( PDF ) Estudos da aplicação do corante azul de metileno em terapia fotodinâmica

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

“ESTUDOS DA APLICAÇÃO DO CORANTE AZUL DE

METILENO EM TERAPIA FOTODINÂMICA”

Dissertação apresentada por

Lílian Somenci Peloi ao Programa

de Pós-Graduação em Química do

Departamento de Química do Centro

de Ciências Exatas da Universidade

Estadual de Maringá como parte dos

requisitos para a obtenção do título de

Mestre em Química

MARINGÁ, OUTUBRO/2007

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

“ Estudos da aplicação do corante azul de metileno

em terapia fotodinâmica”

LILIAN SOMENCI PELOI

Orientador: Prof. Dr. Noboru Hioka

Dissertação apresentada ao programa de Pós-

Graduação em Química do Departamento de Química do

Centro de Ciências Exatas da Universidade Estadual de

Maringá como parte dos requisitos para obtenção do título

de Mestre em Química

MARINGÁ, OUTUBRO/2007

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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)

Peloi, Lilian Somenci

P392e Estudos da aplicação do corante azul de metileno

em terapia fotodinâmica. / Lilian Somenci Peloi. –

Maringá, PR : [s.n.], 2007.

67 f. : il. color.

Orientador : Prof. Dr. Noboru Hioka.

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de

Maringá. Programa de Pó-graduação em Química, 2007.

1. Azul de metileno - Terapia fotodinâmica -

Microrganismos. 2. Azul de metileno - Terapia

fotodinâmica - Leishmaniose Tegumentar Americana. 3.

Azul de metileno - Terapia fotodinâmica -

Substituição do laser por LED. I. Universidade

Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em

Química. II. Tíulo.

CDD 21.ed.541.35

AGRADECIMENTOS

Primeiramente à Deus, pois sem sua vontade nada disso seria possível

Aos meus pais, Luiz e Cirlei, e minha irmã, Vivian, pelo apoio e incentivo

durante toda a minha vida

Ao Matheus por tornar minha mais feliz

Ao profº. Noboru Hioka, pela orientação e confiança

A Profª. Thaís Gomes Verzignassi Silveira, pela orientação e paciência com

os experimentos de

Leishmania

A Profª. Elza Kimura, pelo carinho, atenção e paciência, nos trabalhos

desenvolvidos com os microrganismos

A Profª. Maria Valdrinez Campana Lonardoni, pela ajuda nos experimentos

A Profª. Selma Lucy Franco, pela preparação da loção de azul de metileno

A Profª.Terezinha Inez Estivalet Svidzinski, por ter concedido a cepa de

C.albicans

A Profª. Regina Coeli Cunha Dórea, pelo doação dos animais

A Profª. Silvana Marques de Araújo, pelo espaço concedido no biotério

A Paula Honda e Myriam Emiko Takahashi pelo grande auxílio na execução

dos experimentos com

Leishmania

Aos amigos, Carlos Eduardo Guerino Biondo, Adriana Passarella e Amanda

Santana pelo auxílio do desenvolvimento do trabalho e a todos os colegas do

laboratório

SUMÁRIO

ÍNDICE DE FIGURAS..........................................................................................................iv

ÍNDICE DE TABELAS.........................................................................................................vii

LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................................viii

RESUMO..................................................................................................................................ix

ABSTRACT..............................................................................................................................xi

I. INTRODUÇÃO.....................................................................................................................1

I.1. Terapia Fotodinâmica..........................................................................................1

I.1.1. Breve histórico e princípios................................................................1

I.1.2. Mecanismos fotofísicos e fotoquímicos da TFD...........................4

I.1.3. Fármaco Fotossensível – Azul de Metileno................................... 7

I.1.4. Fontes de iluminação usadas em TFD............................................10

I.1.5. Dificuldades da TFD...........................................................................11

I.2. Aplicações – Doenças........................................................................................12

I.2.1. Leishmaniose....................................................................................... 12

I.2.1.1 A TFD no tratamento da Leishmaniose Tegumentar

Americana........................................................................................................14

I.2.2. Microrganismos patogênicos............................................................16

I.2.2.1. Os microrganismos em estudo..........................................18

II. OBJETIVOS...................................................................................................................20

III. PARTE EXPERIMENTAL............................................................................................21

III.1. Materiais e soluções.....................................................................................21

III.2. Equipamentos................................................................................................22

III.3. Metodologias.................................................................................................23

III.3.1. Sistema de iluminação..................................................................23

III.3.2. Reações de Foto-branqueamento..............................................23

III.3.3. Teste do Ácido Úrico...................................................................24

III.3.4. Ensaio de toxicidade com

Artemia salina

.................................25

III.3.5. Ensaio

in vitro

em culturas de microrganismos......................26

III.3.6. Ensaio

in vitro

com a espécie

Leishmania (Viannia)

braziliensis

.................................................................................................................27

III.3.6.1. Sobre a forma promastigota.......................................27

III.3.6.2. Sobre a forma amastigota...........................................28

III.3.6.3 Determinação do óxido nítrico....................................30

III.3.7. Ensaio

in vivo

em hamsters infectados com

Leishmania

(Leishmania) amazonensis

.......................................................................................30

III.3.7.1 Quantificação de

Leishmania

no baço e no

linfonodo.........................................................................................................32

III.3.8. Aspectos éticos............................................................................33

III.3.9. Análise estatística.......................................................................33

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................34

IV.1. Espectro do azul de metileno.......................................................................34

IV.2. Sistema de iluminação (LED)........................................................................35

IV.3. Estudo de Foto-decomposição (Foto-branqueamento).........................36

IV.4. Formação de oxigênio singlete....................................................................39

IV.5. Ensaio fotodinâmico com

Artemia salina

..................................................43

IV.6. Ação fotodinâmica

in vitro

sobre culturas de microrganismos...........44

IV.7. Ensaio

in vitro

com

Leishmania (Viannia) braziliensis

............................50

IV.7.1. Sobre a forma promastigota........................................................50

IV.7.2. Sobre formas amastigotas............................................................51

IV.7.3. Óxido nítrico....................................................................................53

IV.8. Aplicação da Terapia Fotodinâmica em hamsters infectados com

Leishmania (Leishmania) amazonesis

...............................................................................54

V. CONCLUSÕES..................................................................................................................61

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................62

iii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Diagrama de Jablonski........................................................................................4

Figura 2: Estrutura do Azul de Metileno.........................................................................7

Figura 3: Superposição de um cromóforo fenotiniazino em um par guanina-

citosina......................................................................................................................................8

Figura 4: Esquema da fotoquímica do azul de metileno...............................................9

Figura 5: Representação esquemática da parede celular de bactéria Gram-

positiva (+), Gram-negativa (-) e fungo............................................................................17

Figura 6: Hamsters anestesiados recebendo tratamento com AM/LED...............31

Figura 7: Espectro de absorção do azul de metileno (5x10

-6

mol.L

-1

) em água.....34

Figura 8: Espectro de emissão da fonte de iluminação (LED)..................................35

Figura 9: Fonte de luz constituído de 6 unidades de LED.........................................36

Figura 10: Sobreposição de espectros do azul de metileno (5x10

-6

mol.L

-1

) em

água e etanol em situações de aeração normal, obtidos em intervalos de 5 min em

amostra iluminada.................................................................................................................37

Figura 11: Variação da absorção do azul de metileno (5x10

-6

mol.L

-1

) em função

do tempo de exposição ao LED..........................................................................................38

Figura 12: Potência luminosa absorvida por unidade de comprimento de onda do

azul de metileno 5x10

-6

mol.L

-1

calculado para o LED utilizado..................................41

Figura 13: Variação espectral da solução de azul de metileno 1x10

-6

mol.L

-1

presença de AU (10

-4

mol.L

-1

) em etanol, com a irradiação de luz de LED...............42

Figura 14: Morte percentual de

Artemia salina

em diferentes concentrações de

azul de metileno em água.....................................................................................................44

Figura 15: Curva de inibição de crescimento em culturas de microrganismos em

diversas concentrações de azul de metileno com e sem luz.......................................45

Figura 16: Decréscimo do número de colônias em função das condições aplicadas.

Os grupos C1 e C2, controles, são culturas do microrganismo com e sem exposição

ao LED por 30 minutos, respectivamente (sem AM). Nas amostras onde constam

tempos (de iluminação) correspondem a culturas com AM (35,2 μM) submetidas à

luz. As taxas de morte (k) são derivadas da curva, considerando o tempo 0 a 30

minutos de exposição e o valor-D é calculado pela redução de 1 ciclo-logarítimico

da mesma curva.....................................................................................................................48

Figura 17: Curva de crescimento de promastigotas de

Leishmania (Viannia)

braziliensis

em meio 199, a 26

C, tratadas ou não com azul de metileno, com ou

sem luz.....................................................................................................................................50

Figura 18: Infectividade de promastigotas de

Leishmania (Viannia) braziliensis

para macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c. Promastigotas foram

cultivados sobre monocamadas de macrófagos na proporção 10 parasitos:1

macrófago. As culturas foram tratadas ou não com AM e luz. Os resultados

representam os índices fagocíticos após 24 e 48 horas. Os valores referem-se a

média do experimento realizado em quadruplicata ± erro padrão da média. A:

macrófago infectado (controle); B: macrófago infectado e tratado com 0,53

μmol.L

-1

de AM; C: macrófago infectado e tratado com 0,066 μmol.L

-1

de AM......51

Figura 19: A - Macrófago e

Leishmania

; B - Macrófago, AM (0,53 μmol.L

-1

) e

Luz; C - Macrófago,

Leishmania

, AM (0,066 μmol.L

-1

) e Luz; D - Macrófago,

Leishmania

, AM (0,53 μmol.L

-1

) e Luz..............................................................................53

Figura 20: Produção de óxido nítrico (NO) em macrófagos infectados com

L.(V.)

braziliensis

e tratados com AM e Luz. A: Macrófago e

Leishmania

; B: Macrófago,

Leishmania

e AM 0,53 μmol.L

-1

; C: Macrófago e AM 0,066 μmol.L

-1

.........................54

Figura 21: Evolução da infecção avaliada pela espessura da lesão (média ± desvio

padrão) medida pela diferença entre a pata infectada e a pata contralateral não

infectada. Os animais foram inoculados na pata com 5x10

formas promastigotas

Leishmania (Leishmania) amazonensis

e acompanhados semanalmente. O grupo

controle (n=8), o grupo A (n=14) e o grupo B (n=15).....................................................55

Figura 22: Evolução da infecção avaliada pela espessura da lesão (média ± desvio

padrão). Os animais foram inoculados na pata com 5x10

formas promastigotas de

Leishmania (Leishmania) amazonensis

e após o desenvolvimento da lesão, foram

tratados e acompanhados semanalmente. O grupo controle (n=8) não recebeu

tratamento, o grupo A (n=14) foi tratado com AM em loção e o grupo B (n=15) foi

tratado com AM em água....................................................................................................56

Figura 23: Lesão na pata de hamster inoculada com 5x10

promastigotas de

L.(L.)

amazonensis

. Animal tratado com AM 0,5% em água. A – antes do tratamento; B –

6 semanas com TFD; C – 12 semanas de tratamento; 1 tratado com AM em água e

2 tratado com AM em loção...............................................................................................58

Figura 24: Efeito do tratamento com a TFD sobre o número de parasitos nos

linfonodos poplíteos..............................................................................................................60

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1: Distribuição eletrônica nos orbitais moleculares (π

) do oxigênio

molecular no estado singlete excitado (

∆

) e no estado fundamental (

)..6

Tabela 2: Valores de AFQ para o azul de metileno, determinados pelo teste do

ácido úrico...............................................................................................................................42

Tabela 3: Porcentagem de inibição do crescimento de microrganismos................47

Tabela 4: Inibição da infectividade (%) das promastigotas de

L(V) braziliensis

para

macrófagos peritoneais de camundongos...............................................................52

Tabela 5: Características das lesões dos animais infectados experimentalmente

com

L. (L.) amazonensis

, tratados ou não com AM e luz..............................................57

vii

LISTA DE ABREVIATURAS

TFD Terapia Fotodinâmica

PBS Tampão Fosfato Salino

LED Diodo Emissor de Luz

LTA Leishmaniose Tegumentar Americana

CMH Caldo Muller Hinton

UFC Unidade Formadora de Colônia

AM Azul de metileno

NO Óxido Nítrico

IF Índice Fagocítico

AF Atividade Fotodinâmica

AU Ácido úrico

viii

RESUMO

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade médica que utiliza a

combinação de luz visível, composto fotossensível e oxigênio. A maior aplicação

da TFD é no tratamento de câncer, entretanto, a técnica está sendo difundida no

tratamento de outras doenças incluindo-se infestações microbianas.

Apesar da larga aplicabilidade da TFD, dois fatores dificultam a

disseminação do tratamento: o alto custo dos medicamentos e da fonte de luz. A

opção de corantes como agentes fotodinâmicos é interessante devido ao custo

reduzido e aplicabilidade, sendo um exemplo o azul de metileno (AM). Este

corante absorve na região de luz vermelha e produz oxigênio singlete. Além

disso, já é bastante utilizado na área médica, por exemplo, para o tratamento de

metahemoglobinemia, e tem sido considerado um fármaco para TFD. No caso dos

equipamentos, a substituição do LASER por dispositivos de LED deve ser

investigada.

Assim estudou-se algumas propriedades do AM como fotossensitizador

bem como o uso de LED como uma alternativa para TFD. Investigou-se a ação

fotodinâmica em culturas de microrganismos e

Artemia salina

e no tratamento da

Leishmaniose Tegumentar Americana.

O azul de metileno tem um máximo de absorção na região de 660 nm (na

janela fototerapêutica para TFD); sofre pouca reação de fotobranqueamente e

exibiu um bom valor de atividade fotodinâmica. Este último parâmetro foi

calculado levando-se em consideração o fato do LED ser uma fonte de luz

policromática, levando nos a modificar a equação tradicionalmente empregada

para sistemas LASER nos cálculos de atividade fotodinâmica. O sistema de LED

desenvolvido foi altamente conveniente para as aplicações propostas com o

corante AM.

O efeito fotodinâmico foi testado sobre

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Candida albicans

Artemia salina

. As cepas estudadas sofreram

efeito inibitório no crescimento e mortandade na presença de azul de metileno

(no escuro), sendo este intensificado com aplicação da luz LED. A resposta

AM/LED foi similar para todos os microrganismos. Igualmente com

Artemia

salina

o percentual de morte foi superior nas amostras irradiadas.

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma das doenças

parasitárias de maior incidência no mundo, cujo tratamento convencional emprega

medicamentos caros e com sérios efeitos colaterais. A investigação para LTA

através de LED em associação com AM, foi realizada

in vitro

, em ensaios sobre as

formas promastigotas e amastigotas com

Leishmania (Viannia) braziliensis

vivo

com

Leishmania (Leishmania) amazonensis

em hamsters infectados. Os

resultados dos experimentos

in vitro

mostram que o tratamento com AM e luz

inibiu o crescimento de formas promastigotas em cultura e reduziu a capacidade

de infecção das promastigotas em macrófagos. Os resultados

in vivo

mostram que

o sistema AM/LED reduziu a lesão das patas infectadas e a carga parasitária nos

hamsters.

Assim os bons resultados do tratamento aplicado contra microrganismos e

leishmaniose,

in vitro

in vivo

com AM/LED, confirma que a TFD é altamente

promissora podendo vir a ser uma alternativa no tratamento clínico de pacientes.

ABSTRACT

The Photodynamic Therapy (PDT) is a medical modality that utilizes a

combination of a photosensitizer compound, visible light and oxygen. Its largest

application is in the treatment of cancer, however, this technical is being

diffused far handling other illnesses including microbial infections. Despite of

the wide applicability of the TFD, two factors difficult its dissemination: the

high cost of the medicines and the light source. The option of dyes as the

photodynamic agents is interesting due to the lower cost and possibilities, of

application being an example the Methylene Blue (MB). This dye absorbs in the

red region of the visible absorption spectra and produces high level of singlet

oxygen. Beyond that, it is already utilized in the medical area, for example, to

treat metahemoglobinemia, and has been considered a medication for PDT. In

the case of equipment, the replacement of the LASER by LED units as light

source should be investigated.

In that way the MB was investigated in association with LED light as an

alternative for PDT. It was investigated the photoactivity of MB in cultures of

microorganisms and

Artemia salina

and in the handling of the American

Tegumentar Leishmaniosis. The Methylene Blue has a maximum absorption in

663 nm (inside the phototherapeutic windows for PDT); suffers almost no

photobleaching reaction and exhibits a good value of photodynamic activity (PA).

This last parameter was calculated considering the fact of the LED be a non-

monocromatic light source, leading us to modify the equation traditionally

employed for LASER systems in the calculations of PA. The apparatus of LED

system developed was highly convenient for the proposed application with the

MB dye.

The photoactivity of MB/LED was investigated using the bacteria

Staphylococcus aureus

and

Escherichia coli

, and the fungus

Candida albicans

. A

tiny microcrustaceous

Artemia salina

was also tested. All the microorganisms

studied mesented inhibitory growth activity and killing effect in presence of MB

(in the dark), being this action intensified with the LED light irradiation. The

intensity of effect using MB/LED was similar for all of the microorganisms.

Equally with

Artemia salina

the percentage of death was higher in the irradiated

samples.

To American Tegumentar Leishmaniosis (LTA) is one of the parasitic

disease of largest incidence in the world and in the conventional treatment

employ some costly medicines which show severe colateral effects. The

investigation for LTA through LED in association with MB, was carried out

vitro

, in attempt promastigotes and amastigotes forms of

Leishmania (Viannia)

braziliensis

and,

in vivo

with

Leishmania (Leishmania) amazonensis

infected in

hamsters. The results in vitro show that the combination of MB and light

inhibited the growth of forms promastigotes in culture and reduced the capacity

of infection of the promastigotes in macrofhages. The results

in vivo

show that

the system MB/LED reduced the lesion of the infected paw and the parasitic

load in the hamsters.

The good results showed in the treatment applied against microorganisms

and leishmaniosis,

in vitro

and

in vivo

with the MB/LED, pointed out that this

therapy is very interesting and can be a future alternative in the clinical handling

of patients.

xii

I.INTRODUÇÃO

I.1. Terapia Fotodinâmica

I.1.1. Breve histórico e princípios

O uso de luz e compostos fotossensíveis em humanos é antigo, pois há mais

de 4000 anos atrás os egípcios tratavam vitiligo através da ingestão de plantas

(psoralenos) e exposição à luz do sol. Entretanto, a técnica de Terapia

Fotodinâmica (TFD) começou a ser empregada com sistemática científica

somente bem recentemente.

Em 1900, Oscar Raab descreveu a ação do corante acridina sobre o

microrganismo

Paramecio

, demonstrando que no escuro não havia efeito enquanto

que na presença de luz solar observava-se a morte deste protozoário.

Trappeiner, em 1903, empregou uma solução de eosina e exposição à luz para o

tratamento de câncer de pele. Em 1913 Meyer-Bertz injetou em si mesmo 200mg

de hematoporfirina (Hp) e não sentiu nenhum efeito, porém ao se expor à luz

teve fotossensibilidade na pele por vários meses. Policard, em 1925, estudou

porfirinas objetivando a produção de efeitos fototóxicos em tecidos,

principalmente em tumores malignos (Sternberg e col., 1998).

A história da chamada primeira geração de fármacos para TFD, a base de

derivados hematoporfirínicos, começa com Schwartz no início da década de 50.

Ele mostrou que nos experimentos de Meyer-Bertz, o princípio ativo não era a

hematoporfirina, mas uma mistura de diversas substâncias oligoméricas.

Schwartz enriqueceu a mistura de oligômeros (chamou de HpD) e Lipson, sob

orientação de Schwartz na década de 60, investigou o acúmulo deles em tumores

implantados em camundongos e observou que a incidência de luz proporcionava

regressão da doença. No final da década de 60, Lipson obteve sucesso no

tratamento de uma mulher que possuía câncer de mama usando o HpD e

irradiação seletiva do tumor, marcando assim, o início da TFD como terapia

clínica para câncer (Machado, 2000; Simplicio e col., 2002).

Na realidade a TFD é uma modalidade médica que utiliza a combinação de

luz visível e composto fotossensível na presença de oxigênio. Sua maior aplicação

é no tratamento de câncer, entretanto, a técnica está sendo difundida no

tratamento de outras doenças tais como degeneração macular da retina, miopia

patológica, psoríase, artrite reumatóide sistêmica, arteriosclerose, AIDS,

infestações bacterianas, etc (Levy, 1995; Machado, 2000; Sternberg e Dolphin,

1996; Sternberg e col., 1998). Adicionalmente o uso da TFD na área

dermatológica tem-se desenvolvido bastante, particularmente no tratamento de

acne e rejuvenescimento cutâneo (www.sbcd.org.br).

O tratamento através da TFD inicia-se com a administração do

fotossentizador de forma sistêmica ou tópica. A seguir é aguardado algumas

horas/minutos para que o fármaco se acumule preferencialmente no tecido

doente que será posteriormente irradiado. O composto fotossensível, excitado

pela luz, transfere energia e/ou elétrons para o oxigênio, gerando espécies

reativas de oxigênio (EROs) que são citotóxicas. Tais espécies geram um

estresse oxidativo local ocasionando a morte do tecido doente.

Para que o medicamento (fotossensitizador) seja comercialmente viável e

eficaz em sua ação terapêutica, é necessário que este atenda a um conjunto de

propriedades favoráveis como: (i) características fotofísicas favoráveis; (ii) alta

afinidade e seletividade ao tecido doente, baixa toxicidade no escuro,

fotossensibilidade não prolongada, simplicidade na formulação, reprodutibilidade,

alta estabilidade, farmacocinética favorável e facilidade de obtenção do fármaco

(Simplicio e col., 2002). Dentre as propriedades fotofísicas importantes cita-se

que os compostos utilizados em TFD, além de cromóforos absorventes em

regiões no vermelho, não devem sofrer reações de foto-branqueamento (foto-

degradação), pois daí o cromóforo estaria sofrendo modificações químicas

fazendo com que o processo de absorção de luz fosse alterado e, possivelmente,

diminuindo a efetividade dos processos fotoquímicos subseqüentes. Neste caso

compromete-se a geração de EROs através da diminuição de rendimentos ou

fazendo com que doses elevadas do fotossensitizador sejam necessariamente

administradas para compensar esta perda. Adicionalmente os compostos

normalmente devem possuir longo tempo de vida no estado triplete e levar a alto

rendimento quântico de oxigênio singlete uma vez que esta é a espécie foto-ativa

considerada principal para a TFD (mecanismo tipo II).

Uma outra característica importante dos compostos que estão sendo

aplicados/investigados para TFD é a alta hidrofobicidade, propriedade que

confere a estes maior facilidade de interação com alvos biológicos, dentre

outros, com membranas celulares (Sternberg e col., 1998). Todavia essa

característica confere às moléculas uma alta tendência à auto-agregação em

solução aquosa, veículo usualmente empregado em injeção intravenosa e

componente majoritário de fluídos corpóreos. Subseqüente ao processo de

agregação, estes aglomerados podem levar a formação de precipitados, o que

inviabiliza seu uso clínico devido à dor no momento da injeção, perda de materiais

no recipiente/frasco e mesmo morte do paciente por obstrução de artérias.

Mesmo para o uso tópico a preferência é água uma vez que a maioria dos

solventes orgânicos são tóxicos. Além dos inconvenientes citados, o fármaco no

estado agregado reduz a produção de oxigênio singlete (devido a rápida

desativação de energia de estados excitados pelo fenômeno de auto supressão) e

assim compromete-se a eficiência do tratamento (Sternberg e col., 1998;

Machado, 2000).

I.1.2. Mecanismos Fotofísicos e Fotoquímicos da Terapia

Fotodinâmica

No diagrama de Jablonski (figura 1) estão representados os processos

fotofísicos que um fármaco fotossensível pode sofrer após a absorção de

radiação.

Figura 1: Diagrama de Jablonski

Após a iluminação do fármaco no estado fundamental (S

) é excitado para

o seu estado singlete excitado (S

). Este estado excitado tem um tempo de vida

curto para interagir efetivamente com as moléculas vizinhas (na ordem de

nanosegundos), normalmente perdendo energia rapidamente através de processos

radiativos (emissão de fluorescência, F), e/ou não radiativos (conversão interna,

CI ou cruzamento intersistemas, CIS). Para a TFD, o mais importante destes

processos é o cruzamento intersistemas, caracterizado por uma inversão de spin

eletrônico, levando o fármaco ao seu estado triplete excitado (T

). A partir do

estado triplete, o fármaco pode retornar para o estado fundamental pelo

processo de conversão interna ou pelo processo de emissão de fosforescência

(P). Deste estado excitado (T

) os processos fotoquímicos que o fármaco pode

sofrer são extremamente importantes.

O estado triplete excitado tem um tempo de vida da ordem de

microsegundos (s), que é longo o suficiente para permitir a interação do

fármaco no estado excitado com moléculas vizinhas. Neste estado excitado, pode

por transferência de elétrons com substratos orgânicos (A) produzir um

substrato oxidado (A

-

) e o fármaco reduzido (

+

) que reage com o oxigênio

molecular (

) gerando uma mistura complexa de espécies reativas de oxigênio

(EROS), tais como o ânion radical superóxido (O

-•

), radical hidroxila (OH

•

) e o

peróxido de hidrogênio (H

), os quais são capazes de induzir irreparáveis

danos oxidativos às células (Machado, 2000). Este mecanismo de

fotossensibilização é conhecido como TFD tipo I.

TFD Tipo I: Reações de formação de radicais livres

+ A

→ [T---A]* → [

T---A

]

[

T---A

] +

→ S

+ O

→ H

+ O

+ H

O → O

+ OH

Adicionalmente, o fármaco em seu estado triplete excitado pode

transferir o seu excesso de energia para o oxigênio molecular (no seu estado

fundamental, 3g

) com formação de oxigênio singlete (

); ou seja, o

oxigênio no estado fundamental, tem a configuração eletrônica de dois orbitais

* degenerados (orbitais com a mesma energia) ocupados por 1 elétron cada,

sendo estes de spin paralelos (Ronsein e col., 2006). Este oxigênio triplete, ao

receber energia de um fármaco fotossensível no estado triplete excitado, passa

para um estado excitado com inversão de um dos seus spins, caracterizando o

estado singlete. Esta reação de transferência de energia caracteriza o

mecanismo do Tipo II de TFD.

TFD Tipo II: Reações de formação de oxigênio singlete

→ S

Adicionalmente o

pode existir em duas formas distintas conforme

mostrado na tabela 1.

Tabela 1: Distribuição eletrônica nos orbitais moleculares (

) do oxigênio molecular no

estado singlete excitado (





) e no estado fundamental (



O estado



rapidamente decai para a forma menos energética (



) pois

este tem um tempo de vida muito curto, da ordem de picosegundos. O oxigênio no

estado excitado de configuração

g é a espécie normalmente ativa (TFD tipo

II), sendo esta responsável pelo dano celular foto-induzido. O oxigênio singlete

possui um tempo de vida “relativamente” longo (2 a 4 s em H

O) e por isto é um

importante agente oxidante. Em sistemas biológicos, o tempo de vida do

muito menor, inferior a 0,04 s, devido à presença de inúmeras biomoléculas com

as quais o oxigênio singlete reage (Machado, 2000). A reação, rápida e

indiscriminada, ocorre com os mais variados materiais biológicos ricos em

elétrons como lipídios insaturados (colesterol), aminoácidos (como triptofano,

histidina, metionina), proteínas e ácidos nucléicos, levando danos à membrana

celular, mitocôndrias e lisossomos, comprometendo assim a integridade celular

(Machado, 2000; Ronsein e col., 2006 ).

I.1.3. Fármaco fotossensível - Azul de metileno

O azul de metileno (AM), figura 2, é uma molécula que tem desempenhado

importante papel em microbiologia e farmacologia. É muito conhecido como

corante histológico e usado há muitos anos. Pertence a classe dos compostos

benzofenotiazinios, é amplamente usado clinicamente em organismos vivos para o

tratamento da metahemoglobinemia. Dentre as pesquisas sobre o seu uso inclui-

se a malária e a esquisofrenia, sendo que já em 1891 Ehrlich empregou o AM com

sucesso no tratamento da malária (Wainwright, 2005).

Figura 2: Estrutura do azul de metileno

A síntese do AM ocorreu em 1876, no período em expansão industrial,

especialmente de tinturas para tecidos. É bem estabelecido que o cátion AM

intercala na estrutura do ácido nucléico (DNA) devido à carga positiva e à

geometria planar do fotossensitizador em questão, especialmente em regiões

ricas em guanina-citosina (Wainwright, 2000; Wainwright, 2002), figura 3.

Adicionalmente, o AM acumula-se preferencialmente na mitocôndria das células,

pois estas contém uma variedade de proteínas na sua membrana. A seletividade

deste corante na mitocôndria pode ser determinada pela lipofílicidade e pela

carga, que se for positiva é atraída devido ao ambiente eletroquímico negativo da

matriz mitocondrial (Baptista e col., 2004).

Figura 3: Superposição de um cromóforo fenotiniazino em um par guanina-citosina (G-C)

(

Wainwright, 2000)

O AM em solução aquosa está presente na forma de monômeros (soluções

diluídas), dímeros e agregados maiores (soluções bastante concentradas), sendo

estes distinguíveis pelas suas bandas de absorção, máximos em 664nm, 600nm e

na região de 550 nm, respectivamente (Tardivo e col., 2005). Assim esta classe

de corantes exibe intensa absorção em comprimentos de onda de 600 a 660 nm,

região do espectro vermelho, radiação esta favorável a TFD por estar dentro da

“janela foto-terapêutica” devido a sua eficiência quanto à penetração da luz em

tecidos biológicos (Sternberg e col., 1998; Sternberg e Dolphin, 1996).

O AM, além de barato e absorver na região de luz vermelha, produz

espécies reativas de oxigênio, tais como o ânion superóxido e oxigênio singlete. O

valor de rendimento quântico de oxigênio singlete (



) do AM em água e álcoois é

em torno de 0,52 ± 0,02 (Zhang e Tang, 2004; Fernandez e col., 1997).

Atualmente o AM é empregado em várias agências européias para

desinfecção de plasma sanguíneo, pois é eficaz na inativação de vírus, incluindo

HIV, hepatite B e C (Floyd e col., 2004; Wainwright, 2000). O vírus da dengue

também pode ser erradicado por AM e TFD (Huang e col., 2004). Há pouco tempo

começou a ser considerado como um fármaco para a TFD (Tardivo e col, 2005;

Itri, 2002) pois tem mostrado atividade

in vivo

contra vários tipos de tumor

quando injetado localmente e iluminado com laser emitindo no vermelho. Azul de

metileno tem sido usado clinicamente no tratamento de câncer de bexiga e

recentemente contra tumores de esôfago inoperáveis, virulências da pele,

psoríase e adenocarcinomas (Perussi, 2007).

Os princípios fotoquímicos do AM encontram-se na figura 4. O AM é

ativado ao estado singlete excitado (

AM*) pela luz. Neste estado, com igual

probabilidade, ele pode retornar ao estado singlete ou ir para o estado triplete.

No estado triplete o AM pode reagir com o O

e formar o oxigênio singlete (

)

e voltar ao seu estado normal, ou em um processo muito mais lento formar

superóxido. Alternativamente o

AM* pode reagir com substratos gerando

espécies reativas de oxigênio (Floyd e col., 2004).

+ AM

TFD tipo II

AM*

AM* O

-•

+ AM

luz

AM H ou transferência de e

TFD tipo I

Figura 4: Esquema da fotoquímica do azul de metileno

Devido ao fato do AM ser gerador de espécies ativas de oxigênio, incluindo

o oxigênio singlete e o superóxido, a própria espécie reativa gerada pode atacar

o corante sensitizador, ou seja, produção de reações fotoquímicas (foto-

branqueamento), ex. foto-oxidação do AM. Quanto aos produtos dessas reações,

é proposto inicialmente a desmetilação no grupo amino conduzindo a formação do

Azure e depois a Tionina e, por fim, ocorre a quebra da molécula se decompondo

em espécies benzênicas (Wainwright e Giddens, 2003).

I.1.4. Fontes de Iluminação usadas em TFD

No tratamento de doenças, diversas fontes de luz podem ser usadas para

provocar a excitação das moléculas fotossensibilizadoras, como por exemplo, luz

pulsada, luzes incoerentes (projetor de slides), lâmpada de xenônio, entre outras,

todas com filtros específicos que permitem selecionar o comprimento de onda de

maior penetração nos tecidos e de absorção máxima do fármaco. No tratamento

que envolve a TFD, a radiação utilizada geralmente é fornecida por um sistema

LASER que é dirigida ao local do tratamento através de fibras óticas. Os raios

LASERs são preferencialmente empregados por apresentarem três

características que os diferem da luz comum. A luz é monocromática (um só

comprimento de onda), coerente (unifásica) e unidirecional (raio colimado), sendo

que adicionalmente os sistemas LASER podem ser potentes. A intensidade da

radiação em TFD é dada em J/cm

. Uma variedade de LASERs podem ser

utilizados dependendo da característica e da fase em que se encontra a lesão,

sendo usualmente três tipos os usados na TFD: Nd YAG (neodymium yttrium-

aluminiumgarnet), argônio e os lasers de diodo. Os lasers de diodo são menos

caros, fornecem luz de potência considerável com precisão sobre o tecido a ser

irradiado; em 2000 foi aprovado pela Food and Drug Adminstration (FDA/EUA) o

uso deste laser para a ativação do Photofrin® visando aplicação em lesões

malignas no esôfago e pulmão (Mang, 2004; Machado, 2000).

Uma alternativa adicional razoável é a utilização de LED (diodo emissor de

luz), disponíveis no mercado em várias regiões espectrais, incluindo-se a do

vermelho (630, 670 e 690 nm) (Mang, 2004).

I.1.5. Dificuldades da TFD

Apesar do vasto campo de aplicação da TFD e do grande apelo clínico e

comercial da técnica, dois fatores dificultam a disseminação do tratamento: o

custo dos medicamentos e equipamentos, além da falta de conhecimento da

técnica pela classe médica. Os fármacos utilizados para a TFD, cujos princípios

ativos são sintéticos, são economicamente inacessíveis à maioria da população

devido as dificuldades na produção e alto investimento no desenvolvimento

destes.

No caso de equipamentos, atenção especial é dada ao LASER, que possui

elevado preço e inviabiliza a maior difusão da técnica. O desenvolvimento do

laser de diodo fez com que o custo de aparelhagem fosse diminuído, mas ainda

assim é alto para a realidade brasileira. Uma alternativa possível é o uso do LED,

diodo emissor de luz

(Mang, 2004), dispositivo de luz policromática. As fontes à

base de LED, apesar de apresentarem potência muito inferior aos LASERs, são

muito mais baratas.

Um outro aspecto de interesse neste trabalho é a diversidade de

enfermidades que pode ser tratada com a TFD, doenças muitas vezes

negligenciadas pelas grandes corporações farmacêuticas pelo baixo retorno

financeiro.

I.2. Aplicações / Doenças

I.2.1. Leishmaniose

As leishmanioses são zoonoses causadas por protozoários pertencentes à

ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e gênero

Leishmania

, cujo ciclo

tem a participação de hospedeiros vertebrados e inverteb rados (Rey, 2001).

Durante seu ciclo biológico, este protozoário apresenta duas formas

evolutivas: amastigota e promastigota. A forma amastigota parasita o fagossoma

das células do sistema monocítico macrofágico dos hospedeiros vertebrados

(homem, animais silvestres e animais domésticos) e é caracterizada pela ausência

de flagelo. A forma promastigota habita o aparelho digestivo do vetor, insetos

(mosquito) da família

Psychodidae,

subfamília

Phlebotominae

, pertencentes aos

gêneros

Lutzomyia

- no Novo Mundo, e

Phlebotomus –

no Velho Mundo e

caracteriza-se por possuir flagelo (Neves, 2000).

Durante a picada de um mosquito flebotomíneo contaminado, formas

promastigotas do parasito são inoculadas no hospedeiro vertebrado, as quais são

fagocitadas por macrófagos. No interior destas células as formas promastigotas

transformam-se em amastigotas e dão início ao processo de multiplicação até o

rompimento da membrana da célula hospedeira, promovendo a liberação de

milhares de parasitos amastigotas que irão infectar novas células (Rey, 2001).

A leishmaniose pode apresentar diferentes formas clínicas, dependendo da

espécie de

Leishmania

envolvida e da relação do parasito com seu hospedeiro: (i)

a leishmaniose visceral (LV) é uma enfermidade infecciosa, generalizada, crônica,

caracterizada por febre irregular e de longa duração, hepatoesplenomegalia,

linfadenopatia, emagrecimento, estado de debilidade progressivo levando à

caquexia e até óbito se o paciente não for submetido a tratamento; (ii) a

leishmaniose tegumentar americana (LTA) pode apresentar-se na forma cutânea

localizada caracterizada por lesões ulcerosas, indolores, únicas ou múltiplas; (iii)

a forma cutâneomucosa é caracterizada por lesões mucosas agressivas que

afetam as regiões nasofaríngeas; a forma disseminada apresenta múltiplas

úlceras cutâneas por disseminação hematogênica ou linfática e, finalmente, a

forma difusa apresenta lesões nodulares não ulceradas (Neves, 2000).

A leishmaniose é uma das doenças infecto-parasitárias de maior incidência

no mundo. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2007), mais de

12 milhões de pessoas em 88 países estão infectadas e cerca de 350 milhões

correm o risco de contrair a infecção. A incidência anual é estimada em 1-1,5

milhões de casos de leishmaniose cutânea e 500 mil casos da forma visceral

(WHO, 2007).

Do total de casos de leishmaniose tegumentar já registrados no mundo, 90%

ocorreram em apenas seis países: Irã, Arábia Saudita, Síria e Afeganistão no

Velho Mundo, Brasil e Peru na América do Sul. A LTA ocorre nas Américas desde

o sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina. O foco mais importante é o

sul-americano, que compreende quase todos os países, com exceção do Uruguai e

do Chile (WHO, 2007).

A LTA é problema de Saúde Pública não só no Brasil, mas também em

outros países do Novo Mundo. Sua importância se deve não somente a sua alta

incidência e ampla distribuição geográfica, mas também na possibilidade de

assumir formas que podem levar a lesões destrutivas, desfigurantes e também

incapacitantes, com grande repercussão no campo psicossocial do indivíduo

(Gontijo e Carvalho, 2003). No Brasil a LTA tem sido registrada em todos os

Estados sendo que as regiões Norte e Noroeste do Estado do Paraná são

endêmicas para a doença (Silveira e col., 1996; Silveira e col., 1999; Lima e col.,

2002), devido à intensa destruição de matas nativas e também pela presença do

vetor em regiões peridomiciliares (Teodoro e col., 2001; Castro e col, 2002).

O tratamento de escolha para LTA, recomendado pelo Ministério da

Saúde, é o antimoniato de N-metil glucamina (Glucantime

), na dose de 15mg

/Kg/dia, durante 20 dias e se não houver cicatrização completa após 3 meses

do término do tratamento, o esquema deve ser repetido, agora com duração de

30 dias. Este medicamento tem provocado sérios efeitos colaterais (artralgia,

mialgia, inapetência, náuseas, vômitos entre outros, inchaço e dor no local da

aplicação) (Ministério da Saúde, 2000) além de desconforto para os pacientes, o

que leva ao abandono do tratamento e possibilita a seleção de parasitos

resistentes aos fármacos. Essas preparações de antimônio são empregadas nos

últimos 90 anos. Sua introdução foi baseada em conceitos terapêuticos do

século XIX, onde era significativa a participação terapêutica de sais de metais,

como arsênio e outros. A indústria pouco tem contribuído no desenvolvimento de

novos medicamentos para o tratamento da leishmaniose e, no Brasil, o

medicamento de eleição continua sendo o antimoniato de metilglucamina. A

estrutura e composição deste fármaco ainda não foram totalmente esclarecidas,

e o mecanismo de ação ainda é pouco conhecido. Existem fortes evidências que o

antimônio pentavalente seja reduzido

in vivo

à sua forma trivalente, o que vem a

explicar a toxicidade deste composto, bem como seu efeito terapêutico. Ainda, o

medicamento disponível no Brasil tem apresentado problemas quanto à sua

qualidade (Rath e col., 2003). Por isso, novos tratamentos alternativos devem ser

investigados.

I.2.1.1. A TFD no tratamento da leishmaniose tegumentar

americana

Entre os poucos trabalhos envolvendo

Leishmania

e TFD têm-se um estudo

que mostra a suscetibilidade

in vitro

com as formas promastigotas e amastigotas

Leishmania amazonensis

com cloreto de ftalocianina de alumínio e luz de baixa

energia (Dutta e col., 2005). Em outro estudo

in vitro

(Akilov, e col., 2006)

investigou-se o impacto da carga molecular e estrutura do fotossensitizador na

resposta fototóxica do parasito. A atividade fotodinâmica dos

fotosenssitizadores com carga positiva (benzofenotiazinios – derivados do azul

de metileno) foi maior do que os com carga negativa (porfirinas aniônicas).

Segundo os autores este fato é devido a carga negativa da superfície da

membrana do parasito, ou seja, os fármacos catiônicos, devido a forte interação,

seriam mais eficientes do que os aniônicos. Esta carga negativa é devido a um

componente da membrana, o lipofosfoglicano (LPG).

Alguns poucos estudos mostram a eficiência da terapia fotodinâmica no

tratamento clínico da leishmaniose cutânea. Gardlo e col., (2003) trataram cinco

lesões de leishmaniose tegumentar com TFD utilizando o fármaco fotossensível

Metvix (Metilaminolevulinato, derivado do ALA) (Photocure, Oslo, Norway), e 75

J.cm

-2

de luz vermelha, duas vezes por semana, durante 12 semanas, seguida de 1

vez por semana por mais 4 semanas. Todas as 5 lesões tratadas com esta terapia

ficaram clinicamente e histologicamente livres de

Leishmania

. Não houve

recorrência da lesão no período observado (10 meses) e o resultado estético foi

excelente.

Outro estudo, envolvendo 20 pacientes num total de 31 lesões, foi

realizado com o ácido aminolevulínico (ALA), 100 J.cm

-2

por sessão, duração de 4

semanas e aplicação 1 vez na semana. Os resultados foram muito promissores

sendo que 29 lesões tiveram 100% de cura e as outras 2 tiveram cura parcial

(Asilian e Davami, 2006).

I.2.2. Microrganismos patogênicos

O número de microrganismos (bactérias e fungos) resistentes a

antibióticos cresce no mundo todo. Este fato é preocupante exigindo o

desenvolvimento de novas técnicas antimicrobianas de forma que estas não sejam

capazes de desenvolver resistência. A TFD tem sido apontada como uma terapia

antibacteriana alternativa, podendo ser usada como uma terapia para infecções

localizadas, uma vez que, a morte das células é causada pelo oxigênio singlete e

radicais livres, sendo improvável que adquiram resistência a TFD (O’ Riordan e

col., 2005; Perussi, 2007).

Em relação à inativação de bactéria, diversos trabalhos tem mostrado que

bactérias Gram-positivas (+) são geralmente mais sensíveis à TFD do que as

espécies Gram-negativas (-) que são mais resistentes. Essas diferenças podem

ser explicadas pelas diferenças estruturais na parede celular. As bactérias Gram

(-) tem uma membrana externa à camada de peptídeoglicano, funcionando como

uma barreira física e funcional entre a célula e seu ambiente, o que dificulta a

incorporação de fármacos. As células Gram (+) têm somente uma membrana.

Assim, antibióticos que são eficientes contra bactérias Gram (+) não são

eficientes contra Gram (-) (Phoenix e col., 2003). Já os fungos são ainda mais

resistentes a TFD devido à presença de uma membrana nuclear que pode

representar uma barreira adicional à penetração do fármaco (Perussi, 2007),

figura 5.

Com o crescente número de patógenos fúngicos principalmente em

pacientes imunocomprometidos, causando infecções e micoses (Teichert e col.,

2002; Perussi, 2007), tem aumentado a busca por tratamento fungicidas mais

eficientes. Sabe-se que fármacos seguros e específicos são poucos e caros e a

maioria deles tem ação somente fungistática, ou seja, apenas inibem a

multiplicação, não provocando a morte. Além disso, o uso rotineiro de antibióticos

tem levado ao aparecimento de linhagens resistentes, exigindo doses maiores.

Com isso tem havido um interesse crescente no uso da TFD em tratamentos

contra fungos (O’ Riordan e col., 2005)

Figura 5: Representação esquemática da parede celular de bactéria Gram-positiva (+),

Gram-negativa (-) e fungo.

I.2.2.1. Os microrganismos em estudo

Os microrganismos escolhidos para os ensaios fotodinâmicos foram

Staphylococcus aureus

(Gram-positivo),

Escherichia coli

(Gram-negativo) e

Candida albicans

(fungo).

S. aureus

é o microrganismo mais comum como patógeno oportunista

humano. É uma bactéria muito presente em infecções hospitalares é uma das

maiores causas de morte. Pode causar infecções em diferentes partes do corpo.

Infecções por esta bactéria são frequentemente agudas e piogênicas. Algumas

das infecções mais comuns envolvem a pele e incluem furúnculos, impetigo e

feridas pós cirúrgicas. Algumas das infecções mais sérias causadas pelo

aureus

são bacteremia, pneumonia, osteomielite, endocardites agudas,

miocardites, meningites, síndrome da pele escaldada, abscessos em músculos e

trato geniturinário. Além disso, sua presença em determinados alimentos causa

intoxicação devido à sua capacidade de produzir toxinas( Livermore, 2000).

E. coli

, igualmente uma bactéria, é uma das principais causas de doenças

infecciosas em seres humanos e é o agente etiológico mais freqüente das

infecções do trato urinário, acometendo principalmente mulheres e crianças.

Habitante normal do trato-intestinal em animais de sangue quente, no homem é

responsável por metabolizar uma considerável quantidade de vitaminas e exerce

o importante papel de reprimir a multiplicação de outras bactérias prejudiciais à

saúde. Mas a

E.coli

compreende, na verdade, um grande grupo de

microorganismos, que se subdividem em mais de 160 sorotipos diferentes. Alguns

deles, chamados de

E. coli

enteropatogênicos (EEC), são capazes de provocar

infecções intestinais, algumas de certa gravidade.

Já a

C. albicans

é uma levedura encontrada em regiões mucocutâneas,

trato digestivo e genital de mamíferos e aves, sendo um patógeno oportunista e

produzindo com maior freqüência estomatite e vaginite, mas podendo causar

infecções localizadas na pele, unhas, trato respiratório e levar à septicemia,

dependendo do grau de imunossupressão do indivíduo.

C. albicans

pode afetar a

superfície mucosa da boca, vagina, esôfago e árvore brônquica, e doenças que se

disseminam e acometem múltiplos sistemas orgânicos. O quadro clínico varia,

dependendo do local de infecção. A membrana mucosa da boca, língua e trato

genital são mais comumente envolvidos que a unha e pele.

II. OBJETIVOS

O azul de metileno e a possibilidade de usar como fonte de luz dispositivos

de LED, faz do sistema AM/LED interessante para a TFD devido a redução

significativa de custos podendo ser aplicados às populações de baixa renda no

tratamento de diversas doenças. Essa possibilidade nos motivou a desenvolver um

trabalho interdisciplinar no intuito de investigar a atividade fotodinâmica do

AM/LED e efetuar aplicações em algumas áreas da saúde.

Buscando a meta acima, citam-se os objetivos específicos, como: investigar

algumas propriedades fotofísicas do azul de metileno em meios aquosos, visando

sua aplicabilidade. Desenvolver um sistema de iluminação (fonte de luz), para uso

nos estudos biológicos, afim de verificar a ação fotodinâmica do corante.

Investigar a ação fotodinâmica

in vivo

frente ao micro-crustáceo

Artemia salina

e em culturas de microrganismos:

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Candida albicans.

Avaliar o potencial da terapia fotodinâmica como tratamento alternativo

para a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)

in vivo

em hamsters

infectados com a espécie

Leishmania (Leishmania) amazonensis

e também

in vitro

da espécie

Leishmania (Viannia) braziliensis.

III. PARTE EXPERIMENTAL

III.1. Materiais e soluções

O corante fotossensível investigado como possível fármaco, azul de

metileno, fórmula molecular C

ClN

O e massa molar 373,90 g.mol

-1

, é

proveniente da Vetec. Os solventes e demais reagentes utilizados foram de alto

grau de pureza (qualidade PA). A água utilizada foi bidestilada.

Para os ensaios biológicos envolvendo microrganismos, trabalhou-se com as

cepas das bactérias

Staphylococcus aureus

(ATCC 26923),

Escherichia coli

(ATCC 26922) e

Candida albicans

(ATCC 90028). Ágar nutriente, caldo nutriente

(Difco), caldo Muller Hinton (CMH) e solução fisiológica (NaCl 0,9%, m/v)

peptonada (0,1%, m/v) foram os materiais utilizados para a preparação e

padronização das amostras biológicas. Os ovos de

Artemia salina

foram

adquiridos em loja de animais de estimação (lojas PetShop).

A esterilização dos meios de cultura e soluções utilizadas no cultivo e

manutenção das culturas de microrganismos, bem como todo o material

necessário para a realização dos experimentos, foi realizada em autoclave

horizontal. As soluções foram autoclavadas por 20 minutos a 120 ºC. O descarte

dos meios e do material contendo microrganismos foi sempre precedido por

esterilização utilizando-se a autoclave.

Os parasitos de

Leishmania

utilizados foram promastigotas de

Leishmania

(Viannia) braziliensis

cepa MHOM/BR/1987/M11272 e de

Leishmania

(Leishmania) amazonensis

cepa MHOM/BR/73/M2269.

Os meios de cultura utilizados nos ensaios com

Leishmania

foram: (i) Meio

199 completo (Gibco, Invitrogen Corporation) contendo: 10% de soro bovino

fetal, 1% de L-glutamina, 1% de urina humana estéril, antibióticos (penicilina G

100 UI/mL e estreptomicina 100 μg/mL) e pó para meio (10,7 g para 1000 mL);

(ii) Meio RPMI 1640 completo, contém: 10% de soro bovino fetal, 1% de L-

glutamina, antibióticos (penicilina G 100 UI/mL e estreptomicina 100 μg/mL) e pó

para meio (10,4 g para 1000 mL). Esses meios foram esterilizados por filtração

com filtro Milipore (0,22μm) e conservados em geladeira a 4ºC.

Nos ensaios com

Leishmania

as soluções de AM foram preparadas em meio

de cultura 199 e RPMI e filtradas em filtro Milipore, em câmara de fluxo

laminar, para não contaminar.

Reagente de Griess: 1% de sulfonilamida, 0,1% de dihidrocloreto de

naftilenodiamina (N-(1-naftil-etil) enodiamina), 2,5% de ácido ortofosfórico em

água milli Q.

III.2. Equipamentos

 Espectrofluorômetro - SPEX Fluorolog2, modelo 1680

 Microscópio óptico – Olympus

 Mesa agitadora – Tecnal, TE - 424

 Capela de fluxo laminar

 Estufa de incubação Bacteriológica – Fanem, modelo Orion 502

 BOD - Logen Scientific - Thermostatic Cabinets

 Estufa de CO

- Nuaire, modelo NU-5500G

 Espectrofotômetro UV-Vis da Varian, modelo Cary 50

 Auto clave

 Espectrofotômetro para tubos - Spectronic 20 Bausch, para leitura em

tubos de ensaio 13x100 mm

 Centrífuga

 Handheld Laser Power Meter - Edmund Optics Inc

 Medidor de espessura - Mitutoyo

III.3. Metodologias

III.3.1. Sistema de iluminação

O sistema de iluminação foi construído para os ensaios fotoquímicos

(verificação de reações de foto-branqueamento e a determinação do rendimento

quântico de oxigênio singlete por métodos químicos) e para os ensaios biológicos.

Cada conjunto de fonte é constituído por 6 dispositivos de LED (EverLight co) de

cor vermelha. O espectro de emissão foi obtido em um espectrofluorômetro

SPEX Fluorolog2 modelo 1680 e a potência individual de cada LED foi obtida

através de um Handheld Laser Power Meter, no comprimento de onda de máxima

emissão da mesma, 663 nm.

III.3.2. Reações de Foto-branqueamento (Foto-decomposição)

Para verificar a existência de reações de foto-branqueamento do azul de

metileno, os estudos foram realizados em meio aquoso e etanólico de soluções

aeradas e desaeradas. Iluminaram-se as soluções por um grande intervalo de

tempo (5 horas), utilizando-se a fonte de luz (LED), a temperatura ambiente.

Registraram-se espectros de absorção UV-Vis a cada 5 minutos de irradiação. A

reação de foto-branqueamento é comprovada por mudanças no espectro

decorrente de reações fotoquímicas.

As soluções desaeradas foram preparadas borbulhando-se gás N

(99,99%

de pureza) através da solução por cerca de 30 minutos, previamente a exposição

à luz. Adicionalmente, para garantir a ausência de oxigênio dissolvido, aplicou-se

adicionalmente o método de congelamento (nitrogênio líquido, -196 ºC) – vácuo

(bomba de vácuo por cerca de 5 minutos para retirada de gases acima do

congelado) – descongelamento (temperatura ambiente, com agitação), seguida de

novo ciclo, com 3 repetições sequenciais.

III.3.3. Teste do Ácido Úrico – Reações de captação de

oxigênio singlete

A fim de estimar a atividade fotodinâmica do azul de metileno pela sua

habilidade de formação de oxigênio singlete, realizou-se o teste do ácido úrico

(conhecido reativo para oxigênio singlete), com metodologia adaptada da

literatura (Fisher e col., 1998). Uma mistura de 3,0 mL de ácido úrico (10

-4

mol.L

) e do AM (10

-6

mol.L

-1

) em etanol (ou água), foi colocada em uma cubeta de

quartzo. A solução foi agitada e mantida à temperatura ambiente durante as

medidas. Iluminou-se a solução com a fonte de LED, registrando-se espectros de

absorção (250-800nm) a cada três minutos de irradiação durante 2 horas (36

J.cm

-2

) aproximadamente.

A equação utilizada para o cálculo do índice de atividade

fotodinâmica (AF) foi adaptada daquela utilizada para luz monocromática

(LASER) para luz policromática (LED), Equação 1, levando-se em conta o termo de

potência absorvida.

(Eq. 1)

Onde, ΔAU: variação da absorbância em 293 nm da solução após o tempo total de

irradiação; P

abs

: representa a intensidade de luz absorvida pelo corante em

relação a luz emitida pelo LED; e t: tempo de irradiação.

abs

P x t

AFQ =

10 x ΔAU

Considerou-se neste trabalho a potência absorvida (P

abs

), ou seja, a

quantidade de luz absorvida pelo corante pela excitação com aquele LED. Com

esta finalidade utilizou-se o espectro de transmitância do composto e o espectro

de emissão do LED, determinando-se a quantidade de fótons absorvida pelo

corante em escala de potência (watts). Detalhes dos cálculos são mostrados no

capítulo Resultados e Discussões.

III.3.4. Ensaio de toxicidade com

Artemia salina

(Meyer, 1982)

Os ovos de

Artemia salina

foram eclodidos em salina (NaCl 3,8 g.L

-1

), no

interior de um recipiente retangular, construído com uma divisão interna (com

orifícios) constituindo dois compartimentos. Os ovos foram adicionados no

compartimento menor, protegido da luz. O compartimento maior foi

externamente iluminado com lâmpada de 60 watts, de modo a atrair os

crustáceos recém eclodidos. Após 48 horas, em temperatura ambiente, foram

transferidos cerca de 20 crustáceos para cada tubo de ensaio, utilizando uma

pipeta Pasteur. Adicionou-se 1,5 mL de solução aquosa de azul de metileno no

tubo e o volume foi completado até 3 mL com salina. Na seqüência constituíram-

se dois grupos de amostras: as submetidas à iluminação com luz vermelha (1 hora,

LED) e as sem iluminação, incluindo-se os controles para evitar resultados falso-

positivos. Realizou-se a contagem dos animais vivos e mortos de cada tubo. Todos

os experimentos foram realizados em triplicata.

III.3.5. Ensaio

in vitro

em culturas de microrganismos

As bactérias

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

e o fungo

Candida

Albicans

foram mantidas no ágar nutriente (Caseína Tryptic e Dextrose

Sabouraud) e conservadas em um refrigerador a -4 ºC. Diante dos experimentos,

os microrganismos foram crescidos em caldo Muller Hinton (CMH) a 37ºC por

aproximadamente 15 horas, em estufa para cultura bacteriológica. A suspensão

de microrganismo foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos; o sobrenadante

foi descartado e o concentrado de inóculo foi ressuspenso e lavado com soro

fisiológico peptonado, repetindo-se o procedimento por mais duas vezes. O

inóculo foi ressuspendido com solução fisiológica e calibrado em

espectrofotômetro (para leitura em tubos) a 580 nm em transmitância de 25-

30%. Desta suspensão foram realizadas diluições (1:10 para

S.aureus

; 1:20 para

E.coli

; 1:5 para

C.albicans

) em solução fisiológica obtendo-se uma suspensão de

células calibradas na concentração média de (1-2) 10

UFC. mL

-1

(unidades

formadoras de colônia por volume).

Todas as experiências foram realizadas com dois grupos: um grupo exposto

à luz e outro mantido no escuro. Os grupos controle foram realizados como: um

misturando 400μL do inoculo e 100μL de salina estéril (controle positivo), e outro

100μL AM + 400μL de CMH, sem microrganismo (controle negativo). Os grupos

testes foram preparados adicionando 100μL do AM, em diferentes

concentrações, com 400μL do inoculo calibrado em 4 poços (15 mm diâmetro) de

placas de poliestireno estéril, obtendo concentrações finais de 7 a 140,8 μmol.L

-1

de AM.

A iluminação foi realizada diretamente sobre as placas com as amostras,

utilizando os LEDs como fonte, em mesa agitadora a 80 rpm e 25 ºC, durante 30

minutos. Após o tempo de iluminação, transferiu-se o conteúdo das placas para

tubos de ensaio, completou-se o volume até 4,0 mL com CMH. As amostras foram

incubadas em estufa a 37 ºC. A taxa de crescimento foi quantificada por

espectrofotômetro e a porcentagem de transmitância (%T) em 580 nm foi

medido em 0, 2, 4 e 6 horas até que o crescimento do grupo controle não variasse

mais. Os resultados foram expressos em %T dada pela turbidez do crescimento

das células.

Para calcular a taxa de morte e o valor-D (definido como o tempo em

minutos necessário para reduzir 1 ciclo logaritímico), utilizou-se a concentração

de 35,2 mol L

-1

abaixo da DB

, e o tempo de iluminação foi variado em 10, 20 e

30 minutos. Imediatamente depois da exposição, as células foram colhidas e

lavadas em água salina e diluídas 10, 100 e 1000 vezes, e 100 L foi colocado em

placas (Petri) de cultura com agar Caseína Tryptic, incubada por 24 horas a 37ºC

e o número de UFC contados. Todos os experimentos foram realizados em

triplicata.

III.3.6. Ensaio

in vitro

com a espécie

Leishmania (Viannia)

braziliensis

III.3.6.1 Sobre a forma promastigota

Formas promastigotas de

Leishmania (Viannia) braziliensis

foram isoladas a

partir de hamsters experimentalmente infectados, em meio de cultura 199 a

26ºC.

Tubos contendo 2x10

promastigotas em 1,0 mL de meio 199 completo

contendo diferentes concentrações de azul de metileno foram irradiados ou não,

com LED por 30 minutos (9 J.cm

-2

). Posteriormente as culturas foram mantidas a

26ºC. Tubos contendo apenas parasito em meio de cultura, tratados ou não com

luz, também foram acompanhados como controles.

A avaliação do crescimento dos parasitos foi feita a cada 2 dias durante

10 dias, por contagem em câmara de Neubauer em microscopio. Experimentos

foram realizados em triplicata.

III.3.6.2 Sobre formas amastigotas

Camundongos BALB/c foram inoculados intraperitonealmente com 1 mL

de caldo tioglicolato. Após quatro dias os animais foram anestesiados com uma

combinação de xilazina (10 mg/kg – Rompum

) e cloridrato de quetamina (50

mg/kg – Ketamina

), via intraperitoneal, sacrificados por aprofundamento da

anestesia e desinfectados com álcool. A cavidade peritoneal foi lavada com 8,0

mL de tampão fosfato salino (PBS) estéril gelado para obtenção dos macrófagos

elicitados. A suspensão celular obtida foi centrifugada por 8 minutos a 1200 rpm

e o sedimento ressuspenso em meio de cultura RPMI. A quantidade de

macrófagos foi estimada pela determinação do número total e diferencial de

células presentes no lavado peritoneal, onde à um volume de 90 μL do lavado

foram adicionados 10 μL de cristal violeta (0,5% em ácido acético 30%, v/v )

(Vieira e col, 1994).

Lamínulas de vidro estéreis de 13 mm de diâmetro foram colocadas em

poços de placas de cultura de células de 24 poços. A cada um destes poços foram

acrescentadas suspensões de células peritoneais ajustadas para conter 5x10

macrófagos em 150 μL de meio de cultura RPMI.

As placas foram incubadas durante 1 hora a 25 ºC, para que os macrófagos

pudessem aderir à lamínula. Em seguida, as células não aderentes foram

removidas por lavagem (3 vezes com PBS estéril e 2 vezes com meio de cultura

RPMI).

Os macrófagos foram infectados com formas promastigotas de

Leishmania (Viannia) braziliensis

, que foram adicionadas às culturas na proporção

de 10 parasitos para cada macrófago e mantidos durante 4 horas a 37 ºC em

estufa contendo 5% de CO

. Na seqüência as lamínulas foram lavadas com RPMI

para a remoção dos parasitos não aderidos.

A cada cavidade foram adicionados 300 μL de meio RPMI com diferentes

concentrações de AM e foram tratados ou não com LED por 30 minutos. Foram

realizados controles de toxicidade da LED e do AM sobre os macrófagos. As

placas foram incubadas durante 24 e 48 horas a 37 ºC em atmosfera contendo

5% de CO

. Após, foi retirado 200 μL do sobrenadante, para determinação de

óxido nítrico (NO) e as lamínulas foram retiradas, lavadas em PBS e coradas

utilizando-se os reagentes HEMA 3

. Depois de secas, as lamínulas de vidro

foram montadas sobre lâminas de vidro (24x76mm) utilizando-se para isso o

Entellan

Os experimentos foram realizados em quadruplicata. Para a determinação

do Índice Fagocítico (IF), ou seja, a infectividade dos macrófagos, as lamínulas

coradas foram observadas ao microscópio óptico comum sob aumento de 1000

vezes. Foram examinadas 200 células em cada lamínula, contando-se o número de

macrófagos infectados para obtenção da percentagem de macrófagos infectados.

Adicionalmente foi determinado o número médio de parasitos nos macrófagos

infectados. O cálculo do Índice Fagocítico em cada lamínula foi realizado pela

equação abaixo:

IF = Percentagem de macrófagos

infectados

x número médio de parasitos por

macrófago infectado

III.3.6.3 Determinação do óxido nítrico

A produção de óxido nítrico pelos macrófagos infectados

Leishmania

(Viannia) braziliensis

, tratados ou não com AM e luz foi avaliada através da

determinação da concentração de nitritos presentes nos sobrenadantes das

culturas, conforme ensaio descrito por Ding e col, (1988). Para isso, 50 μL do

sobrenadante das culturas foram incubados com igual volume do reagente de

Griess, durante 10 minutos à temperatura ambiente.

A absorbância foi determinada em espectrofotômetro com filtro em 550

nm, contra branco constituído por meio de cultura e reagente de Griess. Os

resultados foram expressos em μmol.L

-1

de NO

, com base numa curva padrão

com concentrações conhecidas de nitrito de sódio (NaNO

) dissolvido em meio de

cultura. Experimento realizado em quadruplicata.

III.3.7. Ensaio

in vivo

em hamsters infectados com

Leishmania

(Leishmania) amazonensis

Primeiramente os hamsters foram experimentalmente infectados com

5x10

formas promastigotas de

Leishmania (Leishmania) amazonensis

em 100 μL

de solução salina fisiológica (NaCl 0,9% m/v) na pata posterior direita. Na pata

posterior esquerda foram inoculados 100 μL do diluente, a qual foi utilizada como

controle

Trabalhou-se com 38 animais.

A evolução da infecção foi avaliada semanalmente mediante a

determinação da espessura da pata infectada e da não infectada, utilizando-se

um medidor de espessura. Os 38 hamsters infectados foram divididos em 3

grupos: 2 grupos de 15 animais (grupos A e B) e 1 grupo de 8 animais (grupo

controle).

Após o desenvolvimento da lesão (aproximadamente 90 dias após a

infecção), os animais dos grupos A e B foram tratados com a terapia

fotodinâmica utilizando o corante azul de metileno (AM) e LED como fonte de

luz. Para receber o tratamento os animais eram sedados com uma combinação de

xilazina (10 mg/kg – Rompum

) e quetamina (50 mg/kg – Ketamina

). Para os

animais do grupo A foi usado AM (0,5%, m/v) em loção (cera autoemulsionável,

óleo mineral, tensoativo, preparada pelo Departamento de Farmácia e

Farmacologia - UEM, prof. Selma Lucy Franco) e para os do grupo B utilizou-se

AM (0,5%, m/v) em água. O tratamento foi aplicado 3 vezes por semana e o

tempo de exposição à luz foi de 1 hora (18 J.cm

-2

) com duração de 12 semanas (3

meses), figura 6. O grupo controle não recebeu tratamento com a terapia

fotodinâmica, apenas aplicou-se o azul de metileno, nas duas formulações.

A avaliação do tamanho da lesão foi feita semanalmente, onde a pata

infectada e a não infectada eram medidas com um medidor de espessura;

também foram realizados registros fotográficos das mesmas. A espessura da

lesão foi determinada pela diferença da pata infectada e não infectada de cada

animal.

Figura 6: Hamsters anestesiados recebendo tratamento com AM/LED

III.3.7.1 Quantificação de

Leishmania

no baço e no linfonodo

A quantificação de

Leishmania

no baço e no linfonodo dos hamsters

infectados com

Leishmania (Leishmania) amazonensis

(utilizados no estudo

anterior) foi realizada segundo a metodologia descrita por Buffet e col (1995),

com algumas modificações.

Após o término do tratamento com a TFD, os animais foram sacrificados

por aprofundamento da anestesia e desinfectados em álcool. Em seguida de cada

um dos animais foi assepticamente retirado o linfonodo poplíteo regional à lesão

e o baço, seguidos de pesagem. Cada órgão foi colocado em meio de cultura 199 e

macerado em placa de Petri estéril com um embolo de seringa; a seguir esta

amostra foi passada por seringa/agulha de insulina por diversas vezes

(aproximadamente 30 vezes) para rompimento total das células. As suspensões

foram seriadamente diluídas, a partir de ¼, na razão 4, em placas de cultura de

células de 96 poços. Para isso, foram distribuídos 225 μL de meio de cultura 199

em todos os poços e 300 μL da suspensão obtida inicialmente no primeiro poço,

realizando-se a seguir as diluições. Experimento realizado em duplicata. As

placas foram vedadas com papel Parafilm

e incubadas a 26 ºC durante trinta

(30) dias, quando foram observadas no microscópio de luz invertida. Cada poço

foi examinado microscopicamente à procura de formas promastigotas e foi

considerado positivo quando pelo menos um parasito foi encontrado. As placas

foram mantidas por mais quinze (15) dias em cultivo, quando foram novamente

examinadas. Para a obtenção da carga parasitária em cada órgão foi realizado o

seguinte cálculo:

Carga parasitária: Média geométrica da recíproca dos títulos positivos x 16,7

Massa do órgão (g)

Nesta fórmula, 16,7 representa a fração da suspensão de cada órgão

inoculada no primeiro poço da placa de cultura.

III.3.8. Aspectos éticos

Este estudo foi submetido ao Comitê de Conduta Ética no uso de Animais

em Experimentação (CEAE) da Universidade Estadual de Maringá para a sua

realização e aprovado pelo parecer 028/2006 de 11/07/2006.

III.3.9. Análise estatística

Em todos os ensaios biológicos, realizou-se o teste de normalidade (Shapiro

Wilk’S). Sendo normal os valores aplicou-se o teste T de Student. Utilizando o

programa StatSoft®. Foi considerado significativo quando os resultados

apresentavam P < 0,05, ou seja, quando P é acima de 0,05 as diferenças nos

valores são consideradas irrelevantes e assim os resultados são tomados como

estatisticamente iguais.

Os ensaios com microrganismos foram realizados no

Departamento de Farmácia e Farmacologia (DFF/UEM), orientados pela profª

Drª Elza Kimura. Os experimentos com

Leishmania

foram realizados no

Laboratório de Parasitologia Clínica, do Departamento de Análises Clínica

(DAC/UEM) orientados pela profª Drª Thais Gomes Versignassi Silveira.

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO

IV.1. Espectro do azul de metileno

O azul de metileno apresenta alta absorção de luz na região do vermelho,

figura 7, característica necessária a compostos eficientes na terapia

fotodinâmica devido a maior penetração dessa radiação através de tecidos

biológicos (janela fototerapêutica).

500 600 700

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Absorbância

Comprimento de Onda (nm)

Figura 7: Espectro de absorção do azul de metileno (5x10

-6

mol L

-1

) em água

O espectro obtido (figura 7) é igual ao de AM em soluções de solventes

orgânicos mostrando que nesta situação o composto está presente no estado

monomérico. É conhecido que em concentrações altas de AM em água formam-se

auto-agregados do corante, com a formação de bandas adicionais na região de

600 nm (dímeros) e 550 nm (agregados maiores) (Baptista 2005). O estado

monomérico do corante é a forma desejável do fotossensitizador uma vez que

este no estado agregado pode ter sua energia de excitação mais facilmente

suprimida por auto-supressão levando a decaimento não radiativo (CI) para o

estado fundamental; dessa forma diminui-se as possibilidades de conversão

inter-sistema (CIS) ao estado triplete e, conseqüente, reduz o rendimento

quântico de oxigênio singlete (a espécie ativa para a TFD tipo 2).

IV.2. Sistema de iluminação (LED)

Para a realização dos experimentos envolvendo luz investigou-se

dispositivos de LED de cor vermelha (como previamente mencionada em função

da maior penetração da luz em tecidos biológicos). Como conseqüência,

encontrou-se um LED cujo espectro de emissão está apresentado na figura 8.

600 620 640 660 680 700

1x10

2x10

3x10

4x10

5x10

Intensidade de emissão (U.A.)

Comprimento de onda (nm)

Figura 8: Espectro de emissão da fonte de iluminação (LED)

Dos espectros verifica-se que a janela de emissão da fonte (entre 640 a

680 nm) coincide com a região mais intensa de absorção de luz do azul de

metileno (figura 7: absorção e figura 8: emissão). Observa-se que o máximo de

emissão ocorre em 663 nm, mesma região de máximo de absorção do corante no

estado monomérico. O tratamento clássico em TFD utiliza fontes de LASER, luz

monocromática de alta intensidade; no entanto, além de caros, estes

equipamentos possuem luz muito focalizada o que dificulta seu uso clínico em

lesões de diâmetros maiores. O baixo custo de um sistema a base de LED,

aproximadamente R$ 1,00 / unidade de LED, permite efetuar vários

experimentos simultâneos; no caso presente o conjunto é constituído de seis (6)

unidades LED, ou seja, no caso 6 ensaios por sistema - fonte. O conjunto com as

seis (6) unidades de LEDs está apresentado na figura 9. A irradiância de cada

unidade LED é de 5 mwatts.cm

-2

Figura 9: Fonte de luz constituído de 6 unidades de LED

IV.3. Estudo de Foto-decomposição (Foto-branqueamento)

No escuro, as soluções aquosas de azul de metileno mantém-se inalteradas,

fato constatado pela espectrofotometria de absorção; entretanto ao serem

irradiadas com a luz de LED verifica-se perda da coloração devido ao processo de

fotodegradação do corante. Na figura 10 estão apresentados os espectros de

absorção em soluções com aeração normal.

400 500 600 700 800

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Absorbância

Comprimento de onda (nm)

400 500 600 700 800

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Absorbância

Comprimento de onda (nm)

Figura 10: Sobreposição de espectros do azul de metileno (5x10

-6

mol L

-1

) em água (A) e

etanol (B) em situações de aeração normal, obtidos em intervalos de 5 min em amostra

iluminada. As setas indicam a diminuição das bandas com a exposição à luz.

Apesar da existência de reações de branqueamento, observou-se que em

alguns casos a mesma não é intensa. Estes resultados de fotobranqueamento

podem ser mais facilmente visualizados através das curvas de intensidade de

absorção em função do tempo de iluminação, onde inclui-se o estudo em meio

desaerado (sem oxigênio), ilustrados na figura 11. Tratamentos matemáticos dos

dados segundo leis cinéticas de ordem de reação tradicionais não levaram a

ajustes aos pontos experimentais. Tentativas de análise quantitativa através de

tempos de meia-vida foram realizadas uma vez que estes independem da ordem

da reação; entretanto não levaram a resultados coerentes devido a variações de

velocidade e magnitudes de fotodegradação.

Em soluções com aeração normal, tomando a absorbância inicial como

referência, calcula-se que em solução aquosa cerca de 14,2% da intensidade de

absorção decai em 60 minutos; nas mesmas condições em etanol o decréscimo é

de apenas 8,6% em 60 minutos. Adicionalmente nestas condições de aeração

normal, a fotodegradação em meio etanólico aparentemente é limitada,

restringindo-se à 80 minutos de iluminação, com decréscimo de intensidade de

apenas ~13%, enquanto que em água, esse efeito ocorre até aproximadamente 3

horas, com decréscimo de 40%. As velocidades de fotodegradação, visualizadas

pela inclinação da curva de intensidade contra tempo (figura 11), apontam que em

meio aquoso a reação é ligeiramente mais rápida, principalmente nas fases iniciais

da reação. Desse modo verifica-se que em meios com aeração normal o

fotobranqueamento do AM/água é mais intenso e um pouco mais rápido que o do

AM/etanol.

0 50 100 150 200 250 300

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

Absorbância (663 nm)

Tempo (minutos)

etanol aerado

água aerada

etanol desaerado

água desaerada

Figura 11: Variação da absorção do azul de metileno (5x10

-6

mol L

-1

) em função do

tempo de exposição ao LED.

Quanto à questão do nível de oxigênio presente nos meios, observa-se

maior foto-estabilidade do AM em soluções aeradas nos dois solventes

estudados. Na literatura cita-se que o mecanismo de fotobranqueamento do AM

em meios aerados ocorre predominantemente via oxigênio singlete (Zhang e

Tang, 2004), no entanto, o AM no estado triplete também pode ter sua energia

suprimida por colisões com o O

normal presente no meio (neste caso sem levar

necessariamente a

) (Valeur, 2001), mecanismo que diminui o

fotobranqueamento. A reatividade do oxigênio é dependente da difusão, ou seja,

a viscosidade do solvente (água 0,8; etanol 1,04 à 25ºC) é importante, e essa

supressão de energia do fotossensitizador pode ocorrer por estes dois caminhos

(Arik e col., 2005): (i) por processo não radiativo ou; (ii) pela geração de oxigênio

singlete. Dessa forma a fotodegradação do AM em condições aeradas deve

ocorrer via oxigênio singlete, porém ao mesmo tempo, as intensidades de

fotobranqueamento menores na presença de oxigênio (estado fundamental,

triplete) podem ser justificadas pela supressão de energia realizada pelo próprio

oxigênio – choques colisionais (decaimento não radiativo). Adicionalmente, além

de na presença de oxigênio o fotobranqueamento ser mais lento, a intensidade

deste processo foi menor, principalmente em meio etanólico. As reações em

meios de aeração normal foram mais favoráveis em meio aquoso, neste o

complexo ativado que leva aos produtos deve ser melhor estabilizado, além do

que a viscosidade da água é menor, logo facilita a permeabilidade do oxigênio no

meio, consequentemente a reação é mais rápida.

Já no experimento de fotobranqueamento sem a presença do oxigênio, o

estado excitado do corante não é desativado eficientemente, acarretando em

reações fotoquímicas. No caso outros foto-processos podem ocorrer, por

exemplo fotopolimerização, formando compostos oligoméricos que não absorvem

na região do vermelho.

IV.4. Formação de oxigênio singlete

O ácido úrico (AU), um eficiente captador de oxigênio singlete, apresenta

uma banda com máximo de absorção em 293 nm e não absorve na região do

visível. Este tem sido usado como um reagente para a determinação quantitativa

da ação fotodinâmica de compostos fotossensitizadores em TFD por via química,

nos casos em que a produção de oxigênio singlete está associada ao processo

(Fisher e col., 1998). A reação de foto-oxidação do ácido úrico via

pode levar

à formação de produtos como a triuréia, a alantoxaidina, o íon oxanato e CO

(Canellakis e Cohen, 1955). O ácido úrico é seletivo e reage com oxigênio singlete

e radicais hidroxilas; não reage com peróxido ou ânion superóxido.

Para o cálculo da atividade fotodinâmica química, usou-se como referência

a metodologia de Maestrin (2004) com algumas modicações, uma vez que neste

trabalho utilizou-se como fonte de luz LEDs, luz policromática, devendo ser

considerados os fótons absorvidos pelo corante em todos os comprimentos de

onda. Assim estabeleceu-se um parâmetro diretamente relacionado à quantidade

de fótons absorvidos pelos FS, através da relação entre luz emitida (LED) e

absorvida (FS), denominado de “potência absorvida” (P

abs

). Essa relação é obtida

a partir da combinação do espectro de transmitância do corante (que fornece a

luz não absorvida pelo cromóforo em termos percentuais) e o espectro de

emissão do LED (em termos de área que corresponde a potência total de luz

emitida pela fonte), através dos quais calcula-se a intensidade de luz realmente

absorvida pelo corante com este LED. Na figura 12 apresentam-se as

intensidades de luz absorvidas pelo azul de metileno para os diferentes sistemas

na forma gráfica. A área de cada sistema é proporcional à quantidade de fótons

absorvidos pelo FS, permitindo efetuar comparações de forma quantitativa com

outros pares FS/LED.

600 620 640 660 680 700

100

150

200

250

300

Potência absorvida (mW)

Comprimento de onda (nm)

AM água

AM etanol

Figura 12: Potência luminosa absorvida por unidade de comprimento de onda do azul de

metileno 5x10

-6

mol L

-1

calculado para o LED utilizado.

A área calculada do espectro de emissão do LED (figura 8) esta

relacionada a potência total medida (5 mwatts, PowerMeter) enquanto a área do

gráfico de potência absorvida (figura 12) é correlacionada a luz realmente

absorvida (P

abs

). Para etanol e água, solventes utilizados nas medidas de

atividade, o P

abs

foi de 2,53 e 2,36 mwatts, respectivamente. Dessa forma a AFQ

foi calculada através da equação 1.

A amostra de azul de metileno irradiada na presença de ácido úrico com a

fonte vermelha de LED, teve seus espectros de absorção obtidos a tempos de

iluminação determinados (figura 13).

300 400 500 600 700 800

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Absorbância

Comprimento de onda (nm)

Figura 13: Variação espectral da solução de azul de metileno 1x10

-6

mol.L

-1

na presença

de AU (10

-4

mol.L

-1

) em etanol, com a irradiação de luz de LED (espectros a cada 3 min).

A seta indica a diminuição da banda do ácido úrico

Observa-se na figura 13 o decaimento da banda característica do ácido

úrico, em 293 nm, indicando que ocorre a reação de decomposição deste ácido

pelo

(formado pelo azul de metileno excitado). A queda inicial é mais forte

devido à presença de maiores quantidades de oxigênio molecular solubilizado no

meio que, por conseguinte, leva a grandes quantidades de oxigênio singlete nesta

etapa.

Na tabela 2 apresentam-se os resultados de AF do AM em água e etanol e

os dados necessários aos cálculos. Para comparação acrescentou-se os valores de

rendimento quântico de oxigênio singlete obtidos da literatura (Zhang e Tang,

2004).

Tabela 2: Valores de AF para o azul de metileno, determinados pela equação 1,

teste do ácido úrico (9 J.cm

-2

)

ΔA

t (min) P

abs

(mw) AF φ

Água 0,694 30 2,36 16,3 0,52

Etanol 0,194 30 2,53 4,3 0,52

A

: variação da absorbância em 293 nm da solução após o tempo total de irradiação; t

: tempo de irradiação; P

abs

: valor de potência luminosa absorvida pelo FS.

Conforme verificado na tabela 2, a AFQ resultante em água ou etanol

tiveram valores iguais e estão coerentes com os valores (também iguais) de

rendimentos de oxigênio singlete nesses meios.

Adicionalmente, o resultado da figura 13 (etanol) sugere que no tópico

anterior de fotodegradação do AM (realizado na ausência de AU), o processo em

meios aerados deve realmente ser causado por oxidação via oxigênio singlete

(mecanismo principal). Esta afirmação deve-se ao fato do oxigênio singlete, que

reage com o AU, apresentar na figura 13 o AM foto-estável (pico inalterado),

enquanto que na ausência de AU ocorre a fotodecomposição do AM. Em água e

aeração normal, onde a fotodegradação é mais acentuada que em etanol, a

presença de ácido úrico também inibe a decomposição do AM, confirmando os

resultados em etanol.

IV.5. Ensaio fotodinâmico com

Artemia salina

Neste trabalho a adaptação realizada de ensaio com

Artemia Salina

(Meyer, 1982) para investigar a ação fotodinâmica do AM mostrou-se boa. O

teste padrão, empregado na determinação da qualidade de águas e na avaliação

de atividade tóxica de substâncias, consiste na contagem dos microcrustáceos

vivos em tubo após 24 horas de contato com o meio. No caso com AM no escuro -

controle, verificou-se a morte total dos animais nesse tempo, assim restringiu-se

o contato do AM com os microcrustáceos a duas horas, sendo 1 hora (18 J.cm

-2

)

de irradiação (LED) e a contagem após mais 1 hora. Na figura 14 apresentam-se

os resultados obtidos.

0 100 200 300 400 500 600 700

% de morte da Artemia salina

AM (µmol.L

-1

)

sem luz

com luz

Figura 14: Morte percentual de

Artemia salina

em diferentes concentrações de azul de

metileno em água

* significante em relação ao AM sem iluminação (P < 0,05) - teste T de Student

Conforme mencionado anteriormente, na figura 14, mostra-se que o azul de

metileno por si só tem ação tóxica para a

Artemia salina

(no escuro), entretanto,

a percentagem de morte foi potencializada pela iluminação demonstrando a ação

fotodinâmica. Para as amostras com concentração de 13.35 μmol.L

-1

com o AM a

percentagem de morte foi de 27,3% e com o LED aumentou para 61%. Contudo

em altas concentrações (668.5 μmol.L

-1

) este efeito foi bem menor, com AM

apenas foi de 68,5% a percentagem e morte e com LED 79,3%.

IV.6 Ação fotodinâmica

in vitro

sobre culturas de microrganismos

Os resultados obtidos com os microrganismos

Staphylococcus aureus

(Gram +)

Escherichia coli

(Gram -)

Candida albicans

(Fungo), em diversas

concentrações do azul de metileno, encontram-se na figura 15.

01234

100

†

S. aureus

controle

7 μmol.L

-1

14.1 μmol.L

-1

28.2 μmol.L

-1

42.2 μmol.L

-1

56.4 μmol.L

-1

70.4 μmol.L

-1

% Transmitância (580 nm)

Tempo (horas)

01234

100

†

controle

7 μmol.L

-1

14.1 μmol.L

-1

28.2 μmol.L

-1

42.2 μmol.L

-1

56.4 μmol.L

-1

70.4 μmol.L

-1

% Transmitância (580nm)

Tempo (horas)

S. aureus

0123456

100

†

% Transmitância (580nm)

Tempo (horas)

controle

35.2 μmol.L

-1

70.4 μmol.L

-1

105.6 μmol.L

-1

140.8 μmol.L

-1

E. coli

0123456

100

†

††

% Transmitância (580nm)

Tempo (horas)

controle

35.2 μmol.L

-1

70.4 μmol.L

-1

105.6 μmol.L

-1

140.8 μmol.L

-1

E. coli

02468

100

% Transmitância (580nm)

Tempo (horas)

controle

17.6 μmol.L

-1

35.2 μmol.L

-1

52.3 μmol.L

-1

70.4 μmol.L

-1

105.6 μmol.L

-1

C. albicans

0246

100

†

% Transmitância (580nm)

Tempo (horas)

controle

17.6 μmol.L

-1

35.2 μmol.L

-1

52.3 μmol.L

-1

70.4 μmol.L

-1

105.6 μmol.L

-1

C. albicans

Figura 15: Curva de inibição de crescimento em culturas de microrganismos em diversas

concentrações de AM. A, C e E não receberam luz; B, D e F receberam luz por 30

minutos. Cada ponto representa a média ± desvio das medidas em triplicata.

(*) Significante p < 0,05 em relação ao controle

(†) Significante p < 0,05 em relação ao controle em todas as concentrações

No caso da figura 15, à medida que a porcentagem de transmitância

diminui, implica em aumento de taxa de reprodução do microrganismo (ocorre

aumento de espalhamento de luz pela formação de colônias); ou seja, quando a

transmitância aumenta, a taxa de inibição do crescimento aumenta.

Para todos os microrganismos não foi observado inibição de crescimento

com a exposição a luz LED sozinha. No entanto a presença de AM, mesmo

sozinho, inibiu o crescimento das células, sendo este proporcional às

concentrações utilizadas de corante; quanto maior a concentração do AM, maior

o grau de inibição. Inclusive a concentração necessária para inibição de 50 % dos

microrganismos (DB

), obtidos da figura 15 e da tabela 3, foi de 43.35 ±

6.75μmol.L

-1

para

S. aureus

, 56.40 ± 11.48μmol.L

-1

para

E. coli

e 63.20 ± 11.30

μmol.L

-1

para

C. albicans

. Assim a DB

seguiu aumento na seguinte ordem:

aureus

E. coli

C. albicans,

confirmando, de certa forma, a ordem de

suscetibilidade dos três diferentes tipos de células, baseado nas diferenças

estruturais da parede celular: as bactérias gram (+), caso da S. aureus, tem

somente material capsular e a camada peptidioglicanos (parede celular)

externamente à membrana citoplasmática (ver figura 5), permitindo o AM de

cruzá-lo fàcilmente (Zeina e col., 2001). Já as bactérias gram (-), tal como a

coli

, apesar de apresentarem uma barreira extra (de lipopolissacarídeos –

membrana externa, figura 5) comparada as gram (+), o AM também não

apresenta dificuldades de interação devido a sua carga positiva, AM

, de

interagir com as cargas negativas desta membrana lipopolissacarídica (Livermore,

1990). Por último, a penetração solitária de AM em células de

C. albicans

(fungo)

parece ser mais difícil, pois estudos realizados com porfirinas catiônicas

mostraram que estes podem chegar ao citoplasma somente após danos das

membranas que as revestem (no caso induzidos por luz, Lambrechts e col., 2005).

Essa ação bacteriostática e fungiostática do AM (na ausência de luz) é conhecida

(Wainwright e col., 2002; Calzavara-Pinto e col., 2005).

Tabela 3: Porcentagem de inibição do crescimento de microrganismos

Microrganismo

(% inibição)

S.aureus

[AM](μmol.L

-1

)

14,1 28,2 42,2 56,4 70,4

Escuro 7,6 16,5 26,5 41,5 71,2

LED 83,5

90,8 89,1 92,2 100

E.coli

[AM](μmol.L

-1

)

- 35,2 70,4 105,6 140,8

Escuro - 14,8 39,4 56,6 93,1

LED - 94,1 95,6 100 100

C.albicans

[AM](μmol.L

-1

)

17,

35,2 52,3 70,4 105,6

Escuro 7,6 24,3 36,2 46,5 57,8

LED 78,9

90,2 90,3 95,2 100

Os microrganismos foram irradiados com LED por 30 minutos. A porcentagem de

inibição de crescimento foi calculada pela diferença da %T do grupo controle

(sem AM) e a %T das diferentes concentrações de AM depois de 4-6 horas de

incubação.

De modo geral, o tratamento AM/LED apresenta eficiências bastante

altas, mas similares nos três microrganismos, não exibindo diferenças em sua

habilidade de inibir bactérias (gram (+ e -)) e fungo. Observe-se que, apesar da

menor interação do AM sozinho com

C. albicans

, a luz em conjunto com o AM

deve ter induzido danos às membranas externas deste fungo, colaborando com a

proposição de Lambrechts e col., 2005.

Adicionalmente foi avaliado o tempo de exposição à luz (dose de energia),

submetendo-se as amostras de culturas a tempos de 10, 20 e 30 minutos (2, 4, 6

J.cm

-2

) de iluminação, calculando a constante de morte (k) e o valor-D. Neste

ensaio verifica-se o efeito bactericida e fungicida, ou seja, a morte dos

microrganismos. Este resultado é apresentado na figura 16.

C.albicans

0.9287

0.1891

12.18

S.aureus

0.9800

0.1911

12.05

E.coli

0.9872

0.2001

11.51

k (h

-1

)

valor-D (minutos)

Log

UFC/ml

Figura 16: Decréscimo do número de colônias em função das condições aplicadas. Os

grupos C1 e C2, controles, são culturas do microrganismo com e sem exposição ao LED

por 30 minutos, respectivamente (sem AM). Nas amostras onde constam tempos (de

iluminação) correspondem a culturas com AM (35,2 μmol.L

-1

) submetidas à luz. As taxas

de morte (k) são derivadas da curva, considerando do tempo 0 a 30 minutos de exposição

e o valor-D é calculado pela redução de 1 ciclo-logarítimico da mesma curva. Cada ponto

representa a média das medidas em triplicata.

A figura 16 mostra que os efeitos na morte dos microrganismos seguiram

tendência similar a dos efeitos de inibição no crescimento: pela comparação

entre C1 e C2, tem-se que a luz LED sozinha não afeta a morte dos

microrganismos; o AM sozinho provoca mortandade (t= 0 min); a exposição do AM

à luz provoca aumento da mortandade sendo esta proporcional ao tempo de

irradiação; para todos os microrganismos a concentração utilizada 35,2 μmol.L

-1

não foi suficiente para provocar a morte total dentro do tempo máximo utilizado

(30 minutos), apesar da mortandade bastante elevada e a resposta AM/LED,

representada pela constante de morte e pelo valor-D, é similar para todos os

microrganismos.

A investigação do tempo da exposição ao LED indica que o balanço entre a

concentração do AM e o tempo da iluminação pode controlar a eficiência da TFD.

Para tecidos onde a acumulação do azul de metileno é pobre, o tempo de

irradiação deve ser prolongado para permitir eficiência terapêutica similar.

Os resultados com LED em

S. aureus, E. coli

C. albicans

foram tão

eficazes quanto os usando LASER (Usacheva e col., 2001; Wilson e Mia 1993) ou

a Exal light box (Wainwright e col., 1997). Concentrações de AM de 42μmol.L

-1

irradiadas com LASER de diodo (665nm) com potência de 15 J.cm

-2

(Usacheva e

col., 2001) e AM 0,90μmol.L

-1

exposto a Exal light box com potência de 6,3 J.cm

levaram a morte de

S. aureus

(Wainwright e col., 1997), entretanto neste

experimento, AM nas concentrações de 7 e 14μmol.L

-1

exposto ao LED (potencia

de 6 J.cm

-2

) por 30 minutos obteve 79 e 84% de inibição, respectivamente, para

S. aureus.

Para

E. coli

, AM a 180 μmol.L

-1

exposto ao LASER de diodo (665nm)

com potencia de 40 J.cm

-2

(Usacheva e col., 2001) e AM a 90 μmol.L

-1

exposto a

Exal light box, (6,3 J.cm

-2

) (Wainwright e col., 1997), levaram a morte total das

células. No estudo presente, 35,2μmol.L

-1

de AM exposto ao LED com intensidade

de 2 e 4 J.cm

-2

levaram a 88,8 e 93,7% de inibição respectivamente, e AM a

70,4μmol.L

-1

com 6 J cm

-2

induziu 96% de inibição.

Experimentos com

C. albicans

a 130 μmol.L

-1

de AM com: (i) LASER light (685 nm) e 28 J.cm

-2

induziu 88,6% de

inibição (Souza e col., 2006) e (ii) LASER light (660 nm) e 2,04 J.cm

-2

induziu 42

% de inibição (Wilson e Mia 1993). Neste estudo, o LED (6 J.cm

-2

) com 70,4

μmol.L

-1

AM induziu 95,14% de inibição.

IV.7 Ensaio

in vitro

sobre

Leishmania (Viannia) braziliensis

IV.7.1 Sobre a forma promastigota

O efeito da terapia fotodinâmica sobre o crescimento das formas

promastigotas (culturas), contendo ou não azul de metileno, tratadas ou não com

luz, foi acompanhado durante 10 dias (figura 17).

0246810

100

120

140

160

Concentração de parasitos (10

)

Tempo (dias)

controle

controle + luz

0,51 μmol.L

-1

0,51 μmol.L

-1

+ luz

0,25 μmol.L

-1

0,25μmol.L

-1

+ luz

0,12μmol.L

-1

0,12μmol.L

-1

+ luz

0,06μmol.L

-1

0,06μmol.L

-1

+ luz

♦

Figura 17: Curva de crescimento de promastigotas de

Leishmania (Viannia) braziliensis

em meio 199, a 26

C, tratadas ou não com azul de metileno, com ou sem luz

(*) Não significante p > 0,05 em relação ao controle

(♦) Significante p < 0,05 em relação ao controle e as amostra não iluminadas em todas as

concentrações

Pela análise estatística (teste T de Student) a luz não influenciou de

forma significativa no crescimento do parasito, pois não existe diferença em

nenhum dos dias de crescimento analisados (P > 0,05). Todas as concentrações de

azul de metileno, sem luz, influenciaram o crescimento em todos os dias

analisados (P < 0,05), exceto no segundo dia nas concentrações mais baixas (0,12

e 0,06μmol.L

-1

) e, de modo geral, este efeito é dependente da concentração.

Comparando as amostras tratadas com AM que foram iluminadas com as não

iluminadas, em todas as concentrações e em todos os dias, os crescimentos

foram significativamente inferiores nas iluminadas (P < 0,05). A redução do

crescimento do parasito ocorre mesmo nas menores concentrações de AM

utilizadas (0,06μmol.L

-1

IV.7.2 Sobre formas amastigotas

O efeito do tratamento com AM e luz sobre a infectividade de formas

promastigotas para macrófagos peritoneais foi avaliado em 24 e 48 horas, efeito

este calculado pelo índice fagocítico (contagem de formas amastigotas na célula –

realizadas por microscopia). Os resultados estão apresentados na figura 18.

ABC

100

150

200

250

300

48 Horas

Índice Fagocítico

SEM LUZ

COM LUZ

ABC

100

150

200

250

300

24 horas

Índice Fagocítico

SEM LUZ

COM LUZ

♦

Figura 18: Infectividade de promastigotas de

Leishmania (Viannia) braziliensis

para

macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c. Promastigotas foram cultivados sobre

monocamadas de macrófagos na proporção 10 parasitos:1 macrófago. As culturas foram

tratadas ou não com AM e luz. Os resultados representam os índices fagocíticos após 24

e 48 horas. Os valores referem-se a média do experimento realizado em quadruplicata ±

desvio padrão da média. A: macrófago infectado (controle); B: macrófago infectado e

tratado com 0,53 μmol.L

-1

de AM; C: macrófago infectado e tratado com 0,066 μmol.L

-1

de AM. Teste T de Student

(*) Significante p < 0,05 em relação ao controle

(♦) Significante p < 0,05 em relação ao controle e as amostra não iluminadas

Pode-se observar que a luz por si só não inibiu o índice fagocítico em 24

(P=0,4596) ou em 48 horas (P=0,6088). O azul de metileno sozinho inibe

significativamente a infectividade das promastigotas em cultura de macrófago

em relação ao controle, nas duas concentrações estudadas (0,53 e 0,066μmol.L

-1

em 24 horas (P=0,0174 e P=0,0233, respectivamente) e em 48 horas (P=0,0009

e P=0,0027, respectivamente). Os percentuais das inibições de infectividade

para 0,53μmol.L

-1

(sem luz) chegam a 58%, conforme mostrado na tabela 4.

O azul de metileno associado à luz inibiu significativamente a infectividade

das promastigotas em cultura de macrófago em relação ao controle, nas duas

concentrações de AM estudadas (0,53 e 0,066μmol.L

-1

), em 24 horas (P=0,0044 e

P=0,0000945, respectivamente) e em 48 horas (P=0,0035 e P=0,00028,

respectivamente). Com a luz este efeito na capacidade de inibição da infecção

das células é ainda mais acentuado, sendo os percentuais de inibição de 90% em

relação ao controle.

Tabela 4: Inibição da infectividade (%) das promastigotas de

L(V) braziliensis

para

macrófagos peritoneais de camundongos

Controle

versus

24 hora

48 hora

M + L + AM 0,53 μmol.L

-1

58,2 57,7

M + L + AM 0,53 μmol.L

-1

+ Luz

90,5

90,3

M + L + AM 0,066 μmol.L

-1

47,6 45,1

M + L + AM 0,066 μmol.L

-1

+ Lu

91,8

87,7

M: macrófago; L:

Leishmania

Desse modo, mostrou-se que a ação fotodinâmica diminuiu a capacidade

dos parasitos de infectarem macrófagos, ou seja, em uma futura aplicação da

TFD em lesões de leishmania este efeito seria benéfico ao paciente. No intuito

de verificar se os macrófagos (infectados ou não com o parasito) permanecem

íntegros com a aplicação de AM e AM/LED, efetuaram-se registros fotográficos

de microscopia (figura 19).

Figura 19: A - Macrófago e

Leishmania

; B - Macrófago, AM (0,53 μmol.L

-1

) e Luz; C -

Macrófago,

Leishmania

, AM (0,066 μmol.L

-1

) e Luz; D - Macrófago,

Leishmania

, AM (0,53

μmol.L

-1

) e Luz.

Na figura 19A mostra-se a célula (macrófago) podendo-se observar o

núcleo (mancha de diâmetro maior), infectada com as amastigotas (manchas de

diâmetro menor localizadas próximas à membrana na imagem central). Na Figura

19B (ausência de parasito), 19C e 19D (parasito/AM/LED) mostra-se que o

tratamento aparentemente não causou danos às células, ou seja, mantém-se a

integridade da membrana sem perda de material celular.

IV.7.3 Óxido nítrico

A proteção do organismo contra uma variedade de agentes envolve, além

de outros mecanismos, a produção de óxido nítrico (NO) por diversos tipos

celulares, incluindo os macrófagos ativados (Ignácio et al, 2001). Sendo assim, foi

avaliado se o AM e o LED aumentavam em macrófagos elecitados a produção de

NO (figura 20).

A figura 20 demonstra que o AM sozinho não aumentou a produção de NO

e nas duas concentrações de AM estudadas na presença de luz também não se

observou nenhuma diferença significativa.

Figura 20: Produção de óxido nítrico (NO) em macrófagos infectados com

L.(V.)

braziliensis

e tratados com AM e Luz. A: Macrófago e

Leishmania

; B: Macrófago,

Leishmania

e AM 0,53mol.L

-1

; C: Macrófago e AM 0,066mol.L

-1

Como não houve aumento na produção de NO com o tratamento (AM e luz),

conclui-se que o AM/LED não atuou como um agente ativador de macrófago.

Assim o efeito não é mediado pelo NO.

IV.8 Aplicação da Terapia Fotodinâmica em hamsters infectados com

Leishmania (Leishmania) amazonesis

Afim de avaliar o potencial da Terapia Fotodinâmica como um tratamento

alternativo para leishmaniose tegumentar americana o estudo foi conduzido em

ABC

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

24 horas

[NO] μmol.L

-1

com luz

sem luz

ABC

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

48 horas

[NO]μmol.L

-1

sem luz

com luz

hamsters experimentalmente infectados com

Leishmania (Leishmania)

amazonesis.

Os animais foram acompanhados semanalmente quanto ao desenvolvimento

da lesão. A figura 21 mostra a espessura média das lesões, dos três grupos de

animais, expressa como a diferença entre a pata infectada e a pata contralateral

não infectada.

024681012

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

2.4

2.8

Espessura da lesão (mm)

Semanas pós infecção

Controle

Grupo A

Grupo B

Figura 21: Evolução da infecção avaliada pela espessura da lesão (média ± desvio

padrão)

medida pela diferença entre a pata infectada e a pata contralateral não

infectada

. Os animais foram inoculados na pata com 5x10

formas promastigotas de

Leishmania (Leishmania) amazonensis

e acompanhados semanalmente. O grupo controle

(n=8), o grupo A (n=14) e o grupo B (n=15)

Após todos os animais terem desenvolvido lesão, decorridos cerca de 90

dias, iniciou-se o tratamento. A figura 22 mostra a média da espessura da lesão

nas patas infectadas dos três grupos de animais: grupo controle, grupo A (AM

0,5%, m/v em loção) e grupo B (AM 0,5%, m/v em água)), acompanhada durante o

tratamento.

024681012

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

2.4

2.8

Espessura da lesão (mm)

Semanas com TFD

Controle

Grupo A - AM 0,5% loção

Grupo B - AM 0,5% água

Figura 22: Evolução da infecção avaliada pela espessura da lesão (média ± desvio

padrão). Os animais foram inoculados na pata com 5x10

formas promastigotas de

Leishmania (Leishmania) amazonensis

e após o desenvolvimento da lesão, foram tratados

e acompanhados semanalmente. O grupo controle (n=8) não recebeu tratamento, o grupo

A (n=14) foi tratado com AM em loção e o grupo B (n=15) foi tratado com AM em água.

Na figura 22 podemos observar que no grupo controle, o qual recebeu AM

mas não luz, a lesão continuou se desenvolvendo, mostrando que a aplicação do

corante sozinho aparentemente não afeta o desenvolvimento desta (inclusive não

ocorreu mudança no perfil de crescimento das lesões, antes e após aplicação do

AM). Contudo nos animais que receberam o tratamento, azul de metileno e luz, a

lesão regrediu significativamente (P=0,000131 e P=0,000107 nos grupos A e B,

respectivamente, comparando com o controle). Entre os grupos A e B, formulados

em loção e em água, respectivamente, não houve diferenças significativas

(P=0,470357), o que mostra que mesmo o formulado AM/água permite o contato

do corante com o parasito.

Comparando-se os grupos ao final e no início do tratamento, nota-se que

houve diferenças significativas nas espessuras dos mesmos, sendo para o grupo

A: P=0,000007 e grupo B: P=0,000003, o que comprova a eficácia do tratamento.

Em relação a característica física da lesão: no seu início verifica-se o

desenvolvimento de uma inflamação/nódulo dérmico (lesão edemaciada), onde a

epiderme está intacta, apenas com inchaço. Posteriormente ocorre necrose,

resultando na desintegração da pele, formando uma ulcera crostosa (lesão

crostosa) e, em seqüência e decorrente desta, uma ulcera profunda (lesão

ulcerada), (Neves, 2000). Assim o aspecto da lesão na pata dos animais foi

avaliado no período do tratamento. A tabela 5 mostra que antes do tratamento

apresentavam lesões ulceradas 14,3% e 40% dos animais do grupo A e B,

respectivamente. Após 6 semanas de tratamento 13,3% dos animais do grupo B

apresentavam lesões ulceradas enquanto que no grupo A foi de 0%. Ao término do

tratamento (12 semanas) somente animais que não haviam recebido o tratamento

(grupo controle) apresentavam lesões ulceradas, sendo que 40% e 50% dos

animais com lesões do grupo A e B, respectivamente, tiveram cicatrização

completa.

Tabela 5: Características das lesões dos animais infectados experimentalmente

com

L. (L.) amazonensis

, tratados ou não com AM e luz.

Característica da

lesão

Início

6 semanas

Final

Edemaciada 6 5 4

Crosta 2 2 2

Ulcera 0 1 2

Controle

(n=8)

Cicatrizada 0 0 0

Edemaciada 9 9 9

Crosta 3 3 3

Ulcera 2 0 0

Grupo A

(n=14)

Cicatrizada 0 2 2

Edemaciada 5 5 5

Crosta 4 9 5

Ulcera 6 0 0

Grupo B

(n=15)

Cicatrizada 0 1 5

Obviamente na discussão anterior de características físicas há um pouco

de subjetividade, inclusive nesta é difícil, em palavras, apontar melhoras de uma

lesão uma vez que a mesma pode ter tido boa recuperação do tecido, mas ainda

assim apresentar aspectos característicos do tipo da lesão. Para fornecer uma

melhor idéia sobre o quadro das lesões e da eficácia do método efetuou-se

registros fotográficos de todas as patas durante a aplicação do tratamento.

A figura 23 mostra a pata de dois animais infectados representativos de

cada grupo em diferentes períodos de tratamento.

1A 1B 1C

2A 2B 2C

Figura 23: Lesão na pata de hamster inoculada com 5x10

promastigotas de

L.(L.)

amazonensis

. A – antes do tratamento; B – 6 semanas com TFD; C – 12 semanas de

tratamento; 1 tratado com AM em água e 2 tratado com AM em loção

Conforme podemos observar na figura 23-1A, no início tem-se uma lesão

ulcerada, que com o tratamento forma uma crosta e depois cicatriza

completamente; dessa forma vê-se a reepitelização, regressão e cicatrização da

lesão. Segundo o manual de LTA (Ministério da Saúde, 2000) a cicatrização pode

ser utilizada como critério de cura da doença em seres humanos. Entretanto na

figura 23-2A, tem-se uma lesão ulcerada no início, que melhorou com a TFD, mas

mesmo ao final do tratamento ficou uma lesão crostosa.

Para dimensionar a atuação do tratamento avaliou-se o parasito

remanescente através da quantificação deste no baço e no linfonodo poplíteo

regional à lesão. No primeiro órgão não foram encontradas formas do parasito em

nenhum animal, logo não houve disseminação do parasito ao baço tanto em animais

tratados e não tratados.

Quanto a análise no linfonodo, no grupo de controle (8 animais) encontrou-

se parasitos em 7 animais, ou seja, em apenas 1 não encontrou-se parasitos

sugerindo que somente neste a infecção foi controlada pelo sistema imune do

animal. No Grupo A (formulado em água), dos 14 animais (houve morte natural de

1 animal antes do início do tratamento) apenas em 2 foram encontrados formas

promastigotas no linfonodo. No Grupo B (loção) dos 15 animais que receberam

tratamento, em 4 deles foi encontrado o parasito.

Na figura 24 mostra-se o valor médio da carga parasitária encontrado em

cada grupo de estudo. Nos animais que não receberam tratamento, a carga

parasitária foi significativamente maior, enquanto que nos animais tratados a

quantidade remanescente é pequena comparada ao grupo controle, sendo nos

grupos A: P=0,000171 e B: P=0,000702. Em relação às cargas parasitárias dos

animais do grupo A e B, não houve diferença estatística entre ambos

(P=0,529224), sugerindo não haver diferenças de eficiência dos formulados em

loção e em água.

controle Grupo B Grupo A

0.0

0.8

1.6

2.4

3.2

4.0

4.8

Log

(parasitas/g tecido)

Figura 24: Efeito do tratamento com a TFD sobre o número de parasitas nos linfonodos

poplíteos. (*) Significante P < 0,05 em relação ao controle – teste T de Student

De todos os animais tratados com a TFD, em 79,3% dos casos não foi

detectado o parasito no linfonodo mostrando a eficácia do tratamento, enquanto

que apenas em 20,7% apresentaram

Leishmania

residual - não resposta plena ao

tratamento. Estes resultados evidenciam a ação fotodinâmica do sistema

AM/LED mostrando que a Terapia Fotodinâmica pode ser uma boa alternativa no

tratamento de leishmaniose tegumentar americana.

V. CONCLUSÕES

O azul de metileno tem um máximo de absorção na região entre 600 e 800

nm (na janela fototerapêutica para TFD); sofre pouca reação de

fotobranqueamente e tem um bom valor de atividade fotodinâmica. O sistema de

LED desenvolvido foi altamente conveniente para as aplicações propostas com o

corante AM.

Os ensaios com microrganismos mostram efeitos inibitórios de

crescimento e de mortandade nas cepas estudadas na presença de azul de

metileno, com efeito altamente intensificado pela aplicação de luz, demonstrando

que o sistema AM/LED pode ser uma alternativa para o controle de bactérias e

fungos (este é um dos enfoques futuros do grupo visando-se instalações de

hospitais, indústrias alimentícias e outros). Adicionalmente os ensaios com

Artemia salina

também mostraram efeitos similares aos com microrganismos.

Os resultados

in vitro

obtidos mostram que: o tratamento com AM e luz

inibiu o crescimento de formas promastigotas de

Leishmania (Viannia)

braziliensis

em cultura; reduziu o índice fagocítico de macrófagos infectados

com promastigotas de

Leishmania (Viannia) braziliensis

e não influenciou na

produção de NO pelos macrófagos infectados. Os resultados

in vivo

sobre

hamster mostram que o sistema AM/LED: reduziu a lesão das patas infectadas

com

Leishmania (Leishmania) amazonensis

; reduziu a carga parasitária e

aumentou o percentual de cicatrização. Assim o tratamento, aplicado contra

leishmaniose,

in vitro

in vivo

com a TFD, mostra-se altamente promissor

podendo vir a ser uma alternativa no tratamento clínico de pacientes.

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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