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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DOENÇAS INFECCIOSAS
Marcela Segatto do Carmo
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE ISOLADOS DE
Leishmania (Leishmania) chagasi PROVENIENTES DE DIFERENTES
REGIÕES GEOGRÁFICAS DO BRASIL
Vitória
2007
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Marcela Segatto do Carmo
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE ISOLADOS DE
Leishmania (Leishmania) chagasi PROVENIENTES DE DIFERENTES
REGIÕES GEOGRÁFICAS DO BRASIL
Vitória
2007
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Doenças Infecciosas do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito
Santo, como requisito parcial para a obtenção do Grau
de Mestre em Doenças Infecciosas.
Orientadora: Profª. Drª. Elenice Moreira Lemos
Co-orientadora: Profª. Drª. Cristiana Ferreira A. de Brito
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Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Carmo, Marcela Segatto do, 1982-
C287e Estudo da variabilidade genética de isolados de Leishmania
(Leishmania) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas do
Brasil / Marcela Segatto do Carmo. – 2007.
124 f. : il.
Orientadora: Elenice Moreira Lemos.
Co-Orientadora: Cristiana Ferreira Alves de Brito.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Espírito Santo,
Centro de Ciências da Saúde.
1. Leishmania - Brasil. 2. Reação em cadeia de polimerase. 3.
Variabilidade genética. I. Lemos, Elenice Moreira. II. Brito, Cristiana
Ferreira Alves de. III. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de
Ciências da Saúde. IV. Título.
CDU: 61
À minha família, que sempre esteve ao meu
lado, me apoiando em todas as decisões e
vibrando comigo a cada realização.
AGRADECIMENTOS
Deus não prometeu dias sem dor, risos sem sofrimentos, sol sem chuva. Ele
prometeu força para o dia, conforto para as lágrimas e luz para o caminho. Obrigada,
Senhor, pela minha saúde e disposição e, por ter me presenteado com uma família e
amigos tão maravilhosos.
À Profª. Drª. Elenice Moreira Lemos pela orientação neste trabalho. Admiro você
como pesquisadora e professora, por ser extremamente dedicada. Sua sabedoria,
disciplina, organização e seu entusiasmo vêm contribuindo imensamente para a
minha formação, desde a época da graduação. Obrigada por ter acreditado em mim.
À Profª. Drª.Cristiana Ferreira Alves de Brito, agradeço a co-orientação neste estudo.
Suas considerações foram imprescindíveis, desde o momento de escolha das
metodologias, à revisão final do trabalho escrito. Obrigada pelos ensinamentos de
Biologia Molecular e por me tranqüilizar, com sua serenidade, cada vez que fui a BH.
Ao Prof. Dr. Reynaldo Dietze, coordenador do NDI, grande incentivador da pesquisa.
Obrigada pelas oportunidades de aprendizado que você me proporcionou e por
sempre dizer sim ao Laboratório de Leishmanioses.
Aos nossos colaboradores: Dra. Márcia Rosa de Oliveira (Universidade Federal da
Paraíba), Dra. Maria do Socorro Pires e Cruz (Instituto de Doenças Tropicais Natan
Portela - Piauí) e Dr. Sílvio Fernando Guimarães Carvalho (Universidade estadual de
Montes Claros). Muito Obrigada por terem concedido alguns dos isolados utilizados
neste estudo.
Agradeço, especialmente, ao aluno de iniciação científica do Laboratório de
Leishmanioses, Lucas Secchim Ribeiro. Serei eternamente grata por sua ajuda
durante todas as etapas deste trabalho. Com certeza, aprendemos muito ao longo
dessa caminhada.
Ao Antônio, mestrando do LAMAL - Centro de Pesquisas René Rachou/Fiocruz/MG,
pela disponibilidade, paciência e ajuda com a análise dos microssatélites.
Aos amigos do Lab Leish: Aretha, Bruna, Marco André e Priscila, pela convivência
harmônica. Os seminários, lanchinhos e o carinho de vocês nunca serão
esquecidos. Desculpem meus momentos de stress nos últimos meses.
Aos que já fizeram parte do Lab Leish: Bianca, Fábio e Jauber. Fábio, sua alegria de
viver é contagiante. Bianca e Jauber, obrigada pela sincera amizade há tantos anos
e por terem me ensinado, com muita paciência, a rotina do laboratório.
Às amigas da TB: Fabíola, Renata e Tatiana, que me ensinaram a vivência
laboratorial quando fui estagiária da tuberculose. Vocês foram maravilhosas durante
todo esse tempo comigo. Bio, obrigada por me ajudar nos primeiros passos da saga
de géis e PCRs. Rê, obrigada pela motivação diária, você me ajudou a tomar fôlego
nos momentos de cansaço. Tati, obrigada pelo carinho que sempre teve comigo.
Admiro muito vocês.
Às amigas Carlinha, Valéria e Eneida pela amizade, pelo consolo, conselhos e
experiências compartilhadas. Agradeço a disponibilidade que vocês tiveram de ouvir
os meus desabafos. Depois acertamos as contas das terapias e das caronas, ok?
Às amigas viróticas: Christiane, Débora, Ketene e Luciana, pela amizade e apoio.
Foi muito produtiva a nossa troca de experiências sobre o mundo da PCR.
À minha família, por ser a melhor deste mundo. Mãe, obrigada por me deixar à
vontade para fazer minhas escolhas e por me apoiar desde sempre. Felipe e
Renata, obrigada pela paciência e carinho de vocês. À Vovó Euza, pela sua
presença entre nós, você é formidável. Amo todos vocês.
Ao meu bem, Alessandro, por me deixar fazer da sua casa meu escritório durante a
escrita desta dissertação. Seu amor me conforta e sua presença me alegra.
Obrigada por fazer parte da minha vida.
A todos os colegas do NDI, agradeço a descontração dos papos na cozinha que
sempre me ajudavam a relaxar.
“A mente humana, uma vez ampliada por uma nova
idéia, nunca mais volta ao seu tamanho original.”
Oliver Wendell Holmes
RESUMO
Devido à grande importância clínica da leishmaniose visceral (LV) no Brasil e à falta
de conhecimento acerca das características genéticas de seu agente etiológico, a
proposta deste trabalho foi avaliar a variabilidade genética de isolados de L. (L.)
chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas do Brasil. Inicialmente, todos
os isolados estudados foram identificados por PCR-RFLP, como L. (L.) chagasi. A
diversidade genética entre esses parasitos foi avaliada utilizando 3 métodos
moleculares: RAPD, SSR-PCR e MLMT. Os resultados de RAPD e SSR-PCR
apresentaram perfis complexos, permitindo a análise de 181 bandas. Apesar de
pequenas diferenças, a topologia geral das árvores obtidas com os dados de ambas
as técnicas foram muito semelhantes, demonstrando a existência de maior
similaridade genética entre isolados de populações, geograficamente, vizinhas.
Embora tenha sido observada uma distribuição dos isolados de acordo com sua
origem geográfica, a distância genética entre os mesmos revelou uma baixa
variabilidade intra-específica. Nos resultados de MLMT 16, dos 54 isolados de L. (L.)
chagasi, apresentaram variantes alélicos, a combinação dessas variantes resultou
em 8 genótipos diferentes. Não foi possível, com a utilização dessa técnica,
correlacionar a presença de genótipo à determinada região geográfica, exceto para
os isolados do Espírito Santo. A taxa de heterozigose estimada a partir dos
resultados da SSR-PCR e os diferentes genótipos gerados pela MLMT sugeriram
uma maior variabilidade entre os isolados caninos, apesar do pequeno número de
amostras. Ainda assim, os perfis genéticos obtidos entre isolados caninos e
humanos foram muito semelhantes. Em resumo, os resultados mostraram-se
bastante promissores. Entretanto, estudos adicionais para avaliar um maior número
de regiões geográficas, e de isolados por região, são necessários para a
compreensão do papel dos hospedeiros, reservatórios e vetores na geração e
manutenção da diversidade genética. Além disso, esses estudos permitiriam avaliar
a existência de correlação entre a variabilidade intra-específica e resistência às
drogas ou diferentes manifestações clínicas da LV.
Palavras-chave: L. (L.) chagasi. Variabilidade genética. RAPD. SSR-PCR. MLMT.
ABSTRACT
Considering the clinical importance of visceral leishmanisis (VL) in Brazil and the lack
of information about the genetic characteristics of its etiological agent, the aim of this
work was to evaluate the genetic variability of L. (L.) chagasi isolates from different
areas in Brazil. Initially, all isolates were identified by PCR-RFLP as L. (L.) chagasi.
In order to study genetic diversity within these parasites 3 molecular methods were
employed, RAPD, SSR-PCR and MLMT. RAPD and SSR-PCR results showed
complex profiles, allowing analyses of 181 bands. Even with minor differences, the
general topology of the trees obtained for both techniques was quite similar,
revealing the existence of greater genetic similarity within isolates from closely
situated geographic areas. Although we observed distribution of isolates according to
its geographical origin, genetic distance between them shows low levels of intra-
specific variation. In our MLMT results, 16 of 54 L. (L.) chagasi isolates presented
allelic variants, whose combination results in 8 different genotypes. We did not detect
correlation between the microsatellite patterns and geographic origin, except for
Espirito Santo isolates. The frequency of heterozygosity estimated by SSR-PCR and
distinct genotypes generated by MLMT have suggested higher genetic variability
among canine isolates. Even thus, genetic profiles obtained within dog and human
isolates were strongly related. In summary, our results showed to be sufficiently
promising. However, further work should be done, including other geographic areas
and a higher number of isolates, in order to better undestand the hosts, reservoirs
and vectors roles in the generation and maintenance of genetic diversity. Moreover, it
would be possible to evaluate the existence of a correlation between intra-specific
variability and drug resistance or different clinical manifestations of VL.
Keywords: L. (L.) chagasi. Genetic variability. RAPD. SSR-PCR. MLMT.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação taxonômica do agente etiológico da leishmaniose visceral
americana: Leishmania (Leishmania) chagasi...........................................................
23
Tabela 2 – Código e procedência dos isolados estudados.......................................
36
Tabela 3 – Iniciadores utilizados no estudo da variabilidade dos isolados de L. (L.)
chagasi.......................................................................................................................
41
Tabela 4 – Número de bandas avaliadas e taxa de heterozigose estimada obtidas
pela análise dos perfis de RAPD dos isolados de L. (L.) chagasi de diferentes
regiões geográficas....................................................................................................
68
Tabela 5 – Número de bandas avaliadas e taxa de heterozigose estimada obtidas
pela análise dos perfis de SSR-PCR dos isolados de L. (L.) chagasi de diferentes
regiões geográficas...................................................................................................
74
Tabela 6 – Característica dos marcadores de microssatélites testados...................
75
Tabela 7 – Descrição dos genótipos identificados nos isolados de L. (L.) chagasi
através da combinação dos diferentes alelos observados nos loci de
microssatélites............................................................................................................
84
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo evolutivo das espécies de Leishmania causadoras de LV................ 26
Figura 2 – Mapa do Brasil. Em destaque as regiões e cidades selecionadas para o
estudo...........................................................................................................................
35
Figura 3 – Produtos de amplificação da região conservada do minicírculo de kDNA
de Leishmania isolada de diferentes regiões geográficas: Espírito Santo (ES) e
Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A); Minas Gerais (MG) (B); Piauí (PI) e
Maranhão (MA) (C). Cepas de referência: La - L. (L.) amazonensis
(MHOM/BR/73/M2269), Lb - L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) e Lc - L. (L.)
chagasi (MHOM/BR/74/PP75). PM: padrão de peso molecular de 100 pb
(Promega®)..................................................................................................................
46
Figura 4 – Fragmentos de restrição gerados, após digestão, pela enzima Hae III
dos produtos obtidos na PCR específica da região conservada do minicírculo de
kDNA de Leishmania. Isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos;
C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do
Maranhão (MA) (C). Cepas de referência: La - L. (L.) amazonensis
(MHOM/BR/73/M2269), Lb - L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) e Lc - L. (L.)
chagasi (MHOM/BR/74/PP75). PM: padrão de peso molecular de 50 pb
(Promega®)..................................................................................................................
47
Figura 5 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador A1 a partir dos isolados de L.
(L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de
L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba
(PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb
(Promega®). As setas indicam exemplos de bandas polimórficas..............................
49
Figura 6 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador B4 a partir dos isolados de L.
(L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de
L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba
(PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb
(Promega®). As setas indicam exemplos de bandas polimórficas..............................
50
Figura 7 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador B10 a partir dos isolados de L.
(L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de
L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba
(PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb
(Promega®). As setas indicam exemplos de bandas polimórficas..............................
51
Figura 8 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador F10 a partir dos isolados de L.
(L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de
L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba
(PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb
(Promega®). As setas indicam exemplos de bandas polimórficas..............................
52
Figura 9 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador R15 a partir dos isolados de L.
(L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de
L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba
(PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb
(Promega®). As setas indicam exemplos de bandas polimórficas..............................
53
Figura 10 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador A1, baseada na distância genética dos
isolados agrupados por região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando
UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.............
55
Figura 11 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador B4, baseada na distância genética dos
isolados agrupados por região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando
UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.............
55
Figura 12 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador B10, baseada na distância genética dos
isolados agrupados por região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando
UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.............
56
Figura 13 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador F10, baseada na distância genética dos
isolados agrupados por região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando
UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.............
56
Figura 14 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador R15, baseada na distância genética dos
isolados agrupados por região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando
UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.............
57
Figura 15 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados com o iniciador A1 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi,
baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura............................
59
Figura 16 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados com o iniciador B4 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi,
baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura............................
60
Figura 17 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados com o iniciador B10 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi,
baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura............................
61
Figura 18 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados com o iniciador F10 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi,
baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura............................
62
Figura 19 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados com o iniciador R15 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi,
baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura............................
63
Figura 20 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C)
provenientes da Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador A1, baseada na distância genética calculada
conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50%
estão indicados na figura.............................................................................................
65
Figura 21 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C)
provenientes da Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador B4, baseada na distância genética calculada
conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50%
estão indicados na figura.............................................................................................
65
Figura 22 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C)
provenientes da Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador B10, baseada na distância genética calculada
conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50%
estão indicados na figura.............................................................................................
66
Figura 23 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C)
provenientes da Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador F10, baseada na distância genética calculada
conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50%
estão indicados na figura.............................................................................................
66
Figura 24 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C)
provenientes da Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador R15, baseada na distância genética calculada
conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50%
estão indicados na figura.............................................................................................
67
Figura 25 – Perfis de SSR-PCR obtidos com o iniciador (CA)
8
RY a partir dos
isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc -
cepa referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo
(ES) e da Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG)
(B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular
de 100 pb (Promega®). As setas exemplificam bandas polimórficas..........................
70
Figura 26 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador (CA)
8
RY, baseada na distância genética dos
isolados agrupados por região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando
UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.............
72
Figura 27 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados com o iniciador (CA)
8
RY para os 54 isolados de L. (L.)
chagasi, baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de
UPGMA. Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.............
73
Figura 28 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C)
provenientes da Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de
amplificação gerados pelo iniciador (CA)
8
RY, baseada na distância genética
calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura................................................................
74
Figura 29 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Li22-35
a partir dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões
geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados
do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de
Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão
de peso molecular de 25 pb (Promega®)....................................................................
77
Figura 30 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Li23-41
a partir dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões
geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados
do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de
Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão
de peso molecular de 25 pb (Promega®)....................................................................
78
Figura 31 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Li45-24
a partir dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões
geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados
do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de
Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão
de peso molecularde 25 pb (Promega®)....................................................................
79
Figura 32 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Li71-33
a partir dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões
geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados
do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de
Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão
de peso molecular de 25 pb (Promega®)....................................................................
80
Figura 33 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Lm2TG
a partir dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões
geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados
do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de
Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão
de peso molecular de 25 pb (Promega®)....................................................................
81
Figura 34 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Lm4TA
a partir dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões
geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados
do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de
Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão
de peso molecular de 25 pb (Promega®)....................................................................
82
Figura 35 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador TubCA a
partir dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões
geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados
do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de
Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão
de peso molecular de 25 pb (Promega®)....................................................................
83
Figura 36 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para os marcadores
TubCA e Li71-33 a partir dos isolados ES05, PI01, MG15 e PI09 analisados em gel
de agarose 2%. PM: padrão de peso molecular de 25 pb (Promega®)......................
84
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC - American Type Culture Collection – Coleção Americana de Tipos de
Culturas
°C - Graus Celsius
CN - Controle Negativo
cpb - Cisteína protease b
DNA - Deoxyribonucleic acid – ácido desoxirribonucléico
dNTPs - Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid –Ácido etilenodiamino tetracético
ES - Estado do Espírito Santo
x g - Multiplicado pela força da gravidade
gp63 - Glicoproteína 63
HIV - Human Immunodeficiency Virus – Vírus da imunodeficiência humana
ITS - Internal Transcribed Sequence – Seqüência Interna Transcrita
kb - Kilobases (10
3
bases)
kDNA - kinetoplast DNA – DNA do cinetoplasto
Lc - Cepa de referência para Leishmania (Leishmania) chagasi
LIT - Liver Infusion Tryptose – Infusão de fígado e triptose
LV - Leishmaniose visceral
MA - Estado do Maranhão
Mb - Megabases (10
6
bases)
MG Estado de Minas Gerais
MLEE - Multilocus Enzyme Electrophoresis – Eletroforese de enzimas em múltiplos
loci
MLMT - Multilocus microsatellites typing – tipagem de microssatélites em múltiplos
loci
MON - Montpellier (zimodema)
M2269 - Cepa de referência para Leishmania (Leishmania) amazonensis
M2903 - Cepa de referência para Leishmania (Viannia) braziliensis
MS - Ministério da Saúde
NDI - Núcleo de Doenças Infecciosas
NNN - Meio de cultura sólido Novy-MacNeal-Nicolle
pb - Pares de bases
PB - Estado da Paraíba
PBS - Phosphate Buffered Saline – Solução salina de fosfato tamponada
PCR - Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da olimerase
PCR-RFLP - Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length
Polymorphism – Reação em cadeia da polimerase para análise do polimosfismo
dos fragmentos de restrição
pH - Potencial hidrogeniônico
PI - Estado do Piauí
PM - Padrão de peso molecular
PP75 - Cepa de referência para Leishmania (Leishmania) chagasi
RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA - DNA polimórfico amplificado
aleatoriamente
SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SSR-PCR - Simple Sequences Repetitions-Polymerase Chain Reaction - Reação
em cadeia da polimerase de repetições de seqüências simples
TBE - Tris-Borato-EDTA – Solução de tris, ácido bórico e EDTA
TDR - Tropical Diseases Research (The Special Programme for Research and
Training in Tropical Diseases) – Pesquisa em doenças tropicais
TFPGA - Tools for population genetic analyses
UPGMA - Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages
WHO - World Health Organization – Organização Mundial da Saúde
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 21
1.1. Leishmaniose visceral................................................................................ 21
1.2. Variabilidade genética de Leishmania ....................................................... 27
2. OBJETIVOS..................................................................................................... 33
2.1. Objetivo geral............................................................................................. 33
2.2. Objetivos específicos................................................................................. 33
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 35
3.1. Amostras.................................................................................................... 35
3.2. Cultivo de promastigotas de Leishmania ................................................... 37
3.3. Extração e dosagem de DNA .................................................................... 38
3.4. PCR-RFLP................................................................................................. 39
3.5. Análise da variabilidade genética entre os isolados .................................. 40
3.5.1. RAPD .................................................................................................. 40
3.5.2. SSR-PCR ............................................................................................ 40
3.5.3. MLMT.................................................................................................. 41
3.6. Eletroforese em gel de poliacrilamida........................................................ 42
3.7. Análise dos dados obtidos por RAPD e SSR-PCR.................................... 43
3.8. Análise dos dados obtidos por MLMT........................................................ 43
3.9. Aspectos éticos da pesquisa ..................................................................... 43
4. RESULTADOS................................................................................................. 45
4.1. Identificação das espécies de Leishmania................................................. 45
4.2. Análise da variabilidade genética utilizando RAPD ................................... 48
4.3. Análise da variabilidade genética utilizando SSR-PCR ............................. 69
4.4. Análise da variabilidade genética utilizando MLMT ................................... 75
5. DISCUSSÃO .................................................................................................... 86
6. CONCLUSÕES ................................................................................................ 93
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 95
8. ANEXOS ........................................................................................................ 106
ANEXO A. Géis originais de RAPD ................................................................ 106
ANEXO B. Géis originais de SSR-PCR .......................................................... 111
ANEXO C. Freqüência de bandas e taxa de heterozigose............................. 112
ANEXO D. Géis originais de MLMT................................................................ 118
Introdução
20
Introdução
Introdução
21
1 INTRODUÇÃO
1.1 Leishmaniose visceral
A Leishmaniose visceral (LV) ou calazar é considerada pela Organização Mundial de
Saúde uma das seis endemias mais preocupantes do mundo, devido sua alta
incidência e letalidade (WHO, 1990). A LV é uma doença sistêmica causada por
protozoários do complexo Leishmania donovani, que inclui quatro espécies de
parasitos: Leishmania (Leishmania) donovani Laveran & Mesnil, 1903, Leishmania
(L.) infantum Nicolle, 1908, Leishmania (L.) chagasi Cunha & Chagas, 1937 e
Leishmania (L.) archibaldi Castellani & Chalmers, 1919. A L. (L.) donovani é
endêmica no subcontinente Indiano, China, Sudão, Etiópia e Quênia; a espécie L.
(L.) infantum distribui-se da região Mediterrânea ao Irã, China, Sudão e Etiópia; a
espécie L. (L.) archibaldi tem sido encontrada, apenas, no continente africano:
Sudão e Etiópia; já a L. (L.) chagasi é encontrada, exclusivamente, nas Américas
Central e do Sul (KUHLS et al., 2007).
Em 2007, Lukes et al., propuseram uma nova taxonomia, em que L. (L.) donovani e
L. (L.) infantum são as únicas espécies reconhecidas como pertencentes ao
complexo Leishmania donovani, uma vez que esses autores consideram a espécie
L. (L.) chagasi sinonímia de L. (L.) infantum e L. (L.) archibaldi sinonímia de L. (L.)
donovani.
A LV é responsável por, aproximadamente, meio milhão de casos novos e 59.000
óbitos a cada ano (WHO, 2002). Estima-se que 350 milhões de pessoas estejam sob
risco de adquirir a infecção. A doença é autóctone em 65 países, onde a maioria dos
casos (90%) ocorre em áreas rurais e áreas suburbanas de cinco países:
Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão e Brasil (DESJEUX, 2004).
Nas Américas, 90% dos casos de LV humana registrados ocorrem no Brasil,
atingindo o nordeste, norte, centro-oeste e sudeste brasileiro. A sua maior incidência
encontra-se na região nordeste onde se concentram 65% dos casos. No Brasil
registra-se, em média, cerca de 3.700 casos de LV por ano. A letalidade está em
torno de 8%, o que corresponde à média de 230 óbitos por ano. No território
Introdução
22
brasileiro, a L. chagasi acomete freqüentemente crianças menores de 10 anos
(54,4%), e 41% dos casos da doença são registrados em menores de 5 anos
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). No Brasil, a LV encontra-se em franca expansão,
e desde a década de 90 vem ocorrendo um aumento significativo do número de
casos (GONTIJO & MELO, 2004).
A doença deixou de ser primariamente silvestre e passou a se estabelecer em áreas
rurais e, também, em regiões urbanas. Esse notável aumento da incidência de casos
observado nas duas últimas décadas deve-se às transformações no meio ambiente
provocadas por desmatamentos, à migração do homem da área rural para as
periferias da cidade em condições precárias de habitação e saneamento, às
distorções na distribuição de renda, à urbanização crescente e às secas periódicas
que culminam na expansão das áreas endêmicas e no aparecimento de novos
focos. A adaptação do vetor, tipicamente silvestre, ao meio urbano, também tem
facilitado a infecção humana. Além desses motivos, podemos destacar fatores
individuais como a imunossupressão devido à co-infecção por HIV e a má nutrição
infantil (DESJEUX, 2004).
Os dados epidemiológicos dos últimos anos revelam a periurbanização e a
urbanização da LV, destacando-se os surtos ocorridos no Rio de Janeiro (RJ), Belo
Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina (PI), Natal
(RN), São Luís (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA) e, mais recentemente, as
epidemias ocorridas nos municípios de Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e
Palmas (TO) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Em 2006 ocorreram 3.593 casos humanos de LV confirmados e notificados no
Sistema de Informação de Agravos de Notificação – SINAN (SINAN, 2007).
Considerando o número de diagnósticos inadequados e a dificuldade de acesso à
saúde das populações rurais e carentes, pode-se sugerir que muitos casos não são
notificados, logo, esse número seria maior. Nesse mesmo ano, apenas duas
unidades federativas não apresentaram notificação de casos de LV: Santa Catarina
e Rio Grande do Sul.
Introdução
23
A posição taxonômica e a origem do agente etiológico da LV no novo mundo tem
sido uma questão polêmica e muito discutida (Tabela 1). Desde que Cunha e
Chagas (1937) descreveram a Leishmania chagasi como uma nova espécie
responsável pela doença nas Américas, a sua origem tem sido objeto de muito
debate e especulação. Alguns autores separam L. (L.) infantum e L. (L.) chagasi em
duas espécies (LAINSON & SHAW, 1987; PALATNIK et al., 1990; ELLIS &
CRAMPTON, 1991; GRAMICCIA et al., 1992). Outros acreditam que esses parasitos
não são tão diferentes e decidiram separá-los em duas subespécies (LAINSON &
RANGEL, 2005). Existem ainda, alguns que acreditam que L. (L.) chagasi e L. (L.)
infantum são sinônimos, e que a primeira foi importada da Europa no período da
colonização portuguesa e espanhola (KILLICK-KENDRICK, 1985; RIOUX et al.,
1990; DANTAS-TORRES, 2006). Entretanto, até o momento, nenhuma dessas
classificações foi, consensualmente, aceita. Neste estudo adotou-se a nomenclatura
L. (L.) chagasi para o agente etiológico da leishmaniose visceral americana.
Tabela 1 - Classificação taxonômica do agente etiológico da leishmaniose visceral
americana: Leishmania (Leishmania) chagasi.
Reino
Sub-reino
Filo
Sub-filo
Classe
Ordem
Sub-ordem
Família
Gênero
Subgênero
Espécie
Protista Haeckel, 1866
Protozoa Goldfuss, 1817
Sarcomastigophora Honigberg & Balamuth, 1963
Mastigophora Deising, 1866
Zoomastigophorea Calkins, 1909
Kinetoplastida Honigberg, 1963, emend. Vickerman, 1976
Trypanosomatina Kent, 1880
Trypanosomatidae Dofein, 1901, emend. Grobben 1905
Leishmania Ross, 1903
Leishmania Saf ’yanova, 1982
Leishmania chagasi Cunha & Chagas, 1937
Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006.
Introdução
24
Os parasitos do gênero Leishmania, assim como outros organismos pertencentes à
ordem Kinetoplastida, possuem uma característica em comum: uma organela celular
única, situada à base do flagelo, denominada cinetoplasto. O cinetoplasto é uma
estrutura de DNA circular, extranuclear, constituído por maxicírculos e minicírculos.
Os maxicírculos são moléculas homogêneas de DNA circular que apresentam de 20
a 35 kb de tamanho, conservam as mesmas características do DNA mitocondrial e
podem ser encontrados de 20 a 50 cópias por cinetoplasto.
Os minicírculos, ao contrário, constituem um grupo heterogêneo com tamanhos que
variam de 0,5 a 1,5 kb e estão presentes em torno de 10.000 cópias por cinetoplasto
(BREWSTER et al., 1998). Além disso, os minicírculos possuem uma região
conservada de aproximadamente, 120 pb e uma região variável com cerca de 600
pb. As diferenças no número e nas seqüências dos minicírculos vêm sendo
amplamente exploradas utilizando-se técnicas que visam a identificação e a tipagem
das espécies de Leishmania.
Em 1994 a Organização Mundial de Saúde (WHO/TDR) iniciou um programa para o
mapeamento e seqüenciamento do genoma de 3 organismos pertencentes à ordem
Kinetoplastida: Leishmania, Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi. Hoje, a
organização genômica de 3 espécies de Leishmania está disponível: L. (V.)
braziliensis, L. (L.) major e L. (L.) infantum (IVENS et al., 2005; PEACOCK et al.,
2007). Apesar desses genomas apresentarem um tamanho similar,
aproximadamente 33 Mb, L. (L.) major e L. (L.) infantum, assim como as demais
espécies do velho mundo, possuem 36 cromossomos no genoma haplóide,
enquanto as espécies do novo mundo possuem 35 (complexo L. braziliensis) ou 34
(complexo L. mexicana) (BRITTO et al., 1998).
Dentre os 8.300 genes presentes em cada espécie, L. (L.) braziliensis possui 47
genes que estão ausentes nas outras 2 espécies, sendo essa a mais divergente,
tanto genética quanto biologicamente. L. (L.) infantum possui 27 genes espécie-
específicos e L. (L.) major possui apenas 5 (SMITH et al., 2007).
Embora demonstre uma plasticidade cromossomal (MARTINEZ-CALVILLO et al.,
2005), a incrível conservação revelada por análise comparativa do genoma das três
Introdução
25
espécies sugere que o genoma da Leishmania é altamente estável e não sofreu
importantes rearranjos durante os processos de especiação. Um fator que poderia
contribuir para essa estabilidade é a falta de elementos móveis de DNA como,
originalmente, foi demonstrado no genoma de L. (L.) major e confirmado no genoma
de L. (L.) infantum. No entanto, inesperadamente, elementos transponíveis de DNA
foram encontrados no genoma de L. (V.) braziliensis. (SMITH et al., 2007).
As leishmanias são parasitos heteroxenos e apresentam em seu ciclo de vida duas
formas evolutivas: uma flagelada, denominada promastigota, encontrada no tubo
digestivo do inseto vetor e em culturas acelulares e outra, aflagelada, denominada
amastigota, encontrada nos tecidos dos hospedeiros vertebrados e em cultura de
tecido.
O principal mecanismo de transmissão da L. (L.) chagasi em condições naturais
ocorre através da picada da fêmea do mosquito vetor (flebotomíneo) que, ao realizar
seu repasto sanguíneo, deposita na derme do hospedeiro vertebrado, formas
promastigotas infectantes. As promastigotas, após serem fagocitadas por células do
sistema mononuclear fagocitário, se diferenciam em amastigotas e iniciam o
processo de reprodução assexuada por divisão binária. Quando os macrófagos
estão densamente parasitados, rompem-se liberando as amastigotas que irão
parasitar novos macrófagos. Ao se alimentar em um hospedeiro vertebrado
infectado, o mosquito vetor ingere, com o sangue, macrófagos parasitados que, ao
chegarem no intestino do mosquito, se transformam em promastigotas (Figura 1)
(SACKS & KAMHAWI, 2001).
Introdução
26
Figura 1 - Ciclo evolutivo das espécies de Leishmania causadoras de LV.
Duas espécies de vetor, até o momento, estão relacionadas com a transmissão da
LV no Brasil, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi. A primeira é considerada a
principal espécie transmissora da L. (L.) chagasi e, recentemente, Lu. cruzi foi
incriminada como vetora no Estado do Mato Grosso do Sul (DOS SANTOS et al.,
1998; LAINSON & RANGEL, 2005).
À semelhança do calazar causado pela L. (L.) infantum, o cão é tido como o principal
reservatório da doença. A infecção canina tem precedido a ocorrência de casos em
humanos e tem sido mais prevalente. No ambiente silvestre, os reservatórios são as
raposas (Dusicyon vetulus e Cerdoyon thous) e os marsupiais (Didelphis albiventris)
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Introdução
27
A infecção causada pela L. (L.) chagasi apresenta um espectro clínico amplo que
varia, desde formas completamente assintomáticas, passando por formas clínicas
com sintomatologia discreta ou moderada, até àquelas de apresentação mais grave
(DIETZE & CARVALHO, 2003).
A LV caracteriza-se, clínica e laboratorialmente, por febre, hepatoesplenomegalia,
anemia, pancitopenia e alterações da resposta imune celular. A doença é
geralmente fatal, quando não tratada, e a morte advém de complicações como
infecções bacterianas secundárias e distúrbios da coagulação.
1.2 Variabilidade genética de Leishmania
As diferentes espécies de Leishmania são, morfologicamente, similares e até há
poucos anos a classificação dos parasitos causadores de leishmanioses em
humanos era baseada, apenas, nas características extrínsecas como: características
clínicas e epidemiológicas da doença em humanos e o comportamento dos parasitos
cultivados em laboratório. Contudo, apenas as características extrínsecas não são
suficientes e muitos trabalhos foram desenvolvidos com a finalidade de obter
marcadores taxonômicos sensíveis e estáveis para Leishmania. Esses marcadores
utilizam fatores intrínsecos ao parasito, que não são modificados ou mascarados
pelo hospedeiro ou por fatores ambientais (GRIMALDI et al., 1987; MACEDO et al.,
1992).
O procedimento padrão, universalmente aceito, para caracterização e identificação
de cepas de Leishmania é a análise de isoenzimas (multilocus enzyme
electrophoresis – MLEE) (LANOTTE et al., 1981; WHO, 1990; RIOUX et al., 1990).
Por esse método, as cepas são divididas em grupos com padrões enzimáticos
idênticos, chamados zimodemas. Contudo, a MLEE é realizada apenas em poucos
laboratórios, é dependente do número de enzimas avaliadas, é um método
trabalhoso, demorado e requer isolamento e cultivo do parasito.
Outra desvantagem é que essa técnica, às vezes, apresenta poder discriminatório
insuficiente para destacar a diversidade dos parasitos. Na Europa, por exemplo, a
Introdução
28
maioria das cepas de L. (L.) infantum pertence a um mesmo zimodema (MON-01),
embora elas representem cepas provenientes de diferentes hospedeiros (cães,
humanos imunocompetentes e imunodeficientes), diferentes regiões e ciclos
(antroponótico e zoonótico) (BOTILDE et al., 2006).
O poder discriminatório insuficiente dos métodos de tipagem por isoenzimas impede
que os pesquisadores estabeleçam correlações entre características clínicas,
hospedeiro preferencial e um grupo particular de cepas.
Nesse sentido, vários métodos moleculares têm sido desenvolvidos para aumentar o
poder discriminatório dos métodos que avaliam a diversidade do gênero Leishmania.
Incluem-se aqui a amplificação de seqüências de DNA do parasito tanto por PCR
específica quanto por RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), PCR de
repetições de seqüências simples (SSR-PCR) (OLIVEIRA et al., 1997), PCR-RFLP
dos genes gp63 e cpb (MAURICIO et al., 2001; QUISPE TINTAYA et al., 2004) e
PCR-RFLP do minicírculo do kDNA (MORALES et al., 2001; CHICHARRO et al.,
2002).
A metodologia “Random amplified polymorphic DNA” (RAPD) ou polimorfismo do
DNA amplificado aleatoriamente foi descrita simultaneamente por Willians et al.
(1990) e por Welsh & McClealland (1990). A técnica de RAPD é amplamente aceita
como ferramenta útil para caracterização e avaliação de heterogeneidade genética.
A reação de amplificação utiliza condições de baixa estringência e um iniciador curto
que se liga, de forma arbitrária ao DNA molde (WILLIANS et al., 1990). É uma
técnica rápida e de fácil realização, na qual o conhecimento prévio da seqüência
alvo não é necessário.
Essa metodologia possui a capacidade de detectar variações entre isolados, não
encontradas utilizando-se outros métodos de análise (LEWIN et al., 2002). O
resultado é uma identidade polimórfica, característica para cada isolado, revelada
por fragmentos de DNA amplificado. Os polimorfismos revelados pela RAPD
resultam de mudanças na seqüência DNA que alteram os sítios de ligação dos
iniciadores, diminuindo ou aumentando a distância entre eles. Essas mudanças
Introdução
29
podem alterar o tamanho do fragmento compreendido entre os dois sítios ou,
mesmo, impedir que aquela amplificação ocorra.
A RAPD já foi utilizada para diferenciar gêneros da ordem Kinetoplastida
(TIBAYRENC et al., 1993; MOTAZEDIAN et al., 1996), para identificar diferentes
espécies de Leishmania (MAURICIO et al., 1999; ZEMANOVÁ et al., 2004) e para
estudar variabilidade intraespécie (HIDE et al., 2001; CHICHARRO et al., 2002;
TOLEDO et al., 2002; BOTILDE et al., 2006).
A eficiência da RAPD em detectar variabilidade genética, intraespécie, em estudos
com cepas de Leishmania foi demonstrada por vários autores. Bañuls et al. (1999),
utilizando RAPD, identificaram alto grau de polimorfismo genético entre as cepas de
L. (L.) infantum pertencentes ao zimodema MON-1. Hide et al. (2001), também
utilizando RAPD, destacaram que cepas desse mesmo zimodema parecem ser,
filogenética e geneticamente, heterogêneas.
A “Simple Sequence Repeats PCR” (SSR-PCR) ou PCR de repetições de
seqüências simples, conhecidas como microssatélites, é uma técnica aplicada com
êxito em estudos de polimorfismo intraespecífico de cepas de Trypanosoma cruzi,
Leishmania (L.) amazonensis e Schistosoma mansoni e diversos outros organismos
(OLIVEIRA et al., 1997; CAMPOS et al., 2002; FERREIRA et al., 2004; OLIVEIRA et
al., 2007).
Os microssatélites são formados por pequenas unidades de 1 a 6 pares de bases
que são repetidos em série com uma freqüência de até 60 vezes. Oferecem
diversidade alélica substancial num grande número de loci, estão amplamente
distribuídos no genoma de organismos eucariotos, são herdados de forma
mendeliana e expressam co-dominância (LITT & LUTY, 1989). Sua grande
diversidade pode ser explicada, principalmente, pela derrapagem da DNA
polimerase no momento da replicação, devido às repetições, ocasionando ganho ou
perda de unidades repetitivas e, com isso, alterações de seu tamanho (TACHIDA &
IIZUKA, 1992).
Introdução
30
A amplificação do DNA, utilizando como alvo a região inter-microssatélites, foi
empregada pela primeira vez por Meyer et al. (1993) nos estudos de diferenciação
de cepas de fungos. Uma vez que esse procedimento originava um número
indesejável de bandas, devido a ligações do iniciador em diferentes posições dentro
dos microssatélites, Zietkiewicz et al. (1994) descreveram uma nova metodologia
utilizando um iniciador de repetição (CA)n contendo uma purina-pirimidina ancorados
nas extremidades 3´ ou 5´, reduzindo o número de possíveis alvos de anelamento
dos iniciadores e aumentando a especificidade da reação. Esses autores deram a
esta técnica o nome de SSR-PCR e obtiveram ótimos resultados para diferentes
organismos, utilizando o iniciador 5´-(CA)
8
RY-3´, em condições de alta estringência.
É importante salientar que os padrões gerados nas reações de SSR-PCR são
devidos a variações no tamanho do fragmento, resultantes de inserções e/ou
deleções ocorridas nessa região.
A análise de polimorfismos do tamanho de microssatélites também é uma importante
ferramenta para estudos genéticos e de população de diferentes espécies. A
variação no tamanho dos loci individuais pode ser avaliada após a amplificação com
iniciadores que se anelam, especificamente, a sua região flanqueadora.
Rossi et al. (1994) utilizando a análise de microssatélites para estudos de
polimorfismo genético de Leishmania, descreveram dois marcadores polimórficos
para L. (L.) donovani e L. (L.) infantum. Posteriormente, Russell et al. (1999)
diferenciaram as espécies do subgênero Viannia (exceto L. (V.) naiffi) utilizando três
loci de microssatélites. Entretanto, a análise de um pequeno número de loci não se
mostrou adequada para análises populacionais (RUZZANTE, 1998). Sendo assim,
Jamjoom et al. (2002a) desenharam iniciadores para 13 loci polimórficos de
microssatélites a partir do genoma de L. major. Posteriormente, esse mesmo grupo
identificou 20 loci de microssatélites que apresentam polimorfismo entre as espécies
do complexo Leishmania donovani (JAMJOOM et al., 2002b).
Com intuito de ampliar o conhecimento acerca dos microssatélites de L. (L.)
infantum, Bulle et al. (2002) selecionaram três seqüências ricas em microssatélites
presentes no genoma de L. (L.) infantum (ITS, Lm2 e Lm4) e avaliaram o
polimorfismo entre cepas da região mediterrânea. Esses autores encontraram 22
Introdução
31
genótipos para as 50 cepas estudadas (pertencentes a 6 zimodemas), sendo 15
desses genótipos encontrados para cepas pertencentes ao zimodema MON-1. Esse
estudo demonstrou que os microssatélites exibem alto poder discriminatório entre
cepas de L. (L.) infantum intimamente relacionadas.
Em 2004, essa metodologia ficou conhecida como “Multilocus microsatellites typing”
(MLMT) ou tipagem de microssatélites em múltiplos loci, quando foi utilizada por
Fisher et al. para tipagem de Penicillium marneffei. Desde então, foram descritos
vários marcadores de microssatélites baseados, principalmente, nas seqüências
identificadas por Bulle et al. (2002) para tipagem de cepas do complexo Leishmania
donovani, especialmente para as cepas L. (L.) infantum MON-1 (BOTILDE et al.,
2006; OCHSENREITHER et al., 2006; KUHLS et al., 2007).
A MLMT mostrou-se, em todos os trabalhos, como ferramenta útil para investigações
genéticas de populações, assim como para investigações epidemiológicas. Algumas
vantagens foram apontadas para sua aplicação como, a simplicidade e rapidez na
detecção do polimorfismo de microssatélites por PCR, boa reprodutibilidade e alto
poder discriminatório entre os isolados.
Sabe-se que vários estudos têm relatado heterogeneidade genética do complexo
Leishmania donovani. Contudo, são escassos os que visam avaliar a diversidade
genética intra-específica para L. (L.) chagasi. A identificação das espécies de
Leishmania e a análise da variabilidade genética das cepas são elementos
importantes para diagnóstico, estudos epidemiológicos, estudos taxonômicos,
investigação da estrutura das populações, escolha do tratamento e para o
desenvolvimento de vacinas.
Devido à grande importância clínica da leishmaniose visceral no Brasil e à falta de
conhecimento acerca das características genéticas de seu agente etiológico, a
proposta deste trabalho é avaliar a variabilidade genética de isolados de L. (L.)
chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas do Brasil.
Objetivos
32
Objetivos
Objetivos
33
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a variabilidade genética de isolados de L. (L.) chagasi provenientes de
diferentes regiões geográficas do Brasil.
2.2 Objetivos Específicos
- Identificar a(s) espécie(s) de Leishmania dos isolados.
- Analisar a variabilidade genética dos isolados de L. (L.) chagasi utilizando
diferentes metodologias.
- Determinar as relações filogenéticas entre os isolados.
- Avaliar a distribuição dos genótipos nas diferentes regiões geográficas.
Material e Métodos
34
Material e Métodos
Material e Métodos
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostras
Foram utilizados neste estudo 49 isolados de L. (L.) chagasi de pacientes e 4
isolados de cães portadores de leishmaniose visceral. Dos 49 isolados humanos, 5
foram obtidos de pacientes do Espírito Santo (ES), 7 do Maranhão (MA), 20 de
Minas Gerais (MG), 4 da Paraíba (PB), 13 do Piauí (PI) e as 4 amostras isoladas de
cães são provenientes da Paraíba (Figura 2). Para a identificação das espécies de
Leishmania foram utilizadas três cepas de referência: L. (L.) chagasi
(MHOM/BR/74/PP75), L. (L.) amazonensis (MHOM/BR/73/M2269) e L. (V.)
braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), adquiridas na American Type Culture Collection
(ATCC) (Tabela 2).
Figura 2 – Mapa do Brasil. Em destaque as regiões e cidades selecionadas para o estudo.
Material e Métodos
36
Tabela 2 – Código e procedência dos isolados estudados.
Código Origem Código Origem
MHOM/BR/73/M2269 ATCC MHOM/BR/06/MA01 Paraibano - MA
MHOM/BR/75/M2903 ATCC MHOM/BR/05/MA02 Codó - MA
MHOM/BR/74/PP75 ATCC MHOM/BR/06/MA03 Timon - MA
MHOM/BR/96/ES01 Pancas - ES MHOM/BR/06/MA04 Codó - MA
MHOM/BR/96/ES02 Pancas - ES MHOM/BR/05/MA05 Timon - MA
MHOM/BR/95/ES03 Pancas - ES MHOM/BR/06/MA06 Timon - MA
MHOM/BR/06/ES04 Brejetuba - ES MHOM/BR/06/MA07 Caxias - MA
MHOM/BR/96/ES05 Pancas - ES MHOM/BR/00/PB01 Itabaiana - PB
MHOM/BR/05/MG01 Francisco Sá - MG MHOM/BR/00/PB02 Marcação - PB
MHOM/BR/05/MG02 São Francisco - MG MHOM/BR/00/PB03 João Pessoa - PB
MHOM/BR/05/MG03 Montes Claros - MG MHOM/BR/00/PB04 João Pessoa - PB
MHOM/BR/05/MG04 Montes Claros - MG MCAN/BR/99/C01* João Pessoa - PB
MHOM/BR/05/MG05 Montes Claros - MG MCAN/BR/99/C02* João Pessoa - PB
MHOM/BR/05/MG06 Pirapora - MG MCAN/BR/99/C03* João Pessoa - PB
MHOM/BR/05/MG07 Montes Claros - MG MCAN/BR/99/C04* João Pessoa - PB
MHOM/BR/05/MG08 Montes Claros - MG MHOM/BR/06/PI01 José de Freitas - PI
MHOM/BR/05/MG09 Montes Claros - MG MHOM/BR/06/PI02 Valença do Piauí - PI
MHOM/BR/05/MG10 Porteirinha - MG MHOM/BR/06/PI03 Cabeceiras - PI
MHOM/BR/05/MG11 Montes Claros - MG MHOM/BR/05/PI04 Valença do Piauí - PI
MHOM/BR/05/MG12 Montes Claros - MG MHOM/BR/06/PI05 Valença do Piauí - PI
MHOM/BR/05/MG13 São Francisco - MG MHOM/BR/05/PI06 N
a
Sr
a
. dos Remédios - PI
MHOM/BR/05/MG14 Bocaiúva - MG MHOM/BR/06/PI07 Piripiri - PI
MHOM/BR/05/MG15 Montes Claros - MG MHOM/BR/05/PI08 Altos - PI
MHOM/BR/05/MG16 Bocaiúva - MG MHOM/BR/05/PI09 Nova Santa Rita - PI
MHOM/BR/05/MG17 Porteirinha - MG MHOM/BR/06/PI10 Teresina - PI
MHOM/BR/05/MG18 Montes Claros - MG MHOM/BR/06/PI11 José de Freitas - PI
MHOM/BR/05/MG19 Catuni - MG MHOM/BR/05/PI12 Lima Campos - PI
MHOM/BR/05/MG20 Montes Claros - MG MHOM/BR/06/PI13 Sta Cruz dos Milagres - PI
*Isolados caninos.
Material e Métodos
37
3.2 Cultivo de promastigotas de Leishmania
Os isolados utilizados foram obtidos dos pacientes a partir de punção de medula
óssea e, dos cães, a partir de biópsia de baço. Cerca de duas a três gotas do
material obtido na punção e parte dos fragmentos obtidos das biópsias foram
inoculados no meio líquido Liver Infusion Tryptose (LIT) e mantidos à temperatura de
25 ± 1°C por 24 horas. Após esse período, todo o conteúdo foi transferido para o
meio Novy-MacNeal-Nicolle (NNN). As culturas foram examinadas diariamente e,
após o crescimento dos parasitos, era feito um repique para expansão da cultura em
meio LIT contendo 10% de soro fetal bovino e 2% de urina masculina, até que
atingissem uma concentração de 1 x 10
8
parasitos/mL. Nessa fase, as
promastigotas foram criopreservadas em soro fetal bovino contendo 10% de
dimetilsulfóxido e armazenadas no criobanco do Núcleo de Doenças Infecciosas
(NDI).
Os isolados selecionados para extração de DNA foram descongelados e cultivados
em meio NNN/LIT. As culturas foram incubadas à temperatura de 25 ± 1°C durante
quatro dias, quando então foram transferidas para o meio LIT, e mantidas até atingir
a concentração de 1 x 10
8
parasitos/mL. Uma alíquota de 1 mL dessa cultura foi
lavada duas vezes com tampão fosfato (PBS - 0,01 M Na
2
HPO
3,
0,01 M NaHPO
4,
0,15 M NaCl)
pH 7,2 sob centrifugação por 10 minutos a 1.000 x g, 4°C. A massa de
parasitos obtida após essa lavagem foi utilizada para a extração de DNA.
Material e Métodos
38
3.3 Extração e dosagem de DNA
Para a extração de DNA de promastigotas de Leishmania foi utilizado o kit comercial
WIZARD
TM
Genomic DNA Purification Kit (Promega®), seguindo as instruções do
fabricante com algumas modificações. À massa de parasitos, obtida após lavagem
com PBS, foram adicionados 300 μL da solução de lise celular. Esse conteúdo foi
transferido para um microtubo com capacidade para 1,5 mL, incubado por 10
minutos à temperatura ambiente e centrifugado a 2.000 x g por 1 minuto. Em
seguida, o sobrenadante foi descartado e o sedimento homogeneizado por 15
segundos. Após a homogeneização foram adicionados 100 μL da solução de lise
nuclear e novamente homogeneizado, vigorosamente, por 30 segundos.
Posteriormente, foram acrescentados 100 μL da solução de precipitação de
proteínas e essa mistura foi novamente homogeneizada por 30 segundos. Em
seguida, a mistura foi submetida à centrifugação a 2.000 x g por 3 minutos; o
sobrenadante foi retirado, cuidadosamente, e transferido para um novo microtubo
contendo 300 μL de isopropanol. Essa solução foi misturada delicadamente, por
inversão, até o aparecimento de uma massa visível.
Após centrifugação a 2.000 x g por 1 minuto, o sobrenadante foi descartado e ao
sedimento foram adicionados 300 μL de etanol a 70% (v/v). O microtubo foi invertido
várias vezes, durante 5 minutos, para lavar o DNA e após esse período foi
centrifugado a 2.000 x g por 1 minuto. Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, o etanol
foi aspirado e o tubo permaneceu invertido sobre papel absorvente durante 15
minutos para evaporação completa do álcool.
Para solubilização do DNA, foram acrescentados 100 μL de solução de hidratação.
A mistura foi homogeneizada e incubada durante 24 horas à temperatura ambiente.
Caso essa incubação não fosse suficiente para hidratar o DNA extraído, a mistura
era novamente incubada a 65ºC por 1 hora. A concentração de DNA extraído foi
determinada por dosagem no espectrofotômetro Ultrospec 1000 (Pharmacia®) a
260nm.
Material e Métodos
39
3.4 PCR-RFLP
A identificação das espécies de Leishmania foi realizada de acordo com Andrade et
al. (2006), por meio de uma PCR utilizando os iniciadores 150 [5´-
GGG(G/T)AGGGGCGTTCT(G/C)CGAA-3´] e 152 [5´-(G/C)(G/C)(G/C)
(A/T)CTAT(A/T)TTACACCAACCCC-3´] que amplificam um fragmento de 120 pb da
região conservada do minicírculo do kDNA de Leishmania, seguida de digestão dos
fragmentos amplificados pela enzima de restrição Hae III.
Para cada tubo de reação foi utilizado: 1 ng de DNA molde, 1 U de Taq DNA
polimerase (Invitrogen®), 200 μM de cada desoxirribonucleotídeo trifosfatado
(dNTPs)(Promega®), 10 pmoles de cada iniciador, 1 μL de solução tampão 10X
(Tris-HCl 200 mM - pH 8,4; KCl 500 mM), 1,5 mM de MgCl
2
, em um volume final de
10 μL.
Foram utilizadas as seguintes condições de amplificação: desnaturação inicial a 95
ºC por 5 minutos, seguida de 30 ciclos de 95ºC por 1 minuto, anelamento a 65ºC por
1 minuto, extensão a 72ºC por 1 minuto e extensão final a 72ºC por 5 minutos.
Todas as reações foram realizadas no termociclador Perkin Elmer Cetus.
Para a digestão foram adicionados 5 μl do produto amplificado via PCR específica, 1
U de Hae III (Invitrogen®), 1 μL de solução tampão (50 mM Tris-HCl - pH 7,5; 100
mM KCl; 0,5 mM DTT; 500 μg/mL BSA; glicerol 50% (v/v)), 3 μL de água ultra
pura estéril, compondo um volume final de 10 μL de reação. Essa mistura foi
incubada a 37ºC em banho-maria por 3 horas.
Os fragmentos de DNA gerados foram comparados àqueles obtidos das cepas de
referência, após corrida em gel de poliacrilamida a 10% e coloração com brometo de
etídio.
Material e Métodos
40
3.5 Análise de variabilidade genética entre os isolados
3.5.1 RAPD
A técnica de RAPD foi padronizada conforme descrito por Willians et al. (1990) e
Welsh & MacClealland (1990) e, posteriormente, por Steindel et al. (1993), com
algumas modificações. Cada reação foi composta de 1 ng de DNA molde, 200 μM
de dNTPs (Promega®), 2,5 μL de tampão da Taq 10X (200 mM Tris-HCl – pH 8,4;
500 mM KCl), 2 mM de MgCl
2
, 12,5 pmoles de iniciador, 1 U Taq DNA polimerase
(Invitrogen®) em um volume final de 25 μL. Os iniciadores utilizados nas reações de
RAPD foram: A1, B4, B10, F10, R15, U2, 3303, 3304, 3306 e 3307 (tabela 3).
As amplificações foram realizadas utilizando-se as seguintes condições: uma etapa
de desnaturação inicial de 95ºC por 5 minutos, 2 ciclos de 95ºC por 30 segundos,
30ºC por 2 minutos, 72ºC por 1 minuto, seguidos de 30 ciclos de 95ºC por 30
segundos, 40ºC por 2 minutos, 72ºC por 1 minuto e uma etapa de extensão final a
72ºC por 5 minutos.
3.5.2 SSR-PCR
A reação de SSR-PCR foi realizada conforme descrito por Oliveira et al. (1997), com
algumas modificações. Para obter um volume final de 10 μL de reação foram
adicionados 1 ng de DNA molde, 1 U Taq DNA polimerase (Invitrogen®), 200 μM de
dNTPs (Promega®), 1 μL de tampão da Taq 10X (200 mM Tris-HCl - pH 8,4; 500
mM KCl), 1,5 mM de MgCl
2
, 25 pmoles do iniciador (CA)
8
RY (tabela 3) e 2% de
formamida (v/v).
O termociclador foi programado para fazer a amplificação utilizando as seguintes
condições: desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos, seguida de 26 ciclos de
desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento a 52ºC por 45 segundos e
extensão a 72ºC por 1 minuto. A extensão final foi a 72ºC durante 7 minutos.
Material e Métodos
41
3.5.3 MLMT
A reação de MLMT foi realizada de acordo com Ochsenreither et al. (2006). As
reações foram preparadas para um volume final de 25 μL contendo 200 μM de
dNTPs (Promega®), 1 U Taq DNA polimerase (Invitrogen®), 2,5 μL de tampão da
Taq 10X (200 mM Tris-HCl – pH 8,4; 500 mM KCl),
1,5 mM de MgCl
2
, 10 pmoles de
iniciador e 20 ng de DNA molde. Os iniciadores utilizados foram Li22-35, Lm2TG,
Lm4TA, Li71-33, Li45-24, Li23-41 e TubCA (Tabela 3).
A amplificação ocorreu sob as seguintes condições: uma etapa de desnaturação
inicial de 95ºC por 10 minutos, 35 ciclos de 95ºC por 30 segundos, temperatura de
anelamento de 50ºC para Li71-33, 52ºC para Li22-35 e Li23-41, 53ºC para Lm2TG,
54ºC para Li45-24, 56ºC para Lm4TA e 58ºC para TubCA, por 30 segundos, 72ºC
por 1 minuto e uma etapa final de extensão a 72ºC por 10 minutos.
Em todas as PCRs utilizou-se, como controle negativo (CN), um microtubo contendo
todos os reagentes necessários à amplificação e, no lugar de DNA molde foi
acrescentado o mesmo volume de água ultra pura estéril.
Tabela 3 - Iniciadores utilizados no estudo da variabilidade dos isolados de L. (L.) chagasi.
Iniciador Seqüências (5´- 3´) Referência
A1
a
CAGGCCCTTC
Hide et al., 2001
B4
a
GGACTGGAGT
Hide et al., 2001
B10
a
CTGCTGGGAC
Hide et al., 2001
F10
a
GGAAGCTTGG
Hide et al., 2001
R15
a
GGACAACGAG
Hide et al., 2001
U2
a
CTGAGGTCTC
Hide et al., 2001
3303
b
TCACGATGCA
Dias-Neto et al., 1993a/b
3304
b
GCACTGTCA
Dias-Neto et al., 1993a/b
3306
b
AGCATCTGTT
Dias-Neto et al., 1993a/b
3307
b
AGTGCTACGT
Dias-Neto et al., 1993a/b
(CA)
8
RY
b
CACACACACACACACARY
Zietkiewicsz et al., 1994
Li22-35
a
F- CTTGATGTTCGGGTTAGCAAGT R- ATGCACACCAAAAATCATGTG
Ochsenreither et al., 2006
Lm2TG
a
F- AAAAAGCGAGGAATGAAAGAA R- TCCCTCCCCTCTACAACCTT
Ochsenreither et al., 2006
Lm4TA
a
F- TTTGCCACACACATACACTTAG R- GTAGACGACATCGCGAGCAC
Ochsenreither et al., 2006
Li71-33
a
F- CTCCTTTCACACCGCCTCT R- GAGAGAAGACGAGCCGAAGT
Ochsenreither et al., 2006
Li45-24
a
F- GCGCCTACAGGCATAAAGGA R- CTGGCGCATCAACGGTGT
Ochsenreither et al., 2006
Li23-41
a
F- GATCGGAGGTGACAGCGT R- CCTTTAACTGCCAGTGCG
Ochsenreither et al., 2006
TubCA
a
F- GGCGTGGTTGCTAAACTGAT R- GCCTGCGCACACAGAGAC
Ochsenreither et al., 2006
a
Sintetizado pela IDT – Integrated DNA Technologies.
b
Sintetizado pela GIBCO – São Paulo.
*F – iniciador foward (senso).*R – iniciador reverse (antisenso).
Material e Métodos
42
3.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida
Para visualização dos produtos de amplificação da RAPD e da SSR-PCR, 10 μL de
cada produto e 5 μL obtidos pela PCR específica, foram homogeneizados com 1 μL
de tampão de amostra 6X (0,03% de azul de bromofenol, 0,03% de xilenocianol,
0,4% de orange G, 15% de Ficoll, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 50 mM de EDTA
(pH 8,0)) (Promega®) e submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida 6%, a
100 V por 2 horas em TBE 0,5X (44,5 mM de Tris-base, 44,5 mM de ácido bórico, 1
mM de EDTA).
Para as reações de PCR-RFLP o tempo de corrida foi de 1 hora e 15 minutos. Em
cada corrida foi utilizado um marcador de tamanho molecular de 100 pb
(Promega®). Os géis foram corados com brometo de etídio a uma concentração de
0,5 μg/mL, por 5 minutos e, em seguida, lavados com água por mais 5 minutos. Os
perfis moleculares das amostras foram visualizados e fotografados utilizando o
sistema de foto-documentação Eagle Eye II (Stratagene).
Após a digestão pela Hae III, os produtos obtidos foram submetidos à corrida
eletroforética em géis de poliacrilamida 10%, a 100V durante 45 minutos. Em cada
corrida foi utilizado um marcador de tamanho molecular de 50 pb (Promega®) e as
demais condições permaneceram inalteradas.
A corrida dos produtos das reações de MLMT foi feita em gel de poliacrilamida 15%,
durante 4 horas a 80V. Em cada corrida foi utilizado um marcador de tamanho
molecular de 25 pb (Promega®) e as etapas seguintes foram semelhantes às das
outras técnicas.
Material e Métodos
43
3.7 Análise dos dados obtidos por RAPD e SSR-PCR
Inicialmente, foi realizada uma análise visual dos géis para a seleção dos fragmentos
de DNA a serem analisados. Para isso as imagens dos géis foram alinhadas,
aumentadas de tamanho em 2 vezes e, quando necessário, também foram alterados
brilho e contraste das imagens.
Foram selecionados os fragmentos de melhor resolução no gel e com tamanho entre
0,4 e 1,2 kb, para a montagem da matriz de dados necessária para a construção das
árvores filogenéticas. Essa matriz foi construída para cada iniciador tendo, como
base, a presença ou ausência de cada banda, sem considerar a intensidade das
mesmas.
A medida da distância genética entre os isolados foi calculada utilizando o
coeficiente de Nei (1978) e as árvores filogenéticas foram construídas pelo método
UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages), utilizando o
programa TFPGA (Tools for population genetic analyses) versão 1.3 (MILLER,
1997). Os valores de bootstraps foram calculados após 10
4
replicações de cada
árvore filogenética.
3.8 Análise dos dados obtidos por MLMT
Os perfis genéticos obtidos nas reações de MLMT foram analisados visualmente
para identificação do número de alelos encontrados para cada locus de
microssatélites. Posteriormente, os alelos foram combinados para determinação do
número de genótipos diferentes entre os isolados estudados.
3.9 Aspectos éticos da pesquisa
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa, do Centro de Ciências
da Saúde, Universidade Federal do Espírito Santo, sob o número de registro CEP-
023/07.
Resultados
44
Resultados
Resultados
45
4 RESULTADOS
4.1 Identificação das espécies de Leishmania
A primeira etapa para identificação dos isolados estudados consistiu na realização
da PCR específica para amplificação do minicírculo do kDNA de Leishmania. Os
iniciadores utilizados amplificaram um fragmento de 120 pb para cepas de referência
de L. (V.) braziliensis e L. (L.) chagasi e de 116 pb para cepa L. (L.) amazonensis,
correspondente à região conservada do minicírculo. Todos os isolados submetidos à
reação de PCR apresentaram um fragmento de 120 pb (Figura 3).
Na etapa seguinte, os produtos obtidos na PCR específica foram digeridos pela
enzima de restrição Hae III. Após a digestão, as cepas de referência das diferentes
espécies de Leishmania avaliadas puderam ser, facilmente, identificadas de acordo
com o número e tamanho dos fragmentos obtidos. A enzima Hae III digeriu o produto
de PCR de 120 pb da L. (V.) braziliensis em dois fragmentos, um de 40 e outro de 80
pb, mas não digeriu o produto amplificado de L. (L.) amazonensis. O produto
amplificado de L. (L.) chagasi, após digestão, gerou 4 fragmentos correspondentes a
40, 60, 80 e 120 pb. A Figura 4 mostra que, utilizando a técnica de PCR-RFLP, foi
possível identificar todos os isolados estudados como L. (L.) chagasi, uma vez que
apresentaram o mesmo perfil eletroforético, diferenciando-os das espécies L. (V.)
braziliensis e L. (L.) amazonensis.
Resultados
46
Figura 3 – Produtos de amplificação da região conservada do minicírculo de kDNA de
Leishmania isolada de diferentes regiões geográficas: Espírito Santo (ES) e Paraíba (PB -
humanos; C - caninos) (A); Minas Gerais (MG) (B); Piauí (PI) e Maranhão (MA) (C). Cepas
de referência: La - L. (L.) amazonensis (MHOM/BR/73/M2269), Lb - L. (V.) braziliensis
(MHOM/BR/75/M2903) e Lc - L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75). PM: padrão de peso
molecular de 100 pb (Promega®).
Resultados
47
Figura 4 – Fragmentos de restrição gerados, após digestão, pela enzima Hae III dos
produtos obtidos na PCR específica da região conservada do minicírculo de kDNA de
Leishmania. Isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A).
Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). Cepas
de referência: La - L. (L.) amazonensis (MHOM/BR/73/M2269), Lb - L. (V.) braziliensis
(MHOM/BR/75/M2903) e Lc - L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75). PM: padrão de peso
molecular de 50 pb (Promega®).
Resultados
48
4.2 Análise da variabilidade genética utilizando RAPD
Um dos métodos utilizados com a finalidade de avaliar a variabilidade genética entre
os isolados de L. (L.) chagasi, foi o RAPD. Inicialmente, foram testados 10
iniciadores (A1, B4, B10, F10, R15, U2, 3303, 3304, 3306 e 3307) e utilizou-se um
isolado de cada localidade e as cepas de referência de L. (L.) amazonensis, L. (V.)
braziliensis e L. (L.) chagasi, com o objetivo de padronizar os protocolos de reação e
de identificar os iniciadores capazes de amplificar um maior número de bandas
polimórficas (dados não mostrados). Após a análise dos resultados, cinco iniciadores
foram excluídos: U2, 3303, 3304, 3306 e 3307, devido à falta de reprodutibilidade
das reações e baixa resolução das bandas no gel.
Em seguida, todos os 53 isolados, juntamente com a cepa de referência L. (L.)
chagasi (MHOM/BR/74/PP75) foram submetidos às reações de RAPD e utilizaram-
se os iniciadores selecionados (A1, B4, B10, F10, R15). Apenas o isolado MG03 não
gerou fragmentos após as reações de amplificação quando foram utilizados os
iniciadores A1 e B10 mesmo depois de várias repetições. Os perfis genéticos
resultantes das reações de RAPD, com cada iniciador, foram montados em figuras e
agrupados de acordo com a região geográfica (Figuras 5 a 9). Os géis originais de
cada amplificação se encontram no ANEXO A.
Após a corrida eletroforética dos produtos oriundos da RAPD, foram selecionados
para a análise, os fragmentos de tamanho entre 0,4 e 1,2 kb, que correspondiam
àqueles de melhor resolução nos géis. Cada iniciador apresentou um perfil de
bandas característico. Ao todo foram analisadas 143 bandas, 23 para o iniciador A1,
26 para B4, 30 para B10, 26 para F10 e 38 para R15. Analisando-se as figuras,
pôde-se observar a presença de bandas que são compartilhadas entre os 54
isolados e também bandas que são polimórficas (indicadas por setas nos géis).
Resultados
49
Figura 5 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador A1 a partir dos isolados de L. (L.)
chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.)
chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos;
C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão
(MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb (Promega®). As setas indicam exemplos
de bandas polimórficas.
Resultados
50
Figura 6 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador B4 a partir dos isolados de L. (L.)
chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.)
chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos;
C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão
(MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb (Promega®). As setas indicam exemplos
de bandas polimórficas.
Resultados
51
Figura 7 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador B10 a partir dos isolados de L. (L.)
chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.)
chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos;
C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão
(MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb (Promega®). As setas indicam exemplos
de bandas polimórficas.
Resultados
52
Figura 8 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador F10 a partir dos isolados de L. (L.)
chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.)
chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos;
C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão
(MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb (Promega®). As setas indicam exemplos
de bandas polimórficas.
Resultados
53
Figura 9 – Perfis de RAPD obtidos com o iniciador R15 a partir dos isolados de L. (L.)
chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.)
chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos;
C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão
(MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb (Promega®). As setas indicam exemplos
de bandas polimórficas.
Resultados
54
A partir da análise visual, criteriosa, dos perfis de RAPD obtidos com os 5
iniciadores, foram construídas matrizes de presença e ausência de bandas, as quais
foram base para a construção das árvores filogenéticas. Da Figura 10 à Figura 19
estão dispostas as árvores geradas de acordo com o iniciador utilizado, baseadas na
distância genética entre os isolados, calculada pelo coeficiente de Nei (1978) e
construídas por UPGMA utilizando o programa TFPGA.
A princípio, dois tipos de árvores filogenéticas foram construídos: uma com o
objetivo de avaliar a distância genética entre os isolados agrupados por região
geográfica e outra para avaliar os isolados individualmente. Os valores de bootstraps
foram calculados para todas elas. Esses valores revelam a consistência interna dos
dados após 10
4
reamostragens e são expressos em porcentagem, que indicam a
probabilidade com que cada grupo apareceu nas réplicas da árvore. Portanto,
quanto maior o valor do bootstrap, maior a segurança que podemos ter na topologia
dessa árvore.
As árvores construídas para a análise da distância genética entre os isolados,
agrupados por região geográfica, apresentaram resultados consistentes para os
diferentes iniciadores (Figuras 10 a 14). Podemos observar que os isolados do Piauí,
geralmente foram agrupados com os do Maranhão e que os de Minas Gerais
estiveram sempre mais próximos dos isolados do Espírito Santo. Além disso, os
isolados da Paraíba, tanto os de humanos como os provenientes de cães,
agruparam-se entre si.
Apenas em uma árvore, obtida com o iniciador B4, os isolados de cães e de
humanos não permaneceram agrupados (Figura 11). Nas figuras estão indicados
apenas os valores de bootstraps superiores a 50%, que suportavam a maioria dos
ramos. A cepa de referência de L. (L.) chagasi comportou-se como um outgroup
separado na maioria das árvores e, relativamente, distante das demais regiões, com
exceção das árvores geradas pelos iniciadores B10 e R15 (Figura 12 e 14).
Resultados
55
Figura 10 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados pelo iniciador A1, baseada na distância genética dos isolados agrupados por
região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Figura 11 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados pelo iniciador B4, baseada na distância genética dos isolados agrupados por
região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
56
Figura 12 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados pelo iniciador B10, baseada na distância genética dos isolados agrupados por
região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Figura 13 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados pelo iniciador F10, baseada na distância genética dos isolados agrupados por
região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
57
Figura 14 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados pelo iniciador R15, baseada na distância genética dos isolados agrupados por
região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Uma vez avaliada a distância genética entre os isolados agrupados por região
geográfica, foram construídas as árvores filogenéticas dos isolados individualmente.
As Figuras 15 a 19 demonstram a distância genética entre os 54 isolados de L. (L.)
chagasi obtidas a partir das reações com cada iniciador. A topologia observada nas
diferentes árvores não foi constante, porém bastante complexa e, além disso,
poucos ramos obtiveram altos valores de bootstraps.
Após a análise das árvores, observou-se que alguns isolados apresentaram perfis
semelhantes. Os isolados de Minas Gerais apresentaram-se intimamente
relacionados entre si e, de forma geral, a distribuição dos mesmos, nas árvores,
manteve um padrão bastante homogêneo, independente do iniciador utilizado.
Nota-se que em todas as árvores existem grupos especificamente formados por
esses isolados. Na árvore obtida a partir dos produtos de amplificação, gerados com
o iniciador B4 (Figura 16), 16 dos 20 isolados de MG estão reunidos em um único
grupo. Na maioria das árvores, os isolados do Espírito Santo ficaram mais próximos
Resultados
58
dos isolados de Minas Gerais, apesar de o agrupamento entre eles não ser muito
evidente.
A proximidade entre os isolados do Maranhão e do Piauí, já demonstrada nas
árvores de populações, manteve-se quando os isolados foram analisados,
individualmente. Assim, os isolados de cada uma dessas regiões não apresentaram
grupos separados de acordo com sua origem geográfica em nenhuma das árvores e,
sim, grupos com isolados das duas áreas.
Os isolados da Paraíba não mantiveram uma estrutura conservada nas diferentes
árvores mas, na maioria delas, os isolados provenientes de cães se agruparam com,
pelo menos, uma amostra humana da mesma localidade. Em todas as árvores nota-
se a presença de um grupo com, pelo menos, 5 dos 8 isolados dessa região. Na
árvore obtida com o iniciador B4 (Figura 16) todos os isolados provenientes de cães
estão agrupados e a árvore gerada com o iniciador R15 (Figura 19) conseguiu unir
todos os isolados da Paraíba, tanto caninos, quanto humanos.
Ao se analisar a localização da cepa de referência de L. (L.) chagasi
(MHOM/BR/74/PP75) nas diferentes árvores filogenéticas, observa-se que esse
isolado esteve inserido entre as outras populações, de maneira distinta, para cada
iniciador utilizado.
Resultados
59
Figura 15 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados com o iniciador A1 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi, baseada na distância
genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
60
Figura 16 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados com o iniciador B4 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi, baseada na distância
genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
61
Figura 17 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados com o iniciador B10 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi, baseada na distância
genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
62
Figura 18 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados com o iniciador F10 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi, baseada na distância
genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
63
Figura 19 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados com o iniciador R15 para os 54 isolados de L. (L.) chagasi, baseada na distância
genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
64
Além das árvores construídas para avaliar a distância genética entre as populações
e entre os isolados individualmente, outro tipo foi construído para as reações com
cada iniciador usando, apenas, os 8 isolados da Paraíba, sendo 4 humanos e 4
caninos. A finalidade dessa árvore foi evidenciar possíveis variabilidades entre os
isolados provenientes dos diferentes hospedeiros (cão e homem).
Analisando as árvores geradas, podemos constatar que existe íntima relação entre
os isolados provenientes de cães e de humanos, uma vez que não houve um
agrupamento desses isolados, separadamente (Figuras 20 a 24). A distância
genética máxima encontrada entre os 8 isolados foi igual a 0,36 (iniciador B10 -
Figura 22) e, em alguns casos, os isolados de diferentes hospedeiros foram
considerados idênticos. Entretanto, esses resultados não foram consistentes, pois os
isolados considerados idênticos, numa árvore, apresentam-se diferentes após a
mudança do iniciador. Apesar de apresentarem topologias distintas, vários ramos, de
cada árvore, foram suportados por altos valores de bootstraps (superiores a 50%).
Em três, das 5 árvores, o isolado PB01 se mostrou mais distante geneticamente dos
outros, suportados por altos valores de bootstraps (Figuras 20, 21 e 22).
Resultados
65
Figura 20 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C) provenientes da
Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de amplificação gerados pelo iniciador
A1, baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.
Figura 21 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C) provenientes da
Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de amplificação gerados pelo iniciador
B4, baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
66
Figura 22 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C) provenientes da
Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de amplificação gerados pelo iniciador
B10, baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.
Figura 23 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C) provenientes da
Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de amplificação gerados pelo iniciador
F10, baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
67
Figura 24 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C) provenientes da
Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de amplificação gerados pelo iniciador
R15, baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.
As matrizes de presença e ausência de bandas construídas com base nos perfis de
RAPD permitiram, não só, a construção das árvores filogenéticas, como também, a
realização de outras análises disponíveis no programa TFPGA. Dentre as
possibilidades fornecidas pelo programa, selecionou-se a análise de maior
relevância para este estudo, a estatística descritiva. Ela calcula a taxa de
heterozigose baseada na freqüência das bandas avaliadas em cada população
(Tabela 4 e ANEXO C).
A taxa de heterozigose representa a proporção de heterozigotos esperada na
população estimada a partir de freqüências gênicas observadas na amostra. Esse
valor expressa a variabilidade genética da população; quanto menor a taxa de
heterozigose, mais conservada é a população. Analisando-se os valores dispostos
na Tabela 4, pode-se observar que a população que apresentou menor variabilidade
foi a dos cães provenientes da Paraíba. Esses isolados apresentaram taxas de
heterozigose menores que as das outras populações para todos os iniciadores,
exceto para o R15.
Resultados
68
Fazendo essa mesma análise, observa-se que a população mais heterogênea é a
de Minas Gerais. A taxa de heterozigose média entre as populações variou de 27%
a 36%, que foram obtidas com os iniciadores R15 e F10, respectivamente.
Comparando os diferentes iniciadores, observa-se que o iniciador R15 foi o que
gerou perfis menos variáveis entre os isolados estudados, enquanto o iniciador F10
foi o que gerou perfis mais polimórficos.
Tabela 4 – Número de bandas avaliadas e taxa de heterozigose estimada obtidas pela
análise dos perfis de RAPD dos isolados de L. (L.) chagasi de diferentes regiões
geográficas.
Taxa de heterozigose nas populações (%)
Iniciadores
Nº de bandas
analisadas
MG PI ES PB Cães MA
Média
a
A1
23 18 25 14 22 6 19 30
B4
26 29 24 9 12 8 11 28
B10
30 22 21 18 19 2 19 31
F10
26 28 18 13 17 11 15 36
R15
38 20 18 17 6 8 8 27
Total
bandas
Taxa
Heterozigose
b
143 23,4 21,2 14,2 15,2 7 14,4 -
a
Taxa de heterozigose média por iniciador.
b
Total de bandas e taxa de heterozigose média por região geográfica.
Resultados
69
4.3 Análise da variabilidade genética utilizando SSR-PCR
Outra metodologia utilizada para avaliar a variabilidade genética entre os isolados de
L. (L.) chagasi foi a SSR-PCR. Dos 54 isolados, apenas MG05, PI13 e ES05 não
geraram produtos da amplificação, mesmo depois de várias repetições da PCR. Os
outros 51 isolados foram amplificados com êxito e apresentaram perfis
eletroforéticos muito homogêneos quando comparados visualmente (Figura 25). Os
géis originais encontram-se no ANEXO B.
Os critérios de seleção para as bandas a serem analisadas foram semelhantes aos
do RAPD considerado-se para a análise, apenas, os fragmentos de tamanho entre
0,4 e 1,2 kb. Ao todo, foram analisadas 38 bandas para o iniciador (CA)
8
RY e,
apesar da grande quantidade de bandas, os perfis genéticos deste iniciador foram
menos variáveis que os perfis obtidos pelos 5 iniciadores utilizados na técnica de
RAPD.
Resultados
70
Figura 25 – Perfis de SSR-PCR obtidos com o iniciador (CA)
8
RY a partir dos isolados de L.
(L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa referência de L. (L.)
chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da Paraíba (PB - humanos;
C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do Piauí (PI) e do Maranhão
(MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 100 pb (Promega®). As setas exemplificam
bandas polimórficas.
Resultados
71
Para essa avaliação também foram construídas três árvores filogenéticas. A árvore
construída para a análise da distância genética entre os isolados agrupados por
região geográfica manteve a mesma distribuição observada nas árvores do RAPD,
ou seja, os pares Maranhão e Piauí, Minas Gerais e Espírito Santo, e os isolados
caninos e humanos da Paraíba, apresentaram-se muito próximos (Figura 26). Todos
os ramos dessa árvore foram suportados por valores de bootstraps superiores a
50%, confirmando a consistência desta organização entre as populações.
Analisando-se a árvore que compara os isolados individualmente, constata-se que
algumas características conservaram-se como na técnica de RAPD (Figura 27). Os
isolados de Minas Gerais formaram grupos distribuídos ao longo da árvore. Os
isolados do Piauí permaneceram em grupos misturados aos do Maranhão. Já os
isolados da Paraíba ficaram distribuídos entre os isolados de outras populações,
perdendo a característica de agrupamento observada no RAPD. Ao contrário, os
isolados do Espírito Santo revelaram-se intimamente relacionados e os 4 isolados,
amplificados pela SSR-PCR, foram agrupados.
A árvore gerada para análise da variabilidade entre os isolados da Paraíba
demonstrou semelhança entre os isolados caninos e humanos, especialmente os
isolados PB01, PB04 e C01, suportada por valor de bootstrap igual a 63% (Figura
28).
De acordo com a SSR-PCR a população de isolados do Espírito Santo é a mais
homogênea, com taxa de heterozigose igual a 3% (Tabela 5). A população mais
heterogênea foi a dos isolados caninos da Paraíba, taxa de heterozigose igual a
20%, ao contrário do que foi observado na RAPD. A taxa de heterozigose média
entre as populações foi de 25%, valor inferior àqueles encontrados para os
iniciadores de RAPD, indicando que o iniciador (CA)
8
RY foi o que revelou maior
homogeneidade entre os isolados.
Resultados
72
Figura 26 – Árvore filogenética construída a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados pelo iniciador (CA)
8
RY, baseada na distância genética dos isolados agrupados por
região geográfica, calculada conforme Nei (1978) utilizando UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
73
Figura 27 – Árvore filogenética obtida a partir da análise dos produtos de amplificação
gerados com o iniciador (CA)
8
RY para os 54 isolados de L. (L.) chagasi, baseada na
distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA. Valores de bootstraps
superiores a 50% estão indicados na figura.
Resultados
74
Figura 28 – Árvore filogenética dos isolados humanos (PB) e caninos (C) provenientes da
Paraíba, construída a partir da análise dos produtos de amplificação gerados pelo iniciador
(CA)
8
RY, baseada na distância genética calculada conforme Nei (1978) através de UPGMA.
Valores de bootstraps superiores a 50% estão indicados na figura.
Tabela 5 - Número de bandas avaliadas e taxa de heterozigose estimada obtidas pela
análise dos perfis de SSR-PCR dos isolados de L. (L.) chagasi de diferentes regiões
geográficas.
Taxas de heterozigose nas populações (%)
Iniciadores
Nº de
bandas
analisadas
MG PI ES PB Cães MA
Média
a
(CA)
8
RY
38 14 17 3 11 20 12 25
a
Taxa de heterozigose média entre as populações.
Resultados
75
4.4 Análise da variabilidade genética utilizando MLMT
A última metodologia aplicada para avaliar a variabilidade genética de L. (L.) chagasi
foi a MLMT. Os perfis genéticos resultantes das reações de MLMT com cada
iniciador foram montados em figuras, agrupando-os de acordo com a região
geográfica (Figuras 29 a 35). Os géis originais de cada amplificação se encontram
no ANEXO D.
A maioria dos isolados apresentou duas bandas principais, além de um número
variável de bandas secundárias nas amplificações utilizando os diferentes
iniciadores. Alguns dos produtos da PCR foram analisados em gel de agarose a 2%
e os perfis apresentaram, apenas, uma ou duas bandas. Assim, as demais bandas,
observadas nos géis de poliacrilamida, foram consideradas heteroduplex, derivadas
da migração alterada dos produtos pela formação de estruturas secundárias
(exemplificados para TubCA e Li71-33 na Figura 36).
Os fragmentos amplificados com os 7 iniciadores apresentaram o tamanho esperado
para todos os isolados. A Tabela 6 mostra o locus de microssatélite utilizado, tipo de
repetição, tamanho do fragmento esperado e número de variantes alélicos
observado para cada marcador.
Tabela 6 – Características dos marcadores de microssatélites descritos na literatura e
selecionados para este estudo.
Marcador Repetição*
Tamanho do
fragmento (pb)*
Nº de alelos
encontrados
Li22-35 (CA) 5 - 28 78 - 124 2
Li23-41 (GT) 6 - 32 65 - 117 2
Li45-24 (CA) 7 - 20 89 - 115 2
Li71-33 (TG) 6 -27 95 - 137 1
Lm2TG (TG) 9 - 28 110 - 148 3
Lm4TA (TA) 6 – 16 67 - 87 3
TubCA (CA) 8 - 17 78 - 96 1
*Fonte: Kuhls et al., 2007.
Resultados
76
Os perfis eletroforéticos gerados pelos diferentes marcadores apresentaram 1 a 3
alelos entre os isolados avaliados. Todos os géis foram repetidos pelo menos 1 vez
para descartar distorções de migração, permitindo assim que todos os polimorfismos
identificados fossem confirmados.
Os iniciadores mais polimórficos foram Lm2TG e Lm4TA com 3 variantes alélicos
cada um, e em seguida Li22-35, Li23-41 e Li45-24 com 2 variantes alélicos para
cada marcador. O marcador Li22-35 apresentou 2 variantes alélicos, um alelo para
os isolados ES01, ES02, ES03 e ES05, e outro para os demais isolados (Figura 29).
O marcador Li23-41 também apresentou 2 alelos, um exclusivo do isolado C02 e
outro igual para todos os outros isolados (Figura 30).
Analisando-se os perfis gerados com Li45-24 constatou-se um alelo dominante entre
os isolados e outro, apenas, para PI08 e PI09 (Figura 31). Os perfis obtidos com
Lm2TG demonstraram 3 alelos distintos: um exclusivo para C01, outro para PI13 e
um terceiro para o restante dos isolados (Figura 33).
Para o marcador Lm4TA também foram observados 3 alelos: um presente na
maioria dos isolados, outro comum entre C02, PB02 e PI13, e um terceiro para os
isolados MG15, MG16, MG17, MG18, MG19 E MG20 (Figura 34).
Os marcadores Li71-33 e TubCA foram monomórficos, ou seja, o perfil de todos os
isolados foi idêntico apresentando apenas um alelo (Figuras 32 e 35,
respectivamente).
Após a identificação do número de alelos encontrados para cada locus de
microssatélites foi possível observar a existência de 8 genótipos diferentes entre os
isolados estudados (Tabela 7).
Resultados
77
Figura 29 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Li22-35 a partir
dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa
referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da
Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 25 pb (Promega®).
Resultados
78
Figura 30 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Li23-41 a partir
dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa
referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da
Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 25 pb (Promega®).
Resultados
79
Figura 31 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Li45-24 a partir
dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa
referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da
Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 25 pb (Promega®).
Resultados
80
Figura 32 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Li71-33 a partir
dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa
referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da
Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 25 pb (Promega®).
Resultados
81
Figura 33 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Lm2TG a partir
dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa
referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da
Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 25 pb (Promega®).
Resultados
82
Figura 34 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador Lm4TA a partir
dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa
referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da
Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 25 pb (Promega®).
Resultados
83
Figura 35 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para o marcador TubCA a partir
dos isolados de L. (L.) chagasi provenientes de diferentes regiões geográficas. Lc - cepa
referência de L. (L.) chagasi (MHOM/BR/74/PP75), isolados do Espírito Santo (ES) e da
Paraíba (PB - humanos; C - caninos) (A). Isolados de Minas Gerais (MG) (B); Isolados do
Piauí (PI) e do Maranhão (MA) (C). PM: padrão de peso molecular de 25 pb (Promega®).
Resultados
84
Figura 36 – Produtos de amplificação de MLMT obtidos para os marcadores TubCA e Li71-
33 a partir dos isolados ES05, PI01, MG15 e PI09 analisados em gel de agarose 2%. PM:
padrão de peso molecular de 25 pb (Promega®).
Tabela 7 – Descrição dos genótipos identificados nos isolados de L. (L.) chagasi através da
combinação dos diferentes alelos observados nos loci de microssatélites.
Alelos
Genótipo
Locus
Isolados
Li22-35 Li23-41 Li45-24 Li71-33 Lm2TG Lm4TA TubCA
A
Outros* 1 1 1 1 1 1 1
B
MG15 a MG20 1 1 1 1 1 3 1
C
PB02 1 1 1 1 1 2 1
D
PI13 1 1 1 1 2 2 1
E
C01 1 1 1 1 3 1 1
F
PI08 e PI09 1 1 2 1 1 1 1
G
C02 1 2 1 1 1 2 1
H
ES01, ES02,
ES03, ES05
2 1 1 1 1 1 1
*Todos os isolados, exceto os que apresentaram alelos diferentes: C01, C02, ES01, ES02,
ES03, ES05, MG15, MG16, MG17, MG18, MG19, MG20, PB02, PI08, PI09 e PI13.
Discussão
85
Discussão
Discussão
86
5 DISCUSSÃO
O estudo da variabilidade genética de uma espécie permite que as diferenças
encontradas entre os grupos, possam ser correlacionadas a alguma característica
observada entre as populações estudadas, como: diferentes manifestações clínicas,
estado imunológico dos pacientes, diferentes hospedeiros ou vetores, resistência ou
sensibilidade ao tratamento e diferentes distribuições geográficas. Além disso, o
conhecimento dos padrões genéticos dos organismos também é muito importante
para estudos taxonômicos.
Com o advento da biologia molecular, os avanços tecnológicos vêm contribuindo
para aumentar o conhecimento sobre a diversidade populacional de muitos
parasitos. Para o gênero Leishmania não foi diferente; várias metodologias estão
sendo utilizadas a fim de analisar a variabilidade genética dentro dessas
populações.
Considerando a importância da LV para a saúde pública e a necessidade do
conhecimento da variabilidade genética dos parasitos na epidemiologia da doença,
avaliou-se o nível de variabilidade genética em populações de L. (L.) chagasi
provenientes de diferentes áreas endêmicas do Brasil, utilizando as técnicas de
RAPD, SSR-PCR e MLMT. Essas técnicas têm sido descritas na literatura como
ferramentas úteis para detectar polimorfismo genético entre cepas de diferentes
espécies de Leishmania (ZIETKIEWICSZ et al., 1994; HIDE et al., 2001; TOLEDO et
al., 2002; ZEMANOVÁ et al., 2004; BOTILDE et al., 2006; OCHSENREITHER et al.,
2006; LAURENT et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2007).
Com base nos resultados dos estudos de variabilidade genética de L. (L.) infantum,
descrita por vários autores como sinonímia de L. (L.) chagasi, foram selecionados
para este estudo os iniciadores mais polimórficos a serem utilizados em cada
técnica. Os produtos amplificados por RAPD e SSR-PCR utilizando esses
iniciadores apresentaram perfis complexos, o que permitiu a análise de 181 bandas.
Analisando esses perfis constatou-se que, de maneira geral os isolados
apresentaram-se muito semelhantes entre si e em relação à cepa de referência de L.
(L.) chagasi.
Discussão
87
Com a avaliação das árvores filogenéticas construídas para se determinar as
proximidades genéticas entre as populações de L. (L.) chagasi de diferentes regiões
foi possível detectar a formação de grupos constituídos por populações
geograficamente vizinhas. Na maioria das árvores, as populações estudadas se
agruparam de acordo com sua origem geográfica, sendo que as populações do
Espírito Santo e de Minas Gerais ficaram mais próximas entre si, assim como as
populações do Piauí e Maranhão, e as populações da Paraíba (provenientes de
humanos e de cães).
Esses resultados são semelhantes aos de Macedo et al. (1992) que relataram, para
a espécie L. (V.) braziliensis, um nível de similaridade maior entre isolados cuja
origem geográfica era mais próxima. Provavelmente, a migração de hospedeiros
reservatórios entre regiões próximas estaria favorecendo o fluxo gênico nessas
áreas, já que os vetores possuem uma capacidade limitada de deslocamento.
Quando avaliou-se a distribuição dos isolados, individualmente, observou-se que a
topologia das árvores se manteve conservada para os diferentes iniciadores
utilizados. Foi possível confirmar a similaridade genética entre os isolados de regiões
geográficas vizinhas, uma vez que os isolados do Maranhão e Piauí foram
agrupados sem que houvesse separação de acordo com a origem. O mesmo foi
observado, na maioria das árvores, para os isolados do Espírito Santo e Minas
Gerais. Com relação aos isolados provenientes da Paraíba, houve uma tendência de
agrupamento entre esses, independente de terem sido obtidos de cães ou de
humanos. Já a cepa de referência de L. (L.) chagasi se comportou como um
outgroup na maioria das árvores construídas para análise das populações.
Por outro lado, nas árvores para comparação dos isolados individuais, a cepa de
referência se misturou entre os isolados de diferentes populações. Sua relação com
os demais isolados não se manteve constante nas diferentes árvores. Vale destacar
que essa cepa foi isolada na Bahia e nenhum outro exemplar daquela região foi
avaliado neste estudo. Ao contrário do que foi observado para RAPD e SSR-PCR,
os resultados obtidos com a MLMT demonstraram que a cepa de referência de L.
(L.) chagasi apresentou-se indistinguível dos demais isolados.
Discussão
88
A associação da diversidade genética com a origem geográfica de isolados de uma
mesma espécie de Leishmania tem sido descrita por outros autores. Guerbouj et al.
(2001) avaliando o polimorfismo do gene gp63 de L. (L.) infantum proveniente de
diferentes países, demonstraram o agrupamento dos isolados de acordo com a
região de origem. Da mesma forma, Toledo et al. (2002), relataram a formação de 2
grupos de L. (L.) infantum da Espanha que tiveram associação com a origem
geográfica. Lewin et al. (2002) estudando variabilidade genética de L. (L.) donovani,
encontraram um grande grupo formado por isolados do Sudão com uma clara
separação entre os isolados do Kênia. No Brasil, Cupolillo et al. (2003) concluíram
que a maioria dos isolados de L. (V.) braziliensis, estudados, apresentavam
genótipos específicos, restritos a determinadas áreas geográficas.
Por outro lado, Cortes et al. (2006) não encontraram correlação entre diferentes
genótipos e região geográfica, ao estudarem isolados de L. (L.) infantum de
Portugal. Esses autores sugerem que essa falta de correlação é devida ao pequeno
tamanho do país, o que permitiria a migração dos parasitos entre os focos.
Embora tenha-se observado uma distribuição dos isolados de acordo com sua
origem geográfica, a distância genética entre os mesmos revelou uma pequena
variabilidade intra-específica. Mesmo assim, com base nas taxas de heterozigose
média, calculadas a partir dos perfis de RAPD, foi possível observar que a
população mais heterogênea era a de Minas Gerais e a mais homogênea era a dos
cães da Paraíba. Por outro lado, as taxas calculadas a partir dos perfis de SSR-PCR
indicaram a população dos cães como a mais heterogênea e a do Espírito Santo
como a mais homogênea.
A baixa variabilidade genética observada para a espécie L. (L.) chagasi foi também
revelada quando utilizou-se MLMT, uma vez que a maioria dos isolados apresentou
o mesmo alelo, independente do marcador utilizado. Neste estudo, 16 dos 54
isolados de L. (L.) chagasi apresentaram diferentes alelos, cuja combinação resultou
em 8 genótipos. Um desses genótipos foi o mais freqüente nas populações
estudadas (70%). Dessa forma, não foi possível correlacionar a presença do
genótipo à região geográfica, com exceção de um dos genótipos que foi encontrado
em 4 dos 5 isolados do Espírito Santo (genótipo H). O único isolado (ES04) que não
Discussão
89
apresentou esse genótipo foi obtido de uma criança de dois anos residente no
município de Brejetuba, ao sul do Espírito Santo, onde não existem relatos de casos
autóctones de LV.
Na tentativa de explicar a diferença genotípica desse isolado, inicialmente, surgiu a
hipótese de a criança ter adquirido a doença em outra região geográfica. No entanto,
segundo relatos médicos, ela jamais havia saído de sua cidade natal. A outra
hipótese seria a possibilidade de a mãe ter adquirido a doença em outra região e tê-
la transmitido à criança durante a gestação, uma vez que a ocorrência de
transmissão congênita tem sido relatada (SHARMA et al., 1996; MEINECKE et al.
1999; FIGUEIRÓ-FILHO et al., 2004). Entretanto, a mãe faleceu devido à
septicemia durante o parto e segundo a avó da criança, sua filha jamais havia saído
de sua cidade, não sendo possível sugerir a origem desse caso.
Uma investigação detalhada para verificar a existência de vetores e reservatórios na
região é necessária para que essa situação epidemiológica seja compreendida.
Cabe aqui destacar como um dado molecular reforça a dúvida quanto à origem da
infecção dessa criança e pode ser de grande importância no esclarecimento da
epidemiologia da doença.
Com relação aos demais isolados que apresentaram genótipos diferentes dentro de
uma mesma população, nenhuma característica peculiar a cada um desses isolados
foi encontrada, que pudesse ser correlacionada à diferença observada.
Neste estudo foi, também, avaliada a variabilidade genética entre isolados caninos e
humanos de uma mesma região geográfica, representados pelos isolados da
Paraíba. Os resultados demonstraram que todas as técnicas utilizadas detectaram
casos em que isolados caninos e humanos apresentaram perfis semelhantes. A
detecção de perfis idênticos entre isolados caninos e humanos da espécie L. (L.)
infantum tem sido relatada. Chicharro et al. (2002), demonstraram que RAPD e IRT
(Tipagem de região intergênica do RNA ribossomal - ITS) não foram capazes de
discriminar isolados caninos de humanos da ilha de Majorca, na Espanha. Da
mesma forma, Jiménez et al. (1995) estudando a variabilidade entre isolados de L.
Discussão
90
(L.) infantum, encontraram o zimodema MON-1, predominante entre isolados
humanos, em todos os 31 isolados caninos avaliados.
A presença de isolados caninos e humanos, apresentando perfis genéticos muito
semelhantes numa mesma área endêmica, é condizente com o caráter zoonótico do
ciclo de transmissão da L. (L.) chagasi e da L. (L.) infantum, uma vez que o cão
doméstico tem sido incriminado como o principal reservatório da LV.
Outro parâmetro avaliado foi a variabilidade genética dentro de uma mesma
população, estimada pela taxa de hetorosigose média. Com base nas taxas
calculadas a partir dos resultados de RAPD observamos que a população mais
homogênea foi a de cães. No entanto, a taxa de heterosigose obtida pela SSR-PCR
revelou que essa população era a mais heterogênea. Os resultados de MLMT
também revelaram maior heterogeneidade entre esses isolados, uma vez que foram
encontrados, nessa mesma população, 3 genótipos diferentes. Esses dados,
portanto, sugerem uma maior variabilidade nessa população.
A baixa variabilidade genética entre os isolados humanos de L. (L.) chagasi,
demonstrada neste estudo, em comparação à variabilidade genética descrita por
alguns autores para as populações de L. (L.) infantum, poderia ser justificada pela
presença de um vetor principal estar associado à transmissão de L. (L.) chagasi
(LAINSON & RANGEL, 2005), enquanto que L. (L.) infantum apresenta várias
espécies de inseto vetor (LEWIS, 1974; RIOUX et al., 1986; GUILVARD et al., 1996).
Além disso, a homogeneidade observada entre os isolados de L. (L.) chagasi é
consistente com a hipótese de que essa tenha uma origem evolutiva mais recente,
pois se acredita que tenha sido importada, recentemente, para o Novo Mundo
(KILLICK-KENDRICK, 1985; RIOUX et al., 1990; MOMEN et al., 1993; DANTAS-
TORRES, 2006).
Com relação ao desempenho das técnicas empregadas neste estudo, pode-se
concluir que a RAPD, SSR-PCR e MLMT são metodologias importantes e
complementares para o estudo da variabilidade genética de Leishmania. Apesar de
a MLMT não ter sido capaz de agrupar os isolados de acordo com a região
geográfica, diferente das técnicas de RAPD e SSR-PCR, sua grande facilidade de
Discussão
91
execução e análise, sugerem que essa técnica seja uma das mais promissoras no
estudo da variabilidade genética de Leishmania.
Como mencionado anteriormente, neste estudo foram selecionados os marcadores
mais polimórficos para a espécie L. (L.) infantum. Porém, mais marcadores de
microssatélites deverão ser utilizados para aumentar a confiabilidade dos dados
obtidos, uma vez que alguns autores sugerem a análise de cerca de 15 loci
diferentes (RUZZANTE, 1998; BOTILDE et al., 2006; KUHLS et al., 2007). Assim,
propõe-se como perspectiva deste estudo, um aumento no número de loci de MLMT
para a análise de um maior número de isolados. Além disso, seria importante utilizar
outra técnica de análise dos fragmentos gerados, como eletroforese capilar em
seqüenciador automático, capaz de detectar pequenas diferenças entre eles e
determinar, exatamente, o tamanho desses fragmentos.
Em resumo, os resultados mostraram-se bastante promissores. Entretanto, estudos
adicionais avaliando um maior número de regiões geográficas e de isolados por
região são necessários para a compreensão do papel dos hospedeiros,
reservatórios e vetores na geração e manutenção da diversidade genética. Além
disso, esses estudos permitiriam avaliar a existência de correlação entre a
variabilidade intra-específica e resistência às drogas ou diferentes manifestações
clínicas da doença.
Conclusões
92
Conclusões
Conclusões
93
6 CONCLUSÕES
- Todos os isolados foram identificados como L. (L.) chagasi.
- Foi observada uma baixa variabilidade entre isolados de L. (L.) chagasi
provenientes de diversas regiões do Brasil.
- Os perfis gerados pelas técnicas RAPD e SSR-PCR permitiram a formação de
grupos de acordo com a região geográfica dos isolados. Ao contrário, os resultados
da MLMT não apresentaram essa distribuição, exceto para um dos marcadores
utilizados.
- Os resultados demonstraram maior similaridade genética entre isolados
provenientes de regiões geográficas próximas.
- Os isolados caninos e humanos apresentaram-se muito semelhantes.
- Os resultados da taxa de heterozigose estimada pela SSR-PCR e os diferentes
genótipos obtidos pela MLMT, sugerem uma maior variabilidade entre os isolados
caninos.
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amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 1990
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repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics. 1994
Mar 15;20(2):176-83.
Anexos
105
A
nexos
Anexos
106
ANEXO A - Géis originais de RAPD
Géis originais iniciador A1
ES01
ES04
MG02
ES02
ES03
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
PI01
MA04
PI10
PI11
PI12
MA03
PI03
MA01
MA02
PI06
PI07
PI08
PI09
MA07
PI05
MG14
MG20
PM
MA05
MA06
PI13
ES05
PI04
___
500
___
1000
___
500
___
1000
MG09
MG10
MG11
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
___
500
___
1000
MG01
Lc
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG05
MG08
PI02
ES01
ES04
MG02
ES02
ES03
ES01
ES04
MG02
ES02
ES03
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
PI01
MA04
PI10
PI11
PI12
MA03
PI01
MA04
PI10
PI11
PI12
MA03
PI03
MA01
MA02
PI06
PI07
PI08
PI03
MA01
MA02
PI06
PI07
PI08
PI09
MA07
PI05
MG14
MG20
PM
MA05
MA06
PI09
MA07
PI05
MG14
MG20
PM
MA05
MA06
PI13
ES05
PI04
PI13
ES05
PI04
PI13
ES05
PI04
___
500
___
1000
___
500
___
1000
MG09
MG10
MG11
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
___
500
___
1000
MG09
MG10
MG11
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
MG09
MG10
MG11
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
___
500
___
1000
MG01
Lc
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG01
Lc
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG05
MG08
PI02
MG05
MG08
PI02
Anexos
107
Géis originais iniciador B4
MG03
MG02
PI13
MG12
PI02
PI16
ES04
ES05
MG01
Lc
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG09
MG10
MG11
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
MA01
PI03
PI04
MA02
PI06
PM
MA03
___
500
___
1000
ES01
ES02
ES03
MG08
PM
___
1000
___
500
MG20
PI01
PI05
PI12
PM
___
1000
___
500
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA06
MA07
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
MG03MG03
MG02
PI13
MG02
PI13
MG12
PI02
PI16
ES04
ES05
MG12
PI02
PI16
ES04
ES05
MG01
Lc
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG01
Lc
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG09
MG10
MG11
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
MG09
MG10
MG11
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
MG09
MG10
MG11
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
MA01
PI03
PI04
MA02
PI06
PM
MA03
___
500
___
1000
MA01
PI03
PI04
MA02
PI06
PM
MA03
MA01
PI03
PI04
MA02
PI06
PM
MA03
___
500
___
1000
ES01
ES02
ES03
MG08
PM
___
1000
___
500
ES01
ES02
ES03
MG08
PM
___
1000
___
500
MG20
PI01
PI05
PI12
PM
___
1000
___
500
MG20
PI01
PI05
PI12
PM
MG20
PI01
PI05
PI12
PM
___
1000
___
500
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA06
MA07
PM
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA06
MA07
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
Anexos
108
Géis originais iniciador B10
MG01
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PM
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA06
MA07
PM
PI12
ES03
PM
___
500
___
1000
PI13
ES04
ESO5
PM
___
500
___
1000
MG20
MG08
MG02
PI01
ES01
ES02
ES03
PM
Lc
___
500
___
1000
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
MG01
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG01
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG01
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PM
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PM
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PM
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA06
MA07
PM
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA06
MA07
PM
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA06
MA07
PM
PI12
ES03
PM
___
500
___
1000
PI12
ES03
PM
PI12
ES03
PM
___
500
___
1000
PI13
ES04
ESO5
PM
___
500
___
1000
PI13
ES04
ESO5
PM
___
500
___
1000
MG20
MG08
MG02
PI01
ES01
ES02
ES03
PM
Lc
___
500
___
1000
MG20
MG08
MG02
PI01
ES01
ES02
ES03
PM
Lc
MG20
MG08
MG02
PI01
ES01
ES02
ES03
PM
Lc
___
500
___
1000
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
Anexos
109
Géis originais iniciador F10
MG02
PI01
MA02
PI12
Lc
MG01
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
___
1000
___
500
MG20
PI02
PI03
PI04
MA01
PI05
PI06
PM
___
1000
___
500
MA03
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA07
PM
___
1000
___
500
ES01
ES03
MG08
MA06
PI13
ES02
ES05
ES04
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
MG02
PI01
MA02
PI12
MG02
PI01
MA02
PI12
MG02
PI01
MA02
PI12
Lc
MG01
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
Lc
MG01
MG04
MG05
MG06
MG07
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
___
1000
___
500
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
PM
___
1000
___
500
MG20
PI02
PI03
PI04
MA01
PI05
PI06
PM
___
1000
___
500
MG20
PI02
PI03
PI04
MA01
PI05
PI06
PM
MG20
PI02
PI03
PI04
MA01
PI05
PI06
PM
___
1000
___
500
MA03
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA07
PM
___
1000
___
500
MA03
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA07
PM
MA03
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
MA05
MA07
PM
___
1000
___
500
ES01
ES03
MG08
ES01
ES03
MG08
MA06
PI13
ES02
ES05
ES04
PM
MA06
PI13
ES02
ES05
ES04
PM
MA06
PI13
ES02
ES05
ES04
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
Anexos
110
Géis originais iniciador R15
MG01
MG02
MG03
MG04
MG05
MG06
MG07
MG08
PM
MA03
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA07
MA06
ES01
ES02
ES03
ES04
PM
___
1000
___
500
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG19
MG17
MG18
PM
___
1000
___
500
MG20
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
PM
___
1000
___
500
Lc
PI13
ES05
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
MG01
MG02
MG03
MG04
MG05
MG06
MG07
MG08
PM
MG01
MG02
MG03
MG04
MG05
MG06
MG07
MG08
PM
MG01
MG02
MG03
MG04
MG05
MG06
MG07
MG08
PM
MA03
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA07
MA06
MA03
PI07
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA07
MA06
ES01
ES02
ES03
ES04
PM
___
1000
___
500
ES01
ES02
ES03
ES04
PM
ES01
ES02
ES03
ES04
PM
___
1000
___
500
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG19
MG17
MG18
PM
___
1000
___
500
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG19
MG17
MG18
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG19
MG17
MG18
PM
___
1000
___
500
MG20
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
PM
___
1000
___
500
MG20
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
PM
MG20
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
PM
___
1000
___
500
Lc
PI13
ES05
Lc
PI13
ES05
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
Anexos
111
ANEXO B – Géis poriginais de SSR-PCR
Géis originais iniciador CA
8
RY
Lc
MG01
MG02
MG04
MG06
MG07
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG17
MG18
MG16
MG19
PM
___
1000
___
500
MG20
ES01
ES02
ES03
ES04
PM
___
1000
___
500
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
MG08
MG03
PM
___
1000
___
500
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
Lc
MG01
MG02
MG04
MG06
MG07
PM
Lc
MG01
MG02
MG04
MG06
MG07
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG17
MG18
MG16
MG19
PM
___
1000
___
500
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG17
MG18
MG16
MG19
PM
MG09
MG10
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG17
MG18
MG16
MG19
PM
___
1000
___
500
MG20
ES01
ES02
ES03
ES04
PM
___
1000
___
500
MG20
ES01
ES02
ES03
ES04
PM
MG20
ES01
ES02
ES03
ES04
PM
___
1000
___
500
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
MG08
MG03
PM
___
1000
___
500
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
MG08
MG03
PM
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
MG08
MG03
PM
___
1000
___
500
___
1000
___
500
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
PB01
PB02
CA01
CA02
CA03
CA04
PB03
PB04
PM
Anexos
112
ANEXO C
Freqüência de bandas e taxa de heterozigose observadas nas populações de L. (L.) chagasi
obtidas pela análise dos perfis de RAPD com o iniciador A1.
Frequência nas populações (%)
Bandas
Freqüência
média
(%)
MG PI ES PB Cães MA
1
100 100 100 100 100 100 100
2
86 100 100 100 50 100 100
3
43 43 32 36 100 100 46
4
50 100 32 55 50 100 24
5
43 54 32 55 50 100 15
6
10 5 16 36 0 0 7
7
18 14 32 36 13 13 7
8
86 100 100 100 50 100 100
9
31 17 44 22 100 100 24
10
100 100 100 100 100 100 100
11
3 5 3 0 0 0 0
12
69 100 100 100 13 50 100
13
17 11 26 22 0 13 24
14
46 35 60 100 13 100 62
15
66 67 72 100 100 100 34
16
69 100 60 100 29 100 62
17
14 27 16 10 0 0 0
18
100 100 100 100 100 100 100
19
66 77 60 100 50 50 62
20
23 31 12 0 100 100 0
21
86 100 100 100 50 100 100
22
26 11 44 0 50 100 34
23
86 100 100 100 50 100 100
Taxa de
Heterozigose
30 18 25 14 22 6 19
Anexos
113
Freqüência de bandas e taxa de heterozigose observadas nas populações de L. (L.) chagasi
obtidas pela análise dos perfis de RAPD com o iniciador B4.
Freqüência nas populações (%)
Bandas
Freqüência
média
(%)
MG PI ES PB Cães MA
1
21 45 12 10 0 29 0
2
9 16 12 0 0 0 0
3
16 40 3 0 0 13 0
4
23 40 12 100 0 0 0
5
25 55 16 36 0 0 0
6
100 100 100 100 100 100 100
7
31 50 16 100 13 50 0
8
6 16 3 0 0 0 0
9
2 5 3 0 0 0 0
10
76 100 60 100 100 100 62
11
86 100 72 100 100 100 100
12
43 29 51 36 100 100 62
13
27 55 16 0 29 50 0
14
42 55
b
16 36 50 100 46
15
56 100 37 100 100 100 15
16
19 50 8 0 13 0 0
17
12 22 12 0 13 0 0
18
61 77 44 100 50 100 46
19
50 68 37 55 50 100 24
20
100 100 100 100 100 100 100
21
80 77 72 100 100 100 100
22
100 100 100 100 100 100 100
23
100 100 100 100 100 100 100
24
42 36 51 100 29 50 34
25
19 19 16 22 13 100 0
26
86 77 100 100 100 100 100
Taxa de
Heterozigose
28 29 24 9 12 8 11
Anexos
114
Freqüência de bandas e taxa de heterozigose observadas nas populações de L. (L.) chagasi
obtidas pela análise dos perfis de RAPD com o iniciador B10.
Freqüência nas populações (%)
Bandas
Freqüência
média
(%)
MG PI ES PB Cães MA
1
100 100 100 100 100 100 100
2
22 23 3 36 50 100 15
3
34 39 12 55 50 100 24
4
50 77 21 100 50 100 34
5
58 77 51 22 50 100 62
6
54 48 51 55 50 100 62
7
54 67 37 55 50 100 46
8
8 11 8 36 0 0 0
9
52 77 37 55 50 100 34
10
100 100 100 100 100 100 100
11
100 100 100 100 100 100 100
12
54 100 72 36 0 13 100
13
52 77 37 100 100 100 7
14
69 67 100 100 29 100 62
15
9 20 8 10 0 0 0
16
56 100 37 100 50 100 24
17
80 100 100 100 100 100 46
18
22 20 8 22 100 100 15
19
31 67 8 36 50 29 0
20
61 100 100 100 0 0 100
21
100 100 100 100 100 100 100
22
100 100 100 100 100 100 100
23
100 100 100 100 100 100 100
24
52 67 37 100 29 100 34
25
100 100 100 100 100 100 100
26
100 100 100 100 100 100 100
27
72 77 72 36 100 100 100
28
45 77 16 100 100 100 7
29
72 77 72 36 100 100 100
30
61 77 51 100 50 100 34
Taxa de
Heterozigose
31 22 21 18 19 2 19
Anexos
115
Freqüência de bandas e taxa de heterozigose observadas nas populações de L. (L.) chagasi
obtidas pela análise dos perfis de RAPD com o iniciador F10.
Freqüência nas populações (%)
Bandas
Freqüência
média
(%)
MG PI ES PB Cães MA
1
72 55 100 100 100 100 100
2
26 50 16 36 0 0 15
3
4 10 0 0 0 0 0
4
80 100 72 100 100 100 62
5
72 55 100 100 100 100 100
6
15 13 12 36 0 0 34
7
100 100 100 100 100 100 100
8
49 29 51 100 50 100 100
9
49 77 51 55 0 0 100
10
13 16 16 0 0 0 24
11
47 40 60 36 29 50 100
12
40 19 100 55 29 29 62
13
23 10 16 100 100 100 7
14
100 100 100 100 100 100 100
15
12 32 3 10 0 0 0
16
100 100 100 100 100 100 100
17
76 61 100 100 100 100 100
18
100 100 100 100 100 100 100
19
52 50 51 100 50 50 62
20
47 22 100 36 50 100 100
21
39 25 51 100 29 29 62
22
53 61 100 55 13 29 100
23
56 40 72 100 50 100 62
24
66 100 72 100 13 29 100
25
43 29 100 100 13 29 62
26
86 100 100 100 50 100 100
Taxa de
Heterozigose
36 28 18 13 17 11 15
Anexos
116
Freqüência de bandas e taxa de heterozigose observadas nas populações de L. (L.) chagasi
obtidas pela análise dos perfis de RAPD com o iniciador R15.
Freqüência nas subpopulações (%)
Bandas
Freqüência
média
(%)
MG PI ES PB Cães MA
1
100 100 100 100 100 100 100
2
45 36 72 0 50 100 100
3
64 77 51 55 50 50 100
4
49 55 51 55 13 13 100
5
9 13 0 22 13 13 7
6
59 55 72 10 100 100 100
7
47 45 44 55 29 100 46
8
86 100 100 55 100 100 100
9
18 10 12 22 100 100 0
10
100 100 100 100 100 100 100
11
76 77 72 55 100 100 100
12
52 32 72 55 100 100 100
13
59 61 60 10 100 100 100
14
100 100 100 100 100 100 100
15
49 25 72 55 100 100 100
16
52 22 100 100 100 100 100
17
25 25 3 55 100 50 24
18
100 100 100 100 100 100 100
19
59 50 100 22 100 100 62
20
4 13 0 0 0 0 0
21
100 100 100 100 100 100 100
22
56 32 72 100 100 100 100
23
100 100 100 100 100 100 100
24
39 100 37 0 0 0 62
25
100 100 100 100 100 100 100
26
7 10 12 0 0 0 7
27
61 100 100 100 0 0 100
28
1 0 0 0 13 13 0
29
100 100 100 100 100 100 100
30
100 100 100 100 100 100 100
31
100 100 100 100 100 100 100
32
72 100 72 55 100 100 62
33
49 45 100 100 0 0 100
34
19 22 26 36 0 0 15
35
100 100 100 100 100 100 100
36
26 19 32 36 29 29 34
37
76 100 60 100 100 50 100
38
86 100 100 100 100 50 100
Taxa de
Heterozigose
27 20 18 17 6 8 8
Anexos
117
Freqüência de bandas e taxa de heterozigose observadas nas populações de L. (L.) chagasi
obtidas pela análise dos perfis de SSR-PCR com o iniciador (CA)
8
RY.
Freqüência nas populações (%)
Bandas
Freqüência
média
(%)
MG PI ES PB Cães MA
1
100 100 100 100 100 100 100
2
62 43 100 100 100 50 100
3
45 67 29 100 29 29 34
4
49 48 71 0 100 50 46
5
62 60 59 100 100 50 52
6
100 100 100 100 100 100 100
7
100 100 100 100 100 100 100
8
86 100 100 100 100 50 100
9
100 100 100 100 100 100 100
10
51 48 59 0 100 50 100
11
25 20 35 0 29 29 34
12
100 100 100 100 100 100 100
13
86 77 100 100 100 100 100
14
49 67 42 0 100 100 34
15
100 100 100 100 100 100 100
16
100 100 100 100 100 100 100
17
100 100 100 100 100 100 100
18
80 100 100 100 50 50 100
19
31 35 29 0 50 50 24
20
100 100 100 100 100 100 100
21
80 100 100 100 100 29 100
22
1 0 0 0 0 0 7
23
86 100 100 100 100 50 100
24
71 100 71 100 29 50 100
25
100 100 100 100 100 100 100
26
80 100 71 100 100 50 100
27
35 27 59 50 0 0 100
28
100 100 100 100 100 100 100
29
40 17 100 29 50 29 100
30
71 67 71 100 100 100 62
31
65 100 35 100 100 100 62
32
100 100 100 100 100 100 100
33
86 100 100 50 100 100 100
34
34 20 50 0 100 100 34
35
62 100 50 100 50 29 62
36
8 14 4 0 0 0 7
37
75 100 100 100 50 29 100
38
71 100 71 100 50 29 100
Taxa de
Heterozigose
25 14 17 3 11 20 12
Anexos
118
ANEXO D - Géis originais MLMT
Géis originais iniciador Li22-35
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
PI13
PM
PM
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
MG20
MG11
PM
PM
PB01
PB02
C01
C02
C03
C04
PB03
PB04
PM
PM
Lc
ES04
ES01
ES02
ES03
ES05
PM
MG02
MG03
MG04
MG05
MG06
MG07
MG08
MG09
MG10
PM
PM
MG01
PI01
PM
100
50
100
50
100
50
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
PI13
PM
PM
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
PI13
PM
PM
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
MG20
MG11
PM
PM
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
MG20
MG11
PM
PM
PB01
PB02
C01
C02
C03
C04
PB03
PB04
PM
PM
PB01
PB02
C01
C02
C03
C04
PB03
PB04
PM
PM
Lc
ES04
ES01
ES02
ES03
ES05
PM
Lc
ES04
ES01
ES02
ES03
ES05
PM
MG02
MG03
MG04
MG05
MG06
MG07
MG08
MG09
MG10
PM
PM
MG02
MG03
MG04
MG05
MG06
MG07
MG08
MG09
MG10
PM
PM
MG01
PI01
PM
MG01
PI01
PM
100
50
100
50
100
50
100
50
100
50
100
50
Anexos
119
Géis originais iniciador Li23-41
ES01
ES02
ES03
ES04
ES05
Lc
PM
PM
MG02
MG03
MG04
MG05
MG07
MG06
MG08
MG09
MG10
PM
MG01
PM
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PM
PB01
PB02
PB03
PB04
C01
C02
C03
C04
PM
CN
PM
100
50
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
MG20
PM
PM
100
50
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
PI13
PM
PM
100
50
ES01
ES02
ES03
ES04
ES05
Lc
PM
PM
ES01
ES02
ES03
ES04
ES05
Lc
PM
PM
MG02
MG03
MG04
MG05
MG07
MG06
MG08
MG09
MG10
PM
MG01
PM
MG02
MG03
MG04
MG05
MG07
MG06
MG08
MG09
MG10
PM
MG01
PM
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PM
PI01
PI02
PI03
MA01
PI04
MA02
PI05
PI06
MA03
PI07
PM
PM
PB01
PB02
PB03
PB04
C01
C02
C03
C04
PM
CN
PM
100
50
PB01
PB02
PB03
PB04
C01
C02
C03
C04
PM
CN
PM
PB01
PB02
PB03
PB04
C01
C02
C03
C04
PM
CN
PM
100
50
100
50
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
MG20
PM
PM
100
50
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
MG20
PM
PM
MG11
MG12
MG13
MG14
MG15
MG16
MG17
MG18
MG19
MG20
PM
PM
100
50
100
50
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
PI13
PM
PM
100
50
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
PI13
PM
PM
PI08
MA04
PI09
PI10
PI11
PI12
MA05
MA06
MA07
PI13
PM
PM
100
50
100
50
Anexos
120
Géis originais iniciador Li45-24
ES01
ES02
ES03
ES04
ES05
Lc
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PI08
MA04
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ES01
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ES04
ES05
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C01
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125
75
125
75
125
75
125
75
Anexos
121
Géis originais iniciador Li71-33
PB03
PB04
C01
C02
C03
C04
PB01
PB02
PM
PM
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Lc
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MA02
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MA03
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MA05
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75
125
75
Anexos
122
Géis originais iniciador Lm2TG
MG01
MG04
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MG06
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MG10
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125
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MA05
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175
125
175
Anexos
123
Géis originais iniciador Lm4TA
ES01
ES02
ES03
ES04
ES05
Lc
PM
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MG11
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75
100
75
100
75
100
75
100
75
100
Anexos
124
Géis originais iniciador TubCA
ES01
ES02
ES03
Lc
PM
PI01
PI02
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MA01
PI04
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ES01
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C01
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Baixar livros de Teologia
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