Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO
“DELINEAMENTO DE PROTOCOLO EXPERIMENTAL PARA
INVESTIGAÇÃO DA EFICÁCIA TERAPÊUTICA DE ATIVOS DE
Physalis angulata e Eclipta alba NA PREVENÇÃO E/OU CONTROLE
DE EIMERIOSE AVIÁRIA”
LUCIMARA CRISTIANE TOSO BERTOLINI
RIBEIRÃO PRETO-SP
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
LUCIMARA CRISTIANE TOSO BERTOLINI
“INVESTIGAÇÃO DA EFICÁCIA TERAPÊUTICA DE
ATIVOS DE Physalis angulata e Eclipta alba
NA PREVENÇÃO E/ OU CONTROLE DE
EIMERIOSE AVIÁRIA”
UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO
CURSO DE MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
Dissertação de Mestrado apresentada ao
programa de Pós-Graduação da
Universidade de Ribeirão Preto, como
parte dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Biotecnologia
Aplicada à Saúde.
Orientadora: Profª. Drª. Suzelei de Castro França
RIBEIRÃO PRETO-SP
2007
ads:
Ficha catalográfica preparada pelo Centro de Processamento Técnico da
Biblioteca Central da UNAERP
- Universidade de Ribeirão Preto –
Bertolini, Lucimara Cristiane Toso, 1968-
B546d Delineamento de protocolo experimental para
investigação da eficácia terapêutica de ativos de physalis
angulata e eclipta alba na prevenção e/ou controle de
eimeriose aviária / Lucimara Cristiane Toso Bertolini. - -
Ribeirão Preto, 2007.
124 f. : il. color.
Orientador: Profa. Dra. Suzelei de Castro França.
Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-Graduação
em Biotecnologia da Universidade de Ribeirão Preto,
UNAERP, Odontologia, área de concentração:
Biotecnologia Aplicada à Saúde. Ribeirão Preto, 2007.
1. Eimeriose Aviária. 2. Physalis angulata. 3. Eclipta alba. 4.
Biotecnolo
g
ia Ambiental. I. Título.
Não paute sua vida, nem sua carreira, pelo dinheiro.
Ame seu ofício com todo o coração.
Persiga fazer o melhor.
Seja fascinado pelo realizar, que o dinheiro virá como conseqüência.
Quem pensa só em dinheiro não consegue
sequer ser um grande bandido, nem um grande canalha.
Napoleão não invadiu a Europa por dinheiro.
Hitler não matou 6 milhões de judeus por dinheiro.
Michelangelo não passou 16 anos pintando a Capela Sistina por dinheiro.
E, geralmente, os que só pensam nele não o ganham porque são incapazes de sonhar.
E tudo que fica pronto na vida foi construído antes, na alma.
NIZAN GUANAES
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
A DEUS que nos ORIENTA todos os dias de nossas vidas.
A JESUS que é nosso anjo guardião.
À Prof. Dra. Suzelei de Castro França, minha mentora, que aceitou o grande
desafio de orientar um projeto de enorme diversidade e abrangência. Pelo apoio
constante, orientação científica primorosa, sempre pautada na ética, respeito e,
principalmente, carinho. Gostaria de homenagear esta incrível MULHER pela sua
delicadeza, grandeza de caráter e imensa paciência com todos os seus discípulos,
sejam estes alunos, colaboradores ou docentes.
Ao meu esposo e mestre, Wagner L.H.M. Bertolini, que não só me apoiou em
mais uma grande etapa de minha vida, como também é responsável pela revisão deste
trabalho. Por sua imensa paciência e carinho em todos os momentos destes dois anos
de muito trabalho e dedicação.
Aos meus Pais por permitirem meu crescimento pessoal e vocação intelectual.
Por sua importante orientação e apoio em todas as etapas de minha vida, principalmente onde
as escolhas e decisões podiam significar mudanças radicais, sempre ao meu lado me dando
autonomia e confiança para trilhar o caminho escolhido.
Agradecimentos
Agradeço ao apoio e a colaboração técnica de competentes profissionais de
áreas correlatas, que auxiliaram em várias etapas, de forma a possibilitar a execução de cada
tarefa neste projeto, sem os quais seria impossível a execução desta pesquisa:
Drª. Ellen Fukayama (Veterinária/ FCAV-UNESP)
Milenni Michels (Veterinária/ OURO FINO SAÚDE ANIMAL)
Daniela Miyasaka (Veterinária/ OURO FINO SAÚDE ANIMAL)
Dr. Rafael Neme (Zootecnista)
Silvia Barioni Toma (Farmacêutica)
Ricardo Assman (Engenheiro/ OURO FINO SAÚDE ANIMAL)
Frederico Castro (Administrador/ FEA-USP)
Daniela Jacoveto (Farmacêutica/ OURO FINO SAÚDE ANIMAL)
Ao CPPAR-UNESP-Jaboticabal que permitiu a utilização das instalações e
auxiliou durante os experimentos nas dependências do aviário.
Aos técnicos do Departamento de Biotecnologia da UNAERP, Sara e
Wellington, que me auxiliaram no laboratório de.fitoquímica.
A todos os excelentes professores doutores que fazem parte do grupo de
Mestrado em Biotecnologia da UNAERP, fundamentais para que pudéssemos cruzar mais
uma barreira: a do conhecimento.
A todos os meus colegas de mestrado que em dois anos foram capazes de deixar muitas
marcas e muitas saudades....
Agradecimentos
À OURO FINO SAÚDE ANIMAL, que estimulou e apoiou meu
aperfeiçoamento técnico e também foi responsável pelo aporte financeiro de parte do projeto
de pesquisa.
Especialmente aos Diretores da Empresa OURO FINO SAÚDE ANIMAL,
Dolivar Coraucci Neto, Jardel Massari e Norival Bonamichi, homens empreendedores,
competentes e com uma grande visão de futuro, particularmente responsáveis por mais esta
conquista em minha vida. Agradeço pelo estimulo ao meu engrandecimento intelectual.
Sumário
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................
página
I
LISTA DE TABELAS................................................................................................ V
LISTA DE QUADROS............................................................................................... VI
LISTA DE ESQUEMAS............................................................................................. VI
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................... VII
RESUMO.................................................................................................................... IX
SUMMARY................................................................................................................. XI
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1
1.1. Panorama geral da eimeriose aviária.................................................................... 1
1.2. A Enfermidade: Eimeriose Aviária...................................................................... 4
1.2.1. Taxonomia e Etiologia ..................................................................................... 4
1.2.2. Características dos oocistos de Eimeria spp...................................................... 6
1.2.3. Caracterização de oocistos de Eimeria tenella.................................................. 7
1.2.4. Ciclo de Vida Completo.................................................................................... 8
1.2.5. Patogenia e Imunidade...................................................................................... 10
1.2.6. Modos de prevenção e controle da eimeriose aviária....................................... 11
1.3. Promotores de crescimento e a resistência microbiana........................................ 13
1.4. Alternativas terapêuticas para Eimeriose Aviária................................................ 14
1.5. As plantas medicinais........................................................................................... 16
1.5.1. Fontes potenciais de novas drogas.................................................................... 16
1.5.2. Revisão de Plantas medicinais estudadas em coccidiose aviária...................... 17
1.5.4. Importância das técnicas de análise dos extratos vegetais................................ 22
1.5.5. Plantas medicinais escolhidas para o experimento............................................ 23
1.5.5.1. Physalis angulata – família Solanaceae......................................................... 23
1.5.5.1.1. Descrição Botânica...................................................................................... 23
1.5.3.1.2. Indicação Farmacológica............................................................................. 24
1.5.5.2 Eclipta Alba - família Asteraceae.................................................................... 25
1.5.5.2.1.Descrição Botânica....................................................................................... 25
Sumário
1.5.5.2.2. Indicação Farmacológica............................................................................ 26
1.5.6. Aspectos gerais para avaliar novas drogas ou terapêuticas coccidianas........... 27
2. OBJETIVOS............................................................................................................ 32
2.1. Objetivo geral....................................................................................................... 32
2.2. Objetivos Específicos........................................................................................... 32
3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................... 33
3.1. Delineamento geral dos experimentos................................................................. 33
3.2. Materiais vegetais................................................................................................. 34
3.2.1. Physalis angulata.............................................................................................. 34
3.2.1.1. Preparo extrato bruto de Physalis................................................................... 34
3.2.1.2. Filtração em sílica sob vácuo.......................................................................... 34
3.2.1.3. Análises das frações....................................................................................... 37
3.2.1.4. Preparo da fração de fisalinas para mistura na ração.....................................
38
3.2.2. Eclipta Alba.......................................................................................................
39
3.2.2.1. Preparo do extrato bruto.................................................................................
39
3.2.2.2. Partição líquido-líquido..................................................................................
39
3.2.2.3. Preparo da fração de cumestanos para mistura na ração................................
40
3.2.2.4. Preparo das frações de Eclipta alba...............................................................
41
3.2.2.5. Análise da fração de Eclipta alba..................................................................
42
3.3. Pré-teste................................................................................................................
42
3.3.1. Descrição geral..................................................................................................
42
3.3.2. Obtenção dos oocistos empregados na infecção experimental..........................
43
3.3.3. Preparo do inóculo de E. tenella para pré-teste.................................................
44
3.4. Experimento Padrão.............................................................................................
45
3.4.1. Descrição geral do experimento........................................................................
45
3.4.2. Alojamento e manejo das aves para os experimentos.......................................
46
3.4.3. Técnica de preparo do inóculo para infecção experimental..............................
49
3.4.4. Forma de administração dos fitocomplexos......................................................
50
Sumário
3.4.5. Droga padrão utilizada como referência no experimento.................................
50
3.4.6. Obtenção e vacinação das aves para os experimentos......................................
50
3.4.7. Preparo das rações básicas para os experimentos.............................................
51
3.4.8. Preparo de rações medicadas............................................................................
54
3.5. Avaliações de parâmetros clínicos e dos índices zootécnicos..............................
54
3.5.1. Determinação do escore de lesão no ceco das aves...........................................
54
3.5.2. Detecção e contagem de oocistos nas fezes.......................................................
55
3.5.2.1.Descrição da técnica adaptada para a contagem de oocistos nas fezes...........
56
3.5.3. Determinação da taxa de conversão alimentar..................................................
57
3.5.4. Determinação da Mortalidade das aves.............................................................
57
4. RESULTADOS....................................................................................................... 58
4.1. Material Vegetal................................................................................................... 58
4.1.1. Physalis angulata.............................................................................................. 58
4.1.1.1. Rendimento e Análise das frações................................................................. 58
4.1.2. Eclipta Alba....................................................................................................... 62
4.1.2.1. Rendimento e Análise química dos extratos e frações................................... 62
4.2. Pré-teste................................................................................................................ 64
4.2.1. Determinação da mortalidade das aves inoculadas........................................... 65
4.2.2. Avaliação macroscópica dos cecos das aves inoculadas................................... 65
4.2.2.1.Determinação do Escore de Lesão Intestinal................................................... 66
4.3. Experimento padrão.............................................................................................. 74
4.3.1. Parâmetros avaliados no experimento............................................................... 74
4.3.1.1. Controle de Temperatura e Umidade do Aviário........................................... 74
4.3.1.2. Controle de Mortalidade................................................................................. 75
4.3.1.3. Resultados da contagem de oocistos nas fezes.............................................. 79
4.4. Avaliação macroscópica dos cecos das aves infectadas....................................... 83
4.4.1. Determinação do escore de lesão no ceco das aves no 21º dia de vida............. 84
4.4.1.1. Escore de lesão no ceco das aves dos grupos controle................................... 84
4.4.1.2. Escore de lesão intestinal das Aves medicadas com Physalis
angulata...................................................................................................................... 87
Sumário
4.4.1.3. Escore de lesão intestinal das Aves medicadas com Eclipta
alba.............................................................................................................................
89
4.4.2. Determinação do escore de lesão intestinal no 42º dia de
vida............................................................................................................................. 91
4.4.2.1. Escore de lesão intestinal dos Grupos Controle não
inoculados................................................................................................................... 91
4.4.2.2. Escore de lesão intestinal dos Grupos Controle
Infectados.................................................................................................................... 92
4.4.2.3. Escore de lesão intestinal das Aves medicadas com Physalis
angulata...................................................................................................................... 94
4.4.2.4. Escore de lesão intestinal das Aves medicadas com Eclipta
alba............................................................................................................................. 96
5. DISCUSSÃO.......................................................................................................... 98
6. CONCLUSÃO........................................................................................................ 108
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………… 109
8. ANEXOS................................................................................................................. 118
Lista de Figuras
I
LISTA DE FIGURAS
página
Figura 1: Representação de oocistos: (A) oocisto não esporulado de Eimeria spp e
(B) oocisto esporulado de Eimeria spp....................................................................... 5
Figura 2: Organelas e estrutura citoplasmática de oocisto de Eimeria spp............... 6
Figura 3: Oocisto de Eimeria tenella não esporulado (A) e esporulado (B)............. 7
Figura 4: Vilosidades intestinais do ceco infectado por Eimeria tenella.................. 8
Figura 5: Fases intermediárias do ciclo de vida. A: merozoítos; B: esquizontes;
C: micro e macrogametas de E. tenella...................................................................... 9
Figura 6: Ciclo de vida completo com todas as etapas e fases. Fase endógena (A)
e fase exógena no meio ambiente (B)........................................................................ 10
Figura 7: Características físicas e patológicas das diferentes espécies de Eimeria
spp.............................................................................................................................. 11
Figura 8: Origanum vulgaris.................................................................................... 19
Figura 9: fotos da Physalis angulata L...................................................................... 23
Figura 10: fotos da Eclipta alba................................................................................ 26
Figura 11: Fotos características da infecção por E. tenella no intestino de aves...... 30
Figura 12: Imagens dos cecos das aves infectadas por E. tenella. Determinação do
escore para lesão (+1 a +4) de acordo com grau de diferenciação do tecido,
presença de hemorragia e/ou coágulos sanguíneos.................................................... 31
Figura 13: Diagrama resumido das etapas do processo de obtenção dos extratos
brutos da planta medicinal Physalis angulata.e das frações purificadas ricas em
fisalinas....................................................................................................................... 36
Figura 14: Fórmulas estruturais das principais fisalinas obtidas no fracionamento.
Em destaque, na estrutura da esquerda, as posições 5 e 6 na estrutura molecular
das fisalinas................................................................................................................ 37
Figura 15: Estrutura química da wedelolactona (A) e da demetilwedelolactona (B) 40
Figura 16: Diagrama resumido das etapas do processo de obtenção dos extratos
orgânicos e das frações purificadas da planta medicinal Eclipta alba....................... 41
Figura 17: Vista de um dos boxes empregados no experimento no aviário do
CPPAR, onde foi realizado o experimento. Ao fundo, destaque para as cortinas
azuis que foram empregadas para auxiliar no controle da temperatura interna......... 42
Lista de Figuras
II
Figura 18: Foto de uma placa cromatográfica de camada delgada (etapa A)
Filtração do extrato bruto de Physalis angulata. (*) Frações ricas em fisalinas........
58
Figura 19: Análise gráfica de distribuição das frações obtidas nas filtrações de
extrato bruto clorofórmico de acordo com os tipos de eluentes empregados............. 60
Figura 20: Perfil cromatográfico obtido na análise por CLAE da fração F5R (A) e
as varreduras dos picos majoritários do detector de arranjo por diiodos (B e C)....... 61
Figura 21: Perfil cromatográfico (CLAE) para fração acetato de etila rica em
cumestanos e utilizada no experimento. Os picos majoritários são referentes à
demetilwedelolactona e wedelolactona, respectivamente.......................................... 62
Figura 22: Perfil cromatográfico (CLAE) para wedelolactona (padrão
secundário). Tempo de retenção 32,1. Coluna fase reversa C18. Fase móvel:
gradiente metanol: H
2
O (57:43) por 20 minutos e 5 minutos com metanol puro....... 63
Figura 23: Perfil cromatográfico (CLAE) para demetilwedelolactona (padrão
secundário). Tempo de retenção 28,5. Coluna fase reversa C18. Fase móvel:
gradiente metanol: H
2
O (57:43) por 20 minutos e 5 minutos com metanol puro....... 64
Figura 24: Avaliação macroscópica do ceco de aves no pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupo controle negativo) T2: animais inoculados
com cepa H na quantidade de 10.000 oocistos por ave.............................................. 66
Figura 25: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: animais não inoculados (grupo controle negativo).
T3: animais inoculados com cepa MD na quantidade de 10.000 oocistos por ave.... 67
Figura 26: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupos controle negativo).
T4: animais inoculados com cepa H na quantidade de 20.000 oocistos por ave........ 68
Figura 27: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupo controle negativo).
T5: animais inoculados com cepa MD na quantidade de 20.000 oocistos por ave.... 69
Figura 28: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupos controle negativo).
T6: animais inoculados com cepa H na quantidade de 50.000 oocistos por ave....... 70
Figura 29: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupos controle negativo).
T7: animais inoculados com cepa MD na quantidade de 50.000 oocistos por ave.... 71
Figura 30: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupo controle negativo).
T8: animais inoculados com cepa H na quantidade de 100.000 oocistos por ave...... 72
Figura 31: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupo controle negativo).
T9: animais inoculados com cepa MD na quantidade 100.000 oocistos por ave....... 73
Lista de Figuras
III
Figura 32: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T1).
Grupos T1: controles não tratados. Onde: A: T1R1; B: T1R2 e C: T1R3.................
84
Figura 33: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T2).
Grupos T2: controles não tratados e infectados. Onde: A: T2R1; B: T2R2 e
C: T2R3...................................................................................................................... 85
Figura 34: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T3).
Grupos T3: controles com droga referência. Onde: A: T3R1; B: T3R2 e C: T3R3... 85
Figura 35: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T4).
Grupos T4: controles salinomicina e infectados. Onde: A: T4R1; B: T4R2 e
C: T4R3....................................................................................................................... 86
Figura 36: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T5).
Grupos T5: Physalis 40 ppm. Onde: A: T5R1; B: T5R2 e C: T5R3.......................... 87
Figura 37: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T6).
Grupos T6: Physalis 80 ppm. Onde: A: T6R1; B: T6R2 e C: T6R3.......................... 87
Figura 38: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T7).
Grupos T7: Physalis 120 ppm.Onde: A: T7R1; B: T7R2 e C: T7R3......................... 88
Figura 39: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T8).
Grupos T8: Eclipta 40 ppm. Onde: A: T8R1; B: T8R2 e C: T8R3............................ 89
Figura 40: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T9).
Grupos T9: Eclipta 80 ppm. Onde: A: T9R1; B: T9R2 e C: T9R3............................ 89
Figura 41: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T10).
Grupos T10: Eclipta 120 ppm. Onde: A: T10R1; B: T10R2 e C: T10R3.................. 90
Figura 42: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T1).
Grupos T1: controle não tratado. Onde: A: T1R1; B: T1R2 e C: T1R3.................... 91
Figura 43: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T3).
Grupo T3: controle droga referência. Onde: A: T3R1; B: T3R2 e C: T3R3.............. 92
Figura 44: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T2).
Grupos T2: controle não tratado. Onde: A: T2R1; B: T2R2 e C: T2R3.................... 92
Figura 45: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T4).
Grupos T4: controle droga referência. Onde: A: T4R1; B: T4R2 e C: T4R3............
93
Figura 46: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T5). Grupos T5: Physalis
40 ppm. Onde: A: T5R1; B: T5R2 e C: T5R3............................................................ 94
Figura 47: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T6).
Grupos T6: Physalis 80 ppm. Onde: A: T6R1; B: T6R2 e C: T6R3.......................... 94
Lista de Figuras
IV
Figura 48: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T7).
Grupos T7: Physalis 120 ppm. Onde: A: T7R1; B: T7R2 e C: T7R3........................
95
Figura 49: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T8).
Grupos T8: Eclipta 40 ppm. Onde: A: T8R1; B: T8R2 e C: T8R3............................ 96
Figura 50: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T9).
Grupos T9 Eclipta 80 ppm. Onde: A: T9R1; B: T9R2 e C: T9R3............................. 96
Figura 51: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T10).
Grupos T10: Eclipta 120 ppm. Onde: A: T10R1; B: T10R2 e C: T10R3.................. 97
Lista de Tabelas
V
LISTA DE TABELAS
página
Tabela 1: Descrição dos solventes empregados na filtração do extrato bruto
orgânico das partes aéreas de Physalis angulata
35
Tabela 2: Classificação ou determinação do escore em função da lesão e da
presença de determinados fatores na mucosa intestinal e/ou nas fezes das aves
55
Tabela 3: Solventes e rendimentos obtidos das frações de Physalis angulata no
processo de filtração em sílica sob vácuo
59
Tabela 4: Temperatura e umidade relativa máxima e mínima registrada
semanalmente
74
Tabela 5: Percentual de frangos mortos durante todo o experimento (replicatas)
75
Tabela 6: Parâmetros zootécnicos das aves durante período de criação de 1 a 14
dias, em função dos tratamentos de cada grupo. Consumo Médio de Ração (CR),
Ganho Médio de Peso (GP) e Média da Conversão Alimentar (CA)
76
Tabela 7: Parâmetros zootécnicos das aves medidos na fase de 1 a 21 dias de
idade, em função dos tratamentos de cada grupo. Consumo Médio de Ração (CR),
Ganho Médio de Peso (GP) e Média da Conversão Alimentar (CA)
77
Tabela 8: Parâmetros zootécnicos das aves durante toda fase experimental, ou
seja, de 1 a 42 dias de vida. Consumo Médio de Ração (CR), Ganho Médio de
Peso (GP) e Média de Conversão Alimentar (CA)
78
Tabela 9: Contagem total de oocistos nas fezes coletadas de forma randômica nos
boxes, realizada no 21º dia de vida, ou seja, após período pré-patente de 138 horas.
80
Tabela 10 Contagem total de oocistos coletados aleatoriamente nas fezes realizada
no 28º dia de vida, ou seja, após sete dias da primeira contagem
82
Lista de Quadros e Esquemas
VI
LISTA DE QUADROS
página
Quadro 1: Descrição dos grupos, linhagens das cepas de Eimeria e da
quantidade de inóculo utilizado no pré-teste
43
Quadro 2: Grupos e tipos de tratamentos do experimento padrão
48
Quadro 3: Composição das dietas experimentais
52
Quadro 4: Composição calculada das dietas experimentais
53
Quadro 5: Descrição detalhada das mortes ou motivo para retirada das aves
75
LISTA DE ESQUEMAS
página
Esquema 1: Preparo das suspensões aquosas com diferentes concentrações
de inóculo para pré-teste
45
Esquema 2: Distribuição dos grupos de tratamento (T) e replicatas (R) no
galpão experimental utilizado, dispostos aleatoriamente
47
Esquema 3: Preparo do inóculo para experimento padrão
49
Lista de Abreviaturas
VII
LISTA DE ABREVIATURAS
°C Temperatura relativa, em grau Celsius
Alt Altitude
APC Antibióticos promotores de crescimento
APINCO Associação Brasileira dos Produtores de pinto de corte
C&T Ciência e Tecnologia
CCD Cromatografia em camada delgada
CE Comunidade Européia
CEI Comunidade de Estados Independentes
CGEN Centro de Recursos Genéticos
CIM Concentração inibitória mínima
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CNPq Conselho Nacional Pesquisa
COMISA Comissão Mundial de Sanidade Animal
CPPAR Centro Pesquisas Parasitológicas da Unesp de Jaboticabal
EUA Estados Unidos da América
DWL Demetilwedelolactona
FAO Food and Agricultural Organization
FCAV Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias
FDA Food and Drug Administration
g grama
HPLC High pressure liquid chromatograph
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
IDA Ingestão diária aceitável
IEA Instituto de Estudos do Agronegócio
VII
Lista de Abreviaturas
VIII
kg kilograma
L Litro
Lat Latitude
LMR Limite máximo de resíduos
Long Longitude
m Metro
min Minutos
ml Mililitros
nm Nanômetro
OMS Organização Mundial de Saúde
PDI Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação
PIB Produto Interno Bruto
SRBC Células vermelhas de sangue carneiro
TB Tuberculose
ton Tonelada(s)
UE União Européia
UNAERP Universidade de Ribeirão Preto
UNESP Universidade Júlio de Mesquita Filho
USP Universidade de São Paulo
UV Radiação ultravioleta
WAAVP World Association of the Advanced Veterinary Parasitology
WHO World Health Organization
WL Wedelolactona
μg Micrograma
EUDRA European Union Drug Regulatory Authorities
VIII
Resumo
IX
RESUMO
O atual contexto da avicultura no mercado veterinário mundial e sua importância no
Agronegócio brasileiro apontam para a necessidade de inovação na busca por novos agentes
terapêuticos para tratamento de enfermidades em aves de criação intensiva.
O propósito deste trabalho foi a investigação de uma nova alternativa terapêutica a
partir de plantas medicinais da flora brasileira, para uso na prevenção e/ou tratamento da
coccidiose aviária. A coccidiose é uma enfermidade causada por parasitas, e
predominantemente por protozoários do gênero Eimeria, com grande importância econômica
já que é causadora de graves prejuízos aos criadores e à indústria avícola.
As cepas de Eimeria necessitam de ciclo intracelular in vivo e dependem de células
intestinais para se desenvolver, reproduzir e infectar as aves. A Eimeria tenella, espécie eleita
para este trabalho, é um dos mais prevalentes e patogênicos agentes causadores de coccidiose
nas granjas brasileiras e também em nível mundial.
Os experimentos foram conduzidos in vivo, em um aviário, por indução da infecção
experimentalmente em frangos de corte. A inoculação ocorreu por via oral com suspensão
aquosa. Foram testadas duas linhagens diferentes de Eimeria tenella, sendo uma cepa de
origem nacional e outra fornecida pelo grupo internacional que estuda o genoma de Eimerias.
As plantas escolhidas foram a Physalis angulata e Eclipta alba, cujos extratos
orgânicos são fontes ricas de vitaesteróides e cumestanos, respectivamente. O preparo dos
fitocomplexos foi realizado de acordo com protocolo pré-estabelecido pelo grupo de
fitoquímica da UNAERP. A eficácia dos fitocomplexos para induzir proteção in vivo foi
avaliada através de parâmetros clínicos e de índices zootécnicos, de acordo com manual ou
protocolo técnico internacional. Os indicadores avaliados foram: a melhoria na taxa de
conversão alimentar, isto é: a relação entre a ingestão de ração e o ganho de peso; a
diminuição das lesões intestinais; a contagem de oocistos excretados nas fezes e a taxa de
sobrevivência.
Considerados em conjunto os resultados sugerem que o extrato de Physalis angulata
contendo fisalinas apresenta indícios promissores para o combate de infecções experimentais
com coccidiose aviária. No entanto, as dosagens testadas foram, aparentemente, insuficientes
para induzir respostas comparáveis à droga comercial denominada Salinomicina, utilizada
com droga de referência.
O escore de lesão foi ligeiramente menor tendo sido observados indícios de menor
hemorragia em aves tratadas com as fisalinas. A conversão alimentar das aves tratadas com a
Resumo
X
maior dose, ou seja, 120 ppm foi estatisticamente melhor que o grupo não tratado, porém,
menor que o grupo tratado com a droga de referência.
Os resultados de contagem de oocistos nas fezes de aves tratadas com compostos de P.
angulata mostraram ligeira queda em relação ao grupo sem tratamento. Merece destaque a
redução significativa no número de oocistos após 14 dias de tratamento com 40 ppm de
E.alba.
A mortalidade de aves, embora ocorrente em diversos grupos, não foi significativa,
tendo sido correlacionada a defeitos genéticos, que impossibilitavam as aves de se alimentar.
Importante ressaltar que os fitocomplexos foram testados por longo período de tempo, ou seja,
35 dias, sem nenhum indício de toxicidade.
Os resultados globais apontam o potencial uso de dosagens superiores a 120 ppm das
fisalinas ou mesmo a associação de ativos de P.angulata e E.alba como promissores
Summary
XI
SUMMARY
The current context of veterinary market points to the necessity of new
alternative drugs to prevent and treat poultry diseases. The aim of this project was to
investigate if medicinal plants are useful in the prevention or attenuation of avian
coccidiosis, an intestinal disease of chickens caused by various species of protozoan
parasites within the genus Eimeria. This disease has an economic impact due to the
great losses to the growers and to the poultry industry.
Eimeria strains require an in vivo intracellular cicle, which depends on enteric
cells for its reproduction, development and infectivity. E. tenella is one of the most
pathogenic agent causing avian coccidiosis in Brazil and world-wide.
In this work, a field trial was conducted on experimental coccidiosis infection
with chicken infected by oral inoculation of E. tenella cultures. Two strains of E .tenella
were challenged, strain H from Brazilian source, and strain MD of international origin.
Extracts from Physalis angulata and Eclipta alba plants, sources of seco-steroids and
coumestans, respectively, were tested according to a protocol designed in accordance to
international rules to evaluate in vivo drug effect on several parameters, characteristic of
avian coccidiosis.
The efficacy of plant drugs to induce protection in vivo was evaluated according
to the zootechnical index and clinical signs of avian coccidiosis. Among the parameters
evaluated were: the food conversion index; gain of weight; decrease in the severity of
lesions; number of oocists and surviving index.
Three different dosages (40, 80 and 120 ppm) of plant extracts were evaluated in
comparison with Salinomycin, an ionophore type drug used as reference. Drugs tested
were incorporated to the poultry diary food during the first 35 days of growth. After 7,
14 and 42 days of growth chickens were sacrificed and cecal portion of intestine as well
as the excrements were analysed.
Chickens treated with 120 ppm of P. angulata extract fractions, rich in
physalins, showed cutback in the severity of clinical parameters, typical of the disease
and progress in zootechnical indexes evaluated.
Summary
XII
It is important to mention that the broilers were fed with the phytocomplexes
during 35 days and no toxic effects were observed for any dose administered.
Overall results indicated a tendency to get positive effects on the inhibition of
parasite reproduction and gain of weight when higher doses of physalin containing
extract are administered. Also, the association of and E. alba compounds seem to
benefit sinergistic effect and to enhance drug efficacy.
INTRODUÇÃO
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Panorama geral da eimeriose aviária
A coccidiose em aves é uma enfermidade causada por diferentes espécies de
protozoários monoxenos que parasitam o interior de células epiteliais, sendo que a coccidiose
causada por Eimerias é a mais prevalente. Os parasitos do gênero Eimeria, invadem as células
do epitélio intestinal, causando a denominada eimeriose aviária. As coccídias do gênero
Cryptosporidium, também causadoras de coccidiose, são menos comuns e infectam além do
epitélio intestinal, o epitélio respiratório e o renal (KAWAZOE, 2000).
A eimeriose ao lado de outras infecções causadas por microrganismos como a
clostridiose (Clostridium spp), a salmonelose (Salmonella spp), a colibacilose (Escherichia
coli) e outras viroses, tem sido responsável pelos principais problemas da sanidade avícola,
principalmente na criação intensiva. Na atualidade, apesar de todos os esforços e tentativas de
controle, a coccidiose ainda é uma das mais importantes doenças infecciosas que acometem o
plantel avícola de granjas de corte gerando prejuízos elevados. Estes ocorrem pelo fato de que
a enfermidade afeta a sanidade geral das aves, diminuindo a resistência, diminuindo o ganho
de peso, baixando a eficiência alimentar, provocando graves lesões intestinais que podem até
levar as aves à morte, com índices que variam de 5 a 20% (COLNAGO, 2004).
Em 2003 as perdas econômicas ocasionadas pela eimeriose aviária atingiram valores
anuais superiores a US$ 300 milhões, referentes principalmente aos gastos com aplicação de
vacinas e medicamentos para prevenção e controle. Aproximadamente US$ 90 milhões foram
empregados somente nos Estados Unidos da América. Dados mais recentes sinalizam que este
valor vem crescendo a cada ano devido ao aumento na produção e consumo de aves de corte
em todo o mundo (McDOUGALD, 2003).
Introdução
2
A descoberta de novas drogas anticoccidianas na década de 70 reduziu perdas na
avicultura. Entretanto, com o passar do tempo os prejuízos voltaram a ocorrer em
conseqüência da má administração das drogas nas granjas devido à ocorrência de resistência
parcial ou total. Uma das formas de controle desta enfermidade são as vacinas virulentas vivas
ou atenuadas, mais utilizadas para controle de matrizes e poedeiras, nas granjas (KAWAZOE,
2004).
Em Setembro de 2005 ocorreu a IX
th
Conferência Internacional de Coccidiose, em Foz
do Iguaçu, Paraná, Brasil. Os principais temas das discussões foram a genômica, proteômica,
imunologia e aditivos naturais. Novas vacinas com tecnologia de DNA recombinante, vacinas
in ovo, algumas imunoglobulinas e peptídeos imunogênicos também apareceram com
destaque. Diversos modelos para o controle da coccidiose foram apresentados por cientistas e
pesquisadores das universidades e corporações mundiais do setor farmacêutico. Dr. Greg
Mathis, do Centro de Pesquisas Estadual dos EUA, relatou a existência de poucas drogas em
fase final de aprovação pela Food and Drug Administration (FDA) e concluiu que apenas uma
ou duas podem chegar ao mercado até 2009, dependendo dos resultados que devem ser
confirmados no final de 2006 (IX
th
INTERNATIONAL COCCIDIOSIS CONFERENCE).
A contínua ocorrência de cepas resistentes a antibióticos e o uso concomitante de
outras drogas normalmente utilizadas na medicina veterinária e humana, desencadearam
estudos e pesquisas para a proibição de certas classes de produtos terapêuticos como os
antibióticos promotores de crescimento (APC).
As barreiras sanitárias impostas principalmente pelos países da Comunidade Européia
(CE), pelo Japão e pela Austrália, efetivadas através de medidas, marcos regulatórios e
restrições à importação de carne de aves, desencadearam a busca por novas alternativas no
tratamento e prevenção de doenças infecciosas e parasitárias em animais de criação. O
processo de banimento para o uso de APCs pela CE, ocorreu parcialmente em janeiro de 2006
Introdução
3
com extensão de prazo para algumas classes de agentes terapêuticos (ROPPA, 2005). A
extensão da permissão de uso acorreu devido à falta de alternativas eficazes para tratamento e
prevenção de algumas enfermidades. Dentre as classes permitidas estão alguns ionóforos-
poliéter, que continuam sendo utilizados em prevenção de coccidiose e serão permitidos para
uso na Europa até 2012 (DINIZ, 2004).
O equilíbrio entre a alta produtividade e a manutenção dos custos de produção de
carnes de origem animal são desafios enormes e as novas alternativas de tratamento, além dos
aspectos financeiros, não devem induzir ou causar maiores prejuízos à saúde humana
(FORENTIN, 2005). O controle da sanidade animal está diretamente ligado às formas de
manejo e à utilização das boas práticas de biocontrole e biossegurança. Medidas profiláticas
não são suficientes para controlar a coccidiose. Tratamentos alternativos com produtos
naturais ou aditivos alimentares poderiam ser eficientes no controle de algumas patologias
animais (ALLEN & FETTERER, 2002).
As perturbações promovidas pela gripe aviária em meados de 2004 que ocorreram
principalmente nos países da Ásia, que se encontravam dentre os maiores fornecedores de
carne de aves, aliadas ao aumento das importações deste tipo de carne pela CE, elegeram o
Brasil como principal beneficiário deste cenário. Principalmente, devido à imposição das
barreiras sanitárias (NAKAMAE, 2005).
A partir de 2005 o Brasil passa a ocupar o primeiro lugar no ranking de exportadores
de carne de frango. O volume de exportação de carne de frango cresceu de 1,9 bilhões de
toneladas em 2003, para 2,8 bilhões de toneladas em 2005, representando um crescimento de
68%.
O valor bruto da produção pecuária avícola brasileira estava estimado em R$ 22
bilhões, o que representava 2% do total do Produto Interno Bruto (PIB) brasileiro
(QUEVEDO, 2005).
Introdução
4
A avicultura é uma das molas propulsoras dentro do agronegócio brasileiro. De acordo
com o Instituto de Estudos do Agronegócio (IEA), as exportações do agronegócio brasileiro
cresceram 9,6% em 2006. O superávit do agronegócio de janeiro a agosto de 2006 foi de US$
26.17 bilhões, 8,8% superior ao do mesmo período do ano anterior, percentual este maior que
o total nacional (+4,5%). Os dados revelam a importância do agronegócio no saldo da balança
comercial (DE SOUZA et al, 2006).
1.2. A Enfermidade: Eimeriose Aviária
1.2.1. Taxonomia e Etiologia
Os agentes etiológicos da Eimeriose Aviária são protozoários, principalmente do
gênero Eimeria, que pertence ao filo Apicomplexa, à classe Esporozoea, família Eimeriidae e
gênero Eimeria. Podemos citar outros parasitos que pertencem a este filo: Toxoplasma gondii,
Isospora spp, Sarcocystis spp, etc (TOMLEY, 1997).
Estão descritas sete espécies de Eimeria: a Eimeria mitis, Eimeria acervulina, Eimeria
máxima, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria brunetti e Eimeria tenella. No Brasil, as
espécies mais prevalentes são a Eimeria tenella, Eimeria máxima e Eimeria acervulina
(KAWAZOE, 2000).
O contágio se dá através da ingestão de oocistos esporulados que permanecem na
cama das aves e são ingeridos juntamente com a ração ou água de beber. Os oocistos possuem
características morfológicas diferenciadas para cada espécie, tais como, o formato, o tamanho
e o período pré-patente para cada espécie.
Os oocistos esporulados mostrados na Figura 1 contêm quatro esporocistos com dois
esporozoítos cada, num total de oito em cada oocisto. Para desencadear o processo de
infecção nas aves o oocisto deve ser rompido, o que ocorre por ruptura mecânica pela ação
Introdução
5
trituradora da moela. Neste estágio os esporozoítos estão livres e sob a ação sinérgica de
enzimas pancreáticas, como a tripsina e dos sais biliares, responsáveis pelo deslocamento dos
esporozoítos até as paredes do intestino. Os agentes infectantes chegam até a região do trato
gastrintestinal por tactismo, para que ocorra o processo de invasão celular (KAWAZOE,
2004).
Figura 1: Representação de oocistos: (A) oocisto não esporulado de Eimeria spp e
(B) oocisto esporulado de Eimeria spp.
Fonte: Doenças das Aves. Ed. Facta, 2000.
Introdução
6
1.2.2. Características dos oocistos de Eimeria spp
O complexo apical, visível somente por microscopia eletrônica, é essencial no
processo de invasão celular. As organelas citoplasmáticas diferenciadas denominadas
conóides, microtúbulos, roptrias, micronemas e grânulos densos. São as estruturas com
função de adesão aos enterócitos (Figura 2). A invasão das células hospedeiras ocorre em três
etapas e depende da ação dos micronemas, das roptrias e dos grânulos densos (KAWAZOE,
2000).
Figura 2: Organelas e estrutura citoplasmática de oocisto de Eimeria spp.
Fonte: Doença das aves. Editora Facta, 2000.
Os oocistos esporulados são muito resistentes e permanecem no ambiente por longos
períodos, mantendo-se como fonte de material infeccioso. Os oocistos esporulados continuam
viáveis mesmo em condições muito drásticas como em contato com saneantes tradicionais,
quaternários de amônia, fenol, hipocloritos, além de ácidos e bases fortes. A melhor forma de
destruição dos oocistos é através do emprego do calor, com temperaturas acima de 60 ºC.
Outra forma é utilizar amônia na forma gasosa ou brometo de metila, que são gases bastante
tóxicos e requerem cuidados especiais com sua manipulação (KAWAZOE, 2000).
Introdução
7
1.2.3. Caracterização de oocistos de Eimeria tenella
Segundo LONG et al (1976), os oocistos de Eimeria tenella, espécie escolhida para o
experimento devido a sua alta patogenicidade e baixa imunogenicidade, apresentam tamanho
médio de 22 x 19μm de diâmetro, formato arredondado e período pré-patente de 138 horas
com manifestação dos sintomas entre seis e sete dias após inoculação ou contágio (Figura 3).
A B
Figura 3: Oocisto de Eimeria tenella não esporulado (A) e esporulado (B).
Fonte: Departamento de Zoologia, Universidade de Manitoba. USA.
Cada espécie de Eimeria infecta uma porção específica do intestino (Figura 4). O local
exato da infecção no intestino das aves é um importante fator para diagnóstico desta
enfermidade (KAWAZOE, 2000). A Eimeria tenella invade a porção distal ou inferior do
intestino denominada ceco.
Introdução
8
Figura 4: Vilosidades intestinais do ceco infectado por Eimeria tenella.
Fonte: Avian Diseases, Chapman (2003).
1.2.4. Ciclo de Vida Completo
O ciclo de vida das Eimerias ocorre em duas fases, uma endógena e outra exógena. A
fase intra-hospedeiro ou endógena, também se divide em duas e se inicia quando a ave ingere
oocistos esporulados presentes na cama ou solo. Os oocistos sofrem ruptura mecânica através
da ação da moela. A ação de agentes fisiológicos, tais como os sais biliares, responsáveis pela
motilidade dos oocistos, concomitantemente à ação das enzimas pancreáticas, principalmente
a tripsina, degradam o corpo de “stieda” e promovem a liberação dos esporozoítos na luz
intestinal. Deste modo são formados os vacúolos parasitóforos responsáveis pela invasão das
células da parede intestinal, principalmente os enterócitos intestinais das criptas epiteliais.
Uma vez dentro das células hospedeiras, os esporozoítos adquirem forma arredondada
e se transformam em trofozoítos. Neste momento inicia-se a reprodução assexuada, ou
Introdução
9
merogonia, dentro das células hospedeiras. Aparecem nesta etapa os merozoítos, que deixam
as células e invadem novas células, formando várias gerações de merontes. O conjunto de
merozoítos se denomina esquizonte. Os merozoítos da geração final penetram novas células
continuando sua reprodução e, conseqüentemente, destruindo as células. A última geração de
merontes invade novas células, se diferencia em gamontes, ou seja, micro e macrogamontes,
os quais se unem para a etapa da reprodução sexuada. A gamogonia ou reprodução sexuada
vai originar o zigoto ou oocisto imaturo que é eliminado nas fezes (Figura 5).
A B C
Figura 5: Fases intermediárias do ciclo de vida. A: merozoítos; B: esquizontes;
C: micro e macrogametas de E. tenella.
Fonte: Dept. of Zoology, University of Manitoba, USA.
A segunda etapa da reprodução, exógena, ocorre com a postura dos oocistos nas fezes,
que expostos a condições ambientais adequadas, de umidade relativa acima de 50% e
temperatura ambiente entre 28º e 30º C. Os oocistos sofrem um processo denominado
esporogonia, em que as células imaturas se tornam infectantes ou esporuladas (KAWAZOE,
2004). O ciclo de vida pode ser visualizado de forma resumida na Figura 6.
Introdução
10
Figura 6: Ciclo de vida completo com todas as etapas e fases.
Fase endógena (A) e fase exógena no meio ambiente (B)
Fonte: Doença das Aves. Editora Facta, 2000 (Berchieri Junior).
1.2.5. Patogenia e Imunidade
As sete diferentes espécies de Eimeria apresentam grau de virulência, patogenicidade
e imunogenicidade específicos (Figura 7). O contágio induz respostas imunes do tipo humoral
e celular, envolvendo células T, células NK, citocininas e macrófagos, além de desencadear
um processo inflamatório característico. As próprias cepas são fontes variáveis de material
antigênico. O mecanismo imunológico é especialmente importante para aves poedeiras, com
tempo de vida mais longo (KAWAZOE, 2004).
Introdução
11
Figura 7: Características físicas e patológicas das diferentes espécies de Eimeria spp.
Fonte: Doença das Aves. Editora Facta, 2000 (Berchieri Junior).
1.2.6. Modos de prevenção e controle da eimeriose aviária
A terapêutica atual baseia-se no uso de vacinas e/ou medicamentos para prevenir ou
mesmo controlar a enfermidade. O uso de vacinas virulentas vivas ou atenuadas, geralmente
contendo as sete espécies, é mais comum em matrizes e poedeiras, visto que o tempo de
criação de frangos de corte é muito curto, inviabilizando a resposta imune (KAWAZOE,
2000).
Um possível fator de insucesso das vacinas é a diversidade antigênica dos isolados da
mesma espécie de Eimeria em diferentes regiões geográficas. Outro fator negativo é a
introdução de espécies inexistentes em certas localidades e, ainda, o fato de que não se
conseguiu provar a imunidade cruzada que ocorre entre espécies diferentes. Vacinas de DNA
recombinante ainda estão em teste (QUEVEDO, 2005).
Introdução
12
As vacinas do mercado são, geralmente, misturas de todas as espécies ou de pelo
menos três espécies diferentes. O uso constante das vacinas tem sido responsável pela
introdução de novas espécies inexistentes nos plantéis. Cientistas de todo o mundo estão
tentando desenvolver ou construir um novo vetor para expressão antigênica múltipla
(VERMEULEN, 2005).
Com relação aos medicamentos químicos sintéticos existem duas classes terapêuticas,
as quais são classificadas em químicos-sintéticos e os ionóforos-poliéter. Os medicamentos do
tipo químico-sintético atuam em uma das fases do ciclo de vida endógeno, ou seja, no interior
do hospedeiro. O mecanismo de ação dos ionóforos-poliéter interfere no transporte de energia
das mitocôndrias e nas membranas do parasita, alterando sua permeabilidade. Os ionóforos
são obtidos através da fermentação de fungos do gênero Streptomyces e Actinomyces. O
desenvolvimento desta classe terapêutica entre as décadas de 70 e 80 induziu os especialistas
da área a acreditarem que a solução definitiva para os problemas da eimeriose havia sido
encontrada. Tal crença era devido ao diferenciado mecanismo de ação, que permite o estímulo
do sistema imunológico das aves por não eliminar totalmente as formas infectantes das
Eimerias. No entanto, tal expectativa não se confirmou e estas drogas, atualmente, apresentam
algum grau de resistência, além de não terem seus mecanismos totalmente desvendados
(DELL’PORTO & FERREIRA, 2002).
Introdução
13
1.3. Promotores de crescimento e a resistência microbiana
Na atualidade, parte dos medicamentos utilizados para o controle da eimeriose é
classificada como promotores de crescimento. Os APCs aumentam a produtividade, com o
incremento no ganho de peso, a diminuição no tempo de engorda, o aumento na eficiência
alimentar, a diminuição da mortalidade e a prevenção de patologias infecciosas.
Os medicamentos considerados APCs podem ser hormônios anabolizantes (proibidos
no Brasil, porém, permitidos em alguns países), agonistas de receptores β-adrenérgicos ou
antimicrobianos administrados por longos períodos. Em geral os APCs de uso oral
apresentam baixa absorção pela via gastrintestinal e são utilizados em doses bem abaixo dos
níveis terapêuticos usuais. Segundo a FAO e a OMS, os agentes promotores de crescimento
podem ser administrados a animais de criação, através da via oral (água ou ração) ou
parenteral (implantados ou injetados por via subcutânea).
Os promotores antimicrobianos são administrados durante praticamente todo o período
de criação ou engorda dos animais, respeitando-se um período para retirada ou carência,
geralmente no período que antecede o abate, para que ocorra a completa metabolização da
droga (PALERMO NETO, 2002).
O Codex Alimentarius da FAO/OMS determina índices ou limites, denominados IDA
(ingestão diária aceitável) e LMR (limite máximo de resíduos), que os medicamentos podem
deixar na carne ou na carcaça de animais de consumo (ALBUQUERQUE, 2005). A
resistência aos antimicrobianos em seres humanos vem crescendo e alguns estudos sugerem
que esta resistência se deva a mecanismos diversos, podendo existir uma correlação com o
uso de agentes químicos antimicrobianos consumidos na alimentação ou ração de animais
(CORPET, 1996).
Introdução
14
O principal fator de contribuição, para resistência, seria o resíduo da própria droga ou
os seus resíduos metabólicos. Outra suspeita é que os próprios animais de criação estejam
promovendo a seleção de cepas resistentes através de pressão seletiva ou por alteração gênica,
com surgimento de microrganismos resistentes capazes de infectar ou contaminar seres
humanos (ROPPA, 2005).
A maioria dos APC administrados em aves está de alguma forma correlacionada a
fatores de pressão seletiva, visto que possuem largo espectro da ação e também pertencem a
famílias ou classes químicas utilizadas comumente em medicina humana.
Outros mecanismos estudados, como os genéticos, em que os microrganismos ou
parasitas recebem novos genes provenientes de outros organismos, são conhecidos e podem
ocorrer por transformação, transdução ou conjugação. A introdução de novos genes se dá
através de plasmídeos, fagos, ou vírus (DNA/RNA), com a incorporação de informações
capazes de alterar mecanismos moleculares tais como inativação de enzimas, alteração de
alvos receptores nas membranas celulares ou, ainda, redução da sensibilidade ou, ainda, a
expulsão dos agentes terapêuticos através de bombas de efluxo (ALMEIDA & PALERMO
NETO, 2005).
1.4. Alternativas terapêuticas para Eimeriose Aviária
A busca por novos produtos mais seguros, como os produtos de origem natural, vem
ocorrendo desde a segunda metade da década de 90. Esta diretriz foi tomada quando os
principais representantes de Organizações Mundiais, responsáveis pela regulamentação da
Sanidade Animal, se reuniram na Irlanda e CE em Encontros e Fóruns Internacionais para
discussão do tema (WHO, 1997; COMISA, 1998).
Introdução
15
Na Literatura publicada em livros e periódicos são encontrados alguns aditivos
alimentares como adjuvantes na prevenção da coccidiose. De acordo com COLNAGO (2004)
os aminoácidos l-lisina e dl-metionina, as vitaminas C, E, K, parecem exercer forte influência
sobre o sistema imunológico das aves. Os ácidos graxos de cadeia normal com três ou quatro
carbonos e o selênio quelatado ou orgânico também têm a capacidade de reforçar os
mecanismos de defesa e, portanto, incrementam o ganho de peso e diminuem a mortalidade
das aves. A vitamina A atua sobre o epitélio, melhorando a qualidade geral das vilosidades e
das paredes intestinais. Seu efeito protetor sobre os tecidos da parede intestinal evita a invasão
das formas infectantes (DALLOUL, 2002).
Existem também pesquisas no campo da Biotecnologia, como a produção de vacinas
de DNA recombinante e de agentes terapêuticos, tais como peptídeos antibióticos. O uso de
um oligopeptídeo, composto de 12 aminoácidos, descoberto através da técnica de biblioteca
de fagos, capaz de impedir a continuidade de uma das fases do ciclo de vida das Eimerias foi
descoberto (BRITO, 2005). Um outro grupo de pesquisadores tem estudado a inserção do
gene que promove a síntese deste oligopeptídeo no milho, para obtenção de uma planta
transgênica capaz de inibir a reprodução do parasito nas aves. O uso do milho modificado,
como uma das principais fontes nutricionais, poderia facilitar a terapêutica podendo ser
administrado na ração alimentar como agente preventivo natural. Este é um projeto que
envolve muitos testes, além de uma melhor regulamentação para uso de transgênicos em
ração animal. Portanto, o tempo para estas avaliações, acredita-se, deve ser longo (LOPES,
2005).
Diversos grupos de pesquisa nos EUA desenvolvem estudos com ervas medicinais
para aplicações terapêuticas. Algumas destas formulações são classificadas como aditivos,
nutracêuticos ou suplementos alimentares. A regulamentação para esta classe de produtos é
bem diferente e segue parâmetros mais brandos ditados pelo FDA (ELVIN-LEWIS, 2001).
Introdução
16
Pesquisas com uso de plantas medicinais para aplicação em medicina veterinária vêm
ocorrendo com espécies comumente estudadas na Índia, China e em alguns países da África,
segundo dados da Reed Business Information 2006. Segundo PIERONI (2004), o número de
estudos com medicamentos de origem natural, para utilização em medicina veterinária, ainda
é bastante reduzido.
1.5. As plantas medicinais
1.5.1. Fontes potenciais de novas drogas
O Brasil é fonte de uma das maiores biodiversidades do planeta estimando-se que aqui
existam cerca de dois milhões de espécies distintas entre vegetais e microrganismos.
Adicionalmente, possui excelentes condições para cultivo de plantas, com condições
climáticas ideais, solos diversificados e períodos regulares de chuva e sol, bem como água em
abundância (SANDES & Di BLASI, 2005).
O paradigma da experimentação com uso de fitocomplexos ocorre pelo fato de que
estes compostos apresentam efeitos múltiplos, enquanto drogas isoladas exibem atividades
únicas ou particulares. Por este motivo muitos modelos são completamente inapropriados
(BARNES & PRASAIN, 2005).
A maior parte dos clínicos ainda utiliza a terapêutica convencional com drogas puras
ou isoladas, pois considera que os tratamentos com ervas medicinais ou seus derivados podem
ser ou inócuos ou potencialmente problemáticos, devido ao risco de interações, reações
adversas e ou devido à toxicidade (ELWIN-LEWIS, 2001).
A produção de metabólitos secundários pelas plantas medicinais, via bioquímico-
metabólica, depende das condições ambientais a que este organismo está exposto, bem como
das interações entre as espécies vivas orgânicas, sejam estes animais, microrganismos ou
Introdução
17
mesmo outros vegetais. As plantas são consideradas medicinais quando capazes de sintetizar
um conjunto de substâncias responsáveis por diferentes efeitos biológicos ou farmacológicos.
Produtos obtidos de plantas podem ser investigados para controle de muitas enfermidades e
servem também como modelo de estudo para uma gama de diferentes tipos de atividade
biológica. Os fitocomplexos, possuem intrinsecamente maior potencial de ação que os
componentes puros isolados, por outro lado, estes complexos podem também desencadear
efeitos tóxicos ou reações adversas. Os fitocomplexos devem ser avaliados e testados quanto à
sua eficácia, riscos de utilização (toxicologia), assim como frente a aspectos de
reprodutibilidade e constância de caracteres de qualidade determinados através de testes
químicos com comprovação científica (ALONSO, 2004).
Atualmente existem muitas pesquisas com plantas, organismos marinhos, insetos e
microrganismos devido à grande diversidade molecular que estes organismos possuem, com
alta probabilidade de se encontrar uma nova molécula ou complexo com potencial
farmacológico (YUNES & CECHINEL FILHO, 2001). A descoberta de uma nova molécula
por via sintética exige altos investimentos financeiros além das dificuldades da pesquisa em
química fina , geradora de efluentes e resíduos tóxicos (YUNES et al, 2001).
1.5.2. Revisão de Plantas medicinais estudadas em coccidiose aviária
ALLEN et al (1997) infectou frangos com E. tenella, E. máxima e E. acervulina para
avaliar atividade da Artemísia annua e de alguns componentes isolados. Os extratos brutos, a
artemisinina, um dos principais componentes isolados da planta, além de outros componentes
como o óleo essencial de artemísia, cânfora e 1,8-cineole, foram incorporados à ração das
aves. Os resultados mais promissores foram obtidos quando do uso de artemisinina pura a 17
ppm.
Introdução
18
Ervas medicinais comumente utilizadas na Medicina Chinesa (Bupleurum, Pulsatilla,
Ulmus, Sophora, Torreya, Quisqualis, Torilis, Artemísia, Gledtsia, Melia, Inula, Polygonum e
Sinomennium) foram estudadas por YOUN & NOH (2001) através de infecção experimental
em aves com E. tenella. Os parâmetros avaliados foram escore da lesão intestinal, taxa de
sobrevivência das aves, características da diarréia, ganho de peso das aves e taxa de excreção
de oocistos nas fezes. O extrato de Sophora flavescens apresentou melhores resultados.
O uso de plantas medicinais no sudoeste da Ásia tem grande importância
econômica.TIPAKORN (2002) avaliou a atividade anticoccidiana da Andrographis
paniculata na criação de aves, através de experimentos realizados na Tailândia para a
verificação da eficiência desta frente a parasitas naturais. O efeito de 0,4% de extrato bruto
desta espécie vegetal adicionado à ração das aves foi capaz de diminuir a mortalidade das
aves criadas e, também, de diminuir o escore de lesão intestinal causada por Eimeria, após
seis semanas de ingestão diária junto à ração.
GIANNENAS et al (2003) infectou aves com E. tenella e suplementou sua dieta com
óleo essencial de orégano, Origanum vulgare (Figura 8). Este óleo essencial possui
reconhecida atividade antimicrobiana. Os principais componentes presentes, carvacrol e
timol, possuem efeito tóxico para enterócitos das paredes intestinais e também para uma das
fases infectantes da Eimeria, principalmente as que infectam a região superior do intestino. Os
resultados obtidos com o uso do óleo essencial de orégano foram promissores, apesar de
inferiores aos resultados obtidos em relação ao grupo comparativo, no qual foi utilizado um
ionóforo. Testes para a determinação de resíduos ou metabólitos na carne devem ser
realizados para confirmar eficácia e segurança antes de ser liberado para uso.
Introdução
19
Figura 8: Origanum vulgaris
Fonte: http://www.valentine.gr/
EL-ABASY et al (2003) avaliou o extrato de cana de açúcar na concentração de
500mg/kg/dia em frangos infectados com E. tenella, adsorvendo tais extratos na ração e
também adicionados à água administrada para consumo dos animais. Um dos experimentos
realizados empregou somente os extratos de cana e, o outro, foi realizado com os extratos
associados a dois tipos diferentes de antígenos, de Brucella abortus e SRBC (Células
vermelhas de sangue carneiro) de forma intravenosa. Os resultados demonstram que o extrato
de cana de açúcar atua como imunomodulador e promove um efeito hepatoprotetor contra
infecção de coccídeas em aves.
DAKPOGAN (2003) utilizou três diferentes plantas medicinais na África. O princípio
que determinou sua escolha foi o uso de plantas amargas que têm como característica induzir
a produção enzimática nas vias gastrointestinais. Os extratos brutos de Carica papaya,
Vermonia amigdalina e Azadirachta indica foram acrescentados à alimentação destes
animais. Os resultados foram avaliados em relação à Eimeriose e também a outros tipos de
infecção, como salmoneloses, colibacilioses e alguns tipos de helmintos. As plantas, de sabor
amargo inibiram o consumo de ração, com resultados de desempenho ruins. Os resultados
foram apresentados através do uso do índice de sobrevivência que foi de 59% para as aves
tratadas com as plantas e 89% para grupo controle em que se empregou uma droga comercial.
Introdução
20
MATEKAIRE & BWAKURA (2004) realizaram no Zimbabwe uma pesquisa
etnofarmacológica sobre o potencial de algumas plantas medicinais para uso em doenças
animais. Os melhores resultados foram obtidos em Eimeriose aviária, com resultados
estatísticos de 88% quanto à consistência botânica (que é a freqüência da associação de uma
planta em particular com valor medicinal percebido) e 92% de consistência veterinária (que é
a freqüência de uma planta em particular estar associada ao uso ou tratamento de uma doença
especifica). Os criadores utilizavam comumente o Aloe spp ou gavakava.
DU & HU (2004) avaliaram os efeitos de um complexo herbal constituído de dez
ervas medicinais através de infecções experimentais com E. tenella. Foram utilizados extratos
na forma líquida e em pó, administrados via água de beber e/ou ração dos animais. As ervas
testadas foram a Uncariae (Ramulus e Uncis), Agrimoniae Herba, Sanguisorbae Radix,
Eclipta prostata, Pulsatillae Radix, Rehmanniae Radix e Glycyrrhizae Radix. Os resultados
obtidos permitiram observar múltiplos efeitos e verificou-se a ocorrência de alguma
toxicidade. Os autores sugeriram que a formulação ou complexo herbal deveria ser
reorganizada para a realização de novos testes mais conclusivos.
GUO et al (2005) estudou a resposta imune em aves infectadas com Eimeria tenella
tratadas com polissacarídeos provenientes de fungos (Lentinus edodes e Tremella fuciformes)
e também da planta Astragalus membranáceos. O experimento foi conduzido juntamente com
uma vacina e os resultados obtidos na associação das terapêuticas foram promissores, pois,
melhoraram o desempenho zootécnico das aves.
Introdução
21
FAJIMI & TAIWO (2005) realizaram uma revisão de medicamentos de origem herbal
utilizados na Nigéria para controle de doenças parasitárias em animais de criação. Em seguida
testaram a Khaya senegalensis, administrada junto à alimentação das aves na forma de pó
seco e moído, e a Boswellia dalziell, fervida previamente em água e posteriormente
adicionada à água de beber das aves. Os resultados não foram promissores.
1.5.3. Importância das técnicas de preparo dos extratos vegetais
Os procedimentos de extração de fitocomplexos consistem de várias etapas. Podemos
descrevê-las como a seleção, a coleta e a identificação do material vegetal. O material deve
ser selecionado quanto às suas características de integridade, sanidade, ter definição da(s)
parte(s) da planta a ser(em) utilizada(s), entre outros aspectos. As coordenadas geográficas
(GPS) do local de coleta devem ser perfeitamente descritas. Após ser corretamente coletado, o
material deve ser devidamente identificado, com a preparação de uma exsicata. Uma amostra
desta exsicata deve ser submetida à análise por taxonomista especializado, para que possa
receber um número de identificação e uma ficha de registro ou controle em herbário
credenciado pelo Centro de Recursos Genéticos (CGEN), órgão do governo vinculado ao
Instituto Brasileiro do Meio Ambiente (IBAMA) (FRANÇA, 2001).
O material deve ser seco, para evitar perdas ou contaminações e moído de forma a
preservar todas as características dos compostos. As técnicas de extração mais utilizadas são
as macerações, as percolações ou ainda, as infusões. O extrato bruto obtido pode sofrer
partição em água ou em outros solventes orgânicos para posterior fracionamento. A fase de
purificação é considerada ponto chave do processo, de forma a propiciar a separação de
compostos com importância terapêutica.
Introdução
22
Compostos indesejados, bem como os interferentes, podem ser isolados, ou mesmo
retirados através de diversos processos de purificação, alterando-se o pH, ou através da
partição em fase líquida, ou por cromatografia em coluna ou por cromatografia líquida de alta
eficiência preparativa (CLAE preparativa) (SILVA et al, 1998).
1.5.4. Importância das técnicas de análise dos extratos vegetais
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma metodologia química qualitativa
que permite a identificação de compostos químicos, pois, promove a separação destes através
do uso de eluentes de diferentes polaridades, em uma placa de sílica. Os compostos presentes
em uma determinada amostra são separados por afinidade química entre solvente e fase
estacionária (LOPES, 1997).
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é uma técnica qualitativa e
quantitativa empregada na separação e determinação de compostos orgânicos. Seu princípio
se baseia na separação de compostos orgânicos por afinidade química entre a fase
estacionária da coluna e os eluentes. A fase estacionária da coluna pode ser de variados
materiais (sílica, por exemplo) e os eluentes líquidos de polaridades variadas, com o processo
de separação ocorrendo sob alta pressão. A fase sólida (estacionária) pode ser do tipo fase
normal ou de fase reversa, em que os grupos silanóis da sílica estão ligados a cadeias
carbônicas de diferentes dimensões (ex. C8, C10, C12 e C18).
Os solventes orgânicos ou misturas destes com água ou tampões são eluídos através de
bombas de alta pressão. Por este motivo, a maioria das técnicas de CLAE é denominada de
cromatografia líquida sob alta pressão com sigla HPLC (high pressure liquid chromatograph).
Acoplado ao equipamento de separação existe sempre um detector. O detector mais utilizado,
devido sua versatilidade é o de UV (Ultravioleta).
Introdução
23
O detector de varredura de diiodo, que faz uma varredura tanto no comprimento de
luz visível quanto no UV, também é largamente empregado em pesquisa química. Os
compostos químicos que apresentam grupos cromóforos podem ser identificados nestes tipos
de detectores em diversos comprimentos de onda (COLLINS & GUIMARÃES, 1997).
1.5.5. Plantas Medicinais escolhidas para experimento
1.5.5.1. Physalis angulata – família Solanaceae
1.5.5.1.1. Descrição Botânica
Nomes populares: camapu, balãozinho, bucho-de-rã, juá, juá-de-capote (Figura 9).
Características gerais: herbácea ereta, ramificada com altura de 40-70 cm, folhas simples de
margens denteadas de três a cinco centímetros de comprimento. As flores são de coloração
creme a amarelo, solitárias, de 1 cm de diâmetro. Os frutos são bagas globosas envolvidas
por sépalas, conferindo ao conjunto aparência de um balão. Cresce facilmente em quase todo
o Brasil e pode até ser considerada planta daninha (LORENZI & MATOS, 2002).
Figura 9: fotos da Physalis angulata L
Fontes: http://www.missouriplants.com/;www.barbadine.com; www.saunalahti.fi/
Introdução
24
1.5.5.1.2. Indicação Farmacológica
Esta planta é utilizada há muito tempo principalmente pela população da Amazônia.
Seus frutos são comestíveis e muito apreciados, considerada uma iguaria exótica em alguns
países da América do Sul. A população colombiana faz uso desta planta na forma de decocto,
para a cura de diversas enfermidades, agindo como antiinflamatório e anti-séptico na pele. Na
medicina popular do nordeste brasileiro são utilizadas diversas partes da planta e com várias
indicações terapêuticas, tais como diabetes, reumatismo, problemas renais, de bexiga e de
fígado. Estudos fitoquímicos revelam a presença de diversos compostos como flavonóides,
alcalóides e fitoesteróis. Estudos farmacológicos recentes determinaram sua atividade imuno-
estimulante, citotóxica para diversos tipos de células cancerosas, além de atividade antiviral,
inclusive para o Herpes (LORENZI & MATOS, 2002).
Os principais compostos terapêuticos são os vitaesteróides onde se destacam as
fisalinas. Um estudo farmacobotânico detalhado desta espécie foi realizado para melhor
caracterização das espécies (NURIT & AGRA, 2005). A Physalis tem a capacidade de
estimular o sistema imunológico (LIN et al, 1992). Atividades antiinflamatórias e
antinoceptiva foram determinadas em ratos através de indução experimental (CHOI, 2003);
além de pesquisas no combate à malária (Di STASI et al, 1987). A atividade antiparasitária
frente a tripanossomas é exercida por compostos presentes nas partes aéreas desta planta
(NAGAFUJI et al, 2004). Alta atividade antimicrobiana frente a diversas cepas de
Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB). Resultados muito
expressivos, considerando-se que este microrganismo possui características especiais de
resistência, devido aos componentes da parede celular, conhecidos como ácidos micólicos,
que impedem a atividade de antimicrobianos convencionais e conferem a este microrganismo
alta resistência (PIETRO et al, 2000).
Introdução
25
O extrato bruto de Physalis, assim como frações orgânicas e aquosas, têm sido
elucidados quimicamente e frações originadas a partir do extrato orgânico, as quais são ricas
em vitaesteróides denominados fisalinas, foram utilizadas em ensaios de atividade biológica
(JANUÁRIO et al, 2002). Outros estudos também foram realizados, como a micropropagação
das raízes de Physalis angulata, além de técnicas biotecnológicas com uso de Agrobacterium
rhyzogenes, importantes para obtenção futura de material vegetal com qualidade especificada
(FRANÇA et al, 1997).
1.5.5.2. Eclipta Alba - família Asteraceae
1.5.5.2.1. Descrição Botânica
Nomes populares: erva botão; agrião do brejo; surucuina; lanceta (Figura 10).
Características gerais: erva anual de ramificação copiosa, ereta, com 33-99 cm; caules
levemente revestidos de pêlos ásperos e alvos, folhas com 3-10 cm de comprimento, opostas,
serrilhadas e verdes nas duas faces, inflorescência em capítulos ora terminais ora em
bifurcação. Brácteas em número de 10-12, formando invólucro campanulado, receptáculo
convexo. Frutescência em aquênios inverso-lanceolados, encimados em forma de coroa.
Cosmopolita e típica de regiões quentes em todo o Globo. No Brasil ocorre na Amazônia e
parte da Mata Atlântica (CORRÊA, 1984).
Introdução
26
Figura 10: fotos da Eclipta alba.
Fontes: http://www.missouriplants.com; www.biosurvey.ou.edu.
1.5.5.2.2. Indicação Farmacológica
Estudos etnofarmacológicos sobre a Eclipta Alba fazem desta planta uma panacéia
contra diversos tipos de enfermidades, destacando atividades tais como antiofídica,
cicatrizante e adstringente. Na Farmacopéia Homeopática é indicada para bronquite e asma
(CORRÊA, 1984).
Contém óleo essencial e alcalóides pouco estudados. Nativa de climas tropicais e
subtropicais é uma planta muito rica em cumestanos, em que os principais componentes
determinados quimicamente são as wedelolactonas (WL) e a demetilwedelolactona (DWL)
(WAGNER et al, 1986). Os cumestanos são fenilpropanóides, com atividade antiinflamatória,
antimicrobiana, antitumoral e analgésica (SAWANT et al, 2004). Foram realizados vários
tipos de testes in vitro e in vivo, para se analisar o potencial farmacológico destes tipos de
compostos (OJALA, 2001). Os extratos etanólicos, da parte aérea da planta e dos calos
possuem ação hepatoprotetora e também atividade ionotrópica positiva antagonista da
adrenalina (ZAFAR & SAGAR 2000).
Introdução
27
Sua atividade inibitória sobre a enzima proteolítica tripsina foi descrita por SYED et al
(2003). A tripsina é uma das enzimas responsáveis pelo excistamento, ou seja, a destruição da
capa resistente dos oocistos das Eimerias. O extrato metanólico da Eclipta, rico em WL e
DWL, apresentou atividade imunomoduladora em testes realizados com determinação do
título de anticorpos e índice fagocítico (JAYATHIRTHA & MISHRA, 2004).
O gênero Eclipta foi reportado em experimentos no combate a Eimerias, realizados
com complexos herbais de plantas tradicionais da medicina Chinesa, entretanto, esta planta
não foi testada de forma isolada (DU & HU, 2004).
A produção de plantas medicinais através de seleção e propagação de clones
diferenciados é de relevante importância para assegurar a provisão contínua de material
vegetal. Projetos para obtenção de extratos em escala industrial e comercial podem ser
gargalos no uso de plantas. Um estudo aprofundado sobre propagação de Eclipta através de
cultivo in vitro, além de procedimentos de biotecnologia vegetal para clonagem de plantas de
elite foi realizado visando o cultivo em escala e o delineamento de processos para aumento no
rendimento de ativos (FRANÇA et al, 1995). Os processos de produção de biomassa através
de técnicas biotecnológicas, foram também estudados com enfoque no aumento da produção
dos componentes mais ativos, WL e DWL (PEREIRA et al, 1998).
1.5.6. Aspectos gerais para avaliar novas drogas ou terapêuticas anticoccidianas
No ano de 2004 foi publicado um guia específico denominado “Guia para Avaliação
da Eficácia de Novas Drogas Anticoccidianas em frangos e perus”, o qual estabelece
parâmetros para testes com novos ativos ou novas drogas anticoccidianas, harmonizados com
normas e parâmetros internacionais, atendendo regulamentação do FDA (Food, Drug and
Cosmetic Agency), European Union Drug Regulatory Authorities (EUDRA), Austrália e
Nova Zelândia (HOLDSWORTH et al, 2004)
Introdução
28
Segundo este guia os parâmetros para avaliação de novos ativos ou drogas com
potencial de atividade anticoccidiana, devem seguir alguns critérios técnicos específicos, com
rigorosos controles e uso de boas práticas clínicas. É recomendado que alguns parâmetros
clínicos e índices zootécnicos sejam executados por mais de uma pessoa, e que estas tenham
experiência em manejo de aves. As aves utilizadas nos testes devem ser randomicamente
alocadas em gaiolas ou boxes e separadas por sexo. A determinação do peso deve ser
realizada no primeiro dia e, na seqüência, a períodos pré-determinados para cálculos de ganho
de peso. O consumo de ração é determinado para posterior cálculo da taxa de conversão
alimentar e, portanto, é importante que os comedouros estejam sempre com pelo menos a
metade de sua capacidade de enchimento durante todo o período do teste. O índice de
mortalidade das aves também deve ser determinado. Estes são os melhores indícios da
eficácia de novas drogas ou ativos, visto sua importância econômico-financeira.
Outros parâmetros de avaliação, tais como, a postura de oocistos nas fezes e o escore
de lesões intestinais, têm relevância parcial nos resultados finais, visto que este tipo de
diagnóstico raramente é determinado em rotina de aviários. No entanto, devem ser avaliados e
documentados, no caso de testes para novos ativos anticoccidianos em aves. Anotações
diárias sobre as condições climáticas, como temperatura, estação do ano, condições de
manutenção das aves, deverão estar contidas no relatório final. Este manual detalha com
precisão os requerimentos básicos para aprovação de uma nova droga coccidiostática ou
coccidicida. Um dos principais sinais clínicos evidenciados em aves com coccidiose é a
diarréia, que pode variar de simples a intensa; com hemorragia ou não; ou ainda com presença
de material purulento. Na porção infectada do intestino a parede se distende e fica
edemaciada.
Introdução
29
No caso de infecções por Eimeria tenella a porção lesionada é a região do ceco que,
além de ficar mais delgada, fica também mais curta. A presença de pontos esbranquiçados,
denominados petéquias, de coágulos hemorrágicos ou ainda de material necrótico na luz
intestinal são sinais característicos e também auxiliam no diagnóstico da doença (LONG,
1976; HOLDSWORTH et al, 2004).
O controle da temperatura e umidade relativa do criatório, assim como a região
geográfica das instalações são fatores que influenciam bastante na criação das aves. Elevações
e quedas bruscas na temperatura ambiente desencadeiam o estresse metabólico. O manejo
durante os testes deve ter como limite mínimo de umidade relativa valores de 40%, com
ausência de variações extremas da temperatura. O controle da temperatura nos primeiros dias
de vida do pintainho é fundamental, motivo para utilização de lâmpadas especiais. Já na etapa
de crescimento é mais importante o cuidado com variações elevadas da temperatura. São
requeridos sistemas de ventilação ou refrigeração, tais como ventiladores e cortinas
basculantes (TINÔCO, 2004).
A melhor forma de se administrar medicamentos às aves é através da mistura destes
compostos na ração ou dissolvidos na água, sempre dispostos ad libitum. É muito importante
garantir que a posologia diária seja uniforme, isto é, sem muitas variações. Isto pode ser
melhorado com uso de materiais adequados para mistura. A pré-mistura dos agentes
terapêuticos nas rações deve garantir que o material esteja homogêneo para que se possa
aumentar a segurança e para correta posologia (PINHEIRO 1994).
Introdução
30
A Figura 11 apresenta algumas imagens características da porção terminal do
intestino, com destaque para o ceco, de coloração mais escura, presentes em aves infectadas
por Eimeria tenella.
A B C
Figura 11: Fotos características da infecção por E. tenella no intestino de aves.
A) infecção grave no ceco (condição típica de aves jovens);
B) ceco escurecido: distendido e hemorrágico;
C) erosões na mucosa interna e ceco altamente hemorrágico.
Fonte: http://www.poultrymed.com.
Introdução
31
O manual da Pfizer, da Figura 12, foi utilizado e auxiliou no diagnóstico para
determinação do grau de lesão nas aves do experimento.
Figura 12: Imagens dos cecos de aves infectadas por E. tenella. Determinação do escore para
lesão (+1 a +4) de acordo com grau de diferenciação do tecido, presença de hemorragia e/ou
coágulos sanguíneos.
Fonte: Manual de Diagnóstico Avícola da Pfizer.
OBJETIVOS
Objetivos
32
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Este trabalho tem como objetivo geral:
• Investigar a atividade de fitocomplexos, originados de espécies
medicinais, para o combate e/ou prevenção de eimeriose, tipo prevalente
de coccidiose aviária, uma enfermidade bastante importante na avicultura
industrial.
2.2.Objetivos Específicos
• Preparar e administrar fitocomplexos, ou seja, frações purificadas, com
perfil químico padronizado, obtidas a partir de extratos de plantas
medicinais da flora brasileira.
• Avaliar a atividade dos fitocomplexos, através da determinação dos
parâmetros clínicos e dos índices zootécnicos, em aves da espécie Gallus
gallus, infectadas experimentalmente com Eimeria tenella, uma das
principais espécies dos protozoários causadores da coccidiose.
• Sondar uma dose terapêutica, dos fitocomplexos de Physalis angulata e
Eclipta alba, para prevenir ou combater a eimeriose aviária.
MATERIAIS e
MÉTODOS
Materiais e Métodos
33
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Delineamento geral dos experimentos
O experimento foi desenvolvido em três fases experimentais, que envolveram o
preparo do material, vegetal, o pré-teste e a fase experimental. As fases tiveram como
objetivos principais:
Fase I: Preparo do Material Vegetal: coleta, processamento e fracionamento dos
extratos das plantas medicinais Eclipta alba e Physalis angulata, de acordo com
protocolo pré-estabelecido pelo grupo de fitoquímica da Unidade de Biotecnologia da
Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP).
Fase II: Pré-teste: definição da linhagem da cepa de Eimeria tenella para infecção
experimental. Teste de volume para gavagem oral, quantidade de oocistos para o
inóculo das aves e teste de viabilidade das cepas para garantia da infecção
experimental.
Fase III: Teste Experimental: sondagem de três diferentes dosagens das frações
purificadas ou fitomedicamentos da Eclipta alba e Physalis angulata, em aves
inoculadas experimentalmente com Eimeria tenella, através da avaliação de
parâmetros clínicos e de índices zootécnicos.
Materiais e Métodos
34
3.2. Materiais vegetais
3.2.1. Physalis angulata
O material vegetal que deu origem às plantas utilizadas foi depositado no Herbário de
Plantas Medicinais da UNAERP e integra a Coleção de Plantas Medicinais do Departamento
de Biotecnologia da UNAERP-Ribeirão Preto, SP. A exsicata deste material está guardada no
Herbário do INPA, Manaus, AM, Brasil, sob número 173388. As plantas foram cultivadas
em larga escala em Jurucê, distrito da cidade de Jardinópolis, estado de São Paulo, Brasil,
(Lat.21°04’12,5”Long.47°44’08,0” Alt. 545m), entre os meses de agosto e dezembro de
2005. A exsicata citada possui voucher nº HPMU 1074. A colheita das partes aéreas foi
realizada no início do mês de dezembro de 2005, com as plantas em estádio de floração e
frutificação e resultaram em 100 kg de matéria fresca. A massa foi seca em estufa com
circulação de ar à 50ºC durante sete dias e, posteriormente, pulverizada até granulometria de
24 mesh.
3.2.1.1. Preparo extrato bruto de Physalis
A partir de 5,22 kg de material vegetal seco foram acrescidos 15 litros de clorofórmio
(CHCl
3
) PA Synth ACS, para processo de maceração orgânica em mesa agitadora orbital. O
macerado foi filtrado e concentrado no evaporador rotativo sob vácuo e banho-maria a 65 ºC,
procedimento foi repetido por três vezes consecutivas.
Materiais e Métodos
35
3.2.1.2. Filtração em sílica sob vácuo
Misturar e triturar o extrato bruto vegetal com a sílica gel em um almofariz até se
obter um pó homogêneo, e transferi-lo para uma coluna cromatográfica previamente
empacotada com sílica gel 60, sob vácuo. A separação ocorre por diferença na polaridade dos
solventes que eluem o material. Para cada etapa de filtração foram utilizadas,
aproximadamente, 30g do extrato bruto seguindo-se a eluição dos solventes ou das misturas
de solventes na quantidade de 1 litro para cada fase. A filtração ocorreu em sete etapas
devido às limitações das colunas de separação. Os filtrados recolhidos foram concentrados
em evaporador rotativo sob vácuo, procedimento executado em etapas designadas A, B, C, D,
E, F e G. A seqüência da filtração e os solventes ou mistura destes, estão descritos na Tabela
1 e seguem a ordem de eluição de F1 para F8, com aumento crescente na polaridade dos
solventes utilizados.
Tabela 1: Descrição dos solventes empregados na filtração do extrato bruto orgânico
das partes aéreas de Physalis angulata.
Ordem de
Eluição
Eluentes Proporção
F1 Hex /AcOEt 8:2
F2 Hex / AcOEt 7:3
F3 Hex / AcOEt 6:4
F4 Hex / AcOEt 1:1
F5 Hex / AcOEt 3:7
F6 AcOEt Puro
F7 AcOEt I MeOH 1:1
F8 MeOH Puro
Legenda:
AcOEt: Acetato de etila PA / Hex: Hexano PA / MeOH: Metanol PA
Materiais e Métodos
36
A Figura 13 descreve as etapas do procedimento para preparo das frações ricas em
fisalinas de acordo com protocolo pré-estabelecido por JANUÁRIO et al, 2002.
Figura 13: Diagrama resumido das etapas do processo de obtenção das frações da planta
medicinal Physalis angulata ricas em fisalinas
Secagem
Pulverização
Maceração
CHCl
3
24h (Shaker) por 3X
Rotaevaporação
Extrato bruto
Partes aéreas
Filtração
(Repetições)
F1
F2 F3 F4
F5
F6
F7
Frações ricas em fisalinas
Utilizadas no experimento
Ressuspensão
Acetato de Etila
Materiais e Métodos
37
3.2.1.3. Análises das frações
Todas as frações foram submetidas à análise por CCD para identificação das frações
mais ricas em fisalinas. A fase móvel utilizada foi hexano e acetato de etila (3:7) e o reagente
de coloração empregado foi a vanilina sulfúrica, que auxilia na visualização dos compostos.
As frações ricas em fisalinas resultantes de todas as etapas de filtração do extrato bruto foram
agrupadas e analisadas por cromatografia líquida. A Figura 14 representa as fórmulas
estruturais das principais fisalinas presentes na fração testada. As fisalinas B, D e F
apresentam diferenças estruturais entre as posições 5 e 6 do carbono, conforme destacado em
vermelho (JANUÁRIO et al, 2002).
5-6
Figura 14: Fórmulas estruturais das principais fisalinas obtidas no fracionamento.
Em destaque, na estrutura da esquerda, as posições 5 e 6 na estrutura molecular das fisalinas.
As frações foram padronizadas por CLAE. As amostras foram dissolvidas em metanol
de grau espectroscópico (J. T. Baker), o cromatógrafo líquido utilizado foi da marca
“Shimadzu”, com detector de arranjo de diiodo (modelo SPD-M10A VP), injetor automático
(modelo SIL-10AD VP) e volume de injeção de 20 μL. A coluna empregada foi de fase
reversa denominada Supelcosil
TM
LC18 (4,6 x 250 mm, fornecedor Supelco), com fase móvel
de MeOH:H
2
O (Metanol:água) na proporção, em volumes, de 57:43, com gradiente linear por
Materiais e Métodos
38
20 minutos e mais 5 minutos com metanol puro. O fluxo estabelecido foi de 0,9ml/min e a
detecção em comprimento de onda de 230 nm. As análises foram realizadas pelo Dra. Ana
Helena Januário, colaboradora do grupo de fitoquímica do Departamento de Biotecnologia da
UNAERP.
3.2.1.4. Preparo da fração de fisalinas para mistura na ração
A granulometria e a forma cristalina de agentes terapêuticos para misturas devem
possuir similaridade para que não ocorram separações acarretando falta de homogeneidade
(LACHMAN, 2001). Estabeleceu-se o protocolo para preparo da fração devido a sua
característica resinosa de difícil mistura na ração. Foram pesados 36 g da fração à qual foram
adicionados 5 ml de clorofórmio em gral de porcelana, para a mistura e moagem até perfeita
dispersão da massa resinosa. A seguir, foram adicionados 44 g de lactose DCL11. O material
previamente misturado foi novamente homogeneizado em gral com pistilo de porcelana até
formação de pó fino homogeneamente verde. Este material foi colocado em capela de
exaustão à temperatura ambiente para secagem e evaporação total do clorofórmio contendo
45% de componentes ativos (fração rica em fisalinas).
Materiais e Métodos
39
3.2.2. Eclipta Alba
As sementes desta planta foram obtidas na cidade de Botucatu, estado de São Paulo,
Brasil, em janeiro de 1998. Estas plantas pertencem à coleção de plantas medicinais do
Departamento de Horticultura da Universidade Júlio de Mesquita Filho (UNESP) da cidade
de Botucatu. As plantas obtidas a partir dessas sementes foram incorporadas ao Herbário de
Plantas Medicinais da UNAERP sob Voucher nº HPMU 058. A identificação foi realizada
pela Dra. Elizabeth Lopes do Instituto de Botânica da Universidade de São Paulo (USP).
As plantas foram posteriormente cultivadas em Jurucê distrito da cidade de
Jardinópolis, estado de São Paulo, Brasil (Lat.21°04’12,5” Long.47°44’08,0” Alt. 545 m),
entre os meses de fevereiro a julho de 2004. A colheita das partes aéreas foi realizada no
estádio de floração e resultaram em 50 kg de matéria fresca. O material foi seco em estufas
de ar circulante a 50 ºC por dois dias e, posteriormente, foi pulverizado em moinho de facas
até a granulometria de 24 mesh.
3.2.2.1. Preparo do extrato bruto
Partindo de 3,0 kg de material vegetal pulverizado adicionou-se 15 litros de metanol
PA, para a maceração orgânica. O procedimento utilizado foi similar ao descrito para
Physalis, sendo descrito em detalhes em PEREIRA, 1998.
Materiais e Métodos
40
3.2.2.2. Partição líquido-líquido
A partição do extrato bruto foi realizada em duas etapas. A primeira etapa foi
executada em funil de separação, em que o extrato bruto foi dissolvido em uma mistura de
metanol:água 1:1 (500 ml) e particionado com três porções de hexano (500 ml; 200 ml e 200
ml, respectivamente). As frações orgânicas (hexano e metanol) obtidas foram evaporadas em
capela. A fração aquosa foi submetida a uma segunda partição utilizando-se quatro porções
de acetato de etila (300 ml, 200 ml, 200 ml e 100 ml). As frações orgânicas (acetato de etila)
assim obtidas foram reunidas e concentradas em evaporador rotativo (PEREIRA, 1998).
As estruturas químicas das principais substâncias presentes na fração acetato de etila
são apresentadas na Figura 15.
A B
Figura 15: Estrutura química da wedelolactona (A) e da demetilwedelolactona (B).
3.2.2.3. Preparo da fração de cumestanos para mistura na ração
A fração acetato apresentou características físicas adequadas para a pré-mistura nas
rações, visto que se encontrava na forma de pó fino, no entanto, para facilitar as pré-misturas,
padronizou-se procedimento de mistura com lactose. Foram misturadas 31 g da fração a 37 g
de lactose DCL11. Desta forma as duas frações continham 45% de componentes ativos .
Materiais e Métodos
41
3.2.2.4. Preparo das frações de Eclipta alba
A Figura 16 demonstra de forma resumida as etapas do procedimento utilizado no
preparo da fração rica em cumestanos, conforme descrito por PEREIRA et al, 1998.
Figura 16: Diagrama resumido das etapas do processo de obtenção das frações purificadas da
planta medicinal Eclipta alba.
Secagem
Pulverização
Maceração em MeOH
24h (Shaker) 3X
Rotaevaporação
Extrato bruto
Ressuspensão
MeOH: H
2
O (1:1)
PARTIÇÃO
HEXANO
(
F1
)
ÁGUA
(
F2
)
ACETATO
ETILA
FASE AQUOSA
FASE
AQUOSA
ACETATO
ETILA
ANÁLISE (CLAE)
Partes aéreas
Eclipta alba
Materiais e Métodos
42
3.2.2.5. Análise da fração de Eclipta alba
Para a análise por CLAE o material foi dissolvido em metanol grau espectroscópico (J.
T. Baker) em concentração de 20 μg/ml. O cromatógrafo líquido, a coluna e o detector
utilizados são os mesmos anteriormente descritos para a planta P. angulata. O volume de
injeção foi de 20 μL, e a fase móvel empregada foi MeOH:H
2
O (metanol e água), na
proporção volumétrica de 10:90, com ácido acético 0,1% e gradiente linear por 40 minutos. O
fluxo estabelecido foi de 1,0ml/min e a detecção em comprimento de onda de 350 nm. As
análises foram realizadas pelo Dr. Paulo Sérgio Pereira colaborador do grupo de fitoquímica
do Departamento de Biotecnologia da UNAERP.
3.3. Pré-teste
3.3.1. Descrição geral
O teste foi executado no aviário do CPPAR-UNESP-Jaboticabal. As aves utilizadas
foram frangos de corte, da espécie Gallus gallus, do sexo masculino, da linhagem Cobb®,
distribuídas em 9 grupos com 10 aves cada grupo (Quadro 1). O teste consistiu na infecção
das aves com diferentes concentrações de inóculo num intervalo de concentrações de 10.000,
20.000, 50.000 e 100.000 oocistos por ave, de cada uma das linhagens, conforme indicado em
literatura (LONG, 1976; HOLDSWORTH et al, 2004). A inoculação foi realizada por
gavagem oral, na dose de 1 ml, de acordo com a contagem da suspensão obtida. Os frangos
foram abatidos por deslocamento vertebral no 7º dia após o inóculo, quando foi realizada a
necropsia da porção cecal para determinar as lesões (HOLDSWORTH et al, 2004).
Materiais e Métodos
43
Após finalização do pré-teste, foram utilizadas duas técnicas para desinfecção do
aviário, consistindo do uso de saneante comercial à base de cloreto de benzalcônio 80%, para
evitar infecções microbianas, e da técnica da vassoura de fogo, capaz de eliminar os oocistos
remanescentes.
Quadro 1: Descrição dos grupos, linhagens das cepas de Eimeria e da quantidade de inóculo
utilizado no pré-teste.
Tratamentos Inóculo
E.tenella
Número
oocistos
Número
de aves
T 1 Ausente - 10
T 2 Cepa H 10.000 10
T 3 Cepa MD 10.000 10
T 4 Cepa H 20.000 10
T 5 Cepa MD 20.000 10
T 6 Cepa H 50.000 10
T 7 Cepa MD 50.000 10
T 8 Cepa H 100.000 10
T 9 Cepa MD 100.000 10
Total 3.700.000 90
3.3.2. Obtenção dos oocistos empregados na infecção experimental
As cepas utilizadas na infecção experimental foram fornecidas pelo grupo de pesquisa
do Dr. Arthur Gruber, que isola e cultiva este parasita através de passagens in vivo, em uma
unidade especialmente projetada na USP-SP. O grupo isolou a cepa MD em granjas do
Materiais e Métodos
44
território nacional para estudos sobre coccídeas do gênero Eimeria. A cepa H foi gentilmente
cedida pelo mesmo laboratório com autorização do Dr. Martin Shirley, que a isolou em
Londres, no Reino Unido, para estudo mundial do genoma de Eimerias (SHIRLEY et al,
2004). Estudos de biologia molecular para diagnóstico com uso de marcadores moleculares
foram estabelecidos e asseguram a pureza das linhagens testadas (FERNANDEZ et al, 2004;
FERNANDEZ et al, 2003).
Os oocistos esporulados, ou seja, o inóculo das duas linhagens testadas, a cepa H e a
cepa MD de Eimeria tenella, foram fornecidos pelo Prof. Dr. Arthur Gruber, do
Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP-SP. O material de
infecção contendo 5.10
6
oocistos de E. tenella em 20 microtubos foi armazenado em
geladeira, com temperatura monitorada entre 4 e 6 ºC. Os oocistos foram conservados em
solução de dicromato de potássio a 2%, segundo indicação da literatura (LONG et al, 1976).
3.3.3. Preparo do inóculo de E. tenella para pré-teste
Partindo-se de uma solução estoque de 5.10
6
oocistos, das cepas (H e MD), iniciou-se
a técnica com a lavagem com solução salina 0,9%, para a retirada do preservante dicromato
de potássio 2%. Tal procedimento é feito por cinco vezes em centrífuga refrigerada
(Eppendorf Centrifuge 5417R). O sobrenadante foi retirado com pipeta automática a cada
ciclo de centrifugação de 1160 rpm por 5 minutos a 4 ºC. O conteúdo total foi ressuspenso em
solução salina 0,9%. A suspensão dos oocistos foi transferida para balão volumétrico de 50
ml, obtendo suspensão com contagem de 100.000 oocistos em cada 1ml. Tal contagem foi
realizada em câmara de Newbauer e a solução obtida foi denominada C1. Para a obtenção de
C2, suspensão com 50.000 oocistos/ml, partiu-se da solução C1, diluindo-a na proporção de
Materiais e Métodos
45
1:1 com solução fisiológica. Para a obtenção de C3, solução com concentração de 20.000
oocistos/ml, foi realizada uma diluição da solução C1 na proporção de 1:5.
A obtenção de C4, com concentração contendo 10.000 oocistos/ ml, foi realizada a
partir da solução C3, diluindo-a na proporção de 1:1. Desta forma as suspensões de inóculo
foram preparadas para dose de 1 ml por ave. O Esquema 1 descreve de forma simplificada o
procedimento de preparo das diferentes soluções de inóculo.
Esquema 1: Preparo das suspensões aquosas com diferentes concentrações de inóculo
para pré- teste.
3.4. Experimento Padrão
3.4.1. Descrição geral do experimento
Os parâmetros experimentais definidos foram:
a) Pesagem ou ganho de peso: nos dias 1, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 de vida das aves.
b) Determinação da taxa de conversão alimentar: semanal.
c) Infecção experimental: no 14ºdia de vida (gavagem de suspensão oral).
Materiais e Métodos
46
d) Contagem de oocistos nas fezes: no 21º e 28º dia de vida.
e) Escore de lesão intestinal: avaliado no 21º e 42º dia de vida.
f) Mortalidade: índice de animais mortos e causa provável.
3.4.2. Alojamento e manejo das aves para os experimentos
O estudo foi conduzido no aviário experimental do Centro de Pesquisas em Sanidade
Animal-CPPAR/FCAV/UNESP, o qual possui 16 boxes (2,0 x 3,0m), cimentados e isolados
por muretas de alvenaria, alambrado de arame, dotados de portas individualizadas. Na parede
lateral existe uma cortina de lona que pode ser acionada para adequar a temperatura do
interior dos boxes (Figura 17), de acordo com a temperatura diária avaliada. Cada boxe foi
dividido ao meio com placas de madeira compensada medindo 2,0x0,75 m, resultando em
boxes com espaço suficiente para acomodar 15 aves na fase adulta, resultando 32 boxes, com
toda infra-estrutura e condições adequadas ao experimento padrão.
Figura 17: Vista de um dos boxes empregados no experimento no aviário do CPPAR, local
em que foi realizado o experimento. Ao fundo, destaque para as cortinas azuis que foram
empregadas para auxiliar no controle da temperatura interna.
Materiais e Métodos
47
Os grupos controle não infectados foram alocados próximos à porta de acesso em seis
boxes. Os grupos infectados foram isolados por um boxe vazio para evitar a contaminação de
aves destes grupos. Os demais grupos foram dispostos de forma aleatória ou randômica,
conforme apresentado pelo Esquema 2. O Quadro 02 detalha todos os grupos do experimento.
ENTRADA
1 - T1R1 30 - T3R1
2 - T3R3 29 - T1R3
3 - T1R2 28 - T3R2
ISOLAMENTO ISOLAMENTO
4 - T5R3 27 - T9R2
5 - T7R1 26 - T2R1
6 - T6R1 25 - T4R1
7 - T8R2 24 – T10R2
8 - T4R3 23 - T5R1
9 - T9R1 22 - T7R3
10 – T2R3 21 - T8R3
11 – T5R2 20 - T6R2
12 – T10R1 19 – T10R3
13 – T6R3 18 - T7R2
14 – T9R3 17 - T8R1
15 – T4R2
C
O
R
R
E
D
O
R
16 - T2R2
Esquema 2: Distribuição dos grupos de tratamento (T) e replicatas (R) no galpão
experimental utilizado, dispostos aleatoriamente.
Materiais e Métodos
48
Quadro 2: Grupos e tipos de tratamentos do experimento padrão.
Tratamento
Grupos*
Tipo Inóculo
oocistos/ave
Medicamento Dose (ppm)
1 Controle negativo Não se aplica Não se aplica Não se aplica
2 Controle positivo 20.000 Não se aplica Não se aplica
3 Controle droga padrão Não se aplica Salinomicina 66
4 Controle droga padrão 20.000 Salinomicina 66
5
Physalis
20.000 Fisalinas 40
6
Physalis
20.000 Fisalinas 80
7
Physalis
20.000 Fisalinas 120
8
Eclipta
20.000 Cumestanos 40
9
Eclipta
20.000 Cumestanos 80
10
Eclipta
20.000 Cumestanos 120
• Três repetições ou replicatas com 11 aves cada grupo.
Para evitar a contaminação dos grupos controle não infectados durante todas as etapas
do experimento algumas ações foram empregadas. Podemos citar o uso de pedilúvio com
solução saneante, uso de dois conjuntos de botas plásticas, uma para cada lado do aviário, ou
seja, do lado infectado e não infectado, uso de propés e de luvas descartáveis.
O substrato utilizado como cama foi a casca de arroz. Os bebedouros de alumínio do
tipo copo, foram colocados em estrados de madeira, assim como os comedouros infantis, que
foram utilizados até o 7º dia de vida. A partir da primeira semana de idade os bebedouros de
alumínio foram substituídos por bebedouros pendulares automáticos e comedouros tubulares
com capacidade para 20 kg de ração. As rações utilizadas em cada boxe foram colocadas em
baldes individualizados por grupo de tratamento, para controle e pesagem semanal.
Materiais e Métodos
49
3.4.3. Técnica de preparo do inóculo para infecção experimental
A concentração de inóculo definida para o experimento foi de 20.000 oocistos por ave
com volume adequado para a gavagem oral compreendido entre 250 a 500 μl, conforme
estabelecido no pré-teste. Para a infecção experimental de 330 aves foram necessários
6.600.000 oocistos de E.tenella, e a linhagem escolhida foi a cepa H.
A solução estoque continha 5.10
6
oocistos em cada microtubo, portanto, foram
utilizadas 2 unidades. O método empregado foi o mesmo, conforme descrito no item 3.3.3 do
pré-teste. A suspensão de oocistos obtida foi transferida para um balão volumétrico de 10 ml
com solução salina, e a concentração esperada é de 5.10
5
ou 500.000 oocistos/ ml. Após
contagem em câmara de Newbauer, conforme descrito anteriormente, foi realizada a diluição
com solução salina na proporção de 1:10, para obtenção do inóculo preconizado de 20.000
oocistos em cada 400 μl da suspensão, ou seja: 50.000 oocistos em cada 1 ml. Método
baseado em RYLEY e colaboradores, de 1976 (Esquema 3).
Esquema 3: Preparo do inóculo para experimento padrão
CEPA H (2 tubos)
5.10
6
oocistos cada
Total: 1.10
7
oocistos
10mL
50mL
100mL
C1= 1.10
6
oocistos
C: 5.10
4
oocistos / ml
C: 5.10
4
oocistos
Inóculo:
2.10
4
oocistos/µL
Materiais e Métodos
50
3.4.4. Forma de administração dos fitocomplexos
A medicação foi misturada à ração e administrada as aves ad libitum. As doses
definidas para o teste experimental foram baseadas em níveis usuais das drogas de mercado,
visto que não havia nenhum teste prévio ou referência a respeito. As doses comumente
utilizadas variam entre 1 e 800 ppm, e o período de retirada também varia, sendo que a média
é de 3 a 10 dias (REVOLLEDO & FERREIRA, 2005). O período de retirada ou carência
estabelecido para o teste foi de sete dias.
3.4.5. Droga padrão utilizada como referência no experimento
A salinomicina, uma droga da classe dos ionóforos, foi escolhida para ser utilizada no
experimento. A dose padrão desta droga varia de 60 a 80 ppm, com indicação mais recente de
66 ppm (CHAPMAN et al, 2004). O material utilizado no experimento foi adquirido
comercialmente da Empresa Alpharma, com concentração de 12% de princípio ativo.
3.4.6. Obtenção e vacinação das aves para os experimentos
As aves utilizadas nos experimentos foram frangos de corte da linhagem Cobb®, do
sexo masculino, sexadas, com um dia de vida, adquiridas no Incubatório de Aves da
Coperfrango de Descalvado, vacinadas para a doença de “Marek”, uma virose causada pelo
Herpesvírus. Durante o experimento, as aves, foram vacinadas também para doença de
“Gumboro” e para doença de “New Castlle”, viroses endêmicas na região de Jaboticabal, as
quais poderiam afetar o experimento ou algum parâmetro de avaliação do teste. O programa
adicional de vacinação para doença de Gumboro (cepa fraca), foi realizado por via ocular; no
7º dia de vida. No 14º dia de vida aconteceu a vacinação para doença de New Castle, com
Materiais e Métodos
51
reforço para Gumboro (cepa forte) via água de bebida, utilizando leite em pó desnatado como
veículo (2g/L). Os procedimentos são sugeridos no livro da Fundação APINCO, intitulado
“Manejo de Frangos”, (PINHEIRO, 1994).
Os pintainhos foram pesados no primeiro dia de vida e separados, com base no peso
médio de cada ave de forma randômica, visando homogeneizar os grupos e evitar
discrepâncias nos resultados de desempenho zootécnico (PIPPI SALLE & DA SILVA, 2000).
Os experimentos contaram com apoio técnico de veterinários e zootecnistas.
3.4.7. Preparo das rações básicas para os experimentos
As rações para aves de corte são especialmente formuladas de forma que o balanço
financeiro entre consumo e a produção de carne sejam equilibrados. As rações comerciais
disponíveis no mercado são formuladas com aditivos, que podem ser antimicrobianos ou
outros tipos de adjuvantes. Por este motivo as rações utilizadas nos experimentos foram
especialmente formuladas, de acordo com manuais zootécnicos vigentes e atualizados, de
forma a evitar interferências no experimento. A composição básica das rações está descrita
nos Quadros 3 e.4.
Materiais e Métodos
52
Quadro 3: Composição das dietas experimentais
Ingredientes (%) Inicial Crescimento Terminação
Milho 62,526 66,706 67,500
Farelo Soja 32,872 28,585 27,290
Fosfato Bicálcico 1,765 1,607 1,439
Calcáreo 0,824 0,781 0,947
Óleo Vegetal 0,848 1,112 1,760
Sal 0,433 0,430 0,386
MIX Mineral
1
0,100 0,100 0,100
MIX Vitamínico
2
0,200 0,200 0,200
L - Lisina HCl 0,200 0,246 0,193
DL-Metionina 0,223 0,223 0,177
Inertes 0,010 0,100 0,100
Total 100,00 100,09 100,09
Materiais e Métodos
53
Quadro 4: Composição calculada das dietas experimentais
Composição calculada
Cálcio (%) 0,878 0,810 0,828
Energia metabolizável 2,980 3,050 3,100
Fibrea Bruta (%) 3,165 2,993 2,932
Fósforo Disponível (%) 0,439 0,405 0,372
Lisina Dig. (%) 1,113 1,049 0,977
Met+Cist. Dig. (%) 0,790 0,755 0,698
Metionina Dig. (%) 0,512 0,492 0,441
Proteína Bruta (%) 20,650 19,100 18,500
Sódio (%) 0,213 0,210 0,192
Treonina Dig. (%) 0,687 0,632 0,613
Triptofano Dig. (%) 0,227 0,203 0,196
Fonte: Tabelas Brasileiras para Aves e suínos. Composição de Alimentos e Exigências
nutricionais. 2ª Edição. Editor, Horácio Santiago Rostagno. Universidade Federal de
Viçosa. Viçosa, MG. 2005.
1
Níveis de garantia por kg de produto: ferro – 35 g, cobre-12 g, cobalto-2 g, manganês -
35 g, zinco - 30 g, iodo – 600 mg, selênio, 70 mg; qsq - 1000g.
2
Níveis de garantia por kg de produto: vit. A – 4.500.000 UI, vit. D
3
– 1.100.000, UI, vit.
E, 4.400 mg; vit. K
3
, 860 mg, vit. B
1
44 mg, vit. B
2
2.200 mg, vit. B
12
5.000 mcg,
pantotenato de cálcio, 5.000 mg; niacina, 10.600 mg, piridoxina, 45 mg; biotina, 10 mg;
colina, 100 g; ácido fólico, 180 mg; antibiótico, 40 g; antioxidante, 50 g; veículo, 1.000g.
Materiais e Métodos
54
3.4.8. Preparo de rações medicadas
As rações medicadas foram preparadas em duas etapas: uma para fase inicial, de 1 a
21 dias de vida e a outra para fase de crescimento, de 21 a 35 dias. Nos últimos sete dias
houve fornecimento de ração de terminação não aditivada. O consumo de ração total do
experimento foi de aproximadamente 1500 kg, calculados pelo consumo médio por ave de 4,5
kg. Foram preparados dois tipos de ração e oito subtipos diferentes, de acordo com o tipo de
tratamento e fase de crescimento (inicial e terminação). As frações foram pesadas em
balanças analíticas da marca Gehaka modelo 200 com precisão de 0,001 g. Os ativos foram
previamente pesados e posteriormente misturados por vinte minutos às rações em um
equipamento especial do aviário geral da FCAV-UNESP, basculante e rotatório, de acordo
com procedimento padrão estabelecido.
3.5. Avaliações de parâmetros clínicos e dos índices zootécnicos
3.5.1. Determinação do escore de lesão no ceco das aves
As aves foram parcialmente abatidas e necropsiadas após o período pré-patente de 138
horas. A necropsia é geralmente utilizada como fator de diagnóstico para eimeriose aviária. A
determinação exata da porção intestinal lesionada e o grau da lesão determinam a gravidade
da infecção (JOHNSONS & REID, 1970).
No experimento desenvolvido a porção lesionada é o ceco. As porções cecais foram
separadas e dissecadas através de técnica padrão e utilização de Manual diagnóstico auxiliar.
Todas as dissecações foram fotografadas e documentadas. As condições gerais das outras
porções intestinais também foram verificadas e avaliadas. A morte dos frangos ocorreu por
deslocamento vertebral imediatamente seguido da retirada do intestino para diagnóstico e
determinação do escore de lesão.
Materiais e Métodos
55
A Tabela 2 descreve as principais características observadas no diagnóstico do escore de lesão
intestinal para diagnóstico de coccidiose aviária.
Tabela 2: Classificação ou determinação do escore em função da lesão e da presença de
determinados fatores na mucosa intestinal e/ou nas fezes das aves.
Fonte: JOHNSONS & REID, 1970.
3.5.2. Detecção e contagem de oocistos nas fezes
Um dos parâmetros de avaliação de eimeriose é a detecção e/ou contagem dos
oocistos nas fezes. De acordo com LONG (1976), para se obter resultados satisfatórios a
cama deve ser coletada homogeneamente, isto é, devem ser coletadas pequenas porções em
pontos diversos ao longo dos boxes. A contagem de oocistos presentes nas fezes dos frangos
respeitou o período pré-patente de 138 horas, aproximadamente, sete dias após o inóculo, no
entanto definiu-se no protocolo uma outra contagem sete dias após a primeira. A técnica
executada no preparo e contagem dos oocistos coletados na cama das aves foi uma adaptação
das metodologias descritas e padronizadas por RILEY, 1976; ESTRADA et al, 2003 e
HOLDSWORTH et al, 2004.
Valor CARACTERÍSTICAS DO GRAU DE LESÃO
0 Aves sem lesão
+1
Aparecimento de poucas petéquias, porém sem nenhuma alteração visível nas
paredes e no conteúdo fecal
+2
Lesões mais numerosas com traços de sangue no conteúdo do ceco, com parede
ligeiramente mais delgada e fezes normais
+3
Grandes quantidades de sangue e presença de petéquias ou pontos brancos no
ceco; parede muito mais delgada e pouco conteúdo fecal
+4
Parede do ceco amplamente distendida e delgada com vários pontos
hemorrágicos e conteúdo fecal extravasado
+5
Alguns autores consideram grau +5 para as aves mortas em conseqüência da
infecção
Materiais e Métodos
56
3.5.2.1.Descrição da técnica adaptada para a contagem de oocistos nas fezes
Foram coletadas amostras frescas das camas de cada grupo, na quantidade de
aproximadamente 200 g, de forma aleatória, ou seja, em toda área do boxe, no sétimo dia após
o inóculo. O material foi misturado e homogeneizado em saco plástico fechado. Em béquer de
250 ml, pesou-se 10 g de cada amostra, onde foram adicionados 50 ml de água destilada, para
a perfeita homogeneização do material. Este procedimento serviu para quebrar os grumos de
fezes e separar a cama. A seguir o material foi filtrado em tamis ou peneira de malha 70 mesh
para não reter os oocistos. Retirou-se uma alíquota de 20 ml do filtrado a qual foi adicionado
80 ml de uma solução aquosa de dicromato de potássio 2%. O frasco foi tampado com uma
rolha permeável à entrada de umidade e oxigênio e a suspensão foi incubada por 72 horas, sob
temperatura entre 28 e 30 ºC. O material foi incubado em câmara climática com umidade
relativa de 65% e agitação por quatro vezes ao dia.
A solução obtida foi transferida para tubo adequado, para ser centrifugada por 10
minutos a 3500 rpm. O sobrenadante foi descartado e o material foi lavado em centrifuga por
três vezes com 40 ml de água em cada lavagem, à velocidade de 1000 rpm, durante 5 minutos.
Finalmente, adicionou-se ao sobrenadante 60 ml de uma solução saturada de cloreto de sódio
para que os oocistos pudessem ficar suspensos.
O conteúdo foi agitado suavemente e a contagem foi realizada em câmara de Neubauer
e câmara de Mcmaster. A leitura foi realizada em seis linhas da câmara de Mcmaster, de
modo alternado. Na câmara de Newbauer a leitura ocorreu em pelo menos cinco quadrantes.
Os resultados apresentados na tabela 13 e 15 foram os obtidos na contagem em câmara de
Mcmaster, por se tratar de um método mais largamente utilizado na prática veterinária, devido
a melhor visualização dos oocistos esporulados. O microscópio utilizado foi da marca Nikon,
modelo Ellipse type 104E400.
Materiais e Métodos
57
3.5.3. Determinação da taxa de conversão alimentar
As aves foram pesadas semanalmente, onde as replicatas de cada um dos grupos
experimentais foram pesadas em caixas plásticas e balança calibrada. O consumo semanal de
ração também foi verificado, para cálculo da taxa de conversão alimentar. A taxa de
conversão alimentar é a relação entre o consumo médio de ração e o ganho médio de peso da
ave. Este índice é muito importante, pois, a criação intensiva de aves depende de um perfeito
balanço entre consumo e ganho de peso.
3.5.4. Determinação da Mortalidade das aves
As aves que apresentaram problemas ou morreram foram retiradas, pesadas e as
anotações realizadas para a correção do consumo de ração e índices zootécnicos no período
experimental. As perdas ocorrem devido à intercorrências diversas, inclusive defeitos
genéticos nas pernas.
RESULTADOS
Resultados
58
4. RESULTADOS
4.1. Material Vegetal
4.1.1. Physalis angulata
4.1.1.1. Rendimento e Análise química das frações
O rendimento total do extrato bruto orgânico foi de 208 g, equivalente a 4% em
relação ao material vegetal seco. O extrato foi dividido em seis porções com
aproximadamente 35g cada para fracionamento através da técnica da filtração em sílica
(etapas A, B, C, D, E; F), devido à ausência de equipamento adequado para o fracionamento
do total. Os solventes utilizados estão descritos na seqüência em que foram realizadas as
filtrações seqüenciais, na tabela da próxima página, assim como os respectivos rendimentos
de cada etapa do fracionamento de acordo com a mistura utilizada de solvente (Tabela 3).
As amostras obtidas em cada etapa de filtração foram analisadas por cromatografia em
camada delgada (CCD) para identificação das fisalinas. A Figura 18 representa o perfil
cromatográfico em placa de sílica onde foram eluídas as amostras reunidas das filtrações A,
B, C, D, E e F.
1 2 3*
. .
4*
..
.5* 6
..
7 8
Figura 18: Foto de uma placa cromatográfica de camada delgada (etapa A).
Filtração do extrato bruto de Physalis angulata. (*) Frações ricas em fisalinas.
ONDE: 1(F1); 2(F2); 3(F3); 4(F4); 5(F5); 6(F6); 7(F7) e 8(F8)
Resultados
59
Fase móvel: hexano: acetato de etila (3:7)
Revelador ou agente coloração: vanilina sulfúrica.
A análise cromatográfica demonstrou que as frações F3, F4 e F5 continham as maiores
quantidades das substâncias de interesse. No caso, os vita-esteróides denominados fisalinas.
Estas substâncias aparecem na fotografia da placa de CCD com coloração avermelhada. A
fração com a maior quantidade de fisalinas foi a F5. A quantidade total obtida da reunião das
frações da etapa 5, foi suficiente para tratamento do número de aves proposta para o
experimento.
Tabela 3: Solventes e rendimentos das etapas de fracionamento da Physalis angulata no
processo de filtração em sílica sob vácuo.
Massa (g)
Ordem
de
Eluição
Eluentes Proporção
A B C D E F
F1
Hexano I
Acetato
8:2 5,6688 6,4346 7,6631 7,3279 6,724 6,5694
F2
Hexano I
Acetato
7:3 5,9473 5,8993 6,0073 4,9082 5,6249 6,0589
F3
Hexano I
Acetato
6:4 3,2588 2,6222 2,6832 2,7907 3,0963 3,6324
F4
Hexano I
Acetato
1:1 2,913 3,4426 3,3366 4,4599 4,0547 4,2411
F5
Hexano I
Acetato
3:7 4,6353 4,9263 5,2306 5,0272 5,0982 5,3422
F6
Acetato
etila
puro 3,1709 2,9622 4,3635 3,853 3,7715 3,8547
F7
Acetato
etila I
1:1 4,9702 3,6926 4,5446 3,3219 3,5045 3,7859
F8
Metanol
puro 0,5377 0,5185 0,5671 0,7425 0,5883 0,5981
Resultados
60
O gráfico da Figura 19 representa a distribuição das quantidades em massa obtidas em
cada uma das etapas do fracionamento, com destaque (em vermelho) para a fração F5, obtida
através de extração com a mistura de Acetato de Etila/ Metanol 3:7, a qual foi escolhida para
os procedimentos com aves.
Figura 19: Análise gráfica de distribuição das frações obtidas nas filtrações de extrato
clorofórmico bruto, de acordo com os tipos de eluentes empregados.
Legenda: MeOH (metanol) e AcOet (acetato de etila).
A Figura 20 apresenta o perfil analítico obtido na cromatografia líquida de alta
eficiência da fração F5, através da detecção por varredura, na região do ultravioleta entre 200
e 350 nm, nos picos mais abundantes com detector de diiodo. O padrão analítico utilizado é
uma mistura de quatro principais fisalinas, com prevalência de duas sem, no entanto,
determinar qual a ordem de eluição. Os picos principais aparecem com tempos de retenção
8,92 e 11,51 minutos. As análises foram realizadas para o controle da qualidade química do
fitocomplexo testado. As técnicas químicas de extração, análise e caracterização das fisalinas
foram desenvolvidas conforme descrito por JANUÁRIO et al (2002) e foram executadas pela
Prof. Dra. Ana Helena Januário, colaboradora do Departamento de Biotecnologia da
UNAERP.
Resultados
61
B
Spec tr um at time 8.92 min.
nm
200
225 250 275 300 325 350
8.92 min
Lambda max : 198 226 326 323
Lambda min : 207 191 324 277
A C
600 600
Figura 20: Perfil cromatográfico obtido na análise por CLAE da fração F5R (A) e as
varreduras dos picos majoritários do detector de arranjo por diiodos (B e C).
A. Picos das principais fisalinas .
B. Espectro de UV do pico com tempo retenção 8,92 min
C. Espectro de UV do pico com tempo retenção 11,51 min.
Minutes
0
5 10 15 20 25
mAU
0
200
400
mAU
0
200
400
Detector A-230 nm
Fração 3:7-Physalinas
Instrument 1.1 2-8-06 9-57-49 AM.DAT
Spec tr um at time 11.51 min.
nm
200
225 250 27 5 300 325 350
11.51 min
Lambda max : 199 224 329 334
Lambda min : 193 215 332 297
Resultados
62
4.1.2. Eclipta Alba
4.1.2.1. Rendimento e Análise química dos extratos e frações
O rendimento total do extrato bruto orgânico foi de 295,8 g, correspondente a 9,86%
em relação material seco. O fracionamento do extrato bruto com reunião de todas as frações
acetato de etila resultou em massa de 43,73 g, rendimento de 14,78% em relação ao total de
extrato bruto orgânico. A partição aquosa obteve rendimento 50,6%. As substâncias de
interesse foram obtidas na porção orgânica, ou seja, na fração acetato de etila. As frações
orgânicas da E. alba obtidas com uso de acetato de etila foram reunidas e submetidas à análise
química por CLAE para determinação dos cumestanos, principais substâncias de interesse
(Figura 21).
Figura 21: Perfil cromatográfico (CLAE) para fração acetato de etila rica em cumestanos e
utilizada no experimento. Os picos majoritários são referentes a demetilwedelolactona e
wedelolactona, respectivamente.
Resultados
63
A fração acetato de etila apresentou alguns pequenos picos, que não foram
caracterizados e que se encontram em baixíssimas concentrações. Os picos majoritários,
referentes à wedelolactona e à demetilwedelolactona, respectivamente, foram comprovados
com uso de padrões purificados destas substâncias. Os tempos de retenção destas substâncias
são, respectivamente, 32,1 e 28,5 min. Os cromatogramas dos padrões secundários
purificados são apresentados a seguir nas Figuras 22 e 23. Esta análise comprovou o perfil
químico da fração utilizada no experimento.
Figura 22: Perfil cromatográfico (CLAE) para wedelolactona (padrão secundário).
Tempo de retenção 32,1. Coluna fase reversa C18.
Fase móvel: gradiente metanol: H
2
O (57:43) / 20 minutos; 5 minutos com metanol puro.
Resultados
64
Figura 23: Perfil cromatográfico (CLAE) para demetilwedelolactona (padrão secundário).
Tempo de retenção 28,5. Coluna fase reversa C18.
Fase móvel: gradiente metanol: H
2
O (57:43)/ 20 minutos; 5 minutos com metanol puro.
4.2. Pré-teste
ROSTAGNO (2005) no livro “Tabelas Brasileiras para Aves e Suínos”, determina,
para frangos de corte da linhagem Cobb® uma taxa de conversão alimentar de 1,150. Os
resultados obtidos nesta etapa foram bastante diferentes, incluindo as aves do grupo controle
negativo, as não infectadas. Os resultados de conversão das aves nesta etapa foram superiores
a 1,392. Os resultados ruins se devem ao baixo número de aves utilizadas, sem outros grupos,
ou seja, sem repetições, o que impossibilitou uma análise estatística mais precisa. Houve
também problemas nos comedouros com desperdício de ração e, conseqüente, aumento da
taxa de conversão.
Todos os fatores que influenciaram de forma negativa os resultados do pré-teste foram
importantes para que pudessem ser efetuadas as adequações necessárias no que tange ao
manejo das aves para a execução do experimento padrão.
Resultados
65
4.2.1. Determinação da mortalidade das aves inoculadas
Nos grupos do pré-teste com 10 aves cada, não houve nenhuma morte. No entanto,
algumas aves foram retiradas devido a problemas nas pernas. Geralmente este tipo de
problema tem origem genética e dificulta a alimentação das aves, prejudicando o desempenho
das mesmas de forma que poderiam influenciar negativamente os resultados, como os
parâmetros zootécnicos.
4.2.2. Avaliação macroscópica dos cecos das aves inoculadas
Para determinação do escore de lesão as aves foram sacrificadas por deslocamento
vertebral para necropsia no 7º dia após a inoculação. Os intestinos foram isolados dos demais
órgãos para serem examinados. A porção final do intestino, o ceco, foi dissecada e
fotografada para determinação do escore de lesão. As fotos obtidas estão representadas nas
Figuras de 24 a 31, onde o grupo controle (T1) encontra-se disposto em todas as Figuras na
parte superior e os grupos inoculados (T2 a T9) encontram-se na parte inferior. Todos os
diagnósticos foram confirmados pela médica veterinária Dra. Milenni Michels, da empresa
Ouro Fino Saúde Animal, que auxiliou na necropsia das aves.
Resultados
66
4.2.2.1.Determinação do Escore de Lesão Intestinal
T1
T2
Figura 24: Avaliação macroscópica do ceco de aves no pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupo controle negativo).
T2: animais inoculados com cepa H na quantidade de 10.000 oocistos por ave.
O Grupo controle T1 não apresentou nenhum tipo de lesão, ou seja, o escore de lesão
determinado foi zero. Não foi detectado nenhum tipo de hemorragia. Os cecos apresentaram
ligeira hiperemia, fato que pode ter como causa provável infecção por enterobactérias, muito
comum em aves.
O Grupo T2, infectado com cepa da linhagem H, na concentração de 10.000
oocistos/ave, apresentou escores de lesão +3 em sete aves, +2 em duas aves e uma ave foi
retirada do grupo, devido a problemas genéticos. O intestino apresentou hemorragia moderada
em algumas aves, e os cecos tiveram lesão tecidual generalizada, com paredes espessadas,
encurtadas e com conteúdo cecal sanguinolento.
Resultados
67
T1
Figura 25: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T3
T1: animais não inoculados (grupo controle negativo).
T3: animais inoculados com cepa MD na quantidade de 10.000 oocistos por ave.
O grupo T3 infectado com cepa MD, na concentração de 10.000 oocistos/ave
apresentou escore de lesão +3 em sete aves e +2 em três aves. As aves apresentaram
hemorragia intestinal moderada. Os cecos apresentavam lesões generalizadas, com paredes
espessadas e encurtadas. Havia presença de petéquias e conteúdo cecal sanguinolento.
Resultados
68
T1
T4
Figura 26: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupos controle negativo).
T4: animais inoculados com cepa H na quantidade de 20.000 oocistos por ave.
O grupo T4 infectado com cepa H, na concentração de 20.000 oocistos/ave apresentou
escore de lesão +3 em oito aves e +2 em duas aves. Cinco aves apresentaram hemorragia
moderada. As demais não apresentaram hemorragia. Os cecos estavam com lesões
generalizadas, com paredes bastante espessadas e encurtadas. O conteúdo cecal estava
endurecido e sanguinolento, com presença de sangue coagulado nas cinco aves.
Resultados
69
T1
T5
Figura 27: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupo controle negativo).
T5: animais inoculados com cepa MD na quantidade de 20.000 oocistos por ave.
O grupo T5, infectado com cepa MD, na concentração de 20.000 oocistos/ave
apresentou escore de lesão +3 em oito aves e +2 em duas aves; com presença de petéquias
disseminadas por todo ceco. Sete aves apresentaram hemorragia grave, mas o restante
apresentou hemorragia leve. As paredes do ceco estavam espessadas e encurtadas e o
conteúdo cecal endurecido e sanguinolento.
Resultados
70
T1
T6
Figura 28: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupos controle negativo).
T6: animais inoculados com cepa H na quantidade de 50.000 oocistos por ave.
O grupo T6, infectado com cepa H, na concentração de 50.000 oocistos/ave,
apresentou escore de lesão +3 nas dez aves; com presença de hemorragia mais acentuada em
todas. As aves estavam com lesões graves e generalizadas. As paredes do ceco apresentavam
elevado grau de espessamento e estavam bastante encurtadas. O conteúdo cecal estava
fortemente endurecido e sanguinolento.
Resultados
71
T1
T7
Figura 29: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupos controle negativo).
T7: animais inoculados com cepa MD na quantidade de 50.000 oocistos por ave.
O grupo T7, infectado com cepa MD, na concentração de 50.000 oocistos/ave,
apresentou escore de lesão +3 em nove aves; sendo que uma foi retirada por problemas
genéticos. As lesões no ceco foram generalizadas e havia presença abundante de petéquias,
porém com menor grau de hemorragia. As paredes do ceco estavam gravemente espessadas e
encurtadas. O conteúdo cecal estava bastante endurecido.
Resultados
72
T1
T8
Figura 30: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupo controle negativo).
T8: animais inoculados com cepa H na quantidade de 100.000 oocistos por ave.
O grupo T8, infectado com cepa H, na concentração de 100.000 oocistos/ave,
apresentou escore de lesão +3 nas dez aves. As aves apresentaram cecos gravemente
comprometidos, encurtados, com lesões abundantes e muitas petéquias. O conteúdo cecal
estava bastante endurecido e havia presença de sangue coagulado, porém, sem hemorragia.
Resultados
73
T1
T9
Figura 31: Avaliação macroscópica do ceco de aves do pré-teste.
T1: Animais não inoculados (grupo controle negativo).
T9: animais inoculados com cepa MD na quantidade 100.000 oocistos por ave.
O grupo T9, infectado com cepa MD, na concentração de 100.000 oocistos/ave,
apresentou escore de lesão +3 em nove aves, sendo que uma ave foi retirada por problemas
genéticos. As aves apresentaram grave comprometimento das paredes do ceco. As paredes
estavam bastante encurtadas e espessadas, com lesões abundantes. O conteúdo cecal estava
endurecido com presença de sangue coagulado em quatro aves e as outras com conteúdo
hemorrágico.
Resultados
74
4.3. Experimento padrão
4.3.1. Parâmetros avaliados no experimento
4.3.1.1 Controle de Temperatura e Umidade do Aviário
O monitoramento das condições ambientais foi realizado diariamente durante todo o
período experimental, para verificações a ajustes necessários. A tabela completa das medições
diárias encontra-se no Apêndice-Anexo C. Os dados relativos às médias semanais de
temperatura e umidade são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Temperatura e umidade relativa máxima e mínima registrada semanalmente. T
Período (dias) * Temperatura (
o
C) * Umidade relativa do ar (%)
Máxima Mínima Máxima Mínima
1 a 7 34,3 25,4 79 42
8 a 14 34,4 23,9 76 45
15 a 21 32,6 22,2 81 43
22 a 28 30,5 20,1 94 50
29 a 35 35,5 17,5 96 31
36 a 42 34,1 20,8 88 37
Média geral 33,6 21,6 85,6 41,4
*As médias foram calculadas com base nos dados obtidos diariamente nos boxes
experimentais do aviário do CPPAR/FCAV/UNESP
As condições de manejo de aves de corte foram seguidas conforme estabelecido em
protocolos de criação (TINÔCO, 2004). As temperaturas apresentadas na Tabela 4 são
características da época do ano na qual o experimento foi conduzido e se mantiveram em
patamares adequados. Verificou-se que as máximas e mínimas não se alteraram muito, o que
pode ser conseqüência do manejo correto, com uso de lâmpadas durante período inicial e com
uso de cortinas basculantes durante as outras etapas de crescimento. A umidade relativa
manteve-se, também, na média em todo o período, sempre superior a 30%, condição
necessária para esporular os oocistos após postura nas fezes.
Resultados
75
4.3.1.2 Controle de Mortalidade
Os dados obtidos durante o experimento foram devidamente avaliados e estão
apresentados na Tabela 5 e no Quadro 5, que descrevem o percentual de mortalidade e as
causas .
Tabela 5: Percentual de frangos mortos durante todo experimento (soma das 3 replicatas).
Tratamentos Nº aves mortas / grupo
T1 – Sem Inoculação 0
T2 – Com Inoculação 0
T3 – Sem Inoculação + Ionóforo 3
T4 - Com Inoculação + Ionóforo 1
T5 - Com Inoculação + 40ppm Physalis 1
T6 - Com Inoculação + 80ppm Physalis 0
T7 - Com Inoculação + 120ppm Physalis 0
T8 - Com Inoculação + 40ppm Eclipta 0
T9 - Com Inoculação + 80ppm Eclipta 1
T10 - Com Inoculação + 120ppm Eclipta 0
Total aves mortas durante teste 5 aves ou 1,5%
Quadro 5: Descrição detalhada das mortes ou motivo para retirada das aves.
DATA BOX TRAT PESO(g) CAUSAS
21/mar 15 T4R2 113,2 Causa Desconhecida – Fêmea
21/mar 11 T5R2 72,9 Causa Desconhecida
22/mar 12 T10R1 124,7 Perna Torta - não morreu, barriga para cima
22/mar 8 T4R3 142,3 Perna Torta - não morreu, barriga para cima
23/mar 3 T1R2 158,1 Perna Torta - não morreu, barriga para cima
24/mar 28 T3R2 225,0 Morte Súbita
26/mar 28 T3R2 251,0 Causa Desconhecida
30/mar 2 T3R3 355,0 Perna Torta - não morreu, barriga para cima
30/mar 5 T7R1 421,4 Perna Torta - não morreu, barriga para cima
2/abr 14 T9R3 706,5 Morte Súbita
20/abr 10 T2R3 1709,0 Perna Torta - não morreu
20/abr 11 T5R2 1924,0 Perna Torta - não morreu
Resultados
76
4.3.1.3 Resultados dos índices zootécnicos
As pesagens semanais foram realizadas em cada boxe e, portanto, são referentes a
cada repetição ou replicata dos grupos de tratamento. Os resultados apresentados nas Tabelas
6, 7 e 8 são, respectivamente, as médias obtidas da primeira quinzena, ou seja do 1º ao 14º dia
de vida (período pré-inóculo); do 1º ao 21º dia de vida (período até uma semana após inóculo)
e do 1º ao 42º dia de vida (período total de criação). As demais tabelas se encontram no
Apêndice-Anexo G, H e I, no anexo D, E e F apresenta o desempenho detalhado das aves
durante todo período experimental.
Tabela 6: Parâmetros zootécnicos das aves durante período de criação de 1 a 14 dias.
Consumo Médio de Ração (CR), Ganho Médio de Peso (GP) e Média da Conversão
Alimentar (CA).
Tratamentos CR (g) GP (g) CA
T1: Sem Inoculação (controle) 526,17 391,84 1,343
T2: Com Inoculação (controle) 537,05 391,42 1,373
T3: Sem Inoculação + Salinomicina 66 ppm 503,88 375,18 1,344
T4: Com Inoculação + Salinomicina 66 ppm 518,38 377,25 1,374
T5: Com Inoculação + 40 ppm Physalis 512,32 379,98 1,349
T6: Com Inoculação + 80 ppm Physalis 512,55 376,40 1,362
T7: Com Inoculação +120 ppm Physalis 522,38 384,17 1,361
T8: Com Inoculação + 40 ppm Eclipta 512,06 372,09 1,377
T9: Com Inoculação + 80 ppm Eclipta 521,89 384,10 1,358
T10: Com Inoculação +120 ppm Eclipta 521,75 374,76 1,395
CV (%) 4,020 4,898 2,987
P value 0,7917 0,9118 0,8625
CV: coeficiente de variação. P. value: Probabilidade.
Resultados
77
Não foram observados efeitos significativos (P>0,05) dos tratamentos sobre o
consumo de ração, peso corporal, ganho de peso e conversão alimentar, no período de 1 a 14
dias de idade, conforme se verifica na Tabela 6.
Durante este período as aves receberam as rações medicadas ou não de acordo com
protocolo estabelecido, porém não se encontravam infectadas. As rações básicas foram
idênticas, onde a única diferença de cada grupo foi a adição dos fitocomplexos ou da droga
referência. A infecção experimental ocorreu no 14º dia de vida.
Tabela 7: Parâmetros zootécnicos das aves medidos na fase de 1 a 21 dias de idade, em
função dos tratamentos de cada grupo. Consumo Médio de Ração (CR), Ganho Médio de
Peso (GP) e Média da Conversão Alimentar (CA).
Tratamentos CR (g) GP (g) CA
T1: Sem Inoculação (controle) 1200,94 850,07 1,413 AB
T2: Com Inoculação (controle) 1224,52 844,11 1,452 AB
T3: Sem Inoculação + Salinomicina 66 ppm 1154,83 844,36 1,369 A
T4: Com Inoculação + Salinomicina 66 ppm 1203,39 847,63 1,420 AB
T5: Com Inoculação + 40 ppm Physalis 1181,80 803,79 1,470 B
T6: Com Inoculação + 80 ppm Physalis 1205,80 835,93 1,443AB
T7: Com Inoculação +120 ppm Physalis 1207,58 842,68 1,435 AB
T8: Com Inoculação + 40 ppm Eclipta 1181,05 807,75 1,463 AB
T9: Com Inoculação + 80 ppm Eclipta 1222,38 834,82 1,464 AB
T10: Com Inoculação +120 ppm Eclipta 1216,64 826,78 1,473 B
CV (%) 3,541 4,210 2,384
P value 0,6387 0,7458 0,0318
No 7º dia após inoculação, ou seja, no 21º dia de vida, que representa o término do
período pré-patente, de máxima virulência dos parasitos, também não foram observados
efeitos significativos (P>0,05) dos tratamentos sobre o consumo de ração, peso corporal e
Resultados
78
ganho de peso. Foi observado neste período efeito significativo (P<0,05) sobre a conversão
alimentar das aves.
A melhor taxa de conversão alimentar apresentada foi a do grupo T3, grupo este
tratado com a droga de referência e sem inoculação. O grupo T4 também tratado com
salinomicina 66 ppm, porém inoculado, apresentou taxa de conversão alimentar semelhante à
obtida nos tratamentos dos grupos T1, T2, T6, T7, T8 e T9. As aves do grupo T1 e T2, que
não receberam nenhum tipo de tratamento, não apresentaram diferenças estatísticas na CA. Os
tratamentos dos grupos T5 e T10, com adição de 40ppm de Physalis e 120 ppm de Eclipta,
apresentaram os piores resultados, quando comparados aos demais grupos.
Tabela 8: Parâmetros zootécnicos das aves durante toda fase experimental (1 a 42 dias de vida).
Consumo Médio de Ração (CR), Ganho Médio de Peso (GP) e Média de Conversão Alimentar
(CA).
Tratamentos CR (g) GP (g) CA
T1: Sem Inoculação (controle) 4335,96 2684,48 1,615 AB
T2: Com Inoculação (controle) 4451,59 2735,09 1,628 AB
T3: Sem Inoculação + Salinomicina 66 ppm 4224,84 2734,32 1,545 A
T4: Com Inoculação + Salinomicina 66 ppm 4414,32 2757,41 1,601 AB
T5: Com Inoculação + 40 ppm Physalis 4415,93 2654,70 1,664 B
T6: Com Inoculação + 80 ppm Physalis 4515,62 2760,44 1,636 B
T7: Com Inoculação +120 ppm Physalis 4480,61 2766,34 1,620 A
T8: Com Inoculação + 40 ppm Eclipta 4414,47 2702,66 1,634 B
T9: Com Inoculação + 80 ppm Eclipta 4461,41 2695,56 1,656 B
T10: Com Inoculação +120 ppm Eclipta 4529,44 2747,30 1,649 B
CV (%) 3,339 3,356 1,843
P value 0,4010 0,8543 0,0058
Resultados
79
As aves foram submetidas a um período de retirada de sete dias, antes do abate final.
Portanto, as rações medicadas foram suspensas no 35º dia de vida, dando seqüência o
fornecimento de ração sem adição de aditivos.
Não foram observados efeitos significativos (P>0,05) dos tratamentos sobre o consumo de
ração, peso corporal e ganho de peso nos períodos de 1 a 35 e/ou de 1 a 42 dias. Foi observado
neste período efeito significativo (P<0,05) sobre a conversão alimentar das aves, conforme
descrito na Tabela 8.
O melhor resultado foi apresentado pelo grupo T3 com adição da droga de referência e
sem inóculo. Os grupos controle sem medicação, T1 e T2, assim como os grupos T4
(Salinomicina + inóculo) e T7(Physalis 120 ppm), apresentaram resultados de conversão
alimentar um pouco menores, porém, bastante importantes. Os demais grupos, T5, T6, T8, T9
e T10 apresentaram resultados inferiores tanto aos controles sem medicação quanto a aqueles
com a droga referência. Comparando-se os tratamentos entre as duas plantas medicinais,
verificou-se que somente o grupo T7, medicado com Physalis à 120ppm, apresentou resultado
estatístico similar aos grupos controle ou ainda para os medicados com salinomicina 66ppm e
também infectados.
4.3.1.3. Resultados da contagem de oocistos nas fezes
As contagens médias e o desvio padrão são apresentados na Tabela 9 e 10.
Os fatores de diluição foram padronizados para todos os grupos quando da coleta das fezes
para preparo das amostras de acordo com procedimento de esporulação necessário para
contagem dos oocistos.
Resultados
80
Tabela 9: Contagem total de oocistos nas fezes coletadas de forma randômica nos boxes,
realizada no 21º dia de vida, após período pré-patente de 138 horas.
Amostra 1 2 3 4 5 6 MR MD CV
T1R1
0 0 0 0 0 0 0,00
T1R2
0 0 0 0 0 0 0,00
T1R3
0 0 0 0 0 0 0,00
0 0
T2R1
57 75 82 52 62 50 63,00
T2R2
52 50 47 63 44 43 49,83
T2R3
84 95 86 65 56 67 75,50
62,8 0,250
T3R1
0 0 0 0 0 0 0,00
T3R2
0 0 0 0 0 0 0,00
T3R3
0 0 0 0 0 0 0,00
0 0
T4R1
0 1 0 0 0 0 0,17
T4R2
0 0 0 0 0 1 0,17
T4R3
7 4 5 11 4 4 5,83
2,06 1,530
T5R1
73 64 50 38 29 33 47,83
T5R2
63 54 68 40 45 39 51,50
T5R3
57 60 59 53 51 42 53,67
51 0,245
T6R1
37 28 43 40 32 40 36,67
T6R2
16 9 7 14 10 12 11,33
T6R3
91 105 113 79 99 103 98,33
48,8 0,784
T7R1
29 28 40 30 39 38 34,00
T7R2
32 51 54 50 48 51 47,67
T7R3
63 51 79 50 74 87 67,33
49,7 0,344
T8R1
93 71 66 92 80 81 80,50
T8R2
75 82 96 90 86 71 83,33
T8R3
84 75 70 71 92 75 77,83
80,6 0,115
T9R1
89 88 76 87 100 89 88,17
T9R2
82 91 99 87 96 102 92,83
T9R3
79 83 86 75 76 80 79,83
86,9 0,096
T10R1
50 67 45 73 53 70 59,67
T10R2
75 82 91 84 92 96 86,67
T10R3
68 91 95 73 93 91 85,17
77,2 0,208
Legenda:
MR= média das replicatas MD= média geral dos tratamentos CV= coeficiente variação
Grupos:
Azul : controle / Vermelho: droga referência/ Roxo: Physalis/ Verde: Eclipta
Resultados
81
A contagem de oocisto foi realizada em duas etapas, uma após período pré-patente,
indicado no guia da WAAVP (21º dia de vida) e também uma semana depois (28º dia de
vida). Este procedimento foi realizado para pudessem ser verificados efeitos benéficos ou não
dos fitocomplexos sobre a postura de oocistos na cama das aves. A forma infectante, o oocisto
após esporulação, é responsável pelo contágio das aves. Este fator se agrava entre diferentes
lotes quando se reutilizam as camas das aves, prática usual que varia entre granjas, mas, que
geralmente ocorre por quatro ou até seis vezes. A contagem de oocistos dos grupos controle
não-infectados T1 e T3 foi zero, resultado importante para garantir o procedimento de
controle e manejo. As aves dos grupos controle mantiveram-se sem contaminação, validando
o procedimento de isolamento dos boxes.
O resultado obtido pelo grupo controle T2, infectado e não-tratado foi de 62,78
oocistos, enquanto o grupo controle T4 que recebeu a droga padrão de referência e foi
infectado apresentou contagem média de 2,05.
Nos grupos tratados com diferentes concentrações da planta Physalis angulata, T5, T6
e T7, as médias de contagem foram de 51,00; 48,78 e 49,67, respectivamente. Estes resultados
indicam que não houve diferença significativa entre grupos tratados com a mesma planta em
diferentes doses e também em relação ao grupo controle sem tratamento. Com relação ao
grupo controle tratado com a droga de referência, podemos verificar que a contagem média é
bastante superior.
Nos grupos tratados com diferentes concentrações da planta Eclipta alba, T8, T9 e
T10, as médias de contagem foram de 80,56; 86,94 e 77,17 respectivamente. Estes resultados
demonstram que não houve diferença significativa entre os grupos tratados com a mesma
planta e também em relação aos controles negativo. Quanto ao grupo tratado com a droga
referência houve diferença, quando utilizamos modelo de Tukey, com intervalo de confiança
de 5%.
Resultados
82
Tabela 10 Contagem total de oocistos coletados aleatoriamente nas fezes realizada no 28º dia
de vida, ou seja, após sete dias da primeira contagem.
Amostra 1 2 3 4 5 6 MR
MD CV
T1R1
0 0 0 0 0 0
0,00
T1R2
0 0 0 0 0 0
0,00
T1R3
0 0 0 0 0 0
0,00
0 0
T2R1
4 14 12 11 12 0
8,83
T2R2
7 3 3 9 6 3
5,17
T2R3
12 3 10 2 2 2
5,17
6,39 0,704
T3R1
0 0 0 0 0 0
0,00
T3R2
0 0 0 0 0 0
0,00
T3R3
0 0 0 0 0 0
0,00
0 0
T4R1
0 0 0 0 0 0
0,00
T4R2
0 0 0 0 0 0
0,00
T4R3
0 0 0 0 0 0
0,00
0 0
T5R1
1 1 4 1 1 1
1,50
T5R2
2 1 1 2 1 4
1,83
T5R3
4 4 4 1 4 6
3,83
2,39 0,690
T6R1
1 1 1 1 2 1
1,17
T6R2
0 3 2 6 1 3
2,50
T6R3
0 4 3 5 8 6
4,33
2,67 0,861
T7R1
5 3 7 5 8 1
4,83
T7R2
2 1 7 7 5 3
4,17
T7R3
2 0 1 3 2 5
2,17
3,72 0,663
T8R1
0 1 1 0 1 0
0,50
T8R2
0 0 2 0 1 0
0,50
T8R3
0 0 0 2 1 0
0,50
0,5 1,420
T9R1
7 4 6 8 4 13
7,00
T9R2
13 18 14 13 14 10
13,67
T9R3
16 11 10 11 17 6
11,83
10,8 0,398
T10R1
13 11 18 11 20 15
14,67
T10R2
18 15 12 16 15 21
16,17
T10R3
12 18 13 14 21 11
14,83
15,2 0,225
Legenda:
MR = média das replicatas/ MD = média geral dos tratamentos/CV = coeficiente de variação
Azul : controle / Vermelho: droga referência/ Roxo: Physalis/ Verde: Eclipta
Resultados
83
A contagem de oocistos nas fezes foi realizada também no 28º dia de vida, para
verificar se havia ocorrido algum indício de melhoria no quadro geral das aves que
ocasionasse a redução da postura de oocistos nas fezes. O grupo controle não tratado e não
infectado (T1) e os grupos tratados com droga de referência (T3 e T4) apresentaram contagem
zero, resultado importante para assegurar a manutenção da sanitariedade nos controles e,
portanto, validar o procedimento de alojamento.
O grupo não tratado e infectado (T2) que é o controle positivo, teve a média abaixada
para 6,39 oocistos. Os resultados obtidos para a Physalis angulata dos grupos (T5, T6 e T7)
foram de 2,39; 2,67 e 3,72. Contagem similar à primeira contagem, onde não houve
significância com relação ao controle. Porém, a média dos três tratamentos foi menor que a do
grupo não tratado. No caso da E. alba as médias variaram bastante, sendo de 0,50; 10,83 e
15,22. No entanto, não houve significância em relação ao grupo controle não tratado. Houve
significância em relação ao grupo tratado com a droga de referência, porém, não existe
comprovada efetividade. Importante verificar que no caso da Eclipta alba a menor dose foi
mais eficiente. Isto pode indicar que as frações das plantas podem de alguma forma contribuir
para minimizar os quadros de infecção em granjas com reutilização de camas.
4.4. Avaliação macroscópica dos cecos das aves infectadas
Avaliações realizadas no 21º e 42º dias de vida, sendo que no primeiro abate foram
sacrificadas apenas três aves de cada repetição. No abate final o restante das aves foi
sacrificado para necropsia da porção cecal. As aves foram sacrificadas por deslocamento
vertebral. A localização da lesão no intestino e o valor de escore são fatores importantes na
determinação da eficácia da infecção experimental, na validação da pureza da cepa e na
avaliação da eficácia de possíveis drogas de ação anticoccidiana.
Resultados
84
4.4.1. Determinação do escore de lesão no ceco das aves no 21º dia de vida
4.4.1.1. Escore de lesão no ceco das aves dos grupos controle
A B C
Figura 32: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T1).
Grupos T1: controles não medicados. A: T1R1; B: T1R2 e C: T1R3.
Os grupos T1 com as replicatas R1, R2 e R3, foram os controles sem inóculo e sem
tratamento. Os cecos não apresentaram qualquer tipo de lesão, hemorragia, alteração nas
paredes e ou nos conteúdos, somente uma ligeira hiperemia. Verifica-se na Figura 32 na
imagem A que na porção mediana, ou seja, no intestino grosso, aparecem em duas aves uma
lesão redonda avermelhada, diagnosticada como típica de infecção bacteriana. Esta infecção
foi provavelmente causada por enterobactérias, de acordo com parecer da médica veterinária
Dra. Milenni Michels, que auxiliou nas necropsias.
Resultados
85
A B C
Figura 33: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T2).
Grupos T2: controles não tratados e infectados. A: T2R1; B: T2R2 e C: T2R3.
Os grupos T2 com as replicatas R1, R2 e R3, foram os controles com inóculo e sem
tratamento. Os cecos apresentaram escore de lesão +3 e presença de sangue hemorrágico e
coagulado. Os cecos apresentaram petéquias ou pontos vermelhos com bordas abertas
disseminadas (Figura 33). O conteúdo cecal estava mais endurecido e as paredes mais
espessas e encurtadas. Detectou-se a presença de muco e hemorragia. Resultados importantes
para validar procedimento de infecção e virulência da cepa.
A B C
Figura 34: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T3).
Grupos T3: controles com droga referência. A: T3R1; B: T3R2 e C: T3R3.
Resultados
86
Os grupos T3 com as replicatas R1, R2 e R3, foram os controles sem inóculo e com
tratamento, ou seja, os medicados com droga referência salinomicina. Os cecos não
apresentaram qualquer tipo de lesão ou hemorragia, conforme se observa na Figura 34.
Visualiza-se uma ligeira alteração nas paredes, com sua espessura mais fina e também nos
conteúdos cecais, que estavam bastante pastosos e com odor fétido mais forte que o normal.
A B C
Figura 35: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T4).
Grupos T4: controles com droga referência e infectados. A: T4R1; B: T4R2 e C: T4R3.
Os grupos T4 com as replicatas R1, R2 e R3, foram os controles inoculados e tratados
com droga referência salinomicina. Os cecos não apresentaram qualquer tipo de lesão ou
hemorragia. Em algumas aves apareceram pontos avermelhados na porção inicial do ceco,
que poderiam ser diagnosticadas como lesões por enterobactérias. Verificou-se uma ligeira
alteração nas paredes, que estavam mais delgadas e nos conteúdos cecais, que estavam
bastante endurecidos, conforme evidenciado na Figura 35, imagens A e C, ceco disposto no
meio da foto.
Resultados
87
4.4.1.2. Escore de lesão intestinal das Aves medicadas com Physalis angulata
A B C
Figura 36: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T5).
Grupos T5: Physalis 40 ppm. A: T5R1; B: T5R2 e C: T5R3.
Os grupos T5 com as replicatas R1, R2 e R3, foram inoculados e tratados com a fração
purificada de P.angulata a 40 ppm. Os cecos apresentaram escore de lesão +3 em sete aves e
+2 em duas aves. O conteúdo cecal estava sanguinolento, endurecido e com muco (região
escura nas fotos). As paredes estavam espessadas e ligeiramente encurtadas. Verifica-se na
Figura 36 imagens A, B e C, a presença de petéquias ou pontos vermelhos com bordas abertas
disseminadas em todo o ceco.
A B C
Figura 37: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T6).
Grupos T6: Physalis 80 ppm. A: T6R1; B: T6R2 e C: T6R3.
Resultados
88
Os grupos T6 com as replicatas R1, R2 e R3, foram inoculados e tratados com a fração
purificada de P.angulata a 80 ppm. Os cecos apresentaram escore de lesão +3 em sete aves e
+2 em duas aves. O conteúdo cecal estava bastante endurecido e com presença de sangue
coagulado. As paredes estavam um pouco espessadas e ligeiramente encurtadas. Verifica-se
na Figura 37 fotos A, B e C, a presença de petéquias mais esparsas com predominância na
porção inicial do ceco (conforme indicado pelas setas). O íleo continha muco purulento.
A B C
Figura 38: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T7).
Grupos T7: Physalis 120 ppm. A: T7R1; B: T7R2 e C: T7R3.
Os grupos T7 com as replicatas R1, R2 e R3, foram inoculados e tratados com a fração
purificada de P.angulata a 120 ppm. Os cecos analisados apresentaram escore de lesão +3 em
sete aves e +2 em duas aves. O conteúdo cecal estava bastante endurecido com pouca
presença de sangue. As paredes estavam mais espessadas e ligeiramente encurtadas. Verifica-
se na Figura 38, imagens A, B e C, a presença de petéquias mais esparsas com predominância
na porção inicial do ceco (conforme destacado pelas setas).
]
Resultados
89
4.4.1.3. Escore de lesão intestinal das Aves medicadas com Eclipta Alba
A B C
Figura 39: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T8).
Grupos T8: Eclipta 40 ppm. A: T8R1; B: T8R2 e C: T8R3.
Os grupos T8 com as replicatas R1, R2 e R3, foram inoculados e tratados com a fração
purificada de E. alba a 40 ppm. Os cecos analisados apresentaram escore de lesão +3 em
todas as aves. O conteúdo cecal estava endurecido com ligeira hemorragia. As paredes
estavam um pouco mais espessadas e ligeiramente encurtadas. Verifica-se na Figura 39,
imagens A, B e C, a presença de petéquias mais abundantes e disseminadas por todo o ceco.
A B C
Figura 40: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T9).
Grupos T9: Eclipta 80 ppm. A: T9R1; B: T9R2 e C: T9R3.
Resultados
90
Os grupos T9 com as replicatas R1, R2 e R3, foram inoculados e tratados com a fração
purificada de E. alba a 80 ppm. Os cecos analisados apresentaram escore de lesão +3 em
todas as nove aves. O conteúdo cecal estava bastante endurecido com presença de sangue
coagulado. As paredes estavam bastante espessadas e encurtadas. Verifica-se na Figura 40,
imagens A, B e C, a presença de muitas petéquias disseminadas por todo o ceco.
A B C
Figura 41: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T10).
Grupos T10: Eclipta 120 ppm. A: T10R1; B: T10R2 e C: T10R3.
Os grupos T10 com as replicatas R1, R2 e R3, foram inoculados e tratados com a
fração purificada de E. alba a 120 ppm. Os cecos analisados apresentaram escore de lesão +3
em todas as nove aves. O conteúdo cecal estava bastante endurecido com presença de sangue
hemorrágico e muco. As paredes estavam bastante espessadas e encurtadas. Verifica-se na
Figura 41, imagens A, B e C, a presença de muitas petéquias disseminadas por todo o ceco.
Resultados
91
4.4.2. Determinação do escore de lesão intestinal no 42º dia de vida
As aves foram abatidas após um período de sete dias de carência ou de retirada. Foi
realizado o abate final com necropsia de todas as aves restantes do grupo. Os frangos foram
mortos por deslocamento cervical após jejum prévio de 2 horas, de modo a facilitar a
necropsia, de acordo com boas práticas clínicas. As fotos escolhidas para as figuras abaixo
são de duas ou de quatro aves. No entanto, todos os cecos foram necropsiados e fotografados
para determinação do grau de lesão. Os grupos controle infectados serviram de controle para
validação da infecção experimental e determinação da pureza da cepa inoculada.
4.4.2.1 Escore de lesão intestinal dos Grupos Controle não inoculados
A B C
Figura 42: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T1).
Grupos T1: controle não tratado.A: T1R1; B: T1R2 e C: T1R3.
Os grupos T1 com as replicatas R1, R2 e R3, não apresentaram nenhum tipo de lesão.
Os cecos de todas as 23 aves e o conteúdo cecal estavam normais. As paredes do intestino se
apresentavam um pouco hiperêmicas, fato que poderia estar relacionado a uma ligeira
infecção por enterobactérias, conforme Figura 42.
Resultados
92
A B C
Figura 43: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T3).
Grupo T3: controle droga de referência. A: T3R1; B: T3R2 e C: T3R3.
Os grupos T3 com as replicatas R1, R2 e R3, não apresentaram nenhum tipo de lesão
em todas as 21 aves. O conteúdo cecal estava pastoso e as paredes bastante finas, porém com
tamanho normal. As paredes do íleo se apresentavam um pouco hiperêmicas, conforme Figura
43.
4.4.2.2. Escore de lesão intestinal dos Grupos Controle Infectados
A B C
Figura 44: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T2).
Grupos T2: controles não tratados. A: T2R1; B: T2R2 e C: T2R3.
Resultados
93
Os grupos T2 com as replicatas R1, R2 e R3, apresentaram cecos com escore de lesão
+1 em 16 aves, +2 em quatro aves e 0 em três aves. O conteúdo cecal estava mais liquefeito e
a parede intestinal com aparência de recuperação. O ceco estava com tamanho normal e
presença de poucas petéquias somente na porção inicial, conforme Figura 44.
A B C
Figura 45: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T4).
Grupos T4: controle droga referência.A: T4R1; B: T4R2 e C: T4R3.
Os grupos T4 com as replicatas R1, R2 e R3, apresentaram escore de lesão +1 em
quatro aves e 0 (zero) em 18 aves. O conteúdo cecal estava liquefeito e com muitos gases.
Observaram-se paredes mais finas e distendidas, com presença de petéquias em algumas aves
na poção inicial, conforme Figura 45.
Resultados
94
4.4.2.3. Escore de lesão intestinal das Aves medicadas com Physalis angulata
A B C
Figura 46: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T5).
Grupos T5: Physalis 40 ppm. A: T5R1; B: T5R2 e C: T5R3.
Os grupos T5 com as replicatas R1, R2 e R3 (P. angulata a 40 ppm), apresentaram
cecos com escore de lesão +1 em 16 aves e zero em seis aves. O conteúdo cecal estava
liquefeito com presença de gases em uma das replicatas e normal nas outras duas. As paredes
do ceco estavam normais, em fase de recuperação. Havia presença de petéquias em algumas
aves na poção inicial do ceco, conforme Figura 46.
A B C
Figura 47: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T6).
Grupos T6: Physalis 80 ppm. A: T6R1; B: T6R2 e C: T6R3.
Resultados
95
Os grupos T6 com as replicatas R1, R2 e R3 (P.angulata a 80ppm), apresentaram
cecos com escore de lesão +1 em 22 aves e zero em duas aves. O conteúdo cecal estava
liquefeito com presença de gases na maioria das aves. As paredes do ceco estavam um pouco
distendidas, coloração normal, e presença de petéquias em algumas aves na poção inicial do
ceco, conforme Figura 47.
A B C
Figura 48: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T7).
Grupos T7: Physalis 120 ppm. A: T7R1; B: T7R2 e C: T7R3.
Os grupos T7 com as replicatas R1, R2 e R3 (P.angulata a 120 ppm), apresentaram
cecos com escore de lesão +1 em 23 aves. O conteúdo cecal estava líquido com presença de
gases em duas replicatas, em algumas aves o conteúdo estava mais endurecido com aparência
diferenciada. As paredes do ceco estavam normais, com. presença de petéquias em algumas
aves na poção inicial do ceco, conforme Figura 48.
Resultados
96
4.4.2.4 Escore de lesão intestinal das Aves medicadas com Eclipta Alba
A B C
Figura 49: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T8).
Grupos T8: Eclipta 40 ppm. A: T8R1; B: T8R2 e C: T8R3.
Os grupos T8 com as replicatas R1, R2 e R3 (E. alba a 40 ppm), apresentaram cecos
com escore de lesão +1 em 24 aves. O conteúdo cecal estava normal, assim como o tamanho e
a coloração das paredes. Havia presença de petéquias em algumas aves na porção inicial do
ceco, conforme se verifica na Figura 49.
A B C
Figura 50: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T9).
Grupos T9 Eclipta 80 ppm. A: T9R1; B: T9R2 e C: T9R3.
Resultados
97
Os grupos T9 com as replicatas R1, R2 e R3 (E. alba a 80 ppm) apresentaram cecos
com escore de lesão +1 em 23 aves. O conteúdo cecal estava pastoso na maioria e diarréico
em três aves. As paredes do ceco se apresentavam um pouco mais espessas e encurtadas, com
presença de um pouco mais de petéquias na porção inicial e mediana do ceco, conforme
Figura 50.
A B C
Figura 51: Avaliação macroscópica do ceco das aves (T10).
Grupos T10: Eclipta 120 ppm. A: T10R1; B: T10R2 e C: T10R3.
Os grupos T10 com as replicatas R1, R2 e R3 (E. alba a 120 ppm) apresentaram cecos
com escore de lesão +1 em 23 aves. O conteúdo cecal estava em algumas aves pastoso e
normal na maioria das aves. As paredes do ceco se apresentavam um pouco mais espessas e
encurtadas, com presença de petéquias na porção inicial e mediana do ceco, conforme Figura
51.
DISCUSSÃO
Discussão
98
5. DISCUSSÃO
A Biotecnologia Vegetal como fonte de novos ativos
O controle efetivo de parasitas através do uso de produtos químicos convencionais tem
encontrado graves problemas. A alta resistência dos agentes patogênicos, somado ao
problema de resíduos que os medicamentos podem deixar na carne, ovos e/ou leite tem
agravado o panorama geral do uso de fármacos no controle de parasitoses. Pesquisas
científicas em parasitologia têm sido grandemente impulsionadas para a busca por produtos
inovadores que reduzam os fatores acima citados. Este projeto de pesquisa teve como
propósito testar medicamentos à base de fitocomplexos de forma padronizada, através de
experimentos in vivo para eliminar parasitas responsáveis pela eimeriose aviária. Pesquisas
desenvolvidas com ativos de plantas são muito importantes na atualidade, principalmente, na
área de saúde animal (CHAGAS, 2004).
De acordo com FRANÇA (2001) a Biotecnologia vegetal tem contribuído
significativamente para a resolução de diversos problemas em sanidade humana e animal. O
modelo de experimentação de plantas como fonte de ativos medicamentosos ou de novas
moléculas com atividade terapêutica, deve certamente ser um dos mais promissores caminhos
na pesquisa de novas drogas com atividade terapêutica. Aspectos importantes tais como o
efeito sinérgico dos componentes, mecanismos de ação associados, menores efeitos colaterais
e, sobretudo, menores custos de pesquisa indicam a pesquisa nesta área como um campo
promissor.
Tanto do ponto de vista científico como econômico, a descoberta de novos fármacos é
muito dispendiosa para as grandes corporações farmacêuticas. Os processos biotecnológicos
utilizando plantas ou outros organismos vivos como agentes terapêuticos, geralmente
aparecem como uma alternativa importante e menos dispendiosa (YUNES et al, 2001).
Discussão
99
O pré-teste
Infecção experimental in vivo
A fase de pré-teste definiu a quantidade ou volume de inóculo, a linhagem da cepa e
também a contagem de oocistos ideais para o inóculo. Considerando que as cepas de Eimeria
spp parasitam o intestino de aves, com ciclo de vida bifásico intracelular, praticamente não
existem protocolos para teste de Eimeriose in vitro, devido à elevada complexidade e pouca
adequação metodológica.
O cultivo e a propagação deste parasito in vitro são muito difíceis, havendo
necessidade de uma passagem in vivo para que sua virulência seja restabelecida. A simples
manutenção das cepas in vitro promove uma diminuição na virulência natural e no poder de
infectividade. A dificuldade no cultivo de estágios parasitóforos intermediários, que
dependem de condições laboratoriais e biotérios especiais inviabilizam os experimentos.
Todos os modelos experimentais encontrados em recentes publicações descrevem
experimentos para estudo de agentes anticoccidianos in vivo (DU & HU, 2004; GIANENNAS
et al, 2003; EL-ABASY et al, 2003; GUO et al, 2005; FAJIMI & TAIWO, 2005).
SHIRLEY (2004) discorre sobre a importância e os cuidados em experimentos
conduzidos com agentes altamente patogênicos, como as Eimerias, são desafios adicionais,
pois exigem instalações e manejo apropriados. Procedimentos com aves infectadas
experimentalmente exigem que após o término dos testes seja efetuada a perfeita limpeza e
desinfecção de todos os equipamentos e do alojamento, os quais foram realizados para evitar a
contaminação entre experimentos e, também, para que não ocorresse a disseminação e ou
contaminação de aves da região. O pessoal responsável deve ser treinado e possuir
experiência nos cuidados e tratamento das aves.
Discussão
100
O arraçoamento e fornecimento de água são fatores importantes, visto que, além da
avaliação de sintomas clínicos característicos da infecção, também se consideram os índices
zootécnicos. Portanto não podem ocorrer desperdícios de ração e o fornecimento desta deve
ser verificado diariamente (CONY & ZOCHE, 2004).
A espécie escolhida para o experimento foi a Eimeria tenella, devido a características
importantes, dentre as quais, o alto índice de infecção desta em granjas brasileiras e mundiais;
a facilidade de propagação in vivo, condição ótima para repique e obtenção de inóculo; baixa
imunogenicidade, que evita interferências no teste; e a alta patogenicidade. Para infecção
experimental as cepas testadas foram previamente submetidas a testes de biologia molecular
desenvolvidos pelo grupo do Dr. Arthur Gruber, da Universidade de São Paulo (USP), que
asseguraram a pureza das linhagens. As cepas testadas foram a MD e a H. A primeira cepa foi
obtida através de colheita em granjas do território brasileiro e a segunda cepa foi isolada no
Reino Unido e está sendo utilizada por um grupo de cientistas para determinar o genoma desta
espécie através de um consórcio mundial (SHIRLEY, 2004).
Qualidade, quantidade e volume de inóculo para experimento
O protocolo de infecção para causar coccidiose é muito variável e depende de uma
série de fatores, tais como a espécie escolhida; a linhagem das cepas; as condições de
obtenção das cepas; o tipo do experimento (em boxes ou gaiolas); o período do ano; o clima
do local do experimento, etc.
O modelo utilizado, de acordo com o guia da WAAVP, preconiza que a quantidade ideal
de inóculo deve variar entre 1.10
4
e 1.10
5
oocistos /ml. A administração deve ocorrer em
pequenos volumes, de forma lenta, para evitar que as aves inalem o inóculo, que poderia ser
Discussão
101
introduzido pela via respiratória, uma condição altamente indesejável (HOLDSWORTH et al,
2004).
As lesões causadas pela cepa MD, nas diferentes concentrações inoculadas 10.000;
20.000; 50.000 e 100.000 oocistos por ave, seguiram um mesmo padrão, com grave
encurtamento do ceco, presença de petéquias abundantes, porém com pouca hemorragia. As
lesões ocasionadas pela cepa H, nas mesmas concentrações, seguiram também um mesmo
padrão, porém, apresentaram maior grau de hemorragia, paredes um pouco menos encurtadas
e petéquias mais abundantes. Nenhuma ave morreu.
ROSTAGNO (2005) publicou tabelas com valores ideais de índices zootécnicos para a
linhagem Cobb®. O resultado deveria ser de aproximadamente 1,150 e foi de 1,392. Estes
resultados ruins se deveram ao baixo número de aves utilizadas, com poucas repetições,
impossibilitando uma análise estatística mais precisa. Houve também problemas nos
comedouros com desperdício de ração e, conseqüente, aumento da taxa de conversão. Todos
os fatores que influenciaram de forma negativa os resultados do pré-teste foram importantes
para que pudessem ser efetuadas as adequações necessárias no que tange ao manejo das aves
para a execução do experimento padrão.
Após observação criteriosa dos resultados obtidos, a cepa escolhida foi à linhagem de
cepa H (Hougton), na concentração de 20.000 oocistos por inóculo e com volume menor que
0,5 ml por ave.
Discussão
102
Experimento padrão
Protocolo de avaliação
Os critérios mais importantes na avaliação de novas drogas anticoccidianas, são os
índices zootécnicos, de acordo com HOLDSWORTH (2004). A criação intensiva de aves está
totalmente calcada em fatores econômico-financeiros, onde o critério para eleição de um novo
programa de tratamento deve considerar as taxas de conversão alimentar para melhor
aproveitamento da ração. As avaliações da parte clínica são importantes, e podemos salientar
que formas de controle para evitar a re-infecção de novos lotes de criação, teria elevada
importância, principalmente em paises onde é habitual o reaproveitamento da cama das aves.
Os sinais clínicos podem ser considerados secundários quando se trata de frangos de corte,
visto dificuldade de diagnóstico em grandes aviários.
Os programas de controle em uso atualmente levam em consideração a toxicidade das
drogas e os resíduos que estas podem deixar na carne. Estes são os principais fatores que
auxiliam os veterinários na escolha da melhor droga ou programa, que utilizam o sistema de
rotações ou ainda alternam programas mistos de tratamento, incluindo uma etapa de
vacinação (CHAPMAN et al, 2004). Atualmente, os ionóforos são os produtos que possuem
menor toxicidade e mecanismo de ação mais eficaz, devido ao desenvolvimento de resistência
mais lento. Esta classe é largamente utilizada em programas de manejo nas granjas brasileiras
e internacionais (REVOLLEDO & FERREIRA, 2005). A droga eleita e utilizada como
referência foi um ionóforo denominado Salinomicina, na dose de 66 ppm, a qual foi
adicionada à ração, segundo indicação da bula e de acordo com trabalho recente de
CHAPMAN (2004).
As aves foram avaliadas semanalmente com análise estatística dos dados obtidos, os
quais foram submetidos à análise de variância pelo procedimento do SAS® Institute (2001), e
as médias comparadas pelo teste de Tukey com significância de 5 %.
Discussão
103
Mortalidade
O número de mortes ocorridas durante o experimento, conforme Tabela 6 e Quadro 4,
foi muito baixo, atingindo valores de no máximo 1,5%. Algumas aves foram eliminadas ou
retiradas do teste, por apresentarem defeito genético nas pernas, prejudicando o consumo de
ração, o que poderia prejudicar os índices zootécnicos. O número de mortes foi bem inferior
ao descrito por DAKPOGAN (2003), onde a taxa de mortalidade para aves tratadas com
drogas comerciais foi de 11% e para as plantas medicinais testadas de 41%.
Apenas quatro aves morreram durante todo o experimento. O maior número de aves
mortas aconteceu no grupo das aves que receberam a droga de referência salinomicina, no
grupo controle sem inóculo (duas mortes). Também houve duas mortes, de causa
desconhecida, nos grupos T4 e T5, respectivamente, grupos que receberam Salinomicina com
inóculo e Physalis 40ppm. Estas mortes, de causa desconhecida, ocorreram antes da infecção
experimental. Outra morte ocorreu no grupo que recebeu a Eclipta 80 ppm, uma semana após
receber o inóculo. Podemos inferir que os fitomedicamentos testados provavelmente não
apresentaram qualquer grau de toxicidade para as aves, visto que nenhuma morte aconteceu
antes do inóculo e ainda pelo fato de que o índice de mortalidade, de 1,5%, foi extremamente
baixo, sendo que os índices de mortalidade descritos por COLNAGO (2004) variam entre 5 e
20%.
Avaliação da Conversão alimentar
O efeito dos fitocomplexos na taxa de conversão alimentar, ou seja, a relação direta
entre consumo e ganho de peso, não foi significativa até o 14º dia de vida, quando ocorreu a
infecção experimental. A partir do 21º dia de vida, ou seja, após período pré-patente, 138
horas após a infecção, onde esta se apresenta no estágio mais grave, puderam ser observadas
mudanças nas taxas de conversão alimentar.
Discussão
104
No 21º dia de vida, as aves que apresentaram o melhor resultado zootécnico foram as
do grupo que recebeu a droga de referência. Os grupos tratados com Salinomicina e não
infectados (T3) apresentaram o melhor valor de conversão alimentar. Os grupos que
receberam Physalis 40 ppm (T5) e Eclipta 120 ppm (T10) obtiveram os piores resultados de
conversão alimentar. Os demais grupos apresentaram valores intermediários, inclusive os
controles sem nenhum tipo de tratamento.
No 35º dia de vida, as aves passaram a receber ração sem medicamentos, para que
pudesse ser respeitado o período de carência de sete dias antes do abate. Os resultados não
apresentaram muitas diferenças quando se verificam os resultados obtidos no 28º dia de vida.
Os resultados de cada semana podem ser encontrados nos Apêndice- Anexo E, F, H e I..
No 42º dia de vida, ou seja, no dia do abate final, puderam ser verificados resultados
diferentes. As aves com melhor desempenho foram a do grupo (T3), tratadas com droga
referência e sem inóculo. As aves sem medicação dos grupos (T1), sem inóculo e (T2), com
inóculo, bem como as do grupo (T4), droga de referência e inóculo e as do grupo (T7),
Physalis 120 ppm, apresentaram resultados intermediários e estatisticamente parecidos quanto
à taxa média de conversão alimentar. Este resultado demonstrou que das duas plantas, assim
como das três doses testadas, somente a Physalis 120 ppm promoveu a melhoria da conversão
alimentar.
Todos os outros grupos obtiveram resultados piores quando se considera P<0,05. O
modelo estatístico adotado está de acordo com HOLDSWORTH (2004).
Discussão
105
Avaliação de parâmetros clínicos
Contagem de oocistos nas fezes
Segundo a WAAVP (2004), os resultados obtidos na contagem dos oocistos
eliminados nas fezes são representativos da resposta das aves ao agente infectivo e ao efeito
da droga em questão que pode reduzir este número por diversos mecanismos biológicos. De
acordo com ESTRADA (2002) a contagem de oocistos nas fezes pode ser realizada tanto em
câmara de Neubauer quanto em câmara de Mcmaster, com resultados estatísticos similares,
confirmados experimentalmente. As metodologias descritas preconizam a contagem dos
oocistos somente no 7º dia após inóculo. No entanto, o protocolo deste experimento definiu
nova contagem no 14º dia, para verificar se haveria alguma reação diferenciada, talvez
imunológica, nas aves tratadas com extratos de plantas medicinais, ou ainda se os
fitocomplexos poderiam de alguma forma reduzir a postura de oocistos de forma a controlar a
extensão da re-infecção durante o manejo praticado em aviários comerciais.
Na primeira contagem de oocistos no 7º após inóculo, o grupo controle sem medicação
apresentou contagem de 62,78 enquanto a menor contagem foi do grupo que recebeu a droga
referência com contagem de 2,06. A contagem de oocistos nas aves tratadas com P. angulata,
com valores médios de 50,0, foi relativamente menor que nas aves tratadas com E. alba, com
valores médios de 81,6. Entretanto estes resultados não tem significância estatística, ou seja
quando se compara os grupos tratados com plantas em relação a droga de referência, os
resultados são muito distantes, sugerindo a pouca efetividade nesta fase. Comparando-se os
grupos tratados com fitocomplexos e os grupos não tratados, os resultados são parecidos e
sem efetividade aparente.
A contagem no 28ºdia de vida, apresentou resultados melhores visto que ocorreu uma
diminuição na postura dos oocistos em todos os grupos tratados, quando se comparam os
valores da primeira contagem. As médias obtidas com aves tratadas com Physalis foram
Discussão
106
bastante próximas entre si e reduziram de 50,0 para 2,50. Quando se comparam, o grupo
controle sem nenhum tipo de medicação e os tratados com diferentes doses de Physalis temos
um valor reduzido de 6,39 para 2,50, respectivamente. No caso da Eclipta houve uma resposta
acentuadamente diferente de acordo com a dose administrada. A menor dose causou redução
drástica na postura, de 80,50 para 0,50; enquanto a maior dose administrada provocou uma
queda bem menor, ou seja, de 80,50 para 15,22, ainda um aumento na postura de oocistos se
considerarmos o controle sem tratamento com contagem média de 6,39. Os grupos tratados
com droga referência não excretaram oocistos nas fezes. Os grupos não infectados também
não excretaram oocistos nas fezes.
A comparação dos resultados globais obtidos dos grupos tratados com fitocomplexos
sugere que os compostos foram ativos, atuando no sentido de inibir alguma das fases de
reprodução do protozoário ou ainda impedindo a invasão celular no epitélio do hospedeiro.
Vale ressaltar que a redução na contagem pode ser uma importante forma de controlar a
infecção em camas reaproveitadas. Um parâmetro importante na validação do procedimento
de infecção e manejo foi a negativação, a contagem zero nos grupos controle não infectados.
Avaliação escore de lesão cecal
JOHNSONS & REID (1970) padronizaram a técnica de avaliação do escore de lesão
intestinal. O Manual de Diagnóstico Avícola da Pfizer, com fotografias de aves infectadas por
Eimerias, foi utilizado no procedimento para auxiliar nos diagnósticos. Os grupos controle
negativo (T1) e (T3) sem inoculação experimental, não apresentaram lesão, validando o
procedimento de manejo. As fotografias com as imagens dos cecos dissecados se encontram
nas Figuras de 28 a 35.
Discussão
107
Os grupos controle (T2) e (T4) inoculados, sem tratamento e com uso da droga de
referência, respectivamente, validaram o procedimento de inoculação, ou seja, confirmaram a
infecção experimental das aves. Nos grupos (T4), com droga de referência, os efeitos da
infecção foram minimizados ou mesmo debelados, o que comprova a efetividade do
tratamento além de assegurar que as aves receberam a droga na dose adequada. Este fato
confirma que o procedimento de mistura utilizado para adicionar os medicamentos à ração
ocorreu de forma adequada.
Os grupos infectados apresentaram lesões características no ceco, porém, as demais
áreas do intestino estavam ilesas, comprovando que a infecção ocorreu exclusivamente por E.
tenella, não havendo contaminação cruzada por outras espécies. A avaliação do escore de
lesão dos cecos das aves não apresentou diferenças significativas, pois, todas as aves
infectadas que receberam fitocomplexos apresentaram sinais característicos de eimeriose, com
lesões disseminadas, hemorragia e encurtamento das paredes cecais.
Alguns estudos demonstram que o escore de lesão não pode ser utilizado como critério
único para determinar a eficácia de novas drogas anticoccidianas. Um dos principais fatores
para que isto ocorra é o efeito “Crowding”(WILLIAMS, 2001).
CONWAY e colaboradores, em 1999, demonstraram que não existe uma correlação
linear entre a dose de oocistos infectantes e o escore de lesão das aves, devido ao efeito de
coroamento. Infecções por algumas espécies de Eimeria apresentam o efeito de coroamento,
que é a relação entre a dose de infecção e o potencial reprodutivo do parasito, onde a
fecundidade decai na medida em que a dose infectante aumenta. A dose na qual este efeito se
manifesta é variável, sendo difícil constatá-lo por técnicas experimentais usuais, exigindo
modelos matemáticos elaborados para complementar a interpretação dos resultados
(JOHNSTON et al, 2001).
CONCLUSÃO
Conclusão
108
6. CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos nos experimentos, de acordo com Guia internacional da
WAAVP, as seguintes conclusões foram obtidas:
O fitocomplexo proveniente da planta medicinal Eclipta alba apresentou resultados
expressivos quando foram avaliados parâmetros clínicos, especificamente na postura
de oocistos nas fezes das aves. A dose de 40 ppm, a menor testada, promoveu uma
redução significativa na excreção de oocistos nas fezes, importante parâmetro para
evitar a re-infecção em aviários onde se reutilizam as camas das aves em diferentes
lotes de criação.
O fitocomplexo oriundo de Physalis angulata apresentou melhores resultados na
avaliação dos índices zootécnicos, mais especificamente no parâmetro de conversão
alimentar. A dose de 120 ppm, a maior testada, foi estatisticamente similar aos
resultados exibidos pelas aves dos grupos que receberam a droga de referência
salinomicina na dose 66 ppm. Este é um parâmetro bastante importante quando se
estudam novas drogas para combate de coccidiose, visto que o ganho financeiro dos
criadores de aves está diretamente relacionado ao bom aproveitamento dos insumos ou
ração.Estes resultados indicam que deveria ser testada uma dose maior que 120 ppm
de Physalis angulata, visto que não foram observados quaisquer indícios de toxicidade
aguda e ou sub-crônica, em qualquer das doses testadas.
A hipótese de se utilizar uma associação de ativos de Physalis angulata e de Eclipta
alba, nas doses mais efetivas de cada uma das plantas, poderia promover um efeito
sinérgico, com melhoria nos índices zootécnicos além dos parâmetros clínicos e
merece ser investigada, também, futuramente.
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas
109
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBUQUERQUE, R. Antimicrobianos como Promotores de Crescimento. In: PALERMO
NETO, J.; SPINOSA, H.S.; GÓRNIAK, S.L. Farmacologia Aplicada à Avicultura. São
Paulo.Ed. Roca, 1 ed.Cap. 9, p.149-160, 2005.
ALLEN, P. C.; LYDON, J.; DANFORTH, H. D. Effects of Components of Artemisia annua
on Coccidia Infecctions in Chickens. Poultry Science, v.76, p. 1156-1163, 1997.
ALLEN, P. C.; FETTERER, R. H. Recent Advances in Biology and Immunobiology of
Eimeria Species and in Diagnosis and Control of Infection with These Coccidian Parasites of
Poultry. Clinical Microbiology Reviews, v.15, p.58-65, 2002.
ALMEIDA, R.T.; PALERMO NETO, J. Uso de Antimicrobianos em Avicultura e o
Desenvolvimento de Resistência Bacteriana. Cap. 10. In: PALERMO NETO, J.; SPINOSA,
H.S.; GÓRNIAK, S.L. Farmacologia Aplicada à Avicultura. São Paulo.Ed. Roca, 1 ed.Cap.
10 p.161-173, 2005.
ALONSO, J. Tratado de Fitofármacos e Nutracêuticos. Rosário, Argentina. Editora
Corpus, 2004.
ANTUNES, K. Panorama da Avicultura Latino Americana. Futuro em Pauta. Avicultura
Industrial. Guia Gessulli. v.6,ed 1135. p.52-55, 2005.
BRANDÃO, G.E; MEDEIROS, J.X. Programa de C&T para Desenvolvimento do
Agronegócio-CNPq. CALDAS, R.A. Agronegócio Brasileiro.MCT. Brasília, CNPq. 2 ed,
p.11-27, 1998.
BARNES, S.; PRASAIN, J. Current Progress in the use of traditional medicines and
nutracêutical. Plant Biology, n.8, p.324-328, 2005.
BRITO, A. Unicamp cria substância para controle de doença de granja. Jornal da
Unicamp.Disponível:<http://www.unicamp.br/unicamp/unicamp/ju/junho2003/ju215pg03.ht
ml.> Acesso: 20 de abril de 2005.
CHAGAS, A.C.S. Controle de Parasitas utilizando extratos vegetais. Revista Brasileira de
Parasitologia Veterinária, v.13, suplemento 1, p.156-160, 2004.
Referências Bibliográficas
110
CHAPMAN, H.D.; MARSLER, P.; LaVORGNAT, M.W. The effects of Salinomycin and
Roxarsone on the performance of Broilers when Included in the Feed for Four, Five, or Six
Weeks and Infected with Eimeria species During the Starter or Grower Phase of Production.
Poultry Science, v.83, p.761-764, 2004.
CHAPMAN, H.D. Origns of coccidiosis research in fowl – First 50th. Avians Disease.
Vol.47:p.1 – 20, 2003.
CHOI, E.M. Investigations of Anti-inflammatory and Antinociceptive activities of Piper
cubeba, Physalis angulata and Rosa hybrida. Journal of Ethnopharmacology, v.89, p.171-
175, 2003.
COLLINS, C.H.; GUIMARÃES,G.L.Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. In:
COLLINS, C.H.& GUIMARÃES,G.L. Introdução a Métodos Cromatográficos. Campinas:
Editora da Unicamp, p.183-238, 1997.
COLNAGO, G.O. Efeito da Coccidiose nas Exigências Nutricionais das Aves. Guia
Exclusive Aves & Suínos. São Paulo, Ano IX, Ed. 15, p.98-101, Maio 2004/Abril 2005.
COMISA-CONFEDERATION MONDIALE DE L’INDUSTRIE DE LA SANTÉ
ANIMALE: Prudent use of antimicrobials (antibiotics). Documentação: reuniões. Bélgica,
1998.
CONY, A.V.; ZOCCHE, A.T. Manejo de frangos de corte In: MENDES, A.A.; NAAS,I.A.;
MACARI, M. Produção de Frangos de Corte. Campinas, SP: Editora Facta, p.117-135,
2004.
CONWAY, D.P.; DAYTON, A.D.; McKENZIE, M.E.Comparative testing of anticoccidials
in broilers chickens: the role of coccidial lesion scores. Poult. Science, v.78, p.529-535, 1999.
CORPET, D.E. Microbiological hazards for humans of Antimicrobial Growth Promoter use in
Animal Production. R. Med. Vet. v.147(12), p.851-862, 1996.
CORRÊA , M.P. Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas
Cultivadas.v.IV.Rio de Janeiro. Editora Imprensa Nacional, 1984.
Referências Bibliográficas
111
DA SILVA, E.N.; SCHIMIDT, G.S.; SALLE, C.T.P.; GODOY, J.C.A. Cadeia produtiva da
avicultura. CALDAS, R.A. Agronegócio Brasileiro.MCT. Brasília, CNPq. 2 ed, p.225-238,
1998.
DAKPOGAN, H.B. Free-range chick Survivability in improved conditions and the effect
of 3 medicinal plants on Eimeria tenella. Dissertação Mestrado. The Royal Vet. And
Agricultural University, Frederiksberg C. Denmark. 2003.
DALLOUL, R. A.; LILLEHOJ, H.S.; SHELLEM, T.A.; DOERR,J.A. Effect of Vitamin A
Deficiency on Host Intestinal Immune Response to Eimeria acervulina in Broiler Chickens.
Poultry Science. v.81, p.1509-1515, 2002.
DELL’PORTO, A.; FERREIRA, A.J.P. Agentes Antiprotozoários. In: SPINOSA, H.S.;
GÓRNIAK, S.L.; BERNARDI, M. M. Farmacologia Aplicada à Medicina Veterinária.
Rio de Janeiro: Guanabara, p.427-438, 2002.
DE SOUZA, A.A.; MARTIN, N.B.; VICENTE, J.R.; GONÇALVES, J.S. Resultado da
Balança Comercial do Agronegócio Paulista de Janeiro a Agosto de 2006. Análises e
Indicadores do Agronegócio.v.1,n.9, setembro, 2006.
DINIZ,G. Controle da Coccidiose: Atualização Técnica. Avicultura de Corte.Disponível em:
<http://www.zoonews.com.br/noticias 2.> Acesso em 15/05/2005.
Di STASI, L.C; SANTOS, E.M.G.; SANTOS, C.M. Plantas Medicinais da Amazônia. São
Paulo. Editora Unesp, 1987.
DU, A; HU, S. Effects of a Herbal Complex Against Eimeria tenella Infecction in Chickens.
J. Vet. Med., Berlin, B 51, p.194-197, 2004.
EL-ABASY, M.; MOTOBU, M.; SHIMURA, K.; NAKAMURA, K.; KOGE, K.;
ONODERA, T.; HIROTA, Y. Protective effects of sugar cane extracts (SCE) on Eimeria
tenella infection in chickens. J. Vet. Med. Sci., v.65, n.8, p.865-871, 2003.
ELVIN-LEWIS, M. Should we be concerned about herbal remedies.Journal of
Ethnopharmacology. v.75, p.141-164, 2001.
Referências Bibliográficas
112
ESTRADA, M.A.J.; JIMENEZ, J.J.C.; GARCIA, V.M.P.; ISAIAS, G.T. Evaluación del
conteo total de ooquistes de Eimeria tenella a partir del ciego o heces, efectuado con la
cámara de mcmaster y el hemocitómetro de neubauer. Vet. Méx. v. 3(1), p.73-79, 2002.
FAJIMI, A.K.; TAIWO, A.A. Herbal remedies in Animal parasitic diseases in Nigeria: a
rewiew. African J. of Biotechnology.v.4, n.4, p.303-307, 2005.
FERNADEZ, S; PAGOTTO, A.H.; KATSUYAMA, A.M.; MADEIRA, A.M.B.N.;
GRUBER, A. A Multiplex PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of
seven Eimeria species that infect domestic fowl. Parasitology, (127), p.317-325, 2003.
FERNADEZ, S.; COSTA, A.C.; MADEIRA, A.M.B.N.; GRUBER, A. Characterization of
SCAR markers of Eimeria spp of domestic fowl and construction of a public relational
database (SCARdb). Microbiology Letters., (238), p.183-188, 2004.
FIGUEIREDO JUNIOR, G.A. Conturbação é a única certeza no mercado global de carnes.
ANUALPEC. P.223-225, 2006.
FRANÇA, S.C. Abordagens Biotecnológicas para Obtenção de Substâncias Ativas. In:
SIMÕES, C.M.O; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G. Farmacognosia da planta ao
medicamento. Florianópolis. Editora da UFSC, p.105-125, 2001.
FRANÇA, S.C.; LOURENÇO, M.V.; ROBERTO, P.G.; JANUÁRIO, A.H. Root Culture of
Physalis angulata induced by Agrobacterium rhyzogenes for production of secondary
metabolites. Second World Congress on Medicinal and Aromatic Plants for Human
Welfare. Mendoza, Argentina, p.389-394, 1997.
FRANÇA, S.C.; BERTONI, B.W.; PEREIRA, A.M.S. Antihepatotoxic agent in
micropropagated plantlets of Eclipta alba. Plant Cell Tissue and Organ Culture, v.40,
p.297-299, 1995.
FORENTIN, L. Entendendo a Questão dos Antibióticos Promotores de Crescimento em
Frangos. Avicultura Industrial. Ed. 1136. Ano 96, n 07, p.62-64, 2005.
Referências Bibliográficas
113
GIANNENAS, I.; FLOROU-PANELI, P.; PAPAZAHARIADOU, M.; CHRISTAKI, E.;
BOTSOGLOU, N.A.; SPAIS, A.B. Effect of dietary supplentation with oregano essential oil
on performance of broilers after experimental infection with Eimeria tenella. Arch. Anim.
Nutr., v.57, n.2, p.99-106, 2003.
GUO, F. C.; KWAKKEL, R.P.; WILLIAMS, B.A.; SUO, X.; LI, W.K.; VERSTEGEN,
M.W.A. Coccidiosis Immunization: Effects of Mushroom and Herb Polysaccharides on
Immune Responses of Chickens Infected with Eimeria tenella. Avian Diseases, v.49, p. 70-
73, 2005.
HOLDSWORTH, P.A.; CONWAY, D.P.; McKENZIE, M.E.; DAYTON, A.D.; CHAPMAN,
H.D.; MATHIS, G.F.; SKINNER, J.T; MUNDT, H.C.; WILLIAMS, R.B. World Association
of the Advanced Veterinary Parasitology WAAVP. Guidelines for Evaluating the Efficacy of
Anticoccidial drugs in Chickens and Turkeys. Veterinary Parasitology. v.121p.189-212,
2004.
JANUÁRIO, A.H.; RODRIGUES FILHO, E.; FRANÇA, S.C. Antimycobacterial Phisalins
from Physalis angulata L (Solanaceae). Phytotherapy Research, v.16, p.445-448, 2002.
JAYATHIRTHA, M.G.; MISHRA, S.H. Preliminary Immunomodulatory activities of
methanol extracts of Eclipta alba and Centella asiatica. Phitomedicine, v.11, p.361-365,
2004.
JOHSON, J.; REID, W.M. Anticoccidial Drugs: Lesion Scoring Techniques in Battery and
floor-pen Experiments with Chickens. Experimental Parasitology, v.28, p.30-36, 1976.
JOHNSTON, W.T.; SHIRLEY, M.W.; SMITH, M.B.; GRAVENOR, M.B. Modelling host
cell avaibility and crowding effect in Eimeria infections.Intern. Journal for Parasitology,
v.31,p.1070-1081, 2001.
KAWAZOE, U. Espécies Aviárias do Gênero Eimeria e suas Características. Guia Exclusive
Aves & Suínos. São Paulo, Ano IX, Ed. 15, p. 94-97, período de Maio 2004/Abril 2005.
KAWAZOE, U. Enfermidades Parasitárias: Coccidiose. In: BERCHIERI JÚNIOR, A.;
MACARI, M. Doenças das Aves. São Paulo: Ed. Facta, p.390-405, 2000.
Referências Bibliográficas
114
LACHMAN,L.; LIEBERMAN, H.A.; KANIG, J.L. Operações Unitárias em Farmácia. Seção
I. Teoria e Prática na Indústria Farmacêutica. Vol. I Berna. Lisboa.Fund. Calouste
Golbekian, p.3-35, 2001.
LIN, Y. S.; CHIANG, H.C.; KAN, W.S.; HONE, E.; SHIH, S.J.; WON, M.H.
Immunomodulatory Activity of Various Fractions Derived from Physalis angulata L extract.
Am. J. Chinese Med. v.20, p.233-243, 1992.
LONG, P.L.; MILLARD, B.J.; JOYNER, L.P.; NORTON, C.C. A Guide to Laboratory
Techniques used in Study and Diagnosis of Avian Coccidiosis. Fol. Vet. Latin, v.6, p.201-
217, 1976.
LOPES, R. J. Milho transgênico vai atacar doença de galinhas. Herbário. Disponível em:
<http://www.herbario.com.br/atual104/2811graogalinh.htm.> Acesso: 11 de Janeiro de 2005.
LOPES, J.L.C. Cromatografia em Camada Delgada. In: COLLINS, C.H.; GUIMARÃES,G.L.
Introdução a Métodos Cromatográficos. Campinas: Editora da Unicamp, p.45-56, 1997.
LORENZI,, H.; MATOS, F.J.A. Plantas Medicinais no Brasil: nativas e exóticas
cultivadas. Nova Odessa, SP. Editora Plantarum de Estudos da Flora Ltda, 2002.
MATEKAIRE, T.; BWAKURA, T.M. Ethnoveterinary Medicine: a potential Alternative to
Orthodox Animal Health Delivery in Zimbabwe. Intern J Appl Res Vet Med, v.2, n.4,
p.269-273, 2004.
McDOUGALD, L.R. Coccidiosis. Diseases of Poultry. 11º ed.Ed. Univesity Press. Iowa
State, 2003.
NAGAFUJI, S.; OKABE, H.; AKAHANE, H.; ABE, F. Trypanocidal Constituents in Plants.
Whitanolóides from aerial parts of Physalis angulata. Biol.Pharm. Bull. v.27(2), p.193-197,
2004.
NAKAMAE, I.J. ANUALPEC 2005. Anuário da Pecuária Brasileira. Instituto FNP, 2005.
NURIT SILVA, K.; AGRA, M.F. Estudo farmacobotânico comparativo entre Niandra
physalodes e Physalis angulata ( Solanaceae). Rev. Brasileira de Farmacognosia. 15(4),
p.344-351, 2005.
Referências Bibliográficas
115
OJALA, T. Biological Screening of Plant Coumarins. Dissertação mestrado. Helsinki. 2001
PALERMO NETO, J. Considerações Gerais sobre o uso de Promotores de Crescimento. In:
SPINOSA, H.S.; GÓRNIAK, S.L.; BERNARDI, M. M. Farmacologia Aplicada à Medicina
Veterinária. Rio de Janeiro. Ed. Guanabara, 3º ed. p.523-527, 2002.
PEREIRA, A.M.S.; BERTONI, B.W.; FRANÇA, S.C. Soil pH and Production of Biomass of
Wedelolactone in Field Grown from Eclipta alba. Journal of Herbs, Spices & Medicinal
Plants, v. 6(1), p.43-48, 1998.
PIERONI, A.; HOWARD, P.; VOLPATO, G.; SANTORO, R.F. Natural Remedies and
Nutraceuticals used in ethnoveterinary Pratices in Inland Southern Italy. Veterinary
Research Communications, v.28, n.1, p.55-80, 2004.
PIETHAN e SILVA, R.M. A Influenza Aviária e as Exportações brasileiras de frango. Acesso
em http://www.avisite.com.br/notícias; acesso em 19 mar. 2006.
PIETRO, C.L.R.; JANUARIO, A. H.; FRANÇA, S. C. In Vitro Antimycobacterial Activities
of Physalis angulata L. Phytomedicine, v.74, p.335-338, 2000.
PINHEIRO, L.E.L; MEDEIROS, J.X.; CALDAS, R.A.; MIZUTA, K.; GAMA, G.B.M.N.;
KUABARA, M.Y.; CUNHA, P.R.D.L. Experiência na Indução de Demanda em C&T no
âmbito do Agronegócio-CNPq. CALDAS, R.A. Agronegócio Brasileiro.MCT. Brasília,
CNPq. 2 ed, p.27-46, 1998.
PINHEIRO, M.R. Manejo de Frangos. Campinas. Ed. FACTA, 1º ed, p.1-157, 1994.
PIPPI SALLE, C.T.;DA SILVA, A.B. Prevenção de Doenças/Manejo profilático/
Monitoração.In: BERQUIERI JÚNIOR, A. & MACARI, M. Doença das Aves. Campinas.Ed.
FACTA, 1º ed, p.01-13, 2000.
QUEVEDO, A.C. Aves com Jeito Latino. Avicultura Industrial, v.07, ano 96,ed 1136, p.88-
104, 2005.
REVOLLEDO, L.; FERREIRA, A.J.P. Anticoccidianos. In: PALERMO NETO,J.; SPINOSA,
H.S.; GÓRNIAK, S.L. Farmacologia Aplicada à Avicultura. São Paulo.Ed. Roca, 1 ed.
p.189-200, 2005.
Referências Bibliográficas
116
ROPPA, F. Promotores Naturais de Crescimento. Ave World. São Paulo, p.3-7, Maio, 2005.
ROSTAGNO, H.S. Tabelas Brasileiras para Aves e suínos. Composição de Alimentos e
Exigências nutricionais. 2ª Edição. Viçosa, MG .Editora da Universidade Federal de Viçosa,
2005.
RYLEY, J.F.; MEADE, R.; ROBINSON, T.E. Methods in coccidiosis research: separation of
oocysts from faeces. Parasitology, v.73, p.311-326, 1976.
SANDES, A. R. R.; DI BLASI, G. Biodiversidade e Diversidade Química e Genética.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, p.28–32, 2005.
SAS® Institute. SAS/STAT Software, Release 8.2. Institute, Inc., Cary, NC. 2001.
SAWANT, M.; ISAAC, J.C.; NARAYANAN, S. Analgesic Studies on Total Alkaloids and
Alcohol Extracts of Eclipta alba (Linn.) Hassk. Phytotherapy Research. v.18, p.111-113,
2004.
SHIRLEY, M.W.; AL IVENS ; MADEIRA, A.M.B.N.; GRUBER, A.; WAN, K-L.; DEAR,
P.H.; TOMLEY, F.M. The Eimeria genome projects: a sequence of events. Trends in
Parasitology, (20), p.199-201, 2004.
SILVA, G.L; LEE, I.; KINGHORN, A.D. Special problems with the extraction of plants. In:
CANNELL, R.J.P. Natural Products Isolation. II Series: Methods in Biotechnology. New
Jersey. Editora Humana Press, p.343-365, 1998.
SYED, S.D.; DEEPAK, M.; YOGISHA, S.; CHANDRASHEKAR, A.P.;
MUDDARACHAPPA, K.A.; D’SOUZA, P.; AGARWAL, A.; VENKATARAMAN, B.V.
Trypsin Inhibitory Effect of Wedelolactone and Demethylwedelolactone. Phytotherapy
Research, v.17, p.420-421, 2003
TINÔCO, I.F.F. A granja de frangos de corte In: MENDES, A.A.; NAAS,I.A.; MACARI, M.
Produção de Frangos de Corte. Campinas, SP: Editora Facta, p.55-84, 2004.
TOMLEY, F. Techniques for Isolation and Characterization of Apical Organelles from
Eimeria tenella Sporozoites. A Companion to Methods in Enzymology, v.13, p.171-176,
1997.
Referências Bibliográficas
117
TIPAKORN, N. Effects of Andrographis paniculata nees on performance, mortality and
coccidiosis in Broiler chickens. Doctoral Dissertation from Agricultural Sciences Faculty.
Georg-August-University.Gőttingen, Germany.
WAACK, R.S; TERRERAN, M.T. Gestão Tecnológica em Sistemas Industriais. CALDAS,
R.A. Agronegócio Brasileiro.MCT. Brasília, CNPq. 2 ed, p.87-106, 1998.
WAGNER, H.; GEYER, B.; KISO,Y. Coumestans as the main active principles of the liver
drugs Eclipta alba and Wedellia calendulacea. Planta Med. v.52, p.370-373, 1986.
WHO-World Health Organization. Annual Meeting. The Medical Impact of the use of
Antimicrobial in Food Animals. Germany. p.1-24, 1997.
WILLIAMS, R.B. Quantification of the crowding effect during infections with the seven
Eimeria species of the domesticated fowl. International J. Parasitol., v.31,p.1056-1069,
2001.
VERMEULEN, K. New perspectives on Coccidiosis Research. IXth International
Coccidiosis Conference. Foz do Iguaçu,Brasil. Anais, 2005.
YOUN, H. J.; NOH, J. W. Screening of the anticoccidial effects of herb extracts against
Eimeria tenella. Veterinary Parasitology, South Korea, v. 96, p. 257-263, 2001.
YUNES, R.A; PEDROSA, R. C; CECHINEL FILHO, V. Fármacos e Fitoterápicos: a
necessidade do desenvolvimento da Indústria de Fitoterápicos e Fitofármacos no Brasil.
Química Nova. v.24, n.1, p.147-152, 2001.
YUNES, R.A; CECHINEL FILHO, V. Estudo Químico de Plantas Medicinais orientado para
Análise Biológica. Obtenção, Determinação e Modificação Estrutural de Compostos
Bioativos. Plantas Medicinais sob a ótica da Química Medicinal Moderna. Chapecó. Ed
Argos p.47-75, 2001
ZAFAR, R; SAGAR, B.P.S. Hepatoprotective and Cardiac Inhibitory Activities of Ethanolic
Extracts from Plant Leaves and Leaf Callus of Eclipta alba. Pharmaceutical Biology.
v.38(5), p.357-361, 2000.
ANEXOS
Anexos
118
8. ANEXOS
ANEXO A- Importância da Avicultura no Agronegócio Brasileiro
O Agronegócio em 2004 representava 33% do PIB brasileiro e abrangia um mercado
de US$ 180.20 bilhões, sendo responsável por 42% do total das exportações, além de gerar
37% dos empregos, distribuídos nas áreas da agricultura e pecuária (fonte: Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento).
De acordo com o Instituto de Estudos do Agronegócio (IEA), as exportações do
agronegócio brasileiro cresceram 9,6% em 2006, com dados relativos ao mesmo período de
janeiro-agosto, atingindo US$33.39 bilhões (37,9% do total). As importações do setor tiveram
aumento superior ao das vendas externas (+12,6%) e somaram US$ 7.22 bilhões (12,3% do
total). O superávit do agronegócio de janeiro a agosto de 2006 foi de US$ 26.17 bilhões, 8,8%
superior ao do mesmo período do ano anterior (Gráfico 1), percentual este maior que o total
nacional (+4,5%).
Estes dados revelam o incremento da importância do agronegócio no saldo do
comércio externo brasileiro. A balança comercial brasileira registrou superávit de US$ 29.57
bilhões de janeiro a agosto de 2006, com valores de exportação de US$ 88.16 bilhões e
importações de US$ 58.59 bilhões. O incremento do superávit em 4,5% foi maior do que o
superávit do mesmo período em 2005 (De SOUZA, 2006).
Gráfico 1: Balança comercial do agronegócio de janeiro a agosto de 2005 e 2006
Fonte: IEA/APTA/SAA, dados básicos da SECEX/MDIC
Anexos
119
Tabela 1: Balanço mundial de carnes avícolas. Revisão das projeções de consumo,
importação e exportação.
Consumo (mil ton.) Exportação (mil ton.) Importação(mil ton.) Continente
2006
P
P
(1)
2006
R
(2)
% 2006
P
P
(1)
2006
R
(2)
% 2006
P
P
(1)
2006
R
(2)
%
África 4.269 4.067 -4,73 17 16 -5,88 756 726 -3,97
Am. Norte 17.447 17.291 -0,89 2.940 2.890 -1,70 198 198 0,00
Am. Central 4.548 4.548 0,00 16 16 0,00 901 901 0,00
Am. Sul 11.507 11.227 -2,43 3.477 3.254 6,33 263 263 0,00
Ásia 29.513 28.896 -2,09 1.238 1.211 -2,18 3.373 3.228 -4,30
Europa 12.067 10.727 -11,10 878 678 -22,78 1.101 777 -9,43
Oceania 991 991 0,00 27 27 0,00 44 44 0,00
CEI* 4.291 4.068 -5,20 33 33 0,00 1.958 1.888 -3,58
TOTAL 84.633 81.815 -3,33 8.626 8.128 -5,77 8.594 8.025 -6,62
Fonte: FAO, 2006
*CEI = Comunidade de Estados Independentes (Rússia e outros da extinta URSS)
(1) Projeção inicial;
(2) Revista em função da influenza aviária.
Na Gestão Tecnológica de Projetos, cadeias com altos índices de tecnificação, onde as
exigências de manejo e custo influenciam de maneira elevada no processo, demandam o
desenvolvimento de processos diferenciados. Dentre as atividades da pecuária a mais
especializada é a avicultura (WAACK & TERRERAN, 1998). Projetos aplicados à avicultura
são de extrema importância nas políticas nacionais de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação
(PDI) (Da SILVA et al, 1998). A eleição dos principais sítios de ação foi muito importante e
estratégica, sendo a citricultura, com o projeto da Xylella fastidiosa, causadora do cancro
cítrico ou amarelinho, a primeira eleita. O segundo setor foi o avícola, com problemas de
sanidade na cadeia produtiva, principalmente devido às barreiras técnico-comerciais, as quais
são gargalos impeditivos às exportações para CE e EUA (PINHEIRO et al, 1998).
O programa de Ciência e Tecnologia (C&T) do Agronegócio-CNPq, iniciado em
1998, enfocava diversas áreas do agronegócio brasileiro com propósito de impulsionar e
incrementar a economia brasileira. As políticas identificavam gargalos para utilização das
tecnologias no aumento da competitividade (BRANDÃO & MEDEIROS, 1998).
Anexos
120
ANEXO B- O mercado mundial de aves
A disseminação global da gripe aviária modificou o comportamento dos principais
mercados consumidores. As importações e exportações tiveram uma queda brutal devido ao
cenário de pânico generalizado. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) esta
enfermidade já causou perdas de mais de US$10 bilhões nos países afetados. Em um cenário
mais otimista a gripe aviária não atingiria o Brasil e, portanto, poderia ocorrer uma
recuperação no mercado mundial de carne de frangos, gerando assim novos investimentos
(FIGUEIREDO JUNIOR, 2006).
A queda no consumo de carne de aves, devido ao medo de contaminação pelo vírus
H5N1, responsável pela gripe aviária ocasionou uma reviravolta na produção nacional deste
tipo de insumo agropecuário. Internamente o preço da carne caiu devido ao excedente gerado
pela queda das exportações. A Food and Agricultural Organization (FAO) avaliou o mercado
mundial de carnes avícolas e previu uma retração significativa. Os resultados estão publicados
e resumidamente descritos na Tabela 1 (PIETHAN e SILVA, 2006).
A exigência dos países da CE, quanto a normas e procedimentos padronizados
culminou no denominado EurepGap (Good Agricultural Pratices). A diretriz é um conjunto de
requisitos básicos de boas práticas agrícolas com correspondência aos padrões globais de
segurança alimentar, preservação ambiental, saúde e segurança dos trabalhadores que também
engloba itens referentes ao bem-estar animal. O Brasil deverá atender a estas diretrizes caso
tenha intenção de continuar exportando para países da CE (ANTUNES, 2005).
Anexos
121
ANEXO C- Verificações diárias de temperatura e umidade relativa do aviário.
Determinação das mínimas e máximas alcançadas durante o período experimental.
Aviário CPPAR/UNESP-Jaboticabal.
EXPERIMENTO – FITOCOMPLEXOS
Responsável: Lucimara C. Toso Anotações : Ellen Fukayama
DATA Temperatura (ºC) Umidade (%)
Máxima Mínima Máxima Mínima
15/mar quarta 38,5 26,1 66 39
16/mar quinta 36,4 26,8 80 44
17/mar sexta 34,0 25,8 87 47
18/mar sábado 32,8 25,8 83 43
19/mar domingo 33,7 23,9 81 40
20/mar segunda 32,6 24,2 76 40
21/mar terça 32,1 25,1 78 41
22/mar quarta 36,8 22,4 70 66
23/mar quinta 32,0 25,1 79 45
24/mar sexta 33,0 24,4 80 38
25/mar sábado 34,0 24,0 72 45
26/mar domingo 29,5 24,3 74 45
27/mar segunda 38,1 21,6 78 39
28/mar terça 37,5 25,4 80 40
29/mar quarta 28,0 24,2 87 73
30/mar quinta 32,4 23,3 84 45
31/mar sexta 33,2 21,9 79 42
1/abr sábado 34,0 21,0 81 38
2/abr domingo 34,5 23,0 79 37
3/abr segunda 33,0 22,7 76 35
4/abr terça 33,0 19,5 78 34
5/abr quarta 29,0 20,0 85 52
6/abr quinta 28,0 21,0 99 59
7/abr sexta 31,0 20,0 96 52
8/abr sábado 28,2 21,6 95 64
9/abr domingo 31,3 20,2 96 50
10/abr segunda 33,2 19,0 89 37
11/abr terça 33,0 19,0 99 36
12/abr quarta 33,0 18,0 98 33
13/abr quinta 36,0 17,0 99 35
14/abr sexta 36,8 16,4 97 26
15/abr sábado 36,5 17,0 97 26
16/abr domingo 36,8 16,2 97 27
17/abr segunda 36,0 16,4 97 26
18/abr terça 33,6 21,6 86 41
19/abr quarta 33,6 21,6 86 41
19/abr quarta 33,6 21,6 86 41
20/abr quinta 33,6 21,6 86 41
21/abr sexta 33,6 21,6 86 41
22/abr sábado 33,6 21,6 86 41
23/abr domingo 33,6 21,6 86 41
24/abr segunda 36,0 21,6 97 15
25/abr terça 36,0 14,0 97 30
26/abr quarta 33,6 21,6 86 41
MÉDIA 33,6 21,6 85,7 41,2
Anexos
122
ANEXO D – Tabela de desempenho das aves durante o experimento, avaliado por grupo
de tratamento, para cada uma das replicatas na fase de 1 a 7 e de 1 a 14 dias de idade.
Período referente a tratamentos sem inoculação da cepa de Eimeria.
1 a 7 dias 1 a 14 dias
TRAT REP CR Peso GP CA CR Peso GP CA
1 1 137,07 164,35 115,80 1,18 531,66 449,61 401,06 1,33
1 2 146,02 162,87 114,29 1,28 514,81 423,59 375,01 1,37
1 3 136,32 161,80 113,34 1,20 532,03 447,92 399,46 1,33
2 1 136,32 166,30 118,26 1,15 535,94 452,05 404,01 1,33
2 2 156,10 162,65 114,56 1,36 541,97 440,34 392,25 1,38
2 3 138,75 160,05 111,82 1,24 533,23 426,23 378,00 1,41
3 1 131,53 162,44 114,04 1,15 511,72 434,09 385,69 1,33
3 2 147,06 154,55 106,25 1,38 481,93 400,63 352,33 1,37
3 3 140,67 161,35 113,24 1,24 518,00 435,62 387,51 1,34
4 1 133,55 152,39 104,32 1,28 507,68 412,85 364,78 1,39
4 2 144,61 165,91 117,48 1,23 549,09 441,15 392,72 1,40
4 3 131,46 155,40 107,15 1,23 498,36 422,49 374,24 1,33
5 1 125,85 150,25 102,13 1,23 491,53 407,55 359,43 1,37
5 2 136,18 162,76 114,58 1,19 523,22 442,71 394,53 1,33
5 3 128,53 159,07 110,57 1,16 522,22 434,47 385,97 1,35
6 1 129,14 154,98 106,98 1,21 495,61 416,58 368,58 1,34
6 2 131,11 146,25 98,03 1,34 510,18 415,25 367,03 1,39
6 3 137,95 165,01 116,67 1,18 531,86 441,92 393,58 1,35
7 1 136,31 167,42 119,07 1,14 532,50 448,24 399,89 1,33
7 2 142,71 165,45 117,34 1,22 540,45 444,61 396,50 1,36
7 3 125,44 152,05 104,06 1,21 494,18 404,11 356,12 1,39
8 1 131,70 161,75 113,35 1,16 521,75 438,79 390,39 1,34
8 2 130,83 150,92 102,85 1,27 503,51 405,26 357,19 1,41
8 3 134,75 155,05 106,84 1,26 510,92 416,90 368,69 1,39
9 1 126,09 156,30 107,92 1,17 508,67 427,86 379,48 1,34
9 2 122,15 153,46 105,36 1,16 492,64 412,57 364,47 1,35
9 3 143,80 166,80 118,37 1,21 564,35 456,76 408,33 1,38
10 1 146,85 159,47 110,77 1,33 535,02 448,95 400,25 1,34
10 2 124,53 156,51 108,51 1,15 499,94 419,11 371,11 1,35
10 3 123,89 149,10 101,29 1,22 530,28 400,74 352,93 1,50
Legenda:
(CR) consumo médio de ração;
GP) ganho médio de peso;
(PESO) peso médio das aves;
(CA) conversão alimentar média por grupo.
Anexos
123
ANEXO E- Tabela de desempenho das aves durante o experimento, avaliado por grupo
de tratamento, para cada uma das replicatas na fase de 1 a 21 e de 1 a 28 dias de idade.
Período referente ao pós inóculo da cepa de Eimeria, após o período pré patente.
1 a 21 dias 1 a 28 dias
TRAT REP CR Peso GP CA CR Peso GP CA
1 1 1212,96 906,99 858,44 1,41 2230,93 1529,95 1481,40 1,51
1 2 1161,01 864,43 815,85 1,42 2179,34 1508,69 1460,11 1,49
1 3 1228,85 924,38 875,92 1,40 2263,05 1563,84 1515,38 1,49
2 1 1246,97 931,49 883,45 1,41 2321,07 1612,68 1564,64 1,48
2 2 1214,97 876,58 828,49 1,47 2250,92 1538,56 1490,47 1,51
2 3 1211,60 868,63 820,40 1,48 2240,74 1522,66 1474,43 1,52
3 1 1181,93 891,35 842,95 1,40 2235,93 1569,58 1521,18 1,47
3 2 1127,13 859,44 811,14 1,39 2110,98 1473,92 1425,62 1,48
3 3 1155,42 927,10 878,99 1,31 2167,97 1556,59 1508,48 1,44
4 1 1183,35 872,10 824,03 1,44 2230,56 1562,21 1514,14 1,47
4 2 1253,75 928,56 880,13 1,42 2296,19 1588,16 1539,73 1,49
4 3 1173,09 886,99 838,74 1,40 2194,89 1532,45 1484,20 1,48
5 1 1146,55 835,16 787,04 1,46 2177,40 1486,63 1438,51 1,51
5 2 1243,27 883,42 835,24 1,49 2336,65 1562,71 1514,53 1,54
5 3 1155,57 837,58 789,08 1,46 2093,62 1383,96 1335,46 1,57
6 1 1183,85 871,49 823,49 1,44 2262,51 1587,71 1539,71 1,47
6 2 1181,73 862,69 814,47 1,45 2237,96 1556,46 1508,24 1,48
6 3 1251,83 918,17 869,83 1,44 2362,09 1635,90 1587,56 1,49
7 1 1188,12 918,27 869,92 1,37 2207,07 1581,27 1532,92 1,44
7 2 1273,52 921,63 873,52 1,46 2420,24 1655,90 1607,79 1,51
7 3 1161,11 832,60 784,61 1,48 2187,71 1470,44 1422,45 1,54
8 1 1203,44 880,45 832,05 1,45 2252,67 1565,39 1516,99 1,48
8 2 1161,55 826,08 778,01 1,49 2204,45 1488,58 1440,51 1,53
8 3 1178,16 861,40 813,19 1,45 2216,48 1539,24 1491,03 1,49
9 1 1188,78 852,41 804,03 1,48 2187,85 1463,10 1414,72 1,55
9 2 1181,03 869,58 821,48 1,44 2227,59 1526,58 1478,48 1,51
9 3 1297,32 927,38 878,95 1,48 2369,35 1601,46 1553,03 1,53
10 1 1255,06 918,95 870,25 1,44 2362,73 1631,60 1582,90 1,49
10 2 1189,15 871,17 823,17 1,44 2279,64 1553,38 1505,38 1,51
10 3 1205,70 834,73 786,92 1,53 2227,40 1496,15 1448,34 1,54
Legenda:(CR) consumo médio de ração; (GP) ganho médio de peso;(PESO) peso médio das
aves; (CA) conversão alimentar média por grupo.
Não foram observados efeitos significativos (P>0,05) dos tratamentos sobre o
consumo de ração, peso corporal e ganho de peso no período de 1 a 28 dias de idade das aves,
sendo observado neste período efeito significativo (P<0,05) sobre a conversão alimentar das
aves. O tratamento 3 com adição de ionóforo na ração e sem inoculação de oocistos nas aves,
apresentou melhor conversão alimentar.
Anexos
124
ANEXO F– Tabela de desempenho das aves durante o experimento, avaliado por grupo
de tratamento, para cada uma das replicatas na fase de 1 a 35 e de 1 a 42 dias de idade.
Após 35 dias recebendo ração medicada foram respeitados 7 dias de carência pré abate.
1 a 35 dias 1 a 42 dias
TRAT REP CR Peso GP CA CR Peso GP CA
1 1 3128,46 2191,44 2142,89 1,46 4372,96 2723,60 2675,05 1,63
1 2 3026,67 2179,66 2131,20 1,42 4257,15 2720,76 2672,30 1,59
1 3 3089,64 2183,39 2135,39 1,45 4377,75 2754,09 2706,09 1,62
2 1 3284,72 2294,35 2246,25 1,46 4616,75 2884,19 2836,09 1,63
2 2 3145,52 2189,54 2141,54 1,47 4385,69 2769,53 2721,53 1,61
2 3 3087,74 2074,85 2026,78 1,52 4352,33 2695,73 2647,66 1,64
3 1 3183,69 2281,76 2233,95 1,43 4407,54 2848,39 2800,58 1,57
3 2 2909,99 2182,38 2133,68 1,36 4164,19 2795,73 2747,03 1,52
3 3 2991,65 2230,34 2181,76 1,37 4102,79 2703,91 2655,33 1,55
4 1 3187,17 2244,33 2195,95 1,45 4504,00 2852,28 2803,90 1,61
4 2 3193,97 2271,96 2223,46 1,44 4486,60 2860,61 2812,11 1,60
4 3 3045,64 2149,80 2101,50 1,45 4252,35 2704,53 2656,23 1,60
5 1 3106,60 2148,86 2100,79 1,48 4461,79 2745,23 2697,16 1,65
5 2 3216,36 2159,91 2111,48 1,52 4587,99 2812,28 2763,85 1,66
5 3 3029,00 2050,78 2002,74 1,51 4198,01 2551,14 2503,10 1,68
6 1 3204,53 2232,05 2183,82 1,47 4510,96 2806,13 2757,90 1,64
6 2 3129,88 2174,95 2126,84 1,47 4385,29 2743,94 2695,83 1,63
6 3 3307,81 2264,76 2216,64 1,49 4650,61 2875,71 2827,59 1,64
7 1 3089,47 2264,39 2216,30 1,39 4413,45 2896,90 2848,81 1,55
7 2 3418,26 2330,96 2282,62 1,50 4801,23 2920,55 2872,21 1,67
7 3 3015,53 2072,91 2024,51 1,49 4227,13 2626,40 2578,00 1,64
8 1 3119,00 2195,90 2147,68 1,45 4401,31 2780,63 2732,41 1,61
8 2 3111,71 2105,40 2057,00 1,51 4406,30 2680,96 2632,56 1,67
8 3 3146,00 2207,40 2159,41 1,46 4435,79 2790,99 2743,00 1,62
9 1 3089,09 2097,41 2049,30 1,51 4448,83 2697,40 2649,29 1,68
9 2 3152,89 2147,88 2099,45 1,50 4470,84 2723,14 2674,71 1,67
9 3 3230,81 2240,03 2191,85 1,47 4464,55 2810,86 2762,68 1,62
10 1 3259,29 2256,91 2208,66 1,48 4553,83 2863,54 2815,29 1,62
10 2 3232,77 2205,86 2157,65 1,50 4573,95 2792,21 2744,00 1,67
10 3 3125,89 2133,08 2084,73 1,50 4460,53 2730,96 2682,61 1,66
Legenda:
(CR) consumo médio de ração;
(GP) ganho médio de peso;
(PESO) peso médio das aves;
Anexos
125
ANEXO G- Consumo Médio de Ração (CR), Peso Médio Corporal (PC), Ganho de Peso
Médio (GP) e Conversão Alimentar Média (CA) das aves de 1 a 7 dias de idade, em função
dos tratamentos.
Tratamentos CR (g) PC (g) GP (g) CA (g:g)
T1 – Sem Inoculação 139,80 163,01 114,48 1,221
T2 – Com Inoculação 143,72 163,00 114,88 1,252
T3 – Sem Inoculação + Ionóforo 139,75 159,44 111,17 1,260
T4 - Com Inoculação + Ionóforo 136,54 157,90 109,65 1,246
T5 - Com Inoculação + 40ppm Physalis 130,18 157,36 109,10 1,194
T6 - Com Inoculação + 80ppm Physalis 132,73 155,42 107,23 1,242
T7 - Com Inoculação +120ppm Physalis
T8 - Com Inoculação + 40ppm Eclipta
134,82
132,43
161,64
155,91
113,49
107,68
1,189
1,232
T9 - Com Inoculação + 80ppm Eclipta 130,68 158,85 110,55 1,181
T10 – Com Inoculação +120ppm Eclipt
a
131,75 155,03 106,86 1,232
CV (%) 6,146 3,920 5,527 5,786
P value 0,5391 0,7062 0,6973 0,8814
ANEXO H- Consumo Médio de Ração (CR), Peso Médio Corporal (PC), Ganho de Peso
Médio (GP) e Conversão Alimentar Média (CA) das aves de 1 a 28 dias de idade, em função
dos tratamentos.
Tratamentos CR (g) PC (g) GP (g) CA (g:g)
T1 – Sem Inoculação 2224,44 1534,16 1485,63 1,497 AB
T2 – Com Inoculação 2270,91 1557,97 1509,85 1,504 AB
T3 – Sem Inoculação + Ionóforo 2171,62 1533,36 1485,09 1,463 A
T4 – Com Inoculação + Ionóforo 2240,54 1560,94 1512,69 1,481 AB
T5 – Com Inoculação + 40 ppm
Physalis
2202,56 1477,77 1429,50 1,541 B
T6 – Com Inoculação + 80 ppm
Physalis
2287,52 1593,36 1545,17 1,480 AB
T7 – Com Inoculação +120 ppm
Physalis
T8 - Com Inoculação + 40 ppm Eclipta
2271,67
2224,53
1569,20
1531,07
1521,05
1482,84
1,494 AB
1,501 AB
T9 – Com Inoculação + 80 ppm
Eclipta
2261,60 1530,38 1482,07 1,526 AB
T10 - Com Inoculação +120 ppm
Eclipta
2289,92 1560,38 1512,21 1,515 AB
CV (%) 3,475 3,876 3,997 1,620
P value 0,6683 0,6091 0,6060 0,0298
Médias na mesma coluna com letras iguais diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey (P<0.05).
Não foram observados efeitos significativos (P>0,05) dos tratamentos sobre o
consumo de ração, peso corporal e ganho de peso no período de 1 a 28 dias de idade das aves.
Porém, foi observado neste período efeito significativo (P<0,05) sobre a conversão alimentar
das aves.
Anexos
126
ANEXO I- Consumo Médio de Ração (CR), Peso Médio Corporal (PC), Ganho de Peso
Médio (GP) e Conversão Alimentar Média (CA) das aves de 1 a 35 dias de idade, em função
dos tratamentos.
Tratamentos CR (g) PC (g
)
GP (g
)
CA (g:g)
T1 – Sem Inoculação 3081,59 2184,83 2136,49 1,442 AB
T2 – Com Inoculação 3172,66 2186,25 2138,19 1,485 B
T3 – Sem Inoculação + Ionóforo 3028,44 2231,50 2183,13 1,387 A
T4 – Com Inoculação + Ionóforo 3142,26 2222,03 2173,63 1,446 AB
T5 – Com Inoculação + 40 ppm
Physalis
3117,32 2119,85 2071,67 1,505 B
T6 – Com Inoculação + 80 ppm
Physalis
3214,08 2223,92 2175,77 1,477 B
T7 – Com Inoculação +120 ppm
Physalis
T8 – Com Inoculação + 40 ppm
Eclipta
3174,42
3125,57
2222,75
2169,57
2174,48
2121,36
1,460 AB
1,474 B
T9 – Com Inoculação + 80 ppm
Eclipta
3157,60 2161,77 2113,53 1,494 B
T10 - Com Inoculação +120 ppm
Eclipta
3205,98 2198,62 2150,35 1,491 B
CV (%) 3,380 3,368 3,446 1,976
P value 0,5773 0,7153 0,7172 0,0033
Médias na mesma coluna com letras iguais diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey (P<0.05).
Não foram observados efeitos significativos (P>0,05) dos tratamentos sobre o
consumo de ração, peso corporal e ganho de peso nos períodos de 1 a 35 dias de idade das
aves. Porém, foi observado nestes períodos efeito significativo (P<0,05) sobre a conversão
alimentar das aves.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo