( PDF ) Construção de vetor oriC de Mycoplasma hyopneumoniae: uma ferramenta para estudos genéticos do agente da pneumonia enzoótica suína

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

Construção de vetor oriC de Mycoplasma hyopneumoniae – uma ferramenta para

estudos genéticos do agente da Pneumonia Enzoótica Suína

Dissertação de Mestrado

Beatriz Machado Terra Lopes

PORTO ALEGRE

2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

Construção de vetor oriC de Mycoplasma hyopneumoniae – uma ferramenta para

estudos genéticos do agente da Pneumonia Enzoótica Suína

Autora: Beatriz Machado Terra Lopes

Dissertação apresentada como requisito

parcial para obtenção do grau de mestre

em Ciências Veterinárias.

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Ceroni da

Silva

PORTO ALEGRE

2007

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Beatriz Machado Terra Lopes

CONSTRUÇÃO DE VETOR ORIC DE Mycoplasma hyopneumoniae – UMA

FERRAMENTA PARA ESTUDOS GENÉTICOS DO AGENTE ETIOLÓGICO DA

PNEUMONIA ENZOÓTICA SUÍNA

Aprovada em

APROVADO POR:

____________________________________________________

Prof. Dr. Sérgio Ceroni da Silva

Orientador e Presidente da Comissão

___________________________________________________

Prof. Dr. Arnaldo Zaha

Membro da Comissão

___________________________________________________

Prof. Dr.Itabajara da Silva Vaz Júnior

Membro da Comissão

___________________________________________________

Profa. Dra. Luciane Maria Pereira Passaglia

Membro da Comissão

AGRADECIMENTOS

Agradeço a esta Universidade, a sua Faculdade de Veterinária, ao Centro de

Biotecnologia e aos seus docentes pela minha formação acadêmica. Em especial ao meu

orientador Prof. Dr. Sérgio Ceroni da Silva, à Profa. Dr. Irene Schrank e à Profa. Dr.

Marilene Henning Vainstein pelos ensinamentos transmitidos durante o

desenvolvimento deste trabalho.

Agradeço ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da UFRGS e

ao CNPq por possibilitarem a realização desta dissertação.

Agradeço aos queridos colegas de laboratório Clarissa Magalhães Corrêa,

Débora B. Trentini, Fernando Hayashi Sant’Anna, Karyne Maurmann, Luciano Reolon,

Maicon Machado, Ricardo Cecagno e Shana de Souto Weber pelo convívio alegre e

harmonioso e pela ajuda sempre que necessária. À Shana faço um agradecimento

especial pela amizade, acolhimento e carinho desde o primeiro dia em que entrei no

laboratório.

Agradeço à Bianca Gervini Bittencourt não somente pelos importantes cultivos

de M. hyopneumoniae, mas por toda a dedicação, atenção e carinho dispensados para a

realização deste trabalho.

Por fim agradeço aqueles que fazem parte da minha família e que são especiais

para mim simplesmente por estarem presentes na minha vida.

Este trabalho foi integralmente desenvolvido no Centro de Biotecnologia da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul com o apoio financeiro do CNPq.

RESUMO

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica,

enfermidade distribuída mundialmente em rebanhos suínos nas fases de crescimento e

terminação. A pneumonia enzoótica tem sido considerada uma das mais importantes

causas de perdas econômicas na suinocultura mundial.

Tendo em vista a disponibilidade dos genomas completos de três linhagens diferentes de

M. pneumoniae, sendo duas patogênicas (linhagens 7448 e 232) e outra não patogênica

(linhagem J) e a ausência de sistemas genéticos adequados para o estudo destes

genomas, é necessidade emergente o desenvolvimento de ferramentas genéticas

funcionais neste organismo.

Atualmente, cinco espécies de micoplasmas possuem vetores replicativos disponíveis

para transformação. No entanto nenhum deles possui a oriC de M. hyopneumoniae, e

estudos sugerem que estes vetores são espécie-específicos e não seriam replicados em

M. hyopneumoniae.

Este trabalho teve como objetivos a construção de um vetor replicativo e o

desenvolvimento de um sistema para transformação de M. hyopneumoniae. Os

resultados alcançados constituem uma etapa prévia e imprescindível para o estudo de

supostas regiões promotoras nesta espécie.

O plasmídio replicativo pOSTM construído neste trabalho foi obtido a partir do vetor

pUC18, adicionando-se a origem de replicação de M. hyopneumoniae e o cassete de

expressão do gene de resistência à tetraciclina (tetM), controlado pelo promotor do gene

da espiralina de Spiroplasma citri. A transformação foi realizada através de

eletroporação e as células transformantes foram selecionadas pelo fenótipo de

resistência à tetraciclina.

Os transformantes resistentes à tetraciclina foram confirmados através da amplificação

por PCR de porção do vetor inserido nas células. Tal comprovação permite concluir que

o M. hyopneumoniae é um organismo susceptível à transformação e que o determinante

tetM heterólogo é funcional neste patógeno.

Palavras-chave: Mycoplasma hyopneumoniae, eletrotransformação, vetor oriC,

resistência à tetraciclina.

Abstract

Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia of pigs.The

disease has a worldwide distribution in growing and finishing pigs. The enzootic

pneumonia has been considered one of the most important causes of economic losses in

the worldwide swine breeding.

The now available complete sequences of the genomes of two pathogenic (7448 and

232) and one non-pathogenic strain (J) of M. hyopneumoniae and the lack of suitable

genetic systems to study these genomes points to the emergent need for the development

of functional genetic tools for this organism.

Currently, there are replicating vectors available for five species of mycoplasmas.

However none of them posses oriC of M. hyopneumoniae, and studies suggest that these

vectors are species-specific and they would not be functional in M. hyopneumoniae.

The aim of the present study was to construct a replicating vector and the development

of a system for transformation of M. hyopneumoniae. These constitute a previous and

essential stage for the study of putative promoter regions in this species.

To construct the replicating plasmid pOSTM the oriC of M. hyopneumoniae and the

expression cassette containing the gene for tetracycline resistance (tetM), controlled by

spiralin gene promoter of Spiroplasma citri, were introduced into the vector pUC18.

The transformation was achieved by electroporation and transformants were selected

for tetracycline resistance. Tetracycline resistance transformants were confirmed

through PCR amplification of portion of the inserted vector. Such evidence allows the

conclusion that M. hyopneumoniae is amenable to transformation and heterologous

tetM determinant is functional in this pathogen.

Keywords: Mycoplasma hyopneumoniae, electroporation, oriC vector, tetracycline

resistance

LISTA DE FIGURAS

FIGURE 1 Construction and restriction maps of plasmids pOM, pSM, pTM and

pOSTM ………………………………………………………………..

FIGURE 2 Colonies of M. hyopneumoniae strain 7448 transformed with pOSTM

and grown in agar Friis medium with tetracycline…………………….

FIGURE 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products obtained using primers

SPIR/PstI-UP and SPIR/SalI-DO to detect the presence of pOSMT in

the tetracycline-resistant clones of M. hyopneumoniae………….........

LISTA DE ABREVIATURAS E UNIDADES DE MEDIDAS

ATCC

American Type Culture Collection

CDS Seqüência codificante - Coding sequence

CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio - cetyltrimethylammonium bromide

dNTP Desoxiribonucleotídeo trifosfatado

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

HEPES 4-(2-hidroxietil)- 1 -piperazinaetano-ácido sulfônico

IPTG Isopropil B-D-tiogalactopiranosídeo

Kb Quilobase

lacZ’

Fragmento amino-terminal (peptídeo alfa) do gene que codifica a

enzima β-galactosidase

MCS Sítio múltiplo de clonagem

oriC Origem de replicação cromossomal

Pb Pares de bases

PCR Reação em Cadeia da Polimerase - Polymerase Chain Reaction

PCV2 Circovírus suíno tipo 2 -

PE Pneumonia Enzoótica

PEG Polietilenoglicol

PIB Produto interno bruto

PRRSV Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína -

RNAr RNA ribossômico

RNAt RNA transportador

RNAt

fmet

N-formil-metionil-tRNA

SDS Dodecilsulfato de sódio -

SPF Livre de Patógeno Específico - Specific pathogen free

TNF-α

Fator de necrose tumoral – alfa -

U Unidade

UFC Unidade formadora de colônia

VNTARs Repetições de aminoácidos em número variável – variable number

of aminoacid repeats

X-gal

5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo

SUMÁRIO

1- REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................9

1.1 - A Inserção da Suinocultura na Economia .........................................................9

1.2 - Complexo da Doença Respiratória Suína .......................................................10

1.3 - Pneumonia Enzoótica no Brasil ......................................................................10

1.4 - Transmissão da Enfermidade..........................................................................11

1.5 - Patogenia da Enfermidade ..............................................................................11

1.6 - Sinais Clínicos de PE .....................................................................................13

1.7 - Lesões..............................................................................................................14

1.8 - Diagnóstico .....................................................................................................14

1.9 - Coleta de Material...........................................................................................16

1.10 - Terapia e Profilaxia.....................................................................................16

1.11 - Mycoplasma hyopneumoniae......................................................................17

1.12 - Fatores de Virulência ..................................................................................19

1.13 - Transferência Gênica em Micoplasmas ......................................................21

1.14 - Transposons ................................................................................................23

1.15 - Plasmídios Replicativos ..............................................................................24

1.16 - Resistência à Tetraciclina............................................................................26

1.17 - Sistemas “Reporter”....................................................................................27

1.18 - Regiões promotoras.....................................................................................27

1.19 - Objetivos .....................................................................................................29

2- Manuscrito parcial a ser submetido à publicação em revista científica.....................30

2- DISCUSSÃO GERAL ............................................................................................42

3- PERSPECTIVAS....................................................................................................46

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................47

APÊNDICE A – Materiais e Métodos ....................................................................55

APÊNDICE B – Eletroforese de produtos de PCR.................................................61

APÊNDICE C – Seqüências nucleotídica e de aminoácidos do gene tetM............62

1- REVISÃO DA LITERATURA

1.1 - A Inserção da Suinocultura na Economia

A sociedade brasileira como um todo tem se beneficiado de várias maneiras do

desempenho que o agronegócio vem apresentando desde a década de 1990. Sua

produtividade vem crescendo rapidamente e o setor vem gerando substanciais superávits

comerciais (BARROS, 2007). Hoje o agronegócio é responsável por 30% dos empregos

gerados no Brasil, por 40% das exportações e por um terço do PIB, do qual 30%

correspondem ao PIB do agronegócio da pecuária (MAPA, 2007 b; BARROS, 2007).

De 1990 a 2003 a taxa de crescimento da exportação de carne suína no Brasil foi

de 27%, participando com 16% da exportação mundial deste produto e sendo o 4°

colocado no ranking de países exportadores. O Brasil é o quarto produtor mundial de

carnes de suínos e possui o quarto maior rebanho mundial, composto por 38,4 milhões

de cabeças, sendo que a Região Sul concentra 70,2 % do abate (FAO, 2007; IBGE,

2007).

Nas projeções até o ano de 2017 a produção mundial de carne suína apresentará

crescimento 1,69% ao ano e continuará sendo a carne mais produzida no mundo. No

Brasil, esta estimativa é mais animadora, apresentando uma taxa de crescimento de

2,1% ao ano (MAPA, 2007 a).

Em 2015 as exportações de carne suína serão lideradas pelo Brasil, Canadá e

União Européia com um volume total de cinco milhões de toneladas. As projeções para

o Brasil representam a passagem de exportações de 771 mil toneladas em 2006 para 1,1

milhões em 2015 (MAPA, 2007 a).

Focos de febre aftosa em bovinos nos estados de Mato Grosso do Sul e Paraná, no

início de 2006, determinaram a diminuição de 11,1% do valor exportado da carne suína

in natura em relação ao ano de 2005, devido ao fechamento de mercados importantes e,

principalmente, ao embargo não tarifário da Rússia (ABIPECS, 2007). Este fato aponta

a importância de investimentos em programas de sanidade animal no Brasil para

garantir os grandes mercados compradores e conquistar novos.

Hoje a suinocultura industrial brasileira exibe indicadores de produtividade que

podem ser comparados aos obtidos nos EUA, Canadá, Dinamarca, Alemanha, Holanda

e outros países (ABIPECS, 2005c; ABIPECS, 2005b). O Brasil apresenta o menor custo

mundial de produção de suínos (US$ 0,90/kg carcaça) e uma taxa de 26

terminados/porcas/ano, confirmando a eficiência do nosso setor produtivo (ROPPA,

2007). Com apenas 160 dias de idade, chegam a pesar mais de 110 quilos (ABIPECS,

2005c; ABIPECS, 2005b), sendo o peso médio nacional do suíno abatido em torno de

80 quilos (ABIPECS, 2007).

1.2 - Complexo da Doença Respiratória Suína

Mycoplasma hyopneumoniae participa do grupo de agentes etiológicos do

complexo da doença respiratória suína (CDRS) caracterizado por atraso no

desenvolvimento, diminuição na conversão alimentar, letargia, anorexia, febre, tosse e

dispnéia em animais nas fases de crescimento e terminação (16-22 semanas de idade). A

pneumonia apresentada pelos animais com CDRS é causada por uma combinação de

agentes bacterianos e virais tais como: PCV2, PRRSV, vírus da influenza suína,

M. hyopneumoniae, Actinobacilus pleuropneumoniae e Pasteurella multocida (KIM et

al., 2003). Apesar de o PRRSV estar disseminado em rebanhos suínos em todo o

mundo, no Brasil o agente ainda não foi identificado e, portanto, não parece ser uma

associação importante em rebanhos brasileiros (ZANELLA, 2006). Já o PCV2 pode ser

considerado o principal agente desta enfermidade (OPRIESSNIG et al., 2004).

1.3 - Pneumonia Enzoótica no Brasil

O atual sistema de produção de suínos implica na exposição dos animais a

diversos agentes estressantes que são determinantes no desenvolvimento de doenças

multifatoriais. Entre as doenças respiratórias, de origem multifatorial destacam-se a

pneumonia enzoótica (PE) e a rinite atrófica progressiva. Elas são importantes devido a

sua freqüência e por que provocam prejuízos econômicos consideráveis tanto aos

produtores como à indústria. O termo enzoótica evidencia tratar-se de uma doença de

rebanho não de uma doença que atinge animais individualmente (SOBESTIANSKY et

al., 2001 a). A alta prevalência da PE implica em importantes perdas econômicas na

indústria da suinocultura em todo o mundo (SCHMIDT et al., 2004).

Utilizando como parâmetro a prevalência de leitões infectados no desmame para

calcular a gravidade da PE, o cenário de média infecção (5-20% leitões infectados) seria

o mais comum, atualmente, nos sistemas de dois sítios ou múltiplos sítios encontrados

no Brasil. Este resultado está associado à alta reposição de leitoas negativas, o que leva

à diminuição da imunidade do plantel. Ocorre difusão precoce do agente e colonização

de leitões ainda na fase de lactação. A difusão média do agente no ambiente associada à

segregação por idade em dois ou mais sítios, tem como o resultado o aparecimento dos

sintomas nas fases intermediárias e finais da terminação (BARCELLOS, 2006).

A PE apresenta alta morbidade e baixa mortalidade e as perdas econômicas são

decorrentes de quedas na produtividade que podem chegar a 20% sobre a conversão

alimentar e até 30% sobre o ganho de peso, dependendo da gravidade das lesões e

infecções secundárias (SOBESTIANSKY et al., 1999). Sobestiansky et al. (2001 b), em

um estudo envolvendo 3788 suínos de granjas da região sul do país estimaram perdas de

2,52 kg/suíno abatido devido a lesões pneumônicas desde o nascimento até o abate.

1.4 - Transmissão da Enfermidade

A principal forma de transmissão da infecção pelo M. hyopneumoniae é o

contato direto com as secreções respiratórias de animais infectados, por contato com

aerossóis induzidos pela tosse ou, menos freqüentemente, por fômites (BARCELLOS,

2006). A transmissão por contato direto ocorre rapidamente, sendo o agente detectado

no sétimo dia após o desafio (MAROIS et al., 2007).

A fonte de infecção de M. hyopneumoniae para o suíno jovem são as matrizes

ou os animais em crescimento ou terminação (SOBESTIANSKY et al., 2001 a).

1.5 - Patogenia da Enfermidade

Um dos primeiros passos da patogênese da infecção por M. hyopneumoniae é a

aderência do agente ao trato respiratório, afetando as células epiteliais e o sistema de

defesa mucociliar das vias aéreas (ZIELINSKI & ROSS, 1992; CHOI et al., 2006). No

estudo de MEYNS et al. (2006) foi observada a presença por imunofluorescência (IF)

de M. hyopneumoniae no epitélio de brônquios e bronquíolos de suínos inoculados tanto

com isolados de alta virulência quanto de baixa, indicando que ambos aderem às

células do trato respiratório.

A multiplicação de M. hyopneumoniae em pulmões de suínos resulta em

pneumonia caracterizada por infiltrado celular de macrófagos, neutrófilos e linfócitos

(MEYNS et al., 2006). Tem sido proposto que os macrófagos alveolares participam do

início da resposta inflamatória logo após a infecção e rapidamente expressam IL-1 e

TNF-α. Estas citocinas são fatores ativadores de linfócitos T, sendo TNF-α também

responsável pela mobilização de neutrófilos (CHOI et al., 2006).

Citocinas inflamatórias tais como IL-1, TNF-α e IL-6 são importantes

mediadores tanto da defesa pulmonar quanto da inflamação. Um dos principais efeitos

comum aos micoplasmas é a habilidade de induzir a liberação de citocinas. Estudos

prévios revelaram que citocinas inflamatórias estão presentes em excesso no líquido

broncoalveolar de suínos infectados com M. hyopneumoniae (CHOI et al., 2006). CHOI

et al.(2006) demonstraram a expressão de IL-1, TNF-α e IL-6 uma semana após a

infecção, antes do aparecimento de mudanças patológicas e durante a doença,

sugerindo que estas citocinas são importantes na acumulação de células inflamatórias

Micoplasmas possuem fatores mitogênicos para linfócitos, os quais seriam

responsáveis pela hiperplasia linfóide peribronquiolar característica desta doença. Os

micoplasmas são considerados super-antígenos capazes de estimular excessivo número

de células T pela exposição de vários epitopos simultaneamente (RIBEIRO et al., 2004).

Uma depleção no número de linfócitos T diminui a extensão das lesões pneumônicas.

Além disso, uma superprodução de IL-1 e TNF-α dentro dos pulmões pode exacerbar o

efeito do M. hyopneumoniae e causar um dano ao tecido mediado pelo hospedeiro.

Assim, a patogênese da pneumonia micoplásmica é dependente não somente do dano

causado ao cílio diretamente pelo organismo, mas também é dependente do efeito do

sistema imune do hospedeiro sobre as células (CHOI et al., 2006).

Atraso no desenvolvimento pode ser devido à indução de altas concentrações de

TNF-α, o qual é conhecido por causar caquexia ou síndrome de definhamento (CHOI et

al., 2006).

O agente escapa das defesas naturais do hospedeiro fixando-se firmemente à sua

mucosa respiratória, podendo sua localização no lúmen explicar a dificuldade de

eliminação do agente pelos mecanismos de defesa do hospedeiro e tratamento

antimicrobiano (SOBESTIANSKY et al., 2001 a). Além disso, o micoplasma tem a

habilidade de mimetizar várias superfícies antigênicas e utilizar-se dessa variação para

evadir-se do sistema imune (RIBEIRO et al., 2004). Ele pode reconfigurar os antígenos

nas suas superfícies celulares, ligar-se inespecificamente à porção Fc de anticorpos e

também secretar protease de IgA (SOBESTIANSKY et al., 2001 a).

Mycoplasma hyopneumoniae foi re-isolado a partir do fígado e baço de suínos

experimentalmente infectados e de suínos infectados por contato (MAROIS et al.,

2007). Disseminação de M. hyopneumoniae para órgãos internos pode acontecer pela

via linfática ou via sanguínea. No entanto, a disseminação do agente em órgãos internos

parece ser transitória e provavelmente não participa do desenvolvimento da PE

(MAROIS et al., 2007).

1.6 - Sinais Clínicos de PE

O principal sinal clínico da infecção por M. hyopneumoniae é a tosse seca, não

produtiva e crônica que persiste por poucas semanas e até por meses (ROSS, 1999). A

forma clínica da doença é mais comum nos animais em fase de crescimento e

terminação, mas em rebanhos sem imunidade a doença pode afetar leitões já a partir de

duas semanas de idade, bem como animais em reprodução (SOBESTIANSKY et al.,

2001 a). Animais com infecção secundária podem apresentar anorexia, dispnéia, tosse,

hipertermia e prostração. A maioria dos animais com PE não parecem doentes. Podem

apresentar atraso no desenvolvimento, embora o apetite se mantenha normal (ROSS,

1999).

Além das condições de manejo e instalações, o resultado clínico da infecção por

M. hyopneumoniae pode depender da virulência da linhagem, visto que já foi mostrada

diferença de virulência em isolados de campo (MEYNS et al., 2006).

A manisfestação clínica pode passar despercebida quando ocorre a infecção só

por M. hyopneumoniae e na ausência de fatores de risco (SOBESTIANSKY et al., 2001

1.7 - Lesões

Lesões macroscópicas de pulmão de suínos com PE consistem em áreas de

consolidação do parênquima pulmonar com coloração púrpura a cinza. As lesões são

localizadas nos lobos apicais, cardíacos, intermediário e região ântero-ventral dos

diafragmáticos (SOBESTIANSKY et al., 1999), devido a fatores aerodinâmicos e

gravitacionais que produzem uma maior carga de infecção nos lobos craniais

(ANDRADA et al.,2003a). Os linfonodos mediastínicos e bronquiais apresentam

aumento de tamanho (ROSS, 1999).

Lesões histopatológicas na fase aguda da doença são caracterizadas pela perda

dos cílios do trato respiratório, descamação das células ciliadas e acumulação de

neutrófilos e macrófagos nas vias aéreas. No parênquima pulmonar observa-se

broncopneumoniae catarral, com edema alveolar e acúmulo de neutrófilos e

macrófagos. A partir do 15º ao 20º dia de infecção observa-se acúmulo de células

mononucleares engrossando os septos inter-alveolares e caracterizando a

broncopneumonia como intersticial. Observa-se hiperplasia perivascular e peribronquial

do BALT (Tecido Linfóide associado aos Brônquios). No estágio crônico, há

hiperplasia linfóide ou espessamento do septo interalveolar (CHOI et al., 2006;

ANDRADA et al.,2003a).

1.8 - Diagnóstico

Apesar de a cultura ser considerada o teste padrão ouro para diagnóstico de

M. hyopneumoniae, o isolamento do organismo a partir de suínos naturalmente ou

experimentalmente infectados é limitado principalmente pelo fato de que este

micoplasma é extremamente fastidioso, freqüentemente exigindo 4 a 8 semanas para

multiplicação detectável (ROSS, 1999; MAROIS et al., 2007; THACKER, 2004).

Devido à sua multiplicação lenta em cultura, a contaminação por M. hyorhinis, M.

flocullare ou outras bactérias, freqüentemente presentes no trato respiratório de suínos,

pode inibir a multiplicação de M. hyopneumoniae (THACKER, 2004). Mycoplasma

flocullare, microorganismo não patogênico presente no pulmão de suínos, possui

morfologia, multiplicação e características antigênicas semelhantes ao

M. hyopneumoniae (ROSS, 1999; MAROIS et al., 2007). A utilização de antibióticos e

outros quimioterápicos na alimentação dos animais pode mascarar e comprometer os

resultados do isolamento microbiológico (RIBEIRO et al., 2004). Dessa forma, o

fracasso do isolamento do organismo em condições a campo não deve ser utilizado para

refutar a presença de M. hyopneumoniae dentro do rebanho (THACKER, 2004).

O diagnóstico rápido de PE é possível através do teste PCR. A amplificação dos

genes p36 e p46, encontrados somente em M. hyopneumoniae, e também seqüências

internas destes genes elimina os riscos de obter amplificação de falsos positivos devido

à reação cruzada com outro micoplasma ou outras espécies de bactérias (MATTSSON

et al., 1995; CARON et al., 2000).

De Castro et al. (2006) desenvolveram teste de PCR para identificação de

linhagem de M. hyopneumoniae baseado em VNTARs, o qual é útil para diagnóstico de

PE, tipificação de linhagens e discriminação das linhagens vacinais daqueles isolados

de campo em animais vacinados para PE.

A técnica de PCR para a detecção de M. hyopneumoniae é uma ferramenta para

a identificação de animais portadores sadios e para a prevenção da disseminação da

doença (CARON et al., 2000).

As técnicas de anticorpo fluorescente (FA) e imunoistoquímica (IHC) são

utilizadas para identificação de M. hyopneumoniae em tecidos. RIBEIRO et al. (2004)

demonstraram que a técnica de imunoistoquímica com anticorpo policlonal possui alta

sensibilidade (95%) e moderada especificidade (77,5%) podendo ser recomendada

como ferramenta auxiliar, rápida e de baixo custo para diagnóstico de PE em

laboratórios de rotina em histopatologia. A hibridização in situ em tecido fixado é

utilizado menos freqüentemente (THACKER, 2004).

Os métodos para diagnóstico sorológico de PE incluem hemaglutinação indireta

(HI), fixação do complemento (FC) e ELISA (ROSS, 1999).

A baixa sensibilidade dos testes de ELISA para M. hyopneumoniae pode ser

atribuída ao fato que o organismo coloniza as vias aéreas resultando em interação

mínima com o sistema imune sistêmico e resultados sorológicos variáveis. A variação

antigênica das proteínas de superfície de M. hyopneumoniae resulta em resposta imune

por anticorpos variável que é um desafio para a utilização deste teste. Uma alta

porcentagem de resultados falso-negativos deve ser considerada quando os resultados

forem interpretados (THACKER, 2004).

Reações cruzadas com M. flocullare e M. hyorhinis reduzem a especificidade

dos testes sorológicos (BAUMEISTER et al, 1998). O teste ELISA tipo duplo-

sanduíche utilizando anticorpos monoclonais contra o antígeno p46 do

M. hyopneumoniae e a proteína recombinante p46 é específico para M. hyopneumoniae

e pode ser utilizado para determinar o perfil sorológico do rebanho e assim indicar o

início da doença ou o melhor momento para realizar a vacinação contra PE (OKADA,

2005).

A presença do organismo sozinho nem sempre é correlacionado com doença ou

pneumonia. No entanto, se o M. hyopneumoniae estiver presente e o rebanho exibir

doença respiratória clínica, pode-se supor que o organismo está contribuindo para a

patologia de maneira primária ou secundária (THACKER, 2004).

Devido às características singulares dessa enfermidade, o diagnóstico presuntivo

pode ser realizado pela conjunção dos sinais clínicos e dos aspectos macroscópicos e

microscópicos das lesões. Todavia, esse procedimento possui uma parcela de

subjetividade e imprecisão, sendo necessários exames complementares para a

confirmação do diagnóstico (RIBEIRO et al., 2004).

1.9 - Coleta de Material

Suabes da traquéia e lavado traqueobronquiolar são os locais ideais para coletar

amostras em comparação aos suabes nasal e tonsilar (MAROIS et al., 2007) e até

mesmo em relação ao tecido pulmonar (KURTH et al., 2002). Suabe traqueal é a

amostra mais eficiente para detectar M. hyopneumoniae em suínos vivos porque é 4,5

vezes mais sensível em comparação ao suabe nasal. No entanto, é difícil de realizar em

suínos adultos em condições de campo, enquanto o suabe nasal é realizado

freqüentemente nas granjas (MAROIS et al., 2007).

1.10 - Terapia e Profilaxia

Embora vacinas que reduzem as conseqüências da infecção estejam disponíveis,

medicação com antimicrobianos na comida ou na água de beber ainda é uma prática

comum (VICCA et al., 2004). Os antibióticos mais eficazes e utilizados para controle da

PE são: tetraciclina, tiamulina, tilosina, espiramicina, valnemulina, lincomicina e as

novas quinolonas enrofloxacina, danofloxacina e norfloxacina (ANDRADA et al., 2003

b).

As únicas vacinas contra PE disponíveis comercialmente são as bacterinas. Estas

são incapazes de prevenir a colonização do trato respiratório do suíno pelo

M. hyopneumoniae e sua produção é cara (YOUNG et al., 2000; FAGAN et al., 2001).

Novas vacinas contra esta doença vêm sendo desenvolvidas, destacando-se aquelas que

estimulam a produção de IgA na mucosa respiratória suína (CONCEIÇÃO &

DELLAGOSTIN, 2006).

Fagan et al. (1997, 2001) mostraram que a imunização oral com Salmonella

typhimurium atenuada (aroA) expressando o antígeno recombinante NrdF

(ribonucleotide reductase R2 subunit - subunidade R2 da ribonucleotídeo redutase)

induziu secreção de IgA em pulmões de camundongos, e ainda resultou em um maior

ganho de peso diário e redução das lesões pulmonares em suínos.

Uma vacina intranasal atenuada de Erysipelothrix rhusiopathiae expressando a

porção amino-terminal da adesina P97 (YS-19) demonstrou reduzir a severidade das

lesões pulmonares causadas pela infecção por M. hyopneumoniae. Nenhuma resposta

imune humoral ou celular foi observada nos animais imunizados e o mecanismo que

determina a proteção é desconhecido. Anticorpos específicos contra a proteína P97 não

foram detectados, o que sugere que estes não desempenham função protetora contra a

infecção por M. hyopneumoniae (SHIMOJI et al, 2003).

1.11 - Mycoplasma hyopneumoniae

Micoplasmas são microrganismos da classe Mollicutes e da ordem

Mycoplasmatales (QUINN, 2005; WALKER, 2003). Em 1898, Edmond Nocard e

Emilie Roux identificaram o primeiro micoplasma, o agente da pleuropneumonia

contagiosa bovina, que, mais tarde, recebeu o nome Mycoplasma mycoides subsp.

mycoides (BOVÉ, 1999). Em 1950, o termo microorganismos semelhantes aos da

pleuropneumonia (PPLO) foi substituído pelo nome Mycoplasma, do grego mykes

(fungo) e plasma (moldável) (BOVÉ, 1999).

Mare & Switzer (1965) e Goodwin et al. (1965) foram os primeiros a relatar o

isolamento de micoplasma a partir de pulmões com pneumonia e a reprodução

experimental da doença (apud ROSS, 1999).

A multiplicação de M. hyopneumoniae é mais lenta quando comparada com

outras espécies de micoplasmas de suínos. O organismo se multiplica em meio sólido

somente na presença de 5-10% de CO

(FRIIS, 1974). Mycoplasma hyopneumoniae

pode se multiplicar em ovos embrionados de galinha sem efeito patogênico visível e em

cultivos celulares apresentando pequeno efeito citopatogênico (FRIIS, 1974).

Friis (1974) desenvolveu um meio especial para isolamento de M.

hyopneumoniae e M. hyorhinis. Este meio possui como indicador de pH o vermelho

fenol. A multiplicação microbiana é visível quando ocorre a mudança de coloração do

meio de vermelho para amarelo, indicando a oxidação da glicose pelo M.

hyopneumoniae e produção de ácido.

Devido ao fato de não sintetizarem peptideoglicano ou seus precursores, não

possuem parede celular rígida, mas uma membrana trilaminar simples composta de

proteínas, glicoproteínas, fosfolipídeos e colesterol, este último responsável pela rigidez

e estabilidade osmótica da membrana. Sua flexibilidade permite-lhes passar através de

membranas filtrantes com poros do tamanho de 0,22 a 0,45 µm e apresentar diversas

formas (QUINN, 2005; WALKER, 2003).

Os micoplasmas são bastante pleomórficos em função da ausência de parede

celular. A célula pode ser esférica, em forma de pêra, em forma de espiral ou

filamentosa. O diâmetro da forma esférica varia de 0,3 a 0,8 μm. Os micoplasmas

multiplicam-se lentamente em meio de cultivo após incubação de 3 a 20 dias, a uma

temperatura ótima de 37 ºC, pH em torno de 7,5, atmosfera de 5 a 10% CO

e leve

agitação (WALKER, 2003).

As colônias tornam-se visíveis após 2 a 3 dias de incubação, porém o mais

comum é observá-las após 10 dias, quando estão com aproximadamente 0,25 a 1 mm de

diâmetro (ROSS, 1999). As colônias possuem aparência granular com elevações

refrativas no ágar (FRIIS, 1974). São recomendadas as colorações Giemsa, Castañeda,

Dienes e novo azul de metileno (WALKER, 2003).

Os molicutes no teste de Gram não são corados, no entanto, baseado na análise

da seqüência do RNAr 5S, são filogeneticamente relacionados às eubactérias gram-

positivas. De fato, esta classe de organismos evoluiu a partir da classe Clostridia,

através de um processo de evolução redutiva (TRACHTENBERG, 1998; QUINN,

2005).

Similar às mitocôndrias as espécies de Mycoplasma utilizam o códon UGA para

codificar triptofano (KANNAN & BASEMAN, 2000).

Em geral, os genes de micoplasma que possuem um ou mais códons UGA não

serão expressos em sistemas de expressão que utilizam o código genético universal,

devido à terminação prematura. Uma exceção é a rara leitura do códon UGA como

códon de terminação em Escherichia coli e Salmonella enterica sorovar Typhimurium.

Embora UGA também funcione como códon de terminação em Bacillus subtilis, a

presença de RNAt que lê códon de terminação UGA como triptofano determina alta

eficiência de leitura nesta bactéria gram-positiva (KANNAN & BASEMAN, 2000).

Além do código genético, existem outros dois fatores que dificultam a análise

molecular de M. hyopneumoniae. O primeiro é a falta de sistemas genéticos eficazes

que permitam a geração de M. hyopneumoniae mutantes específicos. Um segundo é

também a falta de sistemas repórter que possam ser utilizados para estudo da atividade

de promotores e seus mutantes in vivo (HALBEDEL & SÜLKE, 2006).

Micoplasmas são diferenciados fenotipicamente de outras bactérias pelo seu

diminuto tamanho e ausência de parede celular. Taxonomicamente, a ausência de

parede celular é utilizada para separar os micoplasmas de outras bactérias na classe

Mollicutes (RAZIN et al., 1998).

1.12 - Fatores de Virulência

O seqüenciamento do genoma das três linhagens de M. hyopneumoniae (232,

7448 e J) não só permite rápida identificação de proteínas, como também permite a

comparação de proteínas identificadas nas três linhagens, se presentes. Embora variação

gênica entre os genomas de isolados já foi observada, até hoje, nenhum marcador

genético associado com virulência foi identificado (MEYNS et al., 2006).

Os fatores de virulência em M. hyopneumoniae ainda não foram claramente

estabelecidos, exceto a proteína P97, adesina de cílios. O gene da adesina contém seis

genes parálogos no genoma, mas apenas a interação com a proteína P97 permite que o

M. hyopneumoniae se fixe aos cílios do epitélio respiratório. Um segundo gene (p102)

do operon p97-p102, também contém seis genes parálogos, mas sua função é

desconhecida (MINION et al., 2004). Nas três cepas comparadas por Vasconcelos et al.

(2005) a CDS p97 está ligada à CDS p102 constituindo três operons.

A análise de domínios no genoma de M. hyopneumoniae cepa 232 identificou 53

ORFs com sítios de ligação para lipoproteínas, representando 8,5% da capacidade

codificante do genoma (MINION et al, 2004).

Três lipoproteínas com massa molecular de 44, 50 e 65 kDa foram identificadas

na linhagem J de M. hyopneumoniae, sendo a p65 utilizada para diagnóstico sorológico

de infecção por M. hyopneumoniae (SCHMIDT et al., 2004). A p65 é um membro da

família de enzimas lipolíticas que possuem a porção amino-terminal conservada Gly-

Asp-Ser-Leu (GDSL) e apresenta-se como principal antígeno de superfície

imunodominante de M. hyopneumoniae (SCHMIDT et al., 2004).

Quatro adesinas conhecidas (P97, P146, P76 e P216) apresentam VNTARs em

diferentes linhagens aumentando a complexidade do processo de adesão. Estas

VNTARs são estáveis in vitro e o número de repetições é cepa-específico (DE

CASTRO et al, 2006).

Embora desprovidos de parede celular micoplasmas são capazes de resistir à lise

total, característica que em Mycoplasma pulmonis é dependente do número de

repetições em tandem em diferentes antígenos de superfície (SIMMONS et al., 2004).

Em M. hyopneumoniae, a variabilidade antigênica gerada pelas VNTARs pode ter

importante função no mecanismo de evasão do sistema imune do hospedeiro (DE

CASTRO et al., 2006).

A molécula P97 não é uma lipoproteína e ela contém um domínio

transmembrana na porção amino-terminal (DJORDJEVIC et al., 2004).

CDSs p97 de M. hyopneumoniae cepa 7448, 232 e J codificam proteínas com

10, 15 e 9 repetições R1 em tandem respectivamente. O domínio de ligação da P97 está

dentro da região R1 e os aminoácidos que estão à montante nesta região não são

necessários para a adesão ao cílio. São necessárias no mínimo oito repetições da região

R1 para o sítio ser funcional e ocorrer a adesão aos cílios (MINION et al., 2000). Todas

as linhagens possuem mais que o número mínimo de repetições, dado que leva a

acreditar que outro fator de adesão deve ser responsável pelas diferentes propriedades

de adesão das três linhagens (VASCONCELOS et al., 2005).

Djordjevic et al. (2004) estudaram o processo proteolítico da adesina P97 de

M. hyopneumoniae e constataram que esta molécula é hidrolisada em múltiplos sítios,

gerando uma família de peptídios que permanecem em associação com a célula ou com

proteínas da matriz extracelular. A hidrólise no aminoácido 195 ocorre imediatamente

após a tradução e, provavelmente, conjuntamente com a translocação, gerando P94, P22

e outros fragmentos da hidrólise.

De acordo com Vasconcelos et al (2005) diferenças entre adesinas e outros

fatores de virulência em M. hyopneumoniae linhagens 7448, 232 e J incluem variações

no número repetições de aminoácidos entre proteínas ortólogas. Estas

inserções/deleções resultam de variações no número de repetições em tandem de

nucleotídeos dentro das regiões codificantes, o que é indicativo do mecanismo

molecular envolvido na geração de variantes antigênicos funcionais ou não. Esta

variabilidade antigênica em proteínas de superfície é provavelmente a chave

determinante das diferentes propriedades patogênicas de cada cepa de M.

hyopneumoniae.

A identificação e caracterização de proteínas imunogênicas espécie-específicas

de M. hyopneumoniae é um importante passo para a elucidação dos mecanismos de

patogenicidade e também para o desenvolvimento de reagentes para diagnóstico e

componentes vacinais (MEENS et al., 2006).

No estudo de Meens et al. (2006) foi demonstrada a propriedade antigênica de

duas lipoproteínas hipotéticas expressas como proteínas de fusão recombinantes,

Mhp378 e Mhp651. Nas análises de Western blot e ELISA ambas as proteínas foram

reconhecidas pelos soros de suínos naturalmente infectados e de suínos

hiperimunizados. A Mhp378 parece ser altamente específica de M. hyopneumoniae

enquanto a Mhp651 mostrou uma pequena reatividade cruzada com M. flocculare.

1.13 - Transferência Gênica em Micoplasmas

A ausência de parede celular em molicutes seria uma característica que

facilitaria a introdução de DNA exógeno dentro das células. No entanto, a eficiência de

transferência gênica pelos mecanismos de conjugação natural e transformação é muito

baixa, sendo necessárias microgramas de DNA para obtenção de células transformantes.

Protocolos de transformação e transfecção utilizando PEG ou descarga elétrica têm sido

utilizados com certo sucesso para melhorar a eficiência de transformação (RAZIN et al.,

1996; MINION & KAPKE, 1998).

Conjugação entre micoplasmas já foi relatada. No entanto, o mecanismo de

transferência genética ainda não é compreendido e os gêneros capazes de conjugação

são limitados. Muitos micoplasmas podem adquirir o transposon conjugativo Tn916

através do cruzamento com enterococos doador, mas nenhuma transferência por

conjugação de qualquer elemento genético, inclusive Tn916, a partir de um micoplasma

doador foi descrita. Todavia, evidências sugerem que a transferência horizontal de

genes já ocorreu entre espécies de Mycoplasma. O elemento integrativo IS1221 é

encontrado em M. hyorhinis, M. hyopneumoniae e M. flocullare. Estas três espécies são

parasitas de suínos e IS1221 pode ter se disseminado por transferência gênica horizontal

no hospedeiro (TEACHMAN et al., 2002; MAHAIRAS et al., 1990).

Embora se tenha conhecimento da existência de fagos em micoplasmas,

transdução ainda não foi descrita (TEACHMAN et al., 2002).

Assim, transformação é o único mecanismo seguro para manipulação gênica em

micoplasmas (MINION & KAPKE, 1998).

Dois plasmídios foram isolados em diferentes linhagens de Mycoplasmas

mycoides subespécie mycoides abrindo novas possibilidades para o desenvolvimento de

sistemas para estudos de genes em micoplasmas (KING & DYBVIG, 1992). Bergmann

et al (1989) descreveram o primeiro destes plamídeos, pADB201. O segundo plasmídio

isolado da cepa GM12 de Mycoplasmas mycoides subespécie mycoides foi denominado

pKMK1 (KING & DYBVIG, 1992). Ambos pertencem à família de plasmídios de

bactérias gram-positivas que replicam a partir de um DNA intermediário de fita simples

(KING & DYBVIG, 1994).

Do gênero Spiroplasma também foram isolados plasmídios naturais e vetores de

clonagem foram construídos a partir de um destes plasmídios (pMH1), entretanto eles se

mostraram instáveis (Simoneau & Labarere, 1990 apud KING & DYBVIG, 1994).

Naturalmente estes plasmídios foram considerados como candidatos para

construção de vetores de clonagem e vetor shuttle em espécies de Mycoplasma (RAZIN

et al., 1998).

King & Dybvig (1992) desenvolveram os primeiros vetores de clonagem

replicativos em micoplasmas. Plasmídios p2D4 e pIK∆ derivados do pKMK1 de M.

mycoides foram utilizados para introduzir o gene de resistência à eritromicina de

bactéria gram-positiva em M. mycoides. A resistência se manteve estável, mesmo na

ausência de eritromicina, indicando que estes plasmídios têm potencial para serem

vetores de clonagem para micoplasmas. Podem ser veículos para inserção de genes

exógenos em micoplasmas ou para geração de mutações em genes endógenos via

recombinação com os fragmentos clonados (KING & DYBVIG, 1994). A deficiência

destes vetores é que eles são vetores de baixo número de cópias e replicam apenas em

M. mycoides e M. capricolum (RAZIN et al., 1998).

1.14 - Transposons

Transposons têm se mostrado como ferramentas eficientes de mutagênese em

genomas de molicutes. O estudo de mutantes possibilita a relação entre fenótipo e seu

genótipo correspondente, visto que mutantes com fenótipo diferente do tipo selvagem

permitem o isolamento do gene (LARTIGUE et al., 2002).

Os primeiros relatos de transposição em molicutes foram de experimentos com

M. pulmonis e Acholeplasma laidlawii. Estes foram transformados com sucesso pelo

plasmídio pAM120, contendo o transposon de Enterococcus faecalis Tn916 que

integra-se em sítios aleatórios do genoma destes organismos (HALBEDEL & STÜLKE,

2006). Desde então uma variedade de espécies de molicutes têm sido transformadas

para resistência à tetraciclina com Tn916 e Tn1545 ou para resistência à gentamicina

com o transposon conjugativo de estafilococos Tn4001 (RAZIN et al., 1998).

Tn916 é um transposon conjugativo composto de genes xis-Tn/int-Tn de excisão

e integração, gene tetM e grupo de genes tra necessários para a transferência entre

células. Por ser um transposon conjugativo pode ser introduzido em diferentes espécies

de micoplasmas por conjugação com Enterococcus faecalis (HALBEDEL & STÜLKE,

2006).

Tn4001 é um transposon classe I, composto de 4,7 kb e originalmente isolado de

Staphylococcus aureus. Ele tem sido utilizado para transformação de diversas espécies

de micoplasmas e confere resistência aos antibióticos gentamicina, canamicina e

tobramicina (HALBEDEL & STÜLKE, 2006). Mycoplasma pulmonis, M. pneumoniae

e M gallisepticum foram eficientemente transformados com o plasmídio pISM1001 que

contém Tn4001, sendo utilizado no primeiro o protocolo com PEG e nos outros dois

eletroporação. A resistência à gentamicina foi conferida aos transformantes das três

espécies citadas através da inserção de Tn4001 em sítios aleatórios no DNA

cromossomal (HEDREYDA et al., 1993; CAO et al., 1994). Da mesma forma, o

primeiro relato de transformação de duas espécies de micoplasmas patogênicas para

ruminantes utilizou plasmídio contendo Tn4001 e ocorreu a integração deste em vários

sítios do genoma de M. bovis e M. agalactiae (CHOPRA-DEWASTHALY et al.,

2005b).

Uma desvantagem da utilização do Tn4001 em micoplasmas é a ocorrência de

múltiplos sítios de inserção no genoma, fato que dificulta a análise de mutantes. Um

mini transposon Tn 4001- tetM foi construído com o gene que codifica a transposase

fora do Tn 4001 para prevenir a excisão do transposon após o primeiro evento de

transposição. Este sistema foi eficiente para transformação em M. gallisepticum, porém

foram encontradas inserções do transposon em múltiplos sítios (POUR-EL et al. 2002).

Esta técnica de mutagênese com transposons tem sido eficaz para gerar mutantes

de M. pneumoniae, M. genitalium e M. gallisepticum deficientes em citoaderência

(REDDY et al., 1996; MUDAHI-ORESTEIN et al., 2003; DHANDAYUTHAPANI et

al., 1999), mutantes de S. citri deficientes em motilidade e patogenicidade (FOISSAC et

al., 1997). A caracterização destes mutantes contribuiu significativamente para a

identificação de genes e seus produtos (RAZIN et al., 1998).

Um recente sistema para estudar atividade de regiões promotoras de M.

pneumoniae foi proposto por Halbedel & Stülke (2006). O plasmídio pGP353 é

derivado de um mini Tn4001, possui origem de replicação de E. coli, genes de

resistência à canamicina e gentamicina e como sistema repórter gene lacZ.

1.15 - Plasmídios Replicativos

Plasmídios construídos com a origem de replicação cromossomal do seu

hospedeiro estão sendo utilizados para expressão de genes clonados e inativação

específica de genes do tipo selvagem através de recombinação homóloga e subseqüente

investigação do fenótipo do mutante (LARTIGUE et al., 2002).

Atualmente, o uso de plasmídios replicativos em micoplasmas é restrito a cinco

espécies Spiroplasma citri (YE et al., 1994), M. pulmonis (CORDOVA et al., 2002), M.

agalactiae (CHOPRA-DEWASTHALY et al., 2005a), M. capricolum subsp.

capricolum (Janis et al., 2005; LARTIGUE et al., 2003), M. mycoides subsp. mycoides

large colony - MmmLC and M. mycoides subsp. mycoides small colony - MmmSC

(LARTIGUE et al., 2003).

Lartigue et al (2003) estudaram a especificidade de plasmídios oriC em

molicutes (MmmLC, MmmSC e Mycoplasma capricolum subsp capricolum,

Spiroplasma citri e Mycoplasma pulmonis) através de experimentos de transformação

com plasmídios oriC homólogos e heterólogos. Todas as espécies de micoplasma e

espiroplasma estudadas apresentaram colônias resistentes à tetraciclina quando

transformadas com plasmídio oriC homólogo. Não foi observada compatibilidade de

plasmídios oriC entre M. pulmonis e S. citri. Transformantes de S. citri foram obtidos

exclusivamente com plasmídios homólogos. MmmLC e MmmSC que são altamente

relacionados foram transformados com plasmídios recíprocos. M. capricolum subp

capricolum foram transformados tanto com plasmídios oriC do grupo micoides como de

S. citri. Desta forma, vetores oriC de molicutes parecem ser espécie-específicos.

Plasmídios oriC são eficientemente replicados em seus hospedeiros quando

possuem o gene dnaA flanqueado pelas seqüências DnaA-box (Janis et al., 2005).

Vetores oriC de bactérias gram-positivas têm tendência a integrar-se através de

recombinação homóloga envolvendo um evento de crossing over na região oriC. Uma

vez integradas ao cromossomo as seqüências permanecem estáveis na presença ou

ausência de seleção (LARTIGUE et al., 2002).

A presença de fragmento de 163 pb da oriC de S. citri (composta por três regiões

DNA-box e dois grupos AT) é suficiente para conduzir a replicação de um vetor oriC

em S. citri e reduzir a freqüência de recombinação homóloga na região oriC. A partir

destes dados, a inativação do gene de motilidade (scmI) de S. citri foi obtida com o

plasmídio oriC pCL2. Apesar de ocorrer recombinação no sítio específico, pequena

quantidade de plasmídio livre foi encontrada nas células transformadas sendo

responsável pelo fenótipo de motilidade observado em alguns transformantes

(LARTIGUE et al., 2002). Dados deste estudo são importantes para organismos nos

quais a proteína RecA está ausente, como no caso de S. citri, reduzindo as chances de

eventos de recombinação, pois corroboram para a hipótese de que o uso de vetor

replicativo e o número de cópias do vetor aumentam as oportunidades de recombinação

(LARTIGUE et al., 2002)

Outro plasmídio oriC de S. citri (pOT1) contém o gene tetM e foi introduzido em

células de S. citri por eletroporação. Este plasmídio foi capaz de replicar em S. citri e se

manter estável como um elemento extracromossomal. Por conter também a origem de

replicação cromossomal de E.coli este plasmídio é um vetor shuttle, no entanto após

algumas passagens em S. citri ele perde esta habilidade por ocorrer sua integração ao

genoma da célula hospedeira. Dois genes heterólogos, gene da espiralina de S.

phoeniceum e fragmento G do gene P1 de M. pneumoniae, clonados no vetor pOT1

foram introduzidos em S. citri. O dois genes foram transcritos e o gene da espiralina foi

expresso em S. citri (RENAUDIN et al., 1995).

Vetores oriC têm sido utilizados para expressão de genes heterólogos como

tetM, lacZ e gene de S. citri que codifica a proteína espiralina em M. capricolum subsp

capricolum e M. agalactiae (JANIS et al., 2005; CHOPRA-DEWASTHALY et al.,

2005a).

Também foi obtida inativação do gene lppA de M. capricolum subsp capricolum

direcionada pelo plasmídio com oriC de S. citri (JANIS et al., 2005).

1.16 - Resistência à Tetraciclina

A maioria dos estudos de transferência gênica em molicutes tem utilizado como

marcadores de seleção o determinante de resistência à tetraciclina (TetM) encontrado no

Tn916 ou determinante de resistência à gentamicina do Tn4001. O gene de tetM é

utilizado preferencialmente como marcador de seleção, uma vez que, em geral, os

molicutes são sensíveis ao antimicrobiano tetraciclina enquanto nem todos molicutes

são sensíveis à gentamicina (RAZIN et al., 1998). Vicca et al. (2004) estudaram 21

linhagens de M. hyopneumoniae isoladas de rebanhos suínos da Bélgica e não

encontraram resistência adquirida aos antimicrobianos oxitetraciclina e doxitetraciclina

em nenhum destes isolados.

O marcador tetM confere alto nível de resistência a tetraciclina, mesmo se

estiver presente em cópia única no genoma do micoplasma (DYBVIG & VOELKER,

1996).

O antimicrobiano tetraciclina liga-se à subunidade 30S ribossômica e impede

interação do aminoacil-tRNA ao sítio A, bloqueando a síntese protéica e impedindo a

multiplicação bacteriana (SAMBROOK & RUSSELL, 2001).

A resistência à tetraciclina mediada pelo gene tetM ocorre pela ligação da

proteína TetM ao ribossomo impedindo a inibição da síntese protéica pelo antibiótico

(RASMUSSEN et al., 1994).

A seqüência de aminoácidos da proteína TetM de Streptococcus faecalis é

estreitamente relacionada com a de TetM de Ureaplasma urealyticum (BURDETT,

1990). O gene tetM de U. urealyticum contem 4 códons TGG que codificam triptofano,

garantindo a utilização do códon universal ao invés do códon de terminação TGA que

em micoplasmas codifica triptofano (SANCHEZ-PESCADOR et al., 1988).

1.17 - Sistemas “Reporter”

Três sistemas repórter podem ser utilizados em micoplasmas: β-galactosidase

(lacZ), GFP (Green Fluorescent Protein) e TetM.

O sistema repórter baseado no gene lacZ está estabelecido para diversas espécies

de Molicutes, tais como M. galllisepticum, Acholeplasma sp (KNUDTSON &

MINION, 1993), M. pneumoniae, M. pulmonis, M. capricolum e M. arthritidis

(HALBEDEL & STÜLKE, 2006).

O sistema GFP mostrou-se eficiente para identificação de regiões promotoras de

M. genitalium e M. pneumoniae clonando fragmentos destes micoplasmas em vetores e

transformando em E. coli. (DHANDAYUTHAPANI et al.,1998).

1.18 - Regiões promotoras

O seqüenciamento completo do genoma de diversas espécies de micoplasmas

focou a atenção no estudo do controle da expressão gênica nestas bactérias.

A identificação de regiões promotoras em micoplasmas é dificultosa

considerando que as regiões intergênicas nos genomas de M. hyopneumoniae

apresentam alto conteúdo de A+T (aproximadamente 80%) em comparação às

seqüências codificantes (aproximadamente 70%) e que recentemente foi relacionado

alto conteúdo de AT em regiões montante aos códons de iniciação da tradução

(VASCONCELOS et al., 2005).

A falta desta informação prejudica a interpretação dos dados obtidos com o

seqüenciamento do genoma. A identificação da região de início da transcrição para um

grande número de genes permite a comparação da região imediatamente à montante

destes genes e a identificação de seqüências consenso. Uma vez tendo esta informação,

a análise de genes coordenadamente regulados pode permitir a identificação de

características das regiões promotoras as quais contribuem para o controle da expressão

(WEINER III et al., 2000).

Poucas regiões promotoras têm sido identificadas e analisadas em micoplasmas

(MUSATOVOVA et al., 2003; WALDO et al., 1999; WEINER III et al., 2000) e estes

estudos identificaram seqüências consenso bastante conservadas na região -10. No

entanto, somente seqüências pouco conservadas na região -35 (VASCONCELOS et al.,

2005). Na busca por sinais regulatórios montante às CDSs foram encontrados 17

clusters, representando uma pequena fração das CDSs do genoma de M.

hyopneumoniae (70 CDSs) (VASCONCELOS et al., 2005).

Weiner III et al. (2000) identificaram em M. pneumoniae apenas 10 regiões de

iniciação da transcrição (16S RNAr, 4,5S RNAr, 10S RNAr, operon P1, gene que

codifica P65, gene que codifica proteína de superfície de 116 kDa e outros quatro

localizados no gene hmw).

Dhandayuthapani et al. (1998) identificaram regiões promotoras de M.

genitalium e M. pneumoniae clonando fragmentos destes micoplasmas em vetor com

sistema repórter GFP e transformando em E.coli.

A detecção de regiões promotoras, assim como a determinação de padrões que

eles apresentam, através de bioinformática tem atraído a atenção de pesquisadores nos

últimos anos (KIM & SIM, 2005). No entanto, os mais recentes algoritmos não levam

em conta o contexto biológico. Particularmente, a interação entre diferentes sítios

regulatórios e propriedades estruturais do DNA permanecem impossíveis de integrar os

atuais esquemas algoritmos (KIM & SIM, 2005).

A recente caracterização de fatores que influenciam a curvatura do DNA nos

sítios de regulação da transcrição e a análise da desestabilização por estresse mecânico

da fita dupla de DNA (SIDD - stress-induced DNA duplex destabilization) podem

contribuir para o refinamento dos algoritmos utilizados para predição de genes e regiões

promotoras (WANG et al., 2004; WANG et al., 2006; KOZOBAY-AVRAHAM et al.,

2006)

A grande quantidade de dados disponíveis para E. coli tem sido utilizada para

derivar matrizes com o objetivo de valorar cada base de potenciais seqüências

promotoras. O ajuste da matriz para o conteúdo G+C do cromossomo em análise é uma

adaptação indispensável para sua utilização em diferentes espécies de bactérias

(WEINER III et al., 2000).

Em anotações do genoma de M. hyopneumoniae apenas um fator sigma pôde ser

identificado, apresentando alta similaridade com fator sigma 70 de E.coli

(VASCONCELOS et al., 2005). Weiner III et al. (2003) e Madsen et al. (2006a)

identificaram um grande número de genes de M. pneumoniae e M. hyopneumoniae que

são expressos em diferentes níveis em condições de choque térmico, revelando que de

fato existe regulação da transcrição nestes organismos. Em outro estudo do

transcriptoma de M. hyopneumoniae foram identificados 27 genes diferentemente

expressos em resposta à condição de depleção de ferro durante a multiplicação deste

organismo (Madsen et al., 2006b).

A análise molecular do mecanismo regulatório da transcrição em

M. hyopneumoniae ainda não é possível devido à ausência de sistemas repórter

adequados que possam ser utilizados para o estudo da atividade de regiões promotoras

in vivo.

1.19 - Objetivos

Construção de vetor oriC de M. hyopneumoniae que seja um plasmídio

replicativo e estável em M. hyopneumoniae.

Estabelecer protocolo de eletrotransformação de M. hyopneumoniae.

2- Manuscrito parcial a ser submetido à publicação em revista científica.

Mycoplasma hyopneumoniae Transformation with a New Replicative Vector

Abstract

Mycoplasma hyopneumoniae causes important respiratory disease in swine, but

little is known about its mechanisms of pathogenesis. The availability of molecular

genetic tools is a prerequisite for investigating the biology of pathogenic bacteria. In

contrast to the large data extracted from the analysis of complete genome sequences of

two pathogenic and one non-pathogenic strain there is still a lack of efficient genetic

tools for functional genomics of this bacterium. Recently, artificial plasmids based on

the chromosomal origin of replication were obtained for several mollicutes species that

have shown to be amenable to transformation. In order to develop a genetic system for

analysis of potencial virulence factors of M. hyopneumoniae an oriC plasmid was

constructed. This is the first report that demonstrates the amenability of M.

hyopneumoniae to transformation and functionality of heterologous tetM determinant in

this pathogen.

Keywords: Mycoplasma hyopneumoniae, electroporation, oriC plasmids, tetracycline

Introduction

Mycoplasma hyopneumoniae is an animal pathogenic bacterium belonging to the

class Mollicutes, a group of microorganisms phylogenetically related to low G-C

content Gram-positive bacteria (RAZIN et al., 1998). M. hyopneumoniae is highly

infective for swine and is the causative agent of enzootic pneumonia (EP), a disease

characterized by sporadic, dry and non-productive cough, retarded growth and

inefficient food conversion (MAES et al., 1996). Like most other members of the order

Mycoplasmatales, M. hyopneumoniae is infective for a single host species, but the

mechanisms of host specificity are unknown. This organism has a worldwide

distribution and occurs in almost every herd. Relative control has been achieved through

active vaccination programs, but porcine enzootic pneumonia continues to be one of the

major economic problems in the swine industry (MINION et al., 2004).

To date three strains of M. hyopneumoniae, two pathogenic (7448, 232) and one

non-pathogenic (ATCC 25934), have been sequenced (VASCONCELOS et al., 2005;

MINION et al., 2004). Very little is understood of the structure of mycoplasma

promoters, and this limits the interpretation of genomic sequence data in these species

(WEINER III et al., 2000). There is a lot yet to be learned about gene expression

regulation in M. hyopneumoniae to understand the process of adaptation of the organism

to changing environmental conditions (WEINER III et al., 2003).

The prediction of promoters by current bioinformatics tools is difficult

considering the weak -35 consensus and higher A+T content of intergenic regions in the

M. hyopneumoniae genomes than coding sequences (WEINER III et al., 2000;

VASCONCELOS et al., 2005). It has been lately shown that AT content is higher in the

200 bp upstream of translation start codons than in the 200 bp downstream

(VASCONCELOS et al., 2005).

The detection of promoters in genomic DNA sequences, as well as the

determination of significant patterns they harbor, via computational methods has

attracted considerable research attention in recent years (KIM & SIM, 2005). However

the latter algorithms cannot take biological context into account. In particular,

interaction between different regulatory sites, and structural properties of DNA, remain

impossible to integrate into current algorithmic schemes (KIM & SIM, 2005).

Recently characterization of the factors influencing curved DNA at the

regulation sites of transcription and analysis of stress-induced DNA duplex

destabilization (SIDD) can greatly improve the currently available promoter and gene

prediction algorithm (WANG et al., 2006a; WANG et al., 2006b; KOZOBAY-

AVRAHAM et al., 2006).

In annotations of the M. hyopneumoniae genomes, only one sigma factor could

be identified. The strongest similarity was found in a protein (MHP0063) to sigma-70

factor and sigma-32 factor of E.coli (MINION et al., 2004; VASCONCELOS et al.,

2005). However, WEINER III et al. (2003) have identified several genes which were

up- and down-regulated during heat shock conditions in M. pneumoniae showing that

transcription regulation do exist in this organism.

The molecular analysis of transcription regulatory mechanisms in

M. hyopneumoniae has so far been difficult due to the lack of appropriate reporter

systems that can be used to study the activity of promoter fragments in vivo.

While progress has been made in understanding the molecular basis for some

mycoplasma diseases, M. hyopneumoniae has resisted advances because of its fastidious

growth in liquid and solid media, and the lack of genetic tools (MINION et al., 2004).

The majority of genetic tools and transformation protocols which are well-

established in model organisms such as B. subtilis or E. coli are unavailable for

mycoplasmas (HALBEDEL & STÜLKE, 2006; MINION et al., 2004). Only two

transposons have been used in mycoplasmas, Tn916 e Tn4001, both from gram-positive

organisms (POUR-EL et al., 2002).

Most studies on gene transfer in mollicutes have used as selectable marker the

tetM tetracycline resistance determinant found on Tn916, since mollicutes in general are

sensitive to tetracycline (RAZIN et al., 1998).

The use of replicative plasmids in mycoplasmas is restricted to M. pulmonis

(CORDOVA et al., 2002), M. agalactiae (CHOPRA-DEWASTHALY et al., 2005), M.

capricolum subsp. capricolum (JANIS et al., 2005; LARTIGUE et al., 2003), M.

mycoides subsp. mycoides large colony and M. mycoides subsp. mycoides small colony

(LARTIGUE et al., 2003).

The aim of the present study was to develop a genetic system for analysis of

promoter sequences of M. hyopneumoniae and demonstrate the ability to transform this

organism. M. hyopneumoniae was chosen because its importance to swine production.

Materials and methods

Bacterial strains, plasmids, and enzymes

Escherichia coli XL1-Blue (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac

[F` proAB lacI

Z.M15 Tn10 (Tet

)]) (Stratagene™) was used as the host strain for

cloning experiments and plasmid propagation. For plasmid transformation, E. coli

competent cells were prepared according to the procedure described by Sambrook &

Russell (2001).

Mycoplasma hyopneumoniae strain 7448 was originally isolated from an

infected swine in Lindóia do Sul, Santa Catarina, Brazil. When inoculated in specific

pathogen free (SPF) pigs, this strain caused disease and consistently produced the

characteristic symptoms of EP (VASCONCELOS et al., 2005).

Plasmid vectors pAM120 (GAWRON-BURKE & CLEWEL et al., 1984),

pSRT1 (LARTIGUE et al., 2002), and pOSTM were maintained and multiplied in E.

coli XL1-Blue cultivated in Luria-Bertani broth supplemented with 50 μg/mL of

ampicilin.

Enzymes for molecular biology were purchased from Invitrogen™ and

Fermentas, and were used with the supplied buffers.

Primers and PCR amplification

Primers SPIR/PstI-UP and SPIR/SalI-DO corresponding, respectively, to bases

4154-4171 and 4483-4466 of the published sequence (GenBank accession No.

AF012877) were used to amplify the promoter of the Spiroplasma citri spiralin gene from

the plasmid pSRT1. The tetM gene was amplified from plasmid pAM120 (GenBank

accession No U49939) with primers TETM/Bam-DO and TETM/SalI-UP. These primers

correspond, respectively, to bases 15385-15362 and 13467-13490 of the nucleotide

sequence of the Tn916 tetM gene. Primers MH_ORI-UP and MH_ORI-DO correspond,

respectively, to bases 1-30 and 1700-1671 of the nucleotide sequence of M.

hyopneumoniae oriC region (GenBank accession No. NC_007332) Amplification was

carried out in 25 μL reaction mixture containing 5-10 ng of target DNA and 1U of

Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen™) with the 1X buffer recommended by

supplier, 5mM dNTPs, 2.5mM MgCl

and 30 pmol of each primer. Amplification was

achieved in over 35 cycles, each of 45 s at 94ºC, 45 s at the annealing temperature and 2

minutes or 50 s at 72ºC.

Table 1 - Primers sequence, annealing temperature, extension time and size of

amplicon.

Plasmid constructions

Plasmid pOM was obtained by inserting the oriC, 1700 bp PCR product, at the

SmaI site of pUC18 vector (Stratagene™) (Fig.1A). To construct pSM, the spiralin gene

promoter was PCR-amplified from pSRT1 with primers SPIR/PstI-UP and SPIR/SalI-

DO, and the 342 bp was inserted into the SmaI site of pUC18. After restriction by PstI

and SalI, the 342 bp fragment was inserted into the PstI/SalI sites of pOM to yield

pOSM (Fig1.B).

The tetM gene was amplified from pAM120 with primers TETM/SalI-UP and

TETM/Bam-DO and inserted into the SmaI site of pUC18. After restriction by SalI and

BamHI, the 1917 bp fragment was inserted into BamHI/SalI sites of pOSM to yield the

oriC vector pOSTM (Fig1.C). Correct cloning was confirmed by DNA sequencing of all

fragments cloned.

In the plasmid vector pOSTM, the M. hyopneumoniae oriC region comprises the

dnaA gene, the upstream region of dnaA gene with two DnaA box, and the dnaA-dnaN

intergenic region reported as essential for plasmid replication in S. citri (LARTIGUE et

al., 2002). The tetM gene expression is driven by the S. citri spiralin gene promoter.

Primers Sequence

Annealing

temp.

72°C

extension

step

Size of

amplicon

(bp)

SPIR/Pst1-UP 5’ CTG CAG CAG AAT TAA AAG TTA GTG 3’ 50 ºC

SPIR/SalI-DO 5’ GTC GAC TTC ATT TCT TAT ATT TCC 3’ 50 ºC

50 seconds 342

TETM/SalI-UP 5’ GTC GAC ATG AAA ATT ATT AAT ATT GGA GTT T 3’ 66 ºC

TETM/Bam-DO 5’ GGA TCC CTA AGT TAT TTT ATT GAA CAT ATA 3’ 66 ºC

2 minutes 1917

MH_ORI-UP 5’ TTT TTC TCC TTT TTT TGC TTA AAT TTA AGT 3’ 50 ºC

MH_ORI-DO 5’ TTT AGT TTT AAT AAT AAA AAT AAT AAG GCT 3’ 50 ºC

2 minutes 1700

Figure 1 - Construction and restriction maps of plasmids pOM, pSM, pTM and pOSTM.

Abbreviations: tetM, tetracycline resistance gene; spir., promoter region of the S. citri

spiralin gene; Ap(r), pUC18 ampicilin resistance gene; ORI, chromosomal replication

origin from M. hyopneumoniae.

Transformation

Electrotransformation of M. hyopneumoniae with pOSTM was initially based on

methods previously described for other Mycoplasma species (MINION & KAPKE,

1998, CHOPRA-DEWASTHALY et al., 2005) but were later modified to best suit M.

hyopneumoniae.

Isolation and cultivation were performed in standard conditions, as described by

FRISS (1975), with cells grown in 60 mL of medium, until a density corresponding to

CFU/mL. Cells were harvested by centrifugation at 3360 x g for 30 minutes and

washed one time with the original volume of electroporation buffer - EB (272 mM

sucrose, 8 mM HEPES, pH 7.4) before final resuspension in 300 μl of EB.

Electrotransformation of M. hyopneumoniae with plasmid DNA was carried out with 10

μg or 7.5 μg of DNA.

The DNA-cell mixture was allowed to stand on ice for 15 minutes, transferred to

pre-chilled 2 mm electrocuvettes and then electroporated in a BIO-RAD Gene-Pulser

apparatus. The electroporation conditions using 2,5kV voltage, 25 μF capacitance and

400 Ω resistance, were found to be most suitable and the pulse length varied from 4.8 to

5.5 milliseconds.

After the electric pulse, 900 μl of chilled Friis broth was added and cells were

kept at 37ºC for 3 h to express tetracycline resistance.

Transformants were selected on liquid or/and solid Friis medium supplemented

with 2 μg of tetracycline per mL. Preliminary experiments had indicated that no

spontaneous resistance to tetracycline occurs naturally in M. hyopneumoniae. The plates

were examined up to a maximum of 10 days using magnifying glass and colonies were

picked in 100 μL of Friis broth containing 2 μg/mL of tetracycline for further analysis.

To confirm the presence of plasmid pOSTM in the M. hyopneumoniae PCR was

performed. The PCR primers SPIR/PstI-UP and SPIR/SalI-DO were used to screen for

the spiralin promoter in the plasmid. Crude DNA extracts were obtained by boiling 100

μl of cultures or colony transformants for ten minutes. PCR assays were conducted

using 5 μl of the crude DNA as template in 25 μl reaction mixtures, with 1 U of Taq

DNA polymerase (Cenbiot-UFRGS) in 1X buffer supplied by the manufacturer, 5 mM

dNTPs, 1,5 mM MgCl

and 30 pmol of each primer.

Results

Tetracycline-resistant (tetR) colonies appeared within 10 days of incubation

(Figure 2). The transformation frequency of the pOSTM was 42.6 and 37.9 cfu

transformants/μg for two independent electroporation events with 10 and 7.5 μg of

DNA respectively. At that time, no spontaneous tetR colonies were observed for

untransformed controls. Individual mycoplasma colonies were selected for further study

in order to confirm the presence of plasmid pOSTM in the M. hyopneumoniae.

Individual transformants were picked from selective agar plates using sterile Pasteur

pipettes and transferred to 100μL of Friis broth containing 2 μg/mL of tetracycline and

100μL Friis broth without antibiotic to test the stability of the vector, but no growth was

observed in both media.

Figure 2 – Colonies of M. hyopneumoniae strain 7448 transformed with pOSTM and

grown in agar Friis medium with tetracycline (2μg/mL), visualized with a magnifying

glass (50X).

Transformants selected on liquid Friis medium were propagated in the presence

of tetracycline for up to two passages.

The promoter was amplified indicating that the vector had inserted into the

organism (Figure 3).

Figure 3 – Agarose gel electrophoresis of PCR products amplified from tetracycline-

resistant clones of M. hyopneumoniae.

PCR products were obtained using primers SPIR/PstI-UP and SPIR/SalI-DO to detect

the presence of pOSMT in the different clones. M, 100 bp DNA ladder; NC, PCR

negative control; NT, PCR negative control added with DNA extracted from

nontransformed M. hyopneumoniae cells; NT+P, PCR reaction carried out with DNA

obtained from M. hyopneumoniae cells mixed with 10 μg of the pOSTM plasmid and

incubated for 10 days; lane 1, PCR positive control; lanes 2 to 7, PCR products

amplified from total DNA from six M. hyopneumoniae colonies transformed with

pOSTM; lane 8, PCR product amplified from total DNA from M. hyopneumoniae

transformed with pOSTM and cultivated in Friis broth (second passage);

Discussion

As expected transformants grown at low tetracycline concentration (2 μg/mL)

were found after 10 days of incubation, suggesting that the tetM gene could be

transcribe from DNA sequence carried on the spiralin gene fragment and recognized by

the RNA polymerase. It should be noticed that even so transformation frequency could

not be compare to previous studies with Mycoplasmas, since they determined the

eficiency by transformants/cfu/μg plasmid DNA (JANIS et al., 2005; LARTIGUE et al.,

2003), we considered to our data low efficiency.

The findings of our study have evidenced that M. hyopneumoniae is amenable to

transformation by electroporation and that the tetM gene and the promoter of spiralin

gene are functional in this organism.

It is known that in B. subtilis, dnaA box regions are incompatible so that oriC

plasmids can exists in only one copy and overexpression of the DnaA protein inhibits

initiation of DNA replication and cell division (RENAUDIN et al. 1995). Such an

incompatibility in M. hyopneumoniae would explain the difficult to grow the

transformants after two passages.

M NC NT NT+P 1 2 3 4 5 6 7 8

300 bp

M NC NT NT+P 1 2 3 4 5 6 7 8

300 bp

This plasmid is of particular interest because M. hyopneumoniae causes

important economic loses in swine production and development of new vaccines against

this agent is considered to be an international priority. The complete genome sequence

of three strains are available and genomic comparisons studies among pathogenic and

non-pathogenic strains have been described genes potentially related to virulence and a

few number of genes involved in regulation of gene expression (MADEIRA &

GABRIEL, 2007; FERREIRA & CASTRO, 2007).

The pOSTM can serve as a valuable tool to genetically manipulate M.

hyopneumoniae to identify and study the factors involved in their virulence and

pathogenicity. The experimental approach to test putative promoters and the importance

of the -35 region is now likely to be possible since a reporter system is now available

for M. hyopneumoniae.

In conclusion, our study is the first report of construction and testing of oriC

vector for transformation of M. hyopneumoniae (7448).

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2- DISCUSSÃO GERAL

Neste trabalho foi desenvolvido o primeiro vetor replicativo para transformação

da bactéria M. hyopneumoniae linhagem 7448, uma ferramenta importante para estudos

genéticos deste agente da PE.

Uma falha na construção do vetor pOSTM foi identificada após o

seqüenciamento parcial deste plasmídio, o qual revelou a ausência do nucleotídio

adenosina no iniciador TETM/SalI-UP. Tal erro implica na perda do códon de iniciação

da tradução (A

TG) do gene tetM, presente no vetor pOSTM.

A resistência à tetraciclina foi utilizada neste vetor como marca de seleção das

colônias transformantes, logo a falta da expressão da proteína codificada pelo gene tetM

é vista como um problema para a manutenção do plasmídio no interior da célula

hospedeira e a seleção dos organismos transformantes.

Todavia, a observação de colônias transformantes em meio seletivo com

antibiótico evidenciou que a expressão do gene que confere resistência à tetraciclina

ocorria naquelas células de M. hyopneumoniae contendo o vetor pOSTM. A presença

destas colônias transformantes em meio contendo 2 μg/mL de tetraciclina foi

confirmada por amplificação de uma porção da região ribossômica 16S de

M. hyopneumoniae e da seqüência promotora do gene da espiralina (APÊNDICE B),

com iniciadores específicos já descritos.

A tradução do gene tetM neste vetor faltando o códon de iniciação pode ser

explicada quando analisamos os códons alternativos de iniciação presentes na seqüência

promotora do gene da espiralina e na própria seqüência nucleotídica do gene

(APÊNDICE C). Tal análise foi realizada pelo programa Virtual Ribosome

(WERNERSSON et al., 2006), utilizando a tabela de código genético de micoplasma e

espiroplasma (tabela 4), o qual identificou as trincas TTG e GTG como possíveis

códons alternativos de iniciação, previamente descritos como funcionais em

M. hyopneumoniae (SOUTHERN GENOME INVESTIGATION PROGRAM, 2007).

A cada evento de transformação um baixo número de M. hyopneumoniae

resistentes à tetraciclina foi obtido em relação à quantidade de DNA e ao número de

UFC viáveis após a transformação. Esta baixa eficiência de transformação foi

constatada em sucessivas transformações e diferentes protocolos testados, e poderia ser

o reflexo do baixo nível de expressão do gene de resistência à tetraciclina.

O códon ATG na região de início da tradução interage mais fortemente com o

RNAt iniciador em relação a outros códons iniciadores (SAKAI et al., 2001), dado que

corrobora com a idéia de que a tradução do transcrito do gene tetM é menos eficiente

devido à utilização de um códon alternativo. Uma explicação parcial para esta menor

eficiência é o pareamento fraco de duas bases ao invés das três bases AUG com o

RNAt

fMet

(KOZAK, 2005). E outro agente responsável por esta característica é o fator

de iniciação IF3, presente em genomas procariotos e no genoma de M. hyopneumoniae,

o qual tem a função de desfavorecer o início da tradução a partir de códons alternativos

(KOZAK, 2005).

A utilização do códon de iniciação alternativo TTC obrigatoriamente impediria a

ligação do ribossomo ao sítio RBS do promotor localizado à jusante a esta trinca

(CHEVALIER et al, 1990). No entanto, foi observada a ausência de região 5’ não

traduzida contendo a seqüência RBS em uma grande quantidade de transcritos de

M. pneumoniae (WEINER III et al., 2003). Dessa forma, é possível considerarmos a

tradução deste transcrito sem o reconhecimento direto do RNAr 16S na seqüência RBS.

O erro identificado foi corrigido através da amplificação do gene tetM com um

novo iniciador (5’ GTC GAC ATG AAA ATT ATT AAT ATT GGA GTT T 3’) e posterior

clonagem no vetor pOSM. Os resultados apresentados neste trabalho referem-se à

utilização deste novo vetor pOSTM corrigido para transformação de M.

hyopneumoniae.

O gene tetM mostrou ser uma marca de seleção eficaz neste organismo e um

possível sistema repórter para análise de regiões regulatórias da transcrição de genes.

O vetor construído neste trabalho foi utilizado para experimento de

eletrotransformação em M. hyopneumoniae. Os resultados deste estudo são os primeiros

relatados até o momento para M. hyopneumoniae e a metodologia descrita ainda não

corresponde às condições ideais de eletroporação para este organismo.

Não foi possível comparar a eficiência de transformação de nosso estudo com os

dados relatados para M. agalactiae, M. capricolum e S. citri (CHOPRA-

DEWASTHALY et al., 2005 a; JANIS et al., 2005; LARTIGUE et al., 2002), uma vez

que estes utilizaram a relação entre número de transformantes, número de células e μg

de DNA plasmidial, enquanto em nosso trabalho determinamos o número de

transformantes obtidos em relação a 1 μg de DNA plasmidial.

Apesar de uma baixa freqüência de transformantes ser um resultado esperado

para molicutes, se faz necessário aprimorar a metodologia empregada para aumentar a

taxa de sobrevivência das células à descarga elétrica e garantir a replicação do vetor em

M. hyopneumoniae ao longo de sucessivas passagens em meio seletivo. Em outros

estudos de transformação em molicutes a região oriC promoveu a replicação estável do

plasmídio dentro da bactéria em Spiroplasma citri (YE et al, 1994), M. pulmonis

(CORDOVA et al, 2002), M. mycoides (LARTIGUE et al, 2003), M. capricolum

(JANIS et al, 2005) e M. agalactiae (CHOPRA-DEWASTHALY et al, 2005 a).

A ausência de multiplicação de transformantes após a segunda passagem em

meio Friis seletivo expõe a presente dificuldade de manutenção da marca de seleção do

vetor dentro da célula hospedeira. A ocorrência de integração do plasmídio no

cromossomo, a instabilidade do vetor, a presença em duplicata da região oriC ou a

morte de células transformantes após um período prolongado de cultivo poderiam ser

explicações para a perda precoce destes transformantes e devem ser analisadas.

Neste estudo não foi investigada a possibilidade de integração do vetor oriC no

cromossomo de M. hyopneumoniae. Este evento é passível de ocorrer, visto que estudos

de transformação em molicutes relatam a integração do plasmídio no cromossomo do

hospedeiro através de recombinação homóloga na região oriC envolvendo um evento de

crossing over (LARTIGUE et al., 2002; RENAUDIN et al., 1995).

Sendo confirmada esta hipótese, uma maneira de evitar a integração e promover

a replicação do vetor é a redução do tamanho da origem de replicação de M.

hyopneumoniae a um tamanho mínimo necessário para a replicação (CHOPRA-

DEWASTHALY et al., 2005a). A retirada do gene dnaA do vetor pOSTM é uma

estratégia interessante, pois em S. citri a pequena a região intergênica dnaA-dnaN de

163 pb (contendo três regiões DNA-box) foi suficiente para a manutenção da replicação

do vetor pCL2 (LARTIGUE et al., 2002). Em M. hyopneumoniae foram encontradas

seqüências DnaA-box somente na região intergênica à montante do gene dnaA. Na

região entre os genes dnaA e dnaN foram encontradas estas seqüências DnaA-box

apenas quando utilizados consensos menos específicos, comprometendo a

confiabilidade da seqüência identificada (MINION et al., 2004). Dessa forma, manter as

regiões que flanqueiam o gene dnaA no vetor pOSMT garantiria a presença das

seqüências DnaA-box, descritas como essenciais para replicação plasmidial em M.

pulmonis (CORDOVA et al., 2002).

Em B. subtilis já foi descrita a incompatibilidade de regiões dnaA-box presentes

no plasmídio replicativo e na oriC da bacteria. A superexpressão da proteína DnaA inibe

a iniciação da replicação e divisão celular (RENAUDIN et al. 1995).

Desde a conclusão do seqüenciamento do genoma completo de três linhagens

desta bactéria a atenção de diversos pesquisadores está direcionada para a compreensão

dos mecanismos regulatórios de seus genes e para a identificação de proteínas com

potencial imunogênico, importantes para o desenvolvimento de vacinas recombinantes.

O desenvolvimento de ferramentas genéticas que possibilitem os estudos in vivo e

substituam os sistemas heterólogos de clonagem e expressão são importantes para a

continuidade das pesquisas na área.

Em relação às aplicações do vetor pOSTM, além de ser uma promissora

ferramenta para estudos de regiões promotoras, o mesmo pode ser utilizado para a

identificação de função gênica.

Em estudos futuros, o sistema repórter tetM de pOSMT pode ser utilizado em

análises sobre a importância da região promotora -35 para expressão gênica através da

deleção desta seqüência consenso da região promotora e clonagem em pOSMT para

transformação em M. hyopneumoniae.

O efeito da expressão de genes heterólogos, como por exemplo, na velocidade

da multiplicação in vitro de M. hyopneumoniae, ou o efeito da superexpressão de genes

sobre a característica de virulência são algumas das possíveis utilizações do pOSTM

como vetor replicativo. A função de genes potencialmente envolvidos na

patogenicidade pode ser analisada quando inserimos mutações nestes genes candidatos e

os introduzimos no vetor pOSTM. Após a transformação é possível analisar o efeito

sobre o fenótipo dos transformantes.

Se considerarmos o uso de pOSTM como vetor integrativo, são possíveis

estudos como inativação gênica específica por recombinação homóloga e geração de

mutantes específicos de M. hyopneumoniae. Essa abordagem poderia ser conduzida

através da clonagem do gene de interesse no vetor pOSTM (após mutagênese in vitro) e

subseqüente transformação em M. hyopneumoniae.

Por fim, nossos resultados permitem concluir que a espécie M. hyopneumoniae é

susceptível de transformação artificial pela metodologia de eletroporação e que o gene

heterólogo tetM presente no vetor pOSTM construído neste trabalho confere a

característica de resistência ao antimicrobiano tetraciclina neste organismo.

3- PERSPECTIVAS

• Otimizar as condições de eletroporação a fim de obter uma maior taxa de

sobrevivência das células eletroporadas e aumentar a eficiência de transformação.

• Determinar a concentração ótima de DNA do vetor que corresponda a uma maior

freqüência de transformantes.

• Verificar a estabilidade do vetor pOSTM em M. hyopneumoniae após passagens em

meio Friis seletivo com concentrações crescentes de antibiótico.

• Verificar a ocorrência de integração por recombinação do pOSMT ao DNA

cromossomal de M. hyopneumoniae por Southern blot.

• Utilizar o sistema construído para estudo das possíveis regiões promotoras

encontradas no genoma de M. hyopneumoniae através de análise in silico.

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ZIELINSKI, G.C. & ROSS, R.F. Morphologic features and hydrophobicity of the cell

surface of Mycoplasma hyopneumoniae. American Journal of Veterinary Research,

v.53, p.1119-1124, 1992.

APÊNDICE A – Materiais e Métodos

BACTÉRIAS E PLASMÍDIOS.

TABELA 1 – Bactérias e plasmídios.

Estirpes/Plasmídios Genótipo/Fenótipo Referência/Fonte

E.coli cepa XL1-Blue (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44

relA1 lac [F` proAB lacI

Z.M15 Tn10 (Tet

)])

Stratagene™

M. hyopneumoniae

linhagem 7448

Embrapa Suínos e Aves

pSRT1 tetM, espir

prom

LARTIGUE et al., 2002

pAM120 Tn916 (Tet

) GAWRON-BURKE et al., 1984

pUC18

Ap, ColE1 replicon, MCS lacZ

YANISCH-PERRON et al., 1985

pOSTM tetM , oriC M. hyopneumoniae, espir

prom

Este trabalho

espir

prom

: região promotora do gene da espiralina.

Amostra de Mycoplasma hyopneumoniae.

Foi utilizada a linhagem 7448 de M. hyopneumoniae procedente da Embrapa

Suínos e Aves (Concórdia, SC), isolada de um suíno infectado em Lindóia do Sul, SC,

Brasil. Quando inoculada em suínos SPF (specific pathogen free – livre de patógenos

específicos) causou doença e sempre produziu os sintomas característicos de PE.

Condições de Cultivo.

Quando retiradas dos estoques, as amostras foram cultivadas em meio Friis

líquido, a 37ºC sob leve agitação.

Extração do DNA genômico de M. hyopneumoniae.

O sedimento de células de M. hyopneumoniae linhagem 7448 foi ressuspendido

em 1 mL de tampão TE (Tris HCl 10 mM e EDTA 1mM, pH 8,0) e homogeneizadas em

vórtex. A suspensão foi dividida em dois tubos e foi adicionado em cada tubo 15 µL

SDS 10% e 1,5µL proteinase K (20mg/mL) permanecendo em banho de água a 37ºC

durante uma hora. Em seguida, foram adicionados 100 µL NaCl 5M e 80 µL de CTAB

1% seguido de incubação a 65 ºC durante 10 minutos. O extrato resultante foi

submetido à purificação por volumes iguais de fenol:clorofórmio, seguido da

precipitação por 600µL de isopropanol gelado e incubação a -20ºC por

aproximadamente 16 horas. O DNA resultante foi recuperado após centrifugação a

13000 rpm (14196 x g) durante 5 minutos, sendo o sobrenadante desprezado e o

sedimento lavado duas vezes com etanol 70%. O DNA foi ressuspendido em água

ultrapura estéril e armazenado 4ºC durante 3 horas. Foram adicionados 3 µL de RNase

(10mg/mL) seguido de incubação a 37ºC durante uma hora. O DNA obtido foi estocado

a uma temperatura de -20ºC. O DNA purificado foi analisado por eletroforese em gel de

agarose 0,8% corado com brometo de etídio e visualizado em luz UV.

Escherichia coli XL1-Blue.

Condições de Cultivo.

Foram cultivadas em meio Luria Bertani (LB) (SAMBROOK & RUSSELL,

2001) sob agitação de 150 rpm ou em meio sólido LB, a 37ºC.

Purificação de DNA plasmidial.

O isolamento de plasmídios de E.coli em pequena escala baseou-se no método

de lise alcalina (SAMBROOK & RUSSELL, 2001).

A bactéria E.coli contendo o plasmídio de interesse foi crescida em 3 mL de

meio LB adicionado de antibióticos adequados. A cultura foi transferida para tubos

plásticos de 1,5 mL e as células foram coletadas por centrifugação (14000 rpm (16464 x

g), 1 minuto) e ressuspensas em 100 µL de solução I (50 mM glicose; 25 mM Tris-Cl,

pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0). A lise celular foi obtida com a adição de 200 µL de

solução II (0,2 N NaOH, 1% SDS). As proteínas, o DNA cromossômico, os restos

celulares e o SDS foram precipitados com a adição de 150 µL de solução III (acetato de

potássio 5 M) e incubação durante 5 minutos no gelo. As amostras foram centrifugadas

(14000 rpm (16464 x g) por 5 minutos) e o sobrenadante foi transferido para outro tubo.

O DNA plasmidial foi precipitado dois volumes de etanol absoluto, lavado com 1 mL

de etanol 70%, seco em estufa a 37 ºC e dissolvido em 50 µL de água ultrapura estéril.

Foi adicionado 1,5 µL de RNase (20 mg/mL) seguido de incubação a 37 ºC durante uma

hora. O DNA obtido foi estocado a uma temperatura de - 20 ºC. O DNA purificado foi

analisado por eletroforese em gel de agarose 0,8 % corado com brometo de etídio e

visualizado em luz UV.

OLIGONUCLEOTÍDEOS.

Os oligonucleotídeos sintéticos utilizados para construção do vetor de replicação

em M. hyopneumoniae estão relacionados na Tabela abaixo.

Tabela 1 – Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados

Oligonucleotídeos Seqüência

SPIR/Pst1-UP 5’ CTG CAG CAG AAT TAA AAG TTA GTG 3’

SPIR/SalI-DO 5’ GTC GAC TTC ATT TCT TAT ATT TCC 3’

TETM/SalI-UP 5’ GTC GAC

ATG AAA ATT ATT AAT ATT GGA GTT T 3’

TETM/Bam-DO 5’ GGA TCC CTA AGT TAT TTT ATT GAA CAT ATA 3’

MH_ORI-UP 5’ TTT TTC TCC TTT TTT TGC TTA AAT TTA AGT 3’

MH_ORI-DO 5’ TTT AGT TTT AAT AAT AAA AAT AAT AAG GCT 3’

CONDIÇÕES DE DIGESTÃO DE DNA COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO.

As condições utilizadas para a digestão de DNA com enzimas de restrição foram

aquelas especificadas pelo fabricante.

Uma a duas unidades das diferentes enzimas de restrição foram utilizadas para a

digestão de 1 µg de DNA em um volume de 20 µL durante 3 horas na presença do

tampão recomendado e a temperatura adequada para a enzima.

PREPARO DOS VETORES.

O vetor foi submetido à clivagem com enzimas de restrição adequadas. Após a

restrição, as enzimas foram desnaturadas por calor, conforme instruções do fabricante.

A desfosforilação das extremidades do vetor linearizado foi obtida com a utilização de

dez unidades de enzima SAP (shrimp alkaline phosphatase – fosfatase alcalina de

camarão) por 2 horas a 37 ºC.

LIGAÇÃO DE DNA.

Ligação de pUC18 com o fragmento da origem de replicação de

M. hyopneumoniae.

A clonagem da origem de replicação amplificado do DNA genômico de

M. hyopneumoniae linhagem 7448 com primers específicos foi realizada de acordo com

o protocolo de clonagem blunt de produto de PCR (SAMBROOK & RUSSELL, 2001).

Numa única reação foram adicionados o vetor pUC18 íntegro e o inserto numa razão

molar de 1:3, tampão one for all 10X (Invitrogen), 0,1 µL de 2-mercaptoetanol 100mM,

0,2 µL BSA (10 µg/µL), 1 µL ATP 10 mM, 2 µL dNTP 1mM, 0,2 µL SmaI (10 u/µL),

0,2 µL T4 DNA polimerase (5u/µL), 0,6 µL T4 DNA ligase (5u/µL) e q.s.p 20 µL de

água ultra pura. As condições da reação foram 22 ºC durante 4 horas. Neste método a

ligação do inserto no plasmídio elimina o sítio de restrição da enzima, impedindo que a

enzima destrua os plasmídios recombinantes gerados durante a reação de ligação.

Ligação de pUC18 com a região promotora de espiralina.

A clonagem do promotor da espiralina obtido através da amplificação com

primers específicos utilizando como DNA molde o plasmídio pSRT1 também foi

realizada de acordo com o protocolo de clonagem blunt de produto de PCR

(SAMBROOK & RUSSELL,2001). Numa única reação foram adicionados o vetor

pUC18 íntegro e o inserto numa razão molar de 1:3.

Ligação de pUC18 com região de tetM.

O vetor linearizado e desfosforilado foi ligado ao inserto numa razão molar de

1:3. A estes foi adicionado tampão de ligação e 2,5 U de T4 DNA ligase (Fermentas) e a

mistura foi incubada a 16 ºC durante aproximadamente 16 horas (SAMBROOK &

RUSSELL, 2001).

Ligação de DNA com extremidades coesivas.

O vetor linearizado e desfosforilado foi ligado ao inserto numa razão molar de

1:1. O inserto foi aquecido a 45 ºC durante 5 minutos e resfriado em gelo antes da

adição do tampão de ligação e de 2,5 U de T4 DNA Ligase (Fermentas). O sistema foi

incubado a 16 ºC durante aproximadamente 16 horas (SAMBROOK & RUSSELL,

2001).

TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA POR ELETROPORAÇÃO

Preparo de células E.coli eletrocompetentes.

Foi utilizado o protocolo descrito por Sambrook & Russell (2001).

Preparo de células eletrocompetentes de M. hyopneumoniae (linhagem

7448).

Seis mililitros de uma cultura de M. hyopneumoniae foram inoculados em 54 mL

de meio Friis. A cultura foi mantida a 37 ºC até a mudança na cor do meio, determinada

pelo indicador de pH vermelho-fenol. As células foram coletadas por centrifugação a

3360 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente e lavadas uma vez com tampão de

eletroporação Hepes-sacarose (8mM Hepes, 272mM sacarose, pH 7,4) a 4 ºC. Em

seguida, foram centrifugadas novamente a 3360 x g por 30 minutos e ressuspendidas em

um volume final de 300 µL de tampão de eletroporação, a 4 ºC.

Transformação bacteriana de E. coli.

Um volume de 1 ou 15 µL da solução de DNA a ser eletroporado foi adicionado

a 40 µL de células eletrocompetentes (2 x 10

a 3 x 10

células/mL). A suspensão foi

transferida para uma cubeta de eletroporação (2 mm de espessura) e submetida a um

campo elétrico (25 µFD; 2,5kV; 200 ohms) para induzir a entrada do DNA na bactéria.

Após a descarga elétrica, as células de E. coli foram transferidas para 1 mL do

meio SOC ou LB e mantidas em recuperação a 37ºC por uma hora. A suspensão de

bactérias foi plaqueada em meio LB sólido contendo ampicilina, X-gal (5-bromo-4-

cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo) e IPTG (Isopropil B-D-tiogalactopiranosídeo)

nas concentrações indicadas por Sambrook & Russell (2001).

Seleção dos plasmídios recombinantes.

A seleção de plasmídios recombinantes construídos nos vetores pUC18 foi

realizada pela inativação da expressão da enzima β-galactosidase, a qual é codificada

pelo gene lacZ. O sítio de policlonagem destes vetores encontra-se inserido dentro do

gene lacZ’, havendo inativação da β-galactosidase devido a entrada do inserto no vetor.

As colônias que produzem a enzima β-galactosidase podem ser identificadas daquelas

que não a produzem quando plaqueadas em meio LB sólido contendo o substrato

incolor X-gal e IPTG. IPTG é um análogo da lactose e inativa o repressor do gene lacZ

induzindo a transcrição do operon lac. A enzima β-galactosidase é capaz de hidrolisar o

X-gal formando um produto de coloração azul. Assim as colônias que produzem esta

enzima ficam azuis, enquanto aquelas que não a possuem permanecem brancas. Após

seleção, as colônias brancas foram cultivadas em meio LB contendo ampicilina. A

análise dos plasmídios recombinantes foi feita por digestão com as enzimas de restrição

adequadas.

Transformação bacteriana de M. hyopneumoniae.

Dez microgramas do plasmídio a ser eletroporado foram adicionados em 100 µL

de células eletrocompetentes. A suspensão foi transferida para uma cubeta de

eletroporação (2 mm de espessura) e submetida a um campo elétrico (25 µFD; 2,5kV;

400 Ω; 4,8 a 5,5 milisegundos) para induzir a entrada do DNA na bactéria.

Após a descarga elétrica, as células de M. hyopneumoniae foram transferidas

para 900 μl de meio Friis líquido e incubadas a 37 °C durante 3 horas para recuperação

das células.

Seleção das células de M. hyopneumoniae transformantes.

Metade do volume de suspensão de bactérias foi cultivada em meio Friis sólido

contendo tetraciclina (2 µg/mL). Em cada placa foram inoculados 100 μL da suspensão

da bactéria e espalhados com auxílio de alça de Drigalsky. As placas foram incubadas a

37 °C, em microaerofilia, por 10 dias. Ao volume restante foi adicionado igual volume

de meio Friis líquido, tetraciclina para a concentração final de 2 µg/mL e incubado a 37

°C até a visualização da mudança de cor do meio.

Para controle da sobrevivência das células após a descarga elétrica, 100 µL de

células eletrocompetentes foram eletroporadas sem a presença do DNA. Após a

descarga elétrica, as células de M. hyopneumoniae foram transferidas para 900 µL de

meio Friis e mantidas em recuperação a 37ºC durante 3 horas. A diluição de 1:10 da

suspensão de bactérias foi cultivada em meio Friis sólido.

Para o controle da viabilidade das células após as lavagens com o tampão de

eletroporação as células de M. hyopneumoniae foram transferidas para 900 µL de meio

Friis e mantidas em recuperação a 37ºC durante 3 horas. A diluição de 1:10 da

suspensão de bactérias foi cultivada em meio Friis sólido.

A susceptibilidade de M. hyopneumoniae ao antimicrobiano tetraciclina foi

confirmada pela inoculação de células eletroporadas sem a presença de DNA e células

não eletroporadas em meio Friis sólido contendo tetraciclina (2 µg/mL).

Em cada placa foram inoculados 100 μL da suspensão e espalhados com auxílio

de alça de Drigalsky. As placas foram incubadas a 37 °C, em microaerofilia, por 10 dias

e visualizadas com auxílio de lupa.

SEQÜENCIAMENTO DE DNA.

Reação de seqüenciamento.

Para cada reação de seqüenciamento foi utilizado o DYEnamic™ ETTerminator

Cycle Sequencing Kit (Amershan Pharmacia Biotech). De acordo com o protocolo do

fabricante do kit foi adicionado 100 a 200 fmoles de DNA molde, 5 pmol de

oligonucleotídeo, premix de reagentes para seqüencimento e água para completar o

volume final de 20µl de cada reação. O premix de reagentes contém quatro

didesoxinucleotídeos (ddG, ddA, ddT e ddC) cada um marcado com fluoresceína e um

dos quatro diferentes corantes Rhodamine (Rhodamine 110, Rhodamine-6-G,

Tetrametil Rhodamine e Rhodamine X), e DNA polimerase Thermo Sequenase™ II

(Amershan Pharmacia Biotech).

As condições de reação usadas foram: 95 °C por 20 segundos; 50 °C por

15 segundos e 60 °C por 60 segundos, durante 30 ciclos.

Após o término da reação foi adicionado 2 µL do tampão acetato de amônio

7,5 M em cada tubo. O DNA foi precipitado com a adição de 55 µl de etanol absoluto.

Os tubos foram centrifugados e o sobrenadante descartado. Os sedimentos de DNA

foram lavados com etanol 70 % e os tubos centrifugados novamente. O sobrenadante foi

desprezado e o sedimento seco.

Ressuspensão das amostras e eletroforese.

Os sedimentos foram ressuspendidos em solução de carregamento do Kit ET-

terminator (Amershan Pharmacia Biotech) e injetadas no aparelho seqüenciador

MegaBACE™ (Amershan Pharmacia Biotech) de acordo com o protocolo do fabricante

do equipamento.

Análise das seqüências.

As seqüências nucleotídicas obtidas por seqüenciamento foram analisadas no

software Phred e no pacote Staden (STADEN et al., 2003), e comparadas com o banco

de dados GenBank utilizando a ferramenta BlastN (ZHANG & MADEN, 1997).

CONSTRUÇÃO DO VETOR pOSTM.

A amplificação da seqüência nucleotídica correspondente à origem de replicação

do M. hyopneumoniae foi realizada a partir do DNA cromossomal de M.hyopneumoniae

linhagem 7448 com os oligonucleotídeos específicos MH_ORI- UP e MH_ORI-DO. O

produto da amplificação compreende um fragmento de 1700 pb que possui o gene dnaA

e regiões adjacentes. Este fragmento foi clonado no vetor pUC18 digerido com a enzima

SmaI gerando o vetor pOM.

A amplificação da região promotora do gene que codifica para espiralina de

Spiroplasma faecalis foi realizada a partir do plasmídio pSRT1 com os iniciadores

específicos SPIR/PstI-UP e SPIR/SalI-DO. A amplificação gerou sítios de restrição das

enzimas PstI e SalI nas extremidadee 5’ e 3’, respectivamente. O fragmento de 342 pb

foi clonado no vetor pUC18 digerido com a enzima SmaI gerando o plasmídio pSP.

Este plasmídio foi clivado com as enzimas de restrição PstI e SalI. O fragmento isolado

foi subclonado no vetor pOM, nos sítios PstI e SalI , originando o plasmídio pOSM.

O gene de resistência à tetraciclina foi amplificado a partir do plasmídio

pAM120 com os iniciadores TETM/SalI-UP e TETM/Bam-DO gerando um produto de

amplificação com sítio de SalI na extremidade 5’ e BamHI na extremidade 3’, o qual foi

ligado no sítio SmaI do vetor pUC18 (pTE). Um fragmento SalI/BamHI de 1917 pb

correspondente a seqüência nucleotídica do gene tetM foi subclonado no plasmídio

pOM2, digerido com as mesma enzimas, originando o plasmídio replicativo pOSTM.

O plasmídio replicativo construído (pOSTM), o qual possui um cassete de DNA

que confere resistência à tetraciclina e origem de replicação de M. hyopneumoniae, foi

utilizado para transformar M. hyopneumoniae linhagem 7448.

APÊNDICE B – Eletroforese de produtos de PCR

Figura 1 – Eletroforese de produtos de PCR obtidos por amplificação com iniciadores

SPIR/PstI-UP e SPIR/SalI-DO para detecção da presença de pOSMT em clones de

M. hyopneumoniae resistentes à tetraciclina (linhas 1, 2 e 3). Linha 4 - Controle

negativo; M -Marcador molecular. Gel de agarose 1,2 % corado com brometo de etídeo

e visualizado sob luz ultravioleta.

1 2 3 4

1444 bp

458

754

1 2 3 4 M

1444 bp

458

754

1 2 3 4

1444 bp

458

754

1 2 3 4 M

1444 bp

458

754

342 bp

APÊNDICE C – Seqüências nucleotídica e de aminoácidos do gene tetM

VIRTUAL RIBOSOME

----------------

Translation table: Mold Mitochondrial; Protozoan Mitochondrial; Coelenterate SGC3

>pOSTM_errado (411bp - 2678bp, direct) 2268bp_rframe3_ORF

Reading frame: 3

5' CTGCAGCAGAATTAAAAGTTAGTGAACAAGAAAACAGTGAAGCACCAGTTTCTGAACCAAAAGAAGACGAAAAAACAAAAAAAGATTAAG 90

5' CAATTTATTTGGAAAATCTTTTTTTGTTTTTTTAAGAAATATTTATTGTTTTTTTTAAAAAATTATGTACAATTGCTACTATAAGGGAAA 180

-35

5' GAAAAAAAGAAAGATATAAATTGTATAAAGTAGGGTTAGAAGCAATTAATAATTATTATTAATGTTATTTTTCTCTTATATATTCAATGT 270

-10 M H L L L I K T L L N R E R K Y K K W S R L K I I N I

5' AATTTTAATTACATTTGCTTTTAATAAAAACACTACTTAATAGAGAAAGGAAATATAAGAAATGAAGTCGACTGAAAATTATTAATATTG 360

ATG

G V L A H V D A G K T T L T E S L L Y N S G A I T E L G S V

5' GAGTTTTAGCTCATGTTGATGCAGGAAAAACTACCTTAACAGAAAGCTTATTATATAACAGTGGAGCGATTACAGAATTAGGAAGCGTG

G 450

D K G T T R T D N T L L E R Q R G I T I Q T G I T S F Q W E

5' ACAAAGGTACAACGAGGACGGATAATACGCTTTTAGAACGTCAGAGAGGAATTACAATTCAGACAGGAATAACCTCTTTTCAGTGGGAAA 540

N T K V N I I D T P G H M D F L A E V Y R S L S V L D G A I

5' ATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACATATGGATTTCTTAGCAGAAGTATATCGTTCATTATCAGTTTTAGATGGGGCAATTC 630

L L I S A K D G V Q A Q T R I L F H A L R K M G I P T I F F

5' TACTGATTTCTGCAAAAGATGGCGTACAAGCACAAACTCGTATATTATTTCATGCACTTAGGAAAATGGGGATTCCCACAATCTTTTTTA 720

I N K I D Q N G I D L S T V Y Q D I K E K L S A E I V I K Q

5' TCAATAAGATTGACCAAAATGGAATTGATTTATCAACGGTTTATCAGGATATTAAAGAGAAACTTTCTGCCGAAATTGTAATCAAACAGA 810

K V E L Y P N V C V T N F T E S E Q W D T V I E G N D D L L

5' AGGTAGAACTGTATCCTAATGTGTGTGTGACGAACTTTACCGAATCTGAACAATGGGATACGGTAATAGAGGGAAACGATGACCTTTTAG 900

E K Y M S G K S L E A L E L E Q E E S I R F Q N C S L F P L

5' AGAAATATATGTCCGGTAAATCATTAGAAGCATTGGAACTCGAACAAGAGGAAAGCATAAGATTTCAGAATTGTTCTCTGTTCCCTCTTT 990

Y H G S A K S N I G I D N L I E V I T N K F Y S S T H R G P

5' ATCATGGAAGTGCAAAAAGTAATATAGGGATTGATAACCTTATAGAAGTTATTACTAATAAATTTTATTCATCAACACATCGAGGTCCGT 1080

S E L C G N V F K I E Y T K K R Q R L A Y I R L Y S G V L H

5' CTGAACTTTGCGGAAATGTTTTCAAAATTGAATATACAAAAAAAAGACAACGTCTTGCATATATACGCCTTTATAGTGGAGTACTACATT 1170

L R D S V R V S E K E K I K V T E M Y T S I N G E L C K I D

5' TACGAGATTCGGTTAGAGTATCAGAAAAAGAAAAAATAAAAGTTACAGAAATGTATACTTCAATAAATGGTGAATTATGTAAGATTGATA 1260

R A Y S G E I V I L Q N E F L K L N S V L G D T K L L P Q R

5' GAGCTTATTCTGGAGAAATTGTTATTTTGCAAAATGAGTTTTTGAAGTTAAATAGTGTTCTTGGAGATACAAAACTATTGCCACAGAGAA 1350

K K I E N P H P L L Q T T V E P S K P E Q R E M L L D A L L

5' AAAAGATTGAAAATCCGCACCCTCTACTACAAACAACTGTTGAACCGAGTAAACCTGAACAGAGAGAAATGTTGCTTGATGCCCTTTTGG 1440

E I S D S D P L L R Y Y V D S T T H E I I L S F L G K V Q M

5' AAATCTCAGATAGTGATCCGCTTCTACGATATTACGTGGATTCTACGACACATGAAATTATACTTTCTTTCTTAGGGAAAGTACAAATGG 1530

E V I S A L L Q E K Y H V E I E L K E P T V I Y M E R P L K

5' AAGTGATTAGTGCACTGTTGCAAGAAAAGTATCATGTGGAGATAGAACTAAAAGAGCCTACAGTCATTTATATGGAGAGACCGTTAAAAA 1620

N A E Y T I H I E V P P N P F W A S I G L S V S P L P L G S

5' ATGCAGAATATACCATTCACATCGAAGTGCCGCCAAATCCTTTCTGGGCTTCCATTGGTTTATCTGTATCACCGCTTCCGTTGGGAAGTG 1710

G M Q Y E S S V S L G Y L N Q S F Q N A V M E G I R Y G C E

5' GAATGCAGTATGAGAGCTCGGTTTCTCTTGGATACTTAAATCAATCATTTCAAAATGCAGTTATGGAAGGGATACGCTATGGTTGTGAAC 1800

Q G L Y G W N V T D C K I C F K Y G L Y Y S P V S T P A D F

5' AAGGATTGTATGGTTGGAATGTGACGGACTGTAAAATCTGTTTTAAGTATGGCTTATACTATAGCCCTGTTAGTACCCCAGCAGATTTTC 1890

R M L A P I V L E Q V L K K A G T E L L E P Y L S F K I Y A

5' GGATGCTTGCTCCTATTGTATTGGAACAAGTCTTAAAAAAAGCTGGAACAGAATTGTTAGAGCCATATCTTAGTTTTAAAATTTATGCGC 1980

P Q E Y L S R A Y N D A P K Y C A N I V D T Q L K N N E V I

5' CACAGGAATATCTTTCACGAGCATACAACGATGCTCCTAAATATTGTGCGAACATCGTAGACACTCAATTGAAAAATAATGAGGTCATTC 2070

L S G E I P A R C I Q E Y R S D L T F F T N G R S V C L T E

5' TTAGTGGAGAAATCCCTGCTCGGTGTATTCAAGAATATCGTAGTGATTTAACTTTCTTTACAAATGGACGTAGTGTTTGTTTAACAGAGT 2160

L K G Y H V T T G E P V C Q P R R P N S R I D K V R Y M F N

5' TAAAAGGGTACCATGTTACTACCGGTGAACCTGTTTGCCAGCCCCGTCGTCCAAATAGTCGGATAGATAAAGTACGATATATGTTCAATA 2250

K I T

5' AAATAACTTAGGGATCCC 2268

LEGENDA:

Negrito e sublinhado : Códons de iniciação alternativos

Caixa preta : Regiões -35 e -10

Caixa : Seqüência RBS

ATG : Códon de iniciação da tradução de tetM

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