( PDF ) Análise da região carboxi-terminal da glicoproteína C (gC) e sua utilização na diferenciação entre herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5)

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

ANÁLISE DA REGIÃO CARBOXI-TERMINAL DA GLICOPROTEÍNA C (gC) E

SUA UTILIZAÇÃO NA DIFERENCIAÇÃO ENTRE HERPESVÍRUS BOVINOS

TIPOS 1 (BoHV-1) E 5 (BoHV-5)

Doutorando: Paulo Augusto Esteves

Orientador: Prof. Dr. Paulo Michel Roehe

Co-orientadora: Prof. Dra. Ana Cláudia Franco

Porto Alegre

2007

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

ANÁLISE DA REGIÃO CARBOXI-TERMINAL DA GLICOPROTEÍNA C (gC) E

SUA UTILIZAÇÃO NA DIFERENCIAÇÃO ENTRE HERPESVÍRUS BOVINOS

TIPOS 1 (BoHV-1) E 5 (BoHV- 5)

Doutorando: Paulo Augusto Esteves*

Tese apresentada como requisito ao grau de Doutor

em Ciências Veterinárias, área de Medicina

Veterinária Preventiva – Virologia Veterinária.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Michel Roehe

Co-orientadora: Prof. Dra. Ana Cláudia Franco

Porto Alegre

2007

* Biólogo, MSc

ads:

Paulo Augusto Esteves

ANÁLISE DA REGIÃO CARBOXI-TERMINAL DA GLICOPROTEÍNA C (gC) E

SUA UTILIZAÇÃO NA DIFERENCIAÇÃO ENTRE HERPESVÍRUS BOVINOS

TIPOS 1 (BoHV-1) E 5 (BoHV- 5)

APROVADO POR:

____________________________________________________

Prof. Dr. Paulo Michel Roehe

Orientador e Presidente da Comissão

___________________________________________________

Prof. Dr. Amauri Braga Simonetti

Membro da Comissão

___________________________________________________

Prof. Dr. Cláudio Wageck Canal

Membro da Comissão

___________________________________________________

Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin

Membro da Comissão

AGRADECIMENTOS

Gostaria de humildemente agradecer e dedicar este trabalho a minha família (Muito

obrigado por serem quem são, tudo foi sempre para e por vocês). Meus pais (Luiz e

Carmem), minhas amadíssimas esposa (Alessandra) e filha (Mariane), irmãos (Luis,

Jacqueline e Luciane), sobrinhos (Tamara, Fernando & Feijão, a mais recente aquisição da

família) e eternos cunhados (Alexandre e Delmo). Não posso deixar passar em branco a

gratidão à família de minha esposa (Clóvis, Mariones, Giuliano, Marcelo, Bel & Gabriel)

que sempre estenderam a mão quando necessário.

Sou muitíssimo grato também ao Prof. Dr. e amigo Paulo Roehe, que foi a pessoa

que abriu-me as portas do fantástico mundo da ciência e da virologia. Foi ele também a

apresentar-me ao saudoso Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor (IPVDF),

ou carinhosamente IPV. Sem dúvidas um local privilegiado, afastado da agitação da cidade,

perfeito para estudar, fazer experimentos e ótimos churrascos. Lá no IPV encontrei minha

alma gêmea e grande amor de minha vida, Alessandra, e fiz muitos amigos ao longo deste

período de dez anos, a vocês todos (Ana Cláudia & Frans, Anna, Cintia, Cinthya, Cláudio

Chiminazzo, Cristiane, Diocela, Diogenes, Eber, Fabiane, Fabrício, Fernando & Valeska,

Franco, Helena, Júlio, Marcelo, Marjorie & Laura, Maurício, Rejane & Marcus, Regina,

Renata, Ricardo, Rodrigo, Sílvia Melo, Sílvia Hübner & Dino/ Andressa, Suzana, Tamahini

& Cícero/ Marina, Tamir, Thaís, Vanessa) meu mais caloroso muito obrigado! Agradeço

também aos demais eternos colegas de laboratório (Aline, Bira, Dilmara, Simone, Marcelo

& André).

Aos sempre presentes Odir Dellagostin, Cláudio Canal e Amauri Simonetti,

muitíssimo obrigado por se colocarem sempre a disposição, não importando o tamanho do

pepino. Presentes desde meu mestrado vocês fizeram, fazem e continuarão a fazer a

diferença, muitíssimo obrigado!

Agradeço ao Dr. Frans Rijsewijk (e Ana Cláudia) pela incrível e inesquecível

oportunidade de ter podido ir à Holanda realizar trabalhos relacionados a meu doutorado,

muito obrigado pelo abrigo e companhia em nossas incursões na Europa.

Muito obrigado à diretoria do IPVDF (Dr. Augusto Cunha), demais técnicos (Drs.

Alexandre Braga, José Antônio, Júlio Rosa, Maria Angélica), ex-técnicos do instituto

(Paulo Reckziegel e Sylio Petzhold) bem como os demais funcionários do IPVDF. Meus

parabéns por dar esta oportunidade aos estagiários e estudantes das mais variadas áreas,

vocês estão fazendo a diferença, acreditem.

Muito obrigado aos colegas da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

(Embrapa). Sem seu apoio eu definitivamente não teria tido condições de terminar meu

curso de doutorado. Agradeço simbolicamente a todos os colegas da unidade através da

direção da Unidade Drs. Élsio Figueredo, Teresinha Marisa Bertol e Cláudio Bellaver;

pesquisadores (Cátia, Doralice, Fátima, Iara & Marcelo, Jalusa, Janice, Laurimar, Liana,

Mônica, Marcelo, Morés, Virgínia); demais técnicos do laboratório de sanidade (Alexandre,

Armando, Beatriz, Bordin, Daiane, Franciana, Gérson, Magda, Maria, Marni, Marisete,

Max, Neide, Tânia, Vissotto), ou do SEDISA (Lauren, Régia, Simaia e Suzana) e

estágiários (Aline, Ediane e Marcelo), um grande abraço a todos. Muito obrigado às amigas

Iara, Liana, Rejane e Virginia pelo apoio incondicional, vocês são excelentes pessoas,

muito obrigado por dividir sua amizade e sabedoria.

Um carinhoso agradecimento ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Veterinárias no nome de sua atual gestora a Dra. Ana Paula Ravazzollo, da comissão do

programa de pós-graduação, e de nossos três anjos da guarda as secretárias Joce, Maria e

Vera, muito obrigado por todo o apoio.

Muito obrigado à CAPES por financiar meus estudos de pós-graduação e

possibilitar meu aperfeiçoamento fora do país.

A todos, meus mais humildes agradecimentos e desejos de vidas plenas, com muita

saúde, paz e realizações.

Um mundo melhor é possível, basta acreditar e viver. Obrigado Pai.

ANÁLISE DA REGIÃO CARBOXI-TERMINAL DA GLICOPROTEÍNA C (gC) E

SUA UTILIZAÇÃO NA DIFERENCIAÇÃO ENTRE HERPESVÍRUS BOVINO

TIPOS 1 (BoHV-1) E 5 (BoHV-5)

RESUMO

Membros da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, herpesvírus bovino

tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) tem sido associados a diferentes condições clínicas em

bovinos. Assim, diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 é uma valiosa informação

objetivando um melhor entendimento da patogenia e epidemiologia destes vírus no rebanho

bovino. Contudo, métodos para diferenciação são escassos devido às reações cruzadas

originadas da alta homologia genômica e antigênica entre estes vírus. O presente estudo

concentrou-se na análise da região carboxi-terminal da glicoproteína C (nucleotídeos 16763

- 17337 em BoVH-1 e 17671 - 18242 em BoHV-5), uma vez que tal região apresentou

características potenciais que permitissem a diferenciação entre estes vírus. Assim, no

primeiro capítulo do presente trabalho a região carboxi-terminal da gC foi utilizada como

alvo para o desenvolvimento de uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) seguida da

Análise da Restrição Enzimática (REA) do fragmento amplificado, capaz de diferenciar

entre isolados de BoHV-1 ou BoHV-5, gerando fragmentos com tamanhos de 575 pares de

base (pb) frente a BoHV-1 e 572 pb frente a BoHV-5. A diferenciação entre BoHV-1 e

BoHV-5 foi obtida após a digestão dos amplicons com a enzima de restrição Bgl I. No

segundo capítulo, a região carboxi-terminal de 23 amostras Sul-Americanas de BoHV-1 ou

BoHV-5 foram amplificadas e sequenciadas. A análise filogenética realizada com as

sequências de nucleotídeos revelou identidade variando entre 98,7 a 99,8% (BoHV-1/

BoHV-1), 88,3 a 92% (BoHV-1/ BoHV-5) e 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5).

Alinhamentos realizados com sequências de aminoácidos revelaram identidade variando

entre 97,5 a 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 a 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) e 92,1 a 99,5%

(BoHV-5/ BoHV-5). Análises filogenéticas revelaram, ainda, que: i) alguns isolados de

BoHV-5 apresentaram um padrão diferente daqueles até o presente reconhecidos; ii) uma

amostra isolada no Uruguai (BoHV-1.2) apresentou um padrão de agrupamento distinto

quando comparado com as outra amostras de BoHV-1.2. O terceiro capítulo apresenta o

primeiro relato de detecção de BoHV-5 de sêmen bovino através da análise antigênica,

amplificação diferencial da região amino-terminal do gene da gC de BoHV-1 e 5, seguida

da caracterização por REA do isolado em estudo. Em síntese, através da utilização da gC

foi possível avaliar a homologia entre as amostras Sul- Americanas estudadas; desenvolver

uma PCR/REA diferencial entre estes vírus e relatar a detecção de uma amostra de BoHV-5

isolada à partir de sêmen contaminado.

ANALYSIS AND UTILIZATION OF GLYCOPROTEIN C (gC) CARBOXI-

TERMINAL REGION IN THE DIFFERENTIATION OF BOVINE HERPESVIRUS

TYPES 1 (BoHV-1) AND 5 (BoHV-5)

ABSTRACT

Members of the Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily bovine herpesvirus

types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) have been associated to different clinical conditions of

cattle. Thus, differentiation has become an important tool for a better understanding of the

pathogenesis and epidemiology of BoHV infections in cattle. However, currently available

methods for such differentiation are hampered by cross-reactions from high genomic and

antigenic homology between these viruses. The present work focused on the analysis of the

carboxy-terminal portion of glycoprotein C (gC), corresponding to nucleotides 16763 -

17337 on BoHV-1 and 17671 - 18242 on BoHV-5 once such region showed characteristics

that would allow a clear distinction between BoHV-1 and 5. In view of that, in the first

chapter, the carboxy-terminal region of gC was the target for the development of a

Polymerase Chain Reaction followed by a Restriction Enzyme Analysis (PCR/REA) for

differentiation between BoHV-1 and 5. The PCR/REA was designed to amplify a segment

on the carboxy-terminal portion of the glycoprotein C (gC) gene, giving rise to amplicons

of 575 base pairs (bp) for BoHV- 1, and 572 bp for BoHV-5. The amplicons were digested

with the Bgl I for differentiation between BoHV-1 and 5. In the second chapter the region

previously described of 23 South American isolates of BoHV-1 and BoHV-5 were amplified

and sequenced. Nucleotide sequence alignments revealed identity ranged from 98,7 to

99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 to 92%

(BoHV-1/ BoHV-5) and 96 to 99,7% (BoHV-5/

BoHV-5). The identity deduced from amino acid sequences ranged from 97,5 to 99,5%

(BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 to 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) and 92,1 to 99,5% (BoHV-5/ BoHV-

5) . Phylogenetic analyses and deduced amino acid sequences revealed that: i) some

BoHV-5 isolates seem to be “non a non b” subtype and ii) there is a Uruguayan BoHV-1.2

strain that has a distinct nucleotide and amino acid sequence when compared to others

BoHV-1.2 strains. The third chapter of the present work contains the first report of a

BoHV-5 strain isolated from the bovine semen by antigenic characterization, differential

amplification of the N-terminal region of gC gene from BoHV-1 and 5 followed by genomic

characterization by REA and antigenic characterization of the isolate analyzed.

SUMÁRIO Pg.

RESUMO

ABSTRACT

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Descrição do Agente 9

1.2 Proteínas Virais 11

1.3 Glicoproteína C (gC) 13

1.4 Replicação Viral 14

1.5 Latência 20

1.6 Subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 21

1.7 Patogenia 22

1.8 Epidemiologia 26

1.9 Diagnóstico Laboratorial 29

2. OBJETIVOS

Capítulo 1. Differentiation between bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-

5) by polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis (PCR – REA)

Capítulo 2. Phylogenetic analisys of the carboxy-terminal region of glycoprotein C

(gC) of bovine herpesvirus (BoHV)1.1, 1.2 and 5

Capítulo 3. Bovine herpesvirus type 5 in the semen of a bull not exhibiting clinical

sings

3. DISCUSSÃO GERAL

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANEXOS – Trabalhos publicados durante o curso de doutorado 86

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Descrição do Agente

Os herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são membros da família

Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. Membros da família

Herpesviridae são vírus de tamanho grande (120-300 nm), cujo genoma encontra-se dentro

de uma estrutura protéica icosaédrica, o capsídeo. O capsídeo é cercado por uma camada

protéica denominada tegumento. Este conjunto é, por sua vez, circundado por um envelope

(Figura 1). O envelope apresenta a típica estrutura das membranas de células eucarióticas

com a presença de glicoproteínas virais transmembrana (ROIZMAN et al., 2001).

Figura 1. Partícula de herpesvírus. C) capsídeo,

T) tegumento; E) envelope; G) glicoproteínas

(Fonte: Linda Stannard, Department of Medical

Microbiology, University of Cape Town).

Os alfaherpesvírus são taxonomicamente divididos em quatro gêneros,

Simplexvirus; Varicellovirus; Mardivirus e Iltovirus; apresentam grande variedade de

hospedeiros, ciclo de replicação curto (cerca de 12 horas) e capacidade de indução de

latência principalmente, mas não exclusivamente, em neurônios (THIRY et al., 2006).

Membros desta subfamília apresentam genoma constituído por uma molécula de

DNA linear dupla fita com cerca de 130.000 a 150.000 pares de bases. O genoma viral

pode ser dividido em uma região longa (UL) e uma região curta (US) cercada por duas

regiões repetidas e invertidas, sendo uma interna (IR) e outra terminal (TR). Tal

organização permitiu a inclusão do genoma dos alfaherpesvírus como arranjo típico do

grupo “D” (figura 2) (SCHWYZER e ACKERMANN, 1996) .

Entre os alfaherpesvírus que infectam ruminantes, o protótipo é o BoHV-1,

distribuído mundialmente e responsável por uma série de doenças que afetam bovinos de

leite ou de corte, com reflexos sobre toda a economia mundial (THIRY et al., 2006).

Figura 2. Organização genômica dos alfaherpesvírus (adaptado de Thiry et al., 2006).

O genoma dos alfaherpesvírus consiste em uma molécula dupla fita de DNA, que

compreende uma região longa (UL), uma região curta (US) duas regiões repetidas e

invertidas uma interna e outra terminal (IR e TR, respectivamente). Em destaque na figura a

representação esquemática da localização de várias proteínas. As setas indicam as possíveis

orientações de determinados segmentos genômicos.

1.2 Proteínas Virais

Os genomas de BoHV-1 e BoHV-5 codificam mais de 70 proteínas (Tabela 1). A

maior parte dos genes de BoHV-1 e BoHV-5 apresentam homologia em relação aos genes

do vírus do herpes simples humano tipo 1 ou herpesvírus humano tipo 1 (HSV-1 ou HHV-

1), assim foram nomeados conforme os genes homólogos do HSV-1. Entre as proteínas

codificadas por BoHV-1 e BoHV-5, pelo menos dez são glicoproteínas (SCHWYZER E

ACKERMANN, 1996). Destas, enquanto algumas são essenciais à replicação viral tais

como gB, gD, gH, gL e gK . Outras (gC, gE, gI, gM e gN), embora desempenhem

importantes funções, não são essenciais ao processo de replicação viral (SCHWYZER E

ACKERMANN, 1996).

As glicoproteínas atuam em inúmeras etapas do ciclo de replicação viral

(reconhecimento e ligação aos receptores celulares; fusão das membranas viral e celular;

penetração do material viral no citoplasma; maturação e saída das partículas virais da

célula), bem como muitas são importantes em estratégias de evasão da resposta imune do

hospedeiro (HANON et al., 1999; WINKLER et al., 1999; LIMAN et al., 2000).

Tabela 1. Proteínas Virais de BoHV-1 (várias amostras) e 5 (amostra SV507), adaptado de

Delhon et al., 2003.

Tamanho (aa)

Gene BoHV-5 BoHV-1 Identidade (%) Glicoproteínas

Circ 245 247 84

UL54 403 400 82

UL53 331 332 85

UL52 1085 1074 83

UL51 262 243 81

UL50 321 325 83

UL49.5 95 96 81

UL49 267 258 72

UL48 482 505 98

UL47 741 739 93

UL46 734 748 82

UL44 486 508 75

UL43 380 378 88

UL42 412 408 79

UL41 525 459 91

UL40 315 314 91

UL39 800 787 97

UL38 545 474 87

UL37 1054 1024 88

UL36 3204 3247 80

UL35 125 124 87

UL34 276 260 83

UL33 110 108 89

UL32 598 601 89

UL31 379 361 84

UL30 8750 1246 90

UL29 1208 1203 95

UL28 816 826 90

UL27 947 932 93

UL26.5 315 308 80

UL26 619 621 83

UL25 603 598 94

UL24 279 293 74

UL23 356 359 83

UL22 848 842 86

UL21 603 574 77

UL20 253 231 93

UL19 1391 1385 97

UL18 316 316 92

UL17 707 701 90

UL16 343 339 93

UL15 1869 735 95

UL14 224 222 97

UL13 495 492 90

UL12 487 487 88

UL11 100 89 73

UL10 419 438 85

UL9 823 859 89

UL8 757 748 89

UL7 301 299 88

UL6 820 688 84

UL5 838 838 99

UL4 188 185 86

UL3.5 148 126 69

UL3 217 204 75

UL2 298 301 76

UL1 162 158 81

UL0.7 201 97 41

UL0.5 87

LRORF2 51 181 82

LRORF1 360 336 66

BICP0 720 676 70

BICP4 1408 1343 75

BICP22 314 300 68

US1.67 247 243 79

US2 226 220 69

US3 444 468 79

US4 440 444 72

US6 417 417 98

US7 387 382 78

US8 599 575 74

US9 134 144 79

BICP22 314 300 67

BICP4 1408 1343 75

1.3 Glicoproteína C (gC)

Embora a gC não seja essencial para multiplicação viral in vitro ou in vivo, foi

demonstrado que ela é importante para a manutenção da eficiência da replicação viral

(LIMAN et al., 2000). Além disso, a gC influencia interações imunológicas entre o vírus e

o hospedeiro (LIMAN et al., 2002). A gC tem sido descrita como membro da superfamília

das imunoglobulinas (FITZPATRICK e BIELEFELDT-OHMANN, 1991), sendo capaz de

bloquear a primeira linha do sistema de defesa do hospedeiro através de sua ligação com o

terceiro fator (C3) da cascata de Complemento (HUEMER et al., 1993). Assim, ela é capaz

de, preferencialmente, interferir com eventos relacionados à resposta imune via

Complemento do que com a via de resposta imune tipo MHC (VAN DER MEULEN et al.,

2006).

Os genes que codificam as gCs de BoHV-1 e BoHV-5 localizam-se nas regiões UL

43 de BoHV-1 (16683-18209/ Z49224) e UL 44 de BoHV-5 (19051-17591/ Z54206)

respectivamente (DELHON et al., 2003). A proteína propriamente dita (gC), é uma das

proteínas estruturais não essenciais. É uma proteína transmembrana com cerca de 91 kDa ,

pertencente à superfamília das imunoglobulinas (FITZPATRICK e BIELEFELDT-

OHMANN, 1991; CHOWDHURY, 1997; METTENLEITER, 2003; THIRY et al., 2006).

É uma das principais glicoproteínas virais, sendo expressa em altos níveis no envelope viral

e na superfície de células infectadas. No vírion, a gC apresenta-se como um dímero de 508

aminoácidos (1572 nucleotídeos) no BoHV-1 e 486 aminoácidos (1464 nucleotídeos) no

BoHV-5. As gCs destes vírus compartilham cerca de 75% de similaridade. A região amino-

terminal (N-terminal) concentra a maior parte das diferenças entre as gCs de BoHV-1 e

BoHV-5, enquanto que as regiões central e carboxi-terminal (C-terminal) apresentam-se

bem mais conservadas (SCHWYZER e ACKERMANN, 1996).

A estrutura secundária da gC de BoHV-1, sugere que esta é composta por sete

potenciais domínios estruturais com grande homologia com proteínas da superfamília das

imunoglobulinas (Tabela 2) (FITZPATRICK e BIELEFELDT-OHMANN, 1991;

CHOWDHURY, 1997). Seu papel principal parece estar ligado à adsorção, atuando como

uma das principais glicoproteínas envolvidas neste processo, ligando-se aos receptores de

heparina (“Heparan Sulfate Proteoglycan” - HSPG) na superfície das células-alvo

(OKAZAKI et al., 1994).

As características acima descritas fazem da gC um potencial alvo para o

desenvolvimento de provas de diagnóstico diferencial entre BoHV-1 e BoHV-5 e esta

proteína já foi explorada várias vezes no desenvolvimento de técnicas moleculares do tipo

reação em cadeia da polimerase (PCR), bem como variações desta técnica (nested PCR,

multiplex PCR) para detecção de BoHV-1 ou diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5

(VAN ENGELENBURG et al., 1993; VILCEK, 1993; LYAKU et al., 1996; ASHBAUGH

et al., 1997; ALEGRE et al., 2001; ESTEVES et al., 2003; CLAUS et al., 2005). Não

apenas provas moleculares foram desenvolvidas utilizando-se desta glicoproteína como

alvo. A partir da utilização da gC como antígeno, foi possível desenvolver anticorpos

monoclonais diferenciais entre BoHV-1.1 e BoHV-1.2, bem como provas tipo ELISA

diferenciais entre BoHV-1.1 e 1.2 e BoHV-1 e BoHV-5 (CHOWDHURY, 1997;

RIJSEWIJK et al., 1999; SPILKI et al., 2005).

DOMINIO RESÍDUOS FUNÇÃO OU CARACTERÍSTICAS

1°

7-21 Peptídeo sinal.

2°

22-150

Quase 1/3 da porção extracelular, altamente

antigênico e provavelmente região imunodominante.

Induz formação de anticorpos neutralizantes;

hidrofílico.

3°

151-260

Homólogo ao V conjunto da superfamília de

imunoglobulinas G (IgG).

4°

261-370

Apresenta homologia ao domínio constante de

MHCII, complexa-se com receptores de heparina,

hidrofílico.

5°

371-466

Apresenta homologia aos domínios C2 do conjunto

de superfamílias de Ig.

6°

467-500 Âncora transmembrana.

7°

501-521 Provável cauda citoplasmática.

Tabela 2. Denominação, localização e provável função ou características dos domínios da

gC (CHOWDHURY, 1997).

1.4 Replicação Viral

O processo de replicação viral de BoHV-1 e BoHV-5 em células permissivas (figura

4) tem como modelo o ciclo de replicação do HSV-1, podendo ser dividido da seguinte

forma: 1) adsorção (ligação do vírus a receptores de membrana das células-alvo); 2) fusão

do envelope viral com a membrana plasmática das células infectadas e penetração do

nucleocapsídeo e tegumento no citoplasma das células infectadas; 3) transporte do

nucleocapsídeo e proteínas virais contidas no tegumento ao núcleo das células infectadas;

4) transcrição, replicação e síntese do DNA e proteínas virais respectivamente; 5)

montagem e preenchimento dos capsídeos e 6) liberação da progênie infecciosa

(ROIZMAN e KNIPE, 2001).

1) Adsorção

Glicoproteínas do envelope viral reconhecem e ligam-se a receptores específicos da

membrana celular (BABIUK et al., 1996; MEYER et al., 1998; WILD et al., 1998). Este

processo não depende exclusivamente de uma glicoproteína, mas sim da interação de várias

glicoproteínas do envelope viral. As principais glicoproteínas envolvidas no processo de

adsorção em células epiteliais são a gC e a gB, que reconhecem e ligam-se a receptores

celulares de sulfato de heparina (HSPG), seguido da ligação da gB e da gD a outros

receptores de membrana. Esta estratégia (denominada redundância, onde uma proteína

reconhece mais de um receptor celular) possibilita ao vírus infectar diferentes tipos

celulares (in vivo, o vírus se depara com pelo menos três tipos de membrana celular:

membrana celular de células epiteliais não polarizadas, polarizadas e membranas celulares

de neurônios) (BABIUK et al., 1996; IMMERGLUCK et al., 1998; MEYER et al., 1998;

METTENLEITER, 2003).

2) Fusão e penetração

Pelo menos cinco glicoproteínas estão envolvidas nos processos de fusão e

penetração viral às células-alvo: gB, gD, gH, gL e gK (BABIUK et al., 1996; ROIZMAN e

KNIPE, 2001). Cerca de 40 segundos após o início da infecção viral foram encontrados

alguns vírions parcialmente fusionados à camada mais externa da membrana plasmática.

Quarenta e cinco segundos após foi possível observar fusão completa, que resulta numa

inserção parcial do envelope viral à membrana plasmática, com formação de "dobras" na

membrana. (WILD et al., 1998).

3) Transporte

Acredita-se que o nucleocapsídeo seja transportado através da ação da glicoproteína

VP22 que é responsável pela reorganização do sistema de microtúbulos celulares até o

centrômero, perto do núcleo (ROIZMAN e KNIPE, 2001).

4) Transcrição, replicação e síntese

Os processos de transcrição e replicação do DNA viral ocorrem no núcleo de células

infectadas, enquanto a síntese protéica viral dá-se no citoplasma. A transcrição dos genes

virais (e conseqüente bloqueio da síntese celular) é regulada temporalmente, havendo três

classes de RNAs mensageiros (mRNA), denominadas: “immediate early”, ou

imediatamente precoces (α), “early”, ou precoces (β) e “late”, ou tardias (γ), que são

transcritos pela RNA polimerase II (RNApol II) celular (TIKOO et al., 1995; ROIZMAN e

KNIPE, 2001). Os genes α são os primeiros a serem transcritos. Participam deste processo

proteínas do tegumento (αTIF e VP8), em interação com fatores de transcrição celular

sendo, então, 5 α-proteínas denominadas “Bovine Infected Cell Protein” (BICP0, BICP4,

BICP22, BICP27 e BICP47) expressas no início da síntese protéica viral. A síntese das α-

proteínas alcança o nível máximo entre 2 a 4 horas após o início da infecção (ROIZMAN e

KNIPE, 2001) .

Uma vez tendo sido produzidas α-proteínas em volume suficiente, é iniciado o

processo de transcrição dos genes β , sendo alcançado o nível máximo de expressão cerca

de 5-7 horas após o início da infecção (ROIZMAN e KNIPE, 2001).

Funcionalmente, as β-proteínas estão envolvidas na regulação da transcrição das α-

proteínas (suprimindo-as), das γ-proteínas (promovendo-as), bem como (juntamente com as

α-proteínas) atuam no processo de replicação do genoma viral. A replicação do DNA viral

pode ser detectada cerca de três horas após o início da infecção viral. Este processo conta

com a participação das proteínas α e β, além de proteínas celulares. Nesta fase, o DNA

viral pode ser encontrado na forma circular ou linear, havendo indícios de que os

herpesvírus possam replicar seu material genético pelo mecanismo denominado "círculo

rolante" (ROIZMAN e KNIPE, 2001).

Os genes γ foram, assim como os β, divididos em dois grupos: γ

(também

chamados βγ. Estes genes codificam algumas proteínas tais como: gB, gD, BICP5) e γ

(que codificam gC, US11) sendo expressos mais tardiamente na infecção. É importante

ressaltar que enquanto muitos dos α e β genes codificam enzimas ou proteínas que

complexam-se ao DNA viral, a maioria dos γ genes codificam proteínas estruturais

(ROIZMAN e KNIPE, 2001).

5) Montagem e preenchimento dos capsídeos

A montagem dos capsídeos acontece no núcleo das células infectadas através da

interação de determinadas proteínas virais (UL18; UL19; UL35 e UL38). Os capsídeos são

preenchidos com as moléculas do DNA viral replicado através do auxílio de várias

proteínas virais (UL33; UL32; UL28; UL25; UL15; UL 26.5) (ROIZMAN e KNIPE,

2001).

6) Liberação

O processo de maturação do capsídeo envolve as etapas de formação do

nucleocapsídeo (associação do DNA viral com o capsídeo) e a associação do

nucleocapsídeo com áreas da camada interna da membrana nuclear adquirindo, assim, o

envelope viral. No citoplasma, vírions acumulam-se dentro de vesículas utilizando-se do

Complexo de Golgi para serem secretados para o meio extracelular ou ocorre a dispersão

das partículas virais célula-à-célula (METTENLEITER, 2002).

Fusão e Penetração

Adsorção

Liberação

Transcrição

Imediatamente

Cedo (

)

Transcrição

Cedo (β)

Proteínas

Imediatamente

Cedo

(

)

Proteínas

Cedo (β)

Transcrição

Tardios

(

)

Proteínas

Tardias (γ)

Montagem e

reenchimento

Transporte

Figura 3. Descrição esquemática do processo de replicação dos herpesvírus bovinos

tipos 1 e 5 (adaptado de Tikoo et al, 1995).

Replicação

1.5 Latência

Membros da subfamília Alphaherpesvirinae podem estabelecer infecções latentes

em gânglios nervosos, onde o DNA viral pode persistir sob a forma de concatâmeros nos

núcleos das células infectadas. Assim, animais latentemente infectados servem de

reservatório natural para o vírus durante toda a vida do animal (THIRY et al., 2006).

O vírus pode ser reativado por uma ampla variedade de estímulos imunodepressivos

(estresse, transporte, tratamentos com glicocorticóides, parto), sendo a reativação, o fator

responsável pela perpetuação e transmissão do vírus no rebanho. A disseminação do vírus

no sistema nervoso, a partir de uma infecção primária, ocorre através da penetração via

neurônios sensoriais periféricos e transporte dos capsídeos que podem ou não estarem

acompanhados por proteínas do tegumento por fluxo axonal retrógrado, usualmente aos

gânglios trigêmeo ou sacral (JONES, 2003; METTENLEITER, 2003)

Estudos com o objetivo de determinar as bases moleculares da latência

demonstraram que, em contraste aos cerca de 70-80 genes expressos durante o processo de

lise, no estágio de latência apenas uma pequena região do genoma (conhecida por genes

relacionados à latência – LRG), sobrepostos aos genes α, é transcrita.

Apenas três transcritos foram detectados durante o período de latência: um de 8,7 kb

(em pouquíssima quantidade) e outros dois, de 2 e 1,5 kb (em maior quantidade), no núcleo

das células latentemente infectadas (COFFIN et al., 1995; HOSSAIN et al., 1995).

Devireddy e Jones (1998) sugeriram que a infecção latente poderia ser dividida em três

etapas:

1) Estabelecimento da latência: nesta etapa, os transcritos dos LRG (LRGT) sofrem

processamento alternativo, sendo traduzidos os fragmentos de 2 ou 1,5 kb (processados a

partir do fragmento maior de 8,7 kb).

2) Manutenção da latência: aqui o produto de LRGT (LTRP) reprimiria a expressão

viral dos genes α, complexando-se com fatores de transcrição celulares (ciclina A, ciclina

E, cdk2, cdc2). Nos neurônios infectados, os LTRP devem neutralizar os efeitos deletérios

da ciclina A (necessária para a progressão do ciclo celular e em estágios iniciais de

apoptose), bem como de outros fatores virais ou celulares para assegurar a sobrevivência do

neurônio e o estabelecimento de latência.

3) Reativação do vírus: nesta fase o fato de ter sido detectada a expressão de RNA

de ciclina A durante a reativação, pode indicar que LTRP não conseguem evitar que as

células avancem no ciclo celular ou entrem em apoptose, ou ainda, a reativação pode ser

um ato de prevenção a uma eminente apoptose celular. Ao final do processo de reativação,

o vírion é transportado através dos axônios ao local onde ocorreu a infecção original

(JONES, 2003).

1.6 Subtipos de BoHV-1 e BoHV-5

O fato do BoHV-1 estar associado a várias síndromes, como rinotraqueítes,

conjuntivites, abortos, vulvovaginites, balanopostites e encefalites, levou os pesquisadores

a buscar uma melhor caracterização das amostras isoladas dos diferentes quadros clínicos.

Bagust (1972), demonstrou que o herpesvírus bovino causador de encefalites (N569), era

um vírus antigenicamente relacionado, mas diferente do BoHV-1 (BAGUST, 1972;

METZLER et al., 1985; ENGELS et al., 1986; METZLER et al., 1986; BULACH e

STUDDERT, 1990; MAGYAR et al., 1993).

Posteriormente, Ludwig et al (1972) propuseram uma modificação na classificação

taxonômica de BoHV-1 baseada nos diferentes quadros clínicos observados. No sistema

proposto, as amostras causadoras de rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) foram

denominadas “assemelhadas às amostras causadoras de IBR” (“IBR-like”) e amostras

causadoras de vulvovaginite pustular infecciosa (IPV) foram denominadas “IPV-like”

(LUDWIG, 1972).

Misra et al (1983) e Brake e Studdert (1985) estudaram o genoma de vários isolados

de herpesvírus bovinos, constatando diferenças nos perfís de restrição enzimática daquelas

amostras. Não foi possível àqueles autores, no entanto, associar os perfis de restrição

obtidos com a sintomatologia clínica (MISRA et al., 1983; BRAKE e STUDDERT, 1985).

Mais tarde, com base em análises de perfís de restrição enzimática (REA), Engels et

al (1981), propuseram a subdivisão do BoHV-1 em BoHV-1.1 (“IBR-like”) e BoHV-1.2

(“IPV-like”), também referidos como “Cooper-like” e “K22-like” respectivamente

(ENGELS et al., 1981).

Friedli e Metzler (1987), demonstraram ser possível diferenciar BoHV 1.1, 1.2 e 1.3

através do uso de anticorpos monoclonais e da análise de proteínas em géis de

poliacrilamida (SDS-PAGE) (FRIEDLI e METZLER, 1987).

Posteriormente, Whetstone et al (1989) propuseram a divisão em subtipos 1 (ou

BoHV-1.1, associado à IBR ou abortos), 2a (BoHV-1.2a, associado a vulvovaginite) e 2b (

BoHV-1.2b, associado à balanopostite) e 3 (BoHV-1.3, associado a meningoencefalites)

(WHETSTONE e MILLER, 1989).

Baseados nos perfis genômicos através da análise por enzimas de restrição (REA),

Bulach e Studdert (1990), estimaram haver uma similaridade genômica de 95% entre a

amostra respiratória Cooper e a amostra genital K22 (BoHV-1.2). Em contraste, estimaram

uma identidade de 85% entre a amostra Cooper (BoHV-1.1) e a amostra obtida de um caso

de meningoencefalite denominada N569 (BoHV-5). Mais tarde, devido a diferenças

genômicas, antigênicas e clínico-epidemiológicas observadas, foi proposto que o BoHV-1.3

não fosse mais considerado um subtipo de BoHV-1 e sim alocado em um novo tipo,

denominado BoHV-5 (BULACH e STUDDERT, 1990; ROIZMAN et al., 1992).

A seguir, analisando o genoma de diferentes amostras de BoHV-5, d'Offay et al

(1993) propuseram a subdivisão de amostras de BoHV-5 em subtipos “a” e “b”, com base

nos perfís de restrição enzimática obtidos. Mais recentemente, D'Arce (2002), propôs a

existência de um terceiro subtipo de BoHV-5, a que os autores denominaram de amostras

“não a, não b” (D'OFFAY et al., 1993; D'ARCE et al., 2002).

1.7 Patogenia

O BoHV-1 é o principal patógeno que afeta bovinos sendo o agente responsável por

infecções do sistema respiratório (rinotraqueíte infecciosa bovina – IBR); sistema

reprodutivo (balanopostite/ vulvovaginite pustular infecciosa – IPB/ IPV) e diversas outras

manifestações clínicas tais como conjuntivite, abortos e ocasionalmente encefalites (d’

Offay et al., 1993; Meyer et al., 2001). Embora dados epidemiológicos apontem que

amostras de BoHV-1.1 (“IBR-like”) e BoHV-1.2 (“IPV-like”) causem diferentes sintomas

clínicos nos animais infectados, ambos podem infectar os tratos respiratório ou genital

(RIJSEWIJK et al., 1999; SPILKI et al., 2004).

Especula-se, contudo, que cada genótipo esteja melhor adaptado a uma determinada

localização anatômica; assim, BoHV-1.1 multiplicar-se-ia melhor no trato respiratório,

enquanto que BoHV-1.2 multiplicaria-se preferencialmente no trato genital (EDWARDS et

al., 1991).

Entretanto, Spilki (2004) ao realizar estudo comparativo de patogenia causada por

BoHV-1.1 e BoHV-1.2a descreve que ambos os subtipos induziram igual sintomatologia

clínica no trato respiratório de bovinos experimentalmente infectados.

Apesar de compartilharem alta homologia genômica e antigênica BoHV-1 e BoHV-

5 são responsáveis por diferentes patogenias (MEYER et al., 2001). Embora o BoHV-1

possa estar esporadicamente associado a casos de encefelite, o BoHV-5 é o principal

responsável pela ocorrência de meningoencefalites fatais em bovinos (MEYER et al.,

2001). Já o BoHV-5, embora principalmente associado a casos de meningoencefalites não

supurativas, pode causar doença respiratória no gado. Além disto, há relatos de isolamento

de BoHV-5 a partir de casos de aborto (ELY et al., 1996).

1.7.1 Rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR)

A IBR pode apresentar-se de forma subclínica, leve ou severa, podendo atingir

100% de morbidade. Embora incomumente, a mortalidade pode chegar a cerca de 10% . Os

sinais clínicos incluem febre, depressão, inapetência, conjuntivite, grande descarga nasal

inicialmente serosa e posteriormente mucopurulenta. A mucosa nasal torna-se hiperêmica.

As lesões podem ser de difícil visualização, progredindo de pústulas locais a grandes áreas

superficiais, hemorrágicas, que podem se apresentar cobertas por uma membrana diftérica.

O hálito pode ser fétido, podendo haver dispnéia, respiração pela boca, salivação e um

profundo ruído brônquico. Casos agudos podem durar de 5-10 dias (FENNER et al., 1993;

MEYER et al., 2001).

1.7.2 Vulvovaginite pustular infecciosa (IPV)

Vacas afetadas desenvolvem febre, depressão, anorexia, além de micção freqüente e

dolorosa. Devido à dor, o animal mantém a cauda um pouco levantada para evitar o contato

com a vulva. Os lábios da vulva encontram-se aumentados de volume; há uma leve

descarga e a mucosa vestibular fica avermelhada com muitas pústulas pequenas.

Pústulas adjacentes coalescem formando uma pseudomembrana que tende a cobrir a

mucosa. O estágio agudo da doença dura cerca de 4 a 5 dias, sendo que as lesões tendem à

cura em 10 a 14 dias. Muitos casos são subclínicos (FENNER et al., 1993).

1.7.3 Balanopostite pustular infecciosa (IPB)

Bovinos machos podem cursar IPB de forma clínica ou subclínica. Após um período

de incubação de 1 a 3 dias, a mucosa do prepúcio e pênis tornam-se hiperêmicas. Surgem

pontos avermelhados que tendem a formar pápulas, vesículas e pústulas. Estas lesões

podem coalescer formando placas, úlceras e infecções bacterianas secundárias, resultando

em uma descarga prepucial purulenta (VAN OIRSCHOT et al., 1995). Sob condições

naturais, bovinos são infectados através dos tratos respiratório ou genital. Há evidências

circunstanciais de que após infecções experimentais respiratórias ou intranasais por BoHV-

1, seria possível a excreção do vírus através do sêmen (VAN OIRSCHOT, 1995). A IPB

pode ser acompanhada por febre, depressão, perda de apetite e uma diminuição da

qualidade do sêmen através da redução da mobilidade e anormalidades morfológicas dos

espermatozóides (MEYER et al., 2001).

1.7.4 Abortos

O BoHV-1 tem sido apontado como uma causa vírica freqüente de abortos.

Contudo, há relatos de amostras caracterizadas como BoHV-5 isoladas diretamente de

órgãos internos (baço e fígado) de fetos abortados. Órgãos como útero, ovário e embrião

podem sofrer conseqüências diretas de infecção por BoHV-1. O vírus pode atingir estas

estruturas por viremia (posterior à primo-infecção ou através de reativação), ou através de

sêmen contaminado. Dependendo das estruturas envolvidas e período de gestação, as

infecções por BoHV-1 podem determinar quadros de endometrite, ooforite, mortalidade

embrionária com retorno ao cio, mortalidade fetal com aborto, mumificação (raramente),

natimorto, nascimento de animais fracos e mortalidade neonatal (KAHRS e SMITH, 1965;

HEINLEIN et al., 1993; MILLER et al., 1995).

1.7.5 Encefalite

O BoHV-5 é o principal herpesvírus relacionado a casos de meningoencefalites em

bovinos. Entretanto, embora mais raramente, o BoVH-1 também pode estar associado a

este tipo de manifestação (HEINLEIN et al., 1993; BELKNAP et al., 1994; ELY et al.,

1996; ROELS et al., 2000). Segundo trabalhos anteriores envolvendo infecções

experimentais em bovinos com BoHV-1 e BoHV-5 revelaram que apenas os animais

infectados por BoHV-5 desenvolveram meningoencefalite não supurativa (MEYER et al.,

2001). Nos animais que apresentaram encefalite, o DNA de BoHV-5 foi encontrado

freqüentemente no gânglio trigêmio, córtex cerebral, tálamo, mesencéfalo e cerebelo

(MEYER et al., 2001; VOGEL et al., 2003).

A doença é caracterizada por tremores, opistótono, cegueira, convulsões, bruxismo,

incordenação motora e morte (BELKNAP et al., 1994; MEYER et al., 2001; VOGEL et al.,

2003; HÜBNER et al., 2005; SILVA et al., 2006).

1.8 EPIDEMIOLOGIA

1.8.1 Situação no mundo

1.8.1.1. BoHV-1

O BoHV-1 apresenta distribuição mundial sendo reconhecido como responsável por

severas perdas econômicas em rebanhos de corte e de leite (PORTERFIELD, 1989;

WEIBLEN et al., 1991; SMITH et al., 1995).

As infecções pelo BoHV-1 apresentam prevalência variada em países da

Comunidade Européia. A infecção está em processo de erradicação em alguns países,

enquanto outros apresentam prevalências entre 20 e 90% (tabela 3). Áustria, Dinamarca,

Finlândia, Noruega, Suécia e Suíça são países presentemente considerados livres de BoHV-

1 (VAN OIRSCHOT et al., 1996).

Na América do Norte, as infecções pelo BoHV-1 são freqüentes e muito

prevalentes. Clinicamente, há predomínio da forma respiratória da doença, sendo raras as

formas genitais e encefalíticas (OSORIO et al., 1989). Contudo, na América do Sul, estudos

sobre prevalência de BoHV-1, têm revelado uma distribuição variada do agente (tabela 4).

1.8.1.2. BoHV-5

No Hemisfério Sul, o BoHV-5 tem sido isolado de vários surtos de

meningoencefalite de curso geralmente fatal, usualmente em bovinos jovens (STUDDERT,

1990; SALVADOR et al., 1998; THIRY et al., 2006). É curioso que os casos de

meningoencefalite por BoHV-5 estejam aparentemente concentrados neste hemisfério. A

baixa prevalência de encefalites por herpesvirus em países do Hemisfério Norte parece

estar, pelo menos em parte, relacionada aos programas de vacinação contra BoHV-1.

Reações sorológicas cruzadas entre BoHV-1 e BoHV-5, podem também, mascarar a

prevalência de BoHV-5 (BELKNAP et al., 1994; CASCIO et al., 1999; PETZHOLD et al.,

2001; THIRY et al., 2006).

CONTINENTE PAÍS

PREVALÊNCIA

(%)

REFERÊNCIA

Alemanha 84 VAN WUIJCKHUISE et al.,

Bélgica 60-90 BOELAERT et al., 2000

França 20 VAN OIRSCHOT et al., 1996

Holanda 40 VAN OIRSCHOT et al., 1996

Hungria 45 RUSVAI e FODOR, 1998

Inglaterra 50 VAN OIRSCHOT et al., 1996

COMUNIDADE

EUROPÉIA

Itália 35-39 CASTRUCCI et al., 1997

ÁFRICA

Argélia 39,8 ACHOUR e MOUSSA, 1996

AM. DO NORTE

EUA 50 OSORIO et al., 1989

PAÍS

CASOS

ESTUDADOS

PREVALÊNCIA

(%)

TESTE REFERÊNCIA

2140 48 IFI GALARZA e PERIOLO, 1983

1930 17

1930 68

ARGENTINA

1930 30

ELISA FORT et al., 1996

1512 47 SN HOCHSTEIN-MINTZEL et al., 1986

CHILE

2864 41 NI RIEDEMANN, 1996

NI 13-16 NI ZUÑIGA et al., 1978

COLÔMBIA

NI 50 NI GRIFFITHS et al., 1983

797 4 ANDRADE et al., 1967

2380 43

PERU

2380 54

FONDEVILA et al., 1981

Tabela 3. Prevalência de BoHV-1 em alguns países da Comunidade Européia,

América do Norte e África.

Tabela 4. Prevalência de BoHV-1 na América do Sul. Onde: IFI) Imunofluorescência indireta,

ELISA) “Enzime linked immunosorbent assay”, SN) Soroneutralização, NI) Não informado.

1.8.2 Situação no Brasil

No Brasil, BoHV-1 foi isolado pela primeira vez em 1978 por Alice no Estado da

Bahia. No Rio Grande do Sul, há relatos de isolamento de BoHV-1 desde 1992 (WEIBLEN

et al., 1992) e do BoHV-5 desde 1989 (RIET-CORREA, 1989; WEIBLEN et al., 1989).

No Brasil (assim como em outras partes do mundo) faltam meios para estimar a

prevalência real de BoHV-1 e 5 (tabela 5).

REGIÕES ESTADO

CASOS

ESTUDADOS

PREVALÊNCIA

(%)

TESTE REFERÊNCIA

458 35 GALVÃO et al., 1963

2057 74

NORTE

1618 11

RIBEIRO, 1982

CENTRO

GO NI 66 HA ANUNCIAÇÃO et al.,1989

RJ 235 56 SN GRÉGIO et al., 2000

RJ NI 82 HA ANUNCIAÇÃO et al., 1989

384 42 SN MUELLER et al., 1981

184 50 LANGONI et al., 1995

532 40 TONIN et al., 1996

SP/MG 235 77

ELISA

KUNG et al., 1996

SUDESTE

MG NI 66 HA ANUNCIAÇÃO et al., 1989

150 54 MÉDICI et al., 1996

240 27 BARROS FILHO et al., 1997

7397 51

ELISA

MÉDICI et al., 2000

229 33 SN WIZIGMANN et al., 1972

526 82 RAVAZZOLO et al., 1989

7956 19

LOVATO et al., 1995

2341 32 VIDOR et al., 1995

SUL

1823 29 KRAHL et al., 1997

C.I.A

SP/MG/RS 131 73

PITUCO, 1988

Tabela 5. Prevalência de BoHV-1 no Brasil, onde: C.I.A.) Central de inseminação artificial, SN)

Soroneutralização, HA) Hemoaglutinação e NI) Não informado

1.9 Diagnóstico laboratorial

1.9.1 Diagnóstico virológico

O diagnóstico virológico de infecções por BoHV-1 e BoHV-5 é realizado através da

identificação de antígenos virais sobre secreções ou tecidos de animais infectados

(imunofluorescência direta, imuno-histoquímica), do isolamento do vírus em cultivos

celulares ou, ainda, através de métodos moleculares (ROEHE et al., 1997).

O isolamento viral permanece como técnica padrão para a detecção de BoHV-1 e

BoHV-5. Para sua execução, suspensões de tecidos ou secreções são inoculadas em sobre

cultivos de células, as quais podem ser originárias de cultivos primários ou linhagens

celulares contínuas. Após um período variável de incubação, a presença de vírus é

detectada pelo efeito citopático (ECP) causado nos cultivos celulares (WEIBLEN et al.,

1992; ROEHE et al., 1997).

O diagnóstico rápido buscando a identificação de células contendo antígenos virais

em secreções ou tecidos pode ser obtido através das provas de imunofluorescência direta ou

imunoperoxidase (IPX). Estes testes dependem essencialmente do tipo de anticorpos

empregados para a detecção do antígeno. Se realizados com soros policlonais,

provavelmente serão incapazes de diferenciar entre amostras de BoHV-1 e BoHV-5.

Contudo, se realizados com anticorpos monoclonais tipo-específicos, poderão ser capazes

de diferenciar entre estes vírus (ROEHE et al., 1997).

1.9.2 Diagnóstico molecular

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A PCR tem como objetivo a amplificação de uma região alvo no DNA viral.

Apresenta como vantagens o potencial de altos índices de sensibilidade e especificidade,

além da rapidez de execução. Foram desenvolvidas diversas variantes da PCR (Nested

PCR; Multiplex PCR) para detecção de BoHV-1 e BoHV-5, tendo como regiões-alvo

diversas seqüências do genoma destes vírus (VAN ENGELENBURG et al., 1993;

WAGTER et al., 1996; FUCHS et al., 1999; ROS et al., 1999; SCHYNTS et al., 1999;

ALEGRE et al., 2001; ESTEVES et al., 2003; CLAUS et al., 2005).

Análise genômica por restrição enzimática (REA)

Este tipo de análise é voltada para a caracterização genômica de amostras já

isoladas, sendo, desta forma, dependente de isolamento ou multiplicação do vírus em

cultivo celular, para posterior extração e clivagem do DNA viral com enzima(s) de

restrição. Uma vez realizadas as digestões enzimáticas, os produtos obtidos são analisados

em gel de agarose a fim de determinar o perfil de restrição do DNA clivado (ENGELS et

al., 1981; BRAKE e STUDDERT, 1985; ENGELS et al., 1986; METZLER et al., 1986;

BULACH e STUDDERT, 1990; EDWARDS et al., 1990; D'OFFAY et al., 1993; PIDONE

et al., 1999).

1.9.3 Diagnóstico sorológico

Este tipo de diagnóstico pode ser realizado através de uma variedadde de técnicas,

incluindo: hemaglutinação passiva, fixação do complemento, imunoperoxidase (IPX),

imunofluorescência, soroneutralização (SN) e ensaios imunoenzimáticos (KIRBY et al.,

1974; GIBBS e RWEYEMAMU, 1977; OSORIO et al., 1989; RODRIGUEZ et al., 1989;

SHEN et al., 1991; DEREGT et al., 1993; GRAHAM et al., 1997). Usualmente , na maioria

dos laboratórios, o diagnóstico sorológico de infecções por BoHV-1 ou BoHV-5 baseia-se

em testes de SN (considerada como método padrão) ou ensaios tipo ELISA (ROEHE et al.,

1997).

Soroneutralização (SN)

A SN é considerada a técnica padrão para detecção de anticorpos neutralizantes

contra BoHV-1 (BITSCH, 1978; ROEHE et al., 1997). Entretanto, é uma técnica

trabalhosa, dependente da manutenção de um estoque de vírus e de cultivos celulares

adequados. Variantes dessa prova tem sido propostas, onde o período de incubação para

neutralização do vírus através dos anticorpos pode variar de 1 a 24 horas. O resultado da

prova é usualmente obtido em três a cinco dias (BITSCH, 1978). Entretanto, a SN não

permite uma diferenciação clara entre animais infectados com BoHV-1 ou BoHV-5. Cerca

de 92 % dos animais infectados com BoHV-1 e BoHV-5 apresentam reações cruzadas `a

SN, quando a prova é realizada frente a ambos os vírus, ressaltando o alto grau de

reatividade cruzada existente entre estes (ROEHE et al., 1998; TEIXEIRA et al., 1998).

Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)

Ensaios imunoenzimáticos do tipo “ELISA” (do inglês “enzyme linked

immunosorbent assay”) são presentemente muito utilizados para diagnóstico sorológico,

devido a sua alta sensibilidade, especificidade, capacidade de processamento de grandes

número de amostras, relativa facilidade e rapidez de execução. Os reagentes são, em

princípio, baratos, estáveis, fáceis de preparar e, geralmente, os resultados de provas tipo

ELISA, podem ser quantificados através do uso de um simples espectrofotômetro

(BOLTON et al., 1983). No Brasil, o uso de testes de ELISA comerciais tem sido

dificultado em função do custo de aquisição dos mesmos. Em função disso, em alguns

laboratórios, testes do tipo ELISA produzidos internamente tem sido utilizados

(TEIXEIRA et al., 2001; SPILKI et al., 2005).

Atualmente, no comércio mundial, há vários tipos de ELISA disponíveis para

diagnóstico sorológico de infecções por BoHV-1 (HERRING et al., 1980; CHO e BOHAC,

1985; EDWARDS e GITAO, 1987; KRAMPS et al., 1994; GRAHAM et al., 1997;

TEIXEIRA et al., 2001; WELLENBERG et al., 2001; KRAMPS et al., 2004); testes

específicos para BoHV-5 são mais raros (LINDNER et al., 1993; DUCA et al., 2000),

provavelmente porque a importância deste tipo de vírus em países do Hemisfério Norte é

bem menor. Dentre estes, dois autores (TEIXEIRA et al., 2001; WELLENBERG et al.,

2001) comentam que amostras positivas para BoHV-5 foram analisadas e que reações

cruzadas foram detectadas.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Contribuir para um melhor entendimento da epidemiologia de BoHV-1 e 5.

2.2 Objetivo Específico

Através de estudos do gene que codifica a glicoproteína C (gC) de BoHV-1 e

BoHV-5, desenvolver ferramentas para diagnóstico laboratorial que possibilitem a

diferenciação molecular entre estes dois agentes.

Capítulo 1

Differentiation between bovine herpesvirus types 1 and 5 (BoHV- 1/5) by polymerase

chain reaction-restriction enzyme analysis (PCR – REA)

Esteves, P.A

1,2

.; Silva, A.D

.; Spilki, F.R

.; Pinto, L.S

.; Dellagostin, O.A.

; Franco, A.C

Rijsewijk, F.A.M.

; Puentes, R.

; Maisonnave, J.

; Roehe, P.M.

2,5

1.Embrapa Suínos e Aves, BR 153 Km 110 CEP.: 89700000, Concórdia/SC

[email protected] ;

2.Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Ggraduação em

Ciências Veterinárias – PPGCV ;

3. Laboratório de Virologia Animal, Instituto de Biologia – UNICAMP, P.O. Box 6109,

13084-970 Campinas, Brazil;

4.Universidade Federal de Pelotas, Centro de Biotecnologia. Pelotas, RS, Brazil;

5.Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em

Microbiologia dos Solos;

6. Area de Inmunología. Facultad de Veterinaria – Universidad de la República –

URUGUAY

Abstract

A method for differentiation between bovine herpesvirus types 1 and 5 (BoHV-1 and 5)

was developed based on a polymerase chain reaction followed by a restriction enzyme

analysis (PCR/REA). The PCR/REA was designed to amplify segments of the less

conserved regions on the carboxy-terminal portion of the glycoprotein C (gC) gene, giving

rise to amplicons of 575 base pairs (pb) for BoHV- 1.1/ 1.2, and 572 bp for BoHV-5. After

digestion with the Bgl I restriction enzyme while the BoHV-1 amplicons were not digested,

the BoHV-5 amplicons were separeted in two smalers fregments (239 abd 333 base pair)

alowing the differentiation between BoHV-1 and 5. Twenty eight BoHV isolates and

alphaherpesviruses of other species were examined in order to validate the assay. Although

a more extensive comparison is needed, we conclude that the PCR assay described here

may be a good alternative for an differential detection of BoHV-1 or BoHV-5.

Key words: BoHV-1; BoHV-5; Polymerase chain reaction; Restriction enzyme analysis;

glycoprotein C.

Introduction

Bovine herpesvirus (BoHV) type 1 (BoHV-1), and its subtypes 1 and 2 (BoHV-1.1

and BoHV-1.2), as well as BoHV type 5 (BoHV-5) are members of the Herpesviridae

family, subfamily Alphaherpesvirinae. BoHV virions contain a genome composed by

approximately 135.000 base pairs (bp) of double stranded DNA that codies about 70 to

100 proteins (Roizman e Knipe, 2001; Delhon et al., 2003; Thiry et al., 2006a). Whereas

BoHV-1.1 and BoHV-1.2 are often associated to infections of the respiratory and genital

tracts, BoHV-5 is usually associated to fatal meningoenchephalitis occurring mainly in

young animals (Carrilo et al., 1983; Salvador et al., 1998). However, such association is not

absolute since, occasionally, both BoHV-1.1 and BoHV-1.2 may be associated to

respiratory tract disease (D'Arce et al., 2002). Yet some BoHV-1.2 isolates may cause

severe respiratory illness under experimental conditions (Spilki et al., 2004).

BoHV-1 subtypes (1.1 and 1.2) share extensive genomic homology. Nucleotide

identity between subtypes is around 98%whereas between the two virus types (1 and 5) the

nucleotide homology is about 85% (Metzler et al., 1985; Engels et al., 1986). Such degree

of similarity reflects results in the extensive serological cross reactions detected between

the two virus types (Brake e Studdert, 1985; Metzler et al., 1985; Metzler et al., 1986;

Engels et al., 1987). Despite such high homology, BoHV-1 and BoHV-5 bear differences

along the genome which may be useful for type/subtype specific differentiation (Ashbaugh

et al., 1997; Alegre et al., 2001; Claus et al., 2005; Spilki et al., 2005). One of such regions

is the glycoprotein C (gC) gene which; in view of its high degree of variability along its N-

terminal region, has often been envisaged as a target for the development of type-

differential tests (Chowdhury, 1995; Wellenberg et al., 2001; Spilki et al., 2005). Here, a

method to differentiate BoHV types 1 and 5 by polymerase chain reaction followed by

restriction enzyme analysis (PCR – REA) is described.

Materials and methods

Cells and virus

Madin Darby bovine kidney (MDBK) cells were grown in Eagle’s essential medium

(EMEM, Gibco BRL, USA) supplemented with 5 to 10% of fetal bovine serum (FBS,

Gibco BRL, USA), antibiotics and amphotericin B (Sigma). These cells were used for all

virus isolation (if necessary), multiplication and titration procedures carried out in this

study. BoHV-1 and 5 field isolates and standard strains used are listed in table 1.

The specificity of the PCR was verified with different viruses, including equine

herpesvirus 1 (EHV-1), canine herpesvirus (CaHV-1), bovine viral diarrhea virus (BVDV),

feline herpesvirus type 1 (FHV-1), pseudorabies virus (PRV) and cervine herpesvirus

(CerHV). These were obtained from the stocks of the Virology section of the Instituto de

Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor (IPVDF).

Viral DNA extraction

Total DNA was extracted from viral suspensions as previously described (Vilcek et

al., 1994) with small modifications. Samples (0.5 mL) of BoHV- infected cells suspended

in culture medium were incubated with 15 μL of sodium dodecil sulfate (SDS 10%) and 5

μL of proteinase K (20 mg/mL) for 60 min at 37 ºC. The solution was then extracted with

one volume of phenol (pH 8.0) and centrifuged for 3 min at 14000 x g. The aqueous

fraction was transferred to a 1.5 mL tube and mixed with an equal volume of chloroform:

isoamyl alcohol (24:1). After another centrifugation step (3 min, 14000 x g), the DNA was

precipitated with 2 volumes of cold ethanol and 0.3 M NaCl for 30 min at -20 ºC,

centrifuged at 14000 x g for 20 min. The pellet obtained was rinsed with 1 mL of 70%

ethanol, dried and resuspended in 30 μL of ultrapure water and stored at -20 ºC until use.

The DNA concentration and purity were determined with a spectrophotometer (Pharmacia

LKB Biochrom Ltd., United Kingdom).

Polymerase chain reaction

The primers used in the PCR assays were designed based on the gC gene sequences

of both BoHV-1 and BoHV-5 available at GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Primers forward (PF 5’ CGGCCACGACGCTGACGA 3’) and reverse (PR 5’

CGCCGCCGAGTACTACCC 3’) were designed to target a 575 / 572 bp fragment on

BoHV-1 and 5 (nucleotides 873-1447 and 813-1384 from sequences assecion numbers

Z49223 and Z49224 respectivelly).

Amplification reactions were performed in a thermocycler (Mastercycler

Eppendorf) under the following conditions: a denaturation step of 1 minute at 94 °C,

followed by 35 cycles of 1 min at 94 °C (denaturation); 1 min at 60 °C (annealing); 1 min

at 72 °C (extension) and one last extension step of 5 min at 72 °C. The products were

analysed by 1% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide (0.5 µg/mL) in

TBE buffer pH 8.4 (89 mM Tris; 89 mM boric acid; 2 mM EDTA), and visualized under

UV light. The size of the amplified products was determined by comparison with a 1 kb

DNA ladder (Invitrogen).

Sensitivity and specificity of the PCR

To evaluate the sensitivity of the assay, series of 10-fold dilutions of purified viral

DNA were used. The specificity of the PCR was demonstrated by attempting to amplify

DNA from equine herpesvirus type 1 (EHV-1), canine herpesvirus (CaHV-1), bovine viral

diarrhea virus (BVDV), feline herpesvirus type 1 (FHV-1), pseudorabies virus (PRV) and

cervine herpesvirus (CerHV).

Restriction enzyme analysis (REA)

The amplicons obtained in the PCR reactions were purified using the GFX

PCR

DNA and Gel Band Purification kit (Amersham Biosciences) for further enzymatic

digestions. The reactions were performed using 80 to 100 ng of the purified PCR product.

In order to differentiate BoHV-1 from BoHV-5 the amplicons were digested with Bgl I

(New England Biolabs) restriction enzyme. The products of the digestion reactions were

submmited to electrophoresis on 1 % agarose gels and visualized as described for analysis

of PCR amplicons.

Results

Specificity and Sensitivity of the PCR

The designed PCR amplified DNA from all strains of BoHV-1 (1.1, 1.2) and

BoHV-5 here tested (figure 1). To examine the specificity of the PCR, seven related

herpesvirus strains were tested. After the PCR no specific products could be detected from

these related viruses. Also, when 1 μg of salmon sperm DNA or DNA derived from MDBK

cells non-infected were tested, no specific products were obtained. These results indicated

that this PCR was specific for BoHV-1.1; 1.2 and 5.

To determine the sensitivity of the PCR, 10-fold dilutions of purified BoHV-1 DNA

were submitted to amplification. As few as seventeen molecules of BoHV-1 were

amplified, and the products were easily visualized on an ethidium bromide-stained agarose

gel (figure 2).

Restriction enzyme analysis (REA)

Cleavage patterns generated by digestion with Bgl I allowed the differentiation

between BoHV-1 and 5 (figure 3). As the BoHV-5 amplicon has a site for Bgl I at position

239 nct, the digestion of the BoHV-5 amplicon generated two fragments (239 bp and 333

bp) (figure 3). The Bgl I site is located at the position 1045-1055 in the BoHV-5 gC gene

sequence (assecion number Z49224). Isolateds of BoHV-1, in the other hand showed one

base change (C→G) at the position 1106 of the gC gene sequence (assecion number

Z49223). This change impaired the cleavage by Bgl I digestion enzyme at site 1105-1115 in

the BoHV-1 gC gene sequence (assecion number Z49223).

Discussion

Until the beginning of the eighties, BoHV-1 was understood as the responsible for

such differents like infectious bovine rinotracheitis (IBR); infectious pustular

vulvovaginitis/ balanopostitis (IPV/ IPB); abortions; conjunctivitis and rarely

encephalitis, based almost exclusively in the viral antigenic propierties (Gibbs and

Rweyemamu, 1977). Further studies, however, start to change this concept. With the advent

of the molecular techniques together with the previously antigenic knowledge, it was

possible investigate the molecular characterization of BoHV-1 and the virus was then

clasified in very related but distinct types and subtypes, each one more closely related with

certain types of syndromes . BoHV-1 was divided in subtypes (1.1; 1.2 a/b and 1.3 a/b).

Subtypes 1.1 and 1.2 were usually associated (though not exclusively) with clinicals signs

in the respiratory and genital tract. Subtype 1.3 was usually related to cases of

meningoencephalitis (Engels et al., 1981; Mayfield et al., 1983; Engels et al., 1986). Later,

the encephalitic BoHV-1.3 isolates were considered distinct enough to warrant status of a

new type; subtype 1.3 was then renamed and reclassified as BoHV-5 (Roizman et al.,

1992).

Despite the clinical, antigenic and molecular differences BoHV-1 and BoHV-5 are

very closely related, sharing (on average) 82% of amino acid identity (Delhon et al., 2003).

As BoHV-1 is distributed worldwide and BoHV-5 seems to occur mainly in the regions

where control of BoHV-1 infections is scarce or non-existent, this high antigenic homology

it’s responsible for the lack of information on the actual distribution of BoHV-5 (Roehe et

al., 1997).

In order to develop a technique for differential detection of BoHV-1 and 5 is an

important strategy search into the viral genome regions with lower degree of homology

between these viruses. The glycoprotein C (gC) is an important but not essential envelope

viral protein that show a relative low degree of homology between BoHV-1 and 5 (75%).

makes the gC an important target in the development of assays aimed the differential

detection of these virus.

In recent years different reports have been published describing PCR methods for

detection of BoHV-1 (van Engelenburg et al., 1993; Vilcek et al., 1993), or to differentiate

BoHV-1 to BoHV-5 (Ashbaugh et al., 1997; Ros et al., 1999; Moore et al., 2000; Alegre et

al., 2001; Esteves et al., 2003; Claus et al., 2005).

With the aim to provide a method to differentiate between BoHV-1 and 5 and thus

contribute to a better understanding of the epidemiology of these infections in cattle, the

present work was carried out to develop a PCR/REA applicable in the differential diagnosis

of BoHV-1 and 5.

For that, the carboxy-terminal region of the gC gene was targeted for PCR

amplification and REA analysis (PCR/REA). An amplicon of 575 or 572 bp on BoHV-5

was digested with restriction enzyme Bgl I for differentiation between the two virus types

BoHV-1 or 5. After digestion, it was possible to differentiate between BoHV-1 and 5. The

PCR/ REA proved to be a useful tool for differentiating these two virus types.

Acknowledgements

This work was supported by CNPq and CAPES. Roehe, PM is a CNPq research fellow.

References

Alegre, M.; Nanni, M.; Fondevila, N. (2001). "Development of a multiplex polymerase

chain reaction for the differentiation of bovine herpesvirus-1 and -5." J Vet Med B

Infect Dis Vet Public Health 48(8): 613-21.

Ashbaugh, S. E.; Thompson, K. E.; Belknap, E. B.; Schultheiss, P. C.; Chowdhury, S.;

Collins, J. K. (1997). "Specific detection of shedding and latency of bovine

herpesvirus 1 and 5 using a nested polymerase chain reaction." J Vet Diagn Invest

9(4): 387-94.

Brake, F. and Studdert, M. J. (1985). "Molecular epidemiology and pathogenesis of

ruminant herpesviruses including bovine, buffalo and caprine herpesviruses l and

bovine encephalitis herpesvirus." Aust Vet J 62(10): 331-4.

Carrillo, B. J.; Ambrogi, A.; Schudel, A. A.; Vazquez, M.; Dahme, E.; Pospischil, A.

(1983). "Meningoencephalitis caused by IBR virus in calves in Argentina." Zent

Vet B 30(5): 327-32.

Chowdhury, S. I. (1995). "Molecular basis of antigenic variation between the glycoproteins

C of respiratory bovine herpesvirus 1 (BHV-1) and neurovirulent BHV-5." Virology

213(2): 558-68.

Claus, M. P.; Alfieri, A. F.; Folgueras-Flatschart, A. V.; Wosiacki, S. R.; Medici, K. C.;

Alfieri, A. A. (2005). "Rapid detection and differentiation of bovine herpesvirus 1

and 5 glycoprotein C gene in clinical specimens by multiplex-PCR." J Virol

Methods 128(1-2): 183-8.

D'Arce, R. C.; Almeida, R. S.; Silva, T. C.; Franco, A. C.; Spilki, F.; Roehe, P. M.; Arns, C.

W. (2002). "Restriction endonuclease and monoclonal antibody analysis of

Brazilian isolates of bovine herpesviruses types 1 and 5." Vet Microbiol 88(4): 315-

24.

Delhon, G.; Moraes, M. P.; Lu, Z.; Afonso, C. L.; Flores, E. F.; Weiblen, R.; Kutish, G. F.;

Rock, D. L. (2003). "Genome of bovine herpesvirus 5." J Virol 77(19): 10339-47.

Engels, M.; Steck, F.; Wyler, R. (1981). "Comparison of the genomes of infectious bovine

rhinotracheitis and infectious pustular vulvovaginitis virus strains by restriction

endonuclease analysis." Arch Virol

67(2): 169-74.

Engels, M.; Loepfe, E.; Wild, P.; Schraner, E.; Wyler, R. (1987). "The genome of caprine

herpesvirus 1: genome structure and relatedness to bovine herpesvirus 1." J Gen

Virol 68 ( Pt 7): 2019-23.

Engels, M.; Giuliani, C.; Wild, P.; Beck, T. M.; Loepfe, E.; Wyler, R. (1986). "The genome

of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) strains exhibiting a neuropathogenic potential

compared to known BHV-1 strains by restriction site mapping and cross-

hybridization." Virus Res

6(1): 57-73.

Gibbs, E. P. J. and Rweyemamu, M. M. (1977). "Bovine herpesvirus. Part I. bovine

herpesvirus 1." The Vet Bull

47: 317-343.

Madin S.H., York C.J. & McKercher D.G. (1956). “Isolation of the infectious bovine

rhinotracheitis virus.” Science 124:721-722.

Mayfield, J. E.; Good, P. J.; VanOort, H. J.; Campbell, A. R.; Reed, D. E. (1983). "Cloning

and cleavage site mapping of DNA from bovine herpesvirus 1 (Cooper strain)." J

Virol 47(1): 259-64.

Metzler, A. E.; Schudel, A. A.; Engels, M. (1986). "Bovine herpesvirus 1: molecular and

antigenic characteristics of variant viruses isolated from calves with neurological

disease." Arch Virol

87(3-4): 205-17.

Metzler, A. E.; Matile, H.; Gassmann, U.; Engels, M.; Wyler, R. (1985). "European isolates

of bovine herpesvirus 1: a comparison of restriction endonuclease sites,

polypeptides, and reactivity with monoclonal antibodies." Arch Virol 85(1-2): 57-

69.

Roizman, B. and Knipe, M. D. (2001). Herpes simplex virus and their replication.

Philadelphia, Lippincott Williams and Wilkins publishers.

Roizman, B.; Desrosiers, R. C.; Fleckenstein, B.; Lopez, C.; Minson, A. C.; Studdert, M. J.

(1992). "The Family Herpesviridae: an up date." Arch Virol 123: 425-448.

Salvador, S. C.; Lemos, R. A. A.; Riet-Correa, F.; Roehe, P. M.; Osório, A. L. (1998).

"Meningoencefalite em bovinos causada por herpesvirus bovino-5 no Mato Grosso

do Sul e São Paulo." Pesq Vet Bras 18: 76-83.

Spilki, F. R.; Esteves, P. A.; da Silva, A. D.; Franco, A. C.; Rijsewijk, F. A.; Roehe, P. M.

(2005). "A monoclonal antibody-based ELISA allows discrimination between

responses induced by bovine herpesvirus subtypes 1 (BoHV-1.1) and 2 (BoHV-

1.2)." J Virol Methods 129(2): 191-3.

Spilki, F. R.; Esteves, P. A.; Lima, M.; Franco, A. C.; Chiminazzo, C.; Flores, E. F.;

Weiblen, R.; Driemeier, D.; Roehe, P. M. (2004). "Comparative pathogenicity of

bovine herpesvirus 1 (BHV-1) subtypes 1 (BHV-1.1) and 2a (BHV-1.2a)." Pesq Vet

Bras 24(1): 43-49.

Thiry, J.; Keuser, V.; Muylkens, B.; Meurens, F.; Gogev, S.; Vanderplasschen, A.; Thiry,

E. (2006). "Ruminant alphaherpesviruses related to bovine herpesvirus 1." Vet Res

37(2): 169-90.

Vilcek, S. (1993). "Detection of the bovine herpesvirus-1 (BHV-1) genome by PCR." J

Virol Methods 41(2): 245-7.

Wellenberg, G. J.; Mars, M. H.; Van Oirschot, J. T. (2001). "Antibodies against bovine

herpesvirus (BHV) 5 may be differentiated from antibodies against BHV1 in a

BHV1 glycoprotein E blocking ELISA." Vet Microbiol 78(1): 79-84.

Tables and figures

Table 1. Bovine herpesviruses used in the present study.

Vírus Classification Clinical Sings Country/ State Reference/ Origin

1 Los Angeles (LA) BoHV-1.1 Rhinotracheitis USA

Madin et al., 1956

2 Cooper BoHV-1.1 Rhinotracheitis USA Madin et al., 1956

3 Lam BoHV-1.1 Rhinotracheitis HOL Van Engelenburg et al. 1994

4 T3 BoHV-1.1 Rhinotracheitis URU FVURU

5 UY1999 BoHV-1.1 Rhinotracheitis URU FVURU

6 UY2002 BoHV-1.2 Rhinotracheitis URU FVURU

7 UY2004 BoHV-1.2 Rhinotracheitis URU FVURU

8 SV265/96 BoHV-1.2 Rhinotracheitis BRA/RS UFSM

9 EVI123/98 BoHV-1.1 Rhinotracheitis BRA/RS Souza et al., 2002

10 EVI14/94 BoHV-1.2 Abortion BRA/RS Souza et al., 2002

11 EVI1779 BoHV-1.2 Abortion BRA/RS IPVDF

12 PG2560 BoHV-1.1 Abortion BRA/RS IPVDF

13 A663 BoHV-5 Encephalitis ARG Carrillo et al., 1983

14 N569 BoHV-5 Encephalitis AUS French, 1962

15 T2 BoHV-5 Encephalitis URU FVURU

16 AA05 BoHV-5 Encephalitis BRA/MS Souza et al., 2002

17 EVI88/95 BoHV-5 Encephalitis BRA/RS Souza et al., 2002

18 EVI99 BoHV-5 Encephalitis BRA/RS Souza et al., 2002

19 EVI100 BoHV-5 Encephalitis BRA/RS Souza et al., 2002

20 EVI340/96 BoHV-5 Encephalitis BRA/MS Souza et al., 2002

21 SV136 BoHV-5 Encephalitis BRA/RS Souza et al., 2002

22 SV507 BoHV-5 Encephalitis BRA/RS Delhon et al., 2003

23 Taim BoHV-5 Encephalitis BRA/RS Souza et al., 2002

24 ISO45/97 BoHV-5 Encephalitis BRA/MG Souza et al., 2002

25 ISO87/97 BoHV-5 Encephalitis BRA/SP Souza et al., 2002

26 P160/96 BoHV-5 Encephalitis BRA/RJ Souza et al., 2002

27 RP BoHV-5 Encephalitis BRA/RS Souza et al., 2002

28 V175 BoHV-5 Semen BRA/RS Esmeraldino et al., 1996

1. Universidad de la República/ Uruguay

2. Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor/ Rio Grande do Sul/ Brazil

Figure 1. Ethidium bromide stained 1% agarose gel electrophoresis of the amplified

products by PCR for BoHV-1 (574 bp) and BoHV-5 (571 bp) glycoprotein C gene. Lanes:

1,5) Marker ladder 100 pb; 2) EVI 88/BoHV-5; 3) A663/BoHV-5; 4) N569/BoHV-5;

6) PG 2560/BoHV-1.1; 7) EVI 1779/BoHV-1.2; 8) LA/BoHV-1

Figure 2. Determination of the sensitivity of PCR. Products obtained from a 10 fold

dilutions series of viral DNA were analyzed on 1 % ethidium bromide stained agarose gel

electrophoresis. Lanes: 1) Marker Ladder 100 pb; 2) 10

-1

; 3) 10

-2

; 4) 10

-3

; 5) 10

-4

; 6)

-5

; 7) 10

-6

; 8) 10

-7

; 9) 10

-8

; 10-fold dilutions of viral DNA BoHV-1; 10) Negative

control.

1 2 3 4 5 6 7 8

575 bp

BoHV-5 BoHV-1

572 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

500 bp

Figure 3. Restriction Endonuclease Analysis of the PCR products digested with BglI

restriction enzyme. Lanes: 1,5) Marker Ladder 100 pb; 2) EVI 88/BoHV-5; 3)

A663/BoHV-5; 4) N569/BoHV-5; 6) PG 2560/BoHV-1.1; 7) EVI1779/BoHV-1.2; 8)

LA/BoHV-1.

1 2 3 4 5 6 7 8

BoHV-5 BoHV-1

575 bp

500 bp

333 bp

239 bp

Capítulo 2

Phylogenetic comparison of the carboxy-terminal region of glycoprotein C (gC) of

bovine herpesvirus (BoHV) 1.1, 1.2 and 5

Esteves, PA

1,2

; Silva, AD

; Spilki, FR

; Pinto, LS

; Dellagostin, OA

; Hübner, SO

;

Puentes, R

; Maisonnave, J

; Franco, AC

; Rijsewijk, FAM

; Batista, HBCR

; Teixeira,

; Dezen, D

; Oliveira, AP

; Arns, CW

; Roehe, PM

2,6

5. Embrapa Suínos e Aves, BR 153 Km 110 CEP.: 89700000, Concórdia/SC

[email protected]

;

6. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em

Ciências Veterinárias – PPGCV

7. Universidade de Campinas,

8. Universidade Federal de Pelotas, Centro de Biotecnologia. Pelotas, RS, Brazil.

5. Area de Inmunología. Facultad de Veterinaria – Universidad de la República –

URUGUAY

6. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Programa de Pós Graduação em

Microbiologia dos Solos;

Abstract

Different types and subtypes of BoHV-1 and BoHV-5 have been associated to different

clinical conditions of cattle, in such a way that type/subtype differentiation has become an

essential tool for understanding pathogenesis and epidemiology of BoHV infections in

cattle. However, currently available methods for type/subtype differentiation are

complicated by cross-reactions between these two virus types. In search for a region that

would allow a clear distinction between BoHV-1 and 5, the carboxy-terminal portion of

glycoprotein C (gC), corresponding to residues 321 - 450 (BoHV-1) and 301 - 429 (BoHV-

5) of 23 South American isolates was amplified and sequenced. The nucleotide sequence

alignments revealed identity ranged from 98,7 to 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 to 92%

(BoHV-1/ BoHV-5) and 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5) strains/isolates. The identity

deduced from amino acid sequences ranged from 97,5 to 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5

to 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) and 92,1 to 99,5% (BoHV-5/ BoHV-5). Phylogenetic

analyses and deduced amino acid sequences revealed that: i) some BoHV-5 isolates (ISO45

and ISO87) seems to be “non a non b” subtype and ii) The Uruguayan strain (UY2002) has

a distinct nucleotide and amino acid sequence when compared to others BoHV-1.2 strains.

Key words: Bovine herpesvirus type 1; Bovine herpesvirus type 5; Phylogenetic analysis.

Introduction

Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are members of

Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily, Varicellovirus genus. According to

antigenic and genomic characteristics BoHV-1, was previously divided in two distinct very

closely related subtypes named BoHV-1.1 and BoHV-1.2 (Metzler et al., 1986; Miller et

al., 1991; Roizman et al., 1992). Despite that, they have been associated to distinct

manifestations of disease in cattle (Engels et al., 1992). While BoHV-1.1 can cause

respiratory tract infections known as infectious bovine rhinotracheitis (IBR), BoHV-1.2 and

its variants, known as “BoHV-1.2a” and “BoHV-1.2b”) are associated with infections of

the reproductive tract, a disease named infectious pustular vulvovaginitis/balanopostitis

(IPV/IPB) (Metzler et al., 1986; Miller et al., 1991). However, BoHV-1.2a strains may

induce clearly noticeable disease in calves under natural and experimental inoculations

(D'Arce et al., 2002; Spilki et al., 2004). Although epidemiological data strongly suggest

that BoHV-1.1 and 1.2 strains differ in their clinical effects, it is difficult to determine the

precise biological differences between the two viruses (Rijsewijk et al., 1999; Spilki et al.,

2004). Both subtypes are able to infect respiratory and genital tract of cattle, however, it has

been suggested that each genotype is better adapted to either respiratory (BoHV-1.1) or

genital (BoHV-1.2) tract (Edwards et al., 1991; Rijsewijk et al., 1999; Spilki et al., 2004).

Meanwhile, BoHV-5 is responsible for a severe non-suppurative

meningoenchephalitis in young calves (Meyer et al., 2001; Delhon et al., 2003). It may also

be found infecting the genital tract of cattle (Esteves et al., 2003; Gomes et al., 2003). As in

BoHV-1.2, different strains of BoHV-5 were previously named “BoHV-5a”; “BoHV-5b”

and “BoHV-5 non a non b”, according to molecular and/or antigenic characteristics

(D’Arce et al., 2003; Rijsewijk et al., 1999).

Despite of the high degree of similarity between BoHV-1.1; BoHV-1.2 and BoHV-

5, there are genomic regions of these viruses that can be used for the development of new

differential diagnostic tests (Alegre et al., 2001; Esteves et al., 2003; Claus et al., 2005;

Spilki et al., 2005). BoHV glycoprotein C (gC) is inserted into the viral envelope; it is a

nonessential type I transmembrane protein that belongs to the immunoglobulin superfamily

(Fitzpatrick et al., 1989). It is a dimeric glycoprotein that consists of 521 (BoHV-1) and

471 (BoHV-5) amino acid (aa) residues (Fitzpatrick et al., 1989; Chowdhury et al., 1997).

In order to compare the degree of identity between different strains of BoHV-1.1;

BoHV-1.2 and BoHV-5, we carried out amplification, sequencing and phylogenetic

analysis the carboxy-terminal regions comprising amino acids 321 to 450 (on BoHV-1)

and 301 to 429 (on BoHV-5) of the gC gene from 23 South American BoHV-1.1, BoHV-

1.2 and BoHV-5 isolates.

Material and methods

Cells and virus

Virus multiplication, quantitation and isolation from tissues were performed on

Madin Darby bovine kidney cells (MDBK, ATCC, CCL-22). Cells were routinely

maintained in Eagle’s minimal essential medium (E-MEM) supplemented with 6 % foetal

calf serum (FCS, Nutricell) and 2 mg/L enrofloxacin (Baytril, Bayer). Cells were

maintained and multiplied following standard procedures (Roehe et al., 1997).

The virus strains /isolates used in the study are shown in table 1, with the exception

of the sequence of the pseudorabies virus (PrV) and the sequences of the glycoprotein C of

the Bovine herpesvirus types 1 and 5 (GenBank accession numbers AF403051, Z49223,

and Z49224 respectivally), included for comparisons.