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Tíssiana Rachel Rossi Schneider
ANÁLISE DA VASCULATURA DE LINFONODOS SUBMANDIBULARES EM
DIFERENTES TEMPOS DO PROCESSO CICATRICIAL DE FERIDA CIRÚRGICA
EM LÍNGUA DE RATOS
Tese apresentada como requisito parcial à
obtenção do grau de Doutor pelo Programa de
Doutorado em Odontologia, área de
concentração em Estomatologia Clínica, da
Faculdade de Odontologia da Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
Orientadora: Dra. Maria Antonieta Lopes de Souza
Porto Alegre
2007
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DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho às âncoras da minha vida, minha Mãe Inês Rossi, minha irmã
Liliana Paula Rossi e meu esposo Jean Pierre Schneider.
Jean, meu companheiro, amigo, incentivador, reanimador de forças, corretor de
português, psicólogo, psiquiatra e algumas “cositas más”. Sempre presente,
prestativo, disposto a ajudar, ler, corrigir, enfim, sempre comigo em tudo.
Devemos aproveitar todos os segundos da vida, que é passageira, ao lado de
pessoas que amamos e que nos fazem bem. É ótimo saber que fazes parte da
minha vida e que passarei boa parte dela em tua companhia. De preferência que
possamos matear juntos durante a velhice em algum lugar bem sossegado com a
certeza de que viveremos bem sempre. Te amo muito e serei eternamente grata por
tudo.
Minha mãe Ines, motivo primeiro de minha existência, o ponto de partida. Desde
que nasci, soube que posso encontrar na senhora o ninho aconchegante, o abraço
caloroso de mãe, preocupada sempre. “Liga ou manda uma mensagem quando
chegar em Porto Alegre para dizer se está tudo bem”, “fica tranqüila, tudo vai dar
certo”, frases que mais escutei no tempo de doutorado. Agradecerei sempre por ser
minha mãe ou um anjo que foi colocado em minha vida. Obrigada pela preocupação,
pela força e incentivo constantes. Te amo muito, minha mãe.
“Tu és divina e graciosa, estátua magestosa. Do amor por Deus estruturada...”
Mana Lili, tu és toda coração, amor, dedicação e doação. És outro anjo e tenho
somente a agradecer por poder compartilhar contigo minha vida. Agradeço pela
ternura, amor, preocupação, confiança e incentivo. Tenho a certeza de que muito
ainda viveremos juntas. Te amo, minha irmã.
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AGRADECIMENTOS
À Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS) na pessoa
do Magnífico Reitor Prof. Dr. Joaquim Clotet que viabilizou a realização deste
curso.
À Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul na pessoa do Diretor Prof. Dr. Marcos Túlio Mazzini Carvalho pela
infra-estrutura concedida.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul na pessoa da Coordenadora Profª. Drª. Nilza Pereira
da Costa, símbolo de profissionalismo, diplomacia e dedicação.
À direção da Universidade do Oeste de Santa Catarina (UNOESC),
representada pelo Magnífico Reitor Dr. Aristides Cimadon e à Vice-reitoria de
pesquisa, pós-graduação e extensão na pessoa do Prof. Dr. Luiz Carlos
Lückmann, pelo apoio financeiro concedido através do Plano de Capacitação e
Qualificação Docente dessa instituição.
À Profª. Drª. Maria Antonieta Lopes de Souza serei eternamente grata
pelos ensinamentos que me proporcionou, muito aprendi sobre ser Professor. Como
diz o poeta e escritor Érico Veríssimo: “Olha o que sou mesmo...digamos assim, um
‘aprendiz perplexo’. Mas acho que pelo menos descobri as coisas de que gosto e as
que detesto ou me deixam indiferente. E isso não é pouco”.
Às Professoras do Curso de Doutorado: Drª. Liliane Yurgel, Drª. Fernanda
Salum, Drª. Maria Antônia Z. de Figueiredo e Drª. Karen Cherubini, pela
infindável devoção e constantes ensinamentos. Obrigada por mostrarem que ainda
existem pessoas preocupadas com os semelhantes e que lutam com todas as forças
para dar mais alento aos necessitados. O mundo precisa de mais pessoas como
vocês.
À Profª. Drª. Liliane Yurgel: serei eternamente grata pelas horas
dispensadas em escutar, orientar e reavivar as forças para a contínua caminhada.
Apesar de muitas vezes ser eu a “bola da vez”, me mostrou que o professor deve
repassar conceitos de vida e de humanidade, além do conhecimento. Sua
generosidade e cuidado com todos demonstra a sua grandiosidade.
À Profª. Drª. Karen Cherubini: apesar das infindáveis correções dos artigos
(umas novecentas e noventa vezes mais ou menos) aprendi contigo o sentido da
palavra doação. Tudo o que faz na Estomatologia é doação pura. Me mostrou que
um professor não somente repassa conhecimentos teóricos aos alunos e sim
compartilha de princípios éticos. Com certeza aprendi contigo ser mais dedicada,
mais paciente, mais cuidadosa e mais humana.
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A todos os Professores do curso de Doutorado que, nas mais diferentes
disciplinas, contribuíram para a minha formação possibilitando o nascer de um
novo conhecimento.
Às professoras da disciplina de Patologia do Curso de Odontologia da
Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Drª. Ana Paula Gomes, Drª. Adriana
Etges e Drª. Lenita Araújo, pela incansável ajuda na resolução dos problemas
decorrentes do desenvolvimento da tese. Serei eternamente grata pelo ensinamento
do que é ser Mestre. Lenita: sabes o quanto és importante para mim e para o Jean.
O bom é saber que sempre estarás por perto, mesmo que distante. Obrigada pela
amizade e pelos ensinamentos. Adriana: agradeço pela amizade, pelo carinho, pela
dedicação e pela ajuda dispensada na realização dessa tese. Meu sincero
agradecimento. Ana: sabes o quanto fostes importante para a conclusão desse
trabalho. Palavras não são suficientes para agradecer a amizade, a ajuda, a
paciência, a disponibilidade constante e os conhecimentos repassados.
Ao Prof. Dr. Felipe Luís Schneider por permitir o acesso ao Laboratório de
Neuroanatomia da UFRGS possibilitando o desenvolvimento dessa pesquisa.
À Profª. Drª. Berenice Dedavid, coordenadora do Centro de Microscopia e
Microanálise da PUCRS, pela convivência, pela compreensão das dificuldades e
pela disposição em me ajudar sempre.
Ao Professor Prof. Dr. Manoel Sant’Ana Filho, coordenador do Laboratório
de Patologia da PUCRS, pela compreensão, ajuda e por disponibilizar o uso do
laboratório, fundamental para realização da tese.
À amiga, parceira e agora Drª. Flaviana Dornela Verli. Agradeço o incentivo,
a confiança e a ajuda. Saiba que és parte desse trabalho. Contigo fui ao laboratório
pela primeira vez, aprendi os caminhos, me envolvi na tua pesquisa e me apaixonei
pelo teu trabalho. Por causa disso tudo se criou outra tese, esta que agora defendo.
Nunca conseguirei agradecer o suficiente, tua doação foi fundamental para
realização desse trabalho.
Agradeço ao profissional, amigo, companheiro, orientador, estimulador que é
generoso até no nome: Antônio Generoso Severino pela incansável parceria nas
muuuuuitas horas de trabalho no Laboratório de Neuroanatomia da UFRGS. Meu
sincero agradecimento e respeito.
Aos anjos que apareceram na minha vida e possibilitaram que esse trabalho
fosse concluído no período programado. Os primeiros anjos foram os funcionários do
Centro de Microscopia, Mirian Souza dos Santos e seu esposo Filipe (amigos
sempre, mesmo distante), Maurício França, Eduardo Ávila Perosa e Dr José
Constantino Vaz que passaram a fazer parte da minha vida. Sentirei falta das horas
que passamos juntos e do chimarrão em frente ao laboratório antes de iniciar o
trabalho. Um outro anjo foi a funcionária do Laboratório de Patologia da PUCRS,
Vanessa. Muito obrigada pela ajuda. Vocês são provas vivas de que quando se tem
vontade de ajudar tudo é possível.
5
Aos funcionários da Secretaria da pós-graduação, Davenir Menger Bruch,
Ana Lúcia Silveira Prestes, Marcos Caetano Correa e Carlos Eduardo
Minossi pela incansável ajuda e disponibilidade em resolver todas as
pendengas do dia-a-dia.
Às funcionárias do laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia da
Universidade Federal de Pelotas pela confecção das lâminas. Silvana agradeço de
coração e não tenha dúvida que és parte desse trabalho.
Aos Professores do Curso de Odontologia da Universidade do Oeste de
Santa Catarina (em especial Professores das disciplinas de Semiologia, Clínica
Integrada I, Oclusão e Dentística Restauradora), e aos Funcionários (em
especial Geisa Trombeta, Inácio Cimadon, Kátia Lopes e Leda D’Agostini) pelo
apoio, ajuda e compreensão durante o tempo que estive ausente.
À amiga e incentivadora Profª. Cláudia Wesoloski que me possibilitou
realizar essa tese. Agradecerei eternamente pelo apoio, pela confiança, pela
amizade e por segurar as “pontas” (que não eram poucas) no tempo que estive
ausente. “É bom sair, mas muito melhor é poder voltar para casa”.
À nova amiga Drª. Sandra Marinho (nem tão nova assim, rsrs) que muito me
ajudou nas incansáveis leituras da tese. Agradeço por todas as horas dispensadas,
pela convivência, pelas risadas (alôôu!), pelas conversas, pelos lanches e almoços
juntas, por escutar e por falar (e como fala, dããã!!!!). Sentirei muitas saudades e
espero mesmo longe, ou perto quem sabe, compartilhar ainda mais dessa amizade.
A todos os colegas do curso de Doutorado, em especial Márcia Peter Maahs,
Elaini Hosni e Sérgio Miguens Jr. Foi muito bom ter compartilhado com vocês
esse tempo, sentirei muitas saudades e espero que possamos nos reencontrar
sempre.
Ao amigo e irmão Fernando “Fefo” Schneider, grata novamente pela ajuda,
obrigada pelo pouso, pela hospitalidade, pelas correrias que fizestes para mim,
enfim por tudo. “Alamaula!”, não sei se percebestes mas já fez parte de muita coisa
na minha vida. Obrigada sempre.
Aos Pacientes do Serviço de Estomatologia do Hospital São Lucas da
PUCRS que são pelas lições de luta, de superação e de força.
À todos os Parentes e Amigos, que de uma maneira ou de outra fizeram
parte desse trabalho, incentivando, escutando ou simplesmente por estarem ali por
perto, me fazendo sentir o aconchego de estar ao lado de quem se gosta.
RESUMO
7
RESUMO
Este estudo avaliou a vasculatura dos linfonodos submandibulares em
diferentes tempos cicatriciais de ferida cirúrgica produzida em ventre de língua de
ratos Wistar machos. Através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), foram
avaliados 123 linfonodos pela técnica de moldagem vascular, e em microscopia de
luz, foram avaliados 232 linfonodos através de cortes histológicos corados com HE,
nos tempos 2, 3, 7, 10, 14 e 21 dias pós-operatórios. Analisando os cortes
histológicos, verificou-se que o interior dos nódulos foliculares apresentou uma
quantidade pequena de vasos sanguíneos, ficando estes concentrados na porção
basal desses nódulos. Quando os grupos experimentais foram comparados entre si,
constatou-se maior quantidade de vasos sanguíneos aos 21 dias pós-operatórios,
não diferindo significativamente dos tempos de 2, 7 e 14 dias. Quando os grupos
experimentais foram comparados aos controles, constatou-se diferença significativa
aos 2, 3, 14 e 21 dias pós-operatórios em relação ao número médio de vasos
sanguíneos. Durante a análise dos modelos vasculares através da MEV, mensurou-
se a área dos nódulos foliculares e os diâmetros dos capilares que circundam esses
nódulos. Observou-se um aumento significativo no diâmetro dos capilares a partir do
segundo dia, que persistiu até o décimo dia pós-operatório. A área dos nódulos
foliculares aumentou significativamente somente a partir do terceiro dia e esse
aumento persistiu até o décimo-quarto dia pós-operatório. A angiogênese por
intussuscepção foi vista em todos os grupos avaliados, no entanto, em maior
quantidade no segundo e terceiro dia pós-operatório (83,33% e 80%
respectivamente). Observou-se, no presente estudo, que o aumento do diâmetro dos
capilares ocorreu anteriormente ao aumento da área dos nódulos foliculares, e que a
quantidade de vasos sanguíneos foi semelhante na porção basal dos nódulos
foliculares e na região periférica ao córtex profundo.
Palavras-chave: modelo vascular; inflamação; processo de reparo; linfonodos.
ABSTRACT
9
ABSTRACT
This study evaluated the vasculature of the submandibular lymph nodes in
different healing stages of surgical wound produced in tongues from male Wistar rats.
Using scanning electron microscopy (SEM), 123 lymph nodes were evaluated
through the corrosion cast technique, and using light microscopy, 232 lymph nodes
were evaluated through the histological sections stained with hematoxylin and eosin
after 2, 3, 7, 10, 14 and 21 postoperative days.
Analyzing the histological sections, it was observed that inside of the follicule-
nodules there was a small quantity of blood vessels, most of them concentrated in
the basal portion. When the experimental groups were compared it was observed
that after 21 post operative days there was the major quantity of blood vessels not
presenting significant difference in the 2, 7 and 14 post operative days. When the
experimental groups were compared with the controls it was observed a significant
difference in the 2, 3, 14 and 21 post operative days in relation to the average
number of blood vessels. During the analysis of the vascular models through the
SEM, it was measured the area of follicule-nodules and the diameter of the capillaries
that surround those nodules. A significant increase in the diameter of the capillaries
was observed starting from the second day and persisted until the tenth post
operative day. The area of the folliculo-nodules increased significantly only after the
third day and this increasing persisted until the fourteenth post surgical day. The
intussusceptive angiogenesis was seen in all evaluated groups, although it was in
larger amount in the second and third postoperative days (83,33% and 80%
respectively). In this study, it was observed that the increase of vascular diameter
occurred before the increase of the folliculo-nodules area, and the quantity of blood
vessels were similar in the basal portion of the follicule-nodules and the peripherical
region of the deep cortex.
Key words: corrosion cast; inflammation; wound healing; lymph node.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Mesa cirúrgica interposta entre os maxilares e amarrilho envolvendo
os incisivos inferiores .............................................................................. 46
Figura 2- a) Ponta ativa do punch; b) posicionamento do punch 90° em relação
ao ventre lingual ..................................................................................... 47
Figura 3- Incisão realizada na base da ferida ........................................................ 47
Figura 4- a) Ventre incisionado do animal; b) incisão transversal realizada
abaixo do esterno; c) incisão do diafragma (seta); d) injeção da
heparina diretamente no coração; e) incisão relaxante realizada nas
costelas direitas e esquerdas; f) individualização da artéria aorta
ascendente; g) pinçamento da artéria aorta descendente; h) fixação
do cateter no interior da artéria aorta ascendente; i) incisão do átrio
direito ...................................................................................................... 49
Figura 5- a) Incisão linear desde a sínfise mentoniana até o pescoço; b)
divulsão da pele com tesoura de ponta romba; c) incisão realizada
abaixo da mandíbula; d) visualização da área contendo os linfonodos;
e) incisão profunda logo acima dos linfonodos; f) incisão realizada nas
porções laterais e em profundidade para remoção da peça; g) peça
contendo linfonodos, glândulas sublinguais e glândulas
submandibulares bilaterais ..................................................................... 50
Figura 6- Remoção dos tecidos superficiais com tesoura de ponta romba ........... 51
Figura 7- Visualização dos linfonodos (1), das glândulas sublinguais (2) e das
glândulas submandibulares (3) ............................................................... 51
Figura 8- Posição do linfonodo no emblocamento ................................................. 52
11
Figura 9- a) Modelo esquemático dos locais avaliados em cada linfonodo. HE,
40X de aumento; b) maior aumento do local N2 demonstrando as
áreas avaliadas em cada nódulo folicular. HE, 100X de aumento ......... 52
Figura 10- a e b) Imagens demonstrando a seqüência utilizada para a contagem
dos vasos sanguíneos ............................................................................ 53
Figura 11- a) Espécimes colados nos stubs; b) espécimes metalizados com a
utilização de fios de cobre (setas) .......................................................... 55
Figura 12- a) Eletromicrografia de varredura demonstrando a divisão do linfonodo
em quadrantes. 26X de aumento; b) eletromicrografia de varredura
demonstrando as medidas do diâmetro no eixo X e no eixo Y dos
nódulos foliculares. 200X de aumento .................................................... 56
Figura 13- Eletromicrografia de varredura demonstrando a mensuração do
diâmetro dos vasos sanguíneos na superfície do nódulo folicular. 400X
de aumento ............................................................................................. 56
Figura 14- Vaso sanguíneo com endotélio cúbico, característico das áreas
internodulares. a) HE, 200X de aumento; b) HE, 400X de aumento ...... 63
Figura 15- a) Figura demonstrando nódulo folicular (círculo) e o local no interior
do centro germinativo onde foi realizada a avaliação (retângulo). HE,
40X de aumento; b) visão mais aproximada no centro germinativo
demonstrando a presença de um capilar (seta amarela). HE, 200X de
aumento .................................................................................................. 63
Figura 16- a) Figura demarcando a porção apical de um nódulo folicular
(retângulo). HE, 40X de aumento; b) presença de capilar no interior da
área demarcada (seta amarela). HE, 200X de aumento ........................ 64
12
Figura 17- Cadeia vascular em forma de “cesto” circundando o nódulo folicular
em suas porções inferior. a) 40X de aumento; b) 100X de aumento ..... 64
Figura 18- Vênulas de endotélio alto observadas na zona internodular (área
A2/A3) de animais-controle (setas). HE, 400X de aumento …............... 65
Figura 19- Vênulas de endotélio alto observadas na porção basal dos nódulos
foliculares (área A4) de animais-controle (setas). HE, 400X de
aumento……………………………………………………………………….. 65
Figura 20- Vênulas de endotélio alto observadas na zona internodular (área
A2/A3) de animais dos grupos 2, 3, 4, 5 e 6. Setas localizadas na
periferia das vênulas. HE, 400X de aumento ......................................... 66
Figura 21- Vênulas de endotélio alto observadas na porção basal dos nódulos
foliculares (área A4) de animais dos grupos 2, 3, 4, 5 e 6. Setas
localizadas na periferia das vênulas. HE, 400X de aumento ................. 66
Figura 22- Vênulas de endotélio alto observadas na zona internodular (área
A2/A3) e na porção basal (A4) dos nódulos foliculares de animais do
grupo 6. Setas localizadas na periferia das vênulas. a) HE, 200X de
aumento; b) HE, 200X de aumento; c) HE, 400X de aumento; d) HE,
400X de aumento .............. .................................................................... 67
Figura 23- a) Imagem demonstrando a presença de córtex profundo. HE, 40X de
aumento; b) delimitação do córtex externo (1) e do córtex profundo (2).
HE, 40X de aumento .............................................................................. 68
Figura 24- Vênulas de endotélio alto com endotélio mais regular observadas na
região de córtex profundo (área C1/C2). HE, 400X de aumento ............ 68
Figura 25- Linfócito realizando diapedese (seta). HE, 400X de aumento ................ 68
13
Figura 26- a) Endotélio regular das vênulas presentes na zona medular. HE,
400X de aumento; b) contato íntimo das vênulas (seta preta) com os
cordões medulares (seta azul). HE, 200X de aumento .......................... 69
Figura 27- a) Eletromicrografia de varredura de modelos arteriais; setas indicam a
impressão nuclear. 4000X de aumento; b) eletromicrografia de
varredura de vasos sanguíneos exibindo impressão nuclear (setas
azuis) além da impressão do limite celular (setas pretas). 4000X de
aumento; c) eletromicrografia de varredura de modelos de vênulas
regulares; setas indicam a impressão nuclear. 4000X de aumento; d)
eletromicrografia de varredura de modelos de vênulas de endotélio
alto. 1180X de aumento .......................................................................... 71
Figura 28- a) Eletromicrografia de varredura demonstrando densa rede vascular,
interrompida pelos nódulos foliculares, presentes no córtex externo.
26X de aumento; b) eletromicrografia de varredura demonstrando o
interior dos nódulos foliculares com mínima quantidade de vasos
(seta). 200X de aumento ........................................................................ 72
Figura 29- Eletromicrografia de varredura demonstrando a cadeia de capilares
formando plexo semelhante à cúpula na superfície externa dos
nódulos foliculares; a) 188X de aumento; b) 500X de aumento ............. 72
Figura 30- Eletromicrografia de varredura demonstrando encontro entre um
capilar e uma vênula de endotélio alto (seta). 1000X de aumento ......... 72
Figura 31- Eletromicrografia de varredura dos diferentes padrões de chanfros
circulares observados no encontro de um capilar com uma vênula de
endotélio alto. a) 2000X de aumento; b) 8000X de aumento; c) 1000X
de aumento; d) 4000X de aumento; e) 1000X de aumento; f) 4000X de
aumento; g) 1000X de aumento; h) 4000X de aumento ........................ 73
Figura 32- Eletromicrografia de varredura demonstrando área de constrição no
calibre vascular na união de um capilar com uma vênula de endotélio
14
alto; a) 1000X de aumento; b) medidas demonstrando a diminuição do
calibre no local de união do capilar com a vênula de endotélio alto.
8000X de aumento ................................................................................. 73
Figura 33- Eletromicrografia de varredura demonstrando característica da rede
vascular formada pelas vênulas de endotélio alto na base e nas
laterais dos nódulos foliculares (setas amarelas) e vasos de fundo
cego (setas vermelhas) na periferia dos nódulos foliculares. 200X de
aumento ………………………………………………………………………. 74
Figura 34- Eletromicrografia de varredura demonstrando a fusão de vênulas de
endotélio alto de menor calibre formando vênulas de calibre maior na
porção mais interna dos linfonodos; a) 600X de aumento; b) medidas
demonstrando o aumento do calibre das vênulas de endotélio alto
conforme se aproximam do interior do linfonodo, 500X de aumento ..... 74
Figura 35- Eletromicrografia de varredura demonstrando característica das
vênulas de endotélio alto presentes no grupo-controle e no grupo 1; a)
700X de aumento; b) medidas demonstrando o aumento do calibre
das vênulas de endotélio alto conforme se aproximam do interior do
linfonodo, 600X de aumento ……………………………........................... 75
Figura 36- Eletromicrografia de varredura demonstrando a cópia do espaço
perivascular; a) 875X de aumento; b) seta indicando um capilar
interposto ao espaço perivascular. 1750X de aumento .......................... 75
Figura 37- Eletromicrografia de varredura dos diferentes padrões de angiogênese
por intussuscepção observados nos modelos vasculares. a) 2000X de
aumento; b) 8000X de aumento; c) 1000X de aumento; d); 4000X de
aumento; e) 2000X de aumento; f) 4000X de aumento; g) 1000X de
aumento; h) 8000X de aumento; i) 2000X de aumento; j) 8000X de
aumento; k) 2000X de aumento; l) 8000X de aumento .......................... 76
15
Figura 38- a) Eletromicrografia de varredura dos diferentes padrões de
angiogênese por intussuscepção observados nos modelos vasculares
do grupo 6. a) 2000X de aumento; b) 8000X de aumento; c) 2000X de
aumento; d); 8000X de aumento; e) 2000X de aumento; f) 8000X de
aumento; g) 2000X de aumento; h); 8000X de aumento ....................... 77
Figura 39- a) Eletromicrografia de varredura demonstrando as características dos
vasos sanguíneos presentes na cápsula dos linfonodos. 51X de
aumento; b) eletromicrografia de varredura demonstrando parte da
cápsula sobreposta aos nódulos foliculares (setas). 100X de
aumento................................................................................................... 77
Figura 40- Eletromicrografia de varredura demonstrando artérias da cápsula
(setas) lançando ramos de menor calibre para a região de córtex
externo; a) 250X de aumento b) 500 de aumento; c) 700X de
aumento; d) 600X de aumento ............................................................... 78
Figura 41- Eletromicrografia de varredura demonstrando as características da
vasculatura presente na região do hilo. a) 63X de aumento b)
eletromicrografia de varredura demonstrando veia de grande calibre
penetrando no interior do linfonodo através do hilo. 252X de aumento;
c) 250X de aumento; d) eletromicrografia de varredura demonstrando
veia e artéria penetrando no interior do linfonodo através do hilo.
1154X de aumento ................................................................................. 79
16
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Número de animais e peso médio (g) inicial e final nos grupos
experimentais (excetuando-se os animais-controle). Porto Alegre,
2007 ........................................................................................................ 60
Tabela 2- Concordância intra-examinador em relação ao número de vasos
sanguíneos presentes nas áreas avaliadas. Porto Alegre, 2007 ........... 60
Tabela 3- Número médio total e desvio-padrão (dp) de vasos sanguíneos nos
diferentes grupos experimentais, quando excluídos os animais-
controle. Porto Alegre, 2007.................................................................... 61
Tabela 4- Número médio e desvio-padrão (dp) de vasos sanguíneos nas
diferentes áreas de cada grupo experimental, quando excluídos os
animais-controle. Porto Alegre, 2007 ..................................................... 62
Tabela 5- Número médio total e desvio-padrão (dp) de vasos sanguíneos
presentes nos grupos experimentais comparados com o número
médio total de vasos sanguíneos do respectivo animal-controle. Porto
Alegre, 2007............................................................................................ 62
Tabela 6- Média e desvio-padrão (dp) das áreas dos nódulos foliculares nos
diferentes grupos experimentais. Porto Alegre, 2007 ............................. 69
Tabela 7- Média e desvio-padrão (dp) dos diâmetros dos vasos sanguíneos nos
diferentes grupos experimentais. Porto Alegre, 2007 ............................. 70
Tabela 8- Número total de animais (n) e porcentagem de animais com
angiogênese por intussuscepção nos diferentes grupos experimentais.
Porto Alegre, 2007...................................................................................
76
17
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice A- Peso (g) inicial dos animais nos grupos experimentais .................... 116
Apêndice B- Peso (g) final dos animais nos grupos experimentais ....................... 117
Apêndice C- Identificação das lâminas coradas por HE, de acordo com o grupo
experimental e dia da morte .............................................................. 118
18
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1- Protocolo de aprovação do projeto na Comissão Científica e de Ética
da Faculdade de Odontologia da PUCRS .............................................. 120
Anexo 2- Protocolo de aprovação do projeto no Comitê de Ética do Hospital São
Lucas da PUCRS .................................................................................... 121
Anexo 3- Metodologia da técnica de modelos de corrosão vascular aplicada em
linfonodos ………………………………………………............................... 122
19
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ANOVA – Análise de Variância
CEMM – Centro de Microscopia e Microanálises
CREAL – Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório
EGF – Fator de crescimento epidérmico
FGF – Fator de crescimento de fibroblastos
FO – Faculdade de Odontologia
g – grama
HE – Hematoxilina de Harris e Eosina alcoólica
VEA – Vênula de endotélio alto
HGF – Fator de crescimento de hepatócitos
ICBS – Instituto de Ciências Básicas de Saúde
IGF – Fator de crescimento semelhante a insulina
IL – Interleucina
Kg – kilograma
KGF – Fator de crescimento de queratinócitos
kV – kilovolt
MEC – Matriz extracelular
MEV – microscopia eletrônica de varredura
ml – mililitro
mm – milímetro
PDGF – Fator de crescimento derivado de plaquetas
PF4 – Fator de plaquetas 4
pH – Potencial de hidrogênio
PUCRS – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
TGF – Fator de crescimento de transformação
TNF – Fator de necrose tumoral
UFPel – Universidade Federal de Pelotas
UFRGS – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
UI – Unidade internacional
V – volts
VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular
20
µm – micrômetro
π - Pi
SUMÁRIO
22
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO .............................................................................. 25
2
REVISÃO DE LITERATURA.......................................................... 27
2.1 MODELO DE CORROSÃO VASCULAR E CARACTERIZAÇÃO
HISTOLÓGICA DO SISTEMA LINFÁTICO E LINFONODOS ........................27
2.2 PROCESSO DE REPARO DE FERIDAS.......................................................30
2.2.1 Fase inflamatória ................................................................................................31
2.2.2 Fase proliferativa ................................................................................................34
2.2.2.1 Epitelização .........................................................................................................34
2.2.2.2 Fibroplasia ..........................................................................................................34
2.2.2.3 Angiogênese......................................................................................................... 35
2.2.2.3.1 Angiogênese por brotamento............................................................................ 37
2.2.2.3.2 Angiogênese por intussuscepção ...................................................................... 37
2.2.3 Fase de remodelamento....................................................................................... 38
2.3 IMUNOLOGIA NO PROCESSO DE REPARO DE FERIDAS.........................39
3
OBJETIVOS .................................................................................. 43
3.1 OBJETIVO GERAL.........................................................................................43
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..........................................................................43
4
MATERIAL E MÉTODOS .............................................................. 45
4.1 APROVAÇÃO DO PROTOCOLO DE PESQUISA..........................................45
4.2 MICROSCOPIA DE LUZ ................................................................................45
4.2.1 Amostra................................................................................................................ 45
4.2.2 Grupos experimentais..........................................................................................45
4.2.3 Procedimento cirúrgico...........................................................................46
4.2.4 Procedimento cirúrgico de perfusão e morte ......................................................48
4.2.5 Dissecação dos linfonodos ..................................................................................50
4.2.6 Preparo dos espécimes para análise em microscopia de luz.................51
4.2.7 Análise dos espécimes corados por Hematoxilina e Eosina em microscopia de
luz ........................................................................................................................52
4.2.7.1 Análise quantitativa..............................................................................................53
4.2.7.2 Análise qualitativa................................................................................................54
4.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA.........................................54
4.3.1 Amostra................................................................................................................ 54
4.3.2 Preparo dos espécimes para análise em microscopia eletrônica de varredura
(MEV) .................................................................................................................. 54
4.3.3 Análise dos espécimes em microscopia eletrônica de varredura (MEV)............55
4.3.3.1 Análise quantitativa..............................................................................................55
4.3.3.2 Análise qualitativa................................................................................................57
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................57
4.4.1 Análise em microscopia de luz ............................................................................57
4.4.2 Análise em microscopia eletrônica de varredura................................................ 57
5
RESULTADOS .............................................................................. 60
5.1 CARACTERÍSTICA DA AMOSTRA................................................................60
5.2 ANÁLISE DOS ESPÉCIMES EM CORTES HISTOLÓGICOS CORADOS
COM HEMATOXILINA E EOSINA..................................................................60
23
5.2.1 Análise quantitativa da vasculatura dos linfonodos nos diferentes grupos
experimentais.......................................................................................................60
5.2.2 Análise qualitativa da vasculatura dos linfonodos nos diferentes grupos
experimentais.......................................................................................................62
5.2.2.1 Características da vasculatura da região de córtex externo ...............................62
5.2.2.2 Características da vasculatura da região de córtex profundo............................. 67
5.2.2.3 Características da vasculatura da região medular..............................................68
5.3 ANÁLISE DOS ESPÉCIMES EM MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
VARREDURA (MEV)......................................................................................69
5.3.1 Análise quantitativa da área dos nódulos foliculares nos diferentes grupos
experimentais.......................................................................................................69
5.3.2 Análise quantitativa do diâmetro dos modelos vasculares nos diferentes grupos
experimentais.......................................................................................................70
5.3.3 Análise qualitativa da vasculatura dos linfonodos nos diferentes grupos
experimentais.......................................................................................................70
5.3.3.1 Característica da vasculatura da região de córtex externo ................................. 71
5.3.3.2 Característica da vasculatura da cápsula dos linfonodos ................................... 77
5.3.3.3 Característica da vasculatura da região do hilo ................................................. 78
6
DISCUSSÃO ................................................................................. 81
7
CONCLUSÕES ............................................................................103
7.1 QUALITATIVAS............................................................................................103
7.2 QUANTITATIVAS .........................................................................................103
REFERÊNCIAS...................................................................................106
APÊNDICES .......................................................................................116
ANEXOS.............................................................................................120
1 INTRODUÇÃO
25
1 INTRODUÇÃO
Os linfonodos são cadeias de filtragem que estão intercaladas aos vasos
linfáticos e recebem linfa e antígenos de uma região circunscrita. Durante um trauma
os vasos linfáticos passam a representar a principal rota de drenagem do leito
cirúrgico (ALLER et al., 2004b) e, através da linfa aferente, o fluido inflamatório dos
tecidos juntamente com leucócitos, antígenos, restos celulares, proteínas
plasmáticas e fibrina são transportados para os linfonodos regionais que em
resposta ao estímulo, aumentam de peso e tamanho. No momento seguinte ao
trauma tecidual, um complexo processo é desencadeado e culmina com a
cicatrização da ferida. Durante a cicatrização, seqüência de eventos biológicos e
celulares orquestrados, interdependentes e sobrepostos, muitas substâncias são
liberadas para que a integridade dos tecidos seja restaurada. Dentre essas
substâncias estão as vasoativas e os fatores de crescimento que estimulam a
angiogênese.
A angiogênese, processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a
partir de outros pré-existentes (DVORAK, 2005), é um evento estimulado durante o
reparo em decorrência de desequilíbrio entre a quantidade de fatores pró-
angiogênicos e antiangiogênicos no interior da ferida. Muito tem sido estudado sobre
angiogênese e por estar diretamente envolvida em processos inflamatórios e
neoplásicos. As técnicas histológicas, na análise dos eventos morfológicos da
angiogênese, apresentam como principal limitação o aspecto bidimensional dos
cortes, limitação essa que pode ser superada com a aplicação da técnica de
corrosão vascular permitindo a aquisição de imagens tridimensionais que
possibilitam o estudo morfológico da angioarquitetura existente e da
neovascularização.
O objetivo do presente estudo foi avaliar a vasculatura dos linfonodos
submandibulares em animais-controle e em diferentes tempos do processo cicatricial
de ferida cirúrgica produzida em ventre de língua de ratos através de modelos de
corrosão e cortes histológicos. A razão reside na idéia de que as substâncias
liberadas no fluido da ferida são direcionadas até os linfonodos regionais e causam
alterações vasculares nesses órgãos e por acreditar que a compreensão e o
diagnóstico de alterações patológicas necessita o prévio conhecimento das
estruturas em seu estado normal.
2 REVISÃO DA LITERATURA
27
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 MODELO DE CORROSÃO VASCULAR E CARACTERIZAÇÃO
HISTOLÓGICA DO SISTEMA LINFÁTICO E LINFONODOS
A técnica de modelo de corrosão representa a obturação de espaços vazios
com um material autopolimerizável e resistente à ação corrosiva dos ácidos
empregados na maceração dos tecidos moles e à limpeza final da superfície dos
modelos (LAMETSCHWANDTNER et al., 1989). Essa técnica tem se tornado um
eficiente método de estudar a organização tridimensional da vasculatura dos órgãos,
através da MEV, além de possibilitar a avaliação da relação espacial entre os
diferentes tipos de vasos (CASTENHOLZ, 1989). Rotineiramente essa técnica é
utilizada em animais de laboratório, mas alguns poucos casos são descritos em
órgãos humanos (GRADE et al., 1994; SANGIORGI et al., 2004). A identificação dos
diferentes tipos de vasos sanguíneos é obtida pela análise das impressões deixadas
pelo endotélio vascular sobre a superfície do modelo adquirido (CASTENHOLZ,
1995; VERLI, 2006).
O modelo de corrosão também pode ser aplicado no estudo do sistema
linfático através da injeção da resina diretamente no interstício ou no interior dos
vasos linfáticos (CASTENHOLZ, 1986). A vasculatura linfática não forma um sistema
circulatório fechado, pois transporta unidirecionalmente fluidos, proteínas e células,
extravasadas do plasma e acumuladas nos espaços intersticiais, de volta aos vasos
sanguíneos (SCAVELLI et al., 2004) mantendo, junto com o sistema vascular, a
hemostasia tecidual (AL-RAWI et al., 2005). Estruturalmente os vasos linfáticos são
divididos em iniciais, pré-coletores e coletores. Os vasos linfáticos iniciais não
apresentam células murais e são caracterizados por uma membrana basal ausente
ou incompleta (PODGRABINSKA et al., 2002). Essas estruturas de fundo cego têm a
função de captar fluido, proteínas, partículas e células presentes no interstício e
apresentam suas células endoteliais unidas diretamente aos tecidos subjacentes por
finos filamentos de ancoragem (SCAVELLI et al., 2004). A união de vários vasos
linfáticos iniciais dá origem aos vasos linfáticos pré-coletores que estão envolvidos
na propulsão da linfa e representam a rota de drenagem inicial. Os vasos linfáticos
coletores, formados pela fusão dos pré-coletores, auxiliam na propulsão da linfa,
28
impedem o fluxo retrógrado pela presença de válvulas e são intercalados por
linfonodos, local onde a linfa é drenada (SCAVELLI et al., 2004).
A neoformação de novos linfáticos a partir de vasos pré-existentes, ou
linfangiogênese, ocorre em tecidos normais e em processos patológicos como
inflamação, reparo de feridas e câncer (JI, 2005). A linfangiogênese é reativada
devido a notável capacidade das células endoteliais de se dividirem em resposta a
um estímulo, principalmente pela inflamação, mesmo estando quiescentes durante a
maior parte do tempo no adulto (CARMELIET, 2005). A linfangiogênese está
basicamente ligada a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)
que é liberado durante a injúria tecidual (AL-RAWI et al., 2005). A atuação do VEGF
nesse fenômeno foi comprovada por Nagy et al. (2002) depois de aplicarem essa
citocina em orelha de ratos e observarem a formação de vasos linfáticos gigantes.
Os vasos linfáticos têm um importante papel no sistema imunológico por
transportarem células brancas, do sangue e medula óssea, para o interior dos
órgãos linfóides (SCAVELLI et al., 2004), além de direcionarem células
apresentadoras de antígenos dos tecidos para os linfonodos (OLIVER, 2004; AL-
RAWI et al., 2005). Os linfonodos são estruturas revestidas por cápsula de tecido
conjuntivo, constituídas por uma região cortical externa, pelo córtex profundo e uma
região medular que se irradia a partir do hilo para o interior do linfonodo (SAINTE-
MARIE et al., 1990). O córtex externo está presente em quase toda a periferia dos
linfonodos e é separado da cápsula pelo seio subcapsular, estrutura avascular que
recebe, através dos vasos linfáticos aferentes, as células direcionadas dos tecidos
para os linfonodos (OKADA et al., 2002). O seio subcapsular possui poros que
possibilitam sua comunicação com o centro germinativo e com o espaço perivascular
no córtex externo (OKADA et al., 2002) e, próximo a porção hilar, apresenta-se
contíguo aos sinusóides medulares (OHTANI et al., 2003). O córtex externo
compreende os nódulos foliculares, locais de produção de linfócitos B, separados
entre si pelas regiões internodulares. Cada nódulo folicular apresenta forma ovóide
ou esférica (BELISLE; SAINTE-MARIE, 1990), diâmetro entre 70-100µm (OKADA et
al., 2002) e compreende um folículo linfóide e um centro germinativo (BÉLISLE;
SAINTE-MARIE, 1981a). O córtex profundo, porção contígua ao córtex externo e
responsável pela produção de células T, é formado por unidades semi-esféricas ou
semi-ovais, que se projetam para o interior da porção medular (BÉLISLE; SAINTE-
29
MARIE, 1981b), sendo cada unidade revestida por uma área de córtex externo,
contendo de dois a seis nódulos foliculares (SAINTE-MARIE et al., 1990).
O linfonodo não é uma entidade fisiológica que responde como um todo à
estimulação feita por elementos imunogênicos, e sim uma entidade morfológica e
funcionalmente compartimentalizada. Cada compartimento compreende: a abertura
de um vaso linfático no seio subcapsular, a porção do seio subcapsular que recebe a
linfa, a porção correspondente do córtex externo subjacente, uma unidade de córtex
profundo e os cordões medulares contíguos a esses elementos corticais (SAINTE-
MARIE et al., 1990).
O suprimento vascular de linfonodos cervicais humanos foi avaliado através
da observação de modelos de corrosão vascular em MEV, e estes seguem o mesmo
padrão vascular observado em linfonodos de animais de pequeno porte (GADRE et
al., 1994). Os vasos sanguíneos acessam os linfonodos através de seu hilo e na
porção medular as artérias dão origem a muitas arteríolas, algumas das quais
alcançam diretamente o córtex externo. As arteríolas medulares tornam-se arteríolas
corticais que se dividem formando muitos capilares na periferia do córtex profundo e
na zona internodular sem alcançar o seio subcapsular (OKADA et al., 2002).
Superficialmente aos nódulos foliculares, a cadeia de capilares forma uma
cúpula e, profundamente, esses capilares se conectam diretamente a um tipo
especial de vasos, referidos como vênulas pós-capilares ou vênulas de endotélio
alto (VEA) (BÉLISLE; SAINTE-MARIE, 1985), que são visualizadas nas margens
laterais e porção basal dos nódulos foliculares, mas não no interior desses espaços
(BÉLISLE; SAINTE-MARIE, 1990). As VEAs apresentam endotélio cubóide e são
responsáveis pelo transporte de linfócitos virgens para o interior do córtex dos
linfonodos (CYSTER, 2000; GRETZ et al., 2000). Os demais linfócitos entram nos
linfonodos via linfa aferente juntamente com antígenos e outros tipos de células
hematopoiéticas como as células dendríticas, macrófagos e granulócitos (IRJALA et
al., 2003). Durante a observação de modelos vasculares em MEV, constata-se
nessas VEAs um padrão de marcas profundas e cristas altas, deixando um perfil
corrugado sobre a superfície de seu modelo (CASTENHOLZ, 1989). As vênulas de
endotélio alto (VEAs) expressam, sobre sua superfície, moléculas de adesão e
quimiocinas necessárias para o extravasamento de células para o interior do
parênquima do linfonodo (von ANDRIAN; MEMPEL, 2003) e, por esse motivo,
30
quando visualizadas em MEV, podem apresentar alguns espaços vazios compatíveis
com a diapedese realizada pelos linfócitos (CASTENHOLZ, 1995).
Os numerosos brotos iniciais das VEAs, presentes na porção mais superficial
do córtex externo, se fundem dando origem a vênulas de maior calibre e estas são
encontradas na porção mais interna do linfonodo. Na parte profunda da zona
internodular ocorre conexão entre os troncos maiores das VEAs e, quando
observados na porção cortical que reveste diretamente a medula, são contíguas com
vênulas de endotélio regular dos cordões medulares. Quando observadas no córtex
profundo as VEAs se concentram na periferia dessa região e excepcionalmente são
encontradas no centro dessa unidade (BÉLISLE; SAINTE-MARIE, 1990).
2.2 PROCESSO DE REPARO DE FERIDAS
A ferida cirúrgica caracteriza-se pela descontinuidade do tecido epitelial com
exposição de áreas do tecido conjuntivo e isso desencadeia um complexo processo
que culmina na cicatrização da ferida (BROUGHTON et al., 2006) e no
restabelecimento da proteção epitelial recuperando a força, integridade e função
tecidual (THEORET, 2005).
O processo de cicatrização da ferida é uma seqüência de eventos biológicos
e celulares orquestrados, interdependentes e sobrepostos, cujo objetivo comum é
restaurar a integridade dos tecidos (LINGEN, 2001; BROWN et al., 1992; PARK;
BARBUL, 2004). Esse processo pode ser dividido em fases inflamatória, proliferativa
e de remodelamento (KIRSNER; EAGLSTEIN, 1993; DI VITA et al., 2005; OLUTOYE
et al., 2005; THEORET, 2005).
A fase inflamatória, de curta duração, é caracterizada basicamente pela
vasodilatação, exsudação de fluido rico em proteínas (SHERWOOD; TOLIVER-
KINSKY, 2004), migração de células do sangue para os tecidos e liberação dos
mediadores e citocinas dessas células (KIRSNER; EAGLSTEIN, 1993; DI VITA et
al., 2005). Na fase proliferativa ocorrem os eventos de reepitelização, angiogênese e
fibroplasia, enquanto que a fase de remodelação caracteriza-se pela deposição de
produtos da matriz e subseqüente mudança das características da mesma em
função do tempo (KIRSNER; EAGLSTEIN, 1993; BROUGHTON et al., 2006).
31
2.2.1 Fase inflamatória
A resposta inflamatória é essencial ao reparo e ocorre de forma significativa
como resultado da agregação plaquetária e ativação do complemento na resposta à
injúria tecidual (SCHROCK et al., 1982). A fase inflamatória do processo de reparo
de feridas cirúrgicas é similar em progressão a outras condições inflamatórias
agudas (SZPADERSKA; DIPIETRO, 2005), sendo sua intensidade determinada pela
intensidade do trauma (THEORET, 2005). A inflamação é uma importante reação de
defesa a qual, num primeiro momento, objetiva a restrição, destruição e eliminação
do irritante e, num segundo momento, envolve a regeneração do local injuriado
(SCHROCK et al., 1982; ANISMAN et al., 1996b; SZPADERSKA; DI PIETRO, 2005).
Em feridas cirúrgicas onde os bordos epiteliais não estão em íntimo contato, ocorre a
cicatrização por segunda intenção e a resposta inflamatória é mais intensa quando
comparada com as feridas em que a união primária acontece (GREENHALGH,
1998).
Quando a barreira tecidual é quebrada e o endotélio dos vasos sanguíneos é
rompido, ocorre vasoconstrição momentânea seguida por vasodilatação que facilita
a entrega local de plasma, plaquetas, eritrócitos, leucócitos e mediadores solúveis
(SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; THEORET, 2005). A vasodilatação
induzida pela inflamação é mediada primariamente pelas prostaglandinas e pelo
óxido nítrico (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Os elementos mais
importantes imediatamente após a injúria são as plaquetas (KIRSNER; EAGLSTEIN,
1993; OLUTOYE et al., 2005) que, na presença de condições fisiológicas, não
interagem com a parede dos vasos (KISUCKA et al., 2006). Contudo, em resposta à
injúria vascular, quando a matriz extracelular (MEC) subjacente e o subendotélio
estão expostos, a adesão plaquetária e subseqüente formação de trombo ocorrem
através da ativação da cascata de coagulação (van HINSBERGH, 2001;
SCHOENMAKERS et al., 2005; THEORET, 2005). A ativação das plaquetas resulta
na degranulação e liberação de mediadores contidos em seus grânulos que iniciam
a adesão de outras plaquetas àquelas já aderidas (KIRSNER; EAGLSTEIN, 1993).
Além da adesão de outras plaquetas, promovida pelo fator de von Willembrand
(KISUCKA et al., 2006), fibrinogênio, fibronectina e trombospondina, outros
mediadores como a adenosina difosfato (APPLETON, 1994; LI et al., 2007) e
trombina, recrutam mais plaquetas, permitindo a formação do trombo. Além disto,
32
outros mediadores como a serotonina e o tromboxano reduzem ainda mais a perda
sanguínea pelo efeito vasoconstritor (SANTIAGO-DELPÍN, 2004). Além de promover
a coagulação sanguínea, os produtos da cascata de coagulação são responsáveis
pela produção de citocinas pró-inflamatórias como interleucina 6 (IL-6), interleucina
1β (IL-1), interleucina 8 (IL-8) e fator de necrose tumoral α (TNF-α)
(SCHOENMAKERS et al., 2005). As plaquetas são também extremamente
importantes na secreção dessas citocinas pró-inflamatórias e de fatores de
crescimento como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF), o fator de crescimento α e β de
transformação (TGF-α e TGF-β), o fator 4 de plaquetas (PF4), o fator de crescimento
epidérmico (EGF) e o fator de crescimento semelhante a insulina (IGF) (SCHROCK
et al., 1982; SENIOR et al., 1983; APPLETON, 1994; MÖHLE et al., 1997; YANG et
al., 1999; CARMELIET, 2003; THEORET, 2005; BROUGHTON et al., 2006) os quais
estimulam a migração de leucócitos. Além desses mediadores as plaquetas ainda
liberam o conteúdo dos seus grânulos α como a serotonina, histamina,
prostaglandina, bradicinina, tromboxano (BROUGHTON et al., 2006) e a P-selectina,
que permite o rolamento dos leucócitos sobre o endotélio das VEAs (OLUTOYE et
al., 2005).
A principal função da cascata de coagulação é assegurar a formação de um
coágulo hemostático estável (CHAMBERS; LAURENT, 2002). A ativação da cascata
de coagulação ocorre tanto pela via extrínseca, fonte primária da coagulação,
quanto pela intrínseca, importante na produção de bradicinina, um mediador
vasoativo que aumenta a permeabilidade vascular, e ambos os caminhos induzem a
formação de fibrina que promove a coagulação sanguínea (GAJDUSEK et al., 1986).
O caminho intrínseco da coagulação é representado por uma série de proteínas do
plasma que são ativadas quando o fator de Hageman (fator XII) entra em contato
direto com o colágeno, membrana basal ou plaquetas ativadas. A ativação do fator
XII resulta na conversão de pró-enzimas em enzimas ativadas culminando na
transformação da protrombina em trombina (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004;
LI et al., 2007). O caminho extrínseco por sua vez é iniciado pela produção de fator
tecidual que é expresso sobre a superfície dos tecidos que normalmente não se
encontram expostos ao compartimento vascular. A presença do fator tecidual causa
ativação do fator VII com o qual forma um complexo e ativa uma série de fatores da
coagulação resultando, do mesmo modo que o caminho intrínseco, na produção de
33
trombina (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Esta trombina formada dará
origem a fibrina que apresenta um papel chave no processo de reparo tecidual
subseqüente, pois atua como uma matriz provisória possibilitando a migração de
células inflamatórias e fibroblastos para o interior da área injuriada e atuando como
uma reserva de fatores de crescimento e citocinas (CHAMBERS; LAURENT, 2002).
O endotélio é uma interface ativa entre o sangue e os tecidos produzindo
fatores que evitam uma coagulação excessiva, além de produzirem o TNF- α, IL-1,
IL-6 que são importantes no início da resposta inflamatória e na apresentação do
antígeno (LIN et al., 2000). Recentemente a Interleucina-18 (IL-18), um potente
quimiotático para células T humanas, foi observada em contato íntimo com as
células endoteliais sugerindo que não somente a atração dos leucócitos da primeira
linha de defesa é importante, mas também o recrutamento de macrófagos e
linfócitos pode ocorrer durante o trauma (KOMAI-KOMA et al., 2003). Os fatores e
mediadores liberados pela cascata de coagulação, pelas plaquetas, pela cascata do
complemento e também pelas células injuriadas ou ativadas, são quimiotáticos para
leucócitos fazendo com que os mesmos sejam recrutados da circulação sanguínea
para o local da injúria (SANTIAGO-DELPÍN, 2004).
Os neutrófilos são os primeiros a chegar no local do trauma com a intenção
de destruir e fagocitar bactérias e proteínas da matriz dentro da área da injúria
(LINGEN, 2001; PARK; BARBUL, 2004; SZPADERSKA; DIPIETRO, 2005). Estes
permanecem nos tecidos por pouco tempo, morrem e são fagocitados pelos
macrófagos (THEORET, 2005) que são monócitos fenotipicamente transformados
dentro dos tecidos (SZPADERSKA; DIPIETRO, 2005).
No tempo entre 48-96 horas pós-ferida, ocorre uma alteração no perfil das
células inflamatórias presentes e o infiltrado inflamatório passa a ser
predominantemente composto por macrófagos e linfócitos (BROUGHTON et al.,
2006). Os macrófagos, através da secreção de citocinas e fatores de crescimento,
promovem a ativação e recrutamento de outras células envolvidas na cicatrização
como outros macrófagos, linfócitos, fibroblastos e células endoteliais; além de
influenciar na angiogênese, fibroplasia e síntese da MEC (TONNESEN et al., 2000;
PARK; BARBUL, 2004; SZPADERSKA; DIPIETRO, 2005; BROUGHTON et al.,
2006). Quando os macrófagos estão ausentes o processo cicatricial é suprimido
(SCHROCK et al., 1982).
34
2.2.2 Fase proliferativa
A fase proliferativa, que inicia antes da completa resolução da fase
inflamatória, é caracterizada pela ocorrência da epitelização, da fibroplasia ou da
formação de tecido de granulação e da angiogênese.
2.2.2.1 Epitelização
Um dos principais objetivos do organismo durante o reparo de feridas é
reestabelecer o epitélio, que funciona como uma barreira de proteção. A proliferação
epitelial inicia nas extremidades da ferida um a dois dias após a injúria tecidual e
atinge a máxima proliferação entre 48 e 72 horas. Entretanto, o grau de fechamento
da ferida depende da espécie animal, bem como do local e do tamanho da ferida
(THEORET, 2005). As células epiteliais são estimuladas a lisar e fagocitar restos
celulares encontrados no caminho na tentativa de avançar sob o coágulo, sendo
vista a máxima epitelização entre 5 e 7 dias em uma ferida com cicatrização por
segunda intenção (THEORET, 2005). A IL-1 e o TNF-α, liberados pelas células
inflamatórias, facilitam a migração do epitélio pelo aumento da secreção de enzimas
degradativas e de fator de crescimento de queratinócitos (KGF). O TGF-α e o TGF-β
aumentam a síntese de receptores de superfície da célula epitelial em vários
componentes da matriz extracelular facilitando a migração do epitélio (BROUGHTON
et al., 2006). Esse processo é cessado no momento em que as células epiteliais
entram em contato entre si (THEORET, 2005).
2.2.2.2 Fibroplasia
A substituição do coágulo pelo tecido de granulação assegura uma
progressão ordenada para o reparo, pois a matriz provisória formada, além de
proteger contra a infecção, serve de superfície para migração das células epiteliais
(TONNESEN et al., 2000; THEORET, 2005). O tecido de granulação invade o local
da ferida aproximadamente cinco dias após a injúria, sendo formado por
35
macrófagos, que produzem mediadores estimuladores da angiogênese e a
fibroplasia, por fibroblastos, que proliferam e sintetizam componentes da MEC, e por
novos vasos sanguíneos que carregam nutrientes e oxigênio para as células
crescerem (APPLETON, 1994; THEORET, 2005).
Os sinais para proliferação e migração dos fibroblastos incluem vários
quimiotáticos e citocinas ou fatores de crescimento como: IL-1, TNF-α, IGF, PDGF,
EGF, fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e especialmente o TGF-β
(THEORET, 2005). Outro estímulo para a proliferação de fibroblastos é o baixo
conteúdo de oxigênio no centro da ferida. Assim que a formação de novos vasos
ocorre, a quantidade de oxigênio aumenta e o estímulo para a proliferação dos
fibroblastos diminui, o que caracteriza um processo de controle proliferativo
(KIRSNER; EAGLSTEIN, 1993).
O que possibilita os fibroblastos migrarem para o interior do coágulo é uma
gama de enzimas degradativas derivadas dos próprios fibroblastos, cuja produção e
secreção é estimulada pelo PDGF e TGF-β (APPLETON, 1994). Tão logo os
fibroblastos tenham proliferado, eles iniciam a substituição da matriz provisória por
glicoproteínas, proteoglicanas e colágeno permitindo a união das margens da ferida.
Assim que a matriz é depositada a síntese protéica cessa e os fibroblastos sofrem
apoptose ou adquirem características de células musculares lisas se transformando
em miofibroblastos (HARTY et al., 2003; THEORET, 2005).
2.2.2.3 Angiogênese
A angiogênese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados
a partir vasos pré-existentes (DJONOV et al., 2000; BURRI et al., 2004; DVORAK,
2005). Esse evento tem um importante papel no desenvolvimento vascular normal e
em processos patológicos como o câncer, a cicatrização de feridas e a inflamação
(FOLKMAN; SHING, 1992; LINGEN, 2001; DVORAK, 2005). Em tecidos normais os
vasos são quiescentes e as células secretam baixos níveis de indutores e altos
níveis de inibidores da angiogênese (LINGEN, 2001).
No mecanismo de reparo da ferida a angiogênese é um processo complexo e
acompanhado por uma necessária inflamação (RISAL, 1997). Os capilares,
36
responsáveis pela distribuição de nutrientes, células inflamatórias e oxigênio para o
local da ferida, logo após a injúria invadem o coágulo de fibrina e representam um
dos componentes importantes do tecido de granulação inicial (NISSEN et al., 1998;
LINGEN, 2001). Muitos são os produtos, como citocinas, fatores de crescimento e
pequenas moléculas, envolvidos na geração de novos vasos: VEGF, a-FGF, b-FGF,
fator de crescimento de hepatócito (HGF), PDGF, angiotensina 1 e 2, TGF α e β, IL-
8, prostaglandina e vários lipídios (DVORAK, 2005). A presença de fatores
angiogênicos no fluido da ferida cirúrgica humana e a possibilidade deste fluido
formar novos vasos foi comprovada por Nissen et al. (1998) depois de aplicarem o
fluido da ferida em córnea avascular de ratos e constatarem a formação de vasos
sanguíneos no local (NISSEN et al., 1998).
A presença de exudato fibrinoso pode facilitar o processo de angiogênese por
oferecer fatores de crescimento e matriz para a invasão e expansão de novos
microvasos (van HINSBERGH, 2001). Muitos tipos celulares e fatores angiogênicos
atuam em diferentes momentos do processo cicatricial. Altos níveis de b-FGF estão
presentes na ferida cirúrgica no início da cicatrização e estimulam a migração e a
proliferação das células endoteliais (NISSEN et al.,1996). Os macrófagos em um
meio com hipóxia liberam fatores de crescimento que estimulam as células
endoteliais das vênulas a romperem sua membrana basal e migrarem para dentro da
ferida criando um tecido de granulação altamente vascular (GREENHALGH, 1998).
A quantidade de vasos sanguíneos presente no tecido de granulação diminui
conforme o acúmulo de colágeno aumenta (TONNESEN et al., 2000). A maior
quantidade de vasos observada em feridas, produzidas em pele de ratos, está
presente nos dias 5 e 6 pós-injúria, o que corresponde ao pico na síntese de
colágeno no interior da ferida (THOMPSON et al., 1991).
O VEGF-A, além de outros membros da família de citocinas multifuncionais e
fatores de crescimento como b-FGF, liberado durante a injúria tecidual, podem
induzir tanto a formação de vasos sanguíneos como de vasos linfáticos no local da
injúria (NAGY et al., 2002; AL-RAWI et al., 2005). A formação de novos vasos
sanguíneos a partir de outros pré-existentes pode ocorrer por dois mecanismos:
brotamento e intussuscepção (RISAU, 1997). Embora ambos induzam a
amplificação da cadeia capilar são regulados por diferentes moléculas e ocorrem por
mecanismos distintos (DJONOV et al., 2003; DJONOV; BURRI, 2005).
37
2.2.2.3.1 Angiogênese por brotamento
A angiogênese por brotamento está caracterizada principalmente pela
vasodilatação local, aumento da permeabilidade vascular e proliferação celular
sendo iniciada pela degradação proteolítica da membrana basal, e subseqüente
migração e proliferação das células endoteliais para o interior da MEC (DJONOV et
al., 2003; DJONOV; BURRI, 2005). Este processo é múltiplo e segue um programa
bem definido: necessita da proliferação e migração de células endoteliais,
degradação da membrana basal velha e síntese de nova, formação de brotos
sólidos de células endoteliais conectando vasos vizinhos, reestruturação do interior
do lúmem do broto e aquisição de pericitos (BURRI et al., 2004; DVORAK, 2005).
Nas condições de reprodução, desenvolvimento e processo de reparo apresenta-se
como um processo altamente controlado (FOLKMAN; SHING, 1992). O brotamento
é um processo relativamente lento, que necessita de dias para seu início,
implementação e integração dos segmentos neoformados dentro do sistema
vascular (DJONOV; BURRI, 2005).
2.2.2.3.2 Angiogênese por intussuscepção
A angiogênese por intussuscepção consiste na inserção de colunas teciduais
transcapilares, chamadas de pilares ou pontes, dentro do lúmen vascular e no
subseqüente crescimento dessas colunas resultando na divisão do vaso (DJONOV
et al., 2000; KURZ et al., 2003). A rápida expansão do leito vascular através do
processo de intussuscepção ocorre devido a redistribuição do volume das células
endoteliais visto que estas não proliferam, mas se adelgaçam e se espalham
(DJONOV et al., 2000; DJONOV; BURRI, 2005). Ao contrário da angiogênese por
brotamento, a angiogênese por intussuscepção ocorre na ausência virtual de
proliferação de células endoteliais, é alcançada em baixos níveis de permeabilidade
vascular e necessita de quatro a cinco horas para estar completa (DJONOV et al.,
2003; BURRI et al., 2004).
O estresse mecânico pode, dentro de segundos, através da ativação de
canais iônicos induzir cascatas bioquímicas e, dentro de minutos ou horas, induzir
adaptações nas junções tipo gap entre as células endoteliais. Além disso, várias
38
moléculas angiogênicas, parâmetros hemodinâmicos e/ou tensão de oxigênio
parecem ser responsáveis por iniciar e coordenar o crescimento intussusceptivo
(KURZ et al., 2003). Em reparo de feridas, além da formação de colunas teciduais
transcapilares, responsáveis pela expansão e remodelamento da cadeia vascular
pré-existente, ocorre a formação de alças capilares na parede dos vasos maiores
transformando os mesmos em uma densa cadeia de alças finas. A cadeia de alças
neoformadas e a cadeia de vasos pré-existentes apresentam-se altamente
interconectadas, permitindo o re-direcionamento do fluxo sanguíneo para o interior
da ferida (PATAN et al., 2001). A intussuscepção pode ser regulada por muitos
fatores que trabalham sinergicamente, entre outros o PDGF e seus receptores
(BURRI et al., 2004), presentes em grande quantidade durante o processo de reparo
da ferida.
2.2.3 Fase de remodelamento
Simultaneamente com a contração da ferida, provocada por células que
combinam características de fibroblastos e células musculares lisas
(miofibroblastos), a MEC está sendo formada e remodelada, sendo inicialmente um
tecido de granulação que evolui para um tecido cicatricial maduro. O
remodelamento, pela ação de enzimas degradativas presentes na própria matriz
(metaloproteases), permite a substituição do colágeno imaturo (tipo III) pelo
colágeno maduro (tipo I) além de aumentar a resiliência da matriz (KIRSNER;
EAGLSTEIN, 1993). Durante o remodelamento, a redução na quantidade de vasos
e fibroblastos ocorre paralelamente e pode estar envolvida com a comunicação entre
essas células (DJONOV et al., 2003). Outra maneira de ocorrer a redução na
quantidade de vasos é através da própria angiogênese por intussuscepção, pois a
mesma também está envolvida na “poda” vascular. Essa “poda” ocorre através da
formação de colunas teciduais transcapilares excêntricas na região de bifurcação
dos vasos, induzindo a uma completa oclusão seguida de regressão, retração e por
fim atrofia do broto afetado (KURZ et al., 2003). Patan et al. (2001) ao avaliarem a
cicatrização de pedículos ovarianos de ratas constataram aos 21 dias pós-ferida, a
presença de um tecido cicatricial com menor vascularização.
39
2.3 IMUNOLOGIA NO PROCESSO DE REPARO DE FERIDAS
O sistema imune é fundamental na defesa do hospedeiro contra injúrias
teciduais, pois mesmo na ausência de estimulação antigênica, pode ser ativado por
injúrias biológicas, físicas e químicas (ANISMAN et al., 1996b). O sistema imune
está dividido em defesa humoral, que compreende anticorpos e complemento, e
defesa celular, que consiste em neutrófilos, macrófagos e linfócitos (PARK E
BARBUL, 2004). As células imunes desenvolvem papel importante na inflamação, no
processo de defesa e são vitais para a cicatrização de feridas. Além disso, sua
participação no processo de reparo é comprovada pela migração seqüencial para o
interior da ferida cirúrgica e, pela secreção de moléculas de sinalização (PARK;
BARBUL, 2004). A maioria dessas moléculas liberadas durante o reparo de feridas
está envolvida tanto na reação inflamatória não específica quanto na reação imune
específica, o que dificulta a separação entre esses dois processos (SANTIAGO-
DELPÍN, 2004).
Para que ocorra a interligação entre os tecidos e a imunidade, faz-se
necessária a migração de células e fluido intersticial dos tecidos para os órgãos
linfóides secundários (SCHWARTZ-CORNIL et al., 2005). O sistema linfático é
essencial para a resposta imune durante a exposição a agentes inflamatórios já que
é a principal rota pela qual as células dendríticas, depois de capturarem o antígeno,
migram para os linfonodos (OLIVER, 2004). A injúria tecidual funciona como
iniciadora da inflamação, pois dispara a liberação de citocinas que atraem e
estimulam os leucócitos. Estas quimiocinas ou citocinas quimiotáticas são
produzidas por uma variedade de células como macrófagos, monócitos, linfócitos B
e T, fibroblastos, células endoteliais, condrócitos e células musculares lisas
(ANISMAN et al., 1996b). Em condições fisiológicas, o número de linfócitos que
entram e saem dos linfonodos estão em equilíbrio, mas durante a inflamação ocorre
um aumento no número de linfócitos que entram induzindo a um aumento dos
linfonodos responsáveis pela drenagem da área afetada (CYSTER, 1999).
Durante o processo de dano tecidual as células mortas são fagocitadas por
neutrófilos, células dendríticas ou macrófagos e têm a capacidade de ativar a
resposta pró-inflamatória e imunológica (SHIMAMURA et al., 2005). A presença de
células necróticas no local da ferida aumenta a capacidade dos macrófagos atuarem
como células apresentadoras de antígenos (BARKER et al., 2002); além de serem
40
ótimas estimuladoras da maturação das células dendríticas e fonte de antígeno para
a ativação das células T (MOEHLER et al., 2003). Segundo Hay e Hobbs (1977) a
presença do antígeno pode tanto aumentar a proporção de linfócitos que deixa o
sangue dentro do linfonodo, como o fluxo de sangue para o linfonodo, resultando em
um maior tráfego de células para dentro da linfa eferente. As células dendríticas,
descendentes das células-tronco hematopoiéticas através da linhagem mielóide
(GOLDSBY et al., 2002), apresentam-se esparsamente distribuídas pelos tecidos.
Na presença de mediadores inflamatórios se tornam ativadas (maduras), processam
antígenos e tornam-se migratórias com possibilidade de entrar nos órgãos linfóides
secundários e induzir a resposta imune dependente de células T (DIELI, 2003).
Durante as fases iniciais do processo de reparo, em decorrência da
vasodilatação, a pressão do fluido intersticial aumenta e os filamentos de ancoragem
dos vasos linfáticos iniciais são tracionados (SZCZENSNY; OLSZEWSKI, 2003).
Essa tração dos filamentos provoca um aumento no diâmetro do lúmem dos vasos
linfáticos mantendo abertas as junções intercelulares que facilitam a passagem de
fluido, partículas e células para o interior do lúmem linfático (JI, 2006). Nesse
momento do processo de reparo a circulação linfática é predominante em detrimento
da circulação sanguínea (ALLER et al., 2004b).
A dilatação dos vasos linfáticos e o aumento dos linfonodos regionais
sugerem a existência de uma resposta imune na fase inflamatória do reparo de
feridas (ALLER et al., 2006). A linfa drenada dos tecidos inflamados contém altos
níveis de citocinas e quimiocinas e é o principal meio de deslocamento de bactérias
(SZCZENSNY; OLSZEWSKI, 2003).
Os linfonodos, compartimentos linfóides dinâmicos, são afetados pelo
estímulo inflamatório (GRETZ et al., 2000) através da migração de macrófagos e
monócitos presentes nos tecidos (ALLER et al., 2004a). Durante esse processo
migratório, os monócitos se diferenciam em células dendríticas podendo então
apresentar peptídeos antigênicos para os linfócitos (KAPLANSKI et al., 2003),
contribuindo para a geração de uma resposta imune amplificada (SZCZENSNY;
OLSZEWSKI, 2003). Os linfonodos estimulados apresentam um aumento no seu
peso e um maior número de células que migram do sangue para o seu interior,
quando comparados com linfonodos normais (HAY; HOBBS, 1977).
A ativação imune do sistema linfático estabelece uma ligação entre a resposta
imune inata e a resposta imune adquirida. A resposta imune inata cria resposta
41
inicial à invasão tecidual, mas também serve para ativar e amplificar a resposta
imune adaptativa (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004), que é induzida
primariamente pela apresentação de antígenos estranhos para as células T
(CLARKE et al., 2005). Portanto as células capazes de apresentar antígenos como
macrófagos e células dendríticas migram para os linfonodos onde produzem a
ativação de células T específicas (CLARKE et al., 2005). As injúrias cirúrgicas ou
infecciosas exibem alterações nas respostas hemodinâmicas, metabólicas e imunes
e estas são amplamente orquestradas por mediadores endógenos chamados de
citocinas (LIN et al., 2000). O TNF, produzido principalmente por macrófagos e
monócitos, promove a proliferação de linfócitos T (LIN et al., 2000). A IL-18, que tem
sua presença inicial seguinte ao trauma tecidual, demonstra propriedades
quimiotáticas para as células T recrutando as mesmas para o local do trauma
(KOMAI-KOMA et al., 2003).
O acontecimento da reação imune depende da recirculação de linfócitos do
sangue para o interior do linfonodo, o que permite a interação destes linfócitos com
os antígenos filtrados da linfa, iniciando a resposta imune humoral e resposta
mediada por células (OKADA et al., 2002). A migração de leucócitos é um processo
complexo dependente do tipo celular envolvido, do tipo de interação desta célula
com o endotélio e do estado de ativação desse endotélio. Os linfócitos T em repouso
ou naïve (virgens) migram através das vênulas endoteliais para dentro dos tecidos
linfáticos (SCHOENMAKERS et al., 2005) sendo sua fixação e transmigração
através das VEAs melhoradas na presença da inflamação (DIACOVO et al., 2005),
enquanto que os linfócitos ativados migram para os sítios da inflamação
(SCHOENMAKERS et al., 2005).
3 PROPOSIÇÃO
43
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar, em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de luz,
alterações na vasculatura de linfonodos submandibulares em diferentes tempos do
processo cicatricial de ferida cirúrgica produzida em ventre de língua de ratos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1- Descrever a vasculatura dos linfonodos submandibulares de ratos Wistar
através da microscopia eletrônica de varredura e microscopia de luz;
2- Calcular, através da microscopia eletrônica de varredura, a área dos nódulos
foliculares de linfonodos submandibulares após realização de ferida cirúrgica no
ventre de língua de ratos nos tempos pós-operatórios de 2, 3, 7, 10, 14 e 21 dias;
3- Mensurar, através da microscopia eletrônica de varredura, o diâmetro dos
vasos sanguíneos circundantes aos nódulos foliculares de linfonodos
submandibulares após realização de ferida cirúrgica no ventre de língua de ratos nos
tempos pós-operatórios de 2, 3, 7, 10, 14 e 21 dias;
4- Quantificar, através da microscopia de luz, a vasculatura dos linfonodos
submandibulares após realização de ferida cirúrgica no ventre de língua de ratos nos
tempos pós-operatórios de 2, 3, 7, 10, 14 e 21 dias.
4 MATERIAL E MÉTODOS
45
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 APROVAÇÃO DO PROTOCOLO DE PESQUISA
O protocolo de pesquisa foi submetido a apreciação e aprovação pela
Comissão Científica e de Ética da Faculdade de Odontologia (anexo 1) e do Comitê
de Ética do Hospital São Lucas (anexo 2) da Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul (PUCRS).
4.2 MICROSCOPIA DE LUZ
4.2.1 Amostra
A amostra foi constituída de 60 ratos albinos da espécie Rattus norvegiccus,
linhagem Wistar, machos, adultos com idade de 3 meses, e peso médio de 281g.
Todos os animais foram criados e mantidos no Centro de Reprodução e
Experimentação de Animais de Laboratório (CREAL) do Instituto de Ciências
Básicas de Saúde (ICBS) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).
O experimento foi realizado nas dependências do Laboratório de Neuroanatomia do
Departamento de Ciências Morfológicas do mesmo Instituto. Durante a pesquisa os
animais foram mantidos no referido laboratório em gaiolas plásticas recebendo
alimentação sólida
1
e água ad libittum.
4.2.2 Grupos experimentais
Os 60 animais foram divididos aleatoriamente em 6 grupos de dez animais,
sendo que em cada grupo, nove ratos foram submetidos a uma ferida cirúrgica
produzida em ventre de língua, enquanto um animal serviu como controle. O animal-
controle foi submetido somente ao procedimento anestésico e permaneceu com os
demais de seu grupo até o momento da morte.
Grupo 1: animais mortos 2 dias após o procedimento cirúrgico.
1
Ração Nuvilab-Cr
1
Nuvital Nutrientes - S.A, São Paulo, Brasil
46
Grupo 2: animais mortos 3 dias após o procedimento cirúrgico.
Grupo 3: animais mortos 7 dias após o procedimento cirúrgico.
Grupo 4: animais mortos 10 dias após o procedimento cirúrgico.
Grupo 5: animais mortos 14 dias após o procedimento cirúrgico.
Grupo 6: animais mortos 21 dias após o procedimento cirúrgico.
4.2.3 Procedimento cirúrgico
Os animais foram anestesiados por meio de injeção intraperitoneal de uma
solução contendo partes iguais de cloridrato de quetamina
2
e xilasina
3
na dosagem
de 0,5ml/Kg. Concluída a anestesia os animais foram pesados (apêndice A) em
balança de precisão
4
, posicionados e imobilizados em decúbito dorsal sobre uma
mesa operatória. Uma lâmina de vidro, servindo como mesa cirúrgica (VERLI, 2006),
foi interposta entre os maxilares do animal e um amarrilho de fio, que envolvia os
incisivos inferiores, proporcionou o afastamento dos maxilares e permitiu a
realização da ferida cirúrgica (figura 1).
Figura 1: Mesa cirúrgica interposta entre os
maxilares e amarrilho envolvendo os incisivos
inferiores
Um único operador realizou todas as feridas com o auxílio de um punch
5
de
3mm de diâmetro, colocado perpendicularmente à mucosa na linha média entre o
terço apical e médio do ventre lingual. Na porção externa do punch foi realizada uma
2
Dopamin
, Laboratório Agribrands, São Paulo, SP, Brasil
3
Anasedan
injetável, Laboratório Agribrands, São Paulo, SP, Brasil
4
Helmac 3300
5
Instrumec
, Prodesc, Porto Alegre, RS, Brasil
47
marcação à 1mm da lâmina de corte delimitando a profundidade da ferida (figura 2a
e 2b).
Figura 2: a) Ponta ativa do punch; b) posicionamento do punch
90° em relação ao ventre lingual
Após o posicionamento do punch, foi realizado movimento rotacional no
sentido horário e anti-horário possibilitando o corte da mucosa até atingir o limite de
profundidade demarcado. Um fragmento de 3mm de diâmetro por 1mm de
profundidade foi produzido e sua base liberada por incisão com tesoura cirúrgica
(figura 3).
Figura 3: Incisão realizada na base da
ferida
Concluído o ato cirúrgico, aguardou-se o tempo necessário para que a
hemostasia ocorresse e então o animal foi recolocado na gaiola onde permaneceu
por todo o período pós-operatório.
48
4.2.4 Procedimento cirúrgico de perfusão e morte
Decorrido o tempo pós-operatório de cada grupo, os animais foram
anestesiados conforme descrito anteriormente, pesados (apêndice B), posicionados
e imobilizados em decúbito dorsal na mesa operatória, conforme descrito
anteriormente. Realizou-se uma incisão longitudinal na linha média do ventre do
animal e a pele foi divulsionada deixando o tecido muscular evidenciado (figura 4a).
Um corte transversal ao longo eixo do animal foi realizado, imediatamente abaixo do
osso esterno (figura 4b), possibilitando a incisão do músculo diafragma (figura 4c) e o
acesso à caixa torácica e ao coração.
Com o intuito de evitar a coagulação sanguínea injetou-se, diretamente no
coração, heparina sódica (5000 UI) na proporção 1ml/kg de peso do animal (figura
4d). Para ampliar o campo de trabalho e possibilitar melhor acesso ao coração, uma
incisão relaxante foi efetuada nas costelas do animal, permitindo o rebatimento da
porção torácica (figura 4e).
Afastou-se o timo e individualizou-se a artéria aorta ascendente pela
passagem de um fio ao seu redor (figura 4f). O pulmão esquerdo foi afastado e a
artéria aorta descendente pinçada, de modo que a perfusão ocorresse
exclusivamente dessa região em direção à cabeça (figura 4g).
Um cateter para oxigênio número 6
6
foi acoplado a uma torneira de oxigênio
7
de mesmo número, e esta, a uma seringa de 50ml contendo soro fisiológico. Incisou-
se o ventrículo esquerdo do coração, por onde foi introduzido o cateter até acessar a
artéria aorta ascendente, ocasião em que um duplo nó foi dado no fio que
previamente individualizara a artéria (figura 4h).
Uma incisão no átrio direito (figura 4i) permitiu o extravasamento do sangue e
das soluções seqüencialmente perfundidas via cateter: soro fisiológico (50ml),
paraformaldeído a 4% tamponado com fosfato e pH 7,4 (20ml) e novamente soro
fisiológico (50ml). A substituição do sangue, presente no sistema vascular, pelo soro
fisiológico, foi comprovada pela ausência de sangue nas soluções extravasadas pelo
átrio direito e também pela palidez do animal na região de cabeça e pescoço.
6
Markmedt
, São Paulo, SP, Brasil
7
Sondaplast Materiais Médicos Hospitalares
, Feira de Santana, BA, Brasil
49
Figura 4: a) Ventre incisionado do animal; b) incisão transversal realizada abaixo do esterno; c)
incisão do diafragma (seta); d) injeção da heparina diretamente no coração; e) incisão relaxante
realizada nas costelas direitas e esquerdas; f) individualização da artéria aorta ascendente; g)
pinçamento da artéria aorta descendente; h) fixação do cateter no interior da artéria aorta
ascendente; i) incisão do átrio direito
d
e
f
g
h
i
b
a
c
50
4.2.5 Dissecação dos linfonodos
As cabeças dos animais perfundidos foram armazenadas individualmente em
paraformaldeído 4% por 24 horas. Para a remoção dos linfonodos realizou-se incisão
linear desde a sínfise mentoniana até o pescoço (figura 5a) e a pele da região foi
divulsionada com auxílio de uma tesoura de ponta romba (figura 5b). Para facilitar o
acesso e visualização dos linfonodos foi realizado um corte transversal à primeira
incisão, permitindo o afastamento dos tecidos que encobriam os linfonodos (figura 5c
e 5d). A peça, contendo linfonodos submandibulares, glândulas sublinguais e
glândulas submandibulares bilaterais, foi liberada com auxílio de uma lâmina de
bisturi (figura 5e, 5f e 5g). Para deixar essas estruturas em evidência o tecido
superficial foi divulsionado com tesoura de ponta romba (figura 6 e 7). Dois
linfonodos direitos e dois esquerdos foram retirados de cada animal perfazendo um
total de 232 linfonodos que foram devidamente identificados e mantidos em formalina
tamponada até o momento do processamento das peças para inclusão em parafina.
Figura 5: a) Incisão linear abaixo da mandíbula até o pescoço; b) divulsão da
pele com tesoura de ponta romba; c) incisão realizada abaixo da mandíbula;
d) visualização da área contendo os linfonodos; e) incisão profunda logo acima
dos linfonodos; f) incisão realizada nas porções laterais e em profundidade
para remoção da peça; g) peça contendo linfonodos, glândulas sublinguais e
glândulas submandibulares bilaterais
51
Figura 6: Remoção dos tecidos superficiais Figura 7: Visualização dos linfonodos (1),
com tesoura de ponta romba das glândulas sublinguais (2), e das
glândulas submandibulares (3)
4.2.6 Preparo dos espécimes para análise em microscopia de luz
Os espécimes foram processados, incluídos em parafina e corados com
hematoxilina e eosina (HE) no Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia
(FO) da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Cada linfonodo foi incluído de tal
forma que seu hilo e sua face convexa ficassem paralelos a qualquer uma das
superfícies laterais do bloco e seu maior eixo paralelo à superfície de corte (figura 8).
Os dois linfonodos esquerdos e os dois direitos foram colocados em blocos distintos.
Foram realizados cortes de 4µm utilizando-se micrótomo de deslize
8
. Coletou-se o
décimo primeiro corte de cada bloco para ser corado pela técnica de HE. Durante a
coleta dos cortes, os linfonodos direitos foram dispostos o mais próximos da porção
fosca da lâmina e os esquerdos na extremidade oposta, possibilitando que todos os
linfonodos do mesmo animal fossem visualizados na mesma lâmina. Cada lâmina
recebeu uma identificação contendo o número do animal e o grupo experimental ao
qual o animal pertencia (apêndice C).
8
Leica RM 2165
52
Figura 8: Posição do linfonodo no
emblocamento
4.2.7 Análise dos espécimes corados por Hematoxilina e Eosina em
microscopia de luz
Cada lâmina recebeu uma etiqueta, sobreposta à identificação inicial,
contendo uma numeração aleatória iniciada pelo algarismo um, possibilitando o
cegamento tanto no momento da coleta de imagens quanto no momento da
avaliação dos dados. O local de observação dos cortes histológicos corados com HE
foi a região dos nódulos foliculares e do córtex profundo. Em cada linfonodo, foram
avaliados três nódulos foliculares (N1, N2 e N3) e duas regiões de córtex profundo
(C1 e C2) (figura 9a). Em cada nódulo folicular foram avaliadas quatro áreas,
estando a área 1 (A1) localizada no interior do centro germinativo, área 2 (A2) na
lateral direita, área 3 (A3) na lateral esquerda e área 4 (A4) na base do nódulo (área
voltada para a região central do linfonodo), perfazendo um total de 14 campos em
cada linfonodo (figura 9b).
Figura 9: a) Modelo esquemático dos locais avaliados em cada linfonodo. HE, 40X de
aumento; b) maior aumento do local N2 demonstrando as áreas avaliadas em cada nódulo
folicular. HE, 100X de aumento
53
4.2.7.1 Análise quantitativa
Procurando-se abranger a maior área possível, em cada local de análise,
foram capturadas imagens em aumentos de 200 vezes, utilizando-se microscópio
óptico
9
acoplado ao sistema digital
10
de captação de imagens, por intermédio do
Programa Image Pro-Plus
11
. Esta etapa foi realizada no Laboratório de Patologia da
FO-PUCRS. As imagens, correspondentes a cada local de análise, foram inseridas
no software Image Tool
12
visando a contagem dos vasos sanguíneos, empregando
artifício disponibilizado pelo próprio programa (figura 10a e 10b). A coleta e análise
das imagens foram realizadas por um único operador, sendo que o mesmo
desconhecia o grupo e o animal ao qual a lâmina pertencia. Todas as lâminas foram
avaliadas em duplicata, com intervalo de tempo de uma semana entre a primeira e a
segunda análise. O número total de vasos sanguíneos foi transferido para uma
planilha do Excel. Os espécimes com escores diferentes nas duas observações
foram reavaliados e o escore final para cada variável, nesse caso, foi aquele que
ocorreu em duas das três avaliações.
Figura 10: a e b) Imagens demonstrando a seqüência utilizada para a contagem dos vasos
sanguíneos
9
Olympus BX 50 F4 – Olympus Optical CO. LTD - Japan
10
Sony DXC 107A – Sony Corporation - Japan
11
Image Pro-Plus 4.5
12
Image Tool – 3.0
54
4.2.7.2 Análise qualitativa
Com a intenção de descrever as características da vasculatura de linfonodos
nos diferentes tempos pós-operatórios, foram adquiridas imagens em aumentos de
40, 100, 200 e 400 vezes nos mais diversos locais desses órgãos.
4.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
4.3.1 Amostra
A amostra para a análise em microscopia eletrônica de varredura foi
constituída de 39 ratos albinos da espécie Rattus novergiccus, linhagem Wistar,
machos, com idade de 3 meses e peso entre 250 e 300g. Os 123 linfonodos desses
animais já estavam corroídos e foram provenientes de pesquisa realizada
anteriormente por Verli (2006). Desses linfonodos, nove foram provenientes de
quatro animais saudáveis, ou seja, sem a presença de ferida cirúrgica na língua, que
foram utilizados como animais-controle. A metodologia aplicada para a corrosão
desses linfonodos é descrita no anexo 3.
4.3.2 Preparo dos espécimes para análise em microscopia eletrônica de
varredura (MEV)
Os espécimes corroídos foram fixados em stubs de maneira que seu hilo
permanecesse em contato com a fita adesiva (figura 11a) e metalizados seguindo o
protocolo de metalização com 2 fios de carbono
13
e 90 segundos de ouro platinado
14
.
Para aumentar a condutibilidade de elétrons nos espécimes foram colados fios de
cobre com 0,2mm de espessura, dobrados em “L”, sendo que o maior segmento do
“L” ficava em contato com o espécime e o menor era colado com fita de carbono na
borda lateral do stub (figura 11b) segundo Verli et al., 2007.
13
Electron Microscopy Science, Carbon cord
14
BAL-TEC, Foil target Au, 54mm de diâmetro
55
Figura 11: a) Espécimes colados nos stubs; b) espécimes
metalizados com a utilização de fios de cobre (setas)
4.3.3 Análise dos espécimes em microscopia eletrônica de varredura (MEV)
4.3.3.1 Análise quantitativa
A análise dos linfonodos através da MEV foi realizada no Centro de
Microscopia e Microanálise (CEMM) da PUCRS com microscópio eletrônico de
varredura
15
com poder de resolução de 3,5nm, faixa de aumentos de 10 a 400.000
vezes e tensão de aceleração de elétrons de 200V a 30kV. Todos os linfonodos
foram fotografados em um aumento de 26 vezes e nesta imagem foram aferidas as
medidas do maior e menor diâmetro, dividindo-se desta forma o linfonodo em quatro
quadrantes (figura 12a).
Dentre os vários nódulos foliculares presentes em cada quadrante, três deles
foram escolhidos para serem avaliados, perfazendo um total de 12 nódulos
foliculares avaliados em cada linfonodo. Cada nódulo folicular foi fotografado em um
aumento de 200 vezes e nessa imagem realizou-se a mensuração do maior diâmetro
no eixo X e no eixo Y (figura 12b). Essas medidas tinham como limite externo as
vênulas de endotélio alto que contornam cada nódulo folicular.
A área dos nódulos foliculares foi calculada utilizando-se a fórmula para
cálculo da área de uma elipse que é: A= π.a.b onde π apresenta um valor fixo de
3,141592654, a é igual a metade da medida do maior diâmetro e b é igual a metade
da medida do menor diâmetro.
15
Philips, modelo XL30
56
Figura 12: a) Eletromicrografia de varredura demonstrando a divisão do linfonodo em
quadrantes. 26X de aumento; b) eletromicrografia de varredura demonstrando as medidas do
diâmetro no eixo X e no eixo Y dos nódulos foliculares. 200X de aumento
Visando avaliar o diâmetro dos modelos vasculares presentes na periferia de
cada nódulo folicular, capturou-se imagem com aumento entre 300 a 400 vezes. O
diâmetro de três vasos foi mensurado a uma distância de 30µm de sua extremidade
livre, sendo que para ser avaliado o vaso deveria estar paralelo à superfície do
linfonodo e sem evidências de fraturas (figura 13). Todas as medidas foram
cadastradas em planilha do Excel
16
e os dados analisados estatisticamente.
Figura 13: Eletromicrografia de varredura
demonstrando a mensuração do diâmetro dos
modelos vasculares na superfície do nódulo
folicular. 400X de aumento
16
Microsoft
Excel 2002
57
4.3.3.2 Análise qualitativa
Com o intuito de descrever a vasculatura de linfonodos nos diferentes tempos
pós-operatórios, através da MEV, outras imagens em diferentes aumentos foram
adquiridas em toda a superfície do linfonodo.
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
4.4.1 Análise em microscopia de luz
O grau de concordância intra-examinador, na contagem do número de vasos
sanguíneos, foi verificado por meio do Coeficiente de Correlação Intra-Classe.
O número médio total de vasos sanguíneos foi comparado entre os diferentes
grupos experimentais, excetuando-se o animal-controle, por meio da Análise de
Variância (ANOVA) considerando-se um intervalo de confiança de 95%. Nos casos
de diferença significativa a ANOVA foi complementada pelo Teste de Comparações
Múltiplas de Tukey, no nível de significância de 5%.
O número médio de vasos sanguíneos presentes nas distintas áreas
avaliadas, excetuando-se o animal-controle, foi comparado dentro de cada grupo
experimental por meio da ANOVA considerando-se um intervalo de confiança de
95%. Nos casos de diferença significativa a ANOVA foi complementada pelo Teste
de Comparações Múltiplas de Tukey, no nível de significância de 5%.
O número médio total de vasos sanguíneos presentes nos grupos
experimentais foram comparados com o o número médio total de vasos sanguíneos
do respectivo controle por meio do Teste t considerando-se um intervalo de
confiança de 95%.
4.4.2 Análise em microscopia eletrônica de varredura
As áreas dos nódulos foliculares e o diâmetro dos modelos vasculares, nos
diferentes tempos pós-operatórios, foram comparados por meio da ANOVA
considerando-se um intervalo de confiança de 95%. Nos casos de diferença
58
significativa a ANOVA foi complementada pelo Teste de Comparações Múltiplas de
Tukey, no nível de significância de 5%.
5 RESULTADOS
60
5 RESULTADOS
5.1 CARACTERÍSTICA DA AMOSTRA
Ao final do período experimental não se observou redução no peso médio
total dos animais (tabela 1). No decorrer dos tempos pós-operatório houve morte de
dois animais (grupo 1 e 2), ambos no primeiro dia de controle pós-operatório.
Tabela 1: Número de animais e peso médio (g) inicial e final nos grupos experimentais (excetuando-
se os animais-controle). Porto Alegre, 2007.
Peso médio (g) n Grupos
Inicial Final Inicial Final
1 (2 dias) 273,1 274,2 9 8
2 (3 dias) 262,4 272,2 9 8
3 (7 dias) 281,8 285,8 9 9
4 (10 dias) 270 280,2 9 9
5 (14 dias) 303,3 317,3 9 9
6 (21 dias) 292,6 306,7 9 9
5.2 ANÁLISE DOS ESPÉCIMES EM CORTES HISTOLÓGICOS CORADOS
COM HEMATOXILINA E EOSINA
5.2.1 Análise quantitativa da vasculatura dos linfonodos nos diferentes
grupos experimentais
O Coeficiente de Correlação Intra-classe permitiu verificar que a concordância
intra-examinador na contagem de vasos sanguíneos foi excelente (tabela 2).
Tabela 2: Concordância intra-examinador em relação ao número de vasos sanguíneos presentes nas
áreas avaliadas. Porto Alegre, 2007.
Área r
i
p
A1 1,000 -
A2 0,998 <0,001
A3 0,999 <0,001
A4 0,999 <0,001
C1 1,000 -
C2 1,000 -
Através do Coeficiente de Correlação Intra-Classe (r
i
) verifica-se uma excelente concordância intra-
examinador
Nos diferentes grupos pós-operatórios comparou-se o número médio total de
vasos sanguíneos e constatou-se que o grupo 6 apresentou a maior média não
61
diferindo significativamente dos grupos 1, 3 e 5, contudo diferiu dos grupos 2 e 4
(ANOVA) (tabela 3).
Tabela 3: Número médio total e desvio-padrão (dp) de vasos sanguíneos nos diferentes grupos
experimentais, quando excluídos os animais-controle. Porto Alegre, 2007.
Grupos Número médio total dp
1 (2 dias)
4,11
AB
0,49
2 (3 dias)
3,55
B
0,61
3 (7 dias)
4,62
AB
0,72
4 (10 dias)
3,89
B
1,23
5 (14 dias)
3,96
AB
0,64
6 (21 dias)
5,04
A
0,57
Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem significativamente através da Análise de
Variância complementada pelo Teste de Comparações Múltiplas de Tukey, no nível de significância
de 5%.
Foram também verificadas, dentro de cada grupo experimental, as diferenças
existentes no número médio de vasos sanguíneos nas distintas áreas, e constatou-
se que a área A1 (interior do centro germinativo) apresentou o menor número de
vasos sanguíneos, diferindo significativamente das demais áreas em todos os
grupos experimentais. Já as áreas localizadas na porção basal do nódulo folicular
(área A4) e na região de córtex profundo (C1/C2) apresentaram a maior quantidade
de vasos sanguíneos e foram semelhantes estatisticamente entre si em todos os
grupos experimentais (ANOVA) (tabela 4).
O teste t, considerando-se um intervalo de confiança de 95%, foi utilizado
para comparar o número médio de vasos sanguíneos observados em cada grupo
experimental, com o número médio de vasos sanguíneos do respectivo animal-
controle e constatou-se uma diferença estatisticamente significativa nos grupos 1, 2,
5 e 6 (2, 3, 14 e 21 dias respectivamente) (tabela 5).
62
Tabela 4: Número médio e desvio-padrão (dp) de vasos sanguíneos nas diferentes áreas de cada
grupo experimental, quando excluídos os animais-controle. Porto Alegre, 2007.
Áreas avaliadas
A1 A2/A3 A4 C1/C2
Grupos
N° médio
Dp N° médio dp N° médio dp N° médio dp
1 (2 dias)
0,61
C
0,20 4,20
B
0,53 5,30
A
0,67 5,18
A
0,89
2 (3 dias)
0,27
B
0,12 3,95
A
0,48 4,53
A
0,75 4,48
A
1,10
3 (7 dias)
1,17
C
0,54 4,44
B
0,53 6,14
A
0,76 5,77
A
1,22
4 (10 dias)
0,88
B
0,54 4,14
A
1,34 4,86
A
1,28 4,67
A
1,72
5 (14 dias)
0,27
C
0,14 4,16
B
0,71 5,08
A
0,75 5,05
A
0,99
6 (21 dias)
0,47
C
0,28 5,23
B
0,77 6,53
A
0,61 6,38
A
0,79
Médias seguidas por letras distintas na linha diferem significativamente através da Análise de
Variância, complementada pelo Teste de Comparações Múltiplas de Tukey, no nível de significância
de 5%
Tabela 5: Número médio total e desvio-padrão (dp) de vasos sanguíneos presentes nos grupos
experimentais comparados com número médio total de vasos sanguíneos do respectivo animal-
controle. Porto Alegre, 2007.
Número médio total de vasos sanguíneos
Grupos Grupos experimentais
N° médio de vasos sanguíneos dp
Animais-controle
P
1 (2 dias) 4,11 0,49 2,91 <0,001
2 (3 dias) 3,55 0,61 2,89 0,018
3 (7 dias) 4,62 0,72 4,03 0,055
4 (10 dias) 3,89 1,23 3,35 0,222
5 (14 dias) 3,96 0,64 3,15 0,005
6 (21 dias) 5,04 0,57 2,65 <0,001
p= nível mínimo de significância doTeste t
5.2.2 Análise qualitativa da vasculatura dos linfonodos nos diferentes grupos
experimentais
5.2.2.1 Características da vasculatura da região de córtex externo
Em todos os grupos, inclusive nos animais-controle, poucos capilares foram
vistos na zona internodular (área A2 e A3) e na zona basal (voltada para a porção
medular) dos nódulos foliculares (área A4). Nesses locais a maioria dos vasos
sanguíneos apresentou endotélio cúbico, caracterizando as vênulas de endotélio alto
(VEA) (figura 14).
63
Figura 14: Vaso sanguíneo com endotélio cúbico (VEA), característico das áreas internodulares.
a) HE, 200X de aumento; b) HE, 400X de aumento
No interior do centro germinativo (área A1) dos nódulos foliculares
observou-se um número reduzido de capilares de pequeno calibre (figura 15) e
ausência total de VEAs. Em poucos linfonodos foram visualizados capilares na
porção apical (voltada para a cápsula) dos nódulos foliculares (figura 16).
Figura 15: a) Figura demonstrando nódulo folicular (círculo) e o local no interior do centro
germinativo onde foi realizada a avaliação (retângulo). HE, 40X de aumento; b) visão mais
aproximada no centro germinativo demonstrando a presença de capilar (seta amarela). HE, 200X
de aumento
Na porção basal de alguns poucos nódulos foliculares observou-se que as
VEAs formavam uma cadeia vascular com forma de “cesto” com sua parte côncava
voltada para o interior do centro germinativo. Os vasos, presentes na porção basal
do nódulo folicular, mostraram-se mais calibrosos em conseqüência da anastomose
dos ramos de menor calibre, presentes nas porções laterais dos nódulos (figura 17).
64
Figura 16: a) Figura demarcando a porção apical de um nódulo folicular (retângulo). HE, 40X de
aumento; b) presença de capilar no interior da área demarcada (seta amarela). HE, 200X de
aumento
Figura 17: Cadeia vascular em forma de “cesto” circundando o nódulo folicular em suas porções
inferior e laterais. a) 40X de aumento; b) 100X de aumento
As VEAs, quando localizadas nas áreas A2/A3 e A4, apresentavam calibres
menores que aquelas localizadas em região de córtex profundo (área C1/C2). No
interior dos linfonodos, independente da localização, os vasos apresentavam em seu
lúmem uma quantidade variada de linfócitos e raros eritrócitos. Quando as VEAs
eram visualizados em animais-controles, constatou-se que na zona internodular
(área A2/A3) e na porção basal aos nódulos foliculares (área A4) apresentavam
lúmem aberto com linfócitos no seu interior (figuras 18 e 19).
65
Figura 18: VEAs observadas na zona internodular (área A2/A3) de animais-controle (setas). HE,
400X de aumento
Figura 19: VEAs observadas na porção basal dos nódulos foliculares (área A4) de animais-controle
(setas). HE, 400X de aumento
Quando os mesmos locais (áreas A2/A3 e A4) foram visualizadas nos
diferentes tempos pós-operatórios observou-se que no grupo 1 (48 horas) as
características das VEAs se aproximavam muito daquelas vistas nos animais-
controle, enquanto que nos grupos 2, 3, 4, 5 e 6 (72 horas, 7 dias, 10 dias, 14 dias e
21 dias, respectivamente) as VEAs apresentavam um endotélio hipertrofiado e
lúmem fechado (figura 20 e 21). No grupo 6 constatou-se a presença de alguns
vasos com lúmem aberto e endotélio menos hipertrófico (figura 22).
66
Figura 20: VEAs observadas na zona internodular (área A2/A3) de animais dos grupos
2, 3, 4, 5 e 6. Setas localizadas na periferia das vênulas. HE, 400X de aumento
Figura 21: VEAs observadas na porção basal dos nódulos foliculares (área A4) de animais
dos grupos 2, 3, 4, 5 e 6. Setas localizadas na periferia das vênulas. HE, 400X de aumento
67
Figura 22: VEAs observadas na zona internodular (área A2/A3) e na porção basal
(A4) dos nódulos foliculares de animais do grupo 6. Setas localizadas na periferia
das vênulas. a) HE, 200X de aumento; b) HE, 200X de aumento; c) HE, 400X de
aumento; d) HE, 400X de aumento
5.2.2.2 Características da vasculatura da região de córtex profundo
O córtex profundo foi visualizado abaixo da região do córtex externo,
apresentando forma semi-esférica e projetado para o interior do linfonodo (figura 23).
Na região de córtex profundo as vênulas de endotélio alto (VEAs) apresentavam
calibre e lúmem maiores e menor quantidade de linfócitos em seu interior quando
comparadas àquelas vênulas observadas na região internodular. Além disso, quanto
mais próximo da porção medular do linfonodo, mais regular tornava-se o endotélio
do vaso (figura 24). No interior das VEAs observaram-se alguns linfócitos realizando
diapedese, nessa situação o linfócito lança projeções assumindo forma de “raquete”
ou “ampulheta” (figura 25).
68
Figura 23: a) Imagem demonstrando a presença de córtex profundo. HE, 40X de
aumento; b) delimitação do córtex externo (1) e do córtex profundo (2). HE, 40X
de aumento
Figura 24: VEAs com endotélio mais regular observadas na região de córtex profundo (área
C1/C2). HE, 400X de aumento
Figura 25: Linfócito realizando
diapedese (seta). HE, 400X de aumento
5.2.2.3 Características da vasculatura da região medular
As vênulas de endotélio alto (VEAs) presentes na porção medular do
linfonodo apresentam íntima relação com os labirintos linfáticos sendo separadas
destes por uma fina camada de espaço intersticial. Além disso, apresentam calibre
69
amplo, lúmem aberto, e ausência quase que total de linfócitos em seu interior (figura
26).
Figura 26: a) Endotélio regular das vênulas presentes na zona medular. HE, 400X de
aumento; b) contato íntimo das vênulas (seta preta) com os cordões medulares (seta
azul). HE, 200X de aumento
5.3 ANÁLISE DOS ESPÉCIMES EM MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
VARREDURA (MEV)
5.3.1 Análise quantitativa da área dos nódulos foliculares nos diferentes
grupos experimentais
Verificou-se, através da ANOVA, que a média das áreas dos nódulos
foliculares nos grupos 2, 3, 4 e 5 foram significativamente maiores quando
comparadas ao grupo-controle, enquanto que as áreas dos grupos 1 e 6 não
diferiram dos demais grupos (ANOVA) (tabela 6).
Tabela 6: Média em µm
2
e desvio-padrão (dp) das áreas dos nódulos foliculares nos diferentes
grupos experimentais. Porto Alegre, 2007.
Área dos nódulos foliculares Grupo
Média (µm
2
) dp
Controle 93878
B
8048
1 (2 dias) 144412
AB
22689
2 (3 dias) 161567
A
24671
3 (7 dias) 166113
A
16741
4 (10 dias) 188677
A
39857
5 (14 dias) 158170
A
32268
6 (21 dias) 144376
AB
24843
Médias seguidas de letras distintas na coluna diferem significativamente através da Análise da
Análise de Variância complementada pelo Teste de Comparação Múltiplas de Tukey, no nível de
significância de 5%.
70
5.3.2 Análise quantitativa do diâmetro dos modelos vasculares nos diferentes
grupos experimentais
O diâmetro dos modelos vasculares, presentes na periferia dos nódulos
foliculares, foi comparado nos diferentes grupos pós-operatórios e constatou-se que
nos grupos 1, 2, 3 e 4 foi significativamente maior que no grupo-controle, enquanto
que esse diâmetro nos grupos 5 e 6 não diferiu estatisticamente dos demais grupos
(ANOVA) (tabela 7).
Tabela 7: Média em µm e desvio-padrão (dp) dos diâmetros dos modelos vasculares nos diferentes
grupos experimentais. Porto Alegre, 2007.
Diâmetro dos modelos vasculares Grupos
Média (µm) Dp
Controle 7,70
B
0,24
1 (2 dias) 9,57
A
0,35
2 (3 dias) 9,05
A
0,48
3 (7 dias) 9,25
A
0,58
4 (10 dias) 9,79
A
0,99
5 (14 dias) 8,69
AB
0,80
6 (21 dias) 8,62
AB
0,86
Médias seguidas de letras distintas na coluna diferem significativamente através da Análise de
Variância complementada pelo Teste de Comparação Múltiplas de Tukey, no nível de significância de
5%.
5.3.3 Análise qualitativa da vasculatura dos linfonodos nos diferentes grupos
experimentais
A distinção entre os diferentes tipos de vasos sanguíneos foi feita com base
na impressão das células endoteliais sobre os modelos de corrosão quando
visualizados em MEV. Em modelos arteriais as impressões seguiam um padrão de
ranhuras profundas e os núcleos se apresentavam alongados e orientados
longitudinalmente ao vaso sanguíneo (figura 27a). Nos modelos de vênulas
regulares, as impressões nucleares seguiam um padrão de núcleos esféricos ou
ovóides (figura 27c). Em alguns vasos de maior calibre observou-se, além da
impressão do núcleo, a impressão do limite celular (figura 27b). Já os modelos de
vênulas de endotélio alto (VEAs) apresentavam irregularidades superficiais exibindo
um padrão de marcas profundas e cristas altas (figura 27d).
71
Figura 27: a) Eletromicrografia de varredura de modelos arteriais; setas indicam a
impressão nuclear. 4000X de aumento; b) eletromicrografia de varredura de vasos
sanguíneos exibindo impressão nuclear (setas azuis) além da impressão do limite celular
(setas pretas). 4000X de aumento; c) eletromicrografia de varredura de modelos de
vênulas regulares; setas indicam a impressão nuclear. 4000X de aumento; d)
eletromicrografia de varredura de modelos de VEAs. 1180X de aumento
5.3.3.1 Característica da vasculatura da região de córtex externo
A vasculatura da região do córtex externo apresentou-se como uma densa
rede vascular interrompida por depressões de forma ovóide correspondente aos
nódulos foliculares (figura 28a), sendo que no interior desses espaços poucos
capilares foram observados (figura 28b). Abaixo da cápsula, sobre os nódulos
foliculares, os capilares formam um plexo em forma de cúpula (figura 29) e dirigem-
se para o interior do linfonodo onde se continuam com as vênulas de endotélio alto
(figura 30).
72
Figura 28: a) Eletromicrografia de varredura demonstrando densa rede vascular,
interrompida pelos nódulos foliculares, presentes no córtex externo. 26X de
aumento; b) eletromicrografia de varredura demonstrando o interior dos nódulos
foliculares com mínima quantidade de vasos (seta). 200X de aumento
Figura 29: Eletromicrografia de varredura demonstrando a cadeia de capilares
formando plexo semelhante à cúpula na superfície externa dos nódulos
foliculares; a) 188X de aumento; b) 500X de aumento
Figura 30: Eletromicrografia de varredura
demonstrando encontro entre um capilar e
uma VEA (seta). 1000X de aumento
73
Nas margens laterais dos nódulos foliculares constatou-se a presença de
alguns capilares apresentando um padrão de finos chanfros circulares no local de
união com as vênulas de endotélio alto (figura 31), sendo essa constrição
responsável por uma diminuição brusca no diâmetro do vaso (figura 32).
As VEAs formaram um plexo semelhante a “cesto” circundando os nódulos
foliculares nas porções laterais e basal. Alguns capilares presentes na periferia dos
nódulos foliculares, particularmente nas margens externas mais próximas à cápsula,
apresentam fundo cego (figura 33).
Figura 31: Eletromicrografia de varredura dos diferentes padrões de chanfros circulares observados
no encontro de um capilar com uma VEA. a) 2000X de aumento; b) 8000X de aumento; c) 1000X de
aumento; d) 4000X de aumento; e) 1000X de aumento; f) 4000X de aumento; g) 1000X de aumento;
h) 4000X de aumento
Figura 32: Eletromicrografia de varredura demonstrando área de constrição no calibre
vascular na união de um capilar com uma vênula de endotélio alto; a) 1000X de aumento;
b) medidas demonstrando a diminuição do calibre no local de união do capilar com a VEA.
8000X de aumento
74
Figura 33: Eletromicrografia de varredura demonstrando
característica da rede vascular formada pelas VEAs na
base e nas laterais dos nódulos foliculares (setas
amarelas) e vasos de fundo cego (setas vermelhas) na
periferia dos nódulos foliculares. 200X de aumento
As VEAs iniciais, presentes na zona internodular, fusionam-se e formam
vênulas de calibres crescentes a medida que se aproximam da região de córtex
profundo (figura 34).
Figura 34: Eletromicrografia de varredura demonstrando a fusão de VEAs de menor
calibre formando vênulas de calibre maior na porção mais interna dos linfonodos; a)
600X de aumento; b) medidas demonstrando o aumento do calibre das VEAs conforme
se aproximam do interior do linfonodo. 500X de aumento
Em todos os grupos experimentais as VEAs apresentam o mesmo padrão,
exceto no grupo-controle e no grupo 1 onde constatou-se uma superfície menos
corrugada e depressões menos profundas (figura 35).
75
Figura 35: Eletromicrografia de varredura demonstrando característica das VEAs
presentes no grupo-controle e no grupo 1; a) 700X de aumento; b) medidas demonstrando
o aumento do calibre das VEAs conforme se aproximam do interior do linfonodo, 600X de
aumento
Em alguns linfonodos do grupo 4 (10 dias) e 5 (14 dias), houve cópia do
espaço perivascular, sendo que o mesmo apresentava-se como protrusões
superficiais irregulares que se interpunham entre os capilares. Esse extravasamento
ocorreu sempre na base dos nódulos foliculares e o material projetava-se para o
interior desses espaços (figura 36).
Figura 36: Eletromicrografia de varredura demonstrando a cópia do espaço perivascular;
a) 875X de aumento; b) seta indicando um capilar interposto ao espaço perivascular.
1750X de aumento
Visualizou-se uma quantidade maior de orifícios, compatíveis com a
angiogênese por intussuscepção, nos grupos 1 e 2 apesar dessa característica ter
sido observada em todos os grupos (tabela 8). Nos animais dos grupos-controle, 1,
2, 3, 4 e 5, esses orifícios eram visualizados nas extremidades dos vasos
76
sanguíneos (figura 37), enquanto que no grupo 6 esses orifícios eram visualizados
em locais de bifurcação dos vasos (figura 38).
Tabela 8: Número total de animais em cada grupo (n) e porcentagem de animais com angiogênese
por intussuscepção nos diferentes grupos experimentais. Porto Alegre, 2007.
Grupos n Presença de angiogênese por intussuscepção
Controle 3
33,33%
1 (2 dias) 6 83,33%
2 (3 dias) 5 80%
3 (7 dias) 8 25%
4 (10 dias) 5
40%
5 (14 dias) 5
40%
6 (21 dias) 7
42,85%
Figura 37: Eletromicrografia de varredura dos diferentes padrões de angiogênese por
intussuscepção observados nos modelos vasculares. a) 2000X de aumento; b) 8000X de aumento;
c) 1000X de aumento; d); 4000X de aumento; e) 2000X de aumento; f) 4000X de aumento; g) 1000X
de aumento; h) 8000X de aumento; i) 2000X de aumento; j) 8000X de aumento; k) 2000X de
aumento; l) 8000X de aumento
77
Figura 38: Eletromicrografia de varredura dos diferentes padrões de angiogênese por intussuscepção
observados nos modelos vasculares do grupo 6. a) 2000X de aumento; b) 8000X de aumento; c)
2000X de aumento; d); 8000X de aumento; e) 2000X de aumento; f) 8000X de aumento; g) 2000X de
aumento; h); 8000X de aumento
5.3.3.2 Característica da vasculatura da cápsula dos linfonodos
A rede vascular da cápsula foi observada em alguns linfonodos e constatou-
se que esta percorre toda a extensão do linfonodo. As veias e artérias se ramificam
formando vasos de calibres menores, seguindo trajetos sinuosos dispostos
paralelamente a superfície externa do linfonodo e perpendicularmente aos nódulos
foliculares, estruturas estas encobertas pela cápsula (figura 39).
Figura 39: a) Eletromicrografia de varredura demonstrando as características dos vasos
sanguíneos presentes na cápsula dos linfonodos. 51X de aumento; b) eletromicrografia
de varredura demonstrando parte da cápsula sobreposta aos nódulos foliculares (setas).
100X de aumento
78
Alguns linfonodos, mesmo recebendo fluxo arterial pelo hilo, apresentavam
vasos arteriais provenientes da vasculatura capsular. Essas artérias lançam ramos
de menor calibre que participam da vascularização do córtex externo (figura 40).
Figura 40: Eletromicrografia de varredura demonstrando artérias da cápsula (setas)
lançando ramos de menor calibre para a região de córtex externo; a) 250X de aumento
b) 500X de aumento; c) 700X de aumento; d) 600X de aumento
5.3.3.3 Característica da vasculatura da região do hilo
Na região do hilo constatou-se a presença de uma a duas veias de grande
calibre acompanhadas por duas a três artérias de pequeno calibre que penetram
através dessa região para o interior do linfonodo (figura 40).
79
Figura 41: Eletromicrografia de varredura demonstrando as características da
vasculatura presente na região do hilo; a) 63X de aumento b) eletromicrografia de
varredura demonstrando veia de grande calibre penetrando no interior do linfonodo
através do hilo. 252X de aumento; c) 250X de aumento; d) eletromicrografia de varredura
demonstrando veia e artéria penetrando no interior do linfonodo através do hilo. 1154X
de aumento
6 DISCUSSÃO
81
6 DISCUSSÃO
A lesão tissular causada por um ferimento induz a uma complexa seqüência
de eventos conhecidos como resposta inflamatória. O médico romano Celsus
descreveu os “quatro sinais cardinais da inflamação” como rubor, tumor, calor e dor
e outro médico, Galeano, adicionou o quinto sinal: functio laesa (perda de função).
Esses sinais refletem os três principais eventos de uma resposta inflamatória: a
vasodilatação, o aumento da permeabilidade capilar e o influxo de fagócitos dos
capilares para o interior dos tecidos (GOLDSBY et al., 2002). Na presente pesquisa
a perda de função poderia ter se refletido na perda de peso dos animais, já que o
local da ferida, principalmente durante a alimentação, sofre trauma constante pelo
contato com os incisivos inferiores. Apesar disso, nenhum grupo apresentou perda
de peso, contudo os animais do grupo 1 (2 dias) tiveram o menor ganho de peso
(1,1g) quando comparados com os demais grupos (tabela 1). No primeiro dia
subseqüente ao procedimento cirúrgico a dificuldade de alimentação provavelmente
seja maior pela ausência de proteção epitelial sobre a ferida e, por esse motivo os
animais poderiam apresentar perda de peso. Essa comprovação poderia ser feita
incluindo-se uma avaliação no primeiro dia pós-operatório.
O estudo da anatomia vascular é essencial para a compreensão das
alterações fisiológicas e patológicas que possam ocorrer em qualquer órgão ou
tecido e, por isso, a vasculatura dos linfonodos de ratos foi avaliada através de
microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Uma ferida foi
produzida no ventre da língua dos animais e decorridos os tempos de 2, 3, 7, 10, 14
e 21 dias, os linfonodos foram avaliados, procurando verificar alterações vasculares
que pudessem estar relacionadas com o processo de cicatrização da ferida. A
técnica de corrosão vascular, que representa a obturação de espaços vazios com
um material que autopolimerize e resista a ação corrosiva dos agentes utilizados
para a maceração e descalcificação dos tecidos (LAMESTCHWANDTNER et al.,
1989), tem sido utilizada em modelos animais (CASTENHOLZ, 1989;
CASTENHOLZ, 1995; HOSSLER; MONSON, 1998; OKADA et al., 2002) e algumas
poucas vezes em modelos humanos (GADRE et al., 1994; SANGIORGI et al., 2004).
Essa técnica permite a obtenção de espécimes formados por uma trama de modelos
vasculares (SUGIOKA; IKE, 1993) e através da análise desses modelos pode-se
82
obter a imagem fiel da anatomia vascular (arranjo tridimensional da vascularização,
o diâmetro vascular, a impressão das células endoteliais e dos seus núcleos na
superfície do modelo vascular) (HOSSLER; DOUGLAS, 2001), bem como a relação
espacial entre os diferentes tipos de vasos sanguíneos (CASTENHOLZ, 1989).
Embora os modelos obtidos ofereçam percepção sobre a natureza sistêmica da
vasculatura, uma avaliação clara dos detalhes morfológicos ainda é limitada, pois
toda a avaliação é realizada sobre aspectos indiretos (CASTENHOLZ, 1995) e, além
disso, a exata interpretação morfológica só é conseguida quando realizada sobre os
modelos que apresentem uma ótima qualidade de réplica (CASTENHOLZ, 1989).
Uma das principais desvantagens da técnica de corrosão vascular é a
obtenção de modelos vasculares sem o tecido de sustentação (SUGIOKA; IKE,
1993). Para compensar esse fato e visto que o conhecimento dos vasos a serem
estudados deve ser derivado de observações que correlacionem a microscopia de
luz e a microscopia eletrônica de varredura (CASTENHOLZ, 1989), empregou-se na
presente pesquisa a avaliação de linfonodos regionais de ratos através da
microscopia de luz, além da avaliação de modelos de corrosão vascular desses
órgãos em MEV.
Durante a análise dos linfonodos em microscopia de luz não foram
considerados vasos sanguíneos aqueles que apresentavam em seu interior
estruturas compatíveis com válvulas, apesar da ocorrência das mesmas no interior
de veias e vênulas (CAGIATI et al., 2006). A diferenciação entre a vasculatura
linfática e sanguínea fica dificultada principalmente quando a morfologia histológica
é a única base para esta distinção (OLIVER; DETMAR, 2002) e, além disso,
segundo Scavelli et al. (2004) esses vasos se tornam indistinguíveis na presença de
processos patológicos e precisam ser vistos como integrantes de uma cadeia
vascular funcional e intercomunicante.
Através da técnica de corrosão vascular associada a MEV pôde-se constatar
a riqueza da vasculatura dos linfonodos, muitas vezes inimaginável através da
técnica histológica de rotina. A impossibilidade de visualização de muitos vasos
sanguíneos através da técnica histológica provavelmente se deve ao pequeno
diâmetro apresentado por esses vasos e também pelo ângulo de corte instituído
sobre essas estruturas durante a confecção das lâminas. Portanto, é provável que o
número de vasos sanguíneos verificados através da microscopia de luz esteja,
nesse estudo, subestimado.
83
Os modelos vasculares permitiram a análise da vasculatura superficial dos
linfonodos, visto que os modelos não foram seccionados para visualização da
vasculatura interna. O padrão de impressão endotelial, observado nos modelos de
corrosão dos linfonodos, permitiu que a diferenciação entre veias e artérias fosse
feita. Nos modelos arteriais os núcleos das células endoteliais apresentaram-se
alongados e paralelamente orientados em relação ao longo eixo do vaso,
diferentemente das veias que apresentaram um endotélio com células mais
arredondadas, compatível com as descrições feitas por Castenholz (1995) e Hossler
e Monson (1998). Para Lamestchwandtner et al. (1989) esses padrões de impressão
endotelial, deixados sobre os modelos de corrosão vascular, podem ser
influenciados, por exemplo, pelo método de fixação dos vasos sanguíneos. Bélisle e
Sainte-Marie (1985) estudaram a aparência das vênulas de endotélio alto (VEAs)
depois de utilizarem vários métodos de sacrifício dos animais e várias maneiras de
remoção e fixação dos linfonodos. Comprovaram que os métodos que envolvem
hemorragia (exsanguinação) ou procedimento de rotina (remoção dos linfonodos e
colocação em solução fixadora) resultam em um alto número de VEAs com lúmem
fechado, enquanto que a fixação in situ ou a perfusão evitam o colapso vascular.
Baseados nesses achados os vasos sanguíneos foram fixados por perfusão com
paraformaldeído a 4% tamponado em ambas as técnicas avaliadas.
Através da MEV constatou-se que a angioarquitetura da cápsula é composta
por artérias e veias de calibres variados com trajetos sinuosos que se dispõem
paralelamente à superfície externa dos linfonodos e perpendicularmente aos nódulos
foliculares, estes últimos totalmente encobertos pela vasculatura capsular. Bélisle e
Sainte-Marie (1990) relatam que irrigação capsular é feita por capilares dos tecidos
perinodais e não por capilares do linfonodo; e que o seio subcapsular é desprovido
de vasos sanguíneos. Esses dois fatores poderiam auxiliar na manutenção do
antígeno no interior do linfonodo, impedindo que os mesmos atravessassem a
parede externa do seio e se difundissem para o interior da cápsula e tecidos
perinodais. Não foi tema deste estudo saber se a irrigação da cápsula é de
responsabilidade dos tecidos perinodais, mas se evidenciou que artérias presentes
na cápsula lançam ramos de menor calibre que atravessam o seio subcapsular e
chegam ao córtex externo auxiliando, conseqüentemente, na irrigação do mesmo.
Além disso, a não visualização de artérias de maior calibre no córtex externo leva a
84
sugerir que, embora existam artérias penetrando nos linfonodos através do hilo, os
capilares superficiais dos linfonodos podem ser provenientes das artérias capsulares
e não de artérias vindas do interior do órgão, ficando as artérias hilares responsáveis
pela irrigação das porções internas dos linfonodos. Essa idéia é reforçada pelos
achados de Belz e Health (1995) que comprovam, pela análise através da MEV de
modelos vasculares de linfonodos de cães, que além dos linfonodos receberem
irrigação pelas artérias hilares, recebem artérias adicionais, algumas delas vindas da
cápsula, outras vindas da porção externa da cápsula. Para sanar as dúvidas em
relação a presença ou não de suprimento sanguíneo não-hilar, se faz necessário o
estudo da vasculatura dos tecidos circundantes aos linfonodos e da angioarquitetura
interna desses órgãos, através do secção dos modelos de corrosão. Apesar de
Okada et al. (2002) relatarem, após secção de modelos vasculares de linfonodos de
ratos, que toda a irrigação desse órgão é proveniente do hilo, maiores informações
são necessárias para que essa afirmação seja comprovada, visto que o número de
animais utilizados pelos autores foi pequeno e não houve relato sobre a quantidade
de linfonodos avaliados. Sabendo que as variações no suprimento sanguíneo podem
ocorrer entre diferentes espécies, diferentes grupos de linfonodos e mesmo entre
distintos linfonodos do mesmo grupo (BELZ; HEATH, 1995), se faz necessária uma
quantidade maior de linfonodos para que uma conclusão definitiva seja obtida.
Devido a remoção da cápsula na maioria dos linfonodos, não foi possível verificar se
o processo cicatricial promove alterações no padrão vascular dessa estrutura nos
diferentes grupos experimentais avaliados.
Constatou-se na região de córtex externo, também através da MEV, a
presença de uma rede capilar que se sobrepõe aos nódulos foliculares formando um
plexo em forma de cúpula, disposto logo abaixo do seio subcapsular. Esse achado
concorda com o relato feito por Bélisle e Sainte-Marie (1990) de que a vasculatura
do córtex externo dos linfonodos nunca alcança o seio subcapsular, dispondo-se
sempre abaixo deste. A avaliação em microscopia de luz demonstrou raros capilares
localizados na porção superior dos nódulos foliculares, evidenciando a limitação da
técnica em demonstrar essa rede capilar sobre os nódulos foliculares. Conforme já
discutido o reduzido diâmetro vascular e a não inclusão do capilar e das células
endoteliais no ângulo de corte utilizado no presente estudo, são fatores que podem
dificultar a visualização dessa rede capilar nas lâminas coradas por HE.
85
No córtex externo, esses capilares que estão sobrepostos aos nódulos
foliculares, drenam para o interior das vênulas pós-capilares ou vênulas de endotélio
alto (VEAs), vasos sanguíneos característicos dos linfonodos. Externamente, essas
vênulas percorrem o espaço logo abaixo do seio subcapsular, como VEAs iniciais de
pequeno calibre, e ocupam toda a zona internodular. Essas numerosas VEAs iniciais
se fundem formando vasos mais amplos e menos numerosos conforme se
aproximam da parte interna do linfonodo.
Quando essas vênulas foram visualizadas em um maior aumento, através da
MEV, constatou-se que a superfície do modelo exibe um padrão de marcas
profundas e cristas altas concordando com a descrição feita por Castenholz (1989).
Sua visualização se restringe ao córtex externo delimitando os nódulos foliculares
em sua base e porções laterais, o que concorda com os achados de Bélisle e Sainte-
Marie (1990). Histologicamente, as vênulas de endotélio alto (VEAs) exibem células
endoteliais altas, cuja porção apical projeta-se para o lúmen vascular
(CASTENHOLZ, 1989). A moldagem dessas células permite a obtenção de modelos
totalmente corrugados o que justifica as características irregulares desses vasos
quando analisados através da MEV. Para Bélisle e Sainte-Marie (1990) a
característica das VEAs, vistas em MEV, pode ser fruto da impressão das células
endoteliais hipertrofiadas, já para Castenholz (1989) essa característica pode
decorrente da moldagem dos inúmeros leucócitos, a maioria linfócitos, que se
encontram aderidos na parede desses vasos. Tanto a hipertrofia endotelial quanto a
presença de linfócitos no interior das VEAs foram observações feitas durante a
avaliação dos cortes histológicos e, provavelmente, esses aspectos são os
responsáveis pelas características das vênulas de endotélio alto (VEAs) visualizadas
nos modelos vasculares através da MEV.
Durante a avaliação histológica dos linfonodos, a presença de eritrócitos no
lúmen vascular serviria como auxiliar na identificação dos vasos sanguíneos e na
diferenciação entre vasos sanguíneos e vasos linfáticos, no entanto a lavagem do
sistema vascular realizada durante o preparo dos espécimes impossibilitou tal
visualização. Essa lavagem, contudo, não impediu que muitas células
permanecessem no interior dos vasos sanguíneos, sendo que algumas delas
pareciam estar livres no lúmen vascular. Segundo Selliseth e Selvig (1995), a
lavagem do sistema vascular remove as células que não se encontram unidas ao
86
endotélio. A microscopia intravital utilizada por Warnock et al. (1998) para avaliar o
comportamento de linfócitos, mononucleares e polimorfonucleares, permitiu verificar
que o processo de rolamento no lúmen das VEAs não é exclusivo dos linfócitos, mas
é compartilhado com outros subgrupos de leucócitos, apesar de serem os linfócitos
as células que se fixam firmemente no endotélio desses vasos. Segundo Sainte-
Marie e Peng (1995), os linfócitos que apresentam aderência firme ao endotélio
podem se unir lateralmente por pontes citoplasmáticas a outros linfócitos. Portanto,
as células que parecem estar livres no interior das vênulas de endotélio alto (VEAs),
podem ser linfócitos indiretamente retidos através da união com outros linfócitos
verdadeiramente unidos ao endotélio vascular. A presença das pontes
citoplasmáticas pode ser comprovada através da análise dos linfonodos em
microscopia eletrônica de transmissão, já que essas estruturas não podem ser
visualizadas através da microscopia de luz (SAINTE-MARIE; PENG, 1995). Portanto,
sabendo que a maioria dos linfócitos extravasa para o interior dos linfonodos via
vênulas de endotélio alto (IRJALA et al., 2003) e que a permanência de células no
interior dos vasos sanguíneos pode caracterizar a união firme das mesmas ao
endotélio, pode-se sugerir que as células visualizadas através da microscopia de luz
no interior dos vasos sanguíneos sejam linfócitos. Contudo, pela possibilidade de
alteração no padrão dessas células retidas no interior das VEAs em decorrência do
processo cicatricial, se faz necessária a utilização de outros métodos de avaliação
além da microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura para comprovação
desse fato.
O tráfego de linfócitos, através das vênulas de endotélio alto (VEAs), nos
órgãos linfóides é altamente controlado por moléculas presentes na superfície dos
linfócitos e pelos receptores dessas moléculas dispostos sobre a superfície das
células endoteliais (IRJALA et al., 2003). Em condições fisiológicas o número de
linfócitos que entra e sai dos linfonodos está em equilíbrio, mas durante a inflamação
ocorre um aumento no número de linfócitos que entra nos linfonodos de drenagem
induzindo um aumento dos mesmos (CYSTER, 1999). Observando as vênulas de
endotélio alto (VEAs) da porção medular constatou-se que as mesmas contêm
poucas células retidas no lúmen quando comparadas àquelas presentes no córtex
externo e no córtex profundo, corroborando com os relatos de Sainte-Marie e Peng
(1995) e de Warnock et al. (1998) de que a maioria das células visualizadas no
interior de vasos sanguíneos de linfonodos estão unidas às VEAs corticais. Apesar
87
de não ter sido realizada a contagem das células retidas no lúmen vascular nas
diferentes áreas dos linfonodos, a especificidade do córtex externo e córtex profundo
aos linfócitos poderia permitir que a concentração dessas células fosse maior nesses
locais, resultando em um estímulo cortical maior e, conseqüentemente, uma maior
produção de elementos de defesa.
Constatou-se pela análise dos modelos vasculares através da MEV, que as
características das vênulas de endotélio alto (VEAs) presentes no córtex externo dos
grupos 2, 3, 4, 5 e 6 (3, 7, 10, 14 e 21 dias respectivamente) diferiram daquelas
observadas no grupo controle e grupo 1 (2 dias). As VEAs desses dois últimos
grupos apresentaram-se com depressões menos profundas e conseqüentemente um
modelo vascular menos corrugado (figura 35). Conforme exposto anteriormente os
aspectos dos modelos de corrosão dessas vênulas, visualizados em microscopia
eletrônica de varredura, representam as características do endotélio e a quantidade
de células retidas no lúmen vascular. Durante o processo de reparo ocorre o
estímulo do endotélio das VEAs (OLUTOYE et al., 2005), permitindo a circulação de
linfócitos e a quantidade dessas células circulantes depende do grau de estimulação
desse endotélio (SAINTE-MARIE; PENG, 1995). Baseando-se nesses dados e
sabendo que o pico de linfócitos no interior do leito cirúrgico se dá no sétimo dia pós-
operatório (FISHEL et al., 1987; PARK; BARBUL, 2004), sugere-se que no grupo 1
(2 dias) o número de linfócitos no interior das VEAs dos linfonodos seja menor que
nos demais grupos experimentais. No período de dois dias pós-operatório as VEAs
podem estar sofrendo a ação de substâncias vasodilatadoras vindas do leito
cirúrgico via linfa aferente e, além disso, o estímulo inflamatório pode não ter sido
suficiente para causar hipertrofia endotelial. Esses dados, contudo, precisam ser
posteriormente confirmados através da mensuração do diâmetro e do lúmen
vascular das VEAs e através da contagem das células retidas no interior dessas
vênulas nos diferentes grupos experimentais.
Na região do córtex externo constatou-se que as VEAs formam uma cadeia
em forma de cesto ao redor de espaços ovóides, que correspondem aos nódulos
foliculares, circundando os mesmos em suas porções laterais e basal. Esses
achados concordam com a descrição feita previamente por Bélisle e Sainte-Marie
(1990) e Okada et al. (2002).
88
O interior dos nódulos foliculares apresenta uma vasculatura escassa quando
comparado com a zona internodular e os poucos capilares encontrados estão
dispostos, em sua maioria, na porção basal dos nódulos foliculares. Tanto a
microscopia de luz, quanto a microscopia eletrônica de varredura permitiram a
visualização da limitada vasculatura no interior dos nódulos foliculares, contudo a
MEV possibilita a visualização de uma maior quantidade de vasos quando
comparada com a microscopia de luz. Bélisle e Sainte-Marie (1990) relatam que os
capilares presentes na porção basal dos nódulos foliculares surgem de pequenas
arteríolas que alcançam a porção profunda desses nódulos. Na presente pesquisa a
incapacidade de verificar, através da MEV, a presença de tais arteríolas pode ser
decorrente do não seccionamento dos modelos vasculares. Esse seccionamento
não foi realizado devido a falta de instrumentos adequados para tal fim e por isso a
avaliação da vasculatura interna dos linfonodos foi realizada somente através da
microscopia de luz. Quando, através de ambas as técnicas, foram comparados os
diferentes grupos experimentais não se constatou alteração no aspecto vascular e
nenhum vaso sanguíneo de maior calibre foi visualizado no interior dos nódulos
foliculares.
Bélisle e Sainte-Marie (1981b), estudando linfonodos de ratos em cortes
histológicos corados com prata, que evidencia a trama de fibras reticulares, relatam
que as unidades de córtex profundo se apresentam como uma área de forma e
tamanho variados, centrada sobre a abertura dos vasos linfáticos aferentes e
povoada por pequenos linfócitos. Esta constante associação topográfica sugere que
os fatores, presentes na linfa aferente, sejam responsáveis pela topografia e
possivelmente pela forma da unidade. O local escolhido para a contagem dos vasos
sanguíneos, na região de córtex profundo, foi baseada na descrição de que as VEAs
se concentram na periferia das unidades de córtex profundo (BÉLISLE; SAINTE-
MARIE 1981c) sendo, excepcionalmente, encontradas no centro dessas unidades
(BÉLISLE; SAINTE-MARIE, 1990). Nos cortes histológicos constatou-se que as
VEAs do córtex profundo apresentam endotélio mais regular, maior calibre e lúmen
mais amplo quando comparadas com aquelas observadas na região de córtex
externo.
89
As vênulas medulares passam a apresentar endotélio regular, com lúmen
mais amplo e poucas células no seu interior quando comparadas com as vênulas de
endotélio alto (VEAs) da região cortical. Castenholz e Castenholz (1996) relatam,
depois de análise de modelos de corrosão de linfonodos do grupo para-aórtico, que
as vênulas medulares deixam de apresentar superfície corrugada, passando a
apresentar superfície lisa e com impressões ovóides ou redondas. Sainte-Marie e
Peng (1991) relatam que as VEAs observadas na região cortical podem se contrair
ou dilatar durante a vida dos animais e que quando estimuladas as VEAs presentes
na porção do córtex podem apresentar um diâmetro maior que as vênulas da porção
medular. Com o aumento do diâmetro das VEAs o recrutamento de linfócitos
sanguíneos aumenta, já que o fluxo sanguíneo se torna mais lento possibilitando um
maior tempo de contato dos linfócitos com o endotélio vascular. Os mesmos autores
no ano de 1995, depois de realizarem a incubação de linfócitos sobre lâminas de
linfonodos, constataram que 83% dessas células se encontravam unidas as VEAs
corticais e apenas 5% às vênulas medulares. Essa redução na quantidade de
células nas vênulas medulares é percebida facilmente nos cortes histológicos,
mesmo sem ter sido realizada a contagem dessas células.
No hilo constatou-se a presença de artérias e veias arranjadas em íntimo
contato que penetram para o interior dos linfonodos, sendo as artérias sempre
menores que as veias. Castenholz e Castenholz (1996) relatam que nessa região as
artérias apresentam um padrão de sulcos circulares criados pelas células
musculares, fato este não confirmado na presente pesquisa, contudo salienta-se que
essa diferença pode ter acontecido em função do hilo ter sido avaliado somente em
alguns modelos vasculares. A impossibilidade de avaliação de um número maior de
espécimes nessa região ocorreu pela fratura dos modelos durante a tentativa de
remoção dos mesmos da superfície do stub. É importante relembrar que no
desenvolvimento da pesquisa padronizou-se que o modelo vascular do linfonodo
fosse colado de tal maneira que a região do hilo ficasse voltada para a superfície do
stub. A não inclusão do hilo na maioria dos cortes histológicos avaliados
impossibilitou uma análise mais aprofundada da vasculatura dessa região através da
microscopia de luz e por isso sugere-se a realização de cortes seriados dos
linfonodos em estudos posteriores para superar essa dificuldade encontrada.
90
Nas porções laterais dos nódulos foliculares constatou-se a presença de
vasos de fundo cego concordando com os achados de Bélisle e Sainte-Marie (1990).
Segundo Grunt et al. (1985), as extremidades cegas presentes nos modelos
vasculares podem ser associadas ao preenchimento incompleto do sistema
vascular. Para Bélisle e Sainte-Marie (1990) os caminhos venoso e arterial são
obturados pela resina simultaneamente e de maneira progressiva desde o hilo até a
porção mais periférica dos linfonodos. Se esse fato for verdadeiro a formação de
vasos de fundo cego poderia ser explicada pela manutenção da solução de lavagem
no interior do sistema vascular nas voltas capilares mais externas, impedindo o
preenchimento pelo material de moldagem. A possibilidade de que essas estruturas
sejam artefatos de técnica existe, já que estão localizadas no pólo mais distante da
vasculatura com relação ao hilo, sendo os últimos locais a receber a resina de
infusão. No entanto, protrusões em forma de dedos foram visualizadas nas margens
de uma ferida produzida em mucosa palatina de ratos durante o processo de
cicatrização (SELLISETH; SELVIG, 1995) e, além disso, Bélisle e Sainte-Marie
(1990) constataram a presença de vasos de fundo cego mesmo em animais que
receberam um excesso de resina e que tiveram extravasamento do material de
moldagem em alguns locais. Esses achados deixam a discussão em aberto sobre a
existência dessas estruturas, mas se todos os vasos de fundo cego forem
consideradas artefatos de técnica, a angiogênese por brotamento não poderia estar
sendo discutida, afinal esta se apresenta nos modelos de corrosão vascular como
protusão em forma de dedo, ou seja, de fundo cego.
Em muitos capilares, presentes nas porções laterais dos nódulos foliculares,
foram detectados finos chanfros ou entalhes circulares na união dos capilares com
as vênulas de endotélio alto (VEAs). Segundo Castenholz (1989) esses entalhes são
produzidos por células de músculo liso e raramente são visualizadas na porção
venosa. Segundo esse autor a resina Mercox
®
penetra no interior desses chanfros,
que são produzidos pelos pericitos, imitando o aspecto morfológico dessas células.
Os pericitos são células contráteis que circundam o endotélio capilar capazes de
contrair e relaxar sendo funcionalmente posicionados para afetar a permeabilidade
capilar (EDELMAN et al., 2006).
Selliseth e Selvig (1993) após estudarem a microvasculatura do dorso da
língua de ratos, em modelos de corrosão, detectaram a presença de constrições no
91
ponto de união de capilares com o plexo venoso. A presença de estruturas
semelhantes a esfíncteres na junção de capilares com a vênula de endotélio alto
(VEA) ocorre provavelmente pela necessidade de redução drástica do fluxo
sanguíneo quando da passagem do sangue dos capilares para as VEAs
(CASTENHOLZ; CASTENHOLZ, 1996). No interior do leito cirúrgico, a alteração do
tônus pós-capilar poderia produzir uma elevação da pressão sanguínea capilar
criando uma hiperemia da língua como parte da uma reação inflamatória. Portanto, o
fluxo sanguíneo dos linfonodos pode ser controlado não somente pela alteração na
pressão arterial sanguínea ou pela dilatação vascular, mas também pela alteração
no tônus pós-capilar. Além disso, convém relatar a possibilidade de que no interior
dos linfonodos essas constrições nos diâmetros dos vasos sanguíneos e a diferença
de diâmentro entre capilares e VEAs poderiam ser responsáveis pela diminuição do
fluxo sanguíneo permitindo aos linfócitos circulantes permanecer mais tempo nas
vênulas de endotélio alto facilitando a fixação dos mesmos ao endotélio vascular e
posteriormente o processo de migração para o interior dos linfonodos. Contudo os
efeitos da contração dos pericitos in vivo ainda permanecem desconhecidos (SIMS,
2000).
Em algum exemplares dos modelos vasculares dos grupos 4 e 5 (10 e 14 dias
respectivamente) constatou-se o extravasamento de resina do interior dos vasos
sanguíneos copiando o espaço perivascular. Segundo Lametschwandtner et al.
(1989) o extravasamento de resina para os tecidos pode ter acontecido em
decorrência da ruptura de alguns vasos sanguíneos provocada pelo excesso de
força durante a injeção da resina de infusão. Apesar de possível, é pouco provável
que essa tenha sido a causa desse extravasamento, já que essa característica não
foi uma constante em todos os linfonodos do mesmo animal, o local do
extravasamento foi sempre o mesmo e também porque o processo de infusão do
material foi realizado manualmente sempre pelo mesmo operador. Segundo
Castenholz (1995) o extravasamento da resina para o interstício pode ocorrer
através dos espaços criados no endotélio pelos linfócitos durante o movimento de
diapedese ou, segundo Okada et al. (2002) esse extravasamento pode ser em
decorrência de uma comunicação existente entre vaso sanguíneo e vaso linfático.
Na presente pesquisa essa moldagem ocorreu sempre na base dos nódulos
foliculares e se projetou para o interior do centro germinativo. Sabendo que as VEAs
92
se localizam na base dos nódulos foliculares, e a partir dessas os linfócitos migram
para o interior dos linfonodos, pode-se sugerir que o espaço criado durante o
movimento de diapedese permita o extravasamento de resina moldando o espaço
intersticial, no entanto como esse achado foi verificado em poucos exemplares essa
afirmação pode não ser verdadeira e necessita posterior comprovação.
A análise dos modelos vasculares revelou também a presença de
angiogênese por intussuscepção em todos os grupos experimentais, contudo a
maior porcentagem de animais com esse tipo de angiogênese foi vista nos grupos 1
(2 dias) e 2 (3 dias), respectivamente 83,33%, 80% (tabela 8). Djonov e Burri (2005)
relatam que a angiogênese por intussuscepção somente pode ser visualizada com
segurança através da técnica de corrosão vascular visualizada pela MEV ou através
da reconstrução em três dimensões das imagens de cortes seriados avaliados em
microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de luz. A descrição desse
processo somente foi possível através da análise dos modelos de corrosão vascular
em microscopia eletrônica de varredura, no entanto a não visualização em
microscopia de luz decorre do fato de não ter sido utilizada a análise de cortes
histológicos seriados.
A angiogênese é um processo de crescimento e expansão microvascular
(DJONOV; BURRI, 2005) evidente em processos fisiológicos e patológicos como o
câncer, o processo de cicatrização de feridas e a inflamação (DVORAK, 2005). A
angiogênese por intussuscepção ocorre através da divisão do lúmen de um vaso
pré-existente pela inserção de um pilar intraluminal (PATAN et al., 2001) e é um
processo rápido (BURRI et al., 2004) necessitando somente de 4-5 horas para que o
pilar intraluminal esteja completamente formado (DJONOV; BURRI, 2005). A rapidez
na formação da angiogênese por intussuscepção pode ser a explicação para a
presença de uma maior quantidade desse fenômeno no grupo 1 e 2 (2 e 3 dias
respectivamente).
No leito cirúrgico, desde o momento do trauma até aproximadamente 4 a 6
dias, está ocorrendo a fase de hemostasia e inflamação e uma liberação de
substâncias como vasodilatadores e fatores de crescimento que possibilitam o início
do processo de reparo (BROUGHTON et al., 2006). Patan et al. (2001) relatam que
a presença de vasodilatação auxilia na divisão do lúmem vascular, portanto a
presença de uma maior quantidade de angiogênese por intussuscepção na
93
vasculatura dos linfonodos, durante os períodos iniciais do processo de reparo,
permite cogitar sobre a possibilidade de que a presença dessas substâncias
liberadas no leito cirúrgico não esteja restrita ao local da ferida, mas possam ser
transportadas através da circulação linfática aferente até os linfonodos regionais.
Contudo se faz necessária a comprovação desse fato através de outros métodos de
diagnósticos como a imunohistoquímica.
A presença de pilares intraluminias nos vasos sanguíneos, presentes em
maior quantidade nos grupos 1 e 2, pode facilitar o contato das células vindas do
sangue com as vênulas de endotélio alto (VEAs), proporcionando uma maior
passagem de linfócitos do sangue para o interior dos linfonodos. Segundo Kurz et al.
(2003), a divisão que ocorre nos vasos de maior calibre forma dois vasos menores
cuja soma dos diâmetros é maior que o diâmetro do vaso de origem, diminuindo o
fluxo sanguíneo na periferia do órgão. A progressão da angiogênese permite a
formação de alças capilares primárias que, segundo Patan et al. (2001), iniciam sua
formação no interior da ferida próximo ao terceiro dia pós-trauma, juntamente com a
migração de fibroblastos durante a formação do tecido de granulação. Nos
linfonodos, a presença dessas alças capilares não foi avaliada, mas certamente
estarão presentes e esse processo pode estar relacionado com a necessidade dos
linfonodos regionais reestruturarem sua rede vascular permitindo um maior aporte
sanguíneo, um maior contato com as substâncias vindas do leito cirúrgico e
conseqüentemente uma maior produção de células de defesa. Os mesmos autores
citados relatam que na ferida cirúrgica, aos 7 dias coexistem formação das alças e
início do processo de segmentação dos vasos. Na presente pesquisa aos 7 dias
houve uma diminuição brusca da angiogênese por intussuscepção no interior dos
linfonodos e isso pode ter ocorrido em função da progressão do processo de
angiogênese que é a formação de alças capilares e posterior segmentação vascular.
Em todos os grupos a angiogênese por intussuscepção esteve presente na
extremidade livre dos vasos sanguíneos, exceto no grupo 6 (21 dias) onde a mesma
localizava-se na área de bifurcação desses vasos. Segundo Burri et al. (2004)
quando a formação de pilares intraluminais está localizada nas extremidades livres
dos vasos ocorre a arborização intussusceptiva, ou seja, a expansão da rede
vascular, no entanto, quando ocorrem em bifurcação de vasos induzem a
remodelação ou poda dos brotos vasculares. O destino e efeito desses pilares
formados na bifurcação de pequenos vasos dependem do tamanho, forma e
94
localização dos pilares, podendo otimizar as condições hemodinâmicas, adaptar os
mecanismos de aumento de fluxo e pressão sanguínea e induzir a completa
oclusão, seguido pela regressão, retração e atrofia do broto afetado (BURRI et al.,
2004). Diante disso, e sabendo que a angiogênese por intussuscepção não é
somente responsável pelo aumento no leito vascular, mas está diretamente
envolvida na remodelação estrutural para otimização da forma e função dos vasos
(KURZ et al., 2003), sugere-se que angiogênese por intussuscepção constatada nos
grupos 1 (2 dias) e 2 (3 dias) seja responsável pela expansão da cadeia vascular
dos linfonodos, enquanto que no grupo 6 (21 dias) modifique e otimize a geometria
dos vasos e as condições hemodinâmicas dos linfonodos. Patan et al. (2001)
avaliaram o processo de reparo no pedículo ovariano depois de realizada a remoção
do ovário de ratas e constataram que a partir dos 14 dias pós-operatórios existe uma
regressão na quantidade de vasos sanguíneos no interior da ferida e aos 21 dias o
tecido cicatricial é menos vascularizado. Portanto a angiogênese por intussuscepção
no grupo 6 pode ser responsável pelo remodelamento da vasculatura dos linfonodos
redirecionando as células apresentadoras de antígeno no interior desse órgão ou
pode representar a redução no número de vasos neoformados, retornando à
quantidade de vasos presentes antes da injúria tecidual pela progressão do reparo
da ferida presente na língua.
Na superfície dos linfonodos corroídos foram avaliados o maior e menor
diâmetro dos nódulos foliculares o que possibilitou o cálculo da área superficial
desses nódulos. Para a mensuração dos diâmetros utilizou-se como limite externo
dos nódulos foliculares as vênulas de endotélio alto (VEAs), já que as mesmas estão
sempre circundando tais nódulos. Os valores das áreas foram analisados
estatisticamente e verificou-se que os grupos 2, 3, 4 e 5 (respectivamente 3, 7, 10 e
14 dias) diferiram significativamente do grupo-controle (tabela 6). Quando a
mensuração do diâmetro de três capilares localizados na periferia externa de cada
nódulo folicular foi realizada, constatou-se uma diferença significativa em relação ao
controle nos grupos 1, 2, 3 e 4 (respectivamente 2, 3, 7 e 10 dias) (tabela 7).
Diante desses resultados pôde-se verificar que o aumento do diâmetro dos
vasos sanguíneos ocorreu previamente ao aumento da área dos nódulos foliculares.
No interior da ferida, logo após a injúria tecidual, inicia-se uma série de eventos
objetivando primeiramente cessar o sangramento e na seqüência dar condições
95
para que a cicatrização ocorra. Durante as fases iniciais do processo de reparo a
circulação sanguínea está afetada pelo trauma e a circulação linfática se torna
predominante (ALLER et al., 2004b) sendo que esta linfa drenada dos tecidos
inflamados aos linfonodos regionais contém altos níveis de citocinas e quimiocinas
(SZCZESNY; OLSZEWSKI, 2003). Uma vasoconstrição transitória ocorre no interior
da ferida com a intenção de controlar o sangramento, mas logo em seguida uma
vasodilatação é causada principalmente pela ação da prostaglandina (BROUGHTON
et al., 2006). Avaliando o processo cicatricial de ferida produzida em mucosa
palatina de ratos, Selliseth e Sevig (1995) constataram o aumento no diâmetro dos
vasos na margem da ferida quando comparado com o tecido não operado. Para
esses autores a vasodilatação foi mais pronunciada no segundo dia, diminuindo
progressivamente no período pós-operatório de 20 dias, contudo no período
avaliado, o calibre vascular não alcançou o diâmetro observado no controle. Na
presente pesquisa o diâmetro vascular dos linfonodos também foi maior a partir do
segundo dia pós-operatório e ao final do período experimental (21 dias) não atingiu o
diâmetro dos vasos dos animais-controle, contudo não foi verificada a diminuição
progressiva do calibre vascular.
A ação de substâncias vasoconstritoras nos linfonodos poderia se refletir na
presença de capilares com calibre inferior àquele visto nos animais-controle. Esse
fato não foi verificado, contudo esse achado pode ter sido em função do tempo
decorrido desde o procedimento cirúrgico até a primeira avaliação feita. Para
comprovar se os produtos que provocam a vasoconstrição no interior do leito
cirúrgico podem influenciar no diâmetro dos capilares dos linfonodos, se faz
necessária uma análise da vasculatura dos linfonodos nas primeiras horas pós-
cirúrgicas, momento em que essa vasoconstrição está ocorrendo nos vasos
traumatizados do leito cirúrgico.
A alteração no diâmetro dos capilares que circundam externamente os
nódulos foliculares pode ser causada pela ação de substâncias vasodilatadoras
direcionadas até os linfonodos através da linfa aferente, mas também pela ação de
mastócitos que se encontram em quantidade aumentada no interior de linfonodos
estimulados (SAINTE-MARIE; PENG, 1991). Como para esses autores os produtos
degranulados dos mastócitos (serotonina e histamina) influenciam o estado
fisiológico das VEAs, pode-se sugerir que a ação dos mesmos não seja restrita a
96
essas vênulas, mas possa influenciar toda a vasculatura do local onde estão
presentes.
Para Steeber e Albrecht (1992), os linfonodos ativados em resposta ao
processo inflamatório, aumentam de tamanho e peso devido a mudanças no fluxo
sanguíneo, acúmulo de fluidos, migração e proliferação celular no seu interior. O
aumento no aporte sanguíneo dos linfonodos pode, segundo Hay e Hobbs (1977),
ser decorrente da vasodilatação dos vasos sanguíneos ou também do processo
angiogênico. Como o aumento da área dos nódulos foliculares (local que contém o
centro germinativo) ocorreu somente depois do aumento do calibre vascular pode-se
sugerir que uma ação vasodilatadora esteja ocorrendo. Essa vasodilatação permitiria
uma diminuição do fluxo sanguíneo e facilitaria o contato dos linfócitos com o
endotélio das VEAs e posteriormente a migração destas células do lúmen vascular
para o interior dos linfonodos. Se a maior concentração de linfócitos nos tecidos
ocorre entre o quinto e o sétimo dias pós-injúria (PARK; BARBUL, 2004) e se o
aumento na área dos nódulos foliculares for representativo de uma maior produção
de células de defesa, é esperado que esse aumento ocorra nos primeiros dias pós-
operatórios. Conforme progride o reparo, a necessidade de células de defesa
diminui e, portanto a produção celular no interior dos linfonodos pode ser diminuída.
Essa menor produção de células de defesa pode ser relacionada com a redução na
área dos nódulos foliculares visualizada em MEV. Decorridos 21 dias de controle
pós-operatório, o diâmetro dos vasos e a área dos nódulos foliculares, apesar de
não diferir significativamente, não apresentam valores semelhantes àqueles
observados nos animais-controle.
Okada et al. (2002), analisando modelos vasculares através da MEV, fazem
menção sobre o tamanho dos nódulos foliculares em linfonodos de animais normais
e relatam uma variação entre 70-100µm no diâmetro dos mesmos. Os achados da
presente pesquisa não concordam com os dados relatados por esses autores, já que
em linfonodos submandibulares de animais saudáveis o maior diâmetro variou entre
182-487µm e o menor diâmetro entre 159-438µm. Como os autores citados não
relatam a cadeia linfática utilizada para a análise e nem a padronização feita para
adquirir o valor descrito, acredita-se que essa diferença possa ter ocorrido em
função da análise de diferentes cadeias linfáticas ou por uma padronização diferente
para a realização da medida desse diâmetro.
97
O transporte de substâncias do leito cirúrgico para o interior dos linfonodos
pode causar a alteração no diâmetro dos capilares e posteriormente o aumento da
área dos nódulos foliculares, no entanto essas alterações vasculares podem ser
decorrentes de mudanças intrínsecas ocorridas nos linfonodos. Por esses motivos
sugere-se posterior estudo buscando comprovar a ação nos linfonodos de
substâncias oriundas da ferida.
Através da análise dos cortes histológicos foi realizada a contagem dos vasos
sanguíneos presentes nos linfonodos e constatou-se que o número médio total de
vasos, comparando os diferentes grupos experimentais sem acrescentar os valores
dos animais-controle, foi maior no grupo 6 (21 dias) sendo que este não diferiu
significativamente dos grupos 1, 3 e 5 (2, 7 e 14 dias respectivamente) (tabela 3).
Alguns fatores podem estar relacionados com a maior quantidade de vasos
observada nesses períodos. A angiogênese por intussuscepção, vista em maior
quantidade no grupo 1 (2 dias), não pode ser responsável pela quantidade de vasos
sanguíneos presentes nesse grupo já que esse processo não pode ser visualizado
nos cortes histológicos avaliados. Acredita-se que essa quantidade de vasos
sanguíneos relatada seja decorrente de uma ação vasodilatadora e não de um
aumento real no número de vasos sanguíneos. A visualização dos vasos
sanguíneos nos cortes histológicos pode ser facilitada em função de um maior
diâmetro.
O número de vasos sanguíneos presentes no grupo 3 (7 dias) pode ser
decorrente da segmentação vascular ou da angiogênese por brotamento. A
segmentação vascular, processo pelo qual as alças capilares formadas pelo
processo de angiogênese por intussuscepção são separadas do vaso “mãe” (aquele
que dá origem à alça), ocorre próximo ao sétimo dia pós-operatório (PATAN et al.,
2001) e aumenta a chance do vaso ser incluído no corte histológico já que o mesmo
apresenta um calibre maior. A angiogênese por brotamento necessita para estar
completa: degradação da membrana basal, proliferação de células endoteliais,
formação de brotos sólidos de células endoteliais, reestruturação do broto em lúmen
coberto por células endoteliais e integração ao sistema vascular (BURRI et al., 2004)
e por isso é considerada um processo relativamente lento (DJONOV; BURRI, 2005)
podendo ser outra provável causa para o número de vasos vistos no grupo 3.
98
Segundo Greenhalgh (1998) a apoptose das células da neovascularização
inicia próximo ao décimo segundo dia pós-operatório e tem sua máxima expressão
entre o décimo sexto e vigésimo quinto dias. Por esse motivo poderia se esperar que
uma menor quantidade de vasos sanguíneos estivesse presente nos grupos 5 e 6
(14 e 21 dias respectivamente), no entanto isso não foi verificado. O estímulo
antigênico possibilita que uma maior quantidade de VEAs apresente o lúmen
fechado e o endotélio hipertrófico (BÉLISLE; SAINTE-MARIE,1985). Com a
progressão do processo de reparo das feridas é esperado que o estímulo antigênico
presente nos linfonodos seja menor nos grupos 5 e 6 e por esse motivo as VEAs
poderiam apresentar o lúmen mais aberto e endotélio menos hipertrófico facilitando
a visualização dos mesmos nos cortes histológicos corados com HE. Os valores
obtidos no grupo 6, em semelhança ao descrito no grupo 1, não necessariamente
significam um aumento real no número total de vasos sanguíneos avaliados. Pode-
se sugerir que o número de vasos sanguíneos nos grupos onde as VEAs estejam
com lúmen fechado e endotélio hipertrófico, estejam subestimados na avaliação
histológica da presente pesquisa.
Uma variação no número de vasos sanguíneos dos linfonodos poderia ocorrer
em função da idade ou do peso dos animais e não necessariamente em função da
progressão do reparo da ferida. Como na presente pesquisa todos os animais
apresentavam a mesma idade a única possibilidade de variação seria no peso dos
mesmos. Tomando como base os animais-controle constatou-se que o rato controle
do grupo 1 (2 dias) teve uma perda de peso de 14g e o animal-controle do grupo 4
(10 dias) teve o maior ganho de peso (37g). Seguindo o raciocínio de que o peso
poderia alterar o número de vasos sanguíneos presentes nos linfonodos o rato
controle do grupo 4 deveria apresentar um número maior de vasos, no entanto essa
idéia não pôde ser comprovada, já que o animal-controle do grupo 4 não apresentou
um número médio de vasos maior que os demais animais do grupo controle.
Verli (2006) verificando a vasculatura de feridas produzidas em ventre lingual
através da técnica de corrosão vascular, relatou que a revascularização total da
ferida ocorre aos sete dias pós-operatório e que aos 21 dias o padrão dos vasos
sanguíneos ainda não é semelhante àquele visualizado em estruturas normais. Nos
achados de Selliseth e Selvig (1995), o tempo de revascularização total de uma
ferida palatina foi de 20 dias, provavelmente em função da vascularização do palato
ser menos intensa que a da língua. Além disso, a localização anatômica da língua
99
próxima aos ductos das glândulas submandibulares e sublinguais pode ter auxiliado
o processo de cicatrização, já que segundo Pammer et al. (1998) e Taichman et al.
(1998) a rápida cicatrização de feridas em mucosa oral pode ser explicada pela alta
concentração de alguns fatores de crescimento na saliva. FUJISAWA et al. (2003)
constataram que a remoção das glândulas submandibulares de coelhos torna
crônico o processo de cicatrização de uma ferida produzida em gengiva vestibular e
que ulcerações crônicas podem sofrer remissão após a aplicação, por exemplo, do
fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) comprovando a ação desse
produto sobre o processo cicatricial de lesões produzidas em mucosa oral.
Decorridos 21 dias de controle pós-operatório, o padrão dos vasos
sanguíneos no interior do leito cirúrgico ainda não é semelhante àquele visto em
línguas normais (VERLI, 2006) e, no mesmo período, a quantidade de vasos
sanguíneos dos linfonodos não é semelhante àquela vista em animais-controle.
Diante desses dados e sabendo que a fase de remodelamento pode persistir por até
um ano (GREENHALGH, 1998), existe a necessidade de um tempo maior de
avaliação com a intenção de comprovar se os resultados obtidos nos linfonodos de
animais experimentais serão semelhantes àqueles dos animais-controle após o
completo remodelamento da ferida.
Quando as diferentes áreas foram comparadas, dentro do mesmo grupo, em
relação ao número médio de vasos sanguíneos constatou-se que a área A1 (interior
do centro germinativo) teve o menor número de vasos sanguíneos diferindo
significativamente das demais áreas em todos os tempos pós-operatórios (tabela 4).
Além disso, nesse local observou-se unicamente a presença de vasos de pequeno
calibre, não sendo evidenciada nenhuma vênula de endotélio alto, concordando com
as descrições feitas por Bélisle e Sainte-Marie (1990). O interior dos nódulos
foliculares (área A1) é o local onde os linfócitos B permanecem por um curto período
de tempo e a pequena quantidade vasos sanguíneos poderia refletir uma menor
necessidade de substâncias circulantes devido a reduzida atividade das células
contidas nesse local. Muitas dessas células, presentes no interior do centro
germinativo, podem não estar realmente envolvidas na resposta imune, visto que o
acúmulo de linfócitos nessa área ocorre mesmo na ausência virtual de resposta
imune em animais “germ-free” segundo Bélisle e Sainte-Marie (1982).
100
Quando as porções laterais aos nódulos foliculares (área A2/A3) foram
avaliadas verificou-se uma quantidade maior de vasos sanguíneos que aquela vista
no interior do centro germinativo e menor que aquela encontrada nas áreas A4 (base
dos nódulos foliculares) e C1/C2 (região de córtex profundo) diferindo
significativamente das mesmas exceto nos grupos 2 e 4 onde os valores foram
estatisticamente semelhantes. Essa semelhança estatística entre a área A2/A3 e as
áreas A4 e C1/C2 ocorreu em função da diminuição na quantidade de vasos
presentes nas áreas A4 e C1/C2 e não em decorrência do aumento no número de
vasos sanguíneos na área A2/A3 (tabela 4). Também fica evidente que em relação
ao número médio de vasos sanguíneos as áreas A4 e C1/C2 são estatisticamente
semelhantes.
Durante a descrição da vasculatura de linfonodos de ratos, Bélisle e Sainte-
Marie (1990), apesar de não relatarem a densidade das VEAs, relatam que a zona
internodular apresenta uma densidade menor de capilares quando comparada com
a periferia do córtex profundo. Na presente pesquisa essas áreas não diferiram
significativamente entre si (nos grupos 2 e 4) na quantidade de vasos visualizados
em microscopia de luz, mas vale lembrar que os linfonodos avaliados foram
provenientes da cadeia submandibular de animais que apresentavam uma ferida
cirúrgica produzida em ventre lingual, enquanto que aqueles analisados pelas
autoras eram provenientes de outras cadeias ganglionares de animais saudáveis.
Para Gadre et al. (1994) o aumento na densidade de capilares dos linfonodos
aumenta a área de superfície e conseqüentemente a quantidade de antígeno,
melhorando a resposta imunológica. Por isso presume-se que a grande quantidade
de vasos sanguíneos localizados na porção basal dos nódulos foliculares e na
periferia da unidade de córtex profundo seja decorrente da necessidade abundante
de substâncias circulantes e da alta necessidade metabólica apresentada pelas
numerosas células que migram nesses locais.
Quando comparado o número médio total de vasos sanguíneos entre os
grupos experimentais e seus respectivos animais-controle, constatou-se uma
diferença significativa nos grupos 1, 2, 5 e 6 (respectivamente 2, 3, 14 e 21 dias)
(tabela 5). Analisando os dados descritos na tabela 5 pode-se observar que nos
grupos 3 e 4 (7 e 10 dias respectivamente), onde não houve diferença significativa
em relação ao controle, existem valores que destoam dos demais grupos avaliados.
Levando em consideração o desvio-padrão dos grupos experimentais pôde-se
101
observar que o grupo 4 apresenta o maior valor. Sendo o desvio-padrão a mais
importante medida de dispersão de valores individuais ao redor da média (MOTTA;
WAGNER, 2003), fica evidente a variabilidade de valores apresentados por esse
grupo experimental.
No grupo 3 (7 dias) não se constatou diferença significativa no número de
vasos sanguíneos em relação ao animal-controle. Esses valores não refletem uma
diminuição na quantidade de vasos sanguíneos observados nos animais
experimentais, mas sim um número maior de vasos sanguíneos presentes no
animal-controle. Quando comparados exclusivamente os animais-controle constata-
se que o número de vasos sanguíneos do animal do grupo 3 apresenta uma
discrepância de valores quando comparados com os animais-controle dos demais
grupos experimentais. Diante desses resultados estatísticos e sabendo que o
número de vasos sanguíneos provavelmente esteja subestimado na presente
pesquisa, são necessários novos estudos que utilizem um número maior de animais
experimentais e controles, além de outros métodos de avaliação que permitam a
evidenciação dos vasos sanguíneos, facilitando conseqüentemente a diferenciação
entre vasos sanguíneos e vasos linfáticos, deficiência essa observada durante a
análise de cortes histológicos corados com HE.
7 CONCLUSÕES
103
7 CONCLUSÕES
7.1 QUALITATIVAS
- Os vasos sanguíneos observados no interior dos nódulos foliculares foram
caracterizados como sendo capilares;
- A zona internodular apresenta vasos sanguíneos caracterizados como vênulas de
endotélio alto (VEAs) e estas adquirem um diâmetro maior conforme se aproximam
da região de córtex profundo;
- As artérias capsulares lançam ramos que atravessam o seio subcapsular e
auxiliam na irrigação do córtex externo;
- A angiogênese por intussuscepção aos 2 e 3 dias pós-operatórios representa a
expansão da cadeia vascular dos linfonodos;
- Aos 21 dias pós-operatórios a angiogênese por intussuscepção ocorre na
bifurcação dos vasos e é sugestiva de remodelamento vascular;
- As vênulas de endotélio alto (VEAs) apresentam características corrugadas nos
modelos vasculares em decorrência da hipertrofia endotelial e do número de
linfócitos unidos à parede vascular;
- A presença de modelos vasculares menos corrugados e com depressões menos
profundas nas VEAs do grupo-controle e 2 dias pós-operatórios são representativas
de um processo inflamatório menos intenso.
7.2 QUANTITATIVAS
- O número de vasos sanguíneos presentes no interior dos nódulos foliculares é
pequeno diferindo significativamente das demais áreas dos linfonodos;
- Nos grupos experimentais a porção basal dos nódulos foliculares (área A4) e o
córtex profundo (áreas C1/C2) apresentam características semelhantes em relação a
quantidade de vasos sanguíneos;
- O valor médio da área dos nódulos foliculares de animais normais foi de 93878µm
2
enquanto que nos animais experimentais esse valor não foi inferior à 144376µm
2
;
- O diâmetro médio dos modelos vasculares de animais normais foi de 7,70µm
enquanto que nos animais experimentais o diâmetro médio não foi inferior à 8,62µm;
104
- Durante o processo de cicatrização a área dos nódulos foliculares dos linfonodos
aumenta somente depois do aumento do diâmetro dos capilares que circundam
esses nódulos;
- A angiogênese por intussuscepção foi mais intensa aos 2 e 3 dias pós-operatórios.
REFERÊNCIAS
106
REFERÊNCIAS
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APÊNDICES
117
APÊNDICE A – Peso (g) inicial dos animais nos grupos experimentais
Grupo
animal
1 2 3 4 5 6
Rato 1
313 255 309 273 304 304
Rato 2
246 248 280 260 307 270
Rato 3
259 245 327 286 251 312
Rato 4
267 270 289 240 328 295
Rato 5
268 256 261 286 290 257
Rato 6
297 274 280 243 284 290
Rato 7
265 238 274 250 324 294
Rato 8
263 274 245 296 314 308
Rato 9
280 300 272 296 328 304
Rato10 (controle)
268 264 261 320 304 295
Peso médio total 272,6 262,4 279,8 275 303,4
292,9
Peso médio dos animais
experimentais
273,1
262,2
281,8
270
303,3 292,6
Peso médio dos animais-
controles
285,33
118
APÊNDICE B – Peso (g) final dos animais nos grupos experimentais
Grupo
Animal
1 2 3 4 5 6
Rato 1
307 251 317 293 301 320
Rato 2
249 263 282 274 321 284
Rato 3
257 242 337 305 313 330
Rato 4
278 289 287 275 347 309
Rato 5
277 morreu 258 251 291 288
Rato 6
morreu 274 282 254 288 310
Rato 7
269 260 277 264 344 303
Rato 8
275 281 260 299 321 302
Rato 9
286 320 273 307 330 315
Rato10 (controle)
254 270 269 357 314 307
Peso médio total 245,2 272,2 284,2 287,9 317
306,8
Peso médio dos animais
experimentais
274,7
272,5
285,8
280,2
317,3 306,7
Peso médio dos animais-
controles
295,17
119
APÊNDICE C – Identificação das lâminas coradas por HE, de acordo com o grupo
experimental e dia da morte
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6
2D R1 3D R1 7D R1 10D R1 14D R1 21D R1
2D R2 3D R2 7D R2 10D R2 14D R2 21D R2
2D R3 3D R3 7D R3 10D R3 14D R3 21D R3
2D R4 3D R4 7D R4 10D R4 14D R4 21D R4
2D R5 morreu 7D R5 10D R5 14D R5 21D R5
morreu 3D R6 7D R6 10D R6 14D R6 21D R6
2D R7 3D R7 7D R7 10D R7 14D R7 21D R7
2D R8 3D R8 7D R8 10D R8 14D R8 21D R8
2D R9 3D R9 7D R9 10D R9 14D R9 21D R9
2D R10 3D R10 7D R10 10D R10 14D R10 21D R10
ANEXOS
121
ANEXO 1
122
ANEXO 2
123
ANEXO 3
Metodologia aplicada aos animais submetidos à técnica de modelo de corrosão
vascular.
A amostra foi constituída de 56 ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus),
machos, adultos, com idade de 3 meses, e peso entre 250 e 300g, provenientes do
Biotério do Instituto de Ciências Básicas de Saúde (ICBS) da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul (UFRGS). A parte experimental foi realizada no Laboratório de
Neuroanatomia do Departamento de Ciências Morfológicas.
Todos os animais foram mantidos em gaiolas plásticas e tiveram a sua
disposição, durante todo o período experimental, alimento sólido
17
e água ad libittum.
Os animais foram divididos em sete grupos de oito animais sendo que cada grupo foi
sacrificado depois de 1, 2, 3, 7, 10, 14 e 21 dias. Desses animais foram utilizados
123 linfonodos provenientes de 39 animais dos grupos 2, 3, 7, 10, 14 e 21 dias.
Os animais foram anestesiados através de injeção intraperitoneal de
proporções iguais de cloridrato de quetamina
18
e xilazina
19
na dosagem de 0,5ml/kg
de peso corporal do animal. Cada animal foi disposto sobre uma mesa operatória em
decúbito dorsal, a língua posicionada sobre uma mesa cirúrgica e com o auxílio de
um punch
20
de 3 mm de diâmetro posicionado perpendicularmente ao ventre lingual,
foi realizada a ferida cirúrgica na linha média entre o terço apical e médio da língua.
Movimentos giratórios foram realizados com o punch até que atingisse a
profundidade de 1 mm pré-estabelecido na face externa do punch. O tecido
incisionado foi apreendido por pinça e sua base cortada por uma tesoura cirúrgica.
Depois de realizada a incisão a hemostasia foi feita com compressão leve de uma
gaze sobre leito cirúrgico.
Decorridos os tempos pré-estabelecidos os animais foram novamente
anestesiados para realização da infusão com resina. Realizou-se uma incisão
longitudinal linear na linha média do ventre do rato, a pele localizada sobre a região
torácica e abdominal foi divulsionada, o tecido muscular localizado abaixo do osso
externo foi tracionado e cortado transversalmente. Depois de exposto, o diafragma
17
Ração Nuvilab-Cr
1
Nuvital Nutrientes - S.A, São Paulo, Brasil
18
Dopamin
, Laboratório Agribrands, São Paulo, SP, Brasil
19
Anasedan
injetável, Laboratório Agribrands, São Paulo, SP, Brasil
20
Instrumec
, Prodesc, Porto Alegre.
124
foi incisado possibilitando a visualização da caixa torácica e aplicação, diretamente
no coração, de 1ml/kg de heparina sódica 5000 UI para que não ocorresse
coagulação sangüínea. Uma relaxante nas costelas direitas e esquerdas do animal
foi realizada para ampliar o campo de trabalho. Depois de afastado o timo a artéria
aorta ascendente foi individualizada, com fio de seda 3-0
21
e o pulmão do lado
esquerdo foi afastado para que a artéria aorta descendente fosse pinçada.
O ventrículo esquerdo foi incisado permitindo o acesso de um cateter de
oxigênio ao interior do coração chegando até a artéria aorta ascendente onde foi
fixado através de um nó realizado no fio que previamente individualizara a artéria. O
átrio direito foi incisado para permitir o extravasamento do sangue e das soluções de
soro fisiológico (50ml), paraformaldeído a 2% tamponado com fosfato e pH 7,4
(20ml) e novamente de soro fisiológico (50ml), seqüencialmente perfundidas via
cateter.
A palidez do animal na região da cabeça e pescoço e a ausência de sangue
nas soluções extravasadas pelo átrio direito foram indicativos da substituição do
sangue do sistema vascular pelo soro fisiológico, permitindo que a moldagem com
resina acrílica de baixa viscosidade
22
fosse realizada.
Para essa infusão, foram misturados 0,25g de catalizador e 10g de resina
acrílica por um período de 40 segundos e essa mistura foi prontamente transferida
para uma seringa. A resina era então injetada manualmente no interior dos vasos via
cateter e o tempo decorrido desde o início da infusão até o refluxo pelo átrio direito
foi em média 60 segundos. Tão logo o refluxo acontecia, a palidez da região da
cabeça e pescoço do animal dava lugar à coloração avermelhada da resina.
Ao final, os animais eram mantidos em temperatura ambiente por 2 horas
para que ocorresse a pré-polimerização do material em seguida as cabeças eram
submersas em água corrente destilada em temperatura de 40 °C por uma hora para
acelerar e finalizar o processo de polimerização do material.
Assim que a resina tomava presa era feita a dissecação da língua e dos
linfonodos desses animais. Os linfonodos dissecados eram submersos em 60ml de
água destilada em temperatura ambiente onde permaneciam por um período de 18
horas. Depois desse período aspirava-se a água e nova quantidade de água era
colocada e novamente aspirada. No interior do pote dispensava-se 60ml de solução
21
Ethicon
, Johnson & Johnson
22
Mercox
, Ldd Research Industries, Williston, USA
125
de NaOH
23
(hidróxido de sódio) a 5% em temperatura ambiente e então os potes
eram acondicionados em estufa em temperatura de 45 °C por 18 horas.
Decorridas as 18 horas a solução era aspirada e dentro de cada pote se
dispensava 60ml água destilada em temperatura ambiente com o intuito de lavar o
espécime. Para cada espécime foram realizadas três lavagens consecutivas e
posteriormente os potes eram preenchidos com 60ml de água destilada em
temperatura ambiente e permaneciam por 4 horas. Nesse período em que os
espécimes eram mantidos fora da estufa os mesmos eram observados em lupa
estereoscópica
24
para avaliar o estágio de corrosão em que se encontravam.
Decorridas as 4 horas a água destilada era substituída por 60ml da solução de NaOH
a 5% e os potes eram recolocados em estufa em temperatura de 45 °C.
Em média, o tempo para corrosão dos linfonodos, foi de 3 dias e tão logo a
corrosão fosse suficiente os espécimes eram submersos em água destilada por 6
horas. Logo em seguida essa água era substituída por 60ml de ácido fórmico a 5%
em temperatura ambiente. Decorrido o tempo de uma hora cada espécime era
colocado sobre um papel filtro e acondicionado em estufa a 37 °C onde
permaneceram até o momento da avaliação em microscopia eletrônica de varredura.
23
Labsynth, São Paulo, SP, Brasil
24
DF Vasconcelos
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