( PDF ) Efeito proloferativo do EGF em células da retina in vitro: vias de sinalização envolvidas

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RAPHAEL AMORIM DE ARAÚJO MIRANDA

EFEITO PROLIFERATIVO DO EGF EM CÉLULAS DA RETINA IN VITRO:

VIAS DE SINALIZAÇÃO ENVOLVIDAS.

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE VISANDO A

OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM

NEUROIMUNOLOGIA

Orientadora: Elizabeth Giestal de Araujo

NITERÓI

2008

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

CENTRO DE ESTUDOS GERAIS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA



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RAPHAEL AMORIM DA ARAÚJO MIRANDA

EFEITO PROLIFERATIVO DO EGF EM CÉLULAS DA RETINA IN VITRO:

VIAS DE SINALIZAÇÃO ENVOLVIDAS.

Trabalho desenvolvido no Laboratório de Cultura de Tecidos Hertha Meyer

Departamento de Neurobiologia, Programa de Neuroimunologia

Instituto de Biologia – UFF

Apoio financeiro: CAPES, CNPq, PRONEX e FAPERJ.

Dissertação de mestrado submetida à

Universidade Federal Fluminense

como requisito parcial para obtenção

do grau de Mestre em

Neuroimunologia.

Orientadora: Elizabeth Giestal de Araujo

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III

Raphael Amorim de Araújo Miranda

EFEITO PROLIFERATIVO DO EGF EM CÉLULAS DA RETINA IN VITRO:

VIAS DE SINALIZAÇÃO ENVOLVIDAS.

Dissertação de mestrado submetida à

Universidade Federal Fluminense

como requisito parcial para obtenção

do grau de mestre em

Neuroimunologia.

BANCA EXAMINADORA:

______________________________________________________________________

Dr. Carlos Frederico Leite Fontes (IbioqMed. – UFRJ)

______________________________________________________________________

Dra. Izabel Christina de Palmer Paixão Frugulhetti (UFF)

______________________________________________________________________

Dr. André Lopes Fully (UFF)

______________________________________________________________________

Dra Lidia Maria da Fonte de Amorim (UFF - revisora e suplente)

______________________________________________________________________

Dr. Roberto Paes de Carvalho (Vice-coordenador do Programa)

Miranda, Raphael Amorim de Araújo

EFEITO PROLIFERATIVO DO EGF EM CÉLULAS DA RETINA IN VITRO: VIAS

DE SINALIZAÇÃO ENVOLVIDAS. / Raphael Amorim de Araújo Miranda – Niterói:

[s. n.], 2007.

Dissertação (Mestrado em Neuroimunologia).

Universidade Federal Fluminense, 2008.

1. 2. 3. 4. 5. I. Título.



&''



“Se , a principio, a idéia não é absurda,

então não há esperança para ela. Albert Einstein”

Dedico este trabalho a

minha família. Esta

conquista é nossa.

VII

AGRADECIMENTOS

Aos Deuses, por fazerem parte e ao mesmo tempo serem o todo na

minha vida.

A minha querida Mãe, por ser o meu grande exemplo de força e de

determinação.

A minha orientadora Beth.

Aos irmãos da SECUSS, por estarem presentes em todos os

momentos.

Ao amigo e Professor Jonimar Paiva, por ter sido meu grande

incentivador a fazer este mestrado.

A amiga e fisioterapeuta Irene Conceição por ter me apresentado a

Profa. Beth.

Em especial a amiga Thais (Tatá) pela grande força com a técnica

de incorporação de Timidina.

A Aline e o Leandro pela grande ajuda com o Western Blot.

A todos os amigos do laboratório: Docinho, Babu, Karinne,

Simone, Carla, Sheila, Yolanda, pela amizade e espírito de companheirismo sempre

presente e pela ajuda pois ela foi fundamental para eu chegar até aqui.

VIII

Ao Alexandre José Fernandes, Bernardino Matheus dos Santos e

Alecsandro de Jesus pelo apoio técnico.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

XIII

ABSTRACT

XIV

Introdução

1.1

Histórico

1.2

Fator de Crescimento Epidermal

1.2.1

Efeitos gerais do EGF

1.2.2

Efeitos do EGF no Sistema Nervoso

1.3

Receptor de EGF

1.3.1

Tráfego, Endocitose e Transativação do EGFR

1.4

Vias de Sinalização Ativadas pelo EGF

1.5

Sistema Nervoso Central

1.5.1

Retina

1.5.1.1

Estrutura da Retina

1.5.1.2

Desenvolvimento da Retina

1.5.1.3

EGFR e EGF na Retina

1.6

Ciclo Celular e o Controle da Proliferação Celular

Objetivos

Materiais e Métodos

3.1

Materiais

3.2

Cultura de Células da Retina

3.3

Incorporação de [

H]-Timidina

3.4

Western Blot

3.4.1

Extração de Proteína

3.4.2

Dosagem de proteína

3.4.3

Gel de Poliacrilamida

3.4.4

Transferência das Proteínas do Gel para a Membrana de PVDF

3.4.5

Bloqueio e Imunodetecção

3.4.6

Revelação

3.4.7

Análise dos Resultados

3.5

Análise Estatística dos Resultados

Resultados

Discussão

Conclusão

Perspectivas Futuras

Bibliografia

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPc - 3`5`-adenosina monofosfato cíclico

ATP – adenosina trifosfato

BAPTA-AM - 1.2 bis(aminofenoxi)etano-N,N,N´,N´-ácido tetra acético

BDNF - fator neurotrófico derivado do cérebro

BrdU – bromodeoxiuridina

Brn3 – família de proteínas relacionada à proteína Brahma de Drosofila

BSA - albumina de soro bovino

Cdk - cinases dependentes de ciclinas

CKI - ciclinas inibidoras de cinases

CMF - solução salina sem cálcio e magnésio

CCG – camada de células ganglionares

CNI - camada nuclear interna

– dióxido de carbono

CNE - camada nuclear externa

CPE- camada plexiforme externa

CPI– camada plexiforme interna

Crk – ciclina relacionada a cinase

DAG diacilglicerol

DNA - ácido desoxirribonucléico

E – Dia embrionário

E2F – fator de transcrição (fator de alongamento 2)

EGF – Fator de crescimento epidermal

EPR - epitélio pigmentar da retina

ERK – Cinase reguladas por sinais extracelulares

Fase M – mitose

Fase S – síntese de DNA

FCS - soro fetal bovino

FGF – fator de crescimento de fibroblastos

FGFb ou FGF-2 - fator de crescimento de fibroblasto básico

G1 - Fase da interfase; primeiro intervalo, após a mitose

G2 – Fase da interfase; segundo intervalo, antes da próxima mitose

GH – hormônio de crescimento ou hormônio somatotrófico

GPR – G protein receptors (receptores que ativados se ligam à proteína G)

Grb2 – Proteína 2 ligada ao receptor de fator de crescimento

IGF-1 – fator de crescimento semelhante a insulina do tipo 1

IGF-2 - fator de crescimento semelhante à insulina do tipo 2

IGFR-1 – receptor para IGF do tipo 1

IP3 – Inositol trifosfato

IRS - substrato do receptor de insulina

JAK - família de proteínas tirosina cinases associadas a receptores de citocinas,

chamadas de Janus cinases (um grupo que inclui as seguintes cinases: JAK1, JAK2,

JAK3 e TyK2)

JNK – cinase do c jun

KD - domínio cinase

MAPK - proteína cinase ativadora de mitose

MEK – Cinase ativadora da MAP cinase

1)%– família de proteínas

XII

NGF - fator de crescimento do nervo

NT - neurotrofinas

P0 – Dia pós-natal 0

p38 MAPK – uma outra cinase da família das MAPK

p53 – proteína inibidora de tumor; proteína supressora de tumor de 53kDa

PDGF – fator de crescimento derivado de plaquetas

PE - epitélio pigmentar

PI3 - inositol-3 fosfato

PI3K – cinase do fosfaditilinositol na posição 3

PIP

- fosfatidilinositol bi-fosfato

PKA - proteína cinase A

PKC - proteína cinase C

pRb - proteína inibidora de ciclo celular ausente em de tumor do tipo retinoblastoma

Raf – cinase que ativa a MEK

Ras – proteína de um sarcoma de rato

RE - retículo endoplasmático

RNA - ácido ribonucléico

RNAm: ácido ribonucléico mensageiro

Sh2 – domínio de homologia Src

Shc - proteína semelhante ao colágeno com homologia Src

SN - sistema nervoso

SNC - sistema nervoso central

SOS – “son of sevenless”

Src – família de proteínas cinases nomeada a partir do produto do gene v-src do vírus do

sarcoma Rous; proteína de sarcoma de retina de galinha

TCA - ácido tricloroacético

Tyr – resíduo tirosina

WAF1/CIP1/p21 – gene que codifica a atividade Cdk regulatória

XIII

RESUMO

Desde a sua descoberta por Stanley Cohen em 1959, o Fator de Crescimento

Epidermal (EGF) tem sido alvo de diversos estudos. No SNC, já foi evidenciado que o

EGF é capaz de promover a diferenciação, a proliferação e a sobrevida de diferentes

populações neuronais. O objetivo do nosso trabalho foi investigar o efeito do EGF sobre

a proliferação de células da retina in vitro , bem como caracterizar as vias de sinalização

envolvidas. Nossos resultados mostraram que, em 48 horas, o EGF (1ng/mL-100ng/mL) é

capaz de aumentar a incorporação de [

H] – timidina em 200% em relação ao controle. O

efeito do EGF foi observado até o sexto dia de incubação e após o nono dia não foi mais

observado. O AG1478, o cloreto de queleretrina, o BAPTA- AM, o PD98059 e o

SB202190, foram capazes de bloquear o efeito do EGF, mostrando o envolvimento do

EGFR , de uma PKC dependente de Ca

, da MAP cinase e da p38, nas vias de

sinalização ativadas por este fator de crescimento. Foi demonstrado um aumento na

expressão da ciclina D1 em 4h e 48h após o tratamento com EGF. Nossos resultados

sugerem que o EGF seja um importante agente mitógeno para as células da retina, sendo

seu efeito mediado pela via da PKC-MAP cinase levando a um aumento na expressão da

ciclina D1.

XIV

ABSTRACT

Since its discovery in 1959 by Stanley Cohen, the Epidermal Growth Factor has

been the focus of several studies. In the CNS, it has already been shown that EGF is

able to induce differentiation, proliferation and survival of different neuronal

populations. The aim of our study was to investigate the effect of EGF on retinal cell

proliferation in vitro and analyze the intracellular pathways involved on this

phenomenon. Our results showed that EGF treatment (1ng/mL-100ng/mL) increases

the [

H]-thymidine incorporation in 200% (comparing with the control cultures) after

48h in vitro. The effect was maintained up to six days in culture. However, after nine

days the proliferative effect was abolished. The effect of EGF was inhibited by

AG1478, Chelerithrine Chloride, BAPTA-AM, PD98059 and SB202190 showing the

involvement of EGFR, PKC, MAPK and p38 in the intracellular pathways elicited by

this growth factor. We also observed an increase in the cyclin D1 expression after

treatment with EGF 1ng/mL for 4 and 48h. Our results suggest that EGF could play an

important role mitogenesis of in retinal cells through the activation of PKC-MAP kinase

pathways leading to an increase in cyclin D1 expression.

1- INTRODUÇÃO

1.1– HISTÓRICO:

O Fator de Crescimento Epidermal (EGF) é um fator trófico clássico cuja

descoberta data de 1959, quando Stanley Cohen, pôde pela primeira vez evidenciar seu

efeito. A semelhança de outros fatores descobertos na segunda metade do século

passado, a identificação do EGF ocorreu a partir de extratos de tecidos. Ao injetar

extratos de glândulas salivares de murinos, tanto em cérebro de camundongos como em

cérebro de ratos recém nascidos, Cohen observou a abertura precoce dos olhos e uma

erupção antecipada dos dentes incisivos. Este efeito se dava de forma dose dependente

pois cada vez que se dobrava a concentração do extrato injetado, mais rápido ocorria a

abertura dos olhos. Posteriormente, junto com colaboradores, Cohen conseguiu isolar

esta molécula a partir das glândulas salivares e como sua atividade estava relacionada

ao crescimento e à queratinização da epiderme, recebeu o nome de Fator de

Crescimento Epidermal (Cohen, 2004).

Figura 1: Fotografia de Stanley Cohen, responsável pela descoberta do EGF. Obtido do site:

http://nobelprize.org.

Dando continuidade às pesquisas, Cohen observou que o EGF era capaz de

aumentar a incorporação de timidina em fibroblastos humanos, o que demonstrava seu

efeito proliferativo. Na mesma época ele também evidenciou que a urogastrona, um

polipeptídio isolado da urina humana, apresentava 70% de homologia com a molécula

do EGF de camundongos. Um dado interessante diz respeito ao fato de que tanto o

EGF como a urogastrona serem capazes de inibir a secreção de ácidos estomacais e de

promover a proliferação de fibroblastos. Estudos posteriores constataram que a

urogastrona de fato é o EGF e consideraram esta molécula como sendo o EGF humano

(Cohen, 2004).

1.2 – FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL

A semelhança de outros polipeptídeos, o EGF é inicialmente sintetizado na

forma de um precursor, que se apresenta como uma glicoproteína transmembrana

contendo uma de cadeia de 1217 aminoácidos e um peso molecular entre 140 e 150

KDa. Uma característica interessante no processo de sinalização é que o precursor do

EGF, compete com o EGF maduro, pelo sítio de ligação com o receptor, sendo capaz

de ativá-lo e desencadear cascatas de sinalização intracelulares (Wong e Guillaud, 2004,

para revisão).

O EGF na sua forma madura, é um polipeptídio constituído de 53 resíduos de

aminoácidos, dentre os quais 6 são resíduos de cisteína altamente conservados e que

estabelecem pontes de cistina (figura 2). Estas pontes conferem à molécula uma

estrutura secundária fundamental para a manutenção de sua atividade biológica (Harris

et al., 2003, para revisão;

Freeman et al., 2007

)

Figura 2

: Estrutura do EGF mostrando as 3 pontes dissulfeto (linhas brancas), ligando os 6

resíduos cisteína, obtido do site:

http://

www.kent.ac.uk.

Este fator trófico pertence a uma família de fatores de crescimento

estruturalmente relacionados, denominada família EGF. A ela pertencem o EGF, o Fator

de Crescimento e de Transformação . 7*). D $QILUUHJXOLQD $5WDPEém conhecido

com fator de crescimento derivado de Schwannoma), o EGF ligado à Heparina (HB-

EGF), a Betacelulina (BTC), a Epirregulina (EPR) e a Heregulina ou Neuregulina

(também conhecida como fator de diferenciação Neu). Todas estas moléculas contém

uma estrutura compacta que apresenta 3 alças conservadas ligadas por pontes dissulfeto.

Esta região é conhecida como domínio comum ao EGF e contém uma seqüência de

aproximadamente 50 aminoácidos com cerca de 26% a 50% de homologia entre os

diferentes membros (Rowinsky, 2004, para revisão e Chen et al., 2007).

Assim como o EGF, todos os outros fatores da família EGF são sintetizados

inicialmente na forma de precursores, como uma proteína transmembrana. A partir da

ação de proteases, são clivados em seus ectodomínios e liberados na forma solúvel

(madura) (Xian e Zhou 2004, para revisão; Rowinsky 2004, para revisão e Chen et al.,

2007). Em geral, acredita-se que os membros da família de proteases ADAM sejam

responsáveis pela clivagem dos membros da família EGF na superfície celular (Hsieh e

Conti 2005, para revisão). Entretanto, metaloproteinases também são capazes de

promover a liberação destes fatores. Uma vez liberados da superfície celular, estes

fatores são capazes de ativar a própria célula (mecanismo de sinalização autócrina), ou

células adjacentes (sinalização parácrina)

(Stirnweiss et al., 2005).

1. 2.1 – Efeitos gerais do EGF

O EGF é capaz de promover a proliferação e a diferenciação em vários tecidos

tanto de origem mesodérmica quanto ectodérmica. Sua grande importância pode ser

avaliada pelo fato de sua ausência ou mesmo a diminuição na sua expressão promover

anormalidades em múltiplos órgãos o que caracteriza o efeito ubíquo desta molécula

(Henson e Gibson, 2006 para revisão). Os outros membros pertencentes à família EGF

também apresentam importante papel durante o desenvolvimento, uma vez que,

camundongos com triplo “knockout” para EGF, TGF. e Anfirregulina apresentaram

alvéolos pouco organizados e diferenciados, defeitos nos olhos, acelerada perda de peso

e pêlos, dermatites, ulcerações na pele e retardo no crescimento (Wong, 2006 para

revisão).

O EGF está presente em muitos tipos celulares incluindo: fibroblastos, células

do endotélio vascular, células epiteliais, bem como em vários fluidos corporais como

sangue, urina e saliva. Dependendo do tipo celular e do estado de diferenciação, o EGF

pode tanto estimular quanto inibir a proliferação. Além disso, o EGF é capaz de regular

diversas atividades biológicas e metabólicas (Gobin e West, 2003).

Células tronco embrionárias de camundongos aumentam a proliferação quando

tratadas com EGF. Este efeito se dá através da estimulação de várias cascatas de

sinalização, incluindo a participação da PLC e PKC, o influxo de Ca

e a ativação da

MAP cinase 44/42. Igualmente ocorre a ativação de proteínas do ciclo celular como a

ciclina D1, a ciclina E, a CDK2 e a CDK4 (Heo et al., 2005).

O EGF é capaz de estimular a diferenciação de trofoblastos, através do aumento

da produção de gonadotrofina--coriônica, a qual age de forma autócrina estimulando a

diferenciação. Sendo assim, a ação do EGF se dá de forma indireta. Segundo Johnstone

e colaboradores em 2005, este efeito se dá através da via da MAP cinase p38, pois

bloqueando esta via, ocorre a inibição da diferenciação estimulada pelo EGF.

Srivastava e St-Louis em 1997 demonstraram que fatores tróficos como o PDGF

(Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas) e o EGF são capazes de induzir a

contração da musculatura gástrica, sendo este efeito dose-dependente e mediado por

tirosinas cinases citoplasmáticas. Em culturas de hepatócitos o EGF foi capaz de induzir

a proliferação após 24 - 48h em cultura, sendo este efeito mediado pela ativação da via

da MAP cinase (Guren et al., 1999).

O EGF também tem ação sobre a musculatura lisa dos brônquios, induzindo a

sua proliferação. Para que este efeito se estabeleça é necessário a ativação da via da

MAP cinase. É interessante ressaltar que ratos asmáticos parecem apresentar um

desbalanço na sinalização do EGF o que leva a proliferação da musculatura dos

brônquios (Jing et al., 2007).

O RNAm para o pro-EGF já foi identificado no rim, glândulas submaxilares,

duodeno e pâncreas, sendo que o rim e as glândulas submaxilares apresentaram níveis

de expressão maiores. No rim, o EGF está envolvido em diversas funções como, inibir a

reabsorção de sódio em túbulos coletores e a gliconeogênese em células dos túbulos

proximais e também diminuir a filtração glomerular e o fluxo plasmático renal. Esses

resultados foram obtidos tanto in vitro, quanto in vivo

(Coimbra, 1997, para revisão). O

EGF também participa da regulação do níveis de Mg

nos túbulos contornados distais

do rim. Muallem e Moe em 2007 sugeriram que o EGF seja um hormônio regulador do

, pois de uma forma parácrina e/ou autócrina, regula a reabsorção e a concentração

na urina deste cátion, através da regulação dos canais TRPM6 permeáveis ao Mg

presente na membrana das células dos túbulos contornados distais.

Vários fatores da família EGF, como o próprio EGF, o TGF. H R +%-EGF estão

presentes durante o processo de cicatrização tecidual e desempenham um importante

papel na promoção da migração de fibroblastos. Segundo Gobin and West em 2003,

estes efeitos do EGF são independentes da proliferação celular e estão relacionados com

o aumento de lamelopodias e alterações na geometria da membrana (formação de

ondulações). Tem sido demonstrado que fatores de crescimento como o PDGF e o EGF

são importantes mediadores do processo de cicatrização tecidual. O tratamento com

estes fatores, em pacientes com úlceras diabéticas e de compressão, já mostraram efeitos

benéficos (Yin et al., 2007).

Em células aderentes, ligantes solúveis, como o EGF e o PDGF ativam

receptores do tipo tirosina cinase que medeiam uma cascata de eventos de sinalização

“downstream” envolvendo a estimulação de receptores para integrinas e a conseqüente

adesão à matriz extracelular (Cabodi et al., 2004).

O EGF também é capaz de estimular

a força contrátil de fibroblastos através do gel de colágeno, em um mecanismo

dependente da ligação aos seus receptores e da participação do citoesqueleto (Smith et

al., 2006).

O receptor de EGF é super-expresso em vários tipos de cânceres, como em

várias linhagens de células tumorais. A linhagem de células de carcinoma epidermal

A431, também apresenta a expressão deste receptor aumentada, porém altas doses do

EGF (> 200ng/ml) induzem uma inibição do crescimento celular, sendo parte deste

HIHLWRPHGLDGRSHOD3.&/HSHOR1)d%8P GDGRLQWHUHVVDQWHIRLREWLGRSRU*UXGLQNLQ

e colaboradores em 2007, que mostrou o efeito apoptótico do EGF em células da

linhagem A431 quando o tratamento foi feito com altas doses; sendo este efeito

mediado pela STAT1.

Decker em 1995, compararam os efeitos do EGF com os efeitos do NGF em

células NIH-3T3. Os autores observaram que estes fatores induziam efeitos distintos.

Enquanto o EGF era capaz de induzir proliferação, o NGF era capaz de promover a

parada do crescimento e a diferenciação. Os estudos visando esclarecer estes resultados

opostos mostraram que o efeito mitogênico do EGF dependia da ativação transiente da

MAP cinase e o efeito do NGF era mediado pela ativação sustentada desta enzima. De

acordo com Kholodenko em 2007 as diferenças na ativação da MAP cinase, regulando a

resposta da célula, poderia ser explicado através de um mecanismo de feedback positivo

ou negativo na regulação da Raf-1 pela Erk1/2. O feedback positivo da Raf-1,

promoveria uma ativação sustentada da Erk1/2 e a diferenciação celular, enquanto o

feedback negativo, promoveria uma ativação transitória e a proliferação celular.

1.2.2 – Efeitos do EGF no Sistema Nervoso

Tanto o EGF, quanto os membros da sua família, já tiveram suas ações descritas

durante o desenvolvimento e a maturação do sistema nervoso. Estes fatores são capazes

de regular os mecanismos de sobrevida, de proliferação, de regeneração e de

diferenciação de populações de células neuronais (Gomes et al., 2001, para revisão;

Weuste et al., 2006). O RNAm de EGF foi identificado a partir do 14º dia embrionário

até o período pós-natal em todas as regiões do encéfalo, incluindo tronco cerebral,

cerebelo, córtex cerebral, hipocampo, tálamo, hipotálamo, bulbo olfatório e estriatum,

sendo os maiores níveis encontrado no bulbo olfatório, hipotálamo e cerebelo (Wong e

Guillaud, 2004 para revisão).

Fatores tróficos pertencentes à família EGF, TGF e FGF são secretados por

astrócitos. Cultura de astrócitos cerebelares tratados com o hormônio tireoidiano T3, são

capazes de produzir EGF e promover a proliferação desta população (Gomes, et al.,

2001 para revisão). O tratamento de astrócitos com EGF por 24h foi capaz de aumentar

os níveis de expressão do RNAm do receptor de IL-4 (Interleucina 4) nestas células.

Com o aumento na expressão destes receptores ocorre uma diminuição do efeito

proliferativo do EGF. Assim podemos constatar que o próprio EGF regula o seu efeito

proliferativo (Barna et al., 2001).

Koprovica e colaboradores, em 2005, mostraram que o EGF e o seu receptor

estão envolvidos nos processos de regeneração axonal, pois bloqueando a atividade

cinase do EGFR, houve uma inibição da mielinização e do crescimento axonal em

células granulares do cerebelo.

O EGF é capaz de aumentar a sobrevida de progenitores neurais “in vitro”, como

também estimular diferentes respostas celulares durante os estágios do desenvolvimento

neural (Walder e Ferretti, 2004). Em mamíferos são encontradas duas áreas do Sistema

Nervoso Central (SNC) que apresentam contínua neurogênese: a zona subventricular e o

giro dentado da formação hipocampal. Dados da literatura mostram que quando o EGF

e o FGFb são aplicados previamente a um episódio isquêmico, as células precursoras

neurais destas regiões aumentam tanto a taxa de proliferação como a de diferenciação

(Baldauf e Reymann, 2005). Porém, Laskowski e colaboradores, em 2005, mostraram

que o tratamento pós-isquemia com EGF induz aumento na proliferação, mas não na

neurogênese, na região do giro dentado. O tratamento concomitante de EGF e FGFb não

foi capaz de induzir neurogênese. Apenas foi verificado o efeito proliferativo.

Glaser e colaboradores, em 2007, definiram células tronco neurais como células

clone capazes de se auto-renovar e com potencial de se diferenciar em três principais

tipos de células do sistema nervoso central: neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.

Estas células podem ser isoladas do sistema nervoso central tanto de adultos como de

fetos. Células tronco têm a característica de se agrupar formando as neuroesferas,

capazes de proliferar tanto na presença de EGF quanto de FGFb. Para obter uma

população de oligodendrócitos inicialmente houve o tratamento das células tronco com

EGF, FGFb, PDGF e forskolina; e posteriormente um tratamento com hormônio

tireoideano T3 e com ácido ascórbico para induzir a diferenciação destas células.

Walder e Ferretti em 2004 trataram tanto culturas de células tronco derivadas da

medula em diferentes estágios do desenvolvimento (56, 60 e 88 dias) como culturas de

precursores neuronais de embriões humanos no 40º, 52º, 54º e 56º dia de gestação, com

EGF e FGFb e analisaram a formação de colônias. O tratamento com os fatores isolados

induziram resultados diferentes na capacidade de formar colônias. Entretanto o

tratamento concomitante com EGF e FGFb potenciou os efeitos. Estes resultados

sugerem que estes fatores podem estar agindo em diferentes populações de células –

tronco multipotentes derivadas da medula.

O tratamento das células precursoras cerebrais corticais com agonistas do

receptor D1 de dopamina inibiu os efeitos proliferativos induzidos pelo EGF, através da

regulação da atividade das proteínas ciclina D1 e p27 que estão relacionadas com

ativação e supressão da transição do ciclo celular respectivamente. Estes achados

sugerem a existência de uma rede de efeitos que competem pela progressão ou inibição

das mudanças no ciclo celular (Zhang et al., 2004).

Além do efeito proliferativo, algumas células tronco neurais derivadas do

cérebro também dependem do EGF para sobreviver em cultura, pois a retirada deste

fator trófico induz a apoptose. Este efeito se dá através de um mecanismo relacionado à

via da Bcl-2. De forma similar, uma linhagem de células multipotentes do mesencéfalo

de camundongos é capaz de liberar EGF o que mantém a sobrevida desta população

(Xian e Zhou 2004, para revisão).

Acredita-se que a regulação do ciclo circadiano esteja relacionada com liberação

de fatores que agem localmente dentro do hipotálamo. Embora EGF não seja

encontrado no hipotálamo de hamsteres adultos, como acontece com o seu receptor e o

7*)., a infusão de ambos os fatores dentro do terceiro ventrículo, interrompeu a

atividade do ciclo circadiano de sono e vigila, efeito este mediado pelo EGFR (Kramer

et al., 2001).

Toyoda e colaboradores, em 2007, observaram uma diminuição significativa dos

níveis séricos do EGF, TGF-1 e HGF (fator de crescimento de hepatócitos) em

pacientes autistas, quando comparado ao grupo controle. Igualmente observaram uma

alteração ao nível do gene do EGF. Pacientes com esquizofrenia também mostraram um

nível de EGF abaixo do normal quando comparados ao grupo controle.

1. 3 – RECEPTOR DE EGF:

O receptor de EGF (EGFR) foi o primeiro receptor do tipo tirosina cinase a ser

descoberto e continua a ser investigado como um dos principais modelos de estudo para

os receptores do tipo tirosina cinase (Barnes e Kumar, 2003 para revisão).

O EGFR é uma proteína de 170KDa que transpassa uma única vez a membrana

plasmática. Sua cadeia polipeptídica tem peso de 130KDa e à porção N-terminal estão

ligados oligossacarídeos. Este receptor primeiramente é sintetizado no retículo

endoplasmático na sua forma precursora com peso molecular de 160 KDa e é

processado na sua forma madura, através da ligação a oligossacarídeos (170KDa). A

adição de oligossacarídeos na porção N permite que o precursor do EGFR seja

translocado do reticulo para a membrana celular, bem como, que o EGF se ligue e ative

seu receptor (Slieker et al., 1986).

Em células normais, a expressão do EGFR varia entre 40.000 a 100.000

receptores por célula. Camundongos “knockout” para este receptor morrem ainda na

fase de gestação ou morrem durante os primeiros dias pós-natais. Os animais que

conseguem nascer, apresentam anomalias na pele, no trato gastrintestinal, nos pulmões,

na fenda palpebral e nos dentes (Wong, 2006 para revisão). Por outro lado, o receptor

de EGF é altamente expresso na maioria dos tumores sólidos, incluindo câncer de:

mama, cabeça e pescoço, ovário, rins, cólon e em carcinoma pulmonar de pequenas

células. Em alguns cânceres de mama a expressão do EGFR pode ultrapassar 2x10

moléculas por célula. Tal super-expressão, promove uma intensa sinalização e ativação

de vias “downstream”, resultando em células que possuem uma proliferação

descontrolada com características muito invasivas (Herbst, 2004).

O produto oncogênico da eritroblastose aviária (v-ErbB), tem o domínio

transmembrana e o domínio intracelular tirosina cinase derivado do EGFR de aves, o

que confere uma grande homologia com o EGFR. Por este motivo o EGFR é também

chamado de ErbB1 (Wong e Guillaud, 2004, para revisão). Três outros receptores

semelhantes ao EGFR, já foram identificados, compreendendo então quatro receptores

transmembrana tirosina cinase: ErbB1 ou EGFR, ErbB2 ou HER2, ErbB3 ou HER3,

ErbB4 ou HER4, formando a família EGFR, ou família de receptores ErbB, ou família

de receptores HER (receptor epidermal humano) (Barnes e Kumar, 2003 para revisão,

Toshi e Cappuzzo, 2007 para revisão e Schlessinger, 2002 para revisão).

Já foi descrita a presença tanto do EGFR como do ErbB2 nas regiões de “lipid

rafts”. Freeman e colaboradores relataram, em 2007, que os sítios de fosforilação no

domínio citoplasmático do EGFR são diferentemente sensíveis dependendo da

concentração de colesterol na membrana celular. A ativação do EGFR, também pode

alterar o ambiente dos “lipids rafts”, promovendo a formação de caveolinas

oligoméricas na membrana plasmática o que direciona os mecanismos de sinalização

citoplasmáticos.

Estes receptores têm em comum um domínio extracelular rico em cisteína

responsável pela ligação com o EGF, um único domínio transmembrana e um domínio

tirosina cinase citoplasmático o qual é responsável pela geração e regulação da

sinalização intracelular (Barnes e Kumar, 2003 para revisão e Hsieh e Conti, 2005 para

revisão). O domínio extracelular é composto de 4 subdomínios (I, II, III e IV ou L1,

CR1, L2, CR2, respectivamente) e foi proposto que os subdomínios I e III formem o

sítio de ligação para o ligante, enquanto os outros medeiam a dimerização do receptor e

interações com outras proteínas (Schlessinger, 2002; para revisão).

Os receptores ErbB existem tanto na forma de monômeros quanto dímeros, e

podem formar tanto homodímeros quanto heterodímeros. A ligação de EGF com ErbB1

permite que este receptor se ligue aos outros membros da família ErbB, formando

heterodímeros (Henson e Gibson, 2006 para revisão). Embora ErbB2 não tenha nenhum

ligante conhecido, ele pode também formar heterodímeros com outros receptores ErbB

e potencializar o complexo de sinalização (Henson e Gibson, 2006 para revisão, Barnes

e Kumar, 2003 para revisão e Hsieh e Conti, 2005 para revisão). Quanto ao receptor

ErbB3, este tem uma atividade cinase que só se torna ativa quando associada com outro

receptor da famíla ErbB. Os receptores ErbB2 e ErbB3 são chamados também de co-

receptores (Hsieh e Conti, 2005 para revisão).

Diferentes ligantes pertencentes à família EGF de fatores tróficos também são

capazes de se ligar ao EGFR, ativá-lo e induzir cascatas de sinalização intracelulares.

(Toshi e Cappuzzo, 2007 para revisão, Hsieh e Conti, 2005 para revisão). Esta família

então, é dividida em 3 grupos (tabela 1, figura 3) de acordo com os receptores ao qual

são capazes de se ligar. O grupo 1 se liga especificamente ao EGFR e é formado pelo

(*) 7*). H GD $QILUUHJXOLQD 2 JUXSR  FRPSUHHQGHDV1HXUHJXOLQDVTXH VH OLJDP

tanto ao ErbB3 quanto ao ErbB4. Já o grupo 3 é formado pelo HB-EGF, pela

Betacelluina e pela Epirregulina que se ligam tanto ao EGFR, quanto ao ErbB4 (Hsieh e

Conti, 2005 para revisão). Estas interações trans-regulatórias podem ser mediadas

através das ligações aos receptores, da direta fosforilação dos receptores por proteínas

tirosina cinase e por padrões de heterodimerização e transativação dos receptores ErbB

(Barnes e Kumar, 2003 para revisão).

GRUPO

LIGANTES

RECEPTORES

(*)7*).

ANFIRREGULINA.

Apenas EGFR (ErbB1 ou

HER1)

NEUREGULINAS

ErbB3 e ErbB4

III

HB-EGF,

BETACELULINA E

EPIRREGULINA.

Tanto EGFR quanto ErbB4

Tabela 1:

Grupos de divisão da Família EGF de Fatores Tróficos. Adaptado de Wong e Guillaud (2004).

Figura 3: Representação esquemátca divisão em grupos da Família EGF de fatores troficos (A) e seus

respectivos receptores ativados (B). Adaptado de Wong e Guillaud (2004), para revisão.

Como muitos ligantes são capazes de ativar o mesmo receptor é evidente a

redundância que ocorre neste processo de sinalização. ApesDU GR (*) H GR 7*).VHUHP

quase indistinguíveis no que concerne à ligação ao receptor, à sua ativação e até mesmo

ao processo de “downregulation”, é interessante salientar que dependendo da célula em

questão, as atividades biológicas diferem. Já a Epirregulina a Neuregulina, embora se

liguem a receptores distintos, induzem respostas semelhantes (Rowinsky, 2004, para

revisão).

EGF

TGF

NEU

EGFR

ErbB1

EPR BTC HB-EGF

ErbB4

HER4

ErbB3 ErbB2

Espaço Extracelular

Espaço Intracelular

Espaço Extracelular

Espaço Intracelular

O EGF ao se ligar ao receptor, proporciona respostas celulares que dependem

tanto da concentração desta molécula no meio, como do nível de expressão do seu

receptor (Henson e Gibson, 2006 para revisão). O EGF se liga ao seu receptor de duas

maneiras distintas. Em 95-98% dos casos a ligação é de alta afinidade (KD=10nM) e em

2-5% dos casos a ligação é de baixa afinidade (KD=0,1nM) (Schlessinger, 2002 para

revisão).

Após a ligação do EGF, ocorre a formação de diferentes homodímeros ou

heterodímeros, tendo como conseqüência, a ativação do domínio tirosina cinase

citoplasmático. Conseqüentemente ocorre a fosforilação de resíduos de tirosina que vão

estimular diferentes cascatas de sinalização. O EGF pode estimular a fosforilação de

ErbB2 através da formação do heterodímero EGFR/ErbB2 (Wong e Guillaund, 2004,

para revisão). Isto é possível, pois todos os membros da família EGFR possuem a alça

de dimerização altamente conservada, sendo ErbB2 considerado padrão de

heterodimerização entre todos os outros membros da família de receptores

(Schlessinger, 2002, para revisão). Estes resíduos tirosina citoplasmático servem como

sítio de ligação para vária moléculas, que são recrutadas e permitem a ativação de

diferentes vias intracelulares

(Holbro and. Hynes, 2004; para revisão)

A dimerização dos EGFR requer a ligação de duas moléculas do ligante para

duas moléculas do receptor, formando um complexo estável 2:2 / EGF:EGFR (Barnes e

Kumar, 2003 para revisão, Schlessinger, 2002 para revisão). Cada molécula se liga

entre os domínios L1 e L2 do mesmo receptor e faz contato apenas com um receptor do

dímero. Neste complexo 2:2, os dois ligantes estão localizados em lados opostos e

quando ativa a unidade L1-CR1 sofre uma alteração conformacional e é deslocada para

longe do domínio CR2. Desta forma, esta unidade é estabilizada em uma configuração

na qual as alças CR1 e CR2 do EGFR são ambos expostos e posicionados para interagir

em um padrão ativado, onde os receptores adotam uma configuração “back-to-back”

com a interface do dímero sendo formada apenas pelo contato EGFR:EGFR,

envolvendo a longa alça do domínio CR1 e o terminal carboxi do domínio CR2

(Schlessinger 2002, para revisão; Barnes e Kumar, 2003 para revisão; Gobin and West

2003)

1. 3.1 - Tráfego, Endocitose e Transativação do EGFR:

A sinalização dos receptores de EGF deve ocorrer de forma pontual para evitar o

estímulo crônico das células. A prolongada ativação do receptor de EGF resulta em

amplificação do sinal do receptor, que pode induzir a translocação cromossomal, ou

pontos de mutação que estão associados com desenvolvimento e progressão de vários

tumores. Neste sentido, um grande número de controles de “feedback” ajudam a atenuar

estes efeitos, incluindo a fosforilação de resíduos serina/treonina do receptor ou seus

substratos, a ativação de fosfatases e a endocitose (Martin et al., 2006).

Os receptores de EGF são removidos da superfície celular via endocitose e

subsequente degradação. O complexo EGF – EGFR agrupam-se em “clusteres” nos

“coated pits” e depois são internalizados e degradados nos lisossomas, resultando em

uma “downregulation” do EGFR. O processo de internalização do EGFR induzida pelo

EGF necessita da atividade tirosina cinase intrínseca e de fosforilação de outros sítios

específicos do receptor (Wong e Guillard, 2004 para revisão). Em fibroblastos o

receptor de EGF está localizado nas “caveolas/rafts” e sai deste compartimento após a

estimulação com EGF. Assim, sob estimulação com EGF, o receptor é recrutado para os

“coated pits” que também contém domínios rafts, sugerindo que diferentes vias podem

estar contribuindo para o tráfego intracelular do EGFR (Balbis et al., 2007).

Após a internalização, este complexo EGF – EGFR aparece sequencialmente nos

endossomas primários. Existe um grande número de evidências mostrando que a

ativação da cinase não acontece apenas na membrana plasmática, mas também nos

endossomas, pois várias proteínas, incluindo a Grb2, a Shc e a mSOS foram localizadas

nestas organelas logo após a ativação do EGFR. Desta forma a ativação do EGFR pode

regular a propagação e amplificação do sinal e estar regulando espacialmente e

temporalmente cascatas de sinalização (Vergarajuaregui et al., 2006; Balbis et al.,

2007). Durante a passagem por estes compartimentos, estes complexos podem tanto ser

reciclados e retornar para a superfície celular; como podem seguir em direção aos

endossomas tardios e lisossomas, onde tanto o EGF quanto o seu receptor são

proteoliticamente degradados (Sorkin, 2001).

A anisomicina é um importante antibiótico capaz de ativar cascatas da MAP

cinase em células de mamíferos, principalmente os seus subtipos relacionados com a

ativação após stress. Veragarajuareguie e colaboradores,

em 2006, relatam que este

antibiótico pode ativar a MAP cinase p38 e induzir a internalização do EGFR, embora o

mecanismo de endocitose seja diferente do empregado pelo próprio EGF, pois não

necessita da atividade cinase nem da ubiquitinação do EGFR. Outro efeito observado

por estes autores, foi que o tratamento com a anisomicina não resultou na degradação do

receptor de EGF pelo lisossomas tardios.

O EGFR endocitado pode ser translocado para o núcleo, porém este tráfego é

dependente da ligação do EGF e da participação da importina- SDUD SURPRYHU D

ativação da ciclina D e de outros genes. Liao e Carpenter em 2007 demonstram em

linhagens de células de câncer de mama MDA-MB-468, a translocação dos receptores

para o retículo endoplasmático após a adição do EGF. Nesta organela ocorre a

associação com Sec61, um componente da proteína translocadora translocon Sec61, e

na seqüência o complexo é retranslocado do retículo endoplasmático para o citoplasma.

Embora não se tenha idéia da função deste translocon na via de sinalização do EGFR, a

função deste está relacionada com a inserção de proteínas secretadas e transmembrana

dentro do reticulo ou retranslocar deste local para o citoplasma como parte da via de

degradação do reticulo endoplasmático. No citoplasma o EGFR se associa com a

importina-Hé direcionado para o núcleo onde pode ativar a ciclina D.

Um feedback negativo através da fosforilação do EGFR pela PKC pode ter um

importante papel na downregulation da atividade do receptor. A fosforilação da PKC na

treonina 654 do EGFR diminui a afinidade pelo EGF, reduzindo assim a atividade

tirosina cinase e autofosforilação deste receptor (Wong e Guillard, 2004 para revisão).

Numerosos estudos têm mostrado que receptores ligados à proteína G (GPCR),

podem utilizar receptores do tipo tirosina cinase, como por exemplo, o EGFR, como

uma proteína intermediária sinalizadora que “imitaria” a sinalização de vias

"downstream” do EGFR. A estimulação de vários GPCR com seus agonistas resulta em

autofosforilação do EGFR e consequentemente, na geração e transdução do sinal de

proteínas como a ERK1/2, PLC 3, FLQDVH$NW 3UHYLDPHQWH GHVLJQDGR FRPR

transativação independente do ligante, e posteriormente como via de sinalização com

tripla passagem pela membrana (Hsieh e Conti, 2005 para revisão e Stirnweiss et al.,

2006). A partir de 1999 foi considerado como um mecanismo de ativação dos EGFR o

processo de transativação (Stirnweiss et al., 2006).

Enquanto a transativação do EGFR pode ocorrer pela interação direta dos GPCR

ou pela fosforilação da EGFR mediada pela proteína Src, o mecanismo predominante

parece envolver a liberação de fatores semelhantes ao EGF da superfície celular

mediado por proteases da família ADAMs (Hassan et al., 2004) ou por

metaloproteinases, ativando o EGFR de forma parácrina e ou autócrina (Stirnweiss et

al., 2006). O mecanismo de sinalização envolve basicamente a fosforilação do EGFR e

a ativação da via da Ras – MAP cinase. Outras proteínas também podem estar

envolvidas como, por exemplo, a ativação da PI3 – cinase recrutando a Ras para a

membrana celular e também ativando membros específicos da família da PKC. A PKC

também está envolvida nos mecanismos que levam à ativação da Raf (Hassan et al.,

2004).

A transativação do EGRF após a ativação de GPCR já foi descrita em vários

modelos de estudo. Hassan e colaboradores, em

2004, mostraram em células PC12 que

o efeito proliferativo mediado pela neurotensina em cânceres de próstata poderia ser

gerado através da ativação de metaloproteinases, liberação do HB-EGF e ligação deste

fator trófico ao seu receptor. O mesmo foi demonstrado por Stirnewiss e colaboradores,

em 2005, em células Cos-7, através dos receptores muscarínicos M2, com o

envolvimento da proteína Fyn, porém sem a participação das metaloproteinases.

Cabodi e colaboradores, em 2004, mostraram que a adesão à matriz celular

dependente das integrinas (receptores de adesão, formados pelas subunidades . H  TXH

funcionam ancorando proteínas de matriz para a actina do citoesqueleto), que após a sua

ativação, inicia a transativação do EGFR, ativando vias de sinalização downstrean ao

receptor. Os autores demonstraram também que as integrinas cooperam com a

sinalização do EGF, sugerindo assim uma relação entre a adesão à matriz celular e o

EGFR para induzir respostas biológicas.

Foi proposto por Yin e colaboradores, em 2007, que a lesão do epitélio da

córnea, resulta em liberação de ATP pelas células lesadas, promovendo a ativação dos

receptores PY2, nas células não danificadas. Esta ativação promoveria a genêse de

ondas de Ca

capazes de ativar as proteínas ADAMs, que clivariam o pró-HB-EGF

ligado a membrana celular, liberando este fator trófico na sua forma madura que ativaria

o EGFR de forma parácrina e/ou autócrina. Após a estimulação do EGFR, ocorreria a

sinalização de vias downstream como a PI3-cinase e a Erk que mediariam respostas de

migração e proliferação celular responsáveis por promover a cicatrização tecidual.

Vários autores mostraram a transativação do EGFR em diferentes linhagens

celulares, sendo que neste efeito, não estariam envolvidas as metaloproteinases.

Haas e

colaboradores, em 2002, mostraram nas células A7r5 que a ligação da ouabaína a

Na+/K+ - ATPase é capaz de transativar o EGFR através da ativação da proteína Src. O

receptor de EGF uma vez ativado recrutaria proteínas adaptadoras como a Grb2

ativando a via da MAP cinase. Em células DU145, o IGF-1 é capaz de ativar o EGFR,

mas os resultados sugerem que neste mecanismo a produção basal intracelular de H

tenha um importante papel. Embora o IGF-1 não tenha induzido um aumento na

produção intracelular de H

, este oxidante foi necessário para a ativação do receptor

de EGF, pois a adição de anti-oxidantes ao meio de cultura bloqueou este efeito (Zhou

et al., 2006).

1.4 - VIAS DE SINALIZAÇÃO ATIVADAS PELO EGF:

A seqüência de aminoácidos no terminal carboxi dos receptores de EGF contem

resíduos tirosina que quando fosforilados servem como sítio de ligação para diferentes

proteínas. Algumas destas proteínas apresentam atividade catalítica, enquanto outras

servem como proteínas adaptadoras, ligando o receptor a enzimas envolvidas na

transdução do sinal, conforme mostrado na figura 4 (Sorkin 2001). Segundo Uetz e

Stagljar em 2006 cada fosfotirosina do EGFR se liga a sete proteínas diferentes,

enquanto ErbB2, ErbB3 e ErbB4 se ligam a 17, 9 e 2 proteínas respectivamente.

Após a ligação do EGF, ocorre a dimerização do receptor e a transfosforilação

dos resíduos tirosinas. A partir destes sítios fosforilados se dá a ativação de diferentes

proteínas tais como: Grb2, Shc, tirosinas cinases da família Src, PI3-cinase, fosfolipase-

&3/&-DN67$70DUWLQHWDO*UXGLQNLQHWDO

A transfosforilação do EGFR é capaz de ativar a proteína Grb2 através de seu

domínio SH2, enquanto o domínio SH3 desta proteína promove a associação com o

fator de troca de nucleotídeo Sos, recrutando assim, o complexo Grb2–Sos para a

membrana plasmática em proximidade à proteína Ras ancorada na camada interna da

membrana plasmática. A Sos então, estimula a troca do nucleotídeo GDP para GTP,

resultando na formação de um complexo Ras-GTP que é ativo

(Sorkin 2001, Gale et al.,

1993).

A Ras ativada estimula a cascata das proteínas cinases ativadas por mitógenos

(MAPK), que são uma superfamília de proteínas cinases serina-treonina. Sendo assim,

a Ras ativa a Raf-1 (MAPKKK - proteína cinase cinase cinase ativada por mitógeno),

que por sua vez fosforila e ativa a MEK1/2 (MAPKK - proteína cinase cinase ativada

por mitógeno). A MEK 1/2 fosforila e ativa a cinase regulada por sinal extracelular

(ERK 1/2). As MAPKs podem translocar para o núcleo, ativar fatores de transcrição e

regular a expressão gênica (Henson e Gibson, 2006 para revisão). Esta via de

sinalização é uma das mais bem caracterizadas nos efeitos induzidos pelo EGF (Sorkin

2001), embora dependendo do sistema celular e do estímulo utilizado, outras MAPKs

também possam contribuir para os efeitos proliferativos (Hollborn et al., 2005). A via

da MAPK também está envolvida no aumento dos níveis da ciclina D induzida pelo

EGF. A ciclina D é um alvo primário regulador do ciclo celular, influenciando na

atividade mitogênica induzida por fatores de crescimento, pelo fato de promover a

progressão da fase G1 para fase S (Zhang et al., 2004).

Já foi demonstrado que o EGFR possui um sítio de ligação capaz de ativar a

3/&4XDQGRHVWHUHFHSWRUDWLYDD3/& catalisa a hidrólise do fosfolipídio fosfatidil-

inositol 4,5 bifosfato, em diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP

) (Heo, et

al., 2005). O DAG é um ativador fisiológico da proteína cinase C (PKC), enquanto o IP

induz a liberação de cálcio dos estoques citoplasmáticos, contribuindo nos processos

intracelulares regulados pelo cálcio. A PKC também pode estimular a via da ERK,

através da ativação da Raf-1 – MEK 1/2 – ERK 1/2, induzindo efeitos mitogênicos

(Hassan et al., 2004).

Entre as diferentes classes de PKC, a classe convencional requer, para a sua

ativação, a participação tanto do cálcio quanto do DAG. Estas proteínas estão

freqüentemente envolvidas com efeitos proliferativos. Já a classe atípica, que não

necessita do cálcio para a sua ativação, está muitas vezes envolvida com efeitos de

sobrevida. Embora estes efeitos já tenham sido bem descritos na literatura, células-

tronco derivadas de camundongos e estimuladas com EGF aumentam a proliferação,

sendo este efeito mediado tanto por isoformas da classe convencional quanto da classe

atípica, envolvendo a translocação destas proteínas do citoplasma para a membrana

celular (Heo et al., 2005).

A via da PI3-cinase participa do crescimento, sobrevida e diferenciação de

várias células de mamíferos e estudos têm demonstrado que estes efeitos no crescimento

são dependentes do tipo celular e do estímulo (Hassan et al., 2004). Embora EGF

estimule a atividade da PI3-cinase, esta proteína não se liga diretamente ao EGFR. A

PI3-cinase pode ser ativada pelo estímulo de EGF, quando o EGFR forma heterodimero

com ErbB3. Em ErbB3 há um sítio de ligação do domínio SH2 da subunidade

regulatória da PI3-cinase, mas não no EGFR (Woung e Guillaund, 2004, para revisão).

A PI3-cinase pode ativar a RAS, permitindo a ativação da via de sinalização da Erk,

promovendo assim, um “crosstalk” entre as vias de sinalização na sobrevida (Herson e

Gibson, 2006 para revisão).

A ativação da PI3-cinase cataliza a transferência de um grupo fosfato do ATP

para o fosfatidil-inositol gerando 3`fosfatidil-inositol fosfato (PIP) que age como um

sítio de ligação para proteínas com domínio homólogo a

pectrina (PH) (Henson e

Gibson, 2006 para revisão). A PI3-cinase permite a formação de 3,4,5 fosfatidil-inositol

(PIP3) e subseqüente recrutamento da Akt para membrana plasmática via seu domínio

(PH). A Akt, também chamada de proteína cinase B (PKB), é uma proteína cinase do

tipo serina/treonina que atua regulando várias atividades celulares tais como: apoptose,

proliferação e migração celular. Uma vez na membrana celular, a Akt é fosforilada pela

cinase 1 dependente de fosfoinositídeo (PDK1) no resíduo treonina 308 (T308),

localizado na alça de ativação (Kumar et al., 2007). A ativação da Akt permite a

fosforilação de duas proteínas apoptóticas BAD e Caspase 9, inibindo suas atividades e

ativando fatores de transcrição NF% +,)-. H &5(% UHVXOWDQGR HPXPDXPHQWRGD

transcrição de genes anti-apoptóticos, controlando desta forma a sobrevida celular

(Henson e Gibson, 2006 para revisão).

A família de transdutores de sinal e ativadores de transcrição (STAT) também

está envolvida nos mecanismos de sinalização “downstrean” do EGFR. As proteínas

STAT são um grupo de fatores de transcrição citoplasmáticos que contém o domínio

SH2 e podem interagir com grupos de fosfotirosinas nos receptores de fatores de

crescimento ou nos receptores de citocinas. A ativação ocorre pela fosforilação de uma

única tirosina, tanto por receptores de citocinas associados a tirosinas cinases

citoplasmática como da família Janus cinase (JAKs), ou por receptores de fatores de

crescimento, aparentemente pelo efeito direto do domínio cinase. Após a homo ou

heterodimerização, as proteínas STAT ativadas são translocadas para o núcleo onde se

ligam a regiões promotoras de genes alvos como c-fos, c-junB, c-myc e ciclina D1

regulando a proliferação e diferenciação (Guren et al., 1999). A ativação da STAT 1 por

EGF parece estar associada a afeitos anti-apoptóticos e anti-proliferativos, enquanto a

STAT 3 está envolvida na estimulação do crescimento, ativando o EGFR através de um

mecanismo autócrino. Já a STAT 5 pode esta envolvida tanto com eventos de

proliferação quanto diferenciação (Guren et al., 1999, Grudinkin et al., 2007)

O EGFR é capaz de ativar diferentes cascatas de sinalização contendo a

participação de diferentes MAPKs, regulando a proliferação e sobrevida celular. A p38

é uma MAPK que foi originalmente identificada como uma cinase ativada em resposta a

lipopolissacarídeos. Posteriormente, descobriu-se que a p38 também está supra-

regulada quando as células são expostas a vários estímulos, incluindo alguns fatores de

crescimento, citocinas pro-inflamatórias e sob diferentes formas de stress

(Vergarajaregui et al., 2006). A Erk1/2 é uma proteína reguladora “upstream” da p38 e

esta por sua vez, é capaz de ativar múltiplos fatores de transcrição, como c-jun e c-fos.

Recentemente tem sido sugerido o envolvimento de membros das MAPK em aspectos

da progressão do tumor, incluindo invasão e metástase. Foi demonstrado que a p38 é

um importante mediador da motilidade estimulada pela Ras em cânceres de células

epiteliais (Zhou et al., 2007).

γγ

Figura 4:

representação esquemática das diferentes vias de sinalização ativadas por EGF. Adaptado de

www.biij.org.jpg em 20.08.2007 e Henson e Gibson (2006), para revisão.

1.5 - SISTEMA NERVOSO CENTRAL

A formação de tecidos do SNC depende de um balanço entre a neurogênese e a

morte celular durante o desenvolvimento. No SNC de mamíferos a interação de vários

tipos neuronais e suas terminações sinápticas, bem como a plasticidade e a rede de

sinalização que envolve diferentes citocinas e neurotransmissores, é responsável pelos

processos de desenvolvimento e funcionamento deste complexo sistema (Reuss &

Halbach, 2003).

1.5.1 - R

ETINA

A retina pertence ao SNC, pois se origina do ectoderma neural que também dará

origem às demais áreas do cérebro (Dowling, 1991). Dentre todas as complexas

estruturas do sistema nervoso central, nenhuma oferece tantas vantagens a estudos de

desenvolvimento como a retina (Cepko, 1993 para revisão). Este tecido possui uma

localização periférica privilegiada, a qual permite sua fácil obtenção, livre do tecido

conjuntivo adjacente e de outras populações neuronais e gliais. Esta característica,

aliada a uma organização em camadas sinápticas e nucleares, muito semelhante ao

observado em outras estruturas do sistema nervoso, torna a retina um excelente modelo

experimental para o estudo do desenvolvimento, diferenciação e manutenção de células

do tecido nervoso central in vitro e in vivo (Adler, 1993; Cepko, 1993; Dowling, 1991

para revisão). Uma outra característica importante do tecido retiniano é a presença de

apenas seis classes de tipos neuronais e, em geral, apenas um tipo de célula glial: a

célula de Müller. Oligodendrócitos estão completamente ausentes na retina da maioria

das espécies e os astrócitos se encontram apenas nas camadas de fibras do nervo óptico de

mamíferos (Farah, 2006; Newman & Reichenbach, 1996).

1.5.1.1 Estrutura da Retina

A retina madura é organizada como uma rede neuronal laminar, composta por

neurônios sensoriais, interneurônios e células gliais. Através das projeções das células

ganglionares as informações visuais são enviadas a outros centros superiores onde são

processadas. Na retina estão presentes três camadas de corpos neuronais e duas camadas

onde ocorrem às sinapses entre os neurônios. A organização histológica da retina de

vertebrados ocorre da seguinte forma (figura 5): camada nuclear externa (CNE), onde

encontramos os corpos celulares dos fotorreceptores, que se dividem em dois subtipos:

os cones que possuem baixa sensibilidade à luz e permitem a visão cromática, e os

bastonetes, que possuem apenas um tipo de pigmento visual - a rodopsina (Yau, 1994),

responsável pela adaptação da visão ao claro-escuro; camada plexiforme externa (CPE),

onde os prolongamentos de fotorreceptores, células bipolares e horizontais fazem

conexões sinápticas entre si; camada nuclear interna (CNI), onde se encontram os

corpos celulares de células bipolares, horizontais, amácrinas e de células ganglionares

deslocadas; camada plexiforme interna (CPI), onde prolongamentos de células

bipolares, amácrinas e ganglionares fazem sinapses; camada de células ganglionares

(CCG), onde se encontram os corpos de células amácrinas deslocadas e células

ganglionares (Farah, 2006; Dowling, 1991 para revisão). Um tipo neuronal que liga as

duas camadas plexiformes (CPE e CPI) é conhecido como célula interplexiforme

(Fisher, 1979, Kolb et al., 1992). O soma da célula de Müller, que é um tipo particular

de astroglia radial, exclusivo da retina, está localizado na CNI (Bringmann et al., 2006,

Newman & Reichenbach, 1996 para revisão). Seus prolongamentos se estendem por

todas as camadas da retina, formando a membrana limitante interna, adjacente ao

humor vítreo, e a membrana limitante externa, adjacente à camada nuclear externa

(Newman & Reichenbach, 1996 para revisão). Desde estágios precoces do

desenvolvimento, as células de Müller imaturas são importantes para a organização

histotípica da retina em desenvolvimento. Estas células são um substrato para a

migração e orientação para os neurônios pós-mitóticos jovens, bem como para o

crescimento de seus neuritos (Bringmann et al., 2006).

Figura 5

Esquema simplificado da retina de vertebrados recém-nascidos (A) e adultos (B).

Representação dos diferentes tipos celulares, bem como as camadas celulares e sinápticas da retina neural

(CNE, camada nuclear externa; CPE, camada plexiforme externa; CNI, camada nuclear interna; CPI,

camada plexiforme interna; CCG, camada de células ganglionares) e a camada de células neuroblásticas

(CN). Modificado de Dowling, 1991

CNE

CPE

CNI

CPI

CCG

Carla e

CNE

CPE

CNI

CPI

CCG

Carla e

$  %

1.5.1.2 Desenvolvimento da Retina

O período de gestação de ratos é de 22 dias (Farah, 2006 para revisão) e nesta

fase as células da retina são geradas obedecendo a uma determinada seqüência, com as

primeiras células se tornando pós-mitóticas no tempo em que o cálice óptico se forma.

O começo da diferenciação de uma célula se dá no momento em que ela termina o ciclo

mitótico. O tempo de geração e diferenciação das células da retina pode variar

dependendo da espécie animal, mas invariavelmente as ganglionares são as primeiras a

se diferenciarem (Cepko, 1993; Farah, 2006 para revisão) (tabela 3). Este processo de

diferenciação retiniana depende não apenas de um programa genético pré-determinado

como de pistas ambientais intra-retinianas, tais como a expressão de moléculas de

adesão e da matriz extracelular, assim como a liberação de citocinas diversas.

CURSO TEMPORAL DO DESENVOLVIMENTO CELULAR DA

RETINA DE RATOS

Células ganglionares (células HRP positivas)

E14 a E20

Células amácrinas deslocadas (ChAT

positivas)

E16 a E20

Células amácrinas

E16 a P0

Bipolares, bastonetes

E20 a P13

Glia de Müller

E20 a P13

Horizontais

E16 a E18

Cones

E15 a P0

Tabela 3

– Cronograma, em dias, da gênese dos tipos celulares retinianos em ratos. E, embrionário e P,

pós-natal.

Adaptado de Cepko, 1993 ; Reese & Colello, 1992; Farah, 2006 para revisão).

1. 5.1.3 EGF e EGFR na retina

Fatores tróficos são essenciais para o desenvolvimento, manutenção e sobrevida

de neurônios do SNC. A presença e as ações no tecido retiniano de fatores tróficos

como EGF, TGF., PDGF, FGFb, CNTF, dentre outros, vem sendo descrita na literatura

(Fontaine et al., 1998). Lillien e Cepko em 1992 relatam que vários fatores de

crescimento são normalmente produzidos pela retina e pelo tecido ocular que a cerca,

estimulando a proliferação destas células in vivo. Entretanto, a responsividade das

células da retina a estes fatores, inclusive ao EGF, muda de acordo com o estágio de

desenvolvimento e maturação deste tecido. O pico de proliferação de células

progenitoras da retina acontece por volta do nascimento e declina até aproximadamente

a primeira semana pós-natal. Após este período, há poucas evidências sobre a

proliferação tanto de células progenitoras como células de Müller na retina de

mamíferos. Entretanto em condições patológicas esta proliferação volta a ocorrer (Close

et al., 2005).

Através da técnica de imunohistoquímica a presença do EGF e seu receptor foi

demonstrado por Zheng e colaboradores, em 1996, nas diferentes camadas de células da

retina de ratos neonatos. De acordo com os autores, a marcação para o EGF está

uniformemente distribuída na camada de células ganglionares, camada nuclear interna e

externa e no epitélio pigmentado. Quanto ao seu receptor, este foi encontrado nestas

camadas, tanto no núcleo quanto no citoplasma das células, embora no núcleo seja

aparentemente proeminente.

O nível de expressão tanto da proteína quanto do RNAm para o EGFR na retina

de ratos diminui com a idade do animal. O maior nível é encontrado durante o período

de desenvolvimento (E18), diminuindo cerca de 17 vezes no quarto dia pós-natal (P4),

acontecendo outra pequena queda em P10, chegando a níveis mínimos em P21 (Close et

al., 2006).

Chen e colaboradores em 2006 compararam a presença do receptor de EGF e seu

ligante na retina de humanos, ratos e camundongos adultos, também através da técnica

de imunohistoquímica. Conforme a tabela abaixo (tabela 4), o padrão de expressão

tanto do EGF quanto do seu receptor se difere em alguns aspectos dentre as espécies

pesquisadas.

Camadas da retina

Rato

Camundongo

Humano

Camada de fibra

nervosa

Camada de células

ganglionares

EGFR

EGF

EGFR

EGF

EGFR

EGF

Camada plexiforme

interna

EGF

Camada nuclear

interna

EGFR

EGF

EGFR

EGF

EGFR

Camada plexiforme

externa

EGFR

EGF

Camada nuclear

externa

EGFR

Tabela 4:

Localização de EGF e EGFR nas diferentes camadas de células ganglionares da retina de ratos,

camundongos e humanos adultos

. Modificado e adaptado de Chen, et al.,2006.

Acredita-se que os fatores de crescimento pertencentes à família EGF atuem

localmente na retina, ao invés de difusamente através de longas distancias, pois estes

fatores são expressos e sua localização predominante se dá na membrana celular (Lillien

e Cepko 1992). A propriedade de regulação da proliferação de células da retina é

importante porque o balanço entre o número de células e o tipo celular é crítico para a

manutenção da função neural. Esta ação é regulada tanto através de moléculas de

sinalização mitóticas quanto por moléculas promotoras de diferenciação (Close et al.,

2006). De acordo com estes autores, estudos in vitro têm demonstrado que células de

retina pós-natal são mais responsivas aos efeitos mitogênicos do EGF e/ou TGF.  GR

que durante a idade embrionária.

Close e colaboradores, em 2005, PRVWUDUDP TXH 7*) é capaz de inibir a

proliferação de células da retina, pois bloqueando a sua atividade o efeito proliferativo

foi restaurado. Outro efeito observado foi que este fator de crescimento pode regular a

DWLYLGDGHGR(*)SRLVDRLQLELUR7*)RHIHLWRSUROLIHUDWLYRGR(*)Qas células de

Müller foi potencializado.

Explantes de retina de camundongos, em diferentes fases do desenvolvimento,

quando tratados com EGF mostram a ativação da via da STAT3. O mesmo foi

evidenciado para outros fatores de crescimento como o CNTF e o FGFb, embora este

efeito tenha apresentado diferentes padrões de ativação desta proteína. A ativação da

STAT3 foi correlacionado com o padrão de marcação de células positivas ao BrdU,

sugerindo a sua participação em células mitóticas progenitoras ou em células que

tenham acabado de se dividir (Zang et al., 2005).

Tropete e colaboradores, em 2000, identificaram células tronco numa região

próxima ao pigmento localizado marginalmente à região ciliar da retina de

camundongos adultos, sugerindo que estas células possam ser homologas as

encontradas na zona germinativa de olhos de outros vertebrados. Nestas células tanto o

tratamento com EGF como com FGFb foi capaz de induzir a formação de colônias e

aumentar a proliferação destas células quando comparado ao controle. Gu e

colaboradores, em 2007, observaram efeitos semelhantes em cultura de células da retina

de porcos em diferentes estágios de desenvolvimento (embrionário, pós-natal e adulto)

tratadas com EGF e FGFb. Os autores observaram que células progenitoras da retina e

células tronco derivadas do epitélio pigmentar da retina embrionária e pós-natal

possuem capacidade de autorenovação e formação de colônias, porém este efeito é

tempo-dependente.

EGF e FGFb são capazes de aumentar a sobrevida de fotorreceptores de porcos

mantidos em cultura. Embora o FGFb tenha mostrado um efeito mais significativo do

que o EGF, tratamento com ambos não foi capaz de potencializar a sobrevida destas

células (Traverso et al., 2003).

O fator de crescimento HB-EGF também pode ser encontrado na retina e

participar de mecanismos relacionados com a proliferação, tanto em condições normais

quanto em processos patológicos. Hollborn e colaboradores, em 2005, identificaram na

retina de pacientes post-morten portadores de vítreoretinopatia, a presença de vários

genes relacionados com a proliferação celular e localizaram através da técnica de RT-

PCR a presença do HB-EGF nas células de Muller. A cultura de células gliais tratadas

com tal fator trófico, além de ter induzido a proliferação e a quimiotaxia, induziu a

secreção de VEGF, sugerindo que o HB-EGF possa estar mediando respostas destas

células durante a vitreoretinopatia.

Weuste e colaboradores, em 2006, sugeriram que o HB-EGF possa mediar um

efeito protetor regulando o edema das células de Muller após isquemia, pois após 7 dias

do processo isquêmico houve um aumento na expressão deste fator. Além disso, o HB-

EGF inibiu o edema destas células através da liberação sinaptica de glutamato, ativando

seu receptor e induzindo a liberação autócrina de agonistas purinérgicos que

promoveram a abertura dos canais de K

e Cl

Camundongos homozigóticos para depleção do gene do EGFR apresentam uma

redução na proliferação no tecido retiniano, nos últimos estágios da histogênese. Porém,

o dano causado pela contínua exposição das células da retina à luz, em animais

heterozigóticos, promove um aumento na expressão de receptor de EGF nas células de

Muller resultando em uma renovação da resposta mitótica mediada pelo EGF (Close et

al., 2006).

O aumento na expressão de EGFR em células progenitoras da retina in vitro,

reduz a concentração de TGF. QHFHVVária para induzir a diferenciação em células de

Müller e em fotorreceptores. Porém, não foi capaz de aumentar os níveis de

proliferação. O aumento na expressão destes receptores in vivo aumentou a proporção

de clones que se diferenciavam em células de Müller (Lillien, 1995).

1. 6 - CICLO CELULAR E O CONTROLE DA PROLIFERAÇÃO CELULAR

Apesar das diferenças em alguns detalhes do ciclo celular em eucariotos, os

pontos essenciais são comuns. Geralmente, para que sejam originadas células filhas

idênticas, o DNA se duplica, segrega e finalmente a célula original se divide em duas

células independentes, cada uma com carga genética idêntica à da sua célula irmã. O

ciclo celular divide-se em dois períodos: intérfase e mitose (figura 6).

• Intérfase: fase responsável pelo crescimento. As células estão muito ativas,

sintetizando os componentes que irão constituir as células filhas. Esta fase se

subdivide em três:

o G1: período entre o final da mitose e o início da fase S.

o Fase S: fase onde ocorre a replicação do DNA. Sinais citoplasmáticos

são enviados ao núcleo induzindo-o a iniciar a replicação. Nesta fase as

células podem ser marcadas com [

H]timidina, um nucleotídeo derivado

da timina, utilizado exclusivamente para a síntese de DNA.

o G2: período entre o fim da fase S e o início da mitose. Uma célula que

completa a fase S e entra na G2 condensa seus cromossomos e segue

para mitose. Este é um período de preparação para a produção de fatores

cruciais que disparam a mitose.

• Fase M (mitose): fase onde ocorre a divisão celular.

As fases G1 e G2 proporcionam tempo adicional para o crescimento. Durante a

fase G1, a célula analisa se as condições ambientais são adequadas para começar o

processo de divisão celular. Quando o sinal induz a célula a atravessar o ponto de

partida, se as condições ambientais são favoráveis, há um comprometimento irreversível

da célula iniciando-se assim, o desenvolvimento do ciclo celular. Se as condições são

desfavoráveis para a entrada no ciclo, a célula entra em um período de quiescência

denominado G0, no qual ela pode permanecer por um longo tempo. Se estas condições

ambientais voltarem a ser favoráveis, a célula pode sair dessa fase G0 e iniciar seu ciclo

de divisão. Na fase G2, a célula analisa se a fase S foi realizada de forma correta e

decide se será iniciada a mitose, ou se espera para que sejam realizados reparos

necessários ao DNA devido a erros ocorridos durante a fase S.

Figura 6

: Estágios do ciclo celular

Os locais da atividade regulatória dos complexos CDK/ciclina estão

indicados pelas setas.

Retirado de Vermeulen et al., 2003.

A progressão do ciclo celular da fase G0 para S envolve a ativação de várias

proteínas regulatórias, sendo as ciclinas as maiores representantes (Morgan, 1995). O

nível de expressão das ciclinas é regulado em várias fases do ciclo. As ciclinas D são

sintetizadas durante a fase G1, e sua inibição previne a entrada da célula na fase S

(Resnitzky et al., 1994). A ciclina E é sintetizada em G1 mais tardiamente e é ativa de

forma máxima na transição de G1-S (Dulic et al., 1992), enquanto a ciclina A é expressa

durante a fase S (Pagano et al., 1992). As ciclinas ligam-se a quinases dependentes de

ciclinas (Cyclin dependent kinases, Cdk), que exercem um papel fundamental para a

entrada da célula no ciclo, síntese de DNA e regulação da mitose. Assim, as ciclinas

regulam a atividade da Cdk, que é essencial para a progressão do ciclo. A ciclina D

liga-se à Cdk4 e Cdk6, enquanto a ciclina E e A ligam-se à Cdk2 (Morgan, 1995).

A proteína supressora de tumor de retinoblastoma (pRb) é um regulador

negativo da proliferação celular. Essa ação inibitória da pRb depende de sua capacidade

de ligar proteínas celulares e formar complexos com elas. Ciclinas tipo D, quando

ligadas a Cdk4 e/ou Cdk6, são responsáveis pela fosforilação e inativação funcional da

Rb, um evento que ocorre no meio da fase G1 (Weinberg, 1995).

Além da regulação por ciclinas e suas subunidades catalíticas (Cdk), a

progressão do ciclo celular também pode ser controlada por vários pontos de checagem

(check point) pela associação de proteínas de regulação negativas do ciclo celular,

conhecidas como ciclinas inibidoras de quinases (CKI) (Peter & Herskowitz, 1994).

Esses inibidores podem ligar Cdks e inibir sua atividade. Existem 2 famílias de CKI

que incluem: família da p16

INK4a

e família p21 (Cip1, Waf1, Adil1, Cap20) incluindo

p27

kip1

e p57

kip1

. Todas as CKI são capazes de inibir o complexo ciclina D-Cdk4,

enquanto apenas a p21 e p27 inibem o complexo ciclina E-Cd4 (Dulic et al., 1992).

Quando há supressão de p16, p21 ou p27, várias células param o crescimento

(Toyoshima & Hunter, 1994).

A proliferação celular que é induzida por fatores de crescimento ou citocinas

pode ocorrer apenas na presença de diferentes sinais de sobrevida. As células que

recebem o sinal proliferativo na ausência de sinal de sobrevida não proliferam, ao

contrário, morrem por um processo chamado apoptose (Birkenkamp & Coffer, 2003,

para revisão), que se caracteriza por alterações morfológicas distintas que incluem:

perda de volume celular e condensação da cromatina (Kerr et al., 1972). Assim, a

apoptose age como um importante mecanismo para eliminação de células que sofreram

mutações durante o ciclo celular e que podem resultar em uma proliferação celular

descontrolada (Birkenkamp & Coffer, 2003, para revisão).

2 - OBJETIVOS:

Resultados anteriores do nosso laboratório, mostraram que o tratamento de

células da retina de ratos neonatos com FGFb induz um significativo aumento (150%)

na proliferação de células da retina (Guilarducci-Ferraz, 2007). No decorrer destes

estudos foi observado que parte do efeito do FGFb era mediado pela ativação dos

receptores de EGF visto que, o tratamento com um inibidor seletivo dos receptores de

EGF, abolia parcialmente o efeito do FGFb (figura 7). Vários estudos demonstram a

habilidade do Fator de Crescimento Epidermal em induzir efeitos distintos como

proliferação, sobrevida, angiogênese, entre outros. Apesar de muito ter sido estudado a

respeito do papel deste fator em células da retina, pouco se conhece dos mecanismos de

sinalização intracelular envolvidos na proliferação deflagrada tipo celular. Baseados

neste conjunto de resultados nossos objetivos foram:

• Avaliar os efeitos do EGF em cultura de células da retina;

• Caracterizar as vias de sinalização bioquímicas envolvidas neste efeito;

• Através da técnica de Western Blot, investigar a ativação de proteínas

relacionadas a progressão do ciclo celular.

)*)EQJP/

7\U

7\U)*)E

,QFRUSRUDomRGH> +@WLPLGLQD

GR FRQWUROH

Figura 8: E

FEITO DO

FGFb 25ng/mL

NA PRESENÇA DE INIBIDOR DO RECEPTOR DE

EGF, T

YRFOSTINA

(Tyr).

Culturas controle (Ct), culturas tratadas com FGFb (FGFb 25ng/mL), culturas tratadas com Tyr (Tyr

2,5µM) e culturas tratadas com Tyr/FGFb (Tyr/FGFb). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina

são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 12-16). (* p<0,001). Retirado de

Guilarducci-Ferraz et a.l., (2007).

3 - MATERIAL E MÉTODOS

3.1 - M

ATERIAIS

O fator de crescimento epidermal (EGF) foi comprado da PeproTech (Rocky

Hill, NJ, USA). A penicilina G, sulfato de estreptomicina e L-glutamina foram

comprados da Sigma (St. Louis, MO, USA). Meio 199 foi comprado da Gibco

(Gaithersburg, MD, USA) e a tripsina da Worthington (Freehold, NJ, USA). A solução

salina sem cálcio e sem magnésio (CMF) era produzida no laboratório, tendo a seguinte

composição: NaCl 131mM, KCl 4,09mM, Na

HPO

.7H

O 0,92mM, KH

0,45mM,

glicose.H

O 12,2mM, NaHCO

9,4mM, vermelho de fenol 10mg/mL. Todos os sais

foram obtidos da Reagen e o vermelho de fenol da Sigma. Genisteína, cloreto de

queleritrina, PD98059, PP1, SB-203580 e LY294002 foram comprados na BIOMOL

(Plymouth Meeting, PA, USA). As placas de Petri foram compradas da TPP. A [

H-

metil]-timidina, hiperfilme, acrilamida, metileno bisacrilamida, mercaptoetanol,

anticorpo secundário anti-rabbit HRP, ECL e a membrana PVDF foram comprados da

Amersham (NJ, USA). O SDS, Tris base e o perssulfato de amônia foram obtidos da

USB (Cleveland, OH, USA). A glicina foi obtida da Qeel (São Paulo, SP). Tween 20,

azul de Comassie, o vermelho de Ponceau e o glicerol foram obtidos da VETEC (Rio de

Janeiro, RJ). Os anticorpos anti-actina e anti-ciclina D1, e o BSA foram obtidos da

Santa Cruz Biotechnology (California, USA). O TEMED e o padrão de peso molecular

(10 a 220KD) foram obtidos da Invitrogen (USA). O metanol foi obtido da J.T.Baker

(Phillipsburg, NJ, USA).

3.2 - C

ULTURA DE

ÉLULAS DA

ETINA

Ratos da linhagem Lister Hooded com 48 a 72h de nascidos (dias pós-natal 1 e

2) eram sacrificados por decapitação, seus olhos removidos por enucleação e colocados

em placa de Petri com solução salina sem Ca

e Mg

(CMF) acrescido de antibióticos

(penicilina 100U/mL e estreptomicina 100µg/mL). Os animais foram manuseados

conforme as normas do comitê de ética da Sociedade Internacional de Neurociências. A

seguir, as retinas eram dissecadas e colocadas num tubo de ensaio contendo CMF onde

era adicionada a tripsina 0,1% por 20 min a 37°C, para dissociação química do tecido.

A tripsina era inativada após a retirada do CMF e lavagem por duas vezes com meio de

cultura acrescido de 5% de soro fetal bovino (FCS), glutamina 2,0mM, estreptomicina

100µM e penicilina 100U/mL.

Para completar o processo de separação das células, triturava-se o meio que as

continha, passando-o por uma pipeta Pasteur de ponta afilada por cerca de 10 vezes. A

suspensão de células obtida era contada em um hemocitômetro ao microscópio óptico,

em campo claro, para estabelecermos o quanto de meio de cultura precisava ser

adicionado para a obtenção da densidade desejada. Para todos os experimentos, as

células eram semeadas em placas de Petri de 40 mm na densidade de 1,25x10

células/placa. Todo o procedimento de dissecção, dissociação e plaqueamento das

células foi realizado em capela de fluxo laminar.

As culturas recebiam 1mL de meio completo e eram mantidas por 1h, a 37°C,

para que as células pudessem aderir às placas. Após este período as culturas recebiam

1mL de meio completo (culturas controle) ou 1 mL de meio contendo EGF e ou drogas

a serem testadas. Seguiam-se períodos variados de incubação das células a 37°C, em

atmosfera de 95% de ar e 5% de CO

Droga

Ação

Genisteína

Inibidor de tirosinas cinases

Cloreto de queleritrina

Inibidor da PKC

PD98059

Inibidor da MEK

SB-202190

Inibidor da p38

LY294002

Inibidor da PI3 cinase

PP1

Inibidor das Src

AG1478

Inibidor do receptor de EGF

Tabela 5:

Lista de drogas utilizadas

e suas ações

para testar as vias de sinalização envolvidas no efeito do

EGF.

As células eram mantidas in vitro por diferentes períodos quando então eram

processadas para incorporação de [

H]-timidina ou para Western blot.

3.3 - I

NCORPORAÇÃO DE

[

]-T

IMIDINA

A incorporação de [

H]-timidina nas culturas mantidas por 48 horas in vitro foi

realizada segundo o seguinte protocolo:

a) As culturas foram lavadas por duas vezes com 2mL de meio de cultura 199 a

temperatura ambiente, sem soro fetal bovino;

b) Incubação das culturas com 0,5µCi/mL de [

H]-timidina em 1mL de meio 199 sem

soro por um período de 60 minutos a 37°C em atmosfera de 5% de CO

e 95% de

ar;

c) Após este período de tempo, as culturas eram lavadas por quatro vezes com meio

199 sem soro, a fim de remover a [

H]-timidina que não foi incorporada;

d) O meio 199 foi então removido e 200µL de NaOH 0,4N eram adicionados às

culturas por quinze minutos;

e) O conteúdo de cada placa era transferido para tubos de vidro contendo 3mL de água

Milli-Q, aos quais eram adicionados 600µL de TCA 50% e mantidos por trinta

minutos;

f) Cada amostra era filtrada sob pressão negativa em filtros Whatman GF/B. Os filtros

eram colocados para secar overnight e a radioatividade era determinada em

cintilador de fase líquida (Packard, USA), em vials contendo 3mL de tolueno.

3.4 - Western Blot

A técnica foi utilizada para a detecção da ciclina D1 e actina, conforme

descrito a seguir:

3.4.1 - Extração de Proteína

Para determinar expressão da ciclina D1 e da actina sob o efeito do EGF as

culturas foram lavadas por duas vezes com solução Hank`s e após a retirada desta

solução, as proteínas totais eram extraídas com 100µL de tampão de amostra (glicerol;

2-mercaptoetanol; SDS 3%; Tris 0,5M pH 6,8 e água destilada). As amostras foram

fervidas em água destilada a 100°C por 10 min.

Para determinar a atividade da ciclina D1 na retina ao longo do tempo, ratos da

linhagem Lister Hooded com diferentes estágios de desenvolvimento (P0, P4, P9, P14,

P30, P90 e com um ano de idade) eram sacrificados por decapitação, seus olhos

removidos por enucleação e colocados em placa de Petri com solução salina sem Ca

(CMF) acrescido de antibióticos (penicilina 100U/mL e estreptomicina

100µg/mL). A seguir, as proteínas totais destas amostras foram extraídas com 100µL

de tampão de amostra e fervidas com água destilada a 100

C por 10 min.

3.4.2 - Dosagem de Proteína

A dosagem de proteína foi realizada pelo método de Bradford (Bradford,

1976). A curva padrão foi feita com 0, 5, 10, 15 e 20µg de uma solução de albumina

(BSA) na concentração de 1mg/mL. A leitura das amostras era feita em

espectrofotômetro em 595nm.

3.4.3 - Gel de Poliacrilamida

O gel de poliacrilamida foi preparado na concentração de 9% para analisar a

expressão de ciclina-D1 (31 a 49 KD) e a actina (48KD). O gel de corrida foi preparado

contendo Tris base 1,5M pH 8,8 (2,25ml), acrilamida 30% e metileno bisacrilamida

0,9% (2,7ml), SDS 10% (15µl), TEMED (30µl), persulfato de amônia 10%(30µl). Este

gel foi aplicado e em seguida completou-se o volume com água com o objetivo de

manter o gel bem nivelado e impedir a entrada de O

Após a polimerização, a água foi retirada e adicionou-se o gel de compactação

contendo Tris base 0,5M pH 6,8 (0,625ml); acrilamida 30% + 0,9% de metileno

bisacrilamida (0,325ml), SDS 10% (25µl), TEMED (12,5µl), persulfato de amônia 10%

(25µl). Após aplicar este gel, o pente foi colocado e aguadamos a sua polimerização.

O gel foi colocado na cuba contendo tampão de corrida (14,4g de glicina, 3g

de tris base e 1g de SDS em 1L de água MILI-Q ). As amostras foram aplicadas nos

poços. Utilizamos 15µl do padrão de peso molecular no primeiro poço e volumes

variados das amostras das experiências que representando 60µg de proteínas por poço.

A corrida foi realizada na cuba de eletroforese com corrente constante de 10mA por

aproximadamente 90 min.

3.4.4 - Transferência das Proteínas do Gel para a Membrana de PVDF (membrana

polyvinylidine difluoride)

A membrana foi incubada por 30 segundos em metanol e transferida para uma

cuba contendo tampão de transferência (glicina 14,4g, Tris base 3g, e 200mL de

metanol completando com um volume final de 800ml de água MILI-Q), onde ficou

equilibrando por aproximadamente 20min. O “sandwich” com o gel e a membrana foi

montado, imersos neste tampão e a transferência foi realizada utilizando voltagem

constante de 25V por 60 min em uma temperatura de aproximadamente 4ºC. Após a

transferência a membrana foi incubada por cerca de 1min em vermelho de Ponceou

afim de verificar a qualidade do procedimento, lavada em água Milli-Q para se retirar o

excesso do vermelho de Ponceou e incubada em solução salina tamponada de Tris

(TBS) pH 7.6, para realizar o bloqueio e a imunodetecção.

3.4.5 - Bloqueio e Imunodetecção

O bloqueio foi realizado com 5% de leite desnatado em TBS (pH 7.6) com

0,1% tween 20, por 2h, em temperatura ambiente. Após este período, a solução para o

bloqueio foi retirada e a membrana lavada três vezes em TBS com 1% de leite e 0,1%

de tween. A membrana era então incubada com o anticorpo primário específico em

TBS (1% de leite e 0,1% tween), overnight. Foram utilizados anticorpos anti-ciclina D1

(diluição 1: 200) e anti-actina (diluição 1:100).

Após a incubação com o anticorpo primário, a membrana era lavada três

vezes em TBS (1% de leite e 0,1% tween) por 10 min cada lavagem. A membrana era

então incubada com o anticorpo secundário específico, ligado a peroxidase, na diluição

de 1: 5000 por 1 hora. Utilizamos o anticorpo anti-mouse (para experimentos utilizando

o anti-ciclina D1), o anticorpo anti-goat (nos experimentos utilizando anti-actina). As

membranas foram lavadas duas vezes, por 10 min cada, em TBS com 0,1% tween, e a

última lavagem era realizada apenas com TBS por 10min.

3.4.6 - Revelação

A revelação era realizada com exposição da membrana ao ECL por 5 minutos.

Esta reação é baseada na quimioluminescência que resulta da oxidação do luminol,

catalizada pela peroxidase presente no anticorpo secundário. A membrana fica então

exposta ao filme (Hiperfilme – Amersham) por 5 minutos, pois esta luz resultante é

detectada pelo filme em segundos ou minutos. O filme era retirado e a revelação

realizada com revelador GBX Kodak 1:10 por 15 segundos, seguido de fixação (Fixador

Kodak 1:5) por 1 minuto.

3.4.7 - Análise dos Resultados

A densitometria das bandas obtidas no Western blot foi realizada utilizando-se

o programa Scion Image.

3.5 - Análise Estatística dos Resultados

Os resultados obtidos foram expressos na forma de histogramas e na

apresentação dos filmes obtidos com o Western blot. Cada experimento foi repetido no

mínimo 2 vezes, e no caso dos experimentos sobre proliferação, foram utilizadas no

mínimo 3 amostras por ponto experimental. Em todos os gráficos está representada a

média e o erro padrão da média. As análises estatísticas foram feitas através da análise

de variância (ANOVA) seguida de um pós teste de comparação entres as diferentes

condições experimentais (Newman-Keuls) utilizando o programa GraphPad Prism.

4 – RESULTADOS

Nosso primeiro objetivo foi avaliar se o EGF seria capaz de induzir a aumento

na proliferação das células retinianas e determinar, através de uma curva dose resposta,

qual a concentração ideal para o efeito. Pela pesquisa na literatura verificamos que

vários autores haviam estabelecido uma faixa de concentração entre 0,1 a 100 ng/mL

(Travesso et al., 2003; Close et al., 2005; Close et al., 2006) e por este motivo

decidimos tratar nossas culturas por 48h com EGF nessas diferentes concentrações

(figura 8).

Controle

0,1 ng/mL

1 ng/mL

5 ng/mL

10 ng/mL

100 ng/mL

100

150

200

250

300

350

400

Incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 8: CURVA DOSE-RESPOSTA DO EFEITO PROLIFERATIVO DO EGF EM CULTURA

DE CÉLULAS DA RETINA MANTIDAS EM CULTURA POR 48h.

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 9). (*p<0,001)

Nossos resultados demonstram que o EGF tem um importante efeito na

proliferação das células da retina, sendo este efeito evidenciado a partir de 0,1 ng/mL

(aumento de aproximadamente 50 % na proliferação). Curiosamente observamos que a

concentração de 1 ng/mL já era capaz de induzir um efeito saturante, mantendo-se uma

taxa de proliferação elevada em torno de 200% quando comparado ao controle.

A partir destes resultados fomos avaliar o efeito temporal induzido pelo

tratamento com EGF. O tempo de incubação da cultura por 48h, é um período já

utilizado em nosso laboratório, mas precisávamos avaliar por durante quanto tempo este

fator trófico continuaria induzindo a proliferação das células da retina (figura 9). Para

isto utilizamos a concentração de 1ng/mL em diferentes intervalos de tempo.

Controle

24h

48h

3 DIAS

4 DIAS

5 DIAS

6 DIAS

9 DIAS

100

150

200

250

300

Incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 9

: EFEITO TEMPORAL EM CULTURA DE CÉLULAS DA RETINA TRATADAS COM

EGF 1ng/mL.

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 12). (*p<0,001).

O tratamento das culturas de células da retina com EGF na concentração de

1ng/mL foi capaz de induzir a proliferação em cerca de 200% a partir de 24hs e este

feito se manteve até um período de 6 dias. A figura 10 mostra o efeito do EGF na

morfologia das células da retina mantidas em cultura por 48h e por 9 dias. Podemos

observar que o tratamento tanto por 48h como por 9 dias induz uma grande alteração na

morfologia das culturas (figura 10B e 10D). As culturas tratadas apresentam um maior

número de células e além disso nas culturas de 48h podemos observar um maior

espraiamento dos grumos (seta figura 10B). Após 9 dias, as alterações morfológicas são

ainda mais marcantes podendo ser observada uma total confluência nas culturas tratadas

com EGF (figura 10D).



FIGURA 10:

OTOMICROGRAFIA EM CONTRASTE DE FASE MOSTRANDO O EFEITO PROLIFERATIVO DO

EGF

NAS CULTURAS APÓS

48h

DIAS DE TRATAMENTO

VITRO

A: Cultura controle 48h tratadas com meio 199; B: Cultura tratada com meio 199 adicionado de EGF

1ng/mL por 48h; C: Cultura controle 9 dias tratadas com meio 199; D: Cultura tratada com meio 199

adicionado de EGF 1ng/mL por 9 dias. As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células em

placas previamente tratadas com poli-L-ornitina (50

g/mL). Barra de calibração: 25

Uma vez caracterizado a curva dose resposta e o efeito temporal, decidimos

avaliar as vias bioquímicas envolvidas no efeito proliferativo do EGF. Para melhor

observar este efeito, utilizamos o EGF a concentração de 0,1ng/mL por 48h, para não

trabalharmos na faixa do efeito saturante.

Conforme descrito na literatura, o receptor de EGF quando estimulado,

apresenta atividade tirosina cinase (Barnes e Kumar, 2003 para revisão e Hsieh e Conti,

2005 para revisão). Para iniciarmos então a caracterização das vias de sinalização

envolvidas no efeito, decidimos avaliar a atividade tirosina cinase. Para isto utilizamos

o EGF na concentração de 0,1ng/mL por um período de 48h e um inibidor da atividade

tirosina cinase, a genisteína na concentração de 100ILJXUD).

Controle

EGF 0,1 ng/mL

Genisteína 10

EGF + Genisteína

100

150

200

250

300

Incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 11

: EFEITO DO EGF 0,1ng/mL NA PRESENÇA DO INIBIDOR DE TIROSINAS CINASES,

GENISTEÍNA NA CONCENTRAÇÃO DE 10

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 10). (*p<0,001). Não houve diferença significativa entre o EGF e o EGF +

Genisteína (p>0,05).

Na figura 11, podemos observar que o EGF 0,1ng/mL induziu um efeito

proliferativo de aproximadamente 70% em relação ao controle. Entretanto, a presença

de genisteína não aboliu este efeito.

Embora a genisteína não tenha abolido o efeito proliferativo do EGF em nossas

culturas, decidimos investigar o envolvimento de proteínas cinases intracelulares neste

efeito. Para isto utilizamos o PP1 (1µM), um inibidor seletivo da família Src (figura 12).

Controle

EGF 0,1 ng/mL

PP1 1

EGF + PP1

100

150

200

250

300

Incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 12

: EFEITO DO EGF 0,1ng/mL NA PRESENÇA DO INIBIDOR DA Src O PP1 NA

CONCENTRAÇÃO DE 1

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 14). (*p<0,001).

Analisando o gráfico acima, observamos que o efeito proliferativo do EGF não

foi inibido pela presença do PP1. Este resultado sugere que as proteínas da família Src

não estejam participando da via de sinalização induzida pelo EGF e que leva ao

aumento na proliferação das células da retina.

Dando seqüência as nossas experiências utilizamos um inibidor seletivo dos

receptores de EGF, o AG1478, na concentração de 2,5 µM (figura 13).

Controle

EGF 0,1 ng/mL

AG1478 2,5

EGF + AG1478

100

150

200

250

300

Incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 13

: EFEITO DO EGF 0,1ng/mL NA PRESENÇA DO INIBIDOR ESPECIFICO DO EGFR , O

AG1478, NA CONCENTRAÇÃO DE 2,5

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 15). (*p<0,001).

Ao analisarmos os resultados da figura 13 verificamos que o inibidor do receptor

de EGF aboliu por completo o efeito do seu ligante. Este resultado indica que o efeito

proliferativo do EGF passa pela ativação de seus receptores tirosina cinase.

Dados do nosso laboratório demonstram que o efeito proliferativo induzido pelo

FGFb em culturas de células da retina, foi abolido pelo LY294002, um inibidor seletivo

da PI3 cinase (Gullarduti-Ferraz et al., 2007). Evidências experimentais demonstram

que a PI3 cinase ativa uma via muito envolvida em processos de proliferação, de

crescimento e de diferenciação (Hassan et al., 2004). Diante deste fato, decidimos

avaliar a participação da via da PI3-cinase no efeito proliferativo do EGF utilizando o

LY294002, na concentração de 250  1RVVRV UHVXOWDGRV GHPRQVWUDP TXH Qão há

participação da via da PI3-cinase pois a presença do inibidor não interferiu na resposta

induzida pelo EGF (Figura 14).

Controle

EGF 0,1ng/mL

LY294002 25

LY294002 + EGF

100

150

200

250

300

Incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 14

: EFEITO DO EGF 0,1ng/mL NA PRESENÇA DO INIBIDOR ESPECIFICO DA PI3

CINASE, O LY294002, NA CONCENTRAÇÃO DE 25

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 15). (*p<0,001).



  



Decidimos então estudar a participação da via da PKC, pois já foi descrito por

vários autores o envolvimento desta proteína não apenas em efeitos proliferativos, mas

também regulando diferenciação e sobrevida de diferentes tipos celulares (Hassan et al.,

2004; Heo et al., 2005; Henson e Gibson, 2006 para revisão). Para analisar a

participação desta via, utilizamos o cloreto de queleritrina (CC) na concentração de

0ILJXUD

Controle

EGF 0,1 ng/mL

CC 1,25

CC + EGF

100

150

200

250

300

Incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 15

: EFEITO DO EGF 0,1ng/mL NA PRESENÇA DO INIBIDOR DA PKC, O CLORETO DE

QUELERITRINA (CC), NA CONCENTRAÇÃO DE 1,25

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 10). (*p<0,001).

Analisando a figura 15, observamos que o efeito do EGF foi inibido pelo cloreto

de queleritrina, indicando que o efeito proliferativo promovido por este fator envolve a

participação de enzima ou enzimas da família das PKCs. A partir deste resultado

decidimos investigar se a PKC envolvida pertencia a classe convencional. Essas

isoenzimas dependem de cálcio para o seu processo de ativação e por este motivo

decidimos utilizar o BAPTA-AM, um quelante de Ca

na concentração de 10µM. Na

figura 16 podemos observar que o tratamento com BAPTA-AM aboliu por completo o

efeito do EGF indicando fortemente a participação de PKCs da classe convencional no

efeito.

Controle

EGF 0,1 ng/mL

BAPTA-AM 10

EGF + BAPTA-AM

100

150

200

250

300

Incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 16

: EFEITO DO EGF 0,1ng/mL NA PRESENÇA DO QUELANTE DE Ca

CITOPLASMATICO, O BAPATA-AM NA CONCENTRAÇÃO DE 10

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 11). (*p<0,001).

Vários trabalhos da literatura demonstram o envolvimento da via da MAP cinase

nos efeitos proliferativos induzidos pelo tratamento com EGF (Guren et al., 1999; Heo

et al., 2005; Jin et al., 2007). Assim sendo decidimos estudar o papel desta enzima

utilizando para tal o PD98059, um inibidor da MEK, na concentração de 500

(figura17).

Controle

EGF 0,1 ng/mL

PD 98059 50

EGF + PD

100

150

200

250

300

Incorporação de

[

H]-timidina (%do controle)

FIGURA 17

: EFEITO DO EGF 0,1ng/mL NA PRESENÇA DO INIBIDOR DA MEK, O PD98059, NA

CONCENTRAÇÃO DE 50

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 13). (*p<0,001).

Conforme apresentado na figura 17, o PD98059 foi capaz de bloquear o efeito

do EGF, mostrando que a via da MAP cinase também está envolvida no efeito

proliferativo induzido pelo EGF em células da retina.

Nosso próximo passo foi analisar a participação de outras enzimas pertencentes

à família da MAP cinase em nosso efeito. A MAP cinase p38 está envolvida no efeito

proliferativo do FGFb tanto em fibroblastos como em oligodentrócitos (Baron et al.,

2000). Baseados neste dado analisamos a participação desta MAP cinase nos efeitos do

EGF, utilizando o SB202190 (25µXPLQLELGRUVHOHWLYRGHVWDHQ]LPDILJXUD

Controle

EGF 0,1 ng/mL

SB202190 25

EGF+SB

100

150

200

250

300

Incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 18

: EFEITO DO EGF 0,1ng/mL NA PRESENÇA DO INIBIDOR DA MAP CINASE P38, O

SB202190, NA CONCENTRAÇÃO DE 25

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em % do controle

erro padrão da média (n = 9). (*p<0,001).

De acordo coma figura 18, a MAP cinase p38 também está envolvida no efeito

do EGF, pois o SB202190 conseguiu inibir a proliferação promovida por este fator

trófico em nossas culturas.

A ciclina D1 é uma proteína reguladora do ciclo celular e sua atividade está

relacionada principalmente à ação de fatores tróficos, induzindo progressão da fase G1

para fase S, promovendo a proliferação celular (Morgan, 1995; Guren et al., 1999).

Devido a este a fato decidimos avaliar a atividade desta proteína no efeito proliferativo

do EGF nos períodos de 4 e 48h, através da técnica de Western Blot (Figura 19).

Controle 4h

EGF 4h

Controle 48h

EGF 48h

100

150

Unidades arbitrárias

(% do controle)

Figura 19:

ATIVAÇÃO DA CICLINA D1 EM CULTURAS DE CÉLULAS DA RETINA TRATADAS

COM EGF 1ng/mL em 4h e 48h.

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). A) Westerm Blot mostrando a ativação da ciclina D1 em 4h apresentando a banda de

marcação para peso molecular 35 kDa. B) Westerm Blot mostrando a ativação da ciclina D1 em 4h e 48h

e o controle com a actina (48 kDa). Os resultados das unidades arbitrárias (densitometria da banda) são

expressos em % do controle (4h) ± erro padrão da média (n = 3). (*p< 0,001). CT – Controle; EGF –

Fator de Crescimento Epidermal.

35 kDa

CT4h EGF4h

CT4H EGF4H CT48H EGF48H

ACTINA

CICLINA D1

A figura 19 mostra o padrão de ativação da proteína ciclina D1, apresentando

um padrão de marcação de peso molecular de aproximadamente 35 kDa (figura 19 – A).

Já na figura 19 – B, ao compararmos o padrão de ativação entre os controles (4h e 48),

os resultados mostram que a atividade desta proteína é reduzida em aproximadamente

50%, ao longo do tempo em cultura. Porém nas culturas tratadas com EGF há um

pequeno aumento na marcação em 4h (± 25 %) e em 48 os níveis de ativação da

proteína ciclina D1 se mantém próximo ao controle 4h.

Como os níveis da ciclina D1 com 48h de tratamento com EGF se manteve

próximo ao controle 4h, decidimos avaliar a expressão desta proteína, no tecido

retiniano, durante o desenvolvimento pós-natal (figura 20). As retinas dos ratos da

linhagem Lister Hooded apresentaram um padrão de expressão da ciclina D1 que se

mantém alto até P9, mostrando que durante este período a retina ainda apresenta células

em proliferação. Porém, em P14, há uma queda brusca na expressão da ciclina D1, o

que não nos surpreende, pois confirma os dados na literatura, que relata neste período a

parada na proliferação concomitante a abertura dos olhos (Cepko, 1993 ; Reese &

Colello, 1992; Farah, 2006 para revisão).

Figura 20:

EXPRESSÃO DA CICLINA D1 AO LONGO DO TEMPO.

As amostram representam as retinas de ratos Lister Hooded com as idades de P0, P4, P9, P14, P30, P90 e

com 1 ano de idade. (n=2) (P – dia pós-natal)

P0 P4 P9 P14 P30 P90 1ANO

CICLINA D1

$SyV LQYHVWLJDU DV SULQFLSDLV YLDV GH VLQDOL]DomR HQYROYLGDV QR HIHLWR SUROLIHUDWLYR GR

(*) GHFLGLPRVDQDOLVDU VHHVWH HIHLWRVH VRPDYDDR H IHLWR SUROLIHUDWLYRGR )*)EHP QRVVDV

FXOWXUDVRXVHXPGR VID WRUHVSRGHULD SRWHQFLDURHIHLWRGRRXWUR3DUDLVWRXWLOL]DPRVR (*)QD

FRQFHQWUDomRGHQJP/HR)*)EQDFRQFHQWUDomRGHQJP/HDQDOLVDPRVDLQFRUSRUDomRGH

WLPLGLQDDSyVXPSHUtRGRGHK$ILJXUDPRVWUDRSRWHQWHHIHLWRS UROLIHUDWLYRGHDPERVRV

IDWRUHVWUyILFRVSRUpPDRSUpLQFXEDUPRVFRP)*)ESRUKHSRVWHULRUPHQWHWUDWD UPRVFRP

(*) SRU PDLV  HVWH HIHLWR p SRWHQFLDOL]DGR D OFDQoDQGR X PD PpGLD GH LQFRUSRUDomR GH

WLPLGLQDHPWRUQRDOpPGRFRQWUROH2XWURGDGRLPSRUWDQWHDSUHVHQWDGRQRJUiILFRpTXH

TXDQGR XWLOL]DPRV R )*)E MXQWR FRP R (*) SRU KR PH VPR H IHLWR SRWHQFLDOL]DGRUQmR IRL

REWLGR

Controle

EGF 1ng/mL 48h

FGFb 25 ng/mL 48h

EGF + FGFb 48h

EGF 24h + FGFb 24h

FGFb 24h + EGF 24h

100

150

200

250

300

350

400

incorporação de

[

H]-timidina (% do controle)

FIGURA 21

: EFEITO PROLIFERATIVO DO EGF 0,1ng/mL ASSOCIADO AO EFEITO DO FGFb

25ng/mL .

As células foram plaqueadas na densidade de 1,25x10

células por placa previamente tratadas com poli-L-

ornitina (50

g/mL). As culturas foram tratadas com EGF e FGF por 48h separadamente e em conjunto.

No mesmo experimento algumas placas foram pré-incubadas com EGF por 24h, lavadas e adicionado

FGFb por mais 24h. O mesmo foi feito utilizando o pré-tratamento com FGFb por 24h seguido do

tratamento com EGF por mais 24h. Os resultados das incorporações de [

H]-timidina são expressos em

% do controle

erro padrão da média (n = 8). (*p<0,001).

5 – DISCUSSÃO

A partir da descoberta do EGF, por Stanley Cohen em 1959, muitos

pesquisadores se dedicaram aos estudos sobre os efeitos induzidos por este fator trófico

em inúmeros sistemas. Sua expressão ocorre desde as primeiras etapas do

desenvolvimento até a idade adulta. No Sistema Nervoso Central, o EGF é capaz de

regular diferentes fenômenos dos quais podemos destacar: sobrevida, proliferação e

diferenciação em regiões como hipocampo, diencéfalo, telencéfalo, zona subventricular

e retina (Tropete, 2000; Laskowski et al., 2004; Baldauf e Reyman, 2005; Wueste,

2006; Gu et al., 2007) .

Diferentes grupos têm demonstrado o efeito proliferativo do EGF. É interessante

chamar a atenção para o fato de que dependendo do tipo celular a concentração de EGF

necessária para induzir o efeito máximo, bem como as vias de sinalização que modulam

este efeito, variam de forma significativa (Gobin and West, 2003; Heo et al., 2005;

Henson e Gibson, 2006 para revisão). Isto provavelmente está relacionado ao fato do

EGF poder utilizar vias de sinalização distintas dependendo do estágio de

desenvolvimento de uma dada população celular; bem como utilizar vias diferentes

dependendo da população estudada.

Nosso objetivo neste trabalho, foi avaliar os efeitos do EGF na proliferação das

células da retina in vitro e identificar as vias de sinalização envolvidas neste efeito. Esse

interesse adveio de um resultado prévio, e ainda não publicado de nosso grupo, que

mostrava ser o efeito proliferativo do FGF2 em parte mediado pela ativação dos

receptores de EGF. Os resultados do nosso trabalho mostraram que o EGF é um fator

trófico com grande capacidade de promover a proliferação das células da retina (200%

de aumento com concentrações iguais ou superiores a 1ng/mL) após 48 horas em

cultura. Este efeito foi mantido até o 6

dia em cultura e já no 9

dia não era mais

possível observá-lo.

Corroborando nossos resultados, um aumento semelhante (cerca de 200% na

incorporação de [

H]-timidina) foi observado por Guren e claboradores em 1999 em

cultura de hepatócitos tratadas com EGF. Os autores utilizaram concentrações entre 10 e

100ng/mL e fizeram um tratamento por 24h. Em 2001, Barna e colaboradores utilizaram

a marcação com BrdU (análogo da timidina) para avaliar os efeitos proliferativos do

EGF em cultura de astrócitos. Os autores observaram que o tratamento destas células

com EGF, na concentração de 10ng/ml por apenas 10 minutos, dobrou o número do

núcleo de células marcadas com BrdU. A marcação com BrdU foi a metodologia

também utilizada por Laskowski e colaboradores, em 2005, para avaliar a proliferação

induzida pelo EGF em cultura de células do hipocampo. O tratamento dessas células,

com uma concentração de 20ng/ml por 24h, induziu um aumento de 300% na

proliferação celular. Desta maneira, podemos concluir que o efeito proliferativo do EGF

sobre as células da retina segue o mesmo padrão observado em outras populações

estudadas.

Lillien, em 1995, tratou por 4 dias células progenitoras da retina de

camundongos com TGF.  D  QJP/ H REVHUYRX TXH HP PHQRUHV

concentrações este fator trófico induzia a proliferação, mas a medida que as

concentrações aumentavam ocorria a diferenciação das progenitoras em células de

Müller. O mesmo resultado foi observado com EGF. Quando os autores aumentaram a

expressão dos EGFR nas células progenitoras, foi possível induzir a diferenciação com

baixas concentrações de TGF.  (VWHVUHVXOWDGRV VXJHUHP TXH WDQWR D FRQFHQWUDção do

ligante quanto o nível de expressão do receptor de EGF pode esta influenciando na

resposta celular ao longo do processo de desenvolvimento.

Em nosso trabalho obtivemos aumentos grandes na taxa de proliferação tanto

quando utilizamos concentrações baixas (1 e 5 ng/ml por exemplo) como quanto

utilizamos concentrações elevadas (100ng/ml). Uma possível explicação para estes

resultados se dá pelo fato de trabalharmos com culturas mistas de células da retina por

um período de tempo diferente daquele utilizado por Lillien em 1995. Nosso objetivo

mais imediato será analisar que tipo ou tipos de populações de células da retina estão

proliferando pela ação do EGF. A partir destes estudos nos será possível entender o

porque das diferenças obtidas por nós e por Lillien em 1995.

Nossos resultados apresentados na figura 9 mostram que o tratamento com EGF

1ng/mL já induz aumento de 200% na proliferação após 24h em cultura e este efeito é

mantido até o 6

dia de incubação. Porém no 9

dia em cultura, o índice de incorporação

cai aproximadamente ao nível do controle. Ao observarmos a morfologia das culturas

tratadas com EGF por 48h podemos observar áreas com grande número de células,

assim como áreas ainda descobertas no fundo da placa, quando comparado ao controle.

Todavia ao analisarmos as culturas mantidas por 9 dias na presença de EGF observamos

que a placa de Petri está completamente tomada pelas células, o que poderia justificar a

queda na proliferação devido à inibição por contato. Esta confluência na placa também

foi observada por Guilarducci-Ferraz e colaboradores, em 2007, quando os autores

trataram as culturas de células da retina por 144h na presença de FGF2 25ng/mL e

observaram uma queda na proliferação. No presente momento nosso grupo ainda não é

capaz de responder o porquê das diferenças nas taxas de proliferação e nas cinéticas

observadas com os tratamentos com FGF2 e EGF. Acreditamos que a resposta deve

estar relacionada ao fato dos fatores influenciarem populações diferentes. Porém,

somente com a caracterização do tipo celular proliferante, em cada uma das situações

experimentais, é que poderemos ter esta resposta.

Em 2005, Heo e colaboradores avaliaram os efeitos proliferativos do EGF, em

diferentes concentrações (10, 50, 100 e 200ng/mL) por um período de 0 a 48h, em

cultura de células tronco obtidas de cérebros de camundongos. Para avaliar a

proliferação destas células, o autores usaram tanto a técnica de incorporação de [

H]-

timidina, quanto a utilização da incorporação de BrdU. Em ambas as técnicas o melhor

efeito observado ocorreu após 24h com concentrações de 50 e 100ng/mL. Após este

período tempo o efeito proliferativo apresentou queda.

Quando células de Muller de camundongos têm uma diminuição na expressão

dos receptores de EGF ocorre uma diminuição na taxa de proliferação do tecido

retiniano. Isto ocorre fisiologicamente, após o nascimento. Entretanto, a estimulação

luminosa deste tecido faz com que a expressão deste receptor retorne aos valores

normais. Este efeito é mediado pela ação do EGF endógeno (Close et al., 2006). Estes

dados nos levam a pensar que talvez, no nosso modelo experimental, o tratamento com

EGF possa estar induzindo um aumento no número de receptores para este fator o que

potencializaria os efeitos observados.

Embora muitos trabalhos sobre o efeito proliferativo do EGF tenham sido feitos

em retinas de camundongos no período pós-natal (Lillen 1995, Close et al., 2006) seus

efeitos são bem mais gerais. Lee e colaboradores, em 2007, mostraram que proliferação

das células da musculatura lisa vascular, é mediada pela liberação de IL-6 induzida

pelo HB-EGF. Um outro efeito do EGF que se relaciona com interleucinas é o de que

este fator é capaz de regular os níveis de expressão do receptor de IL-4 em astrócitos

(Barna et al., 2000). Estes resultados nos levam a pensar na possibilidade das

interleucinas 6 e 4 estarem mediando o efeito do EGF em nosso sistema.

Quando analisamos nossos resultados acerca das vias de sinalização utilizadas

pelo EGF observamos que o tratamento com genisteína não foi capaz de bloquear o

efeito proliferativo do EGF, o que nos pareceu um resultado contraditório, pois esta

droga bloqueia a atividade tirosina cinase e o receptor do EGF quando ativado,

apresenta esta atividade. Entretanto, esta não é uma droga seletiva para o receptor de

EGF e isto pode explicar o porquê do não bloqueio. Entretanto, quando as culturas

foram tratadas com AG1478 que é um inibidor seletivo dos receptores de EGF houve

um bloqueio total do efeito. Efeitos semelhantes em bloquear a proliferação do EGF

com este fármaco foram demonstrados por: Hollborn e colaboradores, em 2005, onde o

AG1478 bloqueou a proliferação de células gliais da retina de ratos; por Heo e

colaboradores, em 2005, inibindo a mitose de células tronco embrionárias de

camundongos; e por Lee e colaboradores, em 2007, mostrando envolvimento do EGFR

na proliferação de células da musculatura lisa vascular. Desta maneira, nosso resultado

obtido com o tratamento com o AG1478, indica que o primeiro passo da sinalização do

EGF em nossas culturas se deva à ativação dos receptores.

Analisamos também se as proteínas da família da Src estavam participando da

cascata de sinalizações induzida pelo EGF, e para tal utilizamos um bloqueador seletivo

desta família, o PP1, na concentração de 1µM. Nossos resultados mostram que também

o PP1 não foi capaz de inibir o efeito do EGF. O EGFR possui um sítio de ativação

intracelular que pode ser ativado pela Src (Hass et al., 2002), porém não há

obrigatoriedade desta ativação para que os efeitos deste fator sejam deflagrados. Assim

sendo, podemos sugerir que em nosso sistema, as Src não sejam mediadoras das

respostas proliferativas.

Uma outra via analisada foi a da PI3 cinase, todavia o tratamento com o

LY294002 não bloqueou o efeito proliferativo do EGF. A PI3 cinase é uma via

envolvida nos efeitos proliferativos do FGF2 em culturas de células da retina

(Guilarducci–Ferraz et al., 2007). A participação da PI3-cinase e Akt nos efeitos

mediados pelo EGF e seu receptor já foi demonstrada em alguns trabalhos da literatura

(Kumar et al., 2006; Weuste et al., 2006, Freeman et al., 2007), porém em eventos não

relacionados com a proliferação celular. De acordo com Woung e Guillaund, em

2004, e Herson e Gibson, em 2006, a via da PI3 cinase também está relacionada com

sobrevida celular e a sua ativação depende da heterodimerização do EGFR com Erb3.

Entretanto, até o presente momento não foi identificado o receptor Erb3 em células da

retina. Este resultado poderia explicar porque o efeito do EGF não foi abolido quando

do tratamento com o inibidor da via da PI3 cinase.

Nossos resultados claramente mostram que o cloreto de queleritrina e o BAPTA-

AM, bloquearam o efeito proliferativo do EGF. Este dados arrolam a via da PKC e

possivelmente de uma PKC dependente de cálcio nos efeitos proliferativos do EGF.

Estudos futuros serão realizados para que possamos caracterizar que tipo de PKC está

participando do fenômeno.

Nossos resultados mostram a participação da via da MAP cinase, pois o

PD98059 foi capaz de bloquear os efeitos induzidos pelo EGF. De acordo com nossos

resultados, encontramos trabalhos na literatura que corroboram a participação da via da

PKC-MAP cinase nos efeitos proliferativos do EGF. Heo e colaboradores, em 2005,

mostraram efeitos semelhantes aos nossos na proliferação induzida pelo EGF em células

tronco embrionárias de camundongos, porém além de demonstrarem a participação do

citoplasmático utilizando o BAPTA-AM, o efeito também foi parcialmente inibido

ao bloquearem o influxo de Ca

com um quelante extracelular. A análise por Western

Blot evidenciou a participação da PKC tanto da classe convencional quanto da classe

atípica. O PD98059, também inibiu efeito induzido pelo EGF. Conforme Heo e

colaboradores, em 2005, nossos resultados sugerem que o EGF possa estar estimulando

a proliferação das células da retina através da ligação ao seu receptor, este por sua vez,

ativa uma PKC da classe convencional ativando assim a via da MAP cinase.

O PD98059 é um bloqueador da MEK1/2, por isto decidimos investigar se a

p38, uma outra MAP cinase, estaria envolvida no efeito do EGF. Surpreendentemente, o

SB202190, também bloqueou o efeito do EGF. Ao contrário dos nossos resultados, o

bloqueio da p38 potencializou a proliferação induzida pelo EGF em cultura de

trofoblastos, sugerindo que esta proteína estaria agindo de forma a inibir a proliferação

destas células mediadas pelo EGF, porém induzindo a uma diferenciação (Johstone et

al., 2005).

Vergarajauregui e colaboradores, em 2006, mostraram que a ativação da p38

promove a internalização do EGFR em linhagens de células de Hela, sugerindo um

papel desta proteína na regulação de efeitos proliferativos e anti – apoptóticos mediados

pelo receptor de EGF. Porém Hollborn e colaboradores, em 2005, mostraram que o

bloqueio da p38, reduzia a proliferação em linhagens de células de Muller induzida pelo

HB-EGF.

De acordo com Balbis e colaboradores, em 2007, a internalização do EGFR

pode ser um mecanismo de amplificação do sinal mediado pelo EGF, induzindo a

ativação de cascatas de sinalização citoplasmáticas. Desta forma a ativação da p38 em

nossas culturas poderia estar promovendo a internalização do EGFR, amplificando o

sinal promovido pelo EGF e posteriormente este receptor seria recolocado na membrana

plasmática, onde seria novamente ativado, justificando assim também, nossos efeitos

saturantes na proliferação celular ao longo do tempo.

Nossos resultados mostram que o tratamento com EGF por 4 ou 48h é capaz de

aumentar a expressão de ciclina D1. De acordo com nossos resultados, Decker, em

1995, mostrou que o tratamento de células NIH-3T3 com EGF induz aumento na

expressão da ciclina D1. Este efeito era mediado pela ativação da via da MAP cinase.

Zhang e colaboradores, em 2004, mostraram que o receptor de dopamina D1 era capaz

de inibir a ativação da ciclina D1 e a progressão do ciclo celular estimulado pelo EGF

em cultura de células precursoras de cérebro de camundongos. De acordo com Liao e

Carpenter, em 2007, a internalização e translocação do receptor de EGF para o núcleo

também pode ativar a proteína ciclina D1 e induzir a mitose celular. Nossos resultados

sugerem que após ativação da MAP cinase pela PKC, esta seria translocada para o

núcleo, aumentando a expressão da ciclina D1, promovendo assim a proliferação das

células da retina. Porém, a endocitose do receptor também poderia mediar efeito

semelhante. Sendo assim, uma futura investigação do tráfego do EGFR após sua

ativação se faz necessário.

Nossos resultados mostram que o tratamento com EGF aumentou a expressão

da ciclina D1 tanto em 4 como em 48h. Quando analisamos a expressão da ciclina D1

nas culturas controle, observamos que em 4h os níveis são altos e após 48h a expressão

desta proteína é diminuída (aproximadamente 50%). Anteriormente, nosso laboratório

havia demonstrado que a proliferação celular nas culturas controle, após 48h era

bastante diminuída (Guilarducci-Ferraz et al., 2007) o que está de acordo com a

diminuição da expressão da ciclina D1. O tratamento com EGF por 48h, mantém níveis

altos de expressão da ciclina D1 sugerindo que o aumento na proliferação induzido pelo

EGF se deva a permanente ativação da ciclina D1, mantendo as células em constante

atividade mitótica.

Quando analisamos a expressão da ciclina D1, no tecido retiniano, observamos

uma variação ao longo do desenvolvimento pós-natal. Até P9 a expressão se mantém

alta e em P14 esta expressão diminui significativamente. Este resultado nos permite

sugerir que a ciclina D1 seja um efetivo indicador da proliferação de células retinianas,

visto que em P14 a mitose já está terminando neste tecido. Close e colaboradores em

2006 mostraram que a expressão do EGFR se mantém alta até P4 diminuindo em P10,

acompanhando a queda na proliferação. Comparando estes dados com o nosso

resultado, podemos supor que esta queda na proliferação pode ser devido a uma

diminuição na expressão do EGFR e por sua vez isto repercute na queda da expressão

da ciclina D1.

A associação do EGF (1ng/ml) ao FGFb (25 ng/ml) por 48h em cultura da retina

não potencializou o efeito proliferativo de ambos os fatores, mantendo-se uma taxa de

incorporação de timidina semelhante ao do EGF 1ng/mL (± 150%) (figura 20).

Laskowiski e colaboradores, em 2005, obtiveram efeitos semelhantes em culturas do

hipocampo tratadas com EGF 20 ng/mL e FGFb 25 ng/mL por 24h atribuindo o fato das

células deste tecido apresentarem diferentes estágios de desenvolvimento, evidenciando

então diferentes respostas a cada fator trófico. Como em nosso modelo temos uma

cultura mista, apresentando também células em diferentes estágios de desenvolvimento

podemos encontrar diferentes respostas conforme o tipo celular que estiver sendo

ativado.

A potencialização da proliferação em nosso modelo de estudo só foi observada

quando pré-tratamos as células com FGFb por 24h seguido do tratamento com EGF por

mais 24h. Giordano e colaboradores, em 2007, mostraram culturas de células tronco da

retina de camundongos tratadas com FGFb + EGF por até 5 dias estes efeitos se

somaram e após este período apenas o FGFb manteve o efeito proliferativo. Além disso

os autores mostraram que o pré-tratamento com FGFb aumentaram os níveis de

expressão do FGFR e do EGFR.

O mesmo poderia está ocorrendo em nossos resultados, o pré-tratamento por 24h

com FGFb poderia está promovendo um aumento nos níveis de expressão do EGFR e

ao retirarmos este fator trófico e adicionarmos o EGF por mais 24h, ocorreria uma

potencialização do efeito devido uma maior inserção dos receptores da EGF na

membrana celular. Além disso, se o pré-tratamento com FGFb estiver realmente

aumentando a expressão do EGFR, doses menores destes fatores tróficos poderiam

talvez, mimetizar ou reproduzir efeitos semelhantes em nossos resultados, em nossa

cultura.

Em nosso protocolo experimental utilizamos meio de cultura contendo 5% de

soro fetal bovino. Portanto, em nossas experiências adicionamos o EGF a este meio.

/LOOLHQ H &HSNR HP  WUDWDUDP H[SODQWHV GH UHWLQD FRP 7*).  H FRP )*)E HP

meio sem soro e compararam a proliferação com o desenvolvimento in vivo. Os

resultados mostraram que a proliferação in vitro acompanhou o desenvolvimento in vivo

embora neste último as taxas tenham permanecido sempre mais elevadas. Estes mesmos

autores mostraram que o efeito proliferativo pode ser influenciado pela densidade da

cultura e pelo estágio de desenvolvimento de retina. Retinas com idade de E17 e com

densidade em torno de 50.000 células por placa, apresentaram uma proliferação muito

maior quando comparado à idade de P0 e 200.000 células por placa. Embora tenhamos

utilizado uma densidade já estabelecida em nosso laboratório, uma avaliação do efeito

proliferativo do EGF sob diferentes densidades se faz necessário.

6 - CONCLUSÃO

A partir dos dados apresentados podemos concluir que:

• O tratamento com EGF em culturas de células da retina é capaz de induzir a

grande proliferação das células da retina utilizando doses a partir de 1ng/mL de

forma saturante.

• O efeito proliferativo do EGF se mantém constante em até 6 dias em cultura.

• Para que este efeito ocorra, há a ativação do EGFR pelo seu ligante.

• Neste efeito há a participação da PKC, dos níveis de Ca

citoplasmático, da

MEK e da p38.

• Não há envolvimento de tirosinas cinases, da Src e da via da PI3 cinase.

• O pré-tratamento com FGFb por 24 aumenta a proliferação das células da retina

tratadas com EGF por mais 24h.

• No efeito mitogênico do EGF há a participação da ciclina D1.

7 – PERSPECTIVAS FUTURAS

No doutorado pretendemos:

• Identificar qual célula da retina está proliferando sob ação do EGF em cultura.

• Determinar se o tratamento com EGF, em diferentes períodos em cultura, é

capaz de induzir efeito proliferativo.

• Avaliar os efeitos do EGF nas culturas de células da retina com diferentes

densidades de plaqueamento.

• Verificar se alguma citocina, interleucina ou neurotrofina poderia estar

influenciando no efeito proliferativo do EGF.

• Determinar se pré-tratamento com FGFb está aumentando os níveis de

expressão do EGFR.

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