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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Agrícola
Dissertação
§
Anticorpos monoclonais contra as proteínas LigA e
LigB de leptospiras patogênicas: produção e
caracterização
Núbia Seyffert
Pelotas, 2007
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NÚBIA SEYFFERT
Anticorpos monoclonais contra as proteínas LigA e LigB
de leptospiras patogênicas: produção e caracterização
Orientador: José Antônio Guimarães Aleixo
Pelotas, 2007
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola
da Universidade Federal de Pelotas, como
requisito parcial à obtenção do título de
Mestre em Ciências (área de
conhecimento: Imunologia Aplicada).
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Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901
Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
S519a Seyffert, Núbia
Anticorpos monoclonais contra as proteínas LigA e LigB de
leptospiras patogênicas: produção e caracterização / Núbia
Seyffert ; orientador José Antônio Guimarães Aleixo. – Pelotas,
2007. – 54f. – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia Agrícola. Centro de Biotecnologia.
Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2007.
1.Biotecnologia. 2.Leptospirose. 3.Proteínas de superfície.
4.ELISA. 5.Imuno-histoquímica. I.Aleixo, José Antônio
Guimarães. II.Título.
CDD: 614.56
Banca examinadora:
Prof
a
Dr
a
Josiane Bonel Raposo, Universidade Federal de Pelotas
Prof
a
Dr
a
Sandra Denise Jouglard, Universidade Federal de Pelotas
Prof. Dr. Fabio Leivas Leite, Universidade Federal de Pelotas
Prof. Dr. Jose Antônio Guimarães Aleixo, Universidade Federal de Pelotas
A Deus
Aos meus pais
AGRADECIMENTOS
A Deus pela minha vida, amor, saúde, conforto, paz e proteção.
Aos meus pais pelos conselhos, cuidados e carinho em todos os momentos.
À Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade de realização do curso
de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola.
À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela concessão da bolsa de estudos.
Ao Professor José Antônio Guimarães Aleixo por sua orientação e confiança
dispensadas na execução deste trabalho.
Aos amigos, colegas, estagiários e colaboradores do Centro de Biotecnologia
Cláudia H. P. Fernandes, Flávia A. Vasconcellos, Fabiana K. Seixas, Éverton F. da
Silva, Tessália Luerce, Carina Moraes, Natália Camacho, Ângela Moreira, Josiane B.
Raposo, Bel, Vanusa P. da Hora, Mariana L. Coutinho, Gustavo Cerqueira, Luana
Dummer, Leonardo G. Monte, Gabriela e Michele pela amizade, carinho, incentivo e
auxílio na realização dos experimentos.
E a todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
RESUMO
SEYFFERT, Núbia. Anticorpos monoclonais contra as proteínas LigA e LigB de
leptospiras patogênicas: produção e caracterização. 2007. 54f. Dissertação
(Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola. Universidade
Federal de Pelotas. Pelotas.
As proteínas leptospiral immunoglobulin-like (Lig) estão expostas na superfície da
membrana das leptospiras patogênicas e podem estar envolvidas no ataque e
penetração às células do hospedeiro durante a infecção. Recentemente, foi
identificado um par de Ligs, nomeadas LigA e LigB, com regiões polipeptídicas
idênticas e não-idênticas. As duas proteínas estimulam uma resposta humoral forte
durante a infecção aguda no hospedeiro e têm sido sugeridas como alvos para o
desenvolvimento de vacinas e testes diagnósticos para leptospirose. Este estudo
relata a produção e caracterização de anticorpos monoclonais (Mabs) contra
fragmentos recombinantes não idênticos de LigA (rLigANI) e LigB (rLigBNI). Os
fragmentos recombinantes foram utilizados para a imunização dos camundongos e
triagem dos hibridomas por ELISA indireto. Quatro Mabs obtidos contra rLigANI e 6
Mabs contra rLigBNI foram isotipados e avaliados quanto ao seu potencial para uso
em estudos de imunoproteção e desenvolvimento de testes diagnósticos. Os Mabs
foram dos isotipos IgM (1), IgG
2b
(3) and IgG
1
(6) e reagiram com as proteínas nativas
de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa L1 130 em ELISA indireto e
imunofluorescência. A constante de afinidade dos Mabs manteve-se entre 4x10
7
M
-1
and 2x10
8
M
-1
, e o mapeamento de epitopos por ELISA de aditividade demonstrou
que cada Mab reage com o mesmo epitopo na molécula recombinante ou causa um
impedimento espacial (steric hindrance). Finalmente, os Mabs reagiram
positivamente em testes imuno-histoquímicos de seções do tecido renal de hamsters
experimentalmente infectados com leptospiras. Esses dados sugerem que os Mabs
obtidos podem ser usados para estudos de imunoproteção e desenvolvimento de
testes de diagnóstico de leptospirose.
Palavras-chaves: leptospirose, proteínas de superfície, ELISA, imuno-histoquímica.
ABSTRACT
SEYFFERT, Núbia. Monoclonal antibodies against LigANI and LigBNI of
pathogenic leptospires: production and characterization. 2007. 54f. Dissertation
(Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola. Universidade
Federal de Pelotas. Pelotas.
Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) proteins are exposed on membrane surface of
pathogenic Leptospira and may play a role in host cell attachment and invasion during
infection. A pair of Ligs, named LigA and LigB, with identical and non-identical
polypeptide regions has recently been identified. The two proteins elicit a strong
humoral immune response during acute host infection and have been suggested as
targets for development of vaccines and diagnostic tests for leptospirosis. This study
reports the production and characterization of monoclonal antibodies (Mabs) against
recombinant non-identical fragments of LigA (rLigANI) and LigB (rLigBNI). The
recombinant fragments were used for mice immunization and screening hybridomas
by indirect ELISA. Four Mabs obtained against rLigANI and six Mabs obtained
against rLigBNI were isotyped and evaluated regarding their potential for use in
studies of immunoprotection and diagnostic test development. The Mabs were of the
IgM (1), IgG
2b
(3) and IgG
1
(6) isotypes and reacted with the native proteins from a
pathogenic strain of Leptospira interrogans serovar Copenhageni L1 130 in an indirect
ELISA and immunofluorescence. Mabs affinity constants felt between 4x10
7
M
-1
and
2x10
8
M
-1
, and epitope mapping by additive ELISA has shown that each Mab either
react with the same epitope in the recombinant molecule or cause steric hindrance.
Tissue sections from kidneys of hamsters experimentally infected with leptospires
and probed with the Mabs reacted positively by immunohistochemistry. These
findings suggest that the Mabs obtained can be useful for the studies of
immunoprotection and development of diagnostic tests.
Key words: leptospirosis, outer membrane proteins, ELISA, immunohistochemistry.
Lista de Figuras
Figura 1- Western blot com os Mabs anti-LigA e proteína recombinante................36
Figura 2- Western blot com os Mabs anti-LigB e proteína recombinante................36
Figura 3 - Imunofluorescência indireta do Mab LigANI1 com leptospiras fixadas com
metanol.....................................................................................................37
Figura 4- Imunofluorescência indireta do Mab LigBNI5 com leptospiras fixadas com
metanol.....................................................................................................38
Figura 5- Lesões causadas pelas leptospiras no tecido renal de hamsters
infectados..................................................................................................39
Figura 6- Imuno-histoquímica em tecido renal de hamsters experimentalmente
infectados utilizando os Mabs LigANI2 e LigBNI2....................................41
Lista de Tabelas
Tabela 1- Caracterização isotípica dos Mabs anti-LigA e anti-LigB através de
ELISA indireto.........................................................................................31
Tabela 2- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigA com a proteína
recombinante como antígeno..................................................................32
Tabela 3- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigB com a proteína
recombinante como antígeno..................................................................32
Tabela 4- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigA com a proteína nativa L.
interrogans L1 130....................................................................................33
Tabela 5- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigB com a proteína nativa L.
interrogans L1 130....................................................................................33
Tabela 6- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigA combinados com Mabs
anti-LigB com a proteína nativa L. interrogans L1 130 como
antígeno...................................................................................................34
Tabela 7- Constante de afinidade dos anticorpos monoclonais anti-LigA
determinadas com o antígeno recombinante..........................................34
Tabela 8- Constante de afinidade dos anticorpos monoclonais anti-LigB
determinadas com o antígeno recombinante..........................................34
Tabela 9- Reatividade dos Mabs anti-LigA e anti-LigB com L. interrogans L1 130
intactas e inativadas pelo calor em ELISA indireto.................................35
Tabela 10- Intensidade das reações imuno-histoquímicas dos Mabs anti-LigA e anti-
LigB em tecido renal de hamsters experimentalmente infectados com
leptospiras...............................................................................................39
Lista de símbolos e abreviações
Lig Leptospiral Immunoglobulin-like
LPS Lipopolissacarídeo
mL mililitro(s)
PCR Polymerase Chain Reaction
μg micrograma(s)
μl microlitro(s)
ºC grau(s) Célcius
ELISA Enzime-linked immunossorbent assay
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s Medium
MI Meio Incompleto
MC Meio Completo
HAT Hypoxanthine Aminopterin Thymidine
DMSO dimetilsulfóxido
IHQ Imuno-histoquímica
nm nanômetros
UV ultravioleta
M molar
min minutos
h hora
mg miligramas
cm
2
centímetros quadrados
g força da gravidade
NI não idêntico
SDS dodecil-sulfato de sódio
PVDF difluoreto de polivinilideno
V volts
mA miliampere
BSA albumina sérica bovina
DNA ácido desoxirribonucléico
mM milimolar
kDa kilodalton
SUMÁRIO
Anticorpos monoclonais contra as proteínas LigANI e LigBNI de leptospiras
patogênicas: produção e caracterização.......................................................................
1
AGRADECIMENTOS......................................................................................................... 5
RESUMO............................................................................................................................ 6
ABSTRACT........................................................................................................................ 7
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................... 8
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................... 9
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES......................................................................... 10
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 13
1.1 Importância da leptospirose e epidemiologia............................................................ 13
1.2 Patogênese e manifestações clínicas....................................................................... 14
1.3 Vacinas e diagnóstico laboratorial............................................................................ 16
1.4 Proteinas Lig............................................................................................................. 17
1.5 Anticorpos monoclonais............................................................................................ 19
2 OBJETIVO GERAL......................................................................................................... 21
2.1 Objetivos específicos................................................................................................ 21
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................ 22
3.1 Clonagem e expressão das proteínas Lig................................................................ 22
3.2 Cultivo das leptospiras.............................................................................................. 22
3.3 Produção de Anticorpos monoclonais...................................................................... 22
3.3.1 Imunização dos camundongos....................................................................... 22
3.3.2 Preparação das células de mieloma............................................................... 23
3.3.3 Fusão celular.................................................................................................. 23
3.3.4 Triagem dos hibridomas e clonagem celular.................................................. 24
3.3.5 Estocagem dos hibridomas............................................................................. 24
3.3.6 Produção de ascite e purificação.................................................................... 24
3.4 Caracterização dos Mabs......................................................................................... 25
3.4.1 Isotipagem...................................................................................................... 25
3.4.2 Índice de aditividade....................................................................................... 26
3.4.3 Constante de afinidade................................................................................... 26
3.4.4 ELISA com a proteína nativa L. interrogans L1 130......................................... 27
3.4.5 Western blot com as proteínas recombinantes e nativas............................... 28
3.4.6 Imunofluorescência Indireta............................................................................ 28
3.4.7 Imuno-histoquímica......................................................................................... 29
4 RESULTADOS................................................................................................................ 31
4.1 Produção dos Mabs................................................................................................. 31
4.2 Caracterização dos Mabs........................................................................................ 31
4.2.1 Classificação em isotipos................................................................................ 31
4.2.2 Avaliação da aditividade dos Mabs................................................................. 31
4.2.3 Afinidade dos Mabs pelos antígenos.............................................................. 34
4.2.4 ELISA indireto com a proteína nativa L. interrogans L1 130............................ 35
4.2.5 Western blot com as proteínas recombinantes e nativas............................... 35
4.2.6 Reconhecimento das Ligs em leptospiras fixadas com metanol.................... 37
4.2.7 Reconhecimento das Ligs em tecido renal de hamsters................................ 38
5 DISCUSSÃO.................................................................................................................... 42
6. CONCLUSÕES............................................................................................................... 47
7. REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 48
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 Importância da leptospirose e epidemiologia
A leptospirose é uma doença infecciosa endêmica causada por espécies
patogênicas de bactérias do gênero Leptospira, que afeta humanos e animais e
constitui um sério problema de saúde pública (WHO, 2003). As condições precárias
de saneamento básico associadas à elevada intensidade das chuvas, principalmente
em países tropicais, têm contribuído para o aumento da incidência da enfermidade
tanto nos centros urbanos (KO et al., 1999) como no meio rural (BHARTI et al.,
2003).
No Brasil a leptospirose é uma zoonose muito importante, pois apresenta uma
alta prevalência em várias regiões do país. No período de 2004 a 2006 foram
notificados 39.494 casos de leptospirose no país, sendo que 10.341 foram
confirmados e a taxa de letalidade foi de 11% (SINAN, 2007).
A enfermidade também pode estar relacionada a perdas econômicas na
pecuária, devido a abortos, baixa na produção de leite, mamites e infecções
inaparentes que comprometem a eficiência reprodutiva dos animais (BHARTI et al.,
2003; FAINE et al., 1999).
Na epidemiologia da leptospirose, a fonte de infecção mais comum é
representada pelos mamíferos que produzem uma leptospirúria de longa duração. O
rato de esgoto Rattus novergicus é considerado o principal reservatório do agente,
tendo por característica a urina alcalina, que é propícia à sobrevivência das
leptospiras. É provável que todas as espécies de roedores, marsupiais e mamíferos
sejam os principais portadores e excretores de leptospiras. Entretanto, há relatos do
isolamento do agente de anfíbios, répteis, aves, peixes e invertebrados em diversos
locais do mundo (BINDER, 1998).
A excreção da bactéria ocorre por um período variável, podendo persistir por
toda a vida do hospedeiro (LEONARD; QUINN; ELLIS, 1992); neste caso a bactéria
mantém com o hospedeiro uma relação simbiótica e permanece nos túbulos renais
sem danificar os rins (BINDER, 1998). A sobrevivência da Leptospira no meio
ambiente depende das condições encontradas fora do organismo do hospedeiro
(LEVETT, 2001).
14
O agente da enfermidade é transmitido aos organismos susceptíveis através
da urina infectada de diversas espécies animais (CDC, 2003), ou pelo contato com o
ambiente contaminado com leptospiras viáveis. O homem se infecta principalmente
através da água e do solo contaminados. (CORRÊA, 1987; ACHA; SZYFRES,
1986).
A prevalência de determinados sorovares leptospirais em uma localidade
pode estar relacionada com os tipos de reservatórios animais existentes, assim
como com as condições do ambiente e práticas ocupacionais. Dentre os
profissionais com risco potencial de se contaminarem encontram-se mineiros,
pescadores, médicos veterinários, técnicos de laboratório, trabalhadores de esgoto,
magarefes e agricultores (BHARTI et al., 2003).
Uma mesma espécie animal pode hospedar diferentes sorovares dependendo
da região geográfica em que se encontra. A biodiversidade das leptospiras pode ser
influenciada pelas variações climáticas, interações bióticas e atividades
antropogênicas (VINETZ et al., 1996). As atividades culturais e comportamentais
associadas à miséria e às condições de sobrevivência podem contribuir na
disseminação da doença.
1.2 Patogênese e manifestações clínicas
A patogênese da Leptospira ocorre a partir da penetração ativa através da pele
lesionada ou intacta quando o hospedeiro permanece na água contaminada durante
um período de tempo longo (BHARADWAJ, 2004).
Após ter superado os mecanismos de defesa não-específicos, as leptospiras
se multiplicam no sangue, na linfa, no fluido cérebro espinhal e em todos os tecidos,
constituindo a fase aguda da doença que cursa com leptospiremia (FAINE et al.,
1999).
Na lesão primária as leptospiras danificam as membranas das células
endoteliais de pequenos vasos sanguíneos pela ação dos fatores de virulência,
ocorrendo o rompimento dos capilares e a migração das bactérias para os espaços
extravasculares. As lesões preliminares são atribuídas à ação mecânica dos
microrganismos dentro da parede dos vasos sanguíneos e são seguidas por
hemorragias (BAROCCHI et al., 2002).
15
Provavelmente, os mecanismos de patogenicidade mais importantes sejam a
adesão (BAROCCHI et al., 2002) e a toxicidade (DORIGATTI et al., 2005). Os
efeitos secundários da isquemia, anóxia e aumento da pressão nos tecidos,
reforçam os danos e resultam na perda da função e morte celular (FAINE et al.,
1999). Contudo, o entendimento sobre o mecanismo de patogenicidade da
leptospirose ainda é limitado. Os efeitos do patógeno no organismo podem ser
determinados geneticamente de acordo com a resposta imune do hospedeiro,
permanecendo assim indefinidos (LEVETT, 2001; LINGAPPA et al., 2004).
A fase crônica da infecção é caracterizada pela presença de anticorpos e de
leptospirúria (WHO, 2003). Neste momento a colonização renal é observada,
principalmente dentro dos túbulos contorcidos proximais, onde os microrganismos
podem sobreviver (FAINE et al., 1999; BHARTI et al., 2003).
Os fatores de virulência das leptospiras têm sido estudados para um melhor
entendimento dos mecanismos de ação dessas bactérias no hospedeiro, como
também a resposta imune contra esses patógenos (CULLEN; HAAKE; ADLER,
2003; KLIMPEL; MATTHIAS; VINETZ, 2003; VIRIYAKOSOL et al., 2006; VERMA et
al., 2006).
Um importante foco desse estudo inclui a identificação das proteínas da
membrana externa (OMPs) envolvidas na patogênese da leptospirose (HAAKE,
2000). Devido a sua localização sobre a superfície celular, as OMPs leptospirais são
relevantes para o entendimento das interações hospedeiro-patógeno. A maior classe
de OMPs é composta pelas lipoproteínas LipL32, LipL21, LipL36, LipL45 e LipL41
(CULLEN; HAAKE; ADLER, 2003). A LipL32 é a proteína mais abundante em
leptospiras patogênicas e a mais reconhecida pelo soro de pacientes com
leptospirose (HAAKE et al., 2000). As proteínas LipL41 e LipL21, assim como a
LipL32, são expressas tanto in vivo com in vitro, e somente são detectadas em
sorovares patogênicos (CULLEN; HAAKE; ADLER, 2003).
Os sinais clínicos apresentados pelo hospedeiro infectado dependem da área
afetada e da extensão das lesões causadas pela disseminação das leptospiras
(FAINE et al., 1999; NALLY et al., 2006).
No início da enfermidade, normalmente observam-se febre, dores de cabeça
e articulares, dor na panturrilha, vômitos e sintomas de um resfriado, podendo ser
facilmente confundida com outras enfermidades como gripe e dengue (WHO, 2003).
16
Algumas pessoas com leptospirose podem evoluir para um quadro severo
que é chamado de Doença de Weil, caracterizada pelo comprometimento renal,
hepático, icterícia e hemorragias cutâneas e de mucosas, podendo ocorrer
meningite e também comprometimento funcional de outros órgãos (WHO, 2003).
Outra forma grave de leptospirose, a Síndrome Hemorrágica Pulmonar Severa
(SPHS) pode causar insuficiência respiratória e arritmias podendo levar o indivíduo à
morte em mais de 50% dos casos (SEIJO et al., 2002; SILVA et al., 2002; NALLY et
al., 2006).
Devido a variedade de sintomas e a severidade da doença em estágio
avançado, o diagnóstico precoce da leptospirose é essencial para um tratamento
eficiente que previna a evolução da enfermidade para um quadro severo.
1.3 Vacinas e diagnóstico laboratorial
Atualmente não existe uma vacina contra a leptospirose humana
recomendada pela Organização Mundial da Saúde. Porém, vários estudos têm sido
realizados para avaliar o potencial imunogênico de vacinas em alguns países como
Cuba, Rússia e China (MARTINEZ et al., 2000; IKOEV et al., 1999; ZHUO; WANG;
LAN, 1995).
As vacinas veterinárias contra a leptospirose disponíveis no mercado são as
chamadas bacterinas, que conferem imunidade pouco duradoura e são sorovar-
específicas. Além da necessidade de repetição da dose vacinal para manter a
imunidade, o fato de ser produzida apenas com um sorovar ou um conjunto restrito
de sorovares limita a proteção dos animais quando aplicada, já que as espécies de
leptospiras incluem cerca de 250 sorovares patogênicos (GAMBERINI et al., 2005).
O diagnóstico laboratorial de leptospirose humana depende da fase evolutiva
da doença e baseia-se na detecção do microrganismo em amostras clínicas ou em
uma quadruplicação ou aumento no título de anticorpos no teste de soroaglutinação
microscópica (MAT) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1995). Porém, o isolamento do
microrganismo em meio de cultura é demorado, assim o diagnóstico laboratorial da
leptospirose tem sido baseado principalmente em testes sorológicos.
Embora o MAT seja recomendado pelo Ministério da Saúde para o
diagnóstico sorológico da leptospirose, apresenta uma série de problemas. Por um
lado, o teste é complexo e requer a manutenção de grande número de
17
microrganismos em meio de cultura para garantir uma variedade antigênica dos
diferentes sorogrupos de Leptospira. Por outro lado, apresenta reações cruzadas
entre diferentes sorovares e baixa sensibilidade na fase inicial da doença, já que os
níveis de anticorpos somente são detectáveis 6-7 dias após aparecerem os
sintomas.
Para obter uma melhora no diagnóstico laboratorial diversos testes
sorológicos como ELISA, Dipstick, Immunoblot e Dot-ELISA foram desenvolvidos
com algumas modificações (YAN et al., 1999; GUSSENHOVEN et al., 1997;
LEVETT; BRANCH, 2002; PETCHCLAI; HIRANRAS; POTHA, 1991; RIBEIRO;
SOUZA; ALMEIDA, 1995; SILVA et al., 1997; EFLER et al., 2002), mas a maioria
deles são sorovar-específicos.
Com o estudo das OMPs de leptospiras patogênicas, tem surgido uma nova
perspectiva de melhora no diagnóstico laboratorial da leptospirose. Os antígenos
recombinantes LipL32, LipL41, OmpL1 de Leptospira foram testados em ELISA
(BOMFIM; KO; KOURY, 2005; MARIYA et al., 2006; OKUDA et al., 2005;
FLANNERY et al., 2001) a fim de observar a acurácia desses ensaios. Mais
recentemente, um teste diagnóstico denominado ELISA Cinético foi desenvolvido
não somente para detectar a infecção por leptospiras, mas também diferenciar
animais infectados de animais vacinados através da utilização de proteínas similares
às imunoglobulinas (Ligs) existentes na superfície bacteriana (PALANIAPPAN et al.,
2004).
O teste diagnóstico eficiente para a leptospirose deveria ter sensibilidade e
especificidade necessárias para detectar leptospiras circulantes ou anticorpos da
classe IgM que caracterizam infecção recente, o que proporcionaria a confirmação
da doença.
1.4 Proteínas Lig
Uma família de proteínas com estrutura similar às adesinas bacterianas foi
recentemente identificada e pode ter um papel importante na patogênese das
leptospiras. Essas proteínas têm domínios repetidos em tandem semelhantes às
imunoglobulinas e, por isso, foram denominadas Lig (leptospiral immunoglobulin-like)
(CULLEN; HAAKE; ADLER, 2003).
18
As proteínas LigA e LigB estão expostas na superfície bacteriana e a
expressão delas está correlacionada com a virulência das cepas de Leptospira
(MATSUNAGA et. al., 2003). Essas proteínas de superfície possivelmente mediam a
interação das leptospiras com as células do hospedeiro (MATSUNAGA et al., 2003),
um papel análogo ao da intimina e da invasina existente em outras bactérias (LUO et
al., 2000; HAMBURGER et al., 1999). Por exemplo, foi demonstrado que as
proteínas Lig são responsáveis pela capacidade de penetração, disseminação,
persistência e translocação das leptospiras nos tecidos dos hospedeiros
(MATSUNAGA et al., 2003; BAROCCHI et al., 2002).
Além disso, foi também demonstrado que as proteínas Lig são
osmoreguladas e expressas no hospedeiro principalmente na fase aguda da
enfermidade, onde parecem ser reguladas positivamente. Em meio de cultivo, as
proteínas Lig não são expressas com êxito pelas leptospiras, devido ao baixo nível
de expressão ou instabilidade protéica (PALANIAPPAN et al., 2002; MATSUNAGA
et al., 2005).
O conhecimento sobre a conservação dos genes lig nas diferentes espécies
de leptospiras constitui uma ferramenta importante para dar continuidade a estudos
envolvendo elaboração de vacinas e testes diagnósticos. Recentemente, um estudo
demonstrou que o gene ligA está presente somente nas espécies L. interrogans e L.
kirschneri, enquanto que o gene ligB é conservado em todas as espécies de
leptospiras patogênicas (CERQUEIRA, 2006).
As proteínas Lig foram avaliadas quanto ao seu potencial de proteção no
desafio em camundongos e hamsters, tendo a proteína LigA demonstrado eficiente
proteção (KOIZUMI; WATANABE, 2004; PALANIAPPAN et al., 2006). No
diagnóstico, foi desenvolvido um teste ELISA Cinético utilizando as proteínas Lig
para diferenciar animais vacinados de animais infectados, já que os testes ELISA e
MAT convencionais não possuem essa característica (PALANIAPPAN et al., 2004);
também a amplificação dos genes lig por PCR convencional e real-time foi utilizada
para a detecção de leptospiras patogênicas em estágio inicial da infecção
(PALANIAPPAN et al., 2005).
19
1.5 Anticorpos monoclonais
Em 1975, Georges Köhler e Cesar Milstein conseguiram obter uma célula
híbrida tumoral (hibridoma), originária da fusão de um linfócito B normal com uma
célula proveniente de um mieloma múltiplo (KOHLER; MILSTEIN, 1975). A célula
híbrida apresentava o caráter imortal da célula mielomatosa e a capacidade de
secretar anticorpos com a mesma especificidade daqueles secretados pelo linfócito
B normal. O hibridoma constitui-se em uma fonte duradoura de anticorpos
monoclonais (CAMPBELL, 1991; PASQUALINI; ARAP, 2004).
Desde então, várias aplicações para esses anticorpos têm sido descritas em
pesquisas biomédicas, na detecção de proteínas para o uso em vacinas
recombinantes e tratamento de doenças infecciosas e cancerígenas. Por
reconhecerem determinantes antigênicos únicos, os anticorpos monoclonais (Mabs)
são amplamente utilizados no desenvolvimento de testes diagnósticos específicos
(BERRY, 2005; CAMPBELL, 1991).
Os Mabs possuem diversas vantagens comparando com os anticorpos
policlonais por serem produzidos por clones híbridos derivados de células
progenitoras linfóides únicas, secretando anticorpos homogêneos. A produção e
seleção dos hibridomas podem ser controladas para se obter especificidade,
afinidade e funções efetoras desejadas. Além disso, esse método de produção
apresenta enorme reprodutibilidade não somente em meio de cultivo, mas também
no fluido extraído das ascites que proporciona uma quantidade ilimitada de
anticorpos específicos. O congelamento e descongelamento dos hibridomas também
podem ser realizados sem a alteração de suas propriedades de acordo com a
necessidade de uso (CAMPBELL, 1991).
Apesar de os hibridomas terem sido a fonte de Mabs específicos durante
anos, essa produção envolve uma série de fatores limitantes por ser um processo
trabalhoso, com múltiplas etapas, risco de contaminação, geneticamente instável e
requer células alimentadoras (PASQUALINI; ARAP, 2004). Na tentativa de
solucionar esses inconvenientes, outras tecnologias para a geração de Mabs in vitro
foram desenvolvidas nos últimos 30 anos (WINTER et al., 1994; PETERSON, 2005),
porém a metodologia convencional ainda é a mais empregada.
Em estudos envolvendo leptospirose, Mabs já foram utilizados na
identificação de sorovares (TERPSTRA et al., 1985), na diferenciação de leptospiras
20
patogênicas e saprófitas (CINCO, 1990), na identificação de gêneros e espécies
(ADLER; FAINE, 1983), em Dot-ELISA (SAENGJARUK et al., 2002; CHAICUMPA et
al., 2005) e em ELISA competitivo (SURUJBALLI; HOWLETT; HENNING, 1999;
SURUJBALLI, ELMGREN, 2000).
21
2 OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente estudo foi produzir e caracterizar anticorpos
monoclonais que reajam contra LigA e LigB nativas para uso em testes de
imunodiagnóstico e imunoproteção.
2.1 Objetivos específicos
• Produzir Mabs contra fragmentos não idênticos de LigA e LigB
recombinantes;
• Avaliar se os Mabs reagem com as proteínas nativas de L. interrogans L1 130
utilizando diferentes técnicas;
• Determinar a constante de afinidade dos anticorpos com as proteínas
recombinantes;
• Investigar a possibilidade de uso simultâneo dos Mabs em testes de
imunodiagnóstico através do mapeamento de epitopos.
22
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Clonagem e expressão das proteínas Lig
Os fragmentos não idênticos das proteínas LigA (LigANI) e LigB (LigBNI)
foram clonados e expressos no laboratório de Biologia Molecular do Centro de
Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). As proteínas
recombinantes LigANI e LigBNI foram preparadas para a imunização dos animais
utilizados na fusão celular, como também na sensibilização das placas de ELISA
usadas para a triagem dos hibridomas e testes de caracterização.
3.2 Cultivo das leptospiras
Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa L1 130 (KO et al., 1999) baixa
passagem e L. biflexa sorovar Patoc foram cultivadas em meio Ellinghausen-
McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (Difco Laboratories, USA).
Os antígenos vivos foram mantidos a uma temperatura de 30 °C em estufa
bacteriológica, sendo utilizados após 6 dias de cultivo ao atingirem uma
concentração de 2x10
8
leptospiras/mL, ajustadas utilizando câmara de Petroff-
Hauser (Thomas Scientific).
3.3 Produção de anticorpos monoclonais
3.3.1 Imunização dos camundongos
Quatro camundongos BALB/c com idade de 6 a 8 semanas foram injetados
intraperitonialmente com 50 µg de rLigANI. A imunização dos camundongos foi
realizada nos dias 0, 14 e 21. Na primeira dose a proteína foi emulsificada com um
volume equivalente de Adjuvante Completo de Freünd e nas duas doses
subseqüentes utilizou-se Adjuvante Incompleto de Freünd. Três dias antes da fusão
celular foi aplicada uma dose da proteína com adjuvante incompleto
intraperitonialmente no camundongo selecionado e outra dose intravenosa da
proteína pura. O mesmo procedimento foi utilizado para imunizar camundongos com
rLigBNI.
23
3.3.2 Preparação das células de mieloma
Células de mieloma da linhagem celular Sp2/O foram retiradas do nitrogênio
líquido, descongeladas em banho-maria a 37 °C, centrifugadas em meio DMEM
incompleto (MI) a 1000 g por 8 min, e cultivadas em frascos de cultivo celular com
meio DMEM completo (MC). Após cinco dias de cultivo e sucessivas trocas de meio,
as células foram expandidas para frascos de cultivo maiores até a obtenção de três
frascos de 75 cm
2
.
3.3.3 Fusão Celular
Dez dias após a terceira imunização dos camundongos, o soro dos animais
foi coletado por punção do plexo retro-orbital e o título de anticorpos foi determinado
por ELISA indireto utilizando as proteínas rLigANI e rLigBNI como antígeno. Os
camundongos com os maiores títulos de anticorpos contra as proteínas
recombinantes foram selecionados para serem utilizados na fusão celular.
Na véspera da fusão, um camundongo BALB/c de 6-8 semanas não
imunizado foi sacrificado e o baço removido, macerado, diluído em 50 mL de meio
DMEM HAT e distribuído nas 5 placas de cultivo (0,1 mL/cavidade) a serem
utilizadas na fusão celular, com a finalidade de proporcionar um meio de cultivo com
células alimentadoras para o desenvolvimento dos hibridomas.
No dia da fusão, o animal imunizado foi sacrificado por deslocamento cervical
e teve o baço removido em fluxo laminar. O baço foi macerado em MI e centrifugado
a 1000 g por 8 min, as células foram ressuspendidas em MI e centrifugadas por mais
duas vezes. Ao final de três centrifugações para a remoção dos grumos maiores do
baço, as células foram ressuspendidas em 10 mL de MI.
As células SP2/O cultivadas em MC foram retiradas dos frascos de cultivo e
centrifugadas a 1000 g por 8 min. Após três lavagens com MI, as células foram
ressuspendidas em 10 mL de MI e contadas em câmara de Neubauer.
As células do baço foram misturadas com 4x10
7
células SP2/O e
centrifugadas a 1000 g por 8 min, o sobrenadante foi desprezado e 1 mL de uma
solução de polietilenoglicol (PEG) a 50% em MI foi adicionado durante 1 min. Esta
suspensão foi agitada durante 1 min e, em seguida, 9 mL de meio incompleto foram
adicionados durante 5 min. As células foram centrifugadas a 1000 g por 10 min,
24
ressuspendidas em 50 mL de meio DMEM HAT e distribuídas nas 5 placas de
cultivo celular (0,1 mL/cavidade) anteriormente preparadas com meio de cultura e
células alimentadoras.
3.3.4 Triagem dos hibridomas e clonagem celular
As cavidades com crescimento de células ocupando mais de 50% da
superfície da cavidade foram testadas através de um ELISA indireto utilizando a
proteína de interesse como antígeno. As células que demonstraram estarem
secretando os Mabs foram selecionadas para a realização da clonagem e
posteriormente reclonagem pela técnica da diluição limitante (CAMPBELL, 1991).
3.3.5 Estocagem dos hibridomas
Após a reclonagem, as células secretoras dos Mabs cultivadas em MC foram
expandidas para garrafas de 75 cm
2
, misturadas em uma solução contendo soro
fetal com 10% de DMSO e congeladas em nitrogênio líquido. Uma parte das células
em cultivo foi injetada em camundongos para a produção de ascites.
3.3.6 Produção de ascite e purificação dos Mabs
Camundongos BALB/c com 6-10 semanas de vida foram sensibilizados com
0,5 mL de Pristane (2, 6, 10,14-tetra-metil-pentadecano) (Sigma), e após 10 dias,
5x10
6
células de hibridomas em MI foram injetadas intraperitonealmente. Quatorze
dias depois os camundongos foram puncionados para retirada do fluído ascítico que
foi centrifugado 1500 g por 10 min. Os sobrenadantes dos quatro Mabs anti-LigA e
cinco Mabs anti-LigB foram purificados em coluna de proteína G-Sepharose de
acordo com as instruções do fabricante (Amersham, MS). Alíquotas de 1mL foram
coletadas em Tris pH 9, dialisadas em PBS (500 x o volume total das frações) e
concentradas em solução de polietilenoglicol a 20% (PM 20.000). A concentração
dos anticorpos foi determinada em espectrofotômetro por UV utilizando em
comprimento de onda de 280 nm e o cálculo foi realizado através do coeficiente de
extinção da IgG (1,35). Os anticorpos foram armazenados a -18°C.
25
O Mab LigBNI1 foi purificado por precipitação com uma solução de sulfato de
amônio saturada. A ascite foi misturada com a solução saturada na proporção 1:1
por 2 h a 4 °C. Após este período, a mistura foi centrifugada a 3000 g por 30 min a 4
°C. O pellet foi diluído em PBS na quantidade de 10% do volume inicial. A amostra
foi dialisada como realizado com os demais Mabs. A concentração dos Mabs foi
determinada em espectrofotômetro por UV utilizando um comprimento de onda de
280 nm e o cálculo foi realizado através do coeficiente de extinção da IgM (1,25). Os
anticorpos foram armazenados a -18 °C.
3.4 Caracterização dos Mabs
3.4.1 Isotipagem
A isotipagem dos Mabs anti-LigA e LigB foi realizada através de ELISA, onde
uma placa de poliestireno de 96 cavidades (Nunc, EUA) foi sensibilizada com 50 µL
da proteína de interesse (3 µg.mL
-1
) em tampão carbonato-bicarbonato (0,05 M, pH
9,6) e incubada por 1 h a 37 °C. Como controles positivos foram utilizadas cavidades
sensibilizadas com soros dos camundongos BALB/c imunizados com as proteínas
rLigA e rLigB, diluídos em tampão carbonato bicarbonato pH 9.6. Cada cavidade foi
lavada 3 vezes com 200 µL de PBS com 0,05% de Tween 20 (PBS-T), e em seguida
foi adicionado 50 µL do meio de cultivo de cada hibridoma. Soro de camundongo
não imunizado foi utilizado como controle negativo. Assim como entre todas as
outras etapas desse ELISA, a placa foi incubada a 37 °C por 1 h e lavada 3 vezes
com 200 µL de PBS-T. Após, anticorpos de cabra anti-isotipo específicos (Sigma,
EUA) foram diluídos 1:4000 em PBS-T e adicionados 50 µL às cavidades da placa
que foi incubada a temperatura ambiente por 30 min. Por último, foram adicionados
à placa 50 µL do conjugado de anticorpo de coelho anti-IgG de cabra e peroxidase
na diluição de 1:5000 em PBS-T. Após, 50 µL de solução do cromógeno
ortofenilenodiamina (OPD) diluído em tampão citrato-fosfato (0,2 M, pH 4,0),
contendo 0,01% de peróxido de hidrogênio, foi adicionado às cavidades da placa.
Depois de a placa ser mantida em temperatura ambiente e no escuro por 15 min, foi
realizada a leitura em espectrofotômetro para ELISA (Titertek Multiscan MCC/340)
com filtro de 450 nm.
26
3.4.2 Índice de aditividade
Para a determinação do índice de aditividade inicialmente foi feito um ELISA
indireto para estabelecer a curva de saturação do antígeno com cada um dos Mabs.
Na sensibilização das placas de ELISA foram utilizadas rLigANI ou rLigBNI (3 µg.mL
-
1
) ou a proteína nativa de L. interrogans L1 130 (2x10
8
leptospiras mL
-1
) inativada a 56°
C por 14 h, e diluições seriadas em base dois de cada um dos Mabs.
Em um segundo momento, foi realizado um ELISA competitivo em que as
placas foram sensibilizadas com a mesma concentração de antígeno utilizada
anteriormente. Os Mabs foram adicionados na diluição de saturação adequada,
individualmente ou em pares. Foram testadas todas as combinações (em duplicata)
possíveis entre os dez Mabs. Em cada cavidade foi adicionado o anticorpo de cabra
anti-camundongo conjugado com peroxidase diluído 1:1000 em PBS-T. Entre todas
as etapas mencionadas as placas foram incubadas a 37 °C por 1 h e lavadas 3
vezes com PBS-T. Para a revelação do ELISA, foi adicionada 50 µL de OPD a 0,4
mg.mL
-1
diluído em tampão citrato-fosfato (0,2 M, pH 4,0), contendo 0,01% de
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) às placas e incubadas no escuro em temperatura
ambiente por 15 min. A leitura foi realizada em espectrofotômetro com comprimento
de onda de 450 nm e o resultado foi analisado através da fórmula [A
1+2
–
(A
1
+A
2
/2)/A
1
+A
2
–(A
1
+A
2
/2)] x 100, onde A1 e A2 são os valores das absorbâncias
dos Mabs 1 e 2 quando adicionados individualmente às cavidades, e A
1+2
é a
absorbância quando os dois Mabs foram adicionados juntos nas cavidades. Os
pares de anticorpos com índice de aditividade maior que 50% podem ser
considerados para uso em conjunto por reagirem em regiões diferentes da molécula
do antígeno (BOBROVNIK, 2003).
3.4.3 Constante de afinidade
Um Elisa indireto foi inicialmente realizado para estabelecer a concentração
de Mab adequada para a determinação de sua constante de afinidade (Ka). As
proteínas rLigANI e rLigBNI foram diluídas em tampão carbonato-bicarbonato à
concentração de 3 µg.mL
-1
e adicionadas (50 µL) em cada cavidade das placas de
poliestireno. Após 24 h a 20 °C, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS-T (200
µL/cavidade) e 50 µL do Mabs diluídos em PBS-T, em concentrações de 0,1 a 1x10
-4
27
mg.mL
-1
, foram adicionadas nas cavidades. Em seguida, um conjugado de cabra
anti-camundongo com peroxidase foi diluído 1:2000 e aplicado na placa. Após 1 h de
incubação e lavagem com PBS-T, a solução cromógena foi adicionada na placa na
mesma quantidade (50 µL) das demais soluções. A leitura foi realizada em
espectrofotômetro a 450 nm depois de 15 min em ambiente escuro e a temperatura
ambiente.
A determinação da Ka de cada Mab foi realizada em outro ELISA que utilizou
o Mab na concentração determinada acima, as mesmas concentrações das
proteínas para sensibilização das placas, e os mesmos tampões para diluições e
lavagens. Neste ELISA inicialmente os antígenos foram diluídos (4x10
-10
a 2x10
-7
M), misturados com o Mab em um tubo eppendorf e incubados por 15 h a 20 °C.
Depois desse período, 50 µL da mistura foi adicionada à placa para verificar a
reação entre o Mab livre e o antígeno fixado na placa. As duas últimas etapas desse
ELISA foram realizadas como citadas anteriormente. O período de incubação
quando não mencionado foi de 1 h a 37 °C e a lavagem das placas foi com PBS-T.
As absorbâncias do ELISA foram utilizadas na equação (A
0
– A
i
)/A
i
= Ka. l
i
, onde A
0
é
a absorbância do Mab na concentração selecionada, sem reagir com o antígeno no
microtubo; A
i
é a absorbância da reação após o complexo antígeno-anticorpo ter
atingido o equilíbrio; Ka é a constante de afinidade e l
i
é a concentração de antígeno
(BOBROVNIK, 2003; COUTINHO, 2005).
3.4.4 ELISA com a proteína nativa L. interrogans L1 130
Cada uma de três placas de poliestireno foi sensibilizada com 2x10
8
leptospiras mL
-1
intactas, inativadas pelo calor a 56 ºC por 14 h e a 100 ºC por 10
min. Os Mabs foram diluídos 1:1000 em PBS-T e adicionados 50 µL em cada
cavidade. Entre as etapas desse ELISA o período de incubação foi de 1 h a 37 °C e
as placas foram lavadas com PBS-T. O anticorpo de cabra anti-camundongo
conjugado com peroxidase foi diluído 1:1000 em PBS-T e adicionado à placa. Após
15 min, 50 µL da solução cromógena citada anteriormente, foi adicionada em cada
uma das cavidades da placa. A leitura foi feita a 450 nm.
28
3.4.5 Western blot com as proteínas recombinantes e nativa
As proteínas recombinantes LigANI e LigBNI nas concentrações de 0,250 mg.
mL
-1
foram fervidas a 100 °C por 3 min em tampão de amostra (0,25 M Tris-HCl,
10%SDS, 0,5% azul de bromofenol, 50% glicerol) em presença de agente redutor (β-
mercaptoetanol). As amostras foram aplicadas em um gel de acrilamida 12% na
presença de SDS para a separação eletroforética. Após, as proteínas foram
transferidas para uma membrana de PVDF (Amersham) por 1,5 h com a fonte
ajustada para diferença de potencial elétrico (DDP) = 100 V e corrente (C) = 400 mA.
As membranas foram bloqueadas por 2 h com 5% de leite em pó desnatado em
PBS. Os Mabs anti-LigA e anti-LigB foram diluídos (1:500) em PBS e adicionados à
membrana. Depois de 1 h o conjugado anti-IgG de camundongo com peroxidase foi
diluído 1:1000 em PBS e aplicado à membrana. A revelação foi realizada com a
solução cromógena (1% de cloronaftol e peróxido de hidrogênio pH 7,6). A
membrana foi lavada 3 vezes com PBS por 5 min entre as etapas mencionadas. O
período de incubação dos anticorpos com a membrana foi de 1 h.
O mesmo procedimento descrito anteriormente foi realizado com a proteína
nativa L. interrogans Copenhageni L1 130 baixa passagem com um concentração de
2x10
9
leptospiras mL
-1
.
3.4.6 Imunofluorescência indireta
Lâminas de vidro para microscopia foram cobertas com uma solução de poli-
L-lisina 0,01% (Sigma Aldrich) e incubadas a 37 ºC até secarem completamente.
Uma cultura de L. interrogans L1-130 com 2x 10
8
leptospiras mL
-1
foi centrifugada a
3000 g durante 5 min e ressuspensa em 5 mL de PBS. Após, 20 µL da suspensão
de leptospiras foi adicionada às lâminas que foram incubadas por 1 h a 30 °C. No
caso das leptospiras fixadas com metanol, as lâminas permaneceram na
temperatura de 37 °C até secarem e, após, o metanol a 4 °C foi adicionado sobre
elas por 10 min à temperatura ambiente.
As lâminas fixadas e não fixadas com metanol foram lavadas duas vezes com
PBS contendo 1% de BSA e os dez Mabs anti-LigA e anti-LigB nas concentrações
que variaram de 1,2 a 6,4 mg.mL
-1
foram adicionados na diluição 1:10. Após serem
incubadas por 1 h a 30 °C, as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS-BSA e o
29
anticorpo de coelho anti-camundongo conjugado com FITC foi diluído 1:100 e
adicionado às lâminas. Depois do período de incubação e lavagem das lâminas, foi
adicionado o corante de DNA Hoechst por 30 min. O meio de montagem contendo 9
mL de glicerol, 100 mg de N-phenylenediamine e 1 mL de PBS foi adicionado às
lâminas que foram recobertas com lamínulas. O controle positivo utilizado foi o Mab
anti-LipL32 1D9 e o controle negativo foi o soro de camundongo não imunizado.
3.4.7 Imuno-histoquímica
Quatro hamsters (Mesocricetus auratus) fêmeas criadas no biotério da UFPel,
com peso corpóreo entre 80 e 100 gramas, foram inoculados via intraperitoneal com
1 mL de PBS contendo 50 leptospiras L. interrogans L1 130. Outro hamster foi injetado
com 1mL de PBS para ser utilizado como controle negativo. Os animais foram
observados diariamente até o 21º dia pós-inoculação experimental, quando os
sobreviventes e o controle negativo foram sacrificados e submetidos à necropsia
para a posterior utilização em imuno-histoquímica (IHQ). Na necropsia foram
coletados fragmentos de fígado, rins e pulmão e fixados por um período de 24-48 h
em formol tamponado a 10%. Posteriormente foram clivados, embebidos em
parafina, cortados em seções a 3μm e colocados em estufa (55-60° C) por pelo
menos 2 h. Primeiramente, este material sofreu processamento histopatológico de
rotina, sendo corado com Hematoxilina e Eosina. Após esta avaliação, foi realizada
a técnica de IHQ para observar a reação dos Mabs produzidos com os antígenos
contidos nas seções de tecido selecionadas.
A reação IHQ, com amplificação pelo Sistema HRP DakoCytomation LSAB2
(Dako), foi realizada em seções histológicos de rins, fígado e pulmões dos animais.
As seções foram distribuídas em lâminas silanizadas e desparafinados com xilol frio
por 10 min a temperatura ambiente por duas vezes. Em seguida foram hidratados
com álcool etílico absoluto por 3 min e imersos duas vezes em uma solução
contendo 100 ml de metanol com 10 ml de água oxigenada PA 30 v por 30 min para
bloquear a peroxidase endógena. Após, os cortes foram hidratados
consecutivamente com etanol 90, 80 e 70% por 3 min e duas vezes cada. Quatro
Mabs anti-LigA e cinco Mabs anti-LigB foram adicionados sobre os cortes
histológicos e incubados por 10 min. A seguir foram feitas lavagens com tampão
PBS 10 mM pH 7,4 por 5 min e secagem das lâminas. Posteriormente, adicionou-se
30
o anticorpo biotinilado de cabra anti-camundongo e as lâminas foram incubadas por
10 min, lavadas em PBS por 5 min e a secagem foi realizada a temperatura
ambiente. A estreptavidina-peroxidase foi adicionada, seguindo-se os mesmos
procedimentos de incubação, lavagem e secagem. A revelação foi realizada com
uma solução contendo diaminobenzidina (DAB) (Sigma) a 1%, peróxido de
hidrogênio a 0,3%, água destilada e PBS por 5 min. Os cortes foram lavados com
PBS e contra-corados com hematoxilina de Harris por 20 s. Após a contra-coloração,
os cortes foram lavados em água corrente por 5 min, água destilada por 3 min. e
desidratados consecutivamente com etanol 70, 80, 90 e 100% por 2 min e xilol por 5
min. duas vezes cada. As lâminas foram secadas e montadas para análise em
microscopia. Como controle positivo foi utilizado um anticorpo monoclonal (1D9)
anti-LipL32 (LÜDTKE et. al., 2003), e como controles negativos de cada lâmina
foram utilizados soro de cabra como anticorpo primário e cortes histológicos do
animal inoculado apenas com PBS.
31
4 RESULTADOS
4.1 Produção dos Mabs
Foram produzidos seis hibridomas secretores de Mabs anti-rLigBNI (LigBNI1,
LigBNI2, LigBNI3, LigBNI4, LigBNI5 e LigBNI6) e quatro hibridomas secretores de
Mabs anti-rLigANI (LigANI1, LigANI2, LigANI3 e LigANI4).
4.2 Caracterização dos Mabs
4.2.1 Classificação em isotipos
O resultado da isotipagem dos Mabs é demonstrado na Tab. 1. Seis
anticorpos pertencem ao isotipo IgG1, 3 anticorpos ao isotipo IgG2B e 1 anticorpo ao
isotipo IgM. Os Mabs também foram testados com os anti-isotipos IgG2A, IgG3 e
IgA, mas os resultados foram negativos.
Isotipo
Anticorpos Monoclonais
LigANI1 LigANI2 LigANI3 LigANI4 LigBNI1 LigBNI2 LigBNI3 LigBNI4 LigBNi5 LigBNI6
IgM +
IgG1 + + + + + +
IgG2B + +
4.2.2 Avaliação da aditividade dos Mabs
Na Tabela 2 podemos observar que os Mabs anti-LigA, testados com a
proteína rLigANI, apresentaram índice de aditividade menores que 50%. O Mab
LigANI1 em combinação com LigANI4 apresentou porcentagens mais próximas de
50%, enquanto que LigANI1 com LigANI3 apresentou aditividade de apenas 7%.
Tabela 1- Caracterização isotípica dos Mabs anti-LigA e anti-LigB através de ELISA indireto.
32
LigANI1 LigANI2 LigANI3 LigANI4
LigANI1 - 27 7 35
LigANI2 - 23 18
LigANI3 - 31
LigANI4 -
Conforme a Tabela 3, os Mabs anti-LigB também apresentaram percentuais
de aditividade menores que 50% quando testados com rLigBNI. O Mab LigBNI1
apresentou índices de aditividade bem próximos a 50% com os demais Mabs anti-
LigB, exceto o LigBNI2.
.
LigBNI1 LigBNI2 LigBNI3 LigBNI4 LigBNI5 LigBNI6
LigBNI1 - 18 48 49 46 45
LigBNI2 - 30 46 34 25
LigBNI3 - 16 29 3
LigBNI4 - 34 29
LigBNI5 - 32
LigBNI6 -
Duas combinações de Mabs anti-LigA demonstraram aditividade de 43 e 47%
quando testados com a proteína nativa L. interrogans L1 130 (Tab. 4). No caso dos
Mabs anti-LigB, somente a combinação entre os Mabs LigBNI1 e LigBNI4
apresentou índice de aditividade maior que 40% (Tab. 5). Assim, usando a proteína
nativa nenhuma combinação de Mab anti-LigA ou anti-LigB rendeu aditividade
superior a 50%.
Tabela 2- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigA com a proteína recombinante
como antígeno.
Tabela 3- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigB com a proteína recombinante como
antígeno.
33
LigANI1 LigANI2 LigANI3 LigANI4
LigANI1 - 43 5 3
LigANI2 - 47 32
LigANI3 - 2
LigANI4 -
LigBNI1 LigBNI2 LigBNI3 LigBNI4 LigBNI5 LigBNI6
LigBNI1 - 30 21 44 32 21
LigBNI2 - 20 14 31 1
LigBNI3 - 23 18 2
LigBNI4 - 9 39
LigBNI5 - 1
LigBNI6 -
A maioria das combinações de Mabs anti-LigA com Mabs anti-LigB
apresentou índice de aditividade maior do que 50% quando testadas com a proteína
nativa L. interrogans L1 130, como demonstra a Tab. 6.
Tabela 4- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigA com a proteína nativa L.
interrogans L1 130.
Tabela 5- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigB com a proteína nativa L.
interrogans L1 130.
34
LigANI1 LigANI2 LigANI3 LigANI4
LigBNI1 117 53 93 57
LigBNI2 80 59 52 98
LigBNI3 90 20 35 131
LigBNI4 128 51 58 140
LigBNI5 83 94 125 138
LigBNI6 74 55 105 72
4.2.3 Afinidade dos Mabs pelos antígenos
Nas Tab. 7 e 8 são mostradas as constantes de afinidade dos anticorpos
monoclonais determinadas com rLigANI e rLigBNI. Todos os Mabs apresentaram
elevada afinidade pelos antígenos recombinantes.
Entre os Mabs anti-LigA, o LigANI1 foi o que apresentou a mais alta
constante de afinidade; entre os Mabs anti-LigB o que apresentou a mais alta
constante de afinidade foi o LigBNI6.
Característica
Anticorpos Monoclonais
LigANI1 LigANI2 LigANI3 LigANI4
Ka (L.mol
-1
) 2x10
8
5x10
7
7x10
7
5x10
7
Característica
Anticorpos Monoclonais
LigBNi2 LigBNI3 LigBNI4 LigBNI5 LigBNI6
Ka (L.mol
-1
) 4x10
7
1x10
8
1x10
8
1x10
8
2x10
8
Tabela 6- Índice de aditividade (%) dos Mabs anti-LigA combinados com Mabs anti-
LigB com a proteína nativa L. interrogans L1 130 como antígeno.
Tabela 7- Constante de afinidade dos anticorpos monoclonais anti-LigA determinadas
com o antígeno recombinante.
Tabela 8- Constante de afinidade dos anticorpos monoclonais anti-LigB determinadas
com o antígeno recombinante.
35
4.2.4 ELISA indireto com a proteína nativa L. interrogans L1 130
Sete Mabs reagiram com a proteína nativa de L. interrogans L1 130 intacta e
inativada a 56 °C. Por outro lado, quando os Mabs foram testados com as
leptospiras inativadas a 100 °C, as reações não foram observadas (Tab. 9).
Apenas os Mabs LigANI2, LigANI4 e LigBNI6 não reagiram com a Leptospira
intacta (Tab. 9). No caso do ELISA indireto realizado para testar os Mabs com o
sorovar saprófita Patoc não ocorreu reação com o microrganismo intacto e inativado,
como demonstra a Tab. 9.
Tabela 9- Reatividade dos Mabs anti-LigA e anti-LigB com L. interrogans L1 130 e Patoc
intactas e inativadas pelo calor em ELISA indireto.
Mabs
Condições das leptospiras
L. interrogans L1 130 Patoc
Intacta Inativada a
56°C
Inativada a
100° C
Intacta Inativada a
56° C
Inativada a
100° C
LigANI1
+ + - - - -
LigANI2
- + - - - -
LigANI3
+ + - - - -
LigANI4
- + - - - -
LigBNI1
+ + - - - -
LigBNI2
+ + - - - -
LigBNI3
+ + - - - -
LigBNI4
+ + - - - -
LigBNI5
+ + - - - -
LigBNI6
- + - - - -
+ (positivo); - (negativo)
4.2.5 Western blot com as proteínas recombinantes e nativas
O Western blot foi realizado com as proteínas recombinantes e nativas (L.
interrogans L1 130) para confirmar as reações positivas dos Mabs no ELISA indireto.
Os Mabs anti-LigA e anti-LigB apresentaram reações com as respectivas
proteínas recombinantes como se pode observar nas Fig. 1 e 2.
Os Mabs anti-LigA e anti-LigB reagiram fracamente no Western blot com as
proteínas nativas de L. interrogans L1 130 (dados não mostrados).
36
1 2 3 4 5 6
6
60KDa
1 2 3 4 5 6 7 8
60KDa
Figura 1- Western blot com os Mabs anti-LigA e proteína recombinante.
Linhas: 1. Soro de camundongo imunizado com rLigANI; 2. Soro de
camundongo não imunizado; 3. LigANI1; 4. LigANI2; 5. LigANI3; 6.
LigANI4. A seta indica a massa molecular da proteína recombinante
reconhecida pelos Mabs.
Figura 2- Western blot com os Mabs anti-LigB e proteína recombinante.
Linhas: 1. Soro de camundongo imunizado com LigBNI; 2. Soro de
camundongo não imunizado; 3. LigBNI1; 4. LigBNI2; 5. LigBNI3; 6.
LigBNI4; 7. LigBNI5; 8. LigBNI6. A seta indica a massa molecular da
proteína recombinante reconhecida pelos Mabs.
37
4.2.6 Reconhecimento das Ligs em leptospiras fixadas com metanol
Quatro Mabs anti-LigA e 5 Mabs anti-LigB foram utilizados em
imunofluorescência indireta com leptospiras fixadas e não fixadas com metanol.
Todos os Mabs testados foram capazes de reconhecer as proteínas LigA e LigB na
membrana externa das leptospiras fixadas com metanol. Nas Figuras 3 e 4, como
exemplo dos resultados obtidos, são apresentadas as reações das leptospiras com
os Mabs LigANI1 e LigBNI5. Nos testes realizados com leptospiras não fixadas com
metanol os resultados não foram positivos (dados não mostrados).
Figura 3- Imunofluorescência indireta do Mab LigANI1 com leptospiras fixadas com metanol.
Painéis A, B e C: leptospiras coradas com Hoechst; Painel D: Mab 1D9 (controle positivo);
Painel E: Mab LigANI1; Painel F: soro de animais não imunizados (controle negativo). As
leptospiras foram visualizadas em microscópio de fluorescência com aumento de 1000X.
A
C
D
E
F
B
38
Figura 4- Imunofluorescência indireta do Mab LigBNI5 com leptospiras fixadas com metanol.
Painéis A, B e C: leptospiras coradas com Hoechst; Painel D: Mab 1D9 (controle positivo);
Painel E: Mab LigBNI5; Painel F: soro de animais não imunizados (controle negativo). As
leptospiras foram visualizadas em microscópio de fluorescência com aumento de 1000X.
4.2.7 Reconhecimento das Ligs em tecido renal de hamsters
Nos cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina podemos observar
as lesões nos tecidos renais dos hamsters causadas pelas leptospiras (Fig. 5C,D).
Os Mabs quando utilizados em testes imuno-histoquímicos de tecido renal de
hamsters experimentalmente infectados apresentaram reações com diferentes
intensidades como podemos observar na Tab. 10.
Os Mabs LigANI2 e LigANI4 reagiram fortemente com a proteína nativa de
leptospiras nos tecidos de hamsters. As reações de imunomarcação do Mab LigANI2
nas regiões cortical e medular podem ser observadas em marrom (Fig. 6E,F). O Mab
LigBNI2 apresentou reação mais intensa que os demais Mabs anti-LigB (Fig. 6G,H).
Nas seções de fígado e pulmões não foi possível confirmar claramente a
reação dos Mabs através da IHQ (dados não mostrados).
A
B
C
D
E
F
39
Mabs Intensidade das reações
LigANI1 ++++
LigANI2 +++++
LigANI3 +++
LigANI4 +++++
LigBNI2 +++++
LigBNI3 +++
LigBNI4 ++++
LigBNI5 ++++
LigBNI6 ++++
+++ (leve); ++++ (moderada); +++++ (acentuada).
A B
C D
Tabela 10- Intensidade das reações imuno-histoquímicas dos Mabs anti-LigA e
anti-LigB em tecido renal de hamsters experimentalmente infectados com
leptospiras.
Figura 5- Lesões causadas pelas leptospiras no tecido renal de hamsters infectados.
A. Região cortical do rim de hamsters não infectados. B. Região medular do rim de
hamsters não infectados. C. Região cortical do rim de hamsters infectados, células
epiteliais dos túbulos degeneradas e algumas em necrose. D. Região medular do rim
de hamsters infectados, células epiteliais vacuolizadas e algumas em necrose.
Hematoxilina-eosina. Objetiva 40x.
40
C D
E F
A B
41
Figura 6- Imuno-histoquímica em tecido renal de hamsters experimentalmente
infectados utilizando os Mabs LigANI2 e LigBNI2. A. Controle negativo, região
cortical do rim de hamsters não infectados com o Mab 1D9 anti-LipL32. B.
Controle negativo, região medular do rim de hamsters não infectados tratada
com anticorpo 1D9. C. Controle negativo, região cortical do rim de hamsters
infectados tratada com soro de cabra 10%. D. Controle negativo, região
medular do rim de hamsters infectados tratada com soro de cabra 10%. E.
Região cortical do rim, imunomarcação intensa do Mab LigANI2 no citoplasma
e núcleo das células epiteliais renais atingidas. F. Região medular do rim,
imunomarcação intensa do Mab LigANI2 no citoplasma e núcleo das células
epiteliais renais atingidas. G. Região cortical do rim, imunomarcação intensa do
Mab LigBNI2 no citoplasma e núcleo das células epiteliais renais atingidas. H.
Região medular do rim, imunomarcação intensa do Mab LigBNI2 no citoplasma
e núcleo das células epiteliais renais atingidas. I. Controle positivo: região
cortical do rim, imunomarcação do Mab 1D9 anti-LipL32 no citoplasma e núcleo
das células epiteliais renais atingidas. J. Controle positivo: região medular do
rim de hamsters infectados, imunomarcação do Mab 1D9 anti-LipL32 no
citoplasma e núcleo das células epiteliais renais atingidas. Imuno-histoquímica,
LSAB2, contracoloração por hematoxilina de Harris. Objetiva 40x.
G H
I J
42
5 DISCUSSÃO
A leptospirose é reconhecida em todo o mundo como um importante problema
de saúde pública por apresentar alta incidência e elevada taxa de letalidade (WHO,
2003). O controle da enfermidade é dificultado devido à inexistência de vacinas e
testes laboratoriais que sejam eficazes na prevenção e diagnóstico da doença na
fase aguda (GAMBERINI et al., 2005; MCBRIDE et al., 2005). A necessidade da
observação de fatores como investigação epidemiológica, diagnóstico clínico e
laboratorial são imprescindíveis para detectar a doença com êxito (CDC, 2003).
Na última década foram intensificados os estudos relacionados à busca por
antígenos de leptospiras patogênicas para uso em vacinas e testes diagnósticos
(HAAKE et al., 1999; CULLEN; HAAKE; ADLER, 2003). Várias proteínas de
membrana externa (OMPs) foram identificadas, caracterizadas e testadas (HAAKE;
MATSUNAGA, 2002). Recentemente, as proteínas LigA e LigB foram identificadas
como sendo fatores de virulência comuns às leptospiras patogênicas, expressos
principalmente na fase aguda da enfermidade (MATSUNAGA et al., 2003).
Os antígenos recombinantes Lig foram testados quanto às suas
potencialidades no desenvolvimento de vacinas e ensaios diagnósticos e os
resultados foram satisfatórios (PALANIAPPAN et al., 2006; PALANIAPPAN et al.,
2005; PALANIAPPAN et al., 2004).
Anticorpos monoclonais produzidos contra antígenos específicos de
diferentes patógenos têm sido relevantes em estudos envolvendo o desenvolvimento
de vacinas e testes de diagnóstico (BERRY, 2005). Na busca de alvos para novas
vacinas e metodologias laboratoriais de diagnóstico da leptospirose mais precisas, a
disponibilidade de Mabs contra antígenos recombinantes de LigA e LigB seria um
fator decisivo de sucesso. Nesse contexto, o presente estudo relata a produção de
Mabs anti-LigA e anti-LigB de leptospiras patogênicas e a sua caracterização com
vistas a identificar suas potencialidades para uso em imunoproteção e
imunodiagnóstico.
Os quatro Mabs anti-LigANI e cinco Mabs anti-LigBNI produzidos
apresentaram constantes de afinidade altas, o que significa requererem pequena
concentração de antígeno para que a reação antígeno-anticorpo atinja o equilíbrio
ou, dizendo de outra forma, para a saturação dos epítopos pelos anticorpos
(LUTTMANN et al., 2006). Essa informação é de extrema importância na seleção de
43
Mabs candidatos à padronização de testes imunodiagnósticos, pois antígenos de
leptospiras não são abundantes no soro de pacientes no início da infecção
(MACBRIDE et al., 2005; BOENISCH, 2001). Além disso, anticorpos com alta
afinidade devem ser preferidos para imunoensaios de fase sólida porque eles
permanecem ligados ao antígeno nas várias etapas de lavagem e porque permitem
incubações mais curtas (CROWTHER, 2001).
Os valores de aditividade dos Mabs anti-LigA com a proteína recombinante e
nativa foram menores que 50% (Tab. 2 e 4), significando que os Mabs interferem um
na ligação do outro, possivelmente devido a um impedimento espacial (steric
hindrance) por reagirem em regiões próximas na molécula do antígeno (COUTINHO,
2005). Assim, estes Mabs não podem ser utilizados em conjunto em um teste
diagnóstico. Igualmente, os Mabs anti-LigB apresentaram índices de aditividade
menores que 50% com a proteína recombinante e nativa (Tab. 3 e 5). Resultados
similares foram encontrados por Coutinho (2005), que ao testar Mabs anti-LipL32
recombinante observou aditividade menor que 50%.
Em contraste, quando os Mabs anti-LigA e anti-LigB foram utilizados em
conjunto com a proteína nativa de L. interrogans L1 130 para investigar o impacto no
índice de aditividade, os valores atingiram 100% ou mais em várias combinações de
anticorpos (Tab. 6). Este resultado sugere a possibilidade da utilização conjunta dos
dois tipos de Mabs na padronização de um teste de captura de antígeno para o
imunodiagnóstico da leptospirose.
Na avaliação dos Mabs quanto à reatividade com as proteínas nativas em L.
interrogans L1 130 baixa passagem através de ELISA indireto, foi observado a reação
de todos os Mabs com as leptospiras inativadas a 56 °C e de 7 Mabs com as
leptospiras intactas (Tab. 9). Os Mabs não reagiram com o sorovar saprófita Patoc
(dados não mostrados). Esses dados reforçam a hipótese de que estes Mabs são
adequados para o desenvolvimento de testes mais específicos para a leptospirose.
Mabs contra LipL32, proteína de membrana presente em todas as leptospiras
patogênicas (HAAKE et al., 2000), também reagiram em ELISA indireto com
leptospiras inativadas a 56°C (LÜDTKE et al., 2003; COUTINHO, 2005) e poderiam
ser adicionados a um painel de anticorpos para uso em diagnóstico.
As proteínas Lig são altamente expressas no hospedeiro durante a infecção e
pobremente expressas em meio de cultura (PALANIAPPAN et al., 2002;
MATSUNAGA et al., 2005). Quanto à conservação, os genes ligA e ligB são
44
encontrados na maioria das leptospiras patogênicas e se sabe que a cepa L.
interrogans L1 130 os possui (CERQUEIRA, 2006). A cepa L. interrogans L1 130 foi
seqüenciada (NASCIMENTO et al., 2004) e tem sido utilizada como padrão para a
realização de diversos experimentos.
Baseado nesses fatos, para a realização dos testes de caracterização dos
Mabs anti-LigA e anti-LigB relacionados com o reconhecimento da proteína nativa
utilizamos a cepa L. interrogans L1 130. Outros sorovares e espécies patogênicas não
foram testados pela não disponibilidade desses antígenos em baixa passagem no
período de realização deste trabalho. Além disso, para a confirmação dos relatos de
Matsunaga et al. (2005) que constataram que as proteínas Lig são expressas de
forma restrita em meio de cultura, principalmente em cultivos em que já foram
realizados diversos repiques, os Mabs foram testados através de ELISA indireto com
diferentes sorovares da espécie L. interrogans alta passagem e os resultados foram
negativos (dados não mostrados).
As proteínas nativas das leptospiras inativadas a 100 °C não reagiram com os
Mabs anti-LigA e anti-LigB quando usadas como antígeno no ELISA indireto e
reagiram fracamente no Western blot. Quando os Mabs foram testados com as
proteínas recombinantes no Western blot as reações foram fortemente positivas
(Fig. 1 e 2). Esse resultado sugere que o tratamento térmico intenso pode afetar a
estrutura da proteína nativa e provocar resultados falsos negativos em testes de
detecção de antígeno.
Na imunofluorescência indireta, nove Mabs testados reagiram com as
proteínas nativas apenas quando as leptospiras foram submetidas ao tratamento
com metanol. Isso pode ter ocorrido devido à maior exposição dos epitopos após o
tratamento. As reações mais intensas foram dos Mabs LigANI1 e LigBNI5 (Fig. 3 e
4).
Os cortes histológicos do tecido renal de hamsters experimentalmente
infectados com L. interrogans L1 130 e corados com hematoxilina-eosina
demonstraram hemorragia, lesões como degeneração das células epiteliais e
necrose dos túbulos renais (Fig. 5C,D), semelhantes às encontradas por Nally et. al.
(2005) nos rins de camundongos infectados experimentalmente com uma cepa de L.
interrogans Copenhageni isolada de humanos. Porém, nos experimentos realizados
por Nally et al. (2005) a dose de leptospiras foi maior (10
7
células) e os animais
foram sacrificados antes dos 21 dias.
45
Os Mabs anti-LigA e anti-LigB utilizados como anticorpos primários em IHQ,
reagiram intensamente nos cortes de tecidos renais de hamsters infectados (Tab.
10). Comparando com os resultados do controle positivo, o Mab 1D9 contra a
proteína LipL32 (Fig. 6I,J), principal proteína de membrana expressa durante a
infecção (HAAKE et al., 2000), os Mabs anti-LigA e anti-LigB reagiram com maior
intensidade nos tecidos renais dos hamsters, tanto na região medular renal (Fig.
6F,H) quanto na região cortical renal (Fig. 6E,G). Essa forte reação pode estar
relacionada ao fato de os antígenos Lig serem possíveis fatores de virulência de
leptospiras responsáveis pela adesão e penetração nos tecidos (MATSUNAGA et
al., 2003; BAROCCHI et al., 2002), e dessa forma podem ser expressos
abundantemente no hospedeiro infectado. Por outro lado, as reações de menor
intensidade do Mab 1D9 (Fig. 6I,J), podem ter resultado de alterações sofridas pelo
anticorpo ou antígeno durante sua preparação para utilização em IHQ ou em alguma
das etapas da técnica.
Em um estudo imuno-histoquímico da expressão e distribuição de
componentes da membrana externa de leptospiras como LPS, OmpL1, LipL36 e
LipL41, durante uma infecção experimental de hamsters com L. kirschneri de baixa
passagem, foi demonstrado que alguns desses antígenos estão relacionados à
persistência das leptospiras nos rins (BARNETT et al., 1999). Neste mesmo
experimento, foi possível a visualização da distribuição das proteínas OmpL1 e
LipL41 no lúmen dos túbulos renais dos hamsters infectados com uma dose maior
do que 50 leptospiras e 28 dias pós-infecção. Haake et al. (2000) demonstraram a
reatividade de um soro policlonal anti-LipL32 no lúmen dos túbulos renais de
hamsters experimentalmente infectados com L. Kirshneri. Esses dados da localização
preferencial das leptospiras no tecido renal condizem com os resultados
encontrados no presente trabalho (Fig. 6E-J).
Na IHQ realizada nas seções de fígado e pulmões dos hamsters
experimentalmente infectados, não foi possível confirmar claramente a reação dos
Mabs anti-LigA e anti-LigB (dados não mostrados) devido as reações inespecíficas,
como aquelas com a peroxidase endógena do tecido hepático.
As variações de reatividade do painel de anticorpos anti-LigA e anti-LigB com
a proteína nativa de Leptospira nos diferentes testes de caracterização, pode ser
conseqüência dos diversos tratamentos físicos e químicos a que os Mabs e o
antígeno foram submetidos.
46
No entanto, os dados apresentados nesse trabalho sugerem que os Mabs
anti-LigA e anti-LigB obtidos podem ser usados para estudos de imunoproteção,
com vistas a validação do uso destas proteínas em vacinas, e no desenvolvimento
de testes diagnósticos mais eficientes para a leptospirose.
47
6 CONCLUSÕES
• Os seis Mabs anti-LigB e quatro anti-LigA reagem com epítopos localizados
em regiões próximas na molécula do antígeno;
• Os Mabs possuem alta constante de afinidade;
• Os Mabs reagem com Leptospira interrogans L1 130 intactas e inativadas a
56 °C através de ELISA indireto;
• Os Mabs reagem com Leptospira interrogans L1 130 fixadas com metanol
através de imunofluorescência indireta;
• Os Mabs reagem com a proteína nativa em tecido renal de hamsters
experimentalmente infectados com leptospiras;
• A maioria dos Mabs tem potencial para uso em testes de imunodiagnóstico e
imunoproteção.
48
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