( PDF ) Características dinâmicas do microambiente hepático na hematopoese fetal murina

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas

“CARACTERÍSTICAS DINÂMICAS DO MICROAMBIENTE

HEPÁTICO NA HEMATOPOESE FETAL MURINA”

Jackline de Paula Ayres da Silva

Orientadores:

Henrique Leonel Lenzi

Marcelo Pelajo-Machado

Departamento de Patologia

Instituto Oswaldo Cruz

FIOCRUZ - RJ

2007

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas

“CARACTERÍSTICAS DINÂMICAS DO MICROAMBIENTE

HEPÁTICO NA HEMATOPOESE FETAL MURINA”

Dissertação apresentada

como requisito parcial para

obtenção de grau de Mestre em

Ciências Morfológicas

Jackline de Paula Ayres da Silva

Orientadores:

Henrique Leonel Lenzi

Marcelo Pelajo-Machado

Departamento de Patologia

Instituto Oswaldo Cruz

FIOCRUZ - RJ

2007

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Dedico este trabalho em memória à minha mãe

pelo grande apoio e incentivo à carreira científica.

A vida é um milagre.

Cada flor,

Com sua forma, sua cor, seu aroma,

Cada flor é um milagre.

Cada pássaro,

Com sua plumagem, seu vôo, seu canto,

Cada pássaro é um milagre.

O espaço, infinito,

O espaço é um milagre.

O tempo, infinito,

O tempo é um milagre.

A memória é um milagre.

A consciência é um milagre.

Tudo é milagre.

Tudo, menos a morte.

Manuel Bandeira

No fundo, do real em si não conhecemos nada.

Claude Lévi-Strauss

Agradecimentos:

Aos meus orientadores Henrique Leonel Lenzi e Marcelo Pelajo Machado pelo incentivo

constante e crescente na carreira acadêmica, pelas belíssimas discussões e idéias que tanto me

motivaram, me alimentaram e ajudaram no meu crescimento profissional; não tão menos importantes

foram as conversas, principalmente nos momentos mais difícies, que me ajudaram a enfrentar e

superar os desafios da vida;

Aos meus familiares em especial,que muito me incentivaram no momento mais turbulento de

minha vida, não me deixando abater nem desistir de meus objetivos.

Ao meu pai Luiz Mariano, minha madastra, Helena Augusto e minha tia Joana pelo apoio e

imenso carinho. As palavras são imprecisas para expressar a minha gratidão. Obrigada por me

ensinarem as delícias e mazelas da vida adulta e por estarem cada vez mais presentes.

À minha mãe Olga, que tanto me incentivou e ajudou a trilhar o caminho científico, não se

importantando com luzes acesas e tendo como canção de ninar, incontáveis vezes, os meus dedos no

teclado do computador. Obrigada pelos momentos felizes que tivemos e pela lembrança destes em

todos os dias de minha vida. O meu profundo, respeito, admiração, amor e imensa saudade.

Aos meus amigos (infância, folclore, vizinhos, faculdade, Pedro II e laboratório), pelos

momentos de alegria e incentivo, não me deixando abater nos momentos de tristeza ou estresse. Em

especial, aos amigos e familiares de Guilherme Inocêncio e Isabel Cristina por não medirem esforços e

estarem presentes em qualquer hora e situação. Jóias mais preciosas e raras da minha vida.

Ao André e toda sua família, por todo apoio, conversa e momentos felizes que me fazem

sentir todo o carinho e acolhimento depositados por vocês em mim.

À equipe técnica do laboratório de Patologia (IOC-FIOCRUZ) pela ajuda, atenção e

cuidado dispensados a mim e ao trabalho. Com carinho, à equipe do Histolab Luzia Caputo,

Alexandra Menezes, Luciana e Luzia, os operadores do microscópio confocal Pedro Paulo e

Bernardo, as técnicas de laboratório Andréia e Iolanda e as secretárias Rosi e Alexandra.

Ao Programa de Ciências Morfológicas pelas magníficas aulas, discussões, idéias, apoio

técnico-administrativo e oportunidade de novos amigos.

À Fundação Oswaldo Cruz por ter me iniciado e incentivado na carreira acadêmica; por

todas as pessoas que conheci nesta Instituição e que hoje são verdadeiros amigos; Obrigado por todo

apoio técnico e financeiro para execução deste trabalho.

Aos recém-colegas de trabalho do INCa pelo apoio e incentivo.

Ao Dr. Paulo Antônio, chefe da Divisão de Patologia do Instituto Nacional de Câncer, pelo

apoio, compreensão e pela dispensa nos momentos de finalização deste trabalho.

Obrigado a Deus pela vida, saúde e tranquilidade.

O mais profundo e sincero obrigado.

Resumo:

Em camundongos, o fígado é o principal órgão responsável pela

proliferação hematopoética durante o desenvolvimento embriológico.

O objetivo do trabalho foi descrever as características dinâmicas do

microambiente hepático, visando caracterizar eventos favoráveis e

desfavoráveis à hematopoese local no fígado fetal murino.

Fígados murinos de 12 dias pós-coito a 0 dia pós-parto foram

submetidos a colorações histoquímicas e marcações para várias lectinas.

Também foram realizadas imuno-marcações para fibronectina, MMP-1 e MMP-

Durante a ontogenia, o fígado apresenta duas fases distintas: uma fase

imatura e predominantemente endodérmica (< 14 dpc), onde o fígado funciona

como estroma para linhagem eritróide. A outra fase mais madura

(endodérmico-mesenquimal) (> 15 dpc), onde ocorre o amadurecimento dos

hepatócitos, atua como estroma para linhagem mielóide. A diminuição da

hematopoese hepática (fase de desabitação) coincide com a maturidade

hepática.

Resumo expandido:

Nos mamíferos, o fígado fetal é o principal órgão responsável pela

proliferação das células hematopoéticas durante o desenvolvimento

embrionário. Nos camundongos, a hematopoese murina intraembrionária se

inicia na região da AGM (Aorta-Gônadas-Mesonefros) aos 8,5 dpc. Em

seguida, as células migram para o fígado fetal, onde irão proliferar e se

diferenciar. Posteriormente, as células hematopoéticas migram para a medula

óssea, onde as células sangüíneas adultas serão geradas definitivamente.

O objetivo do trabalho foi descrever as características dinâmicas do

microambiente hepático no fígado fetal murino de camundongos, entre 12 dias

pós coito (dpc) e 0 (zero) dia pós parto (dpp) (período de hematopoese),

visando definir os eventos favoráveis (fase da habitação hematopoética) em

contraste com os eventos desfavoráveis à hematopoese local (fase da

desabitação hematopoética).

Neste estudo, os fígados fetais de 12 dpc ao 0 dpp foram dissecados e

fixados em formalina de Millonig modificada por Carson e processados

segundo a técnica histológica de rotina para inclusão em parafina. Cortes

seriados de 5m foram corados com HE, Giemsa de Lennert, Sirius Red

pH=10,2, Reticulina de Gomori, Perls, PAS-AB em pH=1,0 e em pH 2,5 e

analisados em microscopia de campo claro. Os cortes também foram

submetidos à histoquímica com lectinas com marcação direta (FITC) para SBA,

LCA, UEA, PNA, ABPR3, ConA, PHA e GSI. Reação histoquímica para naftol

cloroacetato esterase foi utilizada para a identificação específica de células

granulocíticas. Marcações imuno-histoquímicas indiretas (AlexaFluor 488) para

fibronectina, MMP-1 e MMP-9 também foram realizadas. O material marcado

com FITC e AlexaFluor 488 foi lido em microscópio confocal (LSM 510-Meta,

Zeiss).

Os resultados revelaram que a fibronectina parece estar relacionada ao

amadurecimento dos hepatócitos e da trama trabecular do fígado fetal. A LCA

apresentou um padrão trabecular e vascular, sugerindo o seu envolvimento

com os processos de adesão/fixação das células eritróides do ambiente

hepático. Após os 16 dpc, a LCA e a PNA marcaram seletivamente os

iii

neutrófilos; a MMP-1 foi expressa nos neutrófilos maduros, sugerindo que a

MMP-1 contribui para a evasão dos neutrófilos do fígado. As fibras reticulares

parecem não ter papel relevante na hematopoese fetal; porém, são

fundamentais na sustentação física do fígado fetal após os 18 dpc.

Baseado nos dados deste estudo é possível concluir que o

desenvolvimento embrionário do fígado fetal murino apresenta duas fases

distintas: uma fase imatura e predominantemente endodérmica (< 14 dpc),

onde as células hepáticas funcionam como estroma para linhagem eritróide; a

outra fase é mais madura (endodérmico-mesenquimal) (> 15 dpc),

apresentando hepatócitos mais maduros, os quais também passam a atuar

como estroma para linhagem mielóide. A redução da hematopoese hepática

(fase de desabitação) coincide com a maturidade hepática.

Abstract

In mice, the liver is the main organ responsible for hematopoietic cell

expansion during the embryologic development.

The aim of this work was to describe the dynamic characteristics of

hepatic microenvironment, defining favorable and unfavorable events to the

focal hematopoiesis.

Thus, the murine fetal liver sections from 12 days post-coitum to 0 day

post-partum were submitted to histolochemical stainings and labeling with

differents lectins. Immunolabeling to fibronectin, MMP-1 and MMP-9 was

performed.

The results showed that: 1) the murine fetal liver during ontogenesis

shows two different phases: one immature, mainly endodermic (< 14 dpc), that

acts as a stroma for erythropoiesis and another mature (endodermic-

mesenchymal) (> 15 dpc), with maturation of hepatocytes, behaving as a

stroma to mieloid linneage; 2) the decrease of hepatic hematopoiesis (leaving)

coincides with hepatic maturation.

Expanded Abstract:

Intraembryonic murine hematopoiesis begins in the AGM (Aorta-Gonads-

Mesonephros) region at 8.5 days post coitus (dpc). Afterwards, blood cells

migrate to fetal liver where they develop and proliferate. In mammals, especially

mice, liver is the main organ responsible for hematopoietic cell expansion

during the embryologic development. After that, hematopoietic cells home to

bone marrow where the adult blood cells will be definitively generated.

The aim of this work was to describe the dynamic characteristics of

murine hepatic microenvironment, defining favorable (phase of hematopoietic

settling) and unfavorable (phase of hematopoietic leaving) events to the focal

hematopoiesis.

Murine fetal liver sections from 12 day post-coitum to 0 day post-partum

were fixed with Carson’s Millonig formalin and embedded in paraffin. Serial

sections (5 m) were stained with HE, Lennert’s Giemsa, Sirius Red pH=10.2,

Gomori’s Reticulin, PAS-AB pH=1,0 and 2,5 and analyzed by brightfield

microscopy. The following lectins (FITC-labeled) SBA, LCA, UEA, PNA, ABPR,

ConA, PHA and GSI

were applied. Indirect imunohistochemistry for fibronectin,

MMP-1 and 9 was developed by secondary antibody AlexaFluor488.

Histochemistry for naphtol cloroacetate esterase was performed for specific

identification of granulocytic cells. FITC and AlexaFluor488 labeled material was

analyzed by confocal microscopy (LSM 510-Meta, Zeiss).

The results showed that fibronectin was related to promotion of

hepatocyte and trabecular differentiation; LCA defined the vascular and

trabecullar hepatic components and appeared to collaborate to the erythroid

adhesion and cellular establishment in the fetal liver. After 16 dpc, LCA e PNA

labeled neutrophils. The MMP-1 was expressed in neutrophils, contributing to

their liver evasion. Reticulin fibers did not appear to participate in the fetal

hematopoiesis, but contributed to the liver physical support after 18 dpc.

In conclusion: 1) the murine fetal liver during ontogenesis shows two

different phases: one immature and mainly endodermic (< 14 dpc), acting as a

stroma for erythropoiesis and another mature (endodermic-mesenchymal) (> 15

dpc), with maturation of hepatocytes, behaving as a stroma to mieloid linneage;

2) the decrease of hepatic hematopoiesis (leaving) coincides with hepatic

maturation.

Índice:

1.Introdução ........................................................................................................................................................... 1

1.1 – Considerações gerais......................................................................................................................... 1

1.2 – Ontogenia da hematopoese murina................................................................................................... 3

1.3 – Estruturas envolvidas na hematopoese embrionária...................................................................... 4

1.3.1 – Placenta........................................................................................................................................... 4

1.3.2 – Saco vitelínico................................................................................................................................ 5

1.3.3 – Esplancnopleura para-aórtica ou região da aorta-gônadas-mesonefros (AGM) ..................... 9

1.3.4 – Fígado fetal..................................................................................................................................... 12

1.3.4.A – O desenvolvimento hepático................................................................................................. 12

1.3.4.B – Ocupação do ambiente hepático pelas células hematopoéticas....................................... 17

1.3.4.C – Arquitetura da matriz extracelular......................................................................................... 19

1.3.4.D – A hematopoese hepática fetal............................................................................................... 23

1.3.4.E – O amadurecimento hepático e a saída das céulas hematopoéticas.................................. 25

1.3.4.F – Moléculas de superfície envolvidas no processo de trânsito de células

hematopoéticas no fígado fetal....…..................................................................................................................... 27

1.3.5 – Medula óssea.................................................................................................................................. 32

2.Objetivos.............................................................................................................................................................. 34

2.1 – Geral....................................................................................................................................................... 34

2.2 – Específicos............................................................................................................................................. 34

3. Metodologia........................................................................................................................................................ 35

3.1 – Acasalamento....................................................................................................................................... 35

3.2 – Determinação da idade gestacional.................................................................................................... 35

3.3 – Determinação do período pós-parto.................................................................................................... 36

3.4 - Processamento....................................................................................................................................... 36

3.4.1 – Técnica de coloração para análise da estrutura morfológica ................................................... 37

3.4.1.A – Técnica de coloração pela Hematoxilina e Eosina.............................................................. 37

3.4.1.B – Técnica de coloração pelo Giemsa de Lennert.................................................................... 38

3.4.1.C – Técnica de coloração pelo método Tricromático de Masson............................................. 39

vii

3.4.1.D – Técnica de coloração pelo Sirius Red pH=10,2................................................................... 40

3.4.1.E – Técnica de coloração pelo Perls............................................................................................ 40

3.4.1.F – Técnica de coloração pelo método Reticulina de Gomori.................................................. 41

3.4.1.G – Técnica de coloração pelo àcido Periódico + Reativo de Schiff (PAS-AB) pH=1,0.......... 42

3.4.1.H – Técnica de coloração pelo àcido Periódico + Reativo de Schiff (PAS-AB) pH=2,5.......... 43

3.4.2 – Técnica de histoquímica para detecção de cloroacetato esterase............................................ 44

3.4.3 – Técnica de histoquímica para revelação de lectinas.................................................................. 44

3.4.4 – Técnica de imunofluorescência.................................................................................................... 46

4.Resultados........................................................................................................................................................... 48

4.1 – 12 dpc..................................................................................................................................................... 48

4.2 – 13 dpc..................................................................................................................................................... 50

4.3 – 14 dpc..................................................................................................................................................... 51

4.4 – 15 dpc..................................................................................................................................................... 52

4.5 – 16 dpc..................................................................................................................................................... 54

4.6 – 17 dpc..................................................................................................................................................... 56

4.7 – 18 dpc..................................................................................................................................................... 57

4.8 – 0 dpp....................................................................................................................................................... 59

5.Discussão............................................................................................................................................................. 99

6.Conclusão............................................................................................................................................................ 121

7. Perpectivas......................................................................................................................................................... 122

7.Referências Bibliográficas................................................................................................................................. 123

viii

Lista de abreviaturas

AFP – alfa-fetoproteína

AGM – Aorta-Gônadas-Mesonefros

BFU-E – burst forming units-erythrocyte,unidades formadoras de burst eritróide

BSA – bovine serum albumin, albumina sérica bovina

CAMs – Cellular Adhesion Molecules

CFU-GEMM

– colony forming units granulocyte-erythrocyte-monocyte and megakaryocyte,

unidade formadora de colônia de granulócitos-eritrócitos-monócitos e megacariócitos

CFU-GM – colony forming units-granulocyte macrophage, unidade formadora de colônias de

granulócitose macrófagos.

CFU-S – Colony Forming Unit – Spleen, unidade formadora de colônia no baço.

CFU-S

– Colony Forming Unit – Spleen 11 days post transplantation, unidade formadora de

colônia no baço 11 dias após o transplante.

CK-8 – citoqueratina 8

ConA – Canavalia ensiformis

CXCL-12 – SDF-1, stromal derived factor - 1

dpc – dias pós coito

FGF-1 – fibroblast growth factor-1, fator de crescimento de fibroblastos-1

FGF-2 – fibroblast growth factor-2, fator de crescimento de fibroblastos-2

FGF-4 – fibroblast growth factor-4, fator de crescimento de fibroblastos-4

FGF-8 – fibroblast growth factor-8, fator de crescimento de fibroblastos-8

G-CSF – Granulocyte-Colony Stimulating Factor, fator estimulador de colônias de granulócitos

GS I

–

Bandeiraea simplicifolia

LCA – Lens culinaris

LTR-HSC – Long-Term Repopulating Hematopoietic Stem Cell, célula-tronco hematopoética de

povoamento de longo duração.

MEC – matriz extracelular

MMP-1 – metaloproteinase de matriz extracelular do tipo 1

MMP-9 – metaloproteinase de matriz extracelular do tipo 9

OSM – oncostatina M

PAF

–

platelet activating factor, fator ativador de plaquetas.

PBS – phosphate buffer saline, salina contendo tampão fosfato

PECAM -1 (CD31) – platelet/endothelial cell adhesion molecule-1, molécula de adesão celular

de plaquetas e células endoteliais.

PHA-L – Phaseolus vulgaris

PNA – Arachis hypogaea

SAMs – Substrate Adhesion Molecules

SDF-1 – stromal derived factor – 1, CXCL-12

SBA – Glycine Max

Thy-1 – CD90

TIMP – Tissue inhibitor of MMP, inibidor tecidual de metaloproteinase

UEA I – Ulex europeus

VCAM-1 – Vascular Cell Adhesion Molecule

VEGF – Vascular endothelial growth factor, fator de crescimento do endotélio vascular

VLA-4 – very late antigen 4

Ayres-Silva, Jackline de Paula

Características dinâmicas do microambiente hepático na

hematopoese fetal murina / Jackline de Paula Ayres da Silva. – Rio

de Janeiro: UFRJ / ICB, 2007.

ix 135 f. : il. ; 31 cm

Orientadores: Henrique Leonel Lenzi e Marcelo Pelajo-Machado

Dissertação (mestrado) –UFRJ / ICB, Programa de Pós-

graduação em Ciências Morfológicas 2007.

Referências bibliográficas: f. 123-135

1. Hematopoese extramedular - fisiologia. 2. Camundongos

embriologia. 3. Lectinas de plantas. 4. Fígado –

anatomia e

histologia. 5. Matriz extracelular. 6. Morfologia -

Tese. I. Lenzi,

Henrique Leonel. II. Pelajo-

Machado, Marcelo. III. Universidade

Federal do Rio de Janeiro, ICB, Morfologia. IV. Título.

1. Introdução:

1.1 – Considerações gerais

Durante a ontogenia, as células hematopoéticas migram a diversos

órgãos/ tecidos propícios à sua proliferação, diferenciação e amadurecimento,

que constituem ambientes diversificados e fomentadores de cada uma de suas

etapas de expansão e desenvolvimento. As células presentes em um

determinado microambiente favorável à sua proliferação e/ ou desenvolvimento

permanecem neste local até o momento em que as condições convenientes se

modifiquem. Concomitantemente ao estabelecimento de um estado de

inadequação no ambiente prévio, outro microambiente favorável se instala em

outro local, receptivo às células migrantes (Dzierzak,1999; Cumano e Godin,

2001).

Inicialmente, células hematopoéticas transientes são geradas no saco

vitelínico e migram para diversos órgãos do embrião em desenvolvimento. A

partir do 8° dia pós-coito (dpc) as células hematopoéticas transientes serão

substituídas por células hematopoéticas definitivas que são geradas na região

da AGM (aorta-gônadas-mesonefros). As células com capacidade multipotente

se originam nesse ambiente a partir do endotélio hemogênico sem passar por

um processo de amadurecimento. Este evento ocorre no fígado fetal, próximo

sítio no qual as células hematopoéticas irão migrar, amadurecer e proliferar.

Essas modificações ocorrem devido ao novo ambiente hepático, que contém

moléculas da matriz extracelular e células, principalmente hepatócitos, que irão

participar ativamente de um processo de indução da determinação do destino

celular de diversas linhagens (cell fate determination within lineages) (Arias e

Stewart, 2002). À medida que o fígado desenvolve, se estabelecem diversos

microambientes, gerando diferentes tipos celulares associados com a

expressão de genes determinantes do destino celular (fate-determining genes).

Estes genes codificam fatores de transcrição, cuja função é iniciar a sequência

de eventos que ocasionam a aquisição de um destino específico (Arias e

Sterwart, 2002). Os hepatócitos em determinado momento ou “janela” do

desenvolvimento ou ontogenia atuam como células estromais favoráveis a

hematopoese local. Devido à ativação de certos genes, o hepatócito

amadurece e deixa de atuar como estroma, fazendo com que as células

hematopoéticas migrem em procura de outros sítios favoráveis à sua

manutenção e diferenciação (Kinoshita et al., 1999).

Com o estabelecimento da vascularização nos ossos longos, células

hematopoéticas migram para medula óssea, ao acaso pela circulação, e a

partir de determinado momento (abertura de outra janela ontogenética),

encontram novo ambiente propício para sua instalação e diferenciação. No

entanto, as células hematopoéticas, principalmente maduras ou semi-maduras,

estão constantemente migrando e podem habitar definitivamente certos órgãos

como ocorre com as linhagens linfóides. As células hematopoéticas também

podem se instalar em sítios variados até seu destino final e irreversível.

Recentemente foi descrito que as células imaturas podem ser mobilizadas para

o sangue periférico sob a ação do fator estimulador de colônias de granulócitos

(G-CSF, Granulokine



). A utilização do G-CSF tem sido empregada na doação

de progenitores hematopoéticos para transplante de medula óssea. Os

trabalhos recentes sobre terapia celular com células-tronco também levam à

reflexão que, fisiologicamente, essas células imaturas migram pela corrente

sangüínea e reparam pequenas lesões (Mansilla et al., 2006).

1.2 - Ontogenia da hematopoese murina:

O sistema hematopoético em camundongo possui dois compartimentos

originários do folheto mesodérmico que geram células hematopoéticas: um

primitivo ou transiente e um definitivo. O compartimento primitivo se localiza

extra-embrionariamente no saco vitelínico, enquanto que o definitivo se origina

da região da esplancnopleura para-aórtica (Dzierzak e Medvinsky, 1995;

Dzierzak, 1999).

Na vida embrionária, na região da aorta-gônadas-mesonefros (AGM), as

células hematopoéticas são geradas a partir de células-tronco multipotentes,

que são induzidas a se diferenciar em células-tronco comprometidas

totipotentes (Cumano et al. 1993; Godin et al. 1993). A partir do 8° dia após o

coito (dpc), as células totipotentes migram para o interior dos vasos e ocupam

o fígado fetal. Neste órgão, as células hematopoéticas se expandem e, aos 16

dpc, as células-tronco hematopoéticas e as células diferenciadas passam a

migrar para as cavidades ósseas, formando assim o componente celular da

medula óssea (Cumano et al. 1993). A medula óssea será responsável pela

hematopoese definitiva nos mamíferos adultos (Dzierzak, 1999; Moore 2004).

1.3 – Estruturas envolvidas na hematopoese embrionária

1.3.1 – Placenta

A placenta é formada por uma parte fetal e outra parte materna, sendo

responsável pela troca de gases e nutrientes entre a mãe e o feto durante a

gestação. A placenta também produz fatores de crescimento e hormônios

importantes para o desenvolvimento fetal, conferindo imunoproteção ao

concepto. A parte materna da placenta consiste na decídua, que é composta

por artérias espiraladas provenientes do endométrio, denominadas labirinto, e

pela parte fetal, que é composta por células derivadas do trofoectoderma e do

mesoderma do alantóide (Rossant e Cross., 2001; Cross at al., 2003).

Durante a gastrulação, o alantóide se forma a partir do epiblasto e

cresce em direção à cavidade exocelômica como uma extensão da parte

posterior da fenda primitiva. O alantóide se fusiona com a placa coriônica,

originando a vasculatura umbilical, o cordão umbilical propriamente dito e os

componentes mesodérmicos fetais da placenta. Em camundongos, aos 8,5

dpc, ocorre a união corio-alantóica na qual o mesoderma da parte posterior do

embrião emite projeções que se insinuam por entre as células trofoblásticas até

alcançar o córion, estabelecendo uma rede altamente vascularizada - o

labirinto da placenta (Downs, 2002; Downs e Gardner, 1995). A molécula de

adesão celular vascular-1 (VCAM-1, vascular cell adhesion molecule) (Kwee et

al., 1995) e a cadeia 4 da integrina (Yang et al., 1995) são importantes neste

processo de fusão como demonstrado pelos estudos com camundongos

nocaute (knockout). Os camundongos nocaute são animais modificados

geneticamente que possuem deleção do gene de interesse, isto é, neste

estudo a cadeia 4 da integrina. Ainda neste estádio do desenvolvimento, há a

conexão da aorta dorsal e da artéria placentária através das artérias umbilicais.

Aos 12,5 dpc, o labirinto é capaz de facilitar a troca de oxigênio entre os

eritrócitos fetais e os eritrócitos maternos (Mikkola et al., 2005).

A primeira descrição do potencial hematopoético placentário foi obtida

com a detecção de precursores de linfócitos B na placenta em ensaios in vitro

(Melchers, 1979). A presença de progenitores hematopoéticos no alantóide de

embriões de galinha foi descrita a partir de enxertos de rudimentos alantóicos

de codornas em ovos de galinhas em estádio de desenvolvimento HH 16-17

(Hamburger-Hamilton 16-17), que são anteriores à vascularização. No entanto,

a origem hemangioblástica dos progenitores provenientes do alantóide ainda

não foi detectada (Caprioli et al., 1998 e 2001). Em mamíferos, os progenitores

hematopoéticos foram detectados no labirinto da placenta (parte materna)

através de ensaios in situ durante o desenvolvimento de placentas de

camundongos (Ottersbach e Dzierzak, 2005), in vitro (Alvarez-Silva et al., 2003)

e in vivo através de ensaios de transplantes destes progenitores em

camundongos irradiados letalmente (Gekas et al., 2005). A presença dos

progenitores hematopoéticos foi observada desde o 8,5 dpc até aos 18 dpc.

1.3.2 – Saco vitelínico

No mesoderma extra-embrionário da região do saco vitelínico são

geradas as ilhotas vitelínicas de Wolff-Pander, por volta de 7,0-7,5 dpc (Russel

e Bernstein, 1966 apud Pelajo-Machado, 2001). No mesoderma esplâncnico

extra-embrionário que circunda o saco vitelínico, surgem regiões de

adensamento celular, cujas células são denominadas hemangioblastos e se

encontram fortemente unidas por desmossomo. Doze horas após o surgimento

dos hemagioblastos, as células mais centrais se despendem das células da

periferia e se diferenciam em células hematopoéticas. As células periféricas da

ilhota de Wolff-Pander se diferenciam em células endoteliais, dando o início à

circulação sanguínea no embrião. Aos 8 dpc, as primeiras células

hematopoéticas compostas por populações de células eritrocíticas nucleadas

(Wong et al., 1986), células megacariocíticas (Xu et al., 2001) e células

macrofágicas (Cline e Moore, 1972; Shepard e Zon, 2000) são geradas no

mesoderma visceral do saco vitelínico.

Os eritrócitos primitivos são células nucleadas que podem possuir tanto

hemoglobina fetal quanto hemoblogina adulta. Xu e colaboradores (2001)

observaram que os sacos vitelínicos de embriões de 7,5 dpc continham

aproximadamente 50% de colônias formadoras de eritrócitos a partir do número

total de células retiradas do saco vitelínico.

No saco vitelínico, os megacariócitos começam a ser produzidos a partir

do 7,5 dpc, perdurando até 13,5 dpc (Xu et al., 2001).

Os macrófagos primitivos foram detectados pela primeira vez no saco

vitelínico por Dantschakoff (1908) (apud Pelajo-Machado, 2001). Takahashi e

colaboradores (1989) sugeriram que a diferenciação dos macrófagos vitelínicos

segue uma via diferente da via descrita para os macrófagos gerados no interior

do embrião. Estes autores, ao estudarem sacos vitelínicos de ratos, detectaram

os primeiros macrófagos por técnicas de microscopia eletrônica aos 9 dpc. Os

macrófagos se apresentavam pequenos e arredondados, com núcleo grande e

exibiam poucas projeções citoplasmáticas. Aos 10 dpc, os macrófagos

desenvolviam filopódios e a partir desse momento, estas células ganhavam a

circulação embrionária, indo povoar diversos órgãos onde se tornavam

macrófagos residentes persistindo até a vida adulta (Takahashi et al., 1993).

Em contrapartida, os megacariócitos e os eritrócitos possuem tempo de vida

limitado, sendo completamente eliminados no transcurso da ontogenia. A

diferenciação destes dois tipos de macrófagos se faz por detecção da atividade

da enzima peroxidase que é observada nas células geradas no interior do

embrião, enquanto que os macrófagos vitelínicos não expressam esta enzima

(Takahashi et al., 1989; 1993).

Godin e colaboradores (1995) observaram pela primeira vez a presença

de precursores de linfócitos B no saco vitelínico de embriões de 8,5 dpc. Neste

estudo, os pesquisadores isolaram as células do saco vitelínico e estimularam

in vitro a diferenciação das células hematopoéticas para as diferentes

linhagens de células sangüíneas, as quais foram detectadas no saco vitelínico.

Aos 8,5 dpc, a circulação intra-embrionária e extra-embrionária se

tornam interligadas, onde as artérias vitelínicas se conectam a aorta e, a partir

de então, o sangue começa a circular no embrião. Aos 9 dpc, as células

hematopoéticas podem ser isoladas de tecidos mesodérmicos embrionários

(Garcia-Porrero, et al. 1995).

Yoder e colaboradores (1994) observaram que as células de origem

endodérmica derivadas do saco vitelínico são um eficiente estroma para o

amadurecimento de neutrófilos. Por outro lado, as células mesodérmicas

isoladas do saco vitelínico possuíam uma maior capacidade de proliferação da

linhagem monocítica em relação a neutrofílica, mostrando que existem

ambientes próprios para diferenciação de cada linhagem hematopoética.

Uma potencial existência de células-tronco no saco vitelínico foi

observada a partir de ensaios de transplante de células do saco vitelínico de

camundongos fêmeas grávidas mutantes para o gene da cadeia da globina

(Toles et al., 1989). Após o transplante, as células do saco vitelínico

colonizaram as fêmeas grávidas. Yoder e colaboradores (1997) após injetarem

células de saco vitelínico de fetos de 9 dpc mutantes para a isoenzima Gpi em

camundongos adultos normais (transplante primário), observaram a presença

de células-tronco hematopoéticas de origem mutante no saco vitelínico dos

animais normais. Células mutantes para a isoenzima obtidas do camundongo

normal transplantado (transplante primário) foram injetadas em outros

camundongos normais (transplante secundário). Nos animais que receberam o

transplante secundário, a isoenzima Gpi também foi detectada.

saco vitelínico

de camundongos

mutantes para Gpi

Cultivo de células

do saco vitelínico

Injeção de células

do saco vitelínico em

camundongos normais

injeção de células dos

camundongos transplantados

em camundongos normais

Transplante primário

Transplante secundário

Figura A - esquema experimental do trabalho de Yoder e colaboradores (1997)

1.3.3 - Esplancnopleura para-aórtica ou região da Aorta-Gônadas-

Mesonefros (AGM)

Aos 8 dpc, o embrião de camundongo se encontra na fase de disco

trilaminar, porém sem que tenha havido o seu fechamento. Nesse estádio de

desenvolvimento, o mesoderma intra-embrionário está dividido em mesoderma

para-axial ou mesoderma somítico, do qual originará primeiramente os somitos.

Posteriormente, dos somitos serão desenvolvidos o dermatomiótomo, que

originará a derme e os músculos; e o esclerótomo, que originará as cartilagens

e os ossos. Aos 9 dpc, do mesoderma intermediário derivará o sistema

urogenital. A diferenciação do sistema urinário se inicia com a formação dos

pronefros que irão se diferenciar em mesonefros, para finalmente formarem os

metanefros, aos 10 dpc (Gilbert e Singer, 2006).

Concomitantemente com a formação dos somitos, o mesoderma lateral

sofre uma bilaminação, dando origem ao mesoderma somático ou pára-aórtico

e o mesoderma esplâncnico que serão importantes no fechamento do embrião.

O mesoderma esplâncnico intra-embrionário em contato com o endoderma do

saco vitelínico irá compor a esplancnopleura enquanto que o mesoderma

somático intra-embrionário e o assoalho da bolsa amniótica irão constituir a

somatopleura. Neste momento, ocorre ainda o fusionamento das duas aortas

dorsais formando um único vaso. Entre os dois folhetos do mesoderma lateral

se formará o celoma intra-embrionário, que originará a cavidade celomática

(Gilbert e Singer, 2006).

Por volta dos 8,5 dpc, na região do mesoderma entre a aorta-gônadas-

mesonefros (aorta-gonad-mesonephros - AGM) se inicia a hematopoese

intraembrionária (Tyan e Herzenberg, 1968). Esta região será o primeiro sítio

de geração das células hematopoéticas definitivas. As células sangüíneas são

geradas até os 12,5 dpc, quando o número destes progenitores diminui no

mesoderma da região da AGM e aumenta no fígado, indicando um evento de

migração das células (Cumano et al., 1993; Godin et al., 1993; Medvinsky et

al., 1993; Müller et al., 1994).

Figura B - Região AGM mostrando o endotélio anterior da aorta dorsal (seta fina)

formando projeções papilíferas de células monocitóides (seta larga) (modificado de

prancha 26-C de Pelajo-Machado, 2001).

Medvinsky e Dzierzak (1996) comprovaram que a região da AGM possui

células-tronco hematopoéticas de povoamento de longa duração (LTR-HSC) ao

observarem a formação de unidades formadoras de colônias no baço (CFU-S,

colony forming unit - spleen) de animais irradiados letalmente que receberam

células da AGM previamente isoladas e em cultura. Este procedimento

possibilitou cultivar células da AGM, do fígado fetal e do saco vitelínico

isoladamente, de tal forma que não existisse circulação de células

hematopoéticas entre os três sítios, possibilitando o estabelecimento da origem

intraembrionária da hematopoese. Assim, após o cultivo in vitro, as células

isoladas dos três sítios foram injetadas em animais irradiados letalmente e, 11

dias após o transplante foram observadas colônias de células no baço (CFU-

). Somente os transplantes de células do saco vitelínico e da região AGM de

10 dpc produziram CFU-S

, sendo a quantidade de células geradas a partir da

AGM superior à quantidade obtida do saco vitelínico.

Medvinsky e Dzierzak (1996), Godin e colaboradores (1999) e De Bruijn

e colaboradores (2000a) após tendo retirado as regiões anterior e posterior da

AGM de embriões machos os explantes foram mantidos em cultura para a

realização de ensaios de transplantes em fêmeas receptoras. As células

cultivadas foram dissociadas e injetadas em fêmeas receptoras irradiadas

letalmente. Os resultados mostraram que a região anterior da AGM possui uma

maior capacidade de repovoamento quando comparada com a região posterior.

Godin e colaboradores (1999) observaram que as células da região da AGM

possuía, além do potencial gerador, capacidade de expansão das células-

tronco hematopoéticas. A partir de células da AGM isoladas e cultivadas em

meios propícios para diferenciação, foi verificada uma pequena capacidade de

geração de colônias eritróides e linfóides (linfócitos T e B) quando comparado a

outras regiões do embrião. De Bruijn e colaboradores (2000b) confirmaram os

achados de Godin e colaboradores (1999) e também confirmaram os dados

sugestivos de Garcia-Porrero e colaboradores (1995), Takakura e

colaboradores (1998) e North e colaboradores (1999) de que o mesênquima ao

redor das artérias vitelínicas e umbilicais, após o estádio de desenvolvimento

E11, também possui progenitores com capacidade de repovoamento de longa

duração, ao injetarem essas células em doadores murinos irradiados

letalmente.

1.3.4 - Fígado fetal

1.3.4.A – O desenvolvimento hepático

O desenvolvimento hepático é iniciado a partir de uma evaginação do

epitélio endodérmico da parte caudal do intestino anterior. As células

endodérmicas formam um broto (divertículo hepático) na região do septo

transverso (futuro diafragma) (Lôbo et al., 1973; Zaret, 1996).

O início da indução de diferenciação parece ser a partir do fator de

crescimento de fibroblastos 8 (FGF-8, fibroblast growth factor-8) que é

expresso no limite entre o mesoderma cardíaco e o endoderma (Jung et al.,

1999). A inativação desse fator causa letalidade do embrião, revelando sua

importância na especificação e diferenciação correta do mesoderma e do

primórdio hepático (Yamaguchi et al., 1994; Zaret, 2002).

Le Douarin e colaboradores (1975) mostraram em embriões de galinha

no estádio de 4-5 somitos que o endoderma do intestino anterior é capaz de se

diferenciar em epitélio hepático quando o mesênquima hepático entra em

contato com o mesênquima cardíaco. Porém, o endoderma retirado no estádio

do desenvolvimento anteriores a 5 somitos não possuía a capacidade de se

desenvolver em parênquima hepático. Nos experimentos, nos quais obstáculos

foram colocados entre o endoderma hepático anterior e o mesênquima da

placa lateral de embriões de galinha de 12 somitos, observou-se que ocorreu o

desenvolvimento do epitélio hepático, mas sem a diferenciação para

parênquima hepático. O mesmo resultado foi obtido quando uma parte de

tecido localizado entre o endoderma anterior e o mesênquima posterior foi

removida.

Fukuda (1979), ao realizar experimento semelhante em embriões de

codorna, também obteve resultados similares. Desta forma, foi possível

concluir que a determinação da estrutura hepática ocorre a partir do estádio de

5 somitos. Contudo, para que ocorra a diferenciação hepática é necessário que

o endoderma hepático interaja com o mesênquima cardíaco.

Em camundongos, por volta dos 8,5 dpc, a região do endoderma do

intestino anterior, adjacente ao mesênquima cardíaco, começa a proliferar

devido a mecanismos de indução das células de revestimento do intestino.

Neste momento, as células do mesoderma cardíaco expressam os fatores

FGF-1 e FGF-2 durante os estádios entre 7 e 8 somitos. Estudos in vitro

mostraram que a ação destes fatores é específica no endoderma ventral

adjacente ao intestino. O endoderma intestinal também expressa FGF-2, além

de expressar os receptores de FGF-1 e FGF-4 (Gualdi et al., 1996; Zaret,

2002).

Entre 9 e 9,5 dpc, o endoderma dos intestinos anterior e médio se

movimentam em direção à região central do embrião e as células migrantes

começam a expressar alfa-fetoproteína (AFP), um dos marcadores de

diferenciação hepatocitária (Gualdi et al., 1996; Zaret, 2002).

Aos 9,5 dpc, o movimento migratório das células do endoderma irá

posicioná-las em contato direto com o mesênquima cardíaco, o que disparará o

processo de diferenciação do endoderma intestinal em endoderma hepático.

Em seguida, células mesenquimais migram e se dispoem formando cordões ao

redor do mesênquima da região do septo transverso, se entremeando com as

veias vitelínicas, as quais começam a se anastomosar em seios venosos. As

células endoteliais ao redor das veias vitelínicas começam a se espessar e a

desenvolver espaços vasculares (Johnson e Jones, 1973). Neste momento, a

albumina começa a ser expressa pelas futuras células hepáticas (Houssaint,

1980). Aos 10,5 dpc, o fígado fetal possui uma estrutura morfológica

semelhante ao fígado de um animal adulto (Zaret, 2002).

O fígado fetal aos 11 dpc é formado por cordões hepáticos primitivos

com alguns hepatócitos anastomosados, os quais estão separados por

sinusóides em expansão (Sasaki, 1990). Os cordões hepáticos primitivos

exibem células hematopoéticas de diferentes linhagens e em diferentes

estágios de diferenciação ocupando os nichos sinusoidais (Thomas e Yoffey,

1964; Zamboni, 1965a; Zamboni, 1965b; Rifkind et al., 1969; Barak et al., 1980;

Sohn et al., 1993).

Fiegel e colaboradores (2003) descreveram a presença de duas

linhagens hepáticas presentes nos fígados fetais de ratos Sprague-Dawley de

16, 18 e 20 dpc: uma população positiva ao Thy1 (CD90) e citoqueratina 18, e

outra população somente positiva à citoqueratina 18. Neste trabalho, após as

células hepáticas terem sido isoladas por MACS (magnetic activated cell

sorting) e colocadas em cultura, foi observada a expressão destas duas

moléculas de superfície marcadoras de diferenciação: a Thy1 como

identificador de célula-tronco e a citoqueratina 18, como identificador da

linhagem hepatocitária. Também foram utilizados outros marcadores de

linhagem hepatocitária como alfa-fetoproteína (AFP) e a albumina. Na fração

enriquecida com células Thy1 positivas foi observado que a expressão de

albumina diminuia com o desenvolvimento, em contraste com a expressão de

AFP que aumentava. Na fração que expressava somente CK-18, na qual

somente foram retiradas as células hematopoéticas e endoteliais, foi observado

um aumento na expressão de albumina e uma diminuição na expressão de

AFP. Os resultados obtidos apontaram para uma linhagem mais primitiva, Thy1

positiva, que originaria as células-tronco hepáticas enquanto que os

hepatoblastos teriam origem em outra população (citoqueratina 18 positiva).

Chagraoui e colaboradores (2003) descreveram que as células

estromais hepáticas fetais passam por uma transição “mesênquima-epitelial”.

Neste trabalho, após o cultivo de células isoladas de fígados fetais de 14,5 dpc

foi detectada a expressão de marcadores mesenquimais e epiteliais, em um

mesmo tipo celular, tais como: alfa-actina de músculo liso, vimentina,

osteopontina, fibronectina, citoqueratina 8 (CK-8), alfa-fetoproteína, albumina,

caderina E, dentre outros marcadores. O cultivo de células de um período mais

tardio, entre 14,5 e 18 dpc, revelou uma diminuição no número de colônias

formadoras de granulócitos e macrófagos (CFU-GM, colony forming unit-

granulocyte and monocyte), granulócitos-eritrócitos-monócitos e megacariócitos

(CFU-GEMM, colony forming units granulocyte-erythrocyte-monocyte and

megakaryocyte) e de “burst” eritróides (BFU-E, burst forming units-erythrocyte).

Além disso, foi detectado num período mais tardio da cultura que 70% das

células com fenótipo “mesênquimo-epitelial” expressavam somente marcadores

epiteliais, como a citoqueratina 8, a qual demonstra diferenciação epitelial, pois

as células se assemelhavam morfologicamente a hepatócitos. Também foi

detectada, mas em menor número, a presença de células com fenótipo

mesenquimal (células positivas à alfa-actina de músculo liso) remetendo a

células estreladas hepáticas (células perisinusoidais ou células de Ito)/

miofibroblastos.

Quando a oncostatina M (OSM) era adicionada à cultura, foi observada a

diferenciação dos tipos celulares de duplo fenótipo em células de fenótipo

poligonal, isto é, células com núcleo proeminente, expressando citoqueratina 8

ou 19, com altos níveis de albumina e diminuição da expressão de alfa-

fetoproteína; o que confirmou os dados de Myajima e seus colaboradores. Este

fenótipo típico de células hepatocitárias, associado à ausência de células

hematopoéticas adjacentes, remetem à diferenciação celular em conseqüência

ao aumento da concentração de OSM (Kamiya et al., 1999; Kinoshita e

Miyajima, 2002).

Chagraoui e colaboradores (2003) em seus estudos in vitro observaram

resultados semelhantes àqueles obtidos nos experimentos em cultura de

células. Nos estádios iniciais do desenvolvimento hepático, de 11,5 a 15,5 dpc,

foram detectados células epitélio-mesenquimais (CK-8 e alfa-actina positivas) e

um grande número de células hematopoéticas. Aos 18,5 dpc, a expressão de

alfa-actina de músculo liso era restrita basicamente aos pericitos e

praticamente todas as células do tecido hepático eram CK-8 positivas (fenótipo

epitelial). Desta forma, os dados deste trabalho levam à reflexão da

necessidade de uma análise mais cuidadosa quanto à origem hepatocitária,

apesar de já terem sido levantadas algumas hipóteses. Uma das hipóteses

sugere a origem mesodérmica para as células parenquimáticas hepáticas e a

outra hipótese seria a presença de células-tronco multipotentes no fígado fetal

como descrito na medula óssea adulta de mamíferos. No entanto, outros

estudos ainda são necessários para esclarecer a origem da célula hepática.

1.3.4.B – Ocupação do ambiente hepático por células hematopoéticas

Anterior aos experimentos realizados com as células da região AGM,

acreditava-se que a chegada das primeiras células hematopoéticas no fígado

fetal seriam proveniente do saco vitelínico, aos 11,5 dpc, quando a vasculatura

hepática já estaria formada. No entanto, Cumano e colaboradores (1993)

observaram células hematopoéticas no fígado fetal desde os 8 dpc, sendo

estas células provenientes tanto do saco vitelínico quanto da região da AGM.

Dos 9 aos 15 dpc, o fígado fetal formado por hepatócitos imaturos é

invadido por células progenitoras hematopoéticas provenientes do saco

vitelínico e da região AGM (Cumano et al., 2000; Kamiya et al., 1999; Kinoshita

e Miyajima, 2002; Moore, 2004). No período compreendido entre 9,5 - 10 dpc,

os primeiros progenitores mielóides-eritróides provenientes do saco vitelínico

chegam através das veias vitelínicas e colonizam o fígado fetal. Num período

mais tardio, ocorre a conexão do fígado fetal com a placenta através da veia

umbilical permitindo o trânsito de progenitores placentários para o fígado fetal

(Mikkola et al. 2005).

Aos 11 dpc, os cordões hepáticos primitivos contêm células da linhagem

eritróide em diferentes estádios de diferenciação, que ocupam os nichos

sinusoidais (Thomas e Yoffey, 1964; Zamboni, 1965b; Rifkind et al., 1969;

Barak et al. 1980; Sohn et al. 1993).

Nos sinusóides também é observada a presença de macrófagos que

atuam como lixeiros (scavengers), fagocitando eritroblastos primitivos e seus

restos nucleares (Jones, 1959; Nagel e Billat, 1974; Sasaki e Iwatsuki, 1997).

Estes macrófagos, por conterem ferro em seu citoplasma (Nagel e Billat, 1974),

parecem atuar na apresentação e captação de ferro para os eritroblastos

(Bessis e Breton-Gorius, 1959; 1962). Recentemente, algumas moléculas

envolvidas na apresentação de ferro em fígado de camundongos adultos foram

descritas como a ferroportina, a transferrina, a hepcidina e o receptor de

transferrina (Kaplan, 2002; Ganz, 2003).

Aos 14 dpc, os macrófagos lixeiros (scavengers) são observados em

mitose, emitindo longas e finas projeções citoplasmáticas, que auxiliam na

migração dos macrófagos sinusoidais para os cordões hepáticos. Nos cordões

hepáticos, os macrófagos criam nichos propícios à diferenciação das células

eritróides (ilhas eritroblásticas) (Sasaki e Iwatsuki, 1997). A microscopia

eletrônica de transmissão revelou que estes macrófagos podem abrigar até 19

eritroblastos, os quais ficam inseridos em lacunas macrofágicas de 2 a 4



m de

profundidade por 2 a 8 m de largura (Morris et al., 1988).

Cumano e colaboradores (1992a

e b) demonstraram que os precursores

hematopoéticos presentes no fígado fetal, após 12 dpc, possuem capacidade

de gerar linfócitos B e macrófagos. Cumano e colaboradores (1993) também

detectaram que os precursores dos linfócitos B estariam presentes tanto no

saco vitelínico quanto no fígado fetal desde 8-8,5dpc (10-12 somitos).

A migração de células hematopoéticas para o fígado fetal parece ser

mediada por quimiocinas. As células hematopoéticas migrantes expressam em

sua superfície o receptor CXCR-4, o qual interage com o fator CXCL-12 (SDF-

1, stromal derived factor-1, fator derivado de estroma-1) produzido pelo sítio a

ser colonizado (Egawa et al., 2001). À medida que o fígado se desenvolve, os

níveis de transcritos de RNAm de CXCL-12 aumentam (McGrath et al., 1999).

Estudos com camundongos nocaute para CXCL-12 (Nagasawa et al., 1996) e

em camundongos nocaute para CXCR4 apresentaram redução dos

progenitores de linfócitos B no fígado fetal (Tachibana et al., 1998). Assim, o

CXCL-12 parece atrair e reter os precursores em ambientes propícios ao

desenvolvimento, enquanto que a expressão do seu receptor, CXCR-4, tem

sido observada em tecidos com potencial hematopoético (McGrath et al.,

1999).

1.3.4.C – Arquitetura da matriz extracelular (MEC)

A matriz extracelular (MEC) hepática fetal é detectada em baixa

quantidade ao redor dos vasos sangüíneos e ao redor dos sinusóides

hepáticos, a partir dos 12,5 dpc em camundongos e a partir de 5ª semana de

gestação em humanos. A MEC do fígado fetal é formada por fibronectina,

laminina, colágeno do tipo I, II, III, IV, VI (Rescan et al., 1989; Reif et al., 1990;

Baloch et al., 1992; Loreal et al., 1992; Couvelard et al., 1996; Monte et al.,

1996; Peters e Hynes, 1996; Amenta e Harrison, 1997; Couvelard et al.,1998;

Quondamatteo et al., 1999b; Sánchez et al., 2000; Gouysse et al., 2002; Shiojiri

e Sugiyama, 2004), vitronetina, tenascina, trombospondina (Couvelard et

al.1998; Gouysse et al. 2002), nidogênio (Quondamatteo et al. 1999b; Sánchez

et al., 2000; Shiojiri e Sugiyama, 2004) e heparan-sulfato (Shiojiri e Sugiyama,

2004).

Em humanos, as expressões de laminina e de nidogênio são

concomitantes e se restringem aos microvasos durante os períodos iniciais do

desenvolvimento hepático (6 a 8 semanas). Após 9 semanas de gestação, a

expressão destas duas moléculas reduz drasticamente, enquanto que a

expressão de colágeno IV é intensa. Somente os hepatócitos que se

diferenciarão em epitélio biliar expressam concomitantemente laminina,

nidogênio e colágeno IV (Quondamatteo et al., 1999b). Em geral, a membrana

basal dos vasos é discontínua e expressão de laminina é intensa no início do

desenvolvimento hepático, sendo substituída por fibronectina, tenascina e

trombospondina (Couvelard et al.,1996). Em ratos, parece que o papel da

fibronectina seria de favorecer a formação dos cordões hepáticos e o seu

conseqüente amadurecimento (Sánchez et al., 2000).

As cadeias





1 e



1 da laminina foram detectadas por imuno-

histoquímica durante o período fetal, onde a laminina parece atuar na

estimulação da divisão celular dos hepatócitos. Após o nascimento, a laminina

deixa de ser expressa no fígado fetal; este fato parece estar relacionado ao

amadurecimento da vasculatura sinusoidal (Amenta e Harrison, 1997).

Com relação aos ligantes da maioria destas moléculas, foi observada a

expressão das cadeias do tipo 1, 1, 5, 6 e 9 da família de integrina. Em

humanos, níveis comparáveis ao detectado em adultos foram observados após

15 semanas de gestação, sendo que a cadeia



6 não é mais detectada após

30 semanas. Este desaparecimento foi correlacionado à concomitante

diminuição da laminina e aumento da expressão de tenascina na matriz

perisinusoidal, demonstrando que existe uma afinidade diferencial pelos

componentes de matriz extracelular nos diversos estádios de diferenciação dos

hepatócitos (Couvelard et al., 1998). Em camundongos, as cadeias dos tipos

2, 3 e 6 de integrina foram detectadas nas veias portais e hepáticas. Com

relação as outras cadeias da integrina, a cadeia do tipo 2 é presente nas

veias portais e ausente nas veias hepáticas; a cadeia do tipo 3 foi detectada

nos tecidos conjuntivos associados ao espaço periportal; enquanto que a

cadeia do tipo 6 foi detecada nas estruturas sinusoidais, diminuindo a partir

dos 17,5 dpc. A cadeia do tipo 4 da integrina foi observada somente nas veias

portais. Além disso, o PECAM-1 é expresso nos sinusóides, mas também

reduz sua expressão ao longo do desenvolvimento (Shiojiri e Sugiyama, 2004).

As metaloproteinases de matriz extracellular (MMP) são conhecidas por

degradarem a maior parte dos componentes de matriz extracelular, regulando

dessa forma eventos fisiológicos e de desenvolvimento através da sua atuação

nos eventos de migração, invasão, proliferação e morte celular. Durante o

desenvolvimento foram observadas nos eventos de crescimento celular,

morfogênese, angiogênese, cicatrização e degradação da matriz extracelular

(Vu e Werb, 2000). No fígado fetal de mamíferos as MMPs paracem ter

funções importantes na manutenção da integridade do tecido hepático em

desenvolvimento inicial, uma vez que foi detectada a presença de colágenos

dos tipos I, III e IV (Quondamatteo et al., 1999b) concomitante com a

expressão de MMPs expecíficas para degradação destes tipos de colágenos

como a MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-13 (Quondamatteo et al., 1999a).

Durante o desenvolvimento embrionário de camundongos é descrita a

presença de MMP-1 na placa ductal e nas células migrantes biliares primitivas

e a expressão de MMP-2, MMP-3 e MMP-9 foi observada na placa ductal

(Terada et al., 1995). A partir de 15 dpc, o fígado fetal de camundongos

expressa transcritos de RNA mensageiro (RNAm) de MMP-9 (Canete-Soler et

al., 1995). A expressão de MMP-1, MMP-2, MMP-7 e MMP-13 foi observada

nos fígados fetais humanos. A MMP-1 foi observada a partir da 6ª semana de

gestação nos hepatócitos, nos ductos biliares em formação e nas células

mesenquimais periportais. A MMP-2 foi restrita ao endotélio microvascular, na

6ª semana de gestação e a partir da 7ª semana de gestação esta

metaloproteinase foi observada nos hepatócitos, eritrócitos, nas células

endoteliais e nas células mesenquimais periportais. A MMP-7 foi detectada em

alguns hepatócitos e em algumas células endoteliais na 6ª semana de

gestação. A partir da 7ª semana a expressão de MMP-7 e MMP-13 se

restringiu às células hematopoéticas (Quondamatteo et al., 1999a).

1.3.4.D – A hematopoese hepática fetal

Na hematopoese hepática fetal foi descrita a presença de células

granulocíticas (Thomas e Yoffey, 1964; Bessis, 1973; Moore e Williams, 1973;

Johnson e Moore, 1975; Enzan et al., 1978; Barak et al., 1980; Lenzi, 1980;

Emura et al., 1983; Sohn et al., 1993; Pelajo-Machado, 2001), células da

linhagem eritróide e células megacariocíticas (Thomas e Yoffey, 1964;

Zamboni, 1965b; Rifkind et al., 1969; Rifkind et al., 1974; Barak et al., 1980;

Lenzi, 1980; Sohn et al., 1993; Sasaki e Iwatsuki, 1997; Pelajo-Machado,

2001).

Nesta condição, as células eritróides proliferam rapidamente e verifica-

se a alteração da arquitetura dos cordões hepáticos e a morfologia das células

hepáticas, que assumem formato piramidal (Zamboni, 1965a). No fígado fetal

humano, as células são escassas por volta da 6ª semana e aumentam

expressivamente na 7ª semana (eritropoese trabecular), mantendo-se até o 7°

mês, quando então passa a assumir gradativamente um caráter focal. No final

da gravidez, as células eritróides reduzem, formando pequenos e esparsos

focos parenquimatosos, constiuídos principalmente por normoblastos ou por

células eritróides de transição (Lenzi, 1980).

Enzan e colaboradores (1978) estudaram fetos humanos entre a 7ª e

13ª semanas de gestação e detectaram a presença de granulócitos

neutrofílicos e eosinofílicos. Na 7ª semana de gestação, somente algumas

células eritrocíticas e granulocíticas imaturas foram observadas; enquanto que

na 10ª semana, se detecta um maior número de células em diferentes estágios

de amadurecimento. Este trabalho não demonstrou distribuição seletiva dos

tipos celulares. No entanto, os autores chamaram a atenção para a presença

de populações granulocíticas em diferentes estágios de diferenciação próximos

às áreas mesenquimais hepáticas.

Barak e colaboradores (1980) investigaram in situ e in vitro a presença

de células e progenitores das linhagens granulocítica, macrofágica e eritrocítica

utilizando a coloração pelo Giemsa. Os resultados in situ mostraram que cerca

de 70% das células eram eritróides. O restante da população celular era

composto por alguns macrófagos, poucos granulócitos e poucas células

mononucleares primitivas. Neste estudo, Barak e colaboradores (1980)

utilizaram diversas técnicas histoquímicas, sendo que as análises citoquímicas

utilizando o ácido periódico e o reativo de Schiff (PAS), fosfatase alcalina,

peroxidase e naftol cloroacetato esterase não forneceram marcações para as

linhagens granulocíticas e para as células mononucleares; somente a -naftil

acetato esterase revelou a presença de macrófagos. No entanto, os resultados

com cultura de células mostraram muitos progenitores granulocíticos, que

representavam 92% das colônias. Dentre células granulocíticas em diferentes

estágios de diferenciação, 65% delas eram células imaturas e 35% eram

células maduras.

Em camundongos, megacariócitos são observados no fígado fetal

durante o período compreendido entre 12 e 15 dpc (Sasaki e Iwatsuki, 1997).

No fígado fetal humano, megacariócitos são identificados na 6ª semana de

gestação, exibindo aumento a partir da 18ª semana, com pico máximo entre a

24ª e 25ª semanas, declinando em seguida (Lenzi, 1980).

1.3.4.E – O amadurecimento hepático e a saída das céulas

hematopoéticas

Com a chegada das células à região da AGM, o fígado fetal inicia seu

processo de amadurecimento com a expressão de genes estádio-específicos,

produzindo proteínas como a alfa-fetoproteína (AFP), a albumina e a

oncostatina M (OSM). O ambiente hepático fetal constitui a maior etapa de

expansão e de diferenciação das células sangüíneas, sendo importante,

também para o amadurecimento dos hepatócitos (Kinoshita e Miyajima, 2002).

A alfa-fetoproteína (AFP) é uma glicoproteína com 590 aminoácidos,

sendo produzida principalmente pelo fígado fetal e em menor quantidade pelo

saco vitelínico e pelo trato gastrointestinal. A expressão de AFP pelos

hepatócitos tem sido utilizada como marcador de diferenciação inicial, embora

seus níveis diminuam ao longo do desenvolvimento embrionário. No entanto,

em humanos esta molécula ainda pode ser detectada em altas quantidades

nos recém-nascidos até um ano de idade. Em mulheres grávidas, a dosagem

de AFP no sangue ou fluído amniótico pode ser um indício da síndrome de

Down ou da mal-formação do tudo neural. Em adultos, a expressão de AFP

acontece em casos de hepatocarcinoma, tumores de células germinais,

metástase em fígado, hepatite e cirrose hepática. Nos casos de neoplasias

hepáticas, a AFP é utilizada como marcador para diagnóstico da doença (Sato

et al., 1993; Buamah et al., 1986; Li et al., 2001).

A expressão de albumina, tirosina amino transferase (TAT) e glicose-6-

fosfato aumentam com o desenvolvimento embrionário, atingindo os níveis

máximos no fígado adulto. Tais moléculas são muito utilizadas para verificação

do estágio e da diferenciação dos hepatócitos fetais. Estas moléculas

começam a ser expressas a partir da indução do amadurecimento dos

hepatócitos fetais pela oncostatina M (Kamiya et al., 1999; Miyajima et al.,

2000; Kamiya et al., 2002; Kinoshita e Miyajima, 2002).

A OSM é uma glicoproteína de 28 KDa, da família IL-6, formada por

duas subunidades: uma subunidade variável e uma subunidade conservada: a

gp130. Existem dois tipos de receptores para OSM: o receptor do tipo I (OSM-

RI) e o receptor do tipo II (OSM-RII), sendo que o OSM-RII é expresso em

camundongos. A OSM é produzida por células hematopoéticas CD45

e parece

reduzir a habilidade dos hepatócitos em propiciar um ambiente favorável a

hematopoese. Com o aumento do número de células CD45

, os níveis

teciduais de OSM aumentam, promovendo o desenvolvimento/

amadurecimento dos hepatócitos, que então adquirem funções metabólicas

como: desintoxicação, eliminação (clearance) de amônia e síntese de lipídeos

e de glicogênio (Kamiya et al., 1999). A OSM também induz mudanças

morfológicas como o aumento da adesão celular homofílica e a indução da

expressão de genes tecido-específicos nos hepatócitos, que também resultam

em um ambiente não propício à hematopoese (Kamiya et al., 1999; Kinoshita e

Miyajima, 2002). No entanto, especula-se que existam outros mecanismos

ainda não definidos que regulem a proliferação e a diferenciação das células

hematopoéticas (Boggs, 1999).

Ao final do período gestacional, no fígado fetal ocorre uma diminuição do

número de células hematopoéticas devido ao amadurecimento dos hepatócitos,

os quais passam a produzir outras moléculas de matriz extracelular, além de

expressar moléculas que não proporcionam um ambiente favorável à

diferenciação hematopoética. Como conseqüência destas mudanças no meio

extracelular, há a desagregação das ilhas eritroblásticas. Primeiramente os

eritrócitos afastam-se da vizinhança dos macrófagos centrais, os quais entram

em degeneração. As ilhotas eritroblásticas finalmente desaparecem no final da

hematopoese hepática e os macrófagos centrais degenerados passam a ser

removidos por macrófagos lixeiros (scavenger) localizados no espaço

perisinusoidal (Sasaki e Iwatsuki, 1997).

1.3.4.F – Moléculas de superfície envolvidas no processo de trânsito de

células hematopoéticas no fígado fetal

As moléculas envolvidas no trânsito celular durante o desenvolvimento

embrionário são pouco conhecidas. Os principais avanços na Biologia do

Desenvolvimento foram alcançados através da identificação das moléculas

envolvidas nos processos de endereçamento (homing), nos modelos de

transplante de medula óssea (TMO) (Zanjani et al., 1993; Hendrikx et al., 1996;

Szilvassy et al., 2003) ou na inflamação tecidual (Gallatin et al., 1986; Jutila et

al.,1989; Yednock e Rosen, 1989; Stoolman, 1989; Butcher, 1990).

A inflamação tecidual gerada por diversos indutores tem sido o melhor

modelo para estudo das moléculas envolvidas no processo de migração. Após

a vasodilatação e a diminuição da velocidade de fluxo sangüíneo, as células

hematopoéticas tendem a margear a parede dos vasos sangüíneos e as

células endoteliais próximas ao tecido lesado expõem as selectinas P e E em

sua porção luminal. As células hematopoéticas leucocitárias presentes na

corrente sangüínea expressam a selectina L, que se liga homotipicamente às

selectinas endoteliais. Esta ligação é fraca e permite que a célula migrante seja

freada e comece a estabelecer interações mais intensas. A ligação das

selectinas E e a presença de quimiocinas, como o fator ativador de plaquetas

(PAF, platelet activating factor), induzem a ativação de integrinas leucocitárias

(Van Der Schoot e Dercksen, 1994; Abbas e Lichtman, 2003; Alberts et al.,

2002). Após a interção com as integrinas, as células aderidas migram por entre

as células endoteliais com a ajuda de integrinas e proteínas da superfamília

das imunoglobulinas, como o PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion

molecule-1, molécula de adesão celular de plaquetas e células endoteliais)

(Müller et al., 1993).

No transplante de medula óssea, a medula óssea é depletada devido à

ação de quimioterapia e/ou radioterapia, de modo a induzir a morte das células

com alto poder proliferativo. A seguir, são administradas células indiferenciadas

de medula óssea ao paciente, sendo que as células migram para o ambiente

medular por processo denominado endereçamento (homing). No entanto, ainda

não estão claros alguns dos mecanismos que governam este processo (Wright

et al., 2001).

No modelo experimental laboratorial de transplante de medula óssea, as

células marcadas são injetadas em camundongos isogênicos, que podem

receber ou não dose sub-letal de irradiação antes da injeção. Através de

estudos morfológicos, estas células são acompanhadas com afinalidade de se

obter informações sobre os sítios preferenciais de migração celular, bem como

as moléculas envolvidas neste processo.

No modelo de transplante de medula óssea, tem sido caracterizado que

a principal molécula endereçadora/ quimioatratora da migração é o CXCL-12

que produz um gradiente permissivo/ indutor à movimentação unidirecional de

células-tronco para o local lesado. Camundongos nocaute para selectina-P e

selectina-E demonstraram uma diminuição na migração das células

hematopoéticas para medula óssea, com retenção destas células no baço após

realização do transplante (Frenette et al., 1998). As células CD34

(células-

tronco) em co-cultura com células endoteliais ativadas tiveram a sua ligação

com as células endoteliais inibidas após o tratamento das células CD34

com

anticorpo anti-VLA-4 (very late antigen 4), demonstrando um possível papel

desta molécula na migração celular (Rood et al., 2000).

Os carboidratos e as lectinas também são moléculas importantes

envolvidas nos processos de opsonização de microorganismos, fagocitose,

interação, adesão, migração, ativação, diferenciação e morte celular

(apoptose). As lectinas foram descritas inicialmente em 1888 por Peter

Hermann Stillmark, que descobriu a reação de hemaglutinação através da

lectina Ricinus communis. Atualmente são descritos inúmeros tipos de lectinas,

não somente em plantas como também em microorganismos e diversas

classes de animais, como a classe Reptilia e Mammalia (Ni e Tizard, 1996).

As lectinas são glicoproteínas ou proteínas ligantes de açúcares muito

variáveis estruturalmente que reconhecem especificamente certos resíduos de

carboidratos, podendo ser encontradas na forma solúvel ou associada a

células, sendo muito empregadas na caracterização de tipos sangüíneos,

reconhecimento e ativação de leucócitos, precipitação de células e

glicoconjugados, dentre outras funções (Ni e Tizard, 1996). Os resíduos de

galactosil e manosil, por exemplo, foram descritos como moléculas importantes

que participam no processo da interação célula migrante-endotélio (Aizawa e

Tavassoli, 1988; Tavassoli e Hardy, 1990). Aizawa e Tavassoli (1988)

realizaram um transplante de medula óssea competitivo com células-tronco

femurais e resíduos de galactosil-BSA, manosil-BSA, fucosil-BSA e

asialofetuína em dois grupos de camundongos isogênicos C57BL6, um

esplectomizado e outro não-esplectomizado que foram irradiados letalmente.

Após o transplante foi observada uma inibição na migração das células

hematopoéticas para a medula óssea nos grupos de animais esplectomizados

que receberam as células-tronco conjuntamente com resíduos de manosil-BSA

e galactosil-BSA, demonstrando a importância destes resíduos de açúcares

nos processos de reconhecimento e migração celular.

A remoção dos resíduos de ácido siálico das células hematopoéticas

também diminui a migração celular das células migrantes para a medula óssea,

demonstrando uma provável importância dos carboidratos no processo de

migração (Tonelli e Meintz, 1977; Papayannopoulou e Craddock, 1997). De

forma semelhante, a inibição competitiva do receptor hepático da

asialoglicoproteina pela fetuína diminui a migração das células hematopoéticas

para o fígado, porém aumenta o número de unidades formadoras de colônias

no baço e a celularidade medular (Samlowski e Daynes, 1985).

Os processos de adesão e de rolamento das células hematopoéticas

sobre as células endoteliais, seguidos da diapedese, parecem ser fenômenos

conservados e funcionam como nos processos inflamatórios (Gallatin et al.,

1986; Yednock e Rosen, 1989; Stoolman, 1989; Butcher, 1990). O CD44

funciona como um receptor de matriz extracelular e de adesão célula-célula e

pode se ligar à fibronectina, ao ácido hialurônico, ao PECAM-1, à proteína

ligante de heparina e à selectina L. O tratamento de camundongos com

anticorpos anti-VLA-4, anti-integrina 1, anti-VCAM-1 ou anti-CD44 inibiram o

endereçamento dos progenitores hematopoéticos para medula óssea e para o

baço (Papayannopoulou et al., 1995; Vermeulen et al., 1998). No entanto,

camundongos nocaute para VCAM-1 não revelaram alterção da mielopoese e

da linfopoese (Friedrich et al., 1996). Contudo, os camundongos nocaute para

CD44 exibiram redução do número de progenitores CFU-GM (colony forming

units–granulocyte macrophage), provavelmente devido à falta de interação das

células mutadas com a matriz extracelular (Schmits et al., 1997). Da mesma

forma, os progenitores hematopoéticos deficientes de integrina 4 se

desenvolvem normalmente no fígado fetal, no baço e na medula óssea (Arroyo

et al., 1996; 1999). Entretanto, estudos com células hematopoéticas nocaute

para a integrina



1 mostraram a incapacidade destas células povoarem o

fígado fetal, o baço, o timo e a medula óssea (Hirsch et al., 1996; Potocnik et

al., 2000).

Apesar dos diversos estudos, os mecanismos referentes à cinética de

migração para os diferentes órgãos durante o período fetal ainda permanecem

escassos, principalmente no que se refere ao conhecimento dos tipos celulares

envolvidos e às moléculas de endereçamento (homing) expressas pelas células

hematopoéticas (Boggs, 1999).

1.3.5 - Medula óssea

Após o período de expansão celular hepato-esplênico, muitas células

diferenciadas migram para a medula óssea que, encontra-se em fase final de

formação. Dos 16 aos 21 dpc, o desenvolvimento da medula óssea tem seu

início definido a partir da penetração de vasos sangüíneos oriundos do

pericôndrio e presentes na zona de cartilagem recém-calcificada, em especial,

na região central dos ossos longos (Moore, 2004). Com a chegada de vasos no

ambiente medular, as células hematopoéticas em diversos estádios de

diferenciação, vindas principalmente do fígado e as células-tronco

mesenquimais começam a ocupar os espaços gerados pela morte dos

condrócitos hipertrofiados imersos em uma matriz extracelular calcificada.

Concomitantemente, começam a diminuir os níveis hepáticos de transcritos de

CXCL-12, a principal quimiocina de atração e de retenção de precursores nos

ambientes propícios ao desenvolvimento (McGrath et al., 1999).

Em camundongo, a hematopoese medular, se inicia com a chegada de

neutrófilos no ambiente medular (Pelajo-Machado, 2001) e é seguida pelo

acúmulo de grande número de células blásticas basofílicas (Moore, 2004). Na

medula óssea de fetos humanos na 10ª semana de gestação, foi possível

identificar pela primeira vez o tecido hematopoético na clavícula e no úmero.

Este tecido é constituído por células das linhagens eritróide e mielóide,

localizado preferencialmente no tecido conjuntivo frouxo periarteriolar (Lenzi,

1980). Estudos com camundongos nocaute para CXCL-12 mostraram uma

diminuição do número de progenitores de linfócitos B no fígado fetal e na

medula óssea, além da redução do número de células mielóides na medula

óssea (Nagasawa et al., 1996). Ara e colaboradores (2003) observaram que a

migração de células mielóides do fígado fetal para medula óssea era afetada

pela ausência da quimiocina; porém, a geração/ amadurecimento de células da

linhagem mielóide não era afetada, pois as células mielóides eram encontradas

no fígado fetal e no sangue periférico. Na medula óssea de camundongos

nocaute para CXCR4 verifica-se um número reduzido de células

hematopoéticas e ausência de linfócitos B maduros, demonstrando a

paticipação deste receptor no comprometimento e/ou proliferação dos

precursores de linfócitos B (Zou et al., 1998). Ma e colaboradores (1999)

observaram que as células da linhagem B dos camundongos nocaute para

CXCR-4 conseguiam se desenvolver normalmente e eram observados no

sangue periférico, mas a migração dos linfócitos B para medula óssea

apresentava-se comprometida.

Até 1 ou 2 dias após o nascimento, os ossos recebem as células

hematopoéticas migrantes que durante toda a vida extra-embrionária, será o

principal sítio de geração de células hematopoéticas. A partir desse momento

até a vida adulta, a medula óssea passa a desempenhar a função de principal

órgão hematopoético em mamíferos (Lenzi, 1980; Pelajo-Machado, 2001;

Moore, 2004).

2.Objetivos

2.1 - Geral

O objetivo geral deste trabalho é descrever as características

dinâmicas do microambiente hepático, relatando os eventos favoráveis à

hematopoese local (

fase da habitação hematopoética

) em contraposição aos

eventos desfavoráveis (fase da desabitação hematopoética) no fígado fetal

murino, entre 12 dias pós-coito (dpc) e 0 (zero) dia pós parto (dpp) (período de

hematopoese).

2.2 - Específicos

 Descrever as etapas de migração dos tipos celulares hematopoéticos para

o fígado fetal (região da aorta-gônadas-mesonefros (AGM)  fígado fetal);

 Descrever os ambientes preferenciais de instalação/ proliferação das

células hematopoéticas;

 Mapear a expressão de fibronectina e de colágenos intersticiais presentes

nos ambientes preferenciais de instalação/ proliferação das células

hematopoéticas;

 Mapear os resíduos glicídicos expressos pelas células endoteliais

hepáticas, que possam participar na implantação e saída das células

hematopoéticas do fígado fetal, bem como a chegada destas células na

medula óssea.

3. Metodologia

Todos os procedimentos envolvendo o uso dos animais deste estudo

estão em conformidade com as normas de ética aplicáveis, tendo sido

submetidos ao Comitê Ética no Uso de Animais da Fundação Oswaldo Cruz

(CEUA-FIOCRUZ), sob o protocolo n° P-0250/05.

3.1 - Acasalamento

Foram utilizados 16 camundongos adultos de Swiss Webster, sendo 8

fêmeas e 8 machos, provenientes do Centro de Criação de Animais de

Laboratório (CECAL) da Fundação Oswaldo Cruz. Estes animais foram

acasalados, mantidos em caixas individuais contendo maravalha e receberam

alimentação e água ad libitum. No dia após o acasalamento, as fêmeas tiveram

seu tampão vaginal verificado pela manhã, tendo sido colocadas em caixas

individualizadas de forma que este dia fosse determinado como o dia 0 (zero)

pós-coito (dpc).

3.2 - Determinação da idade gestacional

A idade gestacional dos fetos foi determinada após verificação do

tampão vaginal, além de ter sido realizada uma datação baseada no atlas

histológico de Kaufman (1992) a partir da análise das lâminas obtidas dos

fetos. Tal confronto empírico-experimental se faz necessário uma vez que fetos

gerados na mesma mãe podem apresentar estágios de desenvolvimento

distintos (Kaufman, 1992).

3.3 - Determinação do período pós-parto

A determinação do período de desenvolvimento do camundongo

nascituro foi estabelecida após o parto normal das fêmeas grávidas. O dia do

nascimento dos camundongos foi estabelecido como dia 0 pós-parto.

3.4 - Processamento

Neste estudo 8 camundongos Swiss Webster fêmeas grávidas (12, 13,

14, 15, 16, 17, 18 dpc e 0 dpp) foram eutanasiadas por inalação de mistura

em câmara fechada, sendo uma fêmea grávida por ponto. Os cornos

uterinos foram dissecados e em seguida, os fetos com suas respectivas

placentas foram individualizados. A partir de 14 dpc, os fetos foram

decapitados e tiveram seu fígado dissecado e fixado em formalina de Millonig

modificada por Carson (Carson et al., 1973).

Os fetos e fígados fetais foram fixados em temperatura ambiente por 7

dias em formalina de Millonig modificada por Carson. Os fetos de 12 e 13 dpc

foram clivados transversalmente na altura abdominal de forma que os fígados

fossem individualizados. A seguir, o material foi processado utilizando-se

banhos crescentes de álcool etílico (70%, 95% e 100% - um banho de 1h cada,

dois banhos de álcool a 100% por 1:30 min cada; um banho de álcool a 100%

por 2:30 min - etapa de desidratação) e xilol (2 banhos de 2h cada - etapa de

diafanização), impregnados (1 banho de parafina por 2h e 30 min) e incluídos à

vácuo em 1 banho de parafina por 2h e 30 min para obtenção de cortes de 5µm

de espessura em lâminas silanizadas. Os cortes foram submetidos a diferentes

métodos histoquímicos como descritos a seguir, tendo sido analisados ao

microscópio de luz de campo claro, equipado com câmera digital Zeiss

AxioCam HRC para aquisição de imagens e posterior gravação em meio digital

e tratadas (correção de curva de cores, recorte/ aumento de áreas

selecionadas), quando necessário, com o auxílio do software AxioVision

(Zeiss) ou Adobe Photoshop 7.0

(Adobe).

3.4.1 - Técnicas de coloração para análise da estrutura morfológica

3.4.1.A - Técnica de coloração pela hematoxilina-eosina (HE)

Esta técnica tem por objetivo fornecer a visualização do aspecto

morfológico geral do órgão.

Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em uma série de

concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 90% e 70%) e lavados em

água destilada. Procedeu-se a coloração pela hematoxilina de Mayer por 20

minutos, seguida de lavagem em água corrente por 25 minutos.

Posteriormente, os cortes foram desidratados em álcool etílico a 70% por 3

minutos. A seguir, os cortes foram submetidos à coloração pela eosina-floxina

por 2 minutos. Após rápida lavagem álcool etílico 90%, os cortes foram

desidratados em 3 banhos de álcool etílico 100%, clarificados em xilol e

montados com lamínulas, usando-se Goma de Damar como meio de

montagem.

Através do emprego desta técnica de coloração, as estruturas basófilas,

como o núcleo, coram-se em azul e as estruturas acidófilas, como citoplasma,

coram-se em rosa.

3.4.1.B – Técnica de coloração pelo Giemsa de Lennert (Lennert, 1978)

Esta técnica tem por objetivo fornecer a visualização do aspecto

morfológico geral do órgão.

Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em uma série de

concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 90% e 70%) e lavados em

água destilada. Os cortes foram corados em solução de Giemsa a 20% por 1

hora. A seguir, os cortes foram diferenciadas em solução de ácido acético 1% e

desidratados em álcool etílico 95% e 3 banhos de álcool isopropílico 100%,

clarificados em xilol e montados com lamínulas, usando-se Goma de Damar

como meio de montagem.

Nesta técnica de coloração, as estruturas basófilas, como o núcleo,

coram-se em azul escuro e as estruturas acidófilas, como citoplasma, grânulos

basófilos e neutrofílicos coram-se em azul mais claro. As hemácias e os

grânulos eosinofílicos coram-se em rosa. Os grânulos de mastócitos coram-se

desde tonalidades arroxeadas a róseas.

3.4.1.C – Técnica pelo método Tricromático de Masson

Esta técnica tem por objetivo detectar a presença de colágeno.

Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em uma série de

concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 90% e 70%) e lavados em

água destilada.

Procedeu-se a coloração pela hematoxilina férrica de Weigert por 10

minutos, seguida de lavagem em água corrente por 10 minutos.

Posteriormente, os cortes foram corados por 5 minutos em solução de Biebrich

Escarlat-Fucsina ácida e lavados em água destilada por 20 minutos. A seguir,

os cortes foram imersos no ácido fosfotúngstico-fosfomolibdico 5% por 30

minutos e corados em azul de anilina por 30 minutos. Após lavagem em água

destilada, os cortes foram desidratados em álcool etílico (95% e 100%),

clarificados em xilol e montados com lamínulas usando-se goma de damar

como meio de montagem.

Nesta técnica de coloração, os núcleos coram-se em azul escuro, as

fibras colagênicas, em azul e o citoplasma em vermelho.

3.4.1.D – Técnica de coloração pelo Sirius Red pH=10,2 (Bogomeletz,

1980; Luque e Montes, 1989)

Esta técnica tem por objetivo visualizar eosinófilos teciduais.

Os cortes foram desparafinados em três banhos de xilol, hidratados em

uma série de concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 90% e 70%)

e lavados em água destilada. Procedeu-se a coloração pela hematoxilina de

Mayer por 3 minutos, lavando os cortes em seguida em água destilada por 5

minutos. A seguir, os cortes foram imersos em álcool 70% por 3 minutos, sendo

corados em seguida pela solução de Sirius Red pH=10,2 por 1 hora. Após

lavagem em água destilada por 3 minutos, os cortes foram desidratados em

álcool etílico (70%, 90% e 100%), clarificados em xilol e montados com

lamínulas usando-se goma de damar como meio de montagem.

Nesta técnica de coloração, os eosinófilos coram-se em vermelho e os

núcleos coram-se em azul.

3.4.1.E – Técnica pelo método de Perls (Perls, 1867)

Esta técnica tem por objetivo detectar pigmentos férricos.

Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em uma série de

concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 90% e 70%) e lavados em

água destilada. Os cortes foram imersos na solução de ferrocianeto de potássio

5% por 5 minutos, seguidos pela solução de ferrocianeto de potássio 3,5% por

20 minutos. Posteriormente, os cortes foram lavados em 2 banhos de água

destilada por 3 minutos cada. A seguir, os cortes foram corados pelo vermelho

rápido, lavados em água destilada desidratados em álcool etílico (70%, 90% e

100%), clarificados em xilol e montados com lamínulas usando-se Goma de

Damar como meio de montagem.

O pigmento férrico é evidenciado em azul, o núcleo cora-se em vermelho

e o citoplasma cora-se em rosa pálido.

3.4.1.F – Técnica de coloração da Reticulina de Gomori (Volnei e Siqueira,

1981)

Esta técnica tem por objetivo detectar a presença de fibras reticulares.

Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em uma série de

concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 90% e 70%) e lavados em

água destilada. Os cortes foram imersos em solução de permanganato de

potássio 1% durante 1 minuto, seguida de lavagem em água destilada por 2

minutos. A seguir, os cortes foram descorados pelo ácido oxálico 3% por 3

minutos e lavados em água corrente por 3 minutos. Em seguida, os cortes

permaneceram na solução de alúmen de ferro 2% por 1 minuto, seguida de

lavagem em água destilada por 2 minutos. Posteriormente, os cortes foram

imersos em solução de nitrato de prata amoniacal por 1 minuto, lavados em

água destilada por 5 minutos, imersos em formol 10% por 3 minutos, lavados

em solução de cloreto de ouro 1% por 3 minutos e lavados em água destilada

por 2 minutos. A seguir, os cortes foram imersos em solução de tiosssulfato de

sódio 5% por 2 minutos, lavados em água corrente por 2 minutos, desidratados

em álcool etílico (70%, 90% e 100%), clarificados em xilol e montados com

lamínulas usando-se Goma de Damar como meio de montagem.

Nesta técnica de coloração, as fibras reticulares são evidenciadas em

negro.

3.4.1.G – Técnica de coloração ácido periódico + reativo de Schiff (PAS) –

Alcian blue (AB) em pH=1,0 (PAS-AB pH=1,0)

Esta técnica tem por objetivo detectar a presença de glicoproteínas

neutras e proteoglicanos ácidos sulfatados.

Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em uma série de

concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 90% e 70%) e lavados em

água destilada. A seguir, os cortes foram imersos em solução de ácido

clorídrico 0,1N por 5 minutos, corados pelo Alcian blue pH=1,0 por 45 minutos

e lavados novamente na solução de ácido clorídrico 0,1 N por 5 minutos. Em

seguida, os cortes foram oxidados em ácido periódico a 1% por 15 minutos,

lavados em água destilada por 5 minutos e colocados no Reagente de Schiff

por 20 minutos. Em seguida, os cortes foram lavados em água corrente por 5

minutos e posteriormente em água destilada. Os cortes foram desidratados em

álcool etílico (70%, 90% e 100%), clarificados em xilol e montados com

lamínulas, usando-se Goma de Damar como meio de montagem.

Nesta técnica de coloração, as glicoproteínas neutras contendo hexose

e/ou ácido siálico são evidenciadas em magenta e os proteoglicanos

carboxilados em azul.

3.4.1.H – Técnica de coloração ácido periódico + reativo de Schiff (PAS) –

Alcian blue (AB) em pH=2,5

(

PAS-AB pH=2,5

)

Esta técnica tem por objetivo detectar a presença de glicoproteínas

neutras e proteoglicanos ácidos sulfatados (menor quantidade) e carboxilados

(maior quantidade).

Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em uma série de

concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 90% e 70%) e lavados em

água destilada. A seguir, os cortes foram imersos em solução de ácido acético

3% por 5 minutos, corados pelo AlcianBlue pH=2,5 por 45 minutos e lavados

novamente na solução de ácido acético 3% por 5 minutos. Em seguida, os

cortes foram oxidados em ácido periódico a 1% por 15 minutos, lavados em

água destilada por 5 minutos e colocados no Reagente de Schiff por 20

minutos. Em seguida, os cortes foram lavados em água corrente por 5 minutos

e posteriormente em água destilada. Após rápida lavagem em água destilada,

os cortes foram desidratados em álcool etílico (70%, 90% e 100%), clarificados

em xilol e montados com lamínulas, usando-se Goma de Damar como meio de

montagem.

Nesta técnica de coloração, as glicoproteínas neutras contendo hexose

e/ou ácido siálico são evidenciadas em magenta e os proteoglicanos em azul.

3.4.2 – Técnica de histoquímica para detecção de cloroacetato-esterase

Esta técnica tem por objetivo detectar a presença granulócitos.

A presença de cloroacetato-esterase em granulócitos foi detectada

utilizando-se o kit naftol AS-D cloroacetato esterase (Sigma-Aldrich

- Kit 91-C)

seguindo as especificações do fabricante.

Os cortes foram desparafinizados em banhos de xilol, hidratados em

banhos decrescentes de álcool (100%, 90% e 70%) e água destilada. A seguir

os cortes foram corados com a solução fornecida pelo kit, revelados com Fast-

Red, montados com lamínula em água destilada e analisadas em microscópio

confocal de varredura a laser LSM 510 META (Zeiss), empregando-se laser

Ar488 e filtro LP650nm e laser 405 e filtro LP420.

3.4.3 – Técnica de histoquímica para detecção de lectinas

Os cortes foram desparafinizados em banhos de xilol, hidratados em

banhos decrescentes de álcool e água destilada. A seguir, os cortes foram

submetidos à recuperação antigênica em forno de microondas doméstico

(Panasonic

), utilizando-se tampão citrato pH=6,0. O tampão foi previamente

aquecido em potência média durante 10 minutos até atingir 96°C. Em seguida,

os cortes foram imersos no tampão citrato e submetidos a 3 ciclos de

aquecimento de 4 minutos com intervalo de 2 ciclos de dois minutos em forno

de microondas. A seguir, os cortes foram lavados 3 vezes (3, 5 e 7 minutos) em

solução salina contendo tampão fosfato (PBS) e incubadas durante a noite

(overnight), à 4ºC, com as seguintes lectinas fluorescinadas: Glycine Max -

SBA, Lens culinaris - LCA, Ulex europeus - UEA, Arachis hypogeae - PNA,

Abrus precatorius - ABPR, Concanavalina A - ConA, Phaseolus vulgaris - PHA

e Bandeirae simplicifolia – GSI (tabela 1).

Tabela 1. Esquema da especificidade de cada lectina utilizada na marcação em fígados

fetais durante o desenvolvimento.

nome específico lectina especificidade

Arachis hypogaea peanut agglutinin (PNA)

beta-galactose (13) N

acetilgalactosamina

Abrus precatorius jequitiri bean (ABPR3) galactose

Lens culinaris lentil (LCA) alfa-D-manose

Canavalia

ensiformis

Concanavalina A (ConA

)

Jack bean tipo IV

alfa-manose

alfa-glicose

Glycine max soy bean (SBA) N acetilgalactosamina

Ulex europeus UEA I alfa-L-fucose

Bandeiraea

simplicifolia

Griffonia simplicifolia - BS I

(GSI)

alfa-galactose

alfa-N-acetilgalactosamina

Phaseolus vulgaris

red kidney bean

(PHA-L)

oligosacarídeo

No dia seguinte, os cortes foram lavados em tampão PBS (3, 5 e 7

minutos). A coloração com DAPI (5g/mL) durante 30 minutos foi utilizada para

evidência dos núcleos. A seguir, os cortes foram contra-corados com azul de

Evans (1:10.000) por 1 minuto, diferenciados em PBS e montados em glicerol

contendo parafenilenodiamina. As lâminas foram analisadas em microscópio

confocal de varredura a laser LSM 510 META (Zeiss), empregando-se laser

Ar488 e filtro BP505-550nm (AlexaFluor488), ou laser HeNe543 e filtro

LP560nm (azul de Evans) e laser 405 e filtro LP420 (DAPI).

3.4.4 – Técnica de imunofluorescência

Os cortes foram desparafinizados em banhos de xilol, hidratados em

banhos decrescentes de álcool e água destilada. A seguir, os cortes foram

submetidos à recuperação antigênica em forno de microondas doméstico

(Panasonic

), utilizando-se tampão citrato pH=6,0. O tampão foi previamente

aquecido em potência média durante 10 minutos até atingir 96°C. Em seguida,

os cortes foram imersos no tampão citrato e submetidas a 3 ciclos de

aquecimento de 4 minutos com intervalo de 2 ciclos de dois minutos em forno

de microondas. A seguir, os cortes foram lavados 3 vezes (3, 5 e 7 minutos) em

solução salina contendo tampão fosfato (PBS) e incubados durante a noite

(overnight), à 4ºC, com anticorpos primários diluídos em PBS contra moléculas

de matriz extracelular (fibronectina, MMP-1, MMP-9 e AFP). No dia seguinte, os

cortes foram lavados em PBS (3, 5 e 7 minutos) e incubados a 37ºC com

anticorpos secundários conjugados a AlexaFluor 488 durante 1 hora. Os cortes

foram novamente lavados em PBS (3, 5 e 7 minutos) e tiveram seus núcleos

corados com DAPI (5g/mL) durante 30 minutos. A seguir, os cortes foram

contra-corados com azul de Evans (1:10.000) por 1 minuto, diferenciados em

PBS e montados em glicerol contendo parafenilenodiamina.

As lâminas imunomarcadas foram analisadas em microscópio confocal

de varredura a laser LSM 510 META (Zeiss), empregando-se laser Ar488 e

filtro BP505-550nm (AlexaFluor488), ou laser HeNe543 e filtro LP560nm (azul

de Evans) e laser 405 e filtro LP420 (DAPI).

4. Resultados:

As lectinas ConA, SBA, UEA, GS-I e PHA-L não revelaram marcação

em nenhum dos estádios estudados: 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18 dpc e 0 dpp.

4.1 – 12 dpc:

Aos 12 dpc, o fígado fetal evidenciava tecido hematopoético com

presença maciça de células eritróides e vários megacarioblastos. A população

eritróide se distribuía uniformemente em grupos misturando-se com os

hepatócitos (Fig.1 e 2). As células em argolas eram raras e bastante imaturas

(mielócitos), sendo predominantemente encontradas na região subcapsular.

Material PAS positivo foi observado próximo ao mesotélio subcapsular e no

endotélio dos vasos intra-hepáticos. A coloração pelo PAS-AB pH=1,0 detectou

uma trama muito delicada, quase imperceptível, de proteoglicanos no endotélio

dos espaços-porta primitivos (Fig. 3). Grande quantidade de figuras mitóticas

(metáfase, anáfase e telófase) e escassas células em apoptose (núcleos

fragmentados) foram visualizadas (Fig. 1). As fibras reticulares estavam

presentes na região submesotelial da cápsula, mas eram raras no interior do

fígado, onde se observou raros filetes próximos a vasos. Na periferia de células

imaturas (com características da linhagem eritróide) notou-se a presença de

fibras reticulares (Fig. 4). A reação de Perls não foi detectada nas células

estromais, restringindo-se aos eritroblastos.

A expressão de fibronectina foi observada na parede de sinusóides e

de vênulas e ao redor de algumas células parenquimatosas e/ ou

hematopoéticas, exibindo um padrão puntiforme descontínuo. A região

capsular foi fracamente positiva (Fig. 45 e 46).

A marcação da lectina LCA, que se liga aos resíduos de -D-manose,

foi observada intensamente em megacariócitos e megacarioblastos, na região

subendotelial de vênulas e em arranjo pericelular fino e granular ao redor de

todas as células; porém não foi possível discriminar as linhagens celulares. As

hemácias nucleadas intracelulares não apresentavam reação à LCA (Fig. 47-

49).

A lectina ABPR3, que se liga aos resíduos de galactose, revelou reação

positiva ao redor de todas as células, exibindo um arranjo pericelular fino nas

regiões subvenular e submesotelial, na superfície de células mesoteliais e em

megacarioblastos (Fig. 50).

A lectina PNA, que possui afinidade para



-galactose (13) N

acetilgalactosamina revelou reação negativa em todo tecido.

A expressão de metaloproteinase-1 (MMP-1) ocorreu na periferia de

células provavelmente da linhagem eritróide, sendo um pouco mais intensa em

vênulas e em alguns tipos celulares imaturos, intravasculares e circulantes

(Fig.51).

A expressão de metaloproteinase-9 (MMP-9) foi observada mais

intensamente na parede de vasos e ao redor de alguns grupos de células

pequenas, provavelmente da linhagem eritróide. Na camada mesotelial a

expressão da MMP-9 era menos intensa (Fig. 52).

4.2 – 13 dpc:

A coloração pelo Giemsa e pela hematoxilina-eosina revelou a presença

de eritroblastos, megacarioblastos, megacariócitos e inúmeras células em

mitose (Fig. 5). No fígado ainda havia nítido predomínio de células eritróides

imaturas, porém com maior grau de diferenciação. As tramas vascular e

trabecular se mostravam mais definidas, com um aumento da população de

células hematopoéticas (Fig. 5 e 6). A reação ao método do PAS evidenciou

material PAS-positivo no tecido conjuntivo da parede de veias e na região da

cápsula (Fig. 7 e 8). Tanto no mesotélio capsular quanto no endotélio venular,

notou-se a presença linear de proteoglicanos AB positivos (pH=1,0) (Fig. 7 e 8).

Fibras reticulares foram detectadas na região submesotelial da cápsula

semelhante como observado aos 12 dpc. As células eritróides não foram

positivas aos métodos da reticulina de Gomori e do Pearls. Nos sinusóides

hemácias nucleadas foram visualizadas (Fig. 5 e 6).

A expressão de fibronectina mostrou um padrão puntiforme endotelial e

subendotelial mais intenso que o observado aos 12 dpc. Também foi possível

notar que a marcação ao redor de certos grupos celulares, provavelmente da

linhagem eritróide, foi menos intensa do que a marcação endotelial e

subendotelial. Detectou-se ainda uma marcação subcapsular linear muito

delgada (Fig. 53 e 54).

A reação a lectina LCA, que identifica os resíduos de -D-manose, foi

observada mais intensamente na região subendotelial de vênulas,

megacariócitos, megacarioblastos e nas células GM, formando um arranjo

pericelular fino em todas as células, mas sem definição de linhagens e

mantendo padrão semelhante ao observado aos 12 dpc. A cápsula e as

hemácias nucleadas intravasculares foram negativas à reação com LCA (Fig.

55 e 56).

A lectina ABPR3 que se liga aos resíduos de galactose mostrou uma

expressão delicada e difusa entre as células, delineando os sinusóides em

formação e definindo melhor o padrão trabecular hepatocitário. A camada

submesotelial também revelou reação à ABPR3 positiva; porém, a linhagem

megacariocítica mostrou uma fraca expressão (Fig. 57).

A expressão de MMP-1 foi observada no citoplasma de células

eritróides, mas a cápsula (mesotélio + camada submesotelial) não apresentou

reação (Fig. 58).

A MMP-9 exibiu expressão mais dispersa que aos 12 dpc, sendo

observada por todo o parênquima, em um padrão granular, assim como na

parede de vênulas. A MMP-9 não foi expressa na cápsula (Fig.59).

A lectina PNA em todo o fígado nesta fase de desenvolvimento não foi

detectada.

4.3 – 14 dpc

O fígado fetal aos 14 dpc continuava ser intensamente eritróide, com

aumento de células maduras e predomínio de hemácias anucleadas nos vasos

sangüíneos (Fig. 9 e 10). Os megacariócitos mostravam também maior

diferenciação e a reação ao PAS–AB era fraca, mas mais fraca no pH=2,5,

quando comparada ao pH=1,0. Vênulas intra-hepáticas ainda eram positivas ao

PAS; contudo, células subendoteliais descontínuas e ricas em finos grânulos

eram PAS positivos (Fig. 11). A superfície do endotélio venular e do mesotélio

revelaram reação positiva ao AB pH=1,0 de forma linear (Fig. 12). Abaixo da

camada de proteoglicanos do mesotélio, notou-se fraca reação ao PAS (Fig.

12). O método da reticulina de Gomori, assim como a reação de Perls não

foram identificados.

A expressão de fibronectina foi restrita à parede de vasos, incluindo

sinusóides, sendo mais acentuada nas veias portais (Fig. 60-62), onde, às

vezes, se organizava em camadas concêntricas.

A expressão da LCA (resíduo de



-D-manose) foi detectada no

citoplasma de megacariócitos, no tecido conjuntivo subendotelial, na região da

cápsula hepática e nos sinusóides, com acentuada diminuição da expressão

nos demais sítios (Fig. 63 e 64).

A lectina ABPR3 (resíduo de galactose) revelou reação na camada

submesotelial e na parede dos ramos portais, além de mostrar uma fraca

marcação pericelular por todo o parênquima (Fig. 65 e 66).

A histoquímica para esterases de granulócitos neutrofílicos (naftol

cloroacetato esterase) mostrou a presença de alguns granulócitos na região

próxima à cápsula e dispersos no parênquima (Fig. 67 e 68).

A lectina PNA, a MMP-1 e a MMP-9 não revelaram reação tecidual.

4.4 – 15 dpc

Aos 15 dpc, o fígado continuava com intensa produção eritróide,

notando-se também aumento da linhagem megacariocítica (Fig. 14 e 15).

Neste ponto, destacava-se o aparecimento de hepatócitos PAS-positivos, ainda

distantes um do outro ou exibindo o início de formação de trabéculas (Fig. 16).

Nos sinusóides, verificou-se diminuição significativa de hemácias nucleadas.

As ilhotas de neutrófilos imaturos eram escassas e se localizavam na região

subcapsular. Os primeiros eosinófilos apareceram, principalmente próximos a

grandes ramos da veia porta. Algumas células em mitose ainda eram

observadas. As vênulas continuavam mostrando um cordão linear e

descontínuo de material PAS-positivo, com desaparecimento das células com

grânulos glicoprotéicos de distribuição subendotelial (Fig. 17). O método da

reticulina de Gomori e o método de Pearls não apresentaram reação (Fig. 18).

A marcação com fibronectina era intensa e exibia um padrão granular

formando lâminas concêntricas na parede de vênulas, no conjuntivo

submesotelial da cápsula e na parede dos sinusóides, delimitando trabéculas

hepáticas ricas em eritropoese (Fig. 69 e 70).

A marcação pela lectina LCA (resíduo de -D-manose) foi intensa em

todo citoplasma de megacariócitos, na parede de veias portais e de sinusóides,

no mesotélio e no tecido submesotelial da cápsula hepática e ao redor de todas

as células hepáticas/ hematopoéticas. A reação da LCA nas vênulas foi mais

intensa na parede vascular do que no endotélio (Fig. 71-73).

A lectina ABPR3 (resíduo de galactose) exibiu reação nos sinusóides,

nos megacariócitos, e por toda a região pericelular do parênquima, sendo um

pouco mais intensa em células da linhagem eritróide (Fig. 74 e 75).

A marcação com PNA (resíduo de -galactose (13) N

acetilgalactosamina), foi evidenciada na camada mesotelial e submesotelial, ao

redor de algumas células e em sinusóides (Fig.76).

As metaloproteinases MMP-1 e MMP-9 não foram expressas.

4.5 – 16 dpc

Aos 16 dpc, as linhagens eritróide e megacariocítica continuavam

intensas, porém a eritróide tendia à diferenciação, caracterizada pelo grande

número de normoblastos (Fig. 19-22). Focos de neutropoese foram

visualizados com número menor de eosinófilos em quase toda a extensão da

região subcapsular e na parede (estroma) de ramos maiores ou principais da

veia porta (Fig. 20).

Os hepatócitos foram mais facilmente visualizados em todas as

colorações, se apresentando mais maduros. Os hepatócitos eram PAS-

positivos e exibiam fraca expressão da alfa-fetoproteína, denotando síntese de

glicogênio (Fig. 23 e 24). Foram observadas isoladamente duas células

esféricas com citoplasma basofílico e metacromático ao Giemsa (precursores

de mastócitos?). Os eosinófilos foram visualizados esparsos no interior do

parênquima hepático, mas sempre com aspecto maduro, não tendo sido

evidenciada a eosinopoese. Algumas células grandes com núcleo em argola

pareciam corresponder a células GM. Um foco subcapsular de monocitopoese

também foi evidenciado. Colágeno intersticial e fibras reticulares ainda eram

ausentes, mesmo na parede da veia porta (Fig. 22), que continha colágeno

evidenciado pelo método tricromático de Masson (Fig. 25). Células esparsas

contendo pigmento férrico foram visualizadas. O mesotélio era AB (pH=1,0)

positivo e houve uma redução do material PAS-positivo na parede das vênulas

com intensificação nos hepatócitos (Fig. 23).

A expressão de fibronectina no fígado fetal estava diminuída na parede

de vênulas, no conjuntivo submesotelial da cápsula e no interstício de todo o

parênquima exibindo um padrão granular na parede de sinusóides (Fig. 77).

Neste estádio também foram observadas algumas células de aspecto

neutrofílico expressando MMP-1. A MMP-9 não foi detectada.

No fígado fetal, a marcação pela lectina LCA foi identificada na região

vascular, sendo mais intensa na camada subendotelial. A reação também foi

evidenciada em células circulantes, provavelmente neutrófilos, bem como

megacariócitos e agregados de células mesoteliais aderidas à cápsula. O

mesotélio e o tecido conjuntivo submesotelial foram intensamente marcados,

enquanto que o arranjo pericelular apresentou marcação linear menos intensa,

principalmente no centro de agregados eritróides. O endotélio não revelou a

reação (Fig. 78-80).

A lectina ABPR3 (resíduo de galactose) foi expressa na parede de

vênulas, em sinusóides, principalmente os centro-lobulares, nas camadas

submesotelial e sub capsular e em células em torno de ramos principais da

veia porta. A marcação celular era difusa, sendo mais intensa em células

pequenas, provavelmente da linhagem eritróide (Fig. 81-83). Os megacariócitos

exibiam marcação granular no citoplasma (Fig. 83).

A lectina PNA (resíduo de -galactose (13) N-acetilgalactosamina)

revelou reação seletiva às células da linhagem mielóide presentes no fígado,

em especial os neutrófilos. Estas células foram encontradas na sua grande

maioria próximas a vasos (Fig. 84-86).

A expressão da MMP-1 também foi intensa no citoplasma de neutrófilos

(Fig. 87 e 88). Contudo, a cloroacetato esterase possibilitou a fácil

visualização da localização preferencial subcpasular dos focos de neutropoese

(Fig. 89).

4.6 – 17 dpc

Aos 17 dpc observou-se amadurecimento significativo da linhagem

eritróide, com predomínio de normoblastos tardios (eritroblástos picnóticos) e

de normoblastos intermediários (eritroblastos policomatófilos). Os normoblastos

se distribuíam homogeneamente por todo o fígado, formando áreas densas em

torno de vênulas portais. Notou-se também expressiva redução de células da

linhagem megacariocítica. Porém, a densidade relativa das células eritróides

em relação aos hepatócitos era menor quando comparada com os fígados dos

estádios anteriores (12, 13, 14, 15 e 16 dpc) e as hemácias intravasculares se

apresentavam anucleadas (Fig.26-28). Também foi observado foco

monocitóide com células imaturas imunoblastóides na perifieria de grandes

ramos da veia porta (Fig. 29). As trabéculas hepatocitárias tornaram-se mais

nítidas e os hepatócitos exibiam citoplasma vacuolizado com conteúdo

fortemente PAS-positivo. Algumas células de Kuppfer continham pigmento

férrico (Fig. 30).

A imuno-marcação para fibronectina evidenciou uma trama intensa de

padrão granular na parede de vênulas, no tecido conjuntivo submesotelial da

cápsula e na parede dos sinusóides (Fig. 90-91).

A marcação com a lectina LCA evidenciou uma marcação subendotelial

na parede vascular, com perda significativa do arranjo pericelular linear, além

da evidenciação da linhagem neutrofílica justa-venular e em toda a camada

subcapsular. A reação também foi detectada nos megacariócitos e na cápsula

(Fig. 92-95).

A galactose evidenciada pela lectina ABPR3 continuou a ser expressa

nos vasos centro-lobulares e nos neutrófilos hepáticos. Células mielóides em

aglomeração, como neutrófilos e eosinófilos, também mostraram reação

positiva a lectina, asssim como células em geral, independentemente do tipo

celular (Fig. 96 e 97).

A lectina PNA foi observada exclusivamente nos neutrófilos maduros,

tanto no fígado fetal, quanto na medula óssea recém formada. No fígado fetal a

reação foi identificada por todo o parênquima e em especial na região

subcapsular e na região justa-endotelial (Fig. 98). Os neutrófilos também foram

visualizados pela marcação da naftol cloroacetato esterase (Fig. 99).

A expressão de MMP1 era bastante intensa nos neutrófilos, que

eventualmente se apresentavam ao redor dos vasos.

4.7 – 18 dpc

As linhagens eritróide e megacariocítica mostraram um padrão bastante

semelhante aos 17 dpc, onde foi observado uma maior rarefação do

componente hematopoético. Porém, ocorreu um aumento das linhagens

neutrofílica e eosinofílica, que eram mais freqüentes e ocorriam em grandes

espaços na região subcapsular. Estas células foram visualizadas em espaços

porta menores, onde a presença de colágenos foi evidente, mas escasso.

Células mielóides (neutrófilos e eosinófilos) também são esparsas no

parênquima (Fig. 31-33). Os hepatócitos tornaram-se mais evidentes, contendo

mais glicogênio (Fig. 34). Pigmento férrico não foi identificado pelo Perls. Fibras

reticulares foram evidentes na cápsula, nos grandes espaços porta; porém

fibras reticulares isoladas foram eventualmente visualizadas no parênquima

(Fig. 35 e 36). O mesotélio capsular era AB positivo ao pH=1,0.

A expressão de fibronectina revelou uma trama um pouco menos

intensa de padrão granular na parede de vênulas, no tecido conjuntivo

submesotelial da cápsula e na parede dos sinusóides (Fig. 100 e 101).

No fígado fetal, a marcação pela LCA foi visualizada nos

megacariócitos, na camada subdendotelial dos grandes vasos portais, nos

neutrófilos justa-endoteliais e no mesotélio. Notou-se perda significativa do

arranjo pericelular linear na maioria das células, restando apenas alguns

agregados ou filas de células eritróides positivas a LCA (Fig. 102 e 103).

A ligação da lectina ABPR3 aos resíduos de galactose foi intensa nos

grandes ramos portais e nos sinusóides, sendo também observada nos

megacariócitos, na camada mesotelial e ao redor das outras células

parenquimáticas (Fig. 104 e 105).

A lectina PNA revelou uma marcação tênue em veias e em sinusóides

(Fig. 106 e 107).

Neste estádio, a MMP-1 ainda é observada nos neutrófilos maduros

(Figs. 108 e109).

4.8 – 0 dpp

A linhagem eritróide se organizava em pequenos focos dispersos por

todo o fígado. Nestes focos existem eritroblastos basófilos, normoblastos

intermediários, normoblastos tardios e, às vezes, fragmentos puntiformes de

núcleos (apoptose) (Fig. 37). A linhagem megacariocítica mostrou um aumento

em relação aos 18 dpc, caracterizada pela presença de megacarioblastos e de

maior número de células (Fig. 38). As células mielóides, principalmente as

células da linhagem neutrofílica, continuaram em progressão crescente,

exibindo focos, principalmente nos grandes espaços porta e na região

subcapsular (Fig. 40). Os eosinófilos foram visualizados em menor número

(Fig. 39), enquanto que as células imunoblastóides (imaturas não

caracterizadas) eram esparças por todo o parênquima. Os mastócitos eram

raros e dispersos pelo parênquima ou nos espaços porta, e focos isolados de

monócitos foram identificados, sendo um destes focos subcapsular (Fig. 38).

As fibras reticulares apresentaram um aumento significativo e formavam uma

trama bem exuberante por todo o parênquima hepático, com maior densidade

nas regiões portal e capsular (Fig. 42-44). Pequenos agregados contendo Fe

+++

foram identificados em todo o parênquima. Os hepatócitos exibiam esteatose

microgoticular difusa e generalizada com material glicoprotéico PAS positivo

circundando os vacúolos lipídicos (Fig. 37-41). Não houve aumento significativo

de colágeno no tecido conjuntivo de vênulas intra-hepáticas e nos espaços

porta.

A expressão de fibronectina continuava mais ou menos constante,

quando comparada com os estádios anteriores, exibindo padrão granular na

parede de vênulas, no tecido conjuntivo submesotelial da cápsula e na parede

dos sinusóides (Fig. 110 e 111).

A marcação com LCA foi mais intensa nos megacariócitos, sendo ainda

bastante proeminente nas paredes venulares e sinusoidais, em agregados da

linhagem eritróide e em neutrófilos maduros. Na cápsula não foi visualizada a

reação (Fig. 112 e 113).

As lectinas

PNA

ABPR3

não revelaram reação. A

MMP-1

marcou

exclusivamente os neutrófilos (Fig. 114).

A tabela 2 resume o resultado das principais marcações realizadas no

desenvolvimento do fígado fetal murino. A tabela 3 analisa a variação semi-

quantitativa dos principais tipos celulares hematopoéticos e a tabela 4 analisa a

variação semi-quantitativa da expressão seqüencial de diferentes componentes

da MEC e a maturidade hepatocitária no desenvolvimento do fígado fetal

murino entre 12 dpc e 0 dpp.

Tabela 2. Sumário dos resultados obtidos com vários marcadores em fígado fetal murino

em diferentes idades gestacionais e logo após o parto (dpp).

Tempo

desenvolvimento

Fibronectina

Lens

culinaris

Abrus

precatorius

Arachis

hypogaea

MMP-1 MMP-9

12 dpc

+ (granular)

++ (celular/

vascular)

+++ (celular)

+++ (vascular)

Negativo

+ (eritróide) +

(endotélio)

+ (eritróide)

+++(endotélio

)

13 dpc

+/++ (linear)

+++ (celular/

vascular)

+ (celular)

+++ (vascular)

Negativo

+ (eritróide)

+++(endotélio)

+++ (eritróide)

+(endotélio)

14 dpc

+/++ (trabecular) + (vascular)

+/++ (celular)

++ (vascular)

Negativo Negativo Negativo

15 dpc

++ (trabecular)

+++ (celular/

vascular)

+++ (eritróide)

++/+++ (vascular)

+ (celular)

+ (vascular)

Negativo Negativo

16 dpc

++ (trabecular) ++ (vascular)

++ (eritróide)

++/+++ (vascular)

Neutrófilos

(vascular

negativo)

Neutrófilos Negativo

17 dpc

+++ (trabecular/

vascular)

++ (vascular/

neutrófilos)

++++ (mielóide)

++ (vascular)

Neutrófilos Neutrófilos Negativo

18 dpc

+++ (trabecular/

vascular)

++ (vascular/

neutrófilos/

megacariócitos)

+ (celular)

++++ (vascular)

+ (vascular) Neutrófilos Negativo

0 dpp

+++ (trabecular/

vascular)

++ (vascular) Negativo Negativo Neutrófilos Negativo

Tabela 3 - Variação semi-quantitativa de diferentes linhagens hematopoéticas no fígado

fetal murino.

Tempo de

desenvolvimento

eritróide megacariócito mielóide

12 dpc

++++ ++++ +

13 dpc

++++ ++++ +

14 dpc

++++ ++++ ++

15 dpc

+++ +++ +++

16 dpc

+++ +++ ++++

17 dpc

+++ ++ ++++

18 dpc

++ ++ ++

0 dpp

+ + +

Tabela 4 - Expressão seqüencial de diferentes componentes da MEC e da maturidade

hepatocitária no fígado fetal murino.

Tempo de

desenvolvimento

colágeno

Fibras

reticulares

AB pH=1,0 PAS

12 dpc

+ ++ + +

13 dpc

+ ++ + ++

14 dpc

+ - + ++

15 dpc

+ - + +++

16 dpc

+ - + ++++

17 dpc

+ - + ++++

18 dpc

+ + + ++++

0 dpp

+ +++ + +++

Para uma análise temporal de cada uma das moléculas estudadas,

sugerimos a observação das lâminas a seguir:

Fibronectina

dpc/ dpp 12 13 14 15 16 17 18 0

Figuras 45, 46 53, 54 60, 62 69, 70 77 90, 91 100,101 110,111

Lens culinaris (LCA)

dpc/ dpp 12 13 14 15 16 17 18 0

Figuras 47-49 55, 56 63, 64 71-73 78-80 92-95 102,103 112,113

Abrus precatorius (ABPR3)

dpc/ dpp 12 13 14 15 16 17 18 0

Figuras 50 57 65, 66 74, 75 81-83 96-97 104,105 ____

Arachis hypogaea (PNA)

dpc/ dpp 12 13 14 15 16 17 18 0

Figuras ____ ____ ____ 76 84-86 98 106,107 ____

MMP-1

dpc/ dpp 12 13 14 15 16 17 18 0

Figuras 51 58 ____ ____ 87 ____ 108,109 114

MMP-9

dpc/ dpp 12 13 14 15 16 17 18 0

Figuras 52 59 ____ ____ ____ ____ ____ ____

Fig. 1 - 4 - fígado fetal aos 12 dpc.

1 e 2) Presença de células das linhagens eritrocítica (), por vezes nucleada,

no interior de vasos e megacariocítica (). Figuras mitóticas () também são

observadas. Coloração: 1 - Sirius Red pH=10,2 e 2 - Giemsa de Lennert.

3) Fina camada contendo proteoglicanos de baixa sulfatação ao redor de

células () e de polissacarídeos PAS-positivos na região da cápsula ().

Corloração: Reação do PAS-AB pH=1,0 (PAS-AB pH=1,0).

4) Grande quantidade de fibras reticulares () na região da cápsula e poucas

tramas de fibras no parênquima hepático. Método: Reticulina de Gomori.

Fig 5 - 8 – fígado fetal aos 13 dpc.

5 e 6) Nichos de proliferação eritróide com a presença de eritroblastos,

normoblastos intermediários e tardios (). Eritrócitos nucleados provenientes

do saco vitelínico ainda são observados no interior de vasos. Presença de

megacariócitos () e mieloblastos (). Ainda são observadas algumas figuras

mitóticas (). Colorações: 5 - Hematoxilina e Eosina (HE) e 6 - Giemsa de

Lennert.

7 e 8) Presença de fina camada de proteoglicanos de baixa sulfatação ao redor

de células e no endotélio (). Polissacarídeos PAS-positivos foram observados

na região da cápsula e ao redor de vasos porta; os polissacarídeos PAS-

positivos distribuem-se em um padrão puntiforme (). Método: PAS-AB

pH=1,0.

Fig. 9 - 13 – fígado fetal aos 14 dpc.

9 e 10) Presença massiva de eritroblastos, normoblastos intermediários e

tardios e eritrócitos com e sem núcleo. megacarioblastos () e monócitos ( )

também são observados. Colorações: 9 - HE e 10 - Giemsa de Lennert.

11 e 12) Fina camada de proteoglicanos de baixa sulfatação ao redor de

células e no endotélio (). Polissacarídeos PAS-positivos na região da

cápsula, ao redor de alguns vasos porta e em alguns hepatócitos (). Método:

PAS-AB pH=1,0.

13) Ausência de fibras reticulares na região capsular. Método: Reticulina de

Gomori.

Fig. 14 - 16 – fígado fetal aos 15 dpc.

14 e 15) Intensa proliferação eritróide e megacariocítica. Na fig. 15 notar

células da linhagem mielóide () em áreas subcapsulares. Coloração: HE.

16) Material PAS-positivo com padrão granular () nos hepatócitos próximos

aos sinusóides e em certas áreas do parênquima. A presença de

proteoglicanos de baixa sulfatação ainda é observada ao redor das células

hematopoéticas e no endotélio (). Método: PAS-AB pH=1,0.

Fig. 17 e 18 - Fígado fetal aos 15 dpc.

17) Polissacarídeos PAS-positivos com padrão granular () nas células

endoteliais de vasos na região porta. Método: PAS-AB pH=1,0.

18) Intensa presença de eritroblastos () e megacariócitos (). Ausência de

fibras reticulares na cápsula e no parênquima hepático. Método: Reticulina de

Gomori.

Fig. 19 - 24 – fígado fetal aos 16 dpc.

19, 21 e 22) Intensa proliferação eritróide, aumento da proliferação da linhagem

megacariocítica () e presença de células mielóides (*). Coloração: 19 - HE;

21 e 22 – Tricromática de Masson.

20) Aparecimento de eosinófilos maduros (corados em vermelho) associados

às áreas perivasculares e a focos mielóides. Coloração: Sirius Red pH=10,2.

23) Amadurecimento dos hepatócitos em todo o parênquima e na região

subcapsular, exibindo material citoplasmático fortemente positivo ao PAS.

Coloração: PAS-AB pH=1,0

24) Fraca expressão de alfa fetoproteína (AFP) (em verde). Método: imuno-

fluorescência anti-AFP revelado com AlexaFluor488

Fig. 25 – fígado fetal aos 16 dpc.

25) Ausência de fibras reticulares. Método: Reticulina de Gomori.

Fig. 26 – 30 – fígado fetal aos 17 dpc.

26 – 29) Redução do componente hematopoético; presença de células

imunoblastóides (), foco monocitóide () justa-venular e foco linfocitário ().

Coloração: Giemsa de Lennert.

30) Áreas de pigmento férrico intracelular (). Método: Perls.

Fig. 31 e 32 – fígado fetal aos 18 dpc.

31) Extensa proliferação mielóide associada às áreas perivasculares.

Proliferação eritróide ainda presente. Método: Giemsa de Lennert.

32) Eosinófilos associados a eritroblastos tardios em áreas próximas a vasos.

Coloração: Sirius Red pH=10,2.

Fig. 33 - 36 – fígado fetal aos 18 dpc.

33) Presença tênue de colágeno (em azul claro) em áreas capsular e

subcapsular e no citoplasma de megacarioblastos. Método: Tricromática de

Masson.

34) Hepatócitos maduros exibindo material citoplasmático PAS-positivo.

Método: PAS-AB pH=1,0.

35 e 36) Reaparecimento de fibras reticulares () nas áreas capsulares (C).

Método: Reticulina de Gomori.

Fig. 37 e 38 – fígado de 0 dpp.

37) Diminuição expressiva da linhagem eritróide () com permanência de

poucos nichos de proliferação. Presença de células mielóides () na área

capsular. Hepatócitos bastante vacuolizados (). Coloração: HE.

38) Área focal de proliferação monocítica (



) na região capsular. Coloração:

Sirius Red pH=10,2.

Fig. 39 - 44 – fígado aos 0 dpp.

39) Presença de eosinófilos e de algumas células em mitose. Colorção: Sirius

Red pH=10,2.

40) Foco de proliferação mielóide () perivascular. Método: Tricromática de

Masson.

41) Glicoproteínas PAS-positivas ao redor dos hepatócitos, alguns dos quais

exibem expressão mais acentuada. A marcação pelo PAS delimita as

vacuolizações hepatocitárias. Método: PAS-AB pH=1,0.

42 - 44) Trama reticular distribuída por todo o fígado, mais freqüente quando

comparada com o fígado fetal de 18 dpc. Método: Reticulina de Gomori.

Fig. 45 - 50 – fígado fetal aos 12 dpc.

45 e 46) Expressão de fibronectina (em verde) em padrão puntiforme

descontínuo ao redor dos sinusóides e de algumas células parenquimatosas e/

ou hematopoéticas. A região capsular mostra fraca positividade. Método:

Imunomarcação.

47 e 48) Marcação por LCA no parênquima hepático ao redor de todas as

células, em células megacariocíticas () e em vênulas. Método: Histoquímica

para lectinas.

49) LCA expresso no mesotélio capsular. Método:Histoquímica para lectinas.

50) Marcação por ABPR3 exibindo arranjo pericelular fino nas regiões

subvenular e submesotelial, na superfície de células mesoteliais e no

citoplasma de megacarioblastos (). Método: Histoquímica para lectinas.

Fig. 51 e 52 – figado fetal aos 12 dpc.

51) Expressão mais intensa de metaloproteinase-1 (MMP-1) no endotélio de

vênulas (



) e em células intravasculares (). No parênquima, a expressão é

evidente na periferia de agregados celulares, provavelmente da linhagem

eritróide (). Método: Imuno-marcação.

52) Expressão de metaloproteinase-9 (MMP-9) nos agregados eritróides do

parênquima e na camada mesotelial (menor intensidade). Método: Imuno-

marcação.

Fig. 53 - 56 – fígado fetal aos 13 dpc.

53 e 54) Expressão de fibronectina em agregados eritróides (), nas regiões

capsular (C), endotelial e subendotelial. Método: Imuno-marcação.

55 e 56) Marcação por LCA no citoplasma de células da linhagem

megacariocítica () (megacariócito e megacarioblasto). Positividade

pericelular em todas as células e na região subendotelial dos vasos e vênulas.

Método:Histoquímica para lectinas.

Fig. 57 - 59 – fígado fetal aos 13 dpc.

57) Marcação por ABPR3 delineando os sinusóides hepáticos em formação.

Método: Histoquímica para lectinas.

58) Expressão de MMP-1 em células eritróides presentes no parênquima

hepático e no interior de vênulas (células circulantes). Método: Imuno-

marcação.

59) Expressão granular de MMP-9 em células dispersas por todo o

parênquima. Método: Imuno-marcação.

Fig. 60 - 62 – fígado fetal aos 14 dpc.

60 - 62) Expressão de fibronectina (em verde) ao redor de grupo de células que

provavelmente são da linhagem eritróide e em áreas subcapsular, endotelial e

subendotelial. Método: Imuno-marcação.

Fig. 63 - 68 - Fígado fetal aos 14 dpc.

63 e 64) Marcação por LCA em citoplasma de megacariócitos (), no

conjuntivo subendotelial, em extensões filamentosas periportais sinusoidais e

na região da cápsula hepática. Método: Histoquímica para lectinas.

65 e 66) Marcação por ABPR3 na parede dos ramos portais. Fraca marcação

no parênquima. Método: Histoquímica para lectinas.

67 e 68) Presença da enzima cloroacetato-esterase em células mielóides (em

vermelho) localizadas no parênquima e na região subcapsular. Método:

Histoquímica para cloroacetato esterase.

Fig. 69 - 74 – fígado fetal aos 15 dpc.

69 e 70) Expressão de fibronectina no tecido conjuntivo submesotelial da

cápsula, na parede de vênulas e sinusóides. Método: Imuno-marcação.

71 - 73) Marcação por LCA na cápsula hepática (mesotélio e tecido

submesotelial), no citoplasma de megacariócitos (), na parede de veias

portais, nos sinusóides e ao redor de todas as células hepáticas/

hematopoéticas. Método: Histoquímica para lectinas.

74) Marcação por ABPR3 em células da linhagem megacariocítica (

megacariócitos e megacarioblastos), em todas as células parenquimais, sendo

um pouco mais intensa nos grupos de eritrócitos (). Observa-se ainda

marcação delineando vasos e sinusóides. Método: Histoquímica para lectinas.

Fig. 75 e 76 – fígado fetal aos 15 dpc.

75) Marcação por ABPR3 em células da linhagem megacariocítica (

megacariócitos e megacarioblastos), em todas as células parenquimais, sendo

um pouco mais intensa em grupos de eritrócitos (). Observa-se ainda a

marcação delineando vasos e sinusóides. Método: Histoquímica para lectinas.

76) Marcação por PNA delineando os sinusóides, em todas as células

parenquimais e na camada mesotelial e submesotelial (cápsula = C). Método:

Histoquímica para lectinas.

Fig. 77 - 80 – fígado fetal aos 16 dpc.

77) Expressão de fibronectina com um padrão granular em parede de vênulas

e no interstício de todo o parênquima. Método: Imuno-marcação.

78 - 80) Marcação por LCA em megacariócitos (), na cápsula hepática (C) e

na camada subendotelial. Agregados eritróides () possuem menor expressão

glicídica quando comparardo com o estádio 14 dpc. Positividade (em verde)

nos neutrófilos perivasculares () (Fig. 80) e circulantes aderidos a vaso justa-

hepático (Fig. 78). Método: Histoquímica para lectinas.

Fig. 81 - 86 – fígado fetal aos 16 dpc.

81 - 83) Marcação por ABPR3 no sinusóide centro-lobular, em torno de ramos

principais da veia porta e em células periportais, das quais algumas são da

linhagem mielóide (



). Ocasionalmente essa marcação se mostrava difusa,

sendo mais intensa em pequenas células, da linhagem eritróide () e em

megacariócitos (). Método: Histoquímica para lectinas.

84, 85 e 86) Marcação com PNA evidenciando células da linhagem mielóide,

majoritariamente perivascular (verde). Método: Histoquímica para lectinas.

Fig. 87 - 89 – fígado fetal aos 16 dpc.

87 e 88) MMP-1 expressa no citoplasma de neutrófilos e eventualmente em

regiões justa-venulares. Método: Imuno-marcação.

89) Granulócitos submesoteliais (em vermelho) expressando cloroacetato-

esterase. Método: Histoquímica para cloroacetato esterase.

Fig. 90 - 92 – fígado fetal aos 17 dpc.

90 e 91) Expressão de fibronectina (em verde) na parede de vênulas, no

conjuntivo submesotelial da cápsula, na parede dos sinusóides e nas células

pequenas (eritróides) perivasculares. Método:Imuno-marcação.

92) Marcação por LCA no mesotélio, no tecido conjuntivo submesotelial e nos

neutrófilos subcapsulares () Método: Histoquímica para lectinas.

Fig. 93 – 98 – fígado fetal aos 17 dpc.

93 - 95) Marcação por LCA na região subendotelial, nos megacariócitos () e

nos neutrófilos peri e justa-venulares. Método: Histoquímica para lectinas.

96 e 97) Marcação por ABPR3 nos vasos centro-lobulares, em células

mielóides e agregados eritróides eventualmente no interior de vênulas. Método:

Histoquímica para lectinas.

98) Marcação por PNA em neutrófilos justavenulares e subcapsulares. Método:

Histqouímica para lectinas.

Fig. 99 – fígado fetal aos 17 dpc.

99) Histoquímica para cloroacetato-esterase evidenciando granulócitos

(vermelho). Método: Histoquímica.

Fig. 100 - 104 – fígado aos 18 dpc.

100 e 101) Expressão de fibronectina nos sinusóides, no tecido conjuntivo

submesotelial, no mesotélio, no endotélio e no subendotélio. Método: Imuno-

marcação.

102 e 103) Marcação por LCA nos megacariócitos (), nos neutrófilos justa-

endoteliais, no mesotélio, alguns agregados de células eritróides () e na

camada subdendotelial dos grandes ramos portais. Método: Histoquímica para

lectinas.

104) Marcação por ABPR3 no mesotélio da cápsula (C) e nos sinusóides.

Método: Histoquímica para lectinas.

Fig. 105 - 109 – fígado fetal aos 18 dpc.

105) Marcação sinusoidal por ABPR3. Método: Histoquímica para lectinas.

106 e 107) Tênue marcação por PNA nos vasos e nos sinusóides. Método:

Histoquímica para lectinas.

108 e 109) Expressão de MMP-1 nos neutrófilos localizados no tecido

conjuntivo peri-venular (Fig. 108) e ocasionalmente distribuídos pelo

parênquima (Fig. 109). Método: Imuno-marcação

Fig. 110 – fígado aos 0 dpp.

110) Expressão de fibronectina em conjuntos de células hematopoéticas e na

parede de vênulas e nos sinusóides. Método: Imuno-marcação.

Fig. 111 - 114 – fígado ao 0 dpp.

111) Expressão de fibronectina na parede de vênulas, no tecido conjuntivo

submesotelial da cápsula e em conjunto de células hematopoéticas. Notam-se

ainda vacuolizações hepatocitárias (). Método:Imuno-marcação.

112 e 113) Marcação por LCA nas paredes sinusoidais, nos megacariócitos,

nos agregados da linhagem eritróide e nos neutrófilos maduros circulantes no

interior de sinusóides (). Método:Histoquímica para lectinas.

114) Expressão de MMP-1 pelos neutrófilos distribuídos uniformemente por

todo o parênquima. Método: Imuno-marcação.

5. Discussão

Este trabalho abordou uma descrição temporal da hematopoese

hepática fetal, que corresponde ao segundo grande sítio da hematopoese

intra-embrionária (período hepático), que se inicia a partir dos 12 dpc,

quando o primórdio hepático está desenvolvido.

A partir dos 12 dpc, ocorre a intensa chegada de células progenitoras,

que inicialmente se diferenciam nas linhagens eritróide e megacariocítica.

Neste momento, os hepatócitos imaturos exercem o papel de células estromais

hematopoéticas, abrigando células hematopoéticas de todas as linhagens até

os 18 dpc. Durante este processo, ocorre o amadurecimento dos hepatócitos e

a modulação da expressão de componentes da matriz extracelular, de

moléculas de adesão, de fatores de transcrição e de uma série de outras

moléculas. Próximo ao puerpério, os ossos apresentam cavidade medular

desenvolvida e repleta por células hematopoéticas, em sua maioria da

linhagem granulocítica. Neste fase do desenvolvimento, a medula óssea passa

a substituir o fígado na produção e manutenção das diversas linhagens

hematopoéticas. O fígado segue as quatro fases morfológicas do

desenvolvimento dos órgãos linfóides e linfo-hematopoéticos descritos por

Lenzi (1980) e Lenzi & Lenzi (1986), isto é: 1- fase pré-hematopoética, que no

fígado fetal é mesênquimo-endodérmica; 2- fase de estabelecimento de

tecido hematopoético; 3- fase de diferenciação e especialização do órgão; 4-

fase de expansão ou terminal.

Os mecanismos de migração e de interação das células hematopoéticas

com as células estromais e as células endoteliais hepáticas são pouco

100

estudados, reforçando a importância desse estudo, que também abordou a

expressão celular de resíduos de açúcares e a expressão de

metaloproteinases pelas células hematopoéticas, bem como a caracterização

da matriz extracelular em fígado fetal murino em diferentes idades do

desenvolvimento.

Os processos ontogenéticos, incluindo o desenvolvimento do fígado

fetal, assemelham-se a outras três situações biológicas, nas quais ocorre o

fenômeno metastático ou metastático similar: disseminação de células linfóides

e inflamatórias, tumores malignos e micoses sistêmicas. Tais eventos se

caracterizam por apresentar as seguintes etapas evolutivas: 1- sítio ou fonte

celular; 2- proliferação local; 3- intravasão (invasão vascular); 4- migração em

vasos sanguíneos e/ou linfáticos (transporte vascular); 5- extravasão (saída

dos vasos); 6- invasão local de sítio(s) diferente(s) do(s) da(s) fonte celular(es)

original(ais), com proliferação (metástase); 7- nova intravasão e repetição

sucessiva das fases descritas (De Vitta et al., 2004; Mendes-Giannini et al.,

2000).

O estudo da matriz extracelular (MEC), em seus aspectos de síntese e

de degradação, tem sido relevante para o entendimento de muitas das etapas

acima referidas como, por exemplo, a proliferação local, a intravasão, o

endereçamento e a proliferação “metastática” distante da fonte original. No que

se refere à hematopoese, principalmente fetal, poucos são os trabalhos de

descrição e fisiologia da matriz extracelular presente no fígado fetal e o seu

papel na proliferação e diferenciação das células hematopoéticas. Assim, o

presente estudo caracterizou as etapas de construção, in situ, desses

101

ambientes de indução hepáticos, uma vez que a maioria dos trabalhos da

literatura foram realizados in vitro ou foram analisaram tópicos isolados, não

incorporando uma visão mais integral e in situ da hematopoese hepática.

Neste trabalho verificamos que os componentes colagênicos e de

proteoglicanos, mostraram-se escassos e mais ou menos constantes,

pricipalmente na fase de hematopoese mais intensa (entre 12 e 18 dpc). A

expressão de

fibronectina

foi intensa e constante, mudando apenas em

alguns aspectos topográficos e de acordo com o amadurecimento do fígado.

Porém, a fibronectina sempre foi mais evidente no território vascular, na parede

de veias e sinusóides, passando a definir a maturidade sinusoidal,

concomitante com a maturidade trabecular dos hepatócitos. Sánchez e

colaboradores (2000) descreveram o papel da fibronectina no favorecimento do

desenvolvimento dos cordões hepatocitários e na promoção da diferenciação

dos hepatócitos. Durante o desenvolvimento, sugere-se que a fibronectina

também possui papel importante na regulação da proliferação/ diferenciação

das células hematopoéticas. Neste trabalho, a regulação da saída das células

hematopoéticas maduras do fígado fetal não parece estar relacionada à

quantidade de fibronectina secretada pelos hepatócitos, pois esta glicoproteina

se manteve mais ou menos constante em todos os períodos fetais analisados.

Craddock e colaboradores (1997a e b) ao tratarem macacos com anticorpos

anti-CD44 ou anti-VLA4, observaram a ocorrência de uma maior mobilização

sistêmica de células hematopoéticas imaturas da medula óssea para o sangue

periférico. Todavia, enquanto anti-VCAM-1 induzia a mobilização, um peptídeo

competidor do segmento conectante-1 da fibronectina (CS1) não exercia

102

nenhum efeito (Craddock et al. 1997a e b). Estes dados indicaram que a

fibronectina não participa no processo de mobilização de células da medula

óssea após o tratamento com os anticorpos. Em conseqüência, foi verificado

um aumento da expressão de fibronectina na medula óssea nos estados de

hipoplasia medular. Assim, podemos sugerir que a fibronectina pode estar

desempenhando um papel importante na ecotaxia de células hematopoéticas

maduras e progenitoras durante a ontogenia, além de contribuir na indução de

proliferação local. Contudo, seu principal efeito parece estar relacionado ao

amadurecimento hepatocitário.

O desenvolvimento do arcabouço de fibras reticulares hepáticas fetais é

bastante tardio, começando a partir de 17,5 dpc como foi detectado por Amenta

e Harrison (1997) e verificado neste estudo. Tal fato talvez favoreça a

hematopoese, pois um ambiente escasso em colágeno facilitaria a

movimentação celular, o que é fundamental para o desenvolvimento da

hematopoese. Um ambiente com grande quantidade de colágeno apresentaria

muitas barreiras físicas, o que dificultaria a chegada e saída das células. Caso

as fibras reticulares, ricas em colágeno III e moléculas adesivas de matriz

extracelular estivessem presentes no fígado fetal, num estádio anterior a 18

dpc, talvez as células hematopoéticas ficassem retidas nesta malha ou

saíssem mais precocemente. Outra hipótese seria que a própria saída das

células hematopoéticas poderia desencadear um estímulo para a produção e

secreção de colágeno pelos hepatócitos. A escassez de elementos lançados

na matriz extracelular, principalmente nos sinusóides imaturos, facilitaria a

penetração das células precursoras no espaço perisinusoidal de Disse,

103

colocando-as em contato direto com os hepatócitos (hematopoese trabecular).

Na realidade, no período fetal, os hepatócitos se comportam como as principais

células estromais da hematopoese. O surgimento tardio da trama colagênica

parece estar mais na dependência da necessidade do estroma de sustentação

resistente e necessário para suportar o aumento gradativo e acentuado do

tamanho do fígado.

Devido à escassez de matriz extracelular no fígado fetal, nos parece

razoável afirmar que a hematopoese hepática fetal é principalmente controlada

por sinalização dependente de contato célula-célula, do que mediada por

elementos da matriz extracelular. Em geral, a matriz extracelular em ambientes

hematopoéticos apresenta-se escassa, reforçando os dados encontrados no

desenvolvimento fetal hepático. Parece que as células hematopoéticas são

sensíveis a baixas concentrações de elementos lançados na matriz extracelular

e reativas a níveis mais baixos ainda. Brill e colaboradores (2002) observaram

que a matriz extracelular extraída de fígados fetais, com remoção das cadeias

de condroitin-sulfato não foi eficiente para induzir a diferenciação de

hepatócitos fetais. Os hepatócitos adultos, cultivados nesta mesma matriz,

também reduziram a sua proliferação, mostrando a importância da presença

dos proteoglicanos na divisão celular, em especial das cadeias de condroitin-

sulfato. Assim sendo, estudos complementares in vitro utilizando hepatócitos,

serão importantes na obtenção de respostas sobre o controle da hematopoese

hepática fetal, enfatizando a sinalização mediada por glicosaminoglicanos e

proteoglicanos.

104

O estudo migratório das células hematopoéticas tem sido bastante

focalizado nos últimos anos, principalmente sob o aspecto das citocinas

pertinentes ao processo. No entanto, poucos são os trabalhos que se

preocupam em observar o tempo de migração de cada uma das linhagens

hematopoéticas entre os sítios de desenvolvimento e a situação anatomo-

funcional dos órgãos doador e receptor. Sabe-se que nestes processos

participam quimiocinas, citocinas, moléculas de adesão, metaloproteinases e

inibidores de metaloproteinases, dentre outras moléculas. (Christensen et al.,

2004), mas ainda não há metodologia acessível que possibilite avaliar,

multifatorialmente, os eventos que ocorrem na complexidade dos tecidos. Por

outro lado, os estudos in vitro são reducionistas e descontextualizados,

gerando interpretações artificiais. Estudar a complexidade dos fenômenos

biológicos in vivo é o grande desafio metodológico do futuro.

A estabilidade de ligações adesivas entre as moléculas é determinada

pelas alterações de energia-livre associada com ligações interativas

eletrostáticas, tipo Van der Waals ou de pontes de hidrogênio entre moléculas

de adesão celular (CAMs, cellular Adhesion Molecules) (Forgacs e Newman

2005). As ligações e separações entre as células (CAMs) e entre as células e o

estroma (SAMs, Substrate Adhesion Molecules) não são lineares. Segundo

Holland (1995), uma característica importante da não linearidade é a taxa de

reação (aderência) que ocorrre no choque ou no encontro entre as células ou

entre os agregados celulares (taxa de reação do agregado). As interações não-

lineares impedem de atribuir uma taxa de reação a reação agregada (Holland,

1995).

105

Neste trabalho, as células eritróides foram observadas no fígado fetal a

partir de 12 dpc e formavam focos (clusteres) de proliferação profundamente

imbricados com os hepatócitos, dificultando a sua visualização (eritropoese

trabecular). Somente após 14 dpc verificou-se a troca gradativa das hemácias

nucleadas pelas anucleadas, em contraste com as observações de Rifkind e

colaboradores (1969), quando descreveram a presença das hemácias a partir

de 10 dpc.

Em humanos, as células da linhagem megacariocítica foram

identificadas no interior de sinusóides e em espaço porta hilar a partir da 6 ª e

7ª semana, respectivamente, junto às células eritróides (Lenzi, 1980). Para

outros autores, o encontro de megacariócitos é mais tardio, apenas na 12ª

semana de gestação, quando a hematopoese hepática está totalmente

estabelecida e todas as linhagens sangüíneas são detectadas (Zamboni, 1965a

e b). Neste trabalho, desde os 12 dpc foram identificados alguns

megacariócitos próximos aos vasos hepáticos. Aos 15 dpc, há uma diminuição

no número dos megacariócitos, os quais persistem até os 18 dpc. Os

megacariócitos são importantes na hemostasia, pois os eventos de coagulação

necessitam que haja a produção/ liberação de plaquetas por estas células.

Assim, observou-se que, no início da hematopoese tanto os precursores

do saco vitelínico, como da região da AGM, amadureceram para células das

linhagens eritróide e megacariocítica. Os mecanismos de migração dos

megacariócitos despertam muito interesse, pois embora teoricamente os

megacariócitos possam provocar um retardamento do fluxo sangüíneo, levando

a uma coagulação intravenosa, tal fenômeno não é observado. Trabalhos como

106

o de Hamada e colaboradores (1998) e Lane e colaboradores (2000), que

buscaram algumas moléculas responsáveis pela migração dos megacariócitos

in vitro, serão importantes no estudo dos mecanismos de migração e saída

dessas células para o fígado fetal e ocupação na medula óssea recém-

formada.

Neste trabalho, constatou-se ainda que os granulócitos neutrofílicos e

raros eosinofílicos estão presentes no fígado fetal a partir dos 12 dpc. No

estádio de 15 dpc até o estádio de 17 dpc, os granulócitos neutrofílicos e

eosinofílicos também foram visualizados junto aos grandes vasos. Em estádios

mais tardios do desenvolvimento, os eosinófilos encontram-se freqüentemente

junto com muitos neutrófilos. Em relação ao surgimento tardio da série

granulocítica ou mielóide há duas possibilidades: 1) os precursores estavam

latentes no fígado até o surgimento local de condições microambientais

favoráveis, dependentes do mesênquima e não do endoderma (aparecimento

de matriz extraceleular subcapsular e em parede de ramos maiores da veia

porta); 2) os precursores migrariam tardiamente a partir de um sítio

desconhecido. Esta segunda hipótese é pouco provável, pois a hematopoese

cessa no saco vitelínico e na placenta aos 11,5 dpc e na região AGM, em 12

dpc (Pelajo-Machado, 2001).

A expressão concomitante de neutrófilos e eosinófilos indica que, a partir

de determinado momento, o fígado estimula a produção de uma cascata de

citocinas, com conseqüente indução de fatores de transcrição favoráveis a

cada linhagem, sem possibilitar, contudo, a discriminação topográfica de

territórios seletivos. Ambas as linhagens neutrofílicas e eosinofílicas são

107

dependentes do estroma mesenquimal, que somente se expressa tardiamente

de modo significativo, principalmente na parede de ramos principais da veia

porta. Desta forma, estes fatos justificam o aparecimento tardio da linhagem

mielóide dependente de mesênquima, diferente da linhagem eritróide, que é

dependente do endoderma, pelo menos no território hepático.

Em relação à fisiologia da migração dos neutrófilos, assim que o

ambiente deixa de ser propício à sua adesão ou fixação local, os neutrófilos

entram na circulação (intravasão) até se instalarem aleatoriamente em algum

ambiente favorável, podendo deixar o fígado como células maduras ou

imaturas. Papayannopoulou e Craddock (1997) mostraram que células

hematopoéticas injetadas em camundongos, incluindo suas progenitoras, não

eram retidas seletivamente pela medula óssea, mas distribuiam-se amplamente

para vários tecidos (fígado, pulmões, rins, baço, medula óssea).

Posteriormente, com o decorrer do desenvolvimento, as células

hematopoéticas são encontradas na medula ósea e no baço, indicando

retenção ou sobrevida e proliferação preferencial nestes dois órgãos. Células-

tronco hematopoéticas no fígado fetal de camundongo dobram em número

diariamente de 12,5 a 14,5 dpc e depois diminuem em número aos 15,5 dpc

(Ikuta e Weissman 1992; Morrison et al., 1995). Aos 12,5 dpc,

aproximadamente 1.200 células-tronco hematopoéticas estavam presentes,

subindo para 2.430 em 13,5 dpc e 5.100 em 14,5 dpc. Todavia, ao vez de

dobrar para 10.200, somente 4.350 células-tronco hematopoéticas do fígado

fetal foram encontradas em 15,5 dpc. Esta diminuição ou falha do fígado fetal

em dobrar as células-tronco hematopoéticas do dia 14,5 para o dia 15,5 dpc foi

108

inesperada, porque a mesma percentagem de células-tronco hematopoéticas

permanecem circulando no sangue fetal durante os estádios 14, 5 e 15,5 dpc

(Morrison et al., 1995). Assim, em torno de 5.800 células-tronco

hematopoéticas “faltaram” no fígado aos 15,5 dpc, possivelmente porque

migraram para a circulação sangüínea para instalar-se no baço e na medula

óssea. Como o número de células-tronco hematopoéticas circulantes no

sangue fetal foi mais ou menos constante durante a maioria do

desenvolvimento fetal tardio, a instalação das células-tronco hematopoéticas

no baço e na medula óssea é progressiva e não parece resultar da grande

migração em determinado tempo da gestação. Assim, a diminuição de células-

tronco hematopoéticas no fígado fetal aos 15,5 dpc parece decorrer da

diferenciação das células-tronco hematopoéticas para células mais maduras

(fora do pool de células-tronco hematopoéticas) sendo devido ao início da

diferenciação hepática e da indução de fatores de crescimento hepáticos

(Kinoshita et al., 1999; Christensen et al., 2004).

Neste estudo, o órgão preferencial para a instalação ou endereçamento

dos neutrófilos que deixam o fígado fetal a partir de 15 dpc, foi a medula óssea,

como observado anteriormente por Pelajo-Machado (2001). Antes da chegada

das células hematopoéticas, a medula óssea fetal é formada por células de

aspecto estromal fibroblastóide e alguns osteoblastos. Moore (2004) também

observou células diferenciadas na medula óssea na fase final de formação,

porém não chamou a atenção para nenhuma linhagem em especial.

Conforme descrito por Moloney e colaboradores (1960) e Rozenszajn e

colaboradores (1968) a reação da naftol cloroacetato esterase demonstra

109

especificamente esterase de neutrófilos, reagindo com promielócitos e

polimorfonucleares. Em complementação a estes trabalhos, este trabalho

mostrou através da reação da naftol cloroacetato esterase, que estas células

realmente se tratam de neutrófilos e que quando ocupam a medula óssea, os

neutrófilos expressam metaloproteinase-1 (MMP-1). Na medula óssea, os

neutrófilos desempenham provavelmente um papel no remodelamento da

matriz extracelular recém-sintetizada pelos osteoblastos, participando na

formação de um estroma mais favorável à posterior instalação de células

progenitoras ou imaturas, como destacado por Pelajo-Machado (2001). Neste

estudo, as metaloproteinase-1 (MMP-1) e metaloproteinase-9 (MMP-9)

expressam comportamentos diferentes: A MMP-1 foi expressa fracamente pelo

endotélio do fígado de 12 dpc, pelas células eritróides (12 e 13 dpc), reagindo

fortemente no citoplasma de neutrófilos maduros (16 dpc a 0 dpp). Khanna-

Gupta e colaboradores (2005) verificaram que a colagenase neutrofílica

humana (HNC, human neutrophilic collagenase) é uma das proteínas presentes

nos grânulos secundários expressada no amadurecimento tardio da linhagem

mielóide. Por outro lado, a

MMP-9

foi expressa somente pelo endotélio e pelas

células eritróides da fase imatura do fígado (12 e 13 dpc); porém, sendo

completamente negativa nos demais estádios do estudo (> 15 dpc). Estes

dados sugerem a possível interferência de ambas metaloproteinases no início

da eritropoese hepática através de mecanismos ainda desconhecidos.

Robinson e colaboradores (2005) mostraram que a MMP-9 não é requerida

para a mobilização de eritropoetina e de G-CSF (granulocyte colony-stimulating

factor). Por outro lado, Heissig e colaboradores (2002) verificaram que a MMP-

110

9, induzida em células da medula óssea, libera ligante solúvel de Kit (SKitL),

possibilitando a transferência de células-tronco endoteliais e hematopoéticas

dos nichos quiescentes para nichos proliferativos. De fato, as

metaloproteinases de matriz extracelular (MMP) promovem não só a quebra de

ligações na matriz, mas também provocam a liberação da ligação de citocinas

à superfície celular (Vu e Werb, 2000), como o fator de crescimento endotelial

vascular (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor), que pode regular a

angiogênese (Bergers et al., 2000) ou o recrutamento osteoclástico (Engsig et

al., 2000). Portanto, além de modificar a matriz extracelular, a MMP e a TIMP

(tissue inhibitor of MMP, inibidor tecidual de MMP) exercem outras funções,

incluindo a atividade de fator de crescimento, remoção de receptores de

superfície celular e auto-imunidade (Guedez et al. 1996). Vários trabalhos

demostraram que a TIMP-1 e a TIMP-2 são moléculas bifuncionais como o

fator de crescimento fibroblástico e a trombina, apresentando atividades anti-

proteásica e de fator de crescimento, atuando como potencializadores da

linhagem eritróide (Docherty et al., 1985; Hayakawa et al., 1990; Stetler-

Stevenson et al., 1992; Chesler et al., 1995). Dados da literatura descrevem

que no remodelamento ósseo há a participação da MMP-1 (Krane, 1995), fato

que corrobora para a importância da expressão MMP-1 nas células de

ocupação pioneira da medula óssea (dado não mostrado). Ademais, foi

descrito que os neutrófilos presentes na doença pulmonar obstrutiva crônica

expressam a MMP-1 (Cawston et al., 2001), bem como nos neutrófilos de

infiltrado inflamatório de lesões da polpa dentária (Shin et al., 2002).

111

A MMP-1 também pode desempenhar um papel na degradação da

matriz extracelular das membranas basais dos vasos durante os eventos de

migração do fígado fetal para a medula óssea, desempenhando um mecanismo

análogo aos eventos de migração e invasão de células neoplásicas

(Brinckerhoff et al., 2000; Yana e Seiki, 2002; Seiki, 2003; Seiki e Yana, 2003;

Pardo e Selman, 2005).

Thomas e Yoffey (1964), Enzan e colaboradores (1978), Lenzi (1980),

Emura e colaboradores (1983) e Sohn e colaboradores (1993) observaram a

presença de granulócitos no fígado fetal de humanos. Em camundongos, não

foram encontrados relatos sobre o assunto, reafirmando a necessidade deste

estudo in situ. O relato feito por Enzan e colaboradores (1978) da presença de

granulócitos em cultura nos instigou a verificar em quais ambientes hepáticos

estariam estas células. Enzan e colaboradores (1978), utilizando a microscopia

de campo claro, detectaram a presença de granulócitos neutrofílicos e

eosinofílicos entre 10 e 13 semanas de gestação humana; contudo, os autores

não mencionaram qualquer característica de distribuição seletiva dessas

células. No entanto, os autores chamaram a atenção para a presença de

populações granulocíticas em diferentes estágios de diferenciação próximos às

áreas mesenquimais hepáticas.

Neste trabalho, a localização preferencial de granulócitos neutrofílicos na

região subcapsular (14 aos 17 dpc) foi observada pela reação da naftol

cloroacetato esterase. A partir de 15 dpc houve um aumento dos granulócitos

neutrofílicos no tecido conjuntivo da parede de grandes ramos da veia porta

que mais tardiamente, quando em maior número, se localizavam de forma

112

difusa pelo parênquima. Barak e colaboradores (1980), utilizando fetos

humanos para investigar a presença de células das linhagens granulocítica,

macrofágica, eritrocítica e leucocitária, constataram in situ que cerca de 70%

das células observadas pelo Giemsa eram células eritróides. O restante da

população celular era constituída por alguns macrófagos, poucos granulócitos e

poucas células mononucleares primitivas. As análises citoquímicas utilizando

diferentes métodos como PAS, fosfatase alcalina, peroxidase e naftol

cloroacetato esterase foram negativas. Somente a -naftil acetato esterase

identificou a presença de macrófagos no tecido. No entanto, os resultados com

cultura de células mostraram que existem muitos progenitores granulocíticos,

uma vez que 92% das colônias observadas eram da linhagem granulocítica.

Dentre estas células granulocíticas em diferentes estágios de diferenciação,

65% delas eram constituídas por células imaturas e 35% por células maduras.

A discrepância observada por Barak e colaboradores (1980), entre os

resultados in situ e in vitro, provavelmente foi devido ao método de detecção

histoquímica/ citoquímica utilizado.

A associação dos granulócitos, tanto neutrofílicos quanto eosinofílicos, à

região capsular ou subcapsular deve ser devido à formação de um ambiente

especial nessa área, com um pouco mais de estroma conjuntivo (fibras

reticulares e colagênicas) e diferente gradiente de oxigenação (área periférica).

As características da região periférica do fígado não são bem conhecidas;

porém esta região normalmente apresenta reações peculiares. Por exemplo,

em pacientes com sangramento digestivo por ruptura de varizes esofágicas,

como nos casos de esquistossomose hepatoesplênica, se instala um quadro

113

regenerativo pseudo-cirrótico na periferia do fígado. A preferência das células

hematopoéticas por células mesenquimais foi descrita por Chagraoui e

colaboradores (2003). Contudo os autores não observaram a composição do

ambiente formado por estas células. Estudos que abordem as moléculas de

matriz extracelular presentes no microambiente de proliferação e

amadurecimento granulocítico nos diferentes sítios hematopoéticos fetais

(fígado e medula óssea) serão importantes na intelecção da cascata de

diferenciação hematopoética.

Os mecanismos responsáveis pela migração de células hematopoéticas

durante a ontogenia têm sido estudados, principalmente pelo uso de animais

nocaute. Nestes animais, as principais moléculas que participam do processo

de endereçamento são retiradas do genoma do camundongo e os efeitos de

sua ausência são observados. No entanto, a obtenção destes animais

mutantes com vida até o estágio de desenvolvimento que se deseja analisar é

razoavelmente árduo, resultando numa análise limitada.

O uso de lectinas na detecção de açúcares importantes na interação

entre diferentes tipos celulares tem sido cada vez mais o alvo de diversos

estudos. A importância das lectinas tem sido destacada na relação parasito-

hospedeiro, incluindo estudos sobre as vias de penetração parasitária, na

ativação de células hematopoéticas, dentre uma gama de outras aplicações. A

utilização de lectinas para identificar os resíduos glicídicos importantes na

interação entre células endoteliais e células hematopoéticas têm sido

empregada para o mapeamento de açúcares importantes no mecanismo de

migração de células hematopoéticas transplantadas. Neste estudo, a

114

expressão de alguns resíduos glicídicos no fígado fetal durante o período

hematopoético foi investigada. Os açúcares são importantes nos mecanismos

migratórios durante a ontogenia, uma vez que a sua utilização em estudos

embriológicos ainda é muito escassa. Detectou-se a marcação citoplasmática

de algumas células, como neutrófilos, eosinófilos e megacariócitos pela LCA

que possui afinidade pelos resíduos de -D-manose. No entanto, trabalhos

anteriores de Malin-Berdel e colaboradores (1984) e De Dios e colaboradores

(1984) relataram a presença de -D-manose em linfócitos. Esses trabalhos

mostraram uma maior afinidade da LCA pelos linfócitos B do que pelos

linfócitos T. Além disso, a participação de resíduos de galactosil e manosil nos

processos de interação entre células migrante-endotélio foi descrita por alguns

autores (Aizawa e Tavassoli, 1988; Tavassoli e Hardy, 1990). Em nosso

trabalho, observou-se que a LCA (-D-manose) apresentava dois padrões

principais: vascular e celular, que oscilaram de intensidade durante o

desenvolvimento hepático. O padrão vascular foi constante, enquanto que o

padrão celular mudou de expressão nas linhagens celulares, marcando

inicialmente a linhagem eritróide (eritropoese trabecular) (até 15 dpc), tendo

uma queda expressiva na intensidade aos 14 dpc. A marcação foi novamente

intensificada nos dois padrões aos 15 dpc, para depois ficar restrita (a partir

dos 16 dpc), além dos vasos e da cápsula, às linhagens megacariocítica e

neutrofílica, sendo negativa na linhagem eritróide.

A presença de



-D-manose foi observada na superfície de

megacariócitos em diferentes estágios de diferenciação (Abgrall et al., 1991) e

na superfície de plaquetas (Tsunehisa et al., 1984), inclusive neste trabalho.

115

Uma das funções descritas para -D-manose é inibir a agregação de plaquetas

e induzir a reação de liberação dessas pelos megacariócitos (Tsunehisa et al.,

1984, Abgrall et al., 1991). Tal reação parece ser causada pelo bloqueio dos

receptores de colágeno presentes na superfície plaquetária, principalmente a

glicoproteína IIb (Tsunehisa et al., 1984).

Uma outra afinidade da LCA é com a fração L3 da alfa fetoproteína

(AFP), sendo inclusive utilizada como marcador de carcinomas hepáticos (Sato

et al.,1993; Buamah et al., 1986; Li et al., 2001). Provavelmente a marcação

das células estromais periductais e algumas células hepáticas até a idade de

15 dpc corresponda a alguns hepatócitos imaturos que ainda estejam

expressando a AFP. Nesse sentido, é importante destacar que, pela

característica de expressão tecidual, a LCA possibilitou distinguir as fases

evolutivas do fígado fetal, que tem como ponto de viragem (turning point) a

transição de 14 para 15 dpc. Até 14 dpc, o fígado é mais imaturo, atuando

quase que exclusivamente como um órgão endodérmico, o qual estimula as

linhagens eritróide e megacariocítica, passando a apresentar sinais de maior

maturidade a partir de 15 dpc: hepatócitos aumentam a síntese de glicogênio,

aumenta o estroma mesodérmico e surgem células mielóides (neutrófilos e

eosinófilos).

Uma outra lectina utilizada no diagnóstico clínico de neoplasias

hepáticas é a ConA. A ConA e a LCA possuem homologias de resíduos, além

de compartilharem a especificidade pela -manose (Foriers et al., 1981;

Buamah et al., 1986). No entanto, neste trabalho, os fetos analisados foram

negativos para ConA, provavelmente devido a sua afinidade de ligação ser

116

diferente (Kornfeld et al.,1981; Buamah et al., 1986). A ConA consegue

diferenciar a AFP de células de carcinoma hepatocelular primário e das células

de metástase hepática; porém, a discriminação entre tumores benignos e

malignos é feita através da afinidade da LCA (Buamah et al., 1984; Buamah et

al. 1986). Atribuímos a diferença de resultados encontrada em nosso trabalho a

afinidade diferencial das duas lectinas pela AFP.

A marcação com a lectina PNA (-galactose (13) N-

acetilgalactosamina) foi completamente negativa na fase mais imatura do

fígado fetal (12 a 14 dpc), surgindo fracamente em células e vasos aos 15 dpc,

para depois marcar intensamente neutrófilos maduros (16-17 dpc). Com a

saída dos neutrófilos do fígado, persitiu apenas uma fraca expressão em vasos

(18 dpc), negativando-se ao 0 dpp. Malin-Berdel e colaboradores (1984), ao

analisarem a afinidade da PNA por células do sangue periférico, não

observaram nenhuma ligação específica da PNA com as células

indiferenciadas e diferenciadas. No entanto, Nicola e colaboradores (1980),

através da PNA, enriqueceram populações de progenitores de granulócitos e

macrófagos. Dini e colaboradores (1987) observaram a presença de receptores

de galatose em hepatócitos e macrófagos durante a ontogenia. Após o

nascimento, os receptores de galactose e manose foram detectados nas

células endoteliais. Kolb-Bachofen e colaboradores (1982) também detectaram

a presença de receptores de galactose nos progenitores de granulócitos e

macrófagos, nos hepatócitos e nas células endoteliais de ratos adultos.

Quondamatteo e colaboradores (1997) também verificaram a presença de

resíduos de galactose no desenvolvimento de fígados humanos e sugeriram

117

que o desaparecimento dos glicoconjugados que possuem -galactose poderia

representar um marcador de diferenciação hepática. De fato, em nossso

material, a PNA somente passou a ser detectada no fígado fetal a partir de 15

dpc, quando o fígado inicia a fase de maior maturidade.

A presença de resíduos de



-galactose foi observada na matriz

extracelular periportal e parece participar na diferenciação dos ductos biliares

(Shiojiri e Nagai, 1992, Quondamatteo et al., 1997). Quando resíduos de -

galactose são expressos na lâmina basal, eles estimulam o movimento de

células epiteliais (Trinkaus-Randall et al., 1988). Assim, nossos resultados

mostraram que não somente o endotélio adulto expõe ligação à -galactose,

mas que durante o desenvolvimento esta ligação também parece ter

importância, possivelmente promovendo a migração dos hepatócitos para

estabelecimento da organização em trabéculas. Ademais, foi possível destacar

as células neutrofílicas in situ.

Os resultados de Aizawa e Tavassoli (1988) e Tavassoli e Hardy (1990)

demonstraram a importância dos resíduos de galactosil e manosil no processo

de migração de células hematopoéticas através do endotélio. Dessa forma, a

marcação pela PNA, observada ao redor de vasos hepáticos sinusoidais e

vasculares aos 15 dpc, não somente confirma os dados da literatura, mas

também os aprofunda, mostrando que existe uma ligação da galactose com N-

acetilgalactosamina exposta pelo endotélio hepático. Esta ligação pode estar

participando no evento da migração/ adesão das células hematopoéticas.

Comparando os resultados obtidos com ABPR3 e PNA, observou-se

que a marcação da ABPR3 foi mais ampla, uma vez que a especificidade desta

118

lectina é maior do que a especificidade de PNA, que reconhece a ligação da

galactose com N-acetilgalactosamina (galactose X -galactose (13) N-

acetilgalactosamina). A lectina ABPR3 (galactose) marcou fortemente as

células endoteliais dos vasos (padrão vascular) e células da linhagem eritróide

e mielóide (neutrófilos) (padrão celular), não tendo sido possível, pela sua

constância de expressão, discriminar as etapas evolutivas do fígado fetal, como

ocorreu com a LCA (-D-manose). Além disso, também foi possível perceber

que os resíduos de galactose estão mais disponíveis que os resíduos de N-

acetilgalactosamina, visto que as lectinas como SBA e GSI foram negativas.

Os eventos de N-glicosilação no aparelho de Golgi terminam com a

adição de ácido siálico a uma molécula de galactose; anterior a galactose, é

encontrada a N-acetilglicosamina. Os nossos dados mostram que as

glicoproteínas expressas pelas células endoteliais hepáticas possuem um

padrão de glicosilação um pouco distinto. Tal fato é importante na investigação

dos açúcares participantes dos eventos de reconhecimento e migração das

células hematopoéticas durante a ontogenia, como também apontará as

prováveis glicoproteínas que devem ser caracterizadas para compreensão da

hematopoese.

O receptor de asialoglicoproteína é expresso no fígado e no endotélio

dos vasos. Tonelli e Meintz (1977) e Papayannopoulou e Craddock (1997)

conseguiram diminuir a migração celular das células hematopoéticas após

removerem os resíduos de ácido siálico, ao exporem os resíduos de galactose.

Os nossos resultados podem estar revelando a localização desse receptor

durante ontogenia através do uso das lectinas ABPR3 e PNA. No entanto,

119

estes resultados necessitam ser aprofundados para que tais propostas sejam

confirmadas.

Outras moléculas que podem estar sendo evidenciadas por essas

lectinas estão relacionadas às células da linhagem neutrofílica. Os neutrófilos

podem estar expondo pequenos glicosaminoglicanos, que interagiriam com o

CD44 expresso pelas células endoteliais e assim mediariam os eventos de

rolamento, adesão e diapedese.

Apesar dos resíduos de fucose estarem presentes em camundongos

Swiss Webster adultos como, por exemplo, em moléculas de sialil-Le(x)

(Watkins e Clarke, 2001), sua expressão entre 14 e 17dpc não foi detectada.

Tal fato deve estar relacionado a uma expressão tardia dessas moléculas

ligantes de selectina.

Alguns dados obtidos pela literatura sobre lectinas objetivaram o

isolamento de populações celulares, principalmente das populações de células

mais indiferenciadas (Reisner et al., 1978; Nicola et al., 1980). No entanto, para

esse fim, a identificação por sialomucinas de conjuntos de diferenciação

(clusters of diferentiation – CD) tem se mostrado mais eficaz. Em contrapartida,

os resultados deste trabalho são importantes para os estudos de identificação

de moléculas de endereçamento ou ecotaxia (homing), uma vez que a

importância de vários resíduos de açúcares durante essse tipo de evento é

conhecida. Os dados descritos neste trabalho merecem um maior

aprofundamento, a fim de que sejam obtidas maiores informações sobre os

mecanismos de endereçamento das células hematopoéticas migrantes para o

120

fígado fetal e a saída das mesmas para a medula óssea, sítio no qual ocorrerá

a hematopoese definitiva nos mamíferos adultos.

De modo complementar, os mecanismos pelos quais as células

hematopoéticas permanecem no fígado fetal, interagindo diretamente com os

hepatócitos também necessitam de uma descrição mais detalhada para um

melhor conhecimento do assunto. Dessa forma, os resultados deste trabalho

confirmaram os dados da literatura sobre a importância dos resíduos de

galactose e manose, além de identificar a importância da ligação da galactose

com a acetilgalactosamina no fígado fetal de camundongos entre 15 e 16 dpc.

121

6. Conclusão

A análise integral dos resultados possibilitou as seguintes conclusões:

1 – O fígado fetal, durante seu processo ontogenético, apresenta duas

fases distintas, uma fase imatura e predominantemente endodérmica (< 14

dpc) e outra fase mais madura (endodérmico-mesenquimal), com

amadurecimento dos hepatócitos, melhor definição dos padrões trabecular e

vascular e aumento do conjuntivo mesenquimal na cápsula, parede de veias e

no interstício do parênquima (> 15 dpc).

2 - Os hepatócitos na fase imatura do fígado fetal atuam como o estroma

fundamental da linhagem eritróide (hematopoese trabecular) (suporte estroma

endodérmico).

3 - A fibronectina parece estar mais relacionada ao amadurecimento

dos hepatócitos e da trama trabecular do fígado fetal.

4 – As fibras reticulares não foram relevantes para a hematopoese fetal

e surgem apenas no período tardio da fase mais madura do fígado fetal.

5 – O surgimento das células da linhagem mielóide (neutrófilos,

eosinófilos e monócitos) no fígado fetal foi dependente do aumento,

principalmente na parede de grandes ramos da veia porta, de estroma

mesenquimal.

6 – A cloroacetato esterase foi o melhor marcador para focos de

neutropoese, enquanto que os neutrófilos maduros foram marcados por LCA,

ABPR3, PNA e MMP-1.

6- A diminuição da hematopoese hepática (fase de desabitação)

coincide com a maturidade hepática.

122

7. Perspectivas

Para complementar este trabalho, novas metodologias deverão ser

empregadas, como:

a ampliação de marcadores imunoistoquímicos para várias proteínas

envolvidas com a hematopoese, os fatores de transcrição e genes in situ

(histogenômica e histoproteômica);

a microdissecção a laser com expressão gênica no tecido microdissecado

(para estudo de microambientes hepáticos, aplicando técnicas moleculares

e de proteômica);

a detecção gênica por microarrranjos;

 estudos ultraestruturais;

 aplicação de microscopia de força atômica em células isoladas para estudo

de interações adesionais;

a utilização de animais nocauteados, transgênicos, com silenciamento

gênico;

Para finalizar, é importante salientar que o estudo in situ da

hematopoese fetal, assim como em outros sítios, é extremamente complexo,

exigindo cada vez mais procedimentos metodológicos não-lineares, ainda

inexistentes ou de difícil aplicação.

123

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