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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Ciências Básicas da Saúde
Departamento de Fisiologia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia
Tese de Doutorado
"PAPEL DA PROSTAGLANDINA A
2
E DO ESTADO REDOX COMO
MODULADORES DO METABOLISMO DO COLESTEROL EM DIFERENTES
TIPOS DE MACRÓFAGOS "
Lucila Ludmila Paula Gutierrez
Orientador:
Prof. Dr. Paulo Ivo Homem de Bittencourt Jr
Porto Alegre
2007
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http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
II
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Ciências Básicas da Saúde
Departamento de Fisiologia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia
"PAPEL DA PROSTAGLANDINA A
2
E DO ESTADO REDOX COMO
MODULADORES DO METABOLISMO DO COLESTEROL EM DIFERENTES
TIPOS DE MACRÓFAGOS "
Lucila Ludmila Paula Gutierrez
Orientador:
Prof. Dr. Paulo Ivo Homem de Bittencourt Jr
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas:
Fisiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul como requisito
parcial para a obtenção do título de Doutor.
Porto Alegre
2007
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III
“Se o trabalhador trabalha com alegria,
o trabalho vira a alegria do trabalhador”
Emmanuel
IV
Dedico este trabalho
a todos os seres que visam
melhorar a vida neste planeta.
V
AGRADECIMENTOS
A esta força maravilhosa que move os mundos.
Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo Ivo Homem de Bittencourt Jr., por me
guiar no caminho do conhecimento científico, pela confiança que depôs no
meu trabalho e por todo o carinho, desvelo e ensinamentos durante todos estes
anos.
Ao meu marido, amigo e companheiro de todas as horas, Fabiano, que
sempre esteve ao meu lado, até como meu “bolsista de iniciação científica”,
fazendo experimento junto comigo nas madrugadas, me ajudando a organizar
a tese e, acima de tudo, me apoiando em tudo, demonstrando paciência
inesgotável ao longo destes tantos anos.
Às minhas incentivadoras de sempre e amigas de todas as horas: Maris
e Jaque.
Aos meus amigos de todos os momentos, que muito me ajudaram me
dando colo ou me fazendo rir...
Aos meus familiares pela compreensão dos momentos de ausência...
A todos do laboratório (os que ainda estão e aos que não mais),
Joelso, Patrícia, Daiane, Maurício, Ângela, Lino, João, Júlia, Damiana,
Gustavo, Lisiane, Mariana, Bibiana, Elza, Alexandre (desculpem se esqueci
alguém) pelo aprendizado, pelo apoio, pelas conversas, risadas, besteiras
e pelo ambiente amistoso.
Aos Professores Maria Flávia Marques Ribeiro e Luiz Carlos Kucharski
pelo empréstimo de material.
Em particular meus agradecimentos a três pessoas especiais no
laboratório: os alunos de iniciação científica Augustus Joli Fernandes e João
Roberto Fernandes e a mestranda Juliane Rossato, que compartilharam
minhas angústias e fizeram meus dias e noites no laboratório mais felizes e
cheios de esperança. A vocês agradeço o maior de todos os presentes: a
amizade!
VI
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS, IX
LISTA DE FIGURAS, XIII
RESUMO, XVIII
1. INTRODUÇÃO, 1
2. REFERENCIAL TEÓRICO, 2
2 .1- Da homeostase do colesterol à aterosclerose, 2
2.2- Metabolismo lipídico do macrófago e seu papel central na
aterogênese, 5
2.3- Exportação de lipídios, sinalizações intracelulares e ativação
metabólica por prostaglandinas ciclopentenônicas, 17
2.4- Estado redox celular e sua importância na aterosclerose, 31
2.5- Vistas ao desenvolvimento de uma terapia vascular à base de CP-
PGs, 37
3. OBJETIVOS, 39
4. METODOLOGIA, 41
4.1 - Animais, 41
4.2 - Obtenção de macrófagos peritoneais, 41
4.3- Obtenção de macrófagos/ foam cell, 41
4.4- Obtenção de macrófagos U937, 41
4.5- Hemólise de eritrócitos contaminantes, 42
4.6- Viabilidade de macrófagos, 42
4.7- Reagentes utilizados no preparo da placa de cultura de macrófagos
peritoneais ou U937 e grupos experimentais, 42
4.8- Oxidação de lipoproteína de baixa densidade (LDL) , 46
4.9- Reagentes utilizados no preparo da placa de cultura de
macrófagos/foam cells e grupos experimentais, 47
4.10- Determinação do conteúdo intracelular de GSH e GSSG e relação
[GSSG/GSH], 50
VII
4.11- Quantificação de proteína, 52
4.12- Medida da Atividade da Acil-CoA: Colesterol O-Aciltransferase
(ACAT) em macrófagos peritoneais e macrófagos/ foam cells, 52
4.13- Medida da Atividade da HMG-CoA redutase pelo método
espectrofotométrico, em macrófagos peritoneais, 56
4.14- Imunoprecipitação e eletroforese SDS-PAGE para HMG-CoA
redutase de macrófagos peritoneais, 58
4.15- Expressão de proteínas de choque térmico (HSP) em macrófagos/
foam cells e peritoneais, 61
4.16- Expressão de proteínas da NO sintase induzível (iNOS, ou NOS-2),
64
4.17- Expressão de proteínas do receptor scavenger CD36, 64
4.18- Expressão de proteínas da bomba MRP1, 64
4.19- Expressão da proteína
β
-Actina, 65
4.20- Análise estatística, 65
5. RESULTADOS, 66
5.1- Atividade da Acil-CoA: Colesterol O-Aciltransferase (ACAT) em
macrófagos/ foam cells, 66
5.2- Atividade da Acil-CoA: Colesterol O-Aciltransferase (ACAT) em
macrófagos peritoneais, 67
5.3- Estado redox celular em macrófagos peritoneais, 71
5.4- Estado redox celular em macrófagos U937, 78
5.5- Expressão da proteína MRP1 em macrófagos peritoneais, 85
5.6- Expressão da proteína HSP70 em macrófagos peritoneais, 88
5.7- Expressão da proteína HSP70 em macrófagos/ foam cells, 94
5.8- Expressão da proteína iNOS em macrófagos peritoneais, 96
5.9- Atividade da 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA
redutase) em macrófagos peritoneais, 99
VIII
5.10- Expressão da proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-
CoA redutase) em macrófagos peritoneais, 103
5.11- Expressão da proteína CD36 em macrófagos peritoneais, 105
6. DISCUSSÃO, 108
7. CONCLUSÃO, 131
8. REFERÊNCIAS, 133
APÊNDICE FINAL, XX
ABSTRACT, XXI
IX
LISTA DE ABREVIATURAS
ABCA1............................................... do inglês, ATP-binding cassette transporter
A1
ACAT............................................. acil CoA: colesterol acil transferase
ACEH ........................................... colesteril éster hidrolase ácida
AMP.............................................. monofosfato de adenosina
AMPK........................................... 5’- proteína quinase dependente de monofosfato
de adenosina
AMPKK........................................... quinase da 5’- proteína quinase dependente de
monofosfato de adenosina
AP-1.............................................. ativador da proteína-1
apoA-1.......................................... apolipoproteína A-1
apoB-100....................................... apolipoproteína B-100
ARE/ EpRE.................................... elemento responsivo a antioxidantes/ eletrófilos
(do inglês antioxidant/ electrophile response element)
ATP.............................................. trifosfato de adenosina
ATPase ....................................... adenosina trifosfatase
Acetil-CoA.................................... acetil- coenzima A
BHT............................................... hidroxibutiltolueno
BSA ............................................ albumina sérica bovina
BSO ............................................ butionina-sulfoximina
CAT............................................. catalase
CEH.............................................. colesteril-éster hidrolase
CETP........................................... proteína de transferência de ésteres de
colesterol
COX ............................................. ciclooxigenase
COX-2.......................................... ciclooxigenase-2
CP-PG ......................................... prostaglandina ciclopentenônica
CP-PGs ....................................... prostaglandinas ciclopentenônicas
DEM ........................................... maleato de dietila
DMSO ........................................ sulfóxido de dimetila
DNP-SG...................................... (2,4-dinitrofenil)-S-glutationa
DTNB ......................................... ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
DTT............................................. ditiotreitol
EAO ............................................ espécies ativas de oxigênio
ECL ............................................. do inglês, Enhanced Chemiluminescence
EDTA .......................................... ácido etilenodiamino tetra-acético
ELAM-1.......................................... molécula de adesão de leucócito endotelial
(do inglês, endothelial leukocyte adhesion molecule-1)
ELISA….................................... do inglês, enzyme-linked immunosorbent
assays
eNOS............................................ óxido nítrico sintase endotelial
G6PDH........................................ glicose-6-fosfato desidrogenase
X
GS-conjugado.............................. S-conjugados de glutationa
GSH............................................ glutationa (forma reduzida)
GSRd ......................................... glutationa redutase
GPx.............................................. glutationa peroxidase
GSSG.......................................... dissulfeto de glutationa
GST........................................... glutationa S-transferase
GS-X........................................... bomba de glutationa
γ-GCS.......................................... γ-glutamilcisteína sintetase
HDL........................................... lipoproteína de alta densidade
HETE........................................ ácido hidróxi-eicosatetraenóico
HMG-CoA................................. 3-hidroxi-3metilglutaril-CoA
HODE....................................... ácido hidróxi-ocatadecadienóico
HPETE...................................... ácido hidroperóxi-eicosatetraenóico
HSC........................................... proteína de choque térmico constitutiva
HSE........................................... elemento de ligação dos HSF ao DNA
HSF........................................... fator de transcrição para HSP
HSG……................................... genes de choque térmico (do inglês, Heat
Shock Genes)
HSP........................................... proteína de choque térmico
ICAM-1....................................... molécula de adesão intracelular (do inglês,
intracellular adhesion molecule-1)
IDL............................................. lipoproteína de densidade intermediária
IFN- λ......................................... Interferon gamma
IκB ……………………………….. do inglês, Inhibitor kappa B
IKK.............................................. do inglês, Inhibitor kappa B quinase
IL-1β.......................................... interleucina- 1 beta
IL-1........................................... interleucina- 1
IL-6............................................ interleucina- 6
iNOS........................................... óxido nítrico sintase induzível
Insig-1......................................... do inglês, insulin-induced genes-1
IP............................................... imunoprecipitação
JNK ........................................... c-Jun quinase
Keap1….................................... . do inglês, Kelch-like ECH-associated protein-1
LCAT......................................... lecitina-colesterol aciltransferase
LDL............................................ lipoproteína de baixa densidade
LDLox........................................ lipoproteína de baixa densidade oxidada
LDLR.......................................... receptor de LDL
LDS............................................ Soro deficiente em lipoproteínas
LOX1......................................... do inglês, lecitin-like oxidized LDL receptor
LPS............................................ lipolissacarídeo
MDA........................................... malondialdeído
MDR.......................................... resistência múltipla a drogas
MPA.......................................... ácido metafosfórico
XI
MRP .......................................... proteínas de multi-resistência a drogas (do
inglês, Multidrug Resistance-Associated Protein)
NAC............................................ N-acetil-cisteína
NADPH ....................................... nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato
NCEH ......................................... colesteril éster hidrolase neutra
NEM............................................ N-etilmaleimida
NF-кB.......................................... fator nuclear kappa B (do inglês, nuclear
factor- кB)
NF-Y.......................................... fator nuclear-Y
nNOS........................................... óxido nítrico sintase neuronal
NO.............................................. óxido nítrico
NOS............................................ óxido nítrico sintase
Nrf2 ............................................ do inglês, nuclear factor erythroid
PBS............................................. do inglês, Phosphate-buffered saline
PDGF........................................ fator de crescimento derivado de plaquetas
PÉS............................................ polietersulfona
PGA.......................................... prostaglandina A
PGA
2
.......................................... prostaglandina A
2
PGE.......................................... prostaglandina E
PGE
2
.......................................... prostaglandina E
2
PGD............................................ prostaglandina D
PGD
2
........................................... prostaglandina D
2
PGF
2α
...................................... ... prostaglandina F
2α
PGI
2
........................................... prostaciclina
PGJ
2
.......................................... prostaglandina J
2
PG............................................. prostaglandina
PGs........................................... prostaglandinas
PIPES....................................... ácido piperazina N-N’-bis-(etanossulfônico)
PKC.......................................... proteína quinase C
PMSF......................................... fluoreto de fenil-metil-sulfonila
PPAR ........................................ do inglês, peroxisome proliferator-activated
receptor
PUFA........................................ ácidos graxos polinsaturados
Scap......................................... do inglês, SREBP-cleavage activating protein
SDS........................................... dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE................................ poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio
SFB............................................ soro fetal bovino
SNAP........................................ S-nitroso-N-acetilpenicilamina
SOD........................................... superóxido dismutase
SR-A ........................................ Receptor scavenger- A (do inglês, scavenger
receptor – A)
SR-BI.......................................... Receptor scavenger- BI (do inglês, scavenger
receptor – BI)
XII
SRE............................................ elementos regulatórios para esteróis
SREBP...................................... elemento de resposta a esterol
SREC......................................... (do inglês, scavenger receptor expressed by
endothelial cells)
TBA ............................................ ácido tiobarbitúrico
TBARS........................................ substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA ............................................ ácido tricloroacético
TGFβ-1....................................... fator de crescimento transformante beta-1(do
inglês, transforming growth factor beta-1)
TLC………………………………. Cromatografia de camada delgada (do inglês,
Thin Layer Chromatography)
TNFα........................................... fator de necrose tumoral
TX............................................. tromboxano
U............................................... unidades de atividade enzimática
UI.............................................. unidades internacionais
VCAM-1.................................... molécula de adesão celular vascular (do inglês,
vascular cellular adhesion molecule-1)
VLDL......................................... lipoproteínas de muito baixa densidade
XIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Rotas metabólicas envolvidas no balanço intracelular do colesterol, 11
Figura 2: Metabolismo do ácido aracdônico e formação das prostaglandinas
ciclopentenônicas (família das PGA
2
e PGJ
2
), 23
Figura 3: Centros eletrofìlicos de um anel ciclopentenônico, 24
Figura 4: Ressonância que ocorre entre os centros eletrofìlicos de um anel
ciclopentenônico, 24
Figura 5: Ação de nucleófilos em centros eletrofílicos de um anel
ciclopentenônico, 24
Figura 6: Adição de Michael, 25
Figura 7: Expressão do receptor scavenger CD36/FAT em macrófagos por
ativação do PPAR-γ, 28
Figura 8: Ativação do fator nuclear PPAR-γ e ciclo que perpetua a lesão
aterosclerótica, 29
Figura 9: Efeitos das CP-PGs no metabolismo do colesterol, 30
Figura 10: Possíveis reações de Adição de Michael entre CP-PGs e
grupamento tiol da glutationa, 34
Figura 11: Possível reação de Adição de Michael entre CP-PGs e cisteínas
reativas de proteínas, 35
Figura 12: Representação esquemática da distribuição experimental de
macrófagos peritoneais ou U937, 45
Figura 13: Representação esquemática da distribuição experimental de
macrófagos peritoneais ou foam cells, 49
Figura 14: Ação enzimática da ACAT sobre o colesterol e o oleato marcado, 53
Figura 15: Ação enzimática da HMG-CoA redutase, 56
Figura 16: Atividade enzimática da acil CoA:colesterol aciltransferase (ACAT),
em macrófagos/ foam cells nos diferentes grupos experimentais, 67
XIV
Figura 17: Atividade enzimática da acil CoA:colesterol aciltransferase (ACAT),
em 1h de tratamento com PGA
2
1μM, em macrófagos peritoneais nos
diferentes grupos experimentais, 69
Figura 18: Atividade enzimática da acil CoA:colesterol aciltransferase (ACAT),
em 24h de tratamento com PGA
2
1μM, em macrófagos peritoneais nos
diferentes grupos experimentais, 70
Figura 19: Concentração de glutationa reduzida (GSH) intracelular de
macrófagos peritoneais em 1h de tratamento, nos diferentes grupos
experimentais, 72
Figura 20: Concentração de glutationa oxidada (GSSG) intracelular de
macrófagos peritoneais em 1h de tratamento, nos diferentes grupos
experimentais, 73
Figura 21: Relação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de macrófagos peritoneais
em 1h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais, 74
Figura 22: Concentração de glutationa reduzida (GSH) intracelular de
macrófagos peritoneais em 24h de tratamento, nos diferentes grupos
experimentais, 75
Figura 23: Concentração de glutationa oxidada (GSSG) intracelular de
macrófagos peritoneais em 24h de tratamento, nos diferentes grupos
experimentais, 76
Figura 24: Relação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de macrófagos peritoneais
em 24h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais, 77
Figura 25: Concentração de glutationa reduzida (GSH) intracelular de células
U937 em 1h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais, 79
Figura 26: Concentração de glutationa oxidada (GSSG) intracelular de células
U937 em 1h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais, 80
XV
Figura 27: Relação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de células U937 em 1h de
tratamento, nos diferentes grupos experimentais, 81
Figura 28: Concentração de glutationa reduzida (GSH) intracelular de células
U937 em 24h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais. Resultados
obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos independentes, 82
Figura 29: Concentração de glutationa oxidada (GSSG) intracelular de células
U937 em 24h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais, 83
Figura 30: Relação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de células U937 em 24h de
tratamento, nos diferentes grupos experimentais, 31
Figura 31: Expressão da proteína MRP1. A expressão relativa da MRP1 em
termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da MRP1 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 6h com PGA2
1mM, 86
Figura 32: Expressão da proteína MRP1 em macrófagos. A expressão relativa
da MRP1 em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de
pixels das bandas da MRP1 pela quantidade de pixels das bandas de beta-
actina de cada amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 24h
com PGA
2
1μM, 87
Figura 33: Expressão da proteína HSC73. A expressão relativa da HSC73 em
termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da HSC73 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de
cada amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 6h com PGA
2
1μM, 89
Figura 34: Expressão da proteína HSC73. A expressão relativa da HSC73 em
termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da HSC73 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de
XVI
cada amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 24h com
PGA
2
1μM, 91
Figura 35: Expressão da proteína HSP72. A expressão relativa da HSP72 em
termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da HSP72 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de
cada amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 24h com
PGA
2
1μM, 93
Figura 36: Expressão da proteína HSP70. A expressão relativa da HSP70 em
termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da HSP70 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de
cada amostra em macrófagos/ foam cells controle e tratados com PGA
2
1μM e
20μM, 95
Figura 37: Expressão da proteína iNOS. A expressão relativa da iNOS em
termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da iNOS pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 6h com PGA
2
1μM,
97
Figura 38: Expressão da proteína iNOS. A expressão relativa da iNOS em
termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da iNOS pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 24h com PGA
2
1μM, 98
Figura 39: Atividade enzimática da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A
redutase (HMG-CoA redutase), em 1h de tratamento com PGA
2
1μM, em
macrófagos peritoneais nos diferentes grupos experimentais, 100
Figura 40: Atividade enzimática da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A
redutase (HMG-CoA redutase), em 24h de tratamento com PGA
2
1μM, em
macrófagos peritoneais nos diferentes grupos experimentais, 102
XVII
Figura 41: Expressão da proteína HMG-CoA redutase em macrófagos
peritoneais controle e tratados por 24h com PGA
2
1μM, 104
Figura 42: Expressão da proteína CD36. A expressão relativa da CD36 em
termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da CD36 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 6h com PGA
2
1μM,
106
Figura 43: Expressão da proteína CD36. A expressão relativa da CD36 em
termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da CD36 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 24h com PGA
2
1μM, 107
Figura 44A: Efeitos da PGA
2
no metabolismo do colesterol em células
oxidadas, 131
Figura 44B: Efeitos da PGA
2
no metabolismo do colesterol em células em
equilíbrio redox, 131
XVIII
RESUMO
Tese de Doutorado
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
"PAPEL DA PROSTAGLANDINA A
2
E DO ESTADO REDOX COMO
MODULADORES DO METABOLISMO DO COLESTEROL EM DIFERENTES
TIPOS DE MACRÓFAGOS "
Autora: Lucila Ludmila Paula Gutierrez
Orientador: Paulo Ivo Homem de Bittencourt Jr.
A aterosclerose é uma doença extremamente grave que leva à morte milhares de
pessoas em todo o mundo. A ruptura do balanço intracelular que leva ao acúmulo
de colesterol é uma das principais características observadas nas células que
participam do desenvolvimento da lesão aterosclerótica. Estudos de nosso grupo
mostraram que as prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs), em particular a
PGA
2
, desviam o metabolismo lipídico de macrófagos e macrófagos-foam cells
reduzindo a síntese de novo de colesterol e ésteres de colesterol e induzindo a
síntese de fosfolípides, no lugar dos derivados do colesterol. Além disso, as CP-PGs
são potentes agentes antiinflamatórios por promoverem diretamente a inibição da
ativação do fator nuclear NF-κB e, indiretamente, pela ativação das proteínas de
choque térmico (HSP), o que também leva à citoproteção. O resultado combinado
dessas alterações é que a PGA
2
induz uma potente redução na quantidade de
colesterol total em macrófagos-foam cells revertendo seu fenótipo ao de uma célula
normal. Assim, e tendo em vista que a aterogênese e o acúmulo de lipídios por
macrófagos está relacionado a disfunções na capacidade de regulação de síntese e
XIX
exportação de lipídios, o objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo de ação
da PGA
2
sobre a atividade e expressão de enzimas que participam do metabolismo
do colesterol, a saber, acil-coenzima A: colesterol acil-transferase (ACAT) e 3-
hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA redutase). Foi estudada,
também, a possibilidade de que o efeito desta prostaglandina pudesse dar-se pela
indução de alterações no estado redox celular e expressão de proteínas
relacionadas à iniciação e desenvolvimento da lesão ateromatosa em macrófagos.
Verificamos que, apesar de a PGA
2
inibir a atividade da ACAT em macrófagos/foam
cells, o mesmo não ocorre com macrófagos normais. Contudo, a PGA
2
apresenta
um potente efeito inibitório sobre a atividade da HMG-CoA redutase, mas não sobre
a expressão da proteína ou de seu mRNA. Os dados obtidos com a PGA
2
, que é um
agente eletrofílico, são mimetizados e potencializados por manobras que alteram as
concentrações intracelulares de glutationa (GSH) e dissulfeto de glutationa (GSSG)
e confirmados pela expressão de proteínas cujos fatores de transcrição específicos
são sensíveis ao estado redox, como a HSP70 (via HSF), MRP1 (via Nrf2/Keap1) e
iNOS (via NF-κB). Os resultados implicam as CP-PGs como uma nova classe de
agentes hipocolesterolemiantes através da modulação do estado redox celular.
XX
APÊNDICE FINAL
Artigo submetido à revista científica Atherosclerosis.
Título: Atherosclerosis: a redox-sensitive lipid imbalance suppressible by
cyclopentenone prostaglandins.
Autores: Lucila Ludmila Paula Gutierrez1, Alexandre Maslinkiewicz, Rui Curi, e
Paulo Ivo Homem de Bittencourt Jr.
XXI
ABSTRACT
Atherosclerosis is a leading cause of death in the world. Disruption of the intracellular
lipid balance, which leads to cholesterol accumulation is one of the features of cells
that participate of the development of atherosclerotic lesions. Evidence form our
laboratory indicates that cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs), particularly
PGA
2
, deviate lipid metabolism from the synthesis of cholesterol and cholesteryl
esters to the synthesis of phospholipids in foam cell macrophages. Moreover,
CP-PGs are powerful anti-inflammatory agents by directly inhibiting nuclear factor
NF-κB, and indirectly through the activation of heat shock protein (HSP) pathway,
which, in turn, confers cytoprotection. The combined effect of such alterations is that
PGA
2
dramatically reduces cholesterol contents in foam cell macrophages, thus
reversing its phenotype to that of a normal cell. Hence, and since atherogenesis and
lipid accumulation by macrophages are related with dysfunctions in the ability of
regulating lipid synthesis and export, the aim of this study was to investigate the
mechanism of action of PGA
2
on the activity and expression of enzymes related to
cholesterol metabolism, namely, acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase
(ACAT) and 3-hidroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMG-CoA
reductase). The possibility that the effects of this CP-PG were modulated by
alterations in the intracellular redox status and expression of proteins related to the
initiation and development of atheromatous lesions in macrophages was also
investigated. We found that, although PGA
2
did inhibit ACAT activity in foam cell
macrophages, the same was not true for normal macrophages. However, PGA
2
showed a powerful inhibitory effect of HMG-CoA reductase activity but not in the
expression of both protein or mRNA. The data obtained with PGA
2
, which is an
electrophilic agent, were mimicked and potentialized by certain maneuvers that alter
intracellular glutathione (GSH) and glutathione disulphide (GSSG) contents and were
confirmed by the expression of proteins whose specific transcription factors are
XXII
redox-sensitive, such as HSP70 (via HSFs), MRP1 (via Nrf2/Keap1) and iNOS (via
NF-κB). The results indicate CP-PGs as a new class of hypocholesterolemic drugs
by virtue of their capacity to modulate intracellular redox status.
1
1. INTRODUÇÃO
A homeostase intracelular do colesterol é sustentada, em células de
mamíferos, através de uma intrincada série de mecanismos que levam ao
preciso balanço entre o input (síntese de novo de lipídios a partir do acetil-CoA
e captação a partir de lipoproteínas) e o output (efluxo) de colesterol pelas
células (Goldstein & Brown, 1990). Por outro lado, a ruptura deste balanço
intracelular levando ao acúmulo de colesterol é uma das principais
características observadas nas células que participam do desenvolvimento de
doenças, como a lesão aterosclerótica (Goldstein & Brown, 1977; Ross, 1995).
A aterosclerose é o principal contribuinte de patogêneses como infarto cerebral
e miocárdico, gangrena e perda de funções das extremidades; por este motivo,
é uma doença mundialmente estudada (Moreno & Mitjavila, 2003).
Apesar de desbalanços no metabolismo lipídico em geral serem
características marcantes do processo de aterosclerose e de que a
hiperlipidemia esteja fortemente associada ao desenvolvimento da doença, o
mecanismo pelo qual as células participantes da lesão acumulam lipídios
permanece por ser esclarecido. Uma notável exceção é constituída pelas
lipoproteínas de baixa densidade (LDL) oxidadas que sabidamente estimulam a
formação de foam cells (Schmitz et al, 1991; Gesquière et al, 1997), enquanto
que lipoproteínas de alta densidade (HDL) oxidadas impedem o efluxo de
colesterol a partir das células (Gross & Wolin, 1995) comprometendo o
transporte reverso do colesterol ao fígado, favorecendo, portanto, o acúmulo de
colesterol na periferia extra-hepática (Goldstein & Brown, 1990). Entretanto,
pouco se sabe sobre o papel da lipogênese e sua regulação para o
estabelecimento da aterosclerose. Da mesma forma, uma deficiente
capacidade de exportação de lipídios para o meio extracelular pode levar ao
acúmulo de colesterol e ésteres de colesterol em células envolvidas na
aterogênese. Contudo, a participação do processo de extrusão de lipídios para
a homeostase do colesterol não é sabida. A presença de cisteínas reativas em
fatores de transcrição gênica e enzimas-chave do metabolismo lipídico podem
favorecer, ou não, o acúmulo de colesterol intracelular logo, é possível que o
estado redox celular influencie no metabolismo do colesterol e, assim, auxiliem
na progressão da doença vascular (Gutierrez et al, 2007).
2
Assim, a proposta deste trabalho baseia-se no estudo dos efeitos de
prostaglandinas ciclopentenônicas, que são eletrofílicas e se ligam a cisteínas
reativas, e no estado redox celular sobre outros processos envolvidos no
acúmulo de lipídios por macrófagos peritoneais, que não a excessiva captação
por receptores de scavenger.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2 .1- Da homesostase do colesterol até a aterosclerose
O colesterol é fisiologicamente imprescindível ao organismo, uma vez
que a partir dele são formadas substâncias importantes para a sobrevivência
dos seres, como os hormônios esteróides, a vitamina D, os ácidos biliares e as
lipoproteínas (Goldstein & Brown, 1990). Além disto, o colesterol faz parte da
bicamada lipídica das membranas celulares (Stryer, 1996). Entretanto, a
hipercolesterolemia é um dos principais fatores que podem levar à
aterosclerose.
Existem dois tipos de transporte de colesterol que ocorrem no corpo
humano: o transporte direto - em que o colesterol é transportado do fígado para
os tecidos, nas VLDL, IDL e LDL (lipoproteínas de muito baixa densidade,
lipoproteínas de densidade intermediária e lipoproteínas de baixa densidade,
respectivamente) – e o transporte reverso – em que o colesterol é transportado
dos tecidos para o fígado, nas HDL (lipoproteínas de alta densidade). As HDL
captam colesterol de células da periferia extra-hepática, de quilomicrons
remanescentes e de VLDL remanescentes (IDL) e o esterificam com o auxílio
de uma enzima plasmática associada às partículas de LDL, a LCAT (lecitina-
colesterol aciltransferase). Os ésteres de colesterol formados pela ação da
LCAT sobre o colesterol livre e os ácidos graxos provenientes de moléculas de
fosfatidilcolina presentes na própria HDL são, então, transferidos para
partículas de VLDL, IDL e LDL, pela ação de outra enzima plasmática, a
proteína de transferência de ésteres de colesterol (CETP). As IDL e as LDL são
catabolizadas no fígado depois da internalização via receptores de LDL. Por
sua vez, as HDL recebem apoE de VLDL, IDL e LDL e passam a poder
interagir com os receptores hepáticos para LDL e lipoproteínas remanescentes
(Yamashita et al, 2000). Desta maneira, as LDL nativas que circulam pelo
3
sangue, são removidas pelos tecidos para serem utilizadas, ao passo que o
colesterol proveniente de morte e renovação celular, entre outros, vindo dos
tecidos, é carreado pela HDL de volta ao fígado, que é capaz de eliminar o
excesso de colesterol como ácidos biliares ou colesterol biliar. Desta forma, o
hepatócito é responsável por manter este balanço, alterando o fluxo de
colesterol através de sua síntese endógena e da síntese, da secreção e da
captação de lipoproteínas, além da conversão de colesterol em ácidos graxos e
da conversão reversível do excesso de colesterol em ésteres de colesterol
(Ghosh et al, 1998). Claro que este equilíbrio só pode ser mantido até dado
limite fisiológico; uma vez este sendo ultrapassado, tem-se o início de doença
vascular.
A literatura descreve que dietas ricas em ácidos graxos podem
influenciar vários aspectos do metabolismo do colesterol, incluindo a síntese
hepática de lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) e o clearance da
LDL a partir da circulação (Lee & Carr, 2004). Um dos determinantes da
aterosclerose na população parece ser a modificação do estado de equilíbrio
da concentração total de colesterol e triacilglicerol no plasma, uma vez que
dietas ricas destes últimos regulam a concentração de LDL (Xie et al, 2002). A
quantidade de colesterol no hepatócito influencia a secreção de ésteres de
colesterol como componente das lipoproteínas (Ghosh et al, 1998); uma vez
que há o aumento do colesterol, o fígado envia mais colesterol por LDL para a
grande circulação (transporte direto).
A expressão de receptores para LDL é regulada pelo conteúdo
intracelular de colesterol. Quando os tecidos necessitam de maiores
quantidades de colesterol, o número de receptores de LDL aumenta nas
superfícies celulares (up-regulation), aumentando a captação de LDL no
plasma. Ao contrário, quando se tem um aumento de colesterol no sangue,
seja devido à dieta ou a algum tipo de doença, como diabete ou
hipercolesterolemia familiar, as células diminuem o número de receptores na
suas superfícies (down-regulation) para LDL nativas, regulando a produção
interna de substâncias a partir do colesterol (Goldstein & Brown, 1990). O
motivo pelo qual as LDL nativas são modificadas ainda não está esclarecido.
Acredita-se que há uma diminuição do clearance das LDL que, não sendo
utilizadas, envelhecem e se oxidam, provavelmente por espécies ativas de
4
oxigênio formadas a partir do O
2
circulante, além de células endoteliais que
também podem oxidar estas partículas (Goldstein & Brown, 1990; Da Luz,
1996). A peroxidação dos fosfolipídios e da fração protéica destas lipoproteínas
(Steinbrecher et al, 1984) também contribuem para o agravamento do processo
ateromatoso, uma vez que LDL oxidadas são citotóxicas às células endoteliais
(Lyons et al, 1994). Estudos apontam que as células endoteliais são
responsáveis pelo aumento de produção de ânion superóxido em plasma
hipercolesterolêmico e a formação deste radical livre parece estar aumentada
na aterosclerose (Shihabi et al, 2002). Temos, então, um quadro de estresse
oxidativo. O aumento de meia-vida das LDL no plasma deve-se à “saturação”
do sistema de remoção destas partículas que é inibido pelo colesterol
intracelular, cujas concentrações, por sua vez, estão elevadas quando o
indivíduo apresenta hipercolesterolemia, conforme descrito.
Os locais preferenciais para formação de lesões por estresse são as
bifurcações arteriais, que têm o fluxo sanguíneo mais turbulento e que por este
motivo aumentam o estresse do vaso, quando em condições anormais. Temos
como exemplo a aorta, as coronárias, as artérias carótidas, a bifurcação renal e
as artérias cerebrais. Qualquer destas situações leva a um estresse oxidativo
das células endoteliais, ocasionando uma cascata de respostas do organismo,
como forma de manter a homeostase. É interessante lembrar que o estresse
de cisalhamento e a hipercolesterolemia promovem formação de radicais livres,
que podem reagir com a LDL, oxidando-a (Berliner, 2002). Além disso, o
processo de oxidação parece conferir atividade fosfolipase à própria LDL
oxidada (Schmitz et al, 1991) o que explica a geração de lisofosfolipídios
(aumento na hidrólise de fosfolipídios) observado nessas lipoproteínas
(Sparrow et al, 1988). Isso tem uma implicação importante na aterogênese
porque a geração de LDL oxidadas com atividade fosfolipase pelo endotélio
pode ser responsável pelo recrutamento de monócitos à lesão, uma vez que os
lisofosfolipídios produzidos são quimiotáticos para macrófagos (Schmitz et al,
1991). A reação entre o ânion superóxido e o óxido nítrico diminui o
relaxamento dependente do endotélio, processo que também influencia na
formação de aterosclerose (Shihabi et al, 2002).
Devido à injúria ao endotélio nos estágios iniciais da aterogênese, as
células endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metabólica, levando
5
à replicação celular, aumento de permeabilidade para elementos do plasma e
ativação de proteínas do sistema complemento, o que favorece a infiltração de
monócitos (Schmitz et al, 1991). Nas camadas subendoteliais, ocorre a
diferenciação destes monócitos em macrófagos com habilidade de acumular
grandes quantidades de lipídios: as foam cells ou células espumosas, que
recebem este nome devido à morfologia característica que passam a
apresentar. Estas partículas de LDL e as LDL oxidadas são fagocitadas pelos
macrófagos, originando as estrias gordurosas e dando início à placa de
ateroma (Da Luz et al, 1996). Foam cells acumulam grandes quantidades de
colesterol e ésteres de colesterol que ficam constantemente sendo submetidos
a um ciclo de hidrólise e reesterificação até que o excesso de colesterol possa
ser secretado ou utilizado para síntese de membranas (Brown & Goldstein,
1983; Brown et al, 1980; Rosenfeld et al, 1991). Uma das características
destes macrófagos é a capacidade das foam cells de captar e degradar
lipoproteínas de baixa densidade (LDL) modificadas, promovendo sua oxidação
e gerando produtos com alta capacidade oxidativa (oxiesteróis) (Rosenfeld
et al, 1991; Bansal et al, 2001). Ainda, a formação de macrófagos/foam cells
pode afetar a estabilidade da placa de ateroma, podendo levar a ruptura do
vaso ou a trombose coronariana (Escary et al, 1998).
Desta forma, quando estas circunstâncias se instalam cronicamente, o
organismo responde ao dano de forma continuada, levando a uma resposta
imune sustentada e à formação da placa de ateroma. Assim sendo, a
aterosclerose é tida, atualmente, como uma doença inflamatória da parede
vascular (Alexander, 1995; Wick et al, 1995), com resolução disfuncional
(Lawrence & Gilroy, 2007).
2.2- Metabolismo lipídico do macrófago e seu papel central na
aterogênese
Macrófagos são espécies celulares que produzem e exportam grandes
quantidades de lipídios, como colesterol, ácidos graxos, ésteres de colesterol,
triacilgliceróis e fosfolipídios para o meio extracelular (Homem de Bittencourt Jr.
et al, 1993). Também transferem ácidos graxos para outras células, como
linfócitos (Garcia Jr. et al, 2001) e estão implicados como mediadores da
proliferação destes últimos (Nishiyama-Naruke & Curi, 2000). Assim,
6
macrófagos são células imunoinflamatórias caracterizadas por metabolismo
energético, oxidativo e lipídico extremamente ativos. Muitas funções do
macrófago dependem de sua composição lipídica, como a percepção e
transdução de sinais, a fagocitose, a síntese de lipídios oxidados e outros
mediadores inflamatórios, como os eicosanóides (Oliveros et al, 2004). Ainda, a
lipogênese é necessária para a rápida proliferação de células e está
estabelecido que a biossíntese de lipídios precede o início da divisão celular
(Homem de Bittencourt Jr. et al, 1994). Uma vez que as células que compõem
o sistema imune humano, como o macrófago, devem ter a capacidade de
proliferação frente ao dano tecidual, a capacidade de lipogênese passa a ser
essencial.
Entretanto, esta capacidade de produção e exportação de colesterol do
macrófago vem sendo muito estudada, porque um desbalanço na produção e
exportação deste lipídio pode levar a aterosclerose (Kisilevsky & Pang Tam,
2003). Um dos maiores marcadores de aterosclerose é justamente o acúmulo
de colesterol intra e extracelular (Wang et al, 2005). Embora seja possível que
a gênese do processo aterosclerótico dê-se pela ativação imunológica de
monócitos, sabe-se que estes são recrutados pela lesão inicial já existente e lá
passam a exercer efeitos sobre as demais populações celulares envolvidas.
Estas células aparecem em um estágio precoce do desenvolvimento da lesão
aterosclerótica e persistem durante toda a sua evolução, indicando que são
células-chave neste processo patológico (Jessup et al, 2002). Além de sua
ação citotóxica no sítio aterogênico, macrófagos promovem recrutamento e
ativação de outros tipos celulares, sendo responsáveis diretos pela indução de
proliferação das células circunjacentes (Sunderkötter et al, 1994; Garcia et al,
2001), acumulam colesterol, são mediadores da resposta imune e fonte de
secreção de enzimas e fatores de crescimento (Jessup et al, 2002). Muitos
desses efeitos são mediados por moléculas de adesão da matriz extracelular
que mantêm a integridade estrutural e funcionalidade do endotélio. Além do
suporte mecânico, fazem ligação entre elementos fibrosos extracelulares e
estruturas intracelulares, contribuindo para as propriedades viscoelásticas,
regulando a permeabilidade e a retenção dos componentes do plasma. O
rompimento desta integridade está implicado na gênese inicial da aterosclerose
(Srinivasan et al, 1991).
7
A aderência de macrófagos à matriz extracelular de células endoteliais
modula a adesão, a produção de superóxidos, o colesterol oxidado e o estado
de ativação geral de macrófagos (Gudewicz & Frewin, 1991; Jang et al, 1993;
Gudewicz et al, 1994).
Macrófagos expostos a LDL oxidadas produzem citocinas que induzem
nas células endoteliais a expressão de receptores (ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1,
integrinas, caderinas) para moléculas de adesão da matriz extracelular
(fibronectina, laminina, trombosposina, α-actina) envolvidas com o
endereçamento de outras células imunológicas e de plaquetas para a lesão
endotelial (Frostegård et al, 1993; Aznar-Salatti et al, 1991). O estresse
oxidativo e a formação de radicais livres também estão implicados na
expressão de moléculas de adesão, como por exemplo o VCAM-1, que é
expresso quando o estado redox das células endoteliais é modificado (Marui et
al, 1993; Alexander, 1995). Macrófagos ainda interferem no metabolismo
lipídico de células endoteliais e secretam fatores como oncostatina M, as
interleucinas IL-1 e IL-6 e TGFβ-1 que são capazes de aumentar a expressão
de receptores de LDL nas células-alvo (Grove et al, 1991). Ainda, a captação e
metabolização de LDL por células endoteliais, que leva a um aumento de
colesterol intracelular, tem sido apontada como fator de diminuição de fluidez
nas membranas destas células, além de facilitar a adesão de macrófagos à
superfície do endotélio (Pritchard & Schwarz, 1991).
Assim, as lesões ateroscleróticas começam como estrias gordurosas
resultantes do recrutamento de monócitos circulantes do sangue para a parede
arterial, que se diferenciam em macrófagos e começam a acumular colesterol
proveniente de lipoproteínas ricas em éster de colesterol modificados. São
nestas células que, nos estágios iniciais da doença, o colesterol em excesso é
depositado como éster de colesterol. Sabe-se que o colesterol das lesões
ateroscleróticas é predominantemente derivado de lipoproteínas séricas, como
a LDL. Esta última consiste de um centro hidrofóbico que contém éster de
colesterol e triglicerídios e apolipoproteína B-100 (apoB-100) (Wang et al,
2005).
As lipoproteínas são internalizadas por macrófagos, via endocitose
mediada por receptor ou fagocitose (Skoczynska, 2005). O componente apoB-
100 da LDL é reconhecido por receptores de fenda revestida por clatrina
8
(Brown & Goldstein, 1985). Embora os mecanismos pelas quais a LDL
constitua-se em uma partícula pró-aterogência não estejam totalmente
elucidados, há evidências de que a modificação oxidativa da mesma, dentro ou
fora das artérias, é uma etapa importante, senão obrigatória, na aterogênese.
De acordo com a literatura, macrófagos internalizam LDL oxidadas através de
sua ligação com muitos tipos de receptores, entre eles os receptores
scavengers. Um destes é o receptor CD36, uma glicoproteína de membrana
expressa por células endoteliais, adipócitos, células da musculatura lisa e
esquelética, cardiomiócitos, plaquetas, monócitos e macrófagos. O CD36, que
é um receptor scavenger de classe B (assim como o SR-BI, segundo Dhaliwal
& Steinbrecher, 1999) reconhece e liga-se a vários ligantes, como a LDL
oxidada, ácidos graxos de cadeia longa, colágeno, células apoptóticas,
fosfolipídios aniônicos, entre outros. Este receptor scavenger está envolvido em
vários processos, como na resposta imune, remoção de células apoptóticas e
no transporte de ácidos graxos de cadeia longa, além da aterosclerose
(Kuliczkowska-Plaksej et al, 2006). É a captação desregulada das formas
modificadas de LDL via receptores scavenger, como receptores scavenger da
classe A (SR-A) tipo I (SR-AI)e II (SR-AII), que leva ao desenvolvimento de
macrófagos/foam cells. Este tipo celular contém massivas quantidades de
inclusões de ésteres de colesterol citoplasmáticas (Ghosh et al, 2003; Linton &
Fazio, 2003). Além dos receptores citados, outras proteínas, como
CD68/macrosialina, LOX-1 (do inglês, lecitin-like oxidized LDL receptor) e
SREC (do inglês, scavenger receptor expressed by endothelial cells) também
são consideradas scavenger, sendo característica de todos estes receptores
possuírem afinidade a vários ligantes (Dhaliwal & Steinbrecher, 1999). Células
da musculatura lisa vascular apresentam os mesmos receptores de remoção
encontrados em macrófagos, e células endoteliais são igualmente capazes de
internalizar LDL (Raines & Ross, 1993), mas por receptores scavenger
diferentes daqueles encontrados em macrófagos/foam cells (Bickel & Freeman,
1992). LDL modificadas, apesar de eficientemente internalizadas, são pouco
metabolizadas por macrófagos, levando a um aumento nas concentrações
intracelulares de colesterol livre (Roma et al., 1992). Além disso, as LDL
oxidadas representam a maior fonte de colesterol para macrófagos de lesões
ateromatosas (Steinberg et al., 1989; Skoczynska, 2005). Uma vez formadas
9
pela endocitose mediada por receptores, as vesículas com LDL se fundem com
endossomos cujo pH interno é de aproximadamente 5. Sob estas condições, a
LDL dissocia-se de seus receptores, que voltam à superfície celular. Então, o
endossomo contendo LDL se funde com um lisossomo, local em que a apoB-
100 é degradada em aminoácidos e os ésteres de colesterol são hidrolisados,
gerando colesterol e ácidos graxos (Voet et al, 2002). Os triacilgliceróis e
ésteres de colesterol associados à lipoproteína são hidrolisados por colesteril-
éster hidrolases ácidas (nos lisossomos), formando ácidos graxos e colesterol
livre; este último é transferido para o citosol (Belkner et al, 2000; Wang et al,
2005; Skoczynska, 2005). No citossol, a acil CoA: colesterol acil transferase
(ACAT) reesterifica o colesterol livre e ácidos graxos de cadeia longa
(Pramfalk, C. et al, 2005) e o resultado é que este colesterol pode ser estocado
como gotas lipídicas citosólicas (Belkner et al, 2000). O colesterol livre também
pode ser estocado na membrana celular (Ru Su et al, 2005), sendo constituinte
desta última (Natarajan et al, 1999).
Se, por um lado, o excesso de colesterol deve ser evitado, por outro, a
quantidade de colesterol deve ser suficiente para que todas as ações
fisiológicas dependentes deste último sejam executadas (como exemplo a
formação de hormônios esteróides e a bile). Logo, a colesterogênese é
essencial para a sobrevivência celular, não só pela produção de esteróis, entre
outros, mas também devido à produção de intermediários isoprenóides não-
esteróis, como pirofosfato de farnesil e de geranilgeranil, que são necessários
na sinalização intracelular que medeia a proliferação e diferenciação das
células (Basso et al, 2006). Assim sendo, outra enzima que passa a ter um
papel ativo na regulação da concentração de colesterol intracelular é a 3-
hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase), enzima microssomal
chave da síntese de colesterol e isoprenoides. A HMG-CoA redutase também é
regulada pela disponibilidade de colesterol proveniente do LDL e por produtos
finais de esteróis e não-esteróis, como pirofosfato de farnesil (Correl &
Edwards, 1994), podendo ser ativada ou inativada, e até mesmo degradada, a
partir dos níveis de colesterol intracelular (Brown & Glodstein, 1999), conforme
demonstrado na Figura 1 (Gutierrez et al, 2007). Está provado que a inibição
desta enzima é efetiva em diminuir os níveis de colesterol total do plasma, da
LDL e de triglicerídeos em humanos, de modo que as estatinas, classe
10
farmacológica de inibidores da HMG-CoA redutase, são utilizados no
tratamento da aterosclerose (Argmann et al, 2005).
Portanto, três processos passam a estar envolvidos na manutenção do
balanço homeostático entre o colesterol livre (forma que pode ser exportada da
célula) e os ésteres de colesterol (forma de armazenamento intracelular): a
esterificação do excesso de colesterol livre pela acil CoA: colesterol acil
transferase (ACAT) (citosólica), a hidrólise de ésteres de colesterol pelas
colesteril-éster hidrolases (CEH) ácidas (lipossomal) e neutras (citosólicas) e a
síntese endógena do colesterol pela HMG-CoA redutase, (Belkner et al, 2000;
Correl & Edwards, 1994). Estas rotas metabólicas envolvidas no balanço
intracelular do colesterol podem ser visualizadas na Figura 1, conforme descrito
por Gutierrez e colaboradores (2007).
11
Figura 1: Rotas metabólicas envolvidas no balanço intracelular do
colesterol. Sinais de menos e mais nas flechas mais finas indicam inibição e
estimulação de expressão gênica, respectivamente. Sinais nas flechas mais
grossas representam a influência direta na atividade das enzimas ou nos
fatores de transcrição, segundo Gutierrez e colaboradores, 2007.
A ACAT é uma enzima integral presente no retículo endoplasmático
rugoso (Lee & Carr, 2004), mais especificamente na membrana desta organela
(Guo et la, 2005). Existem dois genes que regulam a expressão de duas
12
diferentes isoformas da ACAT (ACAT1 e ACAT2), que foram clonadas em
mamíferos. Em humanos, a ACAT1 é expressa na maioria dos tecidos,
incluindo hepatócitos, células da pele, células de Kupffer, enterócitos e
macrófagos (Pramfalk et al, 2005; Ru Su et al, 2005), além de estar presente
em células produtoras de hormônios esteróides, neurônios, túbulos renais,
pituitária, glândula prostática e outros (Sakashita et al, 2000). A ACAT2 é
expressa em células da mucosa intestinal (intestino delgado) e hepatócitos
(Pramfalk et al, 2005; Ru Su et al, 2005). A ACAT1 tem seu sítio ativo orientado
para o citosol e sua função é evitar que excesso de colesterol seja adicionado à
membrana celular. Em contraste, a ACAT2 tem seu sitio ativo voltado para o
lúmen do retículo endoplasmático, sugerindo que esta enzima está envolvida
na síntese e secreção de lipoproteínas hepáticas e na absorção de colesterol
no intestino delgado (Lee & Carr, 2004). A ACAT1 é uma proteína de
membrana integral com múltiplos domínios transmembrana e com quatro
subunidades idênticas (Lu et al, 2002). Recentes pesquisas indicaram que a
ACAT1 possui dois distintos sítios de ligação de esteróis: um sítio de ligação de
substrato e um sítio ativado alostericamente (Liu et al, 2005), sendo que a
ACAT pode ser ativada alostericamente pelo colesterol (Wang et al, 2005).
Entretanto, as bases moleculares do alosterismo da ACAT são desconhecidas
(Lu et al, 2002). Liu e colaboradores (2005) demonstraram que, na ACAT1, a
estereoquímica do grupo 3-OH no anel esteróide A é a estrutura crítica para um
esterol servir como substrato, mas menos crítico para a ativação da enzima.
Estes autores referem que o colesterol enantiomérico, que possui as mesmas
propriedades biofísicas como colesterol nas membranas, falha em ativar a
ACAT1. Assim, a ativação da ACAT1 pelo colesterol é o resultado de
interações estéreo-específicas entre o colesterol e a ACAT1, e não está
relacionada com as propriedades biofísicas dos fosfolipídios de membrana.
Além disso, o referido grupo de pesquisa demonstrou que a ativação da ACAT
se dá não pelo aumento da quantidade de enzima, mas em parte devido ao
aumento da quantidade de colesterol no retículo endoplasmático onde a
ACAT1 está (Liu et al, 2005). Guo e colaboradores (2005) descreveram que a
ACAT1 humana contém nove resíduos de cisteínas, sendo que a cisteína 92
está localizada para o lado citoplasmático da membrana do retículo
endoplasmático e seu dissulfeto está localizado no lúmen desta organela,
13
enquanto todas as outras cisteínas livres estão voltadas para as regiões
hidrofóbicas desta enzima. Assim, estes pesquisadores propuseram que vários
resíduos de cisteína devem constituir parte da região de ligação de substrato
da ACAT.
A CEH, por sua vez, como descrito anteriormente, é uma enzima que
converte os ésteres de colesterol em colesterol livre quando os níveis destes
últimos estão baixos. Entre as várias CEH presentes nas células, a CEH neutra
(citossólica) é a enzima chave necessária para a manutenção da quantidade
adequada de colesterol livre a partir de ésteres de colesterol estocados
intracelularmente. Assim, esta enzima está envolvida na regulação dos níveis
de colesterol livre celular (Grogan et al, 1991). Respondendo à quantidade de
colesterol livre intracelular, a CEH neutra é regulada de modo semelhante a
HMG-CoA redutase e de modo oposto à ACAT (Grogan et al, 1991; Natarajan,
et al, 1999). A regulação da a CEH neutra no fígado ocorre principalmente por
transcrição e por hormônios (Ghosh et al, 1998). A síntese aumentada de
ácidos biliares aumenta a atividade e o RNAm da CEH hepática (Natarajan et
al, 1999). Desta forma, o aumento da expressão de CEH em hepatócitos
humanos resulta em aumento significativo da síntese de ácidos biliares,
demonstrando que esta enzima pode regular a síntese de ácidos biliares e
assim remover o colesterol da circulação
(Zhao et al, 2005). É sabido que a
expressão do gene da CEH neutra de hepatócitos de ratos é regulada por
glicocorticóides, tiroxina e agentes que possam perturbar o metabolismo do
colesterol. Foram identificados elementos responsivos para esteróis (SRE -92 e
SRE -160) e um possível sítio de ligação ao fator nuclear-Y (NF-Y) no promotor
da CEH. Resultados indicam que o gene da CEH possui duas unidades
responsivas a glicocorticóides em porções distais do promotor, assim como
possíveis elementos de resposta a hormônios da tireóide (Natarajan et al,
1999). Os hormônios da tireóide diminuem os níveis séricos de colesterol e
esta diminuição está correlacionada com o aumento de secreção biliar de
colesterol (Ghosh et al, 1998). Os elementos responsivos aos esteróis estão
localizados muito próximos a outros ligantes de fatores de transcrição, o que
aparentemente é essencial para a regulação ótima destes genes sensíveis aos
esteróis. Por exemplo, promotores dos SREs de LDLR, acetil-CoA carboxilase
e da enzima ácido graxo sintase requerem seqüências de Sp1 para que ocorra
14
a resposta aos esteróis (Natarajan et al, 1999). A atividade da CEH tem
mostrado sensibilidade a estímulo hormonal de testículos, corpo lúteo, aorta e
do córtex da adrenal (Ghosh et al, 1998). Gandarias e colaboradores (1984)
demonstraram o aumento de colesterol hepático em resposta a uma única
injeção de estradiol, resultando em diminuição da CEH neutra. Este mesmo
grupo de pesquisa, em 1986, demonstrou uma diminuição da CEH neutra pela
progesterona. Além disto, também está descrito que a prostaciclina (PGI
2
)
estimula a atividade da colesteril éster hidrolase ácida e neutra (Morishita et al,
1990). A lipase ácida lisossomal/ CEH ácida é essencial para a degradação
intracelular de ésteres de colesterol e triacilgligeróis que são endereçados aos
lisossomos pela endocitose de LDL mediada por receptores (Groener et al,
2000). Esta enzima é sintetizada por todas as células, exceto por eritrócitos, e
hidrolisa ésteres de colesterol e trigliceridios contidos em partículas de LDL
endocitadas em colesterol, di e monogliceridios e acidos graxos livres (Lohse et
al, 1997). Um grupo de cisteínas é encontrado nas posições 227, 236 e 244, de
forma conservada na família de genes de lípases ácidas de mamíferos, onde a
lipase ácida lisossomal/ CEH ácida está incluída (Pagani et al, 1997). A lipase
ácida lisossomal/ CEH ácida contém seis resíduos de cisteínas na proteína
madura (Lohse et al, 1997), nas posições 41, 188, 227, 236, 240 e 244 e uma
cisteína adicional no aminoácido 27 no N-terminal (Pagani et al, 1997).
Finalmente, a HMG-CoA redutase, em sua rota bioquímica, produz
numerosas moléculas sinalizadoras bioativas, incluindo oxiesteróis, entre
outros, que geram eventos transcricionais e pós-transcricionais, afetando vários
processos biológicos (Argmann et al, 2005). Esta enzima é regulada em
múltiplos níveis, incluindo a transcrição gênica (Engelking et al, 2005),
degradação protéica (Brown & Glodstein, 1999), fosforilação protéica
(Omkumar, 1984) e estado redox (Roitelman & Shechter, 1989), o que faz a
HMG-CoA redutase ser considerada uma das enzimas mais precisamente e
intrincadamente regulada (Gutierrez et al, 2007). Esta enzima contém múltiplos
domínios transmembrana, que a ancoram na membrana do reticulo
endoplasmático (Correl & Edwards, 1994), estando presente no retículo
endoplasmático e ocorrendo tanto na forma fosforilada inativa, quanto na não-
fosforilada (ativa) (Brown & Goldstein, 1976).
15
Os níveis de colesterol regulam sua própria biossíntese, conforme
descrito anteriormente, apesar dos mecanismos envolvidos ainda serem
apenas parcialmente compreendidos. Um dos principais fatores que
influenciam no conteúdo total de colesterol e ésteres de colesterol nas células e
também em hepatócitos é a dieta, que é capaz de alterar a composição lipídica
das células e aumentar a disponibilidade de LDL (Oliveros et al, 2004). De um
modo geral, uma alta ingestão de colesterol da dieta leva a uma redução global
na produção endógena, enquanto que uma ingestão reduzida leva ao efeito
oposto. Um aumento de colesterol intracelular pode reprimir a expressão de
enzimas da sua sintese endógena, assim como de receptores de LDL (Brown &
Goldstein, 1990), até dado limite fisológico. Estas rotas metabólicas podem ser
visualizadas na Figura 1.
Um dos principais mecanismos regulatórios da síntese do colesterol
ocorre pela proteína de ligação ao elemento de resposta a esterol (SREBP),
presente no retículo endoplasmático. Na presença do colesterol, a SREBP se
liga a outras duas proteínas: Scap (do inglês, SREBP-cleavage activating
protein) e Insig-1 (do inglês, insulin-induced genes-1). Quando os níveis de
colesterol caem, a Insig-1 se dissocia do complexo SREBP-Scap, permitindo
que o complexo migre para o aparelho de Golgi, onde a SREBP é clivada pela
Sp1 e Sp2 (site 1/2 protease), duas enzimas que são ativadas pela Scap
quando os níveis de colesterol estão baixos. Então, a SREBP clivada migra
para o núcleo e age como um fator de transcrição para se ligar ao elemento
regulatório de esterol (SRE) de diversos genes para estimular sua transcrição.
Entre os genes transcritos estão o receptor LDL e o HMG-CoA redutase. O
primeiro procura por LDL circulante na corrente sanguínea, ao passo que o
HMG-CoA redutase leva a uma produção endógena aumentada de colesterol
(Smith et al, 2005; Engelking et al, 2005).
Não surpreendentemente, a HMG-CoA redutase é negativamente
regulada por fosforilação via 5’- proteína quinase dependente de monofosfato
de adenosina (AMPK), que é considerada a quinase “sensível à energia”
celular (Kanellis et al, 2006). A AMPK responde a modificações na relação
AMP/ATP durante a privação metabólica, situações de hipoxia e a baixa
relação de insulina/glucagon, que sinaliza situações fisiológicas de déficit de
energia (jejum) (conforme Figura 1) (Kim & Novak, 2007). A HMG-CoA
16
redutase é fosforilada e inativada pela AMPK (Clarke & Hardie, 1990), que fica
ativa quando os níveis de ATP são depletados, diminuindo a síntese de
colesterol e preservando o estoque energético da célula (Sato et al, 1993).
Ainda, a fosforilação por AMPK ou o tratamento de macrófagos da linhagem
U937 com inibidores da HMG-CoA redutase (como as estatinas), prejudica a
quimiotaxia e a migração destas células (Kanellis et al, 2006), o que reforça a
importância do envolvimento da rota bioquímica do mevalonato para a função
celular na aterosclerose (Gutierrez et al, 2007).
Em estágios avançados da aterosclerose, os lisossomos se tornam o
maior sítio de acúmulo lipídico. Isto ocorre porque a hidrólise do colesterol
ocorre conjuntamente com sua transferência para a membrana. Quando os
níveis de colesterol na membrana plasmática ficam baixos, ocorre a hidrólise
dos ésteres de colesterol. Quando os níveis de aceptores de colesterol na
membrana aproximam-se da saturação ou quando a exportação de colesterol é
bloqueada, o colesterol é reesterificado em endossomos (Wang et al, 2005).
A apoptose de macrófagos ocorre em todos os estágios da
aterosclerose. Em lesões iniciais, onde o clearance fogocítico de células mortas
parece ser eficiente, a apoptose de macrófagos parece estar associada com a
diminuição da celularidade e diminuição da progressão da lesão. Em lesões
avançadas, no entanto, grande número de fatores contribuem para um
clearance fagocítico defeituoso em macrófagos apoptóticos, levando a uma
necrose secundária e a uma reposta pró-inflamatória. O efeito cumulativo desta
lesão tardia é a formação de centro necrótico que, em acordo com os efeitos
pró-aterogênicos gerados pelos macrófagos residuais sobreviventes,
promovem mais inflamação, instabilidade plaquetária e trombose (Tabas,
2005). Os ésteres de colesterol e colesterol, provenientes da apoptose de
macrófagos, ficam libertos na lesão, representando o centro lipídico ou
necrótico que ocorre em lesões em aterosclerose avançadas (Skoczynska,
2005). Então, em resumo, as lesões ateroscleróticas se dividem em três
estágios: a disfunção do endotélio vascular, a formação de estrias gordurosas e
a formação de cápsula fibrosa (Moreno & Mitjavila, 2003).
A partir do exposto, duas principais alternativas são relatadas, na
literatura, para a prevenção desta doença. A primeira é o mecanismo pelo qual
o colesterol é sintetizado, distribuído e levado por macrófagos e a segunda é o
17
processo pelo qual estas células exportam o colesterol. O maior objetivo do
tratamento da prevenção da aterosclerose é regular o balanço entre a
síntese/captação de colesterol pelos macrófagos e sua exportação, de modo a
limitar a quantidade de colesterol intracelular.
Desta maneira, o atual foco do meio científico está nas atividades das
enzimas e receptores envolvidos neste processo, como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA redutase), enzima envolvida na
síntese de colesterol; a LDL e os receptores scavenger, envolvidos no influxo
de colesterol nas células; a ACAT, que esterifica o colesterol, fazendo com que
este fique estocado na célula e a CEH, que forma colesterol livre, que pode ser
exportado (Kisilevsky & Pang Tam, 2003). A saída de colesterol da célula é
controlada pela mobilização de éster de colesterol estocado através da
desesterificação (pela ação de colesterol éster hidrolases ácidas e neutras,
lisossomais e citoplasmáticas, respectivamente), pelo transporte do colesterol
livre formado através da membrana celular (por transportadores como ABCA1
ou pela difusão não-específica do efluxo do colesterol, segundo Yokoyama,
2006) e pela presença de quantidade adequada de aceptores extracelulares
plasmáticos de colesterol, como a apolipoproteína A-I (apoA-I), HDL e albumina
(Belkner et al, 2000; Leventhal et al, 2001; Kisilevsky & Pang Tam, 2003).
Com base nas evidências apresentadas, a migração de monócitos e sua
diferenciação em foam cells constituem-se eventos críticos na formação da
lesão aterosclerótica. Entretanto, o mecanismo que leva à diferenciação de
monócitos em foam cells da lesão ateromatosa e a possibilidade de que
desbalanços na captação, na estocagem, na síntese de novo e no efluxo do
colesterol possam contribuir para esta diferenciação e, portanto, para o
desenvolvimento da aterosclerose, são aspectos ainda não bem esclarecidos,
embora a literatura já descreva que alterações, mesmo discretas, neste
delicado balanço bioquímico, geram acúmulo de colesterol e aterogênese.
2.3- Exportação de lipídios, sinalizações intracelulares e ativação
metabólica por prostaglandinas ciclopentenônicas
Uma das primeiras respostas da parede arterial a estímulos
nocivos/aterogênicos (como hiperlipidemia e hipertensão arterial) é a produção
de autacóides derivados do endotélio, como prostaglandinas (PGs),
18
especialmente a prostaciclina (PGI
2
) e o óxido nítrico (NO) (Schmitz et al.,
1991). Protaglandinas são uma família de ácidos graxos com 20 carbonos
cíclicos que ocorrem naturalmente no organismo e que são sintetizados a partir
do ácido araquidônico ou outros ácidos graxos provenientes de fosfolipídios da
membrana celular pela ação de fosfolipases. O aracdonato é primeiramente
transformado em um endoperóxidointermediário instável pela cicloxigenase
(COX) e subseqüentemente convertido em um de vários produtos, incluindo
PGD
2
, PGE
2
e PGF
2α
, através da ação de muitas PG sintases (Piva et al,
2005). Se, por um lado estes compostos estão implicados na defesa e
manutenção da quiescência da parede vascular, evidências sugerem que
deficiências na produção de PGs e NO possam estar envolvidas no
estabelecimento da aterosclerose (Gross & Wolin, 1995; Harrison, 1997; Michel
& Feron, 1997).
O NO é um mediador de diversos processos fisiológicos e patológicos,
incluindo a inflamação, sendo produzido pela óxido nítrico sintase (NOS), que
catalisa a conversão de L- arginina para NO e L-citrulina. A enzima NOS existe
em três isoformas: neuronal (nNOS), induzível (iNOS) e endotelial (eNOS). Em
muitos tecidos ocorre a expressão de uma ou mais dessas isoformas. A nNOS
e a eNOS são expressas constitutivamente e sua atividade é regulada pela
concentração intracelular de cálcio (Dröge, 2002). A iNOS é estimulada pela
combinação de IFN- λ, TNF - α, IL - β (Niess, 2000), isto é, quando ocorre
inflamação. A isoforma iNOS tem sua expressão induzida nos macrófagos após
a estimulação por citocinas, lipopolissacarídeos (LPS), e outros agentes
imunológicos relevantes.
A inibição local do NO pode acelerar a formação da placa de ateroma,
modulando o recrutamento de monócitos. A redução do relaxamento arterial é
conseqüência da inibição do NO e não devido à ação da PGI
2
, um fator
vasodilatador dependente do endotélio. Ainda, o NO reduz a ativação de
células endoteliais e inibe a adesão de macrófagos por reprimir a expressão do
gene da VCAM-1 e a ação pró-inflamatória das citocinas. Estes achados
sugerem que o NO apresenta propriedades antiaterogênicas e antiinflamatórias
(Da Luz et al, 1996).
Outro fator envolvido na redução do relaxamento arterial pode ser
dependente da produção aumentada de radicais livres nos vasos acometidos.
19
Sabe-se que o ânion superóxido pode ser responsável pela inativação do NO
(Da Luz et al, 1996). O superóxido pode reagir diretamente com o NO,
inativando-o e formando nitratos com atividade biológica reduzida, ou ainda,
formando o radical peroxinitrito que é um subproduto tóxico fortemente
oxidante, além de inativar diretamente a guanililciclase no endotélio (Laurindo &
Da Luz, 1995).
Altos níveis de estresse de cisalhamento (shear stress), aumento na
produção de interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose tumoral (TNFα) derivados
de macrófagos, ativadores da proteína quinase C (PKC), bem como o estresse
oxidativo na parede arterial (provocado pela hipertensão arterial ou pela
hipercolesterolemia) levam à ativação do fator transcripcional NF-κB que
dispara a transcrição de uma grande variedade de genes tanto nas células
endoteliais quanto nas células musculares lisas. O NF-κB pertence à família
Rel e é peça integrante do controle da inflamação e da resposta imune inata
(Piva et al, 2006). Este fator de transcrição normalmente existe como um
complexo inativo citoplasmático, cuja forma predominante é um heterodímero
composto pelas subunidades p50 e p65 (RelA) ligadas a uma proteína inibitória
da família das IκBs. A indução do NF-κB requer a ativação do complexo IκB,
contendo duas subunidades catalíticas (IKKα e IKKβ) e a subunidade
regulatória IKKγ, que fosforila a IκB, fazendo com que o NF-κB fique livre para
atravessar a membrana nuclear. Esta translocação do NF-κB permite que ele
se ligue ao DNA em sítios específicos e induza a transcrição de uma variedade
de genes (Piva et al, 2005).
Quando o NF-κB é ativado, ele precipita, nos macrófagos, a transcrição
de fatores de crescimento, citocinas, moléculas de adesão intercelulares e
fatores de transcrição relacionados ao processo de proliferação celular
(Griendling & Alexander, 1996; Colins et al., 1995; Resnik & Gimbrone, 1995),
estando inclusive, mais recentemente, implicado em muitos aspectos da
oncogênese, migração, progressão do ciclo celular e apoptose (Piva et al,
2006). Assim sendo, moléculas de adesão, como VCAM-1, podem ser
expressas recrutando macrófagos. Estes formarão as foam cells que,
juntamente com outros acontecimentos celulares, vão gerar um quadro
inflamatório e, desta forma, mais macrófagos serão recrutados, mais moléculas
20
de adesão serão expressas e a lesão inicial vai aumentando, devido à
exacerbação da resposta imune por dano continuado, conforme descrito
anteriormente. Decorre desta ativação toda uma transformação celular que
modifica os fenótipos quiescentes das células vasculares transformando-as em
células ativadas com características sintetizantes e proliferativas, alterações
tipicamente encontradas na aterosclerose e doença vascular hipertensiva
(Belló-Klein et al, 2001). Assim, a ativação do NF-κB mediada pelo estresse
celular desempenha papel primordial no desenvolvimento da aterosclerose
iniciada, quer por dislipidemias, quer por outros processos agressivos ao
endotélio, como hipertensão arterial.
O NO, além de seus efeitos hemodinâmicos já bem estabelecidos
(Griendling & Alexander, 1996), induz citoproteção vascular através do bloqueio
exercido sobre as vias de ativação do NF-κB (Xu et al., 1997). Foi observado
que esta citoproteção dá-se através da ativação da via metabólica das
proteínas de choque térmico (HSP). As HSP funcionam como chaperonas e
são chamadas de proteínas de choque térmico (do inglês, heat shock proteins)
por serem sintetizadas em grandes quantidades quando as células são
expostas a temperaturas elevadas (42°C). Chaperonas moleculares são
proteínas que ajudam na formação correta das proteínas, sendo responsáveis
pela síntese, dobramento e degradação protéica (Pockley, 2001).
Várias proteínas de choque térmico funcionam como chaperonas
moleculares, isto é, proteínas que “acompanham” outras proteínas de um
compartimento celular a outro ou até que cheguem a seus destinos fisiológicos
(núcleo, membranas, mitocôndrias, etc). A função chaperona das HSP está
relacionada a sua propriedade de impedir dobramentos indesejáveis e a
desnaturação das proteínas celulares, motivo pelo qual, estas HSP apresentam
efeito citoprotetor (Fehrenbach, 2000) .
Nas células eucarióticas, tanto a família HSP60 quanto a HSP70
possuem afinidade pelas regiões hidrofóbicas expostas por proteínas com um
dobramento incorreto, de forma que estas proteínas de choque térmico se
ligam às proteínas não nativas e através da hidrólise de ATP, modificam a
estrutura protéica, dando a oportunidade de um novo dobramento (Roberts et
al, 1994). Por ter essa função na estabilização protéica, as HSP participam de
uma variedade de processos fisiológicos celulares como controle do ciclo
21
celular, regulação do estado redox celular e apresentação de antígenos (Füst
et al, 2005).
As HSP pertencem a uma classe de proteínas altamente conservadas
filogeneticamente (Watson, 2003), podendo ser agrupadas em famílias de
acordo com suas seqüências de aminoácidos e com seus pesos moleculares,
em kDa (Meyer & Silva, 1999).
Nas células, a família das HSP70 apresentam-se em duas formas:
HSC70 (do inglês, Heat Shock Cognates) e HSP70 induzível. A HSC (73 kDa)
é expressa constitutivamente, ou seja, independe das condições de estresse,
portanto, também ocorre nas células em repouso (Meyer & Silva, 1999). Já a
HSP70 (72 kDa) é induzida por diversos agentes como aumento de
temperatura, estresse oxidativo, depleção de energia celular, concentrações
iônicas extremas, gases e várias substâncias tóxicas (Feder & Hofmann, 1999).
As situações estressantes causam dobramento incorreto ou agregação
protéica, fazendo com que ocorra uma resposta de indução de um fator de
trancrição para proteínas de choque térmico, HSF (do inglês, Heat Shock
Factor), para restabelecer o balanço entre síntese, arranjo e desagregação
protéica. Quatro HSFs foram identificados em vertebrados, sendo o HSF1 o
principal HSF envolvido na resposta fisiológica e ambiental ao estresse
(Todryk et al., 2003). Em estado de repouso, esse fator de transcrição está
presente no citoplasma na forma latente de molécula monomérica que não se
liga ao DNA. Em condições de estresse, HSF é fosforilada tornando-se ativa,
ou seja, capaz de se ligar ao DNA. A regulação da transcrição do gene da HSP
é mediada pela interação do HSF com HSE (do inglês, Heat Shock Element)
nas regiões promotoras do gene de proteínas de choque térmico (Pockley,
2001).
A resposta da HSP ao estresse é somente transiente, pois o
prolongamento e inapropriada presença de moléculas protéicas ligantes
poderiam influenciar adversamente na homeostase protéica e numa variedade
de funções intracelulares. Um mecanismo pelo qual a atividade da HSF1 é
regulada negativamente, ocorre pela ligação da HSP70 ao domínio de
transativação deste fator, o que resulta na repressão do gene de transcrição
das proteínas de choque térmico, pois com o aumento da síntese de HSP,
estas se deslocam para o núcleo, ligando-se ao domínio ativador de transcrição
22
dos HSF1 e reprimindo o processo de transcrição de genes HSP (Santoro et al,
2000).
Macrófagos, que, como discutido acima, ocupam papel de destaque
na iniciação e no desenvolvimento da lesão aterosclerótica, são produtores de
grandes quantidades de PGE
2
e seu isômero, a PGD
2
(Scott et al, 1982; Urade
et al, 1989). Estas prostaglandinas, por sua vez, podem ser transformadas
facilmente no plasma in vivo em PGA
2
e Δ
12
-PGJ
2
e seus J-derivados (Ohno et
al, 1986; Narumiya & Fukushima, 1985; Kikawa et al, 1984; Fitzpatrick &
Wynalda, 1983) que, juntos, são conhecidos como prostaglandinas
ciclopentenônicas (CP-PGs). Assim, as prostaglandinas das séries A e J são
originadas pela desidratação do anel ciclopentano da PGE e PGD,
respectivamente, que produzem uma estrutura ciclopentenônica caracterizada
pela presença de uma carbonila α,β- insaturada (Piva et al, 2005). A Figura 2
mostra estas estruturas, conforme descrito por Gutierrez e colaboradores
(2007).
23
Figura 2: Metabolismo do ácido araquidônico e formação das prostaglandinas
ciclopentenônicas (família das PGA
2
e PGJ
2
), conforme descrito por Gutierrez e
colaboradores (2007).
O anel ciclopentenônico possui dois centros eletrofílicos e por este
motivo, fica muito susceptível a reações de adição nucleofílica, conferindo às
CP-PGs alta capacidade de interação e sendo indispensável para a ação
biológica destas moléculas. São estes centros o grupo carbonil α,β- insaturado
e o carbono da cetona presente no anel, estruturas estas que se encontram em
ressonância (Atsmon et al, 1990; Chen et al, 1999, Straus & Glass, 2001;
Solomons, 2002). Estes compostos reagem rapidamente com cisteínas e
grupamentos tiol pertencentes a diversas moléculas, como glutationa e
proteínas celulares, por adição de Michael (adição nucleofílica na insaturação
24
entre os carbonos α,β, segundo Solomons, 2002), fato este descrito em muitos
estudos (Atsmon et al, 1990; Chen et al, 1999; Straus & Glass, 2001; Bickley et
al, 2004; Musiek et al, 2005). Os centros eletrofílicos, a ressonância, os
ataques nucleofílicos e a adição de Michael estão demonstrados nas Figuras 3,
4, 5 e 6, respectivamente (Solomons, 2002).
Figura 3: Centros eletrofìlicos de um anel ciclopentenônico (uma carbonila α,β-
insaturada e a carbonila da cetona), segundo Solomons (2002).
Figura 4: Ressonância que ocorre entre os centros eletrofìlicos de um anel
ciclopentenônico, conforme Solomons (2002).
Figura 5: Ação de nucleófilos em centros eletrofílicos de um anel
ciclopentenônico (Solomons, 2002).
25
Figura 6: Adição de Michael (Solomons, 2002).
As prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs) são ativadores
universais da via das HSP (Amici et al, 1992; Rossi & Santoro, 1995) e levam a
citoproteção através da inibição dos mecanismos de ativação do NF-κB numa
série de tipos celulares já estudados, incluindo células musculares lisas dos
vasos (Rossi et al, 1997; Wong et al, 1997; Kim et al, 1997; Nagoshi et al,
1998; Feinstein et al, 1996). Essas prostaglandinas (PGs) têm sua produção
relacionada com a resistência celular ao estresse (atividade citoprotetora) e
têm efeito antiproliferativo contra replicação viral e vários tipos de câncer
(Homem de Bittencourt Jr. et al, 1998c; Homem de Bittencourt Jr. & Curi,
2001).
Na verdade, as CP-PGs bloqueiam a ativação do NF-κB através de, pelo
menos um mecanismo conhecido: a inibição da I-κB quinase, enzima que
precipita a ativação deste fator nuclear (Rossi et al, 2000). Assim, o NO e
certas prostaglandinas ativam a via das HSP que desliga a ativação do NF-κB
promovendo citoproteção.
Desta forma, é possível que as PGs e o NO compartilhem outros
mecanismos intracelulares comuns durante o dano celular, ao lado do já bem
estabelecido sinergismo observado durante a inflamação, onde o NO produzido
26
pela NO sintase induzível (iNOS) aumenta a atividade da cicloxigenase-2
(COX-2) que produz PGs no sítio inflamatório (Isakson et al, 1995).
Outro fator que parece estar envolvido no desenvolvimento da
aterosclerose é o PPAR (do inglês, peroxisome proliferator-activated receptor),
que são receptores nucleares que regulam a expressão de genes controlando
o metabolismo lipídico e da glicose. Apesar de três isoformas do PPAR já
terem sido descritas (α, β e δ), a identificação de seus ligantes naturais
permanece controvertida (Bell-Parikh et al, 2003). PPAR-α são ativados por
derivados de ácidos graxos e eicosanóides, sendo expressos em fígado,
coração, músculo e rim, além de estar presente na parede vascular (células da
musculatura lisa e endotélio) e em células como monócitos, macrófagos e
macrófagos/ foam cells. Nestes últimos, o PPAR-α diminui a esterificação do
colesterol por inibir a ACAT, induz a expressão do gene do ABCA1 e promove
o efluxo do colesterol mediado por apoAI (Chinetti et al, 2003). O PPAR-γ, por
sua vez, é um fator de transcrição que regula o metabolismo lipídico e
lipoprotéico, a homeostase da glicose e a inflamação (Duval et al, 2002),
também estando implicado na obesidade, diabetes, reposta imune,
envelhecimento e aterosclerose (Na & Surh, 2003) e sendo expresso
predominantemente em tecido adiposo, cólon e macrófagos e em menor
extensão, em células musculares lisas da vasculatura (Bell-Parikh et al, 2003).
Além disto, três elementos responsivos a PPAR foram identificados no gene da
CEH em macrófagos humanos, nas posições -176, -179 e -1316. Uma
diminuição da atividade do promotor do gene da CEH foi observada na
presença de ligantes específicos de PPAR-α e de PPAR-γ e a introdução de
uma mutação no PPAR a -176 aboliu completamente o efeito de ligantes do
PPAR na atividade do promotor. Assim, viu-se que a CEH humana também é
regulada por PPAR (Ghosh & Natarajan, 2001). Ainda, o PPAR-γ aumenta a
expressão de dois genes envolvidos na síntese de cholesterol, da HMG-CoA
sintase e da HMG-CoA reductase em macrófagos, além de aumentar a
atividade desta última enzima, aumentando a quantidade de colesterol
intracelular (Iida et al, 2002).
Foi demonstrado que LDL oxidadas induzem a expressão (Ricote et al,
1998) e ativação (Tontonoz et al, 1998; Nagy et al, 1998) do fator nuclear
27
PPAR-γ, tendo a camada íntima das células musculares lisas, maiores níveis
presentes que a camada média (Bishop-Bailey et al, 2002). O PPAR-γ pode ser
ativado por um grande número de ligantes, como eicosanóides e produtos da
cicloxigenase, como PGI
2
, PGD
2
, 15-desoxi-Δ
12,14
- PGJ
2
e LDL oxidada. Ainda,
o PPAR-γ é expresso pela vasculatura, monócitos, macrófagos e linfócitos T
auxiliares, estando comprovadamente presente em lesões ateroscleróticas
(Bishop-Bailey et al, 2002). O PPAR-γ ativa a transcrição do gene do receptor
scavenger CD36 (Iida et al, 2002), que estimula a captação de mais LDL
oxidadas por macrófagos (Boullier et al, 2002), fazendo com que estas células
se diferenciem em foam cells e exacerbando o processo aterosclerótico.
Estudos demonstram que o estresse oxidativo aumenta a expressão do
receptor CD36 (Fuhrman et al, 2002) e que sua expressão está aumentada na
placa aterosclerótica e no tecido vascular lesado (Kuliczkowska- Plaksej et al,
2006).
As prostaglandinas podem ser os moduladores fisiológicos do processo
de produção e exportação de lipídios em linfócitos e células tumorais (Homem
de Bittencourt Jr. et al, 1994). Além disso, a prostaciclina (PGI
2
), interfere no
metabolismo lipídico de pré-adipócitos elevando a expressão de glicerol-3-
fosfato desidrogenase e conseqüente acúmulo de triacilgliceróis nestas células
(Vassaux et al, 1992a, 1992b), enquanto que CP-PGs são os ligantes
fisiológicos do fator de transcrição nuclear PPAR-γ que leva à diferenciação de
adipócitos, com profunda influência sobre o metabolismo lipídico destas células
(Forman et al, 1995; Kliewer et al, 1995). Somente a PGJ ativa o PPAR-γ e isto
tem profunda importância farmacológica. As prostaglandinas J, especialmente
a 15-desóxi-Δ
12,14
-prostaglandina J
2
, causam anti-proliferação, apoptose,
diferenciação e tem ação anti-inflamatória em certos tipos de células
cancerígenas. Seus efeitos anti-inflamatórios estão relacionados com a
supressão da expressão de genes que levam a produção da inflamação, via
inativação do fator transcripcional NF-κB. Além disto, a 15-desóxi-Δ
12,14
-
prostaglandina J
2
induziu a expressão de enzimas responsivas ao estresse, o
que pode conferir resistência celular ou adaptação ao estresse oxidativo (Na &
Surh, 2003). A participação do fator de diferenciação de adipócitos PPAR-γ
(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) no
28
desenvolvimento da lesão aterosclerótica passou a receber extrema atenção
depois que foi observado que sua expressão e ativação estão estimuladas em
lesões ateroscleróticas humanas (Ricote et al, 1998a).
Sabe-se que as LDL oxidadas contêm altas concentrações de derivados
lipídicos oxidados, como o 9- e 13-HODE (ácido hidróxi-ocatadecadienóico),
que são metabólitos do ácido linoléico e são ativadores diretos do PPAR-γ e de
sua expressão gênica (Nagy et al, 1998). Por sua vez, a ativação do PPAR-γ
em macrófagos leva à expressão do receptor de scavenger CD36 em
macrófagos (Figura 7), diferenciando-os em macrófagos/ foam cells (Tontonoz
et al, 1998). Assim, a ativação do fator de transcrição nuclear PPAR-γ induz a
um ciclo que perpetua a lesão aterosclerótica (Figura 8, segundo Tontonoz e
colaboradores, 1998), já que componentes das LDL oxidadas ativam este fator
que desencadeia a expressão de receptores de scavenger para a
internalização de mais e mais moléculas de LDL oxidadas contendo mais
ativadores do PPAR-γ.
Figura 7: Expressão do receptor scavenger CD36/FAT em macrófagos por
ativação do PPAR-γ, segundo Tontonoz e colaboradores (1998).
29
Figura 8: Ativação do fator nuclear PPAR-γ e ciclo que perpetua a lesão
aterosclerótica, segundo Tontonoz e colaboradores (1998).
Embora as CP-PGs da família da prostaglandina J
2
sejam ativadoras e
ligantes fisiológicos do PPAR-γ podendo ter algum papel no desenvolvimento
da aterosclerose, CP-PGs da família da PGA
2
não levam à ativação deste fator
nuclear (Forman et al, 1995). Ao contrário, resultados sugerem que as
prostaglandinas da família da PGA
2
sejam citoprotetoras e redutoras das
concentrações intracelulares de colesterol (Senna et al, 1998; Homem de
Bittencourt Jr. et al, 2007). As CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de
induzir citoproteção através da ativação da via metabólica das HSP, que induz
inibição do NF-κB, o que inibe os efeitos citotóxicos decorrentes da ativação
deste fator transcripcional. Foi observado que a PGA
2
e o doador de óxido
30
nítrico SNAP (S-nitroso-N-acetilpenicilamina) reduzem sensivelmente a
lipogênese de macrófagos. É interessante, ainda, que este efeito seja mais
exacerbado em macrófagos inflamatórios, como aqueles encontrados na lesão
ateromatosa.
As CP-PGs provocam um desvio no metabolismo lipídico de macrófagos
inflamatórios no sentido da produção de fosfolipídios. Isto acarreta uma grande
diminuição no acúmulo de colesterol, ésteres de colesterol e ácidos graxos por
estas células. Homem de Bittencourt Jr. e colaboradores (2007) mostraram que
o tratamento de foam cells in vitro com PGA
2
fez com que estas células
voltassem a ser como macrófagos não inflamatórios (Figura 9). Neste estudo,
observou-se que quando macrófagos/ foam cells se encontravam em meio com
colesterol e éster de colesterol radioativos e PGA
2
, havia uma inibição da
incorporação de colesterol e éster de colesterol exógeno, assim como da via de
biotransformação intracelular destes dois lipídios. Ainda, todo o acetil-CoA
presente nos macrófagos inflamatórios, em presença de PGA
2
(segundo
Homem de Bittencourt Jr. et al, 2007), utilizam estes substrato para produção
de fosfolipídios e não para formação intracelular de colesterol, conforme mostra
a Figura 9 (Gutierrez et al, 2007). É interessante lembrar que é a partir de
fosfolipídios que as prostaglandinas são formadas. Apesar dos resultados
obtidos mostrarem a influência da PGA
2
em macrófagos/ foam cells, o
mecanismo pelo qual seu metabolismo está alterado não é conhecido assim
como também não é conhecido em macrófagos residentes.
31
Figura 9: Efeitos das CP-PGs no metabolismo do colesterol (Gutierrez et
al, 2007).
Homem de Bittencourt Jr. e colaboradores (2007) verificaram que a via
que esterifica o colesterol e que transforma os ésteres de colesterol em
colesterol novamente está diminuída em macrófagos inflamatórios, o que
sugere uma diminuição da atividade ou expressão da ACAT e da ACEH/NCEH.
Ainda, a síntese endógena do colesterol pelos macrófagos/foam cells está
diminuída, sugerindo que também aja uma diminuição da atividade ou
expressão da HMG-CoA redutase, enzima chave na formação desta substância
(Figura 9). Entretanto, nenhum destes efeitos foi estudado em macrófagos
peritoneais e macrófagos/ foam cells. Finalmente, as CP-PGs sempre
apresentam efeitos biológicos dependentes da expressão de HSP. Sendo
assim, não se pode descartar a possibilidade de que a indução de HSP possa
influenciar nas alterações observadas.
2.4- Estado redox celular e sua importância na aterosclerose
O dano infligido por radicais livres em alvos celulares e extracelulares,
como as membranas lipídicas, proteínas e DNA claramente contribuem para a
disfunção dos órgãos e tecidos em muitas patologias (Shihabi et al, 2002).
É sabido que o balanço entre oxidantes e antioxidantes é crítico para
função das células, pois isto mantém a integridade e a funcionalidade da
membrana celular, das proteínas celulares e dos ácidos nucléicos, além de ser
essencial no controle da transdução de sinal e expressão gênica. As células
imunológicas são particularmente sensíveis ao estresse oxidativo devido à
grande porcentagem de ácidos graxos polinsaturados existentes em suas
membranas plasmáticas e à grande produção de espécies ativas de oxigênio,
que fazem parte de suas funções normais. Assim sendo, a concentração de
glutationa (GSH) intracelular é essencial para impedir a ação de radicais livres
e regular o metabolismo lipídico do macrófago (Oliveros et al, 2004).
Outro passo essencial para a lipogênese das células envolvidas na
aterosclerose é a geração de NADPH para a síntese de lipídios. A NADPH
oxidase é a maior fonte de formação de espécies ativas de oxigênio de células
vasculares em cultura, embora a xantina oxidase, a óxido nítrico sintase, a
citocromo P450 e a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial também
32
sejam importantes fontes de espécies ativas de oxigênio em dadas
circunstâncias. As enzimas geradoras de NADPH para a lipogênese em
macrófagos/ foam cells são a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e
enzima málica (malato desidrogenase dependente de NADP
+
). A geração de
força redutora para a lipogênese (NADPH) é fundamental para a fisiologia de
macrófagos, células endoteliais e células musculares lisas vasculares, e a
razão NADPH/ NADP
+
(força redutora para a lipogênese) depende do balanço
redox intracelular (Shihabi et al, 2002).
As espécies reativas de oxigênio, formadas, na maioria dos casos, por
agentes genotóxicos exógenos (irradiação, citocinas inflamatórias e
carcinógenos), são elementos desencadeadores das alterações do potencial
redox. As EAO e o potencial redox alterado podem ser considerados como as
mudanças intracelulares primárias que regulam proteínas quinase, servindo,
deste modo, como importantes componentes celulares de ligação entre o
estímulo externo e o sinal de transdução na resposta ao estresse (Adler et al,
1999). Em contraste à noção convencional de que as EAO sejam
primordialmente um gatilho para o dano oxidativo das estruturas biológicas,
está o fato de que, em baixas concentrações (fisiológicas), estas possam
regular uma série de mecanismos moleculares que podem estar ligados a
importantes funções celulares (Sen, 2000).
Assim, o potencial redox, sustentado pela relação entre a glutationa
(GSH) e o dissulfeto de glutationa (GSSG), tem a função de regular a
expressão de genes detoxificantes, sendo finamente regulado nas células sob
condições normais. Nestas condições, a extrusão de GSH e de conjugados de
GSH (GS-conjugados), para fora das células compõe parte do sistema GSH de
defesa celular contra EAO. A redução de hidroperóxidos pela enzima glutationa
peroxidase (GPx) produz GSSG, o qual é transportado através da membrana
celular por intermédio de uma ATPase específica para GS-conjugados
(Akerboom & Sies, 1994). A magnitude da resposta a estímulos fisiológicos,
suficientemente intensos para disparar a sinalização redox sob condições não
tóxicas, no entanto, ainda não é conhecida.
Pesquisas indicam que prostaglandinas podem modular o estado redox
celular através do metabolismo da GSH, afetando a lipogênese de macrófagos
(Homem de Bittencourt Jr. & Curi, 1998; Homem de Bittencourt Jr. et al, 1998a;
33
1998b; 1998c; Senna et al, 1998; Homem de Bittencourt Jr. & Curi, 2001,
Gutierrez et al, 2007). A natureza reativa das CP-PGs conferida pela presença
do grupamento carbonila α,β- insaturado e pela presença da cetona no anel,
que caracterizam estas moléculas, dão sustento à hipótese de sua participação
no estado redox celular e na patogênese de injúrias oxidativas. Como
mencionado anteriormente, as CP-PGs inibem a proliferação celular por sua
habilidade de modular uma variedade grande de genes relacionados com o
crescimento celular e genes induzidos por estresse, induzir apoptose em altas
concentrações e ativar o PPAR-γ (Ricote et al, 1998b). O grupamento carbonila
α,β- insaturado parece ser essencial para muitas destas ações biológicas.
Desde 1968, segundo Boyland & Chasseaud, está descrito que a glutationa é
capaz de reagir com compostos α,β- insaturados, reação esta que pode ser
catalisada por vários tipos de enzimas. A PGA
2
é rapidamente conjugada com
a glutationa pela ação da glutationa-S-transferase, produzindo um GS-
conjugado, diferente da 12- PGJ
2
, que não requer esta catálise para ligar-se
rapidamente à glutationa (Chen et al, 1999). Estes autores demonstraram que
a conjugação das CP-PGs com a glutationa impediu que ocorresse inibição da
proliferação celular e a indução de apoptose por parte das CP-PGs (estas
ações podem ser visualizadas na Figura 10, conforme proposto por Gutierrez,
et al, 2007).
34
Figura 10: Possíveis reações de Adição de Michael entre CP-PGs e
grupamento tiol da glutationa, segundo Gutierrez e colaboradores, 2007.
35
Desta forma, acredita-se que, além das CP-PGs poderem interferir no
estado redox das células, também possam interferir na atividade das enzimas
ACAT, CEH e HMG-CoA redutase, por estas possuírem grupamentos contendo
cisteínas (Figura 11, segundo Gutierrez et al, 2007). Porém, a conseqüência
disto ainda não é conhecida em toda sua extensão.
Proteína
Proteína
Proteína
Proteína
Figura 11: Possível reação de Adição de Michael entre CP-PGs e
cisteínas reativas de proteínas, segundo Gutierrez e colaboradores, 2007.
Ainda, a presença da ATPase de membrana MRP1/bomba GS-X (MRP,
do inglês, Multidrug Resistance-Associated Protein), que exporta GS-
conjugados para o espaço extracelular, pode estar modificada pela presença
de prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs). Em condições normais, a
reação da GST encontra-se próxima do equilíbrio químico sob as condições
fisiológicas do meio intracelular. Porém, em presença de CP-PGs a
MRP1/bomba GS-X desloca o equilíbrio para a direita, no sentido da formação
de mais GS-conjugados, o que impede o acúmulo de eletrófilos, como as
CP-PGs. Logo, a ausência, ou baixa atividade da MRP1/bomba GSX favorece
o acúmulo destas CP-PGs (Homem de Bittencourt Jr. & Curi, 2001), o que
provavelmente modifica o estado redox celular. A baixa expressão de MRP (um
transportador de membrana, tais como as proteínas de multi-resistência a
drogas - MRP, do inglês multidrug resistance-associated protein) está
associada à baixa expressão da γ-GCS (γ- glutamil cisteína sintetase), enzima-
chave de regulação da síntese de GSH, o que poderia sugerir participação da
MRP na regulação da GSH. Porém apesar de o mRNA da γ-GCS apresentar
co-expressão com as MRP-1 e MRP-2, a expressão dos dois genes parece ser
36
controlada independentemente (Kuo et al, 1998). Pouco se sabe sobre a
sinalização envolvida na regulação da MRP, no entanto, alguns fatores
ambientais já foram identificados como reguladores do gene de MRP
(Oosthuizen et al, 2000). Homem de Bittencourt Jr. & Curi, em 2001, sugeriram
que a MRP1, mais do que qualquer outra proteína, é mediadora do transporte
ATP-dependente de S-conjugados de GSH. Uma oxidação aumentada de
GSH, catalisada pela GPx leva à formação aumentada de GSSG, que é um
GS-conjugado e, portanto, substrato para a ATP-dependente MRP/bomba GS-
X, podendo ser exportado pela mesma. Estes resultados sugerem que a
MRP/bomba GS-X possa atuar como moduladora do potencial redox celular ao
exportar os GS-conjugados e regular o balanço entre GSSG e GSH.
A ateroclerose é uma situação de estresse que leva a um desbalanço
redox intracelular, pois macrófagos são capazes de captar LDL oxidadas, o que
leva ao acúmulo de oxiesteróis (colesterol oxidado), podendo modificar o
estado redox celular (Bansal et al, 2001). A presença destes oxiesteróis
prejudica a exportação de colesterol pelo macrófago, sugerindo a ação de
oxiesteróis na manutenção do fenótipo foam cell (Van Reyk & Jessup, 1999).
Os efeitos pró-aterogênicos de LDL oxidadas são atribuídos aos oxiesteróis,
particularmente ao 7β-hidroxicolesterol. Bansal e colaboradores, em 2001,
sugeriram que o 7β-hidroxicolesterol gera estresse oxidativo em macrófagos e
os torna mais suscetíveis aos efeitos pró-aterogênicos por prejudicar o sistema
celular de defesa, que consiste de antioxidantes e de proteínas que respondem
ao estresse, como a HSP 70 (Aviram et al, 2000). Segundo a literatura, o
desequilíbrio redox dá-se tanto pelo aumento de espécies oxidantes, com
conseqüente aumento das concentrações intracelulares de GSSG, quanto pela
depleção não-oxidativa da GSH, através da formação de GS-conjugados.
Nestas situações verifica-se a expressão de HSP, associadas ao estado redox
alterado (Homem de Bittencourt Jr et al, 1998a, b, c). A homeostase do estado
redox intracelular de GSH é finamente regulada para comandar o metabolismo
celular e proteger as células contra o estresse oxidativo.
Além disso, o NF-κB é um fator de transcrição sensível ao estado redox.
Estudos identificaram que uma certa quantidade de GSSG é necessária para a
indução da ativação do NF-κB e da translocação nuclear, enquanto o excesso
37
de GSSG inibe a função do NF-κB em nível da ligação ao DNA (Galter et al,
1994). As etapas sensíveis ao estado redox são comumente dependentes da
natureza do ativador do NF-κB (Janssen-Heininger et al, 2000). Hiperóxia ou
elevações das EAO causam a ubiquinação e destruição das proteínas
inibitórias (I-κB), liberando o NF-κB e permitindo que se ligue aos promotores
dos genes-alvo. Por outro lado, a atividade do NF-κB como ligante do DNA e
fator de transcrição, é inibida por agentes oxidantes e potenciada por tióis
(Mihm et al, 1995). Assim, percebe-se nitidamente que existe um estado redox
"ótimo" abaixo do qual, a ativação do NF-κB diminui e acima do mesmo, a
ativação aumenta, mas sua capacidade de ligação ao DNA diminui (Galter et
al, 1994).
Conforme visto, as interações de lipídios modificados, macrófagos e
macrófagos/ foam cells tem sido muito estudadas; entretanto pouca atenção
tem sido dada ao potencial redox intracelular do macrófago como um
modulador da sua síntese e metabolismo de lipídios e poucos estudos têm esta
abordagem.
2.5- Vistas ao desenvolvimento de uma terapia vascular à base de CP-PGs
Viu-se que CP-PGs da série J são os ativadores fisiológicos do fator de
transcrição nuclear PPAR-γ que leva à diferenciação de adipócitos e
macrófagos, com profunda influência sobre o metabolismo lipídico destas
células (Forman et al, 1995; Kliewer et al, 1995; Ricote et al, 1998b; Tontonoz
et al, 1998; Nagy et al, 1998). Além disto, a 15-deoxi-delta (12,14)-
prostaglandina J
2
induz a expressão de enzimas responsivas ao estresse, o
que pode conferir resistência celular ou adaptação ao estresse oxidativo (Na &
Surh, 2003), conforme descrito anteriormente, mas não é conhecido o efeito da
PGA
2
sobre o estado redox de macrófagos. Entretanto, é possível que exista
uma ligação entre a modulação do metabolismo lipídico por CP-PGs e o estado
redox celular através da supressão das vias efetoras dependentes do NF-κB.
Resultados obtidos com CP-PGs, segundo Homem de Bittencourt Jr. e
colaboradores (2007), podem representar um grande avanço científico, já que
os fármacos e procedimentos utilizados atualmente garantem apenas a
estabilização da placa de ateroma. O efeito das CP-PGs desviando o
38
metabolismo lipídico de macrófagos inflamatórios no sentido da síntese de
fosfolipídios poderá ser explorado clinicamente visando à redução da
lipogênese, em particular, da colesterogênese e produção de ésteres de
colesterol. Por isso, o tratamento com estas substâncias é promissor no sentido
de que se poderá explorar clinicamente o acúmulo de lipídios nos vasos
através de um ponto de vista absolutamente inovador.
A lipogênese em macrófagos é um fenômeno essencial para sua
funcionalidade, já que estas células apresentam uma altíssima taxa de
renovação de membranas (t½ ≈30 min) e intensa produção e secreção de
mediadores lipídicos (Steinman et al, 1983). Entretanto, o efeito de autacóides,
como a CP-PGs, sobre a lipogênese e estado redox de macrófagos nunca foi
investigado e seu estudo poderá esclarecer aspectos críticos do funcionamento
de macrófagos na aterosclerose.
A importância deste estudo justifica-se pelo fato de que a maioria dos
trabalhos referente a interações intercelulares no processo aterogênico leva em
conta apenas os fenômenos ocasionados pela produção de fatores de
crescimento, linfocinas, produtos da matriz extracelular e interações com LDL
modificadas. Apesar de a aterosclerose ser uma síndrome essencialmente de
desbalanço lipídico, pesquisas sobre a participação de lipídios neste processo
normalmente estão relacionadas apenas com evidências epidemiológicas ou
com o metabolismo de lipoproteínas. Portanto, tornou-se mister a investigação
sobre o metabolismo do colesterol para o desenvolvimento da aterosclerose.
Tendo em vista, portanto, que os efeitos das CP-PGs sobre o
metabolismo lipídico de macrófagos podem estar relacionados à ativação da
expressão de HSP e desativação do NF-κB, assim como da expressão de
CD36, iNOS e MRP1, e que o papel das enzimas ACAT (acil CoA:colesterol
aciltransferasel) e HMG-CoA redutase não está elucidado, assim como a ação
das CP-PGs sobre o estado redox celular, foi proposto o estudo do efeito de
CP-PGs da família da prostaglandina A sobre o estado redox e a síntese de
novo de lipídios (lipogênese) em diferentes tipos de macrófagos. Considerando
que os macrófagos são o principal tipo celular desencadeador da
aterosclerose, acreditamos que os resultados desta investigação poderão
auxiliar na compreensão do desenvolvimento desta doença.
39
3. OBJETIVOS
Os resultados de estudos anteriores (Homem de Bittencourt Jr. et al,
2007) mostraram que a PGA
2
tem um efeito benéfico contra o desenvolvimento
da aterosclerose por reduzir dramaticamente a quantidade de colesterol e
ésteres de colesterol em macrófagos/ foam cells. Uma vez que os estudos com
traçadores radioaquímicos indicaram que a PGA
2
bloqueia o fluxo de acetil-
CoA para a síntese de colesterol e ésteres de colesterol, resolveu-se pesquisar
se a PGA
2
possui um efeito inibitório direto sobre a atividade da HMG-CoA
redutase e ACAT em macrófagos peritoneais. Um possível efeito inibitório
sobre a expressão da HMG-CoA redutase, em macrófagos/ foam cells, foi
descartado porque estudos prévios indicaram que a expressão do RNAm
codificado para esta enzima encontra-se inclusive aumentada. Tendo em vista
que a PGA
2
bloqueia a AMPKK, responsável pela ativação da AMPK que, em
última instância, bloqueia a atividade da redutase por fosforilação da enzima,
restou a possibilidade de que a PGA
2
pudesse inibir a atividade HMG-CoA
redutase pela formação de adutos de Michael com as cisteínas reativas Cys
266 (sítio ativo) e Cys 323 (alostérico). Por isso, objetivamos investigar os
efeitos da PGA
2
sobre a atividade da redutase em macrófagos peritoneais
comparando-os com outras alterações no estado redox celular que pudessem
mimetizar seus efeitos. Além disso, como a ACAT também possui uma cisteína
reativa (Cys467) tivemos como objetivo, também, o estudo do efeito da PGA
2
sobre a atividade da mesma também em comparação com várias manobras de
interferência no potencial de redução das células (macrófagos peritoneais e
foam cells, neste caso).
Como objetivos específicos visou-se a estudar:
- A atividade da ACAT, enzima envolvida na síntese de ésteres de
colesterol, em macrófagos/ foam cells em 24h de tratamento com PGA
2
;
- A atividade da ACAT em macrófagos peritoneais em dois tempos
distintos (1h e 24h) de tratamento com PGA
2
, oxidantes (BSO/DEM) e
antioxidantes (NAC);
- O estado redox celular frente a PGA
2
, oxidantes (BSO/DEM) e
antioxidante (NAC) em dois tempos distintos e em duas linhagens celulares
diferentes (macrófagos peritoneais e U937), uma vez que o potencial redox
40
pode ativar cascatas de sinalização e desencadear a ativação de fatores de
transcrição celular;
- A expressão da proteína MRP1, em macrófagos peritoneais em dois
tempos distintos (6h e 24h) de tratamento com PGA
2
, oxidantes (BSO/DEM) e
antioxidantes (NAC), visto que a MRP1 está envolvida no controle redox
intracelular, exportando conjugados eletrofílicos com a glutationa para o meio
extracelular;
- A expressão das proteínas da família HSP70, em macrófagos
peritoneais em dois tempos distintos (6h e 24h) de tratamento com PGA
2
,
oxidantes (BSO/DEM) e antioxidantes (NAC), já que estas proteínas também
são sensíveis a modificações no estado redox celular;
- A expressão das proteínas da família HSP70, em macrófagos/ foam
cells em 24h de tratamento com PGA
2
, pelo mesmo motivo acima exposto;
- A expressão da proteína iNOS, em macrófagos peritoneais em dois
tempos distintos (6h e 24h) de tratamento com PGA
2
, oxidantes (BSO/DEM) e
antioxidantes (NAC), uma vez que modificações no estado redox podem imitar
as condições existentes em células inflamatórias;
- A atividade e a expressão da enzima-chave da síntese de colesterol, a
HMG-CoA redutase, em macrófagos peritoneais, em dois tempos distintos (1h
e 2h para a atividade e 6h e 24h para a expressão da enzima) de tratamento
com PGA
2
, a oxidantes (BSO/DEM) e antioxidantes (NAC). Resultados
anteriores sugerem que a PGA
2
inibe a atividade da HMG-CoA redutase em
macrófagos/ foam cells, mesmo havendo aumento de RNAm desta enzima
neste tipo celular; no entanto, não era conhecido o que ocorria em macrófagos
residentes;
- A expressão da proteína CD36, um receptor scavenger, em
macrófagos peritoneais em dois tempos distintos (6h e 24h) de tratamento com
PGA
2
, oxidantes (BSO/DEM) e antioxidantes (NAC), sabendo-se que dados
anteriores demonstravam inibição de incorporação de colesterol em
macrófagos/ foam cells.
41
4. METODOLOGIA
4.1 - Animais
Foram utilizados ratos machos Wistar, com peso médio de 250g. Os
animais foram provenientes do Biotério do Instituto de Ciências Básicas da
Saúde (ICBS) da UFRGS, sendo mantidos em caixas plásticas de 270 x 260 x
310mm, com cinco ratos em cada uma, tendo o assoalho recoberto por
serragem. Receberam alimentação comercial padrão para ratos de laboratório
e água ad libitum e foram mantidos sob períodos de 12 horas luz/ 12 horas
escuro (começando o ciclo às 7h da manhã), a uma temperatura de 22°C.
Para os experimentos, os animais foram mortos por decapitação, pois
este método produz mudanças fisiológicas mínimas nos tecidos. Os animais
sempre eram decapitados no período da manhã, para que fosse evitada a ação
do cortisol sobre as células imunológicas estudadas.
4.2- Obtenção de macrófagos peritoneais
Após a decapitação, a obtenção de macrófagos peritoneais ocorreu a
partir de lavado peritoneal, por injeção i.p. de PBS (ver adiante a preparação).
Massageou-se a região do peritônio por 30 segundos e as células residentes
foram retiradas com pipeta através de corte abdominal, conforme descrito em
Homem de Bittencourt Jr. et al. (1993) e Homem de Bittencourt Jr. & Curi
(1998). Doze ratos eram decapitados por vez e os macrófagos obtidos destes
animais eram agrupados.
4.3- Obtenção de macrófagos/ foam cell
O procedimento experimental era o mesmo ocorrido no item anterior.
Após a obtenção do pool de macrófagos peritoneais de ratos, estes eram
tratados com LDL oxidada por 18 horas em cultura, conforme metodologia
consagrada (Frostegard et al, 1993; Roma et al, 1992) formando-se, assim,
macrófagos/ foam cell (Homem de Bittencourt Jr. et al, 2007).
4.4- Obtenção de macrófagos U937
Para o estudo de macrófagos humanos da linhagem U937, estes foram
retirados de criotubos armazenados em nitrogênio líquido e tratados em meio
42
RPMI 1640 com antibiótico (10mL finais) com 20% de soro fetal bovino, em
garrafas específicas para cultura de células, até ficarem confluentes. As células
eram provenientes do Banco de Células do Rio de Janeiro (Cell Bank).
4.5- Hemólise de eritrócitos contaminantes
Para a remoção de eritrócitos contaminantes de preparações de
macrófagos obtidos a partir de peritônio de ratos, as suspensões celulares
brutas foram centrifugadas (2500x g por 10 min) com solução de hemólise (Tris
0,017M e NH4Cl 0,144M) e os precipitados celulares ressuspensos em tampão
PBS, pH 7,4. Este procedimento era repetido até que o precipitado não mais
apresentasse eritrócitos. Assim, o protocolo garante preparações celulares
virtualmente isentas de eritrócitos, prestando-se, portanto, ao estudo acurado
do metabolismo da glutationa, quando hemácias contaminantes representariam
fonte considerável de erro.
4.6- Viabilidade de macrófagos
Após o procedimento inicial descrito acima, em capela de fluxo laminar,
o precipitado contendo macrófagos peritoneais ou U937 era semeado em meio
RPMI 1640 com antibiótico em microplacas de poliestireno (Corning) com 24
micropoços (wells), ficando em estufa de CO
2
a 37ºC por uma hora, que é o
suficiente para as células aderirem à superfície das placas. No entanto, a
exemplo do que acontece in vivo, o processo adesivo leva a profundas
alterações nas características dos macrófagos, o que rapidamente diferencia-
os em células mais ativadas, semelhantes aos macrófagos teciduais
encontrados in vivo (Homem de Bittencourt Jr. et al., 1993; 1994).
Uma amostra desta preparação era utilizada para contagem em câmara
de Newbauer e para determinação da viabilidade celular, que foi feita pelo
método da exclusão do azul Trypan. Este teste indicou sempre uma proporção
maior que 98% de células viáveis. Após 1h e 24h de cultivo nestas condições,
98% dos macrófagos permaneciam viáveis. Era necessário que cada well
contivesse 2x 10
6
células para os experimentos, o que sempre foi obtido.
4.7- Reagentes utilizados no preparo da placa de cultura de macrófagos
peritoneais ou U937 e grupos experimentais
43
Os reagentes utilizados para o preparo da placa de cultura de
macrófagos peritoneais e U937 foram:
a) N- acetil- cisteína (NAC- Sigma A8199) 20mM. Em Eppendorf, pesava-se
16,3mg de NAC e adicionava-se 1mL de meio RPMI 1640, para uso imediato;
b) Dietilmaleato (DEM- ICN Biomedicals Inc 141-05-9) 5mM. Em Eppendorf,
misturava-se 4μL de DEM em 10μL de etanol absoluto.
c) Butionina – [S, R] – sulfoxamina (BSO- Sigma B2515) 2,5μM. Em falcon de
15mL, pesava-se 2,8mg de BSO e adicionava-se com 5mL de meio RPMI
1640; após preparava-se uma solução com a mistura dos 4μL de DEM em
10μL de etanol absoluto com os 5mL de BSO, obtendo-se a solução
BSO/DEM, podendo ser armazenada.
d) Prostaglandina A
2
(PGA
2
- ICN Biomedicals Inc 13345-50-1) 1μM. Em
Eppendorf, pipetava-se 2μL de PGA
2
, secava-se em corrente de nitrogênio e
adicionava-se 20μL de etanol absoluto e 1152μL de meio RPMI 1640.
e) Mistura controle: consistia de uma preparação contendo 20μL de etanol
absoluto e 154μL de meio RPMI 1640.
Os reagentes NAC e BSO/DEM eram filtrados por filtro estéril 0,22μm,
com o auxílio de seringa também estéril.
Após a obtenção dos reagentes, para as análises enzimáticas e do
estado redox, as placas de cultura de células eram preparadas com a
pipetagem dos grupos experimentais nos tempos 1h e 24h de ação dos
reagentes sobre as células. Para avaliação da expressão de proteínas, as
placas de cultura de células eram preparadas com a pipetagem dos grupos
experimentais nos tempos 6h e 24h.
Cada well deveria conter 500μL finais. Assim, os grupos experimentais
foram divididos da seguinte maneira:
• Grupo controle, que consistiu de:
- 340μL da preparação contendo macrófagos peritoneais ou U937;
- 110μL de meio RPMI 1640;
- 10μL da mistura controle ou PGA
2
(1μM);
- 50μL de soro fetal bovino.
• Grupo NAC, que consistiu de:
- 340μL da preparação contendo macrófagos peritoneais ou U937;
44
- 100μL de meio RPMI 1640;
- 10μL da mistura controle ou PGA
2
(1μM);
- 50μL de soro fetal bovino.
• Grupo BSO/DEM, que consistiu de:
- 340μL da preparação contendo macrófagos peritoneais ou U937;
- 80μL de meio RPMI 1640;
- 10μL da mistura controle ou PGA
2
(1μM);
- 50μL de soro fetal bovino.
O procedimento experimental foi o seguinte:
a) Plaquear as células (cerca de 2x10
6
células em 340μL);
b) Pipetar o NAC ou o BSO/DEM;
c) Aguardar 15 minutos;
d) Pipetar a PGA
2
1 μM;
e) Aguardar 15 minutos;
f) Adicionar o soro fetal bovino.
45
A representação esquemática da distribuição experimental em placa de
cultura de células era o seguinte:
Na representação esquemática da distribuição experimental não foi
utilizada a última linha da placa de cultura de células. Todos os grupos
experimentais foram feitos em triplicata. O número de células obtidas por well
era de aproximadamente 2 x10
6
. A placa pronta, então era colocada em estufa
a 37°C, com 5% de CO
2
, para incubação de 1h, 6h ou 24h conforme protocolo
experimental.
Após o período de incubação, as células eram retiradas da placa de
cultura e transferidas para Eppendorfs, centrifugadas e os sobrenadantes eram
aspirados com auxílio de bomba de vácuo, para obtenção de um precipitado
de células. A partir deste momento, era dada a continuidade do experimento
de acordo com o que fosse ser analisado.
BSO/DEM
CONTROLE
PGA
2
1
μ
M
NAC
CONTROLE
Figura 12: Representação esquemática da distribuição experimental de
macrófagos peritoneais ou U937. 1, 2 e 3 A – macrófagos peritoneais ou U937.
Controle em triplicata; 1, 2 e 3 B – macrófagos peritoneais ou U937 Controle+
NAC em triplicata; 1, 2 e 3 C– macrófagos peritoneais ou U937 Controle+
BSO/DEM em triplicata; 4, 5 e 6 A- macrófagos peritoneais ou U937 Controle+
PGA
2
em triplicata; 4, 5 e 6 B- macrófagos peritoneais ou U937 NAC+ PGA
2
em triplicata; 4, 5 e 6 B- macrófagos peritoneais ou U937 BSO+ DEM/PGA
2
em
triplicata. A última linha da placa de cultura não foi utilizada.
500μL finais
por well.
1 2 3 4 5 6
A
B
C
46
4.8- Oxidação de lipoproteína de baixa densidade (LDL)
A formação de macrófagos/ foam cells era feita a partir de incubação de
macrófagos peritoneais com LDL oxidada em meio de cultura, por 18 horas.
Para obtenção de LDL oxidada, os reagentes e materiais utilizados para
esta determinação foram, a saber:
a) LDL em PBS a 1 mg/mL (solução comercial em 150 mM NaCl, pH 7,4,
contendo 0,01% EDTA);
b) Tampão PBS (Phosphate-buffered saline): NaCl 136,8 mM, KCl 2,7 mM,
KH
2
PO
4
0,9 mM e Na
2
HPO
4
6,4 mM em água milliQ, pH 7,4.
c) Meio de cultura RPMI 1640 com antibióticos (Ampicilina e estreptomicina
1:100);
d) Filtros (para seringa) descartáveis, estéreis Ultra-Low Binding PES;
e) Torpedo de N
2
gasoso;
f) BHT (hidroxibutiltolueno, 220,4 g/mol) 500x (10 mM) em etanol;
g) Reagente e padrões de BSA (albumina bovina, diluídos a partir de solução a
1mg/mL) para dosagem de proteínas pelo método de Bradford (ver mais
adiante, no item 4.12 da metodologia);
h) Reagentes para TBARS: BHT (hidroxibutiltolueno 220,4 g/mol) 65 x (29,5
mM) em etanol; TCA 30% (ácido tricloroacético) em água milliQ; TBA 0,73%
(ácido tiobarbitúrico) em água milliQ e Tris-HCl 10 mM pH 7,4. A reação era
feita utilizando-se 50 μl de amostra a cerca de 1 mg/ml, em tubo Eppendorf de
1,5ml com furos na tampa, 200 μl de TCA 30%, 200 μl de Tris-HCl,
centrifugando-se 10min a 2500 x g a 4
o
C e coletando-se 440μl do
sobrenadante. Após, adicionava-se ao sobrenadante 200μl de TBA, 10μl de
BHT, agitavam-se e levavam-se as amostras ao banho-maria a 100
o
C por 1h.
Por fim, as amostras eram lidas a 535nm diretamente contra mistura contendo
50μl de água, 200μl de TCA, 200μl de Tris-HCl, 10μl de BHT e 200μl de TBA
fervido paralelamente (segundo Buege & Aust ,1978 e Draper et al,1993).
i) Sacos de diálise (cut off 100.000 Da), cujas instruções de uso vinham nos
pacotes de fábrica;
j) Lacres plásticos para sacos de diálise;
l) Solução de sulfato de cobre 100x (CuSO
4
.5H
2
O 500 μM em PBS);
47
m) Geladeira ou câmara fria (4°C) com espaço para dialisar grandes volumes.
O procedimento experimental era o seguinte:
Dosavam-se proteínas da amostra de LDL nativa a ser oxidada, pelo
método de Bradford. Conhecidas as quantidades de proteínas nas amostras,
tomava-se do frasco-mãe 1mg de proteína e transferia-se esta quantidade para
um saco de diálise completando o volume para 1mg/mL com PBS. Então,
dialisava-se a amostra contra 1000 volumes de PBS durante 3 horas na
geladeira para remover o EDTA e outros conservantes utilizados nas
preparações comerciais, por duas vezes. Após a diálise, transferia-se a
suspensão de LDL para Eppendorfs e adicionava-se 10 μL de solução de
sulfato de cobre 100x (500 μM) por mL para uma concentração final de 5 μM.
Incubavam-se as amostras a 37
º
C em ar, para promover a oxidação, em
banho-maria com agitação por 3 h. Após a oxidação, parava-se a reação com 2
μL de BHT 500x (10 mM) por mL de suspensão de LDL. Dialisavam-se as
amostras contra 1000 volumes de PBS durante 3 horas para retirar o sulfato de
cobre. Finalmente, dosava-se TBARS em alíquotas de 50 μL (em duplicatas)
tanto da LDL nativa, quanto da oxidada. Após dosagem de TBARS, dialisavam-
se as amostras de LDL nativa e oxidada contra 1000 volumes de meio de
cultura RPMI 1640 com antibióticos e filtrava-se em filtro PES (polietersulfona)
ultra low binding.
Este procedimento foi adaptado de Kohno e colaboradores (2000).
4.9- Reagentes utilizados no preparo da placa de cultura de
macrófagos/foam cells e grupos experimentais
Os reagentes utilizados para o preparo da placa de cultura de
macrófagos/ foam cells foram:
a) LDL oxidada (obtida conforme preparação do item anterior);
b) Prostaglandina A
2
(PGA
2
- ICN- Biomedicals Inc. 13345-50-1) 1μM. Em
Eppendorf, pipetava-se 2μL de PGA
2
, secava-se em corrente de nitrogênio e
adicionava-se 20μL de etanol absoluto e 1152μL de meio RPMI 1640.
c) Prostaglandina A
2
(PGA
2
- ICN- Biomedicals Inc. 13345-50-1) 20μM. Em
Eppendorf, pipetava-se 6μL de PGA
2
, secava-se em corrente de nitrogênio e
adicionava-se 20μL de etanol absoluto e 154μL de meio RPMI 1640.
48
d) Mistura controle: consistia de uma preparação contendo 20μL de etanol
absoluto e 154μL de meio RPMI 1640.
Após a obtenção dos reagentes, as placas de cultura de células eram
preparadas com a pipetagem dos grupos experimentais no tempo de 24h de
ação dos reagentes sobre as células, para análise enzimática e para análise da
expressão de proteínas.
Cada well deveria conter 500μL finais. Assim, os grupos experimentais
foram divididos da seguinte maneira:
• Grupo controle, que consistiu de:
- 435μL de meio RPMI 1640;
- 10μL da mistura controle ou PGA
2
(1μM ou 20μM);
- 50μL de soro fetal bovino;
- 5μM de meio ou LDL oxidada.
• Grupo PGA
2
1
μ
M, que consistiu de:
- 435μL de meio RPMI 1640;
- 10μL da mistura controle ou PGA
2
(1μM);
- 50μL de soro fetal bovino;
- 5μM de meio ou LDL oxidada.
• Grupo PGA
2
20
μ
M, que consistiu de:
- 435μL de meio RPMI 1640;
- 10μL da mistura controle ou PGA
2
(20μM);
- 50μL de soro fetal bovino;
- 5μM de meio ou LDL oxidada.
O procedimento experimental foi o seguinte:
a) Plaquear as células em meio RPMI-1640 (cerca de 2x10
6
células por well);
b) Pipetar mistura controle ou PGA
2
(1μM ou 20μM);
c) Aguardar 15 minutos;
d) Pipetar o soro fetal bovino;
e) Aguardar 15 minutos;
f) Adicionar a LDL oxidada.
49
A representação esquemática da distribuição experimental em placa de
cultura de células era o seguinte:
Na representação esquemática da distribuição experimental todas as
linhas da placa de cultura de células foram utilizadas. Todos os grupos
experimentais foram feitos em quadriplicata. O número de células obtidas por
well era de aproximadamente 2 x10
6
. A placa pronta, então era colocada em
estufa a 37°C, com 5% de CO
2
, para incubação de 24h, conforme protocolo
experimental.
Após o perído de incubação, as células eram retiradas da placa de
cultura e transferidas para Eppendorfs numerados, centrifugadas e os
sobrenadantes eram aspirados com auxílio de bomba de vácuo, para obtenção
LDL oxidada
CONTROLE
PGA
2
1
μ
M
CONTROLE
Figura 13: Representação esquemática da distribuição experimental de
macrófagos peritoneais ou foam cells. 1 e 2 A e 1 e 2 B – macrófagos
peritoneais Controle em quadriplicata; 3 e 4 A e 3 e 4 B – macrófagos
peritoneais Controle+ PGA
2
1μM em quadriplicata; 5 e 6 A e 5 e 6 B –
macrófagos peritoneais Controle+ PGA
2
20μM em quadriplicata; 1 e 2 C e 1 e
2 D – macrófagos/foam cells Controle+ LDL oxidada em quadriplicata; 3 e 4 C
e 3 e 4 D - macrófagos/foam cells PGA
2
1μM+ LDL oxidada em quadriplicata;
5 e 6 C e 5 e 6 D – macrófagos/foam cells PGA
2
20μM+ LDL oxidada em
quadriplicata.
500μL finais
por well.
1 2 3 4 5 6
A
B
C
PGA
2
20
μ
M
D
50
de um precipitado de células. A partir deste momento, era dada a continuidade
do experimento de acordo com o que fosse ser analisado.
4.10- Determinação do conteúdo intracelular de GSH e GSSG e relação
[GSSG/GSH]
A partir da obtenção do precipitado de macrófagos peritoneais ou U937,
após o tratamento proposto, a determinação dos conteúdos intracelulares de
glutationa (GSH) e dissulfeto de glutationa (glutationa "oxidada", GSSG), assim
como sua relação [GSH/GSSG] foi obtida. Para isto, as células (cerca 2 x 10
6
)
foram lavadas com 500μL de tampão PBS (4°C) e imediatamente rompidas em
100 μl de ácido metafosfórico 5% (m/v) com homogeneização por micropipeta
para análise cinético-espectrofotométrica pelo método de reciclagem com o
ácido 5,5'-ditiobis-[2-nitrobenzóico] (=DTNB) e GSSG redutase (GSRd) de
Anderson (1985). A rápida homogeneização das células em meio ácido é um
passo de extrema importância para a inativação das tiol-transferases e γ-
glutamiltranspeptidases responsáveis pela transformação da GSH em outros
derivados peptídicos, levando a subestimativas das concentrações reais do
tripeptídeo. Além disso, a acidificação previne a auto-oxidação da GSH que
ocorre rapidamente em pH superior a 7,0 (Anderson, 1985; Akerboom & Sies,
1981, Carlberg & Mannervik, 1985).
Por outro lado, apesar de a auto-oxidação da GSH em GSSG em meio
ácido ocorrer numa taxa mínima (0,1 a 0,2% por hora), pelo fato de as
concentrações intracelulares de GSSG serem naturalmente muito baixas
(menos de 1% da concentração de GSH), o processamento das amostras para
dosagem de GSSG deve ser efetuado o mais rapidamente possível, a fim de
evitar-se resultados falsamente superiores aos valores reais (Akerboom & Sies,
1981).
Os reagentes utilizados para estas determinações foram, a saber:
a) Tampão fosfato (Na
2
HPO
4
/ NaH
2
PO
4
) 0,2M, pH 7,4;
b) Tampão de ensaio: mistura de EDTA dissódico 6,3mM em 100mL de tampão
fosfato;
c) NEM (N-etilmaleimida): 0,2M em etanol absoluto;
d) KOH (hidróxido de potássio) 2M: 11, 22g em 100mL de água destilda;
51
e) PIPES (ácido piperazina-N,N'-bis-[etanossulfônico]) 0,3M, adicionado em
KOH 2M;
f) MPA (ácido metafosfórico) 5% em água destilada;
g) Tampão PBS (Phosphate-buffered saline): NaCl 136,8 mM, KCl 2,7 mM,
KH
2
PO
4
0,9 mM e Na
2
HPO
4
6,4 mM em água destilada, pH 7,4.
A primeira parte do ensaio consistiu na determinação do conteúdo de
glutationa "total" (GSH+ GSSG) medido em equivalentes de GSH pelo método
da reciclagem com DTNB que leva à oxidação estequiométrica da GSH em
GSSG com formação do ácido 5-tio-2-nitrobenzóico (TNB) e posterior
restituição da GSH pela redução altamente específica com GSSG redutase
(GSRd) na presença de NADPH. A taxa de formação de TNB, proporcional à
soma inicial de GSH e GSSG, foi, então, monitorada a 412 nm (ε
TNB
= 13,6
mM
-1
.cm
-1
). Como a velocidade da reação depende não somente da
concentração inicial de GSH+GSSG, mas, também, da atividade da GSRd,
fatores que interfiram na atividade enzimática, levarão invariavelmente a falsos
resultados. Por isso, além de ter sido utilizada uma curva de calibração (0,5;
1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 nmol) com padrão de GSH preparado a cada ensaio, foram
efetuadas leituras de amostras com adição de padrão, sendo os resultados
obtidos idênticos aos observados para as amostras separadamente. A
incubação foi iniciada pela adição de 10 μl de NADPH (concentração final
0,17 mM) e 75μl de DTNB (final 1,26 mM), ambos em tampão fosfato de sódio
143 mM (pH 7,5), a cerca de 10 μl de amostra (em MPA 5%) num volume final
105 μl em cada well, em placa de ELISA (do inglês, enzyme-linked
immunosorbent assays), com 1 cm de caminho óptico a 37°C, tendo sido
registrada a absorbância a 412 nm em jaqueta termostatizada com aquisição
direta e processamento cinético automático (em espectrofotômetro ligado ao
programa Microtemplate Protocol). Em seguida, foram adicionados 10 μl de
GSRd (atividade final na cubeta de 0,5 U/ml) sob agitação e as amostras foram
analisadas espectrofotometricamente a 412 nm por cerca de 10 min adicionais.
Antes da determinação do conteúdo de GSSG, alíquotas de 50 μl das
mesmas amostras ensaiadas para GSH "total" foram retiradas para conjugação
da GSH presente com N-etil-maleimida (NEM, Fluka) segundo metodologia
descrita em Akerboom & Sies (1981). Foram adicionados, então, 17 μl de NEM
52
0,2M diretamente às amostras dissolvidas em MPA 5%. Depois, a mistura foi
neutralizada, cuidadosamente sob agitação, até pH 5,5 pela adição de 20 μl de
KOH 2M em tampão de ácido piperazina-N,N'-bis-(etanossulfônico) (=PIPES,
Boehringer) 0,3 M. Foi efetuada a extração do excesso de NEM com acetato de
etila, tendo o excesso de solvente sido evaporado em concentrador SpeedVac.
Posteriormente, as amostras foram ensaiadas pelo método da reciclagem,
como descrito para a GSH. As amostras foram inicialmente incubadas com a
GSRd por 5 min a 37°C, tendo sido monitorada a absorbância a 340 nm
(consumo de NADPH) até a estabilização. Depois, foi adicionado o DTNB e as
leituras a 412 nm (produção de TNB) foram acompanhadas
espectrofotometricamente conforme descrito acima. A diferença entre os
valores obtidos para glutationa "total" e GSSG forneceu os valores dos
conteúdos de GSH procurados.
4.11- Quantificação de proteína
Na determinação das concentrações de proteínas nas amostras foi
utilizado o método de Bradford (1976). Como padrão de referência, utilizaram-
se soluções de albumina sérica bovina (BSA) fração V (Sigma). O método de
Bradford, baseado na ligação do Azul Comassie Brilhante G-250 0,01% (m/v)
em meio de ácido fosfórico 8,5% (m/v)-etanol 4,7% (m/v) a proteínas das
amostras, com formação de complexo que absorve intensamente a 595 nm
(BIO-RAD Protein Assay kit, Bio-Rad Laboratories, GmbH, DR), apresenta, na
faixa de algumas dezenas de microgramas de proteína ensaiada, sensibilidade
bastante adequada para os fins experimentais determinados.
4.12- Medida da Atividade da Acil-CoA: Colesterol O-Aciltransferase
(ACAT) em macrófagos peritoneais e macrófagos/ foam cells
A conversão intracelular de colesterol e ácidos graxos em ésteres de
colesterol dá-se por ação da ACAT, enzima que é ativada pela presença de
colesterol exógeno proveniente das LDL internalizadas por receptores de LDL
nativa. Assim, quando macrófagos são pré-incubados com soro deficiente em
lipoproteínas e são cultivados na presença de [
14
C ou
3
H]oleato, observa-se um
expressivo aumento na síntese de [
14
C ou
3
H]oleato de colesterol, que é
proporcional à atividade da ACAT intracelular, segundo Figura 14.
53
ACAT
Colesterol + Oleato [
14
C ou
3
H] → Oleato[
14
C ou
3
H] de colesterol
Figura 14: Ação enzimática da ACAT sobre o colesterol e o oleato marcado.
Este protocolo trata da medida indireta da ACAT através da incubação
de células pré-cultivadas em meio deficiente em lipoproteínas (5%) com [
14
C ou
3
H]oleato após a adição de colesterol contido nas LDL do SFB normal. Para
isso, as células foram tratadas pelos períodos de tempo desejados (1h e 24h
para macrófagos peritoneais e 24h para macrófagos/ foam cells), conforme
protocolo experimental. Depois, as células foram lavadas e tratadas com meio
deficiente em lipoproteínas por 5h. Ao final deste período, as células foram
incubadas com [
14
C ou
3
H]oleato na presença de colesterol/LDL (meio normal).
Os reagentes utilizados para esta determinação foram, a saber:
a) NaCl 150 mM em água destilada;
b) Solução A: Tris-HCl 50 mM em NaCl 150 mM, pH 7,4;
c) Solução B: BSA 2 mg/mL de solução A;
d) NaOH 5N em água destilada;
e) Soro fetal bovino (SFB);
f) Soro deficiente em lipoproteínas (LDS, dialisado estéril, Sigma);
g) Albumina deslipidada dialisada estéril (BSA, concentração final de
27,3 mg/mL em PBS, pH 7,4);
h) [
14
C]oleato;
i) Ácido oléico FRIO a 100 mg/ml em clorofórmio/metanol (2:1);
j) Mistura hexano/isopropanol (3:2, v/v);
k) Solventes para TLC – Thin Layer Chromatography (hexano, éter etílico,
ácido acético glacial);
l) Etanol PA;
m) Placas de TLC.
A preparação dos reagentes se deu da seguinte maneira:
• BSA deslipidada e dialisada, segundo a técnica do carvão ativado de
Chen (1967) seguida de diálise contra PBS pH 7,4 e esterilização em filtro de
nitrocelulose (poro <0,22 μm).
54
• Complexo albumina-oleato de sódio 12,7 mM, técnica original descrita
por Goldstein et al. (1983), modificada a saber:
Pipetou-se 318,6 μmol de ácido oléico (solução a 100 mg/mL em
clorofórmio/metanol, 2:1) em um tubo de ensaio e secou-se o solvente em
corrente de nitrogênio. A seguir, adicionou-se 2 mL de etanol e agitou-se este
preparado, que teve adicionado, logo após, 100 μL de NaOH 5N. Agitou-se o
conteúdo novamente, sendo o excesso de etanol removido por evaporação em
corrente de nitrogênio. A esta mistura foi adicionado 10 mL de solução de NaCl
150 mM. Agitou-se em vórtex e aqueceu-se a mistura em banho-maria a 60ºC,
com agitação vigorosa por 5 minutos. Então, pipetou-se 12,5 mL de BSA
deslipidado (concentração final de 27,3 mg/mL), transferindo-se a preparação
para um béquer e agitando-se a solução por 10 minutos. O volume final foi
ajustado para 25 mL com NaCl 150 mM (concentração final de oleato de sódio:
318,6 μmol/25 mL = 12,7 mM) e o pH averiguado. Se fosse necessário, acertar-
se-ia o pH para 7,4.
• Complexo de [1-
14
C] oleato de sódio 12,7 mM em albumina deslipidada:
Visou-se preparar uma mistura de oleato frio+quente contendo cerca de 43
μCi/ml. Para tal, pipetou-se 10μL de ácido oléico[1-
14
C] 50μCi em Eppendorf e
este foi seco em corrente de nitrogênio. Em seguida, o radioativo foi
ressuspenso em 500μL da solução contendo 12,7 mM de oleato de sódio em
BSA deslipidado contendo NaCl 150 mM, pH 7,4. Agitou-se a solução em
banho com agitação por 4 – 6 h à temperatura ambiente.
• Complexo de COLESTEROL FRIO 20 mM com SFB: De uma solução
100 mg/mL de colesterol em clorofórmio/metanol, 2:1 (v/v), aliquotou-se
77,5 μL em Eppendorf e secou-se este volume em corrente de nitrogênio.
Adicionou-se 1 mL de solução de SFB normal estéril e incubou-se de 4 – 6 h a
37
o
C em banho-maria com agitação.
O ensaio, propriamente dito, ocorreu da seguinte forma:
Após o período de cultura de interesse, as células foram transferidas da
placa de cultura para Eppendorfs, foram lavadas e incubadas por 5h, a 37
o
C
em estufa de CO
2
5%, na presença de meio contendo soro deficiente em
lipoproteínas a 5% (v/v), novamente em placa de cultura.
55
Ao término das 5h de incubação, as células foram outra vez transferidas
para Eppendorfs; estes foram centrifugados e tiveram os sobrenadantes
aspirados. Assim, as células foram plaqueadas (em placas de cultura de 24
wells - 500 μL finais) com 430 μL de meio RPMI 1640, 50 μL de SFB, 10 μL de
oleato de sódio (frio e quente, isto é, colesterol normal e colesterol marcado)
em BSA e 10 μL de colesterol em SFB. Coletou-se uma amostra (5 μL) de cada
well para a determinação da radioatividade específica. Finalizado este
procedimento, as células foram incubadas por 2h, a 37
o
C em estufa de CO
2
5%.
Após período de incubação, as células foram transferidas para
Eppendorfs, que sofreram centrifugação e tiveram seus sobrenadantes
aspirados. As células, então, foram lavadas duas vezes com volumes de 2 mL
cada de Solução B e uma vez com um volume de 2 mL de Solução A, foram
centrifugadas e tiveram seus sobrenadantes aspirados. Adicionou-se 1 mL da
mistura hexano/isopropanol (3:2, v/v) em cada amostra para a extração dos
ésteres de colesterol do intracelular. As células, então, ficaram incubando com
os solventes por 30min à temperatura ambiente. Em seguida, o extrato foi
aspirado e transferido para outro tubo Eppendorf. Procedeu-se novamente a
lavagem das células com 1mL da mistura hexano/isopropanol (3:2, v/v),
coletou-se o solvente de cada Eppendorf e somaram-se os extratos nos novos
Eppendorfs para secagem em concentrador (SpeedVac).
Após secagem completa das amostras, estas foram dissolvidas em 50μL
de padrões internos de colesterol e ésteres de colesterol em
clorofórmio/metanol (2:1, v/v). Depois de agitar-se a mistura nos tubos
contendo as amostras, estas foram secas novamente em SpeedVac e lavadas
com 60μL de hexano.
A partir de então, a técnica de TLC pôde ser empregada. A fase móvel
consistiu de hexano/éter dietílico/ácido acético (80:20:1 em volume).
Recortaram-se as bandas dos ácidos graxos e dos ésteres de colesterol. Os
resultados obtidos para o ácido oléico restante, quando somados aos
observados na fração dos ésteres de colesterol são úteis para o cálculo
aproximado da radioatividade total que entrou na célula durante o experimento.
56
Uma unidade da atividade da ACAT corresponde a 1pmol por minuto a
37°C. Assim, os resultados da atividade da ACAT foram expressos em mU/10
6
células (segundo Liu et al, 2005). Este protocolo de medida de atividade da
ACAT foi estabelecido a partir das técnicas originais de Goldstein e
colaboradores (1983), Maor e colaboradores (1991), Calder e colaboradores
(1990) e Chen (1967).
4.13- Medida da Atividade da HMG-CoA redutase pelo método
espectrofotométrico, em macrófagos peritoneais
Trata-se da medida da atividade da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A
redutase ( HMG-CoA redutase) em células cultivadas.
A HMG-CoA redutase é a enzima-chave da síntese de colesterol, cuja
reação pode ser vista na Figura 15:
redutase
HMG-CoA + 2 NADPH mevalonato
-
+ 2 NADP
+
+ CoA-SH
RS-HMG-CoA RS-mevalonolactona
Figura 15: Ação enzimática da HMG-CoA redutase.
A técnica consiste no monitoramento da oxidação do NADPH na
presença de HMG-CoA. Uma unidade da enzima é definida como a quantidade
necessária para oxidar 2 nmols de NADPH (ou 1 nmol de HMG-CoA) por
minuto a 37ºC (Edwards et al., 1979).
Em leucócitos a atividade desta enzima é baixa (cerca de 0,5-1
pmol/min/mg proteína microssomal) (Young & Rodwell, 1977). Esses dados
devem ser levados em conta no momento de se coletar a quantidade adequada
de células.
57
Os reagentes utilizados e a preparação destes se deu da seguinte
maneira para esta determinação, a saber:
a) Tampão fosfato de potássio (K
2
HPO
4
/ KH
2
PO
4
) 40 mM pH 7,2;
b) Tampão de extração: sacarose 100 mM, KCl 50 mM, EDTA 30 mM em
tampão fosfato de potássio 40 mM pH 7,2;
c) Tampão fosfato de potássio (K
2
HPO
4
/ KH
2
PO
4
) 160 mM pH 6,8;
d) Tampão de Ensaio: KCl 200 mM, EDTA 4 mM e DTT (ditiotreitol) 10 mM em
tampão fosfato 160 mM pH 6,8;
No caso de tecidos ou células tratadas com CP-PGs, como a PGA
2
, o
DTT deve ser omitido do tampão de ensaio. Para testar o efeito do DTT (que
pode liberar CP-PGs ligadas por adições de Michael), cada amostra foi
ensaiada 2 vezes: uma na ausência e outra na presença de DTT. O DTT
sempre aumenta a atividade da redutase.
e) β-NADPH 200 μM em NaHCO
3
0,5%;
f) RS-HMG-CoA 2 mM, pH 6,0.
A extração e o preparo das amostras se deu da seguinte maneira:
Usou-se PMSF e leupeptina como inibidores de protease na extração.
Para tal, no momento da homogeneização, adicionou-se:
a) PMSF 100 mM em isopropanol;
b) Leupeptina 2 mg/mL.
Depois dos períodos de cultura, removeram-se os sobrenadantes
celulares por aspiração, as células foram lavadas com PBS e raspadas dos
wells com policial de borracha (cell scraper). Repetiu-se este procedimento
para remoção das células restantes. Assim, procedeu-se a centrifugação da
suspensão resultante a 15000 x g por 10 segundos e descartou-se o
sobrenadante por aspiração. Os precipitados celulares, em seguida, foram
ressuspensos em volumes menores de Tampão Tris-NaCl para serem
transferidos para tubos de homogeneização. As células foram novamente
centrifugadas e os precipitados celulares ressuspensos em 120 μL de Tampão
de Extração. A homogeneização das células e o preparo de suspensão de
microssomos sem a utilização de detergentes ocoreu pela técnica do freezing-
thawing, que consiste em congelar as células em nitrogênio líquido e
descongelar as células rapidamente em banho-maria a 37
o
C. Repetiu-se este
processo de descongelamento/congelamento 3 vezes. As células foram
58
homogeneizadas, ainda nos Eppendorfs, em vórtex e centrifugadas por
20 minutos a 15.000 x g a 4
o
C, para a eliminação das mitocôndrias, núcleos e
debris celulares. Por fim, os sobrenadantes foram coletados em Eppendorfs
para dosagem de proteínas e determinação da atividade da redutase no
sobrenadante. Após o preparo das amostras, dosaram-se as proteínas pelo
método de Bradford (1976).
O ensaio, propriamente, se deu da seguinte forma:
A atividade da HMG-CoA redutase foi analisada
espectrofotometricamente a 340 nm. Em uma microplaca de ELISA, pipetaram-
se os blanks da placa (100 μL). No leitor de ELISA, ligou-se o aquecimento a
37ºC e regulou-se o comprimento de onda para 340 nm. A seguir, todos os
reagentes e amostras foram retirados do gelo, deixando apenas o Tampão de
Ensaio a 37ºC e pipetou-se 130 μL de tampão de ensaio (sem DTT). Após,
pipetou-se 10 μL da solução de NADPH (em todos os wells), 10 μL da solução
de HMG-CoA (apenas nos test-wells), 50 μL de amostra (em todos os wells),
agitou-se a microplaca por 5 segundos e monitorou-se, a 340 nm, por 2 a 4
minutos, a inclinação referente à atividade da HMG-CoA redutase na ausência
de DTT. Em amostras separadas, pipetou-se 10 μL de DTT para determinação
da atividade máxima. A inclinação da linha de base (apenas NADPH e
amostra) foi descontada da inclinação na presença de HMG-CoA. As atividades
máximas são obtidas na presença de DTT, mas as atividades obtidas sem DTT
devem ser comparadas entre os grupos controles e os tratados com CP-PGs.
Uma unidade da atividade da HMG-CoA redutase corresponde a 1nmol
de mevalonato formado por minuto a 37°C e a 2 nmols de NADPH consumidos
por minuto, a esta temperatura. Assim, os resultados da atividade da HMG-CoA
redutase foram expressos em U/mg de proteína (segundo Edwards, 1979).
Este protocolo de medida de atividade da HMG-CoA redutase foi estabelecido
a partir das técnicas originais de Edwards e colaboradores (1979), Young &
Rodwell (1977) e Williamson & Rodwell (1981).
4.14- Imunoprecipitação e eletroforese SDS-PAGE para HMG-CoA
redutase de macrófagos peritoneais
Proteínas celulares ou de amostras teciduais são incubadas na presença
59
dos anticorpos de interesse que são precipitados com proteína A-sepharose
(que reage especificamente com as caudas Fc dos anticorpos). Depois de
separados por centrifugação, os complexos proteína-anticorpo-proteína A-
sepharose são dissolvidos em tampão de imunoprecipitação e submetidos a
eletroforese. A identificação deve ser de uma única banda que pode ser
visualizada por reação com segundo-anticorpo ligado a peroxidase. A técnica
permite que sejam isoladas proteínas expressas em pequenas quantidades,
concentrando-as, o que é o caso da HMG-CoA redutase, presente em muito
baixa quantidade em leucócitos.
Os reagentes utilizados e o preparo destes para esta determinação
foram, a saber:
a) Anticorpo primário de interesse (anticorpo anti- goat/ human/ mouse/ rat
HMG-CoA redutase c-18, SC 27578, Santa Cruz Biotechnology);
b) Anticorpo secundário (anticorpo anti- mouse IgG A9044, Sigma) e reagentes
para identificação por immunoblot;
c) Material para eletroforese e eletrotransferência (descritos posteriormente);
d) PBS para lavagens;
e) Inibidores de protease (leupeptina 5mg/mL e PMSF 100mM).
f) Tampão de imunoprecipitação (tampão ip): Nonidet P-40, 1% (v/v),
Desoxicolato, 0,5% (m/v), NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,4, em água
destilada.
g) Tampão de bloqueio da proteína a-sepharose: BSA a 1 mg/mL em Tampão
IP;
h) SDS (dodecil sulfato de sódio) em tampão de imunoprecipitação (SDS-IP)
0,1%;
i) Proteína A-Sepharose CL4B (GE HealthCare).
O preparo da resina foi feito lavando- se o material com PBS. Então, a
resina foi centrifugada por 30 segundos em microcentrífuga, teve seu
sobrenadante aspirado e o volume inicial foi completado com PBS. A mistura
foi agitada no vórtex e sofreu nova centrifugação, por 30 segundos. Este
processo foi repetido por duas vezes (total = 3 lavagens). Após, a resina foi
ressuspensa em Tampão de Bloqueio da Proteína A-Sepharose, usado para
completar para o volume inicial. Incubou-se a resina no Tampão de Bloqueio
por 24 h a 4ºC. Após o bloqueio, a resina foi lavada uma vez com PBS. Uma
60
nova centrifugação foi realizada e a resina foi ressuspensa em Tampão IP,
ficando pronta para ser utilizada.
O ensaio para esta determinação se deu, a saber:
Os grupos experimentais propostos foram preparados em duplicata,
utilizando-se duas placas de cultura de células. A placa de cultura também
possuía um well adicional para o controle negativo da imunoprecipitação. Após
o período de incubação para tratamento, sugerido neste trabalho, as células
foram lisadas com seringas de insulina em tubos Eppendorf em Tampão IP.
Para isto, as células foram coletadas das placas de cultura em 1mL de PBS em
Eppendorf. Em seguida, foram centrifugadas por 10 segundos em
microcentrífuga (velocidade máxima), descartando-se o sobrenadante.
Novamente as placas de cultura foram lavadas com 1mL de PBS e somado
esse lavado ao tubo contendo as células já coletadas. Os macrófagos foram
centrifugados novamente por 10 segundos e seus sobrenadantes aspirados
para, então, os precipitados celulares serem quebrados. Assim, adicionou-se
às amostras leupeptina e PMSF, agitando-se a mistura em vórtex. Adicionou-se
500 μL de Tampão IP, agitando-se novamente em vórtex. Após, as células
foram quebradas com seringa de insulina. Centrifugaram-se as amostras por 1
segundo na microcentrífuga (velocidade máxima) apenas para baixar os
núcleos e debris celulares. A HMG-CoA redutase fica no sobrenadante, assim,
transferiu-se 500 μL de cada sobrenadante para outros Eppendorfs, onde foi
realizada a reação imunológica. Coletou-se 5 μL de cada amostra para
dosagem de proteínas (cujo blanck continha Tampão IP).
Para que a reação imunológica fosse feita, para cada tubo contendo
500 μL de extrato celular em Tampão IP, adicionou-se 5 μL de anticorpo por
tubo: anticorpo goat anti-human/mouse/rat HMG-CoA redutase (HMGCR da
Santa Cruz Biotechnology, C-18, sc-27578). Reservou-se um tubo de lisado
extra para a realização do controle negativo. Após a adição dos anticorpos, as
preparações foram incubadas por 12 h a 4 ºC com agitação moderada (shaker
circular). O preparo do controle negativo se deu com soro pré-imune, em que
foi adicionado a um tubo Eppendorf, contendo 500 μL de lisado celular, 1 μg de
soro pré-imune (soro que não contém anticorpos específicos contra a HMG-
CoA redutase). Essa amostra foi conduzida em paralelo e, quando todas as
61
amostras foram precipitadas com Proteína A-Sepharose, o controle negativo,
depois de feita a eletroforese, não apresentou nenhuma banda relativa à HMG-
CoA redutase (43 kDa).
Para a que fosse feita a imunoprecipitação, após a incubação de 12
horas, as amostras contendo os conjugados de proteína-anticorpo primário (em
500 μL) foram incubadas, sob agitação, por 90 min adicionais a 4
o
C na
presença de 100 μL de proteína A-Sepharose. Após a incubação com a resina,
as amostras foram centrifugadas por 30 minutos em microcentrífuga
(velocidade máxima). Então, aspiraram-se e descartaram-se os sobrenadantes,
pois são os precipitados que contém os imunoprecipitados da HMG-CoA
redutase com a proteína A-Sepharose. Em seguida, os precipitados foram
lavados 3 vezes com 1 mL de Tampão SDS-IP e centrifugados à velocidade
máxima da microcentrífuga, aspirando e descartando os sobrenadantes. Os
precipitados foram novamente lavados, agora com PBS (mesmo procedimento)
e os sobrenadantes foram aspirados. Os precipitados das amostras
experimentais foram dissolvidos em 55μL de tampão de ensaio para SDS-
PAGE (poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio - 10% poliacrilamida), agitados e
fervidos. Então, as amostras foram centrifugadas por 30 minutos
(microcentrífuga, velocidade máxima) para precipitar a A-Sepharose. Assim,
carregou-se cerca de 50 μL por well para eletroforese dos sobrenadantes (com
iguais quantidades de proteínas). Após eletroforese, foi feita a
eletrotransferência e Western Blot (técnicas descritas mais adiante) utilizando-
se novamente o anticorpo anti-HMG-CoA redutase (a 1:1000) (anticorpo anti-
goat/ human/ mouse/ rat HMG-CoA redutase c-18, SC 27578, Santa Cruz
Biotechnology) e segundo anticorpo (anticorpo anti- mouse IgG A9044, Sigma)
marcado com peroxidase. As amostras foram reveladas por ECL (Enhanced
Chemiluminescence) (técnica também descrita mais adiante). O peso molecular
da HMG-CoA redutase é de 43KDa. Este protocolo de imunoprecipitação foi
estabelecido a partir das técnicas originais de Amici e colaboradores (1994) e
Lee e colaboradores (2000).
4.15- Expressão de proteínas de choque térmico (HSP) em macrófagos/
foam cells e peritoneais
62
Para análise da expressão de HSP70, macrófagos peritoneais foram
tratados, segundo protocolo estabelecido neste trabalho, por 6 horas e 24
horas (6h é o período de expressão gênica máxima da HSP70) e macrófagos/
foam cells foram tratados por 24h. No intuito de avaliarmos a correlação entre o
acúmulo de CP-PGs em macrófagos e a expressão de HSP70, as células
foram, inicialmente, precipitadas em tubos para microcentrífuga (Eppendorf),
agitadas (vórtex), lisadas em solução de SDS a 0,1% e passadas em seringa
de insulina (1ml) para serem homogeneizadas e para que a quantidade total de
proteína pudesse ser medida (Bradford, 1976). A seguir, as preparações foram
diluídas em tampão de amostra, quantidades iguais de proteína foram
carregadas e estas foram separadas (por corrida eletroforética) durante 2 horas
(a 100 mA/ gel) à temperatura ambiente (25°C) por eletroforese em gel de
poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Foi utilizado sistema
vertical Slab Gel BIO-RAD Mini-Protean II (Bio-Rad Laboratories, Richmond,
CA, USA) e tampão de corrida constituído de Tris a 25 mM, glicina a 192 mM e
SDS a 1% (m/v), pH 8,3 usando-se 1cm de gel de empilhamento (entrada) a
4% (m/v) e gel de separação a 10% (m/v) em termos de monômero de
acrilamida, para corridas em géis de 10 cm em tampão de amostra redutor
constituído de Tris-HCL 62,5 mM pH 6,8, glicerol a 10% (v/v), SDS a 2% (v/v) e
β-mercaptoetanol a 5%, conforme descrito em Santoro et al. (1989). Como
marcador de peso molecular foi utilizada a mistura de padrões de pesos
moleculares previamente coloridos (Invitrogen) com as seguintes proteínas:
miosina (200 kDa), fosforilase b (92,5 kDa), BSA (69kDa), ovalbumina (46kDa),
anidrase carbônica (30kDa) e lisozima (14kDa).
Após as corridas, os géis foram destacados das placas de suporte,
tendo sido removidos os géis de separação. As amostras contidas no gel foram
destinadas ao processamento por Western blot, como descrito em Elia &
Santoro (1994), sendo transferidas diretamente para membrana de
nitrocelulose (Millipore) em sistema refrigerado BIO-RAD Blot Cell a 100 V por
90 minutos, por eletrotransferência. Após a transferência, as bandas, contendo
proteínas foram evidenciadas pela coloração com vermelho Ponceau, sal de
sódio (Sigma) a 0,3% (m/v) em solução TCA a 3%. Então, as membranas
foram descoradas em tampão TEN-Tween (Tris 50 mM pH 7,4 EDTA 5 mM,
NaCl 150 mM). Antes do immunoblot, os filtros de nitrocelulose foram imersos
63
em tampão de bloqueio a fim de recobrirem-se as porções da membrana onde
não houve transferência de proteínas, promovendo-se, então, bloqueio de
ligação inespecífica de anticorpos ao filtro. Assim, as membranas foram
incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas sob agitação enérgica em
tampão de bloqueio – bloto (leite em pó a 5%) (Kolberg et al, 2005); após este
procedimento a membrana foi lavada por 3 vezes com 10 ml de TEN-Tween
sob agitação. Para o Western blot das HSP70, as membranas foram incubadas
à temperatura ambiente durante 2 horas sob agitação enérgica em tampão de
bloqueio a 0,05% (v/v) na presença de anticorpo monoclonal BRM-22 de ascite
de camundongo (hibridoma BRM-22) contra HSP70 humana (Amersham), que
reage especificamente com o polipeptídeo de 72 kDa (HSP70, ou HSP
induzível) e com o de 73 kDa (HSP73, também chamado de HSC70 ou HSP70
constitutiva), diluído a 1:1000 em solução de bloqueio. Depois disso, as
membranas foram lavadas três vezes sob agitação por 10 minutos com 5 ml de
TEN-Tween e incubada por 2 horas com 5 ml de tampão de bloqueio contendo
o segundo anticorpo de coelho (diluído também 1:1000) contra IgG de
camundongo conjugado a peroxidase de rabanete (Sigma A 9044) sob
agitação. Após nova lavagem, as membranas foram submetidas à técnica de
ECL (Enhanced Chemiluminescence). A técnica de ECL é feita na câmara
escura, pois o cassete de exposição e o filme de raios X (Hyperfilm,
Amersham) são fotossensíveis. Foram utilizados Luminol (3-
aminophthalhydrazide = 3-aminoftalidrazida) grau QL (Fluka, cód. 09153) e
ácido p-coumárico (Fluka, cód 28200), que foram misturados em 5 mL de
tampão Tris HCl 1,5 M pH 8,8. Esta mistura reage com peróxido de hidrogênio
30% (Fluka), também diluído em Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, que marcaram as
bandas das amostras. A revelação por ECL é um processo que consiste em
mergulhar a membrana de nitrocelulose nas soluções citadas acima, sob
agitação por 3 minutos, a fim de visualizar o aparecimento das bandas. Em
seguida, esta membrana é retirada das soluções e envolvida por um papel
filme de PVC. A membrana é, então, colocada sobre o cassete de exposição
juntamente com o filme de raio X, que vai por cima dela. Após a exposição e
revelação (conforme instruções do fabricante, Amersham), as bandas foram
registradas digitalmente (Vídeo Documentation System de aquisição digital e
processamento de imagens - VDS, Amersham Pharmacia Biotech) e as
64
imagens analisadas para os cálculos posteriores. Os resultados foram
expressos por unidades arbitrárias.
Em muitos experimentos, a reutilização das membranas de nitrocelulose
para ressondagem com outro anticorpo é importante para efeito de controle. A
completa remoção do primeiro e do segundo anticorpos após a detecção pode
ser realizada pela técnica de stripping e ressondagem de membranas. Nestes
casos, as membranas podem ser sondadas e ressondadas várias vezes, desde
que as mesmas sejam mantidas em refrigerador e úmidas (TEN-Tween). Para
tal, a membrana de nitrocelulose foi mergulhada na solução de strip (Tris-HCl
62,5 mM, pH 6,7, SDS 2% e β-mercaptoetanol 100 mM) e incubada por 30 min
a 50
o
.C. Lavou-se a membrana com TEN-Tween por duas vezes, por 10 min
cada e esta foi incubada em tampão de bloqueio. A partir de então, o
procedimento de imunoblot foi repetido (Diaz et al, 1996a, b).
4.16- Expressão de proteínas da NO sintase induzível (iNOS, ou NOS-2)
Para verificar a expressão das NO sintase induzível (iNOS, ou NOS-2),
foi utilizada a mesma técnica acima, porém foram adicionados anticorpos
(primeiro anticorpo anti- Nitric Oxide Synthase indutible –iNOS- N 7782, Sigma;
segundo anticorpo anti-mouse IgG A 9044, Sigma) específicos para pesquisa
dessa proteína nos diferentes grupos experimentais, em macrófagos
residentes. A revelação foi realizada pela técnica de ECL. O peso molecular
desta proteína é de 130KDa.
4.17- Expressão de proteínas do receptor scavenger CD36
Para verificar a expressão do receptor scavenger CD36, foi utilizada a
mesma técnica do item 4.15 da Metodologia, porém foram adicionados
anticorpos (primeiro anticorpo anti- rabbit IgG anti- CD36, H300 – sc9154,
Santa Cruz Biotechnology; segundo anticorpo anti- mouse IgG A 9044, Sigma)
específicos para pesquisa dessa proteína nos diferentes grupos experimentais,
em macrófagos residentes. A revelação foi realizada pela técnica de ECL. O
peso molecular desta proteína está entre 88-90KDa.
4.18- Expressão de proteínas da bomba MRP1
65
Para verificar a expressão da bomba MRP1, foi utilizada a mesma
técnica do item 4.15 da Metodologia, porém foram adicionados anticorpos
específicos para pesquisa dessa proteína nos diferentes grupos experimentais,
em macrófagos residentes (anticorpo primário anti- goat anti- MRP1 clone
QCRL-4, M9192, Sigma; anticorpo secundário, anti- mouse IgG, A9044,
Sigma). A revelação foi realizada pela técnica de ECL. O peso molecular desta
proteína é de 190KDa.
4.19- Expressão da proteína
β
-Actina
Para fins de controle, verificou-se a expressão da proteína β-Actina,
presente no citoesqueleto celular. Assim, todas as proteínas pesquisadas
foram expressas a partir do resultado obtido da divisão da quantidade de pixel
das bandas das proteínas estudadas pela quantidade de pixel das bandas de
actina de cada amostra. Para tal, foi utilizada a mesma técnica do item 4.15 da
Metodologia, porém foram adicionados anticorpos específicos para pesquisa
dessa proteína nos diferentes grupos experimentais, em macrófagos
residentes (primeiro anticorpo anti- Actin I-19, sc- 1616, Santa Cruz
Biotechnology; segundo anticorpo anti- mouse IgG A9044, Sigma). A revelação
foi realizada pela técnica de ECL. O peso molecular desta proteína é de
44KDa.
4.20- Análise estatística
Conforme necessário em cada experimento, as diferenças entre os
grupos controle e os tratados foram comparadas com o teste ANOVA, tendo
sido considerado para nível de significância mínimo um risco α com p<0,05
para erros do tipo I, com uso de testes complementares como Tukey-Kramer
ou Bonferroni para análise de variância. A análise estatística foi efetuada com o
auxílio do programa computacional GraphPad Instat 3.0, versão para Windows.
66
5. RESULTADOS
Os dados aqui descritos são relativos aos resultados encontrados em
cada desenho experimental, nos diferentes tempos de estudo.
As atividades de diferentes enzimas que participam do metabolismo do
colesterol, assim como a expressão de importantes marcadores destas rotas
foi avaliada e comparada entre os grupos.
Para cada análise, há uma Figura e/ou uma tabela, para que se obtenha
uma melhor visualização destes dados.
5.1- Atividade da Acil-CoA: Colesterol O-Aciltransferase (ACAT) em
macrófagos/ foam cells
A atividade ACAT foi determinada por técnica radioquímica através da
adição de [
14
C]-oleato e análise (TLC) dos ésteres de colesterol formados, em
macrófagos/ foam cells tratados com PGA
2
(1μM e 20μM) por 24h, conforme
técnica descrita anteriormente. As diferentes concentrações foram testadas
para que se pudesse escolher a mais efetiva.
Os grupos experimentais foram demonstrados no desenho
experimental no item 4.9 da Metodologia. Foram utilizadas 2 x 10
6
células por
well. Os resultados foram obtidos de 4 wells diferentes, em três experimentos
independentes.
Estes dados podem ser visualizados visualizados na Figura 16. A
transformação dos macrófagos peritoneais em foam cells, após 18h de
incubação com LDL oxidada aumentou a atividade da ACAT em 2,5 vezes
quando se compara o grupo Controle com o grupo Controle+ LDLox (p<0,05).
O tratamento das foam cells com PGA
2
, na concentração de 1μM, reduziu
significativamente em 33% a atividade desta enzima (p<0,05), comparado ao
grupo Controle+ LDLox. Na concentração de 20μM, o poder inibitório da PGA
2
não foi observado. Interessante notar que nos macrófagos Controle,
comparados aos macrófagos Controle que receberam PGA
2
1μM, observa-se o
aumento significativo da atividade ACAT (280% de aumento, p<0,001).
67
*
* *
#
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
600,0
Atividade ACAT (mU/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2 1uM
Controle+ PGA2 20uM
Controle+ LDLox
PGA2 1uM+ LDLox
PGA2 20uM+ LDLox
*
* *
#
Figura 16: Atividade enzimática da acil CoA:colesterol aciltransferase
(ACAT), em macrófagos/ foam cells nos diferentes grupos experimentais.
Resultados obtidos de 4 wells diferentes, em três experimentos independentes.
Os valores são expressos como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e Controle + PGA
2
1μM (p<
0,001).
* * diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle LDLox (p<
0,05).
# diferença significativa entre o grupo Controle LDLox e o grupo PGA
2
1μM+
LDLox (p< 0,05).
5.2- Atividade da Acil-CoA: Colesterol O-Aciltransferase (ACAT) em
macrófagos peritoneais
Uma vez que a PGA
2
diminui a atividade da ACAT em 33% em
macrófagos/ foam cells, visou-se determinar qual a resposta celular em
macrófagos não estimulados, em situações de estresse ou de proteção ao
estresse celular. Como na concentração de 1μM se obteve a melhor resposta,
esta passou a ser a concentração de escolha.
Assim, a atividade ACAT foi determinada por técnica radioquímica
através da adição de [
14
C]-oleato e análise (TLC) dos ésteres de colesterol
68
formados, em macrófagos peritoneais tratados com PGA
2
1μM, na presença
ou ausência de butionina sulfoxamina e dietilmaleato (BSO/DEM, 2,5μM/ 5mM,
para depleção da glutationa [GSH] intracelular) ou N-acetilcisteína (NAC,
20 mM, que eleva os níveis de GSH) por 1h e por 24h, conforme técnica
descrita anteriormente.
Os grupos experimentais foram demonstrados no desenho experimental
no item 4.7 da Metodologia, para ambos os tempos de tratamento. Os
resultados estão expressos como a média ± erro padrão da média, valores
obtidos de três preparações experimentais em triplicatas (2x10
6
células por
well).
Os resultados a seguir descritos são relativos à atividade da ACAT,
inferida pela formação de ésteres de colesterol em 1h de tratamento. Todos os
dados podem ser observados na Figura 17.
Ao contrário do que se verificou com relação à atividade ACAT em
macrófagos/ foam cells, os dados mostraram que a PGA
2
(1μM) aumenta
significativamente (p<0,05) a atividade da ACAT (55% de aumento), quando as
células controle são tratadas por 1h com esta prostaglandina ciclopentenônica,
comparado com o grupo controle, uma vez que a concentração de ésteres de
colesterol formado aumentou. No entanto, os perfis encontrados para o grupo
controle e grupo PGA
2
em
presença de BSO/DEM no sistema de incubação e
grupo controle e PGA
2
em
presença de NAC, não variaram significativamente,
apesar de o tratamento com BSO/DEM apresentar uma tendência de aumento
ainda maior na atividade enzimática.
69
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
350,0
400,0
Atividade ACAT (mU/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
Figura 17: Atividade enzimática da acil CoA:colesterol aciltransferase
(ACAT), em 1h de tratamento com PGA
2
1μM, em macrófagos peritoneais nos
diferentes grupos experimentais. Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em
três experimentos independentes. Os valores são expressos como a Média ±
Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
Os valores encontrados, relativos à atividade da ACAT em macrófagos
peritoneias em 24h de tratamento, estão demonstrados na Figura 18. Os
resultados estão expressos como a média ± erro padrão da média, valores
obtidos de três preparações experimentais em triplicatas (2x10
6
células por
well).
Em relação à atividade da ACAT, a PGA
2
a aumentou em 35% (p<0,05),
quando o grupo Controle e Controle+ PGA
2
1μM são comparados em 24h, uma
vez que houve aumento de ésteres de colesterol formado. Neste período de
tratamento, em macrófagos peritoneais, a depleção de GSH pela presença de
BSO/DEM no meio, juntamente com a PGA
2
,
promoveu redução significativa da
atividade da ACAT (p<0,05), comparando-se os grupos Controle+BSO/DEM e
70
PGA
2
+ BSO/DEM, enquanto que o tratamento com NAC potencializou-a de
modo significativo, se se comparar Controle+ NAC e PGA
2
+ NAC (p<0,05).
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
350,0
Atividade ACAT (mU/10
6
células)
Controle
Controle+PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 18: Atividade enzimática da acil CoA:colesterol aciltransferase
(ACAT), em 24h de tratamento com PGA
2
1μM, em macrófagos peritoneais nos
diferentes grupos experimentais. Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em
três experimentos independentes. Os valores são expressos como a Média ±
Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle+ NAC e o grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Quando se comparam os grupos entre si no período de 1h e 24h de
tratamento, vê-se que o grupo Controle aumenta a atividade da ACAT em 24h,
comparado com 1h, de modo significativo, assim como o fazem os grupos
Controle+ PGA
2
, Controle+ NAC e PGA
2
+ NAC (p<0,05 para todos). No
entanto, o grupo PGA
2
+ BSO/DEM diminui significativamente (p<0,01), a
atividade da enzima, enquanto o grupo Controle+ BSO/DEM não se altera.
71
5.3- Estado redox celular em macrófagos peritoneais
Verificando-se que a atividade da ACAT se modificava com o estado
redox e que a resposta obtida em macrófagos peritoneais era muito diversa da
observada em foam cells (a adição de PGA
2
aumentava a atividade da ACAT
na primeira e a mesma adição diminuía a atividade da enzima na segunda) se
tornou essencial a determinação do estado redox celular.
Então, com a finalidade de se avaliar a resposta celular ao estresse
oxidativo produzido pelo tratamento de macrófagos peritoneais com a PGA
2
(1μM), BSO/DEM e NAC, foram determinadas as concentrações da glutationa
reduzida (GSH), glutationa oxidada (GSSG) e a relação entre elas
[GSSG/GSH], pois sua relação demonstra o estado redox da célula, vez que o
potencial redox das células depende do ln ([GSSG]/[GSH]).
As células foram tratadas conforme desenho experimental descrito no
item 4.7 da Metodologia, e as medidas das concentrações de GSH, GSSG e a
relação [GSSG/GSH] foram obtidas, segundo o protocolo descrito
anteriormente. Os resultados estão expressos como a média ± erro padrão da
média, valores obtidos de duas preparações experimentais em triplicatas
(2x10
6
células por well).
Após o tratamento, observou-se que a PGA
2
reduziu significativamente a
concentração de GSH intracelular 1h (30% menor), conforme mostra a Figura
19. Ainda, em 1h de tratamento, observa-se que as concentrações
intracelulares de GSH diminuem 35% comparando-se os grupos Controle+NAC
e PGA
2
+ NAC, de modo significativo (p<0,05), enquanto que o tratamento do
grupo BSO/DEM com PGA
2
, comparado ao seu Controle, aumentou em mais
de 10 vezes suas concentrações (p< 0,05).
72
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
GSH intracelular
(nmol/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
#
Figura 19: Concentração de glutationa reduzida (GSH) intracelular de
macrófagos peritoneais em 1h de tratamento, nos diferentes grupos
experimentais. Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos
independentes. Os valores são expressos como a Média ± Erro Padrão da
Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ NAC e o grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
# diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Na Figura 20 visualiza-se o que ocorre com a concentração de GSSG
em 1h de tratamento. Em relação à formação de GSSG, neste período de
tratamento, não há alterações de concentração entre os grupos, exceto entre
os grupos Controle+ BSO/DEM e PGA
2
+ BSO/DEM. Observa-se que o grupo
Controle+ BSO/DEM aumenta a quantidade de GSSG, uma vez que BSO/DEM
age como um pró-oxidante realmente, depletando em 45% (p<0,05) a
quantidade de glutationa em 1 hora.
73
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
GSSG intracelular (nmol/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
Figura 20: Concentração de glutationa oxidada (GSSG) intracelular de
macrófagos peritoneais em 1h de tratamento, nos diferentes grupos
experimentais. Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos
independentes. Os valores são expressos como a Média ± Erro Padrão da
Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Para que possa ser avaliado o estado redox intracelular, faz-se mister
avaliar o balanço entre a GSH e a GSSG, dados demonstrados na Figura 21.
Assim, verificou-se que em 1h de tratamento, a relação [GSSG]/[GSH]
apresentou-se modificada significativamente (p<0,05) entre os grupos
Controle+ PGA
2
e PGA
2
+ BSO/DEM, ambos diminuídos em relação aos seus
controles, sendo que entre os grupos BSO/DEM esta redução chegou a 95%.
74
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
Relação [GSSG]/[GHS]
Controle
Controle+ PGA2
Controle+NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 21: Relação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de macrófagos peritoneais
em 1h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais. Resultados obtidos
de 3 wells diferentes, em dois experimentos independentes. Os valores são
expressos como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Os resultados obtidos em 24h de tratamento estão descritos na Figura
22. Após o tratamento das células, observou-se que as células sem tratamento
(controle) mantiveram suas concentrações de glutationa reduzida em 1h, como
visto, e também em 24h, no entanto, o tratamento com PGA
2
fez com que
estas concentrações aumentassem no grupo Controle+ PGA
2
de modo
significativo, nos dois tempos de tratamento (Figuras 19 e 22,
respectivamente). Em 24 horas de tratamento, é possível também observar
uma diminuição grande da quantidade de glutationa intracelular no grupo NAC+
PGA
2
, comparado ao seu controle.
75
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
600,0
700,0
800,0
900,0
GSH intracelular (nmol/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 22: Concentração de glutationa reduzida (GSH) intracelular de
macrófagos peritoneais em 24h de tratamento, nos diferentes grupos
experimentais. Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos
independentes. Os valores são expressos como a Média ± Erro Padrão da
Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ NAC e o grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
Na Figura 23, pode-se observar que a concentração de glutationa
oxidada (GSSG) intracelular de macrófagos peritoneais em 24h de tratamento,
modificou-se apenas entre os grupos Controle e o Grupo Controle + PGA
2
(este
último apresentou aumento significativo em sua concentração).
76
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
GSSG intracelular (nmol/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
Figura 23: Concentração de glutationa oxidada (GSSG) intracelular de
macrófagos peritoneais em 24h de tratamento, nos diferentes grupos
experimentais. Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos
independentes. Os valores são expressos como a Média ± Erro Padrão da
Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
Os valores encontrados na relação da concentração entre glutationa
oxidada (GSSG) e glutationa reduzida (GSH) estão demonstrados na Figura
24. Quando a relação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de macrófagos peritoneais,
em 24h de tratamento, foi analisada, verificou-se que houve diminuição
significativa (p<0,05) do estado redox no grupo Controle + PGA
2
, comparado
ao seu controle e aumento do mesmo (p<0,05) no grupo NAC+ PGA
2
. Os
grupos tratados com BSO/DEM e BSO/DEM+ PGA
2
não se modificaram
significativamente.
77
-
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Relação [GSSG/GSH]
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 24: Relação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de macrófagos peritoneais
em 24h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais. Resultados
obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos independentes. Os valores
são expressos como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ NAC e o grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
Comparando-se os grupos experimentais entre eles mesmos em 1h e
24h, nota-se que as concentrações de GSH e GSSG intracelulares
aumentaram no período de 24h de tratamento, em relação ao de 1h, em todos
os grupos estudados significativamente (p<0,01). No entanto, quando se
comparam as relações da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de macrófagos peritoneais
entre si no período de 1h e 24h de tratamento, vê-se que o grupo Controle se
oxida em 24h, comparado com 1h, de modo significativo, assim como o fazem
78
os grupos Controle+ NAC, PGA
2
+ NAC e Controle+ BSO/DEM (p<0,05 para
todos). Os outros grupos não apresentam variações significantes.
5.4- Estado redox celular em macrófagos U937
Uma vez obtido o estado redox em macrófagos peritoneais, viu-se da
importância de testar-se outros tipos celulares frente ao mesmo tipo de
estresse. Como macrófagos humanos da linhagem U937 são fáceis de se
trabalhar em cultura e são tidos como excelentes modelos de macrófagos
precursores de foam cells da aterosclerose, estas células foram a escolha,
visando-se comparação.
Com a finalidade de se determinar a resposta celular ao estresse
oxidativo produzido pelo tratamento das células U937 com a PGA
2
, BSO/DEM
e NAC, foram determinadas as concentrações da glutationa reduzida (GSH),
glutationa oxidada (GSSG) e a relação entre elas [GSSG/GSH].
Os resultados descritos foram obtidos de 3 wells diferentes, em dois
experimentos independentes (2 x 10
6
células U937por well), pelas medidas das
concentrações de GSH, GSSG e cálculo da relação [GSSG/GSH], segundo o
protocolo descrito anteriormente. O desenho experimental utilizado está
descrito no item 4.7 da Metodologia. Os valores são expressos como a Média ±
Erro Padrão da Média.
Consideradas as diferenças nos valores absolutos (que nas U937 são
muito maiores), os resultados são bastante semelhantes aos obtidos para
macrófagos peritoneais de rato, validando, portanto, os protocolos utilizados
aqui. Após o tratamento, observou-se que as células U937 controle continham
menos glutationa reduzida em 1h comparado ao grupo Controle+ PGA
2
. Ainda
o grupo PGA
2
+ BSO/DEM apresentou-se com um aumento de GSH,
comparado ao seu controle (sem PGA
2
). O grupo Controle+ NAC e PGA
2
+
NAC não mostrou diferença nas concentrações de GSH (Figura 25).
79
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
GSH intracelular
(nmol/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 25: Concentração de glutationa reduzida (GSH) intracelular de
células U937 em 1h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais.
Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos independentes.
Os valores são expressos como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Em relação às concentrações intracelulares de glutationa oxidada
(GSSG), em 1h de tratamento verificou-se que sua quantidade diminui nos
grupos que foram tratados com PGA
2
(Controle+ PGA
2
e PGA
2
+ BSO/DEM),
comparados aos seus respectivos controles; porém, o tratamento de células
com PGA
2
+ NAC aumentou significativamente as quantidades de GSSG
intracelular neste grupo (Figura 26).
80
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
GSSG intracelular
(nmol/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
#
Figura 26: Concentração de glutationa oxidada (GSSG) intracelular de
células U937 em 1h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais.
Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos independentes.
Os valores são expressos como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ NAC e o grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
# diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
A relação [GSSG/GSH] é um importante indicador da resposta celular ao
estresse, pois o balanço redox celular depende em grande parte da
manutenção do metabolismo da glutationa, em especial de sua forma reduzida.
Assim, quando se analisa esta relação em 1 hora de tratamento das
células U937, nota-se que os grupos Controle+ PGA
2
e PGA
2
+ NAC
apresentam estresse oxidativo maior que os seus respectivos controles;
entretanto, os dados obtidos no grupo Controle+ BSO/DEM sugerem um
intenso estresse oxidativo celular. Os valores obtidos estão demonstrados na
Figura 27.
81
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Relação [GSSG/ GSH]
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
#
Figura 27: Relação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de células U937 em 1h de
tratamento, nos diferentes grupos experimentais. Resultados obtidos de 3 wells
diferentes, em dois experimentos independentes. Os valores são expressos
como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ NAC e o grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
# diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Quando se analisam os dados obtidos em 24h de tratamento, observa-
se que houve aumento significativo de GSH intracelular no grupo Controle+
PGA
2
. No entanto, quando as células são tratadas apenas com NAC, observa-
se que a GSH aumenta em resposta ao mesmo, conforme esperado, uma vez
que o NAC é um antioxidante, sendo seu papel mais efetivo após 24 horas,
chegando mesmo a aumentar a quantidade de glutationa reduzida neste grupo,
quando comparado ao grupo Controle. Após 24 horas de tratamento, também
se observa uma diminuição grande da quantidade de glutationa intracelular no
82
grupo PGA
2
+ NAC, comparado ao grupo Controle+ NAC, o que demonstra a
ação da PGA
2
como pró-oxidante, segundo verifica-se na Figura 28.
Quando se compara a ação do grupo BSO/DEM com o grupo PGA
2
+
BSO/DEM, verifica-se que houve depleção na concentração de GSH quando o
BSO/DEM+ PGA
2
foram adicionados ao meio, valores demonstrados na Figura
28.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
GSH intracelular
(nmol/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
#
Figura 28: Concentração de glutationa reduzida (GSH) intracelular de
células U937 em 24h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais.
Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos independentes.
Os valores são expressos como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ NAC e o grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
# diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Em 24h, também se verificou que o grupo Controle e Controle+ PGA
2
não apresentou diferenças significativas em concentração de GSSG. No
entanto, o grupo NAC+ PGA
2
teve esta concentração reduzida e o grupo
83
PGA
2
+ BSO/DEM aumentada, quando comparados aos seus controles,
respectivamente, conforme demonstrado na Figura 29.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
GSSG intracelular
(nmol/10
6
células)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 29: Concentração de glutationa oxidada (GSSG) intracelular de
células U937 em 24h de tratamento, nos diferentes grupos experimentais.
Resultados obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos independentes.
Os valores são expressos como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle+ NAC e o grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Segundo demonstra a Figura 30, em 24 horas, a relação [GSSG/GSH]
não diferiu significativamente entre os grupos Controle+ NAC e PGA
2
+ NAC;
entretanto, o grupo BSO/DEM+ PGA
2
demonstrou ter sofrido intenso estresse
oxidativo com o passar do tempo, ao passo que o grupo Controle+ PGA
2
teve
seu estado redox diminuído (Figura 30).
84
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Relação [GSSG/GSH]
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 30: Relação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de células U937 em 24h de
tratamento, nos diferentes grupos experimentais. Resultados obtidos de 3 wells
diferentes, em dois experimentos independentes. Os valores são expressos
como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle+ BSO/DEM e o grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Comparando-se os grupos experimentais entre eles mesmos em 1h e
24h, nota-se que as concentrações de GSH e GSSG intracelulares se
encontravam diminuídas significativamente no período de 24h de tratamento,
em relação ao de 1h, em todos os grupos estudados (p<0,05). No entanto,
quando se comparam as relações da concentração de glutationa oxidada
(GSSG) e glutationa reduzida (GSH) [GSSG/GSH] intracelular de macrófagos
U937 entre si no período de 1h e 24h de tratamento, vê-se que o grupo
Controle se oxida em 24h, comparado com 1h, de modo significativo, assim
como o faz o grupo Controle+ BSO/DEM (p<0,05). Todos os outros grupos se
85
reduzem em 24h, comparados com eles mesmos em 1h (p<0,05 para todos),
com exceção do grupo Controle+ PGA
2
, que não se altera.
5.5- Expressão da proteína MRP1 em macrófagos peritoneais
Conforme visto, o perfil de resposta dos macrófagos peritoneais e os
macrófagos U937 foi bastante semelhante, embora os níveis basais destas
células sejam diferentes. Porém, é difícil inferir exatamente o que ocorre nas
células se os parâmetros que medem o potencial redox destas são muitos.
Assim, de modo a visualizar-se de forma mais ampla esta resposta celular ao
estresse oxidativo gerado pelo tratamento dos macrófagos peritoneais com
oxidantes, antioxidantes e PGA
2
, fez-se mister avaliar-se a expressão da
MRP1, cuja expressão é regulada pelo complexo Nrf2/Keap1, sendo que a
proteína inibitória Keap1 é sensível ao estado redox. Em outras palavras,
situações de estresse oxidativo, ou tratamento com eletrófilos (como a PGA
2
)
devem incrementar a expressão da mesma pela liberação do Nrf2 que migra
para o núcleo em resposta à alteração redox na proteína inibitória Keap1.
Então, a expressão da proteína MRP1 em macrófagos peritoneais foi
medida em 6h e 24h de tratamento, uma vez que a ação genômica de muitas
drogas e hormônios só começa a ocorrer após, pelo menos, 90 minutos.
Os grupos experimentais foram demonstrados no desenho experimental no
item 4.7 da Metodologia, para ambos os tempos de tratamento. Foram
utilizadas 2 x 10
6
células por well. Os resultados foram obtidos de 2
experimentos independentes. Foram aplicadas amostras contendo 20μg/mL de
proteína por well.
As amostras foram submetidas a Western Blot, utilizando-se anti-MRP1
(primeiro anticorpo) e segundo anticorpo anti-IgG de camundongo marcado
com peroxidase. As bandas foram quantificadas por digitalização de imagem.
Para determinação da β-actina, foi utilizado anti-actina (primeiro anticorpo) e
segundo anticorpo anti-camundongo marcado com peroxidase.
Os dados relativos à expressão da proteína estão representados na
Figura 31. Observou-se que a resposta celular à expressão de MRP1 em 6h de
tratamento não se alterou significativamente entre os grupos.
86
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
1
Expressão relativa de MRP1
(unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
Figura 31: Expressão da proteína MRP1. A expressão relativa da MRP1
em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da MRP1 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 6h com PGA2
1mM. A- análise por immunoblot das amostras transferidas para membranas
de nitrocelulose e submetidas a western blot; 1- Controle; 2– Controle+ NAC;
3– Controle+ BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5- NAC+ PGA
2
; 6- BSO+
DEM/PGA
2
; B - valores arbitrários da expressão de MRP1. Western blot
representativo de 2 experimentos independentes. Foram aplicadas amostras
contendo 20μg/mL de proteína por well.
Os resultados descritos na Figura 32 representam os dados obtidos em
24h de tratamento. Neste período, observa-se um aumento significativo na
expressão desta bomba de extrusão de glutationa conjugada nos grupos
Controle+ PGA
2
e PGA
2
+ NAC, comparados aos seus controles.
1 2 3 4 5 6
A
KDa
190
MRP1
44
β-Actina
KDa
B
87
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
1
Expressão relativa de MRP1
(unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 32: Expressão da proteína MRP1 em macrófagos. A expressão
relativa da MRP1 em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da
quantidade de pixels das bandas da MRP1 pela quantidade de pixels das
bandas de beta-actina de cada amostra em macrófagos peritoneais controle e
tratados por 24h com PGA
2
1μM. A- análise por immunoblot das amostras
transferidas para membranas de nitrocelulose e submetidas a western blot; 1-
Controle; 2– Controle+ NAC; 3– Controle+ BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5-
NAC+ PGA
2
; 6- BSO+ DEM/PGA
2
; B - valores arbitrários da expressão de
MRP1. Western blot representativo de 2 experimentos independentes. Foram
aplicadas amostras contendo 20μg/mL de proteína por well.
* diferença significativa entre o Grupo Controle e o Grupo Controle+ PGA
2
(p<
0,05).
* * diferença significativa entre o Grupo Controle+ NAC e o Grupo PGA
2
+ NAC
(p< 0,05).
1 2 3 4 5 6
A
KDa
190
MRP1
44
β-Actina
B
KDa
88
5.6- Expressão da proteína HSP70 em macrófagos peritoneais
Discutiu-se que muitos parâmetros inferem desequilíbrio redox; assim,
como medida ainda essencial para uma melhor visualização da resposta
celular frente ao tratamento proposto, visou-se a determinar a expressão da
família das HSP70. A ativação dos heat shock factors (HSF) é sensível ao
estado redox pela presença de cisteínas reativas nas cadeias das mesmas.
Por isso, uma das primeiras respostas celulares ao tratamento com PGA
2
é
sempre a indução de HSP70, o que atesta a eficiência do tratamento com a
prostaglandina.
A expressão das isoformas HSC73 (do inglês Heat Shock Cognates –
isoforma constitutiva, de 73KDa) e HSP72 (induzível) em macrófagos
peritoneais foi medida em 6h e 24h de tratamento, uma vez que a ação
genômica de muitas drogas e hormônios só começa a ocorrer após, pelo
menos, 90 minutos. É sabido que 6h é o período de expressão gênica máxima
da família das HSP70.
Os grupos experimentais foram demonstrados no desenho experimental
no item 4.7 da Metodologia, para ambos os tempos de tratamento. Foram
utilizadas 2 x 10
6
células por well. Os resultados foram obtidos de 2
experimentos independentes. Foram aplicadas amostras contendo 20μg/mL de
proteína por well.
As amostras foram submetidas a Western Blot, utilizando-se anti-HSP70
(primeiro anticorpo) e segundo anticorpo anti-camundongo marcado com
peroxidase. As bandas foram quantificadas por digitalização de imagem. Para
determinação da β-actina, foi utilizado o anti-actina (primeiro anticorpo) e
segundo anticorpo anti-camundongo marcado com peroxidase.
Os dados podem ser visualizados na Figura 33. Analisando-se os
resultados após 6h de tratamento dos macrófagos peritoneais, notou-se que o
grupo Controle+ PGA
2
apresentou indução significativa de produção de HSP72,
comparado com o grupo Controle (p<0,05). O grupo Controle+ NAC também
apresentou aumento de expressão da HSP72 neste período (p<0,05). Nos
grupos tratados com BSO/DEM não apresentaram alteração. É importante
notar que em 6h de tratamento, só ocorreu expressão da HSP72, que é a
forma induzível.
89
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
1
Expressão relativa de HSP72 (unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 33: Expressão da proteína HSP72. A expressão relativa da
HSP72 em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de
pixels das bandas da HSP72 pela quantidade de pixels das bandas de beta-
actina de cada amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 6h
com PGA
2
1μM. A- análise por immunoblot das amostras transferidas para
membranas de nitrocelulose e submetidas a western blot; 1- Controle; 2–
Controle+ NAC; 3– Controle+ BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5- NAC+ PGA
2
;
6- BSO+ DEM/PGA
2
; B - valores arbitrários da expressão de HSP72. Western
blot representativo de 2 experimentos independentes. Foram aplicadas
amostras contendo 20μg/mL de proteína por well.
* diferença significativa entre o Grupo Controle e o Grupo Controle+ PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o Grupo Controle+ NAC e o Grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
A
KDa
73
HSP72
1 2 3 4 5 6
44
KDa
B
β-Actina
90
Segundo a Figura 34, após 24h de tratamento, ocorreu a expressão das
duas isoformas da família da HSP70: a HSC73 (constitutiva) e HSP72
(induzível). Houve um aumento significativo na expressão da HSC73, que é a
proteína constitutiva, no grupo Controle+ PGA
2
, comparado com o grupo
Controle (p<0,05). Os grupos PGA
2
+ NAC e PGA
2
+ BSO/DEM mostraram-se
com expressões diminuídas da HSC74 (p<0,05), comparados ao grupo
Controle+ PGA
2
, e sem alterações significativas comparados aos seus
controles, neste período.
91
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
1
Expressão relativa de HSC73
(unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
#
Figura 34: Expressão da proteína HSC73. A expressão relativa da
HSC73 em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de
pixels das bandas da HSC73 pela quantidade de pixels das bandas de beta-
actina de cada amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 24h
com PGA
2
1μM. A- análise por immunoblot das amostras transferidas para
membranas de nitrocelulose e submetidas a western blot; 1- Controle; 2–
Controle+ NAC; 3– Controle+ BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5- NAC+ PGA
2
;
6- BSO+ DEM/PGA
2
;
B - valores arbitrários da expressão de HSC73. Western
blot representativo de 2 experimentos independentes. Foram aplicadas
amostras contendo 20μg/mL de proteína por well.
* diferença significativa entre o Grupo Controle e o Grupo Controle+ PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o Grupo Controle+ NAC e o Grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
# diferença significativa entre o Grupo Controle+ BSO/DEM e o Grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
1 2 3 4 5 6
A
KDa
73
72
HSC73
KDa
44
β-Actina
B
92
Os resultados são apresentados na Figura 35. Em 24h de tratamento,
observou-se que ocorreu um aumento significativo na expressão da HSP72,
que é a proteína induzível, no grupo Controle+ PGA
2
, comparado com o grupo
Controle (p<0,05). Os grupos PGA
2
+ NAC e PGA
2
+ BSO/DEM mostraram o
mesmo perfil verificado na expressão da isoforma contitutiva, diferindo
significativamente de seus controles.
93
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
1
Expressão relativa de HSP72
(unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
#
Figura 35: Expressão da proteína HSP72. A expressão relativa da
HSP72 em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de
pixels das bandas da HSP72 pela quantidade de pixels das bandas de beta-
actina de cada amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 24h
com PGA
2
1μM. A- análise por immunoblot das amostras transferidas para
membranas de nitrocelulose e submetidas a western blot; 1- Controle; 2–
Controle+ NAC; 3– Controle+ BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5- NAC+ PGA
2
;
6- BSO+ DEM/PGA
2
; B - valores arbitrários da expressão de HSP72. Western
blot representativo de 2 experimentos independentes. Foram aplicadas
amostras contendo 20μg/mL de proteína por well.
* diferença significativa entre o Grupo Controle e o Grupo Controle+ PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o Grupo Controle+ NAC e o Grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
# diferença significativa entre o Grupo Controle+ BSO/DEM e o Grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
A
KDa
73
72
HSP72
KDa
44
β-Actina
1 2 3 4 5 6
B
94
5.7- Expressão da proteína HSP70 em macrófagos/ foam cells
Após a obtenção dos resultados de expressão da família das HSP70
em macrófagos peritoneais, visou-se determinar o que ocorreria com as foam
cells, oxidadas frente a ação da LDL oxidada.
Assim, a expressão de HSP70 (proteína de choque térmico de 70
kDa) foi analisada em macrófagos/ foam cells controle e tratados com PGA
2
nas concentrações de 1μM e 20μM, vinte e quatro horas após a incubação.
Foram utilizadas 2 x 10
6
células por well.
Os grupos experimentais foram demonstrados no desenho experimental
no item 4.9 da Metodologia, para ambos os tempos de tratamento. Foram
utilizadas 2 x 10
6
células por well. Os resultados foram obtidos de 1
experimento independente, em triplicata. Foram aplicadas amostras contendo
20μg/mL de proteína por well.
As amostras foram submetidas a Western Blot, utilizando-se anti-HSP70
(primeiro anticorpo) e segundo anticorpo anti-camundongo marcado com
peroxidase. As bandas foram quantificadas por digitalização de imagem. Para
determinação da β- actina, foi utilizado o anti-actina (primeiro anticorpo) e
segundo anticorpo anti-camundongo marcado com peroxidase.
Os dados foram apresentados na Figura 36. Os resultados obtidos
demonstram um aumento de 73% na expressão da HSP70 nos macrófagos/
foam cells tratados com PGA
2
1μM (p<0,05), quando comparado com o
controle tratado com PGA2 1μM, e uma diminuição de 67% de sua expressão
em macrófagos/ foam cells tratados com PGA
2
20μM, quando comparado com
o controle tratado com PGA2 20μM.
95
0,0
2000,0
4000,0
6000,0
8000,0
10000,0
12000,0
14000,0
16000,0
18000,0
Expressão relativa de HSP70 (unidades
arbitrárias)
Controle
Controle+LDLox
PGA2 1uM
PGA2 1uM+ LDLox
PGA2 20uM
PGA2 20uM+ LDLox
*
* *
#
Figura 36: Expressão da proteína HSP70. A expressão relativa da
HSP70 em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de
pixels das bandas da HSP70 pela quantidade de pixels das bandas de beta-
actina de cada amostra em macrófagos/ foam cells controle e tratados com
PGA
2
1μM e 20μM. A- análise por immunoblot das amostras transferidas para
membranas de nitrocelulose e submetidas a western blot; 1- Controle; 2–
Controle+ LDLox; 3– Controle+ PGA
2
1μM; 4- LDLox+ PGA
2
1μM; 5- Controle+
PGA
2
20μM; 6- LDLox+ PGA
2
20μM; B - valores arbitrários da expressão da
HSP70. Western blot representativo de 1 experimento independente, com três
well. Foram aplicadas amostras contendo 20μg/mL de proteína por well.
* diferença significativa entre o grupo Controle e Controle+ PGA
2
1μM (p<
0,05).
* * diferença significativa entre o grupo Controle e o grupo Controle LDLox (p<
0,05).
# diferença significativa entre o grupo Controle LDLox e o grupo PGA
2
1μM+
LDLox (p< 0,05).
A
B
7
3
HSP 70
KDa
1 2 3 4 5 6
44
β-Actina
KDa
96
5.8- Expressão da proteína iNOS em macrófagos peritoneais
Teoricamente, a oxidação gerada intracelularmente pelo tratamento dos
macrófagos peritoneais imita o que ocorre em foam cells e também em células
inflamatórias. Sabe-se que a inflamação gera estresse oxidativo e que isto é
essencial para que ocorra transcrição gênica de diversas moléculas pró-
inflamatórias: uma delas é a iNOS que, inclusive, pode se modificar
drasticamente no processo da aterosclerose. Na verdade, a forma induzida da
NO sintase é expressa somente em resposta à ativação do NF-κB nos
macrófagos e constitui-se, por isso, um importante marcador dos mecanismos
de expressão envolvidos nos tratamentos aplicados.
Desta forma, a expressão da iNOS em macrófagos peritoneais foi
medida em 6h e 24h de tratamento, uma vez que a ação genômica de muitas
drogas e hormônios só começa a ocorrer após, pelo menos, 90 minutos.
Os grupos experimentais foram demonstrados no desenho experimental
no item 4.7 da Metodologia, para ambos os tempos de tratamento. Foram
utilizadas 2 x 10
6
células por well. Os resultados foram obtidos de 2
experimentos independentes. Foram aplicadas amostras contendo 20μg/mL de
proteína por well.
As amostras foram submetidas a Western Blot, utilizando-se anti-iNOS
(primeiro anticorpo) e segundo anticorpo anti-camundongo marcado com
peroxidase. As bandas foram quantificadas por digitalização de imagem. Para
determinação da β-actina, foi utilizado o anti-actina (primeiro anticorpo) e
segundo anticorpo anti-camundongo marcado com peroxidase.
Os resultados podem ser visualizados na Figura 37. Em 6h de
tratamento, somente o grupo Controle+ NAC apresentou aumento significativo
na expressão da iNOS (p<0,05). Os outros grupos não mostraram alterações
em seus níveis de expressão.
97
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
1
Expressão relativa de iNOS
(unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
Figura 37: Expressão da proteína iNOS. A expressão relativa da iNOS
em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da iNOS pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 6h com PGA
2
1μM.
A- análise por immunoblot das amostras transferidas para membranas de
nitrocelulose e submetidas a western blot; 1- Controle; 2– Controle+ NAC; 3–
Controle+ BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5- NAC+ PGA
2
; 6- BSO+
DEM/PGA
2
; B - valores arbitrários da expressão da iNOS. Western blot
representativo de 2 experimentos independentes. Foram aplicadas amostras
contendo 20μg/mL de proteína por well.
* diferença significativa entre o Grupo Controle+ NAC e o Grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
Os resultados estão expressos na Figura 38. Após 24h de tratamento, o
grupo Controle+ NAC continuava com expressão aumentada em relação ao
seu controle e aos outros grupos (p<0,05). O grupo Controle+ BSO/DEM
1 2 3 4 5 6
A
KDa
130
iNOS
B
44
β-Actina
KDa
98
também se apresentou aumentado significativamente (p<0,05), comparado ao
seu controle, no mesmo período de tratamento.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
1
Expressão relativa de iNOS
(unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
** *
Figura 38: Expressão da proteína iNOS. A expressão relativa da iNOS
em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da iNOS pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 24h com PGA
2
1μM. A- análise por immunoblot das amostras transferidas para membranas de
nitrocelulose e submetidas a western blot; 1- Controle; 2– Controle+ NAC; 3–
Controle+ BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5- NAC+ PGA
2
; 6- BSO+
DEM/PGA
2
; B - valores arbitrários da expressão de iNOS. Western blot
representativo de 2 experimentos independentes. Foram aplicadas amostras
contendo 20μg/mL de proteína por well.
* diferença significativa entre o Grupo Controle+ NAC e o Grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
* * diferença significativa entre o Grupo Controle+ BSO/DEM e o Grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
1 2 3 4 5 6
A
KDa
130
iNOS
44
β-Actina
B
KDa
99
5.9- Atividade da 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA
redutase) em macrófagos peritoneais
Foi demonstrado que a PGA
2
1μM, em macrófagos/ foam cells diminui a
formação de colesterol endógeno, a partir do acetil-CoA (Homem de Bittencourt
Jr. et al, 2007), isto é, ocorre modificação destas rotas bioquímicas por ação
deste prostanóide. Isso pode sugerir inibição da atividade ou diminuição da
expressão de HMG-CoA redutase, enzima- chave da síntese de colesterol.
Assim, viu-se da importância de determinar a atividade da HMG-CoA redutase.
Então, a atividade HMG-CoA redutase foi medida por técnica de
monitoramento da oxidação do NADPH na presença de HMG-CoA. Uma
unidade da enzima é definida como a quantidade necessária para oxidar 2
nmols de NADPH (ou 1 nmol de HMG-CoA) por minuto a 37ºC (Edwards et al.,
1979).
No caso de células tratadas com CP-PGs, como a PGA
2
, o DTT
(ditiotreitol) deve ser omitido do tampão de ensaio, conforme descrito
anteriormente. Assim, para testar o efeito do DTT (que pode liberar CP-PGs
ligadas por adições de Michael), cada amostra foi ensaiada 2 vezes: uma na
ausência e outra na presença de DTT. O DTT sempre aumenta a atividade da
HMG-CoA redutase, porque ela é uma enzima que apresenta várias cisteínas
reativas que permanecem oxidadas dentro das células e nas preparações,
dependendo do potencial redox empregado (ou intracelular).
Macrófagos peritoneais foram tratados com PGA
2
1μM, na presença ou
ausência de butionina sulfoxamina e dietilmaleato (BSO/DEM, 2,5μM/ 5mM,
para depleção da glutationa [GSH] intracelular) ou N-acetilcisteína (NAC,
20mM, que eleva os níveis de GSH) por 1h e por 24h. Os resultados estão
expressos como a média ± erro padrão da média, valores obtidos de três
preparações experimentais em triplicatas (2x10
6
células por well).
Os grupos experimentais estão demonstrados no desenho experimental
no item 4.7 da Metodologia, para ambos os tempos de tratamento.
Os resultados a seguir descritos são relativos à atividade da HMG-CoA
redutase em macrófagos peritoneais, inferida pelo consumo de NADPH
+
em
presença da enzima, em 1h de tratamento. Segundo consta na Figura 39, os
dados sugerem que a PGA
2
(1μM) diminui a atividade desta enzima em 64%,
100
na ausência de DTT, comparando-se o grupo Controle com o grupo Controle+
PGA
2
(p<0,05) em 1h. Na presença de DTT, observa-se que a inibição
persistiu, mas que havia uma atividade latente muito maior que a ensaiada na
ausência do redutor. Neste mesmo período de tratamento, a depleção de GSH
pela presença de BSO/DEM no meio, juntamente com a PGA
2
,
promoveu
redução da atividade da HMG-CoA redutase ainda maior, comparando-se com
o grupo Controle+ BSO/DEM (p<0,05), enquanto que o tratamento com NAC
não apresentou diferença significativa.
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
Sem DTT Com DTT
HMG-CoA redutase (U/mg de proteína)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
*
* *
Figura 39: Atividade enzimática da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A
redutase (HMG-CoA redutase), em 1h de tratamento com PGA
2
1μM, em
macrófagos peritoneais nos diferentes grupos experimentais. Resultados
obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos independentes. Os valores
são expressos como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o Grupo Controle e o Grupo Controle + PGA
2
1μM
(p< 0,05).
* * diferença significativa entre o Grupo Controle+ BSO/DEM e o Grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Os resultados referentes a 24h de tratamento podem podem ser
visualizados nas Figuras 40 e 41, respectivamente. Em 24h de tratamento, a
101
atividade da HMG-CoA redutase foi reduzida em 56% no grupo Controle+
PGA
2
com relação ao Controle, em macrófagos residentes do grupo ensaiado
sem DTT.
O tratamento das amostras de 24h com ditiotreitol (DTT, 10 mM) no
momento do ensaio reverteu completamente a inibição. Por outro lado, o
tratamento conjunto com BSO/DEM e PGA
2
(que reduzem a GSH
significativamente, p<0,05), bloqueia a atividade da enzima na forma ativa, mas
leva a um aumento de 2,6 vezes (p<0,01) na quantidade total da redutase,
sugerindo aumento na expressão da enzima, corroborando estudos anteriores
deste laboratório.
102
0,0
200,0
400,0
600,0
800,0
1000,0
1200,0
1400,0
1600,0
1800,0
Sem DTT Com DTT
HMG-CoA redutase (U/mg de proteína)
Controle
Controle+PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
#
#
Figura 40: Atividade enzimática da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A
redutase (HMG-CoA redutase), em 24h de tratamento com PGA
2
1μM, em
macrófagos peritoneais nos diferentes grupos experimentais. Resultados
obtidos de 3 wells diferentes, em dois experimentos independentes. Os valores
são expressos como a Média ± Erro Padrão da Média.
* diferença significativa entre o Grupo Controle e o Grupo Controle + PGA
2
1μM
ou entre o grupo Controle+ NAC e PGA
2
1μM+ NAC (p< 0,05).
* * diferença significativa entre o Grupo Controle+ NAC e o Grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
# diferença significativa entre o Grupo Controle+ BSO/DEM e o Grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
Comparando-se os grupos experimentais entre eles mesmos em 1h e
24h, nota-se que no ensaio sem DTT, a atividade da HMG-COA redutase
aumentou significativamente no período de 24h de tratamento, em relação ao
de 1h, nos grupos Controle, Controle+ PGA
2
e PGA
2
+ BSO/DEM (p<0,01),
enquanto os outros grupos não apresentaram variação. No entanto, quando se
adiciona DTT ao ensaio, a atividade da HMG-CoA redutase de macrófagos
peritoneais comparados entre si no período de 1h e 24h de tratamento,
apresenta-se inalterada no grupo Controle e aumentada em todas os outros
103
grupos em 24h, comparados com 1h, de modo significativo (p<0,05 para
todos).
5.10- Expressão da proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-
CoA redutase) em macrófagos peritoneais
Uma vez que a atividade da HMG-CoA redutase se mostrou
drasticamente inibida pela presença de PGA
2
no meio, fez-se mister a
investigação da expressão da enzima, para que se pudesse inferir se a
diminuição da atividade pela prostaglandina era dada por ação de inibição da
enzima, por ligação da PGA
2
nas cisteínas reativas desta, da expressão ou de
ambas.
A expressão da 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA
redutase) em macrófagos peritoneais foi medida somente em 24h de
tratamento, uma vez que se sabe que a expressão da enzima pode sofrer
alterações que só se verificam nesse período de tempo. Sendo a expressão
desta proteína microssomal bastante baixa, resolvemos optar pela
imunoprecipitação seguida de SDS-PAGE, ao invés do Western blot
convencional diretamente dos extratos celulares.
Os grupos experimentais foram demonstrados no desenho experimental
no item 4.7 da Metodologia, para ambos os tempos de tratamento. Foram
utilizadas 2 x 10
6
células por well. Os resultados foram obtidos de 2
experimentos independentes. As amostras foram carregadas com quantidade
de proteína de 20μg/mL. Também foi utilizado um grupo Controle Negativo da
imunoprecipitação, já que as amostras foram preparadas por
imunoprecipitação.
Após a imunoprecipitação, as amostras foram submetidas a Western
Blot, utilizando-se anti-HMG-Coa redutase (primeiro anticorpo) e segundo
anticorpo anti-camundongo marcado com peroxidase. As bandas foram
quantificadas por digitalização de imagem. Para determinação da β- actina, foi
utilizado o anti-actina (primeiro anticorpo) e segundo anticorpo anti-
camundongo marcado com peroxidase.
Conforme mostra a Figura 41, todos os grupos experimentais não
apresentaram diferença significativa na expressão desta enzima, com exceção
do grupo PGA
2
+ BSO/DEM, que comparado com seu controle e com os outros
104
grupos, aumentou 2,6 vezes (p<0,01) a expressão da HMG-CoA redutase, em
24h, o que é compatível com o aumento de atividade observado para o mesmo
grupo.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Expressão relativa de HMG-CoA redutase (unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
Controle Negativo
*
* *
Figura 41: Expressão da proteína HMG-CoA redutase em macrófagos
peritoneais controle e tratados por 24h com PGA
2
1μM. A- análise por
immunoblot das amostras transferidas para membranas de nitrocelulose e
submetidas a western blot; 1- Controle; 2– Controle+ NAC; 3– Controle+
BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5- NAC+ PGA
2
; 6- BSO+ DEM/PGA
2
; B -
valores arbitrários da expressão da HMG-CoA redutase. Western blot
representativo de 2 experimentos independentes. Foram aplicadas amostras
contendo 20μg/mL de proteína por well.
* diferença significativa entre o Grupo Controle+ BSO/DEM e o Grupo PGA
2
1μM+ BSO/DEM (p< 0,05).
* * diferença significativa entre os grupos experimentais e o grupo Controle
Negativo (p< 0,05).
KDa
43
A
B
HMG-CoA
redutase
1 2 3 4 5 6 7
105
5.11- Expressão da proteina CD36 em macrófagos peritoneais
Já está demonstrado que ocorre a inibição da incorporação de colesterol
exógeno em macrófagos/ foam cells tratados com PGA
2
1μM (Homem de
Bittencourt Jr. et al, 2007). Assim, era importante determinar se ocorria down-
regulation de receptores scavenger na membrana dos macrófagos peritoneais.
Dentre os muitos receptores scavenger que fazem captação de colesterol do
meio extracelular, um dos mais importantes e sabidamente envolvidos com o
acúmulo de colesterol em macrófagos e, portanto, com a aterosclerose, é o
receptor CD36.
A expressão do receptor scavenger CD36 em macrófagos peritoneais foi
medida em 6h e 24h de tratamento, uma vez que a ação genômica de muitas
drogas e hormônios só começa a ocorrer após, pelo menos, 90 minutos.
Os grupos experimentais foram demonstrados no desenho experimental
no item 4.7 da Metodologia, para ambos os tempos de tratamento. Foram
utilizadas 2 x 10
6
células por well. Os resultados foram obtidos de 2
experimentos independentes. Foram aplicadas amostras contendo 20μg/mL de
proteína por well.
As amostras foram submetidas a Western Blot, utilizando-se anti-CD36
(primeiro anticorpo) e segundo anticorpo anti-camundongo marcado com
peroxidase. As bandas foram quantificadas por digitalização de imagem. Para
determinação da β- actina, foi utilizado o anti-actina (primeiro anticorpo) e
segundo anticorpo anti-camundongo marcado com peroxidase.
Os resultados estão demonstrados na Figura 42. Os dados obtidos do
tratamento dos grupos experimentais em 6h, mostraram que a expressão do
receptor scavenger CD36 está diminuída no grupo PGA
2
+ NAC, comparado ao
seu controle (p<0,05). Os grupos Controle+ BSO/DEM e PGA
2
+ BSO/DEM
apresentaram expressões diminuídas deste receptor comparadas com todos os
outros grupos (p<0,05).
106
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
1
Expressão relativa de CD36/FAT
(unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
*
* *
Figura 42: Expressão da proteína CD36. A expressão relativa da CD36
em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da CD36 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 6h com PGA
2
1μM.
A- análise por immunoblot das amostras transferidas para membranas de
nitrocelulose e submetidas a western blot; 1- Controle; 2– Controle+ NAC; 3–
Controle+ BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5- NAC+ PGA
2
; 6- BSO+
DEM/PGA
2
; B - valores arbitrários da expressão de CD36. Western blot
representativo de 2 experimentos independentes. Foram aplicadas amostras
contendo 20μg/mL de proteína por well.
* diferença significativa entre o Grupo Controle+ NAC e o Grupo PGA
2
1μM+
NAC (p< 0,05).
* * diferença significativa entre os Grupos Controle+ BSO/DEM e PGA
2
1μM+
BSO/DEM, comparados a todos os outros grupos (p< 0,05).
A
KDa
90
CD36
1 2 3 4 5 6
KDa
B
44
β-Actina
107
Quando se analisa a resposta celular em 24h de tratamento, nota-se que
não há diferença significativa entre os grupos. Estes dados estão
representados na Figura 43.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
1
Expressão relativa de CD36/FAT
(unidades arbitrárias)
Controle
Controle+ PGA2
Controle+ NAC
PGA2+ NAC
Controle+ BSO/DEM
PGA2+ BSO/DEM
Figura 43: Expressão da proteína CD36. A expressão relativa da CD36
em termos da beta-actina foi obtida pela divisão da quantidade de pixels das
bandas da CD36 pela quantidade de pixels das bandas de beta-actina de cada
amostra em macrófagos peritoneais controle e tratados por 24h com PGA
2
1μM. A- análise por immunoblot das amostras transferidas para membranas de
nitrocelulose e submetidas a western blot; 1- Controle; 2– Controle+ NAC; 3–
Controle+ BSO/DEM; 4- Controle+ PGA
2
; 5- NAC+ PGA
2
; 6- BSO+
DEM/PGA
2
; B - valores arbitrários da expressão de CD36. Western blot
representativo de 2 experimentos independentes. Foram aplicadas amostras
contendo 20μg/mL de proteína por well.
A
KDa
90
CD36
1 2 3 4 5 6
44
β-Actina
B
KDa
108
6. DISCUSSÃO
A aterosclerose relacionada a doenças cardiovasculares responde a,
pelo menos, uma morte a cada três em países industrializados; nos Estados
Unidos da América, estas mortes podem chegar a 40% de todas as mortes
considerando-se todas as faixas etárias de todos os grupos (Mackay &
Mensah, 2004). Entretanto, apesar de desordens no plasma e no metabolismo
intracelular lipídico possivelmente serem características da aterosclerose,
muitos aspectos do desequilíbrio lipídico que acompanham esta doença
continuam sem respostas. Assim, compreender a correlação da aterosclerose
com as alterações lipídicas requer investigação meticulosa de muitos aspectos
do metabolismo destes lipídeos. Particularmente a este respeito, a presença de
cisteínas reativas em fatores de transcrição e enzimas-chave deste
metabolismo pode ditar, ou não, o acúmulo de colesterol intracelular e, assim, a
progressão da aterosclerose (Gutierrez et al, 2007). Contudo, poucos estudos
visaram aplicabilidade nestes achados. O grande efeito inibitório das CP-PGs
na progressão da aterosclerose in vivo (Homem de Bittencourt Jr. et al, 2007)
sugere uma nova conceituação da aterosclerose e de seu tratamento.
Foi demonstrado que o tratamento de macrófagos/ foam cells, in vitro,
com PGA
2
em 24h provoca uma inibição da incorporação de colesterol e éster
de colesterol exógeno, assim como diminuição da formação de colesterol
endógeno, a partir da acetil- CoA (sugerindo inibição da atividade ou
diminuição da expressão de HMG-CoA redutase, enzima chave da síntese de
colesterol), diminuição da formação de ésteres de colesterol (sugerindo
diminuição da atividade ou da expressão da ACAT) e uma diminuição de
formação de colesterol livre (sugerindo diminuição da atividade ou da
expressão da CEH). Ainda, em presença de PGA
2
o processo de exportação de
colesterol a partir do meio intracelular está aumentado (Homem de Bittencourt
Jr. et al, 2007). As enzimas envolvidas no metabolismo do colesterol, no
entanto, além dos processos de regulação metabólica classicamente descritos,
podem ser também reguladas pelo estado redox, já que apresentam cisteínas
reativas, como dito anteriormente. Portanto, fez-se mister o estudo destas rotas
metabólicas, tratando-as com PGA
2
e comparando os resultados obtidos com
modificações do potencial redox intracelular destas.
109
Conforme visto, os macrófagos/ foam cells e os macrófagos peritoneais
eram obtidos de ratos Wistar. Então, além de pesquisarmos o comportamento
destas células entre elas, também comparamos os resultados obtidos em
macrófagos de ratos com macrófagos humanos da linhagem U937, uma vez
que vários trabalhos científicos que estudam diversas doenças, incluindo a
aterosclerose, utilizam-se deste último tipo, pela facilidade de obtenção, cultura
e tratamento destas células, além de elas responderem como ocorre in vivo na
aterosclerose (Erdogan et al, 2006; Hammad et al, 2006; Vogel et al, 2005).
O primeiro experimento feito foi a medida da atividade da Acil-CoA:
Colesterol O-Aciltransferase (ACAT) em macrófagos/ foam cells, para que se
pudesse avaliar o que ocorria nesta rota bioquímica quando estas células eram
tratadas com PGA
2
. Esta é a enzima que primeiramente será discutida.
A transformação dos macrófagos peritoneais em foam cells, pelo
tratamento com LDL oxidada, elevou em 280% a atividade ACAT em relação
aos controles, conforme visto em nosso trabalho. Sabe-se que a LDL oxidada
representa um fator adicional capaz, por si só, de introduzir perturbação na via
de síntese de lipídios, que não é influenciada pelo estado redox do macrófago
(Bravo et al, 2001). Também é sabido que o desenvolvimento de foam cells
poderia ativar o processo de formação de vesículas com ACAT1 pelo retículo
endoplasmático (Sakashita et al, 2000). Entretanto, o tratamento destas células
com PGA
2
, por 24h, na concentração de 1μM, reduziu em 33% a atividade
desta enzima. Na concentração de 20μM, a PGA
2
parece ser menos efetiva
(inibição estatisticamente não significativa) em macrófagos/ foam cells.
A regulação das enzimas envolvidas no metabolismo intracelular do
colesterol em macrófagos é essencial para manutenção do equilíbrio lipídico do
macrófago: a HMG-CoA redutase fazendo a síntese endógena do colesterol; a
CEH formando colesterol livre (para que este possa ser exportado da célula) e
a ACAT gerando ésteres de colesterol (que é a forma de armazenamento
intracelular). Então, as drásticas alterações na atividade da ACAT em
macrófagos/ foam cells tratados com PGA
2
por 24h, tornou necessário a
análise da atividade da mesma sob o efeito dos agentes oxidantes e
antioxidantes em macrófagos peritoneais, em diferentes tempos (1h ou 24h),
uma vez que modificações intracelulares na atividade ou expressão destas
enzimas podem promover o acúmulo de ésteres de colesterol em macrófagos
110
vasculares, sendo este o motivo da corrida científica em busca de drogas que
atuem eficazmente sobre elas (Ru Su et al, 2005). Diversos estudos
demonstram a perturbação que oxidantes ou antioxidantes podem gerar no
metabolismo lipídico. Curiosamente, parece que a natureza possui uma
maneira singular de regular o metabolismo lipídico, que consiste na presença
de resíduos de cisteína reativas nas enzimas-chave desta rota e nos fatores de
transcrição, que prontamente respondem a alterações do equilíbrio redox, e era
justamente nisto que a hipótese deste trabalho estava baseada (Gutierrez et al,
2007).
A atividade da ACAT1, presente em macrófagos é severamente inibida
por vários reagentes modificadores de tióis, incluindo o ácido sulfônico p-
cloromercúriobenzeno, sugerindo que algum resíduo de cisteína (ou vários)
devem estar perto ou no sitio ativo da enzima. A cisteína 467 é o maior alvo do
o ácido sulfônico p-cloromercúriobenzeno e sua ligação com esta substância
leva a inativação da ACAT1 humana (Lu et al, 2002). Interessantemente,
ACAT1 de macrófagos contém nove resíduos críticos de cisteínas, que
sugerem a grande sensibilidade desta enzima a modificações de estado redox
(Schissel et al, 1995; Guo et al, 2005), enquanto alterações na cisteína 467
levam à completa inativação da ACAT (Lu et al, 2002). Embora a estrutura e a
função da ACAT estejam bem definidas, os fatores que a regulam ainda não
estão claros. A disponibilidade de colesterol livre e de ácidos graxos, citocinas
e homônios, a concentração de HDL plasmática, a regulação alostérica e a
regulação pós-transcricional são sugeridas na regulação da ACAT (Li &
Pownall, 2000; Panousis & Zuckerman, 2000; Xie et al, 2002; Lee & Carr,
2004). Como a PGA
2
possui um centro eletrofílico e a ACAT possui cisteínas,
foi testada a hipótese de que o estado redox regularia sua atividade, assim
como a PGA
2
. Observou-se que em macrófagos peritoneais, tratados com
oxidantes e antioxidantes, o tratamento com a PGA
2
(1μM) provocou um
aumento significativo na atividade da ACAT em 1h, quando as células controle
são comparadas com o grupo controle+PGA
2
, e uma tendência ao aumento em
24h (não significativo). No entanto, os perfis encontrados para o grupo controle
e grupo PGA
2
em
presença de BSO/DEM no meio e grupo controle e em
presença de NAC no meio, em 1h de tratamento, não variaram
significativamente. Já em 24h de tratamento, a depleção de GSH pela
111
presença de BSO/DEM no meio, juntamente com a PGA
2
,
promoveu redução
significativa da atividade da ACAT, comparando-se os grupos
Controle+BSO/DEM e PGA
2
+ BSO/DEM, enquanto que o tratamento com NAC
potencializou-a, se se comparar Controle+ NAC e PGA
2
+ NAC.
Comparando-se os tipos celulares estudados, é importante ressaltar que
o aumento da atividade da ACAT em macrófagos peritoneais é um dado
completamente inesperado, já que a PGA
2
é eletrofílica e inibe dramaticamente
a atividade da ACAT em foam cells, conforme discutido. Em uma primeira
análise, estes dados parecem sugerir que a PGA
2
agiria acumulando ésteres
de colesterol em macrófagos peritoneais, levando à aterosclerose e não
diminuindo o acúmulo, conforme demonstrado por Homem de Bittencourt Jr. e
colaboradores (2007). Porém, estudando-se os resultados com mais cautela,
nota-se que, em realidade, o perfil encontrado na atividade da ACAT em
macrófagos/ foam cells foi semelhante ao observado em macrófagos
peritoneais, em meio pró-oxidante, pois, ao que parece, a oxidação do meio
intracelular gera um microambiente que é semelhante àquele obtido pela LDL
oxidada. Assim, em ambos os tipos celulares, quando se adiciona a PGA
2
na
concentração de 1μM, ocorre inibição da atividade da ACAT. Curiosamente,
estes dados vêm de encontro com as observações da literatura, que
demonstram que a depleção de GSH (meio oxidado) leva à inibição da
formação de ésteres de colesterol em células cancerígenas humanas (Madesh
et al, 1998) e em macrófagos (Bravo et al, 2001). Para corroborar com os
resultados obtidos, notou-se que a proteção gerada pela adição de um
antioxidante como o NAC, faz com que a atividade da ACAT aumente, frente à
ação da PGA
2
. Isto sugere que a PGA
2
só inibe a atividade da ACAT em meio
oxidado realmente. Possivelmente isto ocorre porque o aumento de pró-
oxidantes na célula leva à depleção de GSH, sobrando, desta forma, menos
glutationa para reagir coma a PGA
2
. Assim, esta fica livre e em maior
quantidade, quando comparada com os outros grupos experimentais, para
reagir com a cisteína reativa da ACAT, por adição nucleofílica, gerando uma
ligação covalente com a enzima e inibindo sua atividade. Em situação
contrária, quando se tem aumento de antioxidantes, sobra mais GSH livre e
NAC para reagir com a CP-PG, anulando o efeito biológico desta sobre a
atividade da enzima. Gesquiere e colaboradores, em 1999, demonstraram, in
112
vitro, que o estresse oxidativo, induzido por azobis- amidinopropano em células
da musculatura lisa, fez com que estas células apresentassem acúmulo de
colesterol, aparentemente resultado de um aumento da biossíntese de
colesterol e sua esterificação, uma diminuição da colesteril-éster hidrolase
intracelular e uma redução da exportação de colesterol. Todos estes
parâmetros se apresentaram apostos quando foram usados antioxidantes.
Existe, ainda, outra possibilidade: como a medida da atividade da ACAT nas
células foi indireta, e não nos microssomos (isto é, as células foram tratadas
com oleato de colesterol marcado e a incorporação do
14
C nos ésteres de
colesterol foi avaliada), é sempre possível que os efeitos contraditórios possam
ser devidos a uma enorme redução na hidrólise de ésteres de colesterol nestas
células, o que já foi demonstrado (Homem de Bittencourt Jr. et al, 2007).
Portanto, não se pode descartar a possibilidade de que o acúmulo de ésteres
de colesterol, neste caso, possa ser devido a uma redução na hidrólise
mediada pelas colesteril-éster hidrolases.
Ainda mais curiosos ficam estes resultados quando comparamos o que
ocorre com os grupos experimentais de macrófagos peritoneais, em relação a
eles mesmos em 1h e 24h. Viu-se que em 24h a atividade da ACAT aumenta
significativamente em todos os grupos, comparado ao que se tinha em 1h, com
exceção dos grupos que foram tratados com BSO/DEM. Sabe-se que as
células tentam se adaptar frente a substâncias oxidantes e antioxidantes, que
geram modificações de seu potencial redox. Realmente, este quadro fica claro
em 24h, mais do que numa situação aguda (1h), já que há aumento da
atividade da ACAT, inclusive no controle não tratado, demonstrando que o
próprio estresse pela cultura celular a que os macrófagos foram submetidos,
mesmo tentando-se manter uma situação semelhante à fisiológica, gera
modificações no estado redox destas células. Estes dados vêm de encontro
com o que se verifica quando se analisam os resultados de glutationa oxidada
e estado redox (que aumentam quando se comparam os mesmos grupos entre
si em 1h e 24h em quase todos os grupos).
Como os resultados iniciais obtidos foram muito interessantes e com
comportamentos completamente inesperados nos dois tipos celulares, viu-se
que, para que se tivesse certeza do controle redox da enzima, fazia-se mister o
estudo do estado redox das células.
113
A homeostase do estado redox intracelular é regulada por moléculas
contendo grupos tiol (como a glutationa e tiorredoxina) e a manutenção desta
homeostasia (isto é, o balanço apropriado entre oxidantes e antioxidantes) é
essencial para a sustentação das propriedades funcionais celulares. No
entanto, este balanço é perpetuamente ameaçado por fatores externos, como o
aumento de espécies ativas de oxigênio durante a inflamação ou pela
exposição destas células a xenobióticos, que são metabolizados depletando os
antioxidantes intracelulares (Kim & Surh, 2006). Ao longo da evolução, os seres
vivos tiveram que desenvolver um mecanismo capaz de enfrentar as situações
de estresse oxidativo, criando um sistema de defesa que permitisse recuperar
o balanço redução/ oxidação, ou balanço redox celular (Monks et al, 1990).
Várias são as substâncias que participam ativamente deste sistema de defesa,
por exemplo: a enzima superóxido dismutase (SOD) - responsável pela
destruição do radical superóxido, formando peróxido de hidrogênio; a catalase
(CAT) - enzima responsável pela redução do peróxido de hidrogênio à água; a
glutationa peroxidase (GPx) – enzima responsável pela conversão de peróxido
de hidrogênio à água e hidroperóxidos orgânicos em álcool; vitaminas (E e C),
que são scavenger de radicais livres, e outros. Dentre as defesas contra o
estresse oxidativo, uma das mais importantes é a glutationa (GSH), que é um
tripeptídeo composto por um glutamato, uma glicina e uma cisteína, estando
presente em todas as células dos mamíferos. A glutationa é um potente
detoxificante, que permite ao organismo livrar-se de radicais livres, toxinas e
poluentes, formando compostos solúveis (através da ligação com o grupo
sulfidrila existente na cisteína) que podem ser excretados (Jaeschke, 1990).
Diversas funções celulares são influenciadas pelo potencial redox
intracelular, como cascatas de sinalização ativadas por estresse oxidativo,
apoptose, indução de permeabilidade mitocondrial, liberação de fatores de
amplificação da morte mitocondrial, ativação das caspases intracelulares, dano
ao DNA e transcrição de genes (Le Bras et al, 2005; Gayarre et al, 2005; Kim &
Surh, 2006). O mecanismo pelo qual a transcrição de genes específicos é
regulado pelo estado redox em células eucarióticas é bastante complexo,
porém, pesquisas das últimas décadas sugerem que fatores de transcrição
sensíveis ao estado redox têm papel importante neste processo (Arrigo, 1999).
114
As prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs) das séries A e J têm
como característica principal a presença de uma carbonila α,β-insaturada
(Gutierrez et al, 2007), conforme descrito anteriormente. Isto faz com que estas
moléculas sejam extremamente reativas, tornando-as capazes de modular as
funções celulares por múltiplos mecanismos, incluindo a modificação covalente
de resíduos de cisteína pela adição de Michael (Gayarre et al, 2007). Além
disto, as CP-PGs podem formar ligações covalentes com grupamento tiol,
presente na glutationa e em proteínas. Muitas destas proteínas já foram
identificadas e as modificações funcionais importantes que a ligação destes
prostanóides geram, quando se ligam a grupamentos sulfidrila nas proteínas,
contribuem para seus efeitos biológicos (Gayarre et al, 2005). Alguns fatores de
transcrição e moléculas sinalizadoras relacionadas possuem resíduos de
cisteína que servem como sensores redox e a oxidação destas cisteínas
podem modular suas funções fisiológicas. Através de modificações covalentes,
a 15d-PGJ
2
, outra CP-PG, por exemplo, pode oxidar resíduos críticos de
fatores de transcrição sensíveis ao estado redox ou seus reguladores (Kim &
Surh, 2006).
Embora concentrações fisiológicas das CP-PGs não sejam estressantes
para as células, dependendo da dose empregada e do ambiente intracelular,
estes prostanóides podem bloquear a síntese de proteínas, causar dano no
citoesqueleto e ser extremamente tóxicos para a célula (Kim & Surh, 2006;
Gutierrez et al, 2007)
Desta forma, várias linhagens celulares diferentes foram utilizadas com
vistas de comparação entre as respostas destas frente a agentes redutores e
oxidantes e à PGA
2
, em relação ao estado redox e ao metabolismo lipídico.
Assim, começou-se testando macrófagos/ foam cells e em seguida macrófagos
peritoneais e da linhagem U937. Os estudos destes tipos celulares, no entanto,
devem ter prosseguimento.
É importante ressaltar que os efeitos das CP-PGs dependem de sua
captação pelas células e este fenômeno pode ser tão efetivo que se torna difícil
detectar estas substâncias in vivo ou em cultura de células (Gutierrez et al,
2007). Passaremos a discutir, então, o potencial redox intracelular.
O estado redox celular dos vários grupos experimentais foi testado com
agentes oxidantes (BSO/DEM e a própria PGA
2
, já que esta CP-PG gasta a
115
GSH intracelular, induzindo estado de estresse oxidativo) e com antioxidantes
(NAC), em diferentes tempos (1h ou 24h para medidas de estado redox celular
e 6h e 24h para medida de expressão de proteínas envolvidas com o controle
do estado redox), e a resposta celular frente a estes agentes perturbadores foi
analisada.
Sabe-se que a PGA
2
é eletrofílica e, portanto, pode ser considerada um
agente oxidante, nos termos acima descritos. Como tal, pode reagir com a
glutationa (GSH), diminuindo seus níveis livres intracelularmente. Estudos
demonstram que células tratadas com 15d-PGJ
2
, outra CP-PG, tem seus níveis
de glutationa reduzida celular e a atividade da GSPx diminuídos (Kim & Surh,
2006). Realmente, CP-PGs são rapidamente conjugadas com GSH pela
glutationa-S- transferase (GST), formando conjugados de GSH- CP-PGs
(Homem de Bittencourt Jr. et al, 1998a; b). Após serem adicionadas à cultura
de células, concentrações não-tóxicas de CP-PGs diminuem os níveis de GSH
intracelular, levando as células a uma desbalanço redox (Kondo et al, 2001), o
que, por si só, é um importante sinal regulatório que leva a ativação de fatores
de transcrição sensíveis ao potencial redox (Dröge, 2002). Genes que fazem a
detoxificação celular ou enzimas antioxidantes são sabidamente ativados por
eletrófilos e espécies ativas de oxigênio, como parte da resposta adaptativa da
sobrevivência celular. Esta resposta coordenada é regulada através do
elemento responsivo a antioxidantes/ eletrófilos (ARE/ EpRE – do inglês
antioxidant/ electrophile response element), localizado no promotor de genes
que geram antioxidantes. O Nrf2 (do inglês, nuclear factor erythroid) é um dos
principais fatores de transcrição ligantes do ARE/ EpRE. Assim, sempre que a
célula é exposta a estresse oxidativo ou eletrófilos, o Nrf2 é translocado para o
núcleo, induzindo a expressão de proteínas antioxidantes como a glutationa-S-
transferase (GST) e a HSP70, entre outras. A 15d- PGJ
2
, por exemplo, ativa o
Nrf2 por se ligar covalentemente ao Keap1 (do inglês, Kelch-like ECH-
associated protein-1), que é a proteína repressora do Nrf2, permitindo que este
último faça a transcrição de antioxidantes (Kim & Surh, 2006). Adicionalmente,
a depleção da glutationa mediada por CP-PGs provoca um aumento na
atividade de enzimas antioxidantes, como a γ- glutamilcisteína sintetase
(γ-GCS, enzima-chave de regulação da síntese GSH), GST (que protege a
célula por conjugar a glutationa às CP-PGs), e MRP1 (bomba de glutationa -
116
bomba GS-X, que gera a extrusão de eletrófilos conjugados com a glutationa,
do meio intracelular) (Gutierrez et al, 2007). A conjugação intracelular de CP-
PGs com moléculas de GSH e sua exportação pela bomba GS-X na forma de
GS-conjugados pode ser uma estratégia celular importante na manutenção da
homeostase. O primeiro passo na inativação de muitas substâncias endógenas
e exógenas dá-se pela conjugação com moléculas de GSH (Honn & Marnett,
1985; Gouin et al, 1986) e o papel desse processo pode ser inferido pela
importância das GST na detoxificação contra substâncias eletrofílicas (Hales &
Huang, 1994; Zhang & Das, 1994). No caso da PGA
2
, a conjugação com
moléculas de GSH abole todo seu caráter eletrofílico e, portanto, seus efeitos
biológicos sobre as células. O segundo passo no processo de eliminação de
substâncias, como as CP-PGs, seria, então, a exportação destas na forma de
GS-conjugados, como sugerido anteriormente (Ishikawa, 1992). Esta etapa é
capital no processo de defesa celular contra eletrófilos porque desloca o
equilíbrio da reação catalisada pelas GST para a direita, no sentido da
eliminação de mais moléculas do eletrófilo. A expressão da MRP/ bomba GS-X
pode ser um importante agente de modulação da atividade biológica das
CP-PGs, através da exportação das mesmas para o espaço extracelular. O
papel fisiológico destas proteínas pode variar de uma função protetora contra a
toxicidade química e estresse oxidativo (Cole & Deeley, 1998) à regulação do
estado redox e de ativação celular (Homem de Bittencourt Jr. et al, 1998a; b).
Fica claro que a lipogênese e o estado redox são os dois lados de uma mesma
moeda, uma vez que são controlados pelas vias do Keap1/ Nrf2/ ARE, como
discutido. Devido a isto, a ativação das rotas bioquímicas da lipogênese ou a
mudança do potencial redox, no metabolismo da GSH, em sua síntese
(γ-GCS), sua regeneração (por ação da Glutationa Redutase) e sua extrusão
(GST e MRP1), agindo como um todo, protegem o meio intracelular do
acúmulo de eletrófilos, espécies ativas de oxigênio e de GSSG. Juntas, estas
estratégias sustentam o poder redutor necessário para a execução da
biossíntese lipídica (Gutierrez et al, 2007). Assim sendo, para uma análise mais
detalhada, deve-se levar em consideração, não só o potencial redox celular,
mas também a capacidade da célula de exportar conjugados de glutationa, via
MRP1. Conforme discutido anteriormente, as análises enzimáticas e o estado
redox foram avaliados em 1h e 24h, enquanto as expressões das proteínas
117
foram observadas às 6h e 24h. Em 6h se tem o máximo de expressão protéica
para a maioria ds proteínas estudadas, por isto, este período foi o escolhido.
Neste trabalho observou-se que a resposta dos macrófagos peritoneais
frente à PGA
2
fez com que o potencial redox diminuisse, isto é, aumentasse a
concentração de GSH em 1h (provavelmente aumentando só a atividade de
enzimas antioxidantes), uma vez que os resultados obtidos demonstram que
não houve modificação de expressão da bomba de glutationa (MRP1) em até
6h após o tratamento das células. Em 24h, este perfil encontrado foi mantido,
isto é, a concentração de GSH também se apresentou aumentada,
possivelmente por aumento da atividade de enzimas antioxidantes e também
da expressão de enzimas antioxidantes, tanto em macrófagos peritoneais
quanto da linhagem U937. Sabe-se que MRP1 é freqüentemente co-induzida
com a γ- GCS em situações de estresse oxidativo (Kuo et al, 1998), como neste
caso. Realmente, neste período de tratamento, a expressão da MRP1
encontrou-se aumentada no grupo tratado com PGA
2
, o que demonstra a
adaptação celular frente ao estresse oxidativo. Similarmente como ocorre com
a γ-GCS e com a GST, a expressão de MRP1 requer a ativação da rota
Nrf2/ARE, que é promovida pela depleção de GSH dependente de CP-PGs
(Kim & Surh, 2006). Estas alterações levam tempo para ocorrer (24h) e
explicam porque ocorre um aumento na concentração de GSH, restabelecendo
o equilíbrio redox intracelular, após a ação das CP-PGs (Homem de Bittencourt
Jr et al, 1998c). Os resultados encontrados vêm ao encontro de achados da
literatura que, conforme visto, inferem aumento de atividade e/ou de expressão
de antioxidantes e formação de GS- CP-PGs que podem ser exportados pelas
células, em situações de estresse e explicam por que a GSH aumenta em
células tratadas com CP-PGs, embora estas sejam eletrofílicas.
O NAC, como previsto, uma vez que é um antioxidante, em 1h ou 24h de
tratamento em ambos os tipos celulares, manteve a relação [GSSG]/[GSH] ou
a diminui, isto é, diminui o estresse oxidativo em relação ao controle; em até 6h
ou 24h após o tratamento, não havia modificação da expressão da MRP1,
porém em 24h o aumento de GSH já era visto. A combinação de NAC com
PGA
2
, entretanto, ou não é diferente do Controle+ NAC, além de não haver
alteração na expressão da MRP1, ou a oxidação intracelular é maior, em 1h ou
24h para ambos os tipos celulares observados, mesmo estando a expressão
118
desta bomba aumentada em macrófagos peritoneais, em 24h, possivelmente
porque o NAC não consegue neutralizar o efeito oxidante da PGA
2
. Essa
possibilidade encontra-se em estudo atualmente no Laboratório de Fisiologia
Celular, no Departamento de Fisiologia da UFRGS .
Os grupos celulares tratados com oxidantes, o BSO e o DEM,
apresentaram intensa oxidação em macrófagos peritoneais e U937,
principalmente em 1h; esta combinação, no entanto, não apresentou o efeito
supressor esperado em 24h, provavelmente por adaptação celular ao estresse
oxidativo. Destaca-se o fato de que estes grupos experimentais testados não
apresentaram modificação na expressão da bomba de glutationa em até 6h e
em 24h, efeito este que se esperaria aumentado, principalmente nos grupos
tratados com BSO e DEM, que são potentes oxidantes. Provavelmente por falta
desta indução, dentre outros fatores, é que ocorre intensa oxidação dentro da
célula. A combinação de PGA
2
com BSO/DEM fez com que ocorresse uma
grande redução do potencial redox, possivelmente por efeito de ativação de
enzimas antioxidantes intracelulares, uma vez que a bomba de glutationa
também não aumentou sua expressão nos grupos em 6h e 24h. Em realidade,
no que diz respeito ao estado redox, notou-se que o perfil de alteração obtido
foi muito semelhante entre os macrófagos peritoneais e da linhagem U937,
embora os valores basais de ambos os grupos sejam diferentes.
Alterações no potencial redox, como as obtidas nos nossos grupos
celulares pelo tratamento das células com oxidantes e antioxidantes, além da
PGA
2
, levam a uma série de respostas celulares que também foram estudadas.
Processos oxidativos celulares têm papel fundamental na resposta inflamatória
através da ativação de quinases de estresse (como a quinase N-terminal do c-
Jun quinase - JNK, entre outras) e fatores de transcrição sensíveis ao estado
redox, como NF-κB e ativador proteína-1 (AP-1), os quais diferencialmente
regulam os genes mediadores pró-inflamatórios e genes protetores
antioxidantes, como a γ-GCS (Rahman & Macnee, 2000).
Quando macrófagos são retirados de seu meio natural (o organismo) e
são colocados em cultura, o próprio mecanismo de manipulação destas células
sensíveis a modificações do meio, pode gerar estresse nestas últimas, o que é
119
bem conhecido. Também está bem descrito que estas células podem, em
situações de modificação redox, ativar o fator de transcrição NF-κB.
Segundo Dröge (2002), o NF-κB é um fator de transcrição capaz de
responder diretamente ao estresse oxidativo gerado em certos tipos de células
eucarióticas. Este último tem papel proeminente na regulação gênica das
respostas imunológica e inflamatória (Galter et al, 1994). Mas, mais do que isto,
modificações redox num geral ajudam a regular a ativação ou inativação do
NF-κB, pois em baixos níveis de GSSG, o NF-κB está inibido, enquanto que
em células muito oxidadas (altos níveis de GSSG), o NF-κB é também oxidado,
não conseguindo ligar-se à fita de DNA para transcrever genes (Dröge et al,
1994; Haddad et al, 2004).
A literatura mostra que as CP-PGs modificam fatores de transcrição e
seus ativadores por, pelo menos, quatro importantes vias que estão
intimamente relacionadas a aterosclerose e inflamação: NF-κB, AP-1, Nrf2 e
PPARγ. Este último, não será discutido, pois sua ativação dá-se somente pela
família das prostaglandinas J (Kim & Surh, 2006; Forman et al, 1995; Kliwer et
al, 1995).
Alguns fatores de transcrição e moléculas sinalizadoras associadas
possuem resíduos de cisteína, podendo ser moduladas pela ação de eletrófilos,
dentre eles, as CP-PGs. Um exemplo disto é o NF-κB, que possui resíduo de
cisteína e reage covalentemente com 15d-PGJ
2.
As CP-PGs também inibem a
ativação do NF-κB, por inibição direta das IκB quinases, através da reação das
CP-PGs com resíduos cisteína destas quinases, os quais são necessários para
fosforilação e destruição dos IκB e conseqüente ativação e atividade ligante ao
DNA do NF-κB (Rossi et al, 2000). As CP-PGs possuem efeitos
antiinflamatórios bem descritos, e é sabido que a 15d- PGJ
2
atenua a
expressão de mediadores pró-inflamatórios por inibir o NF-κB em monócitos e
macrófagos (Kim & Surh, 2006). Uma vez que, a ativação de NF-κB dispara a
transcrição de inúmeros genes envolvidos com a resposta imunológica,
proliferação e diferenciação celular, o bloqueio da ativação do NF-κB mediado
pelas CP-PGs pode ter papel significativo no metabolismo lipídico de
macrófagos.
120
Outras evidências mostraram existir uma íntima relação entre a resposta
celular ao desbalanço redox e a atividade das HSP (Proteínas de Choque
Térmico), sendo estas proteínas consideradas como marcadores de estresse
celular. Assim, quando o organismo é submetido a situações estressantes, as
HSP são utilizadas no processo de reparo de diferentes tipos de dano (Santoro
et al., 1996). Os efeitos biológicos mediados por CP-PGs estão associados
com a indução de proteínas de choque térmico de 72 kDa (HSP70), através da
ativação dos fatores de transcrição de choque térmico (HSF), que passam de
uma forma monomérica não-ligante de DNA, para uma forma trimérica,
transcripcionalmente ativa, que se liga a seu sítio de controle no promotor dos
genes para o choque térmico (HSG, do inglês, Heat Shock Genes) (Santoro &
Amici, 1989). O efeito protetor das HSP também está relacionado ao fato de
estas proteínas inibirem a ativação do NF-κB, uma vez que as HSP ligam-se à
IKKγ e ao complexo NF-κB/IκB (Chen et al, 2004). Assim, a ação
antiinflamatória das CP-PGs está relacionada a interrupção da via do NF-κB
por ativação de HSP70 (Santoro, 2000).
Visto que muitos parâmetros inferem desbalanço redox, como medida
ainda essencial para uma melhor visualização da resposta celular frente ao
tratamento proposto, visou-se determinar a expressão da família das HSP70
nos distintos tipos celulares estudados.
O tratamento de macrófagos peritoneais por 6h só promoveu a
expressão da HSP70 induzível (HSP72), isto é, a expressão da proteína que
aumenta somente em situação de estresse celular, conforme visto (Feder &
Hofmann, 1999). A resposta obtida em 6h e 24h de tratamento de macrófagos
peritoneais com PGA
2
veio ao encontro com o que está descrito na literatura:
houve indução significativa de produção de HSC73 (em 24h) e de HSP72 (em
6h e 24h), já que sabidamente as CP-PGs inibem a ativação do NF-κB também
por ativar os fatores de transcrição de choque térmico (Rossi et al, 1997;
Santoro, 2000). Uma vez que a expressão de HSP inibe a ativação do NF-κB,
que promove inflamação, nota-se claramente a ação protetora da PGA
2
sobre a
célula. Este mesmo perfil é encontrado quando se analisam macrófagos/ foam
cells, em 24h de tratamento. Tanto na concentração de 1μM, quanto de 20μM,
a PGA
2
provoca um aumento na expressão da HSP72 nestas foam cells,
121
demonstrando o efeito benéfico que pode ser gerado a partir da ação destes
prostanóides. Além dos fatores citados, Kondo e colaboradores (1993)
sugeriram que a síntese de GSH, através da γ-GCS e o transporte de
metabólitos de GSH são responsíveis ao choque térmico, verificando aumento
da expressão de ambos os mRNAs, da γ-GCS e de proteínas de choque
térmico (HSP).
A adição de NAC ao meio, que é sabidamente um antioxidante, também
gerou aumento de expressão da HSP72 em até 6h e de HSC73 e HSP72 em
6h e 24h. Nota-se que esta adição gera um desbalanço redox que altera HSP,
e sabe-se que antioxidantes que contenham cisteínas (como o NAC) inibem a
ativação do NF-κB, o que explica porque algumas terapias com antioxidantes
são utilizadas para o tratamento da aterosclerose (Gutierrez et al, 2007); muito
possivelmente esta inibição observada esteja ocorrendo pelo aumento da HSP,
que e realidade é uma resposta que protege a célula. Além disso, sabe-se que
a NAC consegue elevar os níveis de GSH em situação de estresse oxidativo
mas não em células não-estressadas (Cotgreave et al., 1991). Os grupos
tratados com BSO/DEM, que são oxidantes, não apresentaram alteração de
expressão em 6h e aumentaram sua expressão em de HSC73 e HSP72, já que
é gerado desbalanço redox, como discutido anteriormente.
Viu-se que a combinação PGA
2
+ NAC podia gerar estresse oxidativo, ao
contrário do que se esperaria, uma vez que a ação do NAC pode não estar
sendo suficiente para anular a PGA
2
. Assim, este estresse celular pode
provocar um aumento de expressão de HSP72, que é induzida na célula como
tentativa de proteção do macrófago, que tenta se adaptar a esta situação
adversa. Ao mesmo tempo, os grupos tratados com os oxidantes BSO, DEM e
PGA
2
não apresentaram uma oxidação intracelular muito acentuada, como
esperado, mostrando a capacidade de adaptação celular, novamente, desta
vez, provavelmente devido ao aumento de atividade e/ou expressão de
enzimas antioxidantes, já que a região promotora da γ-GCS, por exemplo,
contém subunidades que são ativadas pela AP-1 e pelo NF-κB, que são
regulados pelo estresse oxidativo (Rahman & Macnee, 2000; Rahman et al,
2005), o mesmo ocorrendo com os genes promotores da GST, que são
regulados pelos fatores de transcrição AP-1 e Nrf2, via ARE, de modo que não
122
houve nem indução de expressão desta HSP. Uma vez que não houve
aumento de HSP, o NF-κB intracelular produzido pelo potencial redox
diminuído induz aumento de γ-GCS e GST, conforme discutido (Ainbinder et al,
1997; Hayes et al, 2005).
Interessantemente, após 24h de tratamento, ocorreu a expressão das
duas isoformas da família da HSP70: a HSC73 e HSP72. A HSC73 é expressa
constitutivamente, ou seja, independe das condições de estresse, portanto,
também ocorre nas células no repouso (Meyer & Silva, 1999), ao contrário da
HSP72. Assim, em 24h, a adição de PGA
2
aos macrófagos peritoneais gerou
expressão aumentada de HSC73, o que demonstra, novamente a ação
protetora das CP-PGs. No entanto, os grupos PGA
2
+ NAC e PGA
2
+ BSO/DEM
mostraram-se com estas expressões diminuídas, comparados ao Controle+
PGA
2
, e sem alterações significativas quando comparados aos seus controles,
neste período, concluindo-se, deste modo, que a interação das PGA
2
com
oxidantes e antioxidantes produzidos intracelularmente ou adicionados ao meio
de cultura modificam a capacidade desta prostaglandina em induzir a
expressão da HPS. Mesmo assim, esta indução de expressão foi
significativamente maior nestas células tratadas com oxidantes e antioxidantes
quando comparados com o grupo que não recebeu nenhum tratamento e que
não teve expressão de HPS, portanto. O mesmo perfil foi encontrado em
relação à expressão da HSP72, de onde se conclui que o estado redox
interfere realmente na expressão das proteínas de choque térmico, porém, com
certeza, não deve ser este o único modo de regulação de sua ativação, visto
que a adição de PGA
2
sempre aumenta a expressão destas, independente do
meio estar oxidado ou reduzido, quando comparado aos macrófagos
peritoneais que não recebem tratamento algum.
Após a obtenção dos resultados de expressão da família das HSP70 em
macrófagos peritoneais tratados com oxidantes e antioxidantes, visou-se a
determinar o que ocorreria com as foam cells, oxidadas frente a ação da LDL
oxidada, uma vez que o comportamento das foam cells podia ser diferente
daquele verificado em macrófagos peritoneais. Encontramos um aumento de
73% na expressão da HSP70 nos macrófagos/ foam cells tratados com PGA
2
1μM, quando comparado com o controle tratado com PGA
2
, efeito semelhante
123
ao obtido em macrófagos peritoneais, corroborando com nossos resultados
anteriores. A PGA
2
20μM também gerou aumento de HSP70 no controle+
PGA
2
20μM e LDLox+ PGA
2
20μM, no entanto, este aumento foi menor quando
comparado com a PGA
2
1μM em macrófagos/ foam cells, o que nos leva crer
que esta dosagem já não é tão efetiva quanto a de 1μM.
Teoricamente, a oxidação gerada intracelularmente pelo tratamento dos
macrófagos peritoneais imita o que ocorre em foam cells e também em células
inflamatórias. Como vimos, a inflamação gera estresse oxidativo e isto é
essencial para que ocorra transcrição gênica de diversas moléculas pró-
inflamatórias: uma delas é a iNOS que, inclusive, pode se modificar
drasticamente no processo da aterosclerose. Esta enzima é a isoforma
induzível da óxido nítrico sintase, tendo como função a produção de NO (Niess,
2000). Existem dois importantes sítios de ligação que se localizam na região
promotora do gene da iNOS, regulando, assim, sua transcrição: um deles é o
sítio de ligação do NFκB (Zhou, 2006). Assim sendo, a expressão da iNOS tem
seus níveis de transcrição regulados por vias de sinalização que envolvem
agentes relacionados com a resposta do NFκB ao estado redox (Dröge, 2002),
assim como o AP-1, fator de transcrição que também é regulado pelo estado
redox e é sabidamente inibido por 15d-PGJ
2
, que tem efeitos antiinflamatórios,
uma vez que AP-1 expressa enzimas pró-inflamatórias, como iNOS, COX-2 e
outros (Kim & Surh, 2006). Deste modo, medir a expressão de iNOS nos faz
ter uma melhor visão da ativação celular, assim como de seu grau de oxidação.
Observou-se nos experimentos com 6h e 24h de tratamento, que o
grupo Controle+NAC apresentou aumento significativo na expressão da iNOS.
Este resultado foi muito interessante e tornou, por este motivo, imprescindível a
investigação do estado redox das células. Viu-se que macrófagos colocados
em cultura podem apresentar estresse pela modificação do meio, embora se
tente sempre mantê-los o mais próximo possível do fisiológico. Também
discutiu-se que tanto em células com seu meio interno muito reduzido (baixos
níveis de GSSG), quanto em células muito oxidadas (altos níveis de GSSG),
ocorre a inibição do fator de transcrição NF-κB (Dröge et al, 1994; Haddad et
al, 2004). Fica clara, nestas situações, a importância da manutenção do estado
redox em equilíbrio. É possível que os macrófagos peritoneais, colocados em
124
cultura, acabem tendo um aumento do estresse oxidativo, inibindo a ação do
NF-κB. Assim, quando o NAC foi adicionado ao meio, estas células se
reduziram o suficiente para que este fator de transcrição fosse ativado e os
macrófagos expressassem a iNOS. Os outros grupos não mostraram
alterações em seus níveis de expressão em 6h; entretanto, em 24h de
tratamento, o grupo que recebeu BSO/DEM também se apresentou aumentado
significativamente, comparado ao seu controle, demonstrando a seqüência de
resposta celular, nesta ordem: o estresse oxidativo, o aumento do NF-κB e a
expressão da iNOS. Nota-se, entretanto, que os grupos tratados com PGA
2
não tiveram alteração na expressão desta enzima, demonstrando mais uma
vez a ação desta CP-PG: o aumento que ela provoca de HSP inibe o NF-κB,
que é o fator de transcrição responsável pela expressão da iNOS.
Corroborando com estes achados, vê-se o mesmo efeito deste prostanóide em
uma outra prostaglandina ciclopentenônica: o 15d-PGJ2, que também inibe a
expressão de iNOS, por inibir o NF-κB (Kim & Surh, 2006).
Conforme visto, foi demonstrado que a PGA
2
1μM, em macrófagos/ foam
cells diminui a formação de colesterol endógeno, a partir da acetil- CoA
(Homem de Bittencourt Jr. et al, 2007), isto é, ocorre modificação desta rota
bioquímica por ação deste prostanóide em algum ponto que se fazia mister
pesquisar. Como a enzima- chave da síntese endógena do colesterol é a HMG-
CoA redutase, resolveu-se estudá-la, uma vez que os resultados encontrados
sugeriam inibição da atividade ou diminuição da expressão desta enzima.
Começou-se estudando a atividade enzimática da HMG-CoA redutase.
O ensaio da atividade da enzima é feito sem DTT (ditiotreitol) e com DTT pela
seguinte razão: o DTT é um potente antioxidante, ao passo que a PGA
2
é um
oxidante. Assim, durante o ensaio é possível que eles reajam entre si ou que o
DTT desloque a PGA
2
ligada covalentemente por adição de Michael na cisteína
da HMG-CoA redutase. A HMG-CoA redutase também possui resíduos de
cisteína reativos localizados próximos ou no seu sítio catalítico (Capel & Hilbert,
1993); assim sendo, esta enzima também poderia ser, teoricamente, modulada
pelo estado redox e/ou pela PGA
2
.
Os resultados obtidos mostram que a PGA
2
1μM adicionada a
macrófagos peritoneais controle diminui drasticamente a atividade desta
125
enzima comparado às células que não receberam tratamento algum, em 1h e
24h, quando o ensaio é realizado sem DTT. Além disto, a depleção de GSH
pela presença de BSO/DEM no meio, juntamente com a PGA
2
,
promoveu
redução da atividade da HMG-CoA redutase também em 1h de tratamento,
neste ensaio. O tratamento das amostras de 24h com ditiotreitol (DTT, 10 mM)
no momento do ensaio reverteu completamente a inibição, pois o DTT, como
antioxidante, reage com a PGA
2
. O NAC adicionado ao meio de cultura não
causou modificações significativas nos grupos.
Comparando-se os grupos experimentais entre eles mesmos em 1h e
24h, nota-se que no ensaio com e sem DTT, a atividade da HMG-COA
redutase aumentou significativamente no período de 24h de tratamento, em
relação ao de 1h, em quase todos os grupos (p<0,05). Este perfil encontrado é
muito parecido com àquele visto em realção a ACAT, demonstrando, mais uma
vez, que o próprio estresse pela cultura celular a que os macrófagos foram
submetidos altera o estado redox destas células. Embora os valores basais nos
dois tempos se modifiquem, a resposta celular encontrada é muito
interessante, conforme discutido abaixo.
Uma vez que os grupos tratados com CP-PGs são ensaiados sem DTT
e dão resultados mais baixos que os controles sem DTT e, quando ensaiados
com DTT ambos (controles e CP-PGs) dão resultados equivalentes, é possível
que a PGA
2
iniba a redutase por ligação às cisteínas da enzima. Assim, o perfil
que se observa é o mesmo que se viu na ACAT: um meio oxidado faz com que
a PGA
2
demonstre todo seu efeito biológico – a presença de BSO/DEM e a
PGA
2
por si só, geram estresse oxidativo, diminuindo a quantidade de GSH
intracelular e aumentando a chance deste prostanóide se ligar à cisteína
reativa da HMG-CoA redutase.
Visto que, realmente, a adição de PGA
2
inibia a atividade da HMG-CoA
redutase, faltava averiguar se esta CP-PG poderia interferir na expressão da
enzima. Assim, foram feitos os ensaios para testar esta possibilidade.
Verificou-se, então, que nenhum dos grupos experimentais apresentou
alteração, com exceção do grupo PGA
2
+ BSO/DEM, que comparado com seu
controle e com os outros grupos, aumentou em 2,6 vezes, em 24h de
tratamento, a expressão da HMG-CoA redutase. No entanto, o aumento da
quantidade da enzima não gera resposta de aumento de atividade, como
126
sugere a medida da atividade da enzima, provavelmente pela ação da PGA
2
,
que deve estar se ligando diretamente às cisteínas da HMG-CoA redutase,
modulando sua resposta, conforme será discutido abaixo.
A HMG-CoA redutase é sabidamente inibida por fosforilação pela AMPK
(Clarke & Hardie, 1990; Kanellis et al, 2006), que é ativa em situações
fisiológicas de déficit de energia (Figura 1) (Kim & Novak, 2007). Obviamente,
quando os níveis energéticos celulares diminuem (jejum), todo o processo de
anabolismo fica interrompido e assim, o mesmo se dá com a síntese endógena
de colesterol, que estará diminuída, como forma de se preservar o estoque
energético da célula (Sato et al, 1993).
Os resultados encontrados neste trabalho indicam que além de inibir a
atividade da enzima por um processo dependente de reação com cisteínas, a
PGA
2
, por bloquear a síntese de colesterol, induz um aumento na expressão e
atividade total da HMG-CoA redutase, embora a enzima permaneça inibida na
ausência de DTT. Isso sugere que parte do efeito benéfico da PGA
2
sobre o
desenvolvimento da aterosclerose está relacionado a seu efeito inibitório sobre
a atividade da HMG-CoA redutase sem nenhuma alteração na expressão ou no
estado de fosforilação da enzima, já que as CP-PGs inibem a AMP quinase
quinase (AMPKK), que, por sua vez, ativaria a AMP quinase (AMPK), enzima
responsável pelo bloqueio da atividade redutase (Clarke & Hardie, 1990). Se a
AMPK não está fosforilando a HMG-CoA redutase, porque esta quinase está
inibida pela PGA
2
, tudo leva a crer que a enzima deve estar apresentando sua
atividade diminuída por ligação direta da PGA
2
em sua cisteína.
No desenvolvimento da aterosclerose, a alta captação de ésteres de
colesterol por receptores scavenger por macrófagos/ foam cells e células
endoteliais contribuem para o acúmulo de colesterol no citoplasma, em forma
de gotas lipídicas (Gutierrez et al, 2007). Logo, após ter sido demonstrado que
ocorre a inibição da incorporação de colesterol exógeno em macrófagos/ foam
cells tratados com PGA
2
1μM (Homem de Bittencourt Jr. et al, 2007), tornou-se
essencial verificar se ocorria down-regulation de receptores scavenger na
membrana dos macrófagos peritoneais. Dentre os muitos receptores scavenger
que fazem a captação de colesterol do meio extracelular, um dos mais
estudados e sabidamente envolvidos com o acúmulo de colesterol em
macrófagos é o receptor CD36. Assim, sua expressão foi averiguada.
127
Os resultados obtidos do tratamento dos grupos experimentais em 6h,
mostraram que a expressão do receptor scavenger CD36 está diminuída no
grupo PGA
2
+ NAC, comparado ao seu controle, assim como os grupos
Controle+ BSO/DEM e PGA
2
+ BSO/DEM apresentaram expressões diminuídas
deste receptor comparadas com todos os outros grupos. Interessante perceber
que, mais uma vez, quando há oxidação do meio (visto que PGA
2
+ NAC
também tiveram seu meio oxidado, conforme descrito anteriormente), o
tratamento das células com PGA
2
diminui a expressão de CD36, diminuindo a
captação de colesterol. Isto ocorre em macrófagos peritoneais e muito
provavelmente nos macrófagos foam cells tratados com PGA
2
, pela resposta
celular obtida por Homem de Bittencourt Jr e colaboradores, em 2007. Quando
se analisa a resposta celular em 24h de tratamento, no entanto, nota-se que
não há diferença significativa entre os grupos. Estes achados vêm de encontro
com o que se observa em células tratadas com 15d-PGJ2, que também é uma
CP-PG, e inibe a expressão de receptores scavenger (Kim & Surh, 2006).
Embora a discussão dos resultados obtidos em relação à atividade e/ ou
expressão das enzimas envolvidas no metabolismo do colesterol se dêem
separadamente, é necessário se ter em mente que o funcionamento destas
está relacionado e é interdependente. Então, passe-se a discutir a ação
coordenada destas enzimas nos macrófagos.
A ACAT age diminuindo o excesso de colesterol livre, formando ésteres
de colesterol, que podem ser estocados, conforme descrito anteriormente. Esta
estratégia celular em aliviar o acúmulo de colesterol livre, não obstante, pode
ser perigosa, uma vez que isto impede a inibição por retroalimentação mediada
pelo colesterol da HMG-CoA redutase e dos receptores de LDL, fazendo com
que a célula continue produzindo e captando colesterol (Gutierrez et al, 2007).
Prova disto é que macrófagos apresentam diminuição de acúmulo de ésteres
de colesterol quando estas células são incubadas com atorvastatina, que é
inibidor da HMG-CoA redutase. Ainda, as estatinas induzem a inibição dos
intermediários não esteróis do mevalonato, o que pode diminuir a formação de
macrófagos/foam cells por aumentar o efluxo de colesterol (Argmann et al,
2005). Sabe-se ainda que a dieta pode influenciar na ação das enzimas
envolvidas no metabolismo do colesterol. Estudos descrevem que a síntese de
ésteres de colesterol e a atividade da ACAT estão aumentadas in vitro em
128
aortas de animais alimentados com grande quantidade de triglicerídeos ou
colesterol (Yang et al, 2004). O colesterol livre, ácidos graxos e ácido
araquidônico (que podem ser obtidos da dieta) podem servir de substrato para
a ACAT (Pollaud et al, 1995; Oliveros et al, 2004), levando ao acúmulo de
ésteres de colesterol.
Após demonstrar que a PGA
2
reduz o acúmulo de colesterol em foam
cells e em lesões ateroscleróticas in vivo (Homem de Bittencourt Jr. et al,
2007), através dos resultados agora obtidos, vê-se que pelo menos parte da
ação da PGA
2
parece se dar pela inibição coordenada desta CP-PG sobre a
ACAT e HMG-CoA redutase, assim como também por ação sobre a CEH, não
testada neste trabalho. No entanto, Homem de Bittencourt e colaboradores
(2007) acharam uma diminuição de formação de colesterol livre, o que indica
uma diminuição da atividade e/ou da expressão da CEH.
A CEH exibe um modelo de regulação compatível com sua função
fisiológica, respondendo a perturbações do metabolismo do colesterol e por
este motivo, esta enzima pode estar envolvida com o acúmulo de lipídios
intracelular e com a aterosclerose (Escary et al, 1999). Dietas ricas em
colesterol suprimem a atividade e a formação de RNAm da CEH. Se a síntese
de colesterol é estimulada por infusão intravenosa de mevalonato, a atividade,
a enzima e o RNAm da CEH estão diminuídos; se a síntese for inibida pela
infusão de um inibidor de HMG-CoA redutase, ocorre o aumento da atividade e
do RNAm da CEH (Ghosh et al, 1998). A perda da atividade desta enzima
ocorre na presença de substâncias reativas a grupamentos sulfidrila, sugerindo
que cisteínas são essenciais na hidrólise dos substratos. Lohse e
colaboradores (1997) substituíram a cisteína da posição 227 e da 236 por
alanina, separadamente, e as duas cisteína destas duas posições por alanina,
simultaneamente. Como resultados, encontraram reduções drásticas na
atividade hidrolítica, demonstrando que estes resíduos são essenciais para o
catabolismo lipídico mediado por lipase ácida lisossomal/ CEH ácida.
Entretanto, Pagani e colaboradores, no mesmo ano do estudo de Loshe, após
substituírem os resíduos de cisteína por mutações, propuseram que estes
resíduos de cisteína estão envolvidos na hidrólise de ésteres de colesterol por
afetar seletivamente o acesso do substrato ao sítio catalítico ativo. Atualmente,
todas as rotas lipogênicas em mamíferos conhecidas são sensíveis ao estado
129
redox (Gutierrez et al, 2007). Assim, possivelmente esta enzima também
responde à ação da PGA
2
, como o fazem a ACAT e a HMG-CoA redutase,
embora esta enzima não tenha sido testada.
A HMG-CoA redutase é regulada, dentre outras coisa, por
retroalimentação negativa, isto é, sempre que a quantidade de colesterol
intracelular diminui, sua atividade/ expressão tende a aumentar. Sabidamente,
no entanto, esta regulação é só uma parte do processo, pois se fosse simples
assim, não seriam geradas as foam cells. Experimentando-se os diferentes
tratamentos nos vários tipos celulares deste trabalho, viu-se que ocorre inibição
da HMG-CoA redutase pela presença de PGA
2
no meio (macrófagos
peritoneais), o que acarreta menor formação de colesterol livre; por sua vez, a
ACAT também se encontra inibida pela PGA
2
, quando as células se encontram
oxidadas (foam cells e macrófagos peritoneias), e o substrato desta enzima,
que é o colesterol livre, também está diminuído pela via de sua síntese e
também pela captação do meio extracelular, como encontramos nos resultados
deste trabalho, gerando menor formação de ésteres de colesterol.
Teoricamente, por si só, esta diminuição nos níveis de colesterol já deveria ser
suficiente para ativar estas enzimas; porém, de algum modo, a PGA
2
está
inibindo esta alça de retroalimentação. Assim, viu-se que a diminuição do
colesterol intracelular observado nos experimentos publicados em 2007, tem
parte de suas rotas metabólicas desvendadas no estudo atual.
Deve-se notar que mesmo aumentando a expressão de HMG-CoA
redutase, a ação desta enzima continuou inibida pela presença de PGA
2
, o que
suscita que os efeitos anti-colesterogênicos desta CP-PG devem envolver a
modulação da atividade desta enzima, uma vez que sua atividade é
dependente dos níveis de GSH e que esta enzima é modulada alostericamente
pelo estado redox em condições fisiológicas (Roitelmand & Shechter, 1984),
assim como deve ocorrer com a ACAT (Gutierrez et al, 2007) e a CEH, que
também são reguladas pelo estado redox celular (Cristóbal et al, 1999).
A presença de resíduos de cisteínas críticas localizadas próximas ou no
sítio ativo da ACAT, da HMG-CoA redutase e da CEH gerou nova luz para o
esclarecimento do mecanismo anti-aterogênico mediado por CP-PGs,
adicionalmente ao seu poder inibitório sobre o NFκB: a modulação do
130
metabolismo lipídico através de ligações destes prostanóides a cisteínas
reativas via adição de Michael com as enzimas acima citadas.
131
7. CONCLUSÃO
As CP-PGs, como visto, modificam a sinalização celular. Entretanto, a
possível participação destes eicosanóides na regulação do metabolismo
lipídico pela ligação destes em cisteínas reativas é uma novidade. Os
resultados obtidos neste trabalho, assim como aqueles encontrados por outros
grupos de pesquisa, mostram uma nova faceta do estudo das prostaglandinas
ciclopentenônicas, uma vez que a sinalização redox é mediada por elas e
podem guiar o metabolismo lipídico em situação de aterosclerose, conforme
demonstrado por Homem de Bittencourt Jr e colaboradores, em 2007 e agora
no atual estudo.
Viu-se que a PGA
2
gera profundos efeitos no estado redox celular,
ativando as cascatas do Keap1/ Nrf2, que culminam na formação de estresse
oxidativo e também de rotas protetoras contra este último, fato este que
também é citoprotetor e anti-aterogênico, uma vez que ele também aumenta o
metabolismo do GSH. Ainda, a habilidade da PGA
2
em bloquear a ativação do
NF-κB e aumentar a expressão de HSP70 reverte a inflamação. Sem dúvida, o
resultado mais importante deste trabalho é que a PGA
2
bloqueia a produção de
colesterol por inibição direta da atividade da HMG-CoA redutase, sem
interferência na sua expressão ou estado de fosforilação, já que a PGA
2
é
inibidora da cascata das AMPK, que reduzem fisiologicamente a atividade da
redutase em situação de jejum ou depleção de ATP. Isto abre uma nova
perspectiva para o tratamento da aterosclerose, uma vez que na atualidade,
conforme discutido, não existe cura para esta doença e nem regressão de
placa de ateroma, no máximo, a estabilização desta. Assim, é possível que
esteja surgindo, aqui, uma nova classe de inibidores da HMG-CoA redutase,
com efeitos mais efetivos, permitindo um melhor prognóstico para os pacientes.
Interessante notar que este efeito de inibição nesta enzima é independente do
estado redox celular. Além disto, este prostanóide também inibe a atividade da
ACAT, que poderia levar ao acúmulo de ésteres de colesterol, gerando placas
de ateroma, tanto em macrófagos/ foam cells, quanto em macrófagos
peritoneais em meio oxidado (que teoricamente é o mesmo estado redox que
se encontra em foam cells). Entretanto, observa-se que os efeitos da PGA
2
em
doses farmacológicas são totalmente benéficos somente em células oxidadas.
132
Em células em equilíbrio redox, a PGA
2
apresenta efeitos semelhantes ou
contrários aos encontrados em células oxidadas, o que fica claro quando os
dados deste trabalho original são avaliados. Entretanto, o porquê destes efeitos
não é conhecido. Assim, os efeitos encontrados neste trabalho, que
corroboram com os dados já obtidos anteriormente, foram descritos em
colorido na Figura 44A e B.
Figura 44: A- Efeitos da PGA
2
no metabolismo do colesterol em células
oxidadas. B- Efeitos da PGA
2
no metabolismo do colesterol em células em
equilíbrio redox. Os dados em colorido expressam os efeitos encontrados neste
trabalho, sobre o metabolismo do colesterol.
PGA
2
↓ ACAT
↓ HMG-CoA
redutase
↑ MRP1
↓ CD36
↑ HSP70
↓ iNOS
PGA
2
A
B
↓ HMG-CoA
redutase
Não modifica CD36
Não modifica ou ↑
MRP1
↑
ACAT
↑ HSP70
↓ iNOS
133
Finalmente, considerando-se que uma doença inflamatória crônica,
como a aterosclerose, pode originar-se de uma falha na resolução da
inflamação mediada por CP-PGs fisiologicamente, é possível que uma melhor
compreensão do porquê de as CP-PGs formadas fisiologicamente não
conseguirem corrigir a inflamação possa explicar muitas questões ainda não
solucionadas, gerando uma nova luz no tratamento da aterosclerose, doença
que ainda ceifa muitas vidas ao redor do mundo.
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