ads:
UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO
Mestrado em Biotecnologia
ESTUDO DA AÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS DE
Pothomorphe umbellata E DROGAS
ANTIFÚNGICAS SOBRE LINHAGENS DE
Trichophyton rubrum E ANÁLISE DA
EXPRESSÃO PROTEICA
Mestrando: Edvânio Ramos Rodrigues
Ribeirão Preto
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO
Mestrado em Biotecnologia
ESTUDO DA AÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS DE
Pothomorphe umbellata E DROGAS
ANTIFÚNGICAS SOBRE LINHAGENS DE
Trichophyton rubrum E ANÁLISE DA
EXPRESSÃO PROTEICA
Dissertação que se destina em
atender as normas da Pós-
Graduação em Biotecnologia de
Plantas Medicinais e Microrganismos
da Unidade de Biotecnologia da
UNAERP
Mestrando: Edvânio Ramos Rodrigues
Orientadora: Profa. Dra. Rosemeire C. L. R. Pietro
Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Lucia Fachin
Ribeirão Preto
2007
ads:
Dedico este trabalho a minha mãe, D.
Nair, que desde o primeiro instante me
apoiou e que soube compreender
minhas ausências e a meu pai, Sr.
Geraldo. Vocês me prepararam para
vida.
A minha esposa e amiga Rozane, pelo
amor e companheirismo
À Profa. Dra. Rosemeire C. L. R. Pietro pela sua
orientação, paciência, compreensão, dedicação
e amizade.
AGRADECIMENTOS
A Deus que é luz e sabedoria no meu caminho.
Agradeço a todas as pessoas que direta e indiretamente colaboraram
para a realização deste trabalho e de modo especial:
Á Profa. Dra. Ana Marisa Fusco Almeida que nos acompanhou na
bancada desde o início e esteve presente a cada análise e discussão,
compartilhando seu conhecimento. Muito obrigado por seu esforço,
dedicação, estimulo e carinho.
Profa. Dra. Ana Lúcia Fachin por ceder as linhagens utilizadas neste
trabalho e apoio na Co-orientação.
À Profa. Dra. Ana Helena Januário que gentilmente forneceu os extratos e
prestou preciosas informações para este trabalho.
À Natália Garcia Prado Nogueira pela amizade e inúmeros auxílios no
início e durante o desenvolvimento deste trabalho que foram de
fundamental importância. A Daniela e Marcos, pela convivência e troca de
experiências.
Ao mestrando Paulo (curuja) pela ajuda na cromatografia.
Aos professores e funcionários (Edna, Marcos, Robinson, D. Clarice) do
Curso de Ciências Farmacêuticas da Universidade de Ribeirão Preto-
UNAERP, pela aprendizagem, trabalho e apoio na execução deste
trabalho.
Às estagiárias do Laboratório de Microbiologia e Micologia do Curso de
Ciências Farmacêuticas da Universidade de Ribeirão Preto-UNAERP
(Fernanda Sangali, Bruna, Carol, Ellen e Ana Paula), pela alegria, carinho,
amizade e ajuda durante cada obstáculo encontrado no caminho.
Aos professores e funcionários da Unidade de Biotecnologia da UNAERP
por compartilharem seus conhecimentos.
Aos meus colegas de turma, que muitas vezes demonstraram que com
união e cooperação conseguimos superar os obstáculos.
À funcionária da pós-graduação Joana Néia Vieira pela atenção durante o
Curso.
Aos Professores Aloísio Calsoni Bozzini e Profa. Dra. Maria Isabel Ribeiro
(UNIFEG) por serem os primeiros incentivadores e despertarem em mim o
anseio de realizar o Curso de Pòs-graduação.
Aos meus amigos que se furtaram da minha presença nos últimos meses.
Ao Alex e Silvia que incentivaram e participaram nos primeiros passos
desta conquista.
A Lazaro e Lucia pelo apoio e auxilio.
À UNAERP pelo apoio tecnológico para o desenvolvimento deste
trabalho.
À Fundação Educacional Guaxupé pelo apoio para a realização do
trabalho.
vii
ÍNDICE
Lista de Tabelas................................................................................................x
Lista de Figuras...............................................................................................xii
Lista de Abreviaturas.....................................................................................xiii
Resumo...........................................................................................................xiv
Abstract ..........................................................................................................xvi
1- Introdução .....................................................................................................1
1.1- Dermatofitoses.....................................................................................1
1.2- Trichophyton rubrum..........................................................................11
1.3- Metabólitos de plantas .......................................................................14
1.4- Pothomorphe umbellata.....................................................................14
2- Objetivos......................................................................................................19
3- Materiais e Métodos....................................................................................20
3.1- Equipamentos....................................................................................20
3.2- Sais e Reagentes...............................................................................21
3.3- Material Vegetal.................................................................................23
3.4- Preparações dos Extratos e Frações.................................................23
3.5- Meios de cultura.................................................................................25
3.5.1- Meios líquido para o crescimento ...........................................25
3.5.2- Meio Sabouraud Líquido.......................................................26
3.5.3- Meio RPMI ..............................................................................26
3.5.4- Meio Agar Batata Dextrose....................................................26
3.6- Soluções ............................................................................................27
3.6.1- Solução de Terbinafina ...........................................................27
3.6.2- Solução de Fluconazol............................................................27
3.6.3- Solução de Itraconazol ...........................................................27
3.6.4- Solução de Griseofulvina ........................................................27
3.6.5- Solução de Anfotericina B.......................................................28
3.7- Marcador de peso molecular para eletroforese..................................28
3.8- Reagentes para o gel de poliacrilamida da eletroforese ....................28
viii
3.8.1- Solução de Acrilamide/Bis-acrilamida.....................................28
3.8.2- Tampão tris HCl pH 8.8 ..........................................................28
3.8.3- Tampão tris HCl pH 6.8 ..........................................................29
3.8.4- Solução de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) ...........................29
3.8.5- Solução de Temed..................................................................29
3.8.6- Solução de persulfato (APS)..................................................30
3.8-7- Tampão de corrida pH 8,3 ......................................................30
3.8.8- Tampão de Amostra ...............................................................30
3.9- Reagentes pra revelação do gel da prata ..........................................31
3.9.1- TCA (Ácido tricloracético) .......................................................31
3.9.2- Solução de lavagem ...............................................................31
3.9.3- Solução oxidante ....................................................................31
3.9.4- Solução nitrato de prata..........................................................31
3.9.5- Solução redutora.....................................................................31
3.9.6- Solução de ácido acético ........................................................32
3.10- Reagentes para a cromatografia......................................................32
3.10.1- Placa de cromatografia .........................................................32
3.10.2- Solução de hexano e acetato de etila (fase móvel) ..............32
3.10.3- Solução de vanilina sulfúrica.................................................32
3.11- Linhagens de Trichophyton rubrum .................................................33
3.12- Manutenção e Estoque das Linhagens............................................33
3.13- Diluição dos Extratos Vegetais ........................................................34
3.14- Preparo e Diluição dos Antifúngicos ................................................34
3.15- Preparo do Inoculo...........................................................................35
3.16- Aplicação do Inóculo em Microplacas para drogas licenciadas .......35
3.17- Aplicação do Inóculo em Microplacas para os extratos vegetais....35
3.18- Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) .................36
3.19- Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM) ..............37
3.20- Obtenção dos Extratos protéicos das Linhagens.............................37
3.20.1- Estabelecimento da Curva de Crescimento..........................37
3.20.2- Obtenção de Extratos Protéicos das Linhagens Frente ao
Extrato vegetal ..................................................................................38
3.20.3- Obtenção dos Extratos Protéicos das Linhagens Frente
aos Agentes Antifúngicos..................................................................39
ix
3.21- Determinação do Perfil Protéico através de Eletroforese em gel
de poliacrilamida .......................................................................................40
3.21.1- Aplicação das amostras no gel de poliacrilamida .................41
3.21.2- Revelação do Gel por Prata..................................................41
3.22- Cromatografia em camada delgada comparativa ............................42
4- Resultados...................................................................................................43
4.1- Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) frente aos
agentes antifúngicos .................................................................................43
4.2-Análise do Perfil Protéico....................................................................47
4.2.1-Estabelecimento da curva de crescimento das linhagens .......47
4.2.2- Análise do perfil protéico através de eletroforese em gel de
Poliacrilamida....................................................................................54
4.3- Cromatografia em camada delgada comparativa dos extratos e
frações ......................................................................................................69
5- Discussão....................................................................................................71
6-Conclusão.....................................................................................................79
7- Referências Bibliográficas.........................................................................80
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Extratos e frações de P. umbellata ...................................................25
Tabela 2: Gel de separação a 12%...................................................................41
Tabela 3: Gel de Empilhamento a 12%.............................................................41
Tabela 4: Determinação da CIM para drogas antifúngicas frente as
linhagens de T. rubrum .....................................................................................43
Tabela 5: Determinação da CIM e CFM para os extratos brutos e partições
de P. umbellata frente à linhagem H6 ...............................................................44
Tabela 6: Determinação da CIM e CFM para os extratos brutos e frações de
P. umbellata frente à linhagem TruMDR2.......................................................45
Tabela 7: Determinação da CIM e CFM para os extratos brutos e frações de
P. umbellata frente à linhagem Tr1 ..................................................................46
Tabela 8: Crescimento da linhagem H6 ............................................................47
Tabela 9: Crescimento da linhagem TruMDR2...............................................48
Tabela 10: Crescimento da linhagem Tr1 .........................................................49
Tabela 11: Crescimento da linhagem H6 frente aos antifúngicos e extratos
vegetais.............................................................................................................49
Tabela 12: Crescimento da linhagem TruMDR2 frente aos antifúngicos e
extratos vegetais...............................................................................................51
Tabela 13: Crescimento da linhagem Tr1 frente aos antifúngicos e extratos
vegetais ...........................................................................................................52
Tabela 14: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem Tr1 frente
aos antifúngicos ..............................................................................................55
Tabela 15: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem Tr1 frente
as partições do extrato vegetal .........................................................................56
Tabela 16: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem H6 frente
aos antifúngicos ................................................................................................60
Tabela 17: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem TruMDR2
frente aos antifúngicos ......................................................................................61
Tabela 18: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem H6 frente
as partições do extrato vegetal .........................................................................65
xi
Tabela 19: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem TruMDR2
frente as partições do extrato vegetal ...............................................................65
Tabela 20: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem H6 controle
de crescimento..................................................................................................68
Tabela 21: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem TruMDR2
controle de crescimento ....................................................................................68
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Pothomorphe umbellata ...........................................................23
Figura 2: Fluxograma de obtenção dos extratos e frações de P. umbellata.....24
Figura 3: Fluxograma de obtenção dos extratos exocelulares (filtrados)
após incubação frente ao extrato vegetal .........................................................39
Figura 4 : Fluxograma de obtenção dos extratos (filtrados) exocelulares
após incubação frente aos agentes antifúngicos 4 ...........................................40
Figura 5: Crescimento da linhagem H6.............................................................47
Figura 6: Crescimento da linhagem TruMDR2................................................48
Figura 7: Crescimento da linhagem Tr1 ............................................................48
Figura 8: Biomassa da linhagem H6 desenvolvida frente ao Fluconazol,
Anfotericina B, Griseofulvina, partição hexano em sub-CIM, partição hexano
em CIM e partição diclorometano em CIM........................................................50
Figura 9: Biomassa da linhagem TruMDR2 desenvolvida frente ao
Fluconazol, Anfotericina B, Griseofulvina, partição hexano em sub-CIM,
partição hexano em CIM e partição diclorometano em CIM .............................51
Figura 10: Biomassa da linhagem Tr1 desenvolvida frente ao Fluconazol,
Anfotericina B, Griseofulvina, partição hexano em sub-CIM, partição hexano
em CIM e partição diclorometano em CIM........................................................53
Figura 11: SDS-PAGE da linhagem Tr1 frente as partições hexano,
diclorometano e antifúngicos.............................................................................54
Figura 12: SDS-PAGE das linhagens H6 e TruMDR2 frente aos
antifúngicos.......................................................................................................59
Figura 13:SDS-PAGE das linhagens H6 e TruMDR2 frente as partições do
extrato vegetal...................................................................................................64
Figura 14: SDS-PAGE das linhagens H6 e TruMDR2 em condição de
crescimento.......................................................................................................67
Figura 15: CCDC dos extratos e partições de P. umbellata..............................70
Figura 16: CCDC dos extratos e partições de P. umbellata..............................70
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
∆TruMDR2: Linhagem de T. rubrum, nocauteada no gene truMDR2, derivada
de H6
ATCC: American Type Culture Collection
CDCC: Cromatografia em camada delgada comparativa
CFM: Concentração fungicida Mínima
CIM: Concentração Inibitória Mínima
CLSI:Clinical and Laboratory Standards Institute
EUCAST:European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing
H6: Linhagem de T. rubrum, isolada de paciente
NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards
P Ac EtOH: Partição acetato etila /água
P Aq.EtOH/H
2
O: Partição aquosa etanol
P dic:Partição diclorometano etanol/água
P Hex.: Partição Hexano
P N-but : Partição N-butanol etanol/água
PA CHCl
3:
Partes Aéreas Extrato clorofórmico
PA EtOH : Partes Aéreas extrato etanólico
PA MeOH : Partes Aéreas Extrato metanólico
SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida
Tr1: Linhagem de T. rubrum, isolada de paciente
KDa: kiloDaltons
UFC: Unidades Formadoras de Colônias
HSP: Proteína de “Heat Shock”
xiv
RESUMO
Dermatófitos são um grupo especial de fungos que afetam tecidos
queratinizados de humanos e outros vertebrados causando infecções
superficiais. Entre estes se destaca o gênero Trichophyton, principalmente a
espécie Trichophyton rubrum, sendo esta uma das mais adaptadas ao ser
humano, causando infecções na pele, pêlo e unha. Entre as infecções
causadas por dermatófitos, tem-se observado um aumento na incidência de
falhas no desempenho dos agentes terapêuticos, especialmente com relação
às drogas de escolha, que apresentam elevada toxicidade e dificuldade de
absorção local, quando usadas topicamente. Adicionalmente tem sido
observado que estes fatores também podem estar ligados à produção de
certas proteínas pelo fungo. Neste trabalho avaliamos a atividade antifúngica
de extratos vegetais de Pothomorphe umbellata (L) Miq. frente a linhagens do
fungo Trichophyton rubrum, Tr1 e H6 (isoladas de pacientes com história de
resistência a antifúngicos) e a linhagem TruMDR2, obtida a partir da linhagem
H6, após a ruptura do gene TruMDR2, que está envolvido na múltipla
resistência a drogas. Foram padronizados ensaios para a determinação da
sensibilidade de fungos filamentosos baseando-se nos métodos preconizados
pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M38A e European
Committee on Antibiotic Susceptibility (EUCAST) com modificações. Foram
realizadas a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e
Concentração Fungicida Mínima (CFM). Os extratos etanólicos mostraram as
melhores atividades antifúngicas frente às linhagens H6 e TruMDR2,
enquanto frente a linhagem de campo (Tr1) os extratos etanólicos e
metanólicos tiveram o mesmo valor de CIM e CFM. As frações das partições
xv
hexânicas e diclorometano do extrato etanólico apresentaram menores CIMs e
CFMs frente às 3 linhagens. Foi também analisado o perfil protéico produzido
pelas linhagens deste fungo na presença e ausência de drogas licenciadas e
partições do extrato da planta, verificando-se modificações no perfil protéico,
onde observamos condições em que ocorreu o aparecimento de bandas e em
outras, o desaparecimento. Observamos modificações em bandas de
aproximadamente 123 kDa, 90 kDa, 70 kDa, 41 kDa e 22 kDa. Estas alterações
podem estar ligadas aos mecanismos de ação das drogas licenciadas e das
partições do extrato vegetal.
Palavras chave: Thichophyton rubrum, Pothomorphe umbellata, extratos
vegetais, perfil protéico, ação antifúngica.
xvi
ABSTRACT
Dermatophytes are a special group of fungi that affect keratinized tissues
of human beings and other vertebrates causing superficial infections. Among
these it can be pointed the Trichophyton, mainly the species Trichophyton
rubrum, the most adapted to the human being, causing infections in the skin,
stratum corneum and nail. Among the infections caused by dermatophytes, an
increase in the fault incidence of the performance of the therapeutical agents,
has been observed specially related to the elective drugs, that presents high
toxicity and difficulty of local absorption when used topically. Additionally it has
been observed that these factors also can be related to the certain protein
production of fungi. In this work we evaluate the antifungal activity of plant
extracts of Pothomorphe umbellata (l) Miq. against Trichophyton rubrum strains,
Tr1 and H6 (isolated from patients with antifungal resistance history) and the
strain TruMDR2, obtained from H6 strain, after disruption in TruMDR2 gene
which is involved in multiple resistance drugs. It was standardized assays for
the determination of the susceptibility of filamentous fungi being based on the
methods recommended for the Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI) M38-A and European Committee on Antibiotic susceptibility (EUCAST)
with modifications. It was carried through the determination of the Minimum
Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal Concentration (CFM).
The ethanolic extracts showed, the best antifungal activities against H6 and
∆TruMDR2 strains, while in front of clinical strain (Tr1) the ethanolic and
methanolic extracts, had the same value of MIC and CFM. The fractions of
hexanic partitions and dichloromethane from ethanolic extract presented lower
MICs and CFMs front in of the 3 strains. The protein profile produced by the
xvii
strains in the presence or absence of therapeutic drugs and hexane extracts
was observed and was verified conditions of appearing and disappearing of
band. It was observed motifications in the bands 123 kDa, 90 kDa, 70 kDa, 41
kDa and 22 kDa. These alterations may be linked to the mechanisms of
therapeutic drugs and partitions of plant extract.
Key words: Thichophyton rubrum, Pothomorphe umbellata, plant extract,
protein profile, antifungal action.
1
1-Introdução
1.1 Dermatofitoses
Nas últimas décadas, com o aumento dos antimicrobianos a área
médica teve avanços significativos, propiciando a sobrevida de muitos
pacientes, mas por outro lado, muitos destes tornaram-se altamente
suscetíveis a infecções causadas por organismos como os fungos, que eram
considerados de baixa virulência, ou até mesmo, não patogênicos. As
infecções causadas por fungos mostraram um grande crescimento, incluindo
aquelas por linhagens iatrogênicas e patogênicas, principalmente devido ao
aparecimento de indivíduos imunodebilitados (PEREA & PATTERSON, 2002).
O aumento das micoses tornou-se um importante problema de saúde pública,
afetando grande parte da população mundial que como conseqüência pode
levar a diminuição da qualidade e expectativa de vida.
O crescimento na incidência dessas infecções tem gerado problemas na
terapêutica. A disponibilidade de antifúngicos na prática médica é relativamente
pequena, algumas vezes ineficiente e a maioria deles apresenta certa
toxicidade. Além do crescimento dessas infecções, o problema da resistência
microbiana também sofreu um aumento acentuado (GIROIS et al., 2006).
A dermatofitose é uma das micoses superficiais mais incidentes do
mundo, causada por um grupo de fungos denominado dermatófitos, que afetam
tecidos queratinizados de humanos e outros vertebrados causando infecções
superficiais (CARRILO-MUNÕZ et al. 2004).
Estudos epidemiológicos indicam que as dermatofitoses estão entre as
doenças mais comuns do mundo, sendo consideradas o terceiro distúrbio de
2
pele em crianças menores de 12 anos e o segundo na população adulta
(GREER, 1994). Vários motivos são aventados para explicar o aumento da
incidência destas infecções nas últimas décadas, entre eles: uso abusivo de
antibióticos, drogas imunossupressoras e citostáticas, bem como o
aparecimento de pacientes com AIDS, os quais constituem alvo para o
desenvolvimento das dermatofitoses (LACAZ et al., 2002). Aliado a esses
fatores, os dermatófitos encontram nas condições de temperatura e umidade
do clima tropical, o habitat ideal para sua disseminação (LACAZ et al., 2002).
Dermatófitos são um grupo de fungos queratinofílicos, estreitamente
relacionados, capazes de invadir tecidos queratinizados como pele, pêlos e
unhas, resultando numa infecção comumente conhecida como tinea ou tinha,
em humanos e animais (WEITZMAN & SUMMERBELL, 1995).
Remak em 1835 e Hube em 1837 foram os primeiros a observar e
descrever estruturas microscópicas de lesões fávicas. A natureza micótica das
estruturas foi reconhecida por Schöenlein em 1839 (SCHÖENLEIN, 1839 apud
WEITZMAN & SUMMERBELL, 1995).
No período de 1841 a 1844, David Gruby descreveu o agente causal do
favo e estabeleceu o contágio natural da doença (GRUBY, 1841 a) e b) apud
WEITZMAN & SUMMERBELL, 1995). A seguir, descreveu o parasitismo do tipo
ectótrico da barba e do couro cabeludo, sendo o agente etiológico denominado
de Microsporum audouinii, referindo-se aos pequenos esporos ao redor do feixe
de cabelo (GRUBY, 1843 apud WEITZMAN & SUMMERBELL, 1995). O
parasitismo do tipo endótrico do cabelo causado pelo Herpes (Trichophyton)
tonsurans foi descrito em 1844 (GRUBY, 1844 apud WEITZMAN &
SUMMERBELL, 1995).
3
Em 1910, Raimond Sabouraud começou a estudar os dermatófitos e os
classificou em 4 gêneros: Achorion, Epidermophyton, Microsporum e
Trichophyton, baseado nos aspectos clínicos da doença, cultura e características
microscópicas (SABOURAUD, 1910).
Em 1934, Chester Emmons (EMMONS, 1934) modernizou a taxonomia
descrita por Sabouraud e estabeleceu a atual classificação dos dermatófitos com
base na morfologia dos esporos, eliminando o gênero Achorion e reconhecendo
somente os três gêneros: Microsporum, Trichophyton e Epidermophyton.
O estado teleomórfico de Trichophyton (Keratinomyces) ajelloi descrito
por Dawson e Gentles, em 1959, foi obtido pela técnica da isca de cabelo
descrita por Vanbreuseghem, que levou a descoberta da forma perfeita de
outros dermatófitos (DAWSON & GENTLES, 1961). As formas teleomorfas de
Microsporum e Trichophyton foram respectivamente classificadas em dois
gêneros Nannizzia e Arthroderma (AJELLO, et al.,1960). No entanto, em
estudo posterior, WEITZMAN et al., (1986) concluíram que devido a diferenças
morfológicas mínimas entre eles, foram considerados congêneres,
prevalecendo Arthroderma por sua descrição prioritária, pertencente ao Reino
Fungi; Filo Ascomycota; Ordem Onygenales; Família Arthrodermataceae. A
forma anamorfa dos gêneros, Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton,
foi incluída na subdivisão-forma Deuteromycotina; Classe-forma dos
Hyphomycetes (WEITZMAN & SUMMERBELL, 1995) e compreendem
aproximadamente 22 espécies de Trichophyton, 16 de Microsporum e duas de
Epidermophyton (ALY, 1994). Não há descrição da forma perfeita de
Trichophyton rubrum, entretanto, após análise do transcriptoma deste
patógeno, foi encontrado um grande número de genes relacionados ao
4
processo de meiose, além de um gene que codifica uma proteína HMG (grupo
de alta mobilidade), que está envolvida com a reprodução sexual em
ascomicetos, sugerindo que T. rubrum pode possuir o ciclo sexual (WANG et
al., 2006).
T. rubrum foi inicialmente descrito como Epidermophyton rubrum por
Castellani em 1910 (RIPPON, 1988), disseminando-se no final do século 19,
após uma epidemia de tinea corporis no sudeste da Ásia (RIPPON, 1988). T.
rubrum é um dermatófito antropofílico que causa principalmente lesões na pele e
unhas. Ao exame direto do material clínico observa-se a presença de hifas
septadas hialinas, muitas vezes artrosporadas. O crescimento das colônias varia
de lento a moderado (7 - 14 dias), tem aspecto cotonoso e branco, tornando-se
posteriormente aveludadas. O reverso da colônia apresenta pigmentação
avermelhada, púrpura. Microconídios são clavados ou piriformes, com 2-3 x 3-5
µm de tamanho disposto ao longo das hifas e produzem raros macroconídios
(LACAZ et al., 2002).
Atualmente existem cerca de 41 espécies de dermatófitos, divididos
em 3 gêneros: Trichophyton (cerca de 22 espécies), Microsporum (cerca de 17
espécies) e Epidermophyton (com 2 espécies) (LACAZ et al., 1991).
Os dermatófitos dividem-se em espécies antropofílicas, zoofílicas e
geofílicas de acordo com seu habitat primário (AJELLO et al., 1960) e estão
entre os poucos fungos causadores de doença transmissível (WEITZMAN &
SUMMERBELL, 1995). As espécies antropofílicas estão primariamente
associadas com humanos e raramente causam doenças em animais (MAYR,
1989). Os zoofílicos usualmente infectam ou estão associados a animais e
ocasionalmente atingem os humanos. Os geofílicos estão primariamente
5
associados com materiais em decomposição contendo queratina como, cabelos,
pêlos, unhas e chifres, podendo causar infecção em humanos e animais
(CHEML, 1980). Em algumas espécies antropofílicas, acredita-se que os
artroconídios possam dissociar-se de células epiteliais no meio ambiente e
contaminar novos hospedeiros, gerando uma fonte ambiental de contágio
podendo induzir a dermatofitoses recorrentes em indivíduos isoladamente ou em
agrupamentos dentro de instituições ( MACKENZIE, 1963).
Segundo GOULART et al. (1960), o solo é um ambiente fundamental
pela grande freqüência com que a partir dele tem-se o isolamento de quase
todas as espécies de fungos que parasitam o homem. A infecção pode se dar
indiretamente através de fômites, ou provenientes de animais saudáveis, de
pequenas epizootias, principalmente animais em cativeiro como coelhos, ratos,
cobaias, camundongos e animais encontrados em áreas rurais. O contato do
homem com esses animais leva facilmente ao contágio (GOULART et
al.,1960).
Dermatófitos são identificados de acordo com o aspecto de sua
colônia, cor de seu verso e reverso, posição e morfologia de seus conídios em
cultura em lâmina (CARRILO-MUNÕZ et al. 2004). Onicomicose é uma doença
comum da unha responsável por aproximadamente 50% das doenças
micóticas. Ocorre mais nas pessoas idosas, embora diversos casos foram
relatados entre crianças e tem influência de diversos fatores, tal como o clima,
a geografia, e a migração. Os dois dermatófitos implicados geralmente na
onicomicose são T. rubrum e T. mentagrophytes contribuindo com mais de
90% dos casos. Entretanto, diversos outros fungos toxigênicos foram
implicados. Para melhor compreensão, a onicomicose é dividida em quatro
6
apresentações clínicas principais: subungal distal, que é a forma mais comum
da doença; subungal proximal, que é a forma mais comum nos pacientes com
infecção humana do vírus da Imunodeficiência, superficial; e onicomicose
distrófica total. A epidemiologia da onicomicose nos adultos e crianças foi
avaliada e os sintomas clínicos mais comuns são dirigidos. Embora os fatores
de risco sejam discutidos, a natureza multifatorial da onicomicose faz com que
esta seja inesgotável. O diagnóstico e o tratamento são difíceis e a escolha das
drogas antifúngicas apropriadas é complexa e requer o conhecimento das
estruturas químicas dos metabólitos dos fungos que causam a onicomicose e a
sua interação com as drogas antifúngicas. Isto é verdadeiro porque a maioria
das drogas antifúngicas são derivadas do metabolismo fúngico. O tratamento
com griseofulvina e anfotericina caiu em desuso pelo uso de drogas mais
novas como derivados azolicos, de pirimidinas, e alaminas. Amorolfine e
itraconazol, ganharam a sustentação global, mas os efeitos co-laterais, a
resistência as drogas e a persistência da doença são ainda significativos para
os pacientes. Portanto, a busca para tratamentos mais seguros e mais eficazes
deve continuar.
Algumas espécies de fungos são cosmopolitas e outras têm
distribuição geográfica limitada. É evidente que as espécies predominantes
diferem não só de região para região, como sofrem modificação com o decorrer
do tempo, por exemplo T. yaondei (África) e o T.concentricum (Oceania e Ásia)
(AJELLO, 1960).
No Rio de Janeiro, foram realizados trabalhos em bairros da cidade,
isolando-se M. gypseum e M. canis, que se destacam por serem mais
encontrados em solos urbanos (GOULART et al.,1960)
7
O T. violaceum é endêmico em certas partes do leste europeu, África,
Ásia e América do Norte e o T. rubrum é o causador de tinha pedis mais
comum no mundo, causando onicomicoses. Essas duas associações tem sido
encontradas com maior freqüência devido ao uso aumentado de sapatos
atléticos por homens e mulheres, bem como uso de banheiros comunitários
(ALY,1994).
GOULART, et al (1960), empregando a técnica de Vanbreseg Hem,
usaram 500 amostras de terra de 100 bairros mais populosos, como também
100 amostras de areia de 15 praias do Rio de Janeiro. Das amostras dos
bairros, obtiveram 313 isolados, sendo que 102 foram identificados como
dermatófitos parasitas do homem, 79 outros queratinófilos, e 132
contaminantes das areias. Os pesquisadores também observaram que o
percentual de isolamento dos fungos foi de 62,6% nos bairros e 39% nas
praias.
Em Florença, foram estudados 2.083 casos de dermatofitoses entre
indivíduos provenientes de áreas rurais. Os fungos T. rubrum, M. canis foram
os principais agentes seguidos do T. mentagrophytes e Epidermophyton
floccosum. A contaminação ocorreu devido ao contato com animais. Entre os
pacientes das áreas urbanas, houve predominância de M. gypseum sendo a
principal fonte de contaminação o contato com a terra e animais domésticos.
Neste grupo observaram também que a maioria eram adultos do sexo
masculino e praticavam esportes coletivos (RIPPON,1988).
Os fungos queratinofílicos podem manter seu ciclo vital através do
contágio inter-humano direto ou indiretamente, pois podem apresentar-se
viáveis durante semanas ou meses em material córneo depositado em pisos,
8
assoalhos e outros substratos úmidos (GENTLES, 1958). Contudo, a
transmissão direta das dermatofitoses parece não ocorrer com muita
freqüência (GEORG, 1960), sendo de maior importância a disseminação
através de objetos, pisos úmidos e águas de recreação. Dentre essas fontes de
infecção, destacam-se os locais de banheiros públicos, como cabines
individuais, vestiários, boxes e lavapés das piscinas, que proporcionam
condições de temperatura e umidade adequada à manutenção dos esporos
infectantes.
Tinha das unhas e dos pés são as duas infecções cutâneas
provocadas por fungos que prevalecem na população em geral. Embora essas
desordens não sejam sérias em termos de mortalidade, danos físicos e/ou
psicológicos, elas têm significante conseqüência clínica, com lesões crônicas,
de difícil tratamento, além de problemas estéticos (PEREA et al., 2000).
PEREA et al., (2000) analisaram a prevalência de tinha das unhas e
dos pés na população geral de Madri na Espanha. Tinha das unhas estava
presente em 2,8% (4,0% em homens e 1,7% em mulheres) e tinha dos pés em
2,9% (4,2% em homens e 1,7% em mulheres) dos casos. Os agentes
etiológicos prevalentes em tinha das unhas foram: T. rubrum 82,1%, seguido
por T. mentagrophytes var. interdigitale 14,3% e T. tonsurans 3,5%; já em tinha
dos pés, os microrganismos isolados foram: T. rubrum e T. mentagrophytes
44,8%, E. floccosum 7% e T. tonsurans 3,4%.
INGORDO et al., (2000) investigaram 410 homens do exército italiano
que apresentavam lesões suspeitas de tinha dos pés; houve o predomínio de
Trichophyton mentagrophytes em 70%, T. rubrum em 20% e Epidermophyton
floccosum em 10% dos casos.
9
BRILHANTE et al., (2000) investigaram 2.297 pacientes com lesões
clínicas sugestivas de dermatofitose na cidade de Fortaleza, CE, no período de
junho de 1996 a dezembro de 1998 e 534 (23,2%) mostraram-se positivas para
dermatófitos. T. rubrum foi a espécie prevalente (49,6%), seguido por T.
tonsurans (34,4%), M. canis (7%) e T. mentagrophytes (6,2%). Ao correlacionar
as espécies isoladas com os respectivos sítios anatômicos, observaram que T.
tonsurans foi o fungo mais isolado de lesões do couro cabeludo (73,9%), por
outro lado, T. rubrum foi o principal envolvido em tinha do corpo (72,8%)
(BRILHANTE et al. 2004).
Estudos epidemiológicos no Brasil têm mostrado o predomínio de T.
rubrum. COSTA et al,(1999) analisaram 6.068 casos suspeitos de dermatofitose
em Goiânia, GO, durante o período de 1993 a 1997, desses 1.595 foram
positivos para dermatófitos. T. rubrum foi encontrado em 37,4% dos casos,
seguido por T. mentagrophytes (36,4%) e M. canis (16%). Além disso, tinha dos
pés foi o tipo de lesão predominante em 30,5%, seguido de tinha das unhas e
tinha cruris em 17,8% e tinha do corpo em 15,5% dos casos. Outro estudo
realizado em Porto Alegre-RS durante os anos de 1981 a 1995, mostrou o
predomínio de T. rubrum em 55,3% das ocorrências, seguido por T.
mentagrophytes em 21,5% (MEZZARI, 1998). Em Florianópolis-SC, durante os
anos de 1995 a 1996, foram analisados 946 pacientes dos quais 249
apresentaram dermatofitose. A maior incidência foi de T. rubrum (58,6%),
seguido por T. mentagrophytes (25,3%), E. floccosum (7,2%), M. canis (4,8%),
T. tonsurans e T. violaceum (1,6%) e M. gypseum (0,8%) (SANTOS et al., 1997).
Os dermatófitos invadem tecidos queratinizados de humanos e outros
animais, pois em vida parasitária esses microrganismos utilizam a queratina,
10
proteína sulfurada com vários aminoácidos, que são importantes no
desenvolvimento desses fungos (LAWSON, et al., 1957).
A virulência dos dermatófitos está associada com a capacidade deste
grupo em degradar proteínas, particularmente queratina (WEITZMAN &
SUMMERBELL, 1995), devido a presença de queratinases e provavelmente
por outras proteinases (TSUBOI et al., 1989 a,b).
A invasão que ocorre por esses fungos é essencialmente cutânea,
pois estes não têm habilidade de penetrar em tecidos mais profundos ou
órgãos; isso se deve a fatores inibitórios específicos do soro que são uma
associação de uma transferrina insaturada que causa a inibição da queratinase
fúngica.
A doença se produz como conseqüência da reação do hospedeiro aos
metabólitos fúngicos (RIPPON,1988).
A ocorrência de infecções leves ou severas depende da resposta do
hospedeiro contra os metabólitos protêicos que muitas vezes são constituintes
da própria parede celular dos fungos. A virulência depende da cepa infectante
e dos fatores ambientais bem como da localização anatômica da infecção
(LACAZ,1991).
Fungos assim como os mamíferos são seres eucariotos, tendo muitas
semelhanças com a célula humana, fato que pode levar o uso de antifúngicos a
efeitos adversos para o ser humano.
A terapêutica das dermatofitoses pode ser tópica, sistêmica ou
combinada. Os antifúngicos de uso tópico são, em geral, de amplo espectro.
Entre eles, podemos citar os derivados azólicos, a amorolfina, a terbinafina e o
ciclopirox olamina, entre outros. Os sistêmicos como a griseofulvina, são
específicos para dermatófitos. Entre os fármacos em uso atualmente podemos
11
citar os polienos, azois e alilaminas. O fluconazol age na enzima 14-alfa-
demetilase lanosterol envolvida na biossíntese do ergosterol. Participa da
conversão de lanosterol em ergosterol, principal constituinte da membrana
celular dos fungos (MARICHAL & VANDEN BOSSCHE, 1995). Os polienos
representados pela anfotericina B, tem seu mecanismo de ação relacionado
com a ligação do composto ao ergosterol, aumentando a permeabilidade da
membrana, levando o fungo a morte (THOMPSON, L. M. ,2002; CARRILLO-
MUNÕZ, 2006). As alilaminas representadas pela terbinafina, agem inibindo a
escaleno epoxidase envolvida na síntese do lanosterol, que é o precursor do
ergosterol (OSBORNE et. al.,2006; ROCHA, E.M.F. 2002)
As drogas utilizadas para tratar dermatofitoses diferem das utilizadas
contra leveduras e outros fungos filamentosos. Ciclopirox, griseofulvina e
terbinafina devem ser incluídas nos painéis de susceptibilidade de dermatófitos.
(GHANNOUM et al. 2006)
1.2- Trichophyton rubrum
T. rubrum parasita tecidos queratinizados, produz proteinases para se
utilizar das proteínas do hospedeiro como fonte de nutrientes. Trabalhos têm
demonstrado que espécies como Aspergillus nidulans e Neurospora crassa
quando desenvolvidos em meio rico que contém substratos facilmente
metabolizados como, glicose, amino ácidos, nitrato e amônia reduzem sua
produção de proteinas (MATILE, 1965) e quando em meios com baixas
quantidades de nutrientes na fase estacionaria, aumentam sua produção
(MATILE, 1965).
12
T. rubrum produz enzimas esterases e o fungo pode apresentar um
perfil de bandas aumentado em presença de antifúngicos ou stress, sugerindo
que estas enzimas podem ser uma resposta celular não específica ao stress,
ou que participam dos processos de detoxificação na presença do antifúngico
(FACHIN et. al. 2001).
Vários trabalhos estão relacionados com enzimas produzidas pelos
dermatófitos, principalmente pelo T.rubrum e isto tem auxiliado para o maior
entendimento do funcionamento bioquímico das enzimas e tem contribuído na
classificação dos fungos (APODACA, 1989 a,b). Algumas enzimas do T.
rubrum já foram purificadas entre elas as lipases, fosfolipases A e B, acetil
CoA, isolecitina transferase, que são secretadas quando cultivadas em meio
Sabouraud (DAS, 1977).
MC GINNIS (1980), através de eletroforese em gel de poliacrilamida,
estudou esterases, fosfatase ácida, desidrogenase láctica e catalase e
construiu matrizes dessas enzimas através de dendogramas
computadorizados, para ajudar a organizar algumas espécies de fungos.
KASINATHAN et al. (1984), encontraram a glicerol quinase nos fungos
M. gypseum e E. floccosum, que apresentaram os pH ótimos de 8,0 e 10,5 e
valores de Km respectivamente de 0,35 mM e de 2,3 mM.
SANYAL et al. (1985), extraíram uma proteinase extracelular produzida
pelo T. rubrum em meio liquído contendo glicose e peptona, usando-se um
filtrado de cultura do dermatófito; localizaram a enzima por meio de eletroforese
em gel de poliacrilamida e isolaram, através de cromatografia uma proteína
homogênea de caráter alcalino com peso molecular 34,7 kDa.
13
TSUBOI et al. (1989 a), fizeram isolamento de proteínas queratolíticas
em pH ácido, com peso molecular de 41 kDa, através de eletroforese em gel de
poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio e um peso exato de 38 kDa pelo
método de filtração em gel. Foi determinado o ponto isoelétrico em 3,9 com pH
ótimo de 4,5 e utilizando como substrato quimiotripsina, mostraram que as
enzimas dos dermatófitos têm atividade tanto em pH alcalino como em pH
ácido, levando a sugerir que seus constituintes estruturais hidrolíticos são
importantes fatores de virulência dos dermatófitos (TSUBOI, et al. 1989 c)
SANYAL et al.(1985), realizaram um estudo da atividade proteolítica
em infecções dermatofíticas através da indução por extratos córneos em
culturas líquidas. Uma atividade enzimática foi notada em 3 semanas, quando
colocada em meio de cultura contendo glicose e peptona, sendo o T.
mentagrophytes com menor atividade que o T. rubrum em tinha pedis. Para
tinha ungueum, os valores obtidos foram mais baixos em ambos os
dermatófitos e foi verificada também, uma variação em termos da expressão da
atividade enzimática quando correlacionada com o local da infecção.
APODACA e MC KERROW, (1989) observaram que o T. rubrum
possui maior atividade proteolítica em cabelo e unha que T. mentagrophytes e
ambas as espécies apresentavam maior atividade proteolítica na fase aguda da
infecção.
Portanto estudos estatísticos e de estruturas enzimáticas são muito
importantes tanto para análise de prevalência e da freqüência dessas doenças,
quanto para achados dos mecanismos de metabolismo do fungo (MC
GINNIS,1989).
14
1.3- Metabólitos de plantas
As plantas produzem grande quantidade de metabólitos compostos,
podendo ser divididos quanto a sua origem em dois grandes grupos, os
metabólitos primários, provenientes do metabolismo primário e os secundários
do metabolismo secundário. Os compostos de origem no metabolismo primário
são constituintes essenciais para a sobrevivência da planta, sendo produzidos
normalmente. Os de origem no metabolismo secundário são produzidos em
situações especiais como resposta a stress, invasão por microrganismos,
insetos ou outros animais, tendo entre outras funções a defesa da planta. Entre
os metabólitos secundários que estão relacionados com a defesa da planta
podemos citar as fitoalexinas, cuja presença aumenta de forma considerável
em resposta a invasão microbiana (DIXON, 2001).
Plantas medicinais têm sido usadas para vários propósitos incluindo sua
utilização como agentes antimicrobianos e tem apresentado inibição do
crescimento de fungos (LEMOS et al., 2005). Dentre as plantas com possíveis
ações antimicrobianas encontramos a Pothomorphe umbellata, com potencial
ação antifúngica.
1.4- Pothomorphe umbellata
Pothomorphe umbellata pertencente a família Piperaceae, divisão
Magnoliophyta, Classe Magnoliopsida, Sub classe Magnoliidae, ordem
Piperales (CRONQUIST, 1981, “ apud” PERAZZO, 2006). É formada por cerca
de 10 gêneros com 1400 espécies distribuídas em regiões tropicais e
subtropicais, ocorrendo na América Central, América Latina, no Brasil sendo
encontrada de norte a sul. Nesta família as plantas são predominantemente de
15
porte herbáceo existindo também plantas trepadeiras, arbustivas e mais
raramente árvores (YUNCKER “apud” JANUÁRIO,1994). A família tem
importância econômica com algumas espécies de valor comercial, como Piper
nigrum (pimenta-do-reino) utilizada como condimento enquanto outras
possuem atividade narcótica, caráter estimulante sendo também utilizadas no
tratamento de diversas doenças (JANUÁRIO,1994)
Em Piperáceas, de acordo com pesquisas fitoquímicas, foram relatadas
a produção de óleos essenciais, lignanas, neolignanas, substâncias
nitrogenadas, flavonóides, kava-lactonas, butenolidos e derivados de ácidos
hidroxibenzóico (JANUARIO, 1994). Entre as neolignanas, destaca-se a
kadsurenona, inibidor do PAF e entre as lignanas lirioresinol C e B. As
substâncias nitrogenadas, constituintes mais comuns do gênero Piper,
apresentam piperina, piperetina, piperoleína e piperamida, sendo estas duas
últimas portadoras de ação larvicida contra Toxocara canis. Foram ainda
detectados flavonóides como a chalcona, flavona e kava-lactonas como as -
pironas (JANUARIO,1994) Encontra-se boa quantidade de óleo essencial em
Piperaceae, as folhas de Piper aduncum var aduncum e var cordulatun contém,
dilapiol, monoterpenos e sesquiterpenos, as de Piper callosum contém safrol,
metileugenol e terpenos e as de Piper hipidinervium safrol e monoterpenos
(GOTTLIEB et al.,1981).
Esta família apresenta muitas espécies de uso na medicina popular,
como estimulantes, estomáquicas, carminativas e desobstruentes do fígado
(JANUARIO, 1994).
16
O gênero Pothomorphe Miquel apresenta dez espécies, com
predominância na região abaixo da linha do equador (BHETTCHARYYA,1998,
“apud” PERAZZO, 2006).
Pothomorphe umbellata (L.) Miq. planta própria da flora Brasileira, é um
subarbusto ereto, perene, muito ramificado, com hastes articuladas, providas
de nós bem visíveis, com 1,0 a 2,5 metros de altura, apresentando folhas
amplas, com bases pregueadas parecendo peltadas, cartáceas, de 15 a 23 cm
de comprimento, com pecíolo de 18 a 24 cm. A espécie produz flores pequenas
e discretas, de cor creme-esverdeada, reunidas em inflorescências axilares
espigadas de 4-8 cm de comprimento e multiplica-se por sementes. A espécie
pertence ao grupo das esciófitas, isto é, planta de sombra obrigatória
(LORENZI & MATOS, 2002)
Pothomorphe umbellata (L.) Miq. possui as sinonímias Piper umbellatum
(L.) Kunth e Hecheria umbellata (L.) Kunth (JANUARIO,1994) e é conhecida
pelo nome popular de caapeba, pariparoba, malvaísco, capeva, caapeba-do-
norte, caapeba-verdadeira. O nome pariparoba significa amargo, que acaba
com feridas, derivado do Tupi pari (ferida) pa (acabar) e rob (amargo), o nome
caapeba deriva de caa (erva) e peba (plano) devido a folhas largas e chatas
(RIEDEL,1941”apud” JANUÁRIO,1994). Pode ser encontrada desde o Sul do
país até a Amazônia, principalmente nos estados de São Paulo, Minas Gerais,
Espírito Santo e sul da Bahia, principalmente nas orlas das matas, capoeiras e
capoeirões. Tem sido usada na medicina popular como analgésico, diurético e
agente anti-espasmódico, desordens inflamatórias, malária, asma e doenças
gastrintestinais. P. umbellata é uma planta muito conhecida nas comunidades
caboclas da região Amazônica, sendo utilizada na cura de feridas, inflamações,
17
irritações da pele; o suco das folhas como emenagogo, e as raízes como
facilitador do parto e acelerador da expulsão de placenta (PERAZZO, 2006)
Na literatura encontramos autores que produziram estudos fitoquímicos
sobre a P. umbellata. Nos extratos hexânicos e diclorometânicos JANUÁRIO
(1994) encontrou os esteróides, sitosterol e estigmasterol isolados de todos os
órgãos da planta, bem como o 4-nerolidilcatecol, principalmente a partir de
folhas e caule, peltatol A, um dímero do 4-nerolidilcatecol. No extrato etanólico,
foi encontrado cloreto de potássio, glicose, manose, galactose, alcalóides. No
óleo essencial foram encontrados constituintes sesquiterpenoídicos como, -
elemeno, -cubebeno, -copaeno, -guaieno, trans-cariofileno, tetrametiltriciclo
undec-1-eno, -humuleno, epibiciloesquifenantreno, -selineno, -cadieno, -
patchuleno, -gurjuneno, -cadieno, -gurjuneno, -ylangeno, cadieno e
nerolidol (JANUARIO, 1994). PERAZZO (2006) encontrou na fração
diclorometanólica, oxiranemetanol, 4-nerolidilcatecol em diversas frações,
hinoquinina, fitoesteróides como campesterol, estigmaterol e -sitosterol na
fração diclorometânica ( PERAZZO, 2006). MESQUITA et al. (2005), encontrou
em seu estudo óleos essenciais como E cariofileno, ∆ cadieno, E nerolidol,
espatulenol, oxido de cariofileno, germacreno D, biciclogermacreno, elemol, β-
pipeno.
O 4-nerolidilcatecol é encontrado em grande quantidade na planta, pode-
se afirmar que este composto é um marcador fitoquímico a ser analisado em
processos de controle de qualidade para formas farmacêuticas que tenham a
planta ou seu extrato como droga vegetal (PERAZZO, 2006).
Estudo da atividade biológica de P. umbellata indicou pouca atividade
anti-PAF para o extrato hexânico de caule, raiz e folha e também para o 4-
18
nerolidilcatecol (JANUÁRIO, 1994). O extrato etanólico apresentou melhor ação
com folhas e uma ação de 100% de atividade anti-PAF quando preparado de
caule. Para a ação analgésica e antiinflamatória os extratos aquosos, hexânico
e etanólico e o 4-nerolidilcatecol apresentaram boa ação. Para atividade anti-
edematogênica o extrato aquoso mostrou ser bem ativo (JANUÁRIO, 1994).
O estudo de PERAZZO (2006) determinou que a DL
50
foi maior que
2,0 g/Kg peso para o extrato bruto, tendo apresentado ação analgésica
avaliada por contorções abdominais, porém sem apresentar efeito significativo
em edema de pata induzido por histamina e atividade sobre a enzima COX-2,
não sendo capaz de inibir o processo de inflamação induzido por óleo de
Cróton. O extrato bruto apresentou menor citotoxicidade em células HL-60,
enquanto o 4-nerolidilcatecol apresentou a mais alta citotoxicidade. P.
umbellata demonstrou ação antimicrobiana (ISOBE et al., 2002), e ação
analgésica e antiinflamatória (PERAZZO et al., 2005).
Sabidamente os vegetais são fontes de substâncias químicas, com
riqueza de diferentes moléculas, sendo muitas ainda não estudadas. A flora
Brasileira possui imensa biodiversidade, podendo por conseguinte ser fonte de
inúmeras moléculas desconhecidas e que podem ser utilizadas na manutenção
da saúde e prevenção de doenças dos seres vivos. A compreensão de
mecanismos de patogenicidade ou defesa dos microganismos, pode nos levar
a novas estratégias terapêuticas e ou profiláticas, a medida que possamos
desenvolver novos alvos para a ação de drogas. Estes fatos refletem a
necessidade de estudos voltados para a investigação de novas estratégias
terapêuticas bem como do desenvolvimento de novos produtos direcionados
para medidas profiláticas e preventivas como desinfetantes e saneantes.
19
2- Objetivos
O objetivo geral do presente trabalho foi analisar a atividade de extratos
e frações de Pothomorphe umbellata frente às linhagens do Trichophyton
rubrum .
Os objetivos específicos do trabalho foram:
1- Padronização do método de determinação de sensibilidade de fungos
filamentosos baseados nos métodos M38-A do CLSI e EUCAST com
modificações.
2- Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para drogas
licenciadas
3- Determinação da CIM e CFM para os extratos vegetais
4- Análise do perfil protéico obtido do meio de cultivo das linhagens de
Trichophyton rubrum: H6, TruMDR2 e Tr1 de campo frente às drogas
licenciadas
5- Análise do perfil protéico obtido do meio de cultivo das linhagens de
Trichophyton rubrum: H6, TruMDR2 e Tr1 de campo frente aos extratos de
Pothomorphe umbellata
20
3-Materiais e Métodos
3.1- Equipamentos
Vidraria:Placas de Petri, tubos de ensaio, pipetas, balão de vidro, balão
volumétrico, provetas, copo de Becker, bastão de vidro, frascos de Erlenmayer,
cuba para revelação da eletroforese, placa de vidro para cromatografia, Cuba
de vidro para cromatografia
Tubos Plástico cônicos tipo Falcon Estantes de arame revestidas com PVC
com capacidade para 24 tubos
Parafim: filme de PVC Marca: American National
Filme de PVC
Espátula de metal
Palitos de madeira
Microplacas com 96 poços marca
Micropipetas com volume ajustável de 5 a 50 µL, 40 a 200 µL, 200 a 1000 µL,
marca Finpippete
Ponteiras descartáveis para volume de 5 a 200 µL e 200 a 1000 µL
Bico de Bunsen
Capela com fluxo laminar, marca Veco
Fonte de eletroforese marca Gibco BRL modelo OS 3002
Cuba Gibco BRL modelo V16
Estufa com agitador marca Marconi modelo MA 830
Espectrofotômetro marca Spectronic Modelo Genesys 5
Autoclave vertical marca Fabbe-Primar, modelo 03
Estufa de secagem marca Fanen modelo 3153 E
21
Câmera fotográfica digital marca Canon, modelo Power Shot A 530
Peagometro, marca Orion modelo 420 A
Placas para cromatografia marca: Macherey - Nagel (Alemanha)
3.2- Sais e Reagentes
2- mercaptoetanol
Acetato de etila
Ácido acético
Ácido cítrico
Ácido sulfúrico
Àcido tricloroacético (TCA)
Acrilamida
Agar
Água bidestilada
Água destilada
Água mili Q
Anfotericina B
Azul de bromofenol
Bis-acrilamida (N.N – metileno bisacrilamida)
Carbonato de sódio
Dextrose
Dicromato de potássio
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)
Etanol
Fluconazol
22
Formaldeido
Glicina
Glicerol
Glicose (sigma-chemical CO)
Griseofulvina
Hexano
Higromicina
Itraconazol
Marcadores de Peso Molecular para eletroforese (GE)
Meio ágar batata
Meio Sabouraud
Meio RPMI 1640 (Gibco)
Peptona (biobras)
Persulfato de Amônio (APS)
Nitrato de Prata
Tampão MOPS (ácido 3-(Nmorfolino) propanosulfônico) marca Acros Organics
Terbinafina
Trizma base (alfa, alfa, alfa-Tris (hidroximethil) Metilamina, Tris (hidroxidi metil
amino metano)
Temed (Gibco GBL)
Vanilina
23
3.3- Material vegetal
As partes aéreas de Pothomorphe umbellata (L.) Miq. foram colhidas
em 15 de Dezembro 2005, no local denominado “Terra de Ismael”, Ribeirão
Preto, SP, Brasil. Foram processadas na Unidade de Biotecnologia da
UNAERP e os extratos produzidos no laboratório de química de produtos
naturais da mesma unidade, sob coordenação da Profa. Dra. Ana Helena
Januário.
Figura 1: Pothomorphe umbellata
3.4- Preparação dos extratos e frações
As partes aéreas da planta foram secas em estufa a 50º C e trituradas
em moinho de facas e colocadas nos solventes (metanol, clorofórmio,
etanol/água 7:3) para maceração. Foram feitas 3 extrações de cada solvente
por um período de 2 dias para cada extração. Após a maceração realizou-se
filtração e concentração dos extratos. Para a tintura Etanol/água utilizou-se
500 g da planta seca, obtendo-se 75 g da tintura com um rendimento de 15%.
24
Para o extrato metanólico e clorofórmico utilizou-se 800 g da planta seca,
obtendo-se respectivamente 65 g e 76,10 g, com rendimento total de 17,64%.
A partir do extrato etanol/água, procedeu-se a obtenção das partições
na presença dos seguintes solventes: hexano, diclorometano, acetato de etila e
n-butanol , conforme fluxograma mostrado na Figura 2:
Figura 2: Fluxograma de obtenção dos extratos e frações de P. umbellata
Extrato
Metanólico
Extrato
Clorofórmico
Extrato Etanólico
Fração Hexano
Fração Aquosa
Fração Diclorometano Fração Aquosa
Fração acetato de
etila
Fração Aquosa
Partes Aéreas de P. umbellata
Fração N-
butanol
Fração residual
(aquosa)
25
Na Tabela 1 estão apresentados os extratos brutos e frações obtidas de
Pothomorphe umbellata para este trabalho.
Tabela 1: Extratos e frações de P. umbellata
a) Amostras Material
vegetal
Solvente Concentra
ção inicial
do Extrato
Data coleta
da planta
Data de
produção
PA EtOH Partes
aéreas
Etanol 50 mg/mL 15/12/05 10/01/06
PA MeOH Partes
aéreas
Metanol 50 mg/mL 15/12/05 10/01/06
PA CHCl
3
Partes
aéreas
Clorofórmio 50 mg/mL 15/12/05 08/05/06
P Hex Partes
aéreas
Hexano 50 mg/mL 15/12/05 10/01/06
P Dic Partes
aéreas
Diclorometano 50 mg/mL 15/12/05 08/05/06
P Ac. EtOH Partes
aéreas
Ac. de etila 50 mg/mL 15/12/05 08/05/06
P N-But Partes
aéreas
N-butanol 50 mg/mL 15/12/05 08/05/06
P Residual Partes
aéreas
Água 50 mg/mL 15/12/05 08/05/06
a)PA EtOH: partes aéreas extrato etanólico, PA MeOH: partes aéreas extrato
metanólico, PA CHCl
3
: Partes aéreas extrato clorofórmico, P Hex.: Partição
hexano, P Dic.: partição diclorometano, P Ac. EtOH: partição acetato de etila,
P N-But.: Partição N-butanol, P Residual: resíduo aquoso
3.5- Meios de cultura
3.5.1-Meio líquido para crescimento
A composição do meio Sabouraud líquido está descrita a seguir:
Glicose 20 g
Peptona bacteriológica 10 g
Água destilada qsp 1000 mL
Após ser dissolvido à quente e o pH ajustado em 5,7 o meio foi
autoclavado a 1 atmosfera de pressão por 20 minutos.
26
3.5.2- Meio Sabouraud sólido
A composição do meio Sabouraud sólido está descrita a seguir:
Peptona 10,0 g
Glicose 40,0 g
Ágar 15,0 g
Foi utilizado meio Sabouraud marca OXOID (Inglaterra) que foi
preparado dissolvendo-se 65 g do meio em 1000 mL de água destilada e
autoclavando-se a 1 atmosfera de pressão por 20 minutos.
3.5.3-Meio RPMI
A composição do meio esta descrita a seguir:
Meio RPMI 1640 10,4 g
Tampão MOPS 35,4 g
Glicose 19,0 g
Água Mili Q 1000 mL
Após o processo de pesagem, o meio RPMI foi dissolvido em 900 mL de
água, acrescentado o MOPS (concentração final 0,165 mol/L), agitando até
dissolver. O pH foi ajustado para 7,0 a 25ºC utilizando hidróxido de sódio 1
mol/L e após foi acrescentada água até o volume final de 1000mL. Esterilizado
por filtração e armazenado a 4ºC até o uso.
3.5.4- Meio ágar batata dextrose
Extrato de batata 20 g
Dextrose 10 g
Agar 15 g
Água Destilada 1000 mL
27
3.6- Soluções
Para os experimentos realizados neste trabalho foram preparadas
soluções de antifúngicos, que foram diluídos conforme preconizado na portaria
M-38 A CLSI.
3.6.1- Solução de terbinafina
Foi preparada solução estoque de terbinafina em dimetilsulfoxido
(DMSO) numa concentração de 5000 µg/mL, sendo diluída em RPMI quando
necessário.
3.6.2- Solução de fluconazol
Foi preparada solução estoque de fluconazol marca Pfizer em água na
concentração de 10000 µg/mL, sendo diluída em RPMI quando necessário.
3.6.3- Solução de itraconazol
Foi preparada solução estoque de itraconazol marca Janseen Cilag em
DMSO na concentração 5000 µg/mL, sendo diluida em RPMI quando
necessário.
3.6.4- Solução de griseofulvina
Foi preparada solução estoque de griseofulvina marca Janseen Cilag
em dimetilsulfoxido (DMSO) numa concentração de 5000 µg/mL, sendo diluída
em RPMI quando necessário.
28
3.6.5- Solução de Anfotericina B
Foi preparada solução estoque de anfotericina B marca Sigma em
dimetilsulfoxido (DMSO) numa concentração de 32000 µg/mL, sendo diluída
em RPMI quando necessário.
3.7- Marcador de peso molecular para eletroforese
Foram utilizados como marcadores de peso molecular o produto Low
Molecular Weight Calibration Kit for SDS Eletrophoresis, fabricado em janeiro
2006, marca Amersham Biosciences - GE Healthcare UK limited, Reino Unido,
preparado segundo instruções do fabricante.
3.8 - Reagentes para o gel de poliacrilamida da eletroforese
3.8.1- Solução de Acrilamida bis-acrilamida
Acrilamida 30% 29,2 g
Bis-acrilamida 0,8 g
H
2
O bidestilada 100,0 mL
Foi adicionada a água sobre a acrilamida e mantida a solução a 56°C
coberta com Parafilm até a dissolução completa. A solução foi filtrada e
estocada em frasco escuro.
3.8.2-Tampão tris HCl pH 8,8
Trizma base 1,5 M (pH 8,8) 18,17 g
SDS 20% 2,00 mL
H
2
O bidestilada qsp 100,00 mL
29
Foram adicionados 50 mL de água e acertado o pH para 8,8 com HCl
6N. Foi acrescentado o SDS, completado o volume e filtrada a solução que foi
armazenada sob refrigeração.
3.8.3-Tampão tris HCl pH 6,8
Trizma base 1,0 M (pH 6,8) 6,06 g
SDS 20% 2,00 mL
H
2
O bidestilada 100,00 mL
Foram adicionados 50 mL de água e acertado o pH para 6,8. Foi
acrescentado o SDS, completado o volume e filtrado. A solução foi guardada
sob refrigeração.
3.8.4-Solução de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)
SDS 10%
SDS 10,0 g
H
2
O bidestilada 100,0 mL
O SDS foi dissolvido em água e armazenado geladeira
SDS 20%
SDS 20,0 g
H
2
O bidestilada 100,0 mL
O SDS foi dissolvido em água e armazenado geladeira
3.8.5-Temed
Solução de N, N, N´, N´-tetrametilenodiamina 99%, marca Gibco GRL
30
3.8.6- Solução de Persulfato de Amônio (APS)
Persulfato de Amônio 0,5 g
H
2
O bidestilada 5,0 mL
Foram misturados até dissolução e distribuídos em alíquotas que foram
mantidas congeladas a -20°C.
3.8.7-Tampão de corrida pH 8,3
Trizma 25 mM 3,06g
Glicina 192 mM 14,4 g
SDS 1,0 g
H
2
O destilada qsp 1000,0 mL
Foram dissolvidos Trizma, glicina e SDS em 900 mL de água, ajustado o
pH para 8,3 e completado o volume para 1000 mL com água destilada.
3.8.8-Tampão de amostra
Trizma 60 mM (pH 6,8) 0,6 mL
Glycerol 25% 2,5 mL
SDS 2% 1,0 mL
2-mercaptoetanol 14,4 mM 0,5 mL
Azul de bromofenol 0,1% 1,0 mL
H
2
O bidestilada 4,4 mL
Foram distribuídos em alíquotas e estocados a -20°C.
31
3.9- Reagentes para revelação do gel pela prata
3.9.1- TCA (Ácido tricloroacético)
Ácido tricloroacético 10 g
Água destilada 100 mL
3.9.2- Solução de lavagem
Etanol 10 mL
Ácido acético 5 mL
Água destilada qsp 100 mL
3.9.3- Solução oxidante
Ácido cítrico 100 mg
Dicromato de Potássio 67 mg
Água destilada 100 mL
3.9.4- Solução Nitrato de Prata
Nitrato de Prata 200 mg
Água destilada 100 mL
3.9.5- Solução redutora
Carbonato de sódio 2,96 g
Formaldeído 200 µL
Água destilada qsp 100 mL
32
3.9.6- Solução ácido acético
Ácido Acético 5 mL
Água destilada qsp 100 mL
3.10- Reagentes para a cromatografia
3.10.1- Placa de cromatografia
Sílica gel, Marca Macherey-Nagel, procedência :Alemanha.
Placa 0,25 mm
Indicador de fluorescência UV 254
3.10.2- Solução de hexano e Acetato de etila (fase móvel)
Hexano 6 mL
Acetato de etila 14 mL
3.10.3- Solução de Vanilina Sulfúrica
Solução 1
Vanilina 0,5g
Etanol 50 mL
Solução 2
Etanol 50 mL
Ácido sulfúrico 2,5 mL
Misturar a solução 1 a solução 2
33
3.11- Linhagens de Trichophyton rubrum
Neste estudo foram utilizadas três linhagens de T. rubrum,
denominadas, Tr1 (previamente identificada pela Profa. Dra Ana Marisa Fusco
Almeida), H6 (identificada pela Profa Dra Claúdia M Leite Maffei da FMRP-
USP) e TruMDR2 obtida a partir da linhagem H6, pela Profa. Dra. Ana Lucia
Fachin, cujas características estão descritas a seguir.
Tr1: Linhagem isolada de lesão de unha, de paciente com dermatofitose,
cedida gentilmente pela Profa. Dra. Ana Marisa Fusco Almeida do curso de
Ciências Farmacêuticas da UNAERP. Apresenta colônias de aspecto cotonoso
e encorpado, com coloração avermelhada no reverso após 21 dias de
crescimento, apresentando histórico de falha terapêutica
H6: Linhagem isolada de paciente com dermatofitose, (ATCC MYA-3108)
cedida gentilmente pela Profa. Dra. Ana Lucia Fachin da Unidade de
Biotecnologia da UNAERP, antes da ruptura do gene TruMDR2
TruMDR2: Linhagem obtida a partir da linhagem H6, no laboratório da Profa.
Dra. Nilce M. Martinez Rossi, pela Profa. Dra. Ana Lucia Fachin da Unidade de
Biotecnologia da UNAERP, que cedeu gentilmente para este trabalho. Esta
cepa constitui-se de uma transformação a partir de ruptura do gene TruMDR2,
que esta envolvido com a múltipla resistência a drogas.
3.12-Manutenção e estoque das linhagens
A manutenção de todas as linhagens foi realizada por repiques
periódicos, nos quais os isolados foram inoculados com o auxílio de palitos de
madeira estéreis em placas de Petri contendo meio ágar Sabouraud ou ágar
batata e mantidos em temperatura ambiente por um período de 15 dias. A
34
composição dos respectivos meios pode ser observada em itens posteriores.
Para a preservação dos isolados por períodos maiores, foram utilizados tubos
de ensaio inclinados com meio ágar Sabouraud. Após o cultivo as linhagens
foram mantidas à temperatura ambiente. Para a linhagem TruMDR2 os meios
de cultura foram adicionados de 400 µg/mL de Higromicina
3.13- Diluição dos extratos vegetais
Para diluição dos extratos vegetais foram utilizados microtubos tipo
eppendorf e como diluente utilizou-se DMSO. Os extratos foram diluídos a
uma concentração de 50 mg/mL. A partir dos extratos diluídos em DMSO
preparou-se soluções mãe em meio RPMI com 2% de glicose tamponado em
MOPS pH 7.2, de modo a obtermos uma concentração de 5 mg/mL. A
composição do meio RPMI está descrita em itens posteriores.
3.14- Preparação e diluição dos antifúngicos
Os antifúngicos Fluconazol, terbinafina e itraconazol foram diluídos
conforme especificado no protocolo M 38A do Clinical and Laboratory Standars
Institute – CLSI (NCCLS, 2002). O fluconazol foi diluído em água estéril para
preparo da solução estoque e a terbinafina, griseofulvina, anfotericina B e
itraconazol foram diluídos em DMSO para preparo das soluções estoque. Após
as diluições conforme recomendações do documento CLSI M-38A, obteve-se
para o fluconazol em tubos concentração final de 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5;
0,25 e 0,125 µL/mL em RPMI. Para a terbinafina, griseofulvina, anfotericina B e
itraconazol obteve-se concentrações finais de 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125;
0,0625 e 0,0313 µL/mL em RPMI.
35
3.15- Preparo do Inóculo
As linhagens foram desenvolvidas em placas com ágar Sabouraud por
sete dias. Após o desenvolvimento adotou-se o seguinte procedimento para o
preparo do inóculo: raspou-se as colônias com auxílio de um fio de platina em
L, desgrudando-as do meio e colocando-as em tubo cônico contendo 3 mL de
salina estéril. Após este procedimento misturou-se em vortex por
aproximadamente 3 minutos. As células foram contadas em câmara de
Neubauer. O número de células foi ajustado para que se obtivesse um número
final de 5,0 x 10
3
UFC/mL em meio RPMI. A seguir foi feito o inóculo de 100µL
por poço na microplaca de 96 poços.
3.16- Aplicação do Inóculo na Microplaca para drogas licenciadas
Para posterior determinação da concentração inibitória mínima foi
utilizada adaptação da metodologia segundo o CLSI M38-A (NCCLS, 2002).
Para tanto, nesta técnica foram utilizadas microplacas de 96 poços, que
contém 8 linhas e 12 colunas. A coluna 1 foi usada para o controle negativo do
teste onde se inoculou apenas o meio RPMI (200 µL). Na coluna 12, o controle
positivo, foram inoculados apenas a suspensão de conídios e o meio RPMI .
Foram colocados 100µL da suspensão de células em cada poço nas colunas 2
a 11, adicionados de 100 µL do antifúngico em suas respectivas diluições
conforme determinado na portaria M 38 A do CLSI (NCCLS, 2002)
3.17 - Aplicação do inóculo em microplacas para os extratos vegetais
Para posterior determinação da concentração inibitória mínima foi
utilizada adaptação da metodologia segundo o CLSI M38-A (NCCLS, 2002).
36
Para tanto nesta técnica também foram utilizadas microplacas de 96 poços,
que contém 8 linhas e 12 colunas. O meio de cultura utilizado foi o meio RPMI
com 2% de glicose tamponado em MOPS pH 7,2 . A coluna 1 foi usada para o
controle negativo do teste onde havia apenas o meio de cultura (200 µL). Na
coluna 11 foram colocados 100 µL do meio e 100 µL do extrato a ser testado,
servindo de controle negativo do extrato e também para controle de turbidez. A
coluna 12 foi considerada como controle positivo onde foram inoculados
apenas 100 µL da suspensão de células (5,0 x 10
3
UFC/mL) e 100 µL do meio.
Em cada poço nas colunas 2 a 10 foram adicionados 100 µL do meio .
Posteriormente na coluna 2 foram colocados 100µL do extrato vegetal,
homogeneizado e retirados 100µL passando para a coluna 3; desta também
foram retirados 100µL e repassados a coluna 4 e assim sucessivamente até a
coluna 10, onde após a adição dos 100µL retirados da coluna 9, foram
retirados 100µL e descartados, obtendo-se então a diluição do extrato vegetal.
Foram colocados 100µL da suspensão de células em concentração 5,0 x 10
3
UFC/mL em cada poço nas colunas 2 a 10.
3.18- Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Após a montagem, a placa foi incubada em estufa com agitação de 20
rpm por sete dias a 28º C. A leitura foi feita observando-se o desenvolvimento
do microrganismo em relação ao controle negativo, isto é, ausência de
crescimento. Foi determinada como CIM o poço com a menor concentração do
antifúngico ou extrato onde não ocorreu o desenvolvimento dos
microrganismos.
37
3.19- Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)
A determinação da concentração fungicida mínima foi realizada em
placa de Petri contendo ágar Sabouraud. A placa de Petri foi previamente
demarcada de acordo com as posições das diluições dos extratos e
antifúngicos na placa de microdiluição.
Uma alíquota do conteúdo dos poços da placa de microdiluição foi
transferida com o auxílio de um palito estéril para o respectivo local na placa de
Petri. Incubou-se a placa em estufa a 28ºC por 7 dias. Foi determinada como
CFM a menor concentração do extrato ou antifúngico onde não ocorreu o
desenvolvimento dos microrganismos.
3.20- Obtenção dos extratos protéicos das linhagens
3.20.1- Estabelecimento da curva de crescimento
Após o desenvolvimento das linhagens do T. rubrum em placas de Petri
com ágar batata dextrose, os micélios foram raspados e transferidos para 3 mL
de solução salina estéril. Após contagem do número de células, foram
transferidas quantidades suficientes para um frasco estéril com 20ml de meio
Sabouraud líquido de modo que neste meio obtivéssemos uma concentração
de 5 x 10
3
UFC/mL. Para cada linhagem foram preparados 4 frascos
(Erlenmeyers) que foram incubados em estufa com agitação a 30 rpm, a 28º C,
permanecendo em incubação por 7, 14, 21 e 28 dias. Após este período, filtrou-
se a cultura em papel de filtro estéril e em ambiente estéril, obtendo-se o
filtrado e a massa celular. Para a obtenção da massa fúngica, mantivemos a
filtração em funil por 5 minutos, sendo a massa coleta e colocada em estufa por
38
7 dias a 60º C. No filtrado estão presentes as proteínas exocelulares e na
massa celular, as proteínas endocelulares. Os filtrados exocelulares ou
extratos exocelulares (metabólitos) foram utilizados para a eletroforese.
3.20.2- Obtenção dos extratos protéicos das linhagens frente ao extrato
vegetal
Após o desenvolvimento das linhagens do T. rubrum em placas de Petri
com ágar batata, os micélios foram raspados e transferidos para 3 mL de
solução salina estéril. Após contagem do número de células, transferiu-se
quantidades suficientes, para um frasco estéril com 20mL de meio Sabouraud
líquido de modo que neste meio obtivéssemos uma concentração de 5 x 10
3
UFC/mL. Foi adicionado o extrato vegetal em condições de CIM e sub-CIM,
isso é, concentração inibitória mínima e metade da concentração inibitória
mínima, respectivamente, baseando-se nas CIM previamente determinadas.
Para cada linhagem foram preparados 3 frascos que foram incubados em
estufa com agitação a 30 rpm, a 28º C, permanecendo em incubação por 7, 14
e 21 dias. Após este período, filtrou-se a cultura contendo o fungo em gaze
estéril e em ambiente estéril, obtendo-se o filtrado e a massa celular, obtida
como descrita no item anterior. No filtrado estão presentes as proteínas
exocelulares e na massa celular, as proteínas endocelulares. Os extratos
exocelulares ou filtrados, obtidos segundo a Figura 3, foram utilizados na
eletroforese.
39
Figura 3: Fluxograma de obtenção dos extratos exocelulares (filtrados) após
incubação frente ao extrato vegetal.
3.20.3- Obtenção dos extratos protéicos das linhagens frente aos agentes
antifúngicos
Após o desenvolvimento das linhagens do T. rubrum em placas de Petri
com ágar batata, os micélios foram raspados e transferidos para 3 mL de
solução salina estéril. Após contagem do número de células, transferiu-se
quantidades suficientes para um frasco estéril com 20mL de meio Sabouraud
líquido de modo que neste meio obtivéssemos uma concentração de 5 x 10
3
UFC/mL. Foram adicionados os antifúngicos conforme CIM previamente
determinada. Os frascos foram incubados em estufa com agitação a 30 rpm, a
28º C, permanecendo em incubação por 7, 14, 21 e 28 dias. Para o fluconazol
foram preparados 5 frascos para cada linhagem, sendo que em 1 (tempo zero),
o antifúngico foi adicionado no primeiro dia e filtrado no sétimo, amostra
denominada F0, nos outros 4 frascos o antifúngico foi adicionado no sexto dia e
foram filtrados em 7, 14, 21 e 28 dias após a inoculação, estas amostras foram
denominadas de F1, F2, F3 e F4 respectivamente. Para a anfotericina B e
griseofulvina foi preparado um frasco de cada linhagem do fungo, onde foi
adicionado o antifúngico no sexto dia de crescimento e no sétimo dia procedeu-
Extrato vegetal filtração após 7 dias E1
Fungos 5,0x10
3
/mL Extrato vegetal filtração após 14 dias E2
Extrato vegetal filtração após 21 dias E3
40
se a filtração. A filtração procedeu em papel de filtro estéril e em ambiente
estéril, obtendo-se o filtrado e a massa célula, conforme descrito em itens
anteriores. No filtrado estão presentes as proteínas exocelulares e na massa
celular, as proteínas endocelulares. Os extratos exocelulares ou filtrados,
obtidos segundo a Figura 4, foram utilizados na eletroforese.
Fungos 5,0 x 10
3
/mL
Filtração 7º dia
Fluconazol
1º dia
Extrato (F0)
Fluconazol
6º dia
Filtração 7º dia
Extrato (F1)
Fluconazol
6º dia
Fluconazol
6º dia
Fluconazol
6º dia
Filtração 14º dia
Filtração 21º dia
Filtração 28º dia
Extrato (F2)
Extrato (F3)
Extrato ( F4)
Anfotericina
6º dia
Filtração 7º dia
Extrato (A)
Griseofulvina
6º dia
Filtração 7º dia
Extrato (G)
Figura 4: Fluxograma de obtenção dos extratos (filtrados) exocelulares após
incubação frente aos agentes antifúngicos.
3.21- Determinação do perfil protéico através de eletroforese em gel de
poliacrilamida
O perfil protéico dos filtrados de cultura das linhagens foi avaliado
através de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
(SDS-PAGE) com gel de empilhamento de 12% e gel de separação de 12%
(LAEMMLI, 1970). Para a confecção dos géis de poliacrilamida foram utilizados
placas de vidro medindo 19,5x16x0,3 cm, separadas por espaçadores de 1mm
41
de espessura. A eletroforese foi realizada em tampão tris-glicina. As
concentrações dos reagentes e quantidades necessárias estão descritas nas
Tabelas 2 e 3. O tempo de corrida foi de aproximadamente 10 horas a 50V, 40
mA e 90 W.
Tabela 2: Gel de separação a 12%
Reagentes Quantidade
Àgua MilliQ 6,6 mL
Acrilamida 30% 8,0 mL
Tris HCL 1,5M Ph8,8 5,0 mL
SDS 10% 200 µL
Persulfato de Amônio 10% 200 µL
Temed 8 µL
Tabela 3: Gel de Empilhamento a 12%
Reagentes Quantidade
Àgua MilliQ 5,5 mL
Acrilamida 30% 1,3 mL
Tris HCL 1,0M Ph6,8 1,0 mL
SDS 10% 80 µL
Persulfato de Amônio 10% 80 µL
Temed 8 µL
3.21.1- Aplicação das amostras no gel de Poliacrilamida
As amostras foram preparadas com 20 µL de tampão de amostra e 80µL
do filtrado, após 3 minutos em banho fervente, foram aplicados 50 µL da
preparação em cada poço.
3.21.2- Revelação do gel pela Prata
Após a retirada do gel da cuba de eletroforese, o perfil protéico foi
revelado utilizando-se o método de revelação pela prata. O gel foi colocado em
TCA 20% por 30 minutos, lavado com uma solução de etanol 10%/ ácido
42
acético 5%, por 10 minutos, três vezes. Após foi colocado a solução oxidante
(dicromato de potássio e ácido cítrico) deixando reagir por 5 minutos, lavado
com água destilada por 10 minutos, duas vezes e adicionado a solução de
nitrato de prata por 20 minutos. O gel foi lavado com água destilada, durante 1
minuto, e adicionado a solução redutora (carbonato de sódio e formaldeido) ,
após o que, a reação foi interrompida com ácido acético a 5%.
3.22- Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)
Foi realizada em placa medindo 10x10 cm, recoberta por sílica gel com
0,25 mm de espessura e indicador de fluorescência UV 254 (marca Marcherey-
Nagel). As amostras do extrato foram dissolvidas em metanol, aplicadas nas
placas, estas foram colocadas em cubas tendo uma a fase móvel de hexano/
acetato de etila (3:7) e a outra fase móvel BAW (butanol, ácido acético, água),
após a corrida a placa foi revelada utilizando Vanilina sulfúrica.
43
4- Resultados
4.1- Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) frente aos
agentes antifúngicos
Após a incubação das placas de microdiluição para determinação da
CIM para os agentes antifúngicos, obtivemos os resultados demonstrados na
Tabela 4.
Tabela 4: Determinação da CIM para drogas antifúngicas frente as linhagens
de T. rubrum
CIM (µg/mL) Drogas
Tr1 H6 TruMDR2
Anfotericina 2,0 2,0 4,0
Griseofulvina 0,25 0,125 0,25
Fluconazol 32 32 32
Terbinafina 1,0 1,0 0,5
Itraconazol 0,5 0,5 0,25
Controle negativo
- - -
Controle positivo
+ + +
Os resultados representam a média de triplicatas de experimento independentes.
A linhagem Tr1 apresenta CIM de 1,0 µg/mL para terbinafina e valores
menores para griseofulvina e itraconazol. Estas CIMs foram idênticas as
obtidas pela linhagem H6, exceto para griseofulvina, que nesta apresentou CIM
de 0,125 µg/mL. Os valores de CIM obtidos para fluconazol foram os mesmos
para as três linhagens, sendo os maiores valores dentro dos antifúngicos
utilizados. A linhagem ∆TruMDR2 apresentou CIM mais elevado para
anfotericina, em relação às demais linhagens. O valor obtido para esta
linhagem para griseofulvina foi idêntico a da Tr1, embora maiores do que a
linhagem H6, da qual ela foi originada. Para o itraconazol o valor foi menor na
linhagem ∆TruMDR2 em relação a Tr1 e H6.
44
As 3 linhagens fúngicas foram testadas frente aos extratos vegetais e os
resultados estão demonstrados nas Tabelas 5, 6 e 7.
Na Tabela 5 observamos ação dos extratos e partições de P. umbellata
frente a linhagem H6.
Tabela 5: Determinação da CIM e CFM para os extratos brutos e partições de
P. umbellata frente à linhagem H6
Amostras
a)
CIM (µg/mL)
b)
CFM (µg/mL)
c)
PA EtOH 312,5 625
PA MeOH 625 1250
PA CHCl
3
2500 2500
P Hex. 156,25 156,25
P Dic 156,25 156,25
P Ac EtOH 312,5 312,5
P N-But 2500 2500
P Residual 2500 > 2500
a) As amostras de P. umbellata representam: PA EtOH : Partes Aéreas extrato etanólico,
PA MeOH: Partes Aéreas Extrato metanólico, PA CHCl
3
:Partes Aéreas Extrato
clorofórmico, P Hex.: Partição Hexano, P dic.: Partição diclorometano, P Ac EtOH: Partição
acetato de etila, P N-But : Partição N-butanol, P Residual: Partição aquosa (residual).As
condições de determinação da CIM e CFM estão apresentadas em Materiais e Métodos e
os resultados representam a média de triplicatas de experimento independentes.
O extrato etanólico e o metanólico apresentaram diferenças entre os
valores de CIM e CFM, demonstrando atividade fungistática em menor
concentração. O extrato clorofórmico, a partição N-butanol e a partição residual
apresentaram baixa atividade inibitória, sendo que a partição residual
apresentou um valor de CFM maior que a máxima concentração testada frente
a linhagem H6. As partições hexano e diclorometano mostraram menores
valores de CIM e CFM, apresentando na mesma concentração ação
fungistática e fungicida, enquanto que a partição acetato de etila apresentou
valores idênticos de CIM e CFM, porém maiores que as anteriores. Em função
da atividade fungicida estar demonstrada em maiores CFMs, a partição acetato
de etila apresentou valores de CIM e CFM intermediários.
45
Na Tabela 6 observamos que o extrato etanólico e a partição hexano
apresentaram os menores valores CIM e CFM, apresentando na mesma
concentração atividade fungistática e fungicida. A partição diclorometano
também apresentou valores de CIM baixos, porem com valor de CFM diferente
demonstrando ação fungistática com concentração menor que a fungicida. Na
partição acetato de etila observamos valores de CIM e CFM diferentes, sendo
estes intermediários em relação aos de menores valores. O extrato metanólico
apresentou valores de CIM e CFM iguais, porem altos, o mesmo ocorrendo
com a partição residual e a partição N-butanol que apresentou os maiores
valores de CIM e CFM. O extrato clorofórmico apresentou valores de CIM e
CFM diferentes, demonstrando pouca ação fungistática e concentração
fungicida maior que os valores testados.
Tabela 6: Determinação da CIM e CFM para os extratos brutos e frações de P.
umbellata frente à linhagem TruMDR2.
Amostras
a)
CIM(µg/mL)
b)
CFM (µg/mL)
c)
PA EtOH 156,25 156,25
PA MeOH 1250 1250
PA CHCl
3
1250 > 2500
P Hex. 156,25 156,25
P Dic 156,25 312,5
P Ac EtOH 312,5 625
P. N-But 2500 2500
P Residual 1250 1250
a) As amostras de P. umbellata representam: PA EtOH : Partes Aéreas extrato etanólico,
PA MeOH: Partes Aéreas Extrato metanólico, PA CHCl
3
:Partes Aéreas Extrato
clorofórmico, P Hex.: Partição Hexano, P dic.: Partição diclorometano, P Ac EtOH: Partição
acetato de etila, P N-But : Partição N-butanol, P Residual: Partição aquosa (residual).As
condições de determinação da CIM e CFM estão apresentadas em Materiais e Métodos e
os resultados representam a média de triplicatas de experimento independentes.
Na Tabela 7 observamos ação dos extratos e partições de P. umbellata
frente a linhagem Tr1.
46
Tabela 7: Determinação da CIM e CFM para os extratos brutos e frações de P.
umbellata frente à linhagem Tr1.
Amostras
a)
CIM(µg/mL)
b)
CFM (µg/mL)
c)
PA EtOH 312,5 625
PA MeOH 312,5 625
PA CHCl
3
312,5 1250
P Hex. 156,25 156,25
P Dic 156,25 156,25
P Ac EtOH 312,5 312,5
P. N-But 625 1250
P Residual 2500 >2500
a) As amostras de P. umbellata representam: PA EtOH : Partes Aéreas extrato etanólico,
PA MeOH: Partes Aéreas Extrato metanólico, PA CHCl
3
:Partes Aéreas Extrato
clorofórmico, P Hex.: Partição Hexano, P dic.: Partição diclorometano, P Ac EtOH: Partição
acetato de etila, P N-But : Partição N-butanol, P Residual: Partição aquosa (residual).As
condições de determinação da CIM e CFM estão apresentadas em Materiais e Métodos e
os resultados representam a média de triplicatas de experimento independentes.
As maiores atividades fungicidas e fungistáticas foram obtidas com as
partições hexânicas e diclorometanicas, demonstradas com valores de CIM e
CFM menores.
Nesta Tabela os extratos etanólicos e metanólicos apresentaram os
mesmos CIM e CFM, demonstrando atividade fungistática em concentrações
intermediarias, entretanto os valores fungicidas foram maiores, enquanto os
valores a partição acetato de etila mantiveram os mesmos níveis de CIM e
CFM. A partição residual apresentou os maiores valores de CIM e CFM. O
extrato metanólico e a partição n-butanol apresentaram diferenças no valor de
CIM e CFM, assim como o extrato clorofórmico que apresentou valores
bastante distintos para ação fungistática e fungicida.
47
4.2-Análise do Perfil Protéico
4.2.1-Estabelecimento da curva de crescimento das linhagens
Para a produção de esporos as linhagens foram desenvolvidas em ágar
Sabouraud ou ágar batata. Observamos uma maior produção de esporos em
meio agar batata em relação ao meio Sabouraud.
As linhagens foram inoculadas em Erlenmeyers conforme descrito em
materiais e métodos, para o estabelecimento da curva de crescimento.
Na Figura 5 e na Tabela 8, verificamos o resultado referente a linhagem
H6.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
7 dias 14 dias 21 dias
Massa mg
M seca
Figura 5: Crescimento da linhagem H6
Tabela 8: Crescimento da linhagem H6
Amostra Massa seca (mg)
H6 7 dias 157
H6 14 dias 963
H6 21 dias 1327
Massa seca obtida após a massa úmida
permanecer em estufa a 60º C por 7 dias
Observamos um aumento de 6,13 vezes de massa da condição 7 dias
para a 14 dias, um aumento de 1,37 vezes da condição 14 dias para a
condição 21 dias. Comparando a condição 7 dias e a 21 dias encontramos um
aumento de 8,45 vezes na massa seca.
48
Na Figura 6 e na Tabela 9, verificamos o resultado referente a linhagem
TruMDR2
0
50
100
150
200
7dias 14dias 21dias
Massa mg
M. seca
Figura 6: Crescimento da linhagem TruMDR2
Tabela 9: Crescimento da linhagem TruMDR2
Amostra Massa seca (mg)
TruMDR2 7 dias 30
TruMDR2 14 dias 49
TruMDR2 21 dias 171
Massa seca obtida após a massa úmida
permanecer em estufa a 60º C por 7 dias
Na tabela 9 observamos que a massa seca aumentou 1,63 vezes da
condição 7 dias para a condição 14 dias, aumentou 3,49 vezes da condição 14
para a 21 dias e aumentou 5,7 vezes quando comparamos a condição 7 dias
com a 21 dias.
Na Figura 7 e Tabela 10, verificamos o resultado referente a linhagem
Tr1.
0
50
100
150
200
250
7 dias 14 dias 21dias
Massa mg
M seca
Figura 7: Crescimento da linhagem Tr1
49
Tabela 10: Crescimento da linhagem Tr1
Amostra Massa seca (mg)
Tr1 7 dias 202
Tr1 14 dias 223
Tr1 21 dias 193
Massa seca obtida após a massa úmida
permanecer em estufa a 60º C por 7 dias
Na Tabela 10 observamos um aumento de 1,10 vezes da condição 7 dias
para a 14 dias, uma diminuição de 1,15 vezes da condição 14 dias para a 21 dias
e uma diminuição de 1,05 vezes quando comparamos a condição 7 e 21 dias.
Na Tabela 11 e Figura 8 demonstramos o desenvolvimento da linhagem
H6 frente as diferentes condições de crescimento.
Tabela 11: Crescimento da linhagem H6 frente aos antifúngicos e extratos
vegetais
Amostra H6 Massa seca (mg)
Fluco zero (F0) 2
Fluco 7 dias (F1) 103
Fluco 14dias (F2) 195
Fluco 21dias (F3) 100
Fluco 28dias (F4) 178
Anfotericina B (A) 125
Griseofulvina (B) 186
Hex Sub CIM 7 dias (HsC7) 77
Hex Sub CIM 14 dias (HsC14) 94
Hex Sub CIM 21dias (HsC21) 1050
Hex CIM 7 dias (HC7) 28
Hex CIM 14 dias (HC14) 202
Hex CIM 21 dias (HC21) 1217
Dic CIM 7 dias ( DC7) 127
Dic CIM 14 dias (DC14) 203
Dic CIM 21 dias (DC21) 122
a)Amostras desenvolvimento em presença de: F0:
fluconazol desde o primeiro dia; F1,F2,F3,F4: fluconazol
colocado após 6 dias de crescimento e filtrado no 7
o
, 14
o
,
21
o
, 28
o
dia respectivamente; A e G: Anfotericina B e
Griseofulvina colocadas no sexto dia e filtrado no sétimo;
HsC7, HsC14, HsC21:partição hexano em sub-CIM por 7,
14 e 21 dias respectivamente; HC7, HC14, HC21: partição
hexano por 7, 14, 21 dias, respectivamente; DC7, DC14,
DC21: partição diclorometano por 7, 14, 21 dias
respectivamente.
50
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
7
di
a
s
14 dias
21 dias
F0
F1
F2
F3
F4
An
fo
Griseo
Hs
C
7d
HsC 14d
Hs
C
21 d
H
C
7
d
HC 14d
H
C
21d
D
C
7
d
DC 14d
DC 21d
Massa mg
M. seca
Figura 8: Biomassa da linhagem H6 desenvolvida frente as diferentes
condições de crescimento.
Na condição de crescimento frente ao fluconazol, observamos uma
aumento da biomassa de F0 para F1 e deste para F2, uma diminuição de F2
para F3 e aumento de F3 para F4. No desenvolvimento da linhagem H6 frente
a Anfotericina observamos uma diminuição de massa se comparado com o
controle 7 dias, porem o mesmo não ocorreu na Griseofulvina onde
observamos um aumento da biomassa. Na condição de desenvolvimento frente
a partição hexano em sub-CIM observamos um aumento de biomassa entre 7 e
14 dias e entre 14 e 21 dias, o mesmo ocorreu na condição partição hexano
CIM. Na condição de desenvolvimento frente a partição diclorometano,
observamos aumento de biomassa entre 7 e 14 dias e diminuição entre 14 e 21
dias, sendo a biomassa de 21 dias menor que o de 7 dias.
Na Tabela 12 e Figura 9 demonstramos o desenvolvimento da linhagem
TruMDR2 frente as diferentes condições de crescimento.
51
Tabela 12: Crescimento da linhagem TruMDR2 frente aos antifúngicos e
extratos vegetais
Amostra TruMDR2 Massa seca (mg)
Fluco zero (F0) 177
Fluco 7 dias (F1) 115
Fluco 14dias (F2) 235
Fluco 21dias (F3) 221
Fluco 28dias (F4) 215
Anfotericina B (A) 50
Griseofulvina (B) 154
Hex Sub CIM 7 dias (HsC7) 96
Hex Sub CIM 14 dias (HsC14) 227
Hex Sub CIM 21dias (HsC21) 490
Hex CIM 7 dias (HC7) 15
Hex CIM 14 dias (HC14) 130
Hex CIM 21 dias (HC21) 262
Dic CIM 7 dias ( DC7) 12
Dic CIM 14 dias (DC14) 216
Dic CIM 21 dias (DC21) 157
a)Amostras desenvolvimento em presença de: F0: fluconazol
desde o primeiro dia; F1,F2,F3,F4: fluconazol colocado após
6 dias de crescimento e filtrado no 7
o
, 14
o
, 21
o
, 28
o
dia
respectivamente; A e G: Anfotericina B e Griseofulvina
colocadas no sexto dia e filtrado no sétimo; HsC7, HsC14,
HsC21:partição hexano em sub-CIM por 7, 14 e 21 dias
respectivamente; HC7, HC14, HC21: partição hexano por 7,
14, 21 dias, respectivamente; DC7, DC14, DC21: partição
diclorometano por 7, 14, 21 dias respectivamente.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
7 dias
14
d
i
as
2
1
d
i
a
s
F0
F1
F2
F
3
F4
Anf
o
G
r
i
seo
HsC 7d
HsC 1
4
d
HsC 21d
HC 7d
HC 14d
HC
2
1
d
DC 7d
DC 14d
DC
2
1
d
Massa mg
M seca
Figura 9: Biomassa da linhagem TruMDR2 desenvolvida frente as diferentes
condições de crescimento.
Na condição de crescimento frente ao fluconazol, observamos uma
diminuição da biomassa de F0 para F1, um aumento de F1 para F2, uma
52
diminuição de F2 para F3 e também de F3 para F4. Na condição de
desenvolvimento frente a Anfotericina observamos uma diminuição de massa se
comparado com o controle 7 dias, porém o mesmo não ocorreu na Griseofulvina
onde observamos um aumento da biomassa. Na condição de desenvolvimento
frente a partição hexano em sub-CIM observamos um aumento de biomassa entre
7 e 14 dias e entre 14 e 21 dias, o mesmo ocorreu na condição partição hexano
CIM. Na condição de desenvolvimento frente a partição diclorometano,
observamos aumento de biomassa entre 7 e 14 dias e diminuição entre 14 e 21
dias, sendo a biomassa de 21 dias maior que o de 7 dias.
Na Tabela 13 e Figura 10 demonstramos o desenvolvimento da
linhagem Tr1 frente as diferentes condições de crescimento.
Tabela 13: Crescimento da linhagem Tr1 frente aos antifúngicos e extratos vegetais
Amostra Massa seca(mg)
Fluco zero (F0) 4
Fluco 7 dias (F1) 176
Fluco 14dias (F2) 244
Fluco 21dias (F3) 130
Fluco 28dias (F4) 127
Anfotericina B (A) 83
Griseofulvina (B) 176
Hex Sub CIM 7 dias (HsC7) 53
Hex Sub CIM 14 dias (HsC14) 155
Hex Sub CIM 21dias (HsC21) 215
Hex CIM 7 dias (HC7) 56
Hex CIM 14 dias (HC14) 100
Hex CIM 21 dias (HC21) 122
Dic CIM 7 dias ( DC7) 46
Dic CIM 14 dias (DC14) 91
Dic CIM 21 dias (DC21) 31
a)Amostras desenvolvimento em presença de: F0: fluconazol
desde o primeiro dia; F1,F2,F3,F4: fluconazol colocado após
6 dias de crescimento e filtrado no 7
o
, 14
o
, 21
o
, 28
o
dia
respectivamente; A e G: Anfotericina B e Griseofulvina
colocadas no sexto dia e filtrado no sétimo; HsC7, HsC14,
HsC21:partição hexano em sub-CIM por 7, 14 e 21 dias
respectivamente; HC7, HC14, HC21: partição hexano por 7,
14, 21 dias, respectivamente; DC7, DC14, DC21: partição
diclorometano por 7, 14, 21 dias respectivamente.
53
0
50
100
150
200
250
7 dias
14
dias
21
dias
F0
F1
F2
F3
F4
An
f
o
Griseo
H
sC
7d
HsC 14d
H
s
C 21d
HC 7d
H
C
14d
HC
21d
DC 7d
D
C
14d
D
C
21d
Massa mg
M seca
Figura10: Biomassa da linhagem Tr1 desenvolvida frente as diferentes
condições de crescimento
Na condição de crescimento frente ao fluconazol, observamos um
aumento da biomassa de F0 para F1 e deste para F2, uma diminuição de F2
para F3 e de F3 para F4. Na condição de desenvolvimento frente a Anfotericina
observamos uma diminuição de massa se comparado com o controle 7 dias, o
mesmo ocorreu na Griseofulvina. Na condição de desenvolvimento frente a
partição hexano em sub-CIM observamos um aumento de biomassa entre 7 e
14 dias e entre 14 e 21 dias, o mesmo ocorreu na condição partição hexano
CIM. Na condição de desenvolvimento frente a partição diclorometano,
observamos aumento de biomassa entre 7 e 14 dias e diminuição entre 14 e 21
dias, sendo a biomassa de 21 dias menor que o de 7 dias.
54
4.2.2- Análise do perfil protéico através de eletroforese em gel de
poliacrilamida
Na Figura 11 e Tabelas 14 e 15 observamos o gel de poliacrilamida da
linhagem Tr1 em crescimento, frente as partições hexano, diclorometano e
antifúngicos.
Figura 11 : SDS-PAGE da linhagem Tr1 frente as diferentes condições de
crescimento: Coluna1: marcador de peso molecular; colunas 2, 3 e 4:
crescimento 7, 14, 21 dias respectivamente; colunas 5, 6 e 7: partição hexano
em sub-CIM 7, 14, 21 dias respectivamente; colunas 8, 9 e 10: partição hexano
em CIM 7, 14, 21 dias respectivamente; colunas 11, 12 e 13: partição
diclorometano em CIM 7, 14, 21 dias respectivamente; colunas 14: fluconazol
desde o primeiro dia e filtrado no sétimo; coluna 15, 16, 17: fluconazol no sexto
dia e filtrado no 7º, 14º, 21º dias respectivamente; coluna 18: linhagem Tr1
frente a anfotericina desde o 6º dia e filtrado no 7º; coluna 19: linhagem Tr1
frente a griseofulvina desde o 6º dia e filtrado no 7º dia.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
PM 7 14 21
7 14 21 7 14 21 7 14 21 F0 F1 F2 F3 A G
controle Hex S CIM Hex CIM Dic CIM
97,0 KDa
66,0 KDa
45,0 KDa
30,0 KDa
20,1 KDa
14,4 KDa
55
Tabela 14: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem Tr1 controle e
frente aos antifúngicos
Bandas (kDa) C 7 d C 14 d C 21d F0 F1 F2 F3 Anf Gris
123 X
112 X X X X X
102 X X X X X
97 X X X X X
87 X X X X
81 X X X X X
70 X X
64 X X X X X X X
61 X X X X X X
54 X X X
52 X X X
48 X X X X X X X X X
43,5 X X X X X X X
41 X X X X
36 X X X X X X X X
34 X X X X X X
32 X X
28 X X X X X X
22 X X X X
19 X X X X X
16 X
15
14 X X X X
C 7 d, C 14 d, C 21 d: controle 7, 14 e 21 dias respectivamente, F0: crescimento frente
ao fluconazol desde o 1º dia filtrado no 7º, F1, F2, F3: crescimento frente ao fulconazol
desde o 6º dia e filtrado no 7º, 14º e 21º dias respectivamente, Anf: crescimento frente
a anfotericina, Gris: crescimento frente a griseofulvina.
56
Tabela 15: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem Tr1 frente as
partições do extrato vegetal
Bandas (kDa) HsC7 HsC14 HsC21 HC7 HC14 HC21 DC7 DC14 DC21
102 X X X
97 X X X
87 X X X X
64 X X
61 X X X X
54
52 X X
48 X X X X X X X
43,5 X X
41 X
36 X X X
34 X X X X X
32
28 X X X
22 X X
16 X X X
14 X X X
HsC7, HsC14, HsC21:crescimento frente partição hexano em sub-CIM 7, 14 e 21
dias respectivamente; HC7, HC14, HC21: crescimento frente partição hexano em
CIM por 7, 14 e 21 dias respectivamente; DC7, DC14, DC21: crescimento frente a
partição diclorometano em CIM por 7, 14 e 21 dias respectivamente.
Observamos a presença de bandas comuns de aproximadamente 112
kDa em controle 7, 14 e 21, aparece também em fluconazol 7 e 21 dias,
estando ausente nas demais situações. Banda de aproximadamente 102 kDa
presente no controle 7, 14 dias, em fluco zero e 21 dias, hexano CIM 21 dias,
diclorometano 14 e 21 dias, anfotericina, que desapareceu nas demais
situações. Observamos banda de 97 kDa, presente, fluconazol tempo zero, 7,
14, 21 dias, hexano CIM 21 dias, diclorometano 14 e 21 dias e anfotericina,
ausente em todas as outras condições. Observamos banda de 87 kDa,
presente no controle 7 e 14 dias, hexano sub-CIM 14 dias, hexano CIM 14 e 21
dias, diclorometano 14 dias, anfotericina e griseofulvina, ausente em todas as
outras condições. A banda de aproximadamente 81 kDa esta presente em
fluconazol tempo zero, 7, 14 e 21 dias, anfotericina e ausente em outras
57
condições. Notamos uma banda de aproximadamente 70 kDa presente em
anfotericina e griseofulvina, estando ausente em outras condições. Notamos
uma banda de aproximadamente 64 kDa presente em controle 7, 14 e 21 dias,
fluconazol tempo zero e 7 dias, partição hexano CIM 21 dias e partição
diclorometano 21 dias, anfotricina e griseofulvina, estando ausente em outras
condições. Podemos notar também banda de aproximadamente 61 kDa
presente em controle 7 e 14 dias, fluconazol 14 e 21 dias, partição hexano sub-
CIM 14 e 21 dias, partição hexano CIM 21 dias, partição diclorometano 14 dias,
anfotericina e griseofulvina, estando ausente em outras condições. Podemos
observar uma banda de aproximadamente 54 kDa presente em controle 14 e
21 dias, e griseofulvina, ausente em outras condições. Observamos uma banda
de aproximadamente 52 kDa presente em controle 7, 14 e 21 dias, partição
hexano em sub-CIM 21 dias e diclorometano 14 dias, ausente em outras
condições. A banda de aproximadamente 48 kDa presente em todas as
condições com exceção, partição hexano em sub-CIM 7 dias e partição
diclorometano 7 dias. Banda de aproximadamente 43,5 kDa está presente em
controle todas as condições, fluconazol tempo 7 e 21 dias, partição hexano
sub-CIM 21 dias e diclorometano 21 dias, anfotericina e griseofulvina. Banda
de aproximadamente 41 kDa presente em controle 7 e 14 dias, fluconazol 14 e
21 dias, partição hexano sub-CIM 21 dias, ausente nas outras condições.
Banda de aproximadamente 36 kDa está presente em controle todas as
condições, fluconazol tempo zero, 7, 14 e 21 dias, partição hexano sub-CIM 21
dias, partição diclorometano 14 e 21 dias, e griseoflvina. Banda de
aproximadamente 34 kDa está presente em fluconazol tempo zero, 7, 14 e 21
dias, partição hexano sub-CIM 21 dias, hexano CIM 14 e 21 dias,
58
diclorometano 14 e 21 dias, anfotericina e griseofulvina. Banda de
aproximadamente 32 kDa está presente apenas na condição fluconazol tempo
zero e griseofulvina, enquanto a banda de aproximadamente 28 kDa presente
na condição controle 7 e 14 dias, fluconazol 7, 14 e 21 dias, partição hexano 21
dias, partição diclorometano 14 e 21 dias, griseofulvina e ausente nas demais
condições. Observamos uma banda de aproximadamente 22 kDa presente em
fluconazol tempo zero, 7 e 14 dias, hexano CIM 21 dias, partição diclorometano
14 dias, griseofulvina, ausente nas demais condições. A banda de
aproximadamente 19 kDa presente em controle 7 dias, fluconazol tempo zero,
7, 14 e 21 dias, encontra-se ausente nas demais condições. Notamos uma
banda de aproximadamente 16,0 kDa presente em fluconazol tempo zero,
partição hexano 14 e 21 dias e partição diclorometano 14 dias. A banda de
aproximadamente 14 kDa está presente em controle, 7 e 14 dias, fluconazol
tempo zero, partição hexano 21 dias, partição diclorometano 14 e 21 dias,
griseofulvina, ausente nas demais condições. Notamos também o
aparecimento de banda de aproximadamente 123 kDa em griseofulvina.
Na Figura 12 e Tabelas 16 e 17 observamos a eletroforese da linhagens
H6 e TruMDR2 frente aos antifúngicos
59
Figura 12: SDS-PAGE das linhagens H6 e TruMDR2 frente aos antifúngicos
coluna 1 peso molecular; colunas 2, 3, 4, 5, 6, 7,e 8 linhagem H6 frente a
fluconazol nas diferentes condições de crescimento, frente a anfotericina (A) e
Griseofulvina (G), colunas 9 e 10 linhagem H6 crescimento por 7 e 14 dias
respectivamente.colunas 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17 linhagem TruMDR2 frente
a fluconazol em diversas condições de crescimento, anfotericina (A) e
griseofulvina (G); colunas 18 e 19 linhagem TruMDR2 crescimento por 7 e 14
dias respectivamente
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
20
PM F0 F1 F2 F3 F4 A G c7d c14d F0 F1 F2 F3 F4 A G C7d C14dG2
H6 Atrd
97 kDa
66 kDa
45 kDa
30 kDa
20,1 kDa
14,4 kDa
60
Tabela 16: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem H6 frente aos
antifúngicos:
Bandas (kDa) C 7 d C 14 d F0 F1 F2 F3 F4 Anf Gris
123 X
112 X
102 X X X X X X
97
90 X X X X X X
70 X X X X
64
61 X X X X X X X X X
56 X X X X X X X
52 X X X X X X X
48 X X X X X X X
45 X
43,5 X X X X X X X
42 X X X X X
39 X X X X X
36 X X X X
32 X X
30 X X X X X
27
26 X
22 X X
19
16 X X X X X X X
15 X X X
14 X X X X X
C 7 d, C14d, C21d: controle 7, 14 e 21 dias respectivamente; F0: crescimento frente
ao fluconazol desde o 1º dia filtrado no 7º, F1, F2, F3, F4: crescimento frente ao
fulconazol desde o 6º dia e filtrado no 7º, 14º, 21º e 24º dia respectivamente; Anf:
crescimento frente a anfotericina, Gris: crescimento frente a griseofulvina.
61
Tabela 17: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem TruMDR2
frente aos antifúngicos.
Bandas (kDa) C 7 d C 14 d C 21d F0 F1 F2 F3 F4 Anf Gris
102 X X X X X
97
92 X X
90 X X X X
85 X X
70 X X X X X
64
61 X X X X X X X X
56 X X X X X
52 X X X X
48 X X X X X X X
45 X X X
43,5 X X X
42 X X X X X X X X
39 X X X
36 X X X X X X X X X
32
30 X X X X X X X
28 X X X X
26 X X
22 X X X
19 X
15
14 X X X X X
C 7 d, C14d, C21d: controle 7, 14 e 21 dias respectivamente; F0: crescimento frente ao
fluconazol desde o 1º dia filtrado no 7º, F1, F2, F3, F4: crescimento frente ao fulconazol
desde o 6º dia e filtrado no 7º, 14º, 21º e 24º dia respectivamente; Anf: crescimento
frente a anfotericina, Gris: crescimento frente a griseofulvina.
Observamos a presença de bandas comuns de aproximadamente 102
kDa presente no controle 7, 14 dias, em fluco 7, 14 e 21 dias, griseofulvina para
a linhagem H6; e em fluconazol tempo zero, 7, 14 dias, anfotericina e
griseofulvina para linhagem TruMDR2, sendo que esta banda desapareceu
nas demais situações. A banda de aproximadamente 90 kDa está presente em
controle 7 e 14 dias, fluconazol 14 e 28 dias, anfotericina e griseofulvina para a
linhagem H6 e em fluconazol tempo zero, 7, 14 dias e anfotericina para
linhagem TruMDR2. Notamos que a banda de aproximadamente 85 kDa
presente em anfotericina e griseofulvina na linhagem TruMDR2, esteve
62
ausente em outras condições. A banda de aproximadamente 70 kDa presente
em fluconazol 21 e 28 dias, anfotericina e griseofulvina, na linhagem H6,
controle 7 e 14 dias, fluconazol 14, 21 e 28 dias na linhagem TruMDR2,
esteve ausente em outras condições. Podemos notar que a banda de
aproximadamente 61 kDa presente em controle 7 , 14 dias, fluconazol zero, 7,
14, 21 e 28 dias, anfotericina e griseofulvina na linhagem H6, controle 7 dias,
fluconazol tempo zero, 7, 14, 21 e 28 dias, anfotericina e griseofulvina na
linhagem TruMDR2, esteve ausente em outras condições. A banda de
aproximadamente 56 kDa presente em controle 7 dias, fluconazol tempo 7, 14,
21, 28 dias, anfotericina e griseofulvina na linhagem H6, e em fluconazol 7, 14,
21 e 28 dias, anfotericina na linhagem TruMDR2, estando ausente em outras
condições. A banda de aproximadamente 52 kDa presente em controle 7, 14
dias, fluconazol 7, 14, 21, 28 dias e anfotericina na linhagem H6, e em
fluconazol 7, 14, 21, e 28 dias na linhagem TruMDR2, esteve ausente em
outras condições. Podemos notar que a banda de aproximadamente 48 kDa
presente em controle 7, 14 dias, fluconazol 7, 14, 21 e 28 dias e anfotericina,
na linhagem H6, controle 7 dias, fluconazol 7, 14, 21 e 28 dias, anfotericina e
griseofulvina na linhagem TruMDR2, esteve ausente nas demais condições.
Banda de 45 kDa presente em griseufulvina na linhagem H6, em fluconazol
tempo zero, anfotericina e griseofulvina na linhagem TruMDR2 A banda de
aproximadamente 43,5 kDa presente em controle 7,dias, fluconazol 7, 14, 21 e
28 dias, anfotericina e griseofulvina na linhagem H6, e em fluconazol 7, 21 e
28 dias, na linhagem TruMDR2, esteve ausente nas demais condições. A
banda de aproximadamente 42 kDa presente em controle 7 dias, fluconazol 7,
14, 21 e 28 dias, na linhagem H6, e em controle 7 dias, fluconazol tempo zero,
63
7, 14, 21 e 28 dias, anfotericina e griseofulvina na linhagem TruMDR2, esteve
ausente nas demais condições. Banda de aproximadamente 39 kDa presente
em controle 7 dias, fluconazol 7, 21, 28 e anfotericina na linhagem H6, em
fluconazol 14, 21 e 28 dias em TruMDR2. Notamos que a banda de
aproximadamente 36 kDa presente em controle 7, 14 dias, fluconazol 14 dias e
griseofulvina na linhagem H6, e em controle 7, 14 dias, fluconazol tempo zero e
7, 14, 21 e 28 dias, anfotericina e griseofulvina na linhagem TruMDR2, esteve
ausente nas demais condições. A banda de 30 kDa presente em controle 7, 14
dias, fluconazol 7, 14, dias, anfotericina na linhagem H6, e em controle 14 dias,
fluconazol tempo zero, 7, 14, 21 dias, anfotericina e griseofulvina na linhagem
TruMDR2, esteve ausente nas demais condições. Notamos que a banda de
aproximadamente 28 kDa presente na condição controle 7 dias, fluconazol
tempo zero, 7 e 14 dias na linhagem TruMDR2, esteve ausente nas demais
condições. A banda de aproximadamente 22 kDa presente em fluconazol 21,
griseofulvina, na linhagem H6, fluconazol tempo zero e 14 dias e griseofulvina,
na linhagem na linhagem TruMDR2, esteve ausente nas demais condições. A
banda de aproximadamente 16 kDa presente em controle 7 e 14 dias,
fluconazol 7, 14 e 21 dias, anfotericina e griseofulvina na linhagem H6, esteve
ausente nas demais condições. A banda de aproximadamente14 kDa presente
em controle 7 e 14 dias, fluconazol 14, 21 e 28 dias, na linhagem H6, e em
controle 7 dias, fluconazol 7 e 14 dias e anfotericina e griseofulvina na
linhagem TruMDR2, esteve ausente nas demais condições. Podemos notar
ainda que a banda de aproximadamente 123 kDa presente somente na
condição de crescimento frente a griseofulvina na linhagem H6. A banda de 26
64
kDa, esteve presente apenas em fluconazol tempo zero e 14 dias na linhagem
TruMDR2.
Na Figura 13 e Tabelas 18 e 19 observamos as linhagens H6 e
TruMDR2 frente as partições do extrato vegetal.
Figura 13:SDS-PAGE das linhagens H6 e TruMDR2 frente as partições do
extrato vegetal. Coluna 1:marcador de peso molecular, coluna 2, 3 e 4
linhagem H6 em presença da partição hexano em sub CIM por 7, 14, 21 dias
respectivamente; coluna 5, 6 e 7 linhagem H6 frente a partição hexano em CIM
por 7, 14, 21 dias respectivamente; colunas 8, 9 e 10 linhagem H6 frente a
partição diclorometano em CIM por 7, 14, 21 dias respectivamente; colunas 11,
12 e 13 linhagem TruMDR2 frente a partição hexano em sub CIM por 7, 14,
21 dias respectivamente; colunas 14, 15 e 16 linhagem TruMDR2 frente a
partição hexano em CIM por 7, 14, 21 dias respectivamente, colunas 17, 18 e
19 linhagem TruMDR2 frente a partição diclorometano em CIM por 7, 14, 21
dias respectivamente.
PM 7 14 21 7 14 21 7 14 21 7 14 21 7 14 21 7 14 21
H6 HsC H6 CIM H H6 CIM D Atrd HsC Atrd HCIM Atrd CIM D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
97,0 KDa
66,0 KDa
45,0 KDa
30,0 KDa
20,1 KDa
14,4 KDa
65
Tabela 18: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem H6 e frente as
partições do extrato vegetal.
Bandas(kDa) HsC7 HsC14 HsC21 HC7 HC14 HC21 DC7 DC14 DC21
123
112 X X
102 X X X
97
90 X X
70 X
61 X X X X X X X X X
48 X X X X X X X X X
45
43,5 X X X X X X X X X
36 X X X X X X
30 X X X X X X X
19 X X X X X
15 X X X X X X X
HsC7, HsC14, HsC21:crescimento frente partição hexano em sub-CIM 7, 14 e 21 dias
respectivamente; HC7, HC14, HC21: crescimento frente partição hexano em CIM por 7, 14
e 21 dias respectivamente; DC7, DC14, DC21: crescimento frente a partição diclorometano
em CIM por 7, 14 e 21 dias respectivamente.
Tabela 19: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem e TruMDR2
frente as partições do extrato vegetal.
Bandas(kDa) HsC7 HsC14 HsC21 HC7 HC14 HC21 DC7 DC14 DC21
112 X X
102 X X
90 X X
61 X X X X X X X X X
48 X X X X X X X X X
45
43,5 X X X X X X X X X
36 X X X X X X
30 X X X X X X X
19 X X X X
15 X X X
HsC7, HsC14, HsC21:crescimento frente partição hexano em sub-CIM 7, 14 e 21 dias
respectivamente; HC7, HC14, HC21: crescimento frente partição hexano em CIM por
7, 14 e 21 dias respectivamente; DC7, DC14, DC21: crescimento frente a partição
diclorometano em CIM por 7, 14 e 21 dias respectivamente.
Na figura 13 observamos o padrão de proteínas das linhagens H6 e
TruMDR2 frente as partições do extrato vegetal. Observamos banda de
aproximadamente 112 kDa presente a partição hexano 7 e 14 dias na
linhagem TruMDR2 e na partição hexano 7 e 14 dias na linhagem H6. A
66
banda de aproximadamente 102 kDa presente na condição partição hexano 7,
14 e 21 dias frente a linhagem H6, e em partição hexano 14 e 21 dias frente a
linhagem TruMDR2. Banda de aproximadamente 90 kDa esteve presente na
condição partição hexano sub-CIM 21 dias e diclorometano 14 dias frente a
linhagem H6 e partição hexano 14 e 21 dias na linhagem TruMDR2. Banda de
aproximadamente 70 kDa presente na condição partição hexano sub-CIM na
linhagem H6. A banda de aproximadamente 61 kDa presente nas condições
partição hexano sub-CIM 7 e 14 e 21 dias, hexano 7, 14 e 21 dias,
diclorometano 7, 14 e 21 dias, frente a linhagem H6, e em partições hexano
sub-CIM 7, 14 e 21 dias, hexano 7, 14 e 21 dias, diclorometano 7, 14 e 21 dias,
frente a linhagem TruMDR2. Notamos que a banda de 48 kDa presente nas
condições, partição hexano sub-CIM 7, 14 e 21 dias, hexano 7, 14 e 21 dias,
diclorometano 7, 14 e 21 dias, frente a linhagem H6, e em partições hexano
sub-CIM 7, 14 e 21 dias, hexano 7, 14 e 21 dias, diclorometano 7, 14 e 21 dias,
frente a linhagem TruMDR2. A banda de 43,5 kDa presente nas condições,
partição hexano sub-CIM 7, 14 e 21 dias, hexano 7, 14 e 21 dias,
diclorometano 7, 14 e 21 dias, frente a linhagem H6, e em partições hexano
sub-CIM 7, 14 e 21 dias, hexano 7, 14 e 21 dias, diclorometano 7, 14 e 21 dias,
frente a linhagem TruMDR2. Podemos notar que a banda de 36 kDa presente
nas condições, partição hexano sub-CIM 7 dias, hexano 7, 14 e 21 dias,
diclorometano 7 e 14 dias, frente a linhagem H6, e em partições hexano sub-
CIM 7 dias, hexano 7, 14 e 21 dias, diclorometano 7 e 14 dias, frente a
linhagem TruMDR2. Banda de 30 kDa presente nas condições, partição
hexano sub-CIM 7 e 21 dias, hexano 7, 14 dias, diclorometano 7, 14 e 21 dias,
frente a linhagem H6, e em partições hexano sub-CIM 7 dias, hexano 7, 14 e
67
21 dias, diclorometano 7, 14 e 21 dias, frente a linhagem TruMDR2. A banda
de 19 kDa esteve presente nas condições, partição hexano sub-CIM 7 e 21
dias, partição hexano 7 e 14 dias, diclorometano 7 dias, frente a linhagem H6,
e em partições hexano 7, 14 e 21 dias, diclorometano 7 dias, frente a linhagem
TruMDR2. A banda de 15 kDa presente nas condições partição hexano sub-
CIM 7 e 21 dias, partição hexano 7, 14 e 21 dias, diclorometano 7 e 14 dias,
frente a linhagem H6, e em partições hexano 14 e 21 dias, diclorometano 14
dias, frente a linhagem TruMDR2.
Figura 14 e Tabelas 20 e 21 observamos as linhagens H6 e TruMDR2 em
condições de crescimento.
Figura 14: Linhagem H6 e TruMDR2 em condição de crescimento. Coluna 1
PM, colunas 2, 3 e 4: linhagem H6 em crescimento por 7, 14, 21 dias
respectivamente; colunas 5, 6 e 7 linhagem TruMDR2 em crescimento por 7,
14 e 21 dias respectivamente
1 2 3 4 5 6 7
97 kDa
66 kDa
45 kDa
30 kDa
20,1 kDa
14,4 kDa
68
Tabela 20: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem H6 controle de
crescimento
Bandas
(kDa)
C 7 d C 14 d C 21d
89 X
61 X X
56 X X
52 X X
48 X X X
43,5 X
42 X X
39 X X
36 X X
30 X
26 X
14 X
Tabela 21: Perfil de bandas relativo ao SDS-PAGE da linhagem TruMDR2
controle de crescimento
Bandas (kDa) C 7 d C 14 d C 21d
73 X X
61 X X
52 X X X
48 X X
43,5 X X
42 X X X
36 X X X
30 X
19 X
14 X
Observamos o aparecimento de banda de aproximadamente 89 kDa em
crescimento 7 dias na linhagem H6 e ausente nas demais condições.A banda
de aproximadamente 73 kDa esta presente em 7 e 21 dias na linhagem
TruMDR2 e ausente nas demais condições. A banda de 61 kDa esta presente
em 7 e 14 dias na linhagem H6 e em 14 e 21 dias na linhagem TruMDR2.
Notamos uma banda de aproximadamente 56 kDa presente em 7 e 14 dias na
linhagem H6. Banda de aproximadamente 52 kDa presente em 14 e 21 dias na
linhagem H6 e 7, 14 e 21 dias na linhagem TruMDR2. Banda de
69
aproximadamente 48 kDa presente em 7, 14 e 21 dias na linhagem H6 e
presnte em 7 e 21 dias na linhagem TruMDR2. Banda de aproximadamente
43,5 kDa presente em 14 dias na linhagem H6 e em 14 e 21 dias na linhagem
TruMDR2. Banda de aproximadamente 42 kDa presente em 7 e 14 dias na
linhagem H6 e em 7, 14 e 21 dias na linhagem TruMDR2. Banda de
aproximadamente 39 kDa presente em 7 e 14 dias na linhagem H6. Banda de
aproximadamente 36 kDa presente em 7 e14 dias na linhagem H6 e em 7, 14 e
21 dias na linhagem TruMDR2. Banda de aproximadamente 30 kDa
presente em 7 dias na linhagem H6 e também na linhagem TruMDR2.
Banda de aproximadamente 26 kDa presente em 21 dias na linhagem H6.
Banda de aproximadamente 19 kDa presente 7 dias na linhagem TruMDR2.
Banda de aproximadamente 14 kDa presente em 14 dias na linhagem H6 e em
7 dias na linhagem TruMDR2
4.3- Cromatografia em camada delgada comparativa dos extratos e
frações
A cromatografia foi realizada conforme descrito em materiais e métodos.
Nas figuras 15 e 16 observamos a cromatografia dos extratos e partições de P.
umbellata, usando como marcadores 4-nerolidilcatecol e rutina. Nos extratos e
partições observamos um mancha com coloração e Rf semelhantes à rutina na
partição N-butano. Não foi evidenciado a presença de 4-NC em nenhuma das
condições analisadas, isto pode se dever ao fato deste componente estar
presente em baixíssimas concentrações.
70
Figura 15: CCDC dos extratos e partições de P. umbellata, marcador 4-
nerolidilcatecol (4-NC). 1-PA EtOH, 2-PA MeOH, 3-PA CHCl
3
, 4-P Ac EtOH, 5-
P Residual, 6- P Hex.: Partição Hexano, 7-P dic.: Partição diclorometano, 8- P
N-But : Partição N-butanol.
Figura 16: CCDC dos extratos e partições de P. umbellata, marcador rutina
(rut). 1-PA EtOH, 2-PA MeOH, 3-PA CHCl
3
, 4-P Ac EtOH, 5- P Residual, 6- P
Hex., 7-P dic., 8- P N-But .
71
5- Discussão
O reino Fungi compreende mais de 100000 espécies de leveduras e
fungos filamentosos. Destes, aproximadamente 44 espécies são dermatófitos.
Esses organismos eucariotos apresentam dificuldades quanto à terapia, pois
muitos dos agentes antifúngicos prescritos atualmente agem na síntese do
ergosterol. As drogas azólicas incluem cetoconazol e os novos triazólicos,
itraconazol e fluconazol. A griseofulvina, utilizada para tratamento,
principalmente de onicomicoses é ativa contra hifas, afeta a síntese de ácidos
nucléicos e interrompe a mitose celular na metáfase (DAVIES,1980). A maioria
dos agentes antifúngicos apresenta efeitos colaterais hepáticos , renais e
reações adversas graves.
Itraconazol e terbinafina via oral são superiores a griseofulvina no
tratamento da onicomicose, com taxas de cura da ordem de 70% (ROSEEUW
& DE DONCKER, 1993 , ZAIAS et al., 1996).
Em vista disto, há necessidade de busca de novos agentes antifúngicos.
Nosso trabalho procurou avaliar a atividade antifúngica de extratos de P.
umbellata frente a várias linhagens de T. rubrum.
Os resultados obtidos com a padronização da técnica para a
determinação da CIM, estão muito próximos de resultados encontrados na
literatura, como em FERNANDES-TORRES et al. (2002), que encontrou para o
Trichophyton rubrum um CIM de 1,0 µg/mL para o itraconazol e 0,03 µg/mL
para a terbinafina,enquanto para o Microsporum canis um CIM de 1,0 µg/mL
para o itraconazol e 0,125 µg/mL para a terbinafina. Neste estudo os autores
concluíram que a incubação por sete dias a 28º C de um inóculo 10
4
células/mL
são condições ótimas para o teste. FERNANDES-TORRES et al. 2001
72
encontrou um CIM90 para o Trichophyton rubrum valores de 16 µg/mL para o
fluconazol, 0,5 µg/mL para o itraconazol e 0,06 µg/mL para a terbinafina. Para
o Microsporum canis apresentou o seguintes CIM, fluconazol 16 µg/mL,
itraconazol 0,5 µg/mL e para a terbinafina 0,06 µg/mL. Enquanto com um
inóculo de aproximadamente 0,5 x 10
4
a 5,0 x 10
4
células/mL, CETINKAYA et
al. (2005), analisaram 108 amostras de T. rubrum, tendo como referência o
método preconizado pelo NCCLS, encontrou valores de CIMs variando entre
0,03-8 µg/mL para o cetoconazol, 0,03-4 µg/mL para a terbinafina, 0,06-8
µg/mL para o itraconazol e 0,25-64 µg/mL para o fluconazol. Da mesma forma
GHANNOUM et al. (2006), em um estudo interlaboratorial, baseado na norma
CLSI M38-A, utilizando-se 5 amostras de T. rubrum e 5 de T. mentagrophytes,
com concentração final do inóculo de 1 x 10
3
a 3 x 10
3
UFC/mL, foram
encontrados os seguintes valores de CIM para o T. rubrum: ciclopirox 0,5-2,0
µg/mL, griseofulvina 0,12-0,5 µg/mL, itraconazol 0,03-0,25 µg/mL, posaconazol
0,03-0,25 µg/mL, terbinafina 0,002-0,008 µg/mL, voriconazol 0,03-0,25 µg/mL.
No nosso trabalho a melhor condição de inóculo foi 5,0 x 10
3
UFC/mL, estando
de acordo com estes últimos estudos.
As linhagens de T. rubrum (Tr, H6 e ∆TruMDR2), escolhidas para o
estudo apresentaram valores de CIM elevados para fluconazol e anfotericina B.
Apesar de não estar bem estabelecido os pontos de cortes para este fungo,
uma das drogas de escolha na terapêutica das dermatofitoses, como
griseofulvina, foi relativamente efetiva contra estas linhagens. A linhagem
∆TruMDR2, desenvolvida por FACHIN et al. (2006), é uma cepa mutante obtida
da linhagem H6. Para esta mutação foi realizada em laboratório uma ruptura do
gene TruMDR2, que está relacionado com mecanismos de múltipla resistência
73
a drogas. Tal linhagem caracteriza-se por apresentar modulação de resistência
a griseofulvina, demonstrando maior sensibilidade a terbinafina. Fato este
confirmado em nosso estudo onde a linhagem ∆TruMDR2 demonstrou ser mais
sensível a terbinafina que a linhagem H6, conforme estudo de FACHIN et al.
2006.
Neste estudo os extratos etanólicos de Pothomorphe umbellata,
mostraram a melhor atividade frente a linhagem ∆TruMDR2, enquanto que
frente à linhagem H6 e Tr1 os valores de CIM e CFM foram superiores. As
partições hexânicas e diclorometânicas obtidas a partir do extrato etanólico
apresentaram as menores CIMs e CFMs frente as três linhagens,
possivelmente devido ao fato de possuírem moléculas apolares, que mais
facilmente seriam transportadas para o interior da célula fúngica. Os valores de
CIM obtidos (156,25 µg/mL) foram concordantes com o estudo de SILVA et al.,
(2005), onde a fração hexânica de Ocimum gratissimun inibiu 100% do
crescimento de dermatófitos na concentração de 125µg/mL, enquanto que o
eugenol inibiu apenas 80% do crescimento nas mesmas concentrações. Por
outro lado, em estudo realizado por GURGEL et al., (2005), a CIM do extrato
de Croton urucurana frente a T. rubrum apresentou valores de 2.500 µg/mL.
SARTORI et al. (2003), encontrou valores de CIM entre 250 e 1000 µg/mL para
E. floccosum, T. menthagrophytes e T. rubrum frente a frações do extrato de
Wedelia palutosa. Em outro estudo, PYUN & SHIN, (2006), mostraram
atividade fungistática de óleo de Allium sativum, A. cepa e A. fistulosum com
CIMs de 64 µg/mL contra espécies de Trichophyton, além de um efeito
sinérgico quando combinado com cetoconazol. KOSALEC et al., (2005),
demonstraram atividade antimicótica contra várias espécies de leveduras e
74
dermatófitos, com CIMs menores que 1,56% e 0,78%, respectivamente. Em
estudo de 2004, com a Piperacea Piper solmsianum, CAMPOS et al. (2004)
encontrou para o T. rubrum, os seguintes valores de CIM, extrato metanólico
bruto 60 µg/mL, fração hexano 80 µg/mL, fração diclorometano 30 µg/mL,
fração acetato de etila 500 µg/mL.
Atividade antimicrobiana foi demonstrada para a espécie vegetal Hyptis
ovalifolia para 60 cepas de dermatófitos sendo 10 de Microsporum canis, 10 de
Microsporum gypseum, 20 de T. rubrum e 20 de T. mentagrophytes, na qual as
frações aquosa, metanólica e hexânica inibiram 40, 90 e 51,7% enquanto que o
óleo essencial inibiu 100% das linhagens (SOUZA et al., 2003).
Nossos resultados indicaram que independente destas vias
moduladoras alteradas na cepa mutante, o extrato da planta em estudo foi
capaz de inibir o crescimento do fungo. Adicionalmente, isto pode ser aventado
para as demais linhagens que têm como características perfis de sensibilidade
elevados para a maioria das drogas antifúngicas incluindo aquelas utilizadas na
terapêutica destas infecções.
Várias classes de compostos químicos já foram identificados do extrato
de Pothomorphe umbellata, como alcalóides, flavonóides, diidrochalcona e
esteróides (ISOBE, et al., 2002) bem como óleos voláteis denominados E-
ecarofileno, E-nerolidol, germacreno D, biciclogermacreno e elemeno
(MESQUITA et al., 2005). Outras espécies de plantas produtoras de óleos
voláteis, como Cymbopogon citratus, que tem entre seus componentes
flavonóides, além dos óleos voláteis, também apresentam ação antifúngica
conta o T. rubrum (ORDÓNEZ, et al., 2004).
75
Devido à atividade efetiva demonstrada pela partição hexano e
diclorometano, este estudo procurou compreender a ação antifúngica do extrato
de Pothomorphe umbellata e das drogas usuais sobre o crescimento destas
linhagens com o objetivo de investigar possíveis alterações na produção de
proteínas excretadas. O entendimento de possíveis atividades deste extrato ou
partições em proteínas de T. rubrum pode levar a localização de novos alvos, uma
vez que este agente etiológico é o maior causador de dermatofitoses.
Recentes investigações mostraram que as proteases secretadas pelos
dermatófitos são similares aquelas de outros fungos como Aspergillus spp
(BROUTA et al. 2002; DESCAMPS et al., 2002; JOUSSON et al., 2004 a,b) e
são membros de grandes famílias de proteínas. Foram encontradas 2 famílias
gênicas codificando endoproteases da família S8 (subtilisinas) e M36
(fungalisinas) (RAWLINGS et al., 2006).
Várias proteinases foram descritas e purificadas em meios de cultivos de
T. rubrum, mostrando atividade enzimática capaz de degradar diversas
proteínas entre estas as queratinas. Algumas serino proteínases de 34,7 kDa
(SANYAL et al. 1985), 90 e 71 kDa (ASAHI et al.,1985) foram demonstradas,
sendo as duas últimas possivelmente consideradas dímeros com propriedades
queratinolíticas. Uma outra de 27 kDa apresentou características de
degradação de componentes de matriz extracelular, laminina, fibronectina e
diversos tipos de colágenos (APODACA et al., 1989a, 1989b). JOUSSON et
al., (2004a) demonstrou uma variação de 13 a 19 bandas perfazendo um total
de 31 a 111 kDa nas massas moleculares das proteínas totais de T. rubrum
determinadas por SDS-PAGE. Ainda neste estudo os autores atestaram que o
T. rubrum e outros dois dermatófitos secretam serino proteases e
76
metaloprotases. As proteínas totais excretadas das diferentes linhagens de T.
rubrum de nosso estudo apresentaram variação de 3 a 14 bandas, ou proteínas
de 14 a 123 kDa.
Não encontramos na literatura, estudos atuais, acerca do efeito
antifúngico de extratos vegetais em proteomas de dermatófitos, e mais
especificamente para T. rubrum.
Nossos resultados mostraram atividade em proteínas de T. rubrum
durante o cultivo das diferentes linhagens na presença das drogas sintéticas ou
de extratos vegetais. O fungo frente a estas situações responde produzindo ou
deixando de produzir certas bandas protéicas. Diversas proteínas foram
descritas e purificadas do meio de cultura do fungo T. rubrum, entretanto, o
papel das proteínas envolvidas em alvos de drogas não foi esclarecido ainda.
Foi descrita uma proteína de 43,5 kDa, designada como uma metaloprotease,
um exoantígeno, com papel na invasão tecidual e no controle dos mecanismos
de defesa do hospedeiro. O nosso trabalho confirmou a presença destas
bandas protéicas envolvidas nas vias metabólicas estudadas por diversos
autores (APODACA et al.,1989 a,b; ASAHI et al., 1985; COLLINS et al. 1973;
LAMBKIN et al. 1996; MEEVOOTISOM & NIEDERPRUEM, 1979)
Dentre as proteínas encontradas em nossas análises destaca-se uma de
massa molecular de aproximadamente 70kDa. De acordo com a literatura, pode-
se tratar de uma Hsp70, uma chaperonina a qual foram atribuídas as seguintes
funções: participação da conformação estrutural estando envolvida em síntese
de proteínas, transporte de proteínas através de membranas e dinâmica da
montagem macromolecular de microtúbulos e clatrina (GAO et al 1991, NELSON
et al 1992, Mc CLELLAN et al 1998). Esta proteína também protege as células
77
de situações de estresse prevenindo a agregação protéica e auxiliando o
redobramento de proteínas desnaturadas (MAYER et al 2001, HARTL &
HAYER-HARTL, 2002). Tal proteína foi encontrada nos ensaios frente aos
antifúngicos fluconazol, anfotericina e griseofulvina para a linhagem H6, e em
anfotericina e griseofulvina para a Tr1. Podemos sugerir que esteja envolvida na
expressão de múltipla resistência às drogas pois na linhagem TruMDR2 a
mesma apareceu apenas em fluconazol em certos períodos de contato, estando
ausente em griseofulvina e anfotericina, o que era esperado devido ao fato desta
linhagem ter sofrido uma ruptura nos genes de múltipla resistência. Na condição
de crescimento em presença da partição hexano sub-CIM para a linhagem H6
houve o aparecimento desta banda podendo ser considerado que o extrato
nestas condições agiu nestas vias de biossíntese protéica.
Ainda em nosso estudo observamos o aparecimento de uma banda de
aproximadamente 61 KDa quando as linhagens H6 e TruMDR2 foram
cultivadas com anfotericina, grieofulvina e fluconazol (7, 14, 21 e 28 dias),
enquanto para Tr1 esteve presente em fluconazol 7 e 14 dias anfotericina e
griseofulvina. Quando cultivado na presença da partição hexano sub-CIM para
a linhagem Tr1 a mesma banda foi observada. Dados da literatura mostram
que uma proteína de 61 KDa foi isolada de Paracoccidioides brasiliensis e foi
caracterizada como catalase peroxisomal responsável pelo papel de defesa
dos fungos contra os mecanismos de morte dependentes de oxigênio
(MOREIRA et al., 2004).
Uma outra banda obtida foi de aproximadamente 90 kDa, que apareceu
quando cultivada em fluconazol 14 dias, extrato hexânico CIM 21 dias para a
linhagem H6, fluconazol tempo zero, 7, 14 dias e anfotericina para linhagem
78
TruMDR2 e em fluconazol 7 dias, anfotericina, partição hexano 14 e 21 dias,
diclorometânico 14 dias na linhagem Tr1. Esta proteína pode ser, de acordo com
dados da literatura, uma heat shock proteína que foi descrita para o S. cerevisiae
e que apresenta o mesmo peso molecular (SCROGGINS et al. (2007).
Nosso trabalho também permitiu evidenciar diferentes perfis protéicos
entre as linhagens em estudo. Observamos o aparecimento de proteína de 123
kDa quando a linhagem H6 e Tr1 foram cultivadas frente a griseofulvina, porém
esta banda não apareceu na linhagem TruMDR2, podendo ser uma
característica ligada ao rompimento do gene TruMDR ligado a multiresistência
a drogas. Observamos o aparecimento de uma proteína de aproximadamente
109 kDa na linhagem H6, nas condições de crescimento frente a griseofulvina e
em algumas condições frente as partições do extrato vegetal, podendo estar
relacionada ao stress causado pelas substâncias, que não aparecia na
condição de crescimento. Estes resultados merecem uma investigação mais
detalhada justificando a ausência de literatura para tais bandas.
Nossos achados sugerem que o efeito inibidor das partições hexano e
diclorometano podem apresentar interações compartilhando vias comuns aos
das drogas sintéticas com ações em alvos protéicos semelhantes.
As proteínas de diversas vias essenciais ao crescimento fúngico
mostram ser alvos moleculares importantes para o descobrimento de fármacos
antifúngicos. Os efeitos citotóxicos na célula fúngica devem vir da
desestabilização ou interrupção de componentes biossintéticos vitais,
intermediários ou finais, impedindo a sobrevida do fungo. Estes processos
devem ser melhor pesquisados para o entendimento do papel de cada proteína
destas vias como um potencial alvo.
79
6- Conclusão
9 A portaria M 38-A aplicada ao estudo da sensibilidade das linhagens de
T. rubrum mostrou-se adequada tanto para antifúngicos sintéticos
quanto para os extratos com reprodutibilidade
9 A atividade antifúngica de P. umbellata foi demonstrada para vários
extratos
9 Dos extratos a melhor atividade antifúngica foi obtida com o extrato
etanólico para as três linhagens
9 A maior atividade antifúngica foi demonstrada com a partição hexânica e
diclorometânica para as três linhagens. Tal atividade foi efetiva em
linhagens resistentes
9 O perfil protéico geral das três linhagens foi alterado em presença de
drogas antifúngicas
9 O perfil protéico geral das três linhagens foi alterado em presença das
partições hexano e diclorometano
9 O extrato vegetal atuou em proteínas comuns às proteínas alteradas
pelos antifúngicos
80
7- Referências Bibliográficas
AJELLO,L.; Geographic distribution and prevalence of the dermatophytes. Ann
N Y Acad Sci. 27;89:30-8.1960
ALY, R. Ecology and epidemiology of dermatophyte infections. J. Am. Acad.
Dermatol, v.31, p. 21-25.1994.
APODACA,G.; McKERROW. Purification and Characterization of a 27,000-M
r
Extracellular Proteinase from Trichophyton rubrum. Infection and Immunity,
v.57, p. 3072-3080, 1989a.
APODACA,G.; McKERROW. Regulation of Trichophyton rubrum proteolitic
activity. Infection and Immunity, v. 57, p. 3081-3090,1989b.
ASAHI, M., LINDQUIST, R., FUKUYAMA, K., APODACA, G., EPSTEIN, W.L.,
McKERROW, J.H., Purification and characterization of major extracellular
proteinases fron Trichophyton rubrum. Biochemical Journal. 232,p:139-
144,1985.
BRILANTE,R.S., PAIXÃO, G.C., SALVINO, L.K., DIOGENES, M.J.,
BANDEIRA, S.P., ROCHA, M.F. , DOS SANTOS, J.B., SIDRIM,J.J.;
Epidemiology and ecology of dematophytoses in city of Fortaleza: Trichophyton
tonsurans as important emerging pathogen of Tinea capitis. Rev. Soc. Bras.
Med. Trop. 33(5):p417-25, 2000.
BRILHANTE, R. S. N., CORDEIRO, R.A., ROCHA, M. F. G., MONTEIRO, A. J.,
MEIRELES, T. E. F., SIDRIM, J. J. C., Tropical medicine rounds Tinea capitis in
a dermatology center in the city of Fortaleza, Brazil: the role of Trichophyton
tonsurans. Intern. J. Dermatol., v. 43, p.575, 2004.
BROUTA, F.; DESCAMOS, F.; MONOD, M.; VERMOUT, S.; LOSSON, B.;
MIGNON, B.; Secret Metalloprotease Gene Family of Microsporum canis.
Infection and immunity. P. 5676-583,2002.
CAMPOS,M.P.;CECHINEL FILHO,V.; SILVA,R.Z.; YUNES,R.A.;ZACCHINO,S.;
JUAREZ,S.; CRUZ, R.C.B.; CRUZ,A.B.; Evaluation of Antifungal Activity of
Piper solmsianum C. DC. Var. solmsianum. Biol. Pharm. Bull, 28 (8) 1527-
1530, 2004.
CARRILLO-MUÑOZ,A.J.; GUGLIETTA,A.; PALACIN,C.; CASALS, J.; DEL
VALLE,O.; GUARDIA,C.; RODRIGUEZ,V.; QUINDÓS,G. In Vitro Antifungal
Active of Sertaconazole Comparated With Nine Other Drugs Against 250
Clinical Isolates of Dermatophytes and Scopulariopsis brevicaulis.
Chemotherapy,v. 50, p. 308-313, 2004.
CARRILLO-MUÑOZ,A.J.; GIUSIANO, G.; EZKURRA, P.A.; QUINDÓS,G.
Antifungal agents: mode of action in yeast cells. Rev Esp Quimioter.
Jun;19(2): p. 130-9, 2006.
81
CETINKAVA, Z., KIRAZ, N., KARACA, S., KULAC, M., CIFTCI, I. H., AKTEPE,
O.C., ALTINDIS, M., KIVILDI, N., PIVADE, M., Antifungal susceptibilities of
dermatophytic agents isolated from clinical specimens. European Journal of
Dermatology, v. 15(4):p. 258-61, 2005.
CHMEL, L. Zoophilic dermatophytes and infections in man. Med. Mycol., v. 8,
p. 61-66, 1980.
COLLINS, J. P., GRAPPEL, S. F., BLANK,F. ; Role of keratinases in
dermatophytosis. II. Fluorescent antibody studies with keratinase II of
Trichophyton mentagrophytes. Dermatologica, 146,p95-100, 1973
COSTA, T. R.; COSTA, M. R.; DA SILVA, M. V.; RODRIGUES, A. B.;
FERNANDES, O. D. E. F.; SOARES, A.J,.; SILVA, M. D. O. R. The etiology and
epidemiology of dermatophytoses in Goiania, GO, Brazil. Rev. Soc. Bras. Med.
Trop. v. 32: p. 367-71, 1999.
DAS, S. K.; BANERJEE, A. B. Lipolytic enzymes of Trichophyton rubrum.
Sabouraudia. v. 15: p. 313-23, 1977.
DAVIES, R.R., Griseofulvin, p.149-182, InD.C.E. Speller (ed.). Antifungal
Chemotherapy. John Wiley & Sons Ltd.; Chichester England), 1980.
DAWSON, C. O.; GENTELES, J. C. The perfect states of Keratinomyces ajelloi
Vanbreuseghem, Trichophyton terrestre Durie & Frey and Microsporum nanum
Fuentes. Sabouraudia, v. 1, p. 49-57, 1961.
DESCAMPS, F.; BROUTA, F.; MONOD, M.; ZAUGG, C.; BAAR, D.; LOSSON,
B.; MIGNON, B. Isolation of a Microsporum canis gene family encoding three
subtilisin-like proteases expressed in vivo. : J Invest Dermatol.
Oct;119(4):p.830-5, 2002.
DIXON, R.A. Natural products and plant disease resistence. Nature, v. 411, p.
843-847, 2001.
EMMONS, C. W. Dermatophytes: natural groupings based on the form of the
spore and accessory organs. Arch. Dermatol. Syphilol., v. 30, p. 337-362, 1934.
FACHIN, A. L.; CONTEL,E. P. B.; MARTINEZ-ROSSI, N. M. Effect of sub-MICs
of antimycotics on expression of intracellular esterase of Trichophyton rubrum.
Medical Mycology, 39, p.129-133, 2001.
FACHIN, A. L., FERREIRA-NOZAWA,M. S., MACCHERONI, W.JR,
MARTINEZ-ROSSI, N. M.; Role of the ABC transporter TruMDR2 in terbinafine,
4-nitroquinoline n-oxide and ethidium bromide susceptibility in Trichophyton
rubrum. Journal of Medicinal Microbiology, 55, p.1093-1099, 2006.
82
FERNANDES-TORRES, B.; CARRILLO, A. J.; MARTIN, E.; DEL PALACIO, A.;
MORRE, M. K.; VALVERDE, A.; SERRANO, M.; GUARRO, J. In Vitro Activities
of 10 Antifungal Drugs against 508 Dermatophyte Strains. Antimicrob. Agents
Chemother., v. 45, p. 2524–2528, 2001.
FERNANDEZ-TORRES, B.; J. CABANES, F.; CARRILLO-MUÑUZ, A. J.;
ESTEBAN, A.; INZA, I.; ABARCA, L.; GUARRO, J. Colaborative Evaluation of
Optimal Antifungal Susceptibility Testing Conditions for Dermatophytes.
Journal of Clinical Microbiology, p. 3999-4003, 2002.
GAO, B.C.; BIOSCA, J.; CRAIG, E.A.; GREENE, L.E. EISENBERG, E.;
Uncoating of coated vesicles by yest hsp70 proteins. J. Biol. Chem. 266,p.
19565-71,1991
GENTLES, J. C. Experimental ringworm in guinea pigs: oral treatment with
griseofulvin. Nature (London), v. 182, p. 476, 1958.
GEORG, L. K. Epidemiology of the dermatophytoses: source of infection,
moldes of transmission and epidemiology. Ann. N. Y. Acad. Sci., v. 89, p. 69-
77, 1960.
GHANNOUM, M. A.,ARTHINGTON-SKAGGS, B., CHATURVEDI, V.,
ESPINEL-INGROFF, A., PFALLER, M. A., RENNIE, R., RINALDI, M. G.,
WLASH, T. J., Interleboratory Study of Quality Control Isolates for a Broth
Microdiluition Method (Modified CLSI M38-A) for Testing Susceptibilities of
Dermatophytes to Antifungals. Journal of Clinical Microbiology, p.4353-4356,
2006
GIROIS, S. B.; CHAPUIS, F.; DECULLIER, E.; REVOL, B. G. Adverse effects of
antifungal therapies in invasive fungal infections: review and meta-analysis.
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., v. 25, p. 138-149, 2006.
GOTTLIEB, J.E., PAUKER, S.G.; Whether or not to administer Amphotericin to
an immunosuppressed patient with hematologic malignancy and undiagnosed
fever. Med. Decis. Making. 1(1): p.74-93, 1981.
GOULART, E. G., LIMA, S. M. F.; CARVALHO, M. A. R.; OLIVEIRA, J. A. ;
JESUS, M. M.; CAMPOS, R. E.; COSENDEY, M. A. E.; Isolamento de fungos
patogênicos do solo no Município do Rio de Janeiro. F.Med. (BR), São Paulo,
v. 93, p.15-20, 1960.
GREER, D. L., An overview of common dermatophytes. J. Am. Acad.
Dermatol. 31(3 pt 2):S 112-6, 1994.
GRUBY, D. Mémoire sur une végétation qui constituent la vraie teigne. C. R.
Acad. Sci., v. 13, 72-75, 1841.
GRUBY, D. Recherches sur la nature, le siege et le development du porrigo
decalvans ou phytoalécie. C. R. Acad. Sci., v. 17, p. 301-302, 1843.
83
GRUBY, D. Recherches sur les cryptogames qui constituent la maladie
contagieuse du cuir chevelu décrito sous lê nom de Teigne tondance (Mahon),
Herpes tonsuras (Cazenave). C. R. Acad. Sci., v. 18, p. 583-585, 1844.
GRUBY, D. Sur les mycodermes qui constituent la teigne faveuse. C. R. Acad.
Sci., v. 13, p. 309-312, 1841.
GURGEL, L. A.; SIDRIM, J. J. C.; MARTINS, D. T.; CECHINEL FILHO, V.;
RAO, V. S. In vitro antifungal activity of dragon´s blood from Croton urucurana
against dermatophytes. Journal of Ethnopharmacology, v. 97, p. 409-412,
2005.
HARTL,F. U., HAYER-HARTL, M., Molecular cheperones in the cytosol:from
nascent chain to folded protein. Science. 295,p.:1852-1858, 2002.
INGORDO V, FRACCHIOLLA S, FIGLIOLA F, D'ANDRIA G, COLECCHIA B,
NALDI L. Prevalence and awareness of tinea pedis in Italian sailors.
Dermatology.;201(4):349-50, 2000.
ISOBE, T.; OSAKI, A.; NAGATA, K. Antibacterial Constituents Against
Helicobacter pylori of Brasilian Medicinal Plant, Pariparoba. Yakugaku Zasshi,
v. 122, p. 291-294, 2002.
JANUÁRIO,V.A. Estudo químico e farmacológico de Pothomorphe
umbellata(L.) Miq. Dissertação de Mestrado-Núcleo de Pesquisa de Produtos
Naturais,UFRJ. 1994.
JOUSSON, O., LECHENNE, B., BONTEMS, O., CAPOCCIA, S. , MIGNON, B. ,
BARBLAN, J. , QUADRONI, M., MONOD, M.; Multiplication of an ancestral
gene encoding secreted fungalysin preced species differentiation in the
dermatophytes Trichophyton and microsporum. Microbiology, 150, p 301-310,
2004a.
JOUSSON, O., LECHENNE, B., BONTEMS, O., MIGNON, B. , REICHADR, U.,
BARBLAN, J. , QUADRONI, M., MONOD, M., Secreted sublisin gene family in
Trichophyton rubrum. Gene. 339,p.79-88,2004b.
KASINATHAN, C.; KHULLER, G. K. Phospholipid synthesizing enzymes of
dermatophytes. III. Glycerol kinase of dermatophytes. Lipids. ;v. 19: p. 289-93,
1984.
KOSALEC, I.;PEPELJNJAK, S.; KUSTRAK, D.; Antifungal activity of fluid
extract and essential oil from anise fruits (Pinpinella anisum L. , Apiaceae),
Acta Pharm., 55(4):p.377-85, 2005.
LACAZ, C.S., PORTO, E., MARTINS, J.E.C, HEINS-VACCARI, E.M., MELLO,
NT. Tratado de Micologia Médica. 9
edição. São Paulo: Sarvier, 2002.
LACAZ,C. S.; PORTO, E.; MARTINS. J. E. C. Micologia Clínica:
Dermatófitos. 8ª edição. São Paulo:Brasil, p.120-160, 1991.
84
LAEMMLI, U.K., Cleavage of stuctural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature, v 227, p. 680-685, 1970.
LAMBKIN, I., HAMILTON, A. J., HAY, R.J.; Purification and characterization of
a novel 34,000-Mr cell-associated proteinase from the dermatophyte
Trichophyton rubrum. FEMS Immunol. Medical Microbiology, 13,p: 131-
140,1996
LAWSON, G.T. ; McLEOD, W.J. Microsporum canis; an intensive outbreak. Br.
Med. J., v.16:1159-60. 1957.
LEMOS, J. A.; PASSOS, X. S., FERNANDES,O. F. L.; PAULA, J. R.; FERRI, P.
H.; SOUZA, L. K. H.; LEMOS, A. A.; SILVA, M. R. R. Antifungal Activity From
Ocimum gratissimum L. Towards Cryptococcus neoformans. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v.100, p. 55-58, 2005.
LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil - nativas e
exóticas. Nova Odessa: Plantarum, p. 148-9, 2002.
MACKENZIE, D. W. R. “Hairbrush diagnosis” in deection and eradication of
non-fluorescent saclp ring Worm. Br.med. J., v. 2, p. 363-365,1963.
MARICHAL, P.; VANDEN BOSSCHE,H. Mechanisms of resistance to azole
antifungals. Acta Biochim. P., v. 42(4):509-16, 1995.
MATILE, P. ; Intracellular localization of proteolytic enzymes of Neurospora
crassa. I. function and subcellular distribuition of proteolytic enzymes.
Zellforsch Mikrosk Anat. v. 16; 65: p884-96, 1965.
MAYER, M. P., BREHMER, D., GASSLER, C. S., BUKAU, B.,Hsp70 chaperone
machines. Adv. Protein Chem. 59,p:1-44,2001.
MAYR, A. Infections which humans in the household transmit to dogs and
cats.Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg., v. 187, p. 508-526, 1989.
MCCLELLAN, A. J., ENDRES, J. B., VOGEL, J.P., PALAZZI, D., ROSE, M. D.,
Specific molecular chaperone interaction and ATP- dependent conformationl
change are required during posttranlational protein translocation in to the yeast.
ER. Mol. Biol. Cell. 9,p.3533-3545, 1998
MC GINNIS, M.R.; Laboratory handbook of Medical Mycology;
Dermatophytoses. Academic Press, New York, N.Y. 1980 p.105-155.
MEEVOOTISOM, V., NIEDERPRUEM, D.J., Controlo f exocellular proteases in
dermatophytes and especially Trichophyton rubrum. Sabouraudia, v. 17, p: 91-
106, 1979.
MESQUITA, J. M.O.; CAVALEIRO,C.; CUNHA, A. P.; LOMBARDI, J. A. Estudo
comparativo dos óleos voláteis de algumas Piperaceae. Revista Brasileira de
Farmacognosia,v. 15, p. 6-12, 2005.
85
MEZZARI, A.; Frequency of dermatophytes in the metropolitan área of Porto
Alegre, RS, Brazil. Rev. Int. Med. Trop. São Paulo. 40,p:71-76, 1998
MOREIRA, S. F. I., BAILÃO, A. M., BARBOSA, M. S., JESUINO, R.S. A.,
FELIPE, M. S. S., PEREIRA, M. , SOARES, C. M. A. Monofunctional catalase P
of Paracoccidioides brasiliensis: identification, characterization, molecular
cloning and expression analysis. Yeast, 21: p. 173-182, 2004.
NATIONAL COMMITE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS.
Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of conidium-
forming filamentous fungi. Proposed standard. NCCLS document M38-A.
National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa, 2002.
NELSON, R. J., ZIEGELHOFFER, T., NOCOLET, C., WERNER-
WASHBURNE, M., CRAIG, E. A., The translation machincry and 70 kD heat
shock protein cooperate in protein synthesis. Cell. 71,p.97-105,1992.
ORDÓÑES, M.G.; JORGE, M.R.; SIMÓN, G.G. Actividad antimicrobiana del
aceite esencial y crema de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. Revista Cubana
Plant Med., v. 9, 2004.
OSBORNE, C.S.;LEITNER,I.;HOFBAUER, B.; FIELDING,C.A.; FAVRE,B.;
RYDER,N.S.; Biological, Biochemical, and Molecular Characterization of a New
Clinical Trichophyton rubrum Isolate Resistant to Terbinafine. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, p. 2234-2236, 2006
PERAZZO, F.F. ; Estudo químico – farmacológico dos extratos e princípios
ativos obtidos da espécie medicinal Pothomorphe umbellata, Tese de
doutorado FCFRP – USP Ribeirão Preto, Brasil, 2006.
PEREA, S.; PATTERSON, T. F. Antifungal resistance in patogenic fungi. Clin.
Infec. Dis., v. 35, p. 1073-1080, 2002.
PEREA, S.; RAMOS, M. J.; GARAU, M.; GONZALEZ, A.; NORIEGA, A. R.; Del
PALACIO, A. Prevalence and risk factors of tinea unguium and tinea pedis in
the general population in Spain. J. Clin. Microbiol., v. 38, p. 3226-3230, 2000.
PYUN,M.S.; SHIN, S. Antifungal effects of the volatile oils from Allium plants
against Trichophyton species and synergism of the oils with ketoconazole.
Phytomedicine, v. 13: p. 394-400, 2006.
RAWLINGS, N. D.; NORTON, F. R.; BARRETT, A. J.; MEROPS The peptidase
database. Nucleic Acid Res. 34,p.270-272,2006
RIPPON, J.W. Medical Mycology: Dermatophytoses, 3° ed., W. B. Saunders
Co, Philadelphia, p. 105-157, 1988.
ROCHA, E.M.F. Mecanismo molecular envolvido na resistência aos derivados
de acridina e ao antimicótico tioconazol em Aspergillus nidulans, Tese de
Doutorado, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, Ribeirão Preto,
São Paulo, Brasil, 2002
86
ROSEEUW, D. & P. DE DONCKER. New approaches to the treatment of
onychomicosis, J. Am. Acad. Dermatol., 24: S 45- S 50, 1993.
SABOURAUD, R. Les teignes, Masson, Paris, 1910.
SANYAL, A.K.; DAS, S. K.; BANERJEE, A. B. Purafication and partial
characterization of an exocellular proteinase from Trichophyton rubrum.
Sabouraudia v. 23, p. 165-78, 1985.
SARTOTI, M. R. K.; PRETTO, J. B.; CRUZ, A. B.; BRESCIANI, L. F. V.; YUNES,
R. A.; SORTINO, M.; ZACCHINO, S. A.; CECHINEL FILHO, V.; Antifungal activity
of fractions and two pure compounds of flowers wedelia paludosa (Acmela
brasiliensis) (Asteraceae). Pharmazie, v. 58, p. 567-569, 2003.
SANTOS, J. I., NEGRI, C., WAGNER, D., PHILIPI, R., NAPPI, B., COELHO,
M., Some aspects o dermatophytoses seen at university Hospital in
Florianopolis, Santa Catarina, Brazil. Revista do Instituto de Medicina
Tropical de São Paulo. V. 39(3), p.137-140, 1997
SCHOENLEIN, J. L. zur Pathogenie der Impetigines Adch. Anat. Physiol.
Wiss. Med. p. 82, 1839.
SCROGGINS, B.T.; ROBZYK, K.; WANG, D.; MARCU, M. G.; TSUTSUMI, S.
BEEBE, K.; COTTER, R. J.; FELTS, S.; TOFT, D.; KARNITZ, L.; ROSEN, N.;
NECKERS, L. An acetylation site in the middle domain of Hsp90 regulates
chaperoe function. Mol. Cellular. 25(1), p. 151-159, 2007
SILVA, M. R. R.; OLIVEIRA Jr, J. G.; FERNANDES, F. L.; PASSOS, C. R.;
COSTA, L. K. H.; LEMOS, J. A.; PAULA, J. R. Antifungal activty of Ocimum
gratissimun towards dermatophytes. Mycoses. v. 48, p. 172, 2005.
SOUZA, L. K; DE OLIVEIRA, C. M.; FERRI, P. H.; DE OLIVEIRA JUNIOR, J.
G.; DE SOUZA JUNIOR, A. H.; FERNANDES, O. F.; SILVA, M. R. Antimicrobial
activity of Hyptis ovalifolia towards dermatophytes. Mem Inst Oswaldo Cruz.
98 (7), p.963-965, 2003
THOMPSON, L. M. Antifungal Drugs. Rev. Chil. Infectol. v. 19, p. , 2002.
TSUBOI, R. KO, I.; TAKAMORI, K.; OGAWA, H. Isolation of a Keratonolytic
proteinase from Trichophyton mentagrophytes with enzymatic activity at acidic
pH. Infect Immun. v. 57, p. 3479-83, 1989 a.
TSUBOI, R.; KO,I.J.; MATSUDA, K.; OGAWA, H. A new keratinolytic proteinase
from clinical isolates of Trichophyton mentagrophytes. J. Dermatol. v. 14, p.
506-508, 1989 b.
TSUBOI, R.; MATSUDA, K.; KO, I. J.; OGAWA, H. Correlation between culture
medium pH, extracellular proteinase activity, and cell growth of Candida
albicans in insoluble stratum corneum-supplemented media. Arch. Dermatol.
Res., v. 281, p. 342-345, 1989 c.
87
WANG, N. L.; WANG, J.; YAO, X. S.; KITANAKA, S. Two Neolignan
Glucosides and Antihistamine Release Activities from Bidens parviflora Willd.
Chem. Pharm. Bull. v. 54, p. 1190-1192, 2006.
WEITZMAN, I.; SUMMERBELL, R. C. The Dermatophytes. Clin Microbiol
Rev., v. 8, p. 240-259, 1995.
WEITZMAN, I. Saprophytic molds as agents of cutaneous and subcutaneous
infection in the immunocompromised host. Arch Dermatol. v. 122, p. 1161-
1168, 1986.
ZAIAS, N.; GLICK, B. REBELL, GLICK, B. Diagnosing and treating
onychomycosis. J. Farm. Pract. 42: S13-S18, 1996.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
