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CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA
PATRICIA CRISTINA FERNANDES ARÊAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NAFTOQUINONAS
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM NEUROIMUNOLOGIA
Orientadora: Lídia Maria da Fonte de Amorim
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
2007
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ii
PATRICIA CRISTINA FERNANDES ARÊAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NAFTOQUINONAS
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Toxicologia Molecular do Departamento de
Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia-UFF
Dissertação de mestrado submetida a
Universidade Federal Fluminense como
requisito parcial para obtenção do grau de
mestre em Neuroimunologia.
Orientadora: Lídia Maria da Fonte de Amorim
NITERÓI
2007
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iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Arêas, Patricia Cristina Fernandes
Avaliação da atividade antitumoral de naftoquinonas / Patricia Cristina Fernandes
Arêas - 2007
Orientadora: Lídia Maria da Fonte de Amorim
Tese (Mestrado) - Universidade Federal Fluminense - UFF, Instituto de Biologia.
1. Naftoquinonas. 2. Câncer. 3. K562. 4. Apoptose. 5. Síntese protéica. 6. Triazóis.
I. Amorim, Lídia Maria da Fonte de. II. Universidade Federal Fluminense - UFF.
Instituto de Biologia.
iv
PATRICIA CRISTINA FERNANDES ARÊAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NAFTOQUINONAS
Dissertação de mestrado submetida a
Universidade Federal Fluminense como
requisito parcial para obtenção do grau de
mestre em Neuroimunologia.
Aprovada em 14 de setembro de 2007.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Adriano Caldeira de Araújo (UERJ)
__________________________________________
Viveca Antônia Giongo (UGF)
__________________________________________
Izabel Christina de Palmer Paixão Frugulhetti (UFF)
REVISOR E SUPLENTE
_________________________________________
Elizabeth Giestal de Araújo (UFF)
v
Dedico este trabalho aos
meus grandes amores,
Antonio, Luiza e Isabella.
vi
AGRADECIMENTOS
A professora Lídia Amorim por sua orientação e seus ensinamentos, e por ter acreditado
em minha capacidade técnica e científica desde o início.
A meu marido Antonio por me compreender e me dar o estímulo, a força e o apoio
incondicionais necessários ao desenvolvimento de um trabalho com esta dimensão.
A minha filha Luiza por ter sido capaz de compreender minha ausência em muitos
momentos, sendo minha companheira e melhor amiga.
A minha filha Isabella, que apesar de ter chegado na fase final deste trabalho, reafirmou
minha determinação para concluí-lo.
Aos meus pais Luiz e Julia, meus sogros Antonio e Jane, e minha cunhada Sávia, por
estarem presentes em momentos cruciais do desenvolvimento de minha filha Luiza,
educando-a e lhe dando amor e carinho quando eu e o Antonio não pudemos estar
presentes, e agora por estarem repetindo esta dedicação com Isabella.
A professora Izabel Frugulhetti por sua co-orientação e por me mostrar que vontade de
ensinar e generosidade independem de colocação profissional.
A professora Tereza Quírico por disponibilizar gentilmente seu laboratório,
imprescindível para realizar várias etapas desta dissertação e, principalmente, por seus
conselhos e estímulo mesmo nos momentos mais difíceis.
A professora Patrícia Burth pelo apoio durante este período.
A professora Elizabeth Giestal de Araújo por acreditar em mim desde a seleção para o
mestrado até sua conclusão.
Aos professores Ana Ventura e Cláudio Alberto Serfaty, e seus alunos, pelo uso de seus
laboratórios para o desenvolvimento de algumas etapas deste trabalho.
vii
Aos professores Adriano Caldeira de Araújo e José Carlos P de Mattos e a aluna
Michelle Pinheiro Rodrigues do Laboratório de Radio e Fotobiologia da UERJ pelo
apoio na realização do teste do cometa.
Ao Prof. Vitor Francisco Ferreira e ao aluno Fernando de Carvalho da Silva pelo
fornecimento das substâncias testadas nesse trabalho e pelo auxilio nas questões
químicas.
A professora Keila Mara Cassiano do Departamento de Estatística da UFF pela análise
estatística dos resultados deste trabalho.
Aos amigos Maria Luiza e Diogo pela constante ajuda e amizade durante todo este
período.
Aos amigos do laboratório de Virologia Molecular pela compreensão durante o uso de
seu laboratório.
Ao Departamento de Imunologia, pelo uso do leitor de microplacas durante o
desenvolvimento deste trabalho.
A todos os professores do curso de pós-graduação por seus ensinamentos práticos e
teóricos.
A FAPERJ/SUS e PROAP/UFF pelo apoio financeiro.
A todos que de alguma forma me apoiaram e confiaram que eu seria capaz de chegar até
aqui.
viii
SUMÁRIO
Página
LISTAS DE TABELAS, FIGURAS E GRÁFICOS ................................................. x
RESUMO.................................................................................................................... xii
ABSTRACT................................................................................................................ xiv
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 1
1.1 Incidência mundial de câncer............................................................................ 1
1.2 Câncer no Brasil................................................................................................ 2
1.3 Tratamento do câncer........................................................................................ 5
1.4 Câncer, aspectos gerais..................................................................................... 8
1.5 Mecanismo de ação dos quimioterápicos contra o câncer................................ 12
1.6 Origem dos quimioterápicos antineoplásicos naturais....................................... 13
1.7 Avaliação de novas drogas................................................................................ 14
1.8 Atividade antineoplásica de naftoquinonas....................................................... 16
1.9 Propriedades farmacológicas dos triazóis .......................................................... 18
2 OBJETIVOS ................................................................................................... 19
2.1 Objetivo geral.................................................................................................... 19
2.2 Objetivos específicos........................................................................................ 19
3 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 20
3.1 Manutenção das linhagens celulares utilizadas no estudo............................... 20
3.2 Substâncias testadas........................................................................................ 21
3.3 Avaliação da viabilidade celular..................................................................... 21
3.3.1 Citotoxicidade celular..................................................................................... 21
3.3.2 Determinação do IC
50
..................................................................................... 23
3.4 Avaliação do mecanismo de ação das substâncias......................................... 23
3.4.1 Avaliação da síntese protéica.......................................................................... 24
3.4.2 Avaliação da apoptose por fragmentação do DNA........................................ 25
3.4.3 Avaliação de lesões oxidativas pelo teste do cometa..................................... 26
3.5 Análise estatística ........................................................................................... 27
4 RESULTADOS ............................................................................................ 28
4.1 Avaliação da viabilidade celular.................................................................... 28
4.1.1 Citotoxicidade celular ................................................................................... 28
ix
4.1.2 Determinação do IC
50
.................................................................................... 32
4.2 Avaliação do mecanismo da ação das substâncias............................................ 36
4.2.1 Avaliação da síntese protéica............................................................................ 36
4.2.2 Avaliação da apoptose por fragmentação do DNA........................................... 36
4.2.3 Avaliação da genotoxicidade das naftoquinonas pelo teste do
cometa.......................................................................................................................... 40
5 DISCUSSÃO ................................................................................................... 43
6 CONCLUSÃO ................................................................................................ 53
7 BIBLIOGRAFIA............................................................................................ 55
8 ANEXOS......................................................................................................... 59
x
LISTA DE TABELAS, GRÁFICOS E FIGURAS
TABELAS
TABELA 1. Estimativas para o ano 2006 das taxas brutas de incidência por
100.000 habitantes e de número de casos novos por câncer, em homens e mulheres,
segundo a região.................................................................................................
3
TABELA 2. Estimativas para o ano 2006 de número de casos novos de câncer, por
região...............................................................................................
3
TABELA 3. Estimativa para 2006 do número de casos novos de câncer em
homens..............................................................................................................
4
TABELA 4. Estimativa para 2006 do número de casos novos de câncer em
mulheres............................................................................................................
4
TABELA 5. Gastos federais em assistência
oncológica...................................................................................................................
6
TABELA 6. Viabilidade celular (%) nas linhagens K562 e HEP2 tratadas com
naftoquinonas na concentração de 50 μM por 24 horas.............................
29
TABELA 7. Viabilidade celular (%) de triazóis na concentração de 50 μM por 24
horas nas linhagens K562 e HEP2..........................................................
31
TABELA 8. Valores de IC 50............................................................................
36
TABELA 9. Análise da síntese protéica em relação ao controle (DMSO)........
37
FIGURAS
FIGURA 1. Tipos de metilação .........................................................................
10
FIGURA 2. Classificação das quinonas.............................................................
16
FIGURA 3. Rota de síntese das naftoquinonas utilizadas no
estudo................................................................................................................
22
FIGURA 4. Apoptose por fragmentação do DNA com incubação das substâncias
por 4 horas.........................................................................................................
37
FIGURA 5. Apoptose por fragmentação do DNA 24 horas.............................
38
FIGURA 6. Alteração da morfologia celular na presença de naftoquinonas na
linhagem K562 após 24 horas de
incubação...................................................................
39
FIGURA 7. Visualização da fragmentação do DNA pelo teste do
xi
cometa........................................................................................................................... 41
GRÁFICOS
GRÁFICO 1. Procedimentos quimioterápicos aprovados pelo
SUS.........................................................................................................
7
GRÁFICO 2. Valores em Reais para os procedimentos
quimioterápicos.............................................................................................
7
GRÁFICO 3. Viabilidade celular em presença das naftoquinonas com maior
potencial citotóxico a 50μM na linhagem K562 em 24
horas...............................................................................
29
GRÁFICO 4. Viabilidade celular em presença das naftoquinonas com maior
potencial citotóxico a 50μM na linhagem HEP2 em 24
horas..............................................................................
30
GRÁFICO 5. Viabilidade da linhagem K562 em diferentes concentrações de
DMSO, no período de 24 horas..........................................................................
33
GRÁFICO 6. Viabilidade da linhagem HEP2 em diferentes concentrações de
DMSO, no período de 24 horas..........................................................................
33
GRÁFICO 7. Viabilidade das linhagens K562 e HEP2 em diferentes concentrações
do quimioterápico Etoposídeo.............................................................................
34
GRÁFICO 8. Regressão logarítmica e sua equação nas diferentes concentrações do
quimioterápico Etoposídeo nas linhagens K562 (A) e HEP2 (B)..................
35
GRÁFICO 9. Teste do cometa (2 horas)............................................................
42
GRÁFICO 10. Viabilidade celular (%) com azul de tripan por 2 horas...........
42
xii
RESUMO
No ano de 2005, foram registrados 58 milhões de óbitos no mundo dos quais
13% ocorreram devido a algum tipo de câncer. No Brasil, as estatísticas mostram o
aumento da incidência de casos de câncer e dos recursos em assistência oncológica
liberados pelo Sistema Único de Saúde (SUS), entre os anos de 2000 e 2005, onde
registrou-se um aumento de 103% nos gastos federais. Somente no ano de 2005 foram
aprovados cerca de 1.5 milhões de procedimentos quimioterápicos em todo Brasil pelo
SUS. Os quimioterápicos naturais foram introduzidos ao longo dos últimos vinte anos
no tratamento do câncer, reforçando o interesse de indústrias farmacêuticas em produtos
de origem natural. Existe grande interesse na identificação de novos agentes
antineoplásicos, que tenham ação seletiva e seus efeitos adversos minimizados. No
presente estudo foi feita uma análise “in vitro” de Triazóis, Ácido Pirazolil Acrílico,
Naftoquinonas e outros derivados do Lapachol e da Lausona, como possíveis agentes
citotóxicos às linhagens tumorais K562 e HEP2. A partir da triagem realizada no teste
de viabilidade celular com MTT, selecionamos a linhagem K562 como a linhagem mais
sensível ao tratamento e cinco naftoquinonas como os compostos mais citotóxicos.
Estas naftoquinonas exibiram citotoxidade mais elevada do que o Etoposídeo, o
controle positivo. As concentrações inibitórias 50% (IC
50
) utilizando células K562
foram 0.06 μM, 467.6 μM, 3126.2 μM, 977.1 μM e 488,0 μM para βLapachona, Nor
βLapachona, Metoxi, Epoxi αLapachona e IVS 320, respectivamente. A síntese
protéica foi inibida em todas as cinco drogas testadas e também foi observada indução
da fragmentação do DNA característica da apoptose após 24 horas de incubação a 50
μM. Após 2 horas 50 μM as células exibiram genototoxicidade no teste do cometa. De
modo geral, observou-se que as substâncias Nor βLapachona e IVS 320 foram mais
xiii
promissoras em relação aos potenciais antitumorais o que sugere a necessidade de
maiores estudos.
xiv
ABSTRACT
Cancer is an important cause of death in worldwide. In 2005 were recorded 58
millions of deaths and about 13% were in consequence of cancer. In Brazil, official data
show an increase of cancer cases as well as the costs with cancer care. Federal resources
show an increase of 103% since 2000 until 2005. In 2005 the Brazilian government
recorded 1,5 million units of chemotherapy proceedings. The chemotherapy with natural
compounds was introduced on cancer therapy about 20 years ago. Besides that, an
increase of pharmaceutical industry interests was observed. Finally, there is a great
interest of more selective and safe new cancer drugs. In doing so, we performed an “in
vitro” study with the antitumoral activity of Triazoles, Pirazolil acrylic acid and
Naphtoquinones compounds as well as others Lapachol and Lausone derivatives
compounds on K562 and HEP2 tumoral cell lineages. A MTT test was performed and
the K562 cells were selected as the most sensitive cellular lineage as well as the five
naphtoquinones as the most citotoxic compounds. These naphtoquinones exhibited
cytotoxicity higher than Etoposide, the positive control of the tests. The IC
50
.using
K562 cells were 0.06 μM, 467.6 μM, 3126.2 μM, 977.1 μM and 488,0 μM
to βLapachone, Nor βLapachone, Metoxi, Epoxi αLapachona and IVS 320,
respectively. Protein synthesis was inhibited for all five compounds and, all five
naphtoquinones induced DNA fragmentation profile characteristics of apoptosis after 24
hours of incubation at 50 μM. After two hours at 50 μM cells exhibited genotoxic
effects on comet assay. Overall, Nor βLapachone and IVS 320 were considered such
potential antitumoral compounds that could be better investigated.
1 – INTRODUÇÃO
1.1 - Incidência mundial de câncer
No ano de 2005, foram registrados 58 milhões de óbitos no mundo dos quais
13% ocorreram devido a algum tipo de câncer. Os casos de mortalidade estão
relacionados principalmente aos cânceres de pulmão (1,3 milhões de mortes/ano),
estômago (1 milhão de mortes/ano), fígado (662.000 mortes/ano), cólon (655.000
mortes/ano) e mama (502.000 mortes/ano). Cerca de 70% destes casos ocorreram em
países em desenvolvimento (WHO, 2006) .
Acredita-se que em 2015 o câncer seja responsável por 9 milhões de mortes, em
2020 trinta milhões de pessoas sejam portadoras desta patologia e em 2030 tenhamos
11,4 milhões de mortes no mundo. As estatísticas globais mostram que os cânceres de
pulmão, estômago, fígado, coloretal, esôfago e próstata são os principais causadores de
mortes em homens, e entre as mulheres, são os cânceres de mama, pulmão, estômago,
coloretal e cervical. O principal responsável por óbitos é o câncer de pulmão, tanto em
países desenvolvidos como em desenvolvimento. Os cânceres de próstata, mama e
colon são mais observados em países desenvolvidos quando comparados a países em
desenvolvimento, onde a maior incidência é de cânceres de fígado, estômago e cervical
(WHO, 2006).
Quase 50% dos casos de câncer podem ser prevenidos através de alimentação
adequada, atividade física e abstinência de tabaco e álcool. A dieta desregulada é
responsável por 30% dos cânceres em países desenvolvidos e 20% dos cânceres em
países em desenvolvimento. Carcinógenos ambientais e agentes infecciosos são
responsáveis por 4% e 18% dos casos de câncer em países desenvolvidos,
respectivamente. O tabaco, é responsável por 30% dos tumores malignos em países
2
desenvolvidos, e além de causar o câncer de pulmão, também é um fator de risco para o
câncer de laringe, esôfago e cavidade oral, entre outros. Consumidores passivos de
tabaco também são acometidos pelo câncer de pulmão. Cerca de 2% dos casos de
câncer ocorrem devido a infecções crônicas como hepatite B (HBV) e papiloma vírus
humano (HPV) (WHO, 2006).
A prevenção do câncer é o passo inicial para o controle desta patologia, tendo
como estratégia principal a redução da exposição a fatores de risco. Altas taxas de cura
são observadas em pacientes que obtiveram uma detecção precoce através de testes
laboratoriais e diagnósticos por imagem, e um tratamento adequado que inclui
principalmente quimioterapia e radioterapia (WHO, 2006).
1.2 – Câncer no Brasil
As informações contidas neste trabalho sobre estimativas de câncer no Brasil
foram fornecidas pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA) para o ano de 2006. Ainda
não foram disponibilizadas informações confirmando estas estimativas nem tampouco
as estimativas para o ano de 2007.
As estimativas para 2006 apontaram cerca de 472.050 casos novos de câncer,
tendo a região sudeste o maior número de casos (TABELA 1). Em todas as regiões, o
câncer de pele não melanoma apresenta maior incidência (TABELA 2) (INCA, 2005).
No Brasil, a maior incidência no sexo masculino seria o câncer de pele não
melanoma, seguido do câncer de próstata e de pulmão (TABELA 3). No sexo feminino,
o tipo mais incidente seria o de pele não melanoma, seguido do câncer de mama e colo
uterino (TABELA 4) (INCA, 2005).
3
TABELA 1. Estimativas para o ano 2006 das taxas brutas de incidência por 100.000
habitantes e de número de casos novos por câncer, em homens e mulheres, segundo a
região (INCA, 2005).
Estimativa dos Casos Novos
Região
Masculino Feminino Total
Norte 8.360 8.910 17.270
Nordeste 34.290 40.480 74.770
Centro-Oeste 14.240 13.910 28.150
Sul 53.420 48.690 102.110
Sudeste 124.260 125.490 249.750
TABELA 2. Estimativas para o ano 2006 de número de casos novos de câncer, por
região (INCA, 2005).
Localização
Primária
Norte Nordeste
Centro-
Oeste
Sul Sudeste
Mama Feminina 1.110 7.120 2.520 9.540 28.640
Traquéia, Brônquio
e Pulmão
990 3.350 1.590 7.230 14.010
Estômago 1.260 3.680 1.310 4.670 12.280
Próstata 1.680 8.730 3.050 9.200 24.620
Colo do Útero 1.610 4.410 1.430 3.840 7.970
Cólon e Reto 520 2.450 1.320 5.920 15.150
Esôfago 220 1.230 550 3.180 5.400
Leucemias 510 1.820 630 1.850 4.740
Cavidade Oral 380 2.170 670 2.520 7.730
Pele Melanoma 140 450 240 1.790 3.140
Outras Localizações 4.230 15.560 6.520 27.520 71.020
Subtotal 12.650 50.970 19.830 77.260 194.700
Pele não Melanoma 4.620 23.800 8.320 24.850 55.050
4
TABELA 3. Estimativa para 2006 do número de casos novos de câncer em homens
(INCA, 2005).
Estimativa dos Casos Novos
Estado Capital
Localização Primária
Neoplasia maligna
Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta
Traquéia, Brônquio e Pulmão 17.850 19,41 5.300 26,40
Estômago 14.970 16,30 3.950 19,68
Próstata 47.280 51,41 13.980 69,74
Cólon e Reto 11.390 12,36 4.390 21,78
Esôfago 7.970 8,64 1.720 8,47
Leucemias 5.330 5,82 1.570 7,78
Cavidade Oral 10.060 10,91 3.050 15,01
Pele Melanoma 2.710 2,92 830 3,80
Outras Localizações 61.530 66,92 18.370 91,45
Subtotal 179.090 194,77 53.160 264,63
Pele não Melanoma 55.480 60,74 13.680 68,13
Todas as Neoplasias 234.570 255,14 66.840 332,62
TABELA 4. Estimativa para 2006 do número de casos novos de câncer em mulheres
(INCA, 2005).
Estimativa dos Casos Novos
Estado Capital
Localização Primária
Neoplasia maligna
Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta
Mama Feminina 48.930 51,66 17.900 80,54
Traquéia, Brônquio e Pulmão 9.320 9,82 2.980 13,38
Estômago 8.230 8,65 2.610 11,55
Colo do Útero 19.260 20,31 6.030 27,11
Cólon e Reto 13.970 14,73 5.370 24,09
Esôfago 2.610 2,74 600 2,43
Leucemias 4.220 4,45 1.360 6,08
Cavidade Oral 3.410 3,58 1.130 4,92
Pele Melanoma 3.050 3,16 940 4,02
Outras Localizações 63.320 66,78 22.750 102,17
Subtotal 176.320 185,95 61.670 276,96
Pele não Melanoma 61.160 64,53 15.340 68,92
Todas as Neoplasias 237.480 250,45 77.010 345,94
5
A leucemia, neoplasia hematológica que afeta o sangue e a medula óssea e é
caracterizada por uma proliferação anormal das células sanguíneas, especialmente as
células brancas, os leucócitos, encontra-se como o sétimo e sexto câncer mais freqüente
em homens e mulheres, respectivamente (TABELAS 3 e 4). A maior estimativa para os
casos de leucemia por estados brasileiros foi de 9,11 casos para homens e 6,59 casos
para mulheres, no Rio Grande do Sul, para cada 100.000 habitantes. No Rio de Janeiro,
estimou-se 7,66 casos para homens e 5,53 casos para mulheres, para cada 100.000
habitantes (INCA, 2005). Entre as leucemias, a leucemia mielóide crônica representa
cerca de 14% de todas as leucemias e 20% das leucemias de adulto, tendo sua maior
incidência na quarta década de vida, mas podendo também afetar crianças e idosos
(Morrison, 1994; Quintas-Cardama & Cortes, 2006).
1.3 – Tratamento do câncer
Após a confirmação do diagnóstico e antes do início do tratamento deve-se fazer
uma avaliação do paciente para determinar a extensão do câncer, o prognóstico e a
melhor terapia. As estatísticas mostram o aumento da incidência de casos de câncer e
dos recursos em assistência oncológica liberados pelo Sistema Único de Saúde (SUS),
entre os anos de 2000 e 2005. Neste período registrou-se um aumento de 103% nos
gastos federais (TABELA 5). Em 2005, foram contabilizadas 1,6 milhões de consultas
oncológicas ambulatoriais, 423 mil internações por câncer, sendo tratados mensalmente
128 mil pacientes por quimioterapia e 98 mil pacientes por radioterapia (INCA, 2006a).
Somente no ano de 2005 foram aprovados cerca de 1.5 milhões de
procedimentos quimioterápicos em todo Brasil pelo SUS (GRÁFICO 1). Quando
6
convertidos em Reais, estes procedimentos atingiram a quantia de aproximadamente R$
900.000.000,00 (GRÁFICO 2). Drogas com alvo molecular específico e radioterapia
também têm mostrado bons resultados, possibilitando a interação dessas drogas com
moléculas mais expressas em células cancerosas e diminuindo efeitos nocivos as células
normais (Ferreira & Rocha, 2004; Vink et al., 2007; Merck co, 2006; INCA, 2006a).
TABELA 5. Gastos federais em assistência oncológica (INCA, 2006a)
Ano Evolução dos gastos (R$)
2000 570.847.495
2001 661.916.854
2002 786.161.628
2003 903.872.011
2004 1.000.135.565
2005 1.159.724.708
A quimioterapia é o método que utiliza compostos químicos, chamados
quimioterápicos, que atuam com diferentes mecanismos de ação detendo a
multiplicação celular. Os avanços verificados nas últimas décadas, na área da
quimioterapia antineoplásica, têm facilitado consideravelmente a aplicação de outros
tipos de tratamento de câncer e permitido maior número de curas (INCA, 2006b).
Os agentes quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer são originalmente
sintéticos, semi-sintéticos ou naturais, sendo divididos em cinco classes diferentes,
agentes alquilantes, antimetabólitos, produtos naturais, agentes diversos e hormônios e
antagonistas (Hardman & Limbird, 2005).
Os agentes antineoplásicos são atualmente utilizados de forma combinada
atuando em processos metabólicos diferentes e aumentando a probabilidade de
7
erradicação das células cancerosas, além de apresentarem menor toxicidade, já que são
utilizados em uma dosagem menor quando comparados ao seu uso separadamente
(Hardman & Limbird, 2005).
GRÁFICO 1. Procedimentos quimioterápicos aprovados pelo SUS. (INCA, 2006a)
GRÁFICO 2. Valores em Reais para os procedimentos quimioterápicos. (INCA, 2006a)
8
Os agentes quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer muitas vezes não
são tolerados pelos pacientes. Atualmente, são testados tratamentos que utilizam
nanopartículas magnéticas como carreadores de agentes antitumorias, que são injetados
na circulação e atingem o tecido tumoral alvo com pequena contaminação de tecidos
normais. Grande quantidade da droga é retida no tecido alvo através de um campo
magnético, favorecendo o tratamento e diminuindo os efeitos colaterais (Alexiou et al.,
2006).
Devido à observação de regressão de tumores utilizando componentes do
sistema imunológico, estão sendo desenvolvidas novas estratégias em imunoterapia
anticâncer. A interlecina 2 (IL2), uma citocina humana que estimula linfócitos, não
demonstrou atividade antineoplásica in vitro, porém se mostrou capaz de estimular
linfócitos T com atividade antitumoral in vivo. O tratamento com IL2 levou à regressão
não só de alguns tipos de câncer como de tumores metastáticos (Rosenberg, 2001).
Embora exista um grande número de agentes quimioterápicos, a eficácia destes
agentes para o tratamento do câncer ainda está distante de ser alcançada. Vários fatores
como: a heterogeneidade da doença que compreende cerca de 100 tipos de cânceres e a
resistência intrínseca ou adquirida aos quimioterápicos depois de pouco tempo de
tratamento dificultam o uso de apenas um agente quimioterápico (Cozzi et al., 2004).
1.4 – Câncer, aspectos gerais.
O câncer é uma doença resultante de alterações genéticas, ou seja, que causam
modificações na estrutura do DNA (ácido desoxirribonucléico), ou epigenéticas, que são
capazes de alterar a constituição química do DNA não alterando diretamente a
seqüência de nucleotídeos. Geralmente, os genes atingidos estão relacionados aos
9
processos de indução e controle do ciclo de divisão celular e/ou um desequilíbrio no
controle da morte celular programada. (Ferreira & Rocha, 2004; Alberts et al., 2004).
Entre os anos de 2001 e 2003 foram identificados na literatura pertinente cerca
de 80 genes associados a quimiosensibilidade in vitro de linhagens celulares tumorais
sendo caracterizados como potencias candidatos que podem auxiliar no estabelecimento
de testes de quimiosensibilidade. As funções celulares dos genes variaram de acordo
com o tipo celular e as condições experimentais. Dentre as proteínas codificadas foram
observadas proteínas transportadoras, detoxificadoras, reparadoras de DNA, reguladoras
do ciclo celular e reguladoras da apoptose, entre outras. Algumas proteínas são
relativamente específicas para uma droga (Cisplatina, Etoposídeo etc) ou tipo celular.
Os genes TP53 e BCL2 foram associados a apoptose. Do ponto de vista celular, várias
vias envolvendo diferentes genes podem agir antagonicamente ou complementando-se
na determinação da quimiosensibilidade da célula (Sekine et al., 2007).
Os pontos de checagem presentes em todas as fases do ciclo celular atuam como
protetores da integridade genômica. Através destes pontos, eventuais danos no DNA são
reconhecidos e vários mecanismos podem ser ativados para reparar o dano, e quando
este for irreversível ou as condições forem adversas ao seu crescimento a célula é
induzida a entrar em apoptose (Li et al., 2003).
As alterações estruturais e/ou funcionais de genes controladores do ciclo celular
podem ser decorrentes da amplificação e ativação de proto-oncogenes, ou mutações que
levem à perda ou inativação de genes supressores de tumor (Ferreira & Rocha, 2004;
Pasternak, 2002; Alberts et al., 2004).
O genoma humano possui dinucleotídeos citosina-fosfoguanina distribuídos
uniformemente, formando as ilhas CpG. Após a replicação, um grupamento metil (CH
3
)
é adicionado a extremidade 5’ do dinucleotídeo CpG. A expressão do gene é regulada
10
por endonucleases, sendo este silenciado quando as ilhas CpG são metiladas. São
gerados padrões de metilação por DNA metiltransferases (DNMTs) que transferem um
grupo metil a partir da adenosilmetionina (SAM). A hipometilação está associada a
reativação de genes e instabilidade cromossômica, podendo levar a ativação de proto-
oncogenes. A hipermetilação está associada a repressão de genes e instabilidade
cromossômica, podendo levar a supressão de genes de reparo do DNA e supressores de
tumor, além de condensação da cromatina. Tanto a hipo como a hipermetilação estão
relacionadas a vários tipos de câncer (FIGURA 1) (Agrawal et al., 2007).
FIGURA 1. Tipos de metilação (Agrawal et al., 2007)
Tipos de Metilação
Hipometilação Hipermetilação
Instabilidade
cromossômica
Repressão
gênica
Reativação
gênica
Global
Regional
11
Indivíduos portadores de alguns tipos de câncer podem produzir marcadores
tumorais, que são produzidos pelo próprio tumor, pelo tecido adjacente ao tumor ou
pelo tecido acometido por metástase. Os marcadores tumorais compreendem DNA,
RNA, proteínas, antígenos e hormônios que podem ser detectados através de ensaios
como a reação da polimerase em cadeia (PCR), western e northern blot. Em estágios
precoces do tumor os marcadores tumorais podem estar em níveis baixos, porém os
testes capazes de detectá-los se propõem em apontar indivíduos sadios que apresentem
condições de desenvolver este tipo de doença, ou que já estejam com a doença em curso
numa forma sub-clínica. A utilização destes marcadores como agentes de diagnóstico é
muito importante pois pode se constituir num elemento de diagnóstico muito precoce,
bem como pode monitorar a eficiência do tratamento ao qual o indivíduo está submetido
(Voorzanger-Rousselot & Garnero, 2007).
Para o desenvolvimento da carcinogênese basta que uma célula alterada por uma
mutação entre em processo de expansão clonal. Estas células passam a se reproduzir
desordenadamente e formam agregados chamados de tumores benignos, ou invadem
tecidos adjacentes, chamados de tumores malignos ou câncer.
As metástases são formadas pela disseminação de uma célula cancerígena e sua
penetração em outros tecidos formando tumores secundários. A aquisição de um
fenótipo migratório pela célula tumoral representa um fator determinante para sua
capacidade invasiva e metastática. A conversão de uma célula normal em tumoral é
acompanhada pela ativação de várias vias oncogênicas. No processo de transformação
maligna há uma remodelagem do estroma, onde células como macrófagos e fibroblastos
liberam fatores solúveis que influenciam o crescimento e a angiogênese. Para que
ocorra o processo invasivo, a adesão entre as células adjacentes e a integridade da
membrana são perdidas devido a ação de metaloproteinases, permitindo que a célula
12
transformada se solte da massa tumoral, chegue ao sistema linfático ou circulação
sanguínea e se instale em outros sítios (Mimeault & Batra, 2007; Alberts et al., 2004).
1.5 – Mecanismo de ação dos quimioterápicos contra o câncer
A mostarda nitrogenada, utilizada durante a 1ª. Guerra Mundial, representa um
dos tipos de agentes alquilantes que são capazes de interagir diretamente com a
estrutura do DNA, danificando-a. Atualmente, mostardas nitrogenadas (Ex.
Ciclofosfamida), triazanos e nitrosuréias, entre outros, são agentes alquilantes utilizados
no tratamento anticâncer. Os antimetabólitos são representados por agentes análogos de
purinas, pirimidinas e ácido fólico, capazes de alterar a síntese ou função dos ácidos
nucléicos, agindo em enzimas-chave como a DNA polimerase. A actinomicina D
(extraída da espécie Streptomyces) e o Etoposídeo (derivado semi-sintético da
podofilotoxina), são agentes da classe dos produtos naturais capazes de se ligar de
forma estável ao DNA, bloqueando a ação da RNA polimerase e da topoisomerase,
respectivamente. A Cisplatina (cis-diaminodicloroplatina), caracterizada como um
agente diverso, foi descoberta ocasionalmente em 1965 e demonstrou inibir a replicação
de Escherichia coli. Posteriormente, foi testada em sistemas tumorais e mostrou sua
capacidade antineoplásica através de ligações cruzadas intra e interfilamentares, que
promoveram a inibição da replicação e transcrição do DNA. Outro composto contendo
platina em sua estrutura química, a Carboplatina foi aprovado para o tratamento de
câncer no final da década de 80. A terapia anticâncer também utiliza hormônios como a
Dexametasona, caracterizada como um quimiosensibilizador capaz de potencializar a
atividade antitumoral de agentes como a Carboplatina. Quando administrada
isoladamente, a Dexametasona apresentou reduzida capacidade de inibir o crescimento
tumoral (Hardman & Limbird, 2005; Wang et al., 2004).
13
1.6 – Origem dos quimioterápicos antineoplásicos naturais
Os quimioterápicos Etoposídeo, Vincristina, Vimblastina, Tenoposídeo e Taxol
foram introduzidos ao longo dos últimos vinte anos no tratamento do câncer, reforçando
o interesse de indústrias farmacêuticas em produtos de origem natural (Viegas &
Bolzani, 2006).
Na década de 60, a Camptotecina foi isolada da árvore chinesa Camptotheca
acuminata, e anos mais tarde mostrou sua atividade citotóxica através da inibição da
topoisomerase I. Porém, a Camptotecina apresentou reduzida solubilidade não sendo
utilizada pela indústria farmacêutica. Foram então desenvolvidos análogos da
Camptotecina (Ex. Topotecan) mais solúveis em água, aprovados em 1996 pela Food
and Drug Adminisration (FDA) para o tratamento do câncer de cólon e ovário (Viegas
& Bolzani, 2006).
O Taxol, descoberto em 1966, apresentou atividade citotóxica in vitro, porém
em função de sua estrutura complexa e dificuldade de fontes naturais (10 toneladas de
casca de Taxus brevifolia: 1 Kg Taxol), seu uso foi interrompido. Cerca de 15 anos
depois, outros taxanos foram descobertos e apresentavam concentração e rendimento
superiores ao do Taxol. Em 1988 foi proposta uma rota semi-sintética para o Taxol, que
foi suplantada em 1994 por outra rota também semi-sintética mais eficiente (Viegas &
Bolzani, 2006).
Atualmente, a procura por novos agentes antitumorais tem se tornado cada vez
mais necessária visando sua maior eficácia e menor efeito citotóxico em tecidos
normais. Na última década, quimioterápicos derivados de bactérias (Adriamicina),
plantas (Lapachol, Taxol), organismos e microorganismos marinhos, entre outros, têm
apresentado resultados bastante satisfatórios (Subramanian et al., 2006). O tratamento
de várias doenças utilizando como base produtos naturais é observado há muitos anos
14
na medicina popular. Partindo desta tradição a utilização de medicamentos produzidos a
partir de plantas no tratamento do câncer tornou-se uma constante, confirmada pelo fato
de cerca de 62% de drogas comercializadas para o tratamento do câncer entre 1983 e
1994 serem de origem natural (Ravelo et al., 2004).
1.7 – Avaliação de novas drogas
O desenvolvimento e avaliação de novas drogas tornaram-se uma prática cada
vez mais necessária visando o tratamento e cura de várias doenças potencialmente
fatais.
Inicialmente, o estudo consiste na extração ou síntese de uma molécula da nova
droga. No caso de ser proveniente de síntese, a identificação desta nova droga é feita a
partir da modificação química de uma molécula já conhecida. A atividade e seletividade
da droga é feita através de uma triagem que utiliza vários ensaios biológicos in vitro e in
vivo, definindo seu perfil farmacológico e comparando-o ao de compostos de referência.
O composto obtido a partir dos ajustes da molécula inicial, pode então ser submetido a
testes pré-clínicos, como a determinação da toxicidade aguda e crônica. A avaliação de
novos medicamentos para seres humanos deve levar em consideração alguns fatores
que, eventualmente podem alterar o estudo em questão: 1, as exacerbações e remissões
em algumas doenças que são capazes de levar a oscilações de sua gravidade; 2, a
presença de outras doenças que poderiam influenciar a avaliação e 3, a tendência dos
pacientes a responder positivamente a um tratamento (resposta placebo) (Katzung,
2003).
Os pacientes são submetidos a quatro fases de estudo clínico. Na fase um,
geralmente em voluntários sadios, são comparadas as respostas em animais e seres
humanos, estabelecidos os limites prováveis de faixa posológica segura e determinados
15
absorção, meia-vida e metabolismo. Na fase dois, é utilizado um grupo menor de
pacientes sendo agora portadores da doença-alvo e avaliando de forma mais
aprofundada as toxicidades da droga estudada. Na fase três, o estudo pode abranger
milhares de pacientes, possibilitando o melhor estabelecimento da segurança e eficácia
da droga. A partir desta fase, desde que autorizado pelo órgão responsável, pode-se
comercializar a nova droga, sendo implantado um serviço de monitoramento,
característico da fase quatro. No caso específico das drogas antineoplásicas com
atividade potencial que não exibem toxicidade excessiva, são realizados os estudos de
fase I em pacientes com câncer avançado e as etapas posteriores são geralmente
aceleradas (Katzung, 2003).
Como um dos órgãos internacionais de grande relevância para o teste de novas
moléculas com potencial atividade antitumoral tem-se o Programa de Desenvolvimento
Terapêutico (DTP) do National Cancer Institute (NCI), que opera testes in vitro e in
vivo com o objetivo de identificar e avaliar novas drogas e mecanismos de ação
(National Cancer Institute, 2007). Este serviço, implementado desde Abril de 1990
para testar compostos com atividades antitumorais, utiliza um painel de 59 células
tumorais in vitro formado de nove tipos de cânceres, entre eles, leucemia, melanoma,
cânceres de pulmão, cólon, cérebro, ovário, mama, próstata e fígado. O objetivo é
priorizar avaliações mais profundas em compostos sintéticos e naturais que mostrem
inibição do crescimento celular ou morte em linhagens de células tumorais (Shoemaker,
2006).
Nessa triagem o ensaio é composto por duas fases, começando com a avaliação
de todos os compostos contra as linhagens celulares do painel em uma dose única (10
-5
M). Os compostos que exibem inibição de crescimento significante são avaliados contra
as células do painel em cinco níveis de concentração. Dentre as cinco linhagens de
16
células leucêmicas presentes no painel de células do NCI, a K562 se encontra presente,
sendo a única representante de leucemia mielóide crônica (Shoemaker, 2006).
1.8 – Atividade antineoplásica de naftoquinonas
As quinonas são classificadas de acordo com o sistema aromático presente em
sua estrutura, tendo as naftoquinonas um anel naftalênico característico (Figura 2) (Silva
et al., 2003).
o-naftoquinona p-naftoquinona
benzeno naftaleno antraceno
FIGURA 2. Classificação das quinonas (Silva et al., 2003).
O
O
O
OH
O
Lapachol
O
O
OH
Lausona
O
O
17
Vários estudos têm demonstrado a ação de naftoquinonas, como Lapachol
(Tabebuia sp) e a Lausona (Lawsonia sp) e seus derivados como agentes
antineoplásicos. A βLapachona, uma orto-naftoquinona, têm sido amplamente estudada
principalmente por apresentar efeitos seletivos em linhagens tumorais quando
comparados a linhagens normais. Vários mecanismos de ação das naftoquinonas se
apresentam de forma dose e tempo-dependente. A inibição do crescimento celular
observada, pode ocorrer em função da indução da apoptose, inibição da topoisomerase
II ou estresse oxidativo, entre outros (Choi et al., 2003; Silva et al., 2003; Kongkathip et
al., 2003; Li et al., 2003; Woo & Choi, 2005; Reinicke et al., 2005).
As naftoquinonas foram descritas como responsáveis por uma significante
redução do crescimento celular em linhagens tumorais quando conjugadas a outros
agentes, como o Tiosemicarbazone (NTQS) e seus complexos formados com metais. A
citotoxicidade do NTQS associada ao cobre, por exemplo, mostrou ser maior que a do
Etoposídeo, quimioterápico usado na clínica (Chen et al., 2004).
Vários estudos têm relatado a importância da atividade antitumoral das
naftoquinonas. A βLapachona destaca-se neste âmbito e sua atividade biológica justifica
a continuidade dos estudos com naftoquinonas e seus derivados, como a 2-fenil-
βLapachona e ésteres de naftoquinonas, agentes ativadores do estresse oxidativo e
inibidores de topoisomerase II, respectivamente (Kongkathip et al., 2004; Kongkathip et
al., 2003).
A Lausona (2 hidroxi-1,4-naftoquinona), também classificada como orto-
naftoquinona, mostrou-se capaz de inibir in vitro o crescimento celular, bloqueando
principalmente na fase S o ciclo de células derivadas de carcinoma de colon humano
(HCT 15) (Kamei et al., 1998).
18
1.9 – Propriedades farmacológicas dos triazóis
Os triazóis são heterocíclicos aromáticos nitrogenados de cinco membros
contendo um ou mais átomos de hidrogênio, sendo denominados genericamente de azol.
Várias publicações têm descrito a atividade biológica dos triazóis. Dentre as atividades
farmacológicas dos heterocíclicos nitrogenados, podemos citar sua ação como fármaco
antiviral (Ribavarina), antifúngico (Fluconazol), antiinflamatório e analgésico
(Dipirona) e antitumoral (Carbamato de fluorouracila), entre outros (Melo et al., 2006).
Partindo da necessidade de se identificar novos agentes antineoplásicos, que
tenham ação seletiva e seus efeitos adversos minimizados, fizemos no presente estudo
uma análise “in vitro” de triazóis, ácido pirazolil acrílico, naftoquinonas e outros
derivados do Lapachol e da Lausona, como possíveis agentes citotóxicos às linhagens
tumorais.
19
2 – OBJETIVOS
2.1 - Objetivo geral
Avaliar o potencial antitumoral de substâncias provenientes de síntese química
cedidas pelo professor Vitor Francisco Ferreira do Departamento de Química Orgânica
da Universidade Federal Fluminense e investigar as ações biológicas dos compostos
com maior atividade citotóxica..
2.2 - Objetivos específicos
- Avaliar o potencial antitumoral de naftoquinonas e derivados, triazóis e do
Ácido Pirazolil Acrílico
- Avaliar a viabilidade celular por MTT
- Calcular a dose que mata 50% das células (IC
50
)
- Avaliar a fragmentação do DNA característica da apoptose
- Avaliar a síntese protéica
- Avaliar a genotoxicidade das drogas através do teste do cometa.
20
3 – MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Manutenção das linhagens celulares utilizadas no estudo
A linhagem celular K562, cedida pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA), e a
linhagem celular HEP2, cedida pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) foram
mantidas em garrafas de poliestireno (TPP) de 25 cm
2
ou 75 cm
2
com tampa de rosca,
obtendo um volume final de 10 mL ou 30 mL, respectivamente em meio DMEM alta
glicose com glutamina (CULTILAB), acrescido de 10 % de soro fetal bovino
(SORALI) previamente inativado a 56 ºC por 1 hora. Também foram acrescentados
para cada litro de meio 0,06 grama de penicilina G (CULTILAB), 0,1 grama de
estreptomcina (CULTILAB), 1 mL de anfotericina B (2,5 mg/mL – FUNGIZON/
BRISTOL-MYERS SQUIBB), 2,25 gramas de NaHCO
3
(REAGEN) e HCl 1N
(REAGEN) para ajustar o pH até 7,6. As células eram repicadas duas vezes por
semana, em fluxo laminar (TROX MODELO FLV SÉRIE 491) previamente limpo com
álcool 70 % e iluminado por luz UV por 30 minutos. Em cada repique da linhagem
K562, foram mantidas 2x10
4
células/mL, após quantificação em hemocitômetro de
Neubauer (BOECO GERMANY 1/10 mm), em garrafas de poliestireno (TPP) de 25
cm
2
ou 75 cm
2
com tampa de rosca, obtendo um volume final de 10 mL ou 30 mL,
respectivamente. A linhagem HEP2 tinha seu meio desprezado, era lavada por duas
vezes com PBS/EDTA e mantida por 5 minutos com tripsina 0,25% a 37ºC. Após o
acréscimo de meio as células eram quantificadas em hemocitômetro de Neubauer, e
repicadas na concentração de 2x10
4
células/mL em garrafas de poliestireno de 25 cm
2
.
As culturas eram visualizadas em microscópio invertido (NIKON ECLIPSE TS100) e
mantidas em estufa (FANEM MODELO 002CB) a 37 ºC.
21
3.2 – Substâncias Testadas
Os triazóis, o Ácido Pirazolil Acrílico e as naftoquinonas, derivadas do Lapachol
e da Lausona, foram cedidos pelo Prof. Vitor Francisco Ferreira, do Departamento de
Química Orgânica do Instituto de Química da Universidade Federal Fluminense (UFF).
A partir do Lapachol marca PVP, foi feito o processo de purificação por Soxhlet com
solvente hexano, segundo Ferreira, 1996. Em seguida, o extrato foi evaporado sob
pressão reduzida em evaporador rotatório, obtendo-se o Lapachol puro.
Além do Lapachol purificado, foram testadas substâncias sintetizadas a partir
dele, a αLapachona, Epóxi αLapachona, βLapachona, Triacetato e Nor βLapachona
(FIGURA 3A). Também foram testadas a Lausona pura da marca Aldrich e três
substâncias sintetizadas a partir dela: Metóxi, Epóxi Metóxi e IVS 320 (Figura 3B e
C)(Ferreira, 1996). Todas as substâncias foram mantidas em uma concentração estoque
de 50 mM, a 4 ºC, após diluição em dimetil sulfóxido (DMSO - SIGMA).
A nomenclatura oficial das naftoquinonas encontram-se no anexo 1, e as
estruturas dos triazóis encontram-se no anexo 2.
3.3 – Avaliação da viabilidade celular
3.3.1 - Citotoxicidade celular
A triagem das substâncias com potencial efeito citotóxico foi feita através do
teste colorimétrico utilizando MTT, descrito por Mosmann (1983). O ensaio avalia a
capacidade de células metabolicamente ativas de reduzirem o MTT, convertendo os sais
amarelos de tetrazolium (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazol brometo) a
cristais de formazan, de cor púrpura. Após a solubilização dos cristais, a quantificação
foi realizada em leitor de microplacas (ANTHOS 2010) a 570 nm (Mosmann, 1983)
22
O
O
O
H
H
O
O
O
H
H
O
OH
O
+
FIGURA 3. Rota de síntese das naftoquinonas utilizadas no estudo. A partir do (A)
lapachol e (B e C) da lausona.
O
OH
O
Lapachol
OAc
OAc
OAc
Triacetato
Zinco metálico
Anidrido acético
H
2
SO
4
O
O
O
β-Lapachona
CH
2
N
2
Éter Etílico
O
O
O
Epoxi-beta
O
O
O
α-Lapachona
CH
2
N
2
Éter Etílico
O
O
O
Epoxi-alfa
HCl
Ácido Acético
O
O
O
Sulfônica
H
2
SO
4
Anidrido Acético
CH
2
N
2
Éter Etílico
SO
3
H
O
O
O
SO
3
Me
O
O
O
SO
3
Me
+
Estersulfônica
Epóxi-sulfônica
O
OH
O
Lapachol
O
OH
O
Nor-lapachol
O
O
O
H
2
SO
4
O
O
O
CH
2
N
2
Éter Etílico
Nor-betalapachona Epóxi-norbeta
O
O
OH
O
O
OAg
1) NH
4
OH
2) HNO
3
3) AgNO
3
Tolueno, CH
3
I
O
O
O
O
O
O
CH
2
N
2
Éter Etílico
Metóxi Epóxi-metóxi
Sal de Prata
da Lausona
Lausona
1)H
2
O
2
/ dioxano, 70
o
C
2)HCl/ SO
2
/ N
2
3)NaOH/ CuSO
4
/ HCl
A
B
C
IVS 320
Lausona
IVS 322
23
No ensaio de citotoxicidade foram utilizadas 2x10
4
células/poço, em placa de 96
poços, incubadas com as substâncias por 20 horas, a 37 ºC. Imediatamente após, 10 μl
da solução de MTT (5 mg/mL – SIGMA) diluídos em meio de cultura DMEM sem
soro, foram acrescentados às culturas tratadas, e estas incubadas por um período de 4
horas, a 37 ºC. Após o período total de incubação, 24 horas, foram adicionados 100 μl
de solução de duodecil sulfato de sódio (SDS - NUCLEAR) 10% e ácido clorídrico
(HCl - REAGEN) 0,01 N, e o experimento mantido overnight, a 37 ºC. A densidade
óptica de cada poço foi obtida a 570 nm, possibilitando determinação do potencial
citotóxico de cada substância testada em relação ao controle não tratado. Os ensaios
foram realizados em triplicatas, e cada experimento repetido três vezes com as
substâncias nas concentrações de 6,25 μM, 12,5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM e 200
μM. Foram utilizados controles negativos com DMSO e sem DMSO, além do controle
positivo contendo o quimioterápico comercial Etoposídeo (DARROW).
3.3.2 – Determinação do IC
50
Os resultados dos valores de absorvância foram convertidos em porcentagem de
viabilidade celular onde as células em presença de DMSO correspondiam a 100% de
viabilidade. A análise de regressão foi realizada nos resultados de viabilidade,
resultando em uma equação usada para calcular a concentração de substância necessária
para produzir 50 % de redução de viabilidade celular (IC
50
).
3.4 – Avaliação do mecanismo de ação das substâncias
Após a avaliação da citotoxicidade, as substâncias com maior atividade
citotóxica foram selecionadas e avaliadas quanto ao mecanismo de ação. Nesses testes
24
foram avaliadas as substâncias: Epóxi α Lapachona, βLapachona, Nor βLapachona,
IVS 320, Metóxi, e Etoposídeo.
3.4.1 – Avaliação da síntese protéica
Com o objetivo de analisar possíveis alterações na biossíntese de proteínas, na
presença das substâncias selecionadas, a linhagem celular K562 foi incubada com
metionina radioativa 25uCi/mL (
35
S-Metionina 47Ci/mmol), a 37ºC, em uma atmosfera
de 5% de CO
2
. A partir da comparação entre os níveis de incorporação de metionina
35
S
do controle não tratado e das culturas tratadas, era possível detectar se havia alguma
alteração na produção de proteínas celulares.
No experimento, 10
5
células em um volume final de 300μl foram incubadas com
as substâncias Epóxi α Lapachona, βLapachona, Nor βLapachona, IVS 320 e Metóxi na
concentração final de 50 μM, por 2 horas a 37 ºC. O Etoposídeo, também na
concentração de 50 μM, foi usado como controle positivo. Após a incubação, foi feita
uma centrifugação a 2000 rpm por 3minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi retirado e as
células ressuspensas em 200μl de meio de cultura (MEM - CULTILAB) sem metionina,
contendo a substância em teste na concentração de 50 μM. Em seguida, foram
adicionados 20 μl de metionina
35
S (40μCi/mL - AMERSHAN), totalizando 220 μl. As
células foram incubadas por 2 horas a 37 ºC. Após centrifugação, as células foram
lavadas e incubadas com 100 μl de tampão de lise (Tris-HCl pH.:8,5 2M; NaCl 5mM;
SDS 20%; EDTA 250Mm.), 100 μl de ácido tricloroacético (TCA) 10 %, agitação e
incubação por 20 minutos a 4 ºC. Posteriormente, foram adicionados 400 μl de água
mili-Q e 500 μl de TCA 20 %. Cada amostra foi filtrada utilizando-se filtro GFA
(WHATMAN) 0,22μm, onde os filtros eram lavados três vezes com TCA 5 % seguido
de uma lavagem com etanol absoluto. Cada filtro foi colocado em um tubo para secar a
25
temperatura ambiente. Após a secagem, cada filtro foi colocado em um tubo de
cintilação com 3 mL de solução cintiladora e contado em cintilador (Carvalho et al.,
2005).
3.4.2 – Avaliação da apoptose por fragmentação do DNA
As substâncias selecionadas foram testadas na concentração de 50 μM, por 4 e
24 horas. Após o tratamento, as células tiveram o DNA extraído e analisado quanto à
fragmentação do DNA, em gel de agarose.
Para cada substância foram utilizados dois poços de placas de 6 poços (TPP),
com 2 mL de células na concentração de 2x10
6
células/mL.
Após incubação, as células foram centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos, o
sobrenadante descartado e o precipitado lavado 2 vezes com PBS (NaCl, KCl,
Na
2
HPO
4
.7H
2
O, KH
2
PO
4
) 1X. Após descarte do sobrenadante, foram adicionados 100
μl de solução de digestão (50 mM Tris pH=8,0; 10 mM EDTA; 0,5% SDS ) com 20 μl
de proteinase K (25 mg/mL - GIBCO), a amostra transferida para um eppendorf e
mantida por 48 horas em banho-maria a 56ºC. Adicionou-se 5 μl RNAse A (0,5 mg/mL
- GIBCO) e as amostras foram mantidas por mais 24 horas em banho-maria, a 37ºC.
Após 72 horas de incubação, as amostras foram centrifugadas a 12000 rpm por 5
minutos a 4ºC. As proteínas não digeridas, presentes no sobrenadante, foram extraídas
com 125 μl da mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1), seguido de
centrifugação a 12000 rpm por 5 minutos a 4ºC. A fase aquosa, contendo o DNA, foi
retirada e estocada a 4ºC. Para visualização do DNA extraído, utilizou-se gel de agarose
a 2% (BIOAMÉRICA) dissolvida em TAE 1X (0,04 M Tris acetato; 0,002 M EDTA -
pH 8,5) e acrescido de 5μg/mL de brometo de etídio (SIGMA). Foram também testados
o Etoposídeo na concentração de 50μΜ e a Dexametasona nas concentrações de 1 e 10
26
μΜ (4 e 24 horas de incubação), e 100 e 200 μΜ (24 horas de incubação). Este método
foi realizado como descrito por Chau (1998).
3.4.3 – Avaliação de lesões oxidativas pelo teste do cometa
O presente teste teve como objetivo detectar possíveis lesões na estrutura do
DNA de células tratadas com as substâncias, após o uso de detergentes e altas
concentrações de sais, que permitem ao DNA desprovido de histonas e aderido à matriz
nuclear residual, migrar ou não quando submetido à eletroforese. De acordo com o
perfil de migração, é possível avaliar o dano causado por cada substância, já que células
sem danos em seu genoma ficariam com seu DNA retido na região anteriormente
ocupada pelo núcleo da célula, e células com danos em seu genoma apresentariam
caudas como conseqüência da migração de fragmentos do DNA.
Foi realizado um controle negativo com DMSO, visto que o DNA pode sofrer
lesões devido ao próprio metabolismo celular. Utilizando a metodologia descrita por
Dantas (2002), 2 mL culturas com densidade de 2x10
5
células/mL, foram plaqueadas
em placas (TPP) de 24 poços com dois poços para cada substância. As substâncias
selecionadas foram analisadas em uma concentração final de 50 μM e incubadas por
duas horas a 37 ºC. Após a incubação, duas alíquotas de 1 mL foram retiradas de cada
poço e centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos a 4ºC. Cada uma das alíquotas teve suas
células ressuspensas em 100 μl de meio onde, uma teve suas células contadas e a outra
foi utilizada no preparo das lâminas para o teste do cometa como descrito a seguir:
- Para realização da contagem, 20 μl das células foram adicionadas a outro eppendorf
contendo 20 μl do corante vital azul de tripan (REAGEN) e 10 μl da mistura foram
contadas em câmara de Neubauer.
27
- Para realização do teste do cometa 20 μl da amostra de células foram adicionadas a
outro eppendorf contendo 240 μl de agarose de baixo ponto de fusão (GIBCO BRL) a
37 ºC e homogeneizados. Um total de 120 μl da mistura foram aplicados em cada
lâmina (25,4 x 76,2 mm com borda fosca) previamente lavada em etanol absoluto, seca,
banhada em agarose 1,5 % (GIBCO) e mantida horizontalmente overnight a temperatura
ambiente. Cada lâmina foi coberta com uma lamínula (24 x 50 mm) e incubada por dez
minutos a 4ºC. Após incubação, as lamínulas foram retiradas e as lâminas colocadas
verticalmente em uma cuba com solução desnaturante (NaCl 2,5M; TRIS 10 mM;
EDTA 100 mM; NaOH; Lauril sarcosinato sódio 1 %), overnight, a 4 ºC em ausência de
luz. Ainda em ausência de luz, as lâminas foram dispostas horizontalmente em uma
cuba com tampão de eletroforese (NaOH 300 mM; EDTA 1 mM) e incubadas por 25
minutos. Em seguida feita uma corrida de 25 minutos (25 volts/300 miliamperes). As
lâminas foram retiradas, colocadas em um suporte horizontal e lavadas com tampão de
neutralização (TRIS 0,4 M) por 1 minuto, seguido de lavagem com etanol absoluto por
1 minuto e uma lavagem com água milli-Q. As lâminas foram deixadas à temperatura
ambiente para secagem. Após secagem, foi adicionada solução corante (brometo de
etídio 40 μg/mL) e foi feita a leitura em microscópio de fluorescência. Para análise da
viabilidade celular, retirou-se todo sobrenadante, o precipitado foi ressuspenso em 100
μl de meio e quantificado com azul de tripan.
3.5 – Análise estatística
Diferenças estatísticas entre as várias substâncias foram feitas por diferentes
testes. A regressão logarítmica e os gráficos foram feitos no programa Excel, as
comparações entre as substâncias no teste com MTT foram feitas pelo teste de Fisher, e
as análises no teste de genotoxicidade foram feitas pelo teste de Turker.
28
4 – RESULTADOS
4.1 Avaliação da viabilidade celular
4.1.1 - Citotoxicidade celular
Foram testadas 27 substâncias pertencentes a diferentes classes químicas (10
naftoquinonas – estruturas no capítulo de material e métodos; 16 triazóis e o Ácido
Pirazoil Acrílico provenientes de síntese química, nas linhagens K562 e HEP2. O
Etoposídeo, quimioterápico comercial, foi utilizado como controle positivo dos testes de
viabilidade celular. Das substâncias avaliadas a classe das naftoquinonas promoveu
maior citotoxicidade celular (TABELA 6).
A partir da análise de citotoxicidade, foram selecionadas 5 naftoquinonas ou
derivados com maior potencial citotóxico na concentração de 50 μM, em um período de
incubação de 24 horas, βLapachona , Epoxi αLapachona, Nor βLapachona, IVS 320 e
Metoxi, na linhagem K562 (GRÁFICO 3). A linhagem celular HEP2, apresentou maior
resistência a algumas substâncias que foram citotóxicas à K562 (GRÁFICO 4). O
Etoposídeo e a βLapachona foram avaliados em ambas as linhagens tendo seus
resultados de viabilidades adicionados aos das naftoquinonas mais citotóxicas
(GRÁFICOS 3 e 4). As outras substâncias testadas (Triazóis e Ácido Pirazolil Acrílico)
apresentaram pequena redução da viabilidade celular tanto na linhagem K562 como na
HEP2, por esse motivo, não foram utilizadas em nenhuma avaliação posterior deste
trabalho (TABELA 7).
Em 50 μM, a Nor βLapachona caracterizou-se como a substância mais
citotóxica, com 67,1 ± 9,5% de viabilidade celular, na linhagem K562.
No experimento com HEP2, a Metoxi foi a substância que exibiu maior
citotoxicidade, com 70,2% ± 8,5 de viabilidade celular.
29
TABELA 6. Viabilidade celular (%) nas linhagens K562 e HEP2 tratadas com
naftoquinonas na concentração de 50 μM por 24 horas.
SUBSTÂNCIAS K562 HEP2
Etoposídeo 88,2 ± 16,5 91,1 ± 8,8
α-Lapachona
85,7 ± 8,8 103,7 ± 13,0
β−Lapachona
83,0 ±24,5 74,0 ± 12,7
Epoxi α-Lapachona
74,3 ± 4,2 78,0 ± 12,9
Nor β− Lapachona
67,1 ± 9,5 87,3 ± 31,5
Triacetato 89,0 ± 8,5 93,7 ± 22,5
IVS 320 70,7 ± 7,3 99,8 ± 5,8
Metoxi 72,1 ± 8,1 70,2 ± 8,5
Epoxi metoxi 85,9 ± 10,5 103,7 ± 12,9
Lapachol 95,5 ± 7,5 104,5 ± 8,3
Lausona 97,0 ± 5,9 98,3 ± 18,3
GRÁFICO 3. Viabilidade celular em presença das naftoquinonas com maior
potencial citotóxico (50 μM) na linhagem K562 em 24 horas.
Etop
Lap
Epoxi
Lap
Nor
Lap
IVS 320
Metoxi
0
20
40
60
80
100
concentração
μ
M
viabilidade celular (%)
30
Etop
Lap
Epoxi
Lap
Metoxi
0
20
40
60
80
100
concentração
μ
M
viabilidade celular (%)
GRÁFICO 4. Viabilidade celular em presença das naftoquinonas com maior
potencial citotóxico (50 μM) na linhagem HEP2 em 24 horas.
31
TABELA 7. Viabilidade celular (%) de triazóis na concentração de 50 μM por 24
horas nas linhagens K562 e HEP2.
SUBSTÂNCIAS K562 HEP2
Triazolmono
85.4 ± 7,1 105.2 ± 5,3
N-H-Triazol
87.0 ± 15,1 103.0 ± 12,0
N-F-Triazol
92.1 ± 7,9 104.4 ± 8,8
N-Cl-Triazol
90.7 ± 13,9 100.0 ± 15,3
Hidra-Triazol
91.9 ± 7,0 110.9 ± 18,8
Triazol-MXI
78.0 ± 9,6 105.1 ± 18,4
Triazol DAF1
90.2 ± 10,6 101.7 ± 14,9
Triazol DAG
81.2 ± 7,2 99.2 ± 12,6
Triazol DAGAL
91.7 ± 6,6 105.3 ± 13,7
Triazol DAF2
95.5 ± 8,2 103.6 ± 16,2
Triazol DAAL
91.8 ± 9,7 98.8 ± 9,1
Hidra-N-Cl
98.9 ± 13,5 106.1 ± 10,4
N-Br-Triazol
95.3 ± 6,2 101.8 ± 13,2
N-Cl,Cl-Triazol
90.2 ± 9,6 99.0 ± 14,3
N-H-Tri-OH
96.0 ± 9,7 104.1 ± 6,8
TriazolriboOH
97,8 ± 9,2 105.7 ± 11,3
Ácido Pirazolil Acrílico
96,8 ± 6,9 103,6 ± 13,1
32
4.1.2 – Determinação do IC
50
Inicialmente, foi feita uma avaliação do DMSO em diferentes concentrações
para verificação do seu efeito citotóxico, já que este foi utilizado como veículo para as
substâncias testadas. Como resultado, o DMSO não mostrou redução significativa
(p>0,05) do crescimento celular (GRÁFICOS 5 e 6).
As substâncias com maior potencial citotóxico foram submetidas a uma análise
de regressão a fim de encontrar o modelo que melhor interpretasse a relação funcional
entre a concentração e a viabilidade celular. Foram propostos pela profa. Keila Mara
Cassiano (Departamento de Estatística/UFF) modelos lineares, exponenciais,
logaritmicos, hiperbólicos, potenciais e sigmoidais e escolheu-se o modelo que
apresentou maior significância estatística e maior poder de explicação. O IC
50
foi obtido
a partir da equação do modelo escolhido, ou seja, considerou-se que o IC
50
é a
estimativa da concentração da substância que, pelo modelo de regressão, promove a
morte celular em 50% das células.
Nas análises realizadas, optou-se pelo modelo logaritmo ( XbaY ln+= ), que
apresentou as melhores qualidades estatísticas e se mostrou o modelo que melhor se
ajustou aos dados. Como exemplo, está ilustrado abaixo a citotoxicidade do
quimioterápico Etoposídeo, nas linhagens HEP2 e K562, com as respectivas equações
de regressão logarítmica. Nota-se tanto graficamente, quanto pelo valor do coeficiente
de explicação,
2
R
, que o modelo se ajustou bem aos dados reais. Foi possível
determinar que o IC
50
na K562 foi de 3595,9 μM e na HEP2 foi de 2378,9 μM
(GRÁFICO 8).
A análise do quimioterápico Etoposídeo, utilizado como controle positivo em
ambas as linhagens, demonstrou uma resposta similar (GRÁFICO 7).
33
0,0012
0,025 0,05 0,1
0,2 0,4
0
20
40
60
80
100
% DMSO
viabilidade celular %
GRÁFICO 5. Viabilidade da linhagem K562 em diferentes concentrações de
DMSO, no período de 24 horas.
0,0012
0,025 0,05 0,1 0,2 0,4
0
20
40
60
80
100
120
% DMSO
viabilidade celular %
GRÁFICO 6. Viabilidade da linhagem HEP2 em diferentes concentrações de
DMSO, no período de 24 horas.
34
50
60
70
80
90
100
110
120
130
0 50 100 150 200
concentração
μ
M
viabilidade celular (%)
K562
HEP 2
GRÁFICO 7. Viabilidade das linhagens K562 e HEP2 em diferentes
concentrações do quimioterápico Etoposídeo.
Após o cálculo para as substâncias em teste, o IC
50
da βLapachona foi de 0,06
μM, tendo essa substância mostrado o melhor potencial antitumoral no período de 24
horas. Seguindo da βLapachona, a Nor βLapachona (IC
50
: 467,6 μM) e IVS 320, (IC
50
:
488,0 μM) se mostraram como as substâncias mais promissoras como inibidoras do
crescimento celular na linhagem K562 (TABELA 8). Na linhagem HEP2 ocorreu maior
citotoxicidade para a βLapachona (IC
50
: 2,3 μM), seguida pela Metoxi (IC
50
: 320,9 μM)
e IVS 320 (IC
50
: 1469,0 μM).
A partir da avaliação anterior, selecionamos a linhagem K562 para a
continuação do estudo por ter apresentado maior sensibilidade ao tratamento, ser
manipulada de forma mais simples e rápida, além de fazer parte do painel de 60 células
do National Cancer Institute usado para a triagem in vitro de substâncias com atividade
antitumoral (Shoemaker, 2006).
35
y = -8,4089Ln(x) + 118,85
R
2
= 0,9213
50
60
70
80
90
100
110
120
0 50 100 150 200
concentração
μ
M
viabilidade celular (%)
A. Célula K562
y = -10,666Ln(x) + 132,93
R
2
= 0,9719
50
60
70
80
90
100
110
120
130
0 50 100 150 200
concentração
μ
M
viabilidade celular (%)
B. Célula HEP2
GRÁFICO 8. Regressão logarítmica e sua equação nas diferentes concentrações
do quimioterápico nas linhagens K562 (A) e HEP2 (B).
36
TABELA 8. Valores de IC
50
SUBSTÂNCIAS K562 HEP2
Etoposídeo
3595,9 μM 2378,9 μM
βLapachona 0,06 μM 2,3 μM
Nor βLapachona 467,6 μM 2111,2 μM
Metoxi
3126,2 μM 320,9 μM
Epóxi αLapachona 977,1 μM 4962,9 μM
IVS 320
488,0 μM 1469,0 μM
4.2 – Avaliação do mecanismo da ação das substâncias
4.2.1 – Avaliação da síntese protéica
A linhagem K562 após o tratamento com Etoposídeo e os derivados do
Lapachol e da Lausona selecionados, na concentração de 50 μM, foi incubada por 2
horas com metionina
35
S, e sua incorporação foi determinada por cintilografia.
Observou-se uma acentuada redução na síntese de proteínas em todas as substâncias
testadas. A maior queda foi observada em relação à βLapachona (96,2%), seguida da
IVS 320 (92,5%), enquanto o Etoposídeo apresentou a menor redução, 60,6%
(TABELA 9).
4.2.2 – Avaliação da apoptose por fragmentação do DNA
Após a incubação em um período de exposição de 4 horas com as substâncias
βLapachona, Nor βLapachona, Metóxi, Epóxi αLapachona, IVS 320 e Etoposídeo a
análise em gel de agarose não detectou um padrão característico de degradação do
DNA. Observou-se que o DNA das células em estudo apresentou um perfil semelhante
ao do controle negativo, não tendo sido possível a observação de fragmentos de DNA
que caracterizariam a apoptose. (Figura 4).
37
TABELA 9. Análise da síntese protéica em relação ao controle (DMSO).
SUBSTÂNCIAS
Síntese protéica (%)
Etoposídeo 39,4 ± 7,2
βLapachona
3,8 ± 3,9
Nor βLapachona
9,3 ± 29,1
Metoxi 7,8 ± 13,6
Epóxi αLapachona
10,7 ± 11,7
IVS 320 7,5 ± 14,8
FIGURA 4. Apoptose por fragmentação do DNA com incubação das substâncias por 4
horas. Marcador de peso molecular de 100 pares de bases. 1. βLapachona. 2. Nor
βLapachona. 4. Metóxi. 5. Epóxi αLapachona. 6. IVS 320. 8. Etoposídeo. 9.
Dexametasona 1 μM. 10. Dexametasona 10 μM. 11. Controle negativo (células
contendo 0,1% de DMSO).
* 3 e 7 excluídos do estudo.
38
Após incubação das substâncias por um período de 24 horas, observamos que
seis substâncias (FIGURA 5, raias de 1 a 5 e 12) poderiam estar induzindo a apoptose
por apresentarem fragmentação do DNA com padrão em escada. Em ambos os
períodos, também foram testadas diferentes concentrações de dexametasona, indutor da
apoptose (Druilhe et al., 2003), porém em nenhuma foi observada a fragmentação do
DNA com padrão em escada e sim um intenso rastro indicativo de degradação. Os
controles negativos também apresentaram rastro (13 e 14).
A morfologia celular foi observada em microscópio invertido com aumento de
200x em presença de três das substâncias mais citotóxicas (Nor βLapachona, Metoxi,
IVS 320). Foi possível observar que em presença das substâncias por 24 horas, ocorreu
alteração da morfologia celular em comparação com os controles negativos, em
presença ou ausência de DMSO. (FIGURA 6)
FIGURA 5. Apoptose por fragmentação do DNA 24 horas. Marcador de peso
molecular de 100 pares de bases. 1. βLapachona. 2. Nor βLapachona. 3. Metóxi. 4.
Epóxi αLapachona. 5. IVS 320. 7. Etoposídeo. 8. Dexametasona 1 μM. 9.
Dexametasona 10 μM. 10. Dexametasona 100 μM. 11. Dexametasona 200 μM. 12.
Actinomicina. 13. Controle negativo com DMSO. 14. Controle negativo sem DMSO.
* 6 excluído do estudo
39
FIGURA 6. Alteração da morfologia celular na presença de naftoquinonas na linhagem
K562 após 24 horas de incubação. (A) Controle negativo sem DMSO. (B) Controle
negativo com DMSO. (C) βLapachona. (D) Nor βLapachona. (E) Metoxi. (F) IVS 320.
A
B
C
D
E
F
40
4.2.3 – Avaliação da genotoxicidade das naftoquinonas pelo teste do cometa
Neste experimento foi possível a visualização da fragmentação do DNA através
do aparecimento do rastro característico após separação por eletroforese, que
dependendo da intensidade foi classificada em classe 0, 1, 2 ou 3 (FIGURA 7). As
quatro classes de cometas encontradas puderam ser observadas em todas as substâncias
testadas: derivados do Lapachol e da Lausona. A análise estatística mostrou diferença
significativa de todas as substâncias em relação ao controle com DMSO (p<0,05)
(GRÁFICO 9). Não foi possível avaliar a genotoxicidade no período de 24 horas,
devido a perda do material que se soltou da lâmina.
A análise da viabilidade celular feita com azul de tripan, simultaneamente ao
teste do cometa, no período de 2 horas, mostrou um resultado semelhante para todas as
substâncias (GRÁFICO 10).
41
FIGURA 7. Visualização da fragmentação do DNA pelo teste do cometa após 4 horas
de incubação. A. Cometa classe 0; B. Cometa classe 1; C. Cometa classe 2; D. Cometa
classe 3.
A
B
C
D
42
DMSO
l
ap
Nor
Metoxi
Epoxi
I
VS
320
0
50
100
150
UA
GRÁFICO 9. Teste do cometa (2 horas).
GRÁFICO 10. Viabilidade celular (%) com azul de tripan por 2 horas.
lap
N
or
Metoxi
Epoxi
IV
S
32
0
50
60
70
80
90
100
110
viabilidade celular
%
43
5 – DISCUSSÃO
As drogas utilizadas atualmente no tratamento quimioterápico apresentam os
mais variados mecanismos de ação e são administradas sozinhas ou combinadas a
outros tratamentos como radioterapia e cirurgia. Porém, estes tratamentos ainda
apresentam efeitos nocivos que podem variar entre os indivíduos e, em alguns tipos de
câncer, são insuficientes. Partindo da necessidade de minimizar estes efeitos e de
aumentar as possibilidades de cura, vários estudos têm apresentado novas substâncias
com possíveis atividades antitumorais.
Para avaliar o potencial antitumoral de um composto, inicialmente este deve ser
testado em laboratório utilizando testes in vitro e in vivo em animais, e caso tenha ação
comprovada, este é testado em seres humanos. No presente trabalho, avaliamos a
capacidade de substâncias promoverem a morte celular utilizando testes in vitro com
linhagens tumorais.
A mensuração da viabilidade e proliferação celulares formam a base de
numerosos testes in vitro que procuram entender a resposta de uma população celular à
fatores externos. Rubstein e colaboradores (1990) compararam a resposta de 197
compostos em 38 linhagens tumorais representando sete tipos de tumores em ensaios de
microplacas utilizando MTT e sulforodamina B. Eles concluíram que as duas
metodologias tiveram respostas similares, mas a avaliação com sulforodamina B foi
mais vantajosa em termos práticos para ensaios em larga escala e, por esse motivo, o
ensaio com sulforodamina B foi adotado pelo NCI no screening de drogas com
atividade antitumoral. Nos nossos ensaios optamos por usar o MTT por ser uma
metodologia já empregada no laboratório de Virologia Molecular do Departamento de
Biologia Celular e Molecular, onde este trabalho foi desenvolvido.
44
O teste de MTT para ensaios de microplacas desenvolvido por Mosmann (1983)
utiliza o sal tetrazolium de MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium
bromide) que possui coloração amarela. No ensaio, o MTT é reduzido nas células
metabolicamente ativas gerando cristais de formazan, de coloração púrpura, que são
solubilizados e quantificados através de espectrofotometria. A intensidade da atividade
metabólica indica o grau de viabilidade das células, quanto maior a citotoxicidade
promovida pelas substâncias menor será a intensidade metabólica e consequentemente
menor será a absorvância da solução (Berridge et al., 2005).
O DMSO (Dimetil Sulfoxido – (CH
3
)
2
SO), composto amplamente utilizado
como solvente, foi utilizado para solubilizar todas as substâncias testadas. Ele tem a
capacidade de dissolver tanto compostos polares quanto apolares e pode ser misturado
em uma grande variedade de solventes orgânicos, como a água. Também é
frequentemente usado como solvente nas reações que envolvem sais, carboidratos,
polímeros e peptídeos. Por essa razão, ele desempenha um papel importante na
dissolução de amostras a serem avaliadas em testes biológicos. Entretanto, é apontado
que o DMSO pode ter efeito citotóxico dependendo da concentração utilizada (Muir,
2007).
Ao avaliar a citotoxicidade em ausência e em presença das diferentes
concentrações de DMSO utilizadas observamos que, em presença de DMSO, não
ocorreu redução significativa do crescimento celular, não sendo citotóxico nem mesmo
na maior concentração testada (0,4%). Mesmo sem esta interferência, as análises da
citotoxicidade das substâncias foram sempre realizadas em relação a um controle
possuindo a quantidade proporcional de DMSO sendo utilizado como controle negativo
dos testes já que outras avaliações experimentais também seriam realizadas.
45
O quimioterápico Etoposídeo tem a capacidade de inibir a enzima topoisomerase
II. Esta enzima normalmente funciona na célula quando se faz necessária a quebra e a
reunião das fitas de DNA em mamíferos como, por exemplo, no processo de duplicação
do DNA. A interação do Etoposídeo impede que a topoisomerase II religue as fitas do
DNA levando a célula a uma parada em G2 e subsequentemente disparando a apoptose
(Hande, 1996). Nos ensaios realizados o Etoposídeo foi utilizado como controle
positivo dos experimentos.
Inicialmente foi feita uma triagem das substâncias na concentração de 50 μM,
tendo como objetivo a detecção dos compostos com maior citotoxicidade. Constatamos
que os triazóis e o Ácido Pirazolil Acrílico, na concentração de 50 μM, não
apresentaram eficácia como substâncias antitumorais tanto na linhagem K562 como na
HEP2, não tendo sido utilizados posteriormente. Como as naftoquinonas foram a classe
química que promoveu maior citotoxicidade, cinco substâncias desta classe foram
selecionadas para serem avaliadas mais detalhadamente.
O Etoposídeo mostrou-se menos citotóxico na triagem das substâncias com
MTT, nas linhagens K562 e HEP2, com viabilidades celulares de 88,2 ± 16,5 e 91,1 ±
8,8, respectivamente, quando comparado as naftoquinonas estudadas, apontando aí uma
ação mais intensa das naftoquinonas em promover a morte das células tumorais.
O Lapachol, um dos precursores das naftoquinonas utilizadas neste estudo não
promoveu efeito citotóxico no ensaio de triagem feito com MTT nas duas linhagens
tratadas. Provavelmente, porque a concentração utilizada (50 μM) não tenha sido
suficiente para se verificar a atividade antitumoral. Carvalho e colaboradores (2005) ao
avaliarem a atividade citotóxica do Lapachol observaram extrema citotoxicidade e
inibição da síntese protéica na concentração de 2,5 mM além da inibição da atividade
46
metastática e alteração no perfil de proteínas na concentração de 1,7 mM em células de
adenocarcinoma de cérvix humano (HeLa).
A Lausona, um precursor das naftoquinonas do estudo, também foi analisada,
tendo uma resposta bastante semelhante a do Lapachol tanto na linhagem K562 como
na HEP2, apesar de já ter sido mostrada como uma substância citotóxica capaz de inibir
50% da viabilidade de células HCT-15 (carcinoma de cólon humano) na fase S em uma
concentração máxima de 60μM (Kamei et al., 1998).
A βLapachona por ser uma das naftoquinonas mais estudadas, teve seu potencial
antitumoral avaliado em todos os ensaios do presente estudo. A βLapachona apresenta
um amplo espectro de ação em células de linhagens tumorais não apresentando
significativa redução da viabilidade de células não transformadas. Há indícios de que
seus efeitos citotóxicos também possam ser observados quando é administrada na forma
de pró-droga sendo convertida em βLapachona no microambiente ácido tumoral e
posteriormente bioativada pela NAD(P)H: quinona oxidorredutase 1 (NQO1), enzima
produzida em grande quantidade em vários tipos de câncer humano. Dentre seus
mecanismos de ação estão a indução da apoptose, inibição da topoisomerase II, inibição
da telomerase e estresse oxidativo
(Reinicke et al., 2005; Lee et al., 2005; Woo & Choi, 2005; Li et al., 2003; Silva et al.,
2003; Krishnan & Bastow, 2000).
A partir dos resultados no ensaio com MTT tornou-se possível apontar a K562
como a linhagem com maior sensibilidade a todas as naftoquinonas estudadas na
concentração de 50 μM, exceto para a βLapachona e Metoxi, que foram mais
citotóxicas na HEP2.
Apesar da ampla utilização da βLapachona em diversos estudos como um
potencial antitumoral, nesta avaliação, ela apresentou menor capacidade de reduzir a
47
viabilidade celular na concentração de 50μM quando comparada as naftoquinonas
Epóxi αLapachona, Nor βLapachona, IVS 320 e Metoxi.
No processo de triagem das naftoquinonas com MTT, na K562, a Nor
βLapachona mostrou ser a mais citotóxica, seguida pela IVS 320. Estas substâncias
apresentam estruturas químicas diferenciadas, sendo a Nor βLapachona uma o-
naftoquinona e a IVS 320 uma p-naftoquinona. Possivelmente, o maior potencial
citotóxico da Nor βLapachona deva estar relacionado à sua estrutura que é bastante
semelhante a da βLapachona, substância encontrada na literatura pertinente como
antitumoral (Lee et al., 2005; Reinicke et al., 2005; Li et al., 2003; Choi et al., 2003).
Após a triagem, as substâncias escolhidas, Epóxi αLapachona, Nor βLapachona,
IVS 320 e Metoxi, foram avaliadas em diferentes concentrações e, com esses resultados
após a análise de regressão, foram determinadas as concentrações de cada substância
com capacidade de matar 50% da população celular (IC
50
). A βLapachona e o
Etoposídeo foram utilizados como controles positivos, representando uma naftoquinona
em teste e um quimioterápico comercial, respectivamente.
Na análise de regressão utilizamos o modelo logarítmico como sendo o mais
ajustado aos dados encontrados, apresentando um bom coeficiente de explicação (R
2
) e
permitindo a determinação da concentração de cada substância que promoveria a morte
de 50% das células (IC
50
). Mesmo tendo sido menos sensível, mostramos também os
cálculos de IC
50
para HEP2. Nesta linhagem, encontramos os menores valores de IC
50
para βLapachona (2,3μM) e Metoxi (320,9μM). Na linhagem K562, a βLapachona
também apresentou o melhor potencial antitumoral com IC
50
de 0,06 μM seguido pela
Nor βLapachona, com IC
50
de 467,6 μM, e IVS 320 com IC
50
de 488,0 μM. Os
resultados encontrados na análise de regressão para K562, com exceção da βLapachona,
são compatíveis com a triagem feita com MTT. Curiosamente, quanto menor a
48
concentração de βLapachona, maior seu potencial citotóxico, característica que a difere
das demais substâncias em ambas as linhagens. É possível que a βLapachona esteja
interferindo na técnica de MTT. Trabalhos apontam que pode ocorrer interferência das
substâncias na metodologia com MTT (Ulukaya et al., 2004; Bruggisser et al., 2002).
A avaliação do possível mecanismo de ação empregado por essas substâncias
para exercerem seus efeitos também foi feita através da alteração na síntese de
proteínas, análise do perfil de fragmentação do DNA celular e genotoxicidade destas
substâncias. Nessas avaliações somente a linhagem K562 foi utilizada, essa escolha se
baseou no fato desta célula ser mais sensível as substâncias utilizadas, estar presente no
painel de células do NCI e de ser mais fácil de manipular.
A síntese de proteínas através da incorporação de metionina na presença de
naftoquinonas foi avaliada em apenas dois estudos. Carvalho e colaboradores (2005)
determinaram que o Lapachol promoveu a inibição da síntese protéica na concentração
de 2,5 mM em linhagem celular de mamíferos e Pereira e colaboradores (2006)
verificaram que a 3-hidroxi-β-N-lapachona, composto ausente em nossas análises,
também inibia a síntese protéica em S. aureus. Em nossos ensaios a síntese de proteínas
mostrou ser um processo metabólico bastante afetado pelo tratamento com as
naftoquinonas, onde a maioria das substâncias levou a uma redução maior que 90%.
Nesta avaliação o Etoposídeo continuou se destacando do restante das substâncias por
apresentar uma queda de 60,6% na síntese de proteínas. Nossos resultados portanto,
reforçam os encontrados na literatura.
Um dos marcadores bioquímicos clássicos de apoptose é o aparecimento de
padrão de fragmentação da cromatina, indicativo da clivagem de regiões entre os
nucleossomos. Essa clivagem internucleossomal, conseqüência da ativação de
endonuclease, produz um padrão de quebra em oligômeros múltiplos de 180 pb
49
formando o padrão em escada quando os fragmentos de DNA são submetidos à
eletroforese (Wyllie, 1980)
Chau e colaboradores (1998) demonstraram que a βLapachona tinha a
capacidade de induzir apoptose, verificada por fragmentação do DNA, em células HL-
60 após 4 horas de exposição na concentração de 1μM. Já por citometria de fluxo outras
duas linhagens de células leucêmicas, a U937 e a Molt-4, tinham cerca de 50% das
células em apoptose após 24 horas de exposição na concentração de 4μM. O autor
relaciona essa indução da apoptose com a produção de H
2
O
2
durante o tratamento com
βLapachona e aponta que as células K562 e MCF-7 seriam mais resistentes a apoptose
pois produziriam menos H
2
O
2
graças a uma quantidade maior de glutationa
intracelular. Portanto, a indução de apoptose pela βLapachona parece estar envolvida
com o estresse oxidativo (Chau et al., 1998).
Ao avaliar a indução da apoptose, verificada pela fragmentação do DNA em
presença das naftoquinonas selecionadas, não foi possível caracterizar nenhum padrão
de fragmentação no tratamento feito durante 4 horas. Entretanto, foi possível observar
indícios da ação das substâncias na indução da apoptose, quando utilizadas na
concentração de 50 μM durante 24 horas, devido a observação em fragmentos na faixa
de 200 a 600 pares de bases. A visualização dos fragmentos ficou prejudicada pelo
intenso rastro, característico de degradação do DNA. Na técnica utilizada para isolar o
DNA as proteínas foram extraídas com fenol:clorofórmio e a fase aquosa obtida,
submetida à eletroforese. A degradação pode ter ocorrido como conseqüência do
armazenamento do DNA com resíduos de fenol:clorofórmio antes da corrida
eletroforética, suspeita reforçada pelo intenso rastro também observado no DNA das
células controle sem DMSO em 24 horas.
50
Observamos que o Etoposídeo também não indicou ser um bom indutor de
apoptose em ambos os períodos de incubação. A actinomicina D, apresentada na
literatura como bloqueador da RNA polimerase mostrou também ser um possível
indutor de morte celular no período de 24h, na linhagem K562, devido a presença do
padrão de bandas em escada compatível com apoptose.
As células utilizadas no experimento para averiguação da morte celular por
apoptose foram fotografadas. Foi possível observar que a morfologia celular dos
controles com e sem DMSO mostrou-se muito similar com a presença de grumos
celulares característicos da linhagem K562. No meio de cultura observamos poucos
restos celulares. Destacamos as células incubadas com βLapachona e Nor βLapachona
por apresentarem maior alteração em termos de coloração de membrana celular e forma.
Pudemos observar também que as células tratadas com estas duas substâncias
apresentavam-se em menor quantidade, individualizadas e misturadas a debris celulares.
Essas alterações morfológicas reforçam os efeitos citotóxicos e de inibição de síntese
protéica anteriormente observados.
As naftoquinonas são apontadas na literatura como substâncias que induzem o
estresse oxidativo. Essas substâncias têm a capacidade de aceitar elétrons e gerar
espécies reativas de oxigênio incluindo
●
O
−
2,
●
OH e H
2
O
2
cujos efeitos oxidativos
poderiam explicar a citotoxicidade (Boveris et al., 1978; Silva et al., 2003; de Witte et
al., 2004).
O método de Single-Cell Gell Assay (SCGE) também conhecido como teste do
cometa, pode detectar e quantificar quebras do DNA em células eucarióticas. O método
é baseado na observação que em presença de um campo elétrico os fragmentos de DNA,
carregados negativamente, migram através do gel de agarose. O DNA intacto presente
no núcleo mantém o formato circular enquanto o núcleo com o DNA fragmentado,
51
apresenta migração para o anodo formando a figura de um cometa com maior
intensidade na cauda quando há uma maior quebra (Gontijo & Tice, 2003). Utilizamos
esse teste para avaliar se haviam lesões do DNA nas células tratadas com as
naftoquinonas, promovidas provavelmente pelas espécies reativas de oxigênio.
Constatamos a genotoxicidade das naftoquinonas através do teste do cometa em
um período de 2 horas de incubação. A βLapachona, a Epóxi αLapachona, a Nor
βLapachona, a IVS 320 e a Metoxi promoveram a quebras do DNA e através da análise
estatística mostramos que todas foram significativamente diferentes em relação ao
controle com DMSO. Nas condições utilizadas, entretanto, não foi possível fazer
distinção entre o número de cometas entre as diferentes naftoquinonas testadas, o que
possibilitaria a avaliação das diferenças estruturais. Tanto nas substâncias estudadas
como no controle com DMSO pudemos observar as quatro classes de cometas. Este
resultado mostra-se em concordância com a análise da síntese de proteínas no mesmo
período de incubação e a avaliação da apoptose em 24 horas de tratamento. Não existem
relatos anteriores na literatura avaliando as naftoquinonas através do teste do cometa.
Na análise feita com azul de Tripan no período de 2 horas não foi possível
identificar uma redução significativa da viabilidade celular durante o tratamento com as
naftoquinonas selecionadas, tendo sido observado o oposto no período de 24 horas,
onde a viabilidade das células tratadas com a substância menos citotóxica foi de cerca
de 20%. Esse resultado provavelmente foi conseqüência do pouco tempo em contato
com as substâncias.
As naftoquinonas demonstraram ser uma classe interessante de compostos com
atividade citotóxica, propriedade que pode ser explorada no tratamento do câncer.
Modificações estruturais podem ser uma importante estratégia para a produção de novas
52
moléculas com maior atividade contra as células tumorais e menor toxicidade para as
células normais.
53
6 – CONCLUSÃO
Partindo da necessidade do desenvolvimento de uma quimioterapia anticâncer
mais eficaz, propomos aqui a investigação do potencial antitumoral, e especificamente,
de possíveis mecanismos de ação de substâncias provenientes de síntese química.
A partir da análise feita, constatamos que a classe das substâncias mais
promissoras à utilização no tratamento quimioterápico contra o câncer foi a das
naftoquinonas. Estas promoveram menor viabilidade celular de linhagens tumorais
utilizando teste de viabilidade por MTT (capaz de avaliar a atividade mitocondrial).
A célula K562 foi mais sensível a citotoxicidade promovida pelas naftoquinonas
quando comparada a HEP-2.
A análise através de regressão logarítmica se ajustou de forma satisfatória aos
dados, e permitiu obter a IC
50
, tendo as substâncias Nor βLapachona e IVS 320,
substâncias pouco avaliadas na literatura, maior citotoxicidade.
As cinco naftoquinonas escolhidas como mais citotóxicas promoveram intensa
redução da síntese protéica, através da avaliação da incorporação de aminoácido
radioativo (
35
S-metionina).
Houve a fragmentação do DNA com padrão em escada nas células tratadas com
as naftoquinonas na concentração de 50 μM após 24 horas de tratamento.
Foi possível observar lesões no DNA na presença das cinco naftoquinonas
escolhidas através do teste do cometa na concentração de 50 μM após 2 horas de
tratamento.
A classe das naftoquinonas mostrou-se promissora no que diz respeito a
continuidade de testes não só in vitro como também in vivo na tentativa de alcançar uma
54
estrutura química que seja mais eficaz na terapia anticâncer e com menos efeitos
nocivos aos tecidos normais.
55
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59
8 - ANEXOS
ANEXO 1. NOMENCLATURA OFICIAL DAS NAFTOQUINONAS.
SUBSTÂNCIA NOME QUÍMICO
αLapachona 2,2-dimetil-3,4-dihidro-2H-benzo[g]cromeno-5,10-diona
βLapachona 2,2-dimetil-3,4-dihidro-2H-benzo[h]cromeno-5,6-diona
Epóxi
αLapachona
2,2-dimetil-3,4-diidropiro[benzo[g]cromeno-10,2’-oxirano]-5(2H)-
ona
Nor
βLapachona
2,2-dimetil-2,3-dihidronaftol[1,2-b]furano-4,5-diona
Triacetato 3-(3-metilbutil-2-enil)-1,4-dihidronaftaleno-1,2,4-triil triacetato
IVS-0320 6b,7-diidro-5H-ciclopenta[d]naftol[1,2-b]furano-5,6(9 aH)-diona
Metoxi 2-hidroxi-4-metoxinaftaleno-1-(4H)-ona
Epoxi-metoxi 4-metoxi-4H-espiro[naftaleno-1,2’-oxirano]-2-ol
Lapachol 2-hidroxi-3-(3-metilbutil-2-enil)naftaleno-1,4-diona
Lausona 2-hidroxinaftaleno-1,4-diona
60
ANEXO 2. ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS TRIAZÓIS E DO ÁCIDO PIRAZOLIL
ACRÍLICO.
N-Cl,Cl-TRIAZOL
N
N
N
HN
O
O
Cl
Cl
C
12
H
12
Cl
2
N
4
O
2
Exact Mass: 314,0337
Mol. Wt.: 315,1548
C. 45,73; H. 3,84; Cl. 22,50; N. 17,78; O. 10,15
N-Br-TRIAZOL
N
N
N
O
O
HN
Br
C
12
H
13
BrN
4
O
2
Exact Mass: 324,0222
Mol. Wt.: 325,1614
C. 44,33; H. 4,03; Br. 24,57; N. 17,23; O. 9,84
N-H-TRIAZOL
N
N
N
HN
O
O
C
12
H
14
N
4
O
2
Exact Mass: 246,1117
Mol. Wt.: 246,2653
C. 58,53; H. 5,73; N. 22,75; O. 12,99
N-Cl-TRIAZOL
N
N
N
HN
O
O
Cl
C
12
H
13
ClN
4
O
2
Exact Mass: 280,0727
Mol. Wt.: 280,7101
C. 51,34; H. 4,67; Cl. 12,63; N. 19,96; O. 11,40
N-F-TRIAZOL
N
N
N
HN
O
O
F
C
12
H
13
FN
4
O
2
Exact Mass: 264,1023
Mol. Wt.: 264,2558
C. 54,54; H. 4,96; F. 7,19; N. 21,20; O. 12,11
HIDRA-N-H
N
N
N
HN
N
H
O
NH
2
C
10
H
12
N
6
O
Exact Mass: 232,1073
Mol. Wt.: 232,2421
C. 51,72; H. 5,21; N. 36,19; O. 6,89
61
HIDRA-N-Cl
N
N
N
HN
N
H
NH
2
O
Cl
C
10
H
11
ClN
6
O
Exact Mass: 266,0683
Mol. Wt.: 266,6869
C. 45,04; H. 4,16; Cl. 13,29; N. 31,51; O. 6,00
N-H-TRI-OH
N
N
N
OH
HN
C
10
H
12
N
4
O
Exact Mass: 204,1011
Mol. Wt.: 204,2286
C. 58,81; H. 5,92; N. 27,43; O. 7,83
TRIAZOLMONO
TRIAZOL-MXI
TRIAZOL DAF1
TRIAZOLDAG
62
TRIAZOL DAGAL
TRIAZOL DAF2
TRIAZOL DAAL
HIDRA TRIAZOL
TRIAZOLRIBOOH
ÁCIDO PIRAZOLIL ACRÍLICO
63
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