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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE
RIBEIRÃO PRETO
Atividade neuroprotetora e anticonvulsivante
do composto FrPbAII isolado da peçonha da
aranha Parawixia bistriata em ratos Wistar
submetidos ao Status Epilepticus por
pilocarpina.
ALEXANDRA OLIMPIO SIQUEIRA CUNHA
Ribeirão Preto,
2008
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Atividade neuroprotetora e anticonvulsivante do
composto FrPbAII isolado da peçonha da aranha
Parawixia bistriata em ratos Wistar submetidos ao
Status Epilepticus por pilocarpina.
Alexandra Olimpio Siqueira Cunha
Ribeirão Preto
2008
Tese de Doutorado apresentada a Faculdade
de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto, da Universidade São Paulo para
obtenção do título de Doutor em Ciências
Área de concentração: Psicobiologia
Orientador: Prof. Dr. Wagner Ferreira dos
Santos
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Cunha, Alexandra Olimpio Siqueira
Atividade neuroprotetora e anticonvulsivante do composto FrPbAII
isolado da peçonha da aranha Parawixia bistriata em ratos Wistar
submetidos ao Status Epilepticus por pilocarpina.
Ribeirão Preto, SP
120p.: 29cm
Tese de Doutorado apresentada a Faculdade de Filosofia, Ciências
e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
1. Epilepsia Experimental 2. Venenos de Aranhas 3.
Anticonvulsivantes
FICHA CATALOGRÁFICA
Capa: Imunofluorescência para GFAP no hipocampo
de animais submetidos ao Status Epilepticus e tratados
com o composto FrPbAII isolado da peçonha da aranha
Parawixia bistriata
Dedico este trabalho
Ao meu marido Aldo,
Aos meus filhos, Barbara, Mariana e Gabriel,
Aos meus pais, Fernando e Lurdinha.
Agradecimentos
! A Deus, pela vontade, determinação, saúde, alegria e principalmente
pelo “leite das pedras” de todos os dias.
! Ao meu marido Aldo, pelo amor e amizade, eternos....
! Aos meus “pequenos” tesouros, por me fazerem feliz todos os dias.
! Aos meus pais, pelo amor, carinho e ensino da Ética.
! Ao Prof. Wagner Ferreira, pela liberdade de criação, pelos conselhos
(nem sempre ouvidos), pelo apoio durante quase 8 anos de
convivência!
! Ao Prof Joaquim Coutinho–Netto da FMRP-USP, pela colaboração
contínua e duradoura.
! Ao Prof Norberto Cysne Coimbra da FMRP-USP, pelo apoio logístico e
discussões científicas sempre produtivas.
! Ao Prof Norberto Peporine Lopes FCFRP-USP, pela abertura do
laboratório para isolamento dos compostos.
! Ao Prof Marcus Lira Brandão FFCLRP-USP, pelo apoio logístico e
abertura do laboratório.
! À Prof Elisabeth Spinelli FFCLRP-USP, por ter me introduzido a
maravilhosa área das Neurociências.
! Aos Profs Luiz Tadeu Moraes Figueiredo e Victor Hugo Aquino da
Unidade de Virologia da FMRP-USP, pela utilização do microscópio de
fluorescência.
! À minha grande amiga, Márcia, pela ajuda, apoio e orientação sempre
disponíveis. Por me ouvir e chorar comigo todas as tristezas e fazer das
quedas só um breve descanso...
! Às minhas queridas irmãs, Ludovica, Clarissa e Ana Luisa, por terem me
ajudado tanto, tantas vezes. Por terem me ouvido chorar e me feito
sorrir. Por nunca me esquecerem, apesar da distância.
! Aos meus queridos amigos do Laboratório de Neurobiologia e
Peçonhas, por terem enchido a minha vida de risadas…. Obrigada aos
que estão: Zezim, Jú grande, André, Adriana, Érica, Helene, Cristina,
Karina, Jú pequena, Silvia e Márcia Prévide. Obrigada aos que já foram:
Lú, Andrea, Renato, Alessandra, Marcelo, Bruna e Zelinda.
! À minha querida mãe de Ribeirão, Nina, pelo apoio, por chorar comigo
tantas vezes, pelo café, sempre aconchegante.
! Às minhas amigas de muitos anos, minha família de Ribeirão, por tudo o
que fizeram e representam pra mim; Marina, Raquel, Fabíola e Karlinha.
Não me esqueço vocês nunca.
! Ao amigo e técnico, Amauri, pela ajuda com a Histologia, por me
ajudar com as minhas idéias malucas e pelas conversas sobre arte….
! Ao inesquecível amigo, Toninho, pelas conversas, apoio e pelo ensino
das técnicas da Histologia, eletroforeses e colunas. Que Deus te dê
sempre amparo e conforto e um descanso em paz.
! Ao pessoal de outros laboratórios, que sempre nos ajudam muito; Renê,
Ruither, Pancinha, Vera e Sivia do laboratório do Prof Coutinho; Jorge,
karina e Milene do laboratório do Prof Brandão; Gobbo do laboratório
do Prof Norberto Lopes e Daoud do laboratório do Prof Coimbra.
! Ao técnico Tomaz do laboratório do Prof Norberto Lopes, pela ajuda
incansável na purificação, no massa e pelos sustos.... muitos!
! Ao Zezim e a Jú por me ouvirem sempre e me ajudarem com tudo das
imunos às compras de casa.….e a Érica pelas cirurgias e ensaios….
! Ao meu genrinho, Thomas, por fazer a minha Barbara feliz.
! À Renata da Psicobio, por ajudar a entender as burocracias e cumprir
os prazos, pela amizade de quase 10 anos. Felicidades pra você!
! Aos meus Professores do curso de Ciências Biológicas da FFCLRP-USP,
pela participação na minha formação.
! A Universidade de São Paulo, pelo privilégio de estudar aqui por 10
anos!
! A Capes, pelo apoio financeiro
! Aos animais pelo sacrifício….
“Para ser grande, sê inteiro: nada
Teu exagera ou exclui.
Sê todo em cada coisa. Põe o que és
No mínimo que fazes.
Assim como em cada lago a lua toda
Brilha, porque alta vive”
Ricardo Reis, Ode (1933)
Resumo
Cunha, A.O.S. Atividade neuroprotetora e anticonvulsivante do composto FrPbAII
isolado da peçonha da aranha Parawixia bistriata em ratos Wistar submetidos ao Status
Epilepticus por pilocarpina. 2008. 120f. Tese de Doutorado – Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, 2007.
A epilepsia do lobo temporal (ELT) acomete cerca de 70% dos pacientes com
diagnóstico de epilepsia, sendo a manifestação mais comum da doença e a que mais
apresenta casos de pacientes refratários. Apesar do potencial terapêutico dos
compostos disponíveis, uma proporção considerável de pacientes não responde ao
tratamento ou ainda apresenta intolerância aos efeitos adversos destas drogas. Desta
forma, existe uma necessidade contínua de se buscar novas alternativas para o
tratamento da ELT e de outras síndromes neurológicas importantes. Neste contexto, os
venenos de artrópodes são fontes alternativas de compostos seletivos e específicos
sobre sítios do tecido nervoso. À luz destes fatos, no laboratório de Neurobiologia e
Peçonhas, isolou-se um composto linear, FrPbAII (174 Da), do veneno da aranha
Parawixia bistriata, o qual atua inibindo os transportes de GABA e de glicina e cujo
mecanismo de ação ainda não foi esclarecido. Demonstrou-se que a FrPbAII exerce
efeito anticonvulsivante contra crises induzidas por vários convulsivantes químicos com
bons índices terapêuticos. Além disso, quando injetado na substância negra, a FrPbAII
inibiu crises evocadas pela estimulação Area tempestas do córtex piriforme. Este
composto apresenta ainda atividade ansiolítica quando injetado no hipocampo
dorsal. Continuando o estudo da atividade neurofarmacológica da FrPbAII, no
presente trabalho avaliou-se a atividade neuroprotetora e anticonvulsivante em um
modelo crônico, comparando sua eficiência a de drogas neuroativas com
mecanismos de ação variados. Para tanto, ratos Wistar foram submetidos a um Status
epilepticus (SE) de 3 h induzido pela injeção intrahipocampal de pilocarpina. A seguir
os animais foram divididos em grupos (n=6-15) tratados com salina, FrPbAII (0.15, 0.075,
0.037 µg/µL), ácido nipecótico (12
µg/µL, i.c.v.), drogas anti-epilépticas convencionais
– fenitoína (60mg/kg, i.p.) e carbamazepina (120mg/kg, i.p.), um anestésico já testado
como neuroprotetor – cetamina (50 mg/kg, i.p.) e um ansiolítico – diazepam (2mg/kg,
i.p.). Como parâmetros de neuroproteção foram monitorados déficits funcionais do
hipocampo no labirinto aquático de Morris, alterações morfológicas em neurônios e
astrócitos e incidência de crises recorrentes de 5-20 dias após o SE. Mostrou-se que os
tratamentos com alvo no sistema GABAégico; diazepam, a FrPbAII (0.15µg/µL) e o
ácido nipecótico foram mais eficientes como neuroprotetores, do que as demais
drogas. Uma semana após o SE, os ratos tratados com estes compostos apresentaram
desempenho no labirinto semelhante àqueles não submetidos ao SE. Com relação à
estimativa de células piramidais do hipocampo, foi constatado que os ratos tratados
com todas as drogas e eutanasiados 20 dias após o SE, exibiram diminuição da perda
destas células, quando comparados aos animais epilépticos sem pós-tratamento. No
entanto, o número de células nestes animais não foi semelhante às de animais dos
grupos controles não epilépticos. Ainda, foi observado um aumento da expressão de
GFAP, devido ao aumento volume das células astrocíticas (corpo celular e
prolongamentos), mas não de número de astrócitos. Além disso, foi observada uma
menor incidência de crises recorrentes entre os ratos tratados com as drogas
potencializadoras do GABA. Considerando que a FrPbAII foi cerca de 100 vezes mais
potente que o ácido nipecótico e que este composto inibe as captações de GABA e
glicina, pode-se supor que o bloqueio inespecífico de transportadores de GABA,
representa uma alternativa poderosa para prospecção de drogas com potencial
antiepileptogênico.
Abstract
Cunha, A.O.S. Neuroprotective and anticonvulsant activity of FrPbAII isolated from the
venom of the spider Parawixa bistrita in Wistar rats submitted to the pilocarpine-induced
Status Epilepticus. 2008. 120f. Thesis (Doctoral) – Faculdade de Filosofia, Ciências e
Letras de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, 2007.
Temporal lobe epilepsy (TLE) is accounts for 70% of patients with epilepsy and it is thus,
the most common epileptic syndrome and the one with the highest number of
refractory. Despite the therapeutic potential of these compounds, many patients either
do not respond to treatment, or do not tolerate the severe side-effects triggered by
chronic treatment. Therefore, there is still a need to search for novel alternatives for the
treatment of TLE as well as other neurological diseases. In this context, arthropod
venoms appear as sources of compounds that act on neuronal structures with
selectivity and specificity. In the light of these facts, the laboratory of Neurobiology and
Venoms isolated a linear molecule named FrPbAII (174 Da) from the venom of the
spider Parawixia bistriata, which inhibits GABA and glycine uptake, through
mechanisms still not fully characterized. Previous data have shown that FrPbAII is
anticonvulsant against seizures evoked by a wide range of chemoconvulsants with
good therapeutic indexes. Moreover, the injection of this compound into the Substantia
nigra pars reticulate blocks seizures elicited from the stimulation of the Area tempestas
in the piriform cortex. Still, intrahippocampal administration of FrPbAII was anxiolytic.
Continuing the studies with this molecule, the present study evaluated its
antiepileptogenic and neuroprotective properties, comparing its effects with the
effects of neuroactive drugs with different modes of action. Therefore, the animals were
submitted to the three-hour SE induced by the intrahippocampal pilocarpina. They
were divided in groups (n=6-15) treated with saline, 3 doses of FrPbAII (0.15, 0.075, 0.037
µg/µL), nipecotic acid, two convencional antiepileptics – carbamazepine and
phenytoin, the neuroprotective agent ketamine and the benzodiazepine diazepam. As
parameters of neuroprotection the cognitive deficits of the hippocampus were
monitored in the Morris water maze. Moreover, morphological alterations in neurons
and astrocytes were analyzed and incidence of recurrent seizures was estimated from
5 to 20 days after the initial SE. The present work shows that drugs targeting GABAergic
system; diazepam, FrPbAII (0.15µg/µL) and nipecotic acid were more efficient
neuroprotective drugs than the rest of the compounds used. One week after SE,
animals treated only with these drugs learned the task in the Morris water maze as
quickly as control healthy animals. Regarding to pyramidal cell estimate densities,
animals treated with all drugs and sacrificed 20 days post-SE showed attenuated cell
loss as compared to epileptic non-treated animals. However, cell density was still lower
than control non-epileptic animals. Furthermore, an increase in GFAP expression was
observed, mainly due to the increase in astrocytes volume (cell body and processes)
rather than astrocytes number. Finally, groups of animals treated with GABA enhancing
drugs had lower number of animals with recurrent seizures, although this result was not
statistically significant. As FrPbAII inhibits both GABA and glicine uptakes and it was over
100 more potent than nipecótico acid in this work, one can suppose that the unspecific
blockade of GABA transporters may represent a powerful alternative to be used in the
design of drugs with antiepileptogenic potential.
Prefácio
A epilepsia, a doença que faz cair, é uma das mais
antigas desordens neurológicas, com registros de até 4500 AC.
Conceitos básicos em epilepsia foram desenvolvidos e
aperfeiçoados na Índia durante o período Védico entre 4500–
1500 AC.
Na literatura Charaka Samhita, a epilepsia é descrita
com o nome de apasmara, que significa perda de
consciência. O Charaka Samhita contém referências sobre
muitos aspectos da epilepsia, incluindo sintomatologia,
etiologia, diagnóstico e tratamento.
No Ocidente, no entanto,
esta doença sempre foi associada à presença de espíritos e
demônios, os quais dominavam as pessoas e provocavam
salivação excessiva, queda e contorções do corpo. Durante
estes ataques de demônios e espíritos, cada tipo de ataque
era provocado por um demônio específico, o espírito da
pessoa seria aprisionado, deixando-a fora da realidade. Os
gregos antigos acreditavam que a pessoa contraía epilepsia
se ofendesse aos deuses, sobretudo a deusa Selena, daí a
epilepsia ser conhecida como a “doença sagrada”. Mais
tarde, Hipócrates utilizou a sua teoria sobre desequilíbrio de humores para explicar o
desencadeamento da epilepsia. Nas palavras de Hipócrates “O cérebro é a causa desta
calamidade. Quando o muco do cérebro desce para as veias, o paciente perde a fala e
espuma pela boca, suas mãos se contraem, seus olhos se contorcem, ele deixa de sentir e em
alguns casos as vísceras se esvaziam. Todos estes sintomas são causados quando o muco frio do
cérebro entra em contato com o sangue quente”. No Evangelho de São Marcos (9, 17-18)
escrito aproximadamente 70 DC está descrito que Jesus Cristo exorcizou um rapaz do qual o
demônio roubava a fala quando o atacava. Segundo o apóstolo quando o demônio atacava,
este fazia o rapaz cair, espumar pela boca, ranger os dentes e torna-se rígido. A idéia de que a
epilepsia era contagiosa surgiu durante o império romano. Nesta época, assim como durante o
final do século 17, os epiléticos eram separados do convívio comum e mesmo em manicômios,
eles eram mantidos afastados dos loucos para não contaminá-los. Durante a Idade Média, os
ataques epilépticos eram considerados características para identificação de bruxos e bruxas.
Relatos desta época mostram que depois da peste, a epilepsia é a segunda maior doença,
cuja cura fora atribuída aos milagres dos santos. A cura da epilepsia na maioria das vezes era
obtida através do exorcismo do paciente. Contudo, outras curas como dormir em templos,
utilizar amuletos ou relicários, alguns fitoterápicos e até absinto também foram utilizados ao
longo do tempo. Devido ao horror que os ataques epilépticos causavam às pessoas que os
assistiam, bem como a explicação baseada em preconceitos e superstições, os portadores de
epilepsia sempre foram tratados como aberrações. Foi somente nos séculos 19 e 20, com o
aumento dos conhecimentos sobre neuroanatomia e fisiologia, que a epilepsia começou a ser
estudada com uso de métodos científicos. Nesta época o notável fisiologista inglês John
Hughlings Jackson (1859-1906), definiu as crises convulsivas como sendo descargas ocasionais,
excessivas e desordenadas dos nervos sobre os músculos. No entanto, mesmo em países
desenvolvidos como nos Estados Unidos na década de 1920, havia leis permitindo a esterilização
compulsória de pessoas epilépticas. De fato, com base no conhecimento de que a epilepsia é
uma doença hereditária, o 3º. Reich, com suas medidas de “higiene racial” descritas na “Lei de
Prevenção a Prole com Doenças Hereditárias” editada em 14 de Julho de 1933, previa que
portadores de epilepsia deveriam ser esterilizados. Além disso, pessoas com epilepsia intratável
deveriam ser encaminhadas aos campos de exterminação. Hoje, o Museu Alemão de Epilepsia
localizado em Kork, em uma antiga casa de tratamento para pessoas epilépticas abriga um
acervo artístico de obras cujo tema está relacionado com a epilepsia. Algumas obras deste
museu estão apresentadas neste trabalho.
Ribeirão Preto, Dezembro de 2007
Sumário
1. Introdução 1
1.1. Epilepsia – panorama, definições, tratamento e modelos
experimentais
1
1.2 Mecanismos básicos da transmissão de informação no cérebro 6
1.2.1. Neurotransmissões inibitórias: GABA e Glicina 6
1.2.2.Neurotransmissão excitatória: L-Glutamato 10
1.3.O Hipocampo e o modelo de Epilepsia pós Status Epilepticus 12
1.5.As neurotoxinas de artrópodos e o desenvolvimento de novas DAs. 17
1.6 A aranha Parawixia bistriata. 19
2. Objetivos 23
3. Material e Métodos 24
3.1 Coleta das aranhas, purificação de veneno e isolamento da FrPbAII 24
3.1.1. Coleta da aranha Parawixia bistriata 24
3.1.2. Purificação do composto FrPbAII 24
3.1.3. Etapas de isolamento em Cromatografia Liquida de Alta
Eficiência (CLAE)
25
3.1.4. Espectrometria de massa 26
3.2. Bioensaios 27
3.2.1. Animais 27
3.2.2. Cirurgia 27
3.2.3. Drogas 27
3.2.4. Indução do SE. 28
3.2.5. Ensaios comportamentais no labirinto Aquático de Morris 29
3.3. Procedimentos histológicos 31
3.4. Imunofluorescência 32
3.4.1. Secções em parafina 32
3.4.2. Secções congeladas 32
3.5. Análise Dano Neuronal 33
3.5.1. Análise Qualitativa, Quantitativa da histologia e
imunofluorecência.
33
3.6. Análise estatística 34
4. Resultados
4.1. Purificação do composto FrPbAII 36
4.2. Espectrometria de massa 38
4.3. O SE induzido por pilocarpina e o tratamento 39
4.4. Labirinto Aquático de Morris 41
4.5. Análise histolopatológica 48
4.5.1. Análise histopatológica qualitativa 48
4.5.2. Análise quantitativa do dano neuronial 54
4.6. Imunofluorescência para GFAP 58
4.7. Incidência de crises recorrentes 60
5. Discussão 61
6. Conclusões 73
7. Referências Bibliográficas 74
8. Anexos 90
Lista de Figuras
Figura 1 Esquematização das sinapses inibitórias GABAérgicas 7
Figura 2 Esquematização do fluxo informacional no hipocampo, suas
aferências, eferências e suas regiões.
13
Figura 3 Binding do H
3
-Glutamato em membranas hipocampais e
corticais de ratos Wistar 15 dias após o SE.
15
Figura 4 Esquematização da epileptogênese secundária. 16
Figura 5 A. Exemplar da aranha P. bistriata. B. Colônia coletada na
região de Mococa
20
Figura 6 Fluxograma ilustrando as etapas experimentais para obtenção
do composto FrPbAII.
26
Figura 7 Labirinto aquático de Morris. 30
Figura 8 Fluxograma mostrando as etapas da parte experimental do
trabalho.
35
Figura 9 Perfil cromatográfico do veneno de P. bistriata 37
Figura 10 Perfil espectrométrico do composto FrPbAII 38
Figura 11 Efeitos comportamentais da injeção por via intrahipocampal do
agonista colinérgico pilocarpina.
40
Figura 12 Trajetórias desenvolvidas pelos animais no labirinto aquático de
Morris
41
Figura 13 Médias (±SEM) das latências de escape para encontrar a
plataforma durante o primeiro e segundo dia de treinamento no
labirinto aquático de Morris
43
Figura 14 Médias (±SEM) das latências de escape para encontrar a 44
plataforma durante o terceiro e quarto dia de treinamento no
labirinto aquático de Morris
Figura 15 Médias (±SEM) das latências de escape para encontrar a
plataforma durante o probe trial no labirinto aquático de Morris.
45
Figura 16 Médias (±SEM) das latências de escape para encontrar a
plataforma durante os quatro dias de treino no labirinto aquático
de Morris dos animais controles.
46
Figura 17 Médias (±SEM) dos tempos de permanência dos animais no
quadrante-alvo (plataforma).
47
Figura 18 Cortes histológicos (parafina) do hipocampo na região da CA1. 49
Figura 19 Cortes histológicos (criostato) do hipocampo na região da CA1. 50
Figura 20 Cortes histológicos (parafina) do hipocampo na região da CA3. 51
Figura 21 Cortes histológicos (criostato) do hipocampo na região da CA3. 52
Figura 22 Cortes histológicos (parafina) do hipocampo na região do GD. 53
Figura 23 Cortes histológicos (criostato) do hipocampo na região do GD 54
Figura 24 Porcentagem de perda de neurônios em três regiões do
hipocampo
57
Figura 25 Secções (parafina) de marcadas com anticorpo para GFAP no
GD do hipocampo
58
Figura 26 Imunomarcação para GFAP no hilus do GD 59
Figura 27 Secções (criostato) de marcadas com anticorpo para GFAP no
GD
59
Lista de Tabelas
Tabela I Classificação das crises convulsivas 2
Tabela II Resumo dos modelos experimentais de epilepsia 3
Tabela III Compostos anticonvulsivantes isolados de venenos de
artrópodos
18
Tabela IV Critérios comportamentais para classificação das crises límbicas 28
Tabela V Protocolo experimental no labirinto aquático de Morris. 30
Tabela VI Incidência de crises recorrentes após SE induzido pela injeção
de pilocarpina
60
Lista de Abreviações
ILAE -
Liga Mundial de Luta contra Epilepsia (do inglês International League
Against Epilepsy)
WHO Organização Mundial de Saúde (do inglês World Health Organization)
EEG Eletroencefalograma
ELT Epilepsia do Lobo Temporal
SE Status Epilepticus
MEST Teste de Máximo Eletrochoque (do inglês Maximal Eletroshock Test)
PTZ Pentilenotetrazol
NMDA N-metil-D-Aspartato
KA Ácido caínico (do inglês Kainic Acid)
AMPA Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionico
DAs Drogas Anticonvulsivantes
GABA
Ácido γ-aminobutírico
SNC Sistema Nervoso Central
PIPS Potencial Inibitório Pós Sináptico
GAT Transportador de GABA (do inglês GABA Transporter), subtipos 1-4
L-Glu L-Glutamato
m-GluR Receptores metabotrópicos de glutamato
EAATs
Transportadores de aminoácidos excitatórios (do inglês Excitatory
aminoacid Transporters), subtipos 1-5
LTP Potencialização à longo prazo (do inglês Long Term Potentiation)
LTD Depressão à longo prazo (do inglês Long Term Depression)
CA1 Corno de Amon 1
CA3 Corno de Amon 3
GD Giro Denteado
PP
Via perfurante (do inglês Perfurant Path) porção lateral LPP e porção
medial MPP
MF Fibras musgosas (do inglês Mossy Fibers)
SrTx1.3 Neurotoxina isolada do veneno da aranha Scaptocosa raptoria
AG2 Neurotoxina isolado do veneno da aranha Argiope trifasciata
BmK AE Neurotoxina isolada do veneno do escorpião Buthus martensi Karsch
i.c.v. Intracerebroventricular
HE Hematoxilina e eosina
GFAP Proteína glial acídica fibrilar (do inglês Glial fibrillary acidic protein)
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CEUA Comitê de Ética para o Uso de Animais
CLAE Cromatografia Liquida de Alta Eficiência
FITC
Fluoresceína isotiocianato (do inglês Fluorescein isothiocyanate)
IgG Imunoglobulina do tipo G
EPM Erro padrão da média
Introdução
1
1. Introdução
1.1. Epilepsia – panorama, definições, tratamento e modelos experimentais
Estima-se que cerca de 1% da população mundial seja afetada por
algum tipo de epilepsia, sendo que 80% dos casos estão em países em
desenvolvimento (Meinardi et al., 2001). Em um recente estudo realizado
durante a campanha mundial contra epilepsia (Global Campaign Against
Epilepsy) promovida pela Liga Mundial Contra Epilepsia (ILAE) e Organização
Mundial da Saúde (WHO), Dua e colaboradores (2006) relataram os resultados
de um levantamento sobre os recursos disponíveis para tratamento da
epilepsia. Os dados deste levantamento revelaram discrepâncias entre países
ricos e pobres, tais como: preço de medicamento (três vezes mais caros em
países pobres), equipamentos disponíveis para diagnóstico (apenas 45% dos
serviços Africanos e 55% dos serviços do leste Asiático fazem monitoramento
do tratamento) e intervenção cirúrgica (apenas 13% dos centros localizados
em países pobres, em contraste com 65% dos centros localizados em países
ricos) (Dua et al., 2006).
As epilepsias constituem um grupo heterogêneo de doenças crônicas
do cérebro, caracterizado pela ocorrência de sincronização de descargas
elétricas neuronais que culminam com a ocorrência de crises espontâneas e
imprevisíveis. A incidência das síndromes epilépticas muda drasticamente com
a idade, ocorrendo no primeiro ano de vida numa freqüência de 150/100.000
de indivíduos caindo para 45-50/100.000 após 9 anos de idade. Até os 15 anos
de 1.0 a 1.7% das crianças têm pelo menos 1 crise e de 0.7 a 0.8% das crianças
têm crises recorrentes (Guerrini, 2006). Curiosamente, a incidência destas
síndromes se eleva novamente entre indivíduos da terceira idade. Grupos de
2
sintomas e sinais definem síndromes epilépticas específicas. A classificação
destas síndromes se baseia em critérios clínicos, neuroimagem e neurofisiologia
(Comissão para Classificação e Terminologia da Liga Internacional Contra
Epilepsia - Commission on Classification and Terminology of the International
League Against Epilepsy, 1989). De uma maneira geral, as epilepsias são
divididas em dois grandes grupos: 1. Generalizadas (40% dos casos) quando o
registro eletroencefalográfico (EEG) detecta disparos sincronizados
generalizados em diversas regiões do cérebro; 2. Parciais (60%), quando o EEG
detecta disparos sincronizados em áreas localizadas (Tabela I) (Löscher, 1998;
Engel, 2001).
Tabela I. Classificação das crises convulsivas
Tipos
Crises generalizadas Crises Parciais
Ausência (Petit mal) Parciais simples
Mioclônicas Parciais complexas
Clônicas Parciais secundariamente generalizadas
Tônicas
Tônico-clônicas (Grand mal)
Atônicas
Classificação proposta pela Comissão para Classificação e Terminologia da Liga
Internacional Contra Epilepsia (Commission on Classification and Terminology of the
International League Against Epilepsy, 1989).
Em alguns casos, as síndromes epilépticas podem apresentar causas
bem definidas, ou seja, decorrentes de traumas, distúrbios bioquímicos, lesões
cerebrais, infecções virais, aberrações genéticas (Síndrome de Lennox-
Gastaut); ou criptogênicas sem causa dectável, sendo, neste caso,
denominadas idiopáticas (Engel, 2001). Dentre as diversas síndromes epiléticas
destaca-se a Epilepsia do Lobo Temporal (ELT), reconhecidamente o tipo mais
3
comum de epilepsia em adultos (40% dos casos), sendo de difícil tratamento,
uma vez que 70% dos pacientes tornam-se refratários (De Deyn et al., 1992).
A atividade epileptiforme inicia-se no sistema límbico no lobo temporal;
hipocampo, amigdala e córtex entorrinal, levando a uma crise parcial
complexa (Engel, 1996). Pacientes com ELT freqüentemente relatam
antecedentes clínicos: Status epilepticus (SE), convulsões febris ou trauma,
seguido por um período de alguns anos antes do desencadeamento de crises
parciais complexas recorrentes (François et al., 2006). Uma das hipóteses
vigentes sugere que após a lesão, contatos sinápticos estabelecidos pelo
brotamento de axônios das fibras musgosas remanescentes, induzem uma
excitabilidade anormal do sistema límbico, sobretudo no hipocampo
(Buckmaster et al., 2002). Esta hipótese é corroborada por dados obtidos de
biópsias do tecido nervoso de alguns pacientes com ELT, os quais revelam a
ocorrência de extensa morte celular e brotamento de fibras nervosas no
hipocampo caracterizando um quadro de esclerose hipocampal (Buckmaster
et al., 2002; Ebert et al., 2002; Furtado et al., 2002). Uma vez que a esclerose
hipocampal não é encontrada em todos os pacientes com ELT, o papel destas
lesões no desencadeamento e manutenção desta patologia ainda não foi
estabelecido. Além disto, diversos trabalhos revelam que portadores de ELT,
apresentam déficits funcionais (Hannesson & Corcoran, 2000) dentre os quais:
diminuição da velocidade de processamento de informações, codificação
gráfico-motora, memória de curto e longo prazo e distorções perceptuais
(Rabinovitz et al., 2004).
Na tentativa de entender os mecanismos envolvidos no
desencadeamento e propagação das crises convulsivas, bem como testar
4
compostos com atividade anticonvulsivante, foram desenvolvidos dezenas de
modelos experimentais de epilepsia. Estes podem ser agrupados em modelos
de indução aguda de crises e modelos crônicos (Tabela II).
Tabela II Resumo dos modelos experimentais de epilepsia
Indução aguda Crônicos
Máximo eletrochoque – MEST Pós-Status Epilepticus induzido por
agentes químicos
Injeção de antagonistas de aminoácidos
inibitórios – PTZ, bicuculina, picrotoxina e
estriquinina
Pós-Status Epilepticus induzido por
estímulo elétrico
Injeção de agonistas de aminoácidos
excitatórios – NMDA, KA e AMPA
Abrasamento elétrico
Injeção de metais – Hidróxido de
Alumínio, Cobalto, Sulfato de Zinco
Abrasamento químico
Injeção de toxinas – tetânica Animais geneticamente modificados
Dados extraídos de DeDeyn (1992) e Löscher (2002).
O uso de modelos animais revelou dados importantes sobre as
epilepsias; substratos neuronais envolvidos, recrutamento de áreas,
neurodegeneração e alvos bioquímicos para o tratamento. Desta forma,
foram descobertas várias drogas anticonvulsivantes (DAs) novas, desenhadas
a partir da modificação estrutural de DAs pré-estabelecidas ou a partir do
conhecimento das estruturas neuronais envolvidas no desencadeamento e
manutenção da atividade epileptiforme.
Os modelos de indução aguda de crise são rápidos e popularmente
utilizados em screenings farmacológicos, revelando informações importantes
como: toxicidade motora e doses efetivas. Estes modelos, no entanto, podem
selecionar DAs sem nenhuma atividade antiepileptogênica, ou seja, DAs que
não alteram a progressão da doença, sendo considerados como modelos de
crises agudas ao invés de modelos de epilepsia (Löscher, 2002). Os modelos
5
crônicos, por sua vez, simulam disfunções crônicas do cérebro e fornecem
pistas sobre a progressão das epilepsias, bem como novos alvos de
intervenção farmacológica. A maior dificuldade no desenvolvimento de
drogas anticonvulsivantes é a falta de modelos animais que reproduzam por
completo as síndromes epilépticas humanas. Isto se dá principalmente devido
às diferenças específicas, etiológicas e ontogenéticas entre homens e demais
animais (De Deyn et al., 1992).
Até o momento, o tratamento das epilepsias consiste na administração
diária de DAs, as quais mantêm as crises sob controle em cerca de 75% dos
pacientes (Kohl & Dannhardt, 2001; Czapinski et al., 2005). Nestes casos, as
drogas anticonvulsivantes convencionais mais utilizadas são: fenobarbital,
carbamazepina, fenitoína e ácido valpróico (em 95, 93, 86 e 87% dos países)
(Dua et al., 2006). Nos demais 25% dos pacientes nos quais ocorre falência
terapêutica e subseqüente ocorrência de crises convulsivas, são freqüentes os
casos onde nem os tratamentos mais invasivos, neurocirurgia e estimulação
vagal são eficazes (Ängehagen et al., 2003). Além disso, o tratamento com as
DAs induz nos pacientes uma ampla variedade de efeitos colaterais, impondo
restrições consideráveis ao tratamento crônico e comprometendo a
qualidade de vida destas pessoas. A administração do ácido valpróico nos
primeiros meses de gravidez induz em cerca de 2% dos fetos,
mielomeningocele (spina bifida aperta) deformação decorrente do
fechamento anormal do tubo neural (Nau et al., 1991 in Kohl & Dannhardt,
2001). A vigabatrina, o primeiro medicamento desenvolvido com uma
estratégia racional de pesquisa por DAs (Rho & Sankar, 1999), induz lesões na
matéria branca cerebelar em espécies não-primatas (Kohl & Dannhardt, 2001).
Outros efeitos colaterais incluem sedação, comprometimento cognitivo,
6
letargia, ataxia, desconforto gástrico, diplopia, distúrbios de comportamento,
agranulocitose e interações medicamentosas diversas (Villetti et al., 2001;
Mortari et al., 2007a).
Apesar da quantidade e severidade das reações adversas ao
tratamento, estudos epidemiológicos mostram que em populações sem
tratamento, há uma piora do quadro e um encurtamento dos intervalos entre
as crises (Reynolds, 1987). Além disso, um recente estudo realizado com 2455
pacientes sem tratamento e com diagnóstico recente de epilepsia em áreas
rurais da China mostrou índices de mortalidade 3.9 vezes maior que na
população em geral para pacientes epilépticos tratados. Vale ressaltar que só
foram consideradas mortes associadas diretamente com a doença (Ding et
al., 2006). Apesar de possuir aspectos éticos questionáveis, o estudo recebeu
um comentário na revista The Lancet, segundo o qual estudos como este são
necessários para ressaltar a necessidade de acesso aos tratamentos de baixo
custo existentes em países pobres e em desenvolvimento (Tomson, 2006).
As primeiras DAs surgiram por acaso, ainda no começo do século XX,
quando foram introduzidos os brometos, seguidos dos barbitúricos. O fato de
que ambas as classes de drogas induzem efeitos sedativos muito intensos,
levou a introdução da Fenitoína em 1938 (Tunnicliff, 1996). Estes agentes são
em sua maioria inespecíficos e possuem múltiplos sítios de ação. A maioria das
DAs em uso clínico faz parte desta primeira geração de medicamentos. A
partir da década de 1970, começaram a surgir as drogas de segunda
geração, desenhadas a partir de drogas já existentes, cuja modificação em
suas estruturas visava mais eficiência e menos efeitos colaterais. Durante este
período apareceram as drogas gabamiméticas, as quais foram desenvolvidas
7
através de uma abordagem racional à luz da hipótese de que disfunções no
sistema inibitório estariam crucialmente envolvidas nas disfunções do cérebro
epiléptico (Löscher, 1998).
1.2. Mecanismos básicos da transmissão de informação no cérebro
1.2.1. Neurotransmissões inibitórias: GABA e Glicina
O Sistema Nervoso Central (SNC) funciona através da comunicação
entre neurônios, a qual se torna possível devido ao equilíbrio entre excitação e
inibição das sinapses. Neste sentido, o principal componente do sistema de
neurotransmissão inibitória do SNC é o ácido γ-aminobutírico (GABA), o qual
medeia cerca de 70% das sinapses rápidas no SNC (Andersen et al., 2001;
Beleboni et al., 2004a).
A função inibitória do GABA é exercida por três tipos de receptores: dois
ionotrópicos, GABA
A
e GABA
C
, e um metabotrópico, GABA
B
. O receptor
GABA
A
encontra-se acoplado a canais de íons de Cl
–
no SNC de vertebrados
(Olsen & Avoli, 1997) e junções neuro-musculares de insetos (Wolff & Wingate,
1998). A ligação do GABA aos receptores pós-sinápticos do tipo GABA
B
ativa
indiretamente a canais de íons de K
+
e Ca
2+
por meio de transdutores de
membrana, sendo esta ativação responsável pelo componente tardio do
potencial inibitório pós sináptico (PIPS) (Kerr & Ong, 1996; Higashima et al.,
2000). O receptor GABA
C
é acoplado a canais de íons de Cl
-
,
predominantemente em retinas de vertebrados (Bormann & Feigenspan, 1995;
Wegelius et al., 1998; Enz & Cutting, 1998). Sabe-se que a ativação dos
receptores de GABA
A
induz hiperpolarização da célula pós-sináptica,
8
enquanto a ativação de receptores de GABA
B
altera a liberação de outros
transmissores. Já o receptor GABA
C
tem sido pouco estudado e sua função
permanece questionada devido à localização restrita à retina (Czapinski et al.,
2005).
O GABA é removido da sinapse por difusão ou por transportadores gliais
e neuronais de alta afinidade dependentes de sódio. Dois transportadores,
GAT 1 e 2 são até o momento, os principais candidatos a alvos de
intervenções farmacológicas, devido a sua extensa localização no cérebro
(Dalby, 2003). Na figura 1 encontra-se esquematizado o sistema GABAérgico
com suas estruturas.
Figura 1. Esquematização das sinapses inibitórias GABAérgicas. Estão descritos o
metabolismo do GABA (•), receptores e transportadores neuronais e gliais. AC=
Adenilato ciclase, G
i/0
= Proteínas G i e 0. Modificado de Böhme & Lüddens (2001).
9
Nos últimos 40 anos, a maioria das pesquisas sobre a neurotransmissão
gabaérgica enfatizou o receptor GABA
A
devido ao fato de que a maioria das
drogas de importância clínica atua sobre este receptor (Martin & Dunn, 2002).
Estes estudos resultaram em grandes avanços no entendimento de aspectos
da farmacologia do GABA. Desta forma, a caracterização dos receptores,
transportadores e enzimas ligadas à sua síntese e degradação (GABA
descarboxilase e GABA transaminase, respectivamente) levou ao
desenvolvimento de novos compostos com comprovado potencial
farmacológico (Beleboni et al., 2004a; Iversen, 2004). No entanto, o benefício
destes compostos muitas vezes é também seguido por efeitos colaterais
indesejados (Villetti et al., 2001). Uma alternativa é o desenvolvimento de
drogas que afetam o transporte de GABA, uma vez que elas atuam sobre uma
quantidade de neurotransmissor liberada em condições fisiológicas, apenas
mantendo-o por mais tempo na fenda sináptica (Andersen et al., 2001).
Desde a década de 80 é sabido que inibidores do transporte de GABA
são anticonvulsivantes, tendo sido empregados esforços para desenvolver
análogos dos inibidores mais antigos, como exemplo o ácido nipecótico, o
qual é um dos mais potentes inibidores da captação do GABA in vitro
(Krogsgaard-Larsen & Johnston 1975; Gadea & Lopez-Colome, 2001a;
Schousboe et al., 2004). No entanto, este composto é altamente polar, sendo
incapaz de ultrapassar a barreira hemato-encefálica, tornando-se ineficiente
quando aplicado sistemicamente (Bonina et al., 1999). Na tentativa de alterar
as propriedades de solubilidade deste composto, muitos análogos foram
sintetizados e testados, dentre estes, o ácido (R)-N-(4,4-di-(3-methylthien-2-yl)
but-3-enyl) nipecótico hidrocloreto, tiagabina. Esta é um potente e seletivo
10
inibidor do transportador GAT1 (Suzdak & Jansen, 1995) comercializada em
vários países como droga antiepilética, sendo utilizada no tratamento de
convulsões complexas refratárias e mioclônicas (Dalby & Nielsen, 1997; Dalby,
2000; Kwan et al., 2001) e recentemente indicada também no tratamento
para o transtorno de ansiedade generalizada (Rosenthal, 2003). No Brasil, a
utilização da tiagabina se encontra em fase de aprovação pelo Ministério da
Saúde.
Apesar dos inúmeros benefícios, o uso crônico da tiagabina também
induz efeitos colaterais indesejados, sendo os mais freqüentes; tonturas, dores
de cabeça, tremores, nervosismo, astenia e pensamento anormal (The
National Society for Epilepsy - Reino Unido - www.epilepsynse.org.uk
). Deste
modo, faz-se necessário buscar novos compostos com atividade sobre o
sistema de transportadores GABAérgicos, os quais poderão ser utilizados como
ferramentas farmacológicas e terapêuticas a serem utilizadas para ambos;
pesquisa básica e terapia clínica.
O segundo aminoácido inibitório mais abundante no SNC é a glicina,
que predomina em número de receptores nas regiões do tronco cerebral,
medula espinhal e retina, não obstante estar presente em outras estruturas do
encéfalo. Semelhante ao GABA, a glicina exerce sua atividade inibitória
através da ativação de receptores de alta afinidade com canais intrínsecos
permeáveis a íons de Cl
-
. A ação da glicina está associada a uma série de
processos fisiológicos, dentre os quais se encontram; respostas reflexas,
processamento de sinais sensoriais e sensação de dor (Bregestovski, 2002).
Devido à semelhança estrutural, muitos ligantes reconhecem ambos
receptores de GABA e glicina, ativando-os de modo semelhante. Este é o caso
11
da picrotoxina, que antagoniza receptores de GABA dos tipos A e C, bem
como, receptores de glicina. Contudo, até o momento, poucos ligantes
específicos de glicina foram identificados. O mais conhecido destes ligantes é
o alcalóide estriquinina, antagonista de alta afinidade dos receptores de
glicina que induz crises convulsivas em animais. Acredita-se que injeção de
agonistas glicinérgicos exerça efeitos anticonvulsivantes. No entanto,
nenhuma droga sintetizada até o momento, exerce efeitos exclusivos sobre
estes receptores (Böhme & Luddens, 2001).
1.2.2. Neurotransmissão excitatória: L-Glutamato
Se por um lado a “Hipótese GABAérgica” da epilepsia levou ao
surgimento de DAs desenvolvidas com o propósito de exacerbar a atividade
do GABA, atualmente existe um consenso de que alterações em ambas as
neurotransmissões, excitatória e inibitória, estariam envolvidas no
desencadeamento de processos patológicos do cérebro. Esta premissa levou
ao do desenvolvimento das drogas de última geração com múltiplos sítios de
ação, incluindo estruturas excitatórias glutamatérgicas.
De fato, a ampla maioria das sinapses excitatórias no SNC é mediada
pelo aminoácido L-Glutamato (L-Glu). O efeito excitatório do L-Glu foi
primeiramente relatado em 1952 pela fisiologista japonesa T. Hayashi que
observou que injeção cortical deste aminoácido em cachorros e macacos
provoca crises clônicas.
Atualmente, sabe-se que o L-Glu exerce seu efeito excitatório através
da ativação de três tipos de receptores ionotrópicos acoplados a canais de
12
Na
+
e Ca
2+
; N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-
isoxazolpropionico (AMPA) e ácido caínico, além oito subtipos de receptores
metabotrópicos; m-GluR 1-8 (Fonnum, 1984; Watkins, 2000). Assim como ocorre
para o GABA, a sinalização glutamatérgica é finalizada pela ação de
transportadores de alta afinidade localizados tanto em membranas de
neurônios quanto de astrócitos. Os transportadores de aminoácidos
excitatórios (EAATs) são divididos em cinco classes EAAT 1-5, os quais captam o
L-Glu em processos dependentes de gradiente iônico estabelecido pelos íons
Na
+
e K
+
(Danbolt, 2001; Proper et al., 2002)
A ativação de receptores de L-Glu está envolvida em processos
essenciais para a sobrevivência, dentre os quais se destaca a potencialização
a longo prazo (LTP), crucialmente envolvida com a formação da memória. No
entanto, a super ativação destes receptores pode induzir a hiperpolarização
maciça das células pós-sinápticas e entrada excessiva de íons de Ca
2+
,
levando a um processo denominado excitotoxicidade (Olney et al., 1991;
Sattler & Tymianski, 2000). Desta forma, a ação dos EAATs é crucial para a
manutenção da concentração de L-Glu extracelular por volta de 1
M
(Dingledine et al., 1990). De fato, vários trabalhos demonstram que a
excitotoxicidade mediada pelo L-Glu está envolvida no desencadeamento de
doenças importantes neurodegenerativas, tais como: mal de Alzheimer,
doença de Parkinson, Esclerose Lateral Amiotrófica e a ELT (Meldrum &
Garthwaite, 1990; Meldrum, 1994; Meldrum et al., 1999; Proper et al., 2002).
Na epilepsia, acredita-se que a hiper ativação dos receptores de L-Glu
seja responsável pela iniciação e manutenção da atividade epiléptica. De
fato, Rice & DeLorenzo (1998) demonstraram que a ativação dos receptores
13
de L-Glu é essencial para o desencadeamento das crises recorrentes no
modelo do SE induzido por pilocarpina.
Apesar de aparentemente promissor, o bloqueio da transmissão
glutamatérgica através de antagonistas NMDA ou AMPA/cainato tem falhado
como alternativa terapêutica devido a um conjunto de sérios efeitos adversos
(Moldrich et al., 2003). Desta forma, uma alternativa viável consiste em
desenvolver antagonistas de receptores metabotrópicos, sobretudo mGluR1 e
5 (Moldrich et al., 2003) ou moduladores alostéricos, incluindo aqueles que
atuam sobre o sítio da fenciclidina (PCP) (Bergink et al., 2004).
Outra alternativa, seria o uso de agentes que estimulem a recaptação
do L-Glu liberado (Gadea & Lopez-Colome, 2001b; Bridges & Esslinger, 2005).
Neste sentido, alguns compostos têm sido testados, tais como o (R)-(-)-5-methil-
1-nicotinoil-2-pirazolina (MS-153), o qual estimula o transportador glial EAAT1 e
apresentou atividade neuroprotetora em modelo de isquemia global
(Shimada et al., 1999). Como outro exemplo pode-se citar o riluzole, utilizado
na prática clínica em casos de esclerose amiotrófica lateral, que
primeiramente teve o seu efeito neuroprotetor atribuído à inibição da
liberação de L-Glu. No entanto, Azbill e colaboradores (2000) demonstraram
que este agente atua estimulando a recaptação do L-Glu em neurônios da
medula espinhal. Mais recentemente, Frizzo e colaboradores (2004) relataram
este efeito estimulante também sobre transportadores de astrócitos em
cultura. Estes autores salientaram, no entanto, que em condições de liberação
excessiva do L-Glu, o riluzole pode ser tóxico, aumentando a intensidade e
duração de descargas epileptiformes (Pena & Tapia, 2000; Frizzo et al., 2004).
14
Concluindo, faz-se necessário buscar fontes alternativas de ligantes
glutamatérgicos, que minimizem os efeitos da hiperexcitabilidade do tecido
neural sem induzir reações adversas que, na maioria dos casos, impossibilitam
o paciente de ter uma vida normal.
1.3. O Hipocampo e o modelo de Epilepsia pós Status Epilepticus
O hipocampo é uma estrutura do lobo temporal pertencente ao
sistema límbico e bastante conservada durante o processo evolutivo. Esta
estrutura é divida em duas regiões principais: Corno de Amon, subdividida em
CA1-3 em roedores e CA1-4 em humanos, e giro denteado (GD). Grande
parte da informação do hipocampo flui através de um circuito tri-sináptico.
Neste circuito, a principal via de entrada para o hipocampo é a via perfurante
formada pelos axônios dos neurônios, cujos corpos celulares encontram-se nas
camadas II e III do córtex entorrinal. Os axônios da via perfurante fazem
sinapse com os neurônios das células granulosas do GD, as quais mandam
prolongamentos até as células piramidais da região da CA3 constituindo as
fibras musgosas. Parte dos axônios dos neurônios piramidais da região de CA3
forma as colaterais de Schaffer, as quais fazem sinapse com as células
piramidais da CA1, cujos axônios mandam a informação para o subículo e
para camada V do córtex entorrinal . Outra parte das células piramidais da
CA3 manda informação para o hipocampo contralateral, assim como outras
estruturas do cérebro (Figura 2).
15
Figura 2. Esquematização do fluxo informacional no hipocampo, suas aferências,
eferências e suas regiões. Abreviações: Via perfurante (PP) porção lateral (LPP) e
porção medial (MPP); camadas III/IV do córtex entorrinal; colaterais de Schaffer (SC);
via comissural associativa (AC); cortex entorrinal medial (MEC) e cortex entorrinal
lateral (LEC).
Cerca de 90% das células hipocampais são excitatórias, fazendo parte
desta população as células piramidais da CA1-3, células granulosas do GD e
as fibras musgosas. Apenas 10% das células hipocampais são inibitórias, as
quais são interneurônios localizados, sobretudo, na região do hilus. Devido à
natureza bioquímica de suas células e o arranjo de sua circuitaria, o
hipocampo é uma das estruturas mais vulneráveis aos insultos neurológicos, tais
como: trauma, isquemia e SE (Nadler, 2003; Zhou et al., 2007). Desta forma,
vários estudos descrevem a extensa perda dos neurônios piramidais da CA1,
CA3 e hilus. Interessantemente, os axônios remanescentes destas regiões
crescem e re-estabelecem contatos sinápticos em um processo denominado
brotamento, inicialmente observado no final dos anos 60 pelos pesquisadores
Carl Cotman e Gary Lynch (para revisão veja Cotman & Lynch, 1989). Esta
16
sinaptogênese reativa nunca tinha sido descrita no cérebro adulto de
mamíferos e continua sendo alvo de diversos estudos (Nadler, 2003).
O modelo da Epilepsia pós SE induzido por pilocarpina foi proposto por
Turski em 1983 e continua sendo amplamente utilizado, uma vez que este
modelo reproduz grande parte das alterações morfológicas, fisiológicas e
bioquímicas encontradas em cérebros de pacientes portadores da ELT (Turski
et al., 1983; Mello et al., 1993; Löscher, 2002). Neste modelo a injeção do
agonista colinérgico pilocarpina induz uma crise de longa duração, o SE, que
pode ser interrompido pela administração de barbitúricos ou
benzodiazepínicos. Após o término do SE, os animais entram em uma fase
onde não é observada a ocorrência de crises convulsivas; período latente ou
silencioso. Nesta fase, ocorre morte celular (neurônios e astrócitos), ativação
da micróglia e re-organização sináptica, assim como alterações na
composição das subunidades de receptores e transportadores, sobretudo no
hipocampo (Turski et al., 1983; Mello et al., 1983; Löscher, 2002; D’Ambrosio,
2004; Tang et al., 2005; Kang et al., 2006). O final da fase silenciosa é marcado
pela ocorrência de crises espontâneas e recorrentes, cuja farmacologia difere
do SE inicial (Rice & DeLorenzo, 1998).
Algumas destas alterações não estão restritas ao hipocampo. De fato,
Fujikawa (1996) descreve a morte neuronal em áreas dos córtices piriforme,
entorrinal e fronto-parietal, amígdala, núcleo do septo lateral e substância
negra mesencefálica em um período que varia de 20 minutos a 72 horas após
o SE. Além disso, em um recente estudo foi observado um aumento na
quantidade de receptores no córtex de ratos 15 dias pós-SE, mas não no
hipocampo, enquanto foi observada alteração da afinidade dos receptores
17
de L-Glu no hipocampo, mas não no córtex destes animais (Figura 3) (Cunha
et al., 2007)
18
0 1 2 3 4 5
0
200
400
600
Controle
Pilocarpina
Hipocampo
Glutamato (µM)
Ligação específica (pmol/mg)
0 1 2 3 4 5
0
200
400
600
Córtex
Glutamato (µM)
Ligação Específica (pmol/mg)
Figura 3. Binding do H
3
-L-Glutamato em membranas hipocampais e corticais de ratos
Wistar 15 dias após o SE. Dados estão representados como média de triplicatas ±EPM.
Cunha et al. (2007).
19
Existem três hipóteses para explicar como ocorre a epileptogênese
secundária a um insulto inicial como trauma ou SE na ELT. A primeira hipótese
propõe que após o dano, as fibras musgosas se re-organizam em circuitos
excitatórios anormais, gerando uma hiper excitabilidade do tecido
hipocampal (Nadler et al., 1980). Várias evidências têm sido acumuladas em
favor desta hipótese, mostrando que as fibras musgosas de fato invadem a
camada molecular do GD, uma região que em condições normais, é evitada
por estas fibras (Buckmaster et al., 2002). A segunda hipótese propõe que as
fibras musgosas estabelecem contatos com neurônios inibitórios e neste caso o
brotamento levaria ao re-estabelecimento da atividade elétrica normal
(Sloviter, 1992). A figura 4 esquematiza um provável processo de
epileptogênese secundária levando em consideração que ambas as
hipóteses estejam corretas.
Figura 4. Esquematização da epileptogênese secundária.
20
No entanto, nem todos os pacientes que sofrem insulto inicial
apresentam crises recorrentes e devido a este fato, acredita-se que fatores
internos influenciem a progressão da epileptogênese secundária. Dentre estes
fatores estariam: predisposição genética, anormalidades durante a ontogenia
e ocorrência de um segundo insulto.
O hipocampo é uma estrutura fundamental em diversos processos
fisiológicos adaptativos; movimento, sono, aprendizagem e memória. De fato,
neurônios hipocampais possuem um padrão de disparos próprios; as ondas
teta, as quais são descritas durante episódios de sono REM (do inglês Rapid Eye
Moviment). Fenômenos de plasticidade neuronal, isto é, de re-organização
sináptica, são descritos em várias regiões cérebro, mas, sobretudo no
hipocampo. É através destes fenômenos que ocorrem aumento e diminuição
da eficiência sináptica, através das LTPs e LTDs, respectivamente. Embora os
mecanismos envolvidos nos processo de plasticidade neural não estejam
completamente esclarecidos, sabe-se que eles participam da formação da
memória e na consolidação de processos de aprendizagem. Desta forma, são
necessários estudos que monitorem a função do hipocampo após dano
neuronal, estabelecendo-se os limites entre a plasticidade neuronal
adaptativa e a patológica.
1.5 As neurotoxinas de artrópodos e o desenvolvimento de novas DAs.
A natureza tem funcionado como um laboratório gigantesco ao longo
de milhões de anos de evolução, onde novas moléculas surgem e
desaparecem de acordo com o grau de adaptação que estas conferem as
21
espécies. Neste sentido, animais peçonhentos, incluindo os artrópodos, têm
sido particularmente favorecidos por um arsenal de compostos bioquímicos, os
quais conferem a estes animais uma habilidade única de paralisar e/ou matar
suas presas. Estes compostos, por sua vez, ativam seletivamente estruturas de
diversos sistemas orgânicos das presas, incluindo o sistema nervoso. Quando
inoculadas, as neurotoxinas ativam ou bloqueiam um vasto espectro de
receptores para neurotransmissores inibitórios e/ou excitatórios,
transportadores, enzimas e canais iônicos (Mortari et al., 2007a). Desde a
década de 70, as neurotoxinas de artrópodos têm sido estudadas gerando um
arsenal de compostos bastante heterogêneos do ponto de vista químico e da
atividade biológica (Beleboni et al., 2004b). Entre estes compostos merecem
destaque as neurotoxinas de escorpiões, vespas e aranhas.
As peçonhas de artrópodos atuam sobre diversos sítios nos sistemas
nervosos de insetos e mamíferos, podendo causar uma grande variedade de
efeitos neurológicos (Mortari et al., 2007b). Até o momento foram descritas
algumas dezenas de compostos que atuam sobre canais iônicos como Na
+
, K
+
e Ca
2+
; receptores colinérgicos, glutamatérgicos e nicotínicos, e
transportadores de L-Glu e GABA (Tabela III) (Beleboni et al., 2004b;
Stromgaard & Mellor 2004; Mortari et al., 2007a). Estes compostos são
altamente seletivos e potentes, garantindo a sobrevivência destes animais por
milhões de anos, sendo no momento, alvo de intensas pesquisas na busca por
novas substâncias neuroativas.
Até o momento, poucos compostos isolados de venenos têm sido
colocados na prática clínica. Contudo, com o uso de novas técnicas de
isolamento e síntese de análogos de compostos naturais, é provável que muito
22
em breve uma nova geração de compostos neuroativos esteja à disposição
para ambos; pesquisa básica e desenvolvimento de novas estratégias
terapêuticas.
Tabela III. Compostos anticonvulsivantes isolados de venenos de artrópodos
Compostos ↓ Canais de
Na
+
↓ Canais
de Ca
2+
↑ Nt
inibitória
↓ Nt
excitatória
Não-
conhecid
o
Aranhas
FrPbAII - - SIM -
Jorotoxin-3 - - - SIM
SrTx1.3 - - - SIM
Argiotoxin-636 - - - SIM
AG2 - - - SIM
ω-Agatoxin-IVA
- SIM - -
Vespas - - -
Philanthotoxin-
343
- - - SIM
Philanthotoxin-
433
- - - SIM
*P. occidentalis X
*P. ignobilis - - SIM SIM
Escorpiões
BmK AE SIM - - -
Cll9 SIM - - -
Dados modificados de Mortari e colaboradores (2007). *Referência aos venenos brutos
desnaturados
1.6 A aranha Parawixia bistriata.
A aranha P. bistriata é semi-colonial, distribuindo-se pelos cerrados da
América do Sul (Figura 5). A caracterização dos componentes do veneno
desta aranha começou em nosso laboratório, quando foi observado que a
23
injeção do veneno bruto em térmitas provoca paralisia destes isópteros
(Fontana et al., 2000). A ação paralisante do veneno é essencial para
sobrevivência das aranhas que paralisam suas presas, mantendo-as vivas até
serem embalsamadas e posteriormente utilizadas na sua alimentação
(Usherwood et al., 1994).
Sabe-se que a junção neuromuscular de insetos é predominantemente
composta de sinapses gabaérgicas e glutamatérgicas (Churchill et al., 2003).
Portanto, foi possível prever que os componentes do veneno de P. bistriata
apresentassem efeitos no SNC de ratos e outros mamíferos.
A B
Figura 5. A. Exemplar da aranha P. bistriata. B. Colônia coletada na região de
Mococa, interior do estado de São Paulo (70 Km de Ribeirão Preto). Escala 1:0,5cm (A)
e 1:3,5 cm. Fotografias dos arquivos do Laboratório de Neurobiologia e Peçonhas –
FFCLRP/USP.
Rodrigues e colaboradores (2001) mostraram que o veneno da P.
bistriata é heterogêneo e possui componentes com atividade farmacológica
diversificada. Esses autores demonstraram que a injeção por via i.c.v. do
veneno bruto de P. bistrita causa crises límbicas, cujas alterações
24
comportamentais são bastante distintas daquelas induzidas pela injeção do
agonista glutamatérgico ácido caínico, indicando que os componentes do
veneno atuam em sítios diferentes do ácido caínico, ou há multiplicidade de
sítios de ação dos componentes convulsivantes. Quando desnaturado, o
veneno de P. bistriata diminui a recaptação do GABA em sinaptossomas de
cérebro corticais de ratos, além de bloquear crises generalizadas tônico-
clônicas induzidas pelos antagonistas gabaérgicos bicuculina, picrotoxina e
pentilenotetrazol (PTZ), quando injetados por via intracerebroventricular (i.c.v.)
em ratos Wistar (Cairrão et al., 2002).
Diversas toxinas foram identificadas do veneno de P. bistriata, como a
inosina que apresenta efeito paralisante sobre insetos e pró-convulsivante em
ratos (Rodrigues et al., 2004) e o composto Parawixina I, o qual estimula a
recaptação de L-Glu em sinaptossomas cérebro corticais de ratos, além de
atuar como neuroprotetor em modelo de lesão da retina de ratos (Fontana et
al., 2003). Um mecanismo de ação inédito para compostos isolados de veneno
foi descrito para a Parawixina I, a qual aumenta seletivamente o influxo de L-
Glu por transportadores de EET2 em liposomas reconstituídos e células COS
(Fontana et al., 2007). Segundo Torres-Salazar & Fahlke (2007) a seletividade e
especificidade da Parawixina I faz com que esta molécula possa ser
considerada como um ponto de partida para síntese de novas drogas a serem
utilizadas como terapia em patologias que envolvem alterações no sistema
glutamatérgico.
Outro composto isolado a FrPbAII, apresenta seletivamente um potente
efeito inibitório sobre a recaptação do GABA e da glicina, além de ser
anticonvulsivante contra crises agudas induzidas pela bicuculina (Cairrão et
25
al., 2002), picrotoxina, pilocarpina, ácido caínico e PTZ, sem induzir toxicidade
motora na dose efetiva (Gelfuso et al., 2007). Além disso, Liberato e
colaboradores (2006) demonstraram que a FrPbAII injetada da substância
negra do mesencéfalo bloqueia crises induzidas pela estimulação da Area
tempestas do córtex piriforme e apresenta efeito ansiolítico quando injetada
no hipocampo dorsal de ratos.
Mais tarde, a estrutura química deste composto foi elucidada
juntamente com parte do seu mecanismo de ação. Foi demonstrado que a
FrPbAII inibe a captação de alta afinidade de GABA e glicina sem alterar a
atividade dos canais de íons de Na
+
, K
+
e Ca
2+
, dos receptores de GABA, da
GABA transaminase ou sobre o transporte reverso deste neurotransmissor. Além
disso, quando injetada por via endovenosa, em ratos Wistar, a FrPbAII
apresentou efeito neuroprotetor nas camadas nuclear interna e nuclear
externa da retina após lesão causada por isquemia e isquemia/reperfusão
(Beleboni et al., 2006). Recentemente, foi constatado que a injeção intra-vítreo
deste composto protege de maneira dose dependente todas as camadas
retinianas de ratos, após isquemia e isquemia seguida de reperfusão. Neste
mesmo paradigma quando comparada ao ácido nipecótico, observou-se
que a FrPbAII é cerca de 100 vezes mais potente que este inibidor específico
do transportador de GABA GAT1 (Dados não publicados).
Apesar de encorajadores, os resultados obtidos com o estudo dos
compostos de baixo peso molecular do veneno da aranha P. bistriata, são
preliminares. Por outro lado, apenas uma pequena parte destes compostos foi
avaliada até agora.
26
Em conclusão, se faz necessário investigar o potencial terapêutico dos
compostos presentes já isolados bem como aqueles ainda não identificados
na peçonha de P. bistriata. Estes estudos podem fornecer novas alternativas
para prospecção de drogas neuroativas, bem como novas ferramentas para
investigação de processos patológicos.
Objetivos
23
2. Objetivos Gerais
Tendo em vista as potencialidades farmacológicas do composto FrPbAII
como inibidor do transporte de GABA e glicina, bem como da grande
necessidade de buscar novas alternativas de substâncias neuroativas, os
objetivos do presente trabalho foram:
• Analisar a atividade neuroprotetora do composto FrPbAII, após a
indução de SE pela injeção intra-hipocampal de pilocarpina,
comparando-se às drogas: diazepam, fenitoína, carbamazepina,
cetamina e ácido nipecótico.
Para tanto,
1. Foi avaliada a atividade neuroprotetora do composto durante a
fase inicial da epileptogênese, no período de 15 dias após a
indução do SE, neste caso, foram utilizados histologia com coloração
por HE e/ou violeta de cresila para contagem de células, bem como
o marcador astrocítico GFAP.
2. Foi avaliado o aspecto funcional do hipocampo submetido ao SE,
duas semanas após as crises, no teste de memória espacial
utilizando-se o labirinto aquático de Morris.
3. Foi avaliada a ocorrência de crises espontâneas durante o período
experimental através de janelas de observação.
24
Material e Métodos
24
3. Material e Métodos
Todos os protocolos experimentais envolvendo animais foram
estabelecidos conforme as diretrizes para o uso de animais em pesquisa
segundo o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Este
trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais (CEUA) do
Campus de Ribeirão Preto (Protocolo nº 06.1.605.53.8).
3.1 Coleta das aranhas, purificação de veneno e isolamento da FrPbAII
3.1.1. Coleta da aranha Parawixia bistriata
As coletas dos espécimes foram realizadas no perímetro rural de
municípios vizinhos a Ribeirão Preto (SP). A ulterior extração de glândulas foi
realizada com auxilio de pinça e tesoura oftálmicas, sendo o material
armazenado a –70
o
C até posterior utilização.
3.1.2. Purificação do composto FrPbAII
Quatro mil e quinhentas glândulas de peçonha foram maceradas e
homogeneizadas, formando um extrato, ao qual foram adicionados 100 µL de
água Milli Q. A suspensão foi centrifugada por 20 min a 10.000 xg, a 4
o
C
(Centrífuga Sorvall RC2-B, rotor SS-34). O sobrenadante foi filtrado em filtro de
13 mm de diâmetro, com membrana PVDF de 0,45 µm de poro (Millipore) e em
seguida filtrado novamente em filtro Microcon (cutoff= 3000 Da, Millipore).
Finalmente o extrato contendo apenas compostos de baixa massa molecular
foi liofilizado, pesado e ressuspendido em água Milli Q.
25
3.1.3. Etapas de isolamento em Cromatografia Liquida de Alta Eficiência
(CLAE)
As preparações das amostras a serem injetadas no cromatógrafo
líquido foram realizadas a partir de extratos contendo 1000 glândulas de
peçonha. Na primeira fase de purificação, o extrato liofilizado foi
ressuspendido em 1 mL de água. A fração ativa foi obtida por CLAE de acordo
com Beleboni et al. (2006) com modificações.
Para o processo de separação foram escolhidas como fases móveis,
água Milli Q, pH = 5.5 (Fase A) e acetonitrila (ACN) (MERCK grau CLAE) (Fase B)
utilizando-se uma coluna de fase reversa (C18 ODS, 15 µm, 20 x 250 mm
Phenomenex, Torrence). Após equilíbrio, 2.0 mL da peçonha (40 mg/mL) foram
aplicados para cada cromatografia. A eluição foi feita com ACN e TFA por um
gradiente isocrático de 1% ACN/água + TFA 0,1% por 10 minutos, seguido de
gradiente linear de 2-60% de ACN/água + TFA 0,1% por 50 min. O fluxo
empregado foi de 8 mL/min e o eluato monitorado a 215 nm. As frações foram
coletadas, liofilizadas, pesadas e monitoradas em espectrômetro de massa. A
fração ativa foi então submetida à segunda etapa de purificação, como
segue.
Setenta microlitros da fração FrPbAI (1,37 mg/mL) foram filtrados em
membrana PVDF (0,45 µm) e aplicados em cada uma das cromatografias
realizadas. Para o processo utilizou-se de uma coluna analítica do tipo Shim-
pack CLC-C8 (M) (4,6 x 250 mm, 5 µm), com pré-coluna LC, Shim-pack, CLC G-
C8 (4 x 10 mm) em modo isocrático com H
2
O/Metanol/TFA (99:1:0,1) (MERCK,
grau CLAE) por 8 min. O fluxo empregado foi de 1 mL/min e a detecção dos
26
picos em 215 nm. Ao final foram obtidas cinco frações, as quais foram
liofilizadas e armazenadas a – 20
0
C para os experimentos posteriores.
3.1.4. Espectrometria de massa
A determinação do grau de pureza da fração que continha a FrPbAII
foi realizada em um espectômetro de massa de alta resolução (UltrOTOF -
Bruker Daltonics, Billerica, USA). As frações da segunda cromatografia foram
injetadas utilizando-se uma micro-seringa acoplada a uma bomba de infusão
por um fluxo de 10 kL/min. O intervalo da varredura foi de m/z 50-2000 Quattro-
LC da Micromass (Manchester, UK). Uma vez constatada a pureza do
composto, este foi ressuspendido em salina 0.9% para a realização dos ensaios
biológicos (Figura 6).
27
Figura 6. Fluxograma ilustrando as etapas experimentais para obtenção do composto
FrPbAII. Fotografias dos arquivos do Laboratório de Neurobiologia e Peçonhas –
FFCLRP/USP.
A primeira etapa de isolamento e espectrometria de massa foi realizada no
laboratório do Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes (FCFRP-USP). A segunda etapa
de isolamento foi realizada no laboratório do Prof. Dr. René de Oliveira
Beleboni (Biotecnologia – UNAERP).
3.2. Bioensaios
3.2.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos (200 a 250 g), adquiridos no Biotério
Central da Universidade de São Paulo, Campus de Ribeirão Preto, os quais
foram acondicionados dois a dois em gaiolas e mantidos em biotério de
manutenção do Departamento de Biologia com ciclo claro/escuro de 12/12hs
(luzes às 7:00), temperatura (25 °C) e umidade (55%) controladas. Foram
oferecidas água e alimentação ad libitum.
3.2.2. Cirurgia
Os ratos (n=6-15, por grupo) foram anestesiados com tiopental sódico
(40 mg/kg, intraperitoneal) para a implantação de uma cânula guia no
hipocampo dorsal (CA1) e outra no ventrículo lateral direito. Foi utilizado um
estereotáxico (Stoelting-Standard), sendo que a introdução das cânulas seguiu
as coordenadas do hipocampo dorsal (AP: -3.8 mm; ML: -1.6 mm e DV: -2.8
mm) e ventrículo lateral (AP: -0.9 mm; ML: - 2.0 mm e DV: -3.4 mm) de acordo
com Paxinos & Watson (1986). As duas cânulas e dois parafusos foram fixados
aos crânios dos animais com acrilato dental. Após a polimerização do
28
cimento, as cânulas foram seladas com fio de aço inoxidável evitando
obstrução das mesmas.
3.2.3. Drogas
Para indução de crises foi utilizado hidrocloreto de pilocarpina (Sigma)
injetado por via intrahipocampal. Para o tratamento subcrônico, foram
utilizados: diazepam (Sanofi-sinthelabo), fenitoína (Hidantal - Hoechst Marion
Roussel), carbamazepina (Tegretol - Novartis Biociências), cetamina (Ketalar
– Parke Davis Warner Lambert) sendo estes últimos injetados por via
intraperitoneal (i.p.).e ácido nipecótico (Sigma-Aldrich-EUA) injetado por via
i.c.v.
3.2.4. Indução do SE.
Após 5-7 dias da cirurgia, os animais foram injetados por via
intrahipocampal com pilocarpina (2.4 mg/µL) sendo, então, observada a
latência para o início do SE. Três horas após o início das crises, o SE foi
interrompido pela injeção i.p. de tiopental sódico (30mg/kg). Os animais que
não apresentaram SE foram descartados do estudo.
O critério de definição do SE se baseia na tabela de classificação de
crises límbicas de Racine (1972) (Tabela IV).
29
Tabela IV. Critérios comportamentais para classificação das crises límbicas.
Classe Comportamentos
1 Movimentos orofaciais, piscar de olhos
2 Mioclonia de cabeça e/ou movimentos clônicos faciais severos
3 Mioclonia dos membros anteriores
4 Convulsões clônicas dos membros anteriores com elevação
5 Convulsões tônico-clônicas generalizadas associadas à perda do
controle postural
Modificado de Racine e colaboradores (1972).
Uma hora após a interrupção do SE, os animais foram tratados com
salina, cetamina (CET, 50 mg/kg, i.p.), diazepam (DZP, 2 mg/kg, i.p.),
carbamazepina (CBZ, 120 mg/kg, i.p.) e fenitoína (FEN, 60 mg/kg, i.p.), ácido
nipecótico (Ác NIPE, 4 µg/µL, 3 µL) ou diferentes doses da FrPbAII (0.037; 0.074;
0.15 µg/µL, 1 µL) sendo, estes tratamentos, mantidos por quatro dias no mesmo
horário. O tratamento foi interrompido dois dias antes do início do teste no
labirinto aquático de Morris.
Durante o mesmo período de tempo, ratos não submetidos ao SE (n=5-6
por grupo) receberam os mesmos tratamentos, sendo subseqüentemente
testados no labirinto aquático, descartando-se a hipótese de efeitos colaterais
das próprias drogas.
Os ratos submetidos ao SE foram filmados em 8 períodos de uma hora
por dia escolhidos aleatoriamente, por todo período experimental para
verificação da incidência de crises recorrentes. Os animais que apresentaram
crises durante o teste cognitivo foram descartados deste teste, evitando-se
30
efeito das crises sobre o experimento. No entanto, os animais submetidos ao
labirinto aquático foram observados após o teste para incidência de crises.
3.2.5. Ensaios comportamentais no labirinto Aquático de Morris
Duas semanas após indução do SE, os animais foram submetidos ao
teste do labirinto aquático de Morris (Morris et al., 1982). Este se constitui de
uma piscina circular em polietileno azul (1.40 cm de diâmetro e 50 cm de
profundidade) onde foi acrescentada água (23 °C) até uma altura de 25 cm e
2000 mL de leite impedindo a visão da plataforma. Uma plataforma branca de
9 cm de diâmetro foi localizada no quadrante na região sudeste. Referências
visuais foram colocadas nas paredes da sala onde se encontra o labirinto
aquático (Figura 7).
Figura 7. Labirinto aquático de Morris. Piscina com plataforma no quadrante de
número 1, com pistas visuais nas paredes da sala. Adaptado do site
http://www.btc.bol.ucla.edu
.
31
Foram feitos 6 treinamentos por dia por quatro dias consecutivos, sendo
registradas as latências de escape até a plataforma. Os ratos foram
colocados em posições diferentes nas laterais da piscina para cada sessão de
treinamento, de costas para a plataforma e deixados por 90 segundos ou até
o encontro da mesma. Caso o animal não conseguisse achar a plataforma
este foi colocado e mantido na mesma por 30 segundos, após os quais foi
novamente colocado na água na posição subseqüente (Tabela V).
Tabela V. Protocolo experimental no labirinto aquático de Morris.
Ordem das tentativas
Dias 1
a
2
a
3
a
4
a
5
a
6
a
1 2 4 3 4 2 3
2 4 2 3 4 2 6
3 4 3 2 4 3 2
4 3 2 4 2 3 4
Número do quadrante do labirinto para o posicionamento dos animais de acordo
com cada tentativa.
No quarto dia, ao final do treinamento, a plataforma foi retirada da
água para realização do probe trial. O teste consiste de determinar a
ocupação do labirinto pelo animal, verificando quanto tempo este passa em
cada quadrante, na ausência da plataforma. O percurso dos animais foi
traçado manualmente.
32
3.3. Procedimentos histológicos
Após o término dos experimentos, os animais receberam uma overdose
de tiopental sódico, sendo perfundidos intracardiamente através do ventrículo
esquerdo. O sangue foi lavado com solução salina a 0,9% (40 mL a 4ûC), e em
seguida foram perfundidos 200 mL de formaldeído a 4% (tampão fosfato 0,5 M;
pH 7.4, gelado) por 15 min a uma pressão de 50 mmHg. Os cérebros foram
extraídos sendo desconectados do cerebelo e bulbos olfatórios e fixados em
solução de formaldeído a 4% por 12 horas. Os cérebros dos animais dos grupos
controles (drogas antiepilépticas, pilocarpina e salina) foram então submetidos
a uma bateria de desidratação para inclusão em parafina. Os blocos foram
então seccionados em cortes de 10 µm em um micrótomo Spencer 820”
(American Optical Corporation, EUA) para procedimento de coloração por
HE.
Os cérebros dos animais tratados com o ácido nipecótico, a FrPbAII,
salina e pilocarpina sem pós-tratamento foram colocados em solução de
sacarose a 30% (tampão fosfato 0.1M) por 48 horas após fixação em
formaldeído. O excesso de tecido adjacente ao hipocampo foi retirado e os
tecidos a serem examinados foram imersos em 2-metilbutano (Sigma-Aldrich,
EUA), congelados em gelo seco por 30 min, cobertos por Tissue Tek e então
cortados em secções seriadas de 50 µm de espessura utilizando-se um
criostato (Leica, Alemanha). Cortes foram montados em lâminas gelatinizadas
sendo então submetidos à coloração por cresil violeta.
33
3.4. Imunofluorescência
3.4.1. Secções em parafina
Os cortes em parafina foram submetidos à desparafinização e re-
hidratação (xilol I e II; seguidos de álcool+xilol; álcool absoluto I e II; álcool a 95,
90, 80 e 70%; água ultrapura e tampão PBS 0.05M, pH 7.6 com BSA a 1%). Os
cortes foram colocados em solução de PBS com BSA a 2% e Triton-X a 0.5%,
para o 1º bloqueio de ligações inespecíficas por 30 min em temperatura
ambiente. A seguir, os cortes foram mergulhados em solução de PBS com BSA
a 1% e Triton-X a 0.1% e deixados em geladeira (aproximadamente 4
o
C) até o
dia seguinte (2º bloqueio).
No dia seguinte, os cortes foram trazidos a temperatura ambiente e
incubados com o anticorpo primário anti-GFAP (Dako, EUA) diluído (1:500) na
mesma solução do 1º bloqueio por duas horas à 37
o
C. Em seguida, os cortes
foram lavados com PBS por 6 vezes de 5 min cada, quando foram então
incubados com o anticorpo secundário. Para tanto, o anticorpo secundário
anti-IgG de camundongo com FITC (Dako, USA) foi diluído (1:200) em solução
utilizada no 2º bloqueio, sendo aplicado aos cortes recém-lavados em PBS. O
tempo de incubação com o anticorpo secundário foi 1 hora em temperatura
de 37
o
C. Ao término do tempo de incubação, os cortes foram lavados em
tampão por 3 vezes de 10 min, sendo as lâminas montadas em solução
etanólica de glicerol a 50%.
34
3.4.2. Secções congeladas
Um dia após o corte, as lâminas mantidas em geladeira foram trazidas à
temperatura ambiente para imunomarcação. A técnica de
imunofluroescência utilizada, se inicia com uma lavagem dos cortes em
solução PBS (0.05 M, pH 7.6) por duas horas, sendo a solução trocada e os
cortes mantidos em PBS até o dia seguinte em geladeira.
No dia seguinte, os cortes foram lavados em solução PBS e depois em
PBS com glicina (0.1 M) por 3 min.O próximo passo consiste em bloquear as
ligações inespecíficas utilizando-se solução de BSA a 1% por 30 min à 37
o
C. Os
cortes são então incubados com anticorpo primário anti-GFAP, diluído (6:1000)
em solução PBS com BSA a 1% por 2 hs a 37
o
C. Ao término deste período, os
cortes foram incubados com o anticorpo secundário previamente diluído em
PBS (20:1000) centrifugado a 10000g, a 4
o
C, por 10 min. Nesta etapa, o tempo
de incubação foi de 30 min a 37
o
C, ao término do qual, os cortes foram
lavados em solução PBS por 6 vezes de 5 min. As lâminas foram montadas com
solução etanólica de glicerol 50%. Para ambos os protocolos, todo o manuseio
do anticorpo secundário fluorescente foi feito em escuro, evitando-se
exposição à luz.
3.5. Análise do Dano Neuronal
3.5.1. Análise Qualitativa, Quantitativa e imunofluorecência.
Para cada animal de cada grupo foram selecionados três cortes da
formação hipocampal. Foram capturadas, em cada um dos cortes
selecionados, imagens de toda a extensão da camada de células piramidais
35
das regiões CA1 e CA3 e da camada de células granulares do GD. Deve-se
salientar que os cortes selecionados encontravam-se nas mesmas
coordenadas estereotáxicas (que variaram de -3,14 mm a -4,52 mm, a partir
do bregma), segundo Paxinos e Watson (1986).
O procedimento de captura de imagem foi realizado utilizando-se um
sistema constituído por uma câmera digital colorida da Leica (DFC300 FX)
conectada a um microscópio (DM 5000 B, Leica Microsytems – Alemanha) e a
um computador. As imagens obtidas foram capturadas utilizando uma
objetiva com aumento de 40x e foram obtidas em média seis imagens de
cada região selecionada.
Para análise histopatológica qualitativa, observou-se a presença de
traços histológicos correspondentes a lesão neuronal: edema extracelular,
vacuolização, núcleos picnóticos e grau de desorganização das camadas
piramidais da CA1 e CA 3 e camada granular do GD.
Os neurônios viáveis foram contados manualmente por meio de seleção
feita com ou auxilio do software Q-Win (Leica Microsytems – Alemanha). Este
programa também foi utilizado para medir as áreas analisadas. O número
estimado de células viáveis (n) foi determinado pela média dos valores de três
secções adjacentes. O número real de células foi calculado utilizando-se o
método de correção de Abercrombie (1949):
N (por mm
2
) = n [T/(T+D)] /A
onde N é o número real de células, T é a espessura da secção (10 ou 50 µm), D
é o diâmetro médio de cada núcleo na população da amostra, o qual foi
36
medido em uma ampliação de 1000X; e A é área medida (em mm
2
) de cada
região hipocampal. Os valores obtidos foram expressos como a média das
densidades (neurônios/mm
2
± E.P.M) (Kwak et al., 2005).
A imunofluorescência foi analisada de foram subjetiva, considerando-se
o aspecto das células marcadas e grau de marcação dos prolongamentos e
corpo celular.
Na figura 8 temos um resumo das etapas do bioensaio conduzido no
presente trabalho, bem como o tempo duração de cada etapa.
3.6. Análise estatística
As contagens de células para cada área foram submetidas ao teste de
análise de variância de uma via (ANOVA), seguido pelo pós-teste de Tukey. Os
dados do labirinto aquático de Morris foram analisados através do teste de
ANOVA de medidas repetitivas, seguido do pós-teste de Tukey. As freqüências
de animais que apresentaram crises recorrentes em cada grupo foram
comparadas utilizando-se o teste de qui-quadrado. Todos estes dados foram
demonstrados como média ± EPM e as análises foram feitas utilizando-se o
programa SPSS, versão 13.0 (EUA, 2004).
37
Figura 8. Fluxograma mostrando as etapas da parte experimental do trabalho. Cirurgia
extereotáxica para o implante de cânula no Hipocampo; indução do SE; teste
cognitivo e secção histológica do hipocampo. Fotografias dos arquivos do Laboratório
de Neurobiologia e Peçonhas – FFCLRP/USP.
Resultados
36
4. Resultados
4.1. Purificação do composto FrPbAII
Após equilíbrio do sistema de CLAE, 1 mL da solução de peçonha bruta
(40 mg/mL) foi filtrado (cutoff <3000Da) e aplicado em coluna de fase reversa
preparativa (C18). O perfil cromatográfico obtido revelou a presença de 12
frações, os quais foram monitorados em espectrômetro de massa. A fração
assinalada (FrPbAI), contendo o composto FrPbAII foi então recromatografada
(Figura 9A).
A segunda etapa de isolamento revelou 4 picos (Figura 9B), os quais
foram injetados novamente em espectrômetro de massa para detecção da
localização e pureza do composto FrPbAII.
37
Figura 9. A. Perfil cromatográfico do veneno de P. bistriata com componentes com
massas moleculares menores que 3000 Da. Cromatografia em coluna C-18 preparativa
com gradiente linear de 0-1% de B por 10min e 1-60% de B por 50 min. Os picos estão
numerados sendo o pico correspondente a fração ativa o de número 1 (FrPbAI). B.
Perfil cromatográfico da recromatografia da fração FrPbAI. Coluna de fase reversa
CLC-C8 (M) (4,6 x 250 mm, 5 µm) e pré-coluna C8 (4 x 10 mm), em modo isocrático
H
2
O/MeOH/TFA (99/01/0,1% v/v). Fluxo de eluição: 8,0 e 1,0 mL/min, para 1ª e 2ª etapas
monitoramento à 215 nm. * Representa FrPbAII.
38
4.2. Espectrometria de massa de alta resolução
O espectro de ESI-MS do composto FrPbAII mostrou alto grau de pureza,
contendo um pico com m/z 175,1258 Da (M+H
+
) (Figura 10). A estrutura
primária do composto foi, então, proposta com base em ressonância
magnética.
Figura 10. Perfil de espectrometria de massa de alta resolução do composto FrPbAII
com sua estrutura, inferida por ressonância, mostrada no alto da figura.
39
4.3. O SE induzido por pilocarpina e o tratamento
Aproximadamente 30 minutos após a injeção de pilocarpina por via
intra-hipocampal, cerca de 70% dos animais apresentaram convulsões
epilépticas. Os primeiros sinais consistiram de automatismos orofaciais,
acinesia, mioclonias localizadas e tremores no corpo. Este quadro evoluiu para
hipersalivação, mioclonias generalizadas, elevação e queda límbica (Classe 5
de Racine). Além disso, alguns animais apresentaram corridas e pulos (Figura
11 A-D).
Na maioria dos animais as crises foram revertidas 3 horas após o início
do SE com a aplicação de tiopental e em um pequeno número de animais as
crises foram revertidas espontaneamente. No caso de reversão espontânea
do SE, optou-se pela exclusão dos animais, evitando-se resultados falsos
positivos.
Com relação ao tratamento, não foram observadas reações adversas
severas após a administração das drogas, com exceção da cetamina que
induziu nos animais uma marcante depressão respiratória freqüentemente
acompanhada de ataxia.
40
Figura 11. Efeitos comportamentais da injeção por via intrahipocampal do agonista
colinérgico pilocarpina. (A) Observa-se um animal com acinesia inicial, cerca de 15
minutos após a injeção de pilocarpina. Este quadro é seguido de mioclonias
localizadas, principalmente dos membros anteriores (B). A seguir, pode-se observar
elevação e queda límbica (C) acompanhada freqüentemente por hipersalivação (D).
41
4.4. Labirinto Aquático de Morris
Após os 4 dias de treinamento, os animais epilépticos submetidos ao
teste do labirinto aquático de Morris apresentaram dificuldade em encontrar a
plataforma de escape. Na figura 12 podem ser observadas as trajetórias que
animais sadios e epilépticos percorrem após algumas sessões de treinamento.
No caso de animais sadios foram necessárias em média 4 sessões de treino
enquanto para os animais epilépticos 24 sessões não foram suficientes para
diminuir a latência de escape para plataforma. É interessante ressaltar que, a
maioria dos animais epilépticos nada junto à parede da piscina durante todas
as sessões de teste.
A B
Figura 12: Trajetórias desenvolvidas pelos animais no labirinto aquático de Morris. A.
Animais sadios. B. Animais epilépticos 7 dias após o SE após algumas sessões de treino;
4 sessões para os animais sadios e 4 dias de treino para os epilépticos. Trajetos
traçados manualmente e digitalizados.
Neste sentido, o teste de ANOVA de
medidas repetitivas revelou
diferenças estatisticamente significantes com relação ao parâmetro sessões
de treino [F(3,49) = 46.529 p<0.001] e tratamento [F(10,53) = 10.620 p<0.001],
42
bem como a relação à interação treino versus tratamento [F(27,143) = 1.681
p=0.028].
As análises de ANOVA de uma via realizadas para cada dia de treino
revelaram que no primeiro dia, os animais epilépticos tratados com salina,
fenitoína e FrPbAII (0.037 µg/µL), tiveram suas latências de escape
estatisticamente maiores que as latências dos animais não operados e
injetados com salina [F(10,53)=5.853; p=0.002). Os mesmos resultados foram
encontrados para o segundo dia de treino. Além disso, foi observada uma
diminuição nas latências de escape dos animais epilépticos pós-tratados com
diazepam e ácido nipecótico em comparação com os animais epilépticos
pós-tratados com salina [F(10,53)=6.788; p<0.001).
No terceiro dia, observou-se uma diminuição na latência de escape dos
animais epilépticos tratados com diazepam, carbamazepina, ácido
nipecótico e FrPbAII (0,15µg/µL). Estes animais encontraram a plataforma tão
rapidamente quanto os animais não epilépticos ou não operados, em
contraste com os ratos epilépticos não tratados assim como os animais
tratados com a menor dose da FrPbAII [F(10,53)= 5.853; p=0<0.0001]. No quarto
dia de treino, verificou-se que as médias das latências de escape para os
animais epilépticos tratados com a FrPbAII nas doses 0.15 e 0.075 µg/µL, assim
como os animais pós-SE tratados com diazepam, ácido nipecótico e
carbamazepina foram estatisticamente menores que as médias dos animais
epilépticos sem tratamento e tratados com a menor dose da FrPbAII [F(10,53)=
8.607; p<0,0001]. As latências de escape observadas durante os dias de
treinamento de todos os tratamentos estão sumarizadas nas figuras 13 e 14.
43
Figura 13: Médias (±EPM) das latências de escape para encontrar a plataforma
durante o 1º e 2º. dias de treinamento no labirinto aquático de Morris. No gráfico
estão representados como controles sadios: os animais do grupo não operado (sham)
(a), animais não submetidos ao SE injetados com salina (canulados) (b). Ainda, animais
submetidos ao SE e pós-tratados com salina (SE+Salina)(c), diazepam (SE+DZP),
carbamazepina (SE+CBZ), fenitoína (SE+FEN), cetamina (SE+CET), ácido nipecótico
(SE+Ác NIPE) e FrPbAII 0.15; 0.075 e 0.037 µg/µL. Dados foram analisados pelo teste de
MANOVA, seguido de ANOVAs de uma via para cada dia de teste. Foi utilizado o teste
de Tukey como pós-tese. *p<0.05.
44
Figura 14:
Médias (±EPM) das latências de escape para encontrar a plataforma
durante o 3º. e 4º. dias de treinamento no labirinto aquático de Morris. No gráfico
estão representados como controles sadios: os animais do grupo não operado (sham)
(a), animais não submetidos ao SE injetados com salina (canulados) (b). Ainda, animais
submetidos ao SE e pós-tratados com salina (SE+Salina)(c), diazepam (SE+DZP),
carbamazepina (SE+CBZ), fenitoína (SE+FEN), cetamina (SE+CET), ácido nipecótico
(SE+Ác NIPE) e FrPbAII 0.15; 0.075 e 0.037 µg/µL. Dados foram analisados pelo teste de
MANOVA, seguido de ANOVAs de uma via para cada dia de teste. Foi utilizado o teste
de Tukey como pós-tese. *p<0.05 e **p<0.01..
45
Durante o probe trial com a plataforma retirada, latências de escape
dos ratos epilépticos tratados com salina diferiram estatisticamente das
latências daqueles dos grupos sham e injetados com salina, bem como as dos
animais epilépticos tratados com o diazepam, ácido nipecótico,
carbamazepina e a dose mais alta da FrPbAII (0.15 µg/µL) [F(10,53)=3,936, p=
0.0008] (Figura 15).
Figura 15: Médias (±EPM) das latências de escape para encontrar a plataforma
durante o probe trial no labirinto aquático de Morris. No gráfico estão representados
como controles sadios: os animais do grupo não operado (sham) (a), animais não
submetidos ao SE injetados com salina (canulados) (b). Ainda, animais submetidos ao
SE e pós-tratados com salina (SE+Salina)(c), diazepam (SE+DZP), carbamazepina
(SE+CBZ), fenitoína (SE+FEN), cetamina (SE+CET), ácido nipecótico (SE+Ác NIPE) e
FrPbAII 0.15; 0.075 e 0.037 µg/µL. Dados foram analisados pelo teste de ANOVAs de
uma via, sendo utilizado o teste de Tukey como pós-tese. *p<0.05,**p<0.01 e
***p<0.001.
46
Para descartar possíveis efeitos das próprias drogas sobre o
desempenho dos animais, grupos de animais sadios foram tratados com cada
uma das drogas de acordo com o mesmo protocolo experimental. Neste
sentido, o teste de MANOVA revelou um forte efeito das sessões de treino
[F(3,21)=60,314 p<0.0001], mas não apontou diferenças entre tratamentos
[F(5,29)= 1,613 p=0,205], nem em relação a interação treino vs tratamento
[F(12,69)=0,844 p=0.606] (figura 16)
Figura 16: Médias (±EPM) das latências de escape para encontrar a plataforma
durante os quatro dias de treino no labirinto aquático de Morris dos animais controles
injetados com diazepam (DZP), cetamina (CET), carbamazepina (CBZ), fenitoína (FEN),
ácido nipecótico (Ác NIPE) e FrPbAII 0.15 µg/µL (Fr0,15). Dados foram analisados pelo
teste de ANOVA de medidas repetitivas.
47
Considerando-se a retenção espacial, animais epiléticos tratados pós-SE
com salina permaneceram o mesmo tempo nos quatro quadrantes da piscina,
enquanto os animais dos grupos sham e injetado com salina, apresentaram
preferência pelo quadrante onde se encontrava a plataforma. Desta forma, o
teste de ANOVA de medidas repetitivas revelou efeito significativo da escolha
do quadrante [F(3,49)= 38.401 p<0.001], dos tratamentos [F(10,53)= 5.092,
p<0.05] e da interação quadrante versus tratamento [F(27,143)= 2.208,
p=0.003]. Os pós-testes indicaram que os animais não operados, injetados com
salina assim como os animais tratados pós-SE com o diazepam e com a dose
mais alta da FrPbAII passaram mais tempo no quadrante alvo do que os
demais grupos de animais [F(10,53)= 4.336, p<0.05].
Figura 17: Médias (±EPM) dos tempos de permanência dos animais no quadrante-alvo
(plataforma). No gráfico estão representados como controles sadios: os animais do
grupo não operado (sham) (a), animais não submetidos ao SE injetados com salina
(canulados) (b). Ainda, animais submetidos ao SE e pós-tratados com salina
(SE+Salina)(c), diazepam (SE+DZP), carbamazepina (SE+CBZ), fenitoína (SE+FEN),
48
cetamina (SE+CET), ácido nipecótico (SE+Ác NIPE) e FrPbAII 0.15; 0.075 e 0.037
µg/µL.Dados foram analisados utilizando-se ANOVA de medidas repetitivas. ANOVAs
de uma via foram utilizados para a análise da permanência em cada um dos
quadrantes, tendo aplicando-se em seguida o teste de Tukey, como pós-teste. Foi
considerado p<0.05(*).
4.5. Análise histopatológica
4.5.1. Análise histopatológica qualitativa
Representações das secções histológicas das regiões hipocampais
analisadas nos grupos controles e tratados estão mostrados nas figuras 18 a 22.
Neste sentido, os cortes histológicos de animais epilépticos não-tratados
e sacrificados 18-20 dias após indução do SE, apresentaram perda neuronal,
núcleos picnóticos, vacuolização e edema extracelular nas áreas da CA1
(Figuras 18B e 19B), CA3 (Figuras 20B e 21B) e hilus. Além disso, observou-se
desorganização da camada piramidal destas regiões. Em contraste, na
camada granulosa do GD podem-se observar células resistentes, não obstante
a presença de núcleos picnóticos e perda moderada de células (Figuras 22B e
23B).
Com relação aos tratamentos, os hipocampos dos animais submetidos
ao SE e tratados com a carbamazepina, fenitoína e cetamina apresentam
proliferação da micróglia e raros núcleos picnóticos nas regiões da CA1
(Figuras 18C-F e 19C-F) e CA3 (Figuras 20C-F e 21C-F). Dados semelhantes
foram encontrados com relação aos hipocampos dos animais tratados com as
duas doses mais baixas da FrPbAII (0.075 e 0.037µg/µL). Em contraste, os
hipocampos dos animais tratados com diazepam, ácido nipecótico e FrPbAII
(0.15 µg/µL) apresentaram as camadas piramidais organizadas, pequena
quantidade de núcleos picnóticos e células da micróglia.
49
Figura 18: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região da CA1. A.
Animais do grupo controle não-epilépticos. Animais experimentais 20 dias após
indução do SE. B. Pós-tratados com salina, cetamina (C), diazepam (D),
carbamazepina (E) e fenitoína (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto setas
amarelas indicam núcleos picnóticos. Secções em parafina de 10 µm cortadas em
micrótomo, visualizadas em um aumento de 400x. Coloração por HE.
50
Figura 19: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região da CA1. A.
Animais do grupo controle não-epilépticos. A seguir, animais experimentais 20 dias
após indução do SE. B. Pós-tratados com salina, ácido nipecótico (C), FrPbAII 0,15 (D),
FrPbAII 0,075 (E) e FrPbAII 0,037 µg/µL (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto
setas amarelas indicam núcleos picnóticos. Secções de 50 µm cortadas em criostato,
visualizadas em um aumento de 400x. Coloração por cresil violeta.
51
Figura 20: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região da CA3. A.
Animais do grupo controle não-epilépticos. Animais experimentais 20 dias após
indução do SE. B. Pós-tratados com salina, cetamina (C), diazepam (D),
carbamazepina (E) e fenitoína (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto setas
amarelas indicam núcleos picnóticos. Em E círculo delimita área de proliferação da
micróglia. Secções em parafina de 10 µm cortadas em micrótomo, visualizadas em um
aumento de 400x. Coloração por HE.
52
Figura 21: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região da CA3. A.
Animais do grupo controle não-epilépticos. A seguir, animais experimentais 20 dias
após indução do SE. B. Pós-tratados com salina, ácido nipecótico (C), FrPbAII 0,15 (D),
FrPbAII 0,075 (E) e FrPbAII 0,037 µg/µL (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto
setas amarelas indicam núcleos picnóticos. Secções de 50 µm cortadas em criostato,
visualizadas em um aumento de 400x.. Coloração por cresil violeta.
53
Figura 22: Cortes histológicos representativas do hipocampo na região da GD. A.
Animais do grupo controle não-epilépticos. Animais experimentais 20 dias após
indução do SE. B. Pós-tratados com salina, cetamina (C), diazepam (D),
carbamazepina (E) e fenitoína (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto setas
amarelas indicam núcleos picnóticos. Em E, um círculo delimita área de proliferação
da micróglia. Secções em parafina de 10 µm cortadas em micrótomo, visualizadas em
um aumento de 400x. Coloração por HE.
54
Figura 23: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região do GD. A.
Animais do grupo controle não-epilépticos. A seguir, animais experimentais 20 dias
após indução do SE. B. Pós-tratados com salina, ácido nipecótico (C), FrPbAII 0,15 (D),
FrPbAII 0,075 (E) e FrPbAII 0,037 µg/µL (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto
setas amarelas indicam núcleos picnóticos. Secções de 50 µm cortadas em criostato,
visualizadas em um aumento de 400x.. Coloração por cresil violeta. *indica o hilus do
GD.
55
4.5.2. Análise quantitativa do dano neuronal
Os dados das estimativas das densidades neuronais estão
demonstrados na figura 24 como porcentagem de perda de células. Esta
porcentagem foi calculada com relação à média da densidade de
neurônios/mm
2
dos animais sadios de cada procedimento histológico;
incluídos em parafina ou cortados em criostato. Para a análise estatística, no
entanto, os dados brutos (nr de neurônios/mm
2
) foram tratados
separadamente, como descritos a seguir.
Observou-se que os cérebros de animais epilépticos não tratados
exibem perda de células em todas as áreas examinadas do hipocampo; CA1,
CA3 e GD, mas principalmente as duas primeiras áreas. Além disso, a análise
de ANOVA utilizando-se as densidades absolutas apontou diferenças
estatisticamente significantes entre os tratamentos na região da CA1 [F(5,37)=
21.33, p<0.0001], CA3 [F(5,37)= 18.32, p<0.0001] e do DG [F(5,37)= 13.28,
p<0.0001], para os grupos incluídos em parafina.
Neste caso, os pós-testes mostraram diferenças estatísticas entre as
secções das regiões hipocampais dos animais epilépticos aquelas dos animais
sadios e animais submetidos ao SE pós-tratados com diazepam,
carbamazepina, fenitoína e cetamina nas regiões da CA1 e CA3 (p<0.05). No
entanto, as densidades de neurônios hipocampais de animais tratados após o
SE com estas drogas foram inferiores as densidades de animais sadios não
epilépticos nas três regiões: CA1 (p<0.05), CA3 (p<0.05) e DG (p<0.05). Os
animais epilépticos tratados com diazepam e carbamazepina apresentaram
densidades neuronais estatisticamente diferentes dos animais epilépticos sem
tratamento nas três regiões, sendo que para o diazepam, as porcentagens de
56
perda neuronal nas três regiões foram menores. Os animais tratados com esta
droga apresentaram densidades neuronais mais próximas daquelas dos
animais sadios. Cortes histológicos de animais pós-SE tratados com fenitoína e
cetamina tiveram densidades neuronais maiores que as dos animais sem
tratamento, embora menores que os valores encontrados para os ratos sadios.
No GD, estes dados não foram estatisticamente significantes (p~0.06, para
ambos).
A análise das densidades de neurônios dos cérebros cortados em
criostato indicam um efeito neuroprotetor sobre as células piramidais da região
da CA1 [F(5,37)= 39,37, p<0.0001], CA3 [F(5,37)= 6,348 p=0.0004] e das células
granulosas do DG [F(5,37)= 5,93, p=0.0006]. Os pós-testes com os valores das
densidades neuronais dos hipocampos cortados em criostato mostraram que
na região da CA1 dos hipocampos dos animais epilépticos tratados com a
FrPbAII na dose de 0.15 µg/µL e com o ácido nipecótico apresentaram
densidades maiores do que os animais não tratados e animais epilépticos
tratados com a menor dose da FrPbAII (0.037 µg/µL) (p<0.01). Além disso, foi
observado que a dose intermediária do composto (0.075 µg/µL) protegeu os
neurônios piramidais da CA1 (p<0.05). No entanto, neste caso, as densidades
neuronais também diferiram estatisticamente dos animais do grupo sadio
(p<0.05). Nas regiões da CA3 e do GD, apenas a administração da dose mais
alta da FrPbAII (0.15 µg/µL) e do ácido nipecótico diminuíram a perda de
neurônios induzida pelo SE (p<0.01 para ambos os tratamentos).
57
Figura 24. Porcentagem de perda de neurônios em três regiões do hipocampo CA1,
CA3 e DG. As perdas neuronais dos animais submetidos ao SE sem tratamento
[SE+Salina(p) - a] e tratados com as drogas DZP, CET, CBZ, FEN foram estimadas com
relação a densidade neuronal média dos cérebros dos animais do grupo sadio
incluídos em parafina. As perdas neuronais dos animais submetidos ao SE sem
tratamento [SE+Salina(c) - b], ácido nipecótico e FrPbAII (0.037, 0.075 e 0.15 µg/µl)
foram estimadas com relação aos cérebros de animais sadios cortados em criostato.
*p<0.05, **p<0.01.
58
4.6. Imunofluorescência para GFAP
Os hipocampos dos animais epilépticos não tratados pós-SE, bem como
aqueles dos animais submetidos ao SE e pós-tratados com fenitoína e
cetamina apresentaram uma intensa marcação para GFAP nas regiões CA1,
CA3 e GD do hipocampo (Figura 25). No entanto, a marcação mais intensa foi
detectada na região do hilus do GD (Figure 26). Além disso, astrócitos dos
astrócitos destes grupos apresentaram hiperplasia do corpo celular e poucos
corpos celulares marcados, isto é, a marcação foi detectada
predominantemente nos prolongamentos destas células.
Figura 25: Secções marcadas com anticorpo para GFAP no GD do hipocampo de
animais submetidos ao SE pela injeção de pilocarpina pós
-tratados com salina
(SE+Salina), Diazepam (SE+DZP), fenitoína (SE+FEN), carbamazepina (SE+CBZ) e
cetamina (SE+CET) sacrificados 20 dias após SE. Estas secções podem ser comparadas
as secções histológicas de animais sadios não submetidos ao SE. Secções de 10 µm,
visualizadas em um aumento de 400x.
59
Figura 26: Imunomarcação para GFAP no hilus do GD dos hipocampos dos animais
submetidos ao SE por pilocarpina e eutanasiados 20 dias após o SE. Animais epilépticos
tratados pós-SE com salina e fenitoína. Secções de 10 µm, visualizadas em um aumento de
400x.
Com relação às secções dos hipocampos cortadas em criostato,
observou-se que os animais tratados com FrPbAII (0,15ug/uL) e ácido
nipecótico apresentaram fraca marcação para GFAP, semelhante aos
hipocampos dos animais sadios não-epilépticos (Figura 27).
Figura 27: Secções (criostato) de marcadas com anticorpo para GFAP no GD do
hipocampo de animais submetidos ao SE pela injeção de pilocarpina pós-tratados
com salina (SE+Salina), Ácido nipecótico (SE+Ác nipecótico) e FrPbAII (SE+FrPbAII 0,15;
0.075 e 0.037 µg/µL) sacrificados 20 dias após SE. Estas secções podem ser
comparadas as secções histológicas de animais sadios não submetidos ao SE. Secções
de 50µm, visualizadas em um aumento de 400x.
60
4.7. Incidência de crises recorrentes
Os dados resultantes dos períodos de observação indicaram que os
animais submetidos ao SE pela injeção de pilocarpina apresentaram crises
recorrentes em um período de que variou de 5 a 20 dias. Para não subestimar
ou superestimar as eficiências dos compostos testados, a freqüência das crises
de cada animal não foi estimada. Desta forma, registraram-se: o período de
ocorrência das crises e o número de animais que apresentaram crises durante
o período de observação em cada grupo (Tabela VI).
Com relação a incidência de crises dentro dos grupos não foram
registradas diferenças estatísticas entre os tratamentos durante o período
observado (χ2=14.44; p= 0.1076).
Tabela VI Incidência de crises recorrentes após SE induzido pela injeção de pilocarpina
em ratos Wistar.
Tratamento Início das crises
(dias pós-SE)*
Nr de animais com
crises
(escore>3)
Salina - -
SE+Salina 4 10/15 (80%)
SE+DZP 8 2/6 (33%)
SE+CET 11 3/6(50%)
SE+CBZ 6 4/6 (66%)
SE+FEN 11 3/6(50%)
SE+Ác nipecótico 7 1/6 (6%)
SE+FrPbAII 0.15µg/µL 7 1/6 (6%)
SE+FrPbAII 0.075µg/µL 7 3/6 (50%)
SE+FrPbAII 0.037µg/µL 6 4/6 (66%)
*Número de dias pós-SE da primeira crise recorrente no grupo. Número de animais
61
com crises de classe >3 segundo índice de Racine (1972), analisados pelo teste de qui-
quadrado. χ2=14.44; p=
0.1076.
Discussão
61
5. Discussão
A natureza tem funcionado como um laboratório gigantesco ao longo de milhões de anos de evolução,
onde novas moléculas surgem e desaparecem de acordo com o grau de adaptação que estas conferem as
espécies. Neste sentido, animais peçonhentos têm sido particularmente favorecidos por um arsenal de
compostos bioquímicos, os quais conferem a estes animais uma habilidade única de paralisar e/ou matar suas
presas. Estes compostos, quando inoculados, ativam e/ou inibem seletivamente estruturas de diversos sistemas
orgânicos das presas, incluindo o tecido nervoso (Mortari
et al
., 2007a).
Até o momento, foram identificadas centenas de neurotoxinas com ação em transportadores, enzimas
e canais iônicos permeáveis aos íons de Na
+
, K
+
, Ca
++
e Cl
-
, ativados por voltagem ou por ligantes tais como L-Glu,
acetilcolina, GABA e Glicina (Uchitel, 1997; Denac
et al
. 2000; Norton & Olivera, 2006; Kyle & Ilyin, 2007). Nestes
estudos, as neurotoxinas isoladas de venenos têm sido úteis na elucidação de vários aspectos do funcionamento
de estruturas neuroniais e têm auxiliado na compreensão do papel destas estruturas na fisiopatologia de diversas
desordens neurológicas (Catterall, 2007). No entanto, estes estudos abordaram apenas uma pequena parte da
enorme biodiversidade existente e utilizam, em sua maioria, ensaios
in vitro
(Mortari
et al
., 2007a).
Há uma década, pesquisadores do laboratório de Neurobiologia e Peçonhas da FFCLRP-USP têm
investigado a ação de venenos de vespas e aranhas sobre o SNC de roedores. Nossos estudos levaram ao
isolamento de vários compostos dos venenos das vespas
Agelaia vicina
,
Polybia ignobilis
,
Polybia occidentalis
, da
aranha solitária
Scaptocosa raptoria
e da aranha colonial
Parawixia bistriata
com ações anticonvulsivante,
ansiolítica, neuroprotetora e antinociceptiva.
Em um destes estudos, foi isolado do veneno de
P. bistriata
o composto FrPbAII, o qual apresenta um
potente efeito inibitório sobre a recaptação do GABA e da glicina. A FrPbAII é um composto pequeno que não
altera a atividade dos canais de íons de Na
+
, K
+
e Ca
++
, dos receptores de GABA, da enzima GABA transaminase
ou do transporte reverso deste neurotransmissor. A atividade neurobiológica deste composto foi testada em
vários modelos. Desta forma, foi observado que quando injetada por via endovenosa, em ratos Wistar, a FrPbAII
exerce efeito neuroprotetor nas camadas nuclear interna e nuclear externa da retina, inibindo a extensão da
lesão causada por isquemia e isquemia/reperfusão (Beleboni
et al
., 2006). Recentemente, foi constatado que a
injeção intra-vítreo deste composto protege de maneira dose dependente todas as camadas retinianas de ratos,
após isquemia e isquemia seguida de reperfusão, sendo cerca de 100 vezes mais potente do que o inibidor
específico do transportador GAT1 do GABA, ácido nipecótico (Dados não publicados). Além do efeito
62
neuroprotetor, a injeção da FrPbAII no hipocampo dorsal de ratos exerce um efeito ansiolítico, aumentando o
tempo de permanência nos braços abertos do labirinto em cruz elevado e no compartimento claro do teste
claro/escuro (Liberato
et al
., 2006)
A atividade anticonvulsivante da FrPbAII foi inicialmente constatada por Cairrão
e colaboradores (2002)
que relataram que a injeção por via i.c.v. desse composto inibe crises induzidas pela administração do antagonista
GABAérgico bicuculina em ratos Wistar. A seguir Liberato e colegas (2006) relataram que quando injetada na
substância negra do mesencéfalo, a FrPbAII bloqueia crises límbicas induzidas pela estimulação da
Area
tempestas
do córtex piriforme. Interessantemente, o ácido nipecótico não exerce efeito em ratos submetidos a
este paradigma. Além disso, foi demonstrado que o composto apresenta bons índices terapêuticos em ratos
com crises induzidas pela picrotoxina, pilocarpina, ácido caínico e PTZ, e não induz comprometimento cognitivo
quando administrada em ratos previamente à exposição ao labirinto aquático de Morris (Gelfuso
et al
., 2007).
Todos os resultados descritos anteriormente foram constatados utilizando modelos de indução aguda
(reativa) de crises pela injeção de quimioconvulsivantes em ratos saudáveis. Estes modelos têm levado a
identificação de compostos anticonvulsivantes, mas não conseguem discriminar compostos que exercem efeito
inibitório sobre a progressão das epilepsias (Löscher, 2002). Apesar da grande quantidade de compostos que
atuam inibindo as crises convulsivas, nenhum tratamento disponível atualmente consegue curar a doença, com
exceção da remoção cirúrgica de um foco epiléptico (Walker
et al
., 2002).
Desta forma, modelos crônicos fornecem pistas sobre a etiologia das epilepsias e auxiliam na descoberta
de novos compostos com propriedades de modificar a progressão da doença. Neste sentido, três modelos
crônicos são particularmente utilizados:
• Injeção sistêmica ou central de ácido caínico (agonista de L-Glu), proposto por Ben-Ari (1981).
• Injeção sistêmica ou central de pilocarpina (agonista de receptores colinérgicos do tipo muscarínicos),
proposto por Turski
et al
. (1983).
• Estimulação elétrica de áreas cerebrais específicas (sistema límbico), proposto por Lothman
et al
.
(1990).
O
Status Epilepticus
(SE) induzido por pilocarpina é um modelo consolidado e bastante utilizado, que
reproduz em roedores muitas das alterações encontradas em pacientes portadores da epilepsia do lobo
temporal (ELT), um dos mais prevalentes tipos de epilepsia (De Deyn
et al
., 1992; Ebert
et al.
, 2002; Löscher,
63
2002). Neste modelo, a injeção da pilocarpina induz crises límbicas que persistem por várias horas ou terminam
espontaneamente. Dependendo da duração das crises, o animal injetado com pilocarpina pode morrer caso o SE
não seja interrompido, o que ocorre regularmente pela injeção de diazepam ou pentobarbital (Löscher, 2002).
Do ponto de vista comportamental, os primeiros sinais detectados após a injeção incluem movimentos orofaciais
que correspondem à atividade epileptiforme no hipocampo, a qual se espalha para a amígdala, quando podem
ser observadas, clonia dos membros anteriores, elevação e queda límbica (Furtado
et al.
, 2002).
Os mecanismos envolvidos no dano neurológico induzido pela injeção sistêmica ou hipocampal de
pilocarpina não são ainda muito claros. No entanto, sabe-se que a farmacologia do SE inicial difere da
farmacologia envolvida no desencadeamento das crises recorrentes (Rice & DeLorenzo, 1998). Após SE inicial, os
animais passam por um período livre das crises, freqüentemente denominado fase latente, o qual segundo Mello
e colaboradores (1993) pode durar de 5 a 34 dias. Durante a fase latente, ocorrem modificações que levam ao
desencadeamento de crises espontâneas e recorrentes, que persistem por toda a vida do animal. Dentre as
mudanças descritas durante a fase latente, podem ser citadas: alterações nas propriedades intrínsecas dos
neurônios (Sanabria
et al
., 2001), ocorrência de neurogênese (Parent
et al
., 1997), alterações funcionais nos
receptores (Brooks-Kayal
et al
., 1998), diminuição da atividade de interneurônios inibitórios (Cossart
et al.
, 2001)
e re-organização sináptica (Okazaki
et al
., 1995).
Vários trabalhos têm destacado a importância do hipocampo e do giro parahipocampal na inicialização e
manutenção das crises convulsivas durante a progressão da ELT. Nestes estudos, são descritas alterações no
hipocampo de animais submetidos ao SE, bem como autópsias de hipocampo
post mortem
de pacientes com
ELT, dentre as quais se destacam: extensa morte celular, brotamento das fibras musgosas e gliose (Turski
et al
.,
1983; Covolan
et al
., 2000; Ebert
et al
., 2002; Thom
et al
., 2005). Em um recente estudo, Scimemi e
colaboradores (2006) descrevem aumento da excitabilidade mediada por L-Glu após SE induzido por
pilocarpina sistêmica, na via perforante que liga o córtex entorrinal às regiões de CA 1-3 que representa a
principal via de entrada excitatória no hipocampo. Segundo os autores deste trabalho, três semanas após o SE
por pilocarpina ocorre um aumento na excitabilidade das células granulosas, o qual deve estar associado com o
aumento da probabilidade de liberação do L-Glu, descartando a possibilidade de alteração nos transportadores
de L-Glu, bem como alterações na cinética (composição de subunidades) dos receptores de L-Glu, em particular
os NMDA. Além disso, foi demonstrada a ocorrência de “
crosstalk
” (comunicação extra-sináptica) entre as
porções medial e lateral da via perforante (Scimemi
et al
, 2006).
64
É interessante ressaltar que o SE induz mudanças que não se restringem ao hipocampo e sistema límbico.
Em ratos Wistar jovens, episódios múltiplos de SE reduzem a expressão de GAD-65 e alteram a expressão de
receptores AMPA e NMDA (da Silva
et al.
, 2005). Além disso, Freitas e colaboradores (2004) demonstraram
que ocorre
up-regulation
dos receptores de L-glu no hipocampo, estriado e córtex frontal de animais adultos,
nas primeiras horas após o SE induzido por pilocarpina sistêmica.
Dados semelhantes foram obtidos pelo nosso laboratório com ratos Wistar sacrificados na fase latente,
quando foi observado um aumento na quantidade de receptores funcionais de L-glu no córtex cerebral. Além
disso, foi verificada também para o córtex, uma diminuição da afinidade destes receptores (Cunha
et al
., 2007).
Tendo em vista todos estes fatos, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade
antiepileptogênica e neuroprotetora do composto FrPbAII isolado do veneno da aranha brasileira
P. bistriata
,
comparando sua eficiência a de drogas neuroativas com mecanismos de ação variados. Para tanto, os animais
foram divididos em grupos onde foram utilizadas 3 doses da FrPbAII, o ácido nipecótico, drogas anti-epilépticas
convencionais – fenitoína e carbamazepina, um anestésico já testado como neuroprotetor – cetamina e um
ansiolítico – diazepam - comumente utilizado para reversão de SE em humanos. Para tanto se padronizou o
tratamento sub-crônico de quatro dias. A escolha deste período de duração baseou-se em achados de Fujikawa
(1996), que descreve perdas contínuas de neurônios do hipocampo, amígdala e áreas subcorticais, como a
substância negra, até 72 horas após um SE de 3 horas de duração. Além disso, um trabalho mais recente
demonstra que o SE induzido por pilocarpina provoca descargas elétricas anormais continuamente observadas
até 72 horas após os SE (Gao
et al
., 2007).
Neste estudo, além de monitorar alterações morfológicas induzidas pelo SE no hipocampo, foi analisado
o desempenho dos animais no labirinto aquático de Morris, o qual é baseado no papel do hipocampo na
navegação espacial de mamíferos (Morris
et al
., 1982). Estudos prévios relatam que lesões no hipocampo de
animais experimentais comprometem o desempenho dos animais neste teste (Halonen
et al
., 1996; Cha
et al
.,
2002). Em humanos, danos aos neurônios do hipocampo são também associados a comprometimentos cognitivos
em pacientes com TLE, os quais relatam freqüentemente dificuldades em aprender novas informações (Lencz
et
al
., 1992; Mikati
et al
., 2001).
No modelo da pilocarpina, comprometimentos cognitivos podem ser observados durante a fase de
aquisição (treino), assim como durante a fase de teste de retenção da memória. Animais epilépticos aprendem a
localização da plataforma de descanso, mas levam muito mais tempo para aprender esta informação do que
animais sadios. Além disso, animais epilépticos apresentam déficit de retenção de memória, uma vez que eles
65
exploram os quatro quadrantes da piscina, sem preferência pelo quadrante onde estava a plataforma (alvo)
(Cavazos
et al
., 1994; Hort
et al
., 1999; Mojajeri
et al
., 2003).
Os resultados do presente trabalho demonstram que o tratamento com a FrPbAII (0.15 µg/µL)
proporcionou melhora da performance dos animais no labirinto aquático de Morris, durante o período de
aprendizagem (treinos) e no teste de retenção. Comparando-se com os tratamentos controles, as performances
dos animais tratados com a FrPbAII foram semelhantes as dos animais tratados com diazepam e com o ácido
nipecótico no terceiro e quarto dia de treino, bem como no teste de retenção (
probe trial
). No entanto, os
animais administrados com diazepam e o ácido nipecótico foram mais rápidos que a FrPbAII no começo do teste
(2º e 3º dias).
As estimativas de densidade neuronal indicam que todos os tratamentos, com exceção da dose mais
baixa da FrPbAII (0,037µg/µL), exerceram algum efeito neuroprotetor sobre as células piramidais da CA1 e CA3,
bem como nas células granulosas do GD. No entanto, as densidades de células dos animais tratados ainda não são
iguais as dos animais sadios.
Neste ponto, é interessante ressaltar que apesar do desempenho dos animais tratados com diazepam,
FrPbAII (0,15 µg/µL) e ácido nipecótico serem semelhantes as dos animais sadios no labirinto aquático de Morris,
a densidade de células hipocampais foi inferior nestes animais comparando-se aos mesmos animais sadios. De fato,
o desempenho dos animais no labirinto aquático de Morris está correlacionado com a severidade das lesões,
sendo que pelo menos 40% das células do hipocampo devem ser lesadas para que seja observado déficit
cognitivo neste teste (Majajeri
et al
., 2003). Isto explica porque os animais com perda moderada de células (10-
20%) apresentaram déficits cognitivos. Por outro lado, os animais com perda de neurônios levemente inferiores
aos animais epilépticos sem pós-tratamento, apresentaram desempenho comprometido no labirinto aquático de
Morris.
Muita atenção tem sido dada a perda de neurônios durante a epilepsia. No entanto, sabe-se que muitas
drogas que inibem a perda neuronal não exercem efeitos antiepileptogênicos (Löscher, 2002; D’Ambrosio,
2004). Neste sentido, alguns trabalhos vêm tentando estabelecer correlações entre a epileptogênese e a
proliferação de células da glia que ocorre após diferentes tipos de insulto ao tecido nervoso, em um processo
denominado gliose reativa. Durante algum tempo acreditou-se que os astrócitos e a micróglia exercessem papéis
semelhantes, ou seja, isolamento da área lesada evitando que as cascatas de excitoxicidade atingissem células
sadias. Contudo, em um recente trabalho Kang e colaboradores (2006) mostraram que a proliferação da micróglia
aumenta a quantidade de fatores de inflamação no tecido, levando a morte de mais células.
66
No presente trabalho, foi detectada astrocitose reativa em animais epilépticos não tratados, assim como
em animais epilépticos tratados com carbamazepina, fenitoína, cetamina e nas doses mais baixas da FrPbAII
(0.075 e 0.037 µg/µL). Neste sentido, os resultados revelaram aumento da imuno-marcação para GFAP em todas
as regiões do hipocampo mas sobretudo, na região do hilus do GD. Além disso, a maior parte da marcação foi
evidenciada nos prolongamentos dos astrócitos, o que aponta mais para processos de crescimento destas células
do que geração de novas células. Dados semelhantes foram encontrados por Kang e colaboradores (2006), em
ratos submetidos ao SE pela injeção sistêmica de pilocarpina, eutanasiados 20 dias após o SE. De fato, estes
autores mostraram dupla marcação de astrócitos com TUNEL (marcador de apoptose) e GFAP a partir de 14
dias após o SE. As células sobreviventes, por sua vez, apresentaram expressão anormal de canais iônicos e
enzimas envolvidas na degradação de neurotransmissores. Segundo D’Ambrosio (2004), as alterações nos
astrócitos podem favorecer a quebra da homeostase do tecido neuronal e alterar a liberação de
neurotransmissores.
Com relação à ocorrência de crises recorrentes, não foram observadas diferenças estatísticas entre o
número de animais epilépticos sem ou com tratamento pós SE. Isto pode ser explicado, pelo número de animais
utilizados, uma vez que se observa uma menor freqüência de animais com crises nos grupos tratados com
diazepam, FrPbAII (0,15 µg/µL) e ácido nipecótico (aproximadamente 15% para os três tratamentos contra 80%
dos animais sem tratamento). De fato, o SE causa morte de vários animais durante o experimento, sobretudo nas
primeiras horas pós-SE, quando apesar do tratamento, cerca de 40% dos animais morrem. Desta forma, apesar
dos esforços, não foi possível obter um número muito maior de animais.
Vários estudos têm tentado estabelecer uma ligação entre a ação anticonvulsivante e ação
neuroprotetora de algumas drogas. Alguns autores questionam o benefício real do uso de anticonvulsivantes
como neuroprotetores, uma vez que as crises recorrentes ocorrem pós SE mesmo após algum tratamento
(Pitkänen, 2002). Neste trabalho, foi observado que a carbamazepina protege parcialmente os neurônios do
hipocampo contra os danos induzidos pelo SE, mas não melhora o desempenho dos animais tratados no labirinto.
Em um estudo prévio, Lahtinen e colaboradores (1996) demonstraram que a administração de carbamazepina
(20mg/kg, via i.p.) uma hora antes da estimulação da via perfurante não inibe perda de neurônios, nem
comprometimentos cognitivos no labirinto aquático de Morris. A ação neuroprotetora da carbamazepina
observada neste trabalho pode ser decorrente da dose, bem como no modelo utilizado. Discrepâncias entre
modelos crônicos de estimulação elétrica e química já foram relatados para outras drogas, como por exemplo, o
ácido valpróico, que inibe crises recorrentes após SE, mas não após estimulação elétrica (Löscher, 2002). Os
67
efeitos da carbamazepina utilizada após SE induzido pro pilocarpina nunca haviam sido relatados (Calabresi
et al
.,
2003).
No presente estudo, foi observado uma maior eficiência dos tratamentos com alvo no sistema
GABAégico, tanto em receptores (diazepam), quanto transportadores (FrPbAII e ácido nipecótico). A ação
neuroprotetora do diazepam foi previamente demonstrada por Pitkänen e colaboradores (2005), que relataram
que a administração do diazepam durante o SE induzido por estimulação elétrica da amígdala, reduz o
desenvolvimento e a severidade das crises recorrentes. Além disso, a inibição do transporte de GABA também
já havia sido relatada como neuroprotetora em ratos submetidos ao modelo de estimulação da via perfurante
(Halonen
et al
., 1996). Foi relatado que a administração da tiagabina, um inibidor seletivo do transportador GAT1,
durante a estimulação elétrica inibiu o comprometimento cognitivo no labirinto aquático de Morris e
concomitantemente reduziu perda de células piramidais de CA1 e CA3. No entanto, esta é a primeira vez que
um inibidor seletivo de GAT1 e um inibidor não específico de GABA e glicina são testados em ratos submetidos
ao modelo da pilocarpina.
Neste sentido, observou-se que a dose utilizada da FrPbAII (0,86 µM) foi quase 100 vezes menor que a
do ácido nipecótico (93 µM). Essa maior eficiência da FrPbAII sobre o ácido nipecótico pode estar ligada a
atuação do composto sobre outros subtipos de transportadores de GABA, que não o GAT1 ou os
transportadores de Glicina. Segundo White e colaboradores (2002), drogas que inibem transportadores de
GABA astrocíticos são mais potentes que inibidores de transportadores neuronais de GABA. Ainda o GAT1 é
predominantemente expresso em neurônios enquanto os transportadores do tipo GAT2 e 3 estão mais
presentes em membranas de astrócitos (Gadea & Lopez-Colomé, 2001a). Uma vez que o ácido nipecótico atua
especificamente sobre o subtipo GAT1 é plausível inferir que esta droga seja menos potente do que um inibidor
não seletivo neste modelo (Schousboe
et al
., 2004). Além disso, estudos prévios mostram que inibidores
seletivos de GAT1 bloqueiam crises secundariamente generalizadas, enquanto inibidores não seletivos não têm
efeito sobre estas crises, mas bloqueiam crises induzidas pela estimulação elétrica (Dalby
et al
.,1997; Dalby,
2003). Isto poderia indicar que a FrPbAII tem uma preferência por GAT1, não obstante a ação deste composto
em outros substratos.
A ação inibitória da FrPbAII sobre os transportadores de glicina, pode ser em parte responsável pelos
efeitos anticonvulsivantes e neuroprotetores observados neste e em outros trabalhos. A glicina atua sobre canais
iônicos ativados pela ligação deste neurotransmissor, em sítios receptores de alta afinidade pelo ligante. Além
disso, a glicina pode atuar como co-agonista nos receptores de L-Glu do tipo NMDA (Böhme & Lüddens, 2001).
68
No SNC, receptores de glicina podem ser encontrados na medula espinhal, tronco encefálico, mesencéfalo,
retina ou áreas do cérebro dentre as quais se encontra o hipocampo. Disfunções em receptores de glicina
podem resultar em convulsões mioclônicas e desordens motoras hipertônicas (Bregestovski, 2002). De modo
contrário, agonistas glicinérgicos são potenciais anticonvulsivantes. No entanto, devido ao tamanho do sítio de
ligação da glicina, poucos agonistas seletivos deste neurotransmissor são conhecidos e até o momento e nenhum
anticonvulsivante com ação comprovadamente exclusiva nos receptores de glicina foi sintetizado (Böhme and
Lüddens, 2001).
A retirada da glicina dos terminais sinápticos é feita por transportadores de alta afinidade que muitas
vezes reconhecem ambos, GABA e glicina (Beleboni
et al
., 2004b). No entanto, ao contrário do que ocorre com
o GABA, a retirada da glicina da fenda sináptica não afeta o potencial inibitório pós-sináptico (PiPs), apenas re-
abastece o
pool
de liberação deste neurotransmissor (Titmus
et al
., 1999; Gadea & Lopez-Colome, 2001c). Uma
vez que a inibição do transporte de glicina aparentemente não afeta o PiPs e conseqüentemente não aumenta os
efeitos inibitórios da glicina, não há registro da ação anticonvulsivante de inibidores exclusivos destes
transportadores.
A ação neuroprotetora da FrPbAII encontra-se atualmente em investigação também no modelo de
isquemia retiniana em ratos Wistar, utilizando-se antagonistas de receptores de glicina e GABA. Muito em breve
teremos melhores esclarecimentos acerca do substrato neuronal envolvido com os efeitos neuroprotetores
deste composto.
Até o momento, vários esforços têm sido feitos no intuito de estabelecer um protocolo de aplicação
terapêutica com drogas neuroprotetoras. Atualmente, preconiza-se a utilização de anticonvulsivantes
profiláticos como a fenitoína após incidentes como trauma e SE. No entanto, alguns trabalhos mostram que esta
profilaxia não tem exercido efeito antiepileptogênico em pacientes, induzindo ainda déficits cognitivos (Brandt
et al
., 2003). Além disso, Hernandez (1997) demonstrou efeito negativo após administração do diazepam ou do
fenobarbital na recuperação do desempenho sensorial motor após traumatismo craniano. Em contraste, estes
efeitos não foram observados durante o tratamento com carbamazepina e vigabatrina.
Apesar de controversos, os resultados de estudos com drogas neuroprotetoras e antiepileptogênicas
sugerem que, mesmo em casos de neuroproteção parcial, onde o processo de desencadeamento da
epileptogênese secundária ocorre apesar do tratamento, efeitos funcionais podem ser detectados. Dentre estes
efeitos pode se citar a diminuição da severidade e da freqüência das crises recorrentes (Brandt
et al
., 2003).
69
Uma vez que a epilepsia é uma condição clinica limitante, outros trabalhos são necessários para que sejam
investigados os benefícios dos efeitos neuroprotetores de drogas anti-epilépticas menos tóxicas. A profilaxia da
epilepsia deve levar em conta janelas terapêuticas e toxicidade das drogas utilizadas. Desta forma, estudos
crônicos devem evidenciar os muitos aspectos da epileptogênese, o que inclui função cognitiva, crises
espontâneas e efeitos colaterais das drogas sobre animais doentes.
Conclusões
73
6. Conclusões
Neste trabalho, avaliou-se o potencial antiepileptogênico do composto FrPbAII isolado do veneno da
aranha
Parawixia bistriata
e de algumas drogas administradas durante os primeiros quatro dias que sucederam o
Status Epilepticus induzido por pilocarpina. Avaliou-se o número de neurônios sobreviventes na CA1, CA3 e GD
do hipocampo dorsal de ratos Wistar; o desempenho destes animais no labirinto aquático de Morris; a incidência
de crises recorrentes para cada tratamento e a expressão da proteína astrocítica GFAP. Neste sentido os dados
do presente trabalho revelaram um efeito neuroprotetor da FrPbAII, do ácido nipecótico e do diazepam,
considerando todos os parâmetros acima. As drogas carbamazepina, fenitoína e cetamina atenuaram perda
celular, mas não melhoraram o desempenho dos animais no labirinto aquático de Morris. Pode-se inferir que a
potencialização do sistema GABAérgico após um insulto inicial como o trauma ou
Status Epilepticus,
representa
uma alternativa viável para proteger os neurônios, evitando com isso o desenvolvimento e a progressão das
epilepsias. Neste contexto, trabalhos adicionais são necessários para melhor caracterizar as populações neuronais
sobreviventes; padrão de atividade elétrica, expressão de enzimas e avaliação do padrão de brotamento.
Concluindo, o composto FrPbAII, inibidor dos transportadores de GABA e glicina, exerce um promissor efeito
neuroprotetor, provavelmente através da inibição não seletiva dos transportadores de GABA. Este trabalho em
conjunto com outros demonstram o grande e inexplorado potencial terapêutico de compostos presentes em
venenos de artrópodos.
Referências
Bibliográficas
74
7. Referências Bibliográficas
Abercrombie M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec 1949;94:239-47.
Andersen KE, Lau J, Lundt BF, Petersen H, Hunsfeldt PO, Suzdak PD, Swedberg MDB. Synthesis of novel GABA
uptake inhibitors. Part 6: Preparation and evaluation of of N-Ω asymmetrically substituted nipecotic acid
derivatives. Bioorg Med Chem 2001;9:2773-2785.
Ängehagen M, Ben-Menachem E, Ronnback L, Hansson E. Novel mechanisms of action of three antiepileptic
drugs, vigabatrin, tiagabine, and topiramate. Neurochem Res 2003;28(2): 333-40.
Azbill RD, Mu X, Springer JE. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes.
Brain Res 2000;871(2):175-80
Beleboni RO, Guizzo R, Fontana AC, Pizzo AB, Carolino RO, Gobbo-Neto L, Lopes NP, Coutinho-Netto J., Santos
WF. Neurochemical characterization of a neuroprotective compound from
Parawixia bistriata
spider
venom that inhibits synaptosomal uptake of GABA and glycine. Mol Pharmacol 2006;69(6):1998-2006.
Beleboni RO, Carolino ROG, Pizzo AB, Baldan LC, Coutinho-Netto J, Santos WF, Coimbra NC. Pharmacological
and biochemical aspects of GABAergic neurotransmission: pathological and neuropsychobiological
relationships. Cell Mol Neurobiol 2004b;24:707-28.
Beleboni RO, Pizzo AB, Fontana ACK, Carolino ROG, Coutinho-Netto J, Santos WF. Spider and wasp neurotoxins:
pharmacological and biochemical aspects. Eur J Pharmacol 2004b;493: 1-17.
Ben-Ari Y, Tremblay E, Riche D, Ghilini G, Naquet R. Electrographic, clinical and pathological alterations following
systemic administration of kainic acid, bicuculline or pentetrazole: metabolic mapping using the
deoxyglucose method with special reference to the pathology of epilepsy. Neuroscience 1981;6:1361–
1391.
Bergink V, van Megen HJ, Westenberg HG. Glutamate and anxiety. Eur Neuropsychopharmacol 2004;14(3):175-
83
Böhme I, Luddens H. The inhibitory neural circuitry as target of antiepileptic drugs. Curr Med Chem
2001;8(11):1257-74.
75
Bonina FP, Arenare L, Palagiano F, Saija A, Nava F, Trombetta D, Capraris P. Synthesis, stability and
pharmacological evaluation of nipecotic acid prodrugs. J Pharm Sci 1999;88(5): 567-567.
Bormann J, Feigenspan A. GABAC receptors. Trends Neurosci 1995;18(12):515-9.
Brandt C, Potschka H, Löscher W, Ebert U. N-Methil-
D-Aspartate receptor blockade after
Status Epilepticus
protects against limbic brain damage but not against epilepsy in the kainite model of temporal lobe
epilepsy. Neuroscience 2003;118:727-740.
Bregestovski P. Function, modulation and pharmacology of inhibitory glycine receptor channels. Neurophysiologia
2002;36:16-22.
Bridges RJ, Esslinger CS. The excitatory amino acid transporters: pharmacological insights on substrate and
inhibitor specificity of the EAAT subtypes. Pharmacol Ther 2005;107(3):271-85.
Brooks-Kayal AR, Shumate MD, Jin H, Rikhter TY, Coulter DA. Selective changes in single cell GABA(A) receptor
subunit expression and function in temporal lobe epilepsy. Nat Med 1998;4:1166-72.
Buckmaster PS, Zhang GF, Yamawaki R. Axon sprouting in a model of temporal lobe epilepsy creates a
predominantly excitatory feedback circuit. J Neurosci 2002;22:6650-8.
Cairrão MAR, Ribeiro AM, Pizzo AB, Fontana ACK, Beleboni RO, Coutinho-Neto J, Miranda A, Santos WF.
Anticonvulsant and GABA uptake inhibition properties of
P. bistriata
and
S. raptoria
spider venom
fractions. Pharm Biol 2002;40: 472-477.
Calabresi P, Centonze D, Pisani A, Cupini L, Bernardi G. Synaptic plasticity in the ischaemic brain. Lancet Neurol
2003;2(10): 622-9.
Cotman CW, Lynch GS. The neurobiology of learning and memory. Cognition 1989;33:201-41.
Catterall WA, Cestele S, Yarov-Yarovoy V, Yu FH, Konoki K, Scheuer T. Voltage-gated ion channels and gating
modifier toxins. Toxicon 2007;9(2):124-41.
Cavazos JE, Das I, Sutula TP. Neuronal loss induced in limbic pathways by kindling: evidence for induction of
hippocampal sclerosis by repeated brief seizures. J Neurosci 1994;14:3106-3121.
Churchill JD; Fang PC; Voss SE; Besheer J; Herron AL; Garraghty PE. Some antiepileptic compounds impair learning
by rats in a Morris water maze. Inter Physiol Behav Sci 2003;38 (2):91-103.
76
COBEA. Princípios Éticos na Experimentação Animal. Colégio Brasileiro de Experimentação Animal/COBEA,
1991 http://www.cobea.org.br/etica.htm#3
Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy Proposal for revised
classification of epilepsies and epileptic syndromes. Commission on Classification and Terminology of the
International League Against Epilepsy. Epilepsia 1989;30:389-99.
Cossart R, Tyzio R, Dinocourt C, Esclapez M, Hirsch JC, Ben-Ari Y, Bernard C. Presynaptic kainate receptors that
enhance the release of GABA on CA1 hippocampal interneurons. Neuron 2001;29:497-508.
Covolan L, Ribeiro LTC, Longo BM, Mello LEAM. Cell damage and neurogenesis in the dentate granule cell layer
of adult rats after pilocarpine- or kainate-induced status epilepticus. Hippocampus 2000;10:169–180.
Cunha AOS, Mortari MR, Carolino ROG, Coutinho-Netto J, dos Santos WF. Glutamate binding is altered in
hippocampus and cortex of Wistar rats after pilocarpine-induced
Status Epilepticus.
Neurosci Lett
2007;424(1):51-54.
Czapinski P, Blaszczyk B, Czuczwar SJ. Mechanisms of action of antiepileptic drugs. Curr Top Med Chem
2005;5:3-14.
D’Ambrosio R. The role of glial membrane ion channels in seizures and epileptogenesis. Pharmacol Ther
2004;103:95-108.
da Silva AV, Regondi MC, Cavalheiro EA, Spreafico R. Disruption of cortical development as a consequence of
repetitive pilocarpine-induced status epilepticus in rats. Epilepsia 2005;46(Suppl. 5):22-30.
Dalby NO, Nielsen EB. Comparison of the preclinical anticonvulsant profiles of tiagabine, lamotrigine, gabapentin
and vigabatrin. Epilepsy Res 1997;28:63-72.
Dalby NO, Nielsen EB. Comparison of the preclinical anticonvulsant profiles of tiagabine, lamotrigine, gabapentin
and vigabatrin. Epilepsy Res 1997;28: 63-72.
Dalby NO. GABA-level increasing and anticonvulsant effects of three different GABA uptake inhibitors.
Neuropharmacology
2000;39(12):2399-407.
Dalby NO. Inhibition of γ-aminobutyric acid uptake: anatomy, physiology and effects against epileptic seizures.
Eur J Pharmacol 2003;479(1-3):127-137.
77
Danbolt NC. Glutamate uptake. Prog Neurobiol 2001;65(1):1-105.
De Deyn PP, D’Hooge R, Marescau B, Pei YQ. Chemical models of epilepsy with some reference to their
aplicability in the development of aniconvulsants. Epilepsy Res 1992;12:87-1.
Denac H, Mevissen M, Scholtysik G. Structure, function and pharmacology of voltage-gated sodium channels.
Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2000;362(6):453-79.
Ding D, Wang W, Wu J, Ma G, Dai X, Yang B, Wang T, Yuan C, Hong Z, de Boer H. Premature mortality in people
with epilepsy in rural China: a prospective study. Lancet Neurol
2006;5:823–27.
Dingledine R, McBain CJ, McNamara JO. Excitatory amino acid receptors in epilepsy. Trends Pharmacol Sci
1990;11:334-8.
Dua T, de Boer HM, Prilipko LL, Saxena S. Epilepsy care in the world: results of an ILAE/IBE/WHO global
campaign against epilepsy survey. Epilepsia 2006;47:1225–31.
Ebert U, Brandt C, Loscher W. Delayed sclerosis, neuroprotection, and limbic epileptogenesis after status
epilepticus in the rat. Epilepsia 2002;43(Suppl 5):86-95.
Engel JJr. Introduction to temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res 1996;26:141-50.
Engel JJr. A Proposed Diagnostic Scheme for People with Epileptic Seizures and with Epilepsy: Report of the
ILAE Task Force on Classification and Terminology. Epilepsia 2001;42:796-803.
Enz R, Cutting GR. Molecular composition of GABAC receptors. Vision Res 1998;38:1431–1441.
Fonnum F. Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain. J Neurochem 1984;42:1-11.
Fontana ACK, Cairrão MAR, Colusso AJ, Santos WF, Coutinho-Netto J. Paralizing activity of the
Parawixia
bistriata
crude venom in termites: a new bioassay. Toxicon 2000;38:133-138.
Fontana AC, Guizzo R, de Oliveira R, Beleboni R, Meirelles e Silva AR, Coimbra NC, Amara SG, dos Santos WF,
Coutinho-Netto J. Purification of a neuroprotective component of Parawixia bistriata spider venom that
enhances glutamate uptake. Br J Pharmacol 2003;139(7):1297-309.
78
Fontana AC, Beleboni RO, Wojewodzic MW, dos Santos WF, Coutinho-Netto J, Grutle NJ, Watts SD, Danbolt
NC, Amara SG. Enhancing glutamate transport: mechanism of action of Parawixin1, a neuroprotective
compound from
Parawixia bistriata
spider venom. Mol Pharmacol 2007;DOI 10.1124/mol.107.037127.
François J, Koning E, Ferrandon A, Nehlig A. The combination of topiramate and diazepam is partially
neuroprotective in the hippocampus but not antiepileptogenic in the lithium-pilocarpine model of
temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res 2006;72:147-163.
Freitas RM, Sousa FC, Vasconcelos SM, Viana GS, Fonteles MM. Pilocarpine-induced status epilepticus in rats: lipid
peroxidation level, nitrite formation, GABAergic and glutamatergic receptor alterations in the
hippocampus, striatum and frontal cortex. Pharmacol Biochem Behav 2004;78(2):327-32.
Fujikawa DG. The temporal evolution of neuronal damage from pilocarpine-induced
Status epilepticus
. Brain Res
1996;725:11-22.
Furtado MA, Braga GK, Oliveira JA, Del Vecchio F, Garcia-Cairasco N. Behavioral, morphologic, and
electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of
pilocarpina. Epilepsia 2002;43(Suppl 5):37-39.
Gadea A, Lopez-Colome AM. Glial transporters for glutamate, glycine, and GABA: II. GABA transporters. J
Neurosci Res 2001a;63(6):461-8.
Gadea A, Lopez-Colome AM. Glial transporters for glutamate, glycine and GABA I. Glutamate transporters. J
Neurosci Res 2001b;63:453-60.
Gadea A, Lopez-Colome AM. Glial transporters for glutamate, glycine, and GABA III. Glycine transporters. J
Neurosci Res 2001c;64:218-22.
Gao XG, Liu Y, Liu XZ. Treatment of late lithium-pilocarpine-induced status epilepticus with diazepam. Epilepsy
Res 2007;74:126-30.
Gelfuso EA, Cunha AOS, Mortari MR, Liberato JL, Paraventi KH, Beleboni RO, Coutinho-Netto J, Lopes NP, dos
Santos WF. Neuropharmacological profile of FrPbAII, purified from the venom of the social spider
Parawixia bistriata
(Araneae, Araneidae), in Wistar rats. Life Sci 2007;80(6):566-72.
Guerrini R. Epilepsy in children. Lancet 2006;367:499-524.
79
Halonen T, Nissinen J, Jansen JA, Pitkanen A. Tiagabine prevents seizures, neuronal damage and memory
impairment in experimental status epilepticus. Eur J Pharmacol 1996;299:69-81.
Hannesson DK, Corcoran ME. The mnemonic effects of kindling. Neurosci Biobehav Rev 2000;24:725-751.
Hayashi T. A physiological study of epileptic seizures following cortical stimulation in animals and its application
to human clinics. Jpn J Physiol 1952;3:46-64.
Hernandez TD. Preventing post-traumatic epilepsy after brain injury: weighing the costs and benefits of
anticonvulsant prophylaxis. Trends Pharmacol Sci 1997;18:59-62.
Higashima M, Ohno K, Kinoshita H, Koshino Y. Involvement of GABA(A) and GABA(B) receptors in afterdischarge
generation in rat hippocampal slices. Brain Res 2000;865:186-93.
Hort J, Brozek G, Mares P, Langmeier M, Komarek V. Cognitive functions after pilocarpine-induced status
epilepticus: changes during silent period precede appearance of spontaneous recurrent seizures. Epilepsia
1999;40:1177-1183.
Iversen L. GABA pharmacology-what prospects for the future? Biochem Pharmacol 2004;68:1537-1540.
Kang TC, Kim DS, Kwak SE, Kim JE, Won MH, Kim DW, Choi SY, Kwon OS. Epileptogenic roles of astroglial death
and regeneration in the dentate gyrus of experimental temporal lobe epilepsy. Glia 2006;54:258-271.
Kerr DIB, Ong J. GABA receptors: targets for drug development. DDT 1996;1(9):371-380.
Kohl BK, Dannhardt G. The NMDA receptor complex: A promising target for novel Antiepileptic strategies. Curr
Med Chem 2001;8(11):1275-1289.
Krogsgaard-Larsen P, Johnston GAR. Inhibition of GABA uptake in rat brain slices by nipecotic acid, various
isoxazoles and related compounds. J Neurochem 1975;25:797-802.
Kwak SE, Kim JE, Kim DS, Won MH, Choi HC, Kim YI, Song HK, Choi SY, Kang TC. (2005). Differential effects of
vigabatrin and zonisamide on the neuropeptide Y system in the hippocampus of seizure prone gerbil.
Neuropeptides. 39:507-13.
Kwan P, Sills GJ, Brodie MJ. The mechanisms of action of commonly used antiepileptic drugs. Pharmacol Ther
2001;90:21–34.
Kyle DJ, Ilyin VI. Sodium channel blockers. J Med Chem 2007;50(11):2583-8.
80
Lahtinen H, Ylinen A, Lukkarinen U, Sirviö J, Miettinen R, Riekkinen P. Failure of carbamazepine to prevent
behavioural and histopathological sequels of experimentally induced
Status epilepticus
. Eur J Pharmacol
1996;297:213-218.
Lencz T, McCarthy G, Bronen RA, Scott TM, Inserni JA, Sass KJ, Novelly RA, Kim JH, Spencer DD. Quantitative
magnetic resonance imaging in temporal lobe epilepsy: relationship to neuropathology and
neuropsychological function. Ann Neurol 1992;31:629-37.
Liberato JL, Cunha AO, Mortari MR, Gelfuso EA, de Oliveira L, Beleboni R, Coutinho-Netto J, dos Santos WF.
Anticonvulsant and anxiolytic activity of FrPbAII, a novel GABA uptake inhibitor isolated from the
venom of the social spider
Parawixia bistriata
(Araneidae: Araneae). Brain Res 2006;1124(1):19-27.
Löscher W. New visions in the pharmacology of anticonvulsion. Eur J Pharmacol 1998;342:1-13.
Loscher W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs.
A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe
epilepsy. Epilepsy Res 2002;50:105-123.
Lothman EW, Bertram EH, Kapur J, Stringer JL. Recurrent spontaneous hippocampal seizures in the rat as a chronic
sequela to limbic
Status epilepticus
. Epilepsy Res 1990;6:110-118.
Martin IL, Dunn SMJ. GABA receptors . Tocris Reviews 2002 Mar 20.
Meinardi H, Scott RA, Reis R, Sander JW; ILAE Commission on the Developing World. The treatment gap in
epilepsy: the current situation and ways forward. Epilepsia 2001;42:136-49.
Meldrum H, Garthwaite J. Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease. Trends Pharmacol
Sci 1990;11:379-387.
Meldrum BS. The role of glutamate in epilepsy and other CNS disorders. Neurology 1994;44(11 Suppl 8):S14-23
Meldrum BS, Akbar MT, Chapman AG. Glutamate receptors and transporters in genetic and acquired models of
epilepsy. Epilepsy Res
1999;36(2-3):189-204.
Mello LE, Cavalheiro EA, Tan AM, Kupfer WR, Pretorius JK, Babb TL, Finch DM. Circuit mechanisms of seizures in
the pilocarpine model of chronic epilepsy: cell loss and mossy fiber sprouting. Epilepsia 1993;34:985-995.
81
Mikati MA, Tarif S, Ltcif L, Jawad MA. Time sequence and types of memory deficits after experimental
status
epilepticus
. Epilepsy Res 2001;43:97-101.
Mohajeri MH, Saini K, Li H, Crameri A, Lipp HP, Wolfer DP, Nitsch RM. Intact spatial memory in mice with seizure-
induced partial loss of hippocampal pyramidal neurons. Neurobiol Dis 2003;12:174-181.
Moldrich RX, Chapman AG, De Sarro G, Meldrum BS. Glutamate metabotropic receptors as targets for drug
therapy in epilepsy. Eur J Pharmacol 2003;476(1-2): 3-16.
Morris RG, Garrud P, Rawlins JN, O'Keefe J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature
1982;297:681-683.
Mortari MR, Cunha AOS, Ferreira LB, Santos WF. Neurotoxins from invertebrates as anticonvulsants: from basic
research to therapeutic application. Pharmacol Ther 2007a;114:171-183.
Mortari MR, Cunha AO, Carolino RO, Coutinho-Netto J, Tomaz JC, Lopes NP, Coimbra NC, Dos Santos WF.
Inhibition of acute nociceptive responses in rats after i.c.v. injection of Thr6-bradykinin, isolated from the
venom of the social wasp,
Polybia occidentalis
. Br J Pharmacol 2007b;151:860-869.
Nadler JV. The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain. Neurochem Res 2003;28:1649-58.
Nau H, Hauck RS, Ehlers K. Valproic acid-induced neural tube defects in mouse and human: aspects of chirality,
alternative drug development, pharmacokinetics and possible mechanisms. Pharmacol Toxicol
1990;69:310-21.
Norton RS, Olivera BM. Conotoxins down under. Toxicon
2006;48(7):780-98.
Okazaki MM, Evenson DA, Nadler JV. Hippocampal mossy fiber sprouting and synapse formation after status
epilepticus in rats: visualization after retrograde transport of biocytin. J Comp Neurol 1995;352:515-534.
Olney JW, Labruyere J, Wang G, Wozniak DF, Price MT, Sesma MA. NMDA antagonist neurotoxicity: Mechanism
and prevention. Science 1991;254:1515-1518.
Olsen RW, Avoli M. GABA and epileptogenesis. Epilepsia 1997;38(4):399-407.
Parent JM, Yu TW, Leibowitz RT, Geschwind DH, Sloviter RS, Lowenstein DH. Dentate granule cell neurogenesis
is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus.
J Neurosci 1997;17:3727-3738.
82
Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 2
nd
edition Academic Press Inc Sidney, 1986.
Pena F, Tapia R. Seizures and neurodegeneration induced by 4-aminopyridine in rat hippocampus in vivo: role of
glutamate- and GABA-mediated neurotransmission and of ion channels. Neuroscience 2000;101(3):547-
561.
Pitkänen A. Efficacy of current antiepileptics to prevent neurodegeneration in epilepsy models. Epilepsy Res
2002;50:141-160.
Pitkänen A, Kharatishvili I, Narkilahti S, Lukasiuk K, Nissinen J. Administration of diazepam during status epilepticus
reduces development and severity of epilepsy in rat. Epilepsy Res 2005;63:27-42.
Proper EA, Hoogland G, Kappen SM, Jansen GH, Rensen MG Schrama LH, van Veelen CW, van Rijen PC, van
Nieuwenhuizen O, Gispen WH, de Graan PN. Distribution of glutamate transporters in the hippocampus
of patients with pharmaco-resistant temporal lobe epilepsy. Brain 2002;125(Pt 1):32-43.
Rabinovitz S, Mostofsky DI, Yehuda S. Anticonvulsant efficiency, behavioral performance and cortisol levels: a
comparison of carbamazepine (CBZ) and a fatty acid compound (SR-3). Psychoneuroendocrinology
2004;29:113-124.
Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin
Neurophysiol 1972;32:281-294.
Reynolds EH. (1987). Early treatment and prognosis of epilepsy. Epilepsia. 28:97-106.
Rho JM, Sankar R. (1999). The pharmacologic basis of antiepileptic drug action. Epilepsia 40:1471-83.
Rice AC, DeLorenzo RJ. (1998) NMDA receptor activation during
status epilepticus
is required for the
development of epilepsy. Brain Res 782:240-247.
Rodrigues MC, Guizzo R, Santos WF, Cairasco NG. A comparative neuroethological satudy of limbic seizures
induced by
Parawixia bistriata
venom and kainic acid injections in rats. Brain Res Bull 2001;55:79-86.
Rodrigues MC, Guizzo R, Gobbo-Neto L, Ward RJ, Lopes NP, Santos WF. The biological activity in mammals and
insects of the nucleosidic fraction from the spider
Parawixia bistriata
. Toxicon 2004;43:375-383.
Rosenthal M. Tiagabine for the treatment of generalized anxiety disorder: a randomized, open-label, clinical trial
with paroxetine as positive control. J Clin Psychiatry 2003;64(10):1245-1249.
83
Sanabria ER, Su H, Yaari Y. Initiation of network bursts by Ca
2+
-dependent intrinsic bursting in the rat pilocarpine
model of temporal lobe epilepsy. J Physiol 2001;532:205-16.
Sattler R, Tymianski M. Molecular mechanisms of calcium-dependent excitotoxicity. J Mol Med 2000;78:3-13.
Schousboe A, Sarup A, Larsson OM, White HS. GABA transporters as drug targets for modulation of GABAergic
activity. Biochem Pharm 2004;68:1557-1563.
Scimemi A, Schorge S, Kullmann DM, Walker MC. Epileptogenesis is associated with enhanced glutamatergic
transmission in the perforant path. J Neurophysiol 2006;95(2):1213-20.
Shimada F, Shiga Y, Morikawa M, Kawazura H, Morikawa O, Matsuoka T, Nishizaki T, Saito N. The neuroprotective
agent MS-153 stimulates glutamate uptake. Eur J Pharmacol 1999;386(2-3):263-70.
Sloviter RS. Possible functional consequences of synaptic reorganization in the dentate gyrus of kainate-treated
rats. Neurosci Lett 1992;137:91-6.
Stromgaard K, Mellor I. AMPA receptor ligands: synthetic and pharmacological studies of polyamines and
polyamine toxins. Med Res Rev 2004;24(5):589-620.
Suzdak PD, Jansen JA. A review of the preclinical pharmacology of tiagabine: a potent and selective
anticonvulsant GABA uptake inhibitor. Epilepsia 1995;36:612-26.
Tang FR, Chia SC, Zhang S, Chen PM, Gao H, Liu CP, Khanna S, Lee WL. Glutamate receptor 1-immunopositive
neurons in the gliotic CA1 area of the mouse hippocampus after pilocarpine-induced status epilepticus.
Eur J Neurosci 2005;21:2361-2374.
The National Society for Epilepsy - Reino Unido - www.epilepsynse.org.uk
Thom M, Martinian L, Williams G, Stoeber K, Sisodiya SM. Cell proliferation and granule cell dispersion in human
hippocampal sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol 2005;64:194-201.
Titmus MJ, Tsai HJ, Lima R, Udin SB. Effects of choline and other nicotinic agonists on the tectum of juvenile and
adult Xenopus frogs: a patch-clamp study. Neuroscience 1999;91:753-769.
Tomson T. Excess mortality in epilepsy in developing countries. Lancet Neurol 2006;6:804-805.
Torres-Salazar D, Fahlke C. Parawixin1: a spider toxin opening new avenues for glutamate transporter
pharmacology. Mol Pharmacol 2007;DOI 10.1124/mol.107.041020.
84
Tunnicliff G. Basis of the antiseizure action of phenytoin. Gen Pharmacol. 1996;27(7):1091-1097.
Turski WA, Cavalheiro EA, Schwarz M, Czuczwar SJ, Kleinronk Z, Turski L. Limbic seizures produced by
pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res
1983;9:315– 336.
Uchitel OD. Toxins affecting calcium channels in neurons. Toxicon 1997;35:1161-91.
Usherwood PR, Peter NR, Blagbrough IS. Spider toxins affecting glutamate receptors: Polyamines in therapeutic
neurochemistry.
Pharmacol Thera 1994;52(2):245-268.
Villetti G, Bregola G, Bassani F, Bergamaschi M, Rondelli I, Pietra C, Simonato M. Preclinical evaluation of CHF3381
as a novel antiepileptic agent. Neuropharmacology 2001;40: 866-878.
Walker MC, White HS, Sander JW. Disease modification in partial epilepsy. Brain 2002;125:1937-1950.
Watkins JC. L-glutamate as a central neurotransmitter: looking back. Biochem Soc Trans
2000;8(4):297-309.
Wegelius K, Pasternack M, Hiltunen JO, Rivera C, Kaila K, Saarma M, Reeben M. Distribution of GABA receptor
rho subunit transcripts in the rat brain. Eur J Neurosci 1998;10:350-7.
White JR, Matchinsky D, Beniak TE, Arndt RC, Walczak T, Leppik IE, Rarick J, Roman DD, Gumnit RJ. Predictors of
postoperative memory function after left anterior temporal lobectomy. Epilepsy Behav 2002;3:383-
389.
Wolff MA, Wingate VP. Characterization and comparative pharmacological studies of a functional gamma-
aminobutyric acid (GABA) receptor cloned from the tobacco budworm,
Heliothis virescens
(Noctuidae:Lepidoptera). Invert Neurosci 1998;3:305-15.
Zhou JL, Zhao Q, Holmes GL. Effect of levetiracetam on visual-spatial memory following status epilepticus.
Epilepsy Res 2007;73:65-74.
85
Anexos
ANEXO A
Alexandra Olimpio Siqueira Cunha
1. Formação Acadêmica
Graduação em Ciências Biológicas – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo concluída em 2001.
Mestrado em Psicobiologia – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo concluído em 2004.
Doutorado em Psicobiologia – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo a concluir em Fevereiro de
2008.
2. Artigos Publicados
Cunha AOS
, Mortari MR, Carolino ROG, Coutinho-Netto J, dos Santos WF.
Glutamate binding is altered in hippocampus and cortex of Wistar rats
after pilocarpine-induced Status Epilepticus. Neurosci Lett 2007;424(1):51-
54.
Mortari MR, Cunha AOS
, Ferreira LB, Santos WF. Neurotoxins from invertebrates
as anticonvulsants: from basic research to therapeutic application.
Pharmacol & Ther 2007;114:171-83.
Mortari MR, Cunha AOS
, Carolino RO, Coutinho-Netto J, Tomaz JC, Lopes NP,
Coimbra NC, dos Santos WF. Inhibition of acute nociceptive responses in
rats after i.c.v. injection of Thr
6
-bradykinin, isolated from the venom of the
social wasp, Polybia occidentalis. Br J Pharmacol 2007;151:860-9.
Gelfuso EA, Cunha AOS
, Mortari MR, Liberato JL, Paraventi KH, Beleboni RO,
Coutinho-Netto J, Lopes NP, dos Santos WF. Neuropharmacological
profile of FrPbAII, purified from the venom of the social spider Parawixia
bistriata (Araneae, Araneidae), in Wistar rats. Life Sci 2007;80(6):566-72.
Liberato JL, Cunha AOS
, Mortari MR, Gelfuso EA, de Oliveira L, Beleboni R,
Coutinho-Netto J, Dos Santos WF. Anticonvulsant and anxiolytic activity
of FrPbAII, a novel GABA uptake inhibitor isolated from the venom of the
social spider Parawixia bistriata (Araneidae: Araneae). Brain Res
2006;1124(1):19-27.
Cunha AOS, Mortari MR, Oliveira L, Carolino RO, Coutinho-Netto J, dos Santos
WF. Anticonvulsant effects of the wasp Polybia ignobilis venom on
chemically induced seizures and action on GABA and glutamate
receptors. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 2005;141:50-57.
Mortari MR, Cunha AOS
, de Oliveira L, Vieira EB, Gelfuso EA, Coutinho-Netto J,
Santos WF. Anticonvulsant and behavioural effects of the denatured
venom of the social wasp Polybia occidentalis (Polistinae, Vespidae).
Basic Clin Pharmacol Toxicol 2005;97(5), 289-95.
Mortari MR, Cunha AOS
, Oliveira L, Gelfuso EA, Vieira EB, Santos WF.
Comparative effects of the venoms from three wasp species of the
Genus Polybia (Hymenoptera, Vespidae). J Biol Sci 2005;5:449-545.
Oliverira L, Cunha AOS
, Mortari MR, Coimbra NC, Santos WF. Cataleptic acitivty
of the denatured venom of the social wasp Agelaia vicina
(Hymenoptera: Vespidae) in Rattus norvegicus (Rodentia, Muridae). Prog
Neuropsychophamacol Biol Psychiatry 2005;30(2):198-203.
Oliveira L, Cunha AOS
, Mortari MR, Pizzo AB, Miranda A, Coimbra NC, Santos
WF. Effects of microinjections of neurotoxin AvTx8, isolated from the social
wasp Agelaia vicina (Hymenoptera; Vespidae) venom, on GABAergic
nigrotectal pathways. Brain Res 2005;1031(1):74-81.
3. Artigos Submetidos
Cunha AOS
, Mortari MR, dos Santos WF. Neuroprotective effects of four
conventional antiepileptic drugs in the pilocarpine-induced Status
Epilepticus: a functional and morphological study. Submetido a revista
Brain Research em Novembro de 2007.
4. Projetos em andamento
Avaliação da atividade neuroprotetora e anticonvulsivante do composto
poliamínico FrPbAII isolado da peçonha da aranha Parawixia bistriata, em
ratos Wistar submetidos ao Status Epilepticus induzido por pilocarpina intra-
hipocampal. Projeto em andamento, FAPESP Nr 05/60254-0. Coordenador: Prof
Dr Wagner Ferreira dos Santos
Investigação de componentes antinociceptivos presentes nas peçonhas da
aranha Parawixia bistriata e da vespa Polybia occidentalis em modelos de
Fontes:
GABA, Carbamazepina e ácido nipecótico -
http://www.neurosci.pharm.utoledo.edu/MBC3320/GABA.htm
Diazepam - http://library.thinkquest.org/C0115926/drugs/sedative2.htm
Fenitoína - http://www.webalice.it/alberto.frangini/phenytoin.jpg
Cetamina - http://www.metrohealthanesthesia.com/edu/ivanes/ketamine2.htm
indução de dor por estimulação térmica e identificação de sítios de ação.
Projeto enviado ao CNPq em 21/09/2007. Edital Universal. Coordenador: Prof Dr
Wagner Ferreira dos Santos
ANEXO B
Estruturas químicas dos compostos utilizados neste trabalho comparadas à do
GABA
Ácido γ-aminobutírico – GABA
FrPbAI
Ácido Nipecótico
Diazepam
Fenitoína
Carbamazepina
Cetamina
Cauterisação feita durante o
século 15. Do livro escrito em
otomano, Cerrahiyyet'ul Haniyye.
Museu de Kork.
Jesus cura um epiléptico –
Extraído do livro das horas
“Les tres riches Heures du
Duc de Berry” escrito em
1500. Musée Condé, Paris.
Epilepticus sic curabitur –
a forma de curar a
epilepsia. Gravura de um
dos manuscritos de Hans
Sloane . De autoria
anônima datado do final do
século 12. Museu Britânico
de Londres.
São Severino de Noricum
1300. Museu Fondazzione
Horne, Florença.
Todas as obras foram copiadas do site do Museu Alemão de Epilepsia de Kork
http://www.epilepsiemuseum.de
O que é isto? – Gravura de
Wilkie Collins 1872
baseada no livro Pobre
Miss Finch, do mesmo
autor. Coleção privada.
A cortina vermelha ou
homenagem a Vincent –
pintado por um paciente
em terapia de grupo com
Van Gogh em 1965.
Museu de Kork.
A deusa asteca Tlazolteotl. Do
manuscrito “Bibliorum Sacrorum
Graecorum Codex Vaticanus B”.
Originais na Biblioteca do
Vaticano, Roma.
O simbolismo da Epilepsia
desenho de - Karlheinz
Geier 1983. Museu de
Kork.
A cura de uma mulher com
a doença que faz cair de
Henry Perche. Século 15.
Seqüência de cura.
Museu de Kork.
ANEXO C
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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