ads:
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA
CAMPUS DE BOTUCATU
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS GENES TGFB1 E TGFBR2 EM
AMOSTRAS DE CARCINOMAS DUCTAIS INVASIVOS
CARLOS EDUARDO PAIVA
ORIENTADOR: PROFA. DRA. SILVIA REGINA ROGATTO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Patologia da Faculdade de
Medicina de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista - UNESP, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre.
BOTUCATU-SP
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Paiva, Carlos Eduardo.
Avaliação da expressão dos genes TGFB1 e TGFBR2 em amostras de
carcinomas ductais invasivos / Carlos Eduardo Paiva. – Botucatu : [s.n.], 2008
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina de Botucatu, 2008.
Orientadora: Silvia Regina Rogatto
Assunto CAPES: 40105008
1. Mamas - Câncer -
Aspectos genéticos
CDD 616.994
Palavras-chave: Fator transformador de crescimento betal; Imunohistoquí-
mica; Neoplasias mamárias; RT –PCR quantitativa em tempo real; Receptor 2
do fator transformador de crescimento beta
ads:
“Todos os médicos deveriam trabalhar, como parte de sua
formação profissional, com pessoas portadoras de doenças
incuráveis. Seriam proibidos de receitar medicamentos ou
intervenções cirúrgicas; precisariam, isso sim, sair a campo e
ajudar os doentes afagando-os, rezando com eles,
participando, no nível emocional, de suas dores”...
(Dr. Bernie Siegel)
À minha filha Ana Beatriz, motivo maior do meu
sorriso estampado no rosto e à minha esposa Bianca,
que teve a paciência de entender os meus momentos de
ausência e a capacidade de ajudar quando das
dificuldades.
Agradeço a Deus, em primeiro lugar. A todos os amigos do “Plano Maior”
que me ajudaram a buscar forças para concluir esta etapa da minha formação
profissional.
À minha orientadora prof. Dra. Silvia Regina Rogatto, por me mostrar o que é
ser pesquisador. Pela integridade de caráter científico e pela amizade.
À Dra. Sandra Drigo, por sua participação essencial em todas as etapas deste
trabalho. Muito Obrigado!
Aos meus queridos pais, Antônio Carlos e Yara, por estarem sempre ao meu
lado, incentivando sempre. Prontos para ajudar nos momentos mais difíceis. Sempre
(desde o berço) fazendo tudo para propiciar-me educação adequada, na escola
tradicional e no exemplo do dia-a-dia.
À minha querida irmã “amiga e leal“ Yara Cristina e seu esposo Marcelo
Maia, exemplos de retidão de caráter na vida acadêmica.
À Dra. Maria Aparecida Custódio Domingues, pela participação na realização
da imunohistoquímica e constante incentivo.
Ao Dr. José Roberto Fígaro Caldeira, pela participação essencial na coleta de
informações clínicas e em disponibilizar as amostras dos tecidos analisados.
Ao estatístico Hélio Rubens, do Grupo de Apoio à Pesquisa (GAP), FMB-
UNESP, Botucatu, SP, pela ajuda no entendimento e análise dos dados de sobrevida
e regressão logística.
Ao prof. Dr. Odair Carlito Michelin (Daya) por incentivar minha carreira
universitária e permitir minha atividade de pesquisador paralela à de oncologista
clínico.
A todos os amigos do laboratório NeoGene, especialmente Fabíola e Renata,
que participaram ativamente deste trabalho.
Ao prof. Luciano, do Departamento de Bioestatística, pelo auxílio no
entendimento e realização dos testes não paramétricos.
A todos os amigos da Seção Técnica de Quimioterapia, pela convivência
harmoniosa dos últimos anos.
À Tânia, secretária do programa de pós-graduação em Patologia, por sua
sempre gentil presteza em informações.
Aos técnicos do laboratório de Imunohistoquímica, Marquinhos e Celene, pela
importante participação na realização da imunohistoquímica e pela boa vontade em
sempre ajudar.
Ao Dr. Francisco Moraes Neto, pela participação na realização de
imunohistoquímica e por disponibilizar as amostras dos tecidos analisados.
Ao Sr. Antônio Bega, pela amizade, pela psicologia e pelos conselhos.
Aos funcionários do setor de pós-graduação da Faculdade de Medicina de
Botucatu, pelas orientações e boa vontade a mim dispensadas.
À todos que de alguma forma contribuíram para a execução deste trabalho.
Agradeço de forma especial a todas as pacientes que aceitaram participar
deste estudo, recebendo em troca a esperança de estarem contribuindo de alguma
forma para um melhor conhecimento do câncer de mama.
O câncer de mama (CM) ocupa o primeiro lugar em incidência e o segundo em
mortalidade entre as mulheres no mundo. É considerada uma doença heterogênea
com alterações em diversas vias de sinalização molecular. Os fatores prognósticos
atuais são incapazes de predizer a evolução da totalidade dos pacientes, assim como
os marcadores preditivos não conseguem evitar que grande parte das pacientes com
CM sejam submetidas à tratamento desnecessário. A busca de outros marcadores
tumorais, tanto prognósticos quanto preditivos tem sido alvo de inúmeras pesquisas,
que buscam predizer a evolução clínica de um número maior de pacientes. Dois
marcadores tumorais com possíveis implicações clínicas são o TGFB1 e o seu
receptor TGFBR2. No entanto, o papel do TGFB1 na carcinogênese e na progressão
do câncer de mama ainda não é totalmente conhecido. Desta forma, o objetivo deste
estudo foi avaliar a expressão do TGFB1 e do TGFBR2 em tumores de mama e
correlacionar com os dados clínicos e histopatológicos. Para tanto, foram analisadas
49 amostras de carcinomas ductais invasivos primários e sete amostras de mamas
normais como controles pelas técnicas de RT-PCR quantitativa em tempo real (qRT-
PCR) e imunohistoquímica (IHQ). Os resultados mostraram que baixos níveis de
expressão protéica de TGFB1 nas células tumorais estavam associados a menor
sobrevida livre de doença. Os tumores apresentaram acentuada diminuição da
expressão do transcrito TGFBR2 quando comparados ao controle normal. Além
disso, foram observados baixos níveis dos transcritos TGFB1 e TGFBR2 nos tumores
com fenótipos mais agressivos (alto índice proliferativo e estadio avançado). Esses
dados sugerem que o TGFB1 atua como supressor tumoral em CMs e que a
diminuição da expressão TGFB1 e TGFBR2 é um evento importante na
carcinogênese mamária. A detecção dos níveis de expressão protéica de TGFB1 no
tumor pode ser utilizada na prática clínica como marcador prognóstico em
carcinomas mamários.
Breast cancer (BC) is the leading female cancer in incidence and the second one in
mortality worldwide. BC is considered a heterogeneous disease, that presents
abnormalities in several molecular pathways. The known prognostic markers are not
capable to predict the outcome of all the patients, as well as the predictive markers
are not capable to avoid unnecessary treatments. It is necessary to search for other
tumor markers, even prognostic and predictive, regarding the prediction of a higher
number of patient’s outcome. Two tumor markers with possible clinical implications
are TGFB1 and its receptor TGFBR2. However the role of TGFB1 in carcinogenesis
and in the BC progression is not totally understood yet. In this way, the aim of this
study was to analyze the expression of TGFB1 and TGFBR2 in breast tumors and to
correlate it with clinical and histopathological data. For this, it were analyzed 49
ductal invasive carcinomas and 7 normal breast tissues as controls with quantitative
real time PCR (qRT-PCR) and immunohistochemistry (IHC) technologies. The
results showed that low expression levels of TGFB1 protein in tumor cells were
associated with a lower disease-free survival. Tumors presented highly diminished
TGFBR2 transcript expression when compared with normal controls. Moreover, low
levels of TGFB1 and TGFBR2 transcripts were observed in tumors with aggressive
phenotypes (high proliferation index and advanced stage). These results suggests
that TGFB1 acts like a tumor supressor in BCs and that the TGFB1 and TGFBR2
lowering expression is an important event in mammary carcinogenesis. The
detection of tumor TGFB1 protein expression levels can be helpful in clinical practice
like a prognostic marker in mammary carcinomas.
1- REVISÃO DE LITERATURA---------------------------------------------------15
2- OBJETIVOS--------------------------------------------------------------------------30
3- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS-------------------------------------------32
4- MANUSCRITO---------------------------------------------------------------------45
5- ANEXOS-----------------------------------------------------------------------------72
15
16
A maioria dos cânceres em países industrializados é representada por
tumores sólidos derivados de tecidos epiteliais, como os carcinomas de mama,
pulmão, trato gastrointestinal e próstata (Woefle et al., 2003; Pantel & Woefle, 2004).
Estima-se que o câncer de mama (CM) é responsável por 300.000 mortes e um
milhão de casos novos por ano no mundo (McPherson et al., 2000, Ozbas et al., 2003).
A incidência do CM continua aumentando gradativamente, mesmo nos países com
baixa incidência da doença, como Índia, Vietnã, Coréia, Tailândia, China e Gâmbia
(McPherson et al.,2000; Goldhirsch et al., 2005). A mortalidade secundária ao CM, por
outro lado, diminuiu na última década nos países ocidentais desenvolvidos, como
resultado da detecção precoce da doença e um tratamento mais adequado (Barrios et
al., 2005; Goldhirsch et al., 2005).
No Brasil, segundo dados do Instituto Nacional do Câncer, foram estimados
para o ano de 2008, 49.400 novos casos de CM. Na região Sudeste, o CM é o mais
incidente entre as mulheres, com um risco estimado de 68 casos novos por 100 mil
habitantes e uma incidência de 28.430 casos anuais (Ministério da Saúde, 2007). Ao
contrário dos países desenvolvidos, o Brasil apresenta uma tendência evidente de
aumento da mortalidade secundária ao CM (Barrios et al., 2005).
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento do CM estão
relacionados a uma maior exposição do tecido mamário aos estrógenos circulantes.
São fatores de risco estabelecidos a idade, menarca precoce, menopausa tardia,
nuliparidade, primeira gravidez tardia, obesidade na pós-menopausa, história
familiar, hiperplasia atípica prévia e CM na mama contra-lateral (McPherson et al.,
2000).
Fatores genéticos são responsáveis por aproximadamente 10% dos casos de
CM (McPherson et al.,2000). Os genes supressores tumorais BRCA1 e BRCA2,
localizados nos braços longos dos cromossomos 17 e 13 respectivamente, são
responsáveis por parcela importante dos casos de CM hereditários (McPherson et al.,
2000). Apesar de conferirem um risco adicional, mutações nos genes TP53, PTEN e
CDH1 raramente são responsáveis pelo desenvolvimento do CM (Goldhirsch et al.,
2005). Os genes conhecidos de suscetibilidade são responsáveis por menos de 25%
17
do risco familial de CM. Easton et al. (2007) relataram 30 polimorfismos de
nucleotídeo único (SNP) relacionados ao desenvolvimento do CM, após análise de
uma população de 4.398 casos e 4.316 controles. Nove destes SNPs foram
confirmados após análise de uma população de quase 45.000 pacientes. Dentre estes
nove SNPs, quatro deles continham genes que biologicamente poderiam estar
relacionados ao CM, incluindo FGFR2, TNRC9, MAP3K1 e LSP1. Cox et al. (2007)
analisaram nove SNPs com relatados em literatura como candidatos a risco
aumentado no CM. Os autores evidenciaram que os SNPs CASP8 e TGFB1
acrescentam um pequeno, porém significativo, aumento no risco de
desenvolvimento do CM.
Marcadores tumorais são úteis na detecção do câncer em estágio precoce, no
monitoramento da progressão da doença, na avaliação do risco de recorrência e
morte na ausência de tratamento (fator prognóstico) e para predizer a resposta ao
tratamento (fator preditivo) (Lonning, 2003).
A pesquisa de marcadores prognósticos para o CM é importante
principalmente no que tange à definição de terapia sistêmica adjuvante. Cerca de
90% das pacientes com CM e ausência de disseminação neoplásica para linfonodos
axilares são submetidas à quimioterapia adjuvante, mesmo sabendo que 70% das
pacientes estariam curadas apenas com tratamento loco-regional (Pantel & Woefle,
2004). O tratamento adjuvante do CM, tanto com o uso de quimioterápicos
antineoplásicos quanto com hormonioterápicos, acarreta um risco de complicações
agudas, sub-agudas e crônicas, que apesar de pequeno, não pode ser desprezado
(Shapiro & Recht, 2001).
Os fatores prognósticos que determinam evolução ruim no CM são: maior
tamanho do tumor, presença de disseminação para linfonodos axilares, grau
histológico 3 (G3), presença de invasão linfo-vascular, aumento da expressão de
marcadores de proliferação celular, idade inferior a 35 anos e provavelmente a raça
negra (Cianfrocca & Goldstein, 2004).
Alguns sistemas de classificação prognóstica foram desenvolvidos com o
objetivo de melhor caracterizar as pacientes com CM em relação ao risco de recidiva
loco-regional e metástase à distância. Estes sistemas são, de alguma forma,
18
arbitrários considerando-se que o risco biológico de recorrência é heterogêneo e
contínuo (Barrios et al., 2005). Os mais utilizados são os sugeridos pela European
Society of Medical Oncology (ESMO) e pelo Consenso da Conferência Internacional de
St. Gallen (Goldhirsch et al., 2005; ESMO, 2007). O programa Adjuvant! Online
(http://www.adjuvantonline.com/) utiliza critérios clínicos (idade e a presença de
comorbidades) e patológicos (tamanho do tumor, grau histológico, presença de
disseminação para linfonodos axilares e expressão da proteína ESR1) para predizer
estatisticamente o risco de recorrência e morte em função do CM e tornou-se
ferramenta útil quando da definição da necessidade de tratamento adjuvante.
A utilização recente da técnica de cDNA array permite a identificação de
perfis de expressão gênica que separam grupos de pacientes segundo características
bem estabelecidas, como diferentes evoluções clínicas (Sorlie et al., 2001). Os tumores
do subtipo luminal A apresentam perfil de expressão gênica similar às células
luminais da glândula mamária normal (Reis-Filho et al., 2006). Os tumores deste
subtipo são caracterizados por expressão aumentada do gene ESR1 e uma variedade
de outros normalmente co-expressos. Dentre estes genes estão o GATA-3, LIV-1 e
EMP-2 (Sorlie et al., 2006). Os tumores do subtipo basalóide apresentam expressão de
genes relacionados ao epitélio basal/mioepitelial, como o KRT5, KRT17, LAMC2,
LBR, DSC2, MRAS e CDCA7 (Sorlie et al., 2006). O subtipo HER-2 é caracterizado
pela expressão aumentada de genes localizados no amplicon 17q22.24, incluindo o
ERBB2/HER-2 e o GRB7 (Sorlie et al., 2001). Os tecidos mamários agrupados no
subtipo “mama normal” apresentam expressão de genes relacionados ao tecido
adiposo e outros tecidos não epiteliais (Sorlie et al., 2001). A evolução das pacientes
com perfil genômico subtipos basalóide e HER-2 é significativamente pior que as
classificadas como luminal A (Reis-Filho et al., 2006; Sorlie et al., 2006).
A proliferação estimulada pelo estrógeno, tanto das células tumorais quanto
das normais, depende da expressão da proteína ESR1 (Early Breast Cancer Trialists’
Collaborative Group, 1998). A expressão protéica, por imuno-histoquímica (IHQ),
dos receptores hormonais esteroidais ESR1 e PGR é fator preditivo definido de
resposta ao tratamento do CM com hormonioterpia. Dois grupos principais de
hormonioterápicos (HT) são utilizados na clínica: os que modulam a proteína ESR1,
19
como o tamoxifeno e os que diminuem a síntese de estrógeno por inibir a enzima
aromatase, como o letrozol, o anastrozol e o exemestano. Pacientes com no mínimo
1% de expressão da proteína ESR1 (IHQ) apresentam melhora na sobrevida livre de
doença com o uso dos HT, sendo que a sobrevida é maior com níveis de expressão
mais elevados (Harvey et al., 1999).
O gene HER-2 encontra-se com aumento de expressão em aproximadamente
30% dos CMs e está relacionado a um pior prognóstico (Slamon et al., 1987). O
anticorpo monoclonal humanizado trastuzumabe se liga à porção extracelular da
proteína transmebrânica codificada pelo HER-2 e aumenta a sobrevida global de
pacientes com CM, tanto na doença metastática quanto na localizada (Carter et al.,
1992; Slamon et al., 2001; Viani et al., 2007). Os carcinomas mamários que apresentam
aumento da expressão protéica de HER-2 ou amplificação gênica (detectada pela
metodologia de FISH –Hibridação in situ por Fluorescência) são os que apresentam
benefício comprovado com o uso do trastuzumabe (Mass et al., 2001). Atualmente
está preconizado o uso da IHQ como teste inicial para a pesquisa de aumento de
expressão do HER-2. A positividade para o anticorpo anti-HER-2 é graduada
utilizando-se uma escala de escores, que varia de 1+ a 3+. As pacientes com CM com
IHQ positiva (3+) apresentam benefício comprovado com o uso do trastuzumabe,
mas o tumor com positividade 2+ necessita de pesquisa de amplificação gênica por
FISH ou outra técnica compatível. O CM com amplificação gênica por FISH também
tem benefício comprovado com o uso da referida medicação (para revisão Tsuda,
2006).
O ESR1 e o ERBB2 se tornaram os protótipos de marcadores preditivos na
oncologia clínica, são amplamente utilizados na prática, sendo capazes de modificar
a conduta terapêutica, porém incapazes de predizer a evolução da totalidade das
pacientes.
Neste sentido, a busca de outros marcadores tumorais, tanto prognósticos
quanto preditivos, é necessária, de maneira que se possa predizer a evolução clínica
de um número maior de pacientes.
20
O Fator de Crescimento Transformante Beta (TGF-β)
O TGF-β foi descrito inicialmente como indutor do crescimento derivado de
ancoragem em fibroblastos murinos (Moses et al., 1981). Posteriormente, foi
demonstrado que estava envolvido em múltiplos processos biológicos, incluindo o
desenvolvimento embrionário, fibrose, cicatrização, sistema imunológico e
carcinogênese (para revisão, Li et al., 2006; Fleisch et al., 2006).
A proteína apresenta três isoformas, TGFB1, TGFB2, TGFB3, em mamíferos e
são codificadas por genes distintos. A isoforma TGFB1 é a mais abundante,
universalmente expressa e a mais estudada (Elliott & Blobe, 2005). O gene TGFB1
está mapeado em 19q13.1-q13.3, contém 7 éxons e grandes regiões intrônicas
(OMIM, 2007). A proteína traduzida tem 390 aminoácidos e 44341 Da
(http://www.genecards.org).
A proteína TGF-β (qualquer uma das isoformas) é produzida na forma inativa
e ligada não covalentemente ao peptídeo associado à latência (LAP). O LAP, por sua
vez, encontra-se ligado à proteína latente ligadora do TGF-β (LTBP). As proteínas
LAP, LTBP e TGF-β, quando associadas, formam o complexo latente (Benson, 2004).
Para a atividade do TGF-β é necessário que ocorra a dissociação do TGF-β maduro
do complexo latente (Mattos et al., 2002). A clivagem do LAP por várias proteases é o
evento inicial para ativação do TGF- β (Fleisch et al., 2006). A maioria das células
(incluindo as epiteliais, as estromais e as do sistema imunológico) sintetiza TGF-β e
possui receptores específicos transmembrânicos, portanto, a ativação do TGF-β é um
evento regulador importante para sua atividade biológica in situ (Fleisch et al.,2006).
O TGF-β ativado exerce suas funções biológicas por ligação a receptores
específicos de transmembrana pelos quais tem alta afinidade. Os receptores de TGF-
β do tipo I (TGFBR1) e tipo II (TGFBR2) contêm serina-treonina quinases em seus
domínios intracelulares (Elliott & Blobe, 2005). O receptor de TGF-β do tipo III
(TGFBR3), também chamado de betaglicano, é uma glicoproteína sem atividade de
proteína quinase que se associa fortemente ao TGF-β aumentando sua concentração
na superfície celular e maximizando sua interação com os TGFBR1 e TGFBR2
(Benson, 2004; Fleisch et al., 2006).
21
O ligante TGFB1 pode se interagir com o TGFBR2 diretamente ou via
apresentação pelo TGFBR3. Em seqüência, o TGFBR2 se associa (formando um
heterodímero) ao TGFBR1, com conseqüente fosforilação deste e início da cascata de
sinalização intracelular via fatores de transcrição denominados Smad´s. Os SMAD2 e
SMAD3 (chamados de R-Smads) ativados pelo TGFBR1 se associam ao SMAD4 (Co-
Smad), formando heterodímeros e translocando para o núcleo celular onde ativam a
transcrição de genes alvo. Os SMAD6 e SMAD7 (I-Smads) inibem a via de
sinalização do TGF-β (Miyazono et al., 2003; Elliott & Blobe, 2005). A Figura 1
esquematiza a via de sinalização do TGF-β em nível celular. Outras vias moleculares
importantes no controle da proliferação celular e carcinogênese estão relacionadas à
via do TGF-β como, por exemplo, as vias do PI3K/AKT, FOXG1, Jagged/Notch,
HER-2 e da MAPkinase
(
Bachman & Park, 2004).
Dados em literatura mostram resultados contraditórios sobre o envolvimento
do TGFB1 na carcinogênese mamária. Ele atua como supressor tumoral em estágios
iniciais da carcinogênese, por inibir o crescimento e induzir apoptose; no entanto, é
promotor tumoral em estágios tardios, por promover migração, degradação da
matriz extracelular, angiogênese, imunossupressão do hospedeiro e possivelmente
atuar na indução da transição de um fenótipo epitelial para mesenquimal (Dumont
& Arteaga, 2000; Muraoka-Cook et al., 2005; Fleisch et al., 2006; Jakowlew, 2006). O
TGFB1 tem ações contexto-dependente que são afetadas pelo tipo celular e pelo
microambiente estromal (Wakefield et al., 2001).
Figura 1. Representação esquemática da via de sinalização celular do TGF- β/Smad´s
(Adaptado de Elliott & Blobe, 2005).
22
O TGF- β como supressor tumoral
Modelos animais com perda parcial ou completa dos genes TGFB1, SMAD2
ou SMAD3, apresentaram maior propensão ao desenvolvimento de tumores (Tange
et al., 1998; Muraoka-Cook et al., 2005). A expressão negativa dominante do gene
TGFBR2 resultou em um desenvolvimento mamário lóbulo-alveolar acelerado e
propensão ao desenvolvimento de carcinomas mamários tanto induzidos
quimicamente quanto espontâneos (Bottinger et al., 1997; Gorska et al., 1998; Gorska
et al., 2003).
O TGFB1 promove a parada do ciclo celular em G1 pela indução dos genes
TP15 e TP21, repressão de c-MYC, CDC25A, CICLINA E e CICLINA A e aumento da
afinidade de TP15, TP21, TP27 pelos CDKs alvo. A inativação dos complexos ciclina-
cdks de G1 promove a desfosforilação da proteína RB1 e inibição de E2F (Donovan &
Slingerland, 2000).
A resistência à apoptose é uma das mais importantes características das
células neoplásicas malignas. Perry et al. (1995) demonstraram que o TGF-β atua
como fator pró-apoptótico em vários tipos de tecidos tumorais, inclusive no CM.
Uma maneira encontrada pelas células neoplásicas para escapar da supressão
tumoral promovida pela via do TGF-β é perder ou diminuir a expressão de seus
receptores de superfície ou de alguns tipos de SMADs, por diversos mecanismos
(Elliott & Blobe, 2005; Jakowlew, 2006). Um destes mecanismos foi relatado por
Gobbi et al. (2000). Os autores demonstraram baixos níveis de expressão protéica de
TGFBR2 em CMs com alto índice mitótico e estadios mais avançados (II e III).
Folgueira et al. (2006) evidenciaram baixos níveis de expressão do mRNA do
TGFBR2 em CMs no estádio III em relação às mamas normais, usando cDNA
microarray. Porém, este achado não foi validado por RT-PCR quantitativa.
Hinshelwood et al. (2007) demonstraram recentemente uma importante diminuição
da expressão do transcrito TGFBR2 em 88% (sete em oito) das linhagens celulares de
CM estudadas e em todas as 18 amostras de tumores mamários analisadas. Segundo
estes autores, alterações epigenéticas poderiam explicar a freqüente diminuição da
expressão do transcrito TGFBR2 encontrada em CMs. Barlow et al. (2007), no entanto,
relataram níveis de expressão protéica do TGFBR2 (IHQ) em 73% das células
23
epiteliais dos tumores avaliados. Os autores evidenciaram que a expressão protéica
do TGFBR2 no estroma tumoral estava associada à disseminação neoplásica para os
linfonodos axilares e/ou negatividade para ESR1 e PGR por IHQ.
O TGF- β como promotor tumoral
A transição epitélio-mesênquima (TEM) é um evento fisiológico onde o
epitélio pode ser transformado em fibroblasto, sendo importante na fibrogênese
(quando da cicatrização de feridas) e na inflamação (Lee et al., 2006). Estudos
recentes têm sugerido que o tumor é capaz de utilizar a mesma “maquinaria
genômica” para promover a mudança de um fenótipo epitelial em mesenquimal
(Xue et al., 2003). Durante o processo de TEM as células tumorais perdem o fenótipo
epitelial, caracterizado pelo forte contato célula-a-célula e menor motilidade, e
adquirem um fenótipo mesenquimal, apresentando contato célula-a-célula reduzido
e maior motilidade e capacidade de invasão (Elliott & Blobe, 2005; Pardali &
Moustakas, 2007). A ocorrência de TEM parece capacitar as células neoplásicas para
infiltrar tecidos adjacentes e disseminar-se à distância. No entanto, existem
evidências que sugerem que muitos carcinomas invasivos e metastáticos apresentam
uma transição de fenótipo epitelial para mesenquimal de forma incompleta ou
mesmo ausente, sugerindo que a TEM não seja o único mecanismo responsável pelos
processos de invasão e metástase (Christiansen & Rajasekaran, 2006).
A demonstração da TEM in vivo é difícil devido à natureza transitória e
reversível da mesma (Valcourt et al., 2005). Algumas vezes apenas o fronte invasivo
do tumor apresenta achados compatíveis com a TEM (Lee et al. ,2006). Outra
dificuldade é a diferenciação das células neoplásicas pós-TEM e fibroblastos
estromais (Valcourt et al., 2005). Estas dificuldades levam alguns autores a certo
cepticismo em relação à hipótese de participação da TEM na evolução e progressão
do tumor (Tarin, 2005).
Os marcadores moleculares mais utilizados para caracterizar a TEM são o
aumento da expressão protéica de VIM e CDH2, a localização nuclear da β-Catenina
e a diminuição da expressão de CDH1 e algumas citoqueratinas, como as KRT8 e
KRT19 (Lee et al.,2006; Christiansen & Rajasekaran, 2006). Os fatores de transcrição
24
SNAIL1, SNAIL2, TWIST, ZEB1, ZEB2 e E47 encontram-se aumentados (Lee et al.,
2006; Peinado et al., 2007).
O TGF-β é regulador importante, porém não único, da TEM (Lee et al., 2006).
Outras citocinas também estão envolvidas, como os fatores de crescimento
epidérmico (EGF) e de fibroblastos (FGF) (Christiansen & Rajasekaran, 2006).
O gene S100A4, também chamado de proteína específica do fibroblasto (FSP-
1) e metastasina (MTS-1), é um membro da família S100 de proteínas ligantes do
cálcio que está envolvido diretamente no processo metastático (Garret et al., 2006;
Egeblad et al., 2005). Encontra-se expresso nos fibroblastos relacionados ao câncer
(CAFs), nas células neoplásicas epiteliais e possivelmente nos macrófagos (Egeblad
et al., 2005). Acredita-se que o S100A4 atue junto ao citoesqueleto celular, levando a
uma conformação mesenquimal e permitindo maior motilidade da célula (Xue et al.,
2003). O TGF-β é um dos fatores importantes na comunicação entre os carcinomas e
os CAFs (Egeblad et al., 2005). Foi demonstrado que a expressão de S100A4 está
aumentada em resposta ao TGF-β e relacionada com a TEM (Okada et al., 1997; Xue
et al., 2003; Robertson et al., 2004).
Relação do TGF-β com os genes ESR1, PGR e HER-2
Linhagens de CM que expressavam ESR1 se mostraram menos sensíveis à
inibição da proliferação pelo TGF-β (Arteaga et al., 1988). No entanto, Ewan et al.
(2005) demonstraram que o TGFB1 diminui em seis vezes a proliferação de células
epiteliais mamárias ESR1 positivas. A co-localização, por IHQ, de ESR1 e Ki67, foi
significativamente mais freqüente em camundongos knockouts heterozigotos para
TGFB1, que produzem 90% menos de sua proteína. A presença de hormônios
ovarianos circulantes foi necessária para que ocorresse a co-localização das proteínas
acima referidas (Ewan et al., 2005).
Matsuda et al. (2001) mostraram que as proteínas codificadas pelos genes
ESR1 e ESR2 se associam estruturalmente ao SMAD3 (via domínio MH2)
diminuindo sua atividade. Por outro lado, o TGFBR1 aumenta a atividade
transcricional dos receptores de estrógeno referidos via fosforilação de SMAD3. Os
resultados deste estudo sugerem uma importante inter-relação entre os genes ESR1,
25
ESR2 e a via do TGF-β, em função da capacidade destes em se ligarem com o
SMAD3.
Tanto o TGF-β quanto o 17-β-estradiol são capazes de aumentar a motilidade
de células da linhagem de câncer de mama MCF-7. No entanto, a pré-incubação com
o 17-β-estradiol diminuiu a estimulação da migração pelo TGF-β (Malek et al., 2006).
Wilson et al. (2005) sugeriram que os receptores de estrógeno podem inibir a
atividade promotora de metástase estimulada pela via do TGF-β (Figura 2).
Figura 2 – Modelo proposto por Wilson
et al
. (2005) das atividades supressora (anti-
proliferativa) e promotora de tumor (via transição epitélio-mesênquima) do TGFβ1 e sua
inter-relação com os marcadores tumorais ERBB2 e ESR1.
O uso exógeno do TGFB1 diminuiu a expressão do mRNA e, em menor grau,
da proteína ESR1 (Stoica et al., 1997). Os autores sugeriram que o TGFB1 regula a
expressão do ESR1 via região promotora. Amoils e Bezwoda (1997) utilizaram RT-
PCR qualitativa e demonstraram que expressão do transcrito TGFB1 se
correlacionava com a expressão do transcrito ESR1. Os tumores positivos para ESR1
também o foram para o TGFB1, porém os negativos para ESR1 tinham expressão
variável de TGFB1 (Amoils & Bezwoda, 1997). Estudo publicado recentemente,
26
sugeriu que o TGF-β atua no compartimento de células progenitoras proliferativas
promovendo diferenciação em células menos proliferativas, mais organizadas e
caracterizadas por expressão aumentada de marcadores da linhagem luminal. O
TGF-β também diminuiu a população de stem cells e de células progenitoras
precoces. Utilizando IHQ em 50 amostras de CM em tissue array, os autores
mostraram que a diminuição da expressão protéica do TGFBR2 se correlacionava
com a perda da diferenciação luminal. Os autores concluíram que o TGFB1 e o
TGFBR2 devam ser importantes para manutenção do CM em um estado
diferenciado, luminal, com expressão de ESR1 (Tang et al. 2007).
Soufla et al. (2006) demonstraram que os níveis de mRNA de TGFB2 e TGFB3
estavam elevados em carcinomas mamários que expressavam a proteína ESR1 e
correlacionados positivamente com a expressão protéica de PGR. Usando
imunohistoquímica, Koumoundourou et al.(2007) demonstraram uma associação
negativa entre a expressão das proteínas PGR e TGFB1.
Wilson et al. (2005) utilizaram tecnologia de cRNA microarray para estudar
diferentes linhagens celulares de CM, com e sem a amplificação do HER-2, obtida
através de infecção por um retrovírus contendo DNA completo do gene HER-2. As
linhagens celulares foram tratadas com solução contendo TGF-β1 recombinante. A
expressão aumentada do HER-2 inibiu a transcrição de genes relacionados à parada
do ciclo celular induzida pelo TGF-β1 em células luminais da linhagem MCF-7. O
aumento da expressão de HER-2 em células da linhagem mesenquimal MDA-MB-
231 aumentou a transcrição de genes relacionados à invasão e metástases induzidos
pelo TGF-β1.
Muraoka et al. (2003), utilizando modelos experimentais de animais
transgênicos, demonstraram que a expressão concomitante de HER-2 e TGFB1
diminuiu em cinco vezes a taxa de morte celular e em três vezes a taxa de
proliferação de carcinomas mamários em relação aos animais que expressavam
apenas o HER-2. A co-expressão destes dois genes aumentou em três vezes a taxa de
metástases pulmonares, assim como aumentou a migração e a invasão em células
cultivadas. De forma interessante, os autores mostraram que mesmo em tumores
avançados o TGFB1 poderia exercer atividade supressora (anti-proliferativa) e
27
promotora de tumor (invasão, motilidade), simultaneamente (Muraoka et al., 2003).
O modelo proposto por Wilson et al. (2005) para a inter-relação do TGFB1 com o
ESR1 e o HER-2 em tipos diferentes de tecidos mamários está apresentado na Figura
2.
Marcadores prognósticos no câncer de mama: TGF-β e seus receptores
Marrogi et al. (1997) utilizaram e PCR semi-quantitativa em 19 amostras de
CM e demonstraram que a expressão de TGFB1 era maior em um grupo de pacientes
que apresentaram evolução clínica favorável. Foi demonstrado que os CMs com
diminuição da expressão da proteína TGFB1 tinham um risco 4,6 vezes maior de
evoluir para metástase à distancia. Estes mesmos autores mostraram que a
diminuição da expressão protéica dos SMAD2 e SMAD3 fosforilados (pSMAD2/3)
foi fator independente de menor sobrevida livre de doença (Koumoundourou et al.,
2007). De forma oposta, a expressão protéica de TGFB1 estava correlacionada
positivamente, e de forma independente de outros fatores prognósticos, com a
progressão de doença (Gorsch et al., 1992).
Os níveis séricos de TGFB1, avaliados pelo método de ELISA, estiveram
aumentados de forma significativa em pacientes com estadios avançados (III e IV)
sendo que um cut off de 3,0 ng/mL permitiu a diferenciação das pacientes quanto a
sua evolução clínica (Ivanovic et al., 2006).
Buck et al. (2005) avaliaram por imunohistoquímica a expressão de TGFBR1 e
TGFBR2 em 246 amostras de CM e mostraram que a presença da proteína ESR1 pode
influenciar nos efeitos do TGFB1. No grupo de tumores que não expressavam ESR1 a
expressão de TGFBR2 estava associada com maior agressividade e menor tempo de
sobrevida. No entanto, a ausência de expressão simultânea das proteínas ESR1 e
TGFBR2, estava associada a tempo de sobrevida prolongado, similar aos tumores
que expressavam ESR1. Os autores concluíram que a expressão protéica do TGFBR2
estava relacionada com evolução desfavorável em pacientes com expressão protéica
diminuída o ESR1.
28
A expressão diminuída de TGFBR3, avaliada em 286 amostras de CM em
tissue microarray por IHQ , se correlacionou com a diminuição da sobrevida livre de
recorrência em estudo de Dong et al. (2007).
A avaliação de 456 casos de CM em tissue microarray usando IHQ mostrou que
a ausência de expressão de SMAD4 se correlacionou inversamente com metástases
para linfonodos axilares. Em pacientes com estádio II, a ausência de expressão da
proteína fosforilada SMAD2 se correlacionou com uma menor sobrevida global (Xie
et al., 2002).
JUSTIFICATIVA
Considerando-se que:
1. O HER-2 e o ESR1 são marcadores preditivos e prognósticos utilizados na
prática da oncologia, porém incapazes de predizer a evolução da totalidade
dos pacientes;
2. O TGF-β tem funções anti-proliferativa e pró-apoptótica, e de forma oposta,
também promove migração, invasão e metástases em carcinomas mamários
in vitro e in vivo (Elliot et al., 2006);
3. Foi demonstrado em modelos experimentais que o TGF-β pode induzir a
TEM, o que aumentaria o potencial invasivo e metastático dos tumores
(Valcourt et al., 2005);
4. A via de sinalização do TGF-β é regulada pela expressão de HER-2 e ESR1
(Wilson et al., 2005);
5. A baixa expressão de TGFBR2 mostrou-se como evento precoce e freqüente
em CM, quando avaliado por imunohistoquímica (Gobbi et al., 2000);
6. Após busca na base de dados Pubmed, não foram encontrados relatos que
tenham avaliado quantitativamente a expressão de TGFB1 em amostras
humanas de CM. Apenas um trabalho avaliou quantitativamente a
expressão de TGFBR2 em amostras humanas de CM (Hinshelwood et al.,
2007);
29
7. O potencial valor prognóstico do TGFB1 e seu receptor TGFBR2 não foi
adequadamente estudado em CMs;
Este estudo foi realizado para avaliar a expressão dos genes TGFB1 e TGFBR2 por
RT-PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) em amostras de carcinomas ductais
invasivos primários (CDIs) comparados à tecidos de mamas normais e correlacionar
os achados com os parâmetros clínico-patológicos. Os dados de expressão gênica
foram validados por meio da detecção das proteínas TGFB1 e TGFBR2 por IHQ em
cortes histológicos das mesmas amostras estudadas. O impacto prognóstico da
expressão destes genes foi analisado por regressão logística em relação à ocorrência
de recorrência local ou metástases à distância, assim como em relação à sobrevida
livre de recorrência.
30
31
Objetivo principal
• Avaliar a expressão dos transcritos (por qRT-PCR) e das proteínas
(por imunohistoquímica) TGFB1 e TGFBR2 em amostras de
carcinomas ductais invasivos mamários primários e correlacionar
com os parâmetros clínicos e patológicos.
Objetivos secundários
• Correlacionar a expressão do mRNA de TGFB1 e TGFBR2 com:
1. a expressão protéica de TGFB1 e TGFBR2 por imuno-
histoquímica;
2. a expressão protéica do marcador de proliferação Ki67;
3. a ocorrência de recidiva local e/ou sistêmica.
• Correlacionar a expressão protéica de TGFB1 e TGFBR2 por
imunohistoquímica com:
1. a expressão do mRNA de TGFB1 e TGFBR2;
2. a expressão protéica do marcador de proliferação Ki67;
3. a expressão protéica dos marcadores ESR1, PGR e HER-2;
4. a ocorrência de recidiva local e/ou sistêmica.
• Avaliar as curvas de sobrevida livre de doença em relação à
expressão dos transcritos e proteínas TGFB1 e TGFBR2.
32
**International Committee of Medical Journal Editors. Uniform Requirements for Manuscripts Submitted
to Biomedical Journal: sample references [homepage on the Internet]. Bethesda: U.S. National Library
of Medicine; 2003 [last update 2003 July 09; cited 2005 Jun 01]. Available from:
http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniforme_requirements.html.
33
Amoils KD, Bezwoda WR. TGF-b1 mRNA expression in clinical breast cancer and its
relationship to ER mRNA expression. Breast Cancer Res Treat. 1997;42:95-101.
Arteaga CL, Tandon AK, Von Hoff DD, Osborne CK. Transforming Growth Factor β:
Potential Autocrine Growth Inhibitor of Estrogen Receptor-negative Human Breast
Cancer Cells. Cancer Res. 1988;48:3898-3904.
Bachman KE, Park BH. Duel nature of TGF-β signaling: tumor suppressor vs. tumor
promoter. Curr Opin Oncol. 2004;17:49–54.
Barrios CH, Bines J, Simon S, Marques R, Costa MA, Azevedo S et al.
Recomendações para o Manejo Adjuvante de Pacientes com Câncer de Mama Inicial.
Rev Bras Oncologia Clínica. 2005;1:3-11.
Benson JR. Role of transforming growth factor β in breast carcinogenesis. Lancet
Oncol. 2004;5:229-239.
Bloom MJC, Richardson WW. Histologic grading and prognosis in breast cancer: a
study of 1709 cases. Br J Cancer. 1957;11:358−377.
Bottinger EP, Jakubczak JL, Haines DC, Bagnall K, Wakefield LM. Transgenic mice
overexpressing a dominant-negative mutant type II transforming growth factor h
receptor show enhanced tumorigenesis in the mammary gland and lung in response
to the carcinogen 7,12-dimethylbenz-[a]-anthracene. Cancer Res. 1997;57:5564-5570.
Buck MB, Knabbe C. TGF-Beta Signaling in Breast Cancer. Ann NY Acad Sci.
2006;1089:119-126.
Buck MB, Fritz P, Dippon J, Zugmaier G, Knabbe C. Prognostic Significance of
Transforming Growth Factor β Receptor II in Estrogen Receptor-Negative Breast
Cancer Patients. Clin Cancer Res. 2004,10:491–498.
34
Cabezón T, Celis JE, Skibshoj I, Klingelhofer J, Grigorian M, Gromov P et al. Int J
Cancer. 2007;121:1433-1444.
Carey LA, Dees EC, Sawyer L, Gatti L, Moore DT, Ollila DW et al. The triple
negative paradox: Primary tumor chemosensitivity of breast cancer subtypes. Clin
Cancer Res. 2007;13:2329-2334.
Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL et al.
Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl
Acad Sci USA. 1992; 89:4285-4289.
Cianfrocca M, Goldstein LJ. Prognostic and Predictive Factors in Early-Stage Breast
Cancer. Oncologist. 2004;9;606-616.
Christiansen JJ, Rajasekaran AK. Reassessing Epithelial to Mesenchimal Transition as
a Prerequisite for Carcinoma Invasion and Metastasis. Cancer Res. 2006;66:8319-
8326.
Cox A, Dunning AM, Garcia-Closas M, Balasubramanian S, Reed MW, Pooley KA et
al. A common coding variant in CASP8 is associated with breast cancer risk. Nat
Genet. 2007; 39:352-358.
Dong M, How T, Kirkbride KC, Gordon KJ, Lee JD, Hempel N et al. The type III
TGF-β receptor suppresses breast cancer progression. J Clin Invest. 2007;117:206-217.
Donovan J, Slingerland J. Transforming growth factor-beta and breast cancer: Cell
cycle arrest by transforming growth factor-beta and its disruption in cancer. Breast
Cancer Res. 2000;2:116-124.
35
Dumont N, Arteaga CL. Transforming growth factor-beta and breast cancer tumor
promoting effects of transforming growth factor-beta. Breast Cancer Res. 2000;2:125–
132.
Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group: Tamoxifen for early breast
cancer: an overview of the randomised trials. Lancet. 1998;351:1451-1467.
Easton DF, Pooley KA, Dunning AM, Pharoah PD, Thompson D, Ballinger DG et al.
Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci.
Nature. 2007; 447:1087-1093.
Elliott RL, Blobe GC. Role of Transforming Growth Factor Beta in Human Cancer. J
Clin Oncol. 2005;23:2078-2093.
Eglebad M, Littlepage LE, Werb Z. The fibroblastic coconspirator in cancer
progression. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2005;70:383-388.
ESMO. Primary breast cancer: ESMO Clinical Recommendations for diagnosis,
treatment and follow-up. Ann Oncol. 2007;18 (Suppl 2):5–8.
Ewan KB, Oketch-Rabah HA, Ravani SA, Shyamala G, Moses HL, Barcellos-Hoff
MH. Proliferation of Estrogen Receptor-α-Positive Mammary Epithelial Cells Is
Restrained by Transforming Growth Factor-β1 in Adult Mice. Am J Pathol.
2005;167:409–417.
Fleisch MC, Maxwell CA, Barcellos-Hoff MH. The pleiotropic roles of transforming
growth factor beta in homeostasis and carcinogenesis of endocrine organs. Endocr
Relat Cancer. 2006;13:379–400.
36
Folgueira MAAK, Brentani H, Katayama MLH, Patrão DFC, Carraro DM, Mourão
Netto M et al. Gene expression profiling of clinical stages II and III breast cancer.
Bras J Biol Res. 2006; 39:1101-1113.
Garrett SC, Varney KM, Weber DJ, Bresnick AR. S100A4, a mediator of metastasis. J
Biol Chem. 2006;281:677–680.
Gobbi H, Arteaga CL, Jensen RA, Simpson JF, Dupont WD, Olson SJ et al. Loss of
expression of transforming growth factor beta type II receptor correlates with high
tumour grade in human breast in-situ and invasive carcinomas. Histopathol.
2000;36:168-177.
Goldhirsch A, Glick JH, Gelber RD, Coates AS, Thurlimann B, Senn HJ et al. Meeting
Highlights: International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast
Cancer 2005. Ann Oncol. 2005;16:1569–1583.
Gorsch SM, Memoli VA, Stukel TA, Gold LI, Arrick BA. Immunohistochemical
staining for transforming growth factor beta 1 associates with disease progression in
human breast cancer. Cancer Res. 1992;52:6949-6952.
Gorska AE, Jensen RA, Shyr Y, Aakre ME, Bhowmick NA, Moses HL. Transgenic
mice expressing a dominant-negative mutant type II transforming growth factor-h
receptor exhibit impaired mammary development and enhanced mammary tumor
formation. Am J Pathol. 2003;163:1539-1549.
Gorska AE, Joseph H, Derynck R, Moses HL, Serra R. Dominant-negative
interference of the transforming growth factor h type II receptor in mammary gland
epithelium results in alveolar hyperplasia and differentiation in virgin mice. Cell
Growth Differ. 1998;9:229-238.
37
Harvey JM, Clark GM, Osborne CK, Allred DC. Estrogen receptor status by
immunohistochemistry is superior to the ligand binding assay for predicting
response to adjuvant endocrine therapy in breast cancer. J Clin Oncol. 1999;17:1474-
1481.
Hinshelwood RA, Huschtscha LI, Melki J, Stirzaker C, Abdipranoto A, Vissel B et al.
Concordant Epigenetic Silencing of Transforming Growth Factor-B Signaling
Pathway Genes Occurs Early in Breast Carcinogenesis. Cancer Res. 2007;67:11517–
11527.
Ihemelandu CU, Leffall Jr. LD, Dewitty RL, Naab TJ, Mezghebe HM, Makambi KH
et al. Molecular Breast Cancer Subtypes in Premenopausal African-American
Women, Tumor Biologic Factors and Clinical Outcome. Ann Surg Oncol.
2007;14:2994-3003.
Ivanovic V, Demajo M, Krtolica K, Krajnovic M, Konstantinovic M, Baltic V et al.
Elevated plasma TGF-beta1 levels correlate with decreased survival of metastatic
breast cancer patients. Clin Chim Acta. 2006;371:191-193.
Jakowlew SB. Transforming growth factor-β in cancer and metastasis. Cancer
Metastasis Rev. 2006;25:435–457.
Koumoundourou D, Kassimatis T, Zolota V, Tzorakoeleftherakis E, Ravazoula P,
Vassiliou V et al. Prognostic significance of TGFβ-1 and pSmad2/3 in Breast Cancer
Patients with T1-2N0 tumours. Anticancer Res. 2007;27:2613-2620.
Landis MD, Seachrist DD, Montañez-Wiscovich ME, Danielpour D, Keri RA. Gene
expression profiling of cancer progression reveals intrinsic regulation of
transforming growth factor-β signaling in ErbB2/Neu-induced tumors from
transgenic mice. Oncogene. 2005;24: 5173–5190.
38
Lee JM, Dedhar S, Kalluri R, Thompson EW. The epithelial–mesenchymal transition:
new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 2006;172:973–981.
Lenferink AEG, Magoon J, Cantin C, O’Connor-MocCourt MD. Investigation of three
new mouse mammary tumor cell lines as models for transforming growth factor
(TGF)-beta and Neu pathway signaling studies: identification of a novel model for
TGF-beta-induced epithelial-to-mesenchymal transition. Breast Cancer Res.
2004;6:514–530.
Li MO, Wan YY, Sanjabi S, Robertson AL, Flavell RA. Transforming growth factor-
beta regulation of immune responses. Annu Rev Immunol. 2006;24:99–146.
Lonning E. Study of suboptimum treatment response: lessons from breast cancer.
Lancet Oncol. 2003;4:177–185.
Mani SA, Yang J, Brooks M, Schwaninger G, Zhou A, Miura N et al. Mesenchyme
Forkhead 1 (FOXC2) plays a key role in metastasis and is associated with aggressive
basal-like breast cancers. PNAS. 2007;104:10069–10074.
Mass RD, Press M, Anderson S, Murphy M, Slamon D. Improved survival benefit
from Herceptin (trastuzumab) in patients selected by fluorescence in situ
hybridization (FISH). Proc Am Soc Clin Oncol. 2001;20:22a.
Matsuda T, Yamamoto T, Muraguchi A, Saatcioglu F. Cross-talk between
Transforming Growth Factor-β and Estrogen Receptor Signaling through Smad3. J
Biol Chem. 2001;276:42908-42914.
Mattos MD, Kimura ET, Silva MR, Egami MI, Segreto RA, Segreto HR. Latent
TGFbeta1 activation in the lung irradiated in vivo. Rev Assoc Med Bras. 2002;48:329-
334.
39
McPherson K, Steel CM, Dixon JM. Breast cancer-epidemiology, risk factors, and
genetics. BMJ. 2000;321:624-628.
Ministério da Saúde. Estimativa 2008: Incidência de Câncer no Brasil, INCA, 2005
[cited 2008 Feb 07]. Available from: http://www.inca.gov.br/estimativa/2008.
Miyazono K, Suzuki H, Imamura T. Regulation of TGF-β signaling and its roles in
progression of tumors. Cancer Sci. 2003;94:230–234.
Moses HL, Branum EL, Proper JA, Robinson RA. Transforming growth factor
production by chemically transformed cells. Cancer Res. 1981;41:2842–2848.
Muraoka RS, Koh Y, Roebuck LR, Sanders ME, Brantley-Sieders D, Gorska AE et al.
Increased malignancy of Neu-induced mammary tumors overexpressing active
transforming growth factor β1. Mol Cell Biol. 2003;23:8691-8703.
Muraoka-Cook RS, Dumont N, Arteaga CL. Dual Role of Transforming Growth
Factor B in Mammary Tumorigenesis and Metastatic Progression. Clin Cancer Res.
2005;11:937-943.
OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man. TRANSFORMING GROWTH
FACTOR, BETA-1; TGFB1 [cited 2007 Jun 14]. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=190180.
Okada H, Danoff TM, Kalluri R, Neilson EG. Early role of Fsp1 in epithelial-
mesenchymal transformation. Am J Physiol. 1997;273:563-574.
Ozbas S, Dafydd H, Purushotham AD. Bone marrow micrometastasis in breast
cancer. Br J Surg. 2003;90:290-301.
Pantel K, Woelfle U. Cancer micrometastasis: Detection, Clinical Relevance, and
Molecular Description. In Perry MC, editors. American Society of Clinical Oncology
Educational Book. Alexandria: VA; 2004. p.701-8.
40
Pardali K, Moustakas A. Actions of TGF-β as tumor suppressor and pro-metastatic
factor in human cancer. Biochim Biophys Acta. 2007;1775:21–62.
Peinado H, Olmeda D, Cano A. Snail, ZEB and bHLH factors in tumour progression:
na alliance against the epithelial phenotype? Nat Rev Cancer. 2007;7:415-428.
Perry RR, Kang Y, Greaves BR. Relationship between tamoxifen-induced
transforming growth factor beta 1 expression, cytostasis and apoptosis in human
breast cancer cells. Br J Cancer. 1995;72:1441-1446.
Rebhan, M, Chalifa-Caspi, V, Prilusky, J, Lancet, D. GeneCards: encyclopedia for
genes, proteins and diseases. Weizmann Institute of Science, Bioinformatics Unit and
Genome Center (Rehovot, Israel), 1997 [cited 2007 Jun 14]. Available from
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TGFBI&search=TGFB1.
Reis-Filho JS, Lakhani SR. The diagnosis and management of pre-invasive breast
disease Genetic alterations in pre-invasive lesions. Breast Cancer Res. 2003,5:313-319.
Reis-Filho JS, Westbury C, Pierga JY. The impact of expression profiling on
prognostic and predictive testing in breast cancer. J Clin Pathol. 2006;59;225-231.
Robertson H, Ali S, Mcdonnell BJ, Burt AD, Kirby JA. Chronic Renal Allograft
Dysfunction: The Role of T Cell–Mediated Tubular Epithelial to Mesenchymal Cell
Transition. J Am Soc Nephrol. 2004;15:390-397.
Salatino M, Labriola L, Schillaci R, Charreau EH, Elizalde PV. Mechanisms of cell
cycle arrest in response to TGF-b in progestin-dependent and -independent growth
of mammary tumors. Exp Cell Res. 2001;265:152–166.
41
Seton-Rogers SE, Lu Y, Hines LM, Koundinya M, LaBaer J, Muthuswamy SK, et al.
Cooperation of the Erb2 receptor and transforming growth factor beta in induction
of migration and invasion in mammary epithelial cells. PNAS. 2004;101:1257–1262.
Shapiro CL, Recht A. Side effects of adjuvant treatment of breast cancer. N Engl J
Med. 2001;344:1997-2008.
Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human
breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-
2/neu oncogene. Science. 1987; 235:177-182.
Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A et al. Use of
chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast
cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med. 2001;344:783-792.
Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, Aas T, Geisler S, Johnsen H et al. Gene expression
patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical
implications. PNAS. 2001;98:10869-10874.
Sorlie T, Wang Y, Xiao C, Johnsen H, Naume B, Samaha RR et al. Distinct molecular
mechanisms underlying clinically relevant subtypes of breast cancer: gene
expression analyses across three different platforms. BMC Genomics. 2006, 7:127-
141.
Sotiriou C, Piccart MJ. Taking gene-expression profile to the clinic:when will
molecular signatures become relevant to patient care. Nat Rev Cancer. 2007;7:545-
550.
42
Soufla G, Porichisa F, Sourvinosa G, Vassilarosb S, Spandidosa DA. Transcriptional
deregulation of VEGF, FGF2, TGF-b1, 2, 3 and cognate receptors in breast
tumorigenesis. Cancer Lett. 2006;235:100–113.
Stoica A, Saceda M, Fakhro A, Solomon HB, Fenster BD, Martin MB. The Role of
Transforming Growth Factor-b in the Regulation of Estrogen Receptor Expression in
the MCF-7 Breast Cancer Cell Line. Endocrinol. 1997;138:1498–1505.
Tang B, Bottinger EP, Jakowlew SB, Bagnall KM, Mariano J, Anver MR et al.
Transforming growth factor-beta1 is a new form of tumor suppressor with true
haploid insufficiency. Nat Med. 1998;4:802-807.
Tang B, Vu M, Booker T, Santner SJ, Miller FR, Anver MR, Wakefield LM. TGF-β
switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer
progression. J Clin Invest. 2003;112:1116–1124.
Tang B, Yoo N, Vu M, Mamura M, Nam J, Ooshima A et al. Transforming Growth
Factor-B Can Suppress Tumorigenesis through Effects on the Putative Cancer Stem
or Early Progenitor Cell and Committed Progeny in a Breast Cancer Xenograft
Model. Cancer Res. 2007;67:8643-8652.
Tarin D. The Fallacy of Epithelial Mesenchymal Transition in Neoplasia. Cancer
Res. 2005;65:5996-6001.
Todorovic-Rakovic N. TGF-beta 1 could be a missing link in the interplay between
ER and HER-2 in breast cancer. Med Hypotheses. 2005;65:546-551.
Tsuda H. HER-2 (c-erbB-2) Test Update: Present Status and Problems. Breast Cancer.
2006;13:236-248.
43
UICC União Internacional Contra o Câncer: Classificação dos tumores malignos, 5°
ed. Ministério da Saúde, Rio de Janeiro - Brasil, 1998.
Valabrega G, Montemurro F, Aglietta M. Trastuzumab: mechanism of action,
resistance and future perspectives in HER2-overexpressing breast cancer. Ann
Oncol. 2007;18:977-984.
Valcourt U, Kowanetz M, Niimi H, Heldin CH, Moustakas A. TGF-β and the Smad
Signaling Pathway Support Transcriptomic Reprogramming during Epithelial-
Mesenchymal Cell Transition. Mol Biol Cell. 2005;16:1987–2002.
Venkov CD, Link AJ, Jennings JL, Plieth D, Inoue T, Nagai K et al. A proximal
activator of transcription in epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 2007;
117:482–491.
Xie W, Mertens JC, Reiss DJ, Rimm DL, Camp RL, Haffty BG et al. Alterations of
smad signaling in human breast carcinoma are associated with poor outcome: A
tissue microarray study. Cancer Res. 2002;62:497-505.
Xue C, Plieth D, Venkov C, Xu C, Neilson EG. The Gatekeeper Effect of Epithelial-
Mesenchymal Transition Regulates the Frequency of Breast Cancer Metastasis.
Cancer Res. 2003;63:3386–3394.
Wakefield LM, Piek E, Bottinger EP. TGF-β Signaling in Mammary Gland
Development and Tumorigenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2001;6:67-82.
Wang SE, Shin I, Wu FY, Friedman DB, Arteaga CL. HER2/Neu (ErbB2) Signaling to
Rac1-Pak1 Is Temporally and Spatially Modulated by Transforming Growth Factor
β. Cancer Res. 2006;66:9591-9600.
44
Weikel W, Beck T, Mitze M, Knapstein PG. Immunohistochemical evaluation of
growth fractions in human breast cancers using monoclonal antibody Ki-67. Breast
Cancer Res Treat. 1991;18:149−154.
WHO World Health Organization: International of Diseases for Oncology, 2nd ed.
World Health Organization, Geneva, 1990.
Willipinski-Stapelfeldt B, Riethdorf S, Assmann V, Woelfle U, Rau T, Sauter G et al.
Changes in Cytoskeletal Protein Composition Indicative of an Epithelial-
Mesenchymal Transition in Human Micrometastatic and Primary Breast Carcinoma
Cells. Clin Cancer Res. 2005; 11:8006-8014.
Wilson CA, Cajulis EE, Green JL, Olsen TM, Chung YA, Damore MA et al. HER-2
overexpression differentially alters transforming growth factor-β responses in
luminal versus mesenchymal human breast cancer cells. Breast Cancer Res.
2005;7:1058-1079.
Woelfle U, Cloos J, Sauter G, Riethdorf L, Janicke F, van Diest P et al. Molecular
signature associated with bone marrow micrometastasis in human breast cancer.
Cancer Res. 2003;63:5679-5684.
Wu L, Wu Y, Gathings B, Wan M, Li X, Grizzle W et al. Smad4 as a transcription
corepressor for estrogen receptor αlpha. J Biol Chem. 2003;278:15192-15200.
Zhang HT, Chen XF, Wang MH, Wang JC, Qi QY, Zhang RM et al. Defective
expression of transforming growth factor β receptor type II is associated with CpG
methylated promoter in primary non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res.
2004;10:2359-2367.
45
* Manuscrito segundo as normas do Periódico Cancer Letters (ISSN:0304-3835), Fator de Impacto:
3.277 (Journal Citation Reports® 2007, Thomson Scientific).
46
The TGFB1 as a prognostic marker in human invasive breast cancers
CE Paiva
a*
, SA Drigo
b
, FE Rosa
b
, FA Moraes Neto
c
, MAC Domingues
d
, JRF Caldeira
e
,
SR Rogatto
b
a Oncological and Hemato-oncological Center, São Paulo State University, Botucatu, São
Paulo, Brazil
b NeoGene Laboratory, Department of Urology, São Paulo State University, Botucatu, São
Paulo, Brazil
c Department of Pathology, Amaral Carvalho Hospital, Jau, São Paulo, Brazil
d Department of Pathology, São Paulo State University, Botucatu, São Paulo, Brazil
e Department of Senology, Amaral Carvalho Hospital, Jau, São Paulo, Brazil
Running title: TGFB1 and TGFBR2 genes in breast cancer
* Corresponding author. Rua Antônio Nunes da Silva Sobrinho, 180, Jardim Paraíso II,
Botucatu-SP-Brasil. CEP:18.610-170. Tel.: +55 14 3814 3640. E-mail address:
[email protected] (CE Paiva).
47
Abstract
Breast carcinoma (BC) is currently regarded as a complex and heterogeneous disease
presenting abnormalities in several molecular pathways. Although BC is the leading female
cancer in incidence and the second one in mortality worldwide, the prognostic and predictive
markers known are incapable to predict the outcome of all patients as well as to avoid
unnecessary treatments. Two potential tumor markers with possible clinical implications are
TGFB1 and its receptor TGFBR2. However, the role of TGFB1 in carcinogenesis and in the
BC progression is not totally understood. The present study was conducted to determine the
expression pattern and predictive / prognostic value of TGFB1 and TGFBR2 in breast tumors.
A series of 49 primary ductal invasive carcinomas and seven normal breast tissues were
evaluated by quantitative real time PCR (qRT-PCR) and immunohistochemistry (IHC). It was
detected that low levels of TGFB1 and TGFBR2 transcripts were significantly correlated with
tumors presenting aggressive phenotypes (high proliferation index and advanced clinical
staging). In addition, low expression levels of TGFB1 protein in tumor cells were associated
with a lower disease-free survival. It was observed that the tumors presented highly
diminished TGFBR2 transcript expression in comparison to normal samples. In overall, these
results suggest that TGFB1 and TGFBR2 downexpression is an important event in breast
carcinogenesis. TGFB1 protein expression levels can be useful in clinical practice as a
prognostic marker in mammary carcinomas.
Keywords: Breast cancer, TGFB1, TGFBR2, transcript expression, protein expression
48
1. Introduction
Breast cancer (BC) is the most frequent female neoplasia and is the second leading
cause of death by malignant disease among North American and Brazilian women [1,2]. BC
is a group of heterogeneous neoplasms characterized by distinct morphological appearances,
genetic alterations and biological behaviors. Over the last decades, a large number of
alterations have been described and implicated in the development and progression of the
breast cancer; however, the known prognostic factors are incapable to predict the progression
of all patients. Currently, the only recommended prognostic and predictive markers in breast
cancer are estrogen and progesterone receptors and ERBB2/HER-2 oncogene status [3].
Consequently, efforts have been done to discover biomarkers related to early detection,
treatment response, and clinical outcome such as metastasis, recurrence, and survival.
Understanding the molecular events and the development of reliable biomarkers will
ultimately offer novel therapeutic strategies and to improve the clinical management of
patients with breast cancer.
The proliferation of neoplasic breast epithelial cells is regulated by different stimuli
including cytokines and growth factors [4], such as the transforming-growth factor β (TGF-
β). TGF-β, a pluripotent cytokine, plays an important role in wound healing, angiogenesis,
and immunoregulation [5]. It has been suggested that TGF-β participates in normal mammary
gland morphogenesis and growth [6]. Three TGF-β isoforms are expressed in mammals
(TGFB1, TGFB2 and TGFB3) and their effects are mediated by cell surface receptors named
as TGFBR1, TGFBR2 and TGFBR3. TGFB1 is the most studied and universally expressed
isoform. TGFB1 binds with high affinity to the TGFBR2, this phosphorilates TGFBR1
initiating the intracellular signaling cascade [7].
It has been proposed that TGFB1 acts as a tumor suppressor in early stages of
neoplasia, by inhibiting epithelial cell proliferation and inducing apoptosis. Besides, it has
been suggested that TGFB1 can also act as a tumor promoter in later stages of carcinogenesis,
by inducing an invasive and pro-metastatic phenotype characterized by an epithelial-to-
mesenchymal transition (EMT) [8,9,10].
Virtually all epithelial-derived tumors become resistant to the growth-inhibitory
effects of TGF-β during tumorigenesis. The mechanisms for this resistance in BC remain
poorly understood. One of the proposed mechanisms includes decreased expression of its
transmembrane receptors, including the TGFBR2 [7]. It has been shown that loss of TGFBR2
protein expression in epithelial cells of breast typical hyperplasia was associated to increased
49
risk of subsequent invasive breast cancer [11]. Recently, it was demonstrated that some
members of the TGF-β signaling pathway (including TGFBR2) are commonly down-
regulated in breast cancer cell lines and in breast cancer tissues samples. Interestingly,
TGFBR2 gene suppression was associated with chromatin repression rather than DNA
methylation [12].
Studies addressing the prognostic role of TGFB1 in human BC have shown
conflicting results. TGFB1 mRNA expression level detected by semi-quantitative method in
BC samples was significantly higher in patients with a favorable outcome as compared to
patients with a poor prognosis [13]. Other studies have shown that high expression of TGFB1
protein was related to worst progression of the disease [14,15]. More recently,
Koumoundourou et al. showed that low expression of TGFB1 protein was related to
recurrence in T
1-2
N
0
breast tumors [16].
Considering the limited amount of data and the contradictory results published, the
purpose of the current study was to correlate the TGFB1 and TGFBR2 transcript (by
quantitative real time RT-PCR) and protein (by immunohistochemistry) expression levels in
breast cancer samples in relation to the clinical-pathological characteristics.
50
2. Materials and methods
2.1. Patients
Forty nine ductal breast carcinoma samples were obtained from 2000 to 2004 from
Amaral Carvalho Hospital, Jaú (São Paulo, Brazil). The patients were accrued consecutively
and had no previous histological diagnosis of BC. The patients had undergone segmental
resection or mastectomy, and none of them had received radiotherapy or chemotherapy prior
to surgery. Five histopathologically normal mammary tissues used as a control were obtained
from patients that undergoing mammary reduction. All patients were advised of the
procedures and provided written informed consent approved by the Institution Ethics
Committee (CEPFHAC 020/06).
Patients were followed every four months post surgery and the mean follow-up was
52.3 ± 19.8 months (13 to 83 months). Immediately after surgery, the tumor samples were
frozen at -80ºC. Frozen tissue sections were histopathologically evaluated and microdissected
to ensure the presence of at least 90% of tumor cells. Histopathological classification was
performed according to the WHO International Classification of Disease for Oncology [17],
and the clinical stage was determined according to the UICC TNM classification [18]. The
malignancy of infiltrating carcinomas was scored according to the Scarff-Bloom and
Richardson grading system [19].
The patients received different chemotherapy treatments: AC (adriamycin,
cyclophosphamide); FEC (5-fluorouracil, epirubicin, cyclophosphamide), FAC (5-
fluorouracil, adriamycin, cyclophosphamide); CMF (cyclophosphamide, methotrexate, 5-
fluorouracil). Thirty-six patients (73%) received radiotherapy. At the end of chemotherapy
treatment, 32 patients (65%), that were estrogen receptor (ESR1) positive and/or
progesterone receptor (PGR) positive cases according to immunohistochemistry (IHC)
analysis were treated with tamoxifen (20 mg/day) for 60 months.
2.2. Total RNA isolation and reverse transcription
Total RNA was extracted from pulverized frozen tumor tissue using an Rneasy mini
Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. The
RNA samples were stored in RNAse-free distilled water at -70ºC. The quality of RNA
samples was confirmed by electrophoresis in a 2% agarose gel followed by ethidium bromide
staining, and the 18S and 28S RNA bands were visualized under ultraviolet light. To avoid
DNA contamination, the samples were digested with Dnase I Amplification Grade 1U (Life
51
Technologies, Rockville, MD, U.S.A.) in 10X Dnase I Reaction Buffer and 25 mM EDTA
pH 8.0. The reaction was carried out in a PTC-100 thermal cycle (Peltier - Effect Cycling -
MJ Research, Inc., USA) for 15 min at room temperature and the enzyme was inactivated by
heating at 70ºC for 10 min. RNA was reverse transcribed in a final volume of 20µl containing
5x First-Strand Buffer (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA), 10 mM each
dNTP, 0.5µg/µl Oligo (dT)
18
, 0.1 M dTT and SuperScript
TM
II reverse transcriptase 200 U
(Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA). Reverse transcription was carried out for
60 min at 42ºC and the reaction mixture was subsequently inactivated for 15 min at 70ºC.
The cDNA was stored at -70ºC.
2.3. Quantitative RT-PCR
The PCR amplification was performed in forty-eight carcinomas and in normal breast
tissues using an ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Primers
for target genes (TGFB1 and TGFBR2) and reference gene (GAPDH) were designed by the
Primers Express software (Applied Biosystems). The PCR primer sequences were: TGFB1
forward primer 5'-ggctaccatgccaacttct-3' and reverse primer 5'-tgtacaaccagcataacccgg-3' (101
pb amplicon); TGFBR2 forward primer 5'-tgggaaatgacatctcgctg-3' and reverse primer 5'-
ccctgtgtcgaaagcatgaa-3' (102 pb amplicon); and GAPDH forward primer 5'-
ggcctccaaggagtaagacc-3' and reverse primer 5'-aggggtctacatggcaactg-3' (147 pb amplicon).
The PCR were carried out in a total volume of 25µl according the manufacturer’s
instructions. Quantitative data was analyzed using the Sequence Detection System software
(v1.0; Applied Biosystems). Standard curves for all primers were constructed using a series
of 5-fold dilutions (pure, 1:5, 1:25, 1:125, 1:625) of cDNA pool (cDNA from normal and
tumor breast tissues). The PCR efficiency (E) was calculated according to the equation:
E=10
[-1/slope]
-1.
The relative quantification (RQ) of the target genes in comparison to GAPDH
were calculated according Pfaffl [20]. The transcripts were considered upregulated when the
RQ was ≥2.0 and downregulated when it was ≤0.5.
2.4. Immunohistochemistry Staining
Formalin-fixed and paraffin-embedded tissues were freshly cut (3 µm) and the
sections were mounted on slides with organosilane (3-aminopropyl triethoxy-silane) (Sigma-
Aldrich Co. St. Louis, MO, USA). Slides were deparaffinized in xylene, gradually rehydrated
through a series of alcohol rinses, and washed in phosphate-buffered saline (PBS). Intrinsic
peroxidase activity was blocked with hydrogen peroxidase and the sections were incubated
52
with the primary antibody. Immunohistochemical reactions were performed using the RTU-
ER-6F11 antibody (Novocastra, Newcastle, UK) (dilution 1:50), the monoclonal anti-human
progesterone receptor 1A6 antibody (DAKO, Carpinteria, CA, USA) (dilution 1:50),
policlonal rabbit anti-human cerbB-2 oncoprotein (DAKO, Carpinteria, CA, USA) (dilution
1:800), monoclonal mouse anti-human Ki67 antigen clone MIB-1 (DAKO, Carpinteria, CA,
USA) (dilution 1:100), polyclonal rabbit antibody anti-TGF-β1 RB-10347-P (Lab Vision,
Fremont, CA, USA) (dilution 1:25), polyclonal rabbit antibody anti-TβRII RB-10345-P (Lab
Vision, Fremont, CA, USA) (dilution 1:25). After incubation for one hour, the sections were
washed in PBS, incubated for 30 min with secondary biotinylated antibody, and incubated for
30 min with streptavidin peroxidase complex (LSAB, DAKO, Carpinteria, CA, USA). The
sections were developed with 3,3'-diaminobenzidine (DAB) and counterstained with
hematoxylin. Negative and positive control slides were included with each assay. In addition,
a positive control of normal placental tissue was used in each assay to quantify the TGFB1
and TGFBR2 relative expression level. Normal placental tissue stained extensively for both
antibodies and the intensity was assigned as 3. It was analyzed 43 breast cancers, 31 adjacent
normal breast, and two normal breast tissues. The staining intensity was scored as follow: 0
(no expression) to 3 (highest expression). Percentage of epithelial tissues expressing TGFB1
and TGFBR2 were also scored as: absent (0%), 1-24% (1), 25-49% (2), 50-74% (3), 75-
100% (4). The staining intensity and percentage of positive cells product was calculated to
obtain a final score. Final score was defined as follow: 0 (0 to 3); 1 (4 to 8) and 2 (9 to 12).
Immunohistochemical staining scoring of for ESR1 and PGR was considered positive if the
percentage of positive nuclear staining was ≥10% of neoplasic cells. In areas of well-
preserved tissue, the fraction of the infiltrating cells was scored. For HER-2, the strength of
the membranous staining was recorded by a four-step scale 0, 1+ to 3+ as follows: continuous
staining of membrane (3+), continuous staining present in >10% of the tumor cells (2+), focal
or discontinuous staining present in >10% of tumor cells (1+), and staining in <10% of
infiltrating cells (0). The Ki67 levels (percentage of stained cells) were evaluated in all cases,
but eight were non-reactive. The median value of the Ki67 labeling index included in this
study was used as a cutoff to distinguish tumors with low (≤25%) and high (>25%)
proliferative fractions [21].
2.5. Statistical Analysis
Non-parametric tests Kruskal-Wallis and Mann-Whitney were applied to compare
TGFB1 and TGFBR2 transcript levels and clinical-pathological characteristics. Data are
53
presented as the median and the minimum and maximum values. Correlation analyses
between immunohistochemistry (IHC) and qRT-PCR results were performed using
Spearman’s rank test. Fisher’s exact test was applied to determine the strength of association
between the categorical variables.
A binary logistic regression model were used to analyze the associations among
TGFB1 and TGFBR2 IHC scores with the variables ESR1, PGR, and HER-2 IHC status;
lymph node involvement; histological grade, and tumor size in relation to local recurrence or
distant metastasis.
Disease-free survival (DFS) was calculated from the date of diagnosis to the
occurrence of local recurrences or distant metastasis. Kaplan-Meier analysis was used to
determine DFS according to the variables studied. The log-rank test was used to compare the
differences between DFS curves.
Statistical significance was designated at P<0.05. Data analysis was done using the
statistical softwares package Prism 3 (San Diego, CA, USA), Stats Direct Statistical software
version 2.6.5 (CamCode, Ashwell, UK), and SPSS version 6.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) for
Windows.
54
3. Results
Most patients were over 50 years of age (65%) with mean age of 59.8 ± 15.5 (range:
30 to 94 years); 72% of the tumors were > 2 cm (pT2 and pT3), and 50% showed a low
proliferation rate (Ki67 ≤ 25%). Twelve cases (24%) overexpressed HER-2 protein (score
3+). During the study, two patients died, one due to unrelated cause and the other due to
cancer. Two patients had BC local recurrence, six presented distant metastasis (one pleura,
one bone, and four lung spread), and in three cases the follow-up was missed. A summary of
the clinical and pathological data is shown in Table 1.
3.1. Transcript expression and clinical histopathological variables
By qRT-PCR, TGFB1 overexpression and downexpression were detected in a similar
number of cases (14 and 11 out of 48 samples, respectively). No statistically difference was
found in TGFB1 mRNA levels between tumor and normal breast tissues (P=0.90, Figure 1A).
TGFBR2 mRNA expression was significantly downregulated in breast tumors compared to
normal breast samples (P=0.013, Figure 1B). Low TGFBR2 transcript levels were detected in
75% of cases (RQ median value = 0.25). Only two cases showed TGFBR2 mRNA
upregulated (RQ=2.59 and RQ=3.51), both with histological grade I, low S-phase fraction,
negative HER-2 status and positive ESR1. It was observed a significant correlation between
TGFB1 and TGFBR2 transcript levels (r=0,724, P<0.0001, data not shown).
The comparison between qRT-PCR and clinical-histopathological data are
summarized in Table 2. TGFB1 transcript levels showed difference marginally significant
between grade III and grade I tumors (P=0.06). In addition, TGFBR2 mRNA expression level
was statistically significant in the comparison with histological groups evaluated (P=0.027).
Grade III tumors showed lower expression levels than those with histological grade I
(P=0.014).
The Ki67 status evaluated by IHQ was compared with TGFB1 transcript levels and it
was detected a statistically significant association (P=0.047). Lower levels of TGFB1 mRNA
were detected in breast tumors with high proliferative index (Ki67>50%) compared to tumors
with low Ki67 status (Ki67<25%, P=0.02). TGFBR2 mRNA levels were also statistically
different in breast tumors with different proliferative index (P=0.02). Similarly to TGFB1, the
most significant difference (P=0.009) was observed in the comparison between TGFBR2
transcript levels and Ki67 < 25% and those with Ki67 > 50%.
55
Tumors in clinical staging III (TNM) showed lower expression levels of TGFB1 and
TGFBR2 mRNA than stage I cases (P=0.03 and P=0.04, respectively). There were no
significant associations between the expression of TGFB1 and TGFBR2 mRNAs with
regional lymph nodes metastasis or local recurrences.
3.2 Protein expression and clinical-histopathological parameters
Analyses of TGFB1 and TGFBR2 protein expression and clinical-pathological
parameters are shown in Table 3. The comparison between TGFB1 and TGFBR2 protein
levels revealed a statistically significant correlation (r=0.51, P=0.005, data not shown).
Nevertheless, none correlation was observed between TGFB1 (r=-0.11, P=0.94) and
TGFBR2 (r=0.29, P=0.057) when it was compared the mRNA and protein levels.
Concordance rate between qRT-PCR and IHC data was 35% (TGFB1) and 61% (TGFBR2).
TGFB1 and TGFBR2 immunostaining exhibited predominantly cytoplasmic and
membranous staining patterns, respectively (Fig 2). TGFB1 and TGFBR2 proteins expression
were detected in 72% (31 out of 43) and 93% (40 out of 43) of the breast tumors,
respectively. Two normal breast samples presented highest level of expression for both
proteins. TGFB1 protein was detected in 21 out of 31 cases (P<0.001) with lower intensity
than adjacent normal samples. TGFBR2 protein expression had no significant difference
between breast carcinomas and adjacent normal breast tissues (P=0.36).
TGFB1 protein expression was inversely associated with ESR1 and PGR positive
tumors (P=0.021 and P=0.0076, respectively). Interestingly, the association of TGFB1
mRNA and protein levels were statistically significant in ESR1 or PGR negative cases
(r=0.59, P=0.007 and r=0.63, P=0.001, respectively, data not shown).
An unexpected association between high TGFB1 score and histological grade III
tumors was observed (P=0.013). Besides, a significant association was found between
TGFB1 protein expression and lymph nodes involvement. It was detected a lower number of
positive lymph nodes in cases presenting TGFB1 score 2 by IHC compared to score 0
(P=0.034) samples. The number of positive lymph nodes was inversely associated with
TGFBR2 scores (P=0.015). Six tumors (6 out of 22) without lymph node involvement
showed both proteins with score 2 by IHC, and in opposition, one case (1 out of 20) with
axillaries metastasis had co-expression pattern. Six patients (14%) presented peritumoral
lymphatic invasion. Interestingly, in all these cases, the tumor cells inside the lymphatic
vessel presented higher intensity of T
βRII than the others cells.
56
Although not statistically significant, it was observed that patients with TGFB1 scores
0 and 1 by IHC presented recurrences (P=0.09). Interestingly, none patient with tumors
expressing TGFB1 protein score 2 developed recurrence during the follow-up. A multivariate
analysis was conducted to evaluate the association between TGFB1 and TGFBR2 protein
expression with local recurrence or distant metastasis adjusted by presence of lymph node
status; histological grade; ESR1, PGR, and HER-2 IHC status; and tumor size. TGFB1
protein level was an independent prognostic factor for distant metastasis or local recurrence
(P=0.043; OR = 0.21; IC
95%
= 0.045 - 0.953). Further comparisons revealed no significant
associations (data not shown). In addition, it was not observed association between TGFB1
and TGFBR2 protein levels with age, proliferative index, TNM stage, tumor size (pT) and
HER-2 status.
3.3 Survival analysis
Univariate analysis demonstrated that no variable could significantly predict disease-
free survival (data not shown). However, it was observed a trend for shorter DFS in cases
with TGFB1 low expression level (P=0.0033, Log-rank test for trend, Figure 3A). In this
basis, patients with TGFB1 score 0 by IHQ presented high risk to develop local recurrence or
distant metastasis (P=0.07, Hazard Ratio =3.9, IC
95%
= 0.88-19.58). TGFB1 was found to be a
significant predictor of worse DFS especially in PGR negative and pN
0
tumors (P=0.0075
and P=0.0096, respectively, Figure 3B-C). TGFBR2 protein expression revealed no
significant associations.
57
4. Discussion
In this study we evaluated the TGFB1 and TGFBR2 expression levels in breast
tumors compared to normal breast tissues by quantitative real-time PCR and
immunohistochemistry. The results showed no correlations between mRNA and protein
expression levels of TGFB1 and TGFBR2 in breast samples. Concordance rate between these
results was 35% for TGFB1 and 61% for TGFBR2. The comparison between IHC and
mRNA expression analysis showed discrepancies already described by other studies (22-25).
Similarly to our results, Soufla et al. reported a negative correlation between TGFB1 mRNA
and protein expression levels [26]. Hypotheses to explain RT-PCR false negative results
could be an insufficient amount of cDNA for reliable amplification, the effect of normal or
inflammatory cells, or the RNA total extraction strategy that may have limited the
amplification of interest transcripts. The discrepancies in the remaining cases, IHC false
negative results, could reflect intratumoral heterogeneity or variation in tumor content
between the tissues either for later mRNA extraction or when fixed and processed for
histological examination [27]. Another possible cause for discrepancies may be due to
varying translation efficiency, post-transcriptional mechanisms involved in gene regulation,
or the speed of degradation of the mRNA and its protein in cancer because the protein
expression is not directly proportional to its mRNA expression [28,29].
We found that TGFBR2 mRNA expression was downregulated in breast tumors in
comparison to normal breast tissues. In addition, the IHC data revealed higher expression
level in normal breast samples for both, TGFB1 and TGFBR2. Similarly, Gobbi et al. showed
reduced TGFBR2 protein expression in breast carcinoma in comparison to normal and benign
breast lesions [30]. Hinshelwood et al. evaluated the TGFBR2 mRNA expression in 18
invasive BCs, 8 BC cell lines and in 4 normal breast tissues by qRT-PCR. They found lower
expression levels in all the BCs and in 88% (7 out of 8) of the BC cell lines analyzed [12].
In the comparison between tumor and paired adjacent breast lesion in each case, we
found a reduced TGFB1 protein expression in tumoral breast cells (P<0.001). However,
TGFBR2 showed no significant differences. More recently, Soufla et al. evaluated the
TGFBR2 mRNA expression in breast tumors by qualitative RT-PCR and found non-
significant differences between BCs and adjacent normal breast tissues [26]. Virtually all
epithelial-derived tumors become resistant to the growth-inhibitory effects of TGF-β during
tumorigenesis [7], therefore, the malignancy could be explained by loss or TGFBR2
downregulation [31]. These results suggest that the tumor adjacent breast tissue could be
58
altered by the tumoral microenvironment and, although considered as normal
histopathologically, could show a different expression profile compared to breast tissues
without malignancies [32].
Our findings regarding the analyses of TGFB1 and TGFBR2 levels and the clinical-
hitopathological characteristics showed the lowest levels of TGFB1 and TGFBR2 transcripts
in tumors with high histological grade. In breast carcinomas, it has been demonstrated a
significant inverse correlation between loss of TGFBR2 protein expression with histological
grade and mitotic counting [30]. However, an unexpected association was observed between
high expression of TGFB1 protein and grade III tumors. A possible explanation for these
findings should be a statistical bias considering that most tumors were ESR1/PGR negative
with histological grade III. To evaluate this hypothesis, a multivariate analysis was performed
to verify the association between histological grade and TGFB1, ESR1, PGR, and HER-2
proteins status. PGR status was the unique variable significantly associated with histological
grade III compared to grade I+II breast tumors (P=0.0009, OR=0.09, CI
95%
=0.02-0.37, data
not shown).
TGFB1 and TGFBR2 were inversely associated with proliferative index (Ki67>50%).
Additionally, our results showed the lowest expression levels of TGFB1 and TGFBR2
mRNAs in stage III tumors. Primary tumors T3 (> 5 cm) presented lower TGFBR2 transcript
levels than breast carcinomas T1 (≤ 2 cm). Previous studies showed low levels of TGFB1
mRNA [26] and TGFBR2 protein expressions [30] in stage III BCs in comparison to initial
stages. In another study, the TGFB1 mRNA expression levels detected by qualitative RT-
PCR were 71%, 69%, 55% e 44% in stages T1, T2, T3, and T4, respectively [33]. In overall,
these data reinforce the role of TGFB1 pathway in inhibit neoplastic cells proliferation during
the tumoral progression [7].
Lymph node metastasis continues to be the most significant predictor of survival in
BC patients [34]. We found that breast tumors expressing the highest levels of TGFB1 or
TGFBR2 proteins presented low number of lymph nodes axillaries involvement. It was
observed that no patient with high TGFB1 protein expression level presented local recurrence
or distant metastasis during follow-up, however, the number of cases was limited to further
conclusions. Nevertheless, when a disease-free survival analysis was carried out, we found an
increased risk of 3.9 times of the patients with low levels of TGFB1 protein expression to
develop local recurrence or distant metastasis. The prognostic impact of this marker was even
stronger when considered PGR negative patients without lymph node dissemination. The
multivariate analysis reinforced these data showing that TGFB1 protein level was an
59
independent prognostic factor for distant metastasis or local recurrences. Conflicting results
regarding the TGFB1 involvement in breast tumor progression has been published. Marrogi
et al. demonstrated that TGFB1 mRNA expression was higher in patients with a favorable
outcome compared to those with poor prognosis [13]. Other studies showed that high
expression of TGFB1 protein was related to unfavorable prognosis [14,15]. In contrast, our
findings are similar to those recently reported by Koumoundourou et al., where low
expression of TGFB1 protein was related to recurrence in T
1-2
N
0
breast tumors [16]. These
data suggest that the TGFB1 could be a prognostic marker, especially in PGR negative
tumors. Additional studies with higher number of patients are necessary to confirm these
findings.
Concerning the relation of TGFB1 expression and ovarian hormones, our study
showed a significant correlation between TGFBR2 mRNA and protein expression levels in
ESR1 or PGR negative breast tumors. In addition, ESR1 or PGR positive tumors showed low
TGFB1 immnostaining. Soufla et al. demonstrated a strong hormonal influence of ESR1 and
PGR on TGF-β mRNA expression, specifically TGFB2 and TGFB3, but not in TGFB1 [26].
Down-expression of ESR1 protein and mRNA was demonstrated 6 hours after treatment of
MCF-7 breast cancer lineage with exogenous TGFB1 in culture [35]. The inhibition of ESR1
with antiestrogens can induce the secretion of TGFB1 in MCF-7 cells [36]. Similarly to our
results, Koumoundourou et al. found a significant inverse association between PGR and
TGFB1 protein expression [16]. We can hypothesize that in hormone responsive breast
carcinomas the TGFB1 down-regulation could be a mechanism developed by the cancer cells
to evade the control of proliferation promoted by TGFB1.
In conclusion, we demonstrated a protective role of TGFB1 expression in human
breast tumors. The patients that presented tumors expressing high levels of TGFB1 protein
showed the longest disease-free survival and the lowest risk to metastasis in lymph nodes. In
addition, high levels of TGFB1 and TGFBR2 mRNA in BC samples were associated to less
aggressive tumors phenotypes. We also showed that TGFBR2 mRNA is significantly
downregulated in human breast cancers. The associations with histological grade,
proliferation index, and tumoral staging suggested that TGFB1 act as a tumor suppressor gene
in breast carcinogenesis. Although the number of cases studied is limited, our data suggest
that TGFB1 may be introduced in clinical practice as a prognostic marker related to disease-
free survival in breast carcinomas.
60
Acknowledgements
The authors thank Mr. Helio Rubens de Carvalho Nunes, from the Research Support Center
of São Paulo State University, for his help in statistical analysis.
61
References
[1] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward,T. Murray, J. Xu, M.J. Thun MJ, Cancer Statistics, 2007,
C.A. Cancer J. Clin. 57 (2007), pp. 43–66.
[2] Ministério da Saúde, Estimativas 2008: Incidência de Câncer no Brasil. INCA (2007).
Available from: <http://www.inca.gov.br/estimativa/2008>.
[3] M.J. Duffy, Predictive markers in breast and other cancers: a review, Clin. Chem. 51 (3)
(2005), pp. 494-503.
[4] K.M. Lee, S.K. Park, N. Hamajima, K. Tajima, K.Y. Yoo, A. Shin et al., Genetic
polymorphisms of TGF-beta1 & TNF-beta and breast cancer risk, Breast Cancer Res. Treat.
90 (2005), pp. 149-155.
[5] G.J. Prud’homme, Pathobiology of transforming growth factor beta in cancer, fibrosis and
immunologic disease, and therapeutic considerations, Lab. Invest. 87 (2007), pp. 1077-1091.
[6] M.H. Barcellos-Hoff, K.B. Ewan, Transforming growth factor-beta and breast cancer:
Mammary gland development, Breast Cancer Res. 2 (2000), pp. 92-99.
[7] R.L. Elliott,G.C. Blobe, Role of transforming growth factor Beta in human cancer, J.
Clin. Oncol. 23 (2005), pp. 2078-2093.
[8] M. Reiss, M.H. Barcellos-Hoff, Transforming growth factor-beta in breast cancer: a
working hypothesis, Breast Cancer Res. Treat. 45 (1997), pp. 81-95.
[9] K.B. Ewan, H.A. Oketch-Rabah, S.A. Ravani, G. Shyamala, H.L. Moses, M.H. Barcellos-
Hoff, Proliferation of Estrogen Receptor-α-Positive Mammary Epithelial Cells Is Restrained
by Transforming Growth Factor-β1 in Adult Mice, Am. J. Pathol. 167 (2005), pp. 409–417.
[10] S.K. Leivonen, V.M. Kahari, Transforming growth factor-b signaling in cancer invasion
and metastasis, Int. J. Cancer 121 (2007), pp. 2119–2124.
[11] H. Gobbi, W.D. Dupont, J.F. Simpson, W.D. Plummer Jr, P.A. Schuyler, S.J. Olson,
C.L. Arteaga, D.L. Page, Transforming Growth Factor-β and Breast Cancer Risk in Women
With Mammary Epithelial Hyperplasia, J. Natl. Cancer Inst. 91 (1999), pp. 2096–2101.
[12] R.A. Hinshelwood, L.I. Huschtscha, J. Melki, C. Stirzaker, A. Abdipranoto, B. Vissel et
al., Concordant Epigenetic Silencing of Transforming Growth Factor-B Signaling Pathway
Genes Occurs Early in Breast Carcinogenesis, Cancer Res. 67 (2007), pp. 11517-11527.
[13] A.J. Marrogi, A. Munshi, A.J. Merogi, Y. Ohadike, A. El-Habashi, O.L. Marrogi et al.,
Study of tumor infiltrating lymphocytes and transforming growth factor-β as prognostic
factors in breast carcinoma, Int. J. Cancer 74 (1997), pp. 492–501.
62
[14] S.M. Gorsch, V.A. Memoli, T.A. Stukel, L.I. Gold, B.A. Arrick, Immunohistochemical
staining for transforming growth factor beta 1 associates with disease progression in human
breast cancer, Cancer Res. 52 (1992), pp. 6949-6952.
[15] S. Desruisseau, J. Palmari, C. Giusti, S. Romain, P.M. Martin, Y. Berthois,
Determination of TGFb1 protein level in human primary breast cancers and its relationship
with survival, Br. J. Cancer 94 (2006), pp. 239-246.
[16] D. Koumoundourou, T. Kassimatis , V. Zolota , E. Tzorakoeleftherakis, P. Ravazoula,
V. Vassiliou, Prognostic significance of TGFbeta-1 and pSmad2/3 in breast cancer patients
with T1-2,N0 tumours, Anticancer Res. 27 (2007), pp. 2613-2620.
[17] WHO World Health Organization: International of Diseases for Oncology (2nd ed.),
World Health Organization, Geneva (1990).
[18] L.H. Sobin and C. Wittekind, UICC TNM classification of malignant tumors (6th ed.),
Wiley-Liss, New York (2002).
[19] M.J.C. Bloom, W.W. Richardson, Histologic grading and prognosis in breast cancer: a
study of 1709 cases, Br. J. Cancer 11 (1957), pp. 358−377.
[20] M.W. Pfaffl, A new mathematical model fro relative quantification in real-time RT-
PCR, Nucleic Acids Res. 29 (2001), pp. e45.
[21] W. Weikel, T. Beck, M. Mitze, P.G. Knapstein, Immunohistochemical evaluation of
growth fractions in human breast cancers using monoclonal antibody Ki-67, Breast Cancer
Res. Treat. 18 (1991), pp. 149−154.
[22] P de Cremoux, C Tran-Perennou, C Elie, E Boudou, C Barbaroux, M.F. Poupon et al.,
Quantitation of estradiol receptors alpha and beta and progesterone receptors in human breast
tumors by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction. Correlation with protein
assays, Biochem. Pharmacol. 64 (2002), pp. 507-515.
[23] K Jarzabek,, M. Koda, L. Kozlowski, H. Mittre, S. Sulkowski, M.L. Kottler et al.,
Distinct mRNA, protein expression patterns and distribution of oestrogen receptors alpha and
beta in human primary breast cancer: correlation with proliferation marker Ki-67 and
clinicopathological factors, Eur. J. Cancer 41 (2005), pp. 2924-2934.
[24] M. Labuhn, V. Vuaroqueaux, F. Fina, A. Schaller, I. Nanni-Metellus, W. Kung et al.,
Simultaneous quantitative detection of relevant biomarkers in breast cancer by quantitative
real-time PCR, Int. J. Biol. Markers 21 (2006), pp. 30-39.
[25] F.E. Rosa, J.R. Caldeira, J. Felipes, F.B. Bertonha, F.C. Quevedo, M.A. Domingues et
al., Evaluation of estrogen receptor alpha and beta and progesterone receptor expression and
63
correlation with clinicopathologic factors and proliferative marker Ki-67 in breast cancers,
Hum. Pathol. 2008 (Epub ahead of print).
[26] G. Soufla, F. Porichisa, G. Sourvinosa, S. Vassilarosb, D.A. Spandidosa, Transcriptional
deregulation of VEGF, FGF2, TGF-b1, 2, 3 and cognate receptors in breast tumorigenesis,
Cancer Lett. 235 (2006), pp. 100–113.
[27] J.A. Shaw, K. Udokang, J.M. Mosquera, H. Chauhan, J.L. Jones, R.A. Walker,.,
Oestrogen receptors alpha and beta differ in normal human breast and breast carcinomas, J.
Pathol. 198 (2002), pp. 450−457.
[28] Y. Omoto, S. Kobayashi, S. Inoue, S. Ogawa, T. Toyama, H. Yamashita et al.,
Evaluation of oestrogen receptor beta wild-type and variant protein expression, and
relationship with clinicopathological factors in breast cancers, Eur. J. Cancer 38 (2002), pp.
380−386.
[29] R. Brockmann, A. Beyer, J.J Heinisch, T. Wilhelm, Posttranscriptional Expression
Regulation: What Determines Translation Rates?, PLoS Comput. Biol. 3 (2007), pp. e57.
[30] H. Gobbi, C.L. Arteaga, R.A. Jensen, J.F. Simpson, W.D. Dupont, S.J. Olson et al.,
Loss of expression of transforming growth factor beta type II receptor correlates with high
tumour grade in human breast in-situ and invasive carcinomas, Histopathology 36 (2000), pp.
168-177.
[31] S.B. Jakowlew, Transforming growth factor-β in cancer and metastasis, Cancer
Metastasis Rev. 25 (2006), pp. 435–457.
[32] A. Tripathi, C. King, A. de la Morenas, V.K. Perry, B. Burke, G.A. Antoine et al., Gene
expression abnormalities in histologically normal breast epithelium of breast cancer patients,
Int. J. Cancer 122 (2008), pp. 1557-1566.
[33] K.D. Amoils, W.R. Bezwoda, TGF-b1 mRNA expression in clinical breast cancer and
its relationship to ER mRNA expression, Breast Cancer Res. Treat. 42 (1997), pp. 95-101.
[34] M. Cianfrocca, L.J. Goldstein, Prognostic and Predictive Factors in Early-Stage Breast
Cancer, Oncologist 9 (2004), pp. 606-616.
[35] A. Stoica, M. Saceda, A. Fakhro, H.B. Solomon, B.D. Fenster, M.B. Martin, The Role of
Transforming Growth Factor-b in the Regulation of Estrogen Receptor Expression in the
MCF-7 Breast Cancer Cell Line, Endocrinol. 138 (1997), pp. 1498–1505.
[36] C. Knabbe, G. Zugmaier, M. Schmahl, M. Dietel, M.E. Lippman, R.B. Dickson,
Induction of transforming growth factor β by the antiestrogens droloxifene, tamoxifen, and
toremifene in MCF-7 cells, Am. J. Clin. Oncol. 14 (Suppl. 2) (1991), pp. S15-20.
64
Fig.1. TGFB1 and TGFBR2 expression levels in breast tumors compared with normal breast
tissues.
65
Fig 2. A-B. Normal mammary glands showing epithelial cells stained for TGFBR2 (A) and
TGFB1 (B). It is observed a cytoplasmic and predominantly membranous immunoreactivity
(score 2). Immunohistochemical staining for TGFBR2 (C and E) and TGFB1 (D and F) in
ductal breast carcinomas. C – D: score 0; E-F: score 2.
66
Fig.3. Disease-free survival analysis. P-values were determined performing the log-rank test.
A- DFS analysis according to TGFB1 expression in all tumors (scores 0 versus 1 versus 2)
(P=0.033). B- DFS analysis according to TGFB1 expression in PGR negative tumors (scores
0 versus 1 and 2) (P=0.0075). C- DFS analysis according to TGFB1 expression in pN
0
tumors (scores 0 versus 1 and 2) (P=0.0096).
67
Table 1. Clinical-pathological characteristics of the ductal breast cancer patients.
Variables N (%)
Age (years)
Median (range) 56 (30-94)
≤50
17 35
>50 32 65
Histological grade
I 9 18
II 14 29
III 26 53
Receptor status (IHC)
ESR1
negative 20 41
positive 29 59
PGR
negative 23 47
positive 26 53
HER-2
0 30 61
1+ 3 6
2+ 4 8
3+ 12 24
Proliferative index (Ki67 status)
Low (≤25%)
18 37
High (>25%) 23 47
Non-reactive 8 16
Primary tumor size
pT
1
8 16
pT
2
36 74
pT
3
4 8
Unknown 1 2
Regional lymph node status
pN
0
25 51
pN
1
13 27
pN
2
7 14
pN
3
4 8
Adjuvant chemotherapy
No 8 16
Yes 41 84
Adjuvant radiotherapy
No 13 27
Yes 36 73
Adjuvant tamoxifen therapy
No 17 35
Yes 32 65
IHC: immunohistochemistry, ESR1: estrogen receptor alfa, PGR: progesterone receptor.
68
Table 2. TGFB1 and TGFBR2 mRNAs expression levels according to clinical-pathological features.
TGFB1 TGFBR2
Variables N
mRNA expression levels
a
P mRNA expression levels
a
P
Histological grade
*
I 8 1.85 (0.79-35.92) P1/2 0.473 0.69 (0.07-3.50) P1/2
0.161
II 14 1.13 (0.28-10.77) P1/3 0.064 0.32 (0.02-1.18) P1/3
0.014
III 26 0.77 (0.05-7.78) P2/3 0.262 0.17 (0.009-1.77) P2/3
0.136
Proliferative index (Ki67 status)
<25% 16 1.36 (0.57-35.92) P1/2 0.787 0.36 (0.08-3.50) P1/2
0.10
25-50 16 1.48 (0.39-10.77) P1/3
0.015
0.26 (0.02-1.18) P1/3
0.009
>50 8 0.62 (0.05-2.92) P2/3 0.051 0.07 (0.009-1.77) P2/3
0.061
Non-reactive 8 0.86 (0.14-2.12) 0.12 (0.01-1.56)
TNM stage
I 6 0.90 (0.45-2.92) P1/2 0.424 0.39 (0.06-1.77) P1/2
0.546
II 33 1.23 (0.05-35.92) P1/3 0.223 0.26 (0.009-3.50) P1/3
0.113
III 9 0.66 (0.20-2.35) P2/3
0.031
0.14 (0.01-0.30) P2/3
0.043
Primary tumor size
pT
1
8 1.01 (0.45-2.92) P1/2 0,839 0.40 (0.06-1.77) P1/2
0,254
pT
2
35 1.08 (0.05-35.92) P1/3 0.367 0.21 (0.009-3.50) P1/3
0.048
pT
3
4 0.58 (0.39-3.51) P2/3 0.532 0.10 (0.02-0.26) P2/3
0.132
Lymph nodes involvement
No 24 1.17 (0.14-10.77) 0.2731
0.28 (0.02-3.50) 0.572
Yes 23 0.99 (0.05-35.92) 0.19 (0.009-2.58)
Distant metastasis / local recurrence
No 40 1.02 (0.14-10.77) 0.989 0.25 (0.01-3.50) 0.922
Yes 8 1.15 (0.05-35.92) 0.22 (0.009-2.58)
a
Data are presented as median values. In parenthesis are shown the minimum and maximum values.
* Comparison between two of three parameters (Mann Withney test).
69
Table 3. Association between tumor expression of TGFB1 and TGFBR2 proteins revealed by immunohistochemistry assay and clinical features.
TGFB1
IHC score
TGFBR2
IHC score
N
0 1+ 2+
P* N
0 1+ 2+
P*
Estrogen receptor
0,021
0,909
Negative 19 3 8 8 19 2 9 8
Positive 24 13 8 3 23 3 9 11
Progesterone receptor
0,007
0,912
Negative 22 5 7 10 22 2 10 10
Positive 21 11 9 1 20 3 8 9
Histological grade
0,013
0,795
I 8 5 2 1 8 2 3 3
II 13 5 8 0 12 1 6 5
III 22 6 6 10 22 2 9 11
Lymph nodes involvement
0,034
0,427
No 20 6 5 9 20 3 6 11
Yes 22 10 10 2 21 2 11 8
Regional lymph node status
0,486
0,005
pN1 12 5 6 1 11 0 4 7
pN2 7 2 4 1 7 0 6 1
pN3 3 3 0 0 3 2 1 0
Distant metastasis / local recurrence
0,099 0,298
No 36 11 14 11 35 5 13 17
Yes 7 5 2 0 7 0 5 2
* Fisher exact test.
70
71
72
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
