 10-12) de
DMSO. Linhas 1, 4, 7 e 10 DNA plasmidial; linhas 2, 5, 8 e 11 DNA na presença do
complexo FeMnOH (10 µM final); 3, 6, 9 e 12 na presença de Fe(EDTA)
-2
/ditiotreitol.
Todas as reações foram incubadas a 37
o
C por 4 horas.
72
4.6. Espectrofotometria UV-Vis
A caracterização da interação de complexos metálicos com o DNA é
uma área de pesquisa em crescimento. Além do potencial terapêutico, estes
complexos têm sido considerados como ferramentas em bioquímica e
biologia molecular. Os complexos metálicos são capazes de interagir
(covalentemente ou não) com o DNA através das bases nitrogenadas e dos
grupos fosfatos estabelecendo interações inter ou intra-fitas do DNA.
[26, 82,
95]
Estas interações podem ser: por interação eletrostática externa, por
interação direta do ligante através dos sulcos do DNA, intercalação ou
através de ligações de hidrogênio dos ligantes coordenados ao átomo do
oxigênio dos fosfatos do DNA e coordenação com íons metálicos.
[4, 29]
Para verificar o tipo de interação do complexo com o DNA foi
realizada titulação espectrofotométrica dos complexos na presença de
concentrações crescentes de DNA plasmidial.
A equação linear é dada por Pyle e colaboradores [DNA]/(εA-
εlivre)=[DNA]/(εligado-εlivre)+1/Kb(εligado-εlivre), onde εA, εlivre e
εligado correspondem a Abs
observada
/[Fe
III
M
II
], ao coeficiente de extinção
molar do complexo Fe
III
M
II
totalmente livre (R = 0) e ao coeficiente de
extinção molar do complexo Fe
III
M
II
na forma totalmente ligada,
respectivamente.
[7, 96]
No gráfico de [DNA]/(ε
a
-ε
f
) x [DNA], a constante de
ligação intrínseca Kb é dada pela razão entre o coeficiente angular e
linear.
[7]
A Figura 40 mostra o espectro UV-Vis do complexo FeCuOAc na
ausência (R = 0) e na presença de concentrações crescentes de DNA
plasmidial (R = 0,59 a 6,6). A adição crescente de DNA ocasionou a
diminuição da absortividade molar da banda p
π - dπ
* com um pequeno
deslocamento de λ
max
de 498 a 504 nm indicando uma forte ligação do
73
complexo ao DNA ( Kb 2,94 x 10
4
M
-1
) possivelmente por um mecanismo
de intercalação.
[26, 72]
FeCuOAc
0,00
0,05
0,10
0,15
300 400 500 600 700
λ
(nm)
Absorvância
R1=0
R2=0.59
R3=1.5
R4=2.5
R5=3.8
R6=6.6
0,0
1,0x10
-4
2,0x10
-4
3,0x10
-4
0,0
-5,0x10
-7
-1,0x10
-6
-1,5x10
-6
-2,0x10
-6
-2,5x10
-6
-3,0x10
-6
-3,5x10
-6
-4,0x10
-6
[DNA]/(
ε
a
-
ε
b
)
[DNA] (mol.L
-1
)
Figura 40. Titulação espectrofotométrica do complexo FeCuOAc com DNA
plasmidial pBSK II. A figura mostra o espectro de absorção corrigido do complexo na
ausência (R=0) e na presença (R= 0.59 a 6.6) de quantidades crescentes de DNA. Os
valores de R correspondem a relação [DNA]/[FeCuOAc], 25 mM MOPS pH 7,0 a
temperatura ambiente com uma concentração do complexo de 80 µM. Gráfico inserido
na figura mostra a relação [DNA]/(ε
a
-ε
f
) x [DNA].
A análise da titulação espectrofotométrica do complexo FeCuOH
(Figura 41) apresentou um deslocamento do λ
max
(488 a 521 nm) e intensa
diminuição da absortividade molar característica de complexos
intercalantes.
[97]
O valor da constante de ligação foi quase o dobro (4,4 x
10
4
M
-1
) do valor para o complexo FeCuOAc
. Além disso, ao serem
adicionadas quantidades maiores de DNA na reação com FeCuOH o
espectro mostrou um padrão irregular de absorção (dados não
apresentados) tornando inviável a análise de valores de R maiores.
74
FeCuOH
0,00
0,05
0,10
350 450 550 650
λ
λλ
λ
(nm)
Absorvância
R= 0
R= 0.1
R= 0.25
R= 0.5
R= 1
0,0
2,0x10
-5
4,0x10
-5
6,0x10
-5
8,0x10
-5
0,0
5,0x10
-8
1,0x10
-7
1,5x10
-7
2,0x10
-7
2,5x10
-7
[DNA]/(
ε
a
-
ε
b
)
[DNA] (mol.L
-1
)
Figura 41. Titulação espectrofotométrica do complexo FeCuOH com DNA
plasmidial pBSK II. A figura mostra o espectro de absorção corrigido do complexo na
ausência (R=0) e na presença (R= 0.1 a 1) de quantidades crescentes de DNA. Os
valores de R correspondem a relação [DNA]/[FeCuOH], 25 mM PIPES pH 6,0 a
temperatura ambiente com uma concentração do complexo de 80 µM. Gráfico inserido
na figura mostra a relação [DNA]/(ε
a
-ε
f
) x [DNA].
A absorção máxima do complexo FeNiOAc livre foi observada a 486
nm, após a adição de concentrações crescentes de DNA foi observada uma
alteração significativa no espectro de absorção, resultando num
deslocamento para o vermelho (λ
max
= 510 nm) e no decaimento
significativo da absortividade molar (hipocromismo) (Figura 42).
A constante de ligação intrínseca de 3 x 10
4
M
-1
(Tabela 3) e o
deslocamento para o vermelho sugerem uma fraca interação do FeNiOAc
com o DNA possivelmente por um mecanismo intercalativo envolvendo
interação por empilhamento do fenolato aromático do complexo entre os
75
pares de base do DNA.
[29, 57, 72]
Este resultado confirma que o retardamento
da corrida da banda do DNA é devido a intercalação com o complexo
FeNiOAc. Complexos metálicos contendo Ni em sua estrutura, que são
capazes de intercalar com o DNA
[98]
mesmo sem clivá-lo foram descritos
recentemente.
[87, 99]
FeNiOAc
0
0,1
0,2
0,3
350 400 450 500 550 600 650
λ
λλ
λ
(nm)
Absorvância
R1 = 0
R2 = 0.5
R3 = 2.8
0,0
5,0x10
-5
1,0x10
-4
1,5x10
-4
2,0x10
-4
2,5x10
-4
0,0
5,0x10
-7
1,0x10
-6
1,5x10
-6
2,0x10
-6
[DNA]/(
ε
a
-
ε
b
)
[DNA] (mol.L
-1
)
Figura 42. Espectro de absorvância corrigido do complexo FeNiOAc na ausência
(R1) e na presença ( R2 e R3) de concentrações crescentes de DNA plasmidial. Os
valores de R correspondem a razão [DNA em pares de base]/[FeNiOAc]. A reação foi
realizada em PIPES pH 6,5 a 37
o
C e a concentração FeNiOAc foi 100 µM. Gráfico
inserido na figura [DNA]/(ε
a
-ε
f
) x [DNA]
Nos experimentos com os complexos FeZnOAc, FeZnOH e FeMnOH
foi demonstrado um comportamento diferente no espectro de absorção dos
complexos anteriores. Em vez da diminuição da absortividade molar houve
um aumento (hipercromismo) e um pequeno deslocamento para a região do
vermelho. Este padrão descrito para complexos de Cu
[8, 70]
e em certas
porfirinas
[100]
porém não está bem esclarecido.
76
Na Figura 43, o espectro UV-Vis mostra as alterações provocadas no
padrão de absorção do complexo FeZnOAc (R=0) à medida que foram
adicionadas quantidades crescentes de DNA plasmidial (R=0.0125 a
R=1.5). Um aumento na absortividade molar (hipercromismo)
deslocamento de 17 nm (λ
max =
492,5 para 509,5 nm). Este perfil dos
espectros de absorção também pode ser visto da Figuras 44 e 45 dos
complexos FeZnOH e FeMnOH, respectivamente.
O valor da constante intrínseca de ligação do complexo FeZnOH de
7,0 x 10
4
foi o maior valor obtido para os complexos da série (Tabela 3). O
complexo FeMnOH, como mencionado anteriormente, apresenta as
mesmas alterações no espectro que os complexos FeZn. Como pode ser
visto na Figura 45, o complexo FeMnOH apresentou um pequeno
hipercromismo e o menor deslocamento do λmax (492 a 495) dos
complexos da série refletindo no menor valor de Kb (1,98 x 10
4
M
-1
).
O comportamento observado na titulação espectrofotométrica dos
complexos FeZnOAc, FeZnOH e FeMn pode indicar uma interação
eletrostática ou de uma intercalação parcial do complexo no DNA.
[101]
Mas
como os valores de Kb obtidos para os complexos FeZn são os mais
elevados pode estar ocorrendo os dois tipos de interação fortalecendo a
ligação ao DNA.
Uma tabela comparativa dos valores da constante intrínseca de ligação
dos complexos está mostrada na Tabela 3.
77
FeZnOAc
0
0,1
0,2
0,3
300 400 500 600 700
λ
λλ
λ
(nm)
Absorvância
R =0
R =0.0125
R= 0.125
R =0.25
R= 0.50
R =1.0
R= 1.5
0,00
2,50x10
-5
5,00x10
-5
7,50x10
-5
1,00x10
-4
0,0
5,0x10
-8
1,0x10
-7
1,5x10
-7
2,0x10
-7
2,5x10
-7
[DNA]/(
ε
a
-
ε
b
)
[DNA] (mol.L
-1
)
Figura 43. Espectro UV-Vis do complexo FeZnOAc com DNA plasmidial pBSK
II. A figura mostra o espectro de absorção corrigido do complexo na ausência (R=0) e
na presença (R= 0.0125 a 1.5) de quantidades crescentes de DNA. Os valores de R
correspondem a relação [DNA]/[FeZnOAc], 10 mM PIPES pH 6,5 a temperatura
ambiente com uma concentração do complexo de 80 µM. Gráfico inserido na figura
mostra a relação [DNA]/(ε
a
-ε
f
) x [DNA].
78
FeZnOH
0,0
0,1
0,2
0,3
400 450 500 550 600 650 700
λ
λλ
λ
(nm)
Absorvância
R=0
R=0,0125
R=0,062
R=0,25
R=0,50
R=1,0
R=1,5
R=2,0
0,0
2,0x10
-5
4,0x10
-5
6,0x10
-5
8,0x10
-5
0,0
5,0x10
-8
1,0x10
-7
1,5x10
-7
2,0x10
-7
2,5x10
-7
3,0x10
-7
3,5x10
-7
4,0x10
-7
[DNA]/(
ε
a
-
ε
b
)
[DNA] (mol.L
-1
)
Figura 44. Titulação espectrofotométrica UV-Vis do complexo FeZnOH com DNA
plasmidial pBSK II. A figura mostra o espectro de absorção corrigido do complexo na
ausência (R=0) e na presença (R= 0.0125 a 2) de quantidades crescentes de DNA. Os
valores de R correspondem a relação [DNA]/[FeZnOH], 10 mM PIPES pH 6,5 a
temperatura ambiente com uma concentração do complexo de 80 µM. Gráfico inserido
na figura mostra a relação [DNA]/(ε
a
-ε
f
) x [DNA].
79
FeMnOH
0,10
0,15
0,20
400 450 500 550 600
λ
λ λ
λ
(nm)
Absorvância
R=0
R=0.06
R=0.2
R=0.3
5,0x10
-6
1,0x10
-5
1,5x10
-5
2,0x10
-5
2,5x10
-5
4,5x10
-7
5,0x10
-7
5,5x10
-7
6,0x10
-7
6,5x10
-7
[DNA]/(
ε
a
-
ε
b
)
[DNA] (mol.L
-1
)
Figura 45. Titulação espectrofotométrica do complexo FeMnOH com CT-DNA. A
figura mostra o espectro de absorção corrigido do complexo na ausência (R=0) e na
presença (R= 0.06, 0.2 e 0.3) de quantidades crescentes de CT-DNA. Os valores de R
correspondem a relação [DNA]/[FeMnOH], 25 mM PIPES pH 7,0 a temperatura
ambiente com uma concentração do complexo de 80 µM. Gráfico menor inserido na
figura [DNA]/(ε
a
-ε
f
) x [DNA].
A diferença nos valores da força de ligação não reflete a diferença de
atividade na clivagem do DNA demonstrada nas reações de cinética dos
complexos FeCu. Supostamente o complexo com maior constante de
ligação apresentaria maior atividade, mas neste caso ocorre o inverso: o
complexo com maior Kb tem atividade menor (FeCuOH) comparado ao
complexo de maior atividade da série (FeCuOAc) apesar de ambos os
complexos apresentarem o mesmo centro metálico. O mesmo ocorre com
os complexos FeZn pois complexo FeZnOH apesar de ter a maior constate
de ligação da série de complexos apresentou a menor atividade frente a
clivagem do DNA.
80
Este resultado só vem confirmar a idéia de que não somente o centro
metálico influencia na reatividade, mas outros fatores devem estar
envolvidos na hidrólise do DNA e que a força de ligação ao DNA não é
determinante na eficiência de clivagem do DNA.
Os valores das constantes de ligação intrínseca encontradas para os
complexos analisados apesar de serem menores que intercalantes clássicos
como o brometo de etídio, apresentam ordem de grandeza similar ou
superior quando comparados a outros complexos metálicos (Tabela 3).
Tabela 3. Constante de ligação intrínseca (Kb) e constante de associação
cinética (K
ass
) dos complexos metálicos Fe
III
M
II
e comparação com outros
compostos.
Complexo Kb M
-1
K
ass
M Ref.
FeZnOH 7,0 x 10
4
3,81 x 10
4
*
FeZnOAc 5,5 x 10
4
6,79 x 10
4
*
FeCuOH 4,4 x 10
4
3,36 x 10
4
*
FeNiOAc 3,0 x 10
4
- *
FeCuOAc 2,94 x 10
4
2,53 x 10
4
*
FeMnOH 1,98 x 10
4
1,53 x x 10
4
*
[Cu(II)(Hist)-(Tyr)]
2,7 x 10
2
-
[96]
[Cu(II)(Hist)-Trp)]
2,2 x 10
2
-
[96]
Cu
2
BMXD
7,0 x 10
5
-
[8]
CuMFF
1,5 x 10
4
-
[8]
[Ru(cyclam)(phi)].(ClO
4
)
2
5 x 10
4
-
[72]
[Mn(Im)
6
]
II
4,44 x 10
3
-
[86]
Brometo de Etídeo
7,0 x 10
7
-
[70]
*Complexos analisados neste trabalho
81
4.7. Teste com Distamicina
O tratamento do plasmidio pBSKII com distamicina antes da adição
dos complexos produziu diferentes conseqüências à clivagem do DNA.
Os complexos FeCu tiveram a atividade parcialmente inibida pela
adição de Distamicina (Figuras 46 e 47). Como a inibição é parcial pode-se
concluir que os complexos não se ligam preferencialmente ao sulco menor
revelando pouca especificidade com relação ao local de ligação das
moléculas de complexo ao DNA.
Figura 46. Teste de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo FeCuOAc na ausência
(linhas 1-4) e na presença (linhas 5-8) do reagente intercalante Distamicina [50 µM
final]. Linha 1 e 5 controle com DNA pBSK II [50 µM pb final]; linhas 2 e 6 DNA+ 10
µM FeCuOAc; linhas 3 e 7 DNA+ 20 µM FeCuOAc; linhas 4 e 8 DNA+ 40 µM
FeCuOAc. Todas as reações foram incubadas por 6 horas a 37
o
C em 25 mM MOPS pH
7,0.
FeCuOAc
0
20
40
60
80
100
120
1
2
3
4
5
6
7
8
% DNA pBSK II
Forma I
Forma II
82
FeCuOH
0
20
40
60
80
100
120
1
2
3
4
5
6
7
8
% DNA pBSK II
Forma I
Forma II
Figura 47. Teste de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo FeCuOH na ausência
(linhas 1-4) e na presença (linhas 5-8) do intercalante Distamicina [50 µM final]. Linha
1 e 5 controle com DNA pBSK II [50 µM pb final]; linhas 2 e 6 DNA+ 10 µM
FeCuOH; linhas 3 e 7 DNA+ 20 µM FeCuOH; linhas 4 e 8 DNA+ 40 µM FeCuOH.
Todas as reações foram incubadas por 6 horas a 37
o
C em 25 mM PIPES pH 6,0.
Nas Figuras 48, 49 e 50 estão mostrados os resultados dos géis e da
quantificação das bandas de DNA (Forma I e II) dos experimentos com
Distamicina para os complexos FeZnOAc, FeZnOH e FeMnOH. Nestes
complexos pode ser observado um aumento significativo da atividade dos
complexos quando o DNA é previamente tratado com a Distamicina.
Inicialmente poderia-se pensar que os complexos estão interagindo
com o DNA pelo sulco maior, mas o mais provável é que a Distamicina ao
se ligar ao sulco menor modifica a estrutura do DNA de tal modo que
aumente a capacidade de ligação do complexo ao DNA.
[74, 76]
Isto demonstra que os complexos metálicos analisados interagem de
maneira diversa no DNA, como já indicavam os resultados anteriores da
titulação espectrofotométrica.
83
FeZnOAc
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8
% DNA pBSK II
Forma I
Forma II
Figura 48. Estudo de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo FeZnOAc na
ausência (linhas 1-4) e na presença (linhas 5-8) de Distamicina. Linha 1 e 5 controle
com DNA pBSK II ; linhas 2 e 6 DNA+ 10 µM FeZnOAc; linhas 3 e 7 DNA+ 20 µM
FeZnOAc; linhas 4 e 8 DNA+ 40 µM FeZnOAc. Todas as reações foram incubadas por
6 horas a 37
o
C em 10 mM PIPES pH 6,5.
FeZnOH
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8
% DNA pBSK II
Forma I
Forma II
Figura 49. Estudo de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo FeZnOH na ausência
(linhas 1-4) e na presença (linhas 5-8) de Distamicina [50 µM final]. Linha 1 e 5
controle com DNA pBSK II [50 µM final]; linhas 2 e 6 DNA+ 10 µM FeZnOH; linhas
3 e 7 DNA+ 20 µM FeZnOH; linhas 4 e 8 DNA+ 40 µM FeZnOH. Todas as reações
foram incubadas por 6 horas a 37
o
C em 10 mM PIPES pH 6,5.
84
FeMnOH
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6
% DNA pBSK II
Forma I
Forma II
Figura 50. Análise de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo FeMnOH na
ausência (linhas 1-3) e na presença (linhas 4-6) do reagente intercalante Distamicina [50
µM final]. Linha 1 e 4 controle com DNA pBSK II [50 µM pb final]; linhas 2 e 5
DNA+ 10 µM FeMnOH; linhas 3 e 6 DNA+ 20 µM FeMnOH. Todas as reações foram
incubadas por 6 horas a 37
o
C em 25 mM HEPES pH 7,0.
85
5. CONCLUSÕES
Desta série de complexos biomiméticos das PAPs os complexos
FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc, FeZnOH e FeMnOH, foram capazes de
clivar o DNA plasmidial em condições próximas à fisiológica (variação de
pH 6,0 a 7,0) a 37
o
C em baixas concentrações dos complexos (a partir de
2,5 µM).
Os testes realizados na presença de captadores de radicais livres e na
ausência de oxigênio indicam que todos os complexos atuam na clivagem
do DNA através de um mecanismo hidrolítico.
O complexo FeNiOAc não foi capaz de hidrolisar o DNA, no entanto
foi demonstrada sua habilidade em se ligar por intercalação com a molécula
de DNA a ponto de alterar a migração da banda da Forma I.
Os testes cinéticos mostraram que o complexo FeCuOAc é o mais
ativo da série na clivagem do DNA, seguido pelos complexos FeMnOH,
FeZnOAc, FeCuOH e FeZnOH.
Os complexos FeMOAc são mais ativos que seus homólogos
isoestruturais FeMOH. As diferenças na atividade dos complexos podem
estar relacionadas não somente com os diferentes centros metálicos mas
também com pequenas diferenças na estruturas dos complexos que
apresentam a mesma composição do centro metálico.
Os complexos interagem com a molécula de DNA de modos distintos.
Esta diferença de interação fica evidenciada nos resultados obtidos nos
experimentos de titulação espectrofotométrica onde os complexos
FeCuOH, FeCuOAc e FeNiOAc se ligam ao DNA de modo intercalativo
clássico enquanto os complexos FeZnOAc, FeZnOH e FeMnOH se ligam
ao DNA por interações eletrostáticas e/ou intercalação. O complexo
FeZnOH tem o maior valor da constante de ligação 7 x 10
4
M
-1
s, enquanto
86
para os demais complexos o valor desta constante decresce no sentido
FeZnOAc, FeCuOH, FeNiOAc, FeCuOAc e FeMnOH.
Os testes com Distamicina ressaltam os comportamentos de interação
diferenciados para os complexos, sendo que a atividade dos complexos
FeZnOAc, FeZnOH e FeMnOH foi grandemente aumentada com adição
previa da distamicina.
Os complexos FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc, FeZnOH e FeMnOH,
constituem uma série de complexos com grande potencial para serem
utilizados como nucleases sintéticas.
87
6. PERSPECTIVAS
O potencial desta série de complexos estudos é imenso, mas ainda são
necessários mais estudos para determinação do mecanismo de clivagem
destes complexos com o DNA. Estudos com DNA linear dupla fita, linear
simples fita, e polinucleotídeos deve ser realizado com o objetivo de
verificar se existe especificidade por algum dos substratos.
A determinação dos sítios de clivagem também é importante que seja
realizada. Tentativas iniciais de se determinar os locais de clivagem foram
feitas com estes complexos utilizando-se sondas marcadas radiativamente,
porém não foi possível determinar um local de clivagem específico.
Experimentos de “Footpring” foram realizados no Laboratório de
Bioquímica da Universidade Federal do Paraná, e todos os complexos
inibiram a clivagem do DNA linear dupla fita pela DNAse I aleatoriamente
na seqüência. Devem ser realizados testes em diferentes condições (pH,
tampão, concentração de complexo) com outras sondas ou com DNA
plasmidial marcado radiativamente.
A obtenção de cristais dos complexos ligados a pequenos nucleotídeos
também é um dado importante que irá elucidar como estas moléculas
interagem e determinar o possível mecanismo de ligação.
Testes iniciais com os complexos FeCuOAc e FeCuOH mostraram a
capacidade destes complexos clivarem proteínas, enquanto que os
complexos FeZnOAc, FeZnOH, FeMnOH e FeNiOAc não demonstraram
tal habilidade. Os resultados não foram apresentados neste trabalho pois
exigem que mais estudos envolvendo esta série de complexos metálicos e
sua atividade frente a proteínas ou pequenos peptídeos deve ser investigada
mais detalhadamente.
88
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II
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III
Cu
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III
(µ−OH)Zn
II
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100
ANEXOS
101
ANEXO 1
2 ,0 3,0 4,0 5,0 6 ,0 7 ,0 8,0 9,0 10 ,0 11 ,0 12,0
0
20
40
60
80
100
D
C
B
A
%
p H
FeZ nO A c
4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0
0
20
40
60
80
100
pKa
3
pKa
2
pKa
1
D
C
B
A
%
-Log[H
+
]
FeC uOA c
Curvas de distribuição das espécies para os complexos FeZnOAc (acima) e FeCuOAc
(abaixo) em função do pH, onde A = (H
2
O)Fe
III
(µ-OAc)M
II
(OH
2
), B = (HO)Fe
III
(µ-
OAc)M
II
(OH
2
), C = (HO)Fe
III
(µ-OH)M
II
(OH
2
) e D = (HO)Fe
III
(µ-OH)M
II
(OH).
[19, 56, 59]
102
ANEXO 2
2 ,0 3, 0 4,0 5, 0 6 ,0 7,0 8,0 9,0 10 ,0 11,0
0
20
40
60
80
100
p K a
2
p K a
1
C
B
A
%
-L og [H
+
]
F eZ n O H
4,0 5, 0 6, 0 7,0 8 ,0 9 ,0 10 ,0 11 ,0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
10 0
p K a
2
p K a
1
C
B
A
%
-L o g [H
+
]
F eC u O H
Curvas de distribuição das espécies para os complexos FeZnOH (acima) e FeCuOH
(abaixo), onde A = (H
2
O)Fe
III
(µ-OH)M
II
(OH
2
), B = (HO)Fe
III
(µ-OH)M
II
(OH
2
) e
C = (HO)Fe
III
(µ-OH)M
II
(OH).
[19]
103
ANEXO 3
Curvas de distribuição das espécies para o complexo FeNiOAc, onde H
3
C =
(H
2
O)Fe
III
(µ-OAc)Ni
II
(OH
2
), H
2
C = (HO)Fe
III
(µ-OAc)Ni
II
(OH
2
), HC = (HO)Fe
III
(µ-
OH)Ni
II
(OH
2
) e C = (HO)Fe
III
(µ-OH)Ni
II
(OH).
[57]
FeNiOAc
104
ARTIGOS PUPLICADOS
105
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