ads:
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
CARACTERIZAÇÃO ANATÔMICA QUANTITATIVA E
COMPOSIÇÃO DE ÓLEOS ESSENCIAIS EM TRÊS ESTÁGIOS
FOLIARES DE CLONES DE EUCALIPTO E SUA RELAÇÃO COM A
FERRUGEM
RENATA RUIZ SILVA SOUZA
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da UNESP - Campus de
Botucatu, para obtenção do título de Mestre em
Agronomia (Proteção de Plantas).
BOTUCATU-SP
Janeiro - 2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
CARACTERIZAÇÃO ANATÔMICA QUANTITATIVA E
COMPOSIÇÃO DE ÓLEOS ESSENCIAIS EM TRÊS ESTÁGIOS
FOLIARES DE CLONES DE EUCALIPTO E SUA RELAÇÃO COM A
FERRUGEM
RENATA RUIZ SILVA SOUZA
Engenheira Florestal
Orientador: Prof. Dr. Edson Luiz Furtado
Co-orientador: Prof. Dr. Roberto Antonio Rodella
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da UNESP - Campus de
Botucatu, para obtenção do título de Mestre em
Agronomia (Proteção de Plantas).
BOTUCATU-SP
Janeiro - 2008
ads:
3
FICHA CATALOGR
Á
FICA ELABORADA PELA SEÇÃO T
É
CNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENT
O
DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP - FC
A
LAGEADO - BOTUCATU (SP)
Souza, Renata Ruiz Silva, 1981-
S731c Caracterização anatômica quantitativa e composição de
óleos essenciais em três estágios foliares de clones de
eucalipto e sua relação com a ferrugem / Renata Ruiz Silva
Souza. – Botucatu : [s.n.], 2008.
viii, 104 f. : il. color., gráfs., tabs.
Dissertação (Mestrado) -Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2008
Orientador: Edson Luiz Furtado
Co-orientador: Roberto Antonio Rodella
Inclui bibliografia.
1. Essências e óleos essenciais. 2. Folhas - Anatomia. 3.
Eucalipto - Resistência a doenças e pragas. 4. Puccinia
psidii. 5. Eucalipto. I. Furtado, Edson Luiz. II. Rodella,
Roberto Antonio. III. Universidade Estadual Paulista “Jú-
lio de Mesquita Filho” (Campus de Botucatu). Faculdade de
Ciências Agronômicas. IV. Título.
4
III
AOS MEUS PAIS, SÔNIA E PAULO,
AO MEU ESPOSO E MEU AMOR, CLEBERSON
AO MEU IRMÃO, GUSTAVO
Á MINHA QUERIDA WENDY (SAUDADES),
DEDICO
IV
AGRADECIMENTOS
À Deus pela presença constante em minha vida.
À Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu-UNESP, pela minha formação
profissional, pessoal e pela oportunidade de realizar o mestrado.
Ao Prof. Dr. Edson Luiz Furtado por estar presente nos momentos mais importantes da minha
vida, sendo responsável por grande parte da minha formação. Agradeço pela amizade,
paciência, compreensão, pelos ensinamentos e apoio prestado, bem como pela confiança
depositada, fazendo com que eu acreditasse sempre no meu trabalho e me motivando a seguir
em frente.
Ao Prof. Dr. Roberto Antonio Rodella, do Instituto de Biociências de Botucatu, com quem tive
o prazer de conviver desde a graduação, sempre me acolhendo com muito carinho, paciência
e boa vontade. Agradeço, pela amizade, por toda a dedicação prestada, pela confiança,
incentivo, por auxiliar em todas as fases da dissertação, contribuindo com todo o seu
conhecimento, bem como pela co-orientação. Agradeço também pelas boas horas de riso e
descontração e por estar sempre presente em todas as fases importantes da minha vida
profissional e pessoal.
Ao saudoso Prof. Dr. Nilton Luiz de Souza, agradeço pela oportunidade de ter sido sua aluna
e de ter conhecido o professor e pesquisador brilhante e a pessoa maravilhosa que era.
A todos os professores da graduação e pós-graduação, sem os quais eu não teria chegado até
aqui.
À Profª Drª. Marina Aparecida de Moraes Dallaqua, responsável pelo laboratório de
anatomia vegetal do Instituto de Biociências de Botucatu, pela utilização do laboratório e
ótima recepção. Ao técnico do laboratório Kleber pelo auxílio no preparo das amostras e na
V
utilização dos equipamentos e funcionamento do laboratório. Às pós-graduandas Tati, Clívia,
Natália, Letícia, Shelly, Milena, Renata, Inara, por serem tão prestativas em todos os
momentos e pela amizade. Em especial à Tatiane, por ter destinado parte de seu tempo, me
auxiliando nas fotos de anatomia vegetal e microscopia eletrônica de varredura.
Às Professoras Rita de Cassia Sindronia Maimoni-Rodella e Silvia Rodrigues Machado, do
Instituto de Biociências de Botucatu, pelo auxílio prestado, amizade e pelo carinho com que
me receberam.
Á Prof.ªDrª. Márcia Ortiz Mayo Marques, do Instituto Agronômico de Campinas, por
possibilitar a realização de parte deste trabalho, pela amizade, disponibilidade e recepção.
Aos funcionários do Laboratório de Fitoquímica do IAC, em especial à Maria Aparecida,
Roselaine, Lenita e Marcos, que disponibilizaram grande parte do seu tempo para me auxiliar
na extração e análise dos óleos essenciais e pela amizade formada.
Á empresa Votorantim Celulose e Papel S.A. pelo fornecimento do material vegetal utilizado
neste trabalho e por fornecer todos os subsídios necessários à realização do mesmo. Ao
Pesquisador Florestal Donizete da Costa Dias e o técnico Elieser de Oliveira Freitas por toda
a colaboração; bem como dos funcionários e da estagiária Gabriela que me auxiliaram nas
coletas no campo.
Ás minhas grandes amigas Maria Rita e Heloiza, por me acolherem em sua casa com muito
carinho, e à grande amiga Letícia, irmãzinha, que foram minha família em Botucatu e que
estarão sempre em meu coração.
Às amigas Martha, Caroline, Juliana e Cristina pela amizade e pelos momentos de alegria e
dificuldade compartilhados durante o mestrado. Aos amigos, Adimara, Paola, Bryan,
Karolina, Kelly, Marcus, Cecília, Tadeu, Djanira, Helenize, Danila, Haroldo e Adriane, pela
amizade, convivência, pela força e estímulo que me deram para seguir em frente e não
desistir. À amiga Sandra Elizabeth de Souza, pela amizade e auxílio na metodologia utilizada
para a inoculação do patógeno.
VI
Aos meus pais, Sônia e Paulo e ao meu irmão Gustavo, por serem o exemplo na minha vida,
pelo amor, dedicação e apoio constante, e principalmente, por serem os grandes responsáveis
por eu ter chegado até aqui e ter vencido todas as dificuldades. Agradeço por serem pessoas
tão maravilhosas e por ter a sorte de fazer parte desta família. Amo vocês.
Ao meu esposo Cleberson, amor da minha vida, que provou que o amor vence qualquer
distância e, que mesmo longe em vários momentos importantes de nossas vidas, sempre
compreendeu e me deu forças para seguir em frente. Agradeço pelo amor, dedicação,
paciência e pelos momentos maravilhosos que passamos juntos, te amo muito.
Aos meus avós, Maria e Eduardo, pelo amor, pelas orações e dedicação sempre, amo vocês.
Á minha lindinha Wendy por compreender a falta de tempo para lhe dar atenção e por aliviar
minhas tensões nos momentos difíceis, me recebendo sempre com muito carinho. Agradeço
por todos esses anos maravilhosos e à felicidade que você trouxe para a minha vida.
A todos os funcionários do Departamento de Produção Vegetal – Defesa Fitossanitária, pelo
carinho, estímulo e auxílio em vários momentos, em especial, à Maria do Carmo, Domingos,
Norberto, Ana Rita, Adriane, Nivaldo, Vera, Fátima e Dinha.
Aos funcionários da Biblioteca pela amizade, desde a graduação, carinho e apoio sempre que
necessitei.
Á Capes pelo apoio e concessão da bolsa de estudos.
VII
SUMÁRIO
Página
1 RESUMO........................................................................................................................ 01
2. ABSTRACT................................................................................................................... 03
3. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 05
4. REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................... 09
4.1. Ferrugem do eucalipto.........................................................................................09
4.2. Relações entre a anatomia vegetal e a ocorrência de doenças............................ 13
4.3. Relações entre óleos essenciais e a resistência de plantas a patógenos.............. 16
CAPÍTULO I
Anatomia foliar quantitativa em três estágios de desenvolvimento de clones de eucalipto e
sua relação com a ferrugem............................................................................................22
RESUMO ......................................................................................................................23
SUMMARY...................................................................................................................24
INTRODUÇÃO.............................................................................................................25
MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................28
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Características anatômicas da região internervural das folhas dos híbridos de Eucalyptus
grandisxEucalyptus urophylla.......................................................................................30
Relação dos caracteres anatômicos quantitativos com a ferrugem................................30
CONCLUSÕES..............................................................................................................35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................35
CAPÍTULO II
Avaliação da patogênese de Puccinia psidii pela micromorfologia da epiderme foliar de
clones de eucalipto.........................................................................................................51
RESUMO.......................................................................................................................52
SUMMARY.................................................................................................................. 53
INTRODUÇÃO.............................................................................................................54
MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................55
RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................56
VIII
CONCLUSÕES..............................................................................................................60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................60
CAPÍTULO III
Composição de óleos essenciais em três estágios de desenvolvimento foliar de clones de
eucalipto e sua relação com a ferrugem..........................................................................71
RESUMO.......................................................................................................................72
SUMMARY ..................................................................................................................73
INTRODUÇÃO.............................................................................................................74
MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................76
RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................77
CONCLUSÕES............................................................................................................. 81
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................81
5. CONCLUSÕES GERAIS.................................................................................................92
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................93
1
1. RESUMO
Na natureza, a maioria das plantas é resistente aos diferentes patógenos, e essa
resistência pode estar relacionada à existência de substâncias tóxicas aos microrganismos. As
reações bioquímicas, que ocorrem nas células do hospedeiro, produzem substâncias que se
mostram tóxicas ao patógeno ou criam condições adversas para o seu crescimento no interior
da planta, contribuindo significativamente para a resistência. Além dos fatores bioquímicos
existem mecanismos estruturais de defesa que atuam conferindo resistência ao hospedeiro à
infecção por patógenos. O presente trabalho procurou quantificar os caracteres anatômicos
foliares, em três estágios (E1, E3 e E5) de desenvolvimento; analisar a patogênese de Puccinia
psidii pela micromorfologia da folha e caracterizar a composição dos óleos essenciais de
clones de eucalipto, a fim de relacionar esses fatores com a resistência à ferrugem, causada
pelo fungo Puccinia psidii. Para o estudo anatômico e dos óleos essenciais, foram
selecionados clones com diferentes graus de resistência, sendo o clone A resistente, o clone B
suscetível e o clone C altamente suscetível. Para a microscopia eletrônica de varredura foram
selecionados os clones A e C. Através da anatomia quantitativa da região internervural da
folha, o clone A apresentou diferenças estruturais que podem estar ligadas à resistência desse
material, como: maior espessura das cutículas abaxial e adaxial, maior espessura do
parênquima paliçádico adaxial, maior % de parênquima paliçádico, maior número e área de
cavidades oleíferas, menor espessura da epiderme abaxial e menor espessura e % de
parênquima lacunoso. Estes parâmetros podem dificultar a penetração do patógeno e a sua
2
colonização nos tecidos do hospedeiro. Além disso, o estudo anatômico possibilitou a
discriminação do primeiro estágio foliar do clone altamente suscetível em relação aos demais,
indicando a relação desses caracteres com a ferrugem, já que esta tem preferência por folhas
novas e órgãos em início de desenvolvimento. A análise dos óleos essenciais e a quantificação
das substâncias presentes demonstraram, por meio de análise estatística multivariada, a
discriminação do primeiro estágio foliar de todos os clones, bem como a diferenciação entre
os clones avaliados. O clone altamente suscetível apresentou alta porcentagem de γ-terpineno
e o clone resistente diferiu pela maior porcentagem de limoneno, podendo essas substâncias
ser consideradas como marcadores bioquímicos de resistência à ferrugem do eucalipto. A
micromorfologia revelou, para o clone A (resistente) a manutenção da sua resistência, nos três
estágios foliares, em função da ausência de sintomas, provocados pelo patógeno, na superfície
foliar e pela menor incidência de apressórios formados. Os resultados demonstram que os
caracteres anatômicos quantitativos e bioquímicos podem influenciar na resistência de uma
planta a determinada doença. Dessa forma, cutículas mais delgadas facilitam a penetração do
patógeno na planta e epidermes mais espessas disponibilizam maior quantidade de nutrientes,
necessários ao desenvolvimento do agente causal. Uma vez que alguns metabólitos
secundários atuam na defesa da planta contra agentes invasores, a composição e quantificação
dos óleos essenciais, bem como a presença de maior área e número de cavidades secretoras
dessas substâncias, são importantes na resistência do hospedeiro ao Puccinia psidii.
_________________________________________________________________________
Palavras-chave: óleos essenciais, anatomia foliar, resistência, Puccinia psidii, eucalipto.
3
Quantitative anatomic characterization and composition of essential oils at three leaf
stages of eucalyptus clones and their relationship with rust. Botucatu, 2008. 104p.
Dissertação (Mestrado em Agronomia/Proteção de Plantas) – Faculdade de Ciências
Agronômicas, Universidade Estadual Paulista.
Author: RENATA RUIZ SILVA SOUZA
Adviser: EDSON LUIZ FURTADO
Co-adviser: ROBERTO ANTONIO RODELLA
2. ABSTRACT
In nature, most plants are resistant to the many existing pathogens, and such
resistance could be related to the existence of substances that are toxic to microorganisms. The
biochemical reactions that take place in cells of the host produce substances that are toxic to
the pathogen or create adverse conditions for their growth inside the plant, significantly
contributing toward resistance. In addition to biochemical factors, there are structural defense
mechanisms that act by conferring resistance to the host against infection by pathogens. This
work's objective was to quantify leaf anatomical characters at three developmental stages (E1,
E3, and E5); analyze Puccinia psidii pathogenesis via leaf micromorphology; and characterize
the essential oils composition of eucalyptus clones, in order to establish a relationship between
these factors and resistance to rust caused by the fungus Puccinia psidii. In the anatomical and
4
essential oils study, clones with different degrees of resistance were selected as follows: clone
A was considered resistant, clone B susceptible, and clone C highly susceptible. Clones A and
C were selected for scanning electron microscopy. By quantitative anatomy of the leaf
interveinal region, clone A exhibited structural differences that could be linked to resistance in
this material, such as: greater thickness of the abaxial and adaxial cuticles, greater thickness of
the adaxial palisade parenchyma, greater palisade parenchyma percentage, higher number and
area of oleiferous receptacles, smaller thickness of the abaxial epidermis, and smaller
thickness and percentage of spongy parenchyma. These parameters can make it difficult for
the pathogen to penetrate and colonize host tissues. In addition, the anatomical study allowed
the discrimination of the first leaf stage in the highly susceptible clone in relation to the others,
indicating a relationship between these characters and rust, since the disease occurs preferably
on young leaves and organs at the initial stages of development. The essential oils analysis and
quantification of substances present demonstrated, by means of multivariate statistical
analysis, the discrimination of the first leaf stage in all clones, as well as a differentiation
between the clones evaluated. The highly susceptible clone showed higher percentage of γ-
terpinene and the resistant clone was different because of its higher percentage of limonene,
which could be biochemical marks for the rust resistance in Eucalyptus. The
micromorphology revealed that clone A (resistant) maintained its resistance condition during
the three leaf stages, because of a lack of symptoms caused by the pathogen on the leaf
surface, and because of a reduced incidence of appressoria formed. The results demonstrate
that quantitative anatomical and biochemical characters influence the resistance of a plant to a
given disease. Thus, thinner cuticles facilitate the pathogen's penetration into the plant, while
thicker epidermides make a greater amount of nutrients available, required for development of
the causal agent. Since some secondary metabolites act by defending the plant against invasive
agents, the composition and quantification of essential oils, as well as the presence of a larger
area and greater number of glands that secrete these substances, are important for host
resistance to Puccinia psidii.
_________________________________________________________________________
Keywords: essential oils, leaf anatomy, resistance, Puccinia psidii, Eucalyptus.
5
3. INTRODUÇÃO
O gênero Eucalyptus pertence à família Myrtaceae, com cerca de 650
espécies, apresenta uma ampla plasticidade e dispersão mundial, crescendo satisfatoriamente
em diferentes situações edafoclimáticas, extrapolando àquelas das regiões de origem (Santos
et al., 2001; Schumacher et al., 2005).
O eucalipto (Eucalyptus spp.) ocorre naturalmente na Austrália,
Indonésia e ilhas próximas, tais como Flores, Alor e Wetar (Santos et al., 2001). De acordo
com Sampaio et al. (1961), é difícil determinar, com segurança, a data da introdução do
eucalipto no Brasil. Presume-se que os primeiros tenham sido plantados por Frederico de
Albuquerque, em 1868 no Rio Grande do Sul (Sampaio et al., 1961).
No entanto, foi o agrônomo Edmundo Navarro de Andrade, que deu
início aos primeiros reflorestamentos experimentais no Brasil, em 1904, no Horto de Jundiaí,
onde assumiu a direção ( Sampaio et al., 1961).
O eucalipto é cultivado para os mais diversos fins, tais como, papel,
celulose, lenha, carvão, aglomerado, serraria, óleos para indústrias farmacêuticas, mel,
ornamentação e quebra-vento. No mundo, o eucalipto é a árvore mais plantada, com mais de
17,8 milhões de hectares (Alfenas et al., 2004).
A importância da cultura do eucalipto para o Brasil pode ser avaliada
pela participação do setor florestal na economia do país. Inicialmente, apoiado por incentivos
fiscais ao reflorestamento, e também pelos Programas Nacionais de Siderurgia a Carvão
6
Vegetal e de Celulose e Papel, o setor responde atualmente por 4,5% do PIB nacional (R$ 22
bilhões), com geração de 6,5 milhões de empregos (9% da população economicamente ativa
brasileira – PEA). Adicionalmente, a contínua expansão do setor florestal brasileiro, baseado
em plantações, principalmente com eucaliptos, possibilita a exportação de US$ 5,5 bilhões por
ano, equivalente a 7,5% das exportações brasileiras (Medrado et al., 2005).
A partir de 1965, com a lei dos incentivos fiscais ao reflorestamento, a
área de plantio de eucalipto no Brasil aumentou de 500 mil para 3 milhões de hectares
(Valverde, 2004). Graças às condições naturais favoráveis de solo e clima, à evolução
tecnológica e aos conhecimentos acumulados sobre o seu manejo, a produtividade
experimental que era de 10 m³/ ha/ano passou a ser de 60 a 70 m³/ ha/ano (SBS, 2004). O
Brasil possui, atualmente, a segunda maior área reflorestada com espécies de Eucalyptus do
mundo (Alfenas et al., 2004).
O processo de clonagem do eucalipto, a partir de árvores adultas teve
início na década de 70 na região de Coff’s Harbour, na Austrália, através da técnica de
enraizamento de estacas obtidas de brotações colhidas no campo ou de mudas (Alfenas et al.,
2004).
Segundo Alfenas et al. (2004), a técnica de clonagem foi decisiva para
o êxito dessa cultura em regiões quentes e úmidas, favoráveis à incidência de doenças. Com
isso, possibilitou um grande impulso no setor florestal no Brasil, permitindo a formação de
plantios homogêneos, resistentes a doenças e de alta produtividade.
A ferrugem, causada pelo fungo Puccinia psidii, é uma das doenças
mais comuns em plantios de eucalipto, devido às condições ambientais favoráveis ao seu
desenvolvimento e maior suscetibilidade de algumas espécies cultivadas. Plantas altamente
suscetíveis podem ter o seu crescimento comprometido pela doença, sofrendo um enfezamento
quando severamente atacadas. Estas plantas poderão ser dominadas pelas adjacentes que,
menos afetadas ou sadias, continuam crescendo normalmente (Ferreira, 1989).
Além do eucalipto, o patógeno infecta outras espécies de Myrtaceae,
como jambo, goiabeira, jabuticabeira, araçazeiro, pitangueira e jamelãozeiro, sendo algumas
destas mais atacadas do que as outras (Joffily, 1944; Ferreira, 1983; Alfenas et al., 2004).
O isolado proveniente de um hospedeiro pode ser específico ou atacar
outras espécies de mirtáceas. Esta relação pode estar associada a componentes específicos,
7
situados na superfície do hospedeiro ou mesmo internamente em folhas e ramos, consistindo
em um fator de reconhecimento por parte do patógeno ao hospedeiro.
A ferrugem pode ocorrer tanto em viveiros como no campo, porém é
neste último que está sua maior importância econômica. Para o controle da doença no campo,
muitas vezes não são utilizadas aplicações com fungicidas, visto que os gastos com o produto
podem ser superiores às perdas provocadas pela ferrugem, tornando-se economicamente
inviável. Além disso, ainda não existem fungicidas registrados para o setor florestal, o que
dificulta a utilização dos mesmos, que deve ser apenas como “uso emergencial”. Neste caso
dá-se preferência a alternativas de controle, como escape e utilização de variedades resistentes.
A resistência de uma planta pode ser caracterizada como a sua
capacidade em atrasar ou evitar a entrada e/ou subseqüente invasão pelo patógeno em seus
tecidos, limitando a penetração, desenvolvimento e/ou reprodução do agente invasor
(Pascholati e Leite, 1995).
No entanto, muitas vezes uma planta considerada resistente a um
determinado patógeno pode sofrer influências de fatores ambientais e genéticos, alterando a
sua condição frente ao patógeno. Assim, uma planta pode manifestar sua resistência sob
determinadas condições e manter ou não esse caráter em outras condições (Silva et al., 2005).
Além disso, alguns agentes patogênicos podem variar quanto ao grau de agressividade, através
de raças fisiológicas, promovendo a infecção de plantas anteriormente consideradas
resistentes.
Os fungos exercem uma grande influência na evolução de seus
hospedeiros, adaptando-se, por sua vez, às mudanças do genótipo do hospedeiro para
aumentar as situações de íntima coevolução (Pyrozinski e Hawksworth, 1988). Enquanto o
hospedeiro utiliza estratégias de defesa para se proteger do agente causal da doença, este
procura neutralizar tais reações através do seu arsenal bioquímico, em busca de nutrientes
necessários a sua sobrevivência (Pascholati e Leite, 1995).
Dessa forma, um dos importantes mecanismos que atuam conferindo
resistência ao hospedeiro à infecção por patógenos é o estrutural, que pode ser dividido em
pré-formado ou constitutivo, ou pós-formado, o qual se origina após o contato patógeno-
hospedeiro (Pascholati e Leite, 1995; Agrios, 2005).
8
A resistência estrutural envolve estruturas de defesa física da planta,
como cutícula, tricomas, estômatos e fibras que atuam como barreiras, impedindo ou
restringindo o desenvolvimento da doença em seus tecidos. Porém, mesmo com a presença
dessas estruturas pré-formadas, muitas vezes o patógeno consegue penetrar na planta; no
entanto seu progresso pode ser evitado pela formação de novas barreiras estruturais, como
papilas, lignificação, periderme de cicatrização e tiloses (Pascholati e Leite, 1995).
Além dos mecanismos estruturais, existem fatores de resistência
bioquímicos que, por meio de reações, produzem substâncias tóxicas ao patógeno ou criam
condições adversas que dificultam o seu desenvolvimento no interior do hospedeiro. São
compostos sintetizados pelo metabolismo secundário das plantas, como os terpenóides que
constituem uma ampla classe de produtos secundários, como os óleos essenciais, ativos contra
vários fitopatógenos (Pascholati e Leite, 1995; Simões e Spitzer, 2004; Agrios, 2005).
Tendo em vista o envolvimento desses fatores no processo de defesa
de uma planta à ação de patógenos, o trabalho teve como objetivos: quantificar as
características anatômicas, avaliar a patogênese de Puccinia psidii pela micromorfologia da
epiderme foliar e caracterizar a composição de óleos essenciais, em três estágios de
desenvolvimento foliar, de clones de eucalipto, procurando-se relacionar com a resistência ou
suscetibilidade à ferrugem.
A presente dissertação será dividida em três capítulos, sendo o
primeiro capitulo intitulado “Anatomia foliar quantitativa em três estágios de desenvolvimento
de clones de eucalipto e sua relação com a ferrugem”, o segundo capítulo intitulado
“Avaliação da patogênese de Puccinia psidii pela micromorfologia da epiderme foliar de
clones de eucalipto” e o terceiro capítulo intitulado “Composição de óleos essenciais em três
estágios foliares de clones de eucalipto e sua relação com a ferrugem, causada pelo fungo
Puccinia psidii”, redigidos conforme as normas da revista Pesquisa Agropecuária Brasileira
(PAB).
9
4. REVISÃO DE LITERATURA
4.1. Ferrugem do eucalipto
O eucalipto é atacado por vários patógenos, principalmente fungos,
desde a fase de viveiro até os plantios adultos. Geralmente, os problemas são observados nas
plantações, ocorrendo nos mais variados locais, espécies e épocas do ano.
O avanço das áreas reflorestadas para regiões mais quentes e úmidas,
o plantio de espécies mais suscetíveis ou de materiais clonais, sem diversidade genética, e a
utilização repetitiva de uma mesma área para plantio criaram condições favoráveis à
ocorrência de doenças (Alfenas et. al, 2004). Dentre elas, a ferrugem causada por Puccinia
psidii Winter é uma das mais limitantes no estabelecimento de novos plantios e na condução
de brotações de algumas espécies e procedências de Eucalyptus (Ruiz et al.,1987; Ferreira,
1989).
A ferrugem é uma doença causada por fungos basidiomicetos,
pertencentes à ordem Uredinales, que pode se manifestar em diversos hospedeiros nativos,
silvestres ou cultivados, sob a forma de diferentes espécies (Figueiredo, 2001). Por serem
parasitas obrigatórios ou biotróficos dependem das células vivas do hospedeiro para sua
sobrevivência, assim não podem ser cultivados em meios artificiais (Ferreira, 1989).
Puccinia psidii ataca espécies da família Myrtaceae, incluindo o
eucalipto, jambeiro, goiabeira, jabuticabeira, araçazeiro, pitangueira e jamelãozeiro,
10
respondendo de maneira diferente em cada hospedeiro quanto à agressividade (Joffily, 1944;
Ferreira, 1983; Alfenas et al., 2004; Tommerup et al., 2004). É um fungo nativo da América
do Sul e encontra-se amplamente distribuído nas Américas do Sul (Argentina, Brasil,
Colômbia, Equador, Paraguai, Uruguai e Venezuela) e Central e nas ilhas do Caribe, havendo
ainda relatos da sua presença na Flórida (Coutinho, 1998; Alfenas et al., 2004). Ainda não
existem evidências do P. psidii na Austrália, centro de origem do Eucalyptus (Coutinho et al.,
1998, Grgurinovic et al., 2006).
No Brasil foi observada a presença do P. psidii inicialmente no Estado
de Santa Catarina, e encontra-se amplamente distribuído pelo país. A ferrugem, causada por
este patógeno, é uma das doenças mais severas na cultura do eucalipto no Brasil, com
potencial de causar perdas em outras áreas tropicais e subtropicais do mundo que possuam
florestas de eucalipto (Coutinho et al., 1998). Foi relatada pela primeira vez no Brasil, em
1929 e formalmente descrita em 1944 (Joffily, 1944).
De acordo com Figueiredo (2001), outro problema notável de P. psidii
é sua capacidade de se adaptar e infectar plantas mirtáceas exóticas e não originárias da
América do Sul. Este é o caso do jambeiro (Syzygium jambos), trazido da Índia pelos
colonizadores portugueses no início do século XVI, do Eucalyptus spp. e da Melaleuca spp.,
plantas de interesse florestal ou de arborização trazidas da Austrália e de outros países
orientais. Ainda, estudos com inoculações cruzadas, têm demonstrado uma grande
variabilidade quanto à especialização fisiológica e grau de infectividade de diferentes
populações de P. psidii coletados de diferentes hospedeiros.
Castro et al. (1983) realizaram inoculações cruzadas de Eucalyptus
grandis e E. cloeziana, goiabeira e jambeiro com P. psidii. Os autores verificaram que as
quatro espécies apresentaram-se como hospedeiras de P. psidii proveniente de eucalipto,
goiabeira e jambeiro; no entanto, mostraram respostas diferentes quanto à intensidade da
infecção. A variabilidade fisiológica de P. psidii também foi testada por Coelho et al. (2001)
em goiabeira, jambeiro e Eucalyptus grandis, utilizando-se 13 isolados do patógeno. Neste
trabalho, os autores detectaram três grupos de especialização fisiológica, sendo o grupo 1
compatível com eucalipto e jambeiro, grupo 2 com eucalipto e goiabeira e o 3 apenas com
goiabeira.
11
Furtado et al. (2005) também verificaram a existência de
especializações fisiológicas em diferentes populações do patógeno testados em Eucalyptus
grandis e no híbrido urograndis. Neste trabalho, foi observada virulência de vários isolados
para E. grandis, sendo que dois isolados induziram reação de hipersensibilidade; já o híbrido
mostrou-se mais resistente que o E. grandis.
Para os fungos causadores de ferrugens, o fotoperíodo, a temperatura
e a umidade são variáveis que desempenham papel fundamental na biologia do patógeno e na
ocorrência e severidade da enfermidade, pois influenciam os processos de germinação,
penetração e infecção (Nutman e Roberts, 1963).
Para que ocorra o ataque de P. psidii são necessárias condições
ambientais favoráveis. Em condições de campo, temperatura menor ou igual a 20°C, longos
períodos com molhamento foliar (maior que seis horas/dia) e umidade relativa noturna ≥80 %,
favorecem a ferrugem no jambeiro (Blum e Dianese, 2001) e no eucalipto (Ruiz, 1989;
Ferreira, 1989). Suzuki e Silveira (2003) verificaram que a temperatura é o fator que mais
afeta a viabilidade de esporos de P. psidii, sendo que temperaturas elevadas contribuem para a
menor incidência da doença em épocas mais quentes do ano.
Ferreira (1983) relata que períodos de duas a três semanas com dias
de temperatura relativamente baixas e alta umidade podem favorecer a ocorrência de surtos da
ferrugem. A formação de orvalho é um dos fatores determinantes de novas infecções e
produção de novos urediniósporos de P. psidii (Blum e Dianese, 2001). Alguns autores
informam que a formação de orvalho ocorre apenas quando a umidade relativa é igual ou
superior a 90% (Ferreira, 1983; Ruiz, 1989) e a temperatura abaixo de 20
o
C (Ferreira, 1989).
Uma das características da ferrugem do eucalipto é manifestar-se na
forma de surtos esporádicos de curta ou, relativamente, longa duração (um mês até mais de
seis meses). Os surtos de longa duração incluem ciclos secundários ou repetidos de infecções
urediniospóricas (Ferreira, 1989).
A doença se manifesta, principalmente, nos primeiros pares de folhas e
órgãos em início de desenvolvimento, sendo as plantas mais suscetíveis até completarem dois
anos de idade (Ferreira, 1989, Demuner e Alfenas, 1991).
12
A etapa de infecção tem início com a deposição de urediniósporos na
superfície foliar, a formação do tubo germinativo e, posteriormente, do apressório, que emitirá
uma estrutura especializada para penetrar na planta por via direta (através da cutícula). Em
seguida, o fungo coloniza os tecidos da planta e retira seus nutrientes por meio de haustórios
formados no interior das células vivas do hospedeiro, promovendo o aparecimento dos
sintomas (Ferreira, 1983;Alfenas et al., 2004).
O ataque da doença é facilmente observado e sua identificação é
segura devido aos sintomas apresentados nos tecidos das plantas, que se dão, inicialmente, por
pontuações cloróticas, que se transformam em pústulas ou soros, onde se expõem, com o
rompimento de epiderme, massas pulverulentas de urediniósporos, de coloração amarelo vivo.
Estas pústulas podem se coalescer, recobrindo a superfície das brotações do eucalipto quando
o ataque é intenso. Em conseqüência, os tecidos afetados morrem e secam, adquirindo
coloração negra, devido à necrose ocasionada pelo patógeno (Ferreira, 1989; Alfenas et al.,
2004; Tommerup et al., 2004).
Como o ataque se dá antes das folhas completarem seu
desenvolvimento, estas freqüentemente acabam ficando deformadas. O mesmo tipo de ataque
pode ocorrer em frutos jovens, deformando-os. Porém, a ferrugem raramente mata as plantas,
exceto quando ataca severamente brotações novas de tocos após o corte raso (Ferreira, 1989).
A ação do patógeno sobre a planta provoca deformações nos órgãos
aéreos (hastes, folhas, flores e frutos), afetando assim os diversos processos fitofisiológicos
(Alfenas et. al, 1989; Ferreira,1989;).
Os primeiros danos seriamente causados por P. psidii em eucalipto
ocorreram em 1973 no Estado do Espírito Santo, provocando uma grande perda em viveiros e
plantios jovens de E. grandis. Demuner e Alfenas (1991) relataram que em 1986 cerca de 122
ha de E. cloeziana foram quase que totalmente dizimados pelo patógeno na região de Teixeira
de Freitas, BA, resultando numa perda de cerca de U$ 73.200,00.
Na década de 90, foram registrados os primeiros surtos de ferrugem
em áreas florestais no Estado de São Paulo, no município de Santa Branca, sendo que desde
1996 a doença tem se manifestado nessa região de forma generalizada (Camargo et al., 1997).
Ferreira e Silva (1982) e Castro (1983) constataram que as espécies de
eucalipto mais susceptíveis a P. psidii são Eucalyptus grandis W.Hill ex Maiden, E. pellita F.
13
Muell, E. phaeotricha Blakely et Mckie e E. cloeziana F. Muell. A doença também foi
relatada em plantios comerciais de Eucalyptus globulus e E. viminalis em Guaíba, no Rio
Grande do Sul, com ataque severo (Alfenas et al., 2003).
O controle da doença no campo pode ser efetuado pela aplicação de
fungicidas, por estratégias de escape, evitando-se áreas propícias à ocorrência da doença ou
evitando-se o plantio de materiais suscetíveis nessa região, bem como utilizando-se materiais
resistentes. A utilização da resistência genética é a medida de controle mais indicada, por ser
de menor custo, facilmente executável e por reduzir o impacto de fungicidas no ambiente
(Alfenas et al., 1989).
4.2. Relações entre a anatomia vegetal e a ocorrência de doenças
A combinação de características estruturais e reações bioquímicas
empregadas nos processos de defesa das plantas são essenciais para a sua manutenção no
ecossistema, em função das adversidades e invasões a que estão submetidas. Assim, o estudo
das estruturas anatômicas pré-formadas da planta é de fundamental importância para uma
melhor compreensão desses processos e dos mecanismos envolvidos na resistência aos
patógenos.
De acordo com Metcalfe e Chalk (1957), a família Myrtaceae
caracteriza-se, principalmente, pela presença de cavidades secretoras de substâncias oleosas;
mesofilo isobilateral a dorsiventral; tricomas simples; estômatos ranunculáceos, ocorrendo em
ambas as superfícies de folhas adultas, e presença de cristais.
O eucalipto apresenta cavidades secretoras lisígenas (Metcalfe e
Chalk, 1957; Esau, 1974; Castro e Machado, 2006) que, na maioria das espécies estão
localizadas abaixo da epiderme e distribuídas nos tecidos parenquimáticos; em algumas
espécies, como Corymbia citriodora, essas cavidades são substituídas por emergências
secretoras localizadas em ambas as faces da folha (Accorsi, 1941; Metcalfe e Chalk, 1957). A
epiderme é revestida por cutícula, composta de cutina e ceras; o mesofilo é isobilateral quando
a folha se encontra em formação, tornando-se dorsiventral posteriormente (Metcalfe e Chalk,
1957).
14
A primeira linha de defesa de uma planta contra agentes invasores é a
sua superfície, onde ocorre a aderência do patógeno, que utiliza seus artifícios para penetrar na
mesma e causar a infecção (Agrios, 2005). A forma física da cutícula, o número de estômatos
e de tricomas por área de epiderme são fatores importantes na definição do nível de resistência
a patógenos por algumas espécies vegetais (Medeiros et. al, 2003; Agrios, 2005).
A cutícula, camada de cutina e cera que recobre a epiderme da folha, é
a primeira barreira enfrentada por um patógeno (Pascholati e Leite, 1995). A espessura e o
tipo da cutícula, bem como a quantidade e a qualidade da cera presente podem dificultar a
ação do patógeno e sua penetração nos tecidos do hospedeiro (Medeiros et. al, 2003).
A composição química, a quantidade e a forma física das ceras
epicuticulares de folhas são governadas por muitos fatores, variando entre espécies (Baker e
Hunt, 1981). Dessa forma, a consideração da cutícula como estrutura de resistência deve ser
analisada com prudência, visto que tal capacidade depende das características desta e do
agente de inter-relação (Silva et. al, 2005).
De acordo com Medeiros (2003), o alto nível de pilosidade e
cerosidade da cutícula dificultam o acúmulo de água sobre a folha, interferindo na germinação
de esporos fúngicos que necessitam de alta umidade para ativar este processo. Este fato foi
verificado por Jerba et al. (2002) em folhas de feijão, em que a maior pilosidade presente em
cultivares resistentes à antracnose, proporcionaram o enovelamento de hifas do fungo.
Além da cutícula, o número e distribuição dos estômatos também
atuam no desenvolvimento do patógeno. No entanto, para patógenos que penetram nos tecidos
do hospedeiro por via direta, como o Puccinia psidii, este fatores não têm influência no
desenvolvimento da doença. Para a maioria das ferrugens, a penetração do tubo germinativo
dos esporos fúngicos é realizada diretamente, dispensando a existência de aberturas naturais
ou ferimentos (Ferreira, 1989). Segundo Furtado (comunicação pessoal), apenas 15% do total
de esporos germinados de Puccinia psidii podem penetrar via estômato, sendo o restante por
via cuticular, ocorrendo entre as paredes anticlinais das células epidérmicas.
A lignificação das paredes celulares também pode contribuir na
restrição à colonização das plantas por fitopatógenos. Assim, paredes mais espessadas podem
se tornar mais resistentes à ação de enzimas degradadoras e à difusão de toxinas provenientes
dos patógenos (Pascholati e Leite, 1995; Agrios, 2005; Silva et al., 2005). Além disso, a
15
parede celular também pode inibir o crescimento do patógeno através de enzimas
degradadoras da parede fúngica e da produção de fitoalexinas, produtos naturais acumulados
após a infecção (Pascholati e Leite,1995; Agrios, 2005).
De acordo com Pascholati e Leite (1995), o xilema e as fibras
esclerenquimáticas, presentes na região da nervura central da folha, são ricos em lignina,
podendo interromper o avanço de fungos e bactérias nessa região. Este fator pode estar
relacionado à preferência de alguns patógenos, como o P. psidii, pela região internervural da
folha, que apresenta lignina somente nas regiões dos feixes vasculares, sendo o restante do
mesofilo destituído de lignificação.
Tecidos parenquimáticos também podem exibir resistência aos
patógenos, através da organização e características das células (Silva et al., 2005). Smith et al.
(2006) verificaram maior proporção de parênquima paliçádico e menor ocorrência de espaços
intercelulares em folhas de Eucalyptus nitens, considerado resistente ao Mycosphaerella spp.
Os autores relataram ainda que camadas de células paliçádicas com menores espaços
intercelulares podem atrasar ou impedir a infecção de algumas espécies de Mycosphaerella no
hospedeiro, devido à compactação dessas células o que dificulta a colonização do patógeno.
Este fato também foi observado por Jerba (2003) em folhas de cultivares de feijoeiro, com
diferentes graus de resistência à antracnose.
No entanto, a exposição de uma planta a condições de estresse e
alterações ambientais, pode modificar a sua estrutura anatômica. As deficiências e
desequilíbrios nutricionais provocam mudanças morfológicas e bioquímicas na planta,
podendo tornar certos materiais genéticos mais suscetíveis à infecção por P. psidii. Dentre os
macronutrientes, as deficiências de Potássio e Cálcio são as que provocam as maiores
mudanças estruturais e bioquímicas, tornando as plantas mais suscetíveis; além disso, a
carência de boro torna as paredes celulares mais finas e desestruturadas, favorecendo a
penetração das hifas (Silva et al., 2005). Estudos mostram também que o silício promove o
espessamento das células epidérmicas, proporcionando uma resistência física à penetração dos
patógenos (Korndörfer e Rodrigues, 2005).
Segundo Medeiros et al. (2003), os mecanismos estruturais explicam
alguns casos de resistência, mas a bioquímica é a chave da imunidade. Porém, estes fatores de
resistência devem ser avaliados conjuntamente, visto que não é apenas uma característica da
16
planta a responsável pelo seu processo de defesa, mas sim fatores estruturais, bioquímicos e
genéticos que estão interligados.
4.3. Relações entre óleos essenciais e a resistência de plantas a patógenos
Ao contrário dos metabólitos primários, como clorofila, aminoácidos,
nucleotídeos, carboidratos simples ou membranas lipídicas, os metabólitos secundários não
tem, geralmente, papel reconhecido no processo de fotossíntese, respiração, transporte de
solutos, translocação e assimilação de nutrientes ( Santos, 2004) .
No entanto, o metabolismo secundário desempenha um papel
importante na interação das plantas com o meio ambiente. Produtos secundários possuem um
papel contra a herbivoria, ataque de patógenos, competição entre plantas, atração de
organismos benéficos, ação protetora em relação a estresses abióticos, como mudanças de
temperatura, conteúdo de água, níveis de luz, exposição à UV e deficiência de nutrientes
minerais (Jones et al., 1991; Santos, 2004;). Segundo Bennett e Wallsgrove (1994), muitos
produtos secundários são componentes chave para um mecanismo de defesa ativo e eficiente
das plantas contra patógenos e insetos.
Gottlieb et al. (1996) caracteriza os metabólitos secundários como
especiais, provenientes da matéria-prima e energia fornecidas pelos metabólitos primários. Os
metabólitos secundários também diferem dos primários por apresentarem uma distribuição
restrita no reino vegetal, ou seja, são freqüentemente encontrados somente em algumas
espécies de plantas ou grupos taxonômicos (Bennett e Wallsgrove, 1994).
O estudo dos metabólitos secundários teve início no século XIX,
devido ao interesse em descobrir sua importância em medicamentos, os efeitos tóxicos,
condimentares e em materiais industriais. Até então, estes metabólitos eram pouco conhecidos,
por serem considerados sem funcionalidade no metabolismo da planta (Agosta, 1996, citado
por Taiz e Zeiger, 1998).
De acordo com os biologistas evolucionários a defesa das plantas
pode ter surgido por meio de mutações genéticas, seleção natural e mudanças na evolução.
Mutações casuais nos caminhos metabólicos levam ao aparecimento de novos componentes
que podem ser tóxicos ou impedir a ação de herbívoros e patógenos.
17
As rotas dos metabólitos secundários são ativadas durante alguns
estádios particulares de crescimento e desenvolvimento da planta ou em períodos de estresse
causados por limitações de recursos ou ataque microbiológico (Mann,1987 citado por Santos,
2004).
As principais classes de metabólitos secundários são compostas por
fenilpropanóides, alcalóides, taninos, antraquinonas, flavonóides e terpenóides (Santos, 2004).
Os terpenos ou terpenóides constituem uma ampla classe de produtos
secundários, que são ativos contra bactérias, fungos, vírus e protozoários (McGarvey e
Croteau, 1995; Cowan, 1999)
Os terpenos são classificados de acordo com o número de unidades de
cinco carbonos que contêm. Assim, terpenos com dez carbonos, contendo duas unidades C
5 ,
são denominadas monoterpenos; com quinze carbonos, sendo três unidades C5,
sesquiterpenos; com vinte carbonos, sendo quatro umidades C5, diterpenos. Acima disso, são
chamados triterpenos (30 carbonos), tetraterpenos (40 carbonos) e politerpenos. Os elementos
estruturais dos terpenos são, às vezes, chamados unidades isopreno, pois em altas
temperaturas, os terpenos podem se decompor e formar isoprenos. Os monoterpenos e os
sesquiterpenos são as principais substâncias que compõem os óleos essenciais (Santos, 2004;
Simões e Spitzer, 2004). Os sesquiterpenos são menos voláteis e tem menos propriedades
organolépticas do que os monoterpenos, no entanto, podem influenciar no odor dos óleos
essenciais (Boland et al., 1991).
Os óleos essenciais são definidos pela ISO (International Standard
Organization) como produtos obtidos de partes de plantas por meio da destilação por arraste
de vapor d'água, bem como os produtos obtidos por prensagem dos pericarpos de frutos
cítricos. De forma geral, são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas,
geralmente odoríferas e líquidas (Simões e Spitzer, 2004). São complexos componentes
voláteis, produzidos em diferentes partes da planta, sendo conhecidos por apresentarem várias
funções na mesma, incluindo resistência conferida a pragas e doenças (Goubran e Holmes
1993, citado por Ranasinghe et al., 2002). Podem ser produzidos em estruturas secretoras
especializadas, como pêlos glandulares, células parenquimáticas diferenciadas e cavidades
oleíferas (Fahn, 1979; Castro e Machado, 2006; Simões e Spitzer, 2004).
18
Na família Myrtaceae uma das principais características é a presença
de pontos translúcidos nas folhas que correspondem às cavidades secretoras de óleos
essenciais, presentes abaixo da epiderme e distribuídas ao longo dos tecidos parenquimáticos
(Johnson, 1926; Accorsi, 1941; Castro e Machado, 2006). De acordo com Castro e Machado
(2006), o material secretado nessas cavidades em espécies de Eucalyptus se constitui em uma
mistura de óleos essenciais e compostos fenólicos.
Assim como os óleos essenciais, os fenóis também são importantes
na proteção das plantas contra fatores ambientais e bióticos, inibindo a ação de fungos,
bactérias, vírus, insetos e apresentando efeito alelopático (Bennett e Wallsgrove, 1994).
Os óleos voláteis, obtidos de diferentes órgãos, de uma mesma planta
podem apresentar composição química, caracteres físico-químicos e odores bem distintos.
Cabe ainda lembrar que a composição química de um óleo volátil, extraído do mesmo órgão
de uma mesma espécie vegetal, pode variar significativamente de acordo com a época de
coleta, condições climáticas e de solo.
Romoff et al. (2005) observaram uma flutuação no teor de
sesquiterpenos nos meses de fevereiro e março, bem como a predominância de derivados
monoterpênicos, nos meses de julho, setembro e novembro, ao analisarem o óleo volátil de
folhas de Syzygium cuminii, confirmando a influência de fatores climáticos e fenológicos.
Maffeis et al. (2000) verificaram que, na omissão dos nutrientes
Potássio e Boro, os valores de citronelal encontrados na composição do óleo essencial de E.
citriodora foram abaixo de 65%, devido ao comprometimento na produção de folhas. Dessa
forma, comprovaram a queda na produção deste componente, tendo em vista que tal espécie
tem de 65-85% de citronelal em sua composição.
A composição química do óleo volátil de uma planta é determinada
geneticamente, sendo geralmente específica para um determinado órgão, e característica para
seu estágio de desenvolvimento (Simões e Spitzer, 1999), mas as condições ambientais são
capazes de causar variações significativas.
Andrade e Gomes (2000), verificando a influência de fatores não
genéticos sobre o teor de óleo essencial, em folhas de E. citriodora, observaram melhores
resultados na destilação das folhas maduras, quando comparadas às folhas jovens (tenras). Isto
ocorreu independentemente do estado físico das folhas e da idade do povoamento florestal que
19
as originou. Além disso, os rendimentos médios em óleo essencial, obtidos a partir da
destilação das folhas previamente trituradas, foram significativamente superiores àqueles
apresentados pelas folhas não trituradas.
O ambiente no qual o vegetal se desenvolve e os tipos de cultivo
também influem sobre a composição química dos óleos voláteis. A temperatura, a umidade
relativa, a duração total de exposição ao sol e o regime de ventos exercem uma influência
direta, sobretudo sobre as espécies que possuem estruturas histológicas de estocagem na
superfície. Nos vegetais em que a localização de tais estruturas é mais profunda, a qualidade
dos óleos voláteis é mais constante (Valmorbida et al., 2006).
Galanti (1987) e Vitti e Brito (1999), citados por Andrade e Gomes
(2000), relatam que o rendimento em óleo essencial pode estar relacionado com as condições
de solo, clima, época da colheita, idade da planta, teor de umidade da folha, método de
destilação, tempo de destilação, pressão de vapor, procedência da planta e com outros fatores.
Em trabalho realizado por Lima et. al. (2005), às 7:30 da manhã a
concentração de óleo essencial em folhas de goiabeira (Psidium guajava), pertencente à
família Myrtaceae, foi de 0,115%, enquanto que às 9:00 horas foi de 0,110% e às 12:00 horas
de 0,090%, sendo os rendimentos calculados em peso/peso.
Sob o ponto de vista da sua composição química, qualitativa e
quantitativamente, os óleos essenciais de eucalipto são misturas, mais ou menos complexas, e
variam com as espécies, genética, tipo e idade da folha, condições ambientais (clima, solo, luz,
calor, umidade) e processo de extração. Predominam nesses óleos os hidrocarbonetos
terpênicos monoclínicos, derivados do isopreno.
De acordo com Boland et al. (1991), o óleo obtido da destilação a
vapor de folhas de Eucalyptus grandis é uma complexa mistura de terpenos e β-tricetonas . Os
principais terpenos encontrados são monoterpenos como α-pineno (22-36%), limoneno (0,6-
2%), 1,8-cineol (0,8-8%), p-cimeno (1,4-17%), aldeído canfonelico (0,6-2,9%), fenchona (0,2-
0,4%), trans-pinocarveol (0,8-3%) e α–terpineol (3-5%); e os sesquiterpenos são os álcoois
globulol (0,2-1%), espatulenol (0,6-3%) e muitos álcoois não identificados variando de 0,3-
2%. Quanto às β-tricetonas, que correspondem a 40% do total de óleo, três estão presentes:
leptospermona (24%), flavosona (13%) e isoleptospermona (3%).
20
Segundo Oqunwande et al (2003), investigações anteriores dos
constituintes químicos do óleo extraído de folhas de Eucalyptus grandis cultivado no Uruguai,
Austrália e Turquia mostraram o 1,8-cineol como principal componente. Já, Dethier et al.
(1994) verificaram que o óleo de folhas de E. grandis crescidos no Burundi apresentou como o
α-pineno como composto majoritário; enquanto que α-pineno e orto-cimeno foram os
principais constituintes no Congo. Dagne et al. (2000) encontraram α-pineno e β-pineno como
mais abundantes na Etiópia.
Oqunwande et al (2003) verificaram ainda que o rendimento dos óleos
obtidos da hidrodestilação de folhas de E. microtheca, E. tereticornis e E. grandis foram 2,3%,
3,4% e 4,7% (peso/peso), respectivamente.
O monoterpeno rico em óleos de folhas de E. grandis foi
caracterizado pela abundância de α-pineno (30,4%), terpinen-4-ol (10,7%), cis-β-ocimeno
(9,4%), borneol (8,4%) e cis-terpineol (8,0%). A ausência de 1,8-cineol revelou um desvio
acentuado dos resultados de investigações prévias, mas nota-se que a quantidade deste
componente relatado na literatura foi relativamente baixo, entre 0,8 a 8% (Oqunwande et al,
2003). Os mesmos autores observaram ainda que os sesquiterpenos estavam presentes em
baixa quantidade (0,6-13,3%) nas três espécies de eucalipto, enquanto um aldeído poderia ser
identificado somente em óleo de E. microtheca.
Segundo Janssen et al. (1987), um composto é considerado
biologicamente ativo quando exerce ação específica sobre determinado ser vivo, seja ele
animal, vegetal ou microrganismo. Uma vasta gama de compostos orgânicos de origem
vegetal é biologicamente ativa, isto é, tem ação tranqüilizante, analgésica, antiinflamatória,
citotóxica, anticoncepcional, antimicrobiana, antiviral, fungicida, inseticida, etc. Dentre os
fitocompostos, os óleos essenciais encontram maior aplicação biológica como agentes
antimicrobianos, o que representa uma extensão do próprio papel que exercem nas plantas,
defendendo-as de bactérias e fungos fitopatogênicos.
No caso de óleos de eucalipto, existem alguns relatos do seu uso
contra fitopatógenos. Salvatori et al. (2002) reportaram a ação antifúngica do óleo de
Corymbia citriodora, testados in vitro através do crescimento micelial, no controle de alguns
fitopatógenos. Zeni et al. (2004) verificaram o efeito inibidor do óleo de C. citriodora sobre
Botritys cinerea.
21
Muitos óleos de eucalipto são relatados apresentando propriedades
carminativa, inseticida e antimicrobial. As folhas têm sido usadas no armazenamento de grãos
devido à habilidade de seus óleos em inibir o crescimento de outros organismos (Oqunwande
et al, 2003)
Salgado et al. (2003) observaram acentuada ação fungitóxica do óleo
essencial de Eucalyptus urophylla sobre Fusarium oxysporum, Bipolaris sorokiniana e
Botrytis cinerea, devido à presença do globulol, composto majoritário desse óleo. No entanto,
Salgado et al. (2001) não detectaram presença deste componente nos óleos de Corymbia
citriodora e Eucalyptus camaldulensis, diferentemente de Boland et al. (1991), que
registraram teor de 3 a 7% de globulol em E. camaldulensis.
Abreu et al. (2005), detectaram ausência completa de folhas e folíolos
doentes de tomateiro, cultivado em ambiente protegido, devido à ação do óleo de Corymbia
citriodora na concentração 5000 μL.L
-1
sobre o fungo Alternaria solani.
Em estudo desenvolvido por Bartynska e Budzikur Ramza (2001), os
óleos essenciais de eucalipto, lavanda, alecrim e tomilho foram efetivos na inibição do
crescimento de fungos pertencentes ao gênero Fusarium.
Apesar dos produtos secundários serem importantes na proteção das
plantas contra uma ampla variedade de microrganismos e herbívoros, em algumas situações
patógenos especializados podem se tornar resistentes às barreiras químicas impostas pelas
plantas, podendo ser atraídos por toxinas produzidas pelas mesmas (Wink, 1987).
A estimulação da germinação de urediniósporos da ferrugem do trigo
foi verificada por French (1961), o qual demonstrou que muitos terpenóides e compostos
relacionados foram capazes de acelerar a taxa de germinação desses esporos. Bizi (2006) ao
testar “in vivo” o efeito dos óleos essenciais de Eucalyptus globulus, Pinus spp. e Corymbia
citriodora verificou a ausência total de controle de Botrytis cinerea e Oidium sp. em
Eucalyptus dunnii e E. benthamii, respectivamente, sugerindo a presença de algum composto
capaz de atrair ou estimular o processo infeccioso do patógeno no hospedeiro.
22
Capítulo I
Anatomia foliar quantitativa em três estágios de desenvolvimento de clones de eucalipto
e sua relação com a ferrugem
23
Anatomia foliar quantitativa em três estágios de desenvolvimento de clones de eucalipto
e sua relação com a ferrugem*
Renata Ruiz Silva-Souza
(1)
, Roberto Antonio Rodella
(2),
Edson Luiz Furtado
(1**).
(1)
Departamento de Produção Vegetal, Setor de Defesa Fitossanitária, Faculdade de Ciências
Agronômicas – UNESP, CEP 18.610-307, Botucatu-SP. E-mail: rrsilv[email protected];
(2)
Departamento de Botânica, Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP, CEP 18618-
000, Botucatu – SP. E-mail: [email protected].
*Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor: Bolsista da Capes
** Bolsista CNPq
Aceito para publicação em: ____/____/______
____________________________________________________________________________
Resumo
Silva-Souza, R.R; Rodella, R.A; Furtado, E.L. Anatomia foliar quantitativa, em três
estágios de desenvolvimento, de clones de eucalipto e sua relação com a ferrugem.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, 2008.
A ferrugem, causada pelo fungo Puccinia psidii, é uma das principais doenças que
ocorrem na cultura do eucalipto, podendo provocar grandes perdas de produtividade no
campo. O controle é efetuado, principalmente, pelo uso de variedades resistentes. Assim,
estudos anatômicos são importantes para caracterizar as estruturas que estão envolvidas no
mecanismo de defesa da planta. O objetivo foi quantificar a estrutura anatômica da região
internervural da lâmina foliar, em três estágios de desenvolvimento (E1, E3 e E5), de três
clones (Clone A-resistente; Clone B-suscetível e Clone C-altamente suscetível),
provenientes do cruzamento entre Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis, procurando-
se relacionar com a resistência à ferrugem. Foram realizados cortes histológicos e a
24
mensuração dos tecidos presentes na região internervural das folhas. Através da
quantificação dos tecidos, cujos dados foram submetidos a análises estatísticas
multivariadas, foi possível discriminar os três estágios foliares e os clones estudados quanto
ao grau de resistência ou suscetibilidade à ferrugem, causada por P. psidii. O clone A
confirmou a sua resistência pela maior espessura das cutículas abaxial e adaxial, maior
espessura do parênquima paliçádico adaxial, maior % de parênquima paliçádico, maior
número e área de cavidades oleíferas, menor espessura da epiderme abaxial e menor
espessura e % de parênquima lacunoso. Estes parâmetros podem dificultar a penetração do
patógeno e a sua colonização nos tecidos do hospedeiro.
Termos para indexação: Puccinia psidii, anatomia foliar, eucalipto, resistência.
________________________________________________________________________
Summary
Silva-Souza, R.R; Rodella, R.A; Furtado, E.L. Quantitative leaf anatomy at three
developmental stages of eucalyptus clones and their relationship with eucalyptus rust.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, 2007.
The rust caused by the fungus Puccinia psidii is one of the main diseases that occur
in eucalyptus, and may cause substantial yield losses in the field. Control is primarily
achieved with the use of resistant varieties. Therefore, anatomical studies are important to
characterize structures involved in the plant's defense mechanism. The objective of the study
was to quantify the anatomic structure of the leaf blade's interveinal region at three
developmental stages (E1, E3, and E5) of three clones (Clone A-resistant; Clone B-
susceptible, and Clone C-highly susceptible) obtained from a cross between Eucalyptus
urophylla × Eucalyptus grandis, attempting to relate it to rust resistance. Histological cuts
were made and the tissues present in the leaves' interveinal region were measured. Using
tissue quantification, whose data were submitted to multivariate statistical analyses, the three
leaf stages and the clones studied could be discriminated as to their degree of resistance or
susceptibility to rust caused by P. psidii. Clone A confirmed to be resistant, in view of the
25
greater thickness of its abaxial and adaxial cuticles, greater thickness of its adaxial palisade
parenchyma, greater palisade parenchyma percentage, higher number and area of oleiferous
receptacles, smaller thickness of the abaxial epidermis, and smaller thickness and percentage
of spongy parenchyma. These parameters may make it difficult for the pathogen to penetrate
and colonize host tissues.
Keywords: Puccinia psidii, leaf anatomy, eucalyptus, resistance.
________________________________________________________________________
Introdução
Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram estratégias de defesa contra
patógenos e agentes invasores, que poderiam colocar em risco a sua sobrevivência. Através de
mecanismos de resistência estruturais ou bioquímicos, as plantas são capazes de estabelecer
barreiras físicas, impedindo a entrada do patógeno e a colonização dos tecidos, bem como de
produzir substâncias que podem ser tóxicas ao patógeno ou interferir no seu processo de
colonização (Pascholati e Leite, 1995; Agrios, 2005).
Muitos trabalhos já demonstraram que os fatores estruturais de resistência
apresentam íntima relação com a defesa do hospedeiro ao ataque por patógenos, através de
mecanismos pré-formados, como a cutícula, tricomas, estômatos e fibras, ou pós-formados
como as papilas, halos, lignificação, periderme de cicatrização e tiloses.
A superfície das plantas constitui-se na primeira linha de defesa contra
fitopatógenos, que devem ultrapassá-la para causar a infecção (Pascholati e Leite, 1995).
Dessa forma, a espessura cuticular pode contribuir para a resistência da planta, reduzindo a
penetração de fungos, como o Puccinia psidii, que penetra diretamente nos tecidos do
hospedeiro. Nesse caso, o número de estômatos na folha não interfere muito no processo
inicial do patógeno, visto que apenas 15% dos esporos germinados de P. psidii penetram por
esta via.
A interferência da espessura cuticular e do parênquima paliçádico de folhas jovens
de Eucalyptus nitens ao ataque de Mycosphaerella sp. foi relatada por Smith et al. (2006). Os
26
autores verificaram que a maior espessura da cutícula e a alta proporção de parênquima
paliçádico estão associadas com a resistência da planta. Esses fatores, juntamente com a maior
compactação de células e maiores espessuras de paredes celulares também comprovaram a
resistência de feijão à antracnose (Jerba, 2003).
Os tricomas interferem na continuidade do filme d’água sobre a superfície foliar,
dificultando a germinação de esporos fúngicos ou expondo o patógeno a substâncias tóxicas
presentes naqueles que apresentam glândulas secretoras (Pascholati e Leite, 1995, Jerba, 2003,
Agrios, 2005).
Apesar da grande maioria das plantas ser resistente à maior parte dos patógenos,
por possuírem um amplo arranjo de componentes constitutivos de defesa e/ou de bloqueio
físico da entrada de microorganismos, muitas plantas cultivadas são suscetíveis a um
determinado número de patógenos capazes de causar enormes perdas de produtividade
(Barbieri e Carvalho, 2001). Além disso, a falta de diversidade genética em monoculturas
favorece o estabelecimento e epidemia de doenças, quando as condições são favoráveis às
mesmas, como ocorre com o patossistema eucalipto-ferrugem.
Com o grande avanço de áreas reflorestadas, principalmente de plantios clonais, a
ferrugem, juntamente com outras doenças, vem ganhando cada vez mais importância em
função da ausência de materiais geneticamente diferentes. Dessa forma, a utilização de
variedades resistentes e o escape são importantes estratégias de controle da doença.
No entanto, a seleção de variedades resistentes depende não só da resposta da
planta à inoculação com o patógeno, em condições controladas e de campo, ou de fatores
genéticos e bioquímicos, mas também do maior conhecimento da estrutura anatômica da
planta.
O estudo da anatomia foliar é bastante importante, pois permite uma análise
comparativa entre os diferentes hospedeiros em diferentes estágios foliares, possibilitando
relacionar o nível de resistência com a quantidade de tecidos presentes que possam constituir
em barreiras à infecção pelo patógeno.
De acordo com Metcalfe e Chalk (1957), a família Myrtaceae caracteriza-se,
principalmente, pela presença de cavidades lisígenas secretoras de substâncias oleosas;
mesofilo isobilateral a dorsiventral; tricomas simples; estômatos ocorrendo em ambas as
superfícies de folhas e presença de cristais.
27
O eucalipto apresenta cavidades secretoras que, na maioria das espécies são
localizadas abaixo da epiderme e distribuídas nos tecidos parenquimáticos, sendo substituídas,
em algumas espécies, como a Corymbia citriodora, por emergências secretoras distribuídas
em ambas as faces da folha (Accorsi, 1941; Metcalfe e Chalk, 1957). A epiderme é revestida
por cutina e cera em algumas espécies de Eucalyptus; o mesofilo é isobilateral quando em
formação, tornando-se dorsiventral posteriormente (Johnson, 1926; Metcalfe e Chalk, 1957).
A associação entre a anatomia vegetal e a fitopatologia, é de fundamental
importância para o melhor entendimento da patogênese e das reações apresentadas pelo
hospedeiro, quando exposto à ação dos patógenos, bem como para verificar diferenças
estruturais capazes de conferir resistência à planta (Jerba, 2003).
Jerba (2003) diferenciou cultivares de feijoeiro quanto ao grau de resistência à
antracnose através de estudo anatômico foliar e histopatológico. A autora demonstrou que o
cultivar resistente apresentou menor área de nervura central, maior número de tricomas, baixo
nível de infecção pelo patógeno e ocorrência precoce de compostos fenólicos quando
infectado pelo patógeno.
Sambugaro (2003) relata que foi possível a diferenciação de estágios foliares da
seringueira através de estudos anatômicos, bem como do grau de resistência de clones ao
Microcyclus ulei. Assim, clones resistentes à doença apresentaram epiderme abaxial mais
espessa e a ausência da fase sexuada do patógeno, sem a formação de tecidos estromáticos e
esporulação ascógena.
Em eucalipto, a relação entre a anatomia foliar e a fitopatologia foi verificada por
Smith et al. (2006). Os autores observaram que folhas jovens de Eucalyptus nitens resistente a
espécies de Mycosphaerella eram mais espessas, com alta proporção de parênquima paliçádico
e menores espaços intercelulares. Nos estudos histopatológicos verificaram aumento na
divisão celular nas folhas resistentes, bem como a formação de uma periderme necrótica mais
organizada, contínua e lignificada do que nas procedências suscetíveis.
Tendo em vista a importância das estruturas anatômicas da planta na sua proteção
contra patógenos, este trabalho tem como objetivo quantificar a estrutura anatômica da região
internervural da lâmina foliar, em três estágios de desenvolvimento, de três clones de
eucalipto, provenientes do cruzamento entre Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis,
procurando-se relacionar com a resistência à ferrugem.
28
Material e Métodos
O material utilizado na condução do ensaio foi obtido de área de plantio clonal de
Eucalyptus urograndis, híbrido proveniente do cruzamento entre Eucalyptus urophylla e
Eucalyptus grandis, com aproximadamente 12 meses de idade, pertencente à empresa
Votorantim Celulose e Papel S. A. Foi selecionado um clone resistente à ferrugem (clone A),
causada pelo fungo Puccinia psidii, um clone suscetível (clone B) e um altamente suscetível
(clone C), de acordo com testes de inoculação realizados no Departamento de Produção
Vegetal, setor de Defesa Fitossanitária, da Faculdade de Ciências Agronômicas, em Botucatu-
SP, e de índices de incidência e severidade da doença provenientes de levantamentos
realizados pela empresa.
De acordo com Ferreira (1989), a doença se manifesta, principalmente, nos
primeiros pares de folhas e órgãos em início de desenvolvimento. Dessa forma foram
selecionados três estágios foliares para o estudo anatômico, de acordo com a disposição dos
pares de folhas nos ramos, sendo o primeiro estágio (E1) considerado susceptível, o terceiro
(E3) moderadamente resistente e o quinto (E5) resistente à ferrugem, estabelecidos por Silva
et al. (2003).
Para se proceder ao estudo anatômico coletaram-se folhas sadias, nos estágios
descritos acima, e destas foram retiradas amostras do terço médio da lâmina foliar, que foram
imediatamente fixadas em FAA 50 (formaldeído + ácido acético glacial + álcool 50 %),
durante 48 horas, sendo posteriormente conservadas em álcool 70 % e desidratadas em série
etílica ascendente (Johansen, 1940).
As amostras foliares da região internervural foram infiltradas em resina glicol-
metacrilato, seguindo-se a técnica de Gerrits (1991), e posteriormente, cortadas
transversalmente em micrótomo rotatório, com 8 μm de espessura, coradas com azul de
toluidina 0,05% pH 4,7 e montadas em resina sintética (O’Brien et al., 1964). Para cada
estágio foliar e para cada clone foram utilizadas três repetições, a fim de se obter resultados
mais consistentes.
29
As estruturas foliares foram desenhadas com auxilio de microscópio de projeção,
sendo, em seguida, efetuadas as mensurações dos caracteres estruturais, através de uma mesa
digitalizadora acoplada a programa computacional específico.
Foram quantificadas as seguintes características anatômicas da região internervural
da lâmina foliar: espessura da cutícula das faces adaxial e abaxial, espessura da epiderme das
faces adaxial e abaxial, espessura do parênquima paliçádico adaxial e abaxial e % de
parênquima paliçádico em relação à espessura foliar, espessura e % do parênquima lacunoso
em relação à espessura foliar, bem como espessura da folha, área e número de cavidades
oleíferas por mm
2
de superfície foliar.
Para a mensuração da espessura da cutícula adaxial e abaxial, os cortes anatômicos,
provenientes de material incluído em historresina, foram corados com Sudan IV (Johansen,
1940), o qual facilita a observação da cutícula, uma vez que esta estrutura apresenta coloração
hialina, dificultando a sua visualização ao microscópio.
A contagem do número de cavidades oleíferas foi realizada em folhas frescas com
o auxílio de estereomicroscópio acoplado a uma câmara clara, onde foi possível a visualização
dos pontos translúcidos das folhas correspondentes às estruturas. Foram utilizadas oito
repetições para cada tratamento, correspondente aos estágios foliares e aos clones estudados.
A área das cavidades oleíferas por mm
2
de superfície foliar foi calculada
multiplicando-se o número de cavidades pela média da área mensurada de trinta cavidades
oleíferas.
Os dados obtidos foram submetidos aos testes estatísticos multivariados de análise
de agrupamento e análise de componentes principais (Sneath e Sokal, 1973), procurando-se
estabelecer diferenças anatômicas quantitativas entre os clones estudados e os estágios
foliares, bem como relacionar com a resistência à ferrugem.
30
Resultados e Discussão
Características anatômicas da região internervural das folhas dos híbridos de
Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla
O estágio inicial de desenvolvimento foliar (E1) caracteriza-se pela presença de
parênquima paliçádico isobilateral, com poucos espaços intercelulares, paredes celulares
delgadas e menor espessura da folha (Figuras 1-3). O parênquima isobilateral é constituído por
camadas de células paliçádicas em ambas as faces da folha, diferentemente do dorsiventral,
que apresenta parênquima paliçádico na face adaxial e lacunoso na face abaxial (Esau, 1974;
Scatena e Scremin-Dias, 2006), como mostram as Figuras 1 a 3.
Observa-se nas Figuras 4 a 6 que, à medida que a planta se desenvolve, no terceiro
estágio foliar o parênquima apresenta aspecto dorsiventral, como verificado também por
Metcalfe e Chalk (1957) em algumas espécies de Eucalyptus e por Silva et. al (2003), em
Eucalyptus grandis. No quinto estágio foliar, os tecidos já estão mais diferenciados, mantendo
a condição do parênquima dorsiventral (Figuras 7-9).
A epiderme é constituída por células estreitamente unidas entre si, sem espaços
intercelulares e dispostas em uma única camada. A cutícula é bem espessa em todos os clones,
entretanto, no primeiro estágio foliar encontra-se mais delgada quando comparada aos outros
estágios. Uma das características do eucalipto é a presença de cavidades secretoras de óleos
essenciais, que estão distribuídas no mesofilo, em contato direto com a epiderme.
Relação dos caracteres anatômicos quantitativos com a ferrugem
Os valores médios referentes aos 12 caracteres anatômicos quantitativos para os
três clones de eucalipto, em três estágios do desenvolvimento foliar, estão relacionados na
Tabela 1.
Os valores da Tabela 2 referem-se aos coeficientes de correlação entre os 12
caracteres anatômicos quantitativos avaliados e os dois primeiros componentes principais (Y
1
31
e Y
2
). Estes componentes foram responsáveis por 91,95% da informação acumulada pelos
caracteres avaliados, sendo 83,05% de informação retida para Y
1
e 8,90% para Y
2
. Assim,
apenas Y1 revelou-se como indicador de dissimilaridade entre as espécies estudadas e seus
correspondentes estágios foliares. A intensidade da contribuição destes caracteres
quantitativos, para a diferenciação das espécies, está relacionada à ocorrência de maiores
valores absolutos em Y
1
, os quais se caracterizam por apresentar maior poder discriminatório.
Verifica-se na Tabela 2 que, para os componentes principais Y
1
, os caracteres mais
relevantes para a discriminação dos estágios foliares foram: % de parênquima lacunoso,
espessura do parênquima lacunoso, % de parênquima paliçádico, espessura do parênquima
paliçádico abaxial, espessura da folha, número de cavidades oleíferas e espessura da epiderme
adaxial, correspondentes à região internervural da folha.
O dendrograma resultante da Análise de Agrupamento (Figura 10) e a dispersão
gráfica referente à Análise dos Componentes Principais (Figura 11) mostraram que os
caracteres anatômicos quantitativos com maior poder discriminatório foram os responsáveis
pelos agrupamentos formados entre os três clones estudados e os três estágios de
desenvolvimento foliar, constituindo dois grupos principais a 0,24 na escala de distância de
similaridade (Figura 10). O primeiro grupo correspondeu aos primeiros estágios foliares dos
clones A (resistente), B (suscetível) e C (altamente suscetível) e o segundo grupo foi formado
pelos terceiros e quintos estágios dos três clones avaliados (Figuras 10 e 11).
O dendrograma (Figura 10) e a dispersão gráfica (Figura 11) demonstram também
que a partir de uma distância euclidiana de, aproximadamente, 0,17 na escala, são formados
três grupos, sendo o grupo um constituído pelo primeiro estágio foliar dos clones A e B, o
grupo dois pelo primeiro estágio foliar do clone C e o grupo três pelos terceiros e quintos
estágios foliares dos três clones.
A discriminação do primeiro estágio foliar em relação aos outros dois estágios
demonstra a existência de diferenças anatômicas presentes nas folhas de eucalipto, que podem
ser relacionadas à maior suscetibilidade dos órgãos, em início de desenvolvimento, à
ferrugem, causada pelo fungo Puccinia psidii. Estas diferenças estão relacionadas com a maior
espessura da epiderme adaxial e do parênquima paliçádico abaxial, maior proporção de
32
parênquima paliçádico, maior número de cavidades oleíferas, menor espessura e proporção de
parênquima lacunoso e menor espessura da folha (Tabelas 1 e 2).
Os estágios iniciais de desenvolvimento das folhas são caracterizados pela maior
suscetibilidade ao ataque por P. psidii, visto que o patógeno tem preferência por órgãos mais
tenros. No entanto, a resistência da planta a este patógeno pode se manifestar até mesmo
nesses estágios iniciais, impedindo a ação do mesmo em seus tecidos. Dessa forma, para
analisar melhor os fatores envolvidos na resistência da planta ao P. psidii, os estágios foliares
mais extremos (E1 e E5) foram submetidos, separadamente, aos testes estatísticos
mutivariados.
A Tabela 3 apresenta os valores médios referentes aos 12 caracteres anatômicos
quantitativos para os três clones de eucalipto, no primeiro estágio foliar (E1).
Os coeficientes de correlação entre os 12 caracteres anatômicos quantitativos
avaliados e os dois primeiros componentes principais (Y
1
e Y
2
) estão expostos na Tabela 4. A
informação retida foi de 68,53% para o componente principal Y
1
e de 31,47% para o
componente Y
2.,
sendo o primeiro considerado mais satisfatório para a diferenciação.
As análises estatísticas multivariadas permitiram a discriminação do clone
resistente (clone A) em relação aos outros clones, no mesmo estágio foliar (E1), como está
apresentado no dendrograma (Figura 12), a uma distância de 0,20 na escala de similaridade, e
na dispersão gráfica (Figura 13).
Verifica-se na Tabela 4 que, para o componente principal Y
1
, as variáveis que mais
contribuíram para a discriminação dos clones no primeiro estágio foliar foram: área de
cavidades oleíferas, espessura do parênquima lacunoso, espessura das cutículas adaxial e
abaxial, número de cavidades oleíferas, % de parênquima lacunoso, espessura da epiderme
abaxial, espessura do parênquima paliçádico adaxial e % de parênquima paliçádico,
De acordo com o componente principal Y
1
, o clone A, resistente à ferrugem,
diferenciou-se dos demais pela ocorrência de maior espessura das cutículas abaxial e adaxial,
maior espessura do parênquima paliçádico adaxial, maior % de parênquima paliçádico, maior
número e área de cavidades oleíferas, menor espessura da epiderme abaxial e menor espessura
e % de parênquima lacunoso.
33
Resultados semelhantes também foram encontrados por Edwards et al. (1999), que
verificaram maiores frações de parênquima paliçádico e cavidades oleíferas em folhas de
genótipos resistentes de aipo à Septoria apiicola.
Cutículas mais espessas dificultam o processo de penetração de patógenos que
atuam por via direta, como o Puccinia psidii , contribuindo para a defesa da planta e para sua
resistência (Pascholati e Leite, 1995; Agrios, 2005; Silva et al., 2005). A maior proporção de
parênquima paliçádico e menor de parênquima lacunoso, bem como a menor espessura da
epiderme abaxial da folha também conferem resistência à planta contra fitopatógenos como
relatado por Smith et al. (2006) em Eucalyptus nitens resistente à Mycosphaerella spp.
A maior proporção de parênquima paliçádico, a compactação das células
parenquimáticas e menores espaços intercelulares conferem resistência à planta contra
fitopatógenos, devido à maior dificuldade de colonização dos patógenos (Jerba, 2003; Silva et
al., 2005; Smith et al., 2006). De acordo com Smith et al. (2006), o Eucalyptus globulus é mais
suscetível à infecção por Mycosphaerella spp. do que o Eucalyptus nitens, por apresentar
mesofilo dorsiventral em folhas jovens, enquanto que o último apresenta mesofilo isobilateral.
No entanto, no presente trabalho, o primeiro estágio foliar, considerado o mais
suscetível à ferrugem, apresentou mesofilo isobilateral nos três clones. Isto pode ser explicado
pelo fato de que nesta fase o mesofilo da folha encontra-se em processo de diferenciação, com
tecidos meristemáticos primários que darão origem ao parênquima paliçádico e lacunoso, que
ficam mais evidentes nos estágios de desenvolvimento mais avançados da folha. Além disso,
em folhas mais novas, as paredes celulares são mais delgadas, facilitando a entrada do
patógeno em seus tecidos, e as folhas são mais tenras, condição necessária ao Puccinia psidii
(Ferreira, 1989).
O número e área das cavidades oleíferas também são muito importantes na
resistência de uma planta, visto que estas estruturas são responsáveis pelo acúmulo de óleos
essenciais, cujas substâncias e quantidades presentes interferem na % de germinação de
esporos e no crescimento micelial de alguns fungos. Dessa forma, o maior número e a maior
área de cavidades oleíferas irão proporcionar a maior produção desses compostos,
contribuindo para a proteção da planta contra agentes invasores e fitopatógenos.
34
O quinto estágio foliar (E5), considerado mais resistente à ferrugem em relação ao
primeiro (E1) e terceiro (E3), também foi analisado separadamente a fim de verificar a
importância ou implicação na resistência à doença.
Os valores médios referentes aos 11 caracteres anatômicos quantitativos para os
três clones, no quinto estágio de desenvolvimento foliar, estão expostos na Tabela 5.
Na tabela 6, estão representados os coeficientes de correlação entre os caracteres
quantitativos e os dois componentes principais (Y
1
e Y
2
) para o quinto estágio foliar. Neste, os
componentes foram responsáveis por 89,32% de informação retida para Y
1
e por 10,68% para
Y
2,
sendo o primeiro componente considerado mais satisfatório para a discriminação.
Verifica-se na Tabela 6 que, para o componente principal Y
1
, as variáveis que mais
contribuíram para a discriminação dos clones no quinto estágio foliar foram: área de cavidades
oleíferas, espessura da cutícula abaxial, número de cavidades oleíferas, espessura da folha,
espessura da cutícula adaxial, espessura do parênquima lacunoso, espessura das epidermes
adaxial e abaxial e espessura do parênquima paliçádico.
O dendrograma (Figura 14), resultante da análise de agrupamento, e o gráfico de
dispersão (Figura 15), resultante da análise dos componentes principais, revelam a formação
de dois grupos a 0,15 na escala de distância de similaridade, sendo um grupo formado pelos
clones A (resistente) e B (suscetível) e o outro grupo formado pelo clone C, confirmando a
diferenciação deste último em relação aos demais, quanto ao grau de resistência à doença.
Assim, para o componente principal Y
1
, no quinto estágio foliar, o clone C apresentou menor
espessura das cutículas adaxial e abaxial, menor número e área de cavidades oleíferas, maior
espessura das epidermes adaxial e abaxial, maior espessura de parênquimas paliçádico e
lacunoso e maior espessura da folha.
Apesar do estágio foliar mais desenvolvido de eucalipto, como o E5, ser
considerado resistente à ferrugem, não desenvolvendo a doença mesmo em espécies ou clones
suscetíveis à mesma, os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que, ao analisar e
quantificar a estrutura anatômica das folhas, um clone altamente suscetível pode manter sua
predisposição à ferrugem, podendo sua resistência ser conferida por outros fatores não
anatômicos.
35
Assim, o presente trabalho permitiu a diferenciação anatômica entre três estágios
foliares e entre três de clones de eucalipto, demonstrando o envolvimento dos caracteres
estruturais da folha na resistência à ferrugem.
Conclusões
• Foi possível discriminar os três estágios foliares e os clones estudados quanto ao grau de
resistência ou suscetibilidade à ferrugem, causada por P. psidii;
• O clone A confirmou a sua resistência pela maior espessura das cutículas abaxial e adaxial,
maior espessura do parênquima paliçádico adaxial, maior % de parênquima paliçádico,
maior número e área de cavidades oleíferas e menor espessura e % de parênquima
lacunoso;
• Estas características podem dificultar a penetração do patógeno e a sua colonização nos
tecidos do hospedeiro.
Referências Bibliográficas
ACCORSI, W. R. Contribuição para o estudo anatômico comparativo das espécies
Eucalyptus tereticornis Smith e Eucalyptus citriodora Hooker. 1941. 104 p. Tese
(functional) – Universidade de São Paulo- ESALQ, Piracicaba.
AGRIOS, G.N. How plants defend themselves against pathogens. In: Plant Pathology.
San Diego: Academic Press, 2005, p. 208-248.
BARBIERI,R.L.; CARVALHO, F. I F. de. Coevolução de plantas e fungos patogênicos.
Rev. Bras. de Agrociência, v.7, n. 2, p. 79-83 mai-ago, 2001.
EDWARDS, S.J; ISAAC, S.; COLLIN, H.A.; CLIPSON, N. J. Stereological analysis of
celery leaves infected by Septoria apiicola. Mycological Research. 1999, 103: 750-756
Cambridge University Press.
36
ESAU, K. Anatomia das plantas com sementes; tradução: Berta Lange de Morretes.
São Paulo, Editora: Edgard Blucher, 1974, 293 p.
FERREIRA, F.A. Patologia Florestal – Principais Doenças Florestais do Brasil.
Viçosa: Sociedade de Investigações Florestais, 1989. 570p.
GERRITS, P.O. The application of glycol metacrylate in histotechnology; some
fundamental principles. Germany : Leica GmbH, 1991. 80p.
JERBA, V. F. Anatomia e ultra-estrutura foliar de cultivares de feijoeiro (Phaseolus
vulgaris L.) e sua relação com a resistência à antracnose. 2003. 108p. Tese (Doutorado) –
Universidade Estadual Paulista, Botucatu.
JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York :McGraw-Hill, 1940. 523p.
JOHNSON, E.D. A comparison of the juvenile and adult leaves of Eucalyptus globulus.
New Phytologist, v. 25, n. 3, p. 202-212, 1926.
METCALFE, C.R.; CHALK, L. Myrtaceae. In: Anatomy of the Dicotyledons. v.1.
Oxford: Clerendon Press, 1957. p.620-631.
O’BRIEN, T.P.; FEDER, N. e McCULLY, M.E. 1964. Polychromatic staining of plant
cell walls by Toluidine Blue O. Protoplasma, 59: 367-373.
PASCHOLATI, S.F.; LEITE, B. Hospedeiro: Mecanismos de Resistência. In: Bergamin
Filho, A.; Kimati, H. e Amorim, L. Manual de Fitopatologia: Princípios e Conceitos. 3º
ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1995. v.1.,p. 417-453.
SAMBUGARO, R. Caracterização anatômica foliar de clones de seringueira (Hevea
spp.) visando resistência ao Microcyclus ulei. 2003. 61p. Dissertação (mestrado)-
Universidade Estadual Paulista, Botucatu.
37
SCATENA, V.L; SCREMIN-DIAS, E. Parênquima, colênquima e esclerênquima. In:
APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, S. M. Anatomia vegetal.
Viçosa: Ed. UFV, 2 ed. 2006. p. 179-204.
SILVA, E. A. R.; FURTADO, E.L. e RODELLA, R. A. Influências da Maturação Foliar
do Eucalipto na Suscetibilidade à Ferrugem. ln: CONGRESSO DE INICIAÇÃO
CIENTÍFICA, 2003, Marília. Anais, Marília, 2003. CD-ROM.
SILVA, L.M.; ALQUINI, Y. e CAVALLET, V.J. Inter-relações entre a anatomia vegetal e
a produção vegetal. Acta bot. bras. 19(1): 183-194. 2005.
SMITH, A.H.; PINKARD, E.A.; HUNTER, G.C.; WINGFIELD, M.J.; MOHAMMED,
C.L. Anatomical variation and defence responses of juvenile Eucalyptus nitens leaves to
Mycosphaerella leaf disease. Australasian Plant Pathology, v.35, p. 725-731, 2006.
SNEATH, P.H.A. e SOKAL, R.R. Numerical Taxonomy. San Francisco: W.h. Freeman,
1973. 573p.
38
Figuras 1-3. Secções transversais da lâmina foliar, no
primeiro estágio, de três clones de eucalipto. 1. Clone A
(resistente); 2. Clone B (suscetível); 3. Clone C (altamente
suscetível). . PP: parênquima paliçádico. PL: parênquima
lacunoso. CO: cavidade oleífera. Barra: 100 µm.
1
2
3
PP
PP
PL
CO
39
6
Figuras 4-6. Secções transversais da lâmina foliar, no
terceiro estágio, de três clones de eucalipto. 4. Clone A
(resistente); 5. Clone B (suscetível); 6. Clone C (altamente
suscetível). . PP: parênquima paliçádico. PL: parênquima
lacunoso. CO: cavidade oleífera. Barra: 100 µm.
5
4
PP
PL
CO
40
8
7
9
Figuras 7-9. Secções transversais da lâmina foliar, no quinto
estágio, de três clones de eucalipto. 7. Clone A (resistente);
8. Clone B (suscetível); 9. Clone C (altamente suscetível).
PP: parênquima paliçádico. PL: parênquima lacunoso. CO:
cavidade oleífera. Barra: 100 µm.
PP
PL
CO
41
Tabela 1. Valores médios dos 12 caracteres anatômicos quantitativos da região internervural da folha, em três estágios de desenvolvimento (E1, E3,
E5), dos três clones de eucalipto. Clone A: resistente à ferrugem, clone B: suscetível e clone C: altamente suscetível.
E1 E3 E5 E1 E3 E5 E1 E3 E5
Espessura cutícula face adaxial (µm) 7,92 7,62 9,51 7,14 7,24 8,63 6,18 6,59 7,02
Espessura cutícula face abaxial (µm) 6,15 5,52 7,36 5,67 5,41 7,24 4,19 5,52 5,97
Espessura epiderme face adaxial (µm) 16,51 14.06 13,88 19,71 16,59 14,47 16,98 16,40 15,10
Espessura epiderme face abaxial (µm) 12,20 13,00 11,20 12,25 13,59 12,35 13,69 14,24 13,30
Espessura do parênquima paliçádico adaxial (µm) 76,23 78,92 65,52 52,79 80,64 75,78 59,58 78,64 80,44
Espessura do parênquima paliçádico abaxial (µm) 73,10 0,00 0,00 53,23 0,00 0,00 78,40 0,00 0,00
Espessura do parênquima lacunoso (µm) 43,80 193,08 170,00 57,82 172,86 163,81 64,21 177,73 176,26
Espessura da folha (µm) 221,84 299,06 260,42 195,80 283,68 266,41 232,86 287,01 285,10
% de parênquima paliçádico 67,31 26,39 25,16 54,15 28,43 28,44 59,25 27,40 28,21
% de parênquima lacunoso 19,74 64,56 65,28 29,53 60,93 61,49 27,57 61,92 61,82
Área de cavidades oleíferas/mm² de superfície foliar 82,39 73,12 70,58 62,19 106,64 77,79 48,13 58,16 42,14
Número de cavidades oleíferas/mm² de superfície foli
a
15,09 6,25 5,19 14,28 8,72 5,97 9,31 4,19 2,97
Clone A Clone B Clone C
CARACTERES
42
Tabela 2. Coeficientes de correlação entre os 12 caracteres anatômicos quantitativos da
região internervural da folha, em três estágios de desenvolvimento, dos três clones de
eucalipto, e os dois componentes principais (Y
1
e Y
2
). Ord.: ordenação dos caracteres quanto
ao poder discriminatório.
CARACTERES Y1 ord. Y2 ord.
Espessura cutícula face adaxial (µm) -0,3083 10 0,5968 2
Espessura cutícula face abaxial (µm) -0,4094 9 0,4915 4
Espessura epiderme face adaxial (µm) 0,6990 7 -0,0156 10
Espessura epiderme face abaxial (µm) -0,1031 12 -0,5031 3
Espessura do parênquima paliçádico adaxial (µm) -0,6122 8 0,1495 6
Espessura do parênquima paliçádico abaxial (µm) 0,9863 4 -0,1160 8
Espessura do parênquima lacunoso (µm) -0,9925 2 -0,0187 9
Espessura da folha (µm) -0,8928 5 -0,1192 7
% de parênquima paliçádico 0,9924 3 -0,0114 11
% de parênquima lacunoso -0,9968 1 -0,0100 12
Área de cavidades oleíferas/mm² de superfície foliar -0,1088 11 0,9122 1
Número de cavidades oleíferas/mm² de superfície foli
a
0,8798 6 0,4368 5
Informação retida (%) 83,05 8,90
Informação acumulada (%) 83,05 91,95
43
|---------------|---------------|---------------|---------------|---------------|---------------|
Figura 10. Dendrograma resultante da Análise de Agrupamento de 12 caracteres
anatômicos da região internervural da folha, utilizando-se a Distância Euclidiana Média,
entre os três clones de eucalipto e os três estágios do desenvolvimento foliar. A: clone
resistente. B: clone suscetível. C: clone altamente suscetível. E1, E3, E5: estágios do
desenvolvimento foliar.
0.48 0.40 0.32 0.24 0.16 0.08 0.00
A-E1
B-E1
C-E1
A-E3
C-E3
C-E5
A-E5
B-E5
B-E3
44
Figura 11. Dispersão gráfica dos três clones de eucalipto em três estágios de
desenvolvimento foliar, utilizando-se os dois primeiros componentes principais (Y
1
e Y
2
)
para o conjunto das 12 caracteres estruturais quantitativos da lâmina foliar. A: clone
Resistente. B: clone suscetível. C: clone altamente suscetível. E1, E3 e E5: estágios do
desenvolvimento foliar.
Y1
Y2
C-E3
C-E5
B-E1
A-E1
B-E5
C-E1
A-E3
B-E3
A-E5
45
Tabela 3. Valores médios dos 12 caracteres anatômicos quantitativos da região internervural da
folha, no primeiro estágio de desenvolvimento (E1) dos três clones de eucalipto. A: clone
resistente à ferrugem; B: clone suscetível; C: clone altamente suscetível.
ABC
Espessura cutícula face adaxial (µm) 7,92 7,14 6,18
Espessura cutícula face abaxial (µm) 6,15 5,67 4,19
Espessura epiderme face adaxial (µm) 16,51 19,71 16,98
Espessura epiderme face abaxial (µm) 12,20 12,25 13,69
Espessura do parênquima paliçádico adaxial (µm) 76,23 52,79 59,58
Espessura do parênquima paliçádico abaxial (µm) 73,10 53,23 78,40
Espessura do parênquima lacunoso (µm) 43,80 57,82 64,21
Espessura da folha (µm) 221,84 195,80 232,86
% de parênquima paliçádico 67,31 54,15 59,25
% de parênquima lacunoso 19,74 29,53 27,57
Área de cavidades oleíferas/mm² de superfície foliar 82,39 62,19 48,13
Número de cavidades oleíferas/mm² de superfície folia
r
15,09 14,28 9,31
CARACTERES
Clones
46
Tabela 4. Coeficientes de correlação entre os 12 caracteres anatômicos quantitativos da região
internervural da folha, no primeiro estágio de desenvolvimento, dos três clones de eucalipto, e os dois
componentes principais (Y
1
e Y
2
). Ord.: ordenação dos caracteres quanto ao poder discriminatório.
CARACTERES Y1 ord. Y2 ord.
Espessura cutícula face adaxial (µm) 0,9853 3 -0,1705 10
Espessura cutícula face abaxial (µm) 0,9218 4 -0,3877 9
Espessura epiderme face adaxial (µm) -0,2455 10 -0,9694 3
Espessura epiderme face abaxial (µm) -0,8221 7 0,5693 6
Espessura do parênquima paliçádico adaxial (µm) 0,7666 8 0,6421 5
Espessura do parênquima paliçádico abaxial (µm) -0,0892 12 0,9960 1
Espessura do parênquima lacunoso (µm) -0,9949 2 -0,1007 11
Espessura da folha (µm) -0,1810 11 0,9835 2
% de parênquima paliçádico 0,6921 9 0,7218 4
% de parênquima lacunoso -0,8240 6 -0,5665 7
Área de cavidades oleíferas/mm² de superfície foliar 0,9999 1 -0,0086 12
Número de cavidades oleíferas/mm² de superfície folia
r
0,8749 5 -0,4842 8
Informação retida (%) 68,53 31,47
Informação acumulada (%) 68,53 100,00
47
|---------------|---------------|---------------|---------------|---------------|
Figura 12. Dendrograma resultante da Análise de Agrupamento de 12 caracteres anatômicos
da região internervural da folha, utilizando-se a Distância Euclidiana Média, entre os três
clones de eucalipto no primeiro estágio (E1) do desenvolvimento foliar. A: clone resistente.
B: clone suscetível. C: clone altamente suscetível.
Figura 13. Dispersão gráfica dos três clones de eucalipto no primeiro estágio de
desenvolvimento foliar, utilizando-se os dois primeiros componentes principais (Y
1
e Y
2
)
para o conjunto de 12 caracteres anatômicos quantitativos da lâmina foliar. A: clone
resistente. B: clone suscetível. C: clone altamente suscetível. E1: primeiro estágio do
desenvolvimento foliar.
0.22 0.21 0.20 0.19 0.18 0.17
A-E1
C-E1
B-E1
A-E1
C-E1
B-E1
Y1
Y2
48
Tabela 5. Valores médios dos 11 caracteres anatômicos quantitativos da região internervural
da folha, no quinto estágio de desenvolvimento (E5) dos três clones de eucalipto. A: clone
resistente à ferrugem; B: clone suscetível; C: clone altamente suscetível.
ABC
Espessura cutícula face adaxial (µm) 9,51 8,63 7,02
Espessura cutícula face abaxial (µm) 7,36 7,24 5,97
Espessura epiderme face adaxial (µm) 13,88 14,47 15,10
Espessura epiderme face abaxial (µm) 11,02 12,35 13,30
Espessura do parênquima paliçádico adaxial (µm) 65,52 75,78 80,44
Espessura do parênquima lacunoso (µm) 170,00 163,81 176,26
Espessura da folha (µm) 260,42 266,41 285,10
% de parênquima paliçádico 25,16 28,44 28,21
% de parênquima lacunoso 65,28 61,49 61,82
Área de cavidades oleíferas/mm² de superfície foliar 70,58 77,79 42,14
Número de cavidades oleíferas/mm² de superfície foliar 5,19 5,97 2,97
Clones
CARACTERES
49
Tabela 6. Coeficientes de correlação entre os 11 caracteres anatômicos quantitativos da região
internervural da folha, no quinto estágio de desenvolvimento, dos três clones de eucalipto, e os dois
componentes principais (Y
1
e Y
2
). Ord.: ordenação dos caracteres quanto ao poder discriminatório.
CARACTERES Y1 ord. Y2 ord.
Espessura cutícula face adaxial (µm) 0,9098 5 0,4149 7
Espessura cutícula face abaxial (µm) 0,9888 2 0,1493 10
Espessura epiderme face adaxial (µm) -0,8383 7 -0,5452 5
Espessura epiderme face abaxial (µm) -0,7703 8 -0,6377 4
Espessura do parênquima paliçádico adaxial (µm) -0,6902 9 -0,7236 3
Espessura do parênquima lacunoso (µm) -0,9011 6 0,4335 6
Espessura da folha (µm) -0,9533 4 -0,3019 8
% de parênquima paliçádico -0,3791 10 -0,9254 2
% de parênquima lacunoso 0,3644 11 0,9312 1
Área de cavidades oleíferas/mm² de superfície foliar 0,9927 1 -0,1202 11
Número de cavidades oleíferas/mm² de superfície folia
r
0,9836 3 -0,1803 9
Informação retida (%) 89,32 10,68
Informação acumulada (%) 89,32 100,00
50
|---------------|---------------|---------------|---------------|---------------|---------------|
Figura 14. Dendrograma resultante da Análise de Agrupamento de 11 caracteres anatômicos
da região internervural da folha, utilizando-se a Distância Euclidiana Média, entre os três
clones de eucalipto no quinto estágio do desenvolvimento foliar . A: clone resistente; B:
clone suscetível; C: clone altamente suscetível. E5: quinto estágio do desenvolvimento
foliar.
Figura 15. Dispersão gráfica dos três clones de eucalipto no quinto estágio de
desenvolvimento foliar, utilizando-se os dois primeiros componentes principais (Y
1
e Y
2
)
para o conjunto das 11 caracteres anatômicos quantitativos da lâmina foliar. A: clone
resistente; B: clone suscetível; C: clone altamente suscetível. E5: quinto estágio do
desenvolvimento foliar.
0.22 0.20 0.17 0.15 0.12 0.10 0.07
A-E5
B-E5
C-E5
A-E5
B-E5
C-E5
Y1
Y2
51
Capítulo II
Aspectos da patogênese de Puccinia psidii pela micromorfologia da epiderme foliar de
clones de eucalipto
52
Aspectos da patogênese de Puccinia psidii pela micromorfologia da epiderme foliar de
clones de eucalipto
Renata Ruiz Silva Souza
(1)
, Roberto Antonio Rodella
(2)
, Edson Luiz Furtado
(1)**
.
(1)
Departamento de Produção Vegetal, Faculdade de Ciências Agronômicas – UNESP, CEP
18.610-307 Botucatu-SP. E-mails: [email protected]; [email protected]
(2)
Departamento de Botânica, Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP, CEP 18618-000
Botucatu-SP. E-mail: rodella@ibb.unesp.br
*Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor: Bolsista da Capes
** Bolsista do CNPq
Aceito para publicação em: ____/____/______
______________________________________________________________________
Resumo
Silva-Souza, R.R; Rodella, R.A; Furtado, E.L. Avaliação da patogênese de Puccinia psidii
pela micromorfologia da epiderme foliar de clones de eucalipto. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, 2007.
A ferrugem é uma das principais doenças em plantios de eucalipto, provocando
sérios prejuízos à cultura, quando esta se encontra em estágio inicial de desenvolvimento. Para
um melhor entendimento dos processos iniciais de infecção pelo patógeno, o trabalho teve
como objetivo avaliar a patogênese de Puccinia psidii pela micromorfologia da epiderme
foliar em clones de eucalipto. Para o ensaio foram utilizadas mudas de dois clones do híbrido
Eucalyptus urograndis, proveniente do cruzamento entre Eucalyptus urophylla e E. grandis,
selecionados em função da resposta à doença, sendo o clone A resistente e o clone C altamente
suscetível à ferrugem. Discos foliares de três estágios de desenvolvimento da folha (E1, E3 e
E5) foram inoculados no terço médio abaxial e mantidos em condições adequadas ao
estabelecimento do patógeno e desenvolvimento da doença. Amostras foram coletadas em 24
e 120 horas após a inoculação, fixadas em glutaraldeído 2,5% e processadas para a análise em
53
microscópio eletrônico de varredura. O clone resistente manteve sua condição, nos três
estágios foliares, em função da ausência de sintomas, provocados pelo patógeno, na superfície
foliar e pela menor incidência de apressórios formados. O outro clone mostrou-se altamente
suscetível à ferrugem, no primeiro e terceiro estágios foliares, devido à maior ocorrência de
urediniósporos germinados e dotados de apressórios, bem como pela degradação dos tecidos
superficiais da folha. O quinto estágio foliar mostrou-se resistente em ambos os clones, sendo
que o material suscetível caracterizou-se pelo crescimento superficial do patógeno, sem
ocorrência de penetração, e o resistente, pela inativação dos urediniósporos. Notou-se a
formação de protuberâncias na superfície da folha, associadas ao patógeno, somente no
primeiro e terceiro estágios foliares do clone resistente, em 120 horas após a inoculação, e no
quinto estágio foliar do clone altamente suscetível, em 24 horas após a inoculação, sugerindo-
se uma possível reação de defesa da planta.
Termos para indexação: Puccinia psidii, patogênese, eucalipto, resistência.
________________________________________________________________________
Summary
Silva-Souza, R.R; Rodella, R.A; Furtado, E.L. Evaluation of Puccinia psidii pathogenesis
via leaf epidermis micromorphology of eucalyptus clones. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, 2007.
Rust is one of the most important diseases in eucalyptus plantations, causing
serious damages to stands in the initial stage of development. In order to better understand the
initial processes of infection by the pathogen, this study aimed to evaluate Puccinia psidii
pathogenesis based on the leaf epidermis micromorphology of eucalyptus clones. Seedlings
from two clones of the Eucalyptus urograndis hybrid were used in the assay, selected based on
their response to the disease; clone A was considered resistant and clone C was considered
highly susceptible to rust. Leaf discs were inoculated at the middle third and were maintained
at adequate conditions for pathogen establishment and development of the disease. Samples
were collected 24 and 120 hours after inoculation, and were fixed in 2.5% glutaraldehyde and
54
processed for analysis under the scanning electron microscope. The resistant clone maintained
its condition during the three leaf stages, based on the lack of symptoms on the leaf surface
caused by the pathogen, and by the smaller incidence of appressoria formed. The other clone
proved highly susceptible to rust during the first and third leaf stages, due to greater
occurrence of germinated, appressoria-bearing uredospores, as well as because of degradation
of leaf surface tissues. The fifth leaf stage was resistant in both clones, and the susceptible
material was characterized by superficial growth of the pathogen, without occurrence of
penetration, while the resistant material was characterized by uredospore inactivation. The
formation of protuberances was noted on the leaf surface, in association with the pathogen,
only in the first and third leaf stages of the resistant clone, after 120 hours of inoculation, and
the fifth leaf stage of the highly susceptible, 24 hours of inoculation, suggesting a possible
defense reaction by the plant.
Keywords: Puccinia psidii, pathogenesis, eucalyptus, resistance.
________________________________________________________________________
Introdução
O avanço das áreas reflorestadas para regiões mais quentes e úmidas, o plantio de
espécies mais suscetíveis ou de materiais clonais, sem diversidade genética, e a utilização
repetitiva de uma mesma área para plantio criaram condições favoráveis à ocorrência de
doenças (Alfenas et al., 2004). Dentre elas, a ferrugem causada por Puccinia psidii Winter é
uma das mais limitantes no estabelecimento de novos plantios e na condução de brotações de
algumas espécies e procedências de Eucalyptus (Ruiz et al.,1987; Ferreira, 1989).
A ferrugem é uma das principais doenças em plantios de eucalipto, provocando
sérios prejuízos à cultura, quando esta se encontra em estágio inicial de desenvolvimento
(Ferreira, 1989, Alfenas et al., 2004). As plantas ficam mais expostas e suscetíveis ao
patógeno até os dois anos de idade, devido ao maior número de brotações emitidas nesta fase e
à presença de órgãos tenros, ideais ao estabelecimento do agente causal (Ferreira, 1989,
Demuner e Alfenas, 1991; Coutinho et al., 1998). Ocorre tanto em viveiros como em áreas de
55
plantio de eucalipto, sendo neste último a situação que melhor representa as perdas
ocasionadas pela mesma.
O fungo Puccinia psidii, causador da ferrugem, é parasita de diferentes espécies de
mirtáceas nativas e exóticas, com a capacidade de se adaptar e infectar mirtáceas importadas e
não originárias da América do Sul, como algumas espécies de eucalipto (Figueiredo, 2001).
A penetração de urediniósporos, na maioria das vezes, é direta, através da cutícula
e epiderme, entre as paredes anticlinais das células epidérmicas, mediante a formação de
apressório. Após a penetração tem início o processo de colonização intercelular dos tecidos do
hospedeiro pelo patógeno, que por meio de haustórios intracelulares retira os nutrientes no
interior das células do hospedeiro (Ferreira, 1989; Bedendo, 1995; Alfenas et al., 2004).
De acordo com Mendgen et al. (1996), os eventos iniciais da infecção ocorrem
através da adesão do patógeno na cutícula e o crescimento direto de tubos germinativoss na
superfície das plantas.
Para um melhor entendimento dos processos iniciais de infecção pelo patógeno,
torna-se importante o estudo das características da superfície foliar, já que a patogênese
depende da resposta tigmotrópica do patógeno no reconhecimento do hospedeiro ( Bailey et
al., 1992; Jiménez-Diaz, 1996, citados por Jerba, 2003).
O objetivo do presente trabalho foi verificar possíveis diferenças estruturais na
superfície epidérmica foliar e comparar o comportamento do patógeno na pré-infecção entre
dois clones de eucalipto, em três estágios foliares.
Material e Métodos
A condução do experimento foi realizada no Setor de Defesa Fitossanitária, do
Departamento de Produção Vegetal, da Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP em
Botucatu- SP. Os estudos ao microscópio eletrônico de varredura foram realizados no Centro
de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
Para o ensaio foram utilizadas mudas de dois clones do híbrido Eucalyptus
urograndis, com aproximadamente três meses de idade. As mudas foram cedidas pela empresa
Votorantim Celulose e Papel S.A., e os clones selecionados em função da resposta ao ataque
por Puccinia psidii, sendo o clone A resistente e o clone C altamente suscetível à ferrugem.
56
Esporos do fungo, cultivado em Syzygium jambos mantidos em casa-de-vegetação,
no Departamento de Defesa Fitossanitária da Faculdade de Ciências Agronômicas de
Botucatu, foram coletados para o preparo da suspensão de inóculo.
Com a finalidade de garantir o local de deposição do inóculo para o estudo da
microscopia eletrônica de varredura, a inoculação foi efetuada em discos foliares. Com o
auxílio de um furador, foram cortados discos de 1,5 cm de diâmetro de folhas destacadas dos
primeiros, terceiros e quintos pares dispostos no ramo, estabelecidos por Silva et. al, (2003).
Os discos foram colocados sobre espumas saturadas em água em bandejas plásticas
(Figura 1) e inoculados no terço médio abaxial com uma suspensão de esporos, provenientes
de Syzygium jambos, a uma concentração de 9x10
4
esporos\mL. O método de inoculação
utilizado foi o pincelamento, que se mostrou mais eficiente do que o método de deposição de
microgotas, pela maior capacidade de espalhamento do inóculo e durabilidade dos discos.
Após a inoculação, as bandejas foram cobertas com tampa de vidro, para evitar a
perda de umidade, e acondicionadas em uma câmara de inoculação com fotoperíodo de 12
horas e temperatura em torno de 20
o
C (±1), ideais para o desenvolvimento da doença.
Para se proceder ao estudo em microscopia eletrônica de varredura, as amostras
foram coletadas em 24 e 120 horas após a inoculação do patógeno, visto que em 24 horas, sob
condições ideais, os esporos de Puccinia psidii já estão germinados. As amostras coletadas
foram fixadas em glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1M pH 7,3 e pós-fixadas em
tetróxido de ósmio 1% em tampão fosfato 0,1M pH 7,3. Em seguida, passou por uma
desidratação em série de acetona, submetido à secagem em ponto crítico e metalização em
ouro, para posterior análise em microscópio eletrônico de varredura “Philips SEM 515”
(Robards, 1978).
Resultados e Discussão
As Figuras 3-26 revelam a presença de ceras epicuticulares, compostas por placas,
nos dois clones e nos três estágios foliares, comum em algumas espécies de eucalipto.
Observa-se que nos locais de penetração do patógeno há menor ocorrência de ceras, podendo-
se sugerir uma possível capacidade do patógeno em degradar esses componentes; só não se
57
sabe se esta camada é digerida pelos microrganismos e aproveitada por eles como fonte de
energia. No entanto, são necessários estudos para comprovar esta hipótese. Este fato também
foi observado por Magnani et al. (2007).
De acordo com Medeiros et al. (2003), a degradação direta das ceras epicuticulares
é difícil de ser comprovada. Diversos fungos fitopatogênicos produzem cutinases (enzimas
degradadoras da cutina) durante o processo de infecção, auxiliando a penetração do mesmo
nos tecidos do hospedeiro, bem como a adesão dos esporos.
A atividade das cutinases, como auxiliares na adesão de esporos na cutícula, tem
sido demonstrada em urediniósporos de ferrugens (Deising et al., 1992, citado por Mendgen et
al., 1996). Pascholati (1995) também descreveu a importância dessas enzimas, para os fungos
que penetram através da superfície intacta da planta, na degradação enzimática dessa barreira,
constituindo em fator chave na patogenicidade.
Após 24 horas da inoculação do patógeno, verificou-se a germinação dos
urediniósporos nos dois clones, no primeiro estágio foliar. No clone resistente (clone A)
ocorreu, algumas vezes, a desidratação de alguns urediniósporos, tubos germinativos e
apressórios formados (Figuras 3 e 4). Este evento de murcha também foi verificado por
Magnani et al. (2007), no mesmo período, com urediniósporos de Phakopsora pachyrhizi. No
clone suscetível, no mesmo estágio foliar, os urediniósporos germinaram, dando origem a
tubos germinativos íntegros, de tamanhos variados, formando o apressório e iniciando o
processo de infecção (Figuras 5 e 6).
Neste mesmo período, os terceiros e quintos estágios foliares mostraram reações
similares nos dois clones, com a menor incidência de urediniósporos germinados na superfície
foliar. A Figura 7 representa a germinação do urediniósporo fúngico, no clone resistente, no
terceiro estágio foliar, evidenciando a estrutura de penetração (“peg”) entre as paredes
anticlinais das células epidérmicas. Isto demonstra que o patógeno pode atacar até mesmo
plantas resistentes à doença, entretanto, após a penetração do mesmo, as plantas resistentes
podem formar barreiras, impedindo o avanço do patógeno em seus tecidos. No clone
altamente suscetível, também no terceiro estágio foliar, foram observados urediniósporos
germinados (Figuras 9 e 10).
No quinto estágio foliar, após 24 horas da inoculação, a resistência do clone A
ficou mais evidente, com a baixa ocorrência de urediniósporos germinados e a ausência de
58
apressórios, como mostram as figuras 11 e 12. Porém, no clone C (altamente suscetível),
observam-se extensos tubos germinativos e ausência da penetração, bem como a formação de
protuberências na superfície da folha, formadas por células epidérmicas (Figuras 13 e 14).
Magnani et al. (2007) verificaram que urediniósporos com tubos germinativos longos, não
formavam apressórios e, quando isso ocorria, o mesmo era pequeno; já quando os tubos
germinativos apresentavam-se curtos, os apressórios tiveram tamanho igual ou superior aos
dos urediniósporos de origem, concordando com as observações do presente trabalho. De
acordo com Hunt (1983), o tubo germinativo curto reduz a quantidade de energia endógena
gasta com o crescimento e, desta forma, esta energia poderá ser utilizada na penetração das
células.
Em 120 horas após a inoculação, no primeiro estágio foliar, ocorreu a progressão
dos sintomas resultantes da ação do patógeno sobre a superfície foliar. No clone resistente
surgem protuberências na superfície da folha, envolvendo os urediniósporos, como uma
possível reação de proteção da planta (Figura 15 e 16). A Figura 15 mostra a associação da
protuberância com o patógeno, evidenciando a desidratação dos apressórios e urediniósporos.
Esta estrutura foi observada apenas no clone resistente, em todos os estágios foliares, 120
horas após a inoculação, e no quinto estágio foliar do clone altamente suscetível, 24 horas
após a inoculação. No clone C (altamente suscetível), após 120 horas da inoculação, ocorreu a
degradação dos tecidos, tanto da cutícula como da epiderme, indicando o provável início do
processo de colonização do hospedeiro pelo patógeno (Figuras 17 e 18).
Neste período (120 h.a.i.), no terceiro estágio foliar, o clone resistente foi marcado pela
presença das protuberâncias na superfície foliar (Figura 19), também observadas no primeiro
estágio do mesmo clone; bem como pela baixa ocorrência de urediniósporos germinados
(Figura 20). Diferentemente deste, o clone altamente suscetível, apresentou locais com a
degradação dos tecidos superficiais, provocada pelo patógeno (Figuras 21 e 22).
No quinto estágio foliar, em 120 horas após a inoculação, foi mantida a integridade das
células, sem o desenvolvimento da doença, em ambos os clones (Figuras 23-26). No material
suscetível (C) o patógeno apresentou longos tubos germinativos e ausência de apressório e de
“pegs” de penetração (Figura 25 e 26). Estes resultados são semelhantes aos encontrados por
Araújo e Matsuoka (2004), em que longos tubos germinativos de Alternaria solani cresceram
e formaram hifas na superfície da folha de tomateito resistente e suscetível à doença.
59
Assim, o clone A, resistente, manteve sua condição, nos três estágios foliares, pela
ausência de sintomas na superfície foliar e menor incidência de apressórios formados,
concordando com os resultados encontrados por Araújo e Matsuoka (2004).
O clone C mostrou-se altamente suscetível à ferrugem, no primeiro e terceiro estágios
foliares, pela maior ocorrência de urediniósporos germinados e dotados de apressórios, bem
como pela degradação dos tecidos superficiais da folha.
O quinto estágio foliar mostrou-se resistente em ambos os clones, sendo que o material
suscetível caracterizou-se pelo crescimento superficial do patógeno, sem ocorrência de
penetração, e o resistente, pela inativação dos urediniósporos. Estes resultados corroboram
com aqueles encontrados por Xavier (1997) em genótipo de Eucalyptus grandis suscetível ao
Puccinia psidii. A autora observou uma redução gradativa da germinação, formação de
apressório e penetração da primeira até a quarta folha posicionada no ramo, sendo que no
quinto estágio foliar não houve penetração e a germinação foi reduzida em relação ao
observado nos quatro primeiros estágios foliares.
Notou-se a formação de protuberâncias na superfície da folha, associadas ao patógeno,
somente no primeiro e terceiro estágios foliares do clone resistente, em 120 h.a.i. e no quinto
estágio foliar do clone C, em 24 h.a.i., sugerindo-se uma possível reação de defesa da planta.
No entanto, para uma exata interpretação dos resultados observados e do acompanhamento do
processo de infecção na planta, serão realizados cortes histológicos para serem analisados em
microscopia de luz.
Dessa forma, a observação em microscopia eletrônica de varredura permitiu a
confirmação da resistência do clone A e da alta suscetibilidade do clone C, concordando com
os resultados obtidos em inoculações artificiais e de índices da doença no campo.
O método de discos foliares e inoculação por pincelamento mostrou-se eficiente tanto
para o estudo em microscopia eletrônica de varredura, quanto para testes de resistência ou
suscetibilidade ao P. psidii, visto que após dez dias ocorreu o aparecimento dos sintomas no
primeiro estágio foliar do clone suscetível (Figura 2). Vários autores verificaram a eficiência
do método de inoculação em folhas destacadas (Xavier, 1997; Bigirimana e Hofte, 2001;
Kamikoga, 2001; Rios et al., 2001; Jerba, 2003; Bizi et al., 2003; Jackson et al., 2004).
Diferentemente de Magnani et al. (2007), que não observaram a produção de urediniósporos
de Phakopsora pachyrhizi em folhas destacadas de soja e acondicionadas em bandejas.
60
Conclusão
• O clone A, resistente, manteve sua condição, nos três estágios foliares, pela ausência de
sintomas na superfície foliar e menor incidência de apressórios formados.
• O clone C mostrou-se altamente suscetível à ferrugem, no primeiro e terceiro estágios
foliares, pela maior ocorrência de urediniósporos germinados e dotados de apressórios,
bem como pela degradação dos tecidos superficiais da folha.
• O quinto estágio foliar mostrou-se resistente em ambos os clones, sendo que o material
suscetível caracterizou-se pelo crescimento superficial do patógeno, sem ocorrência de
penetração, e o resistente, pela inativação dos urediniósporos.
• Notou-se a formação de protuberâncias na superfície da folha, associadas ao patógeno,
somente no primeiro e terceiro estágios foliares do clone resistente, em 120 h.a.i. e no
quinto estágio foliar do clone C, em 24 h.a.i., sugerindo-se uma possível reação de
defesa da planta.
• O método de inoculação em discos foliares de eucalipto mostrou-se eficiente para o
estudo em microscopia eletrônica de varredura, bem como para testes de resistência à
ferrugem.
• Para o acompanhamento do desenvolvimento do patógeno na folha, será efetuado estudo
histopatológico.
Referências Bibliográficas
ALFENAS, A.C.; ZAUZA, E.A.V.; MAFIA, R.G.; ASSIS, T.F. de. Clonagem e doenças
do eucalipto. Editora UFV, Universidade Federal de Viçosa, p. 246-252. 2004.
ARAÚJO, J.C.A. DE; MATSUOKA, K. Histopatologia da Interação Alternaria solani e
Tomateiros Resistente e Suscetível. Fitopatologia. Brasileira. v. 29, n.3, 2004.
BEDENDO, I. P. Ferrugens. In: Bergamin Filho, A.; Kimati, H. e Amorim, L. Manual de
Fitopatologia: Princípios e Conceitos. 3º ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1995.
v.1.,p. 872-880.
61
BIGIRIMANA, J.; HÖFTE, M. Bean Anthracnose: Inoculation Methods and Influence of
Plant Stage on Resistance of Phaseolus vulgaris Cultivars. Journal of Phytopathology.
v.149, n.7-8, p.403–408, 2001.
BIZI, R. M.; GRIGOLETTI JÚNIOR, A.; AUER, C. G. Métodos de inoculação de
Botrytis cinerea em duas espécies de Eucalyptus. In: Evento de iniciação científica da
embrapa florestas, 2, 2003, Colombo. Anais. Colombo: Embrapa Florestas, 2003. Cd-
Rom.
COUTINHO, T.A.,WINGFIELD, M.J., ALFENAS, A .C. & CROUS, P.W. Eucalyptus
Rust: A Disease with the Potential for Serious International Implications. Plant
Disease, v. 82, n.7, p.819–825, july 1998.
DEMUNER, N. L. e ALFENAS, A. C. Fungicidas sistêmicos para o controle da ferrugem
causada por Puccinia psidii em Eucalyptus cloeziana. Fitopatologia Brasileira. Brasília,
v.16, n.3, p. 171-174, setembro 1991.
FERREIRA, F.A. Patologia Florestal – Principais Doenças Florestais do Brasil.
Viçosa: Sociedade de Investigações Florestais, 1989. 570p.
FIGUEIREDO, M. B. Doenças fúngicas emergentes em grandes culturas. O Biológico.
São Paulo, v. 63, n. 01/02, p. 29-32, jan-dez, 2001.
HUNT, P. Cuticular penetration by germinating uredospores. Transactions of the British
Mycological Society 51:103-112. 1983.
JACKSON, S. L., MAXWELL, A., NEUMEISTER-KEMP, H. G., DELL, B., ST J.
HARDY, G. E. Infection, hyperparasitism and conidiogenesis of Mycosphaerella lateralis
on Eucalyptus globulus in Western Australia. Australasian Plant Pathology. v.33, n.1,
p.49-53, 2004.
62
JERBA, V. F. Anatomia e ultra-estrutura foliar de cultivares de feijoeiro (Phaseolus
vulgaris L.) e sua relação com a resistência à antracnose. 2003. 108p. Tese (Doutorado) –
Universidade Estadual Paulista, Botucatu.
KAMIKOGA, A.T.M. Método da folha destacada para avaliar resistência da soja ao
oídio. Tese (Doutorado). Curitiba – Universidade Federal do Paraná. 2001. 86p.
Disponível
em:<http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/7431/1/MetdFolhaDestacAvaliarRes
SojaOidio.pdf> Acesso em 10, nov., 2007.
MAGNANI, E.B.Z.; ALVES, E.; ARAÚJO, D.V. Eventos dos Processos de Pré-
Penetração, Penetração e Colonização de Phakopsora pachyrhizi em Folíolos de Soja.
Fitopatologia Brasileira, v. 32, n.2, p. 156-160, 2007.
MEDEIROS, R.B. de; FERREIRA, M.A.S.V.; DIANESE, J.C. Mecanismos de agressão
e defesa nas interações planta-patógeno. Brasília: Editora Universidade de Brasília,
290p. 2003.
MENDGEN. K.; Hahn, M.; Deising, H. Morphogenesis and mechanisms of penetration
by plant pathogenic fungi . Annual Review of Phytopathology,. V. 34, p. 367-386, 1996.
PASCHOLATI, S.F.; LEITE, B. Hospedeiro: Mecanismos de Resistência. In: Bergamin
Filho, A.; Kimati, H. e Amorim, L. Manual de Fitopatologia: Princípios e Conceitos. 3º
ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1995. v.1.,p. 417-453.
RIOS, G.P., ANDRADE, E.M. & COSTA, J.L.S. Avaliação da resistência de cultivares e
linhagens do feijoeiro comum a diferentes populações de Uromyces appendiculatus.
Fitopatologia Brasileira. v.26, p.28-133, 2001.
63
ROBARDS, A.W. An introduction to techniques for scanning electron microscopy of plant
cell. In: HALL, G.L. Electron microscopy and cytochemistry of plant cells. New York:
Elsevier, p. 343-444. 1978.
RUIZ, R.A.R.; ALFENAS, A.C.; FERREIRA, F.A.; ZAMBOLIM, L. Fungicidas
protetores e sistêmicos para o controle da ferrugem causada por Puccinia psidii. Revista
Árvore. Viçosa, v.11, p.56-65, 1987.
SILVA, E. A. R.; FURTADO, E.L. e RODELLA, R. A. Influências da Maturação Foliar
do Eucalipto na Suscetibilidade à Ferrugem. ln: CONGRESSO DE INICIAÇÃO
CIENTÍFICA, 2003, Marília. Anais, Marília, 2003. CD-ROM.
XAVIER, A.A. Patogênese da Ferrugem (Puccinia psidii) em Folhas de Genótipos de
Eucalyptus grandis. 42p., 1997. Dissertação (Mestrado) -Resumo. Viçosa – Universidade
Federal de Viçosa.
64
Figura 1. Discos foliares de clones de eucalipto, nos três estágios
de desenvolvimento foliar, inoculados com Puccinia psidii. E1:
primeiro estágio foliar; E3: terceiro estágio foliar; E5: quinto
estágio foliar.
Figura 2. Discos foliares do primeiro estágio foliar do clone
altamente suscetível (clone C) apresentando os sintomas de
ferrugem, comprovando a eficiência do método de inoculação.
E1
E5
E3
65
Figuras 3-6. Superfície abaxial da folha, no primeiro estágio de desenvolvimento (E1), de
clones do híbrido Eucalyptus urograndis, 24 horas após a inoculação de Puccinia psidii. 3:
Clone A (resistente) exibindo tubo germinativo provido de apressório (a), em estado de
desidratação. 4: clone resistente (A) apresentando urediniósporos viáveis (seta). 5-6: Clone
C (altamente suscetível) com vários urediniósporos germinados, apresentando apressórios
íntegros (a).
3
4
5
6
a
a
a a
a
a
66
Figuras 7-10. Superfície abaxial da folha, no terceiro estágio de desenvolvimento (E3),
de clones do híbrido Eucalyptus urograndis , 24 horas após a inoculação de Puccinia
psidii. 7: Clone A (resistente) urediniósporo (U) apresentando “peg” (seta), em
processo de penetração pelas paredes anticlinais das células epidérmicas. 8: clone
resistente (A) demonstrando ausência de germinação de alguns urediniósporos (seta). 9-
10: Clone C (altamente suscetível) mostrando urediniósporos germinados (seta).
7
10
8
9
U
67
Figuras 11-14. Superfície abaxial da folha, no quinto estágio de desenvolvimento (E5),
de clones do híbrido Eucalyptus urograndis, 24 horas após a inoculação de Puccinia
psidii. 11-12: Clone A (resistente) com urediniósporos germinados, destituídos de
apressório (setas). 13: Clone C (altamente suscetível) evidenciando extensos tubos
germinativos sobre a superfície foliar, sem a ocorrência de penetração. 14: clone
altamente suscetível (C) com a formação de protuberâncias (P) no local de deposição
do inóculo, próximo à nervura central (NC).
11
12
13
14
P
NC
68
Figuras 15-18. Superfície abaxial da folha, no primeiro estágio de desenvolvimento (E1),
de clones do híbrido Eucalyptus urograndis, 120 horas após a inoculação de Puccinia
psidii. 15-16: Clone A (resistente) apresentando protuberâncias (P) na superfície da folha,
com a desidratação do apressório (a); bem como a desidratação dos esporos (seta). 17-18:
Clone C (altamente suscetível) exibindo a degradação dos tecidos epidérmicos (setas).
15
16
17
18
P
a
P
P
69
Figuras 19-22. Superfície abaxial da folha, no terceiro estágio de desenvolvimento
(E3), de clones do híbrido Eucalyptus urograndis, 120 horas após a inoculação de
Puccinia psidii. 19: Clone A (resistente) com protuberâncias (P) na superfície foliar.
20: clone resistente (A) sem a degradação dos tecidos. 21: Clone C (altamente
suscetível) mostrando extensos tubos germinativos (seta). 22: clone C mostrando os
danos causados pelo patógeno (seta).
19 20
21 22
P
P
70
Figuras 23-26. Superfície abaxial da folha, no quinto estágio de desenvolvimento (E5),
de clones do híbrido Eucalyptus urograndis, 120 horas após a inoculação de Puccinia
psidii. 23-24: Clone A (resistente) com esporos murchos (seta) e ausência de apressório
(seta). 25-26: Clone C (altamente suscetível) exibindo extensos tubos germinativos sem
a penetração do patógeno (setas).
23 24
25 26
71
Capítulo III
Composição de óleos essenciais em três estágios foliares de clones de eucalipto e sua
relação com a ferrugem, causada pelo fungo Puccinia psidii
72
Composição de óleos essenciais em três estágios foliares de clones de eucalipto e sua
relação com a ferrugem, causada pelo fungo Puccinia psidii*
Renata Ruiz Silva-Souza
(1)
, Roberto Antonio Rodella
(2)
, Márcia Ortiz Mayo Marques
(3)
,
Edson Luiz Furtado
(1)**
.
(1)
Departamento de Produção Vegetal, Faculdade de Ciências Agronômicas – UNESP, CEP
18.610-307 Botucatu-SP. E-mail: rrsilva@fca.unesp.br; [email protected].
(2)
Departamento de Botânica, Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP, CEP 18618-000
Botucatu-SP. E-mail: rodella@ibb.unesp.br.
(3)
Centro de P & D de Recursos Genéticos Vegetais, Instituto Agronômico de Campinas, CEP
13012-970 Campinas-SP. E-mail: [email protected].
*Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor: Bolsista da Capes
** Bolsista do CNPq
Aceito para publicação em: ____/____/______
____________________________________________________________________________
Resumo
Silva-Souza, R.R; Rodella, R.A; Marques, M.O.M; Furtado, E.L. Composição de óleos
essenciais em três estágios foliares de clones de eucalipto e sua relação com a ferrugem,
causada pelo fungo Puccinia psidii. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 2007.
A resistência bioquímica é um mecanismo de defesa utilizado pelas plantas para
inibir a ação do patógeno, expondo-o às substâncias tóxicas provenientes de reações químicas
que ocorrem nas células do hospedeiro. Devido à importância dos óleos essenciais na proteção
das plantas contra fatores ambientais e bióticos, inibindo a ação de patógenos, o objetivo do
trabalho foi caracterizar a composição de óleos essenciais em folhas frescas, em três estágios
de desenvolvimento (E1, E3 e E5), de três clones de eucalipto, procurando-se relacionar com a
resistência à ferrugem, causada pelo fungo Puccinia psidii. Os óleos foram extraídos por
hidrodestilação e analisados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas.
73
Os dados da composição química e os respectivas porcentagens dos constituintes foram
submetidos aos testes estatísticos multivariados de análise de agrupamento e análise de
componentes principais. O trabalho permitiu a discriminação dos clones estudados e a
obtenção de dois marcadores bioquímicos de resistência à ferrugem do eucalipto, o limoneno e
o γ-terpineno. O clone altamente suscetível apresentou alta porcentagem de γ-terpineno e o
clone resistente apresentou alta porcentagem de limoneno. Assim, foi possível relacionar a
composição química dos óleos essenciais com as diferentes respostas dos clones à ferrugem.
Termos para indexação: óleos essenciais, Puccinia psidii, resistência, eucalipto.
Summary
Silva-Souza, R.R; Rodella, R.A; Marques, M.O.M; Furtado, E.L. Essential oil composition at
three leaf stages of eucalyptus clones and their relationship with rust caused by the
fungus Puccinia psidii. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 2007.
Biochemical resistance is a defense mechanism used by plants to inhibit a
pathogen's action, by exposing it to toxic substances from chemical reactions that take place in
cells of the host. Due to the importance of essential oils in protecting plants against
environmental and biotic factors, thus inhibiting the action of pathogens, the objective of this
study was to characterize the essential oil composition of fresh eucalyptus leaves at three
developmental stages (E1, E3, and E5) in three clones, attempting to relate them to resistance
against eucalyptus rust caused by the fungus Puccinia psidii. The oils were extracted by
hidrodestilation and were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. The chemical
composition data and their respective constituent contents were submitted to multivariate
statistical tests, namely cluster analysis and principal components analysis. The study allowed
the discrimination of the clones studied and the identification of two biochemical marks, the
limonene and the γ-terpinene. The highly susceptible clone showed higher percentage of γ-
terpinene and the resistant clone was different because of its higher percentage of limonene.
Consequently, it was possible to relate the chemical composition of essential oils with
different clone responses to eucalyptus rust.
74
Keywords: essential oils, Puccinia psidii, resistance, eucalyptus.
Introdução
As ferrugens são doenças causadas por patógenos biotróficos que necessitam do
hospedeiro vivo para sua sobrevivência, retirando nutrientes e utilizando-os nos seus processos
vitais, sem causar a morte da planta. No entanto, esses nutrientes encontram-se no interior das
células vegetais e tornam-se acessíveis aos patógenos somente quando estes conseguem
penetrar nos tecidos do hospedeiro, ultrapassando barreiras físicas e o arsenal bioquímico de
defesa da planta (Ferreira, 1989; Bedendo, 1995; Pascholati e Leite, 1995).
A resistência bioquímica é um mecanismo de defesa utilizado pelas plantas para
inibir a ação do patógeno, expondo-o às substâncias tóxicas provenientes de reações químicas
que ocorrem nas células do hospedeiro. Essas substâncias estarão em alta concentração nos
tecidos sadios das plantas quando forem pré-formadas, e em baixos níveis, antes da infecção,
quando pós-formadas (Pascholati e Leite,1995; Agrios, 2005). As substâncias pré-formadas
como compostos fenólicos, alcalóides e terpenóides, juntamente com outras substâncias, são
produtos do metabolismo secundário das plantas, com a capacidade de garantir vantagens à
sobrevivência e perpetuação da sua espécie (Coutinho et al., 2004; Santos, 2004).
Embora o metabolismo secundário não esteja diretamente envolvido nos processos
vitais da planta, ele desempenha um papel importante na sua interação com fatores bióticos.
As rotas metabólicas são ativadas em algumas fases de desenvolvimento da planta ou períodos
de estresse, causados por limitações nutricionais ou ataque microbiológico (Mann, 1987,
citado por Santos, 2004).
Os terpenóides, que englobam, dentre outros, os mono e os sesquiterpenos
presentes nos óleos essenciais, são ativos contra bactérias, fungos, vírus e protozoários
(Cowan, 1999).
Os óleos essenciais podem apresentar uma composição química e odores bem
distintos, devido às variações climáticas, ambientais e culturais que as plantas estão
submetidas, bem como aos fatores relacionados à época e horário de coleta, métodos de
extração e estágios de desenvolvimento da planta (Santos, 2004).
75
A composição química do óleo essencial de uma planta é determinada
geneticamente, sendo geralmente específica para um determinado órgão, e característica para
seu estágio de desenvolvimento, mas as condições ambientais são capazes de causar variações
significativas (Simões e Spitzer, 2004).
Os óleos essenciais extraídos de folhas de espécies de eucalipto são formados por
misturas complexas de compostos orgânicos voláteis que incluem hidrocarbonetos, álcoois,
aldeídos, cetonas, ácidos e ésteres. São compostos, predominantemente, por mono e
sesquiterpenos, sendo os monoterpenos os mais abundantes (Boland et al., 1991).
Na maioria das espécies de eucalipto, os óleos essenciais estão localizados em
cavidades ou glândulas secretoras lisígenas distribuídas no mesofilo da folha, mais
precisamente entre as células dos parênquimas abaxial e adaxial (Johnson, 1926; Accorsi,
1941; Metcalfe e Chalk, 1957; Esau, 1974; Boland et al., 1991; Castro e Machado, 2006). No
entanto, em Corymbia citriodora essas glândulas estão ausentes no mesofilo da folha, sendo
substituídas por emergências secretoras de essência oleosa, distribuídas em ambas as
epidermes (Accorsi, 1941; Metcalfe e Chalk, 1957 ).
A composição das secreções oleosas presentes nas cavidades secretoras da folha de
eucalipto ainda não é totalmente conhecida; no entanto, alguns autores sugerem a presença de
alguns terpenos, como o 1,8-cineol, felandreno e piperitona, e de misturas de óleos essenciais
e compostos fenólicos (Metcalfe e Chalk, 1979; Boland et al., 1991; Castro e Machado, 2006).
A literatura tem apresentado vários trabalhos demonstrando o potencial dos óleos
essenciais no controle de algumas doenças de plantas, inibindo ou reduzindo o crescimento
micelial e a germinação de esporos. Em contrapartida, existem estudos que também revelam a
capacidade destes compostos em atrair o patógeno ou estimular o seu processo infeccioso no
hospedeiro. Este fato foi sugerido por Bizi (2006) que, ao testar “in vivo” o efeito dos óleos
essenciais de Eucalyptus globulus, Pinus spp. e Corymbia citriodora, verificou a ausência
total de controle de Botrytis cinerea e Oidium sp. em Eucalyptus dunnii e E. benthamii,
respectivamente.
No entanto, a literatura é escassa quando se trata de híbridos de eucalipto,
principalmente relacionando a composição do óleo com a resistência a algumas doenças.
Assim, o presente trabalho foi realizado com a finalidade de caracterizar a
composição de óleos essenciais em folhas frescas, em três estágios de desenvolvimento, de
76
três clones de eucalipto, provenientes do cruzamento entre Eucalyptus urophylla e E. grandis,
procurando-se relacionar com a resistência à ferrugem, causada pelo fungo Puccinia psidii.
Material e Métodos
Para o experimento, foram selecionados três clones do híbrido Eucalyptus
urograndis, proveniente do cruzamento entre Eucalyptus urophylla e Eucalyptus grandis,
cedidos pela empresa Votorantim Celulose e Papel S.A. A escolha dos mesmos foi efetuada
pela resposta à ferrugem, em condições de campo, sendo um clone resistente (clone A), um
suscetível (clone B) e um altamente suscetível (clone C).
Tendo em vista que a doença ocorre em brotações e órgãos em início de
desenvolvimento, foram coletadas folhas, em três diferentes estágios de desenvolvimento
(Figura 3), estabelecidos por Silva (2003), para efeito comparativo. Estas foram selecionadas
de acordo com a sua disposição nos ramos, sendo os primeiros, os terceiros e os quintos pares
escolhidos para o estudo, já que apresentam diferenças anatômicas estruturais, bem como
variação no grau de suscetibilidade à ferrugem.
As amostras foram coletadas em Janeiro de 2007 em fazendas próximas à cidade
de Jacareí, no Estado de São Paulo, em plantios de eucalipto com um ano de idade, em área
pertencente à empresa Votorantim Celulose e Papel S.A. Para reduzir possíveis fatores de
interferência na composição dos óleos essenciais, as plantas selecionadas para o estudo eram
provenientes do mesmo talhão e submetidas às mesmas condições de solo, clima e aspectos
silviculturais.
A extração dos óleos foi efetuada no Laboratório de Fitoquímica do Centro de P &
D de Recursos Genéticos vegetais do Instituto Agronômico de Campinas, através da
hidrodestilação em aparelho Clevenger (Figura 4). Para isso, folhas frescas foram picadas,
pesadas e colocadas em balões de vidro de 2000 mL com água destilada.
Após duas horas de extração, os óleos foram analisados em cromatógrafo gasoso
acoplado a um detector de espectrometria de massas (CG-EM, Shimadzu, QP-5000), operando
a 70eV, com coluna capilar DB-5 (J&W Scientific, 30,0m x 0,25mm x 0,25μm), gás de arraste
hélio (1,0 mL/min), split 1/20, injetor a 240°C e detector a 230°C. O óleo essencial de cada
amostra (1 μL) foi solubilizado em acetato de etila (1mL) e injetado 1μL dessa solução na
77
coluna capilar a uma programação de temperatura de 60ºC a 240º C, a 3ºC/min, sendo três
injeções para cada tratamento correspondentes às repetições.
A identificação das substâncias foi realizada através da comparação dos seus
espectros de massas e índice de retenção de Kovats com o banco de dados do sistema CG-EM
(Nist. 62 lib.) e com a literatura (Adams, 2001).
A proporção relativa das substâncias presentes nos óleos essenciais foi expressa em
porcentagem e efetuada pelo cromatógrafo gasoso (CG-DIÇ, Shimadzu, GC-2010), com
detector de ionização de chama, com coluna capilar DB-5 (J&W Scientific, 30,0m x 0,25mm x
0,25μm), fluxo de 1,7 mL/min e split de 1:30; utilizando-se uma programação de 50ºC a
180ºC, 5ºC/min, 180ºC a 280ºC, 10ºC/min e a 280ºC por 10 minutos.
Após a caracterização da composição dos óleos essenciais, os dados de
porcentagem foram submetidos aos testes estatísticos multivariados de análise de agrupamento
e análise de componentes principais (Sneath e Sokal, 1973), para correlacionar a composição
de óleos essenciais com a resistência ou suscetibilidade das plantas à ferrugem das mirtáceas.
Resultados e Discussão
A análise da composição química dos óleos essenciais de clones de Eucalyptus
urograndis, em três estágios foliares, mostrou que de 75 a 95% dos óleos é constituído por
monoterpenos e o restante por sesquiterpenos. As principais substâncias identificadas e as
respectivas porcentagens em cada amostra são apresentadas na Tabela 1. Os cromatogramas
obtidos na análise dos óleos essenciais estão expostos nas Figuras 6-14.
Os compostos majoritários dos óleos essenciais foram o α-pineno (15-41%),
limoneno (3-34%), 1,8-cineol (18-41%) e γ-terpineno (0,18-20%). Resultado semelhante foi
encontrado no óleo extraído de folhas de Eucalyptus cinerea proveniente de Curitiba, onde os
principais constituintes foram 1,8-cineol, α -pineno, limoneno e α –terpineol (Franco, 2005),
também verificados em Eucalyptus urophylla, cultivado em Taiwan, juntamente com outras
substâncias como ocimeno e 4-terpineol (Shieh, 1998).
Em folhas de Eucalyptus grandis provenientes de Goiás, as principais substâncias
presentes no óleo foram o γ-terpineno, o-cimeno, β-pineno e 1-8 cineol (Estanislau et. al.,
2001). Esta mesma espécie cultivada na Austrália, apresentou como substâncias majoritárias
78
três monoterpenos, α-pineno (22%), 1,8-cineol (6%) e α-terpineol (5%), e duas β-tricetonas,
leptospermona e flavosona (Boland et al., 1991).
Os rendimentos dos óleos essenciais, extraídos de folhas secas, dos três clones de
eucalipto estudados, bem como os rendimentos referentes aos estágios de desenvolvimento das
folhas estão expostos na Tabela 2. Observa-se que o clone C (altamente suscetível) apresentou
menor rendimento quando comparado aos outros clones, nos três estágios foliares, sendo que o
primeiro estágio demonstrou menor quantidade de óleo essencial extraído. Este resultado,
juntamente com outros fatores, pode ser relacionado com a maior suscetibilidade do estágio
um (E1) à ferrugem, visto que maiores quantidades de óleos essenciais podem estar envolvidas
nos processos de defesa da planta.
Os rendimentos obtidos (0,85 a 2,28%) são semelhantes ao observado por Lassak
(1988) e Boland (1991) em folhas frescas de várias espécies de eucalipto, onde os mesmos
variam de 0,2 a 6%. Resultados bem similares também foram obtidos de folhas secas, jovens
e maduras, trituradas e não trituradas de povoamentos florestais de Corymbia citriodora com 6
meses, 7 anos e 45 anos de idade, por Andrade e Gomes (2000), que apresentaram um
rendimento de 0,79 a 1,47 %. Os mesmos autores verificaram que os maiores rendimentos
foram provenientes de folhas maduras e trituradas, concordando com os resultados obtidos no
presente trabalho (Tabela 2).
O menor rendimento do óleo essencial de folhas jovens, em estágios iniciais de
desenvolvimento, como demonstra a Tabela 2, também pode ser considerado como um fator
adicional à predisposição da planta ao ataque pelo P. psidii.
Para uma melhor visualização e correlação dos fatores, foram consideradas
somente as substâncias identificadas e mais abundantes, as quais foram submetidas às análises
estatísticas multivariadas de agrupamento e de componentes principais.
Os valores médios, referentes às três repetições, das 13 substâncias e seus
respectivos teores (%) presentes nos óleos essenciais dos três clones de Eucalyptus, em três
estágios do desenvolvimento foliar, estão relacionados na Tabela 1.
Os valores da Tabela 3 referem-se aos coeficientes de correlação entre as 13
substâncias e os dois primeiros componentes principais (Y
1
e Y
2
).
79
O componente Y
1
, com informação retida de 54,88% apresentou altos coeficientes
de correlação para as substâncias orto-cimeno, γ-terpineno, 4-terpineol, α-acetato de terpenila,
terpinoleno e α-pineno. Para o segundo componente principal, a informação retida foi de
24,53%, cujo valor é considerado baixo e, conseqüentemente, apenas a porcentagem relativa
de limoneno e 1,8-cineol apresentaram poder de discriminação satisfatório, enquanto que os
demais não contribuíram para a diferenciação.
O dendrograma resultante da Análise de Agrupamento (Figura 1) permitiu
discriminar os tratamentos em seis grupos diferentes na escala de similaridade a uma distância
de 0,20. O grupo um foi constituído pelo primeiro estágio foliar do clone C (altamente
suscetível à ferrugem); o grupo dois pelo terceiro e quinto estágios foliares do clone C; o
grupo três pelo primeiro estágio foliar do clone A (resistente à ferrugem); o grupo quatro pelo
terceiro e quinto estágios foliares do clone A; o grupo cinco pelo primeiro estágio foliar do
clone B (suscetível à ferrugem) e o grupo seis foi constituído pelo terceiro e quinto estágios
foliares do clone B.
Observa-se pelo dendrograma da Análise de Agrupamento (Figura 1) que os
primeiros estágios foliares diferenciaram-se dos outros, quanto à composição química dos
óleos essenciais, para todos os clones estudados. Este resultado evidencia que o estágio inicial
de desenvolvimento das folhas de eucalipto são mais suscetíveis ao ataque do Puccinia psidii,
patógeno causador da ferrugem (Ferreira, 1989), podendo-se sugerir o envolvimento dos óleos
essenciais na proteção da planta contra o patógeno.
Verifica-se também que o dendrograma da Figura 1, considerando o valor de 0,35
na escala de distância, e a dispersão gráfica da Figura 2, mostraram a formação de três grupos
distintos, referentes aos três clones, sendo o grupo um formado pelo clone C e os seus estágios
foliares, o grupo dois pelo clone A, juntamente com seus estágios foliares e o grupo três pelo
clone B e seus estágios foliares. Assim, o clone C apresentou alto poder de dissimilaridade em
relação aos clones A e B, possibilitando a sua diferenciação quanto ao grau de suscetibilidade
à doença, com base na composição química dos óleos essenciais e na proporção relativa
referente às substâncias presentes.
Através dos valores do primeiro componente principal (Tabela 3) associados à
dispersão gráfica (Figura 2), constatou-se que o clone C (altamente suscetível à doença), nos
80
três estágios foliares, apresentou as maiores porcentagens de γ-terpineno, α-acetato de
terpenila, orto-cimeno, 4-terpineol, terpinoleno e menor teor de α-pineno. Para o segundo
componente principal, o clone A (resistente) nos três estágios foliares, diferenciou-se por
apresentar maior porcentagem de limoneno e menor de 1,8-cineol, também conhecido como
eucaliptol, em seus óleos essenciais; situação inversa ocorreu para os clones B e C.
O efeito fungitóxico do limoneno, do 1,8-cineol e do α-pineno, bem como do β-
mirceno e β-pineno, presentes em óleos essenciais de Cymbopogon Martini, Thymus zygis,
Cinnamomum zeylanicum e Eugenia caryophylla, foram observados por Wilson et al. (1997)
contra Botrytis cinerea. Hammer et al. (2003) também observou efeito inibitório do
crescimento de vários fungos por 4-terpineol, α-terpineol, linalol, α-pineno e β-pineno,
seguido por 1,8-cineol.
No entanto, a atividade antifúngica e antimicrobiana podem ser resultados da
interação de muitos compostos, agindo sinergicamente, podendo as substâncias isoladas não
ser tão efetivas quanto o conjunto de compostos e suas respectivas concentrações. Este fato foi
verificado por Vilela (2007) em que a substância 1,8-cineol, isolada do óleo essencial de
Eucalyptus globulus foi responsável por apenas 5,5 % da inibição do crescimento micelial de
Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, a uma concentração de 1.500 µL, enquanto que
500 µL do óleo apresentou uma inibição micelial de 90%. A ineficiência do 1,8-cineol isolado
também foi relatada por Lis-Balchin et al. (1998), que verificou uma correlação inversa entre a
substância e a atividade antifúngica sobre Aspergillus niger, A. ochraceus e Fusarium
culmorum.
Todos os clones estudados apresentaram os mesmos constituintes nos óleos
essenciais, nos três estágios foliares, variando apenas a porcentagem de cada composto.
Assim, não foi possível relacionar a presença ou ausência de um composto específico no clone
A ou Clone C, que pudesse conferir aos mesmos a resistência ou alta suscetibilidade ao
Puccinia psidii, respectivamente, mas sim a diferença na porcentagem de determinadas
substâncias. Este resultado pode ser explicado pelo fato de que os três clones são provenientes
do cruzamento entre Eucalyptus grandis x E. urophylla. Através das diferenças nas
porcentagens dos constituintes, submetidas à análise estatística multivariada, foi possível
diferenciar o clone altamente suscetível (clone C) dos demais, bem como discriminar o
81
primeiro estágio foliar dos outros dois estágios, indicando possíveis relações dos óleos
essenciais com a ferrugem.
Conclusões
• Diferenças na porcentagem relativa dos constituintes químicos, presentes nos óleos
essenciais, permitiram discriminar os clones estudados;
• O rendimento foi crescente em relação aos estágios foliares, e quanto aos clones, o
altamente suscetível apresentou menor rendimento em comparação aos outros clones.
• Identificação de dois marcadores bioquímicos de resistência à ferrugem do eucalipto:
maior % de limoneno em clones resistentes e maior % de γ-terpineno em clones
suscetíveis.
• Foi possível relacionar a composição química dos óleos essenciais com as diferentes
respostas dos clones à ferrugem.
Referências Bibliográficas
ACCORSI, W. R. Contribuição para o estudo anatômico comparativo das espécies
Eucalyptus tereticornis Smith e Eucalyptus citriodora Hooker. 1941. 104 p. Tese
(functional) – Universidade de São Paulo- ESALQ, Piracicaba.
ADAMS, R. P. Identification of essential oil compenets by cromatography / mass
spectrocopy. Allured Publ. Corp., Carol Stream, 2001.
AGRIOS, G.N. How plants defend themselves against pathogens. In: Plant Pathology.
San Diego: Academic Press, 2005, p. 208-248.
ANDRADE, A. M e GOMES, S. S. Influência de alguns fatores não genéticos sobre o teor
de óleo essencial em folhas de Eucalyptus citriodora Hook. Floresta e Ambiente. v. 7, n.
1, p. 181 - 189, jan./dez, 2000.
82
BEDENDO, I. P. Ferrugens. In: Bergamin Filho, A.; Kimati, H. e Amorim, L. Manual de
Fitopatologia: Princípios e Conceitos. 3º ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1995.
v.1.,p. 872-880.
BIZI, R.M. Alternativas de controle do mofo-cinzento e do oídio em mudas de
eucalipto. 2006. 70p. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba.
BOLAND, D.J.; BROPHY, J.J.; HOUSE, A. P. N. 1991. Eucalyptus leaf oils: use,
chemistry, distillation and marketing. Inkata Press, Sydney, p. 73-87.
CASTRO, M.M.; MACHADO, S.R. Células e tecidos secretores. In: APPEZZATO-DA-
GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, S. M. Anatomia vegetal. Viçosa: Ed. UFV, 2
ed. 2006. p. 179-204.
COUTINHO, H.D.M. ; BEZERRA, D.A.C.; LÔBO, K.; BARBOSA, I.J.F. Atividade
antimicrobiana de produtos naturais. Julho de 2003/Junho de 2004. p. 77-85.
Disponível em: <http://www.adufpb.org.br/publica/conceitos/10/art_11.pdf> Acesso em:
24 set. 2006.
COWAN, M.M. Plant products as antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews.
v. 12, p. 564-582. 1999.
ESAU, K. Anatomia das plantas com sementes; tradução: Berta Lange de Morretes.
São Paulo, Editora: Edgard Blucher, 1974, 293 p.
ESTANISLAU, A.A.; BARROS, F.A.S.; PENA, A.P.; SANTOS, S.C.; FERRI, P.H.;
PAULA, J.R. Composição química e atividade antibacteriana dos óleos essenciais de cinco
espécies de Eucalyptus cultivadas em Goiás. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.
11, n. 2, p. 95-100, 2001.
83
FERREIRA, F.A. Patologia Florestal – Principais Doenças Florestais do Brasil.
Viçosa: Sociedade de Investigações Florestais, 1989. 570p.
FRANCO, J. Prospecção fitoquímica e análise química e microbiológica do óleo
essencial de Eucalyptus cinerea F. MUELL. ex. BENTH., Myrtaceae. 2005.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba.
HAMMER, K.A.; CARSON, C.F. e RILEY, T.V. Antifungal activity of the components
of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. Journal of Applied Microbiology, v. 95, p.853–
860, 2003.
JOHNSON, E.D. A comparison of the juvenile and adult leaves of Eucalyptus globulus.
New Phytologist, v. 25, n. 3, p. 202-212, 1926.
LASSAK, E. V. The Australian. Eucalyptus oil industry, past and present. Chemistry in
Australia, Victoria, v. 55, p. 396-398, 1988.
LIS-BALCHIN, M.; DEANS, S.G.; EAGLESHAM, E. Relationship between bioactivity
and chemical composition of commercial essential oils. Flavour and Fragrance Journal,
v.13, p. 98-104, 1998.
METCALFE, C.R.; CHALK, L. Myrtaceae. In: Anatomy of the Dicotyledons. v.1.
Oxford: Clerendon Press, 1957. p.620-631.
PASCHOLATI, S.F.; LEITE, B. Hospedeiro: Mecanismos de Resistência. In: Bergamin
Filho, A.; Kimati, H. e Amorim, L. Manual de Fitopatologia: Princípios e Conceitos. 3º
ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1995. v.1.,p. 417-453.
SANTOS, R.I. Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários. In:
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5º ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora
da UFRGS/ Editora da UFSC, 2004. p. 403-434.
84
SHIEH, J.C. Yields and chemical components of essential oils in Eucalyptus urophylla
leaves. Taiwan Journal of Forest Science. v.13, n. 4, p. 291-300, 1998.
SIMÕES, C.M.O. e SPITZER, V. Óleos voláteis. In: Farmacognosia: da planta ao
medicamento. 5º ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/ Editora da UFSC,
2004. p. 467-496.
SILVA, E. A. R.; FURTADO, E.L. e RODELLA, R. A. Influências da Maturação Foliar
do Eucalipto na Suscetibilidade à Ferrugem. ln: CONGRESSO DE INICIAÇÃO
CIENTÍFICA, 2003, Marília. Anais, Marília, 2003. CD-ROM.
SNEATH, P.H.A. e SOKAL, R.R. Numerical Taxonomy. San Francisco: W.h. Freeman,
1973. 573p.
VILELA, G.R. Efeito do óleo essencial de Eucalyptus globulus sobre espécies
produtoras de aflatoxinas. 2007. 64p. Dissertação (Mestrado). Universidade de São
Paulo-ESALQ, Piracicaba.
WILSON, C.L.; SOLAR, J.M.; GHAOUTH, A.EL; WISNIEWSKI, M.E. Rapid
evaluation of plant extracts and essential oils for antifungal activity against Botrytis
cinerea. Plant Disease, v. 81, n.2, p. 204-210, 1997.
85
Tabela 1. Valores médios (%) das 13 substâncias químicas mais abundantes dos óleos essenciais, presentes em três estágios foliares (E1, E3
e E5), dos três clones de eucalipto. Clone A: resistente à ferrugem; clone B: suscetível. Clone C: altamente suscetível. IK Calc.: Índice de
Kovats calculado. IK Lit.: Índice de Kovats da literatura (Adams, 2001).
IK Calc. IK Lit.
E1 E3 E5 E1 E3 E5 E1 E3 E5
α- pineno 20,62 19,88 20,24 33,55 39,64 41,31 15,33 17,29 18,08 932 939
α-felandreno 2,88 4,41 2,77 2,97 1,44 1,13 0,81 0,67 0,49 1004 1005
orto-cimeno 0,96 1,35 1,79 0,83 0,49 0,43 3,89 3,28 3,17 1021 1022
limoneno 29,37 33,87 33,22 4,77 4,65 4,16 2,94 3,45 3,53 1027 1031
1,8 cineol 18,56 22 27,45 35,08 38,97 40,47 21,93 33,91 35,14 1028 1033
cis-β-ocimeno 2,19 1,37 0,85 3,8 2,1 1,65 2,93 2,13 1,45 1034 1040
γ-terpineno 0,4 0,51 0,46 0,18 0,21 0,24 15,14 19,31 19,91 1056 1062
terpinoleno 0,88 0,63 0,6 0,97 0,4 0,35 1,77 1,14 0,90 1086 1088
4- terpineol 0,74 0,75 0,9 0,22 0,29 0,34 1,18 1,63 2,04 1172 1177
α- terpineol 5,1 3,54 2,73 4,55 5,54 5,16 3,93 2,35 2,71 1186 1189
α-acetato de terpenila 3,19 3,4 3,21 0,64 0,27 0,18 6,79 5,69 6,03 1345 1350
trans-cariofileno 1,92 1,22 0,5 1,23 0,67 0,37 1,7 1,08 0,71 1417 1418
viridifloreno 1,29 0,41 0,28 2,24 0,88 0,52 3,59 1,71 1,04 1493 1493
SUBSTÂNCIAS
Clone A Clone B Clone C
86
Tabela 2. Rendimento (%) dos óleos essenciais, provenientes de folhas secas dos três clones
de eucalipto (clone A- resistente à ferrugem, Clone B- suscetível e Clone C-altamente
suscetível), em três estágios foliares (E1, E3 e E5).
Clones E1 E3 E5
A 1,61 2,28 1,88
B 1,44 1,6 1,85
C 0,85 1,35 1,82
Estágios foliares
87
Tabela 3. Coeficientes de correlação entre as 13 substâncias químicas dos
óleos essenciais, presentes em três estágios foliares (E1, E3 e E5), dos três
clones de eucalipto e os dois componentes principais (Y
1
e Y
2
). Ord.:
ordenação das substâncias quanto ao poder discriminatório.
SUBSTÂNCIAS Y1 ord Y2 ord
α- pineno -0,7118 6 -0,6984 3
α-felandreno -0,6315 8 0,6486 4
orto-cimeno 0,9711 1 0,1510 11
limoneno -0,4220 10 0,9000 1
1,8 cineol -0,1454 12 -0,8474 2
cis-β-ocimeno 0,1102 13 -0,4328 5
γ-terpineno 0,9698 2 -0,1207 12
terpinoleno 0,7963 5 0,0881 13
4- terpineol 0,8766 4 0,2169 10
α- terpineol -0,6402 7 -0,4092 6
α-acetato de terpenila 0,9174 3 0,3870 8
trans-cariofileno 0,2697 11 0,3930 7
viridifloreno 0,5939 9 -0,2320 9
Informação retida (%) 54,88 24,53
Informação acumulada 54,88 79,41
88
|---------------|---------------|---------------|---------------|---------------|---------------|
Figura 1. Dendrograma resultante da Análise de Agrupamento das 13 substâncias químicas
dos óleos essenciais, utilizando-se a Distância Euclidiana Média, entre os três clones de
eucalipto e os três estágios do desenvolvimento foliar. A: clone resistente. B: clone suscetível.
C: clone altamente suscetível. E1, E3, E5: estágios do desenvolvimento foliar.
0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00
C-E1
C-E3
C-E5
A-E1
A-E3
A-E5
B-E1
B-E3
B-E5
89
Figura 2. Dispersão gráfica dos três clones de eucalipto e os três estágios de
desenvolvimento foliar, utilizando-se os dois primeiros componentes principais (Y
1
e Y
2
)
para o conjunto das 13 substâncias químicas presentes na composição dos óleos essenciais.
A: clone resistente. B: clone suscetível. C: clone altamente suscetível. E1, E3, E5: estágios
do desenvolvimento foliar.
C-E5
C-E3
C-E1
B-E1
B-E3
B-E5
A-E1
A-E5
A-E3
Y1
Y2
90
Figura 3. Representação dos três estágios de desenvolvimento
foliar dispostos em ramo de eucalipto.
Estágio foliar 1
Estágio foliar 3
Estágio foliar 5
91
Figura 4. Aparelhos de Clevenger, pertencentes ao Instituto
Agronômico de Campinas, utilizados para a extração dos
óleos essenciais.
Figura 5. Cromatógrafo à gás, acoplado ao espectro de
massas (GCMS), pertencente ao Istituto Agronômico de
Campinas, utilizado para a análise dos óleos essenciais.
92
5. CONCLUSÕES GERAIS
• O clone A confirmou a sua resistência pela maior espessura das cutículas abaxial e
adaxial, maior espessura do parênquima paliçádico adaxial, maior % de parênquima
paliçádico, maior número e área de cavidades oleíferas, menor espessura da epiderme
abaxial e menor espessura e % de parênquima lacunoso;
• O clone A, resistente, manteve sua condição, nos três estágios foliares, pela ausência de
sintomas na superfície foliar e menor incidência de apressórios formados.
• O clone C mostrou-se altamente suscetível à ferrugem, no primeiro e terceiro estágios
foliares, pela maior ocorrência de urediniósporos germinados e dotados de apressórios,
bem como pela degradação dos tecidos superficiais da folha.
• O quinto estágio foliar mostrou-se resistente em ambos os clones, sendo que o material
suscetível caracterizou-se pelo crescimento superficial do patógeno, sem ocorrência de
penetração, e o resistente, pela inativação dos urediniósporos.
• Foram identificados dois marcadores bioquímicos, o limoneno, presente em maior
quantidade no clone resistente e o γ-terpineno, presente em maior quantidade no clone
• O rendimento foi crescente em relação aos estágios foliares, e quanto aos clones, o
altamente suscetível apresentou menor rendimento em comparação aos outros clones.
93
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABREU, C. L. M.; CÂMARA, F. L. A.; FURTADO, E. L.; ALMEIDA, C. I.; MAIA, E.
Uso de óleos essenciais para controle de Alternaria solani, fungo do tomateiro cultivado
em ambiente protegido. In: III SIMPÓSIO BRASILEIRO DE ÓLEOS ESSENCIAIS,
2005, Campinas. Documentos IAC, Campinas: IAC, 2005. p.75.
ACCORSI, W. R. Contribuição para o estudo anatômico comparativo das espécies
Eucalyptus tereticornis Smith e Eucalyptus citriodora Hooker. Tese (functional) –
Universidade de São Paulo- ESALQ, Piracicaba, 1941. 104 p.
ADAMS, R. P. Identification of essential oil compenets by cromatography / mass
spectrocopy. Allured Publ. Corp., Carol Stream, 2001.
AGRIOS, G.N. How plants defend themselves against pathogens. In: AGRIOS, G.N.
Plant Pathology. San Diego: Academic Press, 2005, p. 208-248.
ALFENAS, A.C.; DEMUNER, N.L.; BARBOSA, M.M. A ferrugem e as opções de
controle. Correio Agrícola, v.1, p.18-20. 1989.
94
ALFENAS, A. C., ZAUZA, E. A .V. e ASSIS, T. F. First record of Puccinia psidii on
Eucalyptus globulus and E. viminalis in Brazil. Australasian-Plant-Pathology. v. 32, n.2,
p. 325-326, 2003.
ALFENAS, A.C.; ZAUZA, E.A.V.; MAFIA, R.G.; ASSIS, T.F. de. Clonagem e doenças
do eucalipto. Viçosa: Editora UFV, 2004. 442p.
ANDRADE, A. M e GOMES, S. S. Influência de alguns fatores não genéticos sobre o teor
de óleo essencial em folhas de Eucalyptus citriodora Hook. Floresta e Ambiente. v. 7, n.
1, p. 181 - 189, jan./dez, 2000.
ARAÚJO, J.C.A. DE; MATSUOKA, K. Histopatologia da Interação Alternaria solani e
Tomateiros Resistente e Suscetível. Fitopatologia. Brasileira. v. 29, n.3, p.268-275, 2004.
BAKER, E.A.; HUNT, G.M.. Developmental changes in leaf epicuticular waxes in
relation to foliar penetration. New Phytologist. v. 88, p.731-747, 1981.
BARBIERI,R.L.; CARVALHO, F. I F. de. Coevolução de plantas e fungos patogênicos.
Revista Brasileira de Agrociência, v.7, n. 2, p. 79-83 mai-ago, 2001.
BARTYNSKA, M. e BUDZIKUR RAMZA, E. The action of some essential oils on fungi.
Bulletin of the Polish Academy of Sciences Biological Sciences. v. 49, n.4, p.327-331,
2001
BEDENDO, I. P. Ferrugens. In: BERGAMIN FILHO, A.; KIMATI, H. E AMORIM, L.
Manual de Fitopatologia: Princípios e Conceitos. 3º ed. São Paulo: Agronômica Ceres,
1995. v.1., p. 872-880.
BENNETT, R.N. e WALLSGROVE, R.M. Secondary metabolites in plant defence
mechanisms. New Phytologist. v. 127, n.4, p. 617-633, 1994.
95
BIZI, R.M. Alternativas de controle do mofo-cinzento e do oídio em mudas de
eucalipto. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba. 2006. 70p.
BLUM , L. E. B. e DIANESE, J. C. Padrões de liberação de urediniósporos e
desenvolvimento da ferrugem do jambeiro. Pesquisa Agropecuária. Brasileira. Brasília,
v. 36, n. 6, p. 845-850, jun. 2001.
BOLAND, D.J.; BROPHY, J.J.; HOUSE, A. P. N. Eucalyptus leaf oils: use, chemistry,
distillation and marketing. Inkata Press, Sydney. 1991, 249 p.
CAMARGO, F.R.A.; TAKAHASHI, S.S.; FURTADO, E.L.; VALLE, C.F.; BONINE,
C.A.V. Ocorrência e evolução da ferrugem do eucalipto em duas regiões do Estado de São
Paulo. Fitopatologia Brasileira, v.22, p.254, 1997.
CASTRO, H.A. Padronização de metodologia de inoculação e avaliação da resistência
de Eucalyptus spp. a ferrugem causada por Puccinia psidii Winter. Tese (Doutorado) –
Universidade de São Paulo, ESALQ, Piracicaba, 1983.
CASTRO, M.M.; MACHADO, S.R. Células e tecidos secretores. In: APPEZZATO-DA-
GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, S. M. Anatomia vegetal. Viçosa: Editora
UFV, ed. 2, 2006. p. 179-204.
COELHO, L.; ALFENAS, A.C. e FERREIRA, F.A. Variabilidade fisiológica de Puccinia
psidii-ferrugem do eucalipto. Summa Phytopathologica, v. 27, n.3, p. 295-300, 2001.
COUTINHO, H.D.M. ; BEZERRA, D.A.C.; LÔBO, K.; BARBOSA, I.J.F. Atividade
antimicrobiana de produtos naturais. Julho de 2003/Junho de 2004. Disponível em:
<http://www.adufpb.org.br/publica/conceitos/10/art_11.pdf> Acesso em: 24 set. 2006.
96
COUTINHO, T.A.,WINGFIELD, M.J., ALFENAS, A .C. & CROUS, P.W. Eucalyptus
Rust: A Disease with the Potential for Serious International Implications. Plant Disease, v.
82, n.7, p.819–825, Julho, 1998.
COWAN, M.M. Plant products as antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews.
v. 12, p. 564-582. 1999.
DAGNE, E.; BISRAT D.; ALEMAYEHU M.; WORKU T. Essential Oils of Twelve
Eucalyptus Species from Ethiopia. J. Essent. Oil Res. v.12, p. 467-470, 2000.
DEMUNER, N. L. e ALFENAS, A. C. Fungicidas sistêmicos para o controle da ferrugem
causada por Puccinia psidii em Eucalyptus cloeziana. Fitopatologia Brasileira. Brasília,
v.16, n.3, p. 171-174, Setembro 1991.
DETHIER M.; NDUWIMANA A.; COERDIER Y.; MENUT C.; LAMATY G. Aromatic
Plants of Tropical Central Africa XVI. Studies on Essential Oils of Five Eucalyptus
Species Grown in Burundi. J. Essent Oil Res., v.6, p. 463-473, 1994.
EDWARDS, S.J.; ISAAC, S.; COLLIN, H.A.; CLIPSON, N.J. Stereological analysis of
celery leaves infected by Septoria apiicola. Mycological Research. v. 103, p.750-756,
1999.
ESAU, K. Anatomia das plantas com sementes; tradução: Berta Lange de Morretes.
São Paulo, Editora: Edgard Blucher, 1974, 293 p.
ESTANISLAU, A.A.; BARROS, F.A.S.; PENA, A.P.; SANTOS, S.C.; FERRI, P.H.;
PAULA, J.R. Composição química e atividade antibacteriana dos óleos essenciais de cinco
espécies de Eucalyptus cultivadas em Goiás. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.
11, n. 2, p. 95-100, 2001.
FERREIRA, F.A. Ferrugem do eucalipto. Revista Árvore, Viçosa, v.7, n.2, p.23-27, 1983.
97
FERREIRA, F.A. Patologia Florestal – Principais Doenças Florestais do Brasil.
Viçosa: Sociedade de Investigações Florestais, 1989. 570p.
FERREIRA, F.A.; SILVA, A.R.C. Comportamento de procedências de Eucalyptus
grandis e de E. saligna à ferrugem (Puccinia psidii). Fitopatologia Brasileira 7:23-27.
1982.
FIGUEIREDO, M. B. Doenças fúngicas emergentes em grandes culturas. O Biológico.
São Paulo, v. 63, n. 01/02, p. 29-32, Jan-Dez, 2001.
FRANCO, J. Prospecção fitoquímica e análise química e microbiológica do óleo
essencial de Eucalyptus cinerea F. MUELL. ex. BENTH., Myrtaceae. Dissertação
(Mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba. 2005.
FRENCH, R.C. Stimulation of uredospore germination in wheat stem rust by terpenes and
related compounds. Botanical Gazette, v. 122, n. 3, p. 194-198, 1961.
GERRITS, P.O. The application of glycol metacrylate in histotechnology; some
fundamental principles. Germany : Leica GmbH, 1991. 80p.
FURTADO, G. Q. Germinação de urediniósporos e variabilidade fisiológica de
Puccinia psidii Winter. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Lavras. 2002.
55 p.
GOTTLIEB, O. Phytochemicals: differentation and function. Phytochemistry, v.29, n.6,
p.1715-1724, 1990.
HAMMER, K.A.; CARSON, C.F.; RILEY, T.V. Antifungal activity of the components of
Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. Journal of Applied Microbiology, v. 95, p.853–860,
2003.
98
HUNT, P. Cuticular penetration by germinating uredospores. Transactions of the British
Mycological Society. v.51, p.103-112, 1983.
JANSSEN A.M, SCHEFFER J.J.C, BAERHEIM-SVENDSEN A. Antimicrobial activity
of essential oils: a 1976-1986 literature review. Planta Med, v.53, p. 395-398. 1987.
JERBA, V. F. Anatomia e ultra-estrutura foliar de cultivares de feijoeiro (Phaseolus
vulgaris L.) e sua relação com a resistência à antracnose. Tese (Doutorado) –
Universidade Estadual Paulista, Botucatu. 2003. 108p.
JOFFILY, J. Ferrugem do eucalipto. Bragantia, Campinas, v. 4, n. 8, p. 475-487, 1944.
JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York :McGraw-Hill, 1940. 523p.
JOHNSON, E.D. A comparison of the juvenile and adult leaves of Eucalyptus globulus.
New Phytologist, v. 25, n. 3, p. 202-212, 1926.
JONES, C.G.; FIRN, R.D.; MALCOLM, S.B. On the evolution of plant secondary
chemical diversity. Philosophical Transactions: Biological Sciences, v. 333, n. 1267,
p.273-280. 1991.
KORNDORFER, G. H. ; RODRIGUES, F.Á. . Importância do silício na incidência e na
resistência às doenças de plantas. Piracicaba, 2005. Potafos, 2005 (Resumo de Palestra).
Disponível em: <http:
web.cena.usp.br/.../2006/YAMADA/POTAFOS%20(E)/Gaspar%20Korndorfer/Anais%20
do%20Gaspar%20Korndorfer.doc> Acesso em: 18 jul. 2007.
LASSAK, E. V. The Australian. Eucalyptus oil industry, past and present. Chemistry in
Australia, Victoria, v. 55, p. 396-398, 1988.
LIMA, R. K.; CARDOSO, M. G.; SANTOS, C. D.; FREIRE, J. M.; NASCIMENTO, E.
A.; MORAIS, S. A. L. Avaliação do óleo essencial de folhas de goiabeira (Psidium
99
guajava L.) em diferentes horários de coleta. In: III Simpósio Brasileiro de óleos
essenciais. 2005, Campinas. Documentos IAC, Campinas, 2005, p.115.
LIS-BALCHIN, M.; DEANS, S.G.; EAGLESHAM, E. Relationship between bioactivity
and chemical composition of commercial essential oils. Flavour and Fragrance Journal,
v.13, p. 98-104, 1998.
MAFFEIS, A. R.; SILVEIRA, R. L. V. A. e BRITO, J. O. Reflexos das deficiências de
macronutrientes e boro no crescimento de plantas, produção e qualidade de óleo essencial
em Eucalyptus citriodora. Scientia Forestalis. n. 57, p. 87-98, jun. 2000.
MAGNANI, E.B.Z.; ALVES, E.; ARAÚJO, D.V. Eventos dos Processos de Pré-
Penetração, Penetração e Colonização de Phakopsora pachyrhizi em Folíolos de Soja.
Fitopatologia Brasileira, v. 32, n.2, p. 156-160, 2007.
MCGARVEY, D.J.; CROTEAU, R. Terpenoid Metabolism. The Plant Cell, v.7, n.7.
p.1015-1026. 1995.
MEDEIROS, R.B. de; FERREIRA, M.A.S.V.; DIANESE, J.C. Mecanismos de agressão
e defesa nas interações planta-patógeno. Brasília: Editora Universidade de Brasília,
2003. 290p.
MEDRADO, M. J. S.; HOEFLICH, V. A. e CASTRO, A. W. V. 2005. Embrapa:
evolução do setor florestal no século XXI. Disponível em:
<http://www.celuloseonline.com.br/Colunista/colunista.asp?IDAssuntoMateria=271&idite
m=> Acesso em 26 jan. 2006.
MENDGEN. K.; HAHN, M.; DEISING, H. Morphogenesis and mechanisms of
penetration by plant pathogenic fungi . Annual Review of Phytopathology. v.34, p. 367-
386, 1996.
100
METCALFE, C.R.; CHALK, L. Myrtaceae. In: METCALFE, C.R.; CHALK, L.
Anatomy of the Dicotyledons. v.1. Oxford: Clerendon Press, 1957. p.620-631.
NUTMAN, F. J.; ROBERTS, F. M. Studies on the biology of Hemileia vastatrix Berk &
Br. Transactions British Mycological Society, v.46; p.27-48, 1963.
O’BRIEN, T.P.; FEDER, N. e McCULLY, M.E. Polychromatic staining of plant cell walls
by Toluidine Blue O. Protoplasma. v.59, p.367-373, 1964.
OGUNWANDE. I. A. ; OLAWORE, N.O.; ADELEKE, K.A. ; KONIG, W.A. Chemical
composition of the essential oils from the leaves of three Eucalyptus species growing in
Nigeria. Journal of Essential Oil Research: JEOR, Sep/Oct, 2003.
PASCHOLATI, S.F.; LEITE, B. Hospedeiro: Mecanismos de Resistência. In:
BERGAMIN FILHO, A.; KIMATI, H. E AMORIM, L. Manual de Fitopatologia:
Princípios e Conceitos. 3º ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1995. v.1, p. 417-453.
PYROZINSKI, K.A.; HAWKSWORTH, D.L. Coevolution of fungi with plants and
animals. Mycologia. v. 81, n. 3, p. 490-493. Mai - Jun., 1989.
RANASINGHE, L.; JAYAWARDENA, B. e ABEYWICKRAMA, K. Fungicidal activity
of essential oils of Cinnamomum zeylanicum (L.) and Syzygium aromaticum (L.) Merr et
L.M.Perry against crown rot and anthracnose pathogens isolated from banana. Letters in
Applied Microbiology. v. 35, p.208–211. 2002.
ROBARDS, A.W. An introduction to techniques for scanning electron microscopy of plant
cell. In: HALL, G.L. Electron microscopy and cytochemistry of plant cells. New York:
Elsevier, p. 343-444. 1978.
101
ROMOFF, P.; FÁVERO, O.A.; LAGO, J.H.G. Análise química e variação sazonal e
circadiana do óleo volátil das folhas de Syzygium cuminii. In: III Simpósio Brasileiro de
óleos essenciais. 2005, Campinas. Documentos IAC, Campinas, 2005, p.17.
RUIZ, R.A.R.; ALFENAS, A.C.; FERREIRA, F.A.; ZAMBOLIM, L. Fungicidas
protetores e sistêmicos para o controle da ferrugem causada por Puccinia psidii. Revista
Árvore. Viçosa, v.11, p.56-65, 1987.
RUIZ, R.A.R, ALFENAS, A.C., FERREIRA, F.A. & VALLE, F.X.R. Influência de
temperatura, do tempo de molhamento foliar, fotoperíodo e da intensidade de luz sobre a
infecção de Puccinia psidii em eucalipto. Fitopatologia Brasileira, v.14, p.55-61, 1989.
SALGADO, A.P.S.P.; CARDOSO, M.G; SOUZA, P,E, de; SOUZA, J.A. de; ABREU,
C.M.P.; PINTO, J.E.B.P. Avaliação da atividade fungitóxica de óleos essenciais de folhas
de Eucalyptus sobre Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea e Bipolaris sorokiniana.
Ciênc. agrotec.. Lavras. .27, n.2, p.249-254, mar./abr., 2003.
SALGADO, A. P. S. P.; CARDOSO, M. G.; SOUZA, J. A.; SOUZA, P. E.; SHAN, A. Y.
K. V.; GONÇALVES, L. D. Constituintes químicos do óleo essencial de folhas de
Eucalyptus e sua atividade biológica. Poços de Caldas:SBQ, 2001.
SALVATORI, R. K.; POVH, F. P.; SCHWAN-ESTRADA, K. R. F.; STANGARLIN, J.
R.; BERNARDO, R. Atividade antifúngica do óleo essencial de Eucalyptus citriodora. In:
XXV Congresso Paulista de fitopatologia, 2002, Esp. Santo do Pinhal. Anais, v.1. p. 143-
143. 2002.
SAMBUGARO, R. Caracterização anatômica foliar de clones de seringueira (Hevea
spp.) visando resistência ao Microcyclus ulei. Dissertação (mestrado)- Universidade
Estadual Paulista, Botucatu. 2003. 61p.
102
SAMPAIO, A. N. História. In: ANDRADE, E. N. O Eucalipto. 2ª ed. Cia Paulista de
Estradas de Ferro, SP. 1939. p. 58-64.
SANTOS, A. F.; AUER, C. G.; GRIGOLETTI JÚNIOR, A. Doenças do eucalipto no sul
do Brasil: identificação e controle. Embrapa:Circular Técnica. Colombo, Junho, 2001.
SANTOS, R.I. Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários. In: SIMÕES,
C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P. de; MENTZ, L.A.;
PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5º ed. Porto
Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/ Editora da UFSC, 2004. p. 403-434.
SCATENA, V.L; SCREMIN-DIAS, E. Parênquima, colênquima e esclerênquima. In:
APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, S. M. Anatomia vegetal.
2 ed. Viçosa: Ed. UFV, 2006. p. 179-204.
SCHUMACHER, M.V.; CALIL, F.N E VOGEL, H. L.M. Silvicultura aplicada. Santa
Maria, 2005. Disponível em: <http://
www.ufsm.br/petagronomia/apostilas/apostila_silvicultura_aplicada.pdf> Acesso em: 15
de Julho de 2007.
SHIEH, J.C. Yields and chemical components of essential oils in Eucalyptus urophylla
leaves. Taiwan Journal of Forest Science. v.13, n. 4, p. 291-300, 1998.
SILVA, E. A. R.; FURTADO, E.L. e RODELLA, R. A. Influências da Maturação Foliar
do Eucalipto na Suscetibilidade à Ferrugem. ln: CONGRESSO DE INICIAÇÃO
CIENTÍFICA, 2003, Marília. Anais, Marília, 2003. CD-ROM.
SILVA, L.M.; ALQUINI, Y. e CAVALLET, V.J. Inter-relações entre a anatomia vegetal e
a produção vegetal. Acta Botanica Brasilica. v.19, n.1, p.183-194. 2005.
103
SILVEIRA, R. L.V. A.; MUNIZ, M.R.A.; SILVA, C.R.; CAMARGO, F.R.A. de.
Aspectos nutricionais envolvidos na ocorrência de doenças com ênfase para a
ferrugem (Puccinia psidii) do eucalipto. Disponível em <http://
www.rragroflorestal.com.br/divulgacao/pdf/ferrugem.pdf>. Acesso em: 12, mar, 2007.
SMITH, A.H.; PINKARD, E.A.; HUNTER, G.C.; WINGFIELD, M.J.; MOHAMMED,
C.L. Anatomical variation and defence responses of juvenile Eucalyptus nitens leaves to
Mycosphaerella leaf disease. Australasian Plant Pathology, v.35, p. 725-731, 2006.
SIMÕES, C.M.O. e SPITZER, V. Óleos voláteis. In: SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL,
E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P. de; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R.
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5º ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora
da UFRGS/ Editora da UFSC, 2004. p. 467-496.
SNEATH, P.H.A. e SOKAL, R.R. Numerical Taxonomy. San Francisco: W.h. Freeman,
1973. 573p.
SUZUKI, M.S. e SILVEIRA, S. F. Germinação in vitro de urediniosporos de Puccinia
psidii armazenados sob diferentes combinações de umidade relativa e temperatura.
Summa Phytopathologica, v. 29. n. 2, 2003.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Plant Physiology. 2 ed. Sinauer Associates, Sunderland. 1998.
TOMMERUP, I.C.; ALFENAS, A.C. e OLD, K.M. Guava rust in Brazil-a threat to
Eucalyptus and other Myrtaceae. New Zealand Journal of Forestry Science, v.33, n.3,
p.420-428. 2003.
VALVERDE, S.R. As plantações de eucalipto no Brasil. Sociedade Brasileira de
Silvicultura. Disponível em: <http://www.sbs.org.br/destaques_plantacoesnobrasil.htm.
2004> Acesso em: 20, set., 2007.
104
VILELA, G.R. Efeito do óleo essencial de Eucalyptus globulus sobre espécies
produtoras de aflatoxinas. Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo-ESALQ,
Piracicaba. 2007. 64p.
WILSON, C.L.; SOLAR, J.M.; GHAOUTH, A.EL; WISNIEWSKI, M.E. Rapid
evaluation of plant extracts and essential oils for antifungal activity against Botrytis
cinerea. Plant Disease, v. 81, n.2, p. 204-210, 1997.
ZENI, T. L.; GRIGOLETTI JR., A.; AUER, C. G.; MAGALHÃES, W. L. E.; DUARTE,
J. A. S.; BIZI, R. M. Uso de extrato aquoso e óleo de eucaliptos no controle de fungos
fitopatogênicos in vitro. In: III Evento de iniciação científica da Embrapa Florestas.
Colombo, PR. 2004.
105
106
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
