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FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
AVALIAÇÃO DA BACTERIOCINA P34 NO CRESCIMENTO DE Listeria
monocytogenes EM LINGÜIÇA FRESCAL DE FRANGO
DEONI APARECIDA FERREIRA DE QUADROS
PORTO ALEGRE - RS
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
AVALIAÇÃO DA BACTERIOCINA P34 NO CRESCIMENTO DE Listeria
monocytogenes EM LINGÜIÇA FRESCAL DE FRANGO
Autor: DEONI APARECIDA FERREIRA DE QUADROS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande
do Sul como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias.
Orientador: Prof. Dr. Adriano Brandelli
Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos - ICTA/UFRGS
PORTO ALEGRE – RS
2007
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Catalogação na fonte preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Veterinária da UFRGS
Q1a Quadros, Deoni Aparecida Ferreira de
Avaliação da bacteriocina P34 no crescimento de Listeria
monocytogenes em lingüiça frescal de frango / Deoni
Aparecida Ferreira de Quadros - Porto Alegre: UFRGS, 2007.
65 f.; il. – Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, Faculdade de Veterinária, Programa de
Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Porto Alegre, BR-
RS, 2007. Adriano Brandelli, Orient.
1. Atividade antimicrobiana 2. Bacteriocina P34
3. Listeria monocytogenes 4. Lingüiça frescal de frango
I. Brandelli, Adriano, Orient. II. Título
CDD 619.48
Deoni Aparecida Ferreira de Quadros
AVALIAÇÃO DA BACTERIOCINA P34 NO CRESCIMENTO DE Listeria
monocytogenes EM LINGÜIÇA FRESCAL DE FRANGO
Aprovada em
APROVADO POR:
----------------------------------------------------------------------------------------
Profº. Drº. Guiomar Pedro Bergmann
Membro da Comissão
----------------------------------------------------------------------------------------
Profº. Drº. Plinho Francisco Hertz
Membro da Banca
----------------------------------------------------------------------------------------
Profº. Drº. Elci Lotar Dickel
Membro da Banca
A Deus, Infinito de Luz e Energia que rege todas as coisas, aos meus pais, Antonio
Silveira de Quadros (in memorian) e Doreni Ferreira Bastos, que formaram minha
conduta e aos espíritos de luz que me guiaram.
AGRADECIMENTOS
Aos professores do Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos
e da Faculdade de Veterinária, em especial ao meu orientador Adriano Brandelli pela
oportunidade única, confiança, solidariedade e compreensão: Obrigada! Aos professores
Erna, Avancini e Wiest pelas conversas de corredor e apoio incondicional.
Aos funcionários do ICTA, em especial à Luísa, pelo ombro amigo,
ao Roberval pelos “acidentes” e ao pessoal da Secretaria.
Ao Voltaire, sem você não teria acontecido! Amanda, Silvana,
Florência, Roberta, Lucas, Daniel, Rosiele, Ana, Rodrigo e Mário, valeu por tudo!
À empresa BOAVE Ltda. pelo apoio e material cedido, na pessoa
do Sr. André da Rosa Severo.
À Escola Michigan – Canoas, nas pessoas dos meus grandes amigos
Ivan Lamb e Luís Fraga pela confiança e amizade sem limites.
Às minhas grandes amigas Guga, Ana Luisa, Bel, Daí e Marta e ao
Diego Fagundes, que de uma forma ou de outra me ajudaram a concretizar esta etapa e
nunca me abandonaram.
A todos os amigos que de muito longe torceram por mim, em várias
cidades do Estado.
Ao Eduardo, pela cumplicidade e compreensão de tantas viagens.
À minha mãe Dorení, que provou mais uma vez ser a melhor amiga
que eu poderia ter, obrigada por estar comigo me ajudando de todas as formas nestes
momentos e por ter me mostrado o caminho a seguir!
AVALIAÇÃO DA BACTERIOCINA P34 NO CRESCIMENTO DE Listeria
monocytogenes EM LINGÜIÇA FRESCAL DE FRANGO
Autor: Deoni Aparecida Ferreira de Quadros
Orientador: Prof. Adriano Brandelli
RESUMO
A bacteriocina P34 é produzida por um Bacillus sp. e apresenta
atividade antimicrobiana para diversas espécies de Listeria sp. e para L. monocytogenes
ATCC 7644. Neste trabalho, foi pesquisada a presença de bactérias lácticas em lingüiça
frescal de frango. Os resultados demonstraram o isolamento de seis culturas em placas
de ágar MRS a 30ºC por 48 h. Cinco das seis linhagens isoladas inibiram o crescimento
da L. monocytogenes após incubação a 30
o
C por 24 h. Os sobrenadantes brutos destas
bactérias lácticas demonstraram efeito sinérgico quando adicionados em conjunto com a
bacteriocina P34 frente ao microrganismo indicador, L .monocytogenes, pelo método de
difusão em ágar com discos. Foi inoculada L. mononocytogenes ATCC 7644 em
suspensão com 10
3
UFC/g em lingüiça frescal de frango no dia zero e recuperada em
meio MOX nos dias zero, três, sete e dez da inoculação. Os resultados permitiram
concluir que a bacteriocina P34 parcialmente purificada na concentração de 256 UA/g
inibiu L. monocytogenes em todos os tempos. A bacteriocina P34 parcialmente
purificada foi testada em envoltórios naturais de bovinos (tripas semi-secas salgadas)
frente ao mesmo microrganismo indicador, L. monocytogenes ATCC 7644,
demonstrando sua inibição in vitro.
1/ Dissertação de Mestrado em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, Janeiro de 2007 (65 p).
EVALUATION OF BACTERIOCIN P34 ON THE GROWTH OF Listeria
monocytogenes IN FRESH CHICKEN SAUSAGE.
Author: Deoni Aparecida Ferreira de Quadros
Advisor: Prof. Adriano Brandelli
ABSTRACT
The bacteriocin P34, produced by Bacillus sp., showed
antimicrobial activity for many species of Listeria sp and L. monocytogenes ATCC 7644
. In this work, it was investigated the presence of lactic bacteria in fresh chicken
sausage. The results demonstrated the isolation of six cultures in MRS agar plates at
30
o
C for 48h. Five of the six isolated strains inhibited the growing of the L.
monocytogenes after incubation at 30ºC for 24h. The crude supernatants of these lactic
bacteria demonstrated the synergic effect when it were added together with the
bacteriocin P34 against indicator microorganism, L. monocytogenes ATCC 7644, using
the method of diffusion in agar with paper discs. L. monocytogenes ATCC 7644 was
inoculated in a suspension with 10
3
UFC/g in chilled chicken sausage and recovered in
MOX counting from zero, three, seven and ten days from the inoculationt. The results
allowed concluding that the P34 bacteriocin partially purified, in a 256 UA/g
concentration, inhibited the indicator microorganism in all periods of time. At the same
time, the partially purified P34 bacteriocin were tested in natural bovine wrapping (
salty semi-dried tripe ) using the same indicator micro-organism, L. monocytogenes
ATCC 7644, demonstrating its inhibition in vitro.
1/ Essay of Master in Veterinary Science, Faculdade de Veterinária, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, january 2007 (65p).
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 - Efeito da bacteriocina P34 parcialmente purificada no crescimento de L.
monocytogenes ATCC 7644 artificialmente inoculada em lingüiça frescal
de frango. ■ – grupo com L. monocytogenes; ▲ - grupo com L.
monocytogenes e bacteriocina P34 parcialmente purificada; ♦ - grupo
controle. Cada ponto representa a média ±desvio padrão de quatro
determinações ............................................................................................44
Figura 2 - Crescimento de L. monocytogenes ATCC 7644 em lingüiça frescal de frango
artificialmente inoculada sob tratamento com bacteriocina P34 e nisina no
período de dez dias sob resfriamento.........................................................45
Figura 3 - Halo de inibição de envoltório natural comestível contendo a bacteriocina
P34 parcialmente purificada tratado à 4ºC/30seg frente à L. monocytogenes
ATCC 7644................................................................................................46
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 - Atividade da bacteriocina P34 sobre diferentes espécies e linhagens de
Listeria spp. ...............................................................................................39
Tabela 2 - Efeitos da bacteriocina P34 frente à L. monocytogenes ATCC 7644 ..........40
Tabela 3 - Análise Microbiológica da lingüiça frescal de frango ...............................41
Tabela 4 - Teste de antagonismo de bactérias lácticas isoladas de lingüiça frescal de
frango contra L. monocytogenes ATCC 7644. ..........................................41
Tabela 5 - Teste de sinergismo entre sobrenadantes brutos de bactérias lácticas e
bacteriocina P34 parcialmente purificada frente à L. monocytogenes ATCC
7644 ...........................................................................................................43
Tabela 6 - Resultados de atividade da bacteriocina P34 parcialmente purificada
incorporada em tripas naturais frente à Listeria monocytogenes ATCC
7644 ...........................................................................................................47
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
°C – Graus Celsius
NaCl – Cloreto de sódio
BAL – Bactérias ácido- lácticas
GRAS - generally regarded as safe
FDA - Food and Drug Administration
KDa – Quilo dáltons
FAO - Organização de Alimentos e Agricultura
OMS - Organização Mundial de Saúde
Da – dáltons
CISPOA – Coordenadoria de Inspeção Sanitária de Produtos de Origem Animal
rpm – rotações por minuto
UFC – Unidades Formadoras de Colônias
UA – Unidades Arbitrárias
NN – sobrenadante bruto não neutralizado
N – sobrenadante bruto neutralizado
P34+NN – Bacteriocina P34 parcialmente purificada adicionada de sobrenadante bruto
não neutralizado
P34+N – Bacteriocina P34 parcialmente purificada adicionada de sobrenadante bruto
neutralizado
Lm – Grupo com microrganismo Listeria monocytogenes ATCC 7644
Nis – Grupo com bacteriocina nisina
P34+Nis – Grupo com bacteriocina P34 parcialmente purificada e bacteriocina nisina
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................................18
2.1 Listeriose...............................................................................................................18
2.1.1 Definição.............................................................................................................18
2.1.2 Etiologia..............................................................................................................18
2.1.3 Epidemiologia e Patogenia.................................................................................19
2.1.4 Presença da bactéria nos alimentos cárneos......................................................22
2.1.5 Controle de Listeria monocytogenes em alimentos...........................................24
2.2 Bactérias Lácticas................................................................................................24
2.2.1 Generalidades.....................................................................................................24
2.2.2 Definição e características.................................................................................25
2.3 Bacteriocinas........................................................................................................26
2.3.1 Definição.............................................................................................................26
2.3.2 Classificação das bacteriocinas .........................................................................27
2.3.3 Bactérias lácticas como produtoras de bacteriocinas.......................................28
2.3.4 Nisina..................................................................................................................29
2.4 Bacteriocina P34..................................................................................................30
3 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................31
3.1 Materiais.................................................................................................................31
3.1.1 Microrganismos....................................................................................................31
3.1.2 Reagentes e Meios................................................................................................31
3.1.3 Produto a ser testado............................................................................................31
3.2 Métodos...................................................................................................................32
3.2.1 Manutenção dos microrganismos........................................................................32
3.2.2 Obtenção da bacteriocina P34 parcialmente purificada...................................32
3.2.3 Avaliação da atividade antimicrobiana da bacteriocina P34 parcialmente
purificada em diferentes espécies de Listeria spp. ............................................33
3.2.4 Avaliação da atividade da bacteriocina P34 parcialmente purificada em
diferentes tempos de inoculação frente à L. monocytogenes ATCC 7644.......34
3.2.5 Análise microbiológica da lingüiça frescal de frango......................................34
3.2.6 Pesquisa e isolamento de bactérias lácticas do produto....................................34
3.2.7 Teste de antagonismo das bactérias lácticas frente à L. monocytogenes ATCC
7644.....................................................................................................................35
3.2.8 Produção de sobrenadantes brutos de bactérias lácticas e teste de sinergismo
com a bacteriocina P34 parcialmente purificada frente à L. monocytogenes
ATCC 7644 .........................................................................................................35
3.2.9 Inoculação de L. monocytogenes ATCC 7644 e bacteriocina P34 parcialmente
purificada em lingüiça frescal de frango ..........................................................36
3.2.10 Recuperação de L. monocytogenes em lingüiça frescal de frango..................37
3.2.11 Incorporação da bacteriocina P34 parcialmente purificada em envoltório
natural de bovino (tripa) e avaliação de sua atividade frente à L.
monocytogenes ATCC 7644...............................................................................37
3.2.12 Análise Estatística..............................................................................................38
4 RESULTADOS...........................................................................................................39
4.1 Atividade antimicrobiana da bacteriocina P34 parcialmente purificada em
diferentes linhagens de Listeria spp. ..................................................................39
4.2 Efeitos da bacteriocina P34 frente à L. monocytogenes ATCC 7644.................40
4.3 Análise Microbiológica da lingüiça frescal de frango.........................................40
4.4 Pesquisa e isolamento de bactérias lácticas da lingüiça frescal de frango........41
4.5 Verificação de sinergismo entre bactérias lácticas presentes e bacteriocina P34
parcialmente purificada......................................................................................42
4.6 Avaliação da bacteriocina P34 parcialmente purificada incorporada na
lingüiça frescal de frango artificialmente inoculada com L. monocytogenes
ATCC 7644...........................................................................................................43
4.7 Comparação dos efeitos da nisina e bacteriocina P34 parcialmente purificada
em lingüiça frescal de frango artificialmente inoculada com L. monocytogenes
ATCC 7644...........................................................................................................45
4.8 Avaliação da bacteriocina P34 adsorvida em envoltório de lingüiça frescal de
frango frente à L. monocytogenes ATCC 7644..................................................46
5 DISCUSSÃO..............................................................................................................48
6 CONCLUSÕES..........................................................................................................54
BIBLIOGRAFIA...........................................................................................................55
15
1 INTRODUÇÃO
As mudanças nos hábitos alimentares, o aparecimento de novos
produtos do tipo "prontos para consumo" e minimamente processados, o aumento no
número de refeições coletivas e o surgimento de novos processos de criação intensiva
de animais têm feito com que o risco de surtos de doenças transmitidas por alimentos
aumente e microrganismos pouco freqüentes entrem em evidência, principalmente,
quando se consideram indivíduos imunodeprimidos, idosos, crianças e neonatos,
gestantes e enfermos com doenças degenerativas crônicas ou agudas.
A busca ininterrupta por substâncias que possam ser utilizadas como
conservadores alimentares não tóxicos, que não interfiram nas características
organolépticas e sensoriais dos produtos finais são preocupação constante, em particular
para os alimentos cárneos processados.
O abate de frangos, no Brasil, aumentou nos últimos anos, sendo que
parte desta carne é transformada em lingüiça frescal, produto altamente susceptível do
ponto de vista sanitário uma vez que, é altamente manipulada e comercializada sob
resfriamento onde, muitas vezes, não leva adição de culturas iniciadoras como
biopreservativos.
A bactéria Listeria monocytogenes é o agente etiológico da
listeriose, uma doença contraída principalmente pelo consumo de alimentos
contaminados. A taxa de mortalidade associada com a doença pode chegar a 30% em
populações suscetíveis, como mulheres grávidas, recém-nascidos e indivíduos
imunodeprimidos.
No Brasil, as informações referentes à vigilância epidemiológica dos
casos de listeriose assim como dados relativos ao isolamento de L. monocytogenes em
alimentos ainda são escassos. Entretanto, L. monocytogenes tem sido associada
epidemiologicamente ao consumo de carnes e produtos cárneos sendo que várias
linhagens já foram isoladas destes, pois estes alimentos permitem a multiplicação do
patógeno e podem servir de veículo primário para a transmissão de listeriose. O controle
de L. monocytogenes em produtos cárneos, principalmente carne de frango, pode ser
realizado por meio de intervenções físicas e químicas, higiene e sanitização, que
incluem programas de autocontrole industriais visando atender às exigências sanitárias
na área de alimentos, como Boas Práticas de Fabricação, Análise de Pontos Críticos de
Controle, entre outras, e o uso de alguns aditivos alimentares. Porém, L. monocytogenes
16
pode multiplicar-se em ampla faixa de pH, de concentrações de sal, de temperatura e de
atividade de água, e somente a aplicação dessas intervenções pode não ser eficiente para
eliminar esta bactéria em caso de contaminação pós-processamento.
A incorporação de substância antimicrobiana do tipo bacteriocina
nos alimentos cárneos, principalmente de frango, pode ser um método eficiente para
redução dos níveis de L. monocytogenes em alimentos embutidos como a lingüiça
frescal de frango. Contudo, existe pouca informação sobre o comportamento de L.
monocytogenes em lingüiça frescal de frango submetidas à exposição de bacteriocinas.
Logo, a avaliação da sobrevivência deste patógeno em lingüiça frescal de frango, pode
fornecer dados para a incorporação futura de substâncias do tipo bacteriocina nas
normas de preparo, contribuindo para assegurar a qualidade microbiológica do produto
e, assim, diminuir o risco de listeriose.
A substância do tipo bacteriocina P34, isolada da bactéria Bacillus sp.
linhagem P34, foi produzida, purificada e caracterizada anteriormente, demonstrando
possuir atividade inibitória para L. monocytogenes.
Assim, o presente trabalho teve por objetivo:
1) identificar a presença de bactérias ácido-lácticas em lingüiça frescal de frango;
2) avaliar a capacidade de sinergismo entre as bactérias ácido-lácticas presentes e a
bacteriocina P34 na conservação do produto lingüiça frescal de frango frente à bactéria
L. monocytogenes ATCC 7644;
3) avaliar a sobrevivência e persistência de L. monocytogenes inoculada artificialmente
em lingüiça frescal de frango frente a bacteriocina P34 parcialmente purificada durante
estocagem sob temperatura de refrigeração;
4) avaliar o efeito da bacteriocina P34 parcialmente purificada incorporada em
envoltório natural comestível e artificialmente contaminado com L monocytogenes
ATCC 7644 sob diferentes tratamentos;
5) avaliar os efeitos da aplicação da bacteriocina P34 e da nisina em lingüiça frescal de
frango artificialmente contaminada com L monocytogenes ATCC 7644.
17
18
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Listeriose
2.1.1 Definição
É uma doença causada pela bactéria Listeria monocytogenes, sendo
relatada em humanos pela primeira vez em 1929 e foi associada com doença perinatal
em 1933 (JAY, 1996).
É uma doença zoótica grave e infecciosa que pode levar ao aborto,
problemas neurológicos e disfunções gastro-intestinais cuja bactéria causadora possui
habilidade de se desenvolver em temperaturas baixas, em torno de 3°C, permite sua
multiplicação em alimentos refrigerados (VARGAS, 1996).
2.1.2 Etiologia
O gênero Listeria sp. contém seis espécies: L. monocytogenes, L.
innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii e L. gravyi, como evidenciado pelos
valores de homologia de DNA, seqüência 16S rRNA e propriedades
quimiotaxonômicas. (DONNELLY, 2001; McLAUCHLIN, 1997; ROCOURT, 1999;
RYSER; DONNELLY, 2001).
O agente etiológico da maioria dos casos de listeriose em humanos
é L. monocytogenes, um bastonete Gram-positivo, pequeno, curto, de 0,4-0,5 µm de
diâmetro e 0,5-2 µm de comprimento, com extremidades arredondadas, que podem
apresentar forma cocóide ou filamentosa, em culturas com 2-3 dias (DONNELLY,
1994; FARBER; PETERKIN, 1991; LOVETT; TWEDT, 1988; PHAN-THANH;
MAHOUIN; ALIGÉ, 2000), podendo ser observados isolados ou em cadeias curtas
(ROCOURT, 1999; RYSER; DONELLY, 2001). Esta bactéria multiplica-se em
aerobiose ou anaerobiose e prefere ambientes microaerofílicos (ROCOURT, 1999).
Possui rápida multiplicação na maioria dos meios bacteriológicos, crescendo bem em
caldo infusão cérebro coração (BHI). Requer biotina, riboflavina, tiamina e aminoácidos
como cisteína, glutamina, isoleucina e valina (JAY, 1996; ROCOURT, 1999). As
colônias, quando visualizadas a luz transmitida, em direção oblíqua, apresentam brilho
azul-esverdeado (FARBER; PETERKIN, 1991).
19
L. monocytogenes é um patógeno psicrotrófico que se multiplica
geralmente em temperaturas que variam de -0,4 ºC a 50 ºC, com multiplicação ótima
entre 30 °C e 37 ºC (FARBER; PETERKIN, 1991; RYSER; DONELLY, 2001). Possui
flagelos peritríquios, os quais dão ao microrganismo característica de motilidade em
tombamento, e este comportamento ocorre somente em faixas restritas de temperatura
(20ºC a 25ºC) (FARBER; PETERKIN, 1991; HOLT et al., 1994; ROCOURT, 1999).
Pode tolerar concentrações de 10% a 30% de cloreto de sódio e crescer a uma atividade
de água de 0,90 (RYSER, 1999), dependendo de fatores que influenciam a
multiplicação, como pH e temperatura (LOVETT; TWEDT, 1988). Estudos com L.
monocytogenes demonstram que o patógeno multiplica-se em valores de pH que variam
de 4,4 a 9,6, com pH ótimo de crescimento de 7,0 (RYSER; DONELLY, 2001;
SCHUCHAT; SWAMINATHAN; BROOME et al. 1991). O patógeno apresenta reação
catalase positiva e oxidase negativa; expressa ß-hemolisina, produzindo uma zona de
clareamento em ágar sangue (BENEDICT, 1990; FARBER; PETERKIN, 1991; HOLT
et al., 1994); produz ácido por fermentação de glicose, frutose, manose, galactose,
celobiose, maltose, melezitose, trealose e ramnose, sem formação de gás; hidrolisa
esculina, salicina, amigdalina e hipurato de sódio; apresenta teste vermelho de metila
positivo; produz amônia a partir da arginina; reage negativamente para produção de
sulfeto de hidrogênio, indol e nitrato redutase; liquefaz gelatina; hidrólisa amido e uréia;
reduz telurito e é parcialmente inibido por 0,02% de azida e cianida (BENEDICT, 1990;
JAY, 1996; RYSER; DONELLY, 2001).
Apesar de as espécies de Listeria serem fenotipicamente similares,
elas podem ser diferenciadas pela produção de hemolisina, incluindo teste CAMP
(Christie, Atkins e Munch-Petersen) e análise de patogenicidade em camundongos
(HOLT et al.; 1994; McKELLAR, 1994; ROCOURT, 1988; SEELINGER; JONES,
1986; SCHUCHAT; SWAMINATHAN; BROOME, 1991), e pela produção de ácido a
partir de D-xilose, L-ramnose e manitol. A atividade hemolítica é a característica mais
importante na identificação de L. monocytogenes (HOLT et al.; 1994; RYSER;
DONELLY, 2001).
2.1.3 Epidemiologia e Patogenia
20
A bactéria L. monocytogenes encontra-se amplamente difundida em
plantas, solo e água, sendo também encontrada em silagens, esgotos, resíduos de
abatedouros, em leite de vacas saudáveis ou com mastite, e em fezes humanas e de
animais (COLBURN et al., 1990; DONALD; FENLON; SEDDON, 1995; FENLON,
1985; FENLON; WILSON; DONACHIE, 1996; WEIS; SEELIGER, 1975). Tem sido
isolada de bovinos, ovinos, caprinos, suínos e aves (WEHR, 1987; FARBER;
PETERKIN, 1991; FENLON, 1999). Entretanto, o habitat primário para L.
monocytogenes parece ser solo e vegetação, onde a bactéria possui uma existência
saprofítica com o solo servindo de reservatório para posteriores infecções transmitidas
para animais e humanos (RYSER; DONELLY, 2001). Vegetação ou silagem
deterioradas foram associadas como fonte de infecção em vários casos de listeriose em
animais de fazenda, por favorecerem o desenvolvimento de L. monocytogenes e
servirem de suporte para o patógeno se espalhar através da cadeia alimentar (FARBER;
PETERKIN, 1991). A resistência do patógeno à diversidade do meio, aliada à
capacidade de colonizar, multiplicar e sobreviver em equipamentos de plantas de
processamento, fazem com que L. monocytogenes desperte o interesse das indústrias de
alimentos (FENLON, 1999). Em animais, a taxa de portadores assintomáticos é de 1% a
5%, porém estudos utilizando diferentes metodologias para isolamento de Listeria spp.
têm mostrado essas taxas mais elevadas (FARBER; PETERKIN, 1991). Em humanos, a
presença de Listeria spp. no excremento fecal varia de 0% a 77% (RYSER, 1999), com
aproximadamente 5% a 10% da população geral sendo portadora assintomática de L.
monocytogenes (FARBER; PETERKIN, 1991). Dados epidemiológicos do Centers for
Disease Control and Prevention (CDCP) indicam a ocorrência de aproximadamente
2.500 casos de listeriose e 500 mortes anualmente nos Estados Unidos com uma
incidência da doença estimada em 4,4 casos por milhão de habitantes (TAPPERO et al.,
1995).
A listeriose em humanos é freqüentemente vista como uma doença
invasiva em grupo de risco bem definido, ocorrendo principalmente em mulheres
grávidas, pessoas idosas, indivíduos com síndrome de imunodeficiência adquirida,
alcoolismo e cirrose, portadores de diabetes mellitus, doenças cardiovasculares e renais,
carcinoma e outras doenças que afetam o sistema imunológico (FARBER; PETERKIN,
1991; RYSER; DONNELLY, 2001). O intestino humano apresenta-se como ponto de
entrada de L. monocytogenes (LOVETT, 1989). A dose de infecção é baixa, com
período de incubação variável, que pode ir de dias a semanas (SLUTSKER;
21
SCHUCHAT, 1999), exibindo uma taxa de mortalidade de aproximadamente 30% para
indivíduos do grupo de risco. Essa taxa pode chegar a 70% quando a doença se
manifesta através de meningite (GELLIN; BROME, 1989; FARBER; PETERKIN,
1991; LOVETT; TWEDT, 1988).
Bacteremia é a manifestação mais comum da doença em adultos. Os
pacientes apresentam geralmente sintomas como febre, mal-estar, fadiga e dor
abdominal, enquanto, em indivíduos que apresentam o comprometimento do sistema
nervoso central, a doença se manifesta com febre, fadiga, estado mental alterado,
meningite, encefalite e abscessos. Em mulheres grávidas, a doença se manifesta com
sintomas semelhantes aos da gripe, com febre, dores de cabeça e mialgia, podendo
haver a contaminação do feto, dependendo do estágio da gestação. A infecção intra-
uterina pode resultar em nascimento prematuro, aborto espontâneo, nascimento de
natimorto ou septicemia neonatal. Em recém-nascidos, listeriose provoca problemas
cardíacos e respiratórios, convulsões, vômito, granulomas e nódulos em diferentes
órgãos. Também pode causar artrites, osteomielites, septicemia com faringites e
mononucleoses, abscessos na espinha e cérebro, e peritonites (RYSER; DONNELLY,
2001; RYSER; MARTH, 1991; LOVETT, 1989; FARBER; PETERKIN, 1991;
SLUTSKER; SCHUCHAT, 1999).
Apesar da listeriose não ser uma doença recente, só há
relativamente pouco tempo foi associada ao consumo de alimentos contaminados com
L. monocytogenes. Efetivamente, a origem alimentar da listeriose só foi comprovada em
1981 (GUERRA; BERNARDO, 2004) sugerindo que a contaminação de alimentos
pode ser a principal fonte do microrganismo (FARBER; PETERKIN, 1991).
Em 1991, um surto de listeriose em humanos ocorreu na Inglaterra
após o consumo de patê (McLAUCHLIN et al., 1991). Em 1992, seis casos (um fatal)
da doença ocorreram na Noruega, seguidos ao consumo de carnes fatiadas prontas para
consumo, contaminadas com L. monocytogenes sorotipo 1/2 (BREDHOLT;
NESBAKKEN; HOLCK, 1999). Na França, 297 casos e 63 óbitos ocorreram devido ao
consumo de geléia de língua de porco contaminada com L. monocytogenes sorotipo 4b.
Testes moleculares mostraram que linhagens isoladas do produto apresentavam o
mesmo perfil genético das cepas isoladas dos pacientes (ROCOURT; COSSART,
1997). Consumo de patê também foi associado a casos epidêmicos de listeriose no
Reino Unido e na República da Irlanda entre 1985 e 1989. De agosto 1998 a fevereiro
de 1999, ocorreu o segundo maior surto de listeriose na América do Norte, provocado
22
pelo consumo de salsichas. Foram relatados 101 casos em 22 estados, com 12 mortes e
3 abortos (CDCP, 1999). Em 2000, um surto de listeriose resultou em 29 casos da
doença, 4 mortes e 3 abortos, em 10 estados norte-americanos, tendo como veículo de
contaminação carne de peru (CDCP, 2000).
2.1.4 Presença da bactéria nos alimentos cárneos
No Brasil, de acordo com o Regulamento Técnico sobre Padrões
Microbiológicos para Alimentos, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, anexo da
Resolução nº 12, de 2 de janeiro de 2001, não existe critério estabelecido para o
patógeno em carnes, não havendo exigência de análise para detecção de L.
monocytogenes em carnes ou produtos cárneos prontos para consumo (BRASIL, 2001).
Em 1986 e 1987, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças
Norte-Americano (CDCP) conduziu um estudo para verificar que tipo de alimento
estava associado a 82 casos de listeriose, estimando-se que 20% dos casos esporádicos
da doença nos Estados Unidos estavam associados a salsichas consumidas sem serem
reaquecidas antes do consumo e ao consumo de frango mal cozido (TOMPKIN et al.,
1992).
Apesar de a presença de L. monocytogenes ser associada a uma
ampla variedade de alimentos (FARBER; PETERKIN, 1991), os últimos surtos e casos
esporádicos de listeriose em humanos têm sido associados a produtos cárneos prontos
para consumo (CDCP, 1999; CDCP, 2000). Vários estudos realizados com diversos
tipos de carnes e produtos cárneos mostraram que a incidência de contaminação pode
variar significativamente (de menos de 1% a 90%) (HUDSON et al., 1992; JAY, 1996;
JOHNSON; DOYLE; CASSENS, 1990). A variação deve-se a fatores como o método
de detecção utilizado, o tamanho da amostra, o número de colônias individuais isoladas
tomadas para confirmação de presença de colônias hemolíticas e a fonte da qual a
amostra foi obtida (FARBER; PETERKIN, 1991; JOHNSON; DOYLE; CASSENS,
1990).
A incidência de L. monocytogenes no Brasil em carne e produtos
cárneos também tem sido estudada. Destro, Serrano e Kabury (1991) determinaram a
incidência de Listeria spp. em diferentes produtos cárneos, detectando L.
monocytogenes em 75,4% das amostras analisadas, observou-se que 65% das amostras
de carne bovina moída, 82,4% das amostras de salsichas e 80% das amostras de lingüiça
23
de carne suína estavam contaminadas com o patógeno. Assis et al. (2000) investigaram
a incidência de Listeria spp. e L. monocytogenes em carne eqüina para consumo
humano. Das 121 amostras testadas, 18,2% foram positivas para Listeria spp. e destas,
7,4% foram positivas para L. monocytogenes. Bersot et al. (2001) avaliaram a presença
de L. monocytogenes em 30 amostras de mortadelas adquiridas no mercado a varejo e
observaram uma alta incidência do patógeno nesse tipo de produto. Das 30 amostras
analisadas, 36,7% (11 de 30) foram positivas para Listeria spp., e 26,7% (8 de 11)
foram positivas para L. monocytogenes. Na Espanha, a incidência foi pesquisada por
Campillo, Dominguez-Fernandez e Zumalacarregui-Rodríguez (1999). O patógeno foi
isolado em 11,4% das 175 amostras analisadas. Os níveis mais altos de contaminação
inicial (24%) foram observados para as carnes moídas suína e bovina, com incidências
de 16% em hambúrguer de carne bovina e 10% em carne de frango. No Canadá, Farber
et al (1989) pesquisaram a presença de L. monocytogenes em produtos cárneos onde
constataram 56,3% (9 de 16) das amostras de coxas de frango positivas. Na Austrália,
Grau e Vanderlinde (1992) verificaram a incidência de Listeria spp. em produtos
cárneos prontos para consumo comercializados no varejo durante um período de 12
meses. Listeria spp. foi detectada em 93 das 175 amostras analisadas (53%), e L.
monocytogenes foi detectada em 80,6% (75 de 93) das amostras positivas. Genigeorgis,
Oanca e Dutulescu (1990) avaliaram a incidência de Listeria spp. em asas e coxas
frescas de peru comercializadas no varejo, e L. monocytogenes foi detectada em 20%
das asas e em 13,3% das coxas.
A capacidade de alguns produtos cárneos permitirem a
multiplicação ou sobrevivência de L. monocytogenes também vem sendo pesquisada
(BUNCIC; PAUNOVIC; RADISIC, 1991; GRAU; VANDERLINDE, 1992;
McKELLAR; MOIR; KALAB, 1994; VELANI; GILBERT, 1990; YOUSEF et al.,
1991). Várias explicações têm sido atribuídas à capacidade desta bactéria sobreviver a
longos períodos de estocagem sob temperaturas de refrigeração em carnes e produtos
cárneos sem apresentar um aumento da população viável, como, por exemplo, o efeito
competitivo da microbiota natural (JOHNSON et al., 1988; SHELEF, 1989), o efeito da
atmosfera modificada, e ingredientes, como a presença de ácidos orgânicos, NaCl, pH,
presença de bactérias lácticas e/ou bacteriocinas (BUCHANAN; PHILLIPS, 1990;
CHEN; SHELEF, 1992; DE MARTINIS et al, 1997; LE MARC et al., 2002;
NERBRINK et al.,1999; THAYER; BOYD, 1999; THAYER; BOYD, 2000;
TIENUNGOON et al., 2000).
24
2.1.5 Controle de Listeria monocytogenes em alimentos
Os fatores utilizados no controle de L. monocytogenes em
determinado alimento dependem de sua sobrevivência e multiplicação nesse produto
específico. Esta bactéria pode tolerar uma ampla faixa de pH, temperaturas,
concentrações de sal e atividade de água que podem ser indesejáveis para diversas
outras bactérias. Devido a essa característica, tentativas de controle do patógeno têm
sido feitas visando prevenir a presença de L. monocytogenes nas plantas de
processamento, de forma a evitar a contaminação do produto final (LOVETT, 1989).
Em alimentos prontos para consumo, a refrigeração muitas vezes atua como o principal
meio de controle de microrganismos, sendo algumas vezes o único meio utilizado nesse
tipo de produto. Refrigeração ou embalagem à vácuo podem não ser barreiras
suficientes contra a multiplicação de patógenos em produtos cárneos (QVIST;
SEHESTED; ZEUTHEN, 1994). Em caso de temperatura abusiva durante o período de
estocagem, alguns microrganismos patogênicos psicrotróficos, como L. monocytogenes,
podem multiplicar-se com pouca ou nenhuma mudança nas características sensoriais do
produto (HAO; BRACKETT; DOYLE, 1998). Sendo assim, a aplicação de barreiras
físicas (irradiação, ultra-alta pressão, calor), químicas (ácidos orgânicos e sais,
compostos fenólicos) ou biológicas (bactérias lácticas e bacteriocinas) para o controle
de L. monocytogenes deve ser considerada como sistema alternativo na conservação de
produtos cárneos prontos para consumo (CUTTER, 2000; JUNCHER et al., 2000;
KANG; FUNG, 1999; KIM; MARSHALL; WEI, 1995; NIKU-PAAVOLA et al., 1999;
QVIST; SEHESTED; ZEUTHEN, 1994; SAMELIS et al., 2002; SEMAN et al., 2002;
SOFOS et al., 1998).
2.2 Bactérias Lácticas
2.2.1 Generalidades
É notório que alimentos, industrializados ou não, possam conter
uma ampla variedade e quantidade de microrganismos, que interferiram em sua vida útil
assim como, possam ser veiculadores de doenças. Existem inúmeros recursos para
eliminar esses microrganismos ou controlar o seu desenvolvimento nos alimentos,
25
incluindo tratamento térmico, adição de conservadores químicos, uso de baixa
temperatura (refrigeração e congelamento) durante o armazenamento, entre outros. No
entanto, muitos consumidores consideram que esses procedimentos interferem na
qualidade nutricional dos alimentos, além de acreditar que os conservadores químicos
são perigosos para a saúde, até mais perigosos que os próprios microrganismos que
esses produtos pretendem controlar (MURIANA, 1996).
Com isso, aumenta também a preocupação dos fabricantes de
alimentos em produzir alimentos que não necessitem desses procedimentos para que
sejam saudáveis e para que atendam os parâmetros de qualidade e segurança exigidos
pelos consumidores e fabricantes. Uma dessas estratégias é explorar a capacidade dos
microrganismos inócuos, naturalmente presentes nos alimentos ou artificialmente
adicionados, de inibir microrganismos que são indesejáveis, quer sejam deteriorantes,
quer sejam prejudiciais a saúde. Esse processo denomina-se bioconservação, e vem
sendo cada vez mais estudado devido ao seu enorme potencial de aplicação nos mais
variados tipos de alimentos. Os microrganismos mais adequados para uso como
bioconservadores são as bactérias láticas, devido a suas características antagonísticas e
sua grande tradição de uso como bactérias iniciadoras em alimentos fermentados (DE
MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002).
2.2.2 Definição e características
As bactérias láticas (BAL) compreendem um grupo amplo de
microrganismos, mas que apresentam diversas características morfológicas, metabólicas
e fisiológicas comuns. São microrganismos Gram-positivos, não formadores de esporos,
anaeróbios, aerotolerantes, fastidiosos, ácido tolerantes, com metabolismo estritamente
fermentativo, apresentando o ácido lático como principal produto da fermentação de
carboidratos (DE MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002). São bactérias acidófilas
sendo que o ácido láctico é produzido rapidamente e em grande quantidade, reduzindo o
pH e impedindo o desenvolvimento de organismos competidores (CHAGAS, 1994).
Nutricionalmente as bactérias lácticas são muito exigentes. Possuem
habilidade biossintética limitada e necessitam de aminoácidos, vitaminas, purinas e
pirimidinas. Necessitam para o crescimento meios ricos em peptonas e hidrolisados
protéicos, extrato de levedura rico em proteínas, vitaminas e nucleotídeos, e
carboidratos. Apresentam colônias pequenas e sem produção de pigmentos. Algumas
26
bactérias ácido-láticas crescendo em meio sólido com sacarose conseguem produzir
grandes quantidades de polissacarídeos e, em conseqüência, produzem colônias grandes,
translúcidas (compostas principalmente dos polissacarídeos excretados). Quando
microrganismos crescem na presença de O
2
, substâncias oxidantes tóxicas ao
metabolismo são produzidas: peróxidos (H
2
O
2
), superóxidos (O
-
2
), radical hidroxila
(OH). São poucos os ambientes naturais, sendo que o principal habitat dos cocos e
bastonetes homofermentativos é o corpo dos animais de sangue quente. Em animais,
estão associados à flora normal da pele e mucosas como a orofaringe, o trato
gastrointestinal e o trato genito-urinário. Nos vegetais vivem em associação com estes e
crescem as custas de nutrientes eliminados a partir da morte do vegetal. E quando
presentes no leite, tiveram acesso através da pele e mucosas do animal (CHAGAS,
1994).
As bactérias lácticas possuem uma grande importância na indústria
de alimentos, onde os principais gêneros são Leuconostoc, Lactobacillus,
Streptococcus e Pediococcus (TRÍBOLI, 1997), porém dois aspectos devem
ser considerados quando se utiliza cultura iniciadora na indústria de carnes: a
fermentação e a antibiose. No primeiro caso, a cultura iniciadora adicionada age sobre o
substrato, resultando em benefícios à carne. No caso da antibiose, a cultura iniciadora
deve inibir o desenvolvimento de microrganismos indesejáveis que causam danos ao
produto ou à saúde humana (TERRA, 1993).
2.3 Bacteriocinas
2.3.1 Definição
Bacteriocinas são peptídeos biologicamente ativos, com atividade
antimicrobiana contra bactérias, usualmente, estreitamente relacionadas à bactéria
produtora. São caracterizadas como substâncias de espectro de atividade restrito,
possuidoras de uma fração protéica ativa, com atividade bactericida, com mecanismo de
ação dando-se através de ligação a receptores específicos na parede celular das células
sensíveis, com informação genética plasmidial e que sua produção fosse por biossíntese
letal (TAGG, DAJANI, WANNAMAKER, 1976).
Entretanto existe uma diversidade de outras substâncias com
atividade antimicrobiana que não, necessariamente, apresentam todas estas
27
características. O termo substância do tipo-bacteriocina (bacteriocin-like) engloba os
compostos antimicrobianos de natureza protéica que ainda não estão completamente
definidos ou não cumprem com todas as características originalmente associadas às
bacteriocinas. Estas substâncias, geralmente, possuem um espectro de ação maior,
atuando contra uma variedade de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e contra
alguns fungos (DE VUYST, VANDAMME, 1994).
Substâncias com atividade antimicrobiana são encontradas sendo
produzidas por uma diversidade de microrganismos. Acredita-se que 99% de todas as
bactérias possam produzir pelo menos uma bacteriocina, campo este que merece mais
pesquisas para a descoberta de substâncias com potencial de aplicação como
antimicrobianos (KLAENHAMMER, 1988).
Algumas bacteriocinas já possuem seu potencial de ação bem
determinado como antimicrobiano, assim como sua possível aplicação como
conservante de alimentos. As bacteriocinas com maior potencial aplicação prática em
alimentos são as produzidas por bactérias lácticas, as quais são consideradas GRAS
(generally regarded as safe) pelo Food and Drug Administration (FDA) (MONTVILLE;
WINKWOSKI, 1997, SULLIVAN; ROSS, R.P.; HILL, 2002).
2.3.2 Classificação das bacteriocinas
A descoberta de diferentes bacteriocinas revelou diversidade de
estruturas químicas e características permitindo o agrupamento em diferentes classes
(KLAENHAMMER, 1993).
Altena et al. (2000), descrevem a Classe I de bacteriocinas que
contém os lantibióticos como peptídeos pequenos (〈5kDa), que possuem de 19 a 50
aminoácidos. Esta classe está subdividida em Classe Ia e Classe Ib. A Classe Ia, que
inclui a nisina, consiste de peptídeos hidrofóbicos e catiônicos que formam poros na
membrana da célula alvo e possuem uma estrutura flexível, quando comparados com
uma estrutura mais rígida dos peptídeos da Classe Ib, que inclui peptídeos globulares
com carga negativa ou que não possuem carga.
Segundo Nes et al. (1996), a Classe II contém peptídeos não
modificados e estáveis ao calor e que também podem ser subdivididos. A Classe IIa
inclui os peptídeos como a pediocina, ativos contra Listeria. Já as bacteriocinas
compostas de 2 peptídeos diferentes pertencem à Classe IIb, necessitando de ambos
28
para ser totalmente ativa. A Classe IIc foi proposta para separar as bacteriocinas
secretadas pelo sistema sec-dependente.
Na Classe III temos as bacteriocinas maiores (30 kDa) e lábeis ao
calor, mas há poucas informações disponíveis; um exemplo é a helveticina J (NES et
al., 1996).
Já na Classe IV, estão agrupadas as bacteriocinas que formam
complexos com outras macromoléculas (como lipídeos e carboidratos), não sendo uma
classe muito bem estudada em nível bioquímico (CLEVELAND et al., 2001;
MCAULIFFE, ROSS, HILL, 2001). A existência desta classe foi considerada, a partir
do momento em que foi observado que algumas atividades de bacteriocinas obtidas de
sobrenadantes livres de células, foram perdidas, não só por tratamento com proteases,
mas com enzimas lipolíticas e glicolíticas. A plantaricina S é um exemplo de
bacteriocina pertencente a esta classe (KLAENHAMMER, 1993).
2.3.3 Bactérias lácticas como produtoras de bacteriocinas
As bactérias láticas podem produzir substâncias antimicrobianas,
como bacteriocinas, conferindo aos produtos maturados e frescais, melhor qualidade
sanitária (HURST, 1983). Vignollo et al. (1993) afirmaram que bacteriocinas ou
espécies produtoras de bacteriocinas podem ser usadas como conservantes naturais em
alimentos para melhorar a segurança de alguns produtos como derivados do leite e da
carne, enquanto que os antibióticos não são permitidos em alimentos.
Bromberg et al. (2006) isolaram linhagens de bactérias lácticas
produtoras de bacteriocinas de carnes e seus produtos derivados resultando na detecção
de Lactococcus lactis ssp. hordniae CTC 484, proveniente de frango. Sua bacteriocina
correspondente inibiu não apenas uma outra bactéria láctica (Lactobacillus helveticus),
mas também microrganismos patogênicos (Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Bacillus cereus, Clostridium perfringens e Enterococcus faecalis).
De Martinis e Franco (1998) demonstraram que a bactéria
Lactobacillus sake 2a, atualmente Lactobacillus sakei, produtora de bacteriocina e
isolada de lingüiça frescal, apresenta atividade anti-listeria em lingüiça frescal
artificialmente contaminada.
29
2.3.4 Nisina
A nisina é a única bacteriocina disponível comercialmente para
utilização em alimentos. Esta bacteriocina é produzida por algumas linhagens de
Lactococcus lactis subsp. lactis, é atóxica, destruída por enzimas digestivas e não
confere sabores e odores desagradáveis aos alimentos.
A nisina foi reconhecida como aditivo alimentar pela Organização
de Alimentos e Agricultura/Organização Mundial de Saúde (FAO/OMS) em 1969,
sendo permitida para uso em alimentos em diversos países. Na legislação da
Comunidade Européia pode ser rotulada como aditivo natural com código E234.
No Brasil, a nisina é aprovada para uso em todos os tipos de queijo
no limite máximo de 12,5 mg/kg e nosso país é pioneiro na utilização dessa bacteriocina
em produtos cárneos, sendo permitida a sua aplicação na superfície externa de salsichas
de diferentes tipos. O produto pode ser aplicado como solução comercial de nisina a
0,02% (DE MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002).
A aplicação de nisina em carnes é um assunto bastante controverso.
Ela foi avaliada por alguns autores, obtendo-se sucesso quando aplicada em superfícies
de carnes, a fim de reduzir as contagens de L. monocytogenes (DE MARTINIS;
ALVES; FRANCO, 2002). Davies et al. (1999) relataram que nisina, utilizada nos
níveis de 6,25 a 25 mg/g, foi eficiente para controlar bactérias deteriorantes em
mortadela tipo Bologna.
Entretanto, a aplicação de nisina em carnes pode ser limitada devido
à sua baixa solubilidade nesses produtos, à possibilidade de destruição por enzimas da
carne crua e à ineficiência na inibição de vários organismos patogênicos ou
deteriorantes de importância em carnes (DE MARTINIS et al., 2002). A efetividade da
aplicação de nisina na superfície de salsichas, conforme preconizado pelo Ministério da
Agricultura do Brasil, foi avaliada por Castro (2002) que demonstrou que esse
procedimento é pouco efetivo no controle de L. monocytogenes ou de microrganismos
deteriorantes, incluindo psicrotróficos e bactérias láticas.
Porém, Kominsky (1997) testou a nisina onde, em soluções de
imersão, mostrou-se adequada para inibir os microrganismos Brochothrix
thermosphacta, Weissella viridescens, Leuconostoc mesenteroides e Listeria
monocytogenes, testados em salsichas comuns e de frango inoculados artificialmente.
30
2.4 Bacteriocina P34
Motta (2006) identificou, purificou e caracterizou um peptídeo
antimicrobiano, a partir da seleção de culturas oriundas de 86 isolados do ambiente
aquático da Amazônia, o qual apresentou espectro de atividade contra microrganismos
patogênicos importantes. A bactéria produtora do composto foi identificada como
pertencente ao gênero Bacillus, agrupada, segundo a análise filogenética com a espécie
Bacillus infernus, mas com características fisiológicas e bioquímicas bastante distintas,
indicando a possibilidade do isolamento e identificação de uma nova espécie de
Bacillus (Bacillus amazonensis).
O peptídeo antimicrobiano denominado bacteriocina P34 mostra,
segundo a espectometria de massas, tratar-se de um composto com massa molecular de
1498.68 Da e, cujo modo de ação se dá por alterações em nível de membrana celular
provocando efeitos bactericida e bacteriolítico em Listeria monocytogenes. A
bacteriocina P34 causa o rápido decréscimo do número de células viáveis de L.
monocytogenes em fase exponencial de crescimento. Dependendo de sua concentração
no meio de cultura provoca alteração nos constituintes lipídicos da membrana, formação
de vesículas no protoplasma celular, poros na membrana e desintegração das células. É
termoestável e com atividade em ampla faixa de pH, com atividade máxima produzida
na fase estacionária de crescimento bacteriano, embora sendo iniciado na fase
exponencial de crescimento, sugerindo tratar-se de metabólito primário de Bacillus sp.
P34 (MOTTA, 2006).
Segundo Motta (2006), a bacteriocina P34 apresenta espectro
inibitório para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas incluindo microrganismos
importantes como Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Lactobacillus acidophilus,
Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Erwinia carotovora, Aeromonas hydrophila,
Pasteurella haemolytica, entre outras. Apresenta também atividade antimicrobiana
residual de 100% após tratamento térmico de 100°C por 15 minutos, atividade
antimicrobiana na faixa de pH 3,0 a 10,0 e atividade residual em torno de 65% ao
congelamento a -20°C por 15 dias. Apresenta características aniônicas e é altamente
hidrofóbica, sugerindo que a maior parte de seus aminoácidos constituintes são de
natureza apolar. Diante disso, a bacteriocina P34 apresenta um espectro de ação
relativamente amplo o que permite caracterizá-la como pertencente à Classe Ib, de
acordo com a classificação de Klaenhammer (1993).
31
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
3.1.1 Microrganismos
Os microrganismos Bacillus sp. linhagem P34, Listeria
monocytogenes ATCC 7644, Listeria monocytogenes 4C, Listeria monocytogenes
7D78/03, Listeria innocua ATCC 33090 4R, Listeria innocua 1572, Listeria ivanovii 5
NCTC 11007, Listeria seeligeri AC 82/4, Listeria welchimeri AC 73/2 e Listeria spp.
foram obtidos da bacterioteca do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada
do Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul (UFRGS - RS).
As linhagens de bactérias lácticas foram isoladas de lingüiça frescal
de frango pela técnica de pesquisa de bactérias lácticas em ágar MRS (Man-Rogosa-
Sharpe).
3.1.2 Reagentes e Meios
Foram utilizados no decorrer de todo o experimento os seguintes
reagentes e meios: Trypticase Soy Agar (TSA; Mast Group Merseyside, UK); Brain
Heart Infusion (BHI; Oxoid Basingstoke, UK); Trypticase Soy Broth (TSB; Acumedia,
Baltimore, USA); Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Vetec, BR); Agar (Vetec, São Paulo,
BR); Peptone Water (Merck; Darmstadt, Germany); Oxford Listeria agar base
(Acumedia; Baltimore, USA); Oxford Listeria selective supplement (Merck; Darmstadt,
Germany); Sephadex G-100; Solução salina 0,85% (NaCl; Quimex, BR); água destilada
pH 7,0; NaOH 5% (Nuclear; São Paulo, BR); solução tampão fosfato 10 mM pH 7,0 e
pH 6,0 (fosfato dissódico hidratado e fosfato monossódico hidratado; Merck,
Darmstadt, Germany); Tween 80 (Nuclear; São Paulo, BR) e Nisaplin (Danisco).
3.1.3 Produto a ser testado
32
O produto a ser testado foi lingüiça frescal de frango (salsichão de
frango) obtida em sua totalidade de amostras no Estabelecimento Matadouro-Frigorífico
e Fábrica de Embutidos BOAVE – Ltda sob CISPOA nº 787.
3.2 Métodos
3.2.1 Manutenção dos microrganismos
O microrganismo produtor da bacteriocina, Bacillus sp., e o
microrganismo indicador da sensibilidade, L. monocytogenes, foram semeados por
esgotamento em placas de ágar TSB e ágar BHI para confirmação da pureza das
linhagens, e mantidas sob refrigeração. As bactérias lácticas isoladas do produto foram
mantidas em ágar MRS. As linhagens foram repicadas a cada 15 dias.
3.2.2 Obtenção da bacteriocina P34 parcialmente purificada
3.2.2.1 Preparação do pré-inóculo
As colônias do microrganismo produtor, estocadas em ágar TSB,
foram coletadas por raspagem de placas e transferidas para frascos com 20 ml de caldo
TSB. A cultura foi incubada a 37°C por 24 horas; em equipamento incubador com
agitação (180 rpm).
3.2.2.2 Produção da substância antimicrobiana
O crescimento do microrganismo produtor foi acompanhado com
cultivos em frascos erlenmeyer de 500 ml, contendo 200 ml de caldo TSB, pH 7,0. A
incubação foi realizada a 30°C por 24 horas, em equipamento incubador com agitação
(180 rpm). Para a obtenção da substância antimicrobiana do cultivo em caldo, foi
realizada uma centrifugação a 10.000 x g por 15 minutos a 12°C, para separar as células
bacterianas do sobrenadante bruto do meio de cultivo. Após, foi realizada a primeira
etapa de purificação, obtendo-se a substância parcialmente purificada.
33
3.2.2.3 Purificação parcial da bacteriocina P34
O sobrenadante bruto foi submetido a precipitação com sulfato de
amônio à 20 % de saturação, a 10°C em agitação, ressuspendido com tampão fosfato 10
mM pH 7,0 e filtrado em membrana 0,22 μm (Millipore, Bedford, USA). Após, foi
eluído com a mesma solução tampão em coluna de gel-filtração Sephadex G-100 e
frações de 1 ml foram coletadas para realização do teste de atividade antimicrobiana. As
frações com atividade foram reunidas e estocadas a 4ºC para seu uso posterior nos
experimentos realizados.
3.2.3 Avaliação da atividade antimicrobiana da bacteriocina P34 parcialmente
purificada em diferentes espécies de Listeria spp.
Para avaliação da atividade antimicrobiana foi empregado o Método
de Difusão em Ágar com Discos (KIMURA et al., 1998). A substância antimicrobiana
foi testada de modo a verificar sua capacidade de inibir as culturas indicadoras (Listeria
monocytogenes ATCC 7644, Listeria monocytogenes 4C, Listeria monocytogenes
7D78/03, Listeria innocua ATCC 33090 4R, Listeria innocua 1572, Listeria ivanovii 5
NCTC 11007, Listeria seeligeri AC 82/4, Listeria welchimeri AC 73/2 e Listeria spp.).
Para o preparo das culturas indicadoras, foi feita uma suspensão de cada cultura em tubo
de ensaio com 4,5 ml de solução de NaCl 0,85%. Foi feita a padronização da suspensão
obedecendo a densidade ótica de aproximadamente 0,15, que correspondeu a 0,5 na
Escala de McFarland, tendo-se aproximadamente 10
8
UFC/ml (unidades formadoras de
colônias por mililitro) de cada cultura indicadora. A suspensão foi espalhada
uniformemente sobre o ágar com swab estéril e após, foi realizada a colocação dos
discos de celulose esterilizados sobre a superficie da placa contendo meio ágar TSB. As
preparações contendo a substância antimicrobiana foram aplicadas sobre os discos em
alíquotas de 20 μl. As placas foram incubadas nas temperaturas ótimas das culturas
indicadoras. As leituras para verificação da formação de halos de inibição foram
realizadas em 24 horas de incubação; sendo a presença de halos indicativa da presença
de atividade antimicrobiana. O título da atividade da bacteriocina foi determinado pelo
método da diluição seriada. A atividade foi definida como sendo a recíproca da última
diluição que apresentou uma zona de inibição, e foi expressa em unidades arbitrárias por
mililitro (UA/ml), de acordo com Mayr-Harting, Hedjes e Berkeley (1972).
34
3.2.4 Avaliação da atividade da bacteriocina P34 parcialmente purificada em
diferentes tempos de inoculação frente à L. monocytogenes ATCC 7644
A bacteriocina P34 parcialmente purificada foi aplicada em
alíquotas de 20 µl em placas com ágar TSB em dois momentos de crescimento
microbiano de L. monocytogenes, no tempo zero, ou seja, logo após a semeadura na
placa do microrganismo indicador e 24 horas mais tarde, com o patógeno já crescido.
Ambos grupos experimentais foram incubados à temperatura de refrigeração por 8 dias
e testados com 3 concentrações diferentes, 6400 UA/ml, 3200 UA/ml e 1600 UA/ml. O
experimento foi realizado em triplicata e a suspensão com o microrganismo indicador
foi padronizada obedecendo a densidade ótica de aproximadamente 0,15 a 600
nanômetros, que correspondeu a 0,5 na Escala de McFarland.
3.2.5 Análise microbiológica da lingüiça frescal de frango
Foi realizada análise microbiológica do produto a ser testado
conforme os padrões legais vigentes segundo Resolução RDC nº 12 de Janeiro de 2001
do Ministério da Saúde.
3.2.6 Pesquisa e isolamento de bactérias lácticas do produto
Conforme normas preconizadas, a unidade analítica foi coletada
assepticamente e transferida para erlenmeyer previamente esterilizado e tarado, onde foi
homogeneizada. O preparo da primeira diluição constou da adição de 225 ml de água
peptonada 0,1% à 25 g da amostra cárnea. Após transferiu-se para equipamento
stomacker durante 2 minutos com o diluente pré-resfriado em banho de gelo. O
intervalo entre a homogeneização e o prosseguimento da análise não ultrapassou 3
minutos. Foram realizadas mais 3 diluições seriadas da amostra homogeneizada até a
diluição 10
-4
.
Para isolamento das bactérias lácticas, realizou-se a inoculação em
profundidade de 1 ml de cada diluição em placas de Petry estéreis adicionando em
seguida o ágar MRS, sendo estas incubadas invertidas após a completa solidificação do
ágar a 30ºC / 48-72 horas em atmosfera microaerófila. Após 72 horas, as colônias foram
selecionadas e isoladas também em placas com ágar MRS.
35
3.2.7 Teste de antagonismo das bactérias lácticas frente à L. monocytogenes ATCC
7644
As bactérias lácticas já isoladas foram semeadas com agulha em
forma de picada em ágar MRS, colocando-se 3 a 4 pontos por placa e crescidas por 24
horas. Paralelamente, foi realizado pré-inóculo de L. monocytogenes ATCC 7644 em
caldo BHI em 5 tubos contendo 10 ml de caldo BHI e incubados a 37ºC por 24 horas.
Em outros tubos foram preparados 50 ml de ágar BHI semi-sólido (BHI adicionado de
0,6 % de agar) para onde, foram transferidos 200 μl ou 100 μl dos pré-inóculos. Foi
vertido o conteúdo dos tubos de ágar BHI semi-sólido contendo o inóculo sobre as
placas com as bactérias lácticas sendo o local da inoculação de cada ponto identificado.
As placas foram incubadas a 30ºC / 24 hs. O experimento foi realizado em triplicata e os
inóculos de BHI com o microrganismo indicador foram padronizados obedecendo a
densidade ótica de aproximadamente 0,15, que correspondeu a 0,5 na Escala de
McFarland.
3.2.8 Produção de sobrenadantes brutos de bactérias lácticas e teste de sinergismo
com a bacteriocina P34 parcialmente purificada frente à L. monocytogenes
ATCC 7644
Foram preparados pré-inóculos de cada uma das bactérias lácticas
isoladas coletando-se uma colônia da placa e inoculando-a em 20 ml de caldo MRS e
incubando a 30°C / 24 horas, em equipamento incubador com agitação (180 rpm).
Destes, o inóculo fez-se com a adição de 1 ml do pré-inóculo em 99 ml de caldo TSB,
sendo também colocado a seguir em equipamento incubador com agitação (180 rpm) a
30ºC / 48 hs. Para a obtenção da substância antimicrobiana do cultivo em caldo, foi
realizada uma centrifugação a 10.000 x g por 15 minutos a 12°C, para separar as células
bacterianas do sobrenadante do meio de cultivo, que então foi retirado e medido seu pH.
Cerca de metade do volume do sobrenadante foi neutralizado com hidróxido de sódio
5% até obtenção de pH 7,0 e na outra metade do volume foi mantido o valor original do
pH. O microrganismo indicador, L. monocytogenes ATCC 7644, foi ressuspendido em
solução salina 0,85% padronizada em 0,15 por densidade óptica em espectrofotômetro
sendo semeada com swabs estéreis em placas de ágar BHI. Discos de celulose estéreis
foram colocados nestas placas sendo inoculados alíquotas de 20 μl do sobrenadante
36
bruto com pH neutralizado e não-neutralizado. As placas foram divididas em 5 partes,
sendo: sobrenadante bruto não-neutralizado (SNN), sobrenadante bruto neutralizado
(SN), bacteriocina P34, sobrenadante bruto não-neutralizado com bacteriocina P34
(SNN+P34), e sobrenadante bruto neutralizado com bacteriocina P34 (SN+P34), com
seus volumes equalizados.
3.2.9 Inoculação de L. monocytogenes ATCC 7644 e bacteriocina P34 parcialmente
purificada em lingüiça frescal de frango
O microrganismo indicador, L. monocytogenes ATCC 7644, foi
ressuspendido em solução salina 0,85% padronizada em 0,15 por densidade óptica em
espectrofotômetro. Diluições seriadas foram realizadas em água peptonada 0,1%
obtendo-se concentração de células de aproximadamente 10
2
UFC/ g.
As embalagens foram abertas após desinfecção dos pontos de
abertura destas com etanol a 70% conforme os Métodos Analíticos Oficiais para
Controle de Produtos de Origem Animal e seus Ingredientes, preconizado pelo
Ministério da Agricultura. As amostras constando de 25 g foram retiradas e pesadas em
balança analítica sendo depositadas separadamente em placas de Petry estéreis. Assim,
três grupos de tratamento foram arranjados da seguinte forma: grupo 1, que constituiu-
se da amostra cárnea adicionada de 2 ml de solução tampão fosfato 10 mM pH 7,0
sendo conservada sob refrigeração a 5ºC por 10 dias; grupo 2, que constitui-se da
amostra cárnea adicionada de 1 ml da suspensão de células da bactéria L.
monocytogenes ATCC 7644 e 1 ml da bacteriocina P34 parcialmente purificada; e o
grupo 3 que constitui-se da amostra cárnea adicionada de 1 ml da suspensão de células
do microrganismo indicador e 1 ml de solução tampão fosfato 10 mM pH 7,0. Foram
tomadas amostras nos dias zero, três, sete e dez a partir da data de fabricação das
lingüiças nos 3 grupos, todos do mesmo lote de fabricação. Todo o experimento foi
realizado em triplicata.
Foi realizado, adicionalmente, com os mesmos princípios, o
experimento incluindo a nisina que constou de cinco grupos distribuídos da seguinte
forma: grupo controle, grupo com o microrganismo indicador apenas, grupo com
bacteriocina P34 parcialmente purificada, grupo com nisina e grupo com 50% da dose
aplicada de nisina e bacteriocina P34 parcialmente purificada. As coletas para
37
recuperação da L. monocytogenes e contagem de UFC/g foram realizadas nos dias zero
e dez. O experimento foi mantido sob refrigeração a 5ºC.
3.2.10 Recuperação de L. monocytogenes em lingüiça frescal de frango
Foram pesadas 10 g das amostras das placas e colocadas em sacos
plásticos estéreis adicionados de 90 ml de água peptonada 0,1%. Estes foram agitados
em equipamento stomacker por 1 minuto e deixados em repouso por 2 horas
procedendo diluições seriadas em água peptonada até 10
-4
. Alíquotas de 20 µl foram
transferidas para placas com meio MOX (Oxford Listeria agar base adicionado de
Oxford Listeria Selective supplement) que foram incubadas a 37°C por 48 horas. Com
auxílio de estereoscópio e iluminação angular de 45°C realizou-se a contagem das
colônias bacterianas de L. monocytogenes.
3.2.11 Incorporação da bacteriocina P34 parcialmente purificada em envoltório
natural de bovino (tripa) e avaliação de sua atividade frente à L.
monocytogenes ATCC 7644
Foram recortados quadrados de 1,5 cm
2
de envoltório natural
comestível (tripa) e depositados em placa de Petry estéril sendo vertido sobre os
fragmentos 500 μl de bacteriocina P34 parcialmente purificada contendo 3200 UA/ml.
No grupo controle foi vertido 500 μl de solução tampão fosfato 10 mM pH 7,0.
Aguardou-se a secagem completa dos líquidos por cerca de 10 minutos e então se
procedeu a configuração de 6 grupos experimentais, sendo: grupo 1 (controle)
constituído pelo fragmento de envoltório natural comestível impregnado com 500 μl de
solução tampão fosfato 10 mM pH 7,0 ; grupo 2 constituído pelo fragmento de
envoltório natural comestível impregnado com 500 μl de bacteriocina P34 parcialmente
purificada; grupos 3 e 4 constituídos pelos fragmentos de envoltório natural comestível
impregnados com 500 μl de bacteriocina P34 parcialmente purificada previamente
tratados a 100ºC por 30 segundos e 10 minutos, respectivamente; grupos 5 e 6
constituídos pelos fragmentos de envoltório natural comestível impregnados com 500 μl
de bacteriocina P34 parcialmente purificada previamente tratados a 4ºC por 30 segundos
e 10 minutos, respectivamente. Os envoltórios foram aplicados em placas com meio
38
TSA previamente inoculadas com L. monocytogenes. Os resultados foram interpretados
como o aparecimento de halos de inibição em torno dos fragmentos de envoltório
natural comestível após a incubação a 37ºC por 24 horas.
3.2.12 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram analisados pela comparação entre as
médias, através do teste de Tukey, sendo as diferenças consideradas significativas
quando p < 0,05.
39
4 RESULTADOS
4.1 Atividade antimicrobiana da bacteriocina P34 parcialmente purificada em
diferentes linhagens de Listeria spp.
Foi testada a atividade anti-listeria da bacteriocina P34 parcialmente
purificada frente a diferentes linhagens de Listeria spp. em ágar TSB. Os resultados
foram expressos a partir da observação de halos de inibição em torno dos discos de
celulose estéreis depositados sobre o meio inoculado com a respectiva espécie ou
linhagem. A partir disso pode-se determinar o valor das unidades de atividade, como a
recíproca da maior diluição em que foi verificado halo, consequentemente maior
sensibilidade do microrganismo à bacteriocina (Tabela 1).
Tabela 1 - Atividade da bacteriocina P34 sobre diferentes espécies e linhagens de
Listeria spp.
Microrganismo Atividade UA/ml*
Listeria monocytogenes 4C 800
Listeria monocytogenes 7D78/03 800
Listeria innocua ATCC 33090 4R 100
Listeria innocua 1572 400
Listeria ivanovii 5 NCTC 11007 200
Listeria seeligeri AC 82/4 400
Listeria welchimeri AC 73/2 800
Listeria sp. 400
Listeria monocytogenes ATCC 7644 800
* determinação de unidades de atividade por mililitro.
Entre as diferentes espécies de Listeria testadas, as linhagens de L.
monocytogenes foram as que apresentaram maior sensibilidade. A linhagem L.
monocytogenes ATCC 7644 foi escolhida como microrganismo indicador para os
experimentos subseqüentes.
40
4.2 Efeitos da bacteriocina P34 frente à L. monocytogenes ATCC 7644
Foi avaliada a atividade anti-listeria da bacteriocina P34
parcialmente purificada com relação à temperatura de refrigeração em placas com o
microrganismo indicador em crescimento ou inoculado simultaneamente à adição da
bacteriocina. Este experimento foi realizado em duplicata.
Conforme os resultados demonstrados na Tabela 2, houve
diferenças significativas no diâmetro dos halos de inibição nos diferentes tempos de
inoculação. As comparações foram realizadas entre os tempos de inoculação para cada
diluição diferente. Para a concentração de 6400 UA/ ml de bacteriocina P34
parcialmente purificada, a inibição foi maior no tempo zero. Na concentração de 3200
UA/ ml, não houve diferença significativa entre os tempos, e, para a concentração de
1600 UA/ml de bacteriocina, houve maior inibição no tempo 24 horas.
Tabela 2 - Efeitos da bacteriocina P34 frente à L. monocytogenes ATCC 7644
Valores dos halos (em mm) para as diluições
6400 UA/ml 3200 UA/ml 1600 UA/ml
P34 adic t = 0
17,25 ± 1,06 a 13,50 ± 0,70 a 9,25 ± 0,35 a
P34 adic t = 24 hs
15,00 ± 0,0 b 13,25 ± 0,35 a 11,25 ± 0,35 b
P34
adic t = 0 – bacteriocina inoculada no tempo zero e placas incubadas a 5ºC/8 dias
P34 adic t
= 24 hs - bacteriocina inoculada no tempo 24 hs com L. monocytogenes crescida à 5ºC e placas incubadas a 5ºC/8 dias
4.3 Análise Microbiológica da lingüiça frescal de frango
Foi realizada análise microbiológica da lingüiça frescal de frango
como procedimento inicial do experimento. Os resultados demonstram tratar-se de
produto de acordo com os padrões legais vigentes segundo Resolução n° 12 de 02 de
Janeiro de 2001 do Ministério da Saúde (Tabela 3).
41
Tabela 3 - Análise Microbiológica da lingüiça frescal de frango
Ensaios Resultados*
Salmonella
ausente em 25g
Coliformes Totais 21,0NMP/g
Coliformes Fecais 2,3NMP/g
Contagem padrão 1,75x10
4
UFC/g
Clostridium Sulfito Redutor ausente em 0,01g
Staphylococcus aureus
2,5x10
2
UFC/g
* - não houve isolamento de L. monocytogenes.
4.4 Pesquisa e isolamento de bactérias lácticas da lingüiça frescal de frango
Foram isoladas da lingüiça frescal de frango sem adição de cultura
“starter” bactérias lácticas saprófitas que foram, conforme suas características
morfológicas, (arredondadas, apigmentadas e translúcidas) classificadas aleatoriamente
como L1, L2, L3, L4, L5 e L6. A partir disso foi testada a capacidade inibitória destas
frente à L. monocytogenes ATCC 7644. Os resultados demonstram diferenças
significativas entre estas bactérias com relação ao tamanho do halo de inibição
produzido, porém nenhuma diferença com relação à concentração da suspensão do
microrganismo indicador utilizada, considerando-se p < 0,05 (Tabela 4). Para este
experimento foram utilizados 100 e 200 μl da suspensão de L. monocytogenes ATCC
7644 padronizada, correspondendo a 10
2
e 10
3
UFC/ml, respectivamente.
Tabela 4 - Teste de antagonismo de bactérias lácticas isoladas de lingüiça frescal de
frango contra L. monocytogenes ATCC 7644.
Halo de inibição (mm)*
Linhagem
10
2
UFC/ml 10
3
UFC/ml
L1 7,5 ± 0,7 a 3,0 ± 4,2 a
L2 4,0 ± 1,4 b 6,5 ± 0,7 b
L3 2,0 ± 0,0 c 4,0 ± 0,0 b
L4 0,5 ± 0,7 e 1,0 ± 0,0 e
L5*
1
0 0
L6 6,5 ± 0,7 a 6,0 ± 1,4 a
* - Os valores são as médias de três determinações. *
1
– Não houve observação de halos.
42
4.5 Verificação de sinergismo entre bactérias lácticas presentes e bacteriocina P34
parcialmente purificada
Os sobrenadantes brutos das bactérias lácticas não resultaram na
formação de halos de inibição frente ao microrganismo indicador, L. monocytogenes
ATCC 7644 (Tabela 5). A bacteriocina P34 parcialmente purificada apresentou a
formação de halos de inibição e demonstrou efeito sinérgico quando adicionada destes
mesmos sobrenadantes brutos, pelo aumento no tamanho dos halos. Isto foi observado
para os sobrenadantes brutos que tiveram seu pH inicial neutralizado com NaOH para
7,0 e para os sobrenadantes brutos não-neutralizados que apresentaram valores de pH
entre 5,0 e 6,5.
Considerando-se p < 0,05, para as linhagens L1, L2 e L4, não
houveram diferenças entre os tratamentos pois, os tratamentos apenas com a
bacteriocina P34, no grupo P34, não diferiram de P34+N (sobrenadante bruto
neutralizado) com nível de significância abaixo de 95% (93%) e de P34+NN
(sobrenadante bruto não neutralizado) com nível de significância também abaixo de
95% (88%).
Para a linhagem L3, houve diferença entre os tratamentos P34 e
P34+N, e nenhuma diferença entre P34+N e P34+NN.
L6 demonstrou diferença entre os tratamentos P34 e P34+N e
P34+NN, porém nenhuma diferença entre os tratamentos com sobrenadante bruto
neutralizado e sobrenadante bruto não-neutralizado (Tabela 5).
43
Tabela 5 - Teste de sinergismo entre sobrenadantes brutos de bactérias lácticas e
bacteriocina P34 parcialmente purificada frente à L. monocytogenes ATCC
7644
Halos de inibição (mm)* Linhagem
N NN P34 P34+N
P34+NN
L1 0 0 15,7 ± 1,2 a 22,3 ± 4,9 a 21,3 ± 1,2 a
L2 0 0 17,3 ± 2,3 a 22,0 ± 2,0 a 21,7 ± 1,2 a
L3 0 0 16,3 ± 0,6 a 25,7 ± 3,8 b 22,0 ± 1,7 c
L4 0 0 18,3 ± 4,0 a 27,0 ± 5,2 a 24,3 ± 1,2 a
L6 0 0 15,7 ± 0,6 a 24,0 ± 1,0 b 21,0 ± 1,7 b
* - Os valores são as médias de três determinações.
N = sobrenadante neutralizado
NN = sobrenadante não-neutralizado
P34 = bacteriocina P34 parcialmente purificada
P34+N = bacteriocina P34 parcialmente purificada e sobrenadante neutralizado
P34+ NN = bacteriocina P34 parcialmente purificada e sobrenadante não-neutralizado
4.6 Avaliação da bacteriocina P34 parcialmente purificada incorporada na
lingüiça frescal de frango artificialmente inoculada com L. monocytogenes
ATCC 7644
A atividade antimicrobiana da bacteriocina P34 parcialmente
purificada foi avaliada através da inoculação desta em lingüiça frescal de frango
artificialmente inoculada com o microrganismo indicador, L. monocytogenes ATCC
7644. Durante sua recuperação nos intervalos do experimento, observa-se que a
bacteriocina P34 parcialmente purificada inibiu a multiplicação do microrganismo L.
monocytogenes ATCC 7644 no decorrer do experimento sob refrigeração.
A concentração de bacteriocina P34 parcialmente purificada
incorporada à massa cárnea foi de 256 UA/g (6400 UA/ml) e do microrganismo
indicador, L. monocytogenes ATCC 7644 foi de 8,8x10
2
UFC/g.
Durante o armazenamento sob refrigeração a 5ºC o número de
unidades formadoras de colônias por grama (UFC/g) de L. monocytogenes ATCC 7644
diminuiu de 460 para 195 UFC/g (≠264), onde, no grupo apenas com o microrganismo
indicador, houve a redução de 532 para 364 indicando que a bacteriocina P34
parcialmente purificada possuiu atividade anti-listeria capaz de reduzir 95 UFC/g. Esta
diminuição de UFC/g do grupo com a L. monocytogenes e a bacteriocina P34
parcialmente purificada ocorreu, principalmente, do dia zero para o dia três, o que não
44
pôde ser evidenciado quando comparamos os intervalos três dias com sete dias e sete
dias com dez dias, apesar de ter ocorrido uma redução de 329 para 265 UFC/g e de 265
para 195 UFC/g respectivamente, não sendo, as diferenças, nestes tempos do
experimento, significativas com p < 0,05.
Observa-se que o grupo que continha somente L. monocytogenes
apresentou uma redução significativa no número de unidades formadoras de colônias
por grama (UFC/g) do tempo zero ao dia três (p < 0,05). Porém, quando comparada do
dia três ao dia sete e deste ao dia dez, não houve redução significativa apesar de ocorrer
a redução no número de UFC/g (Figura I).
0
100
200
300
400
500
600
700
03710
Tempo (dias)
UFC/g
Figura 1 - Efeito da bacteriocina P34 parcialmente purificada no crescimento de L.
monocytogenes ATCC 7644 artificialmente inoculada em lingüiça frescal de frango. ■ –
grupo com L. monocytogenes; ▲ - grupo com L. monocytogenes e bacteriocina P34
parcialmente purificada; ♦ - grupo controle. Cada ponto representa a média ±desvio
padrão de quatro determinações
45
4.7 Comparação dos efeitos da nisina e bacteriocina P34 parcialmente purificada
em lingüiça frescal de frango artificialmente inoculada com L. monocytogenes
ATCC 7644
O comportamento dos diferentes grupos tratados com bacteriocina
P34 parcialmente purificada, nisina e ambas nos dias zero e dez da inoculação sob
temperatura de refrigeração pode ser observado na Figura 2.
Pode-se notar que houve diferenças significativas entre os grupos L.
monocytogenes e nisina (Lm + Nis), L. monocytogenes e 50% de Nisina com 50% de
bacteriocina P34 parcialmente purificada (Lm e P34+Nis), bacteriocina P34 e nisina
(P34 e Nis), bacteriocina P34 parcialmente purificada e 50% de bacteriocina P34
parcialmente purificada com 50% de nisina (P34 e P34+Nis), nos dois intervalos do
experimento.
0
200
400
600
800
1000
1200
controle LM P34 Nis P34+Nis
dia zero
dia dez
Figura 2 - Crescimento de L. monocytogenes ATCC 7644 em lingüiça frescal de
frango artificialmente inoculada sob tratamento com bacteriocina P34 e
nisina no período de dez dias sob resfriamento
46
4.8 Avaliação da bacteriocina P34 adsorvida em envoltório de lingüiça frescal de
frango frente à L. monocytogenes ATCC 7644
A atividade antimicrobiana da bacteriocina P34 parcialmente
purificada foi testada nos envoltórios naturais comestíveis (tripas de bovinos semi-secas
salgadas) utilizados na lingüiça frescal de frango frente ao microrganismo indicador, L.
monocytogenes ATCC 7644. A Figura 3 ilustra o halo de inibição produzido pelo
envoltório natural comestível contendo bacteriocina P34 parcialmente purificada e
tratada à 4ºC/30seg. Frente à L. monocytogenes ATCC 7644.
Figura 3 - Halo de inibição de envoltório natural comestível contendo a bacteriocina
P34 parcialmente purificada tratado à 4ºC/30seg frente à L. monocytogenes
ATCC 7644
Os resultados como halos de inibição em milímetros da bacteriocina
incorporada ao envoltório frente ao patógeno sob diferentes tratamentos térmicos são
apresentados na Tabela 6. Pode-se notar que todos os grupos, exceto o grupo controle,
que não levou a adição da bacteriocina P34 parcialmente purificada, mostraram
atividade, ou seja, produziram halos de inibição em torno dos fragmentos de tripa
tratada após os tratamentos aplicados nestas.
47
Tabela 6 - Resultados de atividade da bacteriocina P34 parcialmente purificada
incorporada em tripas naturais frente à Listeria monocytogenes ATCC
7644
Grupos
Halos de inibição em mm*
Controle
0
P34
4,7 ± 0,6
P34 + 100ºC/30”
4,2 ± 1,0
P34 + 100ºC/10’
4,3 ± 0,8
P34 + 4ºC/30”
4,3 ± 1,2
P34 + 4ºC/10’
4,0 ± 0,5
* = Os valores são as médias de três determinações
48
5 DISCUSSÃO
A bacteriocina P34 demonstrou atividade inibitória in vitro contra
várias linhagens de Listeria spp., como Listeria monocytogenes ATCC 7644, Listeria
monocytogenes 4C, Listeria monocytogenes 7D78/03, Listeria innocua ATCC 33090
4R, Listeria innocua 1572, Listeria ivanovii 5 NCTC 11007, Listeria seeligeri AC 82/4
e Listeria welchimeri AC 73/2, em ágar TSB e definidos em unidades de atividade por
mililitros de bacteriocina.
A sensibilidade das linhagens de L. monocytogenes observada
sugere a elevada efetividade da bacteriocina P34 parcialmente purificada como agente
antimicrobiano contra este importante patógeno. Conforme anteriormente já descrito por
Motta (2006), a bacteriocina P34 possui efeito bactericida e bacteriolítico sobre L.
monocytogenes spp. pela diminuição das células viáveis durante a fase exponencial de
crescimento celular bacteriano.
O efeito da bacteriocina P34 parcialmente purificada sobre L.
monocytogenes ATCC 7644 em diferentes tempos de inoculação à temperatura de
refrigeração demonstrou haver diferenças. Nesta temperatura de 5ºC, ocorrem mudanças
na composição dos agentes de membrana da L. monocytogenes dificultando a ação das
bacteriocinas. O que pode ser evidenciado em estudos que avaliaram L. monocytogenes,
inoculada em sistema cárneo-modelo, com bacteriocinas (enterocinas A e B, sacacina K,
pediocina AcH e nisina). Sob temperatura de refrigeração e mantida até o final da
estocagem (61 dias) a L. monocytogenes não foi inibida pois, a contagem deste
microrganismo nos tratamentos com as bacteriocinas sacacina, enterocina ou pediocina
foi mantida em 10
2
UFC/g (GARRIGA et al., 2002a).
Todos os alimentos apresentam uma microbiota natural
extremamente variável aliada àquela que pode estar presente em decorrência das
diversas etapas que levam à obtenção de produtos processados, estando estes alimentos
sujeitos à contaminação por diferentes microrganismos provenientes de manipulação
inadequada, contato com equipamentos, superfícies e utensílios e pela atmosfera
ambiental.
Produtos cárneos, principalmente os minimamente processados,
também podem apresentar vários tipos de microrganismos benéficos e prejudiciais à
saúde do consumidor. Dentre esta microbiota natural, é comum a presença de bactérias
lácticas em alimentos cárneos resfriados como contaminantes naturais ou saprófitas
49
destes produtos. Dentre os microrganismos prejudiciais pode estar presente L.
monocytogenes microrganismo patogênico importante freqüente nas plantas de abate
avícolas e contaminar os produtos frescais, antes mesmo destes saírem da indústria,
prejudicando a saúde do consumidor (LOVETT, 1989). Pela análise microbiológica,
pode-se verificar que o produto lingüiça frescal de frango usada neste trabalho encontra-
se dentro dos padrões legais vigentes no país.
Freqüentemente produtos que não levam adição de culturas “starter”
em sua formulação apresentam bactérias lácticas em sua microbiota. Quatro cepas de
bactérias lácticas produtoras de bacteriocinas, que apresentaram atividade anti-listeria,
foram isoladas de cerca de 20 amostras de carnes e produtos cárneos brasileiros sem
adição de culturas “starter”, utilizando o método de antagonismo em ágar e
Lactobacillus sake ATCC 15521 como microrganismo indicador (DE MARTINIS et
al., 2001).
Mais de 200 linhagens de bactérias lácticas foram isoladas de seis
amostras de pernil desossado curado e três amostras de salame tipo italiano artesanal
onde, pelo teste de inibição direta, 59 delas foram capazes de inibir in vitro o
desenvolvimento de Listeria monocytogenes e de Staphylococcus aureus, demonstrando
a produção de compostos inibitórios (DABÉS; SANTOS; PEREIRA, 2000).
A lingüiça frescal de frango apresentou, em sua microbiota,
bactérias lácticas, capazes de causar inibição do crescimento de L. monocytogenes
(antagonismo direto) tanto para concentração de 10
2
como 10
3
UFC/g do
microrganismo indicador, mantendo o diâmetro de seu halo inibitório aproximadamente
constante. Entretanto, quando foram utilizados os sobrenadantes brutos das bactérias
lácticas, não foi verificada atividade anti-listeria sobre o microrganismo indicador.
Além da produção de substâncias antimicrobianas, esta atividade antimicrobiana pode
ter ocorrido devido à linhagem da bactéria láctica a ser avaliada e o microrganismo
indicador se desenvolverem simultaneamente, a inibição pode ser provocada por
competição pelos nutrientes do meio (HOLZAPFEL; GEISEN; SCHILLINGER, 1995).
Analisando os efeitos de antagonismo indireto frente ao
microrganismo indicador, Listeria monocytogenes ATCC 7644, os sobrenadantes brutos
das bactérias lácticas isoladas neste trabalho apresentaram sinergismo quando
combinados com a bacteriocina P34 parcialmente purificada. Os resultados
demonstraram aumento do halo de inibição, tanto os sobrenadantes brutos que tiveram
seu pH inicial neutralizados, quanto os sobrenadantes brutos não-neutralizados (pH
50
entre 5,0 e 6,5). Estes resultados sugerem que este sinergismo não ocorre pela presença
de ácidos orgânicos, uma vez que, foi mantido o pH em torno de 7,0 (HOLZAPFEL;
GEISEN; SCHILLINGER, 1995). As linhagens L1, L2, L3, L4, L5 e L6 podem ser
produtoras de substâncias antimicrobianas tipo bacteriocinas, entretanto a quantidade
secretada para o meio sem a presença da bacteriocina P34 parcialmente purificada, nas
condições do experimento, pode ter sido insuficiente para inibir L. monocytogenes.
Além disso, bacteriocinas produzidas por bactérias lácticas muitas vezes permanecem
adsorvidas às células, necessitando pH < 3,0 para máxima liberação (HURST, 1983).
Estudos com sobrenadantes de cultivos de Lactobacillus
bulgaricus, L. casei, L. plantarum, L. acidophilus, L. brevis, L. fermentum, L. lactis e L.
helveticus isolados de laticínios da Turquia apresentaram efeito inibitório contra as
bactérias patogênicas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Yersinia enterocolítica.
Todas estas bactérias lácticas demonstraram atividade antimicrobiana para as bactérias
teste. Porém, somente três culturas de Lactobacillus spp. demonstraram atividade
antibacteriana, tanto no sobrenadante bruto da cultura com pH ajustado entre 6,5-7,0
como para este sobrenadante tratado com catalase. Este resultado indicou que os
sobrenadantes das culturas de Lactobacillus inibiram S. aureus, E. coli e Y.
enterocolítica devido à produção de peróxido de hidrogênio (ASLIM et al., 2005).
O pH do meio é de extrema importância pois as lactoestrepcinas,
por exemplo, são estáveis e ativas em valores de pH entre 4,2 e 5,0 e reversivelmente
inativadas nos valores de pH 7,0 e 8,0 (YANG et al, 1992).
O estudo da influência da temperatura e do pH sobre a atividade das
bacteriocinas vem interessando a comunidade científica. Pesquisadores avaliaram a
capacidade de Pediococcus acidilactici JBL 1095 produzir bacteriocina e inibir L.
monocytogenes em amostras de salsichas formuladas com carne bovina e embaladas a
vácuo, mantidas a 4ºC ou a 25ºC. Conforme observado, a 4ºC não houve produção de
bacteriocina, enquanto a 25ºC, em presença de P. acidilactici JBL 1095, houve uma
redução de 2,7 ciclos logarítmicos no número de células de L. monocytogenes
(DEGNAN; YOUSEF; LUCHANSKY, 1992).
Algumas bacteriocinas possuem seu potencial de ação e
características bem determinadas como antimicrobiano, assim como sua possível
aplicação como conservante de alimentos. Porém, a única bacteriocina permitida para
uso em alimentos é produzida por uma bactéria láctica, considerada GRAS (generally
regarded as safe) pelo Food and Drug Administration (FDA), a nisina, (MONTVILLE,
51
WINKWOSKI, 1997), que possui um amplo espectro como bioconservante, mas que
possui aplicação restrita em carnes devido à sua baixa solubilidade, distribuição
desuniforme e baixa estabilidade, além de ser inativada pela glutationa s-transferase,
enzima natural da carne (BROMBERG et al., 2006; ENNAHAR; SONOMOTO;
ISHIZAKI, 1999). O agente redutor β-mercaptoetanol, inativa a bacteriocina P34
(MOTTA et al., resultados não publicados) sugerindo que o efeito antimicrobiano da
bacteriocina P34 possa ser também susceptível à glutationa s-transferase.
As bacteriocinas pertencentes à Classe I tem condições de inibir um
número maior de linhagens de Listeria spp. (ENNAHAR; SONOMOTO;
ISHIZAKI,1999), porém nem todas bacteriocinas demonstram significativa atividade
anti-listeria. O efeito combinado da embalagem em atmosfera modificada e da adição da
cepa produtora de bacteriocina L. sake 2a na multiplicação de L. monocytogenes em
lingüiça frescal, embalada com filme plástico permeável ao oxigênio, 100% CO
2
ou
50% + 50%N
2
e mantida a 6
o
C foi avaliado e os resultados indicaram que a embalagem
em atmosfera modificada teve um efeito antilisteria mais acentuado que a simples
adição de L. sake 2a produtor de bacteriocina (LISERRE; FRANCO, 2002).
A bacteriocina P34 parcialmente purificada inibiu o microrganismo
Listeria monocytogenes ATCC 7644 em lingüiça frescal de frango com valores
constantes durante todo o experimento. O grupo que não continha a bacteriocina P34
parcialmente purificada apresentou uma contagem de UFC/g significativamente
superior que se manteve em todos os intervalos do experimento. Isto pode ser esperado
pelo fato do patógeno L. monocytogenes ser capaz de sobreviver, sem multiplicar-se,
por longos períodos de estocagem a 4ºC em salsichas, presunto e carne de peru
(FARBER; DALEY, 1994), por exemplo.
Além da avaliação dos efeitos da bacteriocina P34 parcialmente
purificada em lingüiça frescal de frango artificialmente contaminada com L.
monocytogenes ATCC 7644, foi realizado experimento comparando os efeitos da
bacteriocina nisina sob as mesmas condições. Neste experimento, a bacteriocina P34
parcialmente purificada apresentou a mesma atividade antimicrobiana que no
experimento anterior, porém, a nisina mostrou-se muito mais eficiente, nas condições
citadas, chegando a inibir quase que completamente o microrganismo indicador, L.
monocytogenes ATCC 7644.
Estudos recentes demonstram o efeito anti-listeria da nisina quando
combinada com algum tipo de aditivo alimentar. Samelis et al. (2005) demonstraram o
52
efeito combinado entre a bacteriocina nisina e ácidos orgânicos e sais (3 a 5 g/100 ml de
ácido acético ou 3 g/100 ml de benzoato de potássio) sobre carne suína picada estocada
à 4ºC sob atmosfera modificada resultando em efeito bactericida até 90 dias de
exposição. Pawar et al. (2000) demonstraram o efeito inibitório em combinação com
2% NaCl em carne de búfalo crua.
Diante destes resultados pode-se inferir que algum componente da
lingüiça frescal de frango pode ter concorrido para a interação entre a bacteriocina P34 e
a bacteriocina nisina ou ainda que pode ter ocorrido efeito de diluição da nisina pela
bacteriocina P34, sendo necessários experimentos mais detalhados para elucidação.
Principalmente levando-se em conta a baixa solubilidade da nisina em carnes (DE
MARTINIS et al., 2002). Além disso, estudos que mostram linhagens de L.
monocytogenes com elevada resistência à nisina indicam a necessidade de pesquisar
novos compostos anti-listeria.
A bacteriocina nisina, conforme alguns autores, possui uso restrito
em embalagens, pois é pouco efetiva para carnes frescas, demonstrando atividade anti-
listeria quando combinada com atmosfera modificada e atuante principalmente em
ambientes com baixo pH. A combinação de nisina adicionada de um agente quelante
mostra ser efetiva sobre L. monocytogenes em embalagens para alguns tipos de carnes
processadas (OLIVEIRA; PADULA, 2006).
Entretanto, escassas pesquisas relacionam a atividade de
bacteriocinas com adsorção a superfícies. A bacteriocina P34 parcialmente purificada
foi testada incorporada ao envoltório da lingüiça frescal de frango e inibiu, in vitro, o
microrganismo indicador Listeria monocytogenes ATCC 7644. Neste experimento, os
diferentes tratamentos empregados não demonstraram diferenças significativas quanto à
atividade anti-listeria da bacteriocina P34. Isto sugere que não houve influência de
temperatura, sob as condições do experimento, uma vez que esta bacteriocina apresenta
termoestabilidade e somente perde a atividade após 30 minutos a 100ºC (MOTTA,
2006).
Outras bacteriocinas como a bacteriocina 8AI produzida pelo
Bacillus cereus 8A também demonstrou efeito anti-listeria. Esta bacteriocina inibiu L.
monocytogenes ATCC 7644 quando incorporada em embalagens de polietileno e
poliestireno expandido usadas na industrialização de alimentos (BIZANI, D.;
MORRISY; BRANDELLI 2002).
53
Além de serem necessários estudos específicos, mas, conforme os
estudos realizados neste trabalho e com os resultados até então observados, pode-se
inferir que a bacteriocina P34 parcialmente purificada apresenta efeito antimicrobiano
contra Listeria monocytogenes ATCC 7644.
54
6 CONCLUSÕES
Pode-se concluir dos resultados obtidos neste trabalho:
- As bactérias lácticas presentes na lingüiça frescal de frango apresentaram efeito
antagônico direto frente à L. monocytogenes ATCC 7644.
- Alguns dos sobrenadantes brutos das bactérias lácticas presentes na lingüiça
frescal de frango apresentaram sinergismo com a bacteriocina P34 parcialmente
purificada frente à L. monocytogenes ATCC 7644.
- A bacteriocina P34 parcialmente purificada inibiu L. monocytogenes ATCC
7644 e outras espécies e linhagens de Listeria in vitro.
- A bacteriocina P34 parcialmente purificada inibiu L. monocytogenes ATCC
7644 em temperatura de refrigeração em diferentes tempos de inoculação.
- A bacteriocina P34 parcialmente purificada demonstrou atividade inibitória
quando testada em lingüiça frescal de frango artificialmente inoculada com L.
monocytogenes ATCC 7644 sob temperatura de resfriamento durante 10 dias.
- Houve sensibilidade in vitro do patógeno alimentar L. monocytogenes ATCC
7644 frente à bacteriocina P34 parcialmente purificada incorporada em
envoltórios naturais comestíveis de lingüiça frescal de frango.
- A nisina apresentou efeito anti-listeria superior ao da bacteriocina P34
parcialmente purificada em lingüiça frescal de frango artificialmente inoculada
com L. monocytogenes ATCC 7644.
55
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